(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
転移性腫瘍抗原（ＭＴＡ１）タンパク質と候補薬物とを接触させる段階（第１段階）と、
前記候補薬物と接触されたＭＴＡ１タンパク質の発現レベルを測定する段階（第２段階）と、
候補薬物のない条件で測定されたＭＴＡ１タンパク質の発現レベルを測定する段階（第３段階）と、
前記第２段階及び第３段階のＭＴＡ１タンパク質の発現レベルを比較して、ＭＴＡ１タンパク質の発現レベルを減少させる候補薬物を選別する段階（第４段階）と、
を含んでなることを特徴とする肝細胞癌腫の手術後の再発予防及び治療用薬物のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞癌腫の手術後の再発または再発の危険性の診断方法及び肝細胞癌腫の手術後の再発予防及び治療用薬物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞癌腫（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ；ＨＣＣ）は、世界で５番目に平凡な癌である。肝細胞癌腫に関する最も望ましい治療法は、手術であるが、腫瘍の切開できないサイズ及び数、悪い肝機能、多様な肝内または遠隔転移などによって、肝細胞癌腫の患者のうち、１０ないし２０％以下の患者のみ手術が可能である。
【０００３】
さらには、手術可能な肝細胞癌腫の患者でも、手術後の頻繁な再発が長期間の生存に主な制限要素として作用している。
【０００４】
癌の多様な転移関連のタンパク質が研究されて分離されている。そのうち、最近同定された転移性腫瘍抗原（Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｔｕｍｏｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ１またはｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ１；ＭＴＡ１）は、体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で多様な腫瘍細胞の移住及び浸潤を増加させるものと知られている。
【０００５】
ＭＴＡ１は、また酸素欠乏−誘導性因子１α（Ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒ  １α；ＨＩＦ１α）の安定化剤として血管新生の過程で役割を行うものと提案された。
【０００６】
しかし、ＭＴＡ１が、肝細胞癌腫の患者で浸潤、再発及び生存に如何なる役割を行うかについての報告は、全くない実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前記従来技術の問題点を解決するために、本発明者は、腫瘍内の血管新生を促進し、腫瘍の成長と転移過程とに関与するものと知られた転移性腫瘍抗原（ＭＴＡ１）の発現が増加するほど肝細胞癌腫の手術後の再発が珍しくなく、患者の生存期間が短いということを明らかにすることによって、本発明を完成した。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、肝細胞癌腫の手術後の再発及び不良な生存を予測することができる有用な予後因子であるＭＴＡ１の発現レベルを利用した肝細胞癌腫の手術後の再発または再発の危険性の診断方法を提供することである。
【０００９】
また、本発明の他の目的は、肝細胞癌腫の手術後の再発予防及び治療用薬物のスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を果たすために、本発明は、肝細胞癌腫の手術後に再発するか、再発の危険がある患者から由来した生物学的試料から転移性腫瘍抗原（ＭＴＡ１）タンパク質の発現レベルを測定する段階と、前記測定されたＭＴＡ１タンパク質の発現レベルを正常対照群の発現レベルと比較する段階と、を含んでなることを特徴とする肝細胞癌腫の手術後の再発または再発の危険性の診断方法を提供する。
【００１１】
この際、ＭＴＡ１タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２に記載されており、ＧｅｎＢａｎｋ（登録番号ＮＭ＿００４６８９．３、ＧＩ：１１５５２７０７９）から利用可能である。
【００１２】
本発明によるＭＴＡ１タンパク質発現と関連して、肝細胞癌腫の手術後に再発するか、再発の危険がある患者から由来した生物学的試料の発現レベルは、正常対照群と比較して、その発現の有無によって陽性または陰性と判断し、これは、医師が診断名が分からない状態で正常対照群と比較して、相対的に判断するものである。染色時の背景誤差を除去するために、２５％未満であれば陰性、２５％以上であれば陽性と判断することが望ましい。
【００１３】
また、本発明は、転移性腫瘍抗原（ＭＴＡ１）タンパク質と候補薬物とを接触させる段階（第１段階）と、前記候補薬物と接触されたＭＴＡ１タンパク質の発現レベルを測定する段階（第２段階）と、候補薬物のない条件で測定されたＭＴＡ１タンパク質の発現レベルを測定する段階（第３段階）と、前記第２段階及び第３段階のＭＴＡ１タンパク質の発現レベルを比較して、ＭＴＡ１タンパク質の発現レベルを減少させる候補薬物を選別する段階（第４段階）と、を含んでなることを特徴とする肝細胞癌腫の手術後の再発予防及び治療用薬物のスクリーニング方法を提供する。
【００１４】
前記のように、薬の開発のための候補薬物をスクリーニングすることによって、選別された候補薬物を含有する組成物はＭＴＡ１発現を抑制して、肝細胞癌腫の手術後の再発の予防及び治療に適用可能である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、腫瘍内の血管新生を促進し、腫瘍の成長と転移過程とに関与するものと知られた転移性腫瘍抗原（ＭＴＡ１）の高発現が、肝細胞癌腫の手術後の再発及び生存と密接な相関関係を有することを発見することによって、ＭＴＡ１発現レベルを分析して肝細胞癌腫の手術後の再発または再発の危険性を診断し、このような再発を予防／治療することができる薬物をスクリーニングすることによって、肝細胞癌腫の手術後の再発の予防及び治療に有用に利用される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】肝細胞癌腫の患者試料でＭＴＡ１発現を免疫組織化学的染色で示す図である。
【図２】腫瘍サイズによるＭＴＡ１発現レベルを示す図である。
【図３】腫瘍の類型によるＭＴＡ１発現レベルを示す図である。
【図４】組職学的分化とＭＴＡ１発現レベルとの相関関係を示す図である。
【図５】微細血管の塞栓とＭＴＡ１発現レベルとの相関関係を示す図である。
【図６】肝細胞癌腫の原因とＭＴＡ１発現レベルとの相関関係を示す図である。
【図７】ＭＴＡ１発現レベルによる肝細胞癌腫の累積再発率を示す図である。
【図８】ＭＴＡ１発現レベルによる肝細胞癌腫の生存率を示す図である。
【図９】ＨＢＶ患者で、ＭＴＡ１発現レベルと累積再発率との相関関係を示す図である。
【図１０】ＨＢＶ患者で、ＭＴＡ１発現レベルと累積生存率との相関関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、下記実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。但し、このような実施例によって、本発明が限定されるものではない。
【００１８】
＜実施例１＞患者の特徴
１９９８年から２００３年まで牙山病院で肝細胞癌腫の再発で苦しんでいる患者５０６人を対象に実験した。患者５０６人の臨床的特徴は、下記表１の通りである。患者は、肝切除術後、平均周期４３ヶ月（１〜９６ヶ月）間に追跡調査された。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
肝癌の再発及び生存は、追跡調査の最後の日に医学記録を用いて決定した。３ヶ月以上の間に追跡調査ができない患者の場合には、患者の居住地付近まで訪問して評価した。
【００２１】
＜実施例２＞ＭＴＡ１の免疫組織化学的染色の評価
１．組職マイクロアレイの構成
組職マイクロアレイの構成は、以前に知られた方法によって行われた（Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ．１６：９２９−９３５，２００６）。組職アレイ器具（Ｂｅｅｃｈｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ、ＭＤ）を用いてホルマリン固定されたパラフィン包埋組職試料を整列した。
【００２２】
すなわち、各腫瘍の代表的領域を選択し、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色されたスライド上に表示し、このような関連組職ブロックをサンプリングした。各供給者ブロックの目的領域を１ｍｍ直径の組職シリンダーでパンチし、試料を収容者ブロックに移した。組職損失を最小化するために、各試料を二重に整列した。
【００２３】
２．人間の肝細胞癌腫組職マイクロアレイでＭＴＡ１の免疫組織化学的染色
ＬＳＡＢキット（ＤＡＫＯ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）と３，３´−ジアミノベンジジンを色素原として利用したアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合法でＭＴＡ１に関する免疫組織化学的染色を行った。肝細胞癌腫を含み、非腫瘍の肝組織を取り囲んだパラフィン包埋組職マイクロアレイブロックを５μｍ間隔で切開した。
【００２４】
キシレンでスライドからパラフィンを除去し、一連のアルコールで再脱水した。次いで、スライドを３％過酸化水素で１０分間培養して内因性ペルオキシダーゼ活性を遮断した。免疫反応性を増加させるために、スチームオーブンでクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で１０分間抗原性回復を行った。ＭＴＡ１に対する１次抗体を１：２００の希釈比率に希釈して使った。２次ビオチン化された抗体とアビジン−ビオチン複合体試薬とを適用し、領域をハリスヘマトキシリンでカウント染色した。
【００２５】
陰性対照群のために、領域を１次抗体の代わりに、２％ヤギ血清及び１％牛血清アルブミンを含有したトリスバッファ生理食塩水で培養した。
【００２６】
３．免疫染色の評価
腫瘍細胞核でＭＴＡ１に関して陽性である腫瘍細胞の特性を調査した。各スパットで、最も強いか、圧倒的な染色パターンの領域を記録した。このような染色強度は、一般的に陽性腫瘍細胞と正の比例関係を表わし、両極に分布する傾向を有する。
【００２７】
すなわち、染色値は、弱い陽性の染色所見を示す腫瘍細胞が全体腫瘍細胞の半分以下である場合の群、または強い陽性の染色所見を示す腫瘍細胞が全体腫瘍細胞の９０％以上である場合の群に密集された。
【００２８】
これに基づいて、本発明者は、分類を単純化し、効果的な臨床データを分析するための標準を次のように利用した。（１）０％（なし、−）、（２）ＭＴＡ１低発現群（５０％以下、＋）、（３）ＭＴＡ１高発現群（５０％以上、＋＋）。
【００２９】
核染色は、拡散され、他の核タンパク質で観察される膜、核小体または斑点パターンのような他の染色パターンはなかった。２人の他の観察者がアレイを用いてＭＴＡ１発現程度を決定し、２人の観察者が互いにずれる評価をする場合には、再検査して一致された点数を定めた。
【００３０】
４．統計的分析
ＭＴＡ１の肝細胞癌腫の再発及び全体生存率に関する予後要因としての役割に関する分析及び焦点の混乱を避けるために、本発明者は、次のような基準に実験を行った。
【００３１】
第一に、累積再発率に関する肝細胞癌腫の再発として映像医学所見など客観的な証拠のみを考慮し、潜行性の再発可能性は考慮しなかった。
【００３２】
第二に、進行性の肝不全と関連するか、関連していない肝細胞癌腫の患者のあらゆる死は、累積生存率（全体生存）に考慮された。本発明者は、累積生存率の決定に肝疾患と関連のない死亡は含まなかった。同じ基準にＣｏｘ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｈａｚａｒｄモデルを用いて再発及び生存に関する多変数分析を行った。
【００３３】
生存率分析は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法を使い、単変量分析はｌｏｇ  ｒａｎｋｔｅｓｔを、多変量分析はＣｏｘ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｈａｚａｒｄ  ｍｏｄｅｌを使った。
【００３４】
５．結果
１）肝細胞癌腫及び周辺肝組織でのＭＴＡ１発現頻度
図１に示されたように、５０６人の肝細胞癌腫の患者試料のうち、８８人の試料でＭＴＡ１が染色されたが（１７％）、周辺の非腫瘍の肝組織では、全然染色されなかった。陽性である８８個の試料のうち、６２の試料は＋、２６個の試料は＋＋であった（ｐ＜０．００１）。
【００３５】
２）腫瘍サイズ及びＭＴＡ１発現レベル
ＭＴＡ１発現レベルは、腫瘍の直径が大きい肝細胞癌腫の患者でより高かった。すなわち、図２に示されたように、１５０人の患者は、３ｃｍ直径より小さな肝細胞癌腫を有し、３３３人の患者は、３ｃｍ直径より大きい肝細胞癌腫を有した。３ｃｍより小さな直径の肝細胞癌腫を有した患者のうち、ＭＴＡ１発現は８７％で陰性であり、１１％で＋、２％で＋＋であった。３ｃｍより大きい直径の肝細胞癌腫を有した患者のうち、ＭＴＡ１発現は７９％で陰性であり、１４％で＋、７％で＋＋であった（ｐ＝０．０４）。
【００３６】
３）腫瘍の類型及びＭＴＡ１発現レベル
腫瘍の類型を４３４人の患者で分析した。２６３人の患者で結節性の類型、７４人の患者で結節周囲波及型、７０人の患者で多結節融合型、６人の患者で有茎性結節、２１人の患者で拡散浸湿型を表わした。
【００３７】
図３に示されたように、ＭＴＡ１発現レベルは、他の類型の肝細胞癌腫でより結節性の肝細胞癌腫でさらに低かった。
【００３８】
４）組職学的分化及びＭＴＡ１発現レベル
４６９人の患者全体の試料に対する組職学的分化を分析した。図４に示されたように、３８人の患者、１５４人の患者、２１３人の患者及び６４人の患者でそれぞれＥｄｍｏｎｓｏｎ−Ｓｔｅｉｎｅｒ（Ｅ−Ｓ）等級１、２、３及び４で表われた。Ｅ−Ｓ等級１でのＭＴＡ１発現レベルは、９２％で陰性、８％で＋、０％で＋＋を表わした。Ｅ−Ｓ等級２でのＭＴＡ１発現レベルは、８５％で陰性、１１％で＋、４％で＋＋を表わした。Ｅ−Ｓ等級３でのＭＴＡ１発現レベルは、８０％で陰性、１３％で＋、７％で＋＋を表わした。Ｅ−Ｓ等級４でのＭＴＡ１発現レベルは、７２％で陰性、２０％で＋、７％で＋＋を表わした。
【００３９】
増加したＭＴＡ１発現レベルは、肝細胞癌腫のさらに悪い組職学的分化と関連すると判断された。
【００４０】
５）微細血管の侵犯（塞栓）及びＭＴＡ１発現レベル
４５２人の肝細胞癌腫の患者の凍結組織を用いて微細血管の侵犯（塞栓）を検討した。その結果、図５に示されたように、１０２人の試料で微細血管の塞栓が発見された（２２．６％）。凍結組織で微細血管の塞栓を有した患者のＭＴＡ１発現レベルは、微細血管の塞栓のない患者よりはるかに高く発現された。
【００４１】
６）肝細胞癌腫の原因及びＭＴＡ１発現レベル
肝疾患の多様な原因が、ＭＴＡ１発現レベルの変化に関与する。４８４人の患者のうち、３８０人の患者は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を有し、２７人の患者は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を有し、８人の患者は、ＨＢＶ及びＨＣＶ同時感染者であった。６９人の患者は、非ウイルス性肝疾患の状態であった。
【００４２】
面白くも、ＭＴＡ１は、ＨＢＶ関連肝細胞癌腫を有した３８０人の患者のうち８０人で発現されたが（２１．１％）、ＨＣＶ関連肝細胞癌腫を有した患者では、単に１人の患者でのみ発現された。すなわち、図６に示されたように、ＨＢＶ−関連肝細胞癌腫でのＭＴＡ１発現レベルは、７９％で陰性、１５％で＋、６％で＋＋であり、ＨＣＶ−関連肝細胞癌腫でのＭＴＡ１発現レベルは、９６％で陰性、０％で＋、４％で＋＋であった。
【００４３】
ＨＢＶ及びＨＣＶいずれも感染された肝細胞癌腫の患者では、ＭＴＡ１発現が起きなかった（０％、０／８）。非ウイルス性の原因を有した７２人の肝細胞癌腫の患者のうち、６９人の患者は、ＭＴＡ１染色評価に有用に利用され、そのうち、７％（５／６９）がＭＴＡ１のレベル１（＋）発現、３％（２／６９）がＭＴＡ１のレベル２（＋＋）発現を表わした。
【００４４】
７）他の臨床病理的な因子とＭＴＡ１発現レベルとの相関関係
表２に表われたように、ＭＴＡ１発現レベルと年齢、性別、肝疾患のＣｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈ等級、肝機能の代償不全（ｄｅｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）または肝細胞癌腫の被膜侵入間には、何ら相互関連性もなかった。この際、ＰＶＴは、門脈血栓症の略語である。
【００４５】
【表２】
0005421993.tif 000003
【００４６】
８）ＭＴＡ１発現レベルによる再発及び生存率
図７に示されたように、ＭＴＡ１陽性肝細胞癌腫の１年、３年及び５年累積再発率は、ＭＴＡ１陰性肝細胞癌腫のそれよりはるかに高かった。１年、３年及び５年で高いＭＴＡ１発現レベル（＋＋）を有した患者の累積再発率は、それぞれ４１％、７２％及び９３％であり、ＭＴＡ１発現レベルが、＋である患者（３９％、５４％、６５％）と陰性ＭＴＡ１発現患者（２５％、３９％、５１％）よりもはるかに高いレベルであった。
【００４７】
図８に示されたように、ＭＴＡ１陽性肝細胞癌腫を有した患者の１年、３年及び５年累積生存率（７１％、５４％、４４％）は、ＭＴＡ１陰性肝細胞癌腫を有した患者のそれ（８９％、７２％、６１％）より有意性のあるように短かった。
【００４８】
また、図９及び図１０に示されたように、ＨＢＶ感染を有した患者で、ＭＴＡ１発現レベルが、累積再発率及び累積生存率と有意性のある相関関係を有するものと確認された。
【００４９】
ＭＴＡ１、腫瘍サイズ（＞３．０ｃｍ）、組職学的分布（Ｅ−Ｓ  ＩＩＩ／ＩＶ）、非結節性腫瘍の類型、被膜浸潤、門脈血栓症及び微細血管の侵入が再発及び生存の多様な分析のために利用された。
【００５０】
表３に表われたように、陽性ＭＴＡ１染色（特に、＋＋）、大きい腫瘍サイズ（直径が＞３ｃｍ）、門脈血栓症及び微細血管の侵入が、それぞれ独立した手術後の再発及び生存に関する予後因子であった。
【００５１】
【表３】
0005421993.tif 000004
【００５２】
９）ＭＴＡ１発現レベルによる肝外転移
最後の検査で肝細胞癌腫に関する評価を受けた患者の総４４６人のうち、４８％（２１３／４４６）は再発がなかった。単一及び多数の肝内転移が２１％（９５／４４６）及び１７％（７７／４４６）でそれぞれ表われた。肝外転移は、１４％（６１／４４６）で発見された。
【００５３】
面白くも、各群で陽性ＭＴＡ１染色（＋または＋＋）の頻度は、それぞれ１２％（２６／２１３）、１９％（１８／９５）、２３％（１８／７７）及び３１％（１９／６１）であった。肝外転移は、陰性対照群でよりＭＴＡ１陽性群（＋または＋＋）でさらに平凡に発生した。
【００５４】
配列番号１は、ＭＴＡ１遺伝子の塩基配列に関するものであり、
配列番号２は、ＭＴＡ１タンパク質のアミノ酸配列に関するものである。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明は、肝細胞癌腫の手術後の再発または再発の危険性の診断方法関連の分野に適用可能である。
【図１】
0005421993.tif 000005
【図２】
0005421993.tif 000006
【図３】
0005421993.tif 000007
【図４】
0005421993.tif 000008
【図５】
0005421993.tif 000009
【図６】
0005421993.tif 000010
【図７】
0005421993.tif 000011
【図８】
0005421993.tif 000012
【図９】
0005421993.tif 000013
【図１０】
0005421993.tif 000014
【配列表】
0005421993000001.app