(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺癌又は中皮腫に対する指標としてポドプラニンを用いる方法であって、体液中の該ポドプラニンを測定することを特徴とし、細胞膜表面から外側に突出しているポドプラニンの細胞外領域を認識する抗体及びポドプラニンの細胞外領域以外を認識する抗体を含むモノクローナル抗体であって、該モノクローナル抗体を用いたポドプラニンの２抗体サンドイッチ定量的免疫測定法。
【請求項２】
前記体液が血液又は胸水である請求項１記載の免疫測定法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポドプラニン（ｐｏｄｏｐｌａｎｉｎ）の測定方法に関するものである。更に詳しくは、体液中のポドプラニンを測定するポドプラニンの免疫測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
肺癌の血液中のマーカーとしてガストリン放出ペプチド前駆体（ＰｒｏＧＲＰ）（例えば、特許文献１参照）、サイトケラチン１９フラグメント（Ｃｙｆｒａ）（例えば、特許文献２参照）等が知られている。近年、アスベスト暴露による悪性中皮腫の患者が急増する懸念が示唆されている。現在、悪性中皮腫の検査に使用できるマーカーとして、ポドプラニン（ｐｏｄｏｐｌａｎｉｎ）、メゾテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）及びカルレチニン（ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ）を代表として、いくつかのタンパク質が報告されているが、それらはいずれも細胞の免疫染色による中皮腫の鑑別マーカーとして使用されている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
【特許文献１】特開平６−９８７９４号公報
【特許文献２】特公平８−２９１９号公報
【非特許文献１】Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ,３１（３），５０１〜５０８，２００７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、ＰｒｏＧＲＰ及びＣｙｆｒａ等の肺癌マーカーでは、検出できない肺癌が存在するという問題がある。また、メゾテリンは、悪性中皮腫の上皮型（中皮腫の内約７０％が該当）と肉腫型（中皮腫の内約３０％が該当）の２つの病理分類の内、上皮型にのみ発現しており、肉腫型では発現が無いため、すべての悪性中皮腫に対するマーカーとしては使用できないという問題がある。
本発明の課題は、肺癌及び悪性中皮腫の検査において従来の免疫染色で必須であった組織採取を必要とせず、患者の負担軽減を可能とし、肺癌及び悪性中皮腫の指標となるデータを収集する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、ポドプラニンを高感度に測定する方法を見いだし、肺癌患者及び悪性中皮腫患者の血液等の体液中において従来存在が知られていなかったポドプラニンが存在しており、ポドプラニンを血液等の体液中の肺癌及び悪性中皮腫マーカーとして利用できること、及びポドプラニンは悪性中皮腫の上皮型と肉腫型のすべてに発現していることから、すべての悪性中皮腫マーカーとして利用できることを見出し、本発明に到達した。即ち、本発明は、肺癌又は中皮腫に対する指標としてポドプラニンを用いる方法であって、体液中の該ポドプラニンを測定することを特徴とし、細胞膜表面から外側に突出しているポドプラニンの細胞外領域を認識する抗体及びポドプラニンの細胞外領域以外を認識する抗体を含むモノクローナル抗体であって、該モノクローナル抗体を用いたポドプラニンの２抗体サンドイッチ定量的免疫測定法である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の測定方法により、肺癌及び悪性中皮腫の検査で、従来の免疫染色で必要であった組織採取が必要でなく、患者の負担を軽減できる。更に血液での検査が可能なため、肺癌及び悪性中皮腫のマススクリーニングが可能となる等、肺癌及び悪性中皮腫の検査に非常に有用である。また、ポドプラニンを定量的に測定できるため、肺癌及び中皮腫の治療効果等の判定に利用できるという効果がある。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
ポドプラニンは、１６２アミノ酸からなる３８キロダルトンの１型膜貫通糖タンパク質として知られている。ポドプラニンは各腫の臓器及び細胞、例えば腎臓糸球体足細胞、骨格筋、胎盤、肺、心臓、筋線維芽細胞、リンパ管内皮及び中皮細胞等に存在していることが知られている。但し、血液等の体液中にポドプラニンが存在することはこれまで知られておらず、本発明により初めて明確にされたものである。
ポドプラニンはヒトを含む哺乳類動物に存在するが、本発明の方法により収集されたデータを疾患の検査に役立てる効果が大きいと言う観点からヒトのポドプラニンが好ましい。
【０００８】
本発明における体液としては、例えば、患者から分離採取した血液、漿液、腹水、胸水、リンパ液、尿、脳脊髄液、胸膜液、腹膜液、囲心腔液及び粘膜分泌物が挙げられる。これらの内、検体の採取のしやすさ及びポドプラニンの含有濃度の観点から血液、漿液、腹水、胸水及びリンパ液が好ましく、更に好ましいのは、血液、腹水、胸水及びリンパ液であり、特に好ましいのは血液及び胸水である。血液としては、全血、血清及び血漿が挙げられ、特に好ましくは血清及び血漿である。
【０００９】
本発明における体液中のポドプラニンの測定は従来公知の高感度免疫測定法で実施できる。高感度免疫測定法としては、例えば、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法及び放射性免疫測定法が挙げられる。これらの内、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法及び発光免疫測定法が好ましく、更に好ましいのは酵素免疫測定法、特に酵素の基質に化学発光物質を用いた化学発光酵素免疫測定法が好ましい。
【００１０】
免疫測定に用いるポドプラニンに対する抗体は、従来公知の方法で作製したポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体が使用できるが、好ましい抗体は感度及び特異性（ポドプラニン類似タンパクとの交差反応性を示さない）の観点からポドプラニンに対するモノクローナル抗体である。例えばモノクローナル抗体は、細胞融合技術や遺伝子組替え技術等を利用した自体公知の方法〔例えばＥｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，６５１１（１９７６）〕等によって産生されたものが使用できる。
【００１１】
本発明において使用する抗体は、従来公知の高感度免疫測定に使用する抗体の場合と同様に、認識部位の異なる抗体を組み合わせて使用することが通常行われる。これは高感度免疫測定法の測定原理「２抗体サンドイッチ測定法」に基づくものである。即ち、測定対象である抗原の同一部位を認識する２つの抗体と抗原を反応させた場合、免疫複合体「抗体−抗原−抗体」を形成できず、免疫測定を実施できないことを回避するためである。
【００１２】
認識部位の異なる抗体は従来公知の方法で作製又は選択することができる。例えば、抗原の特定部位を遺伝子組み換えタンパク又は合成ペプチドとして調整し、これをマウス等に免役することで、抗原の特定部位に対する抗体（モノクローナル抗体が好ましい）が作製できる。また、モノクローナル抗体を選択する際に行うＥＬＩＳＡに使用する抗原を同様に調製することで、認識部位の異なる抗体を選択できる。更に、免疫染色、免疫組織化学染色及びフローサイトメトリー等での反応性を確認することでも認識部位の違う抗体を選ぶことができる。
【００１３】
本発明において、使用する抗体の認識部位は免疫複合体「抗体−抗原(ポドプラニン）−抗体」を形成できる限り特に限定はないが、高感度の観点から、好ましくはポドプラニンの細胞外領域（細胞膜表面から外側に突出している部分）を認識する抗体と、ポドプラニンの細胞外領域以外を認識する抗体の組み合わせである。
【００１４】
本発明は、体液中のポドプラニンを測定することで、肺癌及び悪性中皮腫の指標となるデータの収集方法を提供するものであり、例えば多数の健常人から得た血液中のポドプラニンを測定して、その濃度分布から基準となる値を設定し、この基準値に対して、被検者から得た血液中のポドプラニン濃度を比較することにより、肺癌及び悪性中皮腫の検査に役立てることができる。
【００１５】
本発明において、肺癌としては、小細胞癌及び非小細胞癌等が挙げられ、非小細胞癌としては腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌及び腺扁平上皮等が挙げられる。悪性中皮腫としては、胸膜中皮腫、腹膜中皮腫及び心膜中皮腫等が挙げられる。これらの内、特異性（疾患とポドプラニンの関連がより強い）の観点から好ましいのは悪性中皮腫であり、特に好ましいのは胸膜中皮腫及び腹膜中皮腫である。
【実施例】
【００１６】
以下、実施例により、本発明を更に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
[実施例1]
本実施例は、抗ポドプラニンモノクローナル抗体の作製と免疫測定に使用する抗体の選択例を示したものである。
＜抗ポドプラニンモノクローナル抗体の作製＞
１．免疫用抗原の作製
文献（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ３１：５０１−５０８，２００７）に記載の方法で、ヒトポドプラニン融合タンパク質を作製した。即ち、ポドプラニンの細胞外領域に相当するヒトポドプラニンｃＤＮＡの４８９塩基の断片（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＢ１２７９５８のポジション１−４８９）を発現プラスミドｐＩｇｐｌｕｓに組み込み、ｐＩｇ−ｐｏｄｏｐｌａｎｉｎを作製した。このプラスミドはヒト免疫グロブリンのＦｃ領域のＣ末端に融合した形でヒトポドプラニンの細胞外領域タンパク質（ヒトポドプラニン融合タンパク質）を発現することができる。ｐＩｇ−ｐｏｄｏｐｌａｎｉｎを２９３T細胞にトランスフェクション試薬ＦｕＧＥＮＥ６（ロシュ社製）を用いて遺伝子導入した。この細胞をＦＣＳ（牛胎児血清）を含むＤＭＥＭ培地で５日培養し、培養液中にヒトポドプラニン融合タンパク質を分泌させた。培養液をプロテインAセファロースカラム（アマシャムファーマシアバイオテック社製）を用いてアフィニティークロマトグラフィーにより、ヒトポドプラニン融合タンパク質を精製した。このヒトポドプラニン融合タンパク質をマウスへの免疫用抗原とした。
【００１７】
２．モノクローナル抗体の作製
文献（Ｂｌｏｏｄ  ９６：５４６−５５３，２０００）記載の方法でモノクローナル抗体を作製した。即ち、２０μｇの免疫用抗原をフロイントの完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ社製）で乳化し、この乳化液を８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に投与した。その後、２０μｇの免疫用抗原をフロイントの不完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ社製）で乳化した乳化液を２週間間隔で３回追加免疫を行い、更に細胞融合3日前に尾静脈に５μｇの免疫用抗原を含む生理食塩水を注射した。マウス脾細胞を摘出し、マウス骨髄腫細胞（Ｐ３Ｕ１）と融合した後、ＨＡＴ培地によりハイブリドーマを選択培養した。
更にＥＬＩＳＡによって、免疫用抗原を認識し、ヒト免疫グロブリンのＦｃ領域を認識しない抗体を作るハイブリドーマを選択した。即ち、免疫用抗原を５０ｎｇ／ｍLの濃度で含む０．８５％塩化ナトリウム含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を９６穴ＥＬＩＳＡプレート（ヌンク社製、Ｎｕｎｃ  ｗｈｉｔｅプレート ｃａｔ．４３６１１０）の各穴に５０μＬずつ加え、４℃で１夜静置した。洗浄後、ブロックエース［雪印乳業（株）製］を用いてブロッキングし、抗原を固相化した９６穴ＥＬＩＳＡプレートを得た。この９６穴ＥＬＩＳＡプレートの各ウエルに、融合細胞の培養上清５０μLを添加し、室温で１時間反応後、洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（ＨＬ鎖）を添加した。室温で１時間反応後洗浄し、基質液（ｏ−フェニレンジアミン）を各ウエルに５０μLづつ添加し、４９２ｎｍにおける吸光度（吸光度Ａ）を測定した。同様にヒト免疫グロブリンのＦｃ領域を固相化したプレートで吸光度（吸光度Ｂ）を測定した。吸光度Ａから吸光度Ｂを引いた値が大きい５クローンを選択した。
５種のハイブリドーマを更に限界希釈法により３回クローニングを行い、クローニング後のハイブリドーマを1週間前にプリスタン腹腔内注射済みのＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に注射し、１０日後に腹水を採取した。最終的に、腹水中のＩｇＧは硫安塩析後プロテインＡにて精製し、５種の抗ポドプラニンモノクローナル抗体（Ｎｏ．７Ｂ１０、Ｎｏ．５、Ｎｏ．７、Ｎｏ．３１及びＮｏ．３６）を得た。
【００１８】
３．モノクローナル抗体の反応性確認
上記５種のモノクローナル抗体について文献（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ３１：５０１−５０８，２００７）記載の方法で、免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）での反応性を確認した。使用した細胞は、
文献（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ３１：５０１−５０８，２００７）記載のｐｃＤＮＡ−ｐｏｄｏｐｌａｎｉｎ−Ｖ５（ヒトポドプラニン全体の遺伝子を含む発現プラスミド）をトランスフェクトしたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞、及び内在性のポドプラニンを有するヒトリンパ内皮細胞［ｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ（ＬＥＣｓ）］（ＡｎｇｉｏＢｉｏ社から購入）を用いた。
免疫蛍光染色は次のように行った、細胞を４％ＰＦＡ含有ＰＢＳを用いて氷上で１０分間固定した後、ＰＢＳで洗浄した。洗浄した細胞を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを用いて室温３０分間ブロッキングした。この細胞をモノクローナル抗体5μｇ／ｍＬの濃度で含むＰＢＳでインキュベートし、更にＰＢＳで１０００倍希釈したロバ抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｐｒ  ４８８抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）でインキュベートした後、細胞の蛍光を確認した。
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）は、ＦＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）で実施した。培養した細胞を０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｄｉｆｃｏ社製）で処理して集めて使用した。集めた細胞を、モノクローナル抗体（１０6個の細胞を含む液１ｍＬ当たり５μｇ）と抗ヒトＶＥ−Ｃａｈｈｅｒｉｎヤギ抗体（１０6個の細胞を含む液１ｍＬ当たり０．１μｇ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）で染色し、続いて１０００倍希釈したロバ抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｐｒ  ４８８抗体及び１０００倍希釈したウサギ抗ヤギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｐｒ  ６３３抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とインキュベートして、フローサイトメトリーにかけた。結果を表１に示した。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
モノクローナル抗体Ｎｏ．７Ｂ１０は、いずれにも強い反応性（＋＋＋）を示した。モノクローナル抗体Ｎｏ．５は、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（ｐｃＤＮＡ−ｐｏｄｏｐｌａｎｉｎ−Ｖ５）への蛍光免疫染色で弱い反応性（＋）を示したが、そのほかには反応性を示さなかった。モノクローナル抗体Ｎｏ．７は、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（ｐｃＤＮＡ−ｐｏｄｏｐｌａｎｉｎ−Ｖ５）への免疫蛍光染色で弱い反応性（＋）及びＦＡＣＳでは反応性（＋＋）を示し、ＬＥＣｓへの蛍光免疫染色で反応性（＋＋）及びＦＡＣＳで弱い反応性（＋）を示した。モノクローナル抗体Ｎｏ．３１は、いずれにも反応性（＋＋）を示した。モノクローナル抗体Ｎｏ．３６は、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（ｐｃＤＮＡ−ｐｏｄｏｐｌａｎｉｎ−Ｖ５）への免疫蛍光染色で反応性（＋＋）及びＦＡＣＳでは弱い反応性（＋）を示し、ＬＥＣｓへの蛍光免疫染色及びＦＡＣＳで強い反応性（＋＋＋）を示した。
モノクローナル抗体Ｎｏ．５はＥＬＩＳＡでポドプラニン融合タンパク質に対して反応性を示すが、細胞表面に存在するポドプラニンへの反応性はＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（ｐｃＤＮＡ−ｐｏｄｏｐｌａｎｉｎ−Ｖ５）への蛍光免疫染色で弱い反応性（＋）を示した以外は認められなかったことから、モノクローナル抗体Ｎｏ．５は細胞膜から突出した領域ではなく、細胞外領域以外の領域を実質的に認識していると考えられる。
【００２１】
＜ポドプラニン測定用モノクローナル抗体の選択＞
１．モノクローナル抗体固相化プレートの作製
抗ポドプラニンモノクローナル抗体Ｎｏ．５をＰＢＳで１０μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、９６穴ＥＬＩＳＡAプレート（ヌンク社製、Ｎｕｎｃ Ｗｈｉｔｅプレート ｃａｔ．４３６１１０）の各穴に５０μLづつ加え、４℃で１夜静置した。洗浄後、ブロックエース［雪印乳業（株）製］を用いてブロッキングをし、モノクローナル抗体固相化プレートＮｏ．５を得た。抗ポドプラニンモノクローナル抗体Ｎｏ．７、抗ポドプラニンモノクローナル抗体Ｎｏ．３１、抗ポドプラニンモノクローナル抗体Ｎｏ．３６及び抗ポドプラニンモノクローナル抗体Ｎｏ．７Ｂ１０についても同様に操作し、モノクローナル抗体固相化プレートＮｏ．５、モノクローナル抗体固相化プレートＮｏ．７、モノクローナル抗体固相化プレートＮｏ．３１、モノクローナル抗体固相化プレートＮｏ．３６及びモノクローナル抗体固相化プレートＮｏ．７Ｂ１０を得た。
【００２２】
２．ビオチン化モノクローナル抗体の作製
抗ポドプラニンモノクローナル抗体Ｎｏ．５  ０．１ｍｇとビオチニル−N−ヒドキシサクシニミドエステル０．０２ｍｇを混合し、０．１M炭酸水素ナトリウム（ｐＨ８．０）に溶解し、室温で４時間静置し、抗体のビオチン化を行った。更に反応液をＰＢＳ  ２Ｌに対して４℃で一夜透析し、ビオチン化モノクローナル抗体Ｎｏ．５を得た。抗ポドプラニンモノクローナル抗体Ｎｏ．７、抗ポドプラニンモノクローナル抗体Ｎｏ．３１、抗ポドプラニンモノクローナル抗体Ｎｏ．３６及び抗ポドプラニンモノクローナル抗体Ｎｏ．７Ｂ１０についても同様に操作し、ビオチン化モノクローナル抗体Ｎｏ．７、ビオチン化モノクローナル抗体Ｎｏ．３１、ビオチン化モノクローナル抗体Ｎｏ．３６及びビオチン化モノクローナル抗体Ｎｏ．７Ｂ１０を得た。
【００２３】
３．モノクローナル抗体固相化プレート／ビオチン化モノクローナル抗体の組み合わせ試験
抗原（ヒトポドプラニン融合タンパク質）を検体希釈液（1％ＢＳＡ含有ＰＢＳ）にて０〜１０００ｎｇ／ｍＬ（濃度ポイント：０、１０、１００、１０００ｎｇ／ｍＬ）の濃度に調整し、標準液を作製した。その標準液をモノクローナル抗体固相化プレートＮｏ．５の各穴に５０μLづつ添加し、室温で６０分間反応させた。洗浄後、ビオチン化モノクローナル抗体Ｎｏ．５を検体希釈液（1％ＢＳＡ含有ＰＢＳ）で０．２μｇ／ｍＬの濃度に希釈した液を５０μLづつ添加し、室温で６０分間反応させた。洗浄後、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＨＲＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅを添加し、室温で３０分間反応させ、洗浄後、基質液（ｏ−フェニレンジアミン）を５０μLづつ添加し、室温で３０分間反応させた後、各ウエルに１Ｎ硫酸を５０μLづつ添加し、４９２ｎｍの吸光度を測定した。同様にして、モノクローナル抗体固相化プレートＮｏ．５、モノクローナル抗体固相化プレートＮｏ．７、モノクローナル抗体固相化プレートＮｏ．３１、モノクローナル抗体固相化プレートＮｏ．３６及びモノクローナル抗体固相化プレートＮｏ．７Ｂ１０から選んだ１種類とビオチン化モノクローナル抗体Ｎｏ．５、ビオチン化モノクローナル抗体Ｎｏ．７、ビオチン化モノクローナル抗体Ｎｏ．３１、ビオチン化モノクローナル抗体Ｎｏ．３６及びビオチン化モノクローナル抗体Ｎｏ．７Ｂ１０から選んだ1種類を組み合わせて測定を行い、測定吸光度を比較した。結果を表２に示した。
【００２４】
【表２】
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【００２５】
固相化プレートとビオチン化抗体に同一の抗体を使用した組み合わせでは、抗原濃度に応じた吸光度の上昇が認められず、ポドプラニン測定に使用できないことが判った。同様に、モノクローナル抗体Ｎｏ．７Ｂ１０、Ｎｏ．３１及びＮｏ．３６から２つの抗体を組み合わせ、モノクローナル抗体Ｎｏ．５とＮｏ．７の組み合わせも、抗原濃度に応じた吸光度の上昇が認められず、ポドプラニン測定に使用できないことが判った。
測定感度の点で好ましい組み合わせは、抗体Ｎｏ．５又はＮｏ．７と、Ｎｏ．７Ｂ１０、Ｎｏ．３１及びＮｏ．３６から選ばれる１つの抗体との組み合わせてあった。それらの組み合わせの中で、抗体Ｎｏ．５とＮｏ．７Ｂ１０の組み合わせ、及び抗体Ｎｏ．７とＮｏ．７Ｂ１０の組み合わせが優れており、特に抗体Ｎｏ．５とＮｏ．７Ｂ１０の組み合わせが最も測定感度が高い組み合わせであることが判った。
【００２６】
[実施例２]
本実施例は、マイクロプレートを用いた化学発光酵素免疫測定用法によるポドプラニンの測定例である。
＜測定用試薬＞
１．モノクローナル抗体固相化プレート
実施例１で作製したモノクローナル抗体固相化プレートＮｏ．５及びモノクローナル抗体固相化プレートＮｏ．７を使用した。
２．ビオチン化モノクローナル抗体液
実施例１で作製したビオチン化モノクローナル抗体Ｎｏ．７Ｂ１０を検体希釈液（１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ）で抗体濃度として０．２μｇ／ｍＬに希釈して用いた。
３．ストレプトアビジン結合アルカリフォスファターゼ液
Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＭＡＢＴＥＣＨ社製、Ｃｏｄｅ３３１０−８）を検体希釈液（１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ）で１０００倍希釈して用いた。
４．発光試薬
ルミホス５３０［和光純薬工業（株）製］をそのまま使用した。
５．標準液
実施例１と同様に標準液を調製した。但し、濃度範囲は０〜５００ｐｇ／ｍＬ（濃度ポイント：０、７．８、１５．６、３１．３、６２．５、１２５、５００ｐｇ／ｍＬ）とした。
【００２７】
＜測定操作＞
１．検量線の作製（抗体Ｎｏ．５とＮｏ．７Ｂ１０の組み合わせ）
モノクローナル抗体固相化プレートＮｏ．５のブロッキング液を捨て、検体希釈液にて上記各濃度の標準液を２倍希釈した液を５０μLづつ各ウエルに分注し、室温で６０分反応させた。ウエルを洗浄後、ビオチン化モノクローナル抗体液Ｎｏ．７Ｂ１０を５０μL分注し、室温で６０分反応させた。ウエルを洗浄後、ストレプトアビジン結合アルカリフォスファターゼ液を５０μL分注し、室温で３０分反応させた。ウエルを洗浄液で洗浄後、発光試薬５０μLを分注し、室温で３０分反応させた。反応後、Ｗａｌｌａｃ１４２０（パーキンエルマーライフサイエンス社製発光計測器）にて発光量を測定した。
２．検量線の作製（抗体Ｎｏ．７とＮｏ．７Ｂ１０の組み合わせ）
モノクローナル抗体固相化プレートＮｏ．５をモノクローナル抗体固相化プレートＮｏ．７に代えた以外は上記１．と同様にして測定した。
３．同時再現性の確認
濃度３１．３ｐｇ／ｍＬ及び１２５ｐｇ／ｍＬの標準液について上記検量線の作成における操作と同様にして発光量を各１０回測定した。
４．検出感度の設定
濃度０、７．８、１５．６及び３１．３ｐｇ／ｍＬの標準液について各１５回発光量を測定した。各濃度の測定発光の平均値及び標準偏差（ＳＤ）を算出し、測定発光量平均値±３ＳＤの範囲が、濃度０ｐｇ／ｍＬの標準液を使用した場合の測定発光量平均値±３ＳＤの範囲と重ならない最低の濃度を検出感度とした。
【００２８】
＜測定結果＞
１．検量線
結果を図１に示した。抗体Ｎｏ．５とＮｏ．７Ｂ１０の組み合わせ、抗体Ｎｏ．７とＮｏ．７Ｂ１０の組み合わせとも、０〜５００ｐｇ／ｍＬの範囲でほぼ直線となる良好な検量線が得られた。但し、発光量は抗体Ｎｏ．７とＮｏ．７Ｂ１０の組み合わせに対して、抗体Ｎｏ．５とＮｏ．７Ｂ１０の組み合わせで約１．７倍の値を示した。
２．同時再現性
同一サンプルを１０回測定した場合の各測定値、平均値、標準偏差（ＳＤ）及び変動係数（ＣＶ）を表３に示した。抗体Ｎｏ．５とＮｏ．７Ｂ１０の組み合わせではＣＶ１０％以下と良好であった。抗体Ｎｏ．７とＮｏ．７Ｂ１０の組み合わせでは、低濃度サンプル（サンプル１：標準液のポドプラニン濃度３１．３ｐｇ／ｍＬ）でＣＶ１０％を超える結果となった。
３．検出感度試験
検出感度試験の結果を図２及び図３に示した。各濃度の標準液を１５回測定し±３ＳＤをバーで示した。抗体Ｎｏ．５とＮｏ．７Ｂ１０の組み合わせでは、０ｐｇ／ｍＬの３ＳＤと重ならない１５．６ｐｇ／ｍＬを検出感度とした。抗体Ｎｏ．７とＮｏ．７Ｂ１０の組み合わせでは、０ｐｇ／ｍＬの３ＳＤと重ならない３１．３ｐｇ／ｍＬを検出感度とした。
【００２９】
【表３】
0005604726.tif 000004
【００３０】
[実施例３]
本実施例は、健常人から得た血清中のポドプラニンを測定した例である。
＜健常人血清中のポドプラニン測定＞
健常人（健康診断受診者２５７名、平均年齢３９．２才）から採取した血清中のポドプラニンを測定した。ポドプラニンの測定は実施例２に記載の測定操作の「１．検量線の作製（抗体Ｎｏ．５とＮｏ．７Ｂ１０の組み合わせ）」で標準液の代わりに血清検体を用いる以外は同様に操作して発光量を測定し、実施例２に記載の検量線を用いて算出した。
＜測定結果＞
健常人から得た血清中のポドプラニン濃度は、平均±標準偏差  ２３．７±１１．６ｐｇ／ｍＬ（最大値９６．６、中央値２１．３、最小値０）という結果であった。パラメトリック法により求めた健常人のポドプラニンの濃度範囲は８．０〜５２．３ｐｇ／ｍＬ（べき乗＝０．１、変換原点＝−０．７９、 P＝９５．０００％）であった。測定値の分布を図４に示した。
【００３１】
[実施例４]
本実施例は、中皮腫患者から得た血清又は胸水中のポドプラニンを測定した例である。
＜中皮腫患者血清中のポドプラニン測定＞
中皮腫患者５名から採取した血清中のポドプラニン及び中皮腫患者３名から採取した胸水中のポドプラニンを測定した。ポドプラニンの濃度は、実施例２に記載の測定操作の「１．検量線の作製（抗体Ｎｏ．５とＮｏ．７Ｂ１０の組み合わせ）」で標準液の代わりに血清検体又は胸水検体を用いる以外は同様に操作して発光量を測定し、実施例２に記載の検量線を用いて算出した。
＜測定結果＞
中皮腫患者から得た血清又は胸水中のポドプラニン濃度を表４及び図５に示した。実施例３で得た健常人での濃度範囲上限５２．３ｐｇ／ｍＬを疾患の基準とすると、血清で陽性率６０％（３／５）、胸水で陽性率１００％（３／３）となり、中皮腫患者から得た血清又は胸水中のポドプラニン濃度は高いことが判った。
【００３２】
【表４】
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【００３３】
[実施例５]
本実施例は、中皮腫患者に手術及び化学療法を実施し、その前後で血清中のポドプラニンを測定した例である。
＜中皮腫患者治療前後の血清中ポドプラニン測定＞
中皮腫患者２名に手術及び化学療法を実施し、その前後で採取した血清中のポドプラニンを測定した。ポドプラニンの測定は実施例２記載の測定操作の「１．検量線の作製（抗体Ｎｏ．５とＮｏ．７Ｂ１０の組み合わせ）」で標準液の代わりに血清検体を用いる以外は同様操作して発光量を測定し、実施例２に記載の検量線を用いて算出した。尚、手術及び治療前の測定値は実施例４と同値である。
＜測定結果＞
結果を表５に示した。２例とも手術及び化学療法により血清中のポドプラニン濃度が低下した。血中ポドプラニン濃度は治療効果を反映していると考えられた。
【００３４】
【表５】
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【００３５】
[実施例６]
本実施例は全自動化学発光酵素免疫測定装置スフィアライト１８０［オリンパス（株）製］を用いてポドプラニンを高感度かつ短時間で測定し、各種の肺癌患者から得た手術等の治療前後に採取した血清中のポドプラニン濃度を測定した例である。
【００３６】
＜試薬の調製＞
１．抗体ビーズの作製
１重量％γ−アミノプロピルトリエトキシシラン含有アセトン溶液２０ｍLの入った蓋付きポリエチレン瓶にガラスビーズ１０００個を加え、１時間、２５℃で反応させ、反応液をアスピレーターで吸引除去した。
次いで脱イオン水２０ｍＬを加えて蓋をし、ポリエチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌した後、液をアスピレーターで吸引除去してガラスビーズを洗浄した。この洗浄操作を３回行った。
次いで、この洗浄後のガラスビーズ１０００個を２重量％グルタルアルデヒド含有水溶液２０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で１時間反応させた。そして、脱イオン水２０ｍＬを加えて蓋をし、ポリエチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌した後、液をアスピレーターで吸引除去してガラスビーズを洗浄した。この洗浄操作を３回行った。
更にこの洗浄後のガラスビーズ１０００個を抗ポドプラニンモノクローナル抗体Ｎｏ．７を２０μｇ／ｍＬの濃度で含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．７）２０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で１時間反応させた。
反応後、抗ポドプラニンモノクローナル抗体含有リン酸緩衝液を除去し、ガラスビーズを０．１重量％の牛血清アルブミン含有の０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）２０ｍＬに８時間浸漬し、この液を除去した後、ビーズを２０重量％ショ糖含有０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）２０ｍＬに浸漬した。２時間浸漬後、液を除去したビーズを濾紙上で風乾してビーズ表面をショ糖でコーティングし、抗体ビーズを得た。
【００３７】
２．免疫反応用緩衝液の作製
０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍＬに、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）１ｇ、塩化ナトリウム０．８５ｇ及び界面活性剤としてのツイーン８０  ０．５ｇを添加し、免疫反応用緩衝液を作製した。
３．酵素標識抗体液の作製
抗ポドプラニンモノクローナル抗体Ｎｏ．７Ｂ１０及び西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼを用い、文献（エス・ヨシタケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、エトール；ジェイ．バイオケム，Ｖｏｌ．９２，１９８２，１４１３−１４２４）に記載の方法でＰＯＤ標識抗ポドプラニン抗体を調製し、冷凍（−３０℃）保存した。
上記で作製したＰＯＤ標識抗ポドプラニン抗体を免疫反応用緩衝液で抗体濃度として５μｇ／ｍＬとなるように希釈し、酵素標識抗体液を作製した。
【００３８】
４．基質液の作製
ルミノールナトリウム［シグマアルドリッチジャパン（株）製］０．２８ｇ及び４−（シアノメチルチオ）フェノール［三新化学工業（株）製］０．１ｇを、グッド緩衝液（０．１ＭのＥＰＰＥＳ、ｐＨ８．５）１００ｍＬに溶解し、基質液を作製した。
５．過酸化水素液の調製
３５重量％過酸化水素水［和光純薬工業（株）製］を脱イオン水で１８００倍に希釈し、過酸化水素水とした。
６．測定用試薬の調製
測定用カートリッジ［オリンパス（株）製］に抗体ビーズ１個、免疫反応用緩衝液２００μL、酵素標識抗体液２４０μL、基質液１４０μL、過酸化水素液１４０μLを入れ、アルミシールで密閉し測定用試薬とした。測定まで２〜１０℃で冷蔵保存した。
７．標準液
実施例１と同様に標準液を調製した。但し濃度範囲は０〜５０００ｐｇ／ｍＬ（濃度ポイント  ０，５０，２００，４００，８００，２０００，５０００ｐｇ／ｍＬ）とした。
【００３９】
＜測定操作＞
全自動化学発光酵素免疫分析装置スフィアライト１８０［オリンパス（株）製］を用いて測定を実施した。本装置は検体の分注から測定値の出力まで自動的に行う。測定の概要は次の通りである。
測定用試薬及び検体を所定の位置にセットする。測定用試薬のアルミシールを開封し、抗体ビーズが１個入った反応槽に免疫反応用緩衝液８０μＬ及び検体６０μＬを加え、３７℃で１４分間免疫反応する。１回当たり５００μＬの洗浄液（リン酸緩衝液）で６回洗浄してＢ／Ｆ分離を行った後、酵素標識抗体液２４０μＬを加え、３７℃で１４分間免疫反応する。同様にＢ／Ｆ分離を行った後、基質液７０μＬ及び過酸化水素液７０μＬを加え、３７℃で１分間反応させた後、発光量を計測する。  予め測定した既知検体の発光量で検量線を作成し、検体の発光量から濃度を算出する。
【００４０】
＜検体＞
検体として、標準液（上記操作中に記載の既知検体として使用）及び肺癌患者２０名から手術等の治療前後に得た血清を用いた。肺癌患者２０名の内訳は、肺腺癌１２名、肺扁平上皮癌３名、肺神経内分泌大細胞癌２名及び肺大細胞癌３名である。
【００４１】
＜結果＞
結果を図６に示した。治療前後の比較で５０％（１０／２０）の患者にポドプラニン濃度の低下が認められた。特に治療前のポドプラニン濃度が４０ｐｇ／ｍＬ以上であった１２名の患者では、８３％（１０／１２）と高率でポドプラニン濃度の低下が認められ、肺癌に関連したポドプラニンが存在することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明は臨床検査、特に体液中のポドプラニンを免疫測定して肺癌及び中皮腫を検査する臨床検査薬に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】標準液のポドプラニン濃度と発光量の関係を表した検量線のグラフである。
【図２】抗体Ｎｏ．５とＮｏ．７Ｂ１０の組み合わせでの検出感度試験の結果を表したグラフである。
【図３】抗体Ｎｏ．７とＮｏ．７Ｂ１０の組み合わせでの検出感度試験の結果を表したグラフである。
【図４】健常人の血清中のポドプラニン濃度の度数分布を表したグラフである。
【図５】中皮腫患者の血清又は胸水中のポドプラニン濃度を表したグラフである。
【図６】肺癌患者の手術等の治療前後における血清中のポドプラニン濃度を表したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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