(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチダーゼ阻害剤と共有結合している生理活性ペプチドを含んでなる、ペプチド−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲートであって、
ペプチダーゼ阻害剤と共有結合している前記生理活性ペプチドは、ペプチダーゼ阻害剤とコンジュゲートしていない前記生理活性ペプチドと比べてペプチダーゼ耐性が付与され、前記ペプチダーゼ阻害剤は、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、脈管ペプチダーゼ阻害剤及びジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤からなる群から選択され、前記生理活性ペプチドは、ＧＬＰ−１、エキセンディン及びそれらのアナログからなる群から選択される、該コンジュゲート。
【請求項２】
前記ペプチダーゼ阻害剤が脈管ペプチダーゼ阻害剤又はジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤であって、前記生理活性ペプチドがＧＬＰ−１又はそのアナログである、請求項１記載のコンジュゲート。
【請求項３】
前記ペプチダーゼ阻害剤が脈管ペプチダーゼ阻害剤である、請求項２記載のコンジュゲート。
【請求項４】
前記生理活性ペプチドがＧＬＰ−１（７−３７）である、請求項３記載のコンジュゲート。
【請求項５】
前記ペプチダーゼ阻害剤がジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤であって、前記生理活性ペプチドがＧＬＰ−１（７−３７）である、請求項１記載のコンジュゲート。
【請求項６】
前記ペプチダーゼ阻害剤がアンジオテンシン変換酵素阻害剤であって、前記生理活性ペプチドがエキセンディン又はそのアナログである、請求項１記載のコンジュゲート。
【請求項７】
前記生理活性ペプチドが、配列番号６３〜７３、１９０〜２２５、２９８、３１９−３２４、３４８および３４９のいずれか１つに記載されたアミノ酸配列を含んでなる、請求項１記載のコンジュゲート。
【請求項８】
前記生理活性ペプチドが、配列番号４１〜５９のいずれか１つに記載されたアミノ酸配列を含んでなる、請求項１記載のコンジュゲート。
【請求項９】
前記生理活性ペプチドが、配列番号６３〜７３のいずれか１つに記載されたアミノ酸配列を含んでなる、請求項１記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
前記生理活性ペプチドが、（１４Ｌｅｕ−エキセンディン−４（１−２８））（配列番号７０）である、請求項１記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
患者における、ペプチダーゼ感受性ペプチドの分解を減少させるための医薬組成物の調製のための、請求項１から１０のいずれか１項記載のペプチド−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲートの使用。
【請求項１２】
患者における、生物学的活性を有するペプチダーゼ感受性ペプチドの血漿中濃度を上昇させるための医薬組成物の調製のための、請求項１から１０のいずれか１項記載のペプチド−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲートの使用。
【請求項１３】
代謝性又は心血管系の疾患、障害又は症状を治療又は予防するための医薬組成物の調製のための、請求項１から１０のいずれか１項記載のペプチド−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲートの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本特許出願は、２００６年３月２１日に出願の米国仮特許出願第６０／７８４７９５号の優先権を主張し、その全開示内容を本願明細書に援用する。
【０００２】
（技術分野）本発明は、ペプチド分子、より詳細にはペプチド−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲート分子の提供に関する。本発明はまた、医学分野、特に代謝性及び心血管疾患の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
多くのペプチド及びペプチドホルモン類が、通常の健康的代謝状態の身体的調節に関与している。多くの代謝性疾患及び障害の中核を成しているのは、インシュリン濃度及び血液中ブドウ糖濃度の調節である。血液中ブドウ糖濃度を低下させる多くのホルモン類が、腸内での栄養分の存在及び吸着に応答して胃腸粘膜から放出される。
【０００４】
インシュリン分泌は、腸内分泌細胞によって産生され、インクレチンと呼ばれる、分泌促進ホルモンによって部分的に変調される。インクレチンホルモンであるグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）は、インシュリン分泌に対して促進効果を生じることが示されている、腸細胞により分泌されるペプチドホルモンである。ＧＬＰ−１は、腸のプログルカゴンからプロセシングされて、栄養分により誘発されるインシュリンの放出を促進させる（非特許文献１）。ＧＬＰ−１及び種々の末端切断型ＧＬＰ−１、例えばＧＬＰ−１（７−３６）アミド、及びＧＬＰ−１（７−３７）酸は、インシュリン分泌（インシュリン分泌促進作用）及びｃＡＭＰ形成を促進することが知られている（例えば、非特許文献２から６を参照）。ＧＬＰ−１（７−３７）酸は、Ｃ末端が切断され、アミド化されて、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を形成する。遊離酸ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ及びアミドＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の生物学的効果及び代謝ターンオーバーは識別不可能である。
【０００５】
ＧＬＰ−１（７−３６）アミドは、インスリン感受性を刺激することにより、及び生理学的濃度でブドウ糖により誘発されるインシュリン放出を促進することにより、インシュリン依存型糖尿病患者において顕著な抗糖尿病誘発効果を及ぼす。インスリン非依存型糖尿病患者に投与した場合、ＧＬＰ−１（７−３６）アミドはインシュリン放出を刺激して、グルカゴン分泌を低下させ、胃内容排出を抑制して、ブドウ糖の利用を促進する。この種のペプチドの血清中半減期は非常に短いので、糖尿病の長期にわたる治療のためのＧＬＰ−１タイプの分子の使用は困難である。
【０００６】
活性ＧＬＰ−１の血漿中半減期は＜５分であり、その代謝クリアランス率は約１２−１３分である。ＧＬＰ−１の代謝に関係する主なプロテアーゼは、Ｎ末端Ｈｉｓ−Ａｌａジペプチドを切断し、その結果、ＧＬＰ−１受容体の不活性な、弱いアゴニスト又はアンタゴニストとして様々に記載される、代謝産物ＧＬＰ−１（９−３７）ＯＨ又はＧＬＰ−１（９−３６）ＮＨ２を生じる、ジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰ）ＩＶ（ＣＤ２６）である。ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ又はＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２によるＧＬＰ−１受容体の刺激は、アデニル酸シクラーゼの活性化、ｃＡＭＰ合成、膜脱分極、細胞内カルシウム濃度の上昇及びブドウ糖により誘発されたインシュリン分泌の増加をもたらす。
【０００７】
ブドウ糖ホメオスタシスに及ぼすＧＬＰ−１のその他の重要な効果は、グルカゴン分泌の抑制及び胃運動性の抑制である。膵臓α細胞におけるグルカゴン分泌に及ぼすＧＬＰ−１による抑制作用は、糖新生及びグリコーゲン分解の減少を介して、肝臓におけるブドウ糖産生の低下をもたらす。ＧＬＰ−１のこの抗グルカゴン効果は、糖尿病患者において維持されている。ＧＬＰ−１の中心的効果は、食物摂取量の減少と相まった、満腹の増大が挙げられる。
【０００８】
天然のヒトＧＩＰ（胃抑制ペプチド又はブドウ糖に依存するインシュリン分泌性ペプチド）（ＧＬＰ−１と関連している）は、特殊な腸内分泌Ｋ−細胞内で合成され、分泌される単一の４２アミノ酸長ペプチドである。これらの細胞は腸全体にわたって見られ、主に十二指腸及び近位空腸に集中している。ＧＩＰ分泌のための主な刺激となるのは、炭水化物及び脂質の豊富な食事の摂取である。食事摂取の後に、循環血漿中ＧＩＰレベルは、１０〜２０倍に増大する。完全なＧＩＰの半減期は、健常対象において約７．３分及び糖尿病対象において５．２分であると推定される。血清中で、ＧＩＰはＤＰＰ−ＩＶによって分解される。結果として生じる短い生物学的半減期は、ＧＩＰの治療的使用を制限する。
【０００９】
ＧＩＰは、高いグルコース濃度の存在下においては、インシュリン分泌を促進する。このように、内因的に放出されるＧＩＰの効果は、食後のインシュリン分泌の重要な機構であると思われ、絶食状態における役割を果たしているとは思われない。ＧＩＰは、ＩＮＳ−１小島細胞系での研究において、ベータ細胞の増殖及び細胞の生存を促進する。更に、ＧＬＰ−１とは異なり、ＧＩＰは、胃腸運動を抑制することによるというよりむしろ胃内容排出を促進することにより作用すると思われる。
【００１０】
代謝性疾患及び障害に関係するペプチドホルモン類の別のファミリーはアミリンファミリーのペプチドホルモン類であり、例えば、アミリン、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、アドレノメデュリン及びインテルメジン（ＡＦＰ−６とも呼ばれる）が含まれる（非特許文献７参照）。アミリンは、胃腸運動及び胃内容排出を低下させることにより、並びに、食後のグルカゴン分泌及び食物摂取の抑制により、循環中のブドウ糖出現比率を調節する。アミリンは、体重又は体重増加を減らすことが示されている。アミリンは、痛み、骨疾患、胃炎を治療するために、脂質（特にトリグリセリド）を調節するために、又は、脂肪の優先的減少及び脂肪の少ない組織へと骨を惜しむことなど身体組成に影響を及ぼすために用いてもよい。カルシトニン（ＣＴ）は、誘発される高カルシウム血症及びその急速なカルシウム低下効果に応答するその分泌にちなんで命名された。ＣＴは、血漿中カルシウム濃度に影響を及ぼし、破骨細胞機能を抑制して、骨粗鬆症の治療のために広く使われている。治療的に、サケＣＴ（ｓＣＴ）は、最小の副作用で、骨密度を上昇させ、骨折率を低下させると思われる。
【００１１】
カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）は、その受容体が身体（神経系及び心血管系を含む）において広く分布しているニューロペプチドである。このペプチドは、感覚神経伝達を調節すると思われ、強力な内在性血管拡張性ペプチドである。ＣＧＲＰの報告されている生物学的効果には：炎症におけるサブスタンスＰの調節、神経筋接合部のニコチン受容体活性、膵臓酵素分泌の刺激、胃酸分泌の減少、末梢性血管拡張、心臓加速、神経変調、カルシウム代謝調節、骨生成刺激、インシュリン分泌、体温の増加及び食物摂取の減少を含む。ＣＧＲＰの重要な役割は、その強力な血管拡張性作用による、様々な器官への血流を制御することである。うっ血性心不全患者へのＣＧＲＰの長期にわたる注入は、副作用を伴わずに血行動態機能に対する持続した有益な効果を示しており、これは、心不全への使用を示唆している。ＣＧＲＰを使用するその他の適応症には、腎不全、急性及び慢性冠状動脈虚血、心不整脈の治療、レイノー現象などのその他の末梢血管疾患、くも膜下出血、高血圧及び肺高血圧を含む。
【００１２】
血管拡張、細胞増殖、ホルモン分泌の調節及びナトリウム利尿などの一定範囲の生物学的作用で、アドレノメデュリン（ＡＤＭ）は、心血管系、細胞増殖、中枢神経系及び内分泌系に影響を及ぼす（非特許文献８を参照）。ＡＤＭは、下垂体、副腎、生殖器及び膵臓などの内分泌器官に影響を及ぼす。このペプチドは、下垂体からのＡＣＴＨ放出を抑制する役割を果たしていると思われる。副腎において、このペプチドは副腎皮質の分泌活性に影響を及ぼすと思われ、それは副腎の血流を増加させ、副腎血管床における血管拡張物質として作用する。ＡＤＭは女性の生殖器官全体にわたって存在することが示されており、血漿中濃度は通常の妊娠において上昇する。膵臓においては、経口ブドウ糖チャレンジに対してインシュリンの反応を低減し、遅延させ、初期ブドウ糖濃度の上昇をもたらしたことから、ＡＤＭは抑制的役割を果たしている可能性が高い。ＡＤＭは、腎機能にも影響を及ぼし得る。末梢へのボーラス投与は、著しく平均動脈圧を低下することができ、腎臓血流、糸球体濾過率及び尿流を増大させることができる。いくつかの場合においては、Ｎａ＋排出を増加させる場合もある。
【００１３】
既知の骨芽細胞増殖因子（例えば形質転換増殖因子−β）によるのと同等の細胞増殖を増大させるように、胎児及び成体の齧歯類目骨芽細胞にＡＤＭは作用することを研究によっても示されている。肺において、ＡＤＭは、肺血管拡張を引き起こすだけでなく、ヒスタミン又はアセチルコリンにより誘発される気管支収縮も抑制する。健常なボランティアにおいて、ＡＤＭの静脈注入は動脈圧を減らし、心拍数、心拍出量、ｃＡＭＰ、プロラクチン、ノルエピネフリン及びレンニンの血漿中濃度を刺激することが示されている。これらの患者において、観察された尿容量又はナトリウム排出量はほとんど又は全く増加しなかった。心不全又は慢性腎不全患者においては、静注によるＡＤＭは、正常の対象において見られるのと同様の効果を示し、投与される用量に応じて、利尿及びナトリウム利尿をも誘発した（非特許文献９）。実験的ＡＤＭ治療は、動脈及び肺における高血圧、敗血症性ショック及び虚血／再還流障害において有益なことも示した（非特許文献１０）。ＡＤＭ治療に対するその他の適応症には：末梢血管疾患、くも膜下出血、高血圧、前子癇性の妊娠中毒症及び早期分娩、並びに骨粗鬆症を含む。
【００１４】
ＡＦＰ−６（すなわち、インテルメジン）の発現は、主に下垂体及び消化管においてである。Ｉｎ  ｖｉｖｏ研究において、ＡＦＰ−６の投与は、正常の及び本態性高血圧のラット両方の血圧低下をもたらした。マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ投与では、胃内容排出及び食物摂取の抑制をもたらした（非特許文献１１）。
【００１５】
代謝性疾患及び障害に関係するさらに別のペプチドホルモンファミリーはレプチンファミリーである。レプチンは食物摂取及び体重を調節するネガティブフィードバックループにおける求心性シグナルであり、成熟形態の循環レプチンは１４６アミノ酸からなるタンパク質である。
【００１６】
代謝性疾患及び障害に関係する別のペプチドホルモンはコレシストキニン（ＣＣＫ）である。ＣＣＫの報告されている生物学的作用には、膵臓分泌及び膵臓増殖の促進、胆嚢収縮の促進、胃内容排出の遅延、胃酸分泌の抑制、腸運動の促進、インシュリン分泌の促進及び血管拡張を含む。ＣＣＫの作用にはさらに、報告されるところでは、心血管機能、呼吸機能、神経毒性及び発作、癌細胞増殖、無痛覚症、睡眠、性・生殖行動的、記憶、不安症及びドーパミンにより媒介される行動に対する効果を含む。生理的血漿中濃度のＣＣＫは、満腹増大を抑制し、痩せたヒト及び太ったヒト両方における食物摂取を抑制することも報告されている。例えば非特許文献１２及び１３を参照されたい。
【００１７】
代謝性疾患及び障害に関係するペプチドホルモン類の別のファミリーは、膵ポリペプチドファミリー（ＰＰＦ）である。ＰＰＦは、膵ポリペプチド（ＰＰ）、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）及びニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）を含む。これらの３つの関連したペプチドは、様々な生物学的効果を及ぼすことが報告されている。ＰＰの効果は、膵臓分泌の抑制及び胆嚢の緩和を含み、中枢に投与されたＰＰは、視床下部及び脳幹に局在化された受容体により介在され得る摂食の適度の増大をもたらす（非特許文献１４において概説されている）。ＰＹＹの末梢への投与は、報告されているところでは、胃酸分泌、胃運動性、外分泌性の膵臓分泌、胆嚢収縮、及び腸運動性を低下させる（非特許文献１５から１８）。胃内容排出、胃運動性及び胃酸分泌に及ぼすＰＹＹの中枢投与（後大脳／脳幹への又は周辺への注入）の効果は、末梢への注入後に観察される効果とは異なり得る（非特許文献１９から２２）。ＰＹＹは、中枢への投与後、食物及び水分の摂取を促進することが示されている（非特許文献２３及び２４）。
【００１８】
代謝性疾患及び障害は多くの形態を取り、例えば、肥満、糖尿病、異常脂質血症及びインシュリン抵抗性を含む。肥満及びその関連する障害は、米国内及び世界中において、一般的かつ非常に深刻な公衆衛生課題である。上体肥満は、２型糖尿病で知られている最も強い危険因子であり、心血管疾患の強い危険因子である。肥満は、高血圧、アテローム性動脈硬化症、鬱血性心不全、卒中、胆嚢疾患、変形性関節炎、睡眠時無呼吸症、生殖器障害（例えば多嚢胞性卵巣症候群）乳癌、前立腺癌及び直腸癌、並びに、全身麻酔による合併症の発生率増大の認識されている危険因子である（例えば、非特許文献２５参照）。
【００１９】
感染症、静脈瘤、黒色表皮症、湿疹、運動不耐性、インシュリン抵抗、高血圧、高コレステロール血症、胆石症、整形外科的損傷及び血栓塞栓性疾患等の障害と同様に、肥満は、寿命を短くし、上記した併存疾患の深刻な危険度をもたらす（非特許文献２５及び２６）。肥満はインシュリン抵抗症候群又は「Ｘ症候群」及びメタボリックシンドロームと呼ばれている症状群の危険因子でもある。肥満及び関連する障害の世界的な医療費は莫大である。肥満の病因は多因子的に思われるが、基本的な問題は肥満対象の栄養素の利用能にあり、過剰な脂肪組織が存在し続ける間、エネルギー支出はバランスが取れない。肥満は現在、十分には治療可能でない、慢性の、基本的に難治性の代謝性障害である。肥満なヒトの減量において有用な治療薬は、彼等の健康に重大な有益な効果を及ぼし得る。
【００２０】
糖尿病は、インシュリンの不十分な産生又は利用から生じる高血糖及び糖尿によって特徴づけられる炭水化物代謝の障害である。糖尿病は、先進諸国の多くの住民の生活の質に大きく影響を及ぼしている。インシュリンの不十分な産生は１型糖尿病として示され、インシュリンの不十分な利用は２型糖尿病である。しかしながら、患者が顕性糖尿病を有すると診断されるずっと前に、それらの兆候を有する多くの識別可能な糖尿病関連の疾患が存在すると現在広く認識されている。また、糖尿病の糖代謝における次善最適的制御による影響は、広範囲の関連した脂質及び心血管障害を引き起こす。
【００２１】
異常脂質血症、すなわち、血漿中のリポタンパク質の異常な濃度は、糖尿病患者において頻発に起こることである。異常脂質血症は通常、血液中における高い血漿中濃度のトリグリセリド、低ＨＤＬ（高密度リポタンパク質）コレステロール、正常から高い濃度のＬＤＬ（低密度リポタンパク質）コレステロール及び高い濃度の低密度ＬＤＬ粒子によって特徴づけられる。異常脂質血症は、冠動脈イベントの高い発生率及び糖尿病対象の死亡の主因の１つである。糖尿病を罹患していない対象と比較した場合、糖尿病対象における冠状動脈死が数倍増加することを示すことにより、疫学的研究によってこのことを確認している。いくつかのリポタンパク質の異常が、糖尿病対象において説明されている。
【００２２】
インシュリン抵抗とは、幅広い濃度範囲にわたりその生物学的作用を及ぼすインシュリンの低下した能力のことである。インシュリン抵抗では、身体がこの欠陥を補うために異常に高量のインシュリンを分泌し、耐糖能異常の状態を発症する。不完全なインシュリン作用を補えない場合、血漿グルコース値は必然的に上がり、その結果、糖尿病の臨床状態をもたらす。インシュリン抵抗及び相対的高インスリン血症が肥満、高血圧、アテローム性動脈硬化症及び２型糖尿病において寄与的役割を有すると認識されている。インシュリン抵抗の肥満、高血圧及びアンギナとの関連性は、一般的な病理学的関連性としてのインシュリン抵抗を有する症候群（Ｘ症候群）として示されている。
【００２３】
高血圧、すなわち高い血液圧力は、患者の代謝性疾患又は障害と関連しているかもしれないし、していないかもしれない。高血圧は心臓及び血管に影響を及ぼしている最も一般的な疾患であり、統計は、それが５０００万人以上のアメリカ人に起こっていることを示している。高血圧の罹患率は、年齢と共に増加する。高血圧は、それを制御できない状態である場合、心臓、脳及び腎臓に与え得る害のため、大きな懸念事項である。
【００２４】
【非特許文献１】Ｋｒｃｙｍａｎｎ，ら（１９８７）  Ｌａｎｃｅｔ  ２：１３００−１３０３
【非特許文献２】Ｍｏｊｓｏｖ  （１９９２）  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐ．Ｐｒｏ．Ｒｅｓ．４０：３３３−３４３
【非特許文献３】Ｇｕｔｎｉａｋら（１９９２）  Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３２６：１３１６−１３２２
【非特許文献４】Ｎａｕｃｋら（１９９３）  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ３６：７４１−７４４
【非特許文献５】Ｎａｕｃｋら（１９９３）  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：３０１−３０７
【非特許文献６】Ｔｈｏｒｅｎｓら（１９９３）  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４２：１２１９−１２２５
【非特許文献７】Ｗｉｍａｌａｗａｎｓａ（１９９７）  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．  １１：１６７−２３９．
【非特許文献８】Ｈｉｎｓｏｎら２０００）  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２１：１３８−１６７
【非特許文献９】Ｎｉｃｈｏｌｌｓら（２００１）  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２２：１７４５−１７５２
【非特許文献１０】Ｂｅｌｔｏｗｓｋｉ（２００４）  Ｐｏｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５６：５−２７
【非特許文献１１】Ｒｏｈら（２００４）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：７２６４−７２７４．
【非特許文献１２】Ｌｉｅｖｅｒｓｅら（１９９４）  Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７１３：２６８−２７２，
【非特許文献１３】Ｃｒａｗｌｅｙら（１９９４）  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １５：７３１−７５５，  Ｗａｌｓｈ，  “Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｈｏｒｍｏｎｅｓ，”Ｉｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｔｒａｃｔ（３ｄ  ｅｄ．１９９４、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）
【非特許文献１４】Ｇｅｈｌｅｒｔ，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２１８：７−２２（１９９８）
【非特許文献１５】Ｙｏｓｈｉｎａｇａら（１９９２）  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２６３：Ｇ６９５−７０１
【非特許文献１６】Ｇｕａｎら（１９９１）  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２８：  ９１１−９１６
【非特許文献１７】Ｐａｐｐａｓら（１９８６）  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ９１：１３８６−１３８９
【非特許文献１８】Ｓａｖａｇｅら（１９８７）  Ｇｕｔ  ２８：１６６−１７０
【非特許文献１９】Ｃｈｅｎら（１９９５）  Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６９：Ｒ７８７−７９２，
【非特許文献２０】Ｃｈｅｎら（１９８６）  Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔ．６１：９５−９８（１９９６）
【非特許文献２１】Ｙａｎｇら（１９９５）  Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６８：Ｇ９４３−９４８，
【非特許文献２２】Ｃｈｅｎら（１９９７）  Ｎｅｕｒｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｍｏｔｉｌ．９：１０９−１１６
【非特許文献２３】Ｍｏｒｌｅｙら（１９８５）  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．３４１：２００−２０３，
【非特許文献２４】Ｃｏｒｐら（１９９０）  Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５９：Ｒ３１７−３２３
【非特許文献２５】Ｋｏｐｅｌｍａｎ  （２０００）  Ｎａｔｕｒｅ  ４０４：６３５−６４３
【非特許文献２６】Ｒｉｓｓａｎｅｎら（１９９０）  Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｊ．３０１：８３５−８３７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
疾患、症状及び障害の治療（代謝性及び心血管疾患及び関連障害など）に効果的である形の生理活性ペプチドを調製する有効な方法に対するニーズが依然存在する。
【００２６】
本願明細書において引用されるすべての特許、特許出願及び公報は、それらの全開示内容を本願明細書に援用する。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
広義の実施態様では、共有結合してペプチダーゼ阻害剤に結合するペプチドを有するペプチド−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲート化合物の提供に関する。具体的な実施形態では、ペプチド−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲートは、ペプチドのアナログ、ペプチド誘導体又は天然型ペプチドホルモンとのペプチドハイブリッドを含んでなる。幾つかの実施形態では、ペプチド−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲートは、ペプチダーゼ阻害剤とコンジュゲートしない場合のペプチドの血漿中半減期より大きい血漿中半減期を示す。幾つかの実施形態では、ペプチド−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲートのペプチダーゼ阻害剤は、調節ペプチダーゼの活性を低下させる。若干の実施形態では、当該ペプチダーゼ阻害剤は以下の群から選択される：
アンジオテンシン変換酵素阻害剤、脈管ペプチダーゼ阻害剤、内皮変換酵素阻害剤、ヒト中性エンドペプチターゼ阻害剤、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤、アミノペプチダーゼ阻害剤、システインプロテアーゼ阻害剤、セリンプロテアーゼ阻害剤及びカルボキシペプチダーゼ阻害剤。
【００２８】
幾つかの実施形態では、当該ペプチドは複合型ペプチドホルモンである。幾つかの実施形態では、当該ペプチドはＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、ＧＩＰ、エキセンディン、ＰＹＹ、アミリン、カルシトニン、レプチン及びそのアナログからなる群から選択される。幾つかの実施形態では、当該ペプチドはホルモンアゴニストである。幾つかの実施形態では、当該ペプチドはホルモンアンタゴニストである。
【００２９】
他の実施形態では、開示されたペプチド−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲートを含んでなる医薬組成物の提供に関する。幾つかの実施形態では、ペプチド−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲートは医薬組成物の調製において有用である。
【００３０】
別の態様では、提供される方法は、血漿中においてペプチダーゼ感受性ペプチドの分解を減少させるための、有効量のペプチド−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲートの使用を含んでなる。更に、提供される方法は、ペプチダーゼ感受性ペプチドの血漿中半減期を増加させるための、有効量のペプチド−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲートの使用を含んでなる。
【００３１】
別の態様では、提供される方法は、代謝性障害の治療のための、治療上有効量のペプチド−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲートの使用を含んでなる。具体的な実施形態では、当該代謝性障害は肥満、糖尿病（例えば２型又はインスリン非依存性糖尿病、１型糖尿病及び妊娠糖尿病）、摂食障害、インスリン抵抗性症候群及び／又は心血管疾患である。具体的な実施形態では、ペプチド−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲートの投与による栄養分の取り込みを減少させる方法の提供に関する。幾つかの実施形態では、提供される方法は、栄養分の取り込みの減少から利益を得る症状、疾患及び障害の治療のための、治療上有効量のペプチド−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲートの使用を含んでなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
調節ペプチダーゼ、更には非特異的なペプチダーゼによるペプチド結合の裂開は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける生理活性ペプチド及びペプチド薬剤の不活化及びペプチドクリアランスにおいて主要役割を果たすな機構である。本発明者はペプチド薬の設計に用いる新規なアプローチを発見した。すなわち、ペプチダーゼを阻害するモチーフを生理活性ペプチドに戦略的に共有結合させることより、ペプチドにペプチダーゼ耐性を付与するというアプローチである。すなわちかかるペプチド−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲートは、コンジュゲートしていないペプチドよりも長期にわたる血清半減期を示すことができる。場合によっては、半減期の長期化により、治療効果を損なうことなく、ペプチドの投与量を減少させることができる。また、かかるコンジュゲート中のペプチドは、ペプチド受容体が豊富な部位に、特異的かつ効率的に、ペプチダーゼ阻害剤を輸送するのに役立ちうる。またこれにより、当該ペプチダーゼ阻害剤は、それらの活性部位（例えば受容体）で内在性ペプチド分子上のペプチダーゼ活性を阻害できる。
【００３３】
更に、ペプチダーゼ自体が疾患の兆候又は合併症において治療薬の標的である場合、本願明細書に記載のペプチド−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲートは、当該疾患又は合併症の治療において二通りのメカニズムで機能する。この場合、当該ペプチド−ペプチダーゼ阻害剤はペプチド受容体及びペプチダーゼの両方を標的とするため、単一の化学物質の使用により全体的な治療効果を向上させることが可能となる。
【００３４】
本願明細書で開示するＰ−ＰＩコンジュゲートに用いられる成分ペプチドは、特異的若しくは非特異的なペプチダーゼによって分解させるものが挙げられる。本願明細書で開示するＰ−ＰＩコンジュゲートに用いられる典型的な成分ペプチドは、調節ペプチダーゼによって分解される。幾つかの実施形態では、当該成分ペプチドはペプチドホルモン、ホルモン活性を有するペプチド断片又は化学的、代謝的及び／又はそれ以外の薬物動態学的安定性を付与するペプチドホルモンの構造モチーフである。当該ペプチドホルモンとしては、天然型ペプチドホルモン、並びに従来技術において公知で本願明細書に記載のペプチドホルモンアゴニスト、アナログ、誘導体、ハイブリッドが挙げられる。幾つかの実施形態では、当該成分ペプチドはペプチドホルモンアンタゴニスト、ホルモンのアンタゴニスト活性を有するペプチド断片、又は化学的、代謝的及び／又はその他の薬物動態学的安定性を付与するペプチドホルモンアンタゴニストの構造モチーフである。ペプチドホルモンアンタゴニストはペプチドホルモン受容体アンタゴニスト、並びに従来技術において公知で本願明細書に記載の他のホルモンアンタゴニスト、アナログ、誘導体及びそのハイブリッドが挙げられる。
【００３５】
本願明細書で開示するＰ−ＰＩコンジュゲートに用いられる成分ペプチダーゼ阻害剤は、特異的なペプチダーゼ、非特異的なペプチダーゼ又は両方の活性を阻害するか又は低下させるものが挙げられる。本願明細書で開示するＰ−ＰＩコンジュゲートに用いられる成分ペプチダーゼ阻害剤は、Ｐ−ＰＩコンジュゲート複合体中（又はそうでない）において、かかる阻害活性を有する。本願明細書で開示するＰ−ＰＩコンジュゲートに用いられる典型的な成分ペプチダーゼ阻害剤は、調節ペプチダーゼの阻害剤である。当該ペプチダーゼ阻害剤としては、競争的阻害剤、非競争的阻害剤、それ以外の競争的でない阻害剤及び不可逆的な活性部位における阻害剤などが挙げられる。ペプチダーゼ阻害剤としては、限定されないが、小分子の化学物質及びペプチドが挙げられる。本願明細書に記載の成分ペプチダーゼ阻害剤としては、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、脈管ペプチダーゼ阻害剤、内皮変換酵素阻害剤、人間の中立不偏のエンドペプチターゼ阻害剤、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）阻害剤、アミノペプチダーゼ阻害剤、システインプロテアーゼ阻害剤、セリンプロテアーゼ阻害剤及びカルボキシペプチダーゼ阻害剤などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
「ペプチド−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲート」又は「Ｐ−ＰＩコンジュゲート」という用語は、少なくとも１つのペプチドと、少なくとも１つのペプチダーゼ阻害剤が連結している複合体を意味する。かかるコンジュゲートの結合としては、共有結合及び／又は非共有結合性結合が包含される。非共有結合性結合はいかなる非共有結合力によって形成されてもよく、疎水性相互作用、イオン（静電的）結合、金属複合体形成、水素結合、ヴァンデルヴァールス力又はそれらの相互作用の２以上の組合せなどが挙げられる。成分ペプチド及び成分ペプチダーゼ阻害剤は、本願明細書に記載されるか又は当該技術分野で公知のいかなる方法で共有結合されてもよく、限定されないがアミド結合又は化学リンカー基などが挙げられる。
【００３７】
ペプチド−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲートには、ペプチダーゼ阻害剤がペプチドの主鎖に共有結合するものと、ペプチダーゼ阻害剤がペプチドの側鎖に共有結合するものが包含される。ペプチドとペプチダーゼ阻害剤は、直接コンジュゲートしてもよく、又はリンカー分子によりコンジュゲートしてもよい。ペプチド−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲート化合物は、限定されないが、図１に示されるようにデザインされる。図１に示すように、ペプチド（ペプチドｘ）は、ペプチドのカルボキシ末端（ａ）、ペプチドのアミノ末端（ｂ）、ペプチドのポリペプチド鎖へのＰＩの挿入（ｃ）、又はペプチドのアミノ酸側鎖（ｄ）において、ペプチダーゼ阻害剤（ＰＩ）のモチーフにコンジュゲートすることができる。ペプチド中にＡｌａ２を有するペプチド−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲートにおいては、Ａｌａ２はＬ若しくはＤ異性体でもよい。本願明細書に記載のように、ペプチドとペプチダーゼ阻害剤との全ての結合は、直接的な相互作用によって形成されてもよく、又はリンカー分子にを介して形成されてもよい。例えばＧＩＰアナログＧＩＰ（１−３０）−エキセンディン−４（３１−３９）（配列番号１）を含むＰ−ＰＩコンジュゲートとしては、限定されないが以下のものが挙げられる。
【００３８】
【化１】
0005412273.tif 000002
【００３９】
【化２】
0005412273.tif 000003
【００４０】
【化３】
0005412273.tif 000004
【００４１】
典型的には、ＰＹＹアナログＰＹＹ（３−３６）を含むＰ−ＰＩコンジュゲートとしては、限定されないが以下のものが挙げられる。
【００４２】
【化４】
0005412273.tif 000005
【００４３】
【化５】
0005412273.tif 000006
【００４４】
また、本願明細書に記載のコンジュゲート分子及び方法で有用な成分ペプチドには、ＰＰＦペプチドホルモン（ＰＰ及びＰＹＹを含む）が包含される。「ＰＰ」とは、あらゆる生理的形態のヒト膵臓ペプチドポリペプチド又はその種変異体のことを意味する。すなわち用語「ＰＰ」には、ヒトの全長の３６アミノ酸ペプチドのＰＰ、及びＰＰの種変異体（例えばマウス、ハムスター、チキン、ウシ、ネズミ及びイヌＰＰ）の両方が包含される。この意味では、「ＰＰ」、「野生型ＰＰ」、及び「天然型ＰＰ」（すなわち非修飾型ＰＰ）は同義的に用いられる。「ＰＹＹ」とは、あらゆる生理的形態のヒトペプチドＹＹポリペプチド又はその種変異体を意味する。すなわち用語「ＰＹＹ」には、ヒトの全長の３６アミノ酸ペプチドのＰＹＹ、及びＰＹＹの種変異体（例えばマウス、ハムスター、チキン、ウシ、ネズミ及びイヌＰＰ）の両方が包含される。この意味では、「ＰＹＹ」、「野生型ＰＹＹ」、及び「天然型ＰＹＹ」（すなわち非修飾型ＰＰ）は同義的に用いられる。特に明記しない限り、ＰＹＹアナログペプチドに関して本願明細書において記載されている変更態様は、天然型のヒトＰＹＹの３６アミノ酸の配列に基づく。
【００４５】
天然型ＰＰＦペプチドホルモンは当該技術分野で公知であり、同様に機能的なＰＰＦペプチドアゴニスト、アナログ、誘導体及びハイブリッドも公知である。特定の天然型ＰＰＦペプチド及びペプチドアゴニスト、アナログ、誘導体及びハイブリッドが本願明細書に記載されているが、あらゆるＰＰＦペプチド又はＰＰＦアゴニスト、ＰＰＦアナログ、ＰＰＦ誘導体又は公知技術のＰＰＦハイブリッドは、本願明細書で開示する組成物及び方法と組合せて使用できることを認識すべきである。典型的なＰＹＹ成分ペプチドとしては、ヒトＰＹＹ（ｈＰＹＹ）ＹＰＩＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬＶＴＲＱＲＹ（配列番号２）及びｈＰＹＹ（３−３６）ＩＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬＶＴＲＱＲＹ（配列番号３）が挙げられる。幾つかの実施形態では、ペプチダーゼ阻害剤はＰＹＹ（３−３６）の位置２のＬｙｓ、又はＰＹＹ（３−３６）アナログの対応するＬｙｓに結合していない。
【００４６】
一実施形態では、ＰＰＦアゴニスト、アナログ、誘導体及びハイブリッドは、天然型ＰＰＦペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を有する。具体的な実施形態では、ＰＰＦアナログ、誘導体及びハイブリッドは、天然型ＰＰＦペプチドが特異的に結合できる受容体アゴニストである。一実施形態では、ＰＰＦアナログ及び誘導体は通常、ポリプロリンのモチーフ及びＣ末端尾部のモチーフなどの少なくとも２つのＰＹＹのモチーフを含んでなる。かかるアナログは通常、米国の特許出願公開番号２００６／００９４６５３に記載されており、その開示内容を本発明に援用する。一実施形態では、ＰＰＦアナログ、誘導体又はハイブリッドは、天然型のＰＰＦ（例えばＰＹＹ）と比較し、約２０以下、１５以下、１０以下、５以下、４以下、３以下、２以下又は１以下の置換、付加又は欠失を有するアミノ酸配列を有する。
【００４７】
「ＰＹＹモチーフ」は通常、天然型ＰＰＦペプチドの（一次、二次又は三次）構造成分であり、生物学的活性にとりきわめて重大である（すなわち当該モチーフの非存在又は妨害により、生物学的活性が実質的に減少する）。ＰＹＹのモチーフとしては、天然型ＰＰＦペプチドのＮ末端ポリプロリンタイプＩＩのモチーフ、天然型ＰＰＦペプチドのタイプＩＩβ−ターンのモチーフ、天然型ＰＰＦペプチドのＣ末端のαへリックス形のモチーフ、及び天然型ＰＰＦペプチドのＣ末端尾部のモチーフが挙げられる。ＰＰＦペプチドの若干の一実施形態では、Ｎ末端ポリプロリン領域では、天然型ＰＰＦペプチドの残基５及び８に対応するアミノ酸は通常、プロリンとして保存される。タイプＩＩβ−ターンのモチーフは通常、天然型ＰＰＦペプチドの残基１２−１４に対応するアミノ酸を含む。αへリックス形のモチーフが充分な数のアミノ酸残基を含み、αへリックス形のターンが溶液において形成される限り、αへリックス形のモチーフは通常、凡そ天然型ＰＰＦペプチドの残基１４に対応するアミノ酸からＣ末端までのいかなる位置まで続いてもよい。αへリックス形のターンが溶液において形成される限り、αへリックス形のモチーフは、天然型のＰＰファミリー配列中にアミノ酸置換、挿入及び欠失を有してもよい。Ｃ末端尾部のモチーフは一般に、天然型ＰＰＦペプチドの最後の約１０残基に対応するアミノ酸を含む。幾つかの実施形態では、Ｃ末端尾部のモチーフは、天然型ＰＰＦペプチドの最後の７つ、６つ又は５つの残基に対応するアミノ酸、又はアミノ酸残基３２−３５に対応するアミノ酸を含む。
【００４８】
典型的なＰＹＹアナログとしては、ポリプロリンモチーフ及び／又はＣ末端尾部のモチーフに対応しないＰＹＹ分子の領域内部に、欠失、挿入及び置換を有するものが挙げられる。例えば位置４、６、７、９、又は１０における内部欠失が挙げられる。
【００４９】
本願明細書で開示するＰ−ＰＩコンジュゲートの使用の典型的なＰＰＦペプチドとしては、限定されないが以下のものが挙げられる：
ＰＹＹ（１−３６）（配列番号２）、ＰＹＹ（３−３６）（配列番号３）、３Ｌｅｕ−ＰＹＹ（配列番号４）、３Ｖａｌ−ＰＹＹ（配列番号５）、４Ａｒｇ−ＰＹＹ（配列番号６）、４Ｇｌｎ−ＰＹＹ（配列番号７）、４Ａｓｎ−ＰＹＹ（配列番号８）、２５Ｌｙｓ−ＰＹＹ（配列番号９）、３４Ｐｒｏ−ＰＹＹ（配列番号１０）、３４Ｈｉｓ−ＰＹＹ（配列番号１１）、１，３６Ｔｙｒ−ＰＹＹ（配列番号１２）、１３Ｐｒｏ１４Ａｌａ−ＰＹＹ（配列番号１３）、３１Ｌｅｕ３４Ｐｒｏ−ＰＹＹ（配列番号１４）、４ｄｅｓ−ＰＹＹ（配列番号１５）、ＰＹＹ（１−３５）（配列番号１６）、ＰＹＹ（１−３０）（配列番号１７）、ＰＹＹ（１−２５）（配列番号１８）、ＰＹＹ（１−１５）（配列番号１９）、ＰＹＹ（１−１０）（配列番号２０）、ＰＹＹ（２−３６）（配列番号２１）、ＰＹＹ（４−３６）（配列番号２２）、及びＰＹＹ（５−３６）（配列番号２３）。他の典型的なＰＰＦペプチドとしては、限定されないが以下のものが挙げられる：ｉｓｏｃａｐＰＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＡＲＹＹＡＳＬＲＡＹＩＮＬＩＴＲＱＲＹ（配列番号２４）、ｉｓｏｃａｐＹＰＩＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＡＱＹＡＡＤＬＲＲＹＩＮＭＬＴＲＱＲＹ（配列番号２５）、ＩＫＰＥＡＰＧＥＤＡＰＡＥＥＬＡＲＹＹＡＳＬＲＡＹＩＮＬＩＴＲＱＲＹ（配列番号２６）、ＹＰＩＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＡＲＹＹＳＡＬＲＨＹＩＮＬＩＴＲＱＲＹ（配列番号２７）、ＩＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＡＲＹＹＳＡＬＲＨＹＩＮＬＩＴＲＱＲＹ（配列番号２８）、ｉｓｏｃａｐＩＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＡＲＹＹＳＡＬＲＨＹＩＮＬＩＴＲＱＲＹ（配列番号２９）、ＰＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬＶＴＲＱＲＹ（配列番号３０）、ｉｓｏｃａｐＰＫＰＥＨＰＧＥＤＡＳＡＥＥＬＡＲＹＹＡＳＬＲＡＹＩＮＬＩＴＲＱＲＹ（配列番号３１）、ＰＫＰＥＨＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＡＲＹＹＡＳＬＲＡＹＩＮＬＩＴＲＱＲＹ（配列番号３２）、ＰＫＰＥＨＰＧＥＤＡＳＡＥＥＬＡＲＹＹＡＳＬＲＡＹＩＮＬＩＴＲＱＲＹ（配列番号３３）、ＰＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＡＫＹＹＡＳＬＲＡＹＩＮＬＩＴＲＱＲＹ（配列番号３４）、ｉｓｏｃａｐＰＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＡＫＹＹＡＳＬＲＡＹＩＮＬＩＴＲＱＲＹ（配列番号３５）、ＰＫＰＥＨＰＧＥＤＡＰＡＥＥＬＡＫＹＹＡＳＬＲＡＹＩＮＬＩＴＲＱＲＹ（配列番号３６）、ＰＫＰＥＨＰＧＥＤＡＰＡＥＥＬＡＲＹＹＡＳＬＲＡＹＩＮＬＩＴＲＱＲＹ（配列番号３７）、オクタン酸ＩＡＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＡＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬＶＴＲＱＲＹ（配列番号３８）、Ｏｃｔｙｌ−ＧｌｙＩＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＡＲＹＹＳＡＬＲＨＹＩＮＬＩＴＲＱＲＹ（配列番号３９）、及びＹＰＩＲＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＡＲＹＹＡＳＬＲＨＹＩＮＬＩＴＲＱＲＹ（配列番号４０）。
【００５０】
Ｐ−ＰＩアナログで有用な典型的なＰＰＦアナログ及び誘導体は、米国特許出願公開第２００６／００９４６５３、第２００６／０１３５７４７号及び第２００２／０１４１９８５号で開示されており、その各々の内容を本発明に援用する。他の典型的なＰＰＦアナログ及び誘導体は、国際公開第０３／０２６５９１号、第０３／０５７２３５号及び第２００５／０７７０９４号（各々の開示内容を本発明に援用する）に記載されている。
【００５１】
本願明細書で開示する組成物及び方法で有用な成分ペプチドホルモンとしては、限定されないがインクレチンホルモンのファミリー、並びにＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、オキシントモジュリン及びエキセンディンなどの員クレチン擬態物が挙げられる。本願明細書で開示する組成物及び方法で有用な成分ペプチドホルモンとしては、ＧＬＰ−１ペプチドホルモンが挙げられる。本発明の用語「ＧＬＰ−１」とは、あらゆる生理的形態のヒトグルカゴン様ペプチド−１又はその種変異型を意味する。「ＧＬＰ−１」という用語には、ヒトのＧＬＰ−１（１−３７）、ＧＬＰ−１（７−３７）及びＧＬＰ−１（７−３６）アミド（全長のヒトＧＬＰ−１（１−３７）及びＧＬＰ−１の種変異体（例えば、ネズミ、ハムスター、チキン、ウシ、ネズミ及びイヌＧＬＰ−１など）に関する）が包含される。この意味では、「ＧＬＰ−１」、「野生型ＧＬＰ−１」、及び「天然型ＧＬＰ−１」（すなわち修飾されていないＧＬＰ−１）は同義的に用いられる。
【００５２】
天然型ＧＬＰ−１ペプチドホルモンは従来技術において公知であり、ｈＧＬＰ−１（１−３７）  ＨＤＥＦＥＲＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ（配列番号４１）、ｈＧＬＰ−１（７−３７）  ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ（配列番号４２）、ｈＧＬＰ−１（７−３６）アミド  ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ−ＮＨ２（配列番号４３）、及びｆｒｏｇ  ＧＬＰ−１（ｆＧＬＰ−１）  ＨＡＥＧＴＹＴＮＤＶＴＥＹＬＥＥＫＡＡＫＥＦＩＥＷＬＩＫＧＫＰＫＫＩＲＹＳ−ＯＨ（配列番号４４）、及びＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＴＱＱＬＤＥＫＡＡＫＥＦＩＤＷＬＩＮＧＧＰＳＫＥＩＩＳ−ＯＨ（配列番号４５）などが挙げられ、機能的ペプチドのアナログ及び誘導体である。ここで使用するＧＬＰ−１とは、全ての天然型のＧＬＰ−１ペプチドホルモンを指す。特定の天然型ＧＬＰ−１ペプチド及びペプチドアゴニスト、アナログ、誘導体及びハイブリッドが本願明細書に記載されているが、あらゆるＧＬＰ−１ペプチド又はＧＬＰ−１アゴニスト、ＧＬＰ−１アナログ、ＧＬＰ−１誘導体又は公知技術のＧＬＰ−１ハイブリッドは、本願明細書で開示する組成物及び方法と組合せて使用できることを認識すべきである。
【００５３】
一実施形態では、ＧＬＰ−１ペプチドのアナログ、誘導体及びハイブリッドは、天然型ＧＬＰ−１ペプチドの少なくとも１つのホルモン活性を有する。具体的な実施形態では、ＧＬＰ−１ペプチドのアナログ、誘導体及びハイブリッドは、天然型ＧＬＰ−１ペプチドが特異的に結合できる受容体アゴニストである。かかるＧＬＰ−１アナログは公知のようにアミド化されてもよく、又は、特に明記しない限り酸性型であってもよい。
【００５４】
一実施形態では、ＧＬＰ−１ペプチドのアナログ、誘導体又はハイブリッドは天然型であってもよく、又は、天然型のＧＬＰ−１と比較して１つ以上のアミノ酸置換、欠失、変異又は付加を有してもよい。すなわち、ＧＬＰ−１ペプチドのアナログ、誘導体及びハイブリッドは、天然型のＧＬＰ−１と比較して１つ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失を有するアミノ酸配列を有してもよい。一実施形態では、ＧＬＰ−１ペプチドのアナログ、誘導体又はハイブリッドは、天然型のＧＬＰ−１（例えばＧＬＰ−１（７−３７）と比較し、約２５以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下、４以下、３以下、２以下又は１以下の置換、付加又は欠失を有するアミノ酸配列有する。
【００５５】
典型的なＧＬＰ−１ペプチドのアナログ及び誘導体には、本願明細書において記載されているものや、従来技術において公知のものが包含される。典型的なＧＬＰ−１アナログとしては、限定されないが以下のものが挙げられる：
ＧＬＰ−１（７−３５）（配列番号４６）、９Ｇｌｎ−ＧＬＰ−１（７−３７）（配列番号４７）、Ｄ−９Ｇｌｎ−ＧＬＰ−１（７−３７）（配列番号４８）、１６Ｔｈｒ−１８Ｌｙｓ−ＧＬＰ−１（７−３７）（配列番号４９）、１８Ｌｙｓ−ＧＬＰ−１（７−３７）（配列番号５０）、８Ｇｌｙ−ＧＬＰ−１（７−３６）（配列番号５１）、８Ａｉｂ−ＧＬＰ−１（７−３６）（配列番号２９７）、ａｃｅｔｙｌ−９Ｌｙｓ−ＧＬＰ−１（７−３７）（配列番号５２）、９Ｔｈｒ−ＧＬＰ−１（７−３７）（配列番号５３）、Ｄ−９Ｔｈｒ−ＧＬＰ−１（７−３７）（配列番号５４）、９Ａｓｎ−ＧＬＰ−１（７−３７）（配列番号５５）、Ｄ−９Ａｓｎ−ＧＬＰ−１（７−３７）（配列番号５６）、２２Ｓｅｒ２３Ａｒｇ２４Ａｒｇ２６Ｇｌｎ−ＧＬＰ−１（７−３７）（配列番号５７）、２３Ａｒｇ−ＧＬＰ−１（７−３７）（配列番号５８）、及び２４Ａｒｇ−ＧＬＰ−１（７−３７）（配列番号５９）。ＰＰＩアナログで有用な典型的なＧＬＰ−１アナログ及び誘導体は米国特許第５１８８６６６号、第５５１２５４９号、第５５４５６１８号及び第６７４７００６号において、及び国際公開第９１／１１４５７号及び第９９／６４０６１号で開示されてもり、それらの開示内容を本願明細書に援用する。
【００５６】
また、本願明細書で開示する組成物及び方法で有用な成分ペプチドホルモンとしては、ＧＬＰ−２ペプチドホルモンが挙げられる。本発明の用語「ＧＬＰ−２」とは、あらゆる生理的形態の、ヒトグルカゴン様ペプチド−２又はその種変異型を意味する。ＧＬＰ−２は３３のアミノ酸ペプチドであり、小腸及び大腸の腸内分泌細胞から、ＧＬＰ−１とともに共分泌される。天然型のＧＬＰ−２ペプチドホルモン（例えばラットＧＬＰ−２及びそのホモログ、例えばウシＧＬＰ−２、ブタＧＬＰ−２、デグーＧＬＰ−２、ウシ胎児ＧＬＰ−２、モルモットＧＬＰ−２、ハムスターＧＬＰ−２、ヒトＧＬＰ−２、ニジマスＧＬＰ−２及びニワトリＧＬＰ−２など）は当該技術分野で公知であり、機能的ペプチドのアナログ及び誘導体として機能する。ヒトのＧＬＰ−２のアミノ酸配列はＨＡＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＥＴＫＩＴＤ（配列番号６０）であり、カエルＧＬＰ−２のアミノ酸配列はＨＡＥＧＴＦＴＮＤＭＴＮＹＬＥＥＫＡＡＫＥＦＶＧＷＬＩＫＧＲＰ（配列番号６１）である。特定のＧＬＰ−２天然型ペプチド、ペプチドのアナログ、誘導体及びハイブリッドが本願明細書に記載されているが、公知の生物学的活性を呈するいかなる公知のＧＬＰ−２ペプチドも、ＧＬＰ−２アナログ、ＧＬＰ−２誘導体及びＧＬＰ−２ハイブリッドも、本願明細書で開示する組成物及び方法と組合せて使用できると認識すべきである。
【００５７】
一実施形態では、ＧＬＰ−２ペプチドのアナログ、誘導体及びハイブリッドは、天然型ＧＬＰ−２ペプチドの少なくとも１つのホルモン活性を有する。具体的な実施形態では、ＧＬＰ−２ペプチドのアナログ、誘導体及びハイブリッドは、天然型ＧＬＰ−２ペプチドが特異的に結合できる受容体アゴニストである。幾つかの実施形態では、ＧＬＰ−２アナログ、誘導体及びハイブリッドには、位置２でＧｌｙをＡｌａと置換することによって、ＤＰＰ−ＩＶ耐性を付与した、ラット又はヒトのＧＬＰ−２が包含される。ＰＰＩアナログで有用な典型的なＧＬＰ−２ペプチドのアナログ及び誘導体は米国特許番号５７８９３７９及び５９９００７７に記載されているものが挙げられ、それらの開示内容を本願明細書に援用する。
【００５８】
一実施形態では、ＧＬＰ−２ペプチドのアナログ、誘導体又はハイブリッドは、天然型若しくは天然に存在するエキセンディンと比較して１つ以上のアミノ酸置換、欠失、変異又は付加を有してもよいすなわちＧＬＰ−２ペプチドのアナログ、誘導体及びハイブリッドは天然型のＧＬＰ−２と比較して１つ以上のアミノ酸置換、加算又は削除を有するアミノ酸配列を有してもよい一実施形態では、ＧＬＰ−２ペプチドのアナログ、誘導体又はハイブリッドは、天然型のＧＬＰ−２と比較し約２５以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下、４以下、３以下、２以下又は１以下の置換、加算又は削除を有するアミノ酸配列を有する。
【００５９】
また、本願明細書で開示する組成物及び方法で有用な成分ペプチドホルモンには、オキントモジュリン（ＯＸＭ）ペプチドホルモンが包含される。本発明の用語「ＯＸＭ」は、あらゆる生理的形態のヒトオキントモジュリン又はその種変異型を意味する。ＯＸＭは、グルカゴンの２９のアミノ酸配列、及びそれに続く８アミノ酸のカルボキシ端末延長部を有する、３７のアミノ酸ペプチドである。例えば、ヒトＯＸＭのアミノ酸配列はＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＫＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号６２）である。天然型ＯＸＭペプチドホルモンは当該技術分野で公知であり、同様に当該機能を有するペプチドのアナログ及び誘導体も公知である。特定の天然型ＯＸＭペプチド、ペプチドのアナログ、誘導体及びハイブリッドが本願明細書に記載されているが、公知の生物学的活性を呈するいかなる公知のＯＸＭペプチド、ＯＸＭアナログ、ＯＸＭ誘導体、ＯＸＭハイブリッドも、本願明細書で開示する組成物及び方法と組合せて使用できると認識すべきである。一実施形態では、ＯＸＭペプチドのアナログ、誘導体及びハイブリッドは、天然型ＯＸＭペプチドの少なくとも１つのホルモン活性を有する。具体的な実施形態では、ＯＸＭペプチドのアナログ、誘導体及びハイブリッドは、天然型ＯＸＭペプチドが特異的に結合できる受容体アゴニストである。
【００６０】
一実施形態では、ＯＸＭペプチドのアナログ、誘導体又はハイブリッドは、天然型若しくは天然に存在するＯＸＭと比較して、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、変異又は付加を有してもよい。すなわちＯＸＭペプチドのアナログ、誘導体及びハイブリッドは、天然型のＯＸＭと比較して１つ以上のアミノ酸置換、加算又は削除を有するアミノ酸配列を有してもよい。一実施形態では、ＯＸＭペプチドのアナログ、誘導体又はハイブリッドは、天然型のＯＸＭのアミノ酸配列と比較し、約３０以下、２５以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下、４以下、３以下、２以下又は１以下の置換、加算又は削除を有する。
【００６１】
また、本願明細書で開示する組成物及び方法で有用な成分ペプチドホルモンには、エキセンディンペプチドホルモンが包含される。「エキセンディン」とは、アメリカドクトカゲ、アリゾナトカゲ及びメキシコドクトカゲ、並びにその変種の唾液中に存在するペプチドホルモンを意味する。エキセンディン−３はＨｅｌｏｄｅｒｍａ  ｈｏｒｒｉｄｕｍの唾液に存在し、エキセンディン−４はＨｅｌｏｄｅｒｍａ  ｓｕｓｐｅｃｔｕｍの唾液に存在する（Ｅｎｇら（１９９０）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２０２５９−２０２６２、Ｅｎｇら（１９９２）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：７４０２−７４０５）。エキセンディンは、幾つかのグルカゴン様ペプチドファミリーのメンバーと配列類似性を有し、最高５３％の同一性（ＧＬＰ−１）を有することが知られている（Ｇｏｋｅら（１９９３）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９６５０−１９５５５）。この意味で「エキセンディン」、「野生型エキセンディン」、「天然型エキセンディン」（すなわち修飾されていないエキセンディン）の用語は同義的に用いられる。
【００６２】
天然型エキセンディンペプチドホルモンは当該技術分野で公知であり、同様に、その機能を有するエキセンディンペプチドのアナログ、誘導体及びハイブリッドも公知である。エキセンディン−３のアミノ酸配列はＨＳＤＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号６３）であり、エキセンディン−４のアミノ酸配列はＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号６４）である。特定の天然型エキセンディンペプチド、ペプチドのアナログ、誘導体及びハイブリッドが本願明細書に記載されているが、公知の生物学的活性を呈するいかなる公知のエキセンディンペプチド、エキセンディンのアナログ、エキセンディン誘導体及びエキセンディンハイブリッドも、本願明細書で開示する組成物及び方法と組合せて使用できると認識すべきである。
【００６３】
一実施形態では、エキセンディンペプチドのアナログ、誘導体及びハイブリッドは、天然型エキセンディンペプチドの少なくとも１つのホルモン活性を有する。具体的な実施形態では、エキセンディンペプチドのアナログ、誘導体及びハイブリッドは、天然型エキセンディンペプチドが特異的に結合できる受容体アゴニストである。エキセンディンのアナログ、誘導体及びハイブリッドは、特に明記しない限り公知のようにアミド化されてもよく、又は酸の形態であってもよい。一実施形態では、エキセンディンのアナログ、誘導体又はハイブリッドは天然型若しくは天然に存在するエキセンディンと比較し、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、変異又は付加を有してもよい。すなわちエキセンディンのアナログ、誘導体及びハイブリッドは、天然に存在するエキセンディン（例えばエキセンディン−４）と比較して、１つ以上のアミノ酸置換、加算又は削除を有するアミノ酸配列を有してもよい。一実施形態では、エキセンディンのアナログ、誘導体又はハイブリッドは、天然に存在するエキセンディン（例えばエキセンディン−４）のアミノ酸配列と比較して、約３０以下、２５以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下、４以下、３以下、２以下又は１以下の置換、付加又は欠失を有する。
【００６４】
典型的なエキセンディンのアナログとしては、限定されないが、エキセンディン−４（１−３０）（配列番号６５）、エキセンディン−４（１−２８）（配列番号６６）、１４Ｌｅｕ２５Ｐｈｅ−エキセンディン−４（配列番号６７）、５Ａｌａ１４Ｌｅｕ２５Ｐｈｅ−エキセンディン−４（配列番号６８）、１４Ｌｅｕ２２Ａｌａ２５Ｐｈｅ−エキセンディン−４（配列番号６９）、１４Ｌｅｕ−エキセンディン−４（１−２８）（配列番号７０）、１４Ｌｅｕ２５Ｐｈｅエキセンディン−４（１−２８）（配列番号７１）、１４Ｌｅｕ２５Ｐｈｅエキセンディン−４（１−２８）（配列番号７２）及び１４Ｌｅｕ（２２Ａｌａ）、２５Ｐｈｅエキセンディン−４（１−２８）（配列番号７３）などが挙げられる。他の典型的なエキセンディンのアナログ及び誘導体は、米国特許番号６８５８５７６号、第６９５６０２６号及び第６９８９３６６号で開示されており、それらの開示内容を本願明細書に援用する。
【００６５】
付加的な典型的なエキセンディンアゴニストは米国特許出願第１０／１８１１０２号及び国際公開第９９／０７４０４号に記載されており、例えばそれらの特許出願の式（Ｉ）、式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）の化合物が包含され、それらの開示内容を参照によって本願明細書に援用する。
【００６６】
他のエキセンディンアゴニストは米国特許出願第０９／５５４５３３号及び国際公開第９９／２５７２７号に記載されており、その開示内容を本発明に援用する。更に他のエキセンディンアゴニストは米国特許出願番号第０９／５５４５３１号及び国際公開第９９／２５７２８号に記載されており、それらの開示内容を、参照により本願明細書に援用する。更に他のエキセンディンアゴニストは、米国特許出願公開第２００４／０２０９８０３号、第２００４／０２６６６９２号、第２００５／００４３２３８号及び第２００５／０２１５４６９号に記載されており、それらの開示内容を本願明細書に援用する。
【００６７】
また、本願明細書で開示する組成物及び方法で有用な成分ペプチドホルモンには、ＧＩＰペプチドホルモンが包含される。「ＧＩＰ」とは、いかなる種から得られるか若しくは由来する胃抑制ペプチド又はグルコース依存性のインシュリン分泌性ペプチドホルモンを意味する。「ＧＩＰ」（全長ヒトＧＩＰ（１−４２）に関する）という用語には、ｈＧＩＰ（１−４２）酸、ｈＧＩＰ（１−４２）アミド、ＧＩＰ（１−３０）酸、ＧＩＰ（１−３０）アミド、ＧＩＰ（１−１４）、ＧＩＰ（１９−３０）、ＧＩＰ（１−１１）及びＧＩＰの種変異体（例えばマウス、ハムスター、ニワトリ、ウシ、ラット及びイヌなど）が包含される。ヒトＧＩＰ（ｈＧＩＰ）のアミノ酸配列はＹＡＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩＡＭＤＫＩＨＱＱＤＦＶＮＷＬＬＡＱＫＧＫＫＮＤＷＫＨＮＩＴＱ（配列番号７４）である。ラットＧＩＰのアミノ酸配列はＹＡＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩＡＭＤＫＩＲＱＱＤＦＶＮＷＬＬＡＱＫＧＫＫＮＤＷＫＨＮＬＴＱ（配列番号７５）である。マウスＧＩＰのアミノ酸配列はＹＡＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩＡＭＤＫＩＲＱＱＤＦＶＮＷＬＬＡＱＲＧＫＫＳＤＷＫＨＮＩＴＱ（配列番号７６）である。ブタＧＩＰのアミノ酸配列はＹＡＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩＡＭＤＫＩＲＱＱＤＦＶＮＷＬＬＡＱＫＧＫＫＳＤＷＫＨＮＩＴＱ（配列番号７７）である。ウシＧＩＰのアミノ酸配列はＹＡＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩＡＭＤＫＩＲＱＱＤＦＶＮＷＬＬＡＱＫＧＫＫＳＤＷＩＨＮＩＴＱ（配列番号７８）である。この意味では、「ＧＩＰ」、「野生型ＧＩＰ」、及び「天然型ＧＩＰ」（すなわち修飾されていないＧＩＰ）の用語は同義的に用いられる。
【００６８】
天然型ＧＩＰペプチドホルモンは当該技術分野で公知であり、同様にその機能を有するペプチドのアナログ、誘導体及びハイブリッドも公知である。特定の天然型ＧＩＰペプチド、ＧＩＰペプチドのアナログ、誘導体及びハイブリッドが本願明細書に記載されているが、公知の生物学的活性を呈するいかなる公知のＧＩＰペプチド、ＧＩＰアナログ、ＧＩＰ誘導体及びＧＩＰハイブリッドも、本願明細書で開示する組成物及び方法に使用できると認識すべきである。一実施形態では、ＧＩＰペプチドのアナログ、誘導体及びハイブリッドは、天然型ＧＩＰペプチドの少なくとも１つのホルモン活性を有する。具体的な実施形態では、ＧＩＰペプチドのアナログ、誘導体及びハイブリッドは、天然型ＧＩＰペプチドが特異的に結合できる受容体アゴニストである。
【００６９】
幾つかの実施形態では、使用されるＧＩＰのアナログ、誘導体又はハイブリッドには、ヒトＧＩＰ（１−４２）又はｈＧＩＰ（１−３０）と少なくとも約６５％の相同性を有し、ＧＩＰ活性を有するもが包含される。典型的なＧＩＰアナログは、天然型のＧＩＰ（１−３０）、ＧＩＰ（１−２６）、ＧＩＰ（１−３９）、ＧＩＰ（１−１４）、ＧＩＰ（１９−３０）、ＧＩＰ（１９−２６）、ＧＩＰ（１９−３９）又はＧＩＰ（１−４２）の分子の全長に対して、各々少なくとも５０％の配列同一性を有するものであり、本願明細書に記載の組成物及び方法に用いられる更なる実施形態として本発明に包含される。幾つかの実施形態では、使用するＧＩＰアナログ、誘導体又はハイブリッドには、ＧＩＰ（１−４２）のＮ末端から少なくとも１５のアミノ酸残基を含んでなるものが包含され、位置１から３で最低１つのアミノ酸置換又は変異を有し、生物学な活性を有する。例えば、少なくとも１つのリジン残基のεアミノ基における脂肪酸付加が、分子中に存在する若しくは導入された変更態様が挙げられる。かかる変更態様としては、ＧＩＰのＴｙｒ１−グルシトール（例えばＴｙｒ１−グルシトールＧＩＰ（１−４２）又はＴｙｒ１−グルシトールＧＩＰ（１−３０））が挙げられる。目的のＧＩＰアナログとしては、１、２及び／又は３位でのＤ−アミノ酸置換、及び／又はＮ末端への糖付加、アルキル化、アセチル化若しくはアシル化、又は本願明細書に記載の他のＮ末端修飾からなる群から選択される置換又は変異を含むものが挙げられる。更なる目的の物質としては、２又は３位のアミノ酸がリジン、セリン、４−アミノブチルアミノ酸、Ａｉｂ、Ｄ−アラニン、ザルコシン又はプロリンで置換されたアナログである。
【００７０】
一実施形態では、ＧＩＰアナログ、誘導体又はハイブリッドは天然型若しくは天然に存在するＧＩＰと比較して、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、変異又は付加を有してもよい。すなわちＧＩＰアナログ、誘導体及びハイブリッドは、天然型のＧＩＰと比較して、１つ以上のアミノ酸置換、加算又は削除を有するアミノ酸配列を有してもよい。一実施形態では、ＧＩＰアナログ、誘導体又はハイブリッドは、天然型のＧＩＰのアミノ酸配列と比較し、約３０以下、２５以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下、４以下、３以下、２以下又は１以下の置換、付加又は欠失を有する。
【００７１】
典型的なＧＩＰアナログとしては、限定されないが以下のものが挙げられる：
ｈＧＩＰ（１−３０）  ＹＡＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩＡＭＤＫＩＨＱＱＤＦＶＮＷＬＬＡＱＫ（配列番号７９）、ＧＩＰ（１−２６）  ＹＡＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩＡＭＤＫＩ  ＨＱＱＤＦＶＮＷＬ（配列番号８０）、ＧＩＰ（１−１４）  ＹＡＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩＡＭ（配列番号８１）、ＧＩＰ（１−１１）  ＹＡＥＧＴＦＩＳＤＹＳ（配列番号８２）、ＧＩＰ（１９−３０）  ＱＱＤＦＶＮＷＬＬＡＱＫ（配列番号８３）、ＧＩＰ（１９−２６）  ＱＱＤＦＶＮＷＬ（配列番号８４）、ＧＩＰ（１−３９）  ＹＡＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩＡＭＤＫＩＨＱＱＤＦＶＮＷＬＬＡＱＫＧＫＫＮＤＷＫＨＮ（配列番号８５）、ＧＩＰ（１９−３９）  ＱＱＤＦＶＮＷＬＬＡＱＫＧＫＫＮＤＷＫＨＮ（配列番号８６）、ＧＩＰ（１−４２）  ＹＡＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩＡＭＤＫＩＨＱＱＤＦＶＮＷＬＬＡＱＫＧＫＫＮＤＷＫＨＮＩＴＱ（配列番号８７）、Ｄ２−Ａｌａ−ＧＩＰ（１−４２）（配列番号８８）、Ｄ−Ａｌａ２−ＧＩＰ（１−３０）（配列番号２９３）、Ｄ−Ａｌａ２Ｌｅｕ１４−ＧＩＰ（１−３０）（配列番号２９４）、及びＬｅｕ１４−ＧＩＰ（１−３０）（配列番号２９５）。他の典型的なＧＩＰペプチドのアナログ及び誘導体は、米国特許第６４１０５０８号及び第６９２１７４８号、米国特許出願公開第２００３／０２３２７６１号、第２００５／０２７２６５２号及び第２００５／０２７７５９０号において開示され、それらの開示内容を本願明細書に援用する。
【００７２】
本願明細書で開示する組成物及び方法で有用な成分ペプチドホルモンとしては、アミリン、アドレノメデュリン（ＡＤＭ）、カルシトニン（ＣＴ）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）。インテルメジン（別名「ＡＦＰ−６」）及びそれらの関連ペプチドなどのアミリンファミリーのペプチドホルモンが挙げられる。天然型アミリンファミリーペプチドホルモンは当該技術分野で公知であり、同様にその機能を有するアミリンファミリーペプチドのアナログ、誘導体及びハイブリッドも公知である。特定の天然型アミリンファミリーペプチド、アナログ、誘導体及びハイブリッドが本願明細書に記載されているが、公知のホルモン活性を呈するいかなる公知のアミリンファミリーペプチドも、アミリンファミリーペプチドのアナログ、アミリンファミリーペプチド誘導体及びアミリンファミリーペプチドハイブリッドも、本願明細書で開示する組成物及び方法に使用できると認識すべきである。
【００７３】
また、本願明細書で開示する組成物及び方法で有用な成分ペプチドホルモンには、アミリンペプチドホルモンが包含される。「アミリン」とは、アミリンと呼ばれるヒトペプチドホルモン及びその種変異体のことを意味する。アミリンは通常栄養の取り込みに応答して、膵臓β細胞によって、インシュリンと共分泌される３７アミノ酸のポリペプチドホルモンである（Ｋｏｕｄａその他（１９９２）  Ｌａｎｃｅｔ  ３３９：１１７９−１１８０）。この意味で、「アミリン」、「野生型アミリン」及び「天然型アミリン」（すなわち修飾されていないアミリン）の用語は同義的に用いられる。
【００７４】
天然型アミリンペプチドは従来技術において公知であり、同様に、その機能を有するアミリンペプチドのアナログ、誘導体及びハイブリッドも公知である。ヒトアミリン（ｈ−アミリン）のアミノ酸配列はＫＣＮＴＡＴＣＡＴＱＲＬＡＮＦＬＶＨＳＳＮＮＦＧＡＩＬＳＳＴＮＶＧＳＮＴＹ（配列番号８９）であり、ラットアミリン（ｒ−アミリン）のアミノ酸配列はＫＣＮＴＡＴＣＡＴＱＲＬＡＮＦＬＶＲＳＳＮＮＬＧＰＶＬＰＰＴＮＶＧＳＮＴＹ（配列番号９０）である。特定の天然型アミリンペプチド、ペプチドのアナログ、誘導体及びハイブリッドが本願明細書に記載されているが、公知のホルモン活性を呈するいかなる公知のアミリンペプチド、アミリンペプチドのアナログ、アミリンペプチド誘導体及びアミリンペプチドハイブリッドも、本願明細書で開示する組成物及び方法に使用できると認識すべきである。
【００７５】
一実施形態では、アミリンペプチドのアナログ、誘導体及びハイブリッドは、天然型アミリンペプチドの少なくとも１つのホルモン活性を有する。具体的な実施形態では、アミリンペプチドのアナログ、誘導体及びハイブリッドは、天然型アミリンが特異的に結合できる受容体アゴニストである。アミリンペプチドのアナログ、誘導体及びハイブリッドは、公知のようにアミド化されてもよく、又は酸の形態であってもよい。
【００７６】
一実施形態では、アミリンのアナログ、誘導体又はハイブリッドは、天然型若しくは天然に存在するアミリンと比較して、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、変異又は付加を有してもよい。すなわちアミリンのアナログ、誘導体及びハイブリッドは、天然に存在するアミリンと比較して１つ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失を有するアミノ酸配列を有してもよい。一実施形態では、アミリンのアナログ、誘導体又はハイブリッドは、天然に存在するアミリンと比較し、約３０以下、２５以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下、４以下、３以下、２以下又は１以下の置換、付加又は欠失を有するアミノ酸配列を有する。
【００７７】
本願明細書で開示する組成物及び方法に用いられるアミリンのアナログとしては、米国特許第５６８６４１１号、第６１１４３０４号及び第６４１０５１１号に記載されているものが挙げられ、それらの全開示内容を参照によに本願明細書に援用する。典型的な化合物としては、以下の式の化合物が挙げられる：
１Ａ１−Ｘ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−５Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｙ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−１０Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｂ１−Ａｓｎ−１５Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｃ１−Ｄ１−Ｅ１−２０Ｆ１−Ｇ１−Ａｓｎ−Ｈ１−Ｇｌｙ−２５Ｉ１−Ｊ１−Ｌｅｕ−Ｋ１−Ｌ１−３０Ｔｈｒ−Ｍ１−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−３５Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｚ（配列番号９１）、
式中、Ａ１はＬｙｓ、Ａｌａ、Ｓｅｒ又は水素であり、Ｂ１はＡｌａ、Ｓｅｒ又はＴｈｒであり、Ｃ１はＶａｌ、Ｌｅｕ又はＩｌｅであり、Ｄ１はＨｉｓ又はＡｒｇであり、Ｅ１はＳｅｒ又はＴｈｒであり、Ｆ１はＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ又はＡｓｎであり、Ｇ１はＡｓｎ、Ｇｌｎ又はＨｉｓであり、Ｈ１はＰｈｅ、Ｌｅｕ又はＴｙｒであり、Ｉ１はＡｌａ又はＰｒｏであり、Ｊ１はＩｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ又はＬｅｕであり、Ｋ１はＳｅｒ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ又はＴｈｒであり、Ｌ１はＳｅｒ、Ｐｒｏ又はＴｈｒであり、Ｍ１はＡｓｎ、Ａｓｐ又はＧｌｎであり、Ｘ及びＹは各々独立に、分子内結合の形成のために各々化学結合できる側鎖を有するアミノ酸残基から選択され、Ｚはヒドロキシ（アミノ）アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、アルキルオキシ、アリールオキシ又はアラルキルオキシ基である。典型的なアミリンアナログとしては、限定されないが、以下のものが挙げられる：
ｄｅｓ−１Ｌｙｓ−ｈ−アミリン（配列番号９２）、２８Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号９３）、２５，２８，２９Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号９４）、１８Ａｒｇ２５，２８Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号９５）、ｄｅｓ−１Ｌｙｓ１８Ａｒｇ２５，２８Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号９６）、２５Ｐｒｏ２６Ｖａｌ２８，２９Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号９７）、１８Ａｒｇ２５，２８，２９Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号９８）、ｄｅｓ−１Ｌｙｓ１８Ａｒｇ２５，２８，２９Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号９９）、ｄｅｓ−１Ｌｙｓ２５，２８，２９Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号１００）、２３Ｌｅｕ２５Ｐｒｏ２６Ｖａｌ２８，２９Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号１０１）、２３Ｌｅｕ２５Ｐｒｏ２６Ｖａｌ２８Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号１０２）、ｄｅｓ−１Ｌｙｓ２３Ｌｅｕ２５Ｐｒｏ２６Ｖａｌ２８Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号１０３）、１８Ａｒｇ２３Ｌｅｕ２５Ｐｒｏ２６Ｖａｌ２８Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号１０４）、１８Ａｒｇ２３Ｌｅｕ２５，２８，２９Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号１０５）、１８Ａｒｇ２３Ｌｅｕ２５，２８Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号１０６）、１７Ｉｌｅ２３Ｌｅｕ２５，２８，２９Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号１０７）、１７Ｉｌｅ２５，２８，２９Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号１０８）、ｄｅｓ−１Ｌｙｓ１７Ｉｌｅ２３Ｌｅｕ２５，２８，２９Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号１０９）、１７Ｉｌｅ１８Ａｒｇ２３Ｌｅｕ−ｈ−アミリン（配列番号１１０）、１７Ｉｌｅ１８Ａｒｇ２３Ｌｅｕ２６Ｖａｌ２９Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号１１１）、１７Ｉｌｅ１８Ａｒｇ２３Ｌｅｕ２５Ｐｒｏ２６Ｖａｌ２８，２９Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号１１２）、１３Ｔｈｒ２１Ｈｉｓ２３Ｌｅｕ２６Ａｌａ２８Ｌｅｕ２９Ｐｒｏ３１Ａｓｐ−ｈ−アミリン（配列番号１１３）、１３Ｔｈｒ２１Ｈｉｓ２３Ｌｅｕ２６Ａｌａ２９Ｐｒｏ３１Ａｓｐ−ｈ−アミリン（配列番号１１４）、ｄｅｓ−１Ｌｙｓ１３Ｔｈｒ２１Ｈｉｓ２３Ｌｅｕ２６Ａｌａ２８Ｐｒｏ３１Ａｓｐ−ｈ−アミリン（配列番号１１５）、１３Ｔｈｒ１８Ａｒｇ２１Ｈｉｓ２３Ｌｅｕ２６Ａｌａ２９Ｐｒｏ３１Ａｓｐ−ｈ−アミリン（配列番号１１６）、１３Ｔｈｒ１８Ａｒｇ２１Ｈｉｓ２３Ｌｅｕ２８，２９Ｐｒｏ３１Ａｓｐ−ｈ−アミリン（配列番号１１７）、及び１３Ｔｈｒ１８Ａｒｇ２１Ｈｉｓ２３Ｌｅｕ２５Ｐｒｏ２６Ａｌａ２８，２９Ｐｒｏ３１Ａｓｐ−ｈ−アミリン（配列番号１１８）。
【００７８】
幾つかの実施形態では、本願明細書で開示する組成物及び方法に用いられるアミリンのアナログ及び誘導体は、米国特許出願第６０／５４３２７５号、及び国際公開第２００６／０８３２５４号において記載されているものが挙げられ、それらの開示内容を本願明細書に援用する。かかるアミリンのアナログ及び誘導体は、少なくとも、アミリン又はカルシトニンのループ領域及びそのアナログ、カルシトニンのαへリック領域の少なくとも一部のαへリックス領域若しくはそのアナログ、又はアミリンαへリックス領域の一部及びカルシトニンαへリックス領域を有するαへリックス領域若しくはそれらのアナログ、並びに、アミリン又はカルシトニン又はそのアナログのＣ末端尾部を含んでなり、但し、カルシトニン又はカルシトニンアナログのＣ末端尾部はプロリン、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、ホモセリン（Ｈｓｅ）又はＨｓｅの誘導体ではない。したがって、かかるペプチドは本明細書において「ＬＨＣ」（ループへリックスＣ末端）ペプチドと称される。典型的なＬＨＣアミリンペプチドとしては、限定されないが、ＫＣＮＴＡＴＣＶＬＧＲＬＳＱＥＬＨＲＬＱＴＹＰＲＴＮＴＧＳＮＴＹ（配列番号１１９）、イソカプロリル−ＣＮＴＡＴＣＶＬＧＲＬＳＱＥＬＨＲＬＱＴＹＰＲＴＮＴＧＳＮＴＹ（配列番号１２０）、ＣＳＮＬＳＴＣＡＴＱＲＬＡＮＥＬＶＲＬＱＴＹＰＲＴＮＶＧＳＮＴＹ（配列番号１２１）、ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＱＲＬＡＮＥＬＶＲＬＱＴＹＰＲＴＮＶＧＳＮＴＹ（配列番号１２２）、及びＣＳＮＬＳＴＣＶＬＧＲＬＳＱＥＬＨＲＬＱＴＹＰＲＴＮＴＧＳＮＴＹ（配列番号１２３）などが挙げられる。他の典型的なアミリンのアナログ及び誘導体は、米国特許番号６０８７３３４及び第６９３６５８４号で開示され、それらの開示内容を本願明細書に援用する。
【００７９】
また、本願明細書で開示する組成物及び方法において有用な成分ペプチドとしては、例えは米国特許第５６２５０３２号及び第５５８０９５３号に記載のアミリンアンタゴニストペプチドが挙げられ、それらの開示内容を本願明細書に援用する。アミリンアンタゴニストはＮ末端でアセチル化されてもよく、又はアセチル化されなくともよく、また当該分子はアミドの形態であってもよく、酸の形態であってもよい。アミリンアンタゴニストの例として、限定されないが、アセチル−ＡＴＱＲＬＡＮＥＬＶＲＬＱＴＹＰＲＴＮＶＧＳＮＴＹ（配列番号１２４）、ＡＴＱＱＬＡＮＱＬＶＲＬＱＴＹＰＲＴＮＶＧＳＮＴＹ（配列番号１２５）、ＡＴＱＬＬＡＮＱＬＶＲＬＱＴＹＰＲＴＮＶＧＳＮＴＹ（配列番号１２６）、ＡＴＱＲＬＡＮＱＬＶＲＬＱＴＹＰＲＴＮＶＧＳＮＴＹ（配列番号１２７）、ＡＴＱＬＬＡＮＥＬＶＲＬＱＴＹＰＲＴＮＶＧＳＮＴＹ（配列番号１２８）、及びＡＴＱＱＬＡＮＥＬＶＲＬＱＴＹＰＲＴＮＶＧＳＮＴＹ（配列番号１２９）が挙げられる。
【００８０】
また、本願明細書で開示する組成物及び方法に有用な成分ペプチドホルモンとしては、ＡＤＭペプチドが挙げられる。「アドレノメデュリン」又は「ＡＤＭ」は、ヒトペプチドホルモン及びその種変異型のことを意味する。ＡＤＭは連続的な酵素分解及びアミド化による１８５アミノ酸のプレプロホルモンから生じる。このプロセスは５２のアミノ酸性生理活性ペプチドの生成により終了する。公知の生物学的活性を呈するいかなる公知のＡＤＭペプチド、アナログ、誘導体又はハイブリッドも、本願明細書で開示する組成物及び方法と組合せて使用できる。一実施形態では、ＡＤＭペプチド、アナログ、誘導体及びハイブリッドは、天然型ＡＤＭペプチドの少なくとも１つのホルモン活性を有する。具体的な実施形態では、ＡＤＭペプチド、アナログ、誘導体及びハイブリッドは、天然型のＡＤＭが特異的に結合できる受容体アゴニストである。
【００８１】
また、本願明細書で開示する組成物及び方法に有用な成分ペプチドホルモンとしては、カルシトニン（ＣＴ）ペプチドが挙げられる。「カルシトニン」又は「ＣＴ」には、ヒトペプチドホルモン及びその種変異体（サーモンカルシトニン（ｓＣＴ））が包含される。ＣＴは、大分子のプロホルモンから生じる３２のアミノ酸ペプチドである。単一のジスルフィド結合を含み、アミノ末端に環状構造を形成する。天然型ＣＴペプチドは従来技術において公知であり、同様に、その機能を有するＣＴペプチドのアナログ、誘導体及びハイブリッドも公知である。ヒトのＣＴ（ｈＣＴ）のアミノ酸配列はＣＧＮＬＳＴＣＭＬＧＴＹＴＱＤＦＮＫＦＨＴＦＰＱＴＡＩＧＶＧＡＰ（配列番号１３０）であり、ｓＣＴのアミノ酸配列はＣＳＮＬＳＴＣＶＬＧＫＬＳＱＥＬＨＫＬＱＴＹＰＲＴＮＴＧＳＧＴＰ（配列番号１３１）である。公知の生物学的活性を示す公知のいかなるＣＴペプチドのアナログ、誘導体又はハイブリッドも、本願明細書で開示する組成物及び方法と組合せて使用できる。一実施形態では、ＣＴペプチド、アナログ、誘導体及びハイブリッドは、天然型ＣＴペプチドの少なくとも１つのホルモン活性を有する。具体的な実施形態では、ＣＴペプチド、アナログ、誘導体及びハイブリッドは、天然型のＣＴが特異的に結合できる受容体アゴニストである。ＣＴペプチドのアナログ、誘導体及びハイブリッドは、公知のようにアミド化されてもよく、又は酸の形態であってもよい。
【００８２】
一実施形態では、ＣＴアナログ、誘導体又はハイブリッドは、天然型若しくは天然に存在するＣＴと比較して、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、変異又は付加を有してもよい。すなわちＣＴアナログ、誘導体及びハイブリッドは、天然型のＣＴ（例えばｓＣＴ）と比較して１つ以上のアミノ酸置換、加算又は削除を有するアミノ酸配列を有してもよい。一実施形態では、ＣＴアナログ、誘導体又はハイブリッドは、天然型のＣＴ（例えばｓＣＴ）のアミノ酸配列と比較し、約２５以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下、４以下、３以下、２以下又は１以下の置換、加算又は欠失を有する。
【００８３】
典型的なＣＴアナログとしては、限定されないが８Ｇｌｙ−ＣＴ（配列番号１３２）、２２Ｌｅｕ−ＣＴ（配列番号１３３）、２Ｇｌｙ３Ｓｅｒ８Ｇｌｙ２２ｄｅｓ−Ｔｙｒ−ＣＴ（配列番号１３４）、１４Ｇｌｎ−ｓＣＴ（配列番号１３５）、１８Ａｒｇ−ｓＣＴ（配列番号１３６）、１１，１８Ａｒｇ−ｓＣＴ（配列番号１３７）、１４Ｇｌｎ１８Ａｒｇ−ｓＣＴ（配列番号１３８）、及び１４Ｇｌｎ１１，１８Ａｒｇ−ｓＣＴ（配列番号１３９）が挙げられる。他の典型的なＣＴアナログ及び誘導体は、米国特許第４６５２６２７号、第４６０６８５６号、第４６０４２３８号、第４５９７９００号、第４５３７７１６号、第４４９７７３１号、第４４９５０９７号、第４４４４９８１号、第４４１４１４９号、第４４０１５９３号及び第４３９７７８０号で開示されてもい、それらの開示内容を本願明細書に援用する。
【００８４】
また、本願明細書で開示する組成物及び方法に有用な成分ペプチドホルモンとしては、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）が挙げられる。「カルシトニン遺伝子関連ペプチド」又は「ＣＧＲＰ」は、いかなる生理的形態のヒトペプチドホルモン及びその種変異体のことを意味する。ＣＧＲＰは３７アミノ酸ペプチドであり、カルシトニンｐｒｅ−ｍＲＮＡによりコードされ、選択的にスプライシングされて発現する。公知の生物学的活性を呈する、公知のいかなるＣＧＲＰ、ＣＧＲＰのアナログ、誘導体又はハイブリッドも、本願明細書で開示する組成物及び方法と組合せて使用できる。一実施形態では、ＣＧＲＰペプチド、アナログ、誘導体及びハイブリッドは、天然型ＣＧＲＰの少なくとも１つのホルモン活性を有する。具体的な実施形態では、ＣＧＲＰペプチド、アナログ、誘導体及びハイブリッドは、天然型ＣＧＲＰが特異的に結合できる受容体アゴニストである。ＣＧＲＰペプチドのアナログ、誘導体及びハイブリッドは、公知のようにアミド化されてもよく、又は酸の形態であってもよい。
【００８５】
一実施形態では、ＣＧＲＰのアナログ、誘導体又はハイブリッドは天然型若しくは天然に存在するＣＧＲＰと比較して、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、変異又は付加を有してもよい。すなわちＣＧＲＰのアナログ、誘導体及びハイブリッドは、天然に存在するＣＧＲＰと比較して１つ以上のアミノ酸置換、加算又は削除を有するアミノ酸配列を有してもよい。一実施形態では、ＣＧＲＰのアナログ、誘導体又はハイブリッドは、天然に存在するＣＧＲＰのアミノ酸配列と比較し、約３０以下、２５以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下、４以下、３以下、２以下又は１以下の置換、付加又は欠失を有する。
【００８６】
典型的なＣＧＲＰアナログとしては、限定されないが、３６Ｄ−Ｓｅｒ−ＣＧＲＰ（配列番号１４０）、３６Ｄ−Ｔｈｒ−ＣＧＲＰ（配列番号１４１）、３６Ｄ−Ａｓｐ−ＣＧＲＰ（配列番号１４２）、３６Ｄ−Ａｓｎ−ＣＧＲＰ（配列番号１４３）、３６Ｓｅｒ−ＣＧＲＰ（配列番号１４４）、３６Ｈｓｅ−ＣＧＲＰ（配列番号１４５）、３６Ａｓｐ−ＣＧＲＰ（配列番号１４６）、３６Ｔｈｒ−ＣＧＲＰ（配列番号１４７）、及び３６Ａｓｎ−ＣＧＲＰ（配列番号１４８）が挙げられる。他の典型的なＣＧＲＰのアナログ及び誘導体は、米国特許第４６９７００２号及び第４６８７８３９号（本願明細書に援用する）で開示されている。
【００８７】
また、本願明細書で開示する組成物及び方法に有用な成分ペプチドホルモンとしては、インテルメジン又はＡＦＰ−６ペプチドが挙げられる。「インテルメジン」又は「ＡＦＰ−６」とは、いかなる生理的形態のヒトペプチドホルモン及びその種変異型のことを意味する。天然型ＡＦＰ−６ペプチドは公知であり、同様にその機能を有するＡＦＰ−６ペプチドのアナログ、誘導体及びハイブリッドも公知である。ヒトＡＦＰ−６（又はインテルメジン）のアミノ酸配列はＴＱＡＱＬＬＲＶＧＣＶＬＧＴＣＱＶＱＮＬＳＨＲＬＷＱＬＭＧＰＡＧＲＱＤＳＡＰＶＤＰＳＳＰＨＳＹ（配列番号１４９）である。公知の生物学的活性を呈する、公知のいかなるＡＦＰ−６ペプチド、アナログ、誘導体又はハイブリッドも、本願明細書で開示する組成物及び方法と組合せて使用できる。一実施形態では、ＡＦＰ−６ペプチド、アナログ、誘導体及びハイブリッドは、天然型ＡＦＰ−６の少なくとも１つのホルモン活性を有する。具体的な実施形態では、ＡＦＰ−６ペプチド、アナログ、誘導体及びハイブリッドは、天然型ＡＦＰ−６が特異的に結合できる受容体アゴニストである。ＡＦＰ−６ペプチドのアナログ、誘導体及びハイブリッドは、公知のようにアミド化されてもよく、又は酸の形態であってもよい。
【００８８】
典型的なＡＦＰ−６アナログとしては、限定されないが、ＶＧＣＶＬＧＴＣＱＶＱＮＬＳＨＲＬＷＱＬＭＧＰＡＧＲＱＤＳＡＰＶＤＰＳＳＰＨＳＹ（配列番号１５０）、ＲＶＧＣＶＬＧＴＣＱＶＱＮＬＳＨＲＬＷＱＬＭＧＰＡＧＲＱＤＳＡＰＶＤＰＳＳＰＨＳＹ（配列番号１５１）、ＧＣＶＬＧＴＣＱＶＱＮＬＳＨＲＬＷＱＬＭＧＰＡＧＲＱＤＳＡＰＶＤＰＳＳＰＨＳＹ（配列番号１５２）、ＣＶＬＧＴＣＱＶＱＮＬＳＨＲＬＷＱＬＭＧＰＡＧＲＱＤＳＡＰＶＤＰＳＳＰＨＳＹ（配列番号１５３）、ＴＱＡＱＬＬＲＶＧＣＶＬＧＴＣＱＶＱＮＬＳＨＲＬＷＱＬＲＱＤＳＡＰＶＤＰＳＳＰＨＳＹ（配列番号１５４）、及びＴＱＡＱＬＬＲＶＧＣＶＬＧＴＣＱＶＱＮＬＳＨＲＬＷＱＬＤＳＡＰＶＤＰＳＳＰＨＳＹ（配列番号１５５）が挙げられる。他の典型的なＡＦＰ−６アナログ及び誘導体は、米国特許第６９６５０１３号及び国際公開第２００４／０４８５４７号及び第２００６／０４２２４２号で開示されており、それらの開示内容を参照により本願明細書に援用する。
【００８９】
また、本願明細書で開示する組成物及び方法に有用な成分ペプチドホルモンとしては、コレシストキニン（ＣＣＫ）ホルモンのメンバー（ＣＣＫアゴニストを含む）が挙げられる。「ＣＣＫ」とは、ヒトペプチドホルモン及びその種変異型のことを意味する。より具体的には、ＣＣＫはヒトにおいて最初に同定された３３アミノ酸の配列であって、ブタ、ラット、チキン、チンチラ、イヌ及びヒトにおいては、８アミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏＣ末端断片（ＣＣＫ−８）を有することが報告されている。他の種変異型としては、ブタ、イヌ及びモルモットに存在する３９アミノ酸の配列、及びネコ、イヌ及びヒトに存在する５８アミノ酸の配列、及びＣＣＫ及びガストリンに相応する４７アミノ酸の配列が挙げられる。Ｃ末端硫酸化オクタペプチド配列（ＣＣＫ−８）は、多くの種にわたり比較的よく保存されており、齧歯動物の周辺の生物学的活性を有する最小限配列であってもよい。すなわち用語「ＣＣＫ−３３」は通常、ヒトＣＣＫ（１−３３）ＫＡＰＳＧＲＭＳＩＶＫＮＬＱＮＬＤＰＳＨＲＩＳＤＲＤＹＭＧＷＭＤＦ（配列番号１５６）のことを指し、一方、ＣＣＫ−８（ＣＣＫ（２６−３３））は通常、特に明記しない限り、硫酸化された、若しくはされないＣ末端オクタペプチドのことを指す。硫酸化されたＣＣＫ−８はアミノ酸配列ＤＹ（ＳＯ３）ＭＧＷＭＤＦ（配列番号１５７）を有する。更に、ペンタガストリン又はＣＣＫ−５はＣ末端ペプチドＣＣＫ（２９−３３）ＧＷＭＤＦ（配列番号１５８）のことを指し、ＣＣＫ−４はＣ末端テトラペプチドＣＣＫ（３０−３３）ＷＭＤＦ（配列番号１５９）のことを指す。しかしながら、本願明細書で用いられるＣＣＫとしては通常、ＣＣＫ−３３、ＣＣＫ−８、ＣＣＫ−５及びＣＣＫ−４などの、全ての天然型ホルモンのバリエーションが挙げられ、特に明記しない限り、硫酸化された若しくは硫酸化されない形態であってもよい。ＣＣＫｓ及びその様々なアナログは、従来技術において公知である。
【００９０】
ＣＣＫアナログの様々なｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング方法が公知である。例としては、ＣＣＫ様の活性を解析しようとする化合物を迅速にイヌ又はモルモットに静注した後、胆嚢を縮小させることを含んでなるｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ、並びに、ウサギ胆嚢のストリップを使用して測定するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイが挙げられる。Ｅ．ｇ．，Ｗａｌｓｈ，“Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｈｏｒｍｏｎｅｓ”，Ｉｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｔｒａｃｔ（３ｄ  ｅｄ．１９９４、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照。
【００９１】
典型的なＣＣＫｓ及びＣＣＫアナログとしては、限定されないが、ＤＹ（ＳＯ３Ｈ）ＭＧＷＭＤＦ（配列番号１５７）、ＤＹＭＧＷＭＤＦ（配列番号１６０）、ＭＧＷＭＤＦ（配列番号１６１）、ＧＷＭＤＦ（配列番号１５８）、ＷＭＤＦ（配列番号１５９）、ＫＤＹ（ＳＯ３Ｈ）ＭＧＷＭＤＦ（配列番号１６２）、ＫＤＹＭＧＷＭＤＦ（配列番号１６３）、ＫＭＧＷＭＤＦ（配列番号１６４）、ＫＧＷＭＤＦ（配列番号１６５）及びＫＷＭＤＦ（配列番号１６６）が挙げられる。公知のように、かかるＣＣＫペプチドはアミド化されてもよく、又は任意に酸の形態であってもよい。
【００９２】
また、本願明細書で開示する組成物及び方法に有用な成分ペプチドホルモンとしては、グレリンが挙げられる。幾つかの実施形態では、当該ペプチドは国際公開第０１／８７３３５号及び第０２／０８２５０号に記載されているようなグレリンアンタゴニストである。グレリンアンタゴニストは、ＧＨＳ（成長ホルモン分泌促進物質受容体）アンタゴニストとしても公知である。したがって、本発明で提供される組成物及び方法には、グレリンアンタゴニストの代わりにＧＨＳアンタゴニストの使用が包含される。
【００９３】
また、本願明細書で開示する組成物及び方法に有用な成分ペプチドホルモンとしては、レプチンファミリーのペプチドホルモンが挙げられる。「レプチン」とは、あらゆる種に由来する天然に存在するレプチン、並びに天然に存在するレプチン及びその変異体の、生物学的活性を有するＤ−アイソフォーム若しくはその断片、並びに上記の任意の組合せのことを意味する。レプチンは、米国特許第６００１９６８号にて説明されるような、肥満遺伝子からのポリペプチド生成物である。天然型レプチンファミリーのペプチドホルモンは当該技術分野で公知であり、同様に、その機能を有するペプチドのアナログ、誘導体及びハイブリッドも公知である。特定の天然型レプチンペプチド、そのアナログ、誘導体及びハイブリッドが本願明細書に記載されているが、公知のホルモン活性を呈するいかなる公知のレプチンペプチド、アナログ、誘導体又はハイブリッドも、本願明細書で開示する組成物及び方法に使用できると認識すべきである。一実施形態では、レプチンのアナログ、誘導体及びハイブリッドは、天然型レプチンの少なくとも１つのホルモン活性を有する。具体的な実施形態では、レプチンのアナログ、誘導体及びハイブリッドは、天然型レプチンが特異的に結合できる受容体アゴニストである。レプチンのアゴニスト活性又はアンタゴニスト活性の試験方法は、例えば米国特許第６００７９９８号及び第５８５６０９８号に記載されている。
【００９４】
ヒトレプチンは１６７アミノ酸長である：
ＭＨＷＧＴＬＣＧＦＬＷＬＷＰＹＬＦＹＶＱＡＶＰＩＱＫＶＱＤＤＴＫＴＬＩＫＴＩＶＴＲＩＮＤＩＳＨＴＱＳＶＳＳＫＱＫＶＴＧＬＤＦＩＰＧＬＨＰＩＬＴＬＳＫＭＤＱＴＬＡＶＹＱＱＩＬＴＳＭＰＳＲＮＶＩＱＩＳＮＤＬＥＮＬＲＤＬＬＨＶＬＡＦＳＫＳＣＨＬＰＷＡＳＧＬＥＴＬＤＳＬＧＧＶＬＥＡＳＧＹＳＴＥＶＶＡＬＳＲＬＱＧＳＬＱＤＭＬＷＱＬＤＬＳＰＧＣ（配列番号１６７）。このレプチンポリペプチドは、アミノ酸２１（Ａｌａ）の後ろに位置するシグナル配列切断部位を有する。したがって、成熟ヒトレプチンタンパク質は、アミノ酸２２（Ｖａｌ）からアミノ酸１６７（Ｃｙｓ）の領域にわたる、１４６アミノ酸長を有する：
ＶＰＩＱＫＶＱＤＤＴＫＴＬＩＫＴＩＶＴＲＩＮＤＩＳＨＴＱＳＶＳＳＫＱＫＶＴＧＬＤＦＩＰＧＬＨＰＩＬＴＬＳＫＭＤＱＴＬＡＶＹＱＱＩＬＴＳＭＰＳＲＮＶＩＱＩＳＮＤＬＥＮＬＲＤＬＬＨＶＬＡＦＳＫＳＣＨＬＰＷＡＳＧＬＥＴＬＤＳＬＧＧＶＬＥＡＳＧＹＳＴＥＶＶＡＬＳＲＬＱＧＳＬＱＤＭＬＷＱＬＤＬＳＰＧＣ（配列番号１６８）。
【００９５】
他の典型的なレプチンのアナログは、成熟レプチンの位置２８にはないＧｌｎを有し、１４５のアミノ酸長の、ヒトレプチンの天然変異体である：
ＶＰＩＱＫＶＱＤＤＴＫＴＬＩＫＴＩＶＴＲＩＮＤＩＳＨＴＳＶＳＳＫＱＫＶＴＧＬＤＦＩＰＧＬＨＰＩＬＴＬＳＫＭＤＱＴＬＡＶＹＱＱＩＬＴＳＭＰＳＲＮＶＩＱＩＳＮＤＬＥＮＬＲＤＬＬＨＶＬＡＦＳＫＳＣＨＬＰＷＡＳＧＬＥＴＬＤＳＬＧＧＶＬＥＡＳＧＹＳＴＥＶＶＡＬＳＲＬＱＧＳＬＱＤＭＬＷＱＬＤＬＳＰＧＣ（配列番号１６９）。幾つかの実施形態では、レプチン成分ペプチドは組換え型であって、Ｎ末端でメチオニル残基を有する。
【００９６】
典型的なレプチンのアナログは、以下のように置換されていてもよい：配列番号１６７の位置４３のアミノ酸がＡｓｐ又はＧｌｕで置換、位置４８がＡｌａで置換、位置４９がＧｌｕで置換されるか又は不在、位置７５がＡｌａで置換、位置８９がＬｅｕで置換、位置９３がＡｓｐ又はＧｌｕで置換、位置９８がＡｌａで置換、位置１１７がＳｅｒで置換、位置１３９がＬｅｕで置換、位置１６７がＳｅｒで置換、並びにそれらのいかなる組み合わせ。典型的なレプチンアナログとしては、限定されないが、４３Ａｓｐ−ｌｅｐｔｉｎ（配列番号１７０）、４３Ｇｌｕ−ｌｅｐｔｉｎ（配列番号１７１）、４８Ａｌａ−ｌｅｐｔｉｎ（配列番号１７２）、４９Ｇｌｕ−ｌｅｐｔｉｎ（配列番号１７３）、４９Ｄｅｓ−ｌｅｐｔｉｎ（配列番号１７４）、７５Ａｌａ−ｌｅｐｔｉｎ（配列番号１７５）、８９Ｌｅｕ−ｌｅｐｔｉｎ（配列番号１７６）、９３Ａｓｐ−ｌｅｐｔｉｎ（配列番号１７７）、９３Ｇｌｕ−ｌｅｐｔｉｎ（配列番号１７８）、９８Ａｌａ−ｌｅｐｔｉｎ（配列番号１７９）、１１７Ｓｅｒ−ｌｅｐｔｉｎ（配列番号１８０）、１３９Ｌｅｕ−ｌｅｐｔｉｎ（配列番号１８１）、１６７Ｓｅｒ−ｌｅｐｔｉｎ（配列番号１８２）、４３Ａｓｐ４９Ｇｌｕ−ｌｅｐｔｉｎ（配列番号１８３）、４３Ａｓｐ７５Ａｌａ−ｌｅｐｔｉｎ（配列番号１８４）、８９Ｌｅｕ１１７Ｓｅｒ−ｌｅｐｔｉｎ（配列番号１８５）、及び９３Ｇｌｕ１６７Ｓｅｒ−ｌｅｐｔｉｎ（配列番号１８６）である。
【００９７】
他の典型的なレプチンペプチド、アナログ及び誘導体は、米国特許第５９３５８１０号、第６００１９６８号、第６４２９２９０号、第６３０９８５３号、第５５２１２８３号、第５５３２３３６号、第６７７７３８８号及び第６９３６４３９号で開示されており、それらの開示内容を本願明細書に援用する。他の典型的なレプチンペプチド、アナログ及び誘導体は、国際公開第２００４／０３９８３２号、第９７／０２００４号、第９７／０６８１６号、第９７／１８８３３号、第９７／３８０１４号及び第９８／２８４２７号、並びに米国特許出願公開第２００４／００７２２１９号、第２００３／０４９６９３号、第２００３／０１６６８４７号、第２００３／００９２１２６号で開示されており、その全開示内容を本願明細書に援用する。
【００９８】
また、本願明細書で開示する組成物及び方法に有用な成分ペプチドとしては、ハイブリッドポリペプチドが挙げられる。本発明の用語「ハイブリッドポリペプチド」又は「ハイブリッドポリペプチドホルモン」又は「ハイブリッドペプチドホルモン」とは、少なくとも２つのペプチドホルモン部分が結合してなるポリペプチドのことを指し、当該少なくとも２つのペプチドホルモンは同じペプチドホルモンでない。幾つかの実施形態では、ハイブリッドポリペプチドは共有結合する少なくとも２つのペプチドホルモンの部分を含んでなる。幾つかの実施形態では、当該ペプチドホルモン部分は直接結合してもよく、他の実施形態では、当該ペプチドホルモン部分は例えばリンカー基によって間接的に結合してもよい。幾つかの実施形態では、ハイブリッドポリペプチドは、成分ペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を呈する。典型的なハイブリッドポリペプチドとしては、以下成分ペプチドの１つ以上を含んでなるものが挙げられる：
アミリン、ＡＤＭ、ＣＴ、レプチン、ＰＹＹ、ＮＰＹ、ＧＬＰ−１、ＡＦＰ−６、ＣＣＫ、ＣＧＲＰ、ＧＬＰ−２、ＯＸＭ、エキセンディン及びＧＩＰ。
【００９９】
例えば、幾つかのハイブリッドポリペプチドの参照配列としては、ヒトＧＩＰ、切断されたＧＩＰ、ヒトＧＬＰ−１及びエキセンディン−４、典型的なＴｒｐ−ケージ（ＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ、配列番号１８７）、典型的な短いエキセンディン尾部（ＰＳＳＧＡＰＰＰＳ、配列番号１８８）及び典型的な長いエキセンディン尾部（ＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ、配列番号１８９）が挙げられる。本願明細書及び援用する文献に開示されているエキセンディン尾部及び／又はＴｒｐケージ配列及びアナログ及び誘導体は、例示的なペプチドエンハンサである。
【０１００】
典型的なＧＩＰハイブリッド分子としては、例えば、［Ｌｅｕ１４］ＧＩＰ（１−３０）−エキセンディン−４（３１−３９）（配列番号２９１）、［Ｄ−Ａｌａ２］ＧＩＰ（１−３０）−エキセンディン−４（３１−３９）（配列番号２９２）、及びＧＩＰ（１−３０）−エキセンディン−４（３１−３９）（配列番号１）が挙げられる。典型的なエキセンディンハイブリッド分子としては例えば、［Ｌｅｕ１４，Ｇｌｎ２８］エキセンディン−４（１−３１）−ｆＧＬＰ−１（３３−３７）（配列番号２９８）が挙げられる。
【０１０１】
ＧＩＰハイブリッドは、ペプチドエンハンサ：Ｃ末端Ｔｒｐ−ケージのモチーフ配列、を含んでなってもよい。かかる一実施形態は、式Ｄ−Ｌ−Ｃ−ＳのＧＩＰハイブリッドであり、式中、「Ｄ」領域は任意に修飾されたＮ末端ＧＩＰ配列を含んでなる。式中、「Ｓ」領域はＴｒｐ−ケージ配列のＣ末端配列であってもよく、Ｔｒｐ−ケージ配列のＮ末端部分と隣接した場合にＴｒｐ−ケージを形成できる。かかるペプチドエンハンサ配列は、新規なＧＩＰアナログをプロテアーゼ分解から保護し、安定性を向上させると考えられている。Ｓ領域は典型的には、少なくとも１つのプロリン又はプロリン様残基を含んでなり、隣接する配列のトリプトファン又はトリプトファン様の残基と相互作用してＴｒｐ−ケージを形成できる。領域ＣにはＧＩＰのＣ末端配列が含まれる。これらの分子の幾つかの実施形態では、領域Ｓの少なくとも１つのプロリン又はプロリン様残基と相互作用できるトリプトファン又はトリプトファン様残基は、領域「Ｃ」に位置する。別の一実施形態では、領域Ｃが不在の場合、Ｔｒｐ又はＴｒｐ様残基は、リンカー領域「Ｌ」に存在してもよい。
【０１０２】
典型的なＧＩＰハイブリッドの実施形態では、ＧＩＰ部分は、修飾又は置換されたＧＩＰのＮ末端領域を含んでなり、それにより、天然型のＧＩＰよりも高いＤＰＰ−ＩＶ耐性が提供される。ＧＩＰとのハイブリッド分子の形成に適する化合物又はその断片としては、インクレチン（例えばＧＬＰ−１、エキセンディン）、アミリンファミリーペプチド（例えばアミリン、カルシトニン、カルシトニン関連遺伝子ペプチド、アドレノメデュリン、インテルメジン）、コレシストキニン（ＣＣＫ）、ガストリン、ＰＰＦｓ（例えばＰＰ、ＰＹＹ）、セクレチン、ナトリウム排泄増加性ペプチド、ニューロメディン及び尿コルチンなどが挙げられる。
【０１０３】
具体的な実施形態では、Ｃ末端アミド化ペプチドホルモンが、Ｐ−ＰＩコンジュゲートの成分である。他の実施形態では、ペプチドホルモン成分はアミド化されなくともよい。幾つかの実施形態では、アミド化ペプチドホルモンを有するＰ−ＰＩコンジュゲートとしては、限定されないがアミリンファミリーペプチドホルモン、ＣＣＫ、ＰＹＹ、ｈＧＬＰ−１（７−３６）及びｈＧＬＰ−２を有するものが挙げられる。他の実施形態では、アミド化Ｃ末端を含まないペプチドホルモンを有するＰ−ＰＩコンジュゲートとしては、限定されないがエキセンディン−４、エキセンディン−４（１−２８）、ＧＩＰ、ＧＬＰ−１（７−３７）、カエルＧＬＰ−１（７−３６）及びカエルＧＬＰ−２を有するものが挙げられる。しかしながら、他の実施形態では、これらの成分ペプチドホルモンはＣ末端でアミド化されてもよい。
【０１０４】
本願明細書に記載の組成物及び方法に用いられる典型的なハイブリッドポリペプチドとしては、限定されないが以下のものが挙げられる：
エキセンディン−４−ＰＹＹ（２２−３６）（配列番号１９０）、エキセンディン−４−ＰＹＹ（２５−３６）（配列番号１９１）、エキセンディン−４−ＰＹＹ（１８−３６）（配列番号１９２）、エキセンディン−４−βＡｌａ−βＡｌａ−ＰＹＹ（２２−３６）（配列番号１９３）、エキセンディン−４−βＡｌａ−βＡｌａ−ＰＹＹ（２５−３６）（配列番号１９４）、エキセンディン−４−βＡｌａ−βＡｌａ−ＰＹＹ（３１−３６）（配列番号１９５）、エキセンディン−４（１−２８）−ＰＹＹ（２２−３６）（配列番号１９６）、エキセンディン−４（１−２８）−ＰＹＹ（２５−３６）（配列番号１９７）、エキセンディン−４（１−２８）−ＰＹＹ（１８−３６）（配列番号１９８）、エキセンディン−４（１−２８）−βＡｌａ−βＡｌａ−ＰＹＹ（２２−３６）（配列番号１９９）、エキセンディン−４（１−２８）−βＡｌａ−βＡｌａ−ＰＹＹ（２５−３６）（配列番号２００）、エキセンディン−４（１−２８）−βＡｌａ−βＡｌａ−ＰＹＹ（３１−３６）（配列番号２０１）、５Ａｌａ１４Ｌｅｕ２５Ｐｈｅ−エキセンディン−４（１−２８）−ＰＹＹ（１８−３６）（配列番号２０２）、５Ａｌａ１４Ｌｅｕ２５Ｐｈｅ−エキセンディン−４（１−２８）−ＰＹＹ（２２−３６）（配列番号２０３）、５Ａｌａ１４Ｌｅｕ２５Ｐｈｅ−エキセンディン−４（１−２８）−ＰＹＹ（２５−３６）（配列番号２０４）、５Ａｌａ１４Ｌｅｕ２５Ｐｈｅ−エキセンディン−４（１−１７）−ＰＹＹ（１８−３６）（配列番号２０５）、５Ａｌａ１４Ｌｅｕ２５Ｐｈｅ−エキセンディン−４（１−２８）−βＡｌａ−βＡｌａ−ＰＹＹ（２２−３６）（配列番号２０６）、５Ａｌａ１４Ｌｅｕ２５Ｐｈｅ−エキセンディン−４（１−２８）−βＡｌａ−βＡｌａ−ＰＹＹ（２５−３６）（配列番号２０７）、５Ａｌａ１４Ｌｅｕ２５Ｐｈｅ−エキセンディン−４（１−２８）−βＡｌａ−βＡｌａ−ＰＹＹ（３１−３６）（配列番号２０８）、エキセンディン−４−ＣＣＫ−８（配列番号２０９）、エキセンディン−４（１−２８）−ＣＣＫ−８（配列番号２１０）、エキセンディン−４（１−２８）−ＣＣＫ−８（Ｐｈｅ（ＣＨ２ＳＯ３））（配列番号２１１）、エキセンディン−４（１−２８）−（８−アミノ−３，６−ジオキサオクタノイル）−ＣＣＫ−８（配列番号２１２）、エキセンディン−４（１−２８）−（８−アミノ−３，６−ジオキサオクタノイル）−ＣＣＫ−８（Ｐｈｅ（ＣＨ２ＳＯ３））（配列番号２１３）、エキセンディン−４（１−２７）−ｈアミリン（１−７）−１４Ｇｌｎ，１１，１８Ａｒｇ−ｓＣＴ（８−２７）−アミリン（３３−３７）（配列番号２１４）、エキセンディン−４（１−２７）−２，７Ａｌａ−ｈアミリン（１−７）−ｓＣＴ（８−１０）（配列番号２１５）、２９１２  Ａｄｏ−エキセンディン（１−２８）−ｈアミリン（１−７）−１１，１８Ａｒｇ−ｓＣＴ（８−３２）−ｈアミリン（３３−３７）（配列番号２１６）、２９１２  Ａｄｏ−エキセンディン（１−２８）−１ｄｅｓ−Ｌｙｓ−ｈアミリン（１−７）−１１，１８Ａｒｇ−ｓＣＴ（８−３２）−ｈアミリン（３３−３７）（配列番号２１７）、２９３，６−ジオキサオクタノイル−エキセンデ��ン（１−２８）−ｈアミリン（１−７）−１１，１８Ａｒｇ−ｓＣＴ（８−３２）−ｈアミリン（３３−３７）（配列番号２１８）、２９３，６−ジオキサオクタノイル−エキセンディン（１−２８）−１ｄｅｓ−Ｌｙｓ−ｈアミリン（１−７）−１１，１８Ａｒｇ−ｓＣＴ（８−３２）−ｈアミリン（３３−３７）（配列番号２１９）、２９５  Ａｐａ−エキセンディン（１−２８）−ｈアミリン（１−７）−１１，１８Ａｒｇ−ｓＣＴ（８−３２）−ｈアミリン（３３−３７）（配列番号２２０）、２９５  Ａｐａ−エキセンディン（１−２８）−１ｄｅｓ−Ｌｙｓ−ｈアミリン（１−７）−１１，１８Ａｒｇ−ｓＣＴ（８−３２）−ｈアミリン（３３−３７）（配列番号２２１）、２９βＡｌａ−βＡｌａ−エキセンディン（１−２８）−ｈアミリン（１−７）−１１，１８Ａｒｇ−ｓＣＴ（８−３２）−ｈアミリン（３３−３７）（配列番号２２２）、２９βＡｌａ−βＡｌａ−エキセンディン（１−２８）−１ｄｅｓ−Ｌｙｓ−ｈアミリン（１−７）−１１，１８Ａｒｇ−ｓＣＴ（８−３２）−ｈアミリン（３３−３７）（配列番号２２３）、２９４，７，１０−トリオキサ−１３−トリデカナミン  スクシンイミジル−エキセンディン（１−２８）−ｈアミリン（１−７）  １１，１８Ａｒｇ−ｓＣＴ（８−３２）−ｈアミリン（３３−３７）（配列番号２２４）、２９４，７，１０−トリオキサ−１３−トリデカナミン  スクシンイミジル−エキセンディン（１−２８）−１ｄｅｓ−Ｌｙｓ−ｈアミリン（１−７）−１１，１８Ａｒｇ−ｓＣＴ（８−３２）−ｈアミリン（３３−３７）（配列番号２２５）、ＣＣＫ−８−ＧＫＲ−１５Ｇｌｕ−ｈ−アミリン（１−１７）−１８Ａｒｇ−ｓＣＴ（１８−２６）−アミリン（３２−３７）（配列番号２２６）、アミリン（１−１８）−ＰＹＹ（１９−３６）（配列番号２２７）、イソカプロイル−ＳＴＡＶＬ−（Ａｉｂ）−Ｋ（ホルミル）−ＬＳＱＥＬ−（Ａｉｂ）−Ｋ（ホルミル）−ＬＱＴ−ＰＹＹ（１８−３６）（配列番号２２８）、イソカプロイル−ＳＴＡＶＬ−（Ａｉｂ）−Ｋ（ホルミル）−ＬＳＱＥＬ−（Ａｉｂ）−Ｋ（ホルミル）−Ｌ−ＰＹＹ（１６−３６）（配列番号２２９）、ＣＣＫ−８−［スクシノイル−Ｃｙｓ］−ＰＹＹ（３−３６）（配列番号２３０）、ＣＣＫ−８−［ビス−Ｃｙｓ（Ｎ−アセチル）］−ＰＹＹ（３−３６）（配列番号２３１）、及びＣＣＫ−８−［Ｇｌｙ−アミノキシメチルカルボニル］−ＰＹＹ（３−３６）（配列番号２３２）。
【０１０５】
本願明細書に記載の組成物及び方法に用いられる他の典型的なハイブリッドポリペプチドとしては、限定されないが、以下のものを含んでなる：
ＧＩＰ（１−３０）−（１２  Ａｄｏ）−ｈアミリン（１−７）−１１，１８Ａｒｇ−ｓＣＴ（８−２７）−ｈアミリン（３３−３７）（配列番号２３３）、ＧＩＰ（１−３０）−（１２  Ａｄｏ）−１ｄｅｓ−Ｌｙｓ−ｈアミリン（１−７）−１１，１８Ａｒｇ−ｓＣＴ（８−２７）−ｈアミリン（３３−３７）（配列番号２３４）、ＧＩＰ（１−３０）−（３，６−ジオキサオクタノイル）−ｈアミリン（１−７）−１１，１８Ａｒｇ−ｓＣＴ（８−２７）−ｈアミリン（３３−３７）（配列番号２３５）、ＧＩＰ（１−３０）−（３，６−ジオキサオクタノイル）−１ｄｅｓ−Ｌｙｓ−ｈアミリン（１−７）−１１，１８Ａｒｇ−ｓＣＴ（８−２７）−ｈアミリン（３３−３７）（配列番号２３６）、ＧＩＰ（１−３０）−（５  Ａｐａ）−ｈアミリン（１−７）−１１，１８Ａｒｇ−ｓＣＴ（８−２７）−ｈアミリン（３３−３７）（配列番号２３７）、ＧＩＰ（１−３０）−（５  Ａｐａ）−１ｄｅｓ−Ｌｙｓ−ｈアミリン（１−７）−１１，１８Ａｒｇ−ｓＣＴ（８−２７）−ｈアミリン（３３−３７）（配列番号２３８）、ＧＩＰ（１−３０）−（βＡｌａ−βＡｌａ）−ｈアミリン（１−７）−１１，１８Ａｒｇ−ｓＣＴ（８−２７）−ｈアミリン（３３−３７）（配列番号２３９）、ＧＩＰ（１−３０）−（βＡｌａ−βＡｌａ）−１ｄｅｓ−Ｌｙｓ−ｈアミリン（１−７）−１１，１８Ａｒｇ−ｓＣＴ（２７）−ｈアミリン（３３−３７）（配列番号２４０）、ＧＩＰ（１−３０）−（４，７，１０−トリオキサ−１３−トリデカナミン  スクシンイミジル）−ｈアミリン（１−７）  １１，１８Ａｒｇ−ｓＣＴ（８−２７）−ｈアミリン（３３−３７）（配列番号２４１）、ＧＩＰ（１−３０）−（４，７，１０−トリオキサ−１３−トリデカナミン  スクシンイミジル）−１ｄｅｓ−Ｌｙｓ−ｈアミリン（１−７）−１１，１８Ａｒｇ−ｓＣＴ（８−２７）−ｈアミリン（３３−３７）（配列番号２４２）、ＧＩＰ（１−３０）−（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）−ｈアミリン（１−７）−１１，１８Ａｒｇ−ｓＣＴ（８−２７）−ｈアミリン（３３−３７）（配列番号２４３）、ＧＩＰ（１−３０）−（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）−１ｄｅｓ−Ｌｙｓ−ｈアミリン（１−７）−１１，１８Ａｒｇ−ｓＣＴ（２７）−ｈアミリン（３３−３７）（配列番号２４４）、ＧＩＰ（１−３０）−（４，７，１０−トリオキサ−１３−トリデカナミン  スクシンイミジル）−ｈアミリン（１−７）−１１，１８Ａｒｇ−ｓＣＴ（８−２７）−ｈアミリン（３３−３７）（配列番号２４５）、及びＧＩＰ（１−３０）−（４，７，１０−トリオキサ−１３−トリデカナミン  スクシンイミジル）−１ｄｅｓ−Ｌｙｓ−ｈアミリン（１−７）−１１，１８Ａｒｇ−ｓＣＴ（８−２７）−ｈアミリン（３３−３７）（配列番号２４６）。
【０１０６】
本願明細書に記載の組成物及び方法に用いられる典型的なハイブリッドポリペプチドとしては、米国仮特許出願第６０／６５３４３３号、第６０／６５１６４７号、第６０／７０７２４４号、第６０／７０７３６９号、第６０／７０９３１６号及び第６０／７０９３２０号に記載されているのもが挙げられ、それらの分子に関して、本願明細書において援用する。また、本願明細書に記載の組成物及び方法に用いられる典型的なハイブリッドポリペプチドは、米国特許出願第１１／２０１６６４号、米国出願公開第２００６／００９４６５２号及び第２００６／０２９３２３２号及び国際公開第２００５／０７７０７２号に記載されているものが挙げられ、それらの分子に関して、本願明細書において援用する。
【０１０７】
本願明細書に記載のコンジュゲート分子及び方法に有用な成分ペプチダーゼ阻害剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏで活性型の薬剤であってもよく、又はｉｎ  ｖｉｖｏで活性型に変化するプロドラッグであってもよい。本願明細書において示されるように、リシノプリルエステルを有するＰ−ＰＩコンジュゲートは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＣＥ阻害剤アッセイにおいて不活性であるが、非エステル型のリシノプリルを有するＰ−ＰＩコンジュゲートはＡＣＥ阻害活性を示す。典型的な成分ペプチダーゼ阻害剤は活性型の薬剤であっても、若しくは阻害剤のプロドラッグ形態であってもよく、又は、それらのいずれの形態も、本発明のコンジュゲート分子及び方法に使用できる。
【０１０８】
本願明細書に記載のコンジュゲート分子及び方法において有用な成分ペプチダーゼ阻害剤としては、脈管ペプチダーゼ阻害剤（例えばアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、中性エンドペプチターゼ（ＮＥＰ）阻害剤、エンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）阻害剤、ＡＣＥ／ＮＥＰ阻害剤、ＮＥＰ／ＥＣＥ阻害剤）、及びＡＣＥ／ＮＥＰ／ＥＣＥ阻害剤などが挙げられるが、それらに限定されない。アンギオテンシンＩ−変換酵素は、アンギオテンシンＩをアンギオテンシンＩＩ（強力な昇圧剤）及びアルドステロン刺激ペプチドに加水分解することによって、血圧調節及び電解質調節において重要な役割を果たすジペプチジルカルボキシペプチダーゼである。ＡＣＥはまた、キニン（例えばブラジキニン）のような、他の生物学的活性ポリペプチドを加水分解できる。ブラジキニンは血管拡張薬であり、血管拡張プロスタグランジンの放出を誘導することによって少なくとも部分的に作用し、ＡＣＥによる加水分解により不活性化される。すなわちＡＣＥは、少なくとも部分的には、アンギオテンシンＩＩ（血管収縮薬）を生じさせ、またブラジキニン（血管拡張薬）を不活性化することによって血圧を増加させる。ＡＣＥ（ペプチジルジペプチダーゼＡ（ＥＣ３．４．１５．１）及びキニナーゼＩＩとも呼ばれる）は金属ペプチダーゼ（特に亜鉛ペプチダーゼ）である。
【０１０９】
本願明細書に記載のコンジュゲート分子及び方法に用いられる典型的なＡＣＥ阻害剤としては、限定されないが、ベナゼプリル、カプトプリル（１−［（２Ｓ）−３−メルカプト−２−メチルプロピオニル］−Ｌ−プロリン）セロナプリル、エナラプリル（Ｎ−（１−エトキシカルボニル−３−フェニルプロピル）−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリン）エナラプリラット、フェンチアプリル、フォシノプリル、イミダプリル、リシノプリル（メルク、アストラゼネカ社製）、モエキシプリル、ペリンドプリル（セルビエ社製）、キナプリル（ワーナー・ランバート社製）、ラミプリル及びトレンドラプリルが挙げられる。本願明細書に使用できるＡＣＥ阻害剤の他の非限定的な例としては、セタプリル、シラザプリル、デラプリル、インドラプリル（シェーリング社製）、スピラプリル（シェーリング）及びゾフェノプリルなどが挙げられる。幾つかの実施形態では、ＡＣＥ阻害剤はペプチド（例えばｐＧｌｕＷＰＲＰＱＩＰＰ又はｐＧｌｕＫＷＡＰ）であり、式中、ｐＧｌｕはピログルタミン酸を指す。典型的なＡＣＥ阻害剤としては、例えば米国特許第４０４６８８９号、第４３１６９０６号、第４３７４８２９号、第４４５２７９０号、第４１６８２６７号、第４３３７２０１号、第４３８５０５１号及び第４３４４９４９号で開示するものが挙げられる。
【０１１０】
本願明細書に記載のように、本願明細書に記載のコンジュゲート分子及び方法に有用な成分ペプチダーゼ阻害剤には、ＮＥＰ阻害剤が包含される。ＡＣＥと同様、ＮＥＰは内皮細胞表面メタロプロテイナーゼであり、ナトリウム利尿ペプチドなどの幾つかの調整ペプチドの分解に関与し、それにより、心房性ナトリウム利尿ペプチドの濃度上昇による血管拡張及びナトリウム尿排泄亢進がなされる。ＮＥＰ阻害剤のとしては、限定されないがホスホラミドン、チオファン、レトロチオルファン、キャンドキサトリル及びアセトルファンなどが挙げられる。また、本願明細書に記載のコンジュゲート分子及び方法に有用な成分ペプチダーゼ阻害剤には、ＥＣＥ阻害剤が包含される。ＥＣＥは生物学的活性を有するエンドセリンペプチド（強力な血管収縮薬）の形成に関与する主要な酵素である。
【０１１１】
脈管ペプチダーゼ阻害剤にはまた、ＮＥＰ及びＡＣＥ阻害活性を有するＮＥＰ／ＡＣＥ阻害剤が包含される。ＮＥＰ／ＡＣＥ阻害剤の例としては、限定されないが、三環ベンズアゼピノンチオール、オマパトリラット、ゲモパトリラット、ミキサンプリル、ラセカドトリル、ファシドトリル、サムパトリラット、ＭＤＬ１００．２４０、Ｚ１３７５２Ａ、ＢＭＳ１８９９２１、ＢＭＳ１８２６５７及びＣＧＳ３０００８などが挙げられる。本願明細書における使用に適するＮＥＰ／ＡＣＥ阻害剤の例としては、米国特許第５３６２７２７号、第５３６６９７３号、第５２２５４０１号、第４７２２８１０号、第５２２３５１６号、第４７４９６８８号、第５５５２３９７号、第５５０４０８０号、第５６１２３５９号及び第５５２５７２３号で開示するものが挙げられる。典型的なＮＥＰ／ＡＣＥ阻害剤には、以下のものが包含される。
【０１１２】
【化６】
0005412273.tif 000007
【０１１３】
脈管ペプチダーゼ阻害剤にはまた、ＮＥＰ及びＥＣＥ阻害活性を有するＮＥＰ／ＥＣＥ阻害剤が挙げられる。ＮＥＰ／ＥＣＥ阻害剤の例としては、限定されないがホスホラミドンが挙げられる。
【０１１４】
【化７】
0005412273.tif 000008
【０１１５】
Ｖｅｅｌｋｅｎら（２００２）  Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２０：５９９−６０３．参照。
【０１１６】
脈管ペプチダーゼ阻害剤にはまた、ＡＣＥ、ＮＥＰ及びＡＣＥ阻害活性を有するＮＥＰ／ＡＣＥ／ＥＣＥ阻害剤が挙げられる。ＮＥＰ／ＡＣＥ／ＥＣＥ阻害剤の例としては、ＣＧＳ２６５８２及びＮ−［２−（インダン−１−イル）−３−メルカプト−プロピオニル］アミノ酸のアナログなどが挙げられるが、これらに限定されない（Ｉｎｇｕｉｍｂｅｒｔら（２００２）  Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２：２００１−２００５）。典型的なＮＥＰ／ＡＣＥ／ＥＣＥ阻害剤としては、以下のものが挙げられる。
【０１１７】
【化８】
0005412273.tif 000009
【０１１８】
本願明細書に記載のコンジュゲート分子及び方法において有用な成分ペプチダーゼ阻害剤としては、アンギオテンシン変換酵素関連のカルボキシペプチダーゼ（ＡＣＥ２）の阻害剤が挙げられる。ＡＣＥ２は亜鉛金属ペプチダーゼであり、ＡＣＥのホモログであるが、ＡＣＥ２はＡＣＥと異なる基質特異性を有する（Ｖｉｃｋｅｒｓら（２００２）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１４８３８−１４８４３）。ＡＣＥ２はｄｅｓ−Ａｒｇブラジキニン（局地的血管拡張薬）を開裂して不活性化し、炎症又は組織の損傷が発生するとき発現されるブラジキニンＢ１受容体と結合する機能を発揮する。本願明細書に記載のコンジュゲート分子及び方法に用いられる典型的なＡＣＥ２阻害剤としては、ＭＬＮ−４７６０（（Ｓ，Ｓ）−２−｛１−カルボキシ−２−［３−（３，５−ジクロロベンジル）−３Ｈ−イミダゾル−４−イル］−エチルアミノ｝−４−メチルペンタン酸、Ｔｏｗｌｅｒら（２００４）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１７９９６−１８００７）、Ｎ−（２−アミノエチル）−１アジリジン−エタンアミン（Ｈｕｅｎｔｅｌｍａｎら（２００４）  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ４４：９０３−９０６及びＡｃ−ＧＤＹＳＨＣＳＰＬＲＹＹＰＷＷＫＣＴＹＰＤＰＥＧＧＧ−ＮＨ２（配列番号２４７）などのＡＣＥ２のペプチド阻害剤、並びにＨｕａｎｇら（２００３）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１５５３２−１５５４０に記載の他の阻害剤が挙げられる。
【０１１９】
ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）（ＥＣ３．４．１４．５）は、２位においてプロリン又はアラニンを有するペプチド基質から選択的にＮ末端ジペプチドを加水分解するセリンプロテアーゼである。その基質はＧＬＰ−１及びＧＩＰを含むため、ＤＰＰ−ＩＶはブドウ糖ホメオスタシスの制御に関与する。ＰＦＦメンバー（例えばＰＹＹ及びＮＰＹ）のメンバーはＤＰＰ−ＩＶの基質でもある。これらのペプチドからのＮ末端アミノ酸の裂開により、それらは機能的に不活性となる。したがって、ＤＰＰ−ＩＶは本願明細書に記載の糖尿病、糖耐性、肥満、食欲調節、心血管疾患、並びに他の症状又は障害において生理的な役割を演じうる。ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の投与により、ＧＬＰ−１及びＧＩＰのＮ末端の分解が防止され、それにより、これらのペプチドの循環時の濃度を高いレベルに維持することができる。更に、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤による処理により、ＰＹＹ及びＮＰＹの分解が防止される。
【０１２０】
したがって、本願明細書に記載のコンジュゲート分子及び方法に有用な成分ペプチダーゼ阻害剤には、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤も包含される。ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の例としては、Ｎ−（置換グリシル）−２−シアノピロリジン、テトラヒドロイソキノリン３−カルボキサミド誘導体、フッ化環式アミド、アダマンチルグリシンベースの阻害剤及びグリシンニトリルベースの阻害剤などが挙げられるが、これらに限定されない。シアノピロリジン阻害剤としては、限定されないが、可逆的阻害剤（例えば以下の遅い可逆的阻害剤）が挙げられる。
【０１２１】
【化９】
0005412273.tif 000010
【０１２２】
式中、Ｒはペプチド修飾のための共有結合又は非共有結合性リンカーである。本発明における使用に適しているＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の例としては、米国特許第６０１１１５５号、第６１２４３０５号、第６１６６０６３号、第６４３２９６９号、第６１７２０８１号、第６７１００４０号、第６８６９９４７号、第６９９５１８３号及び第６９９５１８０号で開示するそれらが挙げられる。
【０１２３】
ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない（ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の番号を、構造式の下に示す）：
【０１２４】
【化１０】
0005412273.tif 000011
【０１２５】
本願明細書における使用に適するＤＰＰ−ＩＶ阻害剤には、ホウ素含有−及びシアノベースのマレイミドＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が包含される。Ｋｅｌｌｙら（１９９３）  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９：１００９−１０１６、Ｓｎｏｗら（１９９４）  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：１０８６０−１０８６９、  Ｃｏｕｔｔｓら（１９９６）  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：２０８７−２０９４、及びＪｅａｎｆａｖｒｅら（１９９６）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５２：１７５７−１７６５参照。ホウ素ベース（下記の化合物８）及びシアノベース（下記の化合物９）のマレイミドＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の例としては、限定されないが、以下のものが挙げられる。
【０１２６】
【化１１】
0005412273.tif 000012
【０１２７】
２−シアノベースのＤＰＰＩＶ阻害剤（化合物９）の合成は、以下の通り実施できる。
【０１２８】
【化１２】
0005412273.tif 000013
【０１２９】
２−ホウ素ベースのＤＰＰＩＶ阻害剤（化合物８）の合成は、以下の通り実施できる。
【０１３０】
【化１３】
0005412273.tif 000014
【０１３１】
また、本願明細書に記載のコンジュゲート分子及び方法に有用な成分ペプチダーゼ阻害剤には、セリンプロテアーゼ阻害剤が包含される。セリンプロテアーゼ阻害剤は従来技術において公知である。使用のセリンプロテアーゼ阻害剤の例としては、限定されないが、４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオライド（ＡＥＢＳＦ）、アプロチニン、エラスチナル、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン、ＧＧＡＣＫロイペプチン、フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）キモスタチン、アンチトロンビンＩＩＩ、３，４−ジクロロイソクマリン、トシル−Ｌ−リジンクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）、トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）、ジフェニルヨードニウム  ヘキサフルオロホスフェート（ＤＩＦＰ）アンチパイン及びα２−マクログロブリンなどが挙げられる。幾つかの実施形態では、Ｐ−ＰＩコンジュゲートは成分ペプチダーゼ阻害剤としてＡＥＢＳＦを含む。
【０１３２】
また、本願明細書に記載のコンジュゲート分子及び方法に有用な成分ペプチダーゼ阻害剤としては、カルボキシペプチダーゼ阻害剤が挙げられる。一実施形態では、Ｐ−ＰＩコンジュゲートに用いられるカルボキシペプチダーゼ阻害剤はペプチドである。幾つかの実施形態では、カルボキシペプチダーゼ阻害剤は、ＲＱＲＹ又はＲＱＲＷのカルボキシ末端アミノ酸のモチーフを有する基質ペプチドに作用して当該基質ペプチドからＣ末端アミノ酸を除去するカルボキシペプチダーゼの活性を阻害する、ペプチドである。幾つかの実施形態では、カルボキシペプチダーゼの基質ペプチドは、ＰＹＹ（１−３６）、ＰＹＹ（３−３６）及びＮＰＹ（例えばアミド化されたＰＹＹ（１−３６）、ＰＹＹ（３−３６）及びＮＰＹ）である。
【０１３３】
幾つかの実施形態では、カルボキシペプチダーゼ阻害剤は、修飾ＰＹＹペプチド又は修飾ＮＰＹペプチド（例えば位置３６で修飾されるＰＹＹ又はＮＰＹペプチド）である。例えば、典型的なカルボキシペプチダーゼ阻害剤としては、Ｔｙｒ３６のα−アミノ窒素においてメチレン基を有するＰＹＹ又はＮＰＹペプチド、例えば、３６Ｎ−メチル−Ｔｙｒ−ＰＹＹ（１−３６）（配列番号２４８）、３６Ｎ−メチル−Ｔｙｒ−ＰＹＹ（３−３６）（配列番号２４９）、３６Ｎ−メチル−Ｔｙｒ−ＰＹＹ（１２−３６）（配列番号２５０）、３６Ｎ−メチル−Ｔｙｒ−ＰＹＹ（１８−３６）（配列番号２５１）、３６Ｎ−メチル−Ｔｙｒ−ＰＹＹ（２２−３６）（配列番号２５２）、３６Ｎ−メチル−Ｄ−Ｔｙｒ−ＰＹＹ（１−３６）（配列番号２５３）、３６Ｎ−メチル−Ｄ−Ｔｙｒ−ＰＹＹ（３−３６）（配列番号２５４）、３６Ｎ−メチル−Ｄ−Ｔｙｒ−ＰＹＹ（１２−３６）（配列番号２５５）、３６Ｎ−メチル−Ｄ−Ｔｙｒ−ＰＹＹ（１８−３６）（配列番号２５６）、３６Ｎ−メチル−Ｄ−Ｔｙｒ−ＰＹＹ（２２−３６）（配列番号２５７）、３６Ｎ−メチル−Ｔｙｒ−ＮＰＹ（配列番号２５８）、３６Ｎ−メチル−Ｔｙｒ−ＮＰＹ（１２−３６）（配列番号２５９）、３６Ｎ−メチル−Ｔｙｒ−ＮＰＹ（１８−３６）（配列番号２６０）、３６Ｎ−メチル−Ｔｙｒ−ＮＰＹ（２２−３６）（配列番号２６１）、３６Ｎ−メチル−Ｄ−Ｔｙｒ−ＮＰＹ（配列番号２６２）、３６Ｎ−メチル−Ｄ−Ｔｙｒ−ＮＰＹ（１２−３６）（配列番号２６３）、３６Ｎ−メチル−Ｄ−Ｔｙｒ−ＮＰＹ（１８−３６）（配列番号２６４）、及び３６Ｎ−メチル−Ｄ−Ｔｙｒ−ＮＰＹ（２２−３６）（配列番号２６５）が挙げられるが、これらに限定されない。別の典型的なカルボキシペプチダーゼ阻害剤としては、位置３６のＤ−Ｔｙｒ、位置３６のキラルβ−Ｔｙｒ、位置３６のヒドロキシＰｒｏ、位置３６のＰｈｅ、位置３６のＰｈｅ−ＣＨ２ＳＯ３Ｈ又は位置３６のＴｒｐを有する、ＰＹＹ又はＮＰＹペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。典型的なカルボキシペプチダーゼ阻害剤としては、位置３６においてかかる変異を有するＰＹＹ（１−３６）、ＰＹＹ（３−３６）、ＰＹＹ（１２−３６）、ＰＹＹ（１８−３６）、ＰＹＹ（２２−３６）、ＮＰＹ、ＮＰＹ（１２−３６）、ＮＰＹ（１８−３６）及びＮＰＹ（２２−３６）が挙げられる。これらのカルボキシペプチダーゼ阻害剤のカルボキシ末端は、−ＮＨ２、−ＮＨＯＨ、−ＮＨ−ＣＨ３、又は−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ３であってもよい。
【０１３４】
典型的なカルボキシペプチダーゼ阻害剤としてはまた、記載のような位置３６の変異を有し、更に当該ペプチド内の他の部位にも変異を有するＰＹＹ又はＮＰＹペプチドが包含される。例えば、本願明細書で説明される３６位置の変異を有するＰＹＹ又はＮＰＹペプチドはまた、アミノ酸の内部欠失、リンカー基の内部挿入、又は内部アミノ酸の欠失と内部リンカー基の挿入との組合せを有してもよい。このタイプの典型的なカルボキシペプチダーゼ阻害剤としては、限定されないが、３６Ｎ−メチル−Ｔｙｒ−ＰＹＹ（３−１０、２２−３６）ＩＫＰＥＡＰＧＥＡＳＬＲＨＹＬＮＬＶＴＲＱＲＹ（Ｎ−Ｍｅ）（配列番号２６６）、３６Ｎ−メチル−Ｔｙｒ−ＰＹＹ（３−１０−リンカー−２２−３６）ＩＫＰＥＡＰＧＥ（リンカー）ＡＳＬＲＨＹＬＮＬＶ  ＴＲＱＲＹ（Ｎ−Ｍｅ）（配列番号２９６（リンカー）配列番号２５２）、及び３６Ｎ−メチル−Ｔｙｒ−ＰＹＹ（３−１０−リンカー−１８−３６）ＩＫＰＥＡＰＧＥ（リンカー）ＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬＶＴＲＱＲＹ（Ｎ−Ｍｅ）（配列番号２９６）（リンカー）（配列番号２５１）などが挙げられる。これらのカルボキシペプチダーゼ阻害剤のカルボキシ末端は、−ＮＨ２、−ＮＨＯＨ、−ＮＨ−ＣＨ３、又は−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ３であってもよい。例えば、これらのペプチドに用いられるリンカー基を以下に例示する：
【０１３５】
【化１４】
0005412273.tif 000015
【０１３６】
式中、ｎ＝０−３、Ｒ＝ペプチド、Ｒ’＝ＯＨ又はＮＨ２、Ｒ”＝ペプチド。
【０１３７】
典型的なカルボキシペプチダーゼ阻害剤にはまた、本願明細書において説明した３６位置の変異の有無にかかわらずに、当該ペプチドの範囲内の他の部位にも変異を有するＰＹＹ又はＮＰＹペプチドが包含される。例えば、ＰＹＹ又はＮＰＹペプチドは内部Ｄ−アミノ酸、α−アミノ窒素においてメチレン基を有する内部アミノ酸、又はかかるアミノ酸残基の組合せを有してもよいこのタイプの典型的なカルボキシペプチダーゼ阻害剤としては、限定されないが、３５Ｎ−メチル−Ａｒｇ−ＰＹＹ（３−３６）（配列番号２６７）、３５Ｄ−Ａｒｇ３６Ｎ−メチル−Ｔｙｒ−ＰＹＹ（３−３６）（配列番号２６８）、３５Ｎメチル−Ｄ−Ａｒｇ−ＰＹＹ（３−３６）（配列番号２６９）、３４Ｎ−メチル−Ｇｌｎ−ＰＹＹ（３−３６）（配列番号２７０）、３４Ｄ−Ｇｌｎ３６Ｎ−メチル−Ｔｙｒ−ＰＹＹ（３−３６）（配列番号２７１）、３４Ｎ−メチル−Ｄ−Ｇｌｎ−ＰＹＹ（３−３６）（配列番号２７２）、３３Ｎ−メチル−Ａｒｇ−ＰＹＹ（３−３６）（配列番号２７３）、３３Ｄ−Ａｒｇ３６Ｎ−メチル−Ｔｙｒ−ＰＹＹ（３−３６）（配列番号２７４）、３３Ｎ−メチル−Ｄ−Ａｒｇ−ＰＹＹ（３−３６）（配列番号２７５）、１９Ｎ−メチル−Ａｌａ−ＰＹＹ（３−３６）（配列番号２７６）、１９Ｄ−Ａｌａ３６Ｎ−メチル−Ｔｙｒ−ＰＹＹ（３−３６）（配列番号２７７）、１９Ｎ−メチル−Ｄ−Ａｌａ−ＰＹＹ（３−３６）（配列番号２７８）、３５Ｎ−メチル−Ａｒｇ−ＮＰＹ（配列番号２７９）、３５Ｄ−Ａｒｇ３６Ｎ−メチル−Ｔｙｒ−ＮＰＹ（配列番号２８０）、３５Ｎメチル−Ｄ−Ａｒｇ−ＮＰＹ（配列番号２８１）、３４Ｎ−メチル−Ｇｌｎ−ＮＰＹ（配列番号２８２）、３４Ｄ−Ｇｌｎ３６Ｎ−メチル−Ｔｙｒ−ＮＰＹ（配列番号２８３）、３４Ｎ−メチル−Ｄ−Ｇｌｎ−ＮＰＹ（配列番号２８４）、３３Ｎ−メチル−Ａｒｇ−ＮＰＹ（配列番号２８５）、３３Ｄ−Ａｒｇ３６Ｎ−メチル−Ｔｙｒ−ＮＰＹ（配列番号２８６）、３３Ｎ−メチル−Ｄ−Ａｒｇ−ＮＰＹ（配列番号２８７）、１９Ｎ−メチル−Ａｌａ−ＮＰＹ（配列番号２８８）、１９Ｄ−Ａｌａ３６Ｎ−メチル−Ｔｙｒ−ＮＰＹ（配列番号２８９）、及び１９Ｎ−メチル−Ｄ−Ａｌａ−ＮＰＹ（配列番号２９０）などが挙げられる。これらのカルボキシペプチダーゼ阻害剤のカルボキシ末端は、−ＮＨ２、−ＮＨＯＨ、−ＮＨ−ＣＨ３、又は−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ３であってもよい。
【０１３８】
コンジュゲート中のペプチドとペプチダーゼ阻害剤は、本願明細書に記載の方法、又は従来技術において公知のいかなる方法で結合させてもよい。かかるコンジュゲート結合には、共有結合結合、非共有結合性結合又はその両方が包含される。安定な結合を用いてもよく、又は切断可能な結合を用いてもよい。非共有結合性結合は、いかなる非共有結合的な力によって形成されてもよく、例えば、疎水的相互作用、イオン（静電的）結合、金属複合体形成、水素結合、ヴァンデルヴァールス力又はそれらの異なる２以上の相互作用の組合せであってもよい。
【０１３９】
本願明細書に記載の成分ペプチド及び成分ペプチダーゼ阻害剤は、直接アミド結合していてもよく、又は化学的にリンカー基を介して共有結合していてもよい。コンジュゲートしたペプチド及びペプチダーゼ阻害剤成分は、化学的又はペプチドリンカー基、又はターンインデューサーを介して間接的に結合してもよい。有用な連結手段及び結合の例は、本願明細書において示されるＰＰＩアナログにおいて示される。
【０１４０】
一実施形態では、成分ペプチドとペプチダーゼ阻害剤は、第２のモジュールのアミノ基に直接結合してもよい。他の実施形態では、連結基を当該モジュール連結に使用してもよい。典型的な連結基としては、限定されないがアルキル、ＰＥＧ、アミノ酸（例えばＬｙｓ、Ｇｌｕ、β−Ａｌａ）、ポリアミノ酸（例えばｐｏｌｙ−ｈｉｓ、ポリａｒｇ、ポリｌｙｓ、ポリ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（ＧＫＲ）、二官能性リンカー（例えばＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（ロックフォード、ＩＬ）から市販されているアミノカプロイル（Ａｃａ）、β−アラニル、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタノイル、並びに公知の他の切断可能及び非切断可能リンカーが挙げられる。
【０１４１】
１つの態様では、当該ペプチドは、リンカー又はターンインデューサーを介してペプチダーゼ阻害剤に結合する。リンカー又はターンインデューサーは、化学的な結合でもよく、ペプチド性の結合でもよい。リンカーは、例えば、ペプチドのアミノ末端、ペプチドのカルボキシ末端、又はペプチドの内部アミノ酸側鎖に結合してもよく、またペプチド及びペプチダーゼ阻害剤と共有結合する。リンカーは、ペプチダーゼ阻害剤をペプチドに結合できるいかなるリンカーでもあってもよく、例えばコハク酸、オルトゴナルに結合可能なアミノ酸（例えばＧｌｕ又はＬｙｓ）、及びポリアミノ酸（例えばポリリシン、ポリアルギニン、ポリグリシン）などが挙げられる。幾つかの実施形態では、リンカーは図２に示される群から選択される。幾つかの実施形態では、リンカーは以下からなる群から選択される：
【０１４２】
【化１５】
0005412273.tif 000016
【０１４３】
式中、ｎ＝０〜３、Ｒ＝阻害剤又はペプチド、Ｒ’＝ＯＨ又はＮＨ２、Ｒ”＝ペプチド又は阻害剤である。
【０１４４】
一実施形態では、連結基はペプチド擬態を含むことができる。かかる擬態物の使用により、ペプチドの立体構造の形成を誘導若しくは安定させることができる。例えば、β−ターン擬態物には、Ａｌａ−Ａｉｂ及びＡｌａ−Ｐｒｏジペプチド、並びに、以下に例示する擬態Ａ及び擬態Ｂが包含される：
【０１４５】
【化１６】
0005412273.tif 000017
【０１４６】
擬態Ａは、Ｎ−（３Ｓ，６Ｓ，９Ｓ）−２−オキソ−３−アミノ−１−アザビシクロ［４．３．０］−ノナン−９−カルボン酸である。擬態Ｂは、Ｎ−（３Ｓ，６Ｓ，９Ｒ）−２−オキソ−３−アミノ−７−チア−１−アザビシクロ［４．３．０］−ノナン−９−カルボン酸である。
【０１４７】
１つの一実施形態では、リンカーは１〜３０のアミノ酸残基長の鎖であり、他の実施形態では、リンカーは２〜３０のアミノ酸残基長の鎖であり、更に他の実施形態では、リンカーは３〜３０のアミノ酸残基長の鎖である。他の実施形態では、リンカーは２〜３０のいかなる整数のアミノ酸残基長であってもよく、例えば２、３、４、５、６、７などの整数である。一実施形態では、Ｇｌｙリンカーを用いる。一実施形態では、３残基のＧｌｙリンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）を用いる。一実施形態では、β−Ａｌａリンカー（例えばβ−Ａｌａ−β−Ａｌａ）を用いる。一実施形態では、γ−Ａｂｕ（γ−アミノ酪酸）リンカーを用いる。
【０１４８】
幾つかの実施形態では、Ｐ−ＰＩは、成分ペプチドの最低限の生物学的活性を示す。幾つかの実施形態では、Ｐ−ＰＩは、成分ペプチダーゼ阻害剤の最低限の阻害活性を示す。他の実施形態では、Ｐ−ＰＩは、ペプチドの最低限の生物学的活性、及びペプチダーゼ阻害剤の阻害活性を示す。幾つかの実施形態では、Ｐ−ＰＩコンジュゲートは、コンジュゲート複合体中に成分ペプチド若しくは成分プロテアーゼ阻害剤が存在しない場合と比較し、代謝安定性、化学安定性、受容体との相互作用又は高次構造の安定性が少なくとも増加している。
【０１４９】
本願明細書に記載のＰ−ＰＩコンジュゲートは、少なくとも１つのペプチダーゼ阻害剤に結合（共有結合、又は非共有結合）する、少なくとも１つのペプチドを含んでなる。幾つかの実施形態では、Ｐ−ＰＩコンジュゲートは、ペプチダーゼ阻害剤分子に結合する２つ以上のペプチドを含んでなる。幾つかの実施形態では、Ｐ−ＰＩコンジュゲートは、ペプチドに結合する２つのペプチダーゼ阻害剤分子を含んでなる。幾つかの実施形態では、Ｐ−ＰＩコンジュゲートは、ペプチドに結合する２つの異なるペプチダーゼ阻害剤を含んでなる。幾つかの実施形態では、Ｐ−ＰＩコンジュゲートは、ペプチドに結合する３つのペプチダーゼ阻害剤分子を含んでなる。３つの阻害剤分子を有するコンジュゲートにおいては、全ての３つの阻害剤は同じでもよく、全ての３つの阻害剤は異なってもよく、又は２つの阻害剤は同じで、第３のものたそれらの２つのものと異なってもよい。
【０１５０】
本願明細書に記載の単一のペプチダーゼ阻害剤分子は、１つ以上のタイプのペプチダーゼを阻害してもよい。例えば、ＮＥＰ／ＡＣＥ阻害剤は、ＮＥＰ阻害剤及びＡＣＥ阻害剤の二重の活性を有する。したがって、１つのペプチダーゼ阻害剤分子を含んでなるＰ−ＰＩコンジュゲート分子が、複数のペプチダーゼ阻害活性を有する場合もある。幾つかの実施形態では、Ｐ−ＰＩコンジュゲートは２つ以上のペプチダーゼ阻害活性を有する。幾つかの実施形態では、Ｐ−ＰＩコンジュゲートは３つ以上のペプチダーゼ阻害活性を有する。幾つかの実施形態では、１つ以上のペプチダーゼ阻害剤をペプチドに連結することにより、複数のペプチダーゼ阻害活性を有するＰ−ＰＩコンジュゲートが得られる。例えば、ＮＥＰ／ＡＣＥ阻害剤に結合するペプチドを含んでなるＰＰＩは、単一のペプチダーゼ阻害剤分子の結合により２つの阻害活性を示す。別の例として、ＮＥＰ／ＥＣＥ阻害剤及びＡＣＥ阻害剤に結合するペプチドを含んでなるＰＰＩは、２つの異なるペプチダーゼ阻害剤分子の結合により、３つの阻害活性を示す。
【０１５１】
本願明細書に記載のＰ−ＰＩコンジュゲートのいずれも、その成分ペプチドはいかなる長さであってもよい。幾つかの実施形態では、成分ペプチドは２００未満のアミノ酸長である。幾つかの実施形態では、成分ペプチドは１５０未満のアミノ酸長（例えば１００未満、５０未満、４０未満、３０未満又は２０未満のアミノ酸長）である。一実施形態では、成分ペプチドは約３０〜約４０アミノ酸残基長である。幾つかの実施形態では、成分ペプチドは約１５〜約２５アミノ酸長、約２０〜約３０アミノ酸長、又は約２５〜約３５アミノ酸長である。幾つかの実施形態では、成分ペプチドは約１５、約１７、約１９、約２１、約２３、約２５、約２７、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５又は約３６アミノ酸長である。
【０１５２】
典型的なＰ−ＰＩコンジュゲートとしては、限定されないが、ペプチダーゼ阻害剤がペプチドの側鎖に共有結合しているものが挙げられる。
【０１５３】
ペプチド−リシノプリルコンジュゲートの例を以下に示す：
【０１５４】
【化１７】
0005412273.tif 000018
【０１５５】
式中、ｎ＝０、１又は２であり、ｙ＝０、１又は２であり、及びペプチド＝ＧＬＰ−１（７−３７）、エキセンディン−４、ＧＬＰ−１（７−３７）若しくはエキセンディン−４の他の活性アナログ、又は他の目的の生理活性ペプチドである。
【０１５６】
ペプチド−ペプチド／ＡＣＥ阻害剤コンジュゲートの例を、以下に示す：
【０１５７】
【化１８】
0005412273.tif 000019
【０１５８】
式中、ｎ＝０、１又は２であり、ｙ＝０、１又は２であり、ペプチド＝ＧＬＰ−１（７−３７）、エキセンディン−４、ＧＬＰ−１（７−３７）若しくはエキセンディン−４の他の活性アナログ、又は他の目的の生理活性ペプチドである。
【０１５９】
具体的な実施形態では、Ｐ−ＰＩコンジュゲートは、ペプチダーゼ阻害剤（例えばリシノプリル又はｐＧｌｕＫＷＡＰ−ＯＨ（ＡＣＥ阻害剤））と、それらがコンジュゲートするＧＬＰ−１又はエキセンディンアナログ（例えばＧＬＰ−１（７−３７）（配列番号４２）又は１４Ｌｅｕ−エキセンディン−４（１−２８）（配列番号７０））を含んでなる。これらのコンジュゲートにおいては、ペプチダーゼ阻害剤は、様々なリンカーを介して、当該ペプチドアナログのカルボキシ末端、当該ペプチドアナログのアミノ末端、又は当該ペプチドアナログ内部のアミノ酸残基と連結させることができる。かかるＰ−ＰＩコンジュゲートとしては、限定されないが、以下のものが挙げられる：
ＧＬＰ−１（７−３７）−γ−Ａｂｕ−β−Ａｌａ−ＣＯＮＨ−リシノプロピルモノエステル：
【０１６０】
【化１９】
0005412273.tif 000020
【０１６１】
１４Ｌｅｕ−エキセンディン−４（１−２８）−γ−Ａｂｕ−β−Ａｌａ−ＣＯＮＨ−リシノプロピルモノエステル：
【０１６２】
【化２０】
0005412273.tif 000021
【０１６３】
ＧＬＰ−１（７−３７）−γ−Ａｂｕ−Ｌｙｓ（ｐＧｌｕ）ＷＡＰ−ＯＨ：
【０１６４】
【化２１】
0005412273.tif 000022
【０１６５】
ＧＬＰ−１（７−３７）−γ−Ａｂｕ−ＣＯＮＨ−リシノプロピルモノエステル：
【０１６６】
【化２２】
0005412273.tif 000023
【０１６７】
１４Ｌｅｕ−エキセンディン−４（１−２８）−γ−Ａｂｕ−ＣＯＮＨ−リシノプロピル：
【０１６８】
【化２３】
0005412273.tif 000024
【０１６９】
１４Ｌｅｕ−エキセンディン−４（１−２８）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＣＯＮＨ−リシノプロピル：
【０１７０】
【化２４】
0005412273.tif 000025
【０１７１】
幾つかの実施形態では、Ｐ−ＰＩコンジュゲートはペプチダーゼ阻害剤、及びＧＬＰ−１又はエキセンディンペプチド以外のペプチドを含んでなる。したがって、幾つかの実施形態では、Ｐ−ＰＩコンジュゲートは、ペプチドと、それに連結している少なくとも１つのペプチダーゼ阻害剤を含んでなり、当該ペプチドは、ＧＬＰ−１又はＧＬＰ−１アナログでない。他の実施形態では、Ｐ−ＰＩコンジュゲートは、ペプチドと、それに連結する少なくとも１つのペプチダーゼ阻害剤を含んでなり、当該ペプチドはエキセンディン又はエキセンディンのアナログでない。
【０１７２】
具体的な実施形態では、Ｐ−ＰＩコンジュゲートは、ペプチダーゼ阻害剤（例えばリシノプリル又はｐＧｌｕＫＷＡＰ−ＯＨ（ＡＣＥ阻害剤））と、それにコンジュゲートするＧＩＰアナログ又はＧＩＰハイブリッド分子（例えばＧＩＰ（１−３０）（配列番号７９）、［Ｌｅｕ１４］ＧＩＰ（１−３０）（配列番号２９５）、［Ｌｅｕ１４］ＧＩＰ（１−３０）−エキセンディン−４（３１−３９）（配列番号２９１）、［Ｄ−Ａｌａ２］ＧＩＰ（１−３０）−エキセンディン−４（３１−３９）（配列番号２９２）、［Ｄ−Ａｌａ２］ＧＩＰ（１−３０）（配列番号２９３）及びＧＩＰ（１−３０）−エキセンディン−４（３１−３９）（配列番号１））を含んでなる。ペプチドのＡｌａ２を有するペプチド−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲートにおいては、Ａｌａ２はＬ若しくはＤ型の異性体でもよい。これらのコンジュゲートにおいては、ＧＩＰアナログのカルボキシ末端、ＧＩＰアナログのアミノ末端、又はＧＩＰアナログの内部のアミノ酸残基で、例えば３０Ｌｙｓのεアミンの位置で、様々なリンカーを介してペプチダーゼ阻害剤と連結させてもよい。かかるＰ−ＰＩコンジュゲートとしては、限定されないが、以下のものが挙げられる：
［Ｄ−Ａｌａ２、Ｌｅｕ１４］ＧＩＰ−（１−３０）−β−Ａｌａ−β−Ａｌａ−Ｌｙｓ（α−ＮＨ−ピログルタモイル）−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＣＯＯＨ：
【０１７３】
【化２５】
0005412273.tif 000026
【０１７４】
ＧＩＰ−（１−３０）−Ａｄｏ−Ａｄｏ−Ａｕｎ−βＡｌａ−βＡｌａ−ε−ＮＨ−Ｌｙｓ（α−ＮＨ−ピログルタモイル）−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ：
【０１７５】
【化２６】
0005412273.tif 000027
【０１７６】
［Ｄ−Ａｌａ２］ＧＩＰ−（１−３０）−Ａｄｏ−Ａｄｏ−Ａｕｎ−βＡｌａ−βＡｌａ−ε−ＮＨ−Ｌｙｓ（α−ＮＨ−ピログルタモイル）−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（図３に示す）。
【０１７７】
具体的な実施形態では、Ｐ−ＰＩコンジュゲートは、ペプチダーゼ阻害剤と、それにコンジュゲートするＧＩＰアナログ又はＧＩＰハイブリッド分子（例えばＧＩＰ（１−３０）（配列番号７９）、［Ｌｅｕ１４］ＧＩＰ（１−３０）（配列番号２９５）、［Ｌｅｕ１４］ＧＩＰ（１−３０）−エキセンディン−４（３１−３９）（配列番号２９１）、［Ｄ−Ａｌａ２］ＧＩＰ（１−３０）−エキセンディン−４（３１−３９）（配列番号２９２）、［Ｄ−Ａｌａ２］ＧＩＰ（１−３０）（配列番号２９３）及びＧＩＰ（１−３０）−エキセンディン−４（３１−３９）（配列番号１））を含んでなる。具体的な実施形態では、ペプチダーゼ阻害剤はＤＰＰ−ＩＶ阻害剤である。これらのコンジュゲートにおいて、ＧＩＰアナログのカルボキシ末端で、ＧＩＰアナログのアミノ末端で、又はＧＩＰアナログの範囲内のアミノ酸残基で、例えば、３０Ｌｙｓのεアミンの位置で、様々なリンカーによって、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を、連結できる。かかるＰ−ＰＩコンジュゲートは以下を含むが、これに限定されない：
［Ｄ−Ａｌａ２］ＧＩＰ（１−３０）−エキセンディン−４（３１−３９）−（Ｌｙｓ（ε−ＮＨ−（Ａｕｎ−Ａｕｎ−（γ−Ｌ−Ｇｌｕ−（２−（Ｓ）シアノピロリジル）））））：
【０１７８】
【化２７】
0005412273.tif 000028
【０１７９】
Ｌｙｓ３０Ｎ−ε−（Ａｄｏ−（γ−Ｌ−Ｇｌｕ−２−（Ｓ）−シアノピロリジル））ＧＩＰ（１−３０）：
【０１８０】
【化２８】
0005412273.tif 000029
【０１８１】
ＧＩＰ（１−３０）−エキセンディン−４（３１−３９）−Ａｄｏ−Ｌｙｓ−Ｎ−ε−（２−（Ｓ）−シアノピロリジル）：
【０１８２】
【化２９】
0005412273.tif 000030
【０１８３】
ＧＩＰ（１−３０）−Ａｄｏ−Ｌｙｓ−Ｎ−ε−（２−（Ｓ）−シアノピロリジル）：
【０１８４】
【化３０】
0005412273.tif 000031
【０１８５】
ＧＩＰ（１−３０）−エキセンディン−４（３１−３９）−Ａｄｏ−Ａｄｏ−Ｌｙｓ−Ｎ−ε−（２−（Ｓ）−シアノピロリジル）：
【０１８６】
【化３１】
0005412273.tif 000032
【０１８７】
ＧＩＰ（１−３０）−Ａｄｏ−Ａｄｏ−Ｌｙｓ−Ｎ−ε−（２−（Ｓ）−シアノピロリジル）：
【０１８８】
【化３２】
0005412273.tif 000033
【０１８９】
［Ｌｅｕ１４］ＧＩＰ（１−３０）−エキセンディン−４（３１−３９）−Ａｄｏ−Ｌｙｓ−Ｎ−ε−（２−（Ｓ）−シアノピロリジル）：
【０１９０】
【化３３】
0005412273.tif 000034
【０１９１】
［Ｌｅｕ１４］ＧＩＰ（１−３０）−Ａｄｏ−Ｌｙｓ−Ｎ−ε−（２−（Ｓ）−シアノピロリジル）：
【０１９２】
【化３４】
0005412273.tif 000035
【０１９３】
［Ｄ−Ａｌａ２］ＧＩＰ（１−３０）−エキセンディン−４（３１−３９）−Ａｄｏ−Ｌｙｓ−Ｎ−ε−（２−（Ｓ）−シアノピロリジル）：
【０１９４】
【化３５】
0005412273.tif 000036
【０１９５】
Ｌｙｓ３０Ｎ−ε−（Ａｄｏ−（γ−Ｌ−Ｇｌｕ−２−（Ｓ）−シアノピロリジル））  ＧＩＰ（１−３０）−エキセンディン−４（３１−３９）：
【０１９６】
【化３６】
0005412273.tif 000037
【０１９７】
［Ｄ−Ａｌａ２，Ｌｙｓ１６（ε−ＮＨ−（Ａｕｎ−Ａｕｎ−（γ−Ｌ−Ｇｌｕ−（２−（Ｓ）シアノピロリジル））））］  ＧＩＰ（１−３０）−エキセンディン−４（３１−３９）：
【０１９８】
【化３７】
0005412273.tif 000038
【０１９９】
Ｎ−（γ−Ｌ−Ｇｌｕ−２−（Ｓ）−シアノピロリジル）−Ａｄｏ−Ａｄｏ）エキセンディン−４  ＧＩＰ（１−３０）−（３１−３９）：
【０２００】
【化３８】
0005412273.tif 000039
【０２０１】
［Ｄ−Ａｌａ２，Ｌｙｓ（ε−ＮＨ−（Ａｕｎ−Ａｕｎ−（γ−Ｌ−Ｇｌｕ−（２−（Ｓ）シアノピロリジル））））］ＧＩＰ（１−３０）−エキセンディン−４（３１−３９）：
【０２０２】
【化３９】
0005412273.tif 000040
【０２０３】
Ｎ−（γ−Ｌ−Ｇｌｕ−２−（Ｓ）−シアノピロリジル）−Ａｄｏ−Ａｄｏ）ＧＩＰ（１−３０）：
【０２０４】
【化４０】
0005412273.tif 000041
【０２０５】
［Ｄ−Ａｌａ２］ＧＩＰ（１−３０）−エキセンディン−４（３１−３９）−β−Ａｌａ−β−Ａｌａ−Ａｄｏ−Ａｄｏ−Ａｄｏ−Ａｄｏ−Ｌｙｓ−Ｎ−ε−（２−（Ｓ）−シアノピロリジル）、及び［Ｄ−Ａｌａ２］ＧＩＰ（１−３０）−β−Ａｌａ−β−Ａｌａ−Ａｄｏ−Ａｄｏ−Ａｄｏ−Ａｄｏ−Ｌｙｓ−Ｎ−ε−（２−（Ｓ）−シアノピロリジル）（図３で示す）。本発明の用語「Ａｕｎ」は１１アミノウンデカノン酸の略記であり、「Ａｄｏ」は８アミノ３，６−ジオキサオクタノン酸の略記である。
【０２０６】
具体的な実施形態では、Ｐ−ＰＩコンジュゲートは、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤と、それがコンジュゲートするＧＩＰアナログのカルボキシ末端、ＧＩＰアナログのアミノ末端、又はＧＩＰアナログの内部のアミノ酸残基で、様々なリンカーを介して、ＧＩＰアナログ又はＧＩＰハイブリッド分子を含んでなる。かかるコンジュゲートの例としては、以下のものが挙げられる。
【０２０７】
【化４１】
0005412273.tif 000042
【０２０８】
式中、阻害剤が：
【０２０９】
【化４２】
0005412273.tif 000043
【０２１０】
であり、ＭｅはＲ若しくはＳ型異性体である。かかるＰ−ＰＩコンジュゲートの例としては、［Ｄ−Ａｌａ２］ＧＩＰ（１−３０）−エキセンディン−４（３１−３９）−Ｃｙｓ−（Ｓ−マレイミド  プロパノイル）−Ｌｙｓ−Ｎ−ε−（２−（Ｓ）−シアノピロリジル））及び［Ｄ−Ａｌａ２］ＧＩＰ（１−３０）−エキセンディン−４（３１−３９）−Ｃｙｓ−（Ｓ−マレイミド  プロパノイル）−（２−（Ｓ）−４（ｓ）アミノ）プロ−（２−（Ｓ）−ボロ  ピロリジル））が挙げられるが、これらに限定されない（図４に示す）。
【０２１１】
他の実施形態では、Ｐ−ＰＩコンジュゲートは、ＰＹＹアナログ、ＮＰＹアナログ又はハイブリッド分子（例えばＰＹＹ（３−３６））にコンジュゲートするセリンプロテアーゼ阻害剤を含んでなる。他の実施形態では、Ｐ−ＰＩコンジュゲートは、ＰＹＹアナログ、ＮＰＹアナログ又はハイブリッド分子（例えばＰＹＹ（３−３６））にコンジュゲートするカルボキシペプチダーゼ阻害剤を含んでなる。
【０２１２】
単数形を示す本発明の用語「１つの」及び「その」は、特に明記しない限り、又は明らかに前後関係から把握できる場合以外、その事物の複数形を包含する。例えば、前後関係から明確であるように、「１つの」ペプチドホルモンには、１つ以上のペプチドホルモンを包含してもよい。
【０２１３】
本発明の用語「アナログ」とは、その配列がベースの参照配列又は天然型ペプチドの配列に由来するペプチド（例えばアミリン、ＰＹＹ）のことを指し、参照アミノ酸配列中に挿入、置換、延長及び／又は欠失を適宜有する。例えば、ベースペプチドに対して、少なくとも５０又は５５％のアミノ酸配列同一性を有するか、他の場合には例えば、ベースペプチドに対して少なくとも７０％、８０％、９０％又は９５％のアミノ酸配列同一性を有するものが挙げられる。かかるアナログは保存的若しくは非保存的なアミノ酸置換（非自然のアミノ酸、及びＬ及びＤ形など）を含んでもよい。当該アナログには、アゴニストを有する化合物及びアンタゴニスト活性を有する化合物が包含される。当該アナログは、参照ペプチドに存在しない活性（例えばペプチダーゼ阻害活性）を有する化合物を含んでもよい。また、本願明細書において定められるように、アナログに誘導体が包含される。
【０２１４】
「誘導体」とは、上記のように参照ペプチド又はアナログとして定義され、そのアミノ酸の側基、α−炭素原子、末端アミノ基又は末端のカルボン酸基において１つ以上の化学的処理を受けている。化学的処理とは、限定されないが、化学基を更に付加し、新しい結合を形成させ、化学基を取り除くことなどが挙げられる。アミノ酸側基の修飾としては、リジンε−アミノ基のアシル化、アルギニン、ヒスチジン又はリジンのＮ−アルキル化、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸のカルボン酸基のアルキル化、及びグルタミン又はアスパラギンの非アミド化が挙げられるが、これらに限定されない。末端アミノ基の修飾としては、ｄｅｓ−アミノ、Ｎ−低級アルキル、Ｎ−ジ−低アルキル、変形アルキル（例えば分岐状、環状、融合、アダマンチル）、及びＮ−アシル修飾（例えばアルキルアシル、分岐アルキルアシル、アルキルアリール−アシル）が挙げられるが、これらに限定されない。末端カルボキシ基の修飾としては、限定されないが、アミド、低級アルキルアミド、変形アルキル（例えば分岐状、環状、融合、アダマンチル）、ジアルキルアミド、アリールアミド、アルキルアリールアミド及び低級アルキルエステルによる修飾が挙げられる。低級アルキルとはＣ１−Ｃ４アルキルである。更に、１つ以上の側基又は末端基は、通常熟練した当業者に公知の保護基により保護されてもよい。アミノ酸のα−炭素は、モノ−もしくはジメチル化されていてもよい。
【０２１５】
一般に、アミノ酸配列に関して、用語「修飾」とは、置換、挿入、伸長、欠失及び誘導体化（それら単独、又は組み合わせ）のことを指す。幾つかの実施形態では、当該ペプチドは「非本質的」アミノ酸残基の１つ以上の修飾を含んでもよい。「非本質的」アミノ酸残基とは例えば、本願明細書においては、新規なアミノ酸配列中において、ペプチド（例えばアナログのペプチド）の活性（例えばアゴニスト活性）を喪失させるか又は実質的に低下させることなく、変更（欠失又は置換）することができる残基のことを指す。幾つかの実施形態では、当該ペプチドは「本質的」アミノ酸残基の１つ以上の修飾を含んでもよい。「本質的」アミノ酸残基とは例えば、本願明細書においては、新規なアミノ酸配列中において、変更（欠失又は置換）されることにより、ペプチド（例えばアナログのペプチド）の活性（例えばアゴニスト活性）を喪失させるか又は実質的に低下させる残基のことを指す。本質的アミノ酸残基が変更される一実施形態では、当該修飾されたペプチドは、使用されるＰ−ＰＩコンジュゲートの活性（例えばペプチダーゼ阻害活性）を有しうる。Ｐ−ＰＩコンジュゲートにおいて使用するペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のアミノ酸残基が欠失してもよい。Ｐ−ＰＩコンジュゲートにおいて使用するペプチドは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のアミノ酸が付加されていてもよい。Ｐ−ＰＩコンジュゲートにおいて使用するペプチドは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のアミノ酸が置換されていてもよい。
【０２１６】
置換には、保存的アミノ酸置換が包含される。「保存的アミノ酸置換」とはアミノ酸残基が同様の側鎖又は同様の物理化学的な特徴（例えば、静電的、水素結合、立体構造、疎水性）を有するアミノ酸残基と置換されることを指す。アミノ酸は天然に生じるものでもよく、非天然のものでもよい。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは従来技術において公知である。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電の極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、メチオニン、システイン）、無極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸から構成される。置換には、非保存的な変更も含まれうる。
【０２１７】
「アミノ酸」又は「アミノ酸残基」とは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸及び修飾アミノ酸のことを意味する。特に明記しない限り、いかなるアミノ酸も、通常は、又は具体的な名称を記載する場合、Ｄ型及びＬ型の立体異性体が包含される（但し、それらの構造がかかる立体異性形を許容する場合）。天然アミノ酸には、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、Ｌｙｓイン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、Ｓｅｒ（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）及びバリン（Ｖａｌ）が包含される。非天然アミノ酸としては、限定されないが、ホモリジン、ホモアルギニン、ホモセリン、アゼチジンカルボン酸、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、βアラニン、アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソブチル酸、３−アミノイソブチル酸、２−アミノピメリン酸、ｔｅｒｔ−ブチルグリシン、２，４−ジアミノイソブチル酸、デスモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ホモプロリン、ヒドロキシリシン、アロヒドロキシリシン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロイソロイシン、Ｎ−メチルアラニン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルペンチルグリシン、Ｎ−メチルバリン、ナフタアラニン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、ペンチルグリシン、ピペコリン酸、ピログルタミン酸及びチオプロリンなどが挙げられる。更なる非天然アミノ酸には、化学的にブロックされた、又は可逆的、不可逆的もしくは化学的にＮ末端アミノ基又は側鎖基が修飾されている修飾アミノ酸残基が包含され、例えば、Ｎメチル化されたＤ及びＬ型アミノ酸又は残基であって、側鎖官能基が化学的に他の官能基に修飾されているものが挙げられる。例えば、修飾アミノ酸としては、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、アスパラギン酸−（βメチルエステル）（アスパラギン酸由来の修飾アミノ酸）、Ｎ−エチルグリシン（グリシン由来の修飾アミノ酸）、又はアラニンカルボキサミド（アラニン由来の修飾アミノ酸）などが挙げられる。組み込むことができる更なる残基は、Ｓａｎｄｂｅｒｇら（１９９８）  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１：２４８１−２４９１．に記載されている。
【０２１８】
変形例はマーカッシュ群として記載（例えば複数の可能なアミノ酸を含む各アミノ酸位）される点に留意する必要がある。マーカッシュグループの各メンバーは別個に考慮されるべきであり、またそれにより、他の実施形態も含んでなり、マーカッシュグループは単一のユニットとして解釈すべきでない。
【０２１９】
「配列同一性」とは、２つ以上のポリペプチド配列又は２つ以上のポリヌクレオチド配列の関係のことであって、公知の技術において配列を比較することによって定義されるものを指す。従来技術においては、「同一性」とは、ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列間の配列相関性の程度を意味することもあり、それは配列間のマッチングの程度により定まる。「同一性」は、限定されないがＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）、ａｎｄ  Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ，４８：１０７３（１９８８）に記載されている公知の方法によって容易に算出できる。同一性を測定する方法は、試験される配列間で最もマッチするように設計される。更に、同一性を測定する方法は一般公開されているプログラムを用いて実施できる。２つの配列間の同一性の測定に使用できるコンピュータプログラムとしては、限定されないが、ＧＣＧ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（１９８４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：３８７、５つのＢＬＡＳＴプログラムのセット、ヌクレオチド配列質問用に設計された３プログラム（ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ及びＴＢＬＡＳＴＸ）、並びにタンパク質配列質問に設計された２プログラム（ＢＬＡＳＴＰ及びＴＢＬＡＳＴＮ）（Ｃｏｕｌｓｏｎ（１９９４）  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：７６−８０、Ｂｉｒｒｅｎら（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  １：５４３−５５９）などが挙げられる。ＢＬＡＳＴ  ＸプログラムはＮＣＢＩ及び他の情報源から一般公開されている（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら，ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８９４、  Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）。公知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性をの測定に使用できる。
【０２２０】
ポリペプチド配列比較の典型的なパラメータを以下に示す：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３、
比較マトリックス：ＢＬＯＳＳＵＭ６２  ｆｒｏｍ  Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ（１９９２）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９、
ギャップペナルティ：１２、
ギャップ長ペナルティ：４。
これらのパラメータが使用可能であるプログラムは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（“ＧＣＧ”）（マディソン、ＷＩ）から、“ｇａｐ”プログラムとして一般公開されている。エンドギャップに対するペナルティなしにおける上記パラメータが、ペプチド比較におけるデフォルトパラメータである。一実施形態では、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴＰプログラムが、実質的な調整が必要ない、デフォルトパラメータによって用いられる。
予想値：１０、
文字サイズ：３、
ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、
ギャップ拡張コスト：１１、
エンドギャップ拡張コスト：１、
ブラスト拡張のｄｒｏｐｏｆｆ（Ｘ）：７（ビット）、
ギャップアラインメントのＸ  ｄｒｏｐｏｆｆ値：１５（ビット）、
及びギャップアランメントの最終Ｘ  ｄｒｏｐｏｆｆ値２５：（ビット）。
【０２２１】
核酸分子配列比較のパラメータを以下に示す：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．４８：４４３−４５３、
比較マトリックス：マッチ±１０、
ミスマッチ＝０、
ギャップペナルティ：５０、
ギャップ長ペナルティ：３。
本発明の用語「％同一性」は、核酸分子配列比較のデフォルトパラメータとしての上記パラメータと、ＧＣＧの“ｇａｐ”プログラム（バージョン１０．２）を使用して決定される。
【０２２２】
１つの態様では、本願明細書で開示するＰ−ＰＩコンジュゲート化合物の使用により、血漿中のペプチドホルモンの血漿中半減期を長期化させる方法が提供される。Ｐ−ＰＩコンジュゲートの投与により、コンジュゲートしていないペプチドの投与と比較し、コンジュゲートのペプチドの血漿中半減期が長期化する。Ｐ−ＰＩコンジュゲートのペプチダーゼ阻害剤は、内在性成分ペプチドの血漿中半減期を増加させることもできる。ペプチドの血漿中半減期の長期化により、ペプチドの有効血漿濃度の長期にわたる維持もしくは上昇がもたらされる。
【０２２３】
本発明の用語「血漿中半減期の長期化」とは、適切なコントロールと比較し、血漿中のペプチドの半減期が長期化していることを意味する。例えば、Ｐ−ＰＩコンジュゲートのペプチドの血漿中半減期は、コンジュゲートしていないペプチドのそれより長い。一実施形態では、Ｐ−ＰＩコンジュゲートは、コンジュゲートしていない成分ペプチドの血漿中半減期と比較し、少なくとも５％ペプチドの血漿中半減期を長期化させる。幾つかの場合には、Ｐ−ＰＩコンジュゲートは、コンジュゲートしていない成分ペプチドの血漿中半減期と比較し、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、ペプチドの血漿中半減期を長期化させる。ペプチドの血漿中半減期はｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定でき、本願明細書に記載の、又は従来技術において公知の方法を使用して測定できる。
【０２２４】
別の態様では、本願明細書で開示するＰ−ＰＩコンジュゲート化合物の使用により、血漿中でのペプチドホルモンのペプチド分解を減少もしくは遅延させる方法が提供される。Ｐ−ＰＩコンジュゲートの投与により、コンジュゲートしていないペプチドの投与と比較し、コンジュゲートのペプチドの分解が減少又は遅延する。Ｐ−ＰＩコンジュゲートのペプチダーゼ阻害剤はまた、血漿中での内在性成分ペプチドの分解を減少又は遅延させることもできる。血漿のペプチド分解の減少又は遅延により、ペプチドの有効血漿濃度の長期にわたる維持もしくは上昇がもたらされる。
【０２２５】
本発明の用語「ペプチド分解」とは、内在性であるか外生のペプチドが生物学的プロセス（例えばペプチダーゼ）によって、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで分解されるプロセスのことを指す。例えば、血漿のＰ−ＰＩコンジュゲートのペプチド分解は、コンジュゲートしていないペプチドのそれよりも低い程度である。一実施形態では、Ｐ−ＰＩコンジュゲートは、コンジュゲートしていない成分ペプチドの血漿中での分解と比較し、血漿中でのペプチド分解を少なくとも５％減少させるか、又は遅延させる。幾つかの場合には、Ｐ−ＰＩコンジュゲートは、コンジュゲートしていない成分ペプチドの血漿中での分解と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、ペプチドの血漿中での分解を減少させる。ペプチドの分解はｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定でき、本願明細書に記載の方法、又は従来技術において公知の方法によって測定できる。
【０２２６】
一般に、本願明細書で開示するＰ−ＰＩコンジュゲート化合物は、個々の成分ペプチド又はペプチダーゼ阻害剤が、それらの生物学的活性に基づいて機能を発揮する方法において有用である。１つの態様では、本願明細書で開示する特定のＰ−ＰＩコンジュゲートは、コンジュゲートしていないペプチドよりも血清中半減期が長期にわたる。したがって、コンジュゲートは当業者が成分ペプチドを使用する方法において有用である。別の態様では、特定のＰ−ＰＩコンジュゲートのペプチドは、ペプチダーゼ阻害剤がペプチド受容体リッチな部位に特異的かつ効率的に輸送されることを可能にする。したがって、ペプチダーゼ阻害剤により、活性部位（例えばペプチド受容体）で内在性ペプチド分子上のペプチダーゼ活性が低下する。
【０２２７】
１つの一般的態様では、Ｐ−ＰＩコンジュゲート化合物の投与による、栄養分の取り込みを減少させる方法を提供する。すなわち、本発明では、栄養分の取り込みの減少により利益が得られる疾患、障害及び／又は症状を治療するための方法を開示する。栄養分の取り込みの減少により利益が得られえる症状、疾患及び障害としては、限定されないが、肥満、肥満関連の状況、摂食障害、高血圧、肺高血圧、異脂肪血症、高脂血症、心血管疾患、インシュリン耐性、異常な食後の高血糖、及びあらゆる種類の真性糖尿病、ダンピング症候群及びメタボリックシンドロームが挙げられる。血清半減期が長期化し、ペプチド単独の場合と比較してコンジュゲートの効果が長期化するため、本願明細書で開示する方法は、少ない治療薬の投与量の若しくは少ない投与頻度でも効果的である。栄養分の取り込みを減少させる方法に用いられる典型的なＰ−ＰＩコンジュゲート化合物としては、限定されないが、成分ペプチドが、ＰＹＹ、エキセンディン、ＧＬＰ−１、アミリン、ｓＣＴ、ＡＦＰ−６、レプチン、又はこれらのいずれかのハイブリッド、アゴニスト、アナログもしくは誘導体である、コンジュゲートが挙げられる。したがって、成分ペプチドがＰＹＹ、エキセンディン、ＧＬＰ−１、アミリン、ｓＣＴ、ＡＦＰ−６、レプチン、又はこれらのいずれかのハイブリッド、アゴニスト、アナログもしくは誘導体であるコンジュゲートは、本願明細書に記載のように、栄養分の取り込みの減少により利益が得られる、症状、疾患及び障害の治療又は予防に有用なＰ−ＰＩコンジュゲートの非限定的な実施形態である。
【０２２８】
「栄養分の取り込みを減少させる」とは、身体が栄養分を脂肪として貯蔵する量を減少させるためのあらゆる方法のことを指す。換言すれば、栄養分の取り込みの減少は、食物摂取の減少、食欲の減退、満腹感を増加させること、食品の選択／嗜好に影響を与えること、代謝を増加させること、栄養分吸収を減少又は阻害すること、又はそれらのあらゆる組合せ（これらに限定されない）によりなされる。影響を受けうる典型的な機構としては、胃排出遅延などが挙げられる。
【０２２９】
１つの態様では、患者の肥満を治療もしくは予防する方法の提供に関し、当該方法は、患者に治療的又は予防的有効量のＰ−ＰＩコンジュゲートを投与することを含んでなる。また、患者の肥満による症状又は影響を治療又は改善する方法の提供にも関し、当該方法は、患者に治療上有効量のＰ−ＰＩコンジュゲートを投与することを含んでなる。「肥満」とは通常、３０以上の肥満度指数（ＢＭＩ、ｋｇ／ｍ２）として定義されるが、本発明の開示では、３０未満の肥満度指数を有する患者であっても、体重の減少又は体重増加の防止必要とする又は希望する者であれば、「患者」の範囲に包含される。すなわち３０〜２５（体重超過であるとみなされる）又は２５以下のＢＭＩを有する患者は、本願明細書で開示する方法における患者の範囲に包含される。病的な肥満とは、４０以上のＢＭＩのことを指す。
【０２３０】
幾つかの実施形態では、患者の代謝速度を上昇させるか、患者の代謝速度の減少を抑止するか、又は患者の代謝速度を維持する方法の提供に関する。「代謝速度」とは、単位時間当たりの、放出／消費されるエネルギー量のことを意味する。単位時間当たりの代謝は、摂食量、熱として放出されるエネルギー又は代謝プロセスで使用される酸素の量から推定できる。体重を減少させたいときは通常、高い代謝速度を高めることが望ましい。例えば、高い代謝率をもつ人は、ある活動を実施する際、その活動において低い代謝速度を示す人より、多くのエネルギーを消費できる（例えば、身体がより多くのカロリーを消費する）。
【０２３１】
一実施形態では、代謝速度は、エネルギー源として、除脂肪体組織よりも体脂肪の優先的な使用を伴ってもよい。１つの態様では、除脂肪体重はＰ−ＰＩコンジュゲートの投与後に減少しない。別の態様では、除脂肪体重の減少は、Ｐ−ＰＩコンジュゲートの投与後に低減又は防止される。更に別の態様では、除脂肪体重は、Ｐ−ＰＩコンジュゲートの投与後に増加する。かかるエネルギーソースとしての脂肪の選択性は、体組織と脂肪組織の量を比較することにより測定でき、治療期間の始めと終わりにおける、総体重及び脂肪量を測定することにより確認される。代謝速度の増加とは、ある期間における、患者によるカロリー又は他のエネルギー源の使用が、実質的に類似もしくは同一の条件下での、Ｐ−ＰＩコンジュゲートの投与のない他の期間における、当該患者によるカロリー又は他のエネルギー源の使用するレベルと比較し、より高いレベルであることを指す。一実施形態では、患者における代謝速度が、実質的に類似もしくは同一の条件下での、Ｐ−ＰＩコンジュゲートの投与のない他の期間における、当該患者による代謝速度と比較し少なくとも５％増加し、他の一実施形態では、当該代謝速度は、当該患者において少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％又は３５％増加する。代謝速度の増加は例えば、呼吸熱量計を使用して測定できる。
【０２３２】
他の実施形態では、患者の代謝速度の減少を低減させる方法の提供に関する。かかる代謝速度の減少は、様々なコンディショニング療法、栄養的もしくは理学的な治療計画に起因して生じうる。例えばカロリー含量の少ない食品の摂取、食事制限又は体重減少に起因して代謝速度が減少するケースが考えられる。食事制限としては、食事中に含まれてもよい食品のタイプ、食品の量又はその両方（必ずしもカロリーベースではない）に関する、供給量、禁止又はその両方が挙げられる。例えば、個々の食事において、身体は、低いカロリー摂取の際、代謝速度の減少でそれを補償する。要約すれば、身体は食品の必要量を下方制御し、それによって少ない食品での生存を可能にする。ダイエットを継続することにより、カロリー摂取の閾値が次第に減少する。ダイエットが終了した後には、カロリー摂取閾値が低下し、基礎代謝速度が低下しているため、その個人は、通常どおりに食事を摂取した場合、リバウンドにより体重が増加する（ＮＩＨ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐａｎｅｌ（１９９２）  Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１１６：９４２−９４９、Ｗａｄｄｅｎ（１９９３）  Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１１９：６８８−６９３）。１つの態様では、患者の代謝速度の減少を低減するための方法の提供に関し、当該代謝速度の減少は、カロリーダイエットの低下又は体重減少の結果である。かかる方法を用いて、患者の代謝速度の減少は、患者において少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％低減される。かかる方法においては、ＰＰＩコンジュゲートの投与は、代謝速度の損失又は減少につながるコンディショニング療法、栄養的もしくは理学的な療法の開始時に行うのが望ましい。しかしながら、コンディショニング療法、栄養的もしくは理学的な療法の開始前に、Ｐ−ＰＩコンジュゲートの投与を開始してもよい。一例を挙げると、代謝速度は呼吸熱量計を使用して測定される。
【０２３３】
別の態様では、代謝的なプラトーを減少させる方法の提供に関し、当該方法は、患者に有効量のＰ−ＰＩコンジュゲートを投与することを含んでなる。一実施形態では、当該患者は、体重が減少しているか、又は例えばカロリーダイエットを減少させたか、運動量が増加したか又はそれらの組み合わせにより体重を減少させた患者である。「代謝的なプラトー」とは、身体が、カロリー又はエネルギーのインプットの変化に適応している間の、一定の代謝速度が見られる時間間隔のことを意味する。例えば、カロリーインプット又はアウトプットの変化は、カロリーダイエットの減少又は身体運動の増加結果である場合もある。かかるプラトーは例えば、体重減少が減速又は低減する体重減少療法の間に観察されうる。一実施形態では、本発明で提供される方法により、同じ期間にわたり、実質的に類似もしくは同一の条件下で処置した、Ｐ−ＰＩコンジュゲートの投与を行わなかった同一の患者の代謝プラトー期間と比較し、患者の代謝プラトー期間が短期化する。他の実施形態では、本発明で提供される方法により、同じ期間にわたり、実質的に類似もしくは同一の条件下で処置した、Ｐ−ＰＩコンジュゲートの投与を行わなかった同一の患者の代謝プラトー頻度と比較し、患者の代謝プラトーの頻度が減少する。更に他の実施例では、本発明で提供される方法により、同じ期間にわたり、実質的に類似もしくは同一の条件下で処置した、Ｐ−ＰＩコンジュゲートの投与を行わなかった同一の患者の代謝プラトーの開示時期と比較し、患者の代謝プラトーの開始時期が遅延する。一実施形態では、代謝プラトーは、体重減少が低減又はなくなる時期を検出することにより同定される。一実施形態では、少なくとも１つの代謝プラトーが減少する。他の実施形態では、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の代謝プラトーが減少する。別の態様では、同一もしくは類似の条件下でＰ−ＰＩコンジュゲートを投与しなかった患者と比較し、代謝プラトーが１日遅延する。他の実施態様として、２日、３日、４日、５日、６日、１週、１０日、２週又は３週間、患者の代謝プラトーが遅延する。
【０２３４】
更に別の実施形態では、患者の代謝速度を維持する方法の提供に関する。一実施形態では、当該患者は、例えば、カロリーダイエット減少もしくは食事制限の開始、又は体重減少が予想されるために、代謝速度が低下するおそれのある患者である。代謝速度の維持とは、ある期間にわたる、ある患者によるカロリー又は他のエネルギー源を使用するレベルが、Ｐ−ＰＩコンジュゲートの投与のない実質的に類似であるか同一の条件下の同じ期間にわたるそれ以外は同一の患者による、カロリー又は他のエネルギー源を使用するレベルと比較し、維持されることを意味する。１つの態様では、代謝速度は、代謝速度の減少に結びつく事項の開始前における、患者の代謝速度に対して、１５％以内の低下に維持される。他の実施形態では、当該代謝速度の低下は、患者の代謝速度の１０％以内、７％以内、５％以内、３％以内に維持される。１つの態様では、Ｐ−ＰＩコンジュゲートは、カロリーダイエットの減量、食事制限又は運動療法の開始時において投与される。
【０２３５】
他の実施形態では、患者の代謝速度を上昇させることにより脂肪重量を減少させる方法の提供に関する。当該方法は、患者の代謝速度を上昇させることにより脂肪重量を減らすのに効果的な量のＰＰＩを投与することを含んでなる。脂重量は、総体重に対するパーセンテージとして表すことができる。幾つかの場合では、脂肪重量は、治療期間中に少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％又は少なくとも２５％減少する。１つの態様では、患者の除脂肪体重は、治療期間を通じて減少しない。別の態様では、患者の除脂肪体重は、治療期間を通じて維持されるか又は増加する。別の態様では、患者はカロリーダイエットの減量又は食事制限を実施している。「カロリーダイエットの減量」とは、患者が、同じ患者の通常の食事と比較して１日あたりのカロリー摂取量を減少させていることを意味する。一例では、患者は１日当たり少なくとも５０カロリー少なく消費している。他の例において、患者は１日当たり少なくとも１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１，０００カロリー少なく消費している。
【０２３６】
本発明の用語「除脂肪重量」又は「除脂肪体重」とは、筋肉及び骨の重量を指す。除脂肪体重が、脂肪フリーの体重を必ずしも示すというわけではない。除脂肪体重においても、中枢神経系（脳及び脊髄）、骨の髄及び内部臓器の範囲内で、少ないパーセンテージで脂肪が含有される（およそ３％）。除脂肪体重とは密度として計量される。一実施形態では、脂肪重量及び除脂肪体重は、水中重量として計量される。
【０２３７】
一実施形態では、患者の脂肪分布を変化させる方法の提供に関し、当該方法は、患者の脂肪分布を変化させるのに効果的な量のＰ−ＰＩコンジュゲートを投与することを含んでなる。「脂肪分布」とは、身体における、脂肪が蓄積する部位のことを意味する。かかる脂肪蓄積の部位としては例えば、皮下、内臓及び異所性の脂肪細胞などが挙げられる。１つの態様では、当該変化は、患者における内臓、異所性脂肪、又はその両方における代謝増加に起因する。幾つかの実施形態では、当該方法により、内臓脂肪もしくは異所性脂肪、又はその両方の代謝を、皮下脂肪のと比較し、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％又は５０％高い速度とする。１つの態様では、当該方法により、好ましい脂肪分布となる。一実施形態では、好ましい脂肪分布では、皮下脂肪  対  内蔵脂肪、異所性脂肪又はその両方の比率が増加する。１つの態様では、当該方法では、例えば筋肉細胞塊の増加の結果として、除脂肪体重が増加する。
【０２３８】
他の実施形態では、患者の皮下脂肪の量を減らす方法の提供に関し、当該方法は、それを必要とする患者に、患者の皮下脂肪の量を減らすのに効果的な量のＰ−ＰＩコンジュゲートを投与することを含んでなる。「皮下脂肪」とは、表皮直下における脂質の堆積のことを意味する。患者の皮下脂肪の量は、いかなる皮下脂肪の測定方法を使用して計量できる。一例では、患者において、皮下脂肪の量が少なくとも約５％減少する。他の例では、皮下脂肪の量は、ＰＰＩコンジュゲートの投与前の患者と比較し、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％又は５０％減少する。
【０２３９】
本願明細書に記載の方法は、患者の内蔵脂肪量を減少させるために使用できる。「内臓脂肪」とは、腹腔内脂肪組織としての脂肪の沈着物のことを意味する。内蔵脂肪は内蔵を囲み、肝臓によって代謝され、血液中コレステロールとなる。内蔵脂肪は、例えば多嚢胞性卵巣症候群、メタボリックシンドローム及び心血管疾患などの症状の発症率の増加と関連する。内蔵脂肪は、患者の内蔵脂肪量を測定するためのいかなる方法によっても測定できる。一例では、患者において、内蔵脂肪が少なくとも約５％減少する。他の例では、ＰＰＩコンジュゲートの投与前の患者と比較し、患者における内蔵脂肪が少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％又は５０％減少する。
【０２４０】
一実施形態では、異所性脂肪の蓄積を防止するか、又は患者の異所性脂肪の量を減少させる方法の提供に関し、当該方法は、それらを必要とする患者に、患者の異所性脂肪の蓄積を防止する、又は異所性脂肪の量を減少させるのに効果的な量の、Ｐ−ＰＩコンジュゲートを投与することを含んでなる。「異所性脂肪の蓄積」とは、組織の範囲内及び周辺、並びに除脂肪体重を構成する器官（例えば骨格筋、心臓、肝臓、膵臓、腎臓、血管）における脂質沈着物のことを意味する。通常、異所性脂肪の蓄積とは、身体の古典的な脂肪組織の外側における脂質の蓄積のことを指す。一例を挙げると、患者における異所性脂肪の量は、Ｐ−ＰＩコンジュゲートの投与前の患者と比較し、少なくとも約５％減少する。他の例では、患者における異所性脂肪の量は、少なくとも約１０％、又は少なくとも約１５％、２０％、２５％、３０％、４０％又は５０％減少する。あるいは、異所性脂肪の量は、患者の皮下脂肪と比較し、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％減少する。異所性脂肪は、患者における異所性脂肪を測定するためのいかなる方法によって測定してもよい。
【０２４１】
他の実施形態では、患者においてより好ましい脂肪分布を生じさせる方法の提供に関し、当該方法は、患者において好ましい脂肪分布を生じさせるのに効果的な量のＰ−ＰＩコンジュゲートを投与することを含んでなる。一実施形態では、患者へのＰ−ＰＩコンジュゲートの投与により、内蔵脂肪もしくは異所性脂肪の量、又はその両方が減少する。一実施形態では、当該方法では、皮下脂肪の減少よりも、優先的に、内臓もしくは異所性脂肪の量、又はその両方の組合せを減少させる。かかる方法により、皮下脂肪  対  内蔵脂肪又は異所性脂肪の比率が高くなる。かかる比率を改善することにより、心血管疾患、多嚢胞性卵巣症候群、メタボリックシンドローム又はいかなるそれらの組み合わせが進行する危険性が減少する。一実施形態では、異所性若しくは内臓脂肪は、皮下脂肪より５％、代謝速度が高くなる。他の実施形態では、異所性若しくは内臓脂肪は、皮下脂肪より少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％、代謝速度が高くなる。
【０２４２】
更に別の態様では、本発明で提供される方法は、副腎皮質ステロイドとの組み合わせで、治療上有効量のＰ−ＰＩコンジュゲートを投与することを含んでなる。副腎皮質ステロイドは脂肪重量を増加させ、除脂肪体重を減少させる副作用を有する。したがって、副腎皮質ステロイドの使用が有益である条件下で、Ｐ−ＰＩコンジュゲートを、副腎皮質ステロイドと組み合わせて使用してもよい。
【０２４３】
本発明はまた、病的に肥満した患者の体重を減少させる方法の提供に関し、当該方法は、最初に患者の体重を、病的肥満の時のレベル以下に減少させ、更に、患者の体重を減少させるのに効果的な量のＰ−ＰＩコンジュゲートを患者に投与することを含んでなる。患者の体重を病的な肥満のレベル以下に低下させる方法としては、カロリー摂取量の減量、肉体運動の増加、薬物治療、バリアトリック（ｂａｒｉａｔｒｉｃ）手術（例えば胃バイパス手術）又はそれらの任意の組合せが挙げられる。１つの態様では、更なる抗肥満薬品の投与と組み合わせることにより、患者の体重を減少させる。他の実施形態では、更に有効量のＰ−ＰＩコンジュゲートを投与することによって、４０以下の肥満度指数を有する患者の肥満度指数を低下させて、患者の体重を減少させる方法の提供に関する。
【０２４４】
「体重を減少させる」とは、患者が、一定の治療期間（日、週、月又は年で）において、その総体重の一部を減少させることを意味する。あるいは、「体重を減少させる」とは、脂肪重量  対  除脂肪体重の比率を低下させることとして定義されうる（換言すれば、患者は脂肪重量を落としたが、除脂肪体重は維持されたか又は増加してもよく、必ずしも総体重が低下しなくともよい）。この場合、一実施形態では、投与される有効量のＰ−ＰＩコンジュゲートとは、治療期間において患者の体重を減少させるのに効果的な量、又はあるいは治療期間において患者の脂肪重量のパーセンテージを減少させるのに効果的な量のことを指す。具体的な実施形態では、治療期間を通じて、患者の体重が、少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％減少する。具体的な実施形態では、治療期間において、患者のＢＭＩが、約３５未満〜約３０、３０未満〜約２５、２５未満、又は２５〜３０に低下する。あるいは、治療期間において、患者の脂肪重量のパーセンテージが、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％又は少なくとも２５％低下する。
【０２４５】
本発明はまた、患者の熱発生を増加させる方法の提供に関し、当該方法は、それを必要とする患者に、有効量のＰ−ＰＩコンジュゲートを投与することを含んでなる。熱発生とは、身体の代謝速度を上昇させることによる、熱としてカロリーを解放する方法のことを指す。熱発生は、サプリメント、栄養摂取、運動及び寒さへの曝露などのメカニズムによって活性化される。
【０２４６】
本発明はまた、患者の酸化的代謝を増加させる方法の提供に関し、当該方法は、それを必要とする患者に、有効量のＰ−ＰＩコンジュゲートを投与することを含んでなる。酸化的代謝とは、酸素を用いて炭水化物（糖）からエネルギーを発生させるプロセスのことを指す。
【０２４７】
別の態様では、患者の満腹感を誘導する方法の提供に関し、当該方法は、患者に有効量のＰ−ＰＩコンジュゲートを投与することを含んでなる。更に他の態様では、患者の空腹感のコントロール方法の提供に関し、当該方法は、患者に有効量のＰ−ＰＩコンジュゲートを投与することを含んでなる。更なる態様では、患者の満腹感を持続させる方法の提供に関し、当該方法は、患者に有効量のＰ−ＰＩコンジュゲートを投与することを含んでなる。
【０２４８】
更に他の態様では、患者によって摂食される食事の量を減少させることによってカロリー摂取量を減少させる方法の提供に関し、当該方法は、患者に有効量のＰ−ＰＩコンジュゲートを投与することを含んでなる。別の態様では、患者による食物摂取のコントロール方法の提供に関し、当該方法は、患者に有効量のＰ−ＰＩコンジュゲートを投与することを含んでなる。
【０２４９】
更に他の態様では、患者によるカロリー制限又は食事制限の遵守を確実にするか又は援助する方法の提供に関し、当該方法は、患者に有効量のＰ−ＰＩコンジュゲートを投与することを含んでなる。更なる態様では、患者のセットポイントを調整し、身体のホメオスタシス傾向を、より好ましいセットポイントに適合させる方法の提供に関し、当該方法は、患者に有効量のＰ−ＰＩコンジュゲートを投与することを含んでなる。更に他の態様では、患者において、体重減少を維持するか、又は減少した体重を維持する方法の提供に関し、当該方法は、患者に有効量のＰ−ＰＩコンジュゲートを投与することを含んでなる。この態様の一実施形態では、当該体重減少は患者のセットポイントをリセットすることにより維持される。
【０２５０】
一実施形態では、栄養分の取り込みの減少により利益を得る代謝疾患又は障害を治療及び／又は予防するのに有用である方法の提供に関する。したがって、これらの方法は、肥満、糖尿病（例えば２型又はインスリン非依存性糖尿病、１型糖尿病及び妊娠糖尿病）、摂食障害、インスリン耐性症候群及び心血管疾患を治療及び／又は予防に有用であると考えられる。また他の実施形態では、摂食障害（例えばプラデル−ウィリ症候群）、過食症、栄養の過剰摂取に伴う障害、又はそれらの組み合わせを治療又は予防する方法の提供に関し、当該方法は、患者に有効量のＰ−ＰＩコンジュゲートを投与することを含んでなる。
【０２５１】
本発明では、患者の脂肪分布の変化、脂肪重量の減少又はその両方を生じさせるための使用方法の提供に関する。したがって、身体組成を変化させることが好ましい患者は、本発明の方法により利益を得ることもできる。本願明細書「身体組成の変化」とは、例えば除脂肪体重の低下の最小限化、維持又は増加を伴う、体脂肪の減少又は維持のことを指す。かかる状況においては、体重は減少してもよく、また増加してもよい。したがって、これらの用語が通常従来技術において使われるときは、患者はスリムでもよく、体重超過でもよく、肥満でもよい。本発明で提供される方法は、除脂肪体重を維持しつつ、非脂肪組織中の脂肪を減少させてもよい。この方法の用途としては、例えば非アルコール性脂肪肝炎又はリポジストロフィーなどの疾患の治療が挙げられる。
【０２５２】
本願明細書に記載のように、成分ペプチドがＰＹＹ、エキセンディン、ＧＬＰ−１、アミリン、ｓＣＴ、ＡＦＰ−６、レプチン、又はこれらのいずれかのハイブリッド、アゴニスト、アナログもしくは誘導体であるコンジュゲートは、栄養分の取り込みの減少から利益を得ることができるかかる症状、疾患及び障害の治療又は予防の際に有用なＰ−ＰＩコンジュゲートの非限定的な例である。したがって、別の態様では、本願明細書において記載されるＰＰＩコンジュゲート及び組成物は、栄養分の取り込みの減少から利益を得ることができるかかる症状、疾患及び障害を治療もしくは予防に有用な薬剤の製造において有用である。
【０２５３】
代謝速度は、例えば呼吸熱量計などの、かかる速度を測定できるあらゆる方法を使用して測定できる。かかる代謝速度を測定する方法及び装置は従来技術において公知であり、例えば米国特許番号４５７２２０８号、第４８５６５３１号、第６４６８２２２号、第６６１６６１５号、第６０１３００９号及び第６４７５１５８号に記載されている。あるいは、動物の代謝速度は、除脂肪体重  対  食事期間の後に動物により異化される脂肪組織を測定することにより測定できる。すなわち総体重及び脂肪の含有量を、食事期間の終わりに測定してもよい。
【０２５４】
脂肪重量及び除脂肪体重の測定方法としては、限定されないが、水中重量の測定、空気置換プレチスモグラフ、Ｘ線、ＤＥＸＡスキャン、ＭＲＩ及びＣＴスキャンなどが挙げられる。皮下脂肪を測定する方法は公知であり、例えば米国特許第６５３０８８６号に記載されている。内蔵脂肪は、患者の内蔵脂肪量の測定に使用できるいかなる手段によっても測定できる。かかる方法としては、例えばＣＴスキャンによる腹部Ｘ線断層撮影、及びＭＲＩが挙げられる。内蔵脂肪を測定する他の方法は、例えば米国特許第６８６４４１５号、第６８５０７９７号及び第６４８７４４５号に記載されている。異所性脂肪は、患者における異所性脂肪の測定に利用できるいかなる方法を使用して測定してもよい。ラットにおいて、全体脂肪の測定に頻繁に使われる方法は、外科的に、後腹膜脂肪パッド、腹膜後腔に位置する体脂肪、後方腹壁と後方体壁腹膜間の領域を除去し、秤量することである。パッド重量は、動物の体脂肪パーセントと直接関連すると考えられる。ネズミの体重と体脂肪には直線的な相関関係があるため、肥満動物では、体脂肪及び後腹膜脂肪パッド重量のパーセンテージが高い。
【０２５５】
他の実施形態では、患者の糖尿病の症状又は影響を治療、予防又は改善させる方法の提供に関し、当該方法は、患者に治療的又は予防的有効量のＰ−ＰＩコンジュゲートを投与することを含んでなる。当該方法は、２型又はインスリン非依存性糖尿病、１型糖尿病及び妊娠糖尿病などの、いかなるタイプの真性糖尿病の患者においても有用である。本願明細書に記載のように、糖尿病の治療におけるＰ−ＰＩコンジュゲートの使用には、限定されないが、インシュリン分泌の促進、インスリン感受性の刺激、ブドウ糖により誘発されるインシュリン放出の強化、グルカゴン分泌の低下、空腹の防止、ブドウ糖利用の強化などが挙げられる。したがって、糖尿病の症状又は影響を治療、予防又は改善させる方法に用いられる典型的なＰ−ＰＩコンジュゲート化合物は、成分ペプチドが、エキセンディン、ＧＬＰ−１、ＧＩＰ、アミリン、レプチン又はこれらのあらゆるハイブリッド、アゴニスト、アナログ又は誘導体であるコンジュゲートなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５６】
別の態様では、患者のインシュリン耐性の兆候又は効果を治療、予防又は改善する方法の提供に関し、当該方法は、患者に治療的又は予防的有効量のＰ−ＰＩコンジュゲートを投与することを含んでなる。インシュリン耐性とは、幅広い範囲の濃度にわたる、インシュリンの生物学的活性が減弱することを指す。インシュリン耐性の兆候又は効果を治療、予防又は改善させる方法に用いられる典型的なＰ−ＰＩコンジュゲート化合物としては、限定されないが、成分ペプチドが、エキセンディン、ＧＬＰ−１、ＧＩＰ、レプチン、又はこれらのいずれかのハイブリッド、アゴニスト、アナログ若しくは誘導体であるコンジュゲートが挙げられる。
【０２５７】
インシュリン耐性及び高脂血症と共に、高血圧は、メタボリックシンドローム（別名インシュリン耐性症候群（ＩＲＳ）及び症候群Ｘ）を特徴づける症状を構成する。別の態様では、患者のメタボリックシンドロームの症状又は効果を治療、予防又は改善させる方法の提供に関し、当該方法は、患者に治療的もしくは予防的有効量のＰ−ＰＩコンジュゲートを投与することを含んでなる。メタボリックシンドロームの症状又は効果を治療、予防又は改善させる方法に用いられる典型的なＰ−ＰＩコンジュゲート化合物としては、限定されないが、成分ペプチドが、エキセンディン、ＧＬＰ−１、ＧＩＰ、ＣＧＲＰ又はこれらのハイブリッド、アゴニスト、アナログ又は誘導体であるコンジュゲートが挙げられる。
【０２５８】
他の一般の態様において、患者の心血管疾患又は症状の兆候又は影響を治療、予防又は改善させる方法の提供に関し、当該方法は、患者に治療的もしくは予防的有効量のＰ−ＰＩコンジュゲートを投与することを含んでなる。心血管疾患又は症状としては、限定されないが、高血圧、肺高血圧、心筋虚血、心筋再かん流、脳卒中、心臓不整脈、鬱血性心不全、冬眠心筋、心筋梗塞、心筋症及び冠状動脈疾患などが挙げられる。一実施形態では、患者の肥満と関連した心血管疾患又は症状の兆候又は影響を治療、予防又は改善させる方法の提供に関する。他の実施形態では、患者の肥満と関連ない（すなわち患者は肥満でない）心血管疾患又は症状の兆候又は影響を治療、予防又は改善させる方法の提供に関する。心血管疾患又は症状の兆候又は影響を治療、予防又は改善させる方法に用いられる典型的なＰ−ＰＩコンジュゲート化合物としては、限定されないが、成分ペプチドが、エキセンディン、ＧＬＰ−１、アミリン、ｓＣＴ、ＣＧＲＰ又はこれらのハイブリッド、アゴニスト、アナログ又は誘導体であるコンジュゲートが挙げられる。したがって、別の態様では、本願明細書に記載のＰ−ＰＩコンジュゲート及び組成物は、本願明細書に記載の、患者の心血管疾患又は症状の兆候又は影響を治療、予防又は改善にとり有用な薬剤の製造において有用である。
【０２５９】
高血圧とは、多くの患者に生じうる症状であり、その原因となる物質又は障害は不明である。かかる「本質的な」高血圧は、障害（例えば肥満、糖尿病及び高トリグリセリド血症）をしばしば伴う。高血圧は、左室不全、アテローム硬化型心臓病、心筋梗塞、網膜出血、液滲出、乳頭水腫、及び脈管損傷、脳卒中の有無にかかわらない脳血管不全及び腎不全などの多数の合併症にをもたらすこともある。高血圧は網膜出血、液滲出、乳頭水腫及び脈管損傷をもたらすこともある。異常血圧は、具体的な症状又は疾患（例えば心不全）から生じることもある。心不全とは、心臓が身体における代謝に必要なだけの心拍出量を提供できないときに生じる、慢性若しくは急性の症状である。心不全は一般に鬱血性心不全（ＣＨＦ）と呼ばれる。その理由は、増加した静脈圧の兆候（例えば左心不全を有する肺うっ血、及び右心不全を有する末梢浮腫）がしばしば支配的であるからである。ＣＨＦの症状及び徴候としては、疲労、周辺及び肺浮腫、及び内臓鬱血（例えば呼吸困難）などが挙げられる。これらの症状は、心臓から身体の様々な組織に対する血流減少、及び血液供給の不全から生じる、様々な器官における過剰な血液の蓄積によって生じる。心不全は、幾つかの基礎疾患から生じることもあり、最も一般的には、先進工業国においては、心筋梗塞を有するアテローム硬化型冠状動脈疾患から生じる。内分泌の障害に伴う代謝性疾患は心筋症を生じさせることもあり、幾つかの心筋症は、心不全に至ることもある。高血圧、心不全及びそれに関連する症状の兆候又は影響を治療、予防又は改善させる方法に用いられる典型的なＰ−ＰＩコンジュゲート化合物としては、限定されないが、成分ペプチドが、エキセンディン、ＧＬＰ−１、アミリン、ｓＣＴ、ＣＧＲＰ又はそれらのハイブリッド、アゴニスト、アナログ又は誘導体であるコンジュゲートが挙げられる。
【０２６０】
本願明細書において述べられるように、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤は、高血圧の血管拡張剤としての役割、及びＣＨＦを治療する役割を主に果たし、これらの障害を治療する最も効果的な薬剤の１つとして、従来技術において公知である。また、急性及び慢性心筋梗塞患者のＡＣＥ阻害剤の使用による延命効果は、一連の国際的に行われた、ランダム化された、コントロールされた臨床研究によって確立されており、公知である。例えば、ＡＣＥ阻害剤は、急性心筋梗塞による死亡率、及び重度の非致死性心血管事象の発生率を低下させるのに効果的であることが示されている。臨床試験では、ＡＣＥ阻害剤が広い範囲の心筋梗塞及び心不全患者（心室機能不全を有するが、症状がない個人から、対症心不全を有するが、血圧正常者及び血行力学的に安定である個人まで）に対して延命効果を有することが示されている。高血圧、心不全、心筋梗塞及びそれに関連する症状の兆候又は影響を治療、予防又は改善するための方法に用いられる典型的なＰ−ＰＩコンジュゲート化合物としては、成分ペプチダーゼ阻害剤が、ＡＣＥ阻害剤又は中性エンドペプチターゼ（ＮＥＰ）／ＡＣＥ阻害剤であるコンジュゲートが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２６１】
一実施形態では、心臓不整脈を治療又は予防するため、又は心臓不整脈の症状を改善するための方法の提供に関し、当該方法は、それを必要とする患者に有効量のＰ−ＰＩコンジュゲートを投与することを含んでなる。幾つかの実施形態では、Ｐ−ＰＩコンジュゲートの投与により、心筋虚血、心筋再かん流又は鬱血性心不全患者の抗不整脈効果が得られる。例えば、ＧＬＰ−１投与により心臓損傷が軽減し、これらの障害を有する患者の回復が促進されることが示されている。ＧＬＰ−１及びエキセンディンは、効果的に、危険な低血糖症を誘発することなく、周縁部におけるブドウ糖取り込みを促進する。ＧＬＰ−１及びエキセンディンはまた、グルカゴン分泌を協力に抑制し、このことにより、インシュリンによって生じる場合よりもより顕著に、血漿中の遊離脂肪酸（ＦＦＡ）濃度を低下させる。高いＦＦＡレベルは、心筋虚血の間における主要な中毒メカニズムとして関与している。したがって、Ｐ−ＰＩコンジュゲート（ＧＬＰ−１又はエキセンディンペプチドを含有するものを含む）は、心筋虚血の症状を治療又は改善する際に有用である。もう１つの実施例では、ハイブリッドは心臓不整脈を予防、治療するのに有用であり、確実に再かん流を伴う損傷を減少させる。更に他の一実施形態では、急性の脳卒中又は出血後におけるＰ−ＰＩコンジュゲートによる治療により、インシュリン分泌を最適化し、脳同化作用を増加させ、グルカゴンを抑制することによりインシュリン効果を強化し、高度の低血糖症又は他の逆副作用の危険性なく正常血糖症又は軽度の低血糖症を維持するための手段が提供される。
【０２６２】
他の実施形態では、患者の脂質プロファイルを改善する方法の提供に関し、当該方法は、本願明細書で開示する有効量のＰ−ＰＩコンジュゲートを患者に投与することを含んでなる。脂質プロファイルの改善には、ＬＤＬコレステロールを減少させること、中性脂肪濃度を減少させること、ＨＤＬコレステロール濃度を変化させること、又はそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。脂質のプロファイリング方法に用いられる典型的なＰ−ＰＩコンジュゲート化合物としては、限定されないが、成分ペプチドが、エキセンディン、ＧＬＰ−１、ＰＹＹ、アミリン、ｓＣＴ又はそれらのハイブリッド、アゴニスト、アナログ又は誘導体であるコンジュゲートが挙げられる。
【０２６３】
高血圧は、インシュリン耐性及び高脂血症と共に、メタボリックシンドローム（別名インシュリン耐性症候群（ＩＲＳ）及び症候群Ｘ）を特徴づける兆候の一群を構成する。別の態様では、患者のメタボリックシンドロームの兆候又は効果を治療、予防又は改善する方法の提供に関し、当該方法は、患者に治療的もしくは予防的有効量のＰ−ＰＩコンジュゲートを投与することを含んでなる。メタボリックシンドロームの兆候又は効果を治療、予防又は改善させる方法に用いられる典型的なＰ−ＰＩコンジュゲート化合物としては、限定されないが、成分ペプチドが、エキセンディン、ＧＬＰ−１、ＧＩＰ、又はそれらのハイブリッド、アゴニスト、アナログ若しくは誘導体であるコンジュゲートが挙げられる。
【０２６４】
他の一般の態様では、膵臓β細胞の喪失又は欠如と関連する疾患又は障害を治療もしくは予防する方法の提供に関し、当該方法は、患者に有効量のＰ−ＰＩコンジュゲートを投与することを含んでなる。ＧＬＰ−１はβ細胞新生に関与し、β細胞塊を増加させ、更にＧＩＰはβ細胞増殖及び細胞生存を促進する。ＧＬＰ−２は、例えば小島の成長及び増殖によって、膵島の発達を促進する。膵臓β細胞増殖を刺激又は生存させるための方法に用いられる典型的なＰ−ＰＩコンジュゲート化合物としては、限定されないが、成分ペプチドが、エキセンディン、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、ＧＩＰ、又はそれらのハイブリッドト、アゴニスト、アナログもしくは誘導体であるコンジュゲーが挙げられる。
【０２６５】
別の態様では、ネフロパシを予防及び処理する方法の提供に関し、当該方法は、患者に有効量のＰ−ＰＩコンジュゲートを投与することを含んでなる。一実施形態では、ネフロパシ症状を改善するのに効果的な量のＰ−ＰＩコンジュゲートの投与を含んでなる、ネフロパシ症状の改善方法の提供に関する。かかるネフロパシ症状としては、限定されないが、高血圧ネフロパシ、糖尿病性ネフロパシ、インシュリン耐性関連ネフロパシ及びメタボリックシンドロームを伴うネフロパシなどが挙げられる。例えば、Ｐ−ＰＩコンジュゲートは、これらの症状の際に、高血圧、内皮機能、腎機能、糸球体硬化症又はそれらの組み合わせが悪化するのを改善又は予防するため、有用である。本願明細書で開示するＰ−ＰＩコンジュゲートはまた、血管拡張容量が減少し、糸球体硬化症を有し、又は糸球体濾過における他の減少に罹患する患者の内皮機能の改善にとり有用である。他の実施形態では、本願明細書で開示するＰ−ＰＩコンジュゲートは、ネフロパシの末期腎疾患への進行の予防若しくは遅延、並びに、蛋白尿、糸球体硬化症又はその両方の進行を予防、治療又は減速のとり有用である。ネフロパシを予防、治療するための方法に用いられる典型的なＰ−ＰＩコンジュゲート化合物としては、限定されないが、成分ペプチドが、エキセンディン、ＧＬＰ−１又はそれらのハイブリッド、アゴニスト、アナログ若しくは誘導体であるコンジュゲートが挙げられる。
【０２６６】
別の態様では、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）を治療する方法の提供に関し、当該方法は、患者に有効量のＰ−ＰＩコンジュゲートを投与することを含んでなる。本発明の用語「多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）」は、一種の臨床症候群のことを指す。ＰＣＯＳと診断される女性は、以下の症状の１つ以上を示す：希発月経、無月経、無排卵、両面の多嚢胞性卵巣、高アンドロゲン症（高い血清中テストステロン及び／又はアンドロステンジオン）、異常な子宮出血、拡大した多小胞卵巣、不妊性、過剰な顔の毛髪の発達、脱毛、ざ瘡、インシュリン耐性、肥満、高インスリン血症、高血圧、高脂血症及び２型糖尿病。したがって、ＰＣＯＳを有する患者に対するＰ−ＰＩコンジュゲートの投与により、患者の規則的な月経、規則的な排卵又は生殖能力が復元される。一般に、インシュリン耐性の低減、又はインスリン感受性の増加にとり効果的なＰ−ＰＩコンジュゲートは、ＰＣＯＳの治療の際に有用である。幾つかの実施形態では、ＰＣＯＳを有する患者のインシュリン耐性を低減又は防止する方法の提供に関し、当該方法は、患者に有効量のＰ−ＰＩコンジュゲートを投与することを含んでなる。更に別の実施形態では、ＰＣＯＳを有する患者にＰ−ＰＩコンジュゲートの投与を行うことにより、患者の２型糖尿病の発症を予防することができる。ＰＣＯＳを治療する方法に用いられる典型的なＰ−ＰＩコンジュゲート化合物としては、限定されないが、成分ペプチドが、エキセンディン、ＧＬＰ−１又はそれらのハイブリッド、アゴニスト、アナログ若しくは誘導体であるコンジュゲートが挙げられる。
【０２６７】
本願明細書に記載のように、開示されたＰ−ＰＩコンジュゲート化合物は、成分ペプチドによる抗分泌及び抗運動性特性に関連する幾つかの生物学的活性を含む、幅広い範囲において生物学的活性を示す。抗分泌特性としては、胃及び／又は膵臓における分泌の抑制が挙げられる。したがって、胃若しくは膵臓における分泌に関連する疾患及び障害を治療又は予防する方法の提供に関し、当該方法は、患者に有効量のＰ−ＰＩコンジュゲートを投与することを含んでなる。胃若しくは膵臓における分泌と関連する疾患及び障害としては、胃炎、膵炎、バレット食道及び胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）などが挙げられる。胃若しくは膵臓における分泌と関連する疾患及び障害を治療又は予防する方法に用いられる典型的なＰ−ＰＩコンジュゲート化合物としては、限定されないが、成分ペプチドが、ＰＹＹ、エキセンディン、ＧＬＰ−１、アミリン、又はそれらのハイブリッド、アゴニスト、アナログ又はこれらのいずれかの誘導体であるコンジュゲートが挙げられる。
【０２６８】
他の実施形態では、特定のＰ−ＰＩコンジュゲートは、膵島又は膵臓細胞のグルコース応答性を誘導、促進、強化又は復元する際に有用である。かかる活性を測定するためのアッセイは従来技術において公知であり、例えば、米国特許出願公開第２００４／０２２８８４６号に記載されている。膵島又は膵臓細胞のグルコース応答性を誘導、促進、強化又は復元するのに用いられる典型的なＰ−ＰＩコンジュゲート化合物としては、限定されないが、成分ペプチドが、ＰＹＹ、ＮＰＹ、又はそれらのハイブリッド、アゴニスト、アナログ若しくは誘導体であるコンジュゲートが挙げられる。
【０２６９】
別の態様では、腸における過剰な電解質及び水の分泌、並びに吸収減少を伴う胃腸障害を治療する方法の提供に関し、当該方法は、患者に有効量のＰ−ＰＩコンジュゲートを投与することを含んでなる。かかる胃腸障害としては、伝染性の下痢、炎症性下痢、短腸症候群、又は典型的に外科的手技（例えば回腸造瘻術）の後に生じる下痢などが挙げられる（Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１２ｔｈ  Ｅｄ．）。伝染性の下痢の例としては、急性のウイルス性下痢、急性の細菌下痢（例えばサルモネラ菌、カンピロバクター及びクロストリジウム、又は原虫性感染症に起因する下痢）又は旅行者における下痢（例えばノーウォークウイルス又はロータウイルス）が挙げられるが、これに限定されない。炎症性下痢の例としては、吸収不良症候群、熱帯スプルー、慢性膵炎、クローン疾患、下痢及び過敏性大腸症候群が挙げられるが、これに限定されない。ＧＬＰ−２は腸の組織の成長を促進し、本願明細書においてリストされるような小腸管粘膜の異常を特徴とする疾患又は症状に罹患する患者にとり有益な効果を生じさせる。幾つかの実施形態では、Ｐ−ＰＩコンジュゲートは、例えば、手術後、又はコレラにより、胃腸障害を伴う緊急事態又は致命的な症状を治療する際に使用できる。腸における過剰な電解質及び水の分泌及び吸収減少に関連する胃腸障害を治療するための方法に用いられる典型的なＰＰＩコンジュゲートとしては、成分ペプチドが、ＧＬＰ−２、ＰＹＹ、又はそれらのハイブリッド、アゴニスト、アナログ若しくは誘導体であるコンジュゲートが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２７０】
本願明細書において提供される化合物は、単に腸の損傷（例えば下痢）を伴う症状を治療するだけでなく、腸の損傷の治療又は予防にも有用である。かかる腸の損傷は、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、腸萎縮、損失腸粘膜、腸粘膜機能の損失又はいかなるそれらの組み合わせであるか、又はその結果としての損傷である。かかる活性を測定するためのアッセイは従来技術において公知で、例えば国際公開第０３／１０５７６３号及びＭｏｒｒｉｓら（１９８９）  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ９６：７９５−８０３に記載されている。腸の損傷を治療する方法に用いられる典型的なＰ−ＰＩコンジュゲート化合物としては、限定されないが、成分ペプチドが、ＰＹＹ又はＰＹＹのあらゆるハイブリッド、アゴニスト、アナログ若しくは誘導体であるコンジュゲートが挙げられる。
【０２７１】
別の態様では、膵臓腫瘍を治療又は予防する方法の提供に関し、当該方法は、患者に有効量のＰ−ＰＩコンジュゲートを投与することを含んでなる。したがって、膵臓腫瘍細胞の増殖を阻害する又は減少させる方法の提供に関する。また、膵臓腫瘍の成長を阻害する方法の提供にも関する。膵臓腫瘍及び腫瘍細胞は、良性でも悪性でもよい。本願明細書に記載の典型的な方法により治療できる良性の膵臓腫瘍細胞のタイプとしては、漿液嚢胞腺腫、小嚢胞性腫瘍及び充実性嚢胞性腫瘍が挙げられる。本願明細書に記載の典型的な方法により治療できる悪性膵臓腫瘍細胞のタイプとしては、膵臓のダクト、腺房又は小島から生じる癌腫が挙げられる。かかる活性を測定するためのアッセイは従来技術において公知で、例えば米国特許第５５７４０１０号に記載されている。膵臓腫瘍の治療方法に用いられる典型的なＰ−ＰＩコンジュゲート化合物としては、限定されないが、成分ペプチドが、ＰＹＹ、又はあらゆるＰＹＹのハイブリッド、アゴニスト、アナログ又は誘導体であるコンジュゲートが挙げられる。
【０２７２】
他の一般の態様では、骨疾患（例えば骨減少症及び骨粗鬆症）を治療する方法の提供に関し、当該方法は、患者に有効量のＰ−ＰＩコンジュゲートを投与することを含んでなる。特定のＰ−ＰＩコンジュゲートは、骨形成を促進し、骨吸収を減少させ、血漿中カルシウムを減少させ、鎮痛効果を誘導するのに有用である。更に他の一実施形態では、特定のＰ−ＰＩコンジュゲートは、疼痛及び疼痛を伴う神経障害を治療するのに有用である。かかる疼痛又は骨疾患の治療方法に用いられる典型的なＰＰＩコンジュゲート化合物としては、限定されないが、成分ペプチドが、エキセンディン、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、アミリン、ｓＣＴ又はそれらのハイブリッド、アゴニスト、アナログ若しくは誘導体であるコンジュゲートが挙げられる。
【０２７３】
他の一般の態様では、ニューロンの損失又は機能不全を伴う神経病理学的及び神経系障害の進行を治療、予防又は遅延させる方法の提供に関し、当該方法は、患者に有効量のＰ−ＰＩコンジュゲートを投与することを含んでなる。かかる神経病理学的及び神経系障害としては、限定されないが、パーキンソン疾患、アルツハイマー疾患、ハンチントン疾患、筋萎縮性側索硬化症、脳卒中、注意欠陥障害、神経精神病学的症候群、神経変性障害、記憶障害及び認識障害が挙げられる。かかる神経病学的及び神経系障害の進行を治療、予防又は遅延させる方法に用いられる典型的なＰ−ＰＩコンジュゲート化合物としては、限定されないが、成分ペプチドが、エキセンディン、ＧＬＰ−１、ＧＩＰ、ＰＹＹ、ＮＰＹ又はそれらのハイブリッド、アゴニスト、アナログ若しくは誘導体であるコンジュゲートが挙げられる。例えば、米国特許第６７３４１６６号では、ＰＹＹ受容体アゴニストの使用により、治療しようとする中枢神経系のアルミニウム濃度を低下させて、アルツハイマー疾患を治療、予防又はその発症を遅延させる方法について開示している。
【０２７４】
したがって、別の態様では、本願明細書に記載のＰＰＩコンジュゲート及び組成物は、本願明細書に記載の疾患又は症状を治療、予防又は改善するのに有用な薬剤の製造に利用できる。
【０２７５】
「患者」には、本願明細書において開示した組成物及び方法から利益を得ることができ、代謝性疾患、体重又は心血管疾患に問題を有する、ヒト、霊長類及び他の哺乳類（ラット、マウス、ペット（例えばネコ、イヌ）、家畜（例えばウマ、ウシ、ヒツジ及びヤギ）、並びにニワトリ、シチメンチョウ及び他の動物）などのあらゆる動物が包含される。
【０２７６】
本発明で用いられる、従来技術において公知の「治療」とは、臨床結果などの有益若しくは所望の結果を得るためのアプローチのことを指す。疾患、障害又は症状を「治療」又は「緩和」するとは、症状、障害又は疾患状態の範囲及び／又は望ましくない臨床症状が低減することを意味し、及び／又は、当該障害を治療しない場合と比較し、時間経過に伴う進行が遅延又は長期化することを意味する。例えば、肥満の治療（体重の減少）では、例えば少なくとも体重の５％の減少が、望ましい治療結果である。本願明細書で開示する方法の場合、有益若しくは所望の臨床結果は、１つ以上の症状の緩和もしくは好転、疾患の程度の軽減、疾患の状態を安定させる（すなわち悪化させない）こと、疾患進行の遅延又は長期化、疾患状態の緩和及び緩解、改善（部分又は全体）などが挙げられるがこれらに限定されず、それらは検出可能であっても不可能であってもよい。「治療」はまた、治療を受けなかった場合に予想される生存期間と比較し、生存期間が延長されることを意味する場合もある。更に、治療は１回の薬物投与によって必ずしも生じるわけではなく、一連の薬物投与に応じて生じる場合も多い。すなわち、治療的有効量、緩和にとり十分な量、又は疾患、障害又は症状の治療に十分な量の薬物が、１回以上の回数で投与されてもよい。
【０２７７】
本発明の用語「治療的有効量」とは、研究者、獣医師、医師又は他の臨床医によって所望されている、組織、系又は患者における生物学的若しくは医学的な応答（治療されている障害の症状の緩和又は改良を含む）を誘発する組成物中の活性化合物の量を意味する。
【０２７８】
本発明の用語「予防的有効量」とは、研究者、獣医師、医師又は他の臨床医によって、目的の障害、症状又は疾患の発症を防止しようとしている組織、系もしくは患者、又はそのような危険性（例えば、患者における肥満又は肥満関連の障害、症状又は疾患に発展する危険性を有する、肥満又は肥満関連の障害、症状又は疾患）を有する患者の生物学的若しくは医学的な応答を誘発する組成物中の活性化合物の量を意味する。
【０２７９】
本願明細書に記載の成分ペプチド及びペプチド−ペプチダーゼ阻害剤（ＰＰＩ）コンジュゲートは、例えば従来技術において公知の化学ペプチド合成技術（自動若しくは半自動ペプチド合成装置、標準的な組換え技術、又はその両方）を使用して調製できる。
【０２８０】
成分ペプチド及びＰ−ＰＩコンジュゲートは、従来技術に従い、溶液中で合成してもよく、又は固体支持体上で合成してもよい。市販の様々な自動合成装置を用いて、公知のプロトコルに従って合成できる。Ｓｔｅｗａｒｔら（１９８４）  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ．ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｔａｍら（１９８３）  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５：６４４２、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９８６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３４１−３４７、及びＢａｒａｎｙら（１９７９）  Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｇｒｏｓｓら，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１−２８４を参照。固相ペプチド合成は、自動若しくは半自動ペプチド合成装置を使用して実施できる。典型的には、かかる技術を用いて、α−Ｎ−カルバモイル被保護アミノ酸と、樹脂上で伸長するペプチド鎖に結合するアミノ酸とを、室温で、不活性溶剤（例えばジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリジノン又はメチレンクロライド）中で、カップリング剤（例えばジシクロヘキシルカルボジイミド及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）の存在下、塩基（例えばジイソプロピルエチルアミン）の存在下でカップリングさせる。α−Ｎ−カルバモイル保護基は、試薬（例えばトリフルオロ酢酸又はピペリジン）を使用して、得られるペプチド−樹脂から除去され、当該ペプチド鎖に次の所望のＮ保護されたアミノ酸を付加させて、当該カップリング反応を繰り返す。適切なＮ保護基は公知であり、例としてはｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）及びフルオロメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）が挙げられる。例えば、固相ペプチド合成は、自動ペプチド合成装置（例えばＭｏｄｅｌ  ４３０Ａ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）により、ＮＭＰ／ＨＯＢｔ（オプション１）システム、及びｔＢｏｃもしくはＦｍｏｃ化学によるキャッピングにより実施してもよい（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＡＢＩ  ４３０Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．３Ｂ  Ｊｕｌｙ  １，１９８８，ｓｅｃｔｉｏｎ  ６：４９−７０）。ペプチドは、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（モデルＭＰＳ  ３５０、ルイビル、ＫＹ）を用いて合成してもよい。ペプチドは例えば、Ｗａｔｅｒｓ（登録商標）ＤＥＬＴＡ−ＰＲＥＰ（登録商標）３０００システム（ウォーターズ社、ミルフォード、ＭＡ）、及びＣ４、Ｃ８又はＣ１８調製用カラム（１０μ、２．２×２５ｃｍ、Ｇｒａｃｅ  Ｖｙｄａｃ、Ｈａｓｐｅｒｉａ、ＣＡ）を使用して、ＲＰ−ＨＰＬＣ（調製用及びアッセイ用）で精製してもよい。ペプチドは容易に合成でき、更に特定の活性を有するペプチドを同定するためにデザインされたアッセイにおいてスクリーニングすることができる。ペプチドを合成し、精製する他の方法も、当業者に公知である。
【０２８１】
あるいは、本願明細書で開示する成分ペプチド及びＰＰＩ阻害剤コンジュゲートを、公知の組換え技術によって調製してもよい。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照。組換え技術によって得られるペプチドは、ポリヌクレオチドから発現させることができる。当業者であれば、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ及びＲＮＡを含み、かかる様々なペプチド断片をコードする）を、コドン使用頻度を考慮に入れて、野生型ｃＤＮＡから調製することもでき、又は希望通りデザインすることもできる。これらのポリヌクレオチド配列には、微生物宿主中でのｍＲＮＡの転写及び翻訳を効率化するためのコドンを組み込んでもよい。かかる人工配列は、公知技術の方法に従って容易に構築することができる。上記のポリヌクレオチドは、Ｎ末端メチオニン残基を任意にコードしてもよい。上記のポリヌクレオチドは、適当なアミド形成のため、Ｃ末端グリシン残基を任意にコードしてもよい。本願明細書において提供される組成物及び方法にとり有用な非ペプチド化合物は、公知技術の方法により調製できる。例えば、リン酸含有アミノ酸及びかかるアミノ酸を含有するペプチドは、公知技術の方法を使用して調製できる。Ｂａｒｔｌｅｔｔら（１９８６）  Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１４：３５６−３７７を参照。
【０２８２】
様々な細胞タイプ（例えば細菌、酵母、藻類、昆虫細胞、植物細胞及び動物細胞（例えば哺乳類及び鳥類細胞）を用いて、ペプチドをコードする配列を導入し、発現させることができる。様々な発現ベクター／宿主システムが使用可能であり、限定されないが、例えば組換えバクテリオファージ、プラスミド又はコスミドＤＮＡ発現ベクターによって形質転換した微生物（細菌）、酵母発現ベクトルによって形質転換した酵母、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）でトランスフェクトした昆虫細胞系、ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイク病ウイルス（ＴＭＶ）によってトランスフェクトした植物細胞系、又は細菌発現ベクター（例えばＴｉ又はｐＢＲ３２２プラスミド）によって形質転換した動物細胞系などが挙げられる。組換えタンパク質の調製において有用な哺乳動物細胞及び細胞株としては、ＶＥＲＯ（アフリカのミドリザル腎臓）細胞、ヒーラ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、ＣＯＳ細胞（例えばＣＯＳ−７）、ＷＩ３８（ヒト肺線維芽細胞）、乳児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、マディン−ダービー犬腎臓上皮細胞（ＭＤＣＫ）、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２及び２９３細胞などが挙げられるが、それらに限定されない。ポリペプチドの組換え発現のための典型的なプロトコルは、公知技術である。
【０２８３】
宿主細胞株は、発現されたペプチドのプロセシング、又は特定の翻訳後修飾を行う特定の能力に基づき選択することができる（それらは活性型ペプチドを提供する際に重要である）。ポリペプチドのかかる修飾としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、アシル化及びアミド化（例えばカルボキシ末端アミド化）などが挙げられるが、これらに限定されない。翻訳後プロセシング（「プレプロ」型のポリペプチドを切断する）は、正しい挿入、フォールディング及び／又は機能にとって重要となりうる。それぞれの宿主細胞（例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８など）はかかる翻訳後活性のための特定の細胞器官及び特有のメカニズムを有し、それらを適宜選択することにより、導入された異種タンパク質の正しい修飾及びプロセシングを確実に実施できる。
【０２８４】
本願明細書に記載の成分ペプチド及びＰＰＩ阻害剤コンジュゲートは、自動ペプチド合成及び組換え技術の組合せを使用して調製することもできる。例えば、ペプチドにおいて、ＰＥＧ化による欠失、置換及び挿入などの修飾の組合せを導入してもよい。かかるペプチドは段階的に調製してもよい。例えば、第一段階では、記載した組換え技術によって、欠失、置換、挿入及びそれらのあらゆる組み合わせによる修飾を有する中間体ペプチドを調製してもよい。更に、任意の洗浄工程の後、中間体ペプチドに対して、適当なＰＥＧ化試薬（例えば、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、サンカルロス、ＣＡ）で、化学的処理によるＰＥＧ化を行い、所望のペプチドを調製する。ペプチドのアミド化は段階的に実施してもよい。当業者であれば、上記の手順を、欠失、置換、挿入、誘導体化及び公知の、本願明細書において考察される他の修飾方法から選択される修飾の組合せを有するペプチドに適用して一般化できることを認識するであろう。
【０２８５】
本願明細書に記載の成分ペプチド及びＰＰＩ阻害剤コンジュゲートは、公知技術の化学的ライゲーションスキームを使用して調製してもよく、例えば、米国特許出願公開第２００３／０１９１２９１号、第２００３／０２０８０４６号及び第２００４／０１１５７７４号に記載されている方法が挙げられる。化学的ライゲーションとは、２つの化学基の共有結合が行われる化学選択的な反応のことを指し、その個々の部分は、他の部分と不可逆的な共有結合を独立に形成することが独自にできる反応性官能基を有している。第１及び第２の成分に存在する、独特の相互に反応性を有する官能基を用いて、ライゲーション反応を化学選択的にすることができる。例えば、ペプチド及びポリペプチドの化学的ライゲーションには、互換性のある、独特の、相互に反応性を有するＣ末端及びＮ末端アミノ酸残基を有するペプチド又はポリペプチド部分どうしの化学選択的な反応が包含される。化学的ライゲーションには、（１）独自に反応性Ｃ末端基を有する第１のペプチド又はポリペプチドと、（２）独自に反応性Ｎ末端基を有する第２のペプチド又はポリペプチドの共有結合によるライゲーションも包含され、それは、当該Ｃ末端及びＮ末端反応性基が、共有結合による不可逆的結合を形成することを特徴とする。また、Ｎ末端同士、及びＣ末端同士のライゲーションも包含される。特に、化学的ライゲーションには、保護されていないペプチド部分へのライゲーションに適用できるいかなる化学選択的な化学反応も包含される。幾つかの異なる化学反応がこの目的で利用されが、その例としては、ネイティブの化学的ライゲーション、オキシム形成化学的ライゲーション、チオエステル形成ライゲーション（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒら（１９９２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：２２１−２２５、Ｇｉｅｓｅｌｍａｎら（２００１）  Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．３：１３３１−１３３４）、チオエーテル形成ライゲーション（Ｅｎｇｌｅｂｒｅｔｓｅｎら（１９９５）  Ｔｏｔ．Ｌｅｆｆｓ．３６：８８７１−８８７４）、ヒドラゾン形成ライゲーション（Ｇａｅｒｔｎｅｒら（１９９４）  Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．５：３３３−３３８）、並びにチアゾリジン形成ライゲーション及びオキサゾリジン形成ライゲーション（Ｚｈａｎｇら（１９９８）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：９１８４−９１８９、国際公開第９５／００８４６号、米国特許第５５８９３５６号）、並びにシュタウディンガーアミド形成化学的ライゲーション（Ｓａｘｏｎら（２０００）  Ｏｒｇ．Ｌｅｆｆ．２：２１４１−２１４３）などが挙げられる。
【０２８６】
所与のライゲーション化学反応のための反応条件は通常、ライゲーションに使用されるペプチド又はポリペプチド部分の所望の相互作用が維持されるように選択される。例えば、ｐＨ及び温度、ライゲーション成分の水溶性、第２の部分に対する第１の部分の比率、含水量及び反応混合物の組成を適宜変化させ、ライゲーションを最適化できる。更に試薬を添加し又は除去して、そこに溶解するライゲーション成分の濃度を変化させることにより、所望のライゲーション反応の特異性及び速度を調節（すなわち曝露のコントロール、及びペプチド又はポリペプチド部分の溶解性を操作することによる反応性基の露出及び提示をコントロール）することが可能となる。反応条件は、１つ以上の内部及び／又は外部コントロールと比較した、所望の化学選択的な反応生成物の生成をアッセイすることにより容易に決定できる。これらの方法論は、ライゲーションサイトにおけるネイティブなアミド結合を生成するための確固たる方法論であることが証明されている。
【０２８７】
Ｐ−ＰＩコンジュゲートのデザインとの組合せで、ポリペプチド主鎖の合成に利用されるペプチド又はポリペプチド部分が構築される。ペプチド及びポリペプチド主鎖の合成において有用な方法は、例えば以下の文献に記載されている：米国特許出願公開第２００４／０１３８４１２（拡張されたネイティブ化学的ライゲーション）、第２００３／０２０８０４６号（擬ネイティブ化学的ライゲーション）、第２００５／０２６１４７３号（望ましくない副産物の形成を除去するための、化学的ライゲーションにおける酸性Ｃ末端アミノ酸のカルボキシ保護ストラテジー）、第２００５／００６４５３８号及び第２００５／０１１３５６３号（３つ以上の成分を用いた、反応効率の改善されたネイティブ化学的ライゲーション及び化学的ライゲーション）、国際公開第２００４／１０５６８５号（取り外し可能なリンカーを用いた水相溶性の固相化学的ライゲーション）及び国際公開第２００４／０６０９２５号（水溶性ポリマー保護基、及び目的のアダクトを用いたそれらの置換による、多重ポリマーライゲーション）、並びに、米国特許第６３０７０１８号及び第６１８４３４４号（ネイティブ化学的ライゲーション）、第６３２６４６８号（固相ネイティブ化学的ライゲーション）、第６２１７８７３号（ポリオキシム化合物）、第６１７４５３０号（均一なポリオキシム粗製物）、第６００１３６４号（ヘテロ型ポリオキシム化合物）及び第６４５１５４３号（脂質−マトリックスの補助による合成）。一般に、化学的ライゲーションによるペプチド又はポリペプチド主鎖の合成では、適切なライゲーション部位の選択が行われ、その選択は、様々なポリペプチド主鎖部分を構成するために選択されるライゲーション化学反応、所与の標的ペプチドのために選択される可逆的（又は切断可能）ポリマー結合化学反応、及び具体的なポリマー結合部位に基づき行われる。ネイティブの化学的ライゲーションを使用するときは、システインライゲーション部位は、標的のポリペプチド主鎖のアミノ酸配列中における、適切な天然型システイン残基をスキャンすることにより決定される。「拡張された化学的ライゲーション」を使用するときは、ライゲーション部位は、標的ポリペプチド主鎖のアミノ酸配列中における、強力なライゲーションを可能にする適切な天然型のライゲーション部位ジャンクションをスキャンすることにより選択できる。拡張された天然型の化学的ライゲーションは、システイン残基におけるライゲーションに限定されないため、任意の数の残基を、ライゲーション部位ジャンクションとして機能させることができる。幾つかの場合には、ネイティブの、及び拡張されたネイティブの化学的ライゲーションの組合せを、当該デザインの一部としてもよい。
【０２８８】
一実施形態では、ネイティブの化学的ライゲーションを用いて、全長のポリペプチド鎖の一部又は全部を調製してもよい。天然に存在するタンパク質又はペプチド主鎖に存在するシステインを、化学的ライゲーション部位として用いることが可能である。あるいは所望のライゲーションジャンクションが適切なシステインを有さない場合、その位置のシステイン以外のアミノ酸を、システインで置換してもよく、又はその部位におけるネイティブの化学的ライゲーションを可能にするためにシステイン残基を挿入してもよい。必要に応じて、新たに導入されたシステインを、その位置で、最初のアミノ酸に対応する疑似アミノ酸残基に変換させてもよい。ネイティブの化学的ライゲーション部位におけるシステインの変換による疑似アミノ酸の形成のことを、「擬ネイティブ化学的ライゲーション」と称する。あるいは、システインをポリマー保護基による修飾部位に導入する場合、チオール反応性の水溶性ポリマー構築物と結合させるために側鎖チオールを用いてもよいが、但し、修飾することを望まない、標的ポリペプチド中の全てのシステイン残基が保護されていることを必要とする。他の実施形態では、拡張されたネイティブの化学的ライゲーションを、全長ポリペプチドの一部又は全部を調製する用途に利用できる。チオエステルにより媒介されるライゲーション（例えばネイティブの化学的ライゲーション）に使用するペプチドは、例えば米国特許第６３０７０１８号及び第６１８４３４４号に記載の標準的プロトコルに従い調製することができる。
【０２８９】
本発明の用語「精製ペプチド」とは、他の成分から分離された組成物であって、当該ペプチドが、その天然の状態と比較し、ある程度で精製されている組成物のことを指す。ゆえに、精製ペプチドはまた、それが天然の状態で生じる際の環境から隔離されている、ペプチドのことを指す。通常、「精製された」とは、分離工程に供して様々な他の成分と隔離させた、成分ペプチド又はＰ−ＰＩコンジュゲート組成物のことを指し、その組成物は、実質的に生物学的活性を保持している。用語「実質的に精製された」とは、成分ペプチド又はＰ−ＰＩ組成物が、組成物中の主成分であって、例えば、組成物中に、成分ペプチド又はＰ−ＰＩコンジュゲートが、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％又はそれ以上含まれる状態のことを指す。
【０２９０】
本願明細書に記載の方法によって調製される成分ペプチド及びＰＰＩコンジュゲートを、精製するのが好ましい。ペプチド精製技術は当業者にとり公知である。これらの技術は、最初の段階では、細胞培養液を、ポリペプチド画分と非ポリペプチド画分とに粗分画する。当該ポリペプチドを他のタンパク質から分離した後、目的のポリペプチドを、クロマトグラフィ及び電気泳動技術を使用して更に精製し、部分的若しくは完全に精製（又は純粋なレベルにまで精製）することができる。精製技術としては、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体などによる沈殿、熱変性及びそれに続く遠心分離、クロマトグラフィ工程（例えばイオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシルアパタイト及び親和性クロマトグラフィ）、等電点電気泳動、ゲル電気泳動及びそれらの組合せ、並びに他の適切な技術が挙げられる。特に純粋なペプチドの調製に適する分析方法は、イオン交換クロマトグラフィ、限外濾過クロマトグラフィ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び等電点電気泳動である。特に効率的なペプチド精製方法は逆相ＨＰＬＣであり、更に、液体クロマトグラフィ／質量アッセイ（ＬＣ／ＭＳ）及びマトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）による質量アッセイにより精製された物質のアッセイを行う。更なる純度分析は、アミノ酸分析により実施する。従来技術において一般に公知であるように、様々な精製ステップを、適宜順序を変更して実施してもよく、又はある特定のステップを省略してもよく、それでもなお、実質的に精製されたタンパク質又はペプチドの調製が可能である。
【０２９１】
通常、ペプチド又はＰ−ＰＩコンジュゲートは、常に最も精製された状態である必要はない。実際、実質的に精製度の低い生成物を特定の実施形態で利用することも十分可能であると考えられる。少ない数の精製ステップを組合せで用い、又は同様の精製方法に若干を加えることにより、部分的な精製を実施してもよい。例えば、実施しようとする陽イオン交換カラムクロマトグラフィ（ＨＰＬＣ装置を利用）では通常、低圧クロマトグラフィシステムを利用する場合よりも、「数倍」規模での精製が可能になると考えられる。相対的に精製度の低い方法は、タンパク質生成物の完全なリカバリー、又はペプチド若しくはＰＰＩはコンジュゲートの活性を維持という意味で有効である。幾つかの実施形態では、陰イオン交換及び免疫アフィニティクロマトグラフィの組合せを、精製ペプチド又は本願明細書に記載のＰ−ＰＩコンジュゲート組成物の調製に使用することができる。
【０２９２】
本願明細書で開示するＰ−ＰＩコンジュゲート化合物は、単独で、又は薬理学的に許容できる担体又は賦形剤と組み合わせて、単回投与若しくは多回投与することができる。したがって、本発明は、Ｐ−ＰＩコンジュゲート化合物の輸送にとり有用な、薬理学的に許容できる希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、補助剤及び／又は担体と共に、治療的若しくは予防的有効量の少なくとも１つのＰ−ＰＩコンジュゲート化合物、又はその薬理学的に許容できる塩を含有する医薬組成物の提供に関する。医薬組成物に関する一般的説明及び調製技術は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｂｙ  Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  ｉｎ  Ｗａｎｇら（１９８８）  Ｊ．ｏｆ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉ．ａｎｄ  Ｔｅｃｈ．，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｎｏ．１０，Ｓｕｐｐ．４２：２Ｓ．に開示されている。
【０２９３】
個々の成分ペプチド又はペプチダーゼ阻害剤が、それらの薬理学的特性からみて有用であると同様に、本発明のＰ−ＰＩコンジュゲート化合物は通常有用である。１つの典型的な使用としては、かかるＰ−ＰＩコンジュゲート化合物を、代謝異常及び障害の治療又は予防を目的として、末梢投与することが挙げられる。一実施形態では、本発明のＰ−ＰＩ化合物は、栄養分の取り込みを減少させ、食物摂取を減少させ、体重を減少させ、又はそれらの任意の組み合わせを可能にする薬剤としての活性を有する。他の実施形態では、本発明のＰ−ＰＩ化合物は、糖尿病又は糖尿病関連の症状及び障害の治療を目的として投与される。他の実施形態では、本発明のＰ−ＰＩ化合物は、心血管疾患又は障害（例えば鬱血性心不全）の治療を目的として投与される。
【０２９４】
本発明のＰ−ＰＩコンジュゲート化合物は、末梢投与用に製剤化してもよく、当業者に公知のように、注射用、経口投与用、鼻投与用、肺投与用、局所投与用又は他のタイプの投与用に製剤化してもよい。本願明細書に記載の医薬組成物の投与は、そのルートを介して標的組織に至る限り、いかなる通常の投与ルートで実施してもよい。一実施形態では、当該医薬組成物はいかなる公知の末梢投与方法によっても患者に投与でき、例えば、静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹膜内、クモ膜下腔内、眼内、肺内（例えば末端放出）、鼻内、肛門内、経口、舌下、膣内又は経皮内送達、或いは特定部位への外科的インプラントなどが挙げられる。幾つかの実施形態では、提供される医薬組成物は非経口投与用（例えば注入又は注射用）に製剤化されてもよい。当該治療は、単回の投与、又は一定期間にわたる複数回の投与により実施してもよい。Ｐ−ＰＩ組成物を連続的に制御放出する態様も包含される。非経口投与は、最初にボーラス投与を行い、その後に持続的に点滴を行い、薬剤の治療的循環レベルを維持することにより実施してもよい。貯蔵型又は「デポー」型遅延放出製剤を調製し、薬剤の治療的有効量が、経真皮注入又は輸送の後に、多くの時間又は日数にわたり血流中に分配させるようにしてもよい。当業者であれば、個々の患者の臨床的協力及び臨床状態を考慮して、有効な投与量及び投与計画を容易に最適化できる。
【０２９５】
医薬組成物は、様々な形状（例えば固体、液体、半固体又は半液体）で調製できる。本明細書で用いられる用語「固体」とは、例えば粉末及び凍結乾燥製剤などの、この用語が通常適用される用途のことを指す。本発明に記載されている製剤は、例えば再調製して使用するために凍結乾燥状態であってもよい。水性組成物は通常、有効量のＰ−ＰＩコンジュゲートが、薬理学的に許容できる担体又は水性溶媒中に溶解若しくは分散した形で含有される。「医薬的に若しくは薬理学的に許容できる」という用語は、動物又はヒトに投与したときに、逆作用、アレルギー若しくは他の望ましくない反応をもたらさない分子及び組成物のことを指す。本発明の用語「薬理学的に許容できる担体」としては、あらゆる溶媒、分散溶媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌薬、等張剤及び吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的活性物質に対する、かかる溶媒及び物質の使用は公知である。活性成分との適合性を有さないものを除き、あらゆる従来の溶媒又は物質を用いて治療用組成物を調製でき、それらは本発明に包含される。補助活性成分を組成物に組み込んでもよい。場合によっては、Ｐ−ＰＩコンジュゲート化合物と共に、他の化合物（例えば食物摂取を減少させ、糖尿病を治療し、血漿グルコースを低下させ、又は血漿脂質を変化させる薬剤）、アミリン、アミリンアゴニストアナログ、ＣＣＫ若しくはＣＣＫアゴニスト、又はレプチン若しくはレプチンアゴニスト、又はエキセンディン若しくはエキセンディンアゴニストアナログなどを、単一の組成物又は溶液として投与するのが簡便である。あるいは、Ｐ−ＰＩコンジュゲートとは別に、更なる薬剤を投与することがより有利である場合もある。例えば、２つの組成物を用いる場合、個々の薬剤を同じタイミングで（すなわち並行して）投与してもよく、あるいは他の薬剤とは別個に（投与前又は投与後に順次）投与してもよい。幾つかの実施形態では、当該投与は、各々の組成物の投与間隔がオーバーラップする態様で実施してもよい。
【０２９６】
幾つかの実施形態では、本願明細書において提供されるＰ−ＰＩコンジュゲートは、フリーの塩基溶液として調製して投与してもよく、又は薬理学的に許容できる塩の水溶液として、適宜界面活性剤（例えばヒドロキシプロピルセルロース）と混合して調製して投与してもよい。薬理学的に許容できる塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基により形成）が包含され、それらは無機酸（例えば塩化水素若しくはリン酸）又は有機酸（例えば酢酸、蓚酸、酒石酸、マンデル酸など）を用いて調製できる。遊離カルボキシル基により形成される塩は、例えば無機塩基（例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は水酸化鉄（ＩＩＩ））、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基を用いて調製してもよい。かかる生成物は、当業者に公知の手順によって容易に調製される。また、グリセロール、液体状のポリエチレングリコール及びそれらの混合物、並びに油中の分散液を調製してもよい。典型的には、これらの調製物中には微生物の増殖を防止するための防腐剤を添加する。
【０２９７】
バッファ、緩衝液及び緩衝溶液（水素イオン濃度又はｐＨに関して使用する場合）という用語は、酸又はアルカリの添加、又は溶媒による希釈に対するｐＨ変化を緩衝するシステム（特に水溶液）のことを指す。緩衝溶液（酸又は塩基の添加においてもｐＨの変動が小さい）の特徴としては、弱酸及び弱酸塩、又は弱塩基及び弱塩基塩の存在が挙げられる。上記のシステムの例は、酢酸及びナトリウム酢酸塩である。添加されるヒドロニウムイオン又は水酸化物イオンの量が、それを中和するバッファシステムの能力を上回らない限り、ｐＨの変更はわずかである。幾つかの実施形態では、Ｐ−ＰＩコンジュゲートは約３．０〜約８．０のｐＨ、約３．５〜約７．４のｐＨ、約３．５〜約６．０のｐＨ、又は約３．５〜約５．０のｐＨで、水性担体（例えば等張性緩衝液）中に懸濁させることができる。具体的な実施形態では、製剤のｐＨは約３．５〜６．５の範囲で維持され、幾つかの実施形態では約３．７〜約４．３、又は約３．８〜約４．２の範囲で維持される。幾つかの実施形態では、ｐＨは約４．０でもよい。
【０２９８】
有用なバッファとしては、クエン酸ナトリウム／クエン酸、リン酸ナトリウム／リン酸及び酢酸ナトリウム／酢酸バッファが挙げられる。具体的な実施形態では、本願明細書において提供される化合物を有するバッファは、酢酸バッファ（例えば約１〜５ｍＭから約６０ｍＭの最終製剤濃度）、リン酸バッファ（例えば約１〜５ｍＭから約３０ｍＭの最終製剤濃度）、グルタミン酸バッファ（例えば約１〜５ｍＭから約６０ｍＭの最終製剤濃度）、又はクエン酸バッファ（例えば約１〜５ｍＭから約６０ｍＭの最終製剤濃度）である。幾つかの実施形態では、バッファは酢酸塩（例えば、約５〜約３０ｍＭの最終製剤濃度）である。
【０２９９】
注射用途に適する医薬組成物は、滅菌された注射用水溶液又は分散液を即時調製するための、滅菌済み注射用溶液又は分散液、並びに無菌の粉末を含んでなる。全ての場合において、それは無菌である必要があり、またシリンジ操作を簡単に行うために一定以上の流動性を有する必要がある。Ｐ−ＰＩコンジュゲートは通常、製造及び貯蔵の条件下で安定で、また、微生物（例えばバクテリア及び菌類）による汚染から保護されることが望ましい。
【０３００】
薬理学的に許容できる担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒であってもよい。例えばレシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合には必要とされる粒度の維持により、及び界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。
【０３０１】
安定化剤をＰ−ＰＩコンジュゲートの調製において含有させてもよいが、必ずしも必要ではない点に留意すべきである。しかしながら、含有させる場合には、本発明の組成物にとり有用な安定化剤は炭水化物又はポリオールである。典型的な適切な安定化剤は、約１．０〜１０％（ｗ／ｖ）の炭水化物又はポリオールである。すなわち、ポリオール類及び炭水化物は、同じ特徴の主鎖：−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−を有し、それらはタンパク質を安定させる役割を果たす。ポリオールの例としては、ソルビトール、マンニトール、グリセロール及びポリエチレングリコール（ＰＥＧｓ）などの化合物が挙げられる。これらの化合物は直鎖状分子である。炭水化物（例えばマンノース、リボース、蔗糖、フルクトース、トレハロース、マルトース、イノシトール及びラクトース）は、一方では、ケト又はアルデヒド基を有することができる環状分子でもありうる。これらの２つの種類の化合物は、高い温度によって、及び凍結−融解によって生じる変性に対するタンパク質の安定化、又は凍結乾燥工程の実施において効果的であることが証明されている。適切な炭水化物としては、ガラクトース、アラビノース又はラクトースが挙げられる。糖尿病患者への投与用に製剤化する場合、使用する炭水化物は、糖尿病患者に逆作用を及ぼさないものでなければならない（すなわち、炭水化物が代謝されず、それにより血液中のグルコース濃度が許容範囲外にまで上昇する）。糖尿病患者に適する態様のかかる炭水化物は公知である。蔗糖及びフルクトースは、糖尿病でない場合の用途（例えば肥満の治療）のためのコンジュゲートに適している。
【０３０２】
具体的な実施形態では、安定化剤を含有させる場合、Ｐ−ＰＩコンジュゲート化合物は、ポリオール（例えば、分子量２００、４００、１，４５０、３，３５０、４，０００、６，０００及び／又は８０００などの様々なＰＥＧｓ）、並びにソルビトール、マンニトール、イノシトール、グリセロール、キシリトール及びポリプロピレン／エチレングリコール共重合体などにより安定化させることができる。マンニトールは、幾つかの実施形態に係る典型的なポリオールである。
【０３０３】
本願明細書において提供される凍結乾燥された製剤の他の有用な特徴は、同じ製剤成分であっても、本願明細書に記載の凍結乾燥製剤では浸透圧が維持されることであり、それにより安定性が維持される。幾つかの実施形態では、マンニトールはこのために使用する典型的なポリオールである。多くの場合、等張剤（例えば糖又は塩化ナトリウム）を含有させてもよい。場合によっては、賦形剤を用いて、化合物全体の浸透圧を維持してもよい。賦形剤を、様々な濃度で本発明の製剤中に添加してもよい。例えば、賦形剤を約０．０２％〜約２０％で、例えば約０．０２％〜０．５％、０．０２％〜約１０％、又は１％〜約２０％濃度範囲（重量％）で含有させることができる。更に、本発明の製剤自体と同様に、賦形剤を、固体（粉末を含む）、液体、半固体又はゲル中に含有させることもできる。典型的な非経口的製剤は等張性であってもよく、実質的に等張性であってもよい。
【０３０４】
防腐剤は、通常の製薬おいては、微生物の増殖を防止又は阻害する物質であると認識されており、微生物による製剤の損傷を回避するため、それを医薬組成物に添加してもよい。防腐剤の使用量は多くはないものの、ペプチド全体の安定性に影響を及ぼすこともある。微生物活性の防止は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、及びチメロサールなどの様々な抗菌剤及び抗真菌剤の使用により実施できる。医薬組成物に用いる防腐剤の濃度は、一般的に０．００５〜１．０％（ｗ／ｖ）であってもよく、幾つかの実施形態では、以下の防腐剤を、以下の濃度範囲で用いる：ベンジルアルコール（０．１−１．０％）、又はｍ−クレゾール（０．１−０．６％）、又はフェノール（０．１−０．８％）、又はメチル若しくはエチルパラベン（０．０５−０．２５％）と、プロピル若しくはブチルパラベン（０．００５％−０．０３％）の組み合わせ。パラベンは、パラ−ヒドロキシ安息香酸性酸の低級アルキルエステルである。
【０３０５】
界面活性剤の使用は、しばしばタンパク質の変性を生じさせる（疎水的崩壊及び塩橋分離による）。比較的低い濃度の界面活性剤によっても、界面活性剤半分と、タンパク質上の反応性部位との強い相互作用のため、強力な変性が生じうる。しかしながら、この相互作用を有効利用することにより、界面的若しくは表層変性に対してタンパク質を安定化させることができる。Ｐ−ＰＩコンジュゲートを更に安定化できる界面活性剤を、任意に全製剤に対して約０．００１〜０．３％（ｗ／ｖ）の範囲で含有させてもよく、そのような物質としてはポリソルベート８０（すなわちポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレイレート）、ＣＨＡＰＳ（登録商標）（すなわち３［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］１−プロパンスルホネート）、Ｂｒｉｊ（登録商標）（例えばＢｒｉｊ３５、ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル）ポロキサマー又は他の非イオン系界面活性剤などが挙げられる。
【０３０６】
非経口投与用製剤に使用する典型的なビヒクルは水である。非経口投与用の適切な品質の水は、蒸留又は逆浸透により調製できる。注入用の水は、典型的には、医薬組成物に用いられる水性ビヒクルである。
【０３０７】
他の成分を医薬組成物中に存在させてもよい。かかる更なる成分としては、例えば湿潤剤、乳化剤、油、酸化防止剤、増量剤、浸透圧調節剤、キレート剤、金属イオン、油性ビヒクル、タンパク質（例えばヒト血清アルブミン、ゼラチン又はタンパク質）、及び双性イオン（例えばアミノ酸（例えばベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リジン及びヒスチジン）などが挙げられる。更に、ポリマー溶液又はポリマー混合物を用いることにより、ペプチドの徐放が可能となる。吸収遅延剤（例えばアルミニウムモノステアレート及びゼラチン）の組成物への使用によって、注射可能な組成物の長期にわたる吸収が可能となる。かかる更なる成分はもちろん、本発明の医薬製剤の全体の安定性に悪影響を与えてはならない。
【０３０８】
具体的実施形態では、本発明の医薬製剤は所定の濃度範囲でＰ−ＰＩコンジュゲート化合物を含有してもよく、例えば、約０．０１％〜約９８％（ｗ／ｗ）、又は１％〜約９８％（ｗ／ｗ）、又は８０％〜９０％（ｗ／ｗ）、又は約０．０１％〜約５０％（ｗ／ｗ）、又は約１０％〜約２５％（ｗ／ｗ）の濃度範囲であってもよい。注入の際、充分な水量を用いて溶液の濃度を所望の濃度にしてもよい。
【０３０９】
本発明に包含される典型的な医薬組成物は、約０．０１〜１．０％（ｗ／ｖ）（具体的なケースでは０．０５〜１．０％（ｗ／ｖ））のＰ−ＰＩコンジュゲート化合物と、約０．０２〜０．５％（ｗ／ｖ）の酢酸、リン酸、クエン酸又はグルタミン酸バッファ（最終組成物のｐＨを約３．０〜約７．０にする）、約１．０〜１０％（ｗ／ｖ）の炭水化物又はポリオール系浸透圧調節剤、及び任意に、約０．００５〜１．０％（ｗ／ｖ）の防腐剤（ｍ−クレゾール、ベンジルアルコール、メチル、エチル、プロピル及びブチルパラベン（及びフェノール）からなる群から選択される）を含んでなる。製剤化されたペプチドが、複数使用を目的としている場合、通常かかる防腐剤を添加するのが望ましい。
【０３１０】
滅菌された注射溶液は、必要量の活性化合物を、適当な溶媒中に、必要に応じて上記で列挙した他の様々な成分と共に、フィルタ滅菌処理の後に添加して調製することができる。通常、分散液は、様々な滅菌済みの活性成分を、本願明細書において列挙される基本的な分散媒体と、必要となる他の成分とを含有する滅菌済みのビヒクルに添加して調製する。滅菌された注射溶液の調製に、滅菌済みの粉末を用いる場合、典型的な調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、それを用いることにより、事前にフィルター滅菌処理処理を行った溶液から、活性成分と、更なる所望の成分とを含有する粉末が得られる。具体的な実施形態では、当該調製手順においては、成分を特定の順序で溶解させるステップ（例えば防腐剤、安定化剤／浸透圧調節剤、バッファ及びペプチドの順）、又は同時に溶解させるステップを含んでなる。場合によっては、Ｐ−ＰＩコンジュゲートは再調製に備えて、バイアル、シリンジ又はカートリッジ中で凍結乾燥させてもよい。得られる液体製剤は、１若しくは２個のチャンバーを有するカートリッジ、又は１若しくは２個のチャンバーを有するシリンジに充填してもよい。
【０３１１】
他の製剤（例えば非非経口投与用）では、滅菌処理が不要である場合もある。しかしながら、滅菌処理の実施が好ましい又は必要である場合、何らかの適切な滅菌プロセスを実施し、本願明細書において提供されるペプチド医薬製剤を調製してもよい。典型的な滅菌プロセスとしては、濾過、蒸気（蒸気加熱）、乾熱、ガス（例えばエチレンオキシド、ホルムアルデヒド、二酸化塩素、酸化プロピレン、βプロピオールアセトン、オゾン、クロロピクリン、過酢酸臭化メチルなど）、放射線照射及び滅菌操作などが挙げられる。濾過は、得られる液体製剤の典型的な滅菌方法である。当該滅菌処理は、０．４５μｍ及び０．２２μｍ（１又は２）のフィルターによる濾過により実施することができ、それらを直列に連結して実施してもよい。濾過後、適当なバイアル又は容器に溶液を充填する。
【０３１２】
通常、本発明のＰ−ＰＩコンジュゲート治療的もしくは予防的有効量は、受容者の年齢、体重及び健康状態、又は疾患、症状又は障害の重症度を元に決定される。適切な投与量は、適切な用量反応データを組み合わせた、代謝異常又は障害のレベルを測定するための確立したアッセイにより確認することができる。最終的な投与計画は、薬の作用に影響を与えうる諸因子（例えば薬剤の特有の活性、患者における損傷の程度及び反応、患者の年齢、健康状態、体重、性別及び食事、感染症の重症度、投与時間、並びにその他の臨床的要因）などを考慮して、主治医により決定される。試験の実施により、具体的な疾患及び症状に対する適当な投与量レベル及び治療期間に関する詳しい情報が得られる。
【０３１３】
典型的には、約０．００１μｇ／ｋｇ体重／日間〜約１０００μｇ／ｋｇ体重／日までの量で使用されるが、当業者に自明なように、その量を適宜増減させてもよい。典型的な投与量は、１日当たり、約１μｇ、５μｇ、１０μｇ、５０μｇ、約１００μｇ（下限）から、１００μｇ、５００μｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇ又は１００ｍｇ（上限）の医薬化合物を含有する量である。１日における投与は、別々の単位投与形態として実施してもよく、２４時間連続的に提供してもよく、あるいは２４時間の間に分割して投与してもよい。１日あたりの投与回数は、１〜約４回であってもよく、あるいはそれはより多くてもよい。投与は１日あたり１回以上行ってもよく、あるいはそれより少ない頻度（１週間若しくは１ヶ月に１回以上）で行ってもよく、また、本願明細書に記載の他の組成物と組合せて投与してもよい。なお、本発明の方法及び組成物は、本願明細書において詳述された投与量に限定されないことに留意すべきである。
【０３１４】
典型的な投与量は、１日当たり約０．５μｇ、１μｇ、５μｇ、１０μｇ、５０μｇ、約１００μｇ（下限）から、約１００μｇ、５００μｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇ又は１００ｍｇの医薬化合物を含有する量である。１日における投与は、別々の単位投与形態として実施してもよく、２４時間連続的に提供してもよく、あるいは２４時間の間に分割して投与してもよい。１日あたりの投与回数は、１〜約４回であってもよく、あるいはそれはより多くてもよい。
【０３１５】
幾つかの実施形態では、有効量は、５０ｋｇの患者の場合、典型的には、約１〜３０μｇから約５ｍｇ／日、約１０〜３０μｇから約２ｍｇ／日、約５〜１００μｇから約１ｍｇ／日、又は約５μｇから約５００μｇ／日の範囲であり、単回若しくは複数回で投与される。幾つかの実施形態では、投与量は約０．０１〜約１００μｇ／ｋｇ／投与である。他の実施形態では、本発明の組成物は、１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、又は０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲で、Ｐ−ＰＩコンジュゲートが提供される態様で製剤化される。特定の投与経路（例えば経口投与）の場合、少ない生物学的利用能を補うため、例えば投与量を約５〜１００倍増加させてもよい。
【０３１６】
投与頻度は、薬剤の薬物動態学的パラメータ及び投与ルートに部分的に依存する。医薬組成物は、物理的状態、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ放出速度及び投与される薬剤のｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を与えうる。投与のルートに応じて、体重、体表面積又は器官のサイズに従って適切な量を算出できる。適切な治療的投与量を決定するために再度算出を行ってもよく、特に本願明細書で開示される投与量に関する情報及びアッセイ、並びに動物又はヒトの臨床試験において観察される薬物動態学的データを考慮し、過度の実験を要することなく、当業者によって日常的に実施できる。
【０３１７】
所望の効果（例えば栄養分の取り込み、食物摂取、体重、血糖値又は血漿中の脂質の変化の抑制）が受容者にとり好適である場合に、投与を開始するのが好ましく、例えば、症状の最初の徴候、又は肥満、真性糖尿病又はインスリン耐性症候群の診断の直後に開始するのが好ましい。本願明細書において提供される医薬組成物及び治療方法は、医学及び獣医学の分野において有用であることはいうまでもない。
【０３１８】
更に、Ｐ−ＰＩコンジュゲート化合物、製薬用途で用いる、前記Ｐ−ＰＩコンジュゲート化合物の調製に適する成分、並びに、製薬用途で用いる前記Ｐ−ＰＩコンジュゲート及び前記成分の使用説明書を含んでなるキットの提供に関する。
【０３１９】
本願明細書に記載の様々な液体ビヒクルの使用は、ペプチド系の抗肥満剤の調製に適する（例えば水又は水性／有機溶媒混合物又は懸濁液）。
【０３２０】
本願明細書に記載の医薬組成物の投与は、標的組織がそのルートを介して利用できる限り、いかなる通常投与ルートから行ってもよい。一実施形態では、Ｐ−ＰＩコンジュゲートを患者に末梢投与する。一実施形態では、Ｐ−ＰＩコンジュゲートを患者に局所投与する。幾つかの実施形態では、液体状のＰ−ＰＩコンジュゲートの医薬組成物を非経口投与する。適切な投与ルートとしては、筋肉内、静脈内、皮下、皮内、関節内、クモ膜下腔内、乳房内、腹膜内、肺内（例えば末端放出）、眼内などが挙げられる。幾つかの実施形態では、皮下投与ルートが有用である。ある実施形態では、経粘膜輸送であってもよい。これらのルートとしては、限定されないが、液体、半固体又は固体状のコンジュゲートを、口内、鼻内、舌下、肺、頬側、肛門内、膣内及び経真皮ルートによる投与が挙げられる。これらのルートによる投与は、非経口配達と比較して生物学的利用能が低いため、実質的により多くのコンジュゲートが、所望の生物学的効果を得るためには必要となる。非経口投与は、最初にボーラス投与を行い、その後に持続的に点滴を行い、薬剤の治療的循環レベルを維持することにより実施してもよい。
【０３２１】
Ｐ−ＰＩコンジュゲート組成物を連続的に制御放出する態様も包含される。連続的な輸送を、連続的な点滴により実施してもよい。典型的な投与量及び注入速度は、各々の投与あたり０．００５ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約２０ｎｍｏｌ／ｋｇであるか、又は連続的な点滴の場合には０．０１／ｐｍｏｌ／ｋｇ／分〜約１０ｐｍｏｌ／ｋｇ／分である。これらの投与及び注入は、静脈内投与（ｉ．ｖ．）又は皮下投与（ｓ．ｃ．）によって実施してもよい。ｉ．ｖ．による医薬組成物の典型的な全投与／輸送量は約２μｇ〜約８ｍｇ／日であってもよく、ｓ．ｃによる医薬組成物の全投与／輸送量は約６μｇ〜約６ｍｇ／日であってもよい。
【０３２２】
貯蔵型又は「デポー」型遅延放出製剤を調製し、薬剤の治療的有効量が、経真皮注入又は輸送の後に、多くの時間又は日数にわたり血流中に分配させるようにしてもよい。当業者であれば、個々の患者の臨床的協力及び臨床状態を考慮して、有効な投与量及び投与計画を容易に最適化できる。非経口的徐放輸送は、ポリマー性のマイクロカプセル、マトリックス、溶液、インプラント及び装置を調製し、それらを非経口的又は外科的手段によって投与することにより実施できる。徐放製剤の例としては、米国特許第６３６８６３０号、第６３７９７０４号及び第５７６６６２７号に記載されている。これらの剤形は、ポリマーマトリックス又は装置中にコンジュゲートを封入するため、生物学的利用能が低くなる傾向を示す。例えば米国特許第６３７９７０４号、第６３７９７０３号及び第６２９６８４２号を参照。
【０３２３】
以下に実施例を示すが、それらは本発明を例示するものに過ぎず、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０３２４】
実施例１：
ペプチド−ぺプチダーゼ阻害剤コンジュゲートの合成
コンジュゲート分子は、ペプチドＧＬＰ−１（７−３７）（配列番号４２）又は［Ｌｅｕ１４］−エキセンディン（１−２８）（配列番号７０）をアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤に連結することにより調製された。使用した薬は、小分子リシノプリル及びペプチドｐＧｌｕＫＷＡＰ−ＯＨを含むものであった。以下は、阻害剤モチーフがＧＬＰ−１（７−３７）及び［Ｌｅｕ１４］−エキセンディン−（１−２８）のＣ末端に配置されるコンジュゲート分子である３６３３／２１、３６３３／２４、３６３３／４２／１、３６３３／４２／２、３６３３／４２／３及び３６３３／３８の合成スキームを表す。ＡＡ１及びＡＡ２は、２個又は３個の炭素鎖である。
【０３２５】
【化４３】
0005412273.tif 000044
【０３２６】
樹脂結合型中間体の調製：
０．７５ｇのＨ−プロリン−トリチル−レジン（０．６８ｍｍｏｌ／ｇ）を、フリットを有する２０ｍＬのポリプロピレン製シリンジ内で、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、２０分間膨潤させた。その樹脂スラリーに対し、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ａｌｌｏｃ）−ＯＨ（０．６ｇ、２．６当量）、ＨＢＴＵ（０．５１ｇ、２．６当量）、ＨＯＢｔ（０．１７４ｇ）及びＮ−メチルモルホリン（０．２２ｍＬ、４当量）の混合物を加えた。樹脂を室温にて２．５時間振とうした。クロラニル試験は、陰性を示した。ＤＭＦ（４×）、ＤＣＭ（２×）、ＭｅＯＨ（２×）、ＤＣＭ及びＭｅＯＨにて樹脂を洗浄し、高真空下で乾燥させた。重量増加により、樹脂へのロード量を算出した（０．５４ｍｍｏｌ／ｇ、収率１００％）。
【０３２７】
樹脂に結合した中間体２の調製：
樹脂１をＤＭＦ中で１０分間膨潤させ、液を除いた後、２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液中で１５分間処理し、ＤＭＦ（６×）にて洗浄し、この手順を繰り返した。クロラニル試験は、陽性を示した。次いで樹脂を、１０ｍＬのトリメチルオルトギ酸塩（ＴＭＯＦ）中で膨潤させた。この混合物に対し、１ｍＬのＴＭＯＦ中に溶解したエチル−２−オキソ−４−フェニル酪酸塩（２．２ｇ、２０当量）を添加した。その樹脂を１時間振とうし、次いで、５．１ｍＬのＴＭＯＦ及び０．７ｍＬのＭｅＯＨに溶解したＮａＢＨ３ＣＮ（０．６７３ｇ、２０当量）を添加した。樹脂スラリーを室温にて５時間振とうし、次いでＴＭＯＦにて洗浄し、この手順を繰り返した。ＤＣＭ中に溶解した１％ＴＦＡにより樹脂のサンプルを切断し、ＬＣＭＳにより粗生成物を分析した。Ｃ２７Ｈ３９Ｎ３Ｏ７（Ｍ＋Ｈ）＋の計算される質量である５１８．２８が、５１８．３として見出された。
【０３２８】
樹脂に結合した中間体３の調製：
樹脂２（０．７８ｇ）を、アルゴン下で、乾燥ＤＭＦ中、１０分間膨潤させた。混合物に対し、Ｍｅ２ＮＨ−ＢＨ３（０．１４１ｇ、６当量）を添加し、次いで５分後にＰｄ（ＰＰｈ３）４（０．０４７ｇ、１０ｍｏｌ％）を追加した。１０分後に、溶液を除き、樹脂をＤＣＭ（４×）により洗浄した。この手順を繰り返し、次いで樹脂をＤＣＭ（８×３０秒間）、５％ＤＩＥＡのＤＣＭ溶液（３×６０秒間）及びＤＣＭ（５×３０秒間）により洗浄した。この樹脂は、クロラニル試験陽性を示した。ＤＣＭ中に溶解した１％ＴＦＡにより樹脂のサンプルを切断し、ＬＣＭＳにより粗生成物を分析した。Ｃ２３Ｈ３５Ｎ３Ｏ５（Ｍ＋Ｈ）＋の計算される質量である４３４．２６が、４３４．３として見出された。
【０３２９】
樹脂に結合した中間体４の調製：
ＡＡ１＝ＣＨ２−ＣＨ２、ＡＡ２＝ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２樹脂３（０．５１ｇ、０．４ｍｍｏｌ／ｇ）をＤＭＦ中、１０分間膨潤させ、溶液を除き、３ｍＬのＤＭＦに溶解したβ−Ａｌａ−ＯＨ（０．０９４ｇ、１．５当量）、ＨＢＴＵ（０．１１５ｇ、１．５当量）、ＨＯＢＴ（０．０４１ｇ、１．５当量）及びＮ−メチルモルホリン（０．０６６ｍＬ、３当量）の混合物により処理した。３時間後、クロラニル試験は、負の試験を示した。樹脂をＤＭＦにて洗浄（６×３０秒間）し、次いで２０％のピペリジンにより処理（２×１５分間）し、ＤＭＦにて洗浄（６×３０秒間）し、γ−Ａｂｕ−ＯＨ（０．１ｇ、１．５当量）、ＨＯＢＴ、ＨＢＴＵ及びＮ−メチルモルホリンの混合物を用いてカップリングした。３時間後、クロラニル試験により示されるように、カップリングは終了した。樹脂をＤＭＦ（６×）、ＤＣＭ及びＭｅＯＨにて洗浄し、乾燥した。ＤＣＭ中に溶解した１％ＴＦＡにより樹脂のサンプルを切断し、ＬＣＭＳにより粗生成物を分析した。Ｃ３０Ｈ４７Ｎ５Ｏ７（Ｍ＋Ｈ）＋の計算される質量である５８９．３５が、５８９．３として見出された（＞９０％の純度）。
【０３３０】
ＧＬＰ−１−（７−３７）−γ−Ａｂｕ−β−Ａｌａ−ＣＯＮＨ−リシノプリル（３６３３／４２／１）の合成
計算上１１０μｍｏｌの修飾されたトリチル樹脂４をＳｙｍｐｈｏｎｙ（登録商標）ペプチド合成装置（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）の反応容器に秤量し、Ｆｍｏｃペプチド合成プロトコルに従ってペプチド伸長を実施した。２０ｍＬのＴＦＡ／フェノール／Ｈ２Ｏ／ＴＩＰＳ（９５：２：２：１）により、ペプチドを樹脂から切り出した。ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルを用いて、粗ペプチドを沈殿させた。Ｃ１７４Ｈ２６５Ｎ４３Ｏ５３（Ｍ＋Ｈ）＋の計算される質量である３８０７．３１が、ＬＣ−ＭＳでの１２６９．１（Ｍ＋３Ｈ）３として見出された。粗ペプチドを、１ｍＬのＨ２Ｏ／ＡＣＮの６０：４０の混合物中に溶解し、この混合物にＬｉＯＨの２Ｍ溶液を０．２ｍＬ添加した。混合物を、室温にて３時間撹拌した。粗ペプチドをＬＣＭＳ−ＰｒｅｐＥｘｐｒｅｓｓ（分子量による回収）（Ｃ１８、０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ溶液中、３０分間にわたる２５−６０％のＣＨ３ＣＮの勾配）により精製し、標記の化合物を白色粉体（２３．３ｍｇ、５．７％）として得た：ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８、０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ溶液中、１５分間にわたる５−７５％のＣＨ３ＣＮの勾配）の保持時間は９．６４である。Ｃ１７２Ｈ２６１Ｎ４３Ｏ５３（Ｍ＋Ｈ）＋の計算される質量である３７７９．２５が、ＬＣ−ＭＳでの１２５９．７（Ｍ＋３Ｈ）３として見出された。
【０３３１】
ＧＬＰ−１−（７−３７）−γ−Ａｂｕ−β−Ａｌａ−ＣＯＮＨ−リシノプリル（３６３３／４２／２）の合成：
計算上１１０μｍｏｌの修飾されたトリチル樹脂４をＳｙｍｐｈｏｎｙ（登録商標）ペプチド合成装置の反応容器に秤量し、Ｆｍｏｃペプチド合成プロトコルに従ってペプチド伸長を実施した。２０ｍＬのＴＦＡ／フェノール／Ｈ２Ｏ／ＴＩＰＳ（９５：２：２：１）により、ペプチドを樹脂から切り出した。ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルを用いて、粗ペプチドを沈殿させた。Ｃ１７４Ｈ２６６Ｎ４２Ｏ５２（Ｍ＋Ｈ）＋の計算される質量である３７７８．３１が、ＬＣ−ＭＳでの１２５９．４（Ｍ＋３Ｈ）３として見出された。粗ペプチドを、１ｍＬのＨ２Ｏ／ＡＣＮの６０：４０の混合物中に溶解し、この混合物にＬｉＯＨの２Ｍ溶液を０．２ｍＬ添加した。混合物を、室温にて３時間撹拌した。粗ペプチドをＬＣＭＳ−ＰｒｅｐＥｘｐｒｅｓｓ（分子量による回収）（Ｃ１８、０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ溶液中、３０分間にわたる２５−６０％のＣＨ３ＣＮの勾配）により精製し、標記の化合物を白色粉体（２１ｍｇ、５．５％）として得た：ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８、０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ溶液中、１５分間にわたる５−７５％のＣＨ３ＣＮの勾配）の保持時間は９．８０である。Ｃ１７２Ｈ２６２Ｎ４２Ｏ５２（Ｍ＋Ｈ）＋の計算される質量である３７５０．２６が、ＬＣ−ＭＳでの１２５０．１（Ｍ＋３Ｈ）３として見出された。
【０３３２】
ＧＬＰ−１−（７−３７）−γ−Ａｂｕ−β−Ａｌａ−ＣＯＮＨ−リシノプリル（３６３３／４２／３）の合成
計算上１１０μｍｏｌの修飾されたトリチル樹脂４をＳｙｍｐｈｏｎｙ（登録商標）ペプチド合成装置（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）の反応容器に秤量し、Ｆｍｏｃペプチド合成プロトコルに従ってペプチド伸長を実施した。２０ｍＬのＴＦＡ／フェノール／Ｈ２Ｏ／ＴＩＰＳ（９５：２：２：１）により、ペプチドを樹脂から切り出した。粗ペプチドをｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルを用いて沈殿させ、ＬＣＭＳ−ＰｒｅｐＥｘｐｒｅｓｓ（分子量による回収）（Ｃ１８、０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ溶液中、３０分間にわたる２５−６０％のＣＨ３ＣＮの勾配）により精製し、エステル化合物を白色粉体（５．８ｍｇ、１．２％）として得た：ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８、０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ溶液中、１５分間にわたる５−５０％のＣＨ３ＣＮの勾配）の保持時間は８．１３であり；Ｃ１８１Ｈ２７３Ｎ４５Ｏ５３（Ｍ＋Ｈ）＋の計算される質量である３９２７．３６が、ＬＣ−ＭＳでの１３１０．７（Ｍ＋３Ｈ）３として見出された。粗ペプチドを、１ｍＬのＨ２Ｏ／ＡＣＮの６０：４０の混合物中に溶解し、この混合物にＬｉＯＨの２Ｍ溶液を０．１６０ｍＬ添加した。混合物を、室温にて３時間撹拌した。粗ペプチドをＬＣＭＳ−ＰｒｅｐＥｘｐｒｅｓｓ（分子量による回収）（Ｃ１８、０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ溶液中、３０分間にわたる２５−６０％のＣＨ３ＣＮの勾配）により精製し、標記の化合物を白色粉体（１１ｍｇ、２．４％）として得た：ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８、０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ溶液中、１５分間にわたる５−７５％のＣＨ３ＣＮの勾配）の保持時間は９．５１である。Ｃ１７９Ｈ２６９Ｎ４５Ｏ５３（Ｍ＋Ｈ）＋の計算される質量である３８９９．４１が、ＬＣ−ＭＳでの１３００．８１２５０．（Ｍ＋３Ｈ）３として見出された。
【０３３３】
［Ｌｅｕ１４］−エキセンディン−４−（１−２８）−γ−Ａｂｕ−β−Ａｌａ−ＣＯＮＨ−リシノプリル（３６３３／２１）の合成
上記の手順は、中間体４の調製へと進められた。計算上１２０μｍｏｌの修飾されたトリチル樹脂４をＳｙｍｐｈｏｎｙ（登録商標）ペプチド合成装置の反応容器に秤量し、Ｆｍｏｃペプチド合成プロトコルに従ってペプチド伸長を実施した。２０ｍＬのＴＦＡ／フェノール／Ｈ２Ｏ／ＴＩＰＳ（９５：２：２：１）により、ペプチドを樹脂から切り出した。粗ペプチドをｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルを用いて沈殿させ、ＬＣＭＳ−ＰｒｅｐＥｘｐｒｅｓｓ（分子量による回収）（Ｃ１８、０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ溶液中、３０分間にわたる２５−６０％のＣＨ３ＣＮの勾配）により精製し、エステル化合物を白色粉体（１１ｍｇ、２．２％）として得た：ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８、０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ溶液中、１５分間にわたる５−７５％のＣＨ３ＣＮの勾配）の保持時間は８．１３であり；Ｃ１７７Ｈ２７１Ｎ４５Ｏ５３（Ｍ＋Ｈ）＋の計算される質量である３８４９．３９が、ＬＣ−ＭＳでの１２８４．７（Ｍ＋３Ｈ）３として見出された。１００μＬのＨ２Ｏ中に０．８ｍｇの精製されたエステル前駆体を含む溶液を、１２μＬの２ＭのＬｉＯＨ溶液により処理した。２時間後、ＬＣＭＳにより、所望の化合物３６３３／２１への定量的な変換が示された。Ｃ１７５Ｈ２６７Ｎ４５Ｏ５３（Ｍ＋Ｈ）＋のＬＣＭＳで計算される質量である３８２１．３４が、ＬＣ−ＭＳでの１２７４．７（Ｍ＋３Ｈ）３として見出された。
【０３３４】
ＧＬＰ−１−（７−３７）−γ−Ａｂｕ−ＣＯＮＨ−リシノプリル（３６３３／２４）の合成
上記の手順は、中間体４の調製へと進められた。計算上１２０μｍｏｌの修飾されたトリチル樹脂４をＳｙｍｐｈｏｎｙ（登録商標）ペプチド合成装置の反応容器に秤量し、Ｆｍｏｃペプチド合成プロトコルに従ってペプチド伸長を実施した。２０ｍＬのＴＦＡ／フェノール／Ｈ２Ｏ／ＴＩＰＳ（９５：２：２：１）により、ペプチドを樹脂から切り出した。粗ペプチドをｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルを用いて沈殿させ、ＬＣＭＳ−ＰｒｅｐＥｘｐｒｅｓｓ（分子量による回収）（Ｃ１８、０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ溶液中、３０分間にわたる２５−６０％のＣＨ３ＣＮの勾配）により精製し、エステル化合物を白色粉体（６．２ｍｇ、２．２％）として得た：ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８、０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ溶液中、１５分間にわたる５−７５％のＣＨ３ＣＮの勾配）の保持時間は８．８６であり；Ｃ１７９Ｈ２７２Ｎ４４Ｏ５１（Ｍ＋Ｈ）＋の計算される質量である３８５６．４３が、ＬＣ−ＭＳでの１２８６．７（Ｍ＋３Ｈ）３、９６５．５（Ｍ＋４Ｈ）４として見出された。１００μＬのＨ２Ｏ中に０．８ｍｇの精製されたエステル前駆体を含む溶液を、１２μＬの２ＭのＬｉＯＨ溶液により処理した。２時間後、ＬＣＭＳにより、所望の化合物３６３３／２１への定量的な変換が示された。Ｃ１７６Ｈ２６４Ｎ４４Ｏ５２（Ｍ＋Ｈ）＋の計算される質量である３８２８．３３が、ＬＣ−ＭＳでの１２７７．１（Ｍ＋３Ｈ）３として見出された。
【０３３５】
ＧＬＰ−１−（７−３７）−γ−Ａｂｕ−Ｎε２Ｌｙｓ−（Ｐｙｒ）−ＷＡＰ−ＯＨ（３６３３／３８）の合成
計算上３４０μｍｏｌの修飾されたＨ−プロ−トリチル−レジン（０．６８ｍｍｏｌ／ｇ）を手動のペプチド合成装置の反応容器に秤量し、以下のアミノ酸を用いた標準的なＦｍｏｃペプチド合成プロトコルに従ってペプチド伸長を実施した：ＦｍｏｃＡｌａ−ＯＨ、ＦｍｏｃＴｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、ＦｍｏｃＬｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨ及びピログルタミン酸−ＯＨ。次いで、ペンタペプチドを、乾燥ＤＣＭ中、アルゴン下で１０分間膨潤させた。混合物に対し、Ｍｅ２ＮＨ−ＢＨ３（０．０７３ｇ、６当量）を撹拌しながら加え、次いで５分後、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（０．０２４ｇ、１０ｍｏｌ％）を添加した。１０分後、溶液を排出し、樹脂をＤＣＭ（４×）により洗浄した。この手順を繰り返し、次いで樹脂をＤＣＭ（８×３０秒間）、５％ＤＩＥＡのＤＣＭ溶液（３×６０秒間）及びＤＣＭ（５×３０秒間）により洗浄力した。樹脂は、クロラニル試験で陽性を示す。修飾されたトリチル樹脂をＳｙｍｐｈｏｎｙ（登録商標）ペプチド合成装置の反応容器に秤量し、Ｆｍｏｃペプチド合成プロトコルに従ってペプチド伸長を実施した。２０ｍＬのＴＦＡ／フェノール／Ｈ２Ｏ／ＴＩＰＳ（９５：２：２：１）により、ペプチドを樹脂から切り出した。粗ペプチドをｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルを用いて沈殿させ、ＬＣＭＳ−ＰｒｅｐＥｘｐｒｅｓｓ（分子量による回収）（Ｃ１８、０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ溶液中、３０分間にわたる２５−６０％のＣＨ３ＣＮの勾配）により精製し、エステル化合物を白色粉体（８．５ｍｇ、２．１％）として得た。ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８、０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ溶液中、１５分間にわたる５−７５％のＣＨ３ＣＮの勾配）の保持時間は９．８６であり；Ｃ１８５Ｈ２７４Ｎ４８Ｏ５４（Ｍ＋Ｈ）＋の計算される質量である４０３４．５４が、ＬＣ−ＭＳでの１３４４．８（Ｍ＋３Ｈ）３として見出された。
【０３３６】
Ｇｌｕ（γ−メチルアミド）−（２）−Ｓ−シアノピロリジンアミドの合成
以下は、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤をベースとした分子であるＧｌｕ（γ−メチルアミド）−（２）−Ｓ−シアノピロリジンアミドの合成スキームを示す。
【０３３７】
【化４４】
0005412273.tif 000045
【０３３８】
Ｌｙｓ（ε−ＮＨ−アセトイル）−（２）−Ｓ−シアノピロリジンアミドの合成
以下は、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤をベースとした分子であるＬｙｓ（γ−メチルアミド）−（２）−Ｓ−シアノピロリジンアミドの合成スキームを示す。
【０３３９】
【化４５】
0005412273.tif 000046
【０３４０】
マレイミドＤＰＰ−ＩＶ阻害剤−ＧＩＰアナログの合成
以下は、（例えば図４に示されるような）ＧＩＰペプチドに対してマレイミドＤＰＰ−ＩＶ阻害剤アナログをカップリングさせるための典型的な手順である。
【０３４１】
【化４６】
0005412273.tif 000047
【０３４２】
２５ｍＭのＨＥＰＥＳバッファ（５ｍＬ）を、アルゴン下で約１０分間脱気し、遊離のシステインと共に、所望のペプチド（１０ｍｇ  １：１（ｖ／ｖ）  ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ）に対し加えた。マレイミド−ＤＰＰＩＶアナログ（約２〜３当量）の１：１（ｖ／ｖ）  ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ溶液（５ｍＬ）をこのペプチドに加え、アルゴン空気下で溶液を撹拌した。１時間後、ＬＣＭＳにより、所望の生成物への完全な変換が示されたときに、反応物を凍結し、凍結乾燥した。溶離剤としてＣＨ３ＣＮ及びＨ２Ｏの勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにより、粗ペプチドを精製した。
【０３４３】
実施例２：
ＧＬＰ−１−ぺプチダーゼ阻害剤コンジュゲートの合成
コンジュゲート分子は、ペプチドＧＬＰ−１をペプチダーゼ阻害剤に連結することにより調製された。使用するペプチダーゼ阻害剤は、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤及びバソペプチダーゼ（中性エンドペプチターゼ、ＡＣＥ及びエンドセリン変換酵素−１）阻害剤を含んでいた。以下は、阻害剤のモチーフがＧＬＰ−１のＣ末端に配置されるＧＬＰ−１／ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤コンジュゲート分子である４８４４及び４８４５、及び、阻害剤のモチーフがＧＬＰ−１のＮ末端に配置される及びＧＬＰ−１／バソペプチダーゼ阻害剤コンジュゲート分子である４９８３及び４９８４の合成スキームを示す。
【０３４４】
【化４７】
0005412273.tif 000048
【０３４５】
【化４８】
0005412273.tif 000049
【０３４６】
チアゾリジニル（Ｓ）−２−アミノ−６−（フルオレニルメトキシカルボニル）アミノヘキシルカルバメート（１）の調製：
Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ（０．７０３ｇ、１．５ｍｍｏｌ）、ポリスチレン−ＨＯＢｔ（１ｍｍｏｌ／ｇ、１ｇ、１ｍｍｏｌ）、８ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２及び２ｍｌのＤＭＦを２０ｍｌの反応容器に加え、混合物を室温にて２時間、水平振とう機にて穏やかに撹拌した。懸濁液を濾過し、樹脂をＤＭＦ、次いで乾燥ＣＨ２Ｃｌ２によって、十分に洗浄した。樹脂を１０ｍｌの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中に再懸濁し、チアゾリジン（８３μｌ、１．０ｍｍｏｌ）をこの懸濁液に添加した。混合物を次いで、室温にて一晩、水平振とう機にて穏やかに撹拌した。樹脂を濾過して取り除き、濾液を回収して、減圧下で乾燥させた。残渣を次いで、１０ｍｌの５０％ＴＦＡのＣＨ２Ｃｌ２溶液にて、室温で２時間処理した。真空において一晩乾燥後、所望の生成物をＴＦＡ塩として得た（０．４１ｇ、収率７３％）：１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）δ７．７４（ｄ、Ｊ＝４．５Ｈｚ、２Ｈ）７．５７（ｄ、Ｊ＝４．１Ｈｚ、２Ｈ）７．３８（ｔ、Ｊ＝４．５Ｈｚ、２Ｈ）７．２９（ｔ、Ｊ＝４．４Ｈｚ、２Ｈ）５．２１（ｓ、ｂ、１Ｈ）４．５３（ｔ、Ｊ＝、６．２Ｈｚ、１Ｈ）４．４１（ｍ、１Ｈ）４．３４（ｄ、Ｊ＝４．３Ｈｚ、２Ｈ）４．２６（ｍ、１Ｈ）４．１７（ｍ、１Ｈ）３．８４（ｍ、１Ｈ）３．６４（ｍ、１Ｈ）３．１４（ｍ、２Ｈ）３．０３（ｔ、Ｊ＝３．３Ｈｚ、１Ｈ）２．９４（ｔ、Ｊ＝３．８Ｈｚ、１Ｈ）１．８６（ｍ、２Ｈ）１．４８（ｍ、４Ｈ）；ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８、０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ中、５分にわたる３０−９５％のＣＨ３ＣＮ）の保持時間は２．９１であり；Ｃ２４Ｈ３０Ｎ３Ｏ３Ｓ（Ｍ＋Ｈ）＋の計算される質量である４４０．２が、ＬＣ−ＭＳでの４４０．２として見出された。
【０３４７】
２−シアノチアゾリジニル（Ｓ）−２−アミノ−６−（フルオレニルメトキシカルボニル）アミノヘキシルカルバメート（２）の調製：
Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ（０．４８７ｇ、１．０ｍｍｏｌ）、ポリスチレン−ＨＯＢｔ（１ｍｍｏｌ／ｇ、１ｇ、１ｍｍｏｌ）、８ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２及び２ｍｌのＤＭＦを２５ｍｌの反応容器に加え、混合物を室温にて２時間、水平振とう機にて穏やかに撹拌した。懸濁液を濾過し、樹脂をＤＭＦ、次いで乾燥ＣＨ２Ｃｌ２によって、十分に洗浄した。樹脂を１０ｍｌの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中に再懸濁し、２−シアノチアゾリジン塩酸塩（０．１７２ｇ、１．１ｍｍｏｌ）をこの懸濁液に添加した。混合物を次いで、室温にて一晩、水平振とう機にて穏やかに撹拌した。懸濁液を濾過し、樹脂を１０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２により洗浄した。濾液を集め、減圧下で蒸発乾燥させた。残渣を６０％のＣＨ２Ｃｌ２／Ｅｔ０Ａｃにより溶出するシリカゲルクロマトグラフィーに供し、完全に保護された生成物を、結晶状固体として得た（０．１８６ｇ、３３％）。固体を１０ｍｌの５０％ＴＦＡのＣＨ２Ｃｌ２溶液にて、室温で２時間処理し、溶媒を減圧下で除去した。残渣を逆相ＨＰＬＣカラム（Ｃ１８、０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ中、３０分にわたる２０−５０％のＣＨ３ＣＮ勾配）にかけ、標記化合物を白色粉体として得た（０．１４２ｇ、９４％）：１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）δ７．７４（ｄ、Ｊ＝４．５Ｈｚ、２Ｈ）７．５６（ｍ、２Ｈ）７．３８（ｔ、Ｊ＝４．５Ｈｚ、２Ｈ）７．２９（ｔ、Ｊ＝４．５Ｈｚ、２Ｈ）５．２７（ｓ、ｂ、１Ｈ）５．１０（ｍ、１Ｈ）４．６６（ｄ、Ｊ＝５．１Ｈｚ、１Ｈ）４．５０（ｄ、Ｊ＝４．８Ｈｚ、１Ｈ）４．３３（ｄ、Ｊ＝４．１Ｈｚ、２Ｈ）４．１８（ｍ、１Ｈ）３．２２（ｍ、２Ｈ）３．１３（ｍ、２Ｈ）１．９１（ｍ、２Ｈ）１．４７（ｍ、４Ｈ）；ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８、０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ中、５分にわたる３０−９５％のＣＨ３ＣＮ）の保持時間は２．９６であり；Ｃ２５Ｈ２９Ｎ４Ｏ３Ｓ（Ｍ＋Ｈ）＋の計算される質量である４６５．２が、ＬＣ−ＭＳでの４６５．３として見出された。
【０３４８】
ＧＬＰ−１−（７−３７）−ＧＧ−（Ｓ）−２，６−ジアミノ−１−（チアゾリジン−３−イル）ヘキサン−１−オンアミド（３、４８４４）の調製：
チアゾリジニル（Ｓ）−２−アミノ−６−（フルオレニルメトキシカルボニル）アミノヘキシルカルバメート（１）（０．４１ｇ、０．９３ｍｍｏｌ）、トリチル塩化物樹脂（１．０ｍｍｏｌ／ｇ、０．２５ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）、１５ｍｌの無水ＤＭＦを２５ｍｌの反応容器に加え、混合物を一晩室温で穏やかに旋回した。懸濁液を濾過し、樹脂を３０ｍｌのＤＭＦ、３０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２、３０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＤＩＰＥＡ（１７：２：１）、及び３０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２によって順次洗浄した。真空下、ＫＯＨにて、樹脂を一晩乾燥した。試験切断生成物のＬＣ−ＭＳは、最初に結合された断片の存在を示した。計算上５０μｍｏｌの修飾されたトリチル樹脂をＳｙｍｐｈｏｎｙペプチド合成装置の反応容器に秤量し、標準的なＦｍｏｃペプチド合成プロトコルに従ってペプチド伸長を実施した。１０ｍＬのＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＰＳ（９５：２．５：２．５）により、ペプチドを樹脂から切り出し、逆相ＨＰＬＣカラム（Ｃ１８、０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ中、３０分にわたる２０−５０％のＣＨ３ＣＮ勾配）にかけ、標記化合物を白色粉体として得た（５．５ｍｇ、３％）：ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８、０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ中、１５分にわたる１５−４５％のＣＨ３ＣＮ）の保持時間は１０．５２であり；Ｃ１６４Ｈ２５２Ｎ４５Ｏ４９Ｓ（Ｍ＋Ｈ）＋の計算される質量である３６７０．２が、ＬＣ−ＭＳでの１８３６．０（Ｍ＋２Ｈ）２＋、１２２４．７（Ｍ＋３Ｈ）３＋、９１８．５（Ｍ＋４Ｈ）４＋として見出された。
【０３４９】
ＧＬＰ−１−（７−３７）−ＧＧ−（Ｓ）−２，６−ジアミノ−１−（チアゾリジン−２−シアノ−３−イル）ヘキサン−１−オンアミド（４、４８４５）の調製：
２−シアノチアゾリジニル（Ｓ）−２−アミノ−６−（フルオレニルメトキシカルボニル）ＴＦＡ塩（２）（０．０４５ｇ、０．０７８ｍｍｏｌ）、トリチル塩化物樹脂（１．０ｍｍｏｌ／ｇ、０．１０ｇ、０．１０ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（４μｌ、０．０７８ｍｍｏｌ）、５ｍｌの無水ＣＨ２Ｃｌ２を２５ｍｌの反応容器に加え、混合物を一晩室温で、穏やかに旋回した。懸濁液を濾過し、樹脂を３０ｍｌのＤＭＦ、３０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２、３０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＤＩＰＥＡ（１７：２：１）、及び３０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２によって順次洗浄した。真空下、ＫＯＨにて、樹脂を一晩乾燥した。試験切断生成物のＬＣ−ＭＳは、最初に結合された断片の存在を示した。計算上５０μｍｏｌの修飾されたトリチル樹脂をＳｙｍｐｈｏｎｙペプチド合成装置の反応容器に秤量し、標準的なＦｍｏｃペプチド合成プロトコルに従ってペプチド伸長を実施した。１０ｍＬのＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＰＳ（９５：２．５：２．５）により、ペプチドを樹脂から切り出し、逆相ＨＰＬＣカラム（Ｃ１８、０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ中、３０分にわたる２０−５０％のＣＨ３ＣＮ勾配）にかけ、標記化合物を白色粉体として得た（１．７ｍｇ、０．９％）：ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８、０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ中、１５分にわたる１５−４５％のＣＨ３ＣＮ）の保持時間は１０．６０であり；Ｃ１６５Ｈ２５１Ｎ４６Ｏ４９Ｓ（Ｍ＋Ｈ）＋の計算される質量である３６９５．２が、ＬＣ−ＭＳでの１８４８．０（Ｍ＋２Ｈ）によって、２＋、１２３２．７の（Ｍ＋３Ｈ）３＋、９２４．５の（Ｍ＋４Ｈ）４＋として見出された。
【０３５０】
８−アミノ−３，６−ジオキサオクタノイル−ＧＬＰ−１−（７−３６）アミド（５、４９９２）の調製：
標記ペプチドを、標準的なＦａｓｔＭｏｃプロトコルに従ってＡＢＩ−４３３Ａペプチド合成装置により０．２０ｍｍｏｌ  Ｒｉｎｋアミド樹脂（０．６１０ｍｍｏｌ／ｇ、０．３２８ｇ）上に作製した。最終的なＦｍｏｃ基は除去され、樹脂を真空下で乾燥させ、０．９０ｇの重量を得た。樹脂の３分の１（０．３０ｇ）は、濾過フリット付きの反応容器中で１０ｍｌのＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＰＳ（９５：２．５：２．５）により２時間処理し、切断溶液を３５ｍｌのＴＭＢＥへと濾過した。遠心分離によって沈殿物は集められ、逆相ＨＰＬＣカラム（Ｃ１８、０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ中、３０分にわたる２０−５０％のＣＨ３ＣＮ勾配、２０ｍｌ／分の流速）にかけ、標記化合物を白色粉体として得た（３．０ｍｇ、１．３％）：ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８、０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ中、１５分にわたる１５−４５％のＣＨ３ＣＮ）の保持時間は１０．９９であり；Ｃ１５５Ｈ２３８Ｎ４１Ｏ４８（Ｍ＋Ｈ）＋の計算される質量である３４４３．９が、ＬＣ−ＭＳでの１７２２．９（Ｍ＋２Ｈ）、２＋、１１４８．６の（Ｍ＋３Ｈ）３＋、８６１．５の（Ｍ＋４Ｈ）４＋として見出された。
【０３５１】
（Ｒ，Ｓ）−１−［Ｎ２−（１−カルボキシ−３−フェニルプロピル）−Ｌ−ａｌａ］−Ｌ−ｐｒｏ−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタノイル−ＧＬＰ−１−（７−３６）アミド（６、４９８３）の調製：
８−アミノ−３，６−ジオキサオクタノイル−ＧＬＰ−１−（７−３６）断片を上記のように作製し、樹脂の３分の１である０．３０ｇを、標準的なＦａｓｔＭｏｃプロトコルに従って、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨと順次カップリングさせた。Ｆｍｏｃ基を除去し、樹脂を４ｍＬのＤＭＦ／ＨＯＡｃ（９９：１）中に溶解した２−ケト−４−フェニル酪酸（０．１１７ｇ、０．６６ｍｍｏｌ）、ＮａＢＨ３ＣＮ（０．０４５ｇ、０．７２ｍｍｏｌ）と混合した。ＤＭＦ、ＣＨ２Ｃｌ２及びＭｅＯＨによって樹脂を十分に洗浄し、真空下で乾燥させた。次いで樹脂を、濾過フリット付きの反応容器中で１０ｍｌのＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＰＳ（９５：２．５：２．５）により２時間処理し、切断溶液を３５ｍｌのＴＭＢＥへと濾過した。遠心分離によって沈殿物は集められ、逆相ＨＰＬＣカラム（Ｃ１８、０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ中、３０分にわたる２０−５０％のＣＨ３ＣＮ勾配、２０ｍｌ／分の流速）にかけ、標記化合物を白色粉体として得た（１．８ｍｇ、０．７％）：ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８、０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ中、１５分にわたる１５−４５％のＣＨ３ＣＮ）の保持時間は１０．５８であり；Ｃ１７３Ｈ２６０Ｎ４３Ｏ５２（Ｍ＋Ｈ）＋の計算される質量である３７７４．３が、ＬＣ−ＭＳでの１８８８．０（Ｍ＋２Ｈ）によって、２＋、１２５８．７の（Ｍ＋３Ｈ）３＋、９４４．５の（Ｍ＋４Ｈ）４＋として見出された。
【０３５２】
（Ｒ，Ｓ）−１−［Ｎ２−（１−カルボキシ−３−フェニルプロピル）−Ｌ−ａｌａ］−Ｌ−ｐｒｏ−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタノイル−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタノイル−ＧＬＰ−１−（７−３６）アミド（７、４９８４）の調製：
８−アミノ−３，６−ジオキサオクタノイル−ＧＬＰ−１−（７−３６）断片を上記のように作製し、樹脂の３分の１である０．３０ｇを、標準的なＦａｓｔＭｏｃプロトコルに従って、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨと順次カップリングさせた。Ｆｍｏｃ基を除去し、樹脂を４ｍＬのＤＭＦ／ＨＯＡｃ（９９：１）中に溶解した２−ケト−４−フェニル酪酸（０．１１７ｇ、０．６６ｍｍｏｌ）、ＮａＢＨ３ＣＮ（０．０４５ｇ、０．７２ｍｍｏｌ）とともにインキュベートされた。ＤＭＦ、ＣＨ２Ｃｌ２及びＭｅＯＨによって樹脂を十分に洗浄し、真空下で乾燥させた。次いで樹脂を、濾過フリット付きの反応容器中で１０ｍｌのＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＰＳ（９５：２．５：２．５）により２時間処理し、切断溶液を３５ｍｌのＴＭＢＥへと濾過した。遠心分離によって沈殿物は集められ、逆相ＨＰＬＣカラム（Ｃ１８、０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ中、３０分にわたる２０−５０％のＣＨ３ＣＮ勾配、２０ｍｌ／分の流速）にかけ、標記化合物を白色粉体として得た（６．４ｍｇ、２．４％）：ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８、０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ中、１５分にわたる１５−４５％のＣＨ３ＣＮ）の保持時間は１１．４９であり；Ｃ１７９Ｈ２７１Ｎ４４Ｏ５５（Ｍ＋Ｈ）＋の計算される質量である３９１９．４が、ＬＣ−ＭＳでの１９６１．１（Ｍ＋２Ｈ）によって、２＋、１３０７．７の（Ｍ＋３Ｈ）３＋、９８０．５の（Ｍ＋４Ｈ）４＋として見出された。
【０３５３】
実施例３：
ＧＬＰ−１−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲートの特性決定
阻害剤が接合するＧＬＰ−１−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲートのＧＬＰ−１受容体結合活性（ＲＢＡ）を、受容体供給源がＲＩＮ  ｍ５ｆ細胞によって発現された内在性ＧＬＰ−１受容体である結合置換アッセイを用いて評価した。膜画分は、ＲＩＮ  ｍ５ｆ細胞の密集培養物から調製した。ホモジェナイズしたＲＩＮｍ５Ｆ細胞膜を、４０，０００ｃｐｍ［１２５Ｉ］のＧＬＰ−１トレーサを含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファ及び様々な濃度の試験化合物の中でインキュベートした。反応混合物を、２３℃にて２時間、一定して混合した。０．３％のＰＥＩ溶液に予め浸漬され、氷冷されたリン酸バッファ溶液ですすいだガラスフィルターパッドを用いて、反応混合物を濾過した。フィルターパッドと結合している数を、シンチレーションカウンターを使用して測定し、結合親和性をＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を使用して算出した。
【０３５４】
ＧＬＰ−１−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲートは、以下の通りにＧＬＰ−１シクラーゼアッセイで評価した。膜画分は、ＲＩＮ  ｍ５ｆ細胞の密集培養物から調製した。試験化合物は、アッセイバッファで連続希釈し、次に、ＡＴＰ／ＧＴＰ混合物中にＲＩＮ  ｍ５ｆ細胞膜を含む９６ウェルアッセイプレートに添加した。シクラーゼ活性は、ＧＬＰ−１受容体の活性化により誘導されるｃＡＭＰの産生を測定することにより調べた。ｃＡＭＰ産生の定量化は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｆｕｓｉｏｎ（商標）−Ａｌｐｈａ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用し、ビオチン化ｃＡＭＰプローブを用いて、競合的化学蛍光アッセイによって実現された。この化合物のＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）ソフトウェア内の４−パラメータ方程式へ濃度反応曲線をフィッティングすることにより得られた。受容体結合及びシクラーゼアッセイからの結果は、表１に示される。
【０３５５】
ＧＬＰ−１−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲート化合物４８４４及び４８４５は、精製ＤＰＰ−ＩＶ酵素及び発色性基質を用いたＤＰＰ−ＩＶ阻害アッセイにおいて評価した。組換えＤＰＰ−ＩＶ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、純度＞９５％、比活性５．６６±０．４９ｍＵ）を、１００μｌバッファ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＺｎＣｌ２、０．０５％のＮａＮ３、ｐＨ８．０）中に溶解し、溶液を１０本の微小遠心管に分け、−２０℃にて保存した。阻害アッセイのために、２μｌのＨ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ（５ｍＭ、ＰＢＳバッファ中に溶解、ｐＨ７．４）を、３７℃にて、９６ウェル平底マイクロタイタープレート中、様々な濃度で１μｌの化合物４８４４又は４８４５を含む１４６μｌのアッセイバッファ（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４）中でインキュベートした。反応は各ウェルに１μｌのＤＰＰ−ＩＶ酵素（０．０５ｍＵ）を添加することにより開始し、４１０ｎｍにおける吸光度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して、３０分間にわたり２０秒間隔で測定した。様々な阻害剤濃度における各反応速度を計算し、互恵的な速度はＤｉｘｏｎグラフ中に、阻害剤濃度に対して速度の逆数をプロットした。反応速度のＩＣ５０値を、プロットを一次方程式にフィッティングすることにより計算した。ＤＰＰ−ＩＶ酵素阻害物質Ｄｉｐｒｏｔｉｎ  Ａ（ｌｌｅ−Ｐｒｏ−ｌｌｅ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、反応のための陽性対照として使用した。Ｄｉｐｒｏｔｉｎ  Ａに対するＩＣ５０値は５．１μＭであると測定され、これは公表値の３．５μＭと密接に対応している（Ｌｅｉｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３７１：５２５）。ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤アッセイからの結果は、表１に示される。
【０３５６】
ペプチド安定性アッセイは、様々なペプチダーゼが豊富な調製物であるヒト腎臓刷子縁膜（ｈＫＢＢＭ）中に含まれるＧＬＰ−１−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲートを用いて行った。５０％のＡＣＮ（３００μＭ、７０μｌ）中のペプチド（化合物４９９２、４９８３、４９８４及び対照ペプチド）の溶液を、各々１００μｌのＨＥＰＥＳバッファ（２５ｍＭ、ｐＨ７．４）中に０．７８μｌのｈＫＢＢＭを含むＬｏＢｉｎｄ微小遠心管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ）に移した。この管を、５００ＲＰＭ、３７℃にてボルテックスされるＶｏｒＴｅｍｐ５６（商標）（Ｅｕｒｏｔｅｃｈ  Ｌａｂｓ、ＵＫ）中でインキュベートした。０、１、２、３、４、及び５時間の時点で、２００μｌのＳＴＯＰ溶液（５０％のＡＣＮ、１％のギ酸）を所定の管に添加し、サンプルを、実験の終わりまでインキュベートした。サンプルは５時間後に回収し、遠心分離し、上澄みの２００μｌの上清を質量分析バイアル中に移した。各バイアルの母イオンの強度は、ＡＰＩ  １５０ＥＸ（商標）質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）で分析し、ＡＮＡＬＹＳＴ（商標）プログラムを使用して定量化した。ｈＫＢＢＭ安定性アッセイからの結果は、表１に示される。
【０３５７】
ペプチド−ＡＣＥペプチダーゼ阻害剤コンジュゲートを、精製ＡＣＥ酵素及び発色性基質を用いたＡＣＥ阻害アッセイにおいて評価した。ＡＣＥストック溶液は、０．６４０ｍＬのＨＥＰＥＳバッファ（０．１Ｍ、ｐＨ＝８）中に０．１単位の酵素（ウサギ肺由来ＡＣＥ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を溶解させることにより調製した。基質（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−ＯＨ）の２ｍＭストック溶液は、メタノール中に溶解した。ＡＣＥ阻害剤化合物は、０．０、１、１０、２０、６０及び１００μＭの濃度で、リン酸バッファ（０．１Ｍ、ｐＨ＝８）中に溶解した。阻害アッセイのために、６本の２ｍＬ微小遠心管を、１．４５ｍＬのリン酸バッファｐＨ＝８、０．０５ｍＬの１０％ＮａＣｌ及び０．０１５ｍＬの基質溶液を含むように調製した。各微小遠心管に、０．０１５ｍＬのＡＣＥ阻害剤化合物のストック溶液の１つに添加した。この溶液を、３７℃にて、約５分間加熱した。反応は５μＬのＡＣＥストック溶液を各管混合物に添加することにより開始した（３０秒間隔）。反応混合物は、３７℃にてインキュベートした。５分、１０分、３０分及び６０分後に、１００μＬのアリコートを各管から採取した（各サンプルは、３０秒間隔で採取した）。１００μＬのサンプルを含む試験管を、沸騰している水浴中で５分間の浮かし、次に、冷却した。次に、反応サンプルを、２０μＬの２Ｍ  ＮａＯＨ及び２０μＬの０．１％  フタルジアルデヒド溶液で処理した。試験管を４分間振盪し、１０μＬの６Ｍ  ＨＣｌを添加した。６０〜９０分後に、１２０μＬのこの溶液を９６ウェル平底−非結合性−表面プレート定盤（上部が測定される）へ移し、蛍光はλｅｘ＝３６５ｎｍにて測定され、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ（登録商標）分光蛍光計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用した場合、λｅｍ＝５００であった。初速度は、生成物放出曲線の直線部分から測定した。すべてのアッセイにおける開始基質濃度は２０μＭであった。ＡＣＥに対する阻害剤の見かけの結合定数
【０３５８】
【数１】
0005412273.tif 000050
は、阻害曲線（初速度対阻害剤濃度）を式：
【０３５９】
【数２】
0005412273.tif 000051
（式中、ｖ０は阻害剤非存在下での反応速度であり、［Ｉ］は阻害剤濃度である）にフィッティングさせることにより測定した。フィッティングは、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ  ３．６（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｒｅａｄｉｎｇ  ＰＡ）を用いて最小二乗法により行われた。ＡＣＥ阻害アッセイからの結果は、表２に示される。
【０３６０】
表１．ＧＬＰ−１／ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲート活性アッセイ
【０３６１】
【表１】
0005412273.tif 000052
【０３６２】
表２．ＧＬＰ−１アナログ／ＡＣＥ阻害剤コンジュゲート活性アッセイ
【０３６３】
【表２】
0005412273.tif 000053
【０３６４】
実施例２において記載したように、化合物４８４４及び４８４５は、阻害剤のモチーフがＧＬＰ−１（７−３７）のＣ末端であるＧＬＰ−１／ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤コンジュゲートである。化合物４９８３及び４９８４は、阻害剤のモチーフがＧＬＰ−１（７−３７）のＮ末端であるＧＬＰ−１／バソペプチダーゼ阻害剤コンジュゲートである。化合物４９９２はＮ末端にリンカーを有するＧＬＰ−１（７−３７）であり、このリンカーは化合物４９８３及び４９８４におけるものと同じである。化合物３６３３／２１、３６３３／２４、３６３３／４２／１、３６３３／４２／２、３６３３／４２／３及び３６３３／３８は、ＡＣＥ阻害剤のモチーフがＧＬＰ−１（７−３７）のＣ末端又は実施例１において記載したような［Ｌｅｕ１４］−エキセンディン（１−２８）であるコンジュゲート化合物である。
【０３６５】
表１及び２に示されるように、ＧＬＰ−１又はエキセンディン−１アナログのＣ末端に対するペプチダーゼ阻害剤のモチーフの結合は、受容体結合アッセイ及びシクラーゼアッセイの両方で示されるように、ＧＬＰ−１受容体と相互作用するコンジュゲートの能力を維持する。例えば、化合物４８４４及び４８４５の結果をＧＬＰ−１による結果と比較されたい。試験されたコンジュゲート化合物は、ＤＰＰ−ＩＶ又はＡＣＥ阻害活性も維持した。
【０３６６】
ＧＬＰ−１のＮ末端に対するペプチダーゼ阻害剤のモチーフの結合は、受容体結合アッセイにおいて約５５〜８０倍及びシクラーゼアッセイにおいて約５００〜８００倍までＧＬＰ−１活性を減らす。例えば、化合物４９８３及び４９８４の結果をＧＬＰ−１による結果と比較されたい。化合物４９９２は、化合物４９８３及び４９８４と同じ位置にリンカーを有し、活性の同様の低下を受ける。したがって、化合物４９８３及び４９８４において見られる活性の減少は、基本的に、リンカー及び阻害剤のモチーフの位置的効果に起因し得る。
【０３６７】
図５は、親イオンがインキュベーション工程を通じて追跡され、イオン強度によって定量化されるＬＣ−ＭＳシステムにより分析される、ｈＫＢＢＭのペプチド安定性の分析を表す。図５ａに示されるように、ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチド（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ−ＮＨ２）は１時間で急速に分解したのに対し、Ｎ末端がアシル化されたＧＬＰ−１アナログ４９９２はより遅い速度で分解した。インクレチン擬似体であるエキセンディン−４（ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−ＮＨ２）は、インキュベーション工程時にわたり基本的に完全な安定性を示した。ＧＬＰ−１コンジュゲート化合物４９８３及び４９８４は、ＧＬＰ−１（７−３６）と比較して著しく安定であり、Ｎ末端がアシル化されたＧＬＰ−１は、８０％を超える損なわれていない化合物が４時間後に存在した。ｈＫＢＢＭアッセイは、バリンピロリジド（ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤）の存在下でも行われた。図５ｂに示されるように、バリンピロリジド存在下において、試験するすべてのペプチドの安定性がある程度改善された。安定性が限界まで改善されなかったので、ｈＫＢＢＭアッセイは他のペプチダーゼを含んでいると思われる。
【０３６８】
ＡＣＥ阻害剤リシノプリルとのさらなるコンジュゲートを、生物学的活性について評価するように作製した。これらのコンジュゲート化合物は、図２に示されるように、様々なリンカーによってペプチドのＣ末端でリシノプリルと結合している。このペプチド成分には、表３に示されるエキセンディン−４及びＧＬＰ−１アナログを含む。化合物を、本願明細書において記載されるＡＣＥ阻害アッセイで試験した。これらのアッセイからの結果は、表３に示される。
【０３６９】
表３に記載されているコンジュゲートは、内在的に発現されるＧＬＰ−１受容体のペプチドにより誘発される活性化によって細胞系のｃＡＭＰの増加を測定する全細胞アッセイを用いて、ＧＬＰ−１シクラーゼ活性について試験した。甲状腺ｃ−細胞癌系統６−２３由来の細胞を、密集するまで増殖させ、ベルセン（０．５Ｍ  ＥＤＴＡ）を用いて処理することにより回収した。回収時、細胞はＥＤＴＡを含まないように洗浄し、２．５ｘ１０−６細胞／ｍｌの濃度で、刺激バッファ（１Ｘ  ＨＢＳＳ、０．１％のＢＳＡ、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、５００μＭ  ＩＢＭＸ、ｐＨ７．４）中で再懸濁した。ｃＡＭＰの蓄積は、３８４ウェル様式で、ｃＡＭＰアッセイキット（Ｃｉｓｂｉｏ−ＵＳ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いるコンジュゲート又は対照物質による処理の３０分後に測定した。化合物は、１μＭ〜１０ｐＭの最終濃度で試験した。細胞−コンジュゲート混合物は、室温にて、３０分間インキュベートし、それから、キットで提供されたα−ｃＡＭＰクリプターゼ溶液の添加により反応を停止させた。次に、プレートを密封し、室温で一晩保存することにより、成分が完全に平衡になるようにした。ｃＡＭＰ含有量を、次に、時間分解蛍光により測定した。試験した物質の有効性は、１０μＭフォルスコリン（アデニル酸シクラーゼの構成的アクチベーター）による細胞処理と比較して測定し、試験物質の効力（ＥＣ５０）は、４−パラメータモデルにフィッティングさせる非線形回帰分析を用いて、濃度反応曲線の分析により測定した。ＧＬＰ−１シクラーゼアッセイからの結果は、表３に示される。表３の他の結果とは異なり、化合物５７１１のＧＬＰ−１シクラーゼアッセイの結果は、上記した細胞膜アッセイに由来するものであった。
【０３７０】
表３．
【０３７１】
【表３】
0005412273.tif 000054
【０３７２】
ＡＣＥ阻害剤リシノプリルとのさらなるコンジュゲートを、生物学的活性について評価するように作製した。これらのコンジュゲート化合物は、図２に示されるように、様々なリンカーによってペプチドのＣ末端でリシノプリルと結合している。このペプチド成分には、表３に示されるエキセンディン−４及びＧＬＰ−１アナログを含む。化合物を、本願明細書において記載されるＧＬＰ−１シクラーゼアッセイ及びＡＣＥ阻害アッセイで試験した。これらのアッセイからの結果は、表３に示される。
【０３７３】
実施例４：
ＧＬＰ−１−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲートの安定性の特性決定
ＧＬＰ−１−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲート化合物のＤＰＰ−ＩＶに対する抵抗性も質量分析を使用して評価した。質量分析は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてペプチドの分解生成物を分析するための、優れたツールを提供する。安定性アッセイのために、２μｌのＧＬＰ−１、化合物４８４４、又は化合物４８４５（１ｍＭ、ＰＢＳバッファ中に溶解、ｐＨ７．４、２ｎｍｏｌ）を、微小遠心管中、室温で１５時間、２μｌの組換えＤＰＰ−ＩＶ（０．０５ｍＵ／μｌ）を含む１４６μｌのアッセイバッファ（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４）中でインキュベートした。次に、ペプチドを脱塩し、オートサンプラー（Ｍｉｃｈｒｏｍ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｉｎｃ．）によるＬＴＱ  ＦＴ（商標）質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）への導入の前に、Ｃ１８ペプチドマイクロトラップ（Ｍｉｃｈｒｏｍ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）で濃縮した。ペプチドは、５００ｎｌ／分の流速で、５０分にわたる５〜６０％のアセトニトリル／水の勾配を使用して、Ｃ５パック済７５μｍ溶融シリカピコ―フリットカラム（Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）から溶出させた。最も優位な荷電状態の計算ｍ／ｚ値のために抽出されたイオン質量ウィンドウは、親化合物及び所定のクロマトグラム内の理論的加水分解生成物の両方について調べるために使用した。正確な質量は、ＦＴにより、各荷電状態について確認した。ＤＰＰ−ＩＶによって触媒される加水分解のパーセンテージは、合計（親＋生成物）イオンの面積によって生成物イオンの面積を除することにより推定した。
【０３７４】
図６において示されるように、ＧＬＰ−１（９−３６）を生じるＧＬＰ−１（７−３６）のＤＰＰ−ＩＶによる切断は、高感度でＥＳＩ−ＭＳによりモニターすることができ、母イオン及び生成物イオンの両方の存在が、イオン−抽出プロトコルを使用して定量化することができる。図６ａはアッセイバッファ中の５０ｆｍｏｌのＧＬＰ−１の結果を表し、図６ｂはアッセイバッファ中の０．１ｍＵのＤＰＰ−ＩＶ酵素で１２時間処理した５０ｆｍｏｌのＧＬＰ−１の結果を表す。図６ｃはアッセイバッファ中の０．１ｍＵのＤＰＰ−ＩＶ酵素で１２時間処理した２００ｆｍｏｌのコンジュゲート化合物４８４４の結果を表し、図６ｄはアッセイバッファ中の０．１ｍＵのＤＰＰ−ＩＶ酵素で１２時間処理した２００ｆｍｏｌのコンジュゲート化合物４８４５の結果を表す。Ｎ末端の２残基が切断された生成物は、ＧＬＰ−１においてのみ観察され（図６ｂ）、化合物４８４４、化合物４８４５又はＧＬＰ−１単独（それぞれ、図６ｃ、図６ｄ、図６ａ）では観察されなかった。推定される切断生成物の変換は、全イオン（［母イオン］５＋＋［生成物イオン］５＋）の領域と比較した［生成物イオン］５＋に対するイオン抽出領域（ピーク頂部に示される）の比率に基づく。予想されるイオンを探すために用いられるｍ／ｚ比率は、プロットの右側に示されている。
【０３７５】
ＧＬＰ−１については、ＤＰＰ−ＩＶによって触媒された切断は、１７％の収率でＧＬＰ−１（９−３６）生成物を生じることが判明した。化合物４８４４及び４８４５（ＧＬＰ−１のＣ末端と結合したＤＰＰ−ＩＶ阻害モチーフ）については、予想される生成物イオンは観察されず、このことは、これらの２つの化合物が試験条件下でＤＰＰ−ＩＶ抵抗性であることを示している。したがって、本コンジュゲート化合物は、ペプチダーゼにより媒介される切断に対してペプチド安定性を向上した。
【０３７６】
実施例５：
ＧＬＰ−１−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲートの活性の特性決定
ＧＬＰ−１アナログペプチダーゼ阻害剤コンジュゲートのブドウ糖低下効果は、経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）で測定した。試験化合物は、２時間絶食させたＮＩＨ／Ｓｗｉｓｓマウスのベースライン測定直後（ｔ＝０分）に腹腔に注入した。血液サンプルは、注入してから６０、１２０及び１８０分後に採取した。いくらかのアッセイにおいて、サンプルは、注入してから２４０分後にも採取された。血中ブドウ糖は、Ｏｎｅ−Ｔｏｕｃｈ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（登録商標）ブドウ糖メーター（ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｉｐｉｔａｓ，ＣＡ）を用いて測定した。差異分析（ＡＮＯＶＡ）を実施し、図４及び５に、データは平均±ＳＥＭとして表わされ、ビヒクル対照に対する有意差は＊（ｐ値＜０．０５）により示される。
【０３７７】
コンジュゲート化合物４８４４及び４８４５を用いたブドウ糖低下アッセイからの結果は、図７に示される。コンジュゲート化合物４９８３及び４９８４を用いたブドウ糖低下アッセイからの結果は、図８に示される。これらのデータは、これらのコンジュゲート化合物がＧＬＰ−１のブドウ糖低下活性を保持するだけでなく、ＧＬＰ−１と比較して増大したブドウ糖低下作用を一般的に提供することを、示している。コンジュゲート化合物４９８４は、例えば、投与４時間後に持続的効果を示した。化合物４９８３及び４９８４は、ＧＬＰ−１シクラーゼアッセイ（表１参照）においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性が有意に低かったが、これらのコンジュゲートによる作用の持続的継続がｉｎ  ｖｉｖｏにおけるペプチドの半減期の重要性を裏付けている。
【０３７８】
実施例６：
ＧＩＰ−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲート
ペプチド成分としてのＧＩＰアナログとのペプチド−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲート分子は、本願明細書に記載されているペプチダーゼ阻害剤及びリンカー成分を用いて調製した。いくつかのコンジュゲートにおいては、Ｎ−（置換グリシル）−２−シアノピロリジンがＤＰＰ−ＩＶ阻害剤として用いられた。
【０３７９】
ＧＩＰアナログ−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲートのＧＩＰ受容体結合活性（ＲＢＡ）は、受容体供給源がヒトＧＩＰ受容体（ＨＥＫ−ＧＩＰＲ）を安定発現するＨＥＫ２９３細胞系である結合置換アッセイを用いて評価した。膜画分は、ＨＥＫ−ＧＩＰＲの密集細胞培養物から調製し、瞬間凍結し、使用するまで−８０℃にて保存した。アッセイ時、膜を氷上で解凍し、氷冷結合バッファ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．５％のＢＳＡ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ２、１７０μＭのホスホルアミドン、１．５ｍＭのベスタチン−ＨＣｌ及び７０ｍＭのバシトラシン）中で０．０２ｍｇ／ｍＬまで希釈した。非相同結合アッセイは、膜を、アッセイバッファ中に希釈した３０ｐＭ１２５Ｉ−ＧＩＰ及び１０ｎＭ非標識ＧＩＰ−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲートと結合させることにより開始した。反応は、一定して振盪させながら、室温にて、９０分間、平衡になるまで進行させた。次に、反応混合物を、放射性リガンドの結合画分と非結合画分とを分離する９６ウェルのガラスファイバーフィルタープレートで濾過した。各コンジュゲートの放射性リガンドとの置換を、ヒトＧＩＰによる最大の置換（１００％）及び任意の競合リガンドの非存在下での非特異的結合（０％）と比較して計算した。ＧＩＰ  ＲＢＡの結果（１０ｎＭにおける阻害％）は、表４に示される。
【０３８０】
ＧＩＰアナログ−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲートのブドウ糖低下効果は、経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）で測定した。試験は、実施例５に記載されるようにして実行した。３０ｎＭ／ｋｇでコンジュゲートを使用するブドウ糖低下アッセイ（最大限の減少％）からの結果は、表４に示される。
【０３８１】
表４．
【０３８２】
【表４】
0005412273.tif 000055
【０３８３】
ＧＩＰアナログ−ＤＰＰＩＶ阻害剤コンジュゲート及び対照化合物を用いるＤＰＰ−ＩＶ阻害アッセイは、実施例３に記載されるようにして実施した。ＤＰＰ−ＩＶ阻害アッセイ（ＩＣ５０）からの結果は、表５に示される。表５のＩＣ５０（ｎＭ）値は、少なくとも３つの独立した測定値の平均ＳＥＭとして表される。
【０３８４】
表５．
【０３８５】
【表５】
0005412273.tif 000056
【０３８６】
ペプチド安定性アッセイは、さまざまなペプチダーゼが豊富な調製物であるヒト腎臓膜タンパク質中のＧＩＰアナログ−ＤＰＰＩＶ阻害剤コンジュゲートを用いて実施した。アッセイに用いられる腎臓膜タンパク質（ＫＭＰ）溶液は、ＫＭＰ調製物（５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ中、約７．７ｕｇのタンパク質／μｌ溶液）をリン酸バッファ（ＰＢＳ）中、１：１２５に希釈することにより調製した。希釈されたＫＭＰ溶液（６３０μｌ）は深いウエルプレート中に分注し、コンジュゲート化合物又は対照ペプチド（２００ｕｇ／ｍｌの７０μｌ）はＫＭＰ溶液と混合した。５時間にわたり５００ＰＲＭで混合しながら、深底ウエルプレートを３７℃にてＶｏｒＴｅｍｐ５６（商標）インキュベーター／振盪機（Ｌａｂｎｅｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｂｒｉｄｇｅ，ＮＪ）中でインキュベートした。０、１、２、３、４、４、及び５時間の時点で、２５μｌのアリコートを各ウェルから除去し、４ｕｇ／ｍｌの最終的なコンジュゲート又はペプチド濃度になるように、１００μｌの５％リン酸を混合した。すべてのサンプルは、時間的経過を通じ三連で分析した。プレートはプレートマットで被覆し、ＡＰＩ  ４０００  Ｑ  ＴＲＡＰ又はＡＰＩ  ３０００  ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムのオンライン固相抽出ＬＣ／ＭＳ法により分析した。
【０３８７】
ＬＣ／ＭＳの結果は、選択された化合物イオンが取り込まれ、三組でピーク領域として、６つの時点で示される定量テーブルを作成することにより、ＡＮＡＬＹＳＴ（商標）ソフトウェアを用いて定量した。陽性対照及び陰性対照化合物を分析に含まれ、最終結果は曲線下の面積％として表わされ、１００％の陽性対照に対して正規化される。コンジュゲート化合物のいくつかに対するこのアッセイからの結果は図９に示され、ＫＭＰの時間に対するピーク面積比率に基づき、残存している親ペプチドの割合％としてプロットされる。
【０３８８】
表４に示されるように、ＧＩＰアナログのＮ末端又はＣ末端に対するペプチダーゼ阻害剤モチーフの結合は、コンジュゲートがＧＩＰ受容体と相互作用する能力を保持する。ＧＩＰのＮ末端に結合したペプチダーゼ阻害剤のモチーフを有する表４に示される４つのコンジュゲートのうち３つは、ＧＩＰのＣ末端に結合したペプチダーゼ阻害剤のモチーフを有するコンジュゲートと比較して低いＧＩＰ受容体結合能を示した。ＧＩＰアナログ−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲート化合物は、ブドウ糖低下活性を有する（表４）。ＧＩＰアナログ−ＤＰＰＩＶ阻害剤コンジュゲート化合物は、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤活性を保持した（表５）。図９は、親イオンがインキュベーション工程を通じて追跡され、イオン強度によって定量化される、ＬＣ−ＭＳシステムにより分析される腎臓膜抽出物におけるペプチド安定性の分析を表す。図９に示されるように、ＧＩＰアナログ−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲートは、腎臓膜アッセイにおけるＧＩＰと比較して著しく安定であった。
【０３８９】
実施例７：
カルボキシペプチダーゼ阻害剤活性の特性決定
ＰＹＹ（３−３６）からＰＹＹ（３−３５）を形成するＣ末端チロシルアミドの切断は、ラット、マウス及びヒト血漿において示された。その活性がメタロプロテアーゼ阻害剤ＥＤＴＡ又はホスホルアミドン（１ｍＭの最終濃度の各プロテアーゼ阻害剤）によってではなく４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオライド（ＡＥＢＳＦ）により阻害されることから、この血漿カルボキシペプチダーゼはセリンプロテアーゼであると思われる。カルボキシペプチダーゼ活性アッセイは、その物質のカルボキシペプチダーゼ阻害剤活性を調べるためにさまざまな物質の存在下で行われた。
【０３９０】
カルボキシペプチダーゼ活性アッセイは、０時点から開始して、６０分間１０分毎に１００μＬのサンプルを除去するために、十分量のヒト血清中基質として１０μｇ／ｍｌのアミド化ＰＹＹ（３−３６）を調製することにより行われた。基質ＰＹＹ（３−３６）のヒト血漿への添加後、サンプルを穏やかに混合し、１００μｌの混合物サンプルを、０時点を表すために微小遠心管に移した。残りのサンプルは３７℃でインキュベーター中に置き、６００ＲＰＭ／分、６０分間混合した。１０分間隔で、１００μｌの混合物サンプルを除去し、別々の微小遠心管に移した。０時点及び各１０分間隔での１００μＬのサンプルの移送後、それぞれ回収したサンプルは、混合しながら、１００μｌの冷却０．２％ギ酸：アセトニトリルを緩徐に添加することにより抽出した。アセトニトリル溶液の添加後、サンプルは、１５秒間、高速でボルテックス混合した。抽出された試料は、−２０℃にて少なくとも２０分間保存し、次に、１１，０００ｘ  ｇ、５℃にて１０分間遠心分離した。各サンプルの上清は、新しい微小遠心管に移し、再び遠心分離して、最終的にＬＣ／ＭＳ分析のために移された。ＭＳ分析は、親分子及び対象のペプチド断片で最も強度の高いイオンを検出するＱ１単一イオンモニター方法であった。カルボキシペプチダーゼ活性は、ＰＹＹ（３−３５）の出現により測定した。
【０３９１】
図１０に示すように、ヒト血漿中でＰＹＹ（３−３６）をインキュベーションすることにより、ＰＹＹ（３−３６）の代謝物質であるＰＹＹ（３−３５）の出現に伴って、ＰＹＹ（３−３６）の消失が引き起こされる。
【０３９２】
ＰＹＹ、ＰＹＹ（６Ｎ−メチル−Ｔｙｒ−アミド−ＰＹＹ（３−３６））及びこのペプチドのＮ末端を切り詰めたもののＴｙｒ３６におけるα−アミノ窒素に対してメチル基を加えることにより、一連のペプチドをベースとした阻害剤が作られた。ペプチドをベースとした阻害剤は、カルボキシペプチダーゼ活性のアッセイで阻害剤活性を試験された。３６Ｎ−メチル−Ｔｙｒ−アミド−ＰＹＹ（３−３６）は、ヒト血漿中０．５ｍＭで、ＰＹＹ（３−３６）存在下、ＰＹＹ（３−３５）の生成を〜１００％阻害する阻害活性を示した。例えば、図１１を参照されたい。図１２に示すように、３６Ｎ−メチル−Ｔｙｒ−アミド−ＰＹＹ（２２−３６）（０．５ｍＭ）では、ＰＹＹ（３−３５）の生成を阻害する活性は、測定可能ではあるが、より低かった。このペプチドのより短い断片である、３６Ｎ−メチル−Ｔｙｒ−アミド−ＰＹＹ（３４−３６）及びＮメチル−Ｔｙｒ−ＮＨ２は、０．５ｍＭでＰＹＹ（３−３５）の生成を阻害しなかった（それぞれ図１３及び１４）。
【０３９３】
実施例８：
鬱血性心不全アッセイにおけるペプチド−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲート
エキセンディンのアナログ及びＡＣＥ阻害剤のリシノプリルから成るＰ−ＰＩコンジュゲートを、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイでの鬱血性心不全（ＣＨＦ）において試験した。試験されるコンジュゲートは、表３に示すように、化合物５７１５及び５１３１であった。この分析において、ダール塩感受性（ＤＳＳ）オスラットは２１日齢で離乳させ、２週間の低塩（ＬＳ）食（０．２％のＮａＣｌ）で飼育した。ラットを５週齢でケタミン／キシラジン（５０ｍｇ／ｋｇ／１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）で麻酔し、遠隔測定法送信機（ＤａｔａＳｃｉｅｎｃｅｓ社）を大動脈動脈に挿入した。手術後、ＢＰ（収縮期及び拡張期の圧力）を記録する前に、ラットを回復のため１０日間休ませた。
【０３９４】
５週齢から、ＤＳＳラットは高塩（ＨＳ）食（８％のＮａＣｌ）を与えられ、５週間の間、浸透圧ａｌｚｅｔポンプ（Ｄｕｒｅｃｔ社、クパチーノ、ＣＡ）を介して、皮下に、コンジュゲート化合物５７１５（１０μｇ／ｋｇ／ｄａｙ）（ｎ＝３ラット）、又はコンジュゲート化合物５１３１（１０μｇ／ｋｇ／ｄａｙ）（ｎ＝７ラット）を注入された。ＨＳ対照動物（ｎ＝１０ラット）はビヒクル（５０％のＤＭＳＯ）のみを投与され、同様にＨＳを与えられた。ＬＳ対照動物（ｎ＝５ラット）は、ＬＳ食で飼育された。
【０３９５】
図１５は、第５週目に測定された平均拡張期（図１５ａ）及び収縮期の（図１５ｂ）血圧を表す（各グループの全ての動物の平均）。第５週目に測定された時、ＨＳ食の動物に対するＰ−ＰＩコンジュゲートの投与は、ＨＳ対照（拡張期１６７ｍｍＨｇ及び収縮期２１３ｍｍＨｇ）の動物の測定値と比較してより低い平均拡張期血圧（化合物５１３１に関し、１３４ｍｍＨｇ、化合物５７１５に関し１１２ｍｍＨｇ）及び平均収縮期血圧（化合物５１３１に関し１７５ｍｍＨｇ、規化合物５７１５に関し１６１ｍｍＨｇ）をもたらした。同様に第５週目で、動物の平均心拍数は、化合物５１３１を投与されたもので３６３、化合物５７１５を投与されたもので３８１、ＨＳ対照動物では４０１、ＬＳ対照動物では３８６であった。
【０３９６】
上記の説明により本発明を例示したが、それらは説明のみを目的とするものであり、本発明の実施には、特許請求範囲に記載された発明の範囲内としての、通常行われうるバリエーション、改変又は変更態様の全てが包含されることが理解されよう。従って、以上の記載及び実施例は、添付の特許請求の範囲によって記載される本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０３９７】
【図１】ペプチド−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲート化合物の典型的なデザインを表す（ペプチドＸ（長方形）：ペプチド、ＰＩ（三角形）：ペプチダーゼ阻害剤、ＰＸ−１及びＰＸ−２（長方形）：単一のペプチドの２つの部分、暗い卵形：リンカー）。
【図２】本発明に記載の様々なリンカーを介してペプチドのＣ末端でコンジュゲートするＡＣＥ阻害剤リシノプリルを有する、ペプチド−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲート化合物の典型的なデザインを表す。
【図３】ＧＩＰアナログを有する、典型的なペプチド−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲート化合物を表す。
【図４】ＧＩＰ−エキセンディン複合型ペプチドを有する、典型的なペプチド−ペプチダーゼ阻害剤コンジュゲート化合物を表す。
【図５】（ａ−ｂ）は、バリンピロリジドの非存在（５ａ）及び存在（５ｂ）下での、ｈＫＢＢＭアッセイにおける、ペプチド安定性を表すグラフである。
【図６】ＧＬＰ−１（３ａ）、ＧＬＰ−１＋ＤＰＰ−ＩＶ（３ｂ）、ＧＬＰ−１接合した合成４８４４＋ＤＰＰ−ＩＶ（３ｃ）、及びＧＬＰ−１接合した合成４８４５＋ＤＰＰ−ＩＶ（３ｄ）のＤＰＰ−ＩＶ耐性アッセイの質量分析計結果を表すグラフである。
【図７】コントロール化合物及びコンジュゲート化合物４８４４及び４８４５の投与の後、血糖値の変化を表すグラフである。
【図８】コントロール化合物及びコンジュゲート化合物４９８３及び４９８４の投与の後、血糖値の変化を表すグラフである。
【図９】ＫＭＰアッセイのコンジュゲート化合物のペプチド安定性を表すグラフである。
【図１０】ＰＹＹ（３−３６）をヒト血漿中でインキュベートしたとき、時間経過に伴うＰＹＹ（３−３６）及びその代謝物質ＰＹＹ（３−３５）の量の変化を表すグラフである。
【図１１】３６Ｎ−メチル−Ｔｙｒ−アミド−ＰＹＹ（３−３６）の非存在下又は存在下での、血漿中におけるＰＹＹ（３−３６）のインキュベートによるＰＹＹ（３−３５）の形成を表すグラフである。
【図１２】３６Ｎ−メチル−Ｔｙｒ−アミド−ＰＹＹ（２２−３６）の非存在下又は存在下での、血漿中におけるＰＹＹ（３−３６）のインキュベートによるＰＹＹ（３−３５）の形成を表すグラフである。
【図１３】３６Ｎ−メチル−Ｔｙｒ−アミド−ＰＹＹ（３４−３６）の非存在下又は存在下での、血漿中におけるＰＹＹ（３−３６）のインキュベートによるＰＹＹ（３−３５）の形成を表すグラフである。
【図１４】Ｎメチル−Ｔｙｒ−ＮＨ２の非存在下又は存在下での、血漿中におけるＰＹＹ（３−３６）のインキュベートによるＰＹＹ（３−３５）の形成を表すグラフである。
【図１５】（ａ−ｂ）は、ｉｎ  ｖｉｖｏＣＨＦアッセイにおいて、５週目に測定した拡張時（ａ）、及び収縮時（ｂ）の血圧（平均）を表すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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