(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞に存在するヘパリン骨格又はヘパラン硫酸骨格における「Ｎ位が置換されていないグルコサミン残基」の増加を検知するステップを少なくとも含む、アポトーシスの検出方法。
【請求項２】
「Ｎ位が置換されていないグルコサミン残基」が、グルクロン酸残基とグリコシド結合した構造として存在するものである、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
検知が、抗体によって行われるものである、請求項１または２に記載の検出方法。
【請求項４】
抗体が、ヘパリン骨格又はヘパラン硫酸骨格における「Ｎ位が置換されていないグルコサミン残基」に結合する抗体である、請求項３に記載の検出方法。
【請求項５】
ヘパリン骨格又はヘパラン硫酸骨格における「Ｎ位が置換されていないグルコサミン残基」に結合する抗体を有効成分とする、アポトーシス検出剤。
【請求項６】
「Ｎ位が置換されていないグルコサミン残基」が、グルクロン酸残基とグリコシド結合しているものである、請求項５に記載の検出剤。
【請求項７】
次の（１）及び（２）に示す構成成分を少なくとも含む、アポトーシス検出キット；
（１）ヘパリン骨格又はヘパラン硫酸骨格における「Ｎ位が置換されていないグルコサミン残基」に結合する抗体、
（２）上記（１）の抗体を検出する試薬。
【請求項８】
「Ｎ位が置換されていないグルコサミン残基」が、グルクロン酸残基とグリコシド結合しているものである、請求項７に記載の検出キット。
【請求項９】
被験物質と細胞とを接触させ、当該細胞におけるヘパリン骨格又はヘパラン硫酸骨格に
おける「Ｎ位が置換されていないグルコサミン残基」が増加又は減少した場合に当該被験物質を選択するステップを少なくとも含む、アポトーシス誘導剤又はアポトーシス阻害剤の候補物質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
「Ｎ位が置換されていないグルコサミン残基」が、グルクロン酸残基とグリコシド結合した構造として存在するものである、請求項９に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アポトーシスの検出方法、アポトーシス検出剤、アポトーシス検出キット及びアポトーシス誘導剤又はアポトーシス阻害剤の候補物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願書類中で使用する略号及びその意義は以下の通りである。
２ＳＨ：（６−Ｏ・Ｎ）−脱硫酸化・Ｎ−アセチル化ＨＥＰ
６ＤＳＨ：６−Ｏ−脱硫酸化ＨＥＰ
６ＳＨ：（２−Ｏ・Ｎ）−脱硫酸化・Ｎ−アセチル化ＨＥＰ
ＡＳ：アカラン硫酸
ＡＣＨ：２−Ｏ−脱硫酸化ＡＳ
Ａｃ−６ＤＳＨ：Ｎ−アセチル化６ＤＳＨ
Ａｃ−ＮＡＨ：Ｎ−アセチル化ＮＡＨ
Ａｃ−ＮＳＨ；Ｎ−アセチル化ＮＳＨ
ＣＤＳＨ：完全脱硫酸化・Ｎ−アセチル化ＨＥＰ
Ｃｈ：コンドロイチン
ＣＳ：コンドロイチン硫酸
ＣＳ−Ａ（Ｓ）：サメ由来コンドロイチン硫酸Ａ
ＣＳ−Ａ（Ｗ）：クジラ由来コンドロイチン硫酸Ａ
ＣＳ−Ｂ：コンドロイチン硫酸Ｂ（ＤＳと同義である）
ＣＳ−Ｃ：コンドロイチン硫酸Ｃ
ＣＳ−Ｄ：コンドロイチン硫酸Ｄ
ＣＳ−Ｅ：コンドロイチン硫酸Ｅ
ＤＭＥＭ：ダルベッコの改変イーグル培地
ＤＳ：デルマタン硫酸（ＣＳ−Ｂと同義である）
ＤＴＴ：ジチオスレイトール
ＥＨＳ−ＨＳ：マウスのエンジェルブレス−ホーム−スワーン腫瘍組織（Engelbreth-Holm-Swarm sarcoma）由来のＨＳ
ＥＬＩＳＡ法：酵素標識抗体測定法
ＦＣＳ：仔ウシ胎仔血清
ＦＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネート
Ｇ３ＰＤＨ：グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ
ＧｌｃＡ：グルクロン酸
ＧｌｃＮ：Ｎ位が置換されていないグルコサミン
ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルグルコサミン
ＧｌｃＮＳ：Ｎ−硫酸化グルコサミン
ＨＡ：ヒアルロン酸
ＨＥＰ：ヘパリン
ＨＳ：ヘパラン硫酸
ＨＳ２ＳＴ：ＨＳ ２−Ｏ−硫酸基転移酵素
ＨＳ６ＳＴ：ＨＳ ６−Ｏ−硫酸基転移酵素
ＩｄｏＡ：イズロン酸
ＩｄｏＡ（２Ｓ）：２−Ｏ−硫酸化イズロン酸
ＫＳ：ケラタン硫酸
ＮＡｃ−ＨＥＰ：Ｎ−脱硫酸化・Ｎ−アセチル化ＨＥＰ
ＮＡＨ：Ｎ−アセチルヘパロザン
ＮＤＳＴ：ＨＳ／ＨＥＰ ＧｌｃＮＡｃ Ｎ−脱アセチル／ＧｌｃＮ Ｎ−硫酸基転移酵素（heparan sulfate/heparin GlcNAc N-deacetylase/GlcN N-sulfotransferase）
ＮＨ2−２ＳＨ：（６−Ｏ・Ｎ）−脱硫酸化ＨＥＰ
ＮＨ2−６ＳＨ：（２−Ｏ・Ｎ）−脱硫酸化ＨＥＰ
ＮＨ2−ＣＤＳＨ：完全脱硫酸化ＨＥＰ
ＮＨ2−ＨＥＰ：Ｎ−脱硫酸化ＨＥＰ
ＮＳＨ：（２−Ｏ・６−Ｏ）−脱硫酸化ＨＥＰ
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＰＤＮＡｃ−ＮＡＨ：部分的脱アセチル化ＮＡＨ
【０００３】
アポトーシスは、細胞核の染色体凝集、細胞核の断片化、染色体ＤＮＡラダーなどを指標にして検出できることが知られている（非特許文献１）。また、ＬｅY糖鎖を認識する抗体を用いてアポトーシスを検出する方法が知られている（特許文献１）。
しかし、グリコサミノグリカンやプロテオグリカンを指標としてアポトーシスを検出する方法は知られていない。
一方、ＨＥＰ骨格やＨＳ骨格におけるＧｌｃＮ残基を認識し結合する抗体として、例えばＪＭ４０３抗体（特許文献２）や、ＮＡＨ４３抗体（特許文献３）が知られている。そして、例えばＪＭ４０３抗体についてはリソソーム病の検出用途が（特許文献２）、ＮＡＨ４３抗体についてはＨＳやＮＡＨの検出用途が（特許文献３）それぞれ知られている。しかし、いずれの抗体も、アポトーシス検出用途として用いることについては知られていない。
また、ＨＥＰやＨＳの生合成に関与する酵素として、ＮＤＳＴ−１、−２、−３及び−４が知られているが（非特許文献２）、これらの酵素の発現を指標としてアポトーシスを検出することも知られていない。
【０００４】
また、アポトーシスの初期段階には、細胞表面が変化しホスファチジルセリンの原形質膜の内側から外層への転座が起こることから、ホスファチジルセリンと高い親和性で結合するアネキシンＶを用いて、この転座したホスファチジルセリンを検出することでアポトーシスを検出する手法も知られている。しかし、アネキシンＶはカルシウム依存的であり、カルシウムの存在が検出結果に重大な影響を与えるため、この手法は付着性の細胞（解析にあたり培養ディッシュから細胞を剥がす際にカルシウムを用いる必要がある）には利用することができない。
【特許文献１】特開平６−１０９７２９号公報
【特許文献２】特表２００５−５２４０７４号公報
【特許文献３】国際公開第２００６／１０６９５０号パンフレット
【非特許文献１】今堀和友，山川民夫監修，「生化学辞典」（第３版），株式会社東京化学同人，１９９８年１０月８日発行，ｐ５４−５５
【非特許文献２】アイカワ，ジュンイチら（Aikawa, Jun-ichi）ら，２００１年，ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（The Journal of Biological Chemistry），第２７６巻，第８号，ｐ．５８７６−５８８２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、新たなアポトーシスの検出方法、アポトーシス検出剤、アポトーシス検出キット及びアポトーシス誘導剤又はアポトーシス阻害剤の候補物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、細胞に存在するＨＥＰ骨
格又はＨＳ骨格におけるＧｌｃＮ残基の増加を検知することによりアポトーシスを検出できることを見い出した。さらに、細胞におけるＮＤＳＴ−３及びＮＤＳＴ−４の少なくとも一方の発現の増加を検知することによりアポトーシスが検知できることを見い出した。さらに、これらの知見に基づいて、アポトーシス検出剤、アポトーシス検出キット及びアポトーシス誘導剤又はアポトーシス阻害剤の候補物質のスクリーニング方法を提供するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、細胞に存在するＨＥＰ骨格又はＨＳ骨格におけるＧｌｃＮ残基の増加を検知するステップを少なくとも含む、アポトーシスの検出方法（以下「本発明検出方法１」という。）を提供する。
このＧｌｃＮ残基は、ＧｌｃＡ残基とグリコシド結合した構造として存在するものが好ましい。
また、この検知は、なかでも抗体によって行われることが好ましい。この場合に用いる抗体としては、ＨＥＰ骨格又はＨＳ骨格におけるＧｌｃＮ残基に結合する抗体が好ましい。
【０００８】
また本発明は、ＨＥＰ骨格又はＨＳ骨格におけるＧｌｃＮ残基に結合する抗体を有効成分とする、アポトーシス検出剤（以下「本発明検出剤」という。）を提供する。
この抗体が結合するＧｌｃＮ残基は、ＧｌｃＡ残基とグリコシド結合しているものが好ましい。
【０００９】
また本発明は、次の（１）及び（２）に示す構成成分を少なくとも含む、アポトーシス検出キット（以下「本発明キット」という。）を提供する。
（１）ＨＥＰ骨格又はＨＳ骨格におけるＧｌｃＮ残基に結合する抗体、
（２）上記（１）の抗体を検出する試薬。
この抗体が結合するＧｌｃＮ残基は、ＧｌｃＡ残基とグリコシド結合しているものが好ましい。
【００１０】
また本発明は、被験物質と細胞とを接触させ、当該細胞におけるＨＥＰ骨格又はＨＳ骨格におけるＧｌｃＮ残基が増加又は減少した場合に当該被験物質を選択するステップを少なくとも含む、アポトーシス誘導剤又はアポトーシス阻害剤の候補物質のスクリーニング方法（以下「本発明スクリーニング方法１」という。）を提供する。
このＧｌｃＮ残基は、ＧｌｃＡ残基とグリコシド結合した構造として存在するものが好ましい。
【００１１】
また本発明は、細胞におけるＮＤＳＴ−３及びＮＤＳＴ−４の少なくとも一方の発現の増加を検知するステップを少なくとも含む、アポトーシスの検出方法（以下「本発明検出方法２」という。）を提供する。この「発現」は、なかでもｍＲＮＡの発現であることが好ましい。
【００１２】
また本発明は、被験物質と細胞とを接触させ、当該細胞におけるＮＤＳＴ−３及びＮＤＳＴ−４の少なくとも一方の発現が増加又は減少した場合に当該被験物質を選択するステップを少なくとも含む、アポトーシス誘導剤又はアポトーシス阻害剤の候補物質のスクリーニング方法（以下「本発明スクリーニング方法２」という。）を提供する。この「発現」は、なかでもｍＲＮＡの発現であることが好ましい。
【００１３】
以下、本発明検出方法１と２とを併せて「本発明検出方法」と総称する。また、本発明スクリーニング方法１と２とを併せて「本発明スクリーニング方法」と総称する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明検出方法は、従来から知られているアポトーシス検出の方法（アポトーシス小体検出や、ＤＮＡの断片化）とは質的に異なる指標による客観的なアポトーシス検出を可能とすることから、極めて有用である。また本発明検出剤及び本発明キットは、本発明検出方法の実施をより簡便かつ迅速なものとすることができ、極めて有用である。さらに本発明スクリーニング方法は、医薬の候補物質としても利用しうるアポトーシス誘導剤又はアポトーシス阻害剤の候補物質を簡便かつ迅速にスクリーニングできることから、極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
＜１＞本発明検出方法１
本発明検出方法１は、細胞に存在するＨＥＰ骨格又はＨＳ骨格におけるＧｌｃＮ残基の増加を検知するステップを少なくとも含む、アポトーシスの検出方法である。
本発明検出方法１によるアポトーシスの検出対象となる「細胞」は、アポトーシスを引き起こしうる細胞である限りにおいて特に限定されず、アポトーシス検出を所望する細胞をそのまま用いればよい。細胞の一例としては、例えば、癌細胞、Ｔ細胞などの血球細胞、神経細胞などを挙げることができる。例えば、ヒトの癌細胞におけるアポトーシスの検出を所望するのであれば、当該癌細胞をそのまま用いればよい。
【００１６】
本発明検出方法１は、このような細胞に存在する、ＨＥＰ骨格又はＨＳ骨格におけるＧｌｃＮ残基の増加を検知するステップを少なくとも含むことを特徴とする。なお、本出願書類におけるＧｌｃＮ残基は、いずれも「Ｎ位がアセチル基及び硫酸基のいずれにも置換されていないグルコサミン残基」であることが好ましい。
また、本出願書類におけるＧｌｃＮ残基は、ＧｌｃＡ残基とグリコシド結合した構造として存在するものが好ましい。
したがって、本出願書類におけるＧｌｃＮ残基として最も好ましいものは、「Ｎ位がアセチル基及び硫酸基のいずれにも置換されていないグルコサミン残基」であって、これがＧｌｃＡ残基とグリコシド結合した構造として存在するものである。
【００１７】
細胞に存在する、ＨＥＰ骨格又はＨＳ骨格におけるＧｌｃＮ残基の検知の方法は、このような特定の糖鎖構造を検知できる手法を用いる限りにおいて特に限定されない。例えば、アポトーシス検出対象となる細胞の糖鎖を抽出し、抽出された当該糖鎖について、公知の物理化学的分析手法によってＨＥＰ骨格又はＨＳ骨格におけるＧｌｃＮ残基を検知してもよい。
【００１８】
また、ＨＥＰ骨格又はＨＳ骨格におけるＧｌｃＮ残基に結合する抗体を用いた抗原抗体反応により、当該糖鎖構造を検知することもできる。
この場合に用いる抗体は、ＨＥＰ骨格又はＨＳ骨格におけるＧｌｃＮ残基に結合するものである限りにおいて特に限定されない。なかでも、当該抗体が結合する抗原をヘパリチナーゼで処理すると、当該抗原に対する結合性が消失するものであることが好ましい。また、ＨＡ、ＣＳ、ＤＳ、ＫＳのいずれとも実質的に結合しないものが好ましい。すなわち、当該糖鎖構造に特異的に結合するものが好ましい。
また抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれであってもよいが、継続的な生産性の確保や、抗体の均一性の観点からすればモノクローナル抗体であることが好ましい。また、本出願書類において「実質的に結合しない」とは、１分子たりとも結合しないことを意味するものではなく、結合が検出できないか又は結合が検出できたとしても弱いものであって本発明の属する技術分野における当業者からみて無視できる程度のものであることを意味する。
【００１９】
本発明検出方法１において用いることができ、当業者が一般的に入手できる具体的な抗体としては、例えばＪＭ４０３抗体（特表２００５−５２４０７４号公報：Diabetologia
, 37(3), p313-320 (1994)）を挙げることができる。この抗体は、生化学バイオビジネス株式会社から市販され、一般に入手可能である。ＪＭ４０３抗体はモノクローナル抗体であり、その免疫グロブリンクラスはマウスＩｇＭであって、ＨＥＰ骨格又はＨＳ骨格中に存在する、ＧｌｃＮ残基に結合する。
また抗原をヘパリチナーゼ処理することによって結合性が消失し、ＨＡ、ＣＳ、ＤＳ、ＫＳとは実質的に結合しない。
また、ＪＭ４０３抗体と同じ相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗体も本発明において使用できる。
【００２０】
また、本発明検出方法１において用いることができ、当業者が一般的に入手できる別の具体的な抗体としては、例えばＮＡＨ４３抗体（国際公開第２００６／１０６９５０号パンフレット）を挙げることができる。この抗体は、平成１７年３月１１日に独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０５３５として受託されたハイブリドーマによって産生される。ＮＡＨ４３抗体はモノクローナル抗体であり、その免疫グロブリンクラスはマウスＩｇＭであって、ＨＥＰ骨格又はＨＳ骨格中に存在するＧｌｃＮ残基に結合する。一方、ＥＨＳ−ＨＳ、ＨＡ、Ｃｈ、各種ＣＳ（ＣＳ−Ａ、ＣＳ−Ｂ、ＣＳ−Ｃ、ＣＳ−Ｄ、ＣＳ−Ｅ）及びＫＳには実質的に結合しない。
また、ＮＡＨ４３抗体と同じ相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗体も本発明において使用できる。
【００２１】
ここで用いることができる抗体は、ＨＥＰ骨格又はＨＳ骨格における、ＧｌｃＮ残基、好ましくは、ＧｌｃＡ残基とグリコシド結合したＧｌｃＮ残基を抗原として、公知の方法で製造することもできる。例えば、モノクローナル抗体を所望するのであれば、当該抗原で哺乳動物を免疫し、当該動物からリンパ球を採取して、これを哺乳動物由来のミエローマ細胞と細胞融合させることによりハイブリドーマを形成させ、当該ハイブリドーマのなかから当該抗原に特異的に結合する抗体を産生するものを選択し、抗体を採取すればよい。
【００２２】
また、ここで用いることができる抗体は、免疫グロブリンとして精製されたものであっても、未精製のもの（例えば、ハイブリドーマの培養上清、腹水、抗血清そのものなど）であっても良いが、免疫グロブリンとして精製されているものが好ましい。なお、本出願書類において「精製」という語は、いわゆる完全精製（実質的に純粋となるまで精製すること）のみならず、部分精製（実質的に純粋とまではいえないが、画分中に占める精製目的物質の割合が多数となる程度にまで精製すること）をも含む概念として用いる。
また、ここで用いることができる抗体は、免疫グロブリンの分子構造を完全に保持しているものは勿論、抗原結合部位（Ｆａｂ）を分解しないプロテアーゼ（例えばプラスミン、ペプシン、パパイン等）で処理してＦａｂを含むフラグメントとしたものであっても良い。抗体のＦａｂを含むフラグメントとしては、Ｆａｂ以外に、Ｆａｂｃ、(Ｆａｂ')2等が例示される。
【００２３】
また、ここで用いることができる抗体をコードする遺伝子の塩基配列やこれらの抗体のアミノ酸配列が決定されれば、遺伝子工学的にこれらの抗体、Ｆａｂを含むフラグメント、キメラ抗体等を作製することもできる。前記抗体のＦａｂを含むフラグメントやキメラ抗体等も、前記糖鎖構造に結合する限りにおいて、本出願書類における「抗体」の概念に包含される。
【００２４】
抗体を用いて前記の糖鎖構造を検知する場合には、例えばアポトーシスの検出対象となる細胞から抽出された糖鎖と当該抗体とを接触させ抗原抗体反応させてもよく、また当該細胞と当該抗体とを直接接触させ抗原抗体反応させてもよい。前者の場合には、例えばイ
ムノブロッティング法によって当該糖鎖構造を検知することができ、後者の場合には、例えばフローサイトメトリー法によって当該糖鎖構造を検知することができる。なお、抗体を接触させて抗原抗体反応させ、抗原（当該糖鎖構造）を検知する方法・条件等については、一般的なイムノアッセイの手法・条件をそのまま利用することができる。
【００２５】
ここで用いることができる抗体は、標識物質と直接結合させたものでもよい。また、ここで用いることができる抗体を一次抗体とし、この一次抗体に結合し、かつ標識物質が結合した二次抗体（当該一次抗体に係る免疫グロブリンに結合する抗体）を用いてもよい。
この標識物質としては、例えば酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼなど）、放射性同位元素（125Ｉ、131Ｉ、3Ｈなど）、蛍光色素（ＦＩＴＣ、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）、ジクロロトリアジニルアミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リスアミンローダミンＢ（Lissamine Rhodamine B）、テキサスレッド（Texas Red）、フィコエリスリン（Phycoerythrin；ＰＥ）、ウンベリフェロン、ユーロピウム、フィコシアニン、トリカラー、シアニンなど）、化学発光物質（ルミノールなど）、ハプテン（ジニトロフルオロベンゼン、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、２，４−ジニトロアニリンなど）、金属粒子（フェリチン粒子、金コロイド粒子など）、特異的結合対（ビオチンとアビジン類（ストレプトアビジンなど）、レクチンと糖鎖、アゴニストとアゴニストの受容体、ＨＥＰとアンチトロンビンIII（ＡＴＩＩＩ）など）のいずれか一方の物質等が例示される。
【００２６】
抗体の検知は、抗体に直接結合している標識物質のシグナルを検知することにより行うことができる。シグナルの検知は、用いる試料の種類・状態や、標識物質の種類等に応じて、公知の方法から当業者が適宜設定して行うことができる。例えば、細胞そのものを試料とした場合には、顕微鏡を用いて色素、金属粒子の密度、放射能のカウント、蛍光強度、蛍光偏光、発光強度等を検知すればよい。また細胞の懸濁液を試料とした場合には、顕微鏡や、フローサイトメトリー等の手法を採用することができる。また、抽出された糖鎖を試料とした場合には、イムノブロッティング、ＥＬＩＳＡ法等の手法を採用することができる。具体的な一例については、実施例を参照されたい。
なお、迅速性・簡便性等の面からすると、前記の糖鎖構造の検知は、抗体を用いて行われることが好ましい。
【００２７】
細胞に存在するＨＥＰ骨格又はＨＳ骨格におけるＧｌｃＮ残基が増加したか否かは、アポトーシスの検出対象となる細胞において、アポトーシスが惹起されていないもの（正常なもの：ネガティブコントロール）と、アポトーシスが惹起されている可能性があるものとを比較することにより調べることができる。すなわち、アポトーシスが惹起されている可能性がある細胞における前記糖鎖構造の検知結果（当該糖鎖構造の量）が、当該細胞であってアポトーシスが惹起されていないもの（正常なもの）の細胞における当該糖鎖構造の検知結果（当該糖鎖構造の量）を上回るものであれば、前者の細胞における当該糖鎖構造の「増加」として判定・検知することができる。そして、これにより当該糖鎖構造の増加が検知された細胞については、アポトーシスが惹起されているものとして判定・検出することができる。
【００２８】
本発明検出方法１は、以上のような、「細胞に存在するＨＳ骨格におけるＧｌｃＮ残基の増加を検知するステップ」を少なくとも含む限りにおいて、他のステップをさらに含んでいてもよい。例えば、アポトーシスの検出対象となる細胞から糖鎖を抽出するステップや、統計解析するステップなど、本発明の実施にあたりさらに必要となるステップを適宜追加してもよい。
【００２９】
＜２＞本発明検出剤
本発明検出剤は、ＨＥＰ骨格又はＨＳ骨格におけるＧｌｃＮ残基に結合する抗体を有効成分とする、アポトーシス検出剤である。
本発明検出剤の有効成分である、「ＨＥＰ骨格又はＨＳ骨格におけるＧｌｃＮ残基に結合する抗体」についての説明は、前記＜１＞と同様である。すなわち、本発明検出方法１において用いることができる抗体を、そのまま本発明検出剤の有効成分として用いることができる。当該抗体に標識物質が直接結合していてもよいことはいうまでもない。
本発明検出剤は、「ＨＥＰ骨格又はＨＳ骨格におけるＧｌｃＮ残基に結合する抗体」を有効成分として含有している限りにおいて、さらに他の成分を含有していてもよい。このような他の成分の一例としては、例えば試薬的に許容される安定化剤、保存剤、賦形剤等を例示することができる。
本発明検出剤は、「ＨＥＰ骨格又はＨＳ骨格におけるＧｌｃＮ残基に結合する抗体」をそのまま、又は必要に応じてさらに前記のような他の成分を添加して、通常の試薬・製剤等の調製方法にしたがって製造することができる。
また本発明検出剤は、前記＜１＞における本発明検出方法１に記載の方法にしたがって使用することができる。
【００３０】
＜３＞本発明キット
本発明キットは、次の（１）及び（２）に示す構成成分を少なくとも含む、アポトーシス検出キットである；
（１）ＨＥＰ骨格又はＨＳ骨格におけるＧｌｃＮ残基に結合する抗体、
（２）上記（１）の抗体を検出する試薬。
本発明キットの構成成分である、（１）「ＨＥＰ骨格又はＨＳ骨格におけるＧｌｃＮ残基に結合する抗体」についての説明は、前記＜１＞と同様である。すなわち、本発明検出方法１において用いることができる抗体を、そのまま本発明キットの構成成分（１）に係る抗体として用いることができる。当該抗体に標識物質が直接結合していてもよいことはいうまでもない。
【００３１】
また、本発明キットのもう一つの構成成分である「上記（１）の抗体を検出する試薬」は、「ＨＥＰ骨格又はＨＳ骨格におけるＧｌｃＮ残基に結合する抗体」を何らかのかたちで検出できる試薬である限りにおいて特に限定されない。このような試薬としては、例えば、前記＜１＞中で説明した二次抗体（「ＨＥＰ骨格又はＨＳ骨格におけるＧｌｃＮ残基に結合する抗体」（一次抗体）に結合し、かつ標識物質が結合した抗体（当該一次抗体に係る免疫グロブリンに結合する抗体））を例示することができる。また、「ＨＥＰ骨格又はＨＳ骨格におけるＧｌｃＮ残基に結合する抗体」が標識物質と直接結合しているような場合において、例えば当該標識物質が酵素である場合には、「上記（１）の抗体を検出する試薬」は、当該酵素の基質（発色基質など）であってもよい。
本発明キットは、前記＜１＞の本発明検出方法１にしたがって使用することができる。
本発明キットは、前記の（１）及び（２）に示す構成成分を少なくとも含む限りにおいて、さらに所望の他の構成成分を含ませてもよい。このような他の構成成分としては、例えば洗浄液、酵素反応停止液等を例示することができる。また、測定バッチ同士の実施レベルを一定水準に保つための陽性コントロール（ＱＣコントロール）を含有させることもできる。
これらの構成成分は、それぞれ別体の容器に収容し保存しておくことができる。
【００３２】
＜４＞本発明スクリーニング方法１
本発明スクリーニング方法１は、被験物質と細胞とを接触させ、当該細胞におけるＨＥＰ骨格又はＨＳ骨格におけるＧｌｃＮ残基が増加又は減少した場合に当該被験物質を選択するステップを少なくとも含む、アポトーシス誘導剤又はアポトーシス阻害剤の候補物質のスクリーニング方法である。
ここにいう「被験物質」とは、アポトーシス誘導剤又はアポトーシス阻害剤の候補物質のスクリーニングに付される物質を意味する。
本発明スクリーニング方法１においては、まずこの被験物質と、アポトーシス誘導又はアポトーシス阻害のターゲットとする細胞とを接触させる。接触の方法は、被験物質分子が細胞と接触できる状態となる限りにおいて特に限定されない。簡便な方法の一例として、例えば細胞を含有する培養液に、被験物質を添加する方法を例示することができる。
【００３３】
アポトーシス誘導剤の候補物質のスクリーニングを行う場合には、被験物質と、ターゲットとする細胞の維持・生育が可能な培地中でインキュベートした細胞とを接触させ、インキュベートすればよい。
また、アポトーシス阻害剤の候補物質のスクリーニングを行う場合には、ターゲットとする細胞を予めアポトーシスが惹起される環境下（例えば、ダウノマイシン等のアポトーシス誘導物質の存在下や、血清成分が欠乏した環境下）でインキュベートしてこの細胞と被験物質とを接触させるか、または被験物質とターゲットとする細胞とを接触させた後に、そのままアポトーシスが惹起される環境下（上記参照）でインキュベートすればよい。
その後、前記＜１＞の本発明検出方法１にしたがって、当該細胞におけるＨＥＰ骨格又はＨＳ骨格におけるＧｌｃＮ残基を検知すればよい。
そして、アポトーシス誘導剤の候補物質のスクリーニングにおいては、被験物質を接触させることによって細胞における当該糖鎖構造が増加すれば、アポトーシスが誘導されたのであるから、当該被験物質をアポトーシス誘導剤の候補物質として選択することができる。
同様に、アポトーシス阻害剤の候補物質のスクリーニングにおいては、被験物質を接触させることにより、細胞における当該糖鎖構造が減少すれば、アポトーシスが阻害されたのであるから、当該被験物質をアポトーシス阻害剤の候補物質として選択することができる。
【００３４】
本発明スクリーニング方法１は、以上のような、「被験物質と細胞とを接触させ、当該細胞におけるＨＥＰ骨格又はＨＳ骨格におけるＧｌｃＮ残基が増加又は減少した場合に当該被験物質を選択するステップ」を少なくとも含む限りにおいて、他のステップをさらに含んでいてもよい。例えば、当該ステップにより選択された物質（アポトーシス誘導剤又はアポトーシス阻害剤の候補物質）を、他のスクリーニングや試験に付するステップをさらに含んでいてもよい。
【００３５】
＜５＞本発明検出方法２
本発明検出方法２は、細胞におけるＮＤＳＴ−３及びＮＤＳＴ−４の少なくとも一方の発現の増加を検知するステップを少なくとも含む、アポトーシスの検出方法である。
細胞におけるＮＤＳＴ−３やＮＤＳＴ−４の発現は、タンパク質として検知してもよく、ｍＲＮＡとして検知してもよい。タンパク質として検知する場合には、例えば抗体等を用いることもできる。またｍＲＮＡとして検知する場合には、例えば実施例に例示したような、ＮＤＳＴ−３やＮＤＳＴ−４についての特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲを採用することもできる。なかでもｍＲＮＡの発現を検知することが好ましい。この場合におけるＮＤＳＴ−３やＮＤＳＴ−４についての特異的なプライマーは、それぞれの塩基配列（ＮＤＳＴ−３：配列番号１９、ＮＤＳＴ−４：配列番号２１）に基づいて設計することができるが、その具体例としては、ＮＤＳＴ−３について配列番号５と６の組合わせ、ＮＤＳＴ−４について配列番号７と８の組合わせを例示することができる。また、ＲＴ−ＰＣＲの条件等の具体例についても、実施例に記載したものを例示することができる。
【００３６】
細胞におけるＮＤＳＴ−３やＮＤＳＴ−４の発現が増加したか否かは、アポトーシスの検出対象となる細胞において、アポトーシスが惹起されていないもの（正常なもの：ネガティブコントロール）と、アポトーシスが惹起されている可能性があるものとを比較する
ことにより調べることができる。すなわち、アポトーシスが惹起されている可能性がある細胞におけるＮＤＳＴ−３やＮＤＳＴ−４の発現量が、当該細胞であってアポトーシスが惹起されていないもの（正常なもの）の細胞におけるＮＤＳＴ−３やＮＤＳＴ−４の発現量を上回るものであれば、発現の「増加」として判定・検知することができる。そして、これにより発現の増加が検知された細胞については、アポトーシスが惹起されているものとして判定・検出することができる。
【００３７】
＜６＞本発明スクリーニング方法２
本発明スクリーニング方法２は、被験物質と細胞とを接触させ、これにより当該細胞におけるＮＤＳＴ−３及びＮＤＳＴ−４の少なくとも一方の発現が増加又は減少した場合に当該被験物質を選択するステップを少なくとも含む、アポトーシス誘導剤又はアポトーシス阻害剤の候補物質のスクリーニング方法である。ＮＤＳＴ−３及びＮＤＳＴ−４の少なくとも一方の発現が増加した場合には当該被験物質をアポトーシス誘導剤として選択することができ、ＮＤＳＴ−３及びＮＤＳＴ−４の少なくとも一方の発現が減少した場合には当該被験物質をアポトーシス阻害剤として選択することができる。
本発明スクリーニング方法２は、本発明スクリーニング方法１のスクリーニング指標である「ＨＥＰ骨格又はＨＳ骨格におけるＧｌｃＮ残基の増加又は減少」に代えて、「ＮＤＳＴ−３及びＮＤＳＴ−４の少なくとも一方の発現が増加又は減少」をスクリーニング指標として採用したものである。したがって、この点以外の説明は、本発明スクリーニング方法１と同様である。
そして、ＮＤＳＴ−３及びＮＤＳＴ−４の少なくとも一方の発現は、前記＜５＞の本発明検出方法２にしたがって検知すればよい。したがって本発明スクリーニング方法２における「発現」もｍＲＮＡの発現であることが好ましく、これに関する他の説明も前記＜５＞と同様である。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。
以下、実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、これにより本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
【００３９】
１．材料及び方法
１−１．本実施例で用いた細胞
以下の各種細胞株を生体組織由来の試料として用いた。
（１）Ｋ５６２株：  ヒト慢性骨髄性白血病由来細胞株（Blood, 1975 Mar; 45(3): 321-334）（RCB0027）である。
（２）ＨＬ−６０株：  ヒト前骨髄球性白血病細胞株（Nature, 1977 Nov 24; 270(5635): 347-349）（RCB0041）である。
（３）Ｕ９３７株：  ヒトリンパ腫由来細胞株（J. Exp. Med., 1976 Jun 1; 143(6): 1528-1533）（RCB1978）である。
（４）Ｃ−１株：  ヒト大腸癌由来細胞株（Cancer Res. 2001 Jun 1; 61(11): 4620-4627）である。
（５）ＬＳ１７４Ｔ株：  ヒト大腸癌由来細胞株（Clin. Cancer Res., 2006 Mar 1; 12(5): 1606-1614）である。
（６）ＰＣ１２株：  ラット褐色腫由来細胞株であり、NGF添加により神経突起を伸ばして分化する特性を有する（Natl. Acad. Sci. USA., 1976 Jul; 73(7): 2424-2428）（RCB0009）。
（７）Ｊｕｒｋａｔ株：  ヒトＴ細胞株（Int. J. Cancer, 1977 May 15; 19(5): 621-626）（RCB0806）である。
なお、「ＲＣＢ」で始まる番号は、理化学研究所  バイオリソースセンター  細胞バンク（RIKEN CELL BANK）における細胞番号である。
なお、Ｃ−１株、ＬＳ１７４Ｔ株及びＰＣ１２株についてはＦＣＳを１０％含有するＤＭＥＭを、他の細胞株についてはＦＣＳを１０％含有するＲＰＭＩ−１６４０培地を、それぞれ細胞培養液として用いた。
【００４０】
１−２．本実施例で用いた抗体
（１）ＪＭ４０３抗体：  生化学バイオビジネス株式会社製のものを用いた。この抗体の免疫グロブリンクラスはマウスＩｇＭであり、ＨＥＰ骨格又はＨＳ骨格中に存在する、ＧｌｃＮ残基に結合する。抗原をヘパリチナーゼ処理することによって結合性が消失し、ＨＡ、ＣＳ、ＤＳ、ＫＳとは実質的に結合しない。
【００４１】
（２）ＮＡＨ４３抗体：  独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０５３５として受託されたハイブリドーマによって産生されたものを用いた。この抗体の免疫グロブリンクラスはマウスＩｇＭである。この抗体はＨＥＰ骨格又はＨＳ骨格中に存在するＧｌｃＮ残基に結合するが、ＥＨＳ−ＨＳ、ＨＡ、Ｃｈ、各種ＣＳ（ＣＳ−Ａ、ＣＳ−Ｂ、ＣＳ−Ｃ、ＣＳ−Ｄ、ＣＳ−Ｅ）及びＫＳには実質的に結合しない。
【００４２】
（３）ＮＡＨ４６抗体：生化学バイオビジネス株式会社製のものを用いた。この抗体の免疫グロブリンクラスはマウスＩｇＭであり、ＨＥＰ骨格又はＨＳ骨格中に存在するＧｌｃＮＡｃに結合する。抗原をヘパリチナーゼ処理すると結合性が消失し、ＨＡ、ＣＳ、ＤＳ、ＫＳとは結合しない。（WO2006/106950に記載の方法でも製造することができ、また、平成１７年３月１１日に独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０５３６として受託されたハイブリドーマからも製造することができる）。
【００４３】
（４）１０Ｅ４抗体：  生化学バイオビジネス株式会社製のもの（商品名：F58-10E4）を用いた。この抗体の免疫グロブリンクラスはマウスＩｇＭであり、ＨＳ中に存在するＧｌｃＮＳ残基に結合する。抗原をヘパリチナーゼ処理すると結合性が消失し、ＨＡ、ＣＳ、ＤＳ、ＫＳ、ＤＮＡとは実質的に結合しない。
【００４４】
（５）ＨｅｐＳＳ−１抗体：  生化学バイオビジネス株式会社製のものを用いた。この抗体の免疫グロブリンクラスはマウスＩｇＭであり、ＨＳ中に存在するＯ−硫酸化・Ｎ−アセチル化グルコサミンに結合する。マウス、サル、ラット、ハムスター、ニワトリ由来の多様な正常細胞とも結合する。ＨＡ、Ｃｈ、ＨＥＰ、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、ＤＳ、ＣＳ−Ｄ、ＣＳ−Ｅ及びＫＳとは実質的に結合しない。
【００４５】
（６）ＡＣＨ５５抗体：  平成１８年３月１日に独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７７９として受託されたハイブリドーマによって産生されたものを用いた。この抗体の免疫グロブリンクラスはマウスＩｇＭである。この抗体はＡＣＨに結合するが、ＡＳ、ＨＥＰ、ＨＳ、ＮＡＨ及びＥＨＳ−ＨＳ、ＨＡ、各種ＣＳ（ＣＳ−Ａ（Ｗ）、ＣＳ−Ａ（Ｓ）、ＣＳ−Ｂ、ＣＳ−Ｃ、ＣＳ−Ｄ、ＣＳ−Ｅ）及びＫＳには実質的に結合しない。またこの抗体は、ＨＥＰ誘導体のうち、ＣＤＳＨに対しては強く反応し、２ＳＨ、６ＳＨとＡｃ−ＮＳＨに対しては極弱く反応するが、ＮＨ2−ＨＥＰ、ＮＡｃ−ＨＥＰ、６ＤＳＨ、Ａｃ−６ＤＳＨ、ＮＨ2−６ＳＨ、ＮＨ2−２ＳＨ、ＮＳＨ、ＮＨ2−ＣＤＳＨには実質的に結合しない。
ＡＣＨ５５抗体が強く反応したＡＣＨは、イズロン酸ユニット（-[IdoA-GlcNAc]-）を主な構成二糖としていることから、ＡＣＨ５５抗体のエピトープは、イズロン酸ユニットから構成されていると考えられる。このことは、この抗体がＣＤＳＨ（グルクロン酸ユニット及びイズロン酸ユニットにより主に構成される多糖であり、イズロン酸ユニットの存在比は60％以上と高い）とも強く反応することからも裏付けられる。
またこの抗体が結合しなかったＮＡＨは、グルクロン酸ユニット（-[GlcA-GlcNAc]-）からなるＡＣＨのウロン酸Ｃ５−エピマーであることから、特にイズロン酸残基がこの抗体の抗原認識において必須であることが示唆される。さらに、この抗体はＡＳ（イズロン酸残基の２位水酸基が硫酸化されている）に対する結合性がみられないことから、イズロン酸の硫酸化（IdoA(2S)）は、この抗体の結合性を阻害することが示唆される。
またこの抗体の結合性は、ＧｌｃＮＡｃ残基のＮ−脱アセチル化（ＮＨ2−ＣＤＳＨ）及びＮ−硫酸化（ＮＳＨ）によって消失したので、ＧｌｃＮ残基のアミノ基がアセチル化されていることも、この抗体の抗原の認識において重要であることが示唆された。ＡＳと結合しないこの抗体が、２ＳＨ、６ＳＨやＡｃ−ＮＳＨと弱く反応した理由は、ＨＥＰがＮ−脱硫酸化、２−Ｏ脱硫酸化及び６−Ｏ脱硫酸化等、複数の修飾を経る過程で、イズロン酸ユニットがＨＥＰ誘導体中に顕在化したためと推察される。
【００４６】
（７）ＡＳ２２抗体：  平成１８年３月１日に独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７７５として受託されたハイブリドーマによって産生されたものを用いた。この抗体の免疫グロブリンクラスはマウスＩｇＭである。
この抗体はＡＳに対して強く反応するが、ＨＳ及びＨＥＰに対して実質的に結合しない。またこの抗体は、ＡＣＨ、ＥＨＳ−ＨＳ、ＫＳ、ＨＡ、ＮＡＨ、ＣＳ−Ａ（Ｗ）、ＣＳ−Ａ（Ｓ）、ＣＳ−Ｂ、ＣＳ−Ｃ、ＣＳ−Ｄ、ＣＳ−Ｅ及びＣｈのいずれに対しても実質的に結合しない。したがってこの抗体のエピトープには、ＩｄｏＡ（２Ｓ）残基が含まれていることが示唆される。
また、この抗体が結合性を示さないＨＳ及びＨＥＰの分子中には、ＩｄｏＡ（２Ｓ）のα（１−４）結合が存在するが、その大部分はＧｌｃＮＳ又はＯ−硫酸化ＧｌｃＮＳと結合した二糖ユニットとして存在することから、ＧｌｃＮ残基の修飾も、この抗体の結合を阻害する要因となっていることが推察される。
また、この抗体は、ＮＨ2−ＨＥＰ及び６ＤＳＨに対して実質的に結合しないが、それらをＮ−アセチル化したＮＡｃ−ＨＥＰ及びＡｃ−６ＤＳＨに対してはＡＳと同程度の結合性を示す。このことから、この抗体のエピトープには、Ｎ位が何らかの形で修飾されたＧｌｃＮ残基、特にＮ−アセチル化されたＧｌｃＮ残基が含まれていることが示唆される。また、この抗体のＮＡｃ−ＨＥＰ及びＡｃ−６ＤＳＨとの結合性からみて、そのＧｌｃＮ残基のＯ−硫酸化やＮ−硫酸化はこの抗体の結合性に実質的に影響しないことが示唆される。
【００４７】
（８）ＬＹ１１１抗体：  生化学バイオビジネス株式会社製のものを用いた。この抗体の免疫グロブリンクラスはマウスＩｇＭであり、コンドロイチン−４−硫酸と結合する。ＨＡ、Ｃｈ、ＨＥＰ、ＨＳ、ＤＳ及びＫＳとは実質的に結合しない。
【００４８】
（９）Ｇ１５２抗体（6-硫酸化シアリルルイスＸセラミドに結合するが、6'-硫酸化シアリルルイスＸセラミド、6,6'-bis-硫酸化シアリルルイスＸセラミド、6-硫酸化ルイスＸセラミド、ルイスＸセラミド等には結合しない抗体。特開平１１−３１３６８４に記載の方法で製造した。）
【００４９】
１−３．アポトーシス誘導処理
前記の各種細胞に対するアポトーシスの誘導は、以下のいずれかの方法によって行った。
（１）ダウノマイシン（daunomycin、daunorubicinともいう）処理
上記細胞の培養液中に、ダウノマイシン（daunorubicin hydrochloride；シグマ社製）を添加することによってアポトーシスを誘導した。
（２）血清欠乏処理
ＦＣＳ含量（通常は１０％）を０．６％とした細胞培養液中で上記細胞を培養すること
により、アポトーシスを誘導した。
【００５０】
１−４．アポトーシス誘導の確認
アポトーシスが誘導されていることは、アガロースゲル電気泳動によって、細胞の染色体ＤＮＡのラダー（断片化）を観察することにより確認した。
【００５１】
１−５．フローサイトメトリー
前記の各細胞（アポトーシスを誘導しないもの及びアポトーシスを誘導したもののそれぞれ）の懸濁液に、終濃度５μｇ／ｍｌ又は２０μｇ／ｍｌとなるように前記の各種抗体（一次抗体）を添加して４℃で３０分間インキュベートした。その後、終濃度２％のＦＣＳを含有するＰＢＳで洗浄し、次いで1/200に希釈した二次抗体（ＦＩＴＣ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（Chemicon；カタログ番号AQ326F））を添加して４℃で３０分間インキュベートした。その後、終濃度２％のＦＣＳを含有するＰＢＳで洗浄し、フローサイトメトリーにより解析した。なお、一次抗体を用いずに二次抗体のみでインキュベートしたものをコントロールとした。
【００５２】
１−６．ＮＤＳＴのｍＲＮＡの発現解析
前記１−３．（１）に記載の方法でダウノマイシン（終濃度１．０μＭ）処理をしたＫ５６２株における、各種ＮＤＳＴ（ＮＤＳＴ−１、ＮＤＳＴ−２、ＮＤＳＴ−３、ＮＤＳＴ−４）のｍＲＮＡの発現を、ＲＴ−ＰＣＲで解析した。詳細な条件等は、次のとおりである。
前記の各細胞を、直径１００ｍｍの細胞培養ディッシュを用いて、ダウノマイシンの在下又は非存在下で培養した。その後、培養上清を除去し、細胞をＰＢＳ（−）で洗浄した。洗浄後の細胞に、１ｍｌのＩＳＯＧＥＮ（株式会社ニッポンジーン）を添加して細胞を溶解させた。この細胞溶解液をクロロホルム抽出し、ＲＮＡ画分を分離し、イソプロパノール沈殿を行って全ＲＮＡを分離した。回収したＲＮＡを、ＤＥＰＣ処理水（ＲＮａｓｅフリーの水；ナカライテスク株式会社）で溶解してＲＮＡ溶液を得た。
ｃＤＮＡの合成は、SuperScript II Reverse Transcription kit（インビトロジェン社）を用いて行った。全容量１０μｌの反応液に、５μｇの全ＲＮＡ、１ｍＭのｄＮＴＰ混合物、５００ｎｇのオリゴ（ｄＴ）12-18プライマー及びＤＥＰＣ処理水を混合し、６５℃で５分間加熱した後、氷上で急冷した。この反応液に、前記キットに付属している１ｘ反応緩衝液、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＤＴＴ及び４０Ｕ  ＲＮａｓｅＯＵＴ（登録商標）を混合し、全容量を２０μｌとした。４２℃で２分間加熱した後、２００ＵのSuperScript II Reverse Transcriptase（逆転写酵素；インビトロジェン社）を添加し、更に５０分間保温した。その後、７０℃で１５分間加熱することによって逆転写酵素を失活させた。その後、ＲＮａｓｅＨを添加して３７℃で２０分間保温し、ｃＤＮＡ合成の鋳型として用いた全ＲＮＡを分解した。これによって得られたｃＤＮＡを、次の実験に用いた。
前記で得られたｃＤＮＡと、以下に示す各遺伝子特異的プライマーを用いて標的遺伝子の部分配列を増幅した。なお、用いたプライマーは以下の通りである。「Ｆ：」は正方向（forward）プライマーを、「Ｒ：」は逆方向（reverse）プライマーをそれぞれ示す。なお、括弧内に記載された温度の意義は後述する。
【００５３】
（１）ＮＤＳＴ−１（５９℃、３９７ｂｐ）
F：5'-ACCTGTCCAACTATGGGAATGACC-3'（配列番号１）
R：5'-AACTCCATGTACCAGTCGATGCCT-3'（配列番号２）
（２）ＮＤＳＴ−２（５８℃、３０７ｂｐ）
F：5'-TCTCGTGAACTAGACCGGAGCAT-3'（配列番号３）
R：5'-GACGATCACAGGTTTTCTCCTTGGAC-3'（配列番号４）
（３）ＮＤＳＴ−３（５８℃、３１０ｂｐ）
F：5'-ACTATGGGAATGACCGACTGGGAT-3'（配列番号５）
R：5'-GGGGAGTTACTAAGGATGGAAGGATG-3'（配列番号６）
（４）ＮＤＳＴ−４（５９℃、３９７ｂｐ）
F：5'-TGAGCAGAAAGACCCTCTATGGCA-3'（配列番号７）
R：5'-TGAGGGGTCAATGAGGATGGTGAT-3'（配列番号８）
（５）ＨＳ２ＳＴ（６０℃、４４４ｂｐ）
F：5'-CAGGATTTTATCATGGACACG-3'（配列番号９）
R：5'-TCTTTCCTGTGCGATAGAGT-3'（配列番号１０）
（６）ＨＳ６ＳＴ−１（６０℃、４９０ｂｐ）
F：5'-TGGACCGAGCTCACCAACTG-3'（配列番号１１）
R：5'-AGGGCCGGATGAACTTGAGG-3'（配列番号１２）
（７）ＨＳ６ＳＴ−２（６０℃、３３３ｂｐ）
F：5'-TGGACCGAGCTCACCAACTG-3'（配列番号１３）
R：5'-AGGGCCGGATGAACTTGAGG-3'（配列番号１４）
（８）ＨＳ６ＳＴ−３（６０℃、３９８ｂｐ）
F：5'-TAGCTGCAAAGCGGGTCAGAAG-3'（配列番号１５）
R：5'-TGTTAGCCAGGTTGTAGGTGCAATCC-3'（配列番号１６）
（９）Ｇ３ＰＤＨ（５７℃、４９８ｂｐ）
F：5'-AAGGTCATCCATGACAAC-3'（配列番号１７）
R：5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCA-3'（配列番号１８）
【００５４】
ＰＣＲ反応は、１ｘAmpliTaq反応緩衝液、１ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、０．５μＭ 正方向プライマー、０．５μＭ 逆方向プライマー、２５０ｎｇ ｃＤＮＡ（ＲＮＡ換算）、２．５Ｕ AmpliTaq Gold（登録商標） DNA polymerase（アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）社）及びオートクレーブ水を含有する５０μｌの反応液を用いて、GeneAmp9700（アプライドバイオシステムズ社）を用いて行った。増幅は、９４℃（３０秒）、Ｘ℃（上記のプライマーペアに付記された温度。）（３０秒）、７２℃（３０秒）のサイクルを、上記の遺伝子（１）〜（４）については３５回、（５）〜（８）については３０回繰り返した。ただしＧ３ＰＤＨは２５回繰り返した。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルを用いて電気泳動し、増幅されたＤＮＡ断片を検出した。
【００５５】
２．結果
２−１．アポトーシス誘導の確認
前記「１−３．」の方法で処理した細胞は、いずれもアガロースゲル電気泳動によって染色体ＤＮＡのラダー（断片化）が観察され、アポトーシスが誘導されていることが確認された。一例として、Ｋ５６２株を終濃度１μＭのダウノマイシンで２日間処理した場合の電気泳動像を図１に示す。図１中の「Ｍ」のレーンは分子量マーカーを、「−」のレーンはダウノマイシン処理していない細胞を、「＋」のはダウノマイシン処理した細胞をそれぞれ示す。
図１の「＋」において、細胞の染色体ＤＮＡが断片化し、アポトーシスが誘導されたことが示された。
【００５６】
２−２．フローサイトメトリー
結果を図２〜図１３に示す。各図とも、グラフの横軸は蛍光強度を、縦軸は細胞数を示す。また各図とも、グラフ中の左側の位置に存在する山型の実線はコントロールを示す。このコントロールよりも実線のピークが右側にシフトしている場合には、一次抗体が細胞に結合している（一次抗体によって細胞が染色されている）ことになる。
【００５７】
各図の説明は以下の通りである。なお、以下に示した抗体は、一次抗体として用いた抗体である。またカッコ内の濃度は、一次抗体を反応させた際の当該抗体の終濃度である。
図２：Ｋ５６２株を用いた結果である。Ａ〜Ｅは細胞をダウノマイシン処理していないもの、Ｆ〜Ｊは細胞を終濃度２μＭのダウノマイシンで２日間処理したもの、Ｋ〜Ｏは細胞を終濃度５μＭのダウノマイシンで２日間処理したものである。
Ａ：ＪＭ４０３抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｂ：ＮＡＨ４６抗体（５０μｇ／ｍｌ）
Ｃ：ＮＡＨ４３抗体（２０μｇ／ｍｌ）
Ｄ：ＮＡＨ４３抗体（５０μｇ／ｍｌ）
Ｅ：ＮＡＨ４３抗体（１００μｇ／ｍｌ）
Ｆ：ＪＭ４０３抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｇ：ＮＡＨ４６抗体（５０μｇ／ｍｌ）
Ｈ：ＮＡＨ４３抗体（２０μｇ／ｍｌ）
Ｉ：ＮＡＨ４３抗体（５０μｇ／ｍｌ）
Ｊ：ＮＡＨ４３抗体（１００μｇ／ｍｌ）
Ｋ：ＪＭ４０３抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｌ：ＮＡＨ４６抗体（５０μｇ／ｍｌ）
Ｍ：ＮＡＨ４３抗体（２０μｇ／ｍｌ）
Ｎ：ＮＡＨ４３抗体（５０μｇ／ｍｌ）
Ｏ：ＮＡＨ４３抗体（１００μｇ／ｍｌ）
【００５８】
図３：ＨＬ６０株を用いた結果である。Ａ〜Ｃは細胞をダウノマイシン処理していないもの、Ｄ〜Ｆは細胞を終濃度３μＭのダウノマイシンで２日間処理したものである。
Ａ：１０Ｅ４抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｂ：ＮＡＨ４６抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｃ：ＪＭ４０３抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｄ：１０Ｅ４抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｅ：ＮＡＨ４６抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｆ：ＪＭ４０３抗体（５μｇ／ｍｌ）
【００５９】
図４：Ｕ９３７株を用いた結果である。Ａ〜Ｃは細胞を１０％のＦＣＳ存在下で４日間培養したもの、Ｄ〜Ｆは細胞を血清欠乏条件下（０．６％ＦＣＳ存在下）で４日間処理したものである。
Ａ：１０Ｅ４抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｂ：ＮＡＨ４６抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｃ：ＪＭ４０３抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｄ：１０Ｅ４抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｅ：ＮＡＨ４６抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｆ：ＪＭ４０３抗体（５μｇ／ｍｌ）
【００６０】
図５：Ｕ９３７株を用いた結果である。Ａ〜Ｃは細胞をダウノマイシン処理していないもの、Ｄ〜Ｆは細胞を終濃度０．２μＭのダウノマイシンで２日間処理したものである。
Ａ：１０Ｅ４抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｂ：ＮＡＨ４６抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｃ：ＪＭ４０３抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｄ：１０Ｅ４抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｅ：ＮＡＨ４６抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｆ：ＪＭ４０３抗体（５μｇ／ｍｌ）
【００６１】
図６：Ｃ−１株を用いた結果である。いずれも細胞を１０％のＦＣＳ存在下で４日間培養したものである。
Ａ：ＡＳ２２抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｂ：ＡＣＨ５５抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｃ：１０Ｅ４抗体（１μｇ／ｍｌ）
Ｄ：ＮＡＨ４６抗体（１μｇ／ｍｌ）
Ｅ：ＪＭ４０３抗体（１μｇ／ｍｌ）
Ｆ：ＨｅｐＳＳ−１抗体（１μｇ／ｍｌ）
【００６２】
図７：Ｃ−１株を用いた結果である。いずれも細胞を血清欠乏条件下（０．６％のＦＣＳ存在下）で４日間培養したものである。
Ａ：ＡＳ２２抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｂ：ＡＣＨ５５抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｃ：１０Ｅ４抗体（１μｇ／ｍｌ）
Ｄ：ＮＡＨ４６抗体（１μｇ／ｍｌ）
Ｅ：ＪＭ４０３抗体（１μｇ／ｍｌ）
Ｆ：ＨｅｐＳＳ−１抗体（１μｇ／ｍｌ）
【００６３】
図８：ＬＳ１７４Ｔ株を用いた結果である。いずれも細胞を１０％のＦＣＳ存在下で４日間培養したものである。
Ａ：ＡＳ２２抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｂ：ＡＣＨ５５抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｃ：１０Ｅ４抗体（１μｇ／ｍｌ）
Ｄ：ＪＭ４０３抗体（１μｇ／ｍｌ）
Ｅ：ＮＡＨ４６抗体（１μｇ／ｍｌ）
Ｆ：ＨｅｐＳＳ−１抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｇ：ＬＹ１１１抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｈ：Ｇ１５２抗体（２０倍希釈）
【００６４】
図９：ＬＳ１７４Ｔ株を用いた結果である。いずれも細胞を血清欠乏条件下（０．６％のＦＣＳ存在下）で４日間培養したものである。
Ａ：ＡＳ２２抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｂ：ＡＣＨ５５抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｃ：１０Ｅ４抗体（１μｇ／ｍｌ）
Ｄ：ＪＭ４０３抗体（１μｇ／ｍｌ）
Ｅ：ＮＡＨ４６抗体（１μｇ／ｍｌ）
Ｆ：ＨｅｐＳＳ−１抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｇ：ＬＹ１１１抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｈ：Ｇ１５２抗体（２０倍希釈）
【００６５】
図１０：ＰＣ１２株を用いた結果である。Ａ〜Ｃは細胞を１０％のＦＣＳ存在下で５日間培養したもの、Ｄ〜Ｆは細胞を血清欠乏条件下（０．６％ＦＣＳ存在下）で５日間処理したものである。
Ａ：１０Ｅ４抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｂ：ＮＡＨ４６抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｃ：ＪＭ４０３抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｄ：１０Ｅ４抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｅ：ＮＡＨ４６抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｆ：ＪＭ４０３抗体（５μｇ／ｍｌ）
【００６６】
図１１：ＰＣ１２株を用いた結果である。Ａ〜Ｃは細胞をダウノマイシン処理していないもの、Ｄ〜Ｆは細胞を終濃度１μＭのダウノマイシンで２日間処理したものである。
Ａ：１０Ｅ４抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｂ：ＮＡＨ４６抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｃ：ＪＭ４０３抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｄ：１０Ｅ４抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｅ：ＮＡＨ４６抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｆ：ＪＭ４０３抗体（５μｇ／ｍｌ）
【００６７】
図１２：Ｊｕｒｋａｔ株を用いた結果である。Ａ〜Ｃは細胞を１０％のＦＣＳ存在下で５日間培養したもの、Ｄ〜Ｆは細胞を血清欠乏条件下（０．６％ＦＣＳ存在下）で４日間処理したものである。
Ａ：１０Ｅ４抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｂ：ＮＡＨ４６抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｃ：ＪＭ４０３抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｄ：１０Ｅ４抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｅ：ＮＡＨ４６抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｆ：ＪＭ４０３抗体（５μｇ／ｍｌ）
【００６８】
図１３：Ｊｕｒｋａｔ株を用いた結果である。Ａ〜Ｃは細胞をダウノマイシン処理していないもの、Ｄ〜Ｆは細胞を終濃度１μＭのダウノマイシンで２日間処理したものである。Ａ：１０Ｅ４抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｂ：ＮＡＨ４６抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｃ：ＪＭ４０３抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｄ：１０Ｅ４抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｅ：ＮＡＨ４６抗体（５μｇ／ｍｌ）
Ｆ：ＪＭ４０３抗体（５μｇ／ｍｌ）
【００６９】
図２〜図１３より、細胞株の種類、アポトーシスの誘導の有無、用いた一次抗体の種類に応じて、その染色特性はさまざまであった。しかしＪＭ４０３抗体を一次抗体として用いた場合には、すべての細胞株に共通して、アポトーシスを誘導した細胞における染色性がアポトーシスを誘導していない細胞よりも増加することが示された。また、ＮＡＨ４３抗体を用いた場合にも同様であった。
これらのことから、アポトーシスを誘導した細胞においては、アポトーシスを誘導していない細胞に比して、ＪＭ４０３抗体やＮＡＨ４３抗体に対する抗原（ＨＥＰ骨格又はＨＳ骨格におけるＧｌｃＮ残基）の発現が増加することが示された。
【００７０】
２−３．ＮＤＳＴのｍＲＮＡの発現解析
ＲＴ−ＰＣＲによる各種ＮＤＳＴのｍＲＮＡの発現解析の結果を図１４に示す。なお図１４中、レーン「Ｃ」はダウノマイシン処理していないＫ５６２株の結果を、レーン「１」はダウノマイシンで１日間処理したＫ５６２株の結果を、レーン「２」はダウノマイシンで２日間処理したＫ５６２株の結果をそれぞれ示す。またＧ３ＰＤＨは、ＲＴ−ＰＣＲのコントロールである。
図１４より、ＮＤＳＴ−１及びＮＤＳＴ−２については、アポトーシス誘導処理（ダウノマイシン処理）の有無にかかわらず、これらの発現量に変化はなかった。一方、ＮＤＳＴ−３及びＮＤＳＴ−４については、アポトーシス誘導処理（ダウノマイシン処理）によって、これらの発現が誘導されることが示された。
また、図面には示していないが、ＨＳ６ＳＴ−２とＨＳ６ＳＴ−３についてはアポトーシス誘導処理（ダウノマイシン処理）の有無にかかわらずｍＲＮＡの発現は観察されなかった。ＨＳ６ＳＴ−１については、アポトーシス誘導処理（ダウノマイシン処理）によって１日目はｍＲＮＡの発現量に変化はなかったが、２日目に発現量が減少した。ＨＳ２ＳＴについては、アポトーシス誘導処理（ダウノマイシン処理）によって１日目はｍＲＮＡの発現量に変化はなかったが、２日目に発現量が不変かやや減少した。
【００７１】
３．本発明キットの製造
以下の構成成分からなる本発明キットを製造した。
（１）ＪＭ４０３抗体                                １本（一次抗体）
（２）ＦＩＴＣ標識した抗マウスイムノグロブリン抗体  １本（二次抗体）
（３）洗浄液（ＰＢＳ）                              １本
また、以下の構成成分からなる本発明キットを製造した。
（１）ＮＡＨ４３抗体                                １本（一次抗体）
（２）ＦＩＴＣ標識した抗マウスイムノグロブリン抗体  １本（二次抗体）
（３）洗浄液（ＰＢＳ）                              １本
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】終濃度１μＭのダウノマイシンで２日間処理したＫ５６２株の染色体ＤＮＡのアガロース電気泳動を示す図（写真）である。
【図２】Ｋ５６２株への各種抗体の結合の程度を示す図である。Ａ〜Ｅは細胞をダウノマイシン処理していないもの、Ｆ〜Ｊは細胞を終濃度２μＭのダウノマイシンで２日間処理したもの、Ｋ〜Ｏは細胞を終濃度５μＭのダウノマイシンで２日間処理したものの結果である。
【図３】ＨＬ６０株への各種抗体の結合の程度を示す図である。Ａ〜Ｃは細胞をダウノマイシン処理していないもの、Ｄ〜Ｆは細胞を終濃度３μＭのダウノマイシンで２日間処理したものの結果である。
【図４】Ｕ９３７株への各種抗体の結合の程度を示す図である。Ａ〜Ｃは細胞を１０％のＦＣＳ存在下で４日間培養したもの、Ｄ〜Ｆは細胞を血清欠乏条件下（０．６％ＦＣＳ存在下）で４日間処理したものの結果である。
【図５】Ｕ９３７株への各種抗体の結合の程度を示す図である。Ａ〜Ｃは細胞をダウノマイシン処理していないもの、Ｄ〜Ｆは細胞を終濃度０．２μＭのダウノマイシンで２日間処理したものの結果である。
【図６】Ｃ−１株への各種抗体の結合の程度を示す図である。いずれも細胞を１０％のＦＣＳ存在下で４日間培養したものの結果である。
【図７】Ｃ−１株への各種抗体の結合の程度を示す図である。いずれも細胞を血清欠乏条件下（０．６％のＦＣＳ存在下）で４日間培養したものの結果である。
【図８】ＬＳ１７４Ｔ株への各種抗体の結合の程度を示す図である。いずれも細胞を１０％のＦＣＳ存在下で４日間培養したものの結果である。
【図９】ＬＳ１７４Ｔ株への各種抗体の結合の程度を示す図である。いずれも細胞を血清欠乏条件下（０．６％のＦＣＳ存在下）で４日間培養したものの結果である。
【図１０】ＰＣ１２株への各種抗体の結合の程度を示す図である。Ａ〜Ｃは細胞を１０％のＦＣＳ存在下で５日間培養したもの、Ｄ〜Ｆは細胞を血清欠乏条件下（０．６％ＦＣＳ存在下）で５日間処理したものの結果である。
【図１１】ＰＣ１２株への各種抗体の結合の程度を示す図である。Ａ〜Ｃは細胞をダウノマイシン処理していないもの、Ｄ〜Ｆは細胞を終濃度１μＭのダウノマイシンで２日間処理したものの結果である。
【図１２】Ｊｕｒｋａｔ株への各種抗体の結合の程度を示す図である。Ａ〜Ｃは細胞を１０％のＦＣＳ存在下で５日間培養したもの、Ｄ〜Ｆは細胞を血清欠乏条件下（０．６％ＦＣＳ存在下）で４日間処理したものの結果である。
【図１３】Ｊｕｒｋａｔ株への各種抗体の結合の程度を示す図である。Ａ〜Ｃは細胞をダウノマイシン処理していないもの、Ｄ〜Ｆは細胞を終濃度１μＭのダウノマイシンで２日間処理したものの結果である。
【図１４】Ｋ５６２株をダウノマイシン処理することによる、各種ＮＤＳＴのｍＲＮＡ発現の変化を示す図（写真）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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