(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓病理と既に診断された患者において、複数の肝臓病理の発生を検出する方法であって、
患者からのサンプルにおいてヒトプロガストリン（ｈＰＧ）濃度を生化学的アッセイ又は少なくとも１つの抗ｈＰＧ抗体を用いたイムノアッセイにより決定する工程を含み、前記ヒトプロガストリン（ｈＰＧ）濃度が４００ｐＭ以上である場合に、複数の肝臓病理の発生を検出し、前記肝臓病理が、肝臓癌、Ｃ型肝炎、及び肝臓の肝硬変からなる群より選択される、患者の複数の肝臓病理の発生を検出する方法。
【請求項２】
前記複数の肝臓病理が、
肝臓癌及び肝硬変、
肝臓癌及びＣ型肝炎、又は
肝臓癌、肝硬変及びＣ型肝炎
である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ヒトプロガストリン（ｈＰＧ）濃度を決定する工程が、少なくとも１つの抗ｈＰＧ抗体を用いたイムノアッセイにより行われる、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記ヒトプロガストリン（ｈＰＧ）濃度が５００ｐＭ以上である場合に、複数の肝臓病理の発生を検出する、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記患者が平均より高いＣ型肝炎の発生率を有する集団に属するか、前記患者が平均より高いＣ型肝炎の発生率を有する地理的地域に居住するか、前記患者が薬物又はアルコール依存性状態を有する、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
以下の工程：
（ａ）４００pM以上の血液ｈＰＧ濃度を伴う患者を同定すること；
（ｂ）以下の状態の少なくとも２つについて前記患者をテストすること：
ｉ）ラジオグラフィー又は画像技術を使用して、肝臓癌；
ｉｉ）核酸ベースのアッセイを使用して、Ｃ型肝炎ウイルス；及び
ｉｉｉ）線維症の１つ又は複数の血清マーカーについて前記患者からの血液サンプルをテストすることによる、肝臓の肝硬変、
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
肝臓病理と既に診断された患者において複数の肝臓病理について患者のリスクを検出する方法であって、前記肝臓病理が、肝臓癌、Ｃ型肝炎、及び肝臓の肝硬変からなる群より選択され、以下：
（ａ）生化学的アッセイにより、患者の血清又は血漿ｈＰＧレベルを決定すること；及び
（ｂ）（ａ）に基づき、患者に、複数の肝臓病理についての相対リスクを割り当てること、それにおいて：
ｉ）１００pMを下回るｈＰＧレベルは、患者が複数の肝臓病理について「低リスク」にあることを示す；
ｉｉ）１００pM〜４００pMの間のｈＰＧレベルは、患者が、肝臓癌を伴う又は伴わない肝硬変を有する「高リスク」にあり、及び、また、Ｃ型肝炎を有する「上昇リスク」にあることを示す；及び
ｉｉｉ）４００pMを上回るｈＰＧレベルは、患者が肝臓癌、肝硬変、及びＣ型肝炎を有する「重度リスク」にあることを示す；
（ｃ）それにおいて、前記患者が、他の診断手段を使用してさらにテストされ、前記患者が１００pMを下回るｈＰＧレベルを有する場合、前記患者が肝臓癌を有さないことを確認する；及び
（ｄ）それにおいて、前記患者が、他の診断手段を使用して、該患者が１００pM〜４００pMの間のｈＰＧレベルを有する場合、肝臓癌及び／又はＣ型肝炎についてさらにテストされること
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．  関連出願の相互参照
本願は、米国仮出願第６１／２９３，５５７号（２０１０年１月８日に出願）の利益を主張し、その内容はその全体において参照により組み入れられる。
【０００２】
２．  配列リストの参照
配列リストを本明細書と同時に提出する。
【０００３】
３．  背景
本開示は、肝臓病理（肝臓の増殖及び変性疾患を含む）の診断及びスクリーニングのための方法及び材料、特に、肝臓病理を診断するためのプロガストリンレベルの定量化又は決定のための方法及び材料を提供する。
【０００４】
３．１．  ガストリン及びプロガストリンホルモンの背景
ガストリンは、胃酸分泌の刺激剤として機能する消化管ペプチドホルモンである。成体の哺乳動物において、それは主に胃前庭部のＧ細胞により、ならびに上部小腸及び膵臓においては変動する範囲で産生され、結腸においてかろうじて検出可能な量を伴う。最近では、結腸直腸発癌におけるペプチドのガストリンファミリーの役割において関心が増加している。特に、ガストリン（プロガストリン及びグリシン伸長ガストリン）の前駆体形態は、以前に不活性であると考えられていたが、結腸直腸癌の発生において役割を果たしているとの証拠がある。
【０００５】
ガストリン遺伝子は、１０１アミノ酸ポリペプチド（プレプロガストリンと呼ばれる）に翻訳され、それは、切断されて、プロガストリン（８０アミノ酸ポリペプチド）を生じるシグナル配列（下線）を含む。順に、プロガストリンはプロセシングされて、切断産物Ｇ３４（プロガストリンの残基３８〜７１に対応する３４アミノ酸ペプチド）を提供する。Ｇ３４は、次に、グリシン残基を用いてそのカルボキシ末端で伸長されて、グリシン伸長Ｇ３４（「Ｇ３４−Ｇｌｙ」）を生成する。プロガストリン切断の副産物は、６アミノ酸ペプチド（Ｃ末端隣接ペプチド、又はＣＴＦＰと呼ばれる）であり、それは、配列における
プロガストリンの残基５５−７２に配列において対応するペプチド残基、およびＧ１７−Ｇｌｙとして言及される。Ｇ３４−Ｇｌｙ及びＧ１７−ＧｌｙのＣ末端グリシンの除去、それに続くＣ末端アミド化は、それぞれＧ３４及びＧ１７をもたらし、それらの両方がＣ末端アミド化されている。
【０００６】
プロガストリンについての大半のアッセイが、プロガストリンと他のガストリン遺伝子産物の間で区別せず、全長プロガストリンレベルの不正確な測定をもたらす。プロガストリンレベルは１つ又は複数の疾患において役割を果たすため、プロガストリンの測定のための正確な手段が望まれている。
【０００７】
３．２．  肝臓病理のバックグラウンド
多くの肝臓病理は、診断することが困難である。例えば、肝臓癌は定期的な血液検査により診断することはできない。腫瘍マーカーアルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）を用いた医師のスクリーニングが通常必要である。しかし、上昇ＡＦＰレベルは肝臓癌について特異的ではない。成人において、ＡＦＰの高い血液レベル（５００ng/mLを上回る）は、３つの状況において見られる：肝臓癌、胚細胞腫瘍（精巣及び卵巣の癌）、及び肝臓の転移癌（他の臓器において生じる癌）。また、肝臓癌についてのＡＦＰの感度は約６０%である。言い換えれば、上昇ＡＦＰ血液レベルは肝臓癌患者の約６０%だけにおいて見られる；肝臓癌を伴う患者の４０%は正常なＡＦＰレベルを有する。肝臓病理を診断するための別の困難は、肝硬変（肝臓の瘢痕及び不良な肝臓機能により特徴付けられる慢性肝疾患の結果）である。診断のゴールドスタンダードは、肝生検、侵襲的技術による。
【０００８】
Ｃ型肝炎は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）により起こされる肝臓に影響を及ぼす感染性疾患である。感染症はしばしば無症候性であるが、しかし、一旦確立されると、慢性感染症は肝臓の瘢痕（線維症）及び進行した瘢痕（肝硬変）に進行しうる。Ｃ型肝炎は、典型的には、血清学的スクリーニングにより診断される。Ｃ型肝炎を検出及び／又は確認するための他の手段が望まれうる。
【０００９】
肝臓癌、肝硬変、及びＣ型肝炎の早期の及び正確な検出は、患者の生存率を増加させる潜在力を有するため、これらの病理（患者が上記の疾患の１を上回る又は全てを有する例を含む）を診断又は検出する方法についての現在の長く感じられてきた必要性が存在する。
【００１０】
４．  要約
１つ又は２つの肝臓病理を伴う患者が、上昇したヒトプロガストリン（ｈＰＧ）レベルを示しうるのに対し、肝臓癌、Ｃ型肝炎、及び肝硬変を伴う患者は、これらの状態の１つ又は２つだけを伴う患者により示されるｈＰＧレベルの単なる付加的を上回るｈＰＧの極度に上昇したレベルを示すことが発見されている。本開示に基づいて、患者のｈＰＧの血漿又は血清レベルを使用して、肝臓病理についてのリスク因子を割り当てることができる。さらに、ｈＰＧの過剰な血清又は血漿レベルを使用して、肝臓癌、Ｃ型肝炎、及び肝硬変を患う患者を診断することができる。
【００１１】
開示の方法により診断することができる肝臓癌は、原発性肝臓癌（例、肝細胞癌、肝臓において生じる癌）及び二次性肝臓癌を含む。
【００１２】
診断の方法も提供され、そこでは、患者は、閾値を上回るヒトプロガストリン（ｈＰＧ）レベル（例えば、少なくとも約４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、又は７５０pM）が検出される場合、肝又は肝臓状態を患っているとして同定される。そのような方法は、また、肝臓疾患の平均より高い発生率を有する集団における、例えば、薬物又はアルコール使用者集団あるいは平均より高い肝臓疾患の発生率を伴う地理的地域に居住する人々における標準的な診断法として有用でありうる。したがって、そのような集団における上昇ｈＰＧレベルを検出する方法も提供される。
【００１３】
本開示は、また、患者のｈＰＧレベルに基づき、１つ又は複数の肝臓病理（例えば肝臓癌（例、肝細胞癌）、Ｃ型肝炎、及び肝硬変など）についてのリスク群に患者を割り当てるための方法を提供する。例えば、ｈＰＧの第１閾値レベルは、患者が、肝臓病理について「低リスク」にあることを示すことができる；ｈＰＧの第２閾値レベルは、患者が、肝臓病理について「上昇リスク」にあることを示すことができる；ｈＰＧの第３閾値レベルは、患者が、肝臓病理について「高リスク」にあることを示すことができる；及びｈＰＧの第４閾値レベルは、患者が、肝臓病理について「重度リスク」にあることを示すことができる。
【００１４】
定量化したｈＰＧレベルも追加マーカー（例えばアルファ−フェトプロテイン（「ＡＦＰ」）など）と使用し、肝臓病理の同定、診断、区別、又はそれについてのリスク割り当てにおいて助けることができる。
【００１５】
本明細書に開示する方法を使用し、適切な治療方針を決定することができる。一部の例において、肝臓病理と既に診断されている患者をスクリーニングし、さらなる処置選択肢が是認されるか否かを決定することが有用である。したがって、特定の局面において、肝臓病理と以前に診断された患者は、患者の生物学的サンプル中のｈＰＧレベルに基づき、さらなる肝又は肝臓状態を患っていると診断される。以前の肝臓病理は、Ｃ型肝炎、肝硬変、又は肝臓癌（例えば肝細胞癌など）でありうる。有利には、ｈＰＧの極度に高いレベル（例、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００pMを上回るｈＰＧ濃度）は、患者がこれらの状態の全てを有することを示す。
【００１６】
ｈＰＧレベルが、患者が肝臓病理を有する、又は患者が肝臓状態と以前に診断されたことを示し、及び、ｈＰＧレベルが１より多い肝臓状態を示している患者は、特定の肝臓状態を同定するためのさらなるテストに供することができる。患者は、肝臓の肝臓癌、Ｃ型肝炎、又は肝硬変についてテストすることができる。
【００１７】
開示の方法を使用して１つ又は複数の肝臓病態を有するとして同定されている患者は、それらの状態について処置することができる。肝病理のための処置を受けている患者は、また、それらのｈＰＧレベルをモニターし、疾患進行及び／又は処置効力を評価することができる。ｈＰＧレベルが閾値を上回ったままである患者は、処置を受け続けることがある。
【００１８】
本明細書に開示する方法の実行において、ｈＰＧレベルを測定するための特定のアッセイは、測定されたｈＰＧレベルが正確である場合、決定的ではない。一部の実施態様において、抗ｈＰＧ抗体は、ｈＰＧレベルを測定するために便利に使用される。記述した通り、ｈＰＧは、身体により、より小さなペプチドに切断される。ｈＰＧは、不正確なｈＰＧ測定を避けるために、プロガストリンプロセシングの副産物を検出しないアッセイを使用した本開示の方法において検出及び測定することが好ましい。これは、全長ｈＰＧ（しかし、より小さなｈＰＧペプチドではない）に結合する抗体の使用により達成することができる。これは、また、両方が全長ｈＰＧに結合し（しかし、抗体がより小さなｈＰＧペプチドに結合する範囲で）、両方が同じより小さなｈＰＧペプチドに結合するわけではない２つの異なる抗体の使用により達成することができる。そのようなアッセイにおいて、両方の抗体により結合される唯一の産物は全長ｈＰＧである。例えば、ｈＰＧのＣ及びＮ末端エピトープに結合する抗体は、より小さなｈＰＧペプチドの検出及び測定を伴わない全長ｈＰＧの検出及び測定を可能にする。このように、特定の局面において、開示は、患者を診断する方法を提供し、それにおいて、生物学的サンプルを、ｈＰＧの第１エピトープ、好ましくはＣ又はＮ末端エピトープに結合する第１抗体、及びｈＰＧの異なるエピトープ、好ましくは他の末端のエピトープに結合する第２抗体と接触させる。
【００１９】
ｈＰＧの検出及び測定のための抗ｈＰＧ抗体を利用する例示的な方法において、患者は、患者からのサンプルを少なくとも１つの抗ｈＰＧ抗体と接触させること；及びサンプルが、閾値を上回るｈＰＧ濃度、例えば、少なくとも約４００、４５０、５００、５５０、又は６００pM、しばしば４００、４５０、又は５００pMを有するか否かを、抗体に結合したｈＰＧの量を決定することにより、肝又は肝臓状態を患うとして同定される。
【００２０】
開示の方法は、一般的に、ｈＰＧレベルについて生物学的サンプルをアッセイすることを含む。生物学的サンプルは血漿又は血清でありうる。組織レベルも使用することができる；しかし、組織中で測定されるｈＰＧのレベルは、血清又は血漿中で見出されるｈＰＧのレベルとは異なると予測されるが、しかし、患者が肝臓病理を患っている場合、患者の正常なｈＰＧレベルと比べて上昇しうる。このように、ｈＰＧの組織レベルは、また、患者の肝臓病理のリスク又は状態をモニターするために使用することができる。組織サンプルを使用する場合、プロガストリンを、細胞又は組織抽出物で実施するイムノアッセイを使用して検出することができる、あるいは、検出可能なマーカーを用いて標識されたポリクローナル又はモノクローナル抗体を用いて免疫組織化学技術を利用することができる。免疫組織化学的技術は、プロガストリンレベルの質的な測定を提供する。適した検出可能なマーカーは、放射性標識（例えば放射性ヨウ素など）、蛍光標識、又は化学発光ラベルを含む。
【００２１】
診断キットも本明細書において提供する。診断キットは、例えば、検出可能なマーカーを用いて場合により標識された、プロガストリンに対する１つ又は複数の抗体を含み得、肝臓病理をスクリーニング、診断、又は区別するために使用することができる。診断キットは、ｈＰＧのＮ末端ペプチド領域と親和性を有する第１抗体及び異なるエピトープ（例えばｈＰＧのＣ末端ペプチド領域など）と親和性を有する第２抗体を含みうる。本開示は、また、Ｎ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体ならびにモノクローナル又はポリクローナルＣ末端抗ｈＰＧ抗体（各々が別々の容器中）及び適した試薬を含む、肝臓病理を診断する方法を行うためのキットを提供する。一部の実施態様において、提供される抗体の１つ又は両方が標識される。
【００２２】
患者が複数の肝又は肝臓状態を患うか否かを診断する方法も提供し、それにおいて、少なくとも約４００pMの血液ｈＰＧ濃度を伴う患者が、以下の状態の２つ又はそれ以上を有するとして同定される：Ｃ型肝炎、肝臓癌、又は肝硬変（例えば、生化学的アッセイを使用して患者からの血清又は血漿中のｈＰＧレベルをテストすることによる）。そのような患者が特定された後、患者の肝臓病理は、さらに、Ｃ型肝炎、肝臓癌、又は肝硬変のためのアッセイを使用して診断することができる。Ｃ型肝炎は、核酸ベースのアッセイを使用して診断することができる。肝臓癌は、ラジオグラフィー又は画像技術（コントラストを伴う又は伴わない）を使用して診断することができる。肝臓の肝硬変は、線維症の１つ又は複数の血清マーカー（アルファ−２−マクログロブリン、ハプトグロビン、アポリポタンパク質Ａ１、ガンマ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、総ビリルビン、及びアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）を含む）について患者からのサンプルをテストすることにより診断することができる。患者は、他の診断的に重要なマーカー（例えば上昇した血清アルファ−フェトプロテイン及び／又はデス−ガンマカルボキシプロトロンビンなど）を有しうる。診断又は処置の方法は、さらに、そのようなレベルを測定する工程を含みうる。
【００２３】
診断に続き、患者を、従来の薬剤を使用して彼又は彼女の肝臓状態について処置することができる。例えば、Ｃ型肝炎を伴う患者を、ペグ化インターフェロン−アルファ−２ａ、ペグ化インターフェロン−アルファ−２ｂ、及び／又はウイルス薬リバビリンを用いて処置することができる。肝硬変を伴う患者を、肝臓移植手術及び肝硬変の合併症についての対症療法を用いて処置することができる。肝臓癌と診断された患者を、放射線療法及び／又は化学療法を用いて処置することができる。
【００２４】
患者は、また、開示の技術を使用してモニターすることができる。１つの方法において、肝又は肝臓疾患を伴う患者の疾患状態を、肝又は肝臓疾患を患い、閾値量を上回る血液ｈＰＧ濃度を有する患者を、肝又は肝臓疾患のための治療計画に供することによりモニターする。処置後、患者が、閾値量を上回る血液ｈＰＧ濃度を有し続ける否かを決定し、そうである場合、治療計画を継続する。患者が、閾値量を上回る血液ｈＰＧ濃度をもはや有さない場合、患者のｈＰＧレベルを定期的にモニターし、それらが閾値量を上回り上昇するか否かを決定することができ、処置が再開されることを可能にする。
【００２５】
患者の肝臓又は肝健康状態を診断するためのシステムも提供される。開示のシステムは、以下の成分の１つ又は複数を含む：患者の血液ｈＰＧ濃度の値を受けるインプット、患者の血液ｈＰＧ濃度を参照血液ｈＰＧ濃度と比較するために配置されたプロセッサー、患者の血液ｈＰＧ濃度に全体的に又は部分的に基づき、患者について肝臓病理についてのリスクレベルをアウトプットするために配置されたプロセッサー、及び肝臓病理についてのリスクレベルを表示するために配置されたディスプレイ。システムを、プロセッサーが、肝臓病理についての低、上昇、高、又は重度リスクレベル決定をアウトプットするように適応することができる。システムは、また、患者のアルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）レベルについての値を受けるためのインプットを含むことができ、それにおいて、プロセッサーを配置し、ＡＦＰレベルを参照ＡＦＰレベルと比較し、ｈＰＧ及びＡＦＰレベルに基づき、肝臓病理についてのリスクレベルをアウトプットする。異なるリスク群についての閾値（ｉ）ｈＰＧならびに（ｉｉ）ｈＰＧ及びＡＦＰレベルを本明細書に開示する。
【００２６】
コンピューター可読保存媒体も提供され、その中に、患者の肝臓又は肝健康状態を診断する際での使用のためのプログラムプロセッサーにより実行可能な指示を表すデータを保存しており、保存媒体は、患者の血液ｈＰＧ濃度を参照血液ｈＰＧ濃度と比較するための、及び、患者の血液ｈＰＧ濃度に全体的に又は部分的に基づき、患者について肝臓病理についてのリスクレベルをアウトプットするための指示を含む。媒体はリスクレベル（例、肝臓病理についての低、上昇、高、又は重度リスクレベル決定）をアウトプットすることができる。媒体は、また、リスクレベル決定をアウトプットするために患者の血液ＡＦＰレベルを参照レベルと比較するためのデータを含むことができる。異なるリスク群についての閾値（ｉ）ｈＰＧならびに（ｉｉ）ｈＰＧ及びＡＦＰレベルを本明細書に開示する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、プレプロガストリン（シグナルペプチドに下線を引いている）、プロガストリン、及びプロガストリンプロセシングの産物（Ｇ３４、Ｇ３４−Ｇｌｙ、Ｇ１７、Ｇ１７−Ｇｌｙ、及びＣ末端隣接ペプチドＣＴＦＰ）のアミノ酸配列を提供する。
【図２】図２は、特定の肝臓病理を示しているｈＰＧ値のバーチャートを提供する。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｌは、例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのポリペプチド、及び対応するポリヌクレオチド、ＶＨ及びＶＬ鎖の配列を提供する。図３Ａは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ３についてのマウスＶＨ鎖のポリヌクレオチド（配列番号１６）及びポリペプチド（配列番号１２）を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｌは、例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのポリペプチド、及び対応するポリヌクレオチド、ＶＨ及びＶＬ鎖の配列を提供する。図３Ｂは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ３についてのマウスＶＬ鎖のポリヌクレオチド（配列番号１７）及びポリペプチド（配列番号１３）を示す。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｌは、例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのポリペプチド、及び対応するポリヌクレオチド、ＶＨ及びＶＬ鎖の配列を提供する。図３Ｃは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ４についてのマウスＶＨ鎖のポリヌクレオチド（配列番号１８）及びポリペプチド（配列番号１４）を示す。
【図３Ｄ】図３Ａ〜３Ｌは、例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのポリペプチド、及び対応するポリヌクレオチド、ＶＨ及びＶＬ鎖の配列を提供する。図３Ｄは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ４についてのマウスＶＬ鎖のポリヌクレオチド（配列番号１９）及びポリペプチド（配列番号１５）を示す。
【図３Ｅ】図３Ａ〜３Ｌは、例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのポリペプチド、及び対応するポリヌクレオチド、ＶＨ及びＶＬ鎖の配列を提供する。図３Ｅは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ８についてのマウスＶＨ鎖のポリヌクレオチド（配列番号６７）及びポリペプチド（配列番号５９）を示す。
【図３Ｆ】図３Ａ〜３Ｌは、例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのポリペプチド、及び対応するポリヌクレオチド、ＶＨ及びＶＬ鎖の配列を提供する。図３Ｆは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ８についてのマウスＶＬ鎖のポリヌクレオチド（配列番号７１）及びポリペプチド（配列番号６３）を示す。
【図３Ｇ】図３Ａ〜３Ｌは、例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのポリペプチド、及び対応するポリヌクレオチド、ＶＨ及びＶＬ鎖の配列を提供する。図３Ｇは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１３についてのマウスＶＨ鎖のポリヌクレオチド（配列番号６８）及びポリペプチド（配列番号６０）を示す。
【図３Ｈ】図３Ａ〜３Ｌは、例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのポリペプチド、及び対応するポリヌクレオチド、ＶＨ及びＶＬ鎖の配列を提供する。図３Ｈは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１３についてのマウスＶＬ鎖のポリヌクレオチド（配列番号７２）及びポリペプチド（配列番号７４）を示す。
【図３Ｉ】図３Ａ〜３Ｌは、例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのポリペプチド、及び対応するポリヌクレオチド、ＶＨ及びＶＬ鎖の配列を提供する。図３Ｉは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１６についてのマウスＶＨ鎖のポリヌクレオチド（配列番号６９）及びポリペプチド（配列番号６１）を示す。
【図３Ｊ】図３Ａ〜３Ｌは、例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのポリペプチド、及び対応するポリヌクレオチド、ＶＨ及びＶＬ鎖の配列を提供する。図３Ｊは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１６についてのマウスＶＬ鎖のポリヌクレオチド（配列番号７３）及びポリペプチド（配列番号６５）を示す。
【図３Ｋ】図３Ａ〜３Ｌは、例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのポリペプチド、及び対応するポリヌクレオチド、ＶＨ及びＶＬ鎖の配列を提供する。図３Ｋは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１９についてのマウスＶＨ鎖のポリヌクレオチド（配列番号７０）及びポリペプチド（配列番号６２）を示す。
【図３Ｌ】図３Ａ〜３Ｌは、例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのポリペプチド、及び対応するポリヌクレオチド、ＶＨ及びＶＬ鎖の配列を提供する。図３Ｌは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１９についてのマウスＶＬ鎖のポリヌクレオチド（配列番号７４）及びポリペプチド（配列番号６６）を示す。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｚは、例示的なヒト抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのＶＨ及びＶＬ鎖のポリペプチド配列を提供する。図４Ａは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ３についてのヒトＶＨ鎖のポリペプチド（配列番号２１）を示す。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｚは、例示的なヒト抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのＶＨ及びＶＬ鎖のポリペプチド配列を提供する。図４Ｂは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ３についてのヒトＶＬ鎖のポリペプチド（配列番号２２）を示す。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｚは、例示的なヒト抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのＶＨ及びＶＬ鎖のポリペプチド配列を提供する。図４Ｃは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ４についてのヒトＶＨ鎖のポリペプチド（配列番号２３）を示す。
【図４Ｄ】図４Ａ〜４Ｚは、例示的なヒト抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのＶＨ及びＶＬ鎖のポリペプチド配列を提供する。図４Ｄは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ４についてのヒトＶＬ鎖のポリペプチド（配列番号２４）を示す。
【図４Ｅ】図４Ａ〜４Ｚは、例示的なヒト抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのＶＨ及びＶＬ鎖のポリペプチド配列を提供する。図４Ｅは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ８（ａ）についてのヒトＶＨ鎖のポリペプチド（配列番号７５）を示す。
【図４Ｆ】図４Ａ〜４Ｚは、例示的なヒト抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのＶＨ及びＶＬ鎖のポリペプチド配列を提供する。図４Ｆは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ８（ａ）についてのヒトＶＬ鎖のポリペプチド（配列番号７６）を示す。
【図４Ｇ】図４Ａ〜４Ｚは、例示的なヒト抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのＶＨ及びＶＬ鎖のポリペプチド配列を提供する。図４Ｇは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ８（ｂ）についてのヒトＶＨ鎖のポリペプチド（配列番号７７）を示す。
【図４Ｈ】図４Ａ〜４Ｚは、例示的なヒト抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのＶＨ及びＶＬ鎖のポリペプチド配列を提供する。図４Ｈは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ８（ｂ）についてのヒトＶＬ鎖のポリペプチド（配列番号７８）を示す。
【図４Ｉ】図４Ａ〜４Ｚは、例示的なヒト抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのＶＨ及びＶＬ鎖のポリペプチド配列を提供する。図４Ｉは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ８（ｃ）についてのヒトＶＨ鎖のポリペプチド（配列番号７９）を示す。
【図４Ｊ】図４Ａ〜４Ｚは、例示的なヒト抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのＶＨ及びＶＬ鎖のポリペプチド配列を提供する。図４Ｊは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ８（ｃ）についてのヒトＶＬ鎖のポリペプチド（配列番号７６）を示す。
【図４Ｋ】図４Ａ〜４Ｚは、例示的なヒト抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのＶＨ及びＶＬ鎖のポリペプチド配列を提供する。図４Ｋは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１３（ａ）についてのヒトＶＨ鎖のポリペプチド（配列番号８０）を示す。
【図４Ｌ】図４Ａ〜４Ｚは、例示的なヒト抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのＶＨ及びＶＬ鎖のポリペプチド配列を提供する。図４Ｌは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１３（ａ）についてのヒトＶＬ鎖のポリペプチド（配列番号８１）を示す。
【図４Ｍ】図４Ａ〜４Ｚは、例示的なヒト抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのＶＨ及びＶＬ鎖のポリペプチド配列を提供する。図４Ｍは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１３（ｂ）についてのヒトＶＨ鎖のポリペプチド（配列番号８２）を示す。
【図４Ｎ】図４Ａ〜４Ｚは、例示的なヒト抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのＶＨ及びＶＬ鎖のポリペプチド配列を提供する。図４Ｎは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１３（ｂ）についてのヒトＶＬ鎖のポリペプチド（配列番号８３）を示す。
【図４Ｏ】図４Ａ〜４Ｚは、例示的なヒト抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのＶＨ及びＶＬ鎖のポリペプチド配列を提供する。図４Ｏは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１６（ａ）についてのヒトＶＨ鎖のポリペプチド（配列番号８４）を示す。
【図４Ｐ】図４Ａ〜４Ｚは、例示的なヒト抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのＶＨ及びＶＬ鎖のポリペプチド配列を提供する。図４Ｐは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１６（ａ）についてのヒトＶＬ鎖のポリペプチド（配列番号８５）を示す。
【図４Ｑ】図４Ａ〜４Ｚは、例示的なヒト抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのＶＨ及びＶＬ鎖のポリペプチド配列を提供する。図４Ｑは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１６（ｂ）についてのヒトＶＨ鎖のポリペプチド（配列番号８６）を示す。
【図４Ｒ】図４Ａ〜４Ｚは、例示的なヒト抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのＶＨ及びＶＬ鎖のポリペプチド配列を提供する。図４Ｒは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１６（ｂ）についてのヒトＶＬ鎖のポリペプチド（配列番号８７）を示す。
【図４Ｓ】図４Ａ〜４Ｚは、例示的なヒト抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのＶＨ及びＶＬ鎖のポリペプチド配列を提供する。図４Ｓは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１６（ｃ）についてのヒトＶＨ鎖のポリペプチド（配列番号８８）を示す。
【図４Ｔ】図４Ａ〜４Ｚは、例示的なヒト抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのＶＨ及びＶＬ鎖のポリペプチド配列を提供する。図４Ｔは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１６（ｃ）についてのヒトＶＬ鎖のポリペプチド（配列番号８９）を示す。
【図４Ｕ】図４Ａ〜４Ｚは、例示的なヒト抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのＶＨ及びＶＬ鎖のポリペプチド配列を提供する。図４Ｕは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１９（ａ）についてのヒトＶＨ鎖のポリペプチド（配列番号９０）を示す。
【図４Ｖ】図４Ａ〜４Ｚは、例示的なヒト抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのＶＨ及びＶＬ鎖のポリペプチド配列を提供する。図４Ｖは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１９（ａ）についてのヒトＶＬ鎖のポリペプチド（配列番号９１）を示す。
【図４Ｗ】図４Ａ〜４Ｚは、例示的なヒト抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのＶＨ及びＶＬ鎖のポリペプチド配列を提供する。図４Ｗは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１９（ｂ）についてのヒトＶＨ鎖のポリペプチド（配列番号９２）を示す。
【図４Ｘ】図４Ａ〜４Ｚは、例示的なヒト抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのＶＨ及びＶＬ鎖のポリペプチド配列を提供する。図４Ｘは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１９（ｂ）についてのヒトＶＬ鎖のポリペプチド（配列番号９３）を示す。
【図４Ｙ】図４Ａ〜４Ｚは、例示的なヒト抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのＶＨ及びＶＬ鎖のポリペプチド配列を提供する。図４Ｙは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１９（ｃ）についてのヒトＶＨ鎖のポリペプチド（配列番号９４）を示す。
【図４Ｚ】図４Ａ〜４Ｚは、例示的なヒト抗ｈＰＧモノクローナル抗体についてのＶＨ及びＶＬ鎖のポリペプチド配列を提供する。図４Ｚは、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  １９（ｃ）についてのヒトＶＬ鎖のポリペプチド（配列番号９５）を示す。
【００２８】
６．  詳細な説明
６．１．  定義
他に示さない限り、以下の用語は、本開示の文脈において以下で考察される、それらの通常の意味を有することが意図される。
【００２９】
「ヒトプロガストリン」又は「ｈＰＧ」は、配列番号２０として特定されるアミノ酸配列のポリペプチドである。本明細書に使用する通り、ｈＰＧは、ガストリン遺伝子の一次タンパク質産物（即ち、シグナルペプチド又はプレペプチドを伴わないプレプロガストリン）を含むと定義される。Rehfeld et al.(2004) Regulatory Peptides 120(1-3): 177-183を参照のこと。ｈＰＧは、２つのｄ−Ａｒｇ切断部位により分割される３つの十分に定義された領域からなる。したがって、他に定義しない限り、ｈＰＧは、２つのｄ−Ａｒｇ部位を保持するプレプロガストリンプロセシングの産物からなる。ｈＰＧは「ガストリン」（即ち、Ｇ３４及びＧ１７）を含まず、しかし、例えば、短い切断物（１、２、３、４、又は５アミノ酸まで）又はｈＰＧのバリアント（アミノ酸３６／３７及び７３／７４に又はその周囲に位置づけられる２つのｄ−Ａｒｇを保持する）を含みうる。図１を参照のこと。
【００３０】
「生物学的マーカー」又は「マーカー」は、正常な生物学的プロセス、病原性プロセス、又は治療介入に対する薬理学的応答の指標として客観的に測定及び評価される特徴を意味する。
【００３１】
「サンドイッチアッセイ」は、サンプルと相互作用する化合物の量を定量化するために使用することができる特定の型のイムノアッセイを指す。サンドイッチアッセイは、サンプルの抗原が捕捉抗体と検出又は参照抗体の間に結合されるため、そのように呼ばれる。開示のサンドイッチアッセイにおいて、ヒトプロガストリンは抗ｈＰＧ抗体の間に結合される。アッセイは、ｈＰＧ（しかし、その前駆体又は産物ではない）の定量化を提供し、それによりｈＰＧ濃度のより正確な測定を提供する。有利には、プロガストリンのＮ末端又はＣ末端領域に対して向けられた開示の抗体は、また、プロガストリンについて別々に特異的である。プロガストリンのより小さなプロセシングフラグメントは、従って、１つ又は他の抗体に対する競合体として作用する可能性は低く、それにより、恐らくは、アッセイの結果にバイアスをもたらす。
【００３２】
「被験者」又は「患者」は本明細書において互換的に使用され、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。
【００３３】
「抗体」又は「Ａｂ」は、特定の抗原と特異的に結合する、又は免疫学的に反応性である免疫グロブリン分子を指し、ポリクローナル、モノクローナル、遺伝子操作した、及び他の改変形態の抗体（しかし、限定しないが、キメラ抗体、ヒト化抗体、及び抗体の抗原結合フラグメント（例、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒＩｇＧ、及びｓｃＦｖフラグメントを含む）を含む）を含む。種々の実施態様において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、抗体の定常領域の全て又は部分を含む。一部の実施態様において、定常領域は、ＩｇＡ（例、ＩｇＡ１又はＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）、及びＩｇＭより選択されるアイソタイプである。抗体（モノクローナル抗体を含む）を、いくつかの種（しかし、限定しないが、マウス、ウサギ、ラット、ブタ、モルモット、ニワトリ、ロバ、ウマ、ラクダ、及びラマを含む）のいずれかから生成することができる。
【００３４】
本明細書において使用する通り、抗体は、それが全長プロガストリンに結合するが、しかし、ＣＴＦＰ、アミド化ガストリン、又はグリシン伸長ガストリンには全く結合しない場合、ｈＰＧ「について高度に特異的」、及び、それがＣＴＦＰ及びガストリン遺伝子の他の産物よりも少なくとも約５倍大きなｈＰＧの結合を示す場合（標準的な結合アッセイにおいて測定した通り）、「ｈＰＧについて特異的」又は「ｈＰＧに特異的に結合する抗体」である。特定の抗ｈＰＧ抗体の特異性を評価するために使用することができるＥＬＩＳＡアッセイが、実施例４に提供される。
【００３５】
そのような特異的な抗ｈＰＧ抗体（本明細書において「抗ｈＰＧ抗体」として言及される）は、ポリクローナル（「抗ｈＰＧ  ＰＡｂ」）又はモノクローナル（「抗ｈＰＧ  ＭＡｂ」）であるが、治療的使用、一部の例において、診断又は他のインビトロでの使用のために、モノクローナル抗体が好ましい。
【００３６】
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書において使用する通り、ハイブリドーマテクノロジーを通じて産生された抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、当技術分野において利用可能な又は公知の任意の手段により、単一クローン（任意の真核生物、原核生物、又はファージのクローンを含む）に由来する。本開示を用いた有用なモノクローナル抗体は、当技術分野において公知の多様な技術（ハイブリドーマ、組換え、及びファージディスプレイテクノロジー、又はそれらの組み合わせの使用を含む）を使用して調製することができる。本開示の多くの使用（ヒトにおける抗ｈＰＧモノクローナル抗体のインビボでの使用及びインビトロでの検出アッセイを含む）において、キメラ、霊長類化、ヒト化、又はヒト抗体を適切に使用することができる。
【００３７】
用語「ｓｃＦｖ」は、従来の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメインが連結されて、１つの鎖を形成する一本鎖Ｆｖ抗体を指す。
【００３８】
「ＶＨ」の参照は、抗体の免疫グロブリン重鎖（Ｆｖ、ｓｃＦｖ、又はＦａｂの重鎖を含む）の可変領域を指す。「ＶＬ」の参照は、免疫グロブリン軽鎖（Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、又はＦａｂの軽鎖を含む）の可変領域を指す。抗体（Ａｂ）及び免疫グロブリン（Ｉｇ）は、同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は特定の標的に対する結合特異性を示し、免疫グロブリンは、標的特異性を欠く抗体及び他の抗体様分子の両方を含む。天然抗体及び免疫グロブリンは、通常、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成される。各重鎖は一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、多数の定常ドメインが続く。各軽鎖は可変ドメインを一端に（ＶＬ）及び定常ドメインを他端に有する。
【００３９】
開示の抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、「相補性決定領域（ＣＤＲ）」を含む。ＣＤＲは、また、軽鎖及び重鎖可変ドメインの両方における超可変領域として公知である。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。当技術分野において公知の通り、抗体の超可変領域を描写するアミノ酸位置／境界は、状況及び当技術分野において公知の種々の定義に依存して変動しうる。可変ドメイン内の一部の位置を、ハイブリッド超可変位置として見なすことができ、それにおいて、これらの位置は、１セットの基準下で超可変領域内と見なすことができ、異なるセットの基準下で超可変領域外と見なす。これらの位置の１つ又は複数は、また、伸長した超可変領域において見出すことができる。開示は、これらのハイブリッド超可変位置において改変を含む抗体を提供する。天然重及び軽鎖の可変ドメインは、大部分がβシート配置（３つのＣＤＲにより連結され、それは、βシート構造を連結し、一部の場合においてその一部を形成する、ループを形成する）を採用することにより、各々、４つのＦＲ領域を含む。各鎖中のＣＤＲは、ＦＲ領域により近接して他の鎖からのＣＤＲと一緒に保持され、抗体の標的結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, Md.1987を参照のこと）。
【００４０】
用語「エピトープ」は、免疫応答を誘発し、抗体により特異的に結合されることが可能であるタンパク質の任意の部分（決定基）を指す。エピトープ決定基は、通常、分子の活性表面基（例えばアミノ酸又はＧＡＧ側鎖など）からなり、通常、特定の三次元構造的特徴、ならびに特定の電荷特徴を有する。２つの抗体は、１つの抗体の結合を低下又は除去するタンパク質におけるアミノ酸変異が、他の抗体の結合も低下又は除去する場合、及び／又は、抗体がタンパク質への結合について競合する、即ち、１つの抗体のタンパク質への結合が他の抗体の結合を低下又は除去する場合、タンパク質の実質的に同じエピトープ（又はタンパク質の重複するエピトープ）に結合すると言われる。２つの抗体が実質的に同じエピトープに結合するか否かの決定は、当技術分野において公知の方法（例えば競合アッセイなど）により達成される。コントロール抗体（例えば、本明細書に記載する抗プロガストリン抗体の１つ）及び任意のテスト抗体の間での抗体競合試験を行う際、最初に、コントロール抗体を、検出可能な標識（例えばビオチン、酵素、放射性標識、又は蛍光標識など）を用いて標識し、その後の同定を可能にしうる。コントロール（標識）抗体と実質的に同じエピトープに結合するテスト（非標識）抗体は、コントロール抗体結合を遮断できるはずであり、このように、コントロール抗体結合を低下させるはずである。
【００４１】
「ｈＰＧについて特異的なアッセイ」又は「ヒトプロガストリンについて特異的なアッセイ」は、ガストリン遺伝子のＣＴＦＰ及び他の産物から全長ｈＰＧを区別するアッセイを指す。抗体ベースの診断アッセイの状況において、ｈＰＧについて特異的なアッセイは、ｈＰＧに特異的に結合する抗体を利用することができる。あるいは、ｈＰＧについて特異的なアッセイは、両方が全長ｈＰＧに結合するが、しかし、そうでなければ、両方が同じガストリン遺伝子産物に結合するわけではない２つの抗体を利用することができ、ｈＰＧが、両方の抗体により認識される、ガストリン遺伝子により産生される唯一の分子である。例えば、ｈＰＧのＣ及びＮ末端エピトープに結合する抗体を、他のガストリン遺伝子ペプチドからｈＰＧを区別するアッセイにおいて使用することができる。
【００４２】
用語「癌」の使用に関して、原発性（最初の）腫瘍からの細胞が離脱し、身体内の別の部位へ、典型的にはリンパ又は血液を通じて、「転移」と呼ばれるプロセスを介して移動し、別の転移性（又は二次性）腫瘍を形成する患者において、二次性又は転移性腫瘍は、典型的には、最初の腫瘍と同じ型であり（その新たな部位とは無関係に）、疾患は転移癌として言及され、新たな居住組織の癌ではないことに留意する。例えば、肝臓に広がった膵臓癌は、転移性膵臓癌であり、肝臓癌ではない。したがって、転移性肝細胞癌は、肝臓において生じ、他に転移している癌を指す。二次性肝臓癌（即ち、肝臓に転移している非肝臓供給源からの転移癌）は、また、過剰レベルのｈＰＧに基づいて診断することができる。例えば、肝臓に転移した結腸直腸癌（即ち、転移性結腸直腸癌）は、二次性肝臓癌の形態である。言い換えれば、肝臓の癌は、原発性及び二次性肝臓癌の両方において血清、血漿、又は組織中のｈＰＧレベルを使用して検出可能である。
【００４３】
６．２．  プロガストリンレベル及び肝臓病理
正常なプロガストリンレベルは、一般的に、２０〜５０pM未満、典型的には０〜５pMの間であると考えられる。本開示は、１つ又は２つの肝臓病理を伴う患者が上昇したヒトプロガストリン（ｈＰＧ）レベルを示しうること、ならびに、肝臓癌、Ｃ型肝炎、及び肝硬変を伴う患者が極度に上昇したｈＰＧレベルを示すことを実証する。
【００４４】
図２は、１つ又は複数の肝臓病理を伴う患者におけるｈＰＧレベルを図表で例証し、抗ｈＰＧ抗体を使用したＥＬＩＳＡ−サンドイッチアッセイにより決定される通りである。ボックスエリアの外側境界は２５〜７５パーセンタイルを示す。ウィスカーは５〜９５パーセンタイルを示す。１つのラインは中央値を表す。ドットは外れ値を示す。以下の表は５〜９５パーセンタイルデータを要約する：
【００４５】
【表１】
0005543614.tif 000002
【００４６】
上記に基づき、５０pM又は１００pMを上回るｈＰＧレベルは、肝臓の１つ又は複数の病理を示しうる。少なくとも約４００pM、５００pM、又は６００pMのｈＰＧレベルは特に診断的に有意である。なぜなら、それらは、複数の肝臓病理、特に、肝臓癌及び肝硬変、肝臓癌及びＣ型肝炎、ならびに肝臓癌、肝硬変、及びＣ型肝炎を強く示しているからである。
【００４７】
Ｃ型肝炎だけを伴う患者についての血漿レベルは、総プロガストリンレベル（即ち、全長プロガストリン及び切断産物のレベル）を測定する試験において健康な患者と同様であることが見出されている。Konturek et al., 2003, Scand J Gastroenterol 6: 643-647．Ｃ型肝炎を伴う患者だけにおける全長プロガストリンのレベルは、非常に低いと予測される。
【００４８】
プロガストリンレベルを使用して、リスクポイントスコア及び対応する疾患リスク確率を割り当てることができる。末期の肝臓疾患を伴う患者における死亡リスクを割り当てるためのモデルの例については、Kamath et al.(2001) Hepatology 33(2): 464-70を参照のこと。
【００４９】
決定されたプロガストリンレベルと肝臓疾患状態を相関させる経験データを使用し、ポイントスコア及び関連する疾患リスク確率が、バイオマーカー（例えばプロガストリンなど）及び、場合により、他のバイオマーカーのレベルに由来しうる。疾患リスク確率は、４つのリスク群を使用して定量的に記載することができる：低リスク、上昇リスク、より高いリスク、及び重度リスク。
【００５０】
本開示において言及するリスクレベルは、以下の意味を有する：
・「低リスク」は、患者の生物学的マーカーのレベルが所与の肝臓病理の存在を示さないことを意味する。
・「上昇リスク」は、患者の生物学的マーカーのレベルが所与の肝臓病理の増加リスクを示すことを意味する。リスクは、さらなるテストが是認されるような大きさである。
・「高リスク」は、患者の生物学的マーカーのレベルが所与の肝臓病理の大きな増加リスクを示すことを意味する。リスクは、さらなるテストが要求されるような大きさである。生物学的マーカーの特異性に基づく仮診断が正当化されうる。
・「重度リスク」は、患者の生物学的マーカーのレベルが明らかに異常であり、基礎病理を示すことを意味する。生物学的マーカーの特異性に供する診断を行うことができる。
【００５１】
０pM〜１００pMを下回る血清又は血漿プロガストリンレベルを有する患者は、肝臓癌（例、肝細胞癌）及び肝硬変の両方の診断について低リスク、ならびに、肝臓癌、肝硬変、及びＣ型肝炎の全て３つの診断について極度な低リスクを有する。プロガストリンの正常な血清又は血漿レベル（例、０〜５pM）あるいはわずかに上昇したレベル（１００pMまで）を伴う患者は、それにもかかわらず、肝臓癌を有しうる。したがって、１００pM又はそれより低いｈＰＧの血清又は血漿レベルを伴う患者をさらにテストし、彼又は彼女が肝臓癌を有するか否かを評価することが勧められる。
【００５２】
１００pM〜４００pMの間の血清又は血漿プロガストリンレベルを有する患者は、他の肝病理を伴わず肝臓癌を有する可能性は低い。そのような患者は、肝硬変（肝臓癌を伴う又は伴わない）を有する高リスク及びＣ型肝炎を加えて有する上昇リスクを有する。４００pMを上回る血清又は血漿プロガストリンレベルを有する患者は、肝臓癌、Ｃ型肝炎、及び肝硬変を有する重度リスクにある。
【００５３】
患者のｈＰＧレベル及び肝臓病理状態の間の関係を、種々の診断方法において使用することができる。診断方法は、一般的には、患者のサンプル中のｈＰＧレベルをｈＰＧの正常値、例えば、健常個人からのｈＰＧレベル又は健常個人のプールと比較することを伴う。ｈＰＧレベルが上昇した場合、上昇レベルは、例えば、上に提供するリスク割り当てに基づき、可能性のある肝臓病理と相関する。そのような方法は、場合により、患者が体液のサンプルを提供する工程を含む。体液を、次に、ｈＰＧのレベルについて、好ましくは生化学的アッセイにより分析することができる。
【００５４】
特定の適用において、患者のｈＰＧレベルと併せた患者の癌マーカーのレベルのテストを使用して、患者における肝臓癌マーカーの特異性を増加させる、又は、リスクポイントスコア及び対応する疾患リスク確率を割り当てることができる。好ましい二次マーカーはアルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）である。血清ＡＦＰ、胎児特異的糖タンパク質抗原は、肝臓癌（例、肝細胞癌）を伴う患者を検出するための最も広く使用される腫瘍マーカーである。肝細胞癌を検出するためのＡＦＰの報告された感受性は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）陽性集団及びＨＢＶ陰性集団の両方において広く変動し、それはスクリーニングと診断試験計画の間の重複に起因する。ＡＦＰを高リスク集団のスクリーニングのために使用する場合、感受性３９%〜９７%、特異性７６%〜９５%、及び陽性予測値（ＰＰＶ）９%〜３２%が報告されている。ＡＦＰは肝臓癌について特異的ではない。力価は、また、急性又は慢性肝炎において、妊娠において、及び胚細胞腫瘍において上昇する。
【００５５】
以下の表は、ＡＦＰレベルと併せたｈＰＧレベルに基づく、所与の肝臓病態についての相対リスクを示す。ｈＰＧ及びＡＦＰレベルの両方に基づく相対リスクの割り当ては、ＡＦＰ単独に基づくよりも高感度で正確な肝臓病理についてのテストを提供する。
【００５６】
【表２】
0005543614.tif 000003
【００５７】
プロガストリンと併せて使用することができる他の二次マーカーは、癌胎児性抗原、糖タンパク質抗原、酵素及びイソ酵素、遺伝子マーカー、及びサイトカイン（肝臓癌と相関する）を含む。追加の適した二次マーカーは、グリピカン３、ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼＩＩ、アルファ−ｌ−フコシダーゼ、形質転換成長因子ベータ１、腫瘍特異的成長因子、ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼｍＲＮＡ、血管内皮成長因子、インターロイキン８、及びそれらのバリアントを含む。例示的なマーカーがZhou et al.(2006) World Journal of Gastroenterology 12(8):1175-1181に記載されている。
【００５８】
肝臓病理は、当技術分野において公知の標準的な技術により確認することができる。例えば、肝臓癌（例えば肝細胞癌など）は、生検を伴う又は伴わず、及び、血液マーカー（例えばＡＦＰなど）の定量化を伴う又は伴わず、Ｘ線検査又は画像技術（例えばＭＲＩなど）により確認することができる。Ｃ型肝炎は、血液中のウイルス粒子の定量化により、超音波を使用した線維症レベルの分析により、核酸ベースのアッセイを使用して、及び／又はフィブロスキャンにより確認することができる。肝硬変は、生検を伴う又は伴わない超音波を使用した診断により、及び／又は線維症の血清マーカーを検出することにより確認することができる。他の技術も使用することができる。
【００５９】
６．３．  プロガストリンレベルを測定する方法
本開示の方法によって、患者のｈＰＧレベルに基づいて１つ又は複数の肝臓病理を診断する及び／又は患者の肝臓病理のリスクを割り当てる。血漿及び血清プロガストリンレベルを、任意の公知の分析技術を使用して測定することができる。そのような技術は、しかし、限定しないが、以下を含む：ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、イムノブロッティング（ウエスタンブロッティング）、免疫沈降、ＢＩＡＣＯＲＥテクノロジーなど、ならびにタンパク質の特性に基づくアッセイ（しかし、限定しないが、酵素活性又は他のタンパク質パートナーとの相互作用を含む）。イムノアッセイ（アッセイの好ましいクラス）のために、開示の１つ又は複数の抗プロガストリン（抗ＰＧ）抗体（ポリクローナル又はモノクローナル及び中和又は非中和にかかわらず）を使用することができる。
【００６０】
好ましいイムノアッセイは、他のガストリン遺伝子産物（分解産物を含む）とは対照的に、プロガストリンを特異的に検出する。サンドイッチアッセイは、他のガストリン遺伝子副産物とは対照的に、プロガストリンの検出についてそのような特異性を提供し、それにより血清プロガストリンレベルのより正確な測定を与える。好ましいイムノアッセイ抗体は、プロガストリンに固有の末端領域を含む抗原／エピトープに結合する。例えば、一部の実施態様において、プロガストリンは、プロガストリンのＮ末端を標的化する１つの抗ＰＧ抗体及びプロガストリンのＣ末端を標的化する第２の抗ＰＧ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して検出する。例示的な抗体をセクション６．４において以下に開示し、抗ＰＧ抗体を使用してプロガストリンレベルを測定するための一般的な「サンドイッチ」技術を次に開示する。
【００６１】
表面（例えば９６ウェルプレート中のウェルなど）を調製し、それに、既知量のプロガストリンに対する第１「捕捉」抗体を結合させる。捕捉抗体は、例えば、プロガストリンのＣ又はＮ末端に結合する抗ＰＧ抗体でありうる。ブロッキング後、テストサンプルを表面に適用し、インキュベーション期間が続く。表面を次に洗浄し、非結合抗原を除去し、プロガストリンに対する第２「検出」抗体を含む溶液を適用する。検出抗体は、本明細書に記載する抗ＰＧモノクローナル抗体のいずれかでありうる（検出抗体が捕捉抗体とは異なるエピトープに結合する場合）。例えば、捕捉抗体がプロガストリンのＣ末端ペプチド領域に結合する場合、次に、適した検出抗体は、プロガストリンのＮ末端ペプチド領域に結合するものでありうる。プロガストリンレベルを次に直接的（例えば、検出抗体が検出可能な標識に結合している場合）又は間接的（検出抗ＰＧ抗体に結合する標識二次抗体を通じて）のいずれかで検出することができる。
【００６２】
特定の実施態様において、ヒトプロガストリン（ｈＰＧ）レベルを生物学的テストサンプルから測定する（実施例１に記載する通り）。
【００６３】
受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を、サンドイッチアッセイにより決定された血漿ｈＰＧレベルに基づいて生成されており、ｈＰＧレベルの測定は、１つ又は複数の肝臓病理を伴う患者と他の癌を伴う患者及び／又は健常個人の間で区別するための診断的に有用なテストを提供する。
【００６４】
ｈＰＧレベルを測定する抗体ベースの方法のための例示的な抗体を、以下のセクションに開示する。
【００６５】
６．４．  抗ｈＰＧ抗体
ｈＰＧレベルを測定するためのイムノアッセイは、１つ又は複数のポリクローナル又はモノクローナル抗ｈＰＧ抗体あるいはそれらの抗原結合フラグメントを利用することができる。
【００６６】
当技術分野において公知の種々の手順を、ｈＰＧに対するポリクローナル抗体の産生のために使用することができる。特定の実施態様において、ウサギポリクローナル抗体を得ることができる。抗体の産生のために、種々の宿主動物を、ｈＰＧを用いた注射により免疫化する（しかし、限定しないが、ウサギ、マウス、ラットなど）。種々のアジュバントを使用し、免疫学的応答（宿主の種に依存する）を増加させる（しかし、限定しないが、フロイント（完全及び不完全）、ミネラルゲル（例えば水酸化アルミニウムなど）、界面活性物質（例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、及びジニトロフェノールなど）を含む）。
【００６７】
モノクローナル抗体が、好ましくは、本開示の方法において使用される。モノクローナル抗体は、特定の抗原に対する抗体の均質な集団であり、培養中の連続細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技術により得ることができる。これらは、しかし、限定しないが、KohlerとMilsteinのハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、及びＥＢＶハイブリドーマ技術を含む。例えば、Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497；Kozbor et al.(1983) Immunology Today 4:72；Cole et al.(1985) pp.77-96 Reisfeld and Sell (1985) Monoclonal Antibodies and Myeloma Therapy Liss；Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Lippincott；Harlow and Lane; Antibodies: A Laboratory Manual (1988) CSH Press；及びGoding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed.) Academic Press.を参照のこと。そのような抗体は、任意の免疫グロブリンクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤを含む）及びそれらの任意のサブクラスを含みうる。
【００６８】
近年、少なくともモノクローナル抗ｈＰＧ抗体について、抗ｈＰＧ抗体を産生するために使用される抗原の選択が重要でありうることが発見されている（国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／００６３２９号（２０１０年１０月１５日出願）及び米国出願第１２／９０６，０４１号（２０１０年１０月１５日出願）、その開示及び具体的に開示される抗ｈＰＧ抗体が参照により本明細書において組み入れられる；以下、’３２９及び’０４１出願としてそれぞれ言及される）。’３２９及び’０４１出願において開示される通り、ｈＰＧに由来する全ての抗原が、生理学的条件下でｈＰＧに特異的に結合するモノクローナル抗体の産生を刺激するわけではない。実際に、ポリクローナル抗ｈＰＧ抗体を成功裏に産生するために使用されてきた特定の抗原（例えば全長組換えｈＰＧ（例、ＷＯ０８／０７６４５４  Singhを参照のこと）及びｈＰＧのＣ末端の最後の１０アミノ酸に対応するペプチド（ＷＯ０７／１３５５４２  Hollande et al.を参照のこと）など）は、モノクローナル抗体の生成に失敗した。
【００６９】
１つの好ましい実施態様において、ｈＰＧのＣ及びＮ末端エピトープについて特異的な抗体を使用し、特異性を伴いｈＰＧレベルを検出及び測定しうるが、全長ｈＰＧだけが検出されることを意味する。’３２９及び’０４１出願において記述される通り、ｈＰＧ配列内の抗原性Ｎ末端及びＣ末端配列が同定されており、ｈＰＧに特異的に結合するモノクローナル抗体を生成するために使用することができる。興味深いことに、抗原性配列は、それに固有であるｈＰＧ配列の領域に限定する必要はない。ガストリン遺伝子の他の産物と共通の配列の領域を有するペプチド抗原（例えば、Ｇ１７、Ｇ３４、及びＣＴＦＰ）は、ｈＰＧに結合するだけでなく、しかし、それに特異的に結合するモノクローナル抗体をもたらす。
【００７０】
ｈＰＧのＮ末端領域に対応する配列を有するペプチド抗原を使用して入手可能であり及び／又はｈＰＧのＮ末端領域に結合する抗ｈＰＧ抗体を、本明細書において「Ｎ末端抗ＰＧ抗体」として言及する。ｈＰＧについて特異的なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方を得るために適した免疫原を構築するために使用することができるｈＰＧの特定の例示的な抗原性領域は、ｈＰＧの残基１〜１４：ＳＷＫＰＲＳＱＱＰＤＡＰＬＧ（配列番号２５）に対応する。Ｎ末端抗ｈＰＧ抗体を得るために有用な例示的な免疫原、ならびに、これらの例示的な免疫原を用いて得られたＮ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＣＤＲならびにＶＨ及びＶＬ配列を、以下の表３Ａ及び実施例のセクションに提供する：
【００７１】
【表３】
0005543614.tif 000004
【００７２】
ｈＰＧのＣ末端領域に対応する配列を有するペプチド抗原を使用して入手可能であり及び／又はｈＰＧのＣ末端領域に結合する抗ｈＰＧ抗体を、本明細書において「Ｃ末端抗ｈＰＧ抗体」として言及する。ポリクローナル及びモノクローナルＣ末端抗ｈＰＧ抗体の両方を得るために有用な免疫原を構築するために使用することができる特定の例示的な抗原性領域は、ｈＰＧの残基５５〜８０：ＱＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦＧＲＲＳＡＥＤＥＮ（配列番号２７）に対応する。Ｃ末端抗ｈＰＧ抗体を得るために有用なこの抗原を含む例示的な免疫原、ならびに、これらの例示的な免疫原を用いて得られたＣ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＣＤＲならびにＶＨ及びＶＬ配列を、以下の表３Ｂ及び実施例のセクションに提供する。
【００７３】
【表４】
0005543614.tif 000005
【００７４】
表４Ａ及び４Ｂに提供する例示的な抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ１−ＭＡｂ２３により結合される特定のエピトープは、ＳＰＯＴ技術及びアラニンスキャンを使用してマッピングされた（Laune et al., 2002, J. Immunol. Methods 267: 53-70及びLaune, 1997, J. Biol. Chem. 272: 30937-30944にそれぞれ記載される通り）（’３２９出願の実施例６も参照のこと）。
【００７５】
ＳＰＯＴ技術において、推定エピトープに及ぶ１５のアミノ酸ペプチド配列を生成し、ニトロセルロース膜上にスポットし、それを、次に、テスト抗体を用いてプローブし、抗体により認識される最小エピトープ配列を決定する。アラニンスキャンを使用して、抗体結合のために決定的であるエピトープ内の残基を決定する。推定エピトープ内の各残基が、１つずつ、アラニンに変異しており、アラニン含有ペプチドを、次に、テスト抗体を用いてプローブする。
【００７６】
Ｎ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ１−４及び１５−２０について、エピトープは少なくとも以下の配列を含む：ＤＡＰＬＧ（配列番号２８）、ＰＤＡＰＬＧ（配列番号２９）、ＰＲＳＱＱＰＤ（配列番号３０）、ＷＫＰＲＳＱＱＰＤ（配列番号３１）、又はＷＫＰＲＳＱＱＰＤＡＰＬＧ（配列番号３２）（以下の表４Ａに示す通り）。
【００７７】
【表５】
0005543614.tif 000006
【００７８】
Ｃ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ５−７、９−１２、１４、及び２１−２３について、エピトープは少なくとも以下の配列を含む：ＦＧＲＲ（配列番号３３）、ＭＤＦＧＲ（配列番号３４）、ＡＥＤＥＮ（配列番号３５）、及びＧＷＭＤＦＧＲＲ（配列番号３６）（以下の表４Ｂに示す通り）。
【００７９】
【表６】
0005543614.tif 000007
【００８０】
エピトープマッピング実験では、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ２及びＭＡｂ４が同じエピトープに結合することが明らかになる；抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１及びＭＡｂ３はほぼ同じエピトープに結合する；ＭＡｂ１７、ＭＡｂ１８、ＭＡｂ１９、及びＭＡｂ２０はほぼ同じエピトープに結合する；ＭＡｂ１５及びＭＡｂ１６はほぼ同じエピトープに結合する；抗ｈＰＧ  ＭＡｂ５、ＭＡｂ６、ＭＡｂ７、ＭＡｂ９、及びＭＡｂ１２は同じエピトープに結合し、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１０とほぼ同じエピトープに結合する；ならびに抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１１及びＭＡｂ１４はほぼ同じエピトープに結合する。
【００８１】
本明細書に記載する方法及びキットにおいて有用なＮ末端抗ＰＧ抗体の特定の実施態様は、ｈＰＧの残基１０〜１４（配列番号２８）、ｈＰＧの残基９〜１４（配列番号２９）、ｈＰＧの残基４〜１０（配列番号３０）、ｈＰＧの残基２〜１０（配列番号３１）、又はｈＰＧの残基２〜１４（配列番号３２）を含むエピトープに結合する抗体を含む。
【００８２】
本明細書に記載する方法及びキットにおいて有用なＣ末端抗ＰＧ抗体の特定の実施態様は、ｈＰＧの残基７１〜７４（配列番号３３）、ｈＰＧの残基６９〜７３（配列番号３４）、ｈＰＧの残基７６〜８０（配列番号３５）、又はｈＰＧの残基６７〜７４（配列番号３６）を含むエピトープに結合する抗体を含む。
【００８３】
本明細書に開示する方法及びキットにおいて有用なＮ末端及びＣ末端抗ｈＰＧ抗体は、表４Ａ及び４Ｂに提供するものに加えて、例示的なＭＡｂ１−２３を用いた、あるいはＮ又はＣ末端エピトープに結合する他の参照抗体を用いた競合結合アッセイにおいて同定することができる（後のセクションにおいてより詳細に記載する通り）。
【００８４】
抗体を得るための有用なハイブリドーマのいくつかが、２０１０年１０月６日に、ブダペスト条約に従って、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes（ＣＮＣＭ）に寄託された。抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１−２３を産生するハイブリドーマの指定名称及び寄託されたそれらのハイブリドーマの寄託登録番号を表４Ａ及び４Ｂに提供する。また、抗体のいくつかについて、それらの可変重鎖（ＶＨ）、可変軽鎖（ＶＬ）、ＶＬ相補性決定領域（ＣＤＲ）、及びＶＨ  ＣＤＲのアミノ酸配列が決定されている。これらのアミノ酸配列、及び開示を通じてそれらを参照するために使用される省略命名法も表４Ａ及び４Ｂに提供する。簡単には、マウス重鎖及び軽鎖可変ドメインは、本明細書においてｍＶＨ及びｍＶＬとして言及され、対応するモノクローナル抗体の番号が続く（例えば、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ３の可変軽鎖及び可変重鎖についてそれぞれｍＶＨ．３及びｍＶＬ．３）。同様に、ヒト重鎖及び軽鎖可変ドメインは、本明細書においてｈＶＨ及びｈＶＬとして言及され、対応するモノクローナル抗体の番号が続く。３つの可変重鎖ＣＤＲ及び３つの可変軽鎖ＣＤＲは、それぞれＶＨ  ＣＤＲ１、２、又は３及びＶＬ  ＣＤＲ１、２、又は３として言及され、特定の抗ｈＰＧモノクローナル抗体の番号が続く。例えば、ＭＡｂ３のＶＨ  ＣＤＲ１はＶＨ  ＣＤＲ１．３と表示され、及び、ＭＡｂ３のＶＬ  ＣＤＲ  １はＶＬ  ＣＤＲ１．３と表示される。ＭＡｂ３のＶＨ  ＣＤＲ２はＶＨ  ＣＤＲ２．３と表示され、及び、ＭＡｂ３のＶＬ  ＣＤＲ２はＶＬ  ＣＤＲ２．３と表示される。
【００８５】
ほぼ同じエピトープに結合する抗ｈＰＧモノクローナル抗体の対応するＣＤＲ及び／又はＶＨ及びＶＬ鎖を交換して、本明細書に記載する方法及びキットにおいて有用な新たな抗ｈＰＧモノクローナル抗体をもたらしうることが期待される。例えば、上に記述する通り、例示的な抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ５及びＭＡｂ６は同じエピトープに結合する。そのＶＬ鎖において、これらの２つの抗体のＶＬ  ＣＤＲの種々の組み合わせ、及び／又は、そのＶＨ鎖において、これらの２つの抗体のＶＨ  ＣＤＲの種々の組み合わせを含む抗ｈＰＧモノクローナル抗体を設計することができる。可能な種々の組み合わせを例証するための特定の非限定的な例として、そのような抗体は、そのＶＬ鎖において、ＭＡｂ５のＣＤＲ１及び２（それぞれＶＬ  ＣＤＲ  １．５及びＶＬ  ＣＤＲ  ２．５）ならびにＭＡｂ６のＣＤＲ３（ＶＬ  ＣＤＲ  ３．６）、及び、そのＶＨ鎖において、ＭＡｂ６のＣＤＲ１（ＶＨ  ＣＤＲ  １．６）ならびにＭＡｂ５のＣＤＲ２及び３（それぞれＶＨ  ＣＤＲ  ２．５及びＶＨ  ＣＤＲ  ３．５）を含みうる。寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体のＣＤＲのアミノ酸配列は、従来の手段を使用して得ることができる。例えば、Coligan (1996) Current Protocols in Immunology, Vol. 3, New York: John Wiley and Sonsを参照のこと。
【００８６】
表３Ａを参照して、本明細書に記載する方法及びキットにおいて有用なＮ末端抗ｈＰＧ抗体の特定の実施態様は、しかし、限定しないが、以下を含む：
（ａ）配列において、ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４、ＭＡｂ１５、ＭＡｂ１６、ＭＡｂ１７、ＭＡｂ１８、ＭＡｂ１９、又はＭＡｂ２０のＶＬ  ＣＤＲに対応するＶＬ  ＣＤＲ、及び、配列において、ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４、ＭＡｂ１５、ＭＡｂ１６、ＭＡｂ１７、ＭＡｂ１８、ＭＡｂ１９、又はＭＡｂ２０のＶＨ  ＣＤＲに対応するＶＨ  ＣＤＲを有する抗体；
（ｂ）配列において、ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４、ＭＡｂ１５、ＭＡｂ１６、ＭＡｂ１７、ＭＡｂ１８、ＭＡｂ１９、又はＭＡｂ２０のＶＬ及びＶＨ  ＣＤＲに対応するＶＬ  ＣＤＲ及びＶＨ  ＣＤＲを有する抗体；
（ｃ）抗体、それにおいて：
（ｉ）ＶＬ  ＣＤＲ  １はＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹ（「ＶＬ  ＣＤＲ  １．３」；配列番号４）、ＱＳＬＶＨＳＳＧＶＴＹ（「ＶＬ  ＣＤＲ  １．４」；配列番号１０）、ＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹ（「ＶＬ  ＣＤＲ  １．１６」；配列番号５０）、及びＳＱＨＲＴＹＴ（「ＶＬ  ＣＤＲ  １．１９」；配列番号５１）より選択される；
（ｉｉ）ＶＬ  ＣＤＲ２はＫＶＳ（「ＶＬ  ＣＤＲ  ２．３」及び「ＶＬ  ＣＤＲ  ２．４」；配列番号５）、ＬＶＳ（「ＶＬ  ＣＤＲ  ２．１６」；配列番号５３）、及びＶＫＫＤＧＳＨ（「ＶＬ  ＣＤＲ  ２．１９」；配列番号５４）より選択される；
（ｉｉｉ）ＶＬ  ＣＤＲ３はＦＱＧＳＨＶＰＦＴ（「ＶＬ  ＣＤＲ  ３．３」；配列番号６）、ＳＱＳＴＨＶＰＰＴ（「ＶＬ  ＣＤＲ  ３．４」；配列番号１１）、ＷＱＧＴＨＳＰＹＴ（「ＶＬ  ＣＤＲ  ３．１６」；配列番号５７）、及びＧＶＧＤＡＩＫＧＱＳＶＦＶ（「ＶＬ  ＣＤＲ  ３．１９」；配列番号５８）より選択される；
（ｉｖ）ＶＨ  ＣＤＲ１はＧＹＩＦＴＳＹＷ（「ＶＨ  ＣＤＲ  １．３」；配列番号１）、ＧＹＴＦＳＳＳＷ（「ＶＨ  ＣＤＲ  １．４」；配列番号７）、ＧＹＴＦＴＳＹＹ（「ＶＨ  ＣＤＲ  １．１６」；配列番号３９）、及びＧＹＳＩＴＳＤＹＡ（「ＶＨ  ＣＤＲ  １．１９」；配列番号４０）より選択される；
（ｖ）ＶＨ  ＣＤＲ２はＦＹＰＧＮＳＤＳ（「ＶＨ  ＣＤＲ  ２．３」；配列番号２）、ＦＬＰＧＳＧＳＴ（「ＶＨ  ＣＤＲ  ２．４」；配列番号８）、ＩＮＰＳＮＧＧＴ（「ＶＨ  ＣＤＲ  ２．１６」；配列番号４３）、及びＩＳＦＳＧＹＴ（「ＶＨ  ＣＤＲ  ２．１９」；配列番号４４）より選択される；及び
（ｖｉ）ＶＨ  ＣＤＲ３はＴＲＲＤＳＰＱＹ（「ＶＨ  ＣＤＲ  ３．３」；配列番号３）、ＡＴＤＧＮＹＤＷＦＡＹ（「ＶＨ  ＣＤＲ  ３．４」配列番号９）、ＴＲＧＧＹＹＰＦＤＹ（「ＶＨ  ＣＤＲ  ３．１６」；配列番号４７）、及びＡＲＥＶＮＹＧＤＳＹＨＦＤＹ（「ＶＨ  ＣＤＲ  ３．１９」；配列番号４８）より選択される；
（ｄ）配列において、ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４、ＭＡｂ１５、ＭＡｂ１６、ＭＡｂ１７、ＭＡｂ１８、ＭＡｂ１９、又はＭＡｂ２０のＶＬに対応するＶＬ、及び、配列において、ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４、ＭＡｂ１５、ＭＡｂ１６、ＭＡｂ１７、ＭＡｂ１８、ＭＡｂ１９、又はＭＡｂ２０のＶＨに対応するＶＨを有する抗体；及び
（ｅ）配列において、ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４、ＭＡｂ１５、ＭＡｂ１６、ＭＡｂ１７、ＭＡｂ１８、ＭＡｂ１９、又はＭＡｂ２０のＶＬ及びＶＨに対応するＶＬ及びＶＨを有する抗体。
【００８７】
表３Ｂを参照して、本明細書に記載する方法及びキットにおいて有用なＣ末端抗ｈＰＧ抗体の特定の実施態様は、しかし、限定しないが、以下を含む：
（ｆ）配列において、ＭＡｂ５、ＭＡｂ６、ＭＡｂ７、ＭＡｂ８、ＭＡｂ９、ＭＡｂ１０、ＭＡｂ１１、ＭＡｂ１２、ＭＡｂ１３、ＭＡｂ１４、ＭＡｂ２１、ＭＡｂ２２、又はＭＡｂ２３のＶＬ  ＣＤＲに対応するＶＬ  ＣＤＲ、及び、配列において、ＭＡｂ５、ＭＡｂ６、ＭＡｂ７、ＭＡｂ８、ＭＡｂ９、ＭＡｂ１０、ＭＡｂ１１、ＭＡｂ１２、ＭＡｂ１３、ＭＡｂ１４、ＭＡｂ２１、ＭＡｂ２２、又はＭＡｂ２３のＶＨ  ＣＤＲに対応するＶＨ  ＣＤＲを有する抗体；
（ｇ）配列において、ＭＡｂ５、ＭＡｂ６、ＭＡｂ７、ＭＡｂ８、ＭＡｂ９、ＭＡｂ１０、ＭＡｂ１１、ＭＡｂ１２、ＭＡｂ１３、ＭＡｂ１４、ＭＡｂ２１、ＭＡｂ２２、又はＭＡｂ２３のＶＬ及びＶＨ  ＣＤＲに対応するＶＬ  ＣＤＲ及びＶＨ  ＣＤＲを有する抗体；
（ｈ）抗体、それにおいて：
（ｉ）ＶＬ  ＣＤＲ１はＫＳＬＲＨＴＫＧＩＴＦ（「ＶＬ  ＣＤＲ  １．８」；配列番号４９）及びＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹ（「ＶＬ  ＣＤＲ  １．１３」；配列番号５０）より選択される；
（ｉｉ）ＶＬ  ＣＤＲ２はＱＭＳ（「ＶＬ  ＣＤＲ  ２．８」；配列番号５２）及びＬＶＳ（「ＶＬ  ＣＤＲ  ２．１３」；配列番号５３）より選択される；
（ｉｉｉ）ＶＬ  ＣＤＲ３はＡＱＮＬＥＬＰＬＴ（「ＶＬ  ＣＤＲ  ３．８」；配列番号５５）及びＷＱＧＴＨＦＰＱＴ（「ＶＬ  ＣＤＲ  ３．１３」；配列番号５６）より選択される；
（ｉｖ）ＶＨ  ＣＤＲ１はＧＦＴＦＴＴＹＡ（「ＶＨ  ＣＤＲ  １．８」；配列番号３７）及びＧＦＩＦＳＳＹＧ（「ＶＨ  ＣＤＲ  １．１３」；配列番号３８）より選択される；
（ｖ）ＶＨ  ＣＤＲ２はＩＳＳＧＧＴＹＴ（「ＶＨ  ＣＤＲ  ２．８」；配列番号４１）及びＩＮＴＦＧＤＲＴ（「ＶＨ  ＣＤＲ  ２．１３」；配列番号４２）より選択される；及び
（ｖｉ）ＶＨ  ＣＤＲ３はＡＴＱＧＮＹＳＬＤＦ（「ＶＨ  ＣＤＲ  ３．８」；配列番号４５）及びＡＲＧＴＧＴＹ（「ＶＨ  ＣＤＲ  ３．１３」；配列番号４６）より選択される；
（ｉ）配列において、ＭＡｂ５、ＭＡｂ６、ＭＡｂ７、ＭＡｂ８、ＭＡｂ９、ＭＡｂ１０、ＭＡｂ１１、ＭＡｂ１２、ＭＡｂ１３、ＭＡｂ１４、ＭＡｂ２１、ＭＡｂ２２、又はＭＡｂ２３のＶＬに対応するＶＬ、及び、配列において、ＭＡｂ５、ＭＡｂ６、ＭＡｂ７、ＭＡｂ８、ＭＡｂ９、ＭＡｂ１０、ＭＡｂ１１、ＭＡｂ１２、ＭＡｂ１３、ＭＡｂ１４、ＭＡｂ２１、ＭＡｂ２２、又はＭＡｂ２３のＶＨに対応するＶＨを有する抗体；及び
（ｊ）配列において、ＭＡｂ５、ＭＡｂ６、ＭＡｂ７、ＭＡｂ８、ＭＡｂ９、ＭＡｂ１０、ＭＡｂ１１、ＭＡｂ１２、ＭＡｂ１３、ＭＡｂ１４、ＭＡｂ２１、ＭＡｂ２２、又はＭＡｂ２３のＶＬ及びＶＨに対応するＶＬ及びＶＨを有する抗体。
【００８８】
表４Ａ及び４Ｂに記述する通り、いくつかのＮ末端及びＣ末端モノクローナル抗ｈＰＧ抗体が同定されている。これらの抗体の全てがｈＰＧについて特異的であり、ＭＡｂ１４を除く全てが結腸直腸癌に対する中和活性を示す。中和活性は治療適用のために重要でありうるが、本開示の診断目的のために必要ではない。このように、ｈＰＧに特異的に結合する非中和及び中和性抗体の両方が本明細書に記載する種々の診断方法のために有用である。
【００８９】
抗ｈＰＧ抗体の親和性は本開示の診断方法に決定的ではないが、しかし、高親和性抗体はプロガストリン検出の感度を改善する。さらに、高親和性抗体は治療適用のために必要である。したがって、少なくとも約１nMの親和性を示す抗体を使用する利点が存在しうる；例えば、少なくとも約９０nM、８０nM、７０nM、６０nM、５０nM、４０nM、３０nM、２０nM、１５nM、１０nM、７nM、６nM、５nM、４nM、３nM、２nM、１nM、０．１nM、０．０１nM、０．００１nM又はさらに大きい親和性。
【００９０】
表４Ａ及び４Ｂにおいて同定された抗ｈＰＧモノクローナル抗体の測定された親和性は、１０−６〜１０−１２Mの範囲である（以下の表５に記述する通り）：
【００９１】
【表７】
0005543614.tif 000008
【００９２】
特定の所望の適用のために特に適する親和性を有する抗ＰＧモノクローナル抗体を、これらの間より容易に選択する、あるいは、本明細書に記載する抗ｈＰＧ抗体の種々の免疫原、相補性決定領域（ＣＤＲ）配列、可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）配列を使用して生成又は設計することができる。任意の特定の抗ＰＧモノクローナル抗体の親和性は、当技術分野において周知の又は本明細書に記載する技術（例えばＥＬＩＳＡ、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、ＢＩＡｃｏｒｅ、又は蛍光偏光アッセイなど）を使用して決定することができる。特定のアッセイを実施例５に提供する。
【００９３】
当業者により認識される通り、特定の結合特性（例えば、目的の特定のエピトープに結合する能力など）を有する抗ｈＰＧ抗体は、本明細書に記載する種々の抗原及び免疫原を使用し、目的の参照抗体とｈＰＧ結合について競合するそれらの能力を評価して容易に得ることができる。本明細書に記載する抗ｈＰＧ抗体のいずれかを、そのような競合アッセイにおける参照抗体として利用することができる。目的のビオチン化参照抗ｈＰＧ抗体を用いてｈＰＧ結合について競合する抗体の能力を評価するために有用な特定のアッセイを、実施例６に提供する。
【００９４】
参照抗ｈＰＧ抗体と任意のテスト抗体（種又はアイソタイプと無関係）の間での抗体競合試験を行う際、最初に、参照を、直接的（例えばラジオアイソトープ又はフルオロフォアなど）又は間接的（例えばビオチン（蛍光標識ストレプトアビジンとの結合を介して検出可能）又は酵素（酵素反応を介して検出可能）など）のいずれかで検出可能な標識を用いて標識し、その後の同定を可能にしうる。この場合において、標識参照抗ｈＰＧ抗体（固定又は増加濃度で）を、既知量のｈＰＧを用いてインキュベートし、ｈＰＧ標識抗ｈＰＧ抗体複合体を形成する。非標識テスト抗体を、次に、複合体に加える。複合標識の強度を測定する。テスト抗体が、重複するエピトープに結合することにより、ｈＰＧについて標識参照抗ｈＰＧ抗体と競合する場合、複合標識の強度は、テスト抗体の非存在において行うコントロール実験と比べて減少する。
【００９５】
結合競合アッセイを行うための多数の方法が公知であり、適応して、上に及び実施例６に記載するアッセイと同等の結果をもたらすことができる。
【００９６】
抗体は、それが、競合結合アッセイ、及び、具体的には、実施例６の競合結合アッセイにおいて参照抗ｈＰＧ抗体のｈＰＧへの結合を、少なくとも５０%だけ（より高いレベルの低下、例えば６０%、７０%、８０%、９０%、又はさらには１００%が望まれうる）、テスト抗体濃度の範囲０．０１〜１００μg/mL（例、０．０１μg/mL、０．０８μg/mL、０．４μg/mL、２μg/mL、１０μg/mL、５０μg/mL、又は１００μg/mL、あるいは記述する範囲内の他の濃度）で低下させる場合、参照抗ｈＰＧ抗体とｈＰＧ結合について競合すると考えられ、このように、参照抗ｈＰＧ抗体とほぼ同じ又は重複するｈＰＧのエピトープに結合すると考えられる。
【００９７】
当業者により理解される通り、診断方法において有用な抗ｈＰＧ抗体は、任意の起源（例えば、哺乳動物（例、ヒト、霊長類、げっ歯類、ヤギ、又はウサギ）、非哺乳動物、又は自然におけるキメラ（１を上回る種に由来する）を含む）でありうる及び／又はＣＤＲ移植（例、ヒト化）されうる。
【００９８】
抗体をヒト化するための方法（ヒト化抗体を設計するための方法を含む）も当技術分野において周知である。例えば、Lefranc et al. (2003) Dev. Comp. Immunol. 27: 55-77；Lefranc et al. (2009) Nucl. Acids Res. 37: D1006-1012；Lefranc (2008) Mol. Biotechnol. 40: 101-111；Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-7；米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号、及び第６，１８０，３７０号、Queen et al.；ＥＰ２３９４００；ＰＣＴ公開ＷＯ  ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；ＥＰ５９２１０６；ＥＰ５１９５９６；Padlan (1991) Mol. Immunol. 28: 489-498；Studnicka et al. (1994) Prot. Eng. 7: 805-814；Roguska et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 969-973；及び米国特許第５，５６５，３３２号、その開示は、それらの全体において参照により本明細書により組み入れられる。
【００９９】
非ヒト抗ｈＰＧ抗体のＣＤＲに対応するＣＤＲ配列を有する抗体のヒト化バージョン（例として、限定しないが、表３Ａに提供する種々のＮ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体及び表３Ｂに提供する種々のＣ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体を含む）を、これらの周知の方法を使用して得ることができる。選択された抗ｈＰＧ抗体のヒト化ＶＬ及びＶＨ鎖の予測配列を、表４Ａ及び４Ｂに提供する。マウス抗体又はヒト化抗体のいずれかを開示の診断目的のために使用してもよい。ヒト化抗体の特定の例は、以下を含む抗体を含む：
（ａ）本明細書に開示される任意の３つのＶＬ  ＣＤＲ及び任意の３つのＶＨ  ＣＤＲ；
（ｂ）配列番号２１に対応するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２２に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｃ）配列番号２３に対応するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２４に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｄ）配列番号７５、７７、及び７９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号７６及び７８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｅ）配列番号８０及び８２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号８１及び８３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｆ）配列番号８４、８６、及び８８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号８５、８７、及び８９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；及び
（ｇ）配列番号９０、９２、及び９４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号９１、９３、及び９５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【０１００】
本開示の方法において使用する抗ＰＧモノクローナル抗体及び抗体フラグメントを、誘導体化する、例えば、他の分子に共有結合的に修飾又は結合することができる。
【０１０１】
特定の実施態様において、抗ＰＧ抗体又はそのフラグメントを、診断薬剤に結合する。抗ＰＧ抗体に結合したｈＰＧの検出は、抗体を、直接的又は間接的に検出することができる物質に共役させることにより促進することができる。検出可能物質の例は、種々の酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性材料、種々の陽電子放射断層撮影を使用した陽電子放出金属、及び非放射性常磁性金属イオンを含む。
【０１０２】
検出可能物質を、抗体（又はそのフラグメント）に直接的に、又は、中間体（例えば、当技術分野において公知のリンカーなど）を通じて間接的に、当技術分野において公知の技術を使用して共役又は結合させてもよい。
【０１０３】
適した酵素の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼを含む。これらの酵素のための生物発光、化学発光、及び／又は発色基質が当技術分野において公知である。例えば、酵素がアルカリホスファターゼである場合、基質は、化学発光基質、例えばＡＭＰＰＤ（登録商標）（３−（２′−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン）、ＣＤＰ−ｓｔａｒ（登録商標）（二ナトリウム４−クロロ−３−（メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン｝−４−イル）フェニルホスフェート）、及びＣＳＰＤ（登録商標）（二ナトリウム３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン｝−４−イル）フェニルホスフェート）など；発色基質、例えばｐ−ニトロフェニルホスフェート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−リン酸（ＢＣＩＰ）、４−ニトロブルーテトラゾリウムクロライド（ＮＢＴ）、及びヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）などを含みうる。
【０１０４】
開示の診断方法における使用のための抗ｈＰＧ抗体に結合させることができる金属イオンの例が、米国特許出願第４，７４１，９００号に開示されている。適した補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンを含む。適した蛍光材料の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、又はフィコエリスリンを含む。発光材料の例はルミノールである。生物発光材料の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンを含む。適した放射性材料の例は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、又は９９Ｔｃを含む。
【０１０５】
検出可能な基質に抗体を共役する方法は当該分野において公知である。典型的な技術が、Kennedy et al., (1976) Clin. Chim. Acta 70: 1-31)；Schurs et al.(1977) Clin. Chim Acta 81: 1-40；Antibodies: A Laboratory Manual Harlow & Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988) at ch.9; Bioconjugate Techniques, Hermanson, Academic Press (2008)により記載されている。
【０１０６】
抗体は、また、イムノアッセイ又はｈＰＧの精製のために特に有用である固体支持体に付着させることができる。そのような固体支持体は、しかし、限定しないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、又はポリプロピレンを含む。
【０１０７】
本明細書に記載する方法及びキットにおいて有用な種々の抗ｈＰＧ抗体は、全長抗体を用いて例示されてきたが、当業者は、結合フラグメント、あるいは全長抗体又は結合フラグメントから設計される又はそれに由来するサロゲート抗体も使用してもよいことを理解するであろう。適したフラグメント、サロゲートなどは、しかし、限定しないが、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｖＩｇＧ、ｓｃＦｖフラグメント及びサロボディを含む。
【０１０８】
６．５．  キット
開示の局面において、キットを、上に示唆する通りに、診断及び研究の適用における使用のために提供する。一部の実施態様において、サンプル中のｈＰＧを検出及び／又は定量化するために必要な抗ｈＰＧ抗体及び試薬を含むキットを提供し、アッセイ試薬及び緩衝剤を含むことができる。また、キットは、診断方法の実行のための指示（例、プロトコール）を含む指示材料を含むことができる。指示材料は、典型的には、書面の又は印刷された材料を含むが、それらはそのようなものに限定されない。そのような指示を保存し、それらをエンドユーザーに伝達することが可能である媒体が、本発明により熟慮される。そのような媒体は、しかし、限定しないが、電子保存媒体（例、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例、ＣＤ  ＲＯＭ）などを含む。そのような媒体は、そのような指示材料を提供するインターネットサイトへのアドレスを含みうる。
【０１０９】
キットを、１つ又は複数の状態と既に診断されている患者の診断又はスクリーニングのために適応することができる。例えば、キットは、Ｃ型肝炎と診断された患者のための指示材料を含むことができ、ｈＰＧレベルに基づく追加の肝臓病理の診断を行うことができる。材料は、また、他の肝臓状態（例えば肝硬変及び／又は肝臓癌など）と診断された患者に向けることができる。キットは、また、高リスク集団（Ｃ型肝炎又は他の肝臓病理がより蔓延している集団を含む）のスクリーニングのために適応することができる。
【０１１０】
６．６．  自動化方法及び実施
開示の一部の実施態様において、１つ又は複数の肝臓病理について示したリスクを診断又は決定する方法を、全体的に又は部分的に機械により実施する。例えば、方法を、血液サンプルのインプットを含む診断ユニットにより実行することができる。血液サンプルを、次に、プロガストリンレベルを産生する機械により操作する。そのような操作は、血液サンプル中のプロガストリンと１つ又は複数の抗体との結合を含むことができる。プロガストリン−抗体サンプルは検出可能なマーカーを含むことができる。検出可能なマーカーの測定は、ディスプレイに送達することができるデータアウトプットを提供する。あるいは、データアウトプットは、プロガストリンレベルに従って、コンピューターにより１つ又は複数の肝臓病理と相関させることができる。別の実施態様において、データアウトプットは、ｈＰＧの閾値（例えば、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、又は７００pM）と比較することができる。決定したｈＰＧレベルが閾値を上回る場合、１つ又は複数の肝臓病理の診断を行う。
【０１１１】
コンピューターは、さらに、統計又は実験情報のデータベースを含むことができる。情報を使用して、定量化したプロガストリンレベル及び追加データ（ユーザーによりインプットされることができる）を相関させ、１つ又は複数の肝臓病理のより詳細なもしくは正確な診断又はリスクの指標を提供することができる。データベースは、また、推奨される処置又はさらなる診断選択肢に関する情報を含むことができる。したがって、開示の方法を、コンピューター化された医学診断方法の形態で実施することができる。本開示のアッセイ診断法を実施するために有用な例示的な自動化システムは、米国特許第６，０６３，０２６号、第６，０６３，３４０号、及び第７，３８１，３７０号に記載されるものを含む。
【０１１２】
一般的に、そのような自動化システムは、以下の１つ又は複数を含むことができる：血液又はサンプルインプットユニット、血液又はサンプル操作ユニット、ｈＰＧ及び／又はｈＰＧマーカー検出ユニット、１つ又は複数のデータベースのための保存を伴うＣＰＵ、ディスプレイ及び／又は伝達ユニット、又は先のユニットのいずれか１つの機能性を組み合わせるユニット。ユニットを統合して、サンプルを受け、ｈＰＧレベルを示している検出可能なマーカーを提供するための試薬を使用してサンプルをプロセシングし、マーカーのレベルを検出し、マーカーのレベルをｈＰＧレベルと相関させ、情報、すなわち、決定したｈＰＧレベル及び、場合により、決定したｈＰＧレベルに基づく診断のアウトプットを提供する。ユニットは、また、ＣＰＵ及びデータベースと統合し、追加情報（例えば、決定したｈＰＧレベルに基づく、肝臓癌、Ｃ型肝炎、肝硬変、又はその組み合わせの診断など）及び自動化アッセイにより提供される又はユーザーによりインプットされる任意の追加情報を提供することができる。一部の局面において、ユニットを非自動化方法と統合することができる。例えば、部分的に自動化した方法は、サンプルを受け、操作するためのユニットを含むことができる。操作されたサンプルを、次に、非自動化方法によるテストに提出することができる。
【０１１３】
７．  実施例
実施例１：血漿プロガストリンの定量化
９６ウェルマイクロタイタープレートを、０．５〜１０μg/mLの間のＣ末端抗ｈＰＧ抗体、例えば、ウサギＣ末端抗ｈＰＧポリクローナル抗体を用いてコーティングし、次に、一晩インキュベートする。プレートを、次に、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５%）中で３回洗浄し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５%）中の２%（ｗ／ｖ）脱脂乾燥ミルクを用いてブロックする。別々に、テストサンプル、コントロールサンプル（ブランク又はＰＧ陰性血漿又は血清サンプル）、及び約５pM（０．５×１０−１１M）〜約０．１nM（１×１０−１０M）の間のｈＰＧ参照基準（ＰＧ陰性血漿又は血清中で希釈した凍結乾燥ｈＰＧ）を適切な希釈剤（例、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ０．０５%）中で調製する。サンプルを、コーティングしたプレート上で２〜４時間の間にわたり３７℃で、又は、あるいは、１２〜１６時間の間２１℃でインキュベートする。インキュベーション後、プレートを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５%）を用いて３回洗浄し、０．００１〜０．１μg/mLの間のＮ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体（本明細書に記載する）を用いてインキュベートし、２１℃で３０分間にわたり西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Nakane et al., 1974, J. Histochem. Cytochem. 22(12): 1084-1091）に共役させる。プレートを次にＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５%）中で３回洗浄し、ＨＲＰ基質を２１℃で１５分間にわたり加える。反応を、１００μLの０．５M硫酸を加えることにより停止させ、光学密度測定値を４０５nMで取る。テストサンプルｈＰＧレベルを、ｈＰＧ参照基準に由来する測定値から構築された標準曲線との比較により決定する。
【０１１４】
競合についての他のアッセイが公知であり、適応して、上に記載するアッセイと同等の結果をもたらすことができる。
【０１１５】
実施例２：患者における１つ又は複数の肝臓病理の増加リスクの同定又は診断
肝臓病理を有することが疑われる患者、又はスクリーニング（例、定期的な身体検査の一部として行うスクリーニング）を受けている患者は、生物学的サンプル（例えば血漿、血清、又は血液など）を提供する。プロガストリンレベルを定量化し（例えば、実施例１に示す通り）、血液サンプル中のプロガストリン濃度に対応する数字を産生する。開示の方法において、その数字は、一般的に、真のプロガストリンの数字の１%〜５%（又はそれ以下）内である。なぜなら、プロガストリン（その前駆体又は産物ではない）について特異的なアッセイを使用するからである。この数字を、次に、定められた範囲内のプロガストリンレベルと関連する肝臓病理のリストと比較する。言い換えれば、特定の肝臓病理を示しているプロガストリンレベルを、定量化した数字と比較する。特定の部分範囲は、異なるレベルのリスクを示しうる。例えば、低いが、しかし、上昇したプロガストリンレベルは１つ又は複数の病理の中程度のリスクを示しうるのに対し、高いプロガストリンレベルは１つ又は複数の病理の高リスクを示しうる。レベルを閾値と比較し、それにより、陽性又は陰性テスト結果を産生することができる。場合により、第２のバイオマーカーをテストして、診断又は指標を確認することができる。例えば、肝臓病理の中程度のリスク（しかし、高リスクではない）を呈する患者は、第２バイオマーカーをテストされうる。第２バイオマーカーが、また、同じ肝臓病理を示す場合、その時は、その病理の診断は正確である可能性がより高い。プロガストリンレベルを決定するための手段を、キット中に提供することができる。キットは、また、プロガストリンレベルを１つ又は複数の病理、特に肝臓病理と相関させる統計的データ又は他のデータを提供することができ、場合により、１つ又は複数の追加バイオマーカーにより補われる。
【０１１６】
肝臓病理と既に診断された患者は、ｈＰＧテストも受けることができる。例えば、肝臓癌と診断された患者はｈＰＧテストを受けて、患者が追加の肝臓病理（例えばＣ型肝炎及び肝硬変など）も有するか否かを決定することができる。なぜなら、Ｃ型肝炎レベルは、通例、患者が複数の肝臓病理（例、肝臓癌、肝硬変、及びＣ型肝炎）を呈する場合を除いて上昇しないため、プロガストリンは、そのような患者におけるＣ型肝炎の診断のための有用なバイオマーカーである。同様に、Ｃ型肝炎又は肝硬変と既に診断された患者を、ｈＰＧレベルが異常であるか否かを決定することにより、追加の病理についてスクリーニングすることができる。
【０１１７】
ｈＰＧレベルを一部の例において使用し、診断を確認することができる。例えば、肝臓癌又は別の肝臓病理を示している１つ又は複数のバイオマーカーについての異常なテスト結果を呈する患者を、異常に高いｈＰＧレベルについてスクリーニングし、最初の診断を確認することができる。ｈＰＧレベルを、リスクのある集団において、定期的なスクリーニングプログラムの一部として定量化することができる。例えば、非常に高いｈＰＧレベルは複数の肝臓病理と相関するため、及び、Ｃ型肝炎を呈する患者は、典型的には、少なくとも１つの他の肝臓病理を同時に呈するため、高レベルのＣ型肝炎を伴う集団は、ｈＰＧスクリーニングについての可能性のある候補である。ｈＰＧレベルを使用して、１つ又は複数の肝臓病理の処置の経過をモニターすることもできる。減少するｈＰＧレベルは、効果的な処置と相関しうる。
【０１１８】
実施例３：１つ又は複数の肝臓病理の診断のためのキット、ユニット、テスト、及び診断法
１つ又は複数の診断法を含む品目を、本明細書に記載する診断の方法において利用することができる。例えば、ブロッター又はクロマトグラフィーストリップを適応し、患者からの血液又は血液成分との結合時の色を変えることができ、それにおいて、プロガストリンレベルは閾値を上回っている。あるいは、キットは、血液中でマーカーをプロガストリンに結合させるための試薬を含むことができる。そのようなマーカーは、例えば、ラジオアイソトープ又は発色団でありうる。放射線（励起又は別の方法により誘導される）の検出及び定量化を次に使用して、マーカー発光が、閾値を上回るプロガストリンレベルを示す十分な強度である場合、陽性テスト結果を生成することができる。テスト結果を適応して、範囲（例えばリスク値など）を示すことができる。例えば、キットは、プロガストリンレベルの１つの範囲についての第１シグナル及びプロガストリンレベルの他の範囲についての追加シグナルを表示するように適応されたテストを含むことができる。
【０１１９】
特定の例において、診断ユニット又はシステムは、技術者による又は自動機械による血液サンプルの操作のための１つ又は複数のサンプルチェンバーを含む。ユニット又はシステムは、さらに、１つ又は複数の試薬（例えば、プロガストリンに特異的に結合する抗体など）を含む。プロガストリンの特異的なアッセイのためのユニット又はシステムにおいて、サンドイッチアッセイを、ユニット又はシステム中に提供する複数の抗体を使用して実施することができる。システム又はユニットは、結合プロガストリンのレベルを定量化するために使用されるマーカーの量を検出するための検出器を含むことができる。システム又はユニットは、さらに、プロセッサー（例えば、指示によってプログラムされたコンピューターなど）を含み、検出されたマーカーのレベルを結合プロガストリンのレベルと相関させ、結合プロガストリンのレベルを診断と相関させることができる。最後に、システム又はユニットは、テスト結果及び／又は診断を表示又は伝達するためのユニットを含むことができる。代替のユニット又はシステムにおいて、ユニットは、血液サンプルリポジトリ及びプロガストリンに結合する１つ又は複数の試薬を含む。例えば、プロガストリンと接触し、色変化をもたらす試薬を用いて含浸又はコーティングしたテストストリップを使用して、ワンドロップ肝臓病理テストを提供することができる。
【０１２０】
実施例４：抗ｈＰＧ抗体の特異性を評価するためのＥＬＩＳＡアッセイ
抗ｈＰＧ抗体の特異性を、以下の通りにＥＬＩＳＡアッセイを使用して便利に決定することができる。９６ウェルプレートを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の適切な濃度のテストポリペプチド（例、２５及び５０ngの組換えヒトＰＧ、ならびに５０及び２５０ngのＣＴＦＰ又は他のガストリン由来の遺伝子産物）を用いて４℃で一晩インキュベートした。その後、ウェルを、洗浄溶液（ＰＢＳ及び０．１%Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて３回洗浄し、次に１ウェル当たり１００μLのブロッキング溶液（ＰＢＳ、０．１%Ｔｗｅｅｎ−２０、０．１%ウシ血清アルブミン又はカゼイン加水分解物）を用いて２２℃で２時間にわたりインキュベートした。ブロッキング後、ウェルを３回洗浄し、アッセイする抗体（テスト抗体）を加える。１００μLのＰＢＳ中のテスト抗体（０．３〜１ng/mL）及び０．１%Ｔｗｅｅｎ−２０を各ウェルに加える。プレートを次に２２℃で２時間にわたりインキュベートし、その後、テスト抗体溶液を捨て、洗浄工程（３×１００μLの洗浄溶液、上に記述する通り）後、二次抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼに共役させたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を含むブロッキング溶液を用いて置換する。二次抗体を用いた１時間のインキュベーション後、１００μLの基質溶液（例、Fast OPD、又はＯ−フェニレンジアミン二塩酸塩、Sigma-Aldrich Co.から入手可能、製造者の指示に従って調製した）を各ウェルに加え、暗所で、２２℃で２０分間にわたりインキュベートした。反応は、５０μLの４Ｎ硫酸を加えることにより停止させ、触媒された基質の量を、４９２nmでの光学密度（ＯＤ）を測定することにより決定する。基質変換は、抗原に結合した一次（テスト）抗体の量に比例する。実験を２通りに実行し、ＯＤ測定値を抗原濃度の関数としてプロットする。テスト抗体は、測定されたＯＤがｈＰＧについて０．２〜１．５の間であり、ＣＴＦＰ又は他のガストリン遺伝子由来ペプチドのいずれかを用いて、バックグラウンドを上回る統計的に有意なシグナルがない場合、ＰＧについて高度に特異的であるとスコア化される（ここで、バックグラウンドはＰＢＳだけを含むコントロールウェルからの平均シグナルである）。
【０１２１】
実施例５：抗ｈＰＧ抗体の親和性を評価するためのアッセイ
抗ｈＰＧ抗体の親和性定数は、Proteon Technique(BioRad)を使用して、Nahshol et al., 2008, Analytical Biochemistry 383: 52-60（その全体において参照により本明細書により組み入れられる）に従って測定することができる。簡単には、マウス抗ＰＧ抗体について、抗マウスＩｇＧ抗体（５０μg/mL）を最初にセンサーチップ上にコーティングし、抗体の注射後にチップにより検出されたシグナルが１０，０００〜１１，５００応答単位（ＲＵ）の間に入ることを確認する。目的のマウス抗ｈＰＧ抗体（テスト抗体）を次に注射する（３０μg/mLの典型的な濃度で）。テスト抗体が十分に結合する場合、少なくとも５００ＲＵの追加シグナルが観察される。テスト抗体とｈＰＧの間での結合の時間経過を、次に、ｈＰＧの変動濃度、例えば、２００nM、１００nM、５０nM、２５nM、及び１２．５nMを注射し、結合のレベルを検出することにより得る。典型的には、いくつかのチャンネルが、単一の実験において並行して複数の抗体をテストするために利用可能であり、ｈＰＧの異なる濃度で並行して単一のテスト抗体の結合をアッセイすることを可能にする。１つのチャネルを、非特異的結合についてのコントロールとして、ｈＰＧに特異的ではないマウスモノクローナル抗体を用いて注射すべきである。別のチャネルを、バックグラウンドシグナルについてのベースラインとして、希釈緩衝液単独を用いて注射すべきである。一般的に、結合は、非特異的マウス抗体を用いて注射したチャネルにおいて検出可能ではない。この設定において高レベルの結合を表示する抗体は、ｈＰＧによる捕捉モノクローナル抗体の飽和をもたらしうるが、より低いｈＰＧ濃度（５０nM、２５nM、１２．５nM、６．２５nM、及び３．１２５nM）に対してテストすることができ、より洗練された測定を許す。
【０１２２】
親和性定数（ＫＤ）を、解離定数（ｋｄ）と結合定数（ｋａ）の間の比率として算出する。実験値は、結合測定値に基づく実験曲線及び理論上のプロファイルの間での統計的に関連する類似性を分析することにより検証することができる。
【０１２３】
非マウス抗ｈＰＧ抗体の親和性定数は、抗ｈＰＧテスト抗体の起源の種について特異的なＩｇＧを使用して同様のフォーマットにおいて評価することができる。
【０１２４】
実施例６：参照抗ｈＰＧ抗体を用いた競合的結合を評価するためのアッセイ
目的の抗体（テスト抗体）が、ｈＰＧ結合について、ビオチン化参照抗ｈＰＧ抗体と競合するか否かを評価するための特異性を伴うアッセイを、以下の通りに実施することができる。９６ウェルプレートを、捕捉抗ｈＰＧ抗体（ビオチン化参照抗ｈＰＧ抗体により認識されるエピトープとは異なるｈＰＧのＮ又はＣ末端領域を認識するポリクローナル又はモノクローナル抗体）を用いて、１〜１０μg/mLの範囲内で選ばれる濃度で、４℃で一晩コーティングする（０．１〜１μg/ウェル）。２２℃で２時間にわたるブロッキングバッファー（ＰＢＳ中の０．１%  Ｔｗｅｅｎ−２０、０．１%ＢＳＡ）を用いたブロッキング後、組換えｈＰＧを、１０pM〜１nM（１０〜１０００pg/ウェル）の間の範囲の濃度で加え、２２℃で２時間にわたりインキュベートする。その後、ビオチン化参照抗ｈＰＧ抗体（又はビオチン化参照抗ｈＰＧ抗体を含む混合物）を、増加濃度の非標識テスト抗体濃度と共に加え、２２℃で１時間にわたりインキュベートする。非結合抗体を除去するための洗浄後、結合した標識参照抗ｈＰＧ抗体の検出を、混合物を、５０ng/mLのストレプトアビジン（ｓｔｅｐｔａｖｉｄｉｎ）−ＨＲＰと２２℃で１時間にわたりインキュベートすることにより実施し、西洋ワサビペルオキシダーゼ用の蛍光基質とのインキュベーション、及び、次に、ルミノメーターにおける相対的な光単位（ＲＬＵ）の定量化が続く。アッセイを２通りに実施した。
【０１２５】
参照抗ｈＰＧ抗体と競合する抗体は、ｈＰＧへの参照抗体の結合を阻害する。参照抗体と実質的に同一のエピトープに、又は重複するエピトープと結合する抗体は、結合した参照抗ｈＰＧ抗体の量を有意に低下させる（例えば、少なくとも５０%だけ）（観察されたＲＬＵにおける低下により証明される通り）。
【０１２６】
高いコントロール値が、標識した参照抗体を、テスト抗体を伴わず、組換えｈＰＧとインキュベートすることにより行われるコントロール実験から得られる。低いコントロール値は、過剰濃度の非標識参照抗体（非標識参照抗体は、このように、ｈＰＧへの結合について標識抗体と競合する）の存在において、標識された参照抗体を、組換えｈＰＧを用いてインキュベートすることにより行われるコントロール実験から得られる。参照抗ｈＰＧ抗体と競合するテスト抗体の能力は、次に、標識した参照抗体を、増加濃度の非標識テスト抗体の存在において組換えｈＰＧとインキュベートすることにより決定される。
【０１２７】
テストアッセイにおいて、テスト抗体の存在における観察されたＲＬＵにおける有意な低下は、テスト抗体が、参照抗ｈＰＧ抗体と実質的に同じエピトープを認識することを示す。
【０１２８】
結合の阻害は阻害定数、つまりＫｉとして表現することができ、以下の式：
【数１】
0005543614.tif 000009
に従って算出される。
式中、「ＩＣ５０」は、参照抗体の結合における５０%低下をもたらすテスト抗体の濃度であり、Ｒｃは参照抗ｈＰＧ  Ａｂ濃度であり、ＫＤは参照抗ｈＰＧ抗体の解離定数（ｈＰＧについてのその親和性の測定値）である。参照抗ｈＰＧ抗体と競合する有用なテスト抗体（例えば、本明細書に記載する抗ｈＰＧ抗体の１つ）は、典型的には、本明細書に記載するアッセイ条件下で１０pM〜１００nMの範囲のＫｉを有する。
【０１２９】
本願において引用する全ての刊行物、特許、特許出願、及び他の文書が、各々の個々の刊行物、特許、特許出願、又は他の文書が全ての目的のために参照により組み入れられることが個々に示される場合と同じ程度まで、全ての目的のためにそれらの全体において参照により本明細書により組み入れられる。種々の特定の実施態様が例証及び記載されているが、種々の変化を、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく作ることができることが理解されるであろう。
【図１】
0005543614.tif 000010
【図２】
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【図３Ａ】
0005543614.tif 000012
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
0005543614.tif 000014
【図３Ｄ】
0005543614.tif 000015
【図３Ｅ】
0005543614.tif 000016
【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
0005543614.tif 000019
【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
0005543614.tif 000021
【図３Ｋ】
0005543614.tif 000022
【図３Ｌ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
0005543614.tif 000025
【図４Ｃ】
0005543614.tif 000026
【図４Ｄ】
0005543614.tif 000027
【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
0005543614.tif 000029
【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
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【図４Ｋ】
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【図４Ｌ】
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【図４Ｍ】
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【図４Ｎ】
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【図４Ｏ】
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【図４Ｐ】
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【図４Ｑ】
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【図４Ｒ】
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【図４Ｓ】
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【図４Ｔ】
0005543614.tif 000043
【図４Ｕ】
0005543614.tif 000044
【図４Ｖ】
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【図４Ｗ】
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【図４Ｘ】
0005543614.tif 000047
【図４Ｙ】
0005543614.tif 000048
【図４Ｚ】
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【配列表】
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