(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母を用いるタンパク質間相互作用検出方法であって、
（１）第１のタンパク質とＧタンパク質γサブユニット細胞膜非結合変異型との融合タンパク質を発現する第１の発現カセットを調製する工程、
（２）第２のタンパク質と細胞膜局在化シグナル配列との融合タンパク質を発現する第２の発現カセットを調製する工程、
（３）第３のタンパク質を細胞質に発現する第３の発現カセットを調製する工程、
（４）該工程（１）、（２）および（３）でそれぞれ得られた該第１、２および３の発現カセットを酵母に導入して形質転換酵母を調製する工程、および
（５）該工程（４）で得られた該形質転換酵母におけるフェロモンシグナル伝達を検出する、またはフェロモンシグナル伝達を示す形質転換酵母をスクリーニングする工程
を含み、
該第３のタンパク質が、該第１のタンパク質または該第２のタンパク質の競合タンパク質である、方法。
【請求項２】
酵母を用いるタンパク質間相互作用検出方法であって、
（１）第１のタンパク質とＧタンパク質γサブユニット細胞膜非結合変異型との融合タンパク質を発現する第１の発現カセットを調製する工程、
（２）第２のタンパク質と細胞膜局在化シグナル配列との融合タンパク質を発現する第２の発現カセットを調製する工程、
（３）第３のタンパク質を細胞質に発現する第３の発現カセットを調製する工程、
（４）該工程（１）、（２）および（３）でそれぞれ得られた該第１、２および３の発現カセットを１倍体酵母に導入して形質転換酵母を調製する工程、
（５）該工程（４）で得られた該形質転換酵母を、該形質転換酵母と接合可能な１倍体酵母と接合させて２倍体酵母を調製する工程、および
（６）該工程（５）で得られた該２倍体酵母を選択する工程
を含み、
該第３のタンパク質が、該第１のタンパク質または該第２のタンパク質の競合タンパク質である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高親和性のタンパク質間相互作用検出・スクリーニング方法に関する。特に、競合タンパク質を用いるタンパク質間相互作用検出・スクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質間相互作用検出方法として酵母ツーハイブリッド法が知られている。この方法は、遺伝子の発現調節に関与する転写因子が、遺伝子（ＤＮＡ）上の特定の塩基配列を認識して結合するドメイン（ＤＮＡ結合ドメイン：ＢＤ）と、遺伝子の転写に必須の基本因子に作用して遺伝子の転写を活性化するドメイン（転写活性化ドメイン：ＡＤ）とから構成されており、それぞれのドメインが分離できることに基づく。すなわち、タンパク質間相互作用を検出したい１対のタンパク質（ＸとＹ）のうち、一方（Ｘ）を転写因子のＤＮＡ結合ドメインと融合させて１つのハイブリッドタンパク質（Ｘ−ＢＤ）を形成し、他方（Ｙ）を転写因子の転写活性化ドメインと融合させてもう１つのハイブリッドタンパク質（Ｙ−ＡＤ）を形成すると、Ｘ−Ｙ間に相互作用が存在する場合のみ、遺伝子の転写が活性化される。この遺伝子の転写活性化は、ＢＤが結合する特定の塩基配列の下流にレポーター遺伝子を連結することによって、レポーター遺伝子の発現により検出することができる。酵母ツーハイブリッド法に利用される転写因子としては、Ｇａｌ４、ＬｅｘＡ−Ｂ４２、ＬｅｘＡ−ＶＰ１６などが挙げられる。
【０００３】
酵母は、単細胞性の真核生物であり、古くから食品加工などに用いられている。酵母は、真核生物の中で最も研究されており、酵母の遺伝子組換え技術も発達している。酵母は、真核生物という点では、人類など哺乳類をはじめとする高等真核生物と共通するため、高等真核生物のタンパク質を解析するために、これらのタンパク質の発現用宿主として汎用されている。真核生物のタンパク質間相互作用検出方法として酵母ツーハイブリッド法は有用である。
【０００４】
しかし、細胞核内の転写因子を用いる酵母ツーハイブリッド法は、核移行が困難なタンパク質、および元来転写活性化ドメインを有するタンパク質（例えば、転写因子）に適用することが難しいという問題がある。
【０００５】
そこで、近年、タンパク質の局在性や機能に応じて酵母ツーハイブリッド法の変法が考案されている。非特許文献１および２には、酵母のＲａｓシグナル伝達経路を利用する方法が記載されている。この方法では、Ｒａｓの細胞膜結合能をタンパク質間相互作用で代替することで、酵母の増殖を指標としてタンパク質間相互作用を検出する。Ｒａｓ伝達経路のシグナル増幅効果を利用することにより高感度にタンパク質間相互作用を検出することができる。すなわち、タンパク質間相互作用を検出したい１対のタンパク質（ＸとＹ）のうち、一方（Ｘ）を細胞膜に固定し、他方（Ｙ）をヒト由来グアニンヌクレオチド交換因子（ｈＳＯＳ）または細胞膜結合能を欠損させたＲａｓ恒常活性変異型（ｍＲａｓ）と融合させてハイブリッドタンパク質（それぞれＹ−ｈＳＯＳまたはＹ−ｍＲａｓ）を形成すると、Ｘ−Ｙ間に相互作用が存在する場合のみ、ｈＳＯＳまたはｍＲａｓが細胞膜に局在化し、Ｒａｓのシグナル伝達経路が活性化される。このシグナル伝達経路の活性化は、酵母の増殖を指標として検出することができる。
【０００６】
しかしながら、この方法では、酵母の温度感受性変異株（ｃｄｃ２５−２）を使用する必要があり、酵母の増殖に温度制限が課せられる。すなわち、タンパク質のライブラリの構築を感受性温度でない２５℃で行い、タンパク質間相互作用の検出またはスクリーニングを感受性温度である３６℃で行う必要があるため、酵母の最適生育温度である３０℃に比べて酵母の増殖速度が大きく低下し、迅速なタンパク質間相互作用の検出またはスクリーニングが困難であるという問題がある。
【０００７】
非特許文献３には、Ｇタンパク質による接合シグナル（フェロモンシグナル）伝達経路を利用したタンパク質間相互作用の検出方法が記載されている。１倍体酵母は対となる接合型の１倍体酵母に対してフェロモンを分泌し、相手のフェロモンを感知すると接合を促すシグナルを細胞内に伝達する。細胞膜上にはフェロモンと結合する受容体が存在しており、この受容体は細胞内のＧタンパク質と呼ばれる３量体のタンパク質と共役している。フェロモンが受容体に結合すると、Ｇタンパク質はαサブユニットとβγ複合体に解離する。αサブユニットとγサブユニットとはそれぞれ細胞膜に結合しているため、Ｇタンパク質の解離後においてもαサブユニットとβγ複合体は細胞膜に局在化する。βγ複合体のβサブユニットが細胞膜を介してエフェクターに作用することでシグナルが下流に伝達される。一方、γサブユニットの細胞膜結合能を欠損させた変異型（Ｇγｃｙｔｏ）では、Ｇタンパク質の解離によってβγ複合体（Ｇβγｃｙｔｏ複合体）が細胞質中に遊離してしまい、エフェクターに作用できなくなるため、シグナルが下流に伝達されなくなる。非特許文献３では、このＧβγｃｙｔｏ複合体を細胞膜に局在化させるために、タンパク質間相互作用を利用している。まず、タンパク質（Ａ）をＧγｃｙｔｏと融合させた融合タンパク質（Ａ−Ｇγｃｙｔｏ）を発現させる。次に、タンパク質（Ａ）と相互作用するタンパク質（Ｂ）を細胞膜に発現させる（Ｂｍｅｍ）。タンパク質（Ａ）とタンパク質（Ｂ）とが相互作用すると、Ａ−ＧγｃｙｔｏからなるＧβγｃｙｔｏ複合体が細胞膜に局在化し接合シグナル伝達が回復する。したがって、接合シグナル伝達を検出することで、タンパク質（Ａ）とタンパク質（Ｂ）との間の相互作用を検出できる。フェロモン刺激を受けた酵母では、Ｇタンパク質による接合シグナル伝達を介して様々な応答が起こり、様々な遺伝子の転写が活性化される。そこで、フェロモン応答的なプロモーターの下流にレポーター遺伝子を組み込み、接合シグナル伝達をレポーター遺伝子の発現として検出している。非特許文献３では、タンパク質（Ａ）として、ヒトＩｇＧのＦｃ部分を用い、タンパク質（Ｂ）として、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）のプロテインＡ由来のＺドメインを用い、そしてレポーター遺伝子として、緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰを用いて、レポーターの発する蛍光強度をフローサイトメーターで解析することにより、タンパク質間相互作用を定量的に評価している。その結果、結合定数８．０×１０３Ｍ-１という比較的弱い相互作用の検出にも成功している。
【０００８】
しかしながら、非特許文献１〜３の方法では、一定の親和性を有するタンパク質間相互作用がもれなく検出またはスクリーニングされ、親和性の高いタンパク質間相互作用を選択的に検出またはスクリーニングすることが困難である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】A. Aronheimら、「Membrane targeting of the nucleotide exchange factor Sos is sufficient for activating the Ras signaling pathway」、Cell、1994年、第78巻、pp.949-961
【非特許文献２】Y.C. Broderら、「The ras recruitment system, a novel approach to the study of protein-protein interactions」、Curr. Biol.、1998年、第8巻、pp.1121-1124
【非特許文献３】N. Fukudaら、「Construction of a novel detection system for protein-protein interactions using yeast G-protein signaling」、FEBS J.、 2009年、第276巻、pp.2636-2644
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、親和性の高いタンパク質間相互作用を効率よく検出またはスクリーニングする方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、酵母のＧタンパク質による接合シグナル（フェロモンシグナル）伝達経路を利用したタンパク質間相互作用の検出方法において、酵母の細胞質に競合タンパク質を発現させることによって、競合タンパク質よりも高い親和性を有するタンパク質を効率よく検出またはスクリーニングできることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
本発明は、酵母を用いるタンパク質間相互作用検出方法を提供し、該方法は、（１）第１のタンパク質とＧタンパク質γサブユニット細胞膜非結合変異型との融合タンパク質を発現する第１の発現カセットを調製する工程、（２）第２のタンパク質と細胞膜局在化シグナル配列との融合タンパク質を発現する第２の発現カセットを調製する工程、（３）第３のタンパク質を細胞質に発現する第３の発現カセットを調製する工程、（４）該工程（１）、（２）および（３）でそれぞれ得られた該第１、２および３の発現カセットを酵母に導入して形質転換酵母を調製する工程、および（５）該工程（４）で得られた該形質転換酵母におけるフェロモンシグナル伝達を検出する、またはフェロモンシグナル伝達を示す形質転換酵母をスクリーニングする工程を含む。
【００１３】
本発明はまた、酵母を用いるタンパク質間相互作用検出方法のさらなる実施態様を提供し、該方法は、（１）第１のタンパク質とＧタンパク質γサブユニット細胞膜非結合変異型との融合タンパク質を発現する第１の発現カセットを調製する工程、（２）第２のタンパク質と細胞膜局在化シグナル配列との融合タンパク質を発現する第２の発現カセットを調製する工程、（３）第３のタンパク質を細胞質に発現する第３の発現カセットを調製する工程、（４）該工程（１）、（２）および（３）でそれぞれ得られた該第１、２および３の発現カセットを１倍体酵母に導入して形質転換酵母を調製する工程、（５）該工程（４）で得られた該形質転換酵母を、該形質転換酵母と接合可能な１倍体酵母と接合させて２倍体酵母を調製する工程、および（６）該工程（５）で得られた該２倍体酵母を選択する工程を含む。
【００１４】
１つの実施態様では、上記第３のタンパク質は、第１のタンパク質または第２のタンパク質の競合タンパク質である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、親和性の高いタンパク質間相互作用を効率よく検出またはスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明のタンパク質間相互作用検出方法の原理の概略を示す模式図である。
【図２】競合タンパク質を用いない場合における、２倍体選択用培地上で生成した２倍体酵母の生育を示す写真（Ａ）、および菌体濃度ＯＤ６００＝１．０に調整した１ｍＬの酵母懸濁液が生成し得る２倍体酵母のコロニー数を示すグラフ（Ｂ）である。
【図３】競合タンパク質としてＺＫ３５Ａを用いた場合（Ａ）およびＺＷＴを用いた場合（Ｂ）における、５μＭのαファクター存在下での１倍体酵母での緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子の発現を示すグラフである。
【図４】競合タンパク質としてＺＫ３５Ａを用いた場合（ＡおよびＣ）およびＺＷＴを用いた場合（ＢおよびＤ）における、２倍体選択用培地上で生成した２倍体酵母の生育を示す写真（ＡおよびＢ）、および菌体濃度ＯＤ６００＝１．０に調整した１ｍＬの酵母懸濁液が生成し得る２倍体酵母のコロニー数を示すグラフ（ＣおよびＤ）である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明のタンパク質間相互作用検出方法の原理の概略を図１に示す。本発明の方法を、図１を参照して説明する。例えば、タンパク質（Ａ）は、標的タンパク質であり、タンパク質（Ｂ）は、標的タンパク質に対する結合タンパク質であり、そしてタンパク質（Ｃ）は、タンパク質（Ａ）との相互作用において、タンパク質（Ｂ）の競合タンパク質である。すなわち、タンパク質（Ａ）とタンパク質（Ｂ）とが相互作用し、タンパク質（Ａ）とタンパク質（Ｃ）とが相互作用する。この場合に、競合タンパク質とは、タンパク質（Ｂ）とタンパク質（Ｃ）との関係において互いのタンパク質をいう。ここでタンパク質（Ａ）−（Ｂ）間の結合定数をＫＡ−Ｂ、タンパク質（Ａ）−（Ｃ）間の結合定数をＫＡ−Ｃとすると、ＫＡ−ＢがＫＡ−Ｃより小さいとき（図１の右図）、Ｇβγ複合体は細胞質にトラップされて接合シグナルの伝達が阻害される。一方、ＫＡ−ＢがＫＡ−Ｃより大きいとき（図１の左図）、Ｇβγ複合体は細胞膜に結合できるため、接合シグナルが伝達される。このため、接合シグナル伝達により、タンパク質（Ａ）−タンパク質（Ｂ）間の相互作用を検出することによって、標的タンパク質（Ａ）に対して、競合タンパク質（Ｃ）と比べて、より親和性の高い（結合定数の大きい）結合タンパク質（Ｂ）を検出またはスクリーニングすることが可能となる。
【００１８】
ここで、タンパク質間相互作用とは、タンパク質とタンパク質との間の結合または親和性をいう。
【００１９】
本発明の酵母を用いるタンパク質間相互作用検出方法は、第1の実施態様では、（１）第１のタンパク質とＧタンパク質γサブユニット細胞膜非結合変異型との融合タンパク質を発現する第１の発現カセットを調製する工程、（２）第２のタンパク質と細胞膜局在化シグナル配列との融合タンパク質を発現する第２の発現カセットを調製する工程、（３）第３のタンパク質を細胞質に発現する第３の発現カセットを調製する工程、（４）該工程（１）、（２）および（３）でそれぞれ得られた該第１、２および３の発現カセットを酵母に導入して形質転換酵母を調製する工程、および、（５）該工程（４）で得られた該形質転換酵母におけるフェロモンシグナル伝達を検出する、またはフェロモンシグナル伝達を示す形質転換酵母をスクリーニングする工程を含む。
【００２０】
上記の方法において得られた形質転換酵母は、シグナル伝達能を評価できるよう活性化する必要がある。活性化の方法は、Ｇタンパク質の上流側を活性化するものであれば、特に制限されない。例えば、酵母内在性のＧタンパク質共役型受容体に対するリガンド（アゴニスト）を加える方法が挙げられる。ａ接合型細胞の場合、例えば、配列番号１に示される塩基配列を有する遺伝子（GenBankアクセッション番号：NC001148）にコードされ、例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列（GenBankアクセッション番号：NP015137）を有する前駆体であるＭＦ（ａｌｐｈａ）１から生産される１３アミノ酸のペプチドであるαファクターを加える方法が挙げられる。
【００２１】
フェロモンシグナル伝達を検出する方法またはフェロモンシグナル伝達を示す形質転換酵母をスクリーニングする方法は特に制限されない。好ましくは、フェロモンシグナル応答性のプロモーター（例えば、ＦＵＳ１、ＦＩＧ１、ＡＧＡ１など）の制御下でレポーター遺伝子の発現が誘導されるよう修飾する。レポーター遺伝子としては、例えば、蛍光レポーター遺伝子、生育レポーター遺伝子、発色レポーター遺伝子、発光レポーター遺伝子などが挙げられる。蛍光レポーター遺伝子としては、例えば、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、赤色蛍光蛋白質（ＤｓＲｅｄ）、シアン色蛍光蛋白質（ＣＦＰ）などが挙げられる。生育レポーター遺伝子としては、例えば、ＨＩＳ３、ＡＤＥ２、ＵＲＡ３、ＣＡＮ１などが挙げられる。発色レポーター遺伝子としては、例えば、βガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）などが挙げられる。発光レポーター遺伝子としては、例えば、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）などが挙げられる。また、フェロモンシグナル伝達によって誘導される細胞周期抑制を利用してもよい。シグナルによって細胞周期が抑制された酵母は増殖が阻害されるため、固体培地上でのハロ形成や液体培地中での菌体密度を測定することにより、シグナル伝達能を検出することまたはシグナル伝達能を有する形質転換酵母をスクリーニングすることができる。
【００２２】
本発明の酵母を用いるタンパク質間相互作用検出方法の第２の実施態様は、（１）第１のタンパク質とＧタンパク質γサブユニット細胞膜非結合変異型との融合タンパク質を発現する第１の発現カセットを調製する工程、（２）第２のタンパク質と細胞膜局在化シグナル配列との融合タンパク質を発現する第２の発現カセットを調製する工程、（３）第３のタンパク質を細胞質に発現する第３の発現カセットを調製する工程、（４）該工程（１）、（２）および（３）でそれぞれ得られた該第１、２および３の発現カセットを１倍体酵母に導入して形質転換酵母を調製する工程、（５）該工程（４）で得られた該形質転換酵母を、該形質転換酵母と接合可能な１倍体酵母と接合させて２倍体酵母を調製する工程、および（６）該工程（５）で得られた該２倍体酵母を選択する工程を含む。
【００２３】
上記の第２の実施態様において、形質転換に用いる１倍体酵母は、接合能を有する必要がある。好ましくはａ／α接合型のａ型またはα型の１倍体酵母である。いずれも、接合により生成される２倍体酵母を１倍体酵母と区別して選択できるように、適切な選択マーカーを有する必要がある。また、内在性のＧタンパク質γサブユニットをコードする遺伝子が欠損している酵母が好ましい。内在性のＧタンパク質γサブユニットをコードする遺伝子が欠損していない酵母を用いる場合には、上記第１の発現カセットを１倍体酵母に導入して形質転換酵母を調製する工程において、相同組換えにより内在性Ｇタンパク質γサブユニットと第１の発現カセットとを置き換える必要がある。酵母の種としては、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）が挙げられる。
【００２４】
選択マーカーとしては、例えば、栄養要求性マーカー、薬剤耐性マーカーが挙げられる。栄養要求性マーカーとしては、例えば、各種アミノ酸要求性マーカー、各種核酸要求性マーカーなどが挙げられる。アミノ酸要求性マーカーとしては、例えば、リジン要求性マーカー、メチオニン要求性マーカー、ヒスチジン要求性マーカー、トリプトファン要求性マーカー、ロイシン要求性マーカーなどが挙げられる。核酸要求性マーカーとしては、例えば、ウラシル要求性マーカー、アデニン要求性マーカーなどが挙げられる。薬剤耐性マーカーとしては、例えば、ジェネティシン（Geneticin：G418）耐性マーカー、オーレオバシジンＡ（Aureobasidin A）耐性マーカーなどが挙げられる。接合する１対の１倍体酵母は、接合により生成される２倍体酵母を１倍体酵母と区別して選択できるように、互いに異なる選択マーカーを有する必要がある。
【００２５】
ここで、１倍体とは、ゲノムの１セットを有する酵母の個体をいい、半数体ともいう。本発明では、第１のタンパク質（Ａ）、第２のタンパク質（Ｂ）および第３のタンパク質（Ｃ）の遺伝子を１倍体の酵母に導入する。
【００２６】
２倍体とは、ゲノムの２セットを有する酵母の個体をいい、倍数体ともいう。１倍体どうしの接合により生成する。本発明では、２倍体の生成効率により、タンパク質間相互作用を検出またはスクリーニングする。
【００２７】
本発明で用いるＧタンパク質は、αサブユニット、βサブユニットおよびγサブユニットが形成する複合体からなるヘテロ三量体Ｇタンパク質のことをいい、Ｇタンパク質とはグアニンヌクレオチド結合タンパク質の略称である。αサブユニットとγサブユニットとはそれぞれ細胞膜に結合している。フェロモンが受容体に結合すると、Ｇタンパク質はαサブユニットとβγ複合体に解離する。Ｇタンパク質の解離後においてもαサブユニットとβγ複合体は細胞膜に局在化する。βγ複合体のβサブユニットが細胞膜を介してエフェクターに作用することでシグナルが下流に伝達される。Ｇタンパク質の由来としては、接合シグナル伝達に関与する限り、特に制限されない。
【００２８】
本発明で用いるＧタンパク質のγサブユニットとしては、例えば、配列番号３に示される塩基配列を有する遺伝子（GenBankアクセッション番号：AY557888）にコードされ、例えば、配列番号４に示されるアミノ酸配列（GenBankアクセッション番号：CAA89613）を有するタンパク質であるＳｔｅ１８が挙げられる。γサブユニット細胞膜非結合変異型（Ｇγｃｙｔｏ）は、細胞膜結合能を欠損している限り、特に制限されない。Ｇγｃｙｔｏとしては、例えば、γサブユニットＳｔｅ１８の配列番号４に示されるアミノ酸配列の第１０６位〜第１１０位が欠失している変異型が挙げられる。
【００２９】
本発明で第１のタンパク質（Ａ）とＧγｃｙｔｏとを融合させる方法は、Ｇγｃｙｔｏの機能が発揮できる限り、特に制限されない。例えば、γサブユニットＳｔｅ１８の配列番号４に示されるアミノ酸配列の第１０５位に、タンパク質（Ａ）のＮ末端を連結する。
【００３０】
本発明で用いる細胞膜局在化シグナル配列は、第２のタンパク質（Ｂ）を細胞膜に局在化することができる限り、特に制限されない。好ましくは、Ｇタンパク質のγサブユニットの細胞膜局在化シグナル配列である。例えば、このシグナルは、γサブユニットＳｔｅ１８の配列番号４に示されるアミノ酸配列の第１０２位〜第１１０位に相当する。
【００３１】
本発明で第２のタンパク質（Ｂ）と細胞膜局在化シグナル配列とを融合させる方法は、細胞膜局在化シグナル配列の機能が発揮できる限り、特に制限されない。例えば、γサブユニットＳｔｅ１８の配列番号４に示されるアミノ酸配列の第１０２位〜第１１０位からなる断片をタンパク質（Ｂ）のＣ末端に連結する。
【００３２】
本発明でタンパク質（Ｃ）を細胞質に発現させる方法は、特に制限されない。
【００３３】
タンパク質（Ａ）−Ｇγｃｙｔｏ融合タンパク質、細胞膜結合性タンパク質（Ｂ）および細胞質性タンパク質（Ｃ）を酵母で発現させるための発現カセットは、通常、これらのタンパク質のコード領域のほかに、酵母で機能するプロモーター、ターミネーターなどの遺伝子発現調節領域、発現カセットが導入された形質転換酵母を選択するための選択マーカーなどを有する。プロモーターとしては、例えば、ＰＧＫ１プロモーター、ＴＤＨ３プロモーター、ＳＴＥ１８プロモーターが挙げられる。ターミネーターとしては、例えば、ＰＧＫ１ターミネーター、ＴＤＨ３ターミネーター、ＣＹＣ１ターミネーターが挙げられる。選択マーカーとしては、例えば、ロイシン要求性マーカー、ウラシル要求性マーカー、ジェネティシン（Geneticin：G418）耐性マーカーが挙げられる。
【００３４】
発現カセットは、通常、プラスミドとして作製される。プラスミドは、発現カセットのほかに、発現カセットを相同組換えにより酵母染色体に組み込むために必要な断片、またはプラスミドを酵母内で自律複製させるために必要な複製起点を有する。相同組換えに必要な断片としては、組み込みたい染色体上の位置に存在する遺伝子の断片が好ましい。発現カセットの相同組換えによる酵母染色体への組み込みは、当業者が通常用いる方法により行われる。酵母内複製起点としては、例えば、２μ（マルチコピー型）、ＣＥＮ／ＡＲＳ（シングルコピー型）が挙げられる。プラスミドの酵母内での自律複製は、当業者が通常用いる方法により行われる。プラスミドは、当業者が通常用いる方法により、大腸菌などの適切な宿主内で増幅され、調製される。プラスミドを調製するための宿主は特に制限されない。好ましくは、大腸菌である。プラスミドはまた、通常、プラスミドの調製を容易にするために、プラスミドが導入された形質転換大腸菌などを選択するための選択マーカーを有する。選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン耐性、カナマイシン耐性などの抗生物質耐性が挙げられる。
【００３５】
発現カセットは、プラスミドの形状で酵母に導入されてもよく、発現カセットのみが酵母に導入されてもよい。発現カセットは、相同組換えにより、効率的に酵母染色体に組み込むことができる。プラスミドは、選択マーカーに対応する選択条件下で形質転換酵母の培養を継続することにより、酵母内で自律複製させることができる。
【００３６】
発現カセットが導入された形質転換酵母は、選択マーカーに対応する選択条件下、すなわち選択マーカーに対応するアミノ酸もしくは核酸の非存在下の培養により、または薬剤存在下の培養により得ることができる。
【００３７】
本発明の方法の第２の実施態様では、発現カセットが導入された形質転換酵母と、対応する接合型の１倍体酵母、好ましくは野生型の１倍体酵母とを接合させる。ここで用いる１倍体酵母は、選択マーカーを有し、かつ接合可能であれば、特に制限されない。例えば、発現カセットが導入された形質転換酵母がａ型由来であれば、これを対応するａ／α接合型のα型の野生酵母と接合させる。１倍体野生酵母は、形質転換酵母との接合により生成する２倍体酵母のみを選択できる選択マーカーを有し、形質転換酵母との接合能を有する限り、特に制限されない。接合により生成する２倍体酵母は、上記選択マーカーを利用することにより、確認・選択することができる。
【００３８】
本発明では、接合効率を適宜定量化することもできる。例えば、接合させた酵母の懸濁液を適宜希釈して選択用固体培地上にコロニーを形成させて、コロニー数を計測することにより定量化できる。
【００３９】
本発明では、第１のタンパク質（Ａ）、第２のタンパク質（Ｂ）および第３のタンパク質（Ｃ）は、特定のタンパク質であってもよく、不特定のタンパク質であってもよい。不特定のタンパク質とは、ライブラリを構成するタンパク質などをいう。第３のタンパク質（Ｃ）として、第１のタンパク質（Ａ）または第２のタンパク質（Ｂ）の競合タンパク質を用いる点が特徴である。この特徴により、特定の第１のタンパク質（Ａ）を用い、ライブラリを構成する第２のタンパク質（Ｂ）を用いる場合、第１のタンパク質（Ａ）に対して、競合タンパク質である第３のタンパク質（Ｃ）と比べて、より親和性の高い（結合定数の大きい）第２のタンパク質（Ｂ）をライブラリの中から検出またはスクリーニングすることが可能となる。
【実施例】
【００４０】
以下に、実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００４１】
（培地）
１％(w/v)酵母エキストラクト、２％(w/v)ペプトンおよび２％(w/v)グルコースを含むＹＰＤ培地、または０．６７％(w/v)アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース（Becton Dickinson社製）および２％(w/v)グルコースを含むＳＤ培地で酵母を培養した。ＳＤ培地には選択マーカーに対応するアミノ酸および核酸を適宜添加した。２％(w/v)寒天をこれらの培地に添加してＹＰＤおよびＳＤの固体培地を調製した。
【００４２】
（酵母）
酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の１倍体株ＢＹ４７４１（メチオニン要求性ａ細胞）およびＢＹ４７４２（リジン要求性α細胞）、ならびに以下の実施例で用いた酵母株および作製した酵母株の遺伝子型を表１に、そして各株において発現するタンパク質を表２に示す。ａ型のＢＹ４７４１を親株として遺伝子組換えにより作製された形質転換株ＭＣ−Ｆ１は、フェロモン誘導性ＦＩＧ１プロモーターの制御下においてＥＧＦＰレポーター遺伝子を発現する。ＭＣ−Ｆ１を親株として遺伝子組換えにより作製された形質転換株ＢＦＧ２Ｚ１８−Ｋ３５Ａ、ＢＦＧ２Ｚ１８−ＷＴおよびＢＺＦＧ２１１８はいずれも、タンパク質（Ａ）として、ヒトＩｇＧのＦｃ部分をＧタンパク質γサブユニットの細胞膜非結合変異型（Ｇγｃｙｔｏ）との融合タンパク質（Ｇγｃｙｔｏ−Ｆｃ）として細胞質に発現する。ＢＦＧ２Ｚ１８−Ｋ３５Ａ、ＢＦＧ２Ｚ１８−ＷＴおよびＢＺＦＧ２１１８は、タンパク質（Ｂ）として、ヒトＩｇＧのＦｃ部分に対する異なる親和性を有するスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）のプロテインＡ由来のＺドメインを細胞膜に結合して発現する。ＢＦＧ２Ｚ１８−Ｋ３５Ａは、結合定数４．６×１０６Ｍ-１のＺドメイン変異型（ＺＫ３５Ａ，ｍｅｍ）を発現し、ＢＦＧ２Ｚ１８−ＷＴは、結合定数５．９×１０７Ｍ-１のＺドメイン野生型（ＺＷＴ，ｍｅｍ）を発現し、そしてＢＺＦＧ２１１８は、結合定数６．８×１０８Ｍ-１のＺドメイン２量体（ＺＺｍｅｍ）を発現する。ＢＦＧ２１１８は、ネガティブコントロールであり、Ｇγｃｙｔｏ−Ｆｃのみを発現する。
【００４３】
【表１】
0005574479.tif 000002
【００４４】
【表２】
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【００４５】
（参考例）
（接合能を指標とするタンパク質間相互作用検出方法）
ＢＦＧ２Ｚ１８−Ｋ３５Ａ、ＢＦＧ２Ｚ１８−ＷＴ、ＢＺＦＧ２１１８およびＢＦＧ２１１８の各酵母株を初期菌体濃度ＯＤ６００＝０．１で５ｍＬのＹＰＤ培地に播種し、無処置の接合相手ＢＹ４７４２と３０℃にて３時間共培養した。培養後、酵母を回収し、洗浄後、蒸留水に再懸濁した。各株の接合能を評価するために、酵母懸濁液のＯＤ６００＝１．０、０．１および０．００１の希釈系列を調製し、メチオニンおよびリジンを含まず、２０ｍｇ／Ｌのヒスチジン、３０ｍｇ／Ｌのロイシンおよび２０ｍｇ／Ｌウラシルを含む２倍体選択用ＳＤ固体培地上（ＳＤ−Ｍｅｔ、Ｌｙｓプレート）にスポットした。この結果、ＢＦＧ２１１８は増殖しなかったが、他の３つの株は増殖した（図２Ａ）。
【００４６】
増殖した３つの株では、タンパク質（Ａ）とタンパク質（Ｂ）との間には相互作用が存在するため、Ｇタンパク質を介するフェロモンシグナル伝達によるａ型とα型との接合が生じたものと思われる。一方、ＢＦＧ２１１８では、タンパク質（Ｂ）を欠くため、このような相互作用は存在せず、増殖が見られなかった。このように、１倍体酵母のａ型とα型とのフェロモンシグナル伝達を介する接合能は、タンパク質（Ａ）とタンパク質（Ｂ）との相互作用の有無を検出する方法として有効であることが示された。
【００４７】
次に、増殖した３つの株の接合能を定量的に評価するために、菌体濃度ＯＤ６００＝１．０に調整した１ｍＬの酵母懸濁液を、プレート上に１００〜１０００コロニーが成長するように、適宜希釈してＳＤ−Ｍｅｔ、Ｌｙｓプレートに塗布した。コロニー数を計測し、計測したコロニー数に希釈率を乗じて、菌体濃度ＯＤ６００＝１．０に調整した１ｍＬの酵母懸濁液が生成し得る２倍体酵母のコロニー数を求めた。結果を図２Ｂに示す。図２Ｂ中のエラーバーは、３度の独立した実験結果における標準偏差を示す。
【００４８】
図２Ｂからわかるように、タンパク質（Ａ）とタンパク質（Ｂ）との間の結合定数に対応して生成し得る２倍体酵母のコロニー数に差異があった。このように、１倍体酵母のａ型とα型とのフェロモンシグナル伝達を介する接合能は、タンパク質（Ａ）とタンパク質（Ｂ）との相互作用を定量的に評価する方法としても有効であることが示された。
【００４９】
（実施例１）
（細胞質で競合タンパク質（Ｃ）を発現する形質転換株の作製）
細胞質での競合タンパク質（Ｃ）の発現がＧタンパク質を介する接合シグナル伝達の回復を阻害するかどうか調べるために、ＢＦＧ２Ｚ１８−Ｋ３５Ａ、ＢＦＧ２Ｚ１８−ＷＴおよびＢＺＦＧ２１１８を遺伝子組換えし、競合タンパク質（Ｃ）として、Ｚドメイン野生型（ＺＷＴ）またはＺドメイン変異型（ＺＫ３５Ａ）を細胞質に発現する形質転換株を作製した。
【００５０】
細胞質で競合タンパク質として発現させるＺドメイン野生型遺伝子（ＺＷＴ）およびＺドメイン変異型遺伝子（ＺＫ３５Ａ）を酵母染色体上のＨＯＰ２遺伝子の上流（ＰＨＯＰ２：ＨＯＰ２プロモーター領域）に相同組換えにより組み込むため、次のプラスミドを構築した。ＺＷＴおよびＺＫ３５Ａを、プラスミドｐＵＭＺ−ＷＴおよびｐＵＭＺ−Ｋ３５Ａからプライマー１（配列番号５）およびプライマー２（配列番号６）を用いてＰＣＲにより増幅し、プラスミドｐＧＫ４２５のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ部位間に挿入し、それぞれプラスミドｐＬＭＺ−ＷＴおよびｐＬＭＺ−Ｋ３５Ａとした。ＨＯＰ２プロモーター領域での相同組換えに用いるＤＮＡ断片を、ＭＣ−Ｆ１のゲノムＤＮＡからプライマー３（配列番号７）およびプライマー４（配列番号８）を用いてＰＣＲにより増幅し、プラスミドｐＬＭＺ−ＷＴおよびｐＬＭＺ−Ｋ３５ＡのＮｏｔＩ−ＳａｃＩ部位間にそれぞれ挿入し、それぞれプラスミドｐＬＭＺ−ＷＴ−ＨおよびｐＬＭＺ−Ｋ３５Ａ−Ｈとした。
【００５１】
次いで、ＬＥＵ２−ＰＧＫ５’−Ｚ−ＰＧＫ３’−ＰＨＯＰ２（ＰＧＫ５’：ＰＧＫ１プロモーター；ＰＧＫ３’：ＰＧＫ１ターミネーター）を含むＤＮＡ断片をｐＬＭＺ−ＷＴ−ＨおよびｐＬＭＺ−Ｋ３５Ａ−ＨからＰＨＯＰ２のすぐ上流領域に相同な領域を含む５０塩基のプライマー５（配列番号９）およびプライマー６（配列番号１０）を用いてＰＣＲにより増幅した。増幅したＤＮＡ断片をＢＧＦ２Ｚ１８−Ｋ３５Ａ、ＢＦＧ２Ｚ１８−ＷＴおよびＢＺＦＧ２１１８の形質転換に用いた。形質転換では、酢酸リチウム法を用いた。形質転換体は、ウラシルおよびロイシンを含まず、２０ｍｇ／Ｌのヒスチジンおよび３０ｍｇ／Ｌのメチオニンを含むＳＤ培地（ＳＤ−Ｕｒａ、Ｌｅｕプレート）で選択し、ＦＣ１−１、ＦＣ２−１、ＦＣ３−１、ＦＣ１−２、ＦＣ２−２およびＦＣ３−２株を得た（表１）。
【００５２】
（実施例２）
（細胞質で競合タンパク質（Ｃ）を発現する形質転換株における蛍光レポーター遺伝子を指標とするタンパク質間相互作用検出方法）
実施例１で得られた形質転換株の蛍光レポーター遺伝子の発現を評価した。競合タンパク質を発現しない例として、ＢＦＧ２Ｚ１８−Ｋ３５Ａ、ＢＦＧ２Ｚ１８−ＷＴおよびＢＺＦＧ２１１８を用いた。競合タンパク質としてＺＫ３５Ａを発現する例として、ＦＣ１−１、ＦＣ２−１およびＦＣ３−１を用いた。競合タンパク質としてＺＷＴを発現する例として、ＦＣ１−２、ＦＣ２−２およびＦＣ３−２を用いた。各酵母株を初期菌体濃度ＯＤ６００＝０．１で５ｍＬのＹＰＤ培地に播種した後、最終濃度５μＭとなるようαファクターを添加し、３０℃にて６時間培養した。各株の蛍光レポーター遺伝子発現を評価するために、培養後、酵母を回収し、フローサイトメーターを用いて細胞の蛍光強度を評価した。結果を図３に示す。図３のグラフにおいて並立する２本カラムのうち、左（濃色）のカラムは競合タンパク質を導入していない酵母株、および右（淡色）のカラムは競合タンパク質を導入した酵母株の結果を示す。図３中のエラーバーは、３度の独立した実験結果における標準偏差を示す。
【００５３】
この結果、競合タンパク質（Ｃ）を発現しない酵母株ＢＦＧ２Ｚ１８−Ｋ３５Ａ、ＢＦＧ２Ｚ１８−ＷＴおよびＢＺＦＧ２１１８はすべて蛍光を示した。一方で、競合タンパク質（Ｃ）ＺＫ３５Ａを発現する酵母株においては、結合定数の小さい第２のタンパク質（Ｂ）を発現しているＦＣ１−１は全く蛍光を示さず、より結合定数の大きい第２のタンパク質（Ｂ）を発現しているＦＣ２−１およびＦＣ３−１のみ蛍光を示した（図３Ａ）。同様に、競合タンパク質（Ｃ）ＺＷＴを発現する酵母株においては、結合定数の小さい第２のタンパク質（Ｂ）を発現しているＦＣ１−２およびＦＣ２−２は全く蛍光を示さず、より結合定数の大きい第２のタンパク質（Ｂ）を発現しているＦＣ３−２のみ蛍光を示した（図３Ｂ）。
【００５４】
（実施例３）
（細胞質で競合タンパク質（Ｃ）を発現する形質転換株における接合能を指標とするタンパク質間相互作用検出方法）
実施例１で得られた形質転換株の接合能を参考例と同様に評価した。結果を図４に示す。図４のグラフにおいて並立する２本カラムのうち、左（濃色）のカラムは競合タンパク質を導入していない酵母株、および右（淡色）のカラムは競合タンパク質を導入した酵母株の結果を示す。図４中のエラーバーは、３度の独立した実験結果における標準偏差を示す。
【００５５】
この結果、競合タンパク質ＺＫ３５Ａを発現するＦＣ２−１およびＦＣ３−１は、２倍体選択用培地で増殖した（図４Ａ）。ＦＣ２−１およびＦＣ３−１の接合能は、競合タンパク質（Ｃ）を発現しない酵母株とほとんど同等であった（図４Ｃ）。同様の結果が、競合タンパク質（Ｃ）ＺＷＴを発現する酵母株についても得られた。ＦＣ１−２およびＦＣ２−２は、接合能を示さなかったが、ＦＣ３−２のみ、競合タンパク質（Ｃ）を発現しない酵母株とほとんど同等の接合能を示した（図４Ｂおよび４Ｄ）。
【００５６】
（実施例４）
（モデルライブラリからの標的細胞のスクリーニング）
細胞質で競合タンパク質（Ｃ）を発現する形質転換株における接合能を指標とするタンパク質間相互作用検出方法が有効かどうかを、モデルライブラリを用いて検証した。モデルライブラリとして、標的細胞（ＦＣ３−２またはＢＺＦＧ２１１８）とコントロール細胞（ＦＣ２−２またはＢＦＧＺ１８−ＷＴ）とが表３に示す初期割合で混合された２つのライブラリを調製した。一方は、競合タンパク質（Ｃ）を発現していない酵母株からなり、ＺＺを発現する少量のＢＺＦＧ２１１８とＺＷＴを発現する過剰量のＢＦＧ２Ｚ１８−ＷＴとを含み、他方は、競合タンパク質（Ｃ）を発現している酵母株からなり、ＺＺを発現する少量のＦＣ３−２とＺＷＴを発現する過剰量のＦＣ２−２とを含む。これらのライブラリは、各１倍体の初期菌体濃度をＯＤ６００＝０．１に設定して、接合相手のＢＹ４７４２と３０℃にて３時間１０ｍＬのＹＰＤ培地で共培養した。培養後、酵母を回収し、洗浄後、ＳＤ−Ｍｅｔ、Ｌｙｓプレートに塗布し、３０℃にて２日間培養した。１０コロニーをピックアップし、ＹＰＤ培地中で一晩別々に増殖させた。ゲノムを抽出し、タンパク質（Ｂ）のコード領域をプライマー７（配列番号１１）およびプライマー８（配列番号１２）を用いてＰＣＲにより増幅した。増幅した断片がＺＺまたはＺＷＴのいずれに由来するかは、断片の長さで判断した。１０コロニー中、ＺＺの断片が得られたコロニーの割合を、標的細胞の最終割合とした。標的細胞の最終割合を初期割合で除した値をスクリーニング効率として算出し、評価した。結果を表３に示す。
【００５７】
【表３】
0005574479.tif 000004
【００５８】
表３に示すように、競合タンパク質（Ｃ）を用いるタンパク質間相互作用検出方法は、競合タンパク質を用いない従来の方法よりも明らかに優れたスクリーニング効率を示し、最大で７０００倍に達した。
【００５９】
これらの結果は、競合タンパク質（Ｃ）を用いるタンパク質間相互作用検出方法は、標的タンパク質（Ａ）に対して、もとの結合タンパク質（Ｂ）と比べて、より高い親和性を有する結合タンパク質（Ｂ）を検出するのに適していることを示唆する。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明によれば、親和性の高いタンパク質間相互作用を効率よく検出またはスクリーニングすることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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