(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
その微生物のすべてのピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子（ｐｆｌ）を含み、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子（ｌｄｈＡ）、ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子（ｐｔａ）及び酢酸キナーゼ遺伝子（ａｃｋＡ）が欠失しており、嫌気条件でコハク酸以外の有機酸はほとんど生成せず、コハク酸のみを高濃度で生成する特性を有するマンヘミア（Mannheimia）属、アクチノバチルス（Actinobacillus）属及びアネロビオスピリルム（Anaerobiospirillum）属からなる群より選択される変異微生物。
【請求項２】
前記微生物は、副産物として他の有機酸は生成せず、コハク酸のみを生成する同型発酵菌株であることを特徴とする請求項１に記載の変異微生物。
【請求項３】
他の有機酸のそれぞれの生成量が、コハク酸の１重量％以下であることを特徴とする請求項１又は２に記載の変異微生物。
【請求項４】
他の有機酸は、乳酸、酢酸、ギ酸及びピルビン酸からなる群より選択される一種以上であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異微生物。
【請求項５】
その微生物のすべてのピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子（ｐｆｌ）を含み、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子（ｌｄｈＡ）、ホスホトランスアセチラーゼをコードする遺伝子（ｐｔａ）及び酢酸キナーゼをコードする遺伝子（ａｃｋＡ）が欠失しており、嫌気条件でコハク酸以外の有機酸はほとんど生成せず、コハク酸のみを高濃度で生成する特性を有する変異微生物Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）。
【請求項６】
以下のステップを含む請求項１〜５のいずれか一項に記載の変異微生物の製造方法：
（ａ）コハク酸の生成能を有するマンヘミア（Mannheimia）属、アクチノバチルス（Actinobacillus）属及びアネロビオスピリルム（Anaerobiospirillum）属からなる群より選択される微生物のゲノムから相同組換え方法を用いて乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子（ｌｄｈＡ）を欠失させ、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子（ｌｄｈＡ）が欠失した変異微生物を取得するステップ、及び
（ｂ）前記乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子（ｌｄｈＡ）が欠失した変異微生物のゲノムから相同組換え方法を用いてホスホトランスアセチラーゼをコードする遺伝子（ｐｔａ）及び酢酸キナーゼをコードする遺伝子（ａｃｋＡ）を欠失させ、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子（ｌｄｈＡ）、ホスホトランスアセチラーゼをコードする遺伝子（ｐｔａ）及び酢酸キナーゼをコードする遺伝子（ａｃｋＡ）が欠失した変異微生物を取得するステップ。
【請求項７】
前記（ａ）ステップの相同組換えは、破壊されたｌｄｈＡを含む遺伝子交換ベクターを使用して行われることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記（ｂ）ステップの相同組換えは、破壊されたｐｔａ−ａｃｋＡを含む遺伝子交換ベクターを使用して行われることを特徴とする請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記破壊されたｌｄｈＡを含む遺伝子交換ベクターは、ｐＭＬＫＯ−ｓａｃＢであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記破壊されたｐｔａ−ａｃｋＡを含む遺伝子交換ベクターは、ｐＭＰＫＯ−ｓａｃＢであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異微生物を嫌気条件で培養するステップ、及び前記培養液からコハク酸を回収するステップを含むコハク酸の製造方法。
【請求項１２】
前記培養は、ブドウ糖またはグリセロールを炭素原として使用することを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
副産物としての他の有機酸のそれぞれの生成量は、コハク酸の１重量％以下であることを特徴とする請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
変異微生物Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）を嫌気条件で培養するステップ、及び前記培養液からコハク酸を回収するステップを含むコハク酸の製造方法。
【請求項１５】
前記培養は、ブドウ糖またはグリセロールを炭素原として使用することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
副産物としての他の有機酸のそれぞれの生成量は、コハク酸の１重量％以下であることを特徴とする請求項１４又は１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はマンヘミア（Mannheimia）属、アクチノバチルス（Actinobacillus）属及びアネロビオスピリルム（Anaerobiospirillum）属からなる群より選択される純粋コハク酸生成新規変異微生物及び前記変異微生物を用いた純粋なコハク酸の製造方法に関し、より詳しくは、コハク酸を生成する微生物でピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子（以下、「ｐｆｌ」という）は欠失されず、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子（以下、「ｌｄｈＡ」という）、ホスホトランスアセチラーゼをコードする遺伝子（以下、「ｐｔａ」という）及び酢酸キナーゼをコードする遺伝子（以下、「ａｃｋＡ」という）が欠失しており、嫌気条件でコハク酸以外の有機酸はほとんど生成せず、コハク酸のみを高濃度で生成する特性を有するマンヘミア（Mannheimia）属、アクチノバチルス（Actinobacillus）属及びアネロビオスピリルム（Anaerobiospirillum）属からなる群より選択される変異微生物株及び前記変異微生物を用いたコハク酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コハク酸（ＨＯＯＣＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ）は４個の炭素からなるジカルボン酸で、医薬用、食品用、化粧品及び他の産業で使用される化学製品の前具体として広く使用される産業的、経済的な利用価値が高い有機酸である（Zeikus et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 51:545, 1999; Song et al., Enzyme Microbial Technol., 39:352, 2006）。特に最近急激な原油価格の上昇と伴に生分解性高分子の主な原料物質として、のコハク酸の使用可能性が証明され、急激な需要増大が予想されている（Willke et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 66:131, 2004）。
【０００３】
コハク酸は化学合成と醗酵により生産できるが、現在まで産業的に使用される大部分のコハク酸はＢＡＳＦ，ＤｕＰｏｎｔ，ＢＰケミカルなど巨大な化学会社と中国及び日本の化学会社によって原油から由来したｎ−ブタンとアセチレンを原料物質に使用して化学合成法によって生産されており、医薬品などの特殊な用途に使用される少量のコハク酸だけが古典的な微生物醗酵法により生産されている。このようなコハク酸の化学合成法は製造過程から多量の有害廃棄物、廃溶液及び廃ガス（一酸化炭素含み）を排出するという問題点を有しており、特に、資源枯渇の可能性の高い化石原料を其礎物質として使用しており、従って、これの代わりに使用できるコハク酸の生産方法の開発が緊急課題である。
【０００４】
このようなコハク酸の化学合成工程による問題点を解決するため、微生物醗酵を通じて再生可能な原料からコハク酸を生産する研究が多くの研究者らによって集中的に行われていた。醗酵によって、コハク酸の生産に使用される微生物は非常に多様だが、大きく組換え大腸菌、ルーメンバクテリア（ruminal bacteria: Actinobacillus, Bacteroides, Mannheimia, Succinimonas, Succinivibrio等）、及びアネロビオスピリウム（Anaerobiospirillum）に分けることができる（Song et al., Enzyme Microbial Technol., 39:352, 2006）。
【０００５】
組換え大腸菌を利用したコハク酸生産に関する研究を調べてみると、先ずアメリカのシカゴ大学の研究チームが大腸菌の乳酸及びギ酸の生産に関与する遺伝子ら（ｌｄｈ及びｐｆｌ）を除去すると同時にブドウ糖伝達システム遺伝子（ｐｔｓＧ）を操作した変異菌株であるＡＦＰ１１１（ＡＴＣＣ２０２０２１）を製作してコハク酸の生産増加を試みした（米国特許５，７７０，４３５号明細書）。
【０００６】
本発明者らはコハク酸生産に関与するリンゴ酸酵素遺伝子（ｓｆｃＡ）をｌｄｈ遺伝子及びｐｆｌ遺伝子が除去された組換え大腸菌であるＮＺＮ１１１菌株に増幅させ、ＮＺＮ１１１菌株の醗酵過程から蓄積されるピルビン酸を抑制することによってコハク酸の生産を増大したことがあり（Hong et al., Biotechnol. Bioeng., 74:89, 2001）、アメリカのジョージア大学の研究チームはＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｅｔｌｉ菌株のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｃ）を前記ＡＦＰ１１１菌株に発現させることによりＡＦＰ１１１／ｐＴｒｃ９９Ａ−ｐｙｃ菌株を製作し、これをコハク酸生産に利用した（Vemuri et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 28:325, 2001）。最近、好気条件でコハク酸生産を誘導するために、アメリカのライス大学研究チームが解糖過程、ＴＣＡ経路及びグリオキシレート経路に関与する遺伝子を操作した組換え大腸菌株を製作して発表した（Lin et al., Metabol. Eng., 7:116, 2005; Lin et al., Biotechnol. Bioeng., 90:775, 2005）。
【０００７】
コハク酸の生産においてはルーメンバクテリアの一種であるＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、及びＭａｎｎｈｅｉｍｉａ菌株、並びに他のコハク酸産生菌であるＡｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍが最も優れていることが知られており、これら菌株に対する研究が多く行われてきた。アメリカのＭＢＩ（Ｍｉｃｈｇａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）研究チームはＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ１３０Ｚ菌株（ＡＴＣＣ５５６８１）を発見し、コハク酸生産方法を開発し（米国特許５，５０４，００４号明細書）、そして古典的化学突然変異方法を用いてＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓの多様な変異菌株を開発して、これをコハク酸生産及び精製工程の開発に利用した（米国特許５，５２１，０７５号明細書；米国特許５，１６８，０５５号明細書；米国特許５，１４３，８３４号明細書）。
【０００８】
しかし、現在まで開発された微生物の醗酵を通じたコハク酸生産方法は生産性が２ｇ／L／ｈ以下で非常に低く、特に、醗酵時にコハク酸と伴に副産物として各種有機酸とエタノールを同時に生産することにより、莫大な分離及び精製費用が要求されている。たとえ前記結果が一部組換え菌株において、副産物である乳酸、ギ酸、酢酸及びエタノールの生成をある程度減少させる効果を見せたとしても、これを完全に除去することはできなかった。また一部の組換え変異菌株では菌株の生長速度が非常に低下して、全体的なコハク酸の生産性増加が、できない場合もあった。したがって、高いコハク酸生産性を持ちながら、同時に副産物の生産も遮断できる、新しいコハク酸生産菌株システムの開発が要求されている（Hong et al., Biotechnol. Lett., 22:871, 2000）。
【０００９】
このような要求に応える新しいコハク酸生産菌株を開発するためには優秀なコハク酸生産能力を有する菌株の同定及び菌株の遺伝情報の確保、菌株の代謝特性の把握及び遺伝子組み換え菌株製作に必要な遺伝子操作技術の確保が先行されるべきである。現在まで優秀なコハク酸生産能力を表すバクテリアにおいて、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＭＢＥＬ５５Ｅ菌株（ＫＣＴＣ０７６９ＢＰ）だけが遺伝情報が確保されているが、ＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓとＡｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍなどのバクテリアは完全な遺伝情報が確保できない実情である。Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓとＡ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓのホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ｐｃｋＡ）遺伝子を大腸菌に増幅させることによるコハク酸生産の試みが報告されているが（Kim et al., Appl. Environ. Microbiol., 70:1238, 2004; Laivenieks et al., Appl. Environ. Microbiol., 63:2273, 1997）、ゲノム配列を基にした遺伝子組み換えコハク酸生産菌株の開発は、試みられていない。
【００１０】
本発明者らは韓牛からコハク酸を高効率に生産するＭ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＭＢＥＬ５５Ｅ（ＫＣＴＣ ０７６９ＢＰ）菌株を同定して、前記菌株のゲノム配列及び代謝特性を把握して発表した（Hong et al., Nature Biotechnol., 22:1275, 2004）。また、本発明者らはルーメンバクテリアの一種であるＭ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＭＢＥＬ５５Ｅ（ＫＣＴＣ０７６９ＢＰ）から乳酸とギ酸の生成を抑制するため乳酸脱水素酵素遺伝子（ｌｄｈＡ）とピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子（ｐｆｌ）を欠失した変異菌株であるＭ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓＬＰＫ（ＫＣＴＣ １０５５８ＢＰ）を製作し、酢酸の生成を阻害するため、前記変異菌株Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＬＰＫからホスホトランスアセチラーゼ遺伝子（ｐｔａ）と酢酸キナーゼ遺伝子（ａｃｋＡ）を欠失させた変異菌株であるＭ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＬＰＫ７（ＫＣＴＣ １０６２６ＢＰ）を製作して、これらを嫌気条件で培養してコハク酸を製造した（ＷＯ０５／０５２１３５Ａ１；Lee et al., Appl. Environ. Microbiol.72:1939, 2006）。しかし、前記菌株の場合、副産物であるギ酸と酢酸の生成をある程度抑制することができたが、醗酵時副産物として多量のピルビン酸の蓄積をもたらし、なによりも野生菌株と比較して菌株の生長速度が顕著に低くなって全体的に非常に優れたコハク酸生産性の向上を得ることができなかった。
【００１１】
一方、最近ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子（ｐｆｌ）がピルビン酸からアセチル補助酵素Ａ（ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）への変換過程に関与することにより細胞生長とピルビン酸の再分配に大きい影響を及ぼすことが発表された（Wolfe, Microbial. Mol. Biol. Rev., 69:12, 2005）。
【００１２】
そこで、本発明者らは、微生物の生長速度の低下を最小化して、且つピルビン酸を含む多様な副産物らの生成を完全に遮断して高収率で純粋なコハク酸が製造できる変異微生物及び醗酵方法を開発するため、鋭意努力した結果、ルーメンバクテリアの一種であるＭ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＭＢＥＬ５５Ｅ（ＫＣＴＣ０７６９ＢＰ）からピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子（ｐｆｌ）は欠失せず、乳酸脱水素酵素を遺伝子（ｌｄｈＡ）、ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子（ｐｔａ）及び酢酸キナーゼ遺伝子（ａｃｋＡ）を欠失させた変異菌株Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）を製作した後、前記菌株を嫌気条件でブドウ糖またはグリセロールを炭素原として使用して醗酵させた結果、高収率と高生産性で純粋なコハク酸が製造できることを確認して、本発明を完成することに至った。
【発明の詳細な説明】
【００１３】
《技術的課題》
従って、本発明の目的は、生長速度及びコハク酸の生産性が優れて、嫌気条件で培養時、他の有機酸は生成せず、コハク酸のみを高濃度で生産する変異微生物を提供することにある。
【００１４】
本発明の他の目的は、前記変異微生物を嫌気条件下でブドウ糖またはグリセロールを炭素原として使用して他の有機酸は生成せず、純粋なコハク酸を製造する方法を提供することにある。
【技術的解決方法】
【００１５】
前記目的を達成するために、本発明は、ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子（ｐｆｌ）を含み、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子（ｌｄｈＡ）、ホスホトランスアセチラーゼをコードする遺伝子（ｐｔａ）及び酢酸キナーゼをコードする遺伝子（ａｃｋＡ）が欠失しており、嫌気条件でコハク酸以外の有機酸はほとんど生成せず、コハク酸のみを高濃度で生成する特性を有するマンヘミア（Mannheimia）属、アクチノバチルス（Actinobacillus）属及びアネロビオスピリルム（Anaerobiospirillum）属からなる群より選択される変異微生物を提供する。
【００１６】
また、本発明は、ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子（ｐｆｌ）を含み、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子（ｌｄｈＡ）、ホスホトランスアセチラーゼをコードする遺伝子（ｐｔａ）及び酢酸キナーゼをコードする遺伝子（ａｃｋＡ）が欠失しており、嫌気条件でコハク酸以外の有機酸はほとんど生成せず、コハク酸のみを高濃度で生成する特性を有する変異微生物Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）を提供する。
【００１７】
また、本発明は、（ａ）コハク酸の生成能を有するマンヘミア（Mannheimia）属、アクチノバチルス（Actinobacillus）属及びアネロビオスピリルム（Anaerobiospirillum）属からなる群より選択される微生物のゲノムから相同組換え方法を用いて乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子（ｌｄｈＡ）を欠失させ、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子（ｌｄｈＡ）が欠失した変異微生物を取得するステップ、及び（ｂ）前記乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子（ｌｄｈＡ）が欠失した変異微生物のゲノムから相同組換え方法を用いてホスホトランスアセチラーゼをコードする遺伝子（ｐｔａ）及び酢酸キナーゼをコードする遺伝子（ａｃｋＡ）を欠失させ、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子（ｌｄｈＡ）、ホスホトランスアセチラーゼをコードする遺伝子（ｐｔａ）及び酢酸キナーゼ遺伝子（ａｃｋＡ）が欠失したルーメンバクテリア変異菌株を収得するステップを含む変異微生物の製造方法を提供する。
【００１８】
また、本発明は、前記変異微生物を嫌気条件で培養するステップ、及び前記培養液からコハク酸を回収するステップを含むコハク酸の製造方法を提供する。
【００１９】
本発明の他の特徴及び実施態様は、下記の詳細な説明及び特許請求の範囲からなお一層明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明による変異微生物からコハク酸が合成される経路を示す図である。
【図２】相同組換えによるｌｄｈＡ欠失用置換ベクター（ｐＭＬＫＯ−ｓａｃＢ）の作製過程を示す図である。
【図３】相同組換え方法でＭａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＭＢＥＬ５５ＥからｌｄｈＡを欠失させた変異菌株（Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓＬＫ）を作製する過程を示す図である。
【図４】相同組換えによるｐｔａ及びａｃｋＡの欠失用ベクター（ｐＰＴＡ−ｓａｃＢ）の作製過程を示す図である。
【図５】Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＬＫからｐｔａ−ａｃｋＡを欠失させた変異菌株（Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ）を作製する過程を示す図である。
【図６】Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫからｐｔａ−ａｃｋＡの欠失を確認した電気泳動写真である［レーン１〜６：ＰＡＵ１プライマー及びＳＰ１プライマーを用いたＰＣＲ断片（１．１ｋｂ）；レーンＡ〜Ｆ：ＳＰ２プライマー及びＰＡＤ２プライマーを用いたＰＣＲ断片（１．５ｋｂ）］。
【図７】ＣＯ２で飽和された嫌気条件でＭａｎｎｈｅｉｍｉａｓｐ．ＰＡＬＫの培養特性を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は一つの観点において、コハク酸を生成する微生物において、ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子（ｐｆｌ）を含み、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子（ｌｄｈＡ）、ホスホトランスアセチラーゼをコードする遺伝子（ｐｔａ）及び酢酸キナーゼをコードする遺伝子（以下、ａｃｋＡ）が欠失しており、嫌気条件でコハク酸以外の有機酸はほとんど生成せず、コハク酸のみを高濃度で生成する特性を有するマンヘミア（Mannheimia）属、アクチノバチルス（Actinobacillus）属及びアネロビオスピリルム（Anaerobiospirillum）属からなる群より選択される変異微生物に関する。
【００２２】
本発明において、コハク酸生成微生物はエタノール、又は他の有機酸に比べ、コハク酸を過量に生産する微生物で、醗酵によるコハク酸合成に産業的に使用できる微生物を意味する。
【００２３】
代表的コハク酸生成微生物としてはルーメンバクテリア、及び他の種のコハク酸産生菌、例えばＡｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍをあげることができ、ルーメンバクテリアの一種であるＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ及びＭ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓと、Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓと、及び現在まで知られているコハク酸を生産する多様なバクテリアの部分的な遺伝情報（１６ｓｒＲＮＡ）、酵素分析及び醗酵結果を見ると、コハク酸産生微生物のコハク酸生産のための炭素原の主な生合成経路がルーメンバクテリアの一種であるマンヘミア属のコハク酸生産の生合成経路と殆ど同一であることが分かる（表１；Van der Werf et al., Arch Microbiol., 167:332, 1997; Laivenieks et al., Appl. Environ. Microbiol., 63:2273, 1997; Samuelov et al., App. Environ. Microbiol., 65:2260, 1999; Kim et al., Appl. Environ. Microbiol., 70: 1238, 2004）。特に、コハク酸生成に関する全てのルーメンバクテリア及びＡ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓはコハク酸生成の時、二酸化炭素固定化酵素を利用してＣ３化合物であるホスホエノ−ルピルビン酸とピルビン酸をＣ４化合物であるオキサロ酢酸とリンゴ酸に転換した後、最終的にコハク酸を生産する。また、ルーメンバクテリアと及びＡ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓが嫌気条件下で醗酵副産物として酢酸、ギ酸及び乳酸を生成する。従って、マンヘミア属を含む全てのルーメンバクテリア及びＡ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓが同一なコハク酸生合成経路を持つといえる。
【００２４】
【表１】
0005421103.tif 000002
【００２５】
本発明ではコハク酸生産微生物のゲノムを変形させ、菌株の成長速度が高く、且つ他の有機酸を生成せずに、高濃度でコハク酸を生成するコハク酸生成変異微生物を製作した。即ち、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＭＢＥＬ５５Ｅ（ＫＣＴＣ ０７６９ＢＰ）のゲノムＤＮＡから乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子（ｌｄｈＡ）、ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子（ｐｔａ）及び酢酸キナーゼ遺伝子（ａｃｋＡ）を欠失させ，菌株の生長速度が高く、他の有機酸を生成せずに高濃度でコハク酸を生成する変異菌株であるＭａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）を製作した。
【００２６】
本発明には前記各遺伝子の欠失は相同組換えを利用して遺伝子を置換して不活性化させる方法を使用したが、該当遺伝子によってコードされる酵素が生成されないように該当遺伝子を修飾または削除することができる遺伝子操作方法であれば、制限なく使用できる。
【００２７】
本発明において、前記コハク酸産生微生物は、アネロビオスピリルム（Anaerobiospirillum）属の菌、又はマンヘミア（Mannheimia）属、及びアクチノバチルス（Actinobacillus）属からなる群より選択されるルーメンバクテリアであることを特徴とすることができる。
【００２８】
本発明において、前記変異微生物は副産物として他の有機酸は生成せず、コハク酸のみを生成する同型発酵菌株であることを特徴とすることができ、前記他の有機酸のそれぞれの生成量がコハク酸の１重量％以下であることを特徴とすることができ、前記他の有機酸は乳酸、酢酸、ギ酸及びピルビン酸からなる群より選択される一種以上であることを特徴とすることができる。
【００２９】
本発明は他の観点において、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓでピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子（ｐｆｌ）を含み、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子（ｌｄｈＡ）、ホスホトランスアセチラーゼをコードする遺伝子（ｐｔａ）及び酢酸キナーゼをコードする遺伝子（ａｃｋＡ）が欠失しており、嫌気条件でコハク酸以外の有機酸はほとんど生成せず、コハク酸のみを高濃度で生成する特性を有するルーメンバクテリアＭａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）に関する。
【００３０】
本発明において、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）のコハク酸生成能と成長速度を既存の変異菌株と比較するため使用した変異菌株であるＭ． ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＬＰＫ７（ＫＣＴＣ１０６２６ＢＰ）はマンヘミア属菌株のゲノムから乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子（ｌｄｈＡ）、ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子（ｐｆｌ）、ホスホトランスアセチラーゼをコードする遺伝子（ｐｔａ）及び酢酸キナーゼをコードする遺伝子（ａｃｋＡ）が欠失されているした変異微生物で、本発明による変異微生物であるＭ． ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）からピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子（ｐｆｌ）が更に欠失した変異菌株である（WO2005/052135; Lee et al., Appl. Environ. Microbiol. 72:1939, 2006）。
【００３１】
本発明によるコハク酸生成変異微生物Ｍ． ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ１０９７３ＢＰ）はコハク酸の生成に用いられる野生形のＭａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＭＢＥＬ５５Ｅ（ＫＣＴＣ０７６９ＢＰ）及び既に確立された変異微生物であるＭ． ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＬＰＫ７（ＫＣＴＣ１０６２６ＢＰ）と比較してコハク酸生産能が優れており、乳酸、ピルビン酸、酢酸、ギ酸などの副産物を殆ど生産しないから、コハク酸生産菌株として優れた特徴をもち、既に確立された変異微生物であるＭ． ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＬＰＫ７（ＫＣＴＣ１０６２６ＢＰ）と比較して、高い菌株成長速度とコハク酸生産性及びピルビン酸の蓄積を抑えて純粋なコハク酸のみを生産して、高い収率でコハク酸が生産できる。
【００３２】
本発明はまた他の観点において、（ａ）コハク酸の生成能を有するマンヘミア（Mannheimia）属、アクチノバチルス（Actinobacillus）属及びアネロビオスピリルム（Anaerobiospirillum）属からなる群より選択される微生物のゲノムから相同組換え方法を用いて乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子（ｌｄｈＡ）を欠失させ、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子（ｌｄｈＡ）が欠失した変異微生物を取得するステップ、及び（ｂ）前記乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子（ｌｄｈＡ）が欠失したルーメンバクテリア変異菌株のゲノムから相同組換え方法を用いてホスホトランスアセチラーゼをコードする遺伝子（ｐｔａ）及び酢酸キナーゼをコードする遺伝子（ａｃｋＡ）を欠失させ、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子（ｌｄｈＡ）、ホスホトランスアセチラーゼをコードする遺伝子（ｐｔａ）及び酢酸キナーゼをコードする遺伝子（ａｃｋＡ）が欠失した変異微生物を取得するステップを含む変異微生物の製造方法に関する。
【００３３】
本発明において、前記（ａ）ステップの相同組換えは、欠失されたｌｄｈＡを含む遺伝子交換ベクターを使用して行われることを特徴とすることができるし、前記（ｂ）ステップの相同組換えは、欠失されたｐｔａ−ａｃｋＡを含む遺伝子交換ベクターを使用して行われることを特徴とすることができる。
【００３４】
本発明において、欠失されたｌｄｈＡを含む遺伝子交換ベクターはｐＭＬＫＯ−ｓａｃＢであることを特徴とすることができ、欠失されたｐｔａ−ａｃｋＡを含む遺伝子交換ベクターはｐＭＰＫＯ−ｓａｃＢであることを特徴とすることができる。
【００３５】
また、本発明は前記変異微生物を嫌気条件で培養するステップ、及び前記培養液からコハク酸を回収するステップを含むコハク酸の製造方法を提供する。
【００３６】
本発明において、前記培養はブドウ糖またはグリセロールを炭素原として使用することを特徴とすることができ、副産物としての他の有機酸のそれぞれの生成量はコハク酸の１重量％以下であることを特徴とすることができる。
【００３７】
本発明はまた他の観点において、前記変異微生物を嫌気条件で培養するステップ、及び前記培養液からコハク酸を回収するステップを含むコハク酸の製造方法に関する。
【００３８】
本発明によるコハク酸生成変異微生物の培養及びコハク酸の収得過程は従来醗酵工程で通常的に知られている培養方法及びコハク酸分離精製方法を用いて行われる。
【００３９】
本発明において、前記培養はブドウ糖またはグリセロールを炭素原として使用することを特徴とすることができるし、副産物としての他の有機酸のそれぞれの生成量はコハク酸の１重量％以下であることを特徴とすることができる。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。但し、これらの実施例は単に本発明を一層詳しく説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではないということは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかである。
【００４１】
特に、下記実施例では、本発明による遺伝子を除去するために宿主細胞としてコハク酸生成微生物であるマンヘミア属微生物だけを例示したが、他の種類のコハク酸生成微生物を使用しても純粋コハク酸生成変異微生物が収得できることは、当業界における通常の知識を持つ者にとっては明らかであろう。
【００４２】
《実施例１：ｌｄｈＡ欠失ベクター（ｐＭＬＫＯ−ｓａｃＢ）の作製》
コハク酸生成微生物のゲノムからｌｄｈＡを相同組換え方法で除去するために、遺伝子交換ベクターを次のように作製した。まず、Ｍ． ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＭＢＥＬ５５Ｅ（ＫＣＴＣ ０７６９ＢＰ）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記配列番号１及び２のプライマーを用いてＰＣＲを行った後、得られたｌｄｈＡ相同部位１（Ｌ１）を含むＰＣＲ断片をＳａｃＩ及びＰｓｔＩで切断し、これをｐＵＣ１８（New England Biolabs, Inc.,USA）に導入してｐＵＣ１８−Ｌ１を作製した。
配列番号１：５’−ＣＡＧＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＣＣＧＴＡＡＣＧＣＡＴＣＣＧＣＣＧ
配列番号２：５’−ＣＴＴＴＡＴＣＧＡＡＴＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＴＴＴＣＣＡＡＡＡ
【００４３】
その後、Ｍ． ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＭＢＥＬ５５Ｅ（ＫＣＴＣ ０７６９ＢＰ）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記配列番号３及び４のプライマーを用いてＰＣＲを行った後、得られたｌｄｈＡ相同部位２（Ｌ２）を含むＰＣＲ断片をＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、これを前記ｐＵＣ１８−Ｌ１に導入してｐＵＣ１８−Ｌ１−Ｌ２を作製した。
配列番号３：５’−ＧＴＡＣＴＧＴＡＡＡＣＴＧＣＡＧＣＴＴＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣ
配列番号４：５’−ＧＣＣＧＡＡＡＧＴＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＡＧＴＧ
【００４４】
前記ｐＵＣ１８−Ｌ１−Ｌ２に選択マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子（ＫｍＲ）を挿入するため、ｐＵＣ４Ｋ(Pharmacia，Freiburg，Germany)をＰｓｔＩで切断して、得られたカナマイシン耐性遺伝子を、ＰｓｔＩで切断したｐＵＣ１８−Ｌ１−Ｌ２と融合させてｐＵＣ１８−Ｌ１−ＫｍＲ−Ｌ２を作製した。ＳａｃＩで切断したｐＵＣ１８−Ｌ１−ＫｍＲ−Ｌ２に下記配列番号５のリンカーを挿入して、新たなＸｂａＩ切断部位を作製した。
配列番号５：５’−ＴＣＴＡＧＡＡＧＣＴ
【００４５】
前記ＸｂａＩ切断部位が挿入されたｐＵＣ１８−Ｌ１−ＫｍＲ−Ｌ２ベクターにｓａｃＢ遺伝子を挿入するため、ｐＫｍｏｂｓａｃＢ(Schafer et al.，Gene，145:69，1994)を鋳型とし、下記配列番号６及び７のプライマーを用いてＰＣＲを行った後、得られたｓａｃＢ遺伝子を含むＰＣＲ断片をＸｂａＩで切断し、これを前記ＸｂａＩ制限酵素サイトが挿入されたｐＵＣ１８−Ｌ１−ＫｍＲ−Ｌ２ベクターの新たなＸｂａＩ制限酵素サイトに挿入してｌｄｈＡ遺伝子交換ベクターｐＭＬＫＯ−ｓａｃＢを作製した（図２）。
配列番号６：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＴＣＴＡＴＣＧＣＣＴＴＣＴＴＧＡＣＧ
配列番号７：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＧＣＴＡＣＡＡＡＡＴＣＡＣＧＧＧＣＧＴＣ
【００４６】
《実施例２：Ｍ． ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＬＫ菌株の作製》
実施例１から製作されたｌｄｈＡ遺伝子除去用交換ベクターｐＭＬＫＯ−ｓａｃＢを利用してＭａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＭＢＥＬ５５Ｅ（ＫＣＴＣ ０７６９ＢＰ）のゲノムからｌｄｈＡを欠失させて変異菌株を作製した（図３）。
【００４７】
即ち、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＭＢＥＬ５５Ｅ（ＫＣＴＣ ０７６９ＢＰ）を１０ｇ／Ｌのグルコースを含有するＬＢ−グルコース培地に塗抹して、３７℃で３６時間培養した後、コロニーをＬＢ−グルコース液体培地１０ｍＬに接種して１２時間培養した。培養が終わった細菌培養液をＬＢ−グルコース液体培地１００ｍＬに１％接種して、２００ｒｐｍ、３７℃の振盪培養器で培養した。
【００４８】
約４〜５時間後に細菌培養液のＯＤ６００が約０．３〜０．４程度になり、前記細菌培養液を４℃、２０分間、４５００ｒｐｍの条件で遠心分離して細胞を得た後、４℃、１０％のグリセロール溶液２００ｍＬで細胞を再懸濁した。懸濁された細胞溶液を４℃、５５００ｒｐｍで２０分間、再び遠心分離して細胞を得た。再懸濁時、使用されるグリセロール溶液を半分に減らして前記過程を２回繰り返した後、細胞とグリセロールとの体積比が１：１になるように再懸濁して細胞濃縮液を得た。
【００４９】
このようにして得られた細胞濃縮液と、実施例１で作製された遺伝子交換ベクターｐＭＬＫＯ−ｓａｃＢを混合した後、１．８ｋＶ、２５μＦ，２００ｏｈｍｓの条件でエレクトロポレーション方法でｐＭＬＫＯ−ｓａｃＢをＭａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＭＢＥＬ５５Ｅ（ＫＣＴＣ ０７６９ＢＰ）に導入した。ｐＭＬＫＯ−ｓａｃＢが導入された細菌にＬＢ−グルコース液体培地１ｍＬを加えて、２００ｒｐｍ、３７℃の振盪培養器で１時間前培養した後、培養液を抗生剤カナマイシン（最終濃度２５μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ−グルコース固体培地に塗抹して、３７℃で４８時間以上培養した。二重交差(double crossover)が起こされたコロニーのみを選び出すために、形成されたコロニーをカナマイシン（２５μｇ／ｍＬ）と１００ｇ／Ｌのスクロースを含有したＬＢ−スクロース培地にストリークした後、２４時間培養した後、形成されたコロニーを同じ固体培地に再びストリークした。
【００５０】
前記培地で形成されたコロニー（変異株）を、抗生剤が含まれたＬＢ−グルコース液体培地で培養し、ロッシェルなどの方法(Rochelle et al.，FEMS Microbiol．Lett.，100:59，1992)を応用して、培養菌株のゲノムＤＮＡを分離した。前記分離された変異株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った後、得られたＰＣＲ産物を電気泳動することによってゲノムＤＮＡのｌｄｈＡ遺伝子の欠失の可否を確認した。
【００５１】
ｌｄｈＡの欠失の可否は下記のように、ＰＣＲを２回行っテ確認した。まず、前記変異株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記配列番号８及び９のプライマーを用いてＰＣＲを行った。
配列番号８：５’−ＧＡＣＧＴＴＴＣＣＣＧＴＴＧＡＡＴＡＴＧＧＣ（ＫＭ１）
配列番号９：５’−ＣＡＴＴＧＡＧＧＣＧＴＡＴＴＡＴＣＡＧＧＡＡＡＣ（ＬＵ１）
【００５２】
次いで、前記変異株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記配列番号１０及び１１のプライマーを用いてＰＣＲを行った。
配列番号１０：５’−ＧＣＡＧＴＴＴＣＡＴＴＴＧＡＴＧＣＴＣＧＡＴＧ（ＫＭ２）
配列番号１１：５’−ＣＣＴＣＴＴＡＣＧＡＴＧＡＣＧＣＡＴＣＴＴＴＣＣ（ＬＤ２）
【００５３】
前記２回のＰＣＲ反応で得られたＰＣＲ断片を電気泳動して、ＰＣＲ断片のサイズを確認してｌｄｈＡの欠失の可否を確認した。ｌｄｈＡの欠失されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ断片は配列番号８（ＫＭ１）及び９（ＬＵ１）を用いたＰＣＲ産物が１．５ｋｂで得られ、同時に配列番号１０（ＫＭ２）及び１１（ＬＤ２）を用いたＰＣＲ産物が１．７ｋｂに得られることで確認できた。前記各プライマーの位置は図３に表した。
【００５４】
前記のような方法でＭ． ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＭＢＥＬ５５ＥのゲノムからｌｄｈＡを欠失させた変異菌株Ｍ． ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＬＫを製作した。
【００５５】
《実施例３：ｐｔａ及びａｃｋＡ欠失ベクター（ｐＰＴＡ−ｓａｃＢ）の作製》
Ｍ． ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＬＫ菌株のゲノムからｐｔａ及びａｃｋＡを相同組換え方法で欠失させるために、遺伝子交換ベクターを次のように作製した。ｓａｃＢ遺伝子を含有するｐＫｍｏｂｓａｃＢを鋳型とし、下記配列番号１２及び１３プライマーを用いてＰＣＲを行った後、得られたｓａｃＢ産物をＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩで切断し、これをｐＵＣ１９(Stratagene Cloning Systems．USA)に導入してｐＵＣ１９−ｓａｃＢを作製した。
配列番号１２：５’−ＡＧＣＧＧＡＴＣＣＣＣＴＴＣＴＡＴＣＧＣＣＴＴＣＴＴＧＡＣＧ
配列番号１３：５’−ＧＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＴＡＣＡＡＡＡＴＣＡＣＧＧＧＣＧＴＣ
【００５６】
一方、Ｍ． ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＬＫのゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記配列番号１４及び１５のプライマーを用いてＰＣＲを行った後、得られたｐｔａ−ａｃｋＡ相同部位１を含むＰＣＲ断片をＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで切断し、下記配列番号１６及び１７のプライマーを用いてＰＣＲを行って得られたｐｔａ−ａｃｋＡ相同部位２を含むＰＣＲ断片をＸｂａＩ及びＳａｃＩで切断した後、この断片らをｐＵＣ１９のＢａｍＨＩとＳａｃＩ部位に導入してｐＵＣ１９−ＰＴＡ１２を作製した。
配列番号１４：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＡＴＣＣＧＣＡＧＴＡＴＣＡＣＴＴＴＣＴＧＣＧＣ
配列番号１５：５’−ＴＣＣＧＣＡＧＴＣＧＧＡＴＣＣＧＧＧＴＴＡＡＣＣＧＣＡＣＡＧ
配列番号１６：５’−ＧＧＧＧＡＧＣＴＣＧＣＴＡＡＣＴＴＡＧＣＴＴＣＴＡＡＡＧＧＣＣＡＴＧＴＴＴＣＣ
配列番号１７：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＡＴＣＣＧＧＧＴＣＡＡＴＡＴＣＧＣＣＧＣＡＡＣ
【００５７】
前記ｐＵＣ１９−ＰＴＡ１２の選択マーカーとしてスペクチノマイシン耐性遺伝子を挿入するため、スペクチノマイシン耐性遺伝子（GenBankＸ０２５８８；ＳｐＲ）を含有するプラスミドｐＩＣ１５６(Steinmetz et al.，Gene，142:79，1994)を鋳型とし、下記配列番号１８及び１９のプライマーを用いてＰＣＲを行った後、得られたＳｐＲ遺伝子を含むＰＣＲ断片をＥｃｏＲＶで切断し、これを前記製作されたｐＵＣ１９−ＰＴＡ１２に導入してスペクチノマイシン耐性遺伝子を有するｐＵＣ１９−ＰＴＡ１Ｓ２を作製した。前記作製されたｐＵＣ１９−ＰＴＡ１Ｓ２をＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで切断した後、前、製作したｐＵＣ１９−ＳａｃＢに導入してｐｔａ及びａｃｋＡ遺伝子除去用交換ベクターｐＰＴＡ−ｓａｃＢベクターを作製した（図４）。
配列番号１８：５’−ＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＧＡＴＣＣＴＣ
配列番号１９：５’−ＣＣＣＧＧＧＣＣＧＡＣＡＧＧＣＴＴＴＧＡＡＧＣＡＴＧＣＡＡＡＴＧＴＣＡＣ
【００５８】
《実施例４：Ｍ． ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ菌株の作製》
実施例３で製作されたホスホトランスアセチラーゼ遺伝子（ｐｔａ）及び酢酸キナーゼ遺伝子（ａｃｋＡ）除去用交換ベクターｐＰＴＡ−ｓａｃＢを利用してＭ． ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＬＫのゲノムからｐｔａ及びａｃｋＡ遺伝子を欠失させて変異菌株を製作した（図４）。
【００５９】
即ち、実施例２で製作されたＭ． ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＬＫを、１０ｇ／Ｌのグルコースを含有したＬＢ−グルコース培地に塗抹して、３７℃で３６時間培養した後、コロニーをＬＢ−グルコース液体培地１０ｍＬに接種して１２時間培養した。充分に成長した培養液をＬＢ−グルコース液体培地１００ｍＬに１％接種して、３７℃の振盪培養器で培養した。
【００６０】
前記培養液から、実施例２と同じ方法で細胞濃縮液を得た後、これを、実施例３で作製された遺伝子交換ベクターｐＰＴＡ−ｓａｃＢと混合した後、２．５ｋＶ、５０μＦ，２００ｏｈｍｓの条件でエレクトロポレーションを行って、ｐＰＴＡ−ｓａｃＢをＭ． ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＬＫに導入させた。ｐＰＴＡ−ｓａｃＢが導入された細菌にＬＢ−グルコース液体培地８００ｍＬを加えて、３７℃の恒温槽で１時間３０分間、前培養した後、二重交差(double crossover)を誘導するため、培養液を、スペクチノマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍＬ）を含有したＴＳＢ−スクロース固体培地［１００ｇ／Ｌのスクロースを含有したＴｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）固体培地］に塗抹して、３７℃で４８時間以上培養した。コロニーが形成され、二重交差のみが起こったものを選び出すために、各コロニーを、スペクチノマイシン５０μｇ／ｍＬを含有したＴＳＢ−スクロース培地とアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含有したＴＳＢ培地にストリークした。３７℃で１２時間程度培養した後、スペクチノマイシン５０μｇ／ｍＬを含有したＴＳＢ培地では生長するが、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含有したＴＳＢ培地には生長しないコロニーを選別してスペクチノマイシン５０μｇ／ｍＬを含有したＴＳＢ−スクロース培地にストリークした。ここでに形成されたコロニーをスペクチノマイシンとアンピシリンが合有されている培地で再び選別して、望ましい結果を表したコロニーを最終選択した。前記選択された菌株のゲノムを分離して鋳型として使用し、ＰＣＲを通じてｐｔａ−ａｃｋＡの欠失の可否を確認した。
【００６１】
ｐｔａ−ａｃｋＡの欠失の可否は、下記のようにＰＣＲを２回行って確認した。まず、前記変異株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記配列番号２０及び２１のプライマーを用いてＰＣＲを行った。次に、前記変異株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記配列番号２２及び２３のプライマーを用いてＰＣＲを行った。
配列番号２０：５’−ＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣ（ＳＰ１）
配列番号２１：５’−ＧＣＴＧＣＣＡＡＡＣＡＡＣＣＧＡＡＡＡＴＡＣＣＧＣＡＡＴＡＡＡＣＧＧＣ（ＰＡＵ１）
配列番号２２：５’−ＧＣＡＴＧＴＡＡＣＴＴＴＡＣＴＧＧＡＴＡＴＡＧＣＴＡＧＡＡＡＡＧＧＣＡＴＣＧＧＧＧＡＧ（ＳＰ２）
配列番号２３：５’−ＧＣＡＡＣＧＣＧＡＧＧＧＴＣＡＡＴＡＣＣＧＡＡＧＧＡＴＴＴＣＧＣＣＧ（ＰＡＤ２）
【００６２】
前記２回のＰＣＲ反応で得られた産物をゲル電気泳動して、そのサイズによってｐｔａ−ａｃｋＡの欠失の可否を確認した（図６）。ｐｔａ−ａｃｋＡの欠失は配列番号２０及び２１のプライマー（ＳＰ１とＰＡＵ１）を使用したＰＣＲ産物が１．１ｋｂに得られ、同時に、配列番号２２及び２３のプライマー（ＳＰ２及びＰＡＤ２）を用いたＰＣＲの産物が１．５ｋｂに得られることを確認した。前記プライマーの位置は図５に示した。
【００６３】
前記方法で作製されたＭ． ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＬＫのゲノムからｐｔａ−ａｃｋＡが欠失された菌株、即ち、Ｍ． ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓからｌｄｈＡ、ｐｔａ及びａｃｋＡが欠失された変異菌株をＭ． ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫと命名して、２００６年７月２６日付に国際寄託機関であるＫＣＴＣ（韓国生命工学研究院内生物資源センター；韓国デジョンユスングヲウンドン５２）に寄託番号‘ＫＣＴＣ １０９７３ＢＰ’として寄託した。
【００６４】
《実施例５：Ｍ． ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ菌株を利用した純粋コハク酸の生産》
前記実施例４で作製されたＭ． ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ １０９７３ＢＰ）菌株を５ｇ／Ｌのブドウ糖を含む１０ｍＬの合成培地で接種し、嫌気条件で３９℃で８時間前培養した後、これを再び５ｇ／Ｌのブドウ糖を含む２５０ｍＬの合成培地に移して３９℃で培養した。この場合、抗生剤として５０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンを添加した。醗酵は前記２５０ｍＬのＭ． ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ培養液を２．２５Ｌの合成培地（１ｇ／ＬのＮａＣｌ，２ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＨＰＯ４，０．０２ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ，０．２ｇ／ＬのＭｇＣｌ２６Ｈ２Ｏ，８．７０９ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４，０．５ｇ／Ｌのシステイン，０．５ｇ／Ｌのメチオニン，０．５ｇ／Ｌのアラニン，０．５ｇ／Ｌのアスパラギン，０．５ｇ／Ｌのアスパラギン酸，０．５ｇ／Ｌのプロリン，０．５ｇ／Ｌのセリン，０．００５ｇ／Ｌのニコチン酸，０．００５ｇ／ＬのＣａ−パントセネート（ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ），０．００５ｇ／ＬのピリドキシンＨＣｌ（ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ・ＨＣｌ），０．００５ｇ／Ｌのチアミン，０．００５ｇ／Ｌのアスコルビン酸及び０．００５ｇ／Ｌのビオチン）を合有する微生物反応器に接種して行って、醗酵条件は１８．２ｇ／Ｌ（１００ｍＭ）の初期ブドウ糖の濃度９．２ｇ／Ｌ（１００ｍＭ）の初期グリセロール濃度、温度３９℃で醗酵した。醗酵中ｐＨはアンモニア水を使用して６．５に調整し、抗生剤として使用したスペクチノマイシンは５０μｇ／ｍＬの濃度で添加した。高濃度のコハク酸生産のためにブドウ糖を完全に使い果たした場合、濃縮されたブドウ糖溶液を添加して培養液のブドウ糖の濃度が約１８．２ｇ／Ｌ（１００ｍＭ）に成るように調整した。
【００６５】
前記と同じ方法でＭ． ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＭＢＥＬ５５Ｅ（ＫＣＴＣ ０７６９ＢＰ）及びＭ． ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＬＰＫ７（ＫＣＴＣ １０６２６ＢＰ）を培養してコハク酸を醗酵させた。
培養液内の細胞濃度を分光光度計を用いて測定して、既に測定した分光光度計の吸光度と乾燥細胞重量の検量線を利用して細胞濃度を計算した。醗酵過程中の生物反応器から周期的にサンプルを採取して、採取された試料は１３、０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上層液の各種代謝産物及びコハク酸濃度、ブドウ糖とグリセロール濃度を液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）で分析した。
【００６６】
その結果、図７及び表２に表すように、本発明のＭ． ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＰＡＬＫ（ＫＣＴＣ １０９７３ＢＰ）はＭ． ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＭＢＥＬ５５Ｅ（ＫＣＴＣ ０７６９ＢＰ）及びＭ． ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＬＰＫ７（ＫＣＴＣ １０６２６Ｂ）と比較すると、より優れたコハク酸生産性を表すだけではなく、副産物としてほとんど有機酸及びエタノールが生成されないことがわかる。０．４５ｇ／Ｌの酢酸と０．２４ｇ／Ｌのピルビン酸が検出されたけれども、これは菌株の生長のため生成される最小量で生産されたコハク酸に比べ、１重量％以下の極微な量で無視することができるのは当業者に自明な事実である。
【００６７】
【表２】
0005421103.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００６８】
以上詳細に説明したように、本発明は生長速度が速く、且つ嫌気的条件で培養する場合、コハク酸を除き、他の有機酸を殆ど生成せずにコハク酸だけを高濃度で生産するコハク酸生成変異微生物及び前記変異微生物を利用したコハク酸の製造方法を提供する効果がある。本発明による変異微生物は既存のコハク酸生成微生物より菌株の生長速度及びコハク酸生産性が高く、他の有機酸を生成せずに高濃度でコハク酸を生成するから、コハク酸の産業的生産菌株として有用である。
【００６９】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施様態に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかであろう。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定まると言えるであろう。
【図１】
0005421103.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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