(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ANEPPS類、ANRPEQ類、及びRH類から構成されるstyryl hemicyanines系の電位感受性蛍光色素から選択されるいずれかの電位感受性蛍光色素に対して、電離性化合物を添加して電位又はイオン強度変化を与え、更にビタミンE及び／又はコレステロールを添加して前記電位感受性蛍光色素の電位依存性又はイオン強度変化依存性の蛍光強度を増感させることを特徴とする、電位感受性蛍光色素の電位依存性又はイオン強度変化依存性の蛍光強度変化を測定する方法。
【請求項２】
500μM〜5μMのビタミンEを単独で、又は500μM〜5μMのビタミンEと500μM〜5μMのコレステロールを組み合わせて添加する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
電位感受性蛍光色素が、di-8-ANEPPS、di-4-ANEPPS、RH-237、RH-1691、di-5-ASP、RH-160、RH-421、RH-795、di-4-ANEPPDHQ、ANNINE-5、及びANNINE-6からなる群から選択される、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
電離性化合物が、塩化カリウム、塩化カルシウム、及び塩化ナトリウムからなる群から選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
培養液中の培養心筋細胞に対してANEPPS類、ANRPEQ類、及びRH類から構成されるstyryl hemicyanines系の電位感受性蛍光色素から選択されるいずれかの電位感受性蛍光色素を接触させ、培養液中にビタミンE及び／又はコレステロールを添加し、前記電位感受性蛍光色素の電位依存性又はイオン強度変化依存性の蛍光強度変化を測定することを特徴とする、培養心筋細胞の活動電位を測定する方法。
【請求項６】
培養心筋細胞が、初代培養心筋細胞、胚性幹細胞由来心筋細胞、単独の胚性幹細胞由来心筋細胞、誘導性多能性幹細胞（iPS細胞）由来心筋細胞、又は単独の誘導性多能性幹細胞由来心筋細胞である、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
500μM〜5μMのビタミンEを単独で、又は500μM〜5μMのビタミンEと500μM〜5μMのコレステロールを組み合わせて添加する、請求項5または6に記載の方法。
【請求項８】
電位感受性蛍光色素が、di-8-ANEPPS、di-4-ANEPPS、RH-237、RH-1691、di-5-ASP、RH-160、RH-421、RH-795、di-4-ANEPPDHQ、ANNINE-5、及びANNINE-6からなる群から選択される、請求項5〜7のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビタミンＥ及び／又はコレステロールを使用することにより、電位感受性蛍光色素の電位又はイオン強度変化に伴う蛍光を増感する方法又は蛍光強度を増強する方法に関する。本発明はまた、ビタミンＥ及び／又はコレステロールを使用することによって増感・増強した測定系を用いて、培養心筋細胞の活動電位を測定する方法に関する。本発明は更に、基材の表面に固相化した電位感受性蛍光色素を用いて、細胞又は脂質二重膜リポソーム等の膜担体の使用の有無にかかわらず電位感受性蛍光色素の電位又はイオン強度の変化を測定する方法に関する。本発明はまた、電位感受性蛍光色素の電位依存性又はイオン強度依存性蛍光強度の変化率を増感又は蛍光強度を増強する物質を選択する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
不整脈は、患者の生活の質を大きく低下させるだけではなく、時に患者生命を脅かす疾患である。また、様々な疾患に対する薬剤開発において、心筋細胞の電気的活動に影響を及ぼす副作用（例えば、不整脈）を検出し、これを回避することは非常に重要である。これまでは、抗不整脈薬の開発、及び心筋の電気活動に影響する作用を検査する目的で、動物や動物由来心筋細胞が用いられていた。しかし、これらは種差の問題を有するため、ヒトの十分な方法ではなかった（非特許文献１：Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．３８５，ｐ４９７−５０２，２００９）。【０００３】
最近、ヒトＥＳ細胞やヒトｉＰＳ細胞の開発によって、ヒト心筋細胞がこれらを分化させることにより得られることが示された。これらを用いて簡便にヒト心筋細胞の活動電位が取得できる方法があれば、創薬活動において重要な役割を担うと考えられる。このようなヒトＥＳ細胞やヒトｉＰＳ細胞細胞由来の心筋細胞の活動電位を測定するための方法として、電位感受性蛍光色素を用いる方法が想定される状況ではあるが、電位感受性蛍光色素を用いた解析では、ヒトＥＳ細胞由来心筋細胞もヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞も、電位感受性蛍光色素の感度不足により細胞の活動電位を測定することができなかった。【０００４】
また、これまで使用されてきた電位感受性蛍光色素は、細胞又は脂質二重膜リポソーム等の膜担体上に結合された状態でのみ電位を測定することができるものであった。即ち、電位感受性蛍光色素の感度を測定するためには、水溶液中の電位感受性蛍光色素を、細胞又は脂質二重膜リポソーム等の膜担体に固相化してから実験を行うことが必要であり、細胞又は脂質二重膜リポソーム等の膜担体を調製することを必要とした。この方式では、膜担体として、脂質二重膜リポソームの調製が必要であることや、細胞を用いる必要があることから、実験系が複雑化するとともに、種々のアーティファクトの介入を招く懸念があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．３８５，ｐ４９７−５０２，２００９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、電位感受性蛍光色素の電位又はイオン強度変化に依存する蛍光強度の変位を増感する方法及び／又は電位又はイオン強度依存性の蛍光強度を増強する方法を開発することを課題とする。本発明はまた、これまで測定不能であったＥＳ細胞、及びｉＰＳ細胞由来心筋細胞の活動電位変化を測定することを課題とする。本発明は更に、細胞又は脂質二重膜リポソーム等の物質（膜担体）を用いることなく、電位感受性蛍光色素の蛍光強度や、電位依存性の蛍光強度変化量を簡便に測定することを可能にすることを課題とする。本発明は更に、この方法を用いて、電位感受性蛍光色素の蛍光強度を増強する物質をスクリーニングするための方法を開発することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、様々な物質をスクリーニングし、ビタミンＥが電位感受性蛍光色素の感度を増強する作用を、そしてビタミンＥ及びコレステロールの両方ともが電位感受性蛍光色素の蛍光強度を増強する作用を、それぞれ有していることを見出した。しかも、これらは、組み合わせ可能であり、ビタミンＥにより電位感受性蛍光色素の感度を増強しつつ、コレステロール（又はコレステロールとビタミンＥの組合せ）により電位感受性蛍光色素の絶対的蛍光強度を増強することも可能であることが明らかになった。即ち、本願発明の発明者らは、これらの知見に基づいて、電位感受性蛍光色素に対して、電離性化合物を添加して電位又はイオン強度変化を与え、更にビタミンＥ及び／又はコレステロールを添加して電位感受性蛍光色素の電位性又はイオン強度変化を増感させることを特徴とする、電位感受性蛍光色素の電位依存性又はイオン強度変化依存性の蛍光強度変化を測定する方法を提供する。【０００８】
本発明者らはまた、上述した電位感受性蛍光色素の増感作用を利用して電位感受性蛍光色素の蛍光強度を増感することにより、これまで測定不能であったＥＳ細胞、及びｉＰＳ細胞由来心筋細胞等の単細胞の活動電位を測定することができること、更には細胞内の部分的な活動電位の変化を測定することができることを明らかにした。本願発明の発明者らは、この知見に基づいて、培養液中の培養心筋細胞に対して電位感受性蛍光色素を接触させ、培養液中にビタミンＥ及び／又はコレステロールを添加し、電位感受性蛍光色素の電位依存性又はイオン強度変化依存性の蛍光強度変化を測定することを特徴とする、培養心筋細胞の活動電位を測定する方法を提供する。【０００９】
本発明者らは更に、新たに電位感受性蛍光色素がプラスチック表面やガラス表面等の基材表面に吸着、固相化することができることを明らかにした。これは、電位感受性蛍光色素が、プラスチック表面やガラス表面等の基材表面に吸着し易い物質であることを明らかにしたことによる。この固相化した電位感受性蛍光色素を使用することにより、細胞又は脂質二重膜リポソーム等の膜担体の存在なしに、非常に簡便に、しかも、安定的で、再現性の高い、電位感受性蛍光色素を用いた電位又はイオン強度の変化の測定系を開発することに成功した。本願発明の発明者らは、この知見に基づいて、溶液中で基材の表面に電位感受性蛍光色素を固定し、前記溶液に対して電離性化合物を添加して電位又はイオン強度変化を与え、電位感受性蛍光色素の電位依存性又はイオン強度変化依存性の蛍光強度変化を測定することを特徴とする、細胞又は脂質二重膜リポソーム等の膜担体の存在なしに、電位感受性蛍光色素の電位又はイオン強度の変化を測定する方法を提供する。【００１０】
本発明者らは、更に別の態様において、特定の物質を使用することにより、電位感受性蛍光色素の蛍光の感度を増強することや、電位感受性蛍光色素の絶対的蛍光強度を増強することができることを明らかにしたことに基づいて、そして細胞又は脂質二重膜リポソーム等の膜担体の使用の有無にかかわらず、電位感受性蛍光色素の電位又はイオン強度の変化を測定することができることを明らかにしたことに基づいて、電位感受性蛍光色素の感度を増強することができる物質や絶対的蛍光強度を増強することができる物質をスクリーニングできることを明らかにした。本願発明の発明者らは、この知見に基づいて、（ｉ）溶液中で基材の表面に電位感受性蛍光色素を固定し、前記溶液に対して電離性化合物を添加し、そして電位感受性蛍光色素の電位依存性又はイオン強度変化依存性の蛍光強度変化を測定する、ことにより、細胞又は脂質二重膜リポソーム等の膜担体の存在なしに電位感受性蛍光色素の電位又はイオン強度の基準値を測定し、（ｉｉ）溶液中で基材の表面に電位感受性蛍光色素を固定し、前記溶液に対して電離性化合物と被検物質とを添加し、そして電位感受性蛍光色素の電位依存性又はイオン強度変化依存性の蛍光強度変化を測定する、ことにより、細胞又は脂質二重膜リポソーム等の膜担体の存在なしに電位感受性蛍光色素の電位又はイオン強度の試験値を測定し、（ｉｉｉ）（ｉ）で得られた基準値と（ｉｉ）で得られた試験値とを比較して、同一濃度の電離性化合物に対して、（ｉｉ）で得られた電位感受性蛍光色素の蛍光強度が（ｉ）で得られた蛍光強度よりも高い場合、又は少なくとも２点の異なる電離性化合物添加濃度に対して（ｉｉ）で得られた蛍光強度増加率が（ｉ）で得られた増加率よりも高い場合に、電位感受性蛍光色素の電位依存性又はイオン強度依存性蛍光強度の変化率を増強する被検物質を選択する、ことを含む、電位感受性蛍光色素の電位依存性又はイオン強度依存性蛍光強度の変化率を増強する物質を選択する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
細胞又は脂質二重膜リポソーム等の膜担体の存在なしに行う実験系においても、また細胞又は脂質二重膜リポソーム等の膜担体を使用する従来からの実験系においても、ビタミンＥにより電位感受性蛍光色素の電位依存性又はイオン強度変化依存性の蛍光の感度を増強することができること、そしてビタミンＥ及びコレステロールの両方ともにより電位感受性蛍光色素の電位依存性又はイオン強度変化依存性の蛍光強度を増強することができることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、膜担体としての細胞が存在しない条件下にて、基材表面上に固相化した電位感受性蛍光色素が、イオン強度に比例した蛍光強度を発光することを示す図であり、基材の材質（ガラス又はプラスチック）に関わらず、そして電位感受性蛍光色素の種類に関わらず、添加した電離性化合物（塩化カリウム）の濃度に比例して、蛍光強度が増加することを示す。
【図２】図２は、膜担体としての細胞が存在しない条件下にて、基材表面上に固相化した電位感受性蛍光色素が、イオン強度に比例した蛍光強度を発光することを示す図であり、Ｄｉ８−ＡＮＥＰＰＳ（ａ）およびＲＨ２３７（ｂ）について、添加した電離性化合物（塩化カリウム）の濃度に比例した蛍光強度変化を生じることを示す。
【図３】図３は、ビタミンＥが電位感受性蛍光色素の電位依存性蛍光強度変化率を増加させる作用（増感作用）を有する物質として機能すること、そしてコレステロールとビタミンＥが両方とも電位感受性蛍光色素の電位依存性蛍光強度の増強物質として機能することを示す図である。
【図４】図４は、ビタミンＥが電位感受性蛍光色素の電位依存性蛍光強度変化率を増加させる作用（増感作用）を有する物質として機能すること、そしてコレステロールとビタミンＥが両方とも電位感受性蛍光色素の電位依存性蛍光強度の増強物質として機能することを示す図である。
【図５】図５は、ビタミンＥ及びコレステロールは、膜担体として細胞を用いた条件下においても同様に、電位感受性蛍光色素の増感作用又は増強作用を示すことができることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
電位感受性蛍光色素は、心筋細胞や神経細胞の活動電位を測定するために、有用な物質である。これまでに様々な電位感受性蛍光色素物質が報告されている。これらの電位感受性蛍光色素を用いて蛍光強度により活動電位の特性を解析する従来から行われてきた方法は、細胞又は脂質二重膜リポソーム等の膜構造（膜担体）を用いて細胞膜内外の電位差を測定する方法である。これらの従来行われてきた方法においては、自律的な電気的活動性を有する細胞よりもむしろ、電気的活動性を有さない細胞又は脂質二重膜リポソーム等の膜担体を用い、細胞外から電離性化合物を添加することによって、電位差を作成することに基づいて行われる定量的な解析方法として一般的に使用されてきた。
【００１４】
電位感受性蛍光色素を用いて電位を測定するために細胞を用いる理由は、もともと、電位感受性蛍光色素が細胞膜電位差を測定することを目的としていたためであり、その目的を達成するために細胞膜への高い移行性を獲得するように開発されたことに由来する。
【００１５】
本発明者らは、活動電位の変化をより高い感度で検出することを可能にする添加物を探索するために、まず、従来法に従い膜担体として細胞を用いた方法で測定を行った。電位感受性蛍光色素の蛍光強度を強くするために電位感受性蛍光色素の添加濃度を増加したところ、細胞上における蛍光強度よりもむしろ細胞培養皿上の蛍光強度が増加するという現象、即ち、バックグラウンドの蛍光強度が増加するという現象が生じた。この現象は、細胞培養皿の基材表面に対して、電位感受性蛍光色素が固定化されるという現象により生じることを示唆している。これまで、電位感受性蛍光色素は細胞又は脂質二重膜リポソーム等の膜担体に固相化してから実験を行うことが必要と考えられており、プラスチックやガラス等の基材の表面に固定化することができることは、全く予期せぬ現象であった。
【００１６】
この知見に基づいて、本願発明者らは、電位感受性蛍光色素を細胞又は脂質二重膜リポソーム等の膜担体に固相化させる代わりに、電位感受性蛍光色素をプラスチックやガラス等の細胞接着性の基材表面に接着させたこと以外は、従来法に従って、電離性化合物の添加に伴う電離性化合物の濃度（即ち、イオン強度）に依存する蛍光強度の変化を測定した。その結果、細胞又は脂質二重膜リポソーム等の膜担体を用いずとも、電離性化合物の濃度（イオン強度）依存性に蛍光強度が増強することを見出した。これによって、電位感受性蛍光色素の蛍光強度や、電位依存性の蛍光強度変化量を簡便に測定することを可能にした。
【００１７】
即ち、本発明の一態様において、溶液中で基材の表面に電位感受性蛍光色素を固定し、前記溶液に対して電離性化合物を添加し、そして電位感受性蛍光色素の電位依存性又はイオン強度変化依存性の蛍光強度変化を測定する、ことにより、細胞又は脂質二重膜リポソーム等の膜担体の存在なしに、電位感受性蛍光色素の電位又はイオン強度の変化を測定する方法を提供することができることを示した。
【００１８】
ここで、電位感受性蛍光色素は、当該技術分野において一般的に入手可能なもののいずれであってもよく、例えば、ＡＮＥＰＰＳ類、ＡＮＲＰＥＱ類、及びＲＨ類等から構成されるスチリル系の電位感受性蛍光色素；ＤｉＳＣ類、ＤｉＯＣ類、ＤｉＩＣ類、ＤｉＢＡＣ類、ＤｉＳＢＡＣ類等から構成されるｃｙａｎｉｎｅ系、ｏｘｏｎｏｌ系の電位感受性蛍光色素；そしてＲｈ  １２３、ＴＭＲＭ、ＴＭＲＥ等のｒｈｏｄａｍｉｎｅ誘導体の電位感受性蛍光色素；から選択される電位感受性蛍光色素を使用することができる。本発明においては、ＡＮＥＰＰＳ類、ＡＮＲＰＥＱ類、及びＲＨ類等から構成されるスチリル系の電位感受性蛍光色素を使用することがより好ましく、具体的には、ｄｉ−８−ＡＮＥＰＰＳ、ｄｉ−４−ＡＮＥＰＰＳ、ＲＨ−２３７、ＲＨ−１６９１、ｄｉ−５−ＡＳＰ、ＲＨ−１６０、ＲＨ−４２１、ＲＨ−７９５、ｄｉ−４−ＡＮＥＰＰＤＨＱ、ＡＮＮＩＮＥ−５、又はＡＮＮＩＮＥ−６を好ましい電位感受性蛍光色素として使用することができる。
【００１９】
溶液中で基材の表面に固定した電位感受性蛍光色素に対して添加する電離性化合物は、溶液中で電離してイオン化する物質であればどのようなものであってもよい。即ち、カリウム、ナトリウム、カルシウム、重炭酸イオン、塩素イオン、水酸化イオン及びアンモニウムイオン等の生体組織液又は細胞内液に含まれるイオンのみを構成要素とする電離性化合物であればよい。本発明においては、例えば、塩化カリウム、塩化カルシウム又は塩化ナトリウムを好ましい電離性化合物として使用することができる。
【００２０】
プラスチック及びガラス等の基材表面においては、特別の処理を必要とせず、又は細胞が接着し易いような表面処理が施されていても構わない。これらの表面に対し、適切な電位感受性蛍光色素濃度で（例えばＡＮＥＰＰＳ類の電位感受性蛍光色素を使用する場合においては１００μＭ以下の濃度で）、適切な時間（例えばＡＮＥＰＰＳ類では１５分間）、適切な温度において（例えばＡＮＥＰＰＳ類では２０℃）、処理する。処理した表面を任意の水溶液で最低３回洗浄することにより、固定されていない電位感受性蛍光色素を除去する。
【００２１】
本発明において更に、細胞又は脂質二重膜リポソーム等の膜担体の存在なしに、電位感受性蛍光色素の電位又はイオン強度の変化を測定する上述の方法を用いることにより、これまで細胞又は脂質二重膜リポソーム等の膜担体を使用して行ってきた電位感受性蛍光色素による電位又はイオン強度変化の測定を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて非常に簡便に行うことができた。そこで、電位感受性蛍光色素の蛍光強度の変化を増強する物質、及び蛍光強度変化を検出し易くする物質をスクリーニングすることを目的として、上述の方法を使用した。即ち、上述の方法を使用した電位感受性蛍光色素の蛍光強度を改変する物質（即ち、蛍光強度を増強する物質又は低下する物質）、及び蛍光強度変化を検出し易くする物質（即ち、蛍光強度変化の上昇を検出しやすくする物質又は蛍光強度変化の低下を検出しやすくする物質）のスクリーニング方法を提供できることを示した。即ち、この方法においては：
【００２２】
溶液中で基材の表面に電位感受性蛍光色素を固定し、前記溶液に対して電離性化合物を添加し、そして電位感受性蛍光色素の電位依存性又はイオン強度変化依存性の蛍光強度変化を測定する、ことにより、細胞又は脂質二重膜リポソーム等の膜担体の存在なしに電位感受性蛍光色素の電位又はイオン強度の基準値を測定し、
【００２３】
溶液中で基材の表面に電位感受性蛍光色素を固定し、前記溶液に対して電離性化合物と被検物質とを添加し、そして電位感受性蛍光色素の電位依存性又はイオン強度変化依存性の蛍光強度変化を測定する、ことにより、細胞又は脂質二重膜リポソーム等の膜担体の存在なしに電位感受性蛍光色素の電位又はイオン強度の試験値を測定し、
【００２４】
（ｉｉｉ）（ｉ）で得られた基準値と（ｉｉ）で得られた試験値とを比較して、同一濃度の電離性化合物に対して、（ｉｉ）で得られた電位感受性蛍光色素の蛍光強度が（ｉ）で得られた蛍光強度よりも高い場合、又は少なくとも２点の異なる電離性化合物添加濃度に対して（ｉｉ）で得られた蛍光強度増加率が（ｉ）で得られた増加率よりも高い場合に、電位感受性蛍光色素の電位依存性又はイオン強度依存性蛍光強度の変化率を改変する被検物質を選択する、
【００２５】
ことを含む、電位感受性蛍光色素の電位依存性又はイオン強度依存性蛍光強度の変化率を改変する物質を選択する方法を提供する。
【００２６】
ここで、電位感受性蛍光色素の電位依存性又はイオン強度依存性蛍光強度の変化率を「改変する」というばあい、その変化率を増強させる場合、そしてその変化率を低下させる場合のいずれであってもよい。本発明においては、電位感受性蛍光色素の蛍光強度を増強する物質、及び蛍光強度の増加を検出し易くする物質がそれぞれ好ましい。
【００２７】
膜担体として細胞を用いた従来のスクリーニング方法では、物質が、細胞に存在するイオンチャネル等の蛋白質に作用するのか、又は電位感受性蛍光色素と直接相互作用するのか判別が困難であったが、本願発明に係る上記スクリーニング方法では、従来法と異なり細胞又は脂質二重膜リポソーム等の膜担体が存在しないことから、当該色素と直接相互作用を行う物質を選択することができる。
【００２８】
上記の方法の（ｉｉ）被検物質として多数の物質を添加して、それぞれの物質が電位感受性蛍光色素の蛍光強度を増強する物質であるか、又は蛍光強度変化を検出し易くする物質であるかを調べた。その結果、特徴の異なる二つの物質、ビタミンＥ及びコレステロール、が電位感受性蛍光色素の蛍光強度を増強することを見出した。これらの作用を詳細に検討したところ、ビタミンＥは電位感受性蛍光色素の感度を増強する作用を、ビタミンＥ及びコレステロールは両方とも電位感受性蛍光色素の蛍光強度を増強する作用を、それぞれ有していることが明らかになった。
【００２９】
このスクリーニング系では、細胞又は脂質二重膜リポソーム等の膜担体を使用しない実験系を採用することによって、色素と物質との直接相互作用に基づく蛍光強度変化を採取することができる。そのため、ビタミンＥ及びコレステロールは、膜の作用や膜電位による補助によらず、色素に直接作用することによって、周辺イオンに対する感度及び蛍光強度の増強を行うことが明らかになった。
【００３０】
また、ビタミンＥ及びコレステロールの性質から、ビタミンＥ誘導体及びコレステロール誘導体において、ブチル化ヒドロキシトルエン、トロロクス（ｔｒｏｌｏｘ）、カテキン、アスタキサンチン等の誘導体及び公知の文献（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．２８，１９９６，ｐｐ６５−１３８及びＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８０，２００２，ｐｐ１５１−１６７等）に記載される化合物やその誘導体等の脂溶性抗酸化物質において類似の機能が容易に期待できる。
【００３１】
蛍光強度及び電位依存的蛍光強度変化量に影響する物質をスクリーニングする場合には、溶液に対して固相化したい任意の色素物質を添加して、上記の方法に従って処理することができる。これらのスクリーニング系において、ビタミンＥ及びコレステロールの濃度と蛍光強度の増感作用又は増強作用を確認した結果、ビタミンＥは、５００μＭ〜５μＭの濃度で用いることにより、電位感受性蛍光色素の感度を増強することができること、そして同時に電位感受性蛍光色素の蛍光強度を増強することができることを見出した。また、同様に見出したコレステロールは５００μＭ〜５μＭの濃度で用いることにより、電位感受性蛍光色素の蛍光強度を増強することができることを見出した。
【００３２】
更には、このようなスクリーニング方法により得られた感度増強物質や、蛍光強度増強物質を用い、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞由来心筋細胞の多細胞群、及び単独細胞、及び細胞内の一部における活動電位変化を、従来法よりも高感度に測定することができることを示した。具体的には、培養液中の培養心筋細胞に対して電位感受性蛍光色素を接触させ、培養液中にビタミンＥ及び／又はコレステロールを添加し、電位感受性蛍光色素の電位依存性又はイオン強度変化依存性の蛍光強度変化を測定する、ことにより、培養心筋細胞の活動電位を測定することにより、従来法よりも高感度に測定することができることを示した。
【００３３】
心筋細胞の活動電位を測定するためには、プラスチックやガラス等の基材表面に任意の細胞接着促進処理を行い、心筋細胞を接着培養する。接着培養した細胞に対し培養液中に電位感受性蛍光色素を添加することにより細胞を染色し、ビタミンＥ及び／又はコレステロールをそれぞれ５００μＭ〜５μＭの濃度で添加する。この場合、ビタミンＥを単独で使用しても、コレステロールを単独で使用しても、ビタミンＥとコレステロールを組み合わせて使用してもよい。
【００３４】
蛍光顕微鏡としては当該技術分野において使用することができるいずれの蛍光顕微鏡を使用してもよく、例えばＩＸ７１（ＯＬＹＭＰＵＳ株式会社）を使用する。そして、蛍光顕微鏡としてＩＸ７１（ＯＬＹＭＰＵＳ株式会社）を使用する場合には、光源装置として、水銀ランプ（ＯＬＹＭＰＵＳ株式会社）もしくはＬＥＤ光源（ＯＬＹＭＰＵＳ株式会社）を用いた。また、蛍光画像の取得及びイメージング及び数値計算は、当該技術分野において使用することができるイメージング及び数値計算用の解析ソフトであればどのようなものであっても使用することができるが、本発明においてはＭｉＣＡＭ０２システム（ｂｒａｉｎｖｉｓｉｏｎ株式会社）を用いた。
【００３５】
これらの結果を総合すると、細胞又は脂質二重膜リポソーム等の膜担体の存在なしに行う実験系においても、細胞又は脂質二重膜リポソーム等の膜担体を使用する従来からの実験系においても、電位感受性蛍光色素の電位依存性又はイオン強度変化依存性の蛍光強度を、ビタミンＥにより感度を増強することができること、そしてビタミンＥ及びコレステロールの両方ともにより蛍光強度を増強することができることを示した。従って、本発明は、実験系にかかわらず、電位感受性蛍光色素に対して、電離性化合物を添加して電位又はイオン強度変化を与え、更にビタミンＥ及び／又はコレステロールを添加して膜担体の使用の有無にかかわらず電位感受性蛍光色素の電位又はイオン強度変化を増感させることを特徴とする、電位感受性蛍光色素の電位依存性又はイオン強度変化依存性の蛍光強度変化を測定する方法を提供することができることを新たに示した。
【実施例】
【００３６】
本発明を以下の実施例により更に詳細に説明する。しかしながら、以下の実施例は、本発明の例示であって、本発明を限定することを意図するものではない。【００３７】
実施例１：基材表面に固相化した電位感受性蛍光色素を用いた蛍光強度、電位依存性蛍光強度変化測定方法の構築
本実施例においては、透明プラスチック及びガラス等の基材表面に電位感受性蛍光色素を固相化する方法、及び基材表面に固相化した電位感受性蛍光色素の蛍光強度、電位依存性蛍光強度変化の測定方法を示す。【００３８】
電位感受性蛍光色素（Ｄｉ８−ＡＮＥＰＰＳ又はＤｉ４−ＡＮＥＰＰＳ；ともにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、終濃度１０％のウシ胎児血清（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，Ｋａｎｓａｓ，ＵＳＡ）を含むＭＥＭ−ＢＡＳＥ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）中に５０μＭを混合し、これを０．２２μｍシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を用いて、ろ過することにより、電位感受性蛍光色素溶液を作製した。【００３９】
これを３．５ｃｍプラスチック培養皿（ＢＤ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）及び３．５ｃｍガラスボトムディッシュ（ＩＷＡＫＩ，Ａｓａｈｉ  Ｇｌａｓｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に対し、それぞれ１ｍｌ量を添加し、２０℃、１５分間表面を処理した。処理した表面を、３７℃に温めた電位感受性蛍光色素を含まない上記溶液で最低３回洗浄することにより、固相化されていない電位感受性蛍光色素を除去した。【００４０】
５０μＭのＭｎ−ＴＢＡＰ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及び９９２μＭのＴｒｏｌｏｘ（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を含む１０％のウシ胎児血清を含むＭＥＭ−ＢＡＳＥにメディウムを交換し、蛍光顕微鏡システムＩＸ７１（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）及び、水銀ランプ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）もしくはＬＥＤ光源（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用い蛍光シグナルを取得し、ＭｉＣＡＭ０２システム（Ｂｒａｉｎｖｉｓｉｏｎ  Ｉｎｃ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いイメージング及び数値計算を実施した。【００４１】
溶液中の電位変化を与える目的で、終濃度で０、５、１０、１５、２０ｍＭになるように塩化カリウム溶液を溶液中に添加した。塩化カリウム添加後、１分間静置し、それぞれのディッシュ表面（電位感受性蛍光色素存在部位）の蛍光強度を測定した。各濃度における蛍光強度をディッシュ上の異なる３点で取得し、蛍光強度を平均、標準偏差を求めた。上記をグラフ上にプロットし、蛍光強度及び蛍光強度変化をグラフ化した（図１）。【００４２】
図１において、（ａ）はプラスチックディッシュ表面上にＤｉ８−ＡＮＥＰＰＳを固相化した場合、（ｂ）はプラスチックディッシュ表面上にＤｉ４−ＡＮＥＰＰＳを固相化した場合、そして（ｃ）はガラスディッシュ表面上にＤｉ８−ＡＮＥＰＰＳを固相化した場合を示した。これらの結果から、基材の材質（ガラス又はプラスチック）に関わらず、そして電位感受性蛍光色素の種類に関わらず、添加した電離性化合物（塩化カリウム）の濃度に比例して、蛍光強度が増加することが明らかになった。【００４３】
また、電位感受性蛍光色素の使用可能な濃度範囲を求める目的で、Ｄｉ８−ＡＮＥＰＰＳ及びＲＨ２３７（ともにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をそれぞれ１０μＭ又は１００μＭ使用して、３．５ｃｍプラスチック培養皿の表面上に添加し、更に終濃度で０、５、１０、１５、２０ｍＭになるように塩化カリウム溶液を溶液中に添加して、同様の検討を行った結果をグラフ化した（図２）。【００４４】
図２において、（ａ）は１０μＭ  Ｄｉ８−ＡＮＥＰＰＳと１００μＭ  Ｄｉ８−ＡＮＥＰＰＳを使用した場合のデータを、（ｂ）は１０μＭ  ＲＨ２３７と１００μＭ  ＲＨ２３７を使用した場合のデータを、それぞれ示す。これらの結果から、添加した電離性化合物（塩化カリウム）の濃度に比例した蛍光強度変化を生じることが明らかになった。【００４５】
実施例２：基材表面に固相化した電位感受性蛍光色素を用いた蛍光強度、電位依存性蛍光強度変化（感度）増強物質のスクリーニング
本実施例では、実施例１に記載の電位感受性蛍光色素の蛍光強度及び電位依存性蛍光強度変化率（感度）を増強する物質のスクリーニングを実施し、それぞれの作用を有する物質を同定する方法を示す。【００４６】
実施例１に記載の方法に従って電位感受性蛍光色素溶液として１００μＭのＤｉ８−ＡＮＥＰＰＳの溶液を調製し、その溶液に７５μＭのビタミンＥ（和光純薬）、７５μＭのコレステロール（和光純薬）、又はこれらの組合せを添加した。ビタミンＥ添加群（図３「ＶＥ  １８．７５μＭ」）、コレステロール添加群（図３「Ｃｈｏ  １８．７５μＭ」）、ビタミンＥ＋コレステロール添加群（図３「ｄｏｕｂｌｅ」）、そして対照群（図３「ｄｉ−８」）のそれぞれについて、電位依存的な蛍光強度変化量及び電位依存的な蛍光強度を、実施例１の方法と同様に、終濃度で０、５、１０、１５、２０ｍＭになるように塩化カリウム溶液を溶液中に添加する方法を用いて実施した。その結果をグラフ化し、図３に図示した（図３）。【００４７】
図３において、（ａ）は蛍光強度の変化率を、そして（ｂ）は蛍光強度の測定値を、そしてそれぞれの図において、◆は対照群（Ｄｉ８−ＡＮＥＰＰＳのみ）、■はビタミンＥ添加群、▲はコレステロール添加群、そして●はビタミンＥ＋コレステロール添加群、をそれぞれ示している。【００４８】
図３（ａ）において塩化カリウム無添加時と比較した蛍光強度の変化率を調べた結果、ビタミンＥは電位感受性蛍光色素の蛍光の感度を増強する作用（即ち、増感作用）を有することが明らかになった。【００４９】
また、図３（ｂ）において塩化カリウム濃度ごとに比較した蛍光強度の増加を調べた結果、ビタミンＥ及びコレステロールがともに、電位感受性蛍光色素の蛍光強度を増強する作用を有することが明らかになった。更には、ビタミンＥとコレステロールを混合して使用することによって、蛍光強度を相加的に増強させると共に、ビタミンＥに由来する電位依存性蛍光強度変化率を増加させる作用（増感作用）を併せ持たせることができた。この結果は、本明細書に記載する電位感受性蛍光色素の蛍光強度増強物質及び／又は電位依存性蛍光強度変化率を増加させる物質のスクリーニング系が非常に優れた方法であることを示している。【００５０】
更に、図４において、コレステロールとビタミンＥの使用可能な濃度範囲を求める目的で、５μＭ、１８．７μＭ、又は５００μＭのビタミンＥ、又は１８．８μＭ又は２３８μＭのコレステロールを１００μＭのＤｉ８−ＡＮＥＰＰＳ溶液に対してそれぞれ添加して、３．５ｃｍプラスチック培養皿の表面上に添加し、更に終濃度で０、１０、２０、３０、４０、５０ｍＭになるように塩化カリウム溶液を溶液中に添加して、同様の検討を行った結果をグラフ化した（図４）。【００５１】
これにより、コレステロールは、濃度に依存した蛍光強度の増強がえられることが、ビタミンＥは、蛍光強度、蛍光強度変化率共に、濃度に依存せず、少なくとも１８．７μＭから５００μＭの範囲では、蛍光強度を１．５倍程度、蛍光強度変化率を３倍程度増加させた。更にビタミンＥは５μＭの低濃度でも蛍光強度変化率を増加させる作用があることが明らかとなった。【００５２】
実施例３：ヒトＥＳ細胞及びヒトｉＰＳ細胞に由来する心筋細胞の活動電位測定
本実施例においては、ヒトＥＳ細胞及びヒトｉＰＳ細胞から心筋細胞を分化させ、分化した心筋細胞を酵素的に分散培養し、その活動電位の取得する際の、ビタミンＥ及びコレステロールの作用を検討した。【００５３】
ヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、京都大学再生医科学研究所附属幹細胞医学研究センター（ナショナルバイオリソースプロジェクトによる胚性幹細胞センター）から入手した。ヒト誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、京都大学物質細胞統合システム拠点ｉＰＳ細胞研究センターから入手した。【００５４】
このヒト幹細胞を、マイトマイシンＣ処理により増殖不活性化したマウス胚性線維芽細胞（ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ；ＭＥＦ）を用いて未分化維持培養を行った。なお、当該ＭＥＦ細胞は、妊娠１４日のＩＣＲマウス（日本クレア）の胎仔由来材料（内臓と頭部を全て除去した後に残りの部分）を用いて、これをＷＯ２００６／０２２３７７に記載の方法を用いてバラバラに分散処理して得ることができる。【００５５】
培養液としては、Ｆ１２／ＤＭＥＭ（１：１）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、製品番号Ｄ６４２１）、２０％ＫＯ−ＳＥＲＵＭ（ＧＩＢＣＯ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）、１．６ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（ＭＥＭ）、０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール（２−ＭＥ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、及び１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）の組成の培養液を用いた。植え継ぎに際しては、０．１％ＩＩＩ型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）、３７℃、１０分にて胚性幹細胞コロニーを分離した。【００５６】
続いて、ＭＥＦと胚性幹細胞を分離するために、ポアサイズ４０μｍのメッシュの非通過細胞塊（胚様体、ＥＢ）を取得した。この細胞塊が即ち純粋な胚性幹細胞塊である。分化にあたり、ＥＢあたり５０〜１０００個の胚性幹細胞塊を細胞非接着性バクテリアディッシュ（ＡＧＣ  ＴＥＣＨＮＯ  ＧＬＡＳＳ  ＣＯ．，ＬＴＤ．，Ｃｈｉｂａ，Ｊａｐａｎ：滅菌シャーレ）上で胚様体として合計１５〜３０日間培養し心筋細胞を含む胚様体へと分化させた。【００５７】
更に、ＷＯ２００６／０２２３７７に記載の方法を用いて心筋細胞を分散処理した。即ち、胚様体をコラゲナーゼとトリプシンで処理し、バラバラの単細胞を得た。これを、１０％血清を含むαＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に懸濁し、０．００１％フィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）３７℃、１時間処理にて表面をコーティングした３．５ｃｍプラスチック培養皿（ＢＤ）及び３．５ｃｍガラスボトムディッシュ（ＩＷＡＫＩ，Ａｓａｈｉ  Ｇｌａｓｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）に播種した。接着した心筋細胞は、自律的に拍動していた。【００５８】
これに対し、ビタミンＥ及びコレステロールを用いないで測定した場合、及び実施例２に従い培養細胞を電位感受性蛍光色素及び１８．７５μＭのビタミンＥ及び／又は１８．７５μＭのコレステロールにて処理し、蛍光強度の時間的変化を測定した。これにより、単一細胞の活動電位及び単一細胞の一部に由来する活動電位を取得することが可能となった（図５）。【００５９】
図５（ａ）はビタミンＥ及びコレステロールを用いないで単離ヒトＥＳ細胞由来心筋細胞の測定した場合を示し、図５（ｂ）は単離ヒトＥＳ細胞由来心筋細胞の活動電位取得を示し、及び図５（ｃ）は単離ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞の活動電位取得を示す。【００６０】
この結果、ビタミンＥ及びコレステロールを添加しない条件では見出すことができなかった単細胞ＥＳ細胞由来心筋細胞の活動電位波形を、同物質の添加により観察できることが明らかとなった。また、膜担体として細胞が存在しない条件下にて電位感受性蛍光色素の増感作用又は増強作用を有していたビタミンＥ及びコレステロールは、膜担体として細胞を用いた条件下においても同様に、電位感受性蛍光色素の増感作用又は増強作用を示すことができることが明らかになった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５（ａ）−（ｂ）】
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【図５（ｃ）】
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