(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
電子移動を抑制する電子移動抑制剤であって、
前記電子移動は、蛍光標識と蛍光標識との間又は蛍光標識と核酸塩基との間の電子移動であり、
前記蛍光標識は、核酸塩基を備えるバックボーン構造体に連結されており、
前記電子移動抑制剤は、炭素数が４以上７以下であって置換されていてもよい非平面構造の単環式アルカンを有する環状体を前記蛍光標識に隣接して備える、電子移動抑制剤。
【請求項２】
前記電子移動抑制は、前記環状体を一つの前記蛍光標識の両側に隣接して備える、請求項１に記載の電子移動抑制剤。
【請求項３】
前記環状体は、前記バックボーン構造体又は前記バックボーン構造体の前記核酸塩基と相補する核酸塩基を備える別のバックボーン構造体に連結されて用いられる、請求項１又は２に記載の電子移動抑制剤。
【請求項４】
前記単環式アルカンは、シクロヘキサン誘導体である、請求項１〜３のいずれかに記載の電子移動抑制剤。
【請求項５】
前記環状体は、以下から選択される、請求項４に記載の電子移動抑制剤。
【化２７】
0005467275.tif 000029
【請求項６】
ラベル化剤であって、
核酸塩基を備えるバックボーン構造体に連結された、蛍光標識を有する一又は二以上の蛍光標識ユニットと、
前記バックボーン構造体及び／又は前記バックボーン構造体の前記核酸塩基と相補する核酸塩基を備える別のバックボーン構造体に連結された炭素数が４以上７以下であって置換されていてもよい非平面構造の単環式アルカンを有する環状体を含む電子移動を抑制するための一又は二以上の電子移動抑制ユニットと、
を備え、
前記電子移動は、蛍光標識と蛍光標識との間又は蛍光標識と核酸塩基との間の電子移動であり、
前記一又は二以上の電子移動抑制ユニットを、前記蛍光標識ユニットと前記蛍光標識ユニットとの間又は前記蛍光標識ユニットと前記核酸塩基との間に備える、ラベル化剤。
【請求項７】
前記二つの電子移動抑制ユニットを、前記一つの蛍光標識ユニットの両側に隣接して備える、請求項６に記載のラベル化剤。
【請求項８】
前記バックボーン構造体は、リン酸−糖バックボーン及び／又はリン酸−アルキレン鎖バックボーンのいずれかである、請求項６又は７に記載のラベル化剤。
【請求項９】
前記蛍光標識ユニットは、以下の式（１）で表される、請求項６〜８のいずれかに記載のラベル化剤。
【化２８】
0005467275.tif 000030
（式中、Ｘは蛍光標識を表し、Ｒ１は、炭素数が２又は３であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Ｒ２は、直接の結合又は炭素数が１以上２以下であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Ｚは、直接の結合又は連結基を表す。）
【請求項１０】
前記電子移動抑制ユニットは、以下の式（２）で表される、請求項６〜９いずれかに記載のラベル化剤。
【化２９】
0005467275.tif 000031
（式中、Ｙは前記環状体を表し、Ｒ１は、炭素数が２又は３であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Ｒ２は、直接の結合又は炭素数が１以上２以下であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Ｚは、直接の結合又は連結基を表す。）
【請求項１１】
前記蛍光標識は、シアニン系色素、メロシアニン系色素、縮合芳香環系色素、キサンテン系色素、クマリン系色素及びアクリジン系色素からなる群から選択される、請求項６〜１０のいずれかに記載のラベル化剤。
【請求項１２】
請求項６〜１１のいずれかに記載のラベル化剤をオリゴヌクレオチドの一部に備える、ラベル化されたオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
以下の式（３）で表される、炭素数が４以上７以下であって置換されていてもよい非平面構造の単環式アルカンを有する環状体を備える、蛍光標識と蛍光標識との間又は蛍光標識と核酸塩基との間の電子移動を抑制する電子移動抑制剤用材料。
【化３０】
0005467275.tif 000032
（式中、Ｙは前記環状体を表し、Ｒ１は、炭素数が２又は３であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Ｒ２は、直接の結合又は炭素数が１以上２以下であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Ｚは、直接の結合又は連結基を表す。Ｃ１は、水素原子又は水酸基保護基を表し、Ｄ１は、水素原子、水酸基保護基又はホスホアミダイト基を表す。）
【請求項１４】
前記環状体は、以下から選択される、請求項１３に記載の電子移動抑制剤用材料。
【化３１】
0005467275.tif 000033
【請求項１５】
生体分子の検出方法であって、
生体分子を、請求項６〜１１のいずれかに記載のラベル化剤の前記蛍光標識に基づくシグナルによって検出する工程、
を備える、方法。
【請求項１６】
蛍光標識されたオリゴヌクレオチドの生産方法であって、
請求項６〜１１のいずれかに記載のラベル化剤を含んだオリゴヌクレオチドを合成する工程、を備える、生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１０年２月２６日出願の日本国特許出願である特願２０１０−０４２６３２号を優先権の主張の基礎とするものであり、引用によりその出願内容の全てが本願に取り込まれるものとする。本発明は、インスレーター及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸やタンパク質などの生体分子のラベル化法として、フルオレッセインやＣｙ３といった蛍光色素を一分子結合させる手法がある。この手法によれば、検出強度は、一分子の蛍光色素の蛍光強度に依存することになる。蛍光強度は、蛍光色素の二つの特性である光の吸収と量子収率とに比例する。蛍光色素は量子収率が高いものの、一分子で用いられるため、光の吸収が小さく、結果として高い蛍光強度が得られていない。【０００３】
加えて、蛍光色素をＤＮＡ等の核酸に結合させた場合、隣接するヌクレオチドのグアニンやチミンなどの核酸塩基によってその蛍光色素が消光され蛍光強度が低下してしまうという現象があった。このため、隣接する核酸塩基による消光を抑制するためのインスレーター分子が提案されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】J. N. Wilson et al. ChemBioChem, 2008, 9, 279-285
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは、蛍光色素の使用が一分子に限定されていることによる低い検出感度を改善するには、蛍光色素を多数結合して光の吸収を増大させて蛍光強度を増大させることが有効であると考えた。しかしながら、複数の蛍光色素を導入した場合には、多くの蛍光色素は二量体を形成し、量子収率が低下してしまい、結果として消光してしまうという問題があった。非特許文献１に開示されるインスレーター分子は、蛍光色素を多数結合した際の消光現象を抑制することを意図するものではなく、蛍光色素に隣接するヌクレオチドの塩基による消光現象の抑制を目的としていた。したがって、非特許文献１に記載のインスレーター分子が蛍光色素間の消光が可能であるかどうかは不明であった。また、現状において、蛍光色素間の消光抑制に有効な構造を予測できる報告はなされていない。
【０００６】
また、蛍光色素の種類によっては、隣接するヌクレオチドの核酸塩基による影響が大きい場合もある。非特許文献１には、アミノプリンとピレンという２種類の蛍光色素についてヌクレオチドの塩基との間に導入するのに好ましいインスレーター分子が開示されているに留まっている。
【０００７】
そこで、本明細書の開示は、隣接する蛍光色素又は核酸塩基の影響を抑制して、蛍光色素の蛍光強度を増大させることができるインスレーター及びその利用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、隣接する蛍光色素間の電子移動を抑制するためのインスレーターについて種々検討したところ、ある種の骨格を有することが有効であるという知見を得た。さらに、こうした骨格を有するインスレーターを用いることで、蛍光色素を集積化して蛍光強度を増大させうるという知見も得た。また、隣接するヌクレオチドなどの核酸塩基による蛍光色素の消光を抑制するための塩基に対するインスレーター機能についても確認した。これらの知見によれば、以下の手段が提供される。【０００９】
本明細書の開示によれば、非平面の構造の環状体を有し、１又は２以上の蛍光標識に隣接して前記蛍光標識の蛍光強度を増強するインスレーターが提供される。前記環状体は、炭素数が４以上７以下の単環体及び炭素数が８以上１２以下の二環以上の環状体から選択されてもよいし、前記環状体は、炭素数が４以上７以下の少なくとも一つの単環式アルカンであってもよい。さらに、前記環状体は、シクロヘキサン誘導体であってもよい。【００１０】
また、本明細書の開示によれば、核酸塩基を有するバックボーン構造体であって、蛍光標識を有する１又は２以上の蛍光標識ユニットと、非平面構造の環状体を有する分子を含む１又は２以上のインスレーターユニットと、を備え、前記蛍光標識ユニットは前記バックボーン構造体に連結され、１又は２以上の前記インスレーターユニットを、前記蛍光標識ユニットの一方又は両方に隣接して配置可能に備える、構造体が提供される。前記バックボーン構造体は、前記蛍光標識ユニットを前記インスレーターユニット間に有していてもよい。前記バックボーン構造体は、前記蛍光標識ユニットを構造体内部に有していてもよいし、端部（５’末端及び／又は３’末端）側に有していてもよい。特に、バックボーン構造体が塩基対合に基づく相補鎖を含むとき、前記蛍光標識ユニットを前記インスレーターユニットとともに二重鎖内部に有していてもよいし、これらを二重鎖部分でない端部（５’末端及び／又は３’末端）側に有していてもよい。【００１１】
さらに、本明細書の開示によれば、前記構造体から含むラベル化剤が提供される。前記ラベル化剤は、前記蛍光標識ユニット及び前記インスレーターユニットを、核酸塩基を備えるバックボーン及び／又はこのバックボーンの相補鎖に備えていてもよい。前記ラベル化剤は、前記インスレーターユニットを、少なくとも１つの前記分子を２つの前記蛍光標識の間に配置可能に、前記バックボーン及び／又はその相補鎖に備えるものであってもよい。さらに、前記インスレーターユニットを、少なくとも１つの前記分子が１つの前記蛍光標識の両側のそれぞれに隣接して配置可能に、前記バックボーン又はその相補鎖に備えるものであってもよい。さらに、２以上の前記蛍光標識ユニットを備えるbyものであってもよい。【００１２】
前記蛍光標識ユニットは、以下の式（１）で表されるものであってもよい。
【化１】
0005467275.tif 000002
（式中、Ｘは蛍光標識を表し、Ｒ1は、炭素数が２又は３であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Ｒ2は、炭素数が０以上２以下であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Ｚは、直接の結合又は連結基を表す。）【００１３】
また、前記インスレーターユニットは、以下の式（２）で表されるものであってもよい。
【化２】
0005467275.tif 000003
（式中、Ｙはインスレーターを表し、Ｒ1は、炭素数が２又は３であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Ｒ2は、炭素数が０以上２以下であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Ｚは、直接の結合又は連結基を表す。）【００１４】
前記蛍光標識は、シアニン系色素、メロシアニン系色素、縮合芳香環系色素、キサンテン系色素、クマリン系色素及びアクリジン系色素からなる群から選択されるものであってもよい。【００１５】
さらにまた、本明細書の開示によれば、前記インスレーターを有する化合物も提供される。  即ち、本発明の化合物は、非平面構造の環状体を有するインスレーターを含み、以下の式（３）で表される。
【化３】
0005467275.tif 000004
（式中、Ｙは前記インスレーターを表し、Ｒ1は、炭素数が２又は３であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Ｒ2は、炭素数が０以上２以下であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Ｚは、直接の結合又は連結基を表す。Ｃ１は、水素原子又は水酸基保護基を表し、Ｄ１は、水素原子、水酸基保護基、ホスホアミダイト基又は固相担体に結合される若しくは結合された連結基を表す。）【００１６】
本明細書の開示によれば、生体分子の検出方法であって、生体分子を、上記ラベル化剤の前記蛍光標識に基づくシグナルによって検出する工程、を備える、方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本明細書に開示されるラベル化剤の一例を示す図である。
【図２】本明細書に開示されるラベル化剤の他の一例を示す図である。
【図３】本明細書に開示されるラベル化剤のさらに他の一例を示す図である。
【図４】本明細書に開示されるラベル化剤のさらに他の一例を示す図である。
【図５】実施例４における蛍光標識（ピレン）に隣接されるインスレーターを有する二重鎖オリゴヌクレオチドの蛍光強度の測定結果を示す図である。
【図６】実施例６における蛍光標識（ペリレンビスイミド）に隣接されるインスレーターを有する二重鎖オリゴヌクレオチドの蛍光強度の測定結果を示す図である。
【図７】実施例８における複数の蛍光標識（ピレン）間に介在されるインスレーターを有する二重鎖オリゴヌクレオチドの蛍光強度の測定結果を示す図である。
【図８】実施例９で合成したオリゴヌクレオチド中の蛍光標識ユニット（Ｆ）及びインスレーターユニット（Ｈ）と、相補鎖と塩基対合させた二重鎖オリゴヌクレオチドの形態を示す図である。
【図９】末端に蛍光標識ユニットとインスレーターユニットとを備える二重鎖オリゴヌクレオチドの蛍光強度の測定結果を示す図である。上段はｐＨ７における結果を示し、下段はｐＨ９における結果を示す。
【図１０】実施例１１における二重鎖オリゴヌクレオチドの蛍光強度の測定結果を示す図である。
【図１１】実施例１２における一重鎖及び二重鎖オリゴヌクレオチドの蛍光強度の測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書の開示は、インスレーター、該インスレーターを備えるヌクレオシド誘導体、さらに該インスレーターを備えるインスレーターユニットを備えるラベル化剤等に関する。本明細書に開示されるインスレーターによれば、２つの蛍光標識間あるいは１つの蛍光標識に隣接して配置することにより、これらの蛍光標識間あるいは蛍光標識と隣接する核酸塩基との間の電子移動を抑制して、蛍光標識の収率の低下を抑制し、結果として、消光を抑制できる。これにより、蛍光標識による蛍光強度の増強効果を得ることができる。本明細書の開示を限定するものではないが、こうした電子移動の抑制は、非平面構造の環状体によって、塩基や色素のスタッキングを乱すことによって生じるものと推論される。
【００１９】
こうしたインスレーターによれば、検出感度に優れたラベル化剤、ラベル化剤等に用いることのできるヌクレオシド誘導体、アミダイト体、こうしたラベル化剤を用いた生体分子の検出方法が提供される。以下、本明細書の開示に含まれる種々の実施形態について適宜図面を参照しながら説明する。図１は、本明細書に開示されるラベル化剤の一例を示す図であり、図２は、ラベル化剤のさらに他の一例を示す図であり、図３はさらに他の一例を示す図である。図４はさらに他の一例を示す図である。
【００２０】
（インスレーター）
本明細書に開示されるインスレーターは、１又は２以上の蛍光標識に隣接して、隣接する蛍光色素、さらには隣接する可能性のある核酸塩基への電子移動を抑制することにより蛍光標識の蛍光強度の低下を抑制する分子又はその分子の構造を実質的に維持する基である。インスレーターは、これにより蛍光色素の蛍光強度を増強する増強剤として機能する。また、インスレーターを介在させて核酸塩基や蛍光塩基への電子移動を抑制することで、ｐＨによって発光強度が影響される蛍光標識もｐＨにかかわらず発光強度を増強することができる。このため、蛍光を検出するために、ハイブリダイゼーション時とは異なるｐＨの適用が求められていたような蛍光標識であっても、蛍光検出のためのｐＨ範囲の要請が緩まりｐＨの自由度が高まることで、実験操作におけるｐＨ調整の簡略化や省略化が可能となる。
【００２１】
（環状体）
本インスレーターは非平面構造の１又は２以上の環状体を有している。非平面構造とは、その環状体の立体構造が非平面構造であることをいい、非平面構造を有しているとは、こうした非平面構造が許容されていることを意味する。こうした環状体としては、例えば、結合軸周りの回転が許容された結合を少なくとも２以上備えている環状体が挙げられ、具体的には、sp3結合様式を含む炭素−炭素結合を２以上有する環状体が挙げられる。こうした環状体としては、各種の単環炭化水素、橋かけ環炭化水素、スピロ炭化水素及びこれらの誘導体が挙げられる。
【００２２】
環状体としては、例えば、炭素数が４以上７以下の単環体が挙げられる。すなわち、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクヘプタン、シクロペンテン、シクロヘキセン、シクロヘプテン並びにこれらの誘導体が挙げられる。これらのうち、環状体は、炭素数が４以上７以下の少なくとも一つの単環式アルカンであることが好ましい。より好ましくは、シクロヘキサン又はその誘導体である。また、例えば、炭素数が８以上１２以下の二環以上の環状体が挙げられる。二環以上の環状体は、橋かけ環炭化水素であってもよいしスピロ環炭化水素であってもよいし、集合環であってもよい。
【００２３】
環状体に連結する１又は２以上の水素原子は置換されていてもよい。置換基は特に限定されないが、炭素数が１以上８以下の直鎖状又は分岐状のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基などの炭化水素基が挙げられる。好ましくはアルキル基であり、より好ましくは、炭素数が１以上５以下の直鎖状又は分岐状のアルキル基である。
【００２４】
こうした環状体としては、例えば、以下の化合物等が挙げられる。なお、以下の化合物は、後述する主鎖やユニットへの連結部を含めて示している。なお、連結部は、例示される部位に限られるものではなく、適宜決定される。
【００２５】
【化４】
0005467275.tif 000005
【００２６】
インスレーターは、こうした環状体を備えるほか、芳香族環を備えていてもよく、こうした芳香族環は、環状体に直接炭素−炭素結合を介して連結されていてもよいし、適当な連結基を介して連結されていてもよい。また、インスレーターは、後述する主鎖や核酸塩基を備えるバックボーンに備えられる蛍光標識に隣接させるために、主鎖やこのバックボーン又はこの相補鎖に連結するための連結基を備えることもできる。
【００２７】
（蛍光標識）
インスレーターは、１又は２以上の蛍光標識に隣接されて用いられる。ごく通常には、後述するように、蛍光標識を備えるラベル化剤においてインスレーターとして用いられる。蛍光標識は、特に限定しないで公知の蛍光標識を利用できる。例えば、シアニン系色素、メロシアニン系色素、アクリジン系色素、クマリン系色素、エチジウム系色素、フラビン系色素、縮合芳香環系色素、キサンテン系色素等が挙げられ、これらから適宜選択して使用できる。より具体的には、シアニン系色素、クマリン系色素、エチジウム系色素、縮合芳香族環色素、キサンテン系色素が好ましく用いることができる。さらに具体的には、Ｃｙ３，Ｃｙ５，チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、ピレン、ペリレン、ペリレンビスイミド、フルオレッセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン及びテキサスレッド並びにこれらの誘導体からなる群から選択される。
特に、ペリレンビスイミドは光化学的に安定であり、他の蛍光色素と比べ光退色に非常に強いという特長があるため、好ましい。ペリレンビスイミドは、本発明のインスレーターと組み合わせることにより他の蛍光色素同等もしくはそれ以上の量子収率を得ることが出来る。本発明によれば、好適なペリレンビスイミドは、以下の式Ａで表される。
【００２８】
【化５】
0005467275.tif 000006
【００２９】
（式中、Ｒは、アルキル基を示す。好ましくは、分枝アルキル基であり、C1〜C８、より好ましくはC2〜C5の分枝アルキル基、特にイソプロピル基である。）
【００３０】
また、ｐＨに応じて蛍光強度が変化する蛍光標識としては、キサンテン系色素が挙げられる。なかでも、プロトン化に応じて消光する蛍光標識が挙げられる。こうした蛍光標識としては、例えば、以下の標識が挙げられる。なお、以下の各式においては、−ＣＯ−をユニットへの連結基の一例として記載しているが、これに限定するものではない。
【００３１】
【化６】
0005467275.tif 000007
【００３２】
蛍光標識とインスレーターとは、どのような形態で隣接されているかは問わない。例えば、公知のラベル化剤に許容される構造において両者は隣接されて備えられていてもよい。例えば、1又は2以上の蛍光標識をアミノ基、ＳＨ基、アルデヒド基、カルボキシル基及び水酸基などから選択される反応性基を複数個備える適当な高分子の主鎖に結合されて備えられていてもよいし、主鎖の一形態である「核酸塩基を備えるバックボーン構造体」に結合されて備えられていてもよい。核酸塩基とは、天然のアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）並びにこれらの誘導体が挙げられる。また、こうした核酸塩基を備えるバックボーンの構造体は特に限定されないが、互いに相補的な塩基配列のとき、核酸塩基の塩基対を形成可能な二重鎖を構成できる構造を有していることが好ましい。例えば、ホスホジエステル結合により５単糖であるリボースやデオキシリボースが連なったリン酸−糖バックボーンのほか、ＰＮＡなどのペプチド結合によるペプチドバックボーン、さらに後述するように本明細書に開示されるリン酸−アルキレン鎖のバックボーン等が挙げられる。こうしたバックボーン構造体は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド又はこれらの誘導体、ＰＮＡ等として合成又は入手可能である。
【００３３】
主鎖の一形態としての、「核酸塩基を備えるバックボーン構造体」は、通常、２以上の核酸塩基を備えることが好ましく、例えば、１０ｍｅｒ以上１００ｍｅｒ以下程度の塩基長を有するものであってもよい。特にその数を限定するものではなく１００ｍｅｒを越える場合であっても、本明細書のバックボーン構造体に含まれる。また、バックボーン構造体は、１重鎖であってもよいし、塩基対合による相補鎖を含んで二重鎖を有するものであってもよい。なお、ここでいう相補鎖とは、一重鎖のバックボーン構造体の有する塩基又はその配列と塩基対を形成可能な核酸塩基の塩基又はその配列を有するバックボーン構造体を意味している。
【００３４】
こうしたインスレーターによれば、蛍光標識に隣接されるときに当該蛍光標識からインスレーターをおいて隔てた他の電子移動可能な化合物、例えば核酸塩基や他の蛍光標識などのへの電子移動を抑制して、当該蛍光標識の量子収率の低下を抑制して蛍光強度の低下を抑制し、結果として蛍光強度をインスレーター不在のとき(インスレーターによって隣接されないとき）よりも増強できる。したがって、本インスレーターは感度の良好なラベル化剤のための要素となる。
【００３５】
本インスレーターは、蛍光標識と蛍光標識との間に１又は２以上を配置する状態で、これらの蛍光標識間の電子移動を抑制できる。また、蛍光標識と核酸塩基との間に１又は２以上を配置する状態で、これらの間の電子移動を抑制できる。したがって、本インスレーターは、蛍光標識と蛍光標識との間に１又は２以上が配置されるように備えられてもよいし、蛍光標識と核酸塩基との間に１又は２以上が配置されるように備えられていてもよい。さらに、インスレーターは、蛍光標識の一方又は双方に隣接するように備えられていてもよい。
【００３６】
影響を抑制する対象となる核酸塩基や蛍光標識との間に配置される本インスレーターの個数が多いほど、電子移動の抑制効果が高い傾向にある。したがって、電子移動の抑制効果の観点からは、本インスレーターの個数は、２以上が好ましく、より好ましくは３個以上であり、さらに４個以上であることが好ましい。
【００３７】
（ラベル化剤）
本明細書に開示されるラベル化剤は、蛍光標識を有する１又は２以上の蛍光標識ユニットと、非平面構造の環状体を有するインスレーターを含むインスレーターユニットと、を備え、インスレーターユニットを、前記インスレーターを１又は２以上の前記蛍光標識に隣接して配置可能に備えることができる。ここで、非平面構造の環状体を有するインスレーターは、本明細書に開示されるインスレーターである。
【００３８】
本ラベル化剤は、蛍光標識ユニットとインスレーターユニットとを、インスレーターが蛍光標識に隣接して配置されていれば、特に、その構造を問うものではない。例えば、上述のように１又は２以上の蛍光標識をアミノ基、ＳＨ基、アルデヒド基、カルボキシル基及び水酸基などから選択される反応性基を複数個備える適当な高分子の主鎖に結合させた上、これらの蛍光標識の一方又は双方に隣接するように、１又は２以上のインスレーターを同一の主鎖の前記反応性基に結合させることで構成してもよい。この場合、一本の主鎖上に蛍光標識とインスレーターとが配置されることになる。換言すれば、蛍光標識ユニットとインスレーターユニットとが連結された構成となる。
【００３９】
本ラベル化剤の蛍光標識ユニットとインスレーターユニットとは、好ましくは、既に説明した核酸塩基を備えるバックボーン構造体に備えられることが好ましい。すなわち、一重鎖のバックボーン構造体に備えられていてもよいし、二重鎖のバックボーン構造体の一方の鎖又は双方の鎖に備えられていてもよい。これらのユニットを一重鎖のバックボーン構造体に備えることで、蛍光標識を複数個スタックして備えることができるとともに、蛍光標識間や隣接する塩基との間にインスレーターを容易に導入することができる。また、これらのユニットを、二重鎖のバックボーン構造体の一方の鎖又は双方の鎖に備える場合には、二重鎖の間の塩基対形成を利用してより有効に蛍光標識間及び蛍光標識と核酸塩基との間にインスレーターを配置させることができ、インスレーターの優れた機能を効果的に発揮させることができる。例えば、式Ａで表されるペリレンビスイミドを有する蛍光標識ユニットが好適なものとして挙げられる。
【００４０】
（蛍光標識ユニット）
蛍光標識ユニットは、蛍光標識を有してラベル化剤を構成する単位である。蛍光標識以外のユニット構成部分は、主鎖又はバックボーン構造体の種類に依存した構成を有することができる。例えば、バックボーンがリン酸−糖バックボーン構造である場合、蛍光標識ユニットは、リン酸−糖部分を有することができる。すなわち、オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチド単位の塩基以外の骨格単位を備えることができる。また、バックボーン構造がＰＮＡのバックボーン構造の場合には、当該ＰＮＡの骨格単位を備えることができる。さらに、バックボーン構造がリン酸−アルキレン鎖バックボーンである場合、リン酸−アルキレン鎖の骨格単位を備えることができる。リン酸−アルキレン鎖バックボーンは、合成の簡便性の観点から本ラベル化剤に有利である。また、蛍光標識ユニットは、主鎖又はバックボーンの種類に依存した構成を必ずしも採る必要はない。例えば、バックボーンがリン酸−糖バックボーンであっても、リン酸−アルキレン鎖の骨格単位を有していてもよい。リン酸−アルキレン鎖バックボーンを構成する蛍光標識ユニットは、例えば、以下の式（１）で表される。
【００４１】
【化７】
0005467275.tif 000008
（式中、Ｘは蛍光標識を表し、Ｒ1は、炭素数が２又は３であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Ｒ2は、炭素数が０以上２以下であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Ｚは、直接の結合又は連結基を表す。）
【００４２】
Ｒ2は、Ｒ1のアルキレン鎖の５’側の酸素原子から２つ目の炭素原子に結合していることが好ましい。連結基としてのＺは、例えば、−ＮＨＣＯ−、ＮＨＣＳ−、ＣＯＮＨ−、−Ｏ−等あるいはこれらの基を含むものが挙げられる。なお、連結基への連結部分（点線部分）において、蛍光標識の大きさやインスレーターとの関係を考慮して、置換されていてもよいアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基を介在させてもよい。また、蛍光標識として使用する化合物は、式（１）で表されるユニットに連結されるために適宜誘導体化されていてもよい。また、式（１）で表されるユニットに対して連結される蛍光標識上の原子は特に限定されない。
【００４３】
（インスレーターユニット）
インスレーターユニットは、インスレーターを有してラベル化剤を構成する単位である。蛍光標識ユニットと同様、インスレーター以外のユニット構成部分は、主鎖又はバックボーンの種類に依存した構成を有していてもよいし、異なる構成を有していてもよい。リン酸−アルキレン鎖バックボーンを構成するインスレーターユニットは、例えば、以下の式（２）で表される。
【００４４】
【化８】
0005467275.tif 000009
（式中、Ｙはインスレーターを表し、Ｒ1は、炭素数が２又は３であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Ｒ2は、炭素数が０以上２以下であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Ｚは、直接の結合又は連結基を表す。）
【００４５】
式（２）におけるＲ1、Ｒ2、Ｚについては、式（１）におけるのと同義である。なお、連結基への連結部分（点線部分）において、蛍光標識への隣接程度や対合鎖にあるインスレーターとの関係を考慮して、置換されていてもよいアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基を介在させてもよい。また、インスレーターとして使用する化合物は、式（２）で表されるユニットに連結されるために適宜誘導体化されていてもよい。また、式（２）で表されるユニットに対して連結されるインスレーター上の原子は特に限定されない。
【００４６】
式（１）及び式（２）における上記Ｒ1〜Ｒ2の置換基としては、未置換の又はハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基等で置換された炭素数１〜２０、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜４のアルキル基又はアルコキシ基；未置換又はハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシ基等で置換された炭素原子２〜２０、好ましくは２〜１０、より好ましくは２〜４のアルケニル基若しくはアルキニル基；水酸基、ハロゲン原子、アミノ基、ニトロ基又はカルボキシ基等が挙げられる。さらに、水酸基、ハロゲン原子、アミノ基、ニトロ基又はカルボキシ基が挙げられる。Ｒ1の置換基は、アルキレン鎖のいずれの炭素原子に連結されていてもよいが、５’の酸素から２つ目又は３つ目の炭素原子に連結されることが好ましい。
【００４７】
一のラベル化剤において用いられる蛍光標識ユニット及びインスレーターユニットに関し、式（１）及び式（２）における、Ｒ1におけるアルキレン鎖の炭素数は、同一であっても異なっていてもよい。
【００４８】
例えば、式（１）又は式（２）で表されるユニットとして以下のものが挙げられる。
【化９】
0005467275.tif 000010
【化１０】
0005467275.tif 000011
【化１１】
0005467275.tif 000012
【００４９】
こうしたインスレーターユニット及び蛍光標識ユニットは、各種態様の核酸塩基を備えるバックボーンに連結可能に誘導体化されていてもよい。例えば、アミダイトモノマー化されていてもよい。
【００５０】
なお、ラベル化剤が、二重鎖を有するバックボーン構造体からなるとき、各鎖は、インスレーターによって蛍光標識の量子収率の低下を抑制するのに有効な程度に、インスレーターと蛍光標識とが隣接するような量の塩基対を形成できることが好ましい。好ましい塩基対の数は特に限定しないが、が好ましい。こうした塩基対は、蛍光標識及びインスレーターの個数や配置にもよるが、５ｂｐ以上１００ｂｐ以下程度とすることができる。
【００５１】
インスレーターユニットは、少なくとも１つのインスレーターを２つの蛍光標識の間に配置可能に、一重鎖又は二重鎖のバックボーン構造体に備えられることが好ましい。こうした形態によれば、複数の蛍光標識間の電子移動を抑制して蛍光強度を増強できる。また、インスレーターユニットは、少なくとも１つのインスレーターが１つの蛍光標識の両側のそれぞれに配置可能に、一重鎖又は二重鎖のバックボーン構造体に備えられることが好ましい。こうした形態によれば、蛍光標識と核酸塩基との間の電子移動を抑制して蛍光強度を増強できる。また、インスレーターユニットは、少なくとも一つのインスレーターが核酸塩基と蛍光標識の間に介在するように、一重鎖又は二重鎖のバックボーン構造体に備えられていることも好ましい。
【００５２】
蛍光標識ユニットとインスレーターユニットとを、塩基対を形成する一重鎖又は二重鎖のバックボーン構造体に備える形態を図１〜図４に例示する。図１は、独立した２本の一重鎖からなる二重鎖のバックボーン構造体であって、隣接する核酸塩基への電子移動の抑制を意図したものである。図１（ａ）は、１の蛍光標識ユニットを備える一方のバックボーン構造体の両側に１又は２以上のインスレーターユニットを備え、他方のバックボーン構造体にはインスレーターユニットを備えない形態である。図１（ｂ）は、１の蛍光標識ユニットを備える一方のバックボーン構造体の両側に、他方のバックボーン構造体に備えられた１又は２以上のインスレーターユニットが配置される形態である。こうした形態によれば、蛍光標識にインスレーターを隣接させることができる。また、こうした形態によれば、蛍光標識と核酸塩基との間にインスレーターを介在させることができる。
【００５３】
図２は、図１と同様二重鎖の形態であって隣接する塩基への電子移動を意図したものであるが、インスレーターユニットを蛍光標識ユニットを一方のバックボーン構造体と他方のバックボーン構造体とに分配して備える形態である。すなわち、図２（ａ）及び図２（ｂ）は、１の蛍光標識ユニットを備える一方のバックボーン構造体の両側に隣接するように、一方及び他方のバックボーン構造体にインスレーターユニットを備える形態である。インスレーターは、蛍光標識の両側にそれぞれ１又は２以上配置されるようになっている。こうした形態によれば、蛍光標識にインスレーターを隣接させることができるし、蛍光標識と核酸塩基との間にインスレーターを介在させることができる。
【００５４】
また、図２（ｃ）は、蛍光標識ユニットは、一方のバックボーン構造体とこれに対する相補鎖となる他方のバックボーン構造体との双方に備えられており、インスレーターユニットも、一方のバックボーン構造体及び他方のバックボーン構造体の双方に備えられており、この両者の鎖の内部に配置される蛍光標識の両側にそれぞれの鎖に備えたインスレーターユニットのインスレーターが配置されるようになっている。
【００５５】
図３は、一重鎖であっても塩基対の形成による二重鎖を形成可能となるようにループとステムとを有するモレキュラービーコンの形態である。図３では、ステムが図２（ｃ）と同様の構成を有している。
【００５６】
図４は、二重鎖を有するバックボーン構造体の形態である。これらの形態では、二重鎖部分から突き出た主鎖又はバックボーン部分に蛍光標識ユニットとインスレーターユニットとを備えている。
【００５７】
これらの例示形態は各種修飾が可能である。いずれの形態においても、蛍光標識に隣接するインスレーターをバックボーン構造体及び相補鎖のいずれか一方にのみ配置してもよいし双方であてもよい。隣接する核酸塩基や蛍光標識との間に配置されるインスレーターは１以上であればよく、２以上でも３以上であってもよい。完全二重鎖によってバックボーンと相補鎖とを構成してもよいし、一重鎖でこれらを構成してもよい。
【００５８】
ラベル化剤は、ラベル化対象である生体分子等に結合させるための要素を備えることができる。ラベル化対象がタンパク質などの場合には、タンパク質中のアミノ基、ＳＨ基、カルボキシル基及び水酸基などから選択される官能基に対して共有結合を形成する反応性基を有することができる。また、ラベル化対象が核酸の場合、核酸中のこうした官能基あるいは連結のために導入した官能基に対して共有結合を形成する反応性基を有していればよい。さらに、本ラベル化剤が上記バックボーン構造体を備えていれば、バックボーン構造体又は相補鎖の一部に粘着末端を形成することで、核酸試料のラベル化のほか、プローブ、プライマー等となりうるオリゴヌクレオチドのラベル化が容易に可能である。こうしてラベル化されたオリゴヌクレオチドや二重鎖オリゴヌクレオチド等は、ラベル化試料として、あるいは検出対象であるターゲット核酸、プライマー、プローブ等として用いられる。
【００５９】
ラベル化剤は、例えば、通常の固相合成法において、ヌクレオチドに対応するアミダイト誘導体や当該誘導体に代えてこの種のユニットを導入なアミダイド誘導体を用いることによって可能となる。例えば、上記したユニットの導入にあたっては、Ｄ−トレオニールや３−アミノ１，２−プロパンジールなどのアミノアルキルジオール類のアミノ基をアリルオキシカルボニル基などの適当な保護基で保護した上、一方の水酸基をジメトキシトリチルクロリド等で保護し、その後、他方の水酸基に２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトライソプロピルホスホロジアミダイドを導入してアミダイト体を得る。そしてこのアミダイト体に対して、蛍光標識又はインスレーターを導入してアミダイトモノマー化してもよい。例えば、アゾベンゼン系化合物、ペリレン系化合物については、例えば、ネイチャー・プロトコルズ（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）誌２００７年第２巻２０３ページから２１２ページに記載の方法で、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）誌２００３年１２５巻２２１７−２２２３頁記載の方法で、テトラへドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ）誌２００７年第４８巻６７５９−６７６２頁記載の方法を適用することができる。こうしたモノマーを取得した場合には、従来公知のＤＮＡ合成法、例えばネイチャー・プロトコルズ(Nature Protocols)誌２００７年第２巻２０３ページから２１２ページに記載の方法にしたがって、所望の部位に蛍光標識やインスレーターを連結したユニットを備えるオリゴヌクレオチドを合成することができる。
【００６０】
また、蛍光標識やインスレーターは、アリルオキシカルボニル基等でアミノ基を保護した上記アミダイト体を所望の位置に備えるオリゴヌクレオチドを合成後に導入してもよい。例えば、アミノ基を保護したままのユニットを備えたオリゴヌクレオチドをＣＰＧ担体上においてアミノ基を脱保護した後、当該アミノ基と反応可能にカルボン酸基やイソシアネート基を導入したあるいは保持する蛍光標識やインスレーターを反応させることで、フルオロホア等を導入してもよい。
【００６１】
以上の実施形態によれば、核酸塩基を有するバックボーン構造体であって、インスレーターユニットと蛍光標識ユニットとを備え、前記インスレーターユニットを、前記バックボーン構造体の核酸塩基と蛍光標識ユニットとの間に介在させて備える、構造体も本発明の一実施形態である。典型的には、ラベル化剤によりラベル化されたオリゴヌクレオチドなどのバックボーン構造体であるこのバックボーン構造体は、核酸試料、プローブあるいはプライマーでありうる。このバックボーン構造体は、一重鎖であってもよいし二重鎖であってもよい。また、このバックボーン構造体は、１又は2以上、好ましくは一つの蛍光標識ユニットを２つのインスレーターユニット間に有していてもよい。さらに、バックボーン構造体は、蛍光標識ユニットを構造体内部に有していてもよいし、端部（５’末端及び／又は３’末端）側に有していてもよい。特に、バックボーン構造体が塩基対合に基づく相補鎖を備えるとき、蛍光標識ユニットをインスレーターユニットとともに二重鎖内部に有していてもよいし、これらを二重鎖部分でない端部（５’末端及び／又は３’末端）側に有していてもよい。
【００６２】
また、以上の実施形態によれば、インスレーターを有する種々の態様のバックボーン単位を形成可能な化合物（アミダイト化合物を含む）も本明細書の開示に含まれる。インスレーターを備える化合物は、例えば、以下の構造を採ることができる。
【００６３】
【化１２】
0005467275.tif 000013
（上記式（３）中、Ｙは前記分子を表し、Ｒ1は、炭素数が２又は３であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Ｒ2は、炭素数が０以上２以下であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Ｚは、直接の結合又は連結基を表す。Ｃ１は、水素原子又は水酸基保護基を表し、Ｄ１は、水素原子、水酸基保護基、ホスホアミダイト基又は固相担体に結合される若しくは結合された連結基を表す。）なお、本発明において、ホスホアミダイト基とは、このようにホスホアミダイト法に使用することができるものを全て含むものとする。上記式において、Ｒ1、Ｒ２及びＺについては既に説明したとおりである。
【００６４】
上記式（３）において、Ｃ１は、水素原子又は水酸基保護基を表す。水酸基保護基は、特に限定されないが、従来公知の水酸基保護基を用いることができる。例えば、フルオレニルメトキシカルボニル基（ＦＭＯＣ基）、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴ基）、四級ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ基）、モノメトキシトリチル基、トリフルオロアセチル基、レブリニル基、またはシリル基が挙げられる。好ましい保護基は、トリチル基であり、例えば、モノメチルトリチル（ＭＭＴ）ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）及び四級ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ基）から選択される。
【００６５】
また、Ｄ１は、水素原子、水酸基保護基、ホスホアミダイト基又は固相担体に結合される若しくは結合された連結基を表す。Ｄ１がホスホアミダイト基である化合物（アミダイト化合物）は、ホスホアミダイト法によるホスホアミダイト試薬として用いて、オリゴヌクレオチドを合成するのに用いることができる。なお、本発明において、ホスホアミダイト基は、以下の式（４）で表すことができる。
【００６６】
【化１３】
0005467275.tif 000014
（上記式（４）中、各Ｑ1は独立して、同一であっても異なっていてもよく、分枝状又は直鎖状の炭素数１〜５個のアルキル基を表し、Ｑ2は、分枝状又は直鎖状の炭素数１〜５個のアルキル基又は置換されていてもよいアルコキシル基を表す。）
【００６７】
上記式中、Ｑ1は、特に限定しないがイソプロピル基が好ましいものとして挙げられ、また、Ｑ2としては、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ等が挙げられる。例えば、ホスホアミド基としては、下記式（５）の化合物が挙げられる。
【００６８】
【化１４】
0005467275.tif 000015
【００６９】
また、式（３）においてＤ１が固相担体に結合される連結基である化合物は、当該連結基とアミノ基など固相担体上の所定の官能基とを結合させることにより、固相担体に保持される。そして、式（３）において、Ｄ１が固相担体に結合された連結基である化合物は、連結基を介して本オリゴヌクレオチドが固相担体に結合されているため、各種の核酸固相合成法の出発材料として用いることができる。
【００７０】
さらに、本発明によれば、式Ａで表されるペリレンビスイミドを有する蛍光標識ユニットを製造するための以下の式Ｂで表される化合物（アミダイト体）も提供される。
【化１５】
0005467275.tif 000016
【００７１】
（式中、ＰＢは上記式Ａで表されるペリレンビスイミドを表し、Ｒ1は、炭素数が２又は３であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Ｒ2は、炭素数が０以上２以下であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Ｚは、直接の結合又は連結基を表す。Ｃ１は、水素原子又は水酸基保護基を表し、Ｄ１は、水素原子、水酸基保護基、ホスホアミダイト基又は固相担体に結合される若しくは結合された連結基を表す。）なお、式ＢにおけるＲ１、Ｒ２、Ｃ１及びＤ１は、式（３）におけるのと同一の意義を有し、式（３）に含まれ得これらの各種実施形態を包含している。
【００７２】
（生体分子の検出方法）
本明細書に開示の生体分子の検出方法は、生体分子を本ラベル化剤の蛍光標識に基づくシグナルによって検出する工程を備えることができる。本検出方法によれば、感度よく生体分子を検出することができる。生体分子の検出形態は特に限定されない。生体分子自体を本ラベル化剤でラベルして検出してもよいし、ラベル化されかつ生体分子を特異的に検出可能な検出用試薬、例えば、抗体、プローブ、プライマーなどによって、生体分子を検出してもよい。
【００７３】
以下、本明細書の開示を実施例を挙げて具体的に説明するが、以下の実施例は本明細書に開示を限定するものではない。
【実施例１】
【００７４】
（４−シクロヘキシル安息香酸（インスレーターＩ）を結合したインスレーターユニットの合成及びそのアミダイトモノマー化）
本実施例では、以下に示す、インスレーターを有するユニット（炭素数３）を合成し、さらにそのアミダイトモノマーを以下のスキームに従い合成した。３００ｍｌのナスフラスコにＤ−トレオニノール（０．５０ｇ，４．６ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２０ｍｌに溶解させ、４−シクロヘキシル安息香酸（１．０４ｇ，５．１ｍｍｏｌ）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（０．８１ｇ，６．０ｍｍｏｌ）を加え、攪拌した。次に、１０ｍｌのＤＭＦに溶解させておいたジシクロヘキシルカルボジイミド（１．２４ｇ，６．０ｍｍｏｌ）を、室温で上記のＤＭＦ溶液に滴下した。室温で終夜攪拌後、溶媒をエバポレーターで留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフ法（展開溶媒  クロロホルム：メタノール＝５：１）で精製し、化合物１−１を得た。【００７５】
【化１６】
0005467275.tif 000017
【００７６】
次に、得られた化合物１−１（１．１１ｇ、３．８１ｍｍｏｌ）を２００ｍｌの二口ナスフラスコに採取し、窒素下で脱水ピリジン３０ｍｌを加えて溶解させ、これにＮ，Ｎ，ジイソプロピリエチルアミン（ＤＩＰＥＡ：１．０ｍＬ、５．７１ｍｍｏｌ）を加えて攪拌した。次に、５０ｍｌの二口ナスフラスコにジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴ−Ｃｌ：１．９４ｇ、５．７１ｍｍｏｌ）とジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ：０．０５８ｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を加え、さらに溶媒として脱水ジクロロメタン１０ｍｌを加えて溶解させた。その後、このジクロロメタン溶液を、上記のピリジン溶液に氷浴中でゆっくりと滴下した。１５分ほど氷浴下で攪拌した後に氷浴を取り除いて室温で攪拌を続け、ジクロロメタン溶液滴下後３時間後に反応を停止した。溶媒をエバポレーターで留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフ法（展開溶媒  ヘキサン：酢酸エチル：トリエチルアミン＝５０：５０：３）で精製し、化合物１−２を得た。【００７７】
化合物１−２（０．３５ｇ，０．５９ｍｍｏｌ）を二口ナスフラスコに採取し、脱水アセトニトリル８ｍｌで３回共沸して水分を除去した後、脱水アセトニトリル３０ｍｌを加えて溶解させ、これに更に２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ Ｎ，Ｎ，Ｎ¢，Ｎ¢ −ｔｅｔｒａｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｄｉａｍｉｄｉｔｅ：０．２２ｍｌ，０．７１ｍｍｏｌ）を加えて攪拌した。別の二口ナスフラスコに１Ｈ−テトラゾール（１Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｅ：０．０５４ｇ、０．７７ｍｍｏｌ）を採取し、脱水アセトニトリル８ｍｌで３回共沸して水分を除去した後、脱水アセトニトリル１５ｍｌを加えて溶解させた。この１Ｈ−テトラゾール溶液を、上記の化合物１−２のアセトニトリル溶液に氷浴下で滴下し、１５分程度攪拌した後に氷浴を除き、室温に戻して更に攪拌を続けた。この後およそ１時間３０分程度で反応を停止した。この後溶媒をエバポレーターで留去した後、残ったオイル状の化合物に酢酸エチルを加えて溶解した。この酢酸エチル溶液を、分液ロートを用いて重炭酸ナトリウムの飽和水溶液で２回振とうし、続いて塩化ナトリウムの飽和水溶液で同様に２回振とうした。この後、硫酸マグネシウムを加えて水分を除いてから酢酸エチルをエバポレーターで留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフ法（展開溶媒  ヘキサン：酢酸エチル：トリエチルアミン＝５０：５０：３）精製し、化合物Ａを得た。
【実施例２】
【００７８】
（蛍光標識ユニット及びインスレーターユニットの合成）
以下に示す蛍光標識（Ｐ：ペリレン）を備える蛍光標識ユニット、インスレーターＨを備えるインスレーターユニット（化合物Ｂ）及びインスレーターＪを備えるインスレーターユニット（化合物Ｃ）を合成した。なお、これらのユニットは、いずれも、核酸合成のためのアミダイトモノマーの形態で合成した。蛍光標識ユニットは、化合物Ａを用いたケミストリー・アン・ユーロピアン・ジャーナル（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ）誌２０１０年第１６巻２４７９−２４８６頁記載の方法で得、化合物Ｂ及びＣは、原料としてｔｒａｎｓ−４−イソプロピルシクロヘキサンカルボン酸及びビフェニル−４−カルボン酸を使用すること以外は、実施例１と同様の方法により得た。【００７９】
【化１７】
0005467275.tif 000018
【実施例３】
【００８０】
（オリゴヌクレオチドの合成）
本実施例では、実施例１〜２で合成した蛍光標識ユニット及びインスレーターユニットが導入された、以下に示すオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成した。【００８１】
【化１８】
0005467275.tif 000019
【００８２】
オリゴヌクレオチドへの蛍光標識及びインスレーターの導入は、アリルオキシカルボニル基で保護したホスホロアミダイトモノマーを経由した以下のスキームに示す方法で行った。【００８３】
すなわち、ＡＢＩ３４００型ＤＮＡ合成機を使用し、４つの天然の塩基に対応する市販のホスホロアミダイトモノマー、既述の蛍光標識及びインスレーターを備える各種アミダイトモノマーを適宜用いて、コントロールドポアグラス（ＣＰＧ）担体上に所定の配列を持つＤＮＡを伸長させた。このＣＰＧ担体（１０ｍｇ，０．４５μｍｏｌ）を、フィルターを装着しているプラスチックのシリンジに秤取り、アセトニトリル１ｍＬで３回、続いてジクロロメタン１ｍＬで３回洗浄した。続いて、ネイチャー・プロトコルズ（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）誌２００７年第２巻２０３ページから２１２ページに記載の方法でＣＰＧ担体からＤＮＡを切り出し、高速液体クロマトグラフィーで同誌同頁に記載の方法で目的とするＤＮＡを分離精製した）。
【実施例４】
【００８４】
（二重鎖オリゴヌクレオチドの蛍光強度の測定）
実施例４で合成した各種オリゴヌクレオチドを以下に示す組み合わせで二重鎖として、合計６種類の二重鎖オリゴヌクレオチドを取得した。これらのオリゴヌクレオチドにつき、以下の条件で蛍光強度を測定した。結果を図５に示す。
DNA：１．０μｍｏｌ／ｌ
塩化ナトリウム：０．１ｍｏｌ／ｌ
リン酸バッファー：１０ｍｍｏｌ／ｌ（pH７．０）【００８５】
【化１９】
0005467275.tif 000020
【００８６】
図５に示すように、インスレーターＩ又はＨがインスレーターとして有効であることがわかった。一方、インスレーターＪは有効でなかった。以上の結果から、消光の抑制には、非平面構造を有する環状体が有効であることがわかった。また、P1/S0の蛍光量子収率は0.01以下であったが、I1PA/I1B及びI3PA/I3Bの蛍光量子収率は、0.16及び0.44であり、蛍光量子収率は数百倍向上したことがわかった。さらに、インスレーターの数が増加するとインスレーターの効果も増大することがわかった。
【実施例５】
【００８７】
（オリゴヌクレオチドの合成）
本実施例では、以下に示す、蛍光標識としてペリレンビスイミド（Ｂ）を有する蛍光標識ユニット（アミダイトモノマー）を合成し、インスレーターＩ、Ｈを有するインスレーターユニット（アミダイトモノマー）とともに以下に示すオリゴヌクレオチドを、実施例４に準じて合成した。【００８８】
【化２０】
0005467275.tif 000021
【化２１】
0005467275.tif 000022
【００８９】
なお、蛍光標識ユニットのアミダイトモノマー（化合物Ｄ）は以下のようにして合成した。
【化２２】
0005467275.tif 000023
【００９０】
（ペリレンビスイミドを結合したD-トレオニノール（D-threoninol）のアミダイトモノマー化 ）
本実施例では、蛍光標識を連結するユニット（炭素数３）のアミダイトモノマー（化合物Ａ）を以下のスキームに従い合成した。１００ｍｌのナスフラスコにＤ−トレオニノール（１．００ｇ，９．５１ｍｍｏｌ）を脱水メタノール１５ｍｌに溶解させ、攪拌した。次に、トリフルオロ酢酸エチル（１．２５ｍｌ，１０．５ｍｍｏｌ）を、氷浴下上記のメタノール溶液に滴下した。氷浴下で２時間攪拌後、溶媒をエバポレーターで留去し、化合物１−７を得た。
次に、得られた化合物１−７（１．７６ｇ、８．７５ｍｍｏｌ）を２００ｍｌの二口ナスフラスコに採取し、窒素下で脱水ピリジン２０ｍｌを加えて溶解させ、これにＮ，Ｎ，ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ：１．７４ｍＬ、１０．５ｍｍｏｌ）を加えて攪拌した。次に、１００ｍｌの二口ナスフラスコにジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴ−Ｃｌ：３．５６ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）とジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ：０．１６ｇ、１．３１ｍｍｏｌ）を窒素下で加え、さらに溶媒として脱水ジクロロメタン１５ｍｌを加えて溶解させた。その後、このジクロロメタン溶液を、上記のピリジン溶液に氷浴中でゆっくりと滴下した。１５分ほど氷浴下で攪拌した後に氷浴を取り除いて室温で攪拌を続け、ジクロロメタン溶液滴下後３時間後に反応を停止した。溶媒をエバポレーターで留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフ法（展開溶媒  ヘキサン：酢酸エチル：トリエチルアミン＝８０：２０：３）で精製し、化合物１−８を得た。【００９１】
化合物１−８（３．６１ｇ、７．１７ｍｍｏｌ）を２００ｍｌのナスフラスコに採取し、メタノール６０ｍｌを加えて溶解させ、これに２８％アンモニア溶液１２０ｍｌを加えて室温で終夜攪拌した。溶媒をエバポレーターで留去し、化合物１−９を得た。【００９２】
化合物１−９（０．６７６ｇ、１．６６ｍｍｏｌ）、酢酸亜鉛二水和物（０．７２９ｇ、３．３２ｍｍｏｌ）、3,4,9,10-ペリレンテトラカルボン酸二無水物（０．６５１ｇ、１．６６ｍｍｏｌ）を２００ｍｌの二口ナスフラスコに採取し、窒素下で脱水ピリジン１００ｍｌを加えて溶解させ、これにトリエチルアミン（３．４５ｍＬ、１０．５ｍｍｏｌ）を加えて９０℃で１２時間還流した。次に、上記の溶液にイソプロピルアミン（２．８４ｍｌ、３３．２ｍｍｏｌ）を窒素下で加え、さらに１６時間還流した。その後、溶媒をエバポレーターで留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフ法（展開溶媒  ヘキサン：クロロホルム：トリエチルアミン＝５０：５０：３）で精製し、化合物１−１０を得た。【００９３】
化合物１−１０（０．１６ｇ，０．１９ｍｍｏｌ）を二口ナスフラスコに採取し、脱水アセトニトリル８ｍｌで３回共沸して水分を除去した後、脱水アセトニトリル３０ｍｌを加えて溶解させ、これに更に２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ  Ｎ，Ｎ，Ｎ¢，Ｎ¢  −ｔｅｔｒａｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｄｉａｍｉｄｉｔｅ：０．０８ｍｌ，０．２５ｍｍｏｌ）を加えて攪拌した。別の二口ナスフラスコに１Ｈ−テトラゾール（１Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｅ：０．０１８ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を採取し、脱水アセトニトリル８ｍｌで３回共沸して水分を除去した後、脱水アセトニトリル１５ｍｌを加えて溶解させた。この１Ｈ−テトラゾール溶液を、上記の化合物１−１０のアセトニトリル溶液に氷浴下で滴下し、１５分程度攪拌した後に氷浴を除き、室温に戻して更に攪拌を続けた。この後およそ１時間３０分程度で反応を停止した。この後溶媒をエバポレーターで留去した後、残ったオイル状の化合物に酢酸エチルを加えて溶解した。この酢酸エチル溶液を、分液ロートを用いて重炭酸ナトリウムの飽和水溶液で２回振とうし、続いて塩化ナトリウムの飽和水溶液で同様に２回振とうした。この後、硫酸マグネシウムを加えて水分を除いてから酢酸エチルをエバポレーターで留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフ法（展開溶媒  ヘキサン：酢酸エチル：トリエチルアミン＝６０：４０：３）精製し、化合物Dを得た。
【実施例６】
【００９４】
（二重鎖オリゴヌクレオチドの蛍光強度の測定）
実施例５で合成した各種オリゴヌクレオチドを、B1a/S0、I1BA/I1B、H1BA/H1B、H3BA/H3Bで組み合わせて二重鎖オリゴヌクレオチドとして準備した。これらのオリゴヌクレオチドにつき、以下の条件でこの蛍光強度を測定した。結果を図６に示す。
DNA：１．０μｍｏｌ／ｌ
塩化ナトリウム：０．１ｍｏｌ／ｌ
リン酸バッファー：１０ｍｍｏｌ／ｌ（pH７．０）【００９５】
図６に示すように、この蛍光標識（ペリレンビスイミド）に対しても、インスレーターユニットＨ、Ｉが有効であることがわかった。特に、それぞれ３個のインスレーターユニットを蛍光標識の両側に配置することでは、量子収率は１０００倍以上程度上昇することがわかった。以上の結果から、インスレーターユニットＩ、Ｈがインスレーターとして有効であることがわかった。さらに、インスレーターの数が増加するとインスレーターの効果も増大することがわかった。ペリレンビスイミドは光化学的に安定であり、他の蛍光色素と比べ光退色に非常に強いという特長がある。また、インスレーターと組み合わせることにより他の蛍光色素同等もしくはそれ以上の量子収率を得ることが出来る。
【実施例７】
【００９６】
（オリゴヌクレオチドの合成）
本実施例では、以下に示す、実施例１及び実施例２で準備した蛍光標識ユニットとインスレーターユニット（化合物Ａ、Ｂ）を用いて、以下に示すオリゴヌクレオチドを、実施例３に準じて合成した。【００９７】
【化２３】
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【実施例８】
【００９８】
（二重鎖オリゴヌクレオチドの蛍光強度の測定）
実施例７で合成した各種オリゴヌクレオチドを、以下の組み合わせで二重鎖オリゴヌクレオチドとして準備した。これらのオリゴヌクレオチドにつき、以下の条件で蛍光強度を測定した。結果を図７に示す。また、発光量を測定した。結果を以下に示す。
DNA：１．０μｍｏｌ／ｌ
塩化ナトリウム：０．１ｍｏｌ／ｌ
リン酸バッファー：１０ｍｍｏｌ／ｌ（pH７．０）【００９９】
【化２４】
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【０１００】
図７に示すように、複数個の蛍光標識（ピレン）の両側にインスレーターＨ、Ｉを配することで、蛍光強度が約２０倍となった。また、表１に示すように、エキシマー発光を含めた発光量（ピーク面積）は、２８倍程度増加していた。【０１０１】
【表１】
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【実施例９】
【０１０２】
インスレーターユニット及び蛍光標識を備えたオリゴヌクレオチドの合成）
インスレーターＨ及び蛍光標識としてＦＩＴＣを有するオリゴヌクレオチドは、アリルオキシカルボニル基で保護したホスホロアミダイトモノマーを経由し、合成後のオリゴヌクレオチドに対して、ＦＩＴＣを導入するというスキームで行った。まず、ＡＢＩ３９４型ＤＮＡ合成機を使用し、実施例２で合成したインスレーターＨを備えるインスレーターユニット（化合物Ｂ）、Ｄ−トレオニノールのアミノ基をアリルオキシカルボニル基で保護したホスホロアミダイトモノマーＡ、４つの天然の塩基に対応する市販のホスホロアミダイトモノマーを用いて、以下に示す３種のオリゴヌクレオチドをＦＩＴＣに相当する部位にホスホロアミダイトモノマーＡが配置されるオリゴヌクレオチドF1H0p（5’-FGGCAGCGTAGGTCCT-3’）及びF1H2p（5’-HFHGGCAGCGTAGGTCCT-3’）を合成した。なお、４つの天然の塩基に対応する市販のホスホロアミダイトモノマーを用いて、相補鎖ｑ（3’-CCGTCGCATCCAGGA-5’）も合成した。
オリゴヌクレオチドｐ及び相補鎖ｑを塩基対を形成させて得られる二重鎖オリゴヌクレオチドの形態を図８に示す。【０１０３】
【化２５】
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【０１０４】
F1H0p…5’-FGGCAGCGTAGGTCCT-3’
F1H2p…5’-HFHGGCAGCGTAGGTCCT-3’
F…蛍光色素（FITC）
H…インスレーター(trans-Isopropylcyclohexane)
相補鎖q…3’-CCGTCGCATCCAGGA-5’(DNA）【０１０５】
すなわち、コントロールドポアグラス（ＣＰＧ）担体上に所定の配列を持つオリゴヌクレオチドを伸長させ、このＣＰＧ担体（１０ｍｇ，０．４５μｍｏｌ）を、フィルターを装着しているプラスチックのシリンジに秤取り、アセトニトリル１ｍＬで３回、続いてジクロロメタン１ｍＬで３回洗浄した。次にＰｄ（Ｐｈ３）４（５．２ｍｇ，４．５μｍｏｌ）を溶解させたジクロロメタン溶液５００μＬにＮ−メチルアニリン４８．８μＬ（４５０μｍｏｌ）を加え、これを上述のＣＰＧ担体に加えて３５℃で３時間反応させることで、アリルオキシカルボニル基のみをＣＰＧ担体上から脱保護した。【０１０６】
次に、ＦＩＴＣ（１４．０２ｍｇ、１８μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（５００μＬ）にＤＩＰＥＡ（６．１２μｌ，１８μｍｏｌ）を加え、これをアリルオキシカルボニル基のみを脱保護したＣＰＧ担体（１０ｍｇ，０．３６μｍｏｌ）に加え三日間攪拌した後、この後、反応溶液をろ過で除き、続いて０．１ＭのＰＰＴＳのＤＭＦ溶液１ｍＬをシリンジに加えて１分間振とうしてＣＰＧ担体を洗浄し、更にＤＭＦ１ｍＬで３回、続いてジクロロメタン１ｍｌで３回洗浄して、ＦＩＴＣを導入したＣＰＧ担体を得た。【０１０７】
続いて、ネイチャー・プロトコルズ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）誌２００７年第２巻２０３ページから２１２ページに記載の方法でＣＰＧ担体からＤＮＡを切り出し、高速液体クロマトグラフィーで同誌同頁に記載の方法で目的とするインスレーター及びＦＩＴＣを備えるオリゴヌクレオチドを分離精製した。【０１０８】
なお、Ｄ−トレオニノールのアミノ基をアリルオキシカルボニル基で保護したホスホロアミダイトモノマーＡは、以下のスキームに従い合成した。３００ｍｌのナスフラスコにＤ−トレオニノール（０．９９ｇ，９．４１ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）７５ｍｌに溶解させ、トリエチルアミン１５ｍｌを加え、攪拌した。次に、７５ｍｌのＴＨＦに溶解させておいたクロロギ酸アリル（１．０１ｍｌ，９．５１ｍｍｏｌ）を、氷浴中で上記のＴＨＦ溶液に滴下した。１５分後に氷浴を除いて室温に戻し、そのまま攪拌を続け、ＴＨＦ溶液を滴下し終わってから１時間３０分後に反応を停止した。この後、溶媒をエバポレーターで留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフ法（展開溶媒  クロロホルム：メタノール＝３：１）で精製し、化合物１−１を得た。【０１０９】
【化２６】
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【０１１０】
次に、得られた化合物１（１．７２ｇ、９．０９ｍｍｏｌ）を２００ｍｌの二口ナスフラスコに採取し、窒素下で脱水ピリジン３０ｍｌを加えて溶解させ、これにＮ，Ｎ，ジイソプロピリエチルアミン（ＤＩＰＥＡ：１．５４ｍＬ、９．０９ｍｍｏｌ）を加えて攪拌した。次に、５０ｍｌの二口ナスフラスコにジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴ−Ｃｌ：３．０８ｇ、９．０９ｍｍｏｌ）とジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ：０．１４ｇ、１．１４ｍｍｏｌ）を加え、さらに溶媒として脱水ジクロロメタン１０ｍｌを加えて溶解させた。えこのジクロロメタン溶液を、上記のピリジン溶液に氷浴中でゆっくりと滴下した。１５分ほど氷浴下で攪拌した後に氷浴を取り除いて室温で攪拌を続け、ジクロロメタン溶液滴下後４時間３０分後に反応を停止した。溶媒をエバポレーターで留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフ法（展開溶媒  ヘキサン：酢酸エチル：トリエチルアミン＝６６：３３：３）で精製し、化合物１−２を得た。【０１１１】
化合物１−２（０．７４ｇ，１．５１ｍｍｏｌ）を二口ナスフラスコに採取し、脱水アセトニトリル８ｍｌで３回共沸して水分を除去した後、脱水アセトニトリル３０ｍｌを加えて溶解させ、これに更に２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ  Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'  −ｔｅｔｒａｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｄｉａｍｉｄｉｔｅ：０．５４ｇ，１．７９ｍｍｏｌ）を加えて攪拌した。別の二口ナスフラスコに１Ｈ−テトラゾール（１Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｅ：０．１３７ｇ、１．５１ｍｍｏｌ）を採取し、脱水アセトニトリル８ｍｌで３回共沸して水分を除去した後、脱水アセトニトリル１５ｍｌを加えて溶解させた。この１Ｈ−テトラゾール溶液を、上記の化合物１−２のアセトニトリル溶液に氷浴下で滴下し、１５分程度攪拌した後に氷浴を除き、室温に戻して更に攪拌を続けた。この後およそ１時間３０分程度で反応を停止した。この後溶媒をエバポレーターで留去した後、残ったオイル状の化合物に酢酸エチルを加えて溶解した。この酢酸エチル溶液を、分液ロートを用いて重炭酸ナトリウムの飽和水溶液で２回振とうし、続いて塩化ナトリウムの飽和水溶液で同様に２回振とうした。この後、硫酸マグネシウムを加えて水分を除いてから酢酸エチルをエバポレーターで留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフ法（展開溶媒  ヘキサン：酢酸エチル：トリエチルアミン＝５０：５０：３）精製し、ホスホロアミダイトモノマーＡを得た。
【実施例１０】
【０１１２】
（二重鎖オリゴヌクレオチドの蛍光強度の測定）
実施例８で合成した各種オリゴヌクレオチドを、図８示す組み合わせで二重鎖オリゴヌクレオチドとして準備した。これらのオリゴヌクレオチドにつき、２つの異なるｐＨ条件（７及び９）で蛍光強度を測定した。結果を図９に示す。【０１１３】
条件１：ｐＨ７
DNA：１．０μｍｏｌ／ｌ
塩化ナトリウム：０．１ｍｏｌ／ｌ
リン酸バッファー：１０ｍｍｏｌ／ｌ（pH７．０）
温度：２０℃
条件２：ｐＨ９
DNA：１．０μｍｏｌ／ｌ
塩化ナトリウム：０．１ｍｏｌ／ｌ
Trisバッファー：１０ｍｍｏｌ／ｌ（pH９．０）
温度：２０℃【０１１４】
図９に示すように、pH 7及びｐＨ９において、FITC一分子の場合と比べ、FITCの両側にインスレーター（H）を導入したオリゴヌクレオチドの方が４倍程度蛍光強度が増大した。この結果から、ＦＩＴＣのような、ｐＨによって蛍光強度が変化する蛍光色素であっても、インスレーターユニットの導入によって、中性（ｐＨ７程度）からアルカリ（ｐＨ９程度）において、安定して蛍光強度を増強することができることがわかった。したがって、この種の蛍光色素に関して蛍光強度の測定時のｐＨ条件の選択自由度が高まるため、ハイブリダイゼーション〜蛍光強度測定操作におけるｐＨ条件の調整操作などを簡略化したり省略したりすることができることがわかった。
【実施例１１】
【０１１５】
本実施例では、既に作製したユニットを用いて、以下のオリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリゴヌクレオチドにつき、以下の条件で、蛍光強度を測定した。結果を図１０に示す。【０１１６】
Fp            5’-FGGCAGCGTAGGTCCT-3’
HFHp          5’-HFHGGCAGCGTAGGTCCT-3’
HFp           5’-HFGGCAGCGTAGGTCCT-3’
FHp           5’-FHGGCAGCGTAGGTCCT-3’
FHHp          5’-FHHGGCAGCGTAGGTCCT-3’
q(Target)            3’-CCGTCGCATCCAGGA-5’  （DNA）
（測定条件）
DNA：１．０μｍｏｌ／ｌ
塩化ナトリウム：０．１ｍｏｌ／ｌ
リン酸バッファー：１０ｍｍｏｌ／ｌ（pH７．０）【０１１７】
図１０に示すように、蛍光色素をインスレーターで挟むことで最も高い蛍光強度が得られ、次いで、通常塩基に対して二つのインスレーターを隔てて蛍光色素を有すとき、高い蛍光強度が得られた。
【実施例１２】
【０１１８】
本実施例では、既に作製したユニットを用いて、以下のオリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリゴヌクレオチドを一本鎖（I1PAのみ）及び二重鎖として、以下の条件で蛍光強度を測定した。結果を図１１に示す。【０１１９】
I1PA          5’-GGTATCIPIGCAATC-3’
I1B           3’-CCATAGIICGTTAG-3’
DNA：１．０μｍｏｌ／ｌ
塩化ナトリウム：０．１ｍｏｌ／ｌ
リン酸バッファー：１０ｍｍｏｌ／ｌ（pH７．０）【０１２０】
図１１に示すように、一本鎖のラベル化剤（構造体）よりも二本鎖のラベル化剤（構造体）のほうが高い効果が得られた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
0005467275.tif 000039
【図７】
0005467275.tif 000040
【図８】
0005467275.tif 000041
【図９】
0005467275.tif 000042
【図１０】
0005467275.tif 000043
【図１１】
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