(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式の一般式Iの化合物の、疼痛の治療のための薬物の製造における使用。
【化１】
0005537033.tif 000004
(式中、R3はハロゲンであり、
R1、R2、R4及びR5の１又は２つは２乃至１３個の炭素原子を含むアルキルであり、他はHである)
【請求項２】
前記ハロゲンが塩素またはヨウ素である請求項１記載の使用。
【請求項３】
R1、R2、R4又はR5の２つが２乃至１３個の炭素原子を含むアルキル基である請求項１又は２のいずれかに記載の使用。
【請求項４】
前記２つのアルキル基がともにオルトまたはメタ位である請求項３記載の使用。
【請求項５】
前記化合物が、2,6-ジイソプロピル-4-クロロフェノール、2,6-ジイソプロピル-4-ヨードフェノール、2,6-ジイソプロピル-4-フルオロフェノール、2,6-ジイソプロピル-4-ブロモフェノール、3,5-ジイソプロピル-4-クロロフェノール、3,5-ジイソプロピル-4-ヨードフェノール、3,5-ジイソプロピル-4-フルオロフェノール及び3,5-ジイソプロピル-4-ブロモフェノールの一である請求項３記載の使用。
【請求項６】
前記化合物が、4-ブロモプロポフォール、4-クロロプロポフォール及び4-ヨードプロポフォールの一である請求項３記載の使用。
【請求項７】
前記１又は２つのアルキル基がイソプロピルである請求項１乃至６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
慢性疼痛の治療のための請求項１乃至７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
疼痛の治療を必要とする非ヒト被験者に治療上有効量の請求項１乃至８のいずれかに記載の化合物を投与することを含む、前記被験者において疼痛を治療または軽減する方法。
【請求項１０】
治療上有効量の請求項１乃至８のいずれかに記載の化合物を含む、被検者において疼痛を治療または軽減するための医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１乃至８のいずれかに記載の化合物を含む、疼痛を治療または軽減するための薬物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、フェノール誘導体の鎮痛薬としての使用に関する。
【０００２】
効果的で安全な疼痛（pain）コントロールは、最優先の臨床治療の必要性であると世界中で認められている。しかしながら、この分野の大部分の開発は、望ましくない副作用及び安全性の問題のない非常に有効な製品の供給に失敗してきた。アヘン剤は、たぶん依然として使用できる最も有効な治療であり、究極の目標は、アヘン剤の有効性を有するが鎮静、依存性、胃損傷及び一般的な忍容性の問題のない疼痛コントロール物質を供給することである。
フェノール誘導体は多くの神経調節効果を有することが主張されてきた。しかしながら、広範囲に及ぶ臨床治療の用途における唯一のフェノール誘導体は麻酔薬プロポフォール(2,6-ジイソプロピルフェノール)である。
麻酔状態の主要な特徴は、意識の消失、疼痛刺激の存在下における不動及び想起の欠如である。プロポフォールのような麻酔薬は、中枢神経系(CNS)内のγ-アミノ酪酸(GABAA)受容体を活性化することによりその麻酔薬効果を媒介するとされている。
一方、無痛覚は疼痛の欠如と定義されている。末梢及び/または中枢神経のメカニズムのうち、無痛覚は、脊髄の後角内の抑制性シナプス伝達が強められた結果として生じうる。脊髄内の抑制性シナプス後伝達は、主としてグリシン受容体を含むとされている。したがって、グリシン受容体科は、疼痛抑制を図る治療薬の標的サイトを意味する。
GABAA及びグリシン受容体はともに、イオンチャネル内蔵型受容体上科に属する。それらは５つのサブユニットがイオンチャネルを形成する一般的な構造を有する。α及びβサブユニットが、３α:２βの提案された生体内化学量論で五量体の受容体に会合する。GABAA受容体と同様にグリシン受容体は、作動物質の結合後の塩化物チャネルを開くことにより神経細胞の発火を抑制する。グリシン受容体は主として中枢神経系の下部領域に見出され、運動リズムの創出の制御、脊髄侵害受容反射反応の調整及び感覚シグナルの処理にかかわる。
【０００３】
新規及び改良された鎮痛薬を開発する必要性が存在する。グリシン受容体はそのような鎮痛薬を識別するのに良好な標的を意味するけれども、これらの受容体を標的とする鎮痛薬が存在しない。したがって、本発明者らはこの課題を解決するために努力することを決心し、疼痛をコントロールするための新規及び改良された薬物を識別する目的で麻酔状態及び無痛覚の根底にある病態生理学的メカニズムの知見を活用した。
【０００４】
本発明の第一の面によれば、以下の一般式Iの化合物及びそれらの塩の、疼痛の治療のための薬物の製造における使用が提供される。
【０００５】
【化１】
0005537033.tif 000002
(式中、R3はハロゲン、アミンまたはアミドであり、
R1、R2、R4及びR5の１以上は２乃至１３個の炭素原子を含むアルキルであり、他は独立してHまたは２乃至１３個の炭素原子を含むアルキルから選択される)
【０００６】
本発明の第二の面によれば、疼痛の治療を必要とする被験者に治療上有効量の一般式Iの化合物を投与することを含む前記被検者における疼痛の治療方法が提供される。
本発明の第三の面によれば、薬物として使用するための本発明の第一の面により定義された化合物が提供される。
本発明者らは、脊髄の後角内の抑制性シナプス伝達の損失が、炎症または神経損傷後の慢性疼痛の発生に重要な役割を果たすことを認めた。更に彼らは、脊髄内の抑制性シナプス後伝達が主としてグリシンを伴うことを認めた。このことから彼らは、ストリキニーネに敏感なグリシン受容体科が疼痛感作の抑制を図る治療薬の標的サイトを意味すると悟った。この認識は、Ahmadiらにより実施された研究(Nature Neuroscience (2001) Vol. 5 No.1 p34- 40)に基づいた。
本発明者らは、ヒドロキシル基に対してpara位にハロゲン及びorthoまたはmeso位に１または２個のメチル基を有するフェノール誘導体を研究することにより彼らの仮説を試験することにとりかかった。それらの結果は、Haeselerらにより公表され(British Journal of Pharmacology (2005) 145, p916-925)、ハロゲン化がグリシン受容体の共活性化または活性化を改良することを認めさせた。しかしながら、これらの初期の結果は、フェノール環上のメチル基の数または位置がグリシン受容体の共活性化のEC50に有意な影響を及ぼさないことを明示したように思われた。
【０００７】
したがって本発明者らは、特異的にグリシン受容体を標的とする改良された鎮痛薬を開発することを試み、驚いたことに彼らは、アルキル基が２個以上の炭素原子を含む本発明の第一の面による化合物がグリシン受容体の共活性剤としての予想外の有効性を有することを発見した。本発明の第一の面による化合物は、ストリキニーネに敏感なグリシン受容体のリガンドであることが好ましい。化合物は、CNS内のGABA受容体タイプより一層特異的にストリキニーネに敏感なグリシン受容体と結合することが更に好ましい。
本発明者らは麻酔薬プロポフォールの誘導体を製造し、驚くべきことに一般式Iの化合物がストリキニーネに敏感なグリシン受容体の非常に有効なプラスのアロステリック調節物質であることを見出した。
本発明者らは、グリシン受容体α1サブユニットが、アルコール、揮発性麻酔薬及びプロポフォールの結合に不可欠であるアミノ酸残基を有するサブユニットの領域においてGABAA受容体のα、β及びγサブユニットの膜貫通領域と相同の一次配列を共有することを認めたので出発点としてプロポフォールを使用した。更に彼らは、プロポフォールが、GABAA受容体におけるEC50より１０倍高い濃度でグリシン受容体を活性化することが報告されたことを認めた。このことは、プロポフォールの望ましいグリシン活性化効果が、臨床診療において深い昏睡を誘導する濃度において得られるだけであることを意味するので、彼らはその他のプロポフォール誘導体がグリシン誘導体において改良された活性を示し、それにより鎮痛薬として有用であるか否かを研究するために、その他のプロポフォール誘導体を生成することを決心した。
【０００８】
本発明者らは、一般式Iの化合物がグリシン受容体の共活性化において非常に有効であり、それゆえ鎮痛薬として有用であること見出して驚いた。彼らは、(1)フェノールのpara位におけるR3の導入及び(2)特定のアルキルまたはアルキレンを含む基の導入が、当業者に公知の最も有効な化合物より有意に低い(１０００倍以下)グリシン受容体の共活性化のEC50値を有するフェノール誘導体となると確信する。実施例２〜４に記載した化合物は、低いμMまたはnM範囲で半数影響増強効果を示した。このことは、プロポフォールより２０倍以上低い濃度に相当する。更に、本発明による化合物は、実施例１に記載したメチル化フェノール誘導体より有意により有効であった。これらのメチル化フェノールは、低いμM範囲でグリシン受容体の共活性化のEC50値を有する有用な鎮痛薬に相当する。しかしながら、思いがけずGABA受容体よりグリシン受容体活性化の選択性が良好であることを示す本発明による好ましい化合物は、nM範囲でEC50値を有する。このことは、本発明による化合物が理想的な鎮痛薬であり、意識(すなわち、麻酔効果)に全くまたは無視しうるほどしか影響を及ぼさないことを意味するので大きな利点である。
化合物が、GABAA受容体よりストリキニーネに敏感なグリシン受容体に対して選択性を有することは好ましい。化合物は、GABAA受容体におけるEC50より低濃度においてグリシン受容体の共活性化に対するEC50を有するかもしれない。好ましくは、化合物は、GABAA受容体におけるEC50より１０倍低いグリシン受容体の共活性化に対するEC50を有する。化合物が、GABAA受容体におけるEC50より１００倍以上低いグリシン受容体の共活性化に対するEC50を有することが更に好ましい。
化合物はまた、プロポフォールのそれより低いグリシン受容体の共活性化のEC50値を有するべきである。例えば、化合物は、プロポフォールのそれより少なくとも１０倍低いまたは１００倍低いグリシン受容体の共活性化のEC50値を有してもよい。もっとも好ましい化合物(例えば、2,6-ジイソプロピル-4-クロロフェノール)は、プロポフォールのそれより１０００倍低いグリシン受容体の共活性化のEC50値を有する(HEK293細胞中で異種発現したグリシン受容体に関して測定された)。
グリシン受容体の共活性化のEC50値を測定するのに適する方法は実施例１に開示されている。
【０００９】
化合物の有効性は、CNSにおける麻酔及びPNSにおける無痛覚を調節する神経生理学を考慮すると一層驚きである。本発明者らは、一般式Iの化合物がストリキニーネに敏感なグリシン受容体においてプラスのアロステリック調節物質として作用することを確信する。これらの受容体は、過分極により膜電位を安定させ、脊髄レベルで主要な抑制成分を構成する塩化物チャネルである。それにひきかえ、密接な関係があるGABAA受容体は、CNSにおいて主要な抑制成分を構成する。したがって、GABAA作動薬は意識の変換または損失に至るが、本発明による化合物は意識に影響を及ぼさない濃度において末梢レベルで理想的に疼痛を遮断するであろう。本発明者らは、本発明による化合物がストリキニーネに敏感なグリシン受容体においてプラスのアロステリック調節物質として作用し、それにより後根神経節のレベルで求心性神経シグナルを遮断するが、中心のGABAA受容体に少ししかまたはまったく影響しないために、本発明による化合物が有効であると確信する。したがって、当業者は、グリシン受容体作動薬であり、GABAA作動薬の作用をまったく示さない鎮痛薬を選択することを判断するであろう。それゆえ、公知である最も有効なGABAA作動薬であるプロポフォールは、当業者により鎮痛薬の開発の基盤としての機能を果たすのに最も適していない化合物と認められるであろう。更に、当業者はまた、Haeselerらにより公表されたデータ(上記を参照)を再検討して、GABA受容体よりグリシン受容体選択性の化合物の開発にはアルキル化の種類(Haeselerの論文におけるメチル基)は重要ではないという考えに達するであろう。したがって本発明者らは、プロポフォール誘導体の鎮痛薬の性質の研究に対して技術的な先入観が存在したことを確信する。それゆえ、本発明者らが本発明による化合物に関して見出したグリシン受容体の共活性化における並外れた増大は、驚きばかりではなく、当業者には疑わしいと考えられるであろう。理論的には、GABAA受容体レベルにおいて有効性の少ないいずれかのその他のフェノール誘導体が、技術の状態によれば、更に有望な候補であると考えられるであろう。
【００１０】
R3はハロゲンであるのが好ましい。ハロゲンはフッ素でも、塩素でも、ヨウ素でも臭素でもよい。実施例２において示された結果は、4-位がいずれかの望ましいハロゲン、特に塩素、臭素またはヨウ素で置換されている本発明の範囲内の化合物により予想外に良好な有効性が示されることを明らかにする。これらの結果は、提案された生理学的メカニズム、すなわち、天然の伝達物質であるグリシンの最大下濃度の効果のプラスの調節を支持する。
プロポフォールの誘導体に関する実験を実施において、本発明者らは、ある種の好ましい化合物(例えば、実施例２で試験した2,6-ジイソプロピルフェノールの4-クロロ-、4-ブロモ-、4-ヨード-誘導体)が一桁のnM範囲で非常に低いEC50を示すことを認めさせた。このことは、本発明者らに、グリシン受容体において有効性となる(そして鎮痛剤として有用性となる)場合にはR1、R2、R4またはR5の種類が驚くほど重要であるが、GABA受容体には必要以上に影響を与えず、したがって意識に影響を及ぼすことはないことを悟らせる。
R1、R2、R4及びR5のうち２つはHであり、残りの２つは２乃至１３、好ましくは３乃至６個の炭素原子を含むアルキルであるのが好ましい。２つのアルキル基はともに、それぞれorthoまたはmeso位であるのが更に好ましい。したがって、R1及びR5がアルキル基であってR2及びR4が水素であるか、R2及びR4がアルキル基であってR1及びR5が水素であるのが最も好ましい。
【００１１】
好ましくは、R1、R2、R4及びR5は、各々別々に水素原子または直鎖状または分岐状の置換または未置換アルキル基、例えば、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基またはイソブチル基である。最も好ましくは、R1、R2、R4及びR5のうち２つはイソプロピル基であり、好ましくはR1、R2、R4及びR5の残りの２つは水素原子である。本発明による使用のためのそのような好ましい化合物の例には、2,6-ジイソプロピル-4-クロロフェノール、2,6-ジイソプロピル-4-ヨードフェノール、2,6-ジイソプロピル-4-フルオロフェノール、2,6-ジイソプロピル-4-ブロモフェノール、3,5-ジイソプロピル-4-クロロフェノール、3,5-ジイソプロピル-4-ヨードフェノール、3,5-ジイソプロピル-4-フルオロフェノール及び3,5-ジイソプロピル-4-ブロモフェノールが含まれる。
2,6-ジイソプロピル-4-クロロフェノール、2,6-ジイソプロピル-4-ブロモフェノール、及び2,6-ジイソプロピル-4-ヨードフェノールが、本発明による使用のための特に好ましい化合物である。本発明者らは、これらの化合物の各々が、親化合物であるプロポフォールより１０００倍低い濃度でHEK293細胞において異種発現したグリシン受容体の機能を驚くほど増大させることを明らかにした(実施例を参照されたい)。当業者は、このことがこれらの化合物を本明細書に記載されているような鎮痛薬として特に有用とすることを認めるであろう。
本発明による化合物及びそのような化合物を含む薬物は多くの状況で鎮痛薬として使用されうる。
【００１２】
化合物は、これまでは、周知のことであるが治療するのが困難であった慢性の疼痛(例えば、神経障害性及び/または炎症後の慢性疼痛)を対象とするのに特に有用である。化合物は、NSAID、アヘン剤誘導体等のような従来の薬物では治療が難しい慢性神経障害性疼痛の治療に特に有用である。
化合物はまた急性疼痛(例えば、負傷後の疼痛)の治療にも有用である。
本発明の化合物はまた、単剤療法として使用する場合には局所的麻酔薬及び鎮痛薬ならびにNSAID及びアヘン剤のすべてのよく知られている副作用を回避し、同時に、相加効果または相乗効果を図る種々の併用治療方法を可能にするので有利である。
疼痛が調節されうる特定の条件の例には、慢性腰痛、関節炎、癌性疼痛、三叉神経痛、脳卒中及び神経障害性疼痛が含まれる。
化合物は既存の疼痛の治療に使用されうるが、予防的治療が医学上必要であると考えられる場合、例えば、待機手術のまえにも使用されうる。
化合物は単剤療法の形(すなわち、化合物のみの使用)で鎮痛薬として使用されうるが、化合物は疼痛を軽減するその他の治療と組み合わせて投与されてもよい。好ましい併用療法には、一般式の化合物により調節される経路とは異なる疼痛プロセシング経路により疼痛を調節する鎮痛薬との化合物の使用が含まれる。そのような鎮痛薬には、モルヒネ、パラセタモール、及びNSAIDが含まれる。化合物はまた、間接的にのみグリシン受容体と相互作用する局所的麻酔薬(例えば、リグノカイン)と有効に組み合わせうる。
【００１３】
本発明の薬物は、一般式Iの化合物及び薬学的に許容しうる賦形剤を含みうる。賦形剤は、投与される被験者に十分に許容され、作用する領域に化合物を送達しうるものであるべきであることは認められよう。
本発明の薬物は、特に化合物が使用される方法に依存して多くの種々の形をとりうる。したがって、例えば、薬物はフェノール誘導体の塩(例えば、ナトリウム塩)の形で化合物を含みうる。そのような塩は、粉末状で製造され、錠剤、カプセル、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、エーロゾル、スプレー、ミセル、経皮パッチ、リポソームまたはヒトまたは動物に投与されうるいずれかのその他の適する形で添加されうる。
あるいは、本発明によるフェノール誘導体は適する溶剤中に溶解されて液体薬物を形成してもよい。溶剤は水性(例えば、PBSまたは蒸留水)でもよい。あるいは、溶剤はエタノールのようなアルコールでも、そのような溶剤の水性溶剤との混合物でもよい。
薬物は局所的治療に使用されるのが好ましい。そのような薬物は有効なサイトに投与するための液体として配合されうる。あるいは、液体は、注射またはエーロゾルとして投与されるために配合されうる。
化合物はまた持続または遅延放出デバイス内に添加されてもよい。そのようなデバイスは、例えば、皮膚上または皮下に挿入されてもよく、化合物は数週間または数ヶ月にわたって放出されうる。そのようなデバイスは、長期間にわたる慢性疼痛の患者(例えば、関節痛の患者)に特に有用かもしれない。デバイスは、通常常習的な投与を必要とする化合物が使用される場合に特に有利かもしれない。
【００１４】
必要とされる化合物の量は、生物活性及び、投与方法、使用する化合物の物理化学的性質及び化合物が単剤療法としてまたは併用療法で使用されるか否かに依存する生体利用効率により決定されることは認められよう。投与回数もまた前述の因子、特に治療される被験者内の化合物の半減期に影響を受けるであろう。
最適投与量は当業者により決定されうるが、使用する特定の化合物、製剤の強さ、投与方法、及び軽減を必要とする疼痛の程度に伴って変化するであろう。被検者の年齢、体重、性別、食生活、及び投与時間を含む、治療される特定の被検者に依存する追加の因子は、投与量の調整に必要となろう。
製薬業界により従来使用されるような公知の手段(例えば、生体内実験、臨床試験等)が、組成物の特定の配合及び正確な治療規制(化合物の日用量及び投与回数)を確立するのに使用されうる。
一般的には、組織濃度がほぼ使用される化合物のEC50であるように標的サイトに化合物を送達するのに有効な投与量が示されるべきである。
日用量は、単回投与として(例えば、毎日１回の注射として)示されてもよい。あるいは、使用される化合物は１日に２回以上の投与を必要としてもよい。例として、慢性腰痛の治療には2,6-ジイソプロピル-4-クロロフェノールが２回(または疼痛の重症度に依存してそれより多くの回)の日用量の注射溶液または軟膏として投与されうる。治療を受ける患者は、目を覚ましたときに１回目を服用し、次いで夕方２回目を服用する(２回の服用の場合)か、その後３または４時間間隔で服用してもよい。あるいは、繰り返し服用することなく患者に最適投与量を提供するために、徐放性デバイスを使用してもよい。
【００１５】
本発明は更に、治療上有効量の本発明の化合物及び薬学的に許容しうる賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。一実施態様においては、フェノール誘導体(例えば、2,6-ジイソプロピル-4-クロロフェノール)の塩の量は、腸内(経口、直腸)投与のための各投与量ユニット中に体重１kgあたり約１０μg乃至１０mgの量である。別の実施態様においては、その量は、非経口的(静脈内/くも膜下または硬膜外)投与のための各投与量ユニット中に体重１kgあたり約１μg乃至１mgである。
更なる実施態様においては、賦形剤は液体であり、組成物は溶液である。非経口的投与に有用な液体溶液は、０．００１乃至１質量％の式Iのフェノールを含みうる。別の実施態様においては、賦形剤は固体であり、組成物は錠剤である。更なる実施態様においては、賦形剤はゲルであり、組成物は局所使用用である。
本発明においては、“治療上有効量”は、化合物が有効である疼痛状態に苦しむ被験者に投与された場合に、疼痛の低減、鎮静、または退行を引き起こす化合物、薬物または組成物の量である。
“被験者”は、脊椎骨のある哺乳類の家畜またはヒトである。
【００１６】
本発明の実施においては、“薬学的に許容しうる賦形剤”は、薬学的組成物の配合に有用な当業者に公知のいずれかの生理学的賦形剤である。一実施態様においては、薬学的賦形剤は液体でもよく、薬学的組成物は溶液の形であろう。別の実施態様においては、薬学的に許容しうる賦形剤は固体で、組成物は粉末または錠剤の形である。更なる実施態様においては、薬学的賦形剤はゲルで、組成物は坐薬またはクリームである。更なる実施態様においては、化合物または組成物は薬学的に許容しうる経皮パッチの一部として配合されうる。
固体の賦形剤には、滑剤、可溶化剤、懸濁化剤、充填剤、流動促進剤、圧縮助剤、バインダーまたは錠剤崩壊剤としても作用しうる１種以上の物質が含まれうる。それはまたカプセル化物質かもしれない。粉末においては、賦形剤は微粉状の活性成分と混合している微粉状の固体である。錠剤においては、活性成分は適する割合で必要な圧縮性を有する賦形剤と混合され、所望の形状及び寸法に圧縮される。粉末及び錠剤は、好ましくは９９％以下の活性成分を含む。適する固体賦形剤には、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、乳糖、デキストリン、でんぷん、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリドン、低融点ろう状物質及びイオン交換樹脂が含まれる。
液体賦形剤は、溶液、懸濁液、乳濁液等の調製に使用される。フェノール誘導体は、水、エタノール、有機溶剤またはそれらの混合物のような薬学的に許容しうる液体賦形剤または薬学的に許容しうる油または脂質中に溶解または懸濁されうる。
【００１７】
滅菌溶液または懸濁液である液体の薬学的組成物は、例えば、筋肉、髄膜、硬膜外、腹腔内または皮下注射により使用されうる。滅菌溶液はまた経静脈的に投与されてもよい。化合物は、滅菌水、生理食塩水、またはその他の適する滅菌注射用媒体で投与時に溶解または懸濁されうる滅菌固体組成物として調製されうる。
本発明はまた、鎮痛薬としての有効性について化合物をスクリーニングする方法であって、試験化合物をオタマジャクシに適用し、GABA神経伝達媒介挙動に及ぼす化合物の影響をモニターし、かつグリシン神経伝達媒介挙動に及ぼす化合物の影響をモニターすることを含む方法であり、グリシン神経伝達の特徴を示す挙動を排他的にまたは主として誘導する化合物が推測上の鎮痛薬である方法を提供する。
スクリーニング方法の好ましい実施態様は実施例３に開示されている。
本発明を更に実施例により添付図面を参照して説明する。
【００１８】
実施例１
この実施例は、多くのフェノール誘導体のグリシン受容体活性化及び塩化物電流に及ぼす影響を研究するために実施された予備的な実験(そのいくつかはHaeselerらにより公表されたそれ(前述))を説明する。当業者は、これらのデータが、フェノールのpara位におけるハロゲン化がグリシン受容体の活性化を向上させ、化合物が鎮痛薬として使用するのに適することを明らかにすることを認めるであろう。しかしながら、これらのデータは、フェノール環のアルキル化の種類が化合物の鎮痛薬の活性への適合性に及ぼすかもしれない驚くべき特別な影響を予期しない。このことは実施例２において論ずる。
【００１９】
１．１方法
１．１．１細胞培養、トランスフェクション
ラットのα1及びα1βグリシン受容体サブユニットを転換ヒト胚腎臓細胞(HEK 293)に一時的にトランスフェクトした。α1グリシン受容体サブユニットは効率よく異種発現系において同価同義受容体を形成する。βサブユニットは同価同義受容体を形成しないが、異価同義の受容体の機能に影響を及ぼし、グリシンの作動体作用及びピクロトキシン類似物の遮断効果に対する感度を低下させる。グリシン受容体α及びβサブユニットを共トランスフェクトする場合には、βポリペプチドの発現がαサブユニットのそれよりずっと効率的ではないので、それぞれのcDNAは１：１０の比でで結合する。α1β異価同種の受容体における１０００μMのピクロトキシンへの感度の低下はβサブユニットの発現の有効性の分析に使用された。細胞は、３７℃において５％のCO2/空気の培養器中で、１０％のウシ胎仔血清(FCS, Biochrom, Berlin, Germany)、１００U/mlのペニシリン及び１００μ/mlのストレプトマイシンを補足して、ダルベッコの改質イーグル培地(DMEM, Biochrom, Berlin, Germany)中で培養した。トランスフェクションのために、細胞を、５０mMのK2HPO4及び２０mMのK-アセテートを含む緩衝液(pH ７．３５)中に懸濁させた。ラットのα1及びβグリシン受容体サブユニットの共トランスフェクションのために、各々がpCIS2発現ベクター(Invitrogen, San Diego, USA)中でサブクローン化された対応するcDNAを懸濁液に添加した。トランスフェクトされた細胞を視覚化するために、それらは緑色の蛍光たんぱく質のcDNA(GFP １０μg/ml)と共トランスフェクトされた。トランスフェクションのために、本出願人らはEquiBio(Kent, UK)によるエレクトロポレーションデバイスを使用した。トランスフェクトされた細胞をカバーガラス上に再び固定し、記録する前に１５〜２４時間培養した。
【００２０】
１．１．２試薬及び溶液
試薬はすべて、特に指摘されなければ、Sigma Chemicals(Deisenhofen, Germany)から入手した。
研究に使用するフェノール誘導体は、エタノール中の１M原液として調製し、光から保護され、ガラス容器中−２０℃で貯蔵した。濃度はガラス瓶に注入された量から計算された。薬物を含むガラス瓶を６０分間激しく振盪した。グリシン及びピクロトキシンは直接溶液中に溶解させた。
パッチ電極は、KCl １４０mM、MgCl2 ２mM、EGTA １１mM、HEPES １０mM、グルコース １０mMを含有し、溶液はNaCl １６２mM、KCl ５．３mM、NaHPO4 ０．６mM、KH2PO4 ０．２２mM、HEPES １５mM、グルコース ５．６mMを含有した。
【００２１】
１．１．３実験装置
標準全細胞実験(Hamill et al., (1981) Pflugers Arch., 391, 85-100.)は、−３０mVの膜電位で実施した。細胞膜及びパッチクランプ電極間に形成される数GΩの電気的密封は、作動薬誘導チャネルの活性化による内向き電流をpA範囲で変化させる。ピペットの電気抵抗は約５MΩであり、約１０MΩの全細胞構造における総アクセス抵抗に対応する。２秒の持続時間のパルスにおける作動薬の適用には超高速液体フィラメントスウィッチ技術(Franke et al., (1987) Neurosci. Lett., 77, 199-204)を使用した。研究に使用する作動薬及び/または薬物は、圧電結晶に連結する単一の流出流(内径０．１５mmのガラス管)による円滑な液体フィラメントにより細胞に適用される。細胞を、このフィラメント及び連続的に流動するバックグラウンド溶液間の界面に置いた。電圧パルスを圧電結晶に加えると、管が研究に使用する細胞上にまたは細胞から離れるように上下に移動した。細胞の液体フィラメントに対する正しい位置は、各実験の前後に飽和(１０００μM)グリシンのパルスを適用して確保した。実験を進める前に、グリシン活性化電流の大きさ及び形状が確実に安定化するように注意した。試験溶液及びグリシン(１０００μM)は、別々の容器からではあるが、同一のガラス-ポリテトラフルオロエチレンかん流システムにより適用した。これらの容器の内容物は、表面かん流室にはいる直前の接合部で混合された。
薬物は、その作動薬作用を決定するために単独で適用されても、共活性化作用を決定するために飽和以下の濃度のグリシン(１０μM)と組み合わせてもよいし、開いたチャネルの遮断を検出するために飽和濃度(１０００μM)のグリシンと一緒に適用されてもよい。新規細胞を各薬物及び各手順について使用し、各設定について３回以上の実験を実施した。使用する最高薬物濃度に対応する希釈剤エタノールの量は、３４０００μMであった。エタノール自体はこの濃度においてグリシン受容体共活性化にも直接的活性化にも影響を及ぼさないことを本発明者らはすでに示した。
【００２２】
１.１．４電流記録及び分析
データの収集及び更なる分析のために、本発明者らはAxopatch 200B 増幅器をpClamp6ソフトウェア(Axon Instruments, Union City, CA, USA)と組み合わせて使用した。電流は２kHzでフィルターをかけた。適合手段は、非線形最小自乗Marquardt-Levenberg演算手順を用いて実施した。詳細は、適する図面の説明文または結果の欄に提供する。
作動薬として直接作用する化合物により誘導される最大電流応答は、それぞれの実験直後の薬物不在下における１０００μMグリシンに対する最大応答の百分率として表された。共活性化効果は、E(%)＝１００[(I−I0)/ I0](式中、I0は１０μMグリシンに対する電流応答である。)にしたがって、１０μMグリシンにより誘発された電流の百分率として表された。活性化または共活性化電流は、それら自身の最大応答に対して正規化された。非ハロゲン化化合物については、３０００μMより高濃度のフェノール誘導体がシール抵抗において下降し、信頼しうる結果が得られないので、用量-応答曲線は必ずしも平坦域の応答に達しなかった。これらの場合には、最大応答は、信頼しうる応答が記録される試験化合物の最高濃度における応答であった。用量-応答曲線は、(Inorm＝[１＋(EC50/[C])nH]-1)(式中、Inormは、最大内向き電流または最大共活性化電流(Imax−I0)により正規化された、作動薬のそれぞれの濃度[C]により直接的に誘導された電流、または作動薬−グリシン(１０μM)混合物により共活性化された電流(I−I0)で、EC50はそれら自身の最大応答の５０％に達する応答を引き起こすのに必要な濃度であり、かつnHはHill係数である)にしたがって適合させた。
【００２３】
１．１．５統計
α1β受容体について得られた結果のみを統計的検査方法で記録した。α1同価同種受容体において比較的高いグリシン感度が得られた結果、最高共活性化応答(１０００μMグリシンの効果に関して)が時折低薬物濃度で観察され、α1同価同種受容体におけるHillフィットから誘導されるEC50値が過小評価される結果となる。それぞれ、ハロゲン化及び非ハロゲン化類似物間、１個対２個のメチル基を有する化合物間、またはフェノール性ヒドロキシル基に対してorthoまたはmeso位にメチル基を有する化合物間で、一方では最大効果における差異を示すために、他方においては半数影響効果に達するのに必要な濃度(EC50)における差異を示すために統計学的分析を実施した。曲線の適合及びHill曲線のパラメータの評価は、SAS Release 8.02のプログラム“PROC NLMIXED”を用いて実施した。このモデルにおいては、“実験”は支配下にある変数として処理され、パラメータの値(EC50及びnH)は正規分布したランダムの因子として処理される。２つの物質間のこれらのパラメータの平均の差異は、第二組のすべてのデータに関して活性化された一定のシフトパラメータΔEC50及びΔnHとして統一モデルに入れられた。双方の代替物に対してパラメータの差異がないという帰無仮説を試験するために、対応する(漸近的)t-値を使用した。帰無仮説はp＜０．０５で否定された。すべてのデータは、平均±SDとして表される。
ハロゲン化及び非ハロゲン化、モノ-及びジメチル化またはortho-またはmeso-メチル化構造類似物間の最大増強効果における差異の有意性を分析するために２つの試料のt-試験を実施した。
【００２４】
１．２結果
研究には、全部で９４の細胞を用いた。HEK 293細胞におけるラットのα1同価同義及びα1βmRNAの発現は、天然作動薬の濃度を飽和させた(１０００μM)後にα1受容体において−１．０±０．５nA及びα1β受容体において１．３±０．９nAの大きさのグリシン活性化内向き電流を示すグリシン受容体を発生した。各実験後に１０００μMのグリシンとともに１０００μMのピクロトキシンを適用すると、成功したβサブユニットの共発現が確認された。この実験の設定においては、１０００μMのピクロトキシンがα1同価同義受容体を５５±０．０５％遮断したが、α1β受容体はピクロトキシンの影響をほとんど受けなかった(１９±０．０５％遮断)。共トランスフェクションに１：１０の割合のα及びβcDNAを使用した場合には、ピクロトキシンを用いて確認された成功したβサブユニットの共発現は１００％であった。過渡電流は急速に増大し、その後単相減衰した。感度低下の時間定数は、α1同価同義受容体において９５８±２５０分及びα1β受容体において１０２６±２１２分であった。１０００μMのグリシンの存在下において感度が低下しないそれぞれの定常状態電流は、８６±６％及び８４±８％のピーク電流の大きさであった。
グリシンを適用しない場合には、2,6-ジメチルフェノール及び3,5-ジメチルフェノールのみが濃度依存性で受容体媒介内向き電流を直接的に活性化した。電流は、それぞれ高濃度(３０００μM)の3,5-ジメチルフェノールまたは2,6-ジメチルフェノールの存在下において、最大グリシン(１０００μM)応答の３０±１２％(α1、ｎ＝３)及び３８±５％(α1β、ｎ＝３)及び３２±６％(α1、ｎ＝３)及び３３±１０％(α1β、ｎ＝３)に達した。半数影響濃度(EC50)の推定値は、それぞれα1及びα1β受容体において、3,5-ジメチルフェノールに関しては１４６８±２０８及び１４６６±８３μMであり、2,6-ジメチルフェノールに関しては１４１０±１０１及び１５４９±１６４μMであった。
【００２５】
図２における図形により明らかなように、両方の化合物により誘導される電流は２秒の使用中に感度が低下しなかった。
α1及びα1β受容体におけるグリシンの用量―応答曲線は図３に示されている。グリシンのEC50は、それぞれα1において１２．８±２．３μM及びα1β受容体において４７．０±１４．０μMであった。グリシン１０μMは、１０００μMのグリシンの応答の、α1βにおいて２１±７％(ｎ＝３４)及びα1受容体において４６±５％(ｎ＝２４)の電流応答を引き起こしたが、このグリシン感度の差異は有意(ｐ＜０．００１)であった。グリシンが存在する限り、１０μMのグリシンへの電流応答の感度低下は１０％未満であった。
研究したすべてのフェノール誘導体は、α1及びα1β受容体の両方においてグリシン１０μMへの電流応答を増強し、図４及び５はα1β受容体を用いて得られた典型的な電流の図形を示し、図６はα1同価同義受容体を用いて得られた電流の図形を示す。
最大の増強度に対して化合物間の有意な差異は検出されなかった。3-メチルフェノールに関して観察された増強効果だけが2-メチルフェノール関するそれより高かった(ｐ＝０．０４)が、2-メチルフェノールを用いた実験に対して3-メチルフェノールを用いた実験におけるグリシン１０μMへの応答のほうが低い結果かもしれない。
【００２６】
ハロゲン化化合物3,5-ジメチル-4-クロロフェノール及び3-メチル-4-クロロフェノールは、非ハロゲン化類似物と比較して２０倍以上低い濃度で半数影響増強効果を達成したが、この差異は統計的に有意(ｐ＜０．０００１)であった。α1β受容体におけるmeso位にメチル基を有する化合物(3-メチルフェノール及び3,5-ジメチルフェノール)のEC50の推定値は、ortho-メチル化構造類似物(2-メチルフェノール及び2,6-ジメチルフェノール)のEC50値と有意な差異はなかった。非ハロゲン化ジメチル化化合物は、α1β受容体において１個しかメチル基を有していない構造類似物より有意には増強しなかった。各化合物に関する５〜６回の実験から誘導されたα1β受容体における電流増強の濃度依存性は図７に表現されている。
α1及びα1β受容体における正規化応答へのHill式の適合から誘導されるEC50値及びHill係数(±SD)は表１に示されている。
【００２７】
【表１】
0005537033.tif 000003
【００２８】
表１においては、ハロゲン化化合物3-メチル-4-クロロフェノール及び3,5-ジメチル-4-クロロフェノールが非ハロゲン化構造類似物より有意に影響を及ぼした(ボールド体で*印、ｐ＜０．０００１)。α1β受容体においては、１個対２個のメチル基を有する化合物間またはortho-対meso-メチル化化合物間に有意な差異は検出されなかった。
α1同価同種受容体において比較的高いグリシン感度が得られた結果、最高共活性化応答(１０００μMグリシンの効果に関して)が時折低薬物濃度で観察され、α1同価同種受容体におけるHillフィットから誘導されるEC50値が過小評価される結果となり、したがってα1同価同種受容体に関するパラメータを有効性の決定に使用するべきではない。しかしながら、図４、５及び６の電流の図形及び表１に示される値により示されるように、α1β受容体と比較して同様な濃度範囲におけるα1同価同種受容体でのすべてのフェノール誘導体共活性化電流、したがってβ-サブユニットの発現は共活性化効果に必要ではない。
それぞれ３００及び６００μMより高濃度のハロゲン化化合物3,5-ジメチル-4-クロロフェノール及び3-メチル-4-クロロフェノールは、併用の終了時に大きな応答の逆戻りを示すとともに、１０００μMのグリシンを併用したときにピーク電流の大きさを低下させた。電流の減衰はそれぞれの化合物及びグリシン(１０００μM)の併用中に加速された。この効果を立証するために各化合物について全部で３回の実験を実施した。図８は典型的な電流の図形を示す。
【００２９】
１．３考察
これらのデータは、フェノール性ヒドロキシル基に対してpara位に塩素を有する置換フェノール誘導体が低濃度でグリシン受容体を共活性化し、それゆえ痙縮、筋肉弛緩、及び疼痛軽減の治療の潜在能力を提供しうることを示す。一層高い濃度においては、ジメチル化及び非ハロゲン化化合物のみが天然の作動薬の不在下でグリシン受容体を直接的に活性化した。これらの結果は、フェノール誘導体によるグリシン受容体の直接的活性化及び共活性化が明確な構造上の特徴を必要とすることを示す。βサブユニットの存在はフェノール誘導体によるグリシン受容体のプラスの調節にも直接的活性化にも必要とされない。
GABAA及びグリシン受容体は、哺乳動物の中枢神経系における抑制性神経伝達の主要な受容体である。GABAAは脳において最も重要な神経伝達物質であり、グリシンは脊髄及び脳幹下部において重要な役割を果たす。GABAA受容体は、構造上さまざまな鎮静麻酔薬及び抗不安薬の共通の標的サイトとして確認されているが、特にグリシン受容体を標的とする臨床上適用できる化合物はまだ確認されていない。グリシン受容体は、抗侵害受容作用及び筋肉弛緩作用を媒介する治療の有力候補として示唆されている。
【００３０】
本研究において研究したすべてのフェノール誘導体はグリシン受容体の機能をある程度プラスに調節することができた。明らかに、グリシン受容体を共活性化するフェノール誘導体の有効性を決定する重要な構造上の特徴の一は、フェノール性ヒドロキシル基に対してpara位におけるハロゲン化である。第二の対称メチル基の挿入は単一メチル化化合物の有効性を更には増大させず、フェノール性ヒドロキシル基に対するメチル基の位置は共活性化の有効性に影響を及ぼさなかった。より高い濃度(＞３００μM)においては、ハロゲン化化合物の共活性化効果は、１０００μMのグリシンとの併用中にピーク電流の大きさが低下することにより示される抑制効果により無効になった。併用が同時に停止されたときの大きな応答の回復は、高濃度のプロポフォールによるグリシン受容体の調節並びに吸入薬によるGABAA受容体の調節に関してすでに記載した現象の内在するメカニズムとしての開いたチャネルの遮断の仮説と一致する。しかしながら、開いたチャネルの遮断の仮説を実証するために、更なる研究はこれらの効果の電位依存性を標的とすべきである。あるいは、１０００μMのグリシンとの併用中に電流の減衰の加速とともにピーク電流の大きさが低下することは、リガンド依存性塩化物チャネルに上のピクロトキシンに関して仮定された遮断のメカニズムに類似した、受容体の感度低下構造を安定化する高濃度のハロゲン化フェノール誘導体を用いた阻害のアロステリックなメカニズムにより説明されるかもしれない。いかなるハロゲン化化合物も天然の作動薬の不在下では受容体を直接的に活性化しなかった。
グリシン受容体におけるCl-内向き電流を活性化または共活性化するフェノール誘導体の潜在力を決定する構造上の特徴は、GABA作動性受容体の活性化またはナトリウムチャネル遮断作用に関してすでに報告された要件に対して類似点及び相違点を示す。
【００３１】
定性的には、フェノール誘導体によるグリシン受容体の共活性化に関する構造−活性の関係は、電圧調節性のナトリウムチャネルを遮断する構造−活性の関係と類似していることを示す。両者において、有効性はフェノール性ヒドロキシルに対してpara位における塩素により上昇する。定量的には、この研究におけるグリシン受容体共活性化の半数影響濃度は、これらの化合物によるナトリウムチャネルの半数影響遮断に必要な濃度より約１０倍(3,5-ジメチル-4-クロロフェノール)及び１００倍(3-メチル-4-クロロフェノール)低かった。para位に塩素を挿入するとグリシン受容体を共活性化する潜在力及び電圧調節性のナトリウムチャネルを遮断する潜在力が平行して増大するが、第二のメチル基の挿入の場合はそうではない。グリシン受容体における効果とは著しく異なって、第二のメチル基がmeso位に結合した場合にはナトリウムチャネルの遮断の潜在力は増大した。meso位に単一のメチル基を有するハロゲン化化合物(3-メチル-4-クロロフェノール)に関しては、この研究においてグリシン受容体共活性化が観察される濃度範囲及びナトリウムチャネルの遮断が報告される濃度範囲における重なりはごくわずかである。比較のために、グリシン受容体における半数影響効果は４μMの3-メチル-4-クロロフェノールで達成されたが、休止状態のナトリウムチャネルの半数影響遮断は４００μMの3-メチル-4-クロロフェノールを必要とした。２つのメチル基を有する非ハロゲン化フェノール誘導体の場合には、グリシン受容体の共活性化はナトリウムチャネル遮断と同一の濃度範囲で検出された。この研究においては、生理学的休止電位に近い膜電位において電圧調節性のニューロンのナトリウムチャネルの半数影響遮断は１８７μMで観察されたのに対し、半数影響共活性化効果は３７０μMの2,6-ジメチルフェノールで観察された。一層高い濃度(＞１０００μM)においては、ジメチル化化合物は天然の作動薬の不在下でグリシン受容体を直接的に活性化した。これらの結果が一般化されうるとすれば、ハロゲン化フェノール誘導体は、低濃度においてグリシン受容体共活性化を示し、濃度を増大させると電圧調節性ナトリウムチャネルの遮断及びグリシン受容体の開いたチャネルの遮断を示す。非ハロゲン化ジメチル化フェノール誘導体は、中間の濃度においてグリシン受容体の共活性化及びナトリウムチャネルの遮断の両方を示し、高濃度においてグリシン受容体を直接的に活性化する。単一のメチル基を有するハロゲン化フェノール誘導体は、ナトリウムチャネル遮断がまだ小さい濃度においてはグリシン受容体で促進効果を持ちつつ、ナトリウムチャネル遮断薬であることが期待されるであろう。
【００３２】
この研究で観察されるグリシン作動性効果とは著しく異なって、GABA作動性効果はほとんどpara位における置換の影響を受けなかった。フェノール化合物のGABA作動性活性は、フェノール性ヒドロキシル基に対して芳香族環の2及び6位のアルキル基の大きさ及び形状と関連していたが、3,5-ジアルキル置換の効果は系統的には試験されなかった。GABAA受容体の直接的活性化は、メチル基がortho位にあるときのみ単一のメチル化化合物に見られた。本発明者らの研究は、グリシン受容体の直接的活性化に関する限り、フェノール性ヒドロキシル基に対する位置に関係ない検出しうる効果には２個以上のメチル基が必要とされることを示す。
要するに、これらのデータは、好ましくは電圧調節性ナトリウムチャネルまたはGABAA受容体よりむしろグリシン受容体選択性である本発明によるフェノール誘導体が、代表的な使用において望ましい様式の抗侵害受容、筋肉弛緩及び局所麻酔/抗痙攣作用を示すことを示唆した。当業者は、このことが、本発明による化合物が前述のように多くの疼痛状態の制御に有用であることを明らかにするのを認識するであろう。
【００３３】
１．４結論
１．フェノール誘導体は神経作動性化合物群を構成する。本研究の目的は、グリシン受容体におけるそれらの調節作用を決定する構造上の特徴を特定することである。
２．本発明者らは、HEK 293において異種発現したラットのα1及びα1βグリシン受容体による塩化物の内向き電流に及ぼす４種のメチル化フェノール誘導体及び２種のハロゲン化類似物の影響を研究した。
３．すべての化合物が、α1同価同種及びα1βグリシン受容体の両方において最大下のグリシン濃度の影響を増強した。α1β受容体におけるグリシン１０μMの作用の最大増強度は化合物間で変わらなかったけれども、ハロゲン化化合物は、非ハロゲン化類似物と比較して、２０倍以上低い濃度の低いμM範囲において半数影響増強効果を達成した(ｐ＜０．０００１)。共活性化効果は、ハロゲン化化合物においては＞３００μMの濃度において抑制効果により無効になった。
４．ジメチル化化合物である2,6-及び3,5-ジメチルフェノール(＞１０００μMの濃度において)のみが、α1及びα1β受容体の両方を、１０００μMのグリシンにより誘発された最大応答の３０％まで直接的に活性化した。
これらの結果は、直接的活性化は２個以上のメチル基を有する化合物の高濃度においてのみ観察されるが、グリシン受容体機能をプラスに調節するフェノール化合物の潜在力の重大な構造上の特徴はpara位におけるハロゲン化であることを示す。βサブユニットの存在は両方の作用に必要とされない。
【００３４】
実施例２
本発明者らは実施例１で要約した予備的な研究を展開して、鎮痛薬としてのフェノール誘導体の有効性を更に改良しようと努力した。彼らは多くのプロポフォールの誘導体を設計して試験し、驚いたことには、フェノール環上の2、3、5及び6位の置換基の種類(すなわち、一般式IのR1、R2、R4及びR5)が化合物のグリシン受容体選択性及びグリシン誘導体を活性化する効果に有意な影響を及ぼすことを見出した。これらの実験により、本発明の第一の面による化合物の有用性が明確に理解された。本発明による好ましい化合物のデータを、説明の目的で以下に提供する。驚くべきことに、これらの化合物は、nM範囲のグリシン受容体の共活性化のEC50値を有する。
グリシン受容体活性化(したがって疼痛制御)に関する多くの更なるハロゲン化プロポフォール誘導体の有効性を研究するために、実施例１で使用した実験手順を繰り返した。
本発明者らは、R1、R2、R4及びR5の２以上が２乃至１３個の炭素原子のアルキル基からなる一般式Iの化合物がグリシン受容体を調節するのに特に有効であることを立証した。そのような化合物は、本発明による使用の特に好ましい化合物であり、R1、R2、R4及び/またはR5にメチル基を有する一般式Iによる化合物より一層良好な鎮痛薬の性質を示した(上記参照)。
好ましい化合物である4-クロロプロポフォール、4-ブロモプロポフォール及び4-ヨードプロポフォールの説明に役立つデータを以下に示す。
２．１：4-クロロプロポフォール
【００３５】
4-クロロプロポフォール(4-クロロ-2,6-ジイソプロピルフェノール)を用い、実施例１において実施した実験を繰り返した。
図９は、4-クロロプロポフォールを１０μMのグリシンと併用したときの１０μMのグリシンに対する電流応答の共活性化を示す典型的な電流の図形(上から３番目、４番目、５番目及び６番目の電流の図形)を示す。最初の図形は、最大上のグリシン濃度(１０００μM)により誘発された電流を示す。ラットからのグリシン受容体のa-サブユニットは、HEK293細胞においてヒトのβサブユニットとともに共発現した。小さな細胞は、超高速アプリケーションデバイスを用い、全細胞モードで研究した。
図１０は、4-クロロプロポフォールによる１０μMのグリシンに対する電流応答の共活性化の濃度依存性(平均/SD、ｎ＝６)を示す。図１０に提示された結果は、図１１に示されたデータを提供するために図１０に示されたデータを提供するために実施された試験を繰り返すことにより裏付けられた。したがって、図１１もまた、4-クロロプロポフォールによる１０μMのグリシンに対する電流応答の共活性化の濃度依存性(平均/SD、ｎ＝５)を示す。図１０及び１１から、１乃至１００nMの濃度範囲で共活性化効果が観察されることに注目されたい。共活性化効果は、それより高濃度(≧１０００μM)では抑制効果により無効になる。１０μMより高濃度におけるピーク電流の大きさの下降は、たぶん比較的高い濃度における開いたチャネル遮断、すなわちプロポフォールに関して記載された現象のためである。ラットからのグリシン受容体のa-サブユニットは、HEK293細胞においてヒトのβサブユニットとともに共発現した。小さな細胞は、超高速アプリケーションデバイスを用い、全細胞モードで研究した。
【００３６】
図１２は、一番上の、最大上のグリシン濃度(１０００μM)により誘発された電流に対する、天然の作動薬であるグリシンの不在下における4-クロロプロポフォールにより誘発された電流の図形(上から２番目、３番目及び４番目の図形)を示す。ラットからのグリシン受容体のa-サブユニットは、HEK293細胞においてヒトのβサブユニットとともに共発現した。小さな細胞は、超高速アプリケーションデバイスを用い、全細胞モードで研究した。
これらのデータはまた、発現系としてHEK293の代わりに卵母細胞を用いた実験で確認された。
図１３は、それ自身の最大応答(○)または１０００μMグリシンにより誘発された最大応答(●)に対して正規化された4-クロロプロフォールにより直接的に活性化された電流(平均±SD、ｎ＝４)を示す。実線は示されたパラメータを用いたデータへのHillフィットである。直接的活性化効果は、共活性化効果より１０００倍高い濃度において観察されることに注目されたい。
【００３７】
２．２：4-ブロモプロポフォール
4-ブロモプロポフォール(4-ブロモ-2,6-ジイソプロピルフェノール)を用い、実施例１において実施した実験を繰り返した。
図１４は、4-ブロモプロポフォールを１０μMのグリシンと併用したときの１０μMのグリシンに対する電流応答の共活性化を示す典型的な電流の図形(上から３番目、４番目、５番目及び６番目の電流の図形)を示す。最初の図形は、最大上のグリシン濃度(１０００μM)により誘発された電流を示す。ラットからのグリシン受容体のa-サブユニットは、HEK293細胞においてヒトのβサブユニットとともに共発現した。小さな細胞は、超高速アプリケーションデバイスを用い、全細胞モードで研究した。
図１５は、4-ブロモプロポフォールによる１０μMのグリシンに対する電流応答の共活性化の濃度依存性(平均/SD、ｎ＝５)を示す。図１５から、１乃至１００nMの濃度範囲で共活性化効果が観察されることに注目されたい。共活性化効果は、それより高濃度(≧１０００μM)では抑制効果により無効になる。
図１６は、一番上の、最大上のグリシン濃度(１０００μM)により誘発された電流に対する、天然の作動薬であるグリシンの不在下における4-ブロモプロポフォールにより誘発された電流の図形(上から２番目、３番目及び４番目の図形)を示す。ラットからのグリシン受容体のa-サブユニットは、HEK293細胞においてヒトのβサブユニットとともに共発現した。小さな細胞は、超高速アプリケーションデバイスを用い、全細胞モードで研究した。
図１７は、それ自身の最大応答(○)または１０００μMグリシンにより誘発された最大応答(●)に対して正規化された4-ブロモプロフォールにより直接的に活性化された電流(平均±SD、ｎ＝４)を示す。実線は示されたパラメータを用いたデータへのHillフィットである。直接的活性化効果は、共活性化効果より１０００倍高い濃度において観察されることに注目されたい。
【００３８】
２．３：4-ヨードプロポフォール
4-ヨードプロポフォール(4-ヨード-2,6-ジイソプロピルフェノール)を用い、実施例１において実施した実験を繰り返した。
図１８は、4-ヨードプロポフォールを１０μMのグリシンと併用したときの１０μMのグリシンに対する電流応答の共活性化を示す典型的な電流の図形(上から３番目、４番目、５番目及び６番目の電流の図形)を示す。最初の図形は、最大上のグリシン濃度(１０００μM)により誘発された電流を示す。ラットからのグリシン受容体のa-サブユニットは、HEK293細胞においてヒトのβサブユニットとともに共発現した。小さな細胞は、超高速アプリケーションデバイスを用い、全細胞モードで研究した。
図１９は、4-ヨードプロポフォールによる１０μMのグリシンに対する電流応答の共活性化の濃度依存性(平均/SD、ｎ＝４)を示す。図１９から、１乃至１００nMの濃度範囲で共活性化効果が観察されることに注目されたい。共活性化効果は、それより高濃度(≧１０００μM)では抑制効果により無効になる。
図２０は、一番上の、最大上のグリシン濃度(１０００μM)により誘発された電流に対する、天然の作動薬であるグリシンの不在下における4-ヨードプロポフォールにより誘発された電流の図形(上から２番目、３番目及び４番目の図形)を示す。ラットからのグリシン受容体のa-サブユニットは、HEK293細胞においてヒトのβサブユニットとともに共発現した。小さな細胞は、超高速アプリケーションデバイスを用い、全細胞モードで研究した。
【００３９】
図２１は、それ自身の最大応答(○)または１０００μMグリシンにより誘発された最大応答(●)に対して正規化された4-ヨードプロフォールにより直接的に活性化された電流(平均±SD、ｎ＝４)を示す。実線は示されたパラメータを用いたデータへのHillフィットである。直接的活性化効果は、共活性化効果より１０００倍高い濃度において観察されることに注目されたい。
図１２、１３、１６、１７、２０及び２１は、天然の伝達物質であるグリシンの不在下において提供された2,6-ジイソプロピルフェノールの4-クロロ、4-ブロモ及び4-ヨード誘導体の作用に関する実験データを提供する。３種の化合物は、１桁のμM範囲のEC50の値、すなわち、グリシンの存在下におけるより１０００倍大きい値を示した(図１１、１５及び１９を参照されたい)。本発明者らはいずれかの特定の理論により束縛されたくはないが、これらの試験結果は、３種の4-ハロプロポフォール誘導体が直接的効果を示さないというより、グリシン受容体のゲートに及ぼす天然の伝達物質の効果を調節するということを示唆する。
【００４０】
２．４更なる実験データ
本発明による化合物の有効性を確認した4-クロロプロポフォールについて更なる実験を実施した。これらの実験には以下の実験が含まれる。
(a)予備的な実験において、１００nMの4-クロロプロポフォールは、アフリカツメガエルの卵母細胞中で発現した組み換えグリシンα1受容体により媒介されたグリシン(EC10)誘発電流を大きく増強した。これらのデータは、ヒトの細胞株(HEK 293)において発現した組み換え受容体に及ぼす4-クロロプロポフォールの影響に関するデータを支持するが、完全に異なる発現系を使用している。
(b)ラットの生体外脊髄製剤を用いる更なる一連の予備的な実験において、１００nM〜１μMの4-クロロプロポフォールは、sIPSC(シナプスのグリシン受容体により媒介された)の延長及び持続性のコンダクタンス(シナプス以外のグリシン受容体により媒介された)の増大を引き起こした。重要なことには、これらのデータは、ヒトの細胞株並びにアフリカツメガエルの卵母細胞中で発現した組み換え受容体に関して報告された4-クロロプロポフォールの強力な作用が神経環境中の天然のグリシン受容体に関して再現されることを示唆する。
【００４１】
実施例３
３．１序
アフリカツメガエルの幼生のリズミカルな泳ぎ挙動(図２２Ａ)は、移動運動を制御する脊髄神経ネットワークを探求する有力なモデル系として認められている。泳ぎの強さ、振動数及び継続期間は２つの阻害経路、すなわち、泳ぎを停止させる下行脳幹GABA経路及び泳ぎ中に達成される繰返し周期を制御する脊髄グリシン作動性経路により調節される。GABA経路の増強作用が泳ぎエピソードの継続時間を低下させ、グリシン作動性経路の増強作用(すなわち、ノルアドレナリンまたは酸化窒素による)が繰返し周期を増大させて泳ぎの振動数を減速させる。
本発明者らは、GABA受容体またはグリシン受容体のいずれかを調節する化合物の相対的な有効性を評価するのにこのモデルを利用しうることに気がついた。したがって、彼らは、本発明による疼痛の調節に有効な化合物をスクリーニングする方法として、以下に記載する試験を開発することができた。
一般的な麻酔薬であるエトミデート及びプロポフォールは、CNS内でGABA作動性シナプス経路を増強することによりアフリカツメガエルの幼生における泳ぎ行動に阻害効果を発揮することを示した。プロポフォールはまたより高濃度(４０μM)においてシナプス後のグリシン受容体における作用により効果を媒介することを示した。このことは、プロポフォールがこの系においてGABAAの強力なアロステリック調節剤であるばかりでなく、グリシン受容体においても作用することを示した。
本研究においては、動けなくされた幼生において仮想の泳ぎに及ぼす4-クロロプロポフォール(本発明の第一の面による化合物)の作用を試験するためにアフリカツメガエルの卵母細胞を使用した。最初に、プロポフォールと比較したその麻酔薬の性質を決定するために4-クロロプロポフォールを受容体拮抗薬の不在下で使用し、次いで、それぞれビククリン及びストリキニーネを用いプロポフォールとGABA及びグリシン受容体の相互作用を評価した。
【００４２】
３．２方法
ステージ３７/８の幼生(図２２Ａi)は、α-ブンガロトキシンで動けなくされ、記録室内に取り付けられたSylgardブロック上に確保されて、カエルリンガー(ringer)で再循環させた。胴体の左及び右側のわき腹の皮膚を除去して、腹側の根にある筋節間の裂け目を暴露し、３つのガラス吸引電極は、左側の吻側及び尾側の位置及び右側の吻側の位置にあり(図２２Ａiii)、“仮想の”泳ぎを記録した(図２２Ｂ)。泳ぎ行動は、四番目のガラス吸引電極より尾の皮膚に加えられた短い１ミリ秒の電流パルスにより誘発された。薬物は直接漕に添加された。データはCED 1401インターフェースを用いてデジタル化し、スパイク2ソフトウェアを用いて表示し、Dataviewソフトウェア(Courtesy of W.J., Heitler, University of St. Andrews)を用いて分析した。
【００４３】
３．３結果
３．３．１：4-クロロプロポフォールは仮想泳ぎを調節する
図２３は、仮想泳ぎに及ぼす１０μMの4-クロロプロポフォールの影響を示す。4-クロロプロポフォールは泳ぎ中の繰返し周期を有意に増大させ(図２３ＡiとＡiiを比較されたい；各エピソードの終了時から抜粋)、その効果は各エピソード中持続し(図２２Ｂ)、対照生理食塩水に戻すことにより部分的ではあるが有意に逆転した。５回の実験のデータから繰返し周期は平均で約２０％増大する。吻側−尾側及び左側−右側遅延もそれぞれ８％及び１９％増大した(図示せず)が、エピソード継続時間に有意な差はなかった(図２４Ｂ)。生理食塩水洗浄は、繰返し周期に及ぼすこれらの効果を２５〜３０％、吻側−尾側遅延は１２％及び左側−右側遅延は２２％逆転させた。泳ぎ中に達成される繰返し周期は、一部は相反するグリシン作動性の阻害の強さにより規制されるので、これらの結果は、１０μMの4-クロロプロポフォールのグリシン作動性神経伝達を増強する能力を示し、したがって、本発明による化合物がグリシン受容体において良好な活性を有することを示す。更に、エピソード継続時間に及ぼす有意な影響の欠如は、4-クロロプロポフォールがGABA作動性神経伝達にはまったくまたはわずかしか影響を及ぼさないことを示唆する。このことは、本発明の第一の面による化合物が、生体内モデルにおいてGABA受容体よりグリシン受容体に対して良好な選択性を有するので、疼痛の管理に関して有用であることを示す。4-クロロプロポフォールの選択性は、この系における麻酔薬プロポフォールのGABAに及ぼす一層有効な効果とは対照的である。しかしながら、麻酔薬の作用を更に確立するために、その後の実験は最初にGABAA受容体次いでグリシン受容体に対して拮抗薬(それぞれ、ビククリンメチオジド及びストリキニーネ)を使用した。
【００４４】
３．３．２：4-クロロプロポフォール効果はGABAA受容体遮断に耐性を示す
図２５は、GABAA受容体を遮断するために４０μMのビククリンメチオジドに暴露させた後(A)、ビククリンの存在下において１０μMの4-クロロプロポフォールを添加した後(B)の腹側の根の行動の抜粋を示す。繰返し周期に及ぼす4-クロロプロポフォールの影響は、明らかにGABAA受容体の遮断後に持続された。この実験においては、4-クロロプロポフォールがエピソードの継続時間を平均２秒、及び繰返し周期をエピソードの開始時に８．２分(ＡiをＢiと比較されたい)及びエピソードの終了時に２０．３分(ＡiiをＢiiと比較されたい)増大させた。ビククリン洗浄(図示せず)では、エピソードの継続時間を２秒及びエピソードの開始時の繰返し周期を２分減少させたが、エピソードの終了時に繰返し周期を更に６．５分増大させた。ビククリンは、平均繰返し周期が５０．３分の迅速な泳ぎの短いエピソードを提供するが、4-クロロプロポフォール添加の２０分後には平均繰返し周期は６１．３分に増大するが、効果はビククリンメチオジドの洗浄により逆転して５４．５分となった。
これらの結果は、１０μMの４-クロロプロポフォールが、GABAA受容体とは異なる阻害受容体の増強によりその作用の大部分を媒介することを示す。グリシン受容体が重要な役割を果たすことを確認するために、次いで１μMのストリキニーネを使用した。
【００４５】
３．３．３：4-クロロプロポフォールはグリシン作動性経路を増強する
ビククリンの存在下における4-クロロプロポフォールによる繰返し周期の長期化は、以下の実験が強い根拠となる証拠を提供する、化合物のグリシン作動性伝達に及ぼす作用を示唆する。図２７は、１μMのストリキニーネ使用の２０分後(Ａi)及び１０μMの４-クロロプロポフォール使用の４０分後(Ａii)の腹側の根の行動の抜粋を示す。化合物の存在下(図２７Aii)では、エピソードの継続時間は１７秒減少した(Ａ)が、繰返し周期はエピソードの開始時に平均０．５分だけ増大し(Ｂi)、エピソードの終了時に平均３．４分減少した(Ｂii)。ストリキニーネの洗浄(図示せず)はエピソードの継続時間を２秒増大させ(Ａ)、エピソードの開始時(Ｂi)及び終了時(Ｂii)の繰返し周期をそれぞれ３分及び５．４分減少させた。図２７Ｂは、泳ぎのエピソード中の繰返し周期に及ぼす4-クロロプロポフォールの影響の欠如を示す。化合物を１μMのストリキニーネ存在下で使用するときの仮想泳ぎの４つのパラメータに及ぼす影響を調べるのに集計されたデータ(ｎ＝３)を使用した。4-クロロプロポフォールは繰返し周期を著しくではないが２％未満減少させ、ストリキニーネの洗浄により更に３％減少させた。エピソードの継続時間(Ｂ)または左側−右側遅延(Ｄ)に及ぼす4-クロロプロポフォールにより媒介される影響はほとんどまたはまったくなかった。
【００４６】
３．３．４要約
１０μMの濃度において、4-クロロプロポフォールは、グリシン作動性経路により媒介され、拮抗薬ビククリンメチオジド(４０μM)及びストリキニーネ(１μM)の使用前後に仮想泳ぎのパラメータに及ぼす効果により支持された疎外作用を増強する。単独で使用される場合には、化合物は、繰返し周期、吻側−尾側及び左側−右側遅延の増大をもたらし、エピソードの継続時間を変化させない阻害経路の増強により仮想泳ぎを阻害する。GABAA受容体を４０μMのビククリンメチオジドで遮断した後、4-クロロプロポフォールは仮想泳ぎに同様な影響を与えて、洗浄により逆転した効果とほぼ同じ百分率で繰返し周期及び左側−右側遅延を増大し続ける。この場合もエピソードの継続時間にはほとんど変化がないが、これらの実験では吻側−尾側遅延が明らか減少した。4-クロロプロポフォールのグリシン作動性神経伝達を増強する能力を決定するために、グリシン受容体を遮断するのに１μMのストリキニーネを使用した。化合物または洗浄により繰返し周期がわずかに減少し、エピソードの継続時間にも左側−右側遅延にも変化はなく、吻側−尾側遅延がわずかに上昇しただけであった。これらの結果は、グリシン作動性経路の増強による及びそれより程度は少ないがGABA作動性神経伝達の増強による仮想泳ぎを阻害する4-クロロプロポフォールの能力を支持する証拠を提供する。
【００４７】
３．４考察
ステージ３７/８のアフリカツメガエルの幼生の仮想泳ぎは、主として脊髄内に位置する中枢パターン発生器(CPG)により調整されている。このネットワークは、下行及び交連介在ニューロン、及び運動ニューロンを含む。脊髄の両側にあるこれらのニューロンは厳密に交互に発火し、それにより両側の交互の筋収縮を提供する。泳ぎの励起は、グルタミン酸作動性下行介在ニューロンにより引き起こされる。左側−右側交代は、CPGの各半分の中心の周期の中ほどの相反する阻害を媒介するグリシン作動性交連介在ニューロンの働きによりもたらされる。仮想泳ぎのエピソードは自然にまたはGABAA受容体を活性化するために脊髄中にGABAを放出する吻側のセメント腺への圧力により活性化されたGABA作動性の中後脳の網様体脊髄路のニューロンにより終了する。この研究の目的は、ステージ３７/８のアフリカツメガエルの幼生のCNS内の抑制性神経伝達に及ぼす4-クロロプロポフォールの効果を決定することである。
【００４８】
３．４．１：4-クロロプロポフォールは仮想泳ぎを阻害する
4-クロロプロポフォール(本発明の第一の面による化合物)は麻酔薬プロポフォールの誘導体であり、GABAA及びグリシン受容体を増強し、それにより仮想の泳ぎを阻害する抑制作用をアフリカツメガエルの幼生のCNSに及ぼすことが期待される。しかしながら、この実施例で論じられるように、4-クロロプロポフォールは、グリシン受容体(仮想の泳ぎを阻害すると分析された)に対する選択性を示し、それにより鎮痛薬としての4-クロロプロポフォールの有用性を示す、はっきりと識別できる効果を有することが見出された。
最初の組の実験は、１０μMの4-クロロプロポフォールの効果を研究する。集めたデータ(ｎ＝５)は、繰返し周期、吻側−尾側及び左側−右側遅延の増大を示したが、エピソードの継続時間の変化は示さなかった。生理食塩水中での洗浄後、これらのパラメータを測定すると対照の値に戻った。主要な効果は泳ぎの振動数の低下であった。
プロポフォールはGABA作動性神経伝達をグリシン作動性神経伝達より大きく増強し、この証拠から当業者は4-クロロプロポフォールもGABAA伝達を増強してそれにより麻酔薬として作用すると推測した。しかしながら、その後の実験は、４０μMのビククリンメチオジドの存在下における１０μMのp-Cl-プロポフォールの効果を調査し、この場合は驚くべきことにそうではないことを示した。この実験においては、4-クロロプロポフォールは、繰返し周期は同様に増大するがエピソードの継続時間は変化しない、対照生理食塩水を化合物と比較した前述の実験と同様な結果を示した。繰返し周期に及ぼす効果はビククリン単独に戻すと可逆的であった。このことから、4-クロロプロポフォールは、GABAA受容体とのアロステリックな結合相互作用による仮想泳ぎの振動数にその影響を及ぼさないと結論しうる。その代わりに4-クロロプロポフォールはグリシン受容体上のアロステリックなサイトと結合し、これらの阻害経路を増強し、その結果として仮想泳ぎの振動数を低下させる。
【００４９】
最後の組の実験は、4-クロロプロポフォール、及び本発明によるその他の化合物が、グリシン受容体を１μMのストリキニーネで予め遮断し、次いで化合物を使用することによりグリシン作動性神経伝達を増強するという仮説を試験した。結果(ｎ＝３)は、4-クロロプロポフォールの繰返し周期に及ぼす効果がストリキニーネにより遮断されることを示した。繰返し周期は4-クロロプロポフォールの添加後に２％未満減少し、ストリキニーネの洗浄で更に１％減少した。4-クロロプロポフォールが存在する場合には、エピソードの継続時間または左側−右側遅延に変化はなかった。これらの結果は、グリシン作動性阻害の増大により１０μMの4-クロロプロポフォールが繰返し周期、吻側−尾側遅延及び左側−右側遅延を増大させることを示す。
【００５０】
３．５結論
4-クロロプロポフォールは、アフリカツメガエルの幼生の仮想泳ぎの振動数を減少させ、その効果は各エピソード中持続する。しかしながら、各エピソードの継続時間は有意には影響を受けなかった。これらの効果は、グリシン作動性神経伝達の増強により説明され、生体内モデルにおいて、本発明による化合物が、麻酔薬として有用であるプロポフォールのGABA選択性よりむしろグリシン受容体選択性であり、それゆえ鎮痛薬として有用であろうということを示す。
グリシン作動性阻害の強さの変化は、泳ぎの周波数に強力に影響することが知られている。例えば、阻害の低下(例えば、グリシンの使用による)は泳ぎの周波数を増大させ、グリシン作動性シナプシスの増強(例えば、ノルアドレナリンまたは酸化窒素を用いた)は泳ぎの周波数を低下させる。4-クロロプロポフォールの効果は、i)エピソードの継続時間に有意には影響を及ぼさない、及びii)効果はGABAA受容体を遮断するのに十分な濃度のビククリンの存在下において持続する、という理由で、GABA神経伝達に及ぼす影響により説明できない。これに対し、ストリキニーネの使用は4-クロロプロポフォールの泳ぎに及ぼす効果を遮断する。
4-クロロプロポフォールのこれらの効果は、低濃度(１μM)においてはGABAA受容体における作用により泳ぎを阻害するが、それより高い濃度(４０μM)においてはグリシン受容体の増強により影響を及ぼすプロポフォールとは異なる主要な作用サイトを示す。4-クロロプロポフォールは、１０μMではGABAA受容体において無視しうる効果しか示さないと思われるが、グリシン受容体にはこの濃度において強力な影響を及ぼす。このことは明らかに、プロポフォールと比較して本発明による化合物の驚くべき受容体選択性を示す。
【００５１】
実施例４
本発明者らは、本発明による化合物の有効性を更に評価するために生体内疼痛モデルを開発した。
４．１方法
化合物が鎮痛薬の性質を有するか否かを試験するために、約２５０gのオスのSprague-Dawleyラットを使用した。
４．１．１予備実験
試験動物に、標準的な手順に従って髄腔内カニューレ挿入(IC)により投与された試験化合物または賦形剤で慢性収縮損傷(CCI)を受けさせる。
試験は２つの実験グループ(ｎ＋６/群)について実施する。
CCI＋髄腔内カニューレ挿入(IC)＋賦形剤
CCI＋髄腔内カニューレ挿入(IC)＋最高３回の投与
動物に、賦形剤及び化合物に関する毒性の徴候がないかどうか監視する。動物の挙動もまた評価する。
４．１．２主実験
神経障害性疼痛(坐骨神経のゆるい結さつ)のBennettモデル(当業者に公知である)を使用する。
結果判定法は、Frey or paw pressureによる熱である(Randell & Selitto (1957) Arch Int Pharmacodyn  4: p409-421に記載されている)。
賦形剤；化合物投与１；化合物投与２；化合物投与３；陽性の対照(ガバペンチン１００mg/kg/日)を含む５群(各群はｎ＝８)について試験する。
損傷後(７日後)のベースラインにおける値を得る。次いで小型の浸透圧ポンプにより連続的な髄腔内薬物投与を開始する。８、１０及び１４日後に更に３回の挙動試験を実施する。
４．２結果
本発明者らは、本発明による化合物がRandell & Selitto試験基準による鎮痛薬の性質を有することを期待する。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】上から下まで実施例１において試験したフェノール誘導体、すなわち、フェノール性ヒドロキシル基に対してortho位にメチル基を有する化合物、meso位に単一のメチル基を有する化合物及びそのハロゲン化類似物、及びmeso位に２個のメチル基を有する化合物及びそのハロゲン化類似物の化学構造を示す。
【図２】Ａ：同一の実験において１０００μMのグリシンにより誘発された電流(上方の図形)に対する3,5-ジメチルフェノールまたは2,6-ジメチルフェノールの２秒間の使用により誘発された典型的な電流の図形であり、各々α1同価同義またはα1βグリシン受容体のいずれかを発現するHEK 293細胞の一から得られた図形である。Ｂ：実施例１に論じられているように、対数目盛の3,5-ジメチルフェノール(上方の図)または2,6-ジフメチルフェノール(下方の図)の濃度に対してプロットした、グリシンの不在下においてα1同価同義(三角)またはα1β(丸)グリシン受容体(それぞれ平均±SD；ｎ＝３)で活性化された正規化Cl-電流の図であり、電流は高濃度(３０００μM)の化合物により達成された最大値または１０００μMのグリシンにより達成された最大値に対して正規化されており(それぞれ、▲及び●または△及び○)、実線は示されたパラメータを用いたデータへのHillフィットであり、濃度−応答プロットはα1同価同義及びα1βグリシン受容体に関してほぼ重ね合わせることができ、ortho-及びmeso-メチル化化合物間の差は観察されないであろう。
【図３】実施例１に言及されているように、グリシンの濃度に対してプロットした、α1同価同義(三角)またはα1β(丸)グリシン受容体(平均±SD；各々ｎ＝３)でグリシンにより活性化された正規化Cl-電流の図であり、実線は示されたパラメータを用いたデータへのHillフィットである。
【図４】実施例１に記載されているように、α1β異価同義受容体におけるそれぞれの対照実験において１０００μMのグリシンにより誘発された電流(上方の図形)に対する１０μMのグリシン及び(左から右へ)2-メチルフェノール、3-メチルフェノール、及び3-メチル-4-クロロフェノールの２秒間の併用により誘発された典型的な電流の図形であり、すべての化合物は１０μMのグリシンにより誘発された応答の大きさを増大させ、ハロゲン化化合物(右の図形)においては低いμM濃度範囲でこの効果が観察された。
【図５】実施例１に記載されているように、α1β異価同義受容体におけるそれぞれの対照実験において１０００μMのグリシンにより誘発された電流(上方の図形)に対する１０μMのグリシン及び(左から右へ)2,6-ジメチルフェノール、3,5-ジメチルフェノール、及び3,5-ジメチル-4-クロロフェノールの２秒間の併用により誘発された典型的な電流の図形であり、ハロゲン化化合物(右の図形)は低いμM濃度範囲で共活性化効果を示した。
【図６】実施例１に記載されているように、１０００μMのグリシンにより誘発された電流(上方の図形)に対する１０μMのグリシン及び3,5-ジメチルフェノール(上の図形)、3-メチルフェノール(下の図形)、またはそれぞれのハロゲン化類似物(右の図形)の２秒間の併用によりα1同価同義受容体で誘発された典型的な電流の図形であり、１０μMのグリシンにより誘発された効果はα1β異価同義受容体におけるよりα1同価同義受容体におけるほうが高く(図３および４の図形と比較されたい)、α1同価同義受容体におけるフェノール誘導体の共活性化効果はα1β異価同義受容体と同様な濃度範囲で観察される。
【図７】実施例１に記載されているように、対数目盛の濃度に対してプロットされた、α1β異価同義受容体における各化合物による１０μMグリシンにより誘発された電流の増強(％)を示し、実線は表１に示されたパラメータを用いたデータへのHillフィットであり、半数影響共活性化応答に必要な濃度は非ハロゲン化構造類似物と比較してハロゲン化化合物のほうが有意に小さく(ｐ＜０．０００１)、最大増強度に関して化合物間に有意な差異はなく、3-メチルフェノールに関して観察された増強効果のみが2-メチルフェノールより高かった(ｐ＝０．０４)が、2-メチルフェノールを用いた実験に対して3-メチルフェノールを用いた実験におけるグリシン１０μMへの応答のほうが低い結果であろう。
【図８】実施例１に記載されているように、１０００μMのグリシンとの併用中にピーク電流の大きさが低下することにより示される、それぞれ６００及び３００μMより高濃度の3-メチル-4-クロロフェノール(左の図)及び3,5-ジメチル-4-クロロフェノール(右の図)により誘導される抑制効果、使用中の電流減衰の濃度依存性加速、その後の使用の終了時のチャネルの再開を示す。
【図９】実施例２に論じられているように、4-クロロプロポフォールを１０μMのグリシンと併用したときの１０μMのグリシンに対する電流応答の共活性化を示す典型的な電流の図形(上から３番目、４番目、５番目及び６番目の電流の図形)を示し、最初の図形は、最大上のグリシン濃度(１０００μM)により誘発された電流を示す。
【図１０】実施例２に論じられているように、4-クロロプロポフォールによる１０μMのグリシンに対する電流応答の共活性化の濃度依存性(平均/SD、ｎ＝６)を示す。
【図１１】実施例２に論じられているように、4-クロロプロポフォールによる１０μMのグリシンに対する電流応答の共活性化の濃度依存性(平均/SD、ｎ＝５)を示し、実線は示されたパラメータを用いたデータへのHillフィットである。
【図１２】実施例２に論じられているように、一番上の、最大上のグリシン濃度(１０００μM)により誘発された電流に対する、天然の作動薬であるグリシンの不在下における4-クロロプロポフォールにより誘発された典型的な電流の図形(上から２番目、３番目及び４番目の電流の図形)を示す。
【図１３】実施例２に言及されているように、グリシンの濃度に対してプロットされた、それ自身の最大応答(○)または１０００μMグリシンにより誘発された最大応答(●)に対して正規化された4-クロロプロフォールにより活性化された正規化Cl-電流(平均±SD、ｎ＝４)を示し、実線は示されたパラメータを用いたデータへのHillフィットである。
【図１４】実施例２に論じられているように、4-ブロモプロポフォールを１０μMのグリシンと併用したときの１０μMのグリシンに対する電流応答の共活性化を示す典型的な電流の図形(上から３番目、４番目、５番目及び６番目の電流の図形)を示し、最初の図形は、最大上のグリシン濃度(１０００μM)により誘発された電流を示す。
【図１５】実施例２に論じられているように、4-ブロモプロポフォールによる１０μMのグリシンに対する電流応答の共活性化の濃度依存性(平均/SD、ｎ＝５)を示し、実線は示されたパラメータを用いたデータへのHillフィットである。
【図１６】実施例２に論じられているように、一番上の、最大上のグリシン濃度(１０００μM)により誘発された電流に対する、天然の作動薬であるグリシンの不在下における4-ブロモプロポフォールにより誘発された典型的な電流の図形(上から２番目、３番目及び４番目の図形)を示す。
【図１７】実施例２に言及されているように、グリシンの濃度に対してプロットされた、それ自身の最大応答(○)または１０００μMグリシンにより誘発された最大応答(●)に対して正規化された4-ブロモプロフォールにより活性化された正規化Cl-電流(平均±SD、ｎ＝４)を示し、実線は示されたパラメータを用いたデータへのHillフィットである。
【図１８】実施例２に論じられているように、4-ヨードプロポフォールを１０μMのグリシンと併用したときの１０μMのグリシンに対する電流応答の共活性化を示す典型的な電流の図形(上から３番目、４番目、５番目及び６番目の電流の図形)を示し、最初の図形は、最大上のグリシン濃度(１０００μM)により誘発された電流を示す。
【図１９】実施例２に論じられているように、4-ヨードプロポフォールによる１０μMのグリシンに対する電流応答の共活性化の濃度依存性(平均/SD、ｎ＝４)を示し、実線は示されたパラメータを用いたデータへのHillフィットである。
【図２０】実施例２に論じられているように、一番上の、最大上のグリシン濃度(１０００μM)により誘発された電流に対する、天然の作動薬であるグリシンの不在下における4-ヨードプロポフォールにより誘発された典型的な電流の図形(上から２番目、３番目及び４番目の図形)を示す。
【図２１】実施例２に言及されているように、グリシンの濃度に対してプロットされた、それ自身の最大応答(○)または１０００μMグリシンにより誘発された最大応答(●)に対して正規化された4-ヨードプロフォールにより活性化された正規化Cl-電流(平均±SD、ｎ＝４)を示し、実線は示されたパラメータを用いたデータへのHillフィットである。
【図２２Ａ】実施例３にしたがって使用したオタマジャクシを示す。
【図２２Ｂ】吻側、反対側及び尾側の位置で記録された仮想泳ぎの説明に役立つ記録を示す。
【図２３】実施例３の３．３．１において論じられているような、オタマジャクシにおける仮想泳ぎに及ぼす4-クロロプロポフォールの影響を示す。
【図２４】実施例３の３．３．１において論じられている集計されたデータを示す。
【図２５】実施例３の３．３．２において論じられているような、オタマジャクシにおける腹側の根の行動に及ぼす4-クロロプロポフォール及びビククリンメチオジドの影響を示す。
【図２６】実施例３の３．３．２において論じられている集計されたデータを示す。
【図２７】実施例３の３．３．３において論じられているような、オタマジャクシにおける腹側の根の行動に及ぼす4-クロロプロポフォール及びストリキニーネの影響を示す。
【図１】
0005537033.tif 000005
【図２】
0005537033.tif 000006
【図３】
0005537033.tif 000007
【図４】
0005537033.tif 000008
【図５】
0005537033.tif 000009
【図６】
0005537033.tif 000010
【図７】
0005537033.tif 000011
【図８】
0005537033.tif 000012
【図９】
0005537033.tif 000013
【図１０】
0005537033.tif 000014
【図１１】
0005537033.tif 000015
【図１２】
0005537033.tif 000016
【図１３】
0005537033.tif 000017
【図１４】
0005537033.tif 000018
【図１５】
0005537033.tif 000019
【図１６】
0005537033.tif 000020
【図１７】
0005537033.tif 000021
【図１８】
0005537033.tif 000022
【図１９】
0005537033.tif 000023
【図２０】
0005537033.tif 000024
【図２１】
0005537033.tif 000025
【図２２】
0005537033.tif 000026
【図２３】
0005537033.tif 000027
【図２４】
0005537033.tif 000028
【図２５】
0005537033.tif 000029
【図２６】
0005537033.tif 000030
【図２７】
0005537033.tif 000031