(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病、血管障害、および肥満症、耐糖能障害、ならびに代謝症候群から成る群から選択される障害の治療的または予防的処理のための医薬の製造における、完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの使用であって、前記完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンが、前記完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンと成熟ヒトオステオカルシンとを配列相同性が最大となるように整列させた場合、成熟ヒトオステオカルシンと少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有し、かつインスリン発現およびアディポネクチン発現を増大させる活性を有する、使用。
【請求項２】
糖尿病が1型糖尿病である、請求項1に記載の使用。
【請求項３】
糖尿病が2型糖尿病である、請求項1に記載の使用。
【請求項４】
障害が肥満症である、請求項1に記載の使用。
【請求項５】
障害が糖尿病であり、完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンが、耐糖能の増加、インスリン産生の増加、インスリン感受性の増加、膵臓ベータ細胞増殖の増加、およびアディポネクチン血清レベルの増加から成る群から選択される効果をもたらす、請求項1に記載の使用。
【請求項６】
障害が血管障害である、請求項1に記載の使用。
【請求項７】
血管障害がアテローム性動脈硬化症である、請求項6に記載の使用。
【請求項８】
完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンが、酸化リン脂質の低下、アテローム性動脈硬化プラークの退縮、炎症性タンパク質生合成の減少、血漿コレステロールの低下、血管平滑筋細胞(VSMC)の増殖および数の低下、ならびに動脈性プラークの厚さの減少から成る群から選択される効果をもたらす、請求項6に記載の使用。
【請求項９】
障害が耐糖能障害である、請求項1に記載の使用。
【請求項１０】
障害が代謝症候群である、請求項1に記載の使用。
【請求項１１】
完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンが、耐糖能の増加、インスリン産生の増加、インスリン感受性の増加、膵臓ベータ細胞増殖の増加、およびアディポネクチン血清レベルの増加から成る群から選択される効果をもたらす、請求項9または10に記載の使用。
【請求項１２】
ラロキシフェン、カルシトニン、およびアレンドロネートから選択される、骨減少を予防するために使用される作用物質と組み合わせた、請求項1から10のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
配列番号2の68、72、および75位に対応する位置の完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシン中のグルタミン酸の少なくとも1つがカルボキシル化されていない、請求項1から10のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
配列番号2の68、72、および75位に対応する位置の完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシン中のグルタミン酸の3つすべてがカルボキシル化されていない、請求項1から10のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンが、調製物中の配列番号2の68、72、および75位に対応する位置の全Glu残基の20%超がカルボキシル化されていない完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの調製物である、請求項1から10のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンが、カルボキシル化オステオカルシンと比較してヒドロキシアパタイトへの結合低下を示す、請求項1から10のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
有効量の完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンを含む、哺乳動物の糖尿病を治療または予防するための医薬組成物であって、前記完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンが、前記完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンと成熟ヒトオステオカルシンとを配列相同性が最大となるように整列させた場合、成熟ヒトオステオカルシンと少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有し、かつインスリン発現およびアディポネクチン発現を増大させる活性を有する、医薬組成物。
【請求項１８】
糖尿病が1型糖尿病である、請求項17に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
糖尿病が2型糖尿病である、請求項17に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンが、耐糖能の増加、インスリン産生の増加、インスリン感受性の増加、膵臓ベータ細胞増殖の増加、およびアディポネクチン血清レベルの増加から成る群から選択される効果をもたらすのに有効な量である、請求項17から19に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
有効量の完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンを含む、哺乳動物の血管障害を治療または予防するための医薬組成物であって、前記完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンが、前記完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンと成熟ヒトオステオカルシンとを配列相同性が最大となるように整列させた場合、成熟ヒトオステオカルシンと少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有し、かつインスリン発現およびアディポネクチン発現を増大させる活性を有する、医薬組成物。
【請求項２２】
血管障害がアテローム性動脈硬化症である、請求項21に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンが、酸化リン脂質の低下、アテローム性動脈硬化プラークの退縮、炎症性タンパク質生合成の減少、血漿コレステロールの低下、血管平滑筋細胞(VSMC)の増殖および数の低下、ならびに動脈性プラークの厚さの減少から成る群から選択される効果をもたらすのに有効な量である、請求項21または22に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
有効量の完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンを含む、哺乳動物の肥満症を治療または予防するための医薬組成物であって、前記完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンが、前記完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンと成熟ヒトオステオカルシンとを配列相同性が最大となるように整列させた場合、成熟ヒトオステオカルシンと少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有し、かつインスリン発現およびアディポネクチン発現を増大させる活性を有する、医薬組成物。
【請求項２５】
完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンが、耐糖能の増加、インスリン産生の増加、インスリン感受性の増加、膵臓ベータ細胞増殖の増加、およびアディポネクチン血清レベルの増加から成る群から選択される効果をもたらすのに有効な量である、請求項24に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
有効量の完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンを含む、哺乳動物の耐糖能障害を治療または予防するための医薬組成物であって、前記完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンが、前記完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンと成熟ヒトオステオカルシンとを配列相同性が最大となるように整列させた場合、成熟ヒトオステオカルシンと少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有し、かつインスリン発現およびアディポネクチン発現を増大させる活性を有する、医薬組成物。
【請求項２７】
有効量の完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンを含む、哺乳動物の代謝症候群を治療または予防するための医薬組成物であって、前記完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンが、前記完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンと成熟ヒトオステオカルシンとを配列相同性が最大となるように整列させた場合、成熟ヒトオステオカルシンと少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有し、かつインスリン発現およびアディポネクチン発現を増大させる活性を有する、医薬組成物。
【請求項２８】
完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンが、耐糖能の増加、インスリン産生の増加、インスリン感受性の増加、膵臓ベータ細胞増殖の増加、およびアディポネクチン血清レベルの増加から成る群から選択される効果をもたらすのに有効な量である、請求項26または27に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
哺乳動物がヒトである、請求項17から28のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンが、ラロキシフェン、カルシトニン、およびアレンドロネートから選択される、骨減少を予防するために使用される作用物質と組み合わせた状態である、請求項17から28のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
配列番号2の68、72、および75位に対応する位置の完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシン中のグルタミン酸の少なくとも1つがカルボキシル化されていない、請求項17から28のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
配列番号2の68、72、および75位に対応する位置の完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシン中のグルタミン酸の3つすべてがカルボキシル化されていない、請求項17から28のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンが、調製物中の配列番号2の68、72、および75位に対応する位置の全Glu残基の20%超がカルボキシル化されていない完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの調製物である、請求項17から28のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
哺乳動物のインスリン感受性を増加させるための医薬の製造のための、有効量の完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの使用であって、前記完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンが、前記完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンと成熟ヒトオステオカルシンとを配列相同性が最大となるように整列させた場合、成熟ヒトオステオカルシンと少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有し、かつインスリン発現およびアディポネクチン発現を増大させる活性を有する、使用。
【請求項３５】
哺乳動物のインスリン産生を増加させるための医薬の製造のための、有効量の完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの使用であって、前記完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンが、前記完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンと成熟ヒトオステオカルシンとを配列相同性が最大となるように整列させた場合、成熟ヒトオステオカルシンと少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有し、かつインスリン発現およびアディポネクチン発現を増大させる活性を有する、使用。
【請求項３６】
哺乳動物の耐糖能を増加させるための医薬の製造のための、有効量の完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの使用であって、前記完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンが、前記完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンと成熟ヒトオステオカルシンとを配列相同性が最大となるように整列させた場合、成熟ヒトオステオカルシンと少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有し、かつインスリン発現およびアディポネクチン発現を増大させる活性を有する、使用。
【請求項３７】
哺乳動物の膵臓ベータ細胞増殖を増加させるための医薬の製造のための、有効量の完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの使用であって、前記完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンが、前記完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンと成熟ヒトオステオカルシンとを配列相同性が最大となるように整列させた場合、成熟ヒトオステオカルシンと少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有し、かつインスリン発現およびアディポネクチン発現を増大させる活性を有する、使用。
【請求項３８】
哺乳動物のアディポネクチン血清レベルを増加させるための医薬の製造のための、有効量の完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの使用であって、前記完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンが、前記完全長低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンと成熟ヒトオステオカルシンとを配列相同性が最大となるように整列させた場合、成熟ヒトオステオカルシンと少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有し、かつインスリン発現およびアディポネクチン発現を増大させる活性を有する、使用。
【請求項３９】
哺乳動物がヒトである、請求項34から38のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、助成金第PHS398/2590号(修正09/04、2006年4月再発行)の政府の支援で成された。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
本出願は、2006年9月13日に出願された米国仮特許出願第60/844,203号、2006年12月18日に出願された第60/870,604号、2007年4月2日に出願された第60/909,712号、および2007年6月19日に出願された第60/945,081号の利益を主張するものであり、それらの内容は、あたかも本明細書に完全に記載されるように参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、エネルギー代謝、ならびにガンマカルボキシラーゼ、オステオカルシン、およびアディポネクチンが関与するOST-PTPシグナル伝達経路に関する障害を治療、予防、および診断するための方法および組成物に関する。そのような障害は、代謝症候群、耐糖能障害、糖尿病1型および2型、アテローム性動脈硬化症、ならびに肥満症を含むが、これらに限定されない。
【背景技術】
【０００４】
骨生物学で支配的な研究のパラダイムは、2つの骨特異的細胞型である骨芽細胞および破骨細胞の分化および機能が、局所的に作用するサイトカインまたは全身に作用するホルモンとなり得る、分泌分子によって決定されることである(HaradaおよびRodan、2003年、Takayanagi、2006年、TeitelbaumおよびRoss、2003年)。出願人は、エネルギー代謝に関し、かつ骨芽細胞中で生じる以前は知られていなかった遺伝経路を発見したが、この経路では、OST-PTPの活性の減少がガンマカルボキシラーゼの活性の減少をもたらし、これが、順に、骨芽細胞からの低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの分泌の増加をもたらし、グルコースホメオスタシスに対する有益な効果を生じる。
【０００５】
OST-PTPはEsp遺伝子によってコードされたタンパク質である。Esp遺伝子は、元々、胚幹(ES)細胞ホスファターゼと命名され、それはまたマウスでPtprv遺伝子とも呼ばれてきた。(Leeら、1996年、Mech Dev 59:153〜164頁)。OST-PTPは、受容体様タンパク質、骨精巣タンパク質チロシンホスファターゼならびにその断片および変異体である。OST-PTPは、3つの別個のドメインを含む、大きな1711アミノ酸長タンパク質である。OST-PTPは、複数のフィブロネクチンIII型リピートを含有する1068アミノ酸長細胞外ドメインを有する。
【０００６】
Esp発現は、ES細胞、生殖腺、および骨格に限られる。生殖腺中で、Espは、精巣のセルトリ細胞および卵巣の体腔上皮細胞中で特異的に発現する。発生の間に、Espは、四肢の外胚葉性頂堤中で最初に発現する。その後、胚発生の間におよび出生後に、その発現は、軟骨膜および骨膜の前骨芽細胞および骨芽細胞(つまりRunx2ポジティブ細胞)に限られるようになる。その骨および精巣の局在性のために、Espの遺伝子産物は骨芽細胞精巣タンパク質チロシンホスファターゼ(OST-PTP)と称されることが多い。
【０００７】
極めて少数の骨芽細胞特異的タンパク質のうちの1つであるオステオカルシンはホルモンのいくつかの特徴を有する。Ducyらは、老齢のオステオカルシン欠損マウス由来の石灰化した骨は野生型よりも2倍厚かったことを実証した。オステオカルシンの欠如は、骨吸収を損なわないで、骨形成の増加につながり、石灰化に影響を与えなかったことが示された。ヒトオステオカルシンの複数の免疫反応性の形態は、血行路(GarneroらJ Bone Miner Res 1994年;9:255〜4頁)でおよびさらに尿中(TaylorらJ. Clin. Endocrin. Metab. 1990年;70:467〜72頁)でも発見された。ヒトオステオカルシンの断片は、骨基質の破骨細胞による分解の間にまたは骨芽細胞による合成の後の循環タンパク質の異化分解の結果として生産され得る。
【０００８】
代謝症候群は、心臓血管系疾患の危険性を増加させる医学的障害および糖尿病の組み合わせである。代謝症候群の症状のうちのいくつかは、空腹時高血糖、高血圧、HDLコレステロール減少、トリグリセリド上昇、および尿酸レベル上昇を含む。
【０００９】
本明細書に記載される実験は、骨格がエネルギー代謝の内分泌レギュレーターであり、それによって、部分的に、代謝症候群または2型糖尿病の発症および重症度ならびにこれらの障害を発症する危険性を決定するといった第1の証拠を提供する。本明細書に記載される実験は、骨格が、エネルギー代謝を制御するホルモンとして作用する低カルボキシル化オステオカルシンを作り、分泌するといったことを確証する。エネルギー代謝に関し、かつ骨芽細胞中で生じる以前は知られていなかった遺伝経路が本明細書に記載され、この経路では、OST-PTPの活性の減少がガンマカルボキシラーゼの活性の減少をもたらし、これが、順に、骨芽細胞からの低カルボキシル化オステオカルシンの分泌の増加をもたらし、グルコースホメオスタシスに対する有益な効果を生じる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国仮特許出願第60/844,203号
【特許文献２】米国仮特許出願第60/870,604号
【特許文献３】米国仮特許出願第60/909,712号
【特許文献４】米国仮特許出願第60/945,081号
【特許文献５】米国特許第4,631,211号
【特許文献６】欧州特許第0464533号
【特許文献７】欧州特許第0232262号
【特許文献８】米国特許第4,489,159号
【特許文献９】米国特許第4,250,088号
【特許文献１０】米国特許第4,059,589号
【特許文献１１】米国特許第4,801,742号
【特許文献１２】米国特許第6,350,902号
【特許文献１３】米国特許第6,303,326号
【特許文献１４】米国特許第4,448,764号
【特許文献１５】米国特許第4,534,894号
【特許文献１６】米国特許第6,452,035号
【特許文献１７】米国特許出願公開第2007-0059731号
【特許文献１８】国際特許出願第99/15650号
【特許文献１９】国際特許出願第00/49162号
【特許文献２０】国際特許出願第94/12650号
【特許文献２１】国際特許出願第95/31560号
【特許文献２２】国際特許出願第96/29411号
【特許文献２３】米国特許第5,733,761号
【特許文献２４】米国特許第6,270,985号
【特許文献２５】米国特許第4,946,778号
【特許文献２６】米国特許第5,681,707号
【特許文献２７】米国特許第6,828,151号
【特許文献２８】米国特許出願第2004/0023390号
【特許文献２９】米国特許第4,522,811号
【特許文献３０】米国特許第6,560,471号
【特許文献３１】米国特許第5,108,921号
【特許文献３２】米国特許第5,354,844号
【特許文献３３】米国特許第5,416,016号
【特許文献３４】米国特許第5,459,127号
【特許文献３５】米国特許第5,521,291号
【特許文献３６】米国特許第5,543,158号
【特許文献３７】米国特許第5,547,932号
【特許文献３８】米国特許第5,583,020号
【特許文献３９】米国特許第5,591,721号
【特許文献４０】米国特許第4,426,330号
【特許文献４１】米国特許第4,534,899号
【特許文献４２】米国特許第5,013,556号
【特許文献４３】米国特許第5,108,921号
【特許文献４４】米国特許第5,213,804号
【特許文献４５】米国特許第5,227,170号
【特許文献４６】米国特許第5,264,221号
【特許文献４７】米国特許第5,356,633号
【特許文献４８】米国特許第5,395,619号
【特許文献４９】米国特許第5,416,016号
【特許文献５０】米国特許第5,417,978号
【特許文献５１】米国特許第5,462,854号
【特許文献５２】米国特許第5,469,854号
【特許文献５３】米国特許第5,512,295号
【特許文献５４】米国特許第5,527,528号
【特許文献５５】米国特許第5,534,259号
【特許文献５６】米国特許第5,543,152号
【特許文献５７】米国特許第5,556,948号
【特許文献５８】米国特許第5,580,575号
【特許文献５９】米国特許第5,595,756号
【特許文献６０】米国特許第5,830,682号
【特許文献６１】米国特許第6,514,514号
【特許文献６２】米国特許第6,511,958号
【特許文献６３】米国特許出願公開第2006/0063699号
【特許文献６４】米国特許出願公開第2006/0052327号
【特許文献６５】米国特許出願公開第2003/199615号
【特許文献６６】米国特許出願公開第2003/0158302号
【特許文献６７】米国特許出願公開第2004/0157864号
【特許文献６８】米国特許出願公開第2006/0292670号
【特許文献６９】米国特許出願公開第2007/0099831号
【特許文献７０】米国特許出願公開第2006/0257492号
【特許文献７１】米国特許第4,405,712号
【特許文献７２】米国特許第4,650,764号
【特許文献７３】米国特許第6,899,871号
【特許文献７４】米国特許第5,644,048号
【特許文献７５】米国特許第5,386,023号
【特許文献７６】米国特許第5,637,684号
【特許文献７７】米国特許第5,602,240号
【特許文献７８】米国特許第5,216,141号
【特許文献７９】米国特許第4,469,863号
【特許文献８０】米国特許第5,235,033号
【特許文献８１】米国特許第5,034,506号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Leeら、1996年、Mech Dev 59:153〜164頁
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【非特許文献１０】GarneroらJ Bone Miner Res 1994年;9:255〜4頁
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【非特許文献１５】Schumacherら、1996年、Science 271:1854〜7頁
【非特許文献１６】Brodyら、1999年、Mol. Diagn. 4:381〜8頁
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、エネルギー代謝およびOST-PTPシグナル伝達経路を調節する作用物質を含む医薬組成物を提供し、作用物質は、OST-PTPホスホリラーゼ活性を低下させ、ガンマカルボキシラーゼ活性を低下させ、または低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンを増加させ、医薬組成物は、耐糖能の増加、インスリン産生の増加、インスリン感受性の増加、膵臓ベータ細胞増殖の増加、アディポネクチン血清レベルの増加、酸化リン脂質の低下、アテローム性動脈硬化プラークの退縮、炎症性タンパク質生合成の減少、血漿コレステロールの低下、血管平滑筋細胞(VSMC)の増殖および数の低下、ならびに動脈性プラークの厚さの減少から成る群から選択される効果をもたらす量の作用物質を含む。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
ある実施形態では、医薬組成物は、代謝症候群、耐糖能障害、1型糖尿病、2型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、および肥満症から成る群から選択される障害を治療または予防するのに有効な量の作用物質を含む。ある実施形態では、作用物質は、OST-PTPもしくはガンマカルボキシラーゼの発現もしくは活性を阻害し、ガンマカルボキシラーゼのリン酸化を阻害し、低カルボキシル化もしくは非カルボキシル化オステオカルシンのレベルを増加させ、オステオカルシンのカルボキシル化を阻害し、オステオカルシンからカルボキシル基を除く。ある実施形態では、作用物質は、小分子、抗体、核酸、およびその生物学的活性断片または変異体から成る群から選択される。
【００１４】
ある実施形態では、作用物質は低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンである。ある実施形態では、成熟ヒトオステオカルシンの17、21、および24位に対応する位置の低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシン中のグルタミン酸の少なくとも1つはカルボキシル化されていない。ある実施形態では、成熟ヒトオステオカルシンの17、21、および24位に対応する位置の低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシン中のグルタミン酸の3つすべてはカルボキシル化されていない。
【００１５】
ある実施形態では、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンは、調製物中の成熟ヒトオステオカルシンの17、21、および24位に対応する位置の全Glu残基の約20%超はカルボキシル化されていない、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの調製物である。ある実施形態では、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンは、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンおよび成熟ヒトオステオカルシンを配列相同性が最大となるように整列させた場合、成熟ヒトオステオカルシンと少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する。
【００１６】
ある実施形態では、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンは、
(a)C末端から最後の10アミノ酸を欠く成熟ヒトオステオカルシンを含む断片、
(b)N末端から最初の10アミノ酸を欠く成熟ヒトオステオカルシンを含む断片、
(c)配列番号2のアミノ酸62〜90を含む断片、
(d)成熟ヒトオステオカルシンのアミノ酸1〜36を含む断片、および
(e)上記断片の変異体
から成る群から選択されるポリペプチドである。
【００１７】
ある実施形態では、医薬組成物は、ワルファリン、ベータ遮断薬、スタチン、ビタミンK阻害薬、およびその生物学的活性断片または変異体から成る群から選択される小分子を含む。好ましい実施形態では、小分子はワルファリンである。他の好ましい実施形態では、作用物質は、オステオカルシンまたはアディポネクチンの活性または発現を増加させる小分子である。
【００１８】
ある実施形態では、医薬組成物は、OST-PTPまたはガンマカルボキシラーゼに結合する抗体または抗体断片を含む。好ましくは、抗体または抗体断片はモノクローナル抗体である。ある実施形態では、抗体または抗体断片は、OST-PTPの細胞外ドメインに結合する。好ましい実施形態では、OST-PTPはヒトOST-PTPである。ある実施形態では、OST-PTPは、配列番号19のマウスOST-PTPまたは配列番号19に実質的に相同もしくは同一であるアミノ酸配列を有するOST-PTPである。ある実施形態では、OST-PTPは、配列番号19に少なくとも70%相同または同一であるアミノ酸配列を有するOST-PTPである。
【００１９】
ある実施形態では、医薬組成物は、OST-PTPまたはガンマカルボキシラーゼの発現または活性を阻害する核酸を含む。ある実施形態では、核酸はアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAである。ある実施形態では、核酸は、アンチセンスDNA、アンチセンスRNA、および小分子干渉RNAから成る群から選択される単離核酸であり、その核酸は、配列番号18または配列番号18に実質的に相同もしくは同一である配列に十分に相補的であり、配列番号18または配列番号18に実質的に相同もしくは同一である配列への特異的ハイブリダイゼーションを可能にし、ハイブリダイゼーションは、骨芽細胞中のOST-PTPの発現を予防しまたは低下させる。
【００２０】
ある実施形態では、医薬組成物は、血清インスリンのレベルを増加させる作用物質を含む。
【００２１】
ある実施形態では、医薬組成物は、約1mg〜約750mgの作用物質を含む。ある実施形態では、医薬組成物は、徐放性調製物に製剤された作用物質を含む。ある実施形態では、医薬組成物は、人体中でのその半減期を延長するために化学的に修飾された作用物質を含む。
【００２２】
ある実施形態では、医薬組成物は、抗凝固薬、血管拡張薬、アテローム性動脈硬化症を治療するために使用される薬剤、糖尿病を治療するために使用される薬剤、ビタミンK阻害薬、スタチン、またはベータ遮断薬を含む。
【００２３】
本発明はまた、アミノ酸配列
YLYQWLGAPVPYPDPLX1PRRX2VCX3LNPDCDELADHIGFQEAYRRFYGPV
(配列番号23)
を含む低カルボキシル化オステオカルシンポリペプチドを含む医薬組成物であって、
X1、X2、およびX3は、アミノ酸もしくはアミノ酸類似体からそれぞれ独立して選択され、ただし、X1、X2、およびX3がそれぞれグルタミン酸である場合、X1はカルボキシル化されておらず、もしくは50パーセント未満のX2はカルボキシル化されており、かつ/もしくは50パーセント未満のX3はカルボキシル化されており、
または上述のオステオカルシンポリペプチドは、X1、X2、およびX3以外の1〜7つの位置に配列番号23とは異なるアミノ酸配列を含み、
上述のアミノ酸配列は1つのアミドバックボーン置換を含むことができる医薬組成物をも提供する。
【００２４】
ある実施形態では、配列番号23のオステオカルシンポリペプチドは融合タンパク質である。ある実施形態では、配列番号23の43位のアルギニンは、オステオカルシンポリペプチドのタンパク質分解性の分解に対する感受性を低下させるアミノ酸またはアミノ酸類似体と交換される。ある実施形態では、配列番号23の44位のアルギニンはβ-ジメチルアルギニンと交換される。ある実施形態では、オステオカルシンポリペプチドは非カルボキシル化ヒトオステオカルシンのレトロエナンチオマーである(1〜49)。
【００２５】
本発明はまた、エネルギー代謝に関する経路およびOST-PTPシグナル伝達経路を調節する方法であって、OST-PTPホスホリラーゼ活性を低下させ、ガンマカルボキシラーゼ活性を低下させ、または低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンを増加させる作用物質を投与するステップを含み、作用物質は、耐糖能の増加、インスリン産生の増加、インスリン感受性の増加、膵臓ベータ細胞増殖の増加、アディポネクチン血清レベルの増加、酸化リン脂質の低下、アテローム性動脈硬化プラークの退縮、炎症性タンパク質生合成の減少、血漿コレステロールの低下、血管平滑筋細胞(VSMC)の増殖および数の低下、ならびに動脈性プラークの厚さの減少から成る群から選択される効果をもたらす量で投与される方法をも提供する。ある実施形態では、作用物質は、代謝症候群、耐糖能障害、1型糖尿病、2型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、および肥満症から成る群から選択される障害を治療または予防するのに有効な量で投与される。
【００２６】
ある実施形態では、その方法は、代謝症候群、耐糖能障害、1型糖尿病、2型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、および肥満症から成る群から選択される障害を治療または予防するのに有効な量で作用物質を投与するステップを含む。ある実施形態では、作用物質は、OST-PTPまたはガンマカルボキシラーゼの発現または活性を阻害し、ガンマカルボキシラーゼのリン酸化を阻害し、低カルボキシル化または非カルボキシル化オステオカルシンのレベルを増加させ、オステオカルシンのカルボキシル化を阻害し、オステオカルシンからカルボキシル基を除く。ある実施形態では、作用物質は、小分子、抗体、核酸、およびその生物学的活性断片または変異体から成る群から選択される。
【００２７】
ある実施形態では、作用物質は低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンである。ある実施形態では、成熟ヒトオステオカルシンの17、21、および24位に対応する位置の低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシン中のグルタミン酸の少なくとも1つはカルボキシル化されていない。ある実施形態では、成熟ヒトオステオカルシンの17、21、および24位に対応する位置の低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシン中のグルタミン酸の3つすべてはカルボキシル化されていない。ある実施形態では、本発明は、インスリン産生を増加させるために低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンを投与する方法を提供する。
【００２８】
ある実施形態では、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンは、調製物中の、成熟ヒトオステオカルシンの17、21、および24位に対応する位置の全Glu残基の約20%超はカルボキシル化されていない、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの調製物である。ある実施形態では、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンは、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンおよび成熟ヒトオステオカルシンを配列相同性が最大となるように整列させた場合、成熟ヒトオステオカルシンと少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する。
【００２９】
ある実施形態では、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンは、
(a)C末端から最後の10アミノ酸を欠く成熟ヒトオステオカルシンを含む断片、
(b)N末端から最初の10アミノ酸を欠く成熟ヒトオステオカルシンを含む断片、
(c)配列番号2のアミノ酸62〜90を含む断片、
(d)成熟ヒトオステオカルシンのアミノ酸1〜36を含む断片、および
(e)上記断片の変異体
から成る群から選択されるポリペプチドである。
【００３０】
ある実施形態では、作用物質は、OST-PTPまたはガンマカルボキシラーゼの発現または活性を阻害する小分子である。ある実施形態では、作用物質は、ワルファリン、ベータ遮断薬、スタチン、ビタミンK阻害薬、およびその生物学的活性断片または変異体から成る群から選択される小分子である。好ましい実施形態では、小分子はワルファリンである。他の好ましい実施形態では、作用物質は、オステオカルシンまたはアディポネクチンの活性または発現を増加させる小分子である。
【００３１】
ある実施形態では、作用物質は、OST-PTPまたはガンマカルボキシラーゼに結合する抗体または抗体断片である。好ましくは、抗体または抗体断片はモノクローナル抗体である。ある実施形態では、抗体または抗体断片は、OST-PTPの細胞外ドメインに結合する。好ましい実施形態では、OST-PTPはヒトOST-PTPである。ある実施形態では、OST-PTPは、配列番号19のマウスOST-PTPまたは配列番号19に実質的に相同もしくは同一であるアミノ酸配列を有するOST-PTPである。ある実施形態では、OST-PTPは、配列番号19に少なくとも70%相同または同一であるアミノ酸配列を有するOST-PTPである。
【００３２】
ある実施形態では、作用物質は、OST-PTPまたはガンマカルボキシラーゼの発現または活性を阻害する核酸である。ある実施形態では、核酸はアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAである。ある実施形態では、核酸は、アンチセンスDNA、アンチセンスRNA、および小分子干渉RNAから成る群から選択される単離核酸であり、その核酸は、配列番号18または配列番号18に実質的に相同もしくは同一である配列に十分に相補的であり、配列番号18または配列番号18に実質的に相同もしくは同一である配列への特異的ハイブリダイゼーションを可能にし、ハイブリダイゼーションは、骨芽細胞中のOST-PTPの発現を予防しまたは低下させる。
【００３３】
ある実施形態では、本発明の方法は、約1mg〜約750mgの作用物質を投与することにより実行される。ある実施形態では、作用物質は徐放性調製物に製剤される。ある実施形態では、作用物質は、人体中でのその半減期を延長するために化学的に修飾される。ある実施形態では、作用物質は、抗凝固薬、血管拡張薬、アテローム性動脈硬化症を治療するために使用される薬剤、糖尿病を治療するために使用される薬剤、ビタミンK阻害薬、スタチン、またはベータ遮断薬と同時投与される。
【００３４】
本発明はまた、エネルギー代謝およびOST-PTPシグナル伝達経路に関する疾患を発症する危険性がある患者を診断する方法であって、(i)患者由来の生物学的試料中の全オステオカルシンに対する低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの比を決定するステップと、(ii)その比を標準の比と比較するステップとを含み、患者の比が標準の比よりも低い場合、患者が、OST-PTPシグナル伝達経路に関する疾患を発症する危険性がある方法をも提供する。
【００３５】
ある実施形態では、OST-PTPシグナル伝達経路に関する疾患は、代謝症候群、耐糖能障害、1型糖尿病、2型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、および肥満症から成る群から選択される。ある実施形態では、OST-PTPシグナル伝達に関する疾患は、インスリン産生の減少、インスリン感受性の減少、耐糖能の減少、および/または体脂肪量の増加によって特徴づけられる。
【００３６】
ある実施形態では、生物学的試料は血液である。
【００３７】
上記に記載される診断方法のある実施形態では、標準の比は、5%〜10%、10%〜15%、15%〜20%、20%〜25%、25%〜30%、または30%〜35%である。
【００３８】
本発明は、耐糖能の増加、インスリン産生の増加、インスリン感受性の増加、膵臓ベータ細胞増殖の増加、アディポネクチン血清レベルの増加、酸化リン脂質の低下、アテローム性動脈硬化プラークの退縮、炎症性タンパク質生合成の減少、血漿コレステロールの低下、血管平滑筋細胞(VSMC)の増殖および数の低下、ならびに動脈性プラークの厚さの減少から成る群から選択される効果をもたらす量での、エネルギー代謝およびOST-PTPシグナル伝達経路を調節しOST-PTPホスホリラーゼ活性を低下させ、ガンマカルボキシラーゼ活性を低下させ、または低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンを増加させる作用物質の、医薬としての使用を提供する。
【００３９】
ある実施形態では、作用物質は、代謝症候群、耐糖能障害、1型糖尿病、2型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、および肥満症から成る群から選択される障害を治療または予防するために使用される。
【００４０】
ある実施形態では、作用物質は、ガンマカルボキシラーゼのリン酸化を阻害する。ある実施形態では、作用物質は、非カルボキシル化オステオカルシンのレベルを増加させる。ある実施形態では、作用物質は、オステオカルシンのカルボキシル化を阻害する。ある実施形態では、作用物質は、オステオカルシンからカルボキシル基を除く。
【００４１】
ある実施形態では、作用物質は低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンである。ある実施形態では、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンはインスリン産生を増加させる。ある実施形態では、成熟ヒトオステオカルシンの17、21、および24位に対応する位置の低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシン中のグルタミン酸の少なくとも1つはカルボキシル化されていない。ある実施形態では、成熟ヒトオステオカルシンの17、21、および24位に対応する位置の低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシン中のグルタミン酸の3つすべてはカルボキシル化されていない。ある実施形態では、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンは、調製物中の成熟ヒトオステオカルシンの17、21、および24位に対応する位置の全Glu残基の約20%超はカルボキシル化されていない、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの調製物である。ある実施形態では、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンは、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンおよび成熟ヒトオステオカルシンを配列相同性が最大となるように整列させた場合、成熟ヒトオステオカルシンと少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する。
【００４２】
ある実施形態では、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンは、
(a)C末端から最後の10アミノ酸を欠く成熟ヒトオステオカルシンを含む断片、
(b)N末端から最初の10アミノ酸を欠く成熟ヒトオステオカルシンを含む断片、
(c)配列番号2のアミノ酸62〜90を含む断片、
(d)成熟ヒトオステオカルシンのアミノ酸1〜36を含む断片、および
(e)上記断片の変異体
から成る群から選択されるポリペプチドである。
【００４３】
ある実施形態では、作用物質は、小分子、抗体、核酸、およびその生物学的活性断片または変異体から成る群から選択される。
【００４４】
ある実施形態では、作用物質は、OST-PTPまたはガンマカルボキシラーゼの発現または活性を阻害する小分子である。ある実施形態では、作用物質は、ワルファリン、ベータ遮断薬、スタチン、ビタミンK阻害薬、およびその生物学的活性断片または変異体から成る群から選択される小分子である。好ましい実施形態では、小分子はワルファリンである。他の好ましい実施形態では、作用物質は、オステオカルシンまたはアディポネクチンの活性または発現を増加させる小分子である。
【００４５】
ある実施形態では、作用物質は、OST-PTPまたはガンマカルボキシラーゼに結合する抗体または抗体断片である。好ましくは、抗体または抗体断片はモノクローナル抗体である。ある実施形態では、抗体または抗体断片は、OST-PTPの細胞外ドメインに結合する。好ましい実施形態では、OST-PTPはヒトOST-PTPである。ある実施形態では、OST-PTPは、配列番号19のマウスOST-PTPまたは配列番号19に実質的に相同もしくは同一であるアミノ酸配列を有するOST-PTPである。ある実施形態では、OST-PTPは、配列番号19に少なくとも70%相同または同一であるアミノ酸配列を有するOST-PTPである。
【００４６】
ある実施形態では、作用物質は、OST-PTPまたはガンマカルボキシラーゼの発現または活性を阻害する核酸である。ある実施形態では、核酸はアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAである。ある実施形態では、核酸は、アンチセンスDNA、アンチセンスRNA、および小分子干渉RNAから成る群から選択される単離核酸であり、その核酸は、配列番号18または配列番号18に実質的に相同もしくは同一である配列に十分に相補的であり、配列番号18または配列番号18に実質的に相同もしくは同一である配列への特異的ハイブリダイゼーションを可能にし、ハイブリダイゼーションは、骨芽細胞中のOST-PTPの発現を予防しまたは低下させる。
【００４７】
ある実施形態では、約750mgの作用物質は医薬として使用される。ある実施形態では、作用物質は徐放性調製物に製剤される。ある実施形態では、作用物質は、人体中でのその半減期を延長するために化学的に修飾される。ある実施形態では、作用物質は、抗凝固薬、血管拡張薬、アテローム性動脈硬化症を治療するために使用される薬剤、糖尿病を治療するために使用される薬剤、ビタミンK阻害薬、スタチン、またはベータ遮断薬と同時投与される。
【００４８】
本発明は、代謝状態の治療のための医薬の製造における、低カルボキシル化オステオカルシンポリペプチドまたはそのミメティックの使用を提供する。
【００４９】
本発明はまた、代謝症候群、耐糖能障害、1型糖尿病、2型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、および肥満症から成る群から選択される障害の治療または予防のための医薬の製造のための、耐糖能の増加、インスリン産生の増加、インスリン感受性の増加、膵臓ベータ細胞増殖の増加、アディポネクチン血清レベルの増加、酸化リン脂質の低下、アテローム性動脈硬化プラークの退縮、炎症性タンパク質生合成の減少、血漿コレステロールの低下、血管平滑筋細胞(VSMC)の増殖および数の低下、ならびに動脈性プラークの厚さの減少から成る群から選択される効果をもたらす量での、エネルギー代謝およびOST-PTPシグナル伝達経路を調節しOST-PTPホスホリラーゼ活性を低下させ、ガンマカルボキシラーゼ活性を低下させ、または低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンを増加させる作用物質の使用をも提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】Esp-/-マウスでのインスリン分泌およびベータ細胞増殖の増加を示す図である。(A)膵臓または脂肪パッド中ではなく骨および精巣中のEsp遺伝子座活性を実証する新生仔Esp-/-マウス由来のLacZ染色組織。(B)1月齢マウスでのリアルタイムPCRによる、骨芽細胞、脂肪細胞、および膵島中でのEspの発現。(C)Esposb-/-マウスの骨芽細胞中のEsp遺伝子座での効果的な組換えを示すサザンブロット分析。(D)リアルタイムPCRを使用すると、Esp発現は、Esposb-/-マウスの骨芽細胞中で90%減少するが、精巣中では変化しない。(E)Esp+/-マウスの間の交雑から生まれたEsp-/-の子の離乳時の百分率の減少。(F)Esp+/-およびEsp-/-の母親から生まれたEsp-/-の子の出生および離乳時のより低い生存。(GおよびH)示す年齢での給餌前の(P0)またはランダムな給餌後のWTおよびEsp-/-新生仔の血糖レベル(G)および血清インスリンレベル(H)。(I〜J)1月齢のWTマウスおよびEsp-/-マウスでのGSIS(I)およびGTT(J)試験。(K)WTマウスおよび1月齢Esp-/-マウスの膵臓中のより大きな島およびベータ細胞増殖の増加を示すH&E染色、インスリン免疫染色、およびインスリン/Ki67二重免疫染色。矢印は島を示し、矢はKi67ポジティブ細胞を指す。スケールバーは、スケールバーが800mmである上パネル以外においては100mmである。1月齢のWTマウスおよびEsp-/-マウスの間の島の数、サイズ、およびベータ細胞量の組織形態計測的比較(最下のパネル)。(L)1月齢のWTマウスおよびEsp-/-マウスの膵臓インスリン含有量。(M)P5および1月齢のWTマウスおよびEsp-/-マウスの膵島中のKi67免疫反応性細胞の数の定量化。(I)および(J)以外のすべてのパネルで、WTに対して°p<0.05および*p<0.01(スチューデントt検定)。(IおよびJ)WTに対して°p<0.05およびWTに対して*p%0.001(ANOVA、その後事後分析)。
【図２】Esp-/-マウスでのインスリン感受性およびアディポネクチン発現の増加を示す図である。実験はすべて、他に示さない限り、1月齢マウスのWTおよびEsp-/-を比較する。(A)ITT。(B)高インスリン正常血糖クランプの間のグルコース注入速度。(C)リアルタイムPCRによって測定した、骨格筋中のインスリン感受性のマーカーの発現。(D)腓腹筋中のミトコンドリアエリアの電子顕微鏡画像(上パネル、20,0003)および対応する定量化(下パネル)。スケールバーは1mmである。(E)Esposb-/-マウスでのオイルレッドO染色肝臓切片上の脂肪滴の数の減少(上パネル)およびリアルタイムPCRによるインスリン標的遺伝子の発現の修飾(下パネル)。スケールバーは50mmである。(F)脂肪パッド量(体重に対する脂肪パッド重量)。(G)エネルギー消費量。(H)一晩の絶食後の血清トリグリセリドレベル。(I)WTマウスおよびEsp-/-マウスの脂肪組織のH&E染色(上パネル)ならびにスライド当たりの100個の測定した脂肪細胞についての直径のそれぞれの分布(下パネル)。スケールバーは50mmである。(J)脂肪中の脂肪生成、脂質生成、脂肪取り込み、および脂肪分解のマーカーの発現。(K)摂食マウスおよび一晩絶食マウスの血清遊離脂肪酸(FFA)。(L)脂肪中のレプチン、レジスチン、およびアディポネクチンの発現。(M)給餌前の(P0)および他の示した年齢でのランダムな給餌後の新生仔マウスのアディポネクチンの血清レベル。(N)WTマウスおよびEsp-/-マウスの組織中のアディポネクチン標的遺伝子の発現。(A)では、WTに対して°p<0.05およびWTに対して*p%0.001(ANOVA、その後事後分析)。(B)〜(N)では、WTに対して*p<0.01(スチューデントt検定)。
【図３】Esp-/-マウスが肥満症および耐糖能障害から防御されることを示す図である。A〜F)GTGまたは賦形剤注射3か月後の4月齢のWTマウスおよびEsp-/-マウスの1日当たりの食物摂取量(A)、体重曲線(B)、脂肪パッド量(C)、血清トリグリセリドレベル(D)、GTT(E)、およびITT(F)。(G〜I)6週間高脂肪食を与えた3月齢のWTマウスおよびEsp-/-マウスでの体重曲線(G)、GTT(H)、およびITT(I)。(JおよびK)STZまたは賦形剤の注射8日後の1月齢WTおよびEsp-/-マウスでの血清インスリンレベル(J)および膵臓インスリン含有量(K)。(LおよびM)STZ注射後の8日の間の1月齢のWTマウスおよびEsp-/-マウスでのマウスの生存(L)および血糖レベルの変化(M)。(N)STZ注射の8日後の1月齢のWTマウスおよびEsp-/-マウスでの尿中グルコースアッセイ。(A)〜(F)、(J)、および(K)では、a、WT対Esp-/-;b、WT+GTG(またはSTZ)対WT+賦形剤;c、WT+GTG(またはSTZ)対Esp-/-+GTG(またはSTZ);d、Esp-/-+GTG(またはSTZ)対Esp-/-+賦形剤。(G)〜(I)および(M)では、*p<0.05WT対Esp-/-。(A)、(C)、(D)、(J)、および(K)では、スチューデントt検定、a〜dについてp<0.05;(B)、(E)〜(I)、(L)、および(M)では、グループの数>2の場合、ANOVA、その後事後分析、a〜dについてp%0.001。
【図４】骨芽細胞が、インスリンおよびアディポネクチンの発現を制御する因子を分泌することを示す図である。A〜E)実験はすべて、1月齢のWTマウスおよびa1(I)-Espマウスを比較する。(A)インスリン免疫染色(上パネル)ならびに膵臓中の島の数、サイズ、ベータ細胞量、およびKi67免疫反応性細胞の組織形態計測的比較(下パネル)。スケールバーは100mmである。(B)血糖および血清インスリン/アディポネクチンのレベル。(C)GSIS試験。(D)GTT。(E)ITT。(F)線維芽細胞または骨芽細胞と共培養したWT島中のインスリンおよびグルカゴンの発現。(G)線維芽細胞または骨芽細胞と共培養したWT脂肪細胞中のアディポネクチンおよびレプチンの発現。(H)線維芽細胞または骨芽細胞と共培養した、Esp-/-を示す細胞中のインスリンおよびアディポネクチンの発現。(IおよびJ)骨芽細胞とまたは骨芽細胞なしで共培養したWTを示す細胞中の、細胞間接触を予防するフィルターの存在下でのまたは骨芽細胞培養物から収集した条件培地(CM)の存在下でのインスリン(I)およびアディポネクチン(J)の発現。(A、B、およびF〜J)*p<0.05対WT(スチューデントt検定);(C〜E)WTに対して°p<0.05およびWTに対して*p%0.001(ANOVA)。
【図５】オステオカルシンがベータ細胞増殖、インスリン分泌、およびインスリン感受性を制御することを示す図である。実験はすべて、他に示さない限り、3月齢のWTマウスおよびOc-/-マウスを比較する。(A)ランダムな給餌後の血糖レベル。(B)インスリンレベル。(C)GSIS試験。(D)GTT。(E)ITT。(F)高インスリン正常血糖クランプの間のグルコース注入速度。(G)エネルギー消費量。(H)リアルタイムPCRによるインスリン標的遺伝子の発現。(I)膵臓中の島の数、島のサイズ、ベータ細胞量、インスリン含有量、および膵島中のKi67免疫反応性細胞の組織形態計測的比較。P5、5日齢の子;3M、3月齢マウス。(J)脂肪パッド量(体重に対する脂肪パッド重量)。(K)一晩の絶食後の血清トリグリセリドレベル。(LおよびM)アディポネクチンの血清レベル(L)および遺伝子発現(M)。(N)リアルタイムPCRによるアディポネクチン標的遺伝子の発現。(O)示す遺伝子型の骨芽細胞と共培養したWT膵島中のインスリンおよびグルカゴンの発現。(P)示す遺伝子型の骨芽細胞と共培養したWT脂肪細胞中のアディポネクチンおよびレプチンの発現。(Q)オステオカルシン発現ベクターまたはその空の対応物で形質移入したCOS細胞からの条件培地の存在下で培養した、WTを示す細胞中のインスリンおよびアディポネクチンの発現。(R)組換えオステオカルシン(3ng/ml)もしくは賦形剤の存在下の線維芽細胞とまたはオステオカルシンを発現する(5d)もしくはしない(1d)骨芽細胞と共培養したWT島および脂肪細胞中のインスリンおよびアディポネクチンの発現。(SおよびT)グルコースおよび20ngの組換えオステオカルシンまたは賦形剤を同時に注射したOcn-/-マウスでのグルコース(S)およびインスリン(T)のレベルの変遷の型。パネルA、B、F〜R:WTに対して*p<0.05(スチューデントt検定);パネルC〜E、S、およびT、WTに対して°p≦0.01およびWTに対して*p≦0.001(ANOVA)。結果は、平均値±SEMを示す図5F以外においては、平均値±SDとして示す。
【図６】オステオカルシンが、アディポネクチンを介してインスリン感受性を制御することを示す図である。(A〜E)6週齢のWTマウス、アディポネクチン+/-(Adipo+/-)マウス、オステオカルシン+/-(Ocn+/-)マウス、およびOcn+/-;Adipo+/-マウスの間の比較。(A)ITT。(B)インスリン血清レベル。(C)血糖レベル。(D)GSIS試験。(E)アディポネクチン血清レベル。(A)および(D)では、WTに対して*p%0.001(ANOVA、その後事後分析);(B)、(C)、および(E)では、WTに対して*p<0.05(スチューデントt検定)。
【図７】Esp-/-マウスが、オステオカルシン生物活性増加のモデルであることを示す図である。(A〜G)6週齢のWTマウス、Esp-/マウス、Ocn+/-マウス、およびEsp-/-;Ocn+/-マウスの間の比較。(A)血糖レベル。(B)血清インスリンレベル。(C)血清アディポネクチンレベル。(D)GTT。(E)ITT。(F)GSIS試験。(G)膵島中のKi67免疫反応性細胞の数の定量化。(HおよびI)示す遺伝子型の1月齢マウスの血清(H)のまたはワルファリンもしくは賦形剤を用いて処理した骨芽細胞培養物からの条件培地(I)の15分間のインキュベーション後のヒドロキシアパタイト(HA)樹脂に結合したオステオカルシンの百分率の定量化。(J)ワルファリンまたは賦形剤を用いて処理した骨芽細胞と共培養したWT脂肪細胞中のアディポネクチンの発現。(K)賦形剤のまたは1ng/mlの市販で入手可能なカルボキシル化オステオカルシン(Immunotopics)もしくは細菌によって生産した非カルボキシル化オステオカルシンの存在下で培養したWT脂肪細胞中のアディポネクチンの発現。(L)細菌によって生産した0.3ng/mlの非カルボキシル化オステオカルシンまたは賦形剤の存在下で培養したWT島中のインスリンおよびサイクリンD1の発現。(M)コントロールおよび肥満患者での代謝パラメーターおよび全血清オステオカルシンレベル。(N〜O)コントロールおよび肥満患者でのカルボキシル化オステオカルシン(HA結合オステオカルシン)の定量化。(A)〜(C)および(G)〜(L)では、WTに対して*p<0.05(スチューデントt検定)、(D)〜(F)では、WTに対して°p<0.05およびWTに対して*p%0.001(ANOVA、その後事後分析)。
【図８】PCR法および市販で入手可能なキットを使用する部位特異的突然変異誘発を使用してCOS細胞中でOST-PTPを突然変異させたことを示す図である。突然変異したOST-PTP(GST-PTP CA)は、COS細胞(左側の上パネル)およびROS細胞(右側の上パネル)(3番目のレーン)中でインスリン受容体(InsR)と相互作用するが、WT OST-PTP(GST-PTP WT)は相互作用しない(2番目のレーン)。同量のGST融合タンパク質を基質捕捉に使用した(下パネル)。GST=組換えの、細菌によって生産したグルタチオンS-トランスフェラーゼタンパク質。
【図９】突然変異体酵素OST-PTPD1316Aがガンマカルボキシラーゼを捕捉し、それによって、ガンマカルボキシラーゼがOST-PTPの基質であることを実証する図である。しかしながら、これは、ガンマカルボキシラーゼがOST-PTPの唯一の基質であることを意味しない。PTPが形質移入されていないので、GSTレーンで結合はなかった。それは、捕捉がある場合に、捕捉があらゆるGST融合タンパク質のGST部分によるものではないことを示すためにコントロールとした。GST-PTPWTは基質ガンマカルボキシラーゼを脱リン酸し、次いでガンマカルボキシラーゼは放出されるので、この形態との捕捉もまたなかった。突然変異により、基質が酵素に不可逆的に結合し、かつ酵素によって保持されることを可能にする、OST-PTPホスファターゼ活性の欠損を工学技術で作ったので、バンドは、突然変異体OST-PTP(GST-PTPD1316A)を有するレーンで明確に見られる。
【図１０】オステオカルシン皮下注入がwtマウスの血糖症を減少させることを示す図である。示す用量の組換えオステオカルシンまたはPBSをwtマウスに28日間皮下に注入した。血糖を、示す日に測定した。
【図１１】オステオカルシン皮下注入がwtマウスの耐糖能を増加させることを示す図である。wtマウスは、グルコースの単一注射を受ける前に、14日間、示す用量の組換えオステオカルシンまたはPBSを皮下に注入した。血糖は、その後、示す時間に測定した。
【図１２】オステオカルシン皮下注入がwtマウスのインスリン感受性を増加させることを示す図である。wtマウスは、インスリンの単一注射を受ける前に、18日間、示す用量の組換えオステオカルシンまたはPBSを皮下に注入した。血糖は、その後、示す時間に測定した。
【図１３】オステオカルシン皮下注入がwtマウスの体脂肪量を減少させることを示す図である。1)示す用量の組換えオステオカルシンまたはPBSをwtマウスに28日間皮下に注入した。体重は示す日に記録した。(2)生殖腺の脂肪パッド量を28日後に測定した。
【図１４】オステオカルシン皮下注入がwtマウスのGTG誘発性肥満症を予防することを示す図である。wtマウスに金チオグルコース(GTG)または賦形剤を注射して、過食症および肥満症を誘発した。2週目後に、28日間、1n/時の組換えオステオカルシンまたはPBSを注入する皮下浸透性ポンプをマウスに事前に植え込んだ。体重増加は、その後、示す日に記録した。
【図１５】オステオカルシンの断片(1〜36)が、in vitroでアディポネクチン発現を誘発する際に天然のオステオカルシンと同じくらい効力があることを示す図である。Wt脂肪細胞は、組換え完全長オステオカルシン(1〜46)または切断形態(1〜36)または賦形剤を用いて4時間処理した。次いで、アディポネクチン発現をリアルタイムPCRによって定量化した。
【図１６】野生型骨芽細胞へのイソプロテレノール(SNS活性を高める)の適用の、ptprv=Esp/OST-PTP、Ggcx=ガンマカルボキシラーゼ、Vkor=ビタミンKの再利用/ggcx活性に必要、およびBgp=オステオカルシンの発現に対する効果を示す図である。wt骨芽細胞中のmRNAレベルを定量PCRを使用して測定した。
【図１７】様々な遺伝子型:WTマウス、ob-/+マウス(肥満症についてヘテロ接合)、ob/obマウス、Bgp-/+(オステオカルシンについてヘテロ接合)、BGP-/-マウス、およびさらにBgp-/-(Oc欠損)でもあるob/ob/マウスを有する1週齢マウスの血清インスリンのレベルを示す図である。
【図１８】オステオカルシン欠損マウスが西洋食で6週後にアテローム発生病変を発症することを示す図である。大動脈弁のレベルでの、大動脈入口部の組織学的分析はアテローム発生病変が存在することを明確に示す。
【図１９】OST-PTPをコードするEsp遺伝子の欠如が、アテローム性動脈硬化病変を発症することからApoE-/-マウスを防御することを示す図である。ApoE-/-マウスは、6週間西洋食を与えた後にアテローム性動脈硬化病変を発症するが、同じ飼料の二重突然変異体ApoE-/-;Esp-/-マウスは発症しない。
【図２０】骨によるオステオカルシン生産の制御のための経路を示す図である。(上パネル)Espによってコードされるタンパク質であるOST-PTPは、オステオカルシンのγ-カルボキシル化を促進し、したがって、このホルモンの活性形態である非カルボキシル化オステオカルシンのプールを減らす。その結果として、β-細胞増殖、インスリン発現、およびアディポネクチン発現は正常に刺激される。(下パネル)OST-PTPの非存在下では、オステオカルシンのγ-カルボキシル化は妨害され、より多くの非カルボキシル化オステオカルシンがあり、その結果として、β-細胞増殖、インスリン発現、およびアディポネクチン発現は増加する。これは、グルコース処理の改善および体脂肪量の減少をもたらす。
【図２１】種の中のオステオカルシンの高度な保存アミノ酸配列相同性を示す図である。
【図２２】Esposb-/-マウスの産生およびEsp-/-動物での正常な骨形成を示す図である。(A)Espの暫定的な不活性化のための標的構築物。白色のボックス、OST-PTPのホスファターゼドメインをコードするエキソン;灰色の三角形、LoxP部位;黒色のバー、5’および3’外部プローブ;S、Sacl;EV、EcoRV。(B)Esposb-/-マウスのPCR遺伝子型同定。WTおよびフロックス化された対立遺伝子(Fl)は280bpおよび350bpの産物をそれぞれ産出する。1(I)コラーゲン-Cre(1(I)-Cre))遺伝子導入マウス(TG)は導入遺伝子特異的バンドを持つ。(C〜D)WTマウスおよびEsp-/-マウスでの類似する体重増加(C)および直線的成長(D)。P0、新生仔;1M、1か月(E)新生仔のWTマウスおよびEsp-/-マウスの骨格を染色するアリザリンレッド/アルシアンブルー。マウスを解剖し、95%エタノール中で固定し、以前に記載されるように(Ducyら、1996年)アルシアンブルーおよびアリザリンレッドで染色した。突然変異体の子の周産期死亡について説明することができる、石灰化の明白な欠損はない。(F)2月齢のWTマウスおよびEsp-/-マウスの骨組織形態計測。BV/TV、全組織容量当たりの骨容量(%);N.ob/B.Pm、骨周囲長当たりの骨芽細胞の数(mm-1);Dpd/Creat.骨吸収のマーカーであるデオキシピリジノリン架橋結合の相対的レベル。
【図２３】(A〜E)1月齢のWTマウスおよびEsp-/-マウスの比較を示す図である。Esp-/-マウスのC-ペプチドの血清レベル(A)、膵臓中の血清グルカゴンレベル(左側)、およびグルカゴン含有量(右側)(B)ならびにIGF-1(C)、PYY(D)、およびアミリン(E)の血清レベル。(F)10週齢のWTマウスおよびEsp-/-マウスでのプロトン磁気共鳴分光法(1H-MRS)によって算出した体重に対する筋肉量の比を示す図である。(G)10週齢のWTマウスおよびEsp-/-マウスのプロトン1H-MRSの代表的な画像である。(H)1月齢および3月齢のEsp-/-マウスおよびWTマウスでの1日当たりの食物摂取量を示す図である。(IおよびJ)1月齢のEsp-/-マウスならびにWTマウスでのリアルタイムPCRによる発現レベル(I)ならびにTNF-(左側)およびIL-6(右側)の血清レベル(J)の比較を示す図である。(K)1月齢のEsp-/-マウスおよびWTマウスでの血清レプチン(左側)および血清レジスチン(右側)のレベルを示す図である。すべてのパネルで、データは実験の平均値±SDを表す。*、P<0.01(t-検定)。
【図２４】GTGによるVMH核の破壊を示す図である。GTGまたは賦形剤を注射したWTマウスおよびEsp-/-マウスの視床下部の切片を染色するクレシルバイオレット。弓状核は青色で囲まれ、VMHは赤色で囲まれる。
【図２５】共培養アッセイの間の細胞分化転換の欠如を示す図である。(A〜D)脂肪細胞または島との骨芽細胞の共培養の4時間後の、示す細胞中でのリアルタイムPCRによるRunx2(A)、オステオカルシン(B)、アディポネクチン(C)、およびレプチン(D)発現の分析。
【図２６】オステオカルシンの骨特異的発現を示す図である。(A)18.5dpc胚の膵臓中のオステオカルシンおよびEspの発現のin situハイブリダイゼーション分析。どの遺伝子も膵臓中で発現しない。インスリン発現はポジティブコントロールとして使用した。隣接した切片のヘマトキシリンエオシン染色は組織の完全性を判断するために使用した。(B)1月齢WTマウスから収集した骨芽細胞、脂肪細胞、および膵島中のオステオカルシン発現のリアルタイムPCR分析。オステオカルシンは脂肪細胞または島中で発現しない。
【図２７】Esp-/-およびアルファ1(I)Espマウスでの正常なオステオカルシン発現および血清レベルを示す図である。(A〜B)1月齢のWTマウス、Esp-/-マウス、およびアルファ1(I)Espマウスでのオステオカルシン発現(A)およびオステオカルシン血清レベル(B)のリアルタイムPCR分析。(C)クーマシーブルーを用いて染色したSDS-PAGEによる、細菌によって生産したオステオカルシンの純度の分析。
【図２８】遺伝子導入マウスでのアディポネクチンの過剰発現が体脂肪量を減少させ、インスリン感受性を増加させることを示す図である。(A)マウスでアディポネクチン(Adipo)を過剰発現させるために使用する導入遺伝子の略図。(B)SAP-Adipo遺伝子導入マウスのPCR遺伝子型同定。(C)1月齢の3匹の別個のSAP-Adipo遺伝子導入系でのアディポネクチン血清レベル。(D)3月齢のWTマウスおよびSAP-Adipo遺伝子導入マウスでの脂肪パッド量。(E)3月齢のWTマウスおよびSAP-Adipo遺伝子導入マウスでの血清インスリンレベル。(F)3月齢のWTマウスおよびSAP-Adipo遺伝子導入マウスでのインスリン耐性試験。
【図２９】遺伝子導入マウスでのインスリンの過剰発現が体脂肪量を減少させ、耐糖能を増加させることを示す図である。(A〜B)SAP-インスリン遺伝子導入マウスおよびwtマウスでの絶食(A)またはランダムな給餌(B)後の血糖レベル。(C)WTマウスおよびSAP-インスリン遺伝子導入マウスでのトリグリセリドの血清レベル。(D)WTマウスおよびSAP-インスリン遺伝子導入マウスでの遊離脂肪酸の血清レベル。(E)WTマウスおよびSAP-インスリン遺伝子導入マウスでの脂肪パッド量。(F)WTマウスおよびSAP-インスリン遺伝子導入マウスでの耐糖能試験。(G)WTマウスおよびSAP-インスリン遺伝子導入マウスでの食物摂取量。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本発明は、骨中の骨芽細胞によって分泌される低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンがエネルギー代謝の様々な側面の制御を担うといった発見に部分的に基づく。たとえば、それは、膵臓ベータ細胞増殖、インスリン分泌、インスリン感受性、耐糖能、および血清アディポネクチンを増加させ、重量増加および体脂肪量を減少させる。それはまた、アテローム性動脈硬化症の病理学的影響をも低下させる。したがって、本発明のある態様は、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシン、その断片、および変異体の、代謝症候群、1型および2型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、ならびに肥満症を治療または予防するための治療上の使用を対象とする。
【００５２】
本発明はまた、ガンマカルボキシラーゼがオステオカルシンをカルボキシル化し、それによってオステオカルシンを不活性化するといった発見にも基づく。オステオカルシンのそのような不活性化は、膵臓ベータ細胞増殖、インスリン分泌、インスリン感受性、耐糖能、および血清アディポネクチンを減少させ、重量増加および体脂肪量を増加させる。それはまた、アテローム性動脈硬化症の病理学的影響をも増加させる。したがって、本発明のある態様は、ガンマカルボキシラーゼの活性を阻害する作用物質の、代謝症候群、1型および2型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、ならびに肥満症を治療または予防するための治療上の使用を対象とする。
【００５３】
本発明は、さらに、OST-PTPが脱リン酸を通してガンマカルボキシラーゼを活性化するといった発見に基づく。上記に示されるように、ガンマカルボキシラーゼの活性化はオステオカルシンの不活性化をもたらす。オステオカルシンのそのような不活性化は、膵臓ベータ細胞増殖、インスリン分泌、インスリン感受性、耐糖能、および血清アディポネクチンを減少させ、重量増加および体脂肪量を増加させる。それはまた、アテローム性動脈硬化症の病理学的影響をも増加させる。したがって、本発明のある態様は、OST-PTPの活性を阻害する作用物質の、代謝症候群、1型および2型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、ならびに肥満症を治療または予防するための治療上の使用を対象とする。
【００５４】
本発明はまた、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンがアディポネクチン発現のレベルを増加させ、インスリン感受性の増加、耐糖能の増加、重量増加の減少、および体脂肪量の減少をもたらすといった発見にも基づく。それはまた、アテローム性動脈硬化症の病理学的影響をも低下させる。したがって、本発明のある態様は、アディポネクチンの発現を制御するための低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの、代謝症候群、1型および2型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、ならびに肥満症を治療または予防するための治療上の使用を対象とする。
【００５５】
したがって、本発明は、ガンマカルボキシラーゼ、オステオカルシン、およびアディポネクチンを含むOST-PTPシグナル伝達経路に関する障害を治療するおよび診断するための方法および組成物に関する。そのような障害は、代謝症候群、耐糖能障害、糖尿病1型および2型、アテローム性動脈硬化症、ならびに肥満症を含むが、これらに限定されない。本発明は、OST-PTPがガンマカルボキシラーゼを脱リン酸し、それによって、ガンマカルボキシラーゼの活性化をもたらすといった発見に基づく。ガンマカルボキシラーゼの活性化はオステオカルシンのカルボキシル化をもたらし、これは、本明細書に実証されるように、代謝症候群、糖尿病1型および2型、アテローム性動脈硬化症、ならびに肥満症と関連する症状をもたらす。
【００５６】
本発明の他の態様は、代謝症候群、1型および2型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、ならびに肥満症と関連することが分かっている、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンのレベルの減少の検出に基づく診断方法を対象とする。一態様では、患者の、代謝症候群、糖尿病1型および2型、アテローム性動脈硬化症、ならびに肥満症を含む疾患を診断する方法は、(i)患者から採取した生物学的試料中の低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの患者レベルを決定するステップと、(ii)低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの患者レベルおよび低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンのコントロールレベルを比較するステップと、(iii)患者レベルがコントロールレベルよりも有意に低い場合、患者が、代謝症候群、糖尿病1型および2型、アテローム性動脈硬化症、ならびに肥満症を含む疾患を有するまたはその危険性があると診断されるステップとを含む。
【００５７】
本発明の他の態様は、カルボキシル化オステオカルシンに対する低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの比の減少の検出に基づく診断方法を対象とする。そのような比は、代謝症候群、1型および2型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、ならびに肥満症と関連することが分かっている。一態様では、患者の、代謝症候群、糖尿病1型および2型、アテローム性動脈硬化症、ならびに肥満症を含む疾患を診断する方法は、(i)患者から採取した生物学的試料中のカルボキシル化オステオカルシンに対する低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの患者の比を決定するステップと、(ii)カルボキシル化オステオカルシンに対する低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの患者の比およびカルボキシル化オステオカルシンに対する低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンのコントロールの比を比較するステップと、(iii)患者の比がコントロールの比よりも有意に低い場合、患者が、代謝症候群、糖尿病1型および2型、アテローム性動脈硬化症、ならびに肥満症を含む疾患を有するまたはその危険性があると診断されるステップとを含む。
【００５８】
本発明の他の態様は、代謝症候群、耐糖能障害、膵臓ベータ細胞増殖障害、インスリン分泌障害、インスリン感受性障害、アテローム性動脈硬化症、および肥満症を含む疾患を発症する危険性がある患者を、OST-PTPおよび/またはガンマカルボキシラーゼの患者レベルまたは活性のレベルを決定することによって診断するための方法であって、コントロールと比較した上述のレベルの増加は、患者がその疾患を発症する危険性があることを示す方法を対象とする。
【００５９】
本発明の医薬組成物
本発明は、本明細書に開示されるようにガンマカルボキシラーゼおよびオステオカルシンを含むOST-PTPシグナル伝達経路を調節するためのまたはOST-PTPシグナル伝達経路に関する障害を治療するもしくは予防するための作用物質を含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態では、作用物質は、OST-PTPホスホリラーゼ活性を阻害し、ガンマカルボキシラーゼ活性を低下させ、かつ/または低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンを増加させる。特定の実施形態では、作用物質はオステオカルシンからカルボキシル基を除く。作用物質は、小分子、ポリペプチド、抗体、および核酸から成る群から選択されてもよい。本発明の医薬組成物は、OST-PTPシグナル伝達経路と関連する障害を治療または予防するのに有効な量の作用物質を提供する。ある実施形態では、医薬組成物は、被検者の代謝症候群もしくはその構成要素、糖尿病1型、糖尿病2型、アテローム性動脈硬化症、または肥満症を治療または予防するのに有効な量の作用物質を提供する。他の実施形態では、組成物は、インスリン産生の減少、インスリン感受性の減少、および耐糖能の減少または体脂肪量の増加によって特徴づけられる疾患を治療または予防するのに有効な量の作用物質を提供する。
【００６０】
本発明の医薬組成物は、血清オステオカルシンレベル(好ましくは低カルボキシル化もしくは非カルボキシル化オステオカルシン)、血清アディポネクチンレベル、および/または血清インスリンレベルを増加させるように機能してもよい。医薬組成物はまた、耐糖能を増加させてもよい、インスリン感受性を増加させてもよい、および/または膵臓ベータ細胞増殖を増加させてもよい。他の有益な効果は、酸化リン脂質の低下、アテローム性動脈硬化プラークの退縮、炎症性タンパク質生合成の減少、血漿コレステロールの低下、血管平滑筋細胞(VSMC)の増殖および数の低下、動脈性プラークの厚さの減少、心臓発作、アンギナ、または発作等の臨床イベントの低下、ならびに高血圧症の減少を含んでいてもよい。
【００６１】
本発明の特定の実施形態では、投与できる治療薬は、低カルボキシル化オステオカルシン、非カルボキシル化オステオカルシン、またはガンマカルボキシラーゼもしくはOST-PTPの発現もしくは活性を低下させる阻害薬(たとえば抗体、小分子、アンチセンス核酸、もしくはsiRNA)を含む。医薬品はまた、オステオカルシンからカルボキシル基を除く作用物質を含んでいてもよい。
【００６２】
治療薬は、被検者の代謝症候群、肥満症、糖尿病1型および2型、ならびにアテローム性動脈硬化症を治療または予防するのに十分な量で一般に投与される。治療薬はまた、被検者の体脂肪量を低下させるために投与されてもよい。
【００６３】
治療薬の生物学的活性断片または変異体もまた、本発明の範囲内である。「生物学的活性」とは、ガンマカルボキシラーゼ、オステオカルシン、およびアディポネクチンを含むOST-PTPシグナル伝達経路を調節することができることを意味する。本明細書に記載されるように、「生物学的活性」は、OST-PTPの発現もしくはガンマカルボキシラーゼを脱リン酸するその能力を低下させ、ガンマカルボキシラーゼの発現もしくはオステオカルシンをカルボキシル化するその能力を低下させ、またはカルボキシル化オステオカルシンからカルボキシル基を除き、それによって、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシン、インスリン、およびアディポネクチンのレベルの増加をもたらすことを意味する。「生物学的活性」はまた、膵臓ベータ細胞増殖の増加、インスリン分泌の増加、インスリン感受性の増加、耐糖能の増加、重量増加の減少、体脂肪量の減少、減量、血清アディポネクチンの増加、酸化リン脂質の低下、アテローム性動脈硬化プラークの退縮、炎症性タンパク質生合成の減少、血漿コレステロールの低下、血管平滑筋細胞(VSMC)の増殖および数の低下、動脈性プラークの厚さの減少、心臓発作、アンギナ、または発作等の臨床イベントの低下、ならびに高血圧症の減少から成る群から選択される少なくとも1つの効果を引き起こすことができることも意味する。断片および変異体は下記に記載される。下記に記載されるスクリーニングまたはアッセイは、本発明の治療薬の生物学的活性断片および変異体ならびに他の作用物質を同定またはアッセイするために使用されてもよい。
【００６４】
低カルボキシル化オステオカルシンを含む組成物
本発明の特定の実施形態では、オステオカルシン、特に低カルボキシル化または非カルボキシル化オステオカルシンを含む医薬組成物が提供される。
【００６５】
極めて少数の骨芽細胞特異的タンパク質のうちの1つであるオステオカルシンはホルモンのいくつかの特徴を有する。たとえば、それはプレプロ分子として合成され、全身循環中に分泌される(Hauschkaら、1989年、Price、1989年)。それらの強い細胞特異的発現のために、オステオカルシン遺伝子は、集中的に研究されて、骨芽細胞特異的転写因子を同定し、骨生理学の分子的基礎の特徴となった(Ducyら、2000b、HaradaおよびRodan、2003年)。
【００６６】
オステオカルシンは石灰化した骨マトリックスと関連することが分かった最も豊富な非コラーゲン性タンパク質であり、それは、骨代謝回転の臨床的判断に生物学的マーカーとして現在使用されている。オステオカルシンは、その一次構造中に、3つのガンマカルボキシル化グルタミン酸残基を含有する小さな(46〜50残基)骨特異的タンパク質である。名称オステオカルシン(osteo、骨についてのギリシア語;Calc、石灰塩についてのラテン語;in、タンパク質)は、Ca2+に結合するタンパク質の能力および骨中のその存在量に由来する。オステオカルシンは特有の翻訳後修飾を受け、それによって、グルタミン酸残基はカルボキシル化されて、ガンマカルボキシルグルタミン酸(Gla)残基を形成する。したがってオステオカルシンの他の名称は骨Glaタンパク質である(Hauschkaら、1989年)。Gla残基は、通常、ミネラルイオンへの高度な親和性をタンパク質に付与するが、機能損失および獲得実験は、今まで、in vivoでの細胞間マトリックス石灰化でのオステオカルシンについての機能の同定に失敗している(Ducyら、1996年、Murshedら、2004年)。
【００６７】
オステオカルシンは、ビタミンK依存性のカルシウム結合タンパク質である(Priceら(1976年)Proc. Natl. Acad. Sci. 73:3373〜375頁)。成熟ヒトオステオカルシンは、5,800kDaの予測された分子量を有する49アミノ酸を含有する(Poserら(1980年)The Journal of Biological Chemistry、第255巻、第18号、8685〜8691頁)。オステオカルシンは、骨芽細胞および象牙芽細胞によって主に合成され、骨の非コラーゲン性タンパク質の15〜20%を含む。Poserら(1980年)J. Biol. Chem. 255:8685〜8691頁では、成熟オステオカルシンが、グルタミン酸残基の翻訳後のビタミンK依存性の修飾によって形成される3つのカルボキシグルタミン酸残基を含有することが示された。カルボキシル化Gla残基は、マウスおよびヒトの成熟オステオカルシンの17、21、および24位にある。いくつかのヒトオステオカルシンはたった2つのGla残基しか含有しないことが示された。Poser, J. W. & Price, P. A. (1979年) A Method for Decarboxylation of γ-Carboxyglutamic Acid in Proteins. J. Biol. Chem. 254、431〜436頁。
【００６８】
カルボキシル基を除かれた(または非カルボキシル化もしくは低カルボキシル化)オステオカルシンのコンホメーションは、ほぼランダムコイルおよびヘリックス型の間である。したがって、溶液中で、ペプチドは柔軟な構造として生じ、単一のコンホメーションをそれについて定義することができない(AtkinsonらEur. J. Biochem. 1995年;232:515〜21頁)。アルギニン残基19および20の間のならびに残基43および44の間のペプチド結合はトリプシンの加水分解に影響されやすく、血行路中の、ヒトオステオカルシン分解の主産物となるかもしれないペプチド1〜19、20〜43、45〜49、1〜43、および20〜49をもたらす(FarrugiaおよびMelick、Calcif Tissue Int 1986;39:234〜8頁、HellmanらJ Bone Miner Res 1996年;11:1165〜75頁、ならびにGarneroらJ Bone Miner Res 1994年;9:255〜4頁)。
【００６９】
円二色性(CD)によるオステオカルシンのコンホメーションの研究は、オステオカルシン中のアルファヘリックスコンホメーションの存在およびCa2+の追加がより高度なヘリックス含有量を誘発することを示した。溶液中のオステオカルシンの二次元核磁気共鳴(NMR)研究は、構造的に決定的ではないが、カルシウムなしのタンパク質は、Cys23およびCys29の間のジスルフィド架橋に必要とされる回転を除いて実際上構造化されていなかったことを明らかにした。プロリン残基(Hyp9、Pro11、Pro13、Pro15、およびPro27)はすべてトランスコンホメーションであった。ベータターンはTyr12、Asp14、およびAsn26の領域中に存在する。分子の疎水性コアは、Leu2、Leu32、Va136、およびTyr42の側鎖から構成される。カルシウム誘発性のヘリックスは、部分的にC末端ドメインによるヘリックスドメインの疎水性の安定化により、極めて強固である。
【００７０】
溶液中のオステオカルシンは、0.5〜3mMに及ぶ解離定数で、2および5mol Ca2+/タンパク質molの間の化学量論でCa2+にならびにヒドロキシアパタイトに(Kd.は約10-7Mと等しい)結合する。オステオカルシン中のGla残基はCa2+に対するその親和性に重要であると思われる。Ca2+の結合は、アルファヘリックスコンホメーションをとるように正常なオステオカルシンを誘発する。しかしながら、熱によってカルボキシル基を除かれたオステオカルシンは、正常なオステオカルシンよりも高度なアルファヘリックス含有量を示し、カルシウム誘発性のアルファヘリックス形成は維持できなくなった。カルボキシル基を除かれたオステオカルシンはまたヒドロキシアパタイトへのその特異的結合も維持できなくなり、これは、非カルボキシル化オステオカルシンが分泌骨ホルモンであることを示す結果と一致する。ヒドロキシアパタイトに結合すると、Gla残基は熱による脱カルボキシルから防御される。さらに、Glaの形成を阻害するワルファリンを用いて処理した動物で合成されたオステオカルシンは骨に結合しなかった。さらに、ヒドロキシアパタイト競合研究は、プロトロンビン(10Gla/分子)およびカルボキシル基を除かれたオステオカルシンが、ヒドロキシアパタイトに結合した125I標識オステオカルシンと競合しないことを実証した。上記に論じられた情報をすべて組み合わせて、構造モデルを構築した。このモデルは2つの逆平行のアルファヘリックスドメインから成る。Gla残基は、一方のヘリックス上で約5.4オングストローム離れて配置され、これは、ヒドロキシアパタイトのx-y面でのCa2+の原子間の格子間隔に類似している。したがって、オステオカルシン中のGla残基はヒドロキシアパタイト格子の(001)面に結合することが予測された。
【００７１】
骨Glaタンパク質またはBGPとしても知られている「オステオカルシン」は、動物種の中で高度に保存されている小さなビタミンK依存性のカルシウム結合タンパク質(Priceら(1976年) Proc. Natl. Acad. Sci. 73:3373〜5頁)を指す。「オステオカルシン」は、本明細書に記載されるように、カルボキシル化形態、非カルボキシル化形態、および低カルボキシル化形態ならびにその断片および変異体の両方を含む。
【００７２】
「低カルボキシル化オステオカルシン」は、49アミノ酸を有する成熟ヒトオステオカルシンのアミノ酸配列の位置Glu17、Glu21、およびGlu24のまたはオステオカルシンの他の形態のGlu17、Glu21、およびGlu24に対応する位置の1つまたは複数のGlu残基はカルボキシル化されていないオステオカルシンを意味する。低カルボキシル化オステオカルシンは、非カルボキシル化オステオカルシン、つまり、17、21、および24位のグルタミン酸残基の3つすべてがカルボキシル化されていないオステオカルシンを含む。細菌はガンマカルボキシラーゼを有していないので、細菌で発現された組換えオステオカルシンは非カルボキシル化オステオカルシンである。オステオカルシンの調製物は、調製物の成熟オステオカルシン中の位置Glu17、Glu21、およびGlu24の全Glu残基(または他の形態中の対応するGlu残基)の約10%超(まとめて)がカルボキシル化されていない場合、「低カルボキシル化オステオカルシン」であると考えられる。低カルボキシル化オステオカルシンの特定の調製物中では、調製物の成熟オステオカルシン中の位置Glu17、Glu21、およびGlu24の全Glu残基(または他の形態中の対応するGlu残基)の約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%超、または100%はカルボキシル化されていない。特に好ましい実施形態では、本質的に、調製物の成熟オステオカルシン中の位置Glu17、Glu21、およびGlu24のGlu残基(または他の形態中の対応するGlu残基)のすべてはカルボキシル化されていない。
【００７３】
ヒトオステオカルシンcDNA(配列番号1)は、5,800kDaの予測された分子量を有する、配列番号2の最後の49アミノ酸(つまり52〜100位)によって表される成熟オステオカルシンタンパク質をコードする(Poserら、(1980年) The Journal of Biological Chemistry、第255巻、第18号、8685〜8691頁)。配列番号2はヒトオステオカルシンのプレプロ配列であり、成熟ヒトオステオカルシンは配列番号2の処理産物である。本出願では、成熟ヒトオステオカルシンのアミノ酸位が言及される。成熟ヒトオステオカルシンのアミノ酸位は以下のように配列番号2の位置に対応することが理解されるであろう:成熟ヒトオステオカルシンの1位は配列番号2の52位に対応し、成熟ヒトオステオカルシンの2位は配列番号2の53位に対応する等。特に、成熟ヒトオステオカルシンの17、21、および24位は、配列番号2の68、72、および75位にそれぞれ対応する。
【００７４】
2つのアミノ酸配列中の位置が一致する場合、その2つの位置は、その2つのアミノ酸配列がそれらの間の最大の相同性を実現するように互いに整列された場合に、互いに整列することを意味する。一致についてのこの同じ概念はまた核酸にも適用される。
【００７５】
たとえば、2つのアミノ酸配列AGLYSTVLMGRPSおよびGLVSTVLMGN中で、第1の配列の2〜11位は、第2の配列の1〜10位にそれぞれ対応する。したがって、第1の配列の2位は第2の配列の1位に対応し、第1の配列の4位は第2の配列の3位に対応する等である。2つの配列中の位置が同じアミノ酸によって占められていなくても、一方の配列中の位置がもう一方の配列中の位置に対応していてもよいことに注目されたい。
【００７６】
オステオカルシンは骨芽細胞および象牙芽細胞によって主に合成される。「オステオカルシン」は、本明細書に記載されるように、成熟タンパク質を含む、様々なドメインを含む、完全長オステオカルシン(配列番号2)または成熟タンパク質に由来する生物学的活性断片および変異体をさらに含む。
【００７７】
本発明の実施形態では、本発明の医薬組成物は哺乳動物非カルボキシル化オステオカルシンを含む。本発明の好ましい実施形態では、本発明の組成物は、配列番号2のアミノ酸配列もしくはその部分を有するおよび配列番号1の核酸もしくはその部分によってコードされるヒトオステオカルシンを含み、または本発明の組成物は、本明細書に記載される1つまたは複数のヒトオステオカルシン断片を含んでいてもよい。
【００７８】
特定の実施形態では、本発明は、成熟ヒトオステオカルシンの17、21、および24位に対応する1つまたは複数の位置にカルボキシル化グルタミン酸を含有しないヒト低カルボキシル化オステオカルシンを含む医薬組成物を提供する。本発明で使用されるオステオカルシンの好ましい形態は成熟ヒトオステオカルシンであり、17、21、および24位のグルタミン酸残基の少なくとも1つはカルボキシル化されていない。好ましくは、17、21、および24位のグルタミン酸残基の3つすべてはカルボキシル化されていない。成熟ヒトオステオカルシンのアミノ酸配列は配列番号25に示される。
【００７９】
本発明はまた、オステオカルシンのポリペプチド断片の使用をも含む。断片は、オステオカルシンの完全長自然発生アミノ酸配列(たとえば配列番号2)に由来し得る。断片もまた成熟オステオカルシンに由来してもよい。本発明はまた、本明細書に記載されるオステオカルシンの変異体の断片をも包含する。断片は、生物学的に活性である任意の長さのアミノ酸配列を含むことができる。
【００８０】
オステオカルシンの好ましい断片は、成熟タンパク質のGlu17、Glu21、およびGlu24を含有する断片を含む。成熟タンパク質のC末端から最後の10アミノ酸を欠く成熟タンパク質の断片もまた好ましい。成熟タンパク質のN末端から最初の10アミノ酸を欠く断片もまた好ましい。C末端から最後の10アミノ酸およびN末端から最初の10アミノ酸の両方を欠く成熟タンパク質の断片もまた好ましい。そのような断片は、配列番号2のアミノ酸62〜90を含む。
【００８１】
本明細書に記載される本発明の医薬組成物のためのオステオカルシンの他の好ましい断片は、アミノ酸の以下の配列を含む、それから成る、または本質的にそれから成るポリペプチドを含む。
【００８２】
-成熟ヒトオステオカルシンの1〜19位
【００８３】
-成熟ヒトオステオカルシンの20〜43位
【００８４】
-成熟ヒトオステオカルシンの20〜49位
【００８５】
-成熟ヒトオステオカルシンの1〜43位
【００８６】
-成熟ヒトオステオカルシンの1〜42位
【００８７】
-成熟ヒトオステオカルシンの1〜41位
【００８８】
-成熟ヒトオステオカルシンの1〜40位
【００８９】
-成熟ヒトオステオカルシンの1〜39位
【００９０】
-成熟ヒトオステオカルシンの1〜38位
【００９１】
-成熟ヒトオステオカルシンの1〜37位
【００９２】
-成熟ヒトオステオカルシンの1〜36位
【００９３】
-成熟ヒトオステオカルシンの1〜35位
【００９４】
-成熟ヒトオステオカルシンの1〜34位
【００９５】
-成熟ヒトオステオカルシンの1〜33位
【００９６】
-成熟ヒトオステオカルシンの1〜32位
【００９７】
-成熟ヒトオステオカルシンの1〜31位
【００９８】
-成熟ヒトオステオカルシンの1〜30位
【００９９】
-成熟ヒトオステオカルシンの1〜29位
【０１００】
-成熟ヒトオステオカルシンの2〜49位
【０１０１】
-成熟ヒトオステオカルシンの2〜45位
【０１０２】
-成熟ヒトオステオカルシンの2〜40位
【０１０３】
-成熟ヒトオステオカルシンの2〜35位
【０１０４】
-成熟ヒトオステオカルシンの2〜30位
【０１０５】
-成熟ヒトオステオカルシンの2〜25位
【０１０６】
-成熟ヒトオステオカルシンの2〜20位
【０１０７】
-成熟ヒトオステオカルシンの4〜49位
【０１０８】
-成熟ヒトオステオカルシンの4〜45位
【０１０９】
-成熟ヒトオステオカルシンの4〜40位
【０１１０】
-成熟ヒトオステオカルシンの4〜35位
【０１１１】
-成熟ヒトオステオカルシンの4〜30位
【０１１２】
-成熟ヒトオステオカルシンの4〜25位
【０１１３】
-成熟ヒトオステオカルシンの4〜20位
【０１１４】
-成熟ヒトオステオカルシンの8〜49位
【０１１５】
-成熟ヒトオステオカルシンの8〜45位
【０１１６】
-成熟ヒトオステオカルシンの8〜40位
【０１１７】
-成熟ヒトオステオカルシンの8〜35位
【０１１８】
-成熟ヒトオステオカルシンの8〜30位
【０１１９】
-成熟ヒトオステオカルシンの8〜25位
【０１２０】
-成熟ヒトオステオカルシンの8〜20位
【０１２１】
-成熟ヒトオステオカルシンの10〜49位
【０１２２】
-成熟ヒトオステオカルシンの10〜45位
【０１２３】
-成熟ヒトオステオカルシンの10〜40位
【０１２４】
-成熟ヒトオステオカルシンの10〜35位
【０１２５】
-成熟ヒトオステオカルシンの10〜30位
【０１２６】
-成熟ヒトオステオカルシンの10〜25位
【０１２７】
-成熟ヒトオステオカルシンの10〜20位
【０１２８】
-成熟ヒトオステオカルシンの7〜30位
【０１２９】
-成熟ヒトオステオカルシンの7〜25位
【０１３０】
-成熟ヒトオステオカルシンの7〜23位
【０１３１】
-成熟ヒトオステオカルシンの7〜21位
【０１３２】
-成熟ヒトオステオカルシンの7〜19位
【０１３３】
-成熟ヒトオステオカルシンの7〜17位
【０１３４】
-成熟ヒトオステオカルシンの8〜30位
【０１３５】
-成熟ヒトオステオカルシンの8〜25位
【０１３６】
-成熟ヒトオステオカルシンの8〜23位
【０１３７】
-成熟ヒトオステオカルシンの8〜21位
【０１３８】
-成熟ヒトオステオカルシンの8〜19位
【０１３９】
-成熟ヒトオステオカルシンの8〜17位
【０１４０】
-成熟ヒトオステオカルシンの9〜30位
【０１４１】
-成熟ヒトオステオカルシンの9〜25位
【０１４２】
-成熟ヒトオステオカルシンの9〜23位
【０１４３】
-成熟ヒトオステオカルシンの9〜21位
【０１４４】
-成熟ヒトオステオカルシンの9〜19位
【０１４５】
-成熟ヒトオステオカルシンの9〜17位
【０１４６】
とりわけ、成熟ヒトオステオカルシンの1〜36位を含む断片が好ましい。他の好ましい断片は成熟ヒトオステオカルシンの20〜49位を含む断片である。他の断片は、成熟ヒトオステオカルシンのPro13〜Tyr46またはPro13〜Asn26を含有するように設計することができる。さらに、成熟ヒトオステオカルシンの23および29位にシステイン残基を含有し、それらの2つのシステインの間にジスルフィド結合を形成することができる断片が有用である。
【０１４７】
断片は孤立性のものであってもよい(他のアミノ酸またはポリペプチドに融合していない)またはより大きなポリペプチド内のものであってもよい。さらに、いくつかの断片は単一のより大きなポリペプチド内に含まれていてもよい。一実施形態では、宿主中での発現のために設計された断片は、オステオカルシン断片のアミノ末端に融合された異種のプレおよびプロポリペプチド領域ならびに/または断片のカルボキシル末端に融合された付加的な領域を有していてもよい。
【０１４８】
上記に記載されるオステオカルシンおよびオステオカルシンの断片の変異体もまた本発明の組成物および方法で使用するために提供される。「変異体」は、1つまたは複数のアミノ酸の置換、追加、欠失、および/または挿入等の、それらのアミノ酸配列中に修飾を含有しているが、なお生物学的に活性であるオステオカルシンペプチドを指す。いくつかの実例では、変異体の抗原性および/または免疫原性特性は、変異体が由来する対応するペプチドに比べて実質的に変化しない。そのような修飾は、たとえばAdelmanら(DNA, 2:183、1983年)によって教示されるように、オリゴヌクレオチド指定部位特異的突然変異誘発等の標準の突然変異誘発技術を使用してまたは化学合成によって容易に導入されてもよい。変異体および断片は相互に排他的な用語ではない。断片はまた、断片がなお生物学的に活性であるように1つまたは複数のアミノ酸の置換、追加、欠失、および/または挿入を含有していてもよいペプチドをも含む。
【０１４９】
本発明の範囲内である1つの特定の種類の変異体は、成熟ヒトオステオカルシンの17、21、および24位に対応する1つまたは複数の位置はグルタミン酸ではないアミノ酸によって占められている変異体である。いくつかの実施形態では、グルタミン酸ではないアミノ酸はまたアスパラギン酸でもない。そのような変異体は、低カルボキシル化オステオカルシンのバージョンである、なぜなら、成熟ヒトオステオカルシンの17、21、および24位に対応する3つの位置の少なくとも1つは、それらの位置の少なくとも1つがグルタミン酸によって占められていないので、カルボキシル化グルタミン酸とならないからである。
【０１５０】
特定の実施形態では、本発明は、アミノ酸配列
YLYQWLGAPVPYPDPLX1PRRX2VCX3LNPDCDELADHIGFQEAYRRFYGPV
(配列番号23)
を含むオステオカルシン変異体であって、
X1、X2、およびX3は、アミノ酸またはアミノ酸類似体からそれぞれ独立して選択され、ただし、X1、X2、およびX3がそれぞれグルタミン酸である場合、X1はカルボキシル化されておらず、または50パーセント未満のX2はカルボキシル化されており、かつ/または50パーセント未満のX3はカルボキシル化されているオステオカルシン変異体を提供する。
【０１５１】
ある実施形態では、オステオカルシン変異体は、X1、X2、およびX3以外の1〜7つの位置に配列番号23とは異なるアミノ酸配列を含む。
【０１５２】
他の実施形態では、オステオカルシン変異体は、1つまたは複数のアミドバックボーン置換を含むアミノ酸配列を含む。
【０１５３】
完全に機能的な変異体は、典型的に、保存的変異または重要ではない残基もしくは重要ではない領域中の変異のみを含有する。機能的な変異体はまた、機能の変化をもたらさないまたはわずかな変化しかもたらさない、類似アミノ酸の置換を含有していてもよい。あるいは、そのような置換は、ポジティブにまたはネガティブに、ある程度まで機能に影響を与えてもよい。そのような機能的なオステオカルシン変異体の活性は、本明細書に記載されるアッセイ等のアッセイを使用して決定することができる。
【０１５４】
変異体は、自然発生のものとすることができるまたは低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンに有用で新規な特徴を提供するために組換え手段もしくは化学合成によって作ることができる。たとえば、変異体オステオカルシンポリペプチドは、免疫原性が低下していてもよく、血清半減期が増加していてもよく、生物学的利用率が増加していてもよく、および/または効力が増加していてもよい。特定の実施形態では、血清半減期は、成熟オステオカルシンの19、20、43、および44位の1つまたは複数の天然のArg残基を他のアミノ酸またはアミノ酸類似体、たとえばβ-ジメチルアルギニンと置換することにより増加する。そのような置換は、本明細書に記載されるオステオカルシンの天然のアミノ酸配列中の他の変化と組み合わせることができる。
【０１５５】
上記に記載されるオステオカルシンおよびオステオカルシン断片の誘導体である変異体もまた本発明の医薬組成物および方法で使用するために提供される。誘導体化は、誘導体と呼ばれる類似する化学構造の産物に化学化合物を変換する、化学で使用される技術である。一般に、化合物の特異的官能基は、誘導体化反応に関与し、反応性、可溶性、沸点、融点、凝集状態、機能的活性、または化学組成が異なる誘導物に遊離体を変換する。結果として生じる新しい化学的特性は、遊離体の定量化もしくは分離に使用することができるまたは化合物を治療薬として最適化するために使用することができる。誘導体化のためのよく知られている技術は上記のオステオカルシンおよびオステオカルシン断片に適用することができる。したがって、上記に記載されるオステオカルシンおよびオステオカルシン断片の誘導体は、自然のアミノ酸と異なるように、ある方法で化学的に修飾されたアミノ酸を含有する。
【０１５６】
オステオカルシンミメティックもまた提供される。「ミメティック」は、自然発生または非自然発生ポリペプチドと同じ構造的および機能的特徴を実質的に有する合成化学化合物を指し、たとえば、修飾されたバックボーン、側鎖、および/または塩基を有するポリペプチド様およびポリヌクレオチド様ポリマーを含む。ペプチドミメティックは、鋳型ペプチドの特性と類似性の特性を有する非ペプチド薬剤として医薬品産業で通常使用される。一般に、ミメティックは、生物学的または薬理学的活性を有するが、1つまたは複数のポリペプチド連結が交換されているパラダイムポリペプチドに構造的に類似している(つまり、同じ形状を有する)。ミメティックは、アミノ酸の合成非自然類似体からもっぱら構成されるまたは部分的に自然のペプチドアミノ酸およびアミノ酸の部分的に非自然の類似体のキメラ分子である。自然アミノ酸保存的置換がまたミメティックの構造および/または活性をも実質的に変化させない限り、ミメティックはまた任意の量のそのような置換を組み込むこともできる。
【０１５７】
例として、たとえば、Choら、1993年、Science 261:1303〜5頁は、種々様々の側鎖と置換されたキラルアミノカルボネートモノマーから成る「非自然生体高分子」、そのようなポリマーのライブラリーの合成、およびモノクローナル抗体への結合親和性についてのスクリーニングを開示する。同様に、Choら、1998年、J. Am. Chem. Soc.は、直鎖状および環状オリゴカルバメートライブラリーのライブラリーならびにインテグリンGPIIb/IIIaへの結合についてのスクリーニングを開示する。Simonら、Proc. Natl. Acad. Sci. 89:9367〜71頁は、種々の側鎖を有するN置換グリシンから成るポリマー(「ペプトイド」)を開示する。Schumacherら、1996年、Science 271:1854〜7頁は、D-アミノ酸を用いて合成したタンパク質(SH3)に対してL-ペプチドのファージライブラリーをスクリーニングし、次いで、D-アミノ酸を使用して選択したL-ペプチドを合成することによってSrc相同性ドメイン3(SH3ドメイン)に対して特異的なD-ペプチドリガンドを開示する。Brodyら、1999年、Mol. Diagn. 4:381〜8頁は、何百〜何千ものアプタマーの産生およびスクリーニングを記載する。
【０１５８】
本発明の範囲内の特定の種類のオステオカルシン変異体は、1つもしくは複数のバックボーンアミドが異なる化学構造体と交換されたまたは1つもしくは複数のアミノ酸がアミノ酸類似体と交換されたオステオカルシンミメティックである。特定の実施形態では、オステオカルシンミメティックは非カルボキシル化ヒトオステオカルシンのレトロエナンチオマーである。
【０１５９】
オステオカルシンならびにその断片および変異体は化学合成または組換え法によって任意選択で生産され、本明細書に記載されるように、修飾オステオカルシン分子(つまりオステオカルシンの断片または変異体)として生産されてもよい。オステオカルシンポリペプチドは任意の従来の手段によって生産することができる(Houghten, R. A. (1985年) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5131〜5135頁)。同時の複数のペプチド合成は米国特許第4,631,211号に記載され、また使用することもできる。組換えで生産される場合、オステオカルシンは、融合タンパク質、たとえばGST-オステオカルシン融合タンパク質として生産されてもよい。
【０１６０】
本発明の範囲以内にある低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシン分子は、他の生物に由来するタンパク質、つまりオルソログを含む、ヒトオステオカルシンに実質的に相同のタンパク質を含む。特定の1つのオルソログはマウスオステオカルシンである。マウスオステオカルシン遺伝子1 cDNAは配列番号3であり、マウスオステオカルシン遺伝子2 cDNAは配列番号4であり、マウスオステオカルシン遺伝子1および遺伝子2のアミノ酸配列は配列番号5である。
【０１６１】
本明細書に使用されるように、2つのタンパク質は、それらのアミノ酸配列が、少なくとも約70〜75%、典型的には少なくとも約80〜85%、最も典型的には少なくとも約90〜95%、97%、98%、もしくは99%またはそれ以上相同である場合、実質的に相同または同一である。2つのアミノ酸配列または核酸配列の間の「相同性」は、本明細書に開示されるアルゴリズムを使用することによって決定することができる。これらのアルゴリズムはまた、2つのアミノ酸配列または核酸配列の間の同一性パーセントを決定するために使用することもできる。
【０１６２】
本発明の特定の実施形態では、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンは、配列番号2のヒトオステオカルシンまたは少なくとも8アミノ酸長である、配列番号2の一部と少なくとも80%の相同性を有するオステオカルシン分子である。本発明の他の実施形態では、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンは、配列番号2のヒトオステオカルシンまたは少なくとも8アミノ酸長である、配列番号2の一部と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するオステオカルシン分子である。相同の配列は、実質的に同一の配列を含む。好ましい実施形態では、相同性または同一性は成熟ヒトオステオカルシンの全長にわたっている。
【０１６３】
2つのアミノ酸配列または2つの核酸配列の相同性パーセントまたは同一性パーセントを決定するために、配列を最適な比較目的のために整列させる(たとえば、ギャップを、最適な整列のために、第1および第2のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方に導入することができ、非相同配列は比較目的のために無視することができる)。好ましくは、比較目的のために整列させる参照配列の長さは、参照配列が比較される配列の長さの少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%、さらに好ましくは少なくとも60%、およびさらに好ましくは少なくとも70%、80%、もしくは90%またはそれ以上である。次いで、対応するアミノ酸位またはヌクレオチド位のアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第1の配列中の位置が、第2の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められる場合、分子はその位置で同一である。2つの配列の間の同一性パーセントは、2つの配列の最適な整列のために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。
【０１６４】
本発明はまた、より低度の同一性を有するが、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンによって果たされる1つまたは複数の同じ機能を果たすように十分な類似性を有するポリペプチドをも包含する。類似性は保存アミノ酸置換を考慮することにより決定される。そのような置換は、似た特徴の他のアミノ酸によって、ポリペプチド中の所与のアミノ酸を置換するものである。保存的置換は表現型上サイレントである可能性が高い。どのアミノ酸変化が表現型的にサイレントとなりそうかといったことに関係するガイダンスは、Bowieら、Science 247:1306〜1310頁(1990年)に見つけられる。
【０１６５】
保存的置換の例は、疎水性アミノ酸Ala、Val、Leu、およびIleの中での、1つのアミノ酸の他のアミノ酸への交換、ヒドロキシル残基SerおよびThrの相互交換、酸性残基AspおよびGluの交換、アミド残基AsnおよびGlnの間の置換、塩基性残基Lys、His、およびArgの交換、芳香族残基Phe、Trp、およびTyrの中での交換、極性残基GlnおよびAsnの交換、ならびに小さな残基Ala、Ser、Thr、Met、およびGlyの交換である。
【０１６６】
配列の比較ならびに2つのオステオカルシンポリペプチドの間の同一性パーセントおよび相同性パーセントの決定は数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。たとえば、Computational Molecular Biology、Lesk, A. M.編、Oxford University Press、New York、1988年、Biocomputing: Informatics and Genome Projects、Smith, D. W.編、Academic Press、New York、1993年、Computer Analysis of Sequence Data, Part 1、Griffin, A. M.およびGriffin, HG.編、Humana Press、New Jersey、1994年、Sequence Analysis in Molecular Biology、van Heinje, G.、Academic Press、1987年、ならびにSequence Analysis Primer、Gribskov, M.およびDevereux, J.編、M Stockton Press、New York、1991年。そのような数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Karlinら(1993年) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873〜5877頁に記載される。
【０１６７】
2つのオステオカルシンアミノ酸配列の間の同一性パーセントまたは相同性パーセントは、Needlemanら(1970年) (J. Mol. Biol. 48:444〜453頁)のアルゴリズムを使用して決定されてもよい。配列の比較のために利用されてもよい数学的アルゴリズムの他の非限定的な例は、MyersおよびMiller、CABIOS(1989年)のアルゴリズムである。
【０１６８】
実質的に相同のオステオカルシンはまた、本発明によれば、ヒトオステオカルシン核酸配列に、ハイストリンジェントな条件下、たとえば、0.5M NaHPO4、7%硫酸ドデシルナトリウム(SDS)、1mM EDTA中のフィルター結合DNAへの65℃でのハイブリダイゼーションおよび0.1×SSC/0.1%SDS中での68℃での洗浄(Ausubel F.M.ら編、1989年、Current Protocols in Molecular Biology、第I巻、Green Publishing Associates, Inc.およびJohn Wiley & sons, Inc.、New York、2頁10.3)でハイブリダイズすることができ、機能的に等価な遺伝子産物をコードすることができるまたは中程度にストリンジェントな条件等のそれほどストリンジェントではない条件下、たとえば0.2×SSC/0.1%SDS中での42℃での洗浄(Ausubelら、1989年前掲)でハイブリダイズすることができるが、なお生物学的活性低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンをコードする核酸配列によってコードされたポリペプチドであってもよい。
【０１６９】
実質的に相同のオステオカルシンはまた、本発明によれば、ヒトオステオカルシン核酸配列に対して少なくとも70〜75%、典型的には少なくとも約80〜85%、最も典型的には少なくとも約90〜95%、97%、98%、または99%の同一性を有する配列に、ストリンジェントな条件下、たとえば、0.5M NaHPO4、7%硫酸ドデシルナトリウム(SDS)、1mM EDTA中のフィルター結合DNAへの65℃でのハイブリダイゼーションおよび0.1×SSC/0.1%SDS中での68℃での洗浄(Ausubel F.M.ら編、1989年、Current Protocols in Molecular Biology、第I巻、Green Publishing Associates, Inc.およびJohn Wiley & sons, Inc.、New York、2頁10.3)でハイブリダイズすることができ、機能的に等価な遺伝子産物をコードすることができるまたは中程度にストリンジェントな条件等のそれほどストリンジェントではない条件下、たとえば0.2×SSC/0.1%SDS中での42℃での洗浄(Ausubelら、1989年前掲)でハイブリダイズすることができるが、なお生物学的活性低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンをコードする核酸配列によってコードされたポリペプチドであってもよい。
【０１７０】
ヒトオステオカルシンの生物学的活性断片または変異体は天然のヒトオステオカルシンと異なる番号のアミノ酸を含有していてもよいことが理解されるであろう。したがって、成熟ヒトオステオカルシンの17、21、および24位に対応するアミノ酸残基の位置番号は断片または変異体で異なっていてもよい。当業者は、成熟ヒトオステオカルシンのアミノ酸配列を有する断片または変異体のアミノ酸配列の比較からそのような対応する位置を容易に認識するであろう。
【０１７１】
完全長オステオカルシン、成熟オステオカルシン、またはオステオカルシン断片もしくは変異体が無関係のタンパク質またはポリペプチドに融合された融合タンパク質に対応するペプチドもまた本発明の範囲内であり、本明細書に開示されるオステオカルシンのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に基づいて設計することができる。そのような融合タンパク質は、マーカー機能を提供する酵素、蛍光タンパク質、または発光タンパク質への融合物を含む。本発明の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、体内の特定の標的細胞または場所へオステオカルシンを誘導することができるポリペプチドへの融合を含む。たとえば、オステオカルシンポリペプチド配列は、リガンド分子に対する受容体を発現させる細胞へ融合タンパク質を誘導することができる上述のリガンドに融合されてもよい。オステオカルシンはまた、薬剤スクリーニングまたは組換えタンパク質を作る際の使用にキメラタンパク質の一部として作ることができる。これらは、オステオカルシンに実質的に相同ではないアミノ酸配列を有する異種ペプチドに、適切に作用するように連結されたオステオカルシンペプチド配列を含む。この文脈の「適切に作用するように連結された」は、オステオカルシンペプチドおよび異種ペプチドがインフレームで融合されることを示す。異種ペプチドは、オステオカルシンのN末端もしくはC末端に融合することができるまたは内部に配置させることができる。一実施形態では、融合タンパク質はオステオカルシンの機能に影響を与えない。たとえば、融合タンパク質は、オステオカルシン配列がGST配列のNまたはC末端に融合されたGST-融合タンパク質とすることができる。他の種類の融合タンパク質は、酵素融合タンパク質、たとえばベータガラクトシダーゼ融合物、酵母ツーハイブリッドGAL-4融合物、ポリHis融合物、およびIg融合物を含むが、これらに限定されない。そのような融合タンパク質、特にポリHis融合物は、組換えオステオカルシンの精製を容易にすることができる。ある宿主細胞(たとえば哺乳動物宿主細胞)では、タンパク質の発現および/または分泌は異種シグナル配列を使用することにより増加させることができる。したがって、融合タンパク質はそのN末端に異種シグナル配列を含有していてもよい。
【０１７２】
欧州特許第0464533号は、免疫グロブリン定常領域(Fc領域)の様々な部分を含む融合タンパク質を開示する。Fc領域は療法および診断に有用であり、したがって、たとえば、薬物動態学的特性の改善をもたらす(欧州特許第0232262号)。創薬では、たとえば、ヒトタンパク質は、アンタゴニストを同定するためのハイスループットスクリーニングアッセイの目的のためにFc領域と融合された(Bennettら(1995年) J. Mol. Recog. 8:52〜58頁(1995年)およびJohansonらJ. Biol. Chem. 270:9459〜9471頁)。したがって、本発明の様々な実施例はまた、オステオカルシンポリペプチドおよび様々なサブクラス(たとえばIgG、IgM、IgA、IgE、IgB)の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の様々な部分を含有する可溶性融合タンパク質をも利用する。融合がヒンジ領域で起こるヒトIgG、特にIgG1の重鎖の定常部分が免疫グロブリンとして好ましい。いくつかの使用については、たとえば、融合タンパク質が抗原として免疫化に使用されることになっている場合、融合タンパク質がその意図した目的に使用された後、Fc領域を除去することは望ましい。特定の実施形態では、Fc部分は、同様に組み込まれている切断配列によって単純な方法で除去することができ、たとえば第Xa因子を用いて切断することができる。
【０１７３】
キメラタンパク質または融合タンパク質は標準の組換えDNA技術によって生産することができる。たとえば、異なるタンパク質配列をコードするDNA断片は、従来の技術に従って共にインフレームでライゲーションすることができる。他の実施形態では、融合遺伝子は、自動DNA合成機を含む従来の技術によって合成することができる。あるいは、遺伝子断片のPCR増幅は、続いてアニールされ、再増幅されて、キメラ遺伝子配列を産生することができる連続する2つの遺伝子断片の間に相補的なオーバーハングを生じさせるアンカープライマーを使用して実行することができる。(Ausubelら(1992年) Current Protocols in Molecular Biologyを参照されたい)。さらに、融合物部分(たとえばGSTタンパク質)を既にコードしている多くの発現ベクターが市販で入手可能である。オステオカルシンコード核酸は、融合成分がオステオカルシンにインフレームで連結されるようにそのような発現ベクターの中にクローニングすることができる。
【０１７４】
1つまたは複数の機能的部位が異なるアイソフォームまたは他の種の他のオステオカルシン分子に由来するキメラオステオカルシンタンパク質を生産することができる。部位はまた、哺乳動物ゲノム中に存在するが、まだ発見されておらずまたは特徴づけられていないオステオカルシン関連タンパク質に由来し得る。
【０１７５】
ポリペプチドは、20種の自然発生アミノ酸と通常称される20種のアミノ酸以外のアミノ酸を含有していることが多い。さらに、末端アミノ酸を含む多くのアミノ酸は、プロセシングおよび他の翻訳後修飾等の自然のプロセスによってまたは当技術分野でよく知られている化学修飾技術によって修飾されてもよい。ポリペプチド中で自然に生じるよくある修飾は下記に記載される。
【０１７６】
したがって、本発明のオステオカルシンポリペプチドはまた、遺伝コードによってコードされるアミノ酸残基でない置換アミノ酸残基を含有する誘導体であって、置換基が含まれる、成熟ポリペプチドがポリペプチドの半減期を増加させるための化合物(たとえばポリエチレングリコール)等の他の化合物と融合される、またはリーダー配列もしくは分泌配列またはオステオカルシンのポリペプチドもしくはプロタンパク質の配列の精製のための配列等の付加的なアミノ酸がオステオカルシンポリペプチドに融合される誘導体をも包含する。
【０１７７】
低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンは、その安定性、半減期、取り込み、または効能を増加させるために医薬品化学で知られている方法に従って修飾することができる。知られている修飾は、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム成分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋結合の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解性のプロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニン化等の、タンパク質へのアミノ酸の運搬RNA媒介性の追加、およびユビキチン化を含むが、これらに限定されない。
【０１７８】
本発明の特定の実施形態では、修飾は、血清半減期を増加させるための手段として、残基ARG43でのタンパク質分解への感受性を低下させるために、オステオカルシンに成されてもよい。そのような修飾は、たとえば、レトロエナンチオ異性体、D-アミノ酸、または他のアミノ酸類似体の使用を含む。
【０１７９】
N末端アミノ基のアシル化は、ヒドロオロチン酸等のような親水性化合物を使用してまたはN末端に尿素成分を生成するための、メチルイソシアネートもしくはイソプロピルイソシアネート等の適したイソシアネートとの反応によって達成することができる。オステオカルシン誘導体の作用の持続時間を増加させるであろう他の作用物質もまた、当技術分野で知られているようにN末端に連結することができる。
【０１８０】
還元的アミノ化は、アンモニアがアルデヒドまたはケトンと縮合され、続いてアミンに還元されるイミンを形成するプロセスである。還元的アミノ化は、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンおよびその断片または変異体をPEGへ抱合する有用な方法である。低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンならびにその断片および変異体へのポリ(エチレングリコール)(PEG)の共有結合は、増加した水溶性、変化した生物学的利用率、薬物動態、免疫原性特性、および生物学的活性を有する抱合体をもたらすかもしれない。たとえばBentleyら、J. Pharm. Sci. 1998年11月;87(11):1446〜9頁を参照されたい。
【０１８１】
グリコシル化、脂質結合、硫酸化、ヒドロキシル化、ならびにADP-リボシル化等の、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンならびにその断片および変異体に適用されてもよいいくつかの特によくある修飾は、Proteins--Structure and Molecular Properties、第2版、T. E. Creighton、W. H. Freeman and Company、New York (1993年)等の最も基本的な教科書に記載される。多くの詳細な検討が、Wold, F.、Posttranslational Covalent Modification of Proteins、B. C. Johnson編、Academic Press、New York 1〜12頁(1983年)、Seifterら(1990年) Meth. Enzymol. 182: 626〜646頁)、およびRattanら(1992年) Ann. NY: Acad. Sci. 663:48〜62頁等によってこの主題について入手可能である。
【０１８２】
またよく知られているように、ポリペプチドは必ずしも直鎖状であるとは限らない。たとえば、ポリペプチドはユビキチン化の結果として分岐していてもよく、それらは、一般に、自然のプロセシングイベントおよび自然に生じないヒトによる操作によってもたらされるイベントを含む翻訳後イベントの結果として、分岐を有するまたは有していない環状のものであってもよい。環状、分岐、および分岐環状ポリペプチドは、非翻訳自然プロセスおよび合成法によって合成されてもよい。
【０１８３】
修飾は、ペプチドバックボーン、アミノ酸側鎖、およびアミノまたはカルボキシル末端を含む、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンならびにその断片および変異体のいかなる場所にも生じ得る。共有結合による修飾によるポリペプチド中のアミノ基もしくはカルボキシル基またはその両方の封鎖は、自然発生ポリペプチドおよび合成ポリペプチドでよくあり、本発明の低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンまたはその断片および変異体に適用されてもよい。たとえば、タンパク質分解性のプロセシングに先立って大腸菌(E. coli)で作られるポリペプチドのアミノ末端残基はほとんど例外なくN-ホルミルメチオニンであろう。したがって、アミノ末端残基としてN-ホルミルメチオニンを有する低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンならびにその断片および変異体は本発明の範囲内である。
【０１８４】
本発明の範囲に入る様々なタンパク質修飾の簡単な説明を下記の表に記載する。
【０１８５】
【表１Ａ】
0005421109.tif 000002
【０１８６】
【表１Ｂ】
0005421109.tif 000003
【０１８７】
【表１Ｃ】
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【０１８８】
【表１Ｄ】
0005421109.tif 000005
【０１８９】
【表１Ｅ】
0005421109.tif 000006
【０１９０】
【表１Ｆ】
0005421109.tif 000007
【０１９１】
本発明の方法を実施するために、オステオカルシンタンパク質を組換えで発現させることは望ましいかもしれない。ヒトオステオカルシンのcDNA配列および推定されるアミノ酸配列を配列番号1および配列番号2に表す。オステオカルシンヌクレオチド配列は、当業者らに知られている種々様々の異なる方法を使用して単離されてもよい。たとえば、オステオカルシンを発現させることで知られている組織からのRNAを使用して構築したcDNAライブラリーは、標識オステオカルシンプローブを使用してスクリーニングすることができる。あるいは、オステオカルシンタンパク質をコードする核酸分子を得るためにゲノムライブラリーをスクリーニングしてもよい。さらに、オステオカルシン核酸配列は、知られているオステオカルシンヌクレオチド配列に基づいて設計した2つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行うことにより得られてもよい。反応のための鋳型は、オステオカルシンを発現させることで知られている細胞系または組織から調製したmRNAの逆転写によって得たcDNAであってもよい。
【０１９２】
オステオカルシンポリペプチドおよびペプチドは化学的に合成することができる(たとえばCreighton、1983年、Proteins: Structures and Molecular Principles、W.H. Freeman & Co., N.Y.を参照されたい)が、オステオカルシンおよび完全長オステオカルシン自体に由来する大きなポリペプチドは、核酸を発現させるための当技術分野でよく知られている技術を使用する組換えDNA技術によって有利に生産されてもよい。そのような方法は、オステオカルシンヌクレオチド配列ならびに適切な転写および翻訳コントロールシグナルを含有する発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法は、たとえば、in vitro組換えDNA技術、合成技術、およびin vivo遺伝子組換えを含む。(たとえば、Sambrookら、1989年、前掲およびAusubelら、1989年、前掲に記載される技術を参照されたい)。
【０１９３】
種々様々の宿主発現ベクター系は、オステオカルシンヌクレオチド配列を発現させるために利用されてもよい。好ましい実施形態では、オステオカルシンペプチドまたはポリペプチドは分泌され、培地から回収されてもよい。
【０１９４】
適切な発現系は、オステオカルシンタンパク質の正確な修飾、プロセシング、および細胞内局在が生じることを確実にするために選ぶことができる。この目的のために、細菌宿主細胞はオステオカルシンをカルボキシル化することができないので、そのような細胞はオステオカルシンの発現にとって好ましい。
【０１９５】
単離オステオカルシンは、自然にそれを発現させる細胞、たとえば骨芽細胞から精製することができるまたは自然にそれを発現させるが、オステオカルシンを過剰生産するように修飾された細胞から精製することができる、たとえば、知られているタンパク質合成方法を使用して合成されたオステオカルシンを発現するように(組換え)またはそれを発現するように、オステオカルシンを自然にコードする細胞を修飾することによって変化させた細胞から精製することができる。特定の実施形態では、組換え細胞は内因性オステオカルシン遺伝子の発現を活性化するために操作された。たとえば、国際特許出願第99/15650号および国際特許出願第00/49162号は、遺伝子発現のランダム活性化(RAGE)と名付けられた、内因性遺伝子を発現させる方法を記載し、これは、内因性オステオカルシンの発現を活性化するまたは増加させるために使用することができる。RAGE方法論は、下流の内因性遺伝子の発現を活性化するための制御配列の非相同組換えを含む。あるいは、国際特許出願第94/12650号、国際特許出願第95/31560号、国際特許出願第96/29411号、米国特許第5,733,761号、および米国特許第6,270,985号は、標的配列、制御配列、エキソン、およびスプライス供与部位を含むDNA構築物の相同組換えを含む、内因性遺伝子の発現を増加させる方法を記載する。相同組換えに際して、下流の内因性遺伝子は発現する。先の特許に記載された、内因性遺伝子を発現させる方法は、参照によって本明細書に明白に組み込まれる。
【０１９６】
アディポネクチンおよび低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンを含む組成物
本発明の特定の実施形態では、アディポネクチンおよび低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンまたは生物学的活性低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシン断片または変異体を含む医薬組成物は、そのような投与を必要とする患者に投与されてもよい。本発明の実施形態では、アディポネクチンは哺乳動物アディポネクチンである。本発明の好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物はヒトアディポネクチンを含む。ヒトアディポネクチンのcDNA配列は配列番号6に示される。ヒトアディポネクチンのアミノ酸配列は配列番号7に示される。
【０１９７】
本発明の他の態様では、医薬組成物中で低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンまたは生物学的活性低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシン断片と一緒の生物学的活性アディポネクチン断片または変異体は本発明の治療方法で使用することができる。アディポネクチン断片または変異体は、オステオカルシンについて上記に記載され、かつオステオカルシン断片および変異体の生産について上記に記載される方法と同じ方法によって生産することができる、アディポネクチンの天然の配列中の幾種類かの変化を包含する。
【０１９８】
ガンマカルボキシラーゼおよび/またはOST-PTPの阻害薬を含む組成物
本発明の他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、ガンマカルボキシラーゼまたはOST-PTPの発現または活性を低下させる阻害薬を含む。好ましくは、ガンマカルボキシラーゼまたはOST-PTPの生物学的活性(前に記載)は阻害される。阻害薬は、抗体(モノクローナルもしくはポリクローナル)または抗体の断片、小分子、ポリペプチドもしくはタンパク質、または核酸(たとえばアンチセンスDNAもしくはRNA、siRNA)であってもよい。
【０１９９】
ある実施形態では、阻害薬は、配列番号19のアミノ酸配列を有するOST-PTPの活性を低下させる。他の実施形態では、阻害薬は、配列番号19のアミノ酸配列に対して、前に記載されるように実質的に相同または同一のアミノ酸配列を有するOST-PTPの活性を低下させる。
【０２００】
ある実施形態では、阻害薬は、配列番号11のアミノ酸配列を有するガンマカルボキシラーゼの活性を低下させる。他の実施形態では、阻害薬は、そのアミノ酸配列に対して、前に記載されるように実質的に相同または同一のアミノ酸配列を有するガンマカルボキシラーゼの活性を低下させる。
【０２０１】
OST-PTPおよびガンマカルボキシラーゼの小分子阻害薬
ある実施形態では、作用物質は小分子である。「小分子」とは、100を超え、かつ約2,500ダルトン未満の、好ましくは500ダルトン未満の分子量の有機化合物を意味する。そのような小分子は、OST-PTPまたはガンマカルボキシラーゼの生物学的活性を阻害する。
【０２０２】
阻害薬は、ビタミンKの阻害薬、ベータ遮断薬、スタチン、ならびに/または血清アディポネクチン、血清インスリン、および/もしくは血清オステオカルシンのレベル、好ましくは低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンを増加させるように機能するチオール特異的阻害薬として作用する作用物質を含んでいてもよい。作用物質はまた、耐糖能を増加させてもよい、インスリン感受性を増加させてもよい、ベータ細胞増殖を増加させてもよい、および/または前に記載されるように生物学的活性作用物質の他の効果を引き起こしてもよい。
【０２０３】
クマジンおよび他の誘導体を含むワルファリンおよび他のビタミンK阻害薬、ベータ遮断薬、スタチン、ならびにその断片および修飾体は、ガンマカルボキシラーゼの阻害から利益を得ると思われる患者に投与されてもよい。本発明の特定の実施形態では、小分子ワルファリンはガンマカルボキシラーゼの活性を阻害するために使用されてもよい。ワルファリン誘導体はアセノクマロール、フェンプロクーモン、およびフェニンジオンによって例示される。ワルファリンおよび他のクマジン誘導体はビタミンK依存性のガンマカルボキシル化を遮断し、したがって、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンのレベルを増加させる。
【０２０４】
ベータ遮断薬は、高血圧(高血圧症)、うっ血性心不全(CHF)、異常な心臓リズム(不整脈)、および胸痛(アンギナ)を治療するために使用される。ベータ遮断薬は、将来の心臓発作を予防するために心臓発作患者で時に使用される。2つの主なベータ受容体:ベータ1およびベータ2がある。いくつかのベータ遮断薬は、選択的であり、これは、それらがベータ2受容体を遮断する以上に、それらがベータ1受容体を遮断することを意味する。ベータ1受容体は心拍数および心拍動の強度を担う。非選択的ベータ遮断薬はベータ1およびベータ2受容体の両方を遮断する。ベータ2受容体は平滑筋の機能を担う。それらはまた骨芽細胞によって発現される唯一のベータ受容体でもある。ベータ遮断薬の非限定的な例は、ソタロール、チモロール、エスモロール、カルテオロール、カルベジロール、ナドロール、プロプラノロール、ベタキソロール、ペンブトロール、メトプロロール、ラベタロール、アセブトロール、アテノロール、メトプロロール、ラベタロール、ピンドロール、およびビソプロロールを含む。
【０２０５】
スタチンは、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、およびシンバスタチンによってさらに例示される。ベータ遮断薬の非限定的な例は、ソタロール、カルベジロール、メトロプロロールを含む。他の小分子は、本明細書に開示されるスクリーニングおよびアッセイを使用して同定することができる。
【０２０６】
他の阻害薬は、ガンマカルボキシラーゼのチオール特異的阻害薬を含む。ガンマカルボキシラーゼのCysおよびHis残基はガンマカルボキシラーゼのカルボキシラーゼメカニズムに関係し、酵素は、N‐エチルマレイミド(NEM)およびp-ヒドロキシ水銀安息香酸(pHMB)等の水銀剤等のチオール特異的阻害薬によって阻害されることが観察される。これらの阻害薬の付加的な非限定的な例は、5,5-ジチオビス-(2-ニトロ安息香酸)(DTNB)、2-ニトロ-5-チオシアノ安息香酸(NTCB)、ヨードアセトアミド(IA)、N-フェニルマレイミド(PheM)、N-(1-ピレニル)マレイミド(PyrM)、ナフタレン-1,5-ジマレイミド(NDM)、N,N’-(1,2-フェニレン)ジマレイミド(oPDM)、N,N’-1,4-フェニレンジマレイミド(pPDM)、N,N’-1,3-フェニレンジマレイミド(mPDM)、1,1-(メチレンジ-4,1-フェニレン)ビスマレイミド(BM)、4-(N-マレイミド)フェニルトリメチルアンモニウム(MPTM)、N,N’-ビス(3-マレイミドプロピオニル)-2-ヒドロキシ-1,3-プロパンジアミン(BMP)、N-スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート、ピロ炭酸ジエチル、p-クロロ水銀ベンゼンスルホン酸、およびチオスルフィナートを含む。これらの阻害薬はまた、たとえばBSAまたはアミノデキストラン等との抱合体または誘導体として提供されてもよい。
【０２０７】
OST-PTPおよびガンマカルボキシラーゼの抗体阻害薬
本発明はまた、OST-PTPまたはガンマカルボキシラーゼのポリペプチドのエピトープに結合することができる1つまたは複数の抗体およびその生物学的活性断片または変異体を含む組成物を提供する。その活性を減少させるOST-PTPに対する抗体は治療上使用することができる。ある実施形態では、OST-PTPに対する抗体は、OST-PTPの細胞外ドメインに結合する。
【０２０８】
ある実施形態では、OST-PTPに対する抗体は、配列番号19のマウスOST-PTPまたは配列番号19に実質的に相同もしくは同一のアミノ酸配列を有するOST-PTP中のエピトープに結合する。他の実施形態では、OST-PTPに対する抗体は、配列番号19に少なくとも70%相同または同一のアミノ酸配列を有するOST-PTP中のエピトープに結合する。
【０２０９】
ヒトOST-PTPは、当技術分野で知られている方法によって、マウスOST-PTP(配列番号18)(またはラットOST-PTP;配列番号24)のヒトオルソログを単離することによって得ることができる。たとえば、ヒト骨芽細胞からcDNAライブラリーを調製し、ライブラリーのcDNAクローンをマウスプローブへハイブリダイズすることにより、ヒトOST-PTP cDNAを同定することができるかもしれない。マウスプローブは、マウスOST-PTP(配列番号18)の一部に基づくものとすることができるかもしれない。あるいは、マウス配列に基づくプライマーを使用するPCRはヒトOST-PTP遺伝子を得るために使用することができる。
【０２１０】
ガンマカルボキシラーゼは細胞内タンパク質であり、したがって、それに対する抗体または抗体の断片は、好ましくは、ガンマカルボキシラーゼを発現する標的細胞、たとえば骨芽細胞の内部へ、抗体、断片、または変異体を送達するための技術と組み合わせた場合に、治療上使用される。ガンマカルボキシラーゼに対する抗体、断片、または変異体はまた、診断上でまたは薬剤スクリーニングアッセイで使用することができる。オステオカルシンおよびアディポネクチンに対する抗体または抗体断片または変異体は、標的細胞の内部へ抗体または断片を送達するための技術と共に同様に使用することができ、また診断および薬剤スクリーニングアッセイでも使用することができる。
【０２１１】
特定の実施形態では、本発明は、マウスOST-PTPの1316位またはヒトOST-PTPの対応する位置のアミノ酸を含むOST-PTP中のエピトープを認識する抗体、抗体の断片、または変異体を提供する。ある実施形態では、これらの抗体、抗体の断片、または変異体は、ガンマカルボキシラーゼを活性化するOST-PTPの能力を遮断するまたは阻害する。ある実施形態では、これらの抗体または断片の使用は、ガンマカルボキシラーゼを活性化するためのその能力の50%、60%、70%、80%、90%、95%、または本質的にすべてを失ったOST-PTPをもたらす。
【０２１２】
用語「エピトープ」は、抗体が結合する抗原上の抗原決定基を指す。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖等の分子が集まった化学的活性表面から成り、典型的には、特異的三次元構造の特徴および特異的帯電の特徴を有する。エピトープは、一般に、少なくとも5つの近接するアミノ酸を有する。用語「抗体(複数可)」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖Fv抗体断片、Fab断片、およびF(ab’)2断片を含む。ポリクローナル抗体は特定の抗原に対して特異的である抗体分子の異種の集団であるが、モノクローナル抗体は、抗原内に含有される特定のエピトープに対する抗体の同種の集団である。モノクローナル抗体は、本発明で特に有用である。
【０２１３】
対象とするポリペプチド(たとえばOST-PTPまたはガンマカルボキシラーゼ)に対する特異的結合親和性を有する抗体断片は、知られている技術によって産生することができる。そのような抗体断片は、抗体分子のペプシン消化によって生産することができるF(ab’)2断片およびF(ab’)2断片のジスルフィド架橋を還元することにより産生することができるFab断片を含むが、これらに限定されない。あるいは、Fab発現ライブラリーを構築することができる。たとえば、Huseら(1989年) Science 246:1275〜1281頁を参照されたい.単鎖Fv抗体断片は、アミノ酸架橋(たとえば15〜18個のアミノ酸)を介してFv領域の重鎖および軽鎖の断片を連結し、単鎖ポリペプチドをもたらすことにより形成される。単鎖Fv抗体断片は、米国特許第4,946,778号に開示される技術等の標準の技術を通して生産することができる。
【０２１４】
抗体またはその断片は、生産した後、たとえば酵素連結免疫吸着アッセイ(ELISA)またはラジオイムノアッセイ(RIA)を含む標準のイムノアッセイ法によって標的ポリペプチドの認識について試験することができる。Short Protocols in Molecular Biology Ausubelら編、Green Publishing Associates and John Wiley & Sons (1992年)を参照されたい。
【０２１５】
本明細書で使用されるイムノアッセイ、免疫組織化学、RIA、IRMAは、オステオカルシン、OST-PTP、ガンマカルボキシラーゼ、アディポネクチン、ビタミンK、またはそれらの断片もしくは変異体に特異的に結合する抗体を含む様々な抗体の産生に基づくものである。抗体および試料中の特にオステオカルシンの量を定量化するために抗体を使用する方法はまたHosodaらにも記載される(米国特許第5,681,707号)。Hosodaらは、オステオカルシンのN末端の20個のアミノ酸またはC末端の14個のアミノ酸に結合する抗体を開示する。抗OST-PTP抗体は市販で入手可能である。
【０２１６】
一実施形態では、その活性を低下させる、OST-PTPまたはガンマカルボキシラーゼに対する抗体は、OST-PTP経路に関する障害を有する患者の治療で有用である。そのような障害は、代謝症候群、耐糖能障害、糖尿病1型および2型、アテローム性動脈硬化症、ならびに肥満症を含む。そのような障害は、インスリン産生の減少、インスリン感受性の減少、耐糖能の減少、および/または体脂肪量の増加によって特徴づけられる。
【０２１７】
OST-PTPおよびガンマカルボキシラーゼの核酸阻害薬
本発明の他の実施形態は、発現、したがってタンパク質またはペプチド、特にOST-PTPおよびガンマカルボキシラーゼの生物学的活性を低下させるまたは阻害するためのアンチセンス核酸または小分子干渉RNA(siRNA)の使用を対象とする。OST-PTPおよびガンマカルボキシラーゼをコードするcDNA配列は下記に記載される。これらの知られている配列に基づいて、OST-PTPおよびガンマカルボキシラーゼをコードするそれぞれの遺伝子またはmRNAに十分にハイブリダイズして、発現をオフにしまたは低下させるアンチセンスDNAまたはRNAは、当技術分野で知られている方法を使用して容易に設計し、工学技術で作ることができる。
【０２１８】
本発明の特定の実施形態では、本発明で使用されるアンチセンス分子またはsiRNA分子は、配列番号10のヒトガンマカルボキシラーゼ核酸配列にストリンジェントな条件下で結合する分子である。本発明の他の実施形態では、アンチセンス分子またはsiRNA分子は、配列番号18のOST-PTP核酸配列または配列番号18に実質的に相同の配列へストリンジェントな条件下で結合する分子である。他の実施形態では、アンチセンス分子またはsiRNA分子は配列番号18に実質的に相同または同一の配列にストリンジェントな条件下で結合する。
【０２１９】
アンチセンスRNAおよびアンチセンスDNAは、様々な疾患を治療するために哺乳動物で治療上使用されてきた。たとえばAgrawal, S.およびZhao, Q. (1998年) Curr. Opin. Chemical Biol.第2巻、519〜528頁、Agrawal, SおよびZhang, R. (1997年) CIBA Found. Symp.第209巻、60〜78頁、ならびにZhao, Q,ら、(1998年)、Antisense Nucleic Acid Drug Dev.第8巻、451〜458頁を参照されたい。それらの全内容は、あたかも本明細書に完全に記載されるように参照によって本明細書に組み込まれる。アンチセンスのオリゴデオキシリボヌクレオチド(アンチセンスDNA)、オリゴリボヌクレオチド(アンチセンスRNA)、および他のポリマーアンチセンス化合物(たとえば自然発生の核酸塩基、糖、および共有結合ヌクレオシド間連結から構成されるオリゴヌクレオチドならびに同様に機能する非自然発生部分)は遺伝子またはその転写物と塩基対を形成することができる。AIDS患者のサイトメガロウイルス性網膜炎の治療のためのアンチセンスPS-オリゴデオキシリボヌクレオチドは、米国でヒトでの使用について承認された最初のアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドである。Anderson, K.O.ら、(1996年) Antimicrobial. Agents Chemother.第40巻、2004〜2011頁およびBorchersらによる「Antisense modulation of hematopoietic cell protein tyrosine kinase expression」と題する米国特許第6, 828, 151号は、アンチセンス核酸およびそれらの製剤を作り、使用するための方法を記載し、それらの全内容は、あたかも本明細書に完全に記載されるように参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２２０】
アンチセンス核酸を作る方法は当技術分野でよく知られている。細胞または組織を1つまたは複数の本発明のアンチセンス化合物またはアンチセンス組成物と接触させることによって、細胞または組織中のOST-PTPおよびガンマカルボキシラーゼの遺伝子およびmRNAの発現を調節する方法がさらに提供される。本明細書に使用されるように、用語「標的核酸」は、OST-PTPまたはガンマカルボキシラーゼをコードするDNAならびにそのようなDNAから転写されたRNA(プレmRNAおよびmRNAを含む)を包含する。核酸オリゴマー化合物のその標的核酸との特異的ハイブリダイゼーションは標的核酸の正常な機能に干渉する。標的核酸に特異的にハイブリダイズする化合物による標的核酸の機能のこの調節は一般に「アンチセンス」と称される。干渉されるDNAの機能は複製および転写を含む。たとえば、干渉されるRNAの機能は、たとえばタンパク質翻訳の部位へのRNAの移行、RNAからのタンパク質の翻訳、およびRNAが関与してもよいまたはそれによって促進されてもよい触媒活性等の生活機能をすべて含む。標的核酸機能に対するそのような干渉の全体的な効果は、DNAまたはRNAによってコードされたタンパク質の発現の調節である。本発明の文脈では、「調節」は、OST-PTPおよび/またはガンマカルボキシラーゼの遺伝子またはmRNAの発現の低下または阻害を意味する。DNAは好ましいアンチセンス核酸である。
【０２２１】
標的プロセスは、所望の阻害効果が達成されるようにアンチセンス相互作用が生じるように、OST-PTPおよび/またはガンマカルボキシラーゼをコードする標的DNAまたはRNA内の1つまたは複数の部位を決定することを含む。本発明の文脈内で、好ましい遺伝子内の部位は、OST-PTPまたはガンマカルボキシラーゼ、好ましくはヒトOST-PTPまたはガンマカルボキシラーゼのmRNAのオープンリーディングフレーム(ORF)の翻訳開始コドンまたは終止コドンを包含する領域である。当技術分野で知られているように、翻訳開始コドンは、典型的には5’-AUG(転写mRNAの分子中で;対応するDNA分子中で5’-ATG)であるので、翻訳開始コドンはまた、「AUGコドン」、「開始コドン」、または「AUG開始コドン」とも称される。少数の遺伝子は、RNA配列5’-GUG、5’-UUG、または5’-CUGを有する翻訳開始コドンを有し、5’-AUA、5’-ACG、および5’-CUGはin vivoで機能することが示された。したがって、たとえ各事例のイニシエーターアミノ酸が典型的には真核生物のメチオニンであっても、用語「翻訳開始コドン」および「開始コドン」は多くのコドン配列を包含することができる。真核生物の遺伝子は、2つ以上の代替開始コドンを有しているかもしれないことが当技術分野で知られており、そのいずれか1つは、特定の細胞型もしくは組織中でのまたは特定の条件下での翻訳開始のために優先的に利用されるかもしれない。本発明の文脈では、「開始コドン」および「翻訳開始コドン」は、遺伝子から転写されたmRNA分子の翻訳を開始するためにin vivoで使用される1つまたは複数のコドンを指す。日常的な実験作業によりアンチセンスまたはsiRNAの最適な配列が決定されるであろう。
【０２２２】
遺伝子の翻訳終止コドン(または「停止コドン」)が3つの配列、つまり5’-UAA、5’-UAG、5’-UGAのうちの1つを有し得ることが当技術分野で知られている(対応するDNA配列はそれぞれ5’-TAA、5’-TAG、および5’-TGAである)。
【０２２３】
用語「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」は、翻訳開始コドンから一方の方向(つまり5’または3’)に約25〜約50個の近接するヌクレオチドを包含するようなmRNAまたは遺伝子の部分を指す。同様に、用語「停止コドン領域」および「翻訳終止コドン領域」は、翻訳終止コドンから一方の方向(つまり5’または3’)に約25〜約50個の近接するヌクレオチドを包含するようなmRNAまたは遺伝子の部分を指す。
【０２２４】
翻訳開始コドンおよび翻訳終止コドンの間の領域を指すことで当技術分野で知られているオープンリーディングフレーム(ORF)または「コード領域」はまた実際上標的とされてもよい領域でもある。他の標的領域は、翻訳開始コドンから5’方向のmRNAの部分を指すことで当技術分野で知られている5’非翻訳領域(5’UTR)を含み、したがって、mRNAまたは遺伝子上の対応するヌクレオチドの、5’キャップ部位および翻訳開始コドンの間のヌクレオチドを含み、また他の標的領域は、翻訳終止コドンから3’方向のmRNAの部分を指すことで当技術分野で知られている3’非翻訳領域(3’UTR)を含み、したがって、mRNAまたは遺伝子上の対応するヌクレオチドの、翻訳終止コドンおよび3’末端の間のヌクレオチドを含む。
【０２２５】
転写を開始または停止するための代替シグナルの使用を通して変異体を生産することができ、プレmRNAおよびmRNAが複数の開始コドンまたは停止コドンを持ち得ることもまた当技術分野で知られている。代替開始コドンを使用するプレmRNAまたはmRNAに由来する変異体は、そのプレmRNAまたはmRNAの「代替開始変異体」として知られている。代替停止コドンを使用するそれらの転写物は、そのプレmRNAまたはmRNAの「代替停止変異体」として知られている。1つの特定の種類の代替停止変異体は、「ポリA変異体」であり、生産された複数の転写物は、転写機構による「ポリA停止シグナル」のうちの1つの代替の選択に起因し、それによって、特有のポリA部位で終止する転写物を生産する。
【０２２６】
1つまたは複数の標的部位が同定された後、標的に十分に相補的な、つまり、十分に好都合に、十分な特異性でハイブリダイズして、遺伝子の発現および転写またはmRNAの翻訳を阻害する所望の効果を示す核酸が選ばれる。
【０２２７】
本発明の文脈では、「ハイブリダイゼーション」は水素結合を意味し、これは、相補的なヌクレオシド塩基またはヌクレオチド塩基の間のWatson-Crick、Hoogsteen、または逆Hoogsteenの水素結合であってもよい。たとえば、アデニンおよびチミンは水素結合の形成を通して対になる相補的な核酸塩基である。本明細書に使用される「相補性」は、2つのヌクレオチドの間の正確な対形成のための性能を指す。たとえば、核酸のある位置のヌクレオチドがDNA分子またはRNA分子の同じ位置のヌクレオチドと水素結合できる場合、核酸およびDNAまたはRNAはその位置で互いに相補的であると考えられる。各分子の十分な数の対応する位置が、互いに水素結合することができるヌクレオチドによって占められる場合、核酸およびDNAまたはRNAは互いに相補的である。したがって、「特異的にハイブリダイズすることができる」および「相補的な」は、十分な程度の相補性または正確な対形成を示すために使用される用語であり、その結果、核酸およびDNA標的またはRNA標的の間で安定したかつ特異的な結合が生じる。アンチセンス化合物の配列は、特異的にハイブリダイズすることができるその標的核酸の配列に100%相補的である必要がないということが当技術分野で理解されている。標的DNA分子または標的RNA分子への化合物の結合が、標的DNAまたは標的RNAの正常な機能に干渉して、機能の損失を引き起こす場合ならびに特異的結合が所望される条件下で、つまりin vivoアッセイまたは治療上の処理の場合の生理学的条件下でおよびアッセイが行われる条件下のin vitroアッセイの場合に、非標的配列へのアンチセンス化合物の非特異的結合を回避するための十分な程度の相補性がある場合、アンチセンス化合物は特異的にハイブリダイズすることができる。
【０２２８】
アンチセンス核酸は、動物および人の疾患状態の治療での治療成分として用いられてきた。リボザイムを含むアンチセンス核酸薬剤は、ヒトに安全かつ有効に投与され、多数の臨床治験が目下進行中である。したがって、核酸は、たとえばOST-PTPおよびガンマカルボキシラーゼの発現を制御するために、細胞、組織、および動物、とりわけヒトの治療のための治療レジメンで有用となるように構成することができる有用な治療様式となることができることが確証されている。
【０２２９】
本発明の文脈の核酸は「オリゴヌクレオチド」を含み、これは、リボ核酸(RNA)もしくはデオキシリボ核酸(DNA)のオリゴマーもしくはポリマーまたはそのミメティックを指す。この用語は、自然発生核酸塩基、糖、および共有結合ヌクレオシド間(バックボーン)連結から構成されるオリゴヌクレオチドならびに同様に機能する非自然発生部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。そのような修飾オリゴヌクレオチドまたは置換オリゴヌクレオチドは、たとえば、高められた細胞取り込み、核酸標的に対する高められた親和性、およびヌクレアーゼの存在下での安定性の増加等の望ましい特性のために天然の形態より好ましいことが多い。
【０２３０】
アンチセンス核酸はアンチセンス化合物の好ましい形態であるが、本発明は、オリゴヌクレオチドミメティックを含むが、これに限定されない他のオリゴマーアンチセンス化合物を包含する。本発明に従うアンチセンス化合物は、好ましくは、約8〜約50個の核酸塩基(つまり約8〜約50個の連結されたヌクレオシド)を含む。特に好ましいアンチセンス化合物は、約12〜約30個の核酸塩基を含むアンチセンス核酸である。アンチセンス化合物は、リボザイム、外部ガイド配列(EGS)核酸(オリゴザイム)、および標的核酸にハイブリダイズし、かつその発現を調節する他の低分子触媒RNAまたは触媒核酸を含む。
【０２３１】
本発明に従って使用されるアンチセンス化合物は、固相合成のよく知られている技術を通して好都合にかつ日常的に作られてもよい。そのような合成のための装置は、たとえば、Applied Biosystems(Foster City、Calif.)を含むいくつかのベンダーによって販売されている。当技術分野で知られているそのような合成のための任意の他の手段がさらにまたは代わりに用いられてもよい。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体等の核酸を調製するために類似している技術を使用することがよく知られている。
【０２３２】
本発明のアンチセンス化合物は、診断、治療法、および予防のためにならびに研究試薬およびキットとして利用することができる。治療法については、ガンマカルボキシラーゼまたはOST-PTPの発現を調節することによって治療することができる代謝症候群、耐糖能障害、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、および/または肥満症等の疾患または障害を有すると推測される動物、好ましくはヒトは、本発明に従ってアンチセンス化合物を投与することにより治療される。本発明の化合物は、適した薬学的に許容し得る希釈剤または担体へ有効量のアンチセンス化合物を追加することによって医薬組成物中で利用することができる。本発明のアンチセンス化合物および方法は、たとえば、代謝症候群、耐糖能障害、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、または肥満症の出現を予防しまたは遅延させるために予防的に有用である、本発明のアンチセンス化合物および方法はまた、代謝症候群、耐糖能障害、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、または肥満症の進行を遅らせるのにも有用である。
【０２３３】
本発明はまた、糖尿病患者の血清インスリンのレベル(たとえば)を正常に戻すために投与される本発明のアンチセンス化合物を含む医薬組成物および製剤を含む。
【０２３４】
米国特許出願第2004/0023390号(それらの全内容は、あたかも本明細書に完全に記載されるように参照によって本明細書に組み込まれる)は、二本鎖RNA(dsRNA)が、RNA干渉(RNAi)として知られているプロセスによって多くの生物で配列特異的転写後遺伝子サイレンシングを誘発することができることを教示する。しかしながら、哺乳動物細胞では、30塩基対のまたはそれよりも長いdsRNAは、タンパク質合成の活動停止およびアポトーシスを通した細胞死さえも引き起こす配列非特異的応答を誘発し得る。最近の成果は、RNA断片がRNAiの配列特異的媒介物となることを示す(Elbashirら、2001年)。これらの小分子干渉RNA(siRNA)による遺伝子発現の干渉は、今や、線虫、ショウジョウバエ、植物で、ならびにマウス胚性幹細胞、卵母細胞、および初期胚で遺伝子を発現停止させるための自然発生戦略として認識されている(Cogoniら、1994年、Baulcombe、1996年、Kennerdell、1998年、Timmons、1998年、Waterhouseら、1998年、WiannyおよびZernicka-Goetz、2000年、Yangら、2001年、Svobodaら、2000年)。
【０２３５】
哺乳動物細胞培養では、遺伝子発現のsiRNA媒介性の低下は、合成RNA核酸で細胞を形質移入することにより達成された(Caplanら、2001年、Elbashirら、2001年)。出願第2004/0023390号は、それらの全内容は、あたかも本明細書に完全に記載されるように参照によって本明細書に組み込まれるが、対象とする遺伝子に誘導される小分子干渉RNA分子(siRNA)をコードする核酸配列に作動可能に連結されたpolIIプロモーターを含有する発現カセットを含有するウイルスベクターを使用する例示的な方法を提供する。
【０２３６】
本明細書に使用されるように、RNAiはRNA干渉のプロセスである。典型的なmRNAは、タンパク質の約5,000個のコピーを生産する。RNAiは、好ましくはOST-PTPまたはガンマカルボキシラーゼをコードするmRNAによって作られるタンパク質コピーの数に干渉するまたは有意に低下させるプロセスである。たとえば、二本鎖低分子干渉RNA(siRNA)分子は、干渉される標的mRNAのタンパク質コードヌクレオチド配列を補完し、それにマッチするように工学技術で作られる。細胞内送達後、siRNA分子はRNA誘発サイレンシング複合体(RISC)と結合する。siRNA結合RISCは、塩基対形成相互作用を通して標的mRNA(ガンマカルボキシラーゼおよびOST-PTPをコードするmRNA等)に結合し、それを分解する。RISCは、標的mRNAのさらなるコピーを分解し続けることができる。低分子ヘアピン型RNAおよびより長いRNA分子等のRNAの他の形態を使用することができる。より長い分子は、たとえばアポトーシスを起こさせることおよびインターフェロン応答を誘発することにより細胞死を引き起こす。30ヌクレオチドよりも長いdsRNAがRNA転写物の非特異的分解および宿主細胞の全般的な活動停止をもたらす防御メカニズムを活性化したので、細胞死は、哺乳動物でRNAiを達成することへの重大なハードルであった。哺乳動物細胞中での遺伝子特異的抑制を媒介するために約20〜約29個のヌクレオチドsiRNAを使用することによりこの障害を明らかに克服した。これらのsiRNAは、遺伝子抑制を引き起こすのに十分な長さであるが、インターフェロン応答を誘発する長さではない。本発明の特定の実施形態では、遺伝子抑制の標的は、OST-PTP遺伝子およびガンマカルボキシラーゼの遺伝子である。本発明で有用なsiRNA分子は、配列番号10のヒトガンマカルボキシラーゼ遺伝子または配列番号18のOST-PTP遺伝子にストリンジェントな条件下で結合する配列を含む。本発明で有用なsiRNA分子はまた、配列番号18に対して80%、85%、90%、または95%相同である核酸にストリンジェントな条件下で結合する配列を含む。
【０２３７】
本発明の治療薬および他の薬剤の同時投与
本明細書に記載される低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンならびにOST-PTPおよびガンマカルボキシラーゼの阻害薬は、抗凝固薬、血管拡張薬、アテローム性動脈硬化症を治療するために使用される薬剤、耐糖能障害を治療するために使用される薬剤、糖尿病を治療するために使用される薬剤、ビタミンK阻害薬、スタチン、ベータ遮断薬、ならびに代謝症候群、耐糖能障害、1型または2型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、および肥満症を含むがこれらに限定されない、OST-PTPシグナル伝達経路に関する障害と関連する疾患を治療するために使用される他の薬剤等の他の薬剤と共に、併用療法で薬剤の治療上の利益を提供するのに有効な量で患者に同時投与されてもよい。併用により、効果の増加、追加の効果、または相乗効果が提供されるかもしれない。低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシン、OST-PTPの阻害薬、ガンマカルボキシラーゼの阻害薬、および他の薬剤の同時投与は、別個の医薬組成物の投与によって行われてもよいまたは低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシン、OST-PTPの阻害薬、ガンマカルボキシラーゼの阻害薬、および他の薬剤は、単一の医薬組成物中に存在していてもよい。
【０２３８】
本発明で有用な抗凝固薬は、ビタミンKアンタゴニスト、ヘパリンおよびヘパリンの誘導体、ならびに直接トロンビン阻害薬によって例示される。ビタミンKアンタゴニストは、ワルファリン(商品名COUMADIN(登録商標)、JANTOVEN(登録商標)、MAREVAN(登録商標)、およびWARAN(登録商標)でも知られている)、ワルファリン誘導体、アセノクマロール、フェンプロクーモン、ならびにフェニンジオンによって例示される。ヘパリンおよびヘパリンの誘導体は低分子量ヘパリンおよびフォンダパリヌクスによって例示される。直接トロンビン阻害薬は、アルガトロバン、レピルジン、ビバリルジン、およびキシメラガトランによって例示される。
【０２３９】
血管拡張薬は本発明で有用である。血管拡張薬は、アデノシン、亜硝酸アミルおよび他の亜硝酸塩、L-アルギニン、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)、ブラジキニン、エタノール、血管内皮由来過分極因子(EDHF)、ヒスタミン、補体タンパク質C3a、C4a、およびC5a、ナイアシン(ニコチン酸)、一酸化窒素、トリニトログリセリン(ニトログリセリンとして通常知られている)、一硝酸イソソルビド&二硝酸イソソルビド、四硝酸ペンタエリスリトール(PETN)、ニトロプルシドナトリウム、PDE5阻害薬、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、血小板活性化因子(PAF)、プロスタサイクリン(PGI2)、ならびに他のプロスタグランジン、テトラヒドロカンナビノール(THC)、テオブロミン、およびパパベリンによって例示される。
【０２４０】
アテローム性動脈硬化症を治療するために使用される薬剤は、本発明で有用である。アテローム性動脈硬化症を治療するために使用される薬剤は、スタチン、シロスタゾール、ベンゾチアゼピン、フェニルアルキルアミン、ジヒドロピリジン、エポプロステノール、ビタミンB3、およびアスピリンによって例示される。スタチンは、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、およびシンバスタチンによってさらに例示される。ベンゾチアゼピンはジルチアゼムによって例示される。フェニルアルキルアミンはベラパミルによって例示される。ジヒドロピリジンは、アムロジピン、フェロジピン、イスラジピン、ラシジピン、レルカニジピン、ニカルジビン、ニフェジピン、ニモジピン、ニソルジピン、およびニトレンジピンによって例示される。
【０２４１】
糖尿病の治療で有用な薬剤は、スルホニル尿素、メグリチニド、D-フェニルアラニン誘導体(ナテグリニド)、ビグアニド、チアゾリジンジオン、アルファグルコース阻害薬、ジペプチジルペプチダーゼ4(DPP4)阻害薬、インスリン(好ましくはヒト組換えインスリン)、およびインクレチンを含むが、これらに限定されない。
【０２４２】
スルホニル尿素は、グリメピリド、グリブリド、クロルプロパミド、アセトヘキサミド、グリピジド、トルブタミド、およびトラザミドによって例示される。メグリチニドはレパグリニドによって例示される。D-フェニルアラニン誘導体はナテグリニドによって例示される。ビグアニドはメトホルミンおよび塩酸メトホルミンによって例示される。チアゾリジンジオンはピオグリタゾンおよびロシグリタゾンによって例示される。アルファグルコース阻害薬はミグリトールおよびアカルボースによって例示される。ジペプチジルペプチダーゼ4(DPP4)阻害薬はビルダグリプチン、シタグリプチン、およびサクサグリプチンによって例示される。
【０２４３】
一般に、6つの分類のインスリン:超速効型、速効型、中間型、長時間作用型、超長時間作用型、および予混合がある。インクレチンは、食後、血糖レベルが上昇するようになる前でさえ、ランゲルハンス島のベータ細胞から放出されるインスリンの量の増加を引き起こす一種の消化管ホルモンである。インクレチンは、グルカゴン様ペプチド-1(GLP-1)および胃抑制ペプチド(グルコース依存性インスリン分泌性ペプチドまたはGIPとしても知られている)によって例示される。
【０２４４】
ベータ遮断薬は、高血圧(高血圧症)、うっ血性心不全(CHF)、異常心臓リズム(不整脈)、および胸痛(アンギナ)を治療するために使用される。ベータ遮断薬は、将来の心臓発作を予防するために心臓発作患者で時に使用される。ベータ遮断薬は、アドレナリンとしても知られているホルモンエピネフリンの効果を遮断することによって働く。その結果として、心臓はよりゆっくり、それほど力強くなく鼓動し、それによって血圧を下げる。ベータ遮断薬はまた、血管が弛緩し、開いて、血流を改善するように助ける。ベータ遮断薬はまた不整脈を引き起こし得るインパルスをも遮断する。2つの主なベータ受容体:ベータ1およびベータ2がある。いくつかのベータ遮断薬は、選択的である、これは、それらがベータ2受容体を遮断する以上に、それらがベータ1受容体を遮断することを意味する。ベータ1受容体は心拍数および心拍動の強度を担う。非選択的ベータ遮断薬はベータ1およびベータ2受容体の両方を遮断する。ベータ2受容体は平滑筋の機能を担い、それらはまた骨芽細胞によって発現される唯一のベータ受容体でもある。
【０２４５】
米国で通常使用されるベータ遮断薬の商品名および一般クレームは、Betapace(ソタロール)、Blocadren(チモロール)、Brevibloc(エスモロール)、Cartrol(カルテオロール)、Coreg(カルベジロール)、Corgard(ナドロール)、Inderal(プロプラノロール)、Inderal-LA(プロプラノロール)、Kerlone(ベタキソロール)、Levatol(ペンブトロール)、Lopressor(メトプロロール)、Normodyne(ラベタロール)、Sectral(アセブトロール)、Tenormin(アテノロール)、Toprol-XL(メトプロロール)、Trandate(ラベタロール)、Visken(ピンドロール)、Zebeta(ビソプロロール)である。カナダで通常使用される商品名は、Apo-Atenolol(アテノロール)、Apo-Metoprolol(メトプロロール)、Apo-Propranolol(プロプラノロール)、Apo-Timol(チモロール)、Betaloc(メトプロロール)、Blocadren(チモロール)、Corgard(ナドロール)、Inderal(プロプラノロール)、Lopressor(メトプロロール)、Monitan(アセブトロール)、Novo-Atenol(アテノロール)、Novometoprol(メトプロロール)、Novo-Pindol(ピンドロール)、Novo-Timol(チモロール)、Sectral(アセブトロール)、Sotacor(ソタロール)、Tenormin(アテノロール)、Trandate(ラベタロール)、Trasicor(オクスプレノロール)、Visken(ピンドロール)である。
【０２４６】
医薬組成物および投与
本発明は、被検者に投与するための医薬組成物中に製剤された、本明細書に記載されるポリペプチド、核酸、抗体、小分子、および他の治療薬の使用を包含する。治療薬(「活性化合物」とも称される)は、被検者、たとえばヒトへの投与に適した医薬組成物の中に組み込むことができる。そのような組成物は、典型的には、ポリペプチド、核酸、抗体、小分子、および薬学的に許容し得る担体を含む。好ましくは、そのような組成物は、ヒトに投与される場合、非発熱性である。
【０２４７】
本発明の医薬組成物は、ガンマカルボキシラーゼ、オステオカルシン、インスリン、およびアディポネクチンを含むOST-PTPシグナル伝達経路を調節するのに十分な量で投与される。
【０２４８】
本明細書に使用されるように、用語「薬学的に許容し得る担体」は、医薬品の投与と適合する任意のおよびすべての溶剤、結合剤、希釈剤、崩壊剤、滑沢剤、分散媒、コーティング、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤および吸収遅延薬、ならびにその他同種類のものを含むように意図される。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および作用物質の使用は当技術分野でよく知られている。任意の従来の媒体または作用物質が活性化合物と適合する限り、そのような媒体は本発明の組成物中に使用することができる。補充性の活性化合物または治療薬もまた組成物の中に組み込むことができる。本発明の医薬組成物は、投与のその意図した経路と適合するように製剤される。投与の経路の例は、非経口、たとえば静脈内、皮内、鼻腔内、皮下、経口、吸入、経皮(局所的)、経粘膜、および直腸投与を含む。
【０２４９】
用語「投与する」はその最も広い意味で使用され、被検者に本発明の組成物を導入するあらゆる方法を含む。これは被検者に外因的に導入されたポリヌクレオチドの転写または翻訳によるとおりにin vivoでポリペプチドまたはポリヌクレオチドを生産するステップを含む。したがって、被検者で外因性組成物から生産されたポリペプチドまたは核酸は用語「投与する」に包含される。
【０２５０】
非経口、皮内、または皮下の適用に使用される液剤または懸濁剤は、以下の成分を含むことができる:注射のための水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶剤等の無菌希釈剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン等の抗菌薬、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム等の酸化防止剤、エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤、アセテート、シトラート、またはホスフェート等のバッファー、および塩化ナトリウムまたはデキストロース等の張性の調整のための作用物質。pHは、塩酸または水酸化ナトリウム等の酸または塩基を用いて調整することができる。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックで作られたアンプル、使い捨ての注射器、または複数用量バイアル中に封入することができる。
【０２５１】
注射可能な使用に適した医薬組成物は、無菌液剤(治療薬は水溶性)または無菌の注射可能な液剤もしくは分散液を即座に調製するための分散液および無菌散剤を含む。静脈内投与については、適した担体は、生理食塩水、静菌水、Cremophor EL(登録商標)(BASF、Parsippany、N.J.)、またはリン酸緩衝食塩水(PBS)を含む。すべての場合で、組成物は無菌でなければならず、容易な注射可能性(syringability)が存在する程度まで流動性であるべきである。組成物は製造および保管の条件下で安定しているべきであり、細菌および菌類等の微生物の汚染作用に対して保存されるべきである。担体は、たとえば水、エタノール、ポリオール(たとえばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、およびその他同種類のもの)ならびにその適した混合物を含有する溶剤または分散媒とすることができる。適度の流動性は、たとえばレシチン等のコーティングの使用によって、分散液の場合に必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌薬および抗真菌薬、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール、およびその他同種類のものによって達成することができる。多くの場合で、等張剤、たとえば糖、マンニトール、ソルビトール等のポリアルコール、塩化ナトリウムを組成物中に含むことは望ましいであろう。注射可能な組成物の吸収の延長は、組成物中に吸収を遅延させる作用物質、たとえばモノステアリン酸アルミニウム、およびゼラチンを含むことによってもたらすことができる。
【０２５２】
無菌の注射可能な液剤は、活性化合物(たとえば低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンタンパク質または抗OST-PTP抗体)を、必要とされる量で、適切な溶剤中で、必要に応じて、上記に列挙される成分の1つまたはその組み合わせと共に組み込むことにより、その後濾過滅菌を続けることにより調製することができる。一般に、分散液は、基本的な分散媒および上記に列挙される成分からの必要とされる他の成分を含有する無菌賦形剤の中に活性化合物を組み込むことにより調製される。無菌の注射可能な液剤の調製のための無菌散剤の場合では、調製の好ましい方法は、前もって滅菌濾過したその液剤から有効成分および任意の付加的な所望の成分の散剤を産出する真空乾燥および凍結乾燥である。
【０２５３】
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用の担体を含む。それらはゼラチンカプセル剤中に封入するまたは固めて錠剤にすることができる。治療される特定の条件に依存して、アテローム性動脈硬化症または代謝症候群の他の要素の治療のための本発明の医薬組成物は、製剤し、全身にまたは局所的に投与することができる。製剤および投与のための技術は、「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」(第20版、Gennaro(編)およびGennaro、Lippincott、Williams & Wilkins、2000年)に見つけることができる。経口投与については、作用物質は胃に耐えるように腸溶性の形態に含有させることができるまたは知られている方法によって、消化管の特定の領域中に放出されるようにさらにコーティングするもしくは混合することができる。経口治療投与目的のために、活性化合物は添加剤と共に組み込むこともでき、錠剤、トローチ、またはカプセル剤の形態で使用することができる。経口組成物はまた、うがい薬として使用するための流動性の担体を使用して調製することができ、流動性の担体中の化合物は経口的に適用されかつすばやく動かされかつ吐き出されるまたは飲み込まれる。薬学的に適合する結着剤および/またはアジュバント物質は組成物の一部として含むことができる。錠剤、ピル、カプセル剤、トローチ、およびその他同種類のものは、以下の成分または類似している性質の化合物のうちのいずれかを含有することができる:微結晶性セルロース、トラガカントゴム、もしくはゼラチン等の結合剤、デンプンもしくはラクトース等の添加剤、アルギン酸、PRIMOGEL(登録商標)、もしくはコーンスターチ等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムもしくはSTEROTES(登録商標)等の滑沢剤、コロイド状二酸化ケイ素等の滑剤、スクロースもしくはサッカリン等の甘味料、またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香料等の香料。
【０２５４】
吸入による投与については、化合物は、適した噴霧剤、たとえば二酸化炭素等のガスを含有する加圧容器もしくはディスペンサーまたはネブライザーから、エアゾルスプレーの形態で送達される。
【０２５５】
全身投与はまた、経粘膜手段または経皮手段によるものとすることもできる。経粘膜投与または経皮投与については、浸透する障壁に適切な浸透剤が製剤中に使用される。そのような浸透剤は一般に当技術分野で知られており、たとえば、経粘膜投与については、洗浄剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻腔スプレーまたは坐剤の使用を通して達成することができる。経皮投与については、活性化合物は、当技術分野で一般に知られている軟膏剤、軟膏、ゲル剤、またはクリーム剤に製剤される。
【０２５６】
適切な場合、化合物はまた、直腸送達のために坐剤(たとえば、ココアバターおよび他のグリセリド等の従来の坐剤基剤と共に)または保持浣腸剤の形態で調製することができる。
【０２５７】
一実施形態では、活性化合物は、植込錠およびマイクロカプセル化送達系を含む徐放性製剤等の、体からの急速な排出から化合物を防御する担体を用いて調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸等の生物分解性の生物学的適合ポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製のための方法は当業者に明白であろう。その物質はまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.からも市販で得ることができる。リポソーム懸濁剤(たとえばモノクローナル抗体を用いて特定の細胞に誘導されるリポソームを含む)もまた、薬学的に許容し得る担体として使用することができる。たとえば、米国特許第4,522,811号に記載されるように、これらは当業者に知られている方法に従って調製することができる。
【０２５８】
投与の容易性および投薬の均等性のために単位剤形で経口組成物または非経口組成物を製剤することはとりわけ有利である。本明細書に使用される「単位剤形」は、治療される被検者に対する単一の投薬量として適した、物理的に別々の単位量を指し、各単位量は、必要とされる医薬品担体と共同して所望の治療効果を生産するように算出された所定の量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形の規格は、活性化合物の特有の特徴および達成される特定の治療効果ならびに個人の治療のためにそのような活性化合物を配合する、当技術分野で固有の制限によって決まる、またそれらに直接依存する。
【０２５９】
前に述べたように、作用物質は、ポンプによって継続的にまたは長時間、日中頻繁に投与されてもよい。ある実施形態では、作用物質は、約0.3〜100ng/時、好ましくは約1〜75ng/時、より好ましくは約5〜50ng/時、さらに好ましくは約10〜30ng/時の速度で投与されてもよい。作用物質は、約0.1〜100μg/時、好ましくは約1〜75μg/時、より好ましくは約5〜50μg/時、さらに好ましくは約10〜30μg/時の速度で投与されてもよい。治療のために使用される抗体、タンパク質、またはポリペプチドの有効な投薬量は、特定の治療の経過にわたり増加してもよいまたは減少してもよいこともまた十分に理解されるであろう。投薬量の変化は、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンおよび/もしくはアディポネクチンおよび/もしくはインスリンのレベルのモニターならびに/または生物学的試料、好ましくは血液もしくは血清中の血糖症コントロールのモニターに起因してもよく、それから明白になってもよい。
【０２６０】
本発明の実施形態では、作用物質は、所望の時間、所望の用量の作用物質を注入するために浸透性のポンプを使用して、皮下の、長期的な、自動化された薬剤送達によって送達することができる。インスリンポンプは広く入手可能であり、長時間にわたりインスリンを自動的に送達するために糖尿病患者によって使用される。そのようなインスリンポンプは作用物質を送達するように適合させることができる。耐糖能障害、糖尿病1型、または2型をコントロールするための作用物質の送達速度は、個人の変化するインスリン必要量に対応するように広い範囲で容易に調整することができる(たとえば基本的な速度およびボーラス用量)。新しいポンプは定期的な投与様式を可能にする、つまり、液体は、継続的な流動様式ではなく、少ない固定容量の定期的な別々の用量で送達される。装置についての全体的な液体送達速度は、投与期間をコントロールし調整することによってコントロールし調整する。ポンプは、「Analyte Monitoring Device and Methods of Use」と題する米国特許第6,560,471号に記載されるシステム等の継続的な血糖モニターデバイスおよび遠隔ユニットとつなぐことができる。そのような設備では、継続的血糖モニターデバイスをコントロールする携帯型遠隔ユニットは、血糖モニターユニットおよび本発明の治療薬を送達する流動性送達デバイスの両方と無線で通信し、それらをコントロールすることができる。
【０２６１】
タンパク質もしくはポリペプチド、小分子、または核酸の「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するための量である。たとえば、治療薬がアテローム性動脈硬化症を治療または予防するために投与される場合、治療有効量はその疾患の1つまたは複数の症状を寛解させる量であるまたは酸化リン脂質の低下、アテローム性動脈硬化プラークの退縮、炎症性タンパク質生合成の減少、血漿コレステロールの低下、血管平滑筋細胞(VSMC)の増殖および数の低下、動脈性プラークの厚さの減少、心臓発作、アンギナ、もしくは発作等の臨床イベントの低下、高血圧症の減少、ならびにその他同種類のものから成る群から選択される少なくとも1つの効果をもたらす。治療薬が動物(ヒトおよび実験動物を含む哺乳動物を含む)の代謝症候群を治療または予防するために使用される場合、治療有効量は、膵臓ベータ細胞増殖の増加、インスリン分泌の増加、インスリン感受性の増加、耐糖能の増加、重量増加の減少、減量、体脂肪量の減少、血清アディポネクチンの増加、およびアテローム性動脈硬化症の減少またはそのコントロールの改善から成る群から選択される少なくとも1つの効果をもたらす量である。
【０２６２】
本発明で使用されるタンパク質もしくはポリペプチド、小分子、または核酸の治療有効量は典型的には変動し、被検者で典型的には1ミリリットル当たり約1ナノグラムおよび1ミリリットル当たり約10マイクログラムの間の血清治療薬レベルを達成するのに十分な量とすることができるまたは被検者で1ミリリットル当たり約1ナノグラムおよび1ミリリットル当たり約7マイクログラムの間の血清治療薬レベルを達成するのに十分な量とすることができる。他の好ましい血清治療薬レベルは、1ミリリットル当たり約0.1ナノグラム〜1ミリリットル当たり約3マイクログラム、1ミリリットル当たり約0.5ナノグラム〜1ミリリットル当たり約1マイクログラム、1ミリリットル当たり約1ナノグラム〜1ミリリットル当たり約750ナノグラム、1ミリリットル当たり約5ナノグラム〜1ミリリットル当たり約500ナノグラム、および1ミリリットル当たり約5ナノグラム〜1ミリリットル当たり約100ナノグラムを含む。
【０２６３】
1日の用量として表現すると、この量は、1日当たり体重1キログラム当たり約0.1ナノグラムおよび1日当たり体重1キログラム当たり約20ミリグラムの間ならびに1日当たり体重1キログラム当たり約1ナノグラムおよび1日当たり体重1キログラム当たり約10ミリグラムの間とすることができる。他の好ましい1日の投薬量は、1日当たり体重1キログラム当たり約1ナノグラム〜1日当たり体重1キログラム当たり約20ミリグラム、1日当たり体重1キログラム当たり約5ナノグラム〜1日当たり体重1キログラム当たり約5ミリグラム、1日当たり体重1キログラム当たり約20ナノグラム〜1日当たり体重1キログラム当たり約500マイクログラム、および1日当たり体重1キログラム当たり約500ナノグラム〜1日当たり体重1キログラム当たり約100マイクログラムを含む。しかしながら、当業者は、状態の重症度、前の治療、被検者の一般的な健康状態および/または年齢、ならびに存在する他の障害または疾患を含むが、これらに限定されないある種の因子が、被検者を有効に治療するのに必要とされる投薬量に影響を及ぼすかもしれないことを十分に理解するであろう。
【０２６４】
ある実施形態では、本発明の医薬組成物は、約0.1mg〜5g、約0.5mg〜約1g、約1mg〜約750mg、約5mg〜約500mg、または約10mg〜約100mgの治療薬を含む。
【０２６５】
さらに、治療有効量のタンパク質、ポリペプチド、ヌクレオチド、または抗体を用いる被検者の治療は、単一の治療を含むことができ、または、好ましくは一連の治療を含むことができる。
【０２６６】
ある実施形態では、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンを用いる被検者の治療により、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンは、患者の血液中の全オステオカルシンの約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、または約50%となる。
【０２６７】
小分子作用物質の適切な用量は通常の知識を有する医師、獣医師、または研究者の知識内の多くの因子に依存することが理解される。小分子の用量(複数可)は、たとえば、治療される被検者または試料の個性、サイズ、および状態に依存して、組成物が投与される経路および小分子が有していることを従業者が望む効果にさらに依存して変動するであろう。小分子の適切な用量は、調節される発現または活性に関しての小分子の効力に依存することがさらに理解される。そのような適切な用量は本明細書に記載されるアッセイを使用して決定されてもよい。1つまたは複数のこれらの小分子が、OST-PTPまたはガンマカルボキシラーゼの発現または活性を調節するために動物(たとえばヒト)に投与される場合、比較的低用量を最初に処方し、続いて、適切な応答が得られるまで用量を増加させてもよい。加えて、任意の特定の被検者のための特定の用量レベルは、用いられる特定の化合物の活性、被検者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、および食事、投与の時間、投与の経路、排泄の速度、任意の薬剤の併用、ならびに調節される発現または活性の程度を含む種々様々の因子に依存することが理解される。
【０２６８】
アテローム性動脈硬化症の予防または治療については、適した被検者は、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、発作、再狭窄、血管線維筋性異形成、結節性多発動脈炎、高安動脈炎、および当業者によって決定することができるような似た状態を有すると推測される、有すると診断された、または発症する危険性のある個人とすることができる。適した被検者の他の例は、血管バイパス手術、アテレクトミー、動脈内膜切除、レーザーアブレーション、血管形成術、バルーン血管形成術、心臓同種移植(心臓移植)、人工器官の挿入、移植片の挿入、ステントの挿入、カテーテル挿入、または動脈閉塞の評価を含むが、これらに限定されない血管手術を受ける予定である個人である。投与の適した経路は、経口、腸管内、非経口、経粘膜、経皮、筋肉内、皮下、経皮、直腸、髄内、鞘内、静脈内、心室内、心房内、大動脈内、動脈内、または腹腔内投与を含むことができる。本発明の医薬組成物は、これらに限定されないが、カテーテル、バルーン、移植可能デバイス、生物分解性植込錠、人工器官、移植片、縫合糸、パッチ、シャント、またはステント等の医療デバイスによって被検者に投与することができる。アテローム性動脈硬化症については、本発明の医薬組成物は、アテローム性動脈硬化病変の発症を予防する/減速させるのに十分な量の治療薬を含有することができる。好ましい一実施形態では、治療薬(たとえば低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシン)は、標的エリアへの局所的な投与のためにステント上にコーティングすることができる。この状況では、たとえば低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの緩効性調製物は好ましい。
【０２６９】
本発明の化合物はまた、取り込み、分散、および/または吸収を支援するために、他の分子、分子構造体、または化合物の混合物、例として、リポソーム、受容体標的分子、経口製剤、直腸製剤、局所的製剤、または他の製剤と、混ぜてもよく、カプセルにつめてもよく、抱合してもよく、またはその他の形で結合させてもよい。そのような取り込み、分散、および/または吸収を支援する製剤の調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第5,108,921号、第5,354,844号、第5,416,016号、第5,459,127号、第5,521,291号、第5,543,158号、第5,547,932号、第5,583,020号、第5,591,721号、第4,426,330号、第4,534,899号、第5,013,556号、第5,108,921号、第5,213,804号、第5,227,170号、第5,264,221号、第5,356,633号、第5,395,619号、第5,416,016号、第5,417,978号、第5,462,854号、第5,469,854号、第5,512,295号、第5,527,528号、第5,534,259号、第5,543,152号、第5,556,948号、第5,580,575号、および第5,595,756号を含むがこれらに限定されず、これらのそれぞれは参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２７０】
本発明の他の態様では、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンは薬学的に許容し得る添加剤を有する医薬組成物として投与される。低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの例示的な医薬組成物は、液剤としての注射剤または注射可能な自己凝固もしくは自己ゲル化ミネラルポリマー混成体としての注射剤を含む。低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンは、リン酸カルシウムの多孔性結晶バイオミメティック生物活性組成物を使用して投与されてもよい。米国特許第5,830,682号、第6,514,514号、第6,511,958号ならびに米国特許出願公開第2006/0063699号、第2006/0052327号、第2003/199615号、第2003/0158302号、第2004/0157864号、第2006/0292670号、第2007/0099831号、および第2006/0257492号を参照されたい。これらはすべて、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０２７１】
治療の方法
本発明は、ガンマカルボキシラーゼ、オステオカルシン、インスリン、およびアディポネクチンを含むOST-PTPシグナル伝達経路に関する種々様々の異なる障害を治療または予防するための、OST-PTPシグナル伝達経路を通してエネルギー代謝を調節するための方法を提供する。特に、その方法は、OST-PTPホスホリラーゼ活性を阻害するために、ガンマカルボキシラーゼ活性を低下させるために、および/または低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンを増加させるために使用される。本発明によれば、方法は、OST-PTPシグナル伝達経路と関連する障害を治療または予防するのに有効な量の作用物質を提供する。作用物質は、小分子、抗体、および核酸から成る群から選択されてもよい。そのような障害は、代謝症候群、耐糖能障害、糖尿病1型、糖尿病2型、アテローム性動脈硬化症、および/または肥満症を含むが、これらに限定されない。
【０２７２】
ある実施形態では、方法は、代謝症候群、耐糖能障害、糖尿病1型、糖尿病2型、血管障害(アテローム性動脈硬化症等)、および/または肥満症の治療または予防を必要とする患者を同定するステップおよび次いで、本明細書に開示される方法を患者に適用するステップを含む。
【０２７３】
血管障害は、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、および細動脈硬化症を含む。動脈の(動脈)硬化(硬化症)を意味する動脈硬化症は、動脈壁がより厚くなり、それほど弾性ではなくなるいくつかの疾患のための一般用語である。3つの種類:アテローム性動脈硬化症、細動脈硬化症、およびメンケベルク動脈硬化症がある。最もよくある種類であるアテローム性動脈硬化症は、脂肪物質の沈着物であるアテロームに関する硬化を意味する。それは、脳、心臓、腎臓、他の重要器官、および脚の中型血管および大血管に影響を与える。それは、動脈壁がより厚くなり、それほど弾性ではなくなるいくつかの疾患のための一般用語である動脈硬化症の最も重要で最もよくある種類である。
【０２７４】
1型糖尿病は、子供および若年層で通常診断され、前に若年性糖尿病として知られていた。1型糖尿病では、体はインスリンを産生しない。インスリンは、糖(グルコース)、デンプン、および他の食物を日常生活に必要とされるエネルギーに変換するために必要なホルモンである。1型糖尿病と関連する状態は高血糖症、低血糖症、ケトアシドーシス、およびセリアック病を含む。
【０２７５】
2型糖尿病は糖尿病の最もよくある形態である。2型糖尿病では、体は十分なインスリンを産生せず、または細胞はインスリンを無視する。2型糖尿病と関連する状態は高血糖症および低血糖症を含む。
【０２７６】
エネルギー代謝と関連する障害は、糖尿病、耐糖能障害、インスリン感受性の減少、膵臓ベータ細胞増殖の減少、インスリン分泌の減少、重量増加、体脂肪量の増加、および血清アディポネクチンの減少を含む。
【０２７７】
本発明の方法は、血清オステオカルシンレベル(好ましくは低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシン)、血清アディポネクチンレベル、および/または血清インスリンレベルを増加させる。医薬組成物はまた、耐糖能を増加させ、インスリン感受性を増加させ、かつ/または膵臓ベータ細胞増殖を増加させることもできる。
【０２７８】
本明細書に使用されるように、用語「動物」、「患者」、または「被検者」は、哺乳動物、たとえばヒト、イヌ、雌ウシ、ウマ、カンガルー、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット、および遺伝子導入非ヒト動物を含む。好ましい動物、患者、または被検者はヒトである。
【０２７９】
ある実施形態では、その方法は、患者、好ましくはヒトに低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンを投与するステップを含む。本発明の特定の実施形態では、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの1日の用量は、1日当たり体重1キログラム当たり約0.1ナノグラムおよび1日当たり体重1キログラム当たり約20ミリグラムの間または1日当たり体重1キログラム当たり約1ナノグラムおよび1日当たり体重1キログラム当たり約10ミリグラムの間である。他の好ましい1日の投薬量は、1日当たり体重1キログラム当たり約1ナノグラム〜1日当たり体重1キログラム当たり約20ミリグラム、1日当たり体重1キログラム当たり約5ナノグラム〜1日当たり体重1キログラム当たり約5ミリグラム、1日当たり体重1キログラム当たり約20ナノグラム〜1日当たり体重1キログラム当たり約500マイクログラム、および1日当たり体重1キログラム当たり約500ナノグラム〜1日当たり体重1キログラム当たり約100マイクログラムを含む。
【０２８０】
いくつかの実施形態では、1日の投薬量は、1日当たり体重1キログラム当たり約0.1ミリグラム、1日当たり体重1キログラム当たり約0.25ミリグラム、1日当たり体重1キログラム当たり約0.5ミリグラム、1日当たり体重1キログラム当たり約0.75ミリグラム、1日当たり体重1キログラム当たり約1ミリグラム、1日当たり体重1キログラム当たり約2ミリグラム、1日当たり体重1キログラム当たり約5ミリグラム、1日当たり体重1キログラム当たり約10ミリグラム、または1日当たり体重1キログラム当たり約20ミリグラムである。
【０２８１】
本発明の一実施形態では、治療の方法は、治療前患者レベルと比較して、患者の低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの血中レベルを上げるのに十分な治療有効量の低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンをその必要のある患者に投与するステップを含む。好ましくは、患者はヒトである。他の実施形態では、治療の方法は、治療前患者の比と比較して、患者の血液中の全オステオカルシンに対する低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの比を上げるのに十分な治療有効量の低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンをその必要のある患者に投与するステップを含む。
【０２８２】
本発明の他の態様では、動物の代謝症候群を治療または予防するための方法が提供され、その方法は、治療前レベルと比較して、膵臓ベータ細胞増殖の増加、インスリン分泌の増加、インスリン感受性の増加、耐糖能の増加、重量増加の減少、体脂肪量の減少、減量、および血清アディポネクチンの増加から成る群から選択される少なくとも1つの効果をもたらす治療有効量で低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンをその必要のある動物に投与するステップを含む。あるいは、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンは、治療前レベルと比較して、酸化リン脂質の低下、アテローム性動脈硬化プラークの退縮、炎症性タンパク質生合成の減少、血漿コレステロールの低下、血管平滑筋細胞(VSMC)の増殖および数の低下、動脈性プラークの厚さの減少、心臓発作、アンギナ、または発作等の臨床イベントの低下、ならびに高血圧症の減少から成る群から選択される少なくとも1つの効果をもたらす量で投与される。好ましくは、患者はヒトである。
【０２８３】
インスリン感受性はインスリン耐性試験または正常血糖高インスリンクランプによって測定することができる。耐糖能は耐糖能試験によって測定することができる。インスリン分泌はグルコース刺激インスリン分泌試験によって測定することができる。糖尿病患者の血糖コントロールについての最もよくある試験は、試験ストリップおよび血一滴を使用することにより典型的には行われる血糖試験である。長い間にわたって血糖コントロールのレベルをよりモニターするために、ヘモグロビンA1c(グリコシル化ヘモグロビン)を測定することができる。
【０２８４】
本発明の特定の実施形態では、動物の1型もしくは2型糖尿病または耐糖能障害を治療または予防するための方法が提供され、その方法は、治療前レベルと比較して、膵臓ベータ細胞増殖の増加、インスリン分泌の増加、インスリン感受性の増加、耐糖能の増加、重量増加の減少、体脂肪量の減少、減量、および血清アディポネクチンの増加を含む群から選択される少なくとも1つの効果をもたらす治療有効量で低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンをその必要のある動物に投与するステップを含む。好ましくは、患者はヒトである。本発明の実施形態では、上述の方法は、インスリン(好ましくは組換えヒトインスリン)、インクレチン、スルホニル尿素、メグリチニド、D-フェニルアラニン誘導体(ナテグリニド)、ビグアニド、チアゾリジンジオン、アルファグルコース阻害薬、GLP-1、リラグルチド等のGLP-1類似体、エキセンディン-4 LY5448806、およびCJC-1131ならびにジペプチジルペプチダーゼIV阻害薬等の抗糖尿病薬の同時投与をさらに含む。
【０２８５】
スルホニル尿素は、グリメピリド、グリブリド、クロルプロパミド、アセトヘキサミド、グリピジド、トルブタミド、およびトラザミドによって例示される。メグリチニドはレパグリニドによって例示される。ビグアニドはメトホルミンおよび塩酸メトホルミンによって例示される。チアゾリジンジオンはピオグリタゾンおよびロシグリタゾンによって例示される。アルファグルコース阻害薬はミグリトールおよびアカルボースによって例示される。ジペプチジルペプチダーゼ4(DPP4)阻害薬はビルダグリプチン、シタグリプチン、およびサクサグリプチンによって例示される。
【０２８６】
一般に、6つの分類のインスリン:超速効型、速効型、中間型、長時間作用型、超長時間作用型、および予混合がある。インクレチンは、食後、血糖レベルが上昇するようになる前でさえ、ランゲルハンス島のベータ細胞から放出されるインスリンの量の増加を引き起こす一種の消化管ホルモンである。インクレチンは、グルカゴン様ペプチド-1(GLP-1)および胃抑制ペプチド(グルコース依存性インスリン分泌性ペプチドまたはGIPとしても知られている)によって例示される。
【０２８７】
本発明は、(i)重量増加を減少させ、体脂肪量を減少させるまたは体重の損失をもたらす治療有効量で低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンをその必要のある動物に投与するステップを含む、動物の肥満症を治療または予防するための方法、(ii)インスリン感受性を増加させる治療有効量で低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンをその必要のある動物に投与するステップを含む、動物のインスリン感受性を増加させるための方法、(iii)耐糖能を増加させる治療有効量で低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンをその必要のある動物に投与するステップを含む、動物の耐糖能を増加させるための方法、(iv)インスリン分泌を増加させる治療有効量で低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンをその必要のある動物に投与するステップを含む、動物のインスリン分泌を増加させるための方法、および(v)ベータ細胞増殖を増加させる治療有効量で低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンをその必要のある動物に投与するステップを含む、動物のベータ細胞増殖を増加させるための方法をさらに提供する。好ましくは、動物はヒトである。
【０２８８】
本発明の他の態様では、動物のアテローム性動脈硬化症を治療または予防するための方法が提供され、その方法は、酸化リン脂質の低下、アテローム性動脈硬化プラークの退縮、炎症性タンパク質生合成の減少、血漿コレステロールの低下、血管平滑筋細胞(VSMC)の増殖および数の低下、動脈性プラークの厚さの減少、心臓発作、アンギナ、または発作等の臨床イベントの低下、ならびに高血圧症の減少から成る群から選択される少なくとも1つの効果をもたらす治療有効量で低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンをその必要のある動物に投与するステップを含む。好ましくは、動物はヒトである。本発明の実施形態では、上述の方法は、低密度リポタンパク質過酸化阻害薬、抗高脂血症薬、抗凝固薬、血管拡張薬、およびアテローム性動脈硬化症の治療に有用な他の薬剤等の、アテローム性動脈硬化症を治療するために使用される化合物の同時投与をさらに含む。
【０２８９】
抗凝固薬は、ビタミンKアンタゴニスト、ヘパリンおよびヘパリンの誘導体、ならびに直接トロンビン阻害薬によって例示される。ビタミンKアンタゴニストは、ワルファリン(商品名COUMADIN(登録商標)、JANTOVEN(登録商標)、MAREVAN(登録商標)、およびWARAN(登録商標)でも知られている)、アセノクマロール、フェンプロクーモン、ならびにフェニンジオンによって例示される。ヘパリンおよびヘパリンの誘導体は低分子量ヘパリンおよびフォンダパリヌクスによって例示される。直接トロンビン阻害薬は、アルガトロバン、レピルジン、ビバリルジン、およびキシメラガトランによって例示される。
【０２９０】
血管拡張薬は、アデノシン、亜硝酸アミルおよび他の亜硝酸塩、l-アルギニン、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)、ブラジキニン、エタノール、血管内皮由来過分極因子(EDHF)、ヒスタミン、補体タンパク質C3a、C4a、およびC5a、ナイアシン(ニコチン酸)、一酸化窒素、トリニトログリセリン(ニトログリセリンとして通常知られている)、一硝酸イソソルビド&二硝酸イソソルビド、四硝酸ペンタエリスリトール(PETN)、ニトロプルシドナトリウム、PDE5阻害薬、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、血小板活性化因子(PAF)、プロスタサイクリン(PGI2)、ならびに他のプロスタグランジン、テトラヒドロカンナビノール(THC)、テオブロミン、およびパパベリンによって例示される。
【０２９１】
アテローム性動脈硬化症の治療に有用な他の薬剤は、スタチン、シロスタゾール、ベンゾチアゼピン、フェニルアルキルアミン、ジヒドロピリジン、エポプロステノール、ビタミンB3、およびアスピリンによって例示される。スタチンは、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、およびシンバスタチンによってさらに例示される。ベンゾチアゼピンはジルチアゼムによって例示される。フェニルアルキルアミンはベラパミルによって例示される。ジヒドロピリジンは、アムロジピン、フェロジピン、イスラジピン、ラシジピン、レルカニジピン、ニカルジビン、ニフェジピン、ニモジピン、ニソルジピン、およびニトレンジピンによって例示される。
【０２９２】
本発明の他の実施形態では、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンを投与する場合、骨粗鬆症を治療するために通常投与される薬剤を同時投与することは望ましいかもしれない。そのような薬剤は、たとえば、ラロキシフェン、カルシトニン、およびアレンドロネートを含む。
【０２９３】
アディポネクチンが低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンと共に同時投与される方法では、アディポネクチンおよび低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンは単一の医薬組成物で投与されてもよい。あるいは、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンおよびアディポネクチンは別個の医薬組成物で投与されてもよい。本発明の他の実施形態では、アディポネクチンおよび低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンは同日に投与される。他の実施形態では、アディポネクチンおよび低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンは異なる日に投与される。
【０２９４】
本発明の実施形態では、方法は、患者の低レベルの血清オステオカルシンと関連する疾患を治療または予防するために提供され、治療前レベルと比較して、血清オステオカルシンのレベルの増加を引き起こす量のベータ遮断薬もしくはビタミンK遮断薬またはその組み合わせをその必要のある患者に投与するステップを含む。好ましくは、患者はヒトであり、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの血清レベルは増加する。
【０２９５】
本発明は、患者の代謝症候群、耐糖能障害、糖尿病1型および2型、アテローム性動脈硬化症、ならびに肥満症を含むが、これらに限定されない疾患を治療または予防する方法であって、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの患者のレベルを上げるのに十分な、骨芽細胞中のOST-PTPの発現または活性を低下させる作用物質の治療有効量をその必要のある患者に投与するステップを含む方法をさらに提供する。好ましくは、患者はヒトである。
【０２９６】
本発明は、代謝症候群、耐糖能障害、糖尿病1型および2型、アテローム性動脈硬化症、ならびに肥満症から成る群から選択される疾患を治療または予防する方法であって、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの患者のレベルを上げるのに十分な、骨芽細胞中のガンマカルボキシラーゼの発現または活性を低下させる作用物質の治療有効量をその必要のある患者に投与するステップを含む方法をさらに提供する。好ましくは、患者はヒトである。
【０２９７】
本発明の実施形態では、患者の代謝症候群を治療または予防するための方法が提供され、その方法は、治療前レベルと比較して、膵臓ベータ細胞増殖の増加、インスリン分泌の増加、インスリン感受性の増加、耐糖能の増加、重量増加の減少、体脂肪量の減少、減量、および血清アディポネクチンの増加から成る群から選択されるまたはアテローム性動脈硬化症を減少させるもしくはコントロールする少なくとも1つの効果をもたらすのに十分な、骨芽細胞中のOST-PTPの発現または活性を低下させる作用物質の治療有効量をその必要のある患者に投与するステップを含む。好ましくは、患者はヒトである。
【０２９８】
本発明の他の態様では、動物の1型もしくは2型糖尿病または耐糖能障害を治療または予防するための方法が提供され、その方法は、治療前レベルと比較して、骨芽細胞中のOST-PTPの発現または活性を低下させるように、膵臓ベータ細胞増殖の増加、インスリン分泌の増加、インスリン感受性の増加、耐糖能の増加、重量増加の減少、および血清アディポネクチンの増加から成る群から選択される少なくとも1つの効果をもたらすのに十分な治療有効量でアディポネクチンをその必要のある動物に投与するステップを含む。好ましくは、動物はヒトである。
【０２９９】
動物のアテローム性動脈硬化症を治療または予防するための方法が提供され、その方法は治療前レベルと比較して、酸化リン脂質の低下、アテローム性動脈硬化プラークの退縮、炎症性タンパク質生合成の減少、血漿コレステロールの低下、血管平滑筋細胞(VSMC)の増殖および数の低下、動脈性プラークの厚さの減少、心臓発作、アンギナ、または発作等の臨床イベントの低下、ならびに高血圧症の減少から成る群から選択される少なくとも1つの効果をもたらすのに十分な治療有効量で骨芽細胞中のOST-PTPの発現または活性を低下させる作用物質をその必要のある動物に投与するステップを含む。好ましくは、動物はヒトである。
【０３００】
本発明の異なる実施形態では、(i)動物の肥満症を治療または予防するための方法が提供され、その方法は、治療前レベルと比較して、重量増加を減少させる、体脂肪量を減少させる、または減量をもたらすのに十分な治療有効量で骨芽細胞中のOST-PTP発現または活性を低下させる作用物質をその必要のある動物に投与するステップを含み、(ii)動物の耐糖能障害を治療または予防するための方法が提供され、その方法は、治療前レベルと比較して、耐糖能を増加させるのに十分な治療有効量で骨芽細胞中のOST-PTPの発現または活性を低下させる作用物質をその必要のある動物に投与するステップを含み、(iii)動物のインスリン感受性を増加させるための方法が提供され、その方法は、治療前レベルと比較して、インスリン感受性を増加させるのに十分な治療有効量で骨芽細胞中のOST-PTPの発現または活性を低下させる作用物質をその必要のある動物に投与するステップを含む。好ましくは、動物はヒトである。
【０３０１】
本発明の他の態様では、動物の代謝症候群を治療または予防するための方法が提供され、その方法は、(1)治療前レベルと比較して、膵臓ベータ細胞増殖の増加、インスリン分泌の増加、インスリン感受性の増加、耐糖能の増加、重量増加の減少、体脂肪量の減少、減量、および血清アディポネクチンの増加から成る群から選択される少なくとも1つの効果をもたらすのにまたは(2)治療前レベルと比較して、酸化リン脂質の低下、アテローム性動脈硬化プラークの退縮、炎症性タンパク質生合成の減少、血漿コレステロールの低下、血管平滑筋細胞(VSMC)の増殖および数の低下、動脈性プラークの厚さの減少、心臓発作、アンギナ、または発作等の臨床イベントの低下、ならびに高血圧症の減少から成る群から選択される少なくとも1つの効果をもたらすのに十分な治療有効量で骨芽細胞中のガンマカルボキシラーゼの発現または活性を低下させる作用物質をその必要のある動物に投与するステップを含む。好ましくは、動物はヒトである。
【０３０２】
本発明の他の実施形態では、動物の1型もしくは2型糖尿病または耐糖能障害を治療または予防するための方法が提供され、その方法は、治療前レベルと比較して、膵臓ベータ細胞増殖の増加、インスリン分泌の増加、インスリン感受性の増加、耐糖能の増加、重量増加の減少、体脂肪量の減少、減量、および血清アディポネクチンの増加から成る群から選択される少なくとも1つの効果をもたらすのに十分な治療有効量で骨芽細胞中のガンマカルボキシラーゼの発現または活性を低下させる作用物質をその必要のある動物に投与するステップを含む。好ましくは、動物はヒトである。
【０３０３】
動物のアテローム性動脈硬化症を治療または予防するための方法も提供され、その方法は、治療前レベルと比較して、酸化リン脂質の低下、アテローム性動脈硬化プラークの退縮、炎症性タンパク質生合成の減少、血漿コレステロールの低下、血管平滑筋細胞(VSMC)の増殖および数の低下、動脈性プラークの厚さの減少、心臓発作、アンギナ、または発作等の臨床イベントの低下、ならびに高血圧症の減少から成る群から選択される少なくとも1つの効果をもたらすのに十分な治療有効量で骨芽細胞中のガンマカルボキシラーゼの発現または活性を低下させる作用物質をその必要のある動物に投与するステップを含む。好ましくは、動物はヒトである。
【０３０４】
本発明は、(i)治療前レベルと比較して、重量増加の減少、体脂肪量の減少、もしくは減量を引き起こすのに十分な治療有効量で骨芽細胞中のガンマカルボキシラーゼの発現もしくは活性を低下させる作用物質をその必要のある動物に投与するステップを含む、動物の肥満症を治療するもしくは予防するための方法、(ii)治療前レベルと比較して、耐糖能を増加させるのに十分な治療有効量で骨芽細胞中のガンマカルボキシラーゼの発現もしくは活性を低下させる作用物質をその必要のある動物に投与するステップを含む、動物の耐糖能障害を治療するもしくは予防するための方法、または(iii)治療前レベルと比較して、インスリン感受性を増加させるのに十分な治療有効量で骨芽細胞中のガンマカルボキシラーゼの発現または活性を低下させる作用物質をその必要のある動物に投与するステップを含む、動物のインスリン感受性を増加させるための方法を対象とする。好ましくは、動物はヒトである。本発明の実施形態では、作用物質は、cDNA、アンチセンスDNA、アンチセンスRNA、および小分子干渉RNAから成る群から選択される単離核酸であり、この核酸は、ガンマカルボキシラーゼをコードする遺伝子またはmRNAに十分に相補的で、遺伝子またはmRNAへの特異的ハイブリダイゼーションを可能にし、ハイブリダイゼーションは、骨芽細胞中のガンマカルボキシラーゼの発現を予防しまたは低下させる。本発明の他の実施形態では、核酸は、骨芽細胞による取り込みを容易にするためにリン酸基または他の標的リガンドに抱合される。
【０３０５】
本明細書に記載される方法では、疾患を「治療すること」は、疾患またはその症状を改善するだけではなく、疾患の進行を遅らせるまたは疾患を寛解させることをも包含することが理解されるであろう。
【０３０６】
本発明はまた、肥満症、2型糖尿病、耐糖能障害、アテローム性動脈硬化症、および1型糖尿病を含む代謝症候群の治療のための遺伝子療法の使用をも包含する。これは、オステオカルシンをコードする遺伝子またはその生物学的活性断片もしくは変異体をベクターに導入することおよび当技術分野で知られている様々な方法に従って、疾患に罹患したまたは疾患を発症する危険性の高い患者由来の細胞をベクターで形質移入するまたは感染させることによって、達成することができる。細胞は、ex vivoでまたはin vivo法によって形質移入されてもよいまたは感染させてもよい。
【０３０７】
アデノ随伴ウイルス(adeno-associated virus)(AAV)は遺伝子療法のための最も有望なベクターのうちの1つであり、本発明の方法で使用されてもよい。遺伝子移入および遺伝子療法の従来の方法は、たとえばGene Therapy: Principles and Applications、T. Blackenstein編、Springer Verlag、1999年、Gene Therapy Protocols (Methods in Molecular Medicine)、P. D. Robbins編、Humana Press、1997年、およびRetrovectors for Human Gene Therapy、C. P. Hodgson編、Springer Verlag、1996年に記載される。AAVは、ヒトにとって非病原性であり、組み込みが高頻度であり、かつ非分裂細胞に感染することができ、したがって、組織培養物および動物そのものの哺乳動物細胞の中への遺伝子の送達を有用にするので、AAVはヒト遺伝子療法のための魅力的なベクター系である。Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol.、158:97〜129頁、1992年。最近の研究は、AAVが遺伝子送達のための潜在的に有用なベクターであることを実証した。LaFaceら、Viology、162:483〜486頁、1998年、Zhouら、Exp. Hematol. (NY)、21:928〜933頁、1993年、Flotteら、PNAS 90:10613〜10617頁、1993年、およびWalshら、Blood 84:1492〜1500頁、1994年。組換えAAVベクターは、マーカー遺伝子(Kaplittら、Nature Genetics、8:148〜154頁、1994年、Lebkowskiら、Mol. Cell. Biol. 8:3988〜3996頁、1988年、Samulskiら、J. Virol.、63:3822〜3828頁、1989年、Shelling, A. N.およびSmith, M. G.、Gene Therapy、1:165〜169頁、1994年、Yoderら、Blood、82:別冊1:347A、1994年、Zhouら、J. Exp. Med.、179:1867〜1875頁、1994年、Hermonat, P. L.およびMuzyczka, N.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、81:6466〜6470頁、1984年、Tratschinら、Mol. Cell. Biol.、4:2072〜2081頁、1984年、McLaughlinら、J. Virol.、62:1963〜1973頁、1988年)ならびにヒト疾患に関連する遺伝子(Flotteら、Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.、7:349〜356頁、1992年、Luoら、Blood、82:別冊1、303A、1994年、Ohiら、Gene、89L:27914 282、1990年、Walshら、PNAS 89:7257〜7261頁、1992年、Weiら、Gene Therapy、1:261〜268頁、1994年)のin vitroならびにin vivo形質導入にうまく使用されてきた。
【０３０８】
ある他の実施形態では、対象とする遺伝子(たとえばオステオカルシン)は、レトロウイルスベクターを使用して標的細胞に転移させることができる。レトロウイルス(retrovirus)は、レトロウイルス科に属し、オンコウイルス(oncovirus)、フォーミーウイルス(foamy virus)(Russell, D. W.およびMiller, A. D.、J. Virol. 1996年、70:217〜222頁、Wu, M.ら、J. Virol. 1999年、73:4498〜4501頁)、ならびにレンチウイルス(lentivirus)(たとえば、HIV-1(Naldini, L.ら、Science 1996、272:263〜267頁、Poeschla, E.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996年、93:11395〜11399頁、Srinivasakumar, N.ら、J. Virol. 1997年、71:5841〜5848頁、Zufferey, R.らNat. Biotechnol. 1997年、15:871〜875頁、Kim, V. N.ら、J. Virol. 1998年、72:811〜816頁)およびネコ免疫不全ウイルス(feline immunodeficiency virus)(Johnston, J. C.ら、J. Virol. 1999年、73:4991〜5000頁、Johnston, J.およびPower, C.、J. Virol. 1999年、73:2491〜2498頁、Poeschla, E. M.ら、Nat. Med. 1998年、4:354〜357頁))を含むウイルスを指す。多種多様の疾患を治療するためのレトロウイルスベクターを利用する多数の遺伝子療法の方法は当技術分野でよく知られている(たとえば米国特許第4,405,712号および第4,650,764号、Friedmann、1989年Science、244:1275〜1281頁、Mulligan、1993年、Science、260:926〜932頁、R. Crystal、1995年、Science 270:404〜410頁、ならびに米国特許第6,899,871号、Kasaharaらを参照されたい。これらのそれぞれは、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。ますます多くのこれらの方法がヒト臨床治験で現在適用されている。(Morgan, R.、1993年、BioPharm、6(1):32〜35頁、The Development of Human Gene Therapy、Theodore Friedmann編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1999年ISBN 0-87969-528-5もまた参照されたい。これはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。
【０３０９】
本明細書に記載される治療の方法の効能は、その方法が治療されている疾患の症状のうちのいずれかを寛解させるかどうかを決定することによりモニターすることができる。あるいは、血清低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシン(それ自体としてもしくは低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシン/全オステオカルシンの比として)および/または血清アディポネクチンおよび/または血清インスリンのレベルをモニターすることができ、これらのレベルは療法に応じて増加するはずである。あるいは、効能は、治療されている被検者の血糖症をモニターすることにより測定することができる。
【０３１０】
診断
本発明は、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンのレベルの減少と関連する障害等の障害を診断するための方法および組成物を提供する。そのような障害は、代謝症候群、耐糖能障害、糖尿病1型および2型、アテローム性動脈硬化症、ならびに肥満症を含むが、これらに限定されない。
【０３１１】
本発明の特定の実施形態では、耐糖能障害または糖尿病を発症する危険性がある患者を診断するための方法が提供され、その方法は、(i)患者から採取した生物学的試料中の低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの患者レベルおよび耐糖能障害または糖尿病を有していない被検者から採取した生物学的試料中の低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンのコントロールレベルを決定するステップと、(ii)患者およびコントロールのレベルを比較するステップと、(iii)患者レベルが試験レベルよりも低い場合、患者は、耐糖能障害または糖尿病を発症する危険性があることを結論づけるステップとを含む。本発明の実施形態では、糖尿病は1型または2型である。
【０３１２】
「生物学的試料」は固形試料および体液試料を含む。本発明の生物学的試料は、組織、器官、細胞、タンパク質もしくは細胞の細胞膜抽出物、血液もしくは血液等の生体液、血清、腹水、または脳液(たとえば脳脊髄液)を含んでいてもよい。
【０３１３】
本発明の他の実施形態では、耐糖能障害または糖尿病を発症する危険性がある患者を診断するための方法が提供され、その方法は、(i)患者から採取した生物学的試料中の低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの患者レベルを決定するステップと、(ii)患者レベルを標準のレベルと比較するステップとを含み、患者レベルが標準のレベルよりも低い場合、患者は糖尿病を発症する危険性がある。方法がヒトに実施される事例では、標準のレベルは、糖尿病を発症する危険性のない人々について正常範囲であると前に決定された、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンのレベルとすることができる。好ましい実施形態では、生物学的試料は、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、細胞試料、または組織試料である。本発明の実施形態では、糖尿病は1型または2型である。
【０３１４】
ヒトの低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの「標準のレベル」は、0.1ng/ml〜10ng/ml好ましくは0.2ng/ml〜7.5ng/ml、より好ましくは0.5ng/ml〜5ng/ml、さらに好ましくは1ng/ml〜5ng/mlの値を含むことができる。ヒトの低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの標準のレベルはまた、約0.1ng/ml、約0.5ng/ml、約1ng/ml、約2ng/ml、約3ng/ml、約4ng/ml、約5ng/ml、約6ng/ml、約7ng/ml、または10ng/mlを含むこともできる。
【０３１５】
本発明の他の実施形態では、耐糖能障害または糖尿病を発症する危険性がある患者を診断するための方法が提供され、その方法は、(i)患者から採取した生物学的試料中の全オステオカルシンに対する低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの比を決定するステップと、(ii)その比を標準の比と比較するステップとを含み、患者の比が標準の比よりも低い場合、患者は耐糖能障害または糖尿病を発症する危険性がある。ある実施形態では、標準の比は、5%〜10%、10%〜15%、15%〜20%、20%〜25%、25%〜30%、または30%〜35%である。ある実施形態では、標準の比は、約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、または35%である。好ましくは、患者はヒトである。好ましい実施形態では、生物学的試料は、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、細胞試料、または組織試料である。本発明の実施形態では、糖尿病は1型または2型である。
【０３１６】
本発明は、アテローム性動脈硬化症を発症する危険性がある患者を診断するための方法であって、(i)患者から採取した生物学的試料中の低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの患者レベルおよびアテローム性動脈硬化症を有していない被検者から採取した生物学的試料中の低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンのコントロールレベルを決定するステップと、(ii)患者およびコントロールのレベルを比較するステップと、(iii)患者レベルが試験レベルよりも低い場合、患者は、アテローム性動脈硬化症を発症する危険性があることを結論づけるステップとを含む方法をさらに提供する。
【０３１７】
本発明の他の実施形態では、方法は、アテローム性動脈硬化症を発症する危険性がある患者を診断するための方法が提供され、その方法は、(i)患者から採取した生物学的試料中の低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの患者レベルを決定するステップと、(ii)患者レベルを標準のレベルと比較するステップとを含み、患者レベルが標準のレベルよりも低い場合、患者はアテローム性動脈硬化症を発症する危険性がある。方法がヒトに実施される事例では、標準のレベルは、アテローム性動脈硬化症を発症する危険性のない人々について正常範囲であると前に決定された、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンのレベルとすることができる。好ましい実施形態では、生物学的試料は、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、細胞試料、または組織試料である。好ましくは、患者はヒトである。
【０３１８】
本発明の他の実施形態では、アテローム性動脈硬化症を発症する危険性がある患者を診断するための方法が提供され、その方法は、(i)患者から採取した生物学的試料中の全オステオカルシンに対する低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの比を決定するステップと、(ii)その比を標準の比と比較するステップとを含み、患者の比が標準の比よりも低い場合、患者はアテローム性動脈硬化症を発症する危険性がある。ある実施形態では、標準の比は、5%〜10%、10%〜15%、15%〜20%、20%〜25%、25%〜30%、または30%〜35%である。ある実施形態では、標準の比は、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、または35%である。好ましくは、患者はヒトである。好ましい実施形態では、生物学的試料は、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、細胞試料、または組織試料である。
【０３１９】
本発明の他の実施形態では、代謝症候群を発症する危険性がある患者を診断するための方法が提供され、その方法は、(i)患者から採取した生物学的試料中の低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの患者レベルおよび代謝症候群を有していない被検者から採取した生物学的試料中の低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンのコントロールレベルを決定するステップと、(ii)患者およびコントロールのレベルを比較するステップと、(iii)患者レベルが試験レベルよりも低い場合、患者が、代謝症候群を発症する危険性があることを結論づけるステップとを含む方法をさらに提供する。
【０３２０】
本発明の他の実施形態では、代謝症候群を発症する危険性がある患者を診断するための方法が提供され、その方法は、(i)患者から採取した生物学的試料中の低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの患者レベルを決定するステップと、(ii)患者レベルを標準のレベルと比較するステップとを含み、患者レベルが標準のレベルよりも低い場合、患者が代謝症候群を発症する危険性がある。その方法がヒトに実施される事例では、標準のレベルは、代謝症候群を発症する危険性のない人々について正常範囲であると前に決定された、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンのレベルとすることができる。好ましい実施形態では、生物学的試料は、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、細胞試料、または組織試料である。好ましくは、患者はヒトである。
【０３２１】
本発明の他の実施形態では、代謝症候群を発症する危険性がある患者を診断するための方法が提供され、その方法は、(i)患者から採取した生物学的試料中の全オステオカルシンに対する低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの比を決定するステップと、(ii)その比を標準の比と比較するステップとを含み、患者の比が標準の比よりも低い場合、患者が代謝症候群を発症する危険性がある。ある実施形態では、標準の比は、5%〜10%、10%〜15%、15%〜20%、20%〜25%、25%〜30%、または30%〜35%である。ある実施形態では、標準の比は、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、または35%である。好ましくは、患者はヒトである。好ましい実施形態では、生物学的試料は、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、細胞試料、または組織試料である。
【０３２２】
本発明の他の態様では、肥満症を発症する危険性がある患者を診断するための方法が提供され、その方法は、(i)患者から採取した生物学的試料中の低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの患者レベルおよび肥満症を有していない被検者から採取した生物学的試料中の低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンのコントロールレベルを決定するステップと、(ii)患者およびコントロールのレベルを比較するステップと、(iii)患者レベルが試験レベルよりも低い場合、患者が、肥満症を発症する危険性があることを結論づけるステップとを含む。
【０３２３】
本発明の他の実施形態では、肥満症を発症する危険性がある患者を診断するための方法が提供され、その方法は、(i)患者から採取した生物学的試料中の低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの患者レベルを決定するステップと、(ii)患者レベルを標準のレベルと比較するステップとを含み、患者レベルが標準のレベルよりも低い場合、患者は肥満症を発症する危険性がある。その方法がヒトに実施される事例では、標準のレベルは、肥満症を発症する危険性のない人々について正常範囲であると前に決定された、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンのレベルとすることができる。好ましい実施形態では、生物学的試料は、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、細胞試料、または組織試料である。好ましくは、患者はヒトである。
【０３２４】
本発明の他の実施形態では、肥満症を発症する危険性がある患者を診断するための方法が提供され、その方法は、(i)患者から採取した生物学的試料中の全オステオカルシンに対する低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの比を決定するステップと、(ii)その比を標準の比と比較するステップとを含み、患者の比が標準の比よりも低い場合、患者は肥満症を発症する危険性がある。ある実施形態では、標準の比は、5%〜10%、10%〜15%、15%〜20%、20%〜25%、25%〜30%、または30%〜35%である。ある実施形態では、標準の比は、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、または35%である。好ましくは、患者はヒトである。好ましい実施形態では、生物学的試料は、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、細胞試料、または組織試料である。
【０３２５】
本発明の他の実施形態では、耐糖能障害、膵臓ベータ細胞増殖障害、インスリン分泌障害、およびインスリン感受性障害から成る群から選択される疾患を発症する危険性がある患者を診断するための方法が提供され、その方法は、(i)患者から採取した生物学的試料中の低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの患者レベルおよびその疾患を有していない被検者から採取した生物学的試料中の低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンのコントロールレベルを決定するステップと、(ii)患者およびコントロールのレベルを比較するステップと、(iii)患者レベルが試験レベルよりも低い場合、患者が、その疾患を発症する危険性があることを結論づけるステップとを含む。
【０３２６】
本発明の他の実施形態では、耐糖能障害、膵臓ベータ細胞増殖障害、インスリン分泌障害、およびインスリン感受性障害から成る群から選択される疾患を発症する危険性がある患者を診断するための方法が提供され、その方法は、(i)患者から採取した生物学的試料中の低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの患者レベルを決定するステップと、(ii)患者レベルを標準のレベルと比較するステップとを含み、患者レベルが標準のレベルよりも低い場合、患者は、耐糖能障害、膵臓ベータ細胞増殖障害、インスリン分泌障害、およびインスリン感受性障害から成る群から選択される疾患を発症する危険性がある。その方法がヒトに実施される事例では、標準のレベルは、耐糖能障害、膵臓ベータ細胞増殖障害、インスリン分泌障害、およびインスリン感受性障害から成る群から選択される疾患を発症する危険性のない人々について正常範囲であると前に決定された、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンのレベルとすることができる。好ましい実施形態では、生物学的試料は、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、細胞試料、または組織試料である。好ましくは、患者はヒトである。
【０３２７】
本発明の他の実施形態では、耐糖能障害、膵臓ベータ細胞増殖障害、インスリン分泌障害、およびインスリン感受性障害から成る群から選択される疾患を発症する危険性がある患者を診断するための方法が提供され、その方法は、(i)患者から採取した生物学的試料中の全オステオカルシンに対する低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの比を決定するステップと、(ii)その比を標準の比と比較するステップとを含み、患者の比が標準の比よりも低い場合、患者は、耐糖能障害、膵臓ベータ細胞増殖障害、インスリン分泌障害、およびインスリン感受性障害から成る群から選択される疾患を発症する危険性がある。ある実施形態では、標準の比は、5%〜10%、10%〜15%、15%〜20%、20%〜25%、25%〜30%、または30%〜35%である。ある実施形態では、標準の比は、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、または35%である。好ましくは、患者はヒトである。好ましい実施形態では、生物学的試料は、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、細胞試料、または組織試料である。
【０３２８】
低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンのレベルをアッセイすることに加えて、本発明はまた、アディポネクチンのレベルの減少と関連する障害を診断するための方法および組成物をも提供する。そのような障害は、代謝症候群、耐糖能障害、糖尿病1型および2型、アテローム性動脈硬化症、ならびに肥満症を含むが、これらに限定されない。本発明の特定の実施形態では、糖尿病を発症する危険性がある患者を診断するための方法が提供され、その方法は、(i)患者から採取した生物学的試料中のアディポネクチンの患者レベルおよび糖尿病を有していない被検者から採取した生物学的試料中のアディポネクチンのコントロールレベルを決定するステップと、(ii)患者およびコントロールのレベルを比較するステップと、(iii)患者レベルが試験レベルよりも低い場合、患者が、糖尿病を発症する危険性があることを結論づけるステップとを含む。
【０３２９】
ある実施形態では、アディポネクチンおよびインスリンの血清レベルは両方とも測定され、患者のアディポネクチンおよびインスリンの血清レベルが疾患を有していない被検者のレベルよりも両方とも低い場合、患者はその疾患を発症する危険性がある。他の実施形態では、患者についての血清アディポネクチンおよび血糖指数は測定され、患者のアディポネクチンの血清レベルがその疾患を有していない被検者のレベルよりも低く、患者がまた重大な血糖症をも有する場合、患者はその疾患を発症する危険性がある。あるいは、血清アディポネクチンおよび非カルボキシル化オステオカルシンを測定することができまたは血清アディポネクチン、非カルボキシル化オステオカルシン、およびインスリンを測定することができ、代謝症候群、その構成要素、または1型糖尿病の診断のためにコントロールと比較することができる。
【０３３０】
本発明の診断方法を実施するに際して、上記に記載されるように、生物学的試料は、血液、血清、血漿、脳脊髄液、細胞試料、または組織試料から成る群から選択される。他の実施形態では、試料はヒトに由来する。
【０３３１】
タンパク質発現のレベルを検出するためのアッセイは当業者らによく知られている。そのようなアッセイは、たとえば、抗体ベースのイムノアッセイを含む。本明細書に開示される抗体を使用するための方法は、オステオカルシン、OST-PTP、またはガンマカルボキシラーゼを異なって発現するまたはその他に本明細書で論じられる状態に関連する細胞、組織、および障害に特に適用可能である。方法は、対象とするタンパク質およびその断片または変異体に選択的に結合する抗体を使用する。治療的適用については、OST-PTPを認識し、ガンマカルボキシラーゼに結合するまたはそれを脱リン酸するその能力を低下させる抗体が好ましい。診断上の使用については、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシン、ガンマカルボキシラーゼ、アディポネクチン、およびビタミンKに対する抗体が好ましい。抗体は、抗体がまた対象とするタンパク質と実質的に相同ではない他のタンパク質にも結合しても、選択的に結合すると考えられる。これらの他のタンパク質は、対象とするタンパク質の断片またはドメインと相同性を有する。特異的領域中でのこの保存は、相同配列によって両方のタンパク質に結合する抗体を生じさせる。この場合、対象とするタンパク質に結合する抗体はなお選択的であることが理解されると思われる。ある実施形態では、しかしながら、抗体は、対象とするタンパク質以外のタンパク質に実質的に結合しない。
【０３３２】
生物学的試料中の抗原(たとえばオステオカルシンまたは他の対象とするタンパク質)の量は、ラジオイムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、および/または酵素イムノアッセイ等のアッセイによって決定されてもよい。「ラジオイムノアッセイ」は、抗原の標識(たとえば放射性標識)形態を使用して抗原の濃度を検出し、測定するための技術である。抗原の放射性標識の例は3H、14C、および125Iを含む。試料(たとえば生物学的試料)中の抗原(たとえばオステオカルシン)の濃度は、試料中の抗原を標識(たとえば放射性)抗原とその抗原に対する抗体への結合について競合させることによって測定される。標識抗原および非標識抗原の間の競合的結合を確実にするために、標識抗原は、抗体の結合部位を飽和させるのに十分な濃度で存在する。試料中の抗原の濃度が高度であるほど、抗体に結合するであろう標識抗原の濃度は低くなる。
【０３３３】
ラジオイムノアッセイでは、標識抗原に結合した抗体の濃度を決定するために、遊離抗原から抗原抗体複合体を分離させなければならない。遊離抗原から抗原抗体複合体を分離させるための1つの方法は抗アイソタイプ抗血清を用いて抗原抗体複合体を沈殿させることによるものである。遊離抗原から抗原抗体複合体を分離させる他の方法はホルマリン死菌黄色ブドウ球菌(S. aureus)を用いて抗原抗体複合体を沈殿させることによるものである。遊離抗原から抗原抗体複合体を分離させる他の方法は「固相ラジオイムノアッセイ」を行うことによるものであり、抗体はセファロースビーズ、ポリスチレンウェル、ポリ塩化ビニルウェル、またはマイクロタイターウェルに連結される(たとえば共有結合で)。抗体に結合した標識抗原の濃度を既知濃度の抗原を有する試料に基づく標準曲線と比較することによって、生物学的試料中の抗原の濃度を決定することができる。
【０３３４】
「イムノラジオメトリックアッセイ」(IRMA)は抗体試薬が放射性標識されるイムノアッセイである。IRMAは、タンパク質、たとえばウサギ血清アルブミン(RSA)への抱合等の技術による、多価性の抗原抱合体の生産を必要とする。多価性の抗原抱合体は、1分子当たり少なくとも2つの抗原残基を有していなければならず、抗原残基は、抗原への少なくとも2つの抗体による結合を可能にするように十分に離れていなければならない。たとえば、IRMAでは、多価性の抗原抱合体は、プラスチック球体等の固形表面へ付加することができる。非標識「試料」抗原および放射性標識された抗原に対する抗体を、多価性の抗原抱合体コーティング球体を含有する試験管に追加する。試料中の抗原は、抗原抗体結合部位について多価性の抗原抱合体と競合する。適切なインキュベーション期間の後に、非結合反応物を洗浄によって除去し、固相上の放射能の量を決定する。結合した放射性抗体の量は試料中の抗原の濃度に反比例する。
【０３３５】
最もよくある酵素イムノアッセイは「酵素連結免疫吸着アッセイ(ELISA)」である。「酵素連結免疫吸着アッセイ(ELISA)」は、抗体の標識(たとえば酵素連結)形態を使用して抗原の濃度を検出し、測定するための技術である。「サンドイッチELISA」では、抗体(たとえばオステオカルシンに対する)は固相(たとえばマイクロタイタープレート)に連結され、抗原(たとえばオステオカルシン)を含有する生物学的試料に曝露される。次いで、固相を洗浄し、非結合抗原を除去する。標識(たとえば酵素連結)抗体は、次いで、結合した抗原(存在する場合)に結合して、抗体-抗原-抗体サンドイッチを形成する。抗体に連結することができる酵素の例は、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ウレアーゼ、およびβ-ガラクトシダーゼである。酵素連結抗体は、基質と反応して、アッセイすることができる有色反応産物を産生する。
【０３３６】
「競合的ELISA」では、抗体を、抗原(たとえばオステオカルシン)を含有する試料とインキュベートする。次いで、抗原抗体混合物を、抗原をコーティングした固相(たとえばマイクロタイタープレート)と接触させる。より多くの抗原が試料中に存在するほど、固相に結合することができるであろう遊離抗体は少なくなる。次いで、固相に結合した一次抗体の量を決定するために、標識(たとえば酵素連結)二次抗体を固相に追加する。
【０３３７】
「免疫組織化学アッセイ」では、組織の切片を、アッセイされているタンパク質に特異的である抗体に組織を曝露することにより、特異的タンパク質について試験する。次いで、抗体を、存在するタンパク質の存在および量を決定するための多くの方法のうちのいずれかによって可視化する。抗体を可視化するために使用される方法の例は、たとえば、抗体(たとえばルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、もしくはβ-ガラクトシダーゼ)に連結された酵素または化学的方法(たとえばDAB/基質色素原)によるものである。
【０３３８】
タンパク質発現のレベルの検出に加えて、本発明の診断アッセイは、RNA発現のレベルを検出するために設計された方法を用いてもよい。RNA発現のレベルは、たとえば、ノーザンブロット、RT-PCR、またはin situハイブリダイゼーションの使用を含む、当業者らによく知られている方法を使用して決定されてもよい。
【０３３９】
オステオカルシンのカルボキシル化は、ヒドロキシアパタイトに対するより大きな親和性を付与する。典型的には、全オステオカルシンは、イムノアッセイによって測定され、その後、ヒドロキシアパタイトとのインキュベーションおよび遠心分離が続く。次いで、ヒドロキシアパタイトに吸着していないオステオカルシンを含有する上清を同じイムノアッセイを使用して測定する。この手順の結果は、絶対濃度またはカルボキシル化オステオカルシンに対する低カルボキシル化オステオカルシンの比として表現することができる。
【０３４０】
他の手順は、オステオカルシンのGlu/Gla残基のすべてまたはいくつかのカルボキシル化状態を区別するモノクローナル抗体を使用する。たとえば、GluOC4-5(宝カタログ番号M171)は、21および24位のグルタミン酸残基(カルボキシル基を除かれている)でヒトオステオカルシンと反応し、Gla型オステオカルシンと反応しない。
【０３４１】
オステオカルシン測定方法の検討については、Leeら、2000年、Ann. Clin. Biochem. 37、432〜446頁を参照されたい。
【０３４２】
薬剤のスクリーニングおよびアッセイ
薬剤スクリーニングの細胞ベースおよび非細胞ベースの方法は、OST-PTPもしくはガンマカルボキシラーゼの活性もしくは発現を低下させるまたは低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの活性もしくは発現のレベルを増加させる作用物質候補を同定するために提供される。そのような作用物質は、エネルギー代謝およびOST-PTPシグナル伝達経路に関する障害を治療または予防するのに使用される。そのような障害は、代謝症候群、耐糖能障害、1型もしくは2型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、または肥満症を含む。そのような作用物質は、インスリン産生の減少、インスリン感受性の減少、および耐糖能の減少または体脂肪量の増加によって特徴づけられる障害を治療するために使用されてもよい。そのようなアッセイはまた、OST-PTP経路に関する障害を治療または予防する際の作用物質の有効性についてアッセイするために使用されてもよい。
【０３４３】
OST-PTP、ガンマカルボキシラーゼ、またはオステオカルシンに結合し、それによって上述のタンパク質の活性を調節する化合物を同定する、非細胞ベースのスクリーニング法が提供される。
【０３４４】
OST-PTPに結合する作用物質を同定またはアッセイするためのスクリーニング法が提供され、その方法は、(i)OST-PTPまたはその断片もしくは変異体を含む混合物を提供するステップと、(ii)混合物を作用物質と接触させるステップと、(iii)作用物質がOST-PTPに結合するかどうかを決定するステップと、(iv)作用物質がOST-PTPまたはその断片もしくは変異体に結合する場合に、作用物質を同定するステップとを含む。その方法は、作用物質が、ガンマカルボキシラーゼを脱リン酸するOST-PTPの能力を低下させるかどうかを決定するステップをさらに含んでいてもよい。
【０３４５】
OST-PTPのホスファターゼ1ドメインに結合する作用物質を同定またはアッセイするためのスクリーニング法が提供され、その方法は、(i)OST-PTPのホスファターゼ1ドメインまたはその断片もしくは変異体を含む混合物を提供するステップと、(ii)混合物を作用物質と接触させるステップと、(iii)作用物質がOST-PTPのホスファターゼ1ドメインに結合するかどうかを決定するステップと、(iv)作用物質がOST-PTPのホスファターゼ1ドメインまたはその断片もしくは変異体に結合する場合に、作用物質を同定するステップとを含む。その方法は、作用物質が、ガンマカルボキシラーゼを脱リン酸するOST-PTPの能力を低下させるかどうかを決定するステップをさらに含んでいてもよい。
【０３４６】
ガンマカルボキシラーゼに結合する作用物質を同定またはアッセイするためのスクリーニング法が提供され、その方法は、(i)ガンマカルボキシラーゼまたはその断片もしくは変異体を含む混合物を提供するステップと、(ii)混合物を作用物質と接触させるステップと、(iii)作用物質がガンマカルボキシラーゼに結合するかどうかを決定するステップと、(iv)作用物質がガンマカルボキシラーゼまたはその断片もしくは変異体に結合する場合に、作用物質を同定するステップとを含む。その方法は、作用物質がガンマカルボキシラーゼ活性を低下させるかどうかを決定するステップをさらに含んでいてもよい。
【０３４７】
オステオカルシンに結合する作用物質を同定またはアッセイするためのスクリーニング法が提供され、その方法は、(i)オステオカルシンまたはその断片もしくは変異体を含む混合物を提供するステップと、(ii)混合物を作用物質と接触させるステップと、(iii)作用物質がオステオカルシンに結合するかどうかを決定するステップと、(iv)作用物質がオステオカルシンまたはその断片もしくは変異体に結合する場合に、作用物質を同定するステップとを含む。その方法は、作用物質がオステオカルシン活性を増加させるかどうかを決定するステップをさらに含んでいてもよい。
【０３４８】
作用物質の結合は、競合結合アッセイの使用を通して決定されてもよい。競合物は、抗体、ペプチド、結合パートナー、リガンド等のような、標的分子(つまり様々なタンパク質の1つ)に結合することで知られている結合成分である。ある状況下では、作用物質および結合成分の間でのような競合的結合があり、結合成分が作用物質と置き換わる可能性がある。
【０３４９】
作用物質は標識されていてもよい。作用物質もしくは競合物または両方は、存在する場合、結合を可能にするのに十分な時間、タンパク質に最初に追加される。インキュベーションは、典型的に摂氏4度および摂氏40度の間で、最適な活性を容易にする任意の温度で行われてもよい。インキュベーション期間は最適な活性のために選択されるが、また、急速なハイスループットスクリーニングを容易にするために最適化されてもよい。典型的には、0.1および1時間の間で十分であろう。過剰試薬は一般に除去され、または洗い流される。次いで、第2の成分を追加し、標識成分の存在または非存在に従って、結合を示す。
【０３５０】
そのようなアッセイを使用して、競合物を最初に追加し、その後作用物質を追加してもよい。競合物の置き換わりは、作用物質が、様々なタンパク質のうちの1つに結合しており、したがって様々なタンパク質のうちの1つに結合することができ、その活性を潜在的に調節することができることを示す。この実施形態では、どちらの成分も標識することができる。したがって、たとえば、競合物が標識される場合、洗浄溶液中の標識の存在は作用物質による置き換わりを示す。あるいは、作用物質が標識される場合、支持体中の標識の存在は置き換わりを示す。
【０３５１】
他の例では、作用物質は最初に追加され、インキュベーションおよび洗浄を伴って、その後、競合物が追加される。競合物による結合の非存在は、作用物質がより高度な親和性で様々なタンパク質のうちの1つに結合することを示すかもしれない。したがって、作用物質が標識される場合、支持体上の標識の存在は、競合物の結合の欠如と結びつけて、作用物質が様々なタンパク質のうちの1つに結合することができることを示すかもしれない。
【０３５２】
その方法は、様々なタンパク質のうちの1つの活性を調節することができる作用物質を同定するための差異に基づくスクリーニングを含んでいてもよい。そのような事例では、その方法は、第1の試料中でタンパク質および競合物を組み合わせることを含む。第2の試料は作用物質、タンパク質、および競合物を含む。作用物質の追加は、様々なタンパク質のうちの1つの調節を可能にする条件下で行われる。競合物の結合は両方の試料について決定され、2つの試料の間の結合での変化または差異は、様々なタンパク質のうちの1つに結合することができ、潜在的にその活性を調節する作用物質が存在することを示す。つまり、競合物の結合が第1の試料と比較して第2の試料で異なる場合、作用物質は様々なタンパク質のうちの1つに結合することができる。
【０３５３】
ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールがアッセイで使用されてもよい。好ましくは、コントロールおよび試験試料はすべて、統計的に有意な結果を得るために、少なくとも三通り行われる。すべての試料のインキュベーションは、タンパク質への作用物質の結合に十分な時間とする。インキュベーション後、試料はすべて洗浄されて、非特異的結合物質がなくなり、結合した、一般に標識された作用物質の量が決定される。たとえば、放射標識が用いられる場合、結合化合物の量を決定するために、試料はシンチレーションカウンターで数えられてもよい。
【０３５４】
種々様々の他の試薬がスクリーニングアッセイに含まれていてもよい。これらは、最適なタンパク質タンパク質結合を容易にするおよび/または非特異的相互作用もしくはバックグラウンド相互作用を低下させるために使用されてもよい、塩、中性タンパク質、たとえばアルブミン、洗浄剤等のような試薬を含む。プロテアーゼ阻害薬、ヌクレアーゼ阻害薬、抗菌剤等のような、その他にアッセイの効率を改善する試薬もまた使用されてもよい。成分の混合物は、必要な結合を提供する任意の順で追加されてもよい。
【０３５５】
様々なタンパク質のうちの1つの活性を調節する作用物質についての非細胞ベースのスクリーニングもまた行われてもよい。様々なタンパク質のうちの1つの活性を調節することができる作用物質をスクリーニングするための方法は、上記のように、様々なタンパク質のうちの1つの試料に作用物質を追加するステップおよび様々なタンパク質のうちの1つの生物学的活性の変化を決定するステップを含む。「様々なタンパク質のうちの1つの活性を調節する」は、活性の増加、活性の減少、または存在する活性の種類もしくは性質の変化を含む。したがって、作用物質はタンパク質に結合するのみならず(これは必須でなくてもよいが)、本明細書に定義されるその生物学的または生化学的活性をも変化させるはずである。
【０３５６】
したがって、一例では、その方法は、タンパク質試料および作用物質を組み合わせるステップならびにOST-PTP、ガンマカルボキシラーゼ、またはオステオカルシンに対する効果を評価するステップを含む。酵素活性によって、特にOST-PTP活性もしくはガンマカルボキシラーゼの活性または本明細書の文法上の等価物は、酵素と関連する1つまたは複数の生物学的活性を意味する。OST-PTPについては、この活性は、好ましくは、ガンマカルボキシラーゼまたはインスリン受容体の脱リン酸であり、ガンマカルボキシラーゼについては、それはオステオカルシンのカルボキシル化である。スクリーニングアッセイは、形質転換された動物または細胞から採取された生物学的試料中でOST-PTPもしくはガンマカルボキシラーゼの活性を低下させるまたは低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンおよびアディポネクチンのレベルを増加させる作用物質を見つけるように設計される。
【０３５７】
特に、OST-PTP活性を低下させる作用物質を同定またはアッセイするためのスクリーニング法が提供され、その方法は、(a)コントロールおよびOST-PTPまたはその断片もしくは変異体を含む試験混合物を提供するステップと、(b)混合物を作用物質と接触させるステップと、(c)試験混合物およびコントロール中のOST-PTPの活性のレベルを決定するステップと、(d)試験混合物中のOST-PTP活性のレベルがコントロールのレベルよりも低い場合に、生物活性作用物質を選択するステップとを含む。
【０３５８】
ガンマカルボキシラーゼ活性を低下させる作用物質を同定またはアッセイするためのスクリーニング法が提供され、その方法は、(a)コントロールおよびガンマカルボキシラーゼまたはその断片もしくは変異体を含む試験混合物を提供するステップと、(b)生物活性作用物質がガンマカルボキシラーゼまたはその断片もしくは変異体に結合することを可能にする条件下で試験混合物に生物活性作用物質を追加するステップと、(c)試験混合物およびコントロール中のガンマカルボキシラーゼの活性のレベルを決定するステップと、(d)試験混合物中のガンマカルボキシラーゼ活性のレベルがコントロールのレベルよりも低い場合に、生物活性作用物質を選択するステップとを含む。
【０３５９】
OST-PTPをコードするEsp遺伝子またはガンマカルボキシラーゼをコードする遺伝子の発現のレベルを減少させる作用物質を同定またはアッセイするための細胞ベースのスクリーニング法が提供される。あるいは、薬剤スクリーニングアッセイを、オステオカルシン遺伝子発現のレベルを増加させる作用物質を同定またはアッセイするために使用することができる。
【０３６０】
本発明はまた、オステオカルシンからカルボキシル基を除く作用物質を同定するためのスクリーニング法を提供し、その方法は、(a)コントロールおよびカルボキシル化オステオカルシンを含む試験混合物を提供するステップと、(b)試験混合物に作用物質を追加するステップと、(c)試験混合物およびコントロール中のカルボキシル化オステオカルシンのレベルを決定するステップと、(d)試験混合物中のカルボキシル化オステオカルシンのレベルがコントロールのレベルよりも低い場合に、作用物質を選択するステップとを含む。
【０３６１】
OST-PTP遺伝子発現を低下させる作用物質を同定またはアッセイするための細胞ベースの方法が提供され、その方法は、(a)細胞中のOST-PTPの第1の発現レベルを決定するステップと、(b)試験作用物質との接触の後にOST-PTPの第2の発現レベルを決定するステップと、(c)第1の発現レベルを第2の発現レベルと比較するステップとを含み、第1の発現のレベルが第2の発現レベルよりも高い場合に、OST-PTP発現を低下させることができる作用物質が同定される。OST-PTP遺伝子発現のレベルは、作られたOST-PTP mRNAの量または作られたOST-PTPタンパク質の量を測定することによって決定されてもよい。
【０３６２】
ガンマカルボキシラーゼ遺伝子発現を低下させる作用物質を同定またはアッセイするための細胞ベースの方法が提供され、その方法は、(a)細胞中のガンマカルボキシラーゼの第1の発現レベルを決定するステップと、(b)試験作用物質との接触の後にガンマカルボキシラーゼの第2の発現レベルを決定するステップと、(c)第1の発現レベルを第2の発現レベルと比較するステップとを含み、第1の発現のレベルが第2の発現レベルよりも高い場合に、ガンマカルボキシラーゼ発現を低下させることができる作用物質が同定される。ガンマカルボキシラーゼ遺伝子発現のレベルは、作られたガンマカルボキシラーゼmRNAの量または作られたガンマカルボキシラーゼタンパク質の量を測定することによって決定されてもよい。
【０３６３】
オステオカルシン遺伝子発現を増加させる作用物質を同定またはアッセイするための細胞ベースの方法が提供され、その方法は、(a)細胞中のオステオカルシンの第1の発現レベルを決定するステップと、(b)試験作用物質との接触の後にオステオカルシン発現の第2の発現レベルを決定するステップと、(c)第1の発現レベルを第2の発現レベルと比較するステップとを含み、第1の発現のレベルが第2の発現レベルよりも低い場合に、オステオカルシン発現を増加させることができる作用物質が同定される。オステオカルシン遺伝子発現のレベルは、作られたオステオカルシンmRNAの量または作られたオステオカルシンタンパク質の量を測定することによって決定されてもよい。
【０３６４】
レポーター遺伝子を、遺伝子発現を調節することができる作用物質をスクリーニングするために利用してもよい。そのようなアッセイでは、レポーター遺伝子の発現が、対象とする天然の遺伝子、すなわちOST-PTP、ガンマカルボキシラーゼ、またはオステオカルシンの遺伝子の天然の遺伝子発現制御エレメントのコントロール下に置かれている遺伝子構築物を含有する細胞を生成する。レポーター遺伝子は、CAT、LacZ、ルシフェラーゼ、またはGFPを含むが、これらに限定されない。
【０３６５】
OST-PTP遺伝子発現を低下させる作用物質をスクリーニングするまたはアッセイするための細胞ベースの方法が提供され、その方法は、(a)細胞中のレポーター遺伝子の第1の発現レベルを決定するステップであって、レポーター遺伝子の発現が、天然のOST-PTP遺伝子発現制御エレメントのコントロール下にあるステップと、(b)試験作用物質との接触の後にレポーター遺伝子発現の第2の発現レベルを決定するステップと、(c)第1の発現レベルを第2の発現レベルと比較するステップとを含み、第1の発現のレベルが第2の発現レベルよりも高い場合に、レポーター遺伝子発現を低下させることができる作用物質が同定される。
【０３６６】
ガンマカルボキシラーゼ遺伝子発現を低下させる作用物質をスクリーニングするまたはアッセイするための細胞ベースの方法が提供され、その方法は、(a)細胞中のレポーター遺伝子の第1の発現レベルを決定するステップであって、レポーター遺伝子の発現が、天然のガンマカルボキシラーゼ遺伝子発現制御エレメントのコントロール下にあるステップと、(b)試験作用物質との接触の後にレポーター遺伝子発現の第2の発現レベルを決定するステップと、(c)第1の発現レベルを第2の発現レベルと比較するステップとを含み、第1の発現のレベルが第2の発現レベルよりも高い場合に、ガンマカルボキシラーゼ遺伝子発現を低下させることができる作用物質が同定される。
【０３６７】
オステオカルシン遺伝子発現を増加させる作用物質をスクリーニングするまたはアッセイするための細胞ベースの方法が提供され、その方法は、(a)細胞中のレポーター遺伝子の第1の発現レベルを決定するステップであって、レポーター遺伝子の発現が、天然のオステオカルシン遺伝子発現制御エレメントのコントロール下にあるステップと、(b)試験作用物質との接触の後にレポーター遺伝子発現の第2の発現レベルを決定するステップと、(c)第1の発現レベルを第2の発現レベルと比較するステップとを含み、第1の発現のレベルが第2の発現レベルよりも低い場合に、オステオカルシン遺伝子発現を増加させることができる作用物質が同定される。
【０３６８】
OST-PTPまたはガンマカルボキシラーゼの活性を低下させる作用物質を同定するための細胞ベースのスクリーニングアッセイが提供される。
【０３６９】
特に、OST-PTP活性を低下させる作用物質をスクリーニングするための細胞ベースの方法が提供され、その方法は、(a)OST-PTPのホスファターゼ1ドメインを発現する第1の細胞中の第1の活性レベルを決定するステップと、(b)OST-PTPのホスファターゼ1ドメインを発現する第2の細胞を作用物質と接触させるステップと、(c)OST-PTPのホスファターゼ1ドメインを発現する第2の細胞中の第2の活性レベルを決定するステップと、(d)第1の活性レベルを第2の活性レベルと比較するステップとを含み、第1の活性レベルが第2の活性レベルよりも高い場合に、作用物質はOST-PTP活性を低下させる。OST-PTP活性のレベルはガンマカルボキシラーゼ活性のレベルを測定することにより決定されてもよい。OST-PTP活性のレベルは、オステオカルシンカルボキシル化のレベルを測定することにより決定されてもよい。
【０３７０】
ガンマカルボキシラーゼ活性を低下させる作用物質をスクリーニングするまたはアッセイするための細胞ベースの方法が提供され、その方法は、(a)ガンマカルボキシラーゼを発現する第1の細胞中の第1の活性レベルを決定するステップと、(b)ガンマカルボキシラーゼを発現する第2の細胞を作用物質と接触させるステップと、(c)ガンマカルボキシラーゼを発現する第2の細胞中の第2の活性レベルを決定するステップと、(d)第1の活性レベルを第2の活性レベルと比較するステップとを含み、第1の活性レベルが第2の活性レベルよりも高い場合に、作用物質はガンマカルボキシラーゼ活性を低下させる。ガンマカルボキシラーゼ活性を測定するためのアッセイは当業者らに知られている(たとえば、Hubbardら、(1989年) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6893〜6897頁、Rehemtullaら、(1993年) Proc. Natl. acad. Sci USA 90:4611〜4615頁を参照されたい)。
【０３７１】
ガンマカルボキシラーゼは、オステオカルシン内の特異的グルタミン酸残基の翻訳後修飾を触媒して、γ-カルボキシグルタミン酸残基を形成する。本発明の実施形態では、ガンマカルボキシラーゼ活性またはデカルボキシラーゼ活性のレベルは、オステオカルシンカルボキシル化のレベルを測定することにより決定される。
【０３７２】
オステオカルシンからカルボキシル基を除く作用物質をスクリーニングするための細胞ベースの方法が提供され、その方法は、(a)オステオカルシンを発現する第1の細胞中のカルボキシル化オステオカルシンの第1のレベルを決定するステップと、(b)カルボキシル化オステオカルシンを発現する第2の細胞を作用物質と接触させるステップと、(c)カルボキシル化オステオカルシンの第2のレベルを決定するステップと、(d)カルボキシル化オステオカルシンの第1のレベルをカルボキシル化オステオカルシンの第2のレベルと比較するステップとを含み、カルボキシル化オステオカルシンの第1のレベルが第2のレベルよりも高い場合に、作用物質はオステオカルシンからカルボキシル基を除く。
【０３７３】
スクリーニング法またはアッセイ法で使用される細胞は、OST-PTP、ガンマカルボキシラーゼ、またはオステオカルシンを自然に発現する細胞、OST-PTP、OST-PTPのホスファターゼ1ドメイン、ガンマカルボキシラーゼ、またはオステオカルシンを発現する(または過剰発現する)ように遺伝的に操作された細胞、ならびに本発明の遺伝子導入動物に由来する細胞を含む。そのような細胞は、OST-PTPまたはガンマカルボキシラーゼを過剰発現する形質転換骨芽細胞を含む。
【０３７４】
脂肪細胞中のアディポネクチン発現を増加させる作用物質の有効性を試験するための方法が提供され、その方法は、(a)骨芽細胞および脂肪細胞を共培養するステップと、(b)骨芽細胞を作用物質候補と接触させるステップと、(c)作用物質候補が、アディポネクチンまたはその断片もしくは変異体の発現または分泌のレベルを、骨芽細胞を作用物質候補と接触させていないコントロール共培養物中で測定されたコントロールレベルよりも増加させるかどうかを決定するステップと、(d)作用物質候補が、アディポネクチンの発現または分泌のレベルをコントロールレベルよりも増加させる場合に、脂肪細胞中のアディポネクチンの発現または分泌を増加させる作用物質として作用物質候補を選択するステップとを含む。
【０３７５】
膵臓ベータ細胞中のインスリンの発現または分泌を増加させる作用物質の有効性を試験するための方法が提供され、その方法は、(a)骨芽細胞および膵臓ベータ細胞を共培養するステップと、(b)骨芽細胞を作用物質候補と接触させるステップと、(c)作用物質候補が、インスリンの発現または分泌のレベルを、骨芽細胞を作用物質候補と接触させていないコントロール共培養物中で測定されたインスリン発現のコントロールレベルよりも増加させるかどうかを決定するステップと、(d)作用物質候補が、インスリンの発現または分泌のレベルをコントロールレベルよりも増加させる場合に、膵臓ベータ細胞中のインスリンの発現または分泌を増加させる作用物質として作用物質候補を選択するステップとを含む。
【０３７６】
作用物質候補が、動物で、代謝症候群または1型もしくは2型糖尿病の素因、耐糖能障害、インスリン産生の減少、インスリン感受性の減少、耐糖能の減少、アテローム性動脈硬化症、および体脂肪量の増加を含む群から選択される、代謝症候群と関連する表現型を治療または予防する能力を決定するための方法が提供され、その方法は、(a)試験動物およびコントロール動物を提供するステップと、(b)作用物質候補を試験動物に投与するステップと、(c)試験動物中の低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンのレベルをコントロール動物中の低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンのレベルと比較するステップと、(d)低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンのレベルがコントロール動物よりも試験動物で高い場合に、作用物質候補を選択するステップとを含む。本発明の特定の実施形態では、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンのレベルは骨芽細胞中で測定される。
【０３７７】
一例では、低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンのレベルは骨芽細胞中で測定される。作用物質候補は、骨芽細胞によるその取り込みを容易にするリン酸基に結合してもよい。
【０３７８】
動物の代謝症候群または2型糖尿病の素因、耐糖能障害、インスリン産生の減少、インスリン感受性の減少、耐糖能の減少、アテローム性動脈硬化症、および体脂肪量の増加を含む代謝症候群と関連する表現型を治療または予防する能力について作用物質候補をスクリーニングするための方法が提供され、その方法は、(a)第1および第2の動物を提供するステップと、(b)上述の第1の動物に作用物質候補を投与するステップと、(c)作用物質候補を与えたステップ(b)の第1の動物中のOST-PTPの発現または活性のレベルを、上述の作用物質候補を投与しなかったステップ(a)の第2の動物中のOST-PTPのレベルと比較するステップとを含み、OST-PTPの発現または活性のレベルを低下させる作用物質候補が、代謝症候群またはそれと関連する表現型を治療する有効性を有する作用物質として選択される。
【０３７９】
OST-PTPの発現または活性のレベルは骨芽細胞中で測定されてもよい。さらに、作用物質候補は、骨芽細胞によるその取り込みを容易にするリン酸基に結合してもよい。
【０３８０】
動物の代謝症候群または1型および2型糖尿病の素因、耐糖能障害、インスリン産生の減少、インスリン感受性の減少、アテローム性動脈硬化症、耐糖能の減少、ならびに体脂肪量の増加を含む代謝症候群と関連する表現型を治療または予防する能力について作用物質候補をスクリーニングするための方法が提供され、その方法は、(a)第1および第2の動物を提供するステップと、(b)上述の第1の動物に作用物質候補を投与するステップと、(c)作用物質候補を与えたステップ(b)の第1の動物中のオステオカルシンの発現または活性または分泌のレベルを、上述の作用物質候補を投与しなかったステップ(a)の第2の動物中のオステオカルシンの発現または活性のレベルと比較するステップとを含み、オステオカルシンまたはその断片もしくは変異体の発現または活性または分泌を増加させる作用物質候補が、代謝症候群またはそれと関連する表現型を治療する有効性を有する作用物質として選択される。
【０３８１】
動物の代謝症候群または1型もしくは2型糖尿病の素因、耐糖能障害、インスリン産生の減少、インスリン感受性の減少、アテローム性動脈硬化症、耐糖能の減少、および体脂肪量の増加を含む代謝症候群と関連する表現型を治療または予防する能力について作用物質候補をスクリーニングするための方法が提供され、その方法は、(a)第1および第2の動物を提供するステップと、(b)上述の第1の動物に作用物質候補を投与するステップと、(c)作用物質候補を与えたステップ(b)の第1の動物中のアディポネクチンまたはその断片もしくは変異体の発現または分泌のレベルを、上述の作用物質候補を投与しなかったステップ(a)の第2の動物中のアディポネクチンの発現または分泌のレベルと比較するステップとを含み、アディポネクチンまたはその断片もしくは変異体の発現または分泌のレベルを増加させる作用物質候補が、代謝症候群またはそれと関連する表現型を治療する有効性を有する作用物質として選択される。そのような方法では、アディポネクチンの発現または分泌のレベルは脂肪細胞または血清中で測定される。
【０３８２】
オステオカルシン欠損マウスの代謝症候群を治療または予防するための能力について作用物質候補をスクリーニングするための方法が提供され、オステオカルシン欠損マウスは、野生型マウスと比較して、オステオカルシン発現の低下、1型または2型糖尿病の素因、インスリン分泌の減少、アテローム性動脈硬化症、インスリン感受性の減少、アディポネクチンまたはその断片もしくは変異体の発現または分泌の減少、耐糖能の減少、および体脂肪量の増加を含む群から選択される表現型を示し、(a)両方ともオステオカルシン欠損マウスとして同じ株に由来する第1および第2のオステオカルシン欠損マウスを提供するステップと、(b)上述の第1のオステオカルシン欠損マウスに作用物質候補を投与するステップと、(c)作用物質候補を与えたステップ(b)の第1のオステオカルシン欠損マウスの表現型を、上述の作用物質候補を投与しなかったステップ(a)の上述の第2のオステオカルシン欠損マウスの表現型と比較するステップとを含み、表現型を低下させるまたは寛解させる作用物質候補が、代謝症候群を治療する有効性を有する作用物質として選択される。
【０３８３】
アディポネクチン欠損マウスの代謝症候群を治療するための能力について作用物質候補をスクリーニングするための方法も提供され、アディポネクチン欠損マウスは、1型または2型糖尿病の素因、インスリン分泌の減少、インスリン感受性の減少、アテローム性動脈硬化症、耐糖能の減少、および体脂肪量の増加を含む群から選択される表現型を示し、(a)両方とも同じ株に由来する第1および第2のアディポネクチン欠損マウスを提供するステップと、(b)上述の第1のアディポネクチン欠損マウスに作用物質候補を投与するステップと、c)作用物質候補を与えたステップ(b)の第1のアディポネクチン欠損マウスの表現型を、上述の作用物質候補を投与しなかったステップ(a)の上述の第2のアディポネクチン欠損マウスの表現型と比較するステップとを含み、表現型を低下させるまたは寛解させる作用物質候補が、代謝症候群を治療する有効性を有する作用物質として選択される。
【０３８４】
代謝症候群、I型またはII型糖尿病、インスリン分泌の減少、インスリン感受性の減少、耐糖能の減少、体脂肪量の増加、およびアテローム性動脈硬化症を含む群のメンバーである疾患を治療または予防するための治療薬として使用するために、骨芽細胞中のOST-PTPの活性または発現を低下させると推測される作用物質をスクリーニングするための方法が提供され、その方法は、a)骨芽細胞中でOST-PTPを選択的に過剰発現するコントロール遺伝子導入マウスおよびコントロールと同じ株由来の第2の遺伝子導入マウスを得るステップと、b)第1のマウスにプラセボを受けさせ、第2のマウスに治療薬を受けさせるステップと、c)第1および第2のマウス由来の骨芽細胞の試料中のOST-PTP活性のレベルをアッセイするステップと、d)第2のマウスのOST-PTP活性のレベルと第1のマウスでアッセイされたOST-PTP活性のレベルを比較するステップと、e)第1のマウスのレベルが第2のマウスのレベルよりも高い場合に、作用物質が、疾患を治療または予防するための治療化合物として有用であることを結論づけるステップとを含む。
【０３８５】
代謝症候群、I型またはII型糖尿病、インスリン分泌の減少、インスリン感受性の減少、耐糖能の減少、体脂肪量の増加、およびアテローム性動脈硬化症を含む群のメンバーである疾患を治療または予防するための治療化合物として使用するために、骨芽細胞中のガンマカルボキシラーゼの活性または発現を低下させると推測される作用物質をスクリーニングするための方法が提供され、その方法は、a)骨芽細胞中でガンマカルボキシラーゼを選択的に過剰発現するコントロール遺伝子導入マウスおよびコントロールと同じ株由来の第2の遺伝子導入マウスを得るステップと、b)治療化合物が効果を有することを可能にする同じ条件下で、第1のマウスにプラセボを受けさせ、第2のマウスに治療化合物を受けさせるステップと、c)第1および第2のマウス由来の骨芽細胞の試料中のガンマカルボキシラーゼ活性のレベルをアッセイするステップと、d)第1のマウスのガンマカルボキシラーゼ活性のレベルと第2のマウスのガンマカルボキシラーゼ活性のレベルを比較するステップと、e)第1のマウスのレベルが第2のマウスのレベルよりも高い場合に、生物活性作用物質が、骨芽細胞中のガンマカルボキシラーゼの活性または発現を低下させる際の使用のための治療化合物として有用であることを結論づけるステップとを含む。生物活性作用物質は酵素阻害薬であってもよい。
【０３８６】
代謝症候群、I型またはII型糖尿病、インスリン分泌の減少、インスリン感受性の減少、耐糖能の減少、体脂肪量の増加、およびアテローム性動脈硬化症を含む群のメンバーである疾患を治療または予防するために治療上使用できると推測される作用物質をスクリーニングするための方法が提供され、その方法は、(a)疾患を有する動物を提供するステップと、(b)動物から採取された治療前生物学的試料中の低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの量を決定するステップと、(c)作用物質が効果を有することを可能にする条件下で試験動物に生物活性作用物質を投与するステップと、(d)動物から採取された治療後生物学的試料中の低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの量を決定するステップと、(e)生物活性作用物質が、治療前試料と比較して、治療後生物学的試料中の低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンの量を増加させる場合に、作用物質が、治療上使用することができることを結論づけるステップとを含む。
【０３８７】
代謝症候群、I型またはII型糖尿病、インスリン分泌の減少、インスリン感受性の減少、耐糖能の減少、体脂肪量の増加、およびアテローム性動脈硬化症を含む群のメンバーである疾患を治療または予防するために治療上使用できると推測される生物活性作用物質をスクリーニングするための方法が提供され、その方法は、(a)疾患を有する動物を提供するステップと、(b)動物から採取された治療前生物学的試料中のアディポネクチンの量を決定するステップと、(c)作用物質が効果を有することを可能にする条件下で試験動物に生物活性作用物質を投与するステップと、(d)動物から採取された治療後生物学的試料中のアディポネクチンの量を決定するステップと、(e)生物活性作用物質が、治療前試料と比較して、治療後生物学的試料中のアディポネクチンの量を増加させる場合に、作用物質が、治療上使用することができることを結論づけるステップとを含む。
【０３８８】
本明細書で使用される用語「作用物質」または「外因性化合物」は、様々なタンパク質(OST-PTP、ガンマカルボキシラーゼ、オステオカルシン)のうちの1つの生物活性を直接または間接的に変化させる可能性を有する任意の分子、たとえばタンパク質、オリゴペプチド、小有機分子、多糖類、ポリヌクレオチド、脂質等、またはその混合物を含む。いくつかの作用物質は治療上使用することができる。一般に、複数の混合アッセイは、様々な濃度に対して特異な応答を得るために、異なる作用物質濃度で並行して実施される。典型的には、これらの濃度のうちの1つ、つまり、ゼロ濃度のまたは検出のレベルより下の濃度はネガティブコントロールの代わりとなる。
【０３８９】
スクリーニングで使用される作用物質は多数の化学物質のクラスを包含するが、典型的には、それらは、有機分子、好ましくは、100を超え、かつ約2,500ダルトン未満の、好ましくは約500ダルトン未満の分子量を有する小有機化合物である。作用物質は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、典型的には、少なくとも1つのアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基、好ましくは少なくとも2つの官能化学基を含む。作用物質は、1つまたは複数の上記の官能基で置換された環式炭素もしくはヘテロ環式構造体および/または芳香族もしくは多環芳香族構造体を含むことが多い。作用物質はまた、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、その誘導体、構造的類似体、または組み合わせを含む生体分子の中にも見つけられる。特に、ペプチドが好ましい。
【０３９０】
十分に立証された薬理学的活性を有する高純度な小有機リガンドおよびペプチドアゴニストのライブラリーは多数の供給源から入手可能である。1つの例は、1,866個の薬剤様化合物(小さい、中程度の疎水性)を含有するNCI diversity setである。他には、多くの広範囲の柔軟な化合物を含む知られている生物活性体のInstitute of Chemistry and Cell Biology(ICCB;Harvard Medical Schoolによって管理)set(467個の化合物)がある。ICCBライブラリーの他のいくつかの例は、Chem Bridge DiverSet E (16,320個の化合物)、Bionet 1 (4,800個の化合物)、CEREP (4,800個の化合物)、Maybridge 1 (8,800個の化合物)、Maybridge 2 (704個の化合物)、Maybridge HitFinder (14,379個の化合物)、Peakdale 1 (2,816個の化合物)、Peakdale 2 (352個の化合物)、ChemDiv Combilab and International (28,864個の化合物)、Mixed Commercial Plate 1 (352個の化合物)、Mixed Commercial Plate 2 (320個の化合物)、Mixed Commercial Plate 3 (251個の化合物)、Mixed Commercial Plate 4 (331個の化合物)、ChemBridge Microformat (50,000個の化合物)、Commercial Diversity Set1 (5,056個の化合物)である。他のNCI Collectionsは、Structural Diversity Set, version 2 (1,900個の化合物)、Mechanistic Diversity Set (879個の化合物)、Open Collection 1 (90,000個の化合物)、Open Collection 2 (10,240個の化合物)、Known Bioactives Collections:NINDS Custom Collection (1,040個の化合物)、ICCB Bioactives 1 (
489個の化合物)、SpecPlus Collection (960個の化合物)、ICCB Discretes Collectionsである。以下のICCB化合物は、ICCB、Harvard、および他の共同機関の化学者らから個々に収集した:ICCB1 (190個の化合物)、ICCB2 (352個の化合物)、ICCB3 (352個の化合物)、ICCB4 (352個の化合物)。Natural Product Extracts:NCI Marine Extracts (352個の供給源)、Organic fractions--NCI Plant and Fungal Extracts (1,408個の供給源)、Philippines Plant Extracts 1 (200個の供給源)、ICCB-ICG Diversity Oriented Synthesis (DOS) Collections;DDS1 (DOS Diversity Set) (9600個の供給源)。化合物ライブラリーはまた、ActiMol、Albany Molecular、Bachem、Sigma-Aldrich、TimTec、および他等の商業上の供給業者からも入手可能である。
【０３９１】
スクリーニングで同定された知られているおよび新規の薬理学的作用物質は、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等の指向性のまたはランダムな化学修飾にさらにかけて、構造的類似体を生産してもよい。
【０３９２】
化合物をスクリーニングする、設計する、または修飾する場合、考慮するべき他の因子は、製薬技術で認識されており、ほぼ薬剤様の分子を作るための特性および構造的特徴に関するLipinskiの5つのルール(5つ以下の水素結合供与体(OHおよびNH基)、10個以下の水素結合受容体(特にNおよびO)、500g/mol未満の分子量、5未満の分配係数log P)、ならびにVeber基準を含む。
【０３９３】
作用物質はタンパク質であってもよい。この文脈では、「タンパク質」とは、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、およびペプチドを含む少なくとも2つの共有結合されたアミノ酸を意味する。タンパク質は、自然発生アミノ酸およびペプチド結合または合成ペプチドミメティック構造体から作り上げられてもよい。したがって、本明細書に使用される「アミノ酸」または「ペプチド残基」は、共に、自然発生および合成アミノ酸を意味する。たとえば、ホモフェニルアラニン、シトルリン、およびノルロイシンは本発明のためのアミノ酸と考えられる。「アミノ酸」はまた、プロリンおよびヒドロキシプロリン等のイミノ酸残基をも含む。側鎖は(R)または(S)配置のいずれかであってもよい。好ましい実施形態では、アミノ酸は(S)またはL配置である。非自然発生側鎖が使用される場合、非アミノ酸置換基は、たとえば、in vivo分解を予防しまたは遅らせるために使用されてもよい。
【０３９４】
作用物質は、自然発生タンパク質または自然発生タンパク質の断片もしくは変異体であってもよい。したがって、たとえば、タンパク質を含有する細胞抽出物またはタンパク質性細胞抽出物のランダムまたは指向性消化物が使用されてもよい。このように、原核生物および真核生物のタンパク質のライブラリーは、様々なタンパク質のうちの1つをスクリーニングするために作られてもよい。後者が好ましい、とりわけヒトタンパク質が好ましいが、細菌、菌類、ウイルス、および哺乳動物タンパク質のライブラリーが使用されてもよい。
【０３９５】
作用物質は、約5〜約30個のアミノ酸のペプチドであってもよく、約5〜約20個のアミノ酸が好ましく、約7〜約15個が特に好ましい。ペプチドは、上記に概説される自然発生タンパク質の消化物、ランダムなペプチド、または「偏った」ランダムなペプチドであってもよい。本明細書では、「ランダム化」または文法上の等価物は、各核酸およびペプチドは、それぞれ、ランダムなヌクレオチドおよびアミノ酸から本質的に成ることを意味する。一般に、これらのランダムなペプチド(または下記に論じられる核酸)は化学的に合成されるので、それらは、任意の位置に任意のヌクレオチドまたはアミノ酸を組み込んでもよい。合成プロセスは、ランダム化タンパク質または核酸を産生するために設計することができ、配列の全長にわたりすべてのまたはほとんどの可能な組み合わせの形成を可能にし、したがって、ランダム化作用物質生物活性タンパク質性作用物質のライブラリーを形成する。
【０３９６】
ライブラリーは、あらゆる位置での配列の優先または不変性を伴わないで完全にランダム化されてもよい。ライブラリーは偏っていてもよい。つまり、配列内のいくつかの位置は、一定に保たれるまたは限られた数の可能性のあるものから選択される。たとえば、たとえば、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基は、架橋結合のためのシステイン、SH-3ドメインに対するプロリン、リン酸化部位のためのセリン、トレオニン、チロシン、もしくはヒスチジン等の生成のために疎水性アミノ酸、親水性残基、立体的に偏った(小さいまたは大きな)残基の規定されたクラス内でまたはプリン等に対してランダム化される。
【０３９７】
作用物質は、対象とするタンパク質をコードする遺伝子またはそのmRNAのいずれかに結合して、それぞれ遺伝子発現またはmRNAの翻訳を遮断する単離核酸、好ましくはアンチセンス、siRNA、またはcDNAであってもよい。本明細書では、「核酸」もしくは「オリゴヌクレオチド」または文法上の等価物は、共に共有結合された少なくとも2つのヌクレオチドを意味する。そのような核酸は、一般に、リン酸ジエステル結合を含有するであろうが、いくつかの場合では、下記に概説されるように、たとえばホスホルアミド(Beaucageら、Tetrahedron 49)10):1925 (1993年)およびその参考文献、Letsinger, J. Org. Chem. 35:3800 (1970年)、Sprinzlら、Eur. J. Biochem. 81:579 (1977年)、Letsingerら、Nucl. Acids Res. 14:3487 (1986年)、Sawaiら、Chem. Lett. 805 (1984年)、Letsingerら、J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988年)、およびPauwelsら、Chemica Scripta 26:141 91986))、ホスホロチオエート(Magら、Nucleic Acids Res. 19:1437 (1991年)および米国特許第5,644,048号)、ホスホロジチオエート(Briuら、J. Am. Chem. Soc. 111:2321 (1989年)、O-メチルホスホロアミダイト連結(Eckstein、Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach、Oxford University Pressを参照されたい)、ならびにペプチド核酸のバックボーンおよび連結(Egholm、J. Am. Chem. Soc. 114:1895 (1992年)、Meierら、Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008 (1992年)、Nielsen、Nature、365:566 (1993年)、Carlssonら、Nature 380:207 (1996年)を参照されたい、これらのすべては参照によって組み込まれる)を含む代替のバックボーンを有していてもよい核酸類似体が含まれる。
【０３９８】
他の類似体核酸は、陽性のバックボーン(Denpcyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097 (1995年)、非イオン性バックボーン(米国特許第5,386,023号、第5,637,684号、第5,602,240号、第5,216,141号、および第4,469,863号、Kiedrowshiら、Angew. Chem. Intl. Ed. English 30:423 (1991年)、Letsingerら、J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988年)、Letsingerら、Nucleoside & Nucleoside 13:1597 (1994年)、ASC Symposium Series 580、「Carbohydrate Modifications in Antisense Research」、第2および3章、Y. S. SanghuiおよびP. Dan Cook編Mesmaekerら、Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4:395 (1994年)、Jeffsら、J. Biomolecular NMR 34:17 (1994年)、Tetrahedron Lett. 37:743 (1996年))、ならびに米国特許第5,235,033号および第5,034,506号ならびにASC Symposium Series 580、「Carbohydrate Modifications in antisense Research」、第6および7章、Y. S. SanghuiおよびP. Can Cook編に記載されるものを含む非リボースバックボーンを有するものを含む。1つまたは複数の炭素環式糖を含有する核酸もまた核酸の定義内に含まれる(Jenkinsら、Chem. Soc. Rev. (1995年) 169〜176頁を参照されたい)。いくつかの核酸類似体は、Rawls, C & E News 1997年6月2日、35頁に記載される。これらの参照はすべて、これによって、参照によって明白に組み込まれる。リボースリン酸バックボーンのこれらの修飾は、標識等のさらなる成分の追加を容易にするためにまたは生理的環境中でのそのような分子の安定性および半減期を増加させるために行われてもよい。加えて、自然発生の酸および類似体の混合物を作ることができる。あるいは、異なる核酸類似体の混合物ならびに自然発生核酸および類似体の混合物が作られてもよい。核酸は、明示されるように、一本鎖であってもよいもしくは二本鎖であってもよいまたは二本鎖配列または一本鎖配列の両方の部分を含有していてもよい。核酸は、DNA、ゲノムおよびcDNAの両方、RNA、またはハイブリッドであってもよく、核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの任意の組み合わせならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニン等を含む塩基の任意の組み合わせを含有する。
【０３９９】
一般にタンパク質について上記に記載されるように、核酸作用物質は、自然発生核酸、ランダムな核酸、または「偏った」ランダムな核酸であってもよい。たとえば、タンパク質について上記に概説されるように、原核生物または真核生物のゲノムの消化物が使用されてもよい。
【０４００】
作用物質は、コンビナトリアルケミカルライブラリーから得られてもよく、多種多様のものが文献で入手可能である。本明細書では、「コンビナトリアルケミカルライブラリー」とは、規定されたまたはランダムな様式で、一般に化学合成によって産生された種々の化学化合物のコレクションを意味する。何百万もの化学化合物はコンビナトリアル混合を通して合成することができる。
【０４０１】
様々なタンパク質のうちの1つへの作用物質の結合の決定は多くの方法で行われてもよい。好ましい実施形態では、作用物質は標識され、結合は直接決定される。たとえば、これは、様々なタンパク質のうちの1つのすべてまたは部分を固形支持体に付加し、標識作用物質(たとえば蛍光標識を含む作用物質)を追加し、過剰試薬を洗い落とし、標識が固形支持体上に存在するかどうかを決定することによって行われてもよい。様々な遮断ステップおよび洗浄ステップが、当技術分野で知られているように利用されてもよい。
【０４０２】
本明細書では、「標識」とは、作用物質が、検出可能なシグナルたとえば放射性同位体(3H、14C、32P、33P、35S、もしくは125I等)、蛍光化合物もしくは化学発光化合物(フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、もしくはルシフェリン等)、酵素(アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼ等)、抗体、磁気粒子等の粒子、または特異的結合分子等を提供する標識で直接または間接的に標識されることを意味する。特異的結合分子は、ビオチンおよびストレプトアビジン、ジゴキシンおよび抗ジゴキシン等のペアを含む。特異的結合メンバーについては、相補的なメンバーは、上記に概説されるように、知られている手順に従って検出を提供する分子で通常標識されると思われる。標識は、直接または間接的に、検出可能なシグナルを提供することができる。成分のうちの1つだけが標識されてもよい。あるいは、1つを超える成分が異なる標識で標識されてもよい。
【０４０３】
配列表
本出願に関係のある完全な核酸およびアミノ酸の配列表を下記に記載する。記載される核酸(Esp、オステオカルシン、アディポネクチン、ガンマカルボキシラーゼ、アポリポタンパク質EについてのcDNA)のうちのいずれかを過剰または過小発現する遺伝子導入マウスおよびそれら由来の単離細胞(とりわけ骨芽細胞および脂肪細胞)は、ノックインおよびノックアウトマウスを含む、当技術分野で知られているおよび本明細書に記載される日常的な方法を使用して作ることができる。ある事例では、核酸は、生物に核酸遺伝子またはmRNAを過剰発現させるプロモーターおよび制御エレメント(内因性または異種)に作動可能に連結されたならびにそれらのコントロール下の宿主生物のゲノムの中に挿入される。増幅される遺伝子を運ぶ形質移入ベクター中に含まれる外因性/異種のプロモーターの1つの例はアルファ1(I)コラーゲンである。多くのそのようなプロモーターは当技術分野で知られている。ヒト骨芽細胞は、形質移入されたヒト骨芽細胞にオステオカルシン(またはその断片もしくは変異体)を過剰発現させる知られているプロモーターおよび制御エレメントに作動可能に連結されたヒトEspまたはヒトオステオカルシン(またはその断片もしくは変異体)についてのcDNAを運ぶベクターで形質移入することができる。オステオカルシン(またはその断片もしくは変異体)、OST-PTP、またはガンマカルボキシラーゼを過剰発現する遺伝子導入マウスおよびマウス細胞ならびに形質移入されたヒト細胞が本明細書に開示される。オステオカルシン、Esp、ガンマカルボキシラーゼ、およびアディポネクチンについての1つのまたは両方の対立遺伝子の欠失ならびに二重突然変異の様々な組み合わせを有する二重突然変異マウスもまた本明細書に開示される。標的動物または標的細胞のゲノムの中への挿入のための、タンパク質をコードするcDNAまたはmRNAを運ぶベクターもまた本明細書に開示される。そのようなベクターは、cDNAまたはmRNAに作動可能に連結されたプロモーターおよび制御エレメントを任意選択で含むことができる。「作動可能に連結された」とは、プロモーターおよび制御エレメントが、プロモーターおよび制御エレメントのコントロール下でcDNAまたはmRNAの発現を可能にするような方法で、cDNAまたはmRNAに連結
されることを意味する。
【０４０４】
それぞれOST-PTPまたはガンマカルボキシラーゼをコードする遺伝子およびmRNAに特異的にハイブリダイズする、OST-PTPおよびガンマカルボキシラーゼの発現を低下させ、それによって、動物の代謝症候群またはその構成要素または1型糖尿病を治療または予防するのに使用されるアンチセンスおよび小分子干渉RNAを作ることができる。マウス(OST-PTP、Ptprv)cDNAについての配列は、配列番号18に記載される。OST-PTP、Ptprv)タンパク質についてのアミノ酸配列は配列番号19に記載される。このcDNAはOST-PTPについてのmRNAとハイブリダイズし、それによって、その翻訳に干渉する。OST-PTP発現を低下させることにより低カルボキシル化/非カルボキシル化オステオカルシンを増加させる。マウスガンマカルボキシラーゼについてのcDNAは配列番号12によって同定され、そのアミノ酸配列は配列番号13である。このcDNAはガンマカルボキシラーゼについてのmRNAとハイブリダイズし、それによって、その翻訳に干渉し、またこれは好ましい実施形態である。ヒトガンマカルボキシラーゼについてのcDNAは配列番号10によって同定され、アミノ酸配列は配列番号11である。ヒトガンマカルボキシラーゼcDNAは、代謝症候群およびその構成要素ならびに1型または2型糖尿病を治療または予防するように、ガンマカルボキシラーゼ発現を低下させるために治療上使用することができる。
【実施例】
【０４０５】
本発明は、上記に記載される実験によっておよび以下の実施例によって本明細書に示され、これらは、限定するものとして解釈されるべきではない。本出願にわたり引用されたすべての参考文献、係属中の特許出願、および公開された特許の内容は、これによって、参照によって明白に組み込まれる。当業者らは、本発明が異なる形態で具体化されてもよいことおよび本明細書に記載される実施形態に限定されるように解釈されるべきでないことを理解するであろう。むしろ、これらの実施形態は、本開示が本発明を当業者らに完全に伝えるために提供される。本発明の多くの修飾および他の実施形態を、先の説明に示される教示の利益を有する、本発明が属する当業者は思い浮かべるであろう。特定の用語が用いられているが、それらは他に示さない限り当技術分野のものとして使用される。
【０４０６】
材料および方法
Esp-nLacZマウスは、OST-PTPについての一方(+/-)または両方の対立遺伝子(-/-)が動物の細胞のすべてで不活性化されたEsp欠損マウスモデルを指す。nLacZ(またはLacZ)マウスは、核局在的LacZカセットをコードする配列を有する導入遺伝子との標的OST-PTP対立遺伝子の相同組換えによって作られ、このLacZカセットは、導入遺伝子がOST-PTP遺伝子とインフレームとなり、かつ導入遺伝子の発現がOST-PTP対立遺伝子の天然の遺伝子発現制御配列に作動可能に連結されるように、OST-PTP対立遺伝子のエキソン6の中に相同的に組換えられる。Esp KI(ノックイン)=Esp nLacZ(-/-)マウス。
【０４０７】
Esp-nLacZマウスは、LacZがOST-PTP配列とインフレームとなるようにエキソン6の中に核局在的LacZ(nLacZ)カセットを挿入するために設計された標的ベクターを使用して産生した(Dacquinら、2004年、Ducyら、1996年)。全マウスPtprv遺伝子に及ぶゲノムクローンは、マウスcDNAの断片を使用することによってマウスゲノムライブラリー(129ola株)から単離した(Leeら、[1996年])。HPRTヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼミニ遺伝子選択カセット、内部リボソーム侵入部位(Mountfordら、1994年)、およびLacZ遺伝子に融合されたSV40核局在性配列を含有するレポーター(nLacZ)を含有する標的ベクターを構築した。この中に、遺伝子の5’末端からの相同な4.4kbおよび遺伝子の3’末端からの相同な1.9kbをクローニングした。遺伝子ターゲティングは、E14Tg2Aフィーダー非依存的胚幹(ES)細胞(Hooperら、1987年)中で標準の技術(Joyner、1999年)を使用することによって行った。標的ES細胞は、前に記載されるように、HAT(10マイクロMヒポキサンチン、9マイクロMアミノプテリン、20マイクロMチミジン)選択培地中で選択した(Thompsonら、1989年)。組織培養培地は、10%ウシ胎仔血清(FCS)、0.1mM 2メルカプトエタノール、1mMピルビン酸ナトリウム、および約103U/mlの白血病抑制因子を補充したGMEM(Glasgow Modified Eagles Media、Gibco)とした。合計5×106細胞は、800マイクロリットルのリン酸緩衝食塩水(PBS)中で20マイクログラムのNotI直線化ベクターDNAを用いてGene Pulser(Bio-Rad)を使用することによって800Vおよび3マイクロFDで電気穿孔し、ゼラチンをコーティングした10cm組織培養プレート上に平板培養した。48時間後に、細胞をHAT選択培地に移動させた。標的ES細胞クローンは、組み込み部位の、相同な標的ベクターの5’および3’の両方の外側の領域に相補的な放射標識cDNA断片を使用しておよび単一のコピーが組み込まれたことを検査するためにLacZプローブを使用することによって、サザンハイブリダイゼーションにより同定した。標的ES細胞はC57BL/6胚盤胞中に注射し、これらは続いて里親の中に移動させた。キメラオスをMF1株メスと交配させ、灰色の子孫由来の尾の先端のDNAのサザンブロット分析またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)をヘテロ接合動物を同定するために使用した。突然変異体は、後の分析のためのヘテロ接合マウスを用意するために、5回の生殖についてMF1株と交差させた。この突然変異は、ほとんどのOST-PTP細胞外ドメイン、その膜貫通ドメイン、および細胞内ドメイン(1)の欠失をもたらした。この種類の突然変異対立遺伝子は、Esp nLacZ突然変異対立遺伝子またはEsp KI(ノックイン)突然変異対立遺伝子と称される。Esp nLacZマウスでは、OST-PTPについての一方(+/-)または両方の対立遺伝子(-/-)が動物の細胞のすべてで不活性化され、それによって、OST-PTP発現に干渉した。
【０４０８】
「Esp osb突然変異マウス」は、OST-PTPについての一方(+/-)または両方の対立遺伝子(-/-)が、動物の骨芽細胞のみから欠失させられまたはノックアウトされ、それによって、骨芽細胞中でのOST-PTPの合成を選択的に遮断するEsp欠損マウスモデルである。これは、レプチンの一方または両方の対立遺伝子を欠くob突然変異体と混同されないものとする。Esp osbマウスは一方または両方の内因性OST-PTP対立遺伝子に破壊を伴い、OST-PTP対立遺伝子の、ホスファターゼドメインをコードするエキソン24〜35は欠失させられ、OST-PTPについての一方(+/-)または両方の対立遺伝子(-/-)で、loxP部位によってフロックス化されたネオマイシン抵抗性遺伝子と交換されている。
【０４０９】
イントロン23および35内にLoxP部位およびフロックス化されたネオマイシン抵抗性カセットを持つ標的ベクターをES細胞の中に電気穿孔した。標的ES細胞は129Sv/EV胚盤胞中に注射して、フロックス化された対立遺伝子(Espflox)を持つキメラマウスを産生した。Espflox/+マウスはα1(I)コラーゲン-Creマウスと交差させて、Espob-/+マウスを産生し、それらの後代は、相互交配させて、Espob-/-マウスを得た。フロックス化されたEsp対立遺伝子を持つマウスは、プロモーターが活性である場合に細胞中のEsp遺伝子を特異的に不活性化する対象とする任意のこのプロモーターのコントロール下でレコンビナーゼを発現する遺伝子導入マウスと交差させることができる。Espobでは、OST-PTPについての一方(+/-)または両方の対立遺伝子(-/-)は、骨芽細胞中のみで不活性化され、それによって、これらの細胞中でのOST-PTP発現のみに干渉した。分子の分析は、組換えが、精巣、脂肪細胞、または膵臓ベータ細胞を含むあらゆる他の組織または細胞型中ではなく、骨芽細胞中のEsp遺伝子座で高頻度で生じたことを示した(図1Cおよび1D)。ノーザンブロット分析は、それがヌル対立遺伝子であることを立証したが、サザンブロットハイブリダイゼーションは、骨芽細胞中のEsp削除の効率を実証するために使用した(図1C)。定量RT-PCRおよびウエスタン分析は、Espob-/-マウスの骨中で、Esp mRNAおよびOST-PTPタンパク質をそれぞれ検出しなかったが、Esp mRNAおよびOST-PTPタンパク質の両方はEsposb-/-マウスの精巣中に存在した(図1D)。これらのデータは、Espの骨芽細胞特異的不活性化が達成されたことを示す。
【０４１０】
本明細書に使用されるように、「Esp欠損マウス」は、骨精巣タンパク質チロシンホスファターゼOST-PTP(Esp遺伝子によってコード)についての両方の対立遺伝子がEsp osb-/-マウスでのように欠失させた(ノックアウトされた)またはEsp-nLacz-/-マウスでのように破壊もしくは(ノックイン)された遺伝子導入マウスの2つの株のいずれかを意味する。
【０４１１】
図22は、Esposb-/-マウスを産生するためのある程度詳細な方法およびEsp-/-動物での正常な骨形成を示す。図23は、Esp-/-マウスの様々な代謝および生理学的パラメーター:C-ペプチドの血清レベル(A)、膵臓中の血清グルカゴンレベル(左側)およびグルカゴン含有量(右側)(B)、ならびにEsp-/-マウスのIGF-1(C)、PYY(D)、およびアミリン(E)の血清レベル、(F)10週齢のWTマウスおよびEsp-/-マウスでプロトン磁気共鳴分光法(1H-MRS)によって算出した体重に対する筋肉量の比、(G)10週齢のWTマウスおよびEsp-/-マウスのプロトン1H-MRSの代表的な画像、(H)1月齢および3月齢のEsp-/-マウスおよびWTマウスでの1日当たりの食物摂取量、(IおよびJ)1月齢のEsp-/-マウスならびにWTマウスでのリアルタイムPCRによる発現レベル(I)ならびにTNF-α(左側)およびIL-6(右側)の血清レベル(J)の比較、ならびに(K)1月齢のEsp-/-マウスおよびWTマウスの血清レプチン(左側)および血清レジスチン(右側)のレベルに関して1月齢のWTマウスおよびEsp-/-マウスを比較する。すべてのパネルで、データは実験の平均値±SDを表す。*、P<0.01(t-検定)。
【０４１２】
図24は、GTGによるVMH核の破壊の解剖学的形態を示す。図25は、細胞分化転換が共培養物アッセイの間にないことを示す。図26は、オステオカルシン発現が骨特異的であることを示す。18.5dpc胚の膵臓中のオステオカルシンおよびEspの発現のin situハイブリダイゼーション分析は、どちらの遺伝子も膵臓中で発現しないことを示す。インスリン発現はポジティブコントロールとして使用した。隣接した切片のヘマトキシリン‐エオシン染色は組織の完全性を判断するために使用した。1月齢WTマウスから収集した骨芽細胞、脂肪細胞、および膵島中のオステオカルシン発現のリアルタイムPCR分析は、オステオカルシンが脂肪細胞または島中で発現しないことを示した。
【０４１３】
コラーゲンアルファ1(I)-PTPおよびコラーゲンアルファ1(I)-PTPED遺伝子導入マウスの産生。完全長Esp cDNA(アルファ1(I)コラーゲン-OST-PTP)またはOST-PTP細胞外(本明細書で可溶性ドメインとも称される)ドメインのみをコードするこのcDNAの切断バージョン(アルファ1(I)コラーゲン-OST-PTPECマウス)を過剰発現する遺伝子導入マウスを産生した。細胞外ドメインはまた本明細書で可溶性ドメイン(SD)とも称される。これらのcDNA遺伝子は、in vivoで骨芽細胞中でESP(OST-PTP)またはOST-PTP細胞外ドメインを過剰発現するマウスを作るために、アルファ1(I)コラーゲンの骨芽細胞特異的制御エレメントのコントロール下とした。
【０４１４】
1月齢で、アルファ1(I)コラーゲンEsp遺伝子導入マウスは、絶食後のおよび摂食後の血清グルコースの増加、摂食後のインスリン血清レベルの減少、およびエネルギー消費量の減少を呈した。したがって、耐糖能試験(GTT)は、アルファ1(I)コラーゲン-Espマウスがグルコース不耐性であることを示し、一方、インスリン抵抗性試験(ITT)はそれらがインスリン耐性であることを確証した(図4)。概して、遺伝子導入マウスの表現型は、Esp欠損マウスで観察された表現型の鏡像(反対)である。さらに、このEsp cDNA完全転写物導入遺伝子は、Esp欠損で、糖尿病抵抗性のマウスの代謝異常をすべて直した。遺伝子導入マウスは、完全長Esp cDNA(アルファ1(I)コラーゲン-Esp)またはOST-PTP細胞外ドメイン(可溶性ドメインと本明細書で称される)ドメインのみをコードするこのcDNAの切断バージョン(アルファ1(I)コラーゲン-EspECマウス)を過剰発現する。
【０４１５】
ApoE-PTP、ApoE-PTPSD(ApoE-PTPEDとも命名される)遺伝子導入マウスの産生。完全長マウスEsp cDNAまたは細胞外ドメイン(ED)のアミノ酸1〜1111をコードするEspマウスcDNAの断片を、ApoE遺伝子のプロモーターを使用して肝臓特異的発現を指示するベクターの中にクローニングした。OST-PTPについての完全cDNA転写物の発現とは対照的に、OST-PTP細胞外ドメインのみをコードするこのcDNAの切断バージョンを発現するアポリポタンパク質E-OST-PTPEC遺伝子導入マウスは、野生型マウスと区別不能であった。これらの実験は、OST-PTPがその細胞内ホスファターゼドメインを通してエネルギー代謝を制御することをさらに証明する。
【０４１６】
オステオカルシン欠損(Ocn-/-またはBgp-/-とも命名される)マウスの産生。「オステオカルシン欠損マウス」は、両方のオステオカルシン対立遺伝子が欠失させられたマウスの株を意味する。本明細書に記載されるオステオカルシン欠損遺伝子導入マウスでは、成熟タンパク質をコードするオステオカルシン遺伝子1(OG1)のエキソン4および全オステオカルシン遺伝子2(OG2)配列を欠失させたが、オステオカルシン関連遺伝子(ORG)は本来の場所のままとした。正確なターゲティングにより、pGKNeo選択カセットによる全成熟オステオカルシンタンパク質コード配列の交換をもたらした。
【０４１７】
オステオカルシン-/-マウスの産生は前に報告された(Ducyら、1996年)。成熟タンパク質をコードするオステオカルシン遺伝子1(OG1)のエキソン4および全オステオカルシン遺伝子2(OG2)配列を欠失させたが、オステオカルシン関連遺伝子(ORG)は本来の場所のままとした。正確なターゲティングにより、pGKNeo選択カセットによる全成熟オステオカルシンタンパク質コード配列の交換をもたらした。これらのマウスの分析を図5〜7および表1に報告する。
【０４１８】
アディポネクチン欠損マウスおよびOcn+/-;アディポネクチン+/-マウスの産生。アディポネクチン欠損マウスは前に記載される戦略に従って産生し(Maedaら、2002年)、アディポネクチン遺伝子の一方(+/-)または両方(-/-)の対立遺伝子のエキソン2および3を欠失させた。次いで、アディポネクチン+/-または-/-をOcn-/-または+/-のマウスと交差して、アディポネクチン+/-;Ocn+/-マウスを産生した。これらのマウスの分析を図6に報告する。
【０４１９】
SAP-アディポネクチン遺伝子導入マウスの産生。アディポネクチンを過剰発現する遺伝子導入マウスが産生されてもよい。そのような遺伝子導入マウスのゲノムは、マウス血清アミロイドタンパク質(SAP)遺伝子の制御エレメントのコントロール下でアディポネクチンをコードする異種のcDNAを運び、野生型の効果に比べて、アディポネクチンの生産、分泌、および活性の増加から成る群から選択される効果をもたらす。いくつかの場合では、cDNAは配列番号8によって定義される。そのようなマウスを産生するのに使用される構築物は、血清アミロイドタンパク質プロモーターのコントロール下でアディポネクチンについてのcDNAを含む構築物を含み、この構築物はpSAP-Adipoと呼ばれる。脂肪細胞を含む細胞は、そのような遺伝子導入動物から単離されてもよい。
【０４２０】
アディポネクチンを過剰発現するマウスを産生するために、アディポネクチンについてのマウスcDNAを、ヒトSAPプロモーターおよびウサギβ-グロビン非コードエキソン/イントロンを含有するカセットの上流にサブクローニングした(図28)。脂肪パッド重量を、3月齢の各性別のWTおよびアディポネクチン遺伝子導入の子およびマウスで測定した(図28D)。食物摂取量およびエネルギー消費量は、Esp欠損マウスで観察されたエネルギー消費量の増加が単にアディポネクチン血清レベルのそれらの増加によるものかどうかを確かめるために、WTマウスおよびSap-アディポネクチン遺伝子導入マウスで判断した。血清アディポネクチンレベルの増加は食欲に影響を与えないであろうということもまた立証された。その目的のために、代謝ケージおよび装置を使用した。血清グルコースレベルを、出生、2、4、8、および16週齢時にWTマウスおよびSap-アディポネクチン遺伝子導入マウスで測定した。成体マウスでは、これは絶食の後および摂食の後に行った。同じ試料で、血清インスリンおよびアディポネクチンのレベルを測定した(図28Cおよび28E)。血清レプチンレベルを成体マウスの血清中で測定した。インスリン感受性はインスリン耐性試験によって判断した(図28F):マウスを、6時間絶食させ、インスリン(0.2U/BW kg)をIP注射し、グルコースレベルを記載されるように示される時間に測定した(Mauvais-Jarvisら、2002年)。ITTのデータは初めの血糖濃度のうちの百分率として示す。インスリン分泌は、グルコース腹腔内注射後に行った耐糖能試験によっておよびグルコース刺激インスリン分泌によってアッセイした。血液試料は、2g/kgデキストロースの腹腔内注射の後に、GSISについては0、2、5、15、および30分後にまたはGTTについては0、15、30、60、および120分後に得た。全血グルコース値は自動グルコースモニター装置を使用して決定した。組織学的分析。我々は、Esp欠損マウスでは、WTマウスよりも脂肪細胞が少ないが、それらはより大きいことを観察し、それらが脂肪を放出することができないことが示唆された。同じ分析を、1および2月齢のWTマウスおよびSap-アディポネクチン遺伝子導入マウスで行ってもよい。脂肪細胞の大きなサイズにより脂肪細胞が脂肪を放出することができないことが示されることを確かめるために、WT、Esp欠損、およびSap-アディポネクチンの1月齢マウスを16時間または24時間絶食させ、遊離脂肪酸(FFA)血清レベルについて測定してもよい。FFA血清レベルは、WTマウスでのように、Esp欠損およびSap-アディポネクチンで増加しないことが予想される。
【０４２１】
Sap-インスリン遺伝子導入マウスの産生。ゲノムが、マウス血清アミロイドタンパク質(SAP)遺伝子のプロモーターおよび制御エレメントのコントロール下で完全長マウスインスリンをコードするcDNAを運び、野生型に比べて、インスリン発現および分泌の増加を含む効果をもたらす遺伝子導入マウスが本明細書に開示される。
【０４２２】
インスリンを過剰発現するマウスを産生するために、インスリンについてのマウスcDNAを、ヒトSAPプロモーターおよびウサギβ-グロビン非コードエキソン/イントロンを含有するカセットの上流にサブクローニングした。これらの遺伝子導入マウスは、Sap-アディポネクチン遺伝子導入マウスを研究するために使用した試験を含む、代謝/分子試験の同じ設備を使用して分析した。これらの研究を図29に示す。
【０４２３】
基質捕捉。基質捕捉実験のためのプラスミドを以下のように作った:第1のホスファターゼドメイン(アミノ酸1116〜アミノ酸1412)をコードするラットOST-PTP配列は、GST(グルタチオンS-トランスフェラーゼ)をコードするpGEX 4T3(Amersham)のBamHI部位の中にクローニングした。この構築物(GST-PTP)は、部位特異的突然変異誘発によって、酵素基質相互作用の安定化をもたらす触媒突然変異体形態であるAsp1316Ala GST-PTP DAを産生するために使用した。突然変異は、ホスファターゼのこのクラスの脱リン酸機能を媒介することで知られているホスファターゼ1ドメイン中に成された。GST-PTPD1316A突然変異体は、野生型OST-PTPと比較して、ホスファターゼ活性を低下させたが、基質結合能力を増加させた。したがって、それは、野生型タンパク質よりもよく基質を保持する、つまり「捕捉する」ことができる。突然変異体OST-PTPD1316Aを発現する細胞は、OST-PTPの通常の標的であるあらゆる基質を捕捉するであろうが、突然変異体酵素は基質を脱リン酸することができない。したがって、それは、基質を放出せずに、基質を保持する。次いで、各実験条件についてのタンパク質複合体を遠心分離によって下降させ、4回洗浄し、ウエスタンブロットによって分析した。
【０４２４】
基質捕捉実験については、細胞は、溶解バッファー(50mM Tris-HCl、pH7.5、5mM EDTA、150mM NaCl、1%Triton、0.1%CHAPS、5mMヨード酢酸、10mMリン酸ナトリウム、10mM NaF)中で溶解させた。細胞溶解物を、GST、GST-PTPWT(OST-PTPのホスファターゼドメインIとのGSTの融合物)、またはGST-PTPD1316A(ホスファターゼドメインIのAspの捕捉突然変異体)とインキュベートした。組換えタンパク質を4℃で1時間(インスリン受容体捕捉)または4℃で2時間(ガンマカルボキシラーゼ基質捕捉)、セファロースビーズに結合させた。沈澱物を収集し、溶解バッファーを用いて4回洗浄し、SDS-PAGE上で分離し、その後ウエスタンブロッティングを続けた。インスリン受容体(InsR)はウサギ抗インスリン受容体抗体(Santa-Cruz、C-19)を使用して検出し、GSTはマウス抗GST抗体(Santa-Cruz)によって検出した。ガンマカルボキシラーゼはウサギ抗ガンマカルボキシラーゼ抗体を使用して検出した。
【０４２５】
OST-PTPの基質はインスリン受容体およびガンマカルボキシラーゼである。OST-PTPがガンマカルボキシラーゼを通して作用するかどうかを決定するために、我々は初代骨芽細胞で基質捕捉実験を行った。分化した初代骨芽細胞(d10)を、アスコルビン酸(100マイクログラム/ml)およびベータグリセロリン酸(5mM)を補充したアルファMEM/10%ウシ胎児血清(FBS)中で10日間培養した。次いで、それらを、1%FBSのみを補充した同じ培地中で24時間飢餓状態にさせ、30分間、過バナジン酸(100μM)、不可逆性のタンパク質チロシンホスファターゼ阻害薬、および20%FBSを用いて処理した。細胞溶解物をGST、GST-PTPWT、またはGST-PTPD1316Aと4℃で2時間インキュベートした。異なる量の全細胞抽出液もまたコントロールとして添加した。
【０４２６】
完全長または切断OST-PTPを過剰発現する形質転換細胞。フラグタグ付き完全長OST-PTPまたはその細胞外ドメインのみを含有するフラグタグ付き切断OST-PTP(OST-PTPEC)を発現する真核生物発現ベクターを、これらのフラグタグ付きベクターを用いて形質移入したROS(ラット骨芽細胞)17/2.8造骨細胞中でおよびCOS7細胞中でネガティブコントロールとしてDNA永久的形質移入実験を行うために使用した。染色体に2つの遺伝子のそれぞれ(フラグタグ付き完全長OST-PTPまたはその細胞外ドメインのみを含有するフラグタグ付き切断OST-PTP)を組み込んだ細胞のクローンの選択および単離後に、細胞溶解物のRT-PCRおよびウエスタンブロット分析をそれぞれ使用して、遺伝子が転写され、タンパク質が作られたことを立証した。次いで、細胞を一晩、無血清培地中で培養した。空のベクターまたは完全長もしくは切断Esp cDNAをコードするベクターで形質移入した細胞の上清を単離し、ウエスタン分析を市販で入手可能な抗フラグ抗体を使用して行った。
【０４２７】
オステオカルシン生産のための細菌発現ベクター。我々は、GSTタグ付きマウスオステオカルシン、GSTタグ付きヒトオステオカルシン、マウスおよびヒトのオステオカルシンのGSTタグ付き突然変異体、ならびにマウスおよびヒトのオステオカルシンのGSTタグ付き切断型突然変異体のための原核生物発現ベクターを産生した。
【０４２８】
食事およびGTGは肥満症および2型糖尿病を誘発した。食事誘発性の肥満症については、オスおよびメスの6週齢のWTマウスおよびオステオカルシン欠損マウス(グループ当たりn=10)に4、6、8、または12週間、正常食または45%脂肪、35%炭水化物、および20%タンパク質の「西洋」食」を与えた。GTG誘発性肥満症については、オスおよびメスの4週齢のWTマウスおよびオステオカルシン欠損マウス(グループ当たりn=10)に0.5mg/kgのGTGを注射し、12週齢で犠牲死させた。両方の種類の実験で、WTマウスおよび突然変異マウスを以下のように分析した。身体検査:実験の開始時のおよびその後犠牲死までの毎週の各マウスの全体重を測定した。食物摂取量:このパラメーターは、GTG病変が食物摂取量の増加を誘発することを特に確かめるために判断した。その目的のために、代謝ケージおよび装置を使用した。代謝研究:血清グルコースおよびインスリンのレベルを一晩の絶食の後におよび摂食の後に測定した。血清アディポネクチンおよびレプチンのレベルもまた各マウスで測定した。インスリン分泌は、グルコース腹腔内注射後に行った耐糖能試験(GTT)および/またはグルコース刺激インスリン分泌試験(GSIS)の両方によってアッセイした。血液試料は、0、2、5、15、および30分後にまたはGTTについては2g/kgデキストロースの腹腔内注射の後に0、15、30、60、および120分後に得た。全血グルコース値は自動グルコースモニター装置を使用して決定した。分子の分析:各実験の終了時に、肝細胞、脂肪細胞、および筋芽細胞中のインスリン感受性の複数のマーカーの発現を測定した。
【０４２９】
オステオカルシンによるアディポネクチン発現/分泌の制御を研究するための骨芽細胞および脂肪細胞の共培養。共培養アッセイは、アディポネクチン発現での修飾を分析するために骨芽細胞および脂肪細胞の間で進展させた。我々は、このアッセイで、WTマウス、Esp欠損マウス、またはオステオカルシン欠損マウス由来の骨芽細胞を、これらの同じマウスのうちのいずれかから採取した初代脂肪細胞と共に使用した。ネガティブコントロールとして、我々は、各遺伝子型のマウス胚の線維芽細胞を脂肪細胞と共培養した。骨芽細胞および線維芽細胞は、過去12年間研究所で日常的に使用されてきた、あたかも本明細書に完全に記載されるように参照によって組み込まれる標準のプロトコールに従って調製した(DucyおよびKarsenty 1995年)。骨芽細胞または線維芽細胞は、実験を始める36時間前に、アルファMEM、10%ウシ胎児血清(FBS)中70%コンフルエンスで平板培養した。脂肪細胞を追加する前に、培地を変更して、FBS濃度を1%に減少させた。脂肪細胞を、翌朝、0、2、4、8、または12時間追加した。実験の終了時に、非付着細胞として存在した脂肪細胞を培地を遠心分離することによって収集した。脂肪細胞は、RNAを抽出するためにならびにリアルタイムでアディポネクチンおよびできる限り、レプチンを含む他の脂肪細胞由来ホルモンのPCR発現を測定するために使用した。培地は、オステオカルシン、アディポネクチン、レプチン、および他のアディポカインのレベルを測定するために使用した。
【０４３０】
オステオカルシンによるインスリン発現/分泌の制御を研究するための骨芽細胞およびベータ細胞の共培養。骨芽細胞および膵臓ベータ細胞の間の共培養アッセイは、インスリン発現の修飾を分析するために進展させた。WTマウス、Esp欠損マウス、またはオステオカルシン欠損マウス由来の骨芽細胞を、これらの同じマウスのうちのいずれかから採取した膵臓ベータ細胞と共に使用した。ネガティブコントロールとして、各遺伝子型のマウス胚の線維芽細胞を脂肪細胞と共培養した。骨芽細胞および線維芽細胞は、過去12年間研究所で日常的に使用されてきた標準のプロトコールに従って調製した。(DucyおよびKarsenty 1995年、あたかも本明細書に完全に記載されるように参照によって組み込まれる)。骨芽細胞または線維芽細胞は、実験を始める36時間前に、アルファMEM、10%ウシ胎児血清(FBS)中70%コンフルエンスで平板培養した。ベータ細胞を追加する前に、培地を変更して、FBS濃度を1%に減少させた。ベータ細胞を、翌朝、0、2、4、8、または12時間追加した。実験の終了時に、非付着細胞として存在したベータ細胞を培地を遠心分離することによって収集した。ベータ細胞は、RNAを抽出し、リアルタイムでインスリンおよび他のベータ細胞由来ホルモンのPCR発現ならびにインスリン発現および細胞増殖を制御することで知られている分子の発現を測定するために使用した。培地は、オステオカルシン、アディポネクチン、インスリン、および他のサイトカインのレベルを測定するために使用した。
【０４３１】
代謝研究。耐糖能試験(GTT)については、グルコース(2g/体重(BW)1kg)を一晩の絶食の後に腹腔内に(IP)注射し、血糖を、示される時間に血糖ストリップおよびAccu-Checkグルコメーター(Roche)を使用してモニターした。グルコース刺激インスリン分泌試験(GSIS)については、グルコース(3g/BW kg)を一晩の絶食の後にIP注射し、記載されるように血清を尾部から収集し、インスリンを測定した(Mauvais-Jarvisら、2000年)。インスリン耐性試験(ITT)については、マウスを、6時間絶食させ、インスリン(0.2U/kg BW)をIP注射し、血糖レベルを記載されるように示される時間に測定した(Mauvais-Jarvisら、2002年)。ITTのデータは初めの血糖濃度のうちの百分率として示す。金チオグルコース(600mg/BW kg、USP)を一晩の絶食の後にIP注射し、マウスは分析のために3か月後に犠牲死させた。ストレプトゾトシン(150mg/ml単一注射、Sigma)をIP注射し、血糖をその後2日毎に記載されるように測定した。8日後に、膵臓を、前に記載されるように、インスリン含有量を測定するために単離した(Mauvais-Jarvisら、2000年)。食物摂取量は、食物重量の1日の変化として代謝ケージを使用して測定した。エネルギー消費量は、カロリメーター(Columbus Instrument)に連結させた代謝ケージを使用して測定した。発熱量(Kcal/時)は2日間にわたり記録し、マウスBW毎に報告した。
【０４３２】
研究所での測定。血液は、摂食状態および断食状態の、イソフルランで麻酔したマウスの心臓穿刺によって収集した。熱量測定アッセイは、遊離脂肪酸(和光純薬)およびトリグリセリド(Sigma)の血清レベルを測定するために使用した。インスリン(Crystal Chem Inc.キット)、アディポネクチン(Lincoキット)、レプチン(Crystal Chem Inc.キット)、およびレジスチン(Lincoキット)の血清レベルはELISAによって定量化し、オステオカルシンレベルはIRMA(Immunotopicsキット)によって定量化した。マウスの低カルボキシル化オステオカルシンとカルボキシル化オステオカルシンを区別するために設計したIRA、IRMA、またはELISAはない。既存のキットは、全オステオカルシンを測定するが、低カルボキシル化オステオカルシンを特異的に認識することができない。したがって、ヒドロキシアパタイト(HA)樹脂を2つの形態を分離するために使用した。カルボキシル化形態はHAに結合する唯一の形態である。
【０４３３】
マウス島および脂肪細胞の単離。島はHistopaque勾配(1077、Sigma)を使用して単離した。手短かに言えば、総胆管を十二指腸へのその入口でクランプした後、M199培地(GIBCO)中1mg/mlコラゲナーゼP(Sigma)を管の中に注射した。膨張した膵臓を外科的に摘出し、17分間37℃でインキュベートした。消化した膵臓を、ピペットにより分散させ、同じ培地を用いて2回すすいだ。Spectra-mesh(400μm)を通して組織懸濁液を濾過した後に、消化した組織は、Histopaque中に再懸濁させ、M199培地で覆った。次いで、試料を20分間1,700gで遠心分離し、島を界面から収集した。回収した物質は、冷たいM199培地を用いて2回洗浄し、M199/1%NCSまたはαMEM/1%FBS(GIBCO)培地中に再懸濁させ、5%CO2中で37℃で培養した。
【０４３４】
初代脂肪細胞はコラゲナーゼ消化によって精巣上体の脂肪パッドから単離した。手短かに言えば、細かく切った脂肪組織を、37℃で1時間、KRPバッファー(20mM HEPES、120mM NaCl、6mM KCl、1.2mM MgSO4、1mM CaCl2、0.6mM Na2HPO4、0.4mM NaH2PO4、2.5mM D-グルコース、2%BSA、pH7.4)中で1mg/mlコラゲナーゼPによって消化させた。単離細胞は、5%CO2中37℃でαMEM/1% FBS中で培養する前に、KRPバッファーで2回洗浄した。
【０４３５】
細胞培養実験。初代骨芽細胞は、前に記載されるように5日齢の子の頭蓋冠から調製し(Ducyら、2000a)、5日間100μg/mlアスコルビン酸および5mMβ-グリセロリン酸の存在下でαMEM/10%FBS中で培養した。皮膚線維芽細胞はコラゲナーゼ消化(0.5mg/ml)によって単離し、αMEM/10% FBS中で培養した。初代島(または脂肪細胞)の追加の24時間前に、骨芽細胞(または線維芽細胞)をαMEM/1%FBS中に置いた。ワルファリン処理については、ROS17/2.8造骨細胞は、脂肪細胞との共培養の前に48時間、DMEM/F12/1%FBS中の50μMワルファリンまたは賦形剤を補充するまでDMEM/F12/10% FBS中に維持した。共培養の4時間後に、(1μm)培養インサート(Falcon)の存在下または非存在下で、島(または脂肪細胞)をTRIZOL(Invitrogen)を使用してRNA単離のために収集した。
【０４３６】
遺伝子発現分析。遺伝子発現分析はすべてリアルタイムPCRを使用して行った。DNAseI処理全RNAは、SuperScriptIIIキット(Invitrogen)を用いてcDNAに変換させた。リアルタイムPCRは、MX3000機器(Stratagene)上でROX(Biorad)と共にTaq SYBR Green Supermixを使用して行った。ベータアクチン増幅は内部基準として各試料に使用した。プライマーはすべてSuperArrayのプライマーであった。
【０４３７】
オステオカルシン/ヒドロキシアパタイト(HA)結合アッセイ。1月齢マウス、肥満患者由来の血清、またはワルファリン処理した骨芽細胞培養物の上清をHAスラリーに追加して25mgスラリー/mlの最終濃度を達成した。15分(マウス血清、上清)または30分(ヒト血清)後に、HAビーズを遠心分離によってペレットにし、HA結合オステオカルシンを0.5Mリン酸ナトリウムバッファー、pH 8.0を用いて溶出させた。溶出液および初めの試料中に存在するオステオカルシンをIRMAによって測定した。値は、初めのオステオカルシン含有量に対するHA結合オステオカルシンの百分率を表す。Hauschka, P.V.ら、Physiol Review 69、990〜1047頁(1989年)。
【０４３８】
統計分析。結果は、平均値±平均値の標準誤差を示す図2Bおよび5F以外においては平均値±標準偏差として示す。統計分析は、独立両側スチューデントt検定またはANOVA検定、その後、事後分析を使用して行った。p値<0.05は有意であるとみなされ、他に示さない限りすべての図で星印によって示される。
【０４３９】
組換えオステオカルシン。組換えオステオカルシンは細菌によって生産し、標準の手順に従ってグルタチオンビーズ上で精製した。次いで、オステオカルシンはトロンビン消化を使用してGSTサブユニットから切断した。トロンビン混入は親和性カラムを使用して除去した。産物の純度はSDS-PAGEによって定性的に判断した。細菌はガンマカルボキシラーゼ遺伝子を有していない。したがって、細菌中で生産された組換えオステオカルシンは、3つの部位すべてで、常に完全に低カルボキシル化されている。オステオカルシンは、化学的に合成された場合にガンマカルボキシル化されないでオステオカルシンを作ることができるので、化学的に合成することを含む、当技術分野で知られている多くの方法で作ることができる。
【０４４０】
ヒトの研究。この研究により、Center of Research on Human Nutrition、Hotel-Dieu Hospital、Paris、France (PHRCプロトコールN°A0R076)で行われた臨床治験に参加している肥満および非肥満のコーカサス人の女性のグループを登録した。この研究はHotel-DieuのEthics Committees (Paris)によって承認された。すべての被検者から彼らのインフォームドコンセントを得た。被検者は、治験日前の少なくとも3か月間体重が安定していた。臨床的および生化学的パラメーターは朝(午前8:00)に絶食状態で判断した。
【０４４１】
組織学的検査。肝臓の凍結切片を低温包埋し、5μmで薄切し、オイルレッドOで染色した。脂肪組織および膵臓組織は、10%中性ホルマリン中で一晩固定し、パラフィン中に包埋し、5μmで薄切した。組織学的検査切片はヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)で染色した。免疫組織化学的検査は、ウサギ抗インスリン(SantaCruz、1:100)およびマウス抗Ki67(Vector、1:100)抗体およびABC Eliteキット(Vector)を使用して行った。視床下部の組織学的検査は記載されるように行った(Takedaら、2002年)。細胞のサイズまたは数を評価するために、5〜10枚の切片(それぞれ50マイクロメートル間隔)を、CCDカメラ(SONY)を装備したLeica社製顕微鏡で40×対物レンズを使用して分析した。画像はOsteomeasureソフトウェアを使用して処理した。ベータ細胞エリアは、全膵臓表面で割った、インスリン免疫染色についてポジティブな表面を表す。ベータ細胞量は、膵臓重量を掛けたベータ細胞エリアとして算出した。少なくとも3つのマウスを1条件当たりに分析した。前脛骨筋を、4%PFA/2%グルタルアルデヒド/0.1Mカコジル酸ナトリウムph7.3中で固定し、1%四酸化オスミウム中で後固定し、エポキシ樹脂(Epon)中に包埋した。超薄切片は、4%水性酢酸ウラニルおよび2分間Reynoldsのクエン酸鉛中で染色し、JEOL 2000FXを用いて検査した。マウス当たり10枚の電子顕微鏡写真をデジタル化し、それぞれの明確に区別可能なミトコンドリアのエリアをImageJソフトウェアを使用して分析した。15〜25個の個々のミトコンドリアを各遺伝子型の4匹のマウスで測定した。
【０４４２】
結果
Esp-/-マウスモデルの産生および周産期致死性。OST-PTPを研究するために、Espは、古典的方法(Esp-nLacZ)(Dacquinら、2004年)でおよびLoxP/Creレコンビナーゼ技術を使用して、ホスファターゼドメインをコードするエキソン24〜35を欠失させることによる骨芽細胞特異的様式(Espob-/-)(図22A)で破壊した。Espのフロックス化された対立遺伝子を持つマウスをα1(I)コラーゲン-Creマウスと交差させ(Dacquinら、2002年)、骨芽細胞特異的Esp欠損マウス(Espob-/-)を産生した(図22B)。サザンブロット分析は、骨芽細胞中のEsp遺伝子座で高頻度で組換えが生じたことを示した(図1C)。したがって、Esp発現は、Espob-/-骨芽細胞中でほぼ90%低下し、精巣、Esp発現の他の部位で影響を与えられなかった(図1D)。Esp発現は、脂肪細胞または膵臓ベータ細胞中で検出することができなかった(データ示さず)。これらのデータは、Espの骨芽細胞特異的不活性化が達成されたことを確証した。明確にするために、Esp-nLacZおよびEspob-/-マウスの両方を研究した場合、Esp-/-マウスを指すものとする。
【０４４３】
離乳時に分析すると、129Sv/EVまたはC57BL/6遺伝的バックグラウンドのEsp-/-マウスの相互交配は、わずか約25%のEsp-/-マウスしか産出しなかった(図1F)。この早期の出生後の致死性が骨格の発達の遅延によるものかどうかを決定するために、新生仔の野生型(WT)およびEsp-/-の子の骨格標本を染色した。この致死性を説明することができる骨形成の異常は検出されなかった(図22D〜22F)。実験は、Esp-/-の子の致死性が母性効果、おそらく体液性の異常によるものとなり得るかどうか決定するために行った。もしそれがそうであれば、ホモ接合突然変異体の母親から生まれた突然変異体の子は、ヘテロ接合の母親から生まれた子よりも高頻度で死ぬはずである。それがまさに観察された。Esp+/-の母親から生まれたEsp-/-の子の致死性は15%に達しなかったが、Esp-/-の母親から生まれた35%までのEsp-/-の子は離乳前に死んだ(図1F)。これらのデータは、Esp-/-の子の致死性が部分的に母性効果によって引き起こされたことを示す。
【０４４４】
Esp-/-マウスでのベータ細胞増殖およびインスリン分泌の増加。Esp-/-マウスの周産期致死性を担う母性効果が体液性の異常によって引き起こされたかどうかを決定するために、代謝パラメーターを乳摂取の前に新生仔の子で測定した。Esp-/-の子は、遺伝的バックグラウンド、性別、および行った欠失の種類にかかわらず、わずか1つの異常:血糖レベルの3分の1への低下しか示さなかった(図1G)。何匹かの突然変異体の子では、血糖レベルは、検出するには低すぎた。それほど重症ではないとはいえ、血糖レベルの有意な減少はまた給餌の後の1および3月齢のEsp-/-マウスでも観察された(図1G)。この低血糖症は、新生仔、1および3月齢の餌を与えたEsp-/-マウスでの著しい高インスリン血症によって説明された(図1H)。他方では、グルカゴン、膵臓ベータ細胞によって分泌されたホルモンの発現は正常であり(図23B)、したがって、Esp突然変異がベータ細胞に特異的に影響を与えることを示した。
【０４４５】
Esp-/-マウスでインスリン分泌に増加があったことをより堅固に確証するために、腹腔内(IP)グルコース刺激インスリン分泌試験(GSIS)を1および3月齢で行った。これらのアッセイは、OST-PTPの欠如によってインスリン分泌が高められたことを示した(図1Hおよび1L)。インスリン分泌のこの増加がどのように糖負荷を解決するための能力に影響を与えるかを判断するために、耐糖能試験を、一晩の絶食の後のグルコース(2g/体重kg)のIP注射後に行った(GTT)。これらの試験は、1および3月齢のEsp-/-マウスがグルコースにWTマウスよりも有意に高い耐性を有したことを明らかにした(図1J)。
【０４４６】
組織学的および免疫化学的分析は、Esp-/-膵臓中での膵臓インスリン含有量、島の数、島のサイズ、および全体的なベータ細胞量の増加を示した(図1Kおよび1L)。TUNEL分析によりいかなる異常アポトーシスも検出されず、5日齢の子(P5)および1月齢マウスで行ったKi67免疫染色は、ベータ細胞増殖がEsp-/-マウスで60〜300%増加したことを示した(図1M)。これらのデータは、骨芽細胞中で発現したOST-PTPがベータ細胞増殖を制御する経路に影響を及ぼすことを実証する。
【０４４７】
Esp-/-マウスでのインスリン感受性の増加。糖負荷を解決するためのEsp-/-マウスの高められた能力が、インスリン感受性の増加に対する二次的なものであったかどうかを決定するために、インスリン耐性試験(ITT)を行った。IPインスリン注射後の血糖レベルの低下によって定義されるインスリン感受性は、WTマウスと比較して1および3月齢のEsp-/-で有意に増加した(図2A)。したがって、脂肪(PPARα、PPARγ)、肝臓(Foxa2、PPARα)、および骨格筋(Pgc-1α、Nrf-1、Mcad)のインスリン感受性の分子マーカーの発現もまた、WTマウスと比較してEsp-/-で顕著に増加した。Pepck発現はEsp-/-肝臓中で減少し、糖新生がこの器官中で阻害されたことを示した(図2E)。これらの分子のイベントの結果として、エネルギー消費量がEsp-/-マウスで増加したことが推測された(図2G)。すべての分析で、ヘテロ接合Esp+/-マウスはそれらのWT同腹仔として特性を示した。
【０４４８】
実験データは、Esp(OST-PTP)不活性化が新生仔の子で低血糖症、潜在的に致死遺伝子症を引き起こし、これは、インスリンの分泌および感受性の増加と関連していることを示す。これらの異常がEsp-nLacZ-/-およびEspob-/-マウスの両方で同じ程度まで観察されたことは、代謝の表現型を担うのは他の細胞または組織中でではなく骨芽細胞中で発現したEsp遺伝子であることを確証した。
【０４４９】
1および3月齢Esp-/-マウスは他の表現型の異常を呈した。それらの脂肪パッドは、それらのWT同腹仔よりも有意に軽かった(図2F)。血清トリグリセリドレベルもまたWTマウスでよりもEsp-/-マウスで低かった(図2H)。Espは脂肪中で発現せず、食物摂取量はEsp-/-マウスで正常であるので(図23H)、体脂肪量のこの減少はインスリン感受性の増加に対する二次的なものである。脂肪細胞はWTマウスよりもEsp-/-マウスで少なかったが(WT、93.2±10.7x103脂肪細胞/脂肪パッド(n=5);Esp-/-、37±5.1×103脂肪細胞/脂肪パッド(n=3))、それらはより大きかった(図21)。この表現型を理解するために、複数の分子マーカーの発現を研究した。C/EBPα、Srebp1c、脂肪酸シンターゼ(FAS)、およびリポタンパク質リパーゼ(LPL)はEsp-/-およびWTの脂肪細胞中で同様に発現し、脂肪生成、脂質生成、および脂肪取り込みは突然変異によって明白には影響を与えられなかったことを示した(図2J)。対照的に、インスリン感受性の分子マーカー(PPARγおよび脂肪酸化のレギュレーターPPARα)の発現は増加し、したがって、脂肪を蓄積せずにインスリン感受性を高めることを説明した。さらに、2つの抗脂肪分解タンパク質、ペリリピンおよびトリグリセリドリパーゼ(TGL)の発現は、WT脂肪細胞と比較してEsp-/-で顕著に減少し(図2J)、脂肪分解がEsp-/-マウスで阻害されることを示した。したがって、遊離脂肪酸の血清レベルは、WT同腹仔でのように、Esp-/-マウスで一晩の絶食後に増加しなかった(図2K)。インスリン感受性の増加および脂肪細胞からの脂肪放出の阻害を伴う脂肪酸化の組み合わせは、協同して、Esp-/-マウスで大きな脂肪細胞を伴う低度の脂肪蓄積の表現型の観察をもたらした。インスリンは脂肪分解の効力がある阻害薬であるので、これらの結果はEsp欠損マウスでのインスリン分泌の増加と一致している。
【０４５０】
Esp-/-マウスでのアディポネクチン発現の増加。実験は、Esp-/-マウスで観察されたインスリン感受性の増加のための体液性の主成分があったかどうかを決定するために行った。インスリン抵抗性を媒介するアディポカインであるレジスチンの発現および血清レベルはEsp欠失によって実質的に影響を与えられなかった。インスリン抵抗性改善ホルモンであるレプチンについて同じことが言えた(FriedmanおよびHalaas、1998年、Steppanら、2001年)(図2Lおよび23K)。この後者の観察は、食物摂取量がEsp-/-マウスで正常であったという事実と一致している(図23H)。対照的に、インスリンへの感受性を高めることができるアディポカインであるアディポネクチンの発現および血清レベル(Yamauchiら、2001年)は、それらの性別および遺伝的バックグラウンドにかかわらず、出生、1、および3月齢にEsp-/-マウスで3および2倍それぞれ増加した(図2Lおよび23M)。したがって、アシルCoAオキシダーゼ、PPARα、およびUcp2等のアディポネクチン標的遺伝子の発現はEsp-/-マウスで増加したことが観察された(図2N)(KadowakiおよびYamauchi、2005年)。アディポネクチンの発現および血清のレベルのこの増加は、Esp-/-マウスで観察されたインスリン感受性の増加を説明するための1つのメカニズムを提供する。
【０４５１】
要約すると、Esp不活性化は、脂肪蓄積の減少と共に、末梢組織中での膵臓ベータ細胞増殖の増加、高められたインスリン分泌、およびインスリン感受性の改善の結果として低血糖症を引き起こした。これらの異常がEsp-nLacZ-/-およびEspob-/-マウスの両方で観察されたといったことは、骨格が骨芽細胞を介してグルコースホメオスタシスを制御することに関連することを実証した。
【０４５２】
Esp-/-マウスは肥満症および耐糖能障害から防御される。Esp-/-マウスを特徴づけるインスリンの分泌および感受性の増加は、これらの突然変異マウスを肥満症および糖尿病から防御することができるといった見込みを強めた。Esp-nLacZ-/-およびEspob-/-は同一の代謝および分子の異常を示した。いくつかの実験では、一方または他方のモデルのみを試験したので、明確にするために、我々はこの場合、Esp-/-を指すこととする。
【０４５３】
最初に、金チオグルコース(GTG)を1月齢マウスに注射して、視床下部腹内側部中に特異的病変を誘発させた(Brecherら、1965年)。予想通り、GTGは、WTマウスおよびEsp-/-マウスの両方で視床下部腹内側部病変(図24)および過食症(図3A)を誘発した。注射の3か月後に分析すると、GTG処理WTマウスは肥満となり、それらの脂肪パッド量および血清トリグリセリドレベルは有意に増加していた。GTTおよびITT分析は、耐糖能障害およびインスリン抵抗性もまた増加していたことを示した(図3E〜3F)。対照的に、GTG処理Esp-/-マウスは肥満ではなく、PBS処理WTマウスに類似した脂肪パッド量および血清トリグリセリドレベルを有し、それらは耐糖能障害またはインスリン非感受性の証拠を呈しなかった(図3E〜3F)。
【０４５４】
次に、1月齢のWTマウスおよびEsp欠損マウスに6週間高脂肪食(HFD)(58%脂肪kcal)を与えた。体重は、この6週間の期間の終了時にWTマウスよりもEsp-nLacZ-/-マウスで有意に低かったことが分かった(図3G〜3I)。耐糖能試験(GTT)は、6週間HFDを与えた後、Esp-nLacZ-/-マウスは、グルコースに対する正常な耐性を保ち、ITTによって決定したインスリン感受性は正常なままであったことを実証した。対照的に、これらのパラメーターは高脂肪食(HFD)を与えたWTマウスで変化した。
【０４５５】
インスリン感受性の増加が膵臓ベータ細胞不全からEsp-/-マウスを防御することができるかどうかを決定した。その目的のために、マウスにストレプトゾトシン(STZ)を注射して、2型糖尿病で見られるようなベータ細胞中の酸化ストレスおよび細胞死を引き起こした(Le Mayら、2006年)。STZ処理は、両方の遺伝子型で膵臓インスリン含有量およびインスリン血清レベルを顕著に減少させた(図3Jおよび3K)。STZ注射の8日後に、7匹のSTZ処理WTマウスのうちの3匹が死に、生存するマウスはすべて、500mg/dlより上の血清グルコースレベルを有した(図3Lおよび3M)。他方、1匹のSTZ処理Esp-/-マウスのみがこの期間の間に死に、生存するマウスの血糖レベルは250mg/dlを超えなかった。STZ処理WTマウスとは異なり、グルコースはSTZ注射Esp-/-マウスの尿中に検出することができなかった(図3N)。STZ処理したWTマウスおよびEsp-/-マウスの両方は島インスリン含有量が大幅に減少していたので、STZ処理Esp-/-マウスでの明白な糖尿病表現型の欠如は、インスリン感受性のそれらの増加がインスリン分泌のそれらの増加とは無関係に生じたことを示した。これらの結果は、Esp機能(OST-PTP)がマウスの肥満症および耐糖能障害の発症に必要とされることを確証する。
【０４５６】
Espは、骨芽細胞分泌分子の生物学的活性に影響を及ぼす。次の問題は、Espが、骨芽細胞中でのその発現を通して、どのようにインスリンの分泌および感受性を制御することができたかであった。細胞ベースのアッセイは、OST-PTP細胞外ドメインを、ホスファターゼドメインとは無関係に、切断することができた、分泌することができた、または発現させることができたといった証拠を提供しなかった。したがって、Espを通常発現しないCOS細胞を、完全長フラグタグ付きOST-PTPまたはそのフラグタグ付き細胞外ドメインのみを発現するベクターで形質移入した。細胞は、当技術分野でよく知られている標準のリン酸カルシウム法を使用して形質移入した。実験の終了時に、上清を収集し、細胞を溶解させ、上清および細胞溶解物の両方をOST-PTPの存在についてアッセイした。次いで、細胞溶解物または細胞上清を使用してウエスタンブロット分析を行った。組換え完全長または切断タンパク質は、細胞溶解物中に検出されたが、上清中には全く検出されず、OST-PTP細胞外ドメインは細胞によって通常分泌されないことを示した。抗体は、これらの実験を行うことができるようにOST-PTP細胞外ドメインに対して作った;本発明のある実施形態は、この抗体およびOST-PTP細胞外ドメインに結合する他の抗体を対象とする。OST-PTP細胞外ドメインは、細胞膜の内側に隔離されていないので、抗体に接触可能である。OSTの膜貫通ドメインに対する抗体もまた存在する。これらの抗体は両方ともポリクローナルであり、OST-PTPを阻害するために動物に投与し、それによってオステオカルシン活性を増加させることができ、これは、順に、脂肪細胞からのアディポネクチンの産生および分泌を増加させ、これは、順に、インスリンの産生および感受性を増加させる。もちろん、モノクローナル抗体も同様に使用することができる。
【０４５７】
OST-PTP機能をさらに研究するために、骨芽細胞中で完全長OST-PTPまたはその細胞外ドメインのみを発現する遺伝子導入マウスを産生し、分析した。ベータ細胞増殖の減少、より低いベータ細胞量、摂食状態での低インスリン血症、およびグルコースに応じたインスリン分泌障害を呈した、骨芽細胞中で完全長Esp cDNAを選択的に過剰発現する遺伝子導入マウスを作った(アルファ1(I)-OST-PTPマウス)(図4A〜C)。それらはまたより低いアディポネクチン血清濃度をも示した(図4B)。その結果として、アルファ1(I)-OST-PTPマウスは、通常の固形飼料での高血糖症、耐糖能障害、およびインスリン抵抗性を発症した(図4B、4D、および4E)。Esp-/-マウスで観察されたものの鏡像であるこの表現型は、完全長OST-PTPを過剰発現する遺伝子導入マウスで観察されるのみであるという事実は、OST-PTPのホスファターゼ活性が、グルコースホメオスタシスに影響を与えるのに必要とされることを示す。さらにこれらのマウスが骨芽細胞中でEspを過剰発現したという事実は、OST-PTPは、順にグルコースホメオスタシスを制御する、骨芽細胞由来の分泌分子の生物活性を制御するといった結論をさらに支持する。対照的に、OST-PTP細胞外ドメインのみを発現するアルファ1(I)コラーゲン-Espsdマウスはいかなる性質のエネルギー代謝異常をも有していなかった。OST-PTPホスファターゼドメインが活性ドメインであるという十分に記載された事実と合わせたこれらの結果により、OST-PTPがインスリン分泌およびアディポネクチン発現を制御するのは、細胞外ドメインを通してではなく、ホスファターゼドメインを通してであるということが示され、OST-PTPは、骨芽細胞中でのその発現を介してエネルギー代謝の制御に作用することがさらに確認される。
【０４５８】
OST-PTP細胞外ドメインを発現し、全身循環の中にそれを放出するアポリポタンパク質E-OST-PTPEC遺伝子導入マウスもまた産生した。アポリポタンパク質Eプロモーターは、肝臓細胞中でのEsp発現を指示して、それによって、全身循環の中へのOST-PTP細胞外ドメインの放出を引き起こすために使用した。これらの遺伝子導入マウスは、野生型マウスと区別不能であり、OST-PTPが骨芽細胞中でその細胞内ホスファターゼドメインを通してエネルギー代謝をおよびその発現を制御することをさらに証明した。
【０４５９】
骨芽細胞が、膵臓ベータ細胞および脂肪細胞に作用する因子を分泌することをさらに証明するために、付着細胞である骨芽細胞を非付着細胞である膵島または脂肪細胞と共培養した。WTマウスから単離した島との分化したWT骨芽細胞の共培養は、島中のインスリン発現を40%増加させた(図4F)。Esp-/-マウスで観察されたインスリン分泌の増加と完全に一致して、Esp-/-骨芽細胞はインスリン発現をさらに高めた(図4F)。骨芽細胞または線維芽細胞はまた脂肪細胞とも共培養した。線維芽細胞ではなくWT骨芽細胞がアディポネクチンの発現を増加させ、Esp-/-骨芽細胞は、アディポネクチン発現を高めるのにWT骨芽細胞の2倍効力があった(図4G)。このアッセイでは、アディポネクチンは発現が影響を与えられた唯一のアディポカインであった(図4G)。Esp-/-の島または脂肪細胞と共培養したWT骨芽細胞を使用するコントロール実験は、WT島または脂肪細胞を使用した場合に見られる増加と同じインスリンおよびアディポネクチンの発現の増加を示した(図4H)。
【０４６０】
骨芽細胞は分泌分子(複数可)の放出を介してインスリンおよびアディポネクチンの発現に影響を及ぼすことを確証するために、さらなる実験を行った。最初に、骨芽細胞は、細胞間接触を予防するフィルターを使用して島または脂肪細胞と共培養した。次に、島および脂肪細胞を初代骨芽細胞培養物の上清の存在下で共培養した。両方の場合で、インスリンおよびアディポネクチンの発現での有意な増加が観察された(図4Iおよび4J)。まとめると、これらのデータは、骨芽細胞中で発現したEspは、ベータ細胞および脂肪細胞中でのインスリンおよびアディポネクチンの発現に影響を与える分泌分子の発現または活性を制御することを示す。
【０４６１】
オステオカルシンは、増殖、インスリン分泌、およびインスリン感受性を増加させる骨芽細胞由来の分泌分子である。グルコースホメオスタシスを制御する骨芽細胞によって分泌される分子を同定するために、エネルギー代謝パラメーターを、血清中に存在する骨芽細胞特異的分泌分子であるオステオカルシンを欠く突然変異マウス株で分析した。初めの研究では、oc-/-マウスが、それらの産生に際して、異常に肥満であったことが観察された。DucyらNature 1996年、本明細書に参照によって組み込まれる。当時は、なぜこれらの動物がそれほど肥満であったのかについての説明はなかったので、したがって、これらのマウスの肥満症の外観は観察されていたが、公開されなかった。ホモ接合株(Oc-/-)およびヘテロ接合株(Oc+/-)を作った。
【０４６２】
オステオカルシンは、骨芽細胞によって作られる主要な非コラーゲン性タンパク質のうちの1つであり、また骨芽細胞特異的分子でもある。ペプチドホルモンを含む多くの分泌タンパク質のように、オステオカルシンはプレプロオステオカルシンとして産生され、分泌される前に細胞質中で切断および翻訳後修飾を受ける。加えて、オステオカルシンは、いくつかのグルタミン酸残基がガンマカルボキシラーゼによってカルボキシル化されて、gla残基を形成するglaタンパク質のファミリーに属する。したがってオステオカルシンの他の名称は骨glaタンパク質(BGP)である。Gla残基は、ミネラルイオンへの高度な親和性をglaタンパク質に付与する。
【０４６３】
オステオカルシン-/-マウスはWTマウスよりも高い血糖およびより低いインスリンの血清レベルを有した(図5Aおよび5B)。GSIS、GTT、ならびにITTによって分析したインスリンの分泌および感受性ならびに耐糖能はすべて、エネルギー消費量のようにオステオカルシン-/-マウスで減少した(図5C〜5Eおよび5G)。したがって、インスリン作用に関連する遺伝子の発現は骨格筋および肝臓中で減少したが、Pepck発現は増加した(図5H)。島のサイズおよび数、ベータ細胞量、膵臓インスリン含有量、ならびにインスリン免疫活性はすべて、オステオカルシン-/-マウスで顕著に減少した(図5I)。Ki67免疫染色によって測定したベータ細胞増殖は、P5子のおよび3月齢のオステオカルシン-/-膵臓中で2分の1に減少した(図5I)。ベータ細胞増殖、インスリン分泌、および感受性のこの著しい減少に伴って、脂肪パッド量、脂肪細胞数(WT、93.2±10.7×103脂肪細胞/脂肪パッド(n=5)、オステオカルシン-/-、125.6±10.6×103脂肪細胞/脂肪パッド(n=3))、ならびに血清トリグリセリドレベルが増加した(図5Jおよび5K)。アディポネクチンの発現および血清レベルは、WTマウスよりもオステオカルシン-/-マウスで有意に低く、とりわけそれらの脂肪パッド量の増加に注目したが、他のアディポカインの発現は影響を与えられなかった(図5Lおよび5M)。アディポネクチン作用の分子標的の発現はオステオカルシン-/-マウスで減少した(図5N)。しかしながら、オステオカルシン+/-マウスはWT同腹仔と区別がつかなかった(データ示さず)。マウスアディポネクチンのcDNA配列は配列番号8であり、それはまたアミノ酸配列番号9によっても同定される。ヒトアディポネクチンのcDNA配列は配列番号6であり、それはまたアミノ酸配列番号7によっても同定される。
【０４６４】
オステオカルシンは、インスリンおよびアディポネクチンの発現に影響を与える、骨芽細胞によって分泌される分子であることを実証するために、さらなる共培養実験を行った。WT骨芽細胞とは異なり、オステオカルシン-/-骨芽細胞は、島および脂肪細胞中のインスリンおよびアディポネクチンの発現をそれぞれ高めなかった(図5Oおよび5P)。逆の実験では、COS細胞中でのオステオカルシンの発現の上昇は、これらの細胞が島中でのインスリン発現および脂肪細胞中でのアディポネクチン発現を増加させることを可能にした(図5Q)。オステオカルシンを発現しないWT未成熟骨芽細胞(Ducyら、2000b)を、島または脂肪細胞と共培養した。これらの細胞はインスリンまたはアディポネクチンの発現を誘発しなかった(図5R)。まとめると、これらのデータは、オステオカルシンが、インスリンおよびアディポネクチンの発現を制御する、分化した骨芽細胞によって分泌される分子であることを示す遺伝的および細胞性の証拠を提供する。
【０４６５】
オステオカルシンはアディポネクチンを通してインスリン感受性を制御する。インスリンおよびアディポネクチンが、共に、互いに無関係に、オステオカルシン-/-マウスの代謝表現型の一因となるかどうか決定するために、関連する2つの問題が出された。第1に、オステオカルシンは、アディポネクチン発現を、インスリン分泌に対するその作用とは無関係に制御するのか、そうであれば、オステオカルシン-/-マウスで注目されたアディポネクチン発現の減少はインスリン感受性の減少について説明するのか。両方の仮説が正しい場合、複合ヘテロ接合体オステオカルシン+/-;アディポネクチン+/-マウスは、オステオカルシン-/-またはアディポネクチン-/-マウスで観察されたものに類似して、WT同腹仔よりもアディポネクチンの発現が低いはずであり、インスリン感受性の減少を示すはずである(Maedaら、2002年)。ある実施形態はこれらのヘテロ接合遺伝子導入株を対象とする。
【０４６６】
図6A〜Dに示されるように、インスリン感受性は、オステオカルシン+/-;アディポネクチン+/-マウスで顕著に減少したが、GSIS試験によって決定される血糖レベル、インスリン血清レベル、およびインスリン分泌は正常範囲内のままであった。アディポネクチン血清レベルもまた、WTまたは単一のヘテロ接合体マウスと比較して、オステオカルシン+/-;アディポネクチン+/-で有意に減少した(図6E)。これらの観察は、オステオカルシンが、アディポネクチンの発現および分泌のその制御を通して、少なくとも部分的にインスリン感受性を制御するという考えと一致している。
【０４６７】
Esp欠損マウスで観察されたインスリン感受性の増加および脂肪重量の減少が、アディポネクチン発現の増加に対する二次的なものであったことを示すために、Esp欠損マウスで観察されたものに類似して、血清アディポネクチンレベルが2倍増加したSap-アディポネクチン遺伝子導入マウスを産生した。Sap-アディポネクチン遺伝子導入マウスはまた、Esp欠損マウスで観察されたものに類似した低い脂肪パッド重量、高いエネルギー消費量の表現型、ならびにインスリン感受性の増加の代謝的および分子的証拠を示した(図22)。この結果は、アディポネクチン発現の増加が、Esp欠損マウスでのインスリン産生および感受性の増加の主な識別可能な原因であったことを示す。したがって、本発明のある実施形態は、細胞にアディポネクチンを過剰発現させるプロモーターのコントロール下のアディポネクチンについての遺伝子で形質移入したヒト細胞を対象とする。
【０４６８】
OST-PTPは、オステオカルシン生物活性を、そのカルボキシル化に間接的に影響を及ぼすことによって制御する。オステオカルシン-/-マウスの代謝表現型はEsp-/-マウスで観察されたものの鏡像であり、後者では、オステオカルシン活性の増大があることを示唆する。Esp欠損マウス(OST-PTP-/-)がオステオカルシンの活性の増大のモデルであることをさらに証明するために、二重突然変異体を、Esp欠損遺伝子導入マウスの中にさらなる突然変異を導入することによって、特にそれらをオステオカルシン+/-にすることによって作った。
【０４６９】
Esp-/-マウスの代謝異常がオステオカルシン発現を低下させることによって可逆性となるであろうということが仮定された。これはまさに観察された:オステオカルシンの一方の対立遺伝子を欠くEsp-/-マウスは、血糖、インスリンおよびアディポネクチンの血清レベル、耐糖能、インスリンの分泌および感受性等のそれらのすべての代謝異常の著しい逆転を示した(図7A〜F)。Ki67染色は、ベータ細胞増殖もまたこれらの突然変異マウスで低下したことを示した(図7G)。
【０４７０】
確かにEsp-/-;Ocn+/-マウスは、いかなるオステオカルシン欠失をも有していないEsp-/-と比較して、インスリンの合成および感受性の減少を呈し、Esp-/-マウスのすべての代謝異常がwtマウスと比較して完全に直された/正常化されたことを示した。この実験は、OST-PTPおよびオステオカルシンは同じシグナル伝達カスケードにあるということならびにEspob-/-マウス表現型はオステオカルシンの活性の増大のモデルであるということを遺伝的に確証した。言い換えれば、Espob-/-マウスで見られた代謝表現型はオステオカルシン活性の増加によるものである。
【０４７１】
オステオカルシンの発現および血清レベルはEsp-/-マウスで正常であったので、オステオカルシン発現のOST-PTP制御は除外した(図20)。対照的に、Esp-/-マウスは、全オステオカルシンに対する血清カルボキシル化オステオカルシンの比の減少を示した(図7H)。カルボキシル化オステオカルシンは、低カルボキシル化オステオカルシンよりもヒドロキシアパタイト(HA)に対して高い親和性を有する(Hauschkaら、1989年、Price、1989年)。カルボキシル化オステオカルシンをヒドロキシアパタイト(HA)に結合することができる、全オステオカルシンのうちの%として測定するアッセイを使用した。このアッセイは、この値が、wtマウスと比較してEsp-/-マウスで20%減少したことを示した。等量の全オステオカルシンの存在下で、これは、低カルボキシル化オステオカルシンはWTと比較してEsp-/-マウスで20%増加することを意味する。
【０４７２】
この実験は、OST-PTPが、ガンマカルボキシル化のその程度を制御することによってオステオカルシンの機能に影響を及ぼすことおよびグルコースホメオスタシスを制御したのはオステオカルシンの低カルボキシル化形態であったことを示唆した。これがその場合であったかどうかを決定するために、2つのさらなる実験を行った。WT初代骨芽細胞を、共培養アッセイ前におよびその間に、ガンマカルボキシル化の阻害薬であるワルファリンで処理した(Bergner、2005年)。この処理は、HAに結合したオステオカルシンの百分率の著しい減少をもたらし、予想通り、これらの骨芽細胞は、より少ないカルボキシル化オステオカルシンを分泌したことを示した(図7I)。それにもかかわらずおよびWT骨芽細胞よりも少ないオステオカルシンを分泌するにもかかわらず(+賦形剤、10ng/ml;+ワルファリン、2ng/ml)(Hauschkaら、1989年)、ワルファリン処理した骨芽細胞は、賦形剤処理した骨芽細胞よりも有意に高い程度までアディポネクチン発現を誘発した(図7J)。次に、カルボキシル化オステオカルシンおよびカルボキシル化されていない細菌によって生産されたマウスオステオカルシンを細胞ベースのアッセイで使用した。カルボキシル化オステオカルシンはアディポネクチン発現を誘発しなかったが、細菌によって生産されたオステオカルシンは誘発した(図7K)。同様に、低カルボキシル化オステオカルシンは、インスリン発現およびベータ細胞増殖の分子マーカーであるサイクリンD1の発現を誘発した(Kushnerら、2005年)(図7L)。結局、我々は、糖尿病ではないが高インスリン血症であるヒト肥満患者を研究した(図7M)。非カルボキシル化オステオカルシンの量はこれらの患者で有意に増加していたが、オステオカルシン血清レベルは影響を与えられていなかった(図7M〜O)。まとめると、これらのデータは、OST-PTPが、オステオカルシン生物活性に、カルボキシル化のその程度を高めることによって影響を及ぼすことを示す。
【０４７３】
OST-PTPは、カルボキシル化プロセスに関連する酵素に影響を与える。あらゆる細胞型のすべての機能で必須のイベントは、プロテインキナーゼによってリン酸化されるおよび/またはタンパク質ホスファターゼによって脱リン酸される細胞内タンパク質の能力となる。特に、チロシン残基のリン酸化は、全細胞ホスホアミノ酸含有量の0.1%を占め、その結果として、タンパク質チロシンホスファターゼ(PTP)は極めて重要な細胞内タンパク質となる(23)。
【０４７４】
タンパク質チロシンホスファターゼは概略的に4つのクラスに分類することができる:時に切断される細胞外ドメインを有する古典的な受容体様PTP(RPTP);OST-PTPは受容体様PTPである。他のクラスは、古典的な非受容体PTP、二重特異性PTP、および低分子量PTPを含む(24)。ヒトゲノムの中には約20種のRPTPがある。形質膜中に主に局在するRPTPは、細胞間機能、細胞間接着、およびホルモンシグナル伝達に関連し得る。しかしながら、2つの問題が、それらの生物学に関して答えのないままであることが多い。1つは、それらのホスファターゼ活性に対する基質(複数可)の同一性を決定することであり、第2はそれらのリガンドを同定することである。
【０４７５】
結果は、OST-PTPが骨芽細胞中に存在する特異的基質を脱リン酸し、それによってその基質の発現および/または活性を増加させることができたことを示唆した。次いで、この基質は骨芽細胞によって放出され、膵臓ベータ細胞および脂肪細胞にシグナル伝達し、それによってインスリンの分泌および感受性に影響を与えると思われる。オステオカルシンは生理学的に述べるとOST-PTPについての論理的な標的候補であったが、オステオカルシンはリン酸化されない。したがってそれは直接的な標的としては排除した。
【０４７６】
OST-PTPはどのようにしてオステオカルシン活性に影響を及ぼすかをはっきりさせるために、我々は、それが、この分子について知られている主な翻訳後修飾であるオステオカルシンのガンマカルボキシル化を制御しているかどうかを問うた(Hauschkaら、1989年)。この翻訳後修飾はげっ歯動物およびヒトで生じる。Poserらは、ヒトオステオカルシンの一次構造を分析し、ヒトオステオカルシンが、17位がグルタミン酸であるGlu7オステオカルシン(本明細書で「Oc-glu」)および17位がガンマカルボキシルグルタミン酸であるGla7オステオカルシン(本明細書で「BGP」、また骨Glaタンパク質)の混合物であると報告した[Poser, J. W.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.、255、8685〜8691頁(1980年)]。Gla残基は、通常、ミネラルイオンへの高度な親和性をタンパク質に付与する。しかしながら、機能損失および獲得実験は、in vivoでの細胞間マトリックス石灰化でのオステオカルシンについての機能の同定に失敗した(Ducyら、1996年、Murshedら、2004年)。
【０４７７】
OST-PTPの基質はインスリン受容体およびガンマカルボキシラーゼを含む。コンピュータ調査は、ビタミンK依存性のガンマグルタミルカルボキシラーゼとしても知られているガンマカルボキシラーゼがPTPコンセンサス部位を有することを明らかにした。この酵素は、オステオカルシンのような基質タンパク質中でのグルタミン酸のガンマカルボキシルグルタミン酸への変換を触媒する。OST-PTPがガンマカルボキシラーゼに作用するかどうか決定するために、基質捕捉実験を、COS細胞、Ros17/2.8骨芽細胞、および分化した初代骨芽細胞で行った。d10骨由来細胞を、アスコルビン酸(100マイクログラム/ml)およびベータグリセロリン酸(5mM)を補充したアルファMEM/10%ウシ胎児血清(FBS)中で10日間培養した。次いで、これらの細胞を、1%FBSのみを補充したアルファMEM培地中で24時間飢餓状態にさせ、30分間、過バナジン酸(100mM)、不可逆性のタンパク質チロシンホスファターゼ阻害薬、および20%FBSを用いて処理した。細胞溶解物をGST、GST-PTPWT、またはGST-PTPD1316Aと4℃で2時間インキュベートした。異なる量の全細胞抽出液もまたコントロールとして添加した。
【０４７８】
図9の結果は、突然変異体酵素GST-PTPD1316Aはガンマカルボキシラーゼを捕捉し、それによって、ガンマカルボキシラーゼがOST-PTPの基質であることを実証したことを示した。しかしながら、これは、ガンマカルボキシラーゼがOST-PTPの唯一の基質であることを意味しない。PTPが形質移入されていないので、GSTレーンに結合はなかった。それは、捕捉がある場合に、捕捉があらゆるGST融合タンパク質のGST部分によるものではないことを示すためのコントロールとする。GST-PTPWTは基質ガンマカルボキシラーゼを脱リン酸し、次いでガンマカルボキシラーゼは放出されるので、この形態との捕捉もまたなかった。突然変異により、基質が酵素に不可逆的に結合し、かつ酵素によって保持されることを可能にするOST-PTPホスファターゼ活性の欠損を工学技術で作ったので、バンドは、突然変異体GST-PTPD1316Aを有するレーンで明確に見られる。
【０４７９】
これらの結果は、ガンマカルボキシラーゼが骨芽細胞中のOST-PTPについての基質であることを示す。これは、OST-PTPがオステオカルシン生物活性を制御し、OST-PTPがガンマカルボキシラーゼを脱リン酸し、それによってそれを活性化する生化学的経路の一部の解明を可能にした。活性化されたガンマカルボキシラーゼは、順に、カルボキシル化オステオカルシンの増加を引き起こす。OST-PTP欠損マウスでは脱リン酸された活性ガンマカルボキシラーゼはより少なく、これは、より多くの低カルボキシル化オステオカルシンの分泌をもたらす。これは、なぜOST-PTP欠損マウスが上昇したレベルの低カルボキシル化オステオカルシンを有するかについて説明し、それ自体は、代謝症候群および糖尿病に対する抵抗性を引き起こす。
【０４８０】
同じ基質捕捉アッセイを使用して、骨芽細胞中で発現するインスリン受容体はOST-PTPについての基質であることもまた発見された(図8)。基質捕捉実験の結果は、突然変異したOST-PTP(GST-PTPDA)は、COS細胞(左側の上パネル)およびROS17/2.8細胞(右側の上パネル)(3番目のレーン)中で発現したインスリン受容体(InsR)と相互作用することを示す。対照的に、WT OST-PTP(GST-PTP WT)はインスリン受容体と相互作用しない(2番目のレーン)。同量のGST融合タンパク質を基質捕捉に使用した。
【０４８１】
ヒト患者データ。図7Oは、糖尿病患者ではないが、高インスリン血症であるヒト肥満患者は、たとえオステオカルシン血清レベルがほぼ同じでも(7M)、正常な患者と比較して、低カルボキシル化オステオカルシンのレベルが有意に上昇している(約30%高い)ことをを示す。これは、マウスおよびヒトで、オステオカルシンのカルボキシル化のレベルがその生物活性に影響を及ぼすことを示す。図7Oは、肥満の非糖尿病患者が、肥満の糖尿病の患者と比較して、低カルボキシル化オステオカルシンが増加していることをさらに示す。全オステオカルシンと比較したカルボキシル化オステオカルシンの比は、薬物治療されていない正常患者、肥満の非糖尿病患者、および肥満の糖尿病患者由来の血清中で測定した。
【０４８２】
血糖症に対する低カルボキシル化オステオカルシンの効果をモニターしたin vivo実験を行った。野生型マウスに、28日間、3つの異なる量のマウス組換え低カルボキシル化オステオカルシンまたはプラセボ(PBS)を皮下に注入した(0.3、1、および3ng/時)。プラセボを注入したコントロール動物と比較して、3用量の低カルボキシル化オステオカルシンはすべて28日間の期間にわたりin vivoで血糖症を減少させた(図10)。
【０４８３】
他のin vivo実験では、耐糖能に対する非カルボキシル化オステオカルシンの効果を調査した。野生型マウスに、グルコースの単一注射を受けさせる前に、14日間、0.3または3ng/時の用量の組換え非カルボキシル化オステオカルシンまたはPBSを皮下に注入した。血糖は、その後、示す時間に測定した。結果は、両方の用量の非カルボキシル化オステオカルシンがグルコース注射後の120分間の期間にわたりコントロールレベルよりも耐糖能を増加させたことを示す(図11)。
【０４８４】
インスリン感受性に対する非カルボキシル化オステオカルシンの効果もまた検査した。野生型マウスに、インスリンの単一注射を受けさせる前に、18日間、0.3または3ng/時の用量の組換えオステオカルシンまたはPBSを皮下に注入した。血糖は、その後、注射後の0〜120分間、示す時間に測定した。結果は、インスリン感受性が両方の用量の非カルボキシル化オステオカルシンによって増加したことを示す(図12)。
【０４８５】
他のin vivo実験では、体重および脂肪パッド量に対する非カルボキシル化オステオカルシンの効果をモニターした(図13)。野生型マウスに、0.3、1、または3ng/時のPBSまたは非カルボキシル化オステオカルシンを28日間皮下に注入した。結果は、体重が、非カルボキシル化オステオカルシンによってわずかに低下し、最も高い用量が最も有効であったことを示す。(図13)28日後に測定した生殖腺の脂肪パッド量は、3ng/時非カルボキシル化オステオカルシン処理で約18%減少した。他の用量は、その期間で脂肪パッド量を有意に減少させなかった。
【０４８６】
GTG誘発性肥満症に対する非カルボキシル化オステオカルシンの効果を調査した(図14)。野生型マウスに、過食症および肥満症を誘発するために金チオグルコース(GTG)をまたは賦形剤を注射した。2週目後に、28日間、1ng/時間の組換え非カルボキシル化オステオカルシンまたはPBSを注入する皮下浸透性ポンプをマウスに植え込んだ。体重増加は、検査した第1の時点、7日目までは両方の用量の非カルボキシル化オステオカルシンで有意に低下し、全28日間の期間コントロールよりも低いままであった。28日目に、体重は、非カルボキシル化オステオカルシン処理で約15%低下した。
【０４８７】
非カルボキシル化オステオカルシンの断片は生物学的に活性である。実験は、切断オステオカルシンが、in vitroでマウス脂肪細胞からアディポネクチン分泌を刺激する際に完全長非カルボキシル化オステオカルシンと同じくらい有効であったかどうかを試験するために行った。野生型脂肪細胞は、組換え完全長オステオカルシン(1〜46)もしくは切断形態(1〜36)(C末端からの最初の10個のアミノ酸の欠失を有する)または賦形剤を用いて4時間処理した。次いで、アディポネクチン発現はリアルタイムPCRによって定量化した。結果は、完全長非カルボキシル化オステオカルシンが約1.5倍の増加をもたらし、非カルボキシル化オステオカルシンの1〜36の断片が約1.8倍の増加をもたらしたことを示す(図15)。したがって、完全長分子は生物学的活性に必要とされず、少なくとも10個までのアミノ酸を、脂肪細胞およびベータ細胞に対する同じ生物学的効果を達成するためにマウスオステオカルシン分子のC末端から欠失させることができる。本発明のある実施形態は、C末端から最初の10個のアミノ酸を欠失させたオステオカルシン、好ましくはヒトオステオカルシン、好ましくは低カルボキシル化オステオカルシンを対象とする。
【０４８８】
オステオカルシンの一次配列は、種の中で高度に保存されており、それは、ヒト体内の10種の最も豊富なタンパク質のうちの1つであり(図21)、その機能が進化を通じて保存されていることを示唆する。重要なことには、保存された特徴は、17、21、および24位に3つのGla残基、Cys23およびCys29の間にジスルフィド架橋を含み、ほとんどの種は9位にヒドロキシプロリンを含有する。オステオカルシンのN末端は、分子の他の部分と比較して最も高い配列変異を示す。ヒトおよびマウスオステオカルシンの高度の保存は、健常なおよび病気の状態の両方で、ヒトについての動物モデルとしてのマウスの関連性を強調し、代謝症候群またはその構成要素および1型糖尿病を治療または予防するためのオステオカルシンの治療上のおよび診断上の使用に対する我々の主張を有効にする。
【０４８９】
ビタミンKおよびスタチンはオステオカルシンを増加させる。ビタミンKはガンマカルボキシル化に必要とされる。ワルファリンおよび他のCOUMADIN(登録商標)誘導体はビタミンK依存性のガンマカルボキシル化を遮断し、したがって、活性低カルボキシル化オステオカルシンのレベルを増加させる。これは、ワルファリン処理した骨芽細胞が、賦形剤処理した骨芽細胞と比較して、上昇したレベルの低カルボキシル化オステオカルシンを生産することを示すデータに一致している(図7I)。他には、ビタミンKを用いた骨粗鬆症患者の4週間の処理が、ビタミンK処理を用いていないコントロールと比較して、85%の低カルボキシル化オステオカルシンの劇的な百分率平均値の減少を引き起こしたことを示した。ビタミンDは、単独でまたはビタミンKと共に投与された場合に有意な効果を有していなかった。Takahashiら、Clinical Endocrinology (2001年) 54、291〜224頁。Sugiyama, T.、J Bone Miner Metabolism (2001年) 19、146〜159頁もまた参照されたい。この観察は、ビタミンK依存性のガンマカルボキシル化を遮断するためにワルファリンまたは他のCOUMADIN(登録商標)誘導体を使用することができ、代謝障害を予防する/治療することを目的に患者の低カルボキシル化オステオカルシンのレベルを増加させることができたことを示唆する。
【０４９０】
商品名COUMADIN(登録商標)として販売されているワルファリンは、凝固因子の合成を阻害し、したがって、血餅形成を予防する経口抗凝固薬として使用されている。しかしながら、COUMADIN(登録商標)は、出血および皮膚の壊死(壊疽)を引き起こし得る。多くの薬剤、処方箋および非処方箋(OTC)の両方は、COUMADIN(登録商標)の抗凝固作用に影響を与え得る。いくつかの薬品は、COUMADIN(登録商標)の作用を高め、過度の血液菲薄化および生命に危険のある出血を引き起こし得る。そのような薬品の少数の例は、アスピリン、TYLENOL(登録商標)、アルコール、イブプロフェン(MOTRIN(登録商標))、シメチジン(TAGAMET(登録商標))、オキサンドロロン(OXANDRIN(登録商標))、ある種のビタミン、および抗生物質を含む。
【０４９１】
他には、低カルボキシル化オステオカルシンを完全なオステオカルシンと区別することができなかったが、スタチンZOCOR(登録商標)(ヒトで20mg/日のシンバスタチン)が、4週間の処理の後に、オステオカルシンの血清レベルを有意に増加させたことを示した(p値は0.05未満)。Chan, M. H.ら、J Clin Endocrinology and Metabolism (2001年) 第86巻(9)、4556〜59頁。たとえ、低カルボキシル化オステオカルシンのレベルがスタチンによって増加したという実験的な証明がなくても、オステオカルシンの全体的な発現の有意な増加により、ガンマカルボキシラーゼ活性を飽和させることができ、生産されたすべてのオステオカルシンをカルボキシル化することができなくなる。その結果として、スタチンは、血液中に放出される低カルボキシル化オステオカルシンの量を間接的に増加させることができる。さらに、ビタミンKを遮断するワルファリン等の、ガンマカルボキシル化を遮断する薬剤またはOST-PTPおよびガンマカルボキシラーゼの阻害薬とのスタチンの投与は、共に働いて、血清低カルボキシル化オステオカルシンを上昇させ、治療上の使用を有することができた。スタチンおよびビタミンK阻害薬は単一の調製物または別個の調製物中で投与することができた。
【０４９２】
したがって、本発明のある態様は、血清中の低カルボキシル化オステオカルシンレベルを増加させるためのビタミンK阻害薬およびスタチンの使用ならびに代謝症候群およびその様々な構成要素を治療する際のそれらの治療上の使用を対象とする。
【０４９３】
交感神経系はOST-PTP発現をポジティブに制御する。交感神経系(SNS)活性は骨芽細胞中のEsp発現をポジティブに制御することが発見された。実際に、図16は、ベータアドレナリン受容体アゴニストであるイソプロテレノールを用いたSNSシグナル伝達の刺激がEsp発現を4時間で約80%増加させたことおよびこの増加が8時間目でさえ安定したままであったことを示す。しかしながら、SNS活性の増加は、ガンマカルボキシラーゼ(ggcx)、vkor(ggcx活性に必要なビタミンKの再利用に関連する酵素)、またはオステオカルシンの発現を増加させなかった。この実験は、SNSシグナル伝達が骨芽細胞中でEsp発現をポジティブに制御することを示す。したがって、交感神経の活性の減少は、Esp発現の減少をもたらし、それによって、オステオカルシンの低カルボキシル化活性形態を増加させるはずである。
【０４９４】
低い交感神経の活性を有するob/obマウスを使用するin vivo実験により、この仮説を確認し、レプチン(ob遺伝子の産物)およびオステオカルシンの間に遺伝的関係があることを示した。レプチンがSNSを介して骨芽細胞にシグナル伝達することが示された。したがって、ob/obマウスは骨芽細胞に対するSNSシグナル伝達が減少したモデルである。ob/obマウスは、任意の他の代謝異常を発症する前に、インスリンの増加を呈することが示された。この増加は、骨芽細胞に対するSNS活性の減少によるものとすることができ、その結果として、これは、より少ないOST-PTPを発現させ、より多くの生物活性低カルボキシル化オステオカルシンを分泌させ、インスリン発現の増加をもたらすと思われる。血清インスリンのレベルを、様々な遺伝子型:WTマウス、ob-/+マウス(肥満症についてヘミ接合)、ob/obマウス、Bgp-/+(オステオカルシンについてヘミ接合)、BGP-/-マウス、およびさらにBgp-/-(Ocn欠損)でもあるob/obマウスを有する1週齢マウスで測定した。1週目のob/obマウスはまだ肥満ではなく、それらが高い血清インスリンレベルを有することを除いて、比較的、代謝的に正常であるので、1週齢マウスを選んだ。結果は、ob/obマウスが実際に血清インスリンレベルを増加させたが、Bgp遺伝子(オステオカルシンをコード)の両方の対立遺伝子がob/obマウスで欠失している場合、それらの血清インスリンレベルは正常に戻ることを示す。図17。この実験は、ob/obマウスで観察されたインスリンの増加がオステオカルシンに依存性であることを実証する。
【０４９５】
まとめると、上記に示す結果は、SNS活性を減少させるベータ遮断薬の投与は、同様にEsp発現を減少させ、それによって、低カルボキシル化オステオカルシンのレベルを増加させるであろうということを意味する。したがって、それらは、オステオカルシン活性の増加を介して代謝障害を予防する/治療するために使用することができた。ベータ遮断薬は臨床的に長い間使用されてきた、したがって、ヒト使用にとって安全な量が確証されている。日常的な実験作業は、血清低カルボキシル化オステオカルシンのレベルの増加を達成するために投与するための特定のベータ遮断薬の最適な量を決定する。骨格の細胞をより優先的に標的とする新しいベータ遮断薬を、オステオカルシン活性をより特異的に増加させ、副作用の危険性を低下させるために開発することもできる。
【０４９６】
【表２】
0005421109.tif 000008
【０４９７】
【表３】
0005421109.tif 000009
【０４９８】
(参考文献)
0005421109.tif 000010
0005421109.tif 000011
0005421109.tif 000012
【０４９９】
配列表
配列番号1
ヒトオステオカルシンcDNA
【表４】
0005421109.tif 000013
配列番号2
ヒトオステオカルシンタンパク質アミノ酸配列
【表５】
0005421109.tif 000014
配列番号3
マウスオステオカルシン遺伝子1cDNA
【表６】
0005421109.tif 000015
配列番号4
マウスオステオカルシン遺伝子2cDNA
【表７】
0005421109.tif 000016
配列番号5
マウスオステオカルシン遺伝子1および2タンパク質アミノ酸配列
【表８】
0005421109.tif 000017
配列番号6
ヒトアディポネクチンcDNA
【表９−１】
0005421109.tif 000018
【表９−２】
0005421109.tif 000019
配列番号7
ヒトアディポネクチンタンパク質アミノ酸配列
【表１０】
0005421109.tif 000020
配列番号8
マウスアディポネクチンcDNA
【表１１−１】
0005421109.tif 000021
【表１１−２】
0005421109.tif 000022
配列番号9
マウスアディポネクチンタンパク質アミノ酸配列
【表１２】
0005421109.tif 000023
配列番号10
ヒトガンマグルタミルカルボキシラーゼcDNA
【表１３−１】
0005421109.tif 000024
【表１３−２】
0005421109.tif 000025
配列番号11
ヒトガンマグルタミルカルボキシラーゼタンパク質アミノ酸配列
【表１４】
0005421109.tif 000026
配列番号12
マウスガンマグルタミルカルボキシラーゼcDNA
【表１５−１】
0005421109.tif 000027
【表１５−２】
0005421109.tif 000028
配列番号13
マウスガンマグルタミルカルボキシラーゼタンパク質アミノ酸配列
【表１６】
0005421109.tif 000029
配列番号14
ヒトApoE cDNA
【表１７】
0005421109.tif 000030
配列番号15
ヒトApoEタンパク質アミノ酸配列
【表１８−１】
0005421109.tif 000031
【表１８−２】
0005421109.tif 000032
配列番号16
マウスApoE cDNA
【表１９】
0005421109.tif 000033
配列番号17
マウスApoEタンパク質アミノ酸配列
【表２０】
0005421109.tif 000034
配列番号18
マウスEsp(OST-PTP、Ptprv)cDNA
【表２１−１】
0005421109.tif 000035
【表２１−２】
0005421109.tif 000036
【表２１−３】
0005421109.tif 000037
配列番号19
マウスEsp(OST-PTP、Ptprv)タンパク質アミノ酸配列
【表２２】
0005421109.tif 000038
配列番号20
大腸菌ベータガラクトシダーゼcDNA
【表２３】
0005421109.tif 000039
配列番号21
大腸菌ベータガラクトシダーゼタンパク質アミノ酸配列
【表２４】
0005421109.tif 000040
配列番号22
成熟ヒトオステオカルシンアミノ酸配列
【表２５】
0005421109.tif 000041
配列番号23
ヒトオステオカルシン変異体アミノ酸配列
【表２６】
0005421109.tif 000042
【図１Ｅ】
0005421109.tif 000043
【図１Ｆ】
0005421109.tif 000044
【図１Ｇ】
0005421109.tif 000045
【図１Ｈ】
0005421109.tif 000046
【図１Ｉ】
0005421109.tif 000047
【図１Ｊ】
0005421109.tif 000048
【図２Ａ】
0005421109.tif 000049
【図２Ｂ】
0005421109.tif 000050
【図２Ｃ】
0005421109.tif 000051
【図２Ｆ】
0005421109.tif 000052
【図２Ｇ】
0005421109.tif 000053
【図２Ｈ】
0005421109.tif 000054
【図２Ｋ】
0005421109.tif 000055
【図２Ｌ】
0005421109.tif 000056
【図２Ｍ】
0005421109.tif 000057
【図２Ｎ】
0005421109.tif 000058
【図３Ａ】
0005421109.tif 000059
【図３Ｂ】
0005421109.tif 000060
【図３Ｃ】
0005421109.tif 000061
【図３Ｄ】
0005421109.tif 000062
【図３Ｅ】
0005421109.tif 000063
【図３Ｆ】
0005421109.tif 000064
【図３Ｇ】
0005421109.tif 000065
【図３Ｈ】
0005421109.tif 000066
【図３Ｉ】
0005421109.tif 000067
【図３Ｊ】
0005421109.tif 000068
【図３Ｋ】
0005421109.tif 000069
【図３Ｌ】
0005421109.tif 000070
【図３Ｍ】
0005421109.tif 000071
【図３Ｎ】
0005421109.tif 000072
【図４Ｂ】
0005421109.tif 000073
【図４Ｃ】
0005421109.tif 000074
【図４Ｄ】
0005421109.tif 000075
【図４Ｅ】
0005421109.tif 000076
【図４Ｆ】
0005421109.tif 000077
【図４Ｇ】
0005421109.tif 000078
【図４Ｈ】
0005421109.tif 000079
【図４Ｉ】
0005421109.tif 000080
【図４Ｊ】
0005421109.tif 000081
【図５Ａ】
0005421109.tif 000082
【図５Ｂ】
0005421109.tif 000083
【図５Ｃ】
0005421109.tif 000084
【図５Ｄ】
0005421109.tif 000085
【図５Ｅ】
0005421109.tif 000086
【図５Ｆ】
0005421109.tif 000087
【図５Ｇ】
0005421109.tif 000088
【図５Ｈ】
0005421109.tif 000089
【図５Ｉ】
0005421109.tif 000090
【図５Ｊ】
0005421109.tif 000091
【図５Ｋ】
0005421109.tif 000092
【図５Ｌ】
0005421109.tif 000093
【図５Ｍ】
0005421109.tif 000094
【図５Ｎ】
0005421109.tif 000095
【図５Ｏ】
0005421109.tif 000096
【図５Ｐ】
0005421109.tif 000097
【図５Ｑ】
0005421109.tif 000098
【図５Ｒ】
0005421109.tif 000099
【図５Ｓ】
0005421109.tif 000100
【図５Ｔ】
0005421109.tif 000101
【図６Ａ】
0005421109.tif 000102
【図６Ｂ】
0005421109.tif 000103
【図６Ｃ】
0005421109.tif 000104
【図６Ｄ】
0005421109.tif 000105
【図６Ｅ】
0005421109.tif 000106
【図７Ａ】
0005421109.tif 000107
【図７Ｂ】
0005421109.tif 000108
【図７Ｃ】
0005421109.tif 000109
【図７Ｄ】
0005421109.tif 000110
【図７Ｅ】
0005421109.tif 000111
【図７Ｆ】
0005421109.tif 000112
【図７Ｇ】
0005421109.tif 000113
【図７Ｈ】
0005421109.tif 000114
【図７Ｉ】
0005421109.tif 000115
【図７Ｊ】
0005421109.tif 000116
【図７Ｋ】
0005421109.tif 000117
【図７Ｌ】
0005421109.tif 000118
【図７Ｍ】
0005421109.tif 000119
【図７Ｎ】
0005421109.tif 000120
【図７Ｏ】
0005421109.tif 000121
【図１０】
0005421109.tif 000122
【図１１】
0005421109.tif 000123
【図１２】
0005421109.tif 000124
【図１３Ａ】
0005421109.tif 000125
【図１３Ｂ】
0005421109.tif 000126
【図１４】
0005421109.tif 000127
【図１５】
0005421109.tif 000128
【図１６】
0005421109.tif 000129
【図１７】
0005421109.tif 000130
【図２０】
0005421109.tif 000131
【図２２Ａ】
0005421109.tif 000132
【図２２Ｂ】
0005421109.tif 000133
【図２２Ｃ】
0005421109.tif 000134
【図２２Ｄ】
0005421109.tif 000135
【図２２Ｅ】
0005421109.tif 000136
【図２２Ｆ】
0005421109.tif 000137
【図２３Ａ】
0005421109.tif 000138
【図２３Ｂ】
0005421109.tif 000139
【図２３Ｃ】
0005421109.tif 000140
【図２３Ｄ】
0005421109.tif 000141
【図２３Ｅ】
0005421109.tif 000142
【図２３Ｆ】
0005421109.tif 000143
【図２３Ｈ】
0005421109.tif 000144
【図２３Ｉ】
0005421109.tif 000145
【図２３Ｊ】
0005421109.tif 000146
【図２３Ｋ】
0005421109.tif 000147
【図２５Ａ】
0005421109.tif 000148
【図２５Ｂ】
0005421109.tif 000149
【図２５Ｃ】
0005421109.tif 000150
【図２５Ｄ】
0005421109.tif 000151
【図２６Ｂ】
0005421109.tif 000152
【図２７Ａ】
0005421109.tif 000153
【図２７Ｂ】
0005421109.tif 000154
【図２８Ａ】
0005421109.tif 000155
【図２８Ｃ】
0005421109.tif 000156
【図２８Ｄ】
0005421109.tif 000157
【図２８Ｅ】
0005421109.tif 000158
【図２８Ｆ】
0005421109.tif 000159
【図２９Ａ】
0005421109.tif 000160
【図２９Ｂ】
0005421109.tif 000161
【図２９Ｃ】
0005421109.tif 000162
【図２９Ｄ】
0005421109.tif 000163
【図２９Ｅ】
0005421109.tif 000164
【図２９Ｆ】
0005421109.tif 000165
【図２９Ｇ】
0005421109.tif 000166
【図１Ａ】
0005421109.tif 000167
【図１Ｂ】
0005421109.tif 000168
【図１Ｃ】
0005421109.tif 000169
【図１Ｄ】
0005421109.tif 000170
【図１Ｋ】
0005421109.tif 000171
【図１Ｌ】
0005421109.tif 000172
【図１Ｍ】
0005421109.tif 000173
【図２Ｄ】
0005421109.tif 000174
【図２Ｅ】
0005421109.tif 000175
【図２Ｉ】
0005421109.tif 000176
【図２Ｊ】
0005421109.tif 000177
【図４Ａ】
0005421109.tif 000178
【図８】
0005421109.tif 000179
【図９】
0005421109.tif 000180
【図１８】
0005421109.tif 000181
【図１９】
0005421109.tif 000182
【図２１】
0005421109.tif 000183
【図２３Ｇ】
0005421109.tif 000184
【図２４】
0005421109.tif 000185
【図２６Ａ】
0005421109.tif 000186
【図２７Ｃ】
0005421109.tif 000187
【図２８Ｂ】
0005421109.tif 000188
【配列表】
0005421109000001.app