(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アレルギー性気道炎症及び／又は気道過敏症の発症予測を目的とした、ＣＤ４陽性ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞を検出する方法。
【請求項２】
ＩＬ−１７ＲＢの細胞外領域とヒトＩｇＧ１のＦｃ領域とを結合させたＩＬ−１７ＲＢ組換え体によって免疫されたヒト以外の哺乳動物から単離したリンパ球又は脾臓細胞とミエローマ細胞株との融合細胞であって、その培養上清がＩＬ−１７ＲＢと特異的に反応するハイブリドーマにより産生され、ＩＬ−１７ＲＢを特異的に認識するモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
以下の工程を含む、アレルギー性気道炎症及び／又は気道過敏症の治療薬のスクリーニング方法：
ＣＤ４陽性ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞にＩＬ−１７ＲＢのリガンドの存在下、試験化合物を接触させる工程（工程１）、
試験化合物を接触させたＣＤ４陽性ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞と試験化合物を接触させていないＣＤ４陽性ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞との、そのＴｈ２細胞様の機能を測定し、その結果を比較する工程（工程２）、及び
有意にＴｈ２細胞様の機能を抑制した試験化合物をアレルギー性気道炎症及び／又は気道過敏症の治療薬として選抜する工程（工程３）。
【請求項４】
Ｔｈ２細胞様の機能が、リガンド刺激依存性のＴｈ２サイトカイン・ケモカイン産生能である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
Ｔｈ２サイトカイン・ケモカインが、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＴＡＲＣ／ＣＣＬ１７及びＭＤＣ／ＣＣＬ２２からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
以下の工程を含む、アレルギー性気道炎症及び／又は気道過敏症の治療薬のスクリーニング方法：
ＣＤ４陽性ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞を有するヒト以外の哺乳動物にＩＬ−１７ＲＢのリガンドの存在下、試験化合物を投与する工程（工程１）、
試験化合物を投与した哺乳動物と、試験化合物を投与していない哺乳動物との、そのＴｈ２細胞様の機能を測定し、その結果を比較する工程（工程２）、及び
有意にＴｈ２細胞様の機能を抑制した試験化合物をアレルギー性気道炎症及び／又は気道過敏症の治療薬として選抜する工程（工程３）。
【請求項７】
Ｔｈ２細胞様の機能が、リガンド刺激依存性の気道抵抗の上昇である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
リガンドが、ＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５である、請求項３〜７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規なアレルギー性気道炎症及び／又は気道過敏症の治療薬のスクリーニング方法に関する。より詳細には、ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞のＴｈ２細胞様の機能を測定することを含むアレルギー性気道炎症及び／又は気道過敏症の治療薬のスクリーニング方法ならびにＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞のＴｈ２細胞様の機能を阻害又は除去し得る物質を有効成分として含有するアレルギー性気道炎症及び／又は気道過敏症の治療薬等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＬ−１７は１９９３年にマウスのＴ細胞ハイブリドーマからクローニングされ、１９９５年には、このタンパク質にＮＦ−κＢの活性化能やＩＬ−６誘導能があることが示されたサイトカインの１種である。ＩＬ−１７は分子量２０〜３０ｋＤのペプチドからなるホモダイマーの糖蛋白質であり、現在、ＩＬ−１７（ＩＬ−１７Ａとも呼ぶ）以外に、相同性を持つ６個のファミリー分子（ＩＬ−１７、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−２５（ＩＬ−１７Ｅ）、ＩＬ−１７Ｆ）からなることが知られている。ＩＬ−１７は主に活性化Ｔ細胞（Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞）より産生され、線維芽細胞や上皮細胞、血管内皮細胞、マクロファージ等種々の細胞に作用して、炎症性サイトカインやケモカイン、細胞接着因子等、種々の因子を誘導して炎症を誘導することが知られている。
ＩＬ−１７が主に活性化Ｔ細胞から産生されるのに対し、ＩＬ−１７レセプター（以下、ＩＬ−１７Ｒとも称する）は種々の細胞で構成的に発現している。リガンドと同様にレセプターもファミリー（ＩＬ−１７ＲＡ、ＩＬ−１７ＲＢ、ＩＬ−１７ＲＣ、ＩＬ−１７ＲＤ、ＩＬ−１７ＲＥ）を形成していることが知られている。【０００３】
気管支喘息等のアレルギー性気道炎症は、Ｔｈ２細胞、好酸球、好中球、肥満細胞、好塩基球等の炎症局所へ浸潤した血球系細胞と、血管内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞等の組織細胞との相互作用により惹起される。Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＴＡＲＣ／ＣＣＬ１７、ＭＤＣ／ＣＣＬ２２等のＴｈ２サイトカイン・ケモカインを産生し、ＩｇＥ産生、好酸球の活性化、気道上皮細胞からの粘液や他のサイトカイン・ケモカインの産生、血管内皮細胞上の接着分子の発現の誘導により、アレルギー性気道炎症の惹起に中心的な役割を果たしている。
近年、新たなＴｈ２細胞サイトカインとしてＩＬ−１７ファミリーに属するＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５が同定された（非特許文献１、２）。ＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５はＩＬ−１７ＲＢのリガンドであり、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３等のＴｈ２サイトカインの産生を誘導し、気道過敏症や喘息の惹起あるいは増悪をもたらす役割を担っているものと考えられている（非特許文献５〜７）。しかしながら、その標的となるＴｈ２サイトカイン産生細胞の詳細、特に特定のサブセットを有する細胞がアレルギー性気道炎症や気道過敏症へのＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５の関与に重要であるということは明らかにされていない。【０００４】
ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞は抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の抗原提示分子ＣＤ１ｄに提示されたスフィンゴ糖脂質をリガンドとして認識・活性化され、Ｔｈ１／２両方のサイトカインの産生、細胞障害活性を誘導し、特に抗腫瘍に重要な機能発現をもたらすことが知られている。ＮＫＴ細胞は上記のような多機能性を有することから種々の病態の寛解に関与する一方で、増悪に関与するケースが報告されている。特に喘息の発症及び増悪においてはＮＫＴ細胞の活性化がその引き金となっていることが報告されている（非特許文献３、４）。また、喘息の治療には、主に吸入ステロイドを用いた対処療法が行われているが、ステロイド非感受性の喘息患者がいることが知られており、多くの場合、ＮＫＴ細胞が増悪に関与しているケースと相関があるとの報告がある（非特許文献４）。
しかしながら、ＮＫＴ細胞の特定のサブセットが喘息への関与に重要であることは知られていない。
【非特許文献１】Lee J., et al.IL-17E, a novel proinflammatoryligand for the IL-17 receptor homolog IL-17Rh1. J Biol Chem. 2001 Jan 12;276(2):1660-1664.
【非特許文献２】Fort M.M., et al. IL-25 induces IL-4, IL-5, and IL-13 and Th2-associated pathologies in vivo. Immunity. 2001 Dec;15(6):985-995.
【非特許文献３】Akbari O., et al. Essential role of NKT cells producing IL-4 and IL-13 in the development of allergen-induced airway hyperreactivity. Nat Med. 2003 May;9(5):582-588.
【非特許文献４】Umetsu D.T., DeKruyff R.H. A role for natural killer T cells in asthma. Nat Rev Immunol.2006 Dec;6(12):953-8.
【非特許文献５】Angkasekwinai P., et al. Interleukin 25 promotes the initiation of proallergictype 2 responses. J Exp Med. 2007 Jul 9;204(7):1509-17.
【非特許文献６】Wang Y.H., et al. IL-25 augments type 2 immune responses by enhancing the expansion and functions of TSLP-DC-activated Th2 memory cells. J Exp Med. 2007 Aug 6;204(8):1837-47.
【非特許文献７】Ballantyne S.J., et al. Blocking IL-25 prevents airway hyperresponsivenessin allergic asthma. J Allergy Clin Immunol.2007 Sep 20.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、アレルギー性気道炎症及び／又は気道過敏症の治療薬を得る為のスクリーニング方法、新規な作用機序を有するアレルギー性気道炎症及び／又は気道過敏症の治療薬、ならびにそれらを開発し得る種々の手段等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討を行った結果、未刺激のＮＫＴ細胞（定常状態のＮＫＴ細胞）の一部にＩＬ−１７ＲＢの特異的な発現が見られることを、抗ＩＬ−１７ＲＢモノクローナル抗体を用いて確認し、さらに、そのＩＬ−１７ＲＢ陽性のＮＫＴ細胞が活性化されることによりＴｈ２細胞様の機能を示すようになり、喘息の誘導に深く寄与していることを見出した。さらにＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞のＴｈ２細胞様の機能に及ぼす影響を調べることによってアレルギー性気道炎症及び／又は気道過敏症の治療薬のスクリーニング方法を実施し得ることを見出して本発明を完成した。すなわち本発明は以下の通りである。【０００７】
［１］ＩＬ−１７ＲＢの細胞外領域とヒトＩｇＧ１のＦｃ領域とを結合させたＩＬ−１７ＲＢ組換え体によって免疫されたヒト以外の哺乳動物から単離したリンパ球又は脾臓細胞とミエローマ細胞株との融合細胞であって、その培養上清がＩＬ−１７ＲＢと特異的に反応するハイブリドーマ。
［２］上記［１］に記載のハイブリドーマにより産生され、ＩＬ−１７ＲＢを特異的に認識するモノクローナル抗体。
［３］上記［２］に記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、ＩＬ−１７ＲＢ陽性細胞を検出する方法。
［４］定常状態においてはＩＬ−１７ＲＢ陽性細胞がＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞である、上記［３］記載の方法。
［５］上記［２］に記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、ＩＬ−１７ＲＢ陽性細胞を他のリンパ球系細胞から分離する方法。
［６］定常状態においてはＩＬ−１７ＲＢ陽性細胞がＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞である、上記［５］記載の方法。
［７］ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞のＴｈ２細胞様の機能を測定する工程を含む、アレルギー性気道炎症及び／又は気道過敏症の治療薬のスクリーニング方法。
［８］以下の工程を含む、アレルギー性気道炎症及び／又は気道過敏症の治療薬のスクリーニング方法：
ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞にＩＬ−１７ＲＢのリガンドの存在下、試験化合物を接触させる工程（工程１）、
試験化合物を接触させたＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞と試験化合物を接触させていないＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞との、そのＴｈ２細胞様の機能を測定し、その結果を比較する工程（工程２）、及び
有意にＴｈ２細胞様の機能を抑制した試験化合物をアレルギー性気道炎症及び／又は気道過敏症の治療薬として選抜する工程（工程３）。
［９］Ｔｈ２細胞様の機能が、リガンド刺激依存性のＴｈ２サイトカイン・ケモカイン産生能である、上記［８］記載の方法。
［１０］Ｔｈ２サイトカイン・ケモカインが、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＴＡＲＣ／ＣＣＬ１７及びＭＤＣ／ＣＣＬ２２からなる群から選択される少なくとも１種である、上記［９］記載の方法。【０００８】
［１１］以下の工程を含む、アレルギー性気道炎症及び／又は気道過敏症の治療薬のスクリーニング方法：
ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞を有するヒト以外の哺乳動物にＩＬ−１７ＲＢのリガンドの存在下、試験化合物を投与する工程（工程１）、
試験化合物を投与した哺乳動物と、試験化合物を投与していない哺乳動物との、そのＴｈ２細胞様の機能を測定し、その結果を比較する工程（工程２）、及び
有意にＴｈ２細胞様の機能を抑制した試験化合物をアレルギー性気道炎症及び／又は気道過敏症の治療薬として選抜する工程（工程３）。
［１２］Ｔｈ２細胞様の機能が、リガンド刺激依存性の気道抵抗の上昇である、上記［１１］記載の方法。
［１３］リガンドが、ＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５である、上記［８］〜［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞のＴｈ２細胞様の機能を阻害又は除去し得る物質を有効成分として含有する、アレルギー性気道炎症及び／又は気道過敏症の治療薬。
［１５］ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞のＴｈ２細胞様の機能を阻害又は除去し得る物質を有効成分として含有する、好酸球増加症の治療薬。
［１６］ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞のＴｈ２細胞様の機能を阻害又は除去し得る物質が、ＩＬ−１７ＲＢに対するアンタゴニスティック抗体並びに低分子阻害剤、ＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５に対する抗体及びＩＬ−１７ＲＢの可溶化型分子からなる群から選択される少なくとも１種である、上記［１４］記載のアレルギー性気道炎症及び／又は気道過敏症の治療薬。
［１７］ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞のＴｈ２細胞様の機能を阻害又は除去し得る物質が、ＩＬ−１７ＲＢに対するアンタゴニスティック抗体並びに低分子阻害剤、ＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５に対する抗体及びＩＬ−１７ＲＢの可溶化型分子からなる群から選択される少なくとも１種である、上記［１５］記載の好酸球増加症の治療薬。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、ＩＬ−１７ＲＢ陽性細胞あるいはＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞を選択的に検出することができる。また、ＩＬ−１７ＲＢ陽性細胞あるいはＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞を他のリンパ球系細胞から選択的に高い純度で分離することができる。さらに活性化されたＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞はその機能解析の結果からＴｈ２細胞様の機能を有し、リガンドであるＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５の刺激により大量のＩＬ−１３等のＴｈ２サイトカインを産生することから、気道過敏症あるいはアレルギー性気道炎症の増悪に中心的な役割を担っているものと考えられる。これまで、喘息等のアレルギー疾患に関しては、ステロイドを用いた対処療法が施されてきたが、ステロイド不応答性であるケースも知られており、ＮＫＴ細胞が増悪に関与している場合との相関性が指摘されている。これらの結果から、ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞の機能を阻害あるいは除去することで免疫応答を制御し得ることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＩＬ−１７ＲＢのハイドロパシープロット解析の結果を示す図である。
【図２】可溶化型ＩＬ−１７ＲＢ−Ｉｇ組換え体の発現と精製を示す図である。
【図３】ＩＬ−１７ＲＢ特異的モノクローナル抗体（Ｂ５Ｆ６Ｃ１１、３Ｈ８Ｅ９）の、ＩＬ−１７ＲＢ強制発現細胞株への反応性を示す図である。
【図４】ＩＬ−１７ＲＢがＮＫＴ細胞に特異的に発現することを示した図である。
【図５】ＩＬ−１７ＲＢがＴｈ２優位マウスのＮＫＴ細胞に発現することを示した図である。Ｔｈ１優位マウスのＮＫＴ細胞には発現していない。
【図６】ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞の各臓器における存在様式を調べた結果を示す図である。ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞は肺に多く存在している。
【図７】ＩＬ−１７ＲＢがＣＤ４陽性のＮＫＴ細胞に発現することを示した図である。
【図８】ＮＫＴ細胞サブセットの表面マーカーの発現プロファイルを調べた結果を示す図である。
【図９】ＮＫＴ細胞サブセットの遺伝子の発現プロファイルを調べた結果を示す図である。
【図１０】ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞がリガンド依存的に増殖することを示した図である。
【図１１】ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞がリガンド依存的に大量のＴｈ２サイトカイン・ケモカインを産生することを示した図である。
【図１２】リガンドの投与によりＮＫＴ細胞依存的に気道抵抗値が上昇することを示した図である。
【図１３】リガンド投与によりＮＫＴ細胞依存的にＩＬ−１３が産生されることを示した図である。
【図１４】各種細胞におけるＩＬ−１７ＲＢの発現様式について解析した結果を示す図である。図１４ａは、腸管膜リンパ節のｃ−ｋｉｔ陽性非Ｂ非Ｔ細胞におけるＩＬ−１７ＲＢの発現を、図１４ｂは、脾臓細胞の各サブセットにおけるＩＬ−１７ＲＢの発現を、図１４ｃは、肺単核球の各サブセットにおけるＩＬ−１７ＲＢの発現を示している。
【図１５】ＮＫＴ細胞サブセットの遺伝子（ＩＬ−１７／ＩＬ−１７Ａ、ＲＯＲγｔ）の発現プロファイルを調べた結果を示す図である。
【図１６】ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞がリガンド依存的に大量のｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ−Ｌ（ＥＣＦ−Ｌ）を産生することを示した図である。
【図１７】リガンド依存的な気道過敏症発症におけるＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞の役割を解明するために行った実験のプロトコルを示す図である。
【図１８】ＮＫＴ細胞欠損マウスでは、リガンド投与による気道抵抗値の上昇が抑制されていることを示す図である。
【図１９】ＮＫＴ細胞欠損マウスでは、リガンド投与による肺胞液中への細胞浸潤が抑制されていることを示す図である。
【図２０】ＮＫＴ細胞欠損マウスでは、リガンド投与によるＩＬ−４及びＩＬ−５産生が抑制されていることを示す図である。
【図２１】リガンドの投与による好酸球や好中球の浸潤（図２１ａ）及びムチン粘液過剰産生（図２１ｂ）について調べた結果を示す図である。Ｂａｌｂ／ｃマウス（ＷＴ）あるいはＮＫＴ欠損マウス（Ｊα１８−／−）について調べた。
【図２２】抗ＩＬ−１７ＲＢ抗体でＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞を除去することによって、リガンドの投与による気道抵抗値の上昇を抑制し得ることを示した図である。図２２ａはＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞が除去されていることを確認した図であり、図２２ｂは気道抵抗値の測定結果を示した図である。
【図２３】ＮＫＴ細胞欠損マウスにＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞を移入することにより、リガンドの投与による気道抵抗値の上昇が確認されたことを示す図である。
【図２４】ＲＳＶ感染マウスの肺胞洗浄液中のＩＬ−２５、ＩＬ−６、ＩＬ−４あるいはＩＬ−１３の濃度を測定した結果を示す図である。
【図２５】ＲＳＶ感染によりＮＫＴ細胞が肺胞液中に浸潤することを示した図である。
【図２６】ＲＳＶ依存的な気道過敏症発症におけるＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞の関与を解析するためのプロトコルを示す図である。
【図２７】ＲＳＶ依存的な気道過敏症発症におけるＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞の関与を示す図である。図２７ａは、リガンド投与による気道抵抗値の上昇について調べた結果を示す。図２７ｂは、リガンド投与による肺胞液中への細胞浸潤について調べた結果を示す。
【図２８】ＲＳＶ依存的な気道過敏症発症におけるＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞の関与を示す図である。図２８ａは、リガンド投与による肺胞液中への好酸球・好中球の浸潤を、図２８ｂは、リガンド投与によるムチン過剰産生を、それぞれ調べた結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと同様又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及したすべての刊行物及び特許は、例えば、記載された発明に関連して使用されうる刊行物に記載されている、構築物及び方法論を記載及び開示する目的で、参照として本明細書に組み入れられる。【００１２】
本明細書中で使用するＩＬ−１７ＲＢに対する抗体ならびに本発明のＩＬ−１７ＲＢを特異的に認識するモノクローナル抗体（以下、便宜上両者をあわせて本発明の抗体とも称する）は、本発明の抗体がＩＬ−１７ＲＢ分子のみが有するエピトープと免疫学的に交差反応し、他のファミリーのタンパク質と交差反応しないことを意味する。このようなエピトープは、例えばＩＬ−１７ＲＢのアミノ酸配列と他のタンパク質のアミノ酸配列とを整列比較することによって、本質的に異なる配列部分（連続する少なくとも５アミノ酸、好ましくは少なくとも８アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１５アミノ酸）を選択することによって決定できる。【００１３】
目的の抗体を得るための抗原エピトープは、ＩＬ−１７ＲＢのアミノ酸配列（推定アミノ酸配列を配列番号２に、塩基配列を配列番号１に示す）において抗原性の高い領域、表在性がある領域、二次構造をとらない可能性のある領域、他のタンパク質（特にＩＬ−１７ＲＢが属するファミリーの他のタンパク質）と相同性がないか又は低い領域から選択されうる。ここで「相同性」という用語は、２つ以上のアミノ酸配列または塩基配列間での配列の同一性または類似性を意味し、配列は例えば対角線図形法や頻度分布法等を含む慣用的方法で比較しうる。抗原性の高い領域は、Ｐａｒｋｅｒらの方法［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５巻、５４２５−５４３２頁（１９８６年）］によって推定可能である。表在性がある領域は、例えばハイドロパシーインデックスを計算しプロットすることによって推定可能である。二次構造をとらない可能性のある領域は、例えば、ＣｈｏｕとＦａｓｍａｎの方法［Ａｄｖ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  Ｒｅｌａｔ．  Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、４７巻  ４５−１４８頁（１９７８年）］によって推定可能である。さらに、特にＩＬ−１７ＲＢが属する他のタンパク質とホモロジーがないか又は低い領域は、ＩＬ−１７ＲＢのアミノ酸配列と他のタンパク質のアミノ酸配列との相同性比較によって推定可能である。【００１４】
上記の手法で推定された抗原エピトープとして機能し得るＩＬ−１７ＲＢの部分アミノ酸配列を基に、ペプチド合成法を利用することによって該アミノ酸配列からなるペプチドを合成することができる。目的のペプチドは、例えば、Ｒ．Ｂ．  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ［Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３２巻、３４１−３４７頁（１９８６年）］によって開発された固相ペプチド合成に基いた市販のペプチド合成機を使用して合成し、保護基を脱離後、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等を単独もしくは組み合わせた方法により精製する。得られた精製ペプチドはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）やアルブミン等のキャリアタンパク質と結合し免疫原として使用することができる。【００１５】
さらに、遺伝子組換えＩＬ−１７ＲＢ（以下、便宜上ＩＬ−１７ＲＢ組換え体とも称する）を免疫原として用い、ＩＬ−１７ＲＢに対するポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体を公知の手法により作製することもできる。この場合、ＩＬ−１７ＲＢ、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、または他のタンパク質に関して用いられる「組換え」という用語は、これらのタンパク質が宿主細胞内で組換えＤＮＡによって生産されたものであることを意味する。当該組換え体は、上記した目的の抗体を得るための抗原エピトープ部分、すなわちＩＬ−１７ＲＢの部分アミノ酸配列をコードするものであってもよいし、該配列を含む限りＩＬ−１７ＲＢ全長のアミノ酸配列あるいは任意の部分アミノ酸配列をコードするものであってもよい。組換えＤＮＡは適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。【００１６】
好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいてＩＬ−１７ＲＢ組換え体をコードする遺伝子は、適当な転写／翻訳調節配列（例えば、プロモーター等）に機能的に連結されている。発現ベクターの種類としては、例えばプラスミド、ファージ、コスミド、ウイルス等が挙げられる。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。【００１７】
転写／翻訳調節配列には、使用する宿主／ベクター系に応じて選択されたプロモーターおよびエンハンサーを含めることができる。また、上記組換えＤＮＡは必要に応じて、適切なターミネーターに機能的に結合されてもよい。さらに当該組換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル（例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの）、転写エンハンサー配列（例えばＳＶ４０エンハンサー）等の要素を有していてもよい。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含むこともできる。【００１８】
当該組換えＤＮＡあるいは組換えベクターを適当な宿主に導入することによってＩＬ−１７ＲＢ組換え体を発現する形質転換体を作製することができる。ＤＮＡまたはベクターを導入される宿主細胞は、ＩＬ−１７ＲＢ組換え体を発現できれば任意の細胞を使用できる。宿主細胞としては、原核細胞、酵母類、動物細胞、真菌細胞、昆虫細胞又は植物細胞等が使用可能である。
原核細胞の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行なうことができる。酵母宿主へのベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。動物細胞へのベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる。【００１９】
形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞は適当な培養培地中で培養されて目的遺伝子を発現させ、産生したＩＬ−１７ＲＢ組換え体を培地中から、または宿主細胞中から回収する。細胞から回収する場合には、培養終了後、細胞を遠心分離等により分離し、水性緩衝液に懸濁し、音波処理、フレンチプレス、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。膜分子の単離精製は、タンパク質の精製に用いられる一般的方法、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー等のクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、電気泳動法、脱塩法、有機溶媒沈殿法等を任意に組み合わせて行うことができる。【００２０】
本発明の「抗体」はペプチド抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよい。「抗体」は、マウスまたは他の適した宿主動物を免疫に用いられたタンパク質に特異的に結合するであろう抗体を産生するか、産生するであろうリンパ球又は脾臓細胞を引き出すために、皮下、腹腔内、または筋肉内の経路によって、抗原あるいは抗原発現細胞により免疫化することによって得られる。抗原としては上記目的の抗体を得るための抗原エピトープや該エピトープを含む部分アミノ酸配列が挙げられ、抗原発現細胞としては、上記目的の抗体を得るための抗原エピトープや該エピトープを含む部分アミノ酸配列をコードする組換えＤＮＡで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞が挙げられる。さらに宿主動物としてはヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原または抗原発現細胞を投与し、所望のヒト抗体を取得してもよい［Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９７巻、７２２−７２７頁（２０００年）、国際公開ＷＯ９６／３３７３５、ＷＯ９７／０７６７１、ＷＯ９７／１３８５２、ＷＯ９８／３７７５７参照］。そのかわりに、リンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫化してもよい。宿主動物から得られた血清から、抗原に結合する画分を集め、精製することにより、ポリクローナル抗体を取得することができる。また、ハイブリドーマ細胞を形成するために、ポリエチレングリコールのような適当な融合試薬を用いて、リンパ球又は脾臓細胞をミエローマ細胞株と融合させることにより、モノクローナル抗体を作製することができる（Ｇｏｄｉｎｇ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９−１０３頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ、１９８６年）。例えば本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法［Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻、４９５頁（１９７５年）］を用いても、組換えＤＮＡ法（Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４８１６５６７号）を用いても作製することができる。【００２１】
抗原タンパク質はＩＬ−１７ＲＢのタンパク質の全てまたは部分配列をコードするＤＮＡを、大腸菌や酵母、昆虫細胞、動物細胞等で発現させることにより調製することができる。得られた抗原タンパク質は、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等を単独もしくは組み合わせた方法により精製し、この精製標品を免疫原として用いる。【００２２】
また、本発明の抗体は、無傷の抗体であってもよいし、あるいは（Ｆａｂ’）２やＦａｂ等の抗体断片であってもよいし、単鎖抗体等の組換え抗体であってもよい。【００２３】
また、定常領域をヒトの定常領域に置き換えたキメラ抗体（例えばマウス−ヒトキメラ抗体；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許４８１６５６７及びＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻、６８５１頁  （１９８４年））、定常領域および超可変領域（または、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）を除く全ての可変領域をヒトの配列に置き換えたヒト化抗体（Ｃａｒｔｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻、４２８５頁、１９９２年及びＣａｒｔｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻、１６３頁、１９９２年）も本発明の抗体に含まれる。【００２４】
例えば、ＩＬ−１７ＲＢの細胞外ドメインと考えられる領域（例えば配列番号２のアミノ酸１位〜２８２位まで）とヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を結合させた組換え体を免疫原として用いることができる。該組換え体のアミノ酸配列を配列番号４に示す。本発明で用いる組換え体では、細胞表面上に存在するＦｃγ受容体に結合しないよう、３箇所のアミノ酸置換を行なった（配列番号４に示すアミノ酸配列中３０２位（Ｌｅｕ→Ａｌａ）、３０３位（Ｌｅｕ→Ｇｌｕ）、４６９位（Ｖａｌ→Ａｓｐ））。【００２５】
また、このようにして得られた本発明の抗体に対する抗体、すなわち抗イディオタイプ抗体もまた本発明に含まれる。【００２６】
このようにして得られたＩＬ−１７ＲＢに対する各種抗体は、その特徴を生かすことができる様々な用途に使用可能である。本抗体を蛍光性物質（ローダミン、フルオレサミン等）で標識し、周知のＦＡＣＳを用いて目的の、ＩＬ−１７ＲＢを発現している細胞（ＩＬ−１７ＲＢ陽性細胞）、特にＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞を検出・分離することができる。さらに種々の臓器におけるＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞の存在様式を知ることができる。またビオチンで標識し、フィコエリスリン等が結合したアビジンを用いても同様にＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞を検出・分離することができる。ここで分離とは、他の細胞、特にリンパ球系細胞、具体的にはＢ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、ＮＫ細胞、ＩＬ−１７ＲＢ陰性ＮＫＴ細胞、好中球、好酸球、好塩基球等の多型核白血球、マスト細胞等の免疫担当細胞、等からの分離を意味する。【００２７】
ＩＬ−１７ＲＢの検出に関しては、ＦＡＣＳでの検出にとどまるものではない。例えばウェスタンブロッティングにおいて本抗体を１次抗体として作用させることにより検出可能であることが予想されるし、タンパク質レベルでの発現確認を行うことができる。また本抗体を固相（ポリスチレンビーズ、マイクロタイターウエル表面、ラテックスビーズ等）に結合して不均一系で、あるいは均一系で、免疫学的反応を行って検出、定量（蛍光抗体法、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ等の方法を使用）することができる。この場合、免疫学的反応は競合反応であってもよいし非競合反応であってもよい。また２つ以上の抗体（モノクローンまたはポリクローン）を用いるサンドイッチ法による反応も使用できる。上記における検出、定量のためには、当業界で公知のいずれの免疫学的手法も用いることができる。【００２８】
ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞においてＩＬ−１７ＲＢリガンドの刺激により活性化されＴｈ２細胞様の機能が誘導されるようになることは、本発明において得られた知見である。
本発明において、ＩＬ−１７ＲＢ陽性細胞としては、活性化Ｔｈ２細胞、活性化好酸球等が挙げられる。また、定常状態では、ＩＬ−１７ＲＢ陽性細胞として、好ましくはＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞が挙げられる。ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞は、ＮＫＴ細胞の中でも特にＣＤ４陽性のＮＫＴ細胞に見られ、ＣＤ４陽性のＮＫＴ細胞のうち約１／３を占める。脾臓や胸腺、肺に多く見られる。ここで、「定常状態」とは、生体が健康な状態、特に喘息や潰瘍性大腸炎等のアレルギー疾患を有さない状態を示す。【００２９】
本発明は、ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞、特にリガンド刺激により活性化されたＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞のＴｈ２細胞様の機能を測定することを含む、アレルギー性気道炎症及び／又は気道過敏症の治療薬のスクリーニング方法を提供する。アレルギー性気道炎症とは、アレルギーの原因（例、ダニやハウスダスト等の環境性抗原）を吸い込んで気管支粘膜で免疫反応が起こり、ヒスタミン、ロイコトリエン、化学伝達物質が遊離され、マスト細胞、好酸球、好中球、リンパ球によるアレルギー性炎症反応が誘発されて生じる気道の炎症であり、喘息発作を伴う場合がある。気道過敏症では、非特異的な種々の刺激に反応して気管が収縮し、喘息発作を伴う。わずかな刺激でも気管が過剰に反応し、冷たい空気を吸ったり、急に走ったりするだけでも喘息発作が起こる場合がある。
本発明において「Ｔｈ２細胞様の機能」とは、液性免疫を制御するＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３等のサイトカインを産生し、Ｂ細胞の抗体産生を促進するヘルパーＴ細胞２型（Ｔｈ２細胞）と同等の機能を意味する。具体的には、活性化したＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞がＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＴＡＲＣ／ＣＣＬ１７、ＭＤＣ／ＣＣＬ２２等のサイトカイン・ケモカインを産生する能力、産生された種々のサイトカイン・ケモカインが発揮し得る種々の作用を意味する。
さらに、リガンド刺激により活性化されたＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞は、好酸球走化因子（ＥＣＦ−Ｌ）を産生し、ＩＬ−５産生性の好酸球を局所に呼び寄せる機能を有する。
ＩＬ−４（インターロイキン−４）は、活性化されたＣＤ４陽性Ｔ細胞（Ｔｈ２細胞）、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、マスト細胞（肥満細胞）、好塩基球、ＮＫＴ細胞から産生されるサイトカインの１種であり、Ｔｈ２細胞の増殖や分化を促進し、活性化されたＢ細胞に作用してＩｇＭから、ＩｇＧ１、ＩｇＥへのクラススイッチを促進させ、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＥ抗体の産生を促進する。また、マクロファージの活性化を抑制し、ＮＯ、プロスタグランジン（ＰＧＥ２）、ＩＦＮ−γの産生を抑制することが知られている。
ＩＬ−５（インターロイキン−５）は、主として活性化Ｔ細胞および肥満細胞より産生され、Ｂ細胞や好酸球の活性化、増殖・分化に重要な役割を演じるサイトカインである。また、ＩＬ−２共存下の細胞傷害性Ｔ細胞の生成促進や好塩基球のヒスタミン遊離の増強作用も明らかになっている。アレルギー性鼻炎、喘息、アトピー性皮膚炎のようなアレルギー疾患とＩＬ−５の関連を示唆する報告が多い。
ＩＬ−１３（インターロイキン−１３）は、喘息のエフェクター分子として作用し、例えば無感作動物にＩＬ−１３を投与するだけで気道過敏性、好酸球性炎症，粘膜異形成といったアレルギー性喘息に特徴的な症状を発現することが報告されている。
ＴＡＲＣ／ＣＣＬ１７及びＭＤＣ／ＣＣＬ２２は、ともにＣＣＲ４の特異的リガンドであり、Ｔｈ２細胞に発現しているケモカインである。
従ってＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞のＴｈ２細胞様の機能の測定としては、リガンド刺激依存性のＴｈ２サイトカイン・ケモカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＴＡＲＣ／ＣＣＬ１７、ＭＤＣ／ＣＣＬ２２等）を産生する能力の測定、リガンド刺激依存性の気道抵抗の上昇の有無の測定（ｉｎ  ｖｉｖｏでの測定）、これに付随して肺胞洗浄液中に含まれる免疫担当細胞、特に好酸球の数の測定、等が挙げられる。詳細な測定方法・測定手順については後述する。【００３０】
本スクリーニング方法で用いるＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞は、ＮＫＴ細胞を含有する細胞集団から上記した本発明の抗体を用いてＩＬ−１７ＲＢを発現しているＮＫＴ細胞を検出・分離して得ることができる。ＮＫＴ細胞は、その存在割合は少ないが免疫系で制御的な役割を担っているリンパ球の一種である。ＮＫＴ細胞はＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）とＮＫレセプターの２つの抗原レセプターを有する。ＮＫＴ細胞の由来は特に限定されず、ヒトを含む霊長類、げっ歯類、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ及びブタ等の哺乳動物の臍帯血、末梢血、肺、骨髄、脾臓、リンパ節、胸腺等から回収することができる。本明細書で用いる「霊長類」という用語は、サル、類人猿、及びヒトが含まれるがこれらに限定されない、哺乳類の群に属する、任意の動物を意味する。具体的には末梢血や肺、脾臓、胸腺のホモジネートから回収される単細胞の懸濁液を、ＮＫＴ細胞に高度に保持されたＴＣＲに認識され得る、ＣＤ１ｄ分子と結合したα−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ若しくはα−ＧＣ）のような抗原糖脂質を用いてＦＡＣＳ解析することによって選別、回収し、次いで上記したＩＬ−１７ＲＢに対する抗体（好ましくはモノクローナル抗体）を用いてＩＬ−１７ＲＢを発現しているＮＫＴ細胞のみを選別、回収する。あるいは、ＩＬ−１７ＲＢが定常状態にあるＮＫＴ細胞の一部に特異的に発現していることから、末梢血や肺、脾臓、胸腺のホモジネートから回収される単細胞の懸濁液、好ましくは脾臓由来の白血球から直接ＩＬ−１７ＲＢに対する抗体（好ましくはモノクローナル抗体）を用いてＩＬ−１７ＲＢ陽性のＮＫＴ細胞を選別、回収することもできる。【００３１】
本発明のアレルギー性気道炎症及び／又は気道過敏症の治療薬のスクリーニング方法の一態様（態様１）を以下に示す。
態様１
（工程１）ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞にＩＬ−１７ＲＢのリガンドの存在下、試験化合物を接触させる工程。
本工程で用いるＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞としては、上記したＩＬ−１７ＲＢに対する抗体（好ましくはモノクローナル抗体）で検出・分離した細胞が挙げられる。該ＮＫＴ細胞は好ましくはＡＰＣで活性化されているか、活性化される条件下で用いられる。具体的にはＡＰＣの共存下で本工程を実施する。本工程で用いるリガンドとしては、ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞に作用してＴｈ２細胞様の機能を誘導する、すなわちＴｈ２サイトカインやケモカインを産生させるような物質であれば特に限定されないが、ＩＬ−１７ＲＢのリガンドとして知られているＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５を用いることが好ましい。使用するリガンドの濃度は、ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞の増殖に不利に作用することのない、好ましくは増殖を促し、Ｔｈ２サイトカインやケモカインを産生させることが可能な範囲で適宜設定されるが、反応系の媒体となる培養液や緩衝液中、通常０．１〜１０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ程度である。ここで、当該リガンドは、リガンドがＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞に作用してＴｈ２サイトカインやケモカインを産生させるような状態で反応系に存在する限り、試験化合物とＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞との接触の前に反応系に添加されていても、接触の後に反応系に添加されていても、あるいは接触と同時に反応系に添加されるものであってもよい。
本明細書において「試験化合物」とは、ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞に作用してその機能を阻害あるいは除去することができるか否かを調べる目的で選択あるいは合成された化合物であり、新規な化合物以外に、既に別の作用を有することが報告されている既知化合物をも包含する。また組成物として用いてもよい。例えば、核酸（例、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）、糖質（例、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖）、脂質（例、飽和又は不飽和の直鎖、分岐鎖及び／又は環を含む脂肪酸）、アミノ酸、タンパク質（例、オリゴペプチド、ポリペプチド）、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリ、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリ、天然成分（例、微生物、動植物、海洋生物等由来の成分）、あるいは食品、飲料水等が挙げられる。本発明のスクリーニング方法によりＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞の機能を阻害あるいは除去する作用があると認められた化合物は、上述の如くアレルギー性気道炎症や気道過敏症への適用が期待される。
ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞の試験化合物との接触は、該試験化合物が、活性化されたＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞が有するＴｈ２サイトカイン・ケモカイン産生能に影響を及ぼすか否かを判定できる限り、その方法は特に限定されないが、簡便にはＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞及びその活性化物質（例えばリガンドや抗原提示細胞）を含有する細胞懸濁液等の反応系中、リガンドの存在下に所定の量で添加することによって実施される。試験化合物の添加量は、細胞の状況に応じて適宜設定されるが、通常、希釈系列を設定することが好ましい。接触に要する時間も、所望の効果が得られる範囲で適宜設定することができる。通常、２４〜１２０時間、好ましくは４８〜７２時間程度である。【００３２】
（工程２）試験化合物を接触させたＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞と試験化合物を接触させていないＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞との、そのＴｈ２細胞様の機能を測定し比較する工程。
ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）等によって活性化されていることが好ましい。かかるＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞をＩＬ−１７ＲＢのリガンド（例えばＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５）で刺激することによって、Ｔｈ２細胞様の機能が誘導される。Ｔｈ２細胞様の機能としては具体的にはＴｈ２サイトカイン・ケモカインの産生能が挙げられる。Ｔｈ２サイトカイン・ケモカインとしては上述の如き、ＩＬ−１３、ＩＬ−４、ＴＡＲＣ／ＣＣＬ１７、ＭＤＣ／ＣＣＬ２２等が挙げられる。これらサイトカイン・ケモカインの産生能は、通常、当分野で実施される方法、例えば各サイトカイン・ケモカインに対する抗体を用いたウェスタンブロットやＥＬＩＳＡ法、プローブを用いたノザンブロットやプライマーを用いた定量ＰＣＲ等によって測定することができる。各種抗体やプローブ、プライマーは、各サイトカイン・ケモカインのアミノ酸配列や遺伝子配列、あるいは精製方法等の既知の情報に基づいて適宜調製することができるか、商業的に入手可能なものである。【００３３】
（工程３）有意にＴｈ２細胞様の機能を抑制した試験化合物をアレルギー性気道炎症及び／又は気道過敏症の治療薬として選抜する工程。
工程２同様、Ｔｈ２細胞様の機能としてはＴｈ２サイトカイン・ケモカインの産生能が挙げられる。ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞が産生するＴｈ２サイトカイン・ケモカインは、気道過敏症あるいは喘息の増悪に中心的な役割を担っているものと考えられ、従って、上記工程２で得られた情報に基づいて選抜された、有意にＴｈ２細胞様の機能を抑制した、特にＴｈ２サイトカイン・ケモカイン産生を抑制した試験化合物は、アレルギー性気道炎症及び／又は気道過敏症の治療薬の候補となり得る。効果の有意性は、通常、当分野で実施している統計学的処理に基づいて有意差検定を行なうことにより決定することができる。【００３４】
さらに、本発明が提供するスクリーニング方法の別態様（態様２）を以下に示す。
態様２
（工程１）ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞を有するヒト以外の哺乳動物にＩＬ−１７ＲＢのリガンドの存在下、試験化合物を投与する工程（工程１）。
本工程で用いる、ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞を有するヒト以外の哺乳動物としては、ＩＬ−１７ＲＢのリガンド刺激依存性のＴｈ２サイトカイン・ケモカインの産生や、気道抵抗の上昇等の作用が認められるヒト以外の哺乳動物であれば特に限定されず、ヒト以外の霊長類、げっ歯類、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ及びブタ等の哺乳動物が挙げられる。それらの中でも特にＴｈ２優位であることが望ましい。例えばマウスであれば、Ｔｈ１優位として知られるＣ５７ＢＬ／６やＣ３Ｈ／ＨｅＮ系統よりは、Ｔｈ２優位として知られるＢａｌｂ／ｃやＤＢＡ／２ｃｒ系統のマウスが好ましく用いられる（実施例４参照）。ＩＬ−１７ＲＢのリガンド及び試験化合物としては、上記した本発明のスクリーニング方法の態様１で用いられるものと同様なものが挙げられる。
ＩＬ−１７ＲＢのリガンドの投与量は、ヒト以外の哺乳動物の体内に存在するＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞（好ましくは活性化された状態）に対して、リガンド刺激依存的にＴｈ２細胞様の機能を誘導する、すなわち、Ｔｈ２サイトカイン・ケモカイン（ＩＬ−１３、ＩＬ−４、ＴＡＲＣ／ＣＣＬ１７、ＭＤＣ／ＣＣＬ２２等）を産生させる、及び／又は気道収縮物質（メタコリン等）刺激による気道抵抗の上昇をもたらすような量であれば特に限定されないが、通常体重１ｋｇあたり１〜１００ｍｇ、好ましくは１〜１０ｍｇ程度である。上記したＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞のＴｈ２細胞様の機能が誘導され、該機能への試験化合物の影響が測定できれば、試験化合物及びリガンドを、ヒト以外の哺乳動物へ投与する順序は、特に制限されず、試験化合物の投与はリガンドの投与前であっても、リガンド投与後であっても構わない。また、アレルギー性気道炎症及び／又は気道過敏症の治療薬、特に喘息の治療薬として所望される作用点に応じて、適宜投与するタイミングが検討され得る。【００３５】
（工程２）試験化合物を投与した哺乳動物と、試験化合物を投与していない哺乳動物との、そのＴｈ２細胞様の機能を測定し、その結果を比較する工程。
本工程において「Ｔｈ２細胞様の機能」としては、上記本発明のスクリーニング方法の態様１で述べたものと同様なものが挙げられる。具体的にはリガンド刺激依存性のＴｈ２サイトカイン・ケモカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＴＡＲＣ／ＣＣＬ１７、ＭＤＣ／ＣＣＬ２２等）を産生する能力の測定、リガンド刺激依存性の気道抵抗の上昇の有無の測定、これに付随して肺胞洗浄液中に含まれる免疫担当細胞（特に好酸球）の数の測定等が挙げられる。リガンド刺激依存性のＴｈ２サイトカイン・ケモカインを産生する能力の測定は、上記本発明のスクリーニング方法の態様１で述べたものと同様な方法によって実施される。リガンド刺激依存性の気道抵抗の上昇の有無は、卵白アルブミン（ＯＶＡ）誘導性の気道炎症モデル（喘息モデル）を用いて測定することができる。ＯＶＡを用いた気道炎症モデルは、ＯＶＡ−ａｌｕｍで免疫後、ＯＶＡを吸入させて気道炎症を起こすものである。本発明では、このモデルを用いてＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞のＴｈ２細胞様機能を測定することを目的とするのでＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞のＴｈ２細胞様機能の誘導にはＩＬ−１７ＲＢのリガンドを用いる。該誘導により気管支周囲や血管周囲に好酸球性の浸潤が認められる。メタコリン等により気道収縮を起こしたときに非常に強く反応し、気道抵抗が上昇する。ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞のＴｈ２細胞様の機能はこの気道抵抗の上昇の程度に基づいて測定される。試験化合物がこの気道抵抗の上昇を抑制するか否かを測定することによって、試験化合物のアレルギー性気道炎症及び／又は気道過敏症の治療薬としての有用性を確認することができる。肺胞洗浄液中に含まれる免疫担当細胞（特に好酸球）の数の測定は、通常臨床試験の分野で実施されている方法を用いて行なうことができる。例えば好酸球はギムザ染色法により鑑別可能であり、肺胞洗浄液中の好酸球の数を測定し得る。あるいは好酸球特異的表面分子であるＣＣＲ３に注目し、ＣＣＲ３陽性の細胞を数えることで測定しうる。試験化合物が、例えば肺胞洗浄液中の好酸球数の増加を抑制するか否かを測定することによって、試験化合物のアレルギー性気道炎症及び／又は気道過敏症の治療薬としての有用性を確認することができる。【００３６】
（工程３）有意にＴｈ２細胞様の機能を抑制した試験化合物をアレルギー性気道炎症及び／又は気道過敏症の治療薬として選抜する工程。
本工程は、上記本発明のスクリーニング方法の態様１の工程３と同様にして実施することができる。【００３７】
本発明のスクリーニング方法では、好ましくは、陽性の対照化合物を用いることができる。陽性の対照化合物とは、ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞のＴｈ２細胞様の機能、すなわちリガンドでの刺激によりＴｈ２サイトカインやケモカインを産生する能力を抑制することがあらかじめわかっている化合物である。具体的には、ＩＬ−１７ＲＢに対するアンタゴニスティック抗体並びに低分子阻害剤、ＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５に対する抗体あるいはＩＬ−１７ＲＢの可溶型分子等が挙げられる。
ＩＬ−１７ＲＢに対するアンタゴニスティック抗体は、ターゲット抗原であるＩＬ−１７ＲＢに対してアンタゴニスティックに作用し、また、ＩＬ−１７ＲＢとそのリガンドとの結合を阻害することによって、ＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５に対する抗体は、ＩＬ−１７ＲＢとそのリガンドとの結合を阻害することによって、ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞の機能を阻害あるいは除去する。ＩＬ−１７ＲＢに対する低分子阻害剤としては、ＩＬ−１７ＲＢとそのリガンドとの相互作用を調節してＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞のＴｈ２細胞様の機能を阻害あるいは除去できる低分子物質やＩＬ−１７ＲＢとそのリガンドに関わる細胞内シグナル経路を調節してＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞のＴｈ２細胞様の機能を阻害あるいは除去できる低分子物質が挙げられる。さらにはＩＬ−１７ＲＢの可溶化型分子（すなわち、細胞外領域に相当する分子）は、競合的にリガンドと結合することによって、ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞の機能を阻害あるいは除去する。陽性の対照化合物の使用濃度は、ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞の機能を阻害あるいは除去する作用が確認される濃度であれば特に限定されず、用いる化合物の種類によっても異なるが、例えばＩＬ−１７ＲＢに対するアンタゴニスティック抗体を用いる場合であれば、通常体重１ｋｇあたり１〜１００ｍｇ、好ましくは１〜１０ｍｇ程度である。
ＩＬ−１７ＲＢに対するアンタゴニスティック抗体並びに低分子阻害剤、ＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５に対する抗体及びＩＬ−１７ＲＢの可溶型分子としては、それぞれ、後述のアレルギー性気道炎症及び／又は気道過敏症の治療薬に含められる、ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞のＴｈ２細胞様の機能を阻害又は除去し得る物質と同様なものが用いられる。【００３８】
本発明は、また、ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞のＴｈ２細胞様の機能を阻害又は除去する物質を有効成分として含有するアレルギー性気道炎症及び／又は気道過敏症の治療薬を提供する。ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞のＴｈ２細胞様の機能を阻害又は除去する物質としては、例えばＩＬ−１７ＲＢに対するアンタゴニスティック抗体並びに低分子阻害剤、ＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５に対する抗体及びＩＬ−１７ＲＢの可溶型分子等が挙げられる。さらにＮＫＴ細胞においてＩＬ−１７ＲＢが発現するのを阻害する様な物質、例えばアンチセンス核酸（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は修飾ヌクレオチド、あるいはそれらのキメラ分子）、リボザイム、ＲＮＡｉ誘導性核酸（細胞内に導入されることによりＲＮＡｉ効果を誘導し得るポリヌクレオチド、好ましくはＲＮＡ：例、ｓｉＲＮＡ）、アプタマー、並びにこれらをコードする核酸を含む発現ベクターが挙げられる。【００３９】
ＩＬ−１７ＲＢに対するアンタゴニスティック抗体としては、上記したＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞を検出・分離するのに用いられる抗体のうち、ＩＬ−１７ＲＢに対してアンタゴニスティックに作用する抗体が挙げられる。作用の確認はリガンド刺激によって誘導されるＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞のＴｈ２細胞様の機能に対する影響を調べることによって行なうことができる。低分子阻害剤は、ＩＬ−１７ＲＢ強制発現細胞（例えばＩＬ−１７ＲＢ強制発現２９３Ｔ細胞）を用いたり可溶化型組換え体への結合性を測定したりすることによってスクリーニングされたものを用いることができる。本発明において用いられるＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５に対する抗体についてもＩＬ−１７ＲＢに対する抗体と同様、周知の免疫学的手法により、そのポリクローナル抗体、モノクローナル抗体として調製することができる。又、抗体のフラグメント（例、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２）、組換え抗体（例、単鎖抗体）であってもよい。ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞のＴｈ２細胞様の機能を阻害又は除去し得る物質としてＩＬ−１７ＲＢ可溶化型分子を用いることができる。ＩＬ−１７ＲＢ可溶化型分子とは、ＩＬ−１７ＲＢの細胞外領域を含む部分アミノ酸配列を含むタンパク質分子であり、具体的には配列番号２中１位〜２８２位のアミノ酸配列を有する。【００４０】
活性成分であるＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞のＴｈ２細胞様の機能を阻害又は除去し得る物質が、核酸分子又はタンパク質分子である場合、本発明の治療薬は、核酸分子又はタンパク質分子をコードする核酸分子を含む発現ベクターを有効成分とすることもできる。当該発現ベクターは、上記の核酸分子をコードするオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドが、投与対象である哺乳動物の細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されていなければならない。本発明の発現ベクターが含み得るプロモーターは、その制御下にある因子の発現を可能とする限り特に限定されず、因子の種類により適宜選択され得るが、例えば、ｐｏｌＩＩＩプロモーター（例、ｔＲＮＡプロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター）、哺乳動物用プロモーター（例、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＳＶ４０プロモーター）が挙げられる。また、使用されるプロモーターとしては、リンパ球に特異的なプロモーター（例、ｌｃｋプロモーター、Ｐｍｅｄ１プロモーター）を用いてもよい。【００４１】
発現ベクターは、好ましくは核酸分子をコードするオリゴ（ポリ）ヌクレオチドの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含む。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含むこともできる。【００４２】
発現ベクターとして使用される基本骨格のベクターは、プラスミド又はウイルスベクターであり得るが、ヒト等の哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。【００４３】
本発明の治療薬は、ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞のＴｈ２細胞様の機能を阻害又は除去し得る物質に加え、任意の担体、例えば医薬上許容され得る担体を含むことができる。医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックス等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。【００４４】
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水のような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤、あるいは散剤、顆粒剤等である。【００４５】
非経口的な投与（例、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入等）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。【００４６】
本発明の治療薬の活性成分であるＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞のＴｈ２細胞様の機能を阻害又は除去し得る物質の投与法および投与剤型は特に制限されないが、静脈、動脈内投与、筋内投与、経口投与、座剤投与等であり、薬学的に許容可能な賦形剤や希釈剤と組み合わせて経口用または非経口用に処方することができる。投与は１日あたり１回かまたは数回に分けて行い、投与量は患者の重篤度、年齢、性別、体重等の条件に応じて決定され、副作用を併発しない範囲である。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例にそって本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。また、本発明において使用する試薬や装置、材料は特に言及されない限り、商業的に入手可能である。【００４８】
実施例１：ＩＬ−１７ＲＢの同定
理研ＲＣＡＩより報告された各種免疫担当細胞のＤＮＡマイクロアレイの結果（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、ｉｎ  ｐｒｅｓｓ、２００７年）をリファレンスデータベースとして、ＮＫＴ細胞に優位に発現する遺伝子の抽出を行った。その結果、ＩＬ−１７ＲＢ（ＮＭ＿０１９５８３、１４２０７８９＿ａｔ）がＮＫＴ細胞において他の免疫担当細胞よりも遺伝子発現レベルが高いことが明らかとなった。ＩＬ−１７ＲＢの推定ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ構造を配列番号１に、推定されるアミノ酸配列を配列番号２に示す。【００４９】
本膜分子の推定アミノ酸配列の一次構造についてＫｙｔｅとＤｏｏｌｉｔｔｌｅの方法（Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１５７巻、１０５−１３２頁、１９８２年）に従い、ハイドロパシープロット解析を行なった（図１）。その結果、ＩＬ−１７ＲＢはＮ末端にシグナル配列を有するＩ型の細胞膜貫通タンパク質であることが明らかとなった。ＩＬ−１７ＲＢは４９９アミノ酸残基からなり、ハイドロパシープロット解析結果から１７アミノ酸残基のシグナル配列、２６５アミノ酸残基の細胞外領域、２３アミノ酸残基の膜貫通領域、１９４アミノ酸残基の細胞内領域を有していると予想される。さらにホモロジー検索並びにモチーフ検索の結果から細胞外領域は４ヶ所のアスパラギン結合型糖鎖付加部位、１０個のシステイン残基を有することが明らかとなったが、予想される立体構造は未知であった。さらに、ＩＬ−１７ＲＢは細胞内領域にＳＥＦＩＲドメイン（３２９−４７６）を有することが明らかとなり、このドメインを介してアダプター分子と会合していることが予想され、この会合したアダプター分子を介してシグナルを伝達することが予想された。【００５０】
実施例２：ＩＬ−１７ＲＢの可溶化型組換え体（可溶化型ＩＬ−１７ＲＢ−Ｉｇ）の作製
ハイドロパシープロット解析（図１）の結果から、細胞外ドメインと考えられる領域とヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を結合させた組換え体を作製した。なおヒトＩｇＧ１のＦｃ領域は各種細胞表面上に存在するＦｃγ受容体への結合を防ぐために３ヶ所のアミノ酸置換を行った。具体的には細胞外領域としてＩＬ−１７ＲＢの配列番号１のアミノ酸２８２位までを選択した。この可溶化型組換え体をコードするＤＮＡ配列を配列番号３に、アミノ酸配列を配列番号４に示す。Ｆｃ領域でアミノ酸置換を行った部位は配列番号４に示す３０２位（Ｌｅｕ→Ａｌａ）、３０３位（Ｌｅｕ→Ｇｌｕ）、４６９位（Ｖａｌ→Ａｓｐ）に相当する。この遺伝子をｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に導入し、ＣＭＶプロモーター制御下２９３Ｔ細胞で一過性に発現させ、得られた培養上清からＦｃ領域に結合性を有するプロテインＡを結合させた樹脂を用いたアフィニティクロマトグラフィーにより発現産物（ＩＬ−１７ＲＢ可溶化型組換え体）を精製した（図２）。【００５１】
実施例３：ＩＬ−１７ＲＢに対する特異的モノクローナル抗体の樹立
実施例２に記載のＩＬ−１７ＲＢ可溶化型組換え体をラットに免疫後、ラットミエローマ細胞株Ｐ３Ｕ１と細胞融合することにより特異的モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得た。スクリーニングは実施例２に記載の組換え体を固相化しＥＬＩＳＡ法により反応性を有するクローンを選抜するとともに、ＩＬ−１７ＲＢ全長を強制的に発現させた２９３Ｔ細胞に対する反応性をフローサイトメーターで解析することで特異的モノクローナル抗体を選抜した。得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（Ｂ５Ｆ６Ｃ１１、３Ｈ８Ｅ９）の培養上清とＩＬ−１７ＲＢ全長強制発現株への反応性を確認した結果を図３に示す。【００５２】
実施例４：マウス脾細胞へのモノクローナル抗体の反応性の検索
実施例３に記載の技術により樹立されたモノクローナル抗体を用いてＩＬ−１７ＲＢの発現の局在を確認した。該モノクローナル抗体をビオチン化した後Ｂａｌｂ／ｃマウス脾臓由来白血球に作用させ、フィコエリスリン結合アビジンを反応させることによりＩＬ−１７ＲＢの発現細胞を確認した。未刺激の細胞ではα−ＧａｌＣｅｒ／ＣＤ１ｄ  ｄｉｍｅｒ陽性のインバリアントＮＫＴ細胞の一部が反応性を有することが確認された（図４）。一方、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞等の免疫担当細胞においてはＩＬ−１７ＲＢの発現は確認できなかった（図４）。さらに種々の系統マウスにおけるインバリアントＮＫＴ細胞のＩＬ−１７ＲＢの発現について確認したところ、Ｔｈ２優位マウスとして知られるＢａｌｂ／ｃやＤＢＡ／２ｃｒにおいては発現が見られるものの、Ｔｈ１優位マウスとして知られるＣ５７ＢＬ／６やＣ３Ｈ／ＨｅＮにおいては、ほとんど発現が見られなかった（図５）。次にＢａｌｂ／ｃマウスにおけるＩＬ−１７ＲＢ陽性のＮＫＴ細胞の種々の臓器における存在様式を確認した。各臓器から細胞懸濁液を調製し、実施例３で得られたモノクローナル抗体を用いてα−ＧａｌＣｅｒ／ＣＤ１ｄ  ｄｉｍｅｒ陽性のＮＫＴ細胞のうち、ＩＬ−１７ＲＢ陽性のＮＫＴ細胞を検出した。その結果、確認した臓器のうち肺において非常に多く存在し、また、脾臓、胸腺には存在するが、肝臓においては存在しないことが明らかとなった（図６）。【００５３】
実施例５：ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞の表面抗原解析
ＮＫＴ細胞はＣＤ４をマーカーとして、機能的に異なる２つのサブセット（ＣＤ４陽性とＤＮ）に分けられるとの報告（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２０２巻、１２７９−１２８８頁、２００５年）に基づいて、ＩＬ−１７ＲＢのＮＫＴ細胞における表面抗原の発現様式を実施例３に記載のモノクローナル抗体、及び各表面抗原の抗体を用いてＦＡＣＳ解析により調べた。その結果、ＩＬ−１７ＲＢは主にＣＤ４陽性のＮＫＴ細胞に発現し、そのＣＤ４陽性のＮＫＴ細胞のうち約１／３がＩＬ−１７ＲＢ陽性であることが明らかとなった（図７）。すなわちＮＫＴ細胞は（Ａ）ＣＤ４陰性ＩＬ−１７ＲＢ陰性（ＤＮ）、（Ｂ）ＣＤ４陽性ＩＬ−１７ＲＢ陰性、（Ｃ）ＣＤ４陽性ＩＬ−１７ＲＢ陽性の３つのサブセットに分けられることが示された。次に（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）３つのサブセットについて、発現する表面抗原の解析を行った（図８）。その結果、（Ｃ）においては（Ａ）、（Ｂ）に比してＣＤ６９、ＣＤ１２２の発現が低いこと、キラーレセプターＮＫＧ２Ｄ陰性であること、ＣＤ６２Ｌ陰性であること等の知見が得られた。
ＣＤ４発現にはパシフィックブルー標識抗マウスＣＤ４抗体（ＲＭ４−５、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いた。ＣＤ６９発現にはフィコエリスリン標識抗マウスＣＤ６９抗体（Ｈ１．２Ｆ３、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いた。ＣＤ１２２発現にはフィコエリスリン標識抗マウスＣＤ１２２抗体（ＴＭ−β１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いた。ＮＫＧ２Ｄ発現にはフィコエリスリン標識抗マウスＮＫＧ２Ｄ抗体（Ｃ７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いた。ＣＤ６２Ｌの発現にはフィコエリスリン標識抗マウスＣＤ６２Ｌ抗体（ＢＶＤ６−２４Ｇ２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いた。【００５４】
実施例６：ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞の遺伝子発現解析
実施例５で同定されたＮＫＴ細胞の３つのサブセットについて、ｍＲＮＡを調製し、定量ＰＣＲ法による相対的遺伝子発現レベルを確認した（図９）。ｍＲＮＡの調製や定量ＰＣＲについては、通常、当分野で行われている方法を用いて実施した。具体的には、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ定量ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、プライマーは表１に記す組み合わせを用いた。その結果、（Ｃ）においては、Ｔｈ１細胞を規定する遺伝子群の発現は（Ａ）、（Ｂ）に比べて相対的に低いこと、Ｔｈ２細胞を規定する遺伝子群の発現は（Ａ）、（Ｂ）に比べて同程度若しくは相対的に高いことが明らかとなった。また細胞障害活性に関わる遺伝子群は（Ａ）のみで発現が見られることが明らかとなった。さらに、ケモカインレセプターＣＣＲ４の発現が（Ｃ）において、（Ａ）、（Ｂ）に比して高いことが明らかとなった。実施例５及び実施例６の結果を併せて考えると、ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞はＴｈ２細胞と表現型が非常に良く似ていることが明らかとなった。
検出の対象となったＴｈ１細胞を規定する遺伝子及びＴｈ２細胞を規定する遺伝子、細胞障害活性に関わる遺伝子、ならびにケモカイン・ケモカインレセプター遺伝子を、その検出の為のプライマー情報とともに表１にまとめる。尚、各遺伝子の発現はＨＰＲＴ遺伝子の発現で標準化した。【００５５】
【表１】
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【００５６】
実施例７：ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの機能評価（１）
ＩＬ−１７ＲＢに対するリガンドとしてＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５が知られている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６巻、１６６０−１６６４頁、２００１年）。そこで、実施例５に記した（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）３つのサブセットについて、ＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５に対する反応性を確認した。その結果、（Ｃ）のみでＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５依存的な細胞増殖活性が見られた（図１０）。細胞増殖は３Ｈの取込によって測定した。さらに、ＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５依存的な反応は（Ｃ）から大量のＩＬ−１３、ＩＬ−４、ＴＡＲＣ／ＣＣＬ１７、ＭＤＣ／ＣＣＬ２２といったＴｈ２サイトカイン・ケモカインの産生をもたらすことが明らかとなった（図１１）。ＩＦＮ−γ、ＩＬ−５、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−４及びＩＬ−１３については、各サイトカイン・ケモカインの抗体を用いたＥＬＩＳＡ法で、ＴＡＲＣ／ＣＣＬ１７及びＭＤＣ／ＣＣＬ２２については、各ケモカイン遺伝子に対するプライマーを用いた定量ＰＣＲ法により測定した。各プライマーの組み合わせを上記表１に示す。尚定量ＰＣＲ法ではＨＰＲＴ遺伝子の発現で標準化した。この結果はＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞がＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５依存的に増殖し、Ｔｈ２サイトカイン・ケモカインの産生能を有することを示すものである。【００５７】
実施例８：ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの機能評価
実施例７に記載するようにＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞が、アレルギー性気道炎症や気道過敏症の発症に重要となるサイトカイン、特にＩＬ−１３を産生することから、喘息モデルにおける該細胞の役割を明らかとした。Ｂａｌｂ／ｃマウスあるいは本発明者らによって樹立されたＮＫＴ細胞欠損マウス（Ｊα１８欠損マウス（Ｂａｌｂ／ｃバックグラウンド）（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７８巻、１６２３−１６２６頁、１９９７年）をＯＶＡ／Ａｌｕｍを皮下免疫後ＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５あるいはＰＢＳ（コントロール）を静注し、再度ＯＶＡを経鼻投与して、メタコリン刺激で誘導した気道抵抗を測定した。その結果、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいてはＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５依存的に気道抵抗値の上昇が見られるのに対して、ＮＫＴ細胞欠損マウスにおいてはＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５投与による気道抵抗値の上昇が見られなかった（図１２）。さらに気道抵抗値と相関するように、血中のＩＬ−１３濃度はＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５処理したＢａｌｂ／ｃマウスでは上昇が見られるものの、ＮＫＴ細胞欠損マウスではほとんど上昇が見られなかった（図１３）。【００５８】
実施例９：ＩＬ−１７ＲＢ発現細胞の解析
実施例３に記載の技術により樹立されたマウスＩＬ−１７ＲＢ特異的モノクローナル抗体を用いて、脾臓細胞と肺の単核球におけるＩＬ−１７ＲＢの発現様式について、詳細に解析を行なった。これまでＩＬ−１７ＲＢは腸管膜リンパ節（ＭＬＮ）のｃ−ｋｉｔ陽性非Ｂ非Ｔ細胞（ｃ−ｋｉｔ＋ＮＢＮＴ細胞）に発現が見られるという報告（Fallon, P.G., S.J. Ballantyne, N.E. Mangan, J.L. Barlow, A. Dasvarma, D.R. Hewett, A. McIlgorm, H.E. Jolin, and A.N. McKenzie 2006. Identification of an interleukin (IL)-25-dependent cell population that provides IL-4, IL-5, and IL-13 at the onset of helminth expulsion. J. Exp. Med. 203:1105-1116）があることから、本細胞について、本発明の抗体を用いてその染色性を確認したところ、約２０％の細胞が陽性であることが確認できた（図１４ａ）。そこで本抗体を用いて、脾臓細胞と肺の単核球の各サブセットについて発現を確認した。実施例３に記載のモノクローナル抗体、及び各サブセットに特有の各表面抗原の抗体を用いてＦＡＣＳ解析により調べた。結果、脾臓細胞（図１４ｂ）及び肺単核球（図１４ｃ）のいずれにおいてもＣＤ１ｄ拘束性のＮＫＴ細胞の一部でのみ発現が確認され、ＩＬ−１７ＲＢの発現の局在が明らかとなった。【００５９】
実施例１０：ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞の遺伝子発現解析
実施例５でＮＫＴ細胞は（Ａ）ＣＤ４陰性ＩＬ−１７ＲＢ陰性（ＤＮ）、（Ｂ）ＣＤ４陽性ＩＬ−１７ＲＢ陰性、及び（Ｃ）ＣＤ４陽性ＩＬ−１７ＲＢ陽性の３つのサブセットに分けられることが示された。これらＮＫＴ細胞の３つのサブセットについて、ｍＲＮＡを調製し、定量ＰＣＲ法による相対的遺伝子発現レベルをさらに確認した。Ｔ細胞の新しいサブセットとして認知されたＩＬ−１７産生性ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１７）は、転写因子ＲＯＲγｔをマスター遺伝子としている。そこで、ＩＬ−１７（ＩＬ−１７Ａ）とＲＯＲγｔのｍＲＮＡを定量ＰＣＲにて確認したところ、（Ａ）において（Ｂ）（Ｃ）よりも有意に高いことが明らかとなった。この結果は（Ｃ）が既に報告のあるＩＬ−１７産生性ＮＫＴ細胞(Michel, M.L., A.C. Keller, C. Paget, M. Fujio, F. Trottein, P.B. Savage, C.H. Wong, E. Schneider, M. Dy, and M.C. Leite-de-Moraes. 2007. Identification of an IL-17-producing NK1.1(neg) iNKT cell population involved in airway neutrophilia. J. Exp. Med. 204:995-1001.)とは異なる細胞群であることを示しており、ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞が新しく同定された細胞集団であることを強く示唆するものである（図１５）。
本実施例において定量ＰＣＲは、実施例６と同様の手順で行った。検出の対象となったＴｈ１７細胞を規定する遺伝子のプライマー情報を表１に示した。【００６０】
実施例１１：ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの機能評価（２）
実施例１０に記した（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）３つのサブセットについて、ＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５に対する反応性を確認した。その結果、ＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５依存的に（Ｃ）ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞から大量のｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ−Ｌ（ＥＣＦ−Ｌ）を産生することを示された（図１６、上段）。この結果は、ＩＬ−５産生性の好酸球を局所に呼び寄せる機能を有することを示しており、活性化したＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞がＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５依存的に間接的な好酸球増加症（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉａ）を誘導することが示唆された。またＩＬ−１７Ａの発現はＩＬ−２５刺激前後でほとんど変わらないことも明らかとなった（図１６、下段）。【００６１】
実施例１２：ＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５依存的な気道過敏症発症におけるＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞の役割の解明
マウスでの喘息モデルとして卵白アルブミン（ＯＶＡ）を用いた気道炎症モデルがある。これは、ＯＶＡ−ａｌｕｍで免疫後、ＯＶＡを吸入させて気道炎症を起こすものである。通常ＯＶＡ−ａｌｕｍ（１００μｇ／２ｍｇ）を腹腔内に２−３回一週間間隔で免疫後、ＯＶＡ（１００μｇ）を点鼻で３日間投与することにより、メタコリン誘発性気道炎症を発症させることができる。本実施例では、ＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５の作用を確認するために、ＯＶＡ−ａｌｕｍ（５０μｇ／２ｍｇ）を腹腔内に２回一週間間隔で免疫後、ＯＶＡ（５０μｇ）を点鼻で１回投与する、メタコリン誘発性気道炎症の発症が見られない条件下で、Ｂａｌｂ／ｃマウス（ＷＴ）とＮＫＴ細胞欠損マウス（Ｊα１８ＫＯマウス、Ｊα１８−／−）におけるＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５の作用を確認した。一連のプロトコルを図１７に示す。
本モデルにおいて気道圧の上昇を指標に気道炎症の発症を確認したところ、Ｂａｌｂ／ｃマウスではＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５依存的な気道炎症を発症したが、ＮＫＴ細胞欠損マウスでは発症しなかった（図１８）。本条件下ではＯＶＡ吸入後の肺胞洗浄液中への細胞浸潤を確認したところ、総細胞数（Ｔｏｔａｌ）、マクロファージ（Ｍφ）、好酸球（Ｅｏｓ）、好中球（Ｎｅｕ）、リンパ球（Ｌｙｍ）のいずれにおいてもＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５投与群においてはＮＫＴ細胞欠損マウスに比べてコントロールマウスにおいて著しい浸潤が確認された（図１９）。さらに肺胞洗浄液中のサイトカイン濃度についても、ＩＬ−１３およびＩＬ−４について同様の傾向が強く認められた（図２０）。これらマウスの肺組織からミクロトームにより組織切片を作製し、該切片を、ヘマトキシリン・エオシン染色あるいはパス染色により調べた。その結果、ＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５投与コントロールマウスにおいて好酸球・好中球の浸潤（ヘマトキシリン・エオシン染色（図２１ａ））やムチン粘液過剰産生（パス染色（図２２ｂ））が確認できた。これらの結果は、ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞がＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５依存的な気道過敏症発症において中心的な役割を担っていることを示唆するものである。また、上記モデルにおいて、ＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５投与前に抗ＩＬ−１７ＲＢ抗体でＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞を除去することによってＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞の役割を確認した（図２２）。ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞が除去されていることはＦＡＣＳ解析により確認した（図２２ａ）。ＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞が除去されることにより、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいてもＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５依存的な気道炎症が抑制されることがわかった（図２２ｂ）。さらにＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５投与前にＮＫＴ細胞欠損マウスにＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞を移入した系でＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞の役割を確認した。ＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５投与前にＮＫＴ細胞欠損マウスにＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞を移入することにより、細胞数依存的に気道炎症の増悪がみられることも確認された（図２３）。【００６２】
実施例１３：ＲＳウイルス依存的な気道過敏症発症におけるＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞の役割の解明
ＲＳウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ：ＲＳＶ）は、乳児急性気道感染症（細気管支炎、肺炎など）の主な原因ウイルスである。ＲＳウイルスは接触や飛沫を介して気道に感染し、２−５日の潜伏期の後、発熱、鼻水、咳などで発症、通常１−２週間で軽快するが、２歳以下の乳幼児ではしばしば上気道炎から下気道炎に進展して細気管支炎、肺炎を発症し、免疫不全児、低出生体重児や呼吸器・循環器に基礎疾患をもつ乳幼児は重症化しやすく、特に注意が必要である。ＲＳＶ感染症に効果のあるワクチンはなく、多くの場合は症状を抑える対症療法である。ＲＳＶ感染マウスの肺胞洗浄液を用いて、該洗浄液中に含まれるサイトカインについて調べた。ＩＬ−２５、ＩＬ−６、ＩＬ−４及びＩＬ−１３濃度を各サイトカイン・ケモカインの抗体を用いたＥＬＩＳＡ法で測定した。ＲＳＶ感染により肺胞液中に早期にＩＬ−２５が誘導された（図２４）。これはＴｈ２サイトカインであるＩＬ−１３／ＩＬ−４や炎症性サイトカインであるＩＬ−６よりも早い（図２４）。また肺胞洗浄液中のＮＫＴ細胞割合について調べたところ、ＲＳＶ感染によりＮＫＴ細胞が肺胞洗浄液中に浸潤することがわかった（図２５）。これらの結果から、ＲＳＶ依存的な気道過敏症発症におけるＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞の関与について解析を行なった。実施例１１に記載のＯＶＡ−ａｌｕｍの気道炎症発症モデルにおいて、ＯＶＡ／ａｌｕｍ免疫３日前に３回感染させ、ＯＶＡによる惹起で発症を観察した。一連のプロトコルを図２６に示す。その結果、ＮＫＴ細胞欠損マウスにおいては、気道圧の上昇（図２７ａ）、肺胞液中への細胞浸潤（図２７ｂ）、好酸球・好中球の浸潤（図２８ａ）、ムチン過剰産生（図２８ｂ）、いずれもがＢａｌｂ／ｃマウスよりも増悪していることが明らかとなった。これらの結果は、ＲＳＶによる気道過敏症発症においてＩＬ−１７ＲＢ陽性ＮＫＴ細胞がその増悪に関与していることを強く示唆するものである。
本出願は、日本で出願された特願２００７−３０７９８１を基礎としておりそれの内容は本明細書に全て包含されるものである。

【配列表フリーテキスト】
【００６３】
配列番号３：ＩＬ−１７ＲＢの細胞外ドメインとヒトＩｇＧ１のＦｃ領域の融合蛋白質。
配列番号４：ＩＬ−１７ＲＢの細胞外ドメインとヒトＩｇＧ１のＦｃ領域の融合蛋白質。
配列番号５：ＩＦＮ−γ検出用ＰＣＲプライマー（センス）
配列番号６：ＩＦＮ−γ検出用ＰＣＲプライマー（アンチセンス）
配列番号７：ＩＦＮ−γＲ検出用ＰＣＲプライマー（センス）
配列番号８：ＩＦＮ−γＲ検出用ＰＣＲプライマー（アンチセンス）
配列番号９：ＩＬ−１２Ｒβ２検出用ＰＣＲプライマー（センス）
配列番号１０：ＩＬ−１２Ｒβ２検出用ＰＣＲプライマー（アンチセンス）
配列番号１１：ＩＬ−１８Ｒβ検出用ＰＣＲプライマー（センス）
配列番号１２：ＩＬ−１８Ｒβ検出用ＰＣＲプライマー（アンチセンス）
配列番号１３：ＳＴＡＴ４検出用ＰＣＲプライマー（センス）
配列番号１４：ＳＴＡＴ４検出用ＰＣＲプライマー（アンチセンス）
配列番号１５：Ｔ−ｂｅｔ検出用ＰＣＲプライマー（センス）
配列番号１６：Ｔ−ｂｅｔ検出用ＰＣＲプライマー（アンチセンス）
配列番号１７：ＩＬ−４検出用ＰＣＲプライマー（センス）
配列番号１８：ＩＬ−４検出用ＰＣＲプライマー（アンチセンス）
配列番号１９：ＩＬ−５検出用ＰＣＲプライマー（センス）
配列番号２０：ＩＬ−５検出用ＰＣＲプライマー（アンチセンス）
配列番号２１：ＩＬ−１０検出用ＰＣＲプライマー（センス）
配列番号２２：ＩＬ−１０検出用ＰＣＲプライマー（アンチセンス）
配列番号２３：ＩＬ−１３検出用ＰＣＲプライマー（センス）
配列番号２４：ＩＬ−１３検出用ＰＣＲプライマー（アンチセンス）
配列番号２５：ＳＴＡＴ６検出用ＰＣＲプライマー（センス）
配列番号２６：ＳＴＡＴ６検出用ＰＣＲプライマー（アンチセンス）
配列番号２７：ＧＡＴＡ３検出用ＰＣＲプライマー（センス）
配列番号２８：ＧＡＴＡ３検出用ＰＣＲプライマー（アンチセンス）
配列番号２９：ＧｒａｎｚｙｍｅＡ検出用ＰＣＲプライマー（センス）
配列番号３０：ＧｒａｎｚｙｍｅＡ検出用ＰＣＲプライマー（アンチセンス）
配列番号３１：Ｐｅｒｆｏｒｉｎ１検出用ＰＣＲプライマー（センス）
配列番号３２：Ｐｅｒｆｏｒｉｎ１検出用ＰＣＲプライマー（アンチセンス）
配列番号３３：Ｋｌｒａ７検出用ＰＣＲプライマー（センス）
配列番号３４：Ｋｌｒａ７検出用ＰＣＲプライマー（アンチセンス）
配列番号３５：Ｋｌｒｃ１検出用ＰＣＲプライマー（センス）
配列番号３６：Ｋｌｒｃ１検出用ＰＣＲプライマー（アンチセンス）
配列番号３７：Ｋｌｒｄ１検出用ＰＣＲプライマー（センス）
配列番号３８：Ｋｌｒｄ１検出用ＰＣＲプライマー（アンチセンス）
配列番号３９：Ｋｌｒｇ１検出用ＰＣＲプライマー（センス）
配列番号４０：Ｋｌｒｇ１検出用ＰＣＲプライマー（アンチセンス）
配列番号４１：ＣＸＣＲ６検出用ＰＣＲプライマー（センス）
配列番号４２：ＣＸＣＲ６検出用ＰＣＲプライマー（アンチセンス）
配列番号４３：ＣＣＲ４検出用ＰＣＲプライマー（センス）
配列番号４４：ＣＣＲ４検出用ＰＣＲプライマー（アンチセンス）
配列番号４５：ＴＡＲＣ／ＣＣＬ１７検出用ＰＣＲプライマー（センス）
配列番号４６：ＴＡＲＣ／ＣＣＬ１７検出用ＰＣＲプライマー（アンチセンス）
配列番号４７：ＭＤＣ／ＣＣＬ２２検出用ＰＣＲプライマー（センス）
配列番号４８：ＭＤＣ／ＣＣＬ２２検出用ＰＣＲプライマー（アンチセンス）
配列番号４９：ＩＬ−１７Ａ検出用ＰＣＲプライマー（センス）
配列番号５０：ＩＬ−１７Ａ検出用ＰＣＲプライマー（アンチセンス）
配列番号５１：ＲＯＲγｔ検出用ＰＣＲプライマー（センス）
配列番号５２：ＲＯＲγｔ検出用ＰＣＲプライマー（アンチセンス）
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図２１】
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【図２５】
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【図２８】
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【配列表】
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