(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（a）から（c）の工程を含む、細胞内で対象の異種膜タンパク質又は分泌タンパク質をin vitroで製造する方法：
a．前記細胞内におけるセラミド移転タンパク質CERT又はその誘導体の発現を高める工程であって、前記誘導体は、原型CERT配列と配列が少なくとも95%同一であり、かつ、分泌に対して原型CERT配列と同等の作用を示すポリペプチド分子である工程、
b．前記細胞内における前記対象のタンパク質の発現及び前記対象のタンパク質の培養液中への分泌を実施する工程、及び
c．前記培養液から前記対象のタンパク質を回収する工程。
【請求項２】
セラミド移転タンパク質CERTが、配列番号:11又は配列番号:13のアミノ酸配列を有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
セラミド移転タンパク質CERTが、変異したセラミド移転タンパク質CERTであり、前記変異が、CERTの任意のセリン、スレオニン又はチロシンの位置にあるリン酸化部位を不能にさせる及び／又は欠失させる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
セラミド移転タンパク質CERTが、変異したセラミド移転タンパク質CERTであり、前記変異が、CERTの132位のタンパク質キナーゼD（PKD）リン酸化部位を不能にさせる及び／又は欠失させる、請求項３記載の方法。
【請求項５】
変異CERTがCERTS132A（配列番号:15）である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記方法が、対象の前記タンパク質を発現するコントロール細胞と比較して、対象の前記タンパク質の比細胞生産性の増加を前記細胞でもたらすが、前記コントロール細胞では、セラミド移転タンパク質CERT又はその誘導体の発現が増加していない、請求項１から５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）、サル腎CV1、サル腎COS、ヒトレンズ上皮PER.C6TM、ヒト胎児腎、HEK293、ベビーハムスター腎、アフリカミドリザル腎、ヒト子宮頸癌、イヌ腎、バッファローラット肝、ヒト肺、ヒト肝、マウス乳癌若しくはミエローマ細胞、イヌ、ブタ若しくはマカク細胞、ラット、ウサギ、ネコ、又はヤギ細胞である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
対象のタンパク質が抗体又は抗体フラグメントである、請求項１から８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
以下の（i）から（iii）の工程を含む、細胞における対象の膜タンパク質又は分泌タンパク質の比細胞生産性をin vitroで高める方法：
i）少なくとも2つのポリペプチドをコードする核酸配列を含む1つ以上のベクター系を前記細胞に導入する工程であって、
a．第一のポリヌクレオチドは、セラミド移転タンパク質CERT又はその誘導体をコードし、かつ、
b．第二のポリヌクレオチドは前記対象のタンパク質をコードし、
前記誘導体は、原型CERT配列と配列が少なくとも95%同一であり、かつ、分泌に対して原型CERT配列と同等の作用を示すポリペプチド分子である、前記工程、
ii）前記細胞を培養液中で培養する工程であって、前記対象のタンパク質及びセラミド移転タンパク質CERT又はその誘導体が前記細胞によって発現され、かつ、前記対象のタンパク質が前記培養液中へ分泌される、前記工程、及び
iii）前記培養液から前記対象のタンパク質を回収する工程。
【請求項１１】
以下の2つのポリヌクレオチドの両方を単一のベクター分子内に含む発現ベクター：
a．セラミド移転タンパク質CERT又はその誘導体をコードし、前記誘導体は、原型CERT配列と配列が少なくとも95%同一であり、かつ、分泌に対して原型CERT配列と同等の作用を示すポリペプチド分子である、第一のポリヌクレオチド、及び
b．対象の膜タンパク質又は分泌タンパク質をコードする第二のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
セラミド移転タンパク質CERTが、配列番号:11又は配列番号:13のアミノ酸配列を有する、請求項１１記載の発現ベクター。
【請求項１３】
変異CERTがCERTS132A（配列番号:15）である、請求項１１記載の発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１１から１３のいずれか１項記載の発現ベクターを含む細胞。
【請求項１５】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１４記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養技術の分野に関する。本発明は、タンパク質を製造する方法とともに、バイオ医薬の製造のための新規な発現ベクター及び宿主細胞を作製する方法に関する。本発明はさらに医薬組成物及び治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人間の治療に使用されるバイオ医薬の市場は急速に成長を続けており、270の新規なバイオ医薬が臨床試験で評価されつつあり、2003年には300億の概算売上げがあった（Werner, 2004）。バイオ医薬は種々の宿主細胞系（細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞及び哺乳動物細胞（ヒト由来細胞株を含む）を含む）から製造することができる。これまでのところ、真核細胞から製造されるバイオ医薬の数は、ヒトタンパク質を正確にプロセッシングしさらに改変することができるそれらの能力ゆえに増え続けている。これらの細胞からバイオ医薬を成功裡にかつ高収量で製造するということが、したがって極めて重要であり、そのような製造は、このプロセスで用いられる組換え単一クローン細胞株の性状に強く依存する。したがって、改善された特性を有する新規な宿主細胞系を作製すること及び高収量プロセスのための基礎として高い比生産性を有する生産細胞株を培養する方法を確立することが喫緊の要請である。
【０００３】
初期のアプローチではプロセス設計及びリアクター設計に焦点が当てられた。今や主要な改善は、培養液処方の開発及び宿主細胞の遺伝子操作によって推進されている。バイオ医薬の製造のためにもっとも一般的な工業用哺乳動物宿主細胞系は、不朽化チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞株である（Wurm, 2004）。
哺乳動物系生産細胞株の改良を目的とする初期の代謝操作戦略では、無血清培地で増殖するそれらの能力に焦点が当てられた。CHO-K1細胞でのトランスフェリン及びインスリン様増殖因子1（IGF-1）の安定な発現は、無タンパク質条件下で分裂することができる細胞株をもたらした（Pak et al. 1996）。生産細胞株の改良を目的とするさらに別のアプローチは、転写ホットスポットを標的にするか、又は前記を作出するためにトランスフェクションベクターで調節性DNAエレメントを使用することを含む。調節性エレメント、例えばS/MAR（足場／マトリックス結合領域）（前記は染色質構造及ハウスキーピング遺伝子由来UCOE（遍在性染色質オープニングエレメント）を生じる）は、ともにCHO細胞株から製造される組換えタンパク質の比生産性に対し正の方向に影響を与えることが示された（Barnes and Dickson, 2006）。
アポトーシスが哺乳動物細胞培養の製造プロセス中における細胞死の主要原因であることが示されたので（al-Rubeai and Singh, 1998）、哺乳動物宿主細胞における抗アポトーシス遺伝子発現の培養生存率に対する影響が徹底的に調べられた。抗アポトーシス操作戦略の大半が、bcl-2ファミリー（例えばbcl-1又はbcl-xL（Kaufmann and Fussenegger, 2003））の抗アポトーシス遺伝子の過剰発現に焦点が当てられている。発酵中のアポトーシス刺激（例えば栄養枯渇及び老廃物の蓄積）に対する細胞の耐性を高めることによって、アポトーシス操作細胞株を用いた製造プロセスでは長期培養の生存性が示され、いくつかの事例では生成物収量の増加が示された（Chiang and Sisk, 2005）。
【０００４】
大半のバイオ医薬製品が製造プロセスで細胞から分泌されるタンパク質であるので、生産細胞株の分泌性輸送機構は、宿主細胞操作の新規な戦略のためのまた別の重要な標的である。
タンパク質の分泌は複雑な多工程メカニズムである。すなわち、細胞外間隙又は外側原形質膜に輸送される運命にあるタンパク質は、先ず初めに翻訳と同時に小胞体内に運び込まれる。タンパク質はそこから脂質小胞に包まれてゴルジ装置に輸送され、最終的にトランス-ゴルジネットワーク（TGN）から形質膜へ輸送される。前記形質膜でそれらは培養媒体中に放出される（Seth et al. 2006）。
いずれのバイオ医薬製造プロセスの収量も、生産細胞をプロセス条件下で増殖させたときに前記細胞が単位時間に分泌するタンパク質生成物の量に大きく左右される。治療用タンパク質を真核細胞で合成及び分泌させるには多くの複雑な生化学的細胞内プロセスを必要とする。これらの工程、例えば転写、RNA輸送、翻訳後修飾及びタンパク質輸送は全て野生型宿主細胞株で厳密に調節され、この宿主から誘導されるいずれの生産細胞株の比生産性にも大きな影響を与えるであろう。
操作アプローチの多くが、例えば転写及び翻訳のようなプロセスを駆動させる分子ネットワークの理解の深まりを利用して、タンパク質製造におけるこれらの工程の収量を増加させてきた。しかしながら、いずれの多工程製造プロセスに関しても、一連のプロセスの初期工程時の隘路を拡大することは、さらに下流（特に翻訳後）に隘路を作る可能性がある。一定の閾値まで、生産細胞の比生産性は生成物の遺伝子の転写レベルと直線的な相関性を示すと報告された（Barnes et al. 2007）。mRNAレベルにおける生成物発現の更なる強化は、しかしながらタンパク質の合成、折りたたみ又は輸送機構の負荷過多につながり、タンパク質生成物の細胞内蓄積をもたらす可能性がある。実際、このような状況は従来の製造プロセスでしばしば観察することができる（図1）。
【０００５】
この問題点に主眼を置き、真核細胞のタンパク質生成物の分泌の効率的な改善を目指す、標的特定操作アプローチは、タンパク質の形質膜への輸送を駆動する複雑な調節ネットワークについてのこれまでの理解不足のために妨げられている。
分泌された治療用タンパク質の細胞内輸送の操作についての最初の研究は、結合タンパク質BiP/GRP78、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（PDI）のような分子シャペロンの過剰発現周辺に集中した。シャペロンは小胞体（ER）内で主人役を務める細胞タンパク質であり、新規に合成されたタンパク質の折り畳み及びアッセンブリを助ける。予想した事柄とは対照的に、哺乳動物細胞におけるBiP過剰発現は、BiPが密接に関与するタンパク質の分泌を増加させるのではなくかえって低下させることが示された（Dorner and Kaufman, 1994）。同様に、CHO細胞でのPDIの過剰発現はTNFR:FC融合タンパク質の発現を低下させ（Davis et al. 2000）、一方、抗体の生成比速度は40%増加した（Borth et al. 2005）。細胞のタンパク質折り畳み能力の増加は製造の隘路をさらに下流に作り出すという、これらの驚くべき発見に対する可能な説明は、CHO細胞株におけるIFN-γ製造についてERからシス-ゴルジへの輸送の問題を述べた報告によって支持される（Hooker et al. 1999）。
哺乳動物細胞の分泌能力を高めるためのまた別の最近のアプローチは、転写因子X-ボックス結合タンパク質（XBP-1）の異種性過剰発現である。XBP-1は、プラズマ細胞（抗体の高レベル生成及び分泌のために最適化された特殊細胞タイプ）の分化における主調節因子の1つである（Iwakoshi et al. 2003）。XBP-1は、広域の分泌経路遺伝子のプロモーター内でいわゆるERストレス応答エレメント（ERSE）と結合することによってこのプロセスを調節し、（i）ERの物理的拡張、（ii）ミトコンドリアの質量及び機能の強化、（iii）より大きな細胞サイズ、及び（iv）総タンパク質合成の強化をもたらす（Shaffer et al. 2004）。
【０００６】
非プラズマ細胞でXBP-1を過剰発現させることによってタンパク質分泌を増加させる試みが最近報告された。CHO-K1細胞において、2つのレポータータンパク質（分泌性アルカリ性ホスファターゼ（SEAP）及び分泌性アルファ-アミラーゼ（SAMY））の生成レベルは、XBP-1をCHO-K1細胞に導入した後で増加することが示された。しかしながら、他の細胞株、例えばHEK293、HeLa又はHT-1080細胞を用いた一過性実験では効果を示すことができなかった（Tigges and Fussenegger, 2006）。特許出願WO2004111194（Ailor Eric）では、高度に生産性である細胞株の作製のためにXBP-1又はATF6を過剰発現させることが特許請求の範囲に記載されている。
注目すべきことには、XBP-1は、プラズマ細胞分化を調節するだけでなく、非折り畳みタンパク質の応答（UPR）でも重要な役割を果たす（Brewer and Hendershot, 2005）。UPRは、小胞体（ER）でのタンパク質折り畳みの阻害によって活性化される複雑なシグナルトランスダクションネットワークを表す。UPRはこのストレス状況に対する順応応答（ER内在性分子シャペロンの誘発及びタンパク質ホルダーゼ発現を含む）を統合して、ERのタンパク質折り畳み能力、リン脂質合成の誘発、全体的な翻訳の減弱化、及びERの非折り畳みタンパク質負荷を低下させるためのER関連分解のアップレギュレーションを増強させる。激しい又は長期のERストレス時には、UPRは究極的にアポトーシス性細胞死を誘発する（Schroder, 2006）。
【０００７】
最終分化（例えばリンパ球からプラズマ細胞への成熟）のプロセスは通常はアポトーシス様プログラムとみなされ、その間に細胞はその増殖能力を失い、最終的分化を遂げた分泌細胞を生じる。実際、高レベルのタンパク質を分泌するように特異的に設計されたほぼ全ての細胞タイプ（例えば腺細胞、膵臓ベータ細胞）は、最終的な分化を遂げ、増殖することができず、最終的にプログラムされた細胞死を経る前の寿命は限られている（Chen-Kiang, 2003）。したがって、プラズマ細胞分化及びUPRの両者の調節因子としてXBP-1を過剰発現させることは、分裂を阻害するか及び／又はアポトーシスを誘発するその固有のリスクゆえに潜在的な不利益を有する。
総合すれば、組換えタンパク質の製造のために宿主細胞の分泌能力を改善することが希求されている。前記改善は、翻訳後に生じる隘路及びタンパク質生成物の細胞内蓄積を防止するために、新規な転写強化技術との組合せにおいて、さらに高力価プロセスにおいていっそう重要になろう（図1）。しかしながら、現時点では、分泌性輸送機構の標的設定操作の途上には2つの主要な障害（すなわち基礎的な調節メカニズムについてのなお限定的な知識及び付随する生産細胞の増殖阻害性及びアポトーシス性応答の予防の必要性）が存在する。
本発明は、分泌タンパク質の形質膜への輸送におけるセラミド移転タンパク質CERTについて新規で驚くべき役割を述べ、さらにまた真核細胞の分泌経路を介して輸送されるタンパク質の製造を効率的に改善する方法を提供する。
【０００８】
CERT（またグッドパスチャー（Goodpasture）抗原結合タンパク質としても知られている）は、セラミドをその小胞体（ER）の生成部位からゴルジ膜（ここでスフィンゴミエリン（SM）に変換される）へ輸送する非小胞系デリバリーにおいて決定的に重要な細胞質ゾルタンパク質である（Hanada et al. 2003）。
以下の2つのCERTアイソフォームが存在する：より豊富に発現され、幾通りかにスプライシングされる、26アミノ酸のセリン富裕領域を失った形態（配列番号:10、11）及び完全長の624アミノ酸タンパク質でCERTLと称されるもの（配列番号:12、13）（Raya et al. 2000）。両CERTアイソフォームが、セラミドの結合及び輸送に必要にして十分なカルボキシ末端のステロイド生成急性調節（StAR）関連脂質移転（START（steroidogenic acute regulatory related lipid transfer））ドメインを保持する（Hanada et al. 2003）。STARTドメインは、ハエ及び蠕虫からヒトまで高度に保存されている（図2）。それらは長さが約210アミノ酸であり、モノマー脂質を収容する疎水性のトンネルを形成する（Alpy and Tomasetto, 2005；Soccio and Breslow, 2003）。STARTドメインは15の哺乳動物タンパク質で見出され、CERTは、ホスファチジルコリン移転タンパク質Pctp（ホスファチジルコリン（PC）と結合し膜間を往復する）及びStarD10（PC及びPEに特異的な脂質移転タンパク質）と極めて近縁である（Olayioye et al. 2005；Soccio and Breslow, 2003；Wirtz, 2006）。STARTドメインに加えて、CERTタンパク質はさらに、ゴルジ局在に必要なPI(4)Pに特異性を有するアミノ末端PHドメイン（Hanada et al. 2003；Levine and Munro, 2002）、及びER内在性トランスメンブレンタンパク質VAP-A及びVAP-Bとの相互作用を介してERへタンパク質を誘導するFFATモチーフ（酸性鎖中に2つのフェニルアラニン）を有する（Kawano et al. 2006；Loewen et al. 2003）。
【０００９】
脂質トラフィッキングにおけるCERTの基本的役割がチャイニーズハムスター卵巣細胞株LY-Aで明らかにされた。前記細胞株では、非機能性CERT変異体タンパク質の発現によってセラミドの輸送が障害され、したがってスフィンゴミエリンの細胞内レベルが低下した（Hanada et al. 2003）。非小胞系脂質輸送はいわゆる膜接触部位（MCS）で生じると考えられ、前記膜接触部位でERは他の細胞内小器官とぴたりと寄り合うことになる（Levine and Loewen, 2006）。CERTはしたがってERとゴルジ膜との間の非常に短い距離を往復するか、又はおそらく両区画と同時に接触することができる。過剰に発現されたときには、CERTのSTARTドメインはゴルジ装置へのセラミド輸送に十分である（Kawano et al. 2006）。しかしながら、生理学的条件下では、ゴルジ及びERの両方に誘導するモチーフがCERTの機能には必須である。LY-A細胞では、CERTはそのPHドメイン内に変異（G67E）を含み、前記タンパク質のPI(4)P結合に欠陥を生じることが確認された（Hanada et al. 2003）。CERT機能のためにPI(4)Pが必要であることは、P14KIII-ベータ活性がゴルジへのセラミドの効率的なトラフィッキングに必要であり（Toth et al. 2006）、その酵素活性はタンパク質キナーゼD（PKD）によって刺激されるという最近の報告によってさらに支持される。
PKDはセリン／スレオニン特異的タンパク質キナーゼ（PKD1/PKCμ、PKD2及びPKD3/PKCυを含む）のサブファミリーに属し、ゴルジ膜から形質膜へのタンパク質輸送の調節に決定的に重要であることが最近確認された（以下で概説されている:Rykx et al. 2003；Wang, 2006）。TGNにおけるPKDの補充及び活性化は、脂質ジアシルグリセロール（DAG；Baron and Malhotra, 2002）によって仲介され、DAGプールはセラミド及びホスファチジルコリンからスフィンゴミエリンシンターゼによって生成される。
【００１０】
本発明は、PKDはPHドメインに隣接するセリン132でCERTをリン酸化し、それによってPI(4)P結合、ゴルジ誘導及びセラミド移転活性が負の方向に調節されることを示す。さらにまた、DAG産生に必要なセラミドをゴルジ膜に移転させることによって、CERTはPKD活性を刺激し、したがって構成的な分泌性輸送の維持を担保する調節的フィードバックループを確立させる。
重要なことに、提供データはまた、異なる真核細胞（COS7及びHEK293）において、CERTをコードする遺伝子の導入が、培養液中への異種タンパク質の分泌を顕著に強化することを示している。このことは、PKDによってリン酸化されえないCERT変異体を用いたときいっそう決定的である。CERT内にリン酸化アクセプター部位が欠如することによって、CERTでのPKDの負の制御が妨害されるが、PKDに対するCERTの正のフィードバックは、スフィンゴミエリン及びDAGへのセラミドの変換の維持により無傷のままである。したがって、本発明の分泌強化メカニズムは、野生型CERTによってだけでなくPKDの負の作用からCERTを解き放つ全ての変異体によってもまた駆動されえると推察できよう。前記変異体には、アクセプターセリンの点変異、この残基を含む欠失とともにCERT内のPKDドッキング部位又はSTARTドメインのみの変異若しくは欠失が含まれる。
CERTはStAR関連脂質移転タンパク質のファミリーに属する（Soccio and Breslow, 2003）（前記タンパク質は脂質結合のためのそれらのSTARTドメインを特徴とする）。CERTのSTARTドメインは、CERT作用のために必要かつ十分であることが明示されたので（Hanada et al. 2003）、CERTの分泌促進作用は、このタンパク質ファミリーの別のメンバーを過剰発現させたときにも等しく観察されえるであろうと考えられる。これは、PCTPサブファミリーの近縁メンバー（PCTP（配列番号:26、27）、CERT/GPBPそれ自体、StarD7及びStarD10を含む）については特にありそうなことである。これらのタンパク質は別個の脂質結合特異性を有し、異種タンパク質の分泌に中心的に関与する細胞内小器官の機能に等しく影響を及ぼしえよう。
さらにまた、ERストレス時に誘発される関連タンパク質SARD4（配列番号:20、21）及びSTARD5（配列番号:22、23）の発現は、製造プロセス進行時の細胞の脂質移転要求の高まりに対応するために機能することが可能である。
【００１１】
ハエ、蠕虫及びマウスからヒトにいたる真核生物にSTARTドメインタンパク質が存在することは、脂質トラフィッキングの基本的なメカニズムが真核生物界で保存されていることを示している。さらにまた、本発明に記載した原理（すなわちCERTの強制的発現による分泌の強化）は、全ての真核細胞（酵母を含む）に良好に応用しえることが示唆される。
要約すれば、本発明は、CERT、CERT変異体、又はSTARTタンパク質ファミリーの別のメンバーの異種発現によって真核細胞でタンパク質の分泌性輸送を強化する方法を提供する。本方法は、組換えタンパク生成物の発現及び製造のために生産能力が強化された最適化宿主細胞系の作製に特に有用である。
本発明に記載した方法はいくつかの点に関して利点を有する：
第一に、我々は、CERTの異種発現は、宿主細胞の分泌能力を高めることによって組換えタンパク質の製造を強化できる戦略であることを実証する。生産細胞の比生産性の強化は、工業的タンパク質製造プロセスにおけるより高い生成物収量に転換される。高力価プロセス及びより複雑な発現強化プロセスに向かいがちな従来の傾向により、翻訳後に生じる隘路はタンパク質製造における明白な速度制限工程となり、したがって分泌を操作するアプローチにますます注目が集まることになるであろう。
第二に、CERTのSTARTドメインは、C.エレガンス（C. elegans）からヒトに至る真核生物で高度に保存されている。このことは、本発明の方法は、哺乳動物宿主細胞系だけでなく、昆虫細胞及び酵母細胞を含む全ての真核細胞でのタンパク質製造に等しく応用できることを強く示唆している。
【００１２】
第三の重要な特徴として、細胞質ゾル因子としてのCERTは非折り畳みタンパク質の応答部分ではなく、したがって、タンパク質の翻訳の停止を誘発し、もし解決がもたらされなければ細胞周期の停止又はアポトーシスにさえも至る、細胞のストレス応答プログラムに含まれない。対照的に、脂質トラフィッキングで独自の役割を果たすことによって、CERT標的化は、同時にアポトーシスを誘発することなくタンパク質の分泌強化を付与するかもしれない。したがって、宿主生産細胞でのCERTの過剰発現は、XBP-1系遺伝子操作によるアプローチよりも有利でありえよう。
第四に、CERTのSer132の変異はPKDによるCERTのリン酸化を障害し、この変異は負の調節の影響からCERTを解放するということが本発明で示される。一方、DAGを介するCERTによるPKDの正の刺激は無傷のままである（図3A）。この発見は、PKDのシグナリング経路の“上流”にCERTを据える（PKDは、分泌性輸送の後期（すなわちトランス-ゴルジネットワークから形質膜への輸送）の調節に決定的に必要とされると報告されている（Liljedahl et al. 2001））。タンパク質輸送に関して、このことは、CERTはERの“下流”で作用することを意味し、これによって、XBP-1又は特定のER内在性タンパク質と比較してCERTは操作の好ましい標的となろう（図3B）。
CERTは分泌経路の最後の工程でも影響を及ぼすことができるので、CERTの異種発現は、更なる下流に隘路を生じることなく分泌を強化する潜在能力を有すると予測することができる。我々の知る限り、CERTはこれまでのところ、異種タンパク質製造強化を目的とする分泌経路の遺伝子操作に対して最下流で作用する標的である。
総合すれば、脂質移転タンパク質CERTのERからゴルジへ、さらにゴルジ装置から形質膜への分泌性輸送に及ぼす強い影響は、増殖阻害性又はアポトーシス誘発性ストレス応答との不利なつながりを生じることなく、真核細胞の分泌能力の強化を意図する遺伝子操作のアプローチのためにCERT、CERT変異体及び他のSTARTファミリータンパク質を非常に有利で有望な標的にする。
【００１３】
応用性
本発明で述べるCERTの標的設定操作は広範囲の応用で用いることができる。特に以下の2つの基本的なアプローチに区別することができる：（i）細胞の分泌性輸送能力を高めるためにCERT又はCERT誘導体の過剰発現及び／又はその活性の強化、（ii）癌細胞の分裂及び／又は侵襲の緩和を目的とする癌治療の手段としてCERTの活性及び／又は発現の抑制。
CERT過剰発現の応用性：
本発明は、CERT、CERT変異体又はSTARTタンパク質ファミリーの他のタンパク質をコードする遺伝子を導入することによって改善された、異種タンパク質製造用真核宿主細胞を作製する方法について述べる。本方法は、真核細胞を用いる製造プロセスでタンパク質収量の増加を可能にするであろう。したがって、本方法はそのようなプロセスの製品のコストを減少させ、同時に、治療用タンパク質の研究、診断、臨床試験又は市場供給のために要求される材料を生成するために製造しなければならないバッチ数を削減させるであろう。さらにまた、十分な量の前臨床試験用材料の生成はしばしば時間的制限が極めて重要な作業パッケージであるので、本発明によって薬剤開発が加速されるであろう。
本発明は、診断目的、研究目的（標的認定、先導物質認定、先導物質最適化）、又は市場若しくは臨床開発における治療用タンパク質の製造のいずれかのために、1つ又はいくつかの特定のタンパク質の生成に用いられる全ての真核細胞の特性を高めるために用いることができる。
本発明で示されるように、CERTの異種発現は、タンパク質分泌を強化するだけでなく、細胞表面のトランスメンブレンタンパク質の豊富さにも影響を与える。CERTの阻害又は発現低下は、細胞表面レセプター（例えばトランスフェリンレセプター）量の甚だしい減少をもたらす（図8）。分泌タンパク質及びトランスメンブレンタンパク質は同じ分泌経路を共有し、脂質小胞に等しく輸送されるので、これらのデータは、分泌調節とともに膜結合細胞表面レセプターの輸送におけるCERTの重要性を強調している。
したがって、本明細書で述べる方法はまた、細胞表面レセプターの機能の特徴を調べようとする学術的研究及び工業的研究の目的のために用いることができる。例えば、本方法は、表面タンパク質の製造及びその後の精製、結晶化及び／又は分析に用いることができる。細胞表面レセプターは薬剤の標的の主要なクラスであるので、本方法は新規なヒトの薬剤療法の開発に決定的に重要である。さらにまた、本方法は、細胞表面レセプターと密接に関連する細胞内シグナリング複合体の研究、又は細胞間情報伝達（前記は、部分的に可溶性増殖因子とそれらの対応する同一細胞又は別の細胞上のレセプターとの相互作用によって仲介される）の解析のために有益でありえよう。
【００１４】
CERTの低下／阻害の応用性：
本発明で、我々は、CERT発現の低下が豊富な細胞表面レセプターの減少とともに可溶性細胞外タンパク質の分泌低下をもたらすことを示す証拠を提供する。これは、CERTを治療的操作のための標的として魅力あるものにする。
正常で健康な細胞から癌細胞への転換を示す特徴の1つは、外因性増殖因子の存在からの独立性の獲得である（Hanahan and Weinberg, 2000）。正常な細胞とは対照的に、腫瘍細胞は、それらの生存及び分裂に必要な全ての増殖因子を独力で産生することができる。このオートクラインメカニズムに加えて、癌細胞はしばしばそれらの表面の増殖因子レセプターの発現のアップレギュレーションを示す。前記アップレギュレーションによって、周辺組織の細胞から分泌されるパラクライン作動性増殖因子及び生存因子に対する応答性の増加がもたらされる。例えばsiRNAアプローチを用いて腫瘍細胞のCERTを標的とすることにより、2つの方法、すなわち（i）増殖因子の輸送及び分泌を低下させることによって、及び（ii）腫瘍細胞上の対応する増殖因子レセプターの量を減少させることによって、オートクライン性とともにパラクライン性増殖刺激及び／又は生存メカニズムを破壊することが可能であるかもしれない。それによって、増殖刺激シグナルの量及びこれら刺激を感知して応答する癌細胞の能力の両方が低下するであろう。癌細胞におけるCERT発現の阻害は、したがって癌細胞の分裂及び生存を妨げる強力なツールとなりえる。
さらにまた、CERTは、腫瘍の侵襲及び転移を抑制するための強力な治療用標的でありえる。ほとんどのタイプのヒトの癌の後期に、原発腫瘍は、転出して隣接組織に侵襲し、さらに新規なコロニーを立ち上げることができる遠位部位へと移動する（転移として知られている）パイオニア細胞を数多く産出する。
【００１５】
組織侵襲の前提条件として、癌細胞は、それらが周囲の健康な組織を通過して移動し、基底膜を貫通し、血流に乗り、最終的に目的地の組織に侵襲することを可能にするプロテアーゼの全セットを発現させる。これらのプロテアーゼのいくつかは、膜結合タンパク質（例えばMT-MMP（Egeblad and Werb, 2002）及びADAM（Blobel, 2005））として発現される。マトリックス改造、増殖因子の放出及び腫瘍侵襲におけるそれらの決定的な役割ゆえに、プロテアーゼ自体が癌治療用薬剤の標的として議論されている（Overall and Kleifeld, 2006）。我々の仮説は、腫瘍細胞におけるCERTの発現及び／又は活性の阻害は、標的とされる細胞の表面の膜結合プロテアーゼの量を減少させるであろうということである。これによって、腫瘍細胞の侵襲能力とともにその増殖因子放出能力が低下するか又は障害され、腫瘍の侵襲及び転移の潜在能力の低下をもたらしえる。したがって、CERTを標的とすることによって、後期腫瘍形成、特に良性／固形結節から攻撃性で転移性の腫瘍への転換を予防する新規な方法が提供される。
治療的応用のためには、したがって、CERTの活性及び／又は発現の低下及び／又は阻害が目標である。前記目標は、CERT機能を阻害することにより疾患を治療するためにヒトの治療薬として用いられるヌクレオチド組成物（したがって薬剤はRNAi及びsiRNAを含む）によって、又はCERT RNAの配列モチーフとの結合によりCERTを特異的に阻害するアンチセンスRNAによって達成することができる。CERT活性／発現の低下／阻害はまた、CERT遺伝子のプロモーターと結合してこれをサイレンシングさせるヌクレオチドを含む薬剤物質によって達成することができる。
さらにまた、薬剤物質又は生成物は、CERTの発現又は活性を阻害する新規な化学物質又はペプチド又はタンパク質を含むことができる。タンパク質が活性な医薬化合物である事例では、前記は以下のタンパク質でありえる：（i）CERTプロモーターと結合し、それによってCERT発現を阻害するタンパク質、（ii）CERT又はPKDと結合し、したがってPKDとCERTの結合を妨げ、さらにPKDによるCERTリン酸化を妨害するタンパク質、（iii）CERTと類似するが、CERTの機能を果たさないタンパク質（前記は“優性ネガティブ”CERT変種を意味する）、又は（iv）CERT及びPKDの両方ための足場として機能し、CERTとPKDとの不可逆的結合（＝安定的PKD/CERT複合体）を生じるタンパク質（前記複合体は、PKDによるCERTの阻害性リン酸化及び前記複合体からのCERTの解離の妨害のために機能しない）。
【発明の概要】
【００１６】
本発明は従来技術から自明のものではない。本発明の時点まで、タンパク質CERTに関して利用可能な実験的データは、スフィンゴミエリンの前駆体としてのセラミドの小胞体からゴルジ装置への輸送における役割を指摘しただけであった。本発明で開示するデータのみが、真核細胞でのゴルジから形質膜へのタンパク質輸送におけるCERTの役割についての新規な作業モデルをもたらす。従来技術は、CERT又はSTARTドメインタンパク質ファミリーのまた別のメンバーをコードする遺伝子を導入することにより真核細胞株でタンパク質の分泌性輸送速度を強化する可能性に関して何らのヒントも与えない。
瞠目に値する予想外の本発明の作業モデルは、新規なin vivo PKD基質及び決定的に重要なゴルジ機能調製物質としてCERTを認定する。
PKDは従来技術で公知である。前記は、3つの構造的に関連するメンバー、PKD1/PKCμ、PKD2及びPKD3/PKCυを含む、セリン／スレオニン特異的タンパク質キナーゼファミリーである。PKDは2つのアミノ末端ジンクフィンガー様システイン富裕モチーフ（DAGと結合する）、プレックストリン相同性（PH）ドメイン（PKD酵素機能を負の方向に調節する）及びカルボキシ末端キナーゼドメインを含む。
3つのPKDアイソフォームが細胞質ゾル、核、ゴルジ複合体及び形質膜に局在し、そこでそれらは、分裂、分化、アポトーシス、細胞骨格再編及び転移から小胞トラフィッキングに及ぶ多様な細胞プロセスを調節する（以下の文献で概説される：Rykx et al. 2003；Wang, 2006）。これまでのところ、いくつかの生理学的なPKDの基質が知られているだけである（前記にはニューロンタンパク質Kidins220、RasエフェクターRIN1、ヒストンデアセチラーゼ5、E-カドヘリン及びPI4KIIIβが含まれる（Iglesias et al. 2000；Jaggi et al. 2005；Vega et al. 2004；Wang et al. 2002）。TGNでは、PKDは、細胞表面への途上で輸送担体の分裂に決定的に必要とされる（Liljedahl et al. 2001；Yeaman et al. 2004）。PKDは、そのシステイン富裕領域によってTGNに補充され（Baron and Malhotra, 2002；Hausser et al. 2002；Maeda et al. 2001）、そこでPKCc仲介リン酸化によって活性化される（az Anel and Malhotra, 2005）。最近、PI4KIIIa（ゴルジ装置の構造及び機能におけるキープレーヤー）がこの細胞内小器官におけるPKD基質であると認定された（Hausser et al. 2005）。セリン294におけるPI4IIIaのPKD仲介リン酸化はその脂質キナーゼ活性を促進し、ホスファチジルイノシトール4-ホスフェート（PI(4)P）の生成及び水疱性口内炎ウイルスGタンパク質の形質膜への輸送の強化がもたらされる（Hausser et al. 2005）。
【００１７】
タンパク質キナーゼD（PKD）は、トランス-ゴルジ-ネットワーク（TGN）における分泌性輸送で決定的に重要な調節因子と認定されている。TGNにおけるPKDの補充及び活性化は脂質ジアシルグリセロール（DAG）によって仲介され、DAGプールはスフィンゴミエリンシンターゼによってセラミド及びホスファチジルコリンから生成される。小胞体からゴルジへのセラミドの非小胞系輸送は、脂質移転タンパク質CERTによって仲介される。これは、例えば以下の文献（Hanada et al. 2003, Nature 426:803-809；及びHanada 2006, Molecular and Cellular Biochemistry 286:23-31）とともに対応する特許出願WO2005004898及びEP1652530に記載されている。しかしながら、これらの文献のいずれにおいても、Hanadaは、診断、研究又は治療目的のためのタンパク質を製造する方法で、CERT（まして他のSTARTドメインタンパク質についても）の発現又は活性を調節することについて示唆していない。さらにまた、これらの文献／特許出願には、CERT発現又は活性を低下させるか、又は完全に遮断する遮断剤の医薬組成物における使用はまったく記載されていない。Hanadaは、むしろセラミド輸送の促進のための薬剤としてCERTそのものを使用すると結論している。
しかしながら、本発明は、CERTを新規なin vivo PKD基質と認定する。PKDによるセリン132のリン酸化は、CERTのその脂質標的、ゴルジ膜のホスファチジルイノシトール4-ホスフェートに対する親和性を低下させてセラミド移転活性を低下させ、PKDが脂質恒常性の調節因子であると確認される。本発明はまた、CERTはその対応する場面でPKD活性化及び形質膜へのPKD依存性タンパク質輸送に決定的に重要であることを示す。PKDとCERTの相互依存性はしたがって、ゴルジ膜の完全性維持及び分泌性輸送の要である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】細胞内生成物の蓄積：補給式バッチ発酵（Fed-batch fermentation）中に3つのプロセスで示される細胞内生成物の増加。ヒトIgG抗体を発現する、3つの異なるCHO生産細胞クローン（それぞれプロセスA（丸）、B（ひし形）、及びM（三角））を用いて補給式バッチ発酵を実施した。1日おきに細胞サンプルを取り出し、固定して直接免疫蛍光に付して抗体軽鎖を検出した。生成物の量はFACSで測定し、1日目の量に対してプロットした。
【図２】STARTドメインタンパク質ファミリー：（A）ヒトSTARTドメインタンパク質、（B）それらのドメイン構成（4TM：4つのトランスメンブレン、Pre：ミトコンドリア前配列、Thio：アシル-CoAチオエステラーゼ）、及び（C）ハエ及び蠕虫におけるそれらの相同性（Soccio and Breslow, 2003）。
【図３】CERTはゴルジ機能の決定的な調節因子であり、分泌経路でXBP-1の下流で作用する：（A）CERTとPKDは調節性フィードバックループでつながっている。模式図は、従来の作業仮説の要旨で、PKDはDAGによって活性化され、CERTをリン酸化する。リン酸化されたCERTはPI(4)Pから離れ、その到着部位でセラミドを遊離させる。ゴルジでセラミドはスフィンゴミエリン及びDAGに変換され、DAGは対応する局面でPKD活性化に必要である。この循環経路はCERTリン酸化部位の変異（S132A）によって妨害されえる。（B）この模式図は、ER及びゴルジ区画による転写及び翻訳から形質膜への分泌タンパク質の経路を示す（形質膜でタンパク質は最終的に細胞から培養液中に遊離される）。矢印は、タンパク質製造の強化を目指す最近の遺伝子操作によるアプローチを表す。大半の努力が転写強化技術に、少しが翻訳の操作に向けられ、さらに現時点では、ER内での翻訳後プロセッシングに必要とされるタンパク質（BiP、PDI及びXBP-1）を標的とする3例が報告されているだけである。CERTは分泌経路においてERの下流で働き、したがって我々の知るところでは、分泌プロセスのより後期における操作の最初の標的である。
【図４】CERTはPKD基質抗体によって検出される：（A）Flagタグ付加CERTL及びCERTをコードする発現プラスミドをHEK293T細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に細胞を溶解し、CERTアイソフォームを抗Flag抗体で免疫沈澱させた。免疫沈澱タンパク質をSDS-PAGEに付し、続いてPKD基質抗体で（pMOTIF；上段パネル）、さらにストリッピング後に抗Flag抗体（下段パネル）でイムノブロッティングを実施した。（B）Flag-CERT発現プラスミドを、GFP-PKD1 K612W（PKD-KD）又は空ベクターとともにHEK293T細胞にトランスフェクトした。（A）に記載したようにウェスタンブロッティングでCERTを分析した。PKD-KDの発現をPKD特異的抗体によるイムノブロッティングによって実証した（C20；下段パネル）。（C）Flag-CERT及びPKD1-GFP発現プラスミドをCOS7細胞に同時トランスフェクトし、固定してFlag特異的抗体（赤）で染色した。提示した画像はいくつかの共焦点切片の積み重ねである。縮尺バーは20μmである。
【図５】PKDはCERTをセリン132でリン酸化する：（A）PKD基質抗体を得るために用いたペプチド及びCERTの2つの潜在的PKDモチーフのアラインメント。（B）Flagタグ付加CERT野生型（WT）、CERT-S132A、及びCERT-S272Aをコードする発現プラスミドをHEK293T細胞にトランスフェクトした。細胞を溶解し、CERTタンパク質を免疫沈澱させ、図4に記載したようにウェスタンブロッティングで分析した。（C）組換えGST-Flag-CERT野生型（WT）及びS132A融合タンパク質を、[32P]-a-ATPを含むキナーゼ緩衝液中で、精製PKD1の非存在下（−）及び存在下（＋）で30分インキュベートした。SDS-PAGEによってタンパク質を分離し、メンブレンに移した。放射性ホスフェートの取り込みをホスホイメージ（上段）を用いて分析し、続いてFlag特異的抗体を用いるイムノブロッティングを実施してCERTタンパク質が等しくローディングされていることを実証した。（D）組換えCERTタンパク質を、コールドのATPの存在下で（C）に記載したように精製PKD1を用いてin vitroキナーゼ処理に付した。pMOTIF抗体を用いてイムノブロッティングを実施し、さらにストリッピング後にFlag特異的抗体を用いてCERTタンパク質が等しくローディングされていることを実証した。PKD1及びCERTタンパク質には矢印で印が付されている。星印の付いたバンドは非特異的結合によるものである。
【図６】セリン132におけるCERTリン酸化はPI(4)Pの結合及びセラミド移転活性を調整する：GFPタグ付加CERT野生型（WT、配列番号:10、12）及びCERT-S132A（配列番号:14）をコードする発現プラスミドをHEK293T細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション24時間後に、低張性溶解によって細胞を採集し、100,000xgで遠心した後で細胞質ゾル分画を回収した。等量のGFP蛍光を含むサンプルを（A）タンパク質-脂質オーバーレイアッセイに用いた。CERT変種を一過性に発現するHEK293T細胞由来の細胞質ゾルを、種々のホスホイノシチドの濃度勾配をスポットしたメンブレンとともにインキュベートし、結合CERTタンパク質をそれらのGFPタグを介して検出した。（B）TNPPE及びパイレン-セラミドを含むドナーリポソームを10倍過剰の非標識アクセプターリポソームと混合した。60秒後、GFPタグ付加CERT野生型（WT）、S132A、又はGFP単独（con）を一過性に発現する細胞由来の細胞質ゾルを添加し、395nmのパイレン蛍光を記録した（励起：340nm）。スペクトルをトリトンX-100中での最大蛍光及び最大GFP蛍光に対して標準化した。
【図７】CERTはPKD活性化及び分泌性輸送を調節する：（A）Flagタグ付加CERT野生型（配列番号:10、12）又はCERT変異体S132A（配列番号:14）をトランスフェクトしたHEK293T細胞の全細胞溶解物のウェスタンブロット。前記ブロットをホスホ特異的pS916 PKD抗体（上段パネル）、PKD特異的抗体（中段）及びFlag特異的抗体（下段）プローブでそれぞれ調べ、Flagタグ付加構築物の発現を実証した。（B）Flag-ss-HRP及び空ベクター（黒棒線）、PKD1-GFPキナーゼ活動停止（KD、白棒線）、Flag-CERT野生型（WT、薄灰色棒線）又はFlag-CERT-S132A（濃灰色）を同時トランスフェクトしたHEK293T細胞の上清中のHRP活性の測定。培養液交換後の表示時点における相対的光単位（relative light unit, RLU）をプロットした。値はトリプリケートサンプルの平均に一致する。誤差バー＝SEM。（C）COS7細胞におけるGFP-CERT（緑）及びシス／メディアル-ゴルジマーカーGS28（赤）の共焦点免疫蛍光。提示した画像はいくつかの共焦点切片の積み重ねである。縮尺バーは20μmである。（D）COS7細胞におけるGFP-CERT（緑）及びHPR-Flag（赤）の同時局在を示す共焦点画像の積み重ね。縮尺バーは20μm及び5μm（拡大）である。
【図８】RNA干渉によるCERTダウンレギュレーションは分泌性輸送を阻害する：（A）Mock-（白）、lacZ-（薄灰色＝lacZ-特異的siRNA配列番号:9）又はCERT-特異的siRNAオリゴヌクレオチド（濃灰色＝siCERT#1配列番号:7及び黒＝siCERT#2配列番号:8）のいずれかで処理したCOS7細胞の上清のHRP活性の定量的検出。トリプリケート実験の相対的光単位（RLU）が示されている。誤差バー＝SEM。（B）抗トランスフェリンレセプター抗体をプローブとして調べた（A）の細胞溶解物のウェスタンブロット。等しくローディングされていることは抗チューブリン特異的抗体によって確認された。
【図９】STARTドメインについてコンセンサスという用語：コンセンサスとは、このコンセンサス配列と一致するタンパク質の数の関系で与えられ、一致するアミノ酸の数の関係で与えられるものではない。前記は、80%コンセンサス配列という場合、比較されるSTARTドメインタンパク質の80%が特定の位置に一定のアミノ酸、例えば疎水性アミノ酸（“h”と省略される）を有することを意味する。このコンセンサス配列はWEB系プログラム“SMART”を用いることにより作製された（以下もまた参照されたい：Ponting & Aravind, 1999, TIBS, 24:130-132）。（A）STARTドメインタンパク質についての80%コンセンサス配列（配列番号:28）。（B）STARTドメインコンセンサス配列はSTARTドメインタンパク質のアミノ酸アラインメントから誘導された。このアラインメントは50%、65%及び80%コンセンサス配列を含む。  略語及び対応するクラスに関する理解のために以下のアミノ酸分類を参照されたい。<クラスキー残基>アルコール ｏ    S,T/脂肪族 ｌ    I,L,V/任意 ．    A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y/芳香族 ａ    F,H,W,Y/荷電を有する ｃ    D,E,H,K,R/疎水性 ｈ    A,C,F,G,H,I,K,L,M,R,T,V,W,Y/陰性 −    D,E/極性 ｐ    C,D,E,H,K,N,Q,R,S,T/陽性 ＋    H,K,R/小さい ｓ    A,C,D,G,N,P,S,T/極小 ｕ    A,G,S/ターン様 ｔ    A,C,D,E,G,H,K,N,Q,R,S,T
【図１０】CERTの導入はモノクローナル抗体産生を高める：Mock、CERT-WT又はCERT-SA変異体のための発現構築物を、ヒトモノクローナルIgG型抗体を分泌するCHO生産細胞に安定的に導入した。続いて、これら安定なクローンの比IgG生産性に対する前記トランスジーンの影響を、（A）連続ストック培養及び（B）図11に示すように補給式バッチ生産条件下で、各遺伝子型についてｎ＝3−4で測定した。誤差バーは標準偏差を示す。3つの別個の実験のうち1つの代表的な結果が示されている。
【図１１】異種CERTはHASの分泌を高める：（A）連続培養における力価及び生産性の増加。空プラスミド（“Mock”）、CERT野生型（CERT-WT）又はCERT変異体S132A（CERT-SA）を、ヒト血清アルブミン（HAS）を分泌するCHO細胞に安定的にトランスフェクトした。得られた安定な細胞プール（各遺伝子型についてｎ＝3）で、HASの力価を3−5連続継代中に測定した。各遺伝子型について、HASの比生産性（黒棒線）及び力価（灰色棒線）を計算し、3つのプールの平均値としてプロットした。誤差バーは標準偏差を示す。（B）及び（C）振盪フラスコで（A）の細胞を7日間増殖させ、3日目以降24時間毎に栄養補給した。細胞培養液からサンプルを3、5及び7日目に採取し、組換えHSA生成物の力価を測定した。比生産性（B）及び力価（C）を計算し、発酵時間に対してプロットした。以下の細胞を比較した：Mock細胞（白四角）、CERT-WT細胞（黒三角）、及びCERT-SA細胞（黒丸）；誤差バーは、各遺伝子型について3つの安定的プールの標準偏差を示す。  配列表についての説明配列番号:1：ヒトDNA CERT-S132AのためのPCRプライマー配列番号:2：ヒトDNA CERT-S132ArevのためのPCRプライマー配列番号:3：ヒトDNA CERT-S272AのためのPCRプライマー配列番号:4：ヒトDNA CERT-S272ArevのためのPCRプライマー配列番号:5：ヒトDNA CERT-138切端形のためのPCRプライマー配列番号:6：ヒトDNA CERT-138切端形revのためのPCRプライマー配列番号:7：siRNA/DNA siCERT-1配列番号:8：siRNA/DNA siCERT-2配列番号:9：siRNA/DNA siLacZ配列番号:10：ヒト：CERT cDNA配列番号:11：ヒト：CERTタンパク質配列番号:12：ヒト：CERT L cDNA配列番号:13：ヒト：CERT Lタンパク質配列番号:14：ヒト：CERT S132A cDNA配列番号:15：ヒト：CERT S132Aタンパク質配列番号:16：ヒト：STARTドメインCERT cDNA配列番号:17：ヒト：STARTドメインCERTタンパク質配列番号:18：ヒト：STARTドメインCERT L cDNA配列番号:19：ヒト：STARTドメインCERT Lタンパク質配列番号:20：ヒト：StarD4 cDNA配列番号:21：ヒト：StarD4タンパク質配列番号:22：ヒト：StarD5 cDNA配列番号:23：ヒト：StarD5タンパク質配列番号:24：ヒト：StarD6 cDNA配列番号:25：ヒト：StarD6タンパク質配列番号:26：ヒト：PCTP cDNA配列番号:27：ヒト：PCTPタンパク質配列番号:28：STARTドメインコンセンサス配列（図9）
【発明を実施するための形態】
【００１９】
タンパク質のリン酸化による翻訳後修飾は、配座の変化を誘発する一般的なメカニズムであり、この配座変化によって、酵素活性が調整され、タンパク質-タンパク質相互作用が仲介され、又は細胞内分布が調節される。PKDは、ゴルジ複合体における重要な調節因子であり、PI4IIIβがこれまで確認された唯一の局所的基質である。ゴルジ複合体に局在するCERTタンパク質がPKDの基質として供されえるのか否かを試験するために、我々は、PKDによってリン酸化されたコンセンサスモチーフに対してホスホ特異的基質抗体（pMOTIFと称される）を作製した（Doppler et al. 2005）。Flagタグ付加CERT及びCERTLをコードする発現ベクターをHEK293T細胞にトランスフェクトした。CERTアイソフォームをFlag特異的抗体で免疫沈澱させ、pMOTIF抗体によるウェスタンブロッティングで解析した（図4）。CERTの分子量に一致するpMOTIFシグナル、及びそれよりも弱いがCERTLの分子量に一致するものが検出された（図4A）。リン酸化CERTLアイソフォームの検出が弱いのは、凝集を形成するという前記の公知の性質と関係があるのかもしれない。凝集の形成はキナーゼに対するホスホ部位の接近性に影響を与える可能性がある（Raya et al. 2000）。pMOTIF抗体によるCERTの認識がPKDに依存するのか否かを調べるために、HEK293T細胞でPKD1のキナーゼ活動停止変種（K621W）とともにCERTを発現させた。この変異体はゴルジ複合体に局在することが示され、優性ネガティブ態様でPI4KIIIβリン酸化を抑制した（Hausser et al. 2005）。不活性なPKDの同時発現によってpMOTIF抗体によるCERTの検出は停止し、pMOTIFシグナルは実際にPKD仲介CERTリン酸化によるものであることが示唆された（図4B）。脂質移転タンパク質はMCSで作用すると考えられる。MCSはERとTGNの間で形成され（Levine and Loewen, 2006）、ここにPKDが局在する。GFP-タグ付加PKD1を同時発現させたCOS7細胞でのFlag-タグ付加CERTの免疫蛍光染色によって、この2つのタンパク質がゴルジ複合体に同時局在することが立証された（図4C）。RNA干渉実験によって、PKD1及びPKD2の同時ノックダウンがCERTリン酸化の低下に要求されることが示唆され、このことは、これら2つのアイソフォームはもっぱらCERTのリン酸化に必要であることを示し、一方、PKD3はより軽い役割を果たすように思われる（データは示されていない）。この実験結果は、以前に報告されたPKD1及びPKD2のオーバーラップする基質特異性と一致する。例えば、PKD1及びPKD2は両者ともPI4KIIIβをリン酸化することが示されたが、一方、PKD3はリン酸化しなかった（Hausser et al. 2005）。
【００２０】
CERTのpMOTIF認識部位を認定するために、我々は、セリン又はスレオニンに対応する、-5位のロイシン、イソロイシン又はバリン残基及び-3位のアルギニンを特徴とする、潜在的なPKDコンセンサスモチーフを探した。132位と272位の2つのセリン（PKDコンセンサスモチーフと合致し、種全体で保存されている（図5A））を位置特異的変異導入によりアラニンと交換した。これらの変異体をHEK293T細胞で発現させ、pMOTIF抗体による認識について試験した。興味深いことに、セリン132のアラニンへの変異によってpMOTIF抗体によるCERTの検出が停止し、電気泳動移動度の増加が生じ、リン酸化の停止が示唆された。一方、S272A変異はpMOTIFシグナルに影響を与えなかった（図5B）。このことは、セリン132は、PKD基質抗体によって特異的に認識されるPKDリン酸化部位であることを示唆している。PKDがCERTのこのセリン残基を直接リン酸化することができることを確認するために、精製PKD1及び大腸菌（E. coli）生成タンパク質の最初の138アミノ酸を含む組換えCERT GST-融合タンパク質を用いてin vitroキナーゼアッセイを実施した。切端野生型CERT融合タンパク質を[γ-32P]-ATPの存在下でPKD1とインキュベートしたとき、放射能の取り込みが検出された（図5C）。検出はCERT-S132A融合タンパク質の場合には顕著に障害された。野生型（CERT-S132Aではなく）のin vitro PKDリン酸化によって、pMOTIF抗体のための認識部位が生成されることがさらに示された（図5D）。総合すれば、これらの結果は、CERTはPKDの正真正銘のin vitro及びin vivoのPKD基質であることを証明し、セリン132をCERTの特異的なPKDリン酸化部位と認定する。
【００２１】
セリン132はCERT PHドメイン（アミノ酸23−117）の極めて近位にあり、この部位でのリン酸化が、局所の陰性荷電を増加させることによってPI(4)P結合に影響を与えることを可能にする。我々は、したがってタンパク質-脂質オーバーレイアッセイを実施することによって、野生型CERT及びCERT-S132A変異体のPI(4)P結合を定量した。CERT変種を一過性に発現するHEK293T細胞の細胞質ゾルを、種々のホスホイノシチドの濃度勾配をスポットしたメンブレンとともにインキュベートし、結合したCERTタンパク質をそれらのGFPタグにより検出した。以前に報告されたように、完全長の野生型タンパク質はいくつかのリン脂質種との弱い結合を示したが、PI(4)Pとは強い相互作用を示した（Hanada et al. 2003；Levine and Munro, 2002）。CERT-S132AとPI(4)Pとの結合は、野生型タンパク質の結合と比較して2から4倍低濃度で検出することができ、CERT-S132A変異体とこのリン脂質との親和性の増加が示唆された（図6A）。総合すれば、これらのデータは、CERTは、ひとたびゴルジ複合体と結合するとPKDによってリン酸化されることを暗示している。これはCERTのPI(4)Pに対する親和性を低下させ、したがってCERTとゴルジ膜との相互作用が調節される。
【００２２】
CERTタンパク質は脂質移転タンパク質として機能することが示された（Hanada et al. 2003）。我々は、したがってセリン132でのCERTリン酸化が、セラミドと結合しこれを膜間で移転させるCERTの能力に影響を与えるか否かを調べた。この目的のために、野生型CERT及びCERT-S132AのGFPタグ付加型をHEK239T細胞で一過性に発現させ、細胞質ゾル分画をセラミド特異的脂質移転活性についてFRET系アッセイを用いて解析した（図6B）。このアッセイでは、蛍光ドナーとしてパイレン標識セラミド及び消光量のヘッド基標識TNP-PEを含む小さなユニラメラ小胞を用いた（Olayioye et al. 2005；Somerharju, 2002）。これらのドナーリポソームを過剰の非標識アクセプターリポソームと混合したとき、パイレン蛍光の増加はきわめて小さく、アクセプターメンブレンへの偶発的セラミド移転はわずかであることが示された（データは示されていない）。野生型CERT含有細胞質ゾルを添加したとき、蛍光の安定した増加が認められ、この現象は、ベクターをトランスフェクトした細胞のコントロール細胞質ゾルを用いたときには観察されなかった（図6B）。野生型タンパク質と比較して、CERT-S132Aはより高い脂質移転速度を示し、これはパイレン蛍光のより急激な増加から明白であった（図6B）。このことは、セリン132におけるリン酸化は、タンパク質と膜との結合を低下させることによってセラミド移転活性をダウンレギュレートすることを示唆している。以前のデータは、PKDは、PI4KIIIβのリン酸化仲介活性化によってゴルジ複合体におけるPI(4)Pレベルを調節することを既に示している（Hausser et al. 2005）。興味深いことに、PI4KIIIβは、ERとゴルジ複合体との間のセラミド輸送に決定的に重要である（Toth et al. 2006）。したがって、ここに提示したデータと合わせて、ゴルジ膜の脂質恒常性の維持におけるPKDの二元的役割は、CERTのオン率（PI(4)Pレベルを介する）及びオフ率（直接リン酸化を介する）を制御することによって明白となる。
【００２３】
ERからTGNへのセラミドの移転はこの区画におけるSM合成に必須である（Hanada et al. 2003）。ゴルジ局在SMシンターゼ1（SMS1）はセラミド及びPCを利用してSM及びDAGを生成する（Perry and Ridgway, 2005）（後者はPKD補充及び活性化に必要不可欠である（Baron and Malhorta, 2002））。TGNでのDAG生成を遮断する化合物は、PKDとTGNの結合を阻害し、分泌性輸送に干渉する（Baron and Malhorta, 2002）。したがって、CERTの過剰発現によるERからTGNへのセラミド輸送の増加は、局所DAGプールの上昇をもたらすはずで、結果的にPKD活性及び分泌性輸送を刺激することができる。この仮説を試験するために、HEK293T細胞でCERT野生型及びCERT-S132Aを一過性に発現させ、内因性PKDの自己リン酸化を解析した。コントロールと比較して、CERT野生型及びCERT-S132Aの両方の発現が、ホスホ特異的PKD抗体を用いた解析によって示されるようにPKD活性を増加させた（図7A）。この結果は、PKD活性化は、おそらくはセラミドデリバリーの増加及び強制的SM/DAG合成により、CERTタンパク質によって調節されることを示している。類似の機能が、CDP-コリン経路の調節を介する、ゴルジ装置のDAGレベルの維持で脂質移転タンパク質Nir2について最近記載された（Litval et al. 2005）。Nir2のRNAi-仲介ノックダウンは、ゴルジ複合体におけるDAG及びPKDのレベルを低下させ、分泌性輸送を遮断した。興味深いことに、この作用は外因性C6-セラミドの添加によって救済され（Litvak et al. 2005）、DAG合成及びゴルジ複合体へのPKD補充におけるセラミドに対する決定的な役割を示唆した。
【００２４】
CERT-仲介PKD活性化は分泌性輸送の強化に転換されるのか否かという問題に応えるために、我々は、シグナル配列（ss）と融合させたセイヨウワサビペルオキシダーゼをコードするプラスミドを利用した。融合タンパク質ss-HRPは構成的タンパク質分泌のためのレポーターとして用いることができる（Bard et al. 2006）。コントロール細胞では、ss-HRPの分泌は1時間以内に検出され、時間とともに増加した（図7B）。キナーゼ活動停止PKD1（積荷タンパク質の分泌性輸送を阻害する（Hausser et al. 2005；Liljedahl et al. 2001））の同時発現は、ほぼ完全にss-HRPの上清中への分泌を停止させた。これによって、HRPは我々のアッセイではPKD依存態様で分泌されることが確認された。CERT野生型及びCERT-S132Aの同時発現は分泌されるHRPの量を増大させた（図7B）。興味深いことに、CERT野生型タンパク質で観察された増加と比較してCERT-S132Aではわずかな分泌増加が観察できただけであった。これは、CERT及びCERT-S132Aによる同様な活性化（図7A）とは一致するが、CERT変異体のin vitro脂質移転活性が顕著に強化された（図6B）ことを考えると予想に反することであった。しかしながら、セラミドレベルの増加は必ずしもDAGの等価の増加に転換されないかもしれない。なぜならば、DAG合成は、PCの利用可能性及びSMシンターゼの活性によって制限を受ける可能性があるからである。セラミドの蓄積はゴルジ膜の安定性に影響を与え、小胞裂開を誘発する（Fukunaga et al. 2000；Weigert et al. 1999）。我々はしたがって、CERT-S132A変異体の過剰発現がその局在に影響を及ぼすか、及び／又はゴルジ装置の形態学的変化を引き起こすか否かを調べた。CERTはシス／メディアル-ゴルジマーカーGS28と一緒に局在することが示された（Hanada et al. 2003）。COS7細胞で発現させたGFP-タグ付加CERTの免疫蛍光解析によって、前記タンパク質はGS28陽性ゴルジ領域に局在することが示された（図7C）。対照的に、ゴルジ複合体におけるGS28との部分的同時局在に加えて、CERT-S132A変異体タンパク質は、広く散らばった斑点のある染色を示した。注目すべきことに、これらの小胞構造のいくつかは積荷タンパク質ss-HRPを含むことが見出され、実際これらの構造はゴルジ由来の輸送担体を表していることの証拠を提供している（図7D）。この発見は、セラミドレベルの局所的増加によるゴルジ膜構造の観察された変化と一致する（Fukunaga et al. 2000；Weigert et al. 1999）。
【００２５】
結論すれば、我々はCERTをPKD基質と認定し、膜脂質の生体合成及びタンパク質分泌との間の新規な関係についての証拠を提供する。我々は、PKDアクチベーターであるDAGのゴルジ膜での合成の基質としてセラミドを提供することによって、CERTは小胞による輸送プロセスで重要な役割を果たすことを示す。我々はさらに、この系は負のフィードバックループによって緊密に調節されることを示す。すなわち、活性を有するPKDはCERTをセリン132でリン酸化し、したがってその脂質標的PI(4)Pに対するCERTの親和性を低下させて、ERからゴルジ区画への脂質輸送の持続的往復を担保する。
本発明のデータは、CERTの過剰発現はタンパク質分泌を強化することを明瞭に示している。逆もまた正しいか否か（CERTの発現低下が分泌を低下させることを意味する）を調べるために、siRNA実験を実施した。HRPの活性は、両コントロール細胞で3時間後に検出され同等の類似するレベルを示した。対照的に、CERT特異的siRNAオリゴヌクレオチドのいずれかで処理された細胞では、HRP活性の劇的な低下が測定された（図8）。この結果は、CERTレベルの低下は細胞のHRP分泌の低下をもたらし、さらに分泌性輸送におけるCERTの重要な役割を強調する。
興味深いことに、タンパク質分泌だけでなく、トランスメンブレンタンパク質のトランスフェリンレセプターの豊富さもまたCERTの低下によって影響を受けた（図8B）。図8Aの細胞をプールし、その溶解物を、トランスフェリンレセプター特異的抗体をプローブとしてウェスタンブロット実験で調べたとき、トランスフェリンレセプター量の大きな減少が明白となったが、一方、両コントロール細胞で同様なトランスフェリンレセプターレベルが検出された。この発見は、脂質移転タンパク質CERTは、分泌タンパク質の輸送だけでなく、膜配置細胞表面タンパク質の輸送にもまた関与することを示唆している。このことは、両タイプのタンパク質が等しくERからゴルジを介して形質膜へ脂質小胞で輸送され、したがって、（我々が本発明で初めて明らかにするように）CERTによって影響される同じ細胞性輸出ルートを用いるので、驚くべきことではないかもしれない。
【００２６】
前記の発見及び本発明で開示するゴルジ複合体から形質膜への分泌性タンパク質輸送の調節のための、得られた新規なモデルを、バイオ医薬のためのタンパク質の製造に適用することができる。CERTの過剰発現は、多様なタンパク質、例えば抗体、サイトカイン、増殖因子（例えばエリスロポエチン又はインスリン）、表面レセプター（例えば上皮性増殖因子）及び膜結合プロテアーゼのバイオ医薬タンパク質の生成を高める。
本発明で開示する方法は広く全てのタンパク質製造プロセス適用することができるが、生産されるタンパク質の量によって測定されるこの戦略の成功の度合いは、特に対象のタンパク質の個々の性質によって左右されえる。CHO又は他の生産細胞にSTARTドメインタンパク質、例えばCERT、StarD4若しくはStarD5又はその変異体若しくは誘導体をコードする発現構築物をトランスフェクトする。注目に値することには、もっとも高い力価はリン酸化できないCERT変異体S132Aを発現する細胞で検出される。CERT及び特に変異体CERTの異種発現は、例えばモノクローナル抗体のタンパク質分泌を一過性トランスフェクションレベルで強化することができる。これは、医薬の研究及び開発で必要なより少量の薬剤候補物又は薬剤標的の迅速な生産のために特に有用でありえる。
本発明のさらに別の実施態様では、生産細胞株に上記と同じDNA構築物をトランスフェクトし、続いて選別に付して安定な細胞株を得る。選別工程に続く6回の細胞培養継代の間、培養上清を採集して対象のタンパク質の含有量を分析する。モノクローナル抗体の場合、タンパク生成物の濃度をELISAで決定し、細胞の平均数で割って比生産性を算出する。繰り返せば、最高値はCERT変異体を保持する細胞プールで認められる。STARTドメイン構築物を含む細胞では、MOCK又はトランスフェクトしていない細胞と比較して、対象のタンパク質発現は顕著に強化される。安定なトランスフェクタントをバッチ発酵又は補給式バッチ発酵に付した場合、非常に類似する結果を得ることができる。これらの設定の各々で、STARTドメインタンパク質の過剰発現は、安定的にトランスフェクトされたCHO細胞株と同様に一過性にトランスフェクされた細胞株で抗体、単一細胞タンパク質及び表面レセプターの発現強化をもたらし、STARTドメインタンパク質、例えばCERT又はStarD4及びStarD5は、発酵条件下での細胞の比生産性能力を強化することができることを示している。
【００２７】
定義
一般的な実施態様の“含む”又は“含まれる”は、より具体的な実施態様の“から成る”を包含する。さらにまた、単数形及び複数形は限定的に用いられるわけではない。
本発明の過程で用いられる用語は以下の意味を有する。
“STARTドメイン”という用語は、ステロイド生成急性調節タンパク質（StAR）関連脂質移転（START）ドメインを意味する。約200−210アミノ酸を含むこのドメインは、最初脂質結合ドメインとして認定された（Soccio and Breslow, 2003；Tsujishita and Hurley, 2000）。STARTドメインの長さは、STARTドメインファミリーメンバーに応じて、116から250アミノ酸、又は180から223アミノ酸、より具体的には219から223アミノ酸で変動する。STARTドメイン構造のもっとも驚くべき構造は、当該タンパク質のほぼ全長に伸びるもっぱら疎水性のトンネルで、これは、コレステロールのような大きな親油性化合物のひとつずつの分子と結合するために用いられる。STARTドメインファミリーのメンバーであるMLN64-STARTの構造解析によって、9本の鎖がより合わされたアンチパラレルβシート及び4つのαヘリックスから成るα／β型構造が明らかにされた（Tsujishita and Hurley, 2000）。多様な真核細胞タンパク質で見出されるドメインは‘古典的STARTドメイン’（CSD）と称され、一方、植物に特異的な同様のドメインはバーチ（Birch）アレルゲンSTARTドメイン（BA-START）として知られている。
“CERT”という用語は、CERTの両スプライス型、CERT（配列番号:11）及びCERTL（配列番号:13）を包含する。“CERT”という用語はさらにまた、配列番号:12のヌクレオチドから誘導されるCERTの可能な任意の他のスプライス型を包含する。“CERT”という用語はさらにまた、hCERTタンパク質及びその組換え体、hCERT、hCERTA、PHタンパク質、hCERT A MRタンパク質、及びhCERT STタンパク質を包含し、さらにまたPHhCERTタンパク質、MRhCERTタンパク質及びSThCERTタンパク質を包含する（さらに以下を参照されたい：EP1652530；Hanada, 2006；Hanada et al. 2003）。
【００２８】
一般的に“誘導体”という用語は、本発明の意図する使用を達成するために適切な配列を含む（これは当該配列が細胞内の分泌性輸送増加を仲介することを意味する）。
本明細書で用いられる“誘導体”という用語は、原型配列又はその相補性配列と配列が少なくとも70%同一であるポリペプチド分子又は核酸分子を意味する。好ましくは、前記ポリペプチド分子又は核酸分子は、原型配列又はその相補性配列と配列が少なくとも80%同一である。より好ましくは、前記ポリペプチド分子又は核酸分子は、原型配列又はその相補性配列と配列が少なくとも90%同一である。原型配列又はその相補性配列と配列が少なくとも95%同一であり、分泌に対して原型配列と同じか又は類似の作用を示す、ポリペプチド分子又は核酸分子がもっとも好ましい。
配列の相違は、異なる生物の相同性配列における相違から生じえる。それらはまた、1つ以上、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10のヌクレオチド又はアミノ酸の置換、挿入又は欠失による配列の標的設定修正から生じるかもしれない。欠失、挿入又は置換変異体は、位置特異的変異導入及び／又はPCR系変異導入技術を用いて生成することができる。対応する方法は、下記文献（Lottspeich and Zorbas, 1998）の36章の1及びさらに別の参考文献に記載されている。
参照配列（本発明では例えばSTARTドメイン配列番号:16、17又は18、19）の配列同一性は、例えば標準的な‘アラインメント’アルゴリズム、例えばBLAST（Altschul et al. 1990；Madden et al. 1996；Zhang and Madden, 1997）を用いることによって決定することができる。配列が全体的に一致するときにそれら配列でアラインメントを実施し、標準的‘アラインメント’アルゴリズムの支援により認定することができる。
さらにまた、本発明では、“誘導体”という用語は、配列番号:10、12、14、16、18、20、22、24、26とハイブリダイズするか、又はそのフラグメント若しくは誘導体を含むか、又は配列番号:10、12、14、16、18、20、22、24、26と相補的である配列を含む、核酸分子（一本鎖又は二本鎖）を意味する。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション下及び洗浄条件下で実施される（例えば5x SSCを含む緩衝液中で65℃にてハイブリダイゼーション；0.2x SSC/0.1% SDSを用いて42℃で洗浄）。対応する技術は例えば下記に記載されている：Ausubel et al. 2002。
“誘導体”という用語はさらに、タンパク質欠損変異体、特にセリン、スレオニン又はチロシンの位置でのリン酸化変異体、PKD結合部位の欠失、又はCERT Ser132A変異を意味する。
【００２９】
“活性”という用語は、細胞内又はin vitroアッセイでのタンパク質の生物学的機能を指し、さらにその量を表す。
“活性”を測定する方法の例は特許出願EP1652530（Hanada et al.）に記載されており、前記は膜からのセラミド放出促進活性を検出する。セラミドを含む脂質膜は、卵黄に由来する4：1の割合のホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンから成る混合脂質をベースにした[パルミトイル-1-14C]N-パルミトイル-D-エチロ-スフィゴシン（以下では14C-セラミドと称することができる）のサンプル当り12.5nCi（225pmol）を前記脂質膜が含むように調製されねばならない。したがってそのセラミド濃度は2.5mg/mLである。活性を測定される一サンプルのために、この脂質膜は20pLの量が要求される。活性測定に必要な脂質量をエッペンドルフチューブに分注した後、窒素ガスを噴霧することによって前記を乾燥させねばならない、この後、緩衝液1（20mMヘペス-NaOH緩衝液（pH7.4）に50mMのNaCl及び1mMのEDTAを添加）を濃度が2.5mg/mLとなるように前記乾燥膜に添加しなければならない。水浴型超音波発生装置（ブランソン社（Branson, Co., Ltd）製のモデル221 0）を用いて穏やかに超音波処理を実施しなければならない。超音波処理は25℃で3分間実施しなければならない。続いてサンプルをヴォルテックスミキサーで30秒混合し、さらに超音波処理を3分繰り返す。このようにして調製した脂質膜をセラミド放出アッセイで用いる。脂質膜のセラミド放出反応及びその検出は以下のように実施される：CERTタンパク質又はその組換えタンパク質（標準的な条件下では、450ピコモルに対応するタンパク質の量（ドネート膜に含まれるセラミドの2倍のmole濃度に等しい）が用いられる）を、緩衝液2（50mMヘペス-NaOH緩衝液（pH7.4）に100mMのNaCl及び0.5mMのEDTAを添加）を用いて30pLまで混合する。反応は、セラミドを含む脂質膜の20pLを添加することによって開始させる。リン脂質の最終濃度は1mg/mLである。セラミドはリン脂質総量に対して約0.3%の割合で含まれる。これらの混合物を37℃で30分インキュベートし、前記を50,000xgで30分遠心し、さらに脂質膜を沈殿させる。大腸菌由来のCERTを用いる場合は、大半のタンパク質は前記の遠心条件下では上清に残留する。したがって、14C-セラミドがCERTタンパク質と結合するとき、前記は脂質膜から放出され上清分画に移動する。CERTによるセラミド放出促進活性は、液体シンチレーションカウンターを用いて上清分画中の1%の放射能活性を測定することによって算出される。
【００３０】
“活性”を測定するまた別の可能性は、組換え物質又はCERTを含む細胞溶解物を用いるin vitroセラミド移転アッセイである。これによってSUV間のセラミドのタンパク質仲介移転が以前に記載されたように（Olayioye et al. 2005）測定される。移転アッセイ混合物は、ドナー小胞（2nmol脂質/mL）（ブタ脳脂質（Avanti Polar Lipids）、パイレン標識C16-セラミド及び2,4,6-トリニトロフェニル-ホスファチジルエタノールアミン（TNP-PE）（88.6：0.4：11mol％）を含み、P. Somerharjuにより提供された）及びブタ脳脂質を含む10倍過剰のアクセプター小胞を含んでいた。GFPタグ付加CERT野生型及びS132Aタンパク質（上記参照）を一過性に発現するHEK293T細胞由来の細胞質ゾル75μgの添加の前後で、蛍光の強さを395nm（励起、345nm；スリット幅4nm）で記録する。蛍光の強度は、異なるタンパク質の発現レベルを判断するために、（i）トリトンX-100（最終濃度0.5%）の添加後に得られる最大強度、及び（ii）最大GFP蛍光に対して標準化する。
“活性”を測定するためのまた別の可能性は、例えば抗ホスホ特異的抗体を用いることによってCERT S132Aのリン酸化状態をウェスタンブロットで分析することである。全細胞抽出物は、NP40抽出緩衝液（NEB：50mMトリス（pH7.5）、150mM NaCl、1%NP40、1mMオルトバナジウム酸ナトリウム、10mMフッ化ナトリウム及び20mMβ-グリセロホスフェート＋完全プロテアーゼインヒビター）中で細胞を可溶化することによって得られる。溶解物を16,000xgで10分間遠心することによって清澄化する。全細胞抽出物又は免疫沈澱タンパク質をサンプル緩衝液中で煮沸し、SDS-PAGEに付す。タンパク質をポリビニリジンジフルオリドメンブレン（Roth）にブロットする。0.1%のトゥイーン20を含むPBS中の0.5%ブロッキング試薬（Roche）でブロッキングした後、ホスホ特異的抗体（例えば、pMOTIFと称されるホスホ特異的基質抗体で、PKDによってリン酸化されたコンセンサスモチーフに対して作製される（Doppler et al. 2005））をプローブとしてフィルターを分析する。タンパク質は、強化ケミルミネセンス検出系（Pierce）を用いてペルオキシダーゼ結合二次抗体により可視化される。
“活性”を測定するまた別のアッセイは、例えばモデルタンパク質、抗体又は対象のタンパク質のための分泌アッセイである。細胞にss-HRP-Flagプラスミド並びに空ベクター、pEGFP-N1-PKD1KD及び任意のSTARTファミリータンパク質のCERT、CERTの変種をコードするプラスミドをそれぞれ1：6.5の割合で同時トランスフェクトする。トランスフェクション24時間後に、細胞を無血清培養液で洗浄し、清澄化細胞上清をECL試薬とともにインキュベートすることによって0、1、3及び6時間後にHRP分泌を定量する。測定はルミノメーター（Lucy2、Anthos）を用い450nmで実施する。
“活性”を測定するまた別の方法は、蛍光セラミド類似体（例えばBodipy-標識C5-セラミド）を用いることによるもので、チェース実験を無傷の細胞で実施し、ゴルジ複合体におけるタンパク質の蓄積を測定する。
BODIPY(商標)FL-C5-セラミドのゴルジ及びER間の分布の定量：
蛍光セラミドの輸送は、メタモルフ（Metamorph）ソフトウェアのラインスキャン機能を用いて捕捉後に定量した。種々の時点で撮影した共焦点写真中の細胞からラインを描き、蛍光強度を細胞質内及び細胞のゴルジ複合体全体で測定した。“取り込比”は、細胞質で測定された光強度で割ったゴルジ内の蛍光光強度から算出した。最大取り込比は、37℃で25分インキュベートした後のコントロール細胞で測定し、この値を100%とした。定量は、3つの別個の実験のデータから実施した。前記実験では、共焦点写真を12の別々の時点で撮影し、各時点で7細胞を解析した。
【００３１】
“生産性”又は“比生産性”という用語は、所定時間内に所定数の細胞によって生成される特異的タンパク質の量を言う。したがって、比生産性は細胞が対象のタンパク質を発現／合成／生成する能力についての定量的な量である。工業的な生産の関係では、この比生産性は、通常1日1細胞当り生産されるピコグラムタンパク質量として表される（‘pg/細胞*日’又は‘pcd’）。分泌タンパク質の“比生産性”を決定するある方法は、培養液中に分泌される対象のタンパク質の量を酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によって定量的に測定することである。この目的のために、細胞を所定の密度で新しい培養液に播種する。所定時間後（例えば24、48又は72時間後）に、細胞培養液のサンプルを採取し、ELISA測定に付して対象のタンパク質の力価を決定する。平均細胞数及び時間で力価を割ることによって、比生産性を決定することができる。
細胞の“比生産性”のまた別の測定の仕方の例は、均質時間分解蛍光（homogenous time resolved fluorescence（HTRF(商標)）アッセイによって提供される。
細胞内、膜結合又はトランスメンブレンタンパク質についての細胞の“生産性”はまたウェスタンブロッティングによって検出及び定量されえる。先ず初めに細胞を洗浄し、続いて洗剤（例えばトリトン-X、NP-40又はSDS）を含む緩衝液又は高塩濃度の緩衝液中で溶解させる。細胞溶解物中のタンパク質を続いてSDS-PAGEでサイズにより分離し、ナイロンメンブレンに移し、その後前記メンブレン上で対象のタンパク質を特異的な抗体により検出及び可視化する。
細胞の“比生産性”を決定するまた別の方法は、対象のタンパク質に対して作製した蛍光標識抗体により対象のタンパク質を免疫学的に検出し、フローサイトメトリーで蛍光シグナルを定量することである。細胞内タンパク質の場合は、最初に細胞を例えばパラホルムアルデヒド緩衝液中で固定し、続いて透過性を付与して検出抗体の細胞内侵入を可能にする。細胞表面タンパク質では事前固定又は透過性付与の必要はなく生細胞で定量することができる。
細胞の“生産性”はさらにまた、レポータータンパク質（例えば緑色蛍光タンパク質（GFP））の発現を測定することによって間接的に決定することができる。GFPは対象のタンパク質との融合タンパク質として、又は二重、三重又は多重発現ユニットの部分として対象のタンパク質と同じmRNAから発現される。
【００３２】
“生産性の強化／増加”という用語は、細胞の比生産性を増加／強化する方法を含む。比生産性は、対応するコントロール細胞よりも調査されている細胞で生産性が高く、しかもこの差異が統計的に有意であるならば増加又は強化されている。調査されている細胞は、処理、トランスフェクト、又は遺伝的に操作された細胞の非均質集団であっても、又はクローン性細胞株であってもよく、未処理、未トランスフェクト又は未改変細胞はコントロール細胞として供することができる。
本発明で用いられる“インヒビター”又は“サプレッサー”という用語は、CERTのようなSTARTドメインタンパク質の発現又は活性を阻害又は抑制するように作用する任意の分子を意味する。前記用語には、小化合物、核酸（例えばアンチセンスDNA、アンチセンスRNA又はsiRNA）、単鎖抗体、及びCERT転写及び翻訳を遮断するタンパク質とともにSTARTドメインタンパク質（例えばCERT）の脂質結合に干渉するペプチド又はタンパク質が含まれる。
本発明の目的での“宿主細胞”は、例えばハムスター細胞、好ましくはBHK21、BHK TK-、CHO、CHO-K1、CHO-DUKX、CHO-DUKX B1及びCHO-DG44細胞のような細胞、又はそのような細胞株のいずれかの派生細胞／子孫である。特に好ましいものはCHO-DG44、CHO-DUKX、CHO-K1及びBHK21、より好ましいものはCHO-DG44及びCHO-DUKX細胞である。本発明のさらに別の実施態様では、宿主細胞はまたネズミミエローマ細胞、好ましくはNS0及びSp2/0細胞、又はそのような細胞株のいずれかの派生細胞／子孫である。本発明の目的で用いることができるネズミ及びハムスター細胞の例はまた表1に要約される。しかしながら、それら細胞の派生細胞／子孫、他の哺乳動物細胞（マウス、ラット、サル及びげっ歯類細胞株を含む（ただしこれらに限定されない））、真核細胞（酵母、昆虫及び植物細胞を含む（ただしこれらに限定されない））もまた、本発明の目的で、特にバイオ医薬タンパク質の生産に用いることができる。
【００３３】
表1：真核細胞性生産細胞株
0005467415.tif 000002
【００３４】
宿主細胞は、血清を含まない条件下、及び場合によって動物起源のいずれのタンパク質／ペプチドも含まない培養液下で樹立され、順化され及び完全に培養される場合がもっとも好ましい。市販の培養液、例えばハムF12（Sigma, Deisenhofen, Germany）、RPMI-1640（Sigama）、ダルベッコーの改変イーグル培養液（DMEM、Sigma）、最少必須培養液（MEM、Sigma）、イスコフ（Iscove's）改変ダルベッコー培養液（IMDM、Sigma）、CD-CHO（Invitrogen, Carlsbad, CA）、CHO-S（Invitrogen）、無血清CHO培養液（Sigma）、及び無タンパク質CHO培養液（Sigma）が適切な例示的栄養溶液である。前記培養液のいずれも必要な場合に多様な化合物を補充することができる。前記多様な化合物の例は、ホルモン及び／又は他の増殖因子（例えばインスリン、トランスフェリン、上皮増殖因子、インスリン様増殖因子）、塩（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、リン酸塩）、緩衝物質（例えばHEPES）、ヌクレオシド（例えばアデノシン、チミジン）、グルタミン、グルコース又は他の等価のエネルギー源、抗体、微量元素である。必要な他の任意の補充物質もまた当業者に公知の適切な濃度で添加することができる。本発明では、無血清培養液の使用が好ましいが、適切な量の血清を補充した培養液もまた宿主細胞の培養に用いることができる。選別可能な遺伝子を発現している遺伝的に改変された細胞の増殖及び選別のために、適切な選別薬剤が培養液に添加される。
【００３５】
“タンパク質”という用語は、アミノ酸残基配列又はポリペプチドに関して相互に用いられ、任意の長さのアミノ酸のポリマーに該当する。これらの用語はまた、グリコシル化、アセチル化、リン酸化又はタンパク質のプロセッシングを含む（ただしこれらに限定されない）反応を介して翻訳後に改変されるタンパク質を含む。改変及び変更、例えば他のタンパク質との融合、アミノ酸配列の置換、欠失又は挿入をポリペプチドの構造内で実施することができるが、当該分子はその生物学的機能活性を維持する。例えば、ある種のアミノ酸配列置換をポリペプチド内又はその根幹を成す核酸コード配列で実施して、同様な特性を有するタンパク質を得ることができる。
“ポリペプチド”という用語は10を超えるアミノ酸を有する配列を意味し、“ペプチド”という用語は長さが10アミノ酸までの配列を意味する。
本発明は、バイオ医薬ポリペプチド／タンパク質の生産用宿主細胞の作製に適している。本発明は、細胞の生産性が強化された細胞による、多数の種々の対象遺伝子の高収量発現に特に適している。
“対象の遺伝子”（GOI）、“選択した配列”又は“生成物遺伝子”は本明細書では同じ意味を有し、対象の生成物又は“対象のタンパク質”（‘所望の生成物’という用語によってもまた表される）をコードする任意の長さのポリヌクレオチド配列に該当する。選択した配列は完全長遺伝子又は切端遺伝子でも、融合又はタグ付加遺伝子でもよく、さらにcDNA、ゲノムDNA又はDNAフラグメントであってもよいが、好ましくはcDNAである。前記は天然の配列（すなわち天然に存在する形態）であっても、又は変異されるか又は所望のように改変されてあってもよい。これらの改変には、選択した宿主細胞でのコドン使用頻度を最適にするためのコドン最適化、ヒト化、又はタグ付加が含まれる。選択配列は、分泌、細胞質、核、膜結合又は細胞表面ポリペプチドをコードすることができる。
【００３６】
“対象のタンパク質”にはタンパク質、ポリペプチド、そのフラグメント、ペプチドが含まれ、それらはいずれも選択した宿主細胞で発現させることができる。所望のタンパク質は、例えば抗体、酵素、サイトカイン、リンホカイン、粘着分子、レセプター及びその誘導体又はフラグメント、並びにアゴニスト若しくはアンタゴニストとして機能しえるか及び／又は治療的若しくは診断的に有用でありえる他の任意のポリペプチドであってもよい。所望されるタンパク質／ポリペプチドの例はまた下記で提供される。
より複雑な分子、例えばモノクローナル抗体の場合は、GOIは2つの抗体鎖の一方又は両方をコードする。
“対象の生成物”はまたアンチセンスRNAであってもよい。
“対象のタンパク質”又は“所望されるタンパク質”は上記に記載したようなものである。特に、所望されるタンパク質／ポリペプチド又は対象のタンパク質は、例えばインスリン、インスリン様増殖因子、hGH、tPA、サイトカイン（例えばインターロイキン（IL）、例えばIL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、インターフェロン（IFN）アルファ、IFNベータ、IFNガンマ、IFNオメガ又はIFNタウ、腫瘍壊死因子（TNF）、例えばTNFアルファ及びTNFベータ、TNFガンマ、TRAIL；G-CSF、GM-CSF、M-CSF、MCP-1及びVEGF）であるが、ただしこれらに限定されない。さらにまた、エリスロポエチン又は他の任意のホルモン増殖因子の製造が含まれる。本発明の方法はまた、抗体又はそのフラグメントの製造に有利に用いることができる。そのようなフラグメントには例えばFabフラグメント（抗体結合フラグメント（Fragment antigen-binding＝Fab））が含まれる。Fabフラグメントは、両方の鎖の可変領域から成る（前記両方の鎖は隣接する定常領域によってまとめられている）。Fabフラグメントは、プロテアーゼ消化（例えばパパインによる）によって通常の抗体から生成することができるが、同様なフラグメントはわずかな時間で遺伝的操作によってもまた生成することができる。さらに別の抗体フラグメントにはF(ab')2フラグメントが含まれ、前者はペプシンによるタンパク分解切断によって調製することができる。
【００３７】
対象のタンパク質は、好ましくは分泌ポリペプチドとして培養液から回収されるか、または、分泌シグナルをもたずに発現される場合は宿主溶解物から回収することができる。実質的に均質な対象タンパク質の調製物が得られるような方法で、他の組換えタンパク質及び宿主細胞タンパク質から対象のタンパク質を精製することが必要である。最初の工程として、細胞及び／又は粒状化細胞屑を培養液又は溶解物から除去する。その後、対象の生成物は、例えばイムノアフィニティー若しくはイオン交換カラムによる分画、エタノール沈殿、逆相HPLC、セファデックスクロマトグラフィー、シリカ若しくはイオン交換樹脂（例えばDEAD）によるクロマトグラフィーによって、夾雑する可溶性タンパク質、ポリペプチド及び核酸から精製される。一般的には、宿主細胞によって異種発現されるタンパク質をどのように精製するかを当業者に教示する方法は周知である。そのような方法は例えば下記に記載されている：Harris and Angal, 1995；又はRobert Scope, 1998。
遺伝子操作方法を用いて、重鎖可変領域（VH）及び軽鎖可変領域（VL）のみから成る短縮抗体フラグメントを生成することが可能である。前者はFvフラグメント（フラグメント可変部（Fragment variable）＝可変部分のフラグメント）と称される。これらのFvフラグメントは、定常鎖のシステインによる2つの鎖の共有結合を欠くので、Fvフラグメントはしばしば安定化される。重鎖及び軽鎖の可変領域を、例えば10から30アミノ酸、好ましくは15アミノ酸の短いペプチドフラグメントによって連結させることは有利である。このようにして、VH及びVLから成りペプチドリンカーで連結された単一ペプチド鎖が得られる。この種の抗体タンパク質は単鎖Fv（scFv）として知られている。従来技術で知られているこの種のscFv抗体タンパク質の例は下記に記載されている：Huston et al. 1988。
【００３８】
近年、scFvをマルチマー誘導体として調製するための種々の戦略が開発されてきた。この戦略は、特に薬物動態学及び生体分布特性の改善とともに結合アビジティーの向上を示す組換え抗体を得ることを目的とする。scFvのマルチマー化を達成するために、scFvはマルチマー化ドメインとの融合タンパク質として調製された。マルチマー化ドメインは、例えばIgGのCH3領域又は糸毬状コイル構造（ヘリックス構造）（例えばロイシンジッパードメイン）であってもよい。しかしながら、scFvのVH/VL領域間の相互作用がマルチマー化に利用される戦略もまた存在する（例えばジア-、トリ-及びペンタボディー）。当業者では、ジアボディーは二価のホモダイマーscFv誘導体を意味する。scFv分子のリンカーを5−10アミノ酸に短縮することによって、鎖間VH/VLスーパーインポジションが生じるホモダイマーの生成がもたらされる。ジアボディーはさらにまたジスルフィド結合を取り入れることによって安定化されえる。従来技術のジアボディー抗体タンパク質の例は下記で見出すことができる：Peristic et al. 1994。
当業者では、ミニボディーは二価のホモダイマーscFv誘導体を意味する。前者は、ヒンジ領域（例えばIgG1由来）及びリンカー領域を介してscFvと連結されるダイマー化領域として、免疫グロブリン、好ましくはIgG、もっとも好ましくはIgG1のCH3領域を含む融合タンパク質から成る。従来技術のミニボディー抗体タンパク質の例は下記で見出すことができる：Hu et al. 1996。
当業者では、トリアボディーは三価のホモトリマーscFv誘導体を意味する（Kortt et al. 1997）。VH-VLがリンカー配列無しで直かに融合されたscFv誘導体はトリマーの生成をもたらす。
【００３９】
当業者では、“足場タンパク質”は、遺伝子クローニングによって又は同時翻訳プロセスによって、別のタンパク質若しくは別の機能を有するタンパク質の部分と結合される任意の機能的タンパク質ドメインを意味する。
当業者はまた、二価、三価、四価の構造を有し、scFvに由来するいわゆるミニ抗体を周知しているであろう。マルチマー化は、ダイマー、トリマー又はテトラマーの糸毬状コイル構造によって実施される（Lovejoy et al. 1993；Pack et al. 1993；Pack et al. 1995）。
定義では、宿主細胞に導入されるいずれの配列又は遺伝子も、たとえそれら導入配列又は遺伝子が当該宿主の内因性配列又は遺伝子と同一であっても、当該宿主細胞に対して“異種配列”又は“異種遺伝子”又は“トランスジーン”と呼ばれる。
“異種”タンパク質はしたがって異種配列から発現されるタンパク質である。
異種遺伝子配列は、“発現ベクター”、好ましくは真核細胞発現ベクター、より好ましくは哺乳動物発現ベクターを用いることによって標的細胞に導入することができる。ベクターを構築するために用いられる方法は当業者には周知であり、種々の刊行物に記載されている。特に、適切なベクターを構築するための技術（機能的成分、例えばプロモーター、エンハンサー、転写終結及びポリアデニル化シグナル、選別マーカー、複製起点、並びにスプライシングシグナルの記述を含む）は、Sambrookらの著書（Sambrook et al. 1989）及び同書に引用されている参考文献に極めて詳細に総括されている。ベクターには、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工／ミニ染色体（例えばACE）、又はウイルスベクター、例えばバキュロウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レトロウイルス、バクテリオファージが含まれる（ただしこれらに限定されない）。真核細胞発現ベクターは、細菌内でベクターの増殖を促進する原核細胞配列、例えば複製起点及び細菌内での選別のための抗生物質耐性遺伝子もまた含むであろう。多様な真核細胞発現ベクター（その中にポリヌクレオチドが機能的に連結されえるクローニング部位を含む）が当分野でよく知られており、いくつかは例えば以下のような会社から市場で入手できる：Stratagene（La Jolla, CA）；Invitrogen（Carlsbad, CA）；Promega（Madison, WI）；又はBD Biosciences Clontech（Palo Alto, CA）。
【００４０】
好ましい実施態様では、発現ベクターは、対象のペプチド／ポリペプチド／タンパク質をコードするヌクレオチド配列の転写及び翻訳に必要な調節配列である少なくとも1つの核酸配列を含む。
本明細書で用いられる“発現”という用語は、宿主細胞内での異種核酸配列の転写及び／又は翻訳を指す。所望生成物／対象タンパク質の宿主細胞内での発現レベルは、細胞内に存在する対応するmRNAの量、又は本実施例のように選択配列によりコードされた所望ポリペプチド／対象タンパク質の量のどちらかを基準にして決定することができる。例えば、選択配列から転写されたmRNAは、ノザンブロットハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼRNA防御、細胞RNAに対するin situハイブリダイゼーション、又はPCRによって定量することができる（以下を参照されたい：Sambrook et al. 1989；Ausubel et al. 2002, 最新版）。選択配列によってコードされたタンパク質は種々の方法、例えばELISA、ウェスタンブロッティング、放射性免疫アッセイ、免疫沈澱、当該タンパク質の生物学的活性のアッセイ、タンパク質の免疫染色とそれに続くFACS分析（以下を参照されたい：Sambrook et al. 1989；Ausubel et al. 2002, 最新版）、又は均質時間分解蛍光（homogenous time resolved fluorescence（HTRF(商標)）アッセイによって定量することができる。
【００４１】
親核宿主細胞のポリヌクレオチド又は発現ベクターによる“トランスフェクション”（遺伝的に改変された細胞又はトランスジェニック細胞を生じる）は、当分野で周知の任意の方法によって実施でき、それらは例えば以下に記載されている：Sambrook et al. 1989；又はAusubel et al. 2002, 最新版。トランスフェクションの方法には、リポソーム仲介トランスフェクション、リン酸カルシウム同時沈殿、エレクトロポレーション、ポリカチオン（例えばDEAE-デキストラン）仲介トランスフェクション、プロトプラスト融合、ウイルス感染及びマイクロインジェクションが含まれるが、ただしこれらに限定されない。好ましくは、前記トランスフェクションは安定なトランスフェクションである。個々の宿主細胞株及びタイプで最適なトランスフェクション頻度及び異種遺伝子の発現を提供するトランスフェクションの方法が好ましい。適切な方法は日常的な方法によって決定することができる。安定なトランスフェクタントのために、構築物は宿主細胞ゲノムまたは人工染色体／ミニ染色体に組み込まれるか、又は宿主細胞内で安定的に維持されるようにエピソームとして配置される。
特段の記載がなければ、本発明の実施は、当分野の技術範囲内の通常の細胞生物学、分子生物学、細胞培養、免疫学などの技術を利用するであろう。これらの技術は現在の文献に完全に開示されている。例えば以下を参照されたい：Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)；Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1987, updated)；Brown ed., Essential Molecular Biology, IRL Press (1991)；Goeddel ed., Gene Expression Technology, Academic Press (1991)；Bothwell et al. eds., Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes, Bartlett Publ. (1990)；Wu et al., eds., Recombinant DNA Methodology, Academic Press (1989)；Kriegler, Gene Transfer and Expression, Stockton Press (1990)；McPherson et al., PCR: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1991); Gait ed., Oligonucleotide Synthesis (1984)；Miller & Calos eds., Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (1987)；Butler ed., Mammalian Cell Biotechnology (1991)；Pollard et al., eds., Animal Cell Culture, Humana Press (1990)；Freshney et al., eds., Culture of Animal Cells, Alan R. Liss (1987)；Studzinski, ed., Cell Growth and Apoptosis, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Presss (1995)；Melamed et al., eds., Flow Cytometry and Sorting, Wiley-Liss (1990)；Current Protocols in Cytometry, John Wiley & Sons, Inc. (updated)；Wirth & Hauser, Genetic Engineering of Animals Cells, in: Biotechnology Vol. 2, Puhler ed., VCH, Weinheim 663-744; the series Methods of Enzymology (Academic Press, Inc.)；Harlow et al., eds., Antibodies: A Laboratory Manual (1987).
【００４２】
実施態様
本発明は対象の異種タンパク質を細胞で製造する方法に関し、前記方法は、ステロイド生成急性調節関連脂質移転（START）ドメイン又はその誘導体若しくは変異体を含むアミノ酸配列を有するタンパク質の発現又は活性を高める工程、及び前記対象のタンパク質の発現を実施する工程を含む。本発明の好ましい実施態様では、前記方法は、前記異種タンパク質が膜タンパク質又は分泌タンパク質であることを特徴とする。
本発明の具体的な実施態様では、前記方法は、STARTドメインタンパク質が、PCTP（配列番号:27）、StarD7、GPBP、StarD10、StarD8、StarD13、DLC−1、StarD4（配列番号:21）、StarD6（配列番号:25）、StarD5（配列番号:23）、MLN64、StAR、THEA-2、CACH又はStarD9等の哺乳動物STARTドメインファミリーのメンバー、又は前記の誘導体若しくは変異体であることを特徴とする。
本発明のさらに別の具体的な実施態様では、前記方法は、STARTドメインタンパク質がERストレスにより誘発されることを特徴とするか、及び／又は、前記ドメインタンパク質が、StarD4（配列番号:21）、StarD5（配列番号:23）、StarD6（配列番号:25）又はホスファチジルコリン移転タンパク質（PCTP）（配列番号:27）等のSTARTドメインのみから成るという構造的特徴を有することを特徴とする。
【００４３】
本発明の別の具体的な実施態様では、前記方法は、STARTドメインタンパク質が、CERT（配列番号:11又は13）、StarD4（配列番号:21）及びStarD5（配列番号:23）から成る群から選択されることを特徴とする。
本発明のさらに別の実施態様では、前記方法は、STARTドメインタンパク質がStarD6（配列番号:25）であることを特徴とする。好ましい実施態様では、StarD6は配列番号:24を有するヌクレオチドによってコードされる。
本発明の好ましい実施態様では、前記方法は、STARTドメインが、CERTL（配列番号:19）の少なくとも219アミノ酸STARTドメイン、又はCERT及びCERT S132A（配列番号:17）の少なくとも223アミノ酸STARTドメイン、又はStarD4（配列番号:21の少なくともSTARTドメイン、又はStarD5（配列番号:23）の少なくともSTARTドメイン、又は前記の誘導体若しくは変異体を含むことを特徴とする。
本発明の特に好ましい実施態様では、前記方法は、STARTドメインタンパク質が、セラミド転移タンパク質CERT（CERT＝配列番号:11又はCERTL＝配列番号:13）又はその誘導体若しくは変異体であることを特徴とする。
本発明の別の具体的な実施態様では、前記方法は、STARTドメインタンパク質が変異したセラミド転移タンパク質CERTであり、さらに前記変異が、CERTの任意のセリン、スレオニン又はチロシンの位置でリン酸化部位を不能にする又は欠失させることを特徴とする。
本発明のさらに別の具体的な実施態様では、前記方法は、STARTドメインタンパク質が変異したセラミド移転タンパク質CERTであり、さらに前記変異が、CERTのタンパク質キナーゼD（PKD）リン酸化部位を132位で不能にする又は欠失させることを特徴とする。
【００４４】
本発明の特に好ましい実施態様では、前記方法は、変異CERTがCERTS132A（配列番号:15）であることを特徴とする。
本発明の別の実施態様では、前記方法は、前記方法が、前記対象タンパク質を発現するコントロール細胞と比較して、前記細胞における前記対象タンパク質の比細胞生産性の増加をもたらすが、前記コントロール細胞では、ステロイド生成急性調節関連脂質移転（START）ドメイン又はその誘導体若しくは変異体を含むアミノ酸配列を有するタンパク質の発現又は活性の増加がないことを特徴とする。
本発明の別の具体的な実施態様では、前記方法は、生産性の増加が、約5%から約10%、約11%から約20%、約21%から約30%、約31%から約40%、約41%から約50%、約51%から約60%、約61%から約70%、約71%から約80%、約81%から約90%、約91%から約100%、約101%から約149%、約150%から約199%、約200%から約299%、約300%から約499%、又は約500%から約1000%であることを特徴とする。
本発明の好ましい実施態様では、前記方法は、前記細胞が、酵母、植物、蠕虫、昆虫、鳥類、魚類、爬虫類又は哺乳動物細胞等の真核細胞であることを特徴とする。本発明の具体的な実施態様では、前記方法は、前記細胞が動物細胞であることを特徴とする。本発明のさらに別の具体的な実施態様では、前記方法は、前記細胞が後生動物細胞、例えばC.エレガンス（C. elegans）であることを特徴とする。本発明の別の具体的な実施態様では、前記方法は、前記生物が左右相称動物細胞、例えばドロソフィラ・メラノガスター（Drosophila melanogaster）であることを特徴とする。本発明のさらに別の実施態様では、前記方法は、前記細胞が脊椎動物細胞、例えば鳥類、魚類、爬虫類又は哺乳動物細胞であることを特徴とする。本発明の具体的な実施態様では、前記方法は、前記細胞がヒト細胞、例えばヒトミエローマ細胞株U266、HEK293、HeLa、HepG2又はHT1080であることを特徴とする。本発明の好ましい実施態様では、前記方法は、前記細胞がげっ歯類細胞、例えばネズミNSO、Sp2/0又はAg8653細胞、YO又はYB2.0であることを特徴とする。
【００４５】
本発明のさらに別の実施態様では、本発明は、前記真核細胞が哺乳動物細胞であることを特徴とする。
本発明の具体的な実施態様では、前記方法は、前記哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）、サル腎CV1、サル腎COS、ヒトレンズ上皮PER.C6TM、ヒト胎児腎、HEK293、ベビーハムスター腎、アフリカミドリザル腎、ヒト子宮頸癌、イヌ腎、バッファローラット肝、ヒト肺、ヒト肝、マウス乳癌若しくはミエローマ細胞、イヌ、ブタ若しくはマカク細胞、ラット、ウサギ、ネコ、ヤギ、好ましくはCHO細胞であることを特徴とする。
本発明の好ましい実施態様では、前記方法は、前記CHO細胞が、CHO野生型タイプ、CHO K1、CHO DG44、CHO DUKX-B11、CHO Pro-5、好ましくはCHO DG44であることを特徴とする。
本発明の具体的な実施態様では、前記方法は、対象タンパク質が膜タンパク質又は分泌タンパク質であることを特徴とする。本発明の好ましい実施態様では、前記方法は、対象タンパク質が抗体又は抗体フラグメントであることを特徴とする。
本発明のさらに好ましい実施態様では、前記方法は、抗体がモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、哺乳動物抗体、ネズミ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、霊長類抗体、ヒト抗体、又は前記のフラグメント若しくは誘導体、例えば抗体、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖、Fab、F(ab')2、Fc、Fc-Fc融合タンパク質、Fv、単鎖Fv、シングルドメインFv、四価の単鎖Fv、ジスルフィド結合Fv、ドメイン欠失ミニボディ、ジアボディ、又は上記フラグメントの1つと別のペプチド若しくはポリペプチドとの融合ポリペプチド、Fc-ペプチド融合物、Fc-毒素融合物、足場タンパク質であることを特徴とする。
【００４６】
本発明はさらに、対象の膜タンパク質又は分泌タンパク質の細胞での分泌を高めるための方法に関し、前記方法は、前記対象タンパク質を発現させる工程及びステロイド生成急性調節関連脂質移転（START）ドメイン又はその誘導体若しくは変異体を含むアミノ酸配列を有するタンパク質を発現させる工程を含む。
本発明はさらに、対象の膜タンパク質又は分泌タンパク質を細胞で製造する方法に関し、前記方法は、ステロイド生成急性調節関連脂質移転（START）ドメイン又はその誘導体若しくは変異体を含むアミノ酸配列を有するタンパク質の発現を高める工程、及び前記対象タンパク質の発現を実施する工程を含み、ここで工程a及びbの順序は入れ替えることができる。
本発明の具体的な実施態様では、前記方法はさらに、工程a）が工程b）の前に実施されることを特徴とする。本発明のさらに別の具体的な実施態様では、前記方法はさらに、工程a）及びb）が同時に実施されることを特徴とする。本発明の別の実施態様では、前記方法はさらに、工程b）が工程a）の前に実施されることを特徴とする。
本発明の好ましい実施態様では、前記方法はさらに、対象タンパク質を回収する追加の工程を含む。
本発明の特に好ましい実施態様では、前記方法はさらに、対象タンパク質を単離及び精製する追加の工程を含む。
【００４７】
本発明の具体的な実施態様では、前記方法は、ステロイド生成急性調節関連脂質移転（START）ドメイン又はその誘導体若しくは変異体を含むアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞にトランスフェクトすることによって、ステロイド生成急性調節関連脂質移転（START）ドメイン又はその誘導体若しくは変異体を含むアミノ酸配列を有するタンパク質の発現を高める工程を含む。
本発明の具体的な実施態様では、前記方法は、ステロイド生成急性調節関連脂質移転（START）ドメイン又はその誘導体若しくは変異体を含むアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする第一のポリヌクレオチドを前記細胞にトランスフェクトする工程、及び対象タンパク質をコードする第二のポリヌクレオチドを前記細胞にトランスフェクトする工程を含む。
本発明の具体的な実施態様では、前記方法のSTARTドメインタンパク質は、ERストレスにより誘発されることを特徴とするか、及び／又はSTARTドメイン、例えばStarD4（配列番号:21）、StarD5（配列番号:23）、StarD6（配列番号:25）又はPCTP（配列番号:27）以外にさらに別の構造モチーフを含まないという構造的特徴を有する。
本発明の好ましい実施態様では、前記方法は、ステロイド生成急性調節関連脂質移転（START）ドメイン又はその誘導体若しくは変異体を含むアミノ酸配列を有するタンパク質の発現を、好ましくは、ステロイド生成急性調節関連脂質移転（START）ドメイン又はその誘導体若しくは変異体を含むアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする第一のポリヌクレオチドを前記細胞にトランスフェクトすることによって増加させる工程（ここで前記増加は非トランスフェクト細胞との比較で測定される）、対象タンパク質をコードする第二のポリヌクレオチドを前記細胞にトランスフェクトする工程を含む。
本発明の好ましい実施態様では、前記方法は、工程a）及びb）で発現されるタンパク質が同一ではないことを特徴とする。
【００４８】
本発明はさらに対象の膜タンパク質又は分泌タンパク質を細胞で製造する方法に関し、前記方法は、ステロイド生成急性調節関連脂質移転（START）ドメイン又はその誘導体若しくは変異体を含むアミノ酸配列を有するタンパク質の発現を前記細胞で高める工程、及び前記対象タンパク質の発現を前記細胞で実施する工程を含む。
本発明はさらにまた対象の膜タンパク質又は分泌タンパク質を細胞で製造する方法に関し、前記方法は、ステロイド生成急性調節関連脂質移転（START）ドメイン又はその誘導体若しくは変異体を含むアミノ酸配列を有するタンパク質の発現を前記細胞で高める工程、及び前記対象タンパク質を発現させる工程を含む。
本発明の具体的な実施態様では、前記方法は、前記方法が、先に対象タンパク質をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトされたコントロール細胞と比較したとき、前記細胞における前記タンパク質の比細胞生産性の増加をもたらし、しかしながら前記コントロール細胞では、ステロイド生成急性調節関連脂質移転（START）ドメイン又はその誘導体若しくは変異体を含むアミノ酸配列を有するタンパク質の発現は増加していないことを特徴とする。
本発明の具体的な実施態様では、前記方法は、対象タンパク質がゴルジ複合体を通過するタンパク質であることを特徴とする。
本発明はさらに、細胞で対象の膜タンパク質又は分泌タンパク質の比細胞生産性を高める方法に関し、前記方法は、少なくとも2つのポリペプチドをコードする核酸配列を含む1つ以上のベクター系を細胞に導入する工程を含み、ここで第一のポリヌクレオチドはステロイド生成急性調節関連脂質移転（START）ドメイン又はその誘導体若しくは変異体を含むアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、第二のポリヌクレオチドは対象タンパク質をコードし、さらに前記対象タンパク質及びステロイド生成急性調節関連脂質移転（START）ドメイン又はその誘導体若しくは変異体を含むアミノ酸配列を有するタンパク質は、前記細胞によって発現される。
【００４９】
本発明はさらにまた対象の膜タンパク質又は分泌タンパク質を発現する細胞のトランスフェクション効率を高める方法に関し、前記方法は、ステロイド生成急性調節関連脂質移転（START）ドメイン又はその誘導体若しくは変異体を含むアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする第一のポリヌクレオチドを前記細胞にトランスフェクトし、続いて対象のタンパク質をコードする第二のポリヌクレオチドを前記細胞にトランスフェクトする工程を含み、ここで前記第一及び第二のポリヌクレオチドは別個のベクター系に存在する。
さらに別の実施態様では、本発明は細胞のトランスフェクション効率を高める方法に関し、前記方法は、レポーター遺伝子、例えばGFP、YFP、HRP、SEAP又はLacZをトランスフェクトする追加の工程を含み、前記レポーター遺伝子は対象タンパク質に融合させることも可能であり、同じ発現構築物に配置されても又は別のプラスミドに配置されてもよい。
好ましい実施態様では、本発明は細胞のトランスフェクション効率を高める方法に関し、前記方法は、対象タンパク質の検出又はレポーター遺伝子の発現によって、トランスフェクション効率を検出及び／又は測定する追加の工程を含む。
本発明はさらに、2つのポリヌクレオチド、ステロイド生成急性調節関連脂質移転（START）ドメイン又はその誘導体若しくは変異体を含むアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする第一のポリヌクレオチド、及び対象のタンパク質をコードする第二のポリヌクレオチを含む発現ベクターに関する。
【００５０】
本発明の具体的な実施態様では、発現ベクターは、前記STARTドメインタンパク質が、PCTP（配列番号:27）、StarD7、GPBP、StarD10、StarD8、StarD13、DLC-1、StarD4（配列番号:21）、StarD6（配列番号:25）、StarD5（配列番号:23）、MLN64、StAR、THEA-2、CACH又はStarD9等の哺乳動物STARTドメインファミリーメンバー、又は前記の誘導体若しくは変異体であることを特徴とする。
本発明の別の実施態様では、前記発現ベクターは、STARTドメインタンパク質が、セラミド転移タンパク質CERT（CERT＝配列番号:11又はCERTL＝配列番号:13）又はその誘導体若しくは変異体であることを特徴とする。
本発明の具体的な実施態様では、前記発現ベクターは、前記変異CERTがCERTS132A（配列番号:15）であることを特徴とする。
本発明の具体的な実施態様では、前記発現ベクターは、前記第一のポリヌクレオチドが分泌経路を介して細胞内のタンパク質輸送を高めることを特徴とする。
本発明の具体的な実施態様では、前記発現ベクターは、STARTドメインタンパク質が変異したセラミド転移タンパク質CERTであり、さらに前記変異が、CERTタンパク質内の任意のセリン、スレオニン又はチロシンの位置でリン酸化部位を不能にする又は欠失させることを特徴とする。
本発明のまた別の実施態様では、前記発現ベクターは、STARTドメインタンパク質が変異したセラミド移転タンパク質CERTであり、さらに前記変異が、CERTのタンパク質キナーゼD（PKD）リン酸化部位を132位で不能にする又は欠失させることを特徴とする。
【００５１】
本発明はさらに、本発明の発現ベクターを含む細胞に関する。本発明の具体的な実施態様では、前記細胞は、前記細胞が真核細胞、例えば酵母、植物、蠕虫、昆虫、鳥類、魚類、爬虫類又は哺乳動物細胞であることを特徴とする。本発明の具体的な実施態様では、前記細胞は、前記真核細胞が動物細胞であることを特徴とする。
本発明の具体的な実施態様では、前記細胞は、前記哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）、サル腎CV1、サル腎COS、ヒトレンズ上皮PER.C6TM、ヒト胎児腎、HEK293、ベビーハムスター腎、アフリカミドリザル腎、ヒト子宮頸癌、イヌ腎、バッファローラット肝、ヒト肺、ヒト肝、マウス乳癌若しくはミエローマ細胞、イヌ、ブタ若しくはマカク細胞、ラット、ウサギ、ネコ、ヤギ、好ましくはCHO細胞であることを特徴とする。本発明の具体的な実施態様では、前記細胞は、前記CHO細胞が、CHO野生型タイプ、CHO K1、CHO DG44、CHO DUKX-B11、CHO Pro-5、好ましくはCHO DG44であることを特徴とする。
本発明の具体的な実施態様では、前記細胞は、前記細胞が動物細胞、好ましくは後生動物細胞、例えばC.エレガンス（C. elegans）であることを特徴とする。本発明のさらに別の実施態様では、前記細胞は、前記細胞が左右相称動物細胞、例えばドロソフィラ・メラノガスター（Drosophila melanogaster）、好ましくは脊椎動物細胞、例えば鳥類、魚類、爬虫類又は哺乳動物細胞であることを特徴とする。本発明の具体的な実施態様では、前記細胞は、前記真核細胞が哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞、例えばヒトミエローマ細胞株U266、HEK293、HeLa、HepG2又はHT1080、より好ましくは、げっ歯類細胞、例えばネズミNSO、Sp2/0又はAg8653細胞、YO又はYB2.0であることを特徴とする。
【００５２】
本発明はさらに、対象タンパク質、好ましくは記載の方法のいずれかによって製造される抗体に関する。
本発明はさらに、ステロイド生成急性調節関連脂質移転（START）ドメイン又はその誘導体若しくは変異体を含むアミノ酸配列を有するタンパク質の発現を遮断又は低下させるために有用なポリヌクレオチド配列を含む医薬組成物に関する。本発明はさらにまた、STARTドメイン又はその誘導体若しくは変異体を含むアミノ酸配列を有するタンパク質の発現を遮断又は低下させるポリヌクレオチド配列を含む医薬組成物に関する。
本発明の具体的な実施態様では、前記医薬組成物は、STARTドメイン配列がセラミド転移タンパク質CERT（CERT＝配列番号:11又はCERTL＝配列番号:13）又はその誘導体若しくは変異体であることを特徴とする。本発明の別の具体的な実施態様では、前記医薬組成物は、STARTドメイン配列が（配列番号:17又は19）又はその誘導体若しくは変異体であることを特徴とする。
本発明の具体的な実施態様では、前記医薬組成物は、前記ポリヌクレオチド配列がRNAi、siRNA又はアンチセンスRNAであることを特徴とする。
本発明の好ましい実施態様では、前記医薬組成物は、STARTドメインタンパク質が、PCTP（配列番号:27）、StarD7、GPBP、StarD10、StarD8、StarD13、DLC-1、StarD4（配列番号:21）、StarD6（配列番号:25）、StarD5（配列番号:23）、MLN64、StAR、THEA-2、CACH又はStarD9等の哺乳動物STARTドメインファミリーのメンバー、又は前記の誘導体若しくは変異体であることを特徴とする。
本発明の特に好ましい実施態様では、前記医薬組成物は、前記ポリヌクレオチドがCERTヌクレオチド配列又はその部分、特にSTARTドメインに対して相補的であることを特徴とする。
本発明のもっとも好ましい実施態様では、前記医薬組成物は、前記ポリヌクレオチドがCERT遺伝子又はCERTプロモーターに結合することを特徴とする。本発明のさらに好ましい実施態様では、前記医薬組成物は、前記ポリヌクレオチドがCERT遺伝子又はその部分に対してアンチセンスオリゴヌクレオチドであることを特徴とする。
【００５３】
本発明はさらに、ステロイド生成急性調節関連脂質移転（START）ドメイン、好ましくはCERT（配列番号:11又は配列番号:13）又はその誘導体若しくは変異体を含むアミノ酸配列を有するタンパク質のインヒビター又はサプレッサーを含む医薬組成物に関する。
本発明の具体的な実施態様では、前記医薬組成物は、前記インヒビター又はサプレッサーが、化学物質又はペプチドインヒビター又は阻害性タンパク質、例えば（i）CERTプロモーターと結合し、それによってCERT発現を阻害するタンパク質、（ii）CERT又はPKDと結合し、したがってPKDとCERTの結合を妨げ、さらにPKDによるCERTリン酸化を妨害するタンパク質、（iii）CERTと類似するが、CERTの機能を果たさないタンパク質（前記は“優性ネガティブ”CERT変種を意味する）、又は（iv）CERT及びPKDの両方ための足場として機能し、CERTとPKDとの不可逆的結合（＝安定的PKD/CERT複合体）を生じるタンパク質（前記複合体は、PKDによるCERTの阻害性リン酸化及び前記複合体からのCERTの解離の妨害のために機能しない）であることを特徴とする。
本発明の具体的な実施態様では、前記医薬組成物は、前記インヒビター又はサプレッサーがCERT活性のインヒビター又はサプレッサーであることを特徴とする。
本発明はさらに、STARTドメインタンパク質機能、好ましくはCERT機能の調整物質を認定する方法に関し、前記方法は、ステロイド生成急性調節関連脂質移転（START）ドメイン又は前記の誘導体若しくは変異体を含むアミノ酸配列を有するタンパク質、好ましくはCERTを提供する工程、工程a）の前記タンパク質を試験物質と接触させる工程、タンパク質分泌の増加若しくは低下又は細胞表面タンパク質の発現に関係する影響を決定する工程を含む。
本発明はさらに、記載の医薬組成物を癌治療のために適用することを含む方法に関する。
本発明はさらに、対象のタンパク質の分泌及び／又は産生の増加を目的とする、STARTドメインタンパク質又はSTARTドメインタンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用に関する。
本発明はさらに、記載の方法、発現ベクター、細胞又は医薬組成物のいずれかの診断的使用に関する。
【００５４】
具体的な実施態様では、本発明はさらに対象の異種タンパク質を細胞で製造する方法に関し、前記方法は、下記に列挙する、ステロイド生成急性調節関連脂質移転（START）ドメインコンセンサス配列又はその誘導体若しくは変異体を含むアミノ酸配列を有するタンパク質の発現又は活性を高める工程及び前記対象タンパク質の発現を実施する工程を含む：
コンセンサス／80％（配列番号:28）
nhnntnnntnhtnhhntnnnWnnnnnnnnnnnnnnnnnhhthnnnnnnnnnnnnnnnnnnn+hnthhnnnnnnnhnnnhhntnnnnnntWppnhnnnnnnnnnnnnnhthlpnhtnsnnnnnnnsnlnhnnntnnhnnnhnsnR-hhnlRnhpnnnnnnnnnnnttnhhlhnnohpnntnnnnnnnnnthhRsphhnshhhhpnnttsnnnnnnnnnnnnsphhhlnnh-htsnnnnnnnpnhhpnhhtnthnnhhpnnnnhtthptntnp
式中、クラスキー残基は以下のとおりである（一文字アミノ酸コードで表される）：
アルコール    ｏ            S,T
脂肪族        ｌ            I,L,V
任意          ．            A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y
芳香族        ａ            F,H,W,Y
荷電を有する  ｃ            D,E,H,K,R
疎水性        ｈ            A,C,F,G,H,I,K,L,M,R,T,V,W,Y
陰性          −            D,E
極性          ｐ            C,D,E,H,K,N,Q,R,S,T
陽性          ＋            H,K,R
小さい        ｓ            A,C,D,G,N,P,S,T
極小          ｕ            A,G,S
ターン様      ｔ      A,C,D,E,G,H,K,N,Q,R,S,T
本発明のさらに好ましい実施態様では、前述の実施態様のいずれ（例えば発現ベクター、細胞、タンパク質、医薬組成物、方法及び使用）のステロイド生成急性調節関連脂質移転（START）ドメインを含むアミノ酸配列を有するタンパク質も、上記列挙のSTARTドメインコンセンサス配列又はその誘導体若しくは変異体（配列番号:28；図9もまた参照されたい）を含むことによってその定義範囲に入る。
上記で一般的に記述した本発明は、以下の実施例（これらは単に本発明の一定の実施態様の例示を目的として本明細書に含まれる）を参考にすることによってより容易に理解されるであろう。以下の実施例は制限的なものではない。それらは単に本発明の可能な実施態様を示しているだけである。当業者は、他の実施態様に応用するために条件を容易に調整することができよう。
【００５５】
実験材料及び方法
抗体及び試薬：
抗体は以下のとおりである：ウサギ抗PKD基質ポリクローナル抗体（Cell Signaling）、マウス抗Flagモノクローナル抗体（Sigma-Aldrich）、マウス抗GFPモノクローナル抗体（Roche）、ウサギ抗PKDポリクローナル抗体（C-20, Santa Cruz Biotechnology）、マウス抗GS28（BD Biosciences）及びマウス抗チューブリン（Neomarkers）。PKD自己リン酸化をモニターするホスホ特異的抗pS916 PKD抗体は別の場所に記載されている（Hausser et al. 2002）。ペルオキシダーゼ標識二次抗マウス及び抗ウサギIgG抗体はAmershamから、アルカリ性ホスファターゼ標識二次抗マウスIgG抗体はSigmaから、アレクサフルアー（Alexa Fluor）488-及び546-標識二次抗マウス及び抗ラットIgG抗体はMolecular Probesから入手される。
【００５６】
DNA構築物：
完全長CERT cDNAは、EcoRI制限部位を含むプライマーとともに鋳型としてpcDNA3-Flag-CERTを用いてPCRによって増幅し、pEGFPC1ベクターでクローニングする。CERTの点変異体を、Quickchange位置特異的PCR変異導入によって製造業者（Stratagene）の指示に従いながら作製する。切端CERT変種をSTOPコドンの挿入によって作製する。以下のオリゴヌクレオチドを用いる：CERT-S132A（配列番号:1：5'-cgtcgacatggcgcaatggtgtccctgg-3'）、CERT-S132A rev（配列番号:2：5'-ccagggacaccattgcgccatgtcgacg-3'）、CERT-S272A（配列番号:3：5'-ggttaaacgtgaggacgcctggcagaagagactgg-3'）、CERT-S272Arev（配列番号:4：5'-ccagtctcttctgccaggcgtcctcacgtttaacc-3'）、アミノ酸138位切端CERT（配列番号:5：5'-ggtgtccctggtgtcttgagcaagtggctactc-3'）、CERT-138切端rev（配列番号:6：5'-gagtagccacttgctcaagacaccagggacacc-3'）。Flag-CERT cDNAは、EcoRI制限部位を用いてpGEX6P1でサブクローニングする。pEGFP-N1-PKD及びpEGFP-N1-PKDK612Wは以前に記載されている（Hausser et al. 2005）。ss-HRP-FlagをコードするプラスミドはVivek Malhotra氏（UCSD）の好意により提供された。
【００５７】
cDNA及びタンパク質
ヒトCERT cDNA（配列番号:10）：
atgtcggata atcagagctg gaactcgtcg ggctcggagg aggatccaga gacggagtct           60
gggccgcctg tggagcgctg cggggtcctc agtaagtgga caaactacat tcatgggtgg           120
caggatcgtt gggtagtttt gaaaaataat gctctgagtt actacaaatc tgaagatgaa           180
acagagtatg gctgcagagg atccatctgt cttagcaagg ctgtcatcac acctcacgat           240
tttgatgaat gtcgatttga tattagtgta aatgatagtg tttggtatct tcgtgctcag           300
gatccagatc atagacagca atggatagat gccattgaac agcacaagac tgaatctgga           360
tatggatctg aatccagctt gcgtcgacat ggctcaatgg tgtccctggt gtctggagca           420
agtggctact ctgcaacatc cacctcttca ttcaagaaag gccacagttt acgtgagaag           480
ttggctgaaa tggaaacatt tagagacatc ttatgtagac aagttgacac gctacagaag           540
tactttgatg cctgtgctga tgctgtctct aaggatgaac ttcaaaggga taaagtggta           600
gaagatgatg aagatgactt tcctacaacg cgttctgatg gtgacttctt gcatagtacc           660
aacggcaata aagaaaagtt atttccacat gtgacaccaa aaggaattaa tggtatagac           720
tttaaagggg aagcgataac ttttaaagca actactgctg gaatccttgc aacactttct           780
cattgtattg aactaatggt taaacgtgag gacagctggc agaagagact ggataaggaa           840
actgagaaga aaagaagaac agaggaagca tataaaaatg caatgacaga acttaagaaa           900
aaatcccact ttggaggacc agattatgaa gaaggcccta acagtctgat taatgaagaa           960
gagttctttg atgctgttga agctgctctt gacagacaag ataaaataga agaacagtca          1020
cagagtgaaa aggtgagatt acattggcct acatccttgc cctctggaga tgccttttct          1080
tctgtgggga cacatagatt tgtccaaaag gttgaagaga tggtgcagaa ccacatgact          1140
tactcattac aggatgtagg cggagatgcc aattggcagt tggttgtaga agaaggagaa          1200
atgaaggtat acagaagaga agtagaagaa aatgggattg ttctggatcc tttaaaagct          1260
acccatgcag ttaaaggcgt cacaggacat gaagtctgca attatttctg gaatgttgac          1320
gttcgcaatg actgggaaac aactatagaa aactttcatg tggtggaaac attagctgat          1380
aatgcaatca tcatttatca aacacacaag agggtgtggc ctgcttctca gcgagacgta          1440
ttatatcttt ctgtcattcg aaagatacca gccttgactg aaaatgaccc tgaaacttgg          1500
atagtttgta atttttctgt ggatcatgac agtgctcctc taaacaaccg atgtgtccgt          1560
gccaaaataa atgttgctat gatttgtcaa accttggtaa gcccaccaga gggaaaccag          1620
gaaattagca gggacaacat tctatgcaag attacatatg tagctaatgt gaaccctgga          1680
ggatgggcac cagcctcagt gttaagggca gtggcaaagc gagagtatcc taaatttcta          1740
aaacgtttta cttcttacgt ccaagaaaaa actgcaggaa agcctatttt gttctag             1797
【００５８】
ヒトCERTタンパク質（配列番号:11）
Met Ser Asp Asn Gln Ser Trp Asn Ser Ser Gly Ser Glu Glu Asp Pro 
Glu Thr Glu Ser Gly Pro Pro Val Glu Arg Cys Gly Val Leu Ser Lys 
Trp Thr Asn Tyr Ile His Gly Trp Gln Asp Arg Trp Val Val Leu Lys 
Asn Asn Ala Leu Ser Tyr Tyr Lys Ser Glu Asp Glu Thr Glu Tyr Gly 
Cys Arg Gly Ser Ile Cys Leu Ser Lys Ala Val Ile Thr Pro His Asp 
Phe Asp Glu Cys Arg Phe Asp Ile Ser Val Asn Asp Ser Val Trp Tyr 
Leu Arg Ala Gln Asp Pro Asp His Arg Gln Gln Trp Ile Asp Ala Ile 
Glu Gln His Lys Thr Glu Ser Gly Tyr Gly Ser Glu Ser Ser Leu Arg 
Arg His Gly Ser Met Val Ser Leu Val Ser Gly Ala Ser Gly Tyr Ser 
Ala Thr Ser Thr Ser Ser Phe Lys Lys Gly His Ser Leu Arg Glu Lys 
Leu Ala Glu Met Glu Thr Phe Arg Asp Ile Leu Cys Arg Gln Val Asp 
Thr Leu Gln Lys Tyr Phe Asp Ala Cys Ala Asp Ala Val Ser Lys Asp 
Glu Leu Gln Arg Asp Lys Val Val Glu Asp Asp Glu Asp Asp Phe Pro 
Thr Thr Arg Ser Asp Gly Asp Phe Leu His Ser Thr Asn Gly Asn Lys 
Glu Lys Leu Phe Pro His Val Thr Pro Lys Gly Ile Asn Gly Ile Asp 
Phe Lys Gly Glu Ala Ile Thr Phe Lys Ala Thr Thr Ala Gly Ile Leu 
Ala Thr Leu Ser His Cys Ile Glu Leu Met Val Lys Arg Glu Asp Ser 
Trp Gln Lys Arg Leu Asp Lys Glu Thr Glu Lys Lys Arg Arg Thr Glu 
Glu Ala Tyr Lys Asn Ala Met Thr Glu Leu Lys Lys Lys Ser His Phe 
Gly Gly Pro Asp Tyr Glu Glu Gly Pro Asn Ser Leu Ile Asn Glu Glu 
Glu Phe Phe Asp Ala Val Glu Ala Ala Leu Asp Arg Gln Asp Lys Ile 
Glu Glu Gln Ser Gln Ser Glu Lys Val Arg Leu His Trp Pro Thr Ser 
Leu Pro Ser Gly Asp Ala Phe Ser Ser Val Gly Thr His Arg Phe Val 
Gln Lys Val Glu Glu Met Val Gln Asn His Met Thr Tyr Ser Leu Gln 
Asp Val Gly Gly Asp Ala Asn Trp Gln Leu Val Val Glu Glu Gly Glu 
Met Lys Val Tyr Arg Arg Glu Val Glu Glu Asn Gly Ile Val Leu Asp 
Pro Leu Lys Ala Thr His Ala Val Lys Gly Val Thr Gly His Glu Val 
Cys Asn Tyr Phe Trp Asn Val Asp Val Arg Asn Asp Trp Glu Thr Thr 
Ile Glu Asn Phe His Val Val Glu Thr Leu Ala Asp Asn Ala Ile Ile 
Ile Tyr Gln Thr His Lys Arg Val Trp Pro Ala Ser Gln Arg Asp Val 
Leu Tyr Leu Ser Val Ile Arg Lys Ile Pro Ala Leu Thr Glu Asn Asp 
Pro Glu Thr Trp Ile Val Cys Asn Phe Ser Val Asp His Asp Ser Ala 
Pro Leu Asn Asn Arg Cys Val Arg Ala Lys Ile Asn Val Ala Met Ile 
Cys Gln Thr Leu Val Ser Pro Pro Glu Gly Asn Gln Glu Ile Ser Arg 
Asp Asn Ile Leu Cys Lys Ile Thr Tyr Val Ala Asn Val Asn Pro Gly 
Gly Trp Ala Pro Ala Ser Val Leu Arg Ala Val Ala Lys Arg Glu Tyr 
Pro Lys Phe Leu Lys Arg Phe Thr Ser Tyr Val Gln Glu Lys Thr Ala 
Gly Lys Pro Ile Leu Phe 
【００５９】
ヒトCERT L cDNA（配列番号:12）
gcaggaagat ggcggcggta gcggaggtgt gagtggacgc gggactcagc ggccggattt            60
tctcttccct tcttttccct tttccttccc tatttgaaat tggcatcgag ggggctaagt           120
tcgggtggca gcgccgggcg caacgcaggg gtcacggcga cggcggcggc ggctgacggc           180
tggaagggta ggcttcattc accgctcgtc ctccttcctc gctccgctcg gtgtcaggcg           240
cggcggcggc gcggcgggcg gacttcgtcc ctcctcctgc tcccccccac accggagcgg           300
gcactcttcg cttcgccatc ccccgaccct tcaccccgag gactgggcgc ctcctccggc           360
gcagctgagg gagcgggggc cggtctcctg ctcggttgtc gagcctccat gtcggataat           420
cagagctgga actcgtcggg ctcggaggag gatccagaga cggagtctgg gccgcctgtg           480
gagcgctgcg gggtcctcag taagtggaca aactacattc atgggtggca ggatcgttgg           540
gtagttttga aaaataatgc tctgagttac tacaaatctg aagatgaaac agagtatggc           600
tgcagaggat ccatctgtct tagcaaggct gtcatcacac ctcacgattt tgatgaatgt           660
cgatttgata ttagtgtaaa tgatagtgtt tggtatcttc gtgctcagga tccagatcat           720
agacagcaat ggatagatgc cattgaacag cacaagactg aatctggata tggatctgaa           780
tccagcttgc gtcgacatgg ctcaatggtg tccctggtgt ctggagcaag tggctactct           840
gcaacatcca cctcttcatt caagaaaggc cacagtttac gtgagaagtt ggctgaaatg           900
gaaacattta gagacatctt atgtagacaa gttgacacgc tacagaagta ctttgatgcc           960
tgtgctgatg ctgtctctaa ggatgaactt caaagggata aagtggtaga agatgatgaa          1020
gatgactttc ctacaacgcg ttctgatggt gacttcttgc atagtaccaa cggcaataaa          1080
gaaaagttat ttccacatgt gacaccaaaa ggaattaatg gtatagactt taaaggggaa          1140
gcgataactt ttaaagcaac tactgctgga atccttgcaa cactttctca ttgtattgaa          1200
ctaatggtta aacgtgagga cagctggcag aagagactgg ataaggaaac tgagaagaaa          1260
agaagaacag aggaagcata taaaaatgca atgacagaac ttaagaaaaa atcccacttt          1320
ggaggaccag attatgaaga aggccctaac agtctgatta atgaagaaga gttctttgat          1380
gctgttgaag ctgctcttga cagacaagat aaaatagaag aacagtcaca gagtgaaaag          1440
gtgagattac attggcctac atccttgccc tctggagatg ccttttcttc tgtggggaca          1500
catagatttg tccaaaagcc ctatagtcgc tcttcctcca tgtcttccat tgatctagtc          1560
agtgcctctg atgatgttca cagattcagc tcccaggttg aagagatggt gcagaaccac          1620
atgacttact cattacagga tgtaggcgga gatgccaatt ggcagttggt tgtagaagaa          1680
ggagaaatga aggtatacag aagagaagta gaagaaaatg ggattgttct ggatccttta          1740
aaagctaccc atgcagttaa aggcgtcaca ggacatgaag tctgcaatta tttctggaat          1800
gttgacgttc gcaatgactg ggaaacaact atagaaaact ttcatgtggt ggaaacatta          1860
gctgataatg caatcatcat ttatcaaaca cacaagaggg tgtggcctgc ttctcagcga          1920
gacgtattat atctttctgt cattcgaaag ataccagcct tgactgaaaa tgaccctgaa          1980
acttggatag tttgtaattt ttctgtggat catgacagtg ctcctctaaa caaccgatgt          2040
gtccgtgcca aaataaatgt tgctatgatt tgtcaaacct tggtaagccc accagaggga          2100
aaccaggaaa ttagcaggga caacattcta tgcaagatta catatgtagc taatgtgaac          2160
cctggaggat gggcaccagc ctcagtgtta agggcagtgg caaagcgaga gtatcctaaa          2220
tttctaaaac gttttacttc ttacgtccaa gaaaaaactg caggaaagcc tattttgttc          2280
tagtattaac aggtactaga agatatgttt tatctttttt taactttatt tgactaatat          2340
gactgtcaat actaaaattt agttgttgaa agtatttact atgtttttt                      2389
【００６０】
ヒトCERT Lタンパク質（配列番号:13）
Met Ser Asp Asn Gln Ser Trp Asn Ser Ser Gly Ser Glu Glu Asp Pro 
Glu Thr Glu Ser Gly Pro Pro Val Glu Arg Cys Gly Val Leu Ser Lys 
Trp Thr Asn Tyr Ile His Gly Trp Gln Asp Arg Trp Val Val Leu Lys 
Asn Asn Ala Leu Ser Tyr Tyr Lys Ser Glu Asp Glu Thr Glu Tyr Gly 
Cys Arg Gly Ser Ile Cys Leu Ser Lys Ala Val Ile Thr Pro His Asp 
Phe Asp Glu Cys Arg Phe Asp Ile Ser Val Asn Asp Ser Val Trp Tyr 
Leu Arg Ala Gln Asp Pro Asp His Arg Gln Gln Trp Ile Asp Ala Ile 
Glu Gln His Lys Thr Glu Ser Gly Tyr Gly Ser Glu Ser Ser Leu Arg 
Arg His Gly Ser Met Val Ser Leu Val Ser Gly Ala Ser Gly Tyr Ser 
Ala Thr Ser Thr Ser Ser Phe Lys Lys Gly His Ser Leu Arg Glu Lys 
Leu Ala Glu Met Glu Thr Phe Arg Asp Ile Leu Cys Arg Gln Val Asp 
Thr Leu Gln Lys Tyr Phe Asp Ala Cys Ala Asp Ala Val Ser Lys Asp 
Glu Leu Gln Arg Asp Lys Val Val Glu Asp Asp Glu Asp Asp Phe Pro 
Thr Thr Arg Ser Asp Gly Asp Phe Leu His Ser Thr Asn Gly Asn Lys 
Glu Lys Leu Phe Pro His Val Thr Pro Lys Gly Ile Asn Gly Ile Asp 
Phe Lys Gly Glu Ala Ile Thr Phe Lys Ala Thr Thr Ala Gly Ile Leu 
Ala Thr Leu Ser His Cys Ile Glu Leu Met Val Lys Arg Glu Asp Ser 
Trp Gln Lys Arg Leu Asp Lys Glu Thr Glu Lys Lys Arg Arg Thr Glu 
Glu Ala Tyr Lys Asn Ala Met Thr Glu Leu Lys Lys Lys Ser His Phe 
Gly Gly Pro Asp Tyr Glu Glu Gly Pro Asn Ser Leu Ile Asn Glu Glu 
Glu Phe Phe Asp Ala Val Glu Ala Ala Leu Asp Arg Gln Asp Lys Ile 
Glu Glu Gln Ser Gln Ser Glu Lys Val Arg Leu His Trp Pro Thr Ser 
Leu Pro Ser Gly Asp Ala Phe Ser Ser Val Gly Thr His Arg Phe Val 
Gln Lys Pro Tyr Ser Arg Ser Ser Ser Met Ser Ser Ile Asp Leu Val 
Ser Ala Ser Asp Asp Val His Arg Phe Ser Ser Gln Val Glu Glu Met 
Val Gln Asn His Met Thr Tyr Ser Leu Gln Asp Val Gly Gly Asp Ala 
Asn Trp Gln Leu Val Val Glu Glu Gly Glu Met Lys Val Tyr Arg Arg 
Glu Val Glu Glu Asn Gly Ile Val Leu Asp Pro Leu Lys Ala Thr His 
Ala Val Lys Gly Val Thr Gly His Glu Val Cys Asn Tyr Phe Trp Asn 
Val Asp Val Arg Asn Asp Trp Glu Thr Thr Ile Glu Asn Phe His Val 
Val Glu Thr Leu Ala Asp Asn Ala Ile Ile Ile Tyr Gln Thr His Lys 
Arg Val Trp Pro Ala Ser Gln Arg Asp Val Leu Tyr Leu Ser Val Ile 
Arg Lys Ile Pro Ala Leu Thr Glu Asn Asp Pro Glu Thr Trp Ile Val 
Cys Asn Phe Ser Val Asp His Asp Ser Ala Pro Leu Asn Asn Arg Cys 
Val Arg Ala Lys Ile Asn Val Ala Met Ile Cys Gln Thr Leu Val Ser 
Pro Pro Glu Gly Asn Gln Glu Ile Ser Arg Asp Asn Ile Leu Cys Lys 
Ile Thr Tyr Val Ala Asn Val Asn Pro Gly Gly Trp Ala Pro Ala Ser 
Val Leu Arg Ala Val Ala Lys Arg Glu Tyr Pro Lys Phe Leu Lys Arg 
Phe Thr Ser Tyr Val Gln Glu Lys Thr Ala Gly Lys Pro Ile Leu Phe 
【００６１】
ヒトCERT S132A cDNA（配列番号:14）
atgtcggata atcagagctg gaactcgtcg ggctcggagg aggatccaga gacggagtct            60
gggccgcctg tggagcgctg cggggtcctc agtaagtgga caaactacat tcatgggtgg           120
caggatcgtt gggtagtttt gaaaaataat gctctgagtt actacaaatc tgaagatgaa           180
acagagtatg gctgcagagg atccatctgt cttagcaagg ctgtcatcac acctcacgat           240
tttgatgaat gtcgatttga tattagtgta aatgatagtg tttggtatct tcgtgctcag           300
gatccagatc atagacagca atggatagat gccattgaac agcacaagac tgaatctgga           360
tatggatctg aatccagctt gcgtcgacat ggcgcaatgg tgtccctggt gtctggagca           420
agtggctact ctgcaacatc cacctcttca ttcaagaaag gccacagttt acgtgagaag           480
ttggctgaaa tggaaacatt tagagacatc ttatgtagac aagttgacac gctacagaag           540
tactttgatg cctgtgctga tgctgtctct aaggatgaac ttcaaaggga taaagtggta           600
gaagatgatg aagatgactt tcctacaacg cgttctgatg gtgacttctt gcatagtacc           660
aacggcaata aagaaaagtt atttccacat gtgacaccaa aaggaattaa tggtatagac           720
tttaaagggg aagcgataac ttttaaagca actactgctg gaatccttgc aacactttct           780
cattgtattg aactaatggt taaacgtgag gacagctggc agaagagact ggataaggaa           840
actgagaaga aaagaagaac agaggaagca tataaaaatg caatgacaga acttaagaaa           900
aaatcccact ttggaggacc agattatgaa gaaggcccta acagtctgat taatgaagaa           960
gagttctttg atgctgttga agctgctctt gacagacaag ataaaataga agaacagtca          1020
cagagtgaaa aggtgagatt acattggcct acatccttgc cctctggaga tgccttttct          1080
tctgtgggga cacatagatt tgtccaaaag gttgaagaga tggtgcagaa ccacatgact          1140
tactcattac aggatgtagg cggagatgcc aattggcagt tggttgtaga agaaggagaa          1200
atgaaggtat acagaagaga agtagaagaa aatgggattg ttctggatcc tttaaaagct          1260
acccatgcag ttaaaggcgt cacaggacat gaagtctgca attatttctg gaatgttgac          1320
gttcgcaatg actgggaaac aactatagaa aactttcatg tggtggaaac attagctgat          1380
aatgcaatca tcatttatca aacacacaag agggtgtggc ctgcttctca gcgagacgta          1440
ttatatcttt ctgtcattcg aaagatacca gccttgactg aaaatgaccc tgaaacttgg          1500
atagtttgta atttttctgt ggatcatgac agtgctcctc taaacaaccg atgtgtccgt          1560
gccaaaataa atgttgctat gatttgtcaa accttggtaa gcccaccaga gggaaaccag          1620
gaaattagca gggacaacat tctatgcaag attacatatg tagctaatgt gaaccctgga          1680
ggatgggcac cagcctcagt gttaagggca gtggcaaagc gagagtatcc taaatttcta          1740
aaacgtttta cttcttacgt ccaagaaaaa actgcaggaa agcctatttt gttctag             1797
【００６２】
ヒトCERT S132Aタンパク質（配列番号:15）
Met Ser Asp Asn Gln Ser Trp Asn Ser Ser Gly Ser Glu Glu Asp Pro 
Glu Thr Glu Ser Gly Pro Pro Val Glu Arg Cys Gly Val Leu Ser Lys 
Trp Thr Asn Tyr Ile His Gly Trp Gln Asp Arg Trp Val Val Leu Lys 
Asn Asn Ala Leu Ser Tyr Tyr Lys Ser Glu Asp Glu Thr Glu Tyr Gly 
Cys Arg Gly Ser Ile Cys Leu Ser Lys Ala Val Ile Thr Pro His Asp 
Phe Asp Glu Cys Arg Phe Asp Ile Ser Val Asn Asp Ser Val Trp Tyr 
Leu Arg Ala Gln Asp Pro Asp His Arg Gln Gln Trp Ile Asp Ala Ile 
Glu Gln His Lys Thr Glu Ser Gly Tyr Gly Ser Glu Ser Ser Leu Arg 
Arg His Gly Ala Met Val Ser Leu Val Ser Gly Ala Ser Gly Tyr Ser 
Ala Thr Ser Thr Ser Ser Phe Lys Lys Gly His Ser Leu Arg Glu Lys 
Leu Ala Glu Met Glu Thr Phe Arg Asp Ile Leu Cys Arg Gln Val Asp 
Thr Leu Gln Lys Tyr Phe Asp Ala Cys Ala Asp Ala Val Ser Lys Asp 
Glu Leu Gln Arg Asp Lys Val Val Glu Asp Asp Glu Asp Asp Phe Pro 
Thr Thr Arg Ser Asp Gly Asp Phe Leu His Ser Thr Asn Gly Asn Lys 
Glu Lys Leu Phe Pro His Val Thr Pro Lys Gly Ile Asn Gly Ile Asp 
Phe Lys Gly Glu Ala Ile Thr Phe Lys Ala Thr Thr Ala Gly Ile Leu 
Ala Thr Leu Ser His Cys Ile Glu Leu Met Val Lys Arg Glu Asp Ser 
Trp Gln Lys Arg Leu Asp Lys Glu Thr Glu Lys Lys Arg Arg Thr Glu 
Glu Ala Tyr Lys Asn Ala Met Thr Glu Leu Lys Lys Lys Ser His Phe 
Gly Gly Pro Asp Tyr Glu Glu Gly Pro Asn Ser Leu Ile Asn Glu Glu 
Glu Phe Phe Asp Ala Val Glu Ala Ala Leu Asp Arg Gln Asp Lys Ile 
Glu Glu Gln Ser Gln Ser Glu Lys Val Arg Leu His Trp Pro Thr Ser 
Leu Pro Ser Gly Asp Ala Phe Ser Ser Val Gly Thr His Arg Phe Val 
Gln Lys Val Glu Glu Met Val Gln Asn His Met Thr Tyr Ser Leu Gln 
Asp Val Gly Gly Asp Ala Asn Trp Gln Leu Val Val Glu Glu Gly Glu 
Met Lys Val Tyr Arg Arg Glu Val Glu Glu Asn Gly Ile Val Leu Asp 
Pro Leu Lys Ala Thr His Ala Val Lys Gly Val Thr Gly His Glu Val 
Cys Asn Tyr Phe Trp Asn Val Asp Val Arg Asn Asp Trp Glu Thr Thr 
Ile Glu Asn Phe His Val Val Glu Thr Leu Ala Asp Asn Ala Ile Ile 
Ile Tyr Gln Thr His Lys Arg Val Trp Pro Ala Ser Gln Arg Asp Val 
Leu Tyr Leu Ser Val Ile Arg Lys Ile Pro Ala Leu Thr Glu Asn Asp 
Pro Glu Thr Trp Ile Val Cys Asn Phe Ser Val Asp His Asp Ser Ala 
Pro Leu Asn Asn Arg Cys Val Arg Ala Lys Ile Asn Val Ala Met Ile 
Cys Gln Thr Leu Val Ser Pro Pro Glu Gly Asn Gln Glu Ile Ser Arg 
Asp Asn Ile Leu Cys Lys Ile Thr Tyr Val Ala Asn Val Asn Pro Gly 
Gly Trp Ala Pro Ala Ser Val Leu Arg Ala Val Ala Lys Arg Glu Tyr 
Pro Lys Phe Leu Lys Arg Phe Thr Ser Tyr Val Gln Glu Lys Thr Ala 
Gly Lys Pro Ile Leu Phe 
【００６３】
ヒトSTARTドメインCERT cDNA（配列番号:16）
agatttgtcc aaaaggttga agagatggtg cagaaccaca tgacttactc attacaggat            60
gtaggcggag atgccaattg gcagttggtt gtagaagaag gagaaatgaa ggtatacaga           120
agagaagtag aagaaaatgg gattgttctg gatcctttaa aagctaccca tgcagttaaa           180
ggcgtcacag gacatgaagt ctgcaattat ttctggaatg ttgacgttcg caatgactgg           240
gaaacaacta tagaaaactt tcatgtggtg gaaacattag ctgataatgc aatcatcatt           300
tatcaaacac acaagagggt gtggcctgct tctcagcgag acgtattata tctttctgtc           360
attcgaaaga taccagcctt gactgaaaat gaccctgaaa cttggatagt ttgtaatttt           420
tctgtggatc atgacagtgc tcctctaaac aaccgatgtg tccgtgccaa aataaatgtt           480
gctatgattt gtcaaacctt ggtaagccca ccagagggaa accaggaaat tagcagggac           540
aacattctat gcaagattac atatgtagct aatgtgaacc ctggaggatg ggcaccagcc           600
tcagtgttaa gggcagtggc aaagcgagag tatcctaaat ttctaaaacg ttttacttct           660
tacgtccaa                                                                   669
【００６４】
ヒトSTARTドメインCERTタンパク質（配列番号:17）
Arg Phe Val Gln Lys Val Glu Glu Met Val Gln Asn His Met Thr Tyr 
Ser Leu Gln Asp Val Gly Gly Asp Ala Asn Trp Gln Leu Val Val Glu 
Glu Gly Glu Met Lys Val Tyr Arg Arg Glu Val Glu Glu Asn Gly Ile 
Val Leu Asp Pro Leu Lys Ala Thr His Ala Val Lys Gly Val Thr Gly 
His Glu Val Cys Asn Tyr Phe Trp Asn Val Asp Val Arg Asn Asp Trp 
Glu Thr Thr Ile Glu Asn Phe His Val Val Glu Thr Leu Ala Asp Asn 
Ala Ile Ile Ile Tyr Gln Thr His Lys Arg Val Trp Pro Ala Ser Gln 
Arg Asp Val Leu Tyr Leu Ser Val Ile Arg Lys Ile Pro Ala Leu Thr 
Glu Asn Asp Pro Glu Thr Trp Ile Val Cys Asn Phe Ser Val Asp His 
Asp Ser Ala Pro Leu Asn Asn Arg Cys Val Arg Ala Lys Ile Asn Val 
Ala Met Ile Cys Gln Thr Leu Val Ser Pro Pro Glu Gly Asn Gln Glu 
Ile Ser Arg Asp Asn Ile Leu Cys Lys Ile Thr Tyr Val Ala Asn Val 
Asn Pro Gly Gly Trp Ala Pro Ala Ser Val Leu Arg Ala Val Ala Lys 
Arg Glu Tyr Pro Lys Phe Leu Lys Arg Phe Thr Ser Tyr Val Gln 
【００６５】
ヒトSTARTドメインCERT L cDNA（配列番号:18）
caggttgaag agatggtgca gaaccacatg acttactcat tacaggatgt aggcggagat            60
gccaattggc agttggttgt agaagaagga gaaatgaagg tatacagaag agaagtagaa           120
gaaaatggga ttgttctgga tcctttaaaa gctacccatg cagttaaagg cgtcacagga           180
catgaagtct gcaattattt ctggaatgtt gacgttcgca atgactggga aacaactata           240
gaaaactttc atgtggtgga aacattagct gataatgcaa tcatcattta tcaaacacac           300
aagagggtgt ggcctgcttc tcagcgagac gtattatatc tttctgtcat tcgaaagata           360
ccagccttga ctgaaaatga ccctgaaact tggatagttt gtaatttttc tgtggatcat           420
gacagtgctc ctctaaacaa ccgatgtgtc cgtgccaaaa taaatgttgc tatgatttgt           480
caaaccttgg taagcccacc agagggaaac caggaaatta gcagggacaa cattctatgc           540
aagattacat atgtagctaa tgtgaaccct ggaggatggg caccagcctc agtgttaagg           600
gcagtggcaa agcgagagta tcctaaattt ctaaaacgtt ttacttctta cgtccaag             658
【００６６】
ヒトSTARTドメインCERT Lタンパク質（配列番号:19）
Gln Val Glu Glu Met Val Gln Asn His Met Thr Tyr Ser Leu Gln Asp 
Val Gly Gly Asp Ala Asn Trp Gln Leu Val Val Glu Glu Gly Glu Met 
Lys Val Tyr Arg Arg Glu Val Glu Glu Asn Gly Ile Val Leu Asp Pro 
Leu Lys Ala Thr His Ala Val Lys Gly Val Thr Gly His Glu Val Cys 
Asn Tyr Phe Trp Asn Val Asp Val Arg Asn Asp Trp Glu Thr Thr Ile 
Glu Asn Phe His Val Val Glu Thr Leu Ala Asp Asn Ala Ile Ile Ile 
Tyr Gln Thr His Lys Arg Val Trp Pro Ala Ser Gln Arg Asp Val Leu 
Tyr Leu Ser Val Ile Arg Lys Ile Pro Ala Leu Thr Glu Asn Asp Pro 
Glu Thr Trp Ile Val Cys Asn Phe Ser Val Asp His Asp Ser Ala Pro 
Leu Asn Asn Arg Cys Val Arg Ala Lys Ile Asn Val Ala Met Ile Cys 
Gln Thr Leu Val Ser Pro Pro Glu Gly Asn Gln Glu Ile Ser Arg Asp 
Asn Ile Leu Cys Lys Ile Thr Tyr Val Ala Asn Val Asn Pro Gly Gly 
Trp Ala Pro Ala Ser Val Leu Arg Ala Val Ala Lys Arg Glu Tyr Pro 
Lys Phe Leu Lys Arg Phe Thr Ser Tyr Val Gln 
【００６７】
ヒトStarD4 cDNA（配列番号:20）
actgttgaga gcggtgtgag gtgcttggta gcgcgccgta gctgcttcca cgtccttgct            60
tcacctcagg taaagagaga agtaatggaa ggcctgtctg atgttgcttc ttttgcaact           120
aaacttaaaa acactctcat ccagtaccat agcattgaag aagataagtg gcgagttgct           180
aagaaaacga aagatgtaac tgtttggaga aaaccctcag aagaatttaa tggatatctc           240
tacaaagccc aaggtgttat agatgacctt gtctatagta taatagacca tatacgccca           300
gggccttgtc gtttggattg ggacagcttg atgacttctt tggatattct ggagaacttt           360
gaagagaatt gctgtgtgat gcgttacact actgctggtc agctttggaa tataatttcc           420
ccaagagaat ttgttgattt ctcctatact gtgggctata aagaagggct tttatcttgt           480
ggaataagtc ttgactggga tgaaaagaga ccagaatttg ttcgaggata taaccatccc           540
tgtggttggt tttgtgttcc acttaaagac aacccaaacc agagtctttt gacaggatat           600
attcagacag atctgcgtgg gatgattcct cagtctgcgg tagatacagc catggcaagc           660
actttaacca acttctatgg tgatttacga aaagctttat gagaggcaaa atacattcaa           720
acttgtagta ctacagatca actctctcag ctacatggcc tgtaaaaatc attgattcca           780
cttttctgca tagccggtag aaaaatttga aatgtttttg gttcactagt acaatgtttg           840
gttttattcc taaagtaaat agctatctaa gagagggcat tttcactttt ttttttttaa           900
attttgagac aggctctcac tctgttgccc atgctggagg gcagtggtat gatcacagct           960
cactgcagct ttgatctgac cgctcaaggg gttattctac ctcagcctcc tgaatagctg          1020
ggaatacagg tgcacgccac tatgcatggc taatttttgt ttaatttttt gtagagatgt          1080
ggtcacactg tgttgcccag gctggtcttg aactcctggc ctcaagtcat tccccacctt          1140
agcctcccaa agtgttggga ttataagcgt gagccaccat gcctggcccc aatttaaaat          1200
gtggaattca gttggtgtcc aagacttatc ttgagactct taaaagcatc agtctgtaac          1260
tagaacaaat acagtcttag atttacccaa gtgcctagat atcattttat aatgattaga          1320
attgagtatt gtgggtcccc taattctgtg ggtgccttaa gtgagaattt ctaaatgatt          1380
ttcacattct aaatgacttt gggttttgaa ctctccatct agtttacttc taaaatggga          1440
acttgaggca attcaggtat ccaggcaaat ctttgtatat atttttttgt gtacatgcac          1500
acatctcgaa atccatttcc gtgtttaatg ttagttgttt atgtgttagt attcctgtgt          1560
ctactgtttt gttgttgtta atatgggtaa agtgagccct gaaatacatg ctaaacaaga          1620
catgaaattc agaaaggtac atagtgtttc aagtgcatgg tagtttgatc tgtgttttac          1680
tttattgtgt tttcttgagt gtaaagaaag aataaatcaa agttcttcat acccattttg          1740
acaaagtgga acagtggagc tgttttttgc ttttgttttt atttattttt tgccactggt          1800
gatgatagat ttcaaaaaac aaaaggtggc agcagcacaa tgttcatggt gaattatctc          1860
atagtatcta gattgatcaa gatctgacag aaggaatgca caaaggattc tatattctta          1920
atgatttatt aattaccagg atccttttct aaattgaatg tacttttgaa ttactaggtt          1980
tcttcttttt ttttgttctg caatagtgaa agaaaactca gtagtttagt ttcagtttct          2040
catggaaatt ggtaaatgtt agttttgact tcatctattt tttatttgtt tttattagcg          2100
tagagtagga agtctcatat tctactgttc tatctaggat ggtgaaattc caaaggtgcc          2160
taacttgagt aagggatttg tgacaagata gtacacatta ctataagggc tattatttcc          2220
tgaactggat gtccctaaaa gcaaataaac tgcccactat ctct                           2264
【００６８】
ヒトStarD4タンパク質（配列番号:21）
Met Glu Gly Leu Ser Asp Val Ala Ser Phe Ala Thr Lys Leu Lys Asn 
Thr Leu Ile Gln Tyr His Ser Ile Glu Glu Asp Lys Trp Arg Val Ala 
Lys Lys Thr Lys Asp Val Thr Val Trp Arg Lys Pro Ser Glu Glu Phe 
Asn Gly Tyr Leu Tyr Lys Ala Gln Gly Val Ile Asp Asp Leu Val Tyr 
Ser Ile Ile Asp His Ile Arg Pro Gly Pro Cys Arg Leu Asp Trp Asp 
Ser Leu Met Thr Ser Leu Asp Ile Leu Glu Asn Phe Glu Glu Asn Cys 
Cys Val Met Arg Tyr Thr Thr Ala Gly Gln Leu Trp Asn Ile Ile Ser 
Pro Arg Glu Phe Val Asp Phe Ser Tyr Thr Val Gly Tyr Lys Glu Gly 
Leu Leu Ser Cys Gly Ile Ser Leu Asp Trp Asp Glu Lys Arg Pro Glu 
Phe Val Arg Gly Tyr Asn His Pro Cys Gly Trp Phe Cys Val Pro Leu 
Lys Asp Asn Pro Asn Gln Ser Leu Leu Thr Gly Tyr Ile Gln Thr Asp 
Leu Arg Gly Met Ile Pro Gln Ser Ala Val Asp Thr Ala Met Ala Ser 
Thr Leu Thr Asn Phe Tyr Gly Asp Leu Arg Lys Ala Leu 
【００６９】
ヒトStarD5 cDNA（配列番号:22）
gagctccagc ctccaggcac ccgggatcca gcgccgccgc tcataacacc cgcgaccccg            60
cagctaagcg cagctcccga cgcaatggac ccggcgctgg cagcccagat gagcgaggct           120
gtggccgaga agatgctcca gtaccggcgg gacacagcag gctggaagat ttgccgggaa           180
ggcaatggag tttcagtttc ctggaggcca tctgtggagt ttccagggaa cctgtaccga           240
ggagaaggca ttgtatatgg gacactagag gaggtgtggg actgtgtgaa gccagctgtt           300
ggaggcctac gagtgaagtg ggatgagaat gtgaccggtt ttgaaattat ccaaagcatc           360
actgacaccc tgtgtgtaag cagaacctcc actccctccg ctgccatgaa gctcatttct           420
cccagagatt ttgtggactt ggtgctagtc aagagatatg aggatgggac catcagttcc           480
aacgccaccc atgtggagca tccgttatgt cccccgaagc caggttttgt gagaggattt           540
aaccatcctt gtggttgctt ctgtgaacct cttccagggg aacccaccaa gaccaacctg           600
gtcacattct tccataccga cctcagcggt tacctcccac agaacgtggt ggactccttc           660
ttcccccgca gcatgacccg gttttatgcc aaccttcaga aagcagtgaa gcaattccat           720
gagtaatgct atcgttactt cttggcaaag aactcccgtg actcatcgag gagctccagc           780
tgttgggaca ccaaggagcc tgggagcacg cagaggcctg tgttcactct ttggaacaag           840
ctgatggact gcgcatctct gagaatgcca accagaggcg gcagcccacc cttcctgcct           900
cctgccccac tcagggttgg cgtgtgatga gccattcatg tgttccaaac tccatctgcc           960
tgttacccaa acacgcctct cctggcaggg tagacccagg cctctaacca tctgacagag          1020
actcggcctg gacaccatgc gatgcactct ggcaccaagg ctttatgtgc ccatcactct          1080
cagagaccac gtttccctga ctgtcataga gaatcatcat cgccactgaa aaccaggccc          1140
tgttgccttt taagcatgta ccgctccctc agtcctgtgc tgcagccccc caaatatatt          1200
tttctgatat agaccttgta tatggcttta atgccgcaaa atatttattt ttccttaaaa          1260
aaggtgtcaa cttggaaata atggtttaaa aacaggataa gcattaagga aaaacaaaaa          1320
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa                                                 1344
【００７０】
ヒトStarD5タンパク質（配列番号:23）
Met Asp Pro Ala Leu Ala Ala Gln Met Ser Glu Ala Val Ala Glu Lys 
Met Leu Gln Tyr Arg Arg Asp Thr Ala Gly Trp Lys Ile Cys Arg Glu 
Gly Asn Gly Val Ser Val Ser Trp Arg Pro Ser Val Glu Phe Pro Gly 
Asn Leu Tyr Arg Gly Glu Gly Ile Val Tyr Gly Thr Leu Glu Glu Val 
Trp Asp Cys Val Lys Pro Ala Val Gly Gly Leu Arg Val Lys Trp Asp 
Glu Asn Val Thr Gly Phe Glu Ile Ile Gln Ser Ile Thr Asp Thr Leu 
Cys Val Ser Arg Thr Ser Thr Pro Ser Ala Ala Met Lys Leu Ile Ser 
Pro Arg Asp Phe Val Asp Leu Val Leu Val Lys Arg Tyr Glu Asp Gly 
Thr Ile Ser Ser Asn Ala Thr His Val Glu His Pro Leu Cys Pro Pro 
Lys Pro Gly Phe Val Arg Gly Phe Asn His Pro Cys Gly Cys Phe Cys 
Glu Pro Leu Pro Gly Glu Pro Thr Lys Thr Asn Leu Val Thr Phe Phe 
His Thr Asp Leu Ser Gly Tyr Leu Pro Gln Asn Val Val Asp Ser Phe 
Phe Pro Arg Ser Met Thr Arg Phe Tyr Ala Asn Leu Gln Lys Ala Val 
Lys Gln Phe His Glu 
【００７１】
ヒトStarD6 cDNA（配列番号:24）
atggacttca aggcaattgc ccaacaaact gcccaagaag ttttaggtta taatcgagat            60
acatcaggct ggaaagtggt taaaacttca aaaaagataa ctgtttccag taaggcttct           120
agaaaattcc atggaaatct atatcgtgtt gaagggataa ttccagaatc accagctaaa           180
ctatctgatt tcctctacca aactggagac agaattacat gggataaatc attgcaagtg           240
tataatatgg tacacaggat tgattcggac acattcatat gtcataccat tacacaaagt           300
tttgccgtgg gctccatttc ccctcgagac tttatcgact tagtgtacat caagcgctac           360
gaaggaaata tgaacattat cagttctaaa agtgtggatt ttccagaata tcctccatct           420
tcaaattata tccgcggtta taaccatcct tgtggctttg tatgttcacc aatggaagaa           480
aacccagcat attccaaact agtgatgttt gtccagacag aaatgagagg aaaattgtcc           540
ccatcaataa ttgaaaaaac catgccttcc aacttagtaa acttcatcct caatgcaaaa           600
gatggaataa aggcacacag aactccatca agacgtggat ttcatcataa tagtcattca           660
tga                                                                         663
【００７２】
ヒトStarD6タンパク質（配列番号:25）
Met Asp Phe Lys Ala Ile Ala Gln Gln Thr Ala Gln Glu Val Leu Gly 
Tyr Asn Arg Asp Thr Ser Gly Trp Lys Val Val Lys Thr Ser Lys Lys 
Ile Thr Val Ser Ser Lys Ala Ser Arg Lys Phe His Gly Asn Leu Tyr 
Arg Val Glu Gly Ile Ile Pro Glu Ser Pro Ala Lys Leu Ser Asp Phe 
Leu Tyr Gln Thr Gly Asp Arg Ile Thr Trp Asp Lys Ser Leu Gln Val 
Tyr Asn Met Val His Arg Ile Asp Ser Asp Thr Phe Ile Cys His Thr 
Ile Thr Gln Ser Phe Ala Val Gly Ser Ile Ser Pro Arg Asp Phe Ile 
Asp Leu Val Tyr Ile Lys Arg Tyr Glu Gly Asn Met Asn Ile Ile Ser 
Ser Lys Ser Val Asp Phe Pro Glu Tyr Pro Pro Ser Ser Asn Tyr Ile 
Arg Gly Tyr Asn His Pro Cys Gly Phe Val Cys Ser Pro Met Glu Glu 
Asn Pro Ala Tyr Ser Lys Leu Val Met Phe Val Gln Thr Glu Met Arg 
Gly Lys Leu Ser Pro Ser Ile Ile Glu Lys Thr Met Pro Ser Asn Leu 
Val Asn Phe Ile Leu Asn Ala Lys Asp Gly Ile Lys Ala His Arg Thr 
Pro Ser Arg Arg Gly Phe His His Asn Ser His Ser 
【００７３】
ヒトPCTP cDNA（配列番号:26）
ccggactgcg gaaggatgga gctggccgcc ggaagcttct cggaggagca gttctgggag            60
gcctgcgccg agctccagca gcccgctctg gccggggccg actggcagct cctagtggag           120
acctcgggca tcagcatcta ccggctgctg gacaagaaga ctggacttca tgagtataaa           180
gtctttggtg ttctggagga ctgctcacca actctactgg cagacatcta tatggactca           240
gattacagaa aacaatggga ccagtatgtt aaagaactct atgaacaaga atgcaacgga           300
gagactgtgg tctactggga agtgaagtac ccttttccca tgtccaacag agactatgtc           360
taccttcggc agcggcgaga cctggacatg gaagggagga agatccatgt gatcctggcc           420
cggagcacct ccatgcctca gcttggcgag aggtctgggg tgatccgggt gaagcaatac           480
aagcagagcc tggcgattga gagtgacggc aagaagggga gcaaagtttt catgtattac           540
ttcgataacc cgggtggcca aattccgtcc tggctcatta actgggccgc caagaatgga           600
gttcctaact tcttgaaaga catggcaaga gcctgtcaga actacctcaa gaaaacctaa           660
gaaagagaac tgggaacatt gcatccatgg gttgatgtct ctggaagtgc aaccacccaa           720
tgtctctgga agtgccacct ggaagtgcca cctggaagtg tctctggaag agcacccacc           780
actgttcagc cttcccctgc tgtttctgtc ttcagaggcc tacacactac cacatccttt           840
ctaagcatgt ttgcctgaca tccagctcac tcgtctgctt cctttctcgc tccccccatc           900
ctgggctggg ctgccttctt ctacagttca atatggggca gactagggaa acctttgctt           960
gcttactatt aggaggggaa gtcttcagta gggaacacga tcattccatt gtgcaatttt          1020
acggggatgg gtgggcggag ggacacaaca aaatttaaga atgactattt gggcgggctg          1080
gctcttttgc agcttgtgat ttcttccagc ttgggagggg ctgctggaag tggcatttcg          1140
ttcagagctg actttcagtg cacccaaact ggatgacgtg ccaatgtcca tttgccttat          1200
gctttgtgga gctgattagg ctgggatttg aggtgataat ccagtaagtc tttcctcgtt          1260
cctacttgtg gaggatcagt agctgttatg atgccagacc atttggagaa gtatcagagg          1320
cctgaccgga cacataatac gacaaccaca tttttcctca tcatccatga ggaaatggat          1380
gatttctctt ttccatatgt cactggggga aaggctgcct gtacctctca agctttgcat          1440
tttactggaa actgaggcgt caagatggct gtggcagcta gcaaaagcaa agatgctttg          1500
tgcatagcct tgtgaaaaag tatctttcta tgcaataaga tgaattttcc tcccagaata          1560
tttagaaatg tagaagggat aacagttcac agccaggtaa aatttaactg gtggcttaat          1620
gactctgcac ctttttctca ggaattctgc ctaagttgtc tgccttttct accaccaaaa          1680
agacttttag ttttctatgc tttctcctga attttggtag ggtaagtatt tctatgtcaa          1740
aggcacagcc ttgatgatct cagggaaaaa ttttaatcac tgtgtataat gatactgaac          1800
cttgattaat aacagaaatt caggatgtaa agccacagaa tgggatttat taatgtggga          1860
tacctcagac tgtttgtttt ctttctggga agaaaagtgt gttctataat gaataaatat          1920
agagtggttt tt                                                              1932
【００７４】
ヒトPCTPタンパク質（配列番号:27）
Met Glu Leu Ala Ala Gly Ser Phe Ser Glu Glu Gln Phe Trp Glu Ala 
Cys Ala Glu Leu Gln Gln Pro Ala Leu Ala Gly Ala Asp Trp Gln Leu 
Leu Val Glu Thr Ser Gly Ile Ser Ile Tyr Arg Leu Leu Asp Lys Lys 
Thr Gly Leu His Glu Tyr Lys Val Phe Gly Val Leu Glu Asp Cys Ser 
Pro Thr Leu Leu Ala Asp Ile Tyr Met Asp Ser Asp Tyr Arg Lys Gln 
Trp Asp Gln Tyr Val Lys Glu Leu Tyr Glu Gln Glu Cys Asn Gly Glu 
Thr Val Val Tyr Trp Glu Val Lys Tyr Pro Phe Pro Met Ser Asn Arg 
Asp Tyr Val Tyr Leu Arg Gln Arg Arg Asp Leu Asp Met Glu Gly Arg 
Lys Ile His Val Ile Leu Ala Arg Ser Thr Ser Met Pro Gln Leu Gly 
Glu Arg Ser Gly Val Ile Arg Val Lys Gln Tyr Lys Gln Ser Leu Ala 
Ile Glu Ser Asp Gly Lys Lys Gly Ser Lys Val Phe Met Tyr Tyr Phe 
Asp Asn Pro Gly Gly Gln Ile Pro Ser Trp Leu Ile Asn Trp Ala Ala 
Lys Asn Gly Val Pro Asn Phe Leu Lys Asp Met Ala Arg Ala Cys Gln 
Asn Tyr Leu Lys Lys Thr 
【００７５】
細胞培養及びトランスフェクション：
HEK293T細胞及びCOS7細胞を、10%ウシ胎児血清（FCS）を補充したRPMIで5%CO2含有湿潤空気下にて増殖させる。TransIT293試薬（Mirus）を製造業者の指示にしたがって用い、HEK293T細胞にトランスフェクションを実施する。免疫蛍光のために、ガラスのカバースリップ上でCOS7細胞を24時間増殖させ、Lipofectamine 2000試薬（Invitrogen）を用いてトランスフェクションを実施する。
CHO細胞及びCHO由来ヒト血清アルブミン（HSA）又はヒトモノクローナルIgG抗体産生細胞株を、インキュベーター（Thermo, Germany）にて表面曝気T-フラスコ（Nunc, Denmark）で、又は振盪フラスコで5%CO2含有湿潤空気下にて37℃で無血清培養液に懸濁させて培養する。
シードストック培養は、2−3E5細胞/mLの播種密度で2−3日ごとに継代する。細胞濃度は全培養で血球計算板を用いて決定する。生存率はトリパンブルー排除法によって判定する。全てのCHO生産細胞をBI特許培養液で培養し、それらの組成は明らかにできない。
LipofectamineTM及びPLUSTM試薬（ともにInvitrogen, Germany）を製造業者の供給する手引きにしたがって用い、CHO由来細胞にトランスフェクションを実施する。
補給式バッチ培養：
抗生物質又はMTX（Sigma-Aldrich, Germany）を含まない30mLのBI特許生産培養液に3E05細胞/mLで125mLの振盪フラスコに、細胞を播種する。この培養を37℃、5%CO2（後に細胞数の増加につれて2%に減少）にて120rpmで攪拌する。pH、グルコース及び乳酸濃度を含む培養パラメーターを毎日測定し、pHを必要に応じてNaCO3を用いてpH7.0に調整する。BI特許フィード溶液を24時間毎に添加する。細胞密度及び生存率は、自動CEDEX細胞定量系（Innovatis）を用いトリパンブルー排除によって決定する。3、5及び7日目にサンプルを細胞培養液から採集し、ELISAによる力価測定に付す。
【００７６】
ELISA：
細胞クローンの上清中のIgG分子の定量は、サンドイッチELISA技術により実施する。ELISAプレートは、ヤギ抗ヒトIgG Fc-フラグメント抗体（Dianova, Germany）を用い4℃で一晩コーティングする。プレートを洗浄し1%BSA溶液でブロッキングした後、サンプルを添加して1.5時間インキュベートする。洗浄後、検出抗体（アルカリ性ホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトカッパ鎖抗体）を添加し、基質として4-ニトロフェニルホスフェート二ナトリウム塩6水和物（Sigma, Germany）を用いてインキュベートすることによって比色検出を実施する。暗所で20分インキュベートした後、反応を停止させ、吸収読み取り装置（Tecan, Germany）を用いて、405／492nmで直ちに吸収を測定する。濃度は、各プレートについて提示される標準曲線にしたがって計算する。培養サンプル中の分泌HSAの定量的測定は、ヒトアルブミンELISA定量キット（Benthyl Labs, Texas, USA）を製造業者の指示に従いながら用いて同様に実施する。
免疫蛍光顕微鏡法：
細胞をマグネシウム及びカルシウムを含むPBSで洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで室温にて10分間固定し、洗浄して0.1Mグリシンを含むPBSとともに15分間インキュベートする。続いて0.1%トリトン含有PBSで5分間細胞を透過性にした後、0.1%トゥイーン20含有PBS中の5%ヤギ血清で30分間ブロッキングする。ブロッキング緩衝液で希釈した一次抗体と細胞を2時間インキュベートし、続いてブロッキング緩衝液で希釈した二次抗体と1時間インキュベートする。カバースリップをFluoromount G（Southern Biotechnology）中に置き、細胞を共焦点レーザー走査顕微鏡（TCS SL, Leica）で488及び543nmの励起及び40.0/1.25 HCX PL APO対物レンズを用い解析する。画像はAdobeフォトショップで処理する。
【００７７】
タンパク質抽出、免疫沈澱及びウェスタンブロッティング：
NP40抽出緩衝液（NEB）［50mMトリス（pH7.5）、150mM NaCl、1%NP40、1mMオルトバナジウム酸ナトリウム、10mMフッ化ナトリウム及び20mMβ-グリセロホスフェート＋コンプリートプロテアーゼインヒビター］中で細胞を可溶化することによって、全細胞抽出物を得る。溶解物を16,000 x gで10分遠心して清澄にする。免疫沈澱のためには、等しい量のタンパク質を特異的抗体とともに氷上で2時間インキュベートする。免疫複合体をプロテインG-セファロース（GE Healthcare）で収集し、さらにNEB（上記参照）で3回洗浄する。全細胞抽出物又は免疫沈澱させたタンパク質をサンプル緩衝液で煮沸し、SDS-PAGEに付す。タンパク質をポリビニリジンジフルオリドメンブレン（Roth）上にブロットする。0.1%トゥイーン20含有PBS中の0.5%ブロッキング緩衝液（Roche）でブロッキングした後、フィルターを特異的抗体をプローブとして精査する。ケミルミネセンス検出強化系（Pierce）を用い、ペルオキシダーゼ結合二次抗体によりタンパク質を可視化する。メンブレンのストリッピングは、SDS緩衝液［62.5mMトリス（pH6.8）、2%SDS及び100mMβ-メルカプトエタノール］中で60℃にて30分間実施する。続いてメンブレンを表示の抗体をプローブとして用い再度精査する。
組換えタンパク質の精製及びin vitroキナーゼアッセイ：
BL21細菌をpGEX6P-Flag-CERT(1-138)及びCERT-S132A(1-138）ベクターで形質転換する。0.5mMイソプロピル-β-D-1-チオガラクトピラノシドで4時間30℃にて発現を誘発する。細菌を採集し、50μg/mLのリゾチーム、コンプリートプロテアーゼインヒビター（Roche）、10mMフッ化ナトリウム及び20mMβ-グリセロホスフェートを含むPBSに再度分散する。超音波処理の前にトリトンX-100を最終濃度1%で添加する。GST-CERT融合物をグルタチオン樹脂（GE Healthcare）により清澄化溶解物から精製する。タンパク質調製物の純度はSDS-PAGE及びクーマシーブルー染色によって実証する。組換えタンパク質を、キナーゼ緩衝液［50mMトリス（pH7.5）、10mMのMgCl2及び1mMのDTT］中の精製PKD1とともに、2μCiの[γ-32P]-ATP又はコールドATPの存在下で30分間インキュベートする。サンプルをSDS-PAGEで分解し、メンブレンにブロットし、PhosphoImager（Molecular Dynamics）を用いるか又は抗PKD基質抗体によるウェスタンブロッティングによって解析する。
【００７８】
PIPアレイ：
GFPタグ付加CERT変種を一過性に発現しているHEK293T細胞を、低張緩衝液［コンプリートプロテアーゼインヒビター（Roche）を含む50mMトリス（pH7.4）、1mMのPMSF、5Mβ-グリセロホスフェート及び5mMフッ化ナトリウム］中で採集し、25G/16mmゲージの注射針を通過させてせん断する。100,000xgで1時間遠心後に細胞質ゾル分画を入手し、発現タンパク質量を480−550nm（励起466nm）でのGFPピーク発光を測定することによって定量する。PIPアレイ（Echelon）を、3%の無脂肪酸BSA（Roth）を含むTBS-T［10mMトリス（pH8）、150mMのNaCl、0.1%トゥイーン20］でブロッキングし、続いて5mLのブロッキング緩衝液中の等量のGFPタンパク質（トランスフェクトしていない細胞の細胞質ゾルを用いて調整する）を含む細胞質ゾル500μgと室温にて1時間インキュベートする。抗GFP抗体、続いてHRP-結合二次抗体とインキュベートすることによって結合タンパク質を検出する。
in vitroセラミド転移アッセイ：
SUV間のタンパク質仲介セラミド移転は、以前に記載されたように測定する（Olayioye et al. 2005）。移転アッセイ混合物は以下を含む：ブタ脳脂質（Avanti Polar Lipids）、パイレン標識C16-セラミド、及び2,4,6-トリニトロフェニル-ホスファチジルエタノールアミン（TNP-PE）（88.6：0.4：11 mol％）を含むドナー小胞（2nmol脂質/mL）（P. Somerharju提供）及びブタ脳脂質を含む10倍過剰のアクセプター小胞。GFPタグ付加CERT野生型及びS132Aタンパク質（上記参照）を一過性に発現するHEK293T細胞の細胞質ゾル75μgを添加した前後の蛍光の強さを395nmで記録する（励起、345nm；スリット幅、4nm）。種々のタンパク質の発現レベルを明らかにするために、蛍光の強さを（i）トリトンX-100（最終濃度0.5%）の添加後に得られる最大の強さ及び（ii）最大GFP蛍光に対して標準化する。
【００７９】
HRP輸送アッセイ：
HEK293T細胞にss-HRP-Flagプラスミド並びに空ベクター、pEGFP-N1-PKD1KD、pcDNA3-Flag-CERT wt及びpcDNA-Flag-CERT-S132Aをそれぞれ1：6.5の比で同時トランスフェクトする。トランスフェクション24時間後の細胞を無血清培養液で洗浄し、清澄化細胞上清をECL試薬とともにインキュベートすることにより0、1、3及び6時間後にHRP分泌を定量する。測定はルミノメーター（Lucy2, Anthos）を用い450nmで実施する。
siRNAアッセイ：
COS7細胞にssHRP-Flagをコードするベクターをトランスフェクトし、8時間後に採集し、トリプリケートのウェルに再度プレートし、続いてOligofectamineTM試薬（Invitrogen）を製造業者の指示にしたがって用い、CERT特異的siRNAオリゴヌクレオチド（siCERT#1、配列番号:7：5'-ccacaugacuuacucauuatt-3'；siCERT#2、配列番号:8：5'-gaacagaggaagcauauaatt-3'）をトランスフェクトする。コントロール細胞には偽トランスフェクションを実施するかlacZ特異的siRNA（配列番号:9：5'-gcggcugccggaauuuactt-3'）をトランスフェクトする。48時間後に細胞を洗浄し、新しい培養液を添加する。上清に分泌されたHRPの量を上述のようにケミルミネセンスアッセイによって測定する。最後に細胞を溶解し、トリプリケートの溶解物をプールし、チューブリン及びトランスフェリンレセプター特異的抗体を用いてイムノブロッティングによって解析する。
【実施例１】
【００８０】
実施例1：細胞内の生成物の蓄積は分泌における隘路を示す
補給式バッチプロセスをヒトIgG抗体を発現する3つの別個のCHO生産細胞クローンを用いて実施する（それぞれ、プロセスA、B及びC、図1参照）。細胞サンプルを1日おきに採取し、細胞内抗体量をFACS解析によって測定する。略記すれば、細胞をPBS/4%PFAを用いて固定し、透過性にしてFITC結合抗ヒトカッパ軽鎖抗体で染色する。最初の4日以内では、細胞内IgG含有量は定常レベルを維持する。しかしながら、5日目から9日目に細胞内の生成物レベルは恒常的に上昇し、間違えて折り畳まれた軽鎖又は完全な抗体生成物すら細胞内に蓄積されることを示唆する。これらのデータは別個の生産細胞クローン及び生成物による3つのそれぞれ独立した生産プロセスを示し、細胞が培養液に分泌されるタンパク質よりも多くの抗体RNAを転写することを強く示唆し、したがって、産生された抗体の完全な分泌を妨げる翻訳後の隘路を提示している（図1）。
【実施例２】
【００８１】
実施例2：CERTはPKD基質抗体によって検出される
PKDはゴルジ複合体における主要調節因子であり、PI4KIIIβがこれまでに認定された唯一の局所基質である。ゴルジ複合体局在CERTタンパク質（配列番号:11及び13）がPKD基質として供されえるか否かを試験するために、我々は、pMOTIFと称されるホスホ特異的基質抗体（PKDによってリン酸化されたコンセンサスモチーフに対して作製された（Doppler et al. 2005））を利用する。HEK293T細胞にFlagタグ付加CERT（配列番号:10）及びCERTL（配列番号:12）をコードする発現ベクターをトランスフェクトする。CERTアイソフォームをフラッグ付加特異抗体で免疫沈澱させ、pMOTIF抗体によるウェスタンブロッティングによって解析する（図4A）。CERT（配列番号:11）の分子量に一致するpMOTIFシグナル、及び前記よりも弱いがCERTL（配列番号:12）の分子量に一致するpMOTIFシグナルが検出される。リン酸化CERTLアイソフォームのより弱い検出は、凝集物を形成するという既に知られているその行動様式に関係があるかもしれない（凝集はリン酸化部位へのキナーゼの接近性能に影響を与える可能性がある）（Raya et al. 2000）。pMOTIF抗体によるCERTの認識はPKDに依存するのか否かを調べるために、PKD1のキナーゼ活動停止変種（K621W）と一緒にCERTをHEK293T細胞で発現させる。この変異体はゴルジ複合体に局在することが示され、PI4KIIIβリン酸を優性ネガティブ態様で抑制した（Hausser et al. 2005）。活性をもたないPKDの同時発現は、pMOTIF抗体によるCERTの検出を停止させ、pMOTIFシグナルは実際にPKD仲介CERTリン酸化の結果であることが示唆される（図4B）。
脂質移転タンパク質は、ERとTGNの間で形成される膜接触部位で作用すると考えられ（Levine and Loewen, 2006）、ここにPKDは局在する。GFPタグ付加PKD1を同時発現するCOS7細胞でのFlagタグ付加CERTの免疫蛍光染色によって、2つのタンパク質はゴルジ複合体に一緒に局在することが立証された（図4C）。総合すれば、これらのデータによって、CERTはゴルジ装置でのPKDの基質であることが確認される。
【実施例３】
【００８２】
実施例3：PKDはセリン132でCERTをリン酸化する
CERTのpMOTIF認識部位を認定するために、セリン又はスレオニンに対応する、-5位のロイシン、イソロイシン又はバリン残基及び-3位のアルギニンを特徴とする潜在的なPKDコンセンサスモチーフを探査する。132位と272位の2つのセリン（PKDコンセンサスモチーフと合致し、種全体で保存されている（図5A））を位置特異的変異導入によりアラニンと交換する。これらの変異体をHEK293T細胞で発現させ、pMOTIF抗体による認識について試験する。興味深いことに、セリン132のアラニンへの変異によってpMOTIF抗体によるCERTの検出が停止し、電気泳動移動度の増加が生じ、リン酸化の低下を示す。一方、S272A変異はpMOTIFシグナルに影響を与えない（図5B）。このことは、セリン132は、PKD基質抗体によって特異的に認識されるPKDリン酸化部位であることを示唆している。PKDがCERTのこのセリン残基を直接リン酸化できることを確認するために、精製PKD1及び大腸菌（E. coli）生成タンパク質の最初の138アミノ酸を含む組換えCERT GST-融合タンパク質を用いてin vitroキナーゼアッセイを実施する。切端野生型CERT融合タンパク質を[γ-32P]-ATPの存在下でPKD1とインキュベートすると、放射能の取り込みが検出される（図5C）。検出はCERT-S132A融合タンパク質の場合には顕著に障害される。野生型（CERT-S132Aではなく）のin vitro PKDリン酸化によって、pMOTIF抗体のための認識部位が生成されることがさらに示された（図5D）。総合すれば、これらの結果は、CERTはPKDの正真正銘のin vitro及びin vivoのPKD基質であることを証明し、セリン132をCERTの特異的なPKDリン酸化部位と認定する。
【実施例４】
【００８３】
実施例4：セリン132でのCERTリン酸化はPI(4)P結合及びセラミド移転活性を調整する
セリン132はCERT PHドメイン（アミノ酸23−117）の極めて近位に存在し、この部位のリン酸化が局所の陰性荷電の上昇によってPI(4)P結合に影響を及ぼすことを可能にする。我々は、したがって野生型CERT及びCERT-S132A変異体（配列番号:15）のPI(4)P結合を、タンパク質-脂質オーバーレイアッセイを実施することによって定量する。CERT変種を一過性に発現するHEK293T細胞の細胞質ゾルを、種々のホスホイノシチドの濃度勾配をスポットしたメンブレンとともにインキュベートし、結合CERTタンパク質をGFPタグにより検出する。以前に報告されたように、完全長の野生型タンパク質はいくつかのリン脂質種との弱い結合を示すが、PI(4)Pとは強い相互作用を示した（Hanada et al. 2003；Levine and Munro, 2002）。CERT-S132AとPI(4)Pとの結合は、野生型タンパク質の結合と比較して2から4倍低濃度で検出することができ、CERT-S132A変異体とこのリン脂質との親和性の増加が示唆される（図6A）。総合すれば、これらのデータは、CERTは、ひとたびゴルジ複合体と結合するとPKDによってリン酸化されることを暗示している。それによってCERTのPI(4)Pに対する親和性が低下し、したがってCERTとゴルジ膜との相互作用が調節される。
CERTは脂質移転タンパク質として機能することが示されたので（Hanada et al. 2003）、セリン132でのCERTリン酸化が、セラミドと結合しこれを膜間で移転させるCERTの能力に影響を与えるか否かを調べる。この目的のために、野生型CERT（配列番号:10）及びCERT-S132A（配列番号:14）のGFPタグ付加型をHEK239T細胞で一過性に発現させ、細胞質ゾル分画をセラミド特異的脂質移転活性についてFRET系アッセイを用いて解析する（図6B）。このアッセイでは、蛍光ドナーとしてパイレン標識セラミド及び消光量のヘッド基標識TNP-PEを含む小さなユニラメラ小胞を用いる（Olayioye et al. 2005；Somerharju, 2002）。これらのドナーリポソームを過剰の非標識アクセプターリポソームと混合したとき、パイレン蛍光の増加はきわめて小さく、アクセプターメンブレンへの偶発的セラミド移転はわずかであることが示された（データは示されていない）。野生型CERT含有細胞質ゾルを添加したとき、蛍光の安定した増加が認められ、この現象は、ベクターをトランスフェクトした細胞のコントロール細胞質ゾルを用いたときには観察されない（図6B）。野生型タンパク質と比較して、CERT-S132A（配列番号:15）はより高い脂質移転速度を示し、これはパイレン蛍光のより急激な増加から明白である。このことは、セリン132におけるリン酸化は、タンパク質と膜との結合を低下させることによってセラミド移転活性をダウンレギュレートすることを示唆している。
以前のデータは、PKDは、PI4KIIIβのリン酸化仲介活性化によってゴルジ複合体におけるPI(4)Pレベルを調節することを既に示している（Hausser et al. 2005）。興味深いことに、PI4KIIIβは、ERとゴルジ複合体との間のセラミド輸送に決定的に重要である（Toth et al. 2006）。したがって、ここに提示するデータと合わせて、ゴルジ膜の脂質恒常性の維持におけるPKDの二元的役割は、CERTのオン率（PI(4)Pレベルを介する）及びオフ率（直接リン酸化を介する）を制御することによって明白になる。
【実施例５】
【００８４】
実施例5：CERTはPKDの活性化及び分泌性輸送を調節する
我々は、セラミドの移転によるCERTの過剰発現はDAGレベルの上昇をもたらすはずであり、結果としてPKD活性を刺激する可能性があると仮定する。この仮説を試験するために、HEK293T細胞でFlagタグ付加CERT野生型（配列番号:10）及びCERT-S132A（配列番号:14）を一過性に発現させる。トランスフェクション24時間後に全細胞溶解物を調製し、SDS-PAGEに付す。PKD活性化はホスホ特異的pS916 PKD抗体を用いてイムノブロッティングによって解析する（図7A、上段パネル）。試料添加が等しいことはPKD特異的抗体を用いて再度プローブすることによって実証する（図7A、中段パネル）。CERTタンパク質の発現は、Flag-特異的抗体によるイムノブロッティングで実証する（図7A、下段パネル）。コントロールと比較して、CERT野生型及びCERT-S132Aの両者の発現は、ホスホ特異的PKD抗体を用いた解析によって示されるようにPKD活性を高める。この結果は、PKD活性化は、おそらくはセラミドデリバリーの増加及び強制的SM/DAG合成により、CERTタンパク質によって調節されることを示している。
CERT-仲介PKD活性化は分泌性輸送の強化に転換されるのか否かという問題に応えるために、構成的タンパク質分泌のためのレポーターとして用いることができる分泌セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP-ss）をコードするプラスミドを利用する。HEK293T細胞に、Flag-ss-HRPをコードするプラスミド又は空のベクター、並びにPKD1-GFPキナーゼ活動停止型（KD）、Flag-CERT野生型（WT）及びFlag-CERT-S132Aをそれぞれ同時トランスフェクトする。トランスフェクション24時間後に細胞を洗浄し、新しい培養液を添加する。ペルオキシダーゼ活性について上清を0、1、3及び6時間後にケミルミネセンスによって解析する。コントロール細胞では、ss-HRPの分泌は1時間以内に検出され、時間とともに増加する（図7B）。キナーゼ活動停止PKD1（積荷タンパク質の分泌性輸送を阻害する）の同時発現は、ほぼ完全にss-HRPの上清中への分泌を停止させる。これによって、HRPはこのアッセイではPKD依存態様で分泌されることが確認される。対照的に、CERT野生型及びCERT-S132Aの同時発現は分泌されるHRPの量を強力に増大させ（図7B）、変異体はCERT野生型よりもわずかに高い値すら示す。この実験は、CERT過剰発現はPKDリン酸化を刺激し、さらに機能的アッセイでは細胞外タンパク質の培養液中への分泌をほぼ2倍強化することを示している。
我々はさらにまた、CERT-S132A変異体の過剰発現がその局在に影響を及ぼすか、及び／又はゴルジ装置の形態学的変化を引き起こすか否かを精査する。CERTはシス／メディアル-ゴルジマーカーGS28と一緒に局在することが示された（Hanada et al. 2003）。COS7細胞で発現させたGFP-タグ付加CERTの免疫蛍光解析によって、前記タンパク質はGS28陽性ゴルジ領域に局在することが示される（図7C）。対照的に、ゴルジ複合体におけるGS28との部分的同時局在に加えて、CERT-S132A変異体タンパク質は、広く散らばった斑点のある染色を示す。注目すべきことに、これらの小胞構造のいくつかは積荷タンパク質ss-HRPを含むことが見出され、実際これらの構造はゴルジ由来の輸送担体を表していることの証拠を提供している（図7D）。この発見は、セラミドレベルの局所的増加によるゴルジ膜構造の観察された変化と一致する（Fukunaga et al. 2000；Weigert et al. 1999）。
【実施例６】
【００８５】
実施例6：RNA干渉によるCERTのダウンレギュレーションは分泌性輸送を阻害する
本発明でこれまでに提示したデータは、CERTの過剰発現はタンパク質分泌を強化することを明瞭に示している。逆もまた正しいか否か（CERTの発現低下が分泌を低下させることを意味する）を調べるために、siRNA実験を実施する。COS7細胞にssHRP-Flagをコードするベクターをトランスフェクトし、8時間後に採集し、トリプリケートのウェルに再度プレートし、続いてCERT特異的siRNAオリゴヌクレオチド（配列番号:7及び8）をトランスフェクトするか、又はコントロールとして偽トランスフェクションを実施するか又はlacZ-特異的siRNA（配列番号:9）をトランスフェクトする。48時間後に細胞を洗浄し、新しい培養液で覆い、さらに表示の時間後に上清に分泌されたHRP量を測定する。
図8Aに示すように、HRPの活性は両コントロール細胞で3時間後に検出され、同等の類似するレベルを示す。対照的に、CERT特異的siRNAオリゴヌクレオチドのいずれかで処理された細胞では、HRP活性の劇的な低下が測定される。この結果は、CERTレベルの低下は細胞のHRP分泌の低下をもたらすことを示し、さらに分泌性輸送におけるCERTの重要な役割を強調している。
興味深いことに、タンパク質分泌だけでなく、トランスメンブレンタンパク質のトランスフェリンレセプターの豊富さもまたCERTの低下によって影響を受ける（図8B）。図8Aの細胞をプールし、その溶解物を、トランスフェリンレセプター特異的抗体をプローブとしてウェスタンブロット実験で調べたとき、トランスフェリンレセプター量の大きな減少が明白であるが、一方、両コントロール細胞では類似するトランスフェリンレセプターレベルが検出される。この発見は、脂質移転タンパク質CERTは、分泌タンパク質の輸送だけでなく、膜分布細胞表面タンパク質の輸送にもまた関与することを示唆している。このことは、両タイプのタンパク質が等しくERからゴルジを介して形質膜へ脂質小胞で輸送され、したがって（我々が本発明で初めて明らかにするように）CERTによって影響される同じ細胞性輸出ルートを用いるので、驚くべきことではないかもしれない。
【実施例７】
【００８６】
実施例7：CERTの過剰発現は抗体のバイオ医薬タンパク質の生産を高める
（a）ヒト化抗CD44v6 IgG抗体、BIWA4を分泌する抗体産生CHO細胞株（CHO DG44）に空ベクター（MOCKコントロール）又は野生型CERT（配列番号:10及び12）若しくは点変異Ser132Aを保持するCERTの変異体（配列番号:14）をコードする発現構築物をトランスフェクトし、続いて安定な細胞プールを得るために選別に付す。その後の6継代の間、全ての安定な細胞プールのシードストック培養から上清を採取してELISAによってIgG力価を測定し、平均細胞数で割って比生産性を算出する（図10A）。最高値はCERT変異体（配列番号:14）を保持する細胞プールで認められ、野生型CERT（配列番号:10又は12）がこれに続く。両者において、IgG発現は、MOCK又は非トランスフェクト細胞と比較して顕著に強化される。安定なトランスフェクタントをバッチ発酵又は補給式バッチ発酵に付した場合、非常に類似する結果を得ることができる（図10B）。これらの設定の各々で、野生型及び変異体CERTの過剰発現は抗体分泌の増加をもたらし、CERTは、継代培養又はバイオリアクター若しくは補給式バッチ培養で増殖させた細胞の比生産性を強化できることを提示している。
（b）先ず初めにCHO宿主細胞（CHO DG44）に野生型CERT（配列番号:10又は12）又は点変異Ser132Aを保持するCERTの変異体（配列番号:14）をコードするベクターをトランスフェクトする。細胞に選別圧力をかけ、CERT又はCERT変異体の異種発現を示す細胞株を採取する。続いてこれらの細胞及び並行してCHO DG44野生型細胞に、対象の遺伝子としてヒト化抗CD44v6 IgG抗体、BIWA4をコードするベクターをトランスフェクトする。2回目の選別後に、その後の6継代にわたって全ての安定な細胞プールのシードストック培養から上清を採取し、ELISAによってIgG力価を決定し、平均細胞数で割って比生産性を算出する。最高値はCERT変異体（配列番号:14）を保持する細胞プールで認められ、野生型CERT（配列番号:10又は12）がこれに続く。両者において、IgG発現は、CERT又はCERT変異体の発現を示さない細胞と比較して顕著に強化される。安定なトランスフェクタントをバッチ発酵又は補給式バッチ発酵に付した場合、非常に類似する結果を得ることができる。これらの設定の各々で、野生型及び変異体CERTの過剰発現は抗体分泌の増加をもたらし、CERTは、継代培養又はバイオリアクター若しくは補給式バッチ培養で増殖させた細胞の比生産性を強化できることを提示している。
この結果は、CERT、特に変異体CERTの異種発現は、一過性と同様に安定的にトランスフェクトされたCHO細胞株で抗体分泌を強化できることを示している。
【実施例８】
【００８７】
実施例8：CERTの過剰発現は単球ケモアトラクタントタンパク質1（MCP-1）のバイオ医薬タンパク質の生産を高める
（a）単球ケモアトラクタントタンパク質1（MCP-1）を分泌するCHO細胞株（CHO DG44）に、空ベクター（MOCKコントロール）又は野生型CERT（配列番号:10及び12）若しくは点変異Ser132Aを保持するCERTの変異体（配列番号:14）をコードする発現構築物をトランスフェクトし、続いて安定な細胞プールを得るために選別に付す。その後の6継代の間、全ての安定な細胞プールのシードストック培養から上清を採取してELISAによってMCP-1力価を測定し、平均細胞数で割って比生産性を算出する。最高値はCERT変異体を保持する細胞プールで認められ、野生型CERTがこれに続く。両者において、IgG発現は、MOCK又は非トランスフェクト細胞と比較して顕著に強化される。安定なトランスフェクタントをバッチ発酵又は補給式バッチ発酵に付した場合、非常に類似する結果を得ることができる。これらの設定の各々で、野生型及び変異体CERTの過剰発現はMCP-1分泌の増加をもたらし、CERTは、継代培養又はバイオリアクター若しくは補給式バッチ培養で増殖させた細胞の比生産性を強化できることを提示している。
（b）先ず初めにCHO宿主細胞（CHO DG44）に野生型CERT（配列番号:10又は12）又は点変異Ser132Aを保持するCERTの変異体（配列番号:14）をコードするベクターをトランスフェクトする。細胞に選別圧力をかけ、CERT又はCERT変異体の異種発現を示す細胞株を採取する。続いてこれらの細胞及び並行してCHO DG44野生型細胞に、対象の遺伝子として単球ケモアトラクタントタンパク質1（MCP-1）をコードするベクターをトランスフェクトする。2回目の選別後に、その後の6継代にわたって全ての安定な細胞プールのシードストック培養から上清を採取し、ELISAによってMCP-1力価を決定し、平均細胞数で割って比生産性を算出する。最高値はCERT変異体を保持する細胞プールで認められ、野生型CERTがこれに続く。両者において、MCP-1発現は、CERT又はCERT変異体の発現を示さない細胞と比較して顕著に強化される。安定なトランスフェクタントをバッチ発酵又は補給式バッチ発酵に付した場合、非常に類似する結果を得ることができる。これらの設定の各々で、野生型及び変異体CERTの過剰発現は抗体分泌の増加をもたらし、CERTは、継代培養又はバイオリアクター若しくは補給式バッチ培養で増殖させた細胞の比生産性を強化できることを示している。
この結果は、CERT、特に変異体CERTの異種発現は、一過性と同様に安定的にトランスフェクトされたCHO細胞株で単細胞タンパク質の分泌を強化できることを示している。
【実施例９】
【００８８】
実施例9：CERTの過剰発現はトランスメンブレンタンパク質上皮増殖因子レセプター（EGFR）のバイオ医薬タンパク質の生産を高める
（a）トランスメンブレンタンパク質上皮増殖因子レセプター（EGFR）を分泌するCHO細胞株（CHO DG44）に、空ベクター（MOCKコントロール）又は野生型CERT（配列番号:10及び12）若しくは点変異Ser132Aを保持するCERTの変異体（配列番号:14）をコードする発現構築物をトランスフェクトし、続いて安定な細胞プールを得るために選別に付す。その後の6継代の間、全ての安定な細胞プールのシードストック培養から細胞を採取し、EGFRの発現レベルをFACS又はウェスタンブロッティングによって決定する。最高値はCERT変異体を保持する細胞プールで認められ、野生型CERTがこれに続く。両者において、EGFR発現は、MOCK又は非トランスフェクト細胞と比較して顕著に強化される。安定なトランスフェクタントをバッチ発酵又は補給式バッチ発酵に付した場合、非常に類似する結果を得ることができる。これらの設定の各々で、野生型及び変異体CERTの過剰発現はEGFR発現の増加をもたらし、CERTは、継代培養又はバイオリアクター若しくは補給式バッチ培養で増殖させた細胞の比生産性を強化できることを示している。
（b）先ず初めにCHO宿主細胞（CHO DG44）に野生型CERT（配列番号:10又は12）又は点変異Ser132Aを保持するCERTの変異体（配列番号:14）をコードするベクターをトランスフェクトする。細胞に選別圧力をかけ、CERT又はCERT変異体の異種発現を示す細胞株を採取する。続いてこれらの細胞及び並行してCHO DG44野生型細胞に、対象の遺伝子としてEGFRをコードするベクターをトランスフェクトする。2回目の選別後に、連続する6継代について全ての安定な細胞プールのシードストック培養から細胞を採取し、FACS又はウェスタンブロッティングによってEGFRの発現レベルを決定する。最高値はCERT変異体を保持する細胞プールで認められ、野生型CERTがこれに続く。両者において、EGFR発現は、CERT又はCERT変異体の発現を示さない細胞と比較して顕著に強化される。安定なトランスフェクタントをバッチ発酵又は補給式バッチ発酵に付した場合、非常に類似する結果を得ることができる。これらの設定の各々で、野生型及び変異体CERTの過剰発現はEGFR発現の増加をもたらし、CERTは、継代培養又はバイオリアクター若しくは補給式バッチ培養で増殖させた細胞の比生産性を強化できることを示している。
この結果は、CERT、特に変異体CERTの異種発現は、一過性と同様に安定的にトランスフェクトされたCHO細胞株で表面レセプターの発現を強化できることを示している。
【実施例１０】
【００８９】
実施例10：StarD4の過剰発現は抗体のバイオ医薬タンパク質の生産を高める
（a）ヒト化抗CD44v6 IgG抗体、BIWA4を分泌する抗体産生CHO細胞株（CHO DG44）に空ベクター（MOCKコントロール）又はStarD4（配列番号:20）をコードする発現構築物をトランスフェクトし、続いて安定な細胞プールを得るために選別に付す。その後の6継代の間、全ての安定な細胞プールのシードストック培養から上清を採取してELISAによってIgG力価を測定し、平均細胞数で割って比生産性を算出する。最高値はStarD4を保持する細胞プールで認めらる。IgG発現は、MOCK又は非トランスフェクト細胞と比較して顕著に強化された。安定なトランスフェクタントをバッチ発酵又は補給式バッチ発酵に付した場合、非常に類似する結果を得ることができる。これらの設定の各々で、StarD4の過剰発現は、継代培養又はバイオリアクター若しくは補給式バッチ培養で増殖させた細胞の比生産性を強化することができる。
（b）先ず初めにCHO宿主細胞（CHO DG44）にStarD4をコードするベクターをトランスフェクトする。細胞に選別圧力をかけ、StarD4の異種発現を示す細胞株を採取する。続いてこれらの細胞株及び並行してCHO DG44野生型細胞に、対象の遺伝子としてヒト化抗CD44v6 IgG抗体、BIWA4をコードするベクターをトランスフェクトする。2回目の選別後に、その後の6継代にわたって全ての安定な細胞プールのシードストック培養から上清を採取し、ELISAによってIgG力価を決定し、平均細胞数で割って比生産性を算出する。最高値はStarD4を保持する細胞プールで認められる。IgG発現は、StarD4の異種発現を示さない細胞と比較して顕著に強化される。安定なトランスフェクタントをバッチ発酵又は補給式バッチ発酵に付した場合、非常に類似する結果を得ることができる。これらの設定の各々で、StarD4の過剰発現は、継代培養又はバイオリアクター若しくは補給式バッチ培養で増殖させた細胞の比生産性を強化することができる。
この結果は、StarD4の異種発現は、一過性と同様に安定的にトランスフェクトされたCHO細胞株で抗体分泌を強化できることを示している。
【実施例１１】
【００９０】
実施例11：CERTの過剰発現はヒト血清アルブミン（HAS）のバイオ医薬タンパク質の生産を高める
（a）単鎖タンパク質HSAを分泌するCHO細胞株（CHO DG44）に、空ベクター（MOCKコントロール）又は野生型CERT（配列番号:10及び12）若しくは点変異Ser132Aを保持するCERTの変異体（配列番号:14）をコードする発現構築物をトランスフェクトし、続いて安定な細胞プールを得るために選別に付す。その後の4継代の間、全ての安定な細胞プールのシードストック培養から上清を採取してELISAによってHSA力価を測定し、平均細胞数で割って比生産性を算出する（図11A）。
HSA力価及びHSA産生細胞の比生産性の両方が、MOCKトランスフェクションコントロールと比較して、両CERTの異種発現によって顕著に強化される。最高値はCERT変異体を保持する細胞プールで認められ（変種は、コントロールよりも比生産性で51%の増加及びHASで46%の増加をもたらす）、野生型CERTがこれに続く（野生型は比生産性を49%増加させる）。安定なトランスフェクタントをバッチ発酵又は補給式バッチ発酵に付した場合、非常に類似する結果を得ることができる（図11B）。これらの設定の各々で、野生型及び変異体CERTの過剰発現はHSA分泌の増加をもたらし、CERTは、継代培養又は工業的生産条件下（例えばバイオリアクター又は補給式バッチ培養）で増殖させた細胞の比生産性を強化できることを示している。
（b）及び（c）先ず初めにCHO宿主細胞（CHO DG44）に野生型CERT（配列番号:10又は12）又は点変異Ser132Aを保持するCERTの変異体（配列番号:14）をコードするベクターをトランスフェクトする。細胞に選別圧力をかけ、CERT又はCERT変異体の異種発現を示す細胞株を採取する。続いてこれらの細胞株及び並行してCHO DG44野生型細胞に、対象の遺伝子としてヒト血清アルブミンをコードするベクターをトランスフェクトする。2回目の選別後に、その後の6継代にわたって全ての安定な細胞プールのシードストック培養から上清を採取し、ELISAによってHSA力価を決定し（図11C）、平均細胞数で割って比生産性を算出する（図11B）。
最高値はCERT変異体を保持する細胞プールで認められ、野生型CERTがこれに続く。両者において、HSA発現は、CERT又はCERT変異体の発現を示さない細胞と比較して顕著に強化される。安定なトランスフェクタントをバッチ発酵又は補給式バッチ発酵に付した場合、非常に類似する結果を得ることができる。これらの設定の各々で、野生型及び変異体CERTの過剰発現は抗体分泌の増加をもたらし、CERTは、継代培養又はバイオリアクター若しくは補給式バッチ培養で増殖させた細胞の比生産性を強化できることを示している。
この結果は、CERT、特に変異体CERTの異種発現は、一過性と同様に安定的にトランスフェクトされたCHO細胞株で単鎖タンパク質の分泌を強化できることを示している。
0005467415.tif 000003
0005467415.tif 000004
0005467415.tif 000005
0005467415.tif 000006
0005467415.tif 000007
0005467415.tif 000008
0005467415.tif 000009
【図１】
0005467415.tif 000010
【図２】
0005467415.tif 000011
【図３】
0005467415.tif 000012
【図５】
0005467415.tif 000013
【図６Ａ】
0005467415.tif 000014
【図６Ｂ】
0005467415.tif 000015
【図７−１】
0005467415.tif 000016
【図８】
0005467415.tif 000017
【図９】
0005467415.tif 000018
【図１０】
0005467415.tif 000019
【図１１−１】
0005467415.tif 000020
【図１１−２】
0005467415.tif 000021
【図４】
0005467415.tif 000022
【図７−２】
0005467415.tif 000023
【配列表】
0005467415000001.xml