(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＭＨＣクラスＩＩα鎖の細胞外部分の全部または一部分と、
（ｉｉ）ＭＨＣクラスＩＩβ鎖の細胞外部分の全部または一部分と
を含む組換えＭＨＣクラスＩＩ分子であって、
（ｉ）および（ｉｉ）が、機能的ペプチド結合ドメインを提供し、かつ（ｉ）および（ｉｉ）が、前記α鎖のα２ドメイン中に位置するシステイン残基と前記β鎖のβ２ドメイン中に位置するシステイン残基との間のジスルフィド結合により結合しており、前記システイン残基が、天然ＭＨＣクラスＩＩのα２およびβ２ドメイン中には存在せず、かつ前記組換え分子が繊維状ファージ表面に発現されている、組換えＭＨＣクラスＩＩ分子。
【請求項２】
前記ジスルフィド結合が、マウスＩ−ＥアイソタイプのＰｒｏ９６α2−Ｓｅｒ１１９β2（１位）、Ｓｅｒ９５α2−Ｓｅｒ１２１β2（２位）もしくはＡｒｇ９４α2−Ａｓｎ１５１β2（３位）または別のＭＨＣクラスＩＩアイソタイプにおいて相当する位置のシステイン残基間にある、請求項１に記載の組換えＭＨＣクラスＩＩ分子。
【請求項３】
前記ジスルフィド結合が、マウスＩ−ＥアイソタイプのＳｅｒ９５α2−Ｓｅｒ１２１β2（２位）または別のＭＨＣクラスＩＩアイソタイプにおいて相当する位置のシステイン残基間にある、請求項２に記載の組換えＭＨＣクラスＩＩ分子。
【請求項４】
さらに参照配列Ｈ−２ＥＢ*０１（配列番号２）の３８、４２もしくは１０６の位置に対応する１つ以上のシステイン残基または別のＭＨＣクラスＩＩアイソタイプの相当する位置の１つ以上のシステイン残基が除去されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換えＭＨＣクラスＩＩ分子。
【請求項５】
前記組換え分子が、ファージ表面タンパク質ｇｐＩＩＩ、ｇｐＶＩＩ、ｇｐＶＩＩＩまたはｇｐＩＸとの融合体として発現されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えＭＨＣクラスＩＩ分子。
【請求項６】
前記ファージ表面タンパク質がｇｐＩＸである、請求項５に記載の組換えＭＨＣクラスＩＩ分子。
【請求項７】
（ｉ）ＭＨＣクラスＩＩα鎖の細胞外部分の全部または一部分と、
（ｉｉ）ＭＨＣクラスＩＩβ鎖の細胞外部分の全部または一部分と
を含む組換えＭＨＣクラスＩＩ分子であって、
（ｉ）および（ｉｉ）が、機能的ペプチド結合ドメインを提供し、かつ（ｉ）および（ｉｉ）が、前記α鎖のα２ドメイン中に位置するシステイン残基と前記β鎖のβ２ドメイン中に位置するシステイン残基との間のジスルフィド結合により結合しており、前記システイン残基が、天然ＭＨＣクラスＩＩのα２およびβ２ドメイン中には存在せず、かつ前記組換え分子がロイシンジッパーモチーフを含まない、組換えＭＨＣクラスＩＩ分子。
【請求項８】
前記ジスルフィド結合が、マウスＩ−ＥアイソタイプのＰｒｏ９６α2−Ｓｅｒ１１９β2（１位）、Ｓｅｒ９５α2−Ｓｅｒ１２１β2（２位）もしくはＡｒｇ９４α2−Ａｓｎ１５１β2（３位）または別のＭＨＣクラスＩＩアイソタイプにおいて相当する位置のシステイン残基間にある、請求項７に記載の組換えＭＨＣクラスＩＩ分子。
【請求項９】
前記ジスルフィド結合が、マウスＩ−ＥアイソタイプのＳｅｒ９５α2−Ｓｅｒ１２１β2（２位）または別のＭＨＣクラスＩＩアイソタイプにおいて相当する位置のシステイン残基間にある、請求項８に記載の組換えＭＨＣクラスＩＩ分子。
【請求項１０】
さらに参照配列Ｈ−２ＥＢ*０１（配列番号２）の３８、４２もしくは１０６の位置に対応する１つ以上のシステイン残基または別のＭＨＣクラスＩＩアイソタイプの相当する位置の１つ以上のシステイン残基が除去されている、請求項７〜９のいずれか１項に記載の組換えＭＨＣクラスＩＩ分子。
【請求項１１】
前記分子が可溶性分子である、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の組換えＭＨＣクラスＩＩ分子。
【請求項１２】
前記分子の（ｉ）または（ｉｉ）が免疫グロブリンのＦｃ部分と融合している、請求項１１に記載の組換えＭＨＣクラスＩＩ分子。
【請求項１３】
前記分子が多量体である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組換えＭＨＣクラスＩＩ分子。
【請求項１４】
前記分子の（ｉ）および（ｉｉ）が、マウスＭＨＣクラスＩＩ分子またはヒトＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組換えＭＨＣクラスＩＩ分子。
【請求項１５】
前記分子の（ｉ）および（ｉｉ）が、ヒトＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する、請求項１４に記載の組換えＭＨＣクラスＩＩ分子。
【請求項１６】
前記分子が細菌宿主により産生されている、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組換えＭＨＣクラスＩＩ分子。
【請求項１７】
前記細菌宿主が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項１６に記載の組換えＭＨＣクラスＩＩ分子。
【請求項１８】
前記細菌宿主が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２派生物である、請求項１７に記載の組換えＭＨＣクラスＩＩ分子。
【請求項１９】
前記細菌宿主が、ＢＬ２１表現型を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはその派生物である、請求項１７に記載の組換えＭＨＣクラスＩＩ分子。
【請求項２０】
前記ジスルフィド結合が、ＭＨＣクラスＩＩ分子安定化の唯一の手段を提供する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組換えＭＨＣクラスＩＩ分子。
【請求項２１】
前記分子がＴ細胞を染色することができる、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組換えＭＨＣクラスＩＩ分子。
【請求項２２】
前記分子が前記ペプチド結合ドメインと結合したペプチドをさらに含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組換えＭＨＣクラスＩＩ分子。
【請求項２３】
原核宿主で発現させることができる組換えＭＨＣクラスＩＩ分子であって、
（ｉ）ＭＨＣクラスＩＩα鎖の細胞外部分の全部または一部分と、
（ｉｉ）ＭＨＣクラスＩＩβ鎖の細胞外部分の全部または一部分と
を含み、
（ｉ）および（ｉｉ）が、機能的ペプチド結合ドメインを提供し、かつ（ｉ）および（ｉｉ）が、前記α鎖のα２ドメイン中に位置するシステイン残基と前記β鎖のβ２ドメイン中に位置するシステイン残基との間のジスルフィド結合により結合しており、前記システイン残基が、天然ＭＨＣクラスＩＩのα２およびβ２ドメイン中には存在しない組換えＭＨＣクラスＩＩ分子。
【請求項２４】
（ｉ）ＭＨＣクラスＩＩα鎖の細胞外部分の全部または一部分と、
（ｉｉ）ＭＨＣクラスＩＩβ鎖の細胞外部分の全部または一部分と
を含む組換えＭＨＣクラスＩＩ分子の作製方法であって、
（ｉ）および（ｉｉ）が、機能的ペプチド結合ドメインを提供し、かつ（ｉ）および（ｉｉ）が、前記α鎖のα２ドメイン中に位置するシステイン残基と前記β鎖のβ２ドメイン中に位置するシステイン残基との間のジスルフィド結合により結合しており、前記システイン残基が、天然ＭＨＣクラスＩＩのα２およびβ２ドメイン中には存在せず、
前記組換え分子を原核宿主で発現させることを含む、方法。
【請求項２５】
Ｔ細胞により認識され得る抗原ペプチドエピトープを同定する方法であって、
前記方法が、請求項２２に記載の組換えＭＨＣクラスＩＩ分子をＴ細胞受容体と接触させることと、
前記組換えＭＨＣクラスＩＩ分子と前記Ｔ細胞受容体との結合を検出することと、
を含む方法。
【請求項２６】
試料中の抗原特異的Ｔ細胞を検出する方法であって、
前記方法が、請求項２２に記載の組換えＭＨＣクラスＩＩ分子を前記試料と接触させることと、
前記組換えＭＨＣクラスＩＩ分子と前記Ｔ細胞との結合を検出することと、
を含む方法。
【請求項２７】
前記方法が、インビトロで試料中の疾患特異的Ｔ細胞の存在を検出して疾患の有無を診断するために使用される、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジスルフィド結合により安定化された組換えＭＨＣクラスII分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子は、脊椎動物免疫系の中心的な構成要素であり、すべての有核細胞表面に存在する。ＭＨＣは２つの主要な型、すなわちＭＨＣクラスIおよびクラスIIとして存在する。両型とも、所与のＭＨＣを発現する細胞自体の中で、Ｔ細胞エピトープと呼ばれるタンパク質分解処理されたペプチドとともに機能的複合体を形成するということは重要である。生じたペプチド／ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体は、次いで細胞表面の膜貫通型の複合体となり、この現象は抗原提示と呼ばれる。次いで、細胞表面に結合したｐＭＨＣは、その同族パートナー、すなわちＴリンパ球表面に存在するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と相互作用し得る。
【０００３】
ｐＭＨＣ−ＴＣＲ相互作用は適応免疫において極めて重要な役割を果たしているため、基礎および応用科学の分野では、細胞および分子の両レベルで理解し、組換え型の両分子を入手することに大きな注目が集められている。さらに、その系の生態を研究し理解することを可能にするためにも、また新規な治療剤および診断剤を開発するためにも、こうした組換え分子を利用できることが極めて重要であるということも理解されつつある。
【０００４】
多くの重要な医学的状態では、患者の免疫系の活性を調節する治療的介入が必要である。例えば自己免疫疾患およびアレルギーでは、免疫系の亢進および慢性炎症を抑える必要がある。これに対し、免疫促進は、免疫細胞を癌性細胞に対して活性化して標的化する、感染症および癌に適切なアプローチである。さらに、移植レシピエントは通常、免疫抑制を必要とする。同時にこれにより、膨大な量の免疫調節剤が開発されるようになり、現在では数十億ドル規模の産業となっている。
【０００５】
これらの疾患の免疫的構成要素を理解し、新たな治療法をスクリーニングする上で鍵となるのは、抗原提示細胞とＴ細胞の間の相互作用、つまり、より具体的にはＭＨＣクラスＩおよびII分子とＴＣＲの間の相互作用である。クラスIIＭＨＣは外来性のペプチドと特異的に結合し、それをＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞（ＴＨ細胞）に提示する。次いでＴＨ細胞が活性化され、各種サイトカインを分泌するエフェクター細胞となる。これらのサイトカインは、脅威への対処に関与する他の様々な免疫細胞を活性化する。このシステムが機能不全に陥ると、例えば、自己免疫疾患を引き起こしたり、癌細胞が生き残って分裂したりする可能性がある。このように、自己免疫疾患はＭＨＣとの強い関連性および標的器官へのＴ細胞浸潤を特徴とする。
【０００６】
免疫調節剤スクリーニングのためのプラットフォームには、安定で完全に機能的な可溶性ＭＨＣクラスII分子が必要である。重要なのは、可溶性ＭＨＣクラスII分子の作製は現在、分子安定性の欠如という深刻な問題に阻まれているということである。
【０００７】
ここ数年の間に、可溶性ＭＨＣクラスI分子を四量体として作製する能力（テトラマー技術）により、基礎および応用免疫学が大きな変化を遂げた（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  Ｎｕｒｓｉｎｇ，４：１１５−１２７）。テトラマー技術により、抗原およびＴ細胞応答の両方に関して特定の方法で、主としてフローサイトメトリーにより評価される免疫応答の過程を追跡する能力が大幅に向上したというのがその理由である。またこの能力は、免疫系のより一層深い理解にもつながり、新規な診断ツールを実際に生み出す可能性もある。
【０００８】
組換えＭＨＣクラスIの作製に関する技術的問題点の多くが解決されてきたのと同様に、四量体試薬はこれまで、ほとんどがＭＨＣクラスＩ分子に限られてきた。実際、ＭＨＣクラスII分子に関しては、この課題が極めて困難であることが証明されている。したがって、独立した例が文献中にも、また市販の試薬としても見られるが、利用できるＭＨＣクラスII四量体作製の一般的なプロトコルは現在のところない（Ｖｏｌｌｅｒｓ，Ｓ．およびＳｔｅｒｎ，Ｌ．，２００８，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２３：３０５−３１３）。ＭＨＣクラスII四量体が利用可能な少数例では、ＭＨＣクラスII四量体が広範囲で使用され、疾患発症の理解に大きな影響を与えた。したがって、組換えＭＨＣクラスI作製の成功により既に示されている影響を考えれば、新規なＭＨＣクラスII作製手段にさらに力を注ぐ強く明確な学術的・商業上的動機が存在することがわかる。しかし、現在直面している問題を考えれば、成功するか否かは定かではない。
【０００９】
部分的に不明である理由により、ＭＨＣクラスII分子は可溶型の安定な組換え分子として作製することが特に難しいことが証明されている。天然の分子はα鎖とβ鎖を含む非共有結合性の膜貫通型ヘテロ二量体であり、αおよびβの両鎖は膜貫通領域を有し、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに属する。各鎖の細胞外部分は、それぞれ約９０個のアミノ酸残基からなる２つのドメインから構成され、そのうちの２つの膜遠位ドメインであるα１ドメインとβ１ドメインが、Ｔ細胞エピトープのペプチド結合性に不可欠な、互いに格子状になったα／β構造を形成している。２つの膜近位ドメインであるα２ドメインとβ２ドメインは、ともに分離したＩｇドメインを形成している。αおよびβの両鎖では、約２０個のアミノ酸残基の配列が細胞膜を横断し、膜の細胞質側にはごく短いペプチドセグメントがある。
【００１０】
α鎖とβ鎖の二量体化は、（i）膜貫通セグメント、（ii）ペプチド結合および（ｉｉｉ）膜にある推定上の付属構成要素により生じると考えられている。したがって、ＭＨＣクラスII分子を一度その天然の状態から切り離し、可溶性分子として作製すると、本来の低い安定性と非常に低い生産レベルに悩まされることが多い。さらには大規模で供給源を要する、場合に応じた最適化を行わなければならない。
【００１１】
また、上述の二量体化のための必要事項を考慮すれば、任意の非天然の状態、すなわち、細胞が天然でＭＨＣクラスII分子を発現するような細胞膜と関連した産生以外の任意の状態でＭＨＣクラスII分子を作製するための一般的方法、例えば、他の生物学的存在、細胞または粒子の表面に示される不可溶性分子として、例えば、ウイルスキャプシドタンパク質との融合によりファージ表面で発現される不溶性分子として作製することは、容易とは言い難い。
【００１２】
したがって、安定化されたＭＨＣクラスIIヘテロ二量体を作製することができる一般的な戦略は、現在のところ存在しない。しかし、すべて各場合に特有の成功例を示す各種の研究が行われており、これらの例は、むしろこの課題の複雑さを反映している。そのような例は、（i）脂質テザー（ＧＰＩアンカー）の使用による真核細胞表面での膜結合ＭＨＣクラスIIヘテロ二量体の異所性発現（Ｗｅｔｔｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．ｏｆ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１７４：２１９−２２８を参照されたい）；（ii）昆虫細胞でのＭＨＣクラスII外部ドメイン発現（Ｗａｌｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２５：１２６２−１２６６を参照されたい）；（iii）昆虫細胞での産生と組み合わせた、ＭＨＣクラスII分子Ｃ−末端へのロイシンジッパーのような異種二量体化モチーフの導入（Ｑｕａｒｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６７：４８６１−４８６８およびＣｒａｗｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２１０：１５６−１７０を参照されたい）；（iv）昆虫細胞での産生と組み合わせた、抗体／ＭＨＣクラスIIキメラの産生（Ｃａｓａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１０：１２９５−１３０１を参照されたい）；（v）封入体からのリフォールディング法により機能的ｐＭＨＣ三量体の形成が可能な細菌発現系の使用（Ａｒｉｍｉｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：９７１−９７７を参照されたい）；または（vi）封入体からのリフォールディング法により機能的ｐＭＨＣの形成が可能な、α１ドメインとβ１ドメインのみからなる短縮された細菌産生一本鎖ＭＨＣクラスII形式の使用（Ｂｕｒｒｏｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１２：７７１−７７８を参照されたい）である。さらに、Ｌａｎｄａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８３：７９４９−７９５７  には、安定化されたマウスＩ−ＡdＯＶＡ  ＭＨＣクラスII四量体作製のための、内部の人工的なジスルフィド架橋を外来性ロイシンジッパーとともに用いる昆虫細胞発現系が記載されている。重要なのは、改変による発現レベルの増加にもかかわらず、安定性が見かけ上増加した上記分子は、いずれも特異的なＴ細胞染色を示さなかったということである。
【発明の概要】
【００１３】
本明細書に記載の戦略は、あらゆるＭＨＣクラスII分子に適用可能な一般的戦略を提供するだけでなく、原核発現系でも実施可能であり、かつロイシンジッパーのような異種性／外来性の二量体化モチーフを使用する必要がないため、かかる先行技術の方法よりも優れた重要な利点を提供する。さらに、本明細書に記載の戦略は、導入された改変に直接起因する、特異的Ｔ細胞染色として示される機能性の増加につながる。
【００１４】
しかし驚くべきことに、本発明者らは、組換えＭＨＣクラスII分子に関連した不安定性の問題を克服する、または大幅に軽減することができる一般的方法を特定した。この戦略では、αおよびβ鎖の細胞外部分が存在し、かつα２−β２ドメイン接合点を用いて２つの鎖を結合する操作された／人工的なジスルフィド架橋により、α鎖とβ鎖のヘテロ二量体が安定化されている、組換えＭＨＣクラスII分子を作製する。ジスルフィド結合は、分子が完全に機能する安定なコンホメーションを固定する。ＭＨＣクラスIIヘテロ二量体を安定化させるこの戦略は、汎用性があり、また単一の組換え形式に限定されないため、上で議論したような広範で供給源を要する各場合に応じた最適化の必要性が回避されるという点が重要であり、また有利である。さらにこの戦略は、数多く既存の方法とは異なり、原核発現系／宿主で実施することができる。原核宿主には、正確なジスルフィド架橋形成に一般に必要とされる真核細胞の複雑な仕組みがなく、したがって機能的分子が形成されないということを考えれば、このこと自体が驚くべきことである。本発明は、免疫調節剤の探索および開発の分野の妨げとなっている現在の問題点を解決するだけでなく、Ｔ細胞を開発および改変し、それを治療法として使用するための重要なツールとなるであろう。
【００１５】
したがって、本発明の一態様では、
（i）ＭＨＣクラスIIα鎖の細胞外部分の全部または一部分と、
（ii）ＭＨＣクラスIIβ鎖の細胞外部分の全部または一部分と
を含む組換えＭＨＣクラスII分子が提供され、
（i）および（ii）は、機能的ペプチド結合ドメインを提供し、（i）および（ii）は、前記α鎖のα２ドメイン中に位置するシステイン残基と前記β鎖のβ２ドメイン中に位置するシステイン残基との間のジスルフィド結合により結合しており、前記システイン残基は、天然ＭＨＣクラスIIのα２およびβ２ドメイン中には存在しない。
【００１６】
上で述べたように、２つ以上のポリペプチドから構成され、膜貫通ドメインを有するＭＨＣクラスII分子のようなタンパク質は、特にその膜貫通領域およびあるいは膜に付属する構成要素により安定化される場合が多いため、天然の膜から外れた状態で、かつ特に可溶型において作製するのが困難なことがある。このことはＭＨＣクラスII分子の場合に当てはまり、文献にもそれが反映されており、ＭＨＣクラスII分子が不安定であり、十分な収率で作製できない、またはペプチドを認識してそれと結合することができないことが文献で報告されている。したがって、本発明の分子は安定しており、かつペプチドを認識してそれと結合することもでき、またＴ細胞の染色も可能であるため、先行技術を上回る大きな進歩を示すものである。
【００１７】
上で議論したように、天然のＭＨＣクラスII分子はα鎖とβ鎖を含み、両鎖とも膜貫通領域を有し、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに属する。各鎖の細胞外部分は、それぞれ約９０個のアミノ酸残基からなる２つのドメインから構成され、そのうちの２つの膜遠位ドメインであるα１ドメインとβ１ドメインが、Ｔ細胞エピトープのペプチド結合性に不可欠である、互いに格子状になったα／β構造を形成している。２つの膜近位ドメインであるα２ドメインとβ２ドメインは、ともに分離したＩｇドメインを形成している。αおよびβの両鎖では、約２０個のアミノ酸残基の配列が細胞膜を横断し、膜の細胞質側にはごく短いペプチドセグメントがある。
【００１８】
本発明の分子は、ＭＨＣクラスIIα鎖の細胞外部分の全部または一部分と、ＭＨＣクラスIIβ鎖の細胞外部分の全部または一部分とを含む。ＭＨＣクラスIIα鎖の細胞外部分は、シグナル配列と、膜遠位α１ドメインと、膜近位α２ドメイン（分離したＩｇドメインを形成している）とを含む。膜貫通ドメインとα２ドメインの間にスペーサー領域も存在する。同様に、ＭＨＣクラスIIβ鎖の細胞外部分は、シグナル配列と、膜遠位β１ドメインと、膜近位β２ドメイン（分離したＩｇドメインを形成している）と、スペーサー領域とを含む。
【００１９】
したがって、本明細書で使用される「ＭＨＣクラスIIα鎖の細胞外部分」という用語は、α鎖の膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインを包含しない。実際、本発明の好ましい実施形態では、組換えＭＨＣクラスII分子は、前記膜貫通ドメインのアミノ酸残基（すなわち、専用の膜貫通エクソンによりコードされるアミノ酸）または前記細胞質ドメインのアミノ酸残基のいずれも含まない。
【００２０】
したがって同様に、本明細書で使用される「ＭＨＣクラスIIβ鎖の細胞外部分」という用語は、β鎖の膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインを包含しない。実際、本発明の好ましい実施形態では、組換えＭＨＣクラスII分子は、前記膜貫通ドメインのアミノ酸残基（すなわち、専用の膜貫通エクソンによりコードされるアミノ酸）または前記細胞質ドメインのアミノ酸残基のいずれも含まない。
【００２１】
αおよび／またはβ鎖のすべての前記細胞外部分が本発明の組換え分子（すなわち、シグナルペプチド、α１／β１ドメイン、α２／β２ドメインおよびスペーサー領域）中に存在し得る。しかし、組換え分子が、適当なペプチド、例えばＴ細胞エフェクターペプチドと結合する能力に関して依然として機能的である限り、また前記分子が、人工的な（非天然の）システイン残基を、組換えＭＨＣクラスII分子の安定化に機能するジスルフィド結合の形成に使用可能な形態または立体配置で含む限り、代わりにαおよび／またはβ鎖の細胞外部分の一部分だけが本発明の分子中に存在していればよい。
【００２２】
シグナルペプチドは、特にＭＨＣクラスII分子を原核細胞で発現させる場合、本発明の組換えＭＨＣ分子のαおよび／またはβ鎖中に欠けていてもよい。適当な数のＮ末端アミノ酸残基を欠くこのような構築物は、当業者が容易に設計し作製することができる。またかかる欠如が機能に対して、例えば、ペプチドと結合するまたはＴ細胞を活性化もしくは染色する能力、あるいは分子の安定性に対して影響を及ぼすか否かを容易に試験することもできる。
【００２３】
またスペーサー領域も、例えば、α鎖スペーサーおよびβ鎖スペーサーの９個のアミノ酸がいずれも含まれていない実験例に示されるように、その全体が欠けていても、または短縮されていてもよい。ここでも、適当な数のスペーサーアミノ酸残基を欠くこのような構築物は、当業者が容易に設計し作製することができる。またかかる欠如が機能に対して、例えば、ペプチドと結合するまたはＴ細胞を活性化もしくは染色する能力、あるいは分子の安定性に対して影響を及ぼすか否かを容易に試験することもできる。
【００２４】
本発明の好ましい分子は、α１ドメインの少なくとも一部分とβ１ドメインの少なくとも一部分とを含む。ただし、これらのドメインがペプチドと結合する機能、または本明細書に記載の他の機能、例えば、かかるペプチドをＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に提示する機能が影響を受けない。さらに組換えＭＨＣクラスII分子が全体として、ペプチドをＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に提示するために、かかるペプチドと結合する能力または本明細書に記載の他の機能に関して、依然として機能的でなければならない。好ましくは、完全または完全長のα１および／またはβ１ドメインが存在するか、または実質的に完全または実質的に完全長のα１および／またはβ１ドメインが存在し、前記実質的に完全または実質的に完全長のドメインは、例えば、ペプチドをＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に提示するために、かかるドメインがかかるペプチドと結合する機能、または本明細書に記載の他の機能に影響を与えない、天然配列からの変化、例えば、アミノ酸の付加、欠失または置換を含む。かかる機能に影響を与えずに変異させる、修飾するまたは削除することができるアミノ酸の決定は、当業者の技能の範囲内であろう。ＭＨＣクラスII分子が保持するべき他の好ましい機能は、Ｔ細胞を活性化する能力、より好ましくは、Ｔ細胞を染色する能力である。
【００２５】
したがって、本発明におけるこれらの好ましい分子は、例えば、ペプチドをＴＣＲに提示する、Ｔ細胞を活性化する、またはＴ細胞の染色を可能にするために、かかるペプチドと結合することができるように、十分なα１およびβ１ドメイン残基を含む。
【００２６】
本発明の他の好ましい分子は、α２ドメインの少なくとも一部分とβ２ドメインの少なくとも一部分とを含む。ただし、ジスルフィド結合を形成するために使用される非天然のシステイン残基が存在する。かかるシステイン残基は、システイン残基間にジスルフィド架橋を形成することができるように、また組換えＭＨＣクラスII分子の安定化に作用することができるように、互いに適切な方向および距離で存在している必要がある。さらに組換えＭＨＣクラスII分子が全体として、ペプチドをＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に提示するために、かかるペプチドと結合する能力または本明細書に記載の他の機能に関して、依然として機能的でなければならない。好ましくは、完全または完全長のα２および／またはβ２ドメインが存在するか、または実質的に完全または実質的に完全長のα２および／またはβ２ドメインが存在し、前記実質的に完全または実質的に完全長のドメインは、α２ドメインとβ２ドメイン間のジスルフィド結合の形成およびその結果としての組換えＭＨＣクラスII分子の安定化に影響を与えず、かつα２またはβ２ドメインのフォールディングに悪影響を及ぼさない、天然配列からの変化、例えば、アミノ酸の付加、欠失または置換を含む。かかる機能に影響を与えずに変異させる、修飾するまたは削除することができるアミノ酸の決定は、当業者の技能の範囲内であろう。
【００２７】
各種の構造的および機能的ドメインアミノ酸位置ならびにαおよびβＭＨＣクラスII鎖の領域は、当該技術分野において公知であり記載されている（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，上記）。また各種ドメインの配置も図３に示されており、このような情報を用いて、本明細書に記載の本発明の組換え分子（例えば、図７を参照されたい）を容易に設計することができる。
【００２８】
本発明の組換え分子がペプチドと結合する、Ｔ細胞を活性化する、またはＴ細胞を染色する能力を評価するための適当な機能試験も当業者に公知であり、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅのような表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術およびＦＡＣＳのようなフローサイトメトリー技術がこれに含まれるであろう。フローサイトメトリーは生細胞と組み合わせて使用できるため、これを使用することが特に好ましい。
【００２９】
本明細書で使用される「ジスルフィド結合」という用語は、ＭＨＣクラスIIヘテロ二量体のα鎖のα２ドメイン中に位置するシステイン残基とβ鎖のβ２ドメイン中に位置するシステイン残基との間で形成される（すなわち、鎖内ではなく、鎖間のジスルフィド結合である）、任意のジスルフィド架橋、例えば、操作されたまたは人工的なジスルフィド架橋を表す。前記ジスルフィド結合はα鎖とβ鎖間で共有結合を形成し、ＭＨＣクラスIIヘテロ二量体の安定化に作用する。したがって、本発明の組換え分子は安定であるが、完全な機能性を保持している。例えば、本発明の組換え分子は、その同族Ｔ細胞受容体リガンドに対する本来の特異性を保持し、好ましくは、Ｔ細胞を活性化する、またはＴ細胞を染色する能力を保持している。
【００３０】
安定であるまたは安定化されているという本発明のＭＨＣクラスII分子の特性は、温度変性に対する耐性の増加（例えば、ＥＬＩＳＡ法、ＳＰＲ法または円二色法により測定される）のような公知の方法により評価することができる。さらに好ましい試験は、ヘテロ二量体の保存をＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル上で評価することである。インタクトで安定なジスルフィド結合ヘテロ二量体は、非還元条件下で泳動したＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル上で容易に確認することができ、この場合、インタクトのヘテロ二量体に対応する適当な分子量の位置にあるバンドを可視化することができる。適当なアッセイを実施例で示す（図５および１０を参照されたい）。
【００３１】
かかるジスルフィド結合は、天然のＭＨＣクラスIIα２およびβ２ドメインには通常は存在しないシステイン残基間で形成される。したがって、例えば、部位特異的突然変異により天然分子中の適当な非システイン残基からシステイン残基に変異させることにより、システイン残基を操作するかまたは人工的に導入して、α２およびβ２ドメイン内に新たに導入されたシステイン残基間でジスルフィド結合を形成させる。このような結合は内部ジスルフィド結合とも呼ばれる。
【００３２】
システインへの変異に適した残基は、天然のＭＨＣクラスIIヘテロ二量体において、約６Å（０．６ｎｍ）、７Å（０．７ｎｍ）またはそれ未満だけ離れた、例えば、４Å（０．４ｎｍ）または５Å（０．５ｎｍ）〜６．５Å（０．６５ｎｍ）または７Å（０．７ｎｍ）の範囲、好ましくは、５Å（０．５ｎｍ）〜６．５Å（０．６５ｎｍ）の範囲、最も好ましくは、４Å（０．４ｎｍ）または５Å（０．５ｎｍ）〜５．６Å（０．５６ｎｍ）または６Å（０．６ｎｍ）の範囲だけ離れた別々のβ炭素を有することが好ましい。変異に好ましい部位は、種間ならびに特定種内のアイソフォーム間およびアイソタイプ間で保存されている。具体的には変異に好ましい部位は、マウスとヒトのＭＨＣクラスII配列間で保存されているか、またはヒトＭＨＣクラスIIアイソタイプ（例えばＤＰ、ＤＱおよびＤＲなど）間またはマウスアイソタイプ（例えばＩ−ＥおよびＩ−Ａなど）間で保存されている。
【００３３】
代わりにまたは加えて、結晶構造の３Ｄ重ね合わせに基づく構造評価により、変異に好ましい部位を特定する。このようにして、α２ドメインとβ２ドメイン間の接合点を形成している残基を調べることができ、またさらなる解析またはシステイン残基への変異のために、７Å以下（または実際は、上記の他の任意の距離もしくは範囲）の距離だけ離れたβ炭素を有する側鎖を選択することができる。かかる構造評価を行うための方法は当業者に公知であろう。例えば、この解析を行うために、ＭＨＣクラスII分子の結晶構造を、例えばＲＣＳＢ  ＰＤＢタンパク質データバンクから自由に入手することができる。かかる結晶構造の３Ｄ重ね合わせ行うための適当なソフトウェアまたはその他の手段も当該技術分野において、例えば、ＰｙＭＯＬ、ＭＯＬＭＯＬ、ＤｅｅｐＶｉｅｗのような自由に入手できるソフトウェア、またはｉＳｕｐｅｒｐｏｓｅのような専用のウェブサイトを用いて利用することができる。
【００３４】
特に好ましい部位の対は、ジスルフィド結合を形成するようにシステインが導入された、以下に挙げる対のうちの１つ以上、すなわち、Ｐｒｏ９６α2−Ｓｅｒ１１９β2（１位）、Ｓｅｒ９５α2−Ｓｅｒ１２１β2（２位）、Ａｒｇ９４α2−Ａｓｎ１５１β2（３位）、Ｐｈｅ１４８α2−Ｇｌｙ１５２β2（４位）、Ｐｒｏ９６α2−Ｔｈｒ１０１β2（５位）、Ｐｒｏ９６α2−Ｓｅｒ１２１β2（６位）、Ｉｌｅ１０６α2−Ａｓｎ１５１β2（７位）およびＳｅｒ９５α2−Ａｓｐ１２２β2（８位）のうちの１つ以上の対である。これらの対はβ炭素の近接度の順に並べられており、どの対を用いてもよいが、１位〜４位または１位〜３位の対が好ましい。特に１位または２位の対が好ましい。
【００３５】
α２およびβ２ドメイン中にあるおよび上記の残基の対におけるアミノ酸位置およびその位置の天然アミノ酸の性質は、マウスＩ−ＥアイソタイプのＭＨＣクラスII分子に適している。アミノ酸番号付けは、成熟ペプチドのアミノ酸に関するものである（すなわち、番号付けにはシグナルペプチドは含まれていない）。改変システイン残基の位置を特定するために使用することができる参照配列の例は、ＩＭＧＴデータベースで得られるＩ−Ｅ配列であり、これを図３に示す（α鎖ではＨ−２ＥＡ*０２（配列番号１）およびβ鎖ではＨ−２ＥＢ*０１（配列番号２）で示される）。実際、図３では１位、２位および３位の残基の位置に黒い影で印が付してあり、その他の順位の残基は図３から容易にわかる。
【００３６】
したがって、別途記述がない限り、本明細書に記載のＭＨＣクラスIIアミノ酸残基の番号付けおよび性質は、Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ−Ｐ．ら，２００９（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３７：Ｄ１００６−Ｄ１０１２，データベース記事）に記載されているＩＭＧＴ方式および以下のウェブサイト参考文献：ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ．にあるＩＭＧＴデータベースに従っている。関連するＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号も実施例に記載されている。例えば、Ｈ−２Ｅ（マウスＩ−Ｅ）で関連するアクセッション番号はＫ００９７１（α鎖）およびＡＦ０５０１５７（β鎖）である。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態では、ジスルフィド結合は、マウスＩ−Ｅアイソタイプの成熟ポリペプチドのＰｒｏ９６α2−Ｓｅｒ１１９β2（１位）、Ｓｅｒ９５α2−Ｓｅｒ１２１β2（２位）もしくはＡｒｇ９４α2−Ａｓｎ１５１β2（３位）に対応する残基、または別のＭＨＣクラスIIアイソタイプのこれに相当する位置に位置するシステイン残基間にある。かかるシステイン残基の位置を決定するための参照配列が本明細書に記載されている。
【００３８】
上で議論した好ましい部位の対は、１ＦＮＧ番号付け、すなわち、Ｐｒｏ９６α2−Ｓｅｒ１１８β2（１位）、Ｓｅｒ９５α2−Ｓｅｒ１２０β2（２位）、Ａｒｇ９４α2−Ａｓｎ１５０β2（３位）、Ｐｈｅ１４８α2−Ｇｌｙ１５１β2（４位）、Ｐｒｏ９６α2−Ｔｈｒ１００β2（５位）、Ｐｒｏ９６α2−Ｓｅｒ１２０β2（６位）、Ｉｌｅ１０６α2−Ａｓｎ１５０β2（７位）およびＳｅｒ９５α2−Ａｓｐ１２１β2（８位）のうちの１つ以上、ならびにＩＭＧＴ番号付けの両方を用いて、表２にも示されている。１ＦＮＧ番号付けに関して、表２のアミノ酸番号付けは、生体高分子の三次元構造情報のタンパク質データバンク（ＰＤＢ）データベース（登録番号ＰＤＢ  ＩＤ：１ＦＮＧ）で番号付けに対応しており、このデータベース登録のβ鎖中の適当な残基の位置が、ＩＭＧＴデータベース配列のこれに相当する残基よりも１アミノ酸小さいということがわかる。したがって、この命名法は少し異なっている。
【００３９】
表２および図３に示されている残基に相当する残基は、他のマウスアイソタイプ、例えばＩ−Ａアイソタイプ、またはヒトアイソタイプにおいて、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌソフトウェアのような適当なソフトウェアを用いたアライメントにより容易に特定することができる。実際にマウスＩ−Ａアイソタイプとのアライメントが図３に示されている。さらに、ヒトＭＨＣクラスIIアロタイプであるＨＬＡ−ＤＰ、−ＤＱおよび−ＤＲとのアライメントの例も図７に示されている。表２および図３に示されている１位、２位および３位の残基に相当する残基の位置は、α鎖に関しては図７Ａおよびβ鎖に関しては図７Ｂの中で黒い影で印が付してあり、その他の順位の残基の位置は図７から容易にわかる。表２および図３に示されているα２およびβ２の位置は、ヒトＨＬＡレパートリー全体で完全に保存されていることがわかる。
【００４０】
したがって、所望の順位のジスルフィド結合を形成するために、図７に示される配列アライメントを上の情報とともに用いて、任意のヒトＭＨＣクラスII対立遺伝子のα２およびβ２ドメインにおいて、システインに変異させるのに適当な残基の位置を容易に特定することができる。同様のアライメント法を用いて、他の任意の種またはアイソタイプにおいて相当する残基を特定することができる。
【００４１】
本明細書で議論されるジスルフィド結合による安定化結合は、先行技術で述べられているような、ＭＨＣクラスII分子を安定化する他の方法および手段と適合性がある。例えば、ジスルフィド結合を、ロイシンジッパーモチーフのような各種の二量体化モチーフ（例えば、Ｑｕａｒｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１およびＣｒａｗｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６（上記）に記載されているような）とともに、またはＩｇ融合（すなわち、例えばＣａｓａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７（上記）に記載されているような免疫グロブリンのＦｃ部分との融合）とともに用いることができ、また本発明の分子を、それをコードするベクターとともに適当に設計することができる。
【００４２】
本明細書の他の箇所に記載されているように、原核宿主、例えば細菌宿主で、本発明の分子の発現または産生させることが好ましく、このような実施形態、具体的には分子を封入体から単離する実施形態では、ロイシンジッパーモチーフまたはその他の二量体化モチーフを使用しないことが好ましい。
【００４３】
したがって、本発明の好ましい態様では、
（i）ＭＨＣクラスIIα鎖の細胞外部分の全部または一部分と、
（ii）ＭＨＣクラスIIβ鎖の細胞外部分の全部または一部分と
を含み、細菌宿主で発現可能な組換えＭＨＣクラスII分子が提供され、
（i）および（ii）は、機能的ペプチド結合ドメインを提供し、（i）および（ii）は、前記α鎖のα２ドメイン中に位置するシステイン残基と前記β鎖のβ２ドメイン中に位置するシステイン残基との間のジスルフィド結合により結合しており、前記システイン残基は、天然ＭＨＣクラスIIのα２およびβ２ドメイン中には存在しない。
【００４４】
別の好ましい態様では、
（i）ＭＨＣクラスIIα鎖の細胞外部分の全部または一部分と、
（ii）ＭＨＣクラスIIβ鎖の細胞外部分の全部または一部分と
を含む組換えＭＨＣクラスII分子が提供され、
（i）および（ii）は、機能的ペプチド結合ドメインを提供し、（i）および（ii）は、前記α鎖のα２ドメイン中に位置するシステイン残基と前記β鎖のβ２ドメイン中に位置するシステイン残基との間のジスルフィド結合により結合しており、前記システイン残基は、天然ＭＨＣクラスIIのα２およびβ２ドメイン中には存在せず、さらに前記組換え分子はロイシンジッパーモチーフを含まない。他の実施形態では、二量体化モチーフが全く含まれない。これらの実施形態では、組換えＭＨＣクラスII分子が原核宿主、例えば細菌宿主で発現させることができることが好ましい。
【００４５】
本発明のジスルフィド結合による結合を、ＭＨＣクラスII分子を安定化させる他の方法および手段とともに使用することができるが、前記ジスルフィド結合は、ＭＨＣクラスII分子を安定化させる単独の手段を提供する。実際、このような実施形態が好ましい。本明細書で使用される「ＭＨＣクラスII分子を安定化させる単独の手段」という用語は、特定のＭＨＣクラスII分子に天然にまたは本来的に存在するあらゆる安定化以外の、分子を安定化させるための単独または唯一の手段を提供するジスルフィド結合を表す。例えば、本発明のジスルフィド結合は、ＭＨＣクラスII分子を安定化させるための単独または唯一の、人工的または操作されたまたは非天然の手段を提供する。したがって、このような実施形態には、当該技術分野において記載されている、ロイシンジッパーまたはその他の二量体化モチーフのような他の安定化の手段の使用は含まれていない。
【００４６】
かかるジスルフィド結合が、二量体化モチーフのような非天然の安定化の手段をさらに使用することなくＭＨＣクラスII分子を十分に安定化させるという驚くべき発見は、本明細書に記載のデータに明確に示されており、本明細書では、ＭＨＣクラスII分子が繊維状ファージの表面に安定かつ機能的な形態で示される。この発見は、Ｉｇフォールドトポロジーで作製される操作された分子が原核宿主で発現されたということを考慮すると、特に驚くべきことであった。天然では生存している真核ドメインでのみ生じるＩｇフォールドは、その機能的なトポロジーに達するために、天然のシステイン間で形成される保存されたドメイン内Ｓ−Ｓ架橋を必要とする（Ｈａｌａｂｙ，Ｄ．Ｍ．，ら，１９９９，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，１２（７）：５６３）。したがって、原核宿主には正確なＳ−Ｓ架橋形成に必要な真核細胞の複雑なシャペロン機構が必然的に欠けているため、ＭＨＣクラスII分子がそこで発現された場合、異常なＳ−Ｓ架橋形成が顕著であるため、機能的な発現が行われないということが一般に認められている。したがってこれらの系における、明らかに人工的なＳ−Ｓ架橋形成とまでは言わないが、システイン数の増加を含む操作戦略は、一般に発展不可能であると考えられている。ここで本発明者らは、共有結合による二量体形成（図５および１０）により示されるようにファージ上に機能的分子が示され、それらが同族リガンドとの特異的結合（図６および９）を示しているため、このことが当てはまらないという証拠を明確に記載する。
【００４７】
一実施形態では、本発明のＭＨＣクラスII分子のαおよびβ鎖は、鎖内ジスルフィド結合、例えば、天然のシステイン残基間に存在する天然の鎖内ジスルフィド結合も含む。このような天然の鎖内ジスルフィド結合は、例えば、α２およびβ２ドメインのＩｇフォールドトポロジーを形成するために、これらのドメイン中に存在していてもよい。さらに、ＭＨＣクラスII分子の大部分はβ１ドメイン内に、βシート底面とαへリックス部分とを結び付けるドメイン内ジスルフィド架橋を有する。さらに重要なのは、多くのＭＨＣクラスII分子が、どのジスルフィド架橋形成にも関与しないが、新たに導入された非天然のシステイン残基と誤ったジスルフィド結合を形成し得る遊離システインを、β１ドメインのβシート底面にさらに含むということである。したがって、本発明の好ましい実施形態、特に原核発現を用いる実施形態では、例えば、全体の構造を保つセリンまたはアラニンのような別の残基への変異により、この残基を除去する。当業者は、任意のＭＨＣクラスII対立遺伝子において、このシステイン残基の位置を容易に特定することができるであろう。例えば、このシステインは、図３Ｂに示される完全長のＩＭＧＴ参照配列Ｈ−２ＥＢ＊０１（配列番号２）中のβ鎖残基３８または成熟ＩＭＧＴ参照配列（すなわち、シグナルペプチドを含まない）中の残基１２に対応する。
【００４８】
新たに導入された非天然のシステイン残基との誤ったジスルフィド結合の形成にも関与し得るその他のβ１ドメインシステイン（架橋を形成する）も、当業者により容易に位置が特定され得る。例えば、これらは、図３Ｂに示される完全長のＩＭＧＴ参照配列Ｈ−２ＥＢ＊０１（配列番号２）残基４２および１０６または成熟ＩＭＧＴ参照配列（すなわち、シグナルペプチドを含まない）のそれぞれ残基１６および８０の位置にある。本発明の別の好ましい実施形態では、１つ以上のこのようなシステイン残基が存在しない。結合形成を防ぐために、１つ以上の適当な天然のシステイン残基をジスルフィド結合形成に関与しない別のアミノ酸残基へ変異させることにより、これを達成することができる。システインと置き換わる残基の例は、分子の全体構造を保つ残基、例えば水素結合を保つ残基であろう。上で議論したＳｅｒまたはＡｌａのいずれかが好ましい選択であろう。
【００４９】
したがって、上で議論した１つ以上の天然システイン残基の除去は、天然のシステイン残基と本発明の新たに操作された非天然のシステイン残基との間での誤ったジスルフィド結合形成を防ぐのに役立つであろう。したがって、本発明の好ましい実施形態では、β１ドメイン中の１つ以上の天然システイン残基を除去する。本発明の特に好ましい実施形態では、完全長の参照配列Ｈ−２ＥＢ＊０１（配列番号２）の３８、４２もしくは１０６の位置に対応する１つ以上のシステイン残基（または成熟参照配列中のそれに相当する残基）、または別のＭＨＣクラスIIアイソタイプのそれに相当する位置にある１つ以上のシステイン残基を除去する。
【００５０】
本明細書で使用される「機能的ペプチド結合ドメイン」という用語は、ペプチド、例えばＴ細胞エフェクターペプチドまたは抗原ペプチドと結合することができる、本発明の組換えＭＨＣクラスII分子中のドメインを表す。ペプチドとのかかる結合は検出可能なレベルであるべきであり、また結合を検出するための適当な方法は当業者に公知であろう（例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術またはフローサイトメトリー技術）。いくつかの実施形態では、前記ペプチドとは、前記ペプチドのＴＣＲへの提示が可能なように、または少なくとも前記ペプチドのＴＣＲへの提示が可能か否かを試験できるように結合する。
【００５１】
好ましくは、かかるペプチドは、ＴＣＲとｐＭＨＣ複合体の結合が可能となるようにＭＨＣクラスII分子と結合または会合する。より好ましくは、ＴＣＲとのかかる相互作用により、ｐＭＨＣ複合体を認識するＴ細胞が染色されるか、または他の方法で可視化される。好ましくは、かかるペプチド結合ドメインは、ペプチドと結合し、次いでＴＣＲを介してＴ細胞の活性化を引き起こすことができる。例えば、かかるペプチド結合ドメインは、Ｔヘルパー細胞の、例えばサイトカイン（ＩＬ−２など）の分泌または増殖の誘導（例えば、ＢｒｄＵ取込みによりｃｐｍとして測定される）を誘発することができる。かかるペプチド結合ドメインは一般に、ＭＨＣクラスII分子のα１およびβ１ドメイン由来の残基により形成さる。
【００５２】
本発明のＭＨＣクラスII分子を、空の形態または未負荷の形態で、すなわち、ペプチドが上記ペプチド結合ドメインと結合していない状態（すなわち、無ペプチド）で提供し得る。この場合、後でＭＨＣクラスII分子に適当なペプチドをインビトロで負荷することができる。このようなインビトロでの負荷は、クラスIIヘテロ二量体の安定性を補助するために、例えば、短いリンカーを介してＭＨＣβ鎖と共有結合した融合タンパク質としてペプチドを作製することにより、ペプチドが付加した状態で作製しなければならない多くの先行技術のＭＨＣクラスII分子よりも有利である。インビトロ負荷により、異なるＭＨＣ−ペプチド複合体それぞれに対する異なる発現ベクターを得る必要なしに、真に汎用性のあるＭＨＣクラスII分子を作製することができる。
【００５３】
本発明のいくつかの実施形態では、組換えＭＨＣクラスII分子は、上記ペプチド結合ドメインと結合または会合するペプチドを有する。ＭＨＣクラスII分子のα１およびβ１ドメイン由来の残基により形成されたペプチド結合ドメインとの結合または会合に適した任意のペプチドを使用することができる。一般にこのようなペプチドは、１２〜２５マーであり、通常、α１およびβ１ドメインにより形成される溝の両端からはみ出ている。
【００５４】
天然のＭＨＣクラスII分子では、かかるペプチドは外来抗原に由来する。本発明では、任意のこのようなペプチドを使用し得る。例えば、当該技術分野において、ＭＨＣクラスII分子により提示されてＴＣＲ結合およびＴ細胞活性化を生じる特定のＴ細胞エフェクターペプチドがいくつか同定され記載されており、そのいずれも本発明とともに使用し得る。特に、ＭＨＣクラスII分子上で提示される特定のペプチドが、特定の疾患と関連するものとして同定されており、組換えＭＨＣクラスII分子がペプチドと会合する本発明の実施形態では、このような疾患特異的なペプチドが好ましい。このようなペプチドは当該技術分野においていくつか記載されており、将来的には他のペプチドも同定されるであろうが、上記ペプチドはいずれも、本明細書に記載のＭＨＣクラスII分子との使用に適するであろう。
【００５５】
ＭＨＣクラスII分子のペプチド結合ドメインと会合または結合するペプチドの代表例には、ＨＬＡ−ＤＱ２  ＭＨＣクラスII分子上で提示されることがわかっており、セリアック病と関連するヒトα−II−グリアジン（Ｎ−ＰＱＰＥＬＰＹＰＯＰＥ−Ｃ）；ＨＬＡ−ＤＲ４  ＭＨＣクラスII分子上で提示されることがわかっており、関節リウマチと関連するヒトｈＣkappaaa40-48（Ｎ−ＷＫＩＤＧＳＥＲＱ−Ｃ）；ＨＬＡ−ＤＰ１  ＭＨＣクラスII分子上で提示されることがわかっており、破傷風と関連するヒトＴＴaa947-967（Ｎ−ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ−Ｃ）；およびマウスＩ−ＥdクラスII分子上で提示されることがわかっている、Ｈ．インフルエンザのヘマグルチニン（ＨＡ）に由来するペプチド（ａａ１１０−１２０：Ｎ−ＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥ−Ｃ）がある。
【００５６】
あるいは他のペプチドを使用して、例えば、そのペプチドがペプチド結合ドメインと結合することができるか否か、またそのペプチドにより、ＴＣＲを介したＴ細胞結合および好ましくはＴ細胞染色が可能であるか否か、またはＴ細胞活性化が可能であるか否かを確認してもよい。このように、本発明の分子を用いて、Ｔ細胞エピトープとして働く、これまで未知であった新規なペプチド（例えば、抗原ペプチド）を同定することができる。
【００５７】
あるいは、組換えＭＨＣクラスII分子を、無関係な、すなわちＴ細胞エフェクターでないペプチド（いわゆる「スタッファー」ペプチド）（このペプチドをＭＨＣ分子と結合させているリンカーの切断によりＭＨＣクラスII分子から解離し得る）と会合させ、次いで、インビトロペプチド交換反応で目的とするＴ細胞エフェクターペプチドと置き換えることができる。
【００５８】
任意の適当な方法で、かかるペプチドとＭＨＣクラスII分子との結合または会合を促進することができる。例えば、かかるペプチドがＭＨＣクラスII分子とともに産生されるように本発明の構築物を操作する（例えば、これらを同じ構築物にコードさせる、例えば、これらを適当なリンカー配列によりβＭＨＣクラスII鎖またはαＭＨＣクラスII鎖と共有結合させてコードさせることにより、または同一宿主細胞内の異なる構築物にコードさせることにより）ことにより、適当なＴヘルパー細胞による認識に適した前記ペプチドを提示する、またはそれと結合もしくは会合する組換えＭＨＣクラスII分子を産生させることが可能である。このようなペプチド関連分子を作製するための適当な方法は、Ｋｏｚｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）により記載されている（Ｎａｔｕｒｅ，３６９：１５１−１５４）。Ｋｏｚｏｎｏの方法では１８アミノ酸残基のリンカーを使用するが、本発明の好ましい実施形態では、これよりも短いリンカー、例えば１５アミノ酸リンカー（例えば、（Ｇ4Ｓ）3のようなＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー）または６、７もしくは８アミノ酸残基のリンカー（例えば、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー、例えばＧＳＧＳＧＳ、ＧＧＳＧＳＧＳ、ＳＧＳＧＳＧＳまたはＳＧＧＳＧＳＧＳなど）など、最も好ましくは、６アミノ酸残基のリンカーを使用する。
【００５９】
本発明は、任意のタイプのＭＨＣクラスII分子に対して一般的に適用可能である。例えば本発明は、任意の種由来のＭＨＣクラスII分子およびその種内のＭＨＣクラスII分子の任意のサブタイプに対して適用可能である。特に、本明細書で特定された、非天然のシステイン残基に変異させて１つ以上の鎖間ジスルフィド結合を形成させることが可能な残基が種間で保存されていることにより、このアプローチの一般性が支えられている。したがって、本発明をあらゆる哺乳動物のＭＨＣクラスII分子、例えば、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ヤギおよびヒツジ、特にヒトおよびマウスの分子に適用することができる。例えば、本発明は、ＤＰ、ＤＱおよびＤＲヒトＭＨＣクラスII分子（すなわち、ヒトにおいて同定されているＭＨＣクラスII分子の３つの機能的タイプ）に対して、またマウスＩ−ＡおよびＩ−Ｅ分子（例えば、Ｉ−ＥdおよびＩ−Ｅk分子、好ましくはＩ−Ｅd）に対しても適用可能である。Ｉ−ＡおよびＩ−Ｅ分子の他の例を下の表に示す。
【００６０】
【表１】
0005537675.tif 000002
【００６１】
最も好ましいＭＨＣクラスII分子はヒトである。
【００６２】
システインへの変異のために特定された残基は種間で保存されているため、当業者であれば、任意の種由来の任意のＭＨＣクラスII分子において、変異のための対応する、同等の適当な残基を容易に特定し、１つ以上の適当な鎖間ジスルフィド結合により安定化された組換えＭＨＣクラスII分子を作製することができるであろう。
【００６３】
本発明の一実施形態では、組換えＭＨＣクラスII分子を、細胞または別の生物学的存在もしくはパッケージの表面、例えば、繊維状ファージの表面で発現させる。この型は、本明細書では「不溶性」型または「不溶性」分子と呼ばれることがある。このような実施形態では、一般に本発明のＭＨＣクラスII分子のα鎖またはβ鎖が、当該存在物の表面で通常発現される、または当該存在物の表面に組み込まれているかそれに付随しているタンパク質との融合タンパク質として操作される。
【００６４】
ファージ表面タンパク質との融合体としての発現が好ましく、このような実施形態では、本発明のＭＨＣクラスII分子のα鎖またはβ鎖と任意の適当なファージ表面タンパク質との融合が考えられる。好ましい例は、ｇｐIII、ｇｐVIII、ｇｐVIIまたはｇｐIXとの融合、最も好ましくはｇｐIIIとの融合である。ファージ粒子表面での本発明のＭＨＣクラスII分子発現の方法論は、当業者の技術の範囲内であり、技術および方法の例が実施例に記載されている。好ましい方法論は、例えば国際公開第０９／０２４５９１号に記載されている。
【００６５】
本発明の別の実施形態では、組換えＭＨＣ分子は可溶性分子、例えば、ウイルスキャプシドタンパク質との融合体または生物学的存在の表面との会合または複合体形成を生じる他のタンパク質との融合体などとして細胞または生物学的存在の表面に付随していないまたはそこで発現されない、本発明のＭＨＣクラスII分子である。したがって、可溶性分子の例としては、本発明の分子の（i）および（ii）の細胞外部分のみを含む分子が挙げられ、また分子の溶解性に影響を与えない他の短い構成要素、例えば親和性タグおよび／または二量体化モチーフのような短いＣ末端伸長などを含めた外部ドメインも挙げられる。作製方法に応じて、かかる可溶性分子は、宿主細胞から分泌されるか、または他の任意の適当な方法により宿主細胞から入手され得る。かかる可溶性分子を、実質的に純粋な形態で、または精製もしくは単離された調製物として得てもよい。例えば、かかる可溶性分子を、実質的に他のタンパク質を含まない形態で作製し得る。
【００６６】
本発明の好ましい実施形態では、組換えＭＨＣクラスII分子を、例えば多価性の多量体型で得てもよい。一般に単一のｐＭＨＣ複合体とＴ細胞受容体との間の親和性は非常に低いため、かかる多量体型は、ＭＨＣクラスII分子とＴ細胞受容体の結合を可能にするのに有利である場合が多い。かかる多量体型は、複数（２つ以上）の本発明の組換えＭＨＣクラスII分子を含む。複数のＭＨＣクラスII分子はそれぞれ同一であることが好ましい。
【００６７】
多量体型のＭＨＣクラスII分子を調製する任意の適当な方法を使用してよく、そのうちのいくつかは、当該技術分野において記載されている（例えば、Ｖｏｌｌｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８（上記）を参照されたい）。多量体型の本発明のＭＨＣクラスII分子を調製するのに特に有利な方法は、繊維状ファージ表面での提示を利用するものである。このような方法では、ＭＨＣクラスII分子が融合し付随する適当なファージ構造タンパク質を選択することにより、多量体を作製するためにファージ分子の天然の構造を利用することができる。例えば、ｇｐIII、ｇｐVIIまたはｇｐIXとの融合、好ましくはｇｐIIIとの融合を用いて、各ファージ粒子の表面に３〜５コピーのＭＨＣクラスII分子を得ることができる。ｇｐVIIIとの融合を用いて、これよりも多くのコピーを得ることができる（野生型ファージには、約２７００コピーのｇｐVIIIが存在する）。したがって重要なのは、ｐVIII提示法により、ＭＨＣの価数がｇｐIII提示法および古典的なテトラマー技術に比べて少なくとも一桁分増加するため、感度が大幅に増加するということである。これにより新たな興味深い適用が開拓されるであろう。
【００６８】
既知のファージ提示法および構築物設計技術、例えば、ファージミド構築物および改変型のヘルパーファージを用いて、ファージ表面のＭＨＣクラスII分子のコピー数を変化させることができる。ファージ表面に多量体ＭＨＣクラスII分子を生成する能力を用いれば、１回の迅速な費用効率の高い工程で多量体ＭＨＣクラスII分子の製造または作製が可能となるという点で有利である。Ｖｏｌｌｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）に記載されているような従来のテトラマー技術では、各構成要素を別々に作製し、混合して複合体を形成し、精製した後に試薬が下流での適用に適した状態になるが、これとは極めて対照的である。
【００６９】
したがって、好ましい多量体は、互いに会合した２つ、３つ、４つ、５つまたはそれを上回る組換えＭＨＣクラスII分子を含む。このような会合は、当該技術分野において既知であり記載されている方法を用いて行われ得るが、一般的には、リンカー分子のような別の結合により仲介される。適当なリンカー分子は当該技術分野において公知で、記載されており、特に適切なリンカー分子は、組換え分子が結合することができる複数の結合部位を有する。例えば、それぞれが複数のビオチン結合部位を有する、アビジンおよびストレプトアビジン（またはビオチンと多価的に結合する他の任意の分子）のような複数の結合分子を使用し得る。したがって、当該技術分野で公知の方法（例えば、ＡｖｉＴａｇまたはその他のＢｉｒＡ基質を用いて酵素的ビオチン化を可能にする）により組換えＭＨＣ分子へビオチンを組み込むことにより、多量体、例えば四量体のＭＨＣ分子を形成することが可能である。また、例えば、蛍光ストレプトアビジンを用いて、または標識とファージコートタンパク質（例えば、ＭＨＣクラスII分子の提示用に選択したものとは異なるタイプのコートタンパク質）との融合により、標識を多量体型に好都合に組み込むこともできる。こうした標識を組み込むことにより、既知の各種技術で四量体を迅速に検出することが可能となる。例えば、蛍光標識により、特に有利な、ＦＡＣＳ解析のようなフローサイトメトリー技術を用いることが可能となる。
【００７０】
また、本発明のＭＨＣクラスII分子またはその多量体を、平面状または粒子状の固体支持体のような固体支持体、例えば膜、プレートまたはビーズの上にコーティングし得る。このための技術は当該技術分野において公知であり、記載されている。
【００７１】
本発明のＭＨＣクラスII分子、および前記分子を安定化させるために、本明細書に記載のようにＭＨＣクラスII分子のα２ドメインとβ２ドメイン間の１つ以上の操作されたジスルフィド結合を用いることは、ＭＨＣクラスII分子作製のためのあらゆる先行技術の方法と適合性がある。したがって、本発明は、当該技術分野において記載されている従来の型のＭＨＣクラスII分子のいずれとも適合性があり、作製効率および生成物の安定性を向上させるであろう。特に、本発明により組換えＭＨＣクラスIIの適用性および汎用性が広がるため、分子は、例えば、（i）細菌ペリプラズム内の機能的可溶性分子、（ii）好ましくは、現在の標準的なプロトコルにより得られるもの（最大で出発物質の３０％、例えば、Ａｒｉｍｉｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５（上記）を参照されたい）よりも実質的に高い収率で精製した後に、可溶化し機能的な存在にリフォールディングすることができる、細菌封入体の非機能的構成要素、（iii）繊維状ファージ系でファージ提示される構成要素、（iv）真核細胞内のＩｇ融合体、および（v）真核細胞内の可溶性ＭＨＣクラスII分子として、ジスルフィド結合により安定化された形態で作製され得る。
【００７２】
アプローチ（ii）（封入体アプローチ）およびアプローチ（iii）（ファージ提示アプローチ）は、組換えＭＨＣクラスII分子の効率的な使用で非常に重要な２つの適用を直ちに行うことが可能な点で有利であり、このうちアプローチ（iii）は全く新規なものである。この点に関して、繊維状ファージビリオン上でのｐＭＨＣクラスIIの良好な機能的提示法はこれまで達成されたことがなく、ビリオンをわずかなコストで迅速に作製し得ることを除けば、一連の新たなまたは向上した適用、例えば（ａ）ＭＨＣクラスIIに関連したファージ提示ペプチドライブラリー；（ｂ）所与のｐＭＨＣクラスIIの組合せの極めて迅速かつ簡便な作製；および（ｃ）四量体のような従来のｐＭＨＣクラスII多量体に代わるＭＨＣクラスII分子の多価の繊維状ファージ提示などを開拓するものである。
【００７３】
本発明のＭＨＣクラスII分子には、研究試薬として特定の価値および用途がある。このことは、本明細書に記載の多価型およびファージ提示型（ＭＨＣクラスII分子が提示されるファージ粒子の固有の構造により、多価になるよう容易に設計することができる）について特に当てはまる。したがって、四量体型およびファージ提示型のＭＨＣクラスII分子、特に多価ファージ提示型がこの用途には好適である。本発明の四量体型または多価ファージ提示型のＭＨＣクラスII分子を、従来の四量体が使用されている任意の適用に好ましい代替試薬として使用することができる。本発明の分子を従来の四量体の代わりに使用することができる好ましい適用は、一般に二量体およびより高次のオリゴマーのようなｐＭＨＣオリゴマーを用いたフローサイトメトリーによるＴ細胞の検出を含む、Ｔ細胞のＭＨＣ染色におけるものである。本明細書に示されているデータは、本発明のＭＨＣ分子をフローサイトメトリー解析で使用しＴ細胞を染色することができるということを示している。先行技術の多くのＭＨＣクラスII四量体は、Ｔ細胞を活性化することができても、抗原特異的ＴＨ細胞を染色することができないため、このことは非常に有利かつ重要な特性である。したがって、本発明の好ましいＭＨＣクラスII分子は、例えばフローサイトメトリーを用いて検出できるように、Ｔ細胞を染色する能力を有する。単量体型を用いてＴ細胞の染色を観察することは可能であるが、この特性は、特に多量体または多価型の分子で観察される。多量体ファージ提示型のさらなる利点は、一般に、比較的力価の低いファージを用いて同じ結果、例えばＴ細胞染色を達成することができるということである。
【００７４】
かかるＭＨＣクラスII分子を上述のように試薬として提供する場合、分子を関連するペプチドとともにまたはそれなしで提供することができる。かかる試薬を、タンパク質として、またはかかるＭＨＣクラスII分子をコードする核酸として、例えば１つ以上の発現ベクターの形態で提供することができる。
【００７５】
かかる試薬を、特に上述のようにＴ細胞染色に使用する場合、特定のペプチドに対するＴ細胞応答を研究するために、例えば、Ｔ細胞応答のレパートリーおよび動力学を研究するために、ならびに例えば末梢血中での抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の直接的なエクスビボ解析を可能にするために使用することができる。末梢血の解析はこれまで、組換えＭＨＣクラスII分子が関係する課題であった。またこれらを用いて、抗原特異的Ｔ細胞をインビボ、インビトロおよびエクスビボで分離し同定することもできる。このようにして同定されたＴ細胞は、さらなる研究、拡張または活性化に供することができ、また治療で使用される可能性がある。
【００７６】
また本発明の組換えＭＨＣクラスII分子を、免疫調節剤をスクリーニングするためのプラットフォームとして使用することもできる。免疫系が関与する疾患において重要な段階は、抗原提示細胞とＴ細胞間の相互作用である。特に抗原提示細胞上のＭＨＣクラスII複合体は、外部に由来するペプチドと結合して、それをＴヘルパー細胞に提示するため重要である。次いで、Ｔヘルパー細胞が活性化されて、広範なエフェクター細胞を活性化する各種サイトカインを分泌する。
【００７７】
本明細書に記載されているような安定で完全に機能的なＭＨＣクラスII分子および特にこの分子の可溶型を提供することは、Ｔヘルパー細胞とＭＨＣクラスII分子間の相互作用ならびにそれに続くＴヘルパー細胞およびエフェクター細胞の活性化を調節する、例えば上方または下方調節することができる免疫調節剤のスクリーニングのためのプラットフォームを提供するのに重要である。本発明までは、安定なＭＨＣクラスII分子を高収率かつ低コストで作製することの難しさが、こうしたスクリーニングの妨げとなっていた。したがって、本発明の組換えＭＨＣクラスII分子を、免疫調節剤のスクリーニングプラットフォームとして用いることができる。
【００７８】
かかる方法に使用するのに好ましいＭＨＣクラスII分子は、本明細書の他の箇所に記載されている。好ましくは、前記ＭＨＣクラスII分子は疾患特異的ペプチドと会合する。このようなペプチドの例は、本明細書および先行技術に記載されており、セリアック病特異的またはI型糖尿病特異的ペプチドのような疾患特異的ペプチドと会合するヒトＨＬＡ−ＤＱ２分子、関節リウマチの疾患特異的ペプチドと会合するヒトＨＬＡ−ＤＲ４  ＭＨＣクラスII分子、および特定の破傷風ペプチドと会合するヒトＨＬＡ−ＤＰ１  ＭＨＣクラスII分子がこれに含まれる。本発明のＭＨＣクラスII分子と会合する他のペプチドも同様に使用することができる。
【００７９】
次いで、かかる疾患関連ペプチドをＭＨＣクラスIIとの関連で特異的に認識することができるＴ細胞を、例えば、本発明のＭＨＣクラスII分子を上記のように用いて特定するか、または他の方法で入手（例えば、こうした細胞系は科学者により既にいくつか開発されている）した後、１つ以上の化合物がＴ細胞と抗原提示細胞間の相互作用またはその下流の事象（例えばサイトカイン分泌およびエフェクター細胞機能など）を調節する能力を評価することができる。
【００８０】
本発明の組換えＭＨＣクラスII分子および特にこの分子のファージ提示型を、エピトープ発見、例えば、Ｔ細胞により認識される抗原ペプチドエピトープ（Ｔ細胞エピトープ）の同定および特徴付けに使用することができる。したがって、本発明のさらなる実施形態では、Ｔ細胞により認識され得る抗原ペプチドエピトープを同定する方法が提供され、本発明の組換えＭＨＣクラスII分子をＴ細胞受容体と接触させることと、前記組換えＭＨＣクラスII分子と前記Ｔ細胞受容体との結合を検出することとを含む。Ｔ細胞受容体の結合は、ＭＨＣクラスII分子と会合した抗原ペプチドエピトープの存在を示すものであり、その後、このエピトープをさらに解析し特徴付けることができる。
【００８１】
例えば、固定されたＭＨＣとの関連で提示される抗原ペプチドに多様性を導入することにより、エピトープのライブラリーを作出することができる。次いで、例えば、組換え可溶性ＴＣＲもしくはファージ提示ＴＣＲ、またはその他のＴ細胞集団（例えば、患者由来のＴ細胞）を用いて、このライブラリーのスクリーニングを行うことができる。低スループットのバキュロウイルスライブラリーに基づくものであり、生細胞で選択を行うことができないというさらなる不利な点を抱える現在の方法（Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，ＰＬｏｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２：０５２３−０５３３）と比較すれば、これは大きな進歩であろう。
【００８２】
本発明の組換えＭＨＣクラスII分子を診断試薬として使用することができる。例えば、本明細書の他の箇所に記載されているように、疾患特異的ペプチドを本発明のＭＨＣクラスII分子と複合体形成または会合させ、これを用いて試料中、例えば、その疾患を有する可能性のある患者から採取した血液試料中の疾患特異的Ｔ細胞の有無を検出することができる。疾患特異的Ｔ細胞、特に、疾患を有さない患者で見られるレベルと比較して有意な数の疾患特異的Ｔ細胞の存在は、陽性の診断を示すことになる。
【００８３】
したがって、本発明のさらなる態様では、試料中の抗原特異的Ｔ細胞を検出する方法が提供され、前記方法は、本発明の組換えＭＨＣクラスII分子を前記試料と接触させることと、前記組換えＭＨＣクラスII分子と前記Ｔ細胞との結合を検出することとを含む。前記組換えＭＨＣクラスII分子とＴ細胞との結合は、抗原特異的Ｔ細胞の存在を示すものである。
【００８４】
かかる方法を用いて、試料中の疾患特異的Ｔ細胞の存在を検出し、疾患の有無を診断することができる。この方法を用いて診断することができる適当な疾患は、ＭＨＣクラスII分子が疾患特異的ペプチドと結合する疾患である。疾患の例は本明細書の他の箇所に記載されており、セリアック病、関節リウマチ、破傷風およびインフルエンザがこれに含まれる。
【００８５】
特定の疾患の背景にある機構をより詳細に理解するために、捕捉された疾患特異的Ｔ細胞およびこのＴ細胞と本発明のＭＨＣクラスII分子間の相互作用を特徴付けることもできる。したがって、これも、例えば特定のＴ細胞応答をモニターし特徴付けるために、本発明のＭＨＣクラスII分子を研究試薬として使用することができる方法もう１つの例である。
【００８６】
本発明の組換えＭＨＣクラスII分子がペプチドと会合する場合、それをＴＣＲ親和性成熟の標的としても使用することができる。
【００８７】
当該技術分野において公知であり記載されているいくつかの方法のいずれでも、本発明の組換えＭＨＣクラスII分子を調製し得るが、組換え法を用いて調製するのが最も好ましいということを当業者は理解するであろう。
【００８８】
したがって、遺伝子クローニング技術を用いて本発明のＭＨＣクラスII分子を作製してもよく、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９年、に適当な技術が開示されている。したがって、本発明のＭＨＣクラスII分子の鎖（例えば、αおよび／またはβ鎖）をコードする配列またはこれに相補的な配列を含む核酸分子は、本発明のさらなる態様を形成する。
【００８９】
本明細書に記載のＭＨＣクラスII分子のα鎖（すなわち、鎖（i））またはβ鎖（すなわち、鎖（ii））をコードする核酸分子を、任意の適当な方法により、例えばクローニングまたは合成により、入手または作製することができる。例えば、適当な源由来（例えば、標準的なバフィーコートから分離された白血球のような細胞由来）の適当な配列をクローニングすることによりこのような配列を調製することができ、関係する特定のＭＨＣクラスII対立遺伝子の配列を用いて設計された適当なプライマーを用いた標準的ＲＴ−ＰＣＲのようなＰＣＲ技術を用いて、適当な配列をクローニングすることができる。特定のＭＨＣクラスII対立遺伝子の配列はＧｅｎＢａｎｋで入手することができるが、ＩＭＧＴデータベースを介した方が容易にアクセスすることができる。また全遺伝子合成法により、収率を最大化するのに重要となり得るコドン最適化が可能となるため、特に原核発現でこれを行うこともできる。
【００９０】
最初の配列が一度クローニングまたは合成されれば、当該技術分野において公知であり記載されている方法を用いて、例えば部位特異的変異誘発により、本発明の変異システイン残基をコードする核酸分子を得るために配列に対して任意の付属の改変を行うことができる。
【００９１】
さらに必要に応じて、本発明の分子を作製するために、ＭＨＣクラスII分子のαおよび／またはβ鎖の他の部分を操作してもよい。したがって、例えば、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードするヌクレオチドを除去してもよく、同様に、本発明の分子が機能的であるために必要でないと考えられる他の任意の領域も除去してもよい。
【００９２】
本発明のＭＨＣクラスII分子の２つの鎖をコードする核酸フラグメントが得られれば、例えば、本明細書の他の箇所に記載されているように、調節配列などの他の所望の構成要素を含ませる、または非天然のシステイン残基を組み込む、または天然のシステイン残基を除去するために、そのフラグメントを標準的な組換えＤＮＡ技術でさらに操作してもよい。通常は、またはこのさらなる操作手順の一部として、本発明のＭＨＣクラスII分子の作製を容易にするために、本発明のＭＨＣクラスII分子をコードする核酸フラグメントを１つ以上の適当な発現ベクター内に組み込み、このベクター（１つまたは複数）を宿主細胞内に組み込む。かかる発現ベクターおよびかかる発現ベクターを含む宿主細胞は、本発明のさらなる態様を形成する。
【００９３】
したがって、さらなる態様では、１つ以上の本発明の核酸分子を含む発現構築物または発現ベクターが提供される。好ましくは、発現構築物またはベクターは組換えによるものである。好ましくは、前記構築物またはベクターは、本発明の核酸分子によりコードされるタンパク質配列の転写および翻訳に必要な調節配列をさらに含む。
【００９４】
さらなる態様では、１つ以上の本発明の発現構築物または発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。また、１つ以上の本発明の核酸分子を含む宿主細胞も提供される。本発明のＭＨＣクラスII分子を発現する宿主細胞は、さらなる態様を形成する。
【００９５】
本発明のさらなる態様では、例えば本発明の宿主細胞を培養することを含む、本発明のＭＨＣクラスII分子の作製方法が提供される。好ましい方法は、（i）コードされているＭＨＣクラスII分子のαおよびβ鎖の発現に適した条件下で本発明の１つ以上の組換え発現ベクターまたは１つ以上の核酸配列を含む宿主細胞を培養すること；ならびに任意に（ii）宿主細胞由来または増殖培地／上清由来のタンパク質を単離または入手すること、を含む。この作製方法はタンパク質産物を精製することも含み得る。この作製方法は原核宿主細胞、例えば、本明細書の他の箇所に記載されている細菌宿主細胞で行うことが好ましい。
【００９６】
したがって、本発明のさらなる態様では、
（i）ＭＨＣクラスIIα鎖の細胞外部分の全部または一部分と、
（ii）ＭＨＣクラスIIβ鎖の細胞外部分の全部または一部分と
を含む組換えＭＨＣクラスII分子を作製する方法が提供され、
（i）および（ii）は、機能的ペプチド結合ドメインを提供し、（i）および（ii）は、前記α鎖のα２ドメイン中に位置するシステイン残基と前記β鎖のβ２ドメイン中に位置するシステイン残基との間のジスルフィド結合により結合しており、前記システイン残基は、天然ＭＨＣクラスIIのα２およびβ２ドメイン中には存在せず、
前記方法は、前記組換え分子を原核宿主、好ましくは細菌宿主で発現させることを含む。
【００９７】
上で議論したように、原核宿主細胞を用いて、ジスルフィド結合を組み込んで本発明の機能的ＭＨＣクラスII分子を作製することができるということは、驚くべきことであり、また有利である。
【００９８】
本発明のＭＨＣクラスII分子は２つ以上のポリペプチド鎖から構成される（すなわち、ヘテロ二量体である）ため、いくつかの実施形態では、例えば、ファージ提示法、細菌ペリプラズムでの発現および真核発現を含む実施形態では、すべてのポリペプチドを同一の宿主細胞内で、同じまたは異なる発現ベクターから発現させて、その宿主細胞内で完全な二量体タンパク質が組み立てられ、そこから単離または精製され得るようにすることが好ましい。他の実施形態、例えば意図的な封入体産生による細菌での大量生産などでは、各鎖を別々の宿主細胞（同一のタイプ／菌株の宿主細胞であることに留意）で発現させなければならない。
【００９９】
任意の作製系を使用することができ（例えば、原核系も真核系もともに使用することができる）、発現ベクターを選択および設計することにより、使用する宿主細胞と確実に適合させる。したがって、発現ベクターが「宿主細胞の形質転換に適している」ということは、その発現ベクターが１つ以上の本発明の核酸分子と、発現に使用する宿主細胞に基づき選択され、核酸分子と作動可能に連結された調節配列とを含むことを意味する。作動可能に連結されたという表現は、核酸が発現されるように調節配列と連結されているという意味であることが意図される。
【０１００】
ＭＨＣクラスII分子が不溶型である、例えば、別の生物粒子または生物膜の表面に提示される本発明の実施形態では、当該技術分野において記載されている方法により、本発明のＭＨＣ分子の提示を達成することができる。例えば、ＭＨＣクラスII分子が繊維状ファージ表面に提示される本発明の好ましい実施形態では、当該技術分野で記載されている任意の適当な方法を用いることができる。例えば、標準的なテキストとして、例えば「Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」（Ｓａｃｈｄｅｖ  Ｓ．Ｓｉｄｈｕ，１９９５）または「Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）などを参照することができる。方法および系の例は、例えば、国際公開第０９／０２４５９１号に記載されており、また実例にも示されている。
【０１０１】
一般に、本発明のファージ提示法の態様にはファージミドベクターの使用が好ましく、これには、当業者により容易に選択され得る適当なヘルパー株の使用が必要である。例えば、ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびＨｙｐｅｒＰｈａｇｅ（商標）（Ｐｒｏｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ）のような適当なヘルパーファージ株が多数市販されており、そのいずれも好都合に使用し得る。ＭＨＣクラスIIヘテロ二量体の一方の鎖、すなわちα鎖またはβ鎖のどちらかを、選択されたコートタンパク質、例えば、本明細書の他の箇所で議論されているｇｐIIIまたはその他のコートタンパク質の１つとの融合体としてベクターに組み込み、またもう一方の鎖を可溶性分子として、すなわち、コートタンパク質との融合体としてではなく産生させるのが好都合である。コートタンパク質との融合は一般に、前記コートタンパク質のＮ末端で行う。付属の実施例では、β鎖がコートタンパク質との融合体として産生され、α鎖が可溶型で産生される。
【０１０２】
他の適当な構成要素も構築物／ファージミドベクター中に存在していてよく、その多くはこのようなベクターでは普通のことである。例えば、タンパク質を細胞周辺腔へ方向付けるｐｅｌＢのようなシグナル配列が、例えば、適当なプロモーター／オペレーター配列、リボソーム結合部位、複製起点、転写ターミネーターなどとともに一般に組み込まれる。ファージミドベクターおよび構成要素の例を図２に示すが、これらの構成要素のうちの１つ以上を本発明の発現ベクター内に組み込むことができる。
【０１０３】
組換えＭＨＣクラスII分子のペプチド結合ドメインとの結合のためのペプチドを得ることが好都合な本発明の実施形態では、これらも構築物／発現ベクターの適当な位置に組み込んでよい。一般に、これらはリンカーペプチドによりαまたはβ鎖、例えばβ鎖のＮ−末端との共有結合による融合体として産生され、その例が本明細書の他の箇所に記載されている。
【０１０４】
ＭＨＣクラスII分子が可溶型である本発明の実施形態では、この分子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌宿主細胞内の封入体として発現させ、次いでインビトロでリフォールディングさせることにより入手し得る。かかるインビトロでのリフォールディングは、標準的なプロトコル（例えば、Ｑｏｒｏｎｆｌｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ５５：２０９−２２４に記載されている）およびそれを適当に修正したものを用いた、適切なリフォールディング条件下で生じ得る。
【０１０５】
あるいは、本発明の可溶性ＭＨＣクラスII分子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌宿主細胞での発現により入手してもよく、ここでは、前記分子は宿主のペリプラズムで産生される。ペリプラズムでの産生は、適当な発現ベクターの使用により、例えば、タンパク質を細胞周辺腔へ方向付けるｐｅｌＢのようなシグナルペプチドを組み込んで達成され得る。
【０１０６】
原核宿主、特に細菌宿主での本発明のＭＨＣクラスII分子の作製は、本発明の好ましい実施形態である。この作製方法は、本明細書に記載のファージ提示法および可溶型のＭＨＣクラスII分子の両方と適合性があり、この方法を用いて、高度に純化したタンパク質を大量に得ることができる。高度に純化したタンパク質を大量に得るためには、封入体から可溶性分子として産生されることが特に好ましい。操作されたジスルフィド結合を含むことにより安定性が増加した本発明の組換えＭＨＣクラスII分子は、特に高収率での封入体産生に適しており、好ましくは、現在達成可能な収率（現在、出発物質の１０％未満の範囲の収率はごく普通である）よりも高い収率で封入体から機能的ＭＨＣクラスII分子を産生させることを可能にする。
【０１０７】
任意の適当な原核宿主つまり細菌宿主をかかる産生に使用することができる。好ましい宿主細胞は、グラム陰性宿主細胞、より好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であろう。ファージ提示型に適した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主は当業者に公知であり、例えばＸＬ１−ｂｌｕｅがある。特に封入体からの精製が関係する場合に、可溶型の産生に好ましい大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２の派生物、最も好ましくはＢＬ２１表現型を有するものおよびその派生物である（Ｔｅｒｐｅ，Ｋ．，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６  Ｓｅｐ；７２（２）：２１１−２２）。
【０１０８】
可溶性のペリプラズム発現に適した細菌宿主は当業者に公知であろう（例えば、Ｔｅｒｐｅ，Ｋ．，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６  Ｓｅｐ；７２（２）：２１１−２２による総説を参照されたい）。
【０１０９】
あるいは、本発明の可溶性ＭＨＣクラスII分子を、酵母（ｐｉｃｈｉａを含む）、哺乳動物細胞または昆虫細胞のような真核細胞系で発現させることにより入手し得る。このような作製技術に適した宿主細胞は当業者に公知であろう。真核宿主細胞を用いた本発明の好ましい実施形態は、本発明の組換えＭＨＣクラスII分子を免疫グロブリン（Ｉｇ）のＦｃ部分との融合体、すなわち、例えばＣａｓａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７，同上）に記載されているようなＩｇ融合体として作製することである。このような実施形態では、免疫グロブリン分子のＦｃ部分、例えばＩｇＧ２ａ分子のＦｃ部分をαまたはβＭＨＣクラスII鎖（通常はβ鎖のＣ−末端）と融合させて、本発明の組換えＭＨＣクラスII分子（すなわち、本発明の人工的なジスルフィド結合を含む分子）のα鎖とβ鎖の二量体化を達成するために使用することができる。かかる分子を昆虫細胞系（または別の適当な系）で、例えば、昆虫細胞をバキュロウイルスに感染させて発現させることができ、これによりジスルフィド結合により安定化された分泌型のＭＨＣクラスII分子が産生され得る。
【０１１０】
本発明の発現ベクターでの使用に適した調節配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物または昆虫の遺伝子を含めた各種の源に由来し得る（例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，１９９０，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０に記載されている調節配列を参照されたい）。適当な調節配列の選択は選択される宿主細胞によって決まり、当業者はこれを容易に行い得る。かかる調節配列の例としては、転写プロモーター／エンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、翻訳開始シグナルを含むリボソーム結合配列が挙げられる。さらに、選択する宿主細胞および使用するベクターによっては、他の配列、例えば複製起点、追加のＤＮＡ制限部位、エンハンサーおよび転写誘導能を付与する配列などを発現ベクター内に組み込んでもよい。
【０１１１】
また本発明の発現ベクターは、本発明の組換え分子で形質転換された、またはそれが形質移入された宿主細胞の選択を容易にする選択マーカー遺伝子も含み得る。選択マーカー遺伝子の例は、特定の薬剤に対する耐性を付与するネオマイシンおよびヒグロマイシンのようなタンパク質、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、または免疫グロブリンもしくはその一部分（例えば免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧのＦｃ部分など）をコードする遺伝子である。目的とする核酸とは別のベクターに選択マーカーを導入し得るということが理解されるであろう。
【０１１２】
また組換え発現ベクターは、組換えタンパク質の発現増加；組換えタンパク質の溶解性増加をもたらす；およびアフィニティー精製時のリガンド（例えば、精製および／または同定を可能にする適当な「タグ」、例えばＨｉｓタグ、ＨＡタグ、ＦＬＡＧタグまたはｍｙｃタグが存在し得る）として働くことにより標的組換えタンパク質の精製に役立つ融合部分をコードする遺伝子も含み得る。例えば、タンパク質分解性切断部位を標的組換えタンパク質に加えて、融合タンパク質の精製後に組換えタンパク質を融合部分から分離させ得る。典型的な融合発現ベクターにはｐＧＥＸ（Ａｍｒａｄ  Ｃｏｒｐ．、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、ｐＭａｌ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）があり、それぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、マルトースＥ結合タンパク質またはプロテインＡを組換えタンパク質と融合させる。
【０１１３】
発現ベクターのその他の任意選択の構成要素としては、ＡｖｉＴａｇまたは別のＢｉｒＡ基質のようなビオチン化配列（特に多量体型に関係する実施形態において）、検出のための標識、例えば、フローサイトメトリー技術の実施を可能にする蛍光標識が挙げられる。
【０１１４】
発現ベクターを宿主細胞内に導入して、形質転換宿主細胞を作製することができる。「〜で形質転換された」、「〜が形質移入された」、「形質転換」および「形質移入」という用語は、当該技術分野で公知の数多くの可能な技術のいずれか１つによる、細胞への核酸（例えば、ベクター）の導入を包含することが意図される。本明細書で使用される「形質転換宿主細胞」という用語は、本発明の組換え発現ベクターにより形質転換された、グリコシル化が可能な細胞も包含することが意図される。例えば、エレクトロポレーションまたは塩化カルシウムによる形質転換を用いて、原核細胞を核酸で形質転換することができる。例えば、従来技術、例えばリン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストランによる形質移入、リポフェクション、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションなどにより、核酸を哺乳動物細胞内に導入することができる。宿主細胞の形質転換および形質移入に適した方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）およびその他の実験用教科書に記載されている。ファージ提示法が関係する本発明の態様では、関連する技術に関して、「Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」（Ｓａｃｈｄｅｖ  Ｓ．Ｓｉｄｈｕ，１９９５）または「Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）のような汎用的なファージ提示法の教科書を参照することができる。
【０１１５】
他の分子とコンジュゲートされた本発明のタンパク質を含むＮ末端またはＣ末端融合タンパク質を、組換え技術による融合を用いて調製し得る。得られた融合タンパク質は、さらなる選択されたタンパク質（例えば、本明細書に記載のマーカータンパク質またはタグタンパク質）と融合した本発明のタンパク質を含む。また本発明のタンパク質を、他の既知の技術を用いて他のタンパク質とコンジュゲートさせてもよい。例えば、国際公開第９０／１０４５７号に記載されているヘテロ二官能性チオール含有リンカー、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ−プロプリオナート（ｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ））またはＮ−スクシンイミジル−５チオアセタートを用いてタンパク質を結合させてもよい。融合タンパク質またはコンジュゲートを調製するために使用し得るタンパク質の例としては、免疫グロブリンのような細胞結合タンパク質、ホルモン、増殖因子、レクチン、インスリン、低密度リポタンパク質、グルカゴン、エンドルフィン、トランスフェリン、ボンベシン、アシアロ糖タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、赤血球凝集素（ＨＡ）および短縮ｍｙｃなどが挙げられる。
【０１１６】
本発明の第一のＭＨＣクラスII分子をコードする核酸分子の調製方法に関係なく、さらなる適切なバリアント核酸分子を標準的な分子生物学的技術により容易に調製し得る。本発明のＭＨＣクラスII分子をコードする任意のバリアント、変異体または第二世代の核酸分子が本発明での使用に適することを確認するために、本明細書の他の箇所に記載されているように、核酸分子に関して機能性を確認するための試験を行う。またバリアント、変異体または第二世代の核酸セグメントに関しても、標準的な条件下、より好ましくは標準的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションを確認するための試験を行う。適切なハイブリダイゼーション条件の例は、約５０℃で、約７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、約０．５ＭのＮａＰＯ4、約１ｍＭのＥＤＴＡ中でのハイブリダイゼーション；および約４２℃で約１％のＳＤＳによる洗浄を含む。
【０１１７】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上そうでないことが明らかでない限り、複数形の指示対象を包含する。
【０１１８】
以下の非限定的な実施例に関連して、以下の図面を参照しながら本発明をさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】マウスＭＨＣクラスII分子Ｉ−Ｅk（ＰＤＢ：１ＦＮＧ）のα２−β２ドメインを結び付ける推定ジスルフィド架橋のコンピュータモデリングを示す図である。ｗｔ（上段）および対応する変異体（下段）の両方について、表２の上位３位のアミノ酸対の残基：１位（Ａ）、２位（Ｂ）および３位（Ｃ）を関連する原子間距離とともに示している。
【図２】ｐＦＡＢＤＦＮファージミドのベクター骨格がｐIII提示ファージミドｐＳＥＸ８１（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号：Ｙ１４５８４）に基づくことを示す図である。ファージミドは、インフレームの外来配列のセグメント（Ｅ１およびＥ２と呼ぶ）を、それぞれＮｃｏI／ＳｐｅIおよびＭｌｕI／ＳｆｉI部分のカセット交換により収めることができる。Ｉ−Ｅdα鎖（ａａ２６〜２０４）およびβ鎖（ａａ２７〜２１６）をそれぞれＥ１およびＥ２に挿入した。略語：ｌａｃＰＯ、ｌａｃプロモーター；ｓｄ、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列；ｐｅｌＢ、細菌ペクチン酸リアーゼのシグナル配列；ｔ、Ｔ７転写ターミネーター；ｘＰＯ、ｆｋｐＡの天然プロモーター；ＦｋｐＡ、ｆｋｐＡのオープンリーディングフレーム；ｆ１  ＩＧ、ファージｆ１の遺伝子間領域；ＡｍｐＲ、β−ラクタマーゼをコードする領域；ＣｏｌＥ１、複製起点。
【図３】マウスＭＨＣクラスII分子Ｉ−ＥおよびＩ−ＡのＩＭＧＴ参照α鎖（Ａ）およびβ鎖（Ｂ）配列を、クローニングされたＩ−Ｅd（＿ＥＬの記号）およびＩ−Ｅk（１ＦＮＧの記号）のものと比較した、ＣｌｕｓｔａｌＷ２．０２多重配列アライメントを示す図である。システイン置換のために選択された位置が黒い影で強調してある（番号付けは表２／成熟ＩＭＧＴ  Ｉ−Ｅ配列に従った）：１位（α９６−β１１８／α９６−β１１９）、２位（α９５−β１２０／α９５−β１２１）および３位（α９４−β１５０／α９４−β１５１）。α鎖の完全長ＩＭＧＴ配列が示されているが（Ｈ−２ＥＡ*０２）、これは本明細書中で配列番号１と呼ばれる場合がある。β鎖の完全長ＩＭＧＴ配列が示されているが（Ｈ−２ＥＢ１*０１）、これは本明細書中で配列番号２と呼ばれる場合がある。α鎖の成熟ＩＭＧＴ配列、すなわち、シグナルペプチドを含まない完全長配列は、本明細書中で配列番号３と呼ばれる場合がある（シグナルペプチドを含まないＨ−２ＥＡ*０２）。β鎖のＩＭＧＴ配列、すなわち、シグナルペプチドを含まない完全長配列は、本明細書中で配列番号４と呼ばれる場合がある（シグナルペプチドを含まないＨ−２ＥＢ１*０１）。上記各配列の注釈は、ＰＤＢ  ＩＤ：１ＦＮＧおよびＢｕｒｒｏｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１２：７７１−７７８を参照して行った。
【図４】ファージＥＬＩＳＡによるＩ−Ｅd−ｐIIIの整合性の解析を示す図である。対象とする抗体を固定化し、正規量のビリオンを反応させた。捕捉されたビリオンを抗Ｍ１３HRPコンジュゲートで検出し、ＥＬＩＳＡをＴＭＢで発色させてＡ450nmで読み取った。ｐｈＯｘ−ＢＳＡ特異的Ｆａｂにより提示される抗体が対照として含まれていた。
【図５】抗ｐIIIで展開したＳＤＳ  ＰＡＧＥ／ウエスタンブロット法による多価Ｉ−Ｅd−ｐIII提示レベルの解析を示す図である。残基の番号付けはＰＤＢ  ＩＤ：１ＦＮＧに従った（ｇ表２を参照されたい）。
【図６】図６ａは、Ｐ９６α2−Ｓ１１９Ｃβ2（１位、表２）により安定化されたＩ−Ｅdを提示するファージが、ＬＤ１  Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞を特異的に染色することを示す図である。ＬＤ１細胞をブロックし、氷上で２時間、Ｉ−Ｅd−ｐIII提示ファージミドにより染色した後、ビオチン化したウサギ抗ｆｄビオチンコンジュゲートおよびストレプトアビジンＰＥとともにインキュベートした。実線はＨＡaa110-120／Ｉ−Ｅd−ｐIII提示を表し、破線はＩ−Ｅd−ｐIII提示を表す。非常に低い力価（５×１０9ファージ／ｍｌ）でも特異的染色が達成され、また達成可能な最大力価は約１０13ファージ／ｍｌであることに注目されたい。図６ｂは、Ｒ９４Ｃα2−Ｎ１５１Ｃβ2（３位、表２）、Ｓ９５Ｃα2−Ｓ１２１Ｃβ2（２位、表２）またはＰ９６Ｃα2−Ｓ１１９Ｃβ2（１位、表２）のいずれかにより安定化されたＩ−Ｅdを提示するファージが、ＬＤ１  Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞を特異的に染色することを示す図である。ＬＤ１細胞を室温で３０分間、Ｉ−Ｅd−ｐIII提示ファージミドにより染色した後、ビオチン化したウサギ抗ｆｄビオチンコンジュゲートおよびストレプトアビジンＡＰＣとともにインキュベートした。各ファージ調製物の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を棒グラフで表す。非常に低い力価（２×１０9ファージ／ｍｌ）でも特異的染色が達成され、また達成可能な最大力価は約１０13ファージ／ｍｌであることに注目されたい。
【図７】代表的なマウスおよびヒトＭＨＣクラスIIアロタイプであるＩ−Ｅ、Ｉ−Ａ、ＨＬＡ−ＤＰ、−ＤＱおよび−ＤＲ配列のＩＭＧＴのＣｌｕｓｔａｌＷ２．０２多重配列アライメントを示す図である。α鎖のアライメントをＡに、β鎖のアライメントをＢにそれぞれ示す。表２、図１および図３に示されるシステイン置換のために特定された位置が黒い影で強調してある。特定された位置はすべて、保存されたα２／β２ドメイン中にある。
【図８】重ね合った８つの異なるヒトＨＬＡクラスIIの構造を表す図であり、この構造は、分子の四次構造が広範な遺伝的多型にもかかわらず高度に保存されており、したがって図７のアライメントを構造レベル（図８Ａ）で検証するものであることを示している。例えば、Ａの全体的に重ね合った構造のＲ９４α2−Ｎ１５０β2残基の対（３位、表２）に着目すれば、全体的にＲＭＳＤが０．２９〜１．１８Åで変化する高度に保存された配置が明らかとなる（図８Ｂ）。したがって、観察される差が、単一分子の無関係な構造に対して予想される実験変動内にあるに過ぎないため、これらの構造はトポロジーレベルで実質的に同一であると見なすことができる。
【図９】Ｓ９５Ｃα2−Ｓ１２１Ｃβ2（２位、表２）により安定化されたＨＬＡ−ＤＲまたはＨＬＡ−ＤＱ２．５を提示するファージが、ヒトＴ細胞クローンを特異的に染色することを示す図である。Ｔ１８、ＴＣＣ８２０．２６およびＴＣＣ８２０．８８細胞をブロックし、室温で１時間、ＨＬＡクラスII−ｐIII提示ファージミドにより染色した後、ビオチン化したウサギ抗ｆｄビオチンコンジュゲートおよびストレプトアビジンＰＥとともに氷上でインキュベートした。各ファージ調製物の幾何平均強度（ＧＭＩ）を棒グラフで表す。
【図１０】非還元または還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ、次いで抗ｐIIIで検出したウエスタンブロッティングによる、一価（Ｍ１３Ｋ０７）および多価（ＨｙｐｅｒＰｈａｇｅ）のＩ−Ｅd−ｐIII提示レベルの解析を示す図である。残基の番号付けはＩＭＧＴに従った（表２を参照されたい）。
【発明を実施するための形態】
【０１２０】
実施例
【０１２１】
実施例１
材料および方法
構造評価、分子モデリングおよび配列解析
最初のジスルフィド結合予測にヘモグロビン（Ｈｂ）由来ペプチド（Ｈｂaa65-76）1と複合したマウスＭＨＣクラスII分子Ｉ−Ｅkの１．９Å分解能の結晶構造（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＦＮＧ）を用いた。α２−β２定常ドメイン間の接合点を形成している残基を調べ、さらなる解析のためにβ炭素が７Å未満の距離にある側鎖を選択した。最初に、選択された側鎖をコンピュータ上での突然変異によりシステインに変化させて、回転異性体ライブラリーのスキャンにより最適な回転異性体を選択した。選択された残基対のチオール基がジスルフィド結合形成に最適でない位置にある場合、好ましい角度になるまで側鎖のχ１二面角を互いに回転させた。次いでＧｒｏｍｏｓ９６力場を用いて、制約付きエネルギー最小化により局所の幾何学的位置を最適化した。
【０１２２】
Ｈ−２Ｅ（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号：Ｋ００９７１およびＡＦ０５０１５７）およびＨ−２Ａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号：Ｖ００８３２およびＭ１３５３８）の翻訳したマウスＩＭＧ参照配列、本発明者らがクローニングしたＨ−２Ｅd（下を参照されたい）ならびにＰＤＢ：１ＦＮＧ  Ｈ−２Ｅ配列を、ＣｌｕｓｔａｌＷ２．０２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／）を用いて整列させ、手動で注釈を付けた。代表的なマウスＨ−２ＡおよびＥ、ならびにヒトＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱおよびＤＲをＩＭＧＴ（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／ｔｅｘｔｅｓ／ＩＭＧＴｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅＭＨＣ／ＬｏｃｕｓＧｅｎｅｓ／ＲｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅＭＨＣｇｃ．ｈｔｍｌ）からダウンロードして翻訳し、ＣｌｕｓｔａｌＷ２．０２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／）を用いて整列させた。使用したＩＭＧＴ参照配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセションコード（α鎖／β鎖））は、Ｉ−Ａ（Ｖ００８３２／Ｍ１３５３８）、Ｉ−Ｅ（Ｋ００９７１／ＡＦ０５０１５７）、ＨＬＡ−ＤＰ（Ｘ０３１００／Ｍ２３９０７）、ＨＬＡ−ＤＱ（Ｍ２３９０７／Ｕ９２０３２）およびＨＬＡ−ＤＲ（Ｊ００２０４／ＡＪ２９７５８３）であった。Ｈ−２Ｅ、およびＰＤＢ  ＩＤ：１ＦＮＧの構造解析に従って、アライメントに手動で影をつけた。この配列アライメントを、代表的なＰＤＢ登録物：１ＦＮＧ（Ｉ−Ｅk）、１Ｓ９Ｖ（ＨＬＡ−ＤＱ２）、１ＪＫ８（ＨＬＡ−ＤＱ８）、１ＤＬＨ（ＨＬＡ−ＤＲ１）、１ＢＸ２（ＨＬＡ−ＤＲ２）、１ＨＱＲ（ＨＬＡ−ＤＲ２ａ）、１Ａ６Ａ（ＨＬＡ−ＤＲ３）、１Ｄ６Ｅ（ＨＬＡ−ＤＲ４）および２Ｑ６Ｗ（ＨＬＡ−ＤＲ５２ａ）の構造アライメントおよび同時の構造重ね合わせにより検証した。分子の可視化および操作作業では、すべてｓｐｄｂビューア３．７ＳＰ５ソフトウェア2を用いた。
【０１２３】
細菌株、ヘルパーファージおよびプラスミド
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＸＬ１−ＢｌｕｅおよびＶＣＳＭ１３ヘルパーファージはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。ＨｙｐｅｒＰｈａｇｅ（商標）ヘルパーファージはＰｒｏｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ｐｈＯｘ−ＢＳＡに対して特異的な一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を有するｐIII提示ファージミドｐＳＥＸ８１3は、Ａｆｆｉｔｅｃｈ  ＡＳ（Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）の厚意により提供されたが、ＰＲＯＧＥＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手することもできる。ｐＳＥＸ８１系ｐＦＡＢ提示およびｐｈＯｘ−ＢＳＡ特異性を有するｐＦＡＢＤＦＮファージミドは既に記載されている4。
【０１２４】
細胞系
Ｔ細胞ハイブリドーマＬＤ１5は、マウスＭＨＣクラスII分子Ｉ−Ｅd上に提示されたインフルエンザ赤血球凝集素由来ペプチド（アミノ酸１１０〜１２０；Ｎ−ＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥ−Ｃ）に対して特異的である。ヒトＣＤ４+Ｔ細胞クローンＴ１８はマウスＩｇＣカッパ（アミノ酸４０〜４８；Ｎ−ＷＫＩＤＧＳＥＲＱ−Ｃ）に対して特異的であり、ＨＬＡ−ＤＲ４（ＤＲＡ１、Ｂ１*０４０１）（ＰＭＩＤ：１２４５６５９０）拘束性である。ヒトＴ細胞クローンであるＴＣＣ８２０．２６およびＴＣＣ８２０．８８は、それぞれＤＱ２−αI−エピトープ（アミノ酸５７〜６８；Ｎ−ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹ−Ｃ）およびＤＱ２−αII−エピトープ（アミノ酸６２〜７２；Ｎ−ＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＥ−Ｃ）を認識する。各細胞はＳ．−Ｗ．Ｑｉａｏ博士（オスロ大学免疫学研究所、ノルウェー）の厚意により提供された。細胞はすべて、１０％のＦＣＳ、０，１ｍＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５０μＭのモノチオグリセロールおよび１２μｇ／ｍｌの硫酸ゲンタマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０で維持した。
【０１２５】
抗体および追加の試薬
すべての培地および緩衝液は、実質的にはＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．6に記載されている通りに調製した。マウス抗ｐIII、ウサギ抗ｆｄ、ウサギ抗ｆｄビオチンコンジュゲート、ヒツジ抗Ｍ１３−ＨＲＰおよびヒツジ抗マウス−ＨＲＰ抗体は、それぞれＭｏＢｉＴｅｃ（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）およびＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）から購入した。抗Ｉ−Ｅ／Ｉ−Ａ抗体２Ｇ９、ならびにストレプトアビジン−ＰＥおよびストレプトアビジン−ＡＰＣコンジュゲートはＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。ラット抗マウスＣＤ３２抗体２．４Ｇ２（ＡＴＣＣ（登録商標）番号ＨＢ−１９７（商標））は自家製であった。ハプテンである、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とコンジュゲートされた２−フェニルオキサゾール−５−オン（ｐｈＯｘ）は、実質的に記載されている通りに調製した7。制限酵素（ＲＥ）は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）から入手したＤｐｎＩ以外は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。ＤＮＡオリゴは、ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＧ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ａａｒｈｕｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）またはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ＢＳＡおよびＴｗｅｅｎ２０はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）から購入した。Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。トリプシン／ＥＤＴＡはＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（Ｌｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．、Ｖｉｓｐ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入した。
【０１２６】
Ｉ−Ｅd−ｐIII提示ファージミドの構築
実質的にはＣａｓａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．8により記載されている通りに、Ａ２０  ＢＡＬＢ／ｃ  Ｂリンパ腫細胞由来のＨ−２Ｅ遺伝子をＲＴ−ＰＣＲにより回収し、別々に真核ｐＬＮＯＨ２ベクター中にクローニングして、Ｉ−Ｅd−Ｉｇ融合体を作出した。Ｉ−ＥdαおよびＩ−Ｅdβをコードする遺伝子を、以下のプライマー対を用いてこれらのベクターから増幅した：Ｉ−Ｅdαには、ｐＦＡＢ  Ｉ−Ｅdａ  ｆｗ（５’−ＴＡＴＡＣＣＡＴＧＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＡＧＧＡＡＣＡＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＣＡＧＧ−３’）およびｐＦＡＢ  Ｉ−Ｅdａ  ｒｖ（５’−ＴＡＴＡＡＣＴＡＧＴＣＡＴＴＡＣＴＣＣＣＡＧＴＧＣＴＴＣＣＧＣＡＧＡＧ−３’）；Ｉ−Ｅdβには、ｐＦＡＢ  Ｉ−Ｅdｂ  ｆｗ（５’−ＴＡＴＡＡＣＧＣＧＴＣＡＧＡＧＡＣＡＣＣＡＧＡＣＣＡＣＧＧＴＴＴＴＴＧ−３’）およびｐＦＡＢ  Ｉ−Ｅdｂ  ｒｖ（５’−ＴＡＴＡＧＧＣＣＧＣＡＧＣＧＧＣＣＣＣＴＴＴＣＣＡＣＴＣＧＡＣＣＧＴＧＡＣＡＧＧＧＴ−３’）。Ｉ−Ｅdβ遺伝子がＭ１３ｐIII表面タンパク質と融合し、Ｉ−Ｅdα鎖が可溶性の物質として産生されるように、Ｉ−Ｅd遺伝子をｐＦＡＢＤＦＮファージミド中にクローニングした（図２）。インフルエンザ赤血球凝集素由来ペプチド（アミノ酸１１０〜１２０）および１５アミノ酸リンカー（Ｇ4Ｓ）3をコードするＤＮＡを、記載されている重複伸長による遺伝子スプライシング9および以下のプライマーを用いてＩ−Ｅdβ鎖のＮ末端に挿入した：ｐＭＨＣＨＡ  ＳＯＥｉｎｇ  ｆｗ（５’−ＡＡＡＧＧＡＡＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＧＡＧＧＧＧＧＡＡＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＧＴＣＴＧＴＣＡＧＡＧＡＣＡＣＣＡＧＡＣＣＡＣＧＧＴＴ−３’）およびｐＭＨＣＨＡ  ＳＯＥｉｎｇ  ｒｖ（５’−ＧＧＡＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＴＴＣＣＴＴＴＧＧＧＡＡＧＡＴＣＴＣＧＡＡＣＣＴＴＴＣＧＡＡＴＧＡＴＡＣＧＣＧＴＧＣＣＡＴＣＧＣＣＧ−３’）。クローニングのために、製造者のプロトコル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）に従い、プライマー：ＱＣＩＥｄｂＰｓｔＩ  ｆｗ（５’−ＴＧＧＡＣＡＣＧＴＡＣＴＧＴＡＧＡＣＡＣＡＡＣＴＡＴＧＡＧＡＴ−３’）およびＱＣＩＥｄｂＰｓｔＩ  ｒｖ（５’−ＡＴＣＴＣＡＴＡＧＴＴＧＴＧＴＣＴＡＣＡＧＴＡＣＧＴＧＴＣＣＡ−３’）を用いたＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）での部位特異的変異誘発により、Ｉ−Ｅdβ遺伝子内のＰｓｔI制限部位を除去した。製造者のプロトコル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）に従い、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）での部位特異的変異誘発により、ジスルフィド結合を導入するための点突然変異を導入した。使用したプライマーは、Ｉ−ＥdαのＲ９４Ｃ変異には、Ｍｕｔ  Ｒ９４Ｃ  Ｉ−Ｅdアルファｆｗ（５’−ＧＡＣＴＧＴＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＡＧＣＣＣＴＧＴＧＡＡＣＣ−３’）およびＭｕｔ  Ｒ９４Ｃ  Ｉ−Ｅdアルファｒｖ（５’−ＧＧＴＴＣＡＣＡＧＧＧＣＴＡＣＡＧＧＡＧＡＧＴＡＣＡＧＴＣ−３’）；Ｉ−ＥdβのＮ１５０Ｃ変異には、Ｍｕｔ  Ｎ１５１Ｃ  Ｉ−Ｅdベータｆｗ（５’−ＣＣＴＧＧＴＣＣＧＡＴＧＴＧＧＡＧＡＣＴＧＧＡＣＣＴＴＣ−３’）およびＭｕｔ  Ｎ１５１Ｃ  Ｉ−Ｅdベータｒｖ（５’−ＧＡＡＧＧＴＣＣＡＧ��ＣＴＣＣＡＣＡＴＣＧＧＡＣＣＡＧＧ−３’）；Ｉ−ＥdαのＳ９５Ｃ変異には、ＱＣＩＥｄａＳ９５Ｃ  ｆｗ（５’−ＡＣＴＣＴＣＣＡＧＡＴＧＣＣＣＴＧＴＧＡＡＣ−３’）およびＱＣＩＥｄａＳ９５Ｃ  ｒｖ（５’−ＧＴＴＣＡＣＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡＧＡＧＴ−３’）；Ｉ−ＥdβのＳ１２０Ｃ変異には、ＱＣＩＥｄｂＳ１２０Ｃ  ｆｗ（５’−ＧＴＣＴＧＣＴＣＴＧＴＧＴＧＴＧＡＣＴＴＣＴＡＣ−３’）およびＱＣＩＥｄｂＳ１２０Ｃ  ｒｖ（５’−ＧＴＡＧＡＡＧＴＣＡＣＡＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＡＣ−３’）；Ｉ−ＥdαのＰ９６Ｃ変異には、ＱＣＩＥｄａＰ９６Ｃ  ｆｗ（５’−ＣＡＧＡＡＧＣＴＧＴＧＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＡ−３’）およびＱＣＩＥｄａＰ９６Ｃ  ｒｖ（５’−ＴＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＣＡＣＡＧＣＴＴＣＴＧ−３’）；Ｉ−ＥdβのＳ１１８Ｃ変異には、ＱＣＩＥｄｂＳ１１８Ｃ  ｆｗ（５’−ＣＣＴＧＧＴＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧＡＧＴＧＡＣ−３’）およびＱＣＩＥｄｂＳ１１８Ｃ  ｒｖ（５’−ＧＴＣＡＣＴＣＡＣＡＣＡＧＣＡＧＡＣＣＡＧＧ−３’）であった。
【０１２７】
ＭＨＣII提示バクテリオファージの調製
ＶＣＳＭ１３またはＨｙｐｅｒＰｈａｇｅ（商標）ヘルパーファージおよびビリオン会合を用いた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅからのファージミドレスキューを、記載されているスポット力価測定法10によりモニターした。
【０１２８】
ファージ捕捉ＥＬＩＳＡ
捕捉抗体およびｐｈＯｘ−ＢＳＡを、ｐＨ７．４のＰＢＳ中２．５〜５μｇ／ｍｌの濃度で、４℃で一晩、ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）マイクロタイタープレートウェル（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に吸着させた。ウェルをＰＢＳＴＭ（０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ２０および４％ｗ／ｖの脱脂乳を添加したＰＢＳ）により、室温で１時間ブロックした。次いで、正規量のビリオン調製物（ＶＣＳＭ１３レスキュー試料：１×１０10ｃｆｕampR／ウェル；ＨｙｐｅｒＰｈａｇｅレスキュー試料：１×１０8ｃｆｕampR／ウェル）を加え、室温で１〜２時間反応させた後、捕捉されたビリオンを室温で１時間、抗Ｍ１３−ＨＲＰ（１：５，０００）により検出した。ＴＭＢ可溶性基質（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でウェルを発色させ、３０分後に１ＭのＨＣｌで停止させ、Ａ450nmで吸光度を読み取った。
【０１２９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット法
ビリオン（１０8ｃｆｕampR／レーン）を非還元および還元４〜１２％ビス／トリスＸＴ  ＣｒｉｔｅｒｉｏｎプレキャストＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）により分離し、セミドライブロッティング装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、トリス／グリシン緩衝液（２５ｍＭのトリス、１９２ｍＭのグリシンおよび２０％のメタノール、ｐＨ８．３）中、２５Ｖで３０分間、ポリフッ化ビニリデン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＵＳＡ）にブロットした。膜をＰＢＳＴＭ中でブロックした後、マウス抗ｐIIIＭＡｂ（１：４，０００）、次いでヒツジ抗マウス−ＨＲＰ（１：１０，０００）でｐIII融合体を検出した。膜を洗浄し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ基質（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）で発色させ、ＢｉｏＭａｘ（商標）ＭＲフィルム（Ｋｏｄａｋ、Ｆｅｒｎｗａｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に感光させた。
【０１３０】
人工的Ｓ−Ｓ架橋を含むＨＬＡ−ＤＰ、−ＤＲおよび−ＤＱの構築
ＩＭＧＴ（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／）により定義される代表的なＨＬＡ−ＤＲ（ＤＲＡ*０１０１／ＤＲＢ１*１４０２）および−ＤＱ（ＤＱＡ１*０５０１／ＤＱＢ１*０３０１）をコードする遺伝子を化学的に合成した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドンバイアスを修正してＤＮＡ配列を最適化し、２位のα２−β２システイン対を導入するための点突然変異を組み込んだ（表２）。ＤＮＡフラグメントを上記のようにｐＦＡＢＤＦＮファージミド中にクローニングした。
【０１３１】
あるいは、ＩＭＧＴ（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／）により定義される代表的なＨＬＡ−ＤＰ（ＤＰＡ１*０１０３／ＤＰＢ１*０４０１）、−ＤＲ（ＤＲＡ*０１０１／ＤＲＢ１*１４０２）および−ＤＱ（ＤＱＡ１*０５０１／ＤＱＢ１*０３０１）をコードする遺伝子を、新たに単離したヒトＰＢＭＣからＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、上記のようにｐＦＡＢＤＦＮファージミド中にクローニングする。２位（表２）のα２−β２システイン対を導入するための点突然変異を、製造者のプロトコル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）に従いＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）での部位特異的変異誘発により組み込む。使用したプライマー（表１に記載）は、ＨＬＡ−ＤＰＡ  α２−ドメインのＳ９５Ｃ変異には、ＤＰＡ＿Ｓ９５Ｃ＿センスおよびＤＰＡ＿Ｓ９５Ｃ＿アンチセンス；ＨＬＡ−ＤＰＢ  β２−ドメインのＳ１２１Ｃ変異には、ＤＰＢ＿Ｓ１２１Ｃ＿センスおよびＤＰＢ＿Ｓ１２１Ｃ＿アンチセンス；ＨＬＡ−ＤＲＡ  α２−ドメインのＳ９５Ｃ変異には、ＤＲＡ＿Ｓ９５Ｃ＿センスおよびＤＲＡ＿Ｓ９５Ｃ＿アンチセンス；ＨＬＡ−ＤＲＢ  β２−ドメインのＳ１２１Ｃ変異には、ＤＲＢ＿Ｓ１２１Ｃ＿センスおよびＤＲＢ＿Ｓ１２１Ｃ＿アンチセンス；ＨＬＡ−ＤＱＡ  α２−ドメインのＳ９５Ｃ変異には、ＤＱＡ＿Ｓ９５Ｃ＿センスおよびＤＱＡ＿Ｓ９５Ｃ＿アンチセンス；ＨＬＡ−ＤＱＢ  β２−ドメインのＳ１２１Ｃ変異には、ＤＱＢ＿Ｓ１２１Ｃ＿センスおよびＤＱＢ＿Ｓ１２１Ｃ＿アンチセンスである。
【０１３２】
【表２】
0005537675.tif 000003
【０１３３】
フローサイトメトリー
ＬＤ１細胞の単細胞懸濁液を、氷上で１５分間、６０％で熱不活性化したラット血清および１×ＰＢＳ中２００μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３２ｍＡｂ（ＨＢ１９７）によりブロックするか（図６ａ）、またはブロックしなかった（図６ｂ）。ＨｙｐｅｒＰｈａｇｅにパッケージングされたＩ−Ｅd−ｐIII提示の染色を、氷上で２時間、染色緩衝液（０．５％のＢＳＡを含む１×ＰＢＳ）中で（図６ａ）、または室温で３０分間、１％のＢＳＡを含む１×ＰＢＳ中で（図６ｂ）行った。図６ａで使用したファージ投入量は、ＨＡaa110-120−Ｉ−Ｅd提示には５×１０9ｃｆｕampR、Ｉ−Ｅd提示には１．６×１０10ｃｆｕampRであった。図６ｂで使用したファージ投入量は、ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（ネガティブ対照、１×１０11ｃｆｕkanR／ｍｌ）を除くすべての調製物で２×１０9ｃｆｕampRであった。次いで試料を、１０μｇ／ｍｌのビオチン化ウサギ抗ｆｄとともに氷上で１時間（図６ａ）または３０分間（図６ｂ）インキュベートし、次いで２μｇ／ｍｌのストレプトアビジンＰＥとともに氷上で１５分間インキュベートした。
【０１３４】
３つのＴ細胞クローン、すなわちＴ１８、ＴＣＣ８２０．２６またはＴＣＣ８２０．８８のそれぞれの単細胞懸濁液を染色緩衝液（０．５％のＢＳＡを含む１×ＰＢＳ）で調製した。ＨＬＡクラスII−ｐIII融合体（図９）を多価（ＨｙｐｅｒＰｈａｇｅにパッケージング）または一価（ＶＣＳＭ１３にパッケージング）で提示するファージとともに室温で１時間、細胞を染色した。使用したファージ投入量は、それぞれ約１×１０9ｃｆｕampR（図９ａ）、約２×１０9ｃｆｕampR（図９ｂ）および約２×１０12ｃｆｕampR（図９ｃおよび９ｄ）であった。次いで試料を、１０μｇ／ｍｌのビオチン化ウサギ抗ｆｄとともに氷上で１時間インキュベートし、次いで２μｇ／ｍｌのストレプトアビジン−ＰＥとともに氷上で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメータ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で事象を捕捉し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  ＰＲＯソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてそれを解析した。
【０１３５】
結果
分子モデリング
表２（１ＦＮＧ番号付け）は、Ｉ−Ｅdα／Ｉ−Ｅkβ構造（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＦＮＧ）内のα２／β２定常ドメイン接合点中の選択された残基対のβ炭素側鎖の距離を示している。実際、１位〜３位の残基対の、システインへのコンピュータ上での突然変異誘発および側鎖の最適化により、タンパク質の三次構造を不安定にすることなく２．０３〜２．０７Åの間のジスルフィド結合距離が得られた（図１）。この結果は、変異体ポリペプチドにおいてこれらのアミノ酸置換が可能になり、ジスルフィド架橋を形成された可能性があり、したがって、さらなる解析に選択されたということを強く示唆するものであった。ＰＤＢ  ＩＤ  １ＦＮＧで受託されているアミノ酸番号付けは、β鎖のＩＭＧＴ配列番号付け（図３Ｂを参照されたい）からずれていることに留意されたい。
【０１３６】
【表３】
0005537675.tif 000004
【０１３７】
ＭＨＣ−ｐIII融合体の設計
Ｉ−Ｅd遺伝子セグメントを、αおよびβ鎖が２つの別々のポリペプチドとして翻訳され、そのうちβ鎖がウイルスキャプシドタンパク質ｐIIIのＮ末端にインフレームで直接融合されるようにｐＦＡＢＤＦＮファージミド内に挿入した（図２）。両鎖とも、ペリプラズムへの標的化のためのＮ末端シグナル配列（ｐｅｌＢ）を含んでいた。挿入されたα鎖部分（図３Ａ、Ｈ−２ＥＡ＿ＥＬ）は、図３Ａに示されるＩＭＧＴ  Ｈ−２ＥＡ*０２参照配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセションコード：Ｋ００９７１、配列番号１）のアミノ酸２６〜２０４に対応する。同様に、図３Ｂに示されるＩＭＧＴ  Ｈ−２ＥＢ１*０１参照配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセションコード：ＡＦ０５０１５７、配列番号２）のアミノ酸２７〜２１６に対応するβ鎖部分を用いた（図３Ｂ、Ｈ−２ＥＢ＿ＥＬ）。したがって、Ｉ−Ｅ  ＩＭＧＴ参照配列に基づけば、表２の１位〜３位のシステイン置換の位置は、それぞれ成熟ペプチド（すなわち、シグナルペプチドを含まないペプチド）のα鎖の位置９４〜９６（図３Ａ）およびβ鎖の位置１１９、１２１および１５１（図３Ｂ）に対応する。このβ鎖残基の番号付けは、１ＦＮＧテンプレートファイルに受託されている番号付けからずれていることに留意されたい。
【０１３８】
ファージミド由来のＭＨＣII−ｐIII提示の解析
ｐＭＨＣ部分の提示の傾向および整合性を比較するために、Ｉ−Ｅ特異的モノクローナル抗体（ＭＡｂ）である２Ｇ９で正規量のビリオンを捕捉することにより、ファージＥＬＩＳＡを行った。結果は、多価および低価数の提示の両方で、すべての試料がＭＡｂ  ２Ｇ９により認識されることを示していたが（図４）、このことは、構造上の整合性が全体的に保持されたことを示唆している。ＭＡｂ  ２Ｇ９は、ｐIIIと直接融合させたＩ−Ｅβ鎖と結合する。ファージ上に共有結合のα鎖ヘテロ二量体が存在するか否かを評価するために、非還元および還元ＳＤＳ  ＰＡＧE、次いで抗ｐIIIでのウエスタンブロット検出により正規量のビリオンを解析した（図５）。結果は、ｗｔ（図５、レーン５）およびＨＡペプチドを有するα９５／β１２０変異体（図５、レーン３）の２つを除く全試料中に、有意な割合の共有結合のヘテロ二量体が存在することを示していた。しかし、α９５／β１２０変異体の試料は、試料負荷量が非常に少ないため適切な分離が妨げられたことを示していたのは意外であった。すべての共有結合複合体形成が試料の還元の際に打ち消された（図５、レーン１１〜２０）。さらに抗体Ｆａｂ対照（図５、レーン１０および２０）に関して、ｐＭＨＣ部分の改変に対して１つの共有結合ヘテロ二量体種のみが予想されたが、すべての関連試料においてかかる種が複数観察され、予想とは明らかに異なっていた。おそらくこの現象は、導入された変異のほかにも形成された、異所での天然システイン残基間のジスルフィド架橋により説明されるであろう。したがって、実際に提示されたタンパク質のごく一部だけが、人工的に導入された架橋のほかに天然のジスルフィド架橋をα２−β２ドメイン中に有する鎖である。
【０１３９】
Ｉ−Ｅd−ｐIII構築物の一価および多価の提示を同時に解する同様の実験を行った。図１０にその結果を示す。低レベルのファージミド提示（一価）では、約１〜１０％のビリオンが融合タンパク質を有する（ＢｒａｄｂｕｒｙおよびＭａｒｋｓ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００４，２９０（１−２）：２９．）。したがって、はるかに感度の高いＥＬＩＳＡアッセイでは融合体が容易に検出されるのにもかかわらず、これらの試料（Ｍ１３Ｋ０７試料）では融合タンパク質がはっきりとは見られない（図４）。
【０１４０】
細胞表面染色試薬としてのｐＭＨＣ−ｐIII
ｐIIIとの融合体としてバクテリオファージ上に提示されたペプチド−ＭＨＣクラスIIを従来のｐＭＨＣII四量体と同様に染色試薬として使用できるか否かを調べるために、本発明者らは、ＨＡaa110-120／Ｉ−Ｅd−ｐIIIまたは融合ペプチドを含まないＩ−Ｅd−ｐIIIでＬＤ１細胞を染色した。図６ａからわかるように、関連ペプチドなしで産生されたバクテリオファージ上のＩ−Ｅd−ｐIII融合体では染色が観察されなかったが、ＨＡａａ１１０−１２０／Ｉ−Ｅd−ｐIIIは、約０．８ｌｏｇだけ明るい強度で細胞を染色した。図６ｂからわかるように、調べたすべてのジスルフィド架橋でペプチド特異的染色が観察される。陽性染色は、Ｉ−Ｅd−ｐIIIのジスルフィド安定化型および抗原ペプチド有する型（ＨＡaa110-120）でのみ観察された。３つの操作されたジスルフィド架橋間で明らかな差は見られなかった。したがって、これらは同様の効率で作用すると思われる。
【０１４１】
ｐＭＨＣ−ｐIIIの機能性にさらに取り組むために、ＶＣＳＭ１３またはＨｙｐｅｒＰｈａｇｅ（商標）を用いたファージミドレスキューにより、ｍＣκaa40-48／ＨＬＡ−ＤＲ４−ｐIII、αIaa57-68／ＨＬＡ−ＤＱ２．５またはαIIaa62-72／ＨＬＡ−ＤＱ２．５を提示するビリオンを調製した。また対照として、すべてのｐＭＨＣ−ｐIII融合体を抗原ペプチドなしでも作製した。次いでこれらのビリオンを、記載されているようにフローサイトメトリー実験で試験した。図９ａからわかるように、ｍＣκaa40-48／ＨＬＡ−ＤＲ４−ｐIII染色細胞でペプチド特異的染色が観察された。図９ｂおよび９ｃでは、αIaa57-68／ＨＬＡ−ＤＱ２．５の多価および一価の提示がペプチド特異的染色を示している。ファージ投入量は、ＶＣＳＭ１３にパッケージングされたαIaa57-68／ＨＬＡ−ＤＱ２．５提示において１０12ｃｆｕampRであったということに留意されたい。αIIaa62-72−ＨＬＡ−ＤＱ２．５のペプチド特異的染色を図９ｄに示す。
【０１４２】
考察
可溶性の組換えＭＨＣクラスII分子の効果的な使用の主な障害は、このような操作された分子に固有の安定性の問題が原因である。この制限を克服するために様々な立案されたアプローチが採用されてきたが、汎用性のあるアプローチは現在のところ存在しない11。また、現在用いられている手段はすべて、コストと労働力がかかる方法であり、事実上、高スループットなアプローチの妨げとなっている。本発明者らは、組換えＭＨＣクラスII作製とファージ提示技術12を合わせることにより、この問題に対する魅力的な解決方法を見出した。これは非常に迅速かつ安価な技術プラットフォームであるばかりでなく、極めて多様なコンビナトリアルスクリーニングのアプローチを可能にするという固有の特性も有している。ＭＨＣ分子によりもたらされる広大な抗原プロテオーム空間は、例えばエピトープ発見において、このコンビナトリアル性から大きな恩恵を受けるであろう。しかし現在のところ、こうした発見はまだバキュロウイルスに基づく煩雑で低スループットな技術13に限定されている。
【０１４３】
ファージ提示を使用すれば、十分に記述された簡便な形式で12、より大きな桁数のレパートリーサイズに容易に手が届くであろう。このような提示によりＭＨＣクラスI分子が探求されてきたが14〜16、ＭＨＣクラスIファージ提示のアプローチはいずれも、細胞特異的染色がまだ得られていないことから、現在のところ可溶性四量体の代替物として機能しないことがわかっている16。ＭＨＣクラスI分子は単一のポリペプチドとして効率的に作製することができる18のとは対照的に、ＭＨＣクラスIIは、等しく関与する別々の鎖のヘテロ二量体であることから、その作製は複雑である。ＭＨＣクラスIおよびIIの機能的なフォールドはともに、Ｉｇフォールドトポロジーで構築されるため、ドメイン内のジスルフィド架橋の形成も必要とする19。
【０１４４】
ＭＨＣクラスIIとその同族リガンド間の天然の相互作用の鍵となる特徴は、固有の弱い親和性である20。組換えＭＨＣクラスII分子を検出試薬として用いる場合にこの感度における制限を克服するために、分子を四量体または五量体に重合することが必要であった11。こうしたポリマーの作製には、実質的な操作を伴う多段階のプロトコルが含まれている。ここでファージ提示を使用すれば、ファージ上での多量体提示を可能にする既に利用可能な技術の使用により、かかる重合が非常に容易に行われる21。
【０１４５】
ここで本発明者らは、ｐIIIファージミド提示により機能的に提示されるＭＨＣクラスII分子を得るための戦略を提供する。これを達成するために、αおよびβの２つの鎖を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で２つの別々のポリペプチド鎖として発現させ、そのうちの１つの鎖はｐIIIキャプシドと融合され、ペリプラズムへ標的化されている。酸化ペリプラズムでは、２つの鎖が、α２ドメインとβ２ドメインを結合させる新規な人工的ジスルフィド架橋を利用して、安定なヘテロ二量体を形成する。マウスＭＨＣクラスII分子Ｉ−Ｅdの保存されたα２−β２接合点中の複数の位置を、人工的な鎖間ジスルフィド架橋を可能にするアミノ酸置換の標的とすることができる（図１および３）。このような人工のＭＨＣ分子を、標準的なファージミドによるファージ提示を用いてｐIII上に提示させることにより、共有結合のヘテロ二量体が実際にビリオン上に提示される（図５および１０）。ｗｔおよび変異体両方のすべての分子が、マウスＭＨＣクラスII  Ｉ−Ｅ分子に特異的なモノクローナル抗体（ＭＡＢ  ２Ｇ９）と反応することから、分子全体の整合性は保持されると思われる（図４）。Ｉ−Ｅd分子を、β鎖との共有結合テザーとして十分に特徴付けられているＨＡaa110-120抗原ペプチド22を提示するように、実質的には記載されている通りに設計した23。ジスルフィド架橋により安定化されたこれらの組換え分子を提示するファージをフローサイトメトリーで用いて、Ｉ−Ｅd／ＨＡaa110-120複合体に対して特異的なＴ細胞受容体を有するＬＤ１  Ｔ細胞ハイブリドーマ5の特異的染色が得られた（図６ａおよび６ｂ）。重要なのは、特異的染色が抗原ペプチドを有するジスルフィド安定化Ｉ−Ｅd−ｐIII融合体でのみ見られ、このことは真にこのアプローチの機能性を示しているということである。さらに、一価の提示では同様の染色が見られなかったことから（データ不掲載）、ＭＨＣ部分の多価の提示が染色に不可欠であると思われ、このことは、機能的な親和性を天然の相互作用の親和性よりも高める必要性を強調している。これは現在のところ、ファージ提示されたＭＨＣ分子を特定のＴ細胞の直接的な可視化に使用した最初の例であり、古典的なＭＨＣテトラマー技術を補完するものである。
【０１４６】
成功の鍵は、ＭＨＣクラスII分子のα２−β２接合点を安定化させる人工的なジスルフィド架橋の導入である。特定された位置は、ＨＬＡを含めたＭＨＣクラスII分子間で高度に保存されているため（図７および８）、これは汎用性のあるアプローチであると思われる。この汎用性は、試験した他の３つのＭＨＣクラスII複合体、すなわちｍＣκaa40-48／ＨＬＡ−ＤＲ４、αIaa57-68／ＨＬＡ−ＤＱ２．５およびαIＩaa62-72／ＨＬＡ−ＤＱ２．５はすべて、ｐIII融合体として、サイトメトリーにおいて抗原ペプチド特異的に特異的細胞染色を示したということにより強く支持される（図９）。予想されたように、特定のｐＭＨＣII複合体およびそれと反応するＴ細胞クローンの中で染色能および多価相互作用への依存に違いが見られた。したがって、多価相互作用への依存は全か無かの事象ではなく、このことは一価型のαIaa57-68／ＨＬＡ−ＤＱ２．５およびαIIaa62-72／ＨＬＡ−ＤＱ２．５の両方による特異的細胞染色により示された。フローサイトメトリーにおいて特異的に陽性に染色する能力は、特定のＴ細胞受容体のｐＭＨＣに対する本来の親和性、Ｔ細胞上での受容体密度および膜での受容体のクラスター形成能のようなパラメーターに依存するであろう。αIaa57-68／ＨＬＡ−ＤＱ２．５による多価（図９ｂ）と一価（図９ｃ）の染色では、多価型の方がファージ投入量が１０００倍少なかったにもかかわらず、ともにほぼ同じであったということは注目すべきことである。
【０１４７】
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１１．      Ｖｏｌｌｅｒｓ，Ｓ．Ｓ．＆  Ｓｔｅｒｎ，Ｌ．Ｊ．Ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｔｅｔｒａｍｅｒ  ｓｔａｉｎｉｎｇ：ｐｒｏｇｒｅｓｓ，ｐｒｏｂｌｅｍｓ，ａｎｄ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２３，３０５−３１３（２００８）．
１２．      Ｂｒａｔｋｏｖｉｃ，Ｔ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ：ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ（２００９）．
１３．      Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｕｓｅ  ｏｆ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ＭＨＣ／ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｔｏ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｌｉｇａｎｄｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ２１０，１５６−１７０（２００６）．
１４．      Ｌｅ  Ｄｏｕｓｓａｌ，Ｊ．，Ｐｉｑｕｅｒａｓ，Ｂ．，Ｄｏｇａｎ，Ｉ．，Ｄｅｂｒｅ，Ｐ．＆  Ｇｏｒｏｃｈｏｖ，Ｇ．Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ／ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４１，１４７−１５８．（２０００）．
１５．      Ｋｕｒｏｋａｗａ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｏｇｅｔｈｅｒ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｎ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ８０，１６３−１６８（２００２）．
１６．      Ｖｅｓｔ  Ｈａｎｓｅｎ，Ｎ．，Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄ  Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｌ．，Ｓｔｒｙｈｎ，Ａ．＆  Ｂｕｕｓ，Ｓ．Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ／ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３１，３２−３８（２００１）．
１７．      Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｂｏｎｎｅｙ，Ｅ．Ｅ．，Ａｌｔｍａｎ，Ｊ．Ｄ．＆  Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ，Ｏ．Ｌ．Ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ（ＭＨＣ）ｔｅｔｒａｍｅｒ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａｎ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ  Ｎｕｒｓ  ４，１１５−１２７（２００２）．
１８．      Ｌｅｉｓｎｅｒ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｅ−Ｐｏｔ，Ｍｉｘ−ａｎｄ−Ｒｅａｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−ＭＨＣ  Ｔｅｔｒａｍｅｒｓ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ３，ｅ１６７８（２００８）．
１９．      Ｈａｌａｂｙ，Ｄ．Ｍ．，Ｐｏｕｐｏｎ，Ａ．＆  Ｍｏｒｎｏｎ，Ｊ．Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｆｏｌｄ  ｆａｍｉｌｙ：ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ３Ｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １２，５６３−５７１（１９９９）．
２０．      Ｒｕｄｏｌｐｈ，Ｍ．Ｇ．，Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｌ．＆  Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．Ａ．Ｈｏｗ  ＴＣＲｓ  ｂｉｎｄ  ＭＨＣｓ，ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ  ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２４，４１９−４６６（２００６）．
２１．      Ｓｏｌｔｅｓ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２７，６２６−６３７（２００７）．
２２．      Ｓｃｈｉｌｄ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒａｌ  ｌｉｇａｎｄ  ｍｏｔｉｆｓ  ｏｆ  Ｈ−２Ｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｒｅ  ａｌｌｅｌｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ＨＬＡ−ＤＲ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７，１９５７−１９６５（１９９５）．
２３．      Ｋｏｚｏｎｏ，Ｈ．，Ｗｈｉｔｅ，Ｊ．，Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，Ｊ．，Ｍａｒｒａｃｋ，Ｐ．＆  Ｋａｐｐｌｅｒ，Ｊ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｐ
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図３】
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【配列表】
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