(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ノビレチン又はタンゲレチンを有効成分とする、歯槽骨の骨吸収及び骨密度低下の抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非ヒト動物の歯槽骨とＴＬＲ４リガンド及び／又はＴＬＲ２リガンドとを備えた歯周病発症の評価システム、より詳しくは、歯周病の予防・治療剤のスクリーニング方法、歯周病モデル器官培養物、歯周病の予防・治療剤のスクリーニングセット、歯周病発症モデル動物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯周病は、歯の表面についた汚れ（プラーク）により、歯を支えている歯ぐきや骨が、化膿したり破壊されたりする病気であり、日本国民の８割が罹患する国民病疾患である。歯周病の治療方法としては外科的治療方法や、ペリオクリンやファンキゾンという抗生物質による薬物治療法や、チアゾール化合物もしくはその薬学的に許容される塩からなる骨粗鬆症、骨折、歯周病等、種々の骨疾病・障害の治療薬（例えば、特許文献１参照）や、抗ＣＤ１４抗体を有効成分として含有する歯周病治療薬（例えば、特許文献２参照）や、血管内皮細胞増殖因子／血管透過性因子（ＶＥＧＦ／ＶＰＦ）に対する抗体を含む製剤からなることを特徴とする歯周病治療薬（例えば、特許文献３参照）等が知られている。
【０００３】
また、歯周病の予防や治療に有用な物質を評価する方法としては、歯垢が付着しやすくなるように、動物の歯の周りに糸を巻いて装着し、数ヶ月放置して歯周病を発症させ、その後、歯周組織を摘出して切片を作製し、形態学的に観察して評価する、自然発症モデルを用いる方法（例えば、非特許文献１参照）や、ヒト歯周病菌の生きた菌を動物に投与して感染させて発症させる歯周病菌を投与する方法（例えば、非特許文献２参照）等が報告されている。
【０００４】
しかし、上記自然発症モデルを用いる評価方法の場合、その評価は切片を用いた顕微鏡観察による形態学的手法を用いて行われるが、歯周組織は石灰度の高い歯を有しているため、脱灰する必要があり、その切片作製の過程は固定した組織の包埋や薄切を含み、手間と時間がかかる上に、熟練した手技をも必要とする。また、歯周病菌を投与する方法の場合、動物を無菌環境で飼育する必要性があり、実施環境の整備が求められるため、スクリーニング系としては汎用性に欠ける上に、この場合の評価方法も形態学的手法によることから、動物の感染に時間がかかり、切片作製と形態学的評価もあわせると数ヶ月の時間を要するという問題があった。
【０００５】
他方、トール（Ｔｏｌｌ）遺伝子は、ショウジョウバエの胚発生中の背腹軸の決定（例えば、非特許文献３、４参照）、また成体における侵入病原体を検出する自然免疫に関与しており（例えば、非特許文献５〜７参照）、近年、トール遺伝子の哺乳類のホモログが同定され（例えば、非特許文献８〜１２参照）、ヒトのトール様受容体（ＴＬＲ）ファミリーについては、ＴＬＲ２やＴＬＲ４等これまでに１０種が報告されている。ＴＬＲファミリーの役割は、細菌の共通構造を認識するパターン認識受容体として、別々の病原体会合分子パターンを識別し、転写因子であるＮＦ−κＢの核内への移行を導く同様の細胞内シグナル伝達経路の活性化を引き起こす。かかるシグナル伝達経路は、最終的には炎症性サイトカインを産生させ、宿主防衛反応を誘起し、さらに獲得免疫に対しても宿主防衛反応を誘起させる。また、近年多くのＴＬＲリガンドが報告されている。
【０００６】
ＴＬＲ２リガンドとしては、グラム陽性菌のペプチドグリカン（ＰＧＮ）、細菌由来トリアシル化リポタンパク質、マイコプラズマ由来ジアシル化リポタンパク質等の種々の細菌由来のリポタンパク質、結核菌のリポアラビノマンナン、酵母のザイモザン、クルーズトリパノソーマ（Trypanosoma cruzi）のＧＰＩアンカーなどのさまざまな細菌成分が報告されている（例えば、非特許文献１３〜１７参照）。また、ＴＬＲ４リガンドとしては、グラム陰性菌の細胞壁に特異的な糖脂質であるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）が知られており、ＬＰＳは、宿主に対して強力な自然免疫誘導活性を有することも知られている（例えば、非特許文献１８、１９参照）。ＬＰＳは、コア領域とＯ−抗原からなる親水性の多糖部分と、リピドＡと総称される疎水性の糖脂質から構成される両親媒性物質であり、Ｏ−抗原は、細菌種・菌株に特異的なオリゴ糖による繰り返し構造を持っており、グラム陰性細菌の血清学的な分類に用いられており、また、コア領域は、Ｋｄｏやヘプトースといった特徴的な糖成分を含むオリゴ糖であり、その構造はＯ−抗原多糖よりも多様性が少ない。リピドＡは、リン酸化されたグルコサミン二糖に複数のアシル基が結合した構造をもっており、ＬＰＳの免疫誘導活性の本体として認識されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平１１−２０９２８４号公報
【特許文献２】特開平１０−１１４６７９号公報
【特許文献３】特開２００２−０９７１５７号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】J.Periodont Res.39:107-110,2004
【非特許文献２】J.Clin.Invest.106:R59-R67,2000
【非特許文献３】Cell 52, 269-279, 1988
【非特許文献４】Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 393-416, 1996
【非特許文献５】Nature 406, 782, 2000
【非特許文献６】Nat. Immunol. 2, 675, 2001
【非特許文献７】Annu. Rev. Immunol. 20, 197, 2002
【非特許文献８】Nature 388, 394-397, 1997
【非特許文献９】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 588-593, 1998
【非特許文献１０】Blood 91, 4020-4027, 1998
【非特許文献１１】Gene 231, 59-65, 1999
【非特許文献１２】Science 285, 732, 1999
【非特許文献１３】Science 285, 736, 1999
【非特許文献１４】J.Biol. Chem. 274, 33419, 1999
【非特許文献１５】J. Immunol. 164, 554, 2000
【非特許文献１６】Nature 401, 811, 1999
【非特許文献１７】J. Immunol. 167, 416, 2001
【非特許文献１８】Trends Glycosci. Glycotechnol., 14, 53-68, 2002
【非特許文献１９】Crit. Rev. Microbiol., 16, 477-523, 1989
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前記のように、従来、動物の歯周組織を摘出して切片を作製し、形態学的に観察して評価する方法が用いられてきたが、これらの方法は簡便でなく、評価までの時間もかかり、数ヶ月単位の時間を要する評価系であった。従って、数多くの候補物質のスクリーニングは困難である上に、形態学的評価は作製した切片の作製状態や評価する人によってバラツキが生じやすく、実施者や施設間における実験結果に差が生じやすいことから、客観的評価が求められるスクリーニング系としては適さない。本発明の課題は、簡便かつ迅速で客観性に富む歯周病発症の評価システム、歯周病の予防・治療剤のスクリーニング方法、歯周病モデル器官培養物、歯周病の予防・治療剤のスクリーニングセット、歯周病発症モデル動物等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、マウスより下顎を摘出し、実体顕微鏡下において臼歯および切歯を抜歯し、大きさを揃えた歯槽骨を採取し、歯槽骨の器官培養系に、ＬＰＳまたはＴＬＲ２リガンドを添加して６日間培養し、培養後、培養上清中のカルシウム濃度の定量により骨吸収活性を測定したところ、ＬＰＳまたはＴＬＲ２リガンドを添加すると濃度依存的に骨吸収活性が上昇することを見い出し、次に、インドメタシン（Indomethacin）を併用添加して、歯槽骨の骨吸収活性を検討した結果、インドメタシンを併用添加すると、ＬＰＳまたはＴＬＲ２リガンドによる骨吸収活性が完全に抑制されることを見い出した。また、本発明者は、実体顕微鏡下において、マウスの下顎臼歯外側の歯肉に、ＬＰＳを投与することにより歯槽骨の骨密度が低下することを見い出し、次に、インドメタシンを併用投与すると、ＬＰＳによる歯槽骨の骨密度低下が完全に抑制されることを見い出した。本発明は上記の知見に基づいて完成するに至ったものである。
【００１１】
すなわち本発明は、（１）ノビレチン又はタンゲレチンを有効成分とする、歯槽骨の骨吸収及び骨密度低下の抑制剤に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の歯周病の予防・治療剤のスクリーニング方法、歯周病モデル器官培養物、歯周病の予防・治療剤のスクリーニングセット、歯周病発症モデル動物を用いることにより、歯周病の予防あるいは治療に有用な候補物質を１週間程度の短期間に評価することができる。マウス歯槽骨の器官培養系を用いたインビトロ（in vitro）スクリーニング系においては、歯周病に対する数多くの候補物質の有効性の有無を簡便に調べることが可能となり、一次スクリーニング系として特に適している。また、歯周病発症モデル動物を用いたインビボ（in vivo）スクリーニング系においては、歯周病に対する候補物質の有効性の有無を、生体を用いて極めて短期間で評価することが可能となり、生体を用いる系であることから、ヒトにおける有効性の有無を判断する材料として特に適している。これら２つの評価システムは、歯磨剤などのオーラルケア製品、ガムや飴などの食品やサプリメント、及び歯周病予防・治療薬などを対象として、有効成分の添加を検討する際に用いるスクリーニング系としても適している。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明のインビトロ・スクリーニング系（マウス歯槽骨の器官培養系：ＬＰＳによる骨吸収活性の上昇）及びインビボ・スクリーニング系（マウス歯槽骨の骨密度による歯周病評価：下顎へのＬＰＳ投与による骨密度低下）の結果を示す図である。
【図２】本発明のインビトロ・スクリーニング系（マウス歯槽骨の器官培養系：ＬＰＳ、ＴＬＲ２リガンドによる骨吸収活性の上昇とインドメタシン併用による骨吸収活性の上昇抑制）の結果を示す図である。
【図３】本発明のインビボ・スクリーニング系（マウス歯槽骨の骨密度による歯周病評価：下顎へのＬＰＳ投与による骨密度低下とインドメタシン併用による骨密度低下の抑制）の結果を示す図である。
【図４】歯槽骨器官培養系におけるノビレチンおよびタンゲレチンの骨吸収抑制作用の結果を示す図である。
【図５】歯周病モデルマウスの歯槽骨の骨密度に及ぼすノビレチンおよびタンゲレチンの投与効果の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の歯周病発症の評価システムとしては、非ヒト動物の歯槽骨に、ＴＬＲ４リガンド及び／又はＴＬＲ２リガンドを接触せしめることを特徴とし、かかる評価システムの具体的な実施の態様としては、かかる評価システムを利用した歯周病の予防・治療剤のスクリーニング方法、歯周病モデル器官培養物、歯周病の予防・治療剤のスクリーニングセット、歯周病発症モデル動物等を挙げることができる。また、本発明における非ヒト動物としては、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウマ、ウシ、サル等を挙げることができるが、短期間に歯槽骨に歯周病を発症させることができ、かつ取扱いが簡便である点で、特にマウスが好ましい。
【００１７】
本発明の歯周病の予防・治療剤のスクリーニング方法としては、インビトロ系とインビボ系に大別することができ、インビトロ系としては、非ヒト動物の歯槽骨を器官培養した後、培養液にＴＬＲ４リガンド及び／又はＴＬＲ２リガンドと被検物質とを添加してさらに培養し、培養上清中のカルシウム濃度を測定・評価するスクリーニング方法であれば特に制限されるものではないが、被検物質を添加しない対照におけるカルシウム濃度を測定し、比較評価することが好ましい。非ヒト動物がマウスの場合、インビトロ系における器官培養する歯槽骨として、臼歯および切歯を抜歯したものを有利に用いることができ、ここで、器官培養とは、器官片を生体より取り出し、もとの三次元的な構築を失わせることなく、有機的な成長を行わせる培養を云う。また、インビボ系としては、非ヒト動物の歯槽骨近傍の歯肉に、ＴＬＲ４リガンド及び／又はＴＬＲ２リガンドと被検物質とを投与し、歯槽骨の骨密度を測定・評価するスクリーニング方法であれば特に制限されるものではないが、被検物質を投与しない対照における歯槽骨の骨密度を測定し、比較評価することが好ましく、特に同一動物における被検物質を併用投与した以外の左右どちらか一方の歯槽骨の骨密度を測定し、比較評価することが好ましい。また、非ヒト動物がマウスの場合、インビボ系における歯槽骨近傍の歯肉として、下顎臼歯外側の歯肉を好適に例示することができる。
【００１８】
上記ＴＬＲ４リガンドとしては、ＬＰＳを好適に例示することができる。また、ＴＬＲ２リガンドとしては、グラム陽性菌のＰＧＮ、細菌由来トリアシル化リポタンパク質、マイコプラズマ由来ジアシル化リポタンパク質等の種々の細菌由来のリポタンパク質、結核菌のリポアラビノマンナン、酵母のザイモザン、クルーズトリパノソーマ（Trypanosoma cruzi）のＧＰＩアンカー等を具体的に挙げることができる。これらＴＬＲ４リガンドやＴＬＲ２リガンドの使用濃度や使用量は、リガンドの種類、動物種やその体重によって適宜変更しうるが、短期間で歯槽骨に歯周病が発症するように使用濃度や使用量を決定することが好ましく、例えばＬＰＳを使用するマウスの場合、インビトロ・スクリーニング系では、培養液中の濃度が０.１〜１０μｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１０μｇ／ｍｌとなるように添加すればよく、インビボ・スクリーニング系では８２５〜１６５０μｇ／ｋｇとなるように投与すればよい。ＴＬＲ２リガンドを使用するマウスの場合、インビトロ・スクリーニング系では、培養液中の濃度が３０〜３００μｇ／ｍｌ、好ましくは１００〜３００μｇ／ｍｌとなるように添加すればよく、インビボ・スクリーニング系では８.３〜８３ｍｇ／ｋｇとなるように投与すればよい。
【００１９】
上記被検物質としては特に制限されないが、鎮痛・消炎・抗炎症薬（NSAID、ステロイドなど）、抗生物質、動植物からの抽出物、生薬、核酸、糖類、糖アルコール、ポリペプチドなどを挙げることができるが、動植物からの抽出物、生薬、糖類、糖アルコール等の歯磨剤などのオーラルケア製品、ガムや飴などの食品やサプリメントに適用可能な物が好ましい。
【００２０】
候補薬剤としての上記鎮痛・消炎・抗炎症薬としては、イブプロフェンピコノール、インドメタシン、ウフェナマート、ケトプロフェン、グリチルレチン酸、ジクロフェナクナトリウム、スプロフェン、ピロキシカム、フェルビナク、ブフェキサマク、フルルビプロフェン、ペンダザック、ジフェンヒドラミン、ラウリル硫酸ジフェンヒドラミン、アムシノニド、吉草酸酢酸プレドニゾロン、吉草酸ジフルコルトロン、吉草酸デキサメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、酢酸ジフロラゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、ジフルプレドナート、ジプロピオン酸ベタメタゾン、デキサメタゾン、トリアムシノロンアセトニド、ハルシノニド、ピバル酸フルメタゾン、フランカルボン酸モメタゾン、フルオシノニド、フルオシノロンアセトニド、フルドロキシコルチド、プレドニゾロン、プロピオン酸アルクロメタゾン、プロピオン酸クロベタゾール、プロピオン酸デキサメタゾン、プロピオン酸デプロドン、プロピオン酸ベクロメタゾン、酪酸クロベタゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、酪酸プロピオン酸ヒドロコルチゾン、酪酸プロピオン酸ベタメタゾン、酢酸プレドニゾロンなどを挙げることができる。また、候補薬剤としての上記抗生物質としては、塩酸オキシテトラサイクリン、塩酸テトラサイクリン、ゲンタマイシン、フラジオマイシン、エリスロマイシン、ピマリシン、硫酸ブレオマイシン、合成ペニシリン、合成セファロスポリン、バンコマイシンなどを挙げることができる。さらに、植物からの抽出物としては、柑橘類由来のポリメトキシフラボノイド類であるノビレチン、タンゲレチン、ナリルチン、シネンセチンなどを挙げることができ、またこれらのポリメトキシフラボノイドに代えて、シークヮーサーエキスなどのポリメトキシフラボノイド類を含む柑橘類由来のエキス類を候補薬剤として用いることもできる。
【００２１】
本発明の歯周病予防・治療剤としては、上記本発明の歯周病の予防・治療剤のスクリーニング方法により得られるものであれば特に制限されず、具体的には、インドメタシンや、ノビレチン、タンゲレチン、ナリルチン、シネンセチン等のポリメトキシフラボノイド類などを挙げることができる。これらは１種単独若しくは２種以上を混合して用いてもよく、又は、これらの混合物であるシークヮーサーエキスなどのポリメトキシフラボノイド類を含む柑橘類由来のエキス類を用いることもできる。これらの歯周病予防・治療剤を医薬用の治療剤として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。これら治療剤は、経口的又は非経口的に投与することができ、例えば、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば、練り歯磨、口腔内軟膏剤、含嗽剤溶液等の口腔内使用剤や、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射剤として非経口投与することができる。また、本発明の歯周病予防・治療剤を食品又は食品素材に添加・配合して歯周病予防・治療用の食品又は食品素材とすることもできる。上記食品又は食品素材としては、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、酒類、コーヒー、紅茶、煎茶、ウーロン茶、スポーツ飲料等の各種飲料や、プリン、クッキー、パン、ケーキ、ゼリー、煎餅などの焼き菓子、羊羹などの和菓子、冷菓、チューインガム等のパン・菓子類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、みそ、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、チーズ、バター等の乳製品や、豆腐、こんにゃく、その他佃煮、餃子、コロッケ、サラダ等の各種総菜へ配合して食品として使用することができる。なお、歯周病予防・治療用とは、包装容器や説明書に、歯周病の予防や治療に有効である旨表示されている場合などを意味する。
【００２２】
本発明の歯周病モデル器官培養物としては、マウス等の非ヒト動物の歯槽骨を器官培養した後、培養液にＴＬＲ４リガンド及び／又はＴＬＲ２リガンドを添加してさらに培養したものであれば特に制限されるものではなく、かかる歯周病モデル器官培養物は、インビトロにおける歯周病の予防・治療剤のスクリーニングに有利に用いることができる他、歯周病発症のメカニズムの解明に有利に用いることができる。歯槽骨の器官培養は、歯槽骨を生体より取り出し、もとの三次元的な構築を失わせることなく、有機的な成長を行わせる培養であれば公知の方法を含めどのような方法であってもよい。
【００２３】
本発明の歯周病の予防・治療剤のスクリーニングセットとしては、マウス等の非ヒト動物の歯槽骨の器官培養用培地、ＴＬＲ４リガンド及び／又はＴＬＲ２リガンド、及び培養上清中のカルシウム濃度の測定キットを有するセットであれば特に制限されず、歯槽骨の器官培養用培地としては、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ, Penicillin（Ｐ）（６３．２ｍｇ／ｌ）,Streptomycin（Ｓ）（１００ｍｇ／ｌ）を含むＢＧＪｂ液体培地、アルファＭＥＭ液体培地等を挙げることができる。
【００２４】
本発明の歯周病発症モデル動物としては、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウマ、ウシ、サル等の非ヒト動物の歯槽骨近傍の歯肉に、ＴＬＲ４リガンド及び／又はＴＬＲ２リガンドを投与することにより得られる非ヒト動物であれば特に制限されず、かかる歯周病発症モデル動物はインビボにおける歯周病の予防・治療剤のスクリーニングに有利に用いることができる他、歯周病発症のメカニズムの解明に有利に用いることができる。
【００２５】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
［インビトロ・スクリーニング系（マウス歯槽骨の器官培養系：ＬＰＳによる骨吸収活性の上昇）］
６週齢のｄｄｙ系マウスより下顎を採取し、実体顕微鏡下において、臼歯および切歯を抜歯したものを歯槽骨とした。４８ウェルプレートを用い、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ／ＢＧＪｂ medium／Penicillin（Ｐ）（６３．２ｍｇ／ｌ）, Streptomycin（Ｓ）（１００ｍｇ／ｌ）培養液５００μｌにて３７℃で２４時間培養した。その後、同培養液、すなわち、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ／ＢＧＪｂ medium／ＰＳの２００μｌにＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ；Sigma社製）を添加した培地に変え、さらに６日間培養した。培養後、カルシウムＣテストワコー（和光社製）により培養上清中のカルシウム濃度を測定した（ｎ＝４）。培養液のみの場合のカルシウム濃度を差引き、カルシウム濃度の上昇分を歯槽骨から遊出したカルシウムであると判断し、骨吸収活性とした。結果を図１（左）に示す。図１（左）中、＊はｐ＜０．００１を表す。図１（左）に示されるように、ＬＰＳ添加により骨吸収活性の上昇が認められた。
【実施例２】
【００２７】
［インビボ・スクリーニング系（マウス歯槽骨の骨密度による歯周病評価：下顎へのＬＰＳ投与による骨密度低下）］
実体顕微鏡下において、６週齢ｄｄｙ系マウスの左下顎臼歯外側の歯肉にＬＰＳ（０．５ｍｇ／ｍｌ）を２ヶ所に分けて２５μｌずつ（total  ５０μｌ）を１日置きに３回投与する（ＬＰＳ（２５μｇ／ｂｏｄｙ／ｄａｙ））。右下顎臼歯外側の歯肉には対象としてＰＢＳを同様に投与した。３回目投与の３日後に左右下顎より歯槽骨を取り出し、抜歯の後、ＤＥＸＡ（dual energy X-ray absorptiometry：Aloka社製）法により歯槽骨の骨密度（ＢＭＤ）を測定した（ｎ＝４）。結果を図１（右）に示す。図１（右）中、＊はｐ＜０．００１を表す。図１（右）に示されるように、ＬＰＳ投与により骨密度の減少が認められた。
【実施例３】
【００２８】
［インビトロ・スクリーニング系（マウス歯槽骨の器官培養系：ＬＰＳ、ＴＬＲ２リガンドによる骨吸収活性の上昇とインドメタシン併用による骨吸収活性の上昇抑制）］
実施例１と同様に、６週齢のｄｄｙ系マウスより下顎を採取し、実体顕微鏡下において、臼歯および切歯を抜歯したものを歯槽骨とした。４８ウェルプレートを用い、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ／ＢＧＪｂ medium／ＰＳ培養液５００μｌにて３７℃で２４時間培養した。その後、同培養液の２００μｌに、それぞれＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ；Sigma社製）を添加した培地、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ；Sigma社製）とインドメタシン（１０−６Ｍ；Sigma社製）を添加した培地、ＴＬＲ２リガンドであるリポペプチド（３００μｇ／ｍｌ；BACHEM社製）を添加した培地、リポペプチド（３００μｇ／ｍｌ；BACHEM社製）とインドメタシン（１０−６Ｍ；Sigma社製）を添加した培地に変え、さらに６日間培養した。培養後、カルシウムＣテストワコー（和光社製）により培養上清中のカルシウム濃度を測定した（ｎ＝各４）。培養液のみの場合のカルシウム濃度を差引き、カルシウム濃度の上昇分を歯槽骨から遊出したカルシウムであると判断し、骨吸収活性とした。結果を図２に示す。図２中、＊はｐ＜０．０１を、＊＊はｐ＜０．００１を表す。図２に示されるように、ＬＰＳ、ＴＬＲ２リガンドの添加により骨吸収活性の上昇が認められたが、インドメタシンの併用により、骨吸収活性の上昇が抑制された。 
【実施例４】
【００２９】
［インビボ・スクリーニング系（マウス歯槽骨の骨密度による歯周病評価：下顎へのＬＰＳ投与による骨密度低下とインドメタシン併用による骨密度低下の抑制）］
実施例２と同様に、実体顕微鏡下において、６週齢ｄｄｙ系マウスの左下顎臼歯外側の歯肉に、それぞれＬＰＳ（０．５ｍｇ／ｍｌ）のみを２ヶ所に分けて２５μｌずつ（total  ５０μｌ）、ＬＰＳ（０．５ｍｇ／ｍｌ）を２ヶ所に分けて２５μｌずつ（total  ５０μｌ）とインドメタシン（Sigma社製）１μｇ、ＬＰＳ（０．５ｍｇ／ｍｌ）を２ヶ所に分けて２５μｌずつ（total  ５０μｌ）とインドメタシン（Sigma社製）１０μｇを投与した。右下顎臼歯外側の歯肉には対象としてＰＢＳを同様に投与した。投与の７日後に左右下顎より歯槽骨を取り出し、抜歯の後、ＤＥＸＡ（dual energy X-ray absorptiometry：Aloka社製）法により歯槽骨の骨密度（ＢＭＤ）を測定した（ｎ＝各４）。結果を図３に示す。図３中、＊は対照と比較してｐ＜０．０５を、＊＊はｐ＜０．００１を表し、＃＃はＬＰＳ単独投与と比較してｐ＜０．００１を表す。図３に示されるように、ＬＰＳ投与により骨密度の減少が認められたが、インドメタシンの併用により、濃度依存的に骨密度の減少が抑制された。 
【実施例５】
【００３０】
［歯槽骨器官培養系におけるノビレチンおよびタンゲレチンの骨吸収抑制作用］
マウスより下顎を採取し、実体顕微鏡下において、臼歯、および切歯を抜歯したものを歯槽骨とした。１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ／ＢＧＪｂ medium／ＰＳにて２４時間培養後、ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ) および、式（１）に示すノビレチン（３０μＭ）または式（２）に示すタンゲレチン（３０μＭ）を併用処理し、さらに３日間培養後、培養上清中のＣａ濃度を測定し、骨吸収活性を求めた。その結果を図４に示す。処理後３日目において、骨吸収活性はＬＰＳ処理により有意に増加したが（＊Ｐ＜０．００１  ｖｓ  control）、ノビレチンまたはタンゲレチン併用処理により、有意に低下した（＃＃＃Ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＬＰＳ）。
【００３１】
【化１】
0005574490.tif 000002
【００３２】
【化２】
0005574490.tif 000003
【実施例６】
【００３３】
［歯周病モデルマウスの歯槽骨の骨密度に及ぼすノビレチンおよびタンゲレチンの投与効果］
６週齢マウスの下顎臼歯外側の歯肉に溶媒 (ＤＭＳＯ／ＰＥＧ３００  １：４) を１日置きに３回投与したマウスを control群、ＬＰＳ（３０μｇ／ｂｏｄｙ／ｄａｙ）を同様のスケジュールで投与したマウスをＬＰＳ群として、歯周病モデルマウスを作製した。さらに、ＬＰＳにノビレチン（０．３ｍｇ／ｂｏｄｙ／ｄａｙ）またはタンゲレチン（０．５ｍｇ／ｂｏｄｙ／ｄａｙ）を混合した液を１日置きに３回併用投与した。４群について、３回目投与の３日後に歯槽骨を摘出し、抜歯の後、Dual Energy X-ray Absorptiometry (ＤＥＸＡ) 法にて歯槽骨の骨密度を測定した。その結果を図５に示す。ＬＰＳ投与により低下した歯槽骨の骨密度はノビレチン（０．３ｍｇ／ｂｏｄｙ／ｄａｙ）併用投与によりコントロールレベルに維持された（ＬＰＳ投与群：＊Ｐ＜０．００１  ｖｓ  control, ノビレチン群：＃＃Ｐ＜０．０１  ｖｓ  ＬＰＳ）。また、ＬＰＳ投与により低下した歯槽骨の骨密度はタンゲレチン（０．５ｍｇ／ｂｏｄｙ／ｄａｙ）併用投与により有意に回復した（タンゲレチン群：＃Ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＬＰＳ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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