(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームであって、以下：
（ａ）プロモーター配列、翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ；
（ｃ）リボヌクレオチド；ならびに、
（ｄ）無細胞蛋白質合成系、
を含む、一枚膜リポソーム。
【請求項２】
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素、および、ＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される、請求項１に記載の一枚膜リポソーム。
【請求項３】
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素である、請求項１に記載の一枚膜リポソーム。
【請求項４】
核酸分解酵素によって処理された複数の一枚膜リポソームを含むライブラリーであって、該複数の一枚膜リポソームの各々は、以下：
（ａ）プロモーター配列、翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ；
（ｃ）リボヌクレオチド；ならびに、
（ｄ）無細胞蛋白質合成系、
を含む、ライブラリー。
【請求項５】
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素、および、ＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される、請求項４に記載のライブラリー。
【請求項６】
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素である、請求項４に記載のライブラリー。
【請求項７】
核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームであって、以下：
（ａ）翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むＲＮＡ；ならびに、
（ｄ）無細胞蛋白質合成系、
を含む、一枚膜リポソーム。
【請求項８】
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素、および、ＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される、請求項７に記載の一枚膜リポソーム。
【請求項９】
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素である、請求項７に記載の一枚膜リポソーム。
【請求項１０】
核酸分解酵素によって処理された複数の一枚膜リポソームを含むライブラリーであって、該複数の一枚膜リポソームの各々は、以下：
（ａ）翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むＲＮＡ；ならびに、
（ｄ）無細胞蛋白質合成系、
を含む、ライブラリー。
【請求項１１】
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素、および、ＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される、請求項１０に記載のライブラリー。
【請求項１２】
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素である、請求項１０に記載のライブラリー。
【請求項１３】
核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームの製造方法であって、以下：
（１）以下：
（ａ）プロモーター配列、翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ；
（ｃ）リボヌクレオチド；ならびに、
（ｄ）無細胞蛋白質合成系、
を封入した一枚膜リポソームを調製する工程；ならびに、
（２）工程（１）で調製された一枚膜リポソームを、核酸分解酵素によって処理する工程、
を包含する、方法。
【請求項１４】
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素、および、ＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームの製造方法であって、以下：
（１）以下：
（ａ）翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むＲＮＡ；ならびに、
（ｄ）無細胞蛋白質合成系、
を封入した一枚膜リポソームを調製する工程；ならびに、
（２）工程（１）で調製された一枚膜リポソームを、核酸分解酵素によって処理する工程、
を包含する、方法。
【請求項１７】
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素、および、ＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
一枚膜リポソームのライブラリーを用いたスクリーニング方法であって、以下：
（ｉ）請求項４に記載のライブラリーを提供する工程；
（ｉｉ）該ライブラリーから、所望の特徴を有する一枚膜リポソームを選択する工程；
（ｉｉｉ）該一枚膜リポソームに含まれるＤＮＡを増幅する工程；および、
（ｉｖ）該増幅したＤＮＡを単離する工程、
を包含する方法。
【請求項２０】
一枚膜リポソームのライブラリーを用いたスクリーニング方法であって、以下：
（ｉ）請求項１０に記載のライブラリーを提供する工程；
（ｉｉ）該ライブラリーから、所望の特徴を有する一枚膜リポソームを選択する工程；
（ｉｉｉ）該一枚膜リポソームに含まれるＲＮＡに逆転写酵素を作用させて、ＤＮＡを生成する工程；
（ｉｖ）該生成したＤＮＡを増幅する工程；および、
（ｖ）該増幅したＤＮＡを単離する工程、
を包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子進化工学に利用するための、新規の一枚膜リポソームの分野に関連する。また、本発明は、一枚膜リポソームを用いた、新規の分子進化工学、特に、酵素進化工学に関連する。
【背景技術】
【０００２】
酵素を進化工学的に改良する方法として、遺伝子ライブラリーと無細胞蛋白質合成系を封入したリポソームとセルソータを用いた方法が利用されている。この方法では、酵素遺伝子にランダム変異を導入した遺伝子ライブラリーと無細胞蛋白質合成系をリポソームに封入し、内部で酵素を発現させる。そして、セルソータにより、より高機能の酵素を含むリポソームを選択することにより、より高機能の酵素をコードする遺伝子を選択することができる。この選択を繰り返すことによって、酵素をコードする遺伝子を進化させることができる（非特許文献１）。
【０００３】
スクリーニング効率を向上させることによって、より少ない作業量で、より高い機能を有する酵素をコードする遺伝子が可能になると予測される。それゆえ、酵素進化法におけるスクリーニング効率の向上が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｕｎａｍｉ，Ｔ．，Ｓａｔｏ，Ｋ．，Ｍａｔｓｕｕｒａ，Ｔ．，Ｔｓｕｋａｄａ，Ｋ．，Ｕｒａｂｅ，Ｉ．，  ａｎｄ  Ｙｏｍｏ，Ｔ．（２００６）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５７，１２８−１３６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
分子進化工学（例えば、酵素進化法）におけるスクリーニングの効率を向上させることを、本発明の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題は、以下を提供することによって解決された。
（項目１）
核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームであって、以下：
（ａ）プロモーター配列、翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ；
（ｃ）リボヌクレオチド；ならびに、
（ｄ）無細胞蛋白質合成系、
を含む、一枚膜リポソーム。
（項目２）
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素、および、ＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される、項目１に記載の一枚膜リポソーム。
（項目３）
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素である、項目１に記載の一枚膜リポソーム。
（項目４）
核酸分解酵素によって処理された複数の一枚膜リポソームを含むライブラリーであって、該複数の一枚膜リポソームの各々は、以下：
（ａ）プロモーター配列、翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ；
（ｃ）リボヌクレオチド；ならびに、
（ｄ）無細胞蛋白質合成系、
を含む、ライブラリー。
（項目５）
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素、および、ＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される、項目４に記載のライブラリー。
（項目６）
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素である、項目４に記載のライブラリー。
（項目７）
核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームであって、以下：
（ａ）翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むＲＮＡ；ならびに、
（ｄ）無細胞蛋白質合成系、
を含む、一枚膜リポソーム。
（項目８）
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素、および、ＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される、項目７に記載の一枚膜リポソーム。
（項目９）
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素である、項目７に記載の一枚膜リポソーム。
（項目１０）
核酸分解酵素によって処理された複数の一枚膜リポソームを含むライブラリーであって、該複数の一枚膜リポソームの各々は、以下：
（ａ）翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むＲＮＡ；ならびに、
（ｄ）無細胞蛋白質合成系、
を含む、ライブラリー。
（項目１１）
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素、および、ＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される、項目１０に記載のライブラリー。
（項目１２）
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素である、項目１０に記載のライブラリー。
（項目１３）
核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームの製造方法であって、以下：
（１）以下：
（ａ）プロモーター配列、翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ；
（ｃ）リボヌクレオチド；ならびに、
（ｄ）無細胞蛋白質合成系、
を封入した一枚膜リポソームを調製する工程；ならびに、
（２）工程（１）で調製された一枚膜リポソームを、核酸分解酵素によって処理する工程、
を包含する、方法。
（項目１４）
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素、および、ＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素である、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームの製造方法であって、以下：
（１）以下：
（ａ）翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むＲＮＡ；ならびに、
（ｄ）無細胞蛋白質合成系、
を封入した一枚膜リポソームを調製する工程；ならびに、
（２）工程（１）で調製された一枚膜リポソームを、核酸分解酵素によって処理する工程、
を包含する、方法。
（項目１７）
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素、および、ＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素である、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
一枚膜リポソームのライブラリーを用いたスクリーニング方法であって、以下：
（ｉ）項目４に記載のライブラリーを提供する工程；
（ｉｉ）該ライブラリーから、所望の特徴を有する一枚膜リポソームを選択する工程；
（ｉｉｉ）該一枚膜リポソームに含まれるＤＮＡを増幅する工程；および、
（ｉｖ）該増幅したＤＮＡを単離する工程、
を包含する方法。
（項目２０）
一枚膜リポソームのライブラリーを用いたスクリーニング方法であって、以下：
（ｉ）項目１０に記載のライブラリーを提供する工程；
（ｉｉ）該ライブラリーから、所望の特徴を有する一枚膜リポソームを選択する工程；
（ｉｉｉ）該一枚膜リポソームに含まれるＲＮＡに逆転写酵素を作用させて、ＤＮＡを生成する工程；
（ｉｖ）該生成したＤＮＡを増幅する工程；および、
（ｖ）該増幅したＤＮＡを単離する工程、
を包含する方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームを用いることによって、スクリーニング効率が向上した。理論に拘束されることは望まないが、本発明が優れた効果を奏する理由としては、以下が挙げられる。
【０００８】
従来用いられていたリポソームは、凍結乾燥法により調製された多重膜リポソームであり、内部に多重構造をもつため、反応容器の体積を制御することができなかった。リポソームの体積は内部の酵素反応速度に影響をあたえるため、効率よく酵素を改良するためには、多重構造をもたない一枚膜リポソームを使うことが望ましい。しかし、これまでの方法では、遠心沈降法でつくった一枚膜リポソームを反応容器として用いた場合、セルソーターでより反応したリポソームを選択しても、高い機能をもつ酵素をコードした遺伝子を選択して回収することができなかった。
【０００９】
これに対して、本発明では、一枚膜リポソームを核酸分解酵素で処理したところ、従来法において使用されていた多重膜リポソームや、酵素処理をしていない一枚膜リポソームと比較して、より高効率のスクリーニングが可能となり、高機能の酵素をコードした遺伝子を選択して回収することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】左から順番に、従来法の多重膜リポソーム、核酸分解酵素で処理していない一枚膜リポソーム、ＲＮＡ分解酵素で処理した一枚膜リポソーム、および、ＤＮＡ分解酵素で処理した一枚膜リポソームを用いて、より高い活性を有する（すなわち、より強い蛍光を発する）リポソームをスクリーニングした際の選択効率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を説明する。本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【００１２】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００１３】
（定義）
本明細書において使用する場合、用語「微小区画」とは、脂質層、および、その内部の水層から構成される閉じられた微小な空間をいう。「微小区画」としては、例えば、リポソームが挙げられるがこれに限定されない。
【００１４】
本明細書で使用される場合、用語「リポソーム」とは、通常、膜状に集合した脂質層および内部の水層から構成される閉鎖小胞を意味する。代表的に使用されるリン脂質のほか、コレステロール、糖脂質などを組み込ませることも可能である。本発明において、リポソームは、修飾基を付するために、エステル結合を付与する官能基を有する構成単位（例えば、糖脂質、ガングリオシド、ホスファチジルグリセロールなど）またはペプチド結合を付与する官能基を有する構成単位（例えば、ホスファチジルエタノールアミン）を有してもよい。本発明において使用するリポソームは、脂質二重層からなる膜が一枚のみからなる「一枚膜リポソーム」である。一枚膜リポソームの調製法としては、種々の周知の方法が利用可能である。
【００１５】
本明細書において使用する場合、用語「プロモーター配列」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。プロモーターは、誘導性であっても、構成的であっても、部位特異的であっても、時期特異的であってもよい。プロモーターとしては、例えば、哺乳動物細胞、大腸菌、酵母などの宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。代表的なプロモーター配列としては、Ｔ７プロモーター配列、Ｔ５プロモーター配列、Ｓｐ６プロモーター配列、および、Ｔ３プロモーター配列が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１６】
本明細書において使用する「ＲＮＡポリメラーゼ」は、使用するプロモーター配列に適合する、すなわち、その使用するプロモーターからの転写を行なうＲＮＡポリメラーゼであれば、いかなるＲＮＡポリメラーゼを用いてもよい。好ましくは、プロモーター配列とＲＮＡポリメラーゼとが、同じ、あるいは、近接する生物種に由来する。例えば、原核生物由来のプロモーター配列を使用する場合、使用するＲＮＡポリメラーゼもまた、原核生物由来であることが好ましい。あるいは、バクテリオファージ由来のプロモーター配列を使用する場合、使用するＲＮＡポリメラーゼもまた、同一または類似のバクテリオファージ由来であることが好ましい。
【００１７】
本明細書において使用する場合、用語「翻訳開始配列」とは、機能的なリボソーム進入部位を提供できる任意の配列を意味する。バクテリアのシステムにおいては、この領域は、シャイン-ダルガルノ（Shine-Dalgarno）配列ともいわれる。
【００１８】
本明細書において使用される用語「無細胞蛋白質合成系」とは、細胞を処理することによって自律複製能を失った細胞由来の成分であって、蛋白質の合成が可能な成分をいう。無細胞蛋白質合成系としては、例えば、市販のＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（登録商標）（バイオコゥマー株式会社  東京都文京区）を利用することも可能である。あるいは、無細胞蛋白質合成系に必要とされる成分を精製および／または組換え発現して、作製することも可能である。
【００１９】
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
【００２０】
（一枚膜リポソームの製造）
本発明において使用する一枚膜リポソームは、実施例に記載する遠心沈降法を用いて調製することができるが、調製法は、これに限定されない。例えば、遠心沈降法の他にも、静置水和法（Ｐ．Ｍｕｅｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｔ．Ｆ．Ｃｈｉｅｎ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，１９８３，４４，３７５−３８１）、および、エレクトロフォーメーション法（Ｍｉｇｌｅｎａ  Ｉ．Ａｎｇｅｌｏｖｅ  ａｎｄ  Ｄｉｍｉｔｅｒ  Ｓ．Ｄｉｍｉｔｒｏｖ，Ｆａｒａｄａｙ  Ｄｉｓｃｕｓｓ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８６，８１，３０３−３１１）を利用することが可能である。
【００２１】
静置水和法は、代表的には、以下の工程を包含する方法である：（１）脂質を溶媒に溶かしフラスコ中で自然乾燥することにより、フラスコ表面に脂質膜を形成させる工程；および、（２）水溶液を添加し、脂質膜を膨潤させる工程。この第２工程によって、脂質膜が水溶液を取り込んだリポソームが浮き上がってくる。
【００２２】
エレクトロフォーメーション法は、代表的には、以下の工程を包含する方法である：（１）導電性電極上に脂質溶液を塗布し、乾燥させて脂質フィルムを形成させる工程；（２）絶縁性スペーサーを介した反対側にも導電性電極を設置し、その間を水溶液で満たす工程；および、（３）二つの電極間に電界を印加することにより、脂質膜を電極から剥がして巨大薄膜リポソームを作製する工程。
【００２３】
（核酸分解酵素）
本発明において使用する核酸分解酵素としては、例えば、ＲＮＡ分解酵素、および、ＤＮＡ分解酵素が挙げられるがこれらに限定されない。使用する核酸分解酵素の供給源は、特に限定されることはない。核酸分解酵素としてＤＮａｓｅを使用する場合、使用する酵素活性は、１００μＬのリポソーム溶液あたり、１Ｕ〜２０Ｕ、より好ましくは、５Ｕ〜１５Ｕ、もっとも好ましくは、約１２．５Ｕである。核酸分解酵素としてＲＮａｓｅを使用する場合、使用する酵素活性は、１００μＬのリポソーム溶液あたり、１μｇ〜２０μｇ、より好ましくは、５μｇ〜１５μｇ、もっとも好ましくは、約１０μｇである。当業者は、使用する酵素量を容易に決定することができる。
【００２４】
（使用するＤＮＡまたはＲＮＡ）
例えば、リポソームに含ませる遺伝情報がＤＮＡである場合、そのＤＮＡに、タンパク質のコード配列、ならびに、このコード配列に作動可能に連結された翻訳調節配列、および、このコード配列に作動可能に連結された転写翻訳調節配列を含ませる。
【００２５】
翻訳調節配列としては、例えば、翻訳開始配列が挙げられるがこれらに限定されない。必要に応じて、翻訳終止コドンを含ませてもよい。連結される翻訳調節配列は、使用する無細胞蛋白質合成系と適合することが好ましい。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の無細胞蛋白質合成系を利用する場合、連結される翻訳調節配列は、好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉの翻訳開始配列である。使用する翻訳調節配列と無細胞蛋白質合成系とは、必ずしも同一種由来である必要はなく、両者が適合可能、すなわち、無細胞蛋白質合成系が翻訳調節配列からの翻訳を開始できる限り、いかなる種由来であってもよい。
【００２６】
転写翻訳調節配列としては、例えば、プロモーター配列が挙げられるがこれに限定されない。必要に応じて、エンハンサー配列、サプレッサー配列、オペレーター配列、および、転写終結部位を含んでもよい。連結される転写翻訳調節配列は、使用するＲＮＡポリメラーゼと適合することが好ましい。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＲＮＡポリメラーゼを利用する場合、連結される転写翻訳調節配列は、好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉの転写翻訳調節配列である。使用する転写翻訳調節配列とＲＮＡポリメラーゼとは、必ずしも同一種由来である必要はなく、両者が適合可能、すなわち、ＲＮＡポリメラーゼが転写翻訳調節配列からの転写を開始（あるいは、制御）できる限り、いかなる種由来であってもよい。
【００２７】
例えば、リポソームに含ませる遺伝情報がＲＮＡである場合、そのＲＮＡに、タンパク質のコード配列、および、このコード配列に作動可能に連結された翻訳調節配列を含ませる。翻訳調節配列としては、例えば、翻訳開始配列が挙げられるがこれらに限定されない。必要に応じて、翻訳終止コドンを含ませてもよい。連結される翻訳調節配列は、使用する無細胞蛋白質合成系と適合することが好ましい。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の無細胞蛋白質合成系を利用する場合、連結される翻訳調節配列は、好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉの翻訳開始配列である。使用する翻訳調節配列と無細胞蛋白質合成系とは、必ずしも同一種由来である必要はなく、両者が適合可能、すなわち、無細胞蛋白質合成系が翻訳調節配列からの翻訳を開始できる限り、いかなる種由来であってもよい。
【００２８】
（本発明のリポソームの分子進化工学への応用）
本発明のリポソームを分子進化工学に利用することができる。
【００２９】
例えば、核酸分解酵素処理をした一枚膜リポソームを、その内部のＤＮＡまたはＲＮＡがタンパク質産物を生成する条件下にインキュベートし、生成されたタンパク質の活性を測定し、この活性を指標として、高機能性の遺伝情報を含む一枚膜リポソームを選択（スクリーニング）する。利用する活性は、代表的には、一枚膜リポソーム内のＤＮＡまたはＲＮＡがコードするタンパク質の活性である。例えば、一枚膜リポソーム内のＤＮＡまたはＲＮＡがβ−ガラクトシダーゼをコードする場合、利用する活性は、５−クロロメチルフルオレセイン  ジ−β−Ｄ−ガラクロピラノシド（ＣＭＦＤＧ）の分解によって生じる蛍光である。例えば、一枚膜リポソーム内のＤＮＡまたはＲＮＡがＧＦＰをコードする場合、利用する活性は、ＧＦＰによる発光である。
【００３０】
タンパク質のリン酸化や他の他のタンパク質との結合を検出するためには、例えば、以下の方法を用いる：ターゲットとなるタンパク質の端をＦＲＥＴを起こすような蛍光色素でラベルする工程；リン酸化や他のタンパク質との結合によってコンフォメーションが変化し、ＦＲＥＴの程度が変化した場合、その蛍光変化を指標として選択する工程。あるいは、ＧＦＰ遺伝子を例えばＴ３ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの下流に配置し、同時にＴ３ＲＮＡポリメラーゼＲＮＡを用いることにより、よりＲＮＡ合成活性の高いＴ３ＲＮＡポリメラーゼを得ることも可能である。
【００３１】
また、タンパク質のコード配列以外の配列（例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、リボソーム結合配列、翻訳開始部位などの遺伝子発現の制御に関連する配列）に変異を導入し、選択することにより、高い活性（例えば、高いプロモーター活性、エンハンサー活性、翻訳活性など）を有するように配列を進化させることができる。
【００３２】
スクリーニングの結果得られた一枚膜リポソームは、その中にＤＮＡないしＲＮＡとして含まれる遺伝情報を単離するために使用される。遺伝情報がＤＮＡである場合、ＤＮＡを特異的に増幅するプライマーを用いて、ＰＣＲによって遺伝情報を増幅して、単離することができる。あるいは、ＤＮＡが、宿主細胞内で自律複製するために必要な配列を含む場合、ＤＮＡを適切な宿主細胞に導入して増幅後に単離してもよい。
【００３３】
遺伝情報がＲＮＡである場合、（１）逆転写酵素を用いて、ＲＮＡをＤＮＡに変換し、その後、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を用いてＰＣＲによってＤＮＡを増幅するか、あるいは、（２）耐熱性逆転写酵素を用いて、一段階で、ＲＮＡの遺伝情報を増幅してもよい。ＲＮＡが宿主細胞内で自律複製するために必要な配列を含む場合、ＲＮＡを適切な宿主細胞に導入して増幅後に単離してもよい。
【００３４】
第１ラウンドのスクリーニング後に、必ずしも、遺伝情報を単離（純化）する必要はない。例えば、第１ラウンドのスクリーニングによって、単一クローンのＤＮＡないしＲＮＡを得るのではなく、ＤＮＡないしＲＮＡの集団を取得し、その集団を出発材料として、第２ラウンドのスクリーニングを行なってもよい。第２ラウンドのスクリーニングまたはそれ以降のラウンドのスクリーニングによって得られたＤＮＡないしＲＮＡの集団を、次のラウンドのスクリーニングの出発材料としてもよい。
【００３５】
あるいは、スクリーニング後に得られたクローン（純化されたクローン）について、変異誘発を行い、異なる複数のクローンを含む集団を作製し、次のラウンドのスクリーニングの出発材料としてもよい。
【実施例】
【００３６】
以下に実施例等により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３７】
（実施例１：一枚膜リポソームの調製）
以下に記載の遠心沈降法により、一枚膜リポソームを調製した。
・１０ｍｇの脂質（ホスファチジルコリン：コレステロール＝９：１）を１００μｌクロロホルムに溶解し、２ｍｌの流動パラフィンと混合した。
・８０℃で３０分インキュベーションした。
・リポソーム外液（３３３ｍＭ  グルコース、無細胞蛋白質合成系から翻訳タンパク質群とｔＲＮＡを除いたもの）、内液（３３０ｍＭ  スクロース、１μＭ  Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  Ａｌｅｘａ  ６４７、無細胞蛋白質合成系、４０Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅインヒビター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．４μＭ  リボソームＳ１サブユニット、５０μＭ  ５−クロロメチルフルオレセイン  ジ−β−Ｄ−ガラクロピラノシド（ＣＭＦＤＧ）、５０ｐＭ
鋳型ＤＮＡ（ｐＵＣＭＤＶ（＋）（−ＮＨ）−β（＋）Ｇａｌ（−）とｐＵＣＭＤＶ（＋）（−ＮＨ）−ｄＳ−β（＋）Ｇａｌ（−）の１：１混合物）を調製した。
・脂質を溶解した流動パラフィン４００μｌにリポソーム内液２０μｌを入れ、氷上に１分置いた。
・ボルテックスミキサーの最大強度で４０秒攪拌しエマルションを調整後、氷上で１０分置いた。
・新しいチューブにリポソーム外液１５０μｌをいれ、その上に調製したエマルションを積層し、氷上で１０分置いた。
・１４ｋ×ｇ、４℃で３０分遠心した。
・チューブの底に穴を開け、底に溜まったリポソーム懸濁液８０μｌを回収した。
・リポソーム懸濁液に２μｌの５Ｕ／μｌ  ＤＮａｓｅ、または、４ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅを添加した。
・リポソーム懸濁液を３７℃で３時間インキュベーションした。
・希釈液（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ  ７．６）、１３ｍＭ  酢酸マグネシウム、１００ｍＭ  グルタミン酸カリウム）で２０倍に希釈し、セルソーター（ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ）にかけた。
・セルソーターにより、より強い蛍光を持つリポソームを選択した。
・選択されたリポソームから反応中に生じたＲＮＡをＲＮｅａｓｙ（ＱＩＧＥＮ）により精製した。
・得られたＲＮＡを０．２μＭ  プライマー１（配列番号１：ＧＣＡＡＧＴＧＡＣＴＣＡＧＧＡＴＴＣＧＴＡＣＡＴＡＡＴＡＴＣＧＴＣＴＣＣＧＴＡＡＡＣＡＧＴＧ）、各１ｍＭ
ｄＮＴＰと混合し、６５℃で５分熱処理後直ちに氷冷した。
・１０Ｕ／μｌ  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ｂｕｆｆｅｒ、１Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅインヒビター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、５０℃で６０分、７０℃で１５分インキュベーションした。
・反応液を水で５倍希釈した。
・ｐＵＣＭＤＶ（＋）（−ＮＨ）−β（＋）Ｇａｌ（−）を測定する場合には０．４μＭのプライマー２（配列番号２：ＧＧＴＡＧＴＧＴＴＧＴＴＡＣＣＴＡＣＧＡＧＡＡＧ）およびプライマー３（配列番号３：ＧＣＡＡＧＴＧＡＣＴＣＡＧＧＡＴＴＣＧＴＡＣ）を用いた。ｐＵＣＭＤＶ（＋）（−ＮＨ）−ｄＳ−β（＋）Ｇａｌ（−）を測定する場合には０．４μＭのプライマー３（配列番号３：ＧＣＡＡＧＴＧＡＣＴＣＡＧＧＡＴＴＣＧＴＡＣ）とプライマー４（配列番号４：ＣＣＣＴＣＴＧＴＧＡＧＣＴＣＧＡＧＴＣ）を加え、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｓ  Ｅｘ  ＴａｑＩＩと混合した。・ＳＹＢＲ蛍光を指標に定量ＰＣＲを行ない、回収されたＲＮＡ量を測定した。ＰＣＲのサイクルは以下のとおり。９５℃１０秒の後、（９５℃５秒、６３℃１０秒、７２℃１５秒）を５０サイクル。
【００３８】
使用した無細胞蛋白質合成系の組成は、以下のとおりである。
各０．３ｍＭ  アミノ酸（アラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、セリン、スレオニン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、メチオニン、システイン、チロシン）、３．６μｇ／μｌ  ｔＲＮＡ、２ｍＭ  ＡＴＰ、２ｍＭ  ＧＴＰ、１ｍＭ  ＣＴＰ、１ｍＭ  ＵＴＰ、１４ｍＭ  酢酸マグネシウム、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ  （ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  グルタミン酸カリウム、２ｍＭ  スペルミジン、２０ｍＭ  クレアチンリン酸、２ｍＭ  ジチオスレイトール、１０ｎｇ／μｌ  １０−ホルミル−５．６．７．８．−テトラヒドロ葉酸、翻訳タンパク質群（２５００ｎＭ  ＩＦ１、４１１ｎＭ  ＩＦ２、７２８ｎＭ  ＩＦ３、２４７ｎＭ  ＲＦ１、４８４ｎＭ  ＲＦ２、１６８ｎＭ  ＲＦ３、４８５ｎＭ  ＲＲＦ、７２７ｎＭ  ＡｌａＲＳ、９９ｎＭ  ＡｒｇＲＳ、４２０ｎＭ  ＡｓｎＲＳ、１２１ｎＭ  ＡｓｐＲＳ、１００ｎＭ  ＣｙｓＲＳ、１０１ｎＭ  ＧｌｎＲＳ、２３２ｎＭ  ＧｌｕＲＳ、８６ｎＭ  ＧｌｙＲＳ、８５ｎＭ  ＨｉｓＲＳ、３６５ｎＭ  ＩｌｅＲＳ、９９ｎＭ  ＬｅｕＲＳ、１１５ｎＭ  ＬｙｓＲＳ、１０９ｎＭ  ＭｅｔＲＳ、１３４ｎＭ  ＰｈｅＲＳ、１６６ｎＭ  ＰｒｏＲＳ、９９ｎＭ  ＳｅｒＲＳ、８４ｎＭ  ＴｈｒＲＳ、１０２ｎＭ  ＴｒｐＲＳ、１０１ｎＭ  ＴｙｒＲＳ、１００ｎＭ  ＶａｌＲＳ、５８８ｎＭ  ＭＴＦ、９２６ｎＭ  ＭＫ、４６５ｎＭ  ＣＫ、１３０７ｎＭ  ＮＤＫ、６２１ｎＭ  Ｐｐｉａｓｅ２、１２９０ｎＭ  ＥＦ−Ｇ、２３１５ｎＭ  ＥＦ−Ｔｕ、３３００ｎＭ  ＥＦ−Ｔｓ、５２９ｎＭ  Ｔｉｇ、２２ｎＭ  ＨｒｐＡ、１４４０ｎＭ  ＴｒｘＣ）。
【００３９】
（実施例２：ライブラリーの作製およびスクリーニングの結果）
活性のある野生型のガラクトシダーゼ遺伝子と活性のない変異型のガラクトシダーゼ遺伝子とを１：１で混合し、実施例１に記載の方法で作製したリポソームに封入した。蛍光を発したリポソームを回収し、リポソーム内のＤＮＡの種類（野生型か変異型か）を決定した。その結果を、図１に示す。
【００４０】
野生型のガラクトシダーゼ遺伝子を封入したリポソームは蛍光を発するが、変異型のガラクトシダーゼ遺伝子を封入したリポソームは蛍光を生じない。そのため、蛍光を指標として回収されたリポソーム中、変異型遺伝子を含むリポソームは、スクリーニングおけるノイズである。変異型遺伝子を含むリポソームが多いということは、「選択効率」が低いことを示す。そこで、図１の縦軸を、回収された野生型遺伝子の数を、回収された変異型遺伝子の数で割った商とした（「より活性の高い酵素の選択効率」として表す）。
【００４１】
図１の結果は、核酸分解酵素で処理しない一枚膜リポソームを用いた場合、多重膜リポソームを用いた場合よりも選択効率が低かったことを示す。これに対して、核酸分解酵素処理をした一枚膜リポソームを用いた場合は、多重膜リポソームを用いた場合よりも選択効率が高かった。特にＲＮＡ分解酵素を用いた場合に、選択効率が高かった。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
核酸分解酵素処理をした一枚膜リポソームを用いることによって、より高効率のスクリーニングが可能となり、高機能の酵素をコードした遺伝子を選択して回収することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００４３】
配列番号１：プライマー１（逆転写酵素反応用プライマー）
配列番号２：プライマー２（ＰＣＲ用プライマー）
配列番号３：プライマー３（ＰＣＲ用プライマー）
配列番号４：プライマー４（ＰＣＲ用プライマー）
【図１】
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【配列表】
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