(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
β-カテニンが関与する癌に有効な抗癌剤のスクリーニング方法であって、候補化合物の存在下でβ-カテニン/TCF4転写複合体とTNIKの相互作用の強度を測定し、該候補化合物非存在下におけるβ-カテニン/TCF4転写複合体とTNIKの相互作用より、測定した前記相互作用の方が小さい薬剤を抗癌剤として選択することを特徴とする、抗癌剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記β-カテニン/TCF4転写複合体とTNIKの相互作用を、ツーハイブリッド法を用いて測定する、請求項1に記載された抗癌剤のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記β-カテニン/TCF4転写複合体とTNIKの相互作用を、抗原抗体反応を用いて測定する、請求項1に記載された抗癌剤のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記癌が、大腸癌である、請求項１乃至３の何れかに記載された抗癌剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β-カテニンが関与する癌に有効な抗癌剤のスクリーニング方法に関し、更に詳しくは、β-カテニン/TCF4転写複合体の機能を抑制することによって、β-カテニンが関与する癌に有効な抗癌剤をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
家族性大腸腺腫症の原因遺伝子として同定されたAPC(adenomatous
polyposis coli)癌抑制遺伝子の変異は、家族性大腸腺腫症のみならず、散発性大腸癌の発癌過程においても、最も早い時期に起こる変異であり、80％以上の症例でみられる、最も高い頻度で起こる遺伝子異常である。【０００３】
このAPC癌抑制遺伝子の変異は、β-カテニンの細胞内蓄積をもたらし、このβ-カテニンは、TCF/LEFファミリーの転写因子と結合してその転写活性を誘導することが知られている。大腸癌の多くの症例においては、TCF/LEFファミリーのうち、特に、腸上皮の分化の制御に係わるT細胞因子-4(TCF4)の転写活性化によって、腸上皮に細胞生物学的な変化が生じる。次いで、これが初期の大腸腺腫を形成し、さらに二次的な多段階の遺伝子変異を経て癌化に至るものと考えられている。【０００４】
また、APCに遺伝子変異のない症例の約半数においてβ-カテニン遺伝子の変異が見られることから、β-カテニンとTCF4との転写複合体(β-カテニン/TCF4転写複合体)の機能を抑制する化合物が、大腸癌の新規な分子治療薬として有望視されている。
そこで、β-カテニンがTCF/LEFファミリーの蛋白質と複合体を形成して引き起こす転写活性化を、β-カテニンと結合することによって抑制する作用を有する治療薬等が提案されている(特許文献1)。
【特許文献１】国際公開00/64933号
【０００５】
しかしながら、十分満足のできる有効な化合物は未だ開発されておらず、引き続き、大腸癌に有効な分子治療薬の開発が望まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って本発明の目的は、β-カテニン/TCF4転写複合体の機能を抑制することによって、β-カテニンが関与する癌に有効な抗癌剤を見出すためのスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、上記の目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、TRAF2 and NCK interacting kinase(TNIK)が、TCF4(T-cell factor-4)のリン酸化に係わる酵素であること、及び、この酵素が、β-カテニン/TCF4転写複合体と機能的に相互作用し、大腸癌でみられるTCF4の異常な転写活性化に寄与することを見出した。
更に、本発明者等は、TNIKが有するキナーゼ活性を阻害すること、又は、TNIKとβ-カテニン/TCF4転写複合体の結合を妨げることによって、β-カテニン/TCF4転写複合体の機能を抑制し、細胞の癌化を阻止することができることを見出すと共に、TNIKが有するキナーゼ活性を阻害する化合物を選択する、又は、TNIKとβ-カテニン/TCF4転写複合体の結合を妨げる化合物を選択することによって、β-カテニンが関与する癌に有効な抗癌剤をスクリーニングすることができることを見出し、本発明に到達した。【０００８】
すなわち本発明は、候補化合物の存在下でβ-カテニン/TCF4転写複合体とTNIKの相互作用の強度を測定し、該候補化合物非存在下におけるβ-カテニン/TCF4転写複合体とTNIKの相互作用より、測定した前記相互作用の方が小さい薬剤を抗癌剤として選択することを特徴とする抗癌剤のスクリーニング方法である(請求項1)。
【０００９】
上記の該相互作用を、ツーハイブリッド法(請求項２)や、抗原抗体反応(請求項３)を用いて測定することが好ましい。
【００１０】
本発明のスクリーニング方法は、特に大腸癌に有効な抗癌剤をスクリーニングするために有用である(請求項４)。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、TNIKが有するキナーゼ活性を阻害する化合物を選択する、又は、TNIKとβ-カテニン/TCF4転写複合体の結合を妨げる化合物を選択することによって、動物実験の前に、高い確率でβ-カテニンが関与する癌に有効な抗癌剤をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】TRAF2 and NCK interacting kinase(TNIK)とβ-カテニン/TCF4複合体の内因性相互作用を示す図である。
【図２】DLD-1細胞及びHCT-116細胞におけるTNIKとTCF4の局在を示す免疫蛍光染色図である。
【図３】TNIKによるβ-カテニン/TCF4複合体の転写活性の亢進を示す図である。
【図４】TNIKのノックダウンによるβ-カテニン/TCF4複合体の転写活性の抑制を示す図である。
【図５】TNIKによる大腸癌細胞の増殖亢進を示す図である。
【図６】TNIKのノックダウンによる大腸癌細胞の増殖抑制を示す図である。
【図７】ATP結合部位変異型TNIK(K54R)の核移行不全を示す図である。
【図８】ATP結合部位変異型TNIK(K54R)のTCF4の相互作用不全を示す図である。
【図９】TNIKによるTCF4のリン酸化を示す図である。
【図１０】TNIKに対するsiRNA（TNIK-12又はTNIK-13）によって、腫瘍の容積が小さくなって殆ど消失した様子を示す経時変化のグラフである。
【図１１】TNIKに対するsiRNA（TNIK-12又はTNIK-13）によって、TNIKmRNAの発現が抑制されたことを示すグラフである。
【図１２】siRNA投与１８日後のマウスの外観を示す図である。
【図１３】siRNA投与１８日後に切除した腫瘍および腫瘍の平均重量を、各種実験について示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明のβ-カテニンが関与する癌に有効な抗癌剤のスクリーニング方法について詳細に説明する。
本発明のスクリーニング方法に係る一つの態様は、TNIKが有するキナーゼ活性を阻害する化合物を選択する方法である。【００１４】
TRAF2/NCK相互作用キナーゼ(TRAF2 and NCK interacting kinase：TNIK)とは、広範なストレス刺激によって、共通に活性化するc-Jun  N末端キナーゼ(c-Jun  N-terminal  kinase：JNK)シグナル経路を活性化するgerminal  center  キナーゼ(germinal  center  kinase：GCK)ファミリーのメンバーとして同定されたリン酸化酵素である(Fu et al.,  J.Biol.Chem.  274:  30729-30737,  1999)。
このTNIKは、TCF4のリン酸化に係わる酵素であり、β-カテニン/TCF4転写複合体と機能的に相互作用してTCF4の転写を活性化する。従って、このTNIKが有するキナーゼ活性を阻害することができれば、TCF4の転写活性化を抑制することが可能となる。【００１５】
TNIKが有するキナーゼ活性を阻害する化合物の選択に必要とされる膨大なコストや労力等を軽減するために、本発明においては、TNIKが有するキナーゼ活性を阻害する化合物を、コンピュータ技術を用いて予め抽出することが好ましい。例えば、TNIKが有するキナーゼ活性を阻害する化合物として、TNIKのATP結合部位とATPの結合を妨げるように入り込む化合物を候補化合物群として、コンピュータ技術を用いて予め抽出する。すなわち、バイオインフォマティクス技術を利用して、TNIKが有するATP結合部の立体構造に基づいて、ATP結合部とATPの結合を妨げることが可能な化学構造を有する化合物を、公知の化合物の中から選択しても、新しく推定してもよい。公知の化合物の中から選択する場合には、自ら構築した化合物ライブラリーや、インターネット等から入手可能な既存の化合物ライブラリーなどの情報を活用することもできる。【００１６】
TNIKが有するキナーゼ活性を阻害する化合物を選択する他の確実な方法としては、候補化合物の存在下でTNIKのキナーゼ活性を測定し、該候補化合物非存在下におけるTNIKのキナーゼ活性より、測定した前記キナーゼ活性の方が低い薬剤を抗癌剤として選択する方法もある。
本明細書における「候補化合物」とは、抗癌剤の候補となりうる全ての化合物を意味するものであり、公知の化合物のみならず、新しく推定した化合物を含む概念である。【００１７】
本発明において実施するTNIKのキナーゼ活性の測定は、TNIKのリン酸化能を測定することにより行うことができる。
TNIKのリン酸化能を測定する方法は、公知の方法であれば特に制限されることはないが、例えば、試験管内リン酸化反応(In vitro kinase assay)や、生体内リン酸化反応(In vivo kinase assay)などを例示することができる。【００１８】
試験管内リン酸化反応とは、試験管内において、リコンビナント蛋白である酵素とATPを共存させ、次いで、リコンビナント蛋白である基質とインキュベーションすることによってリン酸化反応を行わせた後、基質のリン酸化の程度を判定する方法である。
本発明においては、前記酵素としてTNIK、前記基質としてβ-カテニン/TCF4転写複合体を用いて、リン酸化反応を行わせた後、β-カテニン/TCF4転写複合体のリン酸化の程度を判定することが好ましい。この場合のリン酸化の程度を判定する方法としては、放射性ATP又は非放射性ATPを用いる方法がある。ATPとして32P放射ラベルATPを使用した場合は、基質に取り込まれた32P放射活性を測定し、非放射性ATPを使用した場合は、リン酸化抗体を用いてウエスタンブロット等を行うことにより、β-カテニン/TCF4転写複合体のリン酸化の程度を判定することができる。【００１９】
生体内リン酸化反応とは、細胞内において、内因性の酵素又は過剰発現させた酵素による、内因性の基質又は過剰発現させた基質のリン酸化の程度を判定する方法である。
本発明においては、内因性のATPでリン酸化反応を行わせ、基質を免疫沈降等で分離した後、得られた免疫沈降物について、リン酸化抗体を用いてウエスタンブロット等を行うことによりリン酸化の程度を判定することができる。また、培養液中に32P放射ラベルATPを添加して、細胞の培養を行った後、基質を免疫沈降等で分離し、32P放射活性を測定することによっても測定することができる。【００２０】
本発明のスクリーニング方法に係る他の態様は、TNIKとβ-カテニン/TCF4転写複合体の結合を妨げる化合物を選択する、抗癌剤のスクリーニング方法である。
TNIKは、β-カテニン/TCF4転写複合体と結合し、β-カテニン/TCF4転写複合体と機能的に相互作用してTCF4の転写を活性化する。従って、TNIKとβ-カテニン/TCF4転写複合体との結合を阻害することができれば、TCF4の転写活性化を抑制することが可能となる。【００２１】
TNIKとβ-カテニン/TCF4転写複合体の結合を妨げる化合物を選択する方法の一態様としては、候補化合物の存在下でβ-カテニン/TCF4転写複合体とTNIKの相互作用の強度を測定し、該候補化合物非存在下におけるβ-カテニン/TCF4転写複合体とTNIKの相互作用より、測定した前記相互作用の方が小さい薬剤を、抗癌剤として選択する方法が挙げられる。【００２２】
β-カテニン/TCF4転写複合体とTNIKの相互作用の強度を測定する方法としては、その強度を測定することができれば特に制限されることはないが、例えば、レポーターアッセイ、ツーハイブリッド法及び抗原抗体反応を用いて測定する方法等が挙げられる。【００２３】
ツーハイブリッド法とは、転写因子のDNA結合部位と転写活性化部位が別の分子上にあっても、それらが結合すれば転写因子活性が生じるということを利用して、蛋白質間の相互作用を検討する方法であり、出芽酵母又は動物細胞のいずれの細胞を用いても行うことができる。具体的には、転写因子のDNA結合部位に被検蛋白質Aを融合させ、転写活性化部位に被検蛋白質Bを融合させて細胞に導入し、レポーターアッセイを行うと、蛋白質Aと蛋白質Bが細胞内で結合することによってDNA結合性の転写制御因子が再構築される。その結果、レポーター由来酵素遺伝子が発現するので、蛋白質A及びBの間の相互作用を検知することができる。【００２４】
本発明において実施するツーハイブリッド法は、一般的に用いられている方法であればよく、特に制限されることはない。例えば、転写因子のDNA結合部位とTNIKとの結合蛋白を発現するｃDNA構築物、転写活性化部位とβ-カテニン/TCF4転写複合体との結合蛋白を発現するｃDNA構築物、及び、該転写活性化部位の作用によってレポーターを発現するｃDNA構築物を、同時に細胞内に導入する。TNIKとβ-カテニン/TCF4転写複合体が結合した場合には、転写活性部位の作用によりレポーター遺伝子が発現するので、レポーター遺伝子の発現によってもたらされた酵素活性を測定することにより、その相互作用の強度を測定することができる。当然のことながら、転写因子のDNA結合部位とβ-カテニン/TCF4転写複合体との結合蛋白を発現するｃDNA構築物と、転写活性化部位とTNIKとの結合蛋白を発現するｃDNA構築物を用いてもよい。【００２５】
「レポーター遺伝子」とは、その遺伝子の発現産物を定量的に検出することが可能である遺伝子を意味し、具体的には、その遺伝子のヌクレオチド配列及び/又はアミノ酸配列が知られている遺伝子、その遺伝子の発現量に応じて強度の異なる信号(蛍光など)を発することのできる遺伝子などが挙げられる。レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、CAT遺伝子、lacZ遺伝子などが挙げられ、本発明においては、特に、ホタルルシフェラーゼ遺伝子及びウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子などのルシフェラーゼ遺伝子を使用することが好ましい。【００２６】
本発明においては、候補化合物の存在下で、上記のようにして、レポーター遺伝子を導入した細胞を培養してレポーター遺伝子から発現した酵素量を測定し、候補化合物非存在下において同様の方法で測定した酵素量と比較し、前者の酵素量が後者の酵素量より低下する化合物を選択することにより、β-カテニンが関与する癌に有効な抗癌剤をスクリーニングすることができる。【００２７】
抗原抗体反応を用いて測定する方法は、例えば、TNIK、β-カテニン及びTCF4を発現する細胞の細胞抽出液から、TNIKに対する抗体を用いて免疫沈降させ、次いで、得られた沈降物について、β-カテニン及び/又はTCF4の抗体を用いてイムノブロット分析を行う方法である。このイムノブロット分析によって、TNIK-β-カテニン又はTNIK-TCF4との複合体を示すバンドが得られた場合には、そのバンドに含まれる蛋白質の量がこれらの相互作用の強度を示すものとなる。なお、β-カテニン及び/又はTCF4の抗体を用いて免疫沈降させた後、TNIKに対する抗体を用いてイムノブロット分析を行ってもよい。【００２８】
本発明においては、候補化合物の存在下で、遺伝子導入したTNIK、β-カテニン及びTCF4を発現する細胞を培養し、上記の方法により免疫沈降及びイムノブロット分析を行って相互作用の強度を測定し、候補化合物非存在下で測定した相互作用の強度と比較し、それを存在させることによって強度が小さくなる候補化合物を選択することにより、β-カテニンが関与する癌に有効な抗癌剤を選択することができる。【００２９】
本発明において用いられるTNIK、β-カテニン及びTCF4を発現する細胞としては、ヒトのみならず、マウス、ラットなどの公知の大腸癌細胞等を例示することができるが、β-カテニンが核内に蓄積しているという観点から、DLD-1、HCT-116、WiDrなどを用いることが好ましい。【００３０】
TNIKが有するキナーゼ活性を阻害する化合物、又は、TNIKとβ-カテニン/TCF4転写複合体の結合を妨げる化合物を選択する他の態様としては、β-カテニン、TCF4及びTNIKを発現する細胞を、候補化合物の存在下で培養し、前記細胞を該候補化合物の非存在下で培養した場合より、細胞増殖が抑制される候補化合物を抗癌剤として選択する方法が挙げられる。【００３１】
TNIKが有するキナーゼ活性を阻害するか、又は、TNIKとβ-カテニン/TCF4転写複合体の結合を妨げることにより、TCF4の転写活性を抑制することができる。従って、細胞の増殖が抑制されることを確認することにより、β-カテニンが関与する癌に有効な抗癌剤を選択することができる。なお、細胞の増殖を抑制する作用を確認する方法は特に制限されるものではないが、例えば、コロニーフォーメーションアッセイ、MTT[3-(4,5-Dimethyl thial-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazalium Bromide]法、或は、細胞数を計測することによって、細胞の増殖を抑制する作用を確認することができる。
上記したMTT法とは、細胞培養中にMTTを添加し、添加したMTTが分解された量を測定することにより、生細胞数を解析する発色検出法である。即ち、培養皿上で増殖した細胞を、MTT溶液中でインキュベートすると、主にミトコンドリアの酵素活性に依存して、水に不溶なフォルマザン色素が産生される。このフォルマザン色素を可溶化した後、分光光度計で測定を行う。得られる吸光度は生細胞数に比例するので、相対的に細胞増殖の程度を比較することができる。【００３２】
本発明のスクリーニング方法が対象とするβ-カテニンが関与する癌としては、例えば、大腸癌、卵巣癌、子宮体癌、小児脳腫瘍(髄芽腫)、肝癌、肝芽腫、胃癌等が挙げられるが、特に本発明は、大腸癌に有効な抗癌剤のスクリーニング方法として有用である。【００３３】
以下、実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
先ず、本発明の実施例で用いた試料、試薬、及び、実験方法について説明するが、各実施例において特に記載がない場合には、以下に記載した方法に従って実験を行なった。【００３４】
〔細胞株〕
ヒト大腸癌細胞株DLD-1は、ヒューマンサイエンス研究資源バンク(大阪)より、ヒト大腸癌細胞株HCT-116は、ATCC(American  Type  Culture  Collection)(米国)より分譲を受けた。【００３５】
〔プラスミド〕
ヒトTNIKの全長 cDNAが組み込まれたpCIneo-HAベクター(Promega社,Madison,WI)と、ATP結合部位にある54番目のリジンをアルギニンに置換した変異体TNIK(K54R)が組み込まれたpCIneo-HAベクターは、苅谷研一博士(琉球大学)(沖縄)より供与された。
ヒトTCF4の全長 cDNAは、pFLAG-CMV-4ベクター(Sigma-Aldrich社)にサブクローニングして得た(FLAG-TCF4)。
これらのcDNAを、HCT-116細胞及びDLD-1細胞に、Lipofectamine  2000(Invitrogen社)を用いて導入した。【００３６】
〔抗体〕
抗β-カテニン(clone 14)モノクローナル抗体は、BD Biosciences社(Palo Alto, CA)から購入し、抗TCF4(6H5-3)モノクローナル抗体は、Upstate社(Charlottesville, VA)から購入した。
抗TNIKラビットポリクローナル抗体(GTX13141)は、Gene Tex社(San Antonio, TX) から購入し、抗TNIKモノクローナル抗体(3D4)は、Abnova社(Taipei, Taiwan)から購入した。【００３７】
抗TCF4(sc-13027)、抗HA[hemagglutinin](sc-805)ラビットポリクローナル抗体、ラビットIgG及びマウスIgGは、Santa  Cruz  Biotechnology社(Santa Cruz, CA)から購入した。
抗phospho-serineラビットポリクローナル抗体(ab9332)は、Abcam社(Cambridge,MA)から購入した。
抗HAモノクローナル抗体(12CA5)、及び、抗β-Actinモノクローナル抗体(AC-74)は、Abgent社(San  Diego,  CA)から購入した。【００３８】
〔免疫沈降〕
下記のLysis Bufferを用いて抽出した細胞抽出物を、抗β-カテニン モノクローナル抗体、抗TCF4モノクローナル抗体、抗TNIKラビットポリクローナル抗体、抗HAモノクローナル抗体、マウスIgG、又は、ラビットIgGと、4℃で一晩インキュベートした後、Dynabeads  protein  G  （Dynal  Biotech社,  Oslo,  Norway)と混合し、更に、一時間インキュベートした。その後、磁気により沈降させ、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって分離操作を行った。【００３９】
Lysis Buffer ：50mM トリス-HCl, pH 7.4, 150mM  NaCl, 1mM MgCl2,
1mM CaCl2, 1mM EDTA, 0.5% トリトンX100, 0.05% SDS, 2mM TCEP, 1mM PMSF, 10mM
NaF, protease inhibitor cocktail (Boehringer  Mannheim社,  Indianapolis,  IN), Phosphatase inhibior cocktail 1 and 2 (SIGMA-aldrich社)【００４０】
〔イムノブロット〕
サンプルのタンパク質をSDS-PAGEにより分離した後、Immobilon-P membranes(Millipore,  Billerica  MA)に転写した。得られた転写膜を一次抗体と共に4℃で一晩インキュベートし、更に、二次抗体と一時間インキュベートした後、ECL Western blotting detection reagents(Amersham Biosciences,
Amersham, UK)を用いて検出した。【００４１】
〔蛍光免疫染色法〕
培養したDLD-1細胞及びHCT-116細胞を、4% パラホルムアルデヒドを用いて10分間処理することによってカバーガラス上に固定した後、0.2% Triton X-100を用いて10分間処理することにより、細胞膜の透過性を亢進させた。その後、抗TNIKラビットポリクローナル抗体又は抗TCF4モノクローナル抗体、及び、抗HAラビットポリクローナル抗体と共に、カバーガラス上に固定した前記細胞を、4℃で一時間インキュベートした。得られた細胞を、二次抗体としてのAlexa  594抗マウスIgG抗体及びAlexa  488抗ラビットIgG抗体(Invitrogen社, Carlsbad, CA)と共に一時間インキュベートした後、共焦点レーザ顕微鏡(LSM5 PASCAL社, Carl Zeiss, Jena, Germany)を用いて観察した。【００４２】
〔TCF/Lymphoid enhancer
factor (LEF)レポーターアッセイ〕
ルシフェラーゼレポーターTOP-FLASH及びFOP-FLASH  (millipore社)  (http://www.millipore.com/catalogue/item/21-169及び
http://www.millipore.com/catalogue/item/21-170)を、TCF/LEF転写活性の評価に用いた。ホタルルシフェラーゼレポーター(TOP-FLASH又はFOP-FLASH)プラスミド、及び、内部標準のウミシイタケルシフェラーゼphRG-TK  (Promega)プラスミドを、Lipofectamine 2000  (Invitrogen社)を用いて、DLD-1細胞及びHCT-116細胞に導入した。尚、実験は、3回繰り返して行った。
強制発現系(図3)では24時間後、発現抑制系(図4)では48時間後に、メーカーのプロトコールに従って、キットに付属していたリシス（Ｌｙｓｉｓ）溶液を用いて細胞を可溶化した。次いで、Dual-luciferase Reporter Assay system  (Promega社、Madison,  WI)を用い、ウミシイタケルシフェラーゼを内部標準として、ホタルルシフェラーゼ活性を測定した。【００４３】
〔RNA 干渉〕
TNIKに対する2種類の干渉オリゴRNA siRNA  (small  interfering  ribonucleic  acid)であるTNIK-12及びTNIK-13、並びに、コントロールsiRNAは、Dharmacon社  (Chicago,IL)から購入した。
TNIK-12は、センス鎖が5'-CGACAUACCCAGACUGAUAUU-3'[配列番号1]、アンチセンス鎖が5'-PUAUCAGUCUGGGUAUGUCGUU-3'[配列番号2]であり、TNIK-13は、センス鎖が5'-GACCGAAGCUCUUGGUUACUU-3'[配列番号3]、アンチセンス鎖が5'-PGUAACCAAGAGCUUCGGUCUU-3'[配列番号4]である。ここで、上記配列中の「P」はリン酸基を表わす。従って、配列番号2及び配列番号4で表わされるヌクレオチド配列は、その5'末端の残基がリン酸化されている。【００４４】
pGeneClipベクターに組み込まれたTNIKに対する3種類のshort hairpin
ribonucleic acid (shRNA) plasmidである、TNIK-1、TNIK-2及びTNIK-3、並びに、コントロールshRNAは、SuperArray
Bioscience corporation(Frederick, MD)から購入した。TNIK-1は、Insert
sequenceがACACACTGGTTTCCATGTAAT[配列番号5]であり、TNIK-2は、Insert  sequenceがAGAGAAGGAACCTTGATGATT[配列番号6]であり、TNIK-3は、Insert  sequenceがAGAAAGATTTCGGTGGTAAAT[配列番号7]であり、及び、コントロールshRNAは、Insert  sequenceがGGAATCTCATTCGATGCATAC[配列番号8]である。
これらのsiRNA及びshRNAは、DLD-1細胞及びHCT-116細胞中に、Lipofectamine  2000  (Invitrogen社)を用いて導入された。【００４５】
〔コロニーフォーメーションアッセイ〕
トランスフェクションを行ったDLD-1細胞の培養液及びHCT-116細胞の培養液に、トランスフェクションから24時間後、それぞれ300μg/ml及び1000μg/mlのジェネティシンG418  (Invitrogen社製)を添加し、8日間培養を行った。その後、ギムザ溶液(Wako社製)を用いて、染色を行った。【００４６】
〔リアルタイムRT-PCR〕
全ＲＮＡをRNeasy Miniキット(Qiagen, Valencia, CA)により調製し、DNase-I-処理ＲＮＡについて、ランダムプライマー及びSuperScriptII逆転写酵素(Invitrogen)を用いて逆転写反応を行い、cDNAを合成した。一方、TaqManユニバーサルＰＣＲマスターミックス、及び事前設計されたTaqMan遺伝子発現プローブ並びにプライマーセットを、Applied  Biosystems社から購入した。PRISM7000  Sequence  Detection  system  (Applied  Biosystems社製)を用い、レポーター蛍光の増加として測定された増幅データを集めた。内部コントロール［ヒトの場合はβ−アクチン（ＡＣＴＢ）］に対する相対的なmRNA発現レベルを、比較閾値サイクル(CT)法（M.Peifer, P.Polakis, Science 287, 1606(2000)）を用いて計算した。
【実施例１】
【００４７】
＜大腸癌細胞株におけるTNIKとβ-カテニン/TCF4複合体の結合＞
大腸癌細胞であるDLD-1細胞及びHCT-116細胞の細胞抽出物について、抗TNIKラビットポリクローナル抗体、正常ラビットIgG、抗TCF4モノクローナル抗体、抗β-カテニンモノクローナル抗体、又は正常マウスIgG(IgG)を用いて免疫沈降操作を行った。沈降物(IP)及び細胞抽出物(Total)については、抗TNIKラビットポリクローナル抗体、抗TCF4モノクローナル抗体、及び抗β-カテニンモノクローナル抗体を用いて、イムノブロット分析を行った。【００４８】
イムノブロット分析の結果を図1に示す。TNIKは、抗TCF4抗体によって免疫沈降するが、コントロールIgGによっては免疫沈降しなかった。また、既知のTCF4結合タンパクであるβ-カテニンの抗体(抗β-カテニン抗体)によっても、TNIKは免疫沈降した。更に、TCF4及びその結合蛋白であるβ-カテニンも、抗TNIK抗体により免疫沈降することが確認された。これらの結果から、TCF4、β-カテニン及びTNIKの三者間における相互作用が実証された。【００４９】
次に、DLD-1細胞及びHCT-116細胞におけるTNIKとTCF4の細胞内局在について、蛍光免疫染色法により検討を行った。
その結果を図2に示す。TNIKについては、細胞全体に網目状の染色が認められ(図2,TNIK)、TNIKが細胞全体に存在していることが確認された。これに対し、TCF4の場合には細胞核に染色が認められ(図2,TCF4)、TCF4が核に局在していることが確認された。また、TNIKとTCF4が共に細胞核に局在していることが、図2のMergeによっても確認された。
【実施例２】
【００５０】
＜TNIKによるβ-カテニン/TCF4複合体の転写活性の亢進＞
前述したようにTNIKはリン酸化酵素であり、創薬の標的となり得ることから、β-カテニン/TCF4複合体の転写制御に対するTNIKの影響について検討を行った。
ヒトTNIKの全長c DNAを組み込んだpCIneo-HA-TNIK、又は、ATP結合部位にある54番目のリジンをアルギニンに置換し、リン酸化酵素能を欠損させた変異体であるK54Rを組み込んだpCIneo-HA-TNIK
K54Rを、DLD-1細胞及びHCT-116細胞に導入し、TNIKによるTCF/LEFレポーター活性への影響について検討を行った。【００５１】
DLD-1細胞及びHCT-116細胞に、TCF/LEFルシフェラーゼレポーターベクター(TOP又はFOP)、pCIneo-HA-TNIK、pCIneo-HA-TNIK  K54R、又は、コントロールプラスミド(pCIneo-HA)を導入した。次いで、上記したプロトコールに従って、24時間経過後に、ルシフェラーゼ活性を、3回繰り返し実験を行って測定した。【００５２】
その結果を図3に示す。図3の下図は、蛋白発現レベルを示した、抗HA及び抗β-Actin抗体を用いたイムノブロット分析の結果である。TNIKを強制発現させると、TCF/LEFレポーターTOP-FLASH(黒カラム)のホタルルシフェラーゼ活性が、コントロールベクター(pCIneo-HA)に比べて増加することが確認された。しかしながら、TNIK  K54Rを発現させた場合には、転写活性の亢進は認められなかった。この結果から、TNIKのキナーゼ活性を阻害することにより、β-カテニン/TCF4の転写が抑制されることが確認された。【００５３】
更に、β-カテニン/TCF4複合体の転写制御に対するTNIKの影響について検討するために、RNA干渉(siRNA)を利用してTNIKの発現をノックダウンし、β-カテニン/TCF4の転写活性への影響を調べた。
DLD-1細胞及びHCT-116細胞内に、TCF/LEFルシフェラーゼレポーターベクター(TOP又はFOP)、2種類のTNIKに対するsiRNA(TNIK-12、TNIK-13)、又は、2種類のコントロールsiRNA(X、IX)を導入した。次いで、上記したプロトコールに従って、前記導入から48時間経過後、ルシフェラーゼ活性を、3回繰り返し実験を行って測定した。【００５４】
その結果を図4に示す。図4の下図は、ノックダウンされたTNIK及び蛋白質のレベル量を示した、抗TNIK及び抗β-Actin抗体を用いたイムノブロット分析の結果である。TNIK蛋白の発現がノックダウンされることによって、ルシフェラーゼ活性は約1/3に低下した。このことからTNIK蛋白の発現を抑制することにより、β-カテニン/TCF4の転写を抑制することのできることが確認された。【００５５】
次に、この転写活性による細胞増殖への影響を、コロニーフォーメーションアッセイにより検討した。
DLD-1細胞及びHCT-116細胞に、pCIneo-HA-TNIK、pCIneo-HA-TNIK  K54R、又は、コントロールプラスミド(pCIneo-HA)を導入した。24時間経過後にG418を添加し、更に、細胞を8日間培養した。次いで、ギムザ染色することにより、細胞増殖能を可視化した。【００５６】
その結果を図5に示す。TNIK蛋白の過剰発現によって細胞増殖は著しく亢進した。これに対し、K54Rの発現試験では、有意な、細胞増殖の亢進は認められなかった。この結果から、TNIKによるリン酸化能を欠失させることにより、細胞増殖も抑制されることが確認された。【００５７】
更に、RNA干渉(shRNA)を利用してTNIK蛋白の発現をノックダウンし、そのノックダウンがもたらす細胞増殖への影響を、コロニーフォーメーションアッセイにより検討した。
DLD-1細胞及びHCT-116細胞に、3種類のTNIKに対するshRNAプラスミド(TNIK-1,TNIK-2及びTNIK-3)、又は、コントロールshRNAを導入した。24時間経過後にG418を添加し、更に細胞を8日間培養した。次いで、ギムザ染色することにより、細胞増殖能を可視化した。【００５８】
その結果を図6に示す。尚、図6の右図は、抗TNIK及び抗β-Actin抗体を用い、ノックダウンされたTNIK蛋白及び蛋白質量のレベルを示した、イムノブロット分析の結果である。転写活性の場合と同様に、TNIK蛋白の発現抑制により、細胞増殖が著しく低下することが確認された。この結果からも、TNIKによるβ-カテニン/TCF4の転写の抑制により、細胞増殖が抑制されることが確認された。
【実施例３】
【００５９】
＜TNIKとTCF4との結合に対するTNIKによるTCFのリン酸化の必要性＞
リン酸化酵素である野生型TNIKとリン酸化能を欠損した変異体K54Rが、転写及び細胞増殖を、それぞれ逆方向に制御しているので、両者の機能的差異について詳細な検討を行った。
まず、DLD-1細胞に野生型TNIKとK54R変異体を発現させた後、細胞内における局在について、蛍光免疫染色法により検討を行った。
DLD-1細胞にpCIneo-HA-TNIK、又は、pCIneo-HA-TNIK  K54Rを導入した。TNIKについては、抗HAラビットポリクローナル抗体を用いて、TCF4については、抗TCF4モノクローナル抗体を用いて、二重免疫蛍光染色を行った。【００６０】
図7から分かるように、野生型TNIKを発現させた細胞の場合には、細胞全体にTNIKの局在が見られ、特に核に強い発現が認められた(図7,上段左)。これに対し、K54Rを発現させた細胞の場合には、核には、K54Rの発現がほとんど認められなかった(図7,下段左図)。
TCF4は核に局在しているので(図7,上段及び下段中図)、野生型TNIKは、核に局在する点でTCF4と一致する(図7,上段右図)。一方、K54Rの場合には、TCF4と局在が一致することは認められなかった(図7,下段右)。この結果から、TNIKのキナーゼ活性を阻害することにより、核における、TNIKとβ-カテニン/TCF4転写複合体の相互作用が抑制されることを推定することができる。【００６１】
次に、野生型TNIKとK54RをDLD-1細胞及びHCT-116細胞にそれぞれ発現させた。次いでこれらの細胞から抽出した細胞抽出液を用いて、TNIKとTCF4の相互作用を、免疫沈降法により検討した。
DLD-1細胞及びHCT-116細胞に、pCIneo-HA-TNIK、pCIneo-HA-TNIK  K54R、又は、コントロールプラスミド(pCIneo-HA)を導入した。その細胞抽出物に対して、抗HAモノクローナル抗体、抗TCF4モノクローナル抗体、あるいは正常マウスIgG(IgG)を用いたときの免疫沈降操作を行った。沈降物(Ab)について、抗HAポリクローナル抗体、抗TCF4ポリクローナル抗体を用いてイムノブロット分析を行った。【００６２】
その結果を図8に示す。尚、図8の下図は、蛋白質のレベル量を示した、抗β-Actin抗体を用いたときのイムノブロット分析の結果である。野生型TNIKの場合には、コントロールに比べてTCF4と相互に強い結合が認められたが、K54Rの場合には、弱い免疫沈降バンドしか認められなかった。このことから、TNIKのキナーゼ活性が阻害された場合には、TNIKとβ-カテニン/TCF4複合体との結合が起こらないことが推定される。【００６３】
更に、これらの局在及び相互作用が機能的に働いているかどうかを検討するために、DLD-1細胞に、pFLAG-TCF4と、TNIKの野生型及びK54R変異体を発現させ、その細胞抽出液に対して、抗TCF4抗体を用いて免疫沈降法による評価を行った。
DLD-1細胞に、pFLAG-TCF4、及び、pCIneo-HA-TNIK、pCIneo-HA-TNIK K54R、又は、コントロールプラスミド(pCIneo-HA)を導入した。次いで、その細胞抽出物について抗TCF4モノクローナル抗体(Ab)、又は、正常マウスIgG(IgG)を用いて免疫沈降法による評価を行った。沈降物について、抗phospho-serineラビットポリクローナル抗体(ab9332)、抗TCF4ラビットポリクローナル抗体(sc-13027)を用いてイムノブロット分析を行った。尚、発現のレベル量を示すために、細胞抽出物(Total  cell  lysate)について、抗TCF4モノクローナル抗体(6H5-3)、抗HAモノクローナル抗体(12CA5)、及び、抗β-Actinモノクローナル抗体(AC-74)を用いて、イムノブロット分析を実施した。【００６４】
その結果を図9に示す。尚、図9の下図に、蛋白質の発現レベル量を示した、抗TCF4、抗HA、及び抗β-Actin抗体を用いたイムノブロット分析の結果を表わす図である。
抗リン酸化セリン及び抗リン酸化スレオニン抗体を用いてTCF4のリン酸化の程度を検討したところ、野生型TNIKを発現させた場合にはTCF4のセリンリン酸化バンドが検出された。しかしながら、K54R変異体を発現させた場合には、コントロールに比べて有意な、セリンリン酸化は認められなかった。尚、スレオニンのリン酸化は認められなかった。この結果は、TCF4蛋白質を基質として、そのアミノ酸配列中の少なくとも1箇所のセリンを、TNIKがリン酸化することを示している。
【実施例４】
【００６５】
〈TNIKに対するsiRNAによる大腸癌増殖の抑制〉
0.1 mlのＰＢＳに懸濁した５x１０６HCT-116、DLD1、又はWiDr細胞を、５週齢の雌BALB/c  nu/nuヌードマウス(SLC、東京)の脇腹皮下に接種した。１週間後、形成した腫瘍（224．5±8．9ｍｍ３）に対して、アテロコラーゲン(AteloGene；  高研、東京)単体投与、2種類のコントロールsiRNA（Ｘ又はＩＸ）とアテロコラーゲン(AteloGene；  高研、東京)の混合液、及び、TNIKに対するsiRNA（ＴNIK-12又はTNIK-13）とアテロコラーゲン(AteloGene；  高研、東京)の混合液をそれぞれ投与し、非処理のものと共に比較検討した。上記投与に用いたsiRNAおよびアテロコラーゲンの最終濃度は、夫々、３０μＭおよび０．５％であり、0.2-ml容量の溶液を各腫瘍に直接注入した。HCT-116細胞を用いた場合について、近似式V=A  x  B2π／６（但し、ＡおよびＢは、夫々、最大および最小の寸法を示す）を用いて、腫瘍の容積を２５日間測定した（ｎ＝８）結果は図１０に示した通りである。なお、DLD1又はWiDr細胞を用いた場合にも同様の結果が得られた。
この図から明らかなように、TNIKに対するsiRNA（TNIK-12又はTNIK-13）によって腫瘍は殆ど完全に消失するから、TNIKに対するsiRNAによるTNIKのノックダウンにより、大腸癌の増殖が抑制されることを確認することができる。
【実施例５】
【００６６】
HCT-116細胞を免疫不全マウス（BALB/c nu/nuヌードマウス）の皮下に接種し、接種１週間後に、TNIKに対するsiRNA（TNIK-12又はTNIK-13）とアテロコラーゲン(AteloGene；  高研、東京)の混合液を、形成した腫瘍（２２４．５＋８．９mm3）に投与した。siRNAを投与した３日後に腫瘍を摘出し、リアルタイムPCRによってTNIKmRNAの発現量を測定し（ｎ＝３）、TNIKに対するsiRNA（TNIK-12又はTNIK-13）によってTNIKmRNAの発現が抑制されたことを確認した。その結果を図１１に示す。
また、上記投与から１８日後のマウスの外観（ｎ＝３）、及び切除した腫瘍の平均重量（ｎ＝８）を、それぞれ、図１２及び図１３に示した。
これらの結果から、TNIKに対するsiRNAを投与した腫瘍は、非処理（No treat）、アテロコラーゲンのみの単体投与処理（Atelo only）、又はコントロールsiRNA（Ｘ、ＩＸ）を投与した腫瘍より、有意に小さくなることが実証された。【００６７】
このように、TNIKが、β-カテニン/TCF4複合体と相互作用することにより、TNIKの発現や酵素活性に依存して、TCF/LEFファミリーの転写活性化が亢進されることが判明した。このことから、TNIKを阻害する化合物、又は、TNIKとβ-カテニン/TCF4複合体との相互作用を阻害する化合物を用いて、TCF/LEFファミリーの転写活性を阻害し、癌の予防や治療を行うことが可能になることが理解される。【００６８】
このように、TNIKがβ-カテニン/TCF4複合体と相互作用することにより、TNIK蛋白の発現や酵素活性に依存して、TCF/LEFファミリーの転写活性を阻害することが判明した。この知見により、TNIKが有するキナーゼ活性を阻害する化合物、又は、TNIKとβ-カテニン/TCF4複合体との相互作用を阻害する化合物を用いて、TCF/LEFファミリーが有する転写活性を阻害し、癌の予防や治療を行うことが可能になることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明の抗癌剤のスクリーニング方法は、効率よく、副作用の低い癌治療薬を開発するのに有用であり、大腸癌のみならず、β-カテニンが関与する卵巣癌、子宮体癌等の癌に対する、TCF4の転写活性異常を制御する抗癌剤の開発に寄与することができるので、産業上極めて有用である。
【図１０】
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【図１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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