(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
【化３９】
0005555230.tif 000052
（式中、ｎは、１より大きく、ｍは、１〜１０から選択される整数であり、ｐは１〜２０から選択される数字であり、そしてＲはＨまたはアルキル基である）
であるリンカーを介して担体に結合させられたオリゴ糖を含むオリゴ糖−担体結合体を含む組成物であって、ここで、
該リンカーは、該オリゴ糖の酸素原子に、末端ＣＨ２基を介して連結され、該リンカーは、アミド結合によって該担体中のアミノ基に、末端ＣＯ基を介して連結され、そして
該組成物は、免疫応答を刺激することができる、組成物。
【請求項２】
（ａ）薬学的に許容される担体、
（ｂ）アジュバント、または
（ｃ）抗菌剤
をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
オリゴ糖−担体結合体を合成するための方法であって、
式ＩＸａまたはＩＸｂのリンカー：
【化４０】
0005555230.tif 000053
（式中、ｎは、１より大きく、ｍは、１〜１０から選択される整数であり、ｐは１〜２０から選択される数字であり、そしてＲはＨまたはアルキル基である）
に結合させられたオリゴ糖を、担体（該担体中の末端アミノ基が式Ｘ
【化４１−１】
0005555230.tif 000054
の化合物の結合により修飾される）と反応させて、式ＶＩＩＩａまたはＶＩＩＩｂの構造
【化４１−２】
0005555230.tif 000055
（式中、ｎは、１より大きく、ｍは、１〜１０から選択される整数であり、ｐは１〜２０から選択される数字であり、そしてＲはＨまたはアルキル基である）
を有しているリンカーによって担体化合物に結合させられたオリゴ糖を生じさせる工程を含む、方法。
【請求項４】
前記オリゴ糖−担体結合体が、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、または１００：１の担体に対するオリゴ糖の比を有する、請求項１に記載の組成物、または請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記担体が、
（ａ）ペプチド、
（ｂ）タンパク質、または
（ｃ）破傷風トキソイド
である、請求項１に記載の組成物、または請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記オリゴ糖が
（ａ）β−１−６結合グルコサミン
（ｂ）２〜２０個の単量体の長さである、β−１−６結合グルコサミン
（ｃ）５〜１１個の単量体の長さである、β−１−６結合グルコサミン
（ｄ）７個、９個、または１１個の単量体の長さである、β−１−６結合グルコサミン、または
（ｅ）０〜４０％がアセチル化された、β−１−６結合グルコサミン
である、請求項１に記載の組成物、または請求項３に記載の方法。
【請求項７】
医薬としての使用のための、請求項１〜２、または４〜６のいずれか一項に記載の組成物、あるいは請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法により合成されたオリゴ糖−担体結合体。
【請求項８】
請求項７に記載の使用のための組成物またはオリゴ糖−担体結合体であって、
（ａ）アジュバント、または
（ｂ）抗菌剤
とともに使用される、組成物またはオリゴ糖−担体結合体。
【請求項９】
ポリＮ−アセチルグルコサミンを産生する細菌種によって引き起こされる感染を有するか、または発症するリスクがある被験体において、感染の処置または予防に使用するための、請求項１〜２、または４〜６のいずれか一項に記載の組成物、あるいは請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法により合成されたオリゴ糖−担体結合体。
【請求項１０】
請求項９に記載の使用のための組成物またはオリゴ糖−担体結合体であって、前記感染は、
（ａ）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ感染
（ｂ）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染
（ｃ）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ感染、あるいは
（ｄ）Ｅ．ｃｏｌｉ感染、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ感染、Ｙ．ｅｎｔｅｒｃｏｌｉｔｉｃａ感染、Ｙ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ感染、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ感染、Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ感染、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ感染、アシネトバクター感染、バークホルデリア感染、Ｓｔｅｎａｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ感染、赤痢菌感染、またはクレブシエラ感染
である、組成物またはオリゴ糖−担体結合体。
【請求項１１】
請求項９に記載の使用のための組成物またはオリゴ糖−担体結合体であって、前記被験体は、
（ａ）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓに曝されるリスクがある被験体、または
（ｂ）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓに曝された被験体
である、組成物またはオリゴ糖−担体結合体。
【請求項１２】
請求項９に記載の使用のための組成物またはオリゴ糖−担体結合体であって、前記被験体は、
（ａ）ヒト、または
（ｂ）非ヒト
である、組成物またはオリゴ糖−担体結合体。
【請求項１３】
請求項９に記載の使用のための組成物またはオリゴ糖−担体結合体であって、アジュバントとともに使用される、組成物またはオリゴ糖−担体結合体。
【請求項１４】
抗体を産生する細胞を得る方法であって、該方法は、
ポリＮ−アセチルグルコサミンに特異的な抗体を産生するために有効な量の、請求項１〜２、または４〜６のいずれか一項に記載の組成物、あるいは請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法により合成されたオリゴ糖−担体結合体を、非ヒト被験体に投与する工程、および
該非ヒト被験体から抗体を産生する細胞を採取する工程
を含み、該方法は、手術または治療によって動物の身体を処置する方法ではない、方法。
【請求項１５】
抗体を産生する方法であって、該方法は、
請求項１４に記載の方法にしたがって、抗体を産生する細胞を得る工程、
前記非ヒト被験体由来の抗体を産生する細胞を骨髄腫細胞に融合させる工程、および
融合体のサブクローンから産生された抗体を採取する工程
を含む、方法。
【請求項１６】
式ＩＩＩの化合物または式ＩＶの化合物
【化４２】
0005555230.tif 000056
式ＩＩＩ（スクシンイミジル４−アセチルスルファニルブチラート）
【化４３】
0005555230.tif 000057
式ＩＶ（パラ−ニトロフェニル４−アセチルスルファニルブチラート）
であって、式中、Ａｃはアセチル基である、式ＩＩＩの化合物または式ＩＶの化合物。
【請求項１７】
スクシンイミジル４−アセチルスルファニルブチラート（式ＩＩＩ）またはパラ−ニトロフェニル４−アセチルスルファニルブチラート（式ＩＶ）を合成するための方法であって、
４−アセチルスルファニル酪酸（式Ｖ）：
【化４４】
0005555230.tif 000058
（式中、Ａｃはアセチル基である）：
を、スクシンイミジルトリフルオロアセテート（ＣＦ３ＣＯＯＳｕ）またはパラ−ニトロフェニルトリフルオロアセテート（ＣＦ３ＣＯＯｐＮｐ）と反応させて、それぞれ、スクシンイミジル４−アセチルスルファニルブチラート（式ＩＩＩ）またはパラ−ニトロフェニル４−アセチルスルファニルブチラート（式ＩＶ）を生じさせる工程を含む、方法。
【請求項１８】
担体に結合させられたオリゴ糖を合成するための方法であって、
該オリゴ糖を、最初に、式ＶａまたはＶｂの構造：
【化４５】
0005555230.tif 000059
（式中、ｍは、１〜１０より選択される数字であり、ｐは１〜２０から選択される数字であり、そしてＲはＨまたはアルキル基である）を有する化合物と、
２番目に、式Ｉの化合物：
【化４６】
0005555230.tif 000060
（式中、Ｘは任意の原子または基であり、Ｙは硫黄保護基であり、そしてｎは１より大きい）；
式ＩＩの化合物：
【化４７−１】
0005555230.tif 000061
（式中、Ｘは任意の原子または基であり、ｎは１より大きく、そしてＡｃはアセチル基である）；
式ＩＩＩの化合物、または式ＩＶの化合物
【化４７−２】
0005555230.tif 000062
と、そして
３番目に、担体と
反応させる工程を含み、ここで、該オリゴ糖はβ−１−６結合グルコサミンであり、
ここで、該担体に結合させられたオリゴ糖は、
【化４７−３】
0005555230.tif 000063
（式中、ｎは、１より大きく、ｍは、１〜１０から選択される整数であり、ｐは１〜２０から選択される数字であり、そしてＲはＨまたはアルキル基である）
であるリンカーを介して担体に結合させられたオリゴ糖を含む、方法。
【請求項１９】
Ｏ結合リンカーを持つオリゴ糖を含む組成物であって、ここで、前記リンカーが
【化４８】
0005555230.tif 000064
を含み、該オリゴ糖は、結合グルコサミンである、組成物。
【請求項２０】
前記結合グルコサミンは、
（ａ）β−１−６結合グルコサミンであるか、
（ｂ）２〜２０個の単量体の長さである、β−１−６結合グルコサミンであるか、
（ｃ）５〜１１個の単量体の長さである、β−１−６結合グルコサミンであるか、
（ｄ）７個、９個、または１１個の単量体の長さである、β−１−６結合グルコサミンであるか、
（ｅ）７個、９個、または１１個の単量体の長さであり、１００％がアセチル化された、β−１−６結合グルコサミンであるか、
（ｆ）７個、９個、または１１個の単量体の長さであり、５０％未満がアセチル化された、β−１−６結合グルコサミンであるか、
（ｇ）２〜２０個の単量体の長さであるか、
（ｈ）５〜１１個の単量体の長さであるか、
（ｉ）７個、９個、または１１個の単量体の長さであるか、
（ｊ）７個、９個、または１１個の単量体の長さであり、１００％がアセチル化されているか、または
（ｋ）７個、９個、または１１個の単量体の長さであり、５０％未満がアセチル化されている、請求項１９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００８年７月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／１３５，４９３号、および２００９年２月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／２０８，１５５号の利益を主張し、これらの米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
政府支援
本願は、米国国立衛生研究所ＲＯ１ＡＩ０４６７０６からの助成金により一部が支援された。合衆国政府は、本発明に権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、合成のオリゴ−β−（１→６）−２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド（これは、本明細書中では、オリゴ−β−（１→６）−Ｄ−グルコサミンまたはオリゴグルコサミンと互換的に呼ばれる）に関連する組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
ブドウ球菌は、ヒトの皮膚および粘膜に常在し、コロニーをつくるグラム陽性細菌である。皮膚または粘膜が外科的処置あるいは他の外傷により損傷を受けると、ブドウ球菌は内部組織への接近手段を獲得し得、これは感染を起こす原因となり得る。ブドウ球菌が局所的に増殖するか、あるいはリンパ系または血液系に侵入すると、ブドウ球菌血症に付随する感染性の合併症のような重篤な感染性の合併症が起こり得る。これらの合併症としては、敗血性ショック、心内膜炎、関節炎、骨髄炎、肺炎、および様々な臓器の膿瘍が挙げられる。
【０００５】
ブドウ球菌には、遊離のコアグラーゼを生産するコアグラーゼ陽性菌と、遊離のコアグラーゼを生産しないコアグラーゼ陰性菌の両方が含まれる。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓは、ブドウ球菌の最も一般的なコアグラーゼ陽性形態である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓは一般的には、血管外または血管内のいずれかの局所部位で感染を引き起こし、最終的には、菌血症を生じ得る。Ｓ．ａｕｒｅｕｓはまた、急性骨髄炎の主要原因でもあり、ブドウ球菌性肺炎感染の原因となる。さらに、Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、細菌性髄膜炎の症例のおよそ１％〜９％を、そして脳膿瘍の原因の１０％〜１５％を占める。
【０００６】
少なくとも３１種のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌が知られており、これには、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓ．ｗａｒｎｅｒｉ、Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｉｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｃｏｈｎｉｉ、Ｓ．ｘｙｌｏｓｕｓ、Ｓ．ｓｉｍｕｌａｎｓ、およびＳ．ｃａｐｉｔｉｓが含まれる。Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは、静脈内投与デバイスに関係して最も頻繁に起こる感染の原因物質であり、原発性の院内感染菌血症における最も頻度の高い単離株である。Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓはまた、人工弁心内膜炎とも関係がある。
【０００７】
ブドウ球菌はまた、動物における細菌感染の共通の感染源でもある。例えば、ブドウ球菌乳房炎は、ウシ、ヒツジ、およびヤギのような反芻動物に共通する問題である。この疾患は一般的には、感染を軽減するために抗生物質で処置されるが、この処置は費用のかかる手法であり、これはさらに乳汁生産もできなくする。今日までに同定された最も有効なワクチンは、皮下投与されるＳ．ａｕｒｅｕｓのインタクトな生ワクチンである。しかし、生ワクチンの投与には感染のリスクが伴う。そのため、多くの研究者らが、死滅Ｓ．ａｕｒｅｕｓワクチンを作り出そう、および／またはＳ．ａｕｒｅｕｓに対する免疫を誘導するであろう莢膜多糖類または細胞壁成分を単離しようと試みてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
担体化合物は、抗原に対する免疫応答を増強させるためにワクチンにおいてしばしば使用される。例えば、いくつかのワクチンの担体は、抗原性部分に対する応答におけるＴ細胞ヘルプ（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｈｅｌｐ）を刺激するために有用である。自然界に存在している抗原性部分または自然界に存在している物質の断片はあまり適しておらず、簡単には操作することができない、そして／または例えば担体化合物のような他の部分には簡単には結合させることができないことが多く、これはそのようなワクチンの治療効果を低下させる可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、抗原性組成物（例えば、ワクチンであるがこれに限定されない）を作製するための新規の方法および化合物を提供する。具体的には、本発明は、オリゴ糖抗原を修飾するための新規の方法を提供する。これらの方法は、（ａ）予め決定された順序の単糖単量体からなり、（ｂ）担体化合物に結合させられたオリゴ糖の制御合成を含む。得られる結合体は、目的の微生物多糖類抗原に対する免疫応答を（誘導によるかまたは増強によるかを問わず）よりうまく刺激できる。本明細書中に記載されるように、そのような免疫応答は、ブドウ球菌感染を含むがこれに限定されない様々な感染の処置および／または予防に有用である。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
式Ｉの化合物：
【化３１】
0005555230.tif 000002
式中、Ｘは任意の原子または基であり、Ｙは硫黄保護基であり、そしてｎは１より大きい。
（項目２）
Ｙがアシル基である、項目１に記載の化合物。
（項目３）
Ｙがアセチル基であり、化合物が式ＩＩの構造：
【化３２】
0005555230.tif 000003
を有し、式中、Ａｃはアセチル基である、項目１または２に記載の化合物。
（項目４）
前記化合物が式Ｉの活性化エステルである、項目１に記載の化合物。
（項目５）
前記化合物が、式Ｉの活性化エステルのシアノ、アジド、またはハロゲン誘導体である、項目１に記載の化合物。
（項目６）
前記化合物が式ＩＩＩの構造：
【化３３】
0005555230.tif 000004
を有し、式中、Ａｃはアセチル基である、項目４に記載の化合物。
（項目７）
前記化合物が式ＩＶの構造：
【化３４】
0005555230.tif 000005
を有し、式中、Ａｃはアセチル基である、項目４に記載の化合物。
（項目８）
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル４−アセチルスルファニルブチラート（式ＩＩＩ）を合成するための方法であって、
４−アセチルスルファニル酪酸（式Ｖ）：
【化３５】
0005555230.tif 000006
式中、Ａｃはアセチル基である：
を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルトリフルオロアセテート（ＣＦ３ＣＯＯＳｕ）と反応させて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル４−アセチルスルファニルブチラート（式ＩＩＩ）を生じさせる工程を含む、方法。
（項目９）
Ｎ−ニトロフェニル４−アセチルスルファニルブチラート（ＩＶ）を合成するための方法であって、
４−アセチルスルファニル酪酸（式Ｖ）：
【化３６】
0005555230.tif 000007
式中、Ａｃはアセチル基である：
を、Ｎ−ニトロフェニルトリフルオロアセテート（ＣＦ３ＣＯＯｐＮｐ）と反応させて、Ｎ−ニトロフェニル４−アセチルスルファニルブチラート（式ＩＶ）を生じさせる工程を含む、方法。
（項目１０）
担体に結合させられたオリゴ糖を合成するための方法であって、
該オリゴ糖を、最初に、式ＶａまたはＶｂの構造：
【化３７】
0005555230.tif 000008
を有しており、式中、ｍは、１〜１０より選択される数字であり、ｐは１〜２０から選択される数字であり、そしてＲはＨまたはアルキル基である化合物と、
２番目に、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶの化合物と、そして
３番目に、担体と
反応させる工程を含み、ここで、該オリゴ糖はβ−１−６結合グルコサミンである、方法。
（項目１１）
Ｏ結合リンカーを持つオリゴ糖を含む組成物であって、ここで、前記リンカーが
【化３８】
0005555230.tif 000009
を含む、組成物。
（項目１２）
前記オリゴ糖が、β−１−６結合グルコサミンである、項目１１に記載の組成物。
（項目１３）
前記オリゴ糖が、２〜２０個の単量体の長さである、項目１０または１１に記載の組成物。
（項目１４）
前記オリゴ糖が、５〜１１個の単量体の長さである、項目１０または１１に記載の組成物。
（項目１５）
前記オリゴ糖が、７個、９個、または１１個の単量体の長さである、項目１０または１１に記載の組成物。
（項目１６）
前記オリゴ糖は１００％がアセチル化される、項目１５に記載の組成物。
（項目１７）
前記多糖は５０％未満がアセチル化される、項目１５に記載の組成物。
（項目１８）
以下：
【化３９】
0005555230.tif 000010
であるリンカーを介して担体に結合させられたオリゴ糖を含むオリゴ糖−担体結合体を含む組成物であって、ここで、該リンカーは該オリゴ糖にＯ結合され、該担体にＮ結合される、組成物。
（項目１９）
前記担体がペプチドである、項目１８に記載の組成物。
（項目２０）
前記担体がタンパク質である、項目１８に記載の組成物。
（項目２１）
前記担体が破傷風トキソイドである、項目１８に記載の組成物。
（項目２２）
前記オリゴ糖がβ−１−６結合グルコサミンである、項目１８に記載の組成物。
（項目２３）
前記組成物が、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、または１００：１の担体に対するオリゴ糖の比を有する、項目１８に記載の組成物。
（項目２４）
前記オリゴ糖が、２〜２０個の単量体の長さである、項目２２に記載の組成物。
（項目２５）
前記オリゴ糖が、５〜１１個の単量体の長さである、項目２２に記載の組成物。
（項目２６）
前記オリゴ糖が、７個、９個、または１１個の単量体の長さである、項目２２に記載の組成物。
（項目２７）
前記オリゴ糖は０〜４０％がアセチル化される、項目２２に記載の組成物。
（項目２８）
薬学的に許容される担体をさらに含む、項目１８に記載の組成物。
（項目２９）
アジュバントをさらに含む、項目１８に記載の組成物。
（項目３０）
抗菌剤をさらに含む、項目１８に記載の組成物。
（項目３１）
オリゴ糖−担体結合体を合成するための方法であって、
式ＩＸａまたはＩＸｂのリンカー：
【化４０】
0005555230.tif 000011
に結合させられたオリゴ糖を、アミノ基が修飾されている担体と反応させ、続いて、式
【化４１】
0005555230.tif 000012
の化合物と反応させて、式ＶＩＩＩａまたはＶＩＩＩｂの構造を有しているリンカーによって担体化合物に結合させられたオリゴ糖を生じさせる工程を含む、方法。
（項目３２）
前記オリゴ糖−担体結合体が、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、または１００：１の担体に対するオリゴ糖の比を有する、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記担体がペプチドである、項目３１に記載の方法。
（項目３４）
前記担体がタンパク質である、項目３１に記載の方法。
（項目３５）
前記担体が破傷風トキソイドである、項目３１に記載の方法。
（項目３６）
前記オリゴ糖がβ−１−６結合グルコサミンである、項目３１に記載の方法。
（項目３７）
前記オリゴ糖が、２〜２０個の単量体の長さである、項目３１に記載の方法。
（項目３８）
前記オリゴ糖が、５〜１１個の単量体の長さである、項目３１に記載の方法。
（項目３９）
前記オリゴ糖が、７個、９個、または１１個の単量体の長さである、項目３１に記載の方法。
（項目４０）
前記オリゴ糖は０〜４０％がアセチル化される、項目３６に記載の方法。
（項目４１）
被検体において免疫応答を刺激するための方法であって、
該被検体において免疫応答を刺激するために有効な量の、項目１８〜２７のいずれか１項に記載のオリゴ糖−担体結合体または項目３１〜４０のいずれか１項に記載の方法によって合成されたオリゴ糖−担体結合体を、該刺激を必要とする被検体に投与する工程を含む、方法。
（項目４２）
前記被検体がヒトである、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記被検体が非ヒトである、項目４１に記載の方法。
（項目４４）
前記被検体から抗体または抗体を形成する細胞を単離する工程をさらに含む、項目４１、４２、または４３に記載の方法。
（項目４５）
前記被検体にアジュバントを投与する工程をさらに含む、項目４１、４２、４３、または４４に記載の方法。
（項目４６）
前記被検体に抗菌剤を投与する工程をさらに含む、項目４１〜４４、または４５に記載の方法。
（項目４７）
被検体の感染を処置または予防するための方法であって、
免疫応答を誘導するための有効量の、項目１８〜２７のいずれか１項に記載のオリゴ糖−担体結合体または項目３１〜４０のいずれか１項に記載の方法によって合成されたオリゴ糖−担体結合体を、感染を発症しているかまたは感染を発症するリスクがある被検体に投与する工程を含み、
ここで、該感染は、ＰＮＡＧを生産する細菌種によって引き起こされる、方法。
（項目４８）
前記感染がブドウ球菌感染である、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記ブドウ球菌感染がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染である、項目４７に記載の方法。
（項目５０）
前記ブドウ球菌感染がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓである、項目４７に記載の方法。
（項目５１）
前記被検体がブドウ球菌に曝されるリスクがある、項目４７〜４９、または５０に記載の方法。
（項目５２）
前記被検体がブドウ球菌に曝されている、項目４７〜４９、または５０に記載の方法。
（項目５３）
前記感染が、Ｅ．ｃｏｌｉ感染、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ感染、Ｙ．ｅｎｔｅｒｃｏｌｉｔｉｃａ感染、Ｙ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ感染、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ感染、Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ感染、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ感染、アシネトバクター感染、バークホルデリア感染、Ｓｔｅｎａｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ感染、赤痢菌感染、またはクレブシエラ感染である、項目４７〜５１、または５２に記載の方法。
（項目５４）
前記オリゴ糖−担体結合体が、アジュバントとともに投与される、項目４７〜５２、または５３に記載の方法。
（項目５５）
抗体を生産するための方法であって：
ＰＮＡＧに特異的な抗体を生産させるための有効量の、項目１８〜２７のいずれか１項に記載のオリゴ糖−担体結合体または項目３１〜４０のいずれか１項に記載の方法によって合成されたオリゴ糖−担体結合体を被検体に投与する工程、および
前記被検体から抗体を単離する工程
を含む、方法。
（項目５６）
モノクローナル抗体を生産するための方法であって：
ＰＮＡＧに特異的な抗体を生産させるための有効量の、項目１８〜２７のいずれか１項に記載のオリゴ糖−担体結合体または項目３１〜４０のいずれか１項に記載の方法によって合成されたオリゴ糖−担体結合体を被検体に投与する工程、
該被検体から抗体を生産する細胞を採取する工程、
該被検体由来の抗体を生産する細胞を骨髄腫細胞に融合させる工程、および
融合体のサブクローンによって生産された抗体を採取する工程
を含む、方法。
（項目５７）
前記抗体がポリクローナル抗体である、項目５５に記載の方法。
（項目５８）
前記被検体がウサギである、項目５５または５６に記載の方法。
（項目５９）
前記被検体がヒトである、項目５５または５６に記載の方法。
【００１０】
本発明の様々な態様は、特定のリンカー（または連結剤（ｌｉｎｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）またはスペーサーまたは連結試薬（ｌｉｎｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ）（これらの用語が本明細書中で互換的に使用されるとおりである））、および結合体の合成におけるそれらの使用に関する。特に興味深いのは、オリゴ糖と様々な担体化合物の結合体である。これらのオリゴ糖は、β−（１→６）結合によって互いに結合したグルコサミン単量体からなる（本明細書中で言われる場合には、グルコサミンに連結させられた）オリゴ−β−（１→６）−Ｄ−グルコサミンを含む。連結させられたグルコサミンを構成する様々な単量体の１つ以上はＮアセチル化され得る。したがって、これらの単量体はＤ−グルコサミン単量体またはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単量体であり得、連結させられたグルコサミンは、定義された順序でこれらの単量体（または単糖（これらの用語が本明細書中で互換的に使用されるとおりである））のうちの１つまたは両方のタイプを含み得る。本発明のオリゴグルコサミンはまた、それらの「還元性」末端にチオール含有基を有しているスペーサーも含む。このスペーサーは担体にオリゴグルコサミンを連結させるために使用される。この担体はアミノ酸（例えば、ペプチドまたはタンパク質）からなり得るが、そのように限定はされない。
【００１１】
したがって、１つの態様においては、本発明は式Ｉの化合物を提供する。
【００１２】
【化１】
0005555230.tif 000013
式中、Ｘは任意の原子または基であり、Ｙは硫黄保護基であり、そしてｎは１より大きい。１つの実施形態においては、Ｙはアシル基である。別の実施形態においては、Ｙはアセチル基であり、上記化合物は式ＩＩの構造を有する。
【００１３】
【化２】
0005555230.tif 000014
式中、Ａｃはアセチル基である。
【００１４】
なお別の実施形態においては、上記化合物は式Ｉの活性化エステルである。別の実施形態においては、上記化合物は、式Ｉの活性化エステルのシアノ、アジド、またはハロゲン（ｈａｌｏｉｄ）誘導体である。別の実施形態においては、上記化合物は式ＩＩＩの構造を有する。
【００１５】
【化３】
0005555230.tif 000015
式中、Ａｃはアセチル基であり、上記化合物はＮ−ヒドロキシスクシンイミジル４−アセチルスルファニルブチラートと呼ばれる。別の実施形態においては、上記化合物は式ＩＶの構造を有する。
【００１６】
【化４】
0005555230.tif 000016
式中、Ａｃはアセチル基であり、上記化合物はＮ−ニトロフェニル４−アセチルスルファニルブチラートと呼ばれる。
【００１７】
別の態様においては、本発明は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル４−アセチルスルファニルブチラート（式ＩＩＩ）を合成するための方法を提供し、この方法は、４−アセチルスルファニル酪酸（式Ｖ）：
【００１８】
【化５】
0005555230.tif 000017
をＮ−ヒドロキシスクシンイミジルトリフルオロアセテート（ＣＦ３ＣＯＯＳｕ）と反応させて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル４−アセチルスルファニルブチラート（式ＩＩＩ）を生じさせる工程を含む。
【００１９】
別の態様においては、本発明は、Ｎ−ニトロフェニル４−アセチルスルファニルブチラート（ＩＶ）を合成するための方法を提供し、この方法は、４−アセチルスルファニル酪酸（式Ｖ）：
【００２０】
【化６】
0005555230.tif 000018
をＮ−ニトロフェニルトリフルオロアセテート（ＣＦ３ＣＯＯｐＮｐ）と反応させて、Ｎ−ニトロフェニル４−アセチルスルファニルブチラート（式ＩＶ）を生じさせる工程を含む。
【００２１】
別の態様においては、本発明は、担体に結合させられたオリゴ糖を合成するための方法を提供し、この方法は、オリゴ糖を、（ａ）最初に式ＶａまたはＶｂ：
【００２２】
【化７】
0005555230.tif 000019
（式中、ｍは１〜１０より選択される数字であり、ｐは１〜２０から選択される数字であり、そしてＲはＨまたはアルキル基である）の構造を有している化合物と、（ｂ）２番目に、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶの化合物と、そして（ｃ）３番目に担体と反応させる工程を含む。ここで、オリゴ糖はβ−１−６結合グルコサミンである。
【００２３】
なお別の態様においては、本発明は、Ｏ結合リンカーを持つオリゴ糖を含む組成物を提供する。ここで、上記リンカーは、
【００２４】
【化８】
0005555230.tif 000020
を含む。
【００２５】
１つの実施形態においては、オリゴ糖はβ−１−６結合グルコサミンである。別の実施形態においては、オリゴ糖は、２〜２０個の単量体の長さである。別の実施形態においては、オリゴヌクレオチドは５〜１１個の単量体の長さである。なお別の実施形態においては、オリゴ糖は、７個、９個、または１１個の単量体の長さである。
【００２６】
１つの実施形態においては、オリゴ糖は０％がアセチル化されるか、または１００％がアセチル化される。別の実施形態においては、オリゴ糖は０％〜４０％がアセチル化される。
【００２７】
なお別の態様においては、本発明は、以下であるリンカーを介して担体に結合させられたオリゴ糖を含む、オリゴ糖−担体結合体を含有する組成物を提供する：
【００２８】
【化９】
0005555230.tif 000021
式中、リンカーはオリゴ糖にＯ結合され、担体にＮ結合される。
【００２９】
なお別の態様においては、本発明は、オリゴ糖−担体結合体を合成するための方法を提供し、この方法は、式ＩＸａまたは式ＩＸｂのリンカー：
【００３０】
【化１０】
0005555230.tif 000022
に結合させられたオリゴ糖を、アミノ基が修飾された担体と反応させ、続いて、式Ｘの化合物：
【００３１】
【化１１】
0005555230.tif 000023
と反応させて、式ＶＩＩＩａまたは式ＶＩＩＩｂの構造を有しているリンカーを介して担体化合物に結合させられたオリゴ糖を生じさせる工程を含む。
【００３２】
１つの実施形態においては、担体はペプチドである。別の実施形態においては、担体はタンパク質である。担体の一例は、破傷風トキソイドである。
【００３３】
１つの実施形態においては、オリゴ糖はβ−１−６結合グルコサミンである。
【００３４】
１つの実施形態においては、組成物は、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、または１００：１の担体に対するオリゴ糖の比を有する。
【００３５】
いくつかの実施形態においては、オリゴ糖は２〜２０個の単量体の長さであるか、５〜１１個の単量体の長さであるか、または５個、７個、９個、もしくは１１個の単量体の長さである。
【００３６】
１つの実施形態においては、オリゴ糖は１００％がアセチル化される。別の実施形態においては、オリゴ糖は０％がアセチル化される。なお別の実施形態においては、オリゴ糖は、０％〜４０％がアセチル化される。
【００３７】
いくつかの実施形態においては、組成物はさらに、薬学的に許容される担体、アジュバント、および／または抗菌剤を含む。
【００３８】
別の態様においては、本発明は、被検体において免疫応答を刺激するための方法を提供する。この方法は、被検体において免疫応答を刺激するために有効な量の上記のようなオリゴ糖−担体結合体または上記方法によって合成されたオリゴ糖−担体結合体を、その必要がある被検体に投与する工程を含む。
【００３９】
１つの実施形態においては、被検体はヒトである。別の実施形態においては、被検体は非ヒトである。
【００４０】
別の実施形態においては、この方法はさらに、被検体から抗体または抗体を形成する細胞を単離する工程を含む。
【００４１】
別の実施形態においては、この方法はさらに、被検体にアジュバントを投与する工程を含む。別の実施形態においては、この方法はさらに、被検体に抗菌剤を投与する工程を含む。
【００４２】
なお別の態様においては、本発明は、被検体の感染を処置または予防するための方法を提供する。この方法は、免疫応答を誘導するための有効量の上記のようなオリゴ糖−担体結合体または上記方法によって合成されたオリゴ糖−担体結合体を、感染を発症しているかまたは感染を発症するリスクがある被検体に投与する工程を含む。ここで、感染は、ＰＮＡＧを作るかまたはＰＮＡＧを作ることができる細菌種によって引き起こされる。
【００４３】
１つの実施形態においては、感染はブドウ球菌感染である。関連する実施形態においては、ブドウ球菌感染はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染である。別の関連する実施形態においては、ブドウ球菌感染はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓである。１つの実施形態においては、被検体はブドウ球菌に曝されるリスクがある。別の実施形態においては、被検体はブドウ球菌に曝されている。
【００４４】
他の実施形態においては、感染は、Ｅ．ｃｏｌｉ感染、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ感染、Ｙ．ｅｎｔｅｒｃｏｌｉｔｉｃａ感染、Ｙ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ感染、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ感染、Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ感染、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ感染、アシネトバクター感染、バークホルデリア感染（例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）、Ｓｔｅｎａｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ感染、赤痢菌感染、またはクレブシエラ感染（例えば、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）である。
【００４５】
いくつかの実施形態においては、オリゴ糖−担体結合体は、アジュバントおよび／または抗菌剤とともに投与される。
【００４６】
なお別の態様においては、本発明は抗体を生産するための方法を提供する。この方法は、天然のＰＮＡＧに特異的な抗体を生産させるための有効量の上記のようなオリゴ糖−担体結合体または上記方法によって合成されたオリゴ糖−担体結合体を被検体に投与する工程、および上記被検体から抗体を単離する工程を含む。
【００４７】
別の態様においては、本発明は、モノクローナル抗体を生産するための方法を提供する。この方法は、天然のＰＮＡＧに特異的な抗体を生産させるための有効量の上記のようなオリゴ糖−担体結合体または上記方法によって合成されたオリゴ糖−担体結合体を被検体に投与する工程、被検体から抗体を生産する細胞を採取する工程、被検体由来の抗体を生産する細胞を骨髄腫細胞に融合させる工程、および融合体のサブクローンによって生産された抗体を採取する工程を含む。
【００４８】
１つの実施形態においては、抗体はポリクローナル抗体である。１つの実施形態においては、被検体はウサギである。別の実施形態においては、被検体はヒトである。
【００４９】
上記概念と以下にさらに詳細に議論されるさらなる概念のあらゆる組み合わせ（そのような概念が互いに矛盾しないという条件で）は、本明細書中に開示される発明性のある主題の一部であると当然考えられべきである。具体的には、本開示の最後に添付されている特許請求される主題の全ての組み合わせが、本明細書中で開示される発明性のある主題の一部であると考えられる。引用により組み入れられる任意の開示の中にも現れるであろう本明細書中で明確に使用される専門用語は、本明細書中に開示される特定の概念と最も矛盾のない意味が与えられるべきであることもまた当然のことである。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１ＡおよびＢは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＰＮＡＧ（Ａ）またはｄＰＮＡＧ（Ｂ）に対する、非アセチル化ノナ−グルコサミン（９ＧｌｃＮＨ２）に対して惹起させた抗血清の結合を示しているグラフである。
【図２】図２ＡおよびＢは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＰＮＡＧまたはｄＰＮＡＧに対する、完全にアセチル化されたノナ−グルコサミン（９ＧｌｃＮＡｃ）に対して惹起させた抗血清の結合を示しているグラフである。
【図３】図３ＡおよびＢは、１１ＧｌｃＮＡｃまたは１１ＧｌｃＮＨ２に対する、結合型９ＧｌｃＮＡｃまたは９ＧｌｃＮＨ２に対して惹起させた抗血清の結合を示しているグラフである。
【図４】図４は、２匹のウサギ（一方には９ＧｌｃＮＨ２−ＴＴ結合体を投与し、他方には９ＧｌｃＮＡｃ−ＴＴ結合体を、ワクチンの最後の注射の２週間後に採取した抗血清とともに投与した）において惹起させた抗血清を使用した、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株ＭＮ８細菌の死滅を示しているグラフである。
【図５】図５は、２匹のウサギ（その一方には９ＧｌｃＮＨ２−ＴＴ結合体を投与し、他方には、９ＧｌｃＮＡｃ−ＴＴ結合体を、ワクチンの最後の注射の４週間後に採取した抗血清とともに投与した）において惹起させた抗血清を使用した、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株ＭＮ８細菌の死滅を示しているグラフであり、破傷風トキソイド（ＴＴ）に結合させ、さらに標識した（０５１）約１００ｋＤａのｄＰＮＡＧ分子からなる共役ワクチンに対して惹起させた抗血清による、同じ細菌の死滅もまた比較のために示す。
【図６】図６〜８は、ＴＴ（９ＧｌｃＮＨ２−ＴＴ）に結合させた完全にアセチル化されたかまたはアセチル化されていない９マーのオリゴグルコサミン（９ＧｌｃＮＨ２）に対するウサギ抗血清（ｂｌｅｅｄ  １）による、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株（図６および８、ＬＡＣ（ＮＴ、ＵＳＡ３００）；図７、ＳＦ８３００（ＮＴ、ＵＳＡ３００））の死滅を比較しているグラフである。比較のために、破傷風トキソイド（ＴＴ）に結合させ、さらに標識した（０５１）約１００ｋＤａのｄＰＮＡＧ分子からなる共役ワクチンに対して惹起させた抗血清による同じ細菌の死滅もまた示す。
【図７】図６〜８は、ＴＴ（９ＧｌｃＮＨ２−ＴＴ）に結合させた完全にアセチル化されたかまたはアセチル化されていない９マーのオリゴグルコサミン（９ＧｌｃＮＨ２）に対するウサギ抗血清（ｂｌｅｅｄ  １）による、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株（図６および８、ＬＡＣ（ＮＴ、ＵＳＡ３００）；図７、ＳＦ８３００（ＮＴ、ＵＳＡ３００））の死滅を比較しているグラフである。比較のために、破傷風トキソイド（ＴＴ）に結合させ、さらに標識した（０５１）約１００ｋＤａのｄＰＮＡＧ分子からなる共役ワクチンに対して惹起させた抗血清による同じ細菌の死滅もまた示す。
【図８】図６〜８は、ＴＴ（９ＧｌｃＮＨ２−ＴＴ）に結合させた完全にアセチル化されたかまたはアセチル化されていない９マーのオリゴグルコサミン（９ＧｌｃＮＨ２）に対するウサギ抗血清（ｂｌｅｅｄ  １）による、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株（図６および８、ＬＡＣ（ＮＴ、ＵＳＡ３００）；図７、ＳＦ８３００（ＮＴ、ＵＳＡ３００））の死滅を比較しているグラフである。比較のために、破傷風トキソイド（ＴＴ）に結合させ、さらに標識した（０５１）約１００ｋＤａのｄＰＮＡＧ分子からなる共役ワクチンに対して惹起させた抗血清による同じ細菌の死滅もまた示す。
【図９】図９〜１６は、ＴＴに結合させた完全にアセチル化されたかまたはアセチル化されていない９マーのオリゴグルコサミンに対するウサギ抗血清（「ｂｌｅｅｄ  ２」と表示）による、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株（図９、ＭＮ８（莢膜多糖類（ＣＰ）８）；図１０、ＬＡＣ（判別不能（ＮＴ）、ＵＳＡ３００））；図１１、ＳＦ８３００（ＮＴ、ＵＳＡ３００））；図１２、Ｎｅｗｍａｎ（ＣＰ５）；図１３、ＰＳ８０；図１４、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（ＣＰ５）；図１５、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（判別不能）；図１６、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（ＣＰ８））の死滅を比較しているグラフである。比較のために、破傷風トキソイド（ＴＴ）に結合させ、さらに標識した（０５１）約１００ｋＤａのｄＰＮＡＧ分子からなる共役ワクチンに対して惹起させた抗血清による同じ細菌の死滅もまた示す。
【図１０】図９〜１６は、ＴＴに結合させた完全にアセチル化されたかまたはアセチル化されていない９マーのオリゴグルコサミンに対するウサギ抗血清（「ｂｌｅｅｄ  ２」と表示）による、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株（図９、ＭＮ８（莢膜多糖類（ＣＰ）８）；図１０、ＬＡＣ（判別不能（ＮＴ）、ＵＳＡ３００））；図１１、ＳＦ８３００（ＮＴ、ＵＳＡ３００））；図１２、Ｎｅｗｍａｎ（ＣＰ５）；図１３、ＰＳ８０；図１４、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（ＣＰ５）；図１５、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（判別不能）；図１６、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（ＣＰ８））の死滅を比較しているグラフである。比較のために、破傷風トキソイド（ＴＴ）に結合させ、さらに標識した（０５１）約１００ｋＤａのｄＰＮＡＧ分子からなる共役ワクチンに対して惹起させた抗血清による同じ細菌の死滅もまた示す。
【図１１】図９〜１６は、ＴＴに結合させた完全にアセチル化されたかまたはアセチル化されていない９マーのオリゴグルコサミンに対するウサギ抗血清（「ｂｌｅｅｄ  ２」と表示）による、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株（図９、ＭＮ８（莢膜多糖類（ＣＰ）８）；図１０、ＬＡＣ（判別不能（ＮＴ）、ＵＳＡ３００））；図１１、ＳＦ８３００（ＮＴ、ＵＳＡ３００））；図１２、Ｎｅｗｍａｎ（ＣＰ５）；図１３、ＰＳ８０；図１４、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（ＣＰ５）；図１５、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（判別不能）；図１６、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（ＣＰ８））の死滅を比較しているグラフである。比較のために、破傷風トキソイド（ＴＴ）に結合させ、さらに標識した（０５１）約１００ｋＤａのｄＰＮＡＧ分子からなる共役ワクチンに対して惹起させた抗血清による同じ細菌の死滅もまた示す。
【図１２】図９〜１６は、ＴＴに結合させた完全にアセチル化されたかまたはアセチル化されていない９マーのオリゴグルコサミンに対するウサギ抗血清（「ｂｌｅｅｄ  ２」と表示）による、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株（図９、ＭＮ８（莢膜多糖類（ＣＰ）８）；図１０、ＬＡＣ（判別不能（ＮＴ）、ＵＳＡ３００））；図１１、ＳＦ８３００（ＮＴ、ＵＳＡ３００））；図１２、Ｎｅｗｍａｎ（ＣＰ５）；図１３、ＰＳ８０；図１４、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（ＣＰ５）；図１５、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（判別不能）；図１６、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（ＣＰ８））の死滅を比較しているグラフである。比較のために、破傷風トキソイド（ＴＴ）に結合させ、さらに標識した（０５１）約１００ｋＤａのｄＰＮＡＧ分子からなる共役ワクチンに対して惹起させた抗血清による同じ細菌の死滅もまた示す。
【図１３】図９〜１６は、ＴＴに結合させた完全にアセチル化されたかまたはアセチル化されていない９マーのオリゴグルコサミンに対するウサギ抗血清（「ｂｌｅｅｄ  ２」と表示）による、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株（図９、ＭＮ８（莢膜多糖類（ＣＰ）８）；図１０、ＬＡＣ（判別不能（ＮＴ）、ＵＳＡ３００））；図１１、ＳＦ８３００（ＮＴ、ＵＳＡ３００））；図１２、Ｎｅｗｍａｎ（ＣＰ５）；図１３、ＰＳ８０；図１４、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（ＣＰ５）；図１５、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（判別不能）；図１６、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（ＣＰ８））の死滅を比較しているグラフである。比較のために、破傷風トキソイド（ＴＴ）に結合させ、さらに標識した（０５１）約１００ｋＤａのｄＰＮＡＧ分子からなる共役ワクチンに対して惹起させた抗血清による同じ細菌の死滅もまた示す。
【図１４】図９〜１６は、ＴＴに結合させた完全にアセチル化されたかまたはアセチル化されていない９マーのオリゴグルコサミンに対するウサギ抗血清（「ｂｌｅｅｄ  ２」と表示）による、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株（図９、ＭＮ８（莢膜多糖類（ＣＰ）８）；図１０、ＬＡＣ（判別不能（ＮＴ）、ＵＳＡ３００））；図１１、ＳＦ８３００（ＮＴ、ＵＳＡ３００））；図１２、Ｎｅｗｍａｎ（ＣＰ５）；図１３、ＰＳ８０；図１４、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（ＣＰ５）；図１５、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（判別不能）；図１６、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（ＣＰ８））の死滅を比較しているグラフである。比較のために、破傷風トキソイド（ＴＴ）に結合させ、さらに標識した（０５１）約１００ｋＤａのｄＰＮＡＧ分子からなる共役ワクチンに対して惹起させた抗血清による同じ細菌の死滅もまた示す。
【図１５】図９〜１６は、ＴＴに結合させた完全にアセチル化されたかまたはアセチル化されていない９マーのオリゴグルコサミンに対するウサギ抗血清（「ｂｌｅｅｄ  ２」と表示）による、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株（図９、ＭＮ８（莢膜多糖類（ＣＰ）８）；図１０、ＬＡＣ（判別不能（ＮＴ）、ＵＳＡ３００））；図１１、ＳＦ８３００（ＮＴ、ＵＳＡ３００））；図１２、Ｎｅｗｍａｎ（ＣＰ５）；図１３、ＰＳ８０；図１４、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（ＣＰ５）；図１５、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（判別不能）；図１６、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（ＣＰ８））の死滅を比較しているグラフである。比較のために、破傷風トキソイド（ＴＴ）に結合させ、さらに標識した（０５１）約１００ｋＤａのｄＰＮＡＧ分子からなる共役ワクチンに対して惹起させた抗血清による同じ細菌の死滅もまた示す。
【図１６】図９〜１６は、ＴＴに結合させた完全にアセチル化されたかまたはアセチル化されていない９マーのオリゴグルコサミンに対するウサギ抗血清（「ｂｌｅｅｄ  ２」と表示）による、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株（図９、ＭＮ８（莢膜多糖類（ＣＰ）８）；図１０、ＬＡＣ（判別不能（ＮＴ）、ＵＳＡ３００））；図１１、ＳＦ８３００（ＮＴ、ＵＳＡ３００））；図１２、Ｎｅｗｍａｎ（ＣＰ５）；図１３、ＰＳ８０；図１４、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（ＣＰ５）；図１５、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（判別不能）；図１６、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（ＣＰ８））の死滅を比較しているグラフである。比較のために、破傷風トキソイド（ＴＴ）に結合させ、さらに標識した（０５１）約１００ｋＤａのｄＰＮＡＧ分子からなる共役ワクチンに対して惹起させた抗血清による同じ細菌の死滅もまた示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、最後の免疫化の６週間後に得た９ＧｌｃＮＨ２−ＴＴに対するウサギ抗血清による２種類のＰＮＡＧ陽性Ｅ．ｃｏｌｉ株（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪおよびＥ．ｃｏｌｉ  Ｐ）（ＰＮＡＧ陰性Ｅ．ｃｏｌｉ株（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｈ）ではない）の死滅を示しているグラフである。
【図１７】図１７、１８、および１９は、ＴＴに結合させた９マーのアセチル化されていないオリゴグルコサミン（９ＧｌｃＮＨ２−ＴＴ、ｂｌｅｅｄ  ２）に対して惹起させ、２×１０４（図１８）、２×１０５（図１９）、または２×１０６（図２０）ＣＦＵのＳ．ａｕｒｅｕｓ株ＬＡＣでの感染の２４時間前にマウスに投与した、抗血清での免疫化後のＳ．ａｕｒｅｕｓによる皮膚の膿瘍感染の予防に関するインビボでの実験の結果を示しているグラフである。
【図１８】図１７、１８、および１９は、ＴＴに結合させた９マーのアセチル化されていないオリゴグルコサミン（９ＧｌｃＮＨ２−ＴＴ、ｂｌｅｅｄ  ２）に対して惹起させ、２×１０４（図１８）、２×１０５（図１９）、または２×１０６（図２０）ＣＦＵのＳ．ａｕｒｅｕｓ株ＬＡＣでの感染の２４時間前にマウスに投与した、抗血清での免疫化後のＳ．ａｕｒｅｕｓによる皮膚の膿瘍感染の予防に関するインビボでの実験の結果を示しているグラフである。
【図１９】図１７、１８、および１９は、ＴＴに結合させた９マーのアセチル化されていないオリゴグルコサミン（９ＧｌｃＮＨ２−ＴＴ、ｂｌｅｅｄ  ２）に対して惹起させ、２×１０４（図１８）、２×１０５（図１９）、または２×１０６（図２０）ＣＦＵのＳ．ａｕｒｅｕｓ株ＬＡＣでの感染の２４時間前にマウスに投与した、抗血清での免疫化後のＳ．ａｕｒｅｕｓによる皮膚の膿瘍感染の予防に関するインビボでの実験の結果を示しているグラフである。
【図２０】図２０は、図１７〜１９の結果のまとめである。
【図２１】図２１、２２、および２３は、９マーのアセチル化されていないオリゴグルコサミンに対して惹起させ、１×１０６  ＣＦＵのＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＮ８（図２１）、４×１０６  ＣＦＵのＳ．ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎ（図２２）、および４×１０６  ＣＦＵのＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＮｅｗｍａｎΔｉｃａと１．５×１０６  ＣＦＵのＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＮ８Δｉｃａ（図２３）での感染の前にマウスに投与した、抗血清での免疫化後のＳ．ａｕｒｅｕｓ膿瘍感染の予防に関するインビボでの実験の結果を示しているグラフである。
【図２２】図２１、２２、および２３は、９マーのアセチル化されていないオリゴグルコサミンに対して惹起させ、１×１０６  ＣＦＵのＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＮ８（図２１）、４×１０６  ＣＦＵのＳ．ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎ（図２２）、および４×１０６  ＣＦＵのＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＮｅｗｍａｎΔｉｃａと１．５×１０６  ＣＦＵのＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＮ８Δｉｃａ（図２３）での感染の前にマウスに投与した、抗血清での免疫化後のＳ．ａｕｒｅｕｓ膿瘍感染の予防に関するインビボでの実験の結果を示しているグラフである。
【図２３】図２１、２２、および２３は、９マーのアセチル化されていないオリゴグルコサミンに対して惹起させ、１×１０６  ＣＦＵのＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＮ８（図２１）、４×１０６  ＣＦＵのＳ．ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎ（図２２）、および４×１０６  ＣＦＵのＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＮｅｗｍａｎΔｉｃａと１．５×１０６  ＣＦＵのＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＮ８Δｉｃａ（図２３）での感染の前にマウスに投与した、抗血清での免疫化後のＳ．ａｕｒｅｕｓ膿瘍感染の予防に関するインビボでの実験の結果を示しているグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本発明は、オリゴ糖結合体の合成と使用に広く関係する。本発明は、新規の組成物を生成するためにオリゴ糖結合体の合成と使用で使用される新しい合成方法と組成物を提供する。これらの合成経路は、別の方法では自然界に存在している多糖類抗原を使用することができないオリゴ糖または多糖類の修飾を容易にする。
【００５２】
本発明は、とりわけ、定義された順序の複数の単量体を有しているオリゴ−β−（１→６）−Ｄ−グルコサミンオリゴ糖または多糖類の調製のための方法、その後の担体化合物への結合のためのリンカーに対するそのようなオリゴ糖または多糖類の結合のための方法、オリゴ糖−担体結合体または多糖−担体結合体の調製のための方法、およびこれらの様々な化合物の組成物を提供する。本発明はさらに、これらの調製方法において以前から知られているリンカーよりも思いのほかさらに有用である様々な新規のリンカーに関する。得られるオリゴ糖−担体結合体は、ヒトおよびヒト以外の被検体において、オリゴ糖自体に対する抗体の生成、ならびに対応する自然界に存在しているＰＮＡＧおよびｄＰＮＡＧ抗原の生成を含むインビボでの免疫応答の刺激に有用である。
【００５３】
ＰＮＡＧ抗原およびｄＰＮＡＧ抗原は、公開されているＰＣＴ出願番号ＷＯ２００４／０４３４０５においてさらに詳細に記載されている。簡単に説明すると、ＰＮＡＧは、ポリＮ−アセチルグルコサミンをいい、これは、ブドウ球菌（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）を含むがこれに限定されない様々な細菌種によって作られる表面多糖である。ＰＮＡＧは自然界においては、高度にアセチル化された形態とほとんどアセチル化されていない形態の両方で存在する。ＰＮＡＧの「高度にアセチル化された」形態は、５０％を上回る酢酸塩置換を有しているＰＮＡＧである。ＰＮＡＧのほとんどアセチル化されていない形態（本明細書中ではｄＰＮＡＧと呼ばれる）は、０％〜４０％のアセチル化を有し得る（存在するとすればＲ１がアセチル基の位置を示す式ＶＩＩを参照のこと）。天然のＰＮＡＧは、様々なアセチル化の程度を有する複数のＰＮＡＧ形態の混合物である。天然のＰＮＡＧは、ＰＮＡＧのより高度にアセチル化された形態との混合物の中にｄＰＮＡＧを含み得る。ＰＮＡＧまたはｄＰＮＡＧは、数百または数千、あるいはそれ以上のグルコサミン単位（または単量体）からなり得る。
【００５４】
本発明のオリゴ糖は、ＰＮＡＧまたはｄＰＮＡＧの複数の領域を模倣するように意図される。したがって、インビボで使用される場合には、オリゴ糖−担体結合体は、ＰＮＡＧおよび／またはｄＰＮＡＧと同様あるいは同じオリゴ糖の領域に特異的な免疫応答を誘導し、したがってそのような免疫応答は、ＰＮＡＧおよび／またはｄＰＮＡＧを作るまたは作ることができる細菌種を標的化することにおいて有用である。
【００５５】
本発明のいくつかの態様においては、オリゴ糖はＤ−グルコサミン単位だけ、またはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位だけからなるか、あるいは、予め決定された比および順序の両方のタイプのこれらの単量体からなる。比と順序は、いくつかの実施形態においては、天然のＰＮＡＧにおいて見られる比と順序を模倣するように意図される。オリゴ糖は、その末端（例えば、その還元性末端）にチオール基を有しているスペーサー（またはリンカー（これらの用語が本明細書中で互換的に使用されるとおりである））を含むように本発明にしたがって操作される。
【００５６】
１つ以上の担体への結合に適しているアミン基を含むオリゴ糖（例えば、連結されたグルコサミンオリゴ糖（またはオリゴグルコサミン（これらの用語が本明細書中で互換的に使用されるとおりである））の調製は、当該分野では困難であることが立証されている。これは、連結されたグルコサミンの立体特異的合成には、単量体間に不可欠なβ−グリコシド結合を形成させるために、グリコシルドナーの中の関与があるが一時的なアシルＮ保護基（いわゆる、「関与」基）の使用が必要であることに一部原因がある。Ｎ−フタロイル、Ｎ−トリクロロエトキシカルボニル、およびいくつかの他の部分が関与基として適している。しかし、本発明によって意図されるオリゴ糖のいくつかの中に存在するＮ−アセチル関与基を含む特定の他の関与基は、あまり適さない。一例として、Ｎ−アセチル化グリコシルドナーは反応性が低く、ごくわずかな量のグリコシル化産物しかもたらさない。加えて、グリコシルドナーの中のＮ−アセチル基の存在は、オキサゾリン中間体の形成、Ｎ−アセチル基の移動、および他の望ましくない化学反応が原因で、グリコシル化反応を複雑にする。
【００５７】
連結されたグルコサミン、それらの構造、および特にアミノ基の数に関して、これらには、全てのアミノ基の遊離（ｌｉｂｅｒａｔｉｏｎ）の前にリンカーを導入することが必然的に伴う。遊離のオリゴ糖を調製するための上記一時的なＮ−保護基の除去は、塩基性条件下で行われる。Ｎ−フタロイル関与基の除去に最も有効な試薬は、沸騰エタノール（ｂｏｉｌｉｎｇ  ｅｔｈａｎｏｌ）中の抱水ヒドラジンである。この試薬は、目的のオリゴ糖の中に含まれ得るアセチル基およびベンゾイル基を含むＯ−アシル保護基もまた効率よく除去する。
【００５８】
タンパク質へのアミノ含有リガンドの結合に使用されてきた市販されているリンカーは、ペンタフルオロフェニルＳ−アセチルチオグリコレート（実施例に示す化学構造８）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミジル３−アセチルスルファニル−プロピオネート（実施例に示す化学構造１２）である。これらの連結試薬は、チオール部分をオリゴ糖に導入するために使用できるが、実施例にさらに詳細に記載されるように、いずれもフタロイル基の除去の条件下では不安定であった。実施例５は、チオグリコール酸をベースとするリンカーが酸化的転位を受けることを示しており、実施例６は、３−メルカプトプロピオン酸の誘導体が副生成物の複合混合物を生じることを示す。いずれの変換によっても必要なチオール機能が失われる。
【００５９】
したがって、本発明は、オリゴ糖（そのアミン含有バージョンを含む）を担体（例えばタンパク質）に結合させるための、以前から知られているリンカーよりも効率がよく優れているリンカーの１つのクラスの発見と使用に一部基づく。このクラスのリンカーは、式Ｉのω−アセチルスルファニル炭酸の誘導体（式中、ｎ＞１）と定義される。
【００６０】
【化１２】
0005555230.tif 000024
このクラスのリンカーは、オリゴ糖への結合の間に効率的なＮ−アセチル化を提供する。このリンカーは、式Ｉの活性化エステル、またはそのシアノ、アジド、もしくはハロゲン誘導体であり得る。これは、そのような誘導体がアシル化剤として活性であり、それにより本発明のオリゴ糖への結合に適しているとの条件で、式Ｉの別の誘導体であり得る。Ｙは、当該分野で公知であり、アシル基とアセチル基を含む、硫黄原子の一時的な保護基を示す。Ｙ基の除去により、オリゴ糖の担体への結合に必要なＳＨ基が遊離する。Ｘは、式Ｉの化合物に必要なアシル化能力を提供する任意の脱離基を示す。
【００６１】
本発明によって提供される任意のクラスのリンカーは、担体化合物にオリゴ糖を結合させるために使用できると理解される。
【００６２】
一例として、１つのリンカークラスは、式ＩＩの構造を含み得る（式中、ｎ＞１）：
【００６３】
【化１３】
0005555230.tif 000025
別の例として、別のリンカークラスは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル誘導体を含み得る。そのようなリンカーの例は、実施例１および３に記載されるように、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル４−アセチルスルファニルブチラート（スキーム１の化合物２、実施例１および３）である。このリンカーは以下のような式ＩＩＩの構造を有する：
【００６４】
【化１４】
0005555230.tif 000026
このリンカーは、炭水化物（例えば、オリゴ糖および多糖類）の脱保護の全体の条件下で安定である。
【００６５】
活性化エステルの別の例は、Ｎ−ニトロフェニル４−アセチルスルファニルブチラート（化合物３、実施例２および３）である。この化合物は以下のような式ＩＶの構造を有する：
【００６６】
【化１５】
0005555230.tif 000027
本発明は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル４−アセチルスルファニルブチラート（式ＩＩＩ）を合成するための方法を提供する。この方法は、４−アセチルスルファニル酪酸（式Ｖ）
【００６７】
【化１６】
0005555230.tif 000028
をＮ−ヒドロキシスクシンイミジルトリフルオロアセテート（ＣＦ３ＣＯＯＳｕ）と反応させて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル４−アセチルスルファニルブチラート（式ＩＩＩ）を生じさせる工程を含む。
【００６８】
本発明はさらに、Ｎ−ニトロフェニル４−アセチルスルファニルブチラート（式ＩＶ）を合成するための方法を提供する。この方法は、４−アセチルスルファニル酪酸（式Ｖ）：
【００６９】
【化１７】
0005555230.tif 000029
をＮ−ニトロフェニルトリフルオロアセテート（ＣＦ３ＣＯＯｐＮｐ）と反応させて、Ｎ−ニトロフェニル４−アセチルスルファニルブチラート（式ＩＶ）を生じさせる工程を含む。
【００７０】
これらの合成方法は実施例の中でさらに詳細に記載される。
【００７１】
本発明はさらに、オリゴ糖の「還元性末端」でグルコサミン単位のＯｌ原子に結合させられたリンカーを含むオリゴ糖を含有する組成物を提供する。このＯｌ結合リンカーは、式Ｉの化合物との反応によりＳＨ含有リンカーに結合させるために使用される。Ｏ１結合リンカーは、アミノアルキル基を有している式Ｖａ（以下）の構造を有し、式中、ｍは１〜１０までで変化し得、ＲはＨまたは簡単なアルキル基（例えば、メチル基またはエチル基）であり得る。あるいは、Ｏｌ結合リンカーは、式Ｖｂの構造（以下）を有し得、式中、ｐは、１〜２０までで変化し得、Ｒは式Ｖａ中と同じである。
【００７２】
【化１８】
0005555230.tif 000030
したがって、本発明のオリゴ糖結合体は、式ＶａまたはＶｂの化合物を式Ｉの化合物とカップリングさせることによって合成され得る。一時的なＳ−保護基の変換とその後の除去（実施例８）、または対応する中間体ジスルフィドの還元（実施例７）により、オリゴ糖の担体化合物との結合に使用される最終的な連結基の生成が生じる。そのような最終的な連結基は実施例７および８に記載され、式ＶＩの構造を有する。
【００７３】
【化１９】
0005555230.tif 000031
オリゴ糖は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００個の単糖単量体を含み得る。いくつかの重要な実施形態においては、オリゴ糖は５個以上の単量体を含み、５、７、９または１１個の単量体を含む。いくつかの実施形態においては、オリゴ糖は、２〜２０個の単量体、または３〜２０個の単量体、または４〜２０個の単量体、または５〜２０個の単量体を含む。
【００７４】
いくつかの重要な実施形態においては、単量体はグルコサミンであり、オリゴ糖は連結されたグルコサミンである。グルコサミン単量体の構造（連結されたグルコサミンの中に存在する場合）は以下のとおりである：
【００７５】
【化２０】
0005555230.tif 000032
式中、Ｒ１は、「遊離の」アミノ基を持つグルコサミン単位の場合にはＨであり、また、Ｒ１は、Ｎ−アセチル化グルコサミン単位の場合にはアセチル基（ＣＯＣＨ３）である。これらの単位はβ−（１→６）−結合によって連結される。２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０個、またはそれ以上の単位から１００単位まで（アセチル基で置換されているかまたは未置換であるかは問わない）を含む、任意の数のグルコサミン単位が連結され得る。
【００７６】
式ＶＩＩの化合物中のＮ−アセチル化の程度は様々であり得る。これは、０〜５０％のＮ−アセチル化の範囲（すなわち、Ｒ１のうちの０〜５０％がアセチル基である）であり得、これには０〜４０％のＮ−アセチル化が含まれる。いくつかの実施形態においては、β−（１→６）結合グルコサミンは、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、または５％未満がＮ−アセチル化グルコサミンである。いくつかの重要な実施形態においては、オリゴ糖の中でのＮ−アセチル化のレベルとアセチル基の位置は、合成方法によってわかる。すなわち、オリゴ糖は、Ｎ−アセチル基を有しているグルコサミン単位またはＮ−アセチル基を有さないグルコサミン単位の規則正しい配列から合成され得る。実施例は、定義された規則正しいアセチル置換を有しているオリゴ糖を生産するための方法を提供する。加えて、Ｇｅｎｉｎｇら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００７  ３４２：５６７−５７５，Ｇｅｎｉｎｇら、Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｊ  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍ  ２００６  ３２（４）：３８９−３９９，Ｙａｎｇ  ａｎｄ  Ｄｕ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００３  ３３８：４９５−５０２，Ｙａｎｇら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００３  ３３８：１３１３−１３１８、およびＦｒｉｄｍａｎら、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２００２  ４（２）：２８１−２８３を参照することができる。
【００７７】
本発明はなおさらに、式ＶＩＩＩａまたはＶＩＩＩｂのリンカーを介して担体化合物に結合させられたオリゴ糖を含むオリゴ糖−担体結合体を含有する組成物を提供する。
【００７８】
【化２１】
0005555230.tif 000033
式中、リンカーはオリゴ糖にＯ結合され、担体化合物にＮ結合される。
【００７９】
本発明はさらに、オリゴ糖−担体結合体を合成するための方法を提供する。この方法は、式ＩＸａまたはＩＸｂの構造：
【００８０】
【化２２】
0005555230.tif 000034
（実施例７および８に由来する化合物の場合）
を有しているリンカーのような、ＳＨ終結リンカーを含むオリゴ糖結合体を、式Ｘの化合物：
【００８１】
【化２３】
0005555230.tif 000035
の結合によりその中の末端アミノ基が修飾されている担体化合物と反応させて、式ＶＩＩＩａまたはＶＩＩＩｂの構造を有しているリンカーを介して担体化合物に結合させられたオリゴ糖を生じさせる工程による。
【００８２】
いくつかの実施形態においては、式ＶＩＩＩａまたはＶＩＩＩｂのリンカーは、その末端ＣＨ２基を介して、オリゴ糖の「還元性末端」でグルコサミン単位のＯｌ原子に連結される。そのような連結はＯ結合とみなされ、このオリゴ糖はリンカーにＯ結合されていると言われる。
【００８３】
いくつかの実施形態においては、式ＶＩＩＩａまたはＶＩＩＩｂのリンカーは、アミド結合によって担体化合物中のアミノ基に対して、末端ＣＯ基を介して連結される。そのような連結はＮ結合とみなされ、この担体はリンカーにＮ結合されていると言われる。
【００８４】
アミノ基含有担体と、上記のような、実施例８および９に記載のＳＨ終結リンカーを有しているオリゴグルコサミンとの結合体の調製には、試薬ＳＢＡＰを使用することができる。しかし、本発明は、（特に、Ｇ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，２００８に記載されているような）アミノ基含有担体とＳＨ終結オリゴ糖を連結させるために適している他の試薬の使用を意図する。
【００８５】
担体化合物
「担体化合物」（または担体（これらの用語が本明細書中で互換的に使用されるとおりである））は、本明細書中で使用される場合は、本発明のリンカーの使用によりオリゴ糖に結合させられる化合物である。典型的には、担体化合物は、オリゴ糖リガンドに対する免疫応答を増強するものである。
【００８６】
担体化合物としては、タンパク質、ペプチド、多糖類、核酸、または他のポリマー、脂質、および小さいオリゴマー分子（ｓｍａｌｌ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、特にデンドリマーが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態においては、担体化合物は自然界に存在しているものであり得、また、自然界に存在しているものに由来するものでもあり得る。タンパク質としては、例えば、以下が挙げられる：血漿タンパク質（例えば、血清アルブミン、免疫グロブリン、アポリポタンパク質、およびトランスフェリン）；細菌ポリペプチド（例えば、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＴＲＰＬＥ、β−ガラクトシダーゼ、ヘルペスｇＤタンパク質のようなポリペプチド、アレルギー誘発物質、ジフテリアトキソイド、サルモネラのフラジェリン（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）、ヘモフィルスの繊毛（ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐｉｌｉｎ）、ヘモフィルスの１５ｋＤａ、２８〜３０ｋＤａ、および４０ｋＤａの膜タンパク質、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの易熱性エンテロトキシン（ｈｅａｔ  ｌａｂｅｌ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ）ｌｔｂ、コレラ毒素、ならびにウイルスタンパク質（ロタウイルスＶＰ、ならびに呼吸器合胞体ウイルスｆおよびｇタンパク質を含む）。本発明に有用な担体としては、哺乳動物への投与について安全であり、状況に応じて、免疫学的に有効な担体タンパク質である任意のタンパク質が挙げられる。したがって、いくつかの実施形態においては、担体化合物はそれ自体が免疫原性であり得る。例として、限定されないが本明細書中に列挙されるもののような細菌種に対するワクチンにおいて、またはそのようなワクチンとして使用されている化合物が挙げられる。
【００８７】
免疫化に特に有用である担体化合物としては、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤のようなタンパク質が挙げられる。免疫化される動物の種において免疫原性である任意の他の化合物が同様に使用され得る。
【００８８】
実施例に示されるように、本発明のオリゴ糖−担体結合体における担体に対するオリゴ糖の比は様々であり得る。例えば、オリゴ糖−担体結合体は、１：１、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも９：１、または少なくとも１０：１の、担体に対するオリゴ糖の比を有し得る。なお他の実施形態においては、この比は、少なくとも２０：１、少なくとも３０：１、少なくとも４０：１、少なくとも５０：１、少なくとも６０：１、少なくとも７０：１、少なくとも８０：１、少なくとも９０：１、またはそれ以上であり得、例えば、オリゴ糖リガンドの結合についての担体化合物の能力に応じて１００：１または７００：１までであり得る。一例として、少なくとも３：１の担体に対するオリゴ糖の比を有する結合体は、１つの担体化合物に対して少なくとも３個のオリゴ糖部分が結合した結合体である。
【００８９】
有用性
本発明の組成物は、多数のインビトロでの用途とインビボでの用途を有する。例えば、本発明の組成物は、抗体応答を生じさせるために、例えば、天然のＰＮＡＧを作るかまたは作ることができる細菌の種（ブドウ球菌を含むがこれに限定されない）による感染を防ぐための、ヒトおよび動物の能動免疫化のためのワクチンとして；天然のＰＮＡＧを作るかまたは作ることができる細菌の種（ブドウ球菌を含むがこれに限定されない）による感染を予防もしくは処置するために他のヒトあるいは動物に投与することができる抗ｄＰＮＡＧ抗体を生産するようにヒトあるいは動物を免疫化するためのワクチンとして；天然のＰＮＡＧを作るかまたは作ることができる細菌の種（ブドウ球菌を含むがこれに限定されない）による感染を予防することができるモノクローナル抗体、抗体を作ることに関係がある遺伝子のライブラリー、またはペプチド模倣物のような生物学的因子をスクリーニングするための抗原として；天然のＰＮＡＧを作るかまたは作ることができる細菌の種（ブドウ球菌を含むがこれに限定されない）による感染についての診断試薬として；ならびに、天然のＰＮＡＧを作るかまたは作ることができる細菌の種（ブドウ球菌を含むがこれに限定されない）による感染に対するそれらの感受性に関してヒトまたは動物の免疫学的状態を決定するための診断試薬として有用である。
【００９０】
感染の処置および予防
本発明は、被検体において、天然のＰＮＡＧを作るかまたは作ることができる細菌の種（ブドウ球菌を含むがこれに限定されない）による感染を処置または予防するための方法を提供する。この方法は、本発明のオリゴ糖−担体結合体の免疫応答を誘導するための有効量を、そのような感染を発症しているかまたはそのような感染を発症するリスクがある被検体に投与する工程を含む。
【００９１】
本発明の別の態様は、被検体において、天然のＰＮＡＧを作るかまたは作ることができる細菌の種（ブドウ球菌を含むがこれに限定されない）による感染に対して防御する本発明の結合体の能力を評価するための方法を提供する。この方法は、有効量の結合体を被検体に投与する工程（ここで、結合体は、能動免疫を誘導する）、被検体を天然のＰＮＡＧを作るかまたは作ることができる細菌種に曝す工程、および被検体における上記細菌種の存在を試験する工程を含む。
【００９２】
被検体は、上記細菌種への暴露のリスクがある被検体であり得、また、上記細菌種に暴露されている被検体でもあり得る。結合体は、他の薬剤（例えば、１種類以上のアジュバントおよび／または１種類以上の抗菌剤などであるがこれに限定されない）と一緒に組成物中で投与され得る。
【００９３】
感染はブドウ球菌感染であり得る。ブドウ球菌感染は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ感染であり得るが、そのように限定はされない。感染は、Ｅ．ｃｏｌｉ感染、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ感染、Ｙ．ｅｎｔｅｒｃｏｌｉｔｉｃａ感染、Ｙ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ感染、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ感染、Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ感染、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ感染、アシネトバクター感染（アシネトバクター複合生物による感染を含む）、バークホルデリア感染（バークホルデリア複合生物による感染を含む）、Ｓｔｅｎａｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ感染、赤痢菌（様々な種）感染、またはクレブシエラ（様々な種）感染であり得る。
【００９４】
本発明にしたがって生成された抗体はまた、オリゴ糖−担体結合体に対する免疫応答によって誘導された抗体と反応する分子をつくる任意の感染性または病原性微生物による感染を予防あるいは処置するためにも使用され得る。
【００９５】
「免疫応答（例えば、抗体応答）を誘導するための有効量」は、本明細書中で使用される場合は、（ｉ）例えば、被検体において抗体の生産を誘導すること、記憶細胞の生産を誘導すること、およびおそらく、細胞傷害性リンパ球反応などにより、その自身の免疫防御を生じるように被検体を支援するため、ならびに／あるいは（ｉｉ）ＰＮＡＧを作るかもしくは作ることができる感染性または病原性微生物（ブドウ球菌を含むがこれに限定されない）に曝される被検体において感染が起こることを防ぐために十分な量である。
【００９６】
いくつかの好ましい実施形態においては、免疫応答を刺激するためのワクチンの有効量は、少なくとも２種類のブドウ球菌（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）と交差反応性である抗体の生産を誘発することができるワクチンの量である。
【００９７】
当業者は、ある量が能動免疫を誘導するために十分であるかどうかを、当該分野で公知の日常的に行われている方法によって評価することができる。例えば、哺乳動物において抗体を生産する特異的結合体の能力は、結合体またはそれらの対応するオリゴ糖を使用してマウスあるいは他の被検体において抗体についてスクリーニングすることによって評価することができる。
【００９８】
本明細書中で使用される被検体としては、ヒトおよびヒト以外の被検体が挙げられる。ヒト以外の被検体としては、伴侶動物（例えば、イヌ、猫、フェレット、鳥類など）、農業用動物（例えば、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ニワトリなど）、動物園の動物（例えば、キリン、ライオン、トラ、ゾウ、クマなど）、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）が挙げられるが、これらに限定されない。被検体は６０歳を超えたヒトであり得る。被検体は健常者であり得る。
【００９９】
本発明にしたがって処置される被検体には、病院環境にある細菌への暴露の結果としてブドウ球菌感染を発症するリスクがある入院患者が含まれる。Ｓ．ａｕｒｅｕｓによる感染を発症することについて特にハイリスクの集団には、例えば、透析を受けている腎臓病患者、ハイリスクの外科手術を受けている個体が含まれる。Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓによる感染を発症することについてハイリスクの集団（例えば、留置型の医療用デバイス（ｉｎｄｗｅｌｌｉｎｇ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｄｅｖｉｃｅｓ）（例えば、静脈ライン（例えば、中心静脈ライン）、またはプロテーゼ（例えば、腰または膝の人工関節置換プロテーゼ）を持つ患者）もまた、臨床単離株は、多くの場合に、プラスチックの表面に対して高度に付着性であるので含まれる。いくつかの実施形態においては、被検体は医療用デバイスが埋め込まれた被検体であり、他の実施形態においては、被検体は、医療用デバイスは埋め込まれていないが、埋め込まれるように予定され得る被検体である。Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓによる感染を発症するハイリスクの被検体にはさらに、例えば、早期新生児、および化学療法を受けている患者が含まれる。本発明にしたがって処置されるさらなる被検体には、発病し、そして病因環境または地域集団環境における細菌への暴露の結果としてＰＮＡＧを作るかまたは作ることができる微生物の感染を発症するリスクがある地域集団の中の、入院患者あるいは個体が含まれる。
【０１００】
免疫応答の誘導および抗体の作製
本発明はさらに、被検体において免疫応答を刺激するための方法を提供する。この方法は、被検体において免疫応答を刺激するために有効な量の本発明のオリゴ糖−担体結合体をそれが必要な被検体に投与する工程を含む。免疫応答は抗原特異的免疫応答であり得る。これは、細胞性免疫応答および／または体液性免疫応答であり得る。例えば、免疫応答は、抗体および／または抗体を生産する細胞の生産を生じ得る。
【０１０１】
「受動免疫」は、本明細書中で使用される場合は、被検体への抗体の投与（ここで、抗体は異なる被検体（同じ種の被検体および異なる種の被検体を含む）の中で生産される）を含み、その結果、抗体は細菌の表面に付着し、細菌の取り込みを生じる。
【０１０２】
本発明の結合体を使用して作製された抗体は、ＰＮＡＧを作る種、または受動免疫を誘導するように抗体と反応する別の分子を作る種による感染を発症するリスクがある任意の被検体に投与され得、そしていくつかの実施形態においては、能動免疫を誘導することができない被検体に特に適し得る。抗原での予防接種は、ハイリスクの免疫不全被検体においては完全には有効ではない可能性があるので、これらの被検体には、感染（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓが原因である感染）を予防または処置するために、本発明のオリゴ糖−担体結合体に対して惹起された抗体調製物での処置が有効であろう。免疫応答を誘導することができない被検体は免疫不全被検体（例えば、化学療法を受けている患者、ＡＩＤＳ患者など）または免疫系がまだ発達していない被検体（例えば、早期新生児）である。
【０１０３】
したがって、本発明は、抗体を生産するための方法を提供する。この方法は、本発明のオリゴ糖−担体結合体を使用して、生物（例えば、ブドウ球菌）によって発現されるＰＮＡＧ分子に特異的な抗体を生産させるための有効量を被検体に投与する工程、および被検体から抗体を単離する工程を含む。抗体はポリクローナル抗体であり得る。抗体はさらに修飾され得る。
【０１０４】
本発明はさらに、モノクローナル抗体を生産するための方法を提供する。この方法は、本発明のオリゴ糖−担体結合体を使用して、ＰＮＡＧ分子に特異的な抗体を生産させるための有効量を被検体に投与する工程、抗体を生産する細胞を、被検体由来のそのような細胞を含む任意の組織（例えば、脾臓または血液）から採取する工程、被検体由来の抗体を生産する細胞を骨髄腫細胞に対して融合させる工程、および融合体のサブクローンによって生産された抗体を採取する工程を含む。
【０１０５】
本発明は、本発明のオリゴ−β−（１→６）−Ｄ−グルコサミンに特異的な様々な抗体の作製を意図する。これらの抗体には、キメラ抗体（例えば、ヒト化抗体および抗体断片、ならびに完全なモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体）が含まれる。「ヒト化モノクローナル抗体」は、本明細書中で使用される場合は、少なくともヒト定常領域と、ヒト以外の種に由来する抗原結合領域（例えば、１、２、３、４、５、もしくは６個のＣＤＲ、または１もしくは２個の可変領域、またはＦａｂもしくはＦ（ａｂ）２断片）を有しているヒトモノクローナル抗体あるいはその機能的活性のある断片である。例えば、ヒト化モノクローナル抗体は、もとの抗体のエピトープ特異性を保ったまま、ヒト抗体の類似する領域でヒト以外の哺乳動物の抗体の非ＣＤＲ領域を置き換えることによって構築され得る。例えば、非ヒトＣＤＲ、および状況に応じてフレームワーク領域のいくつかは、機能性抗体が生産されるように、ヒトＦＲおよび／またはＦｃ／ｐＦｃ’領域に共有結合され得る。欧州特許出願番号０２３９４００（その内容全体が引用により本明細書中に組み入れられる）は、マウス（または他のヒト以外の哺乳動物）抗体の少なくともＣＤＲ部分がヒト化抗体に含まれている、ヒト化モノクローナル抗体の生産および使用についての例示的な教示を提供する。特異的なマウス抗体領域からヒト化抗体を商業的に合成できる団体（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、Ａｂｇｅｎｉｘ、およびＭｅｄａｒｅｘ）が米国に複数ある。
【０１０６】
単離された形態の、または薬学的調製物中の完全なヒト化モノクローナル抗体は、本発明のいくつかの態様に特に適している。ヒト化抗体は、特定の臨床的有用性を有する。その理由は、これらはヒトにおいては、抗体自体に対して免疫応答を引き起こすことはないであろうからである。１つの好ましい実施形態においては、マウスＣＤＲがヒト抗体のフレームワーク領域に移植されて、「ヒト化抗体」が調製される。例えば、Ｌ．Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２，３２３（１９８８）；Ｍ．Ｓ．Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４，２６８（１９８５）、およびＥＰＡ  ０  ２３９  ４００（１９８７年９月３０日に公開された）を参照のこと。
【０１０７】
ヒトモノクローナル抗体は、以下のような任意の当該分野で公知の方法によって作られ得る：Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋらに対して発行された米国特許第５，５６７，６１０号、Ｏｓｔｂｅｒｇに対して発行された米国特許第５６５，３５４号、Ｂａｋｅｒらに対して発行された米国特許第５，５７１，８９３号、Ｋｏｚｂｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ，ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）、およびＢｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６−９５（１９９１）の中で開示されている方法。
【０１０８】
ヒトモノクローナル抗体を調製するための従来法に加えて、そのような抗体はまた、ヒト抗体を生産することができるトランスジェニック動物を免疫化することによっても調製され得る（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：３３（１９９３）、およびＬｏｎｂｅｒｇに対して発行された米国特許第５，５６９，８２５号）。
【０１０９】
ヒト抗体はまた、ヒトの血液または他の組織から抗体を生産するリンパ球を回収することによっても得ることができる。これらのリンパ球は、研究室において適切な培養条件下で自然に増殖する（ｇｒｏｗ  ｏｎ  ｔｈｅｉｒ  ｏｗｎ）細胞を生じるように処理することができる。細胞培養物は、本発明の結合体に対する抗体の生産についてスクリーニングされ得、その後、クローニングされ得る。クローン培養が、ヒトモノクローナル抗体を生産させるために使用され得るか、または、抗体の重鎖および軽鎖の可変部分をコードする遺伝子エレメントがクローニングされ得、様々なタイプの抗体の生産のために核酸ベクターに挿入され得る。
【０１１０】
抗体断片もまた本発明に含まれる。周知の機能的活性のある抗体断片としては、抗体のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、およびＦｄ断片が挙げられるが、これらに限定されない。完全な抗体のＦｃ断片を持たないこれらの断片は、循環からより迅速に消えてなくなり、完全な抗体よりも非特異的組織への結合が少ない場合がある（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３））。例えば、単鎖抗体は、Ｌａｄｎｅｒらの米国特許第４，９４６，７７８号に記載されている方法にしたがって構築され得る。そのような単鎖抗体は、可動性リンカー部分によって連結された軽鎖および重鎖の可変領域を含む。単離された可変重鎖単一ドメインを含む単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）（「Ｆｄ」）を得るための方法もまた報告されている（例えば、単離された形態でそれらに結合するその標的エピトープに対して十分な親和性を有している抗体重鎖可変領域（ＶＨ単一ドメイン抗体）を同定するためのスクリーニング方法を開示している、Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：６４４−６４６（１９８９）を参照のこと）。既知の抗体重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列に基づいて組み換え体Ｆｖ断片を作製するための方法は当該分野で公知であり、例えば、Ｍｏｏｒｅら、米国特許第４，４６２，３３４号に記載されている。抗体断片の使用と作製を記載している他の参考文献としては、例えば、Ｆａｂ断片（Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５））、Ｆｖ断片（Ｈｏｃｈｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２：１１３０（１９７３）；Ｓｈａｒｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １５：１５９１（１９７６）；Ｅｈｒｉｌｃｈら、米国特許第４，３５５，０２３号）、および抗体分子の一部（Ａｕｄｉｌｏｒｅ−Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ、米国特許第４，４７０，９２５号）が挙げられる。したがって、当業者は、抗体の特異性を損なうことなく、完全な抗体の様々な部分に由来する抗体断片を構築できる。
【０１１１】
組成物および薬学的調製物
例えば本発明のオリゴ糖−担体結合体を含む本発明の組成物は、薬学的に許容される賦形剤と一緒に処方され得る。用語「薬学的に許容される賦形剤」は、本明細書中で使用される場合は、ヒトまたは他の動物への投与に適している１種類以上の適合性の固体もしくは液体の増量剤、希釈剤、またはカプセル化物質（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）を意味する。本発明においては、用語「賦形剤」は、適用を容易にするために有効成分がそれと組み合わせられる、有機もしくは無機の、天然または合成の成分を示す。薬学的組成物の成分はまた結合体とも、互いに、所望される薬学的効力を実質的に損なうであろう相互作用が起こらない様式で混合することができる。
【０１１２】
したがって、本発明の組成物は薬学的調製物とみなされ得る。これはインビボで使用され得るが、その使用はそのようには限定されない。インビボで使用される場合は、これは、治療的、予防的、または研究の目的を問わず、ヒトまたはヒト以外の被検体において使用され得る。一例として、組成物は、マウス、ウサギのようなヒト以外の被検体、および他の適している動物宿主において、抗体ならびに／あるいは抗体を生産する細胞を作製するために使用され得る。
【０１１３】
したがって、本発明は、上記オリゴ糖−担体結合体のいずれかを含む薬学的調製物を提供する。これはワクチンとして使用され得る。これらの調製物は、免疫応答（例えば、抗原特異的免疫応答）を刺激するために有効な量の結合体を含み得る。これらの調製物は、他の構成要素または成分（例えば、アジュバントおよび抗菌剤であるが、これらに限定されない）を含み得る。そのような調製物は、通常は、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、保存剤、適合性担体、アジュバント、および状況に応じた他の治療用成分を含み得る。
【０１１４】
ワクチンの処方に適している担体媒体として、リン酸ナトリウム緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）、またはｐＨ６のリン酸ナトリウム緩衝化生理食塩水および他の従来からの媒体の中に懸濁させられた０．１２５Ｍのリン酸アルミニウムゲルが挙げられる。一般的には、ワクチンは、温血動物において抗体の有効なレベルを誘発するために、約５〜約１００μｇ、好ましくは約１０〜５０μｇの抗原を含む。
【０１１５】
アジュバントは、その中に抗原が取り込まれるかまたは投与される（同時に、または別の方法で）任意の物質であり、これは、被検体において抗原に対する免疫応答を強化する。アジュバントとしては、アルミニウム化合物（例えば、ゲル、水酸化アルミニウム、およびリン酸アルミニウム）、ならびにフロイトの完全なまたは不完全なアジュバント（例えば、その中に抗原が、パラフィン系オイルエマルジョン中の安定化させられた水の水相に取り込まれる）が挙げられるが、これらに限定されない。パラフィン系オイルは、様々なタイプのオイル（例えば、スクワレンまたはピーナッツ油）で置き換えられ得る。アジュバント特性を持つ他の材料としては、ＢＣＧ（弱毒化Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、リン酸カルシウム、レバミゾール、イソプリノシン、多価陰イオン（例えば、ポリＡ：Ｕ）、レンチナン、百日咳毒素、リピッドＡ、サポニン、ＱＳ−２１、およびペプチド（例えば、ムラミルジペプチド）、および免疫賦活オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）が挙げられる。希土類元素の塩（例えば、ランタンおよびセリウム）もまたアジュバントとして使用され得る。アジュバントの量は、被検体および使用される特定の抗原に応じて様々であり、過度の実験を行うことなく当業者によって容易に決定され得る。
【０１１６】
抗菌剤は、細菌を（例えば、溶解によって）死滅させるか、またはそれらの分裂を妨げる薬剤である。細菌感染の処置における抗生物質の使用は日常的に行われていることである。抗菌剤としては、以下が挙げられる：ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、アンピシリン、アモキシシリン、バカンピシリン、シクラシリン（ｃｙｃｌａｃｉｌｌｉｎ）、エピシリン、ヘタシリン、ピバンピシリン（ｐｉｖａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、カルベニシリン、チカルシリン、アブロシリン（ａｖｌｏｃｉｌｌｉｎ）、メズロシリン、ピペラシリン、アムジノシリン（ａｍｄｉｎｏｃｉｌｌｉｎ）、セファレキシン、セフラジン、セファドロキシル（ｃｅｆａｄｏｘｉｌ）、セファクロール、セファゾリン、セフロキシムアキセチル（ｃｅｆｕｒｏｘｉｍｅ  ａｘｅｔｉｌ）、セファマンドール、セフォニシド、セフォキシチン、セフォタキシム、セフチゾキシム、セフメノキシン、セフトリアキソン、モキサラクタム、セフォテタン、セフォペラゾン、セフタジジム（ｃｅｆｔａｚｉｄｍｅ）、イミペネム、クラブラナート（ｃｌａｖｕｌａｎａｔｅ）、チメンチン（ｔｉｍｅｎｔｉｎ）、スルバクタム、ネオマイシン、エリスロマイシン、メトロニダゾール、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、リンコマイシン、バンコマイシン、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、アミノグリコシド、キノロン、テトラサイクリン、およびリファンピン（Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｃｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第８版、１９９３年、ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ  Ｉｎｃ．を参照のこと）。
【０１１７】
結合体は、他の部分（造影剤、蛍光色素分子、酵素などのような検出可能標識を含むがこれらに限定されない）に対して共有結合または非共有結合され得る。
【０１１８】
非経口投与に適している組成物は、通常は、レシピエントの血液と等張性であり得る滅菌の水性調製物を含む。中でも、使用され得る許容される賦形剤および溶媒は、水、Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ溶液、および等張性の塩化ナトリウム溶液である。加えて、滅菌の固定油が、溶媒または懸濁媒体として便利に使用される。この目的については、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激性の固定油が使用され得る。加えて、オレイン酸のような脂肪酸については、注射物質の調製における用途が見出される。皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内などでの投与に適している担体処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ．の中に見ることができる。
【０１１９】
本発明の調製物は有効量で投与される。有効量は、上記で議論されたように、いくつかの場合には、単独で、もしくはさらなる用量と一緒に、被検体に応じて能動免疫または受動免疫を誘導するであろう量である。投与の態様に応じて、１ｎｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量が有効であろうと考えられる。好ましい範囲は、５００ｎｇ〜５００μｇ／ｋｇの間、そして最も好ましくは１μｇ〜１００μｇ／ｋｇの間であると考えられる。絶対量は、投与がまだ細菌に感染していないハイリスクの被検体に行われるかまたはすでに感染している被検体に行われるか、併用療法、投与回数、ならびに、年齢、健康状態、大きさおよび体重を含む個々の患者のパラメーターを含む様々な要因に応じて変わるであろう。これらは当業者に周知の要因であり、日常的に行われている実験以上を行わなくとも対応することができる。最大用量が使用され得る、すなわち、正常な医学的判断に従う最大の安全な用量が使用されることが、一般的には好ましい。
【０１２０】
本発明の組成物の反復投与が意図される。一般的には、免疫化スキームは、高用量の抗原の投与と、その後の、数週間の期間待った後のより低用量の抗原の投与を含む。さらなる用量がさらに投与され得る。受動免疫化のための投与スケジュールは、必要に応じたより頻繁な投与とはかなり異なるであろう。細菌感染に対する免疫応答の増強および／またはそれに続く感染の防御を生じる任意のレジュメが使用され得る。特定の結合体の複数回投与の送達のための望ましい時間間隔は、日常的に行われている実験以上のものを使用することなく当業者によって決定され得る。
【０１２１】
様々な投与経路が利用可能である。選択される特定の態様は、もちろん、選択される特定の結合体、処置される特定の症状、および治療効力に必要な投与量に応じて様々であろう。一般的に言うと、本発明の方法は、医学的に許容される任意の投与の態様（臨床的に許容されない副作用を生じることなく効果的なレベルの免疫応答を生じる任意の態様を意味する）を使用して実施され得る。好ましい投与の態様は非経口経路である。用語「非経口」は、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、および胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）注射または注入技術を含む。他の経路としては、経口、鼻、皮膚、舌下、および局所が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２２】
以下の実施例は説明の目的のために含まれ、本発明の範囲を限定するようには意図されない。
【実施例】
【０１２３】
本発明の複数の態様は、以下の限定ではない実施例によってさらに説明される。これらの実施例は、とりわけ、オリゴ−β−（ｌ→６）−Ｄ−グルコサミンオリゴ糖を作製するための方法、および担体（例えば、タンパク質担体）に対してそのようなオリゴ糖を結合させるための方法を説明する。そのような結合体は、とりわけ、ワクチンとして使用され得る。
【０１２４】
（実施例１）
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル４−アセチルスルファニルブチラート２の合成
【０１２５】
【化２４−１】
0005555230.tif 000036
ジクロロメタン（４ｍＬ）中の酸１（Ｈｏｇｇ，Ｊ．Ｈｅａｔｈｅｒ；Ｏｌｌｍａｎｎ，Ｉａｎ  Ｒ．；Ｗｅｔｔｅｒｈｏｌｍ，Ａｎｄｅｒｓ；Ａｎｄｂｅｒｇ，Ｍａｒｔｉｎａ  Ｂｌｏｍｓｔｅｒ；Ｈａｅｇｇｓｔｒｏｅｍ，Ｊｅｓｐｅｒら；Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．；ＥＮ；４；９；１９９８；１６９８−１７１３）（２３７ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミジルトリフルオロアセテート（４３１ｍｇ、２．０２ｍｍｏｌ）の溶液に対して、ピリジン（３５５μＬ、４．４ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を室温で２時間撹拌した。この混合物をジクロロメタン（５０ｍＬ）で希釈し、氷冷した１ＭのＨＣｌおよび水で洗浄し、そして濃縮した。残渣のシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン−酢酸エチル９：１）により、活性エステル２（３５９ｍｇ、９５％）を無色のシロップとして得た。
【０１２６】
【化２４−２】
0005555230.tif 000037
（実施例２）
４−ニトロフェニル４−アセチルスルファニルブチラート３の合成
【０１２７】
【化２５−１】
0005555230.tif 000038
ジクロロメタン中の酸１（２３３ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ）（Ｈｏｇｇ，Ｊ．Ｈｅａｔｈｅｒ；Ｏｌｌｍａｎｎ，Ｉａｎ  Ｒ．；Ｗｅｔｔｅｒｈｏｌｍ，Ａｎｄｅｒｓ；Ａｎｄｂｅｒｇ，Ｍａｒｔｉｎａ  Ｂｌｏｍｓｔｅｒ；Ｈａｅｇｇｓｔｒｏｅｍ，Ｊｅｓｐｅｒら；Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．；ＥＮ；４；９；１９９８；１６９８−１７１３）と４−ニトロフェニルトリフルオロアセテート（４７０ｍｇ、２ｍｍｏｌ）の溶液に対して、トリエチルアミン（４００μＬ、２．８８ｍｍｏｌ）を添加し、この溶液を室温で２時間撹拌した。この混合物を２について記載したように処理し（ｗｏｒｋｅｄ−ｕｐ）、活性エステル３（３８５ｍｇ、９４％）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン−酢酸エチル９２：８）によって単離した。
【０１２８】
【化２５−２】
0005555230.tif 000039
（実施例３）
連結試薬２または３を使用したリガンド６および７の合成
【０１２９】
【化２６−１】
0005555230.tif 000040
ノナサッカライド４（Ｍ．Ｌ．Ｇｅｎｉｎｇ，Ｙ．Ｅ．Ｔｓｖｅｔｋｏｖ，Ｇ．Ｂ．Ｐｉｅｒ，Ｎ．Ｅ．Ｎｉｆａｎｔｉｅｖ，「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏ−β（１→６）−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅｓ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ」Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３４２（２００７），５６７−５７５）（１１０ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ（３ｍｌ）、ＴＨＦ（６ｍｌ）、および１ＭのＨＣｌ（０．２ｍｌ）の混合物中に溶解させ、Ｐｄ（ＯＨ）２／Ｃ（１１０ｍｇ）を添加した。得られた混合物を水素雰囲気下で１時間撹拌した。触媒を濾過して取り除き、溶媒を蒸発させた。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（２ｍｌ）とＤＭＦ（１ｍｌ）の混合物中に溶解させ、その後、リンカー試薬２（１２ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ、ＣＨ２Ｃｌ２中の１ｍｌの溶液）とＥｔ３Ｎ（１００μｌ）を添加した。３０分後、この混合物をトルエンで希釈し、濃縮し、そしてシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン／Ｍｅ２ＣＯ、４：１）を行い、５（９８ｍｇ、９８％）を無色の発泡体として得た。リンカーの導入を、保護された炭水化物リガンドのＮＭＲスペクトルにおけるその特徴的なシグナルの存在によって確認した。
【０１３０】
【化２６−２】
0005555230.tif 000041
保護されたノナサッカライド５（９５ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）、ＥｔＯＨ（５ｍｌ）、およびＮ２Ｈ４・Ｈ２Ｏ（０．５ｍｌ）の混合物を還流下で１時間撹拌し、その後、濃縮し、０．１ＭのＡｃＯＨ水溶液中でゲル浸透クロマトグラフィー（ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ  ４０Ｓ、２．５×４０ｃｍ）を行って、ノナサッカライド６（２８ｍｇ、８６％）とした。ゲルクロマトグラフィーの直後には、ＳＨ誘導体を、これが質量スペクトル分析法によって検出されるように得ることができるが、溶液中での保存後は、これは１３Ｃ  ＮＭＲ実験によって確認されるように、対応するジスルフィドに変換された。
【０１３１】
【化２６−３】
0005555230.tif 000042
質量スペクトル：Ｃ６１Ｈ１１４Ｎ１０Ｏ３８Ｓについて計算した  ５４３．２３４［Ｍ＋３Ｈ］３＋、実験用  ５４３．２４３  ［Ｍ＋３Ｈ］３＋。
【０１３２】
ノナサッカライド６（１５ｍｇ）を水／ＭｅＯＨ（２ｍｌ、１：１ｖ／ｖ）の混合物中に溶解させ、ジチオスレイトール（１５ｍｇ）とＮａＨＣＯ３（２０ｍｇ）を添加した。得られた混合物を５分間撹拌し、その後、無水酢酸（１００μｌ）を添加し、撹拌を３０分間継続し、その後、溶媒を蒸発させた。生成物を０．１ＭのＡｃＯＨ水溶液中でのゲル浸透クロマトグラフィー（ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ  ４０Ｓ、２．５×４０ｃｍ）によって精製して、アセチル化産物７（１５ｍｇ、９５％）を得た。
【０１３３】
【化２６−４】
0005555230.tif 000043
質量スペクトル：Ｃ８１Ｈ１３４Ｎ１０Ｏ４８Ｓについて計算した  １０２４．４１８［Ｍ＋２Ｈ］２＋、実験用  １０２４．４２７［Ｍ＋２Ｈ］２＋。
【０１３４】
（実施例４）
連結試薬３を使用した保護されたリガンド５の合成
ノナサッカライド４（６０ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ（１．５ｍｌ）、ＴＨＦ（３ｍｌ）、および１ＭのＨＣｌ（０．１ｍｌ）の混合物中に溶解させ、Ｐｄ（ＯＨ）２／Ｃ（６０ｍｇ）を添加した。得られた混合物を水素雰囲気下で１時間撹拌した。触媒を濾過して取り除き、溶媒を蒸発させた。残渣を、ＣＨ２Ｃｌ２（２ｍｌ）とＤＭＦ（１ｍｌ）の混合物中に溶解させ、その後、リンカー試薬３（２０ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ、１ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２中の溶液）とＥｔ３Ｎ（５０μｌ）を添加した。２０時間後、この混合物をトルエンで希釈し、濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン／Ｍｅ２ＣＯ、４：１）を行って５（３７ｍｇ、６８％）を無色の発泡体として得た。
【０１３５】
（実施例５）
タンパク質とのさらなる結合のためのリガンドの調製のための連結試薬８の適用性の実験
【０１３６】
【化２７−１】
0005555230.tif 000044
ペンタサッカライド９（１５０ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）（Ｍ．Ｌ．Ｇｅｎｉｎｇ，Ｙ．Ｅ．Ｔｓｖｅｔｋｏｖ，Ｇ．Ｂ．Ｐｉｅｒ，Ｎ．Ｅ．Ｎｉｆａｎｔｉｅｖ，「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏ−β（１→６）−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅｓ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ」、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３４２（２００７），５６７−５７５）を、ＭｅＯＨ（１．５ｍｌ）、ＴＨＦ（３ｍｌ）、および１ＭのＨＣｌ（０．１ｍｌ）の混合物中に溶解させ、Ｐｄ（ＯＨ）２／Ｃ（１５０ｍｇ）を添加した。得られた混合物を水素雰囲気下で１時間撹拌した。触媒を濾過して取り除き、溶媒を蒸発させた。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（２ｍｌ）とＤＭＦ（１ｍｌ）の混合物中に溶解させ、その後、リンカー試薬８（３０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、０．１ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２中の溶液）とＥｔ３Ｎ（５０μｌ）を添加した。１時間後、この混合物をトルエンで希釈し、濃縮し、そしてシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン／Ｍｅ２ＣＯ、４：１）を行って１０（１３２ｍｇ、８９％）を無色の発泡体として得た。
【０１３７】
【化２７−２】
0005555230.tif 000045
保護されたペンタサッカライド１０（１００ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）、ＥｔＯＨ（５ｍｌ）、およびＮ２Ｈ４・Ｈ２Ｏ（０．５ｍｌ）の混合物を還流下で１時間撹拌し、その後、濃縮し、そして０．１ＭのＡｃＯＨ水溶液中でゲル浸透クロマトグラフィー（ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ  ４０Ｓ、２．５×４０ｃｍ）を行ってペンタサッカライド１１（３２ｍｇ、９３％）とした。
【０１３８】
【化２７−３】
0005555230.tif 000046
質量スペクトル：Ｃ３５Ｈ６７Ｎ８Ｏ２２について計算した  ９５１．４３８［Ｍ＋Ｈ］＋、実験用  ９５１．４４８［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１３９】
（実施例６）
タンパク質とのさらなる結合のためのリガンドの調製のための連結試薬１２の適用性の実験
【０１４０】
【化２８−１】
0005555230.tif 000047
ペンタサッカライド９（１００ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）（Ｍ．Ｌ．Ｇｅｎｉｎｇ，Ｙ．Ｅ．Ｔｓｖｅｔｋｏｖ，Ｇ．Ｂ．Ｐｉｅｒ，Ｎ．Ｅ．Ｎｉｆａｎｔｉｅｖ，「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏ−β（１→６）−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅｓ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ」、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３４２（２００７），５６７−５７５）を、ＭｅＯＨ（１．５ｍｌ）、ＴＨＦ（３ｍｌ）、および１ＭのＨＣｌ（０．１ｍｌ）の混合物中に溶解させ、Ｐｄ（ＯＨ）２／Ｃ（１５０ｍｇ）を添加した。得られた混合物を水素雰囲気下で１時間撹拌した。触媒を濾過して取り除き、溶媒を蒸発させた。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（２ｍｌ）とＤＭＦ（１ｍｌ）の混合物中に溶解させ、その後、リンカー試薬１２（１５ｍｇ、０．０６１ｍｍｏｌ、０．１ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２中の溶液）とＥｔ３Ｎ（５０μｌ）を添加した。１時間後、この混合物をトルエンで希釈し、濃縮し、そしてシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン／Ｍｅ２ＣＯ、４：１）を行って１３（８７ｍｇ、８５％）を無色の発泡体として得た。
【０１４１】
【化２８−２】
0005555230.tif 000048
保護されたペンタサッカライド１３（８０ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）、ＥｔＯＨ（５ｍｌ）、およびＮ２Ｈ４・Ｈ２Ｏ（０．５ｍｌ）の混合物を還流下で１時間撹拌し、その後、濃縮し、そして０．１ＭのＡｃＯＨ水溶液中でゲル浸透クロマトグラフィー（ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ  ４０Ｓ、２．５×４０ｃｍ）を行って未確認の生成物の複合混合物を得た。
【０１４２】
（実施例７）
リガンド６との破傷風トキソイドの結合体「ＴＴ−９ＮＨ２」の調製
【０１４３】
【化２９】
0005555230.tif 000049
（工程１．タンパク質の修飾）破傷風トキソイド（１２０μｌ中４ｍｇ、ストック溶液）を４００μｌのｐＨ７．２緩衝液（０．１Ｍのリン酸ナトリウム、０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ）で希釈し、ＤＭＳＯ（８０μｌ）中のＳＢＡＰ（２．６ｍｇ）の溶液を添加し、混合物を室温で２時間インキュベートした。未反応のＳＢＡＰを、ｐＨ８．０の泳動緩衝液（０．１Ｍのリン酸ナトリウム、０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ）中でＰＤ−１０カラムを使用して取り除き、得られた３．５ｍｌの修飾されたタンパク質の溶液を４００μｌに濃縮した。
【０１４４】
（工程２．ジスルフィド還元）固定ＴＣＥＰジスルフィド還元ゲル（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ＴＣＥＰ  Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ｇｅｌ）（２００μｌの、水中の５０％スラリー）を遠心分離し、余分な水を取り除き、ジスルフィド６（１００μｌのｐＨ８．０の緩衝液（０．１Ｍのリン酸ナトリウム、０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ）中１．５ｍｇ）を添加した。室温で４５分間のローターラック（ｒｏｔｏｒ  ｒａｃｋ）上でのインキュベーション後、ＳＨ−誘導体の溶液を遠心分離によってゲルから分離し、固定したＴＣＥＰを同じｐＨ８．０緩衝液で洗浄した（３×１００μｌ）。
【０１４５】
（工程３．結合）工程２で得られたリガンドの溶液（４００μｌ、ｐＨ８．０緩衝液中）を、修飾されたタンパク質（４００μｌ、ｐＨ８．０緩衝液中、工程１）とすぐに混合し、室温で一晩撹拌した。この時間の後、結合体を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６プレップグレード（ｐｒｅｐ−ｇｒａｄｅ）カラム上でのゲル濾過によって結合しなかった成分から分離した。ＴＴ−９ＮＨ２結合体を含む画分をプールし、濃縮し、そして−２０℃で凍結保存した。
【０１４６】
（結合体の化学的分析）結合体を、そのオリゴ糖の内容物について、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｇｉｌｋｅｒｓｏｎ（Ｒ．Ｌ．Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｅ．Ｇｉｌｋｅｒｓｏｎ．１９７９  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．９８：４７８−４８０）によって記載されているヘキソサミンアッセイを使用して、標準物として化合物６を用いて分析し、そしてタンパク質についてはＢｒａｄｆｏｒｄ  ａｓｓａｙ（Ｍ．Ｍ．Ｂｒａｄｆｏｒｄ，１９７６，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２５４）を用いて分析した。これらのアッセイにしたがうと、結合体ＴＴ−９ＮＨ２は、タンパク質分子１つあたり７４個の炭水化物リガンドを含む（ｘ＝７４）。
【０１４７】
（実施例８）
リガンド７との破傷風トキソイドの結合体「ＴＴ−９ＮＡｃ」の調製
【０１４８】
【化３０】
0005555230.tif 000050
（工程１．タンパク質修飾）ＴＴを、結合体ＴＴ−９ＮＨ２について上記に記載したようにＳＢＡＰで修飾した。
【０１４９】
（工程２．Ｓ−アセチル脱保護）ノナサッカライド７（２．１ｍｇ）を２００μｌの７％ＮＨ３水溶液に溶解させ、この混合物を室温で１時間維持し、その後、凍結乾燥させた。
【０１５０】
（工程３．結合）凍結乾燥させたオリゴ糖を、すぐに、４００μｌのｐＨ８．０緩衝液（０．１Ｍのリン酸ナトリウム、０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ）中に溶解させ、同じ緩衝液中の４００μｌのＴＴ修飾型の溶液と混合した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。この時間の後、結合体をＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６プレップグレードカラム上でのゲル濾過によって結合しなかった成分から分離した。ＴＴ−９ＮＡｃ結合体を含む画分をプールし、濃縮し、そして−２０℃で凍結保存した。
【０１５１】
（結合体の化学的分析）分析を、結合体ＴＴ−９ＮＨ２（実施例７）と同じ方法で行い、結合体ＴＴ−９ＮＡｃがタンパク質分子１つあたり７１個の炭水化物リガンドを含む（ｙ＝７１）ことを明らかにした。
【０１５２】
（実施例９）
オリゴ糖結合体を使用した抗体生産
（方法）ウサギを、１０μｇの多糖等量の、破傷風トキソイド（ＴＴ）に結合させたノナグルコサミン（すなわち、９個の単量体が連結されている）を、１週間の間隔をあけて２回、等量のＳｐｅｃｏｌアジュバントとともに皮下に免疫化した。３週目に、ウサギを３回（すなわち、月曜日、水曜日、および金曜日）、生理食塩水中の１０μｇのＰＳ当量のＩＶで免疫化した。最後の免疫化の後、ウサギを２週間回復させ、２週間ごとに採血した。この発表のデータには、免疫化後に得た第１の血清（ｂｌｅｅｄ  １）と第２の血清（ｂｌｅｅｄ  ２）による結果を包含する。
【０１５３】
（結果）図１ＡおよびＢは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＰＮＡＧ（Ａ）またはｄＰＮＡＧ（Ｂ）に対する非アセチル化ノナグルコサミン（９ＧｌｃＮＨ２）に対して惹起させた抗血清の結合に関するデータを示す。この実験で使用したｄＰＮＡＧは約１５％がアセチル化されていた。しかし、アセチル化のレベルは０〜４０％の範囲であり得ると理解されるべきである。このデータは、抗血清がＰＮＡＧとｄＰＮＡＧのいずれにも同程度に結合したことを示す。
【０１５４】
図２ＡおよびＢは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＰＮＡＧまたはｄＰＮＡＧに対する、完全にアセチル化された非グルコサミン（９ＧｌｃＮＡｃ）に対して惹起させた抗血清の結合に関するデータを示す。このデータは、抗血清が、ｄＰＮＡＧよりも、高度にアセチル化されたＰＮＡＧに対してより多く結合したことを示す。
【０１５５】
図３ＡおよびＢは、非結合型１１ＧｌｃＮＡｃまたは１１ＧｌｃＮＨ２に対する、ＴＴ結合型９ＧｌｃＮＡｃまたは９ＧｌｃＮＨ２に対して惹起させた抗血清の結合に関するデータを示す。このデータは、アセチル化された９ＧｌｃＮＡｃに対して惹起させた抗血清が、非アセチル化９ＧｌｃＮＨ２に対して惹起させた抗血清よりも、アセチル化された１１ＧｌｃＮＡｃに対してより多く結合したことを示す。９ＧｌｃＮＨ２−ＴＴ結合体に対する抗血清が６４００未満の血清希釈率で上限を超えた（ｏｆｆ−ｓｃａｌｅ）ように、９ＧｌｃＮＨ２に対する結合については反対が真であった。
【０１５６】
図４および５は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＮ８および２種類のＵＳＡ３００株に対するｂｌｅｅｄ  １由来の抗血清を使用した結果を示す。図４は、破傷風トキソイド（ＴＴ）に結合させた完全にアセチル化されたかまたはアセチル化されていない９マーのオリゴグルコサミンに対するウサギ抗血清（「ｂｌｅｅｄ  １」と呼ぶ）によるＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＮ８（ＣＰ８）の死滅を比較する。図５は、ＴＴに結合させた完全にアセチル化されたかまたはアセチル化されていない９マーのオリゴグルコサミンに対するウサギ抗血清（ｂｌｅｅｄ  １）によるＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＮ８の死滅を比較する。抗ｄＰＮＡＧ−ＴＴ結合体抗血清をコンパレーター（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ）として使用した。図６は、ＴＴに結合させた完全にアセチル化されたかまたはアセチル化されていない９マーのオリゴグルコサミンに対するウサギ血清（ｂｌｅｅｄ  １）によるＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＬＡＣ（ＮＴ、ＵＳＡ３００）の死滅を比較する。図７は、ＴＴに結合させた完全にアセチル化されたかまたはアセチル化されていない９マーのオリゴグルコサミンに対するウサギ血清（ｂｌｅｅｄ  １）によるＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＳＦ８３００（ＮＴ，ＵＳＡ３００）の死滅を比較する。図８は、ＴＴに結合させた完全にアセチル化されたかまたはアセチル化されていない９マーのオリゴグルコサミンに対するウサギ血清（ｂｌｅｅｄ  １）によるＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＬＡＣ（ＮＴ、ＵＳＡ３００）の死滅を比較する。一般的には、９ＧｌｃＮＨ２−ＴＴに対して惹起させた血清が、全体として最も優れた活性を示したが、ほとんどのアッセイにおいては、９ＧｌｃＮＡｃ−ＴＴに対して惹起させた血清よりもわずかに優れていたにすぎなかった。
【０１５７】
図９〜１６は、ｂｌｅｅｄ  ２血清の使用によって得られた死滅データを示す。ウサギ抗ｄＰＮＡＧ−ＴＴ対照を株ＭＮ８、ＳＦ８３００、およびＬＡＣについてのコンパレーターとして使用した。ヤギ抗ｄＰＮＡＧ−ＴＴを、Ｎｅｗｍａｎ（ＣＰ５）、ＰＳ８０（ＣＰ８）、および同系株Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ＣＰ５、判別不能Ｒｅｙｎｏｌｄｓ、およびＲｅｙｎｏｌｄｓ  ＣＰ８についてのコンパレーターとして使用した。
【０１５８】
図９は、ＴＴに結合させた完全にアセチル化されたかまたはアセチル化されていない９マーのオリゴグルコサミンに対するウサギ血清（ｂｌｅｅｄ  ２）によるＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＮ８（ＣＰ８）の死滅を比較する。図１０は、ＴＴに結合させた完全にアセチル化されたかまたはアセチル化されていない９マーのオリゴグルコサミンに対するウサギ血清（ｂｌｅｅｄ  ２）によるＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＬＡＣ（ＮＴ．ＵＳＡ３００）の死滅を比較する。図１１は、ＴＴに結合させた完全にアセチル化されたかまたはアセチル化されていない９マーのオリゴグルコサミンに対するウサギ血清（ｂｌｅｅｄ  ２）によるＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＳＦ８３００（ＮＴ，ＵＳＡ３００）の死滅を比較する。図１２は、ＴＴに結合させた完全にアセチル化されたかまたはアセチル化されていない９マーのオリゴグルコサミンに対するウサギ血清（ｂｌｅｅｄ  ２）によるＳ．ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎ（ＣＰ５）の死滅を比較する。図１３は、ＴＴに結合させた完全にアセチル化されたかまたはアセチル化されていない９マーのオリゴグルコサミンに対するウサギ血清（ｂｌｅｅｄ  ２）によるＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＰＳ８０の死滅を比較する。図１４は、ＴＴに結合させた完全にアセチル化されたかまたはアセチル化されていない９マーのオリゴグルコサミンに対するウサギ血清（ｂｌｅｅｄ  ２）によるＳ．ａｕｒｅｕｓ  Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（ＣＰ５）の死滅を比較する。図１５は、ＴＴに結合させた完全にアセチル化されたかまたはアセチル化されていない９マーのオリゴグルコサミンに対するウサギ血清（ｂｌｅｅｄ  ２）によるＳ．ａｕｒｅｕｓ  Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（判別不能）の死滅を比較する。図１６は、ＴＴに結合させた完全にアセチル化されたかまたはアセチル化されていない９マーのオリゴグルコサミンに対するウサギ血清（ｂｌｅｅｄ  ２）によるＳ．ａｕｒｅｕｓ  Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（ＣＰ８）の死滅を比較する。
【０１５９】
一般的には、より高い死滅の程度は、ｄＰＮＡＧ−ＴＴに対して惹起させた抗血清を用いた場合ではなく、オリゴ糖結合体に対して惹起させた抗血清を使用した場合に得られた。株ＬＡＣおよびＳＦ８３００の死滅は、ｂｌｅｅｄ  １血清を用いた場合と比較してｂｌｅｅｄ  ２血清を用いた場合に多かったが、それでもなおＥＬＩＳＡ結合曲線は同様であった。ｂｌｅｅｄ  ２を使用した場合には、９ＧｌｃＮＨ２に対して惹起させた抗血清を使用した死滅において、９ＧｌｃＮＡｃに対して惹起させた血清を使用した溶解と比較して、より大きな差異がみられる。
【０１６０】
（実施例１０）
ウサギ抗血清とＥ．ｃｏｌｉのオプソニン作用による死滅（ｏｐｓｏｎｉｃ  ｋｉｌｌｉｎｇ）
免疫化後のウサギ抗血清（上記）中のウサギ抗体は、ＰＮＡＧを生産することがこれまでに示された２種類のＥ．ｃｏｌｉ株のオプソニン作用による死滅を媒介したが、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰＮＡＧの生合成酵素をコードするｐｇａ遺伝子を持たない第３の株のオプソニン作用による死滅は媒介しなかった（図１６Ａ）。
【０１６１】
（実施例１１）
マウスの皮膚の膿瘍モデル
図１７、１８、および１９は、マウスの皮膚の膿瘍モデルとＳ．ａｕｒｅｕｓ株ＬＡＣ（ＵＳＡ３００）でのチャレンジを使用したインビボでの実験の結果を示す。９ＧｌｃＮＨ２に対して惹起させた抗血清は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＬＡＣ（ＵＳＡ３００）による皮膚感染に対して防御効果を示した。グループ１（９ＧｌｃＮＨ２−ＴＴと表示した）には、０．２ｍｌの９ＧｌｃＮＨ２−ＴＴ抗血清（ｂｌｅｅｄ  ２）を、感染の２４時間前に腹腔内に投与した。グループ２（ＮＲＳと表示した）には、０．２ｍｌの正常なウサギの血清（ＮＲＳ）を、感染の２４時間前に投与した。マウスを、２×１０４  ＣＦＵ（図１７）、２×１０５  ＣＦＵ（図１９）、または２×１０６  ＣＦＵ（図２０）に、１００μｌの皮下注射（膿瘍１つあたり）においてマイクロデックスビーズ（ｍｉｃｒｏｄｅｘ  ｂｅａｄｓ）（１０ｇ／ｍｌ）を用いて感染させた。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＬＡＣ株をＴＳＢ中で一晩増殖させ、その後、洗浄し、投与前にマイクロデックスビーズに対して添加した。７２時間後、個々の膿瘍を切除し、１ｍｌのＴＳＢ中に再懸濁し、ホモジナイズし、希釈し、その後、１００μｌのホモジネートを段階希釈物とともにプレートした。検出の下限値は１０  ＣＦＵ／膿瘍であった。図１７、１８、および１９は、膿瘍１つあたりのＣＦＵの数が、正常なウサギの血清と比較して、９ＧｌｃＮＨ２−ＴＴ抗血清を投与したマウスにおいては大幅に減少したことを示す。図２０は図１８〜２０の結果をまとめ、これは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのそれぞれの投与について、９ＧｌｃＮＨ２を投与したマウスはＳ．ａｕｒｅｕｓでのチャレンジに対してより防御されたことを示している。
【０１６２】
図２１および２２は、同じマウスの皮膚膿瘍モデルと、先の段落に記載した手法を使用したが、チャレンジ株が２種類のさらに別のＳ．ａｕｒｅｕｓ株ＭＮ８およびＮｅｗｍａｎである、２つのインビボでの実験の結果を示す。マウスを、１×１０６  ＣＦＵの株ＭＮ８（図２１）、または４×１０６  ＣＦＵの株Ｎｅｗｍａｎ（図２２）に、１００μｌの皮下注射（膿瘍１つあたり）においてマイクロデックスビーズ（１０ｇ／ｍｌ）を用いて感染させた。図２１および２２は、腫瘍１つあたりのＣＦＵの数が、正常なウサギ血清と比較して、９ＧｌｃＮＨ２−ＴＴ抗血清を投与したマウスにおいては有意に減少したことを示す。
【０１６３】
図２３は、９ＧｌｃＮＨ２−ＴＴ結合体ワクチンに対して惹起させた抗血清が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株ＭＮ８ΔｉｃａおよびＮｅｗｍａｎΔｉｃａのＣＦＵ／膿瘍を有意に（Ｐ＞０．０５）減少させることができないことを示す。これらの２つの株は、ｉｃａ遺伝子座が除去されており、もはやＰＮＡＧ表面多糖を合成できない。ＰＮＡＧ抗原が存在しない場合には、９ＧｌｃＮＨ２オリゴ糖に対する抗体は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓによる皮膚感染に対する防御免疫を全く提供することができない。
【０１６４】
（実施例１２）
Ｅ．ｃｏｌｉによる腹膜炎に対する防御効果
９ＧｌｃＮＨ２−ＴＴに対する抗体の防御効果を、Ｅ．ｃｏｌｉ感染の致死性腹膜炎モデルにおいて試験した。この抗体は、２種類のＰＮＡＧ陽性Ｅ．ｃｏｌｉ単離株（表１、ＵＴＩ株ＪおよびＰ）によって引き起こされる感染に対して、免疫化したマウス全てを防御したが、ＮＲＳを投与した全ての対照は生存できなかった。ＰＮＡＧ陰性Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｈに対する９ＧｌｃＮＨ２−ＴＴ抗血清に対する抗体によっては、防御はもたらされなかった。
【０１６５】
【表１】
0005555230.tif 000051
（結果の考察）
全くアセチル化されていない合成のＧｌｃＮＨ２−ＴＴ結合体ワクチンを使用することにより、動物においてオプソニン作用性の防御抗体を高レベルに生成させるためには、酢酸塩は必要ないこと、健全な免疫応答に十分な大きさの５個のＧｌｃＮＨ２−単量体程度の少数の分子を結合させること、そしてこれらの抗体が高度にＮ−アセチル化されたＰＮＡＧ、ほとんどアセチル化されていないｄＰＮＡＧおよび非アセチル化オリゴ糖に対して容易に結合することが、本発明によって明らかにされている。したがって、これらの防御抗体は、そのアセチル化のレベルを含むその組成とは無関係に、自然界に存在しているＰＮＡＧに結合するであろう。
【０１６６】
本発明はさらに、本発明の非アセチル化オリゴ糖を含む多重抗原を含有するワクチンの生産を意図する。反応性スルフヒドリル基を含む還元性末端リンカーを用いたＧｌｃＮＨ２−オリゴマーの合成は、ＰＮＡＧを作る微生物を標的化するワクチンが、毒性因子およびワクチン抗原として機能する微生物のタンパク質に対してＧｌｃＮＨ２−オリゴ糖を結合させることにより、さらに有効となり得ることを示唆する。例えば、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓのＬｃｒＶタンパク質は、伝染病に対する防御のための標的である（Ｇａｒｍｏｒｙら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２２：９４７−５７（２００４）；Ｏｖｅｒｈｅｉｍら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７３：５１５２−９（２００５）；Ｑｕｅｎｅｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７６：２０２５−２０３６（２００８））が、このタンパク質の血清学的変異体は、中央アジアで流行しているＹ．ｐｅｓｔｉｓのうちでも知られている株であり（Ａｎｉｓｉｍｏｖら、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１７：４３４−４６４（２００４））、これは、そのような株が単独ＬｃｒＶワクチン成分によって生じる免疫を潜り抜けることができる可能性を生じる。ＰＮＡＧはＹ．ｐｅｓｔｉｓによって発現されるので、ＬｃｒＶに対してＧｌｃＮＨ２−オリゴマーを結合させることにより、伝染病ワクチンの防御範囲（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｖｅｒａｇｅ）は大きくなるであろう。ワクチン生産のためのこのアプローチは、ｄＰＮＡＧオリゴ糖の合成バージョンが相当安価に生産され得るとの理由から魅力的であり、重要なことは、これが任意の他の微生物の混入を含まないであろうことである。
【０１６７】
これらの知見全体が、担体タンパク質に結合させたβ（１→６）−結合グルコサミンの小さい大きさのオリゴマーが、オプソニン作用性抗体の高い力価を誘導することができ、これはまた、実験用のＳ．ａｕｒｅｕｓ皮膚感染およびＥ．ｃｏｌｉが原因である致死性の腹膜炎に対しても防御的であることを示す。
【０１６８】
（等価物）
いくつかの本発明の実施形態が本明細書中に記載され、説明されてきたが、当業者は、本明細書中に記載される機能を行う、ならびに／あるいは結果および／または１つ以上の利点を得るための、様々な他の手段および／または構造を容易に想像するであろう。そしてそのようなバリエーションおよび／または改変のそれぞれが、本明細書中に記載される本発明の実施形態の範囲内にあるとみなされる。さらに一般的には、当業者は、本明細書中に記載された全てのパラメーター、寸法、材料、および立体配置が例示と意味され、実際のパラメーター、寸法、材料、および／または立体配置は、本発明の教示が使用される具体的な用途（単数または複数）に応じて変わるであろうことを容易に理解するであろう。当業者は、日常的に行われている実験以上のものを使用することなく、本明細書中に記載された具体的な本発明の実施形態と等価である多くのことを理解するか、または確定することができるであろう。したがって、上記実施形態は例として提示されるにすぎず、添付の特許請求の範囲およびその等価物の範囲内で、本発明の実施形態が、具体的に記載された、特許請求されるものとは別の方法で実施され得ることが理解される。本開示の発明性のある実施形態は、本明細書中に記載されたそれぞれの個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法に関する。加えて、そのような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法の２つ以上の任意の組み合わせが、そのような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法が互いに相矛盾しなければ、本開示の本発明の範囲に含まれる。
【０１６９】
本明細書中で定義され、使用された全ての定義は、辞書的定義、引用により組み入れられた文献の中での定義、および／または定義された用語の通常の意味の全てを支配すると理解されるべきである。
【０１７０】
本明細書中で開示された全ての参考文献、特許、および特許出願は、それぞれが引用される対象物に関して引用により組み入れられる。いくつかの場合には、これにはその文献全体が含まれ得る。
【０１７１】
不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、明細書および特許請求の範囲において本明細書中で使用される場合は、反対のことが明記されない限りは、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
【０１７２】
表現「および／または」は、明細書および特許請求の範囲において本明細書中で使用される場合は、そのように一緒にされた要素の「いずれかまたは両方」を意味する、すなわち、複数の要素が、場合によっては結合して存在し、そして場合によっては結合せずに存在すると理解されるべきである。「および／または」とともに列挙された複数の要素は同じ様式で、すなわち、そのように一緒にされた要素の「１つ以上」と解釈されるべきである。他の要素は、状況に応じて、具体的に特定されたそのような要素と関係があるか関係がないかにかかわらず、「および／または」の箇条によって具体的に特定された要素以外が存在し得る。したがって、限定ではない例として、「Ａおよび／またはＢ」との言及は、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような無制限の言語と組み合わせて使用される場合は、１つの実施形態においては、Ａだけ（状況に応じてＢ以外の要素を含む）；別の実施形態においては、Ｂだけ（状況に応じてＡ以外の要素を含む）；なお別の実施形態においては、ＡとＢの両方（状況に応じて他の要素を含む）などを意味し得る。
【０１７３】
明細書および特許請求の範囲において本明細書中で使用される場合は、「または」は、上記で定義されたような「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リストの中の要素を分ける場合は、「または」、あるいは「および／または」は、包括的である、すなわち、多数の要素または要素のリストのうちの少なくとも１つを含むが、これには２つ以上も含まれ、状況に応じて、さらに別の列挙されていない要素も含むと解釈されるものとする。反対のことが明白に示されている用語（例えば、「そのうちの１つだけ」、または「そのうちの正確に１つ」、または特許請求の範囲において使用される場合は、「〜からなる」）だけが、多数の要素または要素のリストのうちの正確に１つの要素を含むことを意味するであろう。一般的には、用語「または」は、本明細書中で使用される場合は、「いずれか」、「〜のうちの１つ」、「〜のうちの１つだけ」、または「〜のうちの正確に１つ」のような排他性の用語が先行する場合には、排他的な選択肢（すなわち、「一方または他方であるが、両方ではない」）とのみ解釈されるものとする。「本質的に〜からなる」は、特許請求の範囲において使用される場合は、特許法の分野で使用されるその通常の意味を有するものとする。
【０１７４】
明細書中および特許請求の範囲においてここで使用される場合は、１つ以上の要素のリストに関する表現「少なくとも１つ」は、要素のリストの中の要素の任意の１つ以上から選択された少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、要素のリストの中に具体的に列挙された個々の全ての要素のうちの少なくとも１つを含むことは必ずしも必要ではなく、要素のリストの中の複数の要素の任意の組み合わせを排除するものではない。この定義はまた、表現「少なくとも１つ」が言及する要素（具体的に特定されたこれらの要素と関係があるかまたは無関係であるかは問わない）のリストの中に具体的に特定された要素以外の要素が状況に応じて存在し得ることもまた可能にする。したがって、限定ではない例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または同等に、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または同等に、「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、１つの実施形態においては、Ｂが存在しない少なくとも１つ（状況に応じて２つ以上を含む）のＡ（状況に応じてＢ以外の要素を含む）；別の実施形態においては、Ａが存在しない少なくとも１つ（状況に応じて２つ以上を含む）のＢ（状況に応じてＡ以外の要素を含む）；なお別の実施形態においては、少なくとも１つ（状況に応じて２つ以上を含む）のＡと少なくとも１つ（状況に応じて２つ以上を含む）のＢ（状況に応じて他の要素を含む）；などを意味し得る。
【０１７５】
反対であることが明確に示されない限りは、２つ以上の工程または行動を含む本明細書中で特許請求される任意の方法においては、この方法の工程または行動の順序は、この方法の工程または行動が記載された順序に必ずしも限定されないことも理解されるべきである。
【０１７６】
特許請求の範囲、ならびに上記の明細書においては、全ての移行句（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「持つ（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「〜でできている（ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ）」などは、無制限である、すなわち、含むが限定されないことを意味すると理解される。移行句「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」と「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」だけが、米国特許庁特許審査便覧（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｅｘａｍｉｎｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）、セクション２１１１．０３に示されているように、それぞれ、閉じた移行句または半分閉じた移行句であるとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１６Ａ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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