(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種のモデル脂質のラマンスペクトルを測定する工程、
皮膚試料のラマンスペクトルを測定する工程、
前記の皮膚試料のラマンスペクトルから、前記少なくとも１種のモデル脂質のラマンスペクトルにおける該モデル脂質の寄与分を差し引いた補正ラマンスペクトルを得る工程、及び
前記補正ラマンスペクトルにおいて、タンパク質のＣＨ伸縮振動由来の信号強度と水のＯＨ伸縮振動由来の信号強度との比率に基づき皮膚水分量を測定する工程
を含む、皮膚水分量の測定方法。
【請求項２】
脱脂皮膚試料のラマンスペクトルにおけるタンパク質のＣＨ伸縮振動由来の信号強度に対する水のＯＨ伸縮振動由来の信号強度の比率と、該脱脂皮膚試料に含まれる水分量との関係を示す検量線を用いて皮膚水分量を算出する、請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
前記モデル脂質が液体脂及び／又は固体脂である、請求項１又は２に記載の測定方法。
【請求項４】
前記信号強度としてピーク面積を用いる、請求項２又は３に記載の測定方法。
【請求項５】
前記タンパク質のＣＨ伸縮振動由来の信号強度が、タンパク質由来のＣＨ伸縮振動の信号の極大ピークを含む少なくとも１００ｃｍ−１の波数幅におけるピーク面積である、請求項４に記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚水分量の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の水分量は、皮膚の形状・光学特性・力学特性に直接的な影響を及ぼす因子であるため、皮膚の状態や機能を制御する技術の開発においては、皮膚の水分量を正確に測定する技術が必要になる。また、皮膚の水分量は、個々人の皮膚の状態や環境により大きく変動するため、皮膚の状態の個人差や部位差を特性化する上でも、皮膚の水分量を適切に把握することが重要である。
【０００３】
皮膚の水分量を測定する方法としては、従来からスキコンやコルネオメーターを始めとする電気的な手法が広く用いられてきている。これらの手法は水分量の変動を鋭敏に且つ簡便にとらえることができる長所を有する一方、測定深度が不明瞭なこと、水分量を絶対量として産出できないこと、水以外の因子の影響を受けやすいこと等の短所も指摘されている。
【０００４】
このような従来型の水分測定法の課題を解決すべく、共焦点ラマン分光法を用いた水分測定法も開発されてきている。この方法は、皮膚内の特定部位にレーザー光を集光し、集光位置から発生するラマン散乱光を検出してラマンスペクトルとして解析することにより、集光部位における水分量を計測する方法である（例えば特許文献１）。特許文献１に記載の方法は、皮膚角層の成分組成をタンパク質と水の二成分系で近似し、皮膚のラマンスペクトルにおいて、ＣＨ伸縮振動とＯＨ伸縮振動の信号強度比からタンパク質量に対する水分質量の比率を算出し、この比率に基づいて皮膚中の水分量を推定するものである。
しかしながら、実際の皮膚はタンパク質と水の他に、脂質（細胞間脂質や皮脂等）が第三の主要成分として存在する。ラマンスペクトルにおいて、脂質由来のＣＨ伸縮振動のピークはタンパク質由来のＣＨ伸縮振動のピークに近接して存在するため、タンパク質由来のＣＨ伸縮振動の信号を検出すると、脂質由来のＣＨ伸縮振動の信号も共雑信号として検出してしまう。したがって、ラマンスペクトルのデータからタンパク質由来のＣＨ伸縮振動の信号のみを正確に読み取ることができず、皮膚水分量を正確に測定することは困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−１２０７６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ラマン分光法により皮膚の水分量を正確かつ簡便に測定する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は上記課題に鑑み鋭意検討を行った結果、皮膚試料をタンパク質、水及び脂質の三成分系で近似し、脂質由来のラマンスペクトルの寄与分を、皮膚の実測ラマンスペクトルから差し引くことで、タンパク質由来のＣＨ伸縮振動の信号強度を正確に読み取り、その結果皮膚水分量を正確かつ簡便に測定できることを見い出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成させたものである。
【０００８】
本発明は、少なくとも１種のモデル脂質のラマンスペクトルを測定する工程、
皮膚試料のラマンスペクトルを測定する工程、
前記の皮膚試料のラマンスペクトルから、前記少なくとも１種のモデル脂質のラマンスペクトルにおける該モデル脂質の寄与分を差し引いた補正ラマンスペクトルを得る工程、及び
前記補正ラマンスペクトルにおいて、タンパク質のＣＨ伸縮振動由来の信号強度と水のＯＨ伸縮振動由来との信号強度の比率に基づき皮膚水分量を測定する工程
を含む、皮膚水分量の測定方法に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ラマン分光法により皮膚の水分量を正確かつ簡便に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１中、Ａは皮膚試料のラマンスペクトルを示し、Ｂは脱脂乾燥皮膚試料のラマンスペクトルを示し、Ｃはモデル皮脂のラマンスペクトルを示し、Ｄはモデル細胞間脂質のラマンスペクトルを示し、Ｅは水のラマンスペクトルを示す。
【図２】図２中、ａは皮膚試料のラマンスペクトルを示し、ｂは脱脂乾燥皮膚試料の寄与分のラマンスペクトルを示し、ｃはモデル皮脂の寄与分のラマンスペクトルを示し、ｄはモデル細胞間脂質の寄与分のラマンスペクトルを示し、ｅは水の寄与分のラマンスペクトルを示し、ｆは前記ａの皮膚試料のラマンスペクトルから脂質の寄与分（前記ｃ及びｄの各スペクトル）を差し引いた補正ラマンスペクトルを示し、ｇは前記ａの皮膚試料のラマンスペクトルから脂質の寄与分（前記ｃ及びｄの各スペクトル）及び水の寄与分（前記ｅのスペクトル）を差し引いた補正ラマンスペクトルを示す。
【図３】前腕皮膚における測定深度の変化に伴うラマンスペクトルの変化を示す図である。
【図４】図４（ａ）は皮膚表面外側１μｍにおける前腕の皮膚のラマンスペクトルを示し、図４（ｂ）は皮膚表面から深さ１μｍにおける前腕の皮膚のラマンスペクトルを示し、図４（ｃ）は皮膚表面から深さ３μｍにおける前腕の皮膚のラマンスペクトルを示し、図４（ｄ）は皮膚表面から深さ１１μｍにおける前腕の皮膚のラマンスペクトルを示す。なお、図４（ａ）〜（ｄ）中、ａは皮膚試料のラマンスペクトルを示し、ｂは脱脂乾燥皮膚試料の寄与分のラマンスペクトルを示し、ｃはモデル皮脂の寄与分のラマンスペクトルを示し、ｄはモデル細胞間脂質の寄与分のラマンスペクトルを示し、ｅは水の寄与分のラマンスペクトルを示し、ｆは前記ａの皮膚試料のラマンスペクトルから脂質の寄与分（前記ｃ及びｄの各スペクトル）を差し引いた補正ラマンスペクトルを示し、ｇは前記ａの皮膚試料のラマンスペクトルから脂質の寄与分（前記ｃ及びｄの各スペクトル）及び水の寄与分（前記ｅのスペクトル）を差し引いた補正ラマンスペクトルを示す。
【図５】脱脂皮膚試料のラマンスペクトルにおけるタンパク質のＣＨ伸縮振動由来の信号強度に対する水のＯＨ伸縮振動由来の信号強度の比率と、該脱脂皮膚試料に含まれる水分量とタンパク質量の比とをプロットして得られた検量線を示す図である。
【図６】図６（ａ）〜（ｆ）は、健常女性（２０〜３０歳代）６名の前腕の皮膚の水分量の測定結果をそれぞれ示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を図面に基づいて詳細に説明する。
図１において、Ａは皮膚試料（健常男性の前腕）のラマンスペクトルを示し、Ｂは脱脂乾燥皮膚試料のラマンスペクトルを示し、Ｃはモデル皮脂のラマンスペクトルを示し、Ｄはモデル細胞間脂質のラマンスペクトルを示し、Ｅは水のラマンスペクトルを示す。
図１からも明らかなように、脱脂乾燥皮膚試料等のタンパク質由来のＣＨ伸縮振動のピークと、皮脂や細胞間脂質等の脂質由来のＣＨ伸縮振動のピークは、一部が重複した波数領域で観測される。そのため、タンパク質、水及び脂質を構成成分とする皮膚試料のラマンスペクトルを測定すると、図１のＡに示すように、タンパク質、水及び脂質をそれぞれ由来とするピークが重畳したスペクトルが得られる。従って、ラマン分光法を利用し、皮膚試料をタンパク質及び水の二成分系で近似して行う従来の方法では、タンパク質量を実際よりも多く見積もってしまい、その結果水分量を少なく見積もってしまうため、正確な皮膚水分量を測定することができない。
この問題に対して、皮膚試料をタンパク質、水及び脂質の三成分系で近似し、図１のＢに示すような皮膚試料のラマンスペクトルからラマンスペクトルにおける脂質の寄与分を差し引いた補正ラマンスペクトルを作成し、補正ラマンスペクトルにおけるタンパク質のＣＨ伸縮振動由来の信号強度に対する水のＯＨ伸縮振動由来の信号強度の比率に基づき皮膚水分量を測定する。このようにして皮膚水分量の測定することで、正確に皮膚水分量を測定することができることを本発明者等は見出した。本発明はこの知見に基くものである。
【００１２】
本発明の皮膚水分量の測定方法を具体的に説明する。
本発明において、少なくとも１種のモデル脂質のラマンスペクトル（図２ｃ及びｄ参照）及び測定対象である皮膚試料のラマンスペクトル（図２ａ参照）を測定する。次に、皮膚試料のラマンスペクトルから、モデル脂質のラマンスペクトルにおける該モデル脂質の寄与分を差し引いた補正ラマンスペクトルを得る（図２ｆ参照）。そして、前記補正ラマンスペクトルにおいて、タンパク質のＣＨ伸縮振動由来の信号強度と水のＯＨ伸縮振動由来の信号強度との比率に基づき皮膚水分量を測定する。
【００１３】
本発明は、ラマン分光法を用いて皮膚の水分量を測定する方法である。本発明の測定方法は、採取した皮膚試料を測定対象としてもよいし（侵襲法）、生体を覆う皮膚をそのままの状態で測定対象としてもよい（非侵襲法）が、肌の状態を直接測定できる非侵襲法が好ましい。皮膚試料の由来はヒトの他、マウス、モルモット、ラット、ブタ、イヌなどの動物であってもよい。また、皮膚の由来部位についても特に制限はない。皮膚試料のラマンスペクトルは一般的な方法で得ることができるが、顕微ラマン法により得ることが好ましい。ラマンスペクトルの測定装置に特に制限はなく、通常の装置を用いることができるが、水分量の測定箇所が狭い場合には、共焦点光学系を有する測定装置を用いることが好ましい。
【００１４】
ラマンスペクトルの測定における光源はレーザー光源であることが好ましい。光源の波長に特に制限はないが、５００〜１１００ｎｍが好ましく、６００〜９００ｎｍがより好ましい。光源から発せられる照射光の皮膚表面に対する入射角は０°〜６０°が好ましく、０°〜３０°がより好ましい。ここで、「入射角」とは、皮膚表面に対して垂直な法線からの角度を意味する。
【００１５】
本発明において光源から発せられる照射光は、集光レンズにより測定部位で焦点を結ぶことが好ましい。皮膚水分量の測定は、皮膚表面から真皮組織までのいずれかの深さでの水分量を測定するのが好ましい。したがって、皮膚表面からの焦点深度は０〜１０００μｍであることが好ましく、０〜２００μｍであることがより好ましい。
集光レンズとして対物レンズを使用する場合において、その倍率、開口数（Ｎ．Ａ．）に特に制限はない。例えば、４０〜１００倍の倍率で、開口数を０．９〜１．５とすることで高い空間分解能での測定ができるし、１０〜４０倍の倍率で開口数を０．３〜０．９とすれば、水平方向及び深さ方向により広範囲の測定を行うことが可能になる。
【００１６】
本発明におけるモデル脂質は、皮膚に含まれうる脂質であれば特に制限はなく、１種又は２種以上の脂質を本発明におけるモデル脂質として用いてもよい。本発明においては、モデル脂質として液体脂及び／又は固体脂を用いることが好ましい。液体脂としては、オレイン酸、トリオレイン酸、オレイン酸デシルもしくはスクワレン又はこれらの混合物などが挙げられる。また、固体脂としては、細胞間脂質が挙げられ、例えば、セラミドを用いることができる。
【００１７】
本発明の皮膚水分量の測定方法について具体的に説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
本発明の測定方法において、測定対象である皮膚試料のラマンスペクトルをそれぞれ測定する。そして、皮膚試料のラマンスペクトルから、別途測定した少なくとも１種のモデル脂質のラマンスペクトルから算出したモデル脂質の寄与分を差し引いた補正ラマンスペクトルを作成する。このようにして得られた補正ラマンスペクトルにおける、２９００ｃｍ-1付近のラマン信号強度Ｉprotein（主にタンパク質のＣＨ伸縮振動に由来する。以下、タンパク質のＣＨ伸縮振動由来の信号強度ともいう。）と３４００ｃｍ-1付近のラマン信号強度ＩOH（主に水のＯＨ伸縮振動に由来する。以下、水のＯＨ伸縮振動由来の信号強度ともいう。）との比率に基づいて、皮膚水分量を測定する。
【００１８】
前記補正ラマンスペクトルから皮膚水分量を測定する方法について具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
前記補正ラマンスペクトルにおいて、皮膚の角層の主要成分のうち脂質の寄与分を排除し、水とタンパク質の二成分系で近似している。したがって、前記補正ラマンスペクトルにおける、Ｉprotein、ＩOH、及び皮膚試料中の水とタンパク質の質量比ＲH2O/proteinの間には以下の関係が与えられる。
【００１９】
【数１】
0005460528.tif 000002
【００２０】
ここで、Ａ及びＢは、水分量既知のタンパク質（例えば、脱脂皮膚試料）のラマン測定より実験的に導出される定数である。
式（１）において、ＩOH及びＩproteinは以下の式で表すことができる。
【００２１】
【数２】
0005460528.tif 000003
【００２２】
【数３】
0005460528.tif 000004
【００２３】
本発明において、予め脱脂皮膚試料のラマンスペクトルを調湿下で測定し、このようにして得られた脱脂皮膚試料のラマンスペクトルにおけるタンパク質のＣＨ伸縮振動由来の信号強度に対する水のＯＨ伸縮振動由来の信号強度の比率と、該脱脂皮膚試料に含まれる水分量との関係を示す検量線を作成し、該検量線を用いて前記補正ラマンスペクトルから皮膚水分量を測定することが好ましい。
【００２４】
上記検量線は、水分量既知の脱脂皮膚試料を複数用意し、ラマンスペクトルを測定し、前記式（１）の関係に従い、ＩproteinとＩOHとの比率と、該脱脂皮膚試料の総重量に対する該脱脂皮膚試料に含まれる水分量の比率をプロットすることで得られる。上記水分量既知の脱脂皮膚試料に制限はないが、水分量既知の角層であることが好ましい。
【００２５】
本発明において前記Ｉproteinは、補正ラマンスペクトルの好ましくは２８００〜３０５０ｃｍ-1、より好ましくは２８００〜３０３０ｃｍ-1の波数範囲におけるピーク面積であることが好ましい。また、前記ＩOHは、補正ラマンスペクトルの好ましくは３１００〜３８００ｃｍ-1、より好ましくは３１００〜３７５０ｃｍ-1の波数範囲におけるピーク面積であることが好ましい。
【００２６】
本発明の皮膚水分量の測定方法の具体的態様について説明する。
まず、脱脂皮膚試料のラマンスペクトルにおけるＩproteinに対するＩOHの比率と、該脱脂皮膚試料の総質量に対する該脱脂皮膚試料に含まれる水分量の比率との関係を示す検量線を作成する。次に、測定対象である皮膚試料のラマンスペクトルを測定する。次に、前記皮膚試料のラマンスペクトルから、脂質の寄与分を差し引いた補正ラマンスペクトルを作成する。次に、前記補正ラマンスペクトルにおける、Ｉproteinに対するＩOHの比率を算出する。そして、Ｉproteinに対するＩOHの比率から、検量線を用いて、皮膚水分量を測定する。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２８】
（試験例１）補正ラマンスペクトルの妥当性評価
［脱脂乾燥角層の調製］
健常男性（４０歳代）のかかとより角層片（３．０〜５．０ｍｇ）をナイフで切除後、クロロホルム−メタノール（１：１）液に一昼夜浸漬した。その後角層片試料を取り出し、自然乾燥後、イオン交換水に一昼夜浸漬した。その後角層片試料を取り出し、自然乾燥させることで、脂質等の油溶性成分と、アミノ酸等の水溶性成分を除去した脱脂乾燥角層を調製した。
【００２９】
［モデル皮脂の調製］
下記組成のモデル皮脂を調製した。
オレイン酸（関東化学製）                              １７．４質量％
トリオレイン酸（関東化学製）                          ４３．４質量％
オレイン酸デシル（和光純薬製）                        ２６．５質量％
スクワレン（関東化学製）                              １２．７質量％
【００３０】
上記の脱脂乾燥角層及びモデル皮脂、並びにモデル細胞間脂質（シグマ社製non-hydroxy  fatty  ceramide）及び水（イオン交換水）の各試料についてラマンスペクトルを測定した。ラマンスペクトルの測定条件を以下に示す。
装置：顕微ラマン分光器  Ｎａｎｏｆｉｎｄｅｒ３０（商品名、東京インスツルメンツ）
レーザー：Ｈｅ−Ｎｅレーザー（励起波長：６３２．８ｎｍ）
回析格子：１５０ｇｒ／ｍｍ
対物レンズ：１００倍、油浸、ＮＡ＝１．３（ニコン）
ピンホール直径：１５０μｍ
各試料のラマンスペクトルの測定方法を以下に示す。
脱脂乾燥角層については、脱脂乾燥角層を五酸化りんをセットした容器に入れ、容器底面のガラス窓越しにレーザーを照射し、絶乾状態での脱脂乾燥角層のラマンスペクトルを測定した。モデル皮脂、モデル細胞間脂質及び水については、ガラス製の試料台に試料を置き、ガラス越しにレーザーを照射し、ラマンスペクトルを測定した。
【００３１】
このようにして得られた脱脂乾燥角層、モデル皮脂、モデル細胞間脂質及び水のラマンスペクトルを、それぞれ図１中のＢ〜Ｅに示す。
【００３２】
さらに、健常男性（４０歳代）の前腕の皮膚のラマンスペクトル（皮膚表面からの深さ３μｍ）を測定した。その結果を、図１中のＡに示す。
【００３３】
次に、図２中のａに示す、前記条件下で測定した皮膚試料のラマンスペクトルから、図２中のｃ及びｄに示す脂質の寄与分のラマンスペクトルを差し引いて得られる補正ラマンスペクトルの妥当性について検討した。
なお、合成ラマンスペクトルは下記の通りに作成した。
【００３４】
（１）ベースラインの蛍光補正
脱脂乾燥角層及び皮膚のラマンスペクトルでは蛍光によるベースラインのゆがみが認められた。そこで、２０００〜２８００ｃｍ-1および３８００〜４２００ｃｍ-1の波数領域のデータより、最小二乗法を用いた三次関数近似に基づきベースラインを予測し、これを差し引くことにより蛍光の影響を排除したラマンスペクトルに補正する。
【００３５】
（２）ラマンスペクトルの重ね合わせ
蛍光の影響を排除した補正後の脱脂乾燥角層のラマンスペクトルをＩSC(ω)、モデル皮脂のラマンスペクトルをＩSEB(ω)、モデル細胞間脂質のラマンスペクトルをＩCER(ω)、水のラマンスペクトルをＩWAT(ω)とし、これらを重ね合わせて算出されるラマンスペクトルを合成ラマンスペクトルＩCAL(ω)とする。ＩCAL(ω)は下記式（４）で表すことができる。
【００３６】
【数４】
0005460528.tif 000005
【００３７】
ここで式（４）における係数Ｃ1〜Ｃ4は、合成ラマンスペクトルの作成に用いた各ラマンスペクトルの寄与分に関するパラメーターである。
蛍光の影響を排除した補正後の皮膚のラマンスペクトルＩOBS(ω)を、上記合成スペクトルをＩCAL(ω)によりできるだけ良く再現できるように、２５００〜４０００ｃｍ-1の波数領域で、最小二乗法によって、パラメーターＣ1〜Ｃ4を決定した。なお各パラメーターの算出値が負の数となった場合は、そのパラメーターをゼロに固定した上で、再度最小二乗近似を行った。
具体的には、２５００〜４０００ｃｍ-1の各波数における合成ラマンスペクトルＩCAL(ω)と実測した皮膚のラマンスペクトルＩOBS(ω)との差の二乗の和が最小となるようにパラメーターＣ1〜Ｃ4を決定することにより、各成分の寄与分を決定した。
【００３８】
本発明における、皮膚試料のラマンスペクトルから脂質の寄与分を差し引いた補正ラマンスペクトルＩOBS―LIP(ω)は、下記式（５）で表すことができる。
【００３９】
【数５】
0005460528.tif 000006
【００４０】
さらに、皮膚試料のラマンスペクトルから、脂質の寄与分に加えて、水の寄与分も差し引いた補正ラマンスペクトルＩOBS―LIP-WAT（ω）は、下記式（６）で表すことができる。
【００４１】
【数６】
0005460528.tif 000007
【００４２】
このようにして得られた、補正ラマンスペクトルＩOBS―LIP(ω)及び補正ラマンスペクトルＩOBS―LIP-WAT（ω）を図２中ｆ及びｇに示す。
【００４３】
図２から明らかなように、皮膚試料のラマンスペクトルから脂質及び水の寄与分を差し引いて得られた補正ラマンスペクトルｇのパターンは、脱脂乾燥角層のラマンスペクトルｂのパターンと非常によく類似していた。従って、上記工程により、皮膚試料に含まれる水分量を正確に反映した補正ラマンスペクトルが得られることが示された。
【００４４】
（試験例２）補正ラマンスペクトルの妥当性評価
レーザー光の焦点の位置を変化させた以外は試験例１と同様の条件で健常男性（４０歳代）の前腕の皮膚のラマンスペクトルを測定し、測定深度の変化に伴うラマンスペクトルの変化を調べた。結果を図３に示す。
【００４５】
図３中、ｈは皮膚表面よりも１μｍ外側に照射光の焦点をあわせたときのラマンスペクトルである。この条件における深さ方向の空間分解能は１．８μｍなので、皮膚表面より１μｍ外側に焦点を合わせると皮膚からの信号が微弱ながら観測される。図３のｈに示すスペクトルでは、皮脂に由来するピーク（２８８０ｃｍ-1付近のショルダー形状のピーク）が観測された。
図３中、ｉ及びｊはそれぞれ皮膚表面からの深さ１μｍ及び３μｍの位置に照射光の焦点をあわせたときのラマンスペクトルであり、角層のラマンスペクトルに相当する。図３中、ｋは皮膚表面からの深さ１１μｍの位置に照射光の焦点をあわせたときのラマンスペクトルであり、ＣＨ伸縮振動のピーク面積（２８００〜３０００ｃｍ-1）に対するＯＨ伸縮振動のピーク面積（３１００〜３８００ｃｍ-1）が十分に大きいことから、顆粒層またはそれより深い領域を測定しているものと考えられる。
【００４６】
次に、前記皮膚表面からの各距離におけるラマンスペクトルを測定し、試験例１と同じように脱脂乾燥角層、モデル皮脂、モデル細胞間脂質及び水（イオン交換水）のラマンスペクトルを用いて脂質の寄与分を決定し、皮膚試料のラマンスペクトルから脂質の寄与分を差し引いた補正ラマンスペクトルＩOBS―LIP(ω)並びに皮膚試料のラマンスペクトルから脂質及び水の寄与分も差し引いた補正ラマンスペクトルＩOBS―LIP-WAT（ω）を作成した。その結果を図４（ａ）〜（ｄ）に示す。なお、図４（ａ）は皮膚表面外側１μｍにおける前腕の皮膚のラマンスペクトルを示し、図４（ｂ）は皮膚表面から深さ１μｍにおける前腕の皮膚のラマンスペクトルを示し、図４（ｃ）は皮膚表面から深さ３μｍにおける前腕の皮膚のラマンスペクトルを示し、図４（ｄ）は皮膚表面から深さ１１μｍにおける前腕の皮膚のラマンスペクトルを示す。また、図４（ａ）〜（ｄ）中、ａは皮膚試料の実測のラマンスペクトルを示す。また、図４（ａ）〜（ｄ）中、ｂ〜ｅは、式（４）を用いてａのスペクトルを再現した際の、各素スペクトルの寄与分に相当する。即ちｂは脱脂乾燥皮膚試料のラマンスペクトルの寄与分を示し、ｃはモデル皮脂のラマンスペクトルの寄与分を示し、ｄはモデル細胞間脂質のラマンスペクトルの寄与分を示し、ｅは水のラマンスペクトルの寄与分を示す。また、図４（ａ）〜（ｄ）中、ｆは前記ａの皮膚試料のラマンスペクトルから脂質の寄与分（前記ｃ及びｄの各スペクトル）を差し引いた補正ラマンスペクトルを示し、ｇは前記ａの皮膚試料のラマンスペクトルから脂質の寄与分（前記ｃ及びｄの各スペクトル）及び水の寄与分（前記ｅのスペクトル）を差し引いた補正ラマンスペクトルを示す。
【００４７】
図４（ａ）〜（ｄ）から明らかなように、皮膚試料のラマンスペクトルから脂質及び水の寄与分を差し引いて得られた補正ラマンスペクトルｇのパターンは、脱脂乾燥角層のラマンスペクトルｂのパターンと非常によく類似していた。さらに、図４（ａ）〜（ｄ）から、皮膚表面からの距離によって、ラマンスペクトルにおける脂質（細胞間脂質及び皮脂）由来の信号強度が異なっていることがわかる。従って、上記工程により、ラマンスペクトルにおける脂質の寄与分を考慮して差し引くことで、皮膚試料に含まれる水分量を正確に反映した補正ラマンスペクトルが得られることが示された。
【００４８】
また、図４の結果から、皮膚表面の外側のラマンスペクトルではモデル皮脂の寄与分が認められるのに対し、皮膚内部（深さ１、３、１１μｍ）のラマンスペクトルではモデル皮脂の寄与分が認められなかった（寄与分がゼロと算出された）。この結果は、皮膚内部の脂質が液体脂ではなく、一定の構造を有する固体脂であることと一致する。
また、図４の結果は、角層に相当する深さ１μｍ及び３μｍのラマンスペクトルではモデル細胞間脂質の寄与分が大きいのに対し、顆粒層以下に相当する深さ１１μｍのラマンスペクトルではモデル細胞間脂質の寄与分が小さいことを示している。この結果は、角層内には細胞間脂質の量が多く存在するのに対し、顆粒層以下では細胞間脂質はほとんど存在していないことと一致する。
【００４９】
実施例
（１）検量線の作成
健常男性（４０歳代）のかかとより角層片（３．０〜５．５ｍｇ）をナイフで切除後、クロロホルム−メタノール（１：１）液に一昼夜浸漬した。その後角層片試料を取り出し、自然乾燥後、イオン交換水に一昼夜浸漬した。その後角層片試料を取り出し、自然乾燥させることで、脂質等の油溶性成分と、アミノ酸等の水溶性成分を除去した脱脂乾燥角層を調製した。
【００５０】
前記脱脂乾燥角層を調湿剤の入ったガラスボトムディッシュに一昼夜以上放置後、ガラスボトムディッシュに入れたまま、下記調湿剤を用いた調湿環境下でのラマンスペクトルの測定を行った。
調湿剤１：五酸化りん（関東化学、特級、乾燥状態で使用）
調湿剤２：シリカゲル（関東化学、乾燥用、乾燥状態で使用）
調湿剤３：塩化ナトリウム（和光純薬、特級、飽和水溶液で使用、平衡湿度75%R.H.）
調湿剤４：臭化カリウム（スペクトラテック、KBｒ錠剤用、平衡湿度84%R.H.）
調湿剤５：硫酸ナトリウム（関東化学、特級、飽和水溶液で使用、平衡湿度93%R.H.）
調湿剤６：リン酸水素二ナトリウム（和光純薬、特級、飽和水溶液で使用、平衡湿度95%R.H.）
【００５１】
ラマンスペクトル測定後、調湿環境下で平衡化した脱脂角層をガラスボトムデッシュより取り出し、速やかに精密天秤を用いて重量を測定した。五酸化りん平衡時の角層の含水量をゼロとみなし、かつ上記脱脂角層は水とタンパク質の２成分で近似できるとみなし、各湿度平衡時の水とタンパク質の質量比ＲH2O/proteinを式（７）を用いて算出した。
【００５２】
【数７】
0005460528.tif 000008
【００５３】
式（７）において、ＲH2O/proteinは湿度Ｈにおける含水率を表し、Ｗ(Ｈ)は湿度Ｈにおける角層重量を表し、Ｗdryは五酸化りん平衡時の角層重量を表す。
【００５４】
また、上記調湿角層より得られたラマンスペクトルの、タンパク質の信号強度Ｉprotein及びＯＨの信号強度ＩOHを、前記式（２）及び式（３）より算出した。次に、タンパク質の信号強度Ｉprotein及びＯＨの信号強度ＩOHの信号強度比Ｉ（OH/CH）を式（８）を用いて算出した。
【００５５】
【数８】
0005460528.tif 000009
【００５６】
以上のようにして算出した、各湿度平衡時の水とタンパク質の質量比ＲH2O/proteinと、タンパク質の信号強度Ｉprotein及びＯＨの信号強度ＩOHの信号強度比Ｉ（OH/CH）との関係を図５に示す。なお図５中の直線のＸ軸との切片は、便宜上ＯＨのみに由来するピークとみなした3100〜3750cm-1の領域における、タンパク質のNH伸縮振動の寄与分に相当する。
【００５７】
（２）ラマンスペクトルの測定
健常女性（２０〜３０歳代）６名の前腕のラマンスペクトルを皮膚表面からの深さ方向の連続スキャンで測定した。ラマンスペクトル測定条件は以下のとおりである。
＜測定条件＞
装置：顕微ラマン分光器  Ｎａｎｏｆｉｎｄｅｒ３０（商品名、東京インスツルメンツ製）
対物レンズ：１００×、ＮＡ１．３
レーザー：６３３ｎｍ、８ｍＷ（試料上）
積算時間：３ｓ／１点
ピンホール径：１５０μｍ
回折格子：１５０ｇｒ／ｍｍ
深さ方向のスキャン間隔：２μｍ
合計測定点数：２１点
総積算時間：約１分
【００５８】
（３）ラマンスペクトルにおける、皮膚試料の脂質の寄与分の算出
上記の１２６スペクトル（２１スペクトル×６名）に対して、試験例１と同様にベースラインの蛍光補正を行った。次にこの蛍光補正後のスペクトルを、前記式（４）を用いて４つのラマンスペクトル（脱脂乾燥角層、モデル皮脂、モデル細胞間脂質、水）の重ねあわせで表現することを試みた。ここでの４種のラマンスペクトルを得た測定試料、測定条件は試験例１と同一である。最小二乗法により前記式（４）における係数Ｃ1〜Ｃ4を決定した。このときＣ2ＩSEB（ω）が皮脂の寄与分、Ｃ3ＩCER（ω）が細胞間脂質の寄与分となる。
【００５９】
（４）補正ラマンスペクトルの作成
前記（２）で得られた皮膚表面からの深さ方向の連続スキャンで測定したラマンスペクトルから、前記（３）で得られた各皮膚表面からの深さにおける脂質の寄与分Ｃ2ＩSEB（ω）とＣ3ＩCER（ω）を差し引いて、補正ラマンスペクトルを作成した。
【００６０】
（５）水分量の測定
前記（４）で得られた補正ラマンスペクトルにおけるＩprotein（波数領域：２８００〜３０３０ｃｍ-1）に対するＩOH（波数領域：３１００〜３７５０ｃｍ-1）の比率を算出した。このように算出した比率から、前記（１）で作成した検量線に基づいて皮膚の水分量（質量％）を算出した。その結果を図６の曲線Ａに示す。また前記（４）に示す補正ラマンスペクトルを作成せずにＩproteinとＩOHを算出し、前記（１）で作成した検量線に基づいて皮膚の水分量（質量％）を算出した。その結果を図６の曲線Ｂに併せて示す。
【００６１】
図６の結果から、曲線Ａ、Ｂ共に、皮膚表面から深部に向かって水分量が上昇し、皮膚表面からの深さが１０〜１５μｍ以下の領域で７０％程度の一定値に達している。一般にこの水分上昇が見られる領域が角層領域、水分が一定値を示す領域が顆粒層以下の領域と考えられている。一般に角層では水分等の喪失や刺激物質の侵入を防ぐために、細胞間に細胞間脂質と呼ばれる脂質層が出現する。
脂質の寄与分を補正していない曲線Ｂでは、タンパク質の信号を過剰に見積もっているために、いずれの被験者の場合でも水分量が過少に見積もられてしまう。そのため角層領域では、曲線Ｂは脂質補正後の曲線Ａよりも低値を示している。一方、角層以下の領域では細胞間脂質層が形成されていないため、角層よりも脂質量は十分に少ない。そのため皮膚表面からの深さが１０〜１５μｍ以下の領域では、脂質の寄与分の補正の有無に関わらず、水分量は７０％程度を示したと考えられる。以上より、脂質の寄与分の補正により得られた水分プロファイルは、皮膚構造に関する既知の知見と合致した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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