(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中のリン酸に対して、デヒドロゲナーゼを用いた酵素反応を最終酵素反応とする単数または複数の酵素反応を行って、被検試料中のリン酸を測定するリン酸の測定方法であって、デヒドロゲナーゼを用いた酵素反応として、下記反応式（Ｉ）
【化１】
0005458487.tif 000024
（式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ２はＢ１の酸化型生成物を示す）で表わされる酵素サイクリング反応を行って生成物Ｚを生じさせ、該反応によって変化するＡ２またはＢ１の量を測定して被検試料中のリン酸を測定する測定方法において、
被検試料中のリン酸に、上記単数または複数の酵素反応を行うための試薬を作用させる前に、その試薬成分中に存在する遊離リン酸を予め酵素的に除去しておくことを特徴とする、被検試料中のリン酸の測定方法であって、
酵素的に遊離リン酸を除去する方法として、前記の単数または複数の酵素反応を行うための試薬成分であって、前記の酵素サイクリング反応を行うための補酵素以外の試薬成分を用い、更に、それらの補酵素とは別に補酵素Ｃ１として、最終酵素反応であるデヒドロゲナーゼを用いた酵素反応として、下記反応式（ＩＩ）
【化２】
0005458487.tif 000025

（式中、Ｃ１は、Ａ１、Ｂ１とは独立にチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ｃ２はＣ１の還元型生成物を示す）で表される酵素反応を行うための補酵素を用いて、前記の酵素サイクリング反応を行うための補酵素以外の試薬成分中の遊離リン酸に対して、上記反応式（ＩＩ）で表されるデヒドロゲナーゼを用いた酵素反応を最終酵素反応とする単数または複数の酵素反応を行って、生成物Ｚを生じさせ、さらに生成物Ｚが減少していく酵素系を存在させて、前記の単数または複数の酵素反応を行うための試薬成分であって、前記の酵素サイクリング反応を行うための補酵素以外の試薬成分中の遊離リン酸を除去する方法を行う、
被検試料中のリン酸の測定方法。
【請求項２】
請求項１における単数または複数の酵素反応を行うための試薬成分であって、請求項１の酵素サイクリング反応を行うための補酵素以外の試薬成分と補酵素Ｃ１および生成物Ｚが減少していく酵素系とを混合して、それら試薬成分中の遊離リン酸を一緒にし、一緒にした遊離リン酸を含む、該試薬成分の混合物を加温して、反応式（ＩＩ）で表されるデヒドロゲナーゼを用いた酵素反応を最終酵素反応とする単数または複数の酵素反応を行って、遊離リン酸を除去する、請求項１の測定方法。
【請求項３】
反応式（ＩＩ）で表されるデヒドロゲナーゼを用いた酵素反応をｐＨ４．０〜７．５で行ない、生成するチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類のいずれかの還元生成物Ｃ２が分解されていく請求項１または２の測定方法。
【請求項４】
デヒドロゲナーゼを用いた酵素反応を最終酵素反応とする単数の酵素反応が下記式（ＩＩＩ）
【化３】
0005458487.tif 000026
（ただし、デヒドロゲナーゼはＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを示し、Ａ１、Ａ２，Ｂ１，Ｂ２は、それぞれ前記の通りである）で表される請求項１から３のいずれかの測定方法。
【請求項５】
試薬成分中に存在する遊離リン酸を除去するために、試薬成分であるＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸およびＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、更に、チオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を用いて、それら試薬成分中の遊離リン酸に対して、下記式（ＩＶ）
【化４】
0005458487.tif 000027
（ただし、デヒドロゲナーゼはＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを示し、Ｃ１、Ｃ２は、それぞれ前記の通りである）で表される酵素反応を行って、試薬成分中に存在する遊離リン酸を除去し、更に、遊離リン酸除去の際、生成物１，３−ジホスホグリセリン酸を減少させる酵素として、ビホスホグリセレートムターゼを試薬成分中に存在させておくことにより、下記反応式（Ｖ）
【化５】
0005458487.tif 000028

で表される酵素反応を行う、請求項４の測定方法。
【請求項６】
デヒドロゲナーゼを用いた酵素反応を最終酵素反応とする複数の酵素反応が下記式（ＶＩ）
【化６】
0005458487.tif 000029
（式中、Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２は前記のとおり）で表される請求項１から３のいずれかの測定方法。
【請求項７】
試薬成分中に存在する遊離リン酸を除去するために、試薬成分であるマルトース、マルトースホスホリラーゼ、β−ホスホグルコムターゼおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、更に、チオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を用いて、それら試薬成分中の遊離リン酸に対して、下記式（ＶＩＩ）
【化７】
0005458487.tif 000030
（式中、Ｃ１、Ｃ２は前記のとおり）で表される酵素反応を行って、試薬成分中に存在する遊離リン酸を除去し、更に、遊離リン酸除去の際、生成物グルコノラクトン−６−リン酸を減少させる酵素として、６−ホスホグルコノラクトナーゼを試薬成分中に存在させておくことにより、下記反応式（ＶＩＩＩ）
【化８】
0005458487.tif 000031

で表される酵素反応を行う、請求項６の測定方法。
【請求項８】
ＮＡＤＰ類が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰ）、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチドホスフェート（アセチルＮＡＤＰ）およびアセチルピリジンヒポキサンチンジヌクレオチドホスフェートおよびニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドホスフェート（デアミノＮＡＤＰ）からなる群より選ばれるものである請求項１から７のいずれかの測定方法。
【請求項９】
ＮＡＤ類が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド（アセチルＮＡＤ）、アセチルピリジンヒポキサンチンジヌクレオチドおよびニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド（デアミノＮＡＤ）からなる群より選ばれるものである請求項１から７のいずれかの測定方法。
【請求項１０】
チオＮＡＤＰ類が、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（チオＮＡＤＰ）およびチオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドホスフェートからなる群より選ばれるものである請求項１から７のいずれかの測定方法。
【請求項１１】
チオＮＡＤ類が、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）およびチオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドからなる群より選ばれるものである請求項１から７のいずれかの測定方法。
【請求項１２】
被検試料中のリン酸に対して、デヒドロゲナーゼを用いた酵素反応を最終酵素反応とする単数または複数の酵素反応を行って、被検試料中のリン酸を測定するためのリン酸測定用キットであって、
１）請求項１における単数または複数の酵素反応を行うための試薬成分であって、請求項１の反応式（Ｉ）中の酵素サイクリング反応を行うための補酵素以外の試薬成分と、更に、請求項１の反応式（ＩＩ）中の最終酵素反応を行うための補酵素および反応式（ＩＩ）の酵素反応により生じる生成物Ｚを減少させる酵素系試薬を含む、遊離リン酸消去用試薬、あるいは、該遊離リン酸消去用試薬を酵素反応させて得られる遊離リン酸消去試薬、および
２）請求項１の反応式（Ｉ）中の酵素サイクリング反応を行うための補酵素、
を含む、リン酸測定用キット。
【請求項１３】
請求項５に記載の被検試料中のリン酸を測定するためのリン酸測定用キットであって、
１）Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸、Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼおよびビホスホグリセレートムターゼ、更に、チオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類からなる遊離リン酸消去用試薬、あるいは、該遊離リン酸消去用試薬を酵素反応させて得られる遊離リン酸消去試薬、および
２）チオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ類と、還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類とを組み合せた補酵素、あるいはＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類と、還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類とを組み合せた補酵素、
を含む、リン酸測定用キット。
【請求項１４】
請求項７に記載の被検試料中のリン酸を測定するためのリン酸測定用キットであって、
１）マルトース、マルトースホスホリラーゼ、β−ホスホグルコムターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよび６−ホスホグルコノラクトナーゼ、更に、チオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類からなる遊離リン酸消去用試薬、あるいは、該遊離リン酸消去用試薬を酵素反応させて得られる遊離リン酸消去試薬、および
２）チオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ類と、還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類とを組み合せた補酵素、あるいはＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類と、還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類とを組み合せた補酵素、
を含む、リン酸測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床生化学検査等に有用なリン酸の測定方法に関する。更に詳細には、チオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を補酵素としてデヒドロゲナーゼを用いた酵素サイクリング系でリン酸を測定する方法であって、低濃度から高濃度の広範囲の濃度のリン酸の測定が可能なリン酸の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液中のリン酸は、臨床検査では「無機リン」と呼ばれ、副甲状腺ホルモンおよびビタミンＤにより調節される生体内の重要な無機物である。血中のリン酸濃度が低すぎると細胞内有機リン酸化合物の合成障害や細胞機能の障害をもたらし、一方、リン酸濃度が高いと異所性石灰化などをきたす。その結果、血液中のリン酸を測定することにより、例えば、内分泌、骨代謝異常を来たす様々な疾患を類推することができる。
【０００３】
その測定法としては、モリブデンブルー法、酵素法等が知られている。モリブデンブルー法は、試料中のリン酸イオンにモリブデン酸を加え、６価のリンモリブデン酸塩（黄色）を形成させ、これにアスコルビン酸等の還元剤を加えて３価のリンモリブデン酸塩（モリブデンブルー）にし、６６０〜７５０ｎｍで比色することにより、リン酸を測定する方法である（非特許文献１）。また、より緩和な条件で反応させるリン酸測定法として、酵素法、例えば、ＰＮＰ−ＸＯＤ−ＰＯＤ法が知られている。ＰＮＰ−ＸＯＤ−ＰＯＤ法は、試料中のリン酸イオンにイノシン（基質）の存在下でプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）を作用させヒポキサンチンを生成させ、次いで、生成したヒポキサンチンをキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）の作用により、尿酸とＨ２Ｏ２とし、さらに、Ｈ２Ｏ２をトリンダー試薬等で反応させ発色させて比色定量することによりリン酸を測定する方法である（非特許文献２）。
【０００４】
しかし、これらの方法は、低濃度のリン酸の測定法としては感度が低く、また、モリブデンブルー法においては、反応特異性に問題があり、ＰＮＰ−ＸＯＤ−ＰＯＤ法においては還元物質の影響を受けやすい等の問題があった。
一方、特開平４−３４９８９８号においては、試料中のリン酸にＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸、チオＮＡＤ，およびＮＡＤＨを作用させ、リン酸を測定している（特許文献１）。この方法は、チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈが波長４００ｎｍ付近、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが３４０ｎｍ付近に吸光度があり、チオＮＡＤ（Ｐ）ＨとＮＡＤ（Ｐ）Ｈを区別して測定可能であることを利用して酵素サイクリング反応法によりリン酸を高感度で測定できる長所がある。しかし、試薬が高価であり、さらに水溶液として溶解したときに不安定になりやすく、試薬の保存が悪く、実用的に問題である。
【非特許文献１】臨床検査法提要（金原出版），改訂第３１版，５９７〜５９８頁（１９９８年）
【非特許文献２】日本臨床，第４３巻，１９８５年秋季増刊号，広範囲血液尿化学検査・免疫学的検査（上巻），４６０頁（１９８５年）
【特許文献１】特開平４−３４９８９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者は、上記問題に鑑み、低濃度のリン酸を、チオＮＡＤ、還元型ＮＡＤおよびデヒドロゲナーゼを用いた酵素サイクリング系で測定しようと試みたが、ブランク値が高くなりやすく、測定不能であったり、測定できる範囲が狭くなるという問題を発見した。本発明は、かかる問題を解決し、達成されたものである。
本発明の目的は、試薬ブランクを低減し、酵素サイクリング法の特長である低濃度のリン酸を測定でき、しかも高濃度のリン酸をも測定可能とし、従来にはなかった広範囲の濃度で可能なリン酸の測定方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下の（１）から（２２）の発明に関する。
（１）被検試料中のリン酸に対して、デヒドロゲナーゼを用いた酵素反応を最終酵素反応とする単数または複数の酵素反応を行って、被検試料中のリン酸を測定するリン酸の測定方法であって、デヒドロゲナーゼを用いた酵素反応として、下記反応式（Ｉ）
【化１】
0005458487.tif 000002
（式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ２はＢ１の酸化型生成物を示す）で表わされる酵素サイクリング反応を行って生成物Ｚを生じさせ、該反応によって変化するＡ２またはＢ１の量を測定して被検試料中のリン酸を測定する測定方法において、被検試料中のリン酸に、上記単数または複数の酵素反応を行うための試薬を作用させる前に、その試薬成分中に存在する遊離リン酸を予め除去しておくことを特徴とする、被検試料中のリン酸の測定方法；
（２）  遊離リン酸を予め除去する方法として、カラムクロマトグラフィーまたは透析による物理的手段で遊離リン酸を除去する方法あるいは酵素的にリン酸を除去する方法を行う上記（１）の測定方法；
（３）  酵素的にリン酸を除去する方法として、上記（１）における単数または複数の酵素反応を行うための試薬成分であって、上記（１）の酵素サイクリング反応を行うための補酵素以外の試薬成分を用い、更に、それらの補酵素とは別に補酵素Ｃ１として、最終酵素反応であるデヒドロゲナーゼを用いた酵素反応として、下記反応式（ＩＩ）
【化２】
0005458487.tif 000003
（式中、Ｃ１は、Ａ１、Ｂ１とは独立にチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ｃ２はＣ１の還元型生成物を示す）で表される酵素反応を行うための補酵素を用いて、請求項１の酵素サイクリング反応を行うための補酵素以外の試薬成分中の遊離リン酸に対して、上記反応式（ＩＩ）で表されるデヒドロゲナーゼを用いた酵素反応を最終酵素反応とする単数または複数の酵素反応を行って、生成物Ｚを生じさせて、請求項１における単数または複数の酵素反応を行うための試薬成分であって、請求項１の酵素サイクリング反応を行うための補酵素以外の試薬成分中の遊離リン酸を除去する方法を行う上記（２）の測定方法；
（４）  上記（１）における単数または複数の酵素反応を行うための試薬成分であって、上記（１）の酵素サイクリング反応を行うための補酵素以外の試薬成分と補酵素Ｃ１とを混合して、それら試薬成分中の遊離リン酸を一緒にし、一緒にした遊離リン酸を含む、該試薬成分の混合物を加温して、反応式（ＩＩ）で表されるデヒドロゲナーゼを用いた酵素反応を最終酵素反応とする単数または複数の酵素反応を行って、遊離リン酸を除去する、上記（３）の測定方法；
（５）  反応式（ＩＩ）で表されるデヒドロゲナーゼを用いた酵素反応をｐＨ４．０〜７．５で行ない、生成するチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類のいずれかの還元生成物Ｃ２が分解されていく上記（２）から（４）のいずれかの測定方法；
（６）  反応式（ＩＩ）で表されるデヒドロゲナーゼを用いた酵素反応の際、さらに生成物Ｚが減少していく酵素系を存在させておく上記（２）から（５）のいずれかの測定方法；
（７）  デヒドロゲナーゼを用いた酵素反応を最終酵素反応とする単数の酵素反応が下記式
【化３】
0005458487.tif 000004
（ただし、デヒドロゲナーゼはＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを示し、Ａ１、Ａ２，Ｂ１，Ｂ２は、それぞれ前記の通りである）で表される上記（１）から（６）のいずれかの測定方法；
（８）  試薬成分中に存在する遊離リン酸を除去するために、試薬成分であるＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸およびＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、更に、チオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を用いて、それら試薬成分中の遊離リン酸に対して、下記式（ＩＶ）
【化４】
0005458487.tif 000005
（ただし、デヒドロゲナーゼはＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを示し、Ｃ１、Ｃ２は、それぞれ前記の通りである）で表される酵素反応を行って、試薬成分中に存在する遊離リン酸を除去する上記（７）の測定方法；
（９）  遊離リン酸除去の際、生成物１，３−ジホスホグリセリン酸を減少させる酵素として、ビホスホグリセレートムターゼを試薬成分中に存在させておくことにより、下記反応式（Ｖ）
【化５】
0005458487.tif 000006
で表される酵素反応を行う上記（８）の測定方法；
（１０）  デヒドロゲナーゼを用いた酵素反応を最終酵素反応とする複数の酵素反応が下記式（ＶＩ）
【化６】
0005458487.tif 000007
（式中、Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２は前記のとおり）で表される上記（１）から（６）のいずれかの測定方法；
（１１）  試薬成分中に存在する遊離リン酸を除去するために、試薬成分であるマルトース、マルトースホスホリラーゼ、β−ホスホグルコムターゼおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、更に、チオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を用いて、それら試薬成分中の遊離リン酸に対して、下記式（ＶＩＩ）
【化７】
0005458487.tif 000008
（式中、Ｃ１、Ｃ２は前記のとおり）で表される酵素反応を行って、試薬成分中に存在する遊離リン酸を除去する上記（１０）の測定方法；
（１２）  遊離リン酸除去の際、生成物グルコノラクトン−６−リン酸を減少させる酵素として、６−ホスホグルコノラクトナーゼを試薬成分中に存在させておくことにより、下記反応式（ＶＩＩＩ）
【化８】
0005458487.tif 000009
で表される酵素反応を行う上記（１１）の測定方法；
（１３）  ＮＡＤＰ類が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰ）、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチドホスフェート（アセチルＮＡＤＰ）およびアセチルピリジンヒポキサンチンジヌクレオチドホスフェートおよびニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドホスフェート（デアミノＮＡＤＰ）からなる群より選ばれるものである上記（１）から（１２）のいずれかの測定方法；
（１４）  ＮＡＤ類が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド（アセチルＮＡＤ）、アセチルピリジンヒポキサンチンジヌクレオチドおよびニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド（デアミノＮＡＤ）からなる群より選ばれるものである上記（１）から（１２）のいずれかの測定方法；
（１５）  チオＮＡＤＰ類が、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（チオＮＡＤＰ）およびチオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドホスフェートからなる群より選ばれるものである上記（１）から（１２）のいずれかの測定方法；
（１６）  チオＮＡＤ類が、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）およびチオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドからなる群より選ばれるものである上記（１）から（１２）のいずれかの測定方法；
（１７）  被検試料中のリン酸に対して、デヒドロゲナーゼを用いた酵素反応を最終酵素反応とする単数または複数の酵素反応を行って、被検試料中のリン酸を測定するためのリン酸測定用キットであって、
１）請求項１における単数または複数の酵素反応を行うための試薬成分であって、請求項１の反応式（Ｉ）中の酵素サイクリング反応を行うための補酵素以外の試薬成分と、更に、請求項３の反応式（ＩＩ）中の最終酵素反応を行うための補酵素を含む、遊離リン酸消去用試薬、あるいは、該遊離リン酸消去用試薬を酵素反応させて得られる遊離リン酸消去試薬、および
２）請求項１の反応式（Ｉ）中の酵素サイクリング反応を行うための補酵素、
を含む、リン酸測定用キット；
（１８）  上記（８）に記載の被検試料中のリン酸を測定するためのリン酸測定用キットであって、
１）Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸およびＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、更に、チオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類からなる遊離リン酸消去用試薬、あるいは、該遊離リン酸消去用試薬を酵素反応させて得られる遊離リン酸消去試薬、および
２）チオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ類と、還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類とを組み合せた補酵素、あるいはＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類と、還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類とを組み合せた補酵素、
を含む、リン酸測定用キット。
（１９）  上記（１１）に記載の被検試料中のリン酸を測定するためのリン酸測定用キットであって、
１）マルトース、マルトースホスホリラーゼ、β−ホスホグルコムターゼおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、更に、チオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類からなる遊離リン酸消去用試薬、あるいは、該遊離リン酸消去用試薬を酵素反応させて得られる遊離リン酸消去試薬、および
２）チオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ類と、還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類とを組み合せた補酵素、あるいはＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類と、還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類とを組み合せた補酵素、
を含む、リン酸測定用キット。
（２０）  被検試料中のリン酸またはマルトースを測定する方法であって、被検試料中のリン酸またはマルトースに、マルトースホスホリラーゼ、β−ホスホグルコムターゼおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを用いた酵素反応を行うための試薬を加え、かつ、該グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを用いた酵素反応を行う試薬として、チオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ類と、還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類とを組み合せた補酵素、あるいはＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類と、還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類とを組み合せた補酵素を加えて、下記式（ＩＸ）
【化９】
0005458487.tif 000010
（式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、またＡ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ２はＢ１の酸化型生成物を示す）で表わされる、最終酵素反応として、該グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを用いた酵素サイクリング反応を形成せしめてグルコノラクトン−６−リン酸を生じさせ、該反応によって変化するＡ２またはＢ１の量を測定することを特徴とする被検試料中のリン酸またはマルトースの測定方法；
（２１）  生成物グルコノラクトン−６−リン酸が減少していく酵素系として６−ホスホグルコノラクトナーゼを存在させる上記（２０）の測定方法；
（２２）  被検試料中のリン酸またはそのリン酸と酵素Ｘの存在下に反応しうる基質Ｙの測定方法であって、酵素Ｘがデヒドロゲナーゼである場合、酵素Ｘが酵素反応しうる試薬、かつ、該デヒドロゲナーゼを用いた酵素反応を行う試薬として、チオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ類と、還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類とを組み合せた補酵素、あるいはＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類と、還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類とを組み合せた補酵素を加えて、下記反応式（Ｘ）
【化１０】
0005458487.tif 000011
（式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、またＡ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ２はＢ１の酸化型生成物を示す）で表わされる酵素サイクリング反応を形成せしめて生成物Ｚを生じさせ、該反応によって変化するＡ２またはＢ１の量を測定するリン酸の測定方法において、生成物Ｚが減少していく酵素系を存在させておくことを特徴とする、被検試料中のリン酸またはそのリン酸と酵素Ｘの存在下に反応しうる基質の測定方法。
【発明の効果】
【０００７】
上記（１）から（１９）の本発明の測定方法およびキットによれば、特定の補酵素の組み合わせおよびデヒドロゲナーゼを用いた酵素サイクリング反応を含んだ酵素系でリン酸を測定する場合、試薬中の補酵素以外の成分に存在するリン酸をあらかじめ除去しておくことにより、測定時のブランクを低くでき、その結果、リン酸を低濃度から高濃度まで濃度範囲を広く測定できる。
また、上記（２０）から（２１）の本発明の測定方法によれば、特定の補酵素の組み合わせおよびデヒドロゲナーゼを用いた酵素サイクリング反応でリン酸またはマルトースを測定する場合、試薬が安価であり、さらに水溶液として溶解したときに試薬が安定であるため、長期保存可能な試薬を用いて、低濃度のリン酸またはマルトースを正確に測定できる。さらに、上記（２２）の本発明の測定方法によれば、特定の補酵素の組み合わせおよびデヒドロゲナーゼを用いた酵素サイクリング反応を含む酵素系で、リン酸または特定の酵素基質を測定する場合、最終生成物がさらに減少していく系を存在させることにより酵素サイクリング反応の速度をコントロールでき、その結果、測定範囲を高濃度から低濃度まで広い範囲のリン酸濃度を測定できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
上記（１）から（１６）の本発明の測定法における測定対象物質は、リン酸である。また、リン酸を遊離したり、生成したりする酵素系がある場合、中間的に生成するリン酸を測定することにより、その酵素系の酵素活性やその酵素の基質を測定することができる。
また、本発明におけるリン酸とは、無機リン酸またはそのイオン体であればよく、例えばＨ３ＰＯ４、Ｈ２ＰＯ４−イオン、ＨＰＯ４２−イオン、ＰＯ４３−イオンを例示できる。また、これらのイオン体は、塩、例えば、Ｎａ塩、Ｋ塩、アンモニウム塩であってもよい。
【０００９】
本発明の被検試料としては、上述したリン酸またはそのリン酸を含む可能性のある試料であれば特に限定しないが、例えば、生体試料、例えば、血清、血漿、そのモデルサンプルを例示できる。また、測定対象物質を酵素反応等で中間的に発生しうる試料でも構わない。
【００１０】
本発明においては、補酵素として、チオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類、ＮＡＤ類を用いる。チオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ類としては、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（チオＮＡＤＰ）、チオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドホスフェート；およびチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）、チオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドを例示できる。また、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類としては、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰ）、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチドホスフェート（アセチルＮＡＤＰ）、アセチルピリジンヒポキサンチンジヌクレオチドホスフェート、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドホスフェート（デアミノＮＡＤＰ）；およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド（アセチルＮＡＤ）、アセチルピリジンヒポキサンチンジヌクレオチド、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド（デアミノＮＡＤ）を例示できる。なお、本明細書においては、これら補酵素の還元型は、おのおの、チオＮＡＤＰＨ類（還元型チオＮＡＤＰ類）、チオＮＡＤＨ類（還元型チオＮＡＤ類）、ＮＡＤＰＨ類（還元型ＮＡＤＰ類）、ＮＡＤＨ類（還元型ＮＡＤ類）として記載することもある。
【００１１】
本発明のリン酸の測定方法においては、デヒドロゲナーゼを用いた酵素サイクリング反応を最終酵素反応する単数または複数の酵素反応を行って被検試料中のリン酸を測定する。本発明においては、最終酵素反応であるデヒドロゲナーゼを用いた酵素サイクリング反応を行うために、補酵素として、チオＮＡＤ（Ｐ）類とＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類との組み合わせ、あるいは、ＮＡＤ（Ｐ）類とチオＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類との組み合せを用いることが必要である。すなわち、補酵素の組み合せの一つとして、チオ型補酵素を用いる。従って、上述した反応式（Ｉ）において、Ａ１がチオＮＡＤ（Ｐ）類である場合、Ｂ１はＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類であることが必要であり、また、Ａ１がＮＡＤ（Ｐ）類である場合、Ｂ１はチオＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類であることが必要である。
さらに、本発明に用いるデヒドロゲナーゼが、（チオ）ＮＡＤＰ類でなく（チオ）ＮＡＤ類のみを補酵素とする場合は、上述のチオＮＡＤ類とＮＡＤ類より、また、用いるデヒドロゲナーゼが（チオ）ＮＡＤＰ類のみを補酵素とする場合は、上述のチオＮＡＤＰ類およびＮＡＤＰ類より、さらに用いるデヒドロゲナーゼが（チオ）ＮＡＤ類および（チオ）ＮＡＤＰ類を共に補酵素にする場合は上述のチオＮＡＤ類およびチオＮＡＤＰ類と上述のＮＡＤ類およびＮＡＤＰ類より適宜選択し、それらの酸化型、還元型を適宜用いればよい。
本発明においては、被検試薬に使用するＡ１およびＢ１の補酵素中のリン酸量は無視できる量であるが、被検試料中のリン酸が特にないことが好ましいので、Ａ１およびＢ１の組み合わせは、Ａ１としてチオＮＡＤ類とＢ１としてＮＡＤＨ類の組み合わせ、または、Ａ１としてＮＡＤ類とＢ１としてチオＮＡＤＨ類の組み合わせが特に好ましい。
【００１２】
本発明においては、被検試料中のリン酸を測定する前に、測定に用いる試薬成分中に存在している遊離リン酸を予め除去する。
それらの試薬成分中に存在する遊離リン酸の除去方法としては、各々の試薬成分単独または複数の成分を合わせたものを、カラム、透析等の物理的手段でリン酸を除去する方法、酵素的に遊離リン酸を除去する方法等を例示できる。そのうち、簡便な意味から酵素的に遊離リン酸を除去する方法が好ましい。さらには、上記反応式（Ｉ）で表される、被検試料中のリン酸を測定するための単数または複数の酵素反応を行うための試薬成分であって、上記反応式（Ｉ）中の酵素サイクリング反応を行うための補酵素以外の試薬成分を用い、更に、それらの補酵素とは別に補酵素として、上記反応式（ＩＩ）中の最終酵素反応であるデヒドロゲナーゼを用いた酵素反応を行うための補酵素を用いて、それらの試薬成分中の遊離リン酸に対して、上記反応式（ＩＩ）で表される、デヒドロゲナーゼを用いた酵素反応を最終酵素反応とする単数または複数の酵素反応を行って、生成物Ｚを生じさせて、それらの試薬成分中の遊離リン酸を除去する方法が好ましい。この方法を実施するには、例えば、それらの試薬成分と補酵素Ｃ１とを混合して一緒にして、溶液に溶解し、得られる溶液中の遊離リン酸、すなわち、それら各試薬成分中に存在する遊離リン酸を一緒にした遊離リン酸を含む溶液を、加温して、上記反応式（ＩＩ）で表される、デヒドロゲナーゼを用いた酵素反応を最終酵素反応とする単数または複数の酵素反応を行って、生成物Ｚを生じさせて、それらの試薬成分中の遊離リン酸を除去する方法が好ましい。遊離リン酸除去反応は、例えば、溶液の吸光度が時間的に変化しなくなるのを目安として終了させることが好ましい。
【００１３】
遊離リン酸除去反応のｐＨは、４．０〜７．５で行うことが好ましい。上記反応式（ＩＩ）における、補酵素Ｃ１から生成する還元生成物Ｃ２がこの条件で分解しやすいからである。遊離リン酸除去反応の際、デヒドロゲナーゼ反応での遊離リン酸除去反応の効率を高め、また用いる補酵素Ｃ１の量を少なくするため、生成物Ｚを減少させる酵素系がその反応系の中にあることが好ましい。
補酵素Ｃ１は、上記反応式（Ｉ）におけるＡ１、Ｂ１とは独立にチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示すが、Ａ１、Ｂ１と同じであってもよい。補酵素Ｃ１は、入手のしやすさからＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類が好ましい。
【００１４】
このようにして試薬成分中の遊離リン酸を一括除去した液は、遊離リン酸消去試薬として被検試料中のリン酸を測定するときに使用できる。試薬成分中に存在するリン酸を、酵素反応により一括除去するための試薬成分は、補酵素以外は、リン酸測定試薬と重複する。そのため、リン酸測定試薬としてそれらの成分を省略し、補酵素Ａ１と補酵素Ｂ１を成分として溶解したものを用い、遊離リン酸消去試薬と組み合わせて、試料中のリン酸を測定することができる。
従って、本発明においては、被検試料中のリン酸に対して、デヒドロゲナーゼを用いた酵素反応を最終酵素反応とする単数または複数の酵素反応を行って、被検試料中のリン酸を測定するためのリン酸測定用キットとして、１）上記反応式（Ｉ）で表される単数または複数の酵素反応を行うための試薬成分であって、上記反応式（Ｉ）中の酵素サイクリング反応を行うための補酵素以外の試薬成分と、更に、上記反応式（ＩＩ）で表される最終酵素反応を行うための補酵素を含む、遊離リン酸消去用試薬、あるいは、該遊離リン酸消去用試薬を酵素反応させて得られる遊離リン酸消去試薬、および２）上記反応式（Ｉ）中の酵素サイクリング反応を行うための補酵素、を含む、リン酸測定用キットを用いることができる。
【００１５】
以上の通り、本発明においては、デヒドロゲナーゼを用いた酵素反応を最終酵素反応とする単数または複数の酵素反応を行うための試薬を用いて、被検試料中のリン酸を測定する。酵素反応を行うための試薬として、単数の酵素（すなわちデヒドロゲナーゼ単独）反応しうる試薬、またはデヒドロゲナーゼを用いた酵素反応を最終酵素反応とする複数の酵素反応を行うための試薬を用いて被検試料中のリン酸を測定する。この２つの場合を以下に別々に説明する。
【００１６】
Ａ．デヒドロゲナーゼ単独である場合
まず、デヒドロゲナーゼが単独である場合、単独の酵素としてＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを用いたときを例に詳述する。
この場合、Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの存在下に反応しうる基質は、リン酸以外にはＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸であり、生成物Ｚは１，３−ジホスホグリセリン酸である。
試料中のリン酸を測定する原理は、試料中のリン酸にＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸（基質）とＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（デヒドロゲナーゼを最終とする単独の酵素反応をしうる試薬）を加え、更に、ｉ）チオＮＡＤ（Ｐ）類とＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類との組み合わせ、あるいは、ＮＡＤ（Ｐ）類とチオＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類との組み合せを補酵素として用いて、下記反応式（ＩＩＩ）
【化１１】
0005458487.tif 000012
（ただし、デヒドロゲナーゼはＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを示し、Ａ１、Ａ２，Ｂ１，Ｂ２は、それぞれ前記の通りである）
で表わされる酵素サイクリング反応を行って、１，３−ジホスホグリセリン酸（生成物Ｚ）を生じさせ、該反応によって変化するＡ２またはＢ１の量を測定するリン酸の測定方法において、試料中のリン酸に、酵素反応しうる試薬を作用させる前に、その試薬成分中の遊離リン酸を除去しておくことを特徴とする、被検試料中のリン酸の測定方法である。
【００１７】
この場合、被検試料中のリン酸を、Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを用いた酵素反応させる前に、試薬成分中の遊離リン酸をあらかじめ除去しておく。試薬成分中の遊離リン酸の除去方法としては、前記したとおり、各々の成分をカラム、透析等の物理的手段で除去する方法、酵素的に除去する方法等を例示できるが、簡便な意味から酵素的に除去する方法が好ましく、試薬中の上記反応式（ＩＩＩ）で用いる補酵素Ａ１およびＢ１以外の試薬成分の遊離リン酸をあらかじめ酵素的に一括除去しておくことがより好ましい。
酵素的に一括除去する方法としては、例えば、試薬成分中の遊離リン酸をＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ反応により除去する方法が例示でき、これにより、遊離リン酸消去試薬を調製することができる。その原理は、以下の反応式（ＩＶ）とおりである。
【化１２】
0005458487.tif 000013
（ただし、デヒドロゲナーゼはＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを示し、Ｃ１、Ｃ２は、それぞれ前記の通りである）
【００１８】
この場合、必須成分としてＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸、Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ等および補酵素Ｃ１（チオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類から選ばれる）を含む液を、酵素反応、例えば、３７℃で酵素反応させることにより試薬成分中の各成分中の遊離リン酸を除去することができ、その結果、遊離リン酸消去試薬を製造することができる。リン酸除去反応のｐＨは、４．０〜７．５で行うことが好ましい。生成する還元生成物Ｃ２がこの条件で分解しやすいからである。
【００１９】
リン酸除去反応の際、デヒドロゲナーゼ（Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）反応でのリン酸除去反応の効率を高めるため、生成物１，３−ジホスホグリセリン酸を減少させる酵素系がその反応系の中にあることが好ましい。そのような酵素系として、例えば、ビホスホグリセレートムターゼを反応液に存在させておくことにより、下記反応式（Ｖ）の酵素反応を行って、試薬成分中のリン酸の消去を効率的にすることができる。
【化１３】
0005458487.tif 000014
【００２０】
なお、本発明において、この生成物（１，３−ジホスホグリセリン酸）を減少させる酵素系がその反応系の中にあるのは、試薬中のリン酸除去をするしないにかかわらず、試料中のリン酸を酵素サイクリングのデヒドロゲナーゼ系（例えば、Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ系）で測定する場合において、サイクリング反応を抑制する目的で有効である。
被検試料中のリン酸を測定するには、このようにして調製した遊離リン酸消去試薬を用いるが、これとは別に、リン酸濃度測定試薬を製造すると良い。リン酸濃度測定試薬としては、Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸、Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ等、補酵素Ａ１、および補酵素Ｂ１を含む液である。しかし、遊離リン酸消去試薬とリン酸濃度測定試薬を二試薬系として使用して試料中のリン酸を測定する場合、遊離リン酸消去試薬に含まれている成分（すなわち、Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸またはＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）は、リン酸濃度測定試薬に含まれていなくとも構わない。その場合、リン酸濃度測定試薬は、補酵素Ａ１、および補酵素Ｂ１を含む液であってよい。
本発明においては、試料中のリン酸を測定するには、例えば、リン酸を含む試料と遊離リン酸消去試薬とを混合し、次いで、得られる混合物にリン酸濃度測定試薬を加え、リン酸濃度測定試薬添加前後の吸光度変化量の度合いからリン酸濃度を測定できる。この場合、試薬中のリン酸を除去しているため、リン酸濃度の測定範囲が広くなる。
【００２１】
この方法の典型的な例を以下に示す。まず、遊離リン酸消去試薬（第一試薬）として緩衝液、例えばＭＥＳ緩衝液（好ましくはｐＨ６．０〜７．０、好ましくは５〜２００ｍＭ）中に、Ｄ−グリセルアルデヒドー３−リン酸（好ましくは０．２〜５ｍＭ）、ＮＡＤ（好ましくは０．００２〜０．２ｍＭ）、ＥＤＴＡ（好ましくは２〜５０ｍＭ）、Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（好ましくは１．６〜４０Ｕ／ｍｌ）およびビホスホグリセレートムターゼ（好ましくは０．００１〜１０Ｕ／ｍｌ）を溶解させて遊離リン酸消去試薬原液を調製する。この原液を３７℃で試薬中のリン酸を消去する反応を行い遊離リン酸消去試薬（第一試薬）を調製する。次にリン酸濃度測定試薬（第二試薬）として緩衝液、例えば、Ｔｒｉｓ緩衝液（好ましくはｐＨ７．５〜９．０、好ましくは２０〜２００ｍＭ）にチオＮＡＤ（好ましくは０．２〜１０ｍＭ）とＮＡＤＨ（好ましくは０．０５〜１ｍＭ）とを溶解させる。試料中のリン酸の測定としては、例えば、日立７１８０型等の自動分析装置を用い、リン酸を含む測定試料（好ましくは１．５〜１０μｌ）に対し第一試薬（好ましくは１２０〜２００μｌ）を加え、次いで、その５分後に得られる混合液に第二試薬（好ましくは２０〜６０μｌ）を加え反応させる。波長３９０〜４２０ｎｍにおいて、第二試薬添加前後の吸光度変化量の度合いからリン酸濃度を測定できる。また、試薬の安定性を考慮して、自動分析装置が三試薬系として使用できる場合は、第一試薬に遊離リン酸消去試薬を用い、一方、補酵素Ａ１（例えばチオＮＡＤ）溶液と補酵素Ｂ１（例えばＮＡＤＨ）溶液とを別々に分けて、それぞれ第二試薬、第三試薬とし三試薬系として試料に順に試薬を加えていくことにより試料中のリン酸を測定することもできる。
【００２２】
Ｂ．デヒドロゲナーゼを最終とする複数の酵素反応しうる試薬を用いる場合
本発明において、少なくともデヒドロゲナーゼを最終とする複数の酵素反応しうる試薬を用いて被検試料中のリン酸を測定する方法としては、（１）マルトースホスホリラーゼにより、リン酸（試料）＋マルトース→β−グルコース−１−リン酸  ＋  Ｄ−グルコースなる反応をさせ、生じたβ−グルコース−１−リン酸をβ−ホスホグルコムターゼによりβ−グルコース−６−リン酸に転換した後、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（デヒドロゲナーゼ）とＡ１およびＢ１を用いて変化するＡ２またはＢ１を測定する方法、（２）ホスホリラーゼにより、リン酸（試料）＋グリコーゲン→β−グルコース−１−リン酸＋グリコーゲンなる反応をさせ、生じたβ−グルコース−１−リン酸を上記（１）と同様に測定する方法、（３）シュークロースホスホリラーゼを用い、リン酸（試料）＋シュークロース→β−グルコース−１−リン酸＋フルクトースなる反応系によりβ−グルコース−１−リン酸を生成せしめ、生じたβ−グルコース−１−リン酸を上記（１）と同様に測定する方法、（４）６−ホスホフルクトキナーゼ、ホスホグルコイソメラーゼを用い、リン酸（試料）＋Ｄ−フルクトース−１，６−ジリン酸→ピロリン酸＋フルクトース−６−リン酸→グルコース−６−リン酸なる酵素反応により生じたグルコース−６−リン酸を上記（１）と同様に測定する方法等を例示できる。
【００２３】
このうち、上記（１）を例に本発明を詳述する。
この場合、本発明の測定方法は、被検試料中のリン酸に、少なくともデヒドロゲナーゼを最終とする複数の酵素反応しうる試薬としてマルトースホスホリラーゼ、β−ホスホグルコムターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ等の酵素反応をしうる試薬を加え、更に、ｉ）チオＮＡＤ（Ｐ）類とＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類との組み合わせ、あるいは、ＮＡＤ（Ｐ）類とチオＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類との組み合せを補酵素として用いて、下記反応式（ＶＩ）
【化１４】
0005458487.tif 000015
（式中、Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２は前記のとおり）で表される、最終酵素反応として、酵素サイクリング反応を形成せしめて生成物グルコノラクトン−６−リン酸を生じさせ、該反応によって変化するＡ２またはＢ１の量を測定するリン酸の測定方法である。この場合、マルトースホスホリラーゼ、β−ホスホグルコムターゼ 、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ等の複数の酵素反応を構成するための測定試薬は、安定な液状試薬とすることができ試料中のリン酸を測定することができる。
【００２４】
本発明の場合、被検試料中のリン酸に、酵素反応しうる試薬を作用させる前に、その試薬成分中の存在する遊離リン酸を除去しておく。遊離リン酸の除去方法としては、各々の成分をカラム、透析等の物理的手段で除去する方法、酵素的に除去する方法等を例示できるが、簡便な意味から酵素的に除去することが好ましく、試薬中の上記反応式（ＶＩ）で用いる補酵素Ａ１およびＢ１以外の試薬成分の遊離リン酸を一括的に酵素的に除去する方法が好ましい。
一括的に試薬成分中のリン酸を除去しておく場合、少なくともデヒドロゲナーゼを最終とする複数の酵素反応しうる試薬としてマルトースホスホリラーゼ、β−ホスホグルコムターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ等の酵素反応をしうる試薬を加え、更に、チオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を用いて、それら試薬成分中の遊離リン酸に対して、下記式（ＶＩＩ）
【化１５】
0005458487.tif 000016
（式中、Ｃ１、Ｃ２は前記のとおり）で表される酵素反応を行って、生成物グルコノラクトン−６−リン酸を生じさせることにより、遊離リン酸を一括して除去できる。
【００２５】
この場合、必須成分としてマルトース、マルトースホスホリラーゼ、グルコース−１，６−二リン酸、Ｍｇ２＋、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）  および補酵素Ｃ１（チオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類）を含む液を、酵素反応、例えば、３７℃で酵素反応させることにより各試薬成分中の遊離リン酸を一括除去することができ、その結果、遊離リン酸消去試薬を製造することができる。リン酸除去反応はｐＨ４．０〜７．５で行なうことが好ましい。生成するチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類のいずれかの還元生成物が分解されやすいからである。
遊離リン酸除去反応の際、さらに、デヒドロゲナーゼ（グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）反応でのリン酸除去反応の効率を高めるため、生成物（グルコノラクトン−６−リン酸）を減少させる酵素系がその反応系の中にあることが好ましい。そのような酵素として６−ホスホグルコノラクトナーゼを反応液に存在させておくことにより、下記反応式（ＶＩＩＩ）で表される酵素反応を行って、試薬成分中のリン酸の消去を効率的にすることができる。
【化１６】
0005458487.tif 000017
【００２６】
被検試料中のリン酸を測定するには、このようにして調製した遊離リン酸消去試薬とは別に、リン酸濃度測定試薬を製造すると良い。リン酸濃度測定試薬としては、マルトース、マルトースホスホリラーゼ、グルコース−１,６−二リン酸、Ｍｇ２＋、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ(Ｇ６ＰＤＨ) 、補酵素Ａ１および補酵素Ｂ１を含む液である。しかし、遊離リン酸消去試薬に含まれている成分、すなわち、マルトース、マルトースホスホリラーゼ、グルコース−１,６−二リン酸、Ｍｇ２＋、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ(Ｇ６ＰＤＨ) は遊離リン酸消去試薬に含まれているので、リン酸濃度測定試薬に含まれていなくとも構わない。その結果、リン酸濃度測定試薬は、補酵素Ａ１、および補酵素Ｂ１を含む液であってよい。
遊離リン酸消去試薬はｐＨ４．０〜７．５の範囲で、かつ、リン酸濃度測定試薬はｐＨ７．５を超えて１０．０以下が好ましい。このようなｐＨにしておくことにより遊離リン酸消去試薬、リン酸濃度測定試薬とも水溶液として安定であり、液状試薬としても供給できる。
試料中のリン酸を測定するには、例えば、リン酸を含む可能性のある試料と遊離リン酸消去試薬とを混合し、次いで、得られる混合物にリン酸濃度測定試薬を加え、リン酸濃度測定試薬添加前後の吸光度変化量の度合いからリン酸濃度を測定できる。この場合、試薬中のリン酸を除去しているため、リン酸濃度の測定範囲が広くなる。
【００２７】
典型的な例を以下に示す。まず、遊離リン酸消去試薬（第一試薬）として、緩衝液好ましくはＭＥＳ緩衝液（好ましくはｐＨ５．０〜７．０、好ましくは２０〜５００  ｍＭ）中に、マルトース一水和物（好ましくは４〜１００ｍＭ）、酢酸マグネシウム二水和物（好ましくは０．４〜１０ｍＭ）、グルコース−１，６−二リン酸（好ましくは０．０１〜０．３ｍＭ）、ＮＡＤ（好ましくは０．０２〜０．５ｍＭ）、マルトースホスホリラーゼ（好ましくは０．５〜２０Ｕ／ｍＬ）、β−ホスホグルコムターゼ  （好ましくは０．５〜２０Ｕ／ｍＬ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（好ましくは４〜１００Ｕ／ｍＬ）、および６−ホスホグルコノラクトナーゼ（好ましくは０．１〜５Ｕ／ｍＬ）を溶解させて遊離リン酸消去試薬原液を調製する。この原液を３７℃で試薬中のリン酸を消去する反応を行い遊離リン酸消去試薬（第一試薬）を調製する。次にリン酸濃度測定試薬（第二試薬）として緩衝液、好ましくはＴｒｉｓ緩衝液（好ましくはｐＨが７．５を超えて１０．０以下、好ましくは濃度が２０〜２００ｍＭ）にチオＮＡＤ（好ましくは０．２〜１０ｍＭ）、ＮＡＤＨ（好ましくは０．２〜４０ｍＭ）を溶解させる。リン酸の測定としては、例えば、日立７１８０型等の自動分析装置を用い、リン酸を含む測定試料（好ましくは１．５〜１０μｌ）に対し第一試薬（好ましくは１２０〜２００μｌ）を加え、次いで、その５分後に得られる混合液に第二試薬（好ましくは２０〜６０μｌ）を加え反応させる。波長３９０〜４２０ｎｍにおいて、第二試薬添加前後の吸光度変化量の度合いからリン酸濃度を測定できる。
また、試薬の安定性を考慮して、自動分析装置が三試薬系として使用できる場合は、第一試薬に遊離リン酸消去試薬を用い、一方、補酵素Ａ１（例えばチオＮＡＤ）溶液と補酵素Ｂ１（例えばＮＡＤＨ）溶液とを別々に分けて、それぞれ第二試薬、第三試薬とし三試薬系として試料に順に試薬を加えていくことにより試料中のリン酸を測定することもできる。
【００２８】
また、本発明では、被検試料中のリン酸またはマルトースを測定する方法であって、被検試料中のリン酸またはマルトースに、マルトースホスホリラーゼ、β−ホスホグルコムターゼおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを用いた酵素反応を行うための試薬を加え、かつ、該グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを用いた酵素反応を行う試薬として、チオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ類と、還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類とを組み合せた補酵素、あるいはＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類と、還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類とを組み合せた補酵素を加えて、下記式（ＩＸ）
【化１７】
0005458487.tif 000018
（式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、またＡ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ２はＢ１の酸化型生成物を示す）で表わされる、最終酵素反応として、該グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを用いた酵素サイクリング反応を形成せしめてグルコノラクトン−６−リン酸を生じさせ、該反応によって変化するＡ２またはＢ１の量を測定することを特徴とする被検試料中のリン酸またはマルトースの測定方法も提供される。この測定方法においては、生成物グルコノラクトン−６−リン酸が減少していく酵素系として６−ホスホグルコノラクトナーゼを、更に、存在させるのが好ましい。
【００２９】
このリン酸またはマルトースの測定方法は、上述した、デヒドロゲナーゼを最終とする複数の酵素反応しうる試薬を用いて被検試料中のリン酸を測定する方法である、（１）マルトースホスホリラーゼにより、リン酸（試料）＋マルトース→β−グルコース−１−リン酸  ＋  Ｄ−グルコースなる反応をさせ、生じたβ−グルコース−１−リン酸をβ−ホスホグルコムターゼによりβ−グルコース−６−リン酸に転換した後、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（デヒドロゲナーゼ）とＡ１およびＢ１を用いて変化するＡ２またはＢ１を測定する方法とは、予め試薬成分中の遊離リン酸を除去することを除いて、同様であるため、上述した方法と同様にして実施することができる。
上記した本発明の測定方法によれば、特定の補酵素の組み合わせおよびデヒドロゲナーゼを用いた酵素サイクリング反応でリン酸またはマルトースを測定する場合、試薬が安価であり、さらに水溶液として溶解したときに試薬が安定であるため、長期保存可能な試薬を用いて、低濃度のリン酸またはマルトースを正確に測定できる。
【００３０】
また、本発明では、被検試料中のリン酸またはそのリン酸と酵素Ｘの存在下に反応しうる基質Ｙの測定方法であって、酵素Ｘがデヒドロゲナーゼである場合、酵素Ｘが酵素反応しうる試薬、または少なくとも酵素Ｘの反応を最初としデヒドロゲナーゼを最終とする複数の酵素反応しうる試薬を加え、かつ、該デヒドロゲナーゼを用いた酵素反応を行う試薬として、チオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ類と、還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類とを組み合せた補酵素、あるいはＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類と、還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類とを組み合せた補酵素を加えて、下記反応式（Ｘ）
【化１８】
0005458487.tif 000019
（式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、またＡ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ２はＢ１の酸化型生成物を示す）で表わされる酵素サイクリング反応を形成せしめて生成物Ｚを生じさせ、該反応によって変化するＡ２またはＢ１の量を測定するリン酸の測定方法において、生成物Ｚが減少していく酵素系を存在させておくことを特徴とする、被検試料中のリン酸またはそのリン酸と酵素Ｘの存在下に反応しうる基質の測定方法が提供される。
【００３１】
この測定方法は、上述した本発明の測定方法において、更に、生成物Ｚが減少していく酵素系を存在させておくことを必須工程として加えて、被検試料中のリン酸またはそのリン酸と酵素Ｘの存在下に反応しうる基質の測定するものである。リン酸と酵素Ｘの存在下に反応しうる基質としては、例えば、リン酸とＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの存在下に反応しうるＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸が挙げられ、この場合には、上記の測定方法においては、反応式（ＩＩＩ）および反応式（Ｖ）で示される酵素反応を行う。また、リン酸と酵素Ｘの存在下に反応しうる基質としては、リン酸と酵素マルトホスホリラーゼの存在下に反応しうるマルトースが挙げられ、この場合には、上記の測定方法においては、反応式（ＶＩ）および反応式（ＶＩＩＩ）で示される酵素反応を行う。これら以外にも、同様にして、リン酸と酵素Ｘの存在下に反応しうる基質を選択することができる。
この測定方法も、上述した本発明のデヒドロゲナーゼを単独とする酵素反応あるいはデヒドロゲナーゼを最終とする複数の酵素反応により、リン酸を測定する方法とは、予め試薬成分中の遊離リン酸を除去することを除いて、同様であるため、上述した方法と同様にして実施することができる。
【００３２】
上記の本発明の測定方法によれば、特定の補酵素の組み合わせおよびデヒドロゲナーゼを用いた酵素サイクリング反応を含む酵素系で、リン酸または特定の酵素基質を測定する場合、最終生成物がさらに減少していく系を存在させることにより酵素サイクリング反応の速度をコントロールでき、その結果、測定範囲を高濃度から低濃度まで広い範囲のリン酸濃度を測定できる。
【００３３】
以下、本発明を実施例および比較例を用いて更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例および比較例によって何ら制限されるものではない。
実施例１
リン酸の測定
１）遊離リン酸消去試薬（第一試薬）の調製
試薬中のリン酸消去の原理：
この遊離リン酸消去試薬は、以下ようなスキームでリン酸を消去する。
【化１９】
0005458487.tif 000020
【００３４】
試薬組成：
ＭＥＳ                                  １００ ｍＭ ｐＨ ６．０
マルトース一水和物                      ２０ ｍＭ
酢酸マグネシウム二水和物                ２ ｍＭ
グルコース−１,６−二リン酸             ０．０５ ｍＭ
ＮＡＤ                                  ０、０．０１、０．１ ｍＭ
Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００                  ０．０５ ％
マルトースホスホリラーゼ(ＭＰ)          ３ Ｕ／ｍＬ
β−ホスホグルコムターゼ
(β−ＰＧｌｕＭ)                        ３ Ｕ／ｍＬ
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
(Ｇ６ＰＤＨ)                            ２０ Ｕ／ｍＬ
６−ホスホグルコノラクトナーゼ
(６−ＰＧＬ)                            ０、０．５、１ Ｕ／ｍＬ
【００３５】
試薬の調製：
試薬組成にそって成分を混合することにより原試薬を調製し、次いで、原試薬を３７℃にて１時間加温し酵素反応によって、試薬（特にグルコース−１,６−二リン酸）に含まれるリン酸を除去することにより、遊離リン酸消去試薬を製造した。この酵素反応によって生成したＮＡＤＨは緩衝液のｐＨが６．０であるため加水分解される。なお、６−ホスホグルコン酸は反応に関与する物質ではないため、リン酸濃度測定に対して影響を与えることはない。本実験では消去反応に関わるＮＡＤおよび６−ＰＧＬの濃度を適宜変化させることによって、その効果を確認した。比較例として、ＮＡＤ ０ｍＭおよび６−ＰＧＬ ０ Ｕ／ｍＬとした試薬を調製し、測定に供した。
【００３６】
２）リン酸濃度測定試薬（第二試薬）の調製
以下の成分を混合することによりリン濃度測定試薬（第二試薬）を調製した。
Ｔｒｉｓ                  １００ ｍＭ ｐＨ ８．０
チオＮＡＤ                ２ ｍＭ
ＮＡＤＨ                  １０ ｍＭ
Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００    ０．０５ ％
【００３７】
リン酸測定に必要なマルトース、マルトースホスホリラーゼ、β−ホスホグルコムターゼ等その他の成分は第一試薬に含まれているので第二試薬には入れなかった。
【００３８】
３）リン酸の測定
測定原理：
試料中のリン酸は、以下のようにして測定できる。
【化２０】
0005458487.tif 000021
【００３９】
測定方法：
遊離リン酸消去試薬を第一試薬とし、酵素サイクリング用の第二試薬として用いた。試料としては、リン酸二水素ナトリウム水溶液を、リン酸濃度として０〜３０ｍｇ／ｄＬまで生理食塩水で適宜希釈したものを用い、測定試料とした。
リン酸濃度の測定は日立７１８０型自動分析装置を用い、リン酸を含む測定試料２μＬに対し第一試薬１６０μＬを加え、その５分後に第二試薬４０μＬを反応させ、主波長４０５ｎｍ、副波長７００ｎｍにて、１６〜３４測光ポイント間（第二試薬添加直前から添加５分後に相当）において、２ポイントエンド法による吸光度変化量を測定した。
【００４０】
４）測定結果
上記試薬を用いて、リン濃度を測定した際の吸光度変化量を表１に示した。また、表２には０ｍｇ／ｄＬの吸光度を差し引き後の吸光度変化量を示した。さらに、表２で求めた吸光度変化量を図１に示した。
本発明者らは、表１に示したように、ＮＡＤおよび６−ＰＧＬが無添加（比較例）の場合には、リン酸０ｍｇ／ｄＬの試料であっても、自動分析装置の測定可能吸光度を上回ってしまい測定不能となってしまうという問題があることを発見した。通常のリン酸測定酵素系（非酵素サイクリング）では問題とならない試薬中の微量のリン酸量でも、酵素サイクリング法では測定感度が大きいため、試薬ブランク吸光度が極度に上昇し、測定不能となってしまうとも考えられた。一方、遊離リン酸消去系を組み込んだ場合（実施例）では、低濃度から高濃度まで測定可能であることが判明した。
これらのことから、リン酸消去系を組み込んだ酵素サイクリング法は、臨床検査分野において非常に有用であると考えられる。
【００４１】
【表１】
0005458487.tif 000022
【００４２】
【表２】
0005458487.tif 000023
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明のリン酸の測定方法は、チオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を補酵素としてデヒドロゲナーゼを用いた酵素サイクリング系でリン酸を測定する方法であって、低濃度から高濃度の広範囲の濃度のリン酸の測定が可能なリン酸の測定方法であり、臨床生化学検査等に有用なリン酸の測定方法である。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】表２に示したリン酸濃度を測定した際の吸光度変化量を示す。
【図１】
0005458487.tif 000032