(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞を増殖させる方法であって、支持細胞も血清も含まない培地中で、かつラミニン５を含んだ系で該多能性幹細胞を培養することを含み、前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞または胚性幹細胞である、前記方法。
【請求項２】
前記人工多能性幹細胞がヒトの人工多能性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
培養培地に、血清代替添加物を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記血清代替添加物が、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、ヒドロキシプロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンからなる群から選択される１またはそれより多くのアミノ酸、チアミン及び／又はアスコルビン酸からなるビタミン、銀、アルミニウム、バリウム、カドミウム、コバルト、クロム、ゲルマニウム、マンガン、ケイ素、バナジウム、モリブデン、ニッケル、ルビジウム、スズ、及びジルコニウムからなる群から選択される１またはそれより多くの微量金属元素、臭素、ヨウ素、及びフッ素からなる群から選択される１またはそれより多くのハロゲン元素、並びに、アルブミン、還元型グルタチオン、トランスフェリン、インスリン、及び亜セレン酸ナトリウムからなる群から選択される１またはそれより多くの成分、を含む添加物である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ラミニン５に加えて更に他の細胞外マトリックスタンパク質を含んだ系で前記多能性幹細胞を培養する、請求項１ないし請求項４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記他の細胞外マトリックスタンパク質がコラーゲンである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ラミニン５で処理した培養容器中で前記多能性幹細胞を培養する、請求項１ないし請求項６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ラミニン５がヒトラミニン５である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記多能性幹細胞が培養中に分化しない、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ラミニン５の、多能性幹細胞を増殖させるための細胞支持材料としての使用であって、前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞または胚性幹細胞である、前記使用。
【請求項１１】
ラミニン５で処理した培養容器と、血清代替添加物とを含む、多能性幹細胞の培養用キットであって、前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞または胚性幹細胞である、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞を増殖させる方法、ラミニン５の細胞支持材料としての使用、及び多能性幹細胞の培養用キットに関する。
本出願は、２００８年３月３１日に提出された日本特許出願  特願２００８−９３３５０および２００８年９月３日に提出された日本特許出願２００８−２２５６８６号を基礎とする優先権主張出願である。
【背景技術】
【０００２】
多能性幹細胞の増殖方法
あらゆる組織の細胞へと分化する能力（分化多能性）を有する幹細胞である。多能性幹細胞としては、現在、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、体細胞に特定の因子の組み合わせ（例えば、Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４およびｃ―Ｍｙｃの組み合わせ）を導入・発現させることにより作製される人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、始原生殖細胞より作製される胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、精巣の生殖細胞より作製される生殖幹細胞（ＧＳ細胞）等などが知られている。
胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ＥＳ細胞）は、発生初期の胚盤胞内部細胞塊（ＩＣＭ）より樹立された多能性幹細胞である（Ｎａｔｕｒｅ．２９２，１５４−１５６，１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７８，７６３４−７６３８，１９８１、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８２，１１４５−１１４７，１９９８）。マウスＥＳ細胞は白血病抑制因子（ＬＩＦ）の存在下で、その多能性を維持することが出来る（Ｎａｔｕｒｅ．３３６，６８４−６８７，１９８８、Ｎａｔｕｒｅ．３３６，６８８−６９０，１９８８）。通常、維持培養にはＬＩＦを産生する細胞株やマウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）を支持細胞（フィーダー細胞）として用いるか、或いはＬＩＦを添加した培地と適切な支持材料が用いられる。
マウスＥＳ細胞の培養において支持細胞は、細胞接着の足場を提供したり、ＥＳ細胞の成長因子とＬＩＦを供給する役割を担っている。なお支持細胞から供給されるＬＩＦに加えて、更に培養液にＬＩＦを添加してもよい。ＬＩＦを添加する態様としてＬＩＦそのものを培養液へ添加してもよいし、ＬＩＦ産生細胞株の培養上清を培養液に添加してもよい。一方支持細胞を用いない系では、ゼラチンなどの各種細胞外マトリックスを支持材料として、培養液へＬＩＦを添加することによりマウスＥＳ細胞の培養を行う。
一方、ヒトＥＳ細胞の培養では多能性維持には、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ２）の存在が必要であり（Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．２２７，２７１−２７８，２０００）、更にはＭＥＦから供給される因子も必要である。ヒトＥＳ細胞はＦＧＦ２存在下において、ＭＥＦを支持細胞として用いるか、或いはＭＥＦの培養上清と適切な支持材料を用いることで、多能性を保った状態で維持培養することができる（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９，９７１−９７４，２００１）。
具体的にはヒトＥＳ細胞を、ＦＧＦ２に加えて血清存在下で培養することができ、あるいは無血清の培地で培養することもできる。現在では無血清培地でヒトＥＳ細胞を培養する方が一般的であり、血清代替物として例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のノックアウトＴＭ血清代替添加物（ＫＳＲ）などが用いられている。一般的なヒトＥＳ細胞の培養系としては、ＭＥＦを支持細胞として用いて培養液へＦＧＦ２を添加した系や、マトリゲルなどの各種細胞外マトリックスタンパク質を支持材料としてＦＧＦ２を添加したＭＥＦ培養上清中で培養する系が用いられている。なお支持細胞としてマウス線維芽細胞のみならず、ヒト線維芽細胞を用いることもできる。
さらに、近年マウスとヒトにおいて、体細胞から胚性幹細胞に良く似た性質を持つ人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ｉＰＳ細胞）が樹立されたことが報告された（Ｃｅｌｌ．１２６，６６３−６７２，２００６、Ｃｅｌｌ．１３１，８６１−８７２，２００７、Ｓｃｉｅｎｃｅ．３１８，１９１７−１９２０，２００７、国際公開ＷＯ２００７／０６９６６６）。ｉＰＳ細胞は、体細胞にＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ等の因子を導入して樹立された体細胞由来の多能性幹細胞である。一般的にはｉＰＳ細胞の維持培養においても、ＥＳ細胞と同様に支持細胞の存在が必要とされる。
ｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞と同様の方法により培養することができる。マウスｉＰＳ細胞を、ＳＴＯ細胞（ＬＩＦを安定的に産生するＳＩＭマウス線維芽細胞株）上でＬＩＦ産生細胞の培養上清を用いて維持培養することができる。また支持細胞を使用しない系としては、ＬＩＦを培地に添加することによりゼラチンコートしたプレート上で、マウスｉＰＳ細胞を維持培養することができる。なお、ＳＴＯ細胞は、マウス由来のＥＳ細胞、ＥＧ細胞、ＥＣ細胞を安定的に維持するために有効であることが知られている。
ヒトｉＰＳ細胞もまた、マウス線維芽細胞を支持細胞として利用し、ＦＧＦ２を添加した系で培養することができる。なお京都大学山中伸弥らのグループでは、ＳＮＬ細胞（マウス線維芽細胞株でＬＩＦとＧ４１８耐性遺伝子を共発現している株）を用いて培養を行っている（Ｃｅｌｌ．１３１，８６１−８７２，２００７）。支持細胞を使用しない系でヒトｉＰＳ細胞を維持培養する場合には、マトリゲルを支持材料として用い、ＭＥＦの培養上清にＦＧＦ２を添加した系が採用されている。
体細胞由来のｉＰＳ細胞は初期胚由来の胚性幹細胞に比べて倫理的な問題が少なく、また、患者本人の細胞から調製できるため免疫拒絶の問題もない。再生医療への応用が期待されている。
胚性生殖幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌｓ：ＥＧ細胞）は、始原生殖細胞をＳｔｅｅｌ  Ｆａｃｔｏｒ（Ｋｉｔ−Ｌｉｇａｎｄ）、ＬＩＦ、ＦＧＦ２の存在下で培養して樹立された細胞であり、ＥＳ細胞とほぼ同じ性質を有することがマウスの実験で知られている。ＥＧ細胞の維持培養にはＥＳ細胞と同様の培養方法を用いることができる。すなわち、ＭＥＦやＳＴＯ細胞などの支持細胞の存在下、ＬＩＦを添加した系でＥＧ細胞を培養することができる。（Ｃｅｌｌ  ７０：８４１−８４７，１９９２、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２０，３１９７−３１２０，１９９４）。
精巣の生殖細胞より作製される生殖幹細胞（Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ＧＳ細胞）は、少なくともＧＤＮＦ（Ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ−ｌｉｎｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）を含有する培養条件下で培養することで、精原幹細胞（精子幹細胞）を体外で培養できるようにした細胞株であり、精巣の精細管内に注入することで精子を形成できる。ＧＳ細胞の長期的な培養は、支持細胞であるＭＥＦ上で、ＧＤＮＦ、ＦＧＦ２、ＥＧＦ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）及びＬＩＦを添加した培地を用いることにより行うことができる。支持細胞がない系でＧＳ細胞を培養したことも報告されており、ラミニンにてコートしたプレートで培養することにより、ＧＳ細胞を維持することができる（Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ６９：６１２−６１６，２００３、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ７２：９８５−９９１，２００５）。
ＧＳ細胞のうち特に、ｍＧＳ細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）は、ＥＳ細胞と同様の性質を有し、分化多能性も有する。ｍＧＳ細胞は樹立されたＧＳ細胞を更にＥＳ細胞の培養系にて多能性幹細胞に変化させることにより、樹立される。樹立されたｍＧＳ細胞もＥＳ細胞と同様の方法で培養することが可能であり、支持細胞存在下でＬＩＦを添加した培地を用いた系で培養することができる。（Ｃｅｌｌ  １１９：１００１−１０１２，２００４、Ｎａｔｕｒｅ  ４４０：１１９９−１２０３，２００６）。
上記のような多能性細胞は、再生医療などの応用が期待されている。しかし、特に臨床に応用するためには、免疫拒絶の問題や未知のウイルス混入等の潜在的な危険性を避ける必要があり、動物由来の物質を一切使わない維持培養系の開発が必要であると言われている。即ち、ヒトには存在しない動物由来のシアル酸がヒトＥＳ細胞やｉＰＳ細胞に取り込まれると、これらのシアル酸の有する抗原性が問題となり、再生された組織に免疫拒絶が起こることが予想される。また、例えヒトタンパク質を用いても、胎盤などの組織から調製した天然型タンパク質にはエイズウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）など以外にも未知のウイルス混入等の潜在的な危険性がある。
そこでヒトＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞の多能性を維持しつつ、該細胞の増殖を支える培養液組成やＭＥＦに代わる適切な支持材料の探査がなされている（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４，１８５−１８７，２００６、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２４，２６４９−２６６０，２００６）。しかし、ＭＥＦを支持細胞（フィーダー細胞）として使用した場合であっても、細胞接着効率はわずか数％しか得られず、現在検討されている支持細胞を使用しない系ではさらに低くなる。多能性幹細胞の維持培養において、動物由来の物質を一切使わない系の開発が望まれるが、上述した細胞接着効率の低さが大きな問題の１つとなっている。多能性を維持しつつ効果的な接着活性を示すヒト由来の支持材料が求められており、かかる支持材料は、再生医療等の臨床に利用し得る細胞材料の確保に有用なツールとなり得る。
ラミニン５
ラミニンは様々な組織の基底膜に主として局在し、組織構造の維持及び細胞機能の制御において重要な役割を果たす細胞外マトリックスタンパク質である（Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ．，１８：１９−２８，１９９９、Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，２１８：２１３−２３４，２０００）。
ラミニンの構造としては、α鎖、β鎖、γ鎖がそれぞれジスルフィド結合で連結されたヘテロ３量体分子であり、特徴的な十字架構造をとる。各鎖は複数のドメインからなり、ドメインＩおよびＩＩはトリプルヘリックスを形成している。本出願前に、ラミニン分子は５種類のα鎖（α１ないしα５）、３種類のβ鎖（β１ないしβ３）、３種類のγ鎖（γ１ないしγ３）の異なる組み合わせによって、少なくとも１５種類が同定されており、実際にはその数倍の種類が存在することが示唆されている（宮崎ら、実験医学  Ｖｏｌ．１６  Ｎｏ．１６（増刊）１９９８年、第１１４−１１９頁、Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，２１８：２１３−２３４，２０００、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２０：６５１７−６５２８，２０００、Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．８５，９７９−１０００，２００５）。これらα、β、γ鎖はそれぞれ異なる遺伝子によってコードされており、それぞれのラミニンアイソフォームは特有の存在部位や機能があり、主に細胞膜受容体インテグリンを介して細胞接着、増殖、運動、分化などを調節している（Ｄｅｖ．  Ｄｙｎ．２１８，２１３−２３４，２０００、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．８５，９７９−１０００，２００５）。
表１に１５種類のラミニン分子種とそのサブユニット構成を示す。
【表１】
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ラミニン分子は、３本鎖のアミノ（Ｎ）末端部分（短腕）で互いに会合したり、他のマトリックス分子と会合して、基底膜を構築する。一方α鎖のカルボキシ（Ｃ）末端には５つの相同な球状ドメイン（Ｇ１―Ｇ５ドメインまたはＬＧ１―ＬＧ５）が存在し、主にこの部分でインテグリンやその他のリセプターと結合する。
ラミニン５（カリニン、エピリグリン、ナイセイン、ラドシンとも呼ばれる）はα３鎖、β３鎖、γ２鎖からなるラミニンアイソフォームの一つであり、複数の研究機関で別々の経緯で発見された（Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１４，５６７−５７６，１９９１、Ｃｅｌｌ  ６５，５９９−６１０，１９９１、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０１，７３８−７４３，１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９０，１１７６７−１１７７１，１９９３）。
ラミニン５は各種細胞に対して強い細胞接着活性、細胞分散活性、細胞増殖活性等を示すことが報告されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９０，１１７６７−１１７７１，１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１６，８６２−８６９，１９９４、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２５，２０５−２１４，１９９４、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．１６，８８１−８９０，２００５、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２４，２３４６−２３５４，２００６）。国際公開ＷＯ２００７／０２３８７５は、ラミニン５を利用した間葉系幹細胞の培養技術を記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００７／０６９６６６
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００７／０２３８７５
【特許文献３】特開２００１−１７２１９６号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ．２９２，１５４−１５６，１９８１
【非特許文献２】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７８，７６３４−７６３８，１９８１
【非特許文献３】Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８２，１１４５−１１４７，１９９８
【非特許文献４】Ｎａｔｕｒｅ．３３６，６８４−６８７，１９８８
【非特許文献５】Ｎａｔｕｒｅ．３３６，６８８−６９０，１９８８
【非特許文献６】Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２２７，２７１−２７８，２０００
【非特許文献７】Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９，９７１−９７４，２００１
【非特許文献８】Ｃｅｌｌ．１２６，６６３−６７２，２００６
【非特許文献９】Ｓｃｉｅｎｃｅ．３１８，１９１７−１９２０，２００７
【非特許文献１０】Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４，１８５−１８７，２００６
【非特許文献１１】Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２４，２６４９−２６６０，２００６
【非特許文献１２】Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ．，１８：１９−２８，１９９９
【非特許文献１３】Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，２１８：２１３−２３４，２０００
【非特許文献１４】宮崎ら、実験医学  Ｖｏｌ．１６  Ｎｏ．１６（増刊）１９９８年第１１４−１１９頁
【非特許文献１５】Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２０：６５１７−６５２８，２０００
【非特許文献１６】Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．８５，９７９−１０００，２００５
【非特許文献１７】Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１４，５６７−５７６，１９９１
【非特許文献１８】Ｃｅｌｌ．６５，５９９−６１０，１９９１
【非特許文献１９】Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０１，７３８−７４３，１９９３
【非特許文献２０】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９０，１１７６７−１１７７１，１９９３
【非特許文献２１】Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１６，８６２−８６９，１９９４
【非特許文献２２】Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２５，２０５−２１４，１９９４
【非特許文献２３】Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．１６，８８１−８９０，２００５
【非特許文献２４】Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２４，２３４６−２３５４，２００６
【非特許文献２５】Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６３：ｐ．２８８−２９２，１９９４
【非特許文献２６】Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１２７：ｐ．２２４−２２７，１９８８
【非特許文献２７】Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．６：ｐ．５６３−５６８，１９９４
【非特許文献２８】Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．６：ｐ．５５３−５６２、１９９４
【非特許文献２９】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：ｐ．７８４４−７８４８，１９９５
【非特許文献３０】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３７２６−１３７３１，１９９８
【非特許文献３１】Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１８，ｐ．３９９−４０４，２０００
【非特許文献３２】Ｎａｔｕｒｅ  ４３９：２１６−２１９、２００６
【非特許文献３３】Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２：１１３−１１７、２００８
【非特許文献３４】Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２４：２６６９−２６７６、２００６
【非特許文献３５】Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，１１：ｐ．１５５３−１５５８，２００１
【非特許文献３６】Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２６：１０１−１０６，２００８
【非特許文献３７】Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２：１０−１２，２００８
【非特許文献３８】Ｃｅｌｌ  １３１：８６１−８７２，２００７
【非特許文献３９】高橋および山中、細胞工学，Ｖｏｌ．２７、Ｎｏ．３，２５２−２５３，２００８
【非特許文献４０】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０（２００５），１４３７０−１４３７７
【非特許文献４１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：ｐ．２２７７９−２２７８７、１９９４
【非特許文献４２】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：ｐ．１１０７３−１１０８０、１９９４
【非特許文献４３】Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１９：ｐ．６７９−６９３、１９９２
【非特許文献４４】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２、１９９７
【非特許文献４５】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、１９９０
【非特許文献４６】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７、１９８１
【非特許文献４７】Ｃｅｌｌ  ７０：８４１−８４７，１９９２
【非特許文献４８】Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２０，３１９７−３１２０，１９９４
【非特許文献４９】Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ６９：６１２−６１６，２００３
【非特許文献５０】Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ７２：９８５−９９１，２００５
【非特許文献５１】Ｃｅｌｌ  １１９：１００１−１０１２、２００４
【非特許文献５２】Ｎａｔｕｒｅ  ４４０：１１９９−１２０３，２００６
【非特許文献５３】Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．３６：ｐ．４２４−４３３，１９９３
【非特許文献５４】Ｎａｔｕｒｅ  ４５４：６４６−６５０，２００８
【非特許文献５５】Ｃｅｌｌ  １３６：４１１−４１９，２００９
【非特許文献５６】Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ３：５６８−５７４，２００８
【非特許文献５７】Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２：９４５−９４９，２００８
【非特許文献５８】Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２：９４９−９５３，２００８
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、支持細胞や血清などの動物性材料を用いない系で、多能性幹細胞を効率よく増殖させる技術を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究に努めた結果、本発明者らは細胞外マトリックス分子であるラミニン５を利用することにより、支持細胞や血清を用いなくても、多能性幹細胞を未分化状態のままで増殖させることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
よって本発明は、上記課題を解決するべく、多能性幹細胞を増殖させる方法であって、支持細胞も血清も含まない培地中で、かつラミニン５を含んだ系で該多能性幹細胞を培養することを含む、前記方法を提供する。
本発明はまた、ラミニン５の、多能性幹細胞を増殖させるための細胞支持材料としての使用を提供する。
本発明は更に、ラミニン５で処理した培養容器と、血清代替添加物とを含む、多能性幹細胞の培養用キットを提供する。
本発明は、好ましい態様として以下の態様を含む。
［態様１］
多能性幹細胞を増殖させる方法であって、支持細胞も血清も含まない培地中で、かつラミニン５を含んだ系で該多能性幹細胞を培養することを含む、前記方法。
［態様２］
前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、態様１に記載の方法。
［態様３］
前記人工多能性幹細胞がヒトの人工多能性幹細胞である、態様１または２に記載の方法。
［態様４］
前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、及び生殖幹細胞からなる群から選択された細胞である、態様１記載の方法。
［態様５］
前記多能性幹細胞が胚性幹細胞である、態様４に記載の方法。
［態様６］
培養培地に、血清代替添加物を含む、態様１ないし態様５のいずれか１つに記載の方法。
［態様７］
前記血清代替添加物が、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、ヒドロキシプロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンからなる群から選択される１またはそれより多くのアミノ酸、チアミン及び／又はアスコルビン酸からなるビタミン、銀、アルミニウム、バリウム、カドミウム、コバルト、クロム、ゲルマニウム、マンガン、ケイ素、バナジウム、モリブデン、ニッケル、ルビジウム、スズ、及びジルコニウムからなる群から選択される１またはそれより多くの微量金属元素、臭素、ヨウ素、及びフッ素からなる群から選択される１またはそれより多くのハロゲン元素、並びに、アルブミン、還元型グルタチオン、トランスフェリン、インスリン、及び亜セレン酸ナトリウムからなる群から選択される１またはそれより多くの成分、を含む添加物である、態様６に記載の方法。
［態様８］
ラミニン５に加えて更に他の細胞外マトリックスタンパク質を含んだ系で前記多能性幹細胞を培養する、態様１ないし態様７のいずれか１つに記載の方法。
［態様９］
前記他の細胞外マトリックスタンパク質がコラーゲンである、態様８に記載の方法。
［態様１０］
ラミニン５で処理した培養容器中で前記多能性幹細胞を培養する、態様１ないし態様９のいずれか１つに記載の方法。
［態様１１］
前記ラミニン５がヒトラミニン５である、態様１０に記載の方法。
［態様１２］
前記多能性幹細胞が培養中に分化しない、態様１から態様１１のいずれか１つに記載の方法。
［態様１３］
ラミニン５の、多能性幹細胞を増殖させるための細胞支持材料としての使用。
［態様１４］
ラミニン５で処理した培養容器と、血清代替添加物とを含む、多能性幹細胞の培養用キット。
発明の効果
本発明により、支持細胞や血清を用いなくても、多能性幹細胞を未分化状態を維持したままで効率よく増殖させることが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
図１は、精製した組換えヒトラミニン５をＳＤＳポリアクリルアミドゲルにて電気泳動した図である。なお図１の右のレーンが、１μｇの組換えヒトラミニン５を電気泳動した結果である。
図２は、組換えヒトラミニン５と様々な細胞外マトリックスタンパク質が、ＥＳ細胞に対する接着効果に及ぼす効果を比較した図である。図２Ａは、３０分培養後接着アッセイを行った結果、図２Ｂは、６０分培養後接着アッセイを行った結果を示す。
図３は、支持細胞の非存在下、細胞外マトリックスタンパク質がＥＳ細胞の増殖に及ぼす効果を比較した図である。図３は増殖アッセイの結果であり、丸印はＳ＋Ｇ１を示し、菱形印はＫ＋Ｌｍ５−４を示し、バツ印はＫ＋Ｌｍ５−２を示し、アスタリスクマ−クはＫ＋Ｌｍ−Ｍｉｘを示し、小さな黒四角印はＫ＋Ｍｇを示す。
図４は、支持細胞の非存在下、細胞外マトリックスタンパク質がＥＳ細胞の長期継代培養に及ぼす効果を比較した図である。図４は増殖アッセイの結果であり、丸印はＳ＋Ｇ１を示し、菱形印はＫ＋Ｌｍ５−４を示し、バツ印はＫ＋Ｌｍ５−２を示し、三角印はＫ＋Ｌｍ５−４→Ｓ＋Ｇ１を示す。
図５は、組換えヒトラミニン５を固層化したプレートにて無血清培地で長期継代培養されたＥＳ細胞の形態、及びそれをゼラチン固層化プレートにて血清培地での培養に戻した時の細胞の形態を示した図である。図５は上からＳ＋Ｇ１の結果、Ｋ＋Ｌｍ５−４の結果、Ｋ＋Ｌｍ５−４→Ｓ＋Ｇ１の結果を、それぞれ示す。
図６は、ＫＳＲを添加した培地でＥＳ細胞を培養した際において、各培養条件で種々の未分化マーカーの発現を比較したＲＴ−ＰＣＲの図である。
図７は、ＫＳＲを添加した培地で培養したＥＳ細胞を、ＬＩＦを含まない維持培地中で培養を行った時の胚様体の様子を示した図である。図７のスケールバーは２５０μｍである。
図８は、ゼラチン固層化プレートにて血清培地の培養系（Ｓ＋Ｇｌ）においてＥＳ細胞の分化能を検討した結果を示す図である（実施例５）。図８の上段はＳ＋Ｇｌ（ＬＩＦ＋）の結果であり、下段はＳ＋Ｇｌ（ＬＩＦ−）の結果である。図８においてスケールバーは１００μｍであるが、１つのアスタリスクマークはスケールバーが５０μｍであることを示し、２つのアスタリスクマークはスケールバーが２５μｍであることを示す。
図９は、ゼラチン固層化プレートにてＫＳＲを添加した無血清培地の培養系（Ｋ＋Ｇｌ）で培養した後に、血清培地での培養系（Ｓ＋Ｇｌ）に戻し、ＥＳ細胞の分化能を検討した結果を示す図である（実施例６）。図９の上段はＫ＋Ｇｌ⇒Ｓ＋Ｇｌ（ＬＩＦ＋）の結果であり、下段はＫ＋Ｇｌ⇒Ｓ＋Ｇｌ（ＬＩＦ−）の結果である。図９においてスケールバーは１００μｍであるが、２つのアスタリスクマークはスケールバーが２５μｍであることを示す。
図１０は、４μｇ／ｍｌの組換えヒトラミニン５を固層化したプレートにてＫＳＲを添加した無血清培地の培養系（Ｋ＋Ｌｍ５−４）で培養した後に、血清培地での培養系（Ｓ＋Ｇｌ）に戻し、ＥＳ細胞の分化能を検討した結果を示す図である。図１０の上段はＫ＋Ｌｍ５−４⇒Ｓ＋Ｇｌ（ＬＩＦ＋）の結果であり、下段はＫ＋Ｌｍ５−４⇒Ｓ＋Ｇｌ（ＬＩＦ−）の結果である。図１０においてスケールバーは１００μｍであるが、２つのアスタリスクマークはスケールバーが２５μｍであることを示す。
図１１は、２μｇ／ｍｌの組換えヒトラミニン５を固層化したプレートにてＫＳＲを添加した無血清培地の培養系（Ｋ＋Ｌｍ５−２）で培養した後に、血清培地での培養系（Ｓ＋Ｇｌ）に戻し、ＥＳ細胞の分化能を検討した結果を示す図である。図１１の上段はＫ＋Ｌｍ５−２⇒Ｓ＋Ｇｌ（ＬＩＦ＋）の結果であり、下段はＫ＋Ｌｍ５−２⇒Ｓ＋Ｇｌ（ＬＩＦ−）の結果である。図１１においてスケールバーは１００μｍであるが、１つのアスタリスクマークはスケールバーが５０μｍであることを示し、２つのアスタリスクマークはスケールバーが２５μｍであることを示す。
図１２は、支持細胞の非存在下で実施例６記載の血清代替物を添加した培地（培地Ｙ）を用いてＥＳ細胞の長期継代培養を行った際に、細胞外マトリックスタンパク質が及ぼす効果を比較した図である。図１２は増殖アッセイの結果であり、三角印はＹ＋Ｇｌを示し、バツ印はＹ＋Ｌｍ５−４を示し、アスタリスクマークはＹ＋Ｌｍ５−２を示し、丸印はＫ＋Ｌｍ−Ｍｉｘを示し、＋はＹ＋Ｍｇを示す。
図１３は、培地ＹでＥＳ細胞を培養した際において、各培養条件で種々の未分化マーカーの発現を比較したＲＴ−ＰＣＲの図である。
図１４は、培地ＹでＥＳ細胞を培養した後に、ＬＩＦを含まない維持培地中で培養を行った時の胚様体の様子を示した図である。図１４のスケールバーは２５０μｍである。
図１５は、ゼラチン固層化プレートにて血清培地の培養系（Ｓ＋Ｇｌ）においてＥＳ細胞の分化能を検討した結果を示す図である（実施例７）。図１５の上段はＳ＋Ｇｌ（ＬＩＦ＋）の結果であり、下段はＳ＋Ｇｌ（ＬＩＦ−）の結果である。図１５においてスケールバーは１００μｍであるが、２つのアスタリスクマークはスケールバーが２５μｍであることを示す。
図１６は、ゼラチン固層化プレートにてＫＳＲを添加した無血清培地の培養系（Ｋ＋Ｇｌ）で培養した後に、血清培地での培養系（Ｓ＋Ｇｌ）に戻し、ＥＳ細胞の分化能を検討した結果を示す図である（実施例７）。図１６の上段はＫ＋Ｇｌ⇒Ｓ＋Ｇｌ（ＬＩＦ＋）の結果であり、下段はＫ＋Ｇｌ⇒Ｓ＋Ｇｌ（ＬＩＦ−）の結果である。図１６においてスケールバーは１００μｍであるが、２つのアスタリスクマークはスケールバーが２５μｍであることを示す。
図１７は、ゼラチン固層化プレートにて培地Ｙの培養系（Ｙ＋Ｇｌ）で培養した後に、血清培地での培養系（Ｓ＋Ｇｌ）に戻し、ＥＳ細胞の分化能を検討した結果を示す図である。図１７の上段はＹ＋Ｇｌ⇒Ｓ＋Ｇｌ（ＬＩＦ＋）の結果であり、下段はＹ＋Ｇｌ⇒Ｓ＋Ｇｌ（ＬＩＦ−）の結果である。図１７においてスケールバーは１００μｍであるが、２つのアスタリスクマークはスケールバーが２５μｍであることを示す。
図１８は、４μｇ／ｍｌの組換えヒトラミニン５を固層化したプレートにて培地Ｙの培養系（Ｙ＋Ｌｍ５−４）で培養した後に、血清培地での培養系（Ｓ＋Ｇｌ）に戻し、ＥＳ細胞の分化能を検討した結果を示す図である。図１８の上段はＹ＋Ｌｍ５−４⇒Ｓ＋Ｇｌ（ＬＩＦ＋）の結果であり、下段はＹ＋Ｌｍ５−４⇒Ｓ＋Ｇｌ（ＬＩＦ−）の結果である。図１８においてスケールバーは１００μｍであるが、＊＊はスケールバーが２５μｍであることを示す。
図１９は、２μｇ／ｍｌの組換えヒトラミニン５を固層化したプレートにて培地Ｙの培養系（Ｙ＋Ｌｍ５−２）で培養した後に、血清培地での培養系（Ｓ＋Ｇｌ）に戻し、ＥＳ細胞の分化能を検討した結果を示す図である。図１９の上段はＹ＋Ｌｍ５−２⇒Ｓ＋Ｇｌ（ＬＩＦ＋）の結果であり、下段はＹ＋Ｌｍ５−２⇒Ｓ＋Ｇｌ（ＬＩＦ−）の結果である。図１９においてスケールバーは１００μｍであるが、２つのアスタリスクマークはスケールバーが２５μｍであることを示す。
図２０は、Ｌｍ−Ｍｉｘにて培地Ｙの培養系（Ｙ＋Ｌｍ−Ｍｉｘ）で培養した後に、血清培地での培養系（Ｓ＋Ｇｌ）に戻し、ＥＳ細胞の分化能を検討した結果を示す図である。図２０の上段はＹ＋Ｌｍ−Ｍｉｘ⇒Ｓ＋Ｇｌ（ＬＩＦ＋）の結果であり、下段はＹ＋Ｌｍ−Ｍｉｘ⇒Ｓ＋Ｇｌ（ＬＩＦ−）の結果である。図２０においてスケールバーは１００μｍであるが、２つのアスタリスクマークはスケールバーが２５μｍであることを示す。
図２１は、Ｍｇにて培地Ｙの培養系（Ｙ＋Ｍｇ）で培養した後に、血清培地での培養系（Ｓ＋Ｇｌ）に戻し、ＥＳ細胞の分化能を検討した結果を示す図である。図２１の上段はＹ＋Ｍｇ⇒Ｓ＋Ｇｌ（ＬＩＦ＋）の結果であり、下段はＹ＋Ｍｇ⇒Ｓ＋Ｇｌ（ＬＩＦ−）の結果である。図２１においてスケールバーは１００μｍであるが、２つのアスタリスクマークはスケールバーが２５μｍであることを示す。
図２２は、フィーダー細胞上でのヒトｉＰＳ細胞の形態を示す図である。図２２の左側は２０１Ｂ２の形態を示し、右側は２０１Ｂ７の形態を示す。図２２のスケールバーは１ｍｍである。
図２３は、組換えヒトラミニン５と様々な細胞外マトリックスタンパク質が、ヒトｉＰＳ細胞に対する接着効果に及ぼす影響を比較した、接着アッセイの結果を示す図である。
図２４は、接着アッセイにおいて、組換えヒトラミニン５と様々な細胞外マトリックスタンパク質がヒトｉＰＳ細胞に対する接着効果に及ぼす影響を比較した際の、細胞の接着形態を示した図である。図２４のスケールバーは２５０μｍである。
図２５は、組換えヒトラミニン５と様々な細胞外マトリックスタンパク質が、ヒトｉＰＳ細胞のコロニー形成に対する効果を比較した、コロニーアッセイの結果を示す図である。図２５の上段はＳｉｎｇｌｅの結果であり、下段はＣｌｕｍｐの結果である。
図２６Ａは、組換えヒトラミニン５と様々な細胞外マトリックスタンパク質上で単一細胞から形成されたヒトｉＰＳ細胞のコロニーにつき、未分化性を維持しているかを検討した結果を示す図である。図２６Ａは、Ｓｉｎｇｌｅでコロニーアッセイを行った際の免疫染色の結果であり、スケールバーは２５０μｍである。
図２６Ｂは、組換えヒトラミニン５と様々な細胞外マトリックスタンパク質上で細胞塊より形成されたヒトｉＰＳ細胞のコロニーにつき、未分化性を維持しているかを検討した結果を示す図である。図２６Ｂは、Ｃｌｕｍｐでコロニーアッセイを行った際の免疫染色の結果であり、スケールバーは２５０μｍである。
図２７は、組換えヒトラミニン５と様々な細胞外マトリックスタンパク質上で形成されたヒトｉＰＳ細胞の長期継代培養を行った際の、培養５週におけるヒトｉＰＳ細胞の形態を示す図である。スケールバーは各々の細胞外マトリックスについて、左側が１ｍｍであり、右側が１００μｍである。
図２８は、組換えヒトラミニン５と様々な細胞外マトリックスタンパク質の存在下でヒトｉＰＳ細胞を培養した際の、種々の未分化マーカーの発現を検討した結果を示す図である。
図２９は、組換えヒトラミニン５と様々な細胞外マトリックスタンパク質の存在下で培養したヒトｉＰＳ細胞を分化誘導した際の、ヒトｉＰＳ細胞の形態を示す図である。図２９のスケールバーは１ｍｍである。
図３０は、組換えヒトラミニン５と様々な細胞外マトリックスタンパク質の存在下で培養したヒトｉＰＳ細胞を分化誘導した際の、種々の分化マーカーの発現を検討した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
以下、本発明の詳細、並びにその他の特徴および利点について、形態に基づいて詳しく説明する。
１．多能性幹細胞を増殖させる方法
本発明は、多能性幹細胞を増殖させる方法を提供する。本発明の方法は、支持細胞も血清も含まない培地中で、かつラミニン５を含んだ系で該多能性幹細胞を培養することを含む。
多能性幹細胞
本発明において「多能性幹細胞」とは、あらゆる組織の細胞へと分化する能力（分化多能性）を有する幹細胞の総称することを意図する。本明細書において後述する実施例ではＥＳ細胞を用いて検討を行っているが、本発明の方法で増殖させることができる多能性幹細胞には、胚性幹細胞のみに限らず、哺乳動物の成体臓器や組織の細胞、骨髄細胞、血液細胞、更には胚や胎児の細胞等に由来する、胚性幹細胞に類似した形質を有する全ての多能性幹細胞が含まれる。この場合、胚性幹細胞と類似の形質とは、胚性幹細胞に特異的な表面（抗原）マーカーの存在や胚性幹細胞特異的な遺伝子の発現、又はテラトーマ（ｔｅｒａｔｏｍａ）形成能といった、胚性幹細胞に特異的な細胞生物学的性質をもって定義することができる。
限定されるわけではないが、本発明の方法で増殖させることができる細胞の具体例としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、生殖幹細胞（ＧＳ細胞）等が挙げられる。なお本発明における多能性幹細胞として、ＥＳ細胞とｉＰＳ細胞が好ましい。ｉＰＳ細胞は倫理的な問題もない等の理由により特に好ましい。
本明細書における、「ＥＳ細胞」とは、発生初期に存在する個体を構成するすべての組織細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を取り出し、インビトロで培養できるように株化したものを意味する。ＥＳ細胞は、初期胚中の多能性幹細胞と同様に個体を構成するすべての細胞に分化する能力を保持したまま事実上無制限に増やすことができる。
具体的には、ＥＳ細胞はマウスのものが１９８１年に初めて記載された（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８，７６３４−７６３８，１９８１、Ｎａｔｕｒｅ  ２９２，１５４−１５６，１９８１）。ＥＳ細胞は多分化能を有し、個体を構成するすべての組織および細胞タイプを発生させうる。
ラット（Ｉａｎｎａｃｏｎｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６３，２８８−２９２，１９９４）、ハムスター（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１２７，２２４−２２７，１９８８）、ウサギ（Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．３６，４２４−４３３，１９９３）、鳥類、魚類、ブタ（Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．６，５６３−５６８，１９９４）、ウシ（Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．６，５５３−５６２，１９９４）、ならびに霊長類（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２，７８４４−７８４８，１９９５）を包含する多種多様な種から多分化能胚性幹細胞が単離されている。
胚性ヒト組織からのＥＳ細胞およびＥＳ細胞様幹細胞の単離についてもいくつかの研究チームが、成功している。初期の成功例は以下のようなものである。（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２，１１４５−１１４７，１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５，１３７２６−１３７３１，１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１８，３９９−４０４，２０００）。これらのＥＳ細胞株は、胚盤胞から分離したＩＣＭをフィーダー細胞上で培養することで樹立されている。他の最近の研究は、胚および成熟哺乳動物細胞由来の核を脱核卵母細胞中に移植することにより胚および胚性細胞を得ることが可能であることを示している。
２００６年にＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のＲｏｂｅｒｔ  Ｌａｎｚａらのグループは、マウスおよびヒトにおいて、胚盤において、胚盤胞期以前の卵割期の胚の単一割球のみを用いて、胚の発生能を損なうことなく、ＥＳ細胞を樹立することに成功した（Ｎａｔｕｒｅ４３９：２１６−２１９，２００６、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２，１１３−１１７，２００８）。この技術開発により受精卵を破壊せずにＥＳ細胞の樹立を行うことが可能になった。同年、ニューキャッスル大学のＭｉｏｄｒａｇ  Ｓｔｏｊｋｏｖｉｃらのグループが、発生停止したヒトの胚からＥＳ細胞を樹立することに成功した（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２４，２６６９−２６７６，２００６）。これにより、不妊により、治療において廃棄されていた過剰な卵を用いることが可能になった。
また、２００４年にシカゴ生殖遺伝学研究所のユーリー・バーリンスキーらのグループは、遺伝病を持つヒトの胚から２０のＥＳ細胞株を樹立することに成功した。これらは深刻な遺伝病の治療研究に使用可能な初のＥＳ細胞である。ユーリー・バーリンスキーは現在、他に遺伝子の異なる２００株以上のＥＳ細胞を保有しており、これらは医薬品のスクリーニング（選別）などへの使用が可能である。
本発明の方法においては、任意の樹立されたＥＳ細胞株を使用可能である。あるいは、本発明の方法によって作成されたＥＳ細胞を個体に適用した場合の免疫拒絶反応を防ぐためには、個体の体細胞を用いてクローン胚を作成しそこからＥＳ細胞株を樹立する方法が有効である。この方法を用いれば個体と同一の遺伝的要素をもったＥＳ細胞を樹立することが可能である。
あるいは、体細胞クローンの作成では卵子に導入された体細胞の核が受精卵の核と同じような状態に変化する、「初期化」と呼ばれる現象が起きると考えられている。卵子のもつこのような活性に類似した活性をＥＳ細胞ももつことが報告されている（Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，１１，１５５３−１５５８，２００１）。つまり、個体の体細胞とＥＳ細胞を融合することで、体細胞をＥＳ細胞のような細胞に変換できることが期待される。ＥＳ細胞はインビトロで遺伝子操作を行うことができるので、ＭＨＣ遺伝子群などの免疫拒絶に関与する因子をあらかじめ操作したＥＳ細胞でこれを行うことで、体細胞クローン胚作成などの手法を用いることなく拒絶反応を回避できることが期待される。
本発明において、「ＥＳ細胞」は好ましくはヒトのＥＳ細胞である、現在、樹立されたヒトＥＳ細胞株は、例えば京都大学再生医科学研究所より入手可能である。
あるいは、ＥＳ細胞は、本明細書において上述した種々の文献の記載に従って作成することが可能である。
本明細書における「ｉＰＳ細胞」とは、体細胞へＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃなどの転写因子の遺伝子を導入することにより得られた、ＥＳ細胞に似た分化多能性を有する細胞を意味するものである。よってｉＰＳ細胞もＥＳ細胞と同様に、分化多能性を保持したまま無制限に増やすことができる。
京都大学山中伸弥らのグループは、体細胞からＥＳ様細胞に変化した細胞だけを単離するために、ＥＳ細胞のみで発現しているが、ＥＳ細胞の分化多能性維持には必要でないＦｂｘ１５という遺伝子に着目した。この遺伝子部位に相同組換え技術を用いてネオマイシン耐性遺伝子を導入し、培地中にこの耐性遺伝子によって無毒化されるＧ４１８を添加することによって、Ｆｂｘ１５を発現するＥＳ様細胞のみＧ４１８耐性を獲得して生き残り、Ｆｂｘ１５を通常発現していない体細胞は死滅するという実験系を構築した。この実験系を用いて、ｉＰＳ細胞を樹立するには、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ４遺伝子で十分であることを突き止めた（Ｃｅｌｌ．１２６，６６３−６７２，２００６）。
更に同グループは、マウスｉＰＳ細胞樹立で使用されたマウス遺伝子のヒト相同遺伝子であるＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｃ−ＭＹＣを用いて、線維芽細胞からヒトｉＰＳ細胞の樹立にも成功した（Ｃｅｌｌ．１３１，８６１−８７２，２００７）。
時を同じくして、世界で初めてヒトＥＳ細胞を樹立したジェームズ・トムスン（Ｊａｍｅｓ  Ｔｈｏｍｓｏｎ）らのグループは、京都大学山中伸弥らがマウスｉＰＳ細胞樹立に成功した時と同じ戦略を用い、ヒトＥＳ細胞で特異的に発現している遺伝子の中から、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８の４遺伝子を胎児肺由来の線維芽細胞や新生児包皮由来の線維芽細胞へ導入することで、ヒトｉＰＳ細胞の樹立に成功した（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：１９１７―１９２０，２００７）。
また、２００７年１２月には京都大学山中伸弥らのグループによって、ｃ−Ｍｙｃの遺伝子導入をせずにＯｃｔ−４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４の３因子だけでも、マウスおよびヒトにおいてｉＰＳ細胞の樹立が可能であることを示し、ｉＰＳ細胞が癌細胞に変化するのを抑えるのに成功した（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１０１―１０６，２００８）。これは、ほぼ同時にマサチューセッツ工科大学のルドルフ・ヤニッシュ（Ｒｕｄｏｌｆ  Ｊａｅｎｉｓｃｈ）らのグループも同様の実験にマウスで成功している（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２：１０―１２，２００８）。
なお発癌などのリスクを回避するために、導入する因子を更に減らす試みがなされている。その結果マックスプランク研究所のハンス・シェーラー（Ｈａｎｓ  Ｒ  Ｓｃｈｏｌｅｒ）らは成体マウスの神経幹細胞に２つの遺伝子、即ちＯｃｔ４とＫｌｆ４又はＯｃｔ４とｃ−Ｍｙｃのいずれかを導入することにより、ｉＰＳ細胞を樹立することに成功している（Ｎａｔｕｒｅ  ４５４：６４６−６５０，２００８）。更に最近ハンス・シェーラー（Ｈａｎｓ  Ｒ  Ｓｃｈｏｌｅｒ）らは、神経幹細胞からｉＰＳ細胞を作製するには、Ｏｃｔ４を単独で導入するだけでも充分であることを報告している（Ｃｅｌｌ  １３６：４１１−４１９，２００９）。
また、Ｓｈｅｎｇ  ＤｉｎｇらはｉＰＳ細胞を誘導するにあたり、一部の遺伝子を低分子で補完できることを報告している（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ３，５６８−５７４，２００８）。ＢＩＸやＢａｙＫといった低分子を利用することで、マウス胎仔性線維芽細胞にＯｃｔ４とＫｌｆ４の２つの遺伝子を導入するだけで、ｉＰＳ細胞が誘導できることを示した。
さらに、ｉＰＳ細胞の誘導にあたって遺伝子導入方法を改善する試みもなされている。現在、レトロウイルスのように導入遺伝子が染色体に組み込まれる可能性の高いウイルスが広く使われているが、組み込まれる可能性の低いとされるアデノウイルス（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２，９４５−９４９，２００８）や、プラスミドベクター（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２，９４９−９５３，２００８）を使用した方法が報告されている。
本発明において、「ｉＰＳ細胞」は好ましくはヒトのｉＰＳ細胞である、現在、樹立されたヒトｉＰＳ細胞株は、例えば京都大学、理化学研究所バイオリソースセンターより入手可能である。
あるいは、ｉＰＳ細胞を以下の文献の記載を参考にして作製してもよい。例えば人工多能性幹細胞は京都大学山中伸弥教授のグループに係る文献（Ｃｅｌｌ  １３１，８６１−８７２，２００７、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６，１０１―１０６，２００８）や、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ大学のＴｈｏｍｓｏｎのグループに係る文献（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８，１９１７−１９２０，２００７）に記載された方法に従って作製することができる。
具体的には、任意の体細胞に対してＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇ、ＬＩＮ２８の内、少なくとも一つ以上の遺伝子を導入し、多能性幹細胞に特異的な遺伝子やタンパク質の発現を検出し、これらを選別することによって作製することができる。
この様にして作製したｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞と同様に、増殖不活性化したマウス線維芽細胞やこれを代替出来る細胞存在下で、塩基性線維芽細胞増殖因子と共に培養することができ、ＥＳ細胞と同様に多能性幹細胞として利用することができる。
このｉＰＳ細胞は、種々の組織への分化の特徴や細胞内での遺伝子発現の特徴に関して、ＥＳ細胞と同様の性状を有していることがこれまでに明らかになっており（Ｃｅｌｌ．１２６，６６３−６７２，２００６、Ｃｅｌｌ  １３１：８６１−８７２，２００７、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８，１９１７−１９２０，２００７）、ＥＳ細胞の培養条件やＥＳ細胞から種々の組織へ分化誘導する条件を、ｉＰＳ細胞に対してそのまま適用することができる（高橋および山中、細胞工学，Ｖｏｌ．２７、Ｎｏ．３，２５２−２５３，２００８）。
本明細書における「ＥＧ細胞」は始原生殖細胞から作製される任意の胚性生殖幹細胞を意味し、その起原等は特に限定されない。
また本明細書における「ＧＳ細胞」は、精巣の生殖細胞より作製される生殖幹細胞で、精原幹細胞（精子幹細胞）を体外で培養できるようにした細胞株である（Ｃｅｌｌ．１１９，１００１−１０１２，２００４）。ＧＳ細胞のうち特にＥＳ細胞と同様の性質を有し、分化多能性も有する、ｍＧＳ細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）が好ましい。本明細書において「ＧＳ細胞」と記載した場合、文意によりｍＧＳ細胞を意味する。
ラミニン５
本発明の方法は、多能性幹細胞の培養にあたり、ラミニン５を含んだ系で該多能性幹細胞を培養することを、最も顕著な特徴とする。
ラミニン５は、多くの細胞種に対して、他のラミニンアイソフォームを含めた各種細胞外マトリックスタンパク質と比べて強い接着活性を示すことが報告されている（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１６，８６２−８６９，１９９４、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２５，２０５−２１４，１９９４、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ．１６，８８１−８９０，２００５）。
表１に示されるようにラミニン５は、α３鎖、β３鎖、γ２鎖からなるラミニン分子であり、表皮の真皮への結合に中心的な役割を果たしており、殆どの細胞においてインテグリンα３β１に優先的に結合するが、細胞によってはインテグリンα６β１、α６β４にも結合する。ラミニン５におけるα３鎖Ｇ２ドメインのα３Ｇ２Ａ配列（ＲＥＲＦＮＩＳＴＰＡＦＲＧＣＭＫＮＬＫＫＴＳ）やＧ３ドメインのＫＲＤ配列がインテグリンに対する主要な結合部位であることが解明されている。
またラミニン５は３量体として分泌された後、プロテアーゼによる限定分解を受けてα３鎖のＣ末端に存在するＧ４およびＧ５ドメインが除去され、１９０ｋＤａ（非切断型）から１６０ｋＤａ（切断型）へ変換されることが知られている。通常の方法で単離されるラミニン５にはＧ４、Ｇ５ドメインが存在しない。このようなα３鎖切断型ラミニン５は非切断型ラミニン５に比べて高い細胞接着促進活性、運動促進活性、および神経再生促進活性を有することが知られている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０（２００５），１４３７０―１４３７７）。
本発明のラミニン５は、特に限定されず、Ｇ４及びＧ５ドメインを含むままの非切断型であってもよく、あるいはあるいはＧ４及びＧ５ドメイン全体あるいはその一部が除去された切断型であってもよい。
また、ラミニン５タンパク質は天然型であっても、あるいはその生物学的活性、特に細胞接着促進活性保持したまま１又はそれ以上のアミノ酸残基が修飾された修飾型であってもよい。また、本発明におけるラミニン−５タンパク質は本明細書に記載した特徴を有する限り、その起源、製法などは限定されない。即ち、本発明のラミニン−５タンパク質は、天然産のタンパク質、遺伝子工学的手法により組換えＤＮＡから発現させたタンパク質、あるいは化学合成タンパク質の何れでもよい。
ラミニン５タンパク質の由来は特に、限定されないが、好ましくは、ヒト由来のものである。再生医療の材料を得る目的などでヒト多能性幹細胞を培養する場合には、他の動物に由来する材料の使用を避けるという意味で、ヒト由来のラミニン５を用いることが好適である。
本明細書中の配列表の配列番号１−６は、ヒトラミニン５のα３鎖、β３鎖及びγ２鎖の塩基配列及びアミノ酸配列を示す。本発明で使用するラミニン５タンパク質は、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列、またはこの配列において１またはそれ以上のアミノ酸が欠失、付加、または置換されているアミノ酸配列を有するα３鎖（アミノ酸残基Ｎｏ．１―Ｎｏ．１７１３）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２２７７９―２２７８７，１９９４）、配列番号４のアミノ酸配列、またはこの配列において１またはそれ以上のアミノ酸が欠失、付加、または置換されているアミノ酸配列を有するβ３鎖（アミノ酸残基Ｎｏ．１―Ｎｏ．１１７０）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１１０７３―１１０８０、１９９４）、及び配列番号６のアミノ酸配列、またはこの配列において１またはそれ以上のアミノ酸が欠失、付加、または置換されているアミノ酸配列を有するγ２鎖（アミノ酸残基Ｎｏ．１―Ｎｏ．１１９３）（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１９，６７９―６９３、１９９２）の各サブユニットからなるタンパク質である。
α３鎖の球状ドメイン（Ｇ１―Ｇ５ドメイン）はそれぞれ、配列番号１のアミノ酸残基Ｎｏ．７９４―Ｎｏ．９７０、Ｎｏ．９７１―Ｎｏ．１１３９、Ｎｏ．１１４０―Ｎｏ．１３５３、Ｎｏ．１３５４―Ｎｏ．１５２９およびＮｏ．１５３０―Ｎｏ．１７１３に相当する。
ラミニン５の各鎖は、対応する配列番号で示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加、または置換されているアミノ酸配列を有するものであってもよい。このような天然のタンパク質と相同なアミノ酸配列を有するタンパク質も、本発明において使用可能である。変更可能なアミノ酸数は、α３鎖、β３鎖及びγ２鎖の各アミノ酸配列において、限定されるわけではないが、好ましくは１ないし３００アミノ酸残基、１ないし２００アミノ酸残基、１ないし１５０アミノ酸残基、１ないし１２０アミノ酸残基、１ないし１００アミノ酸残基、１ないし８０アミノ酸残基、１ないし５０アミノ酸残基、１ないし３０アミノ酸残基、１ないし２０アミノ酸残基、１ないし１５アミノ酸残基、１ないし１０アミノ酸残基、１ないし５アミノ酸残基である。公知の部位特異的突然変異法で修飾可能な数のアミノ酸残基、例えば、１ないし１０アミノ酸残基、１ないし５アミノ酸残基がより好ましい。
アミノ酸の保存的置換を行って元の機能を保持しているタンパク質またはポリペプチドを得ることができることは、当技術分野においてよく知られている。そのような置換には、アミノ酸を類似の物理化学的特性を有する残基で置き換えること、例えば、１つの脂肪酸残基（Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａ）を別なもので、または塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇ、酸性残基ＧｌｕとＡｓｐ、アミド残基ＧｌｎとＡｓｎ、ヒドロキシル残基ＳｅｒとＴｙｒ、または芳香族残基ＰｈｅとＴｙｒの間で置換することが含まれる。
また、本発明で用いるラミニン５は、配列番号２、４、６に記載されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有し、かつ細胞接着活性を促進することができるタンパク質であってもよい。ラミニン５の構成サブユニットの構造をラミニン１と比較すると、各サブユニット間のアミノ酸配列の相同性は５０％以下である。特に、上述のα鎖のＧドメインの相同性は低く、約２５％である。
同一性は、同一である残基の数を、既知の配列または既知の配列のドメイン中の残基の総数で割り、１００を乗ずることにより計算する。標準的なパラメーターを用いて配列の同一性を決定するためのコンピュータープログラムは、例えば、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ＰＳＩ―ＢＬＡＳＴ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５，３３８９―３４０，１９９７）、ＢＬＡＳＴ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３―４１０，１９９０）、およびＳｍｉｔｈ―Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５―１９７，１９８１）が利用可能である。好ましくは、これらのプログラムのデフォルト設定を用いるが、所望によりこれらの設定を変更してもよい。
本発明におけるラミニン５タンパク質は本明細書に記載した特徴を有する限り、その起源、製法などは限定されない。即ち、本発明のラミニン５タンパク質は、ラミニン５を分泌するヒト或いは動物細胞の培養液上清、あるいはそこから精製した天然型ラミニン５タンパク質であってもよい。しかしラミニン５は、当該技術分野において知られる組換えＤＮＡ技術を用いて各サブユニットを発現させることにより遺伝子組換えタンパク質として効果的に製造することができる。しかし不必要な動物性の因子を避けるという意味から、ラミニン５をヒト組換えタンパク質として得ることは特に好ましい。
ラミニン５のα３鎖をコードする、配列番号１の核酸残基Ｎｏ．１―Ｎｏ．５１３９を含むＤＮＡ配列、β３鎖をコードする配列番号３の核酸残基Ｎｏ．１２１―Ｎｏ．３６３０及びγ２鎖をコードする配列番号５の核酸残基Ｎｏ．１１８―Ｎｏ．３６９６の塩基配列に基づいてプライマーを設計し、適切なｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により目的とする配列を増幅することにより製造することができる。このようなＰＣＲ手法は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｍｉｃｈａｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９９０に記載されている。
ラミニン５の各鎖遺伝子をコードするＤＮＡを、適当なベクター中に組み込み、これを真核生物または原核生物細胞のいずれかに、各々の宿主で発現可能な発現ベクターを用いて導入し、それぞれの鎖を発現させることにより所望のタンパク質を得ることができる。ラミニン５を発現させるために用いることができる宿主細胞は特に限定されるものではなく、大腸菌、枯草菌等の原核宿主細胞、および酵母、真菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核生物宿主が挙げられる。なお下記の実施例で使用しているヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ２９３は宿主細胞として特に好ましい。
ラミニン５を発現するように構築したベクターを、トランスフォーメーション、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション等により、上記の宿主細胞中に導入することができる。ベクターを含む細胞を適当な培地中で成長させて、本発明で使用するラミニン５タンパク質を産生させ、細胞または培地から精製することにより、ラミニン５タンパク質を得ることができる。精製はサイズ排除クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、および免疫アフィニティークロマトグラフィー等を用いて行うことができる。
ラミニン５については、特開２００１―１７２１９６に詳細な記載があり、本明細書中に援用する。
多能性幹細胞を増殖させる方法
本発明においては、ラミニン５を含んだ系で多能性幹細胞を培養する。本発明で「ラミニン５を含んだ系」とは、多能性幹細胞の培養システム中に何らかの形でラミニン５を含むことを意味するものであり、その態様は特に限定されない。
本発明において、ラミニン５を含んだ系で多能性幹細胞を培養するのに、ラミニン５で処理した培養容器を用いることは好適な態様である。しかしそれに限定されるものではなく、本発明の「ラミニン５を含んだ系」には、多能性幹細胞を培養するために培地中にラミニン５を添加するという態様なども含まれる。
また本発明において「ラミニン５で処理した培養容器」とは、その表面にラミニン５を固層化するなどの処理がなされた培養容器を意味する。また本発明における「培養容器」は特に限定されるものではなく、細菌の混入を防ぐために滅菌処理され、かつ細胞を培養するのに適した任意の材料、任意の形状の容器を用いることができる。そのような培養容器の例として、本技術分野で一般的に用いられている培養用ディッシュ、培養用フラスコ、培養用シャーレ、９６ウェル、４８ウェル、１２ウェル、６ウェル、４ウェル等の培養用プレート、培養用ボトルなどを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。培養容器の表面にラミニンを固層化する処理技術は本技術分野で公知であり、当業者は本発明の目的に応じて任意の培養容器を採用して該容器をラミニン５で処理し、ラミニン５処理された該容器を本発明の方法で多能性幹細胞を培養するのに用いることができる。
培養容器を処理に使用されるラミニン５の量は特に限定されされない。好ましくは、０．０５μｇ／ｍｌ以上、好ましくは０．５〜１５μｇ／ｍｌ、より好ましくは３．７５μｇ／ｍｌ−１５μｇ／ｍｌのラミニン５溶液で処理した場合、良好な結果が得られる。
本明細書において後述する下記の実施例に示すように、本発明者らは組換えヒトラミニン５がマウスＥＳ細胞に対してマトリゲルやラミニン混合物や他の細胞外マトリックスタンパク質に比べ、強い接着活性を示すことを見出し、本発明に至った。さらに本発明において、マウスＥＳ細胞は、組換えヒトラミニン５にて固層化したプレートでＬＩＦおよび無血清培地にてＭＥＦ非存在下で維持培養できることが見出された。ＭＥＦ非存在下でのマウスＥＳ細胞の培養は従来、ゼラチンで固層化したプレートで牛胎児血清（ＦＢＳ）存在下で行われてきた。本発明の方法で培養した場合、マウスＥＳ細胞は、ＭＥＦもＦＢＳも存在しない条件でも通常法と同等の増殖を示し、さらに未分化性も維持していることが確認できた。加えて本発明の方法で培養した場合、多分化能も維持していた。
またヒトｉＰＳ細胞における検討も行ったところ、下記の実施例に示すように、組換えヒトラミニン５はヒトｉＰＳ細胞に対しても強い接着活性を示した。加えてヒトｉＰＳ細胞を、組換えヒトラミニン５にて固層化したプレートで培養すると無血清の条件下でコロニーを形成し、維持培養することが可能であった。更には本発明の方法により培養したヒトｉＰＳ細胞は未分化性を維持していた。
よって、本願発明の方法は、支持細胞も血清も含まない培地中で多能性細胞を培養することを含む。より好ましくは、ヒト以外の動物性由来の物質を含まない培地中で培養する。
ヒトＥＳ細胞に関しては過去にＭＥＦに代わる支持材料として、マトリゲル、フィブロネクチン、ラミニン１、１型コラーゲン、４型コラーゲンなど様々な細胞外マトリックスタンパク質が試されているが、いずれも接着活性は数％以下であった（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２４，２６４９−２６６０，２００６）。本発明では、ラミニン５の強い接着活性を、細胞接着効率の極めて悪い、多能性幹細胞、例えばヒトＥＳ細胞やヒトｉＰＳ細胞の維持培養に利用することにより、ＭＥＦ非存在下での接着効率と増殖効率が改善することができる。また、ヒトＥＳ細胞やヒトｉＰＳ細胞を再生医療に利用するための完全に動物由来の物質を含まない培養系を構築する材料として組換えヒトラミニン５は有用である。
このように、本発明ではラミニン５で処理することにより培養容器に対する多能性幹細胞の細胞接着効率が向上し、通常では多能性幹細胞の培養に必要な支持細胞を用いなくても、該細胞を効率良く増殖させることができる。
本明細書中における「支持細胞（フィーダー細胞）」とは、増殖や分化を起こさせようとする目的の多能性幹細胞の培養条件を整えるために用いられ、補助役を果たす他の細胞を意味する。ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性細胞の場合、従来の一般的な方法では、マウス由来の初代培養線維芽細胞を支持細胞として用いることにより、該支持細胞により多能性細胞に成長因子などの栄養物が供給されるので、細胞の培養が可能となる。本発明によればラミニン５の強力な接着効率により、かかる支持細胞を使用せずに、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞など多能性幹細胞の培養が可能となった。
また本発明において「支持材料」とは細胞の増殖を助けるために用いられるタンパク質性の因子を意味するが、本発明では支持材料としてラミニン５を用いる。下記の実施例において示すように、種々の細胞外マトリックスと比べてラミニン５は高い接着能を有し、多能性幹細胞の支持材料として優れている。
また本発明において多能性幹細胞の「分化」とは、全ての組織に分化する潜在的能力を有するという分化多能性を失い、特定の組織を構成する細胞としての形質を有するようになる変化をいう。例えばＥｃａｔｌ、ＥＲａｓ、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｒｅｘ１、Ｓｏｘ２、Ｕｔｆ１などの多能性幹細胞の未分化マーカーを測定することにより、培養中に多能性幹細胞が分化していないか評価することができる。下記の実施例３，４に示すように、本発明の方法により培養したＥＳ細胞の継代による分化を評価したところ、１０回以上継代培養しても分化することはなく未分化状態を保っていた。更に下記の実施例５で示すように、本発明の方法により培養したＥＳ細胞の継代による多分化能の維持を評価したところ、やはり継代しても多分化能を維持していた。
更に下記の実施例１１に示すように、本発明の方法により培養したヒトｉＰＳ細胞も、５週間継代培養しても分化することはなく未分化状態を保っていた。更には下記の実施例１２に示すように、本発明により培養したヒトｉＰＳ細胞を、分化誘導することも可能であった。
本発明の一態様において、培養容器の内部表面にラミニン５を塗布した後に乾燥するなどして培養容器をラミニン５で処理してもよい。ラミニン５処理した培養容器にＧＭＥＭやＤＭＥＭなどの多能性幹細胞の培養に一般的に使用される培地を入れ、その培地中に多能性幹細胞を添加する。次いで、公知の適切な培養条件下、例えば限定するわけではないが３７℃、５％二酸化炭素気層条件下などで該多能性幹細胞の培養を行う。
本発明の好ましい一態様において、ラミニン５を含んだ系に加えて、適切な添加物を培養培地に加えるとさらに好ましい。添加物は、好ましくは血清以外のものであり、より好ましくはヒト以外の動物由来の物質を含まない。
限定されるわけではないが、添加物の一例は、血清代替添加物である。血清代替添加物とは、血清と類似した成分を含むように構成された人工的な液体組成物であって、それを添加することにより、血清が存在しなくても細胞の増殖が可能となる。なお血清代替添加物の一例として、各種アミノ酸、無機塩類、ビタミン、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、抗酸化成分を加えたものを使用することができる。各種アミノ酸とは、例えば、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン等が含まれる。無機塩類とは、例えば、ＡｇＮＯ３、ＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、Ｂａ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２、ＣｄＳＯ４・８Ｈ２Ｏ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、Ｃｒ２（ＳＯ４）３・１Ｈ２Ｏ、ＧｅＯ２、Ｎａ２ＳｅＯ３、Ｈ２ＳｅＯ３、ＫＢｒ、ＫＩ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＮａＦ、Ｎａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏ、ＮａＶＯ３、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、ＲｂＣｌ、ＳｎＣｌ２、ＺｒＯＣｌ２・８Ｈ２Ｏおよび亜セレン酸ナトリウム等が含まれる。ビタミンとは、例えばチアミン、アスコルビン酸等が含まれる。抗酸化成分とは例えば還元型グルタチオンなどが含まれる。
またノックアウトＴＭ血清代替添加物（ＫＳＲ）とは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社が市販しているＥＳ細胞用の血清代替添加物である。下記の実施例３と実施例４のように培地にＫＳＲを１０％程度添加した培地中で多能性幹細胞を培養することは本発明の好適な態様である。
更に、下記の実施例６に示した組成の血清代替添加物を用いることもまた、本発明の好適な態様である。実施例６において、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、ヒドロキシプロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンなどのアミノ酸、チアミン、アスコルビン酸などのビタミン、銀、アルミニウム、バリウム、カドミウム、コバルト、クロム、ゲルマニウム、マンガン、ケイ素、バナジウム、モリブデン、ニッケル、ルビジウム、スズ、ジルコニウムなどの微量金属元素、臭素、ヨウ素、及びフッ素などのハロゲン元素、及び、アルブミン、還元型グルタチオン、トランスフェリン、インスリン、亜セレン酸ナトリウムなどの成分を含む血清代替添加物の組成を開示している。しかし本発明の血清代替添加物を構成する成分はこれらに限定されるものでなく、類似する他の成分で置換するなど、種々の改変を加えることができる。また血清代替添加物に含まれる各成分の含量も、実施例６に記載されたものに限定されるものではなく、細胞の性質や実験の目的により適宜調整することができる。
添加物としてはＫＳＲと同様の成分及び／同様の機能を奏するものであればよい。
２．ラミニン５の細胞支持材料としての使用
本発明はまた、ラミニン５の、多能性幹細胞を増殖させるための細胞支持材料としての使用である。これまで述べてきたように、ラミニン５は細胞接着において強力な作用を有するので、支持細胞も血清も含まない培地中で多能性幹細胞を培養するのに、ラミニン５は有用である。
３．多能性幹細胞の培養用キット
本発明はさらに、ラミニン５で処理した培養容器と、血清代替添加物とを含む、多能性幹細胞の培養用キットである。血清代替添加物は、好ましくはノックアウトＴＭ血清代替添加物（ＫＳＲ）である。あるいは、実施例６に示した組成の血清代替添加物も利用可能である。
該キットはその他に、ＧＭＥＭやＤＭＥＭなど多能性幹細胞の培養用の培地を含むことができる。またもし必要ならば、該キットは更に、細胞培養に必要なその他の添加物や、培養するべき多能性幹細胞を含むこともできる。かかる添加物の例として、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、メルカプトエタノールや抗生物質を挙げることができる。そのようなキットを１つのパッケージとしてキットを構成することもできるし、あるいは低温に保存する必要がある多能性幹細胞のみを別個のパッケージとした複数のパッケージとしてキットを構成することもできる。
【実施例】
【０００８】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１  組換えヒトラミニン５（ｒＬｍ５）の調製
本実施例では、公知の方法に従って組み換えヒトラミニン５タンパク質を調製した。
α３鎖（配列番号１）、β３鎖（配列番号３）、γ２鎖（配列番号３）のｃＤＮＡを導入したヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ２９３（Ｌｍ５−ＨＥＫ２９３）から回収した無血清培養上清を４℃、３０００ｒｐｍで５分遠心した。ヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ２９３は、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３２，６０７−６１２  （２００２）に従って得た。次いで、Ｈｅｐａｒｉｎ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけ、溶出した。マウス抗Ｌｍ−α３（抗ラミニンα３）モノクローナル抗体（ＢＧ５）をＰｒｏｔｅｉｎＡ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に共有結合させた抗体カラムにｒＬｍ５含有画分を通し、次いで溶出した。なお、モノクローナル抗体ＢＧ５はラミニンα３Ｂ鎖Ｎ末端断片を抗原として公知のモノクローナル抗体作成方法に従って、本発明者らが作成した抗体である。
１μｇの精製ｒＬｍ５を還元条件にて変性した後、５−２０％ゲルを用いＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にてα３鎖、β３鎖、γ２鎖のサイズ、純度を確認したところ、それぞれ１６０ｋＤａ、１３５ｋＤａ、１０５ｋＤａのバンドが確認できた。図１に精製ｒＬｍ５についてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果の写真を示す。
ＣＳ−Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて解析した結果、精製ｒＬｍ５の純度は約９８％であった。このようにして調製したｒＬｍ５を以下の実施例において使用した。
実施例２  マウスＥＳ細胞株ＥＢ３を用いた接着アッセイ
本実施例では、各種細胞支持材料を使用した場合におけるマウスＥＳ細胞株ＥＢ３を用いた接着アッセイの結果を示す。
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、１０００Ｕ／ｍｌ  ＥＳＧＲＯ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、及び１０−４Ｍ  ２−メルカプトエタノール（ＷＡＫＯ）を添加したＧＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ）を、マウスＥＳ細胞株であるＥＢ３細胞の維持培地として用いた。ＥＢ３細胞は、大阪大学医学系研究科未来医療開発専攻Ｇ６  分子治療学講座  幹細胞制御分野から提供を受けた。
接着アッセイでは、維持培地と同様の組成であるがＦＢＳは添加していない無血清培地を用いた。細胞支持材料としては、ウシゼラチン（ＳＩＧＭＡ）、ｒＬｍ５、マトリゲル（登録商標、ＢＤ）、ヒトビトロネクチン（ＳＩＧＭＡ）、ヒトＩＶ型コラーゲン（ＢＤ）、ヒトフィブロネクチン（ＢＤ）、ヒトラミニン２（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）及びヒトラミニン（ＳＩＧＭＡ）を用いた。そして下記のように各々の細胞支持材料で処理を行ったプレートを作製し、各細胞支持材料について接着アッセイを行った。
濃度調製した各種の細胞外マトリックスタンパク質で９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を処理し、１．２％ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ）溶液にて３７℃で１時間ブロッキング処理を行った。各種細胞外マトリックスタンパク質を、１．５ｍｇ／ｍｌのゼラチン（Ｇｌ）、３．７５μｇ／ｍｌのラミニン２（Ｌｍ２）、３．７５μｇ／ｍｌのラミニン混合物（Ｌｍ−Ｍｉｘ）、１５０μｇ／ｍｌのマトリゲル（Ｍｇ）、１５μｇ／ｍｌのコラーゲン（Ｃｏ）、１５μｇ／ｍｌのフィブロネクチン（Ｆｎ）、１５μｇ／ｍｌのビトロネクチン（Ｖｎ）の濃度に調製した。また、ｒＬｍ５（Ｌｍ５）は３．７５μｇ／ｍｌ、７．５μｇ／ｍｌ及び１５μｇ／ｍｌの３段階の２倍希釈系列に調製した。
ＥＢ３細胞を無血清培地にて洗浄した後、３００００個／ウェルでプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気の気層条件下で３０分間、および６０分間培養を行った。培養後、ボルテックスミキサーで軽く震動させて接着の弱い細胞をプレート表面から浮遊させ、パーコール（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）処理にて該細胞を除いた。接着した細胞を２５％グルタルアルデヒド（Ｎａｃａｌａｉ）で固定化し、２．５％クリスタルバイオレット（Ｎａｃａｌａｉ）にて染色して相対細胞数を比較した。
図２に、３０分間、および６０分間培養を行った後、ＯＤ５９５を測定することにより、種々の細胞外マトリックスタンパク質がＥＢ３細胞の接着に及ぼす影響を評価した結果を示す。図２の結果から、ｒＬｍ５はＬｍ−Ｍｉｘを含む他の各種細胞外マトリックスタンパク質に比べて、ＥＢ３細胞に対して強い接着活性を示すことが分かった。
なお接着効率の悪いヒトＥＳ細胞では、ＥＨＳ由来ラミニンを用いた場合の接着効率は１％未満であり、現在最も広く用いられているマトリゲル（５０〜６０％ＥＨＳ由来ラミニン、３０％ＩＶ型コラーゲン、１０％エンタクチン）でも、接着効率はわずか３％であると言われている。本実施例において、マウスＥＳ細胞を用いた場合、ＥＨＳラミニンを主要な構成成分とするマトリゲル、ラミニン２、ラミニン１０／１１が多く含まれると思われる胎盤由来のラミニン（Ｌｍ−Ｍｉｘ）と比べて強い接着活性を見出した。これは本発明で用いるラミニン５の顕著な効果であると認められる。
実施例３  マウスＥＳ細胞株ＥＢ３を用いた増殖アッセイ
本実施例では、各種細胞支持材料を使用した場合におけるマウスＥＳ細胞株ＥＢ３を用いた増殖アッセイの結果を示す。
ＥＢ３細胞の維持培地は実施例２と同じものを用いた。増殖アッセイでは１０％ＦＢＳの代わりに、１０％ノックアウトＴＭ血清代替添加物（ＫＳＲ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した培地（ＫＳＲ−ＧＭＥＭ）を用いた。濃度調製した各種細胞外マトリックスタンパク質にて処理した１２ウェルプレート（ＮＵＮＣ）に、ＥＢ３細胞を４００００個／ウェルで播種した。３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気の気層条件下で２日間培養後、酵素処理により細胞を回収し、血球計算盤にて細胞数を計測した。
再び、濃度調製した各種細胞外マトリックスタンパク質にて処理した１２ウェルプレートにＥＢ３細胞を４００００個／ウェルで播種した。この操作を繰り返すことで、ＥＢ３細胞に対する各種細胞外マトリックスの増殖効果を比較した。培養培地として、維持培地（Ｓ）およびＫＳＲ−ＧＭＥＭ（Ｋ）を用いた。細胞支持材料は、１ｍｇ／ｍｌのＧｌ、４μｇ／ｍｌのｒＬｍ５（Ｌｍ５−４）、２μｇ／ｍｌのｒＬｍ５（Ｌｍ５−２）、４μｇ／ｍｌのＬｍ−Ｍｉｘ、１５０μｇ／ｍｌのＭｇに、それぞれ調製した。またこの実験区では、予めＫＳＲ−ＧＭＥＭで数代継代培養して馴化させたＥＢ３細胞を用いた。
図３に、支持細胞の非存在下で、維持培地（Ｓ）又はＫＳＲ−ＧＭＥＭ（Ｋ）中で培養した際に、ＥＢ３細胞の増殖に対する各種細胞外マトリックスが及ぼす効果を検討した結果を示す。図３の結果から、はじめの２〜３回の継代では、Ｋ＋Ｌｍ−ＭｉｘおよびＫ＋Ｍｇは他の実験区に比べて増殖が遅いことが認められた。
そのため、Ｋ＋Ｌｍ−ＭｉｘおよびＫ＋Ｍｇ以外の実験区について、さらに継代を続けた。支持細胞の非存在下で、ＥＢ３細胞の長期継代培養時の細胞増殖に対して、細胞外マトリックスが及ぼす効果を検討した。図４に、理論上、最終的に何倍に細胞が増殖したかを算出した結果を示す。図４の結果から、従来よりＥＳ細胞の維持培養系として広く用いられている対照区（Ｓ＋Ｇｌ）と同等に、ｒＬｍ５はＥＢ３細胞に対して増殖効果を示すことが分かった。
図５に、維持培養の系（Ｓ＋Ｇｌ）、ｒＬｍ５の系（Ｋ＋Ｌｍ５）、及びｒＬｍ５から維持培養の系に戻した系（Ｋ＋Ｌｍ５−４→Ｓ＋Ｇｌ）において、長期継代培養したＥＢ３細胞の形態を示す。図５に示されるように、Ｋ＋Ｌｍ５の実験区は形態が徐々に上皮細胞様に変化したが、通常の維持培養の系に戻すと（Ｋ＋Ｌｍ５−４→Ｓ＋Ｇｌ）再びコロニー形成が認められるようになった。一般的に、未分化なＥＳ細胞はコロニーを形成することが知られているが、上記の結果から、Ｋ＋Ｌｍ５の実験条件で長期継代培養することによりＥＢ３細胞の形態が上皮細胞様に変化しても、未分化性を保っていることが示唆された。
実施例４  未分化性マーカーの検出
本実施例では、マウスＥＳ細胞の未分化マーカーとして知られるＥｃａｔ１、ＥＲａｓ、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｒｅｘ１、Ｓｏｘ２、Ｕｔｆ１の遺伝子に関してＲＴ−ＰＣＲを行ってそれらの未分化マーカーを測定することにより、ｒＬｍ５がＥＢ３細胞に対して未分化性を維持する効果を有しているか検討した。
実施例３にて１０回以上継代培養したＥＢ３細胞からＴＲＩＺＯＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。抽出後、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写反応によりｃＤＮＡ合成を行った。合成したｃＤＮＡを鋳型として表２に示すプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。各遺伝子の変性反応は９４℃  ３０秒、アニーリング反応は３０秒、伸長反応は７２℃  ２０秒で行った。アニーリング反応はＥｃａｔ１が６４℃、ＥＲａｓ、Ｏｃｔ４、Ｕｔｆ１は６１℃、Ｒｅｘ１は５９℃、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２は５４℃の温度で行った。
図６に各種の未分化マーカーの発現を、各培養下で検討した結果を示す。その結果、通常維持される実験条件（Ｓ＋Ｇｌ）と同等に、ｒＬｍ５を固層化してＫＳＲにて培養した実験条件下（Ｋ＋Ｌｍ５−４、Ｋ＋Ｌｍ５−２）でも、ＥＢ３細胞は解析した全ての未分化マーカーを発現していることが分かった。また、通常の維持培養の系に戻すと（Ｋ＋Ｌｍ５−４→Ｓ＋Ｇｌ）、これらの未分化マーカーの発現は、通常の維持培養系（Ｓ＋Ｇｌ）で培養しつづけた場合と区別できないくらいに元に戻ることが分かった。以上から、Ｋ＋Ｌｍ５にて１０回以上継代培養してもＥＢ３細胞は未分化性を維持することが示唆された。
【表２】
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実施例５  ３胚葉系への分化能の検討
本実施例では、各種細胞支持材料を使用してマウス細胞株ＥＢ３を培養した場合における分化能の維持を検討した結果を示す。
実施例３にてＫＳＲを添加した無血清条件化でＥＢ３細胞を培養した後に、維持培養（Ｓ＋Ｇｌ）の条件でさらに５代継代して血清条件下に馴化し直したうえで、分化誘導試験を行った。無血清培地での培養条件として、ゼラチン固層化プレートの系（Ｋ＋Ｇｌ）と、組換えヒトラミニン５固層化プレートの系（Ｋ＋Ｌｍ５−４、Ｋ＋Ｌｍ５−２）を用いた。これらを血清条件下に馴化した実験区を、Ｋ＋Ｇｌ⇒Ｓ＋Ｇｌ、Ｋ＋Ｌｍ５−４⇒Ｓ＋Ｇｌ、Ｋ＋Ｌｍ５−２⇒Ｓ＋Ｇｌと表記する。
分化誘導は以下の手順で行った。ＬＩＦ（ＥＳＧＲＯ）を含まない維持培地中に細胞を縣濁して１０００個／ドロップのハンギングドロップを作製し、胚様体を２日間形成させた。形成させた胚様体を細菌培養プレートに移し、ＬＩＦを含まない維持培地中でさらに５日間浮遊培養を行った。その時の胚様体の様子を図７に示す。
浮遊培養した胚様体を、１ｍｇ／ｍｌのＧｌでコートしたチャンバースライド（ＮＵＮＣ）に移して３日間接着培養を行った後、免疫染色にて分化マーカーを検出することで、ＥＳ細胞の分化能への分化（内胚葉系、中胚葉系、外胚葉系の細胞への分化）を検討した。
この際に、内胚葉系の細胞のマーカーとしてα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）を、中胚葉系の細胞のマーカーとしてα−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）を、外胚葉系の細胞のマーカーとしてβ−ＩＩＩチューブリン（ｔｕｂｕｌｉｎ）を用いた。免疫染色は、細胞を４％ホルムアルデヒドで固定化した後、０．１％トライトン−Ｘ１００（Ｎａｃａｌａｉ）を添加した５％ＦＢＳ溶液でブロッキングを行うことにより実施した。ブロッキングの後に、１次抗体と２次抗体で処理し、更にＤＡＰＩ（Ｎａｃａｌａｉ）染色を行い、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（ＶＥＣＴＯＲ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にて封入して蛍光顕微鏡にて観察することにより、マーカーの発現を検出した。
免疫染色において１次抗体として、α−フェトプロテイン検出には抗ＡＦＰポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ）を、α−平滑筋アクチンの検出には抗α−ＳＭＡモノクローナル抗体（ＤＡＫＯ）を、β−ＩＩＩ  ｔｕｂｕｌｉｎの検出には抗β−ＩＩＩ  ｔｕｂｕｌｉｎモノクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を、それぞれ用いた。２次抗体には抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）および抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いた。
また、Ｓ＋Ｇｌ、Ｋ＋Ｇｌ⇒Ｓ＋Ｇｌ、Ｋ＋Ｌｍ５−４⇒Ｓ＋Ｇｌ、Ｋ＋Ｌｍ５−２⇒Ｓ＋Ｇｌの実験区について上記の手順で分化誘導する一方で、ネガティブコントロールを作製した。ネガティブコントロールは、Ｓ＋Ｇｌ、Ｋ＋Ｇｌ⇒Ｓ＋Ｇｌ、Ｋ＋Ｌｍ５−４⇒Ｓ＋Ｇｌ、Ｋ＋Ｌｍ５−２⇒Ｓ＋Ｇｌの実験区について、胚様体形成など一連の分化誘導操作をせずにＬＩＦ存在下の通常の維持培養系（Ｓ＋Ｇｌ）にて培養し、同様に免疫染色を行ったものである。
４つの実験区について、分化誘導操作を行った実験区と、分化誘導操作を行わなかったネガティブコントロールの実験区の間で、分化マーカーであるＡＦＰ、α−ＳＭＡ、β−ＩＩＩ  ｔｕｂｕｌｉｎの発現を比較した結果を示す（図８から図１１）。なお図８はＳ＋Ｇｌの実験区における結果を、図９はＫ＋Ｇｌ⇒Ｓ＋Ｇｌの実験区における結果を、図１０はＫ＋Ｌｍ５−４⇒Ｓ＋Ｇｌの実験区における結果を、図１１はＫ＋Ｌｍ５−２⇒Ｓ＋Ｇｌの実験区における結果を、それぞれ示す。
その結果全ての実験区について、分化誘導操作を行った実験区ではＡＦＰ、α−ＳＭＡ、β−ＩＩＩ  ｔｕｂｕｌｉｎの３つのシグナルが全て認められた（図８下段、図９下段、図１０下段、図１１下段）。一方通常の維持培養系にて培養したネガティブコントロールの実験区では、ＡＦＰ、α−ＳＭＡ、β−ＩＩＩ  ｔｕｂｕｌｉｎの３つのシグナルが認められず、細胞の分化の誘導は起こっていなかった（図８上段、図９上段、図１０上段、図１１上段）。
この結果は一連の分化誘導操作によってはじめて細胞の分化が誘導され、ＥＢ３細胞が、ＡＦＰ、αＳＭＡ、β−ＩＩＩ  ｔｕｂｕｌｉｎなどのマーカーを発現する３胚葉系の分化細胞となったことを意味する。実施例４の結果と本実施例の結果から、Ｌｍ５にて維持したＥＳ細胞は未分化状態を維持していると同時に、誘導により多様な細胞に分化する多分化能も維持していることが示唆された。
実施例６  ＫＳＲとは異なる他の組成の血清代替添加物の調製
上記のＫＳＲとは異なる他の組成の血清代替添加物を調製した。本実施例の血清代替添加物の組成を表３に示す。
【表３】
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蒸留水に表３に記載した各種アミノ酸（グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、ヒドロキシプロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン）を３倍濃度となるように溶解し、３倍濃縮アミノ酸溶液を調製した。この３倍濃縮アミノ酸溶液に、チアミン、アスコルビン酸、還元型グルタチオンを、３倍濃度となるのに必要な量を加えた。この溶液を溶液Ａとする。次に、蒸留水に２倍濃度となるようにヒトトランスフェリンおよびＢＳＡを溶解し、２倍濃縮ＢＳＡ溶液を調製した。この溶液を溶液Ｂとする。更に蒸留水に必要量亜セレン酸ナトリウムを溶解し、７％亜セレン酸ナトリウム溶液を調製した。この溶液を溶液Ｃとする。調製された溶液Ａ、Ｂ、Ｃに、ウシインスリン溶液（ＳＩＧＭＡ）と微量金属元素を添加して、本実施例の血清代替添加物を調製した。なおここで添加した微量金属元素は、組成が既知の市販のＴｒａｃｅ  ＥｌｅｍｅｎｔＢおよびＣ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）である。本実施例で調製した血清代替添加物は市販品ではなく、組成が既知である。
実施例７  実施例６の血清代替添加物を添加した培地を用いた検討
本実施例においては、実施例６で調製した血清代替添加物を、ＫＳＲと同様に血清の代替物としてＧＭＥＭに加えて、維持培地としてマウスＥＳ細胞の培養に用いた。そのようにして調製した培地を以下で培地Ｙとする。そして培地Ｙを用いて、実施例３に準じて増殖アッセイを行った。更に実施例４に準じて未分化マーカーの検出を行った。更に実施例５に準じて３胚葉系への分化能の検討を行った。
（１）増殖アッセイ
培地Ｙを用いた増殖アッセイの結果を図１２に示す。維持培地として培地Ｙを用いた以外は全て実施例３と同様に実験を行った。マウスＥＳ細胞株ＥＢ３を用いた増殖アッセイの結果、ｒＬｍ５を固相化して培地Ｙにて培養を行った実験区（Ｙ＋Ｌｍ５−４、Ｙ＋Ｌｍ５−２）は、マウスＥＳ細胞に対して増殖効果を示すことが分かった。またＬｍ５を用いた場合には、他の細胞外マトリックス（Ｇｌ、Ｌｍ−Ｍｉｘ、Ｍｇ）を用いた実験区と比べて、より良い増殖が認められた。
（２）未分化マーカーの検出
上記の増殖アッセイを行った後、各実験区における未分化マーカーの発現をＲＴ−ＰＣＲにて検討した。維持培地として培地Ｙを用いた以外は全て実施例４と同様に実験を行った。実施例４と同様に７種の未分化マーカーを検出した結果を図１３に示す。培地Ｙを用いてマウスＥＳ細胞を培養した場合でも、ｒＬｍ５を固相化した実験区（Ｙ＋Ｌｍ５）において全ての未分化マーカーの発現が確認された。よって培地Ｙを用いてｒＬｍ５の系を１０回以上継代培養しても、ＥＢ３細胞は未分化性を維持することが示唆された。
（３）３胚葉系への分化能の検討
また、維持培地として培地Ｙを用いた以外は全て実施例５と同じ方法にて分化誘導試験を行った。分化誘導操作を行った全ての実験区について、対照区（Ｓ＋Ｇｌ）と形態的に酷似した胚様体が形成された。その結果を図１４に示す。
分化誘導を行った後に３胚葉系への分化のマーカー（ＡＦＰ、α−ＳＭＡ、β−ＩＩＩ  ｔｕｂｕｌｉｎ）を検出した。Ｓ＋Ｇｌ（図１５）、Ｋ＋Ｇｌ⇒Ｓ＋Ｇｌ（図１６）、Ｙ＋Ｇｌ⇒Ｓ＋Ｇｌ（図１７）、Ｙ＋Ｌｍ５−４⇒Ｓ＋Ｇｌ（図１８）、Ｙ＋Ｌｍ５−２⇒Ｓ＋Ｇｌ（図１９）、Ｙ＋Ｌｍ−Ｍｉｘ⇒Ｓ＋Ｇｌ（図２０）、Ｙ＋Ｍｇ⇒Ｓ＋Ｇｌ（図２１）の実験区について、分化誘導操を行った実験区（下段、ＬＩＦ−）と、分化誘導操作を行わなかったネガティブコントロールの実験区（上段、ＬＩＦ＋）の間で、分化マーカーの発現を検討した結果を示す。
図１５から図２１の下段（ＬＩＦ−）に見られるように、分化誘導後に免疫染色した系については、全ての実験区においてＡＦＰ、α−ＳＭＡ、β−ＩＩＩ  ｔｕｂｕｌｉｎの３つのマーカーが全て発現していた。一方、分化誘導を行わない通常の維持培養系にて培養したネガティブコントロールの実験区では、図１５から図２１の上段（ＬＩＦ＋）に見られるように、ＡＦＰ、α−ＳＭＡ、β−ＩＩＩ  ｔｕｂｕｌｉｎの発現が認められず、細胞の分化の誘導は起こっていなかった。
以上より、培地Ｙを用いた際にもｒＬｍ５はマウスＥＳ細胞の増殖を支えると共に、増殖したマウスＥＳ細胞は未分化性を保っていることが示唆された。このことから、ｒＬｍ５はフィーダー細胞と血清が存在しない条件下において、マウスＥＳ細胞の有用な支持材料となり得ることが分かった。
実施例８  ヒトｉＰＳ細胞を用いた接着アッセイ
本実施例では、各種細胞支持材料を使用した場合におけるヒトｉＰＳ細胞を用いた接着アッセイの結果を示す。
ヒトｉＰＳ細胞は、京都大学  再生医科学研究所  再生誘導研究分野にて樹立された細胞株２０１Ｂ２または２０１Ｂ７を用いた。図２２において、左側に細胞株２０１Ｂ２の形態を、右側に細胞株２０１Ｂ７の形態を示す。
ヒトｉＰＳ細胞をディッシュから剥離する前に１０μＭ  Ｙ−２７６３２（ＷＡＫＯ）存在下にて１時間培養し、その上でヒトｉＰＳ細胞を実験に用いた。なお実施例８以降のヒトｉＰＳ細胞における実験においても、同様の処理を行った。
ヒトｉＰＳ細胞の維持には、ＤＭＥＭ／Ｆ１２に２０％ＫＳＲ、２ｍＭグルタミン、１％非必須アミノ酸、及び１０−４Ｍ  ２−メルカプトエタノールを添加した培地で調製したマウス胎仔性線維芽細胞の培養上清に４ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（ＷＡＫＯ）を添加したものを維持培地（ＭＥＦ−ＣＭ）として用いた。
細胞支持材料にはマイトマイシンＣ処理を行ったＳＮＬフィーダー細胞（Ｆｄ）、または各種の細胞外マトリックス（Ｇｌ、Ｌｍ５、Ｍｇ、Ｖｎ、Ｃｏ、Ｆｎ、Ｌｍ２、Ｌｍ−Ｍｉｘ）を用いた。そして下記に示すように各々の細胞支持材料で処理を行ったプレートを作製し、各細胞支持材料についてヒトｉＰＳ細胞株２０１Ｂ７を用いて接着アッセイを行った。
濃度調製した各種の細胞外マトリックスタンパク質で９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を処理し、１．２％ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ）溶液にて３７℃で１時間ブロッキング処理を行った。各種細胞外マトリックスタンパク質の濃度を以下の濃度に調製した。即ちＧｌを５ｍｇ／ｍｌ及び１．２５ｍｇ／ｍｌに調製した。Ｌｍ２を５０μｇ／ｍｌ及び１２．５μｇ／ｍｌに調製した。Ｌｍ−Ｍｉｘを５０μｇ／ｍｌ及び１２．５μｇ／ｍｌに調製した。Ｍｇを５００μｇ／ｍｌ及び１２５μｇ／ｍｌに調製した。Ｃｏを５０μｇ／ｍｌ及び１２．５μｇ／ｍｌに調製した。Ｆｎを５０μｇ／ｍｌ及び１２．５μｇ／ｍｌに調製した。Ｖｎを５０μｇ／ｍｌ及び１２．５μｇ／ｍｌに調製した。ｒＬｍ５を、５０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、６．２５μｇ／ｍｌ及び３．１２５μｇ／ｍｌという５段階の２倍希釈系列に調製した。また、２５μｇ／ｍｌのＬｍ５と５０μｇ／ｍｌのＣｏにて同時に処理した実験区（Ｌｍ５＋Ｃｏ）も調製した。
ヒトｉＰＳ細胞をトリプシンで処理し、単一細胞になるまで分散させ、２００００個／ウェルでプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気の気層条件下で６０分間培養を行った。培養後、軽いタッピングで接着の弱い細胞をプレート表面から浮遊させ、パーコール（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）処理にて該細胞を除いた。接着した細胞を２５％グルタルアルデヒド（Ｎａｃａｌａｉ）で固定化し、２．５％クリスタルバイオレット（Ｎａｃａｌａｉ）にて染色して相対細胞数を比較した。
図２３に、６０分間培養を行った後、ＯＤ５９５を測定することにより、種々の細胞外マトリックスタンパク質がヒトｉＰＳ細胞の接着に及ぼす影響を評価した結果を示す。更に図２４に各実験区におけるアッセイを行った後の細胞の形態を示す。
図２３において、ｒＬｍ５の実験区は他の細胞外マトリックスタンパク質の実験区と比較して高いＯＤ５９５の値を示し、ヒトｉＰＳ細胞に対して強い接着活性を示すことが分かった。図２４においても、ｒＬｍ５の実験区では多くの細胞の接着が観察された。また、ｒＬｍ５はＣｏと組み合わせることにより（ｒＬｍ５＋Ｃｏ）、ｒＬｍ５単独よりもさらに強い接着活性を示すことが分かった。
実施例９  ヒトｉＰＳ細胞を用いたコロニーアッセイ
本実施例では、ヒトｉＰＳ細胞株２０１Ｂ２を用いて、各種細胞支持材料を使用してコロニーアッセイを行った結果を示す。
細胞支持材料としては、Ｇｌ、Ｌｍ５、Ｍｇ、Ｖｎ、Ｃｏ、Ｆｎ、Ｌｍ２及びＬｍ−Ｍｉｘを用いた。そして下記のように各々の細胞支持材料で処理を行った６０ｍｍディッシュ（ＩＷＡＫＩ）を作製し、各細胞支持材料についてコロニーアッセイを行った。
各種細胞外マトリックスタンパク質の濃度を以下の濃度に調製した。即ちＧｌを１ｍｇ／ｍｌに調製した。Ｌｍ５を３０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ及び２μｇ／ｍｌに調製した。Ｌｍ２を３０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ及び２μｇ／ｍｌに調製した。Ｌｍ−Ｍｉｘを３０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ及び２μｇ／ｍｌに調製した。Ｍｇを３００μｇ／ｍｌに調製した。Ｃｏを３０μｇ／ｍｌに調製した。Ｆｎを３０μｇ／ｍｌに調製した。Ｖｎを１０μｇ／ｍｌに調製した。
本実施例ではヒトｉＰＳ細胞を、トリプシン処理でコロニーをシングルセルまで分散させた状態（以下、ｓｉｎｇｌｅと称する）と、軽いピペッティングにより分散を抑えて細胞塊の状態（以下、ｃｌｕｍｐと称する）に調製し、両者でアッセイを行った。即ち、ヒトｉＰＳ細胞をｓｉｎｇｌｅまたはｃｌｕｍｐで、１０００個相当／６０ｍｍディッシュで播種した。３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気の気層条件下でｓｉｎｇｌｅは１３日間、ｃｌｕｍｐは６日間培養を行った。培養後、形成されたコロニー数をカウントした。
その結果を図２５に示す。図２５において上段はｓｉｎｇｌｅにおける結果を、下段はｃｌｕｍｐにおける結果を示す。
ｓｉｎｇｌｅではｒＬｍ５、Ｌｍ−Ｍｉｘ、Ｖｎ、Ｍｇの実験区でコロニー形成が認められ、８μｇ／ｍｌ  Ｌｍ５、及び３０μｇ／ｍｌ  Ｌｍ−Ｍｉｘの実験区では、陽性コントロールであるＳＮＬフィーダー細胞（Ｆｄ）が存在する実験区に近いコロニー数が形成された。一方、ｃｌｕｍｐではｒＬｍ５、Ｌｍ２、Ｌｍ−Ｍｉｘ、Ｖｎ、Ｍｇ、Ｃｏの実験区でコロニー形成が認められ、ｒＬｍ５の実験区ではＦｄと比べて同等以上のコロニー形成が認められた。
また、形成されたコロニーについて免疫染色を行ってヒト多能性幹細胞マーカーを検出することで、培養されたヒトｉＰＳ細胞が未分化状態であるかを評価した。ここでヒト多能性幹細胞のマーカーとして、細胞表面抗原マーカーであるＳＳＥＡ３を用いた。
免疫染色は、細胞を４％ホルムアルデヒドで固定化した後、１％ＢＳＡを添加したＰＢＳでブロッキングを行うことにより実施した。ブロッキングの後に、１次抗体と２次抗体で処理し、更にＨｏｅｃｈｉｓｔ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色を行い、蛍光顕微鏡にて観察することにより、マーカーの発現を検出した。免疫染色において１次抗体には抗ＳＳＥＡ３モノクローナル抗体を、２次抗体には抗ラットＩｇＭ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いた。
免疫染色の結果を図２６に示す。図２６Ａはｓｉｎｇｌｅの結果であり、図２６Ｂはｃｌｕｍｐの結果である。ｓｉｎｇｌｅから形成されたコロニーでも、ｃｌｕｍｐから形成されたコロニーでも共に、ＥＳ細胞マーカーであるＳＳＥＡ３が検出された。このことから、ヒトｉＰＳ細胞から形成されたコロニーは未分化性を維持していることが示唆された。
以上の結果から、ｒＬｍ５は他の細胞外マトリックスと比べて同等またはそれ以上にヒトｉＰＳ細胞のコロニー形成を支えると同時に、形成されたコロニーは未分化性を保っていることが示唆された。
実施例１０  ヒトｉＰＳ細胞を用いた維持培養試験
本実施例では、各種細胞支持材料を使用した場合におけるヒトｉＰＳ細胞株２０１Ｂ７を用いた維持培養試験の結果を示す。
細胞支持材料としては、Ｇｌ、Ｌｍ５、Ｌｍ２、Ｖｎ、Ｃｏ、及びＦｎを用いた。そして下記のように各々の細胞支持材料で処理を行った６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）を作製し、各細胞支持材料についてコロニーアッセイを行った。維持培地としては、実施例８に記載したＭＥＦ−ＣＭを用いた。
各種細胞外マトリックスタンパク質の濃度は、１ｍｇ／ｍｌのＧｌ、２μｇ／ｍｌのＬｍ５、３０μｇ／ｍｌのＬｍ２、３０μｇ／ｍｌのＣｏ、３０μｇ／ｍｌのＦｎ、１０μｇ／ｍｌのＶｎに調製した。
本実施例ではヒトｉＰＳ細胞はｃｌｕｍｐの状態でのみアッセイを行った。細胞は１週間に１度、全細胞の９分の１量を各種細胞外マトリックスで処理し、新たに準備した６ウェルプレートに撒き直した。細胞は３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気の気層条件下で５週間培養を行った。５週間培養した細胞の形態を図２７に示す。
その結果、検討した各種細胞外マトリックスタンパク質の実験区において、継代後１週間の培養で陽性コントロールであるＳＮＬフィーダー細胞（Ｆｄ）の実験区と同等程度の細胞増殖が観察された。図２７に示すように５週間の培養後においてもこの傾向が観察された。この結果から、ｒＬｍ５はＦｄとほぼ同等にヒトｉＰＳ細胞の増殖を支えることができることが分かった。なお、Ｌｍ２は培養中にコロニー形成が認められなくなった。
実施例１１  ヒトｉＰＳ細胞における未分化マーカーの検出
本実施例では、ヒト多能性幹細胞の未分化マーカーとして知られるＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２の遺伝子に関してＲＴ−ＰＣＲを行ってそれらの未分化マーカーを検出することにより、ｒＬｍ５がヒトｉＰＳ細胞に対して未分化性を維持する効果を有しているか検討した。
実施例１０にて５週間継代培養したヒトｉＰＳ細胞からＴＲＩＺＯＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。抽出後、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写反応によりｃＤＮＡ合成を行った。合成したｃＤＮＡを鋳型として表４に示すプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。各遺伝子の変性反応は９４℃  １０秒、アニーリング反応は１５秒、伸長反応は７２℃  ３０秒で行った。アニーリング反応はＯＣＴ４とＧＡＰＤＨは６０℃、ＮＡＮＯＧとＳＯＸ２は５５℃の温度で行った。
【表４】
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ＲＴ−ＰＣＲの結果を図２８に示す。全ての実験区で検討した３因子の発現が認められた。このことから、細胞支持材料としてｒＬｍ５を用いてヒトｉＰＳ細胞を培養したところ、ヒトｉＰＳ細胞は未分化性を維持していることが示唆された。
実施例１２  ヒトｉＰＳ細胞における分化誘導試験
本実施例では、各種細胞支持材料を使用してヒトｉＰＳ細胞を培養した場合における分化能の維持を検討した結果を示す。分化誘導を行ったヒトｉＰＳ細胞よりＲＴ−ＰＣＲにて分化マーカーを検出することにより、各種細胞支持材料を使用して培養されたヒトｉＰＳ細胞が分化能を維持しているか検討した。
実施例１０にて３週間培養した後、すなわち３回目の継代の際に一部の細胞を採取し、それを用いて分化誘導試験を行った。分化誘導は以下の手順で行った。
培養中のヒトｉＰＳ細胞をプレートより剥離して作製したｃｌｕｍｐを、低吸着プレート（ＮＵＮＣ）を用いて、ＤＭＥＭ／Ｆ１２に２０％ＫＳＲ、２ｍＭグルタミン、１％非必須アミノ酸、及び１０−４Ｍ  ２−メルカプトエタノールを添加して調製した培地中で８日間浮遊培養を行った。これにより形成された胚様体を１ｍｇ／ｍｌのＧｌでコートした６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に撒き直し、さらに８日間接着培養を行った。
接着培養後の細胞の形態を図２９に示す。ｂＦＧＦが存在しない培地中で分化誘導を行った後の細胞は様々な形態の細胞が混在しており、これは細胞が分化していることを示唆している。ここでの細胞形態は、図２７のようにｂＦＧＦ存在下で通常の維持培養を行った場合とは明らかに異なっている。
分化誘導操作を行ったヒトｉＰＳ細胞から、実施例１１と同じ手順により、ＲＮＡ抽出、及びｃＤＮＡ合成を行い、合成したｃＤＮＡを鋳型として、表５に示すプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。内胚葉マーカーとしてＳＯＸ１７とＡＦＰを、中胚葉マーカーとしてＢＲＡＣＨＹＵＲＹとＭＳＸ１を、外胚葉マーカーとしてＰＡＸ６を、栄養外胚葉マーカーとしてＣＤＸ２を、それぞれ用いた。各遺伝子の変性反応は９４℃  １０秒、アニーリング反応は１０秒、伸長反応は７２℃  ３０秒で行った。アニーリング反応はＳＯＸ１７、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ、ＭＳＸ１、ＰＡＸ６は６３℃、ＡＦＰは６５℃、ＣＤＸ２は５５℃の温度で行った。また、ＣＤＸ２のみ伸長反応は７２℃、１５秒で行った。
ＲＴ−ＰＣＲの結果を図３０に示す。ｒＬｍ５の実験区では陽性コントロールであるＦｄの実験区と同様に、検討した６因子の全てが発現していることが認められた。よってｒＬｍ５はヒトｉＰＳ細胞に対して多分化能を維持する効果を有していることが示唆された。一方で、ｒＬｍ５以外の幾つかの細胞外マトリックス（Ｖｎ、Ｃｏなど）の実験区では、中胚葉マーカーであるＭＳＸ１の発現が非常に弱いことが分かった。このことから、これらの細胞外マトリックスについてはヒトｉＰＳ細胞の分化能が一部失われている、或いは分化に対して抵抗性が生じてきている可能性があることが分かった。
【表５】
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本発明により、細胞外マトリックス分子であるラミニン５を含んだ系で培養することにより、支持細胞と血清を用いなくても、多能性幹細胞を未分化状態のままで増殖させることが可能となった。本発明の方法によれば支持細胞や血清などの動物由来の材料を用いることなく多能性幹細胞を培養できるので、免疫拒絶やウイルス感染などの危険性がない。ヒト由来の多能性幹細胞はその分化全能性から再生医療における細胞材料として大きな利用可能性を有しており、特にヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は倫理的な問題もなくまた患者本人の細胞から調製できるため免疫拒絶の問題もない。
【配列表フリーテキスト】
【０００９】
＜配列番号１＞
配列番号１は、ヒトラミニンα３鎖の塩基配列を示す。
＜配列番号２＞
配列番号２は、ヒトラミニンα３鎖のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号３＞
配列番号３は、ヒトラミニンβ３鎖の塩基配列を示す。
＜配列番号４＞
配列番号４は、ヒトラミニンβ３鎖のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号５＞
配列番号５は、ヒトラミニンγ２鎖の塩基配列を示す。
＜配列番号６＞
配列番号６は、ヒトラミニンγ２鎖のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号７−２２＞
配列番号７−２２は、ＥＳ細胞における未分化性マーカー検出のための、ＲＴ−ＰＣＲ用プライマーの塩基配列を示す。
＜配列番号２３−３０＞
配列番号２３−３０は、ヒトｉＰＳ細胞における未分化性マーカー検出のための、ＲＴ−ＰＣＲ用プライマーの塩基配列を示す。
＜配列番号３１−４２＞
配列番号３１−４２は、ヒトｉＰＳ細胞における分化マーカー検出のための、ＲＴ−ＰＣＲ用プライマーの塩基配列を示す。
［配列表］
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図１２】
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【図２３】
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【図２５】
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【図１】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２４】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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