(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コレステロール誘導体、炭素数１４〜２０の脂肪酸誘導体及び炭素数８〜１８の脂肪族アミンから選択される疎水性キャッピング剤、並びにリガンドが、親水性樹脂に固定化されてなるアフィニティーカラムクロマトグラフィー用の固相担体であって、以下の式（１）：
【化１】
0005561484.tif 000038
（式中、Ｘ1は単結合、又は親水性樹脂における水酸基とポリエチレングリコール部分を共有結合で連結する二価基を表し、Ｚ1はリガンドと前記ポリエチレングリコール部分を共有結合で連結する二価基を表し、Ｙ1は１〜５０個のエチレングリコールユニットを含むポリエチレングリコール部分を表し、ｓは０又は１を表し、Ｘ2は単結合、又は親水性樹脂における水酸基とポリエチレングリコール部分もしくは疎水性キャッピング剤を共有結合で連結する二価基を表し、Ｚ2は２つのポリエチレングリコール部分どうし、又は疎水性キャッピング剤と前記ポリエチレングリコール部分を共有結合で連結する二価基を表し、Ｙ2は１〜５０個のエチレングリコールユニットを含むポリエチレングリコール部分を表す）
で表される部分構造を有し、
前記コレステロール誘導体が以下の群：
コレステロール（cholesterol）、5α-コレスタン-3β-オール（5α-cholestan-3β-ol）、5β-コレスタン-3α-オール（5β-cholestan-3α-ol）、5β-コレスタン-3β-オール（5β-cholestan-3β-ol）、α-コレスタノール（α-cholestanol）、デスモステロール（desmosterol）及びエピコレステロール（epicholesterol）から選択され、
式（１）におけるリガンドが膜結合型蛋白質に特異的に吸着する物質であり、分子量１０００以下のアフィニティーカラムクロマトグラフィーにおけるプローブとなり得る低分子化合物であり、
式（１）における親水性樹脂が、セファロース系樹脂、デキストラン系樹脂、セルロース系樹脂、アミロース系樹脂、アガロース系樹脂、又は、ポリエチレングリコール基もしくはポリオール基を有するメタクリル酸が重合したメタクリレート系樹脂であり、
式（１）におけるＸ1及びＸ2が、単結合及び式（７）〜（１０）:
（７） -X3-(CH2)m-X4-
（８） -X3-(CH2)m-X5-(CH2)n-X4-
（９） -X3-(CH2)m-X5-(CH2)n-X6-(CH2)o-X4-
（１０）-X3-(CH2)m-X5-(CH2)n-X6-(CH2)o-X7-(CH2)p-X4-
（式中、Ｘ3は単結合又はＣＯを表し、Ｘ5、Ｘ6及びＸ7はＯ、Ｓ、ＮＲ1、ＮＨＣＯ又はＣＯＮＨを表し、Ｘ4は酸素原子、ＮＨ又はＣＯを表し、Ｒ1は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表し、ｍ、ｎ、ｏ及びｐは独立して１〜５の整数を表す）
のいずれかで表される二価基から独立して選択され、
式（１）におけるＹ1及びＹ2が以下の式（３）〜（６）：
【化３】
0005561484.tif 000039
（ａ、ｃ、ｆ及びｊは独立して２〜５の整数を表し、ｄ、ｇ、ｉ及びｌは独立して１〜５の整数を表し、ｂ、ｅ、ｈ及びｋは独立して１〜５０の整数を表す）
から独立して選択される二価基、又は前記式（３）〜式（６）から独立して選択される同一もしくは異なる１又は複数の二価基がアミド結合を介して結合して形成される二価基である固相担体。
【請求項２】
式（１）において、ｓが１である、請求項１に記載の固相担体。
【請求項３】
式（１）におけるＺ1及びＺ2が、単結合、ＮＨ、ＣＯ、及び式（１１）：
（１１）  −Ｚ3−（ＣＨ2）t−Ｚ4−
（式中、Ｚ3はＮＨ又はＣＯを表し、Ｚ4はＮＨ、ＣＯ、ＮＨＣＯ、ＣＯＮＨ、ＣＯ−Ｏ又はＯ−ＣＯを表し、ｔは１〜５の整数を表す）
で表される二価基から、独立して選択されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の固相担体。
【請求項４】
Ｙ1におけるエチレングリコールのユニット数が、Ｙ2におけるエチレングリコールのユニット数よりも２以上大きいことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の固相担体。
【請求項５】
Ｙ1におけるエチレングリコールのユニット数が２〜３６であり、Ｙ2におけるエチレングリコールのユニット数が０〜６である、請求項４に記載の固相担体。
【請求項６】
以下の（ａ）〜（ｂ）の工程を含む、リガンド特異的結合蛋白質の濃縮、単離又は精製方法：
（ａ）請求項１〜５のいずれかに記載の固相担体及び試料を接触させる工程；及び
（ｂ）固相担体から、リガンド特異的結合蛋白質を溶出する工程。
【請求項７】
リガンド特異的結合蛋白質が、膜結合型蛋白質である、請求項６に記載の精製方法。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載の固相担体の、アフィニティーカラムクロマトグラフィー用担体としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リガンド及び疎水性キャッピング剤が固定化されてなる親水性固相担体、当該固相担体を用いるリガンド特異的結合蛋白質の濃縮、単離又は精製方法等を提供する。
【背景技術】
【０００２】
近年、分子間相互作用を基盤とした手法を用い、特定の化合物に特異的な相互作用を有する蛋白質を探索する試み、あるいは相互作用を詳細に検討する研究が盛んに行われている。具体的には、特定の低分子化合物リガンドを固相担体に固定化し、当該リガンドに特異的に相互作用する蛋白質をこれに結合させた後、溶出させることによって、リガンド特異的結合蛋白質を単離・精製するアフィニティーカラムクロマトグラフィーが知られている。例えば１９８９年に、シュライバーらは、アフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いることによって、免疫抑制剤、ＦＫ５０６の結合蛋白質（ＦＫＢＰ：FK506 binding proteins)を同定した（非特許文献１を参照）。このように、アフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いることによって、医薬品又は医薬品候補化合物が生体内で特異的に結合する蛋白質を単離、精製、同定することができる。
しかし、アフィニティーカラムクロマトグラフィーでは、リガンド特異的に結合する物質のみならず、非特異的な疎水性相互作用により担体と相互作用する物質が吸着されるという問題があった。
さらに、膜結合型蛋白質の場合、通常の水溶性蛋白質とは異なり、生体内において脂質二重膜に組み込まれた状態で存在するため、取り扱いが非常に難しく、機能や構造等いまだ未解明の部分が多い。そのような膜蛋白質をアフィニティーカラムクロマトグラフィーで精製する場合、膜蛋白質に適したアフィニティー担体や汎用性のある方法が存在しないのが現状である。
ところで、国際公開第２００４／２５２９７号パンフレット（特許文献１）には、アフィニティーカラムクロマトグラフィーのリガンドとポリスチレン等の固相担体表面との間に導入可能な親水性スペーサーが記載されており、国際公開第２００５／３７８８１号パンフレット（特許文献２）には、親水性スペーサーを、メタクリレート系樹脂のモノマーに組み込んだ、アガロース系樹脂に匹敵する親水性特性を有するアフィニティークロマトグラフィー用樹脂が記載されている。更に国際公開第２００６／１８９０１号パンフレット（特許文献３）には、金属の固相担体に親水性スペーサーを導入することにより非特異的蛋白質の吸着が抑制され、かつ分子間の特異的相互作用が増強されることが記載されている。
また、国際公開第２００５／１０５２８号パンフレット（特許文献４）には、ステアリン酸等の疎水性キャッピング剤をメタクリレート系樹脂上に固定化し、ターゲット蛋白質探索の障害となる非特異的蛋白質との結合を抑制できること等が開示されており、国際公開第２００６／８０５５９号パンフレット（特許文献５）には、リガンドとしてのケトプロフェン及びキャッピング剤としてのステアリン酸がそれぞれ固定化され、固相担体表面の疎水性性質が調節されたアフィニティー用アガロース系固相担体が開示されている。
しかしながら、リガンド特異的に結合する膜結合型蛋白質を効率良く吸着させることができる、キャッピング剤が樹脂上に固定化され、かつリガンドが親水性ポリマーを介して樹脂上に固定化された、アフィニティーカラムクロマトグラフィー用固相担体は知られていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】ネイチャー（Nature)、第341巻、p.758-760（1989年）
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００４／２５２９７号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００５／３７８８１号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００６／１８９０１号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００５／１０５２８号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００６／８０５５９号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、リガンド特異的に結合する膜蛋白質を吸着可能な親水性固相担体、当該親水性固相担体を用いて、リガンド特異的に結合する膜蛋白質を単離、精製する方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、リガンド特異的に結合する膜蛋白質を効率よく単離、精製するために有用な、アフィニティークロマトグラフィー用固相担体を得るべく鋭意検討を重ねた結果、リガンドが親水性スペーサーを介して固定化された親水性固相担体を得た。即ち本発明は、
〔１〕  コレステロール誘導体、脂肪酸誘導体及び脂肪族アミンから選択される疎水性キャッピング剤、並びにリガンドが、親水性樹脂に固定化されてなるアフィニティーカラムクロマトグラフィー用の固相担体であって、前記リガンドが、ポリエチレングリコール部分を含むスペーサーを介して前記親水性樹脂と共有結合していることを特徴とする固相担体；
〔２〕  親水性樹脂が、糖類が重合してなる樹脂、又は高度親水性モノマーが重合してなる樹脂である、〔１〕に記載の固相担体；
〔３〕  糖類が重合してなる親水性樹脂が、セファロース系樹脂、デキストラン系樹脂、セルロース系樹脂、アミロース系樹脂又はアガロース系樹脂である、〔２〕に記載の固相担体；
〔４〕  高度親水性モノマーが重合してなる樹脂が、ポリエチレングリコール基又はポリオール基を有するメタクリル酸が重合したメタクリレート系樹脂である、〔２〕に記載の固相担体；
〔５〕  リガンドが、膜結合型蛋白質に特異的に吸着する物質である、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の固相担体；
〔６〕  固相担体が、以下の式（１）：
【化１】
0005561484.tif 000002
（Ｘ1は単結合、又は親水性樹脂における水酸基とポリエチレングリコール部分を共有結合で連結する二価基を表し、Ｚ1はリガンドと前記ポリエチレングリコール部分を共有結合で連結する二価基を表し、Ｙ1は１〜５０個のエチレングリコールユニットを含むポリエチレングリコール部分を表す）
で表される部分構造を含む、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の固相担体；
〔７〕  固相担体が、以下の式（２）：
【化２】
0005561484.tif 000003
（ｓは０又は１を表し、Ｘ2は単結合、又は親水性樹脂における水酸基とポリエチレングリコール部分もしくは疎水性キャッピング剤を共有結合で連結する二価基を表し、Ｚ2は２つのポリエチレングリコール部分どうし、又は疎水性キャッピング剤と前記ポリエチレングリコール部分を共有結合で連結する二価基を表し、Ｙ2は１〜５０個のエチレングリコールユニットを含むポリエチレングリコール部分を表す）
で表される部分構造を含む、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の固相担体；
〔８〕  式（２）において、ｓが１である、〔７〕に記載の固相担体；
〔９〕  式（１）におけるＹ1及び式（２）におけるＹ2が以下の式（３）〜（６）：
【化３】
0005561484.tif 000004
（ａ、ｃ、ｆ及びｊは独立して２〜５の整数を表し、ｄ、ｇ、ｉ及びｌは独立して１〜５の整数を表し、ｂ、ｅ、ｈ及びｋは独立して１〜５０の整数を表す）
から独立して選択される二価基、又は前記式（３）〜式（６）から独立して選択される同一もしくは異なる１又は複数の二価基がアミド結合を介して結合して形成される二価基である、〔６〕〜〔８〕のいずれかに記載の固相担体；
〔１０〕  式（１）におけるＸ1、及び式（２）におけるＸ2が、単結合及び式（７）〜（１０）:
（７） -X3-(CH2)m-X4-
（８） -X3-(CH2)m-X5-(CH2)n-X4-
（９） -X3-(CH2)m-X5-(CH2)n-X6-(CH2)o-X4-
（１０）-X3-(CH2)m-X5-(CH2)n-X6-(CH2)o-X7-(CH2)p-X4-
（式中、Ｘ3は単結合又はＣＯを表し、Ｘ5、Ｘ6及びＸ7はＯ、Ｓ、ＮＲ1、ＮＨＣＯ又はＣＯＮＨを表し、Ｘ4は酸素原子、ＮＨ又はＣＯを表し、Ｒ1は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表し、ｍ、ｎ、ｏ及びｐは独立して１〜５の整数を表す）
のいずれかで表される二価基から独立して選択されることを特徴とする、〔６〕〜〔９〕のいずれかに記載の固相担体；
〔１１〕  式（１）におけるＺ1、及び式（２）におけるＺ2が、単結合、ＮＨ、ＣＯ、及び式（１１）：
（１１）  −Ｚ3−（ＣＨ2）t−Ｚ4−
（式中、Ｚ3はＮＨ又はＣＯを表し、Ｚ4はＮＨ、ＣＯ、ＮＨＣＯ、ＣＯＮＨ、ＣＯ−Ｏ又はＯ−ＣＯを表し、ｔは１〜５の整数を表す）
で表される二価基から、独立して選択されることを特徴とする、〔６〕〜〔１０〕のいずれかに記載の固相担体；
〔１２〕  Ｙ1におけるエチレングリコールのユニット数が、Ｙ2におけるエチレングリコールのユニット数よりも２以上大きいことを特徴とする、〔６〕〜〔１１〕のいずれかに記載の固相担体；
〔１３〕  Ｙ1におけるエチレングリコールのユニット数が２〜３６であり、Ｙ2におけるエチレングリコールのユニット数が０〜６である、〔１２〕に記載の固相担体；
〔１４〕  以下の（ａ）〜（ｂ）の工程を含む、リガンド特異的結合蛋白質の濃縮、単離又は精製方法：
（ａ）〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の固相担体及び試料を接触させる工程；及び
（ｂ）固相担体から、リガンド特異的結合蛋白質を溶出する工程；
〔１５〕  リガンド特異的結合蛋白質が、膜結合型蛋白質である、〔１４〕に記載の精製方法；
〔１６〕  〔１〕〜〔１3〕のいずれかに記載の固相担体の、アフィニティーカラムクロマトグラフィー用担体としての使用；
に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、リガンド特異的に結合する膜結合型蛋白質を吸着可能な親水性固相担体を提供することが可能になった。また、当該担体は、アフィニティークロマトグラフィー用カラム充填剤として有用であり、リガンド特異的な結合蛋白質を単離、精製、同定するために使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の代表的なアフィニティークロマトグラフィー用固相担体を示す図である。
【図２】実施例５に記載の結合実験、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティング実験により得られるバンドである。実施例１で得られた式（１−１３）で表される固相担体がアフィニティークロマトグラフィー用樹脂としてγ−セクレターゼを特異的に結合するか否かを示す。
【図３】式（１−１３）で表される固相担体が、多量に存在する蛋白質を非特異的に結合するものではないことを示す図である。
【図４】式（１−１３）及び式（１−１９）に相当する、アフィゲルのかわりに疎水性樹脂であるトーヨーパールを用いた固相担体を対照として製造し、非特異的な蛋白質の結合の有無を調べた結果を示す図である。
【図５】実施例８に記載の結合実験、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティング実験により得られるバンドである。リンカーの長さが異なるＤＡＰＴをそれぞれ固定化したアフィニティー樹脂の検討結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書において「膜結合型蛋白質」とは、細胞または細胞小器官等の生体膜に付着している蛋白質である。これら蛋白質は該生体膜に部分的に包含されている蛋白質、該生体膜を貫通している蛋白質、又は内在性膜蛋白質と一時的に結合している蛋白質である。ここで生体膜としては、細胞膜、ミトコンドリア外膜、ミトコンドリア内膜、核膜、小胞体膜、ゴルジ体膜等が挙げられる。
これら膜結合型蛋白質は、複数のタンパク質が会合して複合体を形成していても良い。膜結合型蛋白質として、受容体、チャンネル、トランスポーター、ポンプ、酵素等が挙げられる。
前記細胞としては特に限定は無く、本発明の固相担体を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーの試料に用いられる細胞として、具体的には、ラット、マウス、ヒト組織から調製された任意の細胞、細胞バンク等より入手可能な細胞株を培養し用いてもよい。
前記細胞小器官としては、核、小胞体、ゴルジ体、エンドソーム、リソソーム、ミトコンドリア、ペルオキシソーム等が挙げられる。
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用固相担体により精製可能な蛋白質として、好ましくは分子量として5kDa〜500kDaの膜結合型蛋白質が挙げられる。
【００１０】
「リガンド」とは、前記膜結合型蛋白質特異的に結合する化合物であり、アフィニティーカラムクロマトグラフィーにおけるプローブとなる低分子化合物等を表す。当該低分子化合物はスペーサーと結合可能な官能基、もしくは当該官能基へ変換可能な部分構造を少なくとも一つ有している化合物であれば、特に限定はなく、好ましくは分子量 1,000以下の化合物が挙げられる。特に好ましくは、水酸基、アミノ基、カルボキシ基、チオール基および／またはホルミル基、あるいはこれらの基に変換可能な基を有する分子量 1,000以下の化合物であり、例えば、γ−セクレターゼ阻害剤（DAPT、L-685458など）、ヒスタミンH1受容体阻害剤（エバスチン、アレグラ等）、カルシウム拮抗剤（アムロジピン等）、カンビノイドCB1受容体拮抗剤（リモナバン等）、シクロオキシゲナーゼ-２阻害剤（セレコキシブ等）、ドーパミンＤ２阻害剤、セロトニン５−ＨＴ２阻害剤（ブロナンセリン、リスペリドン等）、ＭＡＯ−Ｂ阻害剤（ラサジリン等）、ＭＡＯ−Ａ阻害剤（モクロベミド等）、カリウムチャネル拮抗剤（アミオダロン、ドフェチリド等）、ナトリウムチャネル拮抗剤（シベンゾリン、フルカイニド、モラシジン等）、ベンゾジアゼピン拮抗剤（フルマゼニル等）、アドレナリンβ遮断薬（アロチノール、アモスラロール、カラゾロール等）、抗てんかん剤（ゾニサミド等）等、及びこれらの薬学上等価な誘導体が挙げられる。ここで、薬学上等価な誘導体としては、リガンドの生物活性を維持するために不可欠ではない部分構造を化学的に改変した誘導体、リガンドの生物活性に影響を与えない部分構造を化学的に付加した誘導体等が挙げられる。
【００１１】
「疎水性キャッピング剤」とは、細胞膜、ミトコンドリア外膜、ミトコンドリア内膜、核膜、小胞体膜、ゴルジ体膜等の膜に存在するタンパク質と親和性を有する疎水性の構造を有する化合物であって、コレステロール誘導体、脂肪酸誘導体及び脂肪族アミンから選択される。疎水性キャッピング剤はスペーサーもしくは親水性樹脂と結合可能な官能基、又は当該官能基へ変換可能な部分構造を少なくとも一つ有している化合物であれば、特に限定はなく、好ましくは分子量1,000以下の化合物が挙げられる。
リガンドもしくは疎水性キャッピング剤における官能基としては、水酸基、アミノ基、カルボキシ基、チオール基、ホルミル基等が挙げられる。また、当該官能基へ変換可能な部分構造としては、特に限定は無く、加水分解によりカルボキシ基へ変換可能なカルボン酸エステル、酸化反応により水酸基へ変換可能な炭素−炭素二重結合等が挙げられ、適宜当業者に周知の合成方法により官能基への変換反応を行えばよい。
また、リガンドに官能基を導入する方法としては、１）芳香族化合物等に酸化剤を用いて水酸基を導入する方法、２）S9mix（ラット等の哺乳動物の腹腔内にフェノバルビタール等の薬物を投与して代謝酵素を誘導した肝ホモジネートの上清画分Ｓ９に補助因子を添加したもの）等代謝酵素を用いて水酸基を導入する方法、３）芳香族化合物にニトロ基を導入後、還元剤を用いてアミノ基へ変換する方法、４）芳香族化合物の芳香環上にハロゲン原子を導入後、パラジウム触媒等を用い、カルボン酸等を導入する方法等が挙げられる。
リガンド及び疎水性キャッピング剤は、上記官能基が親水性樹脂やスペーサーとエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ジスルフィド結合、アミン結合、アミド結合、ウレア結合又はウレタン結合等を形成することにより、親水性樹脂に固定化される。従って、反応性を上げるために上記官能基を適宜修飾して固定化してもよく、具体的にはカルボキシ基を酸クロリドや酸ブロミド等の酸ハライドとしたり、水酸基をメタンスルホニル化したりして、官能基の反応性を高めることができる。
【００１２】
コレステロール誘導体としては、ステロイド骨格を有するコレステロール誘導体であれば特に限定は無いが、具体的には、コレステロール(cholesterol）、6-ケトコレスタノール(6-Ketocholestanol)、スティグマスタノール(Stigmastanol)、5α-コレスタン-3β-オール (5α-cholestan-3β-ol)、5β-コレスタン-3α-オール（5β-cholestan-3α-ol）、5β-コレスタン-3β-オール（5β-cholestan-3β-ol）、α-コレスタノール（α-cholestanol）、5α-ヒドロキシコレスタノール（5α-hydroxycholestanol）、5α-コレスタン-3β,6α−ジオール（5α-cholestan-3β,6α-diol)、5β-コレスタン-3α,7α,12α-トリオール（5β-cholestan-3α,7α,12α-triol）、5α-コレスタン-24α-メチル-3β-オール（5α-cholestan-24α-methyl-3β-ol）、5α-コレスタン-3β-オール-6-オン  3-アセテート（5α-cholestan-3β-ol-6-one  3-acetate）、5α-コレスタン-3β,6β−ジオール（5α-cholestan-3β,6β-diol)、5α-コレスタン-3β,5α-ジオール-6-オン（5α-cholestan-3β,5α-diol-6-one）、5α-コレスタン-3β,5β,6β-トリオール（5α-cholestan-3β,5β,6β-triol)、5β-コレスタン-3β,6β-ジオール（5β-cholestan-3β,6β-diol)、5α-コレスタン-3β,7α-ジオール（5α-cholestan-3β,7α-diol)、5α-コレスタン-3β,7β-ジオール（5α-cholestan-3β,7β-diol）、20α-ヒドロキシコレステロール（20α-hydroxycholesterol）、β-シトステロール（β-sitosterol）、7-ケトコレステロール（7-ketocholesterol）、フコステロール（fucosterol）、デスモステロール(desmosterol)、22-ケトコレステロール（22-ketocholesterol）、25-ヒドロキシコレステロール(25-hydroxycholesterol）、3β-ヒドロキシ-δ5-コレニック  アシッド(3β-hydroxy-δ5-cholenic acid）、22(R)-ヒドロキシコレステロール（22(R)-hydroxycholesterol)、エピコレステロール（epicholesterol）、5-コレニックアシッド-3β-オール  メチルエーテル（5-cholenic acid-3β-ol methyl ether）、3-[3β-コレスト-5-エン-3-イルオキシ]-1-プロパナミン（3-[3β-cholest-5-en-3-yloxy]-1-propanamine）、5-コレステン-24α-エチル-3β-オール（5-cholesten-24α-ethyl-3β-ol）、24-ケトコレステロール（24-ketocholesterol）、又は7,5α-コレステン-24α-メチル-3β-オール（7,5α-cholesten-24α-methyl-3β-ol）等を挙げることができ、コレステロール誘導体の水酸基はエステル結合又はエーテル結合を介して、スペーサーと結合している。あるいは、コレステロール誘導体がアミド結合、ウレア結合又はウレタン結合等を介して親水性樹脂やスペーサーと化学結合できるように、当該コレステロール誘導体にアミノ基、水酸基、カルボキシ基等の官能基を導入した誘導体を適宜用いることもできる。
【００１３】
コレステロール誘導体は、適宜水酸基、アミノ基もしくはカルボキシ基等の官能基を修飾することによって、本発明の固相担体を製造するための中間体へと導くことができる。具体的には、コレステロール誘導体の水酸基とコハク酸等のジカルボン酸を反応させたカルボキシ基を有する化合物、コレステロール誘導体の水酸基をクロロフォルメートへ変換した化合物等が挙げられる。例えば5α-コレスタン-3α-オール  ヘミスクシネート（5α-cholestan-3α-ol hemisuccinate)、5α-コレスタン-3β-オール  ヘミスクシネート（5α-cholestan-3β-ol  hemisuccinate）、3β,5α,6β-トリヒドロキシコレスタン  3-ヘミスクシネート（3β,5α,6β-trihydroxycholestan  3-hemisuccinate）、5β-コレスタン-3α-オール  へミスクシネート（5β-cholestan-3α-ol  hemisuccinate）、5β-コレスタン-3β-オール  ヘミスクシネート（5β-cholestan-3β-ol  hemisuccinate）、コレステリル  ハイドロジェン  スクシネート（cholesteryl hydrogen succinate）、5α-コレスタン-3α-オール  ヘミスクシネート（5α-cholestan-3α-ol  hemisuccinate）、5α-コレスタン-3β-オール  ヘミスクシネート（5α-cholestan-3β-ol  hemisuccinate）、3β,5α,6β-トリヒドロキシコレスタン  3-ヘミスクシネート（3β,5α,6β-trihydroxycholestane  3-hemisuccinate）、5β-コレスタン-3α-オール  ヘミスクシネート（5β-cholestan-3α-ol  hemisuccinate）、5β-コレスタン-3β-オール  ヘミスクシネート（5β-cholestan-3β-ol   hemisuccinate）、コレステリル  ハイドロジェン  スクシネート（cholesteryl  hydrogen  succinate）、25-ヒドロキシコレステロール  3-ヘミスクシネート（25-hydroxycholesterol  3-hemisuccinate）、25-ヒドロキシコレステロール  3-ヘミスクシネート（25-hydroxycholesterol 3-hemisuccinate)、5-コレステン-24α-エチル-3β-オール  クロロフォルメート（5-cholesten-24α-ethyl-3β-ol chloroformate）、5α-コレスタン-3β-オール  クロロフォルメート (5α-cholestan-3β-ol chloroformate)、コレステリル  クロロフォルメート（cholesteryl chloroformate）、5-コレステン-24α-エチル-3β-オール  クロロフォルメート（5-cholesten-24α-ethyl-3β-ol chloroformate）等を例示できる。
【００１４】
脂肪酸誘導体としては、１〜６の不飽和結合（二重結合もしくは三重結合）を有していてもよい炭素数６〜３０の直鎖もしくは分枝のカルボン酸、リン酸もしくはスルホン酸、又はこれらのエステルが挙げられる。具体的には、直鎖飽和脂肪酸（例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸）、直鎖不飽和脂肪酸（オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、DHA）、分枝飽和脂肪酸（例えば、19-メチルエイコサノイックアシッド（19-methyleicosanoic acid）、12-メチルテトラデカノイックアシッド（12-methyltetradecanoic acid）、イソステアリックアシッド（isostearic acid）等）、又は分枝不飽和脂肪酸（例えば、2-プロピル-2,4-ペンタジエノイックアシッド、2-メチルヘプタジエノイックアシッド、(6Z)-８−メチルノネノイックアシッド等）が挙げられる。好ましくは炭素数８〜２４、更に好ましくは炭素数１４〜２０の飽和脂肪酸が挙げられる。
【００１５】
脂肪族アミンとしては、１〜６の不飽和結合（二重結合もしくは三重結合）を有していてもよい炭素数６〜３０の直鎖もしくは分枝の脂肪族アミンが挙げられる。具体的にはアルキルアミン（例えば、ステアリルアミン、1-アミノデカン(1-aminodecane）、ミリスチルアミン(myristylamine）、オクタデシルアミン等）、アルケニルアミン（例えば、オレイルアミン（oleylamine）等）等が挙げられる。好ましくは炭素数８〜１８のアルキルアミンが挙げられる。
【００１６】
「親水性樹脂」としては、複数の水酸基もしくはポリエチレングリコール基を有する親水性モノマーが重合してなる親水性樹脂を表す。具体的には、糖類が重合してなる親水性樹脂、又は高度親水性モノマーが重合してなる樹脂が挙げられる。
【００１７】
「糖類が重合してなる親水性樹脂」としては、セファロース系樹脂、デキストラン系樹脂、アミロース系樹脂、セルロース系樹脂又はアガロース系樹脂が挙げられる。
セファロース系樹脂としては、ＧＥヘルスケア社製のECHセファロース4B、EAH-セファロース4B（登録商標）等が挙げられる。デキストラン系樹脂としては、ＧＥヘルスケア社製のセファデックス（登録商標）等が挙げられる。
アミロース系樹脂としては、ニュー・イングランド・バイオラボ(New England BioLab）社製のアミロースレジン（Amylose resin、登録商標）、アミロースセファロースレジン、アミロースアガロースアフィニティレジン等が挙げられる。
セルロース系樹脂としては、シグマ社製のセルロース（商品名：Cellurose（cat.No;22182)、Cellurose,beaded（cat.No; C7079）、Sodium carboxymethyl cellulose（cat.No; 419311））等が挙げられる。
尚、セファロース系樹脂及びアミロース系樹脂は、ともに水酸基を有しているため、カルボキシ基を有する化合物とエステル結合を形成させることができる。また、以下の製造法２で示す方法で、水酸基をアルキル化することにより、カルボキシ基やアミノ基を有する製造中間体へ導くことができる。
【００１８】
アガロース系樹脂としては、バイオラッド社製  アフィゲル(Affi-gel；登録商標。具体的にはアフィゲル１０、アフィゲル１０２及びアフィゲル１５が挙げられる）、シグマ社製のアガロース（商品名：Iminodiacetic acid Agarose（ｃat.No; I4758））、アガロースビーズテクノロジー社(AGAROSE BEAD TECHNOLOGIES社）のLow Density Aminoethyl 6 BCL,Amine Reactive Agarose 等が挙げられる。
【００１９】
また、上記の糖類が重合してなる親水性樹脂が、金膜上に担持されたビアコア用チップ（GEヘルスケア; Sensor Chip CM5; cat. No; BR-1000-12)もまた、本発明の親水性樹脂の範疇に含まれる。
【００２０】
「高度親水性モノマーが重合してなる樹脂」における「高度親水性モノマー」としては、ポリエチレングリコール基又はポリオール基を有するメタクリル酸が挙げられる。具体的には、メタクリル酸のカルボキシ基にポリエチレングリコール基が必要であればスペーサーを介して共有結合したモノマー、又はメタクリル酸のカルボキシ基に２以上の水酸基を有するアルキル基がエステル結合したモノマー等が挙げられる。「高度親水性モノマーが重合してなる樹脂」として、国際公開パンフレットWO2007/142331号に記載された樹脂、又はアクアファームス（ＡＱＵＡＦＩＲＭＵＳ；商品名）として市販されている樹脂を用いることもできる。
【００２１】
リガンドもしくは疎水性キャッピング剤が「固定化される」とは、リガンドもしくは疎水性キャッピング剤に含まれるアミノ基、水酸基、カルボキシ基、チオール基、ホルミル基（CHO）等の官能基が、親水性樹脂上の水酸基と、必要であればスペーサーを介して共有結合していることを意味する。すなわち、リガンドもしくは疎水性キャッピング剤の官能基は、スペーサーもしくは親水性樹脂の官能基とエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ジスルフィド結合、アミン結合、アミド結合、ウレア結合又はウレタン結合等を介して共有結合している。
ここでリガンド及び疎水性キャッピング剤の親水性樹脂表面上の水酸基に対する結合率（これを固定化率という）は、特に限定はなく、０．１％〜６０％程度の水酸基にリガンド又はキャッピング剤が結合している。
また、リガンド及び疎水性キャッピング剤の比は特に限定はなく、リガンド：疎水性キャッピング剤としては、１：１００〜１００：１が挙げられる。
また、本発明の固相担体は複数種類の疎水性キャッピング剤を有していてもよく、好ましくは、１〜３種類の疎水性キャッピング剤を有していてもよい。複数種類の疎水性キャッピング剤を有する固相担体として、具体的には、コレステロール誘導体及び脂肪酸誘導体、コレステロール誘導体及びリン脂質誘導体が固定化された固相担体を挙げることができる。
【００２２】
本明細書において、「スペーサー」とは、キャッピング剤もしくはリガンド及び親水性樹脂を連結している二価基を表し、リガンドを親水性樹脂に固定化するためのスペーサーは、ポリエチレングリコール部分を含む化学的に安定な共有結合を形成可能な二価基であれば特に限定はない。また、疎水性キャッピング剤を親水性樹脂に固定化するためのスペーサーは、化学的に安定な共有結合を形成可能な二価基であれば特に限定はなく、ポリエチレングリコール部分を含んでいてもよい
リガンドを親水性樹脂に固定化するためのスペーサーとして具体的には、式（１）における「−Ｘ1−Ｙ1−Ｚ1−」で表される二価基が、疎水性キャッピング剤を親水性樹脂に固定化するためのスペーサーとして具体的には、式（２）における「−Ｘ2−（Ｙ2−Ｚ2）ｓ−」で表される二価基がそれぞれ挙げられる。
式（１）においてＸ1は単結合又は親水性樹脂における水酸基とポリエチレングリコール部分を共有結合で連結する二価基を表す。Ｘ1における二価基は、Ｙ1で表されるポリエチレングリコール部分の末端の官能基と親水性樹脂における水酸基とを化学的に安定につなぐ二価基であれば特に限定はない。すなわち、当該二価基として、任意のメチレン基が適宜酸素原子、硫黄原子、ＮＲ1（Ｒ1は前記と同義）、ＮＨＣＯ又はＣＯＮＨで置換されていてもよい化学的に安定な炭素数２〜２５の直鎖アルキレンが挙げられる。具体的には、前記式（７）〜式（１０）のいずれかで表される二価基が挙げられる。
式（２）においてＸ2は単結合又は親水性樹脂における水酸基とポリエチレングリコール部分もしくは疎水性キャッピング剤とを共有結合で連結する二価基を表す。
式（２）においてｓが０を表す場合、すなわち疎水性キャッピング剤及び親水性樹脂をつなぐスペーサーがポリエチレングリコール部分を含まない場合、Ｘ2は疎水性キャッピング剤が親水性樹脂上の水酸基と安定な共有結合を形成するための二価基を表す。また、ｓが０を表し、疎水性キャッピング剤がカルボキシ基を有する場合、Ｘ2は単結合を表していてもよい。
式（２）においてｓが１を表す場合、Ｘ2は単結合又は親水性樹脂における水酸基とポリエチレングリコール部分を共有結合で連結する二価基を表す。Ｘ2における二価基は、Ｙ2で表されるポリエチレングリコール部分の末端の官能基と親水性樹脂における水酸基を化学的に安定につなぐ二価基であれば特に限定はない。すなわち、当該二価基として、任意のメチレン基が適宜酸素原子、硫黄原子、ＮＲ1（Ｒ1は前記と同義）、ＮＨＣＯ又はＣＯＮＨで置換されていてもよい化学的に安定な炭素数２〜２５の直鎖アルキレンが挙げられる。具体的には、前記式（７）〜式（１０）のいずれかで表される二価基が挙げられる。
式（１）におけるＹ1は、１〜５０個のエチレングリコールユニット（−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−で表わされる二価基）を含むポリエチレングリコール部分を表す。ここでポリエチレングリコール部分は、両端にＸ1もしくは親水性樹脂における水酸基、及びＺ1と、それぞれエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ジスルフィド結合、アミン結合、アミド結合、ウレア結合又はウレタン結合を形成可能な官能基を有する。また、当該ポリエチレングリコール部分は、エチレングリコールユニットを１〜５０個含んでいれば、個々のエチレングリコールユニット間の結合様式に特に限定は無く、エチレングリコールが１〜５０個重合してポリエチレングリコールを形成しているか、あるいは、エチレングリコールが１〜５０個、好ましくは２〜１５個重合したポリエチレングリコールの両端に適宜炭素数１〜５個の直鎖アルキレンを介して官能基を有する同一もしくは異なる二価基が1又は複数結合し、全体でエチレングリコールユニットを１〜５０個含む二価基を形成していてもよい。具体的には、前記式（３）〜式（６）から選択される二価基、又は前記式（３）〜式（６）から独立して選択される同一もしくは異なる二価基がアミド結合を介して結合して形成される二価基等が挙げられる。
Ｙ1に含まれるエチレングリコールユニット数は好ましくは２〜３６であり、更に好ましくは、５から２４である。
【００２３】
式（２）におけるＹ2は、１〜５０個のエチレングリコールユニットを含むポリエチレングリコール部分を表す。ここでポリエチレングリコール部分は、両端にＸ2もしくは親水性樹脂における水酸基、及びＺ2と、それぞれエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ジスルフィド結合、アミン結合、アミド結合、ウレア結合又はウレタン結合を形成可能な官能基を有する。また、当該ポリエチレングリコール部分は、エチレングリコールユニットを１〜５０個含んでいれば、個々のエチレングリコールユニット間の結合様式に特に限定は無く、エチレングリコールが１〜５０個重合したポリエチレングリコールを形成しているか、あるいは、エチレングリコールが１〜５０個、好ましくは２〜１５個重合したポリエチレングリコールの両端に適宜炭素数１〜５個の直鎖アルキレンを介して官能基を有する同一もしくは異なる二価基が1又は複数結合し、全体でエチレングリコールユニットを１〜５０個含む二価基を形成していてもよい。具体的には、前記式（３）〜式（６）から選択される二価基、又は前記式（３）〜式（６）から独立して選択される同一もしくは異なる二価基がアミド結合を介して結合して形成される二価基が挙げられる。
Ｙ2に含まれるエチレングリコールユニット数は好ましくは１〜６であり、更に好ましくは、１から４である。好ましくは、Ｙ1に含まれるエチレングリコールユニット数は、Ｙ2に含まれるエチレングリコールユニット数よりも２以上大きい。
【００２４】
式（１）におけるＺ1は、隣接するポリエチレングリコール部分とリガンドもしくは疎水性キャッピング剤とを、共有結合で連結する二価基、又は単結合を表す。また、及式（２）におけるＺ2は、隣接する２つのポリエチレングリコール部分、又はポリエチレングリコール部分と疎水性キャッピング剤とを、共有結合で連結する二価基、又は単結合を表す。Ｚ1及びＺ2おける二価基は、ポリエチレングリコール部分の末端の官能基とリガンドもしくは疎水性キャッピング剤とを化学的に安定につなぐ二価基であれば特に限定はない。すなわち、当該二価基として、ＮＨ、ＣＯ、又は任意のメチレン基が適宜酸素原子、硫黄原子、ＮＲ1（Ｒ1は前記と同義）、ＮＨＣＯ又はＣＯＮＨで置換されていてもよい、化学的に安定な炭素数１〜１０、好ましくは炭素数１〜７の直鎖アルキレンが挙げられる。具体的には、前記式（１１）で表される二価基が挙げられる。
【００２５】
リガンドもしくは疎水性キャッピング剤の官能基とスペーサーの官能基との縮合反応は当業者に周知の方法で行うことができる。すなわち、適宜スペーサーを介して官能基が導入された親水性樹脂と、前記官能基と共有結合を形成できる官能基が適宜スペーサーを介して導入されたリガンドもしくは疎水性キャッピング剤を縮合すればよい。ここでリガンド、疎水性キャッピング剤もしくはスペーサーの官能基は、適宜反応性の高い官能基に変換されていてもよい。例えばカルボキシ基をN-ヒドロキシコハク酸イミドエステル等との活性エステルとし、水酸基もしくはアミノ基との脱水縮合反応に用いることができる。また、チオール基を2-チオピリジルジスルフィドへ変換し、ジスルフィド結合を形成するために用いることができる。また、官能基としてアルデヒド基を有する化合物を、アミノ基を有する化合物と還元剤（例えばシアノ水素化ホウ素ナトリウム等のホウ素系還元剤等が挙げられる）の存在下で反応させることもできる。
具体的には、例えばアガロース系樹脂であるアフィゲル102は、アガロース系樹脂の水酸基に、カルボキシ基を有する化合物とアミド結合形成可能なスペーサーが導入されており、以下の式：
【００２６】
【化４】
0005561484.tif 000005
で表される官能基を有する。また、アフィゲル10は、アフィゲル102を無水コハク酸で処理しカルボキシ酸体とした後、N-ヒドロキシコハク酸イミドで活性エステルとした担体であり、アミノ基もしくは水酸基を有する化合物とアミド結合もしくはエステル結合形成可能なスペーサーが導入されて以下の式： 
【００２７】
【化５】
0005561484.tif 000006
で表される。
また、アフィゲル15における活性型官能基は以下の式：
【００２８】
【化６】
0005561484.tif 000007
で表され、スペーサー内に4級アミンを含む担体であり、アミノ基もしくは水酸基を有する化合物とアミド結合もしくはエステル結合等を形成可能である。
また、セファロース系樹脂にはN-ヒドロキシコハク酸イミドで活性エステル化されたカルボキシ基を有する6-Aminocaproic acid N-hydoxysuccinimide ester-activated-Sepharose 4B(登録商標）、6-Aminohexanoic acid N-hydroxysuccinimide ester-activated Sepharose 4B及びCH-activated Sepharose 4B、臭化シアンで活性化されたCNBr-activated Sepharose 4B等がアミノ基を有する化合物を混合するだけでそのまま共有結合を形成できる活性型担体として市販されている。また、アミノ基を有するEAH-Sepharose 4B、及びカルボキシ基を有するECH-Sepahroseが市販されている。更に、エポキシ基を有するEpoxy-activated Sepharose 6Bが、アミノ基、水酸基又はチオール基を有する化合物と共有結合を形成できる担体として市販されている。また、活性化されたチオール基を有するActivated Thiol Sepharose 4Bは、チオール基を有する化合物とジスルフィド結合を形成できる担体として市販されている。
【００２９】
本発明の固相担体は、好ましくは以下の式（１３）：
【００３０】
【化７】
0005561484.tif 000008
（式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｚ1、Ｚ2、Ｙ1、Ｙ2及びｓは前記と同義である）
で表される（図１）。ここで、疎水性キャッピング剤もしくはリガンドが固定化されている親水性樹脂上の水酸基の割合、又は、固定化されたキャッピング剤及び固定化されたリガンドの割合に特に限定は無いが、担体としてアフィゲルを用いる場合、水酸基を、アミノ基等を有する基に変換（官能基化）し、当該官能基化された水酸基に対して、リガンドは６０％から９０％程度、キャッピング剤は０．１％から４０％程度が固定化されていることが好ましい。
式（１）のＹ1や式（２）のＹ2におけるポリエチレングリコール部分として、以下の式（３）〜（６）：
【００３１】
【化８】
0005561484.tif 000009
（ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ及びｌは前記と同義である）
で表される二価基が挙げられる。
【００３２】
式（３）で表される二価基は、エチレングリコールユニットをｂ個有する二価基であって、両端にＮＨを有する。従って、当該二価基は式（１）におけるＸ1、または式（２）におけるＸ2とアミド結合により結合することができる。従って、Ｘ1もしくはＸ2が前記式（７）〜式（１０）のいずれかで表される二価基の場合、式（７）〜式（１０）におけるＸ4はＣＯを表す。
また、式（３）で表される二価基がキャッピング剤もしくはリガンドと結合し、当該キャッピング剤もしくはリガンドがカルボキシ基を有する場合、アミド結合を介して結合できる。この場合、式（１）におけるＺ1、又は式（２）におけるＺ2は単結合を表す。また、式（３）で表される二価基はキャッピング剤もしくはリガンドが水酸基を有する場合、ＮＨＣＯＯ結合を介して結合できる。この場合、式（１）におけるＺ1、又は式（２）におけるＺ2はカルボニル基を表す。また、式（３）で表される二価基はキャッピング剤もしくはリガンドがアミノ基を有する場合、ＮＨＣＯＮＨ結合を介して結合できる。この場合、式（１）におけるＺ1、又は式（２）におけるＺ2はカルボニル基を表す。
また、式（３）で表される二価基は、前記式（１１）で表される二価基からなるスペーサーを介してキャッピング剤もしくはリガンドと結合してもよく、この場合式（１）におけるＺ1又は式（２）におけるＺ2は式（１１）で表され、式（１１）においてＺ3はカルボニル基を表す。
【００３３】
式（４）で表される二価基は、エチレングリコールユニットをｅ個有する二価基であって、両端にカルボニル基、及びＮＨをそれぞれ有する。従って、当該二価基は式（１）におけるＸ1、または式（２）におけるＸ2とアミド結合により結合することができる。具体的には、Ｘ1もしくはＸ2が前記式（７）〜式（１０）のいずれかで表される二価基の場合、式（７）〜式（１０）におけるＸ4はＮＨを表す。
また、式（４）で表される二価基がキャッピング剤もしくはリガンドと結合し、当該キャッピング剤もしくはリガンドがカルボキシ基を有する場合、アミド結合を介して結合できる。この場合、式（１）におけるＺ1、又は式（２）におけるＺ2は単結合を表す。また、式（４）で表される二価基はキャッピング剤もしくはリガンドが水酸基を有する場合、ＮＨＣＯＯ結合を介して結合できる。この場合、式（１）におけるＺ1、又は式（２）におけるＺ2はカルボニル基を表す。また、式（４）で表される二価基はキャッピング剤もしくはリガンドがアミノ基を有する場合、ＮＨＣＯＮＨ結合を介して結合できる。この場合、式（１）におけるＺ1、又は式（２）におけるＺ2はカルボニル基を表す。
また、式（４）で表される二価基は、前記式（１１）で表される二価基からなるスペーサーを介してキャッピング剤もしくはリガンドと結合してもよく、この場合式（１）におけるＺ1又は式（２）におけるＺ2は式（１１）で表され、式（１１）においてＺ3はカルボニル基を表す。
【００３４】
式（５）で表される二価基は、エチレングリコールユニットをｈ個有する二価基であって、両端にカルボニル基を有する。従って、当該二価基は式（１）におけるＸ1、または式（２）におけるＸ2とアミド結合により結合することができる。具体的には、Ｘ1もしくはＸ2が前記式（７）〜式（１０）のいずれかで表される二価基の場合、Ｘ4はＮＨを表す。
また、式（５）で表される二価基がキャッピング剤もしくはリガンドと結合し、当該キャッピング剤もしくはリガンドがアミノ基もしくは水酸基を有する場合に用いられ、アミド結合もしくはエステル結合を介して結合できる。この場合、式（１）におけるＺ1、又は式（２）におけるＺ2は単結合を表す。
また、式（５）で表される二価基は、前記式（１１）で表される二価基からなるスペーサーを介してキャッピング剤もしくはリガンドと結合してもよく、この場合式（１）におけるＺ1又は式（２）におけるＺ2は式（１１）で表され、式（１１）においてＺ3はＮＨ基を表す。
【００３５】
式（６）で表される二価基は、エチレングリコールユニットをｋ個有する二価基であって、末端にＮＨ及びカルボニル基を有する。従って、当該二価基は式（１）におけるＸ1、または式（２）におけるＸ2とアミド結合により結合することができる。具体的には、Ｘ1もしくはＸ2が前記式（７）〜式（１０）のいずれかで表される二価基の場合、式（７）〜式（１０）におけるＸ4はカルボニル基を表す。
また、式（６）で表される二価基がキャッピング剤もしくはリガンドと結合し、当該キャッピング剤もしくはリガンドがアミノ基もしくは水酸基を有する場合に用いられ、アミド結合もしくはエステル結合を介して結合できる。この場合、式（１）におけるＺ1、又は式（２）におけるＺ2は単結合を表す。
また、式（６）で表される二価基は、前記式（１１）で表される二価基からなるスペーサーを介してキャッピング剤もしくはリガンドと結合してもよく、この場合式（１）におけるＺ1又は式（２）におけるＺ2は式（１１）で表され、式（１１）においてＺ3はＮＨ基を表す。
【００３６】
尚、ポリエチレングリコール部分として、エチレングリコールが１〜１５個、好ましくは１〜６個重合したエチレングリコールオリゴマーの両端にカルボキシ基もしくはアミノ基を有する上記式（３）〜（６）のいずれかで表されるいずれかの二価基が、同一もしくは異なって１〜５個重合したものを用いることもできるが、この場合、当該二価基は相互にアミド結合を形成可能な任意の組み合わせから選択され得る。
また、式（１）におけるＺ1、及び式（２）におけるＺ2が前記式（１１）で表わされる場合、キャッピング剤もしくはリガンドがカルボキシ基を有する場合、式（１１）におけるＺ4はＮＨを表す。また、キャッピング剤もしくはリガンドが水酸基を有する場合、式（１１）におけるＺ4はカルボニル基もしくはＮＨＣＯを表す。キャッピング剤もしくはリガンドがアミノ基を有する場合、式（１１）におけるＺ4はカルボニル基もしくはＮＨＣＯを表す。
【００３７】
親水性樹脂とポリエチレングリコール部分の結合部位として、具体的には、以下の式：
【００３８】
【化９】
0005561484.tif 000010
（ｑは２〜６の整数を表し、ｒは１〜６の整数を表す）
で表される部分構造等が挙げられる。
本発明の固相担体の好ましい態様として、上記式（１３）で表される構造を有する固相担体が挙げられる。式（１３）において、Ｙ2は、好ましくは上記式（３）〜式（６）から選択される、同一もしくは異なる１〜５個の二価基がアミド結合で結合して形成される二価基を表し、この場合、Ｙ2に含まれるポリエチレングリコールのユニット数は好ましくは１〜６である。好ましくは、Ｙ2が式（３）〜（６）のいずれかを表し、当該式（３）〜（６）においてｂ、ｅ、ｈ及びｋが１〜５、好ましくは１〜３を表す。
式（１３）において、Ｙ1としては、好ましくは上記式（３）〜式（６）から選択される同一もしくは異なる１〜５個の二価基がアミド結合で結合して形成される二価基が挙げられ、この場合、Ｙ1に含まれるポリエチレングリコールのユニット数は好ましくは２〜３６である。好ましくは、Ｙ1が式（３）〜（６）のいずれかから選択される同一もしくは異なる任意の基が２〜５個結合して形成される二価基を表し、当該式（３）〜（６）においてｂ、ｅ、ｈ及びｋが１〜５、好ましくは２〜３を表す。
【００３９】
本発明の固相担体は、適宜スペーサーを有していてもよい親水性樹脂を、適宜スペーサーを有していてもよいリガンド及び疎水性キャッピング剤と縮合することにより、当業者に周知の方法で製造することができる。
以下に本発明の固相担体の製造方法について、具体的に例示する。
〔製造方法１〕
本発明の固相担体は、以下の工程で製造することができる：
【００４０】
【化１０】
0005561484.tif 000011
（式中、「−Ｘ1”−ＮＨＣＯ−Ｘ1’−」は式（１）における「−Ｘ1−」に相当する二価基であり、「−Ｘ1”−ＮＨＣＯ−Ｘ2’−」は式（２）における「−Ｘ2−」に相当する二価基であり、Ｙ1、Ｙ2、Ｚ1及びＺ2は前記と同義である）。
すなわち、アミノ基を有する担体、カルボキシ基を有するキャッピング剤及びカルボキシ基を有するリガンドを適当な溶媒中で混合し、脱水縮合剤を用いてアミド化反応を行うことにより、本発明の固相担体を製造することができる。
ここで原料となるアミノ基を有する担体は、以下の工程で製造することができる：
【００４１】
【化１１】
0005561484.tif 000012
（式中Ｘ1”は前記と同義であり、Ｌｇは臭素原子等の脱離基を表し、Ｐｇは保護基を表す）。
すなわち、１）アルキル化反応（Ｌｇで表される脱離基が臭素原子やメタンスルホニルオキシ基等であり、担体とＸ1”がエーテル結合をしている場合）、又はジシクロヘキシルカルボジイミド、1-エチル-3-(3'-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（WSCD）もしくは2-(1H-7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェート  メタナミニウム（ＨＡＴＵ）等の縮合剤による脱水縮合反応（Ｌｇで表される脱離基が水酸基であり、担体とＸ1”がエステル結合をしている場合）、２）アミノ基の保護基を除去する脱保護反応を経て製造することができる。
【００４２】
〔製造方法２〕
カルボキシ基を有する担体を用いて以下の工程で本発明の固相担体を製造することもできる：
【００４３】
【化１２】
0005561484.tif 000013
（式中、「−Ｘ1”−ＣＯＮＨ−Ｘ1’−」は式（１）における「−Ｘ1−」に相当する二価基であり、「−Ｘ1”−ＣＯＮＨ−Ｘ2’−」は式（２）における「−Ｘ2−」に相当する二価基であり、Ｙ1、Ｙ2、Ｚ1及びＺ2は前記と同義である）。
カルボキシ基を有する担体は、以下の工程で製造することができる：
【００４４】
【化１３】
0005561484.tif 000014
（式中Ｘ1”は前記と同義であり、Ｌｇは臭素原子等の脱離基を表し、Ｐｇは保護基を表す）。
すなわち、１）アルキル化反応（Ｌｇで表される脱離基が臭素原子やメタンスルホニルオキシ基等であり、担体とＸ1”がエーテル結合をしている場合）、又はジシクロヘキシルカルボジイミド、1-エチル-3-(3'-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(WSCD)、もしくは2-(1H-7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェート  メタナミニウム（ＨＡＴＵ）等の縮合剤による脱水縮合反応（Ｌｇで表される脱離基が水酸基であり、担体とＸ1”がエステル結合をしている場合）、２）カルボキシ基の保護基を除去する脱保護反応を経て製造することができる。
あるいは、Ｘ1”が−ＣＯ（ＣＨ2）2−を表す場合、無水コハク酸を用いてカルボキシ基を有する担体を製造することもできる。
【００４５】
〔製造方法３〕
次いで、キャッピング剤もしくはリガンドにポリエチレングリコール部分を導入した中間体の製造方法について説明する。
キャッピング剤が水酸基を有する場合、キャッピング剤にポリエチレングリコール部分を導入した中間体は、例えば以下の工程で製造できる。
【００４６】
【化１４】
0005561484.tif 000015
（式中Ｙ2及びＰｇは前記と同義である）。
すなわち、キャッピング剤上の水酸基を、トリホスゲン等の試薬を用いてクロロ蟻酸化し、次いで塩基の存在下にPg-Y2-Hで表される化合物のアミノ基もしくはヒドロキシ基と反応させた後保護基を脱保護する。
リガンドが水酸基を有する場合、リガンドにポリエチレングリコール部分を導入した中間体は、前記と同様の方法で製造できる。
キャッピング剤がカルボキシ基を有する場合、キャッピング剤にポリエチレングリコール部分を導入した中間体は、例えば以下の工程で製造できる：
【００４７】
【化１５】
0005561484.tif 000016
（式中Ｙ2及びＰｇは前記と同義である）。
すなわち、キャッピング剤を、塩基及びジシクロヘキシルカルボジイミド、WSCDもしくはHATU等の脱水縮合剤の存在下にPg-Y2-Hで表される化合物のアミノ基もしくはヒドロキシ基と、反応させた後、保護基を脱保護する。
リガンドがカルボキシ基を有する場合、リガンドにポリエチレングリコール部分を導入した中間体は前記と同様の方法で製造できる。
キャッピング剤がアミノ基を有する場合、キャッピング剤にポリエチレングリコール部分を導入した中間体は、例えば以下の工程で製造できる：
【００４８】
【化１６】
0005561484.tif 000017
（式中Ｙ2及びＰｇは前記と同義である）。
すなわち、キャッピング剤を、塩基及びジシクロヘキシルカルボジイミド、WSCDもしくはHATU等の脱水縮合剤の存在下にPg-Y2-OHで表される化合物のカルボキシ基と反応させた後、保護基を脱保護する。
リガンドがアミノ基を有する場合、リガンドにポリエチレングリコール部分を導入した中間体は前記と同様の方法で製造できる。
尚、上記製造方法３に記載された、アミド化（エステル化）反応及び脱保護反応を適宜繰り返すことにより、より高分子量のポリエチレングリコール部分を導入することができる。
【００４９】
〔製造方法４〕
本発明の固相担体は、担体にポリエチレングリコール部分を導入した後、キャッピング剤及びリガンドを固定化することもできる。例えば、以下の式：
【００５０】
【化１７】
0005561484.tif 000018
（式中、Ｘ1”、Ｘ1’、Ｘ2’、Ｙ1、Ｙ2、Ｚ1、Ｚ2及びＬｇは前記と同義であり、Ｐｇ1及びＰｇ2は異なる条件で脱保護可能な保護基を表す）
で示される方法で製造できる。
すなわち、上記製造方法１〜３に記載のアミド化反応及び脱保護反応を行うことにより、ポリエチレングリコール部分を有する固相担体を製造し、これにリガンド及びキャッピング剤を反応させることができる。
また、カルボキシ基を有する担体から出発して、同様の方法で本発明の固相担体を製造することもできる。
【００５１】
本発明の別の態様として、本発明の固相担体を用いたリガンド特異的結合蛋白質の精製方法が挙げられる。
すなわち、本発明は、以下の（ａ）〜（ｂ）の工程を含む、リガンド特異的結合蛋白質の濃縮、単離又は精製方法：
（ａ）〔１〕に記載の固相担体及び試料を接触させる工程；及び
（ｂ）固相担体から、リガンド特異的結合蛋白質を溶出する工程
を包含する。
上記精製方法は、リガンド特異的蛋白質が膜結合型蛋白質である場合に好適である。すなわち、上記精製方法に供される「試料」としては、膜結合型蛋白質を含む試料であれば純度等に限定は無いが、本発明の精製方法は、細胞膜に結合した状態の膜結合型蛋白質を含む試料を精製するために特に有用である。従って試料としては、ヒト、動物由来の生体組織、臓器由来の細胞膜画分を含む試料（粗精製されたものも未精製のものも含む）が挙げられる。
【００５２】
以下に本発明の精製方法の各工程について詳細に説明する。
〔工程（ａ）〕
固相担体と試料は、通常緩衝液(バッファー）中で接触させる。ここで用いられるバッファーとしてはMESバッファー、HEPESバッファー、トリス(Tris)−塩酸バッファー、MOPSバッファー、リン酸（Phosphate)バッファー等が挙げられる。
上記バッファーのｐHは５．０〜９．０に調整され、好ましくは６．０〜８．０に調整される。
固相担体と接触させる際の試料の濃度としては特に限定は無いが、蛋白質混合物（ライゼート)、すなわち組織、細胞から抽出したタンパク質混合物の場合、0.1mg/ml〜10mg/mlが好ましく、更に好ましくは0.5mg/ml〜5mg/mlである。
試料及び固相担体を接触させる時間に特に限定はないが、通常１０分〜２４時間接触させることにより、試料中に含まれる膜結合型蛋白質を固相担体に吸着させることができる。また、通常４〜３７℃下に接触させる。
試料を固相担体に吸着させた後、洗浄バッファーで固相担体を３〜２０回洗浄する。洗浄バッファーとしては、通常試料を接触させる際に用いたものと同じものを用いる。
【００５３】
〔工程（ｂ）〕
リガンド特異的に結合する膜結合型蛋白質の溶出には、通常高濃度にリガンドを溶解した水溶液やバッファーを用いることができる。適宜１〜７０％の親水性有機溶媒（アセトニトリルやイソプロパノールが挙げられる）を添加してもよい。また、適宜１％〜５％のSDSや、０．１％〜１０％の界面活性剤（例えばチャップス、チャプソー、オクチルグルコシド、ドデシルマルトシド、トリトン等）を添加してもよい。具体的には、０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８），２％ＳＤＳ，  ２０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，  ０．２％ＢＰＢ、０．２Ｍ  ＤＴＴからなる組成のバッファーを挙げることができる。
【００５４】
あるいは、１％〜５％のSDSを含む水溶液もしくはバッファーや、０．１％〜１０％の界面活性剤を含む水溶液を用いて吸着した膜結合型蛋白質を溶出させることもできる。また、８Mウレアや６Ｍ塩酸グアニジン等を用いて溶出することも可能である。
溶出液のｐHは特に限定は無く、酸性条件（ｐH2.0〜5.0）、アルカリ性条件（pH9.0-11.0）、中性条件（ｐH5.0-9.0）のいずれでもよい。好ましくは中性条件で溶出される。溶出温度は4℃〜95℃である。
溶出された膜結合型蛋白質は、ウェスタンブロッティング等の当業者に公知の方法で検出することができる。すなわち、溶出された蛋白質溶液をSDS-PAGEに付し、ＰＶＤＦ膜等に蛋白質をトランスファーし、抗体等を用いて得られたバンドを解析すればよい。または、溶出された蛋白質溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、目的のバンドを切りだし、解析すればよい。具体的には、目的のバンドをゲルから切り出し、インゲルトリプシン消化法にて得られるペプチドを質量スペクトル法にて解析することができる。
あるいは、樹脂に結合している状態の蛋白質を溶出することなくトリプシン等の消化酵素で処理し、得られるペプチド断片を含む溶液を質量スペクトル解析することもできる。
【００５５】
また、本発明の別の態様として、本発明の固相担体は、ターゲット蛋白質に特異的に結合するリガンド化合物を探索するために用いることができる。すなわち、特定の膜タンパク質、当該タンパク質に特異的に結合する公知リガンドを有する本発明の固相担体及び被験物質を接触させ、当該被験物質が当該タンパク質と公知リガンドとの特異的結合を拮抗するか否かを調べることにより、当該被験物質が当該タンパク質に特異的に結合するリガンドか否かを評価することができる。具体的には、以下の（ａ）〜（ｂ）の工程でターゲット蛋白質の特異的リガンドを同定することができる：
（ａ）ターゲットタンパク質に特異的に結合する公知のリガンドを有する〔１〕に記載の固相担体、ターゲットタンパク質、及び被験物質を接触させる工程；
（ｂ）前記固相担体から、ターゲット蛋白質を溶出する工程；
（ｃ）溶出されたターゲット蛋白質を検出する工程；及び
（ｄ）（ｃ）の検出結果に基づき、ターゲット蛋白質の検出量が小さい被験物質をターゲット蛋白質特異的リガンドであると判定する工程
を包含する。
【００５６】
また、本発明の別の態様として、式（１２）：
【００５７】
【化１８】
0005561484.tif 000019
（ａ、ｂ及びｃは、式（３）と同義である）
で表わされる化合物またはその塩が挙げられる。当該化合物またはその塩は、γ−セクレターゼを精製するためのアフィニティークロマトグラフィー用固相担体の製造中間体として有用である。すなわち式（１２）で表わされる化合物又はその塩は、γ−セクレターゼのリガンドとする本発明の固相担体を製造するためのスペーサーを導入した化合物に相当する。
前記塩は、当業者に周知の塩であれば特に限定は無く、有機酸塩又は無機酸塩が用いられる。具体的には塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩等を例示することができる。
式（１２）で表わされる化合物は、実施例１に記載の方法に準じて製造することができる。
【００５８】
以下に、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明は必ずしもこれらに限定されるものではない。
尚、本明細書で用いられる略号は以下のとおりである：
iPr2NEt：ジイソプロピルエチルアミン
AcOEt:酢酸エチル
DMF：ジメチルホルムアミド
WSCD：水溶性カルボジイミド（１−エチルー３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）
HOBｔ：N-ヒドロキシベンゾトリアゾール
Boc：tert−ブトキシカルボニル
DAPT：Ｎ−［Ｎ−（3，5−ジフルオロフェニルアセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシン−ｔ−ブチルエステル
HATU：2-(1H-7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェート  メタナミニウム（2-(1H-7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyl uronium hexafluorophosphate Methanaminium）
【実施例】
【００５９】
実施例１【００６０】
（１）コレステロール-PEG(1)-NH2（１−４）の合成【００６１】
【化１９】
0005561484.tif 000020
クロロぎ酸コレステロール（１−１）（東京化成、Cat.no.C0694；637ｍｇ，1.42mmol)をジクロロメタン６０ｍｌに溶かし、氷冷下攪拌した。Mono-N-t-Boc-amido-dPEG3TM-amine（１−２） (QUANTA BIODESIGN製; 500mg,1.56mmol) をジクロロメタン１ｍｌに溶かし、ゆっくりと滴下した。ジイソプロピルエチルアミン（494μl, 2.84mmol) を加え、室温にて一昼夜攪拌した。減圧濃縮後、酢酸エチル２００ｍｌを加えた。酢酸エチル層を水１００ｍｌ、飽和食塩水にて洗浄した。無水硫酸マグネシウムにて乾燥後、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製した。目的のBoc体（１−３）(770mg)を収率７４％にて得た。質量分析結果：ＭS（ｍ／ｚ）：  ７３３（ＭＨ＋）。
得られたBoc体（１−３）（770mg, 1.05mmol) を酢酸エチル６０ｍｌに溶かし、4N-HCl/AcOEt (国産化学製;５ｍｌ) を加え、室温にて５時間攪拌した。反応完結後、溶媒を留去し、クロロホルム５０ｍｌを加え、減圧下溶媒を留去した。この操作を３回繰り返した。真空ポンプにて溶媒を完全に留去し、目的のアミノ体塩酸塩（１−４）（703mg）を定量的に得た。質量分析結果：ＭS（ｍ／ｚ）：  ６３３（ＭＨ＋）。
以下に、製造した化合物の1H-NMRデータを示した。
式（１−３）の化合物：
1H-NMR (CDCl3) δ0.67(s, 3H), 0.86 (d, J=6.6Hz, 3H), 0.87 (d, J=6.6Hz, 3H), 0.91 (d, J=6.4Hz, 3H), 0.94-1.06 (m, 3H), 1.00 (s, 3H), 1.06-1.18 (m, 5H), 1.30-1.40 (m, 3H), 1.40-1.45 (m, 2H), 1.44 (s, 9H), 1.45-1.60 (m, 7H), 1.76 (m, 4H), 1.84 (m, 1H), 1.86 (m, 2H), 1.94 (m, 1H), 2.00 (m, 2H), 2.27 (br d, J=13.1, 5.1, 1.9Hz, 1H), 2.35 (ddd, J=13.1, 5.1, 1.9Hz, 1H), 3.22(br t, J=6.1Hz, 2H), 3.27 (m, 2H), 3.51-3.57(m, 4H), 3.57-3.62 (m, 4H), 3.62-3.66 (m, 4H), 4.48 (m, 1H), 5.36 (m, 1H), 4.95 (br s, 1H), 5.14 (br s, 1H); 
HRMS-ESI (m/z): [M+H]+calcd. for C43H77O7N2, 733.5725; found, 733.5724.
式（１−４）の化合物：
1H-NMR (CDCl3) δ0.67 (s, 3H), 0.86 (d, J=6.6Hz, 3H), 0.87 (d, J=6.6Hz, 3H), 0.88-0.94 (m, 1H), 0.91 (d, J=6.6Hz, 3H), 0.94-1.06 (m, 3H), 1.00 (s, 3H), 1.04-1.20 (m, 5H), 1.20-1.40 (m, 4H), 1.40-1.60 (m, 6H), 1.76-1.90 (m, 4H), 1.80 (m, 2H), 1.92-2.12 (m, 3H), 2.06 (m, 2H), 2.29 (br dd, J=13.1, 2.3Hz, 1H), 2.34 (ddd, J=13.1, 5.2, 1.7Hz, 1H), 3.20-3-30 (m, 4H), 3.58 (m, 2H), 3.64 (m, 6H), 3.73 (m, 4H), 4.44 (m, 1H), 5.35 (m, 1H), 8.05-8.30 (m, 3H);
HRMS-ESI (m/z): [M+H]+calcd. for C38H69O5N2, 633.5201; found, 633.5192【００６２】
（２）DAPT-PEG(2)-NH2（１−１１）の合成【００６３】
【化２０】
0005561484.tif 000021
【化２１】
0005561484.tif 000022
DAPT（１−５）（5.0ｇ、11.56mmol）をジクロロメタン１００ｍｌに溶かし室温にて攪拌した。TFA１０ｍｌをゆっくりと滴下し、室温にて一昼夜攪拌した。溶媒を留去し、クロロホルム５０ｍｌを加え、減圧下溶媒を留去した。この操作を２回繰り返した。析出した結晶をジエチルエーテルにて洗浄し、結晶を濾取した。減圧下乾燥し、目的のカルボン酸体（１−６）(4.28g)を９８．４％にて得た。
カルボン酸体（１−６）（978mg, 2.60mmol) をジクロロメタン４０ｍｌに溶かし、窒素気流下、４℃にて攪拌した。WSCD (546μl, 3.12mmol), HOBt (420mg, 3.12mmol) をゆっくりと加え、室温にて６０分間攪拌した。再度、４℃にて攪拌後、 Mono-N-t-Boc-amido-dPEG3TM-amine (QUANTA BIODESIGN; 1.0g, 3.12mmol) をジクロロメタン2ml に溶かし、ゆっくりと滴下した。ジイソプロピルエチルアミン（542μl, 3.12mmol) を加え、室温にて60分間攪拌した。溶媒を留去後、反応液を酢酸エチル１００ｍｌに溶かし、水１００ｍｌ、飽和食塩水１００ｍｌにて洗浄した。無水硫酸マグネシウムにて乾燥後、減圧濃縮した。
シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的のBoc体（１−７）(1.14g)を収率６４．６％にて得た。質量分析結果: ＭS（ｍ／ｚ）：  ６７９（ＭＨ＋）。
得られたBoc体（１−７）（1.14g, 1.68mmol) を酢酸エチル５０ｍｌ、クロロホルム５０ｍｌの混合溶媒に溶かし、4M(N)-HCl/AcOEt (国産化学製;10ml) を加え、室温にて一昼夜攪拌した。反応完結後、溶媒を留去し、クロロホルム３０ｍｌを加え、減圧下溶媒を留去した。この操作を３回繰り返した。真空ポンプにて溶媒を完全に留去し、目的のアミノ体塩酸塩（１−８）(1.0g)を収率９７％にて得た。質量分析結果：ＭS（ｍ／ｚ）：  ５７９（ＭＨ＋）。
N-t-Boc-amido-d-PEG4TM-acid (QUANTA BIODESIGN,; 715mg, 1.96mmol)（１−９）をジクロロメタン(70ml)及びクロロホルム(10ml)の混合溶媒に溶かし、窒素気流下４℃にて攪拌した。 WSCD (343μl, 1.96mmol), HOBt (264mg, 1.96mmol) をゆっくりと加え、室温にて６０分間攪拌した。再度、４℃にて攪拌後、アミノ体塩酸塩（１−８） （1.0g，1.63mmol) をジクロロメタン１０ｍｌ，クロロホルム５ｍｌの混合溶媒に溶かし、反応系中に滴下した。ジイソプロピルエチルアミン（681μl, 3.91mmol) を加え、室温にて60分間攪拌した。溶媒を留去後、クロロホルム１００ｍｌを加え、水５０ｍｌ、飽和食塩水５０ｍｌにて洗浄した。無水硫酸マグシウムにて乾燥し、減圧濃縮した。
シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的のBoc体（１−１０）(1.07g)を収率７０．９％にて得た。質量分析結果：ＭS(ｍ/z): ９２６（ＭＨ＋）。
得られたBoc体（１−１０）（1.0g, 1.08mmol)をクロロホルム(60ml)−酢酸エチル(20ml)の混合溶媒に溶かし、4M(N)-HCl/AcOEt (国産化学製;10ml) を加え、室温にて１時間攪拌した。反応完結後、溶媒を留去し、クロロホルム(30ml)を加え、減圧下溶媒を留去した。この操作を３回繰り返した。真空ポンプにて溶媒を完全に留去し、目的のアミノ体塩酸塩（１−１１）(931mg)を定量的に得た。質量分析結果: MS (m/z): ８２６（ＭＨ＋）。
尚原料となるＤＡＰＴは、公知化合物であり、J. Neurochem. 2001, 76, p173、Org. Biomol. Chem., 2005, 3, p2450-2457、及びBioorganic & Medicinal Chemistry Letters., 2004, 14, p1983-1985に記載の方法で製造できる。また、市販品（シグマ社、Cat. No. D5942)を入手することもできる。
以下に、製造した化合物の1H-NMRデータを示した。
式（１−７）の化合物：
. 1H-NMR (DMSO-d6)δ1.21 (d, J=7.1Hz, 3H), 1.36 (s, 9H), 1.52-1.62 (m, 4H), 2.94 (q, J=6.6Hz, 2H), 3.07 (m, 2H), 3.26-3.54 (m, 14H), 4.40 (quin, J=7.1Hz, 1H), 5.35 (d, J=8.1Hz, 1H), 6.73 (br t, J=6.6Hz, 1H), 6.92-7.00 (m, 1H), 7.06 (tt, J=9.5, 2.4Hz, 1H), 7.22-7.36 (m, 5H), 8.19 (t, J=5.6Hz, 1H), 8.35 (d, J=7.1Hz, 1H), 8.38 (d, J=8.1Hz, 1H);
HRMS-ESI (m/z): [M+H]+calcd. for C34H49O8N4F2, 679.3513; found, 679.3519
式（１−８）の化合物：
1H-NMR (DMSO-d6) δ1.22 (d, J=7.1Hz, 3H), 1.58 (quin, J=6.7Hz, 2H), 1.76 (quin, J=6.7Hz, 2H), 2.83 (t, J=6.7Hz, 2H), 3.08 (m, 2H), 3.30 (t, J=6.7Hz, 2H), 3.38-3.54 (m, 12H), 4.40 (quin, J=7.1Hz, 1H), 5.36 (d, J=7.8Hz, 1H), 6.94-7.00 (m, 2H), 7.07 (tt, J=9.4, 2.4Hz, 1H), 7.22-7.38 (m, 5H), 7.69 (br s, 2H), 8.23 (t, J=5.6Hz, 1H), 8.381 (d, J=7.8Hz, 1H), 8.383 (d, J=7.1Hz, 1H);
HRMS-ESI (m/z): [M+H]+calcd. for C29H41O6N4F2, 579.2989; found, 579.2983.
式(1-10)の化合物：
1H-NMR (DMSO-d6)δ1.22 (d, J=7.2Hz, 3H), 1.37 (s, 9H), 1.54-1.64 (m, 4H), 2.28 (t, J=6.5Hz, 2H), 3.02-3.10 (m, 10H), 3.26-3.54 (m, 28H), 3.57 (t, J=6.5Hz, 2H), 4.41 (quin, J=7.2Hz, 1H), 5.36 (d, J=7.8Hz, 1H), 6.74 (t, J=5.4Hz, 1H), 6.85-7.00 (m, 2H), 7.07 (tt, J=9.5, 2.4Hz, 1H), 7.20-7.40 (m, 5H), 7.78 (t, J=5.6Hz, 1H), 8.21 (t, J=5.6Hz, 1H), 8.36 (d, J=7.2Hz, 1H), 8.39 (d, J=7.8Hz, 1H);
HRMS-ESI (m/z): [M+H]+calcd. for C45H70O13N5F2, 926.4933; found, 926.4945.
式(1-11)の化合物：
1H-NMR (DMSO-d6)δ1.22 (d, J=7.1Hz, 3H), 1.52-1.64 (m, 4H), 2.29 (t, J=6.5Hz, 2H), 2.97 (q, J=5.5Hz, 2H), 3.02-3.12 (m, 4H), 3.26-3.62 (m, 30H), 4.40 (quin, J=7.1Hz, 1H), 5.36 (d, J=7.8Hz, 1H), 6.94-7.00 (m, 2H), 7.07 (tt, J=9.5, 2.4Hz, 1H), 7.22-7.38 (m, 5H), 7.77 (br s, 2H), 7.82 (t, J=6.5Hz, 1H), 8.22 (t, J=5.5Hz, 1H), 8.37 (d, J=7.1Hz, 1H), 8.38 (d, J=7.8Hz, 1H);
HRMS-ESI (m/z): [M+H]+calcd. for C40H62O11N5F2, 826.4408; found, 826.4414.
式(1-7)の化合物の製造例（別法）
カルボン酸体（１−６）（587mg, 1.56mmol) Mono-N-t-Boc-amido-dPEG3TM-amine (QUANTA BIODESIGN; 500mg, 1.56mmol) をDMF10ml に溶かし、ジイソプロピルエチルアミン（300μl, 1.72mmol) を加え、氷冷下攪拌した。HATU（渡辺化学工業, Cat, no, A01695; 652mg, 1.72mmol）を加え氷冷下３時間攪拌した。 クロロホルム１５０ｍｌを加え、有機層を水１００ｍｌにて２回、飽和食塩水１００ｍｌにて洗浄した。無水硫酸マグネシウムにて乾燥後、減圧濃縮した。
シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的のBoc体（１−７）(656mg)を収率６２％にて得た。
同様に、縮合剤としてWSCD及びHOBTのかわりにHATUを用いて、式（１−１０）、式（１−１３）、式（１−１４）、式（１−１９）、式（１−２０）、式（１−２１）、式（１−２２）、式（６−３）、式（６−４）及び式（９−１）化合物を合成することができる。【００６４】
（３）Affi-gelの修飾（DAPT-PEG(2)+Chole-PEG(1))【００６５】
【化２２】
0005561484.tif 000023
Affi-Gel 102Gel (BIO-RAD, cat. No; 153-2401) 12ml（144μmol）をDMFにて置換し、無水コハク酸（28.8mg, 288mol)、iPr2NEt (75μmol, 432μmol)を加え、室温にて一昼夜攪拌した。樹脂をDMFにて洗浄後、ニンヒドリンテストを行い、定量的に目的のカルボン酸体 (１−１２)（144μmol）が得られたのを確認した。引き続き、樹脂を２０％無水酢酸DMF溶液にて３０分間室温で攪拌した。得られたカルボン酸樹脂(１−１２)（36μmol)にDMF１0ｍｌを加え、WSCD（7.5μl, 43.2μmol), HOBt (5.8mg, 43.2μmol)を加え室温にて３０分間攪拌した。化合物（１−１１）（18.6mg, 21.6μmol), 化合物（１−４）(7.2mg, 10.8μmol), エタノールアミン(0.22mg, 3.6μmol), iPr2NEt (15μl, 86.4μmol)を加え、室温にて一昼夜攪拌した。樹脂をDMFにて洗浄後、引き続き２０％エタノール水溶液にて洗浄し、目的の固相担体：DAPT-PEG(2)+コレステロール-PEG(1)（１−１３）を得た。
樹脂に結合しない化合物（１−１１），化合物（１−４）を、ＨＰＬＣを用い定量した結果、樹脂上のカルボン酸官能基に対して(１-１１)が５７％，(１-１２)が３０％固定化された樹脂：DAPT-PEG(2)+コレステロール-PEG(1)(１−１３)を得た。
尚、リガンドもしくは疎水性キャッピング剤の固定化率が異なる固相担体は、目的とする固定化率を達成するために理論的に必要なモル比に応じたリガンドもしくは疎水性キャッピング剤を原料として反応させることにより、製造した。      【００６６】
実施例２
（１）DAPT-PEG(3)-NH2（１−１５）の合成【００６７】
【化２３】
0005561484.tif 000024
N-t-Boc-amido-d-PEG4TM-acid (化合物（１−９）、QUANTA BIODESIGN,;127mg, 0.348mmol)をジクロロメタン１０ｍｌ、クロロホルム４ｍｌの混合溶媒に溶かし、窒素気流下４℃にて攪拌した。 WSCD (343μl, 1.96mmol), HOBt (264mg, 1.96mmol) をゆっくりと加え、室温にて６０分間攪拌した。再度、４℃にて攪拌後、上記で得られたアミノ体塩酸塩（１−１１）(250mg, 0.29mmol）ジクロロメタン１ｍｌ，クロロホルム２．５ｍｌの混合溶媒に溶かし、反応系中に滴下した。ジイソプロピルエチルアミン（121μl, 0.696mmol) を加え、室温にて1昼夜攪拌した。
溶媒を留去後、クロロホルム１００ｍｌを加え、水５０ｍｌ、飽和食塩水５０ｍｌにて洗浄した。無水硫酸マグシウムにて乾燥し、減圧濃縮した。
シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的のBoc体（１−１４）(150mg)を収率４４％にて得た。質量分析結果:ＭS (m/z)：１１７３（ＭＨ＋）。得られたBoc体（１−１４）（150mg, 0.128mmol)をクロロホルム１０ｍｌ−酢酸エチル２ｍｌの混合溶媒に溶かし、4M(N)-HCl/AcOEt (国産化学製;２ml) を加え、室温にて２時間攪拌した。反応完結後、溶媒を留去し、クロロホルム３０ｍｌを加え、減圧下溶媒を留去した。この操作を３回繰り返した。真空ポンプにて溶媒を完全にとばし、目的のアミノ体塩酸塩（１−１５）(123mg)を定量的に得た。質量分析結果: ＭS (m/z):  1073(ＭＨ＋)。【００６８】
（２）コレステロール-PEG(0)-NH2（１−１８）の合成【００６９】
【化２４】
0005561484.tif 000025
クロロぎ酸コレステロール（１−１）（東京化成；637ｍｇ，1.42mmol)をジクロロメタン６０ｍｌに溶かし、氷冷下攪拌した。N-(2-アミノエチル）カルバミン酸tert-ブチル (東京化成; 250mg,1.56mmol) をジクロロメタン１ｍｌに溶かし、ゆっくりと滴下した。ジイソプロピルエチルアミン（494μl, 2.84mmol) を加え、室温にて一昼夜攪拌した。減圧濃縮後、酢酸エチル２００ｍｌを加えた。酢酸エチル層を水１００ｍｌ、飽和食塩水にて洗浄した。無水硫酸マグネシウムにて乾燥後、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製した。目的のBoc体（１−１７）(645mg, 1.12mmol)を収率７９％にて得た。質量分析結果：ＭS (ｍ／ｚ): 595(M+Na)  。
得られたBoc体（１−１７）（645mg, 1.12mmol) を酢酸エチル１０ｍｌ−クロロホルム３０ｍｌの混合溶媒に溶かし、4M(N)-HCl/AcOEt (国産化学製;  3ml) を加え、室温にて３時間攪拌した。反応完結後、結晶を濾取し、結晶をクロロホルム２ｍｌにて洗浄した。減圧下乾燥し、目的のアミノ体塩酸塩（１−１８）(570mg)を定量的に得た。質量分析結果: ＭS (m/z)：473(ＭＨ+)。
化合物（１−１３）を得た同様の方法で、化合物（１−４）、（１−１５）、（１−１１），（１−１８）を組み合わせることによりポリエチレングリコール部分の長さの異なるアフィニティー樹脂（１−１９）（DAPT-PEG(2)+Chole-PEG(0))： 【００７０】
【化２５】
0005561484.tif 000026
、式（１−２０）（DAPT-PEG(3)+Chole-PEG(0))：【００７１】
【化２６】
0005561484.tif 000027
及び式（１−２１）（DAPT-PEG(3)+Chole-PEG(1))：【００７２】
【化２７】
0005561484.tif 000028
を合成した。【００７３】
実施例３
（１）ラット脳抽出物の作成
i) ラット全脳 (2g)を、２０ｍｌのバッファーA（subcellular buffer A） (20mM Hepes pH7.5, 50mM KCl, 2mM EGTA+proteaseinhibitor) 中でホモジナイズした。
ii)遠心分離した(回転数1000  x  g, 10分間）
iii)  ii)で得られた上清を更に遠心分離した（回転数10,000  x  g, 15分間）
iv)  iii)で得られた上清を更に遠心分離し（回転数100,000  x  g, 60分間）、ペレットを得た(0.26g)。
v) 得られたペレット(0.26g)に、１％チャプソー入りバッファーＡ（1% CHAPSO/buffer A ；2.6ml）を加えて懸濁し、氷冷下に60分間インキュベートした。４℃下に遠心分離（回転数100,000  x  g, 30分間）し、２．６ｍｌのbuffer Aを加え、最終濃度が０．５％CHAPSOとなるように調製した。
（２）結合実験
実施例１で調製したアフィニティー樹脂（１−１３）（4.8μmol相当)を正確にはかり取り、（１）で得られたラット脳ライゼート（200μl)と示された結合条件（温度・時間）で結合実験を実施した。拮抗（+）はあらかじめLysateに１００ｍM DAPT ０．２μl加え（最終濃度 100μM)、各実験温度にて30分間インキュベーションした後、結合実験に用いた。結合実験終了後、樹脂を１２，０００ｘｇにて遠心分離し、上澄みを捨て、残された樹脂をbufferB  (20mM Hepse pH7.5, 50mM KCl, 2mM EGTA+  protease  inhibitor,  0.5%CHAPSO) ８００μl にて3回（１５分ｘ３）洗浄した。樹脂にSDS用ローディングバッファー（nakalai cat. No; 30566-22, 2-ME(2-メルカプトエタノール）含有電気泳動サンプルバッファー溶液（２ｘ））４０μlを加え、９０℃にて３分間インキュベーションした。こうして得られたサンプル液を市販のSDSゲル（BioRad  ready Gel J, 5-20%SDS, cat. No; 161-J371V)で分離し、そのSDSゲルを解析した。【００７４】
（３）ウエスタンブロッティング
SDS-PAGEによって分離した蛋白質をPVDF Membrane Filter Paper Sandwich 0.2um Pore Size, 20/pk.(invitrogen cat. No; LC2002)へトランスファーした。PVDF膜をトレーに移し、ブロッキング剤であるBlocking One (nakalai)を５０ｍｌ加え、室温にて１時間振とうした。TBS-Tにて３回洗浄した（１０分ｘ３）。１次抗体をCan Get Signal Solution 1 (TOYOBO, cat. No;NKB-101)にて希釈し、室温にて１時間振とうした。TBS-Tにて３回洗浄した（１０分ｘ３）。 ２次抗体をCan Get Signal Solution ２ (TOYOBO, cat. No;NKB-101)にて希釈し、室温にて１時間インキュベーションした。TBS-Tにて３回洗浄した（１０分ｘ３）。検出試薬はECL Plus western Blotting Detection System (GE Healthcare cat. No;RPN2132)を用いて行った。検出装置としてルミノ・イメージアナライザーLAS-1000（富士フィルム）を用いて検出した。
その結果、脳抽出物にあらかじめγ−セクレターゼ阻害剤であるDAPTを添加しなかった場合はγ−セクレターゼ（ニカストリン(Nct),プレセニリン１（PS1-ＮＴＦ，ＰＳ１−ＣＴＦ），アフ−１（Ａｐｈ−１），ペン−２(Pen-2)のコンプレックス体）と結合するが、脳抽出物に拮抗剤であるDAPTをあらかじめ添加した場合にはＮｃｔ，ＰＳ１，Ａｐｈ−１、Ｐｅｎ−２のバンドが検出されなかった。バンドの消失からこれら４つの構成成分がコンプレックス体としてＤＡＰＴに特異的に結合していることがわかった。従って、式（１−１３）の固相担体とγ−セクレターゼの構成成分との結合は、DAPTにより拮抗される特異的なものであることがわかった。【００７５】
実施例４
実施例１と同様の方法で、以下の式（１−２２）で表される固相担体（DAPT-(PEG)1-Chol(PEG1)）を製造した。
式（１−２２）：【００７６】
【化２８】
0005561484.tif 000029
Affi-Gel 102Gel (BIO-RAD, cat. No; 153-2401) 12ml（144μmol) をDMFにて置換し、無水コハク酸（28.8mg, 288μmol)、iPr2NEt (75μl, 432μmol)を加え、室温にて一昼夜攪拌した。樹脂をDMFにて洗浄後、ニンヒドリンテストを行い、定量的に目的のカルボン酸体 (１−１２)が得られたのを確認した。引き続き、樹脂を２０％無水酢酸DMF溶液にて３０分間室温で攪拌した。得られたカルボン酸樹脂(１−１２)（36μmol)にDMF１０ｍｌを加え、WSCD（7.5μl, 43.2μmol), HOBt (5.8mg, 43.2μmol)を加え室温にて３０分間攪拌した。化合物（１−８）（ 21.6μmol), 化合物（１−４）(7.2mg, 10.8μmol), エタノールアミン(0.22mg, 3.6μmol), iPr2NEt (15μl, 86.4μmol)を加え、室温にて一昼夜攪拌した。樹脂をDMFにて洗浄後、引き続き２０％エタノール水溶液にて洗浄し、目的の固相担体：DAPT-PEG(1)+コレステロール-PEG(1)（式（１−２２））を得た。【００７７】
実施例５
実施例１で得られた式（１−１３）で表される固相担体についてアフィニティークロマトグラフィー用樹脂としてγ−セクレターゼを特異的に結合するか否かを調べた。すなわち、ＤＡＰＴの固定化率が１０％、３０％、６０％と異なる3種類の固相担体について、結合実験、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティング実験により得られるバンドを解析した。
実施例１で調製したアフィニティー樹脂（１−１３）（4.8μmol相当)を正確にはかり取り、実施例3と同様の方法で得られたラット脳ライゼート（200μl)と示された結合条件（温度・時間）で結合実験を実施した。結合実験終了後、樹脂を１２，０００ｘｇにて遠心分離し、上澄みを捨て、残された樹脂をbufferB  (20mM Hepse pH7.5, 50mM KCl, 2mM EGTA+  protease  inhibitor,  0.5%CHAPSO) ８００μl にて３回（１５分ｘ３）洗浄した。樹脂にSDS用ローディングバッファー（nakalai cat. No; 30566-22, 2-ME(2-メルカプトエタノール）含有電気泳動サンプルバッファー溶液（２ｘ））４０μlを加え、９０℃にて３分間インキュベーションした。こうして得られたサンプル液を市販のSDSゲル（BioRad  ready Gel J, 5-20%SDS, cat. No; 161-J371V)で分離した。
ウエスタンブロッティング
SDS-PAGEによって分離した蛋白質をPVDF Membrane Filter Paper Sandwich 0.2um Pore Size, 20/pk.(invitrogen cat. No; LC2002)へトランスファーした。PVDF膜をトレーに移し、ブロッキング剤であるBlocking One (nakalai)を５０ｍｌ加え、室温にて１時間振とうした。TBS-Tにて３回洗浄した（１０分ｘ３）。１次抗体をCan Get Signal Solution 1 (TOYOBO, cat. No;NKB-101)にて希釈し、室温にて１時間振とうした。TBS-Tにて３回洗浄した（１０分ｘ３）。 ２次抗体をCan Get Signal Solution ２ (TOYOBO, cat. No;NKB-101)にて希釈し、室温にて１時間インキュベーションした。TBS-Tにて３回洗浄した（１０分ｘ３）。検出試薬はECL Plus western Blotting Detection System (GE Healthcare cat. No;RPN2132)を用いて行った。検出装置としてルミノ・イメージアナライザーLAS-1000（富士フィルム）を用いて検出した。
結果を図２に示す。
図２に示すとおり、アフィゲル１０２ゲル上のアミノ基を無水コハク酸で処理することで得られるカルボン酸樹脂（１−１２）上のカルボキシル基に対し、１０％〜１００％でＤＡＰＴがポリエチレングリコールを介して固定化されている固相担体（レーン１−４）、及び樹脂上のカルボキシル基（１−１２）に対し、３０％でコレステロールが固定化されている固相担体（レーン８）にはγ−セクレターゼが全く結合できないのに対して、樹脂上のカルボキシル基（１−１２）に対し、１０〜６０％にポリエチレングリコールを介してＤＡＰＴが固定化され、かつ３０％にコレステロールが固定化されている固相担体（レーン５−７）にはγ−セクレターゼの4種類の構成成分が結合した。
また、式（１−１３）で表される固相担体が、サンプル中に存在する多量の蛋白質を非特異的に吸着するものでないことを確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ゲルを１０％酢酸４０％メタノール水溶液中で３０分間振とうし、溶液を除いた後、ＣＢＢ染色液（ナカライテスク製）５０ｍｌ中にて１５分間振とうした。水でゲルを数回洗い得られたバンドを解析した。結果を図３に示す。
図３に示されるとおり、式（１−１３）で表される固相担体は、多量に存在する蛋白質を非特異的に結合するものではないことが確認された。一方アフィゲルのかわりに疎水性樹脂であるトーヨーパールを用いて製造した固相担体で同様の実験を行った。その結果、図４に示されるとおり、式（１−１３）に相当する固相担体（１）及び式（１−１９）に相当する固相担体（２）においては、いずれも非特異的な蛋白質の結合が観察された。      【００７８】
実施例６
（１）  C18-PEG(1)-NH2（６−２）の合成
ステアリン酸（404mg，1.42mmol）をジクロロメタン６０ｍｌに溶かし、氷冷下攪拌した。WSCD (343μl, 1.96mmol)、HOBt (264mg, 1.96mmol) をゆっくりと加え、室温にて６０分間攪拌した。再度、４℃にて攪拌後、Mono-N-t-boc-amido-dPEG3TM-amine（１−２） (QUANTA BIODESIGN製; 500mg,1.56mmol) をジクロロメタン１ｍｌに溶かし、ゆっくりと滴下した。ジイソプロピルエチルアミン（494μl, 2.84mmol) を加え、室温にて一昼夜攪拌した。減圧濃縮後、酢酸エチル２００ｍｌを加えた。酢酸エチル層を水１００ｍｌ、飽和食塩水にて洗浄した。無水硫酸マグネシウムにて乾燥後、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製した。目的のBoc体（６−１）(730mg)を収率８７％にて得た。質量分析結果：HRMS-ESI (m/z):[M+H]+calcd.for C33H67O6N2, 587.4994; found, 587.4986。
得られたBoc体（700mg, 1.19mmol) を酢酸エチル６０ｍｌに溶かし、4N-HCl/AcOEt (国産化学製;５ｍｌ) を加え、室温にて５時間攪拌した。反応完結後、溶媒を留去し、クロロホルム５０ｍｌを加え、減圧下溶媒を留去した。この操作を３回繰り返した。真空ポンプにて溶媒を完全に留去し、目的のアミノ体塩酸（６−２）を得た。質量分析結果：HRMS-ESI(m/z)：[M+H]+calcd.for C28H59O4N2, 487.4469; found, 487.4449 。【００７９】
【化２９】
0005561484.tif 000030
【００８０】
（２）  C18-PEG(1)によるAffi-Gelの修飾
実施例１に記載の方法で調製したカルボン酸樹脂(１−１２)（36μmol)にDMF１０ｍｌを加え、WSCD（7.5μl, 43.2μmol), HOBt (5.8mg, 43.2μmol)を加え室温にて３０分間攪拌した。化合物（１−１１）（18.6mg, 21.6μmol), C18-PEG(1)-NH2 (5.7mg, 10.8μmol), エタノールアミン(0.22mg, 3.6μmol), iPr2NEt (15μl, 86.4μmol)を加え、室温にて一昼夜攪拌した。樹脂をDMFにて洗浄後、引き続き２０％エタノール水溶液にて洗浄し、目的の固相担体：DAPT-PEG(2)+C18-PEG(1)（６−３）を得た。【００８１】
【化３０】
0005561484.tif 000031
（３）  C18-PEG(1)及びコレステロール-PEG(1)によるAffi-Gelの修飾
上記（２）と同様の方法で、カルボン酸樹脂(１−１２)（36μmol)にDMF１0ｍｌを加え、WSCD（7.5μl, 43.2μmol), HOBt (5.8mg, 43.2μmol)を加え室温にて３０分間攪拌した。化合物（１−１１）（18.6mg, 21.6μmol), 化合物（１−４）（2.4mg，3.6μmol）,C18-PEG(1)-NH2（６−２） (3.8mg,7.2μmol), エタノールアミン(0.22mg, 3.6μmol), iPr2NEt (15μl, 86.4μmol)を加え、室温にて一昼夜攪拌した。樹脂をDMFにて洗浄後、引き続き２０％エタノール水溶液にて洗浄し、目的の固相担体：DAPT-PEG(2)+C18-PEG(1)+コレステロール-PEG(1)（６−４）を得た。【００８２】
【化３１】
0005561484.tif 000032
【００８３】
実施例７
コレステロール以外のキャッピング剤の効果を検討した。
すなわち、６０％ＤＡＰＴ−ＰＥＧ（２）にキャッピング剤であるＣ１８−ＰＥＧ（１）、又はコレステロール−ＰＥＧ（１）及びＣ１８−ＰＥＧ（１）を導入した樹脂を作成し、γ−セクレターゼの結合量を解析した。
実施例６で調製したアフィニティー樹脂（６−３）（4.8μmol相当)を正確にはかり取り、実施例３と同様の方法で得られたラット脳ライゼート（200μl)と示された結合条件（温度・時間）で結合実験を実施した。結合実験終了後、樹脂を１２，０００ｘｇにて遠心分離し、上澄みを捨て、残された樹脂をbufferB  (20mM Hepse pH7.5, 50mM KCl, 2mM EGTA+  protease  inhibitor,  0.5%CHAPSO) ８００μl にて３回（１５分ｘ３）洗浄した。樹脂にSDS用ローディングバッファー（nakalai cat. No; 30566-22, 2-ME(2-メルカプトエタノール）含有電気泳動サンプルバッファー溶液（２ｘ））４０μlを加え、９０℃にて３分間インキュベーションした。こうして得られたサンプル液を市販のSDSゲル（BioRad  ready Gel J, 5-20%SDS, cat. No; 161-J371V)で分離した。
ウエスタンブロッティング
SDS-PAGEによって分離した蛋白質をPVDF Membrane Filter Paper Sandwich 0.2um Pore Size, 20/pk.(invitrogen cat. No; LC2002)へトランスファーした。PVDF膜をトレーに移し、ブロッキング剤であるBlocking One (nakalai)を50ｍｌ加え、室温にて１時間振とうした。TBS-Tにて３回洗浄した（１０分ｘ３）。１次抗体をCan Get Signal Solution 1 (TOYOBO, cat. No;NKB-101)にて希釈し、室温にて１時間振とうした。TBS-Tにて３回洗浄した（１０分ｘ３）。 ２次抗体をCan Get Signal Solution ２ (TOYOBO, cat. No;NKB-101)にて希釈し、室温にて１時間インキュベーションした。TBS-Tにて３回洗浄した（１０分ｘ３）。検出試薬はECL Plus western Blotting Detection System (GE Healthcare cat. No;RPN2132)を用いて行った。検出装置としてルミノ・イメージアナライザーLAS-1000（富士フィルム）を用いて検出した。
カルボン酸樹脂（1−12）上のカルボキシル基に対し、１００％でＤＡＰＴがポリエチレングリコールを介して固定化されている固相担体、カルボン酸樹脂（１−１２）上のカルボキシル基に対し、３０％でステアリン酸が固定化されている固相担体及びカルボン酸樹脂（１−１２）上のカルボキシル基
に対し、３０％でコレステロールが固定化されている固相担体にはγ−セクレターゼが全く結合できなかった。一方、カルボン酸樹脂（１−１２）上のカルボキシル基に対し、６０％でＤＡＰＴがポリエチレングリコールを介して固定化され、かつ30％もしくは20%のコレステロールが固定化されている固相担体、30%もしくは20%のステアリン酸が固定化されている固相担体、並びに10%のコレステロール及び10%ステアリン酸が固定化されている固相担体にはγ−セクレターゼの４種類（Nct, PS1（PS1-NTF,PS1-CTF), Aph-1, Pen2）の構成成分が結合した。【００８４】
実施例８
キャッピング剤であるコレステロール−ＰＥＧ（１）を固定化し、リンカーの長さが異なるＤＡＰＴをそれぞれ固定化したアフィニティー樹脂を用い、特異的結合γ−セクレターゼを解析した。
実施例２で調整したアフィニティー樹脂（１−２１）（4.8μmol相当)を正確にはかり取り、実施例３と同様の方法で得られたラット脳ライゼート（200μl)と示された結合条件（温度・時間）で結合実験を実施した。拮抗（+）はあらかじめLysateに１００ｍM DAPT ０．２μl加え（最終濃度 100μM)、各実験温度にて３０分間インキュベーションした後、結合実験に用いた。結合実験終了後、樹脂を１２，０００ｘｇにて遠心分離し、上澄みを捨て、残された樹脂をbufferB  (20mM Hepse pH7.5, 50mM KCl, 2mM EGTA+  protease  inhibitor,  0.5%CHAPSO) ８００μl にて３回（１５分ｘ３）洗浄した。樹脂にSDS用ローディングバッファー（nakalai cat. No; 30566-22, 2-ME(2-メルカプトエタノール）含有電気泳動サンプルバッファー溶液（２ｘ））４０μlを加え、９０℃にて３分間インキュベーションした。こうして得られたサンプル液を市販のSDSゲル（BioRad  ready Gel J, 5-20%SDS, cat. No; 161-J371V)で分離した。
ウエスタンブロッティング
SDS-PAGEによって分離した蛋白質をPVDF Membrane Filter Paper Sandwich 0.2um Pore Size, 20/pk.(invitrogen cat. No; LC2002)へトランスファーした。PVDF膜をトレーに移し、ブロッキング剤であるBlocking One (nakalai)を５０ｍｌ加え、室温にて１時間振とうした。TBS-Tにて３回洗浄した（１０分ｘ３）。１次抗体をCan Get Signal Solution 1 (TOYOBO, cat. No;NKB-101)にて希釈し、室温にて１時間振とうした。TBS-Tにて３回洗浄した（１０分ｘ３）。 ２次抗体をCan Get Signal Solution ２ (TOYOBO, cat. No;NKB-101)にて希釈し、室温にて１時間インキュベーションした。TBS-Tにて３回洗浄した（１０分ｘ３）。検出試薬はECL Plus western Blotting Detection System (GE Healthcare cat. No;RPN2132)を用いて行った。検出装置としてルミノ・イメージアナライザーLAS-1000（富士フィルム）を用いて検出した。
図５に示すとおり、親水性樹脂及びＤＡＰＴの間のポリエチレングリコール部分の長さが長い程、γ−セクレターゼの構成成分が良好に結合している（レーン３、５及び７）。一方、親水性樹脂及びＤＡＰＴの間にポリエチレングリコールを含まない固相担体（レーン１）では、ＰＳ−１（Ｃ末端を認識する抗体で検出したもの）及びＰｅｎ−２の結合量が十分でないことがわかった。【００８５】
実施例９
実施例２と同様の方法で、以下の固相担体を製造した。【００８６】
【化３２】
0005561484.tif 000033
【００８７】
実施例１０
DAPT(式（１−５）で表される化合物）の代わりに、カラゾロール(Carazolol; Life Sci. 1979, 24(24), 2255-64を参照）：
【化３３】
0005561484.tif 000034
をリガンドとして有するアフィニティークロマトグラフィー用担体を製造すべく、
式（１０−６）で表される化合物を製造した。
【化３４】
0005561484.tif 000035
【化３５】
0005561484.tif 000036
４−グリシジルオキシカルバゾール（化合物（１０−１）；東京化成；Cat. No, G0296; 976mg, 4.08mmol)と（２−アミノ−２−メチルプロピル）−カルバミックアシッドｔブチルエステル（化合物（１０−２）；Prime Organics. Inc;852mg, 4.53mmol)を１−ブタノール２ｍｌに加え９０℃にて５時間加熱還流した。１−ブタノールを留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。目的のBoc体（化合物（１０−３）；１．２６３g）を収率７２．４％にて得た。HRMS-ESI(m/z): [M+H]+calcd.for C24H33N3O4, 428.2544; found, 428.2541.
得られたBoc体（1.185g, 2.77mmol)をクロロホルム３０ｍｌに溶かし、4M(N)-HCl/AcOEt (国産化学製；５ｍｌ）を加え、室温にて６時間攪拌した。反応完結後、溶媒を留去し、クロロホルム３０ｍｌを加え、減圧下溶媒を留去した。この操作を３回繰り返した。真空ポンプにて溶媒を完全に留去し、目的のアミノ体塩酸塩(１０−４)を定量的に得た。
HRMS-ESI(m/z):[M+H]+calcd.for C19H25N3O2, 328.2020; found, 328.2018.
N-t-Boc-amido-d-PEG4TM-acid (化合物（１−９）；QUANTA BIODESIGN; 500mg, 1.37mmol)と得られたアミノ体塩酸塩（化合物（１０−４）；548mg,1.37mmol)をDMF３ｍｌに加え窒素気流下４℃にて攪拌した。HATU（572mg, 1.51mmol), ジイソプロピルエチルアミン（107μl, 2.736mmol)を加え、窒素気流下、４℃にて１時間攪拌した。クロロホルム１００ｍｌを加え、水５０ｍｌ、飽和食塩水５０ｍｌにて有機層を洗浄した。無水硫酸マグネシウムにて有機層を乾燥し、減圧濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的のBoc体（化合物（１０−５）；359mｇ）を収率38.9％にて得た。
HRMS-ESI(m/z): [M+H]+calcd.for C35H54N4O9, 675.3964; found, 675.3960.
得られたBoc体（１０−５）（302mg, 0.45mmol)をクロロホルム３０ｍｌに溶かし、4M(N)-HCl/AcOEt (国産化学製；５ｍｌ）を加え、室温にて６時間攪拌した。反応完結後、溶媒を留去し、クロロホルム３０ｍｌを加え、減圧下溶媒を留去した。
この操作を３回繰り返した。真空ポンプにて溶媒を完全に留去し、目的のアミノ体塩酸塩（化合物（１０−６））を定量的に得た。HRMS-ESI(m/z): [M+H]+calcd.for C30H46N4O7, 575.3439; found, 575.3440.
実施例１１【００８８】
実施例４と同様の方法で、実施例４における化合物（１−８）の代わりに実施例１０で得られた化合物（１０−６）を用いて、アフィニティーカラムクロマトグラフィー用担体を製造した。
すなわち、以下の式（１１−１）で表される固相担体（Carazolol-PEG(1)-Chole-PEG(1）を製造した。
式（１１−１）： 【００８９】
【化３６】
0005561484.tif 000037
Affi-Gel 102Gel (BIO-RAD, cat. No; 153-2401) 12ml（144μmol) をDMFにて置換し、無水コハク酸（28.8mg, 288μmol)、iPr2NEt (75μl, 432μmol)を加え、室温にて一昼夜攪拌した。樹脂をDMFにて洗浄後、ニンヒドリンテストを行い、定量的に目的のカルボン酸体 (１−１２)が得られたのを確認した。引き続き、樹脂を２０％無水酢酸DMF溶液にて３０分間室温で攪拌した。得られたカルボン酸樹脂(１−１２)（36μmol)にDMF１０ｍｌを加え、アミノ体塩酸塩（１０−６）（14mg, 21.6μmol）,（化合物（１−４）(7.2mg, 10.8μmol), エタノールアミン(0.22mg, 3.6μmol),HATU(15mg, 39.6μmol), iPr2NEt (22.5μl, 129.6μmol)を加え、室温にて一昼夜攪拌した。樹脂をDMFにて洗浄後、引き続き２０％エタノール水溶液にて洗浄し、目的の固相担体：Carazolol-PEG(1)+コレステロール-PEG(1)（式(11-1)）を得た。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明のアガロース系固相担体は、医薬品又は医薬品候補化合物の作用機序を解明する上で重要な、特異的結合蛋白質、詳しくは受容体等の膜結合型蛋白質を単離、精製、同定するために有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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