(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）ポリペプチド、担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖５型、および担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖８型を含み、ここで莢膜多糖５型が７０から３００ｋＤａの間の高分子量莢膜多糖である、免疫原性組成物。
【請求項２】
単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣタンパク質をさらに含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）ポリペプチドをさらに含む、請求項１または２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
ＣｌｆＡポリペプチドが、ＣｌｆＡの、
リガンド結合領域；
Ｎ１ドメイン、Ｎ２ドメイン、およびＮ３ドメイン；ならびに
Ｎ２ドメインおよびＮ３ドメイン
からなる群から選択されるポリペプチド断片である、請求項１から３のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
ＣｌｆＢポリペプチドが、ＣｌｆＢの、
リガンド結合領域；
Ｎ１ドメイン、Ｎ２ドメイン、およびＮ３ドメイン；ならびに
Ｎ２ドメインおよびＮ３ドメイン
からなる群から選択されるポリペプチド断片である、請求項３または４に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
ＣｌｆＡポリペプチドが、フィブリノーゲンと天然ＣｌｆＡとで観察される結合と比較して低減したレベルでフィブリノーゲンに結合する、請求項１から５のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
ＣｌｆＡポリペプチドが、Ｔｙｒ３３８、Ｔｙｒ２５６、Ｐｒｏ３３６、Ｌｙｓ３８９、Ａｌａ２５４、またはＩｌｅ３８７の１つまたは複数におけるアミノ酸置換を有する、請求項１から６のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
アミノ酸置換がＡｌａまたはＳｅｒへのものである、請求項７に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
Ｔｙｒ３３８がＡｌａに置換されている、請求項８に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
莢膜多糖５型が、１０％から１００％の間でＯ−アセチル化されている、５０％から１００％の間でＯ−アセチル化されている、または７５％から１００％の間でＯ−アセチル化されている、請求項１から９のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
莢膜多糖８型が、７０から３００ｋＤａの間の高分子量莢膜多糖である、請求項１から１０のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
莢膜多糖８型が、１０％から１００％の間でＯ−アセチル化されている、５０％から１００％の間でＯ−アセチル化されている、または７５％から１００％の間でＯ−アセチル化されている、請求項１から１１のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
担体タンパク質が、ジフテリア菌（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）毒素ＣＲＭ１９７である、請求項１から１２のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣタンパク質が、脂質化されたタンパク質または脂質化されていないタンパク質である、請求項１から１３のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
アジュバントをさらに含む、請求項１から１４のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
薬学的に許容できる担体をさらに含む、請求項１から１５のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
Ｏｐｐ３ａ、ＤｌｔＤ、ＨｔｓＡ、ＬｔａＳ、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＳｄｒＦ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、ＳｒｔＡ、ＳｐＡ、Ｓｂｉ、ＦｍｔＢ、α溶血素（ｈｌａ）、β溶血素、フィブロネクチン結合タンパク質Ａ（ｆｎｂＡ）、フィブロネクチン結合タンパク質Ｂ（ｆｎｂＢ）、コアグラーゼ、Ｆｉｇ、ｍａｐ、パントン・バレンタイン型ロイコシジン（ｐｖｌ）、α毒素およびその変型、γ毒素（ｈｌｇ）および変型、ｉｃａ、免疫優性ＡＢＣ輸送体、Ｍｇ２＋輸送体、Ｎｉ  ＡＢＣ輸送体、ＲＡＰ、自己溶解酵素、ラミニン受容体、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ＩｓａＢ／ＰｉｓＢ、ＳＰＯＩＩＩＥ、ＳｓａＡ、ＥｂｐＳ、Ｓａｓ  Ａ、ＳａｓＦ、ＳａｓＨ、ＥＦＢ（ＦＩＢ）、ＳＢＩ、Ｎｐａｓｅ、ＥＢＰ、骨シアロ結合タンパク質ＩＩ、アウレオリシン前駆体（ＡＵＲ）／Ｓｅｐｐ１、Ｃｎａ、ならびにそれらの断片、Ｍ５５、ＴＳＳＴ−１、ｍｅｃＡ、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＰＮＡＧ／ｄＰＮＡＧ）エキソ多糖、ＧｅｈＤ、ＥｂｈＡ、ＥｂｈＢ、ＳＳＰ−１、ＳＳＰ−２、ＨＢＰ、ビトロネクチン結合タンパク質、ＨａｒＡ、ＥｓｘＡ、ＥｓｘＢ、エンテロトキシンＡ、エンテロトキシンＢ、およびエンテロトキシンＣ１からなる群から選択される抗原をさらに含む、請求項１から１６のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）に対する免疫応答を誘発する医薬の製造における、免疫学的に効果的な量の請求項１から１７のいずれかに記載の免疫原性組成物の使用。
【請求項１９】
免疫応答が、対象におけるブドウ球菌生物に関連する疾患、症状、または少なくとも１つの症候を予防するかまたは低減させる、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
疾患が、侵襲性の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）疾患、敗血症、および保菌からなる群から選択される、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
誘発される免疫応答が、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対するオプソニン性貪食活性（ＯＰＡ）を有する抗体の生成を含む、請求項１８から２０のいずれかに記載の使用。
【請求項２２】
対象に受動免疫をもたらす抗体調製物の製造における、請求項１から１７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２００９年６月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／２１９，１３４号の優先権を主張するものであり、該出願の全体は、参照することによって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）から単離されたポリペプチドおよび莢膜多糖を含む免疫原性組成物に関する。さらに、本発明は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ポリペプチドおよび莢膜多糖の免疫原性組成物を用いる、対象において黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）に対する免疫応答を誘発する方法に関する。得られた抗体はまた、受動免疫療法を介して黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）感染を治療または予防するために用いることができる。
【背景技術】
【０００３】
ヒトは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の自然宿主である。健康な個体は、持続的に（１０〜３５％）、断続的に（２０〜７５％）、皮膚上、鼻孔内および喉内に、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）によってコロニー形成されている可能性があるか、または関連疾患を有さない非保菌状態（５〜７０％）である可能性がある。Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．３７：３１３３〜３１４０（１９９９）を参照されたい。手術の間、留置カテーテルもしくは他の装置の設置、外傷、または創傷など、個体が免疫バリアの破損に起因して免疫不全となると、疾患が続いて生じる。その結果生じた黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染は、軽度の皮膚感染から心内膜炎、骨髄炎、菌血症、敗血症、および高死亡率を伴う他の形態の疾患にわたる、広範な異なる疾患を生じさせ得る。大型のヒト宿主は、適合型の病原性クローン型の進化および蔓延の機会を増強させる。
【０００４】
グラム陽性球菌である黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）および表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）からの侵襲性のブドウ球菌感染は、世界中で増大している公衆衛生問題であるため、特に懸念されている。具体的には、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、ほとんどの院内（院内で起こる）感染の原因であり、公衆発生型感染におけるその有病率は増大している。例えば、侵襲性のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）の発生は、２００５年の米国における１８６５０人の死亡を含めて、１０万人当たり３１．８人と推定された。Ｋｌｅｖｅｎｓ  Ｒ．Ｍ．ら、ＪＡＭＡ、２９８：１７６３〜７１（２００７）を参照されたい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ブドウ球菌疾患は、ここ２０年間で劇的に増大しており、この増大は、静脈内装置および侵襲的手段の使用と並行する形である。疾患の発生のこの上昇は、抗生物質耐性が並行して生じるため、より厄介となり、したがって、ワクチンにおいて用いるための、またはブドウ球菌感染および関連疾患を予防もしくは治療するための手段として受動免疫をもたらすためのポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体を誘導するための、免疫原性組成物が緊急に必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ブドウ球菌細菌から単離された少なくとも３つの抗原を含む、多抗原免疫原性組成物または多成分免疫原性組成物を対象とする。抗原は、ポリペプチドおよび多糖であるが、とりわけ、当業者に知られている単離手順を用いて細菌から直接的に得られ得るか、またはこれらの抗原は、合成プロトコルを用いて生産され得るか、またはこれらの抗原は、同様に当業者に知られている遺伝子操作手順を用いて組換えによって生産され得るか、または、前述のいずれかの組み合わせを介して生産され得る。特定の実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）ポリペプチド、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）ポリペプチド、担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖５型（ＣＰ５）、担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖８型（ＣＰ８）、および単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣタンパク質から選択される、３つ以上の抗原を含む。さらに、本発明は、ブドウ球菌細菌に対する免疫応答を誘発するための方法、ブドウ球菌細菌により生じる疾患を予防するため、疾患の重症度を低減させるため、または疾患の発生を遅延させるための方法、およびブドウ球菌細菌での感染によって生じる疾患の少なくとも１つの症候を予防するため、症候の重症度を低減させるため、または症候の発生を遅延させるための方法を提供する。
【０００７】
したがって、１つの実施形態において、本発明は、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）ポリペプチド、担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖５型（ＣＰ５）、および担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖８型（ＣＰ８）を含む、免疫原性組成物を提供する。
【０００８】
１つの実施形態において、本発明は、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）ポリペプチド、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）、担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖５型（ＣＰ５）、および担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖８型（ＣＰ８）を含む、免疫原性組成物を提供する。
【０００９】
１つの実施形態において、本発明は、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）ポリペプチド、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）ポリペプチド、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣタンパク質、担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖５型（ＣＰ５）、および担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖８型（ＣＰ８）を含む、免疫原性組成物を提供する。
【００１０】
１つの実施形態において、本発明は、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）ポリペプチド、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣタンパク質、担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖５型（ＣＰ５）、および担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖８型（ＣＰ８）を含む、免疫原性組成物を提供する。
【００１１】
１つの実施形態において、本発明は、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）ポリペプチド、担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖５型（ＣＰ５）、および担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖８型（ＣＰ８）を含む、免疫原性組成物を提供する。
【００１２】
１つの実施形態において、本発明は、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）ポリペプチド、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣタンパク質、担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖５型（ＣＰ５）、および担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖８型（ＣＰ８）を含む、免疫原性組成物を提供する。
【００１３】
１つの実施形態において、本発明は、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）ポリペプチド、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）ポリペプチド、および単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣタンパク質を含む、免疫原性組成物を提供する。
【００１４】
１つの実施形態において、本発明は、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣタンパク質、担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖５型（ＣＰ５）、および担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖８型（ＣＰ８）を含む、免疫原性組成物を提供する。
【００１５】
１つの実施形態において、免疫原性組成物は、単離されたＣｌｆＡポリペプチド断片を包含し、ＣｌｆＡポリペプチド断片は、ＣｌｆＡのフィブリノーゲン結合ドメインを含む。１つの実施形態において、ＣｌｆＡポリペプチド断片は、ＣｌｆＡのＮ１ドメイン、Ｎ２ドメイン、およびＮ３ドメインを含むフィブリノーゲン結合ドメインを含む。１つの実施形態において、ＣｌｆＡポリペプチド断片は、ＣｌｆＡのＮ２ドメインおよびＮ３ドメインを含むフィブリノーゲン結合ドメインを含む。１つの実施形態において、ＣｌｆＡフィブリノーゲン結合ドメインを含有する組成物は、フィブリノーゲンに対する低減した結合を示す。１つの実施形態において、ＣｌｆＡのフィブリノーゲン結合ドメインは、フィブリノーゲンとＣｌｆＡの天然のフィブリノーゲン結合ドメインとで観察される結合と比較して低減したレベルで、フィブリノーゲンに結合する。１つの実施形態において、ＣｌｆＡフィブリノーゲン結合ドメインを含有する組成物は、フィブリノーゲンに対する低減した結合を示し、シグナル配列を含有する完全長タンパク質のＴｙｒ３３８、Ｔｙｒ２５６、Ｐｒｏ３３６、Ｌｙｓ３８９、Ａｌａ２５４、およびＩｌｅ３８７の１つまたは複数におけるアミノ酸置換を有する。１つの実施形態において、ＣｌｆＡフィブリノーゲン結合ドメインを含有する組成物は、Ｔｙｒ３３８、Ｔｙｒ２５６、Ｐｒｏ３３６、Ｌｙｓ３８９、Ａｌａ２５４、およびＩｌｅ３８７の１つまたは複数におけるアミノ酸置換を示し、これらの位置のいずれか１つまたは複数にあるアミノ酸は、ＡｌａまたはＳｅｒに変化している。１つの実施形態において、組成物は、３３８位のＴｙｒがＡｌａに変化している、ＣｌｆＡフィブリノーゲン結合ドメインを含む。
【００１６】
１つの実施形態において、免疫原性組成物は、単離されたＣｌｆＢポリペプチド断片を包含し、ＣｌｆＢポリペプチド断片は、ＣｌｆＢのフィブリノーゲン結合ドメインを含む。１つの実施形態において、ＣｌｆＢポリペプチド断片は、ＣｌｆＢのＮ１ドメイン、Ｎ２ドメイン、およびＮ３ドメインを含むフィブリノーゲン結合ドメインを含む。１つの実施形態において、ＣｌｆＢポリペプチド断片は、ＣｌｆＢのＮ２ドメインおよびＮ３ドメインを含むフィブリノーゲン結合ドメインを含む。１つの実施形態において、ＣｌｆＢフィブリノーゲン結合ドメインを含有する組成物は、フィブリノーゲンに対する低減した結合を示す。１つの実施形態において、ＣｌｆＢのフィブリノーゲン結合ドメインは、フィブリノーゲンとＣｌｆＢの天然のフィブリノーゲン結合ドメインとで観察される結合と比較して低減したレベルで、フィブリノーゲンに結合する。
【００１７】
１つの実施形態において、免疫原性組成物は、２０から１０００ｋＤａの間の高分子量多糖である、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖５型（ＣＰ５）を含む。１つの実施形態において、５型の高分子量多糖は、５０から３００ｋＤａの間の分子量を有する。１つの実施形態において、５型の高分子量多糖は、７０から１５０ｋＤａの間の分子量を有する。
【００１８】
１つの実施形態において、免疫原性組成物は、１０％から１００％の間でＯ−アセチル化されている、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖５型を含む。１つの実施形態において、免疫原性組成物は、５０％から１００％の間でＯ−アセチル化されている、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖５型を含む。１つの実施形態において、免疫原性組成物は、７５％から１００％の間でＯ−アセチル化されている、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖５型を含む。
【００１９】
１つの実施形態において、免疫原性組成物は、２０から１０００ｋＤａの間の高分子量多糖である、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖８型を含む。１つの実施形態において、８型の高分子量多糖は、５０から３００ｋＤａの間の分子量を有する。１つの実施形態において、８型の高分子量多糖は、７０から１５０ｋＤａの間の分子量を有する。
【００２０】
１つの実施形態において、免疫原性組成物は、１０％から１００％の間でＯ−アセチル化されている、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖８型を含む。１つの実施形態において、免疫原性組成物は、５０％から１００％の間でＯ−アセチル化されている、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖８型を含む。１つの実施形態において、免疫原性組成物は、７５％から１００％の間でＯ−アセチル化されている、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖８型を含む。
【００２１】
１つの実施形態において、免疫原性組成物内に存在する莢膜多糖５および／または８は、担体タンパク質にコンジュゲートしている。１つの実施形態において、担体タンパク質は、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）毒素ＣＲＭ１９７である。
【００２２】
１つの実施形態において、免疫原性組成物は、脂質化されたタンパク質である、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣを含む。１つの実施形態において、免疫原性組成物は、脂質化されたタンパク質ではない、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣを含む。
【００２３】
１つの実施形態において、本発明は、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、およびＳｄｒＥからなる群から選択されるセリン−アスパラギン酸反復（Ｓｄｒ）タンパク質ファミリーの少なくとも１つのタンパク質をさらに含む、本明細書において記載される免疫原性組成物を提供する。
【００２４】
１つの実施形態において、本発明は、鉄表面決定基Ｂ（ＩｓｄＢ）タンパク質をさらに含む、本明細書において記載される免疫原性組成物を提供する。
【００２５】
免疫原性組成物が３つ以上の列挙された抗原を含む、本明細書において記載される実施形態のそれぞれにおいて、該組成物はさらに、他の免疫原性物質および／または非免疫原性物質を含み得る。特定の実施形態において、各免疫原性組成物は、本明細書においてさらに詳細に記載されるように、二者択一的に、３つ以上の列挙された抗原から「原則的に構成され」得るかまたは「構成され」得、１つまたは複数の非免疫原性物質をさらに含む。
【００２６】
１つの実施形態において、本発明は、Ｏｐｐ３ａ、ＤｌｔＤ、ＨｔｓＡ、ＬｔａＳ、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＣ、ＳｄｒＦ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、ＳｒｔＡ、ＳｐＡ、Ｓｂｉ  ＦｍｔＢ、α溶血素（ｈｌａ）、β溶血素、フィブロネクチン結合タンパク質Ａ（ｆｎｂＡ）、フィブロネクチン結合タンパク質Ｂ（ｆｎｂＢ）、コアグラーゼ、Ｆｉｇ、ｍａｐ、パントン・バレンタイン型ロイコシジン（ｐｖｌ）、α毒素およびその変型、γ毒素（ｈｌｇ）および変型、ｉｃａ、免疫優性ＡＢＣ輸送体、Ｍｇ２＋輸送体、Ｎｉ  ＡＢＣ輸送体、ＲＡＰ、自己溶解酵素、ラミニン受容体、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ＩｓａＢ／ＰｉｓＢ、ＳＰＯＩＩＩＥ、ＳｓａＡ、ＥｂｐＳ、Ｓａｓ  Ａ、ＳａｓＦ、ＳａｓＨ、ＥＦＢ（ＦＩＢ）、ＳＢＩ、Ｎｐａｓｅ、ＥＢＰ、骨シアロ結合タンパク質ＩＩ、アウレオリシン前駆体（ＡＵＲ）／Ｓｅｐｐ１、Ｃｎａ、ならびにそれらの断片、例えば、Ｍ５５、ＴＳＳＴ−１、ｍｅｃＡ、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＰＮＡＧ／ｄＰＮＡＧ）エキソ多糖、ＧｅｈＤ、ＥｂｈＡ、ＥｂｈＢ、ＳＳＰ−１、ＳＳＰ−２、ＨＢＰ、ビトロネクチン結合タンパク質、ＨａｒＡ、ＥｓｘＡ、ＥｓｘＢ、エンテロトキシンＡ、エンテロトキシンＢ、エンテロトキシンＣ１、および新規な自己溶解酵素という抗原のいずれか１つをさらに含む、本明細書において記載される免疫原性組成物を提供する。本発明の特定の実施形態において、免疫原性組成物が特定の形態のＣＰ５および／またはＣＰ８を含む場合、これはＰＮＡＧをさらに含まない可能性がある。
【００２７】
１つの実施形態において、免疫原性組成物はさらにアジュバントを含む。１つの実施形態において、免疫原性組成物はさらに薬学的に許容できる担体を含む。
【００２８】
１つの実施形態において、免疫原性組成物は、ワクチンを製剤するために用いられる。１つの実施形態において、ワクチンは、対象において黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する免疫応答を誘発するために用いられる。１つの実施形態において、免疫原性組成物は、対象に受動免疫をもたらすための抗体製剤を生成するために用いられる。
【００２９】
１つの実施形態において、本発明は、免疫原性量の本明細書において記載される免疫原性組成物のいずれかおよび薬学的に許容できる担体を対象に投与することを含む、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する免疫応答を誘発する方法を提供する。
【００３０】
１つの実施形態において、本発明は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）での感染を予防するかもしくは低減させる方法、または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）により生じる感染に関連する少なくとも１つの症候の重症度を予防するかもしくは低減させる方法を提供し、この方法は、免疫原性量の本明細書において記載される免疫原性組成物のいずれかおよび薬学的に許容できる担体を対象に投与することを含む。
【００３１】
１つの実施形態において、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する免疫応答を誘発するための方法は、免疫原性組成物をアジュバントと共に送達することを含む。１つの実施形態において、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する免疫応答を誘発するための方法は、免疫原性組成物を薬学的に許容できる担体と共に送達することを提供する。
【００３２】
１つの実施形態において、本明細書において記載される免疫原性組成物によって誘発される免疫応答は、対象におけるブドウ球菌生物に関連する疾患もしくは症状を予防するかもしくは低減させるか、または、対象におけるブドウ球菌生物に関連する１つもしくは複数の症候を予防するかもしくは低減させる。１つの実施形態において、疾患は、侵襲性の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）疾患、敗血症、および保菌からなる群から選択される。
【００３３】
１つの実施形態において、誘発される免疫応答は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対するオプソニン性貪食活性（ＯＰＡ）を有する抗体の生成を含む。１つの実施形態において、誘発される免疫応答は、免疫化されていない対象において観察されるものと比較して高力価の、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に特異的なオプソニン性貪食抗体の生成を含む。１つの実施形態において、オプソニン性貪食の力価は少なくとも１：２０である。
【００３４】
１つの実施形態において、免疫応答が誘発される対象である黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、ＭＲＳＡである。１つの実施形態において、免疫応答が誘発される対象である黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、ＭＳＳＡである。１つの実施形態において、免疫応答が誘発される対象である黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、ＶＲＳＡである。１つの実施形態において、免疫応答が誘発される対象である黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、ＶＩＳＡである。
【００３５】
１つの実施形態において、本発明は、外科手術を受けている対象におけるブドウ球菌感染を予防する方法を提供し、この方法は、免疫学的に効果的な量の本明細書において記載される免疫原性組成物のいずれかを外科手術の前に対象に投与することを含む。外科手術は、待機的手術または非待機的手術であり得る。１つの実施形態において、外科手術は、心胸郭の外科手術である。１つの実施形態において、対象はヒト、伴侶動物、または家畜動物である。
【００３６】
１つの実施形態において、本発明は、（１）本発明の免疫原性組成物を用いて抗体調製物を生成するステップ、および（２）対象に抗体調製物を投与して受動免疫をもたらすステップを含む、対象に受動免疫をもたらす方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】様々な形態の組換えＣｌｆＡを示し、示されている順にそれぞれ配列番号１２５および１２７〜１２９を開示する図である。
【図２】ＣｌｆＡを発現させるためのｐＬＰ１１７９の構築に用いられるクローニングステップを示す図である。
【図３】Ｔ７ＣｌｆＡ（Ｎ１２３）Ｙ３３８Ａ発現ベクター、ｐＬＰ１１７９を示す図である。
【図４】ＣＰ５多糖およびＣＰ８多糖の反復構造を示す図である。
【図５Ａ】異なる培養液ｐＨで生産されたＣＰ５（Ａ）の分子量プロフィールを示す図である。
【図５Ｂ】異なる培養液ｐＨで生産されたＣＰ８（Ｂ）の分子量プロフィールを示す図である。
【図６Ａ】異なる温度で生産されたＣＰ５（Ａ）の分子量プロフィールを示す図である。
【図６Ｂ】異なる温度で生産されたＣＰ８（Ｂ）の分子量プロフィールを示す図である。
【図７】精製されたＣＰ５およびＣＰ８の分子量と弱酸加水分解の処理時間との相関を示す図である。
【図８Ａ】黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の様々な株間のＣｌｆＡのアラインメントを示す図である（示されている順にそれぞれ配列番号６２、６４、６８、８４、７０、１０４、６６、７８、８６、８８、９０、７２、７４、７６、８０、９４、８２、９２、９６、９８、１００、１０２、１０６、および１０８）。
【図８Ｂ】黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の様々な株間のＣｌｆＡのアラインメントを示す図である（示されている順にそれぞれ配列番号６２、６４、６８、８４、７０、１０４、６６、７８、８６、８８、９０、７２、７４、７６、８０、９４、８２、９２、９６、９８、１００、１０２、１０６、および１０８）。
【図８Ｃ】黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の様々な株間のＣｌｆＡのアラインメントを示す図である（示されている順にそれぞれ配列番号６２、６４、６８、８４、７０、１０４、６６、７８、８６、８８、９０、７２、７４、７６、８０、９４、８２、９２、９６、９８、１００、１０２、１０６、および１０８）。
【図８Ｄ】黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の様々な株間のＣｌｆＡのアラインメントを示す図である（示されている順にそれぞれ配列番号６２、６４、６８、８４、７０、１０４、６６、７８、８６、８８、９０、７２、７４、７６、８０、９４、８２、９２、９６、９８、１００、１０２、１０６、および１０８）。
【図８Ｅ】黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の様々な株間のＣｌｆＡのアラインメントを示す図である（示されている順にそれぞれ配列番号６２、６４、６８、８４、７０、１０４、６６、７８、８６、８８、９０、７２、７４、７６、８０、９４、８２、９２、９６、９８、１００、１０２、１０６、および１０８）。
【図９】ＣｌｆＡの系統樹を示す図である。
【図１０Ａ】黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の様々な株間のＣｌｆＢのアラインメントを示す図である（示されている順にそれぞれ配列番号２６、２８、３２、１８、５４、３４、３６、３０、１６、２０、２２、２４、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５６、５８、および６０）。
【図１０Ｂ】黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の様々な株間のＣｌｆＢのアラインメントを示す図である（示されている順にそれぞれ配列番号２６、２８、３２、１８、５４、３４、３６、３０、１６、２０、２２、２４、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５６、５８、および６０）。
【図１０Ｃ】黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の様々な株間のＣｌｆＢのアラインメントを示す図である（示されている順にそれぞれ配列番号２６、２８、３２、１８、５４、３４、３６、３０、１６、２０、２２、２４、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５６、５８、および６０）。
【図１０Ｄ】黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の様々な株間のＣｌｆＢのアラインメントを示す図である（示されている順にそれぞれ配列番号２６、２８、３２、１８、５４、３４、３６、３０、１６、２０、２２、２４、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５６、５８、および６０）。
【図１０Ｅ】黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の様々な株間のＣｌｆＢのアラインメントを示す図である（示されている順にそれぞれ配列番号２６、２８、３２、１８、５４、３４、３６、３０、１６、２０、２２、２４、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５６、５８、および６０）。
【図１１】ＣｌｆＢの系統樹を示す図である。
【図１２】黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の様々な株間のＭｎｔＣのアラインメントを示す図である（示されている順にそれぞれ配列番号２、８、１０、４、６、１４、および１２）。
【図１３】ウサギ抗ＣｌｆＡポリクローナル抗体がマウス敗血症モデルにおいて黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）６５９−０１８のコロニー数を低減させることを示す図である。
【図１４】ＣｌｆＡでの能動免疫化がウサギ感染性心内膜炎モデルにおいて黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＦＥＳＡ０００３による心臓のコロニー形成を低減させることを示す図である。
【図１５Ａ】ＭｎｔＣでの免疫化が血液中の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を低減させることを示す図である。Ａ：黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＦＥＳＡ０２３７株。
【図１５Ｂ】ＭｎｔＣでの免疫化が血液中の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を低減させることを示す図である。Ｂ：黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＦＥＳＡ０２６６株。
【図１６】黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＣＰ５−ＣＲＭ１９７コンジュゲート免疫原性製剤がマウス腎盂腎炎モデルにおいて防御を一貫して示すことを示す図である。
【図１７】ＣＰ８−ＣＲＭ１９７コンジュゲート免疫原性製剤でのワクチン接種が敗血症モデルにおいて死亡を低減させることを示す図である。
【図１８】高分子量（ＨＭＷ）のＣＰ５−ＣＲＭ、低分子量（ＬＭＷ）のＣＰ５−ＣＲＭ、またはＰＰ５−ＣＲＭ対照でワクチン接種されたマウスにおける、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＦＥＳＡ０２６６でチャレンジした後の腎臓において回収されたコロニー形成単位（ＣＦＵ）を示す図である。
【図１９】多糖コンジュゲート（高分子量（ＨＭＷ）のＣＰ５−ＣＲＭ、低分子量（ＬＭＷ）のＣＰ５−ＣＲＭ）の異なる製剤でワクチン接種されたマウスから得られる血清のＯＰＡ力価（ｇｅｏｍｅａｎ）の比較を示す図である。
【図２０】異なる組み合わせの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗原でのワクチン接種の前（０週目、白抜きの記号）および２週間後（２週目、黒い記号）の、ヒトではない霊長類の血清についてのＯＰＡ力価を示す図である。３抗原（３Ａｇ）ワクチンは３つの抗原から構成され、４抗原（４Ａｇ）ワクチンは４つの抗原から構成された。各製剤は２つのＣＰコンジュゲートおよび１つまたは２つのペプチドを有する。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本方法および本治療法を記載する前に、本発明が、記載される特定の方法および実験条件に限定されるわけではないことを理解されたく、それは、このような方法および条件が変化し得るためである。また、本明細書において用いられる用語は特定の実施形態のみを記載することを目的としており、限定することを意図したものではないことも理解されたい。
【００３９】
本明細書において記載されるものに類似の、または等しいあらゆる方法および材料が、本発明の実施または試験において用いられ得るが、好ましい方法および材料が以下に記載される。本明細書において述べられる全ての刊行物は、参照することによってその全体が組み込まれる。
【００４０】
本明細書において用いられる用語は、当業者に認められ知られている意味を有するが、利便性および完全性のために、特定の用語およびそれらの意味を以下に説明する。
【００４１】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、単一形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈からそうでないことが明らかに示されない限り、複数形の言及を含む。したがって、例えば、「その方法」への言及は、本明細書において記載されるタイプの、および／またはこの開示を読むことなどで当業者に明らかとなる、１つまたは複数の方法および／またはステップを含む。
【００４２】
「約」または「およそ」という用語は、値の統計的に有意な範囲内を意味する。このような範囲は１桁以内であり得、所与の値または範囲の典型的には２０％以内、より典型的にはさらに１０％以内、さらに典型的には５％以内であり得る。「約」または「およそ」という用語によって包含される許容可能な変化量は、研究下の特定の系に依存し、当業者によって容易に理解され得る。本出願内で範囲が列挙される場合は常に、その範囲内の全ての整数もまた、本発明の実施形態として検討される。
【００４３】
「抗体」は、少なくとも１つの抗原認識部位を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に特異的に結合し得る、免疫グロブリン分子であり、該抗原認識部位は、該免疫グロブリン分子の可変領域内に位置する。本明細書において用いられる場合、文脈からそうではないことが示されない限り、この用語は、無傷のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけではなく、操作された抗体（例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ならびに／またはエフェクター機能、安定性、および他の生物学的活性を改変するように誘導体化された抗体）およびその断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）およびドメイン抗体（サメ抗体およびラクダ抗体を含む）、ならびに、抗体部分を含む融合タンパク質、多価抗体、多特異的抗体（例えば、それらが所望の生物学的活性を示す限り、二重特異性抗体）、ならびに本明細書において記載される抗体断片、ならびに抗原認識部位を含む、免疫グロブリン分子のあらゆる他の修飾立体形状を含むことを意図するものである。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（または、そのサブクラス）などの、あらゆるクラスの抗体を含み、抗体は、何らかの特定のクラスのものである必要はない。抗体の重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭという５つの主要なクラスがあり、これらのうちのいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）に分けられ得、該サブクラスは例えば、ヒトではＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２である。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する、重鎖の定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体形状は周知である。
【００４４】
「抗体断片」は、無傷の抗体の１つの部分のみを含み、該部分は、好ましくは、無傷の抗体内に存在する場合にその部分に通常は関連する機能の少なくとも１つ、好ましくはほとんどまたは全てを保持している。
【００４５】
「抗原」という用語は通常、生物学的分子、通常は、同族抗体が選択的に結合し得る対象である少なくとも１つのエピトープを含有するタンパク質、ペプチド、多糖、脂質、もしくはコンジュゲートを言うか、または、一部の場合には、動物に注射されるかもしくは吸収される組成物を含む、動物において抗体もしくはＴ細胞応答もしくはその両方の生産を刺激し得る免疫原性物質を言う。免疫応答は、分子全体に対して生じ得るか、または、分子の１つもしくは複数の様々な部分（例えば、エピトープまたはハプテン）に対して生じ得る。この用語は、個別の分子を言うため、または抗原分子の同種集団もしくは異種集団を言うために用いられ得る。抗原は、抗体、Ｔ細胞受容体、または特異的な液性免疫および／もしくは細胞性免疫の他の要素によって認識される。「抗原」という用語は、全ての関連する抗原エピトープを含む。所与の抗原のエピトープは、当技術分野において周知のあらゆる数のエピトープマッピング技術を用いて同定され得る。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．６６（Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編、１９９６）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．を参照されたい。例えば、線形エピトープは、例えば、タンパク質分子の部分に相当する多数のペプチドを固体担体上に同時に合成し、ペプチドを担体に付着させたままペプチドを抗体と反応させることによって決定され得る。このような技術は、当技術分野において知られており、例えば米国特許第４，７０８，８７１号、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３９９８〜４００２、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９〜７１５において記載されており、これらは全て、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。同様に、立体配座エピトープは、例えばｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴により、アミノ酸の空間立体配座を決定することによって同定され得る。例えば、上記のＥｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを参照されたい。さらに、本発明の目的では、「抗原」はまた、そのタンパク質が免疫学的応答を誘導する能力を維持している限り、天然配列に対する欠失、付加、および置換などの修飾（通常は本質的には保存的であるが、非保存的であり得る）を含むタンパク質を言うためにも用いられ得る。これらの修飾は、部位特異的突然変異生成を介する、もしくは特定の合成手順を介する、もしくは遺伝子操作アプローチを介するように、意図的なものであり得るか、または、抗原を生産する、宿主の突然変異を介するような、偶発的なものであり得る。さらに、抗原は、微生物、例えば細菌に由来し得るか、これらから得られ得るか、もしくはこれらから単離され得るか、または生物全体であり得る。同様に、核酸免疫化用途におけるような、抗原を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドもまた、定義に含まれる。合成抗原、例えばポリエピトープ、隣接エピトープ、および他の組換え抗原または合成に由来する抗原もまた含まれる（Ｂｅｒｇｍａｎｎら（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：２７７７  ２７８１；Ｂｅｒｇｍａｎｎら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３２４２  ３２４９；Ｓｕｈｒｂｉｅｒ，Ａ．（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７５：４０２  ４０８；Ｇａｒｄｎｅｒら（１９９８）１２ｔｈ  Ｗｏｒｌｄ  ＡＩＤＳ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、Ｇｅｎｅｖａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、Ｊｕｎ．２８〜Ｊｕｌ．３、１９９８）。
【００４６】
「アジュバント」という用語は、本明細書においてさらに記載され例証されるように、抗原に対する免疫応答を増強させる化合物または混合物を言う。
【００４７】
「菌血症」は、血液中における細菌の一次的な存在を言う。菌血症は、感染と考えられ臨床的兆候／症候に関連する血液中の細菌の持続的な存在である、腐敗症または敗血症に進行し得る。全ての細菌が血液中で生存し得るわけではない。特別な遺伝的形質を有するものが、その能力をもたらす。また、宿主の因子が、同様に重要な役割を有する。
【００４８】
「莢膜多糖」または「被膜多糖」は、ブドウ球菌のほとんどの単離体の細胞壁の外側にある多糖被膜を言う。例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、ペプチドグリカン複合体から構成される細胞壁成分を含み、これは、好ましくない浸透圧条件下でのこの生物の生存を可能にし、また、ペプチドグリカンに結合した固有のテイコ酸を含む。細胞壁の外側で、薄い多糖被膜は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のほとんどの単離体を被覆する。この血清学的に異なる被膜は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の様々な単離体を血清型決定するために用いることができる。臨床的に重要な単離体の多くは、血清型５（ＣＰ５）および血清型８（ＣＰ８）という２つの莢膜型を含むことが示されている。ＣＰ５およびＣＰ８の構造を、図４に概略的に示す。
【００４９】
本明細書において用いられる場合、「コンジュゲート」は、通常は所望の範囲の分子量の被膜多糖と担体タンパク質とを含み、被膜多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートしている。コンジュゲートは、ある程度の量の遊離被膜多糖を含んでいてもいなくてもよい。本明細書において用いられる場合、「遊離被膜多糖」は、コンジュゲートした莢膜多糖−担体タンパク質と非共有結合的に関連している（すなわち、これに非共有結合しているか、これに吸着しているか、またはこの内部に捕捉されているかもしくはこれで捕捉されている）被膜多糖を言う。「遊離被膜多糖」、「遊離多糖」、および「遊離糖」はほぼ同じ意味で用いられ得、同一の意味を伝えることが意図されている。担体分子の性質に関係なく、担体分子は、直接的に、またはリンカーを介して、莢膜多糖にコンジュゲートし得る。本明細書において用いられる場合、「コンジュゲートする」、「コンジュゲートした」、および「コンジュゲートしている」は、細菌莢膜多糖を担体分子に共有結合によって付着させるプロセスを言う。コンジュゲーションは、細菌莢膜多糖の免疫原性を増強させる。コンジュゲーションは、以下に記載される方法に従って、または当技術分野において知られているプロセスによって行われ得る。
【００５０】
上記のように、本発明は、担体タンパク質にコンジュゲートした黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５莢膜多糖（ＣＰ５）を含むコンジュゲート、および担体タンパク質にコンジュゲートした黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型８莢膜多糖（ＣＰ８）を含むコンジュゲートに関する。本発明の１つの実施形態は、担体タンパク質にコンジュゲートした黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５莢膜多糖および担体タンパク質にコンジュゲートした黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型８莢膜多糖を含むコンジュゲートを提供し、ここで、５型莢膜多糖は５０ｋＤａから８００ｋＤａの間の分子量を有し、８型莢膜多糖は５０ｋＤａから７００ｋＤａの間の分子量を有し、免疫原性コンジュゲートは約１０００ｋＤａから約５０００ｋＤａの間の分子量を有し、かつコンジュゲートは全多糖に対して約３０％未満の遊離多糖を含む。１つの実施形態において、コンジュゲートは、全多糖に対して約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、または約５％未満の遊離多糖を含む。１つの実施形態において、５型多糖または８型多糖は、２０ｋＤａから１０００ｋＤａの間の分子量を有する。
【００５１】
１つの実施形態において、コンジュゲートは、約５０ｋＤａから約５０００ｋＤａの間の分子量を有する。１つの実施形態において、コンジュゲートは、約２００ｋＤａから約５０００ｋＤａの間の分子量を有する。１つの実施形態において、免疫原性コンジュゲートは、約４００ｋＤａから約２５００ｋＤａの間の分子量を有する。１つの実施形態において、免疫原性コンジュゲートは、約５００ｋＤａから約２５００ｋＤａの間の分子量を有する。１つの実施形態において、免疫原性コンジュゲートは、約６００ｋＤａから約２８００ｋＤａの間の分子量を有する。１つの実施形態において、免疫原性コンジュゲートは、約７００ｋＤａから約２７００ｋＤａの間の分子量を有する。１つの実施形態において、免疫原性コンジュゲートは、約１０００ｋＤａから約２０００ｋＤａの間、約１８００ｋＤａから約２５００ｋＤａの間、約１１００ｋＤａから約２２００ｋＤａの間、約１９００ｋＤａから約２７００ｋＤａの間、約１２００ｋＤａから約２４００ｋＤａの間、約１７００ｋＤａから約２６００ｋＤａの間、約１３００ｋＤａから約２６００ｋＤａの間、約１６００ｋＤａから約３０００ｋＤａの間の分子量を有する。
【００５２】
したがって、１つの実施形態において、本発明の免疫原性コンジュゲート内の担体タンパク質はＣＲＭ１９７であり、ＣＲＭ１９７は、カルバメート結合、アミド結合、または両方を介して、莢膜多糖に共有結合している。莢膜多糖にコンジュゲートする担体タンパク質におけるリジン残基の数は、コンジュゲートしたリジンの範囲として特徴付けされ得る。例えば、所与の免疫原性組成物において、ＣＲＭ１９７は、莢膜多糖に共有結合している３９個のリジンのうち５から１５個のリジンを含み得る。このパラメータを表すための別の手段は、ＣＲＭ１９７リジンの１２％から４０％が莢膜多糖に共有結合しているというものである。いくつかの実施形態において、ＣＲＭ１９７に共有結合している多糖のＣＲＭ１９７部分は、多糖に共有結合している５から２２個のリジンを含む。いくつかの実施形態において、ＣＲＭ１９７に共有結合している多糖のＣＲＭ１９７部分は、多糖に共有結合している５から２３個のリジンを含む。いくつかの実施形態において、担体タンパク質に共有結合している多糖のＣＲＭ１９７部分は、多糖に共有結合している８から１５個のリジンを含む。いくつかの実施形態において、担体タンパク質に共有結合している多糖のＣＲＭ１９７部分は、多糖に共有結合している８から１２個のリジンを含む。例えば、所与の免疫原性組成物において、ＣＲＭ１９７は、莢膜多糖に共有結合している３９個のリジンのうち１８から２２個のリジンを含み得る。このパラメータを表すための別の手段は、ＣＲＭ１９７リジンの４０％から６０％が莢膜多糖に共有結合しているというものである。いくつかの実施形態において、ＣＲＭ１９７は、ＣＰ８に共有結合している３９個のリジンのうち５から１５個のリジンを含む。このパラメータを表すための別の手段は、ＣＲＭ１９７リジンの１２％から４０％がＣＰ８に共有結合しているというものである。いくつかの実施形態において、ＣＲＭ１９７は、ＣＰ５に共有結合している３９個のリジンのうち１８から２２個のリジンを含む。このパラメータを表すための別の手段は、ＣＲＭ１９７リジンの４０％から６０％がＣＰ５に共有結合しているというものである。
【００５３】
上記で論じたように、莢膜多糖にコンジュゲートした担体タンパク質におけるリジン残基の数は、コンジュゲートしたリジンの範囲として特徴付けされ得、これはモル濃度比として表され得る。例えば、ＣＰ８免疫原性コンジュゲートにおける、ＣＲＭ１９７に対するコンジュゲートしたリジンのモル濃度比は、約１８：１から約２２：１の間であり得る。１つの実施形態において、ＣＰ８免疫原性コンジュゲートにおける、ＣＲＭ１９７に対するコンジュゲートしたリジンのモル濃度比率の範囲は、約１５：１から約２５：１の間であり得る。いくつかの実施形態において、ＣＰ８免疫原性コンジュゲートにおける、ＣＲＭ１９７に対するコンジュゲートしたリジンのモル濃度比の範囲は、約１４：１から約２０：１の間、約１２：１から約１８：１の間、約１０：１から約１６：１の間、約８：１から約１４：１の間、約６：１から約１２：１の間、約４：１から約１０：１の間、約２０：１から約２６：１の間、約２２：１から約２８：１の間、約２４：１から約３０：１の間、約２６：１から約３２：１の間、約２８：１から約３４：１の間、約３０：１から約３６：１の間、約５：１から約１０：１の間、約５：１から約２０：１の間、約１０：１から約２０：１の間、または約１０：１から約３０：１の間であり得る。また、ＣＰ５免疫原性コンジュゲートにおける、ＣＲＭ１９７に対するコンジュゲートしたリジンのモル濃度比は、約３：１から２５：１の間であり得る。１つの実施形態において、ＣＰ５免疫原性コンジュゲートにおける、ＣＲＭ１９７に対するコンジュゲートしたリジンのモル濃度比の範囲は、約５：１から約２０：１の間であり得る。１つの実施形態において、ＣＰ５免疫原性コンジュゲートにおける、ＣＲＭ１９７に対するコンジュゲートしたリジンのモル濃度比の範囲は、約４：１から約２０：１の間、約６：１から約２０：１の間、約７：１から約２０：１の間、約８：１から約２０：１の間、約１０：１から約２０：１の間、約１１：１から約２０：１の間、約１２：１から約２０：１の間、約１３：１から約２０：１の間、約１４：１から約２０：１の間、約１５：１から約２０：１の間、約１６：１から約２０：１の間、約１７：１から約２０：１の間、約１８：１から約２０：１の間、約５：１から約１８：１の間、約７：１から約１６：１の間、または約９：１から約１４：１の間であり得る。
【００５４】
莢膜多糖にコンジュゲートした担体タンパク質におけるリジン残基の数を表すための別の手段は、コンジュゲートしたリジンの範囲としてというものであり得る。例えば、所与のＣＰ８免疫原性コンジュゲートにおいて、ＣＲＭ１９７は、莢膜多糖に共有結合している３９個のリジンのうち５から１５個のリジンを含み得る。あるいは、このパラメータは、パーセンテージとして表され得る。例えば、所与のＣＰ８免疫原性コンジュゲートにおいて、コンジュゲートしたリジンのパーセンテージは、１０％から５０％の間であり得る。いくつかの実施形態において、リジンの２０％から５０％がＣＰ８に共有結合していてよい。あるいは、さらに、ＣＲＭ１９７リジンの３０％から５０％がＣＰ８に共有結合していてよく、ＣＲＭ１９７リジンの１０％から４０％、ＣＲＭ１９７リジンの１０％から３０％、ＣＲＭ１９７リジンの２０％から４０％、ＣＲＭ１９７リジンの２５％から４０％、ＣＲＭ１９７リジンの３０％から４０％、ＣＲＭ１９７リジンの１０％から３０％、ＣＲＭ１９７リジンの１５％から３０％、ＣＲＭ１９７リジンの２０％から３０％、ＣＲＭ１９７リジンの２５％から３０％、ＣＲＭ１９７リジンの１０％から１５％、またはＣＲＭ１９７リジンの１０％から１２％がＣＰ８に共有結合している。また、所与のＣＰ５免疫原性コンジュゲートにおいて、ＣＲＭ１９７は、莢膜多糖に共有結合している３９個のリジンのうち１８から２２個のリジンを含み得る。あるいは、このパラメータは、パーセンテージとして表され得る。例えば、所与のＣＰ５免疫原性コンジュゲートにおいて、コンジュゲートしたリジンのパーセンテージは、４０％から６０％の間であり得る。いくつかの実施形態において、リジンの４０％から６０％がＣＰ５に共有結合していてよい。あるいは、さらに、ＣＲＭ１９７リジンの３０％から５０％がＣＰ５に共有結合していてよく、ＣＲＭ１９７リジンの２０％から４０％、ＣＲＭ１９７リジンの１０％から３０％、ＣＲＭ１９７リジンの５０％から７０％、ＣＲＭ１９７リジンの３５％から６５％、ＣＲＭ１９７リジンの３０％から６０％、ＣＲＭ１９７リジンの２５％から５５％、ＣＲＭ１９７リジンの２０％から５０％、ＣＲＭ１９７リジンの１５％から４５％、ＣＲＭ１９７リジンの１０％から４０％、ＣＲＭ１９７リジンの４０％から７０％、またはＣＲＭ１９７リジンの４５％から７５％がＣＰ５に共有結合している。
【００５５】
莢膜多糖鎖が担体分子上のリジンに付着している頻度は、被膜多糖のコンジュゲートを特徴付けするための別のパラメータである。例えば、１つの実施形態において、ＣＲＭ１９７と多糖との間の少なくとも１つの共有結合が、莢膜多糖の少なくとも５から１０個の糖反復単位ごとに生じる。別の実施形態において、ＣＲＭ１９７と莢膜多糖との間には、莢膜多糖の５から１０個の糖反復単位ごと、２から７個の糖反復単位ごと、３から８個の糖反復単位ごと、４から９個の糖反復単位ごと、６から１１個の糖反復単位ごと、７から１２個の糖反復単位ごと、８から１３個の糖反復単位ごと、９から１４個の糖反復単位ごと、１０から１５個の糖反復単位ごと、２から６個の糖反復単位ごと、３から７個の糖反復単位ごと、４から８個の糖反復単位ごと、６から１０個の糖反復単位ごと、７から１１個の糖反復単位ごと、８から１２個の糖反復単位ごと、９から１３個の糖反復単位ごと、１０から１４個の糖反復単位ごと、１０から２０個の糖反復単位ごと、５から１０個の糖反復単位ごとに、少なくとも１つの共有結合が存在する。別の実施形態において、ＣＲＭ１９７と莢膜多糖との間の少なくとも１つの結合は、莢膜多糖の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個の糖反復単位ごとに生じる。
【００５６】
多糖の化学的活性化およびその後の担体タンパク質へのコンジュゲーションは、従来の手段によって達成され得る。例えば、米国特許第４，６７３，５７４号および米国特許第４，９０２，５０６号を参照されたい。他の活性化方法およびコンジュゲーション方法を代替的に用いることができる。
【００５７】
本明細書において用いられる「担体タンパク質」または「タンパク質担体」は、免疫応答が望まれる対象である抗原（莢膜多糖など）にコンジュゲートし得る、あらゆるタンパク質分子を言う。担体タンパク質への、多糖などの抗原のコンジュゲーションによって、抗原の免疫原性がもたらされ得る。担体タンパク質は、好ましくは、無毒性および非反応原性であり十分な量および純度で得られ得るタンパク質である。担体タンパク質の例は、破傷風、ジフテリア、百日咳、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、および連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種の毒素、トキソイド、または毒素のあらゆる突然変異交差反応性物質（ＣＲＭ１９７）である。担体タンパク質は、標準的なコンジュゲーション手順に適しているべきである。本発明の特定の実施形態において、ＣＲＭ１９７が担体タンパク質として用いられる。
【００５８】
ＣＲＭ１９７（Ｗｙｅｔｈ／Ｐｆｉｚｅｒ、Ｓａｎｆｏｒｄ、ＮＣ）は、カザミノ酸および酵母抽出物に基づいた培地内で成長したジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）株Ｃ７（β１９７）の培養物から単離されたジフテリア毒素の無毒性の変型（すなわちトキソイド）である。ＣＲＭ１９７は、限外濾過、硫酸アンモニウム沈殿、およびイオン交換クロマトグラフィーを介して精製される。ＣＲＭ１９７タンパク質を生産するジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）株Ｃ７（１９７）の培養物は、メリーランド州、ロックビルにあるＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されており、ＡＴＣＣ５３２８１という受託番号を付与されている。他のジフテリア毒素もまた、担体タンパク質としての使用に適している。
【００５９】
他の適切な担体タンパク質は、不活化された、破傷風毒素、百日咳毒素、コレラ毒素（例えば、国際特許出願ＷＯ２００４／０８３２５１において記載されているもの）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＴ、および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の外毒素Ａなどの細菌毒素を含む。外膜タンパク質複合体ｃ（ＯＭＰＣ）、ポーリン、トランスフェリン結合タンパク質、ニューモリシン、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌アドヘシンタンパク質（ＰｓａＡ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のエンテロトキシン（毒素Ａ）および細胞毒素（毒素Ｂ）、またはインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄなどの、細菌の外膜タンパク質もまた用いることができる。オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、またはツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）などの他のタンパク質もまた、担体タンパク質として用いることができる。
【００６０】
莢膜多糖が担体タンパク質にコンジュゲートした後、多糖−タンパク質コンジュゲートは、様々な技術によって精製される（多糖−タンパク質コンジュゲートの量に関して強化される）。これらの技術には、例えば、濃縮／ダイアフィルトレーション操作、沈殿／溶出、カラムクロマトグラフィー、および深層濾過が含まれる。以下の実施例を参照されたい。
【００６１】
個別のコンジュゲートが精製された後、これらは、例えばワクチンにおいて用いられ得る、本発明の免疫原性組成物を製剤するために組み合わされる。本発明の免疫原性組成物の製剤は、当技術分野において認識されている方法を用いて達成され得る。
【００６２】
この開示において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語は、米国特許法においてそれらが有する意味を有し得、例えば、それらは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得る。このような用語は、あらゆる他の構成要素を排除することなく特定の構成要素または構成要素の組を含むことを意味する。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」などの用語は、米国特許法においてそれらが有する意味を有し、例えば、それらは、本発明の新規なまたは基本的な特徴を損ねることのないさらなる構成要素またはステップが含まれることを認め、すなわち、それらは、本発明の新規なまたは基本的な特徴を損ねる、さらなる列挙されていない構成要素またはステップを排除し、また、特に、特許性のある実施形態、例えば、先行技術に対して、例えば本明細書において引用されるかまたは参照することによって本明細書に組み込まれる文献に対して新規性のある、自明ではない、進歩性のある実施形態を定義することが本明細書の目的であるため、上記用語は、本明細書において引用されるかまたは参照することによって本明細書に組み込まれる当技術分野における文献などの先行技術の構成要素またはステップを排除する。さらに、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語は、米国特許法においてそれらが有する意味を有し、すなわち、これらの用語はクローズエンド型である。したがって、これらの用語は、特定の構成要素または構成要素の組が含まれること、および全ての他の構成要素が排除されることを言う。
【００６３】
「保存的なアミノ酸置換」は、タンパク質のアミノ酸残基の１つまたは複数の、類似の物理的特性および／または化学的特性を有する他のアミノ酸残基での置換を言う。配列内のアミノ酸のための置換基は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択され得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれる。芳香環構造を含有するアミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンである。極性の中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれる。負に荷電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。このような改変は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定される見かけの分子量、または等電点には影響しないと予想される。特に好ましい置換は、正の荷電が維持され得るようなＬｙｓによるＡｒｇの置換およびその逆、負の荷電が維持され得るようなＧｌｕによるＡｓｐの置換およびその逆、遊離−ＯＨが維持され得るようなＳｅｒによるＴｈｒの置換、および遊離ＮＨ２が維持され得るようなＧｌｎによるＡｓｎの置換である。
【００６４】
「断片」は、より大きなタンパク質の特異的ドメインのみが含まれるタンパク質を言う。例えば、ＣｌｆＡタンパク質およびＣｌｆＢタンパク質は、シグナル配列が含まれる場合、それぞれ８個ものドメインを含有する。Ｎ１Ｎ２Ｎ３ドメイン、Ｎ２Ｎ３ドメイン、Ｎ１Ｎ２ドメイン、Ｎ１ドメイン、Ｎ２ドメイン、またはＮ３ドメインに対応するポリペプチドは、それぞれＣｌｆＡまたはＣｌｆＢの断片であると考えられる。「断片」はまた、親タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも４個のアミノ酸残基（好ましくは、少なくとも１０個のアミノ酸残基、少なくとも１５個のアミノ酸残基、少なくとも２０個のアミノ酸残基、少なくとも２５個のアミノ酸残基、少なくとも４０個のアミノ酸残基、少なくとも５０個のアミノ酸残基、少なくとも６０個のアミノ酸残基、少なくとも７０個のアミノ酸残基、少なくとも８０個のアミノ酸残基、少なくとも９０個のアミノ酸残基、少なくとも１００個のアミノ酸残基、少なくとも１２５個のアミノ酸残基、または少なくとも１５０個のアミノ酸残基）からなるアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはポリペプチド、または、親核酸のヌクレオチド配列の少なくとも１０塩基対（好ましくは、少なくとも２０塩基対、少なくとも３０塩基対、少なくとも４０塩基対、少なくとも５０塩基対、少なくとも５０塩基対、少なくとも１００塩基対、少なくとも２００塩基対）からなるヌクレオチド配列を含むポリペプチドもしくは核酸を言う。
【００６５】
本明細書において用いられる抗体の「機能的活性」または「機能的抗体」は、最低でも抗原に特異的に結合し得る抗体を言う。さらなる機能は、当技術分野において知られており、オプソニン化、ＡＤＣＣ、または補体介在性細胞毒性を介するような病原体のクリアランスまたは死滅に影響する、免疫系のさらなる成分を含み得る。抗原の結合の後、あらゆるその後の抗体機能が、抗体のＦｃ領域を介して仲介され得る。抗体のオプソニン性貪食アッセイ（ＯＰＡ）は、インビトロでのエフェクター細胞（白血球）による細菌のＩｇ補体補助型の死滅を測定するために設計された、インビトロでのアッセイであり、したがって、生物学的プロセスを模倣する。抗体の結合はまた、それが結合する抗原の生物学的機能を直接的に阻害し得、例えば、ＣｌｆＡを結合する抗体は、ＣｌｆＡの酵素機能を中和することができる。いくつかの実施形態において、「機能的抗体」は、動物効力モデルまたは抗体が細菌を死滅させることを実証するオプソニン性貪食死滅アッセイにおける細菌の死滅によって測定されるように機能的である抗体を言う。
【００６６】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の被膜多糖の分子量は、免疫原性組成物における使用のための考慮事項である。例えば、高分子量の被膜多糖は、抗原表面上に存在するエピトープの価数が高いことに起因して、特定の抗体免疫応答を誘発し得る場合がある。「高分子量莢膜多糖」の単離は、本発明の組成物および方法における使用のために検討される。例えば、本発明の１つの実施形態において、サイズが分子量で約５０から約８００ｋＤａにわたる５型高分子量多糖の単離が検討される。本発明の１つの実施形態において、サイズが分子量で約２０から約１０００ｋＤａにわたる５型高分子量多糖の単離が検討される。本発明の１つの実施形態において、サイズが分子量で約５０から約３００ｋＤａにわたる５型高分子量莢膜多糖の単離および精製が検討される。１つの実施形態において、分子量が７０から３００ｋＤａにわたる５型高分子量莢膜多糖の単離および精製が検討される。１つの実施形態において、分子量が９０ｋＤａから２５０ｋＤａにわたる５型高分子量莢膜多糖の単離および精製が検討される。１つの実施形態において、分子量が９０ｋＤａから１５０ｋＤａにわたる５型高分子量莢膜多糖の単離および精製が検討される。１つの実施形態において、分子量が９０ｋＤａから１４０ｋＤａにわたる５型高分子量莢膜多糖の単離および精製が検討される。１つの実施形態において、分子量が８０ｋＤａから１２０ｋＤａにわたる５型高分子量莢膜多糖の単離および精製が検討される。本発明の方法によって単離および精製され得る、他の範囲の高分子量血清型５莢膜多糖は、分子量で約７０ｋＤａから約１００ｋＤａ、分子量で７０ｋＤａから１１０ｋＤａ、分子量で７０ｋＤａから１２０ｋＤａ、分子量で７０ｋＤａから１３０ｋＤａ、分子量で７０ｋＤａから１４０ｋＤａ、分子量で７０ｋＤａから１５０ｋＤａ、分子量で７０ｋＤａから１６０ｋＤａ、分子量で８０ｋＤａから１１０ｋＤａ、分子量で８０ｋＤａから１２０ｋＤａ、分子量で８０ｋＤａから１３０ｋＤａ、分子量で８０ｋＤａから１４０ｋＤａ、分子量で８０ｋＤａから１５０ｋＤａ、分子量で８０ｋＤａから１６０ｋＤａ、分子量で９０ｋＤａから１１０ｋＤａ、分子量で９０ｋＤａから１２０ｋＤａ、分子量で９０ｋＤａから１３０ｋＤａ、分子量で９０ｋＤａから１４０ｋＤａ、分子量で９０ｋＤａから１５０ｋＤａ、分子量で９０ｋＤａから１６０ｋＤａ、分子量で１００ｋＤａから１２０ｋＤａ、分子量で１００ｋＤａから１３０ｋＤａ、分子量で１００ｋＤａから１４０ｋＤａ、分子量で１００ｋＤａから１５０ｋＤａ、分子量で１００ｋＤａから１６０ｋＤａのサイズ範囲、および類似の所望の分子量範囲を含む。
【００６７】
上記で論じたように、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の被膜多糖の分子量は、免疫原性組成物における使用のための考慮事項である。例えば、高分子量の被膜多糖は、抗原表面上に存在するエピトープの価数が高いことに起因して、特定の抗体免疫応答を誘発し得る場合がある。本発明の１つの実施形態において、分子量が約２０ｋＤａから約１０００ｋＤａにわたる８型高分子量莢膜多糖の単離および精製が検討される。本発明の１つの実施形態において、分子量が約５０ｋＤａから約７００ｋＤａにわたる８型高分子量莢膜多糖の単離および精製が検討される。本発明の１つの実施形態において、分子量が５０ｋＤａから３００ｋＤａにわたる８型高分子量莢膜多糖の単離および精製が検討される。１つの実施形態において、分子量が７０から３００ｋＤａにわたる８型高分子量莢膜多糖の単離および精製が検討される。１つの実施形態において、分子量が９０ｋＤａから２５０ｋＤａにわたる８型高分子量莢膜多糖の単離および精製が検討される。１つの実施形態において、分子量が９０ｋＤａから１５０ｋＤａにわたる８型高分子量莢膜多糖の単離および精製が検討される。１つの実施形態において、分子量が９０ｋＤａから１２０ｋＤａにわたる８型高分子量莢膜多糖の単離および精製が検討される。１つの実施形態において、分子量が８０ｋＤａから１２０ｋＤａにわたる８型高分子量莢膜多糖の単離および精製が検討される。本発明の方法によって単離および精製され得る、他の範囲の高分子量血清型８莢膜多糖は、分子量で約７０ｋＤａから約１００ｋＤａ、分子量で７０ｋＤａから１１０ｋＤａ、分子量で７０ｋＤａから１２０ｋＤａ、分子量で７０ｋＤａから１３０ｋＤａ、分子量で７０ｋＤａから１４０ｋＤａ、分子量で７０ｋＤａから１５０ｋＤａ、分子量で７０ｋＤａから１６０ｋＤａ、分子量で８０ｋＤａから１１０ｋＤａ、分子量で８０ｋＤａから１２０ｋＤａ、分子量で８０ｋＤａから１３０ｋＤａ、分子量で８０ｋＤａから１４０ｋＤａ、分子量で８０ｋＤａから１５０ｋＤａ、分子量で８０ｋＤａから１６０ｋＤａ、分子量で９０ｋＤａから１１０ｋＤａ、分子量で９０ｋＤａから１２０ｋＤａ、分子量で９０ｋＤａから１３０ｋＤａ、分子量で９０ｋＤａから１４０ｋＤａ、分子量で９０ｋＤａから１５０ｋＤａ、分子量で９０ｋＤａから１６０ｋＤａ、分子量で１００ｋＤａから１２０ｋＤａ、分子量で１００ｋＤａから１３０ｋＤａ、分子量で１００ｋＤａから１４０ｋＤａ、分子量で１００ｋＤａから１５０ｋＤａ、分子量で１００ｋＤａから１６０ｋＤａのサイズ範囲、および類似の所望の分子量範囲を含む。
【００６８】
免疫原性組成物に対する「免疫応答」は、対象における、目的の組成物内に存在する分子（例えば、タンパク質または多糖などの抗原）に対する液性免疫応答および／または細胞介在性免疫応答の発達である。本発明の目的では、「液性免疫応答」は、抗体介在性の免疫応答であり、本発明の免疫原性組成物内に存在する抗原に対する親和性を有する抗体の生成を伴うが、「細胞介在性免疫応答」は、Ｔリンパ球および／または他の白血球によって仲介されるものである。「細胞介在性免疫応答」は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）のクラスＩ分子またはクラスＩＩ分子に伴う抗原エピトープの提示によって誘導される。これは、抗原特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞またはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（「ＣＴＬ」）を活性化する。ＣＴＬは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）またはＣＤ１によってコードされるタンパク質に伴って提示され、細胞の表面上に発現する、ペプチド抗原または脂質抗原に対する特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の細胞内破壊の誘発および促進、またはこのような微生物に感染した細胞の溶解を促す。細胞性免疫の別の態様は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答を伴う。ヘルパーＴ細胞は、古典的ＭＨＣ分子または非古典的ＭＨＣ分子に伴うペプチド抗原を表面上に提示している細胞に対する非特異的エフェクター細胞の機能の刺激に役立つように作用し、該エフェクター細胞の活性に焦点を置くものである。「細胞介在性免疫応答」はまた、サイトカイン、ケモカイン、ならびに、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するものを含む活性化されたＴ細胞および／または他の白血球によって生産される他のこのような分子の生産を言う。特定の抗原または組成物の、細胞介在性の免疫学的性応答を刺激する能力は、多くのアッセイによって、例えば、リンパ増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞傷害性細胞アッセイによって、感作された対象における抗原に特異的なＴリンパ球についてのアッセイによって、または抗原での再刺激に応じたＴ細胞によるサイトカイン生産の測定によって、決定され得る。このようなアッセイは、当技術分野において周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：４１８９〜４１９９；Ｄｏｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：２３６９〜２３７６を参照されたい。
【００６９】
「免疫原性」という用語は、抗原またはワクチンの、液性または細胞介在性または両方の免疫応答を誘導する能力を言う。
【００７０】
それぞれ本明細書においてほぼ同じ意味で用いられる「免疫原性量」または「免疫学的に効果的な量」または「用量」は、全体として、当業者に知られている標準的なアッセイによって測定されるように、細胞性（Ｔ細胞）応答または液性（Ｂ細胞または抗体）応答または両方の免疫応答を誘導するために十分な抗原または免疫原性組成物の量を言う。
【００７１】
組成物内の特定のコンジュゲートの量は、通常、そのコンジュゲートについてコンジュゲートしているおよびコンジュゲートしていない全多糖に基づいて計算される。例えば、２０％の遊離多糖を有するＣＰ５コンジュゲートは、１００ｍｃｇのＣＰ５多糖用量中に、約８０ｍｃｇのコンジュゲートしたＣＰ５多糖および約２０ｍｃｇのコンジュゲートしていないＣＰ５多糖を有することになる。コンジュゲートに対するタンパク質の寄与は、コンジュゲートの用量を計算する場合には通常は考慮されない。コンジュゲートの量は、ブドウ球菌の血清型に応じて変化し得る。通常、各用量は、０．０１から１００ｍｃｇ、特徴的には０．１から１０ｍｃｇ、さらに特徴的には１から１０ｍｃｇの多糖を含む。免疫原性組成物内の異なる多糖成分の「免疫原性量」は相違し得、それぞれ、０．０１ｍｃｇ、０．１ｍｃｇ、０．２５ｍｃｇ、０．５ｍｃｇ、１ｍｃｇ、２ｍｃｇ、３ｍｃｇ、４ｍｃｇ、５ｍｃｇ、６ｍｃｇ、７ｍｃｇ、８ｍｃｇ、９ｍｃｇ、１０ｍｃｇ、１５ｍｃｇ、２０ｍｃｇ、３０ｍｃｇ、４０ｍｃｇ、５０ｍｃｇ、６０ｍｃｇ、７０ｍｃｇ、８０ｍｃｇ、９０ｍｃｇ、または約１００ｍｃｇのあらゆる特定の多糖抗原を含み得る。
【００７２】
別の実施形態において、免疫原性組成物内の「免疫原性量」のタンパク質成分は、約１０ｍｃｇから約３００ｍｃｇの各タンパク質抗原にわたり得る。特定の実施形態において、免疫原性組成物内の「免疫原性量」のタンパク質成分は、約２０ｍｃｇから約２００ｍｃｇの各タンパク質抗原にわたり得る。免疫原性組成物内の異なるタンパク質成分の「免疫原性量」は相違し得、それぞれ、１０ｍｃｇ、２０ｍｃｇ、３０ｍｃｇ、４０ｍｃｇ、５０ｍｃｇ、６０ｍｃｇ、７０ｍｃｇ、８０ｍｃｇ、９０ｍｃｇ、１００ｍｃｇ、１２５ｍｃｇ、１５０ｍｃｇ、１７５ｍｃｇ、または約２００ｍｃｇのあらゆる特定のタンパク質抗原を含む。
【００７３】
免疫原としての抗原の有効性は、免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、機能的抗体アッセイ、例えばインビトロでのオプソニンアッセイ、および当技術分野において知られている多くの他のアッセイを用いて血清中の抗原に特異的な循環抗体のレベルを測定することによってＢ細胞活性のレベルを測定することによって測定することができる。Ｔ細胞免疫原としての抗原の有効性の別の尺度は、増殖アッセイによって、または、細胞溶解アッセイ、例えば、特異的標的細胞を溶解するＴ細胞の能力を測定するためのクロム放出アッセイによって、測定することができる。さらに、本発明において、「免疫原性量」はまた、本明細書において記載されるように、抗原投与後に誘発される抗原特異的抗体の血清レベルを測定することによって、またはそのように誘発された抗体の、特定の白血球のオプソニン性貪食能力を増強させる能力を測定することによって、規定され得る。免疫応答の防御レベルは、注射されている抗原で、免疫化された宿主をチャレンジすることによって測定することができる。例えば、免疫応答が望まれる対象である抗原が細菌である場合、「免疫原性量」の抗原によって誘発される防御レベルは、細菌細胞で動物をチャレンジした後の生存率のパーセンテージまたは死亡率のパーセンテージを検出することによって測定することができる。１つの実施形態において、防御の量は、細菌感染に関連する少なくとも１つの症候、例えば、感染に関連する発熱を測定することによって測定され得る。多抗原または多成分のワクチンまたは免疫原性組成物における各抗原の量は、他の成分に応じて変化し、当業者に知られている方法によって決定することができる。このような方法には、例えば、免疫原性および／またはインビボでの効力を測定するための手順が含まれる。
【００７４】
「免疫原性組成物」という用語は、抗原、例えば微生物、またはその成分を含有するあらゆる医薬組成物に関するものであり、該組成物は、対象において免疫応答を誘導するために用いられ得る。本発明の免疫原性組成物は、全身的な経皮経路または粘膜経路を介して免疫原性組成物を投与することによって、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染しやすいヒトを治療するために用いることができる。これらの投与には、筋肉内（ｉ．ｍ．）経路、腹腔内（ｉ．ｐ．）経路、皮内（ｉ．ｄ．）経路、もしくは皮下経路を介する注射、パッチもしくは他の経皮送達装置による塗布、または経口／消化管、気管、もしくは尿生殖路への粘膜投与を介するものが含まれ得る。１つの実施形態において、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の鼻咽頭保菌を治療または予防するために鼻腔内投与が用いられ、したがって、その最も早い段階で感染が弱められる。１つの実施形態において、免疫原性組成物は、ワクチンの製造において、または動物を受動的に防御もしくは治療するために用いられ得るポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体の誘導において用いられ得る。
【００７５】
特定の免疫原性組成物にとっての最適な成分量は、対象における適切な免疫応答の観察を伴う標準的な研究によって確定することができる。初回ワクチン接種の後、対象に、適切に間隔をあけた１回または数回のブースター免疫化を行うことができる。
【００７６】
本発明の１つの実施形態において、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の免疫原性組成物は、組換え黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）断片（Ｎ１Ｎ２Ｎ３またはその組み合わせ）、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートした単離された莢膜多糖５型、およびＣＲＭ１９７にコンジュゲートした単離された莢膜多糖８型を含む。別の実施形態において、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の免疫原性組成物は、組換え黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子（ＣｌｆＡ）断片（Ｎ１Ｎ２Ｎ３またはその組み合わせ）、組換え黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）断片（Ｎ１Ｎ２Ｎ３またはその組み合わせ）、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートした単離された莢膜多糖５型、およびＣＲＭ１９７にコンジュゲートした単離された莢膜多糖８型の無菌製剤（液体製剤、凍結乾燥製剤、ＤＮＡワクチン、皮内調製物）である。本発明の１つの実施形態において、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の免疫原性組成物は、組換え黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）断片（Ｎ１Ｎ２Ｎ３またはその組み合わせ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）鉄結合タンパク質ＭｎｔＣ、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートした単離された莢膜多糖５型、およびＣＲＭ１９７にコンジュゲートした単離された莢膜多糖８型を含む。１つの実施形態において、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の免疫原性組成物は、組換え黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子（ＣｌｆＡ）断片（Ｎ１Ｎ２Ｎ３またはその組み合わせ）、組換え黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）断片（Ｎ１Ｎ２Ｎ３またはその組み合わせ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）鉄結合タンパク質ＭｎｔＣ、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートした単離された莢膜多糖５型、およびＣＲＭ１９７にコンジュゲートした単離された莢膜多糖８型の無菌製剤（液体製剤、凍結乾燥製剤、ＤＮＡワクチン、皮内調製物）である。本発明の１つの実施形態において、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の免疫原性組成物は、組換え黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）断片（Ｎ１Ｎ２Ｎ３またはその組み合わせ）、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートした単離された莢膜多糖５型、およびＣＲＭ１９７にコンジュゲートした単離された莢膜多糖８型を含む。本発明の１つの実施形態において、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の免疫原性組成物は、組換え黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）断片（Ｎ１Ｎ２Ｎ３またはその組み合わせ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）鉄結合タンパク質ＭｎｔＣ、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートした単離された莢膜多糖５型、およびＣＲＭ１９７にコンジュゲートした単離された莢膜多糖８型を含む。本発明の１つの実施形態において、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の免疫原性組成物は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）鉄結合タンパク質ＭｎｔＣ、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートした単離された莢膜多糖５型、およびＣＲＭ１９７にコンジュゲートした単離された莢膜多糖８型を含む。
【００７７】
本発明の免疫原性組成物はさらに、免疫系を混乱させるかまたは改変する作用物質である、１つまたは複数のさらなる「免疫調節物質」を含み得、その結果、液性免疫および／または細胞介在性免疫の上方調節または下方調節が観察される。１つの特定の実施形態において、免疫系の液性部門および／または細胞介在性部門の上方調節が好ましい。特定の免疫調節物質の例には、例えば、アジュバントまたはサイトカイン、または、とりわけ米国特許第５，２５４，３３９号において記載されている、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（ＣＳＬ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）が含まれる。本発明のワクチンにおいて用いられ得るアジュバントの非限定的な例には、ＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ  Ｉｎｃ．、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍｏｎｔ．）、アルム、水酸化アルミニウムゲルなどの無機ゲル、水中油型エマルジョン、例えば完全フロイントアジュバントおよび不完全フロイントアジュバントなどの油中水型エマルジョン、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ、Ａｔｌａｎｔａ  Ｇａ．）、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｍａｓｓ．）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ  Ｃａｌｉｆ．）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバント、サポニン、Ｑｕｉｌ  Ａまたは他のサポニン画分、モノホスホリル脂質Ａ、ならびにアブリジン脂質−アミンアジュバントが含まれる。本発明のワクチンにおいて有用な水中油型エマルジョンの非限定的な例には、修飾型ＳＥＡＭ６２製剤およびＳＥＡＭ１／２製剤が含まれる。修飾型ＳＥＡＭ６２は、５％（ｖ／ｖ）スクアレン（Ｓｉｇｍａ）、１％（ｖ／ｖ）ＳＰＡＮ（登録商標）８５洗浄剤（ＩＣＩ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）、０．７％（ｖ／ｖ）ポリソルベート（登録商標）８０洗浄剤（ＩＣＩ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）、２．５％（ｖ／ｖ）エタノール、２００μｇ／ｍｌのＱｕｉｌ  Ａ、１００μｇ／ｍｌのコレステロール、および０．５％（ｖ／ｖ）レシチンを含有する水中油型エマルジョンである。修飾型ＳＥＡＭ１／２は、５％（ｖ／ｖ）スクアレン、１％（ｖ／ｖ）ＳＰＡＮ（登録商標）８５洗浄剤、０．７％（ｖ／ｖ） ポリソルベート８０洗浄剤、２．５%（ｖ/ｖ）エタノール、１００μｇ／ｍｌのＱｕｉｌ  Ａ、および５０μｇ／ｍｌのコレステロールを含む水中油型エマルジョンである。ワクチン内に含まれ得る他の「免疫調節物質」には、例えば、１つまたは複数のインターロイキン、インターフェロン、または他の既知のサイトカインもしくはケモカインが含まれる。１つの実施形態において、アジュバントは、例えばそれぞれ米国特許第６，１６５，９９５号および米国特許第６，６１０，３１０号において記載されているような、シクロデキストリン誘導体またはポリアニオンポリマーであり得る。用いるべき免疫調節物質および／またはアジュバントは、ワクチンまたは免疫原性組成物を投与する対象、注射経路、および行う注射の数に応じることを理解されたい。
【００７８】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の「侵襲性疾患」は、疾患の関連する臨床的兆候／症候が存在する、通常は無菌の部位からの、細菌の単離である。通常は無菌の身体部位には、血液、ＣＳＦ、胸水、心膜液、腹水、関節液／滑液、骨、体内部位（リンパ節、脳、心臓、肝臓、脾臓、ガラス体液、腎臓、膵臓、卵巣）、または他の通常は無菌の部位が含まれる。侵襲的疾患を特徴付けする臨床的症状には、菌血症、肺炎、蜂巣炎、骨髄炎、心内膜炎、敗血症性ショックなどが含まれる。
【００７９】
「単離された」という用語は、物質がその元の環境（例えば、それが天然のものである場合には天然環境、または、それが組換え体である場合もしくは１つの環境から異なる環境へ移された場合にはその宿主生物）から取り出されたことを意味する。例えば、「単離された」被膜多糖、タンパク質、またはペプチドは、そのタンパク質の由来源である細胞もしくは組織の細胞物質もしくは他の汚染タンパク質を実質的に有さないか、または化学的に合成された場合には化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に有さないか、さもなければ、化学反応の一環として混合物内に存在する。本発明において、タンパク質または多糖は、免疫原性組成物の製造において有用な形態で提供されるように、細菌細胞または細胞残屑から単離され得る。「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」または「単離する（ｉｓｏｌａｔｉｎｇ）」という用語には、例えば、本明細書において記載されるような、タンパク質または莢膜多糖の精製方法を含む、精製工程または精製が含まれ得る。「細胞物質を実質的に有さない」という表現は、ポリペプチド／タンパク質が、それが単離されるかまたは組換えによって生産される元である細胞の細胞成分から分離されている、ポリペプチド／タンパク質の調製物を含む。したがって、細胞物質を実質的に有さない被膜多糖、タンパク質、またはペプチドには、約３０％、２０％、１０％、５％、２．５％、または１％（乾燥重量で）未満の汚染タンパク質または多糖または他の細胞物質を有する、被膜多糖、タンパク質、またはペプチドの調製物が含まれる。ポリペプチド／タンパク質が組換えによって生産される場合には、これはまた好ましくは培地を実質的に有さず、すなわち、培地がタンパク質調製物の容積の約２０％、１０％、または５％未満に相当する。ポリペプチド／タンパク質または多糖が化学合成によって生産される場合には、これは好ましくは化学的前駆体または他の化学物質を実質的に有さず、すなわち、これは、化学的前駆体、またはタンパク質もしくは多糖の合成に関与する他の化学物質から分離されている。したがって、ポリペプチド／タンパク質または多糖のこのような調製物は、約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量で）未満の、目的のポリペプチド／タンパク質または多糖の断片以外の化学的前駆体または化合物を有する。
【００８０】
「非保存的なアミノ酸置換」は、上記に定義される特徴を用いる、タンパク質のアミノ酸残基の１つまたは複数の、類似していない物理的特性および／または化学的特性を有する他のアミノ酸残基での置換を言う。
【００８１】
「薬学的に許容できる担体」という用語は、連邦政府の管理機関、州政府、もしくは他の管理機関によって認可されている担体、または米国薬局方もしくは他の一般に認められている薬局方において、ヒトおよびヒトではない哺乳動物を含む動物における使用について列挙されている担体を意味する。「担体」という用語は、医薬組成物と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または媒体を言う。このような薬学的担体は、水および油などの無菌液体であり得、油には、石油、動物、植物、または合成由来のものが含まれる。水、生理食塩水および水性デキストロース、ならびにグリセロール溶液を、液体担体として採用することができ、特に注射用溶液のための液体担体として採用することができる。適切な薬学的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。組成物はまた、所望であれば、微量の湿潤剤、充填剤、乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有し得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、持続放出製剤などの形態を取り得る。適切な薬学的担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」において記載されている。製剤は、投与態様に適しているべきである。
【００８２】
「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを言い、最短の生成物に限定されるわけではない。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体などが、定義に含まれる。完全長タンパク質およびその断片の両方が定義に包含される。この用語はまた、天然配列に対する欠失、付加、および置換などの修飾（通常は天然に保存的であるが、非保存的であり得る）、好ましくは、タンパク質が、そのタンパク質が投与される動物内で免疫学的応答を誘導する能力を維持するような修飾を含む。また、発現後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、脂質化、リン酸化なども含まれる。
【００８３】
「防御的」免疫応答は、免疫原性組成物の、感染から対象を防御するために役立つ、液性または細胞介在性の免疫応答を誘導する能力を言う。もたらされる防御は完全なものである必要はなく、すなわち、対象の対照集団、例えばワクチンまたは免疫原性組成物を投与されていない感染動物と比較して、統計的に有意な改善があれば、感染は完全に予防または根絶される必要はない。防御は、感染の症候の発生の重症度または迅速性の軽減に限定されない場合がある。通常、「防御免疫応答」は、対象の少なくとも５０％における、各抗原に対するある程度のレベルの測定可能な機能的抗体応答を含む、特定の抗原に特異的な抗体レベルの増大の誘発を含む。特定の状況において、「防御免疫応答」は、対象の少なくとも５０％における、各抗原に対するある程度のレベルの測定可能な機能的抗体応答を含む、特定の抗原に特異的な抗体レベルの２倍の増大または抗体レベルの４倍の増大を誘発することを含み得る。特定の実施形態において、オプソニン化抗体は、防御免疫応答と相関する。したがって、防御免疫応答は、例えば以下に記載されるようなオプソニン性貪食アッセイにおける細菌数の減少のパーセンテージを測定することによってアッセイすることができる。好ましくは、細菌数は、少なくとも１０％、２５％、５０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上減少する。
【００８４】
本明細書において用いられる「組換え」という用語は、単に、遺伝子操作方法によって生産されるあらゆるタンパク質、ポリペプチド、または目的の遺伝子を発現する細胞について言う。タンパク質またはポリペプチドに関して用いられる「組換え」という用語は、組換えポリヌクレオチドの発現によって生産されるポリペプチドを意味する。本発明の免疫原性組成物において用いられるタンパク質は、天然源から単離され得るか、または例えば組換えＣｌｆＡ、組換えＣｌｆＢ、もしくは組換えＭｎｔＣなどのように、遺伝子操作方法によって生産され得る。本明細書において用いられる「組換え」はさらに、核酸分子の由来源または操作に起因して、それが天然で伴うポリヌクレオチドの全てまたは一部を伴わない核酸分子を説明するものである。宿主細胞に関して用いられる「組換え」という用語は、組換えポリヌクレオチドが導入されている宿主細胞を意味する。
【００８５】
本明細書において用いられる組換えＣｌｆＡ（ｒＣｌｆＡ）および組換えＣｌｆＢ（ｒＣｌｆＢ）は、本発明の免疫原性組成物において用いるためのＣｌｆＡまたはＣｌｆＢの形態を言う。１つの実施形態において、ｒＣｌｆＡは、Ｎドメインの１つまたは複数、例えばＮ１Ｎ２Ｎ３、Ｎ２Ｎ３、Ｎ２、またはＮ３を含む、ＣｌｆＡの断片であり、本明細書において「組換えＣｌｆＡ」または「ｒＣｌｆＡ」と呼ばれる。１つの実施形態において、ｒＣｌｆＢは、ＣｌｆＢのＮドメインの１つまたは複数、例えばＮ１Ｎ２Ｎ３、Ｎ２Ｎ３、Ｎ２、またはＮ３を含む、ＣｌｆＢの断片であり、本明細書において「組換えＣｌｆＢ」または「ｒＣｌｆＢ」と呼ばれる。
【００８６】
「対象」という用語は、哺乳動物、鳥、魚、爬虫類動物、またはあらゆる他の動物を言う。「対象」という用語にはまた、ヒトも含まれる。「対象」という用語にはまた、ペットも含まれる。ペットの非限定的な例には、犬、猫、豚、ウサギ、ラット、マウス、スナネズミ、ハムスター、モルモット、フェレット、鳥、ヘビ、トカゲ、魚、カメ、およびカエルが含まれる。「対象」という用語にはまた、家畜動物が含まれる。家畜動物の非限定的な例には、アルパカ、バイソン、ラクダ、牛、鹿、豚、馬、ラマ、ラバ、ロバ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、トナカイ、ヤク、ニワトリ、ガチョウ、および七面鳥が含まれる。
【００８７】
本明細書において用いられる場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（その変型、例えば「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療される（ｔｒｅａｔｅｄ）」を含む）は、（ｉ）従来のワクチンにおけるような、感染または再感染の予防、（ｉｉ）症候の重症度または除去の低減、および（ｉｉｉ）問題の病原体または障害の実質的なまたは完全な除去のいずれか１つまたは複数を言う。したがって、治療は、予防的に（感染の前に）または治療的に（感染の後に）達成され得る。本発明において、予防的治療または治療的治療が用いられ得る。本発明の特定の実施形態に従うと、微生物感染（例えば、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種などの細菌）に対して宿主動物を治療する組成物および方法が提供され、該治療は、予防的および／または治療的な免疫化を含む。本発明の方法は、予防的免疫および／または治療的免疫を対象にもたらすために有用である。本発明の方法はまた、生物医学的な調査の用途で、対象に対して実施され得る。
【００８８】
「ワクチン」または「ワクチン組成物」という用語は、ほぼ同じ意味で用いられるものであり、動物における免疫応答を誘発する少なくとも１つの免疫原性組成物を含む医薬組成物を言う。
【００８９】
概要
本発明は、ブドウ球菌生物、例えば黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）から得られる少なくとも３つの抗原を含む免疫原性組成物に関する。抗原は、生化学的単離手順を用いて生物から単離され得るか、または、合成もしくは組換え手段によって生産され得る。抗原は、ポリペプチドまたは多糖またはそれらの組み合わせであり得る。これらの免疫原性組成物は、ブドウ球菌生物によって生じる感染に対して対象を免疫化するためのワクチンの製造において用いることができる。これらの組成物における使用に適した成分は、以下でさらに詳細に記載される。
【００９０】
ブドウ球菌免疫原性組成物
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、表在性の皮膚感染から、肺炎、敗血症、および心内膜炎などの生命に関わる症状にわたる、広範なヒト疾患の原因物質である。Ｌｏｗｙ  Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３９：５８０〜５３２（１９９８）を参照されたい。侵襲性の疾患のケースでは、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、血液、脳脊髄液ＣＳＦ、胸水、心膜液、腹水、関節液／滑液、骨、体内部位（リンパ節、脳、心臓、肝臓、脾臓、ガラス体液、腎臓、膵臓、卵巣）、または他の通常は無菌の部位を含む、通常は無菌の身体部位から単離され得る。これは、菌血症、肺炎、蜂巣炎、骨髄炎、心内膜炎、および敗血症性ショックなどの生命に関わる臨床的症状をもたらし得る。成人、高齢者、および小児の患者が、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の感染について最もリスクがある。
【００９１】
本発明の実施形態は、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）ポリペプチド、担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖５型、担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖８型、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）、および組換え黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣタンパク質を含む、免疫原性組成物内の選択された抗原を記載する。次に、抗原は、一連の組み合わせとして免疫原性組成物内において特徴付けされ、具体的な組み合わせが、免疫原性組成物のための個別の成分を用いて生じるものよりも優れている可能性がある免疫応答をもたらすことを実証した。したがって、１つの組み合わせは、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）ポリペプチド、担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖５型、および担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖８型を含む免疫原性組成物を提供する。第２の組み合わせは、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）ポリペプチド、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）、担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖５型、および担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖８型を含む免疫原性組成物を提供する。第３の組み合わせは、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）ポリペプチド、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）ポリペプチド、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣタンパク質、担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖５型、および担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖８型を含む免疫原性組成物を提供する。第４の組み合わせは、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）ポリペプチド、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣタンパク質、担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖５型、および担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖８型を含む免疫原性組成物を提供する。第５の組み合わせは、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）ポリペプチド、担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖５型、および担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖８型を含む免疫原性組成物を提供する。第６の組み合わせは、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）ポリペプチド、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣタンパク質、担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖５型、および担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖８型を含む免疫原性組成物を提供する。第７の組み合わせは、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣタンパク質、担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖５型、および担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖８型を含む免疫原性組成物を提供する。第８の組み合わせは、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）ポリペプチド、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）ポリペプチド、および単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣタンパク質を含む免疫原性組成物を提供する。いくつかの実施形態において、上記の組み合わせはさらに、ＥｋｅＳ、ＤｓｑＡ、ＫｅｓＫ、ＫｒｋＮ、ＫｒｋＮ２、ＲｋａＳ、ＲｒｋＮ、ＫｎｋＡ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、Ｏｐｐ３ａ、ＤｌｔＤ、ＨｔｓＡ、ＬｔａＳ、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＳｄｒＦ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、ＳｒｔＡ、ＳｐＡ、Ｓｂｉ溶血素（ｈｌａ）、β溶血素、フィブロネクチン結合タンパク質Ａ（ｆｎｂＡ）、フィブロネクチン結合タンパク質Ｂ（ｆｎｂＢ）、コアグラーゼ、Ｆｉｇ、ｍａｐ、パントン・バレンタイン型ロイコシジン（ｐｖｌ）、α毒素およびその変型、γ毒素（ｈｌｇ）および変型、ｉｃａ、免疫優性ＡＢＣ輸送体、Ｍｇ２＋輸送体、Ｎｉ  ＡＢＣ輸送体、ＲＡＰ、自己溶解酵素、ラミニン受容体、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ＩｓａＢ／ＰｉｓＢ、ＳＰＯＩＩＩＥ、ＳｓａＡ、ＥｂｐＳ、Ｓａｓ  Ａ、ＳａｓＦ、ＳａｓＨ、ＥＦＢ（ＦＩＢ）、ＳＢＩ、Ｎｐａｓｅ、ＥＢＰ、骨シアロ結合タンパク質ＩＩ、アウレオリシン前駆体（ＡＵＲ）／Ｓｅｐｐ１、Ｃｎａ、ならびにそれらの断片、例えば、Ｍ５５、ＴＳＳＴ−１、ｍｅｃＡ、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＰＮＡＧ／ｄＰＮＡＧ）エキソ多糖、ＧｅｈＤ、ＥｂｈＡ、ＥｂｈＢ、ＳＳＰ−１、ＳＳＰ−２、ＨＢＰ、ビトロネクチン結合タンパク質、ＨａｒＡ、ＥｓｘＡ、ＥｓｘＢ、エンテロトキシンＡ、エンテロトキシンＢ、エンテロトキシンＣ１、および新規な自己溶解酵素という抗原の少なくとも１つを含む。
【００９２】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の発生の疫学的研究は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の進化が天然ではクローン性であり、成功裏の遺伝子型を獲得した単一のクローンが迅速に拡大し、感染の多くを引き起こしたことを示す。したがって、進化はクローン性であると考えられる。細菌のゲノムは、より広くより安定した種の核ゲノムと、より多様なアクセサリー遺伝子の組とからなる。Ｆｅｉｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２：４８３〜４９５（２００４）を参照されたい。核遺伝子は、その種の全てのクローン内に遍在し、アクセサリー遺伝子は、あらゆる所与のクローン内に必ずしも存在するわけではない。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を考慮すると、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ゲノムの９０％超に相当するＤＮＡマイクロアレイを用いる１つの研究によって、ゲノム内の遺伝子の７８％が全ての黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）において共通であり、したがって「種の核」に相当し、残りの２２％が「アクセサリー遺伝子」であることが見出された。アクセサリー遺伝子は、不可欠でない遺伝物質を含み、該遺伝物質のほとんどは、病原性因子、抗生物質耐性を仲介するタンパク質、および特定の宿主環境との相互作用に特異的なタンパク質をコードする遺伝子をコードする。Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄら、ＰＮＡＳ  ９８：８８２１〜８８２６（２００１）；Ｆｅｉｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ：  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２：４８３〜４９５（２００４）を参照されたい。通常、核遺伝子は、よりゆっくりと進化し、アクセサリー遺伝子は多型性である。Ｋｕｈｎら、Ｊ．Ｂａｃｔ．１８８：１６９〜１７８（２００６）を参照されたい。したがって、適切に選択された核遺伝子は、感染を予防するための免疫原性組成物において用いるための、より良好な標的抗原を提供する。
【００９３】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の疾患原因単離体またはクローン型から得られる、表面に発現した抗原は、免疫および機能的抗体を誘発し得る抗原の由来源を提供する。高分子レベル（アミノ酸配列または多糖配列）では、ワクチン標的の抗原的変型を有し得る株に対する抗体の広範な交差反応性を可能にするために、異なる疾患単離体により発現される抗原の保存された形態が選択され得る。
【００９４】
本明細書において記載される多抗原免疫原性組成物において抗原を誘発するための１つの重要な考慮事項は、抗原が、免疫原性組成物として投与された場合に、細菌感染の１つまたは複数の動物モデルにおいて防御を提供することによって実証される効力を有するかどうかである。様々な黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）疾患には、多くの動物モデルが存在する。これらのモデルのそれぞれは、長所および短所を有する。
【００９５】
ヒトによる細菌感染のクリアランスは、貪食細胞の取り込み後に仲介されるオプソニン性死滅を介して進行し得る。肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖および黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖などのグラム陽性多糖抗原を用いる研究から得られる、これについての多くの有力な例がある。Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏ．２９：３３３〜３４９（２００３）を参照されたい。グラム陽性タンパク質抗原によって誘発されるオプソニン活性についてはあまり証拠がない。貪食細胞による取り込みは観察されているが、直接的な死滅は実証することが難しい。タンパク質に対するモノクローナル抗体は、感染の動物モデルにおいて黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）チャレンジに対する防御をもたらすことが示されており、オプソニン性貪食性死滅以外のメカニズムは、観察される防御を説明し得る。
【００９６】
オプソニン性貪食活性（ＯＰＡ）などの測定可能な機能的活性を有する抗体の誘発は、特定の抗原が本発明の免疫原性組成物内への内包に有用であるかどうかの１つの指標である。他の指標には、限定はしないが、抗原特異的抗体を用いて測定される、インビボでの発現の際の細胞表面上での抗原の発現、または、抗体の、抗原機能を阻害／中和する能力が含まれる。
【００９７】
種／株
あらゆる特定の院内株または疾患株が、由来源、クローンの関連性を決定するため、および発生の疫学をモニタリングするために有用である。多くの方法が、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株の分類に利用可能である。細菌種の従来の実用的な定義は、７０％を超えるゲノムハイブリダイゼーション（ＤＤＨのＤＮＡ−ＤＮＡゲノムハイブリダイゼーション）および９７％を超える１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子配列同一性によって特徴付けされる、株の１群である。Ｖａｎｄａｍｍｅら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６０：４０７〜４３８（１９９６）を参照されたい。バクテリオファージ分類（ＢＴ）は、特定のファージ型による溶解に対する感受性に基づいて黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株を分類する方法である。Ｂｌａｉｒら、Ｂｕｌｌ．Ｗ．Ｈ．Ｏ．２４：７７１〜７８４（１９６１）を参照されたい。この古い方法は、実験室間での再現性を欠き、単離体の１５〜２０％を分類できない。
【００９８】
単一抗原免疫原性組成物と多抗原免疫原性組成物
主要な黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株の感染に対して防御するための最適な免疫原性組成物が単一成分から構成されるべきかまたは多成分から構成されるべきかということについて、問題が生じる。多数の研究によって、単一のタンパク質成分または炭水化物成分に基づく免疫原性組成物が、特定の動物モデルにおいて、その成分を発現する黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株でのチャレンジからのある程度の防御をもたらし得ることが示されている。重要なことに、単一抗原からの防御が、選択される株に依存し得ることも実証されている。
【００９９】
アドヘシンなどの表面タンパク質は、単一成分ワクチンとして研究されている。例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＣｌｆＡで免疫化されたマウスは、対照タンパク質で免疫化されたマウスよりも、発症した関節炎が重症ではなかった。Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８４：１５７２〜１５８０（２００１）を参照されたい。コラーゲン結合アドヘシン（ｃｎａ）の断片は、マウス敗血症モデルにおいて防御をもたらした。Ｎｉｌｓｓｏｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０１：２６４０〜２６４９（１９９８）を参照されたい。ＣｌｆＢのＡドメインでマウスを免疫化すると、マウスモデルにおける鼻腔でのコロニー形成が低減し得た。Ｓｃｈａｆｆｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７４：２１４５〜２１５３（２００６）を参照されたい。
【０１００】
ＩｓｄＢとして知られている、１４個の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）鉄封鎖タンパク質のうちの１つが、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染からの防御のための一価免疫原性製剤において研究されている。このタンパク質は、マウスにおいて良好な防御効果を示しており、ヒトではない霊長類において良好な免疫原性を示している。Ｋｕｋｌｉｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７４：２２１５〜２２２３（２００６）を参照されたい。
【０１０１】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、同一のまたは類似の機能を行うために、異なるタンパク質を進化させるかまたは置換するという広大な能力を有するため、ほとんどの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）疾患からほとんどの人々を防御するための最適な免疫原性製剤は、適切に選択され免疫原性製剤内に存在する２つ以上（例えば、３つ、４つ、５つなど）の抗原を含む多抗原製剤である。特定の実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）ポリペプチド、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）ポリペプチド、担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖５型（ＣＰ５）、担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖８型（ＣＰ８）、および単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣタンパク質から選択される３つ以上の抗原を含む。特定の実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）ポリペプチド、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）ポリペプチド、担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖５型（ＣＰ５）、担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖８型（ＣＰ８）、および単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣタンパク質から選択される４つ以上の抗原を含む。特定の実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、抗原として、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）ポリペプチド、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）ポリペプチド、担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖５型（ＣＰ５）、担体タンパク質にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖８型（ＣＰ８）、および単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣタンパク質を含む。
【０１０２】
アジュバント
本明細書において記載される免疫原性組成物はまた、特定の実施形態において、１つまたは複数のアジュバントを含む。アジュバントは、免疫原または抗原と共に投与されると免疫応答を増強させる物質である。限定はしないがインターロイキン１−α、１−β、２、４、５、６、７、８、１０、１２（例えば、米国特許第５，７２３，１２７号を参照されたい）、１３、１４、１５、１６、１７、および１８（およびその突然変異形態）、インターフェロンα、β、およびγ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（例えば、米国特許第５，０７８，９９６号およびＡＴＣＣ受託番号３９９００を参照されたい）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ならびに腫瘍壊死因子αおよびβを含む、多くのサイトカインまたはリンホカインが、免疫調節活性を有し、したがってアジュバントとして有用であることが示されている。本明細書において記載される免疫原性組成物と共に有用であるさらに他のアジュバントには、限定はしないがＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、およびＲＡＮＴＥＳを含むケモカイン；セレクチン、例えばＬ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、およびＥ−セレクチンなどの接着分子；ムチン様分子、例えば、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、およびＭａｄＣＡＭ−１；ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、およびｐ１５０．９５などのインテグリンファミリーのメンバー；ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ（例えばＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、およびＩＣＡＭ−３）、ＣＤ２、およびＬＦＡ−３などの免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー；Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ４０、およびＣＤ４０Ｌなどの共刺激分子；血管成長因子、神経成長因子、線維芽細胞成長因子、上皮成長因子、ＰＤＧＦ、ＢＬ−１、および血管内皮成長因子を含む成長因子；Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、およびＤＲ６を含む受容体分子；ならびにカスパーゼ（ＩＣＥ）が含まれる。
【０１０３】
免疫応答を増強させるために用いられる適切なアジュバントにはさらに、限定はしないが、ＭＰＬ（商標）（３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ、Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）が含まれ、これは、米国特許第４，９１２，０９４号において記載されている。アジュバントとしての使用に同様に適しているものは、合成脂質Ａ類似体もしくはリン酸アミノアルキルグルコサミン化合物（ＡＧＰ）、またはその誘導体もしくは類似体であり、これは、Ｃｏｒｉｘａ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）から入手可能であり、米国特許第６，１１３，９１８号において記載されている。１つのこのようなＡＧＰは、２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル−２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−ｂ−Ｄ−グルコピラノシドであり、これはまた５２９としても知られている（以前はＲＣ５２９として知られていた）。この５２９アジュバントは、水性形態（ＡＦ）または安定なエマルジョン（ＳＥ）として製剤される。
【０１０４】
さらに他のアジュバントには、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルノルムラミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などのムラミルペプチド；ＭＦ５９（米国特許第６，２９９，８８４号）（Ｍｏｄｅｌ  １１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）などのマイクロフルイダイザーを用いてサブミクロン粒子内に製剤された、５％スクアレン、０．５％ポリソルベート８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５を含有する（様々な量のＭＴＰ−ＰＥを含有していてよい））およびＳＡＦ（サブミクロンエマルジョン内にマイクロ流体化されたか、またはより大きな粒子サイズのエマルジョンが生じるようにボルテックスされた、１０％スクアレン、０．４％ポリソルベート８０、５％プルロニックブロック型ポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有する）などの水中油型エマルジョン；不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなどのアルミニウム塩（アルム）；Ａｍｐｈｉｇｅｎ；アブリジン；Ｌ１２１／スクアレン；Ｄ−ラクチド−ポリラクチド／グリコシド；プルロニックポリオール；死滅ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）；米国特許第５，０５７，５４０号において記載されているＳｔｉｍｕｌｏｎ（商標）ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ．）、米国特許第５，２５４，３３９号において記載されているＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（ＣＳＬ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、および免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ）などのサポニン；結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）；細菌リポ多糖；ＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチドなどの合成ポリヌクレオチド（例えば、米国特許第６，２０７，６４６号）；欧州特許第１，２９６，７１３号および欧州特許第１，３２６，６３４号において記載されているＩＣ−３１（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌ  ＡＧ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）；百日咳毒素（ＰＴ）もしくはその突然変異体、コレラ毒素もしくはその突然変異体（例えば、米国特許第７，２８５，２８１号、米国特許第７，３３２，１７４号、米国特許第７，３６１，３５５号、および米国特許第７，３８４，６４０号）；または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素（ＬＴ）もしくはその突然変異体、特にＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２（例えば、米国特許第６，１４９，９１９号、米国特許第７，１１５，７３０号、および米国特許第７，２９１，５８８号）が含まれる。
【０１０５】
候補抗原：
ＣｌｆＡ：ドメインの構成
クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）は、フィブリノーゲン結合部位を介する宿主マトリクスタンパク質への結合に関連する、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の表面タンパク質である。ＣｌｆＡは、カルボキシル末端のＬＰＸＴＧ（配列番号１２５）モチーフを含有するタンパク質ファミリーのメンバーであり、該モチーフによって、該タンパク質が細胞表面に共有結合することが可能になる。ＣｌｆＡはまた、フィブリノーゲン（ＣｌｆＡによって結合される）、フィブロネクチン結合タンパク質（ＦｎｂＡおよびＦｎｂＢ）、コラーゲン結合タンパク質（Ｃｎａ）などの宿主タンパク質の結合に関連する、別のタンパク質ファミリー（微生物表面成分認識接着マトリクス分子、またはＭＳＣＲＡＭＭ）にも属する。これらのタンパク質は全て、細胞表面への輸送を仲介するアミノ末端シグナル配列を共有する。ＭＳＣＲＡＭＭはまた、リガンドの結合（例えば、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、ケラチン）のための活性部位を含有する機能的領域であるＡドメインを含む。Ａドメインの後には、セリンアスパラギン酸反復（ＳＤ反復）から構成される領域があり、これはペプチドグリカン層に広がると考えられる。ＳＤ反復の後には、ペプチドグリカンへのタンパク質の共有結合のためのＬＰＸＴＧ（配列番号１２５）モチーフを含む膜貫通領域がある。ＣｌｆＡは、米国特許第６，００８，３４１号において記載されている。
【０１０６】
ＡドメインのＮ１Ｎ２Ｎ３を含むＣｌｆＡのリガンド結合領域（図１）は、アミノ酸４０〜５５９に広がる。ＣｌｆＡのＮドメインは、以下のように割り当てられている：Ｎ１は残基４５〜２２０を包含し、Ｎ２は残基２２９〜３６９を包含し、Ｎ３は残基３７０〜５５９を包含する。Ｄｅｉｖａｎａｙａｇａｍら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２１：６６６０〜６６７２（２００２）を参照されたい。参照を容易にするため、Ｎ１Ｎ２Ｎ３ドメインはＮ１２３と呼ぶことができ、同様に、Ｎ２Ｎ３はＮ２３と呼ぶことができる。組換えＮ１Ｎ２Ｎ３の調製において、Ｎ１ドメインはプロテアーゼ感受性であることが明らかにされており、容易に切断または加水分解されて、安定なリガンド結合組換え断片としてＮ２Ｎ３を残す。Ｄｅｉｖａｎａｙａｇａｍら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２１：６６６０〜６６７２（２００２）を参照されたい。ＣｌｆＡのＡドメインのフィブリノーゲン結合Ｎ２Ｎ３断片の結晶構造によって、Ｎ２およびＮ３の両方が逆平行β鎖によって占められていることが明らかになった。逆平行β鎖に加え、Ｎ２ドメインは、１回転のαヘリックスおよび２つの３１０ヘリックスを含有し、Ｎ３ドメインは、３つの３１０ヘリックスを含有する。Ｄｅｉｖａｎａｙａｇａｍら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２１：６６６０〜６６７２（２００２）を参照されたい。Ｎ２およびＮ３の配列アラインメントにより、それらの全長にわたり１３％の配列同一性および３６％の配列類似性のみが明らかになる。Ｄｅｉｖａｎａｙａｇａｍら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２１：６６６０〜６６７２（２００２）を参照されたい。Ｎ２ドメインおよびＮ３ドメインのトポロジーは、従来のＩｇＧの折り畳みに類似しており、ＩｇＧの折り畳みの新たな変型であることが提案されている。Ｄｅｉｖａｎａｙａｇａｍら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２１：６６６０〜６６７２（２００２）を参照されたい。
【０１０７】
ＣｌｆＡの配列
ＣｌｆＡと呼ばれるクランピング因子タンパク質Ａの遺伝子はクローニングされており、配列決定されており、そして分子レベルで詳細に分析されている（ＭｃＤｅｖｉｔｔら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１：２３７〜２４８（１９９４）；ＭｃＤｅｖｉｔｔら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６：８９５〜９０７（１９９５））。１１１個の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）疾患原因単離体のＣｌｆＡのアミノ酸配列についての配列識別記号を、表１０に示す。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＰＦＥＳＡ０２３７の完全長（シグナル配列を含む）野生型ＣｌｆＡのアミノ酸配列を、配列番号１３０に示す。この配列は、３３８位にチロシンを有し、これは、ＣｌｆＡの突然変異形態ではアラニンに変化する。Ｎ１２３領域、反復領域、およびアンカー領域を含む、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＰＦＥＳＡ０２３７の野生型ＣｌｆＡをコードする完全長遺伝子を、配列番号１３１に示す。ＣｌｆＡのＹ３３８Ａ突然変異形態のアミノ酸配列を、配列番号１２３に示す。しかし、チロシンからアラニンへの変化は、野生型ＣｌｆＡでは配列番号１３０の３３８位で生じ、Ｙ３３８Ａと呼ばれるが、ＣｌｆＡの突然変異形態では、配列番号１２３の３１０位にあることに留意されたい。さらに、配列番号１２３のアミノ酸配列に示されるＣｌｆＡの突然変異形態は、シグナル配列を有さないＣｌｆＡの成熟形態であり、したがって、配列番号１３０と配列番号１２３との間のこの突然変異の位置の違いを説明するものである。
【０１０８】
ＣｌｆＢ：ドメインの構成
ＣｌｆＢは、フィブリノーゲン結合活性を有する黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）タンパク質であり、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に血漿の存在下で凝集塊を形成させる。ＣｌｆＢはＭＳＣＲＡＭＭタンパク質であり、リガンドの結合（例えば、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、ケラチン）のための活性部位を含有する機能的領域であるＡドメインを含む特徴的なＭＳＣＲＡＭＭドメイン構成を示す。Ａドメインの後には、セリンアスパラギン酸反復（ＳＤ反復）から構成される領域があり、これはペプチドグリカン層に広がると考えられる。ＳＤ反復の後には、ペプチドグリカンへのタンパク質の共有結合のためのＬＰＸＴＧ（配列番号１２５）モチーフを含む膜貫通領域がある。ＣｌｆＢは、ＷＯ９９／２７１０９および米国特許第６，６８０，１９５号において記載されている。
【０１０９】
ＣｌｆＢのＮ末端のＡドメインの内部構成は、ＣｌｆＡにおいて見られるものと非常に類似した構成である。Ａドメインは３つのサブドメインＮ１、Ｎ２、およびＮ３から構成される。ＡドメインのＮ１Ｎ２Ｎ３を含むＣｌｆＢのリガンド結合領域（図１）は、アミノ酸４４〜５８５に広がる。参照を容易にするため、Ｎ１Ｎ２Ｎ３ドメインはＮ１２３と呼ぶことができ、同様に、Ｎ２Ｎ３はＮ２３と呼ぶことができる。ＣｌｆＢのＮドメインは、以下のように割り当てられている：Ｎ１は残基４４〜１９７を包含し、Ｎ２は残基１９８〜３７５を包含し、Ｎ３は残基３７５〜５８５を包含する。ＣｌｆＡにおいて、Ａドメインの結晶構造は、免疫グロブリンの折り畳みの固有の型を有することが明らかにされ、類推によって、同一のことがＣｌｆＢのケースにも当てはまることが推測され得る。Ｄｅｉｖａｎａｙａｇａｍら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２１：６６６０〜６６７２（２００２）を参照されたい。ＣｌｆＢおよびＣｌｆＡのＡドメインの構成が類似していても、配列同一性はわずか２６％である。Ｎｉ  Ｅｉｄｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：２４５〜２５７（２００２）を参照されたい。
【０１１０】
ＣｌｆＢの配列
ＣｌｆＢをコードする遺伝子は、核アドヘシン遺伝子として分類される。複数の病状に関連する９２の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株のＣｌｆＢの配列を、表１１にまとめる。さらなる配列は、ＧｅｎＢａｎｋから得た。
【０１１１】
他のＭＳＣＲＡＭＭＳ
他のＭＳＣＲＡＭＭＳを、本発明の免疫原性組成物における使用のために考慮することができる。例えば、セリンアスパラギン酸反復（Ｓｄｒ）タンパク質、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、およびＳｄｒＥは、一次配列および構造的構成においてＣｌｆＡタンパク質およびＣｌｆＢタンパク質に関連しており、細胞表面上に位置している。ＳｄｒＣタンパク質、ＳｄｒＤタンパク質、およびＳｄｒＥタンパク質は、細胞壁に関連するタンパク質であり、Ｎ末端にシグナル配列を有し、Ｃ末端にＬＰＸＴＧ（配列番号１２５）モチーフ、疎水性ドメイン、および正に荷電した残基を有する。それぞれはまた、細胞表面上でのリガンド結合ドメインの領域Ａの効率的な発現をＢモチーフに沿って可能にするために十分な長さの領域Ｒを含有する、ＳＤ反復を有する。細胞表面上に位置するＳｄｒＣタンパク質、ＳｄｒＤタンパク質、およびＳｄｒＥタンパク質は、これらのタンパク質のＡ領域で、血漿内のタンパク質、細胞外マトリクス、または宿主細胞の表面上の分子と相互作用し得る。Ｓｄｒタンパク質は、ＣｌｆＡおよびＣｌｆＢと、ある程度限定されたアミノ酸配列類似性を共有する。ＣｌｆＡおよびＣｌｆＢと同様に、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、およびＳｄｒＥもまた、細胞外マトリクスタンパク質の、陽イオン依存性のリガンド結合を示す。
【０１１２】
ｓｄｒ遺伝子は、緊密に結合しており、直列に配列している。（ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＣｌｆＡ、およびＣｌｆＢの）Ｓｄｒタンパク質は、Ａ領域を含むことを特徴とし、該領域内には、コンセンサスＴＹＴＦＴＤＹＶＤ（配列番号１２６）モチーフを誘導するために用いられ得る、高度に保存されたアミノ酸配列が存在する。このモチーフは、異なるタンパク質間でわずかな変化を示す。モチーフのコンセンサス配列に沿った、この変化は、米国特許第６，６８０，１９５号において記載されている。Ｃｌｆ−Ｓｄｒタンパク質において、このモチーフは高度に保存されている。このモチーフは、細菌感染に対する広範囲な免疫をもたらすために免疫原性組成物において用いることができ、また、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の生産において抗原として用いることができる。このような抗体は、広範囲な受動免疫をもたらすために用いることができる。
【０１１３】
Ｓｄｒタンパク質は、領域ＡとＲ領域との間に位置する２個から５個のさらなる１１０〜１１３残基の反復配列（Ｂモチーフ）を有する点で、ＣｌｆＡおよびＣｌｆＢと異なる。各Ｂモチーフは、真核生物タンパク質において通常見られるコンセンサスＣａ２＋結合ＥＦハンドループを含有する。ＳｄｒＤの５つのＢ反復を含む組換えタンパク質の構造的完全性は、ｂｉｓＡＮＳ蛍光分析によってＣａ２＋依存性であることが示され、このことは、ＥＦハンドが機能的であることを示唆する。Ｃａ２＋を除去すると、構造は、折り畳まれていない立体配座に崩壊した。Ｃａ２＋を添加することによって、元の構造を回復させた。Ｓｄｒタンパク質のＣ末端のＲドメインは、１３２〜１７０個のＳＤ残基を含有する。これらの後には、グラム陽性細菌の多くの表面タンパク質に特徴的な、保存された細胞壁固定領域がある。
【０１１４】
Ｓｄｒタンパク質およびＣｌｆタンパク質において、このＢモチーフは高度に保存されているが、フィブロネクチン結合ＭＳＣＲＡＭＭＳおよびコラーゲン結合タンパク質Ｃｎａにおいては縮重型が生じる。Ｒ領域とコンジュゲートしたＢモチーフは、細胞表面からある程度の距離でリガンド結合ドメインを提示するために必要である。反復Ｂモチーフは、本明細書において記載されるＳＤ反復タンパク質のサブグループの１共通点である。これらのモチーフは、株ＰＦＥＳＡ０２３７の３つのＳｄｒタンパク質において異なる数で見られる。個体のＢモチーフ間には明らかな差異がある。最も保存されている単位は、Ｒ領域に隣接しているものである（ＳｄｒＣ  Ｂ２、ＳｄｒＤ  Ｂ５、およびＳｄｒＥ  Ｂ３）。これらは、いくつかの部位で、特にＣ末端側の半分で、残りのものと異なる。特筆すべき構造上の詳細として、隣接するＢ反復は、Ｃ末端領域内に存在するプロリン残基によって常に分離されているが、プロリンは最後のＢ反復とＲ領域との間には決して生じない。その代わり、このリンカーは、短い酸性鎖によって特徴付けされる。これらの差は、末端の単位が、他のＢモチーフと比較して異なる構造的または機能的役割を有することの証拠である。ＳｄｒＤおよびＳｄｒＥのＮ末端のＢモチーフは、他のものから離れており、小さな挿入および欠失を含む多くのアミノ酸改変が存在するが、残りの内部Ｂモチーフは、より高度に保存されている。３つのＳｄｒタンパク質のそれぞれが、それぞれの種類の少なくとも１つのＢモチーフを有することに留意されたい。
【０１１５】
Ｓｄｒタンパク質のＣ末端のＲドメインは、１３２〜１７０個のＳＤ残基を含有する。これらの後には、グラム陽性細菌の多くの表面タンパク質に特徴的な、保存された細胞壁固定領域がある。
【０１１６】
他の候補ＳｄｒＤ分子は、本発明の免疫原性組成物において用いるための様々な種の生物に由来し得、そのうちのいくつかには、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の株ＵＳＡ３００  ＦＰＲ３７５７（タンパク質受託番号ＳＡＵＳＡ３００  ０５４７）、株ＮＣＴＣ８３２５（タンパク質受託番号ＳＡＯＵＨＳＣ  ００５４５）、株ＭＷ２（タンパク質受託番号ＭＷ０５１７）、株ＭＳＳＡ４７６（タンパク質受託番号ＳＡＳ０５２０、および株Ｍｕ５０（タンパク質受託番号ＳＡＶ０５６２）のＳｄｒＤが含まれる。
【０１１７】
本発明の免疫原性組成物における使用について考慮され得る、さらなるＭＳＣＲＡＭＭＳには、ＥｋｅＳ、ＤｓｑＡ、ＫｅｓＫ、ＫｒｋＮ、ＫｒｋＮ２、ＲｋａＳ、ＲｒｋＮ、およびＫｎｋＡが含まれる。これらのＭＳＣＲＡＭＭＳはＷＯ ０２／１０２８２９において記載されており、これは、参照することによって本明細書に組み込まれる。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号によって同定されるさらなるＭＳＣＲＡＭＭＳには、ＮＰ＿３７３２６１．１、ＮＰ＿３７３３７１．１、ＮＰ＿３７４２４６．１、ＮＰ＿３７４２４８．１、ＮＰ＿３７４８４１．１、ＮＰ＿３７４８６６．１、ＮＰ＿３７５１４０．１、ＮＰ＿３７５６１４．１、ＮＰ＿３７５６１５．１、ＮＰ＿３７５７０７．１、ＮＰ＿３７５７６５．１、およびＮＰ＿３７５７７３．１が含まれる。
【０１１８】
被膜多糖５型および８型
侵襲的な疾患を生じさせ得るブドウ球菌微生物はまた、通常、細菌を莢膜化し、宿主の本来の免疫系によるクリアランスに対するその耐性を増強させる、被膜多糖（ＣＰ）を生産し得る。ＣＰは、細菌細胞を、貪食作用および細胞内死滅に対する耐性を細菌にもたらす防御性被膜で覆うために役立つ。被膜を有さない細菌は、より貪食作用を受けやすい。莢膜多糖は、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、およびＢ群ブドウ球菌を含む多くの細菌病原体にとって重要な病原性因子であることが多い。
【０１１９】
被膜多糖は、特定の種の細菌を血清型決定するために用いることができる。分類は通常、被膜多糖に特徴的な特異的構造または固有のエピトープに対して生成された特異的な抗血清またはモノクローナル抗体との反応によって達成される。莢膜化された細菌は、平滑なコロニーに成長する傾向があるが、被膜を失った細菌のコロニーは粗い外見である。粘液状の外見をもたらすコロニーは、重度に莢膜化されたものとして知られている。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の１型および２型は、重度に莢膜化されており、疾患にはあまり関連しない。
【０１２０】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のほとんどの臨床的な単離体は、血清型５または８で莢膜化されている。５型（ＣＰ５）莢膜多糖および８型（ＣＰ８）莢膜多糖は、Ｎ−アセチルマンノサミヌロン酸、Ｎ−アセチルＬ−フコサミン、およびＮ−アセチルＤ−フコサミンを含む、類似の三糖反復単位を有する。Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４５：９７〜９３（１９８４）およびＭｏｒｅａｕ，Ｍ．ら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．２０１：２８５〜２９７（１９９０）を参照されたい。同一の糖を有するが糖の結合およびＯアセチル化の部位が異なる、２つのＣＰは、血清学的に異なるパターンの免疫反応性を生じさせる。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、本発明の血清型５および／または８の莢膜多糖は、Ｏ−アセチル化されている。いくつかの実施形態において、５型の莢膜多糖またはオリゴ多糖のＯ−アセチル化の程度は、１０〜１００％、２０〜１００％、３０〜１００％、４０〜１００％、５０〜１００％、６０〜１００％、７０〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％、５０〜９０％、６０〜９０％、７０〜９０％、または８０〜９０％である。いくつかの実施形態において、８型の莢膜多糖またはオリゴ多糖のＯ−アセチル化の程度は、１０〜１００％、２０〜１００％、３０〜１００％、４０〜１００％、５０〜１００％、６０〜１００％、７０〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％、５０〜９０％、６０〜９０％、７０〜９０％、または８０〜９０％である。いくつかの実施形態において、５型および８型の莢膜多糖またはオリゴ多糖のＯ−アセチル化の程度は、１０〜１００％、２０〜１００％、３０〜１００％、４０〜１００％、５０〜１００％、６０〜１００％、７０〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％、５０〜９０％、６０〜９０％、７０〜９０％、または８０〜９０％である。
【０１２２】
多糖またはオリゴ糖のＯ−アセチル化の程度は、当技術分野において知られているあらゆる方法によって、例えばプロトンＮＭＲ（ＬｅｍｅｒｃｉｎｉｅｒおよびＪｏｎｅｓ  １９９６、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２９６、８３〜９６；ＪｏｎｅｓおよびＬｅｍｅｒｃｉｎｉｅｒ  ２００２、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ３０、１２３３〜１２４７；ＷＯ０５／０３３１４８；またはＷＯ００／５６３５７）によって決定することができる。別の一般に用いられる方法は、Ｈｅｓｔｒｉｎ（１９４９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８０、２４９〜２６１によって記載されている。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、本発明の血清型５および／または８の莢膜多糖は、動物効力モデルまたは抗体が細菌を死滅させることを実証するオプソニン性貪食死滅アッセイにおける細菌の死滅によって測定されるように機能的である抗体を生成するために用いられる。このような機能性は、効力におけるＯ−アセチル化の重要性の指標ではない抗体生成のみをモニタリングするアッセイを用いては観察され得ない。
【０１２４】
被膜の疫学
特定の被膜血清型と疾患との関連付けは、臨床単離体のモニタリングを通して可能である。同定された（ＫａｒａｋａｗａおよびＶａｎｎ（１９８２）黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の８つの異なる血清型のうち、血清型１および２のみが重度に莢膜化されており、これらはほとんど単離されない。Ｃａｐｓｕｌａｒ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、ｐ．２８５〜２９３、Ｉｎ  Ｊ．Ｂ．Ｒｏｂｂｉｎｓ、Ｊ．Ｃ．ＨｉｌｌおよびＪ．Ｃ．Ｓａｄｏｆｆ（編）、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ、ｖｏｌ．４、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｔｈｉｅｍｅ  Ｓｔｒａｔｔｏｎ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照されたい。調査によって、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の臨床単離体のおよそ８５〜９０％がＣＰ５またはＣＰ８を発現することが示されている（Ａｒｂｅｉｔ  ＲＤら、Ｄｉａｇｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（１９８４）Ａｐｒ、２（２）：８５〜９１；Ｋａｒａｋａｗａ  ＷＷら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８５）Ｓｅｐ、２２（３）：４４５〜７；Ｅｓｓａｗｉ  Ｔら、Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｉｎｔ．Ｈｅａｌｔｈ．（１９９８）Ｊｕｌ、３（７）：５７６〜８３；Ｎａ’ｗａｓ  Ｔら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９８）３６（２）：４１４〜２０。ＣＰ５およびＣＰ８の分類不可能な株のほとんどは、遺伝的に、ｃａｐ５／８遺伝子座内に突然変異を含有する５型または８型である（Ｃｏｃｃｈｉａｒｏ，Ｇｏｍｅｚら、（２００６）、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｆｅｂ．５９（３）：９４８〜９６０）。いくつかの株の莢膜化は、インビトロでの数回の継代の間に迅速に喪失し、これは、被膜の生産に対する臨床診断で用いられる培地における高いリン酸濃度の抑制作用に起因する。莢膜化されていない単離体が、牝牛を通った後に被膜の発現を回復することも報告された。Ｏｐｄｅｂｅｃｋ，Ｊ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９：２７５〜２７８（１９８５）を参照されたい。いくつかの分類不可能な株は、適切な成長条件下で被膜陽性となる。
【０１２５】
ＣＰ５およびＣＰ８の構造
ＣＰ５およびＣＰ８の両方の反復単位は、２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−マンヌロン酸、２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｌ−フコース、および２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−フコースから構成される。Ｃ．Ｊｏｎｅｓら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３４０：１０９７〜１１０６（２００５）を参照されたい。ＣＰ５およびＣＰ８は同一の糖組成を有するが、これらは、免疫学的に異なることが実証されている。これらは、グリコシド結合およびウロン酸のＯ−アセチル化の部位が異なる。ＦｕｃＮＡｃ残基の１つの株依存性の不完全なＮ−アセチル化が観察された。Ｔｚｉａｎａｂｏｓら、ＰＮＡＳ  Ｖ９８：９３６５（２００１）を参照されたい。
【０１２６】
免疫原性組成物における黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の被膜多糖
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の被膜多糖の分子量は、免疫原性組成物における使用のための重要な考慮事項である。高分子量の被膜多糖は、抗原表面上に存在するエピトープの価数が高いことに起因して、特定の抗体免疫応答を誘発し得る。本明細書において記載される方法は、これまでに入手可能であったものよりもはるかに高い分子量の被膜多糖５型および８型の単離および精製を提供する。
【０１２７】
ＭｎｔＣ／ＳｉｔＣ／唾液結合タンパク質
ＭｎｔＣ／ＳｉｔＣ／唾液結合タンパク質は、ＡＢＣ輸送タンパク質であり、表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）および黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）において相同体を有する。これは本発明において、ＭｎｔＣと呼ばれる。このタンパク質は、３２ｋＤａのリポタンパク質であり、細菌細胞壁内に位置する。ＳｅｌｌｍａｎらおよびＣｏｃｋａｙｎｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６：３７６７（１９９８）を参照されたい。表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）において、これは、鉄調節型オペロンの成分である。これは、ストレプトコッカス・パラサングイス（Ｓ．ｐａｒａｓａｎｇｕｉｓ）のＦｉｍＡを含むアドヘシンおよび証明されたまたは推定上の金属鉄輸送機能を有するＡＢＣ輸送体ファミリーのリポタンパク質の両方に対して、顕著な相同性を示す。（黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の株および配列については表１２を参照されたい。）
【０１２８】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＭｎｔＣタンパク質
ＭｎｔＣの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）相同体は、唾液結合タンパク質として知られており、米国特許第５，８０１，２３４号において開示され、本発明の免疫原性組成物内に含まれ得る。ＭｎｔＣ／ＳｉｔＣ／唾液結合タンパク質の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）相同体のタンパク質配列は、株Ｍｕ５０では、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿３７１１５５で見られる。（ＳＡＶ０６３１としても知られている。）配列識別記号は、配列番号１１９である。株Ｍｕ５０の完全なゲノムのヌクレオチド配列についての受託番号は、ＮＣ＿００２７５８．２（座標７０４９８８〜７０５９１７）である。
【０１２９】
表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）のＳｉｔＣタンパク質
ＭｎｔＣ／ＳｉｔＣ／唾液結合タンパク質の表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）相同体は、ＳｉｔＣとして知られており、Ｓｅｌｌｍａｎら（Ｓｅｌｌｍａｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２００５  Ｏｃｔｏｂｅｒ、７３（１０）：６５９１〜６６００）において開示された。ＭｎｔＣ／ＳｉｔＣ／唾液結合タンパク質の表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）相同体のタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿１８７８８６．１で見られる。（ＳＥＲＰ０２９０としても知られている。）配列識別記号は、配列番号１２１である。
【０１３０】
株ＲＰ６２Ａの完全なゲノムのヌクレオチド配列についての受託番号は、ＮＣ＿００２９７６（座標２９３０３０〜２９３９５９）である。他の候補ＳｉｔＣ分子は、本発明の免疫原性組成物において用いるための様々な種の生物に由来し得、そのうちのいくつかを、以下の表１に列挙する。
【０１３１】
【表１】
0005395264.tif 000002
【０１３２】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の鉄結合タンパク質
本発明の免疫原性組成物における使用のために考慮される別の考えられる候補抗原には、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）表面タンパク質鉄表面決定基Ｂ（ＩｓｄＢ）が含まれる。このＭＳＣＲＡＭＭは、Ｍａｚｍａｎｉａｎら（Ｍａｚｍａｎｉａｎ，ＳＫら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ  ９９：２２９３〜２２９８（２００２））によって記載されており、これはその後試験されて、感染のマウスモデルおよびＫｕｋｌｉｎら（Ｋｕｋｌｉｎ，ＮＡら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、Ｖｏｌ．７４、Ｎｏ．４、２２１５〜２２２３（２００６））によるアカゲザルの免疫原性研究において、ワクチン候補として効果的であることが示されている。このＩｓｄＢ分子は、株ＭＲＳＡ２５２（タンパク質受託番号ＣＡＧ４０１０４．１）、株Ｎｅｗｍａｎ（タンパク質受託番号ＢＡＦ６７３１２．１）、株ＭＳＳＡ４７６（タンパク質受託番号ＣＡＧ４２８３７．１）、株Ｍｕ３（タンパク質受託番号ＢＡＦ７８００３．１）、株ＲＦ１２２（タンパク質受託番号ＣＡＩ８０６８１．１）を含む、様々な株の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）において存在する。
【０１３３】
候補抗原：
本発明の免疫原性組成物はまた、Ｏｐｐ３ａ、ＤｌｔＤ、ＨｔｓＡ、ＬｔａＳ、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＣ、ＳｄｒＦ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、ＳｒｔＡ、ＳｐＡ、Ｓｂｉα溶血素（ｈｌａ）、β溶血素、フィブロネクチン結合タンパク質Ａ（ｆｎｂＡ）、フィブロネクチン結合タンパク質Ｂ（ｆｎｂＢ）、コアグラーゼ、Ｆｉｇ、ｍａｐ、パントン・バレンタイン型ロイコシジン（ｐｖｌ）、α毒素およびその変型、γ毒素（ｈｌｇ）および変型、ｉｃａ、免疫優性ＡＢＣ輸送体、Ｍｇ２＋輸送体、Ｎｉ  ＡＢＣ輸送体、ＲＡＰ、自己溶解酵素、ラミニン受容体、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ＩｓａＢ／ＰｉｓＢ、ＳＰＯＩＩＩＥ、ＳｓａＡ、ＥｂｐＳ、Ｓａｓ  Ａ、ＳａｓＦ、ＳａｓＨ、ＥＦＢ（ＦＩＢ）、ＳＢＩ、Ｎｐａｓｅ、ＥＢＰ、骨シアロ結合タンパク質ＩＩ、アウレオリシン前駆体（ＡＵＲ）／Ｓｅｐｐ１、Ｃｎａ、ならびにそれらの断片、例えば、Ｍ５５、ＴＳＳＴ−１、ｍｅｃＡ、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＰＮＡＧ／ｄＰＮＡＧ）エキソ多糖、ＧｅｈＤ、ＥｂｈＡ、ＥｂｈＢ、ＳＳＰ−１、ＳＳＰ−２、ＨＢＰ、ビトロネクチン結合タンパク質、ＨａｒＡ、ＥｓｘＡ、ＥｓｘＢ、エンテロトキシンＡ、エンテロトキシンＢ、エンテロトキシンＣ１、および新規な自己溶解酵素という抗原の１つまたは複数を含み得る。本発明の特定の実施形態において、免疫原性組成物が特定の形態のＣＰ５および／またはＣＰ８を含む場合、これはＰＮＡＧをさらに含まない可能性がある。
【０１３４】
免疫原性組成物製剤
１つの実施形態において、本発明の免疫原性組成物はさらに、アジュバント、緩衝剤、抗凍結剤、塩、二価陽イオン、非イオン性洗浄剤、遊離ラジカル酸化の阻害剤、希釈剤、または担体の、少なくとも１つを含む。
【０１３５】
本発明の免疫原性組成物はさらに、複数のブドウ球菌タンパク質抗原および莢膜多糖−タンパク質コンジュゲートに加え、１つまたは複数の防腐剤を含み得る。ＦＤＡは、わずかな例外のみを除いて、複数回用量（複数用量）用バイアル内の生物学的製品が防腐剤を含有することを要求している。防腐剤を含有するワクチン製品には、塩化ベンゼトニウム（炭疽菌）、２−フェノキシエタノール（ＤＴａＰ、ＨｅｐＡ、ライム、ポリオ（非経口））、フェノール（肺炎球菌、チフス（非経口）、ワクシニア）、およびチメロサール（ＤＴａＰ、ＤＴ、Ｔｄ、ＨｅｐＢ、Ｈｉｂ、インフルエンザ、ＪＥ、髄膜炎菌、肺炎球菌、狂犬病）を含有するワクチンが含まれる。注射可能な薬剤における使用が認可された防腐剤には、例えば、クロロブタノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、２−フェノキシエタノール、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、フェノール、チメロサール、および硝酸フェニル水銀が含まれる。
【０１３６】
本発明の製剤はさらに、緩衝液、塩、二価陽イオン、非イオン性洗浄剤、糖などの抗凍結剤、および遊離ラジカルスカベンジャーもしくはキレート化剤などの抗酸化剤、またはそれらのあらゆる複数の組み合わせの１つまたは複数を含み得る。いずれか１つの成分、例えばキレート剤の選択により、別の成分（例えばスカベンジャー）が所望であるかどうかが決定され得る。投与のために製剤された最終組成物は、無菌であり、かつ／または発熱性物質を有さないものである。当業者は、所要の特定の保管条件および投与条件などの様々な因子に応じて、これらの成分および他の成分のどの組み合わせが、防腐剤を含有する本発明の免疫原性組成物内に含めるために最適であるかを経験的に決定し得る。
【０１３７】
特定の実施形態において、非経口投与に適合した本発明の製剤は、限定はしないがＴｒｉｓ（トリメタミン）、リン酸エステル、酢酸エステル、ホウ酸塩、クエン酸エステル、グリシン、ヒスチジン、およびコハク酸エステルから選択される、１つまたは複数の生理学的に許容できる緩衝液を含む。特定の実施形態において、製剤は、約６．０から約９．０、好ましくは約６．４から約７．４のｐＨ範囲内に緩衝される。
【０１３８】
特定の実施形態において、本発明の免疫原性組成物または免疫原性製剤のｐＨを調節することが望ましい場合がある。本発明の製剤のｐＨは、当技術分野における標準的な技術を用いて調節され得る。製剤のｐＨは、３．０から８．０の間に調節され得る。特定の実施形態において、製剤のｐＨは、３．０から６．０の間、４．０から６．０の間、または５．０から８．０の間であり得るか、またはそれに調節され得る。他の実施形態において、製剤のｐＨは、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約５．８、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、または約８．０であり得るか、またはそれに調節され得る。特定の実施形態において、ｐＨは、４．５から７．５、または４．５から６．５、５．０から５．４、５．４から５．５、５．５から５．６、５．６から５．７、５．７から５．８、５．８から５．９、５．９から６．０、６．０から６．１、６．１から６．２、６．２から６．３、６．３から６．５、６．５から７．０、７．０から７．５、または７．５から８．０の範囲であり得るか、またはそれに調節され得る。具体的な実施形態において、製剤のｐＨは、約５．８である。
【０１３９】
特定の実施形態において、非経口投与に適合した本発明の製剤は、限定はしないがＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、およびＭｎＣｌ２を含む、１つまたは複数の二価陽イオンを、約０．１ｍＭから約１０ｍＭにわたる濃度で含み、最大約５ｍＭが好ましい。
【０１４０】
特定の実施形態において、非経口投与に適合した本発明の製剤は、限定はしないが塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、および硫酸カリウムを含む、１つまたは複数の塩を含み、これは、非経口投与の際に対象に生理学的に許容できるイオン強度で存在し、かつ最終製剤における選択されたイオン強度または浸透圧をもたらすような最終濃度で含まれる。製剤の最終的なイオン強度または浸透圧は、複数の成分（例えば、（１つまたは複数の）緩衝化合物および他の非緩衝塩に由来するイオンによって決定される。好ましい塩であるＮａＣｌは、最大約２５０ｍＭの範囲で存在し、塩濃度は、製剤の最終的な全浸透圧が非経口投与（例えば、筋肉内注射または皮下注射）に適合するように、他の成分（例えば糖）を補うように選択され、様々な温度範囲にわたり、免疫原性組成物製剤の免疫原性成分の長期にわたる安定性を促進する。塩を有さない製剤は、１つまたは複数の選択された抗凍結剤の増大する範囲に耐えて、所望の最終浸透圧レベルを維持する。
【０１４１】
特定の実施形態において、非経口投与に適合した本発明の製剤は、限定はしないが二糖（例えば、ラクトース、マルトース、ショ糖、またはトレハロース）およびポリヒドロキシ炭化水素（例えば、ズルシトール、グリセロール、マンニトール、およびソルビトール）から選択される、１つまたは複数の抗凍結剤を含む。
【０１４２】
特定の実施形態において、製剤の浸透圧は、約２００ｍＯｓ／Ｌから約８００ｍＯｓ／Ｌの範囲であり、約２５０ｍＯｓ／Ｌから約５００ｍＯｓ／Ｌまたは約３００ｍＯｓ／Ｌから約４００ｍＯｓ／Ｌの範囲が好ましい。塩を有さない製剤は、例えば、約５％から約２５％のショ糖、好ましくは約７％から約１５％または約１０％から約１２％のショ糖を含有し得る。あるいは、塩を有さない製剤は、例えば、約３％から約１２％のソルビトール、好ましくは約４％から７％または約５％から約６％のソルビトールを含有し得る。塩化ナトリウムなどの塩が添加されると、効果的な範囲のショ糖またはソルビトールが比較的減少する。これらの浸透圧および他のこのような浸透圧ならびに浸透圧についての考慮事項は、当業者の技術範囲内である。
【０１４３】
特定の実施形態において、非経口投与に適合した本発明の製剤は、１つまたは複数の遊離ラジカル酸化阻害剤および／またはキレート化剤を含む。様々な遊離ラジカルスカベンジャーおよびキレート剤が当技術分野において知られており、本明細書において記載される製剤および使用方法に適用される。例としては、限定はしないが、エタノール、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ／エタノールの組み合わせ、トリエタノールアミン、マンニトール、ヒスチジン、グリセロール、クエン酸ナトリウム、イノシトール六リン酸、トリポリリン酸エステル、アスコルビン酸／アスコルビン酸エステル、コハク酸／コハク酸エステル、リンゴ酸／リンゴ酸エステル、デスフェラール、ＥＤＤＨＡおよびＤＴＰＡ、ならびに上記の２つ以上の様々な組み合わせが挙げられる。特定の実施形態において、少なくとも１つの非還元性遊離ラジカルスカベンジャーを、製剤の長期にわたる安定性を効果的に増強させる濃度で添加することができる。スカベンジャーおよび二価陽イオンなどの１つまたは複数の遊離ラジカル酸化阻害剤／キレート剤もまた、様々な組み合わせで添加することができる。キレート剤の選択によって、スカベンジャーの添加が必要であるかどうかが決定される。
【０１４４】
特定の実施形態において、非経口投与に適合した本発明の製剤は、限定はしないが、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリソルベート−６０（Ｔｗｅｅｎ６０）、ポリソルベート−４０（Ｔｗｅｅｎ４０）、およびポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、限定はしないがＢｒｉｊ５８、Ｂｒｉｊ３５、およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００などの他のものを含むポリオキシエチレンアルキルエーテル、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４、ＮＰ４０、Ｓｐａｎ８５、ならびにプルロニック系の非イオン性界面活性剤（例えばプルロニック１２１）を含めた、１つまたは複数の非イオン性界面活性剤を含み、好ましい成分は、約０．００１％から約２％（最大約０．２５％が好ましい）の濃度のポリソルベート−８０または約０．００１％から１％（最大０．５％が好ましい）の濃度のポリソルベート−４０である。
【０１４５】
特定の実施形態において、本発明の製剤は、非経口投与に適した１つまたは複数のさらなる安定剤、例えば、少なくとも１つのチオール（−ＳＨ）基を含む還元剤（例えば、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、還元型グルタチオン、チオグリコール酸ナトリウム、チオ硫酸エステル、モノチオグリセロール、またはそれらの混合物）を含む。あるいは、または場合によって、本発明の防腐剤を含有する免疫原性組成物製剤はさらに、保管容器から酸素を除去すること、光から製剤を保護することによって（例えば、琥珀色のガラス容器を用いることによって）安定化され得る。
【０１４６】
本発明の防腐剤を含有する免疫原性組成物製剤は、１つまたは複数の薬学的に許容できる担体または賦形剤を含み得、これは、それ自体は免疫応答を誘発しないあらゆる賦形剤を含む。適切な賦形剤には、限定はしないが、タンパク質、糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸共重合体、ショ糖（Ｐａｏｌｅｔｔｉら、２００１、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９：２１１８）、トレハロース、ラクトース、および脂質凝集体（油滴またはリポソームなど）などの高分子が含まれる。このような担体は、当業者に周知である。薬学的に許容できる賦形剤は、例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ、２０００、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２において議論されている。
【０１４７】
本発明の組成物は、凍結乾燥されているか、または水性形態、すなわち溶液もしくは懸濁液であってよい。液体製剤は、有利には、それらの包装形態から直接的に投与され得、したがって、そうでなければ本発明の凍結乾燥組成物に必要な、水性媒質内での再構成の必要性を伴うことなく、注射に理想的である。
【０１４８】
対象への本発明の免疫原性組成物の直接的な送達は、非経口投与（筋肉内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、または組織の間質腔へ）によって、または直腸投与、経口投与、膣投与、局所投与、経皮投与、鼻腔内投与、眼球投与、耳投与、肺投与、もしくは他の粘膜投与によって達成され得る。好ましい実施形態において、非経口投与は、筋肉内注射、例えば対象の大腿部または上腕部への筋肉内注射による。注射は、針（例えば、皮下注射用針）を介するものであり得るが、代わりに無針注射を用いることができる。典型的な筋肉内用量は、０．５ｍＬである。本発明の組成物は、様々な形態、例えば、液体溶液または懸濁液として注射するための様々な形態で調製することができる。特定の実施形態において、組成物は、肺投与のための粉末またはスプレーとして、例えば吸入器内に調製することができる。他の実施形態において、組成物は、坐剤もしくはペッサリーとして、または経鼻投与、耳投与、または眼球投与のために、例えばスプレー、トロップ、ゲル、もしくは粉末として調製することができる。
【０１４９】
特定の免疫原性組成物にとっての最適な成分量は、対象における適切な免疫応答の観察を伴う標準的な研究によって確定することができる。初回ワクチン接種の後、対象に、適切に間隔をあけた１回または数回のブースター免疫化を行うことができる。
【０１５０】
包装および投薬形態
本発明の免疫原性組成物は、単位用量形態または複数用量形態（例えば、２回用量、４回用量、またはそれ以上）に包装され得る。複数用量形態では、バイアルが典型的であるが、必ずしも充填前のシリンジより好ましいというわけではない。適切な複数用量形態には、限定はしないが、用量あたり０．１から２ｍＬでの容器当たり２から１０回用量が含まれる。特定の実施形態において、用量は、０．５ｍＬ用量である。例えば、参照することによって本明細書に組み込まれる国際特許出願ＷＯ２００７／１２７６６８を参照されたい。
【０１５１】
組成物は、バイアルもしくは他の適切な保管容器内に存在され得るか、または、充填前の送達装置、例えば針を有するかもしくは有さない場合がある、単一成分もしくは複数成分用のシリンジ内に存在し得る。シリンジは典型的には、防腐剤を含有する単回用量の本発明の免疫原性組成物を含有するが、必ずしもその必要があるわけではなく、複数用量用の充填前のシリンジもまた想定される。同様に、バイアルは、単回用量を含み得るが、代替的に複数回用量を含む場合もある。
【０１５２】
効果的な投薬容積は、習慣的に確立され得るが、注射のための組成物の典型的な用量は、０．５ｍＬの容積を有する。特定の実施形態において、用量は、ヒト対象に投与するために製剤される。特定の実施形態において、容量は、成人、十代、青年、幼児、または乳児（すなわち、わずか１歳）のヒト対象に投与するために製剤され、好ましい実施形態においては注射によって投与され得る。
【０１５３】
本発明の液体免疫原性組成物はまた、凍結乾燥形態で存在する他の免疫原性組成物を再構成するために適している。免疫原性組成物をこのような即時の再構成に用いる場合、本発明は、２つ以上のバイアル、２つ以上の充填済みのシリンジ、またはそれぞれの１つもしくは複数を有するキットを提供し、シリンジの内容物は、注射の前にバイアルの内容物を再構成するために用いられるか、またはその逆も同様である。
【０１５４】
あるいは、本発明の免疫原性組成物は、例えば当技術分野において周知の複数のフリーズドライ方法の１つを用いて、凍結乾燥および再構成されて、マイクロペレットまたはミクロスフェアなどの、乾燥した規則正しい形状の（例えば球状の）粒子を形成し得、該粒子は、これらを調製するために用いられる的確な方法を変化させることによって選択および制御され得る平均直径サイズなどの粒子特徴を有するものである。免疫原性組成物はさらにアジュバントを含み得、アジュバントは、マイクロペレットまたはミクロスフェアなどの個別の乾燥した規則正しい形状の（例えば球状の）粒子と共に調製されてもよいし、または該粒子内に含有されてもよい。このような実施形態において、本発明はさらに、本発明の１つまたは複数の防腐剤をさらに含んでもよい、安定化された乾燥免疫原性組成物を含む第１の成分と、第１の成分を再構成するための無菌の水性溶液を含む、第２の成分とを含む、免疫原性組成物キットを提供する。特定の実施形態において、水性溶液は、１つまたは複数の防腐剤を包含し、少なくとも１つのアジュバントを含んでもよい（例えば、ＷＯ２００９／１０９５５０を参照されたい（参照することによって本明細書に組み込まれる））。
【０１５５】
さらに別の実施形態において、複数用量形式の容器は、限定はしないが通常の実験用ガラス製品、フラスコ、ビーカー、メスシリンダー、発酵槽、バイオリアクター、管類、ピペット、袋、瓶、バイアル、バイアルの蓋（例えば、ゴム製のストッパー、キャップ上のねじ）、アンプル、シリンジ、二腔シリンジまたは多腔シリンジ、シリンジストッパー、シリンジプランジャー、ゴム製の蓋、プラスチック製の蓋、ガラス製の蓋、カートリッジ、および使い捨てペンなどからなる群の１つまたは複数から選択される。本発明の容器は、製造の材料によっては限定されず、ガラス、金属（例えば、スチール、ステンレススチール、アルミニウムなど）およびポリマー（例えば、熱可塑性物質、エラストマー、熱可塑性エラストマー）などの材料を含む。特定の実施形態において、この形式の容器は、ブチル製のストッパーを有する５ｍＬのＳｃｈｏｔｔ  Ｔｙｐｅ  １ガラスバイアルである。当業者には、上記に説明された形式が決して網羅的な列挙ではなく、本発明に利用可能な形式の種類に関する当業者への案内として役立つのみであることが理解されよう。本発明における使用について検討されるさらなる形式は、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｃｏｒｐ．（Ｌｉｍａ、ＯＨ）、ＶＷＲなどの実験器具の供給メーカーおよび製造者から発行されているカタログで見ることができる。
【０１５６】
免疫原性組成物の評価
１つの実施形態において、本発明は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）生物の少なくとも３つの抗原を含む免疫原性組成物を提供する。
【０１５７】
本発明の免疫原性組成物の免疫原性を評価するために、様々なインビトロでの試験が用いられる。例えば、インビトロでのオプソニンアッセイは、ブドウ球菌細胞、問題の抗原に対する特異的抗体を含有する熱不活化血清、および外因性の補体源の混合物を共にインキュベートすることによって行われる。オプソニン性貪食は、新たに単離された多形核細胞（ＰＭＮ）または分化したエフェクター細胞、例えばＨＬ６０と、抗体／補体／ブドウ球菌細胞混合物とをインキュベートする間に進行する。抗体および補体で被覆された細菌細胞は、オプソニン性貪食で死滅する。オプソニン性貪食から回収される生存細菌のコロニー形成単位（ｃｆｕ）は、アッセイ混合物を平板培養することによって決定される。力価は、アッセイ対照との比較によって決定される５０％の細菌死滅をもたらす最大希釈の逆数として報告される。
【０１５８】
全細胞ＥＬＩＳＡアッセイもまた、抗原のインビトロでの免疫原性および表面での曝露を評価するために用いられ、ここでは、目的の細菌株（黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））を９６ウェルプレートなどのプレート上に被覆し、免疫化された動物から得られた試験血清を細菌細胞と反応させる。試験抗原に特異的ないずれかの抗体が、抗原の、表面に曝露されたエピトープと反応性である場合、これは当業者に知られている標準的な方法によって検出され得る。
【０１５９】
所望のインビトロでの活性を示すいずれかの抗原は、次に、インビボでの動物チャレンジモデルにおいて試験される。特定の実施形態において、免疫原性組成物は、当業者に知られている免疫化方法および免疫化経路（例えば、鼻腔内、非経口、経口、直腸、膣、経皮、腹腔内、静脈内、皮下など）による動物（例えばマウス）の免疫化において用いられる。特定のブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）の免疫原性組成物で動物を免疫化した後、動物をブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）でチャレンジし、ブドウ球菌感染に対する耐性についてアッセイする。
【０１６０】
１つの実施形態において、病原体を有さないマウスを黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）で免疫化し、チャレンジする。例えば、マウスは、免疫原性組成物内の所望の抗原の１つまたは複数の用量で免疫化される。その後、マウスを黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）でチャレンジし、チャレンジ後、経時的に生存をモニタリングする。
【０１６１】
免疫化の方法
ブドウ球菌感染を予防するために宿主を免疫化するための方法も提供される。好ましい実施形態において、宿主はヒトである。したがって、宿主または対象は、免疫学的量の、本明細書において記載される免疫原性組成物を投与される。免疫原性組成物の免疫学的量は、徐々に増加する量の免疫原性組成物で対象を免疫化し、そして免疫応答を分析して最適な投薬量を決定する、用量応答研究を行うことによって決定され得る。研究の開始点は、動物モデルにおける免疫化データから推論することができる。投薬量は、個体の具体的な状態に応じて変化し得る。量は、当業者に知られている手段を用いる習慣的な試験で決定され得る。いくつかの実施形態において、ブドウ球菌感染、疾患、または症状を予防するために宿主を免疫化する方法は、ヒトの、獣医的な、動物の、または農業的な治療を含む。別の実施形態は、対象におけるブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）に関連するブドウ球菌感染、疾患、または症状を予防するために宿主を免疫化する方法を提供し、この方法は、本明細書において記載される免疫原性組成物からポリクローナル抗体調製物またはモノクローナル抗体調製物を生成すること、および前記抗体調製物を用いて対象に受動免疫をもたらすことを含む。
【０１６２】
適切な数の用量の、免疫学的に効果的な量の免疫原性組成物が、免疫応答を誘導するために対象に投与される。治療される個体は、より重症な、ブドウ球菌感染の臨床的所見を示さない。投薬量は、年齢および体重などの個体の具体的な状態に応じて変化し得る。量は、当業者に知られている手段を用いる習慣的な試験において決定され得る。
【０１６３】
１つの実施形態において、本発明の免疫原性組成物を投与される患者は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の保菌率の低減を示す。免疫原性組成物を投与した後の、このような保菌の低減または非保菌者として過ごす期間の間隔の延長は、医学的必要性の観点から重要である。例えば、保菌者における全体的な黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の保菌の低減は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の多抗原ワクチンを１回投与した後に評価され得る。例えば、免疫原性組成物を投与する１日前、１８〜５０歳の成人群を、鼻および喉のスワブによって保菌についてスクリーニングし、その後、彼らの保菌状態を決定するために培養することができる。次に、その群に本発明の免疫原性組成物を投与し、１つの群には対照を投与する。鼻および喉のスワブ採取を、１２週間にわたり毎週、および免疫原性組成物の投与後には最大６ヶ月間毎月行い、プラセボと比較する。１つの主要評価項目は、免疫化後、３ヶ月の間隔で、免疫原性組成物の投与後の患者における保菌率とプラセボでの保菌率とを比較することである。
【０１６４】
ブドウ球菌感染の動物モデル
本明細書において記載される免疫原性組成物のいずれか１つの効力の評価において用いるためのいくつかの動物モデルを、以下に記載する。
【０１６５】
マウス敗血症モデル（受動または能動）
受動免疫化モデル
マウスを、免疫性のＩｇＧまたはモノクローナル抗体で、腹腔内（ｉ．ｐ．）で受動免疫化する。マウスをその後、２４時間後に、致死用量の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）でチャレンジする。細菌チャレンジは静脈内（ｉ．ｖ．）またはｉ．ｐ．で投与して、あらゆる生存が確実に抗体と細菌との特異的なインビボでの相互作用に起因し得るようにする。細菌チャレンジ用量は、免疫化されていない対照マウスのおよそ２０％が致死的な敗血症となるために必要な用量となるよう決定される。生存研究の統計的評価は、カプランマイヤー分析によって実施され得る。
【０１６６】
能動免疫化モデル
このモデルにおいて、マウス（例えば、Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウス）を、０週目、３週目、および６週目に（または他の類似の適切に間隔の開いたワクチン接種スケジュールで）標的抗原で腹腔内（ｉ．ｐ．）または皮下（ｓ．ｃ．）で能動免疫化し、その後、８週目に、静脈内経路で黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）でチャレンジする。細菌チャレンジ用量は、１０〜１４日間の期間にわたり対照群のおよそ２０％が生存するように調整される。生存研究の統計的評価は、カプランマイヤー分析によって実施され得る。
【０１６７】
感染性心内膜炎モデル（受動または能動）
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）により生じる感染性心内膜炎（ＩＥ）の受動免疫化モデルは、これまでに用いられており、ＣｌｆＡが防御免疫を誘発し得ることを示している。Ｖｅｒｎａｃｈｉｏら、Ａｎｔｍｉｃｒｏ．Ａｇｅｎｔｓ  ＆  Ｃｈｅｍｏ．５０：５１１〜５１８（２００６）を参照されたい。ＩＥのこのモデルにおいて、ウサギまたはラットを用いて、中心静脈カテーテル、菌血症、および遠位の器官への血行性播種を含む臨床的感染を刺激する。無菌性大動脈弁疣腫を有する、カテーテル挿入されたウサギまたはラットに、標的抗原に特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の単回または複数回の静脈内注射を投与する。その後、動物を、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株または表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）株で、ｉ．ｖ．でチャレンジする。チャレンジ後、心臓、心臓疣腫、および腎臓を含むさらなる組織、および血液を採取し、培養する。次に、心臓組織、腎臓、および血液におけるブドウ球菌感染の頻度を測定する。１つの研究において、動物をＭＲＳＥ  ＡＴＣＣ  ３５９８４またはＭＲＳＡ  ６７−０でチャレンジした場合、ＣｌｆＡに対するポリクローナル抗体調製物またはモノクローナル抗体を用いて、感染率の有意な低減が示された。Ｖｅｒｎａｃｈｉｏら、Ａｎｔｍｉｃｒｏ．Ａｇｅｎｔｓ  ＆  Ｃｈｅｍｏ．５０：５１１〜５１８（２００６）を参照されたい。
【０１６８】
感染性心内膜炎モデルはまた、ウサギおよびラットの両方における活性免疫化研究に適合させられている。ウサギまたはラットを、標的抗原で、筋肉内または皮下で免疫化し、静脈内経路を介して２週間後に黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）でチャレンジする。
【０１６９】
腎盂腎炎モデル
腎盂腎炎モデルにおいて、マウスを、０週目、３週目、および６週目に（または他の類似の適切に間隔の開いたワクチン接種スケジュールで）標的抗原で免疫化する。その後、動物を、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＦＥＳＡ０２６６でｉ．ｐ．またはｉ．ｖ．でチャレンジする。４８時間後、腎臓を採取し、細菌ＣＦＵを数える。
【０１７０】
抗体および抗体組成物
本発明はさらに、本発明の免疫原性組成物の１つまたは複数の抗原に特異的および選択的に結合する抗体および抗体組成物を提供する。いくつかの実施形態において、抗体は、本発明の免疫原性組成物を対象に投与すると生成する。いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の免疫原性組成物の抗原の１つまたは複数に対する精製または単離された抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、動物効力モデルにおける細菌の死滅またはオプソニン性貪食死滅アッセイを介する細菌の死滅によって測定されるように機能的である。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、対象に受動免疫をもたらす。本発明はさらに、当業者に周知の技術を用いて、本発明の抗体または抗体断片をコードするポリヌクレオチド分子、ならびに本発明の抗体または抗体組成物を生産する細胞または細胞系（ハイブリドーマ細胞または抗体の組換え生産のための他の操作された細胞系）およびトランスジェニック動物を提供する。
【０１７１】
本発明の抗体または抗体組成物は、対象におけるブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）に関連するブドウ球菌感染、疾患、または症状を治療または予防するための方法において用いることができ、該方法は、ポリクローナル抗体調製物またはモノクローナル抗体調製物を生成すること、および前記抗体または抗体組成物を用いて対象に受動免疫をもたらすことを含む。本発明の抗体はまた、診断方法、例えば、本発明の免疫原性組成物の１つまたは複数の抗原の存在の検出、または該抗原のレベルの定量に有用であり得る。
【実施例】
【０１７２】
以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態を実証するものである。しかし、これらの実施例は例示のみを目的とするものであり、本発明の条件および範囲に関して完全に限定的である趣旨のものではないことを理解されたい。当然のことながら、典型的な反応条件（例えば、温度、反応時間など）が与えられている場合、特定された範囲の上下両方の条件もまた用いられ得るが、通常はあまり好都合ではない。本明細書において言及される全ての部またはパーセントは重量に基づくものであり、全ての温度は、別段の特定がない限り、摂氏で表される。
【０１７３】
さらに、以下の実施例は、別段の詳細な記載がない限り、当業者に周知であり習慣的な、標準的な技術を用いて実施した。上記に述べたように、以下の実施例は、例示的な目的のためにあるものであり、本発明の範囲を限定すると決して解釈されるべきではない。
【０１７４】
（実施例１）抗原ＣｌｆＡおよびＣｌｆＢの防御
クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）およびＢ（ＣｌｆＢ）は、フィブリノーゲン（ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ）およびサイトケラチン１０（ＣｌｆＢ）を含む宿主タンパク質への結合に寄与する、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の表面タンパク質である。ＣｌｆＡおよびＣｌｆＢは、カルボキシ末端のＬＰＸＴＧ（配列番号：１２５）モチーフを含有するタンパク質ファミリーのメンバーであり、該モチーフによって、該タンパク質が細胞表面に共有結合することが可能になる。ＣｌｆＡおよびＣｌｆＢの両方は、フィブリノーゲン（ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ）、フィブロネクチン（ＦｎｂＡおよびＦｎｂＢ）、コラーゲン（Ｃｎａ）などの宿主の細胞外マトリクスタンパク質を認識し結合するタンパク質（微生物表面成分認識接着マトリクス分子、またはＭＳＣＲＡＭＭ）ファミリーに属する。これらのタンパク質は全て、細胞表面への輸送を仲介するアミノ末端シグナル配列を共有する。ＭＳＣＲＡＭＭはまた、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、およびケラチンのためのリガンド結合部位を含有する機能的領域であるＡドメインを含む。Ａドメインの後には、セリン−アスパラギン酸反復（ＳＤ反復）から構成される領域があり得、これはペプチドグリカン層に広がると考えられる。ＳＤ反復の後には、ペプチドグリカンへのタンパク質の共有結合のためのＬＰＸＴＧ（配列番号１２５）モチーフを含む膜貫通領域がある。
【０１７５】
ＡドメインのＮ１Ｎ２Ｎ３を含むＣｌｆＡおよびＣｌｆＢのリガンド結合領域は、アミノ酸４０〜５５９に広がる。ＣｌｆＡ／ＣｌｆＢのＮドメインは、以下のように割り当てられている：Ｎ１は残基４５〜２２０を包含し、Ｎ２は残基２２９〜３６９を包含し、Ｎ３は残基３７０〜５５９を包含する。Ｄｅｉｖａｎａｙａｇａｍら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２１：６６６０〜６６７２（２００２）を参照されたい。組換えＣｌｆＡ  Ｎ１Ｎ２Ｎ３の調製において、Ｎ１ドメインはプロテアーゼ感受性であることが明らかにされており、容易に切断または加水分解されて、安定なリガンド結合組換え断片としてＮ２３を残す。Ｄｅｉｖａｎａｙａｇａｍら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２１：６６６０〜６６７２（２００２）を参照されたい。同様に、ＣｌｆＢのＮ１ドメインもまたプロテアーゼ感受性であり、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のメタロプロテアーゼによって容易に切断され得ることが実証された（ＭｃＡｌｅｅｓｅ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１、２７６、ｐｐ．２９９６９〜２９９７８）。ＣｌｆＡのＡドメインのフィブリノーゲン結合Ｎ２３断片の結晶構造によって、Ｎ２およびＮ３の両方が逆平行β鎖によって占められていることが明らかになった。逆平行β鎖に加え、Ｎ２ドメインは、１回転のαヘリックスおよび２つの３１０ヘリックスを含有し、Ｎ３ドメインは、３つの３１０ヘリックスを含有する。Ｄｅｉｖａｎａｙａｇａｍら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２１：６６６０〜６６７２（２００２）を参照されたい。
【０１７６】
Ｎ２およびＮ３の配列アラインメントにより、それらの全長にわたり１３％の配列同一性および３６％の配列類似性のみが明らかになる。Ｄｅｉｖａｎａｙａｇａｍら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２１：６６６０〜６６７２（２００２）を参照されたい。Ｎ２ドメインおよびＮ３ドメインのトポロジーは、従来のＩｇＧの折り畳みに類似しており、ＩｇＧの折り畳みの新たな変型であることが提案されている。Ｄｅｉｖａｎａｙａｇａｍら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２１：６６６０〜６６７２（２００２）を参照されたい。
【０１７７】
本明細書において記載される免疫原性組成物において用いられるＣｌｆＡの組換え形態は、Ｎドメインの１つまたは複数を含むＣｌｆＡの断片、例えばＮ１Ｎ２Ｎ３、Ｎ２Ｎ３であり、本明細書において「組換えＣｌｆＡ」または「ｒＣｌｆＡ」と呼ばれる。さらに、あらゆるｒＣｌｆＡは、個別のＮドメインの天然構造および重大なエピトープを維持するが、投与の後に、免疫化された個体の正常なプロセスには干渉しない（すなわち、フィブリノーゲンを結合しない）ものである。突然変異の研究によって、Ｙ３３８Ａ（Ｎ２）の突然変異によって、フィブリノーゲンへのＮ２３断片の結合が完全に排除されたことが示されている。（このＹ３３８Ａ位は、リーダー配列が依然として付着している未熟な形態のポリペプチド配列における３３８位でのチロシンからアラニンへの変化を言う。この変化は、フィブリノーゲンへの結合の欠如を示す、配列番号１２３の突然変異型ＣｌｆＡポリペプチドの成熟形態における３１０位で見ることができる。）Ｄｅｉｖａｎａｙａｇａｍら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２１：６６６０〜６６７２（２００２）を参照されたい。したがって、Ｙ３３８Ａ突然変異を、以下の研究において、ＣｌｆＡの全ての断片に採用した。
【０１７８】
同様に、本明細書において記載される免疫原性組成物において用いられるＣｌｆＢの組換え形態は、Ｎドメインの１つまたは複数を含むＣｌｆＢの断片、例えばＮ１Ｎ２Ｎ３、Ｎ２Ｎ３であり、本明細書において「組換えＣｌｆＢ」または「ｒＣｌｆＢ」と呼ばれる。さらに、あらゆるｒＣｌｆＢは、個別のＮドメインの天然構造および重大なエピトープを維持するが、投与の後に、免疫化された個体の正常なプロセスには干渉しない（すなわち、フィブリノーゲンを結合しない）ものである。（例えば、Ｗａｌｓｈ，Ｅ．Ｊ．ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００８）、１５４、５５０〜５５８を参照されたい）。
【０１７９】
ＣｌｆＡおよびＣｌｆＢ：クローニング戦略の概説
前臨床効力データを生成するために用いられる異なる形態のｒＣｌｆＡタンパク質には、ＨｉｓＣｌｆＡ（Ｎ１２３）、Ｔ７ＣｌｆＡ（Ｎ１２３）、Ｔ７ＣｌｆＡ（Ｎ１２３）、Ｙ３３８Ａ、ＣｌｆＡ（Ｎ２３）、およびＣｌｆＡ（Ｎ２３）Ｙ３３８Ａが含まれる。図１を参照されたい。ＣｌｆＡ遺伝子は、残基４０〜５５９に対応する黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＦＥＳＡ０２３７のＡ領域コード配列を含有する。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）からクローニングされたリーディングフレームを、ベクター（ＭＲＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳ  配列番号１２７）のＮ末端ＨｉｓＴａｇおよびリンカー配列に融合し、それとともに、Ｃ末端に３つのさらなるコード配列（ＫＬＮ）を導入した。（詳細な手順については以下を参照されたい。）このベクターから発現されたタンパク質を全ての実験に用い、その際、これはＨｉｓＣｌｆＡ（Ｎ１２３）と呼ばれる。
【０１８０】
異なる形態のｒＣｌｆＡは、Ａ領域に由来するものであった（黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＦＥＳＡ０２３７により発現されるＣｌｆＡの残基４０〜５５９（最上の行）。ＨｉｓＣｌｆＡ（Ｎ１２３）は、ｐＱＥ３０に含有されるＴ５プロモーターを用いて発現させ、全ての他の形態は、Ｔ７に基づくｐＥＴ発現系を用いて発現させる。
【０１８１】
２つの形態のＣｌｆＢ（Ｔ７ＣｌｆＢのＮ１Ｎ２Ｎ３およびＣｌｆＢのＮ２３）を、前臨床の動物研究に利用した。
【０１８２】
ＣｌｆＡクローニングの手順
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＰＦＥＳＡ０２３７のアミノ酸残基４０〜５５９に対応するＣｌｆＡのコード配列をクローニングし、突然変異Ｙ３３８Ａを導入して、フィブリノーゲンの結合を排除した。突然変異型ＣｌｆＡ遺伝子をＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ発現ベクターｐＥＴ９ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）内に導入して、プラスミドｐＬＰ１１７９を得た。ｐＬＰ１１７９内のＴ７プロモーターおよびコード領域を含む領域のＤＮＡ配列は、配列番号１２４である。発現ベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬＲ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）内に形質転換し、組換えＣｌｆＡを生産した。
【０１８３】
Ｔ７ＣｌｆＡ（Ｎ１２３）Ｙ３３８Ａの構築は、いくつかのステップを伴うものであった。最終的な発現プラスミドｐＬＰ１１７９を構築するために用いられるクローニングステップの概要を、図２に示す。
【０１８４】
ｐＱＥＣｌｆ４０内に存在するｃｌｆＡ  ＤＮＡ配列は、ｐＱＥ３０のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位内に当初クローニングされたＣｌｆＡのアミノ酸残基４０〜５５９に対応する。これは、ＣｌｆＡのＮ末端でＨｉｓＴａｇ融合を生じさせ、Ｃ末端に３つの残基を添加する。（ＡｍｐＲ）ｐＱＥＣｌｆ４０内に存在するＣｌｆＡコード領域を、ＫａｎＲ  ｐＥＴ  ２７ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）内にサブクローニングして、ｐＬＰ１１３７を生じさせた。さらに、アミノ酸残基２２１〜５５９に対応するｃｌｆＡ  ＤＮＡ配列を、ｐＥＴ２７ｂのＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位内にクローニングして、ｐＬＰ１１３４を生じさせた。ＣｌｆＡのＮ末端のＨｉｓＴａｇを、ｐＱＥＣｆ４０のＢａｍＨＩ−ＢｌｐＩ  ＤＮＡ断片をｐＥＴ９ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）内にサブクローニングすることによって、Ｎ末端のＴ７で置き換えて、ｐＬＰ１１５３を生じさせた。ｐＬＰ１１５３内に存在するＴ７ＣｌｆＡ（Ｎ１２３）のコード配列は、ｐＥＴ９ａのＴ７タグの１１個のＮ末端アミノ酸残基を含有し、その後には、リンカー配列の３つのアミノ酸残基とｐＱＥ３０Ｃｌｆ４０内に元々存在する３つのＣ末端リンカー由来残基とがある。Ｙ３３８Ａ突然変異をまず、ｐＬＰ１１３４のＣｌｆＡ（Ｎ２３）コード配列内に導入して、ｐＬＰ１１６８を生じさせた。その後、ｐＬＰ１１６８のＣｌｆＡ（Ｎ２３）のＹ３３８突然変異を含有するＰｓｔＩ−ＳｎａＢＩ  ＤＮＡ断片を、ｐＬＰ１１５３のＴ７ＣｌｆＡ（Ｎ１２３）コード配列のＰｓｔＩ−ＳｎａＢＩに置き換えて、ｐＬＰ１１７１を生じさせた。ｐＬＰ１１７１のＴ７ＣｌｆＡ（Ｎ１２３）Ｙ３３８Ａのコード配列内に存在する内部リボソーム結合部位を、Ｔ７  ｒＣｌｆＡ  Ｙ３３８Ａ  ＯＲＦのＤＮＡ３３９位および３４２位でのサイレント突然変異によって改変し、それぞれＧからＴに、およびＧからＡに変化させた。得られたプラスミドｐＬＰ１１７６を次に、Ｔ７タグとＣｌｆＡコード領域の開始との間の、ｐＱＥ３０Ｃｌｆ４０に元々由来する３つの外来残基を除去するために用いた。リンカーに由来する３つのＣ末端残基もまた、この時点で除去された。
【０１８５】
得られたプラスミドｐＬＰ１１７９（図２および３）によって発現されるｒＣｌｆＡは、ＣｌｆＡ（Ｎ１２３）Ｙ３３８Ａの残基４０〜５５９に融合された１１個のＮ末端アミノ酸のみを含有する。ｐＬＰ１１７９のＴ７プロモーターおよびＴ７  ｒＣｌｆＡ（Ｎ１２３）Ｙ３３８Ａのコード配列を含む領域のＤＮＡ配列は、配列番号１２４である。
【０１８６】
細菌株およびプラスミド
プラスミド骨格ｐＥＴ９ａ（Ｎｏｖａｇｅｎから得た）を用いて、Ｔ７プロモーターのＴ７ＣｌｆＡ（Ｎ１２３）Ｙ３３８Ａを発現するｐＬＰ１１７９を構築した。このプラスミドは、正の選択のためのカナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）を含有する。当初、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主株  ［Ｆ−ｏｍｐＴ  ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−ｍＢ−）ｇａｌ  ｄｃｍ（ＤＥ３）］（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて、Ｔ７ＣｌｆＡ（Ｎ１２３）Ｙ３３８Ａの発現を得た。ＤＥ３という記号は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの発現の誘発とその後のｐＬＰ１１７９内に存在するＣｌｆＡ（Ｎ１２３）Ｙ３３８Ａコード配列に近接するＴ７プロモーターからの転写とに用いられるｌａｃＵＶ５（ＩＰＴＧ誘発性）プロモーターの制御化にあるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有するラムダ溶原菌を意味する。宿主株は、ＢＬ２１（ＤＥ３）溶原性宿主株が大規模な発酵の際に溶解性ファージを誘発し得るという情報を受けると、ｒｅｃＡ  ＢＬＲ（ＤＥ３）宿主株［Ｆ−ｏｍｐＴ  ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−ｍＢ−）ｇａｌ  ｄｃｍΔ（ｓｒｉ−ｒｅｃＡ）３０６：：Ｔｎ１０（ＴｃＲ）（ＤＥ３）］（Ｎｏｖａｇｅｎ）に変化した。
【０１８７】
ＣｌｆＡの生産および精製
ＣｌｆＡの生産のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＬＰ１１７９を、バイオリアクターにおいてグルコースフェドバッチモードで、規定の培地内で成長させた。培養物が３０〜５０の間の光学密度（ＯＤ６００）に達すると、ＩＰＴＧを添加することによってＣｌｆＡの発現を誘発した。培養物を、誘発後３〜１６時間の間に採取した。
【０１８８】
細胞を分離させ、澄明化した可溶性画分を回収した。硫酸アンモニウムを添加した後、フェニル−セファロース樹脂を含有するカラムに材料をアプライし、溶出した。ＣｌｆＡを含有する画分を同定し、透析し、陰イオン交換カラム（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）にロードした。塩勾配で溶出した後、ＣｌｆＡを含有する画分を同定し、限外濾過によって濃縮し、サイズ排除カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５）にロードした。ＣｌｆＡを含有する画分を同定し、プールした。この時点でのＣｌｆＡの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定すると約９８％であった。
【０１８９】
ＣｌｆＢ  Ｎ１Ｎ２Ｎ３のクローニングおよび精製
アミノ酸残基４４〜５４２に対応するＣｌｆＢコード配列をＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ発現ベクターｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）内にクローニングして、プラスミドｐＰＸ１１８９を得た。発現ベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬＲ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）内に形質転換し、組換えＣｌｆＢを生産した。（Ｗａｌｓｈら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５４：５５０〜５５８（２００８）を参照されたい。）
【０１９０】
ＣｌｆＢの生産のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＬＰ１１７９を、バイオリアクターにおいてグルコースフェドバッチモードで、規定の培地内で成長させた。培養物が３０〜５０の間の光学密度（ＯＤ６００）に達すると、ＩＰＴＧを添加することによってＣｌｆＢの発現を誘発した。培養物を、誘発後３〜１６時間の間に採取した。
【０１９１】
細胞を分離させ、澄明化した可溶性画分を回収した。可溶性画分のｐＨを約ｐＨ３．２に調節し、沈殿した不純物を除去した。ＣｌｆＢを含有する可溶性画分のｐＨを約ｐＨ８．０に調節し、透析して塩を除去した。硫酸アンモニウムを添加した後、フェニル−セファロース樹脂を含有するカラムに材料をアプライし、溶出した。ＣｌｆＢを含有する画分を同定し、透析し、陰イオン交換カラム（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）にロードした。塩勾配で溶出した後、ＣｌｆＢを含有する画分を同定し、限外濾過によって濃縮し、サイズ排除カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５）にロードした。ＣｌｆＢを含有する画分を同定し、プールした。この時点でのＣｌｆＢの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定すると約９４％であった。
【０１９２】
（実施例２）抗原：黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈ  Ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣの生産
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の脂質化されたＭｎｔＣのクローニング
組換えＭｎｔＣを、当初、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株Ｍｕ５０からクローニングした。ｒＭｎｔＣコード配列を、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｍｕ５０のゲノムＤＮＡから、ＰＣＲによって増幅した。２対のネステッドプライマーを増幅に用いた（表２）。最初のプライマー対である上流側５’ＳＡ９２６−ＭｎｔＣおよび下流側３’ＳＡ９２６−ＭｎｔＣは、ｒＭｎｔＣのオープンリーディングフレームの上流および下流の配列にアラインする。第２のプライマー組はｒＭｎｔＣのコード配列にアラインし、アミノ酸残基１９〜３０９に対応する配列の増幅を可能にする。制限酵素部位をこれらのプライマーの５’末端に組み込んで、方向性クローニングを容易にした。ＴａＫａＲａ  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｐｒｅｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  ＵＳＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて、Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ、Ｗａｌｔｈａｎ、ＭＡ）内でＰＣＲを実施した。ＱＩＡＥＸ  ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）によってＰＣＲ産物を精製し、適切な制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）で切断し、ａｒａＢＡＤプロモーター駆動型の発現ベクターｐＢＡＤ１８Ｃｍ内にサブクローニングした。このベクターはまた、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）のリポタンパク質Ｐ４のシグナルペプチドを含有する。ＭｎｔＣ  ＰＣＲ産物をインフレームでＰ４シグナルペプチドから下流においてサブクローニングして、ｐＬＰ１１９４を生じさせた。ｐＬＰ１１９４のＭｎｔＣコード領域のＤＮＡ配列を、配列番号１２０に示す。ｐＬＰ１１９４から発現されるＭｎｔＣは、リポタンパク質である。組換えプラスミドＤＮＡを、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＢｉｇＤｙｅ（商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｖ．３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって配列決定し、組換えタンパク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬＲ（ＮＯＶＡＧＥＮ）において発現させて、脂質化されたｒＭｎｔＣを生産した。
【０１９３】
脂質化されたＭｎｔＣの生産および精製
脂質化されたＭｎｔＣの生産のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬＲ／ｐＬＰ１１９４を、バイオリアクターにおいてグルコースフェドバッチモードで、規定の培地内で成長させた。培養物が約６０の光学密度（ＯＤ６００）に達すると、栄養をグルコースとアラビノースとの混合物に切り替えることによって、ｒＭｎｔＣの発現を誘発した。培養物を、誘発の約２４時間後に採取した。
【０１９４】
細胞を分離させ、不溶性画分を回収した。脂質化したＭｎｔＣは、脂質の修飾に起因して、細胞膜に付随していることが明らかになった。洗浄剤（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ＺＷ−３１２）を用いて、ＭｎｔＣを膜画分から抽出した。不溶性の残屑を除去した後、脂質化されたＭｎｔＣは可溶性画分内に見られた。可溶性画分を、混合された態様の樹脂を含有するカラムにアプライし、塩およびｐＨの線形勾配で溶出した。ＭｎｔＣを含有する画分を同定し、プールした。硫酸アンモニウムをプールに添加し、ブチル−セファロースを含有するカラムに材料をアプライし、溶出した。ＭｎｔＣを含有する画分を同定し、脱塩し、陽イオン交換カラム（ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）にロードした。塩勾配で溶出した後、ｒＭｎｔＣを含有する画分を同定し、プールした。
【０１９５】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の脂質化されていないＭｎｔＣのクローニング
脂質化されていないｒＭｎｔＣを発現させるために採用されたＤＮＡ配列を、プラスミドｐＬＰ１１９４からＰＣＲ増幅によって単離した。得られた配列はアミノ酸残基１９〜３０９に対応し、分泌および脂質化を指示するシグナル配列は含有していない。ｐＬＰ１２１５のｒＭｎｔＣコード領域のＤＮＡ配列は、ＤＮＡの配列番号１２０において見られる。
【０１９６】
ｐＬＰ１２１５を生じさせるために、ＭｎｔＣを、ｐＬＰ１１９４からＰＣＲによって増幅した。ｐＬＰ１２１５内に存在するＭｎｔＣのＤＮＡ配列は、アミノ酸残基１９〜３０９に対応し、この構築物の最初のコドンを、遺伝子の増幅において用いられるフォワードプライマー内に導入した。ＰＣＲに用いられるプライマーはまた、５’末端に制限酵素部位を含有しており、そのため、方向性クローニングが容易である（表２）。増幅された遺伝子のＰＣＲおよび精製は、上記のように実施した。精製されたＰＣＲ産物を適切な制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）で切断し、Ｔ７プロモーター駆動型の発現ベクターｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）内にサブクローニングした。組換えプラスミドＤＮＡ  ｐＬＰ１２１５を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＢｉｇＤｙｅ（商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｖ．３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって配列決定し、組み換えタンパク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬＲ（ＤＥ３）において発現させた。ｐＬＰ１２１５のプラスミドＤＮＡを精製し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を形質転換するために用いて、タンパク質の発現を評価した。
【０１９７】
【表２】
0005395264.tif 000003
【０１９８】
ｒＭｎｔＣ構築物を生成するために用いられる合成オリゴヌクレオチド。制限エンドヌクレアーゼ部位に下線が引かれている。太字のヌクレオチドは、脂質化されていないｒＭｎｔＣ構築物の最初のコドンを示す。
【０１９９】
脂質化されていないｒＭｎｔＣの生産および精製
脂質化されていないｒＭｎｔＣの生産のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／ｐＬＰ１２１５を、バイオリアクターにおいてグルコースフェドバッチモードで、規定の培地内で成長させた。培養物が約６０から８０の光学密度（ＯＤ６００）に達すると、ＩＰＴＧを添加することによってｒＭｎｔＣの発現を誘発した。培養物を、誘発の約２４時間後に採取した。細胞を分離させ、澄明化した可溶性画分を回収した。陽イオン交換樹脂（ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を含有するカラムに溶解物をアプライし、塩の線形勾配で溶出した。ＭｎｔＣを含有する画分を同定した。硫酸アンモニウムを添加した後、フェニル−セファロース樹脂を含有するカラムに材料をアプライし、溶出した。溶出した後、ｒＭｎｔＣを含有する画分を同定し、プールし、脱塩した。この時点でのｒＭｎｔＣの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定すると＞９５％であった。
【０２００】
（実施例３）被膜多糖ＣＰ５およびＣＰ８の生産
この実施例において、様々なサイズの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）被膜多糖５型および８型の生産が記載される。ＣＰ５多糖およびＣＰ８多糖の構造を図４に示す。本明細書において記載される方法は、約５０ｋＤａから８００ｋＤａにわたる分子量のＣＰ５およびＣＰ８の生産において効果的である。成長の特徴および生産される被膜の量に基づいて、ＣＰ５の生産には株ＰＦＥＳＡ０２６６が選択され、一方、ＣＰ８の生産には株ＰＦＥＳＡ０００５またはＰＦＥＳＡ０２８６が用いられた。株ＰＦＥＳＡ０００５およびＰＦＥＳＡ０２８６から単離された被膜は同一であることが示された。
【０２０１】
莢膜多糖の生産のために、主に炭素源（ラクトースまたはショ糖）、窒素源としての加水分解黄な粉、および微量の金属からなる複合培地において株を成長させた。株は、バイオリアクターにおいて２から５日間にわたり成長させた。
【０２０２】
コンジュゲートの調製に用いられるＣＰ５およびＣＰ８の精製を、細胞から被膜を放出させ、多糖の分子量を低減させるための、高温および低いｐＨに基づく、２つの異なる方法によって行った。得られた分子量は、加水分解ステップの時間、温度、およびｐＨに依存している。
【０２０３】
ＣＰ５およびＣＰ８の特徴付けを、表３に特定する技術を用いて行った。この手順によって生産される被膜多糖によって、低レベルのタンパク質汚染物質、ＮＡ汚染物質、ペプチドグリカン汚染物質、およびＴＡ汚染物質を伴う、純粋な多糖が生じる。表４および５を参照されたい。
【０２０４】
【表３】
0005395264.tif 000004
【０２０５】
第１の方法において、細胞からの被膜の放出および分子量の低減の後、被膜調製物を酵素カクテル（リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、リゾチーム、およびプロテアーゼ）で処理して不純物を消化する。インキュベーションの後、エタノール（約２５％の最終濃度）を添加することによって、残りの不純物を沈殿させる。残りのエタノールを除去した後、被膜を含有する溶液を陰イオン交換カラム（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）にロードし、塩の線形勾配で溶出した。被膜を含有する画分をプールし、メタ過ヨウ素酸ナトリウムで処理した。この処理によって、残りのテイコ酸汚染物質が酸化的加水分解されたが、ＣＰ５またはＣＰ８は影響されなかった。エチレングリコールを添加することによって反応を抑えた。材料を濃縮し、ｄＨ２０に対してダイアフィルトレーションして、あらゆる残りの試薬および副産物を除去した。
【０２０６】
被膜を生産するために用いられた第２の方法は、様々な細胞由来不純物を消化するための酵素の使用を伴わなかった。この方法において、細胞からの被膜の放出および分子量の低減の後、加水分解された発酵培養液を、精密濾過し、その後に限外濾過およびダイアフィルトレーションすることによって、澄明化した。活性化された炭素で溶液を処理して、不純物を除去した。炭素処理の後、材料をメタ過ヨウ素酸ナトリウムで処理して、残りのテイコ酸を酸化し、その後、プロピレングリコールで抑えた。材料を濃縮し、ｄＨ２０に対してダイアフィルトレーションして、あらゆる残りの試薬および副産物を除去した。
【０２０７】
いずれかの方法を用いて生産された被膜によって、低レベルのタンパク質汚染物質、核酸汚染物質、およびテイコ酸汚染物質を伴う、純粋な多糖が生じる。記載される方法を用いて、加水分解の条件を単に変えるだけで、特定された範囲の所望の高分子量多糖を生産することができる。７０から１５０ｋＤａにわたる特に有利な範囲の高分子量多糖は、多糖を担体タンパク質にコンジュゲートさせることによる免疫原性組成物の作製において有用である。
【０２０８】
本明細書において記載される方法によって得られ得る高分子量被膜多糖の例を、以下の表４に示す。精製された高めのＭＷのＣＰ５のバッチはまた、ＴＡ、ペプチドグリカンが存在しないこと、および残りのタンパク質が少ないことにより示されるように、高い純度を有していた。表４を参照されたい。これらの例における分子量の範囲は、１３２．７ｋＤａから８００ｋＤａにわたり、精製された多糖は、９０〜１００％にわたり高度にＯ−アセチル化されていて、１００％Ｎ−アセチル化されていた。表４を参照されたい。
【０２０９】
本明細書において記載される方法によって得られ得る低めの分子量の被膜多糖の例を、以下の表５に示す。精製された低めのＭＷのＣＰ８のバッチは、テイコ酸（ＴＡ）、ペプチドグリカンが存在しないこと、および残りのタンパク質が少ないことにより示されるように、高い純度を有していた。表５を参照されたい。低めの分子量の範囲は、２０．４ｋＤａから６５．１ｋＤａにわたり、精製された多糖は、７５〜９６％にわたり高度にＯ−アセチル化されていた。核酸汚染のレベルは低く、０．５％〜２．４５％であった。表５を参照されたい。
【０２１０】
【表４】
0005395264.tif 000005
【０２１１】
【表５】
0005395264.tif 000006
【０２１２】
莢膜多糖の分子量の選択
この動態分析によって、広範な分子量の被膜多糖が本明細書において記載される方法によって生成され得ることが実証される。まず、大き目の多糖を細菌細胞によって生産し、その後、所望の分子量範囲を選択することができ、次に、加熱および加水分解のステップのｐＨおよび熱の条件を操作することによって精製することができる。
【０２１３】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）発酵培養液の熱処理は、発酵とＣＰの回収との間のプロセスステップであった。このプロセスステップは、熱を用いて、特定の期間にわたり、ｐＨ調節された培養液を処理する。低いｐＨでの熱処理の目的は、細胞を死滅させること、エンテロトキシンを不活化させること、細胞に結合した多糖を放出させること、および分子量を所望のサイズに低減させることであった。これらの目的のうち、分子量の低減は、このステップにおいて必要なプロセス時間の観点から、最も遅いものであった。したがって、他の目的は、考慮される処理時間内に必ず達成された。
【０２１４】
熱処理
様々な分子量範囲の被膜多糖を選択するための温度およびｐＨの条件が決定された。培養液のｐＨを、濃硫酸で調節した。次に、培養液の温度を設定値まで上昇させた。熱処理時間は、温度が設定値に達するとすぐに開始した。所望の処理時間に達すると、培養液を室温まで冷却した。プロセス中の試料を採取して、それぞれＨＰＬＣ系およびＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ系によって多糖の濃度および分子量を決定した。ＭＷデータを動態分析において用いた。ＭＷのプロフィールは、ＣＰ５ではｐＨ４．０、４．５、および５．０で、ＣＰ８ではｐＨ３．５、４．０、および５．０で、経時的に決定した。図５Ａおよび５Ｂを参照されたい。
【０２１５】
多糖の弱酸加水分解の動態を、プロセスから得られた精製されたＣＰ−５およびＣＰ−８を用いて行った。精製された多糖の溶液を、実験のために、硫酸を用いて所望のｐＨに調節した。試料を、精密温度制御系を備えた油浴内に置いた。各試料を所定の時間間隔で取り出し、アイスバケット内で急冷した。実験の最後に、１ＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）のアリコートを試料に添加して、ｐＨを再び約７に調節した。試料をＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ系によって分析した。ＭＷデータを動態分析において用いた。ＭＷのプロフィールに対する温度の効果を、ＣＰ５ではｐＨ４．５で、ＣＰ８ではｐＨ３．５で、経時的に決定した。図６Ａおよび６Ｂを参照されたい。この酸加水分解手順は、発酵槽での培養を用いて、または精製の中間段階で、または本明細書において示されるように、精製された多糖を用いて、実行することができる。超音波処理またはせん断などの他の分子量低減ステップが、同様に実行され得る。
【０２１６】
結果
熱処理におけるＭＷの低減に対するｐＨの効果を、ＣＰ−５およびＣＰ−８についてそれぞれ図５Ａおよび５Ｂに示す。低いｐＨが多糖のサイズの低減においてより効果的であったことを見ることができる。データはまた、ＣＰ−５が同一のｐＨでＣＰ−８よりも加水分解しにくかったことを示唆する。ＣＰ８のプロフィールを考慮すると、３００ｋＤａから６００ｋＤａの間の分子量範囲が、１５分間から１２０分間の間にわたり９５℃でｐＨ５を用いることにより生じ得る。同様に、１５分間から１２０分間の間にわたり９５℃でｐＨ４を選択することにより、２５０ｋＤａから４５０ｋＤａの間のＣＰ８多糖の分子量範囲が得られ得る。さらに、１５分間から１２０分間の間にわたり９５℃でｐＨ３．５を選択することにより、１２０ｋＤａから４５０ｋＤａの間のＣＰ８多糖の分子量範囲が得られ得る。
【０２１７】
ＭＷの低減に対する温度の効果を、回収プロセスから回収された精製された多糖を用いて行った。結果を図６Ａおよび６Ｂに示す。示されるように、温度が高いほど、加水分解の速度が速く、経時的に生産される多糖の分子量の範囲が広い。同一のｐＨで、９５℃に対して、低い温度である５５℃を用いると、狭い範囲の多糖分子量が生じる。
【０２１８】
さらに、図７は、精製されたＣＰ５およびＣＰ８の分子量と弱酸加水分解の処理時間との間の相関を実証している。精製された多糖は、先に詳述した回収プロセスから得られる最終生成物である。図７に示すように、ｐＨ４．５での黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＦＥＳＡ０２６６株の熱処理の時間を増大させることにより、より小さい分子量のＣＰ５多糖が生成し、一方、ｐＨ４．５で熱処理時間を短くすると、より大きな分子量のＣＰ５多糖が生成する。ＣＰ５多糖のサイズは、低いｐＨ（４．５）では、熱処理時間の長さに応じて、約９０ｋＤａから約２２０ｋＤａにわたった。同様に、ｐＨ３．５での黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＦＥＳＡ０００５株の熱処理の時間を増大させることにより、より小さい分子量のＣＰ８多糖が生成し、一方、ｐＨ３．５で熱処理時間を短くすると、より大きな分子量のＣＰ８多糖が生成する。ＣＰ８多糖のサイズは、低いｐＨ（３．５）では、熱処理時間の長さに応じて、約８０ｋＤａから約２２０ｋＤａにわたった。この研究において示されるように、低いｐＨでの熱処理の時間と精製されたＣＰ５多糖およびＣＰ８多糖のサイズとの間の相関によって、特定の範囲の分子量を有する精製された多糖を生産するために必要な処理時間の推定が可能になる。
【０２１９】
上記で実証されるように、ＣＰ５およびＣＰ８の両方で、２０ｋＤａから８００ｋＤａ超の被膜多糖の全範囲の分子量が生産、放出、および精製され得ることに留意することが重要である。記載される方法は、特定の範囲の所望の高分子量被膜多糖を生産するために用いることができる。７０から１５０ｋＤａにわたる分子量を有する、得に有利な範囲の高分子量被膜多糖５型および８型を、これらの方法から生成することができる。表６を参照されたい。被膜多糖のこの範囲の分子量は、多糖を担体タンパク質にコンジュゲートさせることによる免疫原性組成物の作製において有用である。あるいは、高分子量被膜多糖のこの有利な範囲は、８０から１４０ｋＤａのＣＰ５およびＣＰ８にわたる。表６を参照されたい。高分子量被膜多糖ＣＰ５およびＣＰ８の別の有利な範囲は、９０から１３０ｋＤａ、または９０から１２０ｋＤａのＣＰ５およびＣＰ８である。表６を参照されたい。約１００から１４０ｋＤａの分子量範囲を有するＣＰ５被膜多糖を生成するために用いられる条件は、９５℃、ｐＨ４．５で１３５分間というものである。約８０から１２０ｋＤａの分子量範囲を有するＣＰ８被膜多糖を生成するために用いられる条件は、９５℃、ｐＨ３．５で３００分間というものである。
【０２２０】
【表６】
0005395264.tif 000007
【０２２１】
（実施例４）ＣＲＭ１９７への被膜多糖ＣＰ５およびＣＰ８のコンジュゲーション
この実施例は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＣＰ５−ＣＲＭ１９７コンジュゲートおよびＣＰ８−ＣＲＭ１９７コンジュゲートの生産において用いられるプロセスおよび特徴付けアッセイを記載する。いくつかのコンジュゲーション化学を、担体タンパク質への黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）被膜多糖ＣＰ５およびＣＰ８のコンジュゲーションについて評価した。ＰＤＰＨ（３−２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジン）を用いるコンジュゲーションによって、チオエーテル共有結合が生じ、ＣＤＩ／ＣＤＴ（１，１−カルボイルジイミダゾール／１，１−カルボイル−ジ−１，２，４−トリアゾール）によって、ＣＰと担体タンパク質との間の１つの炭素または０個の炭素のリンカーが生じる。
【０２２２】
ＰＤＰＨコンジュゲーション化学によるＣＲＭ１９７へのＣＰのコンジュゲーション
ＰＤＰＨコンジュゲーション化学は、多糖の活性化、チオール保護基の除去、活性化された多糖中間体の精製、ＣＲＭ１９７タンパク質の活性化および精製、ならびに活性化された成分のコンジュゲーションおよびその後の精製を伴う、多段階プロセスである。リンカーを含有するチオール基を多糖に導入し、ハロアセチル基をＣＲＭ１９７タンパク質担体に導入した後、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣＰ５多糖およびＣＰ８多糖を、チオエーテル結合を介してタンパク質担体に結合させた。ブロモ酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとアミン基とを反応させることによって、ブロモアセチル基をＣＲＭ１９７タンパク質内に導入した。チオール化されたＣＰを生成するために、ＣＰ内のＮ−アセチルマンノサミノウロン酸の、カルボジイミドで活性化されたカルボキシレート基を、スルフィドリル反応性のヒドラジンヘテロ二機能性のリンカーである３−（２−ピリジルジチオ）プロピニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）にカップリングさせた。ＤＴＴでの還元によって生成し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラムでのＳＥＣによって精製した、ＰＤＰＨでチオール化されたＣＰのチオールを、活性化されたタンパク質のブロモアセチル基と反応させることによって、ＣＰとタンパク質との間の臭素の転移によって形成されたチオエーテル共有結合が生じた。未反応のブロモアセチル基を、システアミン塩酸塩（２−アミノエタンチオールヒドロクロリド）で「キャップ」した。反応混合物を次に濃縮し、ダイアフィルトレーションした。残りのコンジュゲートしていないブロモアセチル基を、システアミン塩酸塩でキャップし、それによって、確実に、反応性のブロモアセチル基がコンジュゲーション後に残らないようにした。これによって、臭素の転移の後に、システアミンのチオール末端とリジン残基上のアセチル基との間の共有結合が形成された。
【０２２３】
ＰＤＰＨでの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖のチオール化
多糖をまず、ＰＤＰＨでのチオール化によって活性化した。多糖を新たに調製したＰＤＰＨストック溶液（ＤＭＳＯ内に２５０ｍｇ／ｍＬ）、ＥＤＡＣストック溶液（ｄｉＨ２Ｏ内に９０ｍｇ／ｍＬ）、およびＭＥＳ緩衝液ストック溶液（０．５Ｍ、ｐＨ４．８５）と混合して、０．１ＭのＭＥＳならびに１ｍＬ当たり２ｍｇおよび４ｍｇのＣＰという最終濃度とし、一方で、ＣＰ：ＰＤＰＨ：ＥＤＡＣの重量比をＣＰ５では１：５：３に、ＣＰ８では１：０．６：１．２５に維持した。この混合物を室温で１時間にわたりインキュベートし、次に、４℃から８℃の間で３５００ＭＷＣＯ透析装置を用いて１０００倍の容積の蒸留Ｈ２Ｏに対して４回透析して、未反応のＰＤＰＨを除去した。０．２ＭのＤＴＴで、ＰＤＰＨに結合した多糖を作製し、室温で３時間にわたり、または４℃から８℃の間で一晩、インキュベートした。過剰なＤＴＴおよび反応副産物を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５樹脂および移動相としての蒸留水を用いるＳＥＣによって、活性化された多糖から分離した。ＤＴＤＰアッセイによって、チオール基について画分をアッセイし、カラムの空隙容積の近辺に溶出されたチオール陽性画分をプールした。画分のプールをＰＡＨＢＡＨアッセイおよびＯ−アセチルアッセイによってアッセイして、活性の程度を決定し、これは、チオール基を含有する反復単位のモル濃度パーセント（チオールのモル濃度／反復単位のモル濃度）として表される。活性化された多糖を凍結乾燥し、コンジュゲーションに必要となるまで−２５℃で保管した。
【０２２４】
担体タンパク質の活性化
個別に、担体タンパク質をブロモアセチル化によって活性化した。ＣＲＭ１９７を、１０ｍＭのリン酸緩衝した０．９％ＮａＣｌ（ｐＨ７）（ＰＢＳ）で５ｍｇ／ｍＬに希釈し、次に、１Ｍのストック溶液を用いて、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ７．０）を作製した。ブロモ酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＡＡＮＳ）を、２０ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯのＢＡＡＮＳストック溶液を用いて、１：０．２５（ｗ：ｗ）のＣＲＭ１９７：ＢＡＡＮＳ比で添加した。この反応混合物を、４から８℃の間で１時間にわたりインキュベートし、次に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５上でのＳＥＣを用いて精製した。精製された、活性化されたＣＲＭ１９７を、Ｌｏｗｒｙアッセイによってアッセイして、タンパク質濃度を決定し、次にＰＢＳで５ｍｇ／ｍＬに希釈した。抗凍結剤としてショ糖を５％ｗｔ／容積まで添加し、活性化されたタンパク質を凍結し、コンジュゲーションに必要となるまで−２５℃で保管した。
【０２２５】
カップリング反応
活性化された被膜多糖および活性化された担体タンパク質を調製すると、２つをコンジュゲーション反応において組み合わせた。凍結乾燥およびチオール化された多糖を、０．１６Ｍのホウ酸（ｐＨ８．９５）内に溶解し、解凍したブロモアセチル化されたＣＲＭ１９７および蒸留水と混合して、０．１Ｍのホウ酸塩、１：１ｗｔ／ｗｔ比のＣＲＭ１９７：ＣＰ、ならびにＣＰ８では１ｍｇ／ｍＬの多糖およびＣＰ５では２ｍｇ／ｍＬの多糖という最終濃度とした。この混合物を室温で１６から２４時間の間にわたりインキュベートした。タンパク質上の未反応のブロモアセチル基を、０．１Ｍのホウ酸塩（ｐＨ８．９５）内に溶解したシステアミンストック溶液１３５ｍｇ／ｍＬを用いて、１：２（ｗｔ／ｗｔ）のＣＲＭ１９７：システアミン比でシステアミン塩酸塩を添加することによって、キャップし、室温で４時間にわたりインキュベートした。被膜多糖−ＣＲＭ１９７コンジュゲート（コンジュゲート）を、１００Ｋポリエーテルスルホン限外濾過装置を用いて、０．９％ＮａＣｌに対して５０倍ダイアフィルトレーションすることによって精製した。
【０２２６】
ＰＤＰＨでのＣＰ５およびＣＰ８のチオール化研究の再現性の結果は、ＣＰ５の活性化の程度が１１から１９％の範囲であることを実証し、前記範囲は、１０個のＣＰ反復単位当たりおよそ１つのリンカー分子から、５個の反復単位当たり１つのリンカー分子に相当する。ＣＰ８の活性化は１２から１６％の範囲であり、これは、ＣＰ５の活性化に非常に類似していた。
【０２２７】
ＣＲＭ１９７のリジン残基のブロモアセチル化は非常に一貫しており、３９個の利用可能なリジンのうち１９から２５個のリジンの活性化をもたらした。この反応は、高収量の活性化されたタンパク質を生産した。
【０２２８】
ＣＤＩ／ＣＤＴコンジュゲーション化学によるＣＲＭ１９７へのＣＰのコンジュゲーション
ＣＤＩおよびＣＤＴは、多糖が無水環境（ＤＭＳＯ）内で活性化されて、利用可能なヒドロキシルを有するカルバミン酸イミダゾール部分またはカルバミン酸トリアゾール部分、およびカルボン酸を有するアシルイミダゾール部分またはアシルトリアゾール部分を形成する、１段階のコンジュゲーションプロセスを提供する。タンパク質担体（ＤＭＳＯ内）を添加すると、リジンによるイミダゾールまたはトリアゾールの求核置換、ならびにカルバメート結合（活性化されたヒドロキシルで）およびアミド結合（活性化されたカルボン酸で）が生じる。反応溶液は、水性溶液内に１０倍希釈されて、未反応の活性化基が除去され、その後、ダイアフィルトレーションによって精製される。
【０２２９】
両コンジュゲーション化学は、担体タンパク質に共有結合したＣＰを生産し、これは、サイズ排除クロマトグラフィーから得られる画分における糖およびタンパク質の存在によって、ならびにグリコールアルデヒドによりキャップされたコンジュゲートまたはシステアミン塩酸塩によりキャップされたコンジュゲートのアミノ酸分析によって示された。
【０２３０】
２０から４０ｋＤａの範囲の多糖サイズを有する両莢膜血清型についての、ＰＤＰＨ化学およびＣＤＩ／ＣＤＴ化学の両方によって調製されたコンジュゲートのいくつかのロットの調製物から得られる結果の概要を、以下の表７に示す。遊離被膜多糖、ＣＰ：タンパク質の比、およびこれらの２つのコンジュゲーション方法によって生成されるコンジュゲートの収量に有意な差はなかった。コンジュゲートしたＣＰの抗原性は、コンジュゲートと天然ＣＰとの間の同一性沈降素系統により示されるように、コンジュゲーションによっては変化しなかった。
【０２３１】
【表７】
0005395264.tif 000008
【０２３２】
上記に示されるように、本明細書において記載される方法は、特定の範囲の所望の高分子量被膜多糖を生産するために用いることができる。この研究の目的は、高分子量の事前に選択された範囲から、免疫原性組成物において用いるための濾過および精製されたＣＰであり得るコンジュゲートを調製することであった。この実施例において、ＣＰ５被膜多糖の分子量が約９０ｋＤａから約１２０ｋＤａにわたる８つのバッチが選択され、チアゾール（ＣＤＴ）での活性化を用いてコンジュゲーションが行われた。表８を参照されたい。得られたコンジュゲートの分子量は、１５３３ｋＤａから２６５６ｋＤａにわたった。ＣＲＭ１９７当たりのコンジュゲートしたリジンの数は、高くて２２から低くて１５にわたった。遊離被膜多糖は、高くて１８％から低くて１１％にわたった。表８を参照されたい。
【０２３３】
【表８】
0005395264.tif 000009
【０２３４】
表９は、ＣＰ８被膜多糖の分子量が約８７ｋＤａから１１３ｋＤａにわたり、イミダゾールコンジュゲーション化学を用いた、ＣＰ８コンジュゲートの分析をまとめたものである。得られたコンジュゲートの分子量は、５９５ｋＤａから９４３ｋＤａにわたった。ＣＲＭ１９７当たりのコンジュゲートしたリジンの数は、高くて９から低くて３にわたった。遊離被膜多糖は、高くて６％から低くて２％にわたった。表９を参照されたい。
【０２３５】
【表９】
0005395264.tif 000010
【０２３６】
両コンジュゲーション化学は、担体タンパク質に共有結合したＣＰを生産する。遊離被膜多糖、ＣＰ：タンパク質の比、およびこれらの２つの方法によって生成されるコンジュゲートの収量に有意な差はなかった。
【０２３７】
（実施例５）ＣｌｆＡのポリペプチド断片Ｎ１、Ｎ２、およびＮ３の配列多様性
この実施例において、様々な由来源から得られる疾患原因単離体から得られるＣｌｆＡポリペプチド断片Ｎ１、Ｎ２、およびＮ３のタンパク質配列の不均一性を評価した。ＣｌｆＡ遺伝子を、複数の病状に関連する黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株から配列決定した。さらなる株から得られる配列情報を、ＧｅｎＢａｎｋから得て、関連する株から配列を生成した。表１０は、異なるＣｌｆＡ配列を列挙する。
【０２３８】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の異なる疾患原因株から得られるＣｌｆＡタンパク質の配列アラインメントを、図８Ａ〜８Ｅに示す。ＭＵＳＣＬＥを用いてタンパク質配列をアラインした。Ｅｄｇａｒ，Ｒ．Ｃ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２（５）：１７９２〜１７９７（２００４）を参照されたい。ＳＨＯＷＡＬＩＧＮを用いてアラインメントを表示した。Ｒｉｃｅ，Ｐ．ら、「ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ」Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１６（６）：２７６〜２７７（２０００）を参照されたい。配列の多くは、変化を伴わずに複数回再発した。明瞭性のために、それぞれの固有の配列は、アラインメントにおいて１回のみ示した。図８Ａ〜８Ｅを参照されたい。固有の配列のみを配列表に含めた。例えば、ＣｌｆＡ＿００１のタンパク質配列は、変化を全く伴わずに、複数の異なる株から得られた。図８Ａ〜８Ｅを参照されたい。あらゆる配列について、配列表番号はまた、表１０：ＣｌｆＡ株および配列表からも得ることができる。表１０は、この同一のＣｌｆＡ＿００１タンパク質配列を含有していた１つの例となる株を列挙する。この配列は、図８Ａ〜８Ｅのアラインメントの最初の行において示される。ＣｌｆＡ抗原の固有の配列のこのアラインメントは、多型がＣｌｆＡのＡ領域全体（Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３）に分布していたことを示す。いくつかのケースにおいて、ＣｌｆＡのあらゆる所与の固有のタンパク質配列で、同一のタンパク質をコードする２つ以上のヌクレオチド配列が発見された。最も頻繁に生じるＤＮＡ配列のみを、配列表および表１０に含めた。ＣｌｆＡでは、ＣｌｆＡ＿００３、ＣｌｆＡ＿００５、ＣｌｆＡ＿００８、ＣｌｆＡ＿００９、ＣｌｆＡ＿０１３、ＣｌｆＡ＿０１４、ＣｌｆＡ＿０１５、ＣｌｆＡ＿０１６、ＣｌｆＡ＿０１７、ＣｌｆＡ＿０１８、ＣｌｆＡ＿０１９、ＣｌｆＡ＿０２０、ＣｌｆＡ＿０２１、ＣｌｆＡ＿０２２、ＣｌｆＡ＿０２３、およびＣｌｆＡ＿０２４という配列が本明細書において開示され、ＧｅｎＢａｎｋにおいては見られない。
【０２３９】
【表１０】
0005395264.tif 000011
【０２４０】
ＣｌｆＡタンパク質配列の系統発生を試験し、系統樹を構築した。ＣｌｕｓｔａｌＷを用いて配列をアラインした。Ｃｈｅｎｎａ  Ｒ、Ｓｕｇａｗａｒａ  Ｈ、Ｋｏｉｋｅ  Ｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．３１（１３）：３４９７〜３５００（２００３）を参照されたい。近隣結合樹を１０００回ブートストラップにかけ、ＭＥＧＡ４．０で表示した。Ｔａｍｕｒａ  Ｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．２４（８）：１５９６〜１５９９（２００７）を参照されたい。枝上に示されるブートストラップ値は、その枝が１０００回の試行において再現された回数である。５００（５０％再現性）未満の値は、あまり裏付けられていないと考えられる。
【０２４１】
ＣｌｆＡ配列は、２つの主要な枝を有する系統樹を形成する。図９を参照されたい。これらの２つの群の分離は、系統発生において非常によく裏付けられている。１つの枝（上部）は９個の配列を含み、これらは、互いに極めて緊密に関連している（９６〜９９％の同一性）が、候補配列ｃｌｆＡ＿０１１に対してはより遠い関連を有し、９１〜９２％の同一性である。ｃｌｆＡ＿０１１を含む第２の群は、より多様であり、この群における系統発生はあまり裏付けられていない。これらのタンパク質配列は、互いに９３〜９９％同一である。
【０２４２】
（実施例６）ＣｌｆＢのポリペプチド断片Ｎ１、Ｎ２、およびＮ３の配列多様性
この実施例において、様々な由来源から得られる９２個の疾患原因単離体から得られるＣｌｆＢのＮ１、Ｎ２、およびＮ３ポリペプチド断片のタンパク質配列の不均一性を評価した。ＣｌｆＢ遺伝子を、複数の病状に関連する黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株から配列決定した。表１１を参照されたい。さらなる株から得られる情報を、ＧｅｎＢａｎｋから得て、さらなる配列を生成した。
【０２４３】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の異なる疾患原因株から得られるＣｌｆＢタンパク質の配列アラインメントを、図１０Ａ〜１０Ｅに示す。ＭＵＳＣＬＥを用いてタンパク質配列をアラインした。Ｅｄｇａｒ，Ｒ．Ｃ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２（５）：１７９２〜１７９７（２００４）を参照されたい。ＳＨＯＷＡＬＩＧＮを用いてアラインメントを表示した。Ｒｉｃｅ，Ｐ．ら、「ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ」Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１６（６）：２７６〜２７７（２０００）を参照されたい。図１０Ａ〜１０ＥのＣｌｆＢアラインを参照されたい。ＣｌｆＡのように、配列の多くは、変化を伴わずに複数回再発した。明瞭性のために、それぞれの固有の配列は、アラインメントにおいて１回のみ示した。図１０Ａ〜１０Ｅを参照されたい。固有のＣｌｆＢ配列のみを配列表に含めた。例えば、ＣｌｆＢ＿００６の配列は、変化を全く伴わずに、複数の異なる株から得られた。この配列は、図１０Ａ〜１０Ｅにおけるアラインメントの最初の行において示される。あらゆる配列について、配列表番号はまた、表１１からも得ることができる。ＣｌｆＢ抗原のそれぞれの固有の配列のこのアラインメントは、多型がＣｌｆＢのＡ領域全体（Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３）に分布していたことを示す。ＣｌｆＡと同様に、ＣｌｆＢのあらゆる所与の固有のタンパク質配列で、同一のタンパク質をコードする２つ以上のヌクレオチド配列が発見された。最も頻繁に生じるＤＮＡ配列のみを、配列表および表１１に含めた。ＣｌｆＢでは、ＣｌｆＢ＿００１、ＣｌｆＢ＿００４、ＣｌｆＢ＿００５、ＣｌｆＢ＿０１０、ＣｌｆＢ＿０１１、ＣｌｆＢ＿０１３、ＣｌｆＢ＿０１４、ＣｌｆＢ＿０１５、ＣｌｆＢ＿０１６、ＣｌｆＢ＿０１７、ＣｌｆＢ＿０１８、ＣｌｆＢ＿０１９、ＣｌｆＢ＿０２０、ＣｌｆＢ＿０２１、ＣｌｆＢ＿０２２、ＣｌｆＢ＿０２３、およびＣｌｆＢ＿０２４という配列が本明細書において開示され、ＧｅｎＢａｎｋにおいては見られない。系統樹を図１１に示す。
【０２４４】
【表１１】
0005395264.tif 000012
【０２４５】
（実施例７）黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の疾患原因クローンの配列多様性
この実施例において、様々な由来源から得られる１０４個の疾患原因単離体から得られるＭｎｔＣ遺伝子のタンパク質配列の不均一性を評価した。ＭｎｔＣ遺伝子を、複数の病状に関連する黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の株から配列決定した。表１２を参照されたい。さらなる株から得られる情報を、ＧｅｎＢａｎｋから得て、株の配列を生成した。
【０２４６】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の異なる疾患原因株から得られるＭｎｔＣタンパク質の配列アラインメントを、図１２Ａ〜１２Ｂに示す。ＭＵＳＣＬＥを用いてタンパク質配列をアラインした。Ｅｄｇａｒ，Ｒ．Ｃ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２（５）：１７９２〜１７９７（２００４）を参照されたい。ＳＨＯＷＡＬＩＧＮを用いてアラインメントを表示した。Ｒｉｃｅ，Ｐ．ら、「ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ」Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１６（６）：２７６〜２７７（２０００）を参照されたい。図１２を参照されたい。ＣｌｆＡのように、配列の多くは、変化を伴わずに複数回再発した。明瞭性のために、それぞれの固有の配列は、アラインメントにおいて１回のみ示した。図１２を参照されたい。固有のＭｎｔＣ配列のみを配列表に含めた。例えば、ＭｎｔＣ＿００１の配列は、変化を全く伴わずに、異なる株から得られた。図１２を参照されたい。この配列は、図１２におけるアラインメントの最初の行において示される。あらゆる配列について、配列表番号はまた、表１２からも得ることができる。最も頻繁な対応するＤＮＡ配列のみを、配列表に含めた。ＭｎｔＣでは、ＭｎｔＣ＿００２、ＭｎｔＣ＿００６、ＭｎｔＣ＿００７、ＭｎｔＣ＿００８、およびＭｎｔＣ＿００９という配列が本明細書において開示され、ＧｅｎＢａｎｋにおいては見られない。
【０２４７】
【表１２】
0005395264.tif 000013
【０２４８】
（実施例８）感染の際のインビボでのＣｌｆＡ、ＣＰ５、ＣＰ８、およびＭｎｔＣの表面発現
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、様々なヒト感染の原因である。その結果、この細菌は、感染に必要な病原性因子の差次的な発現によって、異なる環境ニッチに適応するはずである。標的抗原の発現を、感染の原発部位での抗原の発現を測定するための創傷モデル、血液内での抗原の発現をモニタリングする菌血症モデル、および栄養／酸素限定条件での抗原発現をモニタリングする留置チャンバモデルという３つのインビボでの齧歯動物アッセイにおいて研究して、感染の際のそれらの発現を評価した。これらのモデル全てで、齧歯動物を、研究部位で細菌によってチャレンジした。感染の後、細菌を様々な時点で採取し、抗原の発現（ＣｌｆＡ、ＣＰ５、ＣＰ８、ＭｎｔＣ）を、免疫蛍光顕微鏡法（創傷および菌血症）またはフローサイトメトリー（チャンバ）を用いて評価した。
【０２４９】
材料および方法
創傷モデルにおける発現
創傷感染実験は、１群あたり５頭の動物、かつ最大５群で、１実験当たり最大２５頭の動物から構成される。６から８週（ｗｋ）齢のオスのＣ５７ＢＬ／６マウスを手術して、大腿筋の切開部内に輪状の縫合糸を包埋した。これにより、細菌の付着のための外来の身体構造が提供され、ブドウ球菌による創傷感染をもたらすために必要な最少感染用量が有意に低減する。５μＬの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または無菌生理食塩水を、４−０シルクの深部組織構造下の切開部内に導入した。皮膚を４−０Ｐｒｏｌｅｎｅ構造または外科用接着剤（例えば、シアノアクリレート）で閉じた。動物を感染後３０分間から１０日間の間の時点で安楽死させ、大腿筋を切除し、ホモジナイズし、細菌計数した。感染部位の細菌を、免疫蛍光（ＩＦ）共焦点顕微鏡法によって、抗原の発現について分析した。
【０２５０】
菌血症モデルにおける発現
１０頭の４週齢のＣＤ−１マウスまたはＢａｌｂ／Ｃマウスからなる群を、０週目、３週目、および６週目に、皮下注射によって、１μｇのタンパク質またはＣＰコンジュゲートで免疫化した。動物を０週目および８週目に出血させ、その後、ＴＳＢ内の後期対数期まで成長した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）で腹腔内チャレンジした。チャレンジの３時間後に動物を安楽死させ、ＩＦ共焦点顕微鏡法のために血液を回収した。
【０２５１】
留置透析管モデルにおける発現
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の単離体をＴＳＡプレート上で、３７℃で一晩成長させた。細菌をプレートから擦り取り、無菌ＰＢＳ内に再懸濁し、ＯＤ６００を１、すなわちおよそ１０９コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍＬに調節した。細菌を１０３ｃｆｕ／ｍＬの濃度まで希釈し、透析管内に接種した。懸濁液のアリコートを平板培養して、ｃｆｕの実際の数値を決定した。３．５ｋＤａのＭＷＣＯを有する透析管を、７０％エタノール内で３０分間にわたり滅菌し、その後、滅菌水内で十分にすすぎ、次に無菌生理食塩水内で十分にすすぐことによって、移植のために調製した。細菌懸濁液の２ｍＬのアリコートを透析管に移し、袋を結んで閉じ、次に、滅菌生理食塩水で十分にすすいだ。オスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（６週齢）を麻酔し、２〜３ｃｍの切開部を背側正中線に沿って形成した。下層の組織から皮膚を穏やかに分離することによって、切開部でポケットを生じさせた。管をポケット内に移植し、外科用ステープルを用いて皮膚を閉じた。２４時間後、ラットを安楽死させ、管を取り外し、フローサイトメトリー分析のために細菌を回収した。
【０２５２】
免疫蛍光顕微鏡法（ＩＦ）
５頭のマウスの血液を、氷冷したクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）内にプールした（最終濃度０．４％）。真核細胞を１％ＮＰ−４０（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）ですすいだ。細菌をＰＢＳで洗浄し、ウサギの免疫血清または免疫前血清（１：１００）と共に４℃で一晩インキュベートし、ＡＬＥＸＡ４８８にコンジュゲートしたヤギαウサギ抗体（１：２５０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で検出した。標識された細菌を顕微鏡スライド上で乾燥させ、カバースリップをＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  ＨａｒｄＳｅｔ培地（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）と共に載せた。Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＬスペクトル共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）で画像を得た。
【０２５３】
フローサイトメトリー分析
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の単離体を、ラット透析管モデルの手順において記載したように成長させた。およそ１０７個の細菌細胞を、染色緩衝液（１０％ヤギ血清を有するＨａｎｋｓ平衡塩溶液）内で、氷上で１時間にわたりブロックした。細菌細胞を１００００ｒｐｍで５分間にわたり遠心分離し、上清を除去し、マウス抗体またはアイソタイプ対照抗体と共に、氷上で３０分間にわたりインキュベートした。次に、細胞を洗浄し、ＦＩＴＣにコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で、氷上で３０分間にわたり染色した。細菌を染色緩衝液で洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで固定し、データを得、ＦＡＣＳ  ＣａｌｉｂｅｒフローサイトメーターおよびＣｅｌｌ探求ソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．）を用いて分析した。全部で３００００の事象を各サンプルについて回収した。
【０２５４】
【表１３】
0005395264.tif 000014
【０２５５】
【表１４】
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【０２５６】
【表１５】
0005395264.tif 000016
【０２５７】
結果
１９個の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）単離体の組み合わせを、感染の際の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細胞表面上でのＣｌｆＡ、ＣＰ５、ＣＰ８、またはＭｎｔＣの発現について試験した（表１３ａ、１３ｂ、および１３ｃ）。これらの単離体は、最近の臨床的に関連する株を含み、ＭＬＳＴでモニタリングすると多様であった。抗原の発現は、株、時点、および感染モデルに依存した。異なるインビボ環境（血流と創傷）における単離体間の抗原発現における変化は、様々な異なる感染における広範なブドウ球菌単離体を誘発するための多抗原免疫原性組成物の使用を裏付けるものである。抗原は、感染の最初の２４時間以内に表面に発現し、したがって、抗ブドウ球菌免疫原性組成物のための有効な成分である。タンパク質抗原ＣｌｆＡおよびＭｎｔＣは、被膜の発現の存在下での染色において利用しやすく、このことは、被膜の存在によって、これらのタンパク質に対する抗体から、これらのタンパク質が隠されないことを示す。
【０２５８】
試験された８型単離体のほとんどは、チャレンジ後のさらに遅い時点（＞４時間）まで、血液内でＣＰを発現しなかった（表１３ａ〜ｃを参照されたい）。これらの結果は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）において、ＣＰがインビボの微小環境、すなわち感染部位に応じて差次的に調節されることを実証する。これらの結果は、動物モデルにおいてＣＰ８コンジュゲートについて報告された、矛盾した効力結果を説明し得る。
【０２５９】
インビボでの発現の結果は、単一抗原免疫原性製剤が、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染の大部分に対して広く網羅しないことを示唆する。インビボの微小環境内の個別の株によって、発現表現型の過度の多様性が存在する。したがって、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）疾患を予防するためには、２つ以上の抗原から構成される免疫原性組成物が必要である。
【０２６０】
（実施例９）ＣｌｆＡ、ＣＰ５−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、およびＣＰ８−ＣＲＭ１９７コンジュゲートを含有する多抗原製剤の免疫原性
この実施例において、本発明者らは、ＣｌｆＡ、ＣＰ５−ＣＲＭ１９７、およびＣＰ８−ＣＲＭ１９７の組み合わせの免疫原性を評価した。
【０２６１】
Ａ．  二抗原（ＣＰ５−ＣＲＭ１９７／ＣＰ８−ＣＲＭ１９７）免疫原性組成物製剤  −  ウサギにおける抗莢膜抗体応答に対する用量の効果
この実施例において、ウサギにおける組み合わされたＣＰ５−ＣＲＭ１９７およびＣＰ８−ＣＲＭ１９７免疫原性製剤の免疫原性に対する用量の効果を評価した。ウサギを０週目、３週目、および６週目に、二価コンジュゲートと１２５μｇのＡｌＰＯ４とを皮下注射によって投与して免疫化した。この研究において評価された用量は、それぞれ０．１μｇ、１μｇ、または１０μｇのＣＰ５−ＣＲＭ１９７およびＣＰ８−ＣＲＭ１９７（０．２μｇ、２μｇ、および２０μｇの、最終的な組み合わされたＣＰ−ＣＲＭ１９７用量）であった。コンジュゲートの用量は、タンパク質多糖コンジュゲートの全多糖成分を反映する。ウサギを０週目、３週目、６週目、および８週目に出血させた。プールされた個別の血清に対してＥＬＩＳＡを行った。終点の抗体力価を、０．１ＯＤ４０５での希釈の逆数として決定した。統計分析を個別の８週目の力価に対して行った。結果は、ＣＰ５では５×１０５およびＣＰ８では１×１０６の、最大のＣＰ５特異的抗体力価およびＣＰ８特異的抗体力価が、各成分のＣＰ用量が１μｇので二価免疫原性製剤を用いてウサギをワクチン接種することによって誘発されたことを実証した（データは示されていない）。
【０２６２】
Ｂ．  三抗原製剤（ＣＰ５−ＣＲＭ１９７＋ＣＰ８−ＣＲＭ１９７＋ｒＣｌｆＡ）  −  ウサギにおける固定された用量（１μｇ）の各コンジュゲートを用いたｒＣｌｆＡ用量範囲の研究
各成分に対する免疫応答に対する、ｒＣｌｆＡおよびＣＰ５コンジュゲートおよびＣＰ８コンジュゲートの組み合わせの効果を試験した。３つの群を、１、１０、および１００μｇという３つの異なる用量のＴ７−ＣｌｆＡ（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）と組み合わされた二価黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＣＰ５−ＣＲＭ１９７＋ＣＰ８−ＣＲＭ１９７（１μｇ用量の各コンジュゲート）で免疫化した。対照群は、１００μｇのＴ７−ＣｌｆＡ（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）と組み合わされた、コンジュゲートしていないＣＰ５およびＣＰ８（それぞれ５０μｇ）で免疫化した。各免疫原性組成物は、５００μｇのアジュバントＡｌＰＯ４と共に製剤した。免疫原性組成物は、頸部に皮下注射することによって投与した。ウサギを０週目、６週目、および８週目に出血させた。プールされた個別の血清に対してＥＬＩＳＡを行い、終点の抗体力価を、０．１ＯＤ４０５での希釈の逆数として決定した。
【０２６３】
結果は、増大した量のｒＣｌＡが、二価コンジュゲートと組み合わされると、莢膜抗体応答に影響しないことを示した。両莢膜血清型に対する抗体レベルは、二価コンジュゲートのみで免疫化したウサギにおける範囲と同一の範囲であった（データは示されていない）。ＣＰ５およびＣＰ８に対する抗体レベルは、１μｇ用量のｒＣｌｆＡ（２７３Ｋ）と比較して、１０μｇ用量（１０３Ｋ）および１００μｇ用量（１０６Ｋ）で２．５倍低かった。２回目および３回目の注射の後にブースター効果があった。１００μｇのｒＣｌｆＡと組み合わされた、コンジュゲートしていない二価多糖免疫原性製剤（ＣＰ５＋ＣＰ８、それぞれ５０μｇ）は、ＣＰ特異的抗体を誘発しなかった。ｒＣｌｆＡ特異的抗体応答もまた、用量によって大きくは影響されず、力価は、１、１０、および１００μｇ用量で、３回の投与の後に、１×１０５から１×１０６の間であった（データは示されていない）。また、コンジュゲートしたまたはコンジュゲートしていないＣＰ５多糖およびＣＰ８多糖を投与した場合に得られる抗ＣｌｆＡ応答のレベルは類似していた。
【０２６４】
（実施例１０）三抗原製剤  −  高い免疫前ＣＰ５  Ａｂ、ＣＰ８  Ａｂ、およびＣｌｆＡ  Ａｂの力価を有するウサギにおける免疫原性
ブドウ球菌免疫原性組成物の標的を、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の表面成分に対する既存の抗体を有する成体集団とした。免疫原性製剤に対する応答に対する、免疫原性製剤成分に対する既存の抗体の効果を研究するために、本発明者らは、高い力価の自然獲得された抗ＣＰ５抗体、抗ＣＰ８抗体、および抗ＣｌｆＡ抗体を有するウサギを選択した。２つの群のウサギ（ｎ＝６／７）を、０週目、３週目、および６週目に、三抗原免疫原性製剤（ＣＰ５−ＣＲＭ１９７（１μｇ）およびＣＰ８−ＣＲＭ１９７（１μｇ）およびＴ７−ＣｌｆＡ（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）Ｙ３３８Ａ（１０μｇ））で免疫化した。第１の群は、アジュバントである５００μｇのＡｌＰＯ４と共に製剤された免疫原性組成物で免疫化し、第２の群は、アジュバントを含有しない免疫原性組成物製剤で免疫化した。免疫原性組成物は、皮下注射によって投与した。ウサギを０週目、３週目、６週目、および８週目に出血させた。ＣＰ５、ＣＰ８、およびｒＣｌｆＡに対する抗体力価を、プールされた個別の血清に対する終点の抗体力価として、ＥＬＩＳＡによって決定した（０．１ＯＤ４０５での希釈の逆数として決定した）。
【０２６５】
結果は、自然感染によって誘発された既存の抗体力価を有するウサギが、全ての免疫原性製剤成分ＣＰ５、ＣＰ８、およびｒＣｌｆＡに対する抗体のレベルの増大を伴って、三価免疫原性製剤に応答することを示した。１×１０６の抗体力価を有する動物においてさえも、５倍から１０倍の間の各抗原に対するＡｂレベルの増大が示された。免疫原性製剤におけるアジュバントの存在によって、アジュバントを伴わずに免疫化された群と比較して抗体力価が高まった（データは示されていない）。
【０２６６】
（実施例１１）被膜多糖成分に対する応答に対するアジュバントの効果
Ａ．  ウサギにおける二価ＣＰ５−ＣＲＭ１９７／ＣＰ８−ＣＲＭ１９７コンジュゲート免疫原性組成物に対する応答に対するＡｌＰＯ４の２つの異なる用量の効果
ウサギにおける抗ＣＰ５応答および抗ＣＰ８応答に対する、アジュバントＡｌＰＯ４の用量効果を研究した。ウサギを、０週目、３週目、および６週目に、二価黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＣＰ５−ＣＲＭ１９７／ＣＰ８−ＣＲＭ１９７（１μｇ用量の各コンジュゲート）で免疫化した。第１の群（ｎ＝５／群）は、アジュバントである１２５μｇのＡｌＰＯ４と共に製剤された免疫原性組成物で免疫化し、第２の群は、５００μｇのＡｌＰＯ４と共に製剤された免疫原性組成物製剤で免疫化した。免疫原性組成物は、頸部における皮下注射によって投与した。ウサギを０週目、６週目、および８週目に出血させ、抗莢膜抗体を、０．１ＯＤ４０５での希釈の逆数として決定される終点の抗体力価として、ＥＬＩＳＡによって決定した。結果は、１２５μｇまたは５００μｇのＡｌＰＯ４で免疫化されたウサギにおいてＣＰ８特異的抗体応答に差がないことを示した。１２５μｇのアジュバントを有する製剤は、より高いＣＰ５抗体応答をもたらした。また、１２５μｇの群における全てのウサギは、より高いＣＰ５抗体応答で応答したが、５００μｇのアジュバントの群では、２頭のウサギが製剤に対して低い応答であった。
【０２６７】
Ｂ．  三抗原製剤の免疫原性に対するＡｌＰＯ４の効果
ウサギ（ＮＺＷ、１群当たりｎ＝６／７のウサギ）を、０週目、３週目、および６週目に、ＣＰ５−ＣＲＭ１９７（１μｇ）およびＣＰ８−ＣＲＭ１９７（１μｇ）およびＴ７−ＣｌｆＡ（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）Ｙ３３８Ａ（１０μｇ）からなる三抗原製剤で免疫化した。第１のウサギ群は、５００μｇのＡｌＰＯ４を有する免疫原性製剤で免疫化し、第２の群はアジュバントを伴わずに製剤され、第３の群は、５００μｇのＡｌＰＯ４を有する免疫原性製剤で０週目に免疫化し、かつアジュバントを有さない免疫原性製剤で３週目および６週目に免疫化した。免疫原性製剤は皮下注射によって投与し、ウサギを０週目、３週目、６週目、および８週目に出血させ、血清を抗原特異的ＥＬＩＳＡによって評価した。結果は、免疫原性製剤におけるアジュバントの存在が、ウサギにおける抗ＣＰ５応答または抗ＣＰ８応答に対する効果を有さないことを示した（データは示されていない）。両被膜に対するＡｂのＧＭＴ力価は同程度であった。しかし、３つ全てのワクチン接種において、アジュバントを伴って免疫化された群において示されるＣｌｆＡ特異的抗体応答に対するアジュバントの効果が存在した。アジュバントを含有する免疫原性製剤で初回免疫されたウサギにおける、ＡｌＰＯ４を含有しない免疫原性製剤での２回目および３回目のブーストは、アジュバントを伴わない群と比較して高いＣｌｆＡ応答をもたらした。
【０２６８】
（実施例１２〜２９）黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣｌｆＡ、ＭｎｔＣ、ＣＰ５−ＣＲＭ１９７、およびＣＰ８−ＣＲＭ１９７の臨床前評価
以下の実施例１２から２９において、ＣＰ５およびＣＰ８コンジュゲート、ＣｌｆＡ、およびＭｎｔＣの臨床前評価の結果が記載される。これらの実施例は、臨床前動物モデルにおけるこれらの抗原の効力を実証する。これらの実施例はまた、ＣＰコンジュゲート、ＣｌｆＡ、およびＭｎｔＣにより生成される抗体が、インビトロのアッセイにおいて機能的活性を有することを実証する。
【０２６９】
２つの異なる化学を用いて、ＣＰをＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたが、異なる方法によって調製されたコンジュゲートで、効力に差は観察されなかった。莢膜多糖のＯ−アセチル化は、機能的抗体の誘導に影響することが示された。ＣＰ５−ＣＲＭ１９７、ＣＰ８−ＣＲＭ１９７、およびＣｌｆＡを含む組み合わされた免疫原性組成物の評価は、各免疫原性製剤成分に対する特異的抗体（Ａｂ）レベルに対する干渉を示さなかった。
【０２７０】
材料および方法
ＥＬＩＳＡ
ＭａｘｉｓｏｒｐマイクロタイターＥＬＩＳＡプレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を、４℃で１８時間、または３７℃で９０分間にわたり、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）内の１μｇ／ｍＬのＣｌｆＡ抗原で被覆した。プレートをＰＢＳＴ（１×ＰＢＳ、０．１％ポリソルベート２０）内で５回洗浄し、ＰＢＳ内の１％（ｗ／ｖ）無脂肪乳および０．０５％ポリソルベート２０で、室温で１時間にわたりブロックした。プレートをＰＢＳＴで洗浄し、連続希釈（３倍）し、個別の０週目、３週目、６週目、および８週目にウサギ抗血清をプレートに添加し、４℃で一晩または３７℃で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、結合した一次抗体を、ＰＢＳＴ内のホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート型ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：１０００希釈）で検出した。プレートを３７℃で１時間にわたりインキュベートし、次に、洗浄し、ＡＢＴＳ−ペルオキシダーゼ基質溶液（ＫＰＬ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で、室温でおよそ２０分間にわたり発色させた。１％（ｖ／ｖ）ＳＤＳ溶液を添加することによって反応を止めた。吸光度を、自動プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）で、４０５ｎｍで測定した。抗体力価は、吸光度値が０．１の最大の血清希釈の逆数として表した。ＪＭＰ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を用いるスチューデントｔ検定を用いて、異なる群間の抗体力価における差を決定した。０．０５未満の確率を、統計的に有意な差を示すと考えた。
【０２７１】
マウス敗血症モデル
マウス敗血症モデルは、血液感染性疾患を模倣する。受動免疫化のために、１５頭のＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスからなる群をＩｇＧで腹腔内（ｉ．ｐ．）処理した。２４時間後、マウスを、尾部静脈を介する単回の静脈内（ｉ．ｖ．）注射（０．１ｍｌ）によって、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）６５９−０１８でチャレンジした。全ての動物を１４から１５日間にわたり追跡し、その時点で、全ての残っているマウスを屠殺した。
【０２７２】
能動免疫化のために、マウスを、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を用いる静脈内経路によって、０週目、２週目、および４週目に抗原で免疫化し、６週目にチャレンジした。
【０２７３】
能動免疫化ウサギ心内膜炎モデル
成体のＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅウサギを、２５μｇの抗原で４回、筋肉内で免疫化した。手術の１日後、動物を、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のボーラスでｉ．ｖ．でチャレンジし、心臓組織におけるコロニー形成単位（ｃｆｕ）の数をチャレンジの２４時間後に決定する。
【０２７４】
マウス菌血症
３時間の菌血症モデルを用いて、感染早期の細菌数に対するワクチン接種の効果を決定した。マウスを０週目、３週目、および６週目に抗原で免疫化し、その後、８週目に黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）でｉ．ｐ．チャレンジした。動物を３時間後に放血させ、血液の連続希釈物を平板培養して細菌を数えた。
【０２７５】
マウス腎盂腎炎モデル
マウス腎盂腎炎モデルは、菌血症からの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の播種を模倣する。１０頭の４週齢のメスＣＤ−１マウスからなる群を、０週目、３週目、および６週目に抗原で免疫化した。マウスを黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のｉ．ｐ．注射によってチャレンジした。チャレンジの４８時間後、マウスを屠殺し、腎臓および血液における細菌を数えた。
【０２７６】
ラット心内膜炎モデル
ラット心内膜炎モデルは、血液感染性疾患が損傷した心臓組織のコロニー形成をもたらす後にコロニー形成が生じる、ヒト心内膜炎を模倣する。５頭の５週齢のオスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、ＮＹ）を、０週目、２週目、および４週得目に、１００μｇのＡｌＰＯ４と共に製剤された１μｇのＣＰ５−ＣＲＭ１９７コンジュゲートで免疫化した。０週目の、ワクチン接種する前、および５週目の最後に、動物を出血させた。７２時間後、カテーテル（ＰＥ−１０管）を、頸動脈を介して左心室内に外科的に置いた。カテーテルを置くことで、ブドウ球菌が感染の際に付着し得る無菌性疣腫が形成される。外科手術から生じる感染を防ぐために、動物を、手術の時点および手術の８時間後に、抗生物質バイトリル（５ｍｇ／ｋｇ）で処理した。手術の４８時間後、ラットをＰＦＥＳＡ０２６６（およそ４×１０８ｃｆｕ）またはＳＡ３１５（およそ１×１０９ｃｆｕ）で腹腔内注射によってチャレンジした。チャレンジの４８時間後、ラットを安楽死させ、心臓および腎臓を取り出し、３ｍＬのリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）内に置いた。次に、これらの器官を組織ホモジナイザー（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ  ＡＧ、Ｌｕｚｅｒｎｅｒｓｔｒａｓｓｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でホモジナイズし、ＰＢＳで１０ｍＬにした。次に、ホモジネートを連続希釈し、細菌を数えるために平板培養した。
【０２７７】
オプソニン性貪食死滅アッセイを用いる機能的抗体のモニタリング
ＬＹＭＰＨＯＬＹＴＥ（登録商標）−ポリ溶液（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）を製造者のプロトコルに従って用いてドナーヒト血液から単離される細胞系（例えばＨＬ６０）または多形核細胞（ＰＭＮ）から得られる分化したエフェクター細胞を、このアッセイに用いることができる。エフェクター細胞をアッセイ緩衝液（１％ウシ血清アルブミンを含有する変法イーグル培地）内におよそ２×１０７個細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し、使用する直前まで３７℃のインキュベーター内に置いた。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＰＦＥＳＡ０２６６をトリプシン大豆寒天プレート上で一晩成長させた。細菌細胞を擦り取り、２回洗浄し、およそ５×１０８ｃｆｕ／ｍｌの濃度に等しいＯＤ６００＝１まで、５％グリセロールを含有するアッセイ緩衝液内に再懸濁した。細菌懸濁液の１ｍｌのアリコートを凍結し、使用する直前まで−４０℃で保管した。凍結した細菌懸濁液を解凍し、アッセイ緩衝液内で１０６ｃｆｕ／ｍｌの濃度まで調節し、氷上に置いた。無菌９６ディープウェル１ｍｌポリプロピレンプレートを用いて、アッセイを行った。抗体試料（５０ｍｌ）の２倍連続希釈物を調製し、その後、３００μｌのアッセイ緩衝液を抗体混合物に添加した。細菌をプレートに添加し（５０μｌ）、４℃で３０分間にわたり回転振とう機上に置いた。５０μｌのヒト補体（１％の最終濃度）を添加して、オプソニン化ステップを生じさせた。最後に、５０μｌのエフェクター細胞（１０７個細胞／ｍｌの濃度）をプレートに添加し、懸濁液を、ピペッティングを繰り返すことによって良く混合した。懸濁液の５０μｌのアリコートを無菌１％サポニン溶液内に１０倍連続希釈し、ボルテックスして細菌のクラピングを最小化し、トリプシン大豆寒天上に２回平板培養した。アッセイプレートを、回転式肉焼き機様式の振とう機を用いて連続的に混合しながら、３７℃で１時間にわたりインキュベートした。インキュベーションの最後に、懸濁液の５０μｌのアリコートを無菌１％サポニン溶液内に１０倍連続希釈し、ボルテックスすることによって混合して細菌のクラピングを最小化し、トリプシン大豆寒天上に２回平板培養した。抗体を有さないが細菌、補体、およびエフェクター細胞を含有する試験管内で生存しているｃｆｕの数に対する、細菌、抗体、補体、およびエフェクター細胞を有するウェルにおいて６０分の時点で生存しているｃｆｕの数の比率を決定することによって、死滅のパーセンテージを計算した。細菌、補体、および血清を含有する対照を、クランピングに起因するｃｆｕのあらゆる低減について調節するために含めた。
【０２７８】
補体の吸着
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＰＦＥＳＡ０２６６、ＰＦＥＳＡ０２８６、およびＰＦＥＳＡ０２７０に対して吸着したヒトドナーの血清を、アッセイにおける補体源として用いることができる。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株を、３７℃で、ＴＳＡプレート上で一晩成長させた。細胞をプレートから擦り取り、無菌ＰＢＳ内に再懸濁した。細菌細胞を４℃で１０分間にわたり、１００００ｒｍｐで遠心分離し、細胞ペレットを、吸着のために、ヒト血清内に再懸濁した。血清を４℃で３０分間にわたりｎｕｔａｔｏｒ上で細菌と共にインキュベートした。細胞を遠心分離し、細菌を含有する別の試験管に血清を移し、吸着ステップを再び３０分間にわたり繰り返した。最後に、細胞を遠心分離し、血清を０．２ミクロンのフィルターに通し、その後、０．５ｍｌのアリコートを液体窒素内で凍結した。
【０２７９】
方法ＩＩ  −  ＨＬ−６０細胞を用いるＯＰＡ
ＨＬ−６０細胞を、Ｓ．Ｒｏｍｅｒｏ−Ｓｔｅｉｎｅｒら、Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４（４）（１９９７）、ｐｐ．４１５〜４２２に従って分化させた。採取したＨＬ−６０細胞をアッセイ緩衝液（１％ウシ血清アルブミンを含有する変法イーグル培地）内におよそ１０８個細胞／ｍｌで再懸濁し、使用する直前まで３７℃のインキュベーター内に置いた。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）をトリプシン大豆寒天プレート上で一晩成長させた。細菌細胞を擦り取り、２回洗浄し、およそ５×１０８ｃｆｕ／ｍｌに等しいＯＤ６００＝１まで、５％グリセロールを含有するアッセイ緩衝液内に再懸濁した。細菌懸濁液の１ｍｌのアリコートを凍結し、使用する直前まで−４０℃で保管した。凍結した細菌懸濁液を解凍し、アッセイ緩衝液内で１０６ｃｆｕ／ｍｌの濃度まで調節し、氷上に置いた。無菌９６ディープウェル１ｍｌポリプロピレンプレートを用いて、アッセイを行った。モノクローナル抗体試料（２５ｍｌ）の２倍連続希釈物を調製し、その後、１５０μｌのアッセイ緩衝液を抗体懸濁液に添加した。細菌をプレートに添加し（２５μｌ）、４℃で３０分間にわたり回転振とう機上に置き、その後、２５μｌのヒト補体（１％の最終濃度）を添加した。最後に、２５μｌのＨＬ−６０細胞（１０７個細胞／ｍｌ）をプレートに添加し、懸濁液を、ピペッティングを繰り返すことによって良く混合した。懸濁液の２５μｌのアリコートを無菌１％サポニン溶液内に１０倍連続希釈し、ボルテックスすることによって混合して細菌のクラピングを最小化し、トリプシン大豆寒天上に２回平板培養した。アッセイプレートを、回転式肉焼き機様式の振とう機を用いて連続的に混合しながら、３７℃で１時間にわたりインキュベートした。インキュベーションの最後に、懸濁液の２５μｌのアリコートを無菌１％サポニン溶液内に１０倍連続希釈し、ボルテックスすることによって混合して、トリプシン大豆寒天上に２回平板培養した。抗体を有さないが細菌、補体、およびＨＬ−６０細胞を含有する試験管内で生存しているｃｆｕの数に対する、細菌、抗体、補体、およびＨＬ−６０細胞を有するウェルにおいて６０分の時点で生存しているｃｆｕの数の比率を決定することによって、死滅のパーセンテージを計算した。細菌、補体、およびｍＡｂを含有する対照を、クランピングに起因するｃｆｕのあらゆる低減について調節するために含めた。
【０２８０】
（実施例１２）インビボの動物モデルにおけるＣｌｆＡによる防御効果の実証
ＣｌｆＡに対して誘導されたポリクローナルウサギ抗体がマウス敗血症モデルにおいて黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のコロニー数を低減させ得るかどうかを評価するために、精製されたウサギポリクローナル抗ＣｌｆＡ  ＩｇＧを、受動免疫化研究において２つの投薬量（０．８ｍｇおよび１．６ｍｇ）で用いた（図１３）。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）チャレンジ株は、最近の臨床単離体６５９−０１８であった。両抗体投薬量により、マウス敗血症モデルにおいて細菌コロニー数が有意に低減した(１．８ｍｇ用量ではｐ＝０．０１３４であり、０．８ｍｇ用量ではｐ＝０．００１３)。この実験は、さらなる黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）単離体で繰り返され、類似の結果を示している（データは示されていない）。
【０２８１】
（実施例１３）ＣｌｆＡでの能動免疫化は黄色ブドウ球菌（Ｓ．Ａｕｒｅｕｓ）による心臓のコロニー形成を低減させる
ＣｌｆＡでのウサギの能動免疫化によって、ウサギ心内膜炎モデルが防御された。本発明者らは、陰性対照（ＰＢＳまたはＡｌＰＯ４）で免疫化された動物と比較して、ＣｌｆＡで免疫化された動物で、心臓疣腫から回収される黄色ブドウ球菌（Ｓ．Ａｕｒｅｕｓ）のｃｆｕが３〜４ｌｏｇ低減することを見出した（図１４）。
【０２８２】
（実施例１４）インビボの動物モデルでのＭｎｔＣの防御効果
ＭｎｔＣでの能動免疫化は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）でのチャレンジ後の早い時点からマウスの一貫した防御を示した。ｉ．ｐ．での黄色ブドウ球菌（Ｓ．Ａｕｒｅｕｓ）チャンレジを受けたマウスの血液における細菌数は、ＰＢＳで免疫化された対照と比較して有意に低減した（図１５Ａおよび１５Ｂ）。６回の個別の研究のうち４回は、免疫化された動物における血液１ｍｌ当たりのｃｆｕの有意な低減を示した。ＭｎｔＣでの免疫化により仲介される防御は、ＰＦＥＳＡ０２３７（図１５Ａ）およびＰＦＥＳＡ０２６６（図１５）という２つの異なる黄色ブドウ球菌（Ｓ．Ａｕｒｅｕｓ）チャレンジ株を用いて実証された。
【０２８３】
（実施例１５）ＣＰ５コンジュゲートはマウス腎盂腎炎モデルにおいて防御する
ＣＰ５コンジュゲートを、能動免疫化腎盂腎炎モデルにおいてマウスを防御する能力について評価した。図１６は、いくつかの研究からの結果を示す。ｉ．ｐ．で黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）チャレンジを受けたマウスの血液における細菌数は、ｐｂｓで免疫化された対照と比較して有意に低減した（図１６）。６回の個別の研究のうち６回が、免疫化された動物における腎臓１ｍｌ当たりのｃｆｕの有意な低減を示した。データは、ＣＰ５コンジュゲートでの能動免疫化後の腎臓のコロニー形成の一貫した低減を示した。
【０２８４】
（実施例１６）異なるコンジュゲーション化学により調製されるＣＰ５コンジュゲートは実験的感染からマウスを防御する
マウス腎盂腎炎モデルにおける能動免疫化研究を、ＰＤＰＨ化学またはＣＤＴ化学によって調製されたＣＰ５コンジュゲートを用いて行った。ＣＲＭ１９７にＣＰ５またはＣＰ８をコンジュゲートさせるための方法は、上記に記載した。結果は、両コンジュゲートが、偽免疫化動物と比較して、マウスにおけるコロニー形成を有意に低減させることを示した（表１４）。
【０２８５】
【表１６】
0005395264.tif 000017
【０２８６】
（実施例１７）ＣＰ５コンジュゲートはラット心内膜炎モデルにおいて防御する
１μｇ用量のＣＰ５−ＣＲＭ１９７ＰＤＰＨコンジュゲートおよび関連していないコンジュゲート（ＰＰ５−ＣＲＭ１９７）を用いて、４つの研究を行った。ＣＰ５コンジュゲートは、３つの実験のうち２つにおいて、心臓および腎臓の両方においてコロニー形成を有意に低減させ、前記チャレンジにおいて、５型チャレンジ株はＰＦＥＳＡ０２６６であった（表１５）。第３の研究において、幾何平均力価（ＧＭＴ）抗ＣＰ５力価は、３つの実験のうち最も低かったが、これは、先の実験における力価よりわずかに低いのみであった（５１０００対６７０００）。
【０２８７】
【表１７】
0005395264.tif 000018
【０２８８】
（実施例１８）腎盂腎炎モデルにおけるＣＰ５−ＣＲＭ１９７コンジュゲート
コンジュゲートの効力を調べる最初の研究を、２５ｋＤａのＭＷのＣＰ５で行った。発酵プロセスの向上によって、高いＭＷの多糖が生産され、これを、タンパク質担体にコンジュゲートさせ、２５ｋＤａのＣＰ５コンジュゲートと並行して試験した。２５ｋＤａ（低いＭＷ）および３００ｋＤａ（高いＭＷ）のＭＷを有するＣＰを含むコンジュゲートを、ＣＤＴコンジュゲーション化学を用いて調製し、マウス腎盂腎炎モデルにおいて評価した。３つの用量（０．０１、０．１、および１μｇ）のＨＭＷコンジュゲートを試験し、１μｇの用量の、対照であるＬＭＷ  ＣＰ５−ＣＲＭ１９７および関連していないコンジュゲート（ＰＰ５−ＣＲＭ１９７）と比較した。結果は、１μｇの用量での、腎臓から回収された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＦＥＳＡ０２６６のＣＦＵにおける有意な低減を示した。１μｇの用量では、異なるサイズのＣＰ５で調製されたコンジュゲートの防御間に、統計的な差はなかった（表１６）。低用量（０．０１μｇおよび０．１μｇ）のコンジュゲートは、感染を有意に低減させるほどに十分には免疫応答を誘導することができなかった。同一の免疫化およびチャレンジの手順を用いて実験を繰り返した。繰り返された実験において、１μｇの用量のＬＭＷ  ＣＰ５−ＣＲＭ１９７のみが、コロニー形成を有意に低減させた（ｐ＝０．０１）。１μｇの用量のＨＭＷ  ＣＰ５−ＣＲＭ１９７は、腎臓においてｃｆｕを低下させたが、低減は統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．０５６）。
【０２８９】
【表１８】
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【０２９０】
（実施例１９）多糖のＯ−アセチル化は、ＣＰ５コンジュゲート免疫原性製剤に対する防御的抗体応答の誘発に重要である
ＣＰ５のＯ−アセチル化の重要性を評価するために、天然ＣＰ５を脱Ｏ−アセチル化（ｄＯＡｃ）し、ＰＤＰＨコンジュゲーション化学を用いてＣＲＭ１９７にコンジュゲートした（ｄＯＡｃ−ＣＲＭ１９７）。ｄＯＡｃＣＰ−ＣＲＭ１９７コンジュゲートの効率を、マウス腎盂腎炎モデルにおいて、ＣＰ５−ＣＲＭ１９７と並行して比較した。結果は、腎臓における細菌のコロニー形成において有意な変化がないことにより実証されるように、Ｏ−アセチル基を有さないコンジュゲート（ｄＯＡｃ  ＣＰ５−ＣＲＭ１９７）がこのモデルにおいて有効ではないことを示した。これらのデータ（表１７）は、Ｏ−アセチル化が、ＣＰ５に対する機能的抗体の誘導に重要であったことを示す。
【０２９１】
【表１９】
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【０２９２】
（実施例２０）ＣＰ８コンジュゲートでの免疫化は敗血症モデルにおいて死亡を低減させる
ＣＰ８−ＣＲＭ１９７コンジュゲートの効力を、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＦＥＳＡ０２６８（８型）でチャレンジした後のマウス敗血症モデルにおいて評価した。Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（ｎ＝３０）を、共に１００μｇのＡｌＰＯ４と共に製剤された、１μｇのＣＰ８−ＣＲＭ１９７および生理食塩水で、皮下注射によって能動免疫化した。研究は、ＡｌＰＯ４のみで免疫化したマウスと比較して、敗血症の有意な低減（ｐ＝０．０３０８）を示した。図１７を参照されたい。
【０２９３】
（実施例２１）マウス菌血症モデルにおけるコンジュゲートした天然ＣＰ８および塩基処理されたＣＰ８の評価
機能的抗体応答の誘発にとっての、コンジュゲーションする前の天然ＣＰ８上に存在するＯ−アセチル基の重要性を、ＣＰ８コンジュゲートについて評価した。ＣＰ８多糖を、弱塩基条件下で脱Ｏ−アセチル化し、ＮＭＲおよびイオンクロマトグラフィー（ＩＣ）の両方によって、ＣＰ８脱Ｏ−Ａｃ−ＣＲＭ１９７におけるＯ−アセチル化の不存在を確認した。
【０２９４】
マウス菌血症モデルを用いて、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートした天然ＣＰ８と塩基処理したＣＰ８との効力を評価した。メスＢＡＬＢ／ｃマウス群（１５頭／群）を、１μｇのＣＰ８脱Ｏ−Ａｃ−ＣＲＭ１９７または１μｇのＣＰ８  Ｏ−Ａｃ−ＣＲＭ１９７で、０週目、３週目、および６週目に免疫化した。免疫原性製剤を、２２μｇのＡｌＰＯ４と共に製剤した。動物を黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＦＥＳＡ０００３でチャレンジした。チャレンジの３時間後、マウスを屠殺し、細菌を血液内で数えた。データは、スチューデントｔ検定により決定されるように、未処理の天然ＣＰ８コンジュゲートで免疫化された動物の血液から回収された細菌ｃｆｕが統計的に有意に（ｐ＝０．０３６２）低減したことを示した（表１８）。塩基処理されたＣＰ８コンジュゲートで免疫化された動物において、血液から回収された細菌ｃｆｕは、生理食塩水対照群に類似していた。
【０２９５】
【表２０】
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【０２９６】
（実施例２２）既知の特異性を有するＭＡｂを用いるＯＰＡによるＣＰ５の機能的エピトープとしてのＯ−アセチル化の重要性の確認
ＣＰ５  ＯＡｃ＋（ＣＰ５−７−１）、ＣＰ５  ＯＡｃ＋／−（ＣＰ５−５−１）、およびＣＰ５  ＯＡｃ−（ＣＰ５−６−１）に対する特異性を有するＣＰ５モノクローナル抗体を、５型株ＰＦＥＳＡ０２６６に対するＯＰ死滅活性について評価した（表１９）。ＣＰ８  ＯＡｃ＋に特異的なＭＡｂ  ＣＰ８−３−１を陰性対照として用いた。結果は、ＣＰ５−７−１  ｍＡｂ（ＣＰ５  ＯＡｃ＋特異性）が、試験された両方の５型株の死滅を仲介することを示した。また、ＣＰ５  ＯＡｃ＋およびＣＰ５  ＯＡｃ−の両方により共有されるエピトープを認識するｍＡｂ  ＣＰ５−５−１は、ＰＦＥＳＡ０２６６株の死滅を仲介した。ＣＰ５  ＯＡｃ−多糖上に存在するエピトープに特異的なＭＡｂは、ＰＦＥＳＡ０２６６株の死滅を仲介しなかった。これらの結果は、ＣＰ５上のＯ−アセチルエピトープがＣＰ５特異的抗体の機能的活性に関与することを示す。
【０２９７】
【表２１】
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【０２９８】
（実施例２３）マウス抗体のオプソニン活性は高ＭＷおよび低ＭＷのＣＰ５コンジュゲートを誘発した
実施例１８の１μｇの高分子量群および低分子量群から得られる高いＣＰ５  ＥＬＩＳＡ力価を有するマウス（ｎ＝５）の血清を、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＦＥＳＡ０２６６を用いてオプソニン活性について比較した。ＯＰＡの結果は、両コンジュゲートがマウスにおいてオプソニン抗体を誘導することを示した（表２０）。高ＭＷのコンジュゲートが、より高い力価のオプソニン抗体を誘導する傾向が観察された。データは、５つの個別のマウス血清についての死滅％の平均±ＳＥＭとして示される。抗体は、動物効力モデルにおける細菌の死滅または抗体が細菌を死滅させることを実証するオプソニン性貪食死滅アッセイを介する細菌の死滅によって測定されるように機能的である必要がある。機能的死滅は、効力における高分子量コンジュゲートの重要性の指標ではない抗体生成のみをモニタリングするだけのアッセイを用いては実証され得ない。
【０２９９】
【表２２】
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【０３００】
（実施例２４）天然ＣＰ８コンジュゲートおよび化学的に修飾されたＣＰ８コンジュゲートで免疫化されたマウスの血清のオプソニン活性
実施例２１における研究から得られる高いＣＰ８力価を有する選択されたマウス血清（ｎ＝５）を、ＰＦＥＳＡ０００５株を用いてオプソニン活性について比較した。ＯＰＡの結果（表２１）は、天然ＣＰ８のコンジュゲーションによって調製されたコンジュゲートのみがマウスにおいてオプソニン抗体を誘導したことを示す。このアッセイにおいて、脱ＯＡｃ  ＣＰ８コンジュゲートはマウスにおいて免疫原性であったが、誘導された抗体はオプソニン性ではなかったということは、注目に値する。ＯＰＡの力価は、４０％の死滅が観察された希釈の逆数として報告される。抗体は、動物効力モデルにおける細菌の死滅または抗体が細菌を死滅させることを実証するオプソニン性貪食死滅アッセイを介する細菌の死滅により測定されるように機能的である必要がある。機能的死滅は、効力におけるＯ−アセチル化の重要性の指標ではない抗体生成のみをモニタリングするだけのアッセイを用いては実証され得ない。
【０３０１】
【表２３】
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【０３０２】
（実施例２５）
ヒトではない霊長類のＣＰコンジュゲート抗血清による８型株の死滅は天然ＣＰ８の添加によって阻害される
ＣＰ８コンジュゲートで免疫化されたヒトではない霊長類の血清における死滅活性の特異性を確認するため、天然ＣＰ８の存在下でアッセイを行った。ＯＰ方法ＩＩを、以下の変更を伴って用いた。抗体試料（２５μｌ）の２倍連続希釈物を調製し、その後、１５０μｌ（Ｐｎ１４競合物質）または１２５μｌ（ＣＰ８競合物質）のアッセイ緩衝液を抗体懸濁液に添加した。競合物質は精製されたＣＰ８多糖（ＣＰ８ポリ）であり、関連していない肺炎球菌多糖（Ｐｎ１４ポリ）を対照として用いた。多糖を抗体懸濁液に添加し（５０μｇ）、プレートを、転倒混合しながら、４℃で３０分間にわたりインキュベートした。多糖とインキュベーションした後、細菌をプレートに添加し（２５μｌ）、４℃で３０分間にわたり回転振とう機上に置き、その後、２５μｌのヒト補体（１％の最終濃度）を添加した。結果（表２２）は、反応混合物内における天然ＣＰ８の存在が、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）８型のオプソニン性貪食死滅を阻害することを示した。これらの結果は、免疫血清によるオプソニン性貪食死滅が被膜特異的Ａｂによって仲介されたことを裏付けるものである。
【０３０３】
【表２４】
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【０３０４】
（実施例２６）ＣｌｆＡに対する自然獲得された抗体は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のオプソニン性貪食死滅を仲介する
集団内のヒトは、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に自然に曝露されており、したがって、それらの循環においてその細菌に対する既存の抗体を有する。本発明者らは、ヒト血清から抗ＣｌｆＡ抗体をアフィニティー精製し、抗体がオプソニン性死滅を仲介し得るかどうかを評価した。ＣｌｆＡに対する抗体が黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖についてオプソニン性であることが示されている（データは示されていない）。株ＰＦＥＳＡ０２６６を、２％ＮａＣｌを有するＣｏｌｕｍｂｉａ培養液において一晩成長させた。細菌を、ＣｌｆＡアフィニティー精製されたヒトＩｇＧまたは関係のない抗原でアフィニティー精製されたヒトＩｇＧ（陰性対照、ブドウ球菌ＳＣＰタンパク質）でオプソニン化し、オプソニン活性を試験した。分化したＨＬ−６０細胞を、１００：１のエフェクター／標的比でオプソニン性貪食アッセイにおいて用いた。さらなる対照として、ＣＰ５  ｍＡｂを、表面上のＣＰ５の存在を実証するために、実験に含めた。結果は、２つの独立した実験の平均である。ＣｌｆＡ特異的抗体およびＣＰ５特異的抗体は、オプソニン性死滅を仲介し、ＳＣＰ特異的（陰性対照）抗体は、このアッセイにおいて活性を有さなかった。
【０３０５】
（実施例２７）ＣＰ５−ＣＲＭ１９７コンジュゲートは、ヒトではない霊長類（ＮＨＰ）においてオプソニン抗体を誘導する
ＮＨＰにおける高分子量ＣＰ５−ＣＲＭ１９７コンジュゲートと低分子量ＣＰ５−ＣＲＭ１９７コンジュゲートとの機能性を比較するために、５頭のサルからなる群を、ＡｌＰＯ４アジュバントを有するかまたは有さない、２および２０μｇ用量のコンジュゲートで免疫化した。サルには、それぞれ０日目および２８日目に、第１のワクチン接種および第２のワクチン接種を行った。０日目、１４日目、２８日目、および４２日目の出血を、ＯＰ活性について試験した。結果を表２３にまとめる。２０μｇのＨＭＷコンジュゲートは、他の群と比較して最も高いＯＰ力価を有していた。また、ＯＰ陽性サルの頻度は、対応する低ＭＷ群と比較して、両用量の高ＭＷ群で高かった。これらの結果は、ＮＨＰにおいて、ＨＭＷのＣＰ５−ＣＲＭ１９７コンジュゲートが、ＬＭＷのＣＰ５コンジュゲートよりも良好なＯＰ応答を誘導する傾向があることを実証する。
【０３０６】
【表２５】
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【０３０７】
（実施例２８）高分子量の多糖を含む被膜多糖コンジュゲートは、低分子量の多糖を含むコンジュゲートと比較して増強した免疫原性を示す。
異なる被膜コンジュゲート製剤の免疫原性を評価するために、ヒトではない霊長類（ＮＨＰ）での研究を行った。２つの製剤を、２つの異なる投薬量レベル（２および２０μｇ）で試験した。第１の製剤は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートした、高分子量（ＨＭＷ）の多糖（およそ１３０ｋＤａ）から構成されるものであった。第２の製剤は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートした、低分子量（ＬＭＷ）の多糖（およそ２５ｋＤａ）を含有していた。５頭の霊長類からなる群を、単回用量のいずれかのワクチンでワクチン接種し、ワクチン接種の前およびワクチン接種の２週間後の免疫力価をモニタリングした。ＯＰＡ力価は、ＯＰＡアッセイにおいて黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＰＦＥＳＡ０２６６の４０％を死滅させるために必要な血清の希釈として定義された。抗体力価はまた、ＥＬＩＳＡによってもモニタリングした。ＬＭＷ製剤と比較して、ＨＭＷワクチンで、増強された活性が見られ（表２４）、このことは、ＬＭＷワクチンと比較してＨＭＷワクチンで抗体力価が１０倍上昇することによって証明された。ＨＭＷワクチンを投与したＮＨＰでのＯＰＡ応答者の比率もまた、より高かった（４０％に対し８０％）。
【０３０８】
【表２６】
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【０３０９】
（実施例２９）二抗原（ＣＰ５−ＣＲＭ１９７およびＣｌｆＡ）製剤  −  ヒトではない霊長類における抗体応答
ＮＨＰにおける単回用量の二抗原免疫原性組成物（ＣＰ５−ＣＲＭ１９７およびＣｌｆＡ）に対する免疫応答を評価するため、５頭のサルからなる群を、ＡｌＰＯ４を添加していない異なる用量の２つの抗原で免疫化した。０日目、１４日目、および２８日目の出血を、オプソニン性貪食（ＯＰ）活性およびＥＬＩＳＡ力価について試験し、結果を表２４にまとめる。結果は、ＯＰ活性が、ＣＰ５偽群と比較して、ＣＰ５で免疫化した動物で一貫して観察されることを示した。全体的に、１００μｇの群は、他の群と比較して、最も高いＥＬＩＳＡ力価およびＯＰ力価を有していた。ＣｌｆＡのみの群の血清ではＯＰ死滅活性は観察されなかった。ＣｌｆＡまたはＣＰ５の用量を上昇させて投与した群において、干渉は観察されなかった。表２５を参照されたい。
【０３１０】
【表２７】
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【０３１１】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＣＰ５被膜多糖抗原およびＣＰ８被膜多糖抗原の能力を実証する動物モデル
ＣＰ５−ＣＲＭ１９７コンジュゲートおよびＣＰ８−ＣＲＭ１９７コンジュゲートの両方は、マウス、ラット、ウサギ、およびヒトではない霊長類（ＮＨＰ）において、莢膜血清型特異的抗体応答を誘発した。コンジュゲート誘発型の抗体は、インビトロでの機能的オプソニン性貪食死滅アッセイにおいて機能的であった。Ｏ−アセチル化がＣＰ５およびＣＰ８の両方にとって防御抗体を誘導するために重要であること、ならびにＯ−アセチル基が、ＣＰ５に対するＯＰＡ＋ｍＡｂにより認識されるエピトープの一部であることを実証するために、データを得た。Ｏ−アセチル化された天然ＣＰ５を認識するＭＡｂは、ＯＰＡにおいて機能的であり、細菌の死滅を仲介する。ＣＰ８コンジュゲートは、マウスおよびウサギの両方において、ＯＰＡにおいて８型株の死滅を仲介する、機能的抗体を誘発した。ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体による死滅の特異性は、相同な天然多糖をアッセイに添加した後に死滅がなくなったことによって確認された。様々な活性免疫化モデルを用いて、ＣＰ５−ＣＲＭ１９７コンジュゲートおよびＣＰ８−ＣＲＭ１９７コンジュゲートの両方の臨床前効率を示した。ＣＰ５コンジュゲートは、マウス腎盂腎炎モデルおよびラット心内膜炎モデルにおいて一貫した効率を示した。ＣＰ５のＯ−アセチル化の重要性は、マウス腎盂腎炎モデルにおいて確認され、このモデルにおいて、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートした脱Ｏ−アセチル化型ＣＰ５は、実験的感染に対して動物を防御できなかった。
【０３１２】
二抗原製剤におけるコンジュゲートの組み合わせは、被膜ＣＰ５およびＣＰ８の両方に対して抗体を誘発し、単一抗原での免疫化と比較して、誘発される特異的抗体レベルに対する干渉はなかった。三抗原製剤におけるコンジュゲートとＣｌｆＡとの組み合わせは、高レベルのＣＰ５、ＣＰ８、およびＣｌｆＡを誘発し、組み合わせ内に存在するいずれかの抗原に対して誘発された抗体応答に対する干渉はなかった。三抗原免疫原性組成物は、高い免疫前力価でウサギにおける３つ全ての成分に対してブーストされ得る抗体（Ａｂ）応答を誘発した。
【０３１３】
これらの結果は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートしたＣＰ５およびＣＰ８が、防御性の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）免疫原性組成物の免疫原性製剤成分として含まれるべきであることを示唆する。
【０３１４】
（実施例３０）複数の考えられる黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）疾患から防御するための異なる抗原の要件
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、比較的軽度の皮膚感染から、心内膜炎、壊疽性筋膜炎、骨髄炎、敗血症性関節炎、および肺炎などの、より重症で侵襲性の感染にわたる、広範な感染の原因である。これらのインビボでの部位のそれぞれは固有であり、細菌は、それらの抗原発現プロフィールを、個別の株がコロニー形成し、成長し、最終的に疾患を生じさせるために最も適したプロフィールに改変することによって、環境刺激の差に応答する可能性がある。実施例１２において例示されるように、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株は、インビボでの抗原発現の多様性を示す。異なる抗原から構成される多成分免疫原性組成物は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）により生じる多様な疾患所見に対して防御する可能性が高い。
【０３１５】
ＣｌｆＡは、齧歯動物の心内膜炎モデルおよび敗血症モデルにおいて防御することが示された。ＣｌｆＢは、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の鼻腔でのコロニー形成において重要であることが報告されている。ＭｎｔＣは、マウス菌血症モデルにおいてマウスを防御した。ＣＰ５コンジュゲートは、腎盂腎炎および心内膜炎において防御し、ＣＰ８コンジュゲートは、齧歯動物の腎盂腎炎モデルおよび敗血症モデルにおいて防御した。これらの結果は、これらの抗原を含有する多成分ワクチンが、複数のタイプの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）疾患に対して防御することを実証する。
【０３１６】
インビボでの動物モデルは、実際の感染の経過に近似し、どの抗原が特定の疾患からの防御において有用であり得るかを解明するために役立つ。表２６は、様々なインビボモデルで行われた多くの実験の結果をまとめたものである。結果は、各ブロックにおいて、スラッシュによって分けられた４つの数字として報告されており、例えば、敗血症モデルにおけるＣｌｆＡは、２７／１／３／３１という数を有する。最初の数は、ＣｌｆＡ免疫化が防御の統計的に有意な正の結果をもたらした実験の数である。２番目の数は、ＣｌｆＡ免疫化が、有意的な傾向を示すが統計的に有意ではない防御の正の結果をもたらした、実験の数である。３番目の数は、ＣｌｆＡ免疫化が負の結果をもたらしたが、統計的に有意ではなかった、実験の数である。４番目の数は、行われた実験の総数である。最初の３つの数は、加算されると、４番目の数に等しくなる。
【０３１７】
【表２８】
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【０３１８】
（実施例３１）インビトロおよびインビボでの様々な多抗原免疫原性組成物の試験
ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、ＭｎｔＣ、ＣＰ５−、およびＣＰ８というポリペプチドおよび／または多糖から選択される３つ、４つ、または５つの抗原を含有する様々な多抗原ブドウ球菌免疫原性製剤を、様々なインビボモデルにおいて免疫原性および効力について試験する。免疫原性組成物は以下の通りである。
【０３１９】
（１）単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）ポリペプチド、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖５型、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖８型を含む、免疫原性組成物。
【０３２０】
（２）第２の組み合わせは、クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）、クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）、単離されたＭｎｔＣ、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートした単離されたブドウ球菌莢膜多糖ＣＰ５、およびＣＲＭ１９７にコンジュゲートした単離されたブドウ球菌莢膜多糖ＣＰ８を提供する。
【０３２１】
（３）第３の組み合わせは、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）ポリペプチド、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）ポリペプチド、または単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣタンパク質、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖５型、およびＣＲＭ１９７にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖８型を含む免疫原性組成物を提供する。
【０３２２】
（４）第４の組み合わせは、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）ポリペプチド、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖５型、およびＣＲＭ１９７にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖８型を含む免疫原性組成物を提供する。
【０３２３】
（５）第５の組み合わせは、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）ポリペプチド、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣタンパク質、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖５型、およびＣＲＭ１９７にコンジュゲートした単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖８型を含む免疫原性組成物を提供する。
【０３２４】
そして、（６）第６の組み合わせは、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）ポリペプチド、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）ポリペプチド、および単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣタンパク質を含む免疫原性組成物を提供する。
【０３２５】
ｒＣｌｆＡおよびｒＣｌｆＢは、実施例１において記載したように調製および精製する。ＭｎｔＣは、実施例２において記載したように調製および精製する。単離されたＣＰ５およびＣＰ８は、実施例３において記載したように調製および精製し、実施例４において記載したようにＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせる。
【０３２６】
より具体的には、上記の先の実施例において記載された手順を用いて、免疫原性および効率を測定する。３つ、４つ、または５つの成分のそれぞれが、単独でまたは共に送達された場合に免疫応答を誘発するかどうかを決定するために研究を行う。これらの同一の研究を用いて、４つまたは５つの成分のいずれか１つの存在が、他の３つまたは４つの成分のいずれか１つの、免疫応答を誘発する能力に干渉するか否かを決定する。さらに、４つまたは５つの成分が、単独で試験された場合に、または共に試験された場合に、上記の動物モデルのいずれか１つまたは複数において防御をもたらすかどうかを決定するために研究を行う。４つまたは５つの成分は、上記の先の実施例において述べたように、単回用量または複数回用量として動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、またはヒトではない霊長類に投与される。動物を出血させ、血清を回収し、４つまたは５つの成分のそれぞれに対する抗体の存在について試験する。抗原特異的抗体の存在は、当業者に知られているあらゆる免疫アッセイによって測定し、例えば、ＥＬＩＳＡ（実施例１１〜２９を参照されたい）またはウェスタンブロット（実施例１を参照されたい）を用いて、抗原特異的抗体の存在または不存在を評価する。さらに、オプソニン性貪食アッセイを用いて、抗原特異的抗体が、貪食細胞によるブドウ球菌生物の死滅の仲介において効果的であるかどうかを決定する（実施例１１〜２９を参照されたい）。
【０３２７】
インビボでの効力はまた、限定はしないが、留置管モデル、マウス菌血症モデル、創傷感染モデル、マウス腎盂腎炎モデル、ラット心内膜炎モデル、およびマウス敗血症モデルなどの、上記の動物研究のいずれか１つまたは複数を用いて評価される（実施例１１〜３０を参照されたい）。
【０３２８】
（実施例３２）黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗原の組み合わせは、ヒトではない霊長類において、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株Ｐｆｅ５−１の死滅を増強させる抗体を生成する。
抗原の組み合わせを用いると、ＯＰＡアッセイを用いて測定されるように増強された効力が観察された。３〜１０頭のサルからなる群を多成分ワクチンで免疫化する、ヒトではない霊長類での研究を行った。単回用量のワクチンを与えた動物およびＯＰＡ力価を、０日目およびワクチン接種の２週間後にモニタリングした。ＯＰＡ力価は、ＯＰＡアッセイにおいて黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株Ｐｆｅ５−１の５０％を死滅させるために必要な血清の希釈として定義された。増強された活性が、３抗原ワクチン製剤と比較して、４抗原の組み合わせで見られた（ｐ＝０．０２７２、図１８）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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