(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
olfactomedin 4タンパク質およびReg IVタンパク質を含み、胃癌の検出に用いられることを特徴とする消化器癌検出用血清腫瘍マーカー。
【請求項２】
上記olfactomedin 4タンパク質は、（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；または（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、
上記Reg IVタンパク質は、（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載の消化器癌検出用血清腫瘍マーカー。
【請求項３】
血清中のolfactomedin 4タンパク質の発現を検出するための物質であって、olfactomedin 4タンパク質と特異的に相互作用する物質、および血清中のReg IVタンパク質の発現を検出するための物質であって、Reg IVタンパク質と特異的に相互作用する物質を含み、胃癌の検出に用いられることを特徴とする消化器癌検出キット。
【請求項４】
上記olfactomedin 4タンパク質と特異的に相互作用する物質が抗olfactomedin 4抗体であり、
上記Reg IVタンパク質と特異的に相互作用する物質が抗Reg IV抗体であることを特徴とする請求項３に記載の消化器癌検出キット。
【請求項５】
上記olfactomedin 4タンパク質は、（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；または（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、
上記Reg IVタンパク質は、（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項３または４に記載の消化器癌検出キット。
【請求項６】
被検体由来試料において、olfactomedin 4タンパク質およびReg IVタンパク質の発現レベルを測定する測定工程を含み、
上記被検体由来試料が血清であり、胃癌の検出に用いられることを特徴とする被検体由来試料の消化器癌検出方法。
【請求項７】
上記測定工程が、被検体由来試料中のolfactomedin 4タンパク質およびReg IVタンパク質の濃度を測定する工程である、請求項６に記載の消化器癌検出方法。
【請求項８】
上記olfactomedin 4タンパク質は、（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；または（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、
上記Reg IVタンパク質は、（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項６または７に記載の消化器癌検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胃癌をはじめとする消化器癌の選択的な検出に用いられる新規消化器癌検出用血清腫瘍マーカー、当該新規消化器癌検出用血清腫瘍マーカーを検出するための検出手段を備えた消化器癌検出キット、および当該新規消化器癌検出用血清腫瘍マーカーを検出する工程を含む消化器癌検出方法に関するものである。上記新規消化器癌検出用血清腫瘍マーカーは、olfactomedin 4タンパク質およびReg IVタンパク質を含んでなるものである。特に本発明に係る新規消化器癌検出用血清腫瘍マーカーは、血清等を用いた簡便な検査で消化器癌の有無を検出することができる、血清腫瘍マーカーである。
【背景技術】
【０００２】
従来、癌の診断には主として病理形態学的診断が用いられてきた。病理形態学的診断による病変の質的診断、広がりの程度、脈管内侵襲および断端浸潤の有無の判定は、後治療の選択および決定に不可欠である。しかし、良性と悪性との中間的な形態を示す病変はまれではなく、また、形態の変化では悪性度や予後の類推に限界がある。さらに、病理形態学的診断は、１つ１つの検体から癌を目視により検出し、診断するものである。そのため熟練した経験が必要となるばかりか、主観的な判断により診断を行うという恐れがある。また、検体を１つ１つ調べるため、多数の検体を簡便に調べることは困難である。このような病理形態学的診断の弱点を補うために、分子生物学的解析が用いられており、様々な癌の検出マーカーが開発されている。特に血清をはじめとする体液中に存在するタンパク質の発現レベルの差異を検出することで癌の有無を検出することができる所謂「血清腫瘍マーカー」は、血清等を用いた簡便な検査で癌の有無を検出することができるために特に有用である。
【０００３】
すでに実用化されている血清腫瘍マーカーとして、CEAやCA19-9が挙げられる。CEAやCA19-9は消化器癌をはじめとする腺癌の検出に広く使用されている（例えば、非特許文献１および２を参照のこと）。しかし、CEAやCA19-9は、早期の消化器癌では発現していないために胃癌や大腸癌において早期の癌を検出するのに不適切であり、さらに喫煙や肝硬変等の影響によっても被検体の血清中から検出されるために偽陽性が多いことも問題点として指摘されている（例えば非特許文献３を参照のこと）。
【０００４】
ところで、Reg IVタンパク質が胃癌患者の血清中で検出され、胃癌の血清腫瘍マーカーになり得るということが知られている（例えば非特許文献４を参照のこと）。他方、胃癌組織および正常細胞組織においてolfactomedin 4（別名：hGC-1）タンパク質の発現が、免疫染色によって確認された（例えば非特許文献５を参照のこと）。ただし、olfactomedin 4タンパク質が胃癌の血清腫瘍マーカーとなり得ることは知られていない。
【非特許文献１】Horie Y, Miura K, Matsui K, Yukimasa A, Ohi S, Hamamoto T, Kawasaki H.Marked elevation of plasma carcinoembryonic antigen and stomach carcinoma. Cancer. 1996;77(10):1991-7.
【非特許文献２】Kochi M, Fujii M, Kanamori N, Kaiga T, Kawakami T, Aizaki K, Kasahara M, Mochizuki F, Kasakura Y, Yamagata M.Evaluation of serum CEA and CA19-9 levels as prognostic factors in patients with gastric cancer.Gastric Cancer. 2000;3(4):177-186.
【非特許文献３】Molnar IG, Vandevoorde JP, Gitnick GL. CEA levels in fluids bathing gastrointestinal tumors. Gastroenterology.1976;70(4):513-5.
【非特許文献４】Mitani Y, Oue N, Matsumura S, Yoshida K, Noguchi T, Ito M, Tanaka S, Kuniyasu H, Kamata N, Yasui W. Reg IV is a serum biomarker for gastric cancer patients and predicts response to 5-fluorouracil-based chemotherapy.Oncogene. 26(30):4383-4393, 2007
【非特許文献５】Liu W, Zhu J, Cao L, Rodgers GP. Expression of hGC-1 is correlated with differentiation of gastric carcinoma.Histopathology. 51(2):157-65, 2007
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記の通り、従来公知の血清腫瘍マーカーは、胃癌、膵癌、大腸癌の早期発見が困難であり、さらに偽陽性が多いという問題がある。つまり、早期の消化器癌（特に胃癌や膵癌）の検出が可能な特異性の高い血清腫瘍マーカーはこれまでに知られていなかった。それゆえ、早期の消化器癌（特に胃癌や膵癌）の検出が可能な特異性の高い血清腫瘍マーカーの開発が強く望まれている。
【０００６】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、胃癌をはじめとする消化器癌の選択的な検出に有効な血清腫瘍マーカー、胃癌をはじめとする消化器癌を選択的に検出するためのキット、および当該血清腫瘍マーカーを用いた消化器癌の選択的な検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために、Serial analysis of gene expression法（ＳＡＧＥ法）を用いて、胃癌における遺伝子発現解析を行い、ＳＡＧＥライブラリーを構築した。ＳＡＧＥライブラリーのデータと、ＮＣＢＩのＳＡＧＥデータベースに登録されている主要臓器の正常組織のＳＡＧＥデータとを比較し、胃癌組織において高発現しており、正常組織では発現していない遺伝子を検索した。これによって見出された候補遺伝子についてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法を用い、１４例の正常組織および９例の胃癌組織を材料とした遺伝子発現解析を行った。その結果、olfactomedin 4遺伝子およびReg IV遺伝子が胃癌において発現が高く、正常組織では発現が非常に低いことが明らかとなった。さらに、胃癌患者の血清におけるolfactomedin 4タンパク質およびReg IVタンパク質の濃度と、健常者の血清におけるolfactomedin 4タンパク質およびReg IVタンパク質の濃度とをＥＬＩＳＡ法で測定した結果、胃癌患者の血清ではolfactomedin 4タンパク質およびReg IVタンパク質の濃度が上昇していることを確認し、olfactomedin 4タンパク質およびReg IVタンパク質が本発明の目的である、胃癌をはじめとする消化器癌の選択的な検出に有効な血清腫瘍マーカーとして利用可能であることを見出した。特に、olfactomedin 4タンパク質とReg IVタンパク質とを組み合わせることによって、極めて選択性が高い消化器癌の検出手段を提供しえることを見出した。本発明は、上記発明者らの鋭意検討によって完成された。
【０００８】
すなわち、本発明にかかる消化器癌検出用血清腫瘍マーカーは、olfactomedin 4タンパク質およびReg IVタンパク質を含むことを特徴としている。
【０００９】
また本発明にかかる消化器癌検出用血清腫瘍マーカーは、胃癌の検出に好適に用いられ得る。
【００１０】
また本発明にかかる消化器癌検出用血清腫瘍マーカーにおいて、上記olfactomedin 4タンパク質は、（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；または（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、
上記Reg IVタンパク質は、（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする消化器癌検出用血清腫瘍マーカーであってもよい。
【００１１】
一方、本発明にかかる消化器癌検出キットは、olfactomedin 4タンパク質の発現を検出するための検出手段Ａ、およびReg IVタンパク質の発現を検出するための検出手段Ｂを含むことを特徴としている。
【００１２】
また、本発明にかかる消化器癌検出キットは、上記検出手段Ａはolfactomedin 4タンパク質と特異的に相互作用する物質であり、上記検出手段ＢはReg IVタンパク質と特異的に相互作用する物質であってもよい。
【００１３】
また、本発明にかかる消化器癌検出キットは、上記olfactomedin 4タンパク質と特異的に相互作用する物質が抗olfactomedin 4抗体であり、上記Reg IVタンパク質と特異的に相互作用する物質が抗Reg IV抗体であることが好ましい。
【００１４】
また、本発明にかかる消化器癌検出キットにおいて、上記olfactomedin 4タンパク質は、（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；または（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、上記Reg IVタンパク質は、（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする消化器癌検出キットであってもよい。
【００１５】
また、本発明にかかる消化器癌検出キットは、胃癌の検出に好適に用いられ得る。
【００１６】
一方、本発明にかかる被検体由来試料の消化器癌検出方法は、被検体由来試料において、olfactomedin 4タンパク質およびReg IVタンパク質の発現レベルを測定する測定工程を含むことを特徴としている。
【００１７】
また本発明にかかる被検体由来試料の消化器癌検出方法は、上記測定工程が、被検体由来試料中のolfactomedin 4タンパク質およびReg IVタンパク質の濃度を測定する工程であってもよい。
【００１８】
また本発明にかかる被検体由来試料の消化器癌検出方法は、上記被検体由来試料が血清であってもよい。
【００１９】
また本発明にかかる被検体由来試料の消化器癌検出方法は、上記olfactomedin 4タンパク質は、（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；または（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、上記Reg IVタンパク質は、（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする消化器癌検出方法であってもよい。
【００２０】
また本発明にかかる被検体由来試料の消化器癌検出方法は、胃癌の検出に好適に用いられ得る。
【発明の効果】
【００２１】
本発明にかかる消化器癌検出用血清腫瘍マーカー、消化器癌検出キット、消化器癌検出方法を使用することにより、消化器癌を客観的な分子学的基準に基づき検出することができるという効果を奏する。それゆえ、病理形態学的診断が困難な癌について分子学的基準に基づく診断ができ、癌の機序解明に貢献できる。
【００２２】
また、従来公知の血清腫瘍マーカーによる検出では偽陽性が多いことが問題となっているが、本発明に係る癌検出方法は特異性が極めて高いので、偽陽性が少ないという効果を奏する。さらに、従来公知の血清腫瘍マーカーでは早期癌の検出が困難であったが、本発明にかかる被検体由来試料の消化器癌検出方法を用いれば、早期癌を選択的且つ極めて高感度に検出することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本明細書中に記載された非特許文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【００２４】
＜１.消化器癌検出マーカー＞
本発明にかかる消化器癌検出用血清腫瘍マーカー（以下「本発明のマーカー」という）は、olfactomedin 4タンパク質およびReg IVタンパク質を含むことを特徴としている。本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、olfactomedin 4タンパク質が消化器癌検出用の血清腫瘍マーカーとして利用し得ることを見出した。さらに、本発明者らは、被検体由来血清中のolfactomedin 4タンパク質およびReg IVタンパク質レベルを測定することによって、極めて高い検出感度および極めて高い特異性をもって胃癌を検出することができるとともに、早期癌についても検出することができるということを発見し、本発明を完成させるに至った。olfactomedin 4タンパク質およびReg IVタンパク質を含む本発明のマーカーは、極めて高い検出感度および高い特異性をもって胃癌をはじめとする消化器癌を検出することができるとともに、早期癌についても検出することができるという従来のマーカーにはない顕著かつ有利な効果を奏するものである。
【００２５】
ここで本発明にかかる「消化器癌検出用血清腫瘍マーカー」とは「消化器癌を検出するために用いられる血清腫瘍マーカー」を意味する。「血清腫瘍マーカー」とは、血清や血しょう等を試料として用いた検査を用いて被検体中の腫瘍（癌）を検出し得るいわゆる「腫瘍マーカー」である。つまり本発明のマーカーは、被検体由来の血清や血しょうをはじめとする体液を試料として用い、当該試料中のolfactomedin 4タンパク質の濃度およびReg IVタンパク質の濃度を測定し、健常者の体液試料中の濃度と比較することによって被検体中の消化器癌を検出することができるというものである。より具体的には、被検体由来試料中のolfactomedin 4タンパク質の濃度およびReg IVタンパク質の濃度が、健常者由来試料中のそれらより高ければ被検体中に消化器癌が存在すると判断できる。また本発明のマーカーが血清腫瘍マーカーであるため、熟練を要する病理形態学的診断を行うことなく、血清や血しょう等を試料として用いた簡便な検査のみで被検体中の消化器癌を検出することができ、多数の検体を効率よく検査することができるという効果を享受することができる。特に本発明のマーカーは、消化器癌のうち、胃癌、膵癌の検出に好ましく用いられ得る。なお、前出の「腫瘍マーカー」とは、その有無や濃度、変異の状況などを検出することによって、被検体中に腫瘍（癌）が存在するかどうかを判定し得る物質のことを意味する。
【００２６】
本発明のマーカーはolfactomedin 4タンパク質およびReg IVタンパク質の両方を含むものである。後述する実施例において示すとおり、本発明者らは血清中のolfactomedin 4タンパク質濃度が上昇している症例と、血清中のReg IVタンパク質濃度が上昇している症例とは一致しない傾向にあることを見出した。そして、血清中のolfactomedin 4タンパク質濃度とReg IVタンパク質濃度とを合わせて測定することによって、被検体中の胃癌の検出感度を著しく向上させることができるということを見出した。よって本発明のマーカーにolfactomedin 4タンパク質およびReg IVタンパク質が含まれることによって、高い検出感度を有する消化器癌の検出方法を実現することができる。なお、本発明のマーカーには従来公知の血清腫瘍マーカーが含まれていてもよい。
【００２７】
ここで「olfactomedin 4タンパク質」は、その遺伝子が既にクローニングされており、そのｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ）の塩基配列がＧｅｎＢａｎｋに登録されている（Accession No. NM_006418）。olfactomedin 4タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１に示し、olfactomedin 4遺伝子であるｃＤＮＡの塩基配列を配列番号３に示す。なお、olfactomedin 4タンパク質のアミノ酸配列はこれに限定されるものではなく、配列番号１に示されるアミノ酸は列を有するolfactomedin 4タンパク質の変異体も含まれる。すなわちolfactomedin 4タンパク質をコードするolfactomedin 4遺伝子の起源や、突然変異によって生じ得る変異タンパク質も、本発明の説明におけるolfactomedin 4タンパク質に含まれる。換言すれば、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有する変異タンパク質も、本発明の説明におけるolfactomedin 4タンパク質に含まれる。上記「１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加された」とは、特に限定されるものではないが、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されるものであることを意味する。なお、olfactomedin 4タンパク質の機能については、これまで特定されておらず、またolfactomedin 4タンパク質の血清中の濃度と、消化器癌との関連性については一切知られていない。よって、olfactomedin 4タンパク質が胃癌をはじめとする消化器癌の血清腫瘍マーカーとして機能し得ることを見出した本発明者らの功績は大きい。
【００２８】
一方、「Reg IVタンパク質」についても、その遺伝子が既にクローニングされており、そのｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ）の塩基配列がＧｅｎＢａｎｋに登録されている（Accession No. NM_032044）。Reg IVタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示し、Reg IV 遺伝子であるｃＤＮＡの塩基配列を配列番号４に示す。なお、Reg IVタンパク質のアミノ酸配列はこれに限定されるものではなく、配列番号２に示されるアミノ酸は列を有するReg IVタンパク質の変異体も含まれる。すなわちReg IVタンパク質をコードするReg IV遺伝子の起源や、突然変異によって生じ得る変異タンパク質も、本発明の説明におけるReg IVタンパク質に含まれる。換言すれば、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有する変異タンパク質も、本発明の説明におけるReg IV タンパク質に含まれる。上記「１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加された」とは、特に限定されるものではないが、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されるものであることを意味する。なお、Reg IV タンパク質の機能については、epidermal growth factor receptorをリン酸化し、アポトーシスを抑制することが知られている（「Mitani Y, Oue N, Matsumura S, Yoshida K, Noguchi T, Ito M, Tanaka S, Kuniyasu H, Kamata N, Yasui W.Reg IV is a serum biomarker for gastric cancer patients and predicts response to 5-fluorouracil-based chemotherapy.Oncogene. 2007;26(30):4383-4393. 」、「Bishnupuri KS, Luo Q, Murmu N, Houchen CW, Anant S, Dieckgraefe BK.Reg IV activates the epidermal growth factor receptor/Akt/AP-1 signaling pathway in colon adenocarcinomas.Gastroenterology. 2006;130(1):137-149」を参照のこと）。
【００２９】
なお本発明の説明において「olfactomedin 4遺伝子」および「Reg IV 遺伝子」とは、それぞれ「olfactomedin 4タンパク質をコードするポリヌクレオチド」および「Reg IV をコードするポリヌクレオチド」を意味する。また上記「ポリヌクレオチド」にはイントロンが含まれていてもよく、またＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
【００３０】
＜２.消化器癌検出方法＞
本発明にかかる被検体由来試料の消化器癌検出方法（以下「本発明の検出方法」という）は、被検体由来の試料において、olfactomedin 4タンパク質の発現レベルおよびReg IVタンパク質の発現レベルを測定する測定工程を含むことを特徴としている。すなわち、上述のとおり、olfactomedin 4タンパク質およびReg IVタンパク質は、胃癌をはじめとする消化器癌の腫瘍マーカーとなり得る。よって、上記本発明のマーカーを構成するタンパク質の発現レベルを被検体由来の試料において検討することによって、被検体由来の試料中の消化器癌を検出することができる。より具体的には、被検体由来試料中のolfactomedin 4タンパク質の発現レベルおよびReg IVタンパク質の発現レベルが、健常者由来試料中のそれらより、高ければ被検体中に消化器癌が存在すると判断できる。
【００３１】
なお、本発明の検出方法の説明において、本発明のマーカーと共通する用語については、本発明のマーカーの項における用語の説明を適宜援用するものとする。
【００３２】
本発明の検出方法の一実施形態は、上記測定工程が、被検体由来試料中のolfactomedin 4タンパク質の濃度およびReg IVタンパク質の濃度を測定する工程である。ここで被検体由来試料としては、特に限定されるものではなく、被検体から採取した、血液（血清、血しょう）、体液、リンパ液、尿、消化器（胃など）細胞、消化器分泌液、が利用可能である。試料の調製の容易さから、被検体由来試料としては血液、特に血清が好ましい。上述のとおり本発明のマーカーはいわゆる血清腫瘍マーカーであるために、血清中においても検出され得る。上記被検体由来試料の調製方法は、公知の方法を適宜実施すればよい。例えば、血清を調製する場合、血液を被検体から取得し、血液を遠心分離にかけ、その上清を取得すればよい。
【００３３】
本発明にかかる検出方法の対象となる被検体は、消化器癌を発症し得る被検体であれば特に限定されるものではなく、例えばヒト、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタを始めとする哺乳動物全般、が挙げられる。
【００３４】
測定工程において、被検体由来試料中のolfactomedin 4タンパク質の濃度およびReg IVタンパク質の濃度を測定する場合、olfactomedin 4タンパク質およびReg IVタンパク質と特異的に相互作用する物質、例えば、olfactomedin 4タンパク質に特異的な抗体（「抗olfactomedin 4抗体」という）およびReg IVタンパク質に特異的な抗体（「抗Reg IV抗体」という）を用い、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法（固相酵素免疫検定法）、免疫沈降法、免疫組織化学法、抗体アレイ法などの公知の方法を適宜採用の上、適用すればよい。上記の測定法の内、より感度が高く、簡便であるという点から、ＥＬＩＳＡ法が好ましい。なお、これらの測定法の具体的な条件は、当業者が適宜設定し得る事項である。
【００３５】
ここでＥＬＩＳＡ法は、上記被検体試料に含まれるタンパク質をマルチウェルプレート（「マイクロタイタープレート」ともいう）に固定し、その後、抗olfactomedin 4抗体および抗Reg IV抗体によって、olfactomedin 4タンパク質濃度およびReg IVタンパク質濃度を検出する方法である。例えば、olfactomedin 4タンパク質およびReg IVタンパク質に結合した抗体を、アルカリフォスファターゼまたはペルオキシダーゼ結合抗ＩｇＧ抗体などを２次抗体として用いて検出すればよい。またＥＬＩＳＡ法は、サンドイッチ法であってもよい。
【００３６】
他方、ウェスタンブロット法は、被検体由来試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で分離させた後、ニトロセルロース膜などに転写し、抗olfactomedin 4抗体および抗Reg IV抗体によって、olfactomedin 4タンパク質濃度およびReg IVタンパク質濃度を検出する方法である。olfactomedin 4タンパク質およびReg IVタンパク質に結合した抗体を、例えば、125Ｉ−標識プロテインＡ、ペルオキシダーゼ結合抗ＩｇＧ抗体などを２次抗体として用いて検出すればよい。olfactomedin 4タンパク質濃度およびReg IVタンパク質濃度は、例えば、デンシトメーター等を用いて得られるシグナル強度を確認することにより測定され得る。すなわち、シグナル強度が強いほどolfactomedin 4タンパク質濃度およびReg IVタンパク質濃度が高いと判断され、検量線を用いて濃度が測定され得る。
【００３７】
本発明の検出方法の一実施形態は、上記のようにして測定された被検体由来試料中のolfactomedin 4タンパク質の濃度およびReg IVタンパク質の濃度が、健常者由来試料中のこれらの濃度に比して高いかどうかを指標として被検体試料中の消化器癌を検出する。ここで、被検体由来試料中のolfactomedin 4タンパク質の濃度およびReg IVタンパク質の濃度と、健常者由来試料中のこれらとの比較は、被検体由来試料と同時に健常者由来試料について上記測定工程を実施し、これによって得られた濃度とを比較することによって実施され得る。この時、被検体由来試料中のolfactomedin 4タンパク質の濃度およびReg IVタンパク質の濃度が健常者由来試料中のこれらの濃度に比して高いかどうかは、両者を比較して相対的に判断すればよい。また、被検体由来試料中のolfactomedin 4タンパク質の濃度およびReg IVタンパク質の濃度と、健常者由来試料中のこれらとの比較は、あらかじめ測定された健常者由来試料中のolfactomedin 4タンパク質の濃度およびReg IVタンパク質の濃度と、被検体由来試料について測定されたこれらの濃度とを比較することによって実施されてもよい。さらに、被検体中の消化器癌の有無を判断し得る境界値（カットオフ値）をあらかじめ設定しておいて、被検体由来試料中の濃度が当該境界値より高いかどうかで被検体由来試料中の消化器癌の有無を判断してもよい。
【００３８】
ここで、上記境界値は、用いられる試料によって変動し得るために限定されるものではないが、例えば、後述する実施例におけるヒト由来血清中のolfactomedin 4タンパク質濃度の境界値およびReg IVタンパク質濃度の境界値は、それぞれ２ｎｇ/ｍｌ、８．３１ｎｇ／ｍｌである。なお、本発明の検出方法においては、被検体由来試料中のolfactomedin 4タンパク質の濃度およびReg IVタンパク質の濃度が上記境界値よりそれぞれ高ければ、被検体中に消化器癌が存在すると判断することができる。また逆に被検体由来試料中のolfactomedin 4タンパク質の濃度およびReg IVタンパク質の濃度が上記境界値よりそれぞれ低ければ被検体中に消化器癌が存在しないと判断することができる。
【００３９】
また上記の抗olfactomedin 4抗体および抗Reg IV抗体は、種々の公知の方法を用いて作製することができ、その作製方法は特に限定されるものではない。例えば、ＨａｒＬｏｗら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）」、岩崎ら、「単クローン抗体  ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ、講談社（１９９１）」）等の方法を用いて作製することができる。また、上記抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、またolfactomedin 4タンパク質またはおよびReg IVタンパク質に特異的に結合し得る完全な抗体分子のみならず、例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントのような抗体フラグメントであってもよい。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは完全な抗体のＦｃ部分を欠いており、循環によってさらに迅速に除去され、そして完全な抗体の非特異的組織結合をほとんど有し得ないため（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３））、好ましく用いることができる。
【００４０】
ところで本発明の検出方法における測定工程は、被検体由来試料中のolfactomedin 4遺伝子のｍＲＮＡ量およびReg IV遺伝子のｍＲＮＡ量を測定する工程であってもよい。つまり、本発明の検出方法は、上記測定工程がolfactomedin 4遺伝子のｍＲＮＡ量およびReg IV遺伝子のｍＲＮＡ量を測定することによって、olfactomedin 4タンパク質の発現レベルおよびReg IVタンパク質の発現レベルを測定するという態様であってもよいということである。かかる態様においては、被検体由来試料におけるolfactomedin 4遺伝子のｍＲＮＡおよびReg IV遺伝子のｍＲＮＡ量から当該遺伝子の発現レベルを測定し、このレベルを健常者由来試料の発現レベルと比較することにより、被検体中の消化器癌の有無を検出するという態様である。
【００４１】
上記のようにして測定された被検体由来試料中のolfactomedin 4遺伝子の発現レベルおよびReg IVタンパク遺伝子の発現レベルが、健常者由来試料中のこれらの発現レベルに比して高いかどうかを指標として被検体試料中の消化器癌を検出する。ここで、被検体由来試料中のolfactomedin 4遺伝子の発現レベルおよびReg IV遺伝子の発現レベルと、健常者由来試料中のこれらとの比較は、被検体由来試料と同時に健常者由来試料についてｍＲＮＡ量の測定を実施し、これによって得られたｍＲＮＡ量を比較することによって実施され得る。この時、被検体由来試料中のolfactomedin 4遺伝子の発現レベルおよびReg IV遺伝子の発現レベルが健常者由来試料中のこれらの濃度に比して高いかどうかは、ｍＲＮＡの量を両者間で比較して相対的に判断すればよい。また、被検体由来試料中のolfactomedin 4遺伝子の発現量およびReg IV遺伝子の発現量と、健常者由来試料中のこれらとの比較は、あらかじめ測定された健常者由来試料中のolfactomedin 4遺伝子のｍＲＮＡ量およびReg IV遺伝子のｍＲＮＡ量と、被検体由来試料について測定されたこれらのｍＲＮＡ量とを比較することによって実施されてもよい。さらに、被検体中の消化器癌の有無を判断し得る境界値（カットオフ値）をあらかじめ設定しておいて、被検体由来試料中のｍＲＮＡ量が当該境界値より高いかどうかで被検体由来試料中の消化器癌の有無を判断してもよい。
【００４２】
ｍＲＮＡ量を測定する方法としては、所望のｍＲＮＡ量を測定できる方法であれば特に限定されず、公知の方法から適宜選択して用いることができる。例えば、上記、olfactomedin 4遺伝子のｍＲＮＡおよびReg IV遺伝子のｍＲＮＡ、もしくはそれらのｃＤＮＡまたはそれらの相補鎖の一部からなるポリヌクレオチドであって、当該olfactomedin 4遺伝子およびReg IV遺伝子のＲＮＡまたはｃＤＮＡに部位特異的に結合（ハイブリダイズ）するポリヌクレオチドを含むプライマーやプローブを用いた方法が挙げられる。
【００４３】
具体的には、上記プライマーやプローブを標識し、当該標識を検出することにより、上記ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを検出することができる。そして、当該標識のシグナナル強度を調べることによりｍＲＮＡ量を測定することができる。上記標識としては特に限定されないが、例えば、３２Ｐに代表される放射性物質のほか、フルオレセインに代表される蛍光物質を用いることができる。上記プライマーおよび／またはプローブとして使用するポリヌクレオチドは、例えば、配列番号３に示されるolfactomedin 4遺伝子の塩基配列、および配列番号４に示されるReg IV遺伝子の塩基配列を元に、従来公知の方法により設計され得る。例えば目的のｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を特異的に増幅させるプライマーとして利用可能なポリヌクレオチドは、当該ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を特異的に検出するためのプローブとして使用可能であることは当業者にとって周知であるため、この知見を元にプローブとして利用可能なポリヌクレオチドを設計すればよい。
【００４４】
ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに部位特異的に結合するポリヌクレオチドを含むプライマーやプローブを用いてｍＲＮＡを検出する公知の方法としては、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、コンペティティブＰＣＲ法、ｉｎ  Ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法、ｉｎ  Ｓｉｔｕ  ＰＣＲ法、ＤＮＡアレイ法、ノーザンブロット法などを挙げることができる。
【００４５】
ＲＴ−ＰＣＲ（Reverse transcribed-Polymerase chain reaction）法とは、olfactomedin 4遺伝子のｍＲＮＡおよびReg IV遺伝子のｍＲＮＡを鋳型とし、逆転写酵素反応によりｃＤＮＡを合成後、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅を行う方法［Kawasaki,E.S.,et al.,Amplification of RNA.In PCR Protocol,A Guide to methods AND applications,Academic Press,Inc.,SanDiego,21-27(1991)］である。なお、ＤＮＡの増幅反応は特に限定されるものではなく、当業者は適宜最適な条件を検討の上、採用することができる。また、olfactomedin 4遺伝子およびReg IV遺伝子の増幅領域は、必ずしも全長である必要はなく、増幅産物の確認に支障が無ければ、当該遺伝子の一部領域であってもよい。増幅されたＤＮＡ量（ｍＲＮＡ量に相当する）は、例えば、上記ＤＮＡ増幅反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、目的増幅断片に特異的にハイブリダイズするプローブを用いることで検出することができる。一方、十分量の増幅産物が得られる場合には、アガロースゲル電気泳動を行った後、ゲルをＥｔＢｒ染色し、増幅ポリヌクレオチドの位置とその蛍光強度により確認することも可能である。
【００４６】
さらに、ＲＴ−ＰＣＴの際に、リアルタイムモニタリング試薬を用いることによりリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法を行うことができる。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法は、増幅産物の生成過程をリアルタイムでモニタリングし、解析する方法である。そのため、増幅産物の増幅量が飽和する前に増幅反応をストップすることができる。したがって、olfactomedin 4遺伝子のｍＲＮＡ量およびReg IV遺伝子のｍＲＮＡ量をより正確に測定することができる。上記リアルタイムモニタリング試薬としては、例えば、ＳＹＢＲ（登録商標：Molecular Probes社）Ｇｒｅｅｎ、ＴａｑＭａｎ（登録商標：Applied Biosystems社）プローブ等が挙げられる。
【００４７】
またノーザンハイブリダイゼーション法によってもolfactomedin 4遺伝子のｍＲＮＡ量およびReg IV遺伝子のｍＲＮＡ量の測定し得る。この場合、試料より抽出された一定量の粗ＲＮＡ試料を分子量等による分画後ナイロンフィルター等に固定し、検出対象となるolfactomedin 4遺伝子のｍＲＮＡおよびReg IV遺伝子のｍＲＮＡとプローブとを接触させ、当該ｍＲＮＡにハイブリダイズした上記プローブを検出することによりｍＲＮＡ量の測定を実施することができる。
【００４８】
またｉｎ  Ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法によるolfactomedin 4遺伝子のｍＲＮＡおよびReg IV遺伝子のｍＲＮＡレベルの検出は、例えば、以下の方法で行うことができる。被検体由来試料（細胞、組織切片等の試料）をホルマリン等で固定する。Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ等を用いてプローブが試料を透過できるように処理した後、プローブを加えてolfactomedin 4遺伝子のｍＲＮＡおよびReg IV遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズさせる。そして、上記ｍＲＮＡにハイブリダイズしたプローブを検出することにより実施することができる。
【００４９】
またＤＮＡアレイ法によるolfactomedin 4遺伝子のｍＲＮＡおよびReg IV遺伝子のｍＲＮＡ量の検出は、例えば、以下の方法で行うことができる。支持体上にolfactomedin 4遺伝子およびReg IV遺伝子のｃＤＮＡまたはその部分配列を固定化し、被検体由来試料から調製したｍＲＮＡまたはｃＤＮＡとハイブリダイズさせる。この際、上記ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを蛍光標識等することにより、支持体上に固定化したｃＤＮＡまたはその部分配列と試料から調製したＲＮＡまたはｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションを検出することができる。
【００５０】
ｍＲＮＡ量の測定は、例えば、上述の方法で検出したｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに対してデンシトメーター等を用いて得られるシグナル強度を確認することにより実施することができる。すなわち、シグナル強度が強いほどｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの量が高いと判断できる。
【００５１】
＜３.消化器癌検出キット＞
本発明にかかる消化器癌検出キット（以下「本発明のキット」という）は、olfactomedin 4タンパク質の発現を検出するための検出手段Ａ、およびReg IVタンパク質の発現を検出するための検出手段Ｂを含むことを特徴としている。上述のとおり、olfactomedin 4タンパク質およびReg IVタンパク質は、胃癌をはじめとする消化器癌の血清腫瘍マーカーとなり得る。よって、上記本発明のマーカーを構成するタンパク質の発現レベルを被検体由来の試料において検討し得る手段を含むキットによれば、被検体由来の試料中の消化器癌を選択的且つ簡便に検出することができる。すなわち、本発明のキットを用いて、被検体由来試料中のolfactomedin 4タンパク質およびReg IVタンパク質の発現レベルが、健常者由来試料中のそれらより、高ければ被検体中に消化器癌が存在すると判断することができる。
【００５２】
なお、本発明の検出方法の説明において、本発明のマーカーと共通する用語については、本発明のマーカーおよび検出方法の項における用語の説明を適宜援用するものとする。
【００５３】
ここでolfactomedin 4タンパク質の発現を検出するための検出手段Ａとしては、olfactomedin 4タンパク質と特異的に相互作用する物質、例えば、olfactomedin 4タンパク質に特異的な抗体（「抗olfactomedin 4抗体」という）が挙げられる。かかる検出手段Ａを用い、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法（固相酵素免疫検定法）、免疫沈降法、免疫組織化学法、抗体アレイ法などの公知の方法を実施することによって、olfactomedin 4タンパク質の発現を検出することができる。抗体の説明、およびolfactomedin 4タンパク質の発現の具体的な検出方法については、本発明の検出方法において説明したとおりである。
【００５４】
また検出手段Ａは、olfactomedin 4遺伝子のＲＮＡまたはｃＤＮＡに部位特異的に結合（ハイブリダイズ）するポリヌクレオチドを含むプライマーやプローブであってもよい。かかる検出手段Ａを構成し得るポリヌクレオチドは、olfactomedin 4遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドということもできる。ここで、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％以上の同一性、好ましくは少なくとも９５％以上の同一性、最も好ましくは９７％の同一性が配列間に存在する時にのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。上記ハイブリダイゼーションは、「Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）」に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（すなわちハイブリダイズし難くなる）。ハイブリダイゼーションの条件としては、従来公知の条件を好適に用いることができ、特に限定されないが、例えば、４２℃、６×ＳＳＰＥ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ  サケ精子ＤＮＡ、５×デンハルト液（ただし、１×ＳＳＰＥ；０．１８Ｍ  塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．７、１ｍＭ  ＥＤＴＡ。５×デンハルト液；０．１％  牛血清アルブミン、０．１％  フィコール、０．１％  ポリビニルピロリドン）が挙げられる。
【００５５】
一方Reg IVタンパク質の発現を検出するための検出手段Ｂとしては、Reg IVタンパク質と特異的に相互作用する物質、例えば、Reg IVタンパク質に特異的な抗体（「抗Reg IV抗体」という）が挙げられる。また検出手段Ｂは、Reg IV 遺伝子のＲＮＡまたはｃＤＮＡに部位特異的に結合（ハイブリダイズ）するポリヌクレオチドを含むプライマーやプローブであってもよい。かかる検出手段Ｂを構成し得るポリヌクレオチドは、Reg IV 遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドということもできる。なお検出手段Ｂの説明については、検出手段Ａの説明における「olfactomedin 4」を「Reg IV」に読み替えて援用することとする。
【００５６】
本発明のキットには、検出手段Ａおよび検出手段Ｂが支持体上に固定化された器具が含まれていてもよい。より具体的には、olfactomedin 4遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド（検出手段Ａ）およびReg IV遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド（検出手段Ｂ）が支持体上に固定化されたＤＮＡアレイ（ＤＮＡチップ）が挙げられる。上記支持体上に固定化されるポリヌクレオチドはolfactomedin 4遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド（検出手段Ａ）およびReg IV遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド（検出手段Ｂ）であれば特に限定されるものではない。また、上記支持体上には、olfactomedin 4遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド（検出手段Ａ）およびReg IV遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド（検出手段Ｂ）以外の、ポリヌクレオチド、例えば従来公知の腫瘍マーカーを検出し得るポリヌクレオチドが固定されていてもよい。
【００５７】
上記支持体としては、ポリヌクレオチドを固定化できるものであれば特に限定されるものではなく、どのような形状や材質であってもよい。支持体の材料としては、一般的には、例えば、ガラス、シリコンウエハ等の無機系材料、紙等の天然高分子、ニトロセルロース、ナイロン等の合成高分子、合成高分子や天然高分子を用いたゲル体等を挙げることができる。
【００５８】
またポリヌクレオチドの支持体への固定方法は、公知のＤＮＡアレイ作製方法を採用することができる。例えば、ｃＤＮＡ（全長配列または部分配列）からなるポリヌクレオチド溶液を調製し、スポッター等により支持体上にスポットして固定化すればｃＤＮＡアレイを作製することができる。固定化するポリヌクレオチドはｃＤＮＡの塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドでもよい。また、基板上でＤＮＡを合成する、いわゆるアフィメトリクス型のＤＮＡチップ技術を用いることも可能である。
【００５９】
またＤＮＡチップに関する公知の手法は、本発明においても適用可能であり、例えば、被検体由来のトータルＲＮＡやｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡやｃＲＮＡを蛍光標識しておき、支持体上に固定化されたポリヌクレオチドとハイブリダイズさせる。そのハイブリダイズしたｃＤＮＡやｃＲＮＡの量を、蛍光を指標に測定することにより遺伝子の発現レベルを評価することができる。また、２種類の試料から調製したｃＤＮＡやｃＲＮＡをそれぞれ異なる色を発する蛍光物質で標識し、同一の支持体上のポリヌクレオチドにハイブリダイズさせれば、その色調と蛍光強度を測定することにより、遺伝子発現の差異を評価することができる。
【００６０】
また、本発明のキットには、抗olfactomedin 4抗体（検出手段Ａ）および抗Reg IV抗体（検出手段Ｂ）が支持体上に固定化された器具が含まれていてもよい。より具体的には、抗olfactomedin 4抗体（検出手段Ａ）および抗Reg IV抗体（検出手段Ｂ）が支持体上に固定化された抗体アレイまたはＥＬＩＳＡ用プレートが挙げられる。なお、上記器具には抗olfactomedin 4抗体（検出手段Ａ）および抗Reg IV抗体（検出手段Ｂ）以外の抗体（例えば、従来公知の腫瘍マーカータンパク質と特異的に結合し得る抗体）が同じ支持体上に固定化されているものであってもよい。
【００６１】
支持体としては、抗体、すなわちポリペプチドを固定化できるものであれば特に限定されるものではなく、どのような形状や材質であってもよい。支持体の材料としては、一般的には、例えば、ガラス、シリコンウエハ等の無機系材料、紙等の天然高分子、ニトロセルロース、ナイロン、ポリスチレン等の合成高分子、合成高分子、天然高分子を用いたゲル体等を挙げることができる。
【００６２】
抗体を用いてポリペプチドを検出するための公知の手法は、本発明においても適用可能であり、例えば、サイファージェン・バイオシステムズ社より、プロテインチップの１種類としてバイオロジカルチップが販売されている。これは基板（支持体）の表面にカルボニルジイミダゾールまたはエポキシの活性基を持つもので、ユーザーが自由に目的のポリペプチドや抗体を固定化して使用するものである。上記抗olfactomedin 4抗体（検出手段Ａ）および抗Reg IV抗体（検出手段Ｂ）が支持体上に固定化された器具の作製にこれを応用することが可能である。
【００６３】
本発明のキットには、上記以外の構成が含まれていてもよい。例えば、被検体由来の試料からＲＮＡを調製するための試薬、逆転写酵素、逆転写反応に用いる緩衝液、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲ用試薬、リアルタイムＰＣＲ用試薬、ＰＣＲ用チューブ、ＰＣＲ用プレート、ｃＤＮＡを蛍光標識するための試薬、ハイブリダイゼーション用試薬などが含まれていてもよい。
【００６４】
また本発明のキットには、ＥＬＩＳＡ法やウェスタンブロット法を行うための構成、例えば、標識された二次抗体、発色用試薬、洗浄用緩衝液などが含まれていてもよい。
【００６５】
なお本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００６６】
以下、本発明について実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、核酸の抽出、切断、連結、大腸菌の形質転換、遺伝子の塩基配列決定等、一般の遺伝子組換えに必要な方法は、特に記載のない限り、各操作に使用する市販の試薬、機器装置等に添付されている説明書や、実験書（例えば「Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 3rd Ed(Sambrookら(2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press)」）に基本的に従った。
【００６７】
（１）ＳＡＧＥ法による胃癌特異的遺伝子候補の同定
ヒト由来胃癌組織について、ＳＡＧＥ法を用いて遺伝子発現を網羅的に解析した。すなわち、上記胃癌から調製したｍＲＮＡ（５μｇ）を材料として、ビオチンラベルされたオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写反応を行い、ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄおよびｓｅｃｏｎｄ  ｓｔｒａｎｄを合成した。次に、ＣＡＴＧを認識して切断する制限酵素ＮｌａＩＩＩで切断し、アビジンをコートしたマグネットビーズを用いて３’側のフラグメントを回収した。ライゲースによりリンカーを結合させた後、ＣＡＴＧから３’側に１０〜１２塩基を認識して切断する制限酵素ＢｓｍＦＩで切断し、アビジンをコートしたマグネットビーズを用いて５’側のフラグメントを回収した。得られたフラグメントをライゲースを用いて２分子結合させ、これを鋳型としてリンカーの塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行い増幅させた。
【００６８】
増幅産物をゲルで精製した後、ライゲースによりフラグメントをいくつも直列に結合させた。電気泳動により５００ｂｐ以上のフラグメントを回収し、ｐＺｅｒｏに組み込んで大腸菌ＤＨ１０Ｂにトランスフォームした。抗生物質ゼオシンを含むＬＢ培地で大腸菌を培養し、生育したコロニーからプラスミドを抽出して、組み込まれたフラグメントの塩基配列を決定した。塩基配列情報を、ＳＡＧＥ２０００ソフトウェアを用いて遺伝子発現情報に変換し、胃癌ＳＡＧＥライブラリーを構築した。
【００６９】
胃癌に特異的に発現している遺伝子を同定するため、ＮＣＢＩ（米国国立バイオテクノロジーインフォメーションセンター）のＳＡＧＥデータベースである「ＳＡＧＥｍａｐ」で利用可能な正常胃組織のＳＡＧＥライブラリーと、上記胃癌ＳＡＧＥライブラリーとをコンピュータ上で比較した。その結果、胃癌組織で高発現しており、正常胃組織では発現していない５４種類の候補遺伝子（olfactomedin 4遺伝子およびReg IV遺伝子を含む）を見出した。
【００７０】
（２）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によるマーカー遺伝子の発現レベルの測定
上記olfactomedin 4遺伝子およびReg IV遺伝子を含む５４種類候補遺伝子のｍＲＮＡについて、ヒト由来胃癌におけるレベルを、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法を用いて測定した。試料として、ヒト由来胃癌組織９例を用い、対照試料として１４種類のヒト正常組織を用いた。上記胃癌９例のそれぞれからＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。また、正常組織１４種類のそれぞれのＴｏｔａｌ  ＲＮＡは、クロンテックより購入した（大脳（カタログ番号６３６５３０）、脊髄（カタログ番号６３６５５４）、心臓（カタログ番号６３６５３２）、肺（カタログ番号６３６５２４）、胃（カタログ番号６３６５７８）、小腸（カタログ番号６３６５３９）、結腸（カタログ番号６３６５５３）、肝臓（カタログ番号６３６５３１）、膵臓（カタログ番号６３６５７７）、腎臓（カタログ番号６３６５２９）、骨髄（カタログ番号６３６５４８）、脾臓（カタログ番号６３６５２５）、骨格筋（カタログ番号６３６５３４）、白血球（カタログ番号６３６５８０））。
【００７１】
上記の胃癌９例、および上記正常組織１４例の各Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型として、常法にしたがってｃＤＮＡを合成した。次に上記ｃＤＮＡを鋳型とし、特異的プライマーを用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ行った。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、アプライドバイオシステムズ社製のABI PRISM（登録商標） 7700 Sequence Detection System上で、SYBR Green PCR Core Reagents Kitを用いて行った。
【００７２】
反応液の組成は、10×SYBR Green PCR Buffer:5μL、25mM MgCl2 Solution:6μL、12.5mM dNTP Mix:4μL、5U/μL Ampli Taq GoldTM:0.25μL、1U/μL AmpErase(登録商標):0.5μL、Forwardプライマー:0.5μL、Reverseプライマー:0.5μL、試料(各組織由来のcDNA):1μLおよび滅菌蒸留水:32.25μLとした。なお、プライマー、試料および滅菌蒸留水以外はすべて上記SYBR Green PCR Core Reagents Kitに付属のものである。反応条件は、５０℃／２分、９５℃／１０分に引き続き、９５℃／１５秒および６０℃／１分の反応を４０サイクル行った。
【００７３】
なお、olfactomedin 4遺伝子用のＦｏｒｗａｒｄプライマーとして、配列番号５で表される塩基配列のプライマー（TGGTGAACATCAGCAAACCG）を用い、Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーとして、配列番号６で表される塩基配列のプライマーを用いた（TCCCTACCCCAAGCACCATA）。またReg IV遺伝子用のＦｏｒｗａｒｄプライマーとして、配列番号７で表される塩基配列のプライマー（GCCCCGCCATCCCTT）を用い、Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーとして、配列番号８で表される塩基配列のプライマーを用いた（CTGCTCGAGACAGCCAGAGA）。
【００７４】
上記リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果、olfactomedin 4遺伝子およびReg IV遺伝子が胃癌組織において発現が高く、正常組織では発現が非常に低いことが明らかとなった。
【００７５】
図１は、olfactomedin 4遺伝子についてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った結果を示す図である。具体的には、図１は胃癌９例および正常組織１４種類の各試料におけるolfactomedin 4遺伝子のｍＲＮＡ量を表している。なお、図１の縦軸の値は、正常組織の中で最も高かったolfactomedin 4遺伝子のｍＲＮＡ量を１としたときの、各試料におけるolfactomedin 4遺伝子のｍＲＮＡ量の相対値を表している。図１の結果からolfactomedin 4遺伝子が胃癌組織において発現が高く、正常組織では発現が非常に低いことがわかる。
【００７６】
図２は、Reg IV遺伝子についてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った結果を示す図である。具体的には、図２は胃癌９例および正常組織１４種類の各試料におけるReg IV遺伝子のｍＲＮＡ量を表している。なお、図２の縦軸の値は、正常組織の中で最も高かったReg IV遺伝子のｍＲＮＡ量を１としたときの、各試料におけるReg IV遺伝子のｍＲＮＡ量の相対値を表している。図２の結果からReg IV遺伝子が胃癌組織において発現が高く、正常組織では発現が非常に低いことがわかる。
【００７７】
（３）ＥＬＩＳＡ法による血清中のマーカータンパク質の検出
胃癌患者（Stage I患者３５例、Stage II患者６例、Stage III患者１０例、Stage IV患者９例）の血清および健常者（olfactomedin 4タンパク質の場合は３５例、Reg IVタンパク質の場合は１０１例）の血清を試料として、olfactomedin 4タンパク質およびReg IVタンパク質の濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。具体的には、以下のようにした。
＜olfactomedin 4タンパク質の場合＞
(1)一次抗体であるマウス抗olfactomedin 4抗体（本発明者らが調製したもの）１０μg/mLをマイクロタイタープレート（以下「プレート」という）の各ウェルに加え、４℃で一晩静置して固層化した。なおマウス抗olfactomedin 4抗体は、１％ＢＳＡ、Tris-HCl（ｐＨ７．４）で希釈された。
(2)３回ＰＢＳでプレートを洗浄した。その後、プレートの各ウェルに５％スキムミルクを加えし、３７℃、３時間、ブロッキングを行った。
(3)３回ＰＢＳで洗浄し、５倍に希釈した血清試料とスタンダード（リコンビナントolfactomedin 4：発明者が調製したもの）とをプレートの各ウェルに加え、４℃で一晩静置した。血清試料は１%ＢＳＡ、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈された。
(4)３回ＰＢＳでプレートを洗浄した。その後、二次抗体であるビオチンラベルされたマウス抗olfactomedin 4抗体（本発明者らが調製したもの）０.７５μg/mLをプレートの各ウェルに加え、３７℃、１時間処理した。抗体は１％ＢＳＡ、Tris-HCl（ｐＨ７．４）、０．０５％ヤギ血清で希釈された。
(5)３回ＰＢＳで洗浄した。その後、２０００倍希釈したストレプトアビジン標識アルカリフォスファターゼ（Dako社より購入、カタログ番号D0396）をプレートの各ウェルに加え、３７℃、1時間処理した。ストレプトアビジン標識アルカリフォスファターゼは１％、Tris-HCl（pH７．４）で希釈された。
(6) ３回ＰＢＳで洗浄した。pNPP（Sigmaより購入、カタログ番号N7653）をプレートの各ウェルに加え、３７℃、１時間処理した。
(7)O.D. 405nmを測定し、スタンダード曲線から、血清olfactomedin 4タンパク質濃度を算出した。
＜Reg IVタンパク質の場合＞
(1)一次抗体であるマウス抗Reg IV抗体（R&D Systemsより購入、カタログ番号MAB1379）２．５μg/mLをプレートの各ウェルに加え、４℃で一晩静置して固層化した。なおマウス抗olfactomedin 4抗体は、1%BSA、Tris-HCl（pH7.4）で希釈された。
(2)３回ＰＢＳでプレートを洗浄した。その後、プレートの各ウェルに５％スキムミルクを加えし、３７℃、３時間、ブロッキングを行った。
(3)３回ＰＢＳで洗浄し、５倍に希釈した血清試料とスタンダード（リコンビナントReg IV：発明者が調製したもの）とをプレートの各ウェルに加え、４℃で一晩静置した。血清試料は１%ＢＳＡ、ＰＢＳ（pH７．４）で希釈された。
(4)３回ＰＢＳでプレートを洗浄した。その後、二次抗体であるビオチンラベルされたヤギ抗Reg IV抗体（R&D Systemsより購入、カタログ番号BAF1379）１．５μg/mLをプレートの各ウェルに加え、３７℃、１時間処理した。抗体は１％ＢＳＡ、Tris-HCl（ｐＨ７．４）、０．０５％ヤギ血清で希釈された。
(5)３回ＰＢＳで洗浄した。その後、２０００倍希釈したストレプトアビジン標識アルカリフォスファターゼ（Dako社より購入、カタログ番号D0396）をプレートの各ウェルに加え、３７℃、1時間処理した。ストレプトアビジン標識アルカリフォスファターゼは１％、Tris-HCl（pH７．４）で希釈された。
(6) ３回ＰＢＳで洗浄した。pNPP（Sigmaより購入、カタログ番号N7653）をプレートの各ウェルに加え、３７℃、1時間処理した。
(7)O.D. 405nmを測定し、スタンダード曲線から、血清Reg IVタンパク質濃度を算出した。
【００７８】
胃癌患者の血清中および健常者の血清中におけるolfactomedin 4タンパク質の濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した結果を図３に示す。図３における横軸は胃癌患者の各グループおよび健常者を示し、縦軸はolfactomedin 4タンパク質の濃度(ng/ml)を示す。また被検体中の胃癌の有無を判断し得るolfactomedin 4タンパク質濃度の境界値（カットオフ値：８３．１ng/ml）を、図３中破線で示す。なお、「カットオフ値＝（健常者の血清olfactomedin 4タンパク質の濃度の平均）＋２×標準偏差」である。さらに、〔胃癌有り（＝陽性）と判断された症例数〕／〔解析した症例数〕、およびその割合（％）を図３中に記載した。
【００７９】
図３の結果によれば、Stage I患者３５例中、７例がolfactomedin 4タンパク質による検出で陽性と判断された（２０％）。またStage II患者６例中、４例がolfactomedin 4タンパク質による検出で陽性と判断された（６７％）。またStage III患者１０例中、４例がolfactomedin 4タンパク質による検出で陽性と判断された（４０％）。またStage IV患者９例中、３例がolfactomedin 4タンパク質による検出で陽性と判断された（３３％）。一方、健常者３５例中、３例がolfactomedin 4タンパク質による検出で陽性と判断された（９％）。この結果をまとめると、olfactomedin 4タンパク質を胃癌マーカーとして用いた場合の感度（＝胃癌患者の症例数に対する陽性と判断された症例数の割合）は３０％であり、特異性（＝〔１−陽性判断された健常者の割合〕×１００）は９１％であった。したがって、olfactomedin 4タンパク質は、高感度かつ高い特異性を持った胃癌検出用の血清腫瘍マーカーであり、かつ早期癌の検出に利用可能であることが確認された。さらに、Stage IおよびIIの患者に対しても高感度で検出することができるため、早期癌の検出に利用可能であるということも確認された。
【００８０】
次に、胃癌患者の血清中および健常者の血清中におけるReg IVタンパク質の濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した結果を図４に示す。図４における横軸は胃癌患者の各グループおよび健常者を示し、縦軸はReg IVタンパク質の濃度(ng/ml)を示す。また被検体中の胃癌の有無を判断し得るReg IVタンパク質濃度の境界値（カットオフ値:２ng/ml）を図４中破線で示す。なお、「カットオフ値＝（健常者の血清Reg IVタンパク質の濃度の平均）＋２×標準偏差」である。さらに、〔胃癌有り（＝陽性）と判断された症例数〕／〔解析した症例数〕、およびその割合（％）を図４中に記載した。
【００８１】
図４の結果によれば、Stage I患者３５例中、１２例がReg IVタンパク質による検出で陽性と判断された（３４％）。またStage II患者６例中、３例がReg IVタンパク質による検出で陽性と判断された（５０％）。またStage III患者１０例中、５例がReg IVタンパク質による検出で陽性と判断された（５０％）。またStage IV患者９例中、２例がReg IVタンパク質による検出で陽性と判断された（２２％）。一方、健常者１０１例中、１例がReg IVタンパク質による検出で陽性と判断された（１％）。この結果をまとめると、Reg IVタンパク質を胃癌検出マーカーとして用いた場合の感度（＝胃癌患者の症例数に対する陽性と判断された症例数の割合）は３７％であり、特異性（＝〔１−陽性判断された健常者の割合〕×１００）は９９％であった。したがって、Reg IVタンパク質は、高感度かつ高い特異性を持った胃癌検出用の血清腫瘍マーカーであることが確認された。さらに、Stage IおよびIIの患者に対しても高感度で検出することができるため、早期癌の検出に利用可能であるということも確認された。
【００８２】
各胃癌患者について、olfactomedin 4タンパク質の濃度と、Reg IVタンパク質の濃度との相関を調べた結果を図５に示す。図５の横軸にolfactomedin 4タンパク質の濃度を、縦軸にReg IVタンパク質の濃度をプロットした。図５によれば血清中のolfactomedin 4タンパク質の濃度が高い患者と、血清中のReg IVタンパク質の濃度が高い患者とは相関が低く、両者は一致しない傾向があるということがわかった（Ｐ＝０．３４３１、ｒ＝−０．１２４５）。そして、血清中のolfactomedin 4タンパク質濃度と、血清中のReg IVタンパク質濃度とを合わせて測定した場合、胃癌検出の感度は５３％まで上昇した。これは、従来公知の血清腫瘍マーカーであるCEAとCA19-9とを合わせて測定した場合の感度である、１５％を大きく上回るものであった。よって、血清中のolfactomedin 4タンパク質の濃度とReg IVタンパク質の濃度を合わせて測定することは、胃癌を検出する場合において極めて有効であるといえる。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明は上述のとおり、胃癌をはじめとする消化器癌の選択的な検出において有効である。本発明のマーカーは、消化器癌診断薬、消化器癌診断キット、消化器癌研究用試薬等として利用可能である。したがって、本発明は医薬、臨床検査薬、医療機器、研究用試薬などの産業において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】olfactomedin 4遺伝子についてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った結果を示す図である。
【図２】Reg IV遺伝子についてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った結果を示す図である。
【図３】胃癌患者の血清中および健常者の血清中におけるolfactomedin 4タンパク質の濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した結果を示す図である。
【図４】胃癌患者の血清中および健常者の血清中におけるReg IVタンパク質の濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した結果を示す図である。
【図５】各胃癌患者について、olfactomedin 4タンパク質の濃度と、Reg IVタンパク質の濃度との相関を調べた結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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