(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
後期糖化反応生成物レセプター（ＲＡＧＥ）様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体を含む、後期糖化反応生成物（ＡＧＥ）検出剤であって、該ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、
（Ｐ１）配列番号１２に示されるアミノ酸配列；
（Ｐ２）配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｐ３）配列番号１１に示される核酸配列と少なくとも９０％以上の核酸配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸は、配列番号１２における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｑ１）配列番号１４に示されるアミノ酸配列；
（Ｑ２）配列番号１４に示されるアミノ酸配列において、９２位、９５位、２０６位および２５０位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｑ３）配列番号１３に示される核酸配列と少なくとも９０％以上の核酸配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位、９５位、２０６位および２５０位のアミノ酸は、配列番号１４における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｒ１）配列番号３７に示されるアミノ酸配列；
（Ｒ２）配列番号３７に示されるアミノ酸配列において、９２位、９５位および２０６位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｒ３）配列番号３６に示される核酸配列と少なくとも９０％以上の核酸配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位、９５位および２０６位のアミノ酸は、配列番号３７における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｓ１）配列番号３９に示されるアミノ酸配列；
（Ｓ２）配列番号３９に示されるアミノ酸配列において、９２位、９５位および２０６位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｓ３）配列番号３８に示される核酸配列と少なくとも９０％以上の核酸配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位、９５位および２０６位のアミノ酸は、配列番号３９における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｕ１）配列番号４３に示されるアミノ酸配列；
（Ｕ２）配列番号４３に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｕ３）配列番号４２に示される核酸配列と少なくとも９０％以上の核酸配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸は、配列番号４３における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｖ１）配列番号４５に示されるアミノ酸配列；
（Ｖ２）配列番号４５に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｖ３）配列番号４４に示される核酸配列と少なくとも９０％以上の核酸配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸は、配列番号４５における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｗ１）配列番号４７に示されるアミノ酸配列；
（Ｗ２）配列番号４７に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｗ３）配列番号４６に示される核酸配列と少なくとも９０％以上の核酸配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸は、配列番号４７における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｘ１）配列番号４９に示されるアミノ酸配列；
（Ｘ２）配列番号４９に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｘ３）配列番号４８に示される核酸配列と少なくとも９０％以上の核酸配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸は、配列番号４９における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
からなる群より選択される配列を含むポリペプチドを含む、検出剤。
【請求項２】
前記置換は、保存的置換である、請求項１に記載の検出剤。
【請求項３】
前記（Ｐ１）〜（Ｘ３）に示されるアミノ酸配列において、配列番号１０のアミノ酸配列における３８位、９９位、１４４位、２０８位、２５９位および３０１位に対応するシステイン残基が保持されている、請求項１に記載の検出剤。
【請求項４】
前記欠失は、配列番号１２、１４、３７、３９、４１、４３、４５、４７および４９において、配列番号１０の１位〜３７位に対応するアミノ酸配列におけるいずれかのアミノ酸の欠失である、請求項１に記載の検出剤。
【請求項５】
前記付加は、配列番号１０の１位〜２２位から選択される任意の連続する１または数個のアミノ酸配列のＮ末端側への付加、配列番号１０の１２１位〜４０４位から選択される任意の連続する１または数個のアミノ酸の付加、あるいはフレキシブルなリンカー配列もしくはその反復配列、またはＬＤＬ受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）のＥＧＦ反復配列（上皮増殖因子受容体様システインリッチドメイン）を含む配列の付加である、請求項１に記載の検出剤。
【請求項６】
前記リンカー配列は、Gly-Gly-Ser、配列番号１５または配列番号１６に示されるアミノ
酸配列である、請求項５に記載の検出剤。
【請求項７】
前記天然型ＲＡＧＥの活性は、ＡＧＥの認識能である、請求項１に記載の検出剤。
【請求項８】
タグ配列をさらに有する、請求項１に記載の検出剤。
【請求項９】
前記タグ配列は、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９である、請求項８に記載の検出剤。
【請求項１０】
前記ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体は乾燥形態のものである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の検出剤。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の検出剤および基材を含む、ＡＧＥ検出用デバイス。
【請求項１２】
前記ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体は乾燥形態のものである、請求項１１に記載の検出用デバイス。
【請求項１３】
前記基材は、ビーズ、金粒子、プレート、試験管、チップ、磁性粒子、膜、繊維、スライドガラス、金属薄膜、フィルター、チューブ、ボールまたはダイアモンド様炭素被膜ステンレスを含む、請求項１１に記載の検出用デバイス。
【請求項１４】
前記ビーズは、ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂、天然樹脂、プラスチック、ゼラチン、シリカゲル、金属、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、アガロース、ポリアミノ酸、セルロース、ハイドロキシアパタイト、ポリエチレン、ポリスルフォン、ポリプロピレン、セルロースアセテート、ポリメチルメタクリレート、セルロースジアセテートまたはメチレンビニルアルコールから作製されるビーズを含む、請求項１３に記載の検出用デバイス。
【請求項１５】
ＡＧＥを検出する方法であって、該方法は、
（Ａ）被験体から単離されたサンプルを提供する工程；
（Ｂ）該サンプルと、以下：
（１）請求項１〜１０のいずれか１項に記載の検出剤；または
（２）請求項１１に記載のデバイス、
のうちのいずれかとを接触させて、該ポリペプチドと該ＡＧＥとの複合体を形成させる工程；および
（Ｃ）該複合体を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項１６】
（Ｂ’）抗体と接触させて、３成分複合体を形成する工程をさらに包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体は、抗ＨｂＡ１ｃ抗体、抗ＡＧＥ抗体および抗カルボキシメチルリジン抗体からなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記サンプルは、タンパク質を含む体液である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記タンパク質を含む体液は、血液、血清、血漿、髄液、漿膜腔液、関節液、肺胞洗浄液、涙液または尿を含む体液である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＡＧＥは糖化タンパク質である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記複合体を検出する工程は、光学的に検出する工程、物理的に検出する工程または化学的に検出する工程を包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の検出剤を含む、ＡＧＥ検出用キット。
【請求項２３】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の検出剤と該検出剤とＡＧＥとの複合体を検出するための検出手段とを備える、ＡＧＥ検出システム。
【請求項２４】
前記検出手段は、光学的検出手段、物理的検出手段または化学的検出手段を包含する、請求項２３に記載のシステム。
【請求項２５】
前記光学的検出手段は、分光光度計、ＦＡＣＳ、比色計、蛍光光度計、化学発光検出器、電気化学発光検出器、イメージアナライザー、または顕微鏡を包含する、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２６】
前記物理的検出手段は、電気検出、表面プラズモン共鳴、水晶発振マイクロバランス、または熱測定を包含する、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２７】
前記化学的検出手段は、質量分析、または高速液体クロマトグラフィーを包含する、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２８】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の検出剤を含む、糖尿病性血管障害診断剤。    
【請求項２９】
ＡＧＥにより引き起こされる疾患の診断を支援する方法であって、該方法は、
（Ａ）糖尿病性血管障害に罹患していると疑われる被験体から単離されたサンプルを提供する工程；
（Ｂ）糖尿病性血管障害に罹患していないコントロール被験体から単離されたサンプルを提供する工程；
（Ｃ）該サンプルと、以下：
（１）請求項１〜１０のいずれか１項に記載の検出剤；
（２）請求項１１に記載のデバイス；または
（３）請求項２８に記載の糖尿病性血管障害診断剤、
のうちのいずれかとを接触させて、該ＲＡＧＥ様ポリペプチドと該ＡＧＥとの複合体を形成させる工程；および
（Ｄ）該複合体を検出する工程、
（Ｅ）該被験体から単離されたサンプル中の複合体の量と、該コントロール被験体から単離されたサンプル中の複合体の量とを比較して、該被験体中のＡＧＥの該コントロール被験体に対する相対値を算出する工程、
を包含する、方法。
【請求項３０】
（Ｃ’）抗体と接触させて、３成分複合体を形成する工程をさらに包含する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗体は、抗ＨｂＡ１ｃ抗体、抗ＡＧＥ抗体および抗カルボキシメチルリジン抗体からなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＡＧＥにより引き起こされる疾患は、糖尿病、糖尿病性血管障害、細小血管症、および大血管障害からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記細小血管症は、腎症、網膜症、または神経症を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記大血管障害は、虚血性心疾患、脳血管疾患、または閉塞性動脈硬化症を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の検出剤の、ＡＧＥにより引き起こされる疾患の診断剤の製造のための使用。
【請求項３６】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の検出剤を製造する方法であって、
Ａ）前記ポリペプチドを細菌宿主細胞で封入体として生産する工程；および
Ｂ）該封入体を界面活性剤とサイクロアミロースでリフォールディングして、ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体を得る工程、
を包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＬＯＸ−１変異体−界面活性剤複合体およびＲＡＧＥ変異体−界面活性剤複合体、ならびにこれらを用いて生活習慣病危険因子などを検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
レクチン様酸化低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体１（Ｌｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ＬＤＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：本明細書中以降、ＬＯＸ−１ともいう）は、アテローム発生の原因となる酸化ＬＤＬ（本明細書中以降、ＯｘＬＤＬともいう）のような変性ＬＤＬに対する特有のスカベンジャー受容体であり、１９９７年に、培養ウシ大動脈内皮細胞において初めて同定された。ＬＯＸ−１は、他のスカベンジャー受容体と機能的には類似しているにもかかわらず、構造的には異なる独特の構造を有している。
【０００３】
ウシＬＯＸ−１（ｂＬＯＸ−１）は、Ｃ型レクチンファミリーに属する２７３アミノ酸残基からなる分子量約５０ｋＤａの糖タンパク質であり、Ｎ末端が細胞質内にあり、Ｃ末端が細胞外に出ている細胞膜１回貫通型のＩＩ型膜タンパク質である。ヒトＬＯＸ−１（ｈＬＯＸ−１）はまた、Ｃ型レクチンファミリーに属する２７３アミノ酸残基からなる約３０ｋＤａ（１３９位および１８３位の糖鎖付加により、分子量約４０ｋＤａ）のＩＩ型膜タンパク質である。この受容体は、構造的には、以下の４つのドメイン：Ｎ末端側の細胞質ドメイン、疎水性膜貫通ドメイン、ネックドメイン、およびＣ型レクチン様ドメイン（本明細書中以降、ＣＴＬＤという）からなる。このＣＴＬＤは、種間で、特に、６個のシステイン残基の位置で高度に保存されており、ＬＯＸ−１のリガンドを認識するための機能的ドメインである。このＣＴＬＤ中の６個のシステイン残基は、ｈＬＯＸ−１の分子内ジスルフィド結合に関与している。この保存されたＣＴＬＤに加えて、ｈＬＯＸ−１および他の既知の種におけるネックドメインは、高い配列同一性を有している。また、Ｘｉｅら（非特許文献１：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ３２：６８−７４（２００３））によれば、ＣＴＬＤが変性ＬＤＬを結合するのに十分な最小ドメインであり、たとえＣＴＬＤがグリコシル化されていなくても、変性ＬＤＬを認識および結合できることが明らかにされた。
【０００４】
これまでの研究により、ＬＯＸ−１は、血管内皮細胞のみならず、マクロファージおよび活性化血管平滑筋細胞において発現されており、構造的に関連性のない種々の高分子（変性ＬＤＬ、細菌、老化赤血球、アポトーシスを受けた細胞、および血小板があげられる）を認識し、生体防御機構や炎症性機転などの種々の生命現象において重要な役割を果たしていること、そしてその発現は種々の条件下で、高脂血症、糖尿病、高血糖、高血圧症、高血圧性腎硬化症、動脈硬化、虚血再灌流傷害、血管バルーン傷害後のような病態；ならびに酸化ＬＤＬ、アンジオテンシンＩＩ、エンドセリン、ＴＮＦ−α、後期糖化反応生成物（ＡＧＥ）、ＴＧＦ−β、８−イソ−プロスタグランジンＦ２α、ズリ応力のような刺激によって、調節されていることが分かっている（非特許文献２：Ｆｏｌｉａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｊｐｎ．  １２７，１０３−１０７（２００６））。
【０００５】
変性ＬＤＬ測定に関しては、疾病の早期診断、機能性食品の予防効果評価、生活改善や投薬による治療効果の評価など様々な分野での活用が期待されている。これまで、ヒト血漿中の動脈硬化危険因子である変性ＬＤＬの測定には、モノクローナル抗体が用いられてきたが、特に変性ＬＤＬは分子の修飾構造は一定ではなく、意味のある分子種が明確でないなどの理由で、モノクローナル抗体による検出にも問題が多い。
【０００６】
後期糖化反応生成物（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  Ｅｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ：本明細書中以降、ＡＧＥという）は、糖尿病患者の生活の質を損ねる元凶である血管合併症として知られる糖尿病性血管障害の発症・進展に関与している。血管合併症による眼、神経、腎臓の障害は、それぞれ糖尿病網膜症、神経症、腎症（あわせて三大合併症）とよばれており、糖尿病患者に特徴的な病態である。
【０００７】
ＡＧＥを認識する受容体（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ＡＧＥ：本明細書中以降、ＲＡＧＥという）は、１９９２年に、ウシ肺から同定され、ＡＧＥと結合するイムノグロブリンスーパーファミリーに属する、分子量約３５ｋＤａのＩ型膜タンパク質（糖鎖修飾を受けた完全なＲＡＧＥは、分子量５５ｋＤａ）である。ＲＡＧＥの細胞外ドメインは、１つのＶ型イムノグロブリンドメイン、続いて、２つのＣ型イムノグロブリンドメイン（Ｃ１領域およびＣ２領域）の３つのイムノグロブリンフォールド構造を取るドメインが結合した構造を取っている。ＲＡＧＥはまた、細胞膜１回貫通型のドメインおよび４３アミノ酸の細胞内ドメインを含む。ＲＡＧＥは、多様なクラスのリガンド（ＡＧＥ、Ｓ１００／カルグラニュリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎｅ）、アンホテリンおよびアミロイド−βペプチド（およびβ−シート原線維のクラス））と相互作用する。Ｖドメインは、リガンド結合に必須の部位であり、細胞内ドメインは、ＲＡＧＥ媒介性細胞内シグナル伝達に必須であることが示された（非特許文献３：Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．２００３；９３：１１５９−１１６９）。
【０００８】
ＲＡＧＥは、正常組織および血管系においては低レベルでしか発現されない。しかし、この受容体は、そのリガンドが蓄積した場所においてアップレギュレートされる。例えば、糖尿病患者の血管では、ＲＡＧＥの代表的リガンドとしては、以下のＡＧＥ構造体が挙げられる：（カルボキシメチル）リジン−タンパク質付加物（インビボで存在する主なＡＧＥ）、カルボキシエチル−リジン（ＣＥＬ）タンパク質付加物、ペントシジン−付加物（コラーゲンおよび基底膜の不安定化に関連した糖尿病組織において見いだされる主要なＡＧＥ架橋物質）、ピラリン、イミダゾロン、メチルグリオキサール（他の範囲のＡＧＥの形成の前駆体）、クロスリン、フルオロリンク、プロピリジン、アルグピリミジン、ベスパーリジン、グリオキサール誘導リジンダイマー、デオキシグルコサミン誘導リジンダイマーなど。ＲＡＧＥの発現は、糖尿病血管系において内皮細胞、平滑筋細胞、および浸潤性単核食細胞で増加している。ＡＧＥ−ＲＡＧＥ相互作用は、血管系ホメオスタシスにおいて重要な細胞の特性を変化させる。例えば、ＲＡＧＥがＡＧＥと結合した後、内皮細胞は、ＶＣＡＭ−１、組織因子、およびＩＬ−６の発現、ならびに高分子へのそれらの透過性を増加させる。単核食細胞において、ＲＡＧＥは、サイトカインおよび増殖因子の発現を活性化し、可溶性ＡＧＥに応じて細胞移動を誘導するのに対して、走触性は、固定リガンドで起こる（非特許文献４：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０８：９４９−９５５（２００１））。
【０００９】
これまでに、変性ＬＤＬを検出するために、抗酸化ホスファチジルコリンモノクローナル抗体および抗ヒトアポリポプロテインＢ抗体などが、そしてＡＧＥを検出するために抗ＡＧＥモノクローナル抗体および抗ペントシジンモノクローナル抗体、ＡＧＥ構造体を加水分解後のＨＰＬＣなどが用いられてきた。
【００１０】
また、ＬＯＸ−１およびＲＡＧＥの細胞外領域には、血液中などに存在する特異性の高いプロテアーゼの認識部位は存在せず、切断をうけることはないと予想されてきた。しかし、実際、ＬＯＸ−１の細胞外領域は、過剰量のトロンビンなどによって分解が起こり、ＲＡＧＥの細胞外領域（ｓＲＡＧＥ１という）は、過剰量のトロンビン、第Ｘａ因子などによって切断が起こることを発明者らは初めて明らかにした。これらのプロテアーゼによる分解は、ＬＯＸ−１およびＲＡＧＥを変性ＬＤＬ／ＡＧＥ検出アッセイなどにおいて活用する際に大きな問題となる。
【００１１】
また、変性ＬＤＬおよびＡＧＥは分子の修飾構造が一定ではなく、バイオマーカーとして意味のある分子種が明確でないために、モノクローナル抗体、ＨＰＬＣなどによる定量的検出にも問題が多い。ＬＯＸ−１は、それぞれ、幅広い分子種の変性ＬＤＬおよびＡＧＥを認識可能な曖昧さがありながら、変性を受けたＬＤＬには鋭敏に反応する可能性が高い。そしてＲＡＧＥは幅広い分子種のＡＧＥを認識可能なマルチリガンドレセプターであり、生体内のＡＧＥを鋭敏に検出する可能性が高い。
【非特許文献１】Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ３２：６８−７４（２００３）
【非特許文献２】Ｆｏｌｉａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｊｐｎ．  １２７，１０３−１０７（２００６）
【非特許文献３】Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．２００３；９３：１１５９−１１６９
【非特許文献４】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０８：９４９−９５５（２００１）
【特許文献１】特開２００２−３２０４８９
【特許文献２】特開２００２−１８１８２０
【特許文献３】特開２００３−３６４９９
【特許文献４】特開２００３−２３８４０４
【特許文献５】特開２００３−１２５７８６
【特許文献６】特開２００２−１７３５３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、抗体に代わる、汎用性の高い検出方法において使用しやすい、幅広い分子種の変性ＬＤＬおよびＡＧＥを特異的に認識するペプチドを得ることである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
そこで本発明者らは、鋭意工夫した結果、認識能に影響を与えずにプロテアーゼ耐性を増したＬＯＸ−１およびＲＡＧＥの変異体−界面活性剤複合体を開発することに成功した。
【００１４】
従って、本発明はまた、ＬＯＸ−１およびＲＡＧＥの変異体−界面活性剤複合体を使用して変性ＬＤＬおよびＡＧＥを検出する方法を提供する。
【００１５】
一局面において、本発明は、Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体を提供し、上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチドは、
（Ａ１）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
（Ａ２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、９０位および１０７位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示す、アミノ酸配列；および
（Ａ３）配列番号１に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９０位および１０７位のアミノ酸配列は、配列番号２における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示す、アミノ酸配列；
（Ｂ１）配列番号６に示されるアミノ酸配列；
（Ｂ２）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１０４位および１２１位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＬＯＸ−１の活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｂ３）配列番号５に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において１０４位および１２１位のアミノ酸配列は、配列番号６における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示す、アミノ酸配列；
（Ｃ１）配列番号８に示されるアミノ酸配列；
（Ｃ２）配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１７２位および１８９位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＬＯＸ−１の活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｃ３）配列番号７に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において１７２位および１８９位のアミノ酸配列は、配列番号８における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示す、アミノ酸配列；
からなる群より選択される配列を含み得る。
【００１６】
本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体の一実施形態において、上記置換は、好ましくは、保存的置換であり得る。
【００１７】
本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチドのなお別の実施形態において、上記（Ａ１）〜（Ｃ３）に示されるアミノ酸配列、配列番号４の１４４位、１５５位、１７２位、２４３位、２５６位、２６４位に対応するシステインが保持され得る。
【００１８】
本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体の一実施形態において、上記欠失は、配列番号２、６および８において、配列番号４の２６８位〜２７１位までのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列のうちのいずれか１〜６個のアミノ酸の欠失；配列番号４の２００位〜２０５位までのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列のうちのいずれかのアミノ酸の欠失；配列番号４の１４３位に対応するアミノ酸の欠失；または
これらの任意の組み合わせであり得る。
【００１９】
本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体の好ましい一実施形態において、上記（Ａ１）〜（Ａ３）において、上記付加は、配列番号４の６１位〜１４２位から選択される任意の連続する１〜８２個のアミノ酸配列の付加であり得る。
【００２０】
本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体のさらに好ましい実施形態において、上記付加は、フレキシブルなリンカー配列もしくはその反復配列、またはＬＤＬ受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）のＥＧＦ反復配列（上皮増殖因子受容体様システインリッチドメイン）を含む配列の付加であり得る。本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体のなお好ましい実施形態において、上記リンカー配列は、Gly-Gly-Ser、配列番号１５、配列番号１６に示されるアミノ酸配列であり得る、
本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体の一実施形態において、上記天然型ＬＯＸ−１の活性は、変性ＬＤＬの認識能であり得る。
【００２１】
本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体の好ましい実施形態において、Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、好ましくは、タグ配列をさらに有し得る。さらに好ましくは、上記タグ配列は、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９であり得る。
【００２２】
本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、一実施形態において、標識をさらに含み得る。
【００２３】
本発明は、一局面において、上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体の二量体；上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体の多量体；上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体がジスルフィド結合によって結合されている、二量体を提供する。
【００２４】
なお別の局面において、本発明は、上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体を含む、変性ＬＤＬ検出剤を提供し得る。
【００２５】
本発明の変性ＬＤＬ検出剤の一実施形態において、上記検出剤におけるＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体は乾燥形態のものであり得る。
【００２６】
さらなる局面において、本発明は、上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体および基材を含む、変性ＬＤＬ検出用デバイスを提供する。
【００２７】
上記変性ＬＤＬ検出用デバイスの一実施形態において、上記検出用デバイスにおけるＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体は乾燥形態のものであり得る。
【００２８】
上記変性ＬＤＬ検出用デバイスの一実施形態において、上記基材は、ビーズ、金粒子、プレート、試験管、チップ、磁性粒子、膜、繊維、スライドガラス、金属薄膜、フィルター、チューブ、ボール、ダイアモンド様炭素被膜ステンレスであり得る。さらに好ましい実施形態において、上記ビーズは、ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂、天然樹脂、プラスチック、ゼラチン、シリカゲル、金属、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、アガロース、ポリアミノ酸、セルロース、ハイドロキシアパタイト、ポリエチレン、ポリスルフォン、ポリプロピレン、セルロースアセテート、ポリメチルメタクリレート、セルロースジアセテート、メチレンビニルアルコールから作製されるビーズを含み得る。
【００２９】
本発明は、一局面において、被験体のサンプル中の変性ＬＤＬを検出する方法を提供し、上記方法は、
（Ａ）被験体から単離されたサンプルを提供する工程；
（Ｂ）上記サンプルと、以下：
（１）本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体；
（２）本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体の二量体；
（３）本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体の多量体；
（４）本発明の変性ＬＤＬ検出剤；または
（５）本発明の変性ＬＤＬ検出用デバイス、
のうちのいずれかとを接触させて、上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチドと上記変性ＬＤＬとの複合体を形成させる工程；および
（Ｃ）上記複合体を検出する工程、
を包含し得る。
【００３０】
本発明の被験体のサンプル中の変性ＬＤＬを検出する方法の一実施形態において、上記方法は、（Ｂ’）抗体と接触させて、３成分複合体を形成する工程をさらに包含し得る。上記方法の好ましい実施形態において、上記抗体は、抗ＡｐｏＢ抗体、抗ＯｘＬＤＬ抗体、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体、抗アクロレイン（ＡＣＲ）抗体、抗クロトンアルデヒド（ＣＲＡ）抗体、抗マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）抗体、抗４−ヒドロキシノネナール（ＨＮＥ）抗体、抗ヘキサノイルリジン（ＨＥＬ）抗体からなる群より選択され得る。
【００３１】
本発明の被験体のサンプル中の変性ＬＤＬを検出する方法の一実施形態において、上記サンプルは、ＬＤＬを含む体液であり得、好ましくは、上記ＬＤＬを含む体液は、血液、血清、血漿、髄液、漿膜腔液、肺胞洗浄液であり得る。
【００３２】
本発明の被験体のサンプル中の変性ＬＤＬを検出する方法の一実施形態において、上記変性ＬＤＬは、酸化ＬＤＬ、マロンジアルデヒド化ＬＤＬ、アセチル化ＬＤＬ、アクロレイン修飾ＬＤＬ、ノネナール修飾ＬＤＬ、ヘキサノイル化ＬＤＬ，サクシニル化ＬＤＬ、または糖化ＬＤＬから選択され得る。
【００３３】
本発明の被験体のサンプル中の変性ＬＤＬを検出する方法の一実施形態において、上記複合体を検出する工程は、光学的に検出する工程、物理的に検出する工程または化学的に検出する工程を包含し得る。
【００３４】
一局面において、本発明は、上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体を含む、変性ＬＤＬ検出用キットを提供し得る。
【００３５】
別の一局面において、本発明は、上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体を含む変性ＬＤＬ検出剤と、上記変性ＬＤＬ検出剤と変性ＬＤＬとの複合体を検出するための手段とを備える、変性ＬＤＬ検出システムを提供し得る。
【００３６】
本発明のシステムの好ましい実施形態において、上記検出手段は、光学的検出手段、物理的検出手段または化学的検出手段を包含し得る。なお好ましい実施形態において、上記光学的検出手段は、分光光度計、蛍光発色セルソーター（ＦＡＣＳ）、比色計、蛍光光度計、化学発光検出器、電気化学発光検出器、イメージアナライザー、または顕微鏡を包含し得る。別の好ましい実施形態において、上記物理的検出手段は、電気検出、表面プラズモン共鳴、水晶発振マイクロバランス、または熱測定を包含し得る。さらに別の好ましい実施形態において、上記化学的検出手段は、質量分析、または高速液体クロマトグラフィーを包含し得る。
【００３７】
さらなる一局面において、本発明は、上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体を含む動脈硬化診断剤を提供し得る。
【００３８】
なお別の一局面において、本発明は、変性ＬＤＬによって引き起こされる疾患の診断を支援する方法を提供し、上記方法は、
（Ａ）上記疾患に罹患していると疑われる被験体から単離されたサンプルを提供する工程；
（Ｂ）上記疾患に罹患していないコントロール被験体から単離されたサンプルを提供する工程；
（Ｃ）上記サンプルと、以下：
（１）本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体；
（２）本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体の二量体；
（３）本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体の多量体；
（４）本発明の変性ＬＤＬ検出剤；
（５）本発明の変性ＬＤＬ検出用デバイス；または
（６）本発明の動脈硬化診断剤、
のうちのいずれかとを接触させて、上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチドと上記変性ＬＤＬとの複合体を形成させる工程；および
（Ｄ）上記複合体を検出する工程、
（Ｅ）上記被験体から単離されたサンプル中の複合体の量と、上記コントロール被験体から単離されたサンプル中の複合体の量とを比較して、上記被験体中の変性ＬＤＬの上記コントロール被験体に対する相対値を算出する工程、
を包含し得る。
【００３９】
本発明の変性ＬＤＬによって引き起こされる疾患の診断を支援する方法の一実施形態において、上記方法は、（Ｃ’）抗体と接触させて、３成分複合体を形成する工程をさらに包含し得る。
【００４０】
本発明の変性ＬＤＬによって引き起こされる疾患の診断を支援する方法の好ましい実施形態において、上記抗体は、抗ＡｐｏＢ抗体、抗ＯｘＬＤＬ抗体、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体、抗アクロレイン（ＡＣＲ）抗体、抗クロトンアルデヒド（ＣＲＡ）抗体、抗マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）抗体、抗４−ヒドロキシノネナール（ＨＮＥ）抗体、抗ヘキサノイルリジン（ＨＥＬ）抗体からなる群より選択され得る。
【００４１】
本発明の変性ＬＤＬによって引き起こされる疾患の診断を支援する方法の一実施形態において、上記変性ＬＤＬにより引き起こされる疾患は、動脈硬化症、虚血性心疾患、脳血管障害、大動脈瘤、腎梗塞、高脂血症、および全身性エリテマトーデス（SLE）のような自己免疫疾患からなる群より選択され得る。好ましい実施形態において、上記虚血性心疾患は、心筋梗塞、または狭心症を含み得る。別の好ましい実施形態において、上記脳血管障害は、脳梗塞、脳出血、くも膜下出血、または一過性脳虚血発作を含み得る。
【００４２】
一局面において、本発明は、上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体の、変性ＬＤＬにより引き起こされる疾患の診断のための医薬の製造のための使用を提供する。
【００４３】
さらなる一局面において、本発明は、Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体を製造する方法を提供し、上記方法は、
Ａ）本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチドを細菌宿主細胞で封入体として生産する工程；および
Ｂ）上記封入体を界面活性剤とサイクロアミロースでリフォールディングして、上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体を得る工程、
を包含し得る。
【００４４】
一局面において、本発明は、後期糖化反応生成物レセプター（ＲＡＧＥ）様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体を提供し、上記ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、
（Ｐ１）配列番号１２に示されるアミノ酸配列；
（Ｐ２）配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｐ３）配列番号１１に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸は、配列番号１２における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｑ１）配列番号１４に示されるアミノ酸配列；
（Ｑ２）配列番号１４に示されるアミノ酸配列において、９２位、９５位、２０６位および２５０位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｑ３）配列番号１３に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位、９５位、２０６位および２５０位のアミノ酸は、配列番号１４における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｒ１）配列番号３７に示されるアミノ酸配列；
（Ｒ２）配列番号３７に示されるアミノ酸配列において、９２位、９５位および２０６位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｒ３）配列番号３６に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位、９５位および２０６位のアミノ酸は、配列番号３７における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｓ１）配列番号３９に示されるアミノ酸配列；
（Ｓ２）配列番号３９に示されるアミノ酸配列において、９２位、９５位および２０６位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｓ３）配列番号３８に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位、９５位および２０６位のアミノ酸は、配列番号３９における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｔ１）配列番号４１に示されるアミノ酸配列；
（Ｔ２）配列番号４１に示されるアミノ酸配列において、１４位、１７位、１２８位および１７２位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｔ３）配列番号４０に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において１４位、１７位、１２８位および１７２位のアミノ酸配列は、配列番号４１における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｕ１）配列番号４３に示されるアミノ酸配列；
（Ｕ２）配列番号４３に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｕ３）配列番号４２に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸は、配列番号４３における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｖ１）配列番号４５に示されるアミノ酸配列；
（Ｖ２）配列番号４５に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｖ３）配列番号４４に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸は、配列番号４５における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｗ１）配列番号４７に示されるアミノ酸配列；
（Ｗ２）配列番号４７に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｗ３）配列番号４６に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸は、配列番号４７における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｘ１）配列番号４９に示されるアミノ酸配列；
（Ｘ２）配列番号４９に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｘ３）配列番号４８に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸は、配列番号４９における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
からなる群より選択される配列を含み得る。
【００４５】
本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体の一実施形態において、上記置換は、保存的置換であり得る。
【００４６】
本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体の別の一実施形態において、上記（Ｐ１）〜（Ｘ３）に示されるアミノ酸配列において、配列番号１０のアミノ酸配列における３８位、９９位、１４４位、２０８位、２５９位および３０１位に対応するシステイン残基は保持されている。
【００４７】
本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体の好ましい一実施形態において、上記欠失は、配列番号１２、１４、３７、３９、４１、４３、４５、４７および４９において、配列番号１０の１位〜３７位に対応するアミノ酸配列におけるいずれかのアミノ酸の欠失であり得る。
【００４８】
本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体のさらに別の一実施形態において、上記付加は、配列番号１０の１位〜２２位から選択される任意の連続する１〜２２個のアミノ酸配列のＮ末端側への付加、配列番号１０の１２１位〜４０４位から選択される任意の連続する１〜２８４個のアミノ酸の付加、あるいはフレキシブルなリンカー配列もしくはその反復配列、またはＬＤＬ受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）のＥＧＦ反復配列（上皮増殖因子受容体様システインリッチドメインを含む配列の付加であり得る。好ましい実施形態において、上記リンカー配列は、Gly-Gly-Ser、配列番号１５、配列番号１６に示されるアミノ酸配列であり得る。
【００４９】
本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体の一実施形態において、上記天然型ＲＡＧＥの活性は、ＡＧＥの認識能であり得る。
【００５０】
本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体のなお別の一実施形態において、上記ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、タグ配列をさらに有し得る。好ましくは、上記タグ配列は、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９であり得る。
【００５１】
一局面において、本発明は、上記ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体を含む後期糖化反応生成物（ＡＧＥ）検出剤を提供し得る。
【００５２】
後期糖化反応生成物（ＡＧＥ）検出剤の好ましい実施形態において、上記検出剤におけるＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体は乾燥形態のものであり得る。
【００５３】
本発明は、一局面において、上記ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体および基材を含む、ＡＧＥ検出用デバイスを提供し得る。
【００５４】
上記ＡＧＥ検出用デバイスの一実施形態において、上記検出デバイスにおけるＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体は乾燥形態のものであり得る。
【００５５】
上記ＡＧＥ検出用デバイスの一実施形態において、上記基材は、ビーズ、金粒子、プレート、試験管、チップ、磁性粒子、膜、繊維、スライドガラス、金属薄膜、フィルター、チューブ、ボール、ダイアモンド様炭素被膜ステンレスを含み得る。さらに好ましい実施形態において、上記ビーズは、ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂、天然樹脂、プラスチック、ゼラチン、シリカゲル、金属、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、アガロース、ポリアミノ酸、セルロース、ハイドロキシアパタイト、ポリエチレン、ポリスルフォン、ポリプロピレン、セルロースアセテート、ポリメチルメタクリレート、セルロースジアセテート、メチレンビニルアルコールから作製されるビーズを含み得る。
【００５６】
本発明は、一局面において、被験体のサンプル中のＡＧＥを検出する方法を提供し、上記方法は、
（Ａ）被験体から単離されたサンプルを提供する工程；
（Ｂ）上記サンプルと、以下：
（１）本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体；
（２）本発明のＡＧＥ検出剤；または
（３）本発明のＡＧＥ検出用デバイス、
のうちのいずれかとを接触させて、上記ポリペプチドと上記ＡＧＥとの複合体を形成させる工程；および
（Ｃ）上記複合体を検出する工程、
を包含し得る。
【００５７】
本発明の被験体のサンプル中のＡＧＥを検出する方法の一実施形態において、上記方法は、（Ｂ’）抗体と接触させて、３成分複合体を形成する工程をさらに包含し得る。上記好ましい方法の実施形態において、上記抗体は、抗ＨｂＡ１ｃ抗体、抗ＡＧＥ抗体および抗カルボキシメチルリジン抗体からなる群より選択され得る。
【００５８】
本発明の被験体のサンプル中のＡＧＥを検出する方法の一実施形態において、上記サンプルは、タンパク質を含む体液であり得、好ましくは、上記タンパク質を含む体液は、血液、血清、血漿、髄液、漿膜腔液、関節液、肺胞洗浄液、涙液または尿を含む体液であり得る。
【００５９】
本発明の被験体のサンプル中のＡＧＥを検出する方法の一実施形態において、上記ＡＧＥは糖化タンパク質であり得る。
【００６０】
本発明の被験体のサンプル中のＡＧＥを検出する方法の一実施形態において、上記複合体を検出する工程は、光学的に検出する工程、物理的に検出する工程または化学的に検出する工程を包含し得る。
【００６１】
一局面において、本発明は、上記ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体を含む、ＡＧＥ検出用キットを提供する。
【００６２】
別の一局面において、本発明は、上記ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体を含むＡＧＥ検出剤と上記ＡＧＥ検出剤とＡＧＥとの複合体を検出するための手段とを備える、ＡＧＥ検出システムを提供し得る。
【００６３】
本発明のシステムの好ましい実施形態において、上記検出手段は、光学的検出手段、物理的検出手段または化学的検出手段を包含し得る。なお好ましい実施形態において、上記光学的検出手段は、分光光度計、ＦＡＣＳ、比色計、蛍光光度計、化学発光検出器、電気化学発光検出器、イメージアナライザー、または顕微鏡を包含し得る。別の好ましい実施形態において、上記物理的検出手段は、電気検出、表面プラズモン共鳴、水晶発振マイクロバランス、または熱測定を包含し得る。さらに別の好ましい実施形態において、上記化学的検出手段は、質量分析、または高速液体クロマトグラフィーを包含し得る。
【００６４】
さらなる局面において、本発明は、上記ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体を含む、糖尿病性血管障害診断剤を提供し得る。
【００６５】
なお別の一局面において、本発明は、ＡＧＥにより引き起こされる疾患の診断を支援する方法を提供し、上記方法は、
（Ａ）上記疾患に罹患していると疑われる被験体から単離されたサンプルを提供する工程；
（Ｂ）上記疾患に罹患していないコントロール被験体から単離されたサンプルを提供する工程；
（Ｃ）上記サンプルと、以下：
（１）本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体；
（２）本発明のＡＧＥ検出剤；
（３）本発明のＡＧＥ検出用デバイス；または
（４）本発明の糖尿病性血管障害診断剤、
のうちのいずれかとを接触させて、上記ＲＡＧＥ様ポリペプチドと上記ＡＧＥとの複合体を形成させる工程；および
（Ｄ）上記複合体を検出する工程、
（Ｅ）上記被験体から単離されたサンプル中の複合体の量と、上記コントロール被験体から単離されたサンプル中の複合体の量とを比較して、上記被験体中のＡＧＥの該コントロール被験体に対する相対値を算出する工程、
を包含し得る。
【００６６】
本発明のＡＧＥにより引き起こされる疾患の診断を支援する方法の一実施形態において
上記方法は、（Ｃ’）抗体と接触させて、３成分複合体を形成する工程をさらに包含し得る。
【００６７】
本発明のＡＧＥにより引き起こされる疾患の診断を支援する方法の好ましい実施形態において、上記抗体は、抗ＨｂＡ１ｃ抗体、抗ＡＧＥ抗体および抗カルボキシメチルリジン抗体からなる群より選択され得る。
【００６８】
本発明のＡＧＥにより引き起こされる疾患の診断を支援する方法の一実施形態において、上記ＡＧＥにより引き起こされる疾患は、糖尿病、糖尿病性血管障害、細小血管症、および大血管障害からなる群より選択され得る。好ましい実施形態において、上記細小血管症は、腎症、網膜症、または神経症を含み得る。別の好ましい実施形態において、上記大血管障害は、虚血性心疾患、脳血管疾患、または閉塞性動脈硬化症を含み得る。
【００６９】
一局面において、本発明は、上記ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体質の、ＡＧＥにより引き起こされる疾患の診断剤の製造のための使用を提供する。
【００７０】
さらなる局面において、本発明は、ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体を製造する方法を提供し、上記方法は、
Ａ）本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチドを細菌宿主細胞で封入体として生産する工程；および
Ｂ）上記封入体を界面活性剤とサイクロアミロースでリフォールディングして、ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体を得る工程、
を包含し得る。
【００７１】
本発明のなおさらなる実施形態および利点は、以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７２】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞または形容詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００７３】
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００７４】
本明細書において使用される場合、用語「受容体」とは、１個以上のリガンドと可逆的、かつ特異的に複合体化する１個以上の結合ドメインを備える生物学的な構造であって、ここで、この複合体化は生物学的な構造を有する。受容体は、完全に細胞の外部（細胞外の受容体）、細胞膜の中（しかし、受容体の部分を細胞外部の環境および細胞質ゾルに向けている）、または完全に細胞の中（細胞内の受容体）に存在し得る。これらはまた、細胞と独立的に機能し得る。細胞膜中の受容体は、細胞を、その境界の外部の空間と連絡（例えば、シグナル伝達）させ、そして細胞の内側および外側への分子およびイオンの輸送において機能させることを可能とする。本明細書において使用する場合、受容体は、受容体全長であっても、受容体のフラグメントであってもよい。
【００７５】
本明細書において使用される場合、用語「レクチン様酸化低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体１（Ｌｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ＬＤＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」とは、ＬＯＸ−１ともいわれ、（１）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号４に示されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド；（３）上記配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド；（５）配列番号３に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（６）上記配列番号３に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド；（７）上記配列番号３に示される核酸配列において１または数個のヌクレオチドの置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド；（８）上記配列番号３に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド；および（９）上記配列番号３に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド、のうちの１つである。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９  （２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。また、ＬＯＸ−１としては、ヒトＬＯＸ−１（ｈＬＯＸ−１ともいう）、ウシＬＯＸ−１（ｂ−ＬＯＸ１ともいう）、ブタＬＯＸ−１、マウスＬＯＸ−１、ウサギＬＯＸ−１のような哺乳動物のＬＯＸ−１が挙げられるが、これらに限定されない。ｂＬＯＸ−１は、Ｃ型レクチンファミリーに属する２７３アミノ酸残基からなる分子量約５０ｋＤａの糖タンパク質であり、Ｎ末端が細胞質内にあり、Ｃ末端が細胞外に出ている細胞膜１回貫通型のＩＩ型膜タンパク質である。ｈＬＯＸ−１はまた、Ｃ型レクチンファミリーに属する２７３アミノ酸残基からなる約３０ｋＤａのＩＩ型膜タンパク質である。ＬＯＸ−１は、構造的には、以下の４つのドメイン：Ｎ末端側の細胞質ドメイン、疎水性膜貫通ドメイン、ネックドメイン、およびＣ型レクチン様ドメインからなる。
【００７６】
本明細書において使用される場合、用語「Ｃ型レクチン様ドメイン」とは、ＣＴＬＤともいい、Ｃ型レクチンファミリーに属するメンバーの糖鎖認識部位と相同性を有する。ＣＴＬＤは、このメンバー間で、種間で非常によく保存されており、６個のシステイン残基の位置は、完全に保存されている。また、ＣＴＬＤは、ＬＯＸ−１のリガンドを認識するための機能的ドメインであり、この中の６個のシステイン残基は、ｈＬＯＸ−１の３カ所の分子内ジスルフィド結合に関与している。従って、本発明の変異ＬＯＸ−１−界面活性剤複合体は、配列番号４のアミノ酸配列において、１４４位、１５５位、１７２位、２４３位、２５６位、２６４位におけるシステインが保持されていることが好ましい。同様に、本発明のＣＴＬＤ−界面活性剤複合体においても、配列番号４のアミノ酸配列における１４４位、１５５位、１７２位、２４３位、２５６位、２６４位におけるシステインに対応するアミノ酸が保持されていることが好ましい。この保存されたＣＴＬＤに加えて、ｈＬＯＸ−１および他の既知の種におけるネックドメインは、高い配列同一性を有している。また、ｈＬＯＸ−１における１４０位のシステインは、分子間ジスルフィド結合に関与し、ｈＬＯＸ−１の二量体を形成する。しかし、この１４０位のシステインは、変性ＬＤＬの認識に必須ではないので、発現された場合に、必ずしもこの１４０位のシステインが保持されている必要はなく、変異されていてもよい。さらに、ｈＬＯＸ−１では、１８３位のＮと１３９位のＮにおいて糖鎖が付加されている。糖鎖が付加されたｈＬＯＸ−１の分子量は、４０ｋＤａである。通常ｈＬＯＸ−１はグリコシル化されているが、たとえグリコシル化されていなくても、グリコシル化された通常のｈＬＯＸ−１と同様に、変性ＬＤＬを認識および結合できる。上記ＣＴＬＤは、変性ＬＤＬを結合するのに必要十分な最小ドメインである。このＬＯＸ−１のＣ末端の４残基（ＬＲＡＱ）は、リガンドの認識と取り込みに必須であり、Ｃ末端の７残基（ＫＡＮＬＲＡＱ）がｈＬＯＸ−１のフォールディングと輸送に必須である。ｈＬＯＸ−１のＷ１５０、Ｒ２０８、Ｒ２２９、Ｒ２３１、Ｒ２４８等がリガンド認識と取り込みに必須のアミノ酸である。ＬＯＸ−１はまた、細胞膜から切断され、可溶性形態として放出され、健常者の血中にも存在することが報告されている。
【００７７】
本明細書において使用される場合、用語「ＣＴＬＤ様ポリペプチド」とは、「ＣＴＬＤ」、「ＰＲ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ（プロテアーゼ耐性））−ＣＴＬＤ」、「ＣＴＬＤ１４」（ＣＴＬＤ＋ネックドメインのＣ末端側の１４アミノ酸を有するポリペプチド）、「ＰＲ−ＣＴＬＤ１４」、「ＣＴＬＤ＋ネック」（ＣＴＬＤ＋ネックドメインを有するポリペプチド）、または「ＰＲ−ＣＴＬＤ＋ネック」に包含される全てのポリペプチドまたはその変異体を包含する。
【００７８】
本明細書において使用される場合、用語「ＣＴＬＤ」および「ＰＲ−ＣＴＬＤ」とは、代表的には、（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列において９０位および１０７位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；（４）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；（５）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；（６）配列番号１に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号１に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）配列番号１に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９０位および１０７位のアミノ酸は、配列番号２における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号１に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド；（１０）上記配列番号１に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（１１）上記配列番号１に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９  （２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。
【００７９】
本明細書において使用される場合、用語「ＣＴＬＤ１４」および「ＰＲ−ＣＴＬＤ１４」とは、（１）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号６に示されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号６に示されるアミノ酸配列において１０４位および１２１位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；（４）上記配列番号６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；（５）上記配列番号６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；（６）配列番号５に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号５に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）配列番号５に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において１０４位および１２１位のアミノ酸は、配列番号６における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号５に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド；（１０）上記配列番号５に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（１１）上記配列番号５に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９  （２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。
【００８０】
本明細書において使用される場合、用語「ＣＴＬＤ＋ネック」および「ＰＲ−ＣＴＬＤ＋ネック」とは、（１）配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号８に示されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号８に示されるアミノ酸配列において１７２位および１８９位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；（４）上記配列番号８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；（５）上記配列番号８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；（６）配列番号７に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号７に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）配列番号７に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において１７２位および１８９位位のアミノ酸は、配列番号６における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号７に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド；（１０）上記配列番号７に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（１１）上記配列番号７に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９  （２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。
【００８１】
なお、上記ＣＴＬＤ様ポリペプチドは、天然型ＬＯＸ−１の活性が保持されている限り、非天然アミノ酸を含んでいてもよいし、アミノ酸アナログ、アミノ酸誘導体などを含んでいてもよい。
【００８２】
上記に示されるＣＴＬＤ様ポリペプチド−界面活性剤複合体においても、システイン残基は、分子内ジスルフィド結合に関与しているので、本発明のＣＴＬＤ様ポリペプチドにおいて、配列番号４のアミノ酸配列の１４４位、１５５位、１７２位、２４３位、２５６位、２６４位に対応するシステインが保持されていることが好ましい。
【００８３】
本明細書において使用される場合、用語「リガンド」とは、特異的な受容体または受容体のファミリーに対する結合パートナーである。リガンドは、受容体に対する内因性のリガンドであるか、またはその代わりに、薬剤、薬剤候補、もしくは薬理学的手段のような受容体に対する合成リガンドであり得る。
【００８４】
本明細書において使用される場合、「変性ＬＤＬ」とは、ＬＤＬが体内で活性酸素、酸化的酵素、Ｆｅ３＋などと接触すること、あるいは、血管内皮細胞やマクロファージなどによる細胞依存性化学変化によって発生する種々の分子修飾を有する任意のＬＤＬ改変体である。生体内に存在する変性ＬＤＬとしては、代表的には、酸化ＬＤＬ（完全酸化ＬＤＬ（本明細書中Ｆ−ＯｘＬＤＬともいう）および部分酸化ＬＤＬ（本明細書中Ｍ−ＯｘＬＤＬともいう）が挙げられる）、マロンジアルデヒド化ＬＤＬ（ＭＤＡ−ＬＤＬ）、アクロレイン修飾ＬＤＬ、ノネナール修飾ＬＤＬ、クロトンアルデヒド（ＣＲＡ）修飾ＬＤＬ、４−ヒドロキシノネナール（ＨＮＥ）修飾ＬＤＬ、ヘキサノイル（ＨＥＬ）修飾ＬＤＬ、小粒子ＬＤＬ（直径２５５ｎｍ以下のＬＤＬ）、糖化ＬＤＬなどが挙げられるが、これらに限定されない。酸化ＬＤＬが異常値を示す場合、動脈硬化症、虚血性心疾患（心筋梗塞、狭心症など）、脳血管障害（脳梗塞、脳出血、くも膜下出血、一過性脳虚血発作など）、大動脈瘤、腎梗塞、高脂血症などのような疾患が予想されるがこれらに限定されない（「今日の臨床検査  ２００７−２００８」発行所  株式会社  南江堂、参照）。一般に使用される検査方法では、基準物質としては、ＭＤＡ−ＬＤＬ（正常範囲：１０〜８０Ｕ／Ｌ）および酸化ホスファチジルコリン（正常範囲：８．４Ｕ／ｍＬ〜１７．６Ｕ／ｍＬ）が使用されている。
【００８５】
本明細書において使用される場合、用語「後期糖化反応生成物（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  Ｅｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）」とは、ＡＧＥともいわれ、糖尿病患者の生活の質を損ねる元凶である血管合併症として知られる糖尿病性血管障害の発症・進展に関与している。グルコースに代表される還元糖は、タンパク質、アミノ酸のアミノ基と非酵素的に反応して、シッフ塩基またはアマドリ転位化合物などの糖化生成物を形成する。ここまでの反応は可逆的であり、前期反応とよばれている。その後、さらに縮合、開裂、架橋形成などの複雑かつ不可逆的な反応を経て、後期糖化反応生成物を形成する。このような一連の反応は、グリケーションと称される。ＡＧＥはまた、このような過程を経て生成された構造物の総称である。生体中に存在するＡＧＥ構造としては、カルボキシメチルリジン(ＣＭＬ)、カルボキエチルリジン(ＣＥＬ)、ペントシジン、ピラリン、イミダゾリン、メチルグリオキサール、クロスリンなどが挙げられるが、これに限定されない。血漿中に存在するアルブミン、イムノグロブリン、オボアルブミンなどが上記の糖化を受けた産物もＡＧＥであり、ＡＧＥとして実験系に汎用されている。さらに、インビトロ実験系では、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）に糖化処理を施したもの、例えば、Ｒ−ＡＧＥ（リボースにより糖化処理をしたＢＳＡ）、Ｆ−ＡＧＥ（フルクトースにより処理をしたＢＳＡ）；Ｇ−ＡＧＥ（グルコースにより糖化処理をしたＢＳＡ）なども汎用されている。血糖コントロールの指標として用いられているヘモグロビンＡ１ｃはアマドリ転移化合物であるが、ＡＧＥに包含される。また、任意のタンパク質も、ＡＧＥに変換可能である。例えば、ＡＧＥに包含されるＣＭＬアルブミンおよびＣＥＬアルブミンは、いずれもアルブミンが糖化を受けたＡＧＥである。このようなＡＧＥ生成反応は、生体内において循環血液中、細胞外マトリクス、細胞内のいずれでも起こり得る。例えば、糖尿病患者の血管に存在するＡＧＥとしては、：蛍光性で架橋構造を有するもの（ペントシジン、クロスリンなど）および蛍光も架橋もないもの（カルボキシメチルリジン、ピラリン、メチルグリオキサール（ＭＧ）−イミダゾロンなど）の２つに大別できる。ＡＧＥが異常値を示す場合、細小血管症（腎症、網膜症、神経症など）、大血管障害（虚血性心疾患、脳血管疾患、閉塞性動脈硬化症のような疾患が予想される。一般に使用される検査方法では、基準物質としては、ピラリン（正常範囲：血漿中２３ｐｍｏｌ／ｍＬ未満）、ペントシジン（正常範囲：血漿中０．００９１５〜０．０４３１μｇ／ｍＬ（ＥＬＩＳＡで測定した場合））などが使用される（「今日の臨床検査  ２００７−２００８」発行所  株式会社  南江堂、参照）。
【００８６】
本明細書において使用される場合、用語「ＡＧＥ受容体（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ＡＧＥ）」とは、ＲＡＧＥともいわれ、（１）配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号１０に示されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（３）上記配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（５）配列番号９に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（６）上記配列番号９に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（７）上記配列番号９に示される核酸配列において１または数個のヌクレオチドの置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（８）上記配列番号９に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；および（９）上記配列番号９に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド、のうちの１つである。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９  （２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。ＲＡＧＥはまた、１９９２年に、ウシ肺から同定され、ＡＧＥと結合するイムノグロブリンスーパーファミリーに属する、分子量約３５ｋＤａのＩ型膜タンパク質（糖鎖修飾を受けた完全なＲＡＧＥは、分子量５５ｋＤａ）である。ＲＡＧＥの細胞外ドメインは、１つのＶ型イムノグロブリンドメイン、続いて、２つのＣ型イムノグロブリンドメイン（Ｃ１領域およびＣ２領域）の、３つのイムノグロブリンフォールド構造を取るドメインが結合した構造を取っている。ＲＡＧＥはまた、細胞膜１回貫通型のドメインおよび４３アミノ酸の細胞質ドメインを含む。ＲＡＧＥは、多様なクラスのリガンド（ＡＧＥ、Ｓ１００／カルグラニュリン、アンフォテリンおよびアミロイド−βペプチド）と相互作用する。Ｖドメインは、リガンド結合に必須の部位であり、細胞質ドメインは、ＲＡＧＥ媒介性細胞内シグナル伝達に必須である。ＲＡＧＥはまた、各ドメイン内でジスルフィド結合を有するので、本発明の変異ＲＡＧＥ−界面活性剤複合体は、配列番号１０のアミノ酸配列における３８位、９９位、１４４位、２０８位、２５９位および３０１位に対応するシステイン残基を保持していることが好ましい。ＲＡＧＥは、正常組織および血管系においては低レベルでしか発現されない。しかし、この受容体は、そのリガンドが蓄積した場所においてアップレギュレートされる。ＲＡＧＥの発現は、糖尿病血管系において内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、腎メサンギウム細胞および浸潤性単核食細胞で増加している。また、ＡＧＥが蓄積している動脈硬化巣のような病的部位においても、ＲＡＧＥの発現が増加している。ＡＧＥ−ＲＡＧＥ相互作用は、血管系ホメオスタシスにおいて重要な細胞の特性を変化させる。例えば、ＲＡＧＥがＡＧＥと結合した後、血管内皮細胞は、ＶＣＡＭ−１、組織因子、およびＩＬ−６の発現、ならびに高分子へのそれらの透過性を増加させる。単核食細胞において、ＲＡＧＥは、サイトカインおよび増殖因子の発現を活性化し、可溶性ＡＧＥに応じて細胞移動を誘導するのに対して、走触性は、固定リガンドで起こる。
【００８７】
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ様ポリペプチド」とは、「ＲＡＧＥ８」、「ｍＲＡＧＥ８」、「ＲＡＧＥ１」、「ｍＲＡＧＥ１」、「ＲＡＧＥ２」、「ｍＲＡＧＥ２」、「ＲＡＧＥ３」、「ｍＲＡＧＥ３」、「ＲＡＧＥ４」、「ｍＲＡＧＥ４」、「ＲＡＧＥ７」、「ｍＲＡＧＥ７」、「ＲＡＧＥ１４３」、「ｍＲＡＧＥ１４３」、「ＲＡＧＥ２２３」、「ｍＲＡＧＥ２２３」、「ＲＡＧＥ２２６」および「ｍＲＡＧＥ２２６」と称されるポリペプチドまたはこれらの変異体を包含する。
【００８８】
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ８」および「ｍＲＡＧＥ８」とは、（１）配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号１２に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド；（５）上記配列番号１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド；（６）配列番号１１に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号１１に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号１１に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号１１に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸配列は、配列番号１２における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、ポリペプチド；（１０）上記配列番号１１に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号１１に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドのうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９  （２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。
【００８９】
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ１」および「ｍＲＡＧＥ１」とは、（１）配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号１４に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号１４に示されるアミノ酸配列において、９２位、９５位、２０６位および２５０位以外のアミノ酸位置で１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド；（５）上記配列番号１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド；（６）配列番号１３に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号１３に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号１３に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号１３に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位、９５位、２０６位および２５０位のアミノ酸配列は、配列番号１４における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、ポリペプチド；（１０）上記配列番号１３に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号１３に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９  （２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。
【００９０】
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ２」および「ｍＲＡＧＥ２」とは、（１）配列番号３７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号３７に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号３７に示されるアミノ酸配列において、９２位、９５位および２０６位以外のアミノ酸位置で１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号３７に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド；（５）上記配列番号３７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド；（６）配列番号３６に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号３６に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号３６に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号３６に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において９２位、９５位および２０６位のアミノ酸配列は、配列番号３７における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、ポリペプチド；（１０）上記配列番号３６に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号３６に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９  （２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。
【００９１】
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ３」および「ｍＲＡＧＥ３」とは、（１）配列番号３９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号３９に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号３９に示されるアミノ酸配列において、９２位、９５位および２０６位以外のアミノ酸位置で１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（３７４）上記配列番号３９に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド；（５）上記配列番号３９に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド；（６）配列番号３８に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号３８に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号３８に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号３８に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において９２位、９５位および２０６位のアミノ酸配列は、配列番号３９における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、ポリペプチド；（１０）上記配列番号３８に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号３８に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９  （２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。
【００９２】
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ４」および「ｍＲＡＧＥ４」とは、（１）配列番号４１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号４１に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号４１に示されるアミノ酸配列において、１４位、１７位、１２８位および１７２位以外のアミノ酸位置で１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号４１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド；（５）上記配列番号４１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド；（６）配列番号４０に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号４０に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号４０に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号４０に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において１４位、１７位、１２８位および１７２位のアミノ酸配列は、配列番号４１における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、ポリペプチド；（１０）上記配列番号４０に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号４０に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９  （２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。
【００９３】
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ７」および「ｍＲＡＧＥ７」とは、
（１）配列番号４３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号４３に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号４３に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号４３に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド；（５）上記配列番号４３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド；（６）配列番号４２に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号４２に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号４２に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号４２に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸配列は、配列番号４３における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、ポリペプチド；（１０）上記配列番号４２に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号４２に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９  （２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。
【００９４】
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ１４３」および「ｍＲＡＧＥ１４３」とは、（１）配列番号４５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号４５に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号４５に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号４５に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド；（５）上記配列番号４５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド；（６）配列番号４４に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号４４に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号４４に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号４４に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸配列は、配列番号４５における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、ポリペプチド；（１０）上記配列番号４４に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号４４に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９  （２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。
【００９５】
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ２２３」および「ｍＲＡＧＥ２２３」とは、（１）配列番号４７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号４７に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号４７に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号４７に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド；（５）上記配列番号４７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド；（６）配列番号４６に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号４６に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号４６に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号４６に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸配列は、配列番号４７における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、ポリペプチド；（１０）上記配列番号４６に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号４６に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９  （２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。
【００９６】
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ２２６」および「ｍＲＡＧＥ２２６」とは、（１）配列番号４９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号４９に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号４９に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号４９に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド；（５）上記配列番号４９に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド；（６）配列番号４８に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号４８に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号４８に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号４８に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸配列は、配列番号４９における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、ポリペプチド；（１０）上記配列番号４８に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号４８に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９  （２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。
【００９７】
なお、上記ＲＡＧＥ様ポリペプチドは、天然型ＲＡＧＥの活性が保持されている限り、非天然アミノ酸を含んでいてもよいし、アミノ酸アナログ、アミノ酸誘導体などを含んでいてもよい。
【００９８】
上記のＲＡＧＥ様ポリペプチドにおいても、分子内ジスルフィド結合を形成することは重要であるので、配列番号１０のアミノ酸配列の３８位、９９位、１４４位、２０８位、２５９位および３０１位に対応するシステインは保持されていることが好ましい。
【００９９】
本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。
【０１００】
本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。
【０１０１】
本明細書において「アミノ酸誘導体」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのようなアミノ酸誘導体およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。本明細書では、アミノ酸誘導体およびアミノ酸アナログは、アミノ酸と同じ生物学的機能を提供し得る限り代替として使用され得ることが理解される。
【０１０２】
本明細書において「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体であるが、Ｄ体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にある。
【０１０３】
本明細書において「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ−フェニルアラニンが挙げられる。
【０１０４】
本明細書において「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および／または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、２−メチルグルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。
【０１０５】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。
【０１０６】
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９  （２００４．５．１２  発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。
【０１０７】
本明細書において、「対応する」アミノ酸とは、あるタンパク質分子またはポリペプチド分子において、比較の基準となるタンパク質またはポリペプチドにおける所定のアミノ酸と同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸をいう。例えば、ＬＯＸ−１においては、２３２位および２４９位におけるアミノ酸であり、ＲＡＧＥにおいては、１１４位、１１７位、２２８位、２７２位におけるアミノ酸である。
【０１０８】
本明細書において、「対応する」遺伝子とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子（例えば、ＬＯＸ−１）に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、ヒトの遺伝子に対応する遺伝子は、他の動物（マウス、ラット、ブタ、ウサギ、モルモット、ウシ、ヒツジなど）においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウサギ、モルモット、ウシ、ヒツジなど）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
【０１０９】
本明細書中で使用される「異種」とは、異なる配列または対応しない配列、あるいは異なる種由来の配列である、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列をいう。例えば、ヒトのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、マウスのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して異種であり、そしてヒトＬＯＸ−１の核酸配列またはアミノ酸配列は、ヒトアルブミンのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して異種である。
【０１１０】
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用なフラグメントの長さは、そのフラグメントの基準となる全長タンパク質の機能のうち少なくとも１つの機能が保持されているかどうかによって決定され得る。
【０１１１】
本明細書において「生物学的機能」とは、ある遺伝子またはそれに関する核酸分子もしくはポリペプチドについて言及するとき、その遺伝子、核酸分子またはポリペプチドが生体内において有し得る特定の機能をいい、これには、例えば、特異的な抗体の生成、酵素活性、抵抗性の付与等を挙げることができるがそれらに限定されない。本発明においては、例えば、ＬＯＸ−１が変性ＬＤＬを認識する機能、ＲＡＧＥがＡＧＥを認識する機能などを挙げることができるがそれらに限定されない。本明細書において、生物学的機能は、「生物学的活性」によって発揮され得る。本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質など）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含され、例えば、ある分子との相互作用によって別の分子が活性化または不活化される活性も包含される。２つの因子が相互作用する場合、その生物学的活性は、その二分子との間の結合およびそれによって生じる生物学的変化、例えば、一つの分子を抗体を用いて沈降させたときに他の分子も共沈するとき、２分子は結合していると考えられる。したがって、そのような共沈を見ることが一つの判断手法として挙げられる。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。
【０１１２】
したがって、「活性」は、結合（直接的または間接的のいずれか）を示すかまたは明らかにするか；応答に影響する（すなわち、いくらかの曝露または刺激に応答する測定可能な影響を有する）、種々の測定可能な指標をいい、例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに直接結合する化合物の親和性、または例えば、いくつかの刺激後または事象後の上流または下流のタンパク質の量あるいは他の類似の機能の尺度が、挙げられる。
【０１１３】
本明細書において「相互作用」とは、２つの物質についていうとき、一方の物質と他方の物質との間で力（例えば、分子間力（ファンデルワールス力）、水素結合、疎水性相互作用など）を及ぼしあうこという。通常、相互作用をした２つの物質は、会合または結合している状態にある。
【０１１４】
本明細書中で使用される用語「結合」は、２つのタンパク質もしくは化合物または関連するタンパク質もしくは化合物の間、あるいはそれらの組み合わせの間での、物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが含まれる。物理的相互作用（結合）は、直接的または間接的であり得、間接的なものは、別のタンパク質または化合物の効果を介するかまたは起因する。直接的な結合とは、別のタンパク質または化合物の効果を介してもまたはそれらに起因しても起こらず、他の実質的な化学中間体を伴わない、相互作用をいう。
【０１１５】
本明細書において第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」とは、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して、第二の物質または因子以外の物質または因子（特に、第二の物質または因子を含むサンプル中に存在する他の物質または因子）に対するよりも高い親和性で相互作用することをいう。物質または因子について特異的な相互作用としては、例えば、核酸におけるハイブリダイゼーション、タンパク質における抗原抗体反応、リガンド−レセプター反応、酵素−基質反応など、核酸およびタンパク質の両方が関係する場合、転写因子とその転写因子の結合部位との反応など、タンパク質−脂質相互作用、核酸−脂質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、物質または因子がともに核酸である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して少なくとも一部に相補性を有することが包含される。また例えば、物質または因子がともにタンパク質である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」こととしては、例えば、抗原抗体反応による相互作用、レセプター−リガンド反応による相互作用、酵素−基質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。２種類の物質または因子がタンパク質および核酸を含む場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、転写因子と、その転写因子が対象とする核酸分子の結合領域との間の相互作用が包含される。したがって、本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの生物学的因子に対して「特異的に相互作用する因子」とは、そのポリヌクレオチドまたはそのポリペプチドなどの生物学的因子に対する親和性が、他の無関連の（特に、同一性が３０％未満の）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に（例えば、統計学的に有意に）高いものを包含する。そのような親和性は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、結合アッセイなどによって測定することができる。
【０１１６】
本明細書中で使用される「接触（させる）」とは、化合物を、直接的または間接的のいずれかで、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して物理的に近接させることを意味する。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、多くの緩衝液、塩、溶液などに存在し得る。接触とは、核酸分子またはそのフラグメントをコードするポリペプチドを含む、例えば、ビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコまたはマイクロアレイ（例えば、遺伝子チップ）などに化合物を置くことが挙げられる。
【０１１７】
本明細書において「複合体」とは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低分子などの分子が複数種連結してできた分子をいう。そのような複合体としては、例えば、糖脂質、糖ペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書では、配列番号２のアミノ酸を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントであって、ＬＯＸ−１に関する生物学的な活性を有する限り、それぞれの改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸分子も使用することができる。また、そのような核酸分子を含む複合体も使用することができる。
【０１１８】
本明細書において使用される場合、用語「３成分複合体」とは、広義には、第一の物質または因子と、この物質もしくは因子に特異的に相互作用する第二の物質もしくは因子と、これら第一の物質もしくは因子または第二の物質もしくは因子のいずれかに対して特異的に相互作用する第三の物質もしくは因子との複合体をいう。このような３成分複合体としては、受容体と、そのリガンドと、そのリガンドもしくはリガンド中の成分に特異的に相互作用する因子との複合体が挙げられるが、これに限定されない。最も狭義には、３成分複合体とは、本発明のＣＴＬＤ様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体もしくはＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤複合体と、ＬＯＸ−１もしくはＲＡＧＥのリガンドと、これらリガンドに対して特異的に結合する抗体との複合体をいう。３成分複合体を形成するために使用される抗体としては、代表的には、本発明の本発明のＣＴＬＤ様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体もしくはＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤複合体のリガンド（例えば、ＭＤＡ化ＬＤＬ、すなわちＭＤＡ−ＬＤＬ）またはリガンドに含まれる成分（例えば、リガンドがＭＤＡ−ＬＤＬの場合には、ＭＤＡ）に特異的に結合する抗体（例えば、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体または抗ＭＤＡ抗体）が挙げられるが、これらに限定されず、上記リガンドを認識する限りにおいて、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体が挙げられる）が使用されてもよい。
【０１１９】
本明細書において、ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して類似性または相同性を有するヌクレオチド鎖の相補鎖が標的配列に優先的にハイブリダイズし、そして類似性または相同性を有さないヌクレオチド鎖の相補鎖が実質的にハイブリダイズしない条件を意味する。ある核酸配列の「相補鎖」とは、核酸の塩基間の水素結合に基づいて対合する核酸配列（例えば、Ａに対するＴ、Ｇに対するＣ）をいう。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、そして種々の状況で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列についての熱融解温度（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。Ｔｍは、規定されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で、標的配列に相補的なヌクレオチドの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。「ストリンジェントな条件」は配列依存的であり、そして種々の環境パラメーターによって異なる。核酸のハイブリダイゼーションの一般的な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｎｉｑｕｅｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｐａｒｔ
Ｉ、第２章  「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅａｓｓａｙ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に見出される。
【０１２０】
代表的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ  Ｎａ＋未満であり、代表的には、ｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０ＭのＮａ＋濃度（または他の塩）であり、そして温度は、短いヌクレオチド（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、そして長いヌクレオチド（例えば、５０ヌクレオチドより長い）については少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成され得る。本明細書におけるストリンジェントな条件として、５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（３７℃）の緩衝溶液中でのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣで６０℃での洗浄が挙げられる。
【０１２１】
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、９０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【０１２２】
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、および５０％  ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ．１９８９）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＶ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ
ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。
【０１２３】
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。
【０１２４】
本明細書において「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が、形成し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、５０〜６５℃、または０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、および２０％ホルムアミド、３７〜５０℃である。例として、０．０１５Ｍ  ナトリウムイオン中、５０℃の「中程度にストリンジェントな」条件は、約２１％の不一致を許容する。
【０１２５】
本明細書において「高度」にストリンジェントな条件と「中程度」にストリンジェントな条件との間に完全な区別は存在しないことがあり得ることが、当業者によって理解される。例えば、０．０１５Ｍ  ナトリウムイオン（ホルムアミドなし）において、完全に一致した長いＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃（同じイオン強度）での洗浄において、これは、約６％不一致を許容にする。より離れた関連する配列を捕獲するために、当業者は、単に温度を低下させ得るか、またはイオン強度を上昇し得る。
【０１２６】
約２０ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、１Ｍ  ＮａＣｌにおける融解温度の適切な概算は、
Ｔｍ＝（１つのＡ−Ｔ塩基につき２℃）＋（１つのＧ−Ｃ塩基対につき４℃）
によって提供される。なお、６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）におけるナトリウムイオン濃度は、１Ｍである（Ｓｕｇｇｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ
Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅｓ、６８３頁、ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ（編）（１９８１）を参照のこと）。
【０１２７】
配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸は、本質的に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；４２℃の温度で  ７％  ＳＤＳ  を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に２×ＳＳＣ（６００ｍＭ  ＮａＣｌ；６０ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；５０℃の０．１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、さらに好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；  ７％  ＳＤＳ  を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に５０℃の１×ＳＳＣ（３００ｍＭ  ＮａＣｌ；３０ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、最も好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；２００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；７％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に６５℃の０．５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；０．１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下に配列番号１に示す配列の１つまたはその一部とハイブリダイズし得る。
【０１２８】
本明細書において「相同性」は、２以上の配列の比較において、それらの配列が進化的に祖先を共有することを示す。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較により類似性に基づいた判定をおこなうか、またはストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。配列の直接の比較により類似性に基づいた判定をおこなう場合、その類似性測定過程のアライメントにおける最も単純な解釈として、同一な（もしくは等価である）文字列（塩基、アミノ酸残基など）で並置されている文字列が、これらの領域が祖先配列のまま変化しなかったものであることを示し、同一でない（もしくは、等価でない）文字列が、突然変異が一方の配列で起こったものであるとの考察が可能である。アライメントにおけるギャップ（インデル）は、配列の一方で、挿入または欠失が起こったものであると考えられる。つまり、それらの配列の同一性または類似性は高いことは、それらの配列における相同性を強く示唆することが理解される。相同性は、発現抑制剤の設計において参照される。
【０１２９】
本明細書において「相補的」または「相補体」という用語は、本明細書では、相補領域全体がそのまま別の特定のポリヌクレオチドとＷａｔｓｏｎ  ＆  Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成することのできるポリヌクレオチドの配列を示す。本発明の目的で、第１のポリヌクレオチドの各塩基がその相補塩基と対になっている場合に、この第１のポリヌクレオチドは第２のポリヌクレオチドと相補であるとみなす。相補塩基は一般に、ＡとＴ（あるいはＡとＵ）、またはＣとＧである。本願明細書では、「相補」という語を「相補ポリヌクレオチド」、「相補核酸」および「相補ヌクレオチド配列」の同義語として使用する。これらの用語は、その配列のみに基づいてポリヌクレオチドの対に適用されるものであり、２つのポリヌクレオチドが事実上結合状態にある特定のセットに適用されるものではない。
【０１３０】
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトとマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子とβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用であることから、オルソログもまた、本発明において有用であり得る。
【０１３１】
本明細書において「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。このような塩基配列の改変法としては、制限酵素などによる切断、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、ＤＮＡリガーゼなどによる処理等による連結等の処理、合成オリゴヌクレオチドなどを用いた部位特異的塩基置換法（特定部位指向突然変異法；Ｍａｒｋ  Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４６８−５００（１９８３））が挙げられるが、この他にも通常分子生物学の分野で用いられる方法によって改変を行うこともできる。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。
【０１３２】
あるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、リガンド分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。
【０１３３】
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
【０１３４】
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、リガンド結合能において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。米国特許第４、５５４、１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタ
ミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン
（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
【０１３５】
本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３６】
本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
【０１３７】
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
【０１３８】
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加および／または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わること、または取り除かれることをいう。このような置換、付加および／または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。基準となる核酸分子またはポリペプチドにおけるこれらの変化は、目的とする機能（例えば、ＡＧＥの認識能など）が保持される限り、この核酸分子の５’末端もしくは３’末端で生じ得るか、またはこのポリペプチドを示すアミノ酸配列のアミノ末端部位もしくはカルボキシ末端部位で生じ得るか、またはそれらの末端部位の間のどこにでも生じ得、基準配列中の残基間で個々に散在する。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ＡＧＥの認識能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１５％以内、１０％以内、５％以内、または１５０個以下、１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
【０１３９】
本明細書において使用される場合、用語「フレキシブルなリンカー配列」とは、特定の立体構造をとらず、連結される分子の機能に影響を与えない分子をいう。このようなリンカー配列は、当業者に周知である。リンカー配列がある分子に連結した場合に、その分子がとるべき立体構造を妨害せず、その電荷に実質的に影響を及ぼさない限り、どのようなリンカー配列を使用してもよい。
【０１４０】
本明細書において使用される場合、用語「タグ配列」とは、受容体−リガンドのような特異的認識機構により分子を選別するための物質、より具体的には、特定の物質を結合するための結合パートナーの役割を果たす物質（例えば、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジンのような関係を有する）をいう。よって、例えば、タグ配列が結合した特定の物質は、タグ配列の結合パートナーを結合させた基材を接触させることで、この特定の物質を選別することができる。このようなタグ配列は、当該分野で周知である。代表的なタグ配列としては、ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡ、Ａｖｉタグなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４１】
本明細書において使用される場合、用語「検出剤」とは、広義には、目的の物質（例えば、変性ＬＤＬ、ＡＧＥなど）を検出できるあらゆる因子をいう。
【０１４２】
本明細書において使用される場合、用語「固相」とは、本明細書中において「基板」および「基材」と互換的に使用され、本発明のデバイスが構築される材料をいう。抗体のような分子が固定され得る平面状の支持体をいう。本発明において表面プラズモン共鳴の原理を用いて検出する場合、固相は、金、銀またはアルミニウムを含む金属薄膜を片面に持つガラス基板の基材であることが好ましい。本発明において水晶発振子マイクロバランスの原理を用いて検出する場合は、周波数変換素子（例えば水晶発振子、表面弾性波素子）を固相として用い、直接受容体を結合させる。水晶板の片面はシリコーンで被覆し、もう一方の面は金電極を施したものを固相として用いる。本発明において酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）のような機構を使用する場合、一般に、固相（基材）としては、マイクロタイタープレートが使用される。基板の材料としては、共有結合かまたは非共有結合のいずれかで、本発明において使用される生体分子に結合する特性を有するかまたはそのような特性を有するように誘導体化され得る、任意の固体材料が挙げられる。適切な基材としては、ビーズ、金粒子、プレート（例えば、マイクロタイタープレート）、試験管、チップ、磁性粒子、膜、繊維、スライドガラス、金属薄膜、フィルター、チューブ、ボール、ダイアモンド様炭素被膜ステンレスなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４３】
固相および基板として使用するためのそのような材料としては、固体表面を形成し得る任意の材料が使用され得るが、例えば、ガラス、シリカ、シリコーン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属（合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、ポリスチレン、セルロース、アミロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）以下が挙げられるがそれらに限定されない。基板は、複数の異なる材料の層から形成されていてもよい。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素などの無機絶縁材料を使用できる。また、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を用いることができる。本発明においてはまた、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜など、ブロッティングに使用される膜を用いることもできる。高密度のものを解析する場合は、ガラスなど硬度のあるものを材料として使用することが好ましい。基板として好ましい材質は、測定機器などの種々のパラメータによって変動し、当業者は、上述のような種々の材料から適切なものを適宜選択することができる。
【０１４４】
本明細書において「チップ」は、多様の機能をもち、システムの一部となる超小型集積回路をいう。本明細書において、ビオチン化受容体を固定化した固相を、受容体チップおよび／または受容体マイクロチップと呼ぶ。
【０１４５】
本明細書において使用される場合、用語「乾燥形態」とは、本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体もしくはＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体を含む検出剤、デバイス、診断剤などにおいて、実質的に水分含量が低下している状態であることをいう。一般的には、「乾燥状態」は、風乾、減圧乾燥などの当該分野で周知の技術を用いて容易に達成することができる。
【０１４６】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ
ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【０１４７】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【０１４８】
本発明において用いられる配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドならびにそのフラグメントおよび改変体は、遺伝子工学技術を用いて生産することができる。
【０１４９】
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」または「組み換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。ベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」という。そのようなクローニングベクターは通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。そのような制限酵素部位およびマルチプルクローニング部位は、当該分野において周知であり、当業者は、目的に合わせて適宜選択して使用することができる。そのような技術は、本明細書に記載される文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）に記載されている。好ましいベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、エピソーム、ウイルス粒子またはウイルスおよび組み込み可能なＤＮＡフラグメント（すなわち、相同組換えによって宿主ゲノム中に組み込み可能なフラグメント）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５０】
ベクターの１つの型は、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状二重鎖ＤＮＡループをいう。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノム中に連結され得る。特定のベクター（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）は、これらが導入される宿主細胞中で自律的に複製し得る。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、これらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書中で、「発現ベクター」といわれる。
【０１５１】
従って、本明細書において「発現ベクター」または「発現プラスミド」とは、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、哺乳動物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【０１５２】
本発明において用いられ得る原核生物細胞に対する「組み換えベクター」としては、ｐｃＤＮＡ３（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ（＋／−）、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＧＦＰ、ｐＨＡＴ、ｐＵＣ１８、ｐＦＴ−ＤＥＳＴＴＭ４２ＧＡＴＥＷＡＹ、ｐＥＮＴＲＴＭ／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが例示される。原核生物細胞は、遺伝子の増幅、改変などに用いることができる。
【０１５３】
本明細書において用いられ得る真核生物細胞に対する「組み換えベクター」としては、ｐＥＣＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＡｃＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐＥＹＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐＤｓＲＥＤ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐＴＲＥ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐＣＭＶ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＴａｒｇｅｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）などを挙げることができるがそれらに限定されない。
【０１５４】
本明細書において「哺乳動物発現ベクター」は、本発明の遺伝子の発現を調節するプロモーターなどの種々の調節エレメントが宿主細胞中で作動可能に連結されている核酸配列をいう。本願明細書で用いる用語「制御配列」は、機能的プロモーターおよび、任意の関連する転写要素（例えば、エンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有するＤＮＡ配列をいう。本願明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子が発現し得るように、それに関するポリヌクレオチドと、その発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントとが宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。哺乳動物発現ベクターは、好適には、哺乳動物遺伝子、プロモーター、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子およびエンハンサーを含み得る。発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【０１５５】
上記のような哺乳動物発現ベクターは、当業者に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製され得る。哺乳動物発現ベクターの構築には、例えば、ｐＥＣＦＰ系のベクター、ｐｃＤＮＡ系のベクターなどが好適に用いられるが、これらに限定されない。
【０１５６】
本明細書において「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、およびポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に寄与し、そして遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。
【０１５７】
本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。
【０１５８】
プロモーターは、誘導性であっても、構成的であっても、部位特異的であっても、時期特異的であってもよいが、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターが好ましい。プロモーターとしては、例えば、哺乳動物細胞、大腸菌、酵母などの宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。
【０１５９】
本明細書において、プロモーターの発現が「構成的」であるとは、生物のすべての組織において、その生物の成長／増殖のいずれにあってもほぼ一定の量で発現される性質をいう。具体的には、ノーザンブロット分析したとき、例えば、任意の時点で（例えば、２点以上（例えば、５日目および１５日目））の同一または対応する部位のいずれにおいても、ほぼ同程度の発現量がみられるとき、本発明の定義上、発現が構成的であるという。構成的プロモーターは、通常の生育環境にある生物の恒常性維持に役割を果たしていると考えられる。本発明のプロモーターの発現が「応答性」であるとは、少なくとも１つの因子が生物体に与えられたとき、その発現量が変化する性質をいう。特に、発現量が増加する性質を因子に対して「誘導性」といい、発現量が減少する性質を因子に対して「減少性」という。「減少性」の発現は、正常時において、発現が見られることを前提としているので、「構成的」な発現と重複する概念である。これらの性質は、生物の任意の部分からＲＮＡを抽出してノーザンブロット分析で発現量を分析することまたは発現されたタンパク質をウェスタンブロットにより定量することにより決定することができる。因子に対して誘導性のプロモーターを本発明の部位特異的組換え誘導因子をコードする核酸とともに組み込んだベクターで形質転換された哺乳動物細胞または哺乳動物（特定の組織などを含む）は、そのプロモーターの誘導活性をもつ刺激因子を用いることにより、ある条件下での部位特異的組換え配列の部位特異的組換えを行うことができる。
【０１６０】
本発明のポリヌクレオチドは、そのままでまたは改変されて、当業者に周知の方法を用いて、適切な発現ベクターに連結され、公知の遺伝子組換え技術により、宿主細胞に導入され得る。導入された遺伝子は、宿主細胞中のＤＮＡに組み込まれて存在する。なお、宿主細胞中のＤＮＡとは、染色体のみならず、宿主細胞中に含まれる各種オルガネラ（例えば、ミトコンドリアなど）に含まれるＤＮＡを含む。
【０１６１】
大腸菌を宿主細胞として使用する場合、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌およびファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を挙げることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ  ｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ  Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【０１６２】
本明細書において「複製起点」とは、ＤＮＡ複製が開始する染色体上の特定領域をいう。複製起点は、内因性起点を含むようにそのベクターを構築することによって提供され得るか、または宿主細胞の染色体複製機構により提供され得るかのいずれかであり得る。そのベクターが、宿主細胞染色体中に組み込まれる場合、後者が十分であり得る。あるいは、ウイルス複製起点を含むベクターを使用するよりも、当業者は、選択マーカーと本発明のＤＮＡとを同時形質転換する方法によって、哺乳動物細胞を形質転換し得る。適切な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼである（米国特許第４，３９９，２１６号を参照）。
【０１６３】
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
【０１６４】
本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．およびその第三版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
【０１６５】
また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられる。
【０１６６】
本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。本発明において用いられる細胞は、形質転換体であってもよい。
【０１６７】
本発明において遺伝子操作などにおいて原核生物細胞が使用される場合、原核生物細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属などに属する原核生物細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ１が例示される。
【０１６８】
本明細書において使用される場合、組換えベクターの導入方法としては、ＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、リポフェクション法、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法などが挙げられる。
【０１６９】
本明細書において遺伝子発現（たとえば、ｍＲＮＡ発現、ポリペプチド発現）の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２００２  Ｄｅｃ；３２  Ｓｕｐｐｌ：５２６−３２に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔  羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
【０１７０】
本明細書において使用される場合、用語「標識」とは、特定の物質を検出するために、この物質に結合することが既知の物質に付加される分子をいう。標識としては、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７１】
本明細書において使用される場合、用語「リフォールディング」とは、異常な折り畳みを有するためにその本来有する機能を失っているポリペプチドの異常な構造を解きほぐし、界面活性剤により再凝集を防ぎつつ、サイクロアミロースの包接能を活用してそのポリペプチドの本来の正しい構造に再折りたたみすることをいう。
【０１７２】
本明細書において使用される場合、用語「界面活性剤」とは、液体に溶解すると、溶液の表面張力を著しく減少させる物質をいう。界面活性剤は、溶液の中で臨海ミセル濃度を超えると、ミセルコロイドを形成する。界面活性剤は、親水性基と親油性基とを有するために、両親媒性化合物であり、二相界面で方向配位をして安定な層をなす。界面活性剤は、長鎖脂肪酸塩やドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のような陰イオン性界面活性剤、臭化セチルトリメチルアンモニウムのような陽イオン界面活性剤、さらに両性界面活性剤、ＴｒｉｔｏｎシリーズおよびＴｗｅｅｎシリーズのような非イオン性界面活性剤に分けられる。適切な界面活性剤としては、ポリオキシエチレン系界面活性剤、イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７３】
（好ましい実施形態の説明）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。
【０１７４】
本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、
（Ａ１）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
（Ａ２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、９０位および１０７位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示す、アミノ酸配列；および
（Ａ３）配列番号１に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９０位および１０７位のアミノ酸は、配列番号２における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示す、アミノ酸配列；
（Ｂ１）配列番号６に示されるアミノ酸配列；
（Ｂ２）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１０４位および１２１位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＬＯＸ−１の活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｂ３）配列番号５に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において１０４位および１２１位のアミノ酸は、配列番号６における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示す、アミノ酸配列；
（Ｃ１）配列番号８に示されるアミノ酸配列；
（Ｃ２）配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１７２位および１８９位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＬＯＸ−１の活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｃ３）配列番号７に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において１７２位および１８９位のアミノ酸は、配列番号８における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示す、アミノ酸配列；
からなる群より選択される配列を含む、Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体を含み得る。好ましくは、本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、変性ＬＤＬの認識能を有し得る。好ましいのは、上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号４における２３２位および２４９位のアミノ酸に対応するアミノ酸がＡ（アラニン）であるＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体である。このポリペプチド部分は、上記部位を変異させたことによって、大過剰のプロテアーゼに曝されても、分解されず、天然型ＬＯＸ−１の活性を保持している。
【０１７５】
一実施形態において、本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、そのＣ型レクチン様ドメインポリペプチドにおいて保存的置換を含んでいてもよい。別の実施形態において、本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体はまた、天然型ＬＯＸ−１の活性を保持している限りにおいて、そのＣ型レクチン様ドメインポリペプチドにおいて欠失を含んでいてもよい。好ましい欠失としては、（Ａ１）〜（Ｃ３）に示されるアミノ酸配列において、そのＣ末端から１〜６個目までのいずれか１〜６個のアミノ酸の欠失、配列番号４におけるアミノ酸配列の２００位〜２０５位までに対応するアミノ酸配列のうちのいずれかのアミノ酸の欠失、もしくは配列番号２のアミノ酸配列の１位のアミノ酸に対応するアミノ酸の欠失、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられ得る。
【０１７６】
特に好ましいＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体としては、（Ｐ１）〜（Ｘ３）の各アミノ酸配列において、配列番号４における１４４位、１５５位、１７２位、２４３位、２５６位、２６４位に対応するシステインが保持されているものが挙げられる。
【０１７７】
なお別の実施形態において、本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、そのＣ型レクチン様ドメインポリペプチドにおいて別の分子の付加を含んでいてもよい。好ましくは、このような付加は、（Ａ１）〜（Ｃ３）に示されるアミノ酸配列において、配列番号４の６１位〜１４２位に対応するアミノ酸から選択される任意の連続する１〜８２個のアミノ酸配列、リンカー配列もしくはその反復配列、またはＬＤＬ受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）のＥＧＦ反復配列（上皮増殖因子受容体様システインリッチドメインを含む配列）の付加が挙げられるが、これらに限定されない。好ましいリンカー配列としては、Gly-Gly-Ser、配列番号１５、配列番号１６に示されるアミノ酸配列、または他の当該分野で公知のフレキシブルなリンカー配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７８】
特に好ましい実施形態において、本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み得る。
【０１７９】
一実施形態において、本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、タグ配列をさらに含み得る。上記タグ配列としては、代表的には、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８０】
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、標識をさらに含み得る。代表的な標識としては、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい蛍光標識としては、フルオレセイン、フルオレセインイソチアネート、ローダミン、過塩素酸１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン（ＤｉＤ）、過塩素酸１，１’−ジオクタデシル−３，３，３７，３７−テトラメチル−ｅｎｄｏ−カルボシアニン（ＤｉＩ）、Ａｌｅｘａ、蛍光タンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい化学発光標識としては、ルミノール、ルシゲニンなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい生物発光標識としては、ルシフェラーゼ、エクオリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８１】
好ましい一実施形態において、本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、二量体であり得る。さらに好ましくは、本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、多量体であり得る。別の好ましい一実施形態において、本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、ジスルフィド結合によって結合された二量体であり得る。本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、単量体で変性ＬＤＬを認識できるので、必ずしも二量体である必要はないが、より高い認識能を発揮するためには、二量体または多量体を形成することが好ましい。本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、１４０位（ここでこの番号付けは、ＬＯＸ−１のアミノ酸配列（配列番号４）に従う）のシステインによって分子間でジスルフィド結合されるのが好ましい。このような分子間ジスルフィド結合によって、生体内で通常発現されているような状態を再現することができ、より高感度な変性ＬＤＬの認識が可能になる。
【０１８２】
本発明はまた、上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体を含む、変性ＬＤＬ検出剤；変性ＬＤＬ検出用キット；動脈硬化などの変性ＬＤＬによって引き起こされる疾患を診断するための診断剤を包含し得る。さらに、本発明は、これらを用いて被験体のサンプル中の変性ＬＤＬを検出する方法；変性ＬＤＬ検出システム；ＬＤＬによって引き起こされる疾患の診断を支援する方法を包含し得る。上記変性ＬＤＬによって引き起こされる疾患としては、代表的には、動脈硬化症、冠動脈疾患、動脈炎、動脈硬化症に基づく冠攣縮性狭心症、拡張型心筋症、虚血性心疾患（心筋梗塞、狭心症など）、脳血管障害（脳梗塞、脳出血、くも膜下出血、一過性脳虚血発作など）、大動脈瘤、腎梗塞、高脂血症などなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８３】
本発明の検出剤および診断剤は、当該分野で周知の賦形剤を含み得る。このような賦形剤は、本発明のポリペプチドのリガンド認識能を妨害しない限り、どのようなものであってもよいことが理解される。また、このような検出剤およびキット中に含まれるＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、液体として提供されてもよいし、使用時に適宜調製するための乾燥粉体、乾燥フィルム、固相化物として提供されてもよい。
【０１８４】
本発明はさらに、上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体と基材とを含む変性ＬＤＬ検出用デバイス、上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体を含む変性ＬＤＬ検出剤などを使用して変性ＬＤＬを検出する方法を包含し得る。
【０１８５】
本発明の方法は、上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体、デバイス、検出剤などを、サンプルと接触させて、サンプル中に含まれる変性ＬＤＬと複合体を形成させる工程を包含し得る。一実施形態において、上記サンプルは、ＬＤＬを含む体液であり得る。代表的には、これらの体液としては、血液、血清、血漿、髄液、漿膜腔液、肺胞洗浄液などが挙げられ得るが、これらに限定されない。サンプルは、予め標識されていてもよいし、そうでなくてもよい。
【０１８６】
一実施形態において、本発明の方法は、上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体、デバイス、検出剤などを、上記サンプルと接触させた後に、変性ＬＤＬもしくは変性ＬＤＬに含まれる成分に結合する抗体と接触させて、Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体と変性ＬＤＬと抗体との３成分複合体を形成させる工程を包含し得る。このように３成分複合体を形成させると、変性ＬＤＬをさらに特異的に検出できる可能性があり、よって、検出される変性ＬＤＬの種類、変性ＬＤＬにおける各種分子の組成などが明らかにできる。使用される好ましい抗体としては、抗ＡｐｏＢ抗体、抗ＯｘＬＤＬ抗体、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体、抗アクロレイン（ＡＣＲ）抗体、抗クロトンアルデヒド（ＣＲＡ）抗体、抗マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）抗体、抗４−ヒドロキシノネナール（ＨＮＥ）抗体、抗ヘキサノイルリジン（ＨＥＬ）抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８７】
一実施形態において、上記デバイスは、採用される検出方法／検出手段に依存して、種々の形態をとり得る。上記デバイスにおいて使用される好ましい基材としては、ビーズ、金粒子、プレート（例えば、マイクロタイタープレート）、試験管、チップ、磁性粒子、膜、繊維、スライドガラス、金属薄膜、フィルター、チューブ、ボール、ダイアモンド様炭素被膜ステンレスなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、上記ビーズは、ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂、天然樹脂、プラスチック、ゼラチン、シリカゲル、金属、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、アガロース、ポリアミノ酸、セルロース、ハイドロキシアパタイト、ポリエチレン、ポリスルフォン、ポリプロピレン、セルロースアセテート、ポリメチルメタクリレート、セルロースジアセテート、メチレンビニルアルコールから作製されるビーズなどであり得る。
【０１８８】
さらに、本発明の方法は、複合体を検出する工程を包含し得る。複合体を検出するための手段／検出方法はまた、本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体に付加されている標識によって変動し得る。代表的な検出手段としては、光学的検出手段、物理的検出手段、化学的検出手段が挙げられる。好ましい実施形態において、上記光学的検出手段としては、一般に、分光光度計、ＦＡＣＳ、比色計、蛍光光度計、化学発光検出器、電気化学発光検出器、イメージアナライザー、顕微鏡などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、上記物理的検出手段としては、一般に、電気検出、表面プラズモン共鳴、水晶発振マイクロバランス、熱測定などが挙げられるが、これらに限定されない。上記化学的検出手段としては、一般に、質量分析法、高速液体クロマトグラフィーなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８９】
最も簡便に使用される変性ＬＤＬの検出方法は、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）を採用するものである。ＥＬＩＳＡは、標識系として酵素とその基質を用いる結合測定法であり、当該分野で周知である。
【０１９０】
本発明の変性ＬＤＬによって引き起こされる疾患の診断を支援する方法においては、上記疾患に罹患していない被験体（例えば、健常者）サンプルと、上記疾患に罹患していることが疑われる被験体（患者）サンプルの両方で変性ＬＤＬが検出され、これらのサンプル間で本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体と変性ＬＤＬとの複合体の量が比較されて、上記疾患が疑われている被験体中の変性ＬＤＬのコントロール被験体に対する相対値が算出される。基準物質としては、ＭＤＡ−ＬＤＬ（正常範囲：１０〜８０Ｕ／Ｌ）および酸化ホスファチジルコリン（正常範囲：８．４Ｕ／ｍＬ〜１７．６Ｕ／ｍＬ）が使用される。これらの正常範囲を参考にすることもできる。この相対値が異常値である場合、上記疾患に罹患していると診断され得る。変性ＬＤＬによって引き起こされる疾患は、代表的には、動脈硬化症、冠動脈疾患、動脈炎、動脈硬化症に基づく冠攣縮性狭心症、拡張型心筋症、虚血性心疾患（心筋梗塞、狭心症など）、脳血管障害（脳梗塞、脳出血、くも膜下出血、一過性脳虚血発作など）、大動脈瘤、腎梗塞、高脂血症、および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のような自己免疫疾患などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９１】
本発明の後期糖化反応生成物レセプター（ＲＡＧＥ）様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体を提供し得、ここで該ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、
（Ｐ１）配列番号１２に示されるアミノ酸配列；
（Ｐ２）配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｐ３）配列番号１１に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸は、配列番号１２における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｑ１）配列番号１４に示されるアミノ酸配列；
（Ｑ２）配列番号１４に示されるアミノ酸配列において、９２位、９５位、２０６位および２５０位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｑ３）配列番号１３に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位、９５位、２０６位および２５０位のアミノ酸は、配列番号１４における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｒ１）配列番号３７に示されるアミノ酸配列；
（Ｒ２）配列番号３７に示されるアミノ酸配列において、９２位、９５位および２０６位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｒ３）配列番号３６に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位、９５位および２０６位のアミノ酸は、配列番号３７における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｓ１）配列番号３９に示されるアミノ酸配列；
（Ｓ２）配列番号３９に示されるアミノ酸配列において、９２位、９５位および２０６位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｓ３）配列番号３８に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位、９５位および２０６位のアミノ酸は、配列番号３９における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｔ１）配列番号４１に示されるアミノ酸配列；
（Ｔ２）配列番号４１に示されるアミノ酸配列において、１４位、１７位、１２８位および１７２位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｔ３）配列番号４０に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において１４位、１７位、１２８位および１７２位のアミノ酸配列は、配列番号４１における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｕ１）配列番号４３に示されるアミノ酸配列；
（Ｕ２）配列番号４３に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｕ３）配列番号４２に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸は、配列番号４３における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｖ１）配列番号４５に示されるアミノ酸配列；
（Ｖ２）配列番号４５に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｖ３）配列番号４４に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸は、配列番号４５における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｗ１）配列番号４７に示されるアミノ酸配列；
（Ｗ２）配列番号４７に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｗ３）配列番号４６に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸は、配列番号４７における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
（Ｘ１）配列番号４９に示されるアミノ酸配列；
（Ｘ２）配列番号４９に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（Ｘ３）配列番号４８に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸は、配列番号４９における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
からなる群より選択される配列を含み得る。好ましくは、本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、ＡＧＥの認識能を有し得る。好ましいのは、上記ＲＡＧＥ様ポリペプチドのアミノ酸配列各々において、配列番号１０における１１４位、１１７位、２２８位および２７２位に対応するアミノ酸が、それぞれＱ（グルタミン）、Ａ（アラニン）、Ｎ（アスパラギン）、およびＩ（イソロイシン）であるＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体である。このポリペプチド部分は、上記部位を変異させたことによって、大過剰のプロテアーゼに曝されても、分解されず、天然型ＲＡＧＥの活性を保持している。
【０１９２】
一実施形態において、本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、そのＲＡＧＥ様ポリペプチドにおいて保存的置換を含んでいてもよい。別の実施形態において、本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体はまた、天然型ＲＡＧＥの活性を保持している限りにおいて、そのＲＡＧＥ様ポリペプチドにおいて欠失を含んでいてもよい。好ましい欠失としては、（Ｐ１）〜（Ｘ３）に示されるアミノ酸配列において、配列番号１０のアミノ酸配列における３７位（リジン）に対応するアミノ酸の位置までの欠失が挙げられる。
【０１９３】
特に好ましいＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤複合体としては、配列番号１０における３８位、９９位、１４４位、２０８位、２５９位および３０１位におけるシステインに対応するアミノ酸がさらに保持されているものが挙げられる。
【０１９４】
別の実施形態において、本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、そのＲＡＧＥ様ポリペプチドにおいて別の分子の付加を含んでいてもよい。好ましくは、このような付加は、（Ｐ１）〜（Ｘ３）に示されるアミノ酸配列において、配列番号１０の１位〜２２位から選択される任意の１〜２２個のアミノ酸配列のＮ末端側への付加、配列番号１０の１２１位〜４０４位に対応するアミノ酸列から選択される任意の連続する１〜２８４個のアミノ酸の付加、あるいはフレキシブルなリンカー配列もしくはその反復配列、またはＬＤＬ受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）のＥＧＦ反復配列（上皮増殖因子受容体様システインリッチドメインを含む配列の付加が挙げられるが、これらに限定されない。好ましいリンカー配列としては、Gly-Gly-Ser、配列番号１５、配列番号１６に示されるアミノ酸配列、または他の当該分野で公知のフレキシブルなリンカー配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９５】
特に好ましい実施形態において、本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、配列番号１２、１４、３７、３９、４１、４３、４５、４７および４９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み得る。
【０１９６】
本発明の一実施形態において、本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、タグ配列をさらに含み得る。上記タグ配列としては、代表的には、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９７】
好ましい実施形態において、本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、標識をさらに含み得る。代表的な標識としては、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい蛍光標識としては、フルオレセイン、フルオレセインイソチアネート、ローダミン、過塩素酸１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン（ＤｉＤ）、過塩素酸１，１’−ジオクタデシル−３，３，３７，３７−テトラメチル−ｅｎｄｏ−カルボシアニン（ＤｉＩ）、Ａｌｅｘａ、蛍光タンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい化学発光標識としては、ルミノール、ルシゲニンなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい生物発光標識としては、ルシフェラーゼ、エクオリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９８】
本発明はまた、上記ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体を含む、ＡＧＥ検出剤；ＡＧＥ検出用キット；糖尿病性血管障害などのようなＡＧＥによって引き起こされる疾患を診断するための診断剤を包含し得る。さらに、本発明は、これらを用いて被験体のサンプル中のＡＧＥを検出する方法；ＡＧＥ検出システム；ＡＧＥによって引き起こされる疾患の診断を支援する方法を包含し得る。上記ＡＧＥによって引き起こされる疾患としては、糖尿病、非糖尿病性の腎機能障害、糸球体腎炎、糖尿病性血管障害、腎不全、細小血管症（腎症、網膜症、神経症など）、大血管障害（虚血性心疾患、脳血管疾患、閉塞性動脈硬化症などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９９】
本発明の検出剤および診断剤は、当該分野で周知の賦形剤を含み得る。このような賦形剤は、本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体のリガンド認識能を妨害しない限り、どのようなものであってもよいことが理解される。また、このような検出剤およびキット中に含まれるＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、液体として提供されてもよいし、使用時に適宜調製するための乾燥粉体、乾燥フィルム、固相化物として提供されてもよい。
【０２００】
本発明はさらに、上記ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体、上記ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体と基材とを含むＡＧＥ検出用デバイス、上記ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体を含むＡＧＥ検出剤などを使用してＡＧＥを検出する方法を包含し得る。
【０２０１】
本発明の方法は、上記ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体、デバイス、検出剤などを、サンプルと接触させて、サンプル中に含まれるＡＧＥと複合体を形成させる工程を包含し得る。一実施形態において、上記サンプルは、タンパク質を含む体液であり得る。代表的には、これらの体液としては、血液、血清、血漿、髄液、漿膜腔液、関節液、肺胞洗浄液、涙液、尿などが挙げられるが、これらに限定されない。サンプルは、予め標識されていてもよいし、そうでなくてもよい。
【０２０２】
一実施形態において、本発明の方法は、上記ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体、デバイス、検出剤などを、上記サンプルと接触させた後に、ＡＧＥもしくはＡＧＥに含まれる成分に結合する抗体と接触させて、ＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体とＡＧＥと抗体との３成分複合体を形成させる工程を包含し得る。このように３成分複合体を形成させると、ＡＧＥをさらに特異的に検出できる可能性があり、よって、検出されるＡＧＥの種類、ＡＧＥにおける各種分子の組成などが明らかにできる。使用される好ましい抗体としては、抗ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）抗体、抗ＡＧＥ抗体および抗カルボキシメチルリジン抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０３】
一実施形態において、上記デバイスは、採用される検出方法／検出手段に依存して、種々の形態をとり得る。上記デバイスにおいて使用される好ましい基材としては、ビーズ、金粒子、プレート（例えば、マイクロタイタープレートが挙げられる）、試験管、チップ、磁性粒子、膜、繊維、スライドガラス、または金属薄膜などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、上記ビーズは、ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂、天然樹脂、プラスチック、ゼラチン、シリカゲル、金属、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、アガロース、ポリアミノ酸、セルロース、ハイドロキシアパタイト、ポリエチレン、ポリスルフォン、ポリプロピレン、セルロースアセテート、ポリメチルメタクリレート、セルロースジアセテート、メチレンビニルアルコールから作製されるビーズなどであり得る。
【０２０４】
さらに、本発明の方法は、複合体を検出する工程を包含し得る。複合体を検出するための手段／検出方法はまた、本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体に付加されている標識によって変動し得る。代表的な検出手段としては、光学的検出手段、物理的検出手段、化学的検出手段が挙げられる。好ましい実施形態において、上記光学的検出手段としては、一般に、分光光度計、ＦＡＣＳ、比色計、蛍光光度計、化学発光検出器、電気化学発光検出器、イメージアナライザー、顕微鏡などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、上記物理的検出手段としては、一般に、電気検出、表面プラズモン共鳴、水晶発振マイクロバランス、熱測定などが挙げられるが、これらに限定されない。上記化学的検出手段としては、一般に、質量分析法、高速液体クロマトグラフィーなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０５】
最も簡便に使用されるＡＧＥの検出方法は、分解反応後のＨＰＬＣ分析、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）を採用するものである。ＥＬＩＳＡでは、標識系として酵素とその基質を用いる結合測定法であり、当該分野で周知である。
【０２０６】
本発明のＡＧＥによって引き起こされる疾患の診断を支援する方法においては、上記疾患に罹患していない被験体（例えば、健常者）サンプルと、上記疾患に罹患していることが疑われる被験体（患者）サンプルの両方でＡＧＥが検出され、これらのサンプル間で本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体とＡＧＥとの複合体の量が比較されて、上記疾患が疑われている被験体中のＡＧＥのコントロール被験体に対する相対値が算出される。基準物質としては、ピラリン（正常範囲：血漿中２３ｐｍｏｌ／ｍＬ未満）、ペントシジン（正常範囲：血漿中０．００９１５〜０．０４３１μｇ／ｍＬ（ＥＬＩＳＡで測定した場合））が使用される（「今日の臨床検査  ２００７−２００８」発行所  株式会社  南江堂、参照）。これらの正常範囲を参考にすることもできる。この相対値が異常値である場合、上記疾患に罹患していると診断される。ＡＧＥによって引き起こされる疾患は、代表的には、糖尿病、非糖尿病性の腎機能障害、糸球体腎炎、糖尿病性血管障害、腎不全、細小血管症（腎症、網膜症、神経症など）、大血管障害（虚血性心疾患、脳血管疾患、閉塞性動脈硬化症などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０７】
（ＣＴＬＤ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体およびＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体の生成）
１つの局面において、本発明は、Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチド−界面活性剤結合複合体を製造する方法およびＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体を提供する。この方法は、Ｃ型レクチン様ドメインペプチドまたはＲＡＧＥ様ポリペプチドを大腸菌で封入体として大量生産する工程を包含し得る。大腸菌などの細菌宿主細胞を用いて、外来タンパク質を多量に発現すると、封入体を形成する場合が多い。封入体は、ポリペプチドの折り畳みが異常であり、そのため、ポリペプチドが本来有する機能を失っている場合が多い。そこで、（１）封入体を形成しない（または少量のみの封入体を形成する）宿主細菌細胞の使用、（２）封入体を形成しない条件での宿主細菌細胞の培養、（３）形成された封入体のリフォールディング、または、（４）これら（１）〜（３）の組合せを用いる必要がある。これら各々について、限定されることはないが、例えば、本発明の方法は、さらに該封入体を界面活性剤とサイクロアミロースでリフォールディングする工程を包含し得る。
【０２０８】
本明細書において、封入体として発現された本発明のポリペプチドのリフォールディングは、変性剤により間違った高次構造を解きほぐした後、環状糖質サイクロアミロースとポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する溶液中、または環状糖質サイクロアミロースとイオン性界面活性剤を含有する溶液中で行われる。本明細書において使用される環状糖質サイクロアミロース（ＣＡと略す）の重合度の下限は１７以上、好ましくは３０以上、より好ましくは５０以上であり、重合度の上限は５００以下、好ましくは２００以下、より好ましくは１００以下である。
【０２０９】
上記リフォールディング法に使用されるポリオキシエチレン系界面活性剤としては、一般式ＣｎＨ２ｎ＋１（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｘＯＨと表され、通常ＣｎＥｘと略記されるポリオキシエチレン系界面活性剤、好ましくはポリオキシエチレンソルビタンエステル、ポリオキシエチレンドデシルエーテル、ポリオキシエチレンヘプタメチルヘキシルエーテル、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステルまたはスクロース脂肪酸エステルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１０】
上記リフォールディング法に使用されるイオン性界面活性剤としては、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシル硫酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、３−[(３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホン酸、ヘキサデシ
ルトリメチルアンモニウムブロマイド（以下、ＣＴＡＢと略記することもある。）、ミリスチルサルフォベタイン（以下、ＳＢ３−１４と略記することもある。）などが挙げられ、特に、ＣＴＡＢ、ＳＢ３−１４などのカチオン系、ないしは両性界面活性剤が望ましいが、これらに限定されない。
【０２１１】
正しい高次構造にリフォールディングする際に使用する特に好ましい界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、ポリオキシエチレンドデシルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステルまたはスクロース脂肪酸エステル、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムプロマイド（ＣＴＡＢ）、デオキシコール酸ナトリウム、ミリスチルサルフォベタイン（ＳＢ３−１４）等が挙げられる。
【０２１２】
界面活性剤を過剰量に添加することにより、ポリペプチドなどを変性状態にしている物質を希釈すると共に、ポリペプチド−界面活性剤複合体を形成させて、ポリペプチド同士の凝集を防ぐことができる。また、環状糖質としては、前記したように、重合度が１７以上の環状α−１，４−グルカンなどを挙げることができる。
【０２１３】
また、リフォールディングしたポリペプチドをアビジンもしくはストレプトアビジンを介して方向性を保った状態で固相上に固定し、例えばマイクロタイタープレート、ビーズなどに結合させたり、表面プラズモン共鳴や水晶発振子マイクロバランスなどの原理を利用した検出機器のセンサー部位として利用したりすることによって、変性ＬＤＬまたはＡＧＥなどを簡便に検出することが可能である。
【０２１４】
上記リフォールディング法に従って、間違った構造を取っているポリペプチドの構造を変性剤により解きほぐした後、過剰量の界面活性剤を添加することにより、本発明のポリペプチドを変性状態にしている物質を希釈すると共に、ポリペプチド−界面活性剤複合体を形成させ、ポリペプチド同士の凝集を防ぎ、次いで重合度が１７以上の環状α−１，４−グルカンを添加し、その包接能を利用して前記ポリペプチド−界面活性剤複合体から界面活性剤を除き、ポリペプチドを、リガンド認識能を有する正しい高次構造に戻し、センサーとして利用することも可能である。
【０２１５】
大腸菌内に蓄積した本発明のポリペプチドのリガンド認識に関係する領域の再構成は、第１段階として、不溶性画分に回収された受容体の細胞外領域またはリガンド認識領域を、最終濃度で４０ｍＭのＤＴＴを含む６Ｍのグアニジン塩酸塩中で１時間処理し、間違った構造を解きほぐすことにより行う。続いて、第２段階として、７０倍容量の０．０１〜０．１５％の範囲の界面活性剤溶液、好ましくは、０．０５〜０．１％界面活性剤溶液（最終濃度で２ｍＭのＤＬ−ｃｙｓｔｉｎｅを含むＴＢＳ）を添加し、室温で１時間反応させる。
【０２１６】
この過程で、変性剤が希釈されると同時に、変性剤の希釈に伴う受容体同士の凝集は、添加した界面活性剤が受容体・界面活性剤複合体を形成することにより防止される。さらに、最終段階として、最終濃度で０．６％になるように３％のＣＡ保存溶液を添加し、室温で１時間反応させる。ＣＡは、受容体・界面活性剤複合体から界面活性剤を剥離する。この過程で受容体は正しい立体構造にリフォールディングされ、再構成受容体を得ることができる。
【０２１７】
上記リフォールディング法に用いる変性剤としては、グアニジン塩酸塩、尿素などがあるが、間違った構造を完全に解きほぐす目的で、最終濃度で６Ｍのグアニジン塩酸塩を一般に用いる。また、間違って形成されているＳ−Ｓ結合を切断する目的で、変性剤溶液中には最終濃度で４０ｍＭのＤＴＴを添加する。処理するタンパク質濃度は、１０〜２５ｍｇ／ｍ１程度である。封入体をＴＢＳに懸濁した後、最終濃度で４０ｍＭのＤＴＴを含む最終濃度６Ｍのグアニジン塩酸塩を加え、室温で１時間反応させる。
【０２１８】
発現させたポリペプチド（例えば、ＣＴＬＤ様ポリペプチドまたはＲＡＧＥ様ポリペプチド）を封入体として大腸菌内に蓄積させた後、上記したように、グアニジン塩酸塩などの変性剤を用いて間違った高次構造を解きほぐす。続いて、変性状態にあるビオチン化ポリペプチドに過剰量の界面活性剤を添加することにより、ポリペプチドを変性状態にしている物質を希釈すると共に、ポリペプチド同士の凝集を防ぐ。
【０２１９】
次いで、環状糖質、例えば重合度が１７以上の環状α−１，４−グルカンを添加し、その包接能を利用して前記界面活性剤を除き、正しい高次構造にリフォールディングし、リガンド認識能を有した状態に変換する。発現させたポリペプチドを利用して変性ＬＤＬまたはＡＧＥなどを検出する。アビジンもしくはストレプトアビジン等を介して方向性を保った状態でチップ、キュベット等の固相上に固定し、これをセンサー（すなわち、受容体チップ）として使用する。
【０２２０】
上記リフォールディングを用いることによって、封入体として発現されたＣＴＬＤ様ポリペプチド、ＲＡＧＥ様ポリペプチドをリフォールディングして、正常な変性ＬＤＬ結合活性またはＡＧＥ結合活性を有するポリペプチドとすることが可能である。
【０２２１】
上記工程によって得られたポリペプチドは、混在している他のタンパク分子から分離されているという意味でそれ自体純度が非常に高いため、本発明において実際に使用する際にはこのポリペプチドをさらに精製してもよいし、精製せずそのまま使用してもよい。上記工程によって得られたポリペプチドには、本来の天然型のポリペプチドには結合していない、リフォールディング工程で使用した界面活性剤が結合している。これまで、このような再生されたタンパク質は、溶液中の遊離の界面活性剤だけでなく、ポリペプチドに結合している界面活性剤も、リフォールディング工程の後に除去する必要があると考えられていた。なぜなら、例えば、アッセイ系などで使用する場合において、界面活性剤が残っていると測定時に何らかの悪影響があると考えられていたからである。しかしながら、これに反して、本発明者らは、余分な界面活性剤分子も、再生（リフォールディング）されたポリペプチドに結合した界面活性剤分子も、除去する必要がないことを見いだした。むしろ、再生されたポリペプチドを界面活性剤と結合したままにすることで、界面活性剤分子を全く含んでいない天然型のポリペプチドと比較して、結合能などが天然型のポリペプチドと何ら遜色ないばかりか、アッセイ系で使用した場合にバックグランド値の低下がもたらされ、測定のＳ／Ｎ比が上昇した。その理由としては、再生されたタンパク質（例えば、ＣＴＬＤ様ポリペプチド）における物性が、可溶性ポリペプチドとして発現したタンパク質とは異なることが挙げられる。結果的に、リフォールドされたポリペプチドの精製工程および界面活性剤の除去工程は省略可能であり、生成しようとするポリペプチド（例えば、ＣＴＬＤ様ポリペプチド）の製造工程が簡略化されて、製造コストの低下がもたらされる。
【０２２２】
上記のリフォールディング方法によって生成されたタンパク質もまた、本発明の範囲に包含され得ることが理解される。
【０２２３】
（使用）
別の局面において、本発明は、本発明のリフォールディングされたポリペプチドの、変性ＬＤＬによって引き起こされる疾患（例えば、動脈硬化症など）、またはＡＧＥによって引きおこされる疾患（例えば、糖尿病性血管障害）を診断するための薬剤を製造するための使用を提供する。ここで使用されるポリペプチドは、本明細書において上記される任意のものであり得ることが理解される。
【０２２４】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０２２５】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０２２６】
（材料および方法）
以下に示す実施例において、特段の記載がない場合、一般的に、以下に記載される材料および方法を用いて実験を行った。
【０２２７】
（実施例１：ＬＯＸ−１は、大過剰のプロテアーゼによって分解される）
本発明者らは、変性ＬＤＬおよびＡＧＥを検出することにおいてより安定な変性ＬＤＬ認識分子を得るために、ＬＯＸ−１のリガンド認識に必須のＣ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ；ＬＯＸ−１のアミノ酸配列の１４３位〜２７３位）のプロテアーゼに対する安定性について試験した。
【０２２８】
ｃＤＮＡライブラリーを、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）から単離したｍＲＮＡ（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）により、コピーキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてｃＤＮＡライブラリーを構築した。Ｓａｗａｍｕｒａら（Ｎａｔｕｒｅ  ３８６（６６２０），７３−７７（１９９７））に示される配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２５４３もまた参照のこと）に基づいて、ＣＴＬＤに適合する２種類の特異的プライマー：
５’−ＧＴＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＣＣＴＴＧＴＣＣＧＣＡＡＧＡＣＴＧＧＡ−３’（順方向プライマー；配列番号２０）；および
５’−ＣＡＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＴＧＴＧＣＴＣＴＴＡＧＧＴＴＴＧＣＣ−３’（逆方向プライマー；配列番号２１）
を用いて増幅した。増幅転写物を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｒｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、ＤＮＡ配列分析により確認した。
【０２２９】
増幅転写物を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｒｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、ＤＮＡ配列分析により確認した。
【０２３０】
Ｎ末端ビオチン化タンパク質を生産するために、ｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＮｄｅＩ切断部位の上流に、ＡｖｉＴａｇをコードする配列を挿入し、ｐＥＴ  Ｎ−Ａｖｉベクターを構築した。ＣＴＬＤをコードするＤＮＡ（配列番号１）をＮｄｅＩ切断部位、ＸｈｏＩ切断部位でｐＥＴ  Ｎ−Ａｖｉにクローニングした。ＣＴＬＤ内の分子間Ｓ−Ｓ結合を正しく構成するため、発現宿主としてＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いた。上記で得られたベクターを、Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）に形質転換した。Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）は、チオレドキシンレダクターゼおよびグルタチオンレダクターゼ変異株であり、細胞質内に発現させたタンパク質のＳ−Ｓ結合形成を促進する性質がある。ＡｖｉＴａｇを付加する場合、ＡｖｉＴａｇおよび目的タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターと、ＢｉｒＡ遺伝子を含む発現ベクターとで同時に形質転換させた。得られた形質転換宿主細胞を、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（１２．５μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を添加した（いずれも最終濃度）ＬＢ培地中で２５℃で培養した。ＣＴＬＤの発現を、ＩＰＴＧを添加することによって誘導し、２０℃で２０時間培養した後、菌体を収菌後、ＴＢＳにて洗浄し超音波破砕した。９５％程度のＣＴＬＤは封入体を形成し、可溶性ポリペプチドとして得られるのは、５％程度であったが、可溶性ポリペプチド画分をＮｉ−アガロースに吸着させた後、イミダゾールによる濃度勾配で溶出し、ＣＴＬＤを部分精製した。得られたＣＴＬＤは、Ｎｉ−アガロース上に固定した状態で、ＤｉＤ−ＡｃＬＤＬを認識し結合することを確認した。
【０２３１】
このようにして得られたＣＴＬＤ（０．２５ｍｇ／ｍＬ）をプロテアーゼ処理した。反応は、０．１ｍｌ（最終濃度で０．０２ｍｇのＣＴＬＤ含む）の系で行い（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）、２ユニットのトロンビン（１ユニット（１ｕ）は、１ｍｇの対象タンパク質を分解可能な濃度である）、１０ｕのエンテロキナーゼ（１ｕは、０．０５ｍｇの対象タンパク質を分解可能な濃度）、または１０ｕの第Ｘａ因子（１ｕは、０．０５ｍｇの対象タンパク質を分解可能な濃度）とともに２５℃で１８時間反応させた。１８時間後にフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を添加し、反応を停止した直後に、この反応産物を、定法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に処理した。プロテアーゼ非処理である対象区は、プロテアーゼ添加と同時にＰＭＳＦを添加してプロテアーゼを不活化すると共に、直ちにＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプル処理に供し、−２０℃にて保存した。プロテアーゼ処理区、非処理区をＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色に供したところ、低分子領域にＣＴＬＤの断片が認められた（図３を参照のこと）。さらに、ペプチドマッピングを行ったところ、ＣＴＬＤは、ＬＯＸ−１のＲ２３１とＧ２３２の間、およびＲ２４８とＧ２４９との間に対応する位置で切断され、この切断部位はＬＯＸ−１のリガンド認識に必須なアミノ酸残基を含むことが明らかになった（図５を参照のこと）。
【０２３２】
従って、本発明者らは、リガンド認識能に影響を与えずにプロテアーゼ耐性が付与されたＣＴＬＤ様ポリペプチドの生成を試みた。
【０２３３】
（実施例２：ＣＴＬＤ様ポリペプチドの生成）
実施例１において得られた知見に基づいて、上記の切断部位２箇所に変異を導入したＣＴＬＤ様ポリペプチド（Ｇ２３２Ａ／Ｇ２４９Ａ；本実施例中、ＰＲ−ＣＴＬＤともいう）をコードする核酸を、定法に従って生成した。定法に従って、この核酸を、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）を融合させた哺乳動物用発現ベクターｐＥＣＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＵＳＡ）に導入することによって、Ｎ末端にＣＦＰが融合したＰＲ−ＣＴＬＤコード核酸を含むプラスミドを構築した。ＣＨＯ細胞を１０％  ＦＣＳを補充したＦ１２培地中、３７℃において５％ＣＯ２加湿雰囲気下で培養した。１×１０４細胞／ｍｌの密度で懸濁したＣＨＯ細胞４００μｌを、トランスフェクションを行う２４時間前に、カバーガラス上に播種した。細胞を、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬を用いて製造業者のプロトコルに従って、細胞をトランスフェクトし、４８時間インキュベートし、ＣＨＯ細胞に一過性発現させた。その後、この細胞を蛍光顕微鏡で観察したところ、ＣＦＰの蛍光によりＣＴＬＤ様ポリペプチド発現細胞が確認できた。また、リガンドである変性ＬＤＬを蛍光色素である過塩素酸１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン（ＤｉＤ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）により標識し、この変性ＬＤＬをＣＴＬＤ様ポリペプチド発現細胞に添加したところ、リガンドの認識能および取り込み能が確認できた（図４）。
【０２３４】
これらの結果から、ＰＲ−ＣＴＬＤ発現細胞は、明瞭なリガンド取り込み能を示し、プロテアーゼ耐性を付与するために行ったアミノ酸置換は、変性ＬＤＬ認識能には何ら影響を与えていないことが示された。
【０２３５】
さらに、このＰＲ−ＣＴＬＤのプロテアーゼ感受性を検討したところ、２ｕ（１ｕは、１ｍｇの対象タンパク質を分解可能な濃度）のトロンビンで、０．０２ｍｇのＰＲ−ＣＴＬＤを１８時間処理しても分解が起こらないことが確認され、プロテアーゼ耐性ＣＴＬＤ様ポリペプチド（ＰＲ−ＣＴＬＤ）を生成することに成功した（図３）。
【０２３６】
（実施例３：タグ配列付加ＣＴＬＤ様ポリペプチドの生成）
実施例２において生成したＣＴＬＤ様ポリペプチド（ＰＲ−ＣＴＬＤ）に加えて、さらに、ＣＴＬＤ様ポリペプチドと同様のプロテアーゼ耐性変異を導入した長さの異なるタンパク質ＰＲ−ＣＴＬＤ１４（ネック領域の１４アミノ酸を含む、ＬＯＸ−１のアミノ酸１２９位〜２７３位；図５）を作成した。ＰＲ−ＣＴＬＤ１４のアミノ酸配列には分子間Ｓ−Ｓ結合に関与するＣｙｓが含まれる。分子間Ｓ−Ｓ結合を形成しなくても認識能はあるが、細胞上で機能を発現する際には、一定以上の分子密度をとる必要がある（Ｘｉｅら、ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２３（２）：１１１−１１７（２００４）およびＭａｔｓｕｎａｇａら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１３：１２０３−１２１４（２００７））。そこで、高密度集積に寄与し得る構造として分子間Ｓ−Ｓ結合形成が可能なＰＲ−ＣＴＬＤ１４もまた、実施例２と同様に生成して、変性ＬＤＬを検出するアッセイ系を構築するのに使用した。
【０２３７】
発現させたプロテアーゼ耐性のＣＴＬＤ様ポリペプチド（ＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４）を検出／評価系において活用する際には、有効な修飾が施されていることが望ましい。そこでこれらの分子のＮ末側に２種類のタグ（一つは大腸菌内でビオチン化を受ける配列ＡｖｉＴａｇ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ（配列番号１７））、他方はストレプトアビジンに直接認識される配列であるＳｔｒｅｐｔａｇ（ＡＷＲＨＰＱＦＧＧ（配列番号１８））またはＳｔｒｅｐｔａｇＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１９））を付加した。ビオチンとストレプトアビジンの結合は非共有結合で最も強く（ＫＤ＝１０−１５Ｍ）、ストレプトアビジンを介した固定化などへの発展に際しても有効である。しかし、ビオチン化のためには、培地中へのビオチンの添加、ビオチンリガーゼを共発現させる必要があるなどの手間が掛かる。そこで、結合の強さでは劣るが（ＫＤ＝１０−７Ｍ）、遺伝子配列上でタグを付加し大腸菌で発現させればストレプトアビジンへの結合が可能なＳｔｒｅｐｔａｇＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１９））付加タンパク質も生成した。いずれもｐＥＴ系ベクターの５’側に、タグ配列をコードする核酸配列を導入して発現用プラスミドとした（ｐＥＴ  Ｎ−Ａｖｉ、ｐＥＴ  Ｎ−ＳｔＩＩ）。定法に従って、これらの発現ベクターそれぞれにＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４を導入して、発現構築物を生成した。ＡｖｉＴａｇ付加タンパク質のビオチン化のために、ｐＥＴ系ベクターと同一菌体内で保持可能なｐＡＣ系ベクターにビオチンリガーゼをコードしているＢｉｒＡ遺伝子を導入し、発現用プラスミドを作製した（ＢｉｒＡ／ｐＡＣ）。
【０２３８】
ＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４はともに、分子内Ｓ−Ｓ結合の形成が構造の安定化と機能に必須である。そこで発現宿主としてＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いた。Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）は、チオレドキシンレダクターゼおよびグルタチオンレダクターゼ変異株であり、細胞質内に発現させたタンパク質のＳ−Ｓ結合形成を促進する性質がある。プロテアーゼ耐性ＣＴＬＤ様ポリペプチドにＡｖｉＴａｇを付加する場合、ＡｖｉＴａｇおよび目的タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターと、ＢｉｒＡ遺伝子を含む発現ベクターとで同時に形質転換させた。得られた形質転換宿主細胞を、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（１２．５μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を添加した（いずれも最終濃度）ＬＢ培地中で３７℃で培養した。ＳｔｒｅｐｔａｇＩＩコード核酸を含む発現ベクターで形質転換した場合は、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（１２．５μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢ培地中で３７℃で培養した。ＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４の発現を、ＩＰＴＧを添加することによって誘導した。
【０２３９】
予備実験として、ＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４を可溶性ポリペプチドとして発現するための温度条件および誘導時間を調べた。温度条件は、（１）３７℃、（２）２５℃および（３）２０℃に設定した。誘導時間は、（Ａ）２時間、（Ｂ）４時間、（Ｃ）８時間、（Ｄ）１８時間、（Ｅ）２４時間に設定した。まず、これらの宿主細胞を３７℃で誘導し、誘導されたタンパク質の分子量を測定したところ、予想される分子量のタンパク質の誘導が確認されたが、１００％が不溶性画分に回収された。この結果に鑑みて、誘導時間を変動させずに、誘導時の温度を２５℃に下げたところ、わずかながら可溶性ポリペプチドとしての発現が確認された。さらに誘導時の温度を２０℃にまで下げて、誘導時間の検討を行ったところ、可溶性ポリペプチドとして回収するためには、温度条件（３）および誘導時間（Ｄ）１８時間〜（Ｅ）２４時間、特に２０〜２４時間の誘導が適切であると結論付けられた（図６を参照のこと）。
【０２４０】
上記の形質転換細胞を３７℃で１２時間前培養した。本培養は、この前培養液を、２０倍希釈になるように上記の各ＬＢ培地に添加し、２５℃で旋回培養した。上記で得られた条件に基づいて、培養液の光学密度（Ａ６００）が約０．５に達したときに、培養温度を２０℃に下げると同時に、１ｍＭ（最終濃度）ＩＰＴＧを添加し、目的タンパク質の発現を誘導した。ＡｖｉＴａｇ付加タンパク質を生成する場合は、誘導開始と同時に５０μＭ（最終濃度）のビオチンを添加し、発現される目的タンパク質のビオチン化も同時に行わせた。誘導開始後２０〜２４時間後に１２，０００ｒｐｍ×５分の遠心分離により菌体をペレット化して上清を廃棄し、適量のＴＢＳで洗浄した。
【０２４１】
ＴＢＳに懸濁した菌体を、超音波破砕機にて破砕後、１５，０００ｒｐｍ×３０分の遠心分離により回収される上清を可溶性画分とした。発現された目的タンパク質の９０％以上が不溶性画分に残った。目的タンパク質は、精製のためのＨｉｓタグがＣ末側に付加されているので、Ｎｉ−アガロースに結合させた後、イミダゾールにより溶出させ精製した（図７）。検出用として付加したＡｖｉＴａｇも精製に利用可能であり、この場合は、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｍｕｔｅｉｎ  ｍａｔｒｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）に吸着後、ビオチンにより溶出させた。ＳｔｒｅｐＴａｇＩＩの場合、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＩＢＡ，ＵＳ）に吸着後、ｄｅｓｔｈｉｏｂｉｏｔｉｎにより溶出させた。ＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４とも、１Ｌ当たりの収量は、以下の表１に示すように、０．５ｍｇ未満であった。
【０２４２】
【表１】
0005604782.tif 000002
【０２４３】
（実施例４：ＲＡＧＥは、大過剰のプロテアーゼによって分解される）
本発明者らは、ＡＧＥを検出することにおいてより安定なＡＧＥ認識分子を得るために、図８に模式的に示されるＲＡＧＥの細胞外ドメイン（ｓＲＡＧＥ１；ＲＡＧＥのアミノ酸配列の２３位〜３３２位）のプロテアーゼに対する安定性について試験した。
【０２４４】
ヒト肺ｐｏｌｙＡ  ＲＮＡを鋳型に逆転写反応後、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０３６４３２に示される配列に基づいて、ＲＡＧＥに適合する２種類の特異的プライマー：
５’−ＧＡＡＴＴＣＡＧＧＡＴＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＡＣＡＧＣＡＧ−３’（順方向プライマー；配列番号２２）；および
５’−ＣＴＣＧＡＧＴＣＡＡＧＧＣＣＣＴＣＣＡＧＴＡＣＴＡＣ−３’（逆方向プライマー；配列番号２３）
を用いて増幅した。増幅転写物を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｒｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、ＤＮＡ配列分析により確認した。
【０２４５】
ｐＥＴ系ベクターの３’側にＡｖｉタグ配列をコードする核酸配列を導入して、Ｃ末端ビオチン化タンパク質の生産を可能とするベクターを構築し発現用プラスミドとした（ｐＰＥＴ  Ｃ−Ａｖｉ）。定法に従って、発現ベクターにＲＡＧＥ１を導入して、発現構築物を生成した。
【０２４６】
ＲＡＧＥは、ＣＴＬＤと同様に、Ｓ−Ｓ結合の形成が構造の安定化と機能に必須である。そこで発現宿主としてＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いた。Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）は、チオレドキシンレダクターゼおよびグルタチオンレダクターゼ変異株であり、細胞質内に発現させたタンパク質のＳ−Ｓ結合形成を促進する性質がある。ビオチン化ペプチドとして生産させるために、ＢｉｒＡ遺伝子を含む発現ベクター（ｐＥＴ系ベクターと同一菌体内で保持可能なｐＡＣ系ベクターにビオチンリガーゼをコードしているＢｉｒＡ遺伝子を導入）とで同時に形質転換させた。得られた形質転換宿主細胞を、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（１２．５μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を添加した（いずれも最終濃度）ＬＢ培地中で２５℃で培養した。ＲＡＧＥ様ポリペプチドの発現を、ＩＰＴＧを添加することによって誘導した。誘導は２５℃で１８時間行った。２５℃で誘導することにより、９０％以上が可溶性ポリペプチドとして発現された。誘導開始と同時に５０μＭ（最終濃度）のビオチンを添加し、発現される目的タンパク質のビオチン化も同時に行わせた。誘導開始後１８時間後に１２，０００ｒｐｍ×５分の遠心分離により菌体をペレット化して上清を廃棄し、適量のＴＢＳで洗浄した。
【０２４７】
ＴＢＳに懸濁した菌体を、超音波破砕機にて破砕後、１５，０００ｒｐｍ×３０分の遠心分離により回収される上清を可溶性画分とした。目的タンパク質は、精製のためのＨｉｓタグがＣ末側に付加されているので、Ｎｉ−アガロースに結合させた後、イミダゾールにより溶出させ精製した。検出用として付加したＡｖｉＴａｇも精製に利用可能であり、この場合は、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｍｕｔｅｉｎ  ｍａｔｒｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）に吸着後、ビオチンにより溶出させた。精製したタンパク質は、認識されている結合特異性およびＲ−ＡＧＥ（リボースにより糖化処理をしたＢＳＡ）、Ｆ−ＡＧＥ（フルクトースにより処理をしたＢＳＡ）、Ｇ−ＡＧＥ（グルコースにより糖化処理をしたＢＳＡ）に対する親和性を示した。このことは、この精製タンパク質がビオチン化されていることを利用し、ＢＩＡＣＯＲＥのストレプトアビジンセンサーチップ上に、リガンド認識に関わる部分が外側を向くように固定化し、このセンサーチップをＢＩＡＣＯＲＥ本体に挿入後、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００，Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により確認した。
【０２４８】
このようにして得られたｓＲＡＧＥ１（０．２５ｍｇ／ｍＬ）をプロテアーゼ処理した。反応は、０．１ｍｌ（最終濃度で０．０２ｍｇのｓＲＡＧＥ１含む）の系で行い（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）、２ユニットのトロンビン（１ｕは、１ｍｇの対象タンパク質を分解可能な濃度）、１０ｕのエンテロキナーゼ（１ｕは、０．０５ｍｇの対象タンパク質を分解可能な濃度）、または１０ｕの第Ｘａ因子（１ｕは、０．０５ｍｇの対象タンパク質を分解可能な濃度）とともに２５℃で１８時間反応させた。１８時間後にＰＭＳＦを添加し、反応を停止した直後に、この反応産物を、定法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に処理した。プロテアーゼ非処理である対象区は、プロテアーゼ添加と同時にＰＭＳＦを添加しプロテアーゼを不活化すると共に、直ちにＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプル処理に供し、−２０℃にて保存した。プロテアーゼ処理区、非処理区を、定法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ＣＢＢ染色に供したところ、低分子領域にｓＲＡＧＥの断片が認められた（図９を参照のこと）。さらに、ペプチドマッピングを行ったところ、ｓＲＡＧＥ１は、大過剰のトロンビンではＲＡＧＥのＲ１１４とＶ１１５の間、およびＲ２２８とＶ２２９との間に該当する位置で、大過剰の第Ｘａ因子ではＲＡＧＥのＲ１１４とＶ１１５の間、Ｖ１１７とＹ１１８との間、およびＭ２７２とＫ２７３との間に該当する位置で切断されることが明らかになった（図８を参照のこと）。
【０２４９】
従って、本発明者らは、リガンド認識能に影響を与えずにプロテアーゼ耐性が付与されたＲＡＧＥ様ポリペプチドの生成を試みた。
【０２５０】
（実施例５：ＲＡＧＥ様ポリペプチドの生成））
実施例４において得られた知見に基づいて、上記の切断部位４箇所に変異を導入したｓＲＡＧＥ１様ポリペプチド（Ｒ１１４Ｑ／Ｖ１１７Ａ／Ｒ２２８Ｎ／Ｍ２７２Ｉ；本実施例中、ｍＲＡＧＥ１ともいう）を定法に従って生成した。この核酸を、定法に従って、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）を融合させた哺乳動物用発現ベクターｐＥＣＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＵＳＡ）またはｐＴａｒｇｅｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に導入することによって、Ｎ末端にＣＦＰが融合したｍＲＡＧＥ１コード核酸を含むプラスミドを構築した。ＣＨＯ細胞を１０％  ＦＣＳを補充したＦ１２培地中、３７℃において５％ＣＯ２加湿雰囲気下で培養した。１×１０４細胞／ｍｌの密度で懸濁したＣＨＯ細胞４００μｌを、トランスフェクションを行う２４時間前に、カバースリップ上に播種した。細胞を、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬を用いて製造業者のプロトコルに従って、細胞をトランスフェクトし、４８時間インキュベートし、ＣＨＯ細胞に一過性発現させた。その後、この細胞を蛍光顕微鏡で観察したところ、ＣＦＰの蛍光によりｍＲＡＧＥ１発現細胞が確認できた。また、リガンドであるリボースにより糖化処理したＢＳＡ（Ｒ−ＢＳＡ）を蛍光色素であるＡｌｅｘａ６３３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）により標識し、この標識糖化ＢＳＡをｍＲＡＧＥ１発現細胞に添加したところ、リガンドの認識能および取り込み能が確認できた。
【０２５１】
ｍＲＡＧＥ１発現細胞は、明瞭なリガンド取り込み能を示し（図１０）、プロテアーゼ耐性の増大を狙ったアミノ酸置換は、リガンド認識能には影響を与えていないことが示された。
【０２５２】
さらに、そのプロテアーゼ感受性を検討したところ、天然型に比べ耐性が上昇していることが示され、プロテアーゼ耐性の上がったＲＡＧＥ分子の作出に成功した（図１１）。
【０２５３】
（実施例６：ＲＡＧＥのリガンド認識能に必須の最小領域の決定）
これまで、ＲＡＧＥの細胞外領域がリガンド認識に必須であることは知られていたが、細胞外領域のどの部分がリガンド認識に必要十分であるかは明らかにされていない。よってリガンド認識に必須の最小領域を決定する目的で、領域欠損などによる削りこみを行って、ｍｉｎｉＲＡＧＥを作製した。
【０２５４】
ｍｉｎｉＲＡＧＥとして、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０３６４３２に示される配列に基づいて、以下のプライマー：
順方向プライマー（ＲＡＧＥ１、ＲＡＧＥ２、ＲＡＧＥ３、ＲＡＧＥ７、ＲＡＧＥ８、ＲＡＧＥ９、ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６に共通）
５’−ＣＴＡＣＡＴＡＴＧＧＣＴＣＡＡＡＡＣＡＴＣＡＣＡＧＣ−３’（配列番号２４）
逆方向プライマー
・ＲＡＧＥ１については、
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＧＣＣＴＧＣＡＧＴＴＧＧＣＣＣ−３’（配列番号２５）
・ＲＡＧＥ２については、
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＣＣＡＧＡＣＡＣＧＧＧＧＣＴＧ−３’（配列番号２６）
・ＲＡＧＥ３については、
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＡＧＣＴＡＣＴＧＣＴＣＣＡＣＣ−３’（配列番号２７）
・ＲＡＧＥ７については、
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＣＡＧＣＣＧＴＧＡＧＴ−３’（配列番号２８）
・ＲＡＧＥ８については、
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＡＡＴＣＴＧＧＴＡＧＡＣＡＣＧＧ−３’（配列番号２９）
・ＲＡＧＥ９については、
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＣＴＴＧＧＴＣＴＣＣＴＴＴＣＣ−３’（配列番号３０）
・ＲＡＧＥ１４３については
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＴＣＣＣＣＡＣＣＴＴＡＴＴＧＧＧ−３’（配列番号３３）、
・ＲＡＧＥ２２３については、
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＣＴＧＴＧＣＧＣＡＡＧＧＣＣＣＧ−３’（配列番号３４）
・ＲＡＧＥ２２６については、
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＣＴＧＧＡＴＧＧＧＧＧＣＴＧＴＧＣ−３’（配列番号３５）
を設計し、ＲＡＧＥ４については、順方向プライマー
５’−ＴＣＧＣＡＴＡＴＧＧＣＡＡＴＧＡＡＣＡＧＧＡＡＴＧＧ−３’（配列番号３１）
逆方向プライマー
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＧＣＣＴＧＣＡＧＴＴＧＧＣＣＣ−３’（配列番号３２）
を設計し、ＲＡＧＥ２（天然型ＲＡＧＥのアミノ酸配列２３〜２５０位）をコードするＤＮＡ、ＲＡＧＥ３（天然型ＲＡＧＥのアミノ酸配列２３〜２３０位）をコードするＤＮＡ、ＲＡＧＥ４（天然型ＲＡＧＥのアミノ酸配列１０１〜３３２位）をコードするＤＮＡ、ＲＡＧＥ７（天然型ＲＡＧＥのアミノ酸配列２３〜１３７位）をコードするＤＮＡ、ＲＡＧＥ８（天然型ＲＡＧＥのアミノ酸配列２３〜１２０位）をコードするＤＮＡ、ＲＡＧＥ９（天然型ＲＡＧＥのアミノ酸配列２３〜１１２位）をコードするＤＮＡ、ＲＡＧＥ１４３（天然型ＲＡＧＥのアミノ酸配列２３〜１４３位）をコードするＤＮＡ、ＲＡＧＥ２２３（天然型ＲＡＧＥのアミノ酸配列２３〜２２３位）をコードするＤＮＡ、およびＲＡＧＥ２２６（天然型ＲＡＧＥのアミノ酸配列２３〜２２６位）をコードするＤＮＡを得た。
【０２５５】
これらｍｉｎｉＲＡＧＥをコードするＤＮＡを、制限酵素の認識配列を付加した特異的プライマーによりＰＣＲにより増幅した後、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をクローニング用ベクターとしてＴＡクローニングを行い、塩基配列を確認した。
【０２５６】
（２）タグ配列付加ＲＡＧＥ様ポリペプチドの生成
実施例６において生成したＲＡＧＥ様ポリペプチド（ｓＲＡＧＥ１、ｍＲＡＧＥ１、ＲＡＧＥ２〜ＲＡＧＥ８、ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６）を検出／評価系において活用する際には、有効な修飾が施されていることが望ましい。そこでこれらの分子のＮ末側に２種類のタグ（一つは大腸菌内でビオチン化を受ける配列ＡｖｉＴａｇ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ（配列番号１７））、他方はストレプトアビジンに直接認識される配列であるＳｔｒｅｐｔａｇ（ＡＷＲＨＰＱＦＧＧ（配列番号１８）またはＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１９））を付加した。ビオチンとストレプトアビジンの結合は非共有結合で最も強く（ＫＤ＝１０−１５Ｍ）、ストレプトアビジンを介した固定化などへの発展に際しても有効である。しかし、ビオチン化のためには、培地中へのビオチンの添加、ビオチンリガーゼを共発現させる必要があるなどの手間が掛かる。そこで、結合の強さでは劣るが（ＫＤ＝１０−７Ｍ）、遺伝子配列上でタグを付加し大腸菌で発現させればストレプトアビジンへの結合が可能なＳｔｒｅｐｔａｇＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１９））付加タンパク質も生成した。いずれもｐＥＴ系ベクターの３’側にタグ配列をコードする核酸配列を導入して、発現用プラスミドとした（ｐＥＴ  Ｃ−Ａｖｉ、ｐＥＴ  Ｃ−ＳｔＩＩ）。定法に従って、これらの発現ベクターに、ｍＲＡＧＥおよびｍｉｎｉＲＡＧＥを導入して、発現構築物を生成した。ＡｖｉＴａｇ付加タンパク質のビオチン化のために、ｐＥＴ系ベクターと同一菌体内で保持可能なｐＡＣ系ベクターにビオチンリガーゼをコードしているＢｉｒＡ遺伝子を導入したＢｉｒＡ／ｐＡＣを作製した。
【０２５７】
ＲＡＧＥは、ＣＴＬＤと同様に、Ｓ−Ｓ結合の形成が構造の安定化と機能に必須である。そこで発現宿主としてＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いた。Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）は、チオレドキシンレダクターゼおよびグルタチオンレダクターゼ変異株であり、細胞質内に発現させたタンパク質のＳ−Ｓ結合形成を促進する性質がある。ＲＡＧＥ様ポリペプチド（ｓＲＡＧＥ１、ｍＲＡＧＥ１、ＲＡＧＥ２〜ＲＡＧＥ８、ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６をまとめて「ＲＡＧＥ様ポリペプチド」と称する）にＡｖｉＴａｇを付加する場合、ＡｖｉＴａｇおよびこのポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターと、ＢｉｒＡ遺伝子を含む発現ベクターとで同時に形質転換させた。得られた形質転換宿主細胞を、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（１２．５μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を添加した（いずれも最終濃度）ＬＢ培地中で３７℃で培養した。ＳｔｒｅｐｔａｇＩＩコード核酸を含む発現ベクターで形質転換した場合は、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（１２．５μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢ培地中で３７℃で培養した。ＲＡＧＥ様ポリペプチドの発現を、ＩＰＴＧを添加することによって誘導した。
【０２５８】
予備実験として、ＲＡＧＥ様ポリペプチドを可溶性ポリペプチドとして発現するための温度条件および誘導時間を調べた。温度条件は、（１）３７℃、（２）２５℃および（３）２０℃に設定した。誘導時間は、（Ａ）１８時間、（Ｂ）２０時間、および（Ｃ）２４時間に設定した。まず、これらの宿主細胞を３７℃で誘導し、誘導されたタンパク質の分子量を測定したところ、大部分が不溶性画分に回収された。培養温度を２５℃に下げるとｓＲＡＧＥの場合、９０％以上が可溶性ポリペプチドとして発現されたが、ｍＲＡＧＥ１の場合は、２０％程度しか可溶性ポリペプチドとして発現されなかった。各ｍｉｎｉＲＡＧＥに関しては、欠損部分が長くなるほど可溶化率が下がる傾向が観察された。ＲＡＧＥ８およびＲＡＧＥ９に関しては培養温度を下げても殆どが不溶性となり、可溶性ポリペプチドとして発現させるのは困難であった。上記の結果に鑑みて、培養温度を２５℃に維持して、誘導時間の検討を行ったところ、誘導時間（Ａ）１８時間が適切であることが分かった（図１３を参照のこと）。
【０２５９】
上記の形質転換細胞を３７℃で１２時間前培養した。本培養は、この前培養液を、２０倍希釈になるように上記の各ＬＢ培地に添加し、２５℃で旋回培養した。上記で得られた条件に基づいて、培養液の光学密度（Ａ６００）が約０．５に達したときに、１ｍＭ（最終濃度）ＩＰＴＧを添加し、目的タンパク質の発現を誘導した。ＡｖｉＴａｇ付加タンパク質を生成する場合は、誘導開始と同時に５０μＭ（最終濃度）のビオチンを添加し、発現される目的タンパク質のビオチン化も同時に行わせた。誘導開始後１８時間後に１２，０００ｒｐｍ×５分の遠心分離により菌体をペレット化して上清を廃棄し、適量のＴＢＳで洗浄した。
【０２６０】
ＴＢＳに懸濁した菌体を、超音波破砕機にて破砕後、１５，０００ｒｐｍ×３０分の遠心分離により回収される上清を可溶性画分とした。目的タンパク質は、精製のためのＨｉｓタグがＣ末側に付加されているので、Ｎｉ−アガロースに結合させた後、イミダゾールにより溶出させ精製した（図１３）。検出用として付加したＡｖｉＴａｇも精製に利用可能であり、この場合は、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｍｕｔｅｉｎ  ｍａｔｒｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）に吸着後、ビオチンにより溶出させた。ＳｔｒｅｐＴａｇＩＩの場合、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＩＢＡ，ＵＳ）に吸着後、ｄｅｓｔｈｉｏｂｉｏｔｉｎにより溶出させた。
【０２６１】
（３）ＲＡＧＥのリガンド認識能に必須の最小領域の決定
上記のようにして溶出させた各ＭｉｎｉＲＡＧＥの発現効率、可溶性ポリペプチドとして発現する比率、収率などは以下の表２に示すとおりである。
【０２６２】
【表２−１】
0005604782.tif 000003
【０２６３】
【表２−２】
0005604782.tif 000004
【０２６４】
上記の結果から、ＲＡＧＥのリガンド認識能に必須の最小領域は、ＲＡＧＥ８（天然型ＲＡＧＥのアミノ酸配列２３〜１２０位）であることが分かった。
【０２６５】
（実施例７：ＣＴＬＤ様ポリペプチドのリフォールディング）
（１）ＣＴＬＤ様ポリペプチドのリフォールディング
実施例３に示されるように、ＣＴＬＤ様ポリペプチドは、ほとんどが封入体として発現されるので、発現宿主をＢＬ２１（ＤＥ３）とし、１００％近くを封入体として発現させた後、サイクロアミロースの包接能を活用しリフォールディングさせた。これにより、20mg/L程度の変異受容体を得ることが可能になった。
【０２６６】
上記実施例３で得られた発現構築物とＢｉｒＡ遺伝子を含むベクターとで同時に形質転換させたＢＬ２１（ＤＥ３）、若しくは発現構築物のみで形質転換させたＢＬ２１（ＤＥ３）を、以下のように培養した。培養は、ＬＢ培地を基本とし、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を添加した（いずれも最終濃度）。ＳｔｒｅｐｔａｇＩＩを付加したポリペプチドを発現させる場合、若しくは発現構築物のみで形質転換させたＢＬ２１（ＤＥ３）の場合、ＬＢ培地にアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を添加した。
【０２６７】
本培養は、実施例３に示される前培養液を２０倍希釈になるように添加し、３７℃で旋回培養した。培養液の濁度（Ａ６００）が約０．５に達したときに、１ｍＭ（最終濃度）ＩＰＴＧを添加し、目的タンパク質の発現を誘導した。ＡｖｉＴａｇ付加ポリペプチドを発現させる場合は、誘導開始と同時に５０μＭ（最終濃度）のビオチンを添加し、発現タンパク質のビオチンも同時に行わせた。誘導開始後４時間後に１２，０００ｒｐｍ×５分の遠心分離で菌体を回収し、ＴＢＳにて洗浄した。
【０２６８】
次いで、ＴＢＳに懸濁した菌体を超音波破砕機にて破砕後、細胞破砕液の沈殿画分をＴＢＳで洗浄し封入体とした。封入体を最終濃度４０ｍＭのＤＴＴを含む６Ｍのグアニジン塩酸塩溶液で室温にて１時間処理し、間違った構造を完全に解きほぐした。続いて、７０倍容量の４種類の界面活性剤溶液（０．１％  ＣＴＡＢ、ＳＢ３−１４、Ｔｗｅｅｎ  ４０、Ｔｗｅｅｎ  ６０、いずれも最終濃度で２ｍＭのＤＬ−ｃｙｓｔｉｎｅを含むＴＢＳ溶液）を添加し、室温で１時間反応させた後、最終濃度で０．６％になるように、それぞれに３％ＣＡ溶液を加え、さらに室温で１時間反応させた。その反応溶液を、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得られた上清を、リフォールディング溶液とした。ＣＴＡＢ、ＳＢ３−１４を用いた場合、ＣＴＬＤ様ポリペプチドの９０％程度がリフォールディング溶液として回収されていることが確認されたが、Ｔｗｅｅｎ４０，Ｔｗｅｅｎ６０では効果が無かった（図１４）。精製はＨｉｓタグを活用したＮｉ−Ａｇａｒｏｓｅ精製、またはビオチン、ＳｔｒｅｐＴａｇを利用して、実施例３に示される可溶性ポリペプチドの精製と同様に精製できた。以下の表３に、ＣＴＡＢを用いた場合の結果を示す。
【０２６９】
【表３】
0005604782.tif 000005
【０２７０】
（２）可溶性ＰＲ−ＣＴＬＤとＲｅ−ＣＴＬＤの変性ＬＤＬ認識能の比較
各濃度のＦ−ＯｘＬＤＬ（０、０．１、０．２、０．４、０．８、１、２、４、８、１０、１５、２０μｇ／ｍＬ）を９６穴プレートに分注し（５０μｌ／ウェル）、４℃で一晩放置後、１％ＢＳＡ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０含ＴＢＳ（３００μｌ／ウェル）でブロッキング（３７℃で４時間、若しくは４℃で一晩）し、ビオチン化ＣＴＬＤ（５μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェル）と３７℃で２時間反応させた。定法に従ってＨＲＰ標識ストレプトアビジン（濃度１０ｍＵ／ｍＬ；１００μｌ／ウェル）を添加し、３７℃で１時間反応させた後、ＴＭＢ（ＨＲＰの基質）を添加し、１５分間放置した。１Ｎ  ＨＣｌにて反応停止後、Ａ４５０の吸光度を測定した。各反応工程の間は、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０２％  Ｔｗｅｅｎ−２０）にて５回洗浄した。結果を、図１６に示す。
【０２７１】
図１６から明らかなように、Ｒｅ−ＣＴＬＤの認識能は、可溶性ＣＴＬＤに比較して遜色が無いことが実証された。
【０２７２】
（実施例８：ＲＡＧＥ様ポリペプチドのリフォールディング）
（１）ＲＡＧＥ様ポリペプチドのリフォールディング
実施例６に示されるように、ＲＡＧＥ様ポリペプチドは、ほとんどが封入体として発現されるので、発現宿主をＢＬ２１（ＤＥ３）とし、１００％近くを封入体として発現させた後、サイクロアミロースの包接能を活用しリフォールディングさせた。これにより、２０ｍｇ／Ｌ程度の変異受容体を得ることが可能になった。
【０２７３】
上記で得られたＢＬ２１（ＤＥ３）を、以下のように培養した。培養は、ＬＢ培地を基本とし、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を添加した（いずれも最終濃度）。ＳｔｒｅｐｔａｇＩＩを付加したポリペプチドを発現させる場合、ＬＢ培地にアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を添加した。前培養は、３７℃で１２時間培養することによって行った。
【０２７４】
本培養は、上記に示される前培養液を２０倍希釈になるように添加し、３７℃で旋回培養した。培養液の濁度（Ａ６００）が約０．５に達したときに、１ｍＭ（最終濃度）ＩＰＴＧを添加し、目的タンパク質の発現を誘導した。ＡｖｉＴａｇ付加ポリペプチドを発現させる場合は、誘導開始と同時に５０μＭ（最終濃度）のビオチンを添加し、発現タンパク質のビオチンも同時に行わせた。誘導開始後４時間後に１２，０００ｒｐｍ×５分の遠心分離で菌体を回収し、ＴＢＳにて洗浄した。
【０２７５】
次いで、ＴＢＳに懸濁した菌体を超音波破砕機にて破砕後、細胞破砕液の沈殿画分をＴＢＳで洗浄し封入体とした。封入体を最終濃度４０ｍＭのＤＴＴを含む６Ｍのグアニジン塩酸塩溶液で室温にて１時間処理し、間違った構造を完全に解きほぐした。続いて、７０倍容量の４種類の界面活性剤溶液（０．１％  ＣＴＡＢ、ＳＢ３−１４、Ｔｗｅｅｎ  ４０、Ｔｗｅｅｎ  ６０、いずれも最終濃度で２ｍＭのＤＬ−ｃｙｓｔｉｎｅを含むＴＢＳ溶液）を添加し、室温で１時間反応させた後、最終濃度で０．６％になるように、それぞれに３％ＣＡ溶液を加え、さらに室温で１時間反応させた。その反応溶液を、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得られた上清を、リフォールディング溶液とした。ＲＡＧＥ様ポリペプチドは、４種類の界面活性剤（ＣＴＡＢ、ＳＢ３−１４、Ｔｗｅｅｎ４０、およびＴｗｅｅｎ６０）いずれによっても効率的にリフォールディングされた（図１５）。精製はＨｉｓタグを活用したＮｉ−Ａｇａｒｏｓｅ精製、またはビオチン、ＳｔｒｅｐＴａｇを利用して、実施例６に示される可溶性ポリペプチドの精製と同様に精製できた。以下の表４に、ＣＴＡＢを用いた場合の結果を示す。
【０２７６】
【表４−１】
0005604782.tif 000006
【０２７７】
【表４−２】
0005604782.tif 000007
【０２７８】
（実施例９：ＣＴＬＤ様ポリペプチドによる変性ＬＤＬの検出と、市販の抗体による変性ＬＤＬの検出との比較）
ヒト血漿中の動脈硬化危険因子である変性ＬＤＬの測定手法は、疾病の早期診断、機能性食品の予防効果評価、生活改善や投薬による治療効果の評価など様々な分野での活用が期待されている。しかし、変性ＬＤＬは分子の修飾構造が一定ではなく、意味のある分子種が明確でないためにモノクローナル抗体による変性ＬＤＬの検出は、必ずしも正確であるとは言えなかった。一方で、ＬＯＸ−１は、幅広い分子種の変性ＬＤＬを認識可能な曖昧さがありながら、変性を受けたＬＤＬには鋭敏に反応する可能性が高い。そこで、簡便かつ汎用性が高いＥＬＩＳＡシステムにおいて、抗体に代わる分子として受容体認識能を活用可能か検討した。
（１）リガンドの調製
リガンドとして、以下のものを使用した：ＬＤＬ（変性を受けていない正常なＬＤＬ（ネガティブコントロール。ヒト血漿より調製、またはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ，ＵＳＡより購入）；完全酸化ＬＤＬ（銅酸化法により調製）；部分酸化ＬＤＬ（銅酸化法により調製）；マロンジアルデヒド化ＬＤＬ（ＭＤＡ−ＬＤＬ（酸化ストレスの指標）。ＭＤＡ修飾により調製）。
【０２７９】
酸化ＬＤＬを、以下のように調製した。調製に際して、可能なものはすべて滅菌し、可能な限り無菌的に操作した。
【０２８０】
完全酸化ＬＤＬに関しては、ＬＤＬを、必要な場合、酸化する前に予め透析して、ＥＤＴＡを完全に取り除いた。このＥＤＴＡ非含有ＬＤＬを、ＥＤＴＡ非含有ＰＢＳ（以下、（−）ＰＢＳという）で１ｍｇ／ｍＬ濃度の溶液にし、その溶液に、最終濃度が５μＭになるようにＣｕＳＯ４を添加した。次いで、この溶液を、３７℃で２０時間インキュベートし、その後、５０μＭ  ブチル化ヒドロキシトルエンまたは１ｍＭ  ＥＤＴＡ（最終濃度）を添加して、酸化を停止した。この溶液を、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％ＥＤＴＡ）またはＰＢＳ（−）（１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７  ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ  ７．４）に対して透析した。得られた完全酸化ＬＤＬ含有溶液を濾過滅菌し、その濾液に０．０２％  ＮａＮ３（最終濃度）を添加し、使用時まで４℃で保存した。
【０２８１】
部分酸化ＬＤＬに関しては、同様に、ＥＤＴＡ非含有ＬＤＬを、ＥＤＴＡ非含有ＰＢＳ（以下、（−）ＰＢＳという）で２ｍｇ／ｍＬ濃度の溶液にし、その溶液に、最終濃度が２μＭになるようにＣｕＳＯ４を添加した。次いで、この溶液を、３７℃で４時間インキュベートし、その後、５０μＭ  ブチル化ヒドロキシトルエンまたは１ｍＭ  ＥＤＴＡ（最終濃度）を添加して、酸化を停止した。この溶液を、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％ＥＤＴＡ）またはＰＢＳ（−）に対して透析した。得られた部分酸化ＬＤＬ含有溶液を濾過滅菌し、その濾液に０．０２％  ＮａＮ３（最終濃度）を添加し、使用時まで４℃で保存した。
【０２８２】
ＭＤＡ−ＬＤＬを以下のように調製した。０．１６５ｍＬのマロンアルデヒドビス（ジメチルアセタール）（Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）の急速酸加水分解（０．２ｍＬの１２Ｍ
ＨＣｌ）により、マロンジアルデヒドを室温で生成し、４．８ｍＬの０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．４）をこの溶液に添加し、１０Ｍ  ＮａＯＨでｐＨを６．４に調節した。ＥＤＴＡ非含有ＬＤＬを、０．０１Ｍ  リン酸ナトリウム／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．０１％  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４（緩衝液Ａ）中の等量のタンパク質（５〜１０ｍｇ／ｍＬ）と、０．１Ｍ  リン酸ナトリウム（ｐＨ６．４）中の新たに調製した０．２Ｍ  マロンジアルデヒドとを混合し、この混合物を３７℃で３時間インキュベートすることによって修飾した。この混合物を緩衝液Ａに対して、４℃で１６時間透析することにより、反応を停止した。ＭＤＡ−ＬＤＬ含有溶液を濾過滅菌し、その濾液に０．０２％  ＮａＮ３（最終濃度）を添加し、使用時まで４℃で保存した。
【０２８３】
（２）ＣＴＬＤ様ポリペプチドによる変性ＬＤＬの検出と、市販の抗体による変性ＬＤＬの検出との比較
９６穴プレート（Ｎｕｎｃ）に、ＬＤＬおよび上記のように調製した各リガンドを、０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌにＴＢＳで希釈した後、１００μｌ／ウェルずつ分注し、４℃で一晩放置した。ＴＢＳでプレートを洗浄し、２％スキムミルク／ＴＢＳにて１時間ブロッキングおよびＴＢＳで洗浄した後、５μｇ／ｍｌに希釈した各受容体（ネイティブＣＴＬＤ、ネイティブＣＴＬＤ１４、ＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４）溶液１００μｌを添加し、２時間室温で放置した。ＴＢＳにて十分に洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジン（Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の１００，０００×希釈溶液を１００μｌ／ウェルで添加し、さらに室温で１時間放置した。ＴＢＳにて十分に洗浄後、ＨＲＰの発色基質である３，３’，５，５’
テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）を５０μｌ／ウェルで添加し、発色を確認後に反応停止液として１Ｎ  ＨＣｌを５０μｌ／ウェルで加え、Ａ４５０における吸光度を測定した。比較対照として、市販の抗酸化ＬＤＬウサギポリクローナル抗体（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，ＵＳＡ）、抗ＭＤＡ−ＬＤＬマウスモノクローナル抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｈｏｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、ＣＴＬＤ様ポリペプチドの代わりに使用した。抗体使用時は、ＨＲＰ−ストレプトアビジンの代わりに、ＨＲＰ標識２次抗体を使用した。
【０２８４】
その結果、ＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４はともに、１μｇ／ｍｌの濃度（ウェル当たりでは、１００ｎｇ）の濃度の完全酸化ＬＤＬ、部分酸化ＬＤＬ、ＭＤＡ−ＬＤＬを十分認識可能なことが示された。未変性のＬＤＬとも反応はするが、１０μｇ／ｍＬ（ｗｅｌｌ当たりでは１μｇ）と検出感度が低かった。また、目的タンパク質の変性ＬＤＬ認識能は、以下の表５に示されるように、プロテアーゼ耐性変異を導入していないネイティブＣＴＬＤ、ネイティブＣＴＬＤ１４と比較しても、何ら遜色が無いことが示された。
【０２８５】
さらに、市販の抗酸化ＬＤＬ抗体、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体は、以下の表６に示されるように、未変性ＬＤＬとも反応する上、酸化ＬＤＬ、ＭＤＡ−ＬＤＬへの特異性が特別高くないことが明らかになった。
【０２８６】
これらの結果から、ＰＲ−ＣＴＬＤ、ＰＲ−ＣＴＬＤ１４は、ＥＬＩＳＡにおける抗体に代わる変性ＬＤＬ検出系として十分に機能し得ることが示された。
【０２８７】
【表５】
0005604782.tif 000008
【０２８８】
【表６】
0005604782.tif 000009
【０２８９】
総変性ＬＤＬを捕捉した後、総変性ＬＤＬに占める各種変性ＬＤＬ分子種の検出への可能性を明らかにする目的で、サンドイッチＥＬＩＳＡシステムにおけるＰＲ−ＣＴＬＤの有効性を検討した。
【０２９０】
９６穴のプレートに５μｇ／ｍｌの濃度にＴＢＳにて希釈した受容体（ＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４）溶液を、１００μｌ／ウェルで添加した。４℃で一晩放置した後、２％  スキムミルク溶液で１時間ブロッキングおよびＴＢＳでの洗浄後、ＬＤＬ、完全酸化ＬＤＬ、部分酸化ＬＤＬ、ＭＤＡ−ＬＤＬの各リガンドを添加し、室温で２時間反応させた。ＴＢＳにて十分に洗浄した後、抗酸化ＬＤＬ抗体、または抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体と反応させ、ＴＢＳで十分に洗浄し、次いで、ＨＲＰ標識２次抗体と反応させ、ＴＢＳで十分に洗浄した。この９６穴プレートに、ＴＭＢを基質として添加し、上記のようにＡ４５０の吸光度を測定した。上記で説明したように、使用した抗体の特異性が低いために、完全なタイプ分けには至らなかったが、各種ＬＤＬを捕捉後、異なった特異性の抗体などの分子を使用することにより、最初の段階で捕えられた総変性ＬＤＬを分類可能なことが示された（表７）。
【０２９１】
【表７】
0005604782.tif 000010
【０２９２】
（３）Ｒｅ−ＣＴＬＤは、変性ＬＤＬを特異的に検出する
酸化ＬＤＬを検出するために、種々の抗体が使用されている。また、市販の酸化ＬＤＬ測定用キット（サンドイッチＥＬＩＳＡ機構による）において二次抗体として抗ＡｐｏＢ抗体が使用されていることから、Ｒｅ−ＣＴＬＤと抗ＡｐｏＢ抗体とを組み合わせて、より実用的な酸化ＬＤＬ検出系を作製することが考えられる。そこで、本実験においては、抗ＡｐｏＢ抗体を用いた新たな検出系が実現可能かどうかを調べるために、酸化されていないＬＤＬに対する特異性を検討した。
【０２９３】
９６穴のプレートに１５μｇ／ｍｌの濃度にＴＢＳにて希釈した受容体（ＰＲ−ＣＴＬＤ）溶液を、５０μｌ／ウェルで添加した。４℃で一晩放置した後、１％  ＢＳＡ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０含ＴＢＳ溶液（３００μｌ／ウェル）で一晩ブロッキングおよびＴＢＳでの洗浄後、ＬＤＬ、完全酸化ＬＤＬ、部分酸化ＬＤＬ、ＭＤＡ−ＬＤＬの各リガンド（濃度０、０．０１、０．０４、０．１、０．２、０．４、０．８、１、２、４、８および１０μｇ／ｍＬ）を１００μｌ／ウェルで添加し、３７℃で２時間反応させた。ＴＢＳ-Ｔｗｅｅｎ（０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０）にて十分に洗浄した後、ＨＲＰ標識抗ＡｐｏＢ抗体と３７℃で６０分反応させ、ＴＢＳ―Ｔｗｅｅｎで十分に洗浄した。この９６穴プレートに、ＴＭＢを基質として添加し、上記のようにＡ４５０の吸光度を測定した。結果を図１７に示す。この図から明らかなように、Ｒｅ−ＣＴＬＤは変性ＬＤＬを特異的に検出し、ＬＤＬに対する特異性は極めて低いことが実証された。
【０２９４】
（実施例１０：ＣＴＬＤ様ポリペプチドによる変性ＬＤＬ含有溶液からの変性ＬＤＬの除去）
（１）人工の変性ＬＤＬ含有溶液からの変性ＬＤＬの除去
溶液中に存在する変性ＬＤＬなどの除去にＰＲ−ＣＴＬＤなどが有効であるか明らかにする目的で、ＰＲ−ＣＴＬＤ等をビーズ上に固定化し、この固定化ビーズに変性ＬＤＬを結合させた。Ｍｕｔｅｉｎ  Ｍａｔｒｉｘ  １０μｌ（５０％スラリー）とビオチン化ＣＴＬＤまたはビオチン化ＰＲ−ＣＴＬＤ（５μｇ／１００μｌ  ＴＢＳ）を４℃で３０分間反応させた。２，５００ｒｐｍ×５分間のスイングローターによる遠心分離でこのＭａｔｒｉｘを回収後、冷ＴＢＳで繰り返し洗浄した。続いて、ＤｉＤ標識変性ＬＤＬと５分間反応させた後、このＭａｔｒｉｘと上清を回収した。コントロールとして、ＣＴＬＤを結合させていないＭｕｔｅｉｎ  Ｍａｔｒｉｘ  １０μｌ（５０％スラリー）のみを添加した実験区を設けた。回収した上清（１００μｌ）を蛍光フリーのマイクロタイタープレートに分注し、マイクロタイタープレート対応の蛍光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）により蛍光強度を測定した。その結果、ＣＴＬＤもしくはＰＲ−ＣＴＬＤを結合したＭａｔｒｉｘと反応させた上清からは蛍光がほとんど検出できず、ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤにより変性ＬＤＬが溶液中から完全に除去されたことが示された。
【０２９５】
上記の結果から、表８に示すように、固相上に固定化されたＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤは、変性ＬＤＬを結合し、このことによって溶液中から除去可能なことが示された。
【０２９６】
【表８】
0005604782.tif 000011
【０２９７】
（２）変性ＬＤＬ含有血漿モデルからの変性ＬＤＬの除去
Ｎｉ−ａｇａｒｏｓｅビーズ  ２０μｌ（５０％スラリー）とＲｅ−ＰＲ−ＣＴＬＤ（５μｇ／１００μｌ  ＴＢＳ）を４℃で３０分間反応させた。２５００ｒｐｍ×５分間のスイングローターによる遠心分離でこのビーズを回収後、冷ＴＢＳで繰り返し洗浄した。
【０２９８】
大過剰の酸化ＬＤＬを添加した血漿中（１２０μｌ）にＲｅ−ＰＲ−ＣＴＬＤを固定化したＮｉ−ａｇａｒｏｓｅビーズ  ２０μｌ（５０％スラリー）を添加し、３０分間４℃で反応させた後、遠心（２，８００ｒｐｍ×５分間）し、上清に回収される血漿中の酸化ＬＤＬ濃度を、上記実施例９（３）で用いたＣＴＬＤ−抗ＡｐｏＢ抗体によるサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定し、含有酸化ＬＤＬ除去効率を求めた。結果を図１８に示す。
【０２９９】
Ｒｅ−ＰＲ−ＣＴＬＤ固定化ビーズにより、１０μｇ／ｍｌ程度までの酸化ＬＤＬであれば、変性ＬＤＬ含有血漿モデルから酸化ＬＤＬを８６％回収可能なことが確認された。１００μｇ／ｍｌという異常な高濃度を含有するモデル血漿においても、含有変性ＬＤＬのうちの５０％以上は回収可能であった。
【０３００】
（実施例１１：ＲＡＧＥ様ポリペプチドによるＡＧＥの検出）
ヒト血液、尿中などのＡＧＥの測定手法は、糖尿病性血管障害の早期診断、機能性食品の予防効果評価、生活改善や投薬による治療効果の評価など様々な分野での活用が期待される。しかし、ＡＧＥは分子の修飾構造が一定ではなく、バイオマーカーとして意味のある分子種が明確でないなど、モノクローナル抗体やＨＰＬＣなどによるＡＧＥの定量的検出は、必ずしも正確であるとは言えなかった。一方でＲＡＧＥは幅広い分子種のＡＧＥを認識可能なマルチリガンドレセプターであり、生体内のＡＧＥを鋭敏に検出する可能性が高い。そこで、広く様々な分野で活用されており汎用性が高いＥＬＩＳＡシステムにおいて、受容体認識能を活用可能か検討した。
（１）リガンドの調製
リガンドとして、以下のものを使用した：ｃＢＳＡ（糖化処理をしていないＢＳＡ，ネガティブコントロールとして使用）；Ｒ−ＡＧＥ（リボースにより糖化処理をしたＢＳＡ）、Ｆ−ＡＧＥ（フルクトースにより処理をしたＢＳＡ）；Ｇ−ＡＧＥ（グルコースにより糖化処理をしたＢＳＡ）。
【０３０１】
糖化ＢＳＡを、以下のように調製した。調製に際して、可能なものはすべて滅菌し、可能な限り無菌的に操作した。
【０３０２】
エタノールで洗浄したスパチュラを使用して、各糖（グルコース  ４．５１ｇ、フルクトース  ４．５１ｇおよびリボース  ３．７５ｇ）を秤量して、滅菌したキャップ付きプラスチックチューブ中に入れた。各プラスチックチューブに、２０ｍＬの滅菌１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を無菌的に添加し、穏やかに転倒混和することによってその溶液を混合した。最後に２１ｍＬのエンドトキシンフリーの蒸留水を添加した。各成文の最終濃度は、４００ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中、５０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、５００ｍＭ  グルコース（Ｇｌｕ５００  ＢＳＡ）、５００ｍＭ  フルクトース（Ｆｒｕ５００  ＢＳＡ）、５００ｍＭ  リボース（Ｒｉｂ５００  ＢＳＡ）であった。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ０．２２μｍフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濾過滅菌した後、これらの糖−ＢＳＡ溶液を、最大１２週間、遮光して３７℃でインキュベートした。１週間に１回、無菌条件下で、チューブをアルコールに浸したペーパータオルで拭いてからキャップを開け、各糖−ＢＳＡ調製物を８０μｌ取り出し、３．５ｍｍマイクロプローブを備えたｐＨメーターでｐＨをモニターした。各糖−ＢＳＡ溶液のｐＨを、１０Ｎ  水酸化ナトリウム溶液（エンドトキシンフリー）で７．４に調節した。１週間に１回ｐＨを調節した後、５〜１０ｍＬずつ分注して、分析に供するまで−８０℃で保存した。未反応の糖を除去することによってこの反応を停止するために、分注したものをすべて解凍して透析チューブに入れ、オートクレーブ処理したビーカー中で滅菌ＰＢＳに対して完全に透析した。透析チューブから糖−ＢＳＡ溶液を取り出す前に、チューブの開口部を７０％エタノールで滅菌した。取り出した糖−ＢＳＡ溶液を、滅菌チューブに入れ、使用時まで４℃で保存した。
（２）ＲＡＧＥ様ポリペプチドによるＡＧＥの検出
ｓＲＡＧＥ、ｍＲＡＧＥ、ＲＡＧＥ１〜ＲＡＧＥ８については、９６穴プレート（Ｎｕｎｃ）に、ＢＳＡおよび上記のように調製した各リガンドを、ＴＢＳにて０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌにＴＢＳにて希釈した後、１００μｌ／ウェルずつ分注し、４℃で一晩放置した。Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｆｒｅｅブロッキング剤（Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ）により１時間ブロッキングおよびＴＢＳで洗浄した後、５μｇ／ｍｌに希釈した受容体（ｓＲＡＧＥ、ｍＲＡＧＥ、ＲＡＧＥ１〜ＲＡＧＥ８）溶液を１００μｌを添加し、２時間室温で放置した。
【０３０３】
ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６については、９６穴プレート（Ｎｕｎｃ）に、ＢＳＡおよび上記のように調製した各リガンドを、ＴＢＳにて０、０．０１、０．０４、０．１、０．２、０．４、０．８、１、２、４、８および１０μｇ／ｍＬに希釈した後、１００μｌ／ウェルずつ分注し、４℃で一晩放置した。Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｆｒｅｅブロッキング剤（Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ）により１時間ブロッキングおよびＴＢＳで洗浄した後、５μｇ／ｍｌに希釈した各ＲＡＧＥ様ポリペプチド溶液を１００μｌを添加し、２時間室温で放置した。
【０３０４】
上記のように処置した各９６穴プレートをＴＢＳにて十分に洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジン（Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の１００，０００×希釈溶液を１００μｌ／ウェルで添加し、さらに室温で１時間放置した。ＴＢＳにて十分に洗浄後、ＨＲＰの発色基質である３，３’，５，５’  テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）を５０μｌ／ウェルで添加し、発色を確認後に反応停止液として１Ｎ  ＨＣｌを５０μｌ／ウェルで加え、Ａ４５０における吸光度を測定した。比較対照として、市販の抗ＡＧＥ抗体（Ｔｒａｎｓ  Ｇｅｎｉｃ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）、抗ペントシジン抗体（Ｔｒａｎｓ  Ｇｅｎｉｃ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を各ＲＡＧＥ様ポリペプチドの代わりに使用した。抗体使用時は、ＨＲＰ−ストレプトアビジンの代わりに、ＨＲＰ標識２次抗体を使用した。
【０３０５】
その結果、４箇所に変異を導入したｍＲＡＧＥ１にも天然型のＲＡＧＥに遜色がない認識能が確認された。さらに、可溶性ポリペプチドとして調製可能であったＲＡＧＥ２、ＲＡＧＥ３、およびＲＡＧＥ７も認識能を有していた。ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６もまた、ＡＧＥ認識能を有していた。ｍＲＡＧＥ１については、０．１〜１０μｇ／ｍｌの範囲において非常に検出感度が高かったために、さらに低い濃度（０、０．００１、０．００４、０．０１、０．０２、０．０４、０．０８、０．１、０．２、０．４、０．８および１μｇ／ｍｌ）（ＴＢＳ希釈））でも実験を行ったところ、非常に微量のリガンドを認識できることが分かった（図１９Ａ）。
【０３０６】
以下の表９は、可溶性ポリペプチドとして発現されるＲＡＧＥ様ポリペプチドについての結果を示す。いずれもネガティブコントロールであるｃＢＳＡはほとんど認識せず、特異性が強いことが示された。いずれのＲＡＧＥでも反応のバックグランドが高いという難点はあるが、検出感度もよく、０．１μｇ／ｍｌ（ウェル当たりでは１０ｎｇ）でも十分に検出可能であり、また、生体内における反応性  Ｒ−ＡＧＥ  ＞  Ｆ−ＡＧＥ  ＞  Ｇ−ＡＧＥと一致した反応の強度を示した。また、バックグラウンドが高く、リガンドごとに値が異なるため、各実験においてリガンドを添加しなかった場合のＡ４５０もまた表中に示した。ｍＲＡＧＥ、ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６については、その検出感度をそれぞれ、図１９Ａ〜Ｄにグラフに示す。ＲＡＧＥ１４３は、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメインを欠いているにも関わらず、ＲＡＧＥ１と同等の認識特性を示し、認識能も大差は無かった。ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６は、Ｃ２ドメインを欠いているにも関わらず、ＲＡＧＥ１と同等の認識特性を示し、認識能にも遜色が無かった。
【０３０７】
さらに、市販の抗ＡＧＥ抗体も検出に使用可能であったが、検出感度はＲＡＧＥの方が高かった。抗ペントシジン抗体は、いずれのタイプのＡＧＥとの反応も確認できず、ＥＬＩＳＡ系への適用は難しいことが示された。
【０３０８】
【表９】
0005604782.tif 000012
【０３０９】
総ＡＧＥを捕捉した後、総ＡＧＥに占める各種ＡＧＥ分子種の検出への可能性を明らかにする目的で、サンドイッチＥＬＩＳＡシステムにおけるＲＡＧＥ様ポリペプチドの有効性を検討した。
【０３１０】
９６穴のプレートに５μｇ／ｍｌの濃度にＴＢＳにて希釈した受容体（各ＲＡＧＥ様ポリペプチド）溶液を１００μｌ／ウェルで添加した。４℃で一晩放置した後、Ｐｒｏｅｔｉｎ−Ｆｒｅｅブロッキング剤で１時間ブロッキングおよびＴＢＳでの洗浄後、Ｃ−ＢＳＡ、Ｒ−ＢＳＡ、Ｆ−ＢＳＡ、Ｇ−ＢＳＡの各ＡＧＥを添加し、室温で２時間反応させた。ＴＢＳにて十分に洗浄し、抗ＡＧＥ抗体と反応させ、ＴＢＳで十分に洗浄し、次いで、ＨＲＰ標識２次抗体と反応させ、ＴＢＳで十分に洗浄した。この９６穴プレートに、ＴＭＢを基質とて添加し、上記のようにＡ４５０の吸光度を測定した。上記で説明したように、使用した抗体の特異性が低いために、完全なタイプ分けには至らなかったが、各種ＡＧＥを捕捉後、異なった特異性の抗体などの分子を使用することにより、最初の段階で捕えられた総ＡＧＥを分類可能なことが示された（表１０）。
【０３１１】
【表１０】
0005604782.tif 000013
【０３１２】
（３）ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６によるＡＧＥの検出および認識能の比較
上記（２）と同様に、ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６によるＡＧＥ（ｃＢＳＡ、Ｒ−ＡＧＥ、Ｆ−ＡＧＥおよびＧ−ＡＧＥ）の検出を行った。その結果をそれぞれ図２０Ａ〜Ｄに示す。これら図から明らかなように、ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６はいずれも、ＲＡＧＥ１と同等の認識特性を示し、認識能にも遜色が無いことが実証された。
【０３１３】
（４）ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６によるヘモグロビンＡ１ｃの検出
ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）はアマドリ転移化合物であるが、ＡＧＥに包含され、血糖コントロールの指標として用いられている。そこで、ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６の各分子が、ヘモグロビンＡ１ｃを特異的に検出するか否かを決定した。
【０３１４】
ＨｂＡ１ｃ（ＫＡＭＩＹＡ  ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ  ＣＡＭＰＡＮＹ，ＵＳＡ、  ＫＡＩ−０９８Ｃ）をプレート上に固定し、上記（２）のＡＧＥ検出の場合と同様にして、ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６で検出した。結果を図２１に示す。各ＲＡＧＥ様分子によりＨｂＡ１ｃが検出可能なことが示された。
【０３１５】
（５）ＲＡＧＥ様ポリペプチドと種々の抗体によるＡＧＥの検出
ＡＧＥの構造は、変性ＬＤＬ以上に多様であるため、ＡＧＥを定量可能な優れた抗体および特定の構造のＡＧＥ分子種を識別可能な特異性の高い抗体に関する報告は少なく、ＡＧＥ分子種の定量と各分子の識別の両方を可能にするパネル開発は、酸化ＬＤＬ分子種に関するパネル開発以上に困難である。従って、現時点で実現可能なＡＧＥ様分子種の定量および各分子種の識別を可能にするパネルを作製するために、サンドイッチＥＬＩＳＡを行い、多様な構造のＡＧＥ様分子種の定量および各分子種の識別を可能にするパネル作製を試みた。
【０３１６】
（ａ）抗ＨｂＡ１ｃ抗体；
ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６をプレート上に固定化し、抗ＨｂＡ１ｃマウスモノクローナル抗体（ＥＸＯＣＥＬＬ，ＩＮＣ，ＵＳＡ、  Ｅ８５Ａ）でサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。一般的な検出工程は、上記（２）と同様である。ただし、抗ＨｂＡ１ｃ抗体は、ＨＲＰ標識がなされていないため、二次抗体として、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を用いて検出した。
【０３１７】
結果を図２２に示す。ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６のいずれもＨｂＡ１ｃを濃度依存的に検出可能なことが実証された。
【０３１８】
（ｂ）抗ＡＧＥ抗体；
ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６をプレート上に固定化し、抗ＡＧＥマウスモノクローナル抗体（ＴｒａｎｓＧｅｎｉｃ  Ｉｎｃ.，日本  ６Ｄ１２）でサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。一般的な検出工程は、上記（２）と同様である。ただし、抗ＡＧＥ抗体は、ＨＲＰ標識がなされていないため、二次抗体として、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を用いて検出した。
【０３１９】
結果を図２３Ａおよび図２３Ｂに示す。ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６のいずれも、ｃＢＳＡに対してはほとんど反応せず、Ｒ−ＡＧＥに対して高い反応性を有することが実証された。
【０３２０】
（実施例１２：ＲＡＧＥ様ポリペプチドによるＡＧＥ含有溶液からのＡＧＥの除去）
溶液中に存在するＡＧＥなどの除去にｍＲＡＧＥ１などが有効であるか明らかにする目的で、ＲＡＧＥ様ポリペプチドをビーズ上に固定化し、この固定化ビーズにＡＧＥ（Ｒ−ＢＳＡ）を結合させた。Ｍｕｔｅｉｎ  Ｍａｔｒｉｘと１０μｌ（５０％  スラリー）とビオチン化ネイティブＲＡＧＥまたはビオチン化ｍＲＡＧＥ１（５μｇ／１００μｌ  ＴＢＳ）を４℃で３０分間反応させた。２，５００ｒｐｍ×５分間のスイングローターによる遠心分離でこのＭａｔｒｉｘを回収後、冷ＴＢＳにて繰り返し洗浄した。続いて、Ａｌｅｘａ６３３標識Ｒ−ＢＳＡと５分間反応させた後、Ｍａｔｒｉｘと上清を回収した。コントロールとしてＲＡＧＥもｍＲＡＧＥ１も結合させていないＭｕｔｅｉｎ  Ｍａｔｒｉｘ  １０μｌ（５０％  スラリー）のみを添加した実験区を設けた。回収した上清（１００μｌ）を蛍光フリーのマイクロタイタープレートに分注し、マイクロタイタープレート対応の蛍光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）により蛍光強度を測定した。その結果、ＲＡＧＥもしくはｍＲＡＧＥを結合したＭａｔｒｉｘと反応させた上清からは蛍光がほとんど検出できず、ＲＡＧＥおよびｍＲＡＧＥによりＡＧＥ溶液中から完全に除去されたことが示された（表１１）。
【０３２１】
【表１１】
0005604782.tif 000014
【０３２２】
（実施例１３：リフォールディングされたＣＴＬＤ様ポリペプチドまたはＲＡＧＥ様ポリペプチドによる変性ＬＤＬまたはＡＧＥの検出）
（１）Ｒｅ−ＣＴＬＤ様ポリペプチドによる変性ＬＤＬの検出
上記実施例７において作製したリフォールディングした分子も可溶性ポリペプチドと同様に、変性ＬＤＬを検出できるか否かを確認した。検出方法は、上記実施例９に記載されるとおりである。予備試験の結果、ＣＴＬＤ様ポリペプチドおよびリフォールディングしたＣＴＬＤ様ポリペプチドの場合は、全てＴＢＳを使用した。
【０３２３】
結論として、リフォールディングされたＣＴＬＤ様ポリペプチドは、可溶性ＣＴＬＤ様ポリペプチドと何ら遜色のない反応性を示した（表１２）。さらにリフォールディングにより得られた分子には、リフォールディング過程で使用した界面活性剤が結合している。そのため、その物性が可溶性ポリペプチドとして発現した受容体と異なっていた。その特徴は、ＥＬＩＳＡの結果から観察された。
【０３２４】
【表１２】
0005604782.tif 000015
【０３２５】
リフォールディングに使用した界面活性剤のＥＬＩＳＡへの影響をＣＴＬＤの場合、ＣＴＡＢ，ＳＢ３−１４に関して検討した（表１４）。可溶化にはＳＢ３−１４も有効であったが、ＥＬＩＳＡの結果からＣＴＡＢによるリフォールディングが検出系としては有効であることが示された。
【０３２６】
【表１４】
0005604782.tif 000016
【０３２７】
表１２の結果から明らかなように、Ｒｅ−ＣＴＬＤおよびＲｅ−ＣＴＬＤ１４の種々の変性ＬＤＬに対する特異性は非常に高いので、さらに低い濃度（０、０．００５、０．０１、０．０２、０．０４、０．０８、０．１、０．２、０．４、０．８、１、１．５μｇ／ｍｌ）の各変性ＬＤＬを調製して、基本的には実施例７（２）に記載されるように検出を行った。測定は、通常使用されるマイクロプレートリーダーを用いて行った。結果をそれぞれ、図２４Ａおよび２４Ｂに示す。
【０３２８】
これら図から明らかなように、Ｒｅ−ＣＴＬＤおよびＲｅ−ＣＴＬＤ１４は、完全酸化ＬＤＬ、部分酸化ＬＤＬ、マロンジアルデヒド化ＬＤＬなど、代表的な変性ＬＤＬをプレート上で認識可能であることが確認された。また測定は、通常のマイクロプレートリーダーで行えるため、実験室、病院、その他医療検査機関において容易に行うことができる。
【０３２９】
Ｒｅ−ＣＴＬＤ１４については、リフォールディング直後では、Ｒｅ−ＣＴＬＤより感度が高かったが、数週間以上の冷蔵保存時には沈殿が生じ、活性が低下したが、リフォールディング直後に固相上で乾燥させた場合には、安定であると考えられる。
【０３３０】
（２）Ｒｅ−ビオチン化ＣＴＬＤおよび／またはＲｅ−ビオチン化なしＣＴＬＤと、種々の抗体とによる変性ＬＤＬの検出
（Ｉ）材料および方法
本実施例において使用する抗体のうち、（ａ）〜（ｃ）については、従来からＬＤＬの生体内修飾に伴って生じると報告がある変性ＬＤＬの成分（もしくは変性ＬＤＬ自体）に結合する抗体である。（ｄ）〜（ｈ）については、最近、ＬＤＬの生体内修飾に伴って生じると報告がある変性ＬＤＬの成分に結合する抗体である。「動脈硬化症」というグループに属するとしても、脳血管系の動脈硬化症と心臓血管系の動脈硬化症では、生じる変性ＬＤＬの種類が異なるとの報告もあり、ＣＴＬＤと各成分に特異的な抗体とを組み合わせることで、多様な変性ＬＤＬ分子種の検出および定量を可能にするパネルが作製可能であると考えられる。この可能性を探るための基礎として、本実施例を行った。
【０３３１】
本実施例では、具体的には、全てサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて各変性ＬＤＬ（完全酸化ＬＤＬ、部分酸化ＬＤＬ、ＭＤＡ−ＬＤＬ）を検出した。Ｒｅ−ＣＴＬＤ（１５μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウェル）をプレートに分注後、４℃で一晩放置した。ビオチン化されている場合には、予めストレプトアビジンを固定化したプレートを準備し、ストレプトアビジンを介して方向性を維持して固定した。その後、１％ＢＳＡ/０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０含ＴＢＳ（３００μｌ／ウェル）を加え、４℃で１晩ブロッキングした。各変性ＬＤＬ（濃度：０、０．０１、０．０４、０．１、０．２、０．４、０．８、１、２、４、８、１０μｇ／ｍＬ）を、１００μｌ／ウェル添加し、３７℃で反応後、以下に示す各抗体（１００μｌ／ウェル）と反応させた後、最終的にはＨＲＰ−ＴＭＢによる発色で認識能を検出した。各反応の間は、ＴＢＳ―Ｔｗｅｅｎで５回洗浄した。
【０３３２】
（ＩＩ）結果
（ａ）抗ＡｐｏＢ抗体による検出
現在報告のある酸化ＬＤＬ検出用ＥＬＩＳＡは、検出に抗ＡｐｏＢ抗体を使用するのが一般的であるので、本実験では、各酸化ＬＤＬを検出するために、ＨＲＰ標識抗ＡｐｏＢウサギポリクローナル抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ，Ｉｎｃ．（ＵＳＡ），  ＧＴＸ４００４７）とＲｅ−ビオチン化なしＣＴＬＤまたはＲｅ−ビオチン化ＣＴＬＤと組み合わせて使用した。
【０３３３】
結果をそれぞれ図２５Ａ〜Ｂに示す。これら図から明らかなように、Ｒｅ−ビオチン化なしＣＴＬＤまたはＲｅ−ビオチン化ＣＴＬＤと抗ＡｐｏＢとの組み合わせは、変性ＬＤＬを高感度で検出できることが示された。しかし、抗ＡｐｏＢ抗体を用いた場合、変性ＬＤＬ内のＡｐｏＢも脂質同様に酸化などの修飾を受けている可能性が高く、抗ＡｐｏＢ抗体による検出が最適であるかは疑問がある。従って、抗ＡｐｏＢ抗体以外にも、さらに種々の変性ＬＤＬの成分に結合する抗体を用いて、Ｒｅ−ＣＴＬＤとの併用によって、変性ＬＤＬを高感度で検出し得るか否かを確認した。
【０３３４】
（ｂ）抗酸化ＬＤＬ（抗ＯｘＬＤＬ）抗体による検出
抗ＯｘＬＤＬ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ（ビオチン化なしのＣＴＬＤ）
上記実施例９（２）に示されるように、抗ＯｘＬＤＬ抗体の変性ＬＤＬ認識特異性は低い。抗酸化ＬＤＬ抗体を用いた競合ＥＬＩＳＡ系も販売されてはいる（ＭｅｒｃｏｄｉａＯｘｉｄｉｚｅｄＬＤＬＣｏｍｐｅｔｉｔｉｃｅＥＬＩＳＡ,  Ｍｅｒｃｏｄｉａ（Ｓｗｅｄｅｎ））が、このキットも含めて、抗酸化ＬＤＬ抗体の特異性は高くない。しかし、優れた抗体が得られれば、抗ＡｐｏＢ抗体に代わる検出系となり得る。そこで、本実験では、比較的特性の高い抗体として、抗ＯｘＬＤＬウサギポリクローナル抗体（ＮＯＶＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ（ＵＳＡ），  ＮＢ６００−１３３２）を選択し、このポリクローナル抗体とＲｅ−ビオチン化なしＣＴＬＤまたはＲｅ−ビオチン化ＣＴＬＤとを組み合わせて使用し、二次抗体としてＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体とさらに３７℃で１時間反応させることによって、変性ＬＤＬの認識を検出した。
【０３３５】
結果を図２６Ａ〜Ｂに示す。これら図から明らかなように、Ｒｅ−ＣＴＬＤと上記抗ＯｘＬＤＬウサギポリクローナル抗体との組み合わせは、変性ＬＤＬを高感度で検出できることが示された。
【０３３６】
（ｃ）抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体による検出
抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体は市販されており、この抗体の特異性は高いと報告されている。そこで、本実験では、市販の抗ＭＤＡ−ＬＤＬマウスモノクローナル抗体（ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＳＨＯＰ（Ｄｅｎｍａｒｋ）、  ＨＹＢ２６２）とＲｅ−ビオチン化なしＣＴＬＤまたはＲｅ−ビオチン化ＣＴＬＤとを組み合わせて使用し、二次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体とさらに３７℃で１時間反応させることによって、変性ＬＤＬの認識を検出した。
【０３３７】
結果を図２７Ａ〜Ｂに示す。これら図から明らかなように、Ｒｅ−ＣＴＬＤと抗ＭＤＡ−ＬＤＬマウスモノクローナル抗体との組み合わせは、ＭＤＡ−ＬＤＬのみを極めて特異的に検出できることが示された。
【０３３８】
（ｄ）抗アクロレイン（ＡＣＲ）抗体による検出
アクロレイン（ＡＣＲ）は、脂質の過酸化反応により生成し、動脈硬化巣における存在が確認されている。そこで、市販の抗アクロレインマウスモノクローナル抗体（日油株式会社、日本）とＲｅ−ビオチン化ＣＴＬＤとを組み合わせて使用し、二次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体とさらに３７℃で１時間反応させることによって、変性ＬＤＬの認識を検出した。
【０３３９】
結果を図２８に示す。抗ＡＣＲモノクローナル抗体との組み合わせは、ＭＤＡ−ＬＤＬを顕著に検出することが実証された。
【０３４０】
（ｅ）抗クロトンアルデヒド（ＣＲＡ）抗体による検出
クロトンアルデヒド（ＣＲＡ）は、生体内の脂質の酸化反応などにより生じることが報告された。そこで市販の抗ＣＲＡマウスモノクローナル抗体（日油株式会社、日本）とＲｅ−ビオチン化ＣＴＬＤとを組み合わせて使用し、二次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体とさらに３７℃で１時間反応させることによって、変性ＬＤＬの認識を検出した。
【０３４１】
結果を図２９に示す。抗ＡＣＲモノクローナル抗体との組み合わせは、酸化ＬＤＬおよびＭＤＡ−ＬＤＬを顕著に検出することが実証された。
【０３４２】
（ｆ）抗マロンジアルデヒド（ＭＤＬ）抗体による検出
マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）は、脂質の酸化により生じる。本実施例１３（２）（ｃ）の抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体は、ＭＤＡ−ＬＤＬ（すなわちＭＤＡ化ＬＤＬ）に結合する抗体であるが、本実験において使用する抗ＭＤＡモノクローナル抗体は、ＭＤＡがタンパク質のリジン残基と反応して生じるジヒドロピリジン−リジン誘導体（ＤＨＰ−Ｌｙｓ）に高い反応性を示す抗体である。そこで市販の抗ＭＤＡマウスモノクローナル抗体（日油株式会社、日本）とＲｅ−ビオチン化ＣＴＬＤとを組み合わせて使用し、二次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体とさらに３７℃で１時間反応させることによって、変性ＬＤＬの認識を検出した。
【０３４３】
結果を図３０に示す。抗ＭＤＡモノクローナル抗体との組み合わせは、ＭＤＡ−ＬＤＬを顕著に検出することが実証された。
【０３４４】
（ｇ）抗４−ヒドロキシノネナール（ＨＮＥ）抗体による検出；
不飽和脂肪酸が酸化ストレスを受けて生成する酸化二次生成物である４−ヒドロキシノ−２−ノネナール（ＨＥＮ）は、タンパク質のＬｙｓ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓのアミノ基と比較的安定な反応物（マイケル付加化合物）を形成し、抗ＨＮＥモノクローナル抗体は、この反応物を認識する。そこで、市販の抗ＨＮＥマウスモノクローナル抗体（日油株式会社、日本）とＲｅ−ビオチン化ＣＴＬＤとを組み合わせて使用し、二次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体とさらに３７℃で１時間反応させることによって、変性ＬＤＬの認識を検出した。
【０３４５】
結果を図３１に示す。抗ＨＮＥモノクローナル抗体との組み合わせは、ＭＤＡ−ＬＤＬおよび酸化ＬＤＬを顕著に検出することが実証された。
【０３４６】
（ｈ）抗ヘキサノイルリジン（ＨＥＬ）抗体による検出；
脂質の過酸化による生じる４−ヘキサノールは、Ｌｙｓと反応して、ヘキサノイル−Ｌｙｓを形成する。抗ＨＥＬモノクローナル抗体は、このヘキサノイル−Ｌｙｓを認識する。そこで、市販の抗ＨＥＬマウスモノクローナル抗体（日研ザイル株（日本）、日本老化制御研究所）とＲｅ−ビオチン化ＣＴＬＤとを組み合わせて使用し、二次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体とさらに３７℃で１時間反応させることによって、変性ＬＤＬの認識を検出した。
【０３４７】
結果を図３２に示す。抗ＨＥＬモノクローナル抗体との組み合わせは、ＭＤＡ−ＬＤＬおよび酸化ＬＤＬを顕著に検出することが実証された。
【０３４８】
（３）市販の酸化ＬＤＬ測定キットとの比較
本実施例においては、市販のキットとして、協和メデックス社（日本、東京）製の酸化ＬＤＬ測定試薬「ＭＸ」を使用した。このキットでは、抗酸化ホスファチジルコリン（ＰＣ）マウス抗体がプレート上に固定化されており、ＨＲＰ標識抗ヒトＡｐｏＢヤギ抗体とのサンドイッチＥＬＩＳＡにより酸化ＬＤＬを検出する。このキットにおいて使用されている抗酸化ＰＣ抗体部分を可溶性ＰＲ−ＣＴＬＤ、Ｒｅ−ＰＲ−ＣＴＬＤ（ビオチン化の有りおよびなし両者）に置き換えて、上記抗ＡｐｏＢ抗体と本発明のＲｅ−ＣＴＬＤとを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡを作製して、市販のキットと比較し、本発明のＲｅ−ＣＴＬＤの変性ＬＤＬに対する特異性を確認した。
【０３４９】
結果を図３３に示す。この図から明らかなように、抗ＰＣ抗体を本発明のＰＲ−ＣＴＬＤで置き換えても、上記キットと同様の感度で変性ＬＤＬを検出可能なことが実証された。よって、本発明のＰＲ−ＣＴＬＤは、大腸菌のような細菌で大量かつ安価に製造できるため、ＰＲ−ＣＴＬＤを用いるサンドイッチＥＬＩＳＡの方が安定に供給できる。
【０３５０】
（４）市販の抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体を用いて作製した酸化ＬＤＬ測定キットとの比較
本実施例においては、市販のキットにおいて使用される予定である抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体と本発明のＲｅ−ＣＴＬＤとを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡを作製し、同じサンドイッチＥＬＩＳＡ機構を用いる発売予定のキットと比較して、本発明のＲｅ−ＣＴＬＤの変性ＬＤＬに対する特異性を確認した。。発売が予定されているキットでは、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体がプレート上に固定化されており、抗ＡｐｏＢ抗体とのサンドイッチＥＬＩＳＡにより酸化ＬＤＬ（特にＭＤＡ−ＬＤＬ）を検出する。本発明のＲｅ−ＣＴＬＤを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡを行うにあたって、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体を固定化したプレートを作製し、以下の４つの系のサンドイッチＥＬＩＳＡを設計した：
１．酸化ＬＤＬ（Ｏｘ−ＬＤＬ）と反応させた後、抗ＡｐｏＢ抗体で検出する系（市販のキットと同じ）；
２．Ｏｘ−ＬＤＬと反応させた後、Ｒｅ−ＰＲ−ＣＴＬＤ（ビオチン化）と反応させる系；
３．ＭＤＡ−ＬＤＬと反応させた後、抗ＡｐｏＢ抗体で検出する系（市販のキットと同じ）；
４．ＭＤＡ−ＬＤＬと反応させた後、Ｒｅ−ＰＲ−ＣＴＬＤ（ビオチン化）と反応させる系。
【０３５１】
結果を図３４に示す。抗ＡｐｏＢモノクローナル抗体を使用した発売予定の系に準じた検出系（検出系１：菱形、検出系３：四角）の場合、高いＯＤ値を与えるものの、酸化ＬＤＬとＭＤＡ−ＬＤＬの識別が極めて低かった。一方、ＣＴＬＤを使用した検出系（検出系２：三角、検出系４：×）では、ＭＤＡ−ＬＤＬに対する認識能が高く、ＭＤＡ−ＬＤＬに特異的な検出系として優れていた。バックグランドが高いという欠点はあるが、低濃度範囲における認識能も高く、感度的にも優れていることが実証された。
【０３５２】
（実施例１４：Ｒｅ−ＲＡＧＥ様ポリペプチドによるＡＧＥの検出）
（１）Ｒｅ−ＲＡＧＥ様ポリペプチドによるＡＧＥの検出
上記実施例８において作製したリフォールディングしたＲＡＧＥ様ポリペプチドも可溶性ポリペプチドと同様に、ＡＧＥを検出できるか否かを確認した。検出方法は、上記実施例１１（２）に記載されるとおりである。予備試験の結果、Ｒｅ−ＲＡＧＥ様ポリペプチドに限り、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎを使用した場合に安定して活性が検出されたので、本試験においては、ＥＬＩＳＡにおける洗浄、希釈溶液は全てＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ）を使用した。上記実施例において可溶性ポリペプチドとして発現したＲＡＧＥ様ポリペプチドの場合は、ＴＢＳを使用した。
【０３５３】
結論として、リフォールディングされたＲＡＧＥ様ポリペプチド（Ｒｅ−ＲＡＧＥ）は、可溶性ＲＡＧＥ様ポリペプチドと何ら遜色のない反応性を示した（表１３）。さらリフォールディングにより得られた分子には、リフォールディング過程で使用した界面活性剤が結合している。そのため、その物性が可溶性ポリペプチドとして発現した受容体と異なっていた。その特徴は、ＥＬＩＳＡの結果から観察された。ことにＲＡＧＥに顕著であるが、界面活性剤と結合したことで、バックグランド値の低下がもたらされ、測定のＳ／Ｎ比が上昇する結果となった（表１３）。
【０３５４】
さらに、可溶性ポリペプチドとしての取得が不可能であったＲＡＧＥ８およびＲＡＧＥ９に関しても認識能の検証が可能になった。その結果、ＲＡＧＥ８でも、ＡＧＥの検出に使用することができるが、Ｖ領域のみのＲＡＧＥ９では、ほとんど認識能が確認されず、Ｖ領域のみでは十分に機能し得ないことが示された。
【０３５５】
【表１３】
0005604782.tif 000017
【０３５６】
ＲＡＧＥに関しては、ＲＡＧＥ７に関して４種類の界面活性剤の影響を検討した。ＣＴＡＢ以外に、Ｔｗｅｅｎ４０，６０の系もＳ／Ｎ比が向上しており使用可能であることが示された（表１５）。使用する界面活性剤により、精製効率、検出系としての優位性、分子の安定性が異なることから、リフォールディング過程で目的分子と複合体を形成した界面活性剤が分子の特性に影響していることが示された。
【０３５７】
【表１５】
0005604782.tif 000018
【０３５８】
さらに、Ｒｅ−ｍｉｎｉＲＡＧＥのリガンド認識能を詳細に比較した。リガンドとして、表１３に示される濃度より低い濃度（０、０．０１、０．０４、０．１、０．２、０．４、０．８、１、２、４、８μｇ／ｍＬ）のコントロールＢＳＡ（ｃ−ＢＳＡ）、ＡＧＥ（Ｒ−ＡＧＥ、Ｆ−ＡＧＥおよびＧ−ＡＧＥ）を調製し（実施例１１（１）を参照のこと）、そして市販のＣＭＬ−ＢＳＡ（ＣｙｃＬｅｘ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ（カタログ番号ＣＹ−Ｒ２０５４（長野、日本））およびＨｂＡ１ｃを（ＫＡＭＩＹＡ  ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ  ＣＡＭＰＡＮＹ，ＵＳＡ、  ＫＡＩ−０９８Ｃ）を上記と同じ濃度に調製し、実施例１１（２）に記載されるように検出を行った。測定は、通常使用されるマイクロプレートリーダーを用いて行った。結果を図３５Ａ〜Ｃ、図３６Ａ〜Ｄ、および図３７Ａ〜Ｂに示す。
【０３５９】
図３５Ａ〜Ｃまたは表１３から明らかなように、Ｒｅ−ＲＡＧＥ  １，３，７は、可溶性ＲＡＧＥと同様に、ＡＧＥを認識した。しかし、図３６Ａから明らかなように、Ｒｅ−ＲＡＧＥ３についてはバックグラウンド値が高いものの、いずれのＲｅ−ＲＡＧＥ様ポリペプチドも、ｃＢＳＡを濃度依存的に検出しなかった。また、図３６Ｂ〜Ｄから認められるように、Ｖドメインを欠くＲＡＧＥ４はＡＧＥに対する認識能を有しておらず、この事実から、Ｖドメインは、ＡＧＥ認識に必須であると考えられる。図３７Ａ〜Ｂから明らかなように、Ｒｅ−ＲＡＧＥ様ポリペプチドは、ＣＭＬ−ＢＳＡおよびＨｂＡ１ｃを認識することが示された。
【０３６０】
（２）Ｒｅ−ＲＡＧＥ１４３、２２３および２２６によるＡＧＥ（Ｒ−ＡＧＥ）の検出および認識能の比較
Ｒｅ−ＲＡＧＥ１４３、２２３および２２６と抗ＡＧＥ抗体とを使用して実施例１１（５）に記載されるようなサンドイッチＥＬＩＳＡを行う以外は、上記実施例１１（２）と同様に検出を行った。ただし、抗Ｒ−ＡＧＥ抗体は、ＨＲＰ標識がなされていないため、二次抗体として、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を用いて検出した。
【０３６１】
結果を図３８Ａ〜Ｂに示す。これら図から明らかなように、Ｒｅ−ＲＡＧＥ１４３、２２３および２２６はいずれも、コントロールＢＳＡ（Ｃ−ＢＳＡ）は殆ど認識せず（図３８Ａ）、Ｒ−ＡＧＥに対する特異的認識能が回復している（図３８Ｂ）ことが実証された。
【０３６２】
上記と同様に調製したプレートをクリーンベンチで１日乾燥させたものを使用して、同様にＡＧＥに対する認識能を調べた。
【０３６３】
結果を図３８Ｃ〜Ｄに示す。これら図から明らかなように、Ｒｅ−ＲＡＧＥ１４３、２２３および２２６はいずれも、安定してＡＧＥを認識し、図３８Ａ〜Ｂに示されるのと同様に、コントロールＢＳＡ（Ｃ−ＢＳＡ）は殆ど認識せず（図３８Ｃ）、Ｒ−ＡＧＥに対する特異的認識能が回復している（図３８Ｄ）ことが実証された。
【０３６４】
（３）市販のＡＧＥ検出キットとの比較
本実施例においては、市販のＣｙｃＬｅｘ社製のＣｉｒｃｕＬｅｘＴＭ  ＣＭＬ／Ｎε−（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｌｙｓｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＣＹ−８０６６）を使用した。このキットでは、ＣＭＬ−ＨＳＡがプレート上に固定化されており、競合ＥＬＩＳＡの原理に基づいてＣＭＬ−ＨＳＡ量を定量する。よって、ＣＭＬ−ＨＳＡ量に対してＡ４５０は減少する。
【０３６５】
この市販のキットを用いた競合ＥＬＩＳＡを行う前に、カルボキシメチルリジンを結合したリガンド分子、ＣＭＬ−ＢＳＡ（カタログ番号ＣＹ−Ｒ２０５２、ＣｙｃＬｅｘ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ製）およびＣＭＬ−ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）、ならびにＣＭＬ化リジンと同様にＡＧＥの一つとして知られるＣＥＬ（カルボキシエチル）化リジンを結合したリガンド分子、ＣＥＬ−ＢＳＡおよびＣＥＬ−ＨＳＡ（それぞれ、カタログ番号ＣＹ−Ｒ２０５４およびＣＹ−Ｒ２０６７、ＣｙｃＬｅｘ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ製）を、種々の濃度（０、０．０１、０．０４、０．１、０．２、０．４、０．８、１、２、４、および８μｇ／ｍＬ）に調製してプレート上に固定し、ｍｉｎｉＲＡＧＥ（ＲＡＧＥ１、２、３、４、７、および８）でこれら分子に対する認識能を調べた。結果をそれぞれ図３９Ａ〜Ｄに示す。いずれのリガンド分子に関しても、ＲＡＧＥ１、３は、認識能が高かった。ＲＡＧＥ７でも認識は可能であった。また、ｍｉｎｉＲＡＧＥは、ＣＥＬ化分子よりもＣＭＬ化分子に対する認識能が高かった。
【０３６６】
第二に、上記キットと本発明のＲｅ−ＲＡＧＥとを比較するために、以下の実験を行った。この市販のキットを用いた競合ＥＬＩＳＡについては、製造業者の説明書で推奨されるように行った。本発明のＲｅ−ＲＡＧＥを用いる実験については、その市販のキット中に含まれる抗ＣＭＬ付加物モノクローナル抗体ＫＭ−２Ａ９をプレートに固定化し、この抗体に直接ＣＭＬ−ＨＳＡを認識させ、続いてビオチン化Ｒｅ−ＲＡＧＥ１を反応させ、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（実施例９（２）に示されるように調製）と反応させ、最終的にＨＲＰの基質であるＴＭＢを加え、発色を比色した。結果を図４０に示す。市販のキットの方が吸光度の値としては高かった。しかし、本発明のＲｅ−ＲＡＧＥの場合、０．１μｇ／ｍｌ以下の領域でも検出可能である点など、感度的には遜色がなかった。
【０３６７】
（実施例１５：（Ｒｅ−）ＲＡＧＥは、変性ＬＤＬをも認識する）
（１）ｍｉｎｉＲＡＧＥの変性ＬＤＬに対する認識能
ＲＡＧＥ１の変性ＬＤＬに対する認識能
ＡＧＥの代わりに変性ＬＤＬをリガンドとして使用して、ＲＡＧＥ様ポリペプチド（ＲＡＧＥ１）による変性ＬＤＬの検出を行った。各リガンド（完全酸化ＬＤＬ、部分酸化ＬＤＬ、ＭＤＡ−ＬＤＬ）を、０、０．００１、０．００４、０．０１、０．０２、０．０４、０．０８、０．１、０．２、０．４、０．８および１μｇ／ｍＬの濃度でＴＢＳで希釈した後プレート上に固定し、ＲＡＧＥ１で検出した。基本的な検出工程は、実施例９（２）と同様であった。結果を図４１に示す。
【０３６８】
ＲＡＧＥはマルチリガンドレセプターであるものの、意外なことに、この図から明らかなように、酸化ＬＤＬ、ＭＤＡ−ＬＤＬなど、本来ＣＴＬＤにより検出される変性ＬＤＬ分子も効果的に認識可能であった。酸化ＬＤＬに対する特異性の高い優れた抗体が多くないという現状に鑑みれば、ＲＡＧＥ様ポリペプチドとＣＴＬＤ様ポリペプチドとを組み合わせることにより、特異性の高いサンドイッチＥＬＩＳＡを組むことの可能性が示された。
【０３６９】
（２）Ｒｅ−ＲＡＧＥの変性ＬＤＬに対する認識能
本実験においては、Ｒｅ−ＲＡＧＥ１〜９を使用した以外は、上記（１）と同様に、ＡＧＥの代わりに完全酸化ＬＤＬをリガンドとして、ＲＡＧＥ様ポリペプチドによる変性ＬＤＬの検出を行った。結果を図４２に示す。この図から明らかなように、Ｒｅ−ＲＡＧＥ１および３による完全酸化ＬＤＬの認識が高かった。Ｒｅ−ＲＡＧＥ２および７は、Ｒｅ−ＲＧＡＥ１および３には劣るが、認識能が認められた。よって、Ｒｅ−ＲＡＧＥ１４３、２２３および２２６も、変性ＬＤＬに対する認識能を有し、変性ＬＤＬの検出用素子として機能すると考えられる。
【０３７０】
（３）ＲＡＧＥ様ポリペプチドによる変性ＬＤＬ含有血漿モデルからの変性ＬＤＬの除去
Ｎｉ−ａｇａｒｏｓｅビーズ  ２０μｌ（５０％スラリー）とＲｅ−ＲＡＧＥ１（５μｇ／１００μｌ  ＴＢＳ）を４℃で３０分間反応させた。２５００ｒｐｍ×５分間のスイングローターによる遠心分離でこのビーズを回収後、冷ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで繰り返し洗浄した。
【０３７１】
大過剰の酸化ＬＤＬを添加した血漿中（１２０μｌ）にＲｅ−ＲＡＧＥ１を固定化したＮｉ−ａｇａｒｏｓｅビーズ  ２０μｌ（５０％スラリー）を添加し、３０分間４℃で反応させた後、遠心（２，８００ｒｐｍ×５分間）し、上清に回収される血漿中の酸化ＬＤＬ濃度を、受容体がＲｅ−ＲＡＧＥ１であることを除いて、上記実施例９（３）に記載されるようにＲｅ−ＲＡＧＥ１−抗ＡｐｏＢ抗体によるサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定し、含有酸化ＬＤＬ除去効率を求めた。結果を図４３に示す。
【０３７２】
Ｒｅ−ＲＡＧＥ１固定化ビーズにより、２０μｇ／ｍｌ程度までの酸化ＬＤＬであれば、変性ＬＤＬ含有血漿モデルから酸化ＬＤＬを１００％回収可能なことが確認された。１００μｇ／ｍｌという異常な高濃度を含有するモデル血漿においても、含有変性ＬＤＬのうちの８０％以上は回収可能であった。
【０３７３】
（４）ＲＡＧＥ様ポリペプチドとＣＴＬＤ様ポリペプチドとの組み合わせによる変性ＬＤＬの検出
ＣＴＬＤは変性ＬＤＬのみではなく、ＡＧＥ認識能も有している。一方、ＲＡＧＥはＡＧＥのみではなく、変性ＬＤＬ認識能を有している。そこで両者を組み合わせ、サンドイッチＥＬＩＳＡによる検出系を組み立てた。
【０３７４】
抗ＡｐｏＢ抗体の代わりにＲｅ−ＲＡＧＥ様ポリペプチドを使用することを除いて、実施例９（３）に記載されるように、変性ＬＤＬの検出を行った。
【０３７５】
Ｒｅ−ＰＲ−ＣＴＬＤをプレート上に固定化し、ＬＤＬ、完全酸化ＬＤＬ、ｃＢＳＡ、Ｒ−ＡＧＥ（濃度０、０．０１、０．０４、０．１、０．２、０．４、０．８、１、２、４、８および１０μｇ／ｍＬ）と反応させた。続いてＲｅ−ビオチン化ＲＡＧＥ１（５μｇ／ｍＬ；１００μｌ／ウェル）と反応させ、さらにＨＲＰ標識ストレプトアビジン（実施例９（２）に示されるように調製）と反応後、最終的には比色定量を行った。結果を図４４に示す。
【０３７６】
図から明らかなように、ＬＤＬに比して完全酸化ＬＤＬに対する認識が有意に高く、ｃＢＳＡに比してＲ−ＡＧＥに対する認識能が有意に高かった。現時点では、バックグラウンド値が高いなどの問題はあるが、さらに条件を至適化することによって、バックグラウンド値の低い、より特異性の高い変性ＬＤＬ検出系が開発可能であると考えられる。
【０３７７】
（実施例１６：Ｒｅ−ＣＴＬＤを固定化した基材の安定性および種々の抗体を用いた変性ＬＤＬの検出）
（１）Ｒｅ−ＣＴＬＤ固定化ビーズの保存期間による変性ＬＤＬ認識能の変化
検出用ビーズとしての安定性を検証する目的で、Ｒｅ−ＣＴＬＤをＮｉ−Ａｇａｒｏｓｅビーズに固定化したものを用いて、変性ＬＤＬが安定して検出できるか否かを調査した。
【０３７８】
実施例１０（２）に従って、Ｒｅ−ＰＲ−ＣＴＬＤ固定化Ｎｉ−Ａｇａｒｏｓｅビーズ（２０μｌ×５；５０％スラリー）を調製した。このように調製したビーズを４℃で保存した。上記５連で調製したビーズのうち１連を調製直後（０週間とする）に変性ＬＤＬ検出のために使用して、検出安定性の基準とした。残りのビーズのうちの４連を、調製後１、２、４、６週間の間、４℃で保存し、保存期間による変性ＬＤＬ検出の安定性の変化を測定した。変性ＬＤＬ含有血漿モデルは、実施例７（２）に従って測定時に調製した。結果を図４５に示す（０週間で測定した場合の結果を１００％として示した）。
【０３７９】
Ｒｅ−ＣＴＬＤは４℃で保存時に、数週間で一部が沈殿することがあるが、図から明らかなように、固相上へ固定すると分子の安定性が上昇し、６週間経過しても、変性ＬＤＬ認識能の９７％が保持され、固相上で極めて安定であることが示された。
【０３８０】
（２）Ｒｅ−ＣＴＬＤ固定化乾燥プレートの保存期間による変性ＬＤＬ認識能の変化
ＥＬＩＳＡプレートとしての安定性を検証する目的で、Ｒｅ−ＣＴＬＤを９６穴プレートに固定化し、一旦乾燥させたプレートを用いて、変性ＬＤＬが安定して検出できるか否かを調査した。検出工程は、基本的には実施例９（３）に示されるとおりである。使用した受容体、検出するまでのプレートの保存期間および使用する二次抗体は、以下のとおりである。
（ａ）受容体：Ｒｅ−ＣＴＬＤ、保存期間：０（すなわち、乾燥直後）、二次抗体：抗ＡｐｏＢ抗体
（ｂ）受容体：Ｒｅ−ＣＴＬＤ、保存期間：１週間、二次抗体：抗ＡｐｏＢ抗体
（ｃ）受容体：Ｒｅ−ビオチン化ＣＴＬＤ、保存期間：１週間、二次抗体：抗ＡｐｏＢ抗体
（ｄ）受容体：Ｒｅ−ビオチン化ＣＴＬＤ、保存期間：１週間、二次抗体：抗ＯｘＬＤＬ抗体
（ｅ）受容体：Ｒｅ−ビオチン化ＣＴＬＤ、保存期間：１週間、二次抗体：抗ＭＤＡ  ＬＤＬ抗体
９６穴のプレートに、１５μｇ／ｍｌの濃度にＴＢＳにて希釈した受容体（Ｒｅ−ＰＲ−ＣＴＬＤ（ビオチン化ありまたはなし））溶液を５０μｌ／ウェルで添加した。４℃で一晩放置した後、１％ＢＳＡ/０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０含ＴＢＳで４℃で一晩ブロッキングし、ブロッキング溶液を除去した。その後、クリーンベンチ内でプレートを乾燥させ、使用時まで、４℃で保存しておいた。上記の条件で認識能が維持されているか否かを確認した。（ａ）〜（ｅ）についての結果を、それぞれ、図４６Ａ〜Ｅに示す。
【０３８１】
これら図から明らかなように、ストレプトアビジンを介した固定のあるなしに拘わらず、乾燥過程を経たＲｅ−ＣＴＬＤ固定化プレートにおいても、実施例１３（１）のように乾燥過程を経ていないＲｅ−ＣＴＬＤ固定化プレートと同様に安定して変性ＬＤＬを検出可能であり、乾燥状態での保存、輸送が可能であることが示された。
【０３８２】
（実施例１７：Ｒｅ−ｍｉｎｉＲＡＧＥを固定化した基材の安定性および種々の抗体を用いた変性ＬＤＬの検出）
実施例１６（１）と同様に、ｍｉｎｉＲＡＧＥにおいても検出用ビーズとしての安定性を検証する目的で、Ｒｅ−ＲＡＧＥ１をＮｉ−Ａｇａｒｏｓｅビーズに固定化したものを用いて、変性ＬＤＬが安定して検出できるか否かを調査した。
【０３８３】
実施例１０（２）に従って、Ｒｅ−ＲＡＧＥ１固定化Ｎｉ−Ａｇａｒｏｓｅビーズ（２０μｌ×５；５０％スラリー）を調製した。このように調製したビーズを４℃で保存した。上記５連で調製したビーズのうち１連を調製直後（０週間とする）に変性ＬＤＬ検出のために使用して、検出安定性の基準とした。残りのビーズのうちの４連を、調製後１、２、４、６週間の間、４℃で保存し、保存期間による変性ＬＤＬ検出の安定性の変化を測定した。結果を図４５に示す（０週間で測定した場合の結果を１００％として示した）。
【０３８４】
図から明らかなように、固相上へ固定すると分子の安定性が上昇し、６週間経過しても、変性ＬＤＬ認識能の９６％が保持され、固相上で極めて安定であることが示された。
【０３８５】
（実施例１８：Ｒｅ−ＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４の動脈硬化診断への応用）
実施例１３（２）（Ｉ）に示されるようにＲｅ−ＣＴＬＤ固定化プレートを調製し、変性ＬＤＬ測定用サンプルとして、正常血清（１２０μｌ）中に０、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．４、０．５、１、２および４μｇ／ｍＬ血漿となるように完全酸化ＬＤＬを添加し、変性ＬＤＬ含有血漿モデルを調製した。変性ＬＤＬの検出工程は、基本的に実施例１３（２）（Ｉ）に従って、抗ＡｐｏＢ抗体を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡにより行った。結果を図４７に示す。
【０３８６】
図から明らかなように、プレートに固定化したＲｅ−ＣＴＬＤが血漿中の成分に妨害されずに酸化ＬＤＬを認識可能なことが実証された。また血漿中には大量のＬＤＬが存在するが、ＣＴＬＤの親和性は酸化ＬＤＬに対して圧倒的に高いため、膨大な量のＬＤＬより先に酸化ＬＤＬが結合することが検証された。
【０３８７】
これらの結果と、動脈硬化の疑いがある患者から得られた血漿で得られた値とを比較することにより、患者血清中に含まれる変性ＬＤＬの相対量を算出する。これらの値を、臨床検査で使用される値と比較することによって、上記患者が動脈硬化および他の変性ＬＤＬによって引き起こされる疾患に罹患しているかどうかを予想することができる。
【０３８８】
（実施例１９：ＲＡＧＥ様ポリペプチドの糖尿病性血管障害への応用）
受容体としてＲｅ−ＲＡＧＥを使用することを除いて、実施例１３（２）（Ｉ）に示されるようにＲｅ−ＲＡＧＥ固定化プレートを調製し、ＡＧＥ測定用サンプルとして、正常血清（１２０μｌ）中に０、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．４、０．５、１、２および４μｇ／ｍＬ血漿となるようにＡＧＥを添加し、ＡＧＥ含有血漿モデルを調製した。ＡＧＥの検出工程は、基本的に実施例１１（５）に従って、抗ＡＧＥ抗体を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡにより行う。
【０３８９】
プレートに固定化したＲｅ−ＲＡＧＥが血漿中の成分に妨害されずにＡＧＥを認識可能なことが実証される。
【０３９０】
これらの結果と、糖尿病性血管障害の疑いがある患者から得られた血漿で得られた値とを比較することにより、患者血清中に含まれるＡＧＥの相対量を算出する。これらの値を、臨床検査で使用される値と比較することによって、上記患者が糖尿病性血管障害および他のＡＧＥによって引き起こされる疾患に罹患しているかどうかを予想することができる。
【産業上の利用可能性】
【０３９１】
ＣＴＬＤ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体およびＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、動脈硬化、糖尿病性血管障害などの早期診断、機能性食品の予防効果評価、生活改善や投薬による治療効果の評価など様々な分野で活用できる。
【図面の簡単な説明】
【０３９２】
【図１】図１は、ＬＯＸ−１の模式図をあらわす。図中の数字は、ＬＯＸ−１のアミノ酸配列の番号付けに従うアミノ酸残基の位置を表す。
【図２】図２は、ＲＡＧＥの模式図を表す。図中の数字は、ＲＡＧＥのアミノ酸配列の番号付けに従うアミノ酸残基の位置を表す。
【図３】図３は、Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）およびＣＴＬＤ様ポリペプチド（ＰＲ−ＣＴＬＤ）のプロテアーゼによる分解の程度を示す。ＣＴＬＤまたはＰＲ−ＣＴＬＤを大過剰のプロテアーゼ（Ｔ：トロンビン、Ｅ：エンテロキナーゼ、Ｘａ：第Ｘａ因子）ともに３７℃で１８時間インキュベートした後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した後、ＣＢＢ染色した。Ａは、天然型Ｃ型レクチン様ドメイン（ネイティブＣＴＬＤ）のプロテアーゼによる分解を示す。Ｂは、ＰＲ−ＣＴＬＤ（Ｇ２３２Ａ／Ｇ２４９Ａ変異が導入されている）のプロテアーゼによる分解を示す。
【図４】図４は、ＣＴＬＤ様ポリペプチド発現細胞  による変性ＬＤＬ  の認識および取り込みを示す。Ａは、ＰＲ−ＣＴＬＤをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の明視野像を示す。Ｂは、ＣＦＰの蛍光により、ＰＲ−ＣＴＬＤの発現が確認された細胞を示す。Ｃは、ＣＦＰの蛍光によりＰＲ−ＣＴＬＤの発現が確認された細胞によるＤｉＤ標識ＡｃＬＤＬの明瞭な取り込みを示す。
【図５】図５は、ＬＯＸ−１の細胞外領域および変性ＬＤＬの認識に必須の最小領域、ならびに分子間Ｓ−Ｓ結合を形成するアミノ酸残基を含むネック由来の１４アミノ酸残基とＣＴＫＤからなるＣＴＬＤ１４を示す。図中の矢印は、大過剰のトロンビンに対して感受性の部位を示す。
【図６】図６は、温度および誘導時間を変化させた場合の形質転換細胞において発現されたＣＴＬＤ様ポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ像を示す。Ａは、ＰＲ−ＣＴＬＤを含む発現ベクターで形質転換した細胞を３７℃で培養したときのＰＲ−ＣＴＬＤの発現状態を示す。レーン１：誘導前；レーン２および３：誘導後２時間；レーン４および５：誘導後４時間。レーン２および４は、可溶性画分を示す。レーン３および５は、不溶性画分を示す。発現は良好であるが、１００％が不溶性として発現した。Ｂは、誘導後２０℃で培養したときの時のＰＲ−ＣＴＬＤの発現状態を示す。発現量は低いが、可溶性画分へ発現する割合は増えた。レーン１：誘導前；レーン２：誘導２４時間後の可溶性画分、レーン：誘導２４時間後の不溶性画分。
【図７】図７は、形質転換細胞から発現されたＰＲ−ＣＴＬＤ可溶性画分をＮｉ−アガロースに吸着させた後、０．１Ｍイミダゾールで洗浄し、０．５Ｍイミダゾールにて溶出させた結果を示す。レーン１は、Ｎｉ−アガロース吸着画分であり、レーン２は、０．５Ｍ  イミダゾール溶出画分である。
【図８】図８は、ｈＲＡＧＥおよびｈＲＡＧＥの可溶性ドメイン（ｈｓＲＡＧＥ）およびｈｓＲＡＧＥを構成する各ドメインを模式的に示す。図中の矢印およびアミノ酸の１文字表記と数字の組み合わせは、大過剰のプロテアーゼに感受性の部位を示す。括弧中の記号は、Ｔ：トロンビン、Ｘａ：第Ｘａ因子を示す。矢印で示される位置に、アミノ酸置換Ｒ１１４Ｑ、Ｖ１１７Ａ、Ｒ２２８Ｎ、Ｍ２７２Ｉを導入して、ＰＲ−ＣＴＬＤを作製する。
【図９】図９は、ｈｓＲＡＧＥのプロテアーゼによる分解の程度を示す。ｈｓＲＡＧＥを大過剰のプロテアーゼ（Ｔ：トロンビン、Ｅ：エンテロキナーゼ、Ｘａ：第Ｘａ因子）とともに３７℃で１８時間インキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した後、ＣＢＢ染色した。０で示されるレーンは、プロテアーゼ非処理区のｈｓＲＡＧＥを泳動した。１８で示されるレーンは、１８時間のプロテアーゼ処理後のｈｓＲＡＧＥを泳動した。Ｈｉｓタグ除去の目的のために、ｐＥＴ  Ｃ−Ａｖｉにはエンテロキナーゼ認識配列が挿入されている。エンテロキナーゼによる切断は、デザインに従いタグ部分のみが除去された予想される分子量の減少が起こっている。それに対して、ＴやＸａにより処理した結果、ｈｓＲＡＧＥにはプロテアーゼによって特異的に切断される部位が存在しないにもかかわらず、予想外の切断による断片が確認された。
【図１０】図１０は、ｍＲＡＧＥ１発現細胞  によるＡＬｅｘａ６３３標識ＡＧＥの認識および取り込みを示す。Ａは、ｍＲＡＧＥ（Ｒ１１４Ｑ／Ｖ１１７Ａ／Ｒ２２８Ｎ／  Ｍ２７２Ｉ  ）をトランスフェクトした細胞の明視野像を示す。Ｂは、  ｍＲＡＧＥ発現細胞におけるＡＬｅｘａ６３３標識ＡＧＥの顕著な取り込みを示す。
【図１１】図１１は、ｍＲＡＧＥのプロテアーゼによる分解の程度を示す。Ａは、ｈｓＲＡＧＥ１（天然型）のプロテアーゼ処理結果を示す。Ｂは、ｍＲＡＧＥのプロテアーゼ処理結果を示す。それぞれ、レーン１は、第Ｘａ因子（必要量の１００倍濃度）添加直後に、反応を停止させたものを示し、レーン２は、必要量の１０倍濃度の第Ｘａ因子を添加し、２３℃で４時間反応させたものを示し、レーン３は、必要量の１００倍濃度の第Ｘａ因子を添加し、２３℃で２時間反応させたものを示す。反応停止後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供しＣＢＢ染色した。レーン２でｈｓＲＡＧＥに観察される切断されたＲＡＧＥ由来のバンドがｍＲＡＧＥでは少なく、レーン３でも同様な傾向が観察され、ｍＲＡＧＥはプロテアーゼ抵抗性が増していることが確認された。
【図１２】図１２は、領域欠損によるｈｓＲＡＧＥの削りこみを示す。図中の数字は、ＲＡＧＥのアミノ酸配列のアミノ酸番号付けに従う。
【図１３】図１３は、温度および誘導時間を変化させた場合の形質転換細胞において発現されたＲＡＧＥ様ポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ像を示す。上段は、左から順に、天然型ＲＡＧＥ１（ｈｓＲＡＧＥ１）、ｍＲＡＧＥ、ＲＡＧＥ２、ＲＡＧＥ３およびＲＡＧＥ７のＳＤＳ−ＰＡＧＥ像を示す。レーン１は、可溶性画分であり、レーン２は、不溶性画分である。欠損により分子量が小さくなるに連れ、発現量、可溶性ポリペプチドとしての発現量が共に低下した（表６もまた参照のこと）。下段は、Ｍｕｔｅｉｎ−Ｍａｔｒｉｘに吸着後、ビオチンで溶出することにより精製したＲＡＧＥ様ポリペプチドを示す。Ｎ：天然型ＲＡＧＥ１（ｈｓＲＡＧＥ１）；Ｍ：ｍＲＡＧＥを示す。
【図１４】図１４は、封入体からリフォールディングの過程を経て得られたＣＴＬＤ様ポリペプチドのリフォールディング率を示す。Ａは、封入体からリフォールディングの過程を経て得られたＣＴＬＤのＳＤＳ−ＰＡＧＥ像である。Ｂは、封入体からリフォールディングの過程を経て得られたＰＲ−ＣＴＬＤのＳＤＳ−ＰＡＧＥ像である。Ｃは、ｒｅｆｏｌｄｉｎｇに使用する界面活性剤の違いによるリフォールディング効率を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ像である。
【図１５】図１５は、封入体からリフォールディングの過程を経て得られたＲＡＧＥ様ポリペプチドのリフォールディング率を示す。Ａは、界面活性剤の種類によるｍＲＡＧＥのリフォールディング効率を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ像である。レーン１−３：ＣＴＡＢ；レーン４−６：ＳＢ３−１４；レーン７−９：Ｔｗｅｅｎ４０；レーン１０−１２：Ｔｗｅｅｎ６０；レーン１，４，７，１０：リフォールディング溶液；レーン２，５，９，１１：Ｎｉ−ａｇａｒｏｓｅ吸着画分；レーン３，６，９，１２：イミダゾール溶出画分。Ｂは、リフォールディングの過程を経て得られたＲＡＧＥ７のＳＤＳ−ＰＡＧＥ像である。レーン１−３：ＳＢ３−１４；レーン４−６：Ｔｗｅｅｎ４０；レーン７−９：Ｔｗｅｅｎ６０。Ｃは、ＣＴＡＢによりリフォールディングされたｍＲＡＧＥの精製率を示す；レーン１：リフォールディング溶液、２：Ｎｉ−Ａｇａｒｏｓｅ結合、３：０．１Ｍイミダゾール溶出、４：０．２５Ｍイミダゾール溶出、５：０．５Ｍイミダゾール溶出。
【図１６】図１６は、変性ＬＤＬの濃度を変化させた場合の吸光度値（Ａ４５０）の変化を表す。グラフ中、菱形は可溶性ＣＴＬＤを表し、四角は、Ｒｅ−ＣＴＬＤを表す。このグラフから、可溶性ＣＴＬＤとｒｅ−ＣＴＬＤがともに、変性ＬＤＬを特異的に認識することが理解される。
【図１７】図１７は、ビオチン化なしのＣＴＬＤと抗ＡｐｏＢ抗体によるサンドイッチＥＬＩＳＡを行ったときの、種々のリガンド濃度に対する吸光度値（Ａ４５０）の変化を表す。グラフ中、菱形は、完全酸化ＬＤＬ（Ｆ−ＯｘＬＤＬ）を表し、四角は、中程度酸化ＬＤＬ（Ｍ−ＯｘＬＤＬ）を表し、三角は、ＭＤＡ−ＬＤＬ（ＭＤＡ化ＬＤＬ）を表し、×は、ＬＤＬを表す。このグラフから、Ｒｅ−ＣＴＬＤは、変性ＬＤＬを特異的に検出することが理解される。
【図１８】図１８は、種々の濃度の変性ＬＤＬを含む変性ＬＤＬ含有血漿モデルからの、ＣＴＬＤを結合させたビーズの変性ＬＤＬ除去効率を示す。菱形は、ＣＴＬＤを表し、四角は、ＲＡＧＥ１を表す。
【図１９】図１９は、ＥＬＩＳＡでＲＡＧＥ様ポリペプチドを受容体としてＡＧＥの検出を行った場合の、種々のＡＧＥ濃度に対する吸光度値（Ａ４５０）の変化を表す。図１９Ａは、ｍＲＡＧＥ１を受容体として使用した場合を示し、図１９Ｂは、ＲＡＧＥ１４３を受容体として使用した場合を示し、図１９Ｃは、ＲＡＧＥ２２３をを受容体として使用した場合を示し、図１９Ｄは、ＲＡＧＥ２２６を受容体として使用した場合を示す。グラフ中、菱形は、ｃＢＳＡ（コントロールＢＳＡ）を表し、四角はＲ−ＡＧＥ（リボースにより糖化処理をしたＢＳＡ）を表し、三角はＦ−ＡＧＥ（フコースにより糖化処理をしたＢＳＡ）を表し、×は、Ｇ−ＡＧＥは、（グルコースにより糖化処理をしたＢＳＡ）を表す。
【図２０】図２０Ａは、ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６を受容体としてＡＧＥの検出を行った場合の、種々のＡＧＥ濃度に対する吸光度値（Ａ４５０）の変化を表す。図２０Ａは、種々のｃＢＳＡ濃度に対する吸光度値の変化を表し、図２０Ｂは、種々のＲ−ＡＧＥ濃度に対する吸光度値の変化を表し、図２０Ｃは、種々のＦ−ＡＧＥ濃度に対する吸光度値の変化を表し、図２０Ｄは、種々のＧ−ＡＧＥ濃度に対する吸光度値の変化を表す。これらグラフから、ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６は、ＡＧＥを特異的に認識することが理解される。
【図２１】図２１は、ＲＡＧＥ１４３（菱形）、ＲＡＧＥ２２３（四角）およびＲＡＧＥ２２６（三角）を受容体としてＡＧＥの検出を行った場合の、種々のヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）濃度に対する吸光度値の変化を表す。これらグラフから、いずれのＲＡＧＥ様ポリペプチドも、ＨｂＡ１ｃを特異的に検出することが理解される。
【図２２】図２２は、ＲＡＧＥ１４３（菱形）、ＲＡＧＥ２２３（四角）およびＲＡＧＥ２２６（三角）を受容体として使用し、抗ＨｂＡ１ｃ抗体との組み合わせてサンドイッチＥＬＩＳＡによりＨｂＡ１ｃの検出を行った場合の、種々の濃度のＨｂＡ１ｃに対する吸光度値の変化を示す。このグラフから、いずれの受容体も、ＨｂＡ１ｃを濃度依存的に検出可能であることが理解される。
【図２３】図２３は、ＲＡＧＥ１４３（菱形）、ＲＡＧＥ２２３（四角）およびＲＡＧＥ２２６（三角）を受容体として使用し、抗ＡＧＥ抗体との組み合わせてサンドイッチＥＬＩＳＡを行った場合の、種々の濃度のＡＧＥに対する吸光度値の変化を示す。図２３Ａは、ｃＢＳＡをリガンドとして用いた場合の結果を示し、図２３Ｂは、Ｒ−ＡＧＥをリガンドとして用いた場合の結果を示す。これらグラフから、いずれのＲＡＧＥ様ポリペプチドも、ｃＢＳＡに対してはほとんど反応せず、Ｒ−ＡＧＥに対して高い反応性を有することが理解される。
【図２４】図２４Ａ〜Ｂは、ＣＴＬＤ様ポリペプチド（図２４Ａ：Ｒｅ−ＣＴＬＤおよび図２４Ｂ：Ｒｅ−ＣＴＬＤ１４）を受容体として使用した場合の種々の濃度のリガンドに対する吸光度値の変化を示す。グラフ中、菱形は、完全酸化ＬＤＬ（Ｆ−ＯｘＬＤＬ）を表し、四角は、中程度酸化ＬＤＬ（Ｍ−ＯｘＬＤＬ）を表し、三角は、ＭＤＡ−ＬＤＬ（ＭＤＡ化ＬＤＬ）を表す。これらグラフから、いずれの受容体も各種変性ＬＤＬを認識可能であることが理解される。
【図２５】図２５Ａ〜Ｂは、Ｒｅ−ビオチン化なしＣＴＬＤ（図２５Ａ）またはＲｅ−ビオチン化ＣＴＬＤ（図２５Ｂ）を受容体として使用し、抗ＡｐｏＢ抗体と組み合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡにより種々の濃度の変性ＬＤＬを検出した場合の吸光度値の変化を示す。グラフ中、菱形は、完全酸化ＬＤＬ（Ｆ−ＯｘＬＤＬ）を表し、四角は、中程度酸化ＬＤＬ（Ｍ−ＯｘＬＤＬ）を表し、三角は、ＭＤＡ−ＬＤＬ（ＭＤＡ化ＬＤＬ）を表す。これらグラフから、抗ＡｐｏＢ抗体との組み合わせにおいて、いずれの受容体も高感度で変性ＬＤＬを検出し得ることが理解される。
【図２６】図２６Ａ〜Ｂは、Ｒｅ−ビオチン化なしＣＴＬＤ（図２６Ａ）またはＲｅ−ビオチン化ＣＴＬＤ（図２６Ｂ）を受容体として使用し、抗ＯｘＬＤＬ抗体と組み合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡにより種々の濃度の変性ＬＤＬを検出した場合の吸光度値の変化を示す。グラフ中、菱形は、完全酸化ＬＤＬ（Ｆ−ＯｘＬＤＬ）を表し、四角は、中程度酸化ＬＤＬ（Ｍ−ＯｘＬＤＬ）を表し、三角は、ＭＤＡ−ＬＤＬ（ＭＤＡ化ＬＤＬ）を表す。これらグラフから、抗ＯｘＬＤＬ抗体との組み合わせにおいて、いずれの受容体も高感度で変性ＬＤＬを検出し得ることを示す。
【図２７】図２７Ａ〜Ｂは、Ｒｅ−ビオチン化なしＣＴＬＤ（図２７Ａ）またはＲｅ−ビオチン化ＣＴＬＤ（図２７Ｂ）を受容体として使用し、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体と組み合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡにより種々の濃度の変性ＬＤＬを検出した場合の吸光度値の変化を示す。グラフ中、菱形は、完全酸化ＬＤＬ（Ｆ−ＯｘＬＤＬ）を表し、四角は、中程度酸化ＬＤＬ（Ｍ−ＯｘＬＤＬ）を表し、三角は、ＭＤＡ−ＬＤＬ（ＭＤＡ化ＬＤＬ）を表す。これらグラフから、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体との組み合わせにおいて、いずれの受容体もＭＤＡ−ＬＤＬのみを極めて特異的に検出し得ることが理解される。
【図２８】図２８は、Ｒｅ−ビオチン化なしＣＴＬＤを受容体として使用し、抗ＡＣＲモノクローナル抗体と組み合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡにより種々の濃度の変性ＬＤＬを検出した場合の吸光度値の変化を示す。グラフ中、菱形は、完全酸化ＬＤＬ（Ｆ−ＯｘＬＤＬ）を表し、四角は、中程度酸化ＬＤＬ（Ｍ−ＯｘＬＤＬ）を表し、三角は、ＭＤＡ−ＬＤＬ（ＭＤＡ化ＬＤＬ）を表す。このグラフから、抗ＡＣＲモノクローナル抗体との組み合わせにおいて、Ｒｅ−ビオチン化なしＣＴＬＤがＭＤＡ−ＬＤＬを顕著に検出し得ることが理解される。
【図２９】図２９は、Ｒｅ−ビオチン化なしＣＴＬＤを受容体として使用し、抗ＣＲＡモノクローナル抗体と組み合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡにより種々の濃度の変性ＬＤＬを検出した場合の吸光度値の変化を示す。グラフ中、菱形は、完全酸化ＬＤＬ（Ｆ−ＯｘＬＤＬ）を表し、四角は、中程度酸化ＬＤＬ（Ｍ−ＯｘＬＤＬ）を表し、三角は、ＭＤＡ−ＬＤＬ（ＭＤＡ化ＬＤＬ）を表す。このグラフから、抗ＣＲＡモノクローナル抗体との組み合わせにおいて、Ｒｅ−ビオチン化なしＣＴＬＤが酸化ＬＤＬおよびＭＤＡ−ＬＤＬを顕著に検出し得ることが理解される。
【図３０】図３０は、Ｒｅ−ビオチン化なしＣＴＬＤを受容体として使用し、抗ＭＤＡモノクローナル抗体と組み合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡにより種々の濃度の変性ＬＤＬを検出した場合の吸光度値の変化を示す。グラフ中、菱形は、完全酸化ＬＤＬ（Ｆ−ＯｘＬＤＬ）を表し、四角は、中程度酸化ＬＤＬ（Ｍ−ＯｘＬＤＬ）を表し、三角は、ＭＤＡ−ＬＤＬ（ＭＤＡ化ＬＤＬ）を表す。このグラフから、抗ＭＤＡモノクローナル抗体との組み合わせにおいて、Ｒｅ−ビオチン化なしＣＴＬＤがＭＤＡ−ＬＤＬを顕著に検出し得ることが理解される。
【図３１】図３１は、Ｒｅ−ビオチン化なしＣＴＬＤを受容体として使用し、抗ＨＮＥモノクローナル抗体と組み合わたサンドイッチＥＬＩＳＡにより種々の濃度の変性ＬＤＬを検出した場合の吸光度値の変化を示す。グラフ中、菱形は、完全酸化ＬＤＬ（Ｆ−ＯｘＬＤＬ）を表し、四角は、中程度酸化ＬＤＬ（Ｍ−ＯｘＬＤＬ）を表し、三角は、ＭＤＡ−ＬＤＬ（ＭＤＡ化ＬＤＬ）を表す。このグラフから、抗ＨＨＮＥモノクローナル抗体との組み合わせにおいて、Ｒｅ−ビオチン化なしＣＴＬＤがＭＤＡ−ＬＤＬおよび酸化ＬＤＬを顕著に検出し得ることが理解される。
【図３２】図３２は、Ｒｅ−ビオチン化なしＣＴＬＤを受容体として使用し、抗ＨＥＬモノクローナル抗体と組み合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡにより種々の濃度の変性ＬＤＬを検出した場合の吸光度値の変化を示す。グラフ中、菱形は、完全酸化ＬＤＬ（Ｆ−ＯｘＬＤＬ）を表し、四角は、中程度酸化ＬＤＬ（Ｍ−ＯｘＬＤＬ）を表し、三角は、ＭＤＡ−ＬＤＬ（ＭＤＡ化ＬＤＬ）を表す。このグラフから、抗ＨＥＬモノクローナル抗体との組み合わせにおいて、Ｒｅ−ビオチン化なしＣＴＬＤがＭＤＡ−ＬＤＬおよび酸化ＬＤＬを顕著に検出し得ることが理解される。
【図３３】図３３は、市販の変性ＬＤＬ検出用キットにおいて使用される抗ＰＣ抗体を本発明のＰＲ−ＣＴＬＤで置き換えて種々の濃度の変性ＬＤＬを検出した場合の吸光度値の変化を示す。グラフ中、菱形は、可溶性ＰＲ−ＣＴＬＤを表し、四角は、Ｒｅ−ビオチン化ＰＲ−ＣＴＬＤを表し、三角はＲｅ−ＰＲ−ＣＴＬＤを表す。このグラフから、本発明のＰＲ−ＣＴＬＤは上記キットと同様の感度で変性ＬＤＬを検出可能であることが理解される。
【図３４】図３４は、市販のキットにおいて使用される抗ＡｐｏＢモノクローナル抗体の代わりにＣＴＬＤを使用して種々の濃度の変性ＬＤＬを検出した場合の吸光度値の変化を示す。グラフ中、菱形は、ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体と抗ＡｐｏＢ抗体とによるＯｘ−ＬＤＬの検出（検出系１）を表し、四角は、ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体と抗ＡｐｏＢ抗体とによるＭＤＡ−ＬＤＬの検出（検出系３）を表し、三角は、ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体とＣＴＬＤとによるＯｘ−ＬＤＬの検出（検出系２）を表し、×は、ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体とＣＴＬＤとによるＭＤＡ−ＬＤＬの検出（検出系４）を表す。このグラフから、ＣＴＬＤを使用した検出系では、ＭＤＡ−ＬＤＬに対する認識能の方が高いことが理解される。
【図３５】図３５Ａ〜Ｃは、Ｒｅ−ＲＡＧＥ１（図３５Ａ）、Ｒｅ−ＲＡＧＥ３（図３５Ｂ）、Ｒｅ−ＲＡＧＥ７（図３５Ｃ）を受容体として使用して種々の濃度のＡＧＥを検出した場合の吸光度値の変化を示す。これらグラフから、いずれのＲｅ−ＲＡＧＥ様ポリペプチドも可溶性ＲＡＧＥと同様に、ＡＧＥを特異的に認識することが理解される。
【図３６】図３６Ａ〜Ｄは、Ｒｅ−ＲＡＧＥ１（図３６Ａ）、Ｒｅ−ＲＡＧＥ２（図３６Ｂ）、Ｒｅ−ＲＡＧＥ３（図３６Ｃ）、Ｒｅ−ＲＡＧＥ７（図３６Ｄ）を受容体として使用して種々の濃度のＡＧＥを検出した場合の吸光度値の変化を示す。これらグラフから、Ｒｅ−ＲＡＧＥ  １，３，７は、種々のＡＧＥに対する認識能を有し、ＲＡＧＥ８は、ＡＧＥの検出に使用することができるが、Ｖ領域のみのＲＡＧＥ９では、ほとんど認識能が確認されず、Ｖドメインを完全に欠くＲＡＧＥ４は、ＡＧＥに対する認識能を有していないことが理解される。また、図３６Ａから、Ｒｅ−ＲＡＧＥ３のバックグラウンド値が高いものの、いずれのＲｅ−ＲＡＧＥ様ポリペプチドによるｃＢＳＡの濃度依存的検出も認められないことが理解される。
【図３７】図３７Ａ〜Ｂは、Ｒｅ−ＲＡＧＥ様ポリペプチドを受容体として使用して種々の濃度のＣＭＬ−ＢＳＡ（図３７Ａ）およびＨｂＡ１ｃ（図３７Ｂ）を検出した場合の吸光度値の変化を示す。
【図３８】図３８Ａ〜Ｂは、ＲＡＧＥ１４３（菱形）、ＲＡＧＥ２２３（四角）およびＲＡＧＥ２２６（三角）を受容体として使用して、抗ＡＧＥ抗体と組み合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡを行った場合の種々の濃度のコントロールＢＳＡ（図３８Ａ）およびＲ−ＡＧＥ（図３８Ｂ）に対する吸光度値（Ａ４５０）の変化を表す。図３８Ｃ〜Ｄは、乾燥プレートの状態でＲＡＧＥ１４３（菱形）およびＲＡＧＥ２２３（四角）を受容体として使用して、抗ＡＧＥ抗体と組み合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡを行った場合の種々の濃度のコントロールＢＳＡ（図３８Ｃ）およびＲ−ＡＧＥ（図３８Ｄ）に対する吸光度値（Ａ４５０）の変化を表す。これらグラフから、いずれのＲｅ−ＲＡＧＥ様ポリペプチドもｃ−ＢＳＡを殆ど認識せず、Ｒ−ＡＧＥに対する特異的認識能が回復していることが理解される。
【図３９】図３９Ａ〜Ｄは、Ｒｅ−ＲＡＧＥ様ポリペプチドを受容体として、それぞれ、リガンドとしてＣＭＬ−ＢＳＡ（図３９Ａ）、ＣＭＬ−ＨＳＡ（図３９Ｂ）、ＣＥＬ−ＢＳＡ（図３９Ｃ）およびＣＥＬ−ＨＳＡ（図３９Ｄ）の検出を行った場合の、種々のリガンド濃度に対する吸光度値の変化を示す。これらグラフから、ＲＡＧＥ１、３がいずれのリガンドに関しても認識能が高く、ｍｉｎｉＲＡＧＥはＣＥＬ化分子よりもＣＭＬ化分子に対する認識能が高いことが理解される。
【図４０】図４０は、市販のキット（ａｎｔｉ−ＣＭＬ−ＨＡＳ）およびＲＡＧＥ１を受容体として、リガンドとしてＣＭＬ−ＨＳＡを検出する場合の、種々のリガンド濃度に対する吸光度値の変化を示す。このグラフから、ＲＡＧＥ１は０．１μｇ／ｍｌ以下の領域でも検出可能であることが理解される。
【図４１】図４１は、ＲＡＧＥ１を受容体として変性ＬＤＬを検出する場合の、種々の変性ＬＤＬの濃度に対する吸光度値の変化を示す。
【図４２】図４２は、種々のＲＡＧＥ様ポリペプチドを受容体として変性ＬＤＬを検出する場合の、種々の変性ＬＤＬの濃度に対する吸光度値の変化を示す。このグラフから、Ｒｅ−ＲＡＧＥ１および３が完全酸化ＬＤＬを認識し、Ｒｅ−ＲＡＧＥ２および７は、Ｒｅ−ＲＧＡＥ１および３には劣るが、認識能を有することが理解される。
【図４３】図４３は、ＣＴＬＤ固定化ビーズまたはＲｅ−ＲＡＧＥ１固定化ビーズを使用して、抗ＡｐｏＢ抗体とのサンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用した場合の、種々の濃度の変性ＬＤＬを含む変性ＬＤＬ含有血漿モデルからの酸化ＬＤＬ除去効率を示す。グラフにおいて菱形は、ＣＴＬＤ固定化ビーズを使用した場合を表し、四角は、Ｒｅ−ＲＡＧＥ１固定化ビーズを使用した場合を表す。このグラフから、いずれの受容体を結合したビーズも変性ＬＤＬを回収し得ることが理解される。
【図４４】図４４は、Ｒｅ−ＰＲ−ＣＴＬＤとＲｅ−ＲＡＧＥとのサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いて変性ＬＤＬを検出した場合の、種々の濃度の変性ＬＤＬに対する吸光度値の変化を示す。このグラフから、ＰＲ−ＣＴＬＤが、ＬＤＬよりも完全酸化ＬＤＬに対する認識が有意に高く、ｃＢＳＡよりもＲ−ＡＧＥに対する認識能が有意に高いことが理解される。
【図４５】図４５は、Ｒｅ−ＰＲ−ＣＴＬＤ固定化Ｎｉ−ＡｇａｒｏｓｅビーズおよびＲｅ−ＲＡＧＥ固定化Ｎｉ−Ａｇａｒｏｓｅビーズの保存期間による変性ＬＤＬ検出の変化を示す。このグラフから、保存期間６週間後であっても、変性ＬＤＬが安定して検出できることが理解される。
【図４６】図４６Ａ〜Ｅは、それぞれ、（ａ）受容体：Ｒｅ−ＣＴＬＤ、保存期間：０（すなわち、乾燥直後）、二次抗体：抗ＡｐｏＢ抗体；（ｂ）受容体：Ｒｅ−ＣＴＬＤ、保存期間：１週間、二次抗体：抗ＡｐｏＢ抗体；（ｃ）受容体：Ｒｅ−ビオチン化ＣＴＬＤ、保存期間：１週間、二次抗体：抗ＡｐｏＢ抗体；（ｄ）受容体：Ｒｅ−ビオチン化ＣＴＬＤ、保存期間：１週間、二次抗体：抗ＯｘＬＤＬ抗体；（ｅ）受容体：Ｒｅ−ビオチン化ＣＴＬＤ、保存期間：１週間、二次抗体：抗ＭＤＡ  ＬＤＬ抗体の条件を用いた場合の、種々の濃度のリガンドに対する吸光度値の変化を示す。このグラフから、ストレプトアビジンを介した固定のあるなしに拘わらず、乾燥過程を経たＲｅ−ＣＴＬＤ固定化プレートが安定して変性ＬＤＬを検出可能であることが理解される。
【図４７】図４７は、Ｒｅ−ＣＴＬＤ固定化プレートを使用して、抗ＡｐｏＢ抗体を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡによりの酸化ＬＤＬの検出を行った場合の、種々の濃度の酸化ＬＤＬに対する吸光度の変化を示す。このグラフから、プレートに固定化したＲｅ−ＣＴＬＤが血漿中の成分に妨害されずに酸化ＬＤＬを認識可能であることが明らかにされる。
【配列表フリーテキスト】
【０３９３】
配列番号１：ＰＲ−ＣＴＬＤまたはＣＴＬＤをコードする核酸配列
配列番号２：ＰＲ−ＣＴＬＤまたはＣＴＬＤのアミノ酸配列
配列番号３：ＰＲ−Ｌｏｘ−１またはＬｏｘ−１をコードする核酸配列
配列番号４：ＰＲ−Ｌｏｘ−１またはＬｏｘ−１のアミノ酸配列
配列番号５：ＰＲ−ＣＴＬＤ１４またはＣＴＬＤ１４をコードする核酸配列
配列番号６：ＰＲ−ＣＴＬＤ１４またはＣＴＬＤ１４のアミノ酸配列
配列番号７：Ｌｏｘ−１のＣＴＬＤ＋ネックまたはＰＲ−ＣＴＬＤ＋ネックをコードする核酸配列
配列番号８：Ｌｏｘ−１のＣＴＬＤ＋ネックまたはＰＲ−ＣＴＬＤ＋ネックのアミノ酸配列
配列番号９：ＲＡＧＥまたはｍＲＡＧＥをコードする核酸配列
配列番号１０：ＲＡＧＥまたはｍＲＡＧＥのアミノ酸配列
配列番号１１：ＲＡＧＥ８またはｍＲＡＧＥ８をコードする核酸配列
配列番号１２：ＲＡＧＥ８またはｍＲＡＧＥ８のアミノ酸配列
配列番号１３：ＲＡＧＥ１またはｍＲＡＧＥ１をコードする核酸配列
配列番号１４：ＲＡＧＥ１またはｍＲＡＧＥ１のアミノ酸配列
配列番号１５：Gly-Gly-Gly-Ser
配列番号１６：Gly-Gly-Gly-Gly-Ser
配列番号１７：AviTagのアミノ酸配列
配列番号１８：Streptagのアミノ酸配列
配列番号１９：StreptagIIのアミノ酸配列
配列番号２０：ＣＴＬＤの順方向プライマー
配列番号２１：ＣＴＬＤの逆方向プライマー
配列番号２２：ＲＡＧＥの順方向プライマー
配列番号２３：ＲＡＧＥの逆方向プライマー
配列番号２４：ｍｉｎｉＲＡＧＥ（ＲＡＧＥ１、ＲＡＧＥ２、ＲＡＧＥ３、ＲＡＧＥ７、ＲＡＧＥ８、ＲＡＧＥ９、ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６）の順方向プライマー
配列番号２５：ＲＡＧＥ１の逆方向プライマー
配列番号２６：ＲＡＧＥ２の逆方向プライマー
配列番号２７：ＲＡＧＥ３の逆方向プライマー
配列番号２８：ＲＡＧＥ７の逆方向プライマー
配列番号２９：ＲＡＧＥ８の逆方向プライマー
配列番号３０：ＲＡＧＥ９の逆方向プライマー
配列番号３１：ＲＡＧＥ４の順方向プライマー
配列番号３２：ＲＡＧＥ４の逆方向プライマー
配列番号３３：ＲＡＧＥ１４３の逆方向プライマー
配列番号３４：ＲＡＧＥ２２３の逆方向プライマー
配列番号３５：ＲＡＧＥ２２６の逆方向プライマー
配列番号３６：ＲＡＧＥ２またはｍＲＡＧＥ２をコードする核酸配列
配列番号３７：ＲＡＧＥ２またはｍＲＡＧＥ２のアミノ酸配列
配列番号３８：ＲＡＧＥ３またはｍＲＡＧＥ３をコードする核酸配列
配列番号３９：ＲＡＧＥ３またはｍＲＡＧＥ３のアミノ酸配列
配列番号４０：ＲＡＧＥ４またはｍＲＡＧＥ４をコードする核酸配列
配列番号４１：ＲＡＧＥ４またはｍＲＡＧＥ４のアミノ酸配列
配列番号４２：ＲＡＧＥ７またはｍＲＡＧＥ７をコードする核酸配列
配列番号４３：ＲＡＧＥ７またはｍＲＡＧＥ７のアミノ酸配列
配列番号４４：ＲＡＧＥ１４３またはｍＲＡＧＥ１４３をコードする核酸配列
配列番号４５：ＲＡＧＥ１４３またはｍＲＡＧＥ１４３のアミノ酸配列
配列番号４６：ＲＡＧＥ２２３またはｍＲＡＧＥ２２３をコードする核酸配列
配列番号４７：ＲＡＧＥ２２３またはｍＲＡＧＥ２２３のアミノ酸配列
配列番号４８：ＲＡＧＥ２２６またはｍＲＡＧＥ２２６をコードする核酸配列
配列番号４９：ＲＡＧＥ２２６またはｍＲＡＧＥ２２６のアミノ酸配列
【図１】
0005604782.tif 000019
【図２】
0005604782.tif 000020
【図３】
0005604782.tif 000021
【図４】
0005604782.tif 000022
【図５】
0005604782.tif 000023
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
0005604782.tif 000032
【図１５】
0005604782.tif 000033
【図１６】
0005604782.tif 000034
【図１７】
0005604782.tif 000035
【図１８】
0005604782.tif 000036
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
0005604782.tif 000039
【図２２】
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【図２３】
0005604782.tif 000041
【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【配列表】
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