(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＭＧＢ１のＣテイルに結合する抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を有効成分とすることを特徴とするアテローム動脈硬化抑制剤。
【請求項２】
静脈注射投与するものである請求項１に記載のアテローム動脈硬化抑制剤。
【請求項３】
抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を、１回当たり０．２ｍｇ／ｋｇ以上、２ｍｇ／ｋｇ以下投与するものである請求項２に記載のアテローム動脈硬化抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アテローム動脈硬化を抑制するための薬剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アテローム動脈硬化は、アテローム硬化プラークと呼ばれる沈着物が動脈血管内膜層で発達し、血流が減少したり遮断される疾患である。さらに、アテローム硬化プラークは、線維性被膜の消化やカルシウムイオンの蓄積などにより硬くなって破裂する場合がある。破裂したアテローム硬化プラークでは、血栓が高頻度で形成される。また、破裂したアテローム硬化プラークへは血液が流れ込み、プラーク自体が増大し得る。また、破裂したアテローム硬化プラークから脂肪性の内容物が血液中へ流入し、別の箇所で血管を閉塞することもある。このようにアテローム動脈硬化は、進行すると血栓症や臓器虚血の原因となり、脳梗塞、心筋梗塞、腎不全などを引き起こす。
【０００３】
ある統計によれば、日本における死因は、上位からがんなどの悪性新生物、心臓病、脳血管疾患となっている。しかし、心臓病と脳血管疾患は動脈硬化が原因であり得、動脈硬化の中でもアテローム動脈硬化の割合が最も高いことから、実はアテローム動脈硬化こそが死因の第一位であるともいわれている。よって、アテローム動脈硬化の改善は非常に重要である。
【０００４】
アテローム動脈硬化に対しては、一般的に、スタチンなどの抗高脂血症薬や、アンギオテンシン受容体遮断薬などの抗高血圧薬が用いられる。しかし、アテローム動脈硬化の発生や進行には様々な要因が複雑に関与していることから、これらと作用機序の異なるアテローム動脈硬化抑制剤が求められていた。
【０００５】
アテローム動脈硬化は、血液中の単球が活性化されて血管内皮細胞下に侵入することから始まるといわれている。血管内膜層に侵入した単球はマクロファージへと変化し、さらにコレステロールなどの脂肪性物質を取り込んで泡沫細胞へと変化する。かかる泡沫細胞や平滑筋細胞が形質転換した上で遊走して蓄積し、アテローム硬化プラークが形成される。ここで、単球やマクロファージの活性化は、炎症反応で見られる現象である。よって、炎症反応を抑制する因子によりアテローム動脈硬化を治療するということが検討されている。
【０００６】
例えば特許文献１には、ＨＭＧ（高移動度群タンパク質）の一部を構成するＡボックスを含むポリペプチドや、或いはＨＭＧの一部を構成するＢボックスへ特異的に結合する抗体により起炎症性サイトカインの放出を阻害し、炎症性サイトカインカスケードを原因とする疾患を処置することが記載されている。かかる疾患の一つとして、アテローム動脈硬化が記載されている。
【０００７】
また、特許文献２には、ＨＭＧのボックスに結合する抗体によりアテローム動脈硬化などの血管疾患を治療することが記載されている。
【０００８】
上記特許文献において、ＨＭＧとして利用されているのは、ＨＭＧＢ１（High Mobility Group Box 1）である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表２００５−５１２５０７号公報
【特許文献２】特表２００４−５２３５７９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述したように、ＨＭＧＢ１のボックスに結合する抗体によりアテローム動脈硬化を治療するというアイデアはあった。しかし、上記特許文献に開示されている実験結果はインビトロの基礎的なものであり、かかる抗体によりアテローム動脈硬化を実際に抑制できるかは不明である。
【００１１】
具体的には、特許文献１に記載されているアテローム動脈硬化は、炎症性サイトカインカスケードに関係するものとして例示されている多数の疾患のうちの一つに過ぎない。また、特許文献１で開示されている実験例では、ＨＭＧＢ１のＢボックスに結合する抗体が腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の放出を阻害するといった基礎的な知見が主に示されているのみであって、改善結果が実際に示されている疾患は敗血症のみである。
【００１２】
また、特許文献２で実験的に示されているのは、ＨＭＧＢ１に対する抗体が平滑筋細胞（ＲＳＭＣ）の移動や形態的変化を阻害することなどのみであり、かかる抗体が実際に血管疾患の治療に用い得ることを実証する試験は開示されていない。さらに、特許文献２に記載されているのはインビトロ試験のみであり、実験動物を用いたインビボ試験や臨床試験の結果は記載されていない。また、確かに平滑筋細胞の遊走はアテローム動脈硬化の部分的な現象ではあるが、平滑筋細胞の遊走を阻害したからといって単球の活性化やアテローム硬化プラークそのものを抑制できるとは限らない。
【００１３】
以上の状況下、本発明が解決すべき課題は、実際のアテローム動脈硬化の抑制に有効であり、且つ副作用の少ない薬剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を進めた。その結果、ＨＭＧＢ１のＣテイルに結合する抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体が、実際のアテローム動脈硬化の抑制に極めて有効であることを見出して、本発明を完成した。
【００１５】
より詳しくは、従来、ＨＭＧＢ１に対するモノクローナル抗体としては、主にＡボックスやＢボックスに結合するものが検討されていた。これは、ＨＭＧＢ１のボックス部位が、平滑筋細胞や神経細胞など様々な細胞で発現しているマルチリガンド受容体であるＲＡＧＥ（receptor for advanced glycation endproducts）に対する結合部位の一つであることによると考えられる。一方、本発明者らは、独自にＨＭＧＢ１のＣテイルに結合するモノクローナル抗体につき研究を進め、ＨＭＧＢ１のボックスに結合するモノクローナル抗体がＨＭＧＢ１による血管透過性の亢進を全く阻害しないのに対して、Ｃテイルに対するモノクローナル抗体が有意に亢進を阻害できることを見出した。よって、ＨＭＧＢ１のＣテイルに結合するモノクローナル抗体は血管内皮細胞下への単球の侵入の促進を含む、ＨＭＧＢ１の作用を効率良く阻害でき得る。その上、アテローム動脈硬化を総合的に抑制できることを、モデル動物を用いて実験的に証明した。
【００１６】
本発明に係るアテローム動脈硬化抑制剤は、ＨＭＧＢ１のＣテイルに結合する抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を有効成分とすることを特徴とする。
【００１７】
上記アテローム動脈硬化抑制剤の投与形態としては、静脈注射が好適である。上記抗体を障害部位へ速やかに送達できるからであり、また、本発明者らの実験によって、モデルマウスに上記抗体を静脈注射で投与することによりアテローム動脈硬化が顕著に改善されることが実証されている。
【００１８】
また、上記抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体の投与量としては、後述する実験結果より、１回当たり０．２ｍｇ／ｋｇ以上、２ｍｇ／ｋｇ以下が好適である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に係る薬剤は、活性化された単球の血管内膜層への集積を阻害することなどにより、脳梗塞や心筋梗塞など様々な臓器障害の原因となるアテローム動脈硬化を効果的に抑制することができる。また、現在使用されている抗体薬剤を考慮すれば、重篤な副作用を生じる可能性は極めて少ないと考えられる。従って、本発明のアテローム動脈硬化抑制剤は、抗高脂血症薬や抗高血圧薬などこれまで実用化されている薬剤とは異なる作用機序によりアテローム動脈硬化を抑制可能な実用的薬剤として、極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実験用ラットの背部皮内に、生理食塩水、ＨＭＧＢ１のみ、ＨＭＧＢ１＋本発明に係る抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体、またはＨＭＧＢ１＋ＨＭＧＢ１のＢボックスに結合するモノクローナル抗体を投与した後における色素（エバンスブルー）の血管透過量の相対割合を示すグラフである。
【図２】アテローム動脈硬化モデルマウスの大動脈洞スライスの断面に存在するＨＭＧＢ１を免疫染色した写真である。（１）は一次抗体として抗ＨＭＧＢ１抗体を用いた場合の写真であり、（２）は一次抗体として非特異的ＩｇＧ抗体を用いた場合の写真である。
【図３】アテローム動脈硬化モデルマウスの大動脈洞スライスの断面を、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏで染色した写真を示す。（１）は対照としてKeyhole Limpet Hemocyanin抗体を投与したマウスの写真であり、（２）は本発明に係る抗ＨＭＧＢ１抗体を投与したマウスの写真である（以下、図４〜１０において同様である）。
【図４】アテローム動脈硬化モデルマウスの大動脈洞スライスの断面に存在するＣＤ６８を免疫染色した写真である。
【図５】アテローム動脈硬化モデルマウスの大動脈洞スライスの断面に存在するＶＣＡＭ−１を免疫染色した写真である
【図６】アテローム動脈硬化モデルマウスの大動脈洞スライスの断面に存在するＭＣＰ−１を免疫染色した写真である。
【図７】アテローム動脈硬化モデルマウスの大動脈洞スライスの断面に存在するＣＤ１１ｃを免疫染色した写真である。
【図８】アテローム動脈硬化モデルマウスの大動脈洞スライスの断面に存在するＣＤ８３を免疫染色した写真である。
【図９】アテローム動脈硬化モデルマウスの大動脈洞スライスの断面に存在するＣＤ４を免疫染色した写真である。
【図１０】アテローム動脈硬化モデルマウスの大動脈洞スライスの断面に存在するＰＣＮＡを免疫染色した写真である。
【図１１】対照であるＩｇＧ抗体または本発明に係る抗ＨＭＧＢ１抗体を投与したアテローム動脈硬化モデルマウスの大動脈洞スライスの断面を、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏで染色した場合、または抗原を免疫染色した場合における、染色部位の面積や割合、または染色された細胞数を示すグラフである。（１）はＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏで染色した場合であり、（２）〜（８）はそれぞれＣＤ６８、ＶＣＡＭ−１、ＭＣＰ−１、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８３、ＣＤ４、ＰＣＮＡを免疫染色した場合の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明のアテローム動脈硬化抑制剤は、ＨＭＧＢ１のＣテイルに結合する抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を有効成分とする。
【００２２】
本発明に係る抗体は、投与後、血液内において単球の活性化を抑制し、その血管内膜層への侵入を顕著に抑制する。また、血管内壁におけるマクロファージの泡沫化や、単球の血管内皮細胞への接着を促進する因子の発現を抑制する。これら作用により、本発明に係る抗体は、実際にアテローム動脈硬化の病巣を減少させる。その上、モノクローナル抗体としての特性から、他の化合物などには作用せず、副作用が生じる可能性は無いか、極めて少ないと考えられる。
【００２３】
本発明に係る抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体の調製は、常法に従えばよい。例えば、市販のＨＭＧＢ１を用いてマウスやラット等を免疫し、その抗体産生細胞や脾細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを得る。このハイブリドーマをクローニングし、ＨＭＧＢ１のＣテイルへ特異的に反応する抗体を産生しているクローンをスクリーニングする。このクローンを培養し、分泌されるモノクローナル抗体を精製すればよい。
【００２４】
本発明で使用する抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体の種類は、特に制限されない。例えば、ヒト型抗体や完全ヒト抗体を用いることができる。好適には、投与対象である動物に由来する抗体を用いる。
【００２５】
本発明に係るアテローム動脈硬化抑制剤の剤形は特に問わないが、有効成分である抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体がペプチドであることを考慮すれば、注射剤としての投与を志向して、溶液やエマルション製剤などの液状製剤とすることが好ましい。
【００２６】
液状製剤の溶媒としては、ｐＨを調整した生理食塩水やグルコース水溶液など、血漿の等張液を用いることができる。また、抗体を塩類等と共に凍結乾燥した場合には、純水、蒸留水、滅菌水等も使用できる。その濃度も通常の抗体製剤のものとすればよく、一般的には０．１ｍｇ／ｍＬ以上、１ｍｇ／ｍＬ以下程度、点滴用では０．０２ｍｇ／ｍＬ以上、０．２ｍｇ／ｍＬ以下程度とすることができる。但し、注射剤の浸透圧は、血漿と同等にする必要がある。
【００２７】
本発明における「抑制」には、アテローム動脈硬化の発生の抑制、即ち「予防」と、発生したアテローム動脈硬化の軽減や進行の抑制、即ち「治療」の両方の概念が含まれる。従って、本発明のアテローム動脈硬化抑制剤は、アテローム動脈硬化の憎悪因子の上昇から実際にアテローム動脈硬化が発生する前に予防的に投与してもよいし、アテローム動脈硬化の発生後に治療的に投与してもよい。
【００２８】
本発明に係るアテローム動脈硬化抑制剤の投与頻度や投与量は、患者の重篤度、年齢、性別などに応じて適宜調整すればよい。後述する実施例で示す通り、体重約２５ｇのモデルマウスに対して１回当たり４００μｇの抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を週当たり２回投与した場合に、顕著なアテローム動脈硬化の抑制効果が得られた。斯かる結果から考えると、ヒトに対する投与量は、１回当たり抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を０．１ｍｇ／ｋｇ以上、２ｍｇ／ｋｇ以下程度とし得、より好適には０．２ｍｇ／ｋｇ以上、２ｍｇ／ｋｇ以下とし、１週間当たり２回から一日当たり３回程度投与することができる。
【００２９】
投与形態も特に制限されず、適宜調整すればよいが、本発明に係る抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体は、血液中の単球やアテローム硬化プラークに作用させる必要があることから、血中への注射投与、特に静脈注射投与が好ましい。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例により制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に含まれる。
【００３１】
実施例１  ＨＭＧＢ１のＣテイルに結合する抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体の調製
（ａ）ラットの免疫
市販のウシ胸腺由来ＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ２との混合物（和光純薬工業社製、コード番号：０８０−０７０７４１）１ｍｇ／ｍＬを２ｍＬガラス製注射筒にとり、別の２ｍＬガラス製注射筒にとった等容量のフロイント完全アジュバンドと連結管を通じて徐々に混和することによって、エマルションとした。セボフルレンにより麻酔したラットの後肢足蹠に、得られたエマルションを０．１ｍＬずつ、計０．２ｍＬ注射投与した。２週間後、頚静脈から試験採血し、抗体価の上昇を確認した。次いで、腫大した腸骨リンパ節を前記注射投与から５週間後に無菌的に取り出した。得られた２個のリンパ節から、約６×１０7個の細胞を回収することができた。
【００３２】
（ｂ）細胞融合とクローニング
上記腸骨リンパ節細胞とマウスミエローマＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４（ＳＰ２）細胞を、ポリエチレングリコールを用いて融合させ、得られた融合細胞を９６穴マイクロプレートに蒔いた。１週間後、最初のＥＬＩＳＡスクリーニングを行ない、陽性ウェルについて、ウェスタンブロットにより二次スクリーニングを行なった。陽性を示すウェル細胞を２４穴マイクロプレートに移し、細胞をほぼコンフルエントな状態（約２×１０5）に殖やしてから、０．５ｍＬの凍結培地（ＧＩＴ培地にウシ胎児血清を１０％とジメチルスルホキシドを１０％添加したもの）を用いて、液体窒素中で凍結保存した。この凍結保存細胞を解凍した後、９６穴マイクロプレートでクローニングした。
【００３３】
（ｃ）抗体の精製
回転培養装置（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ社製）により上記陽性細胞を２週間大量培養し、濃度２〜３ｍｇ／ｍＬの抗体液を得た。中性ｐＨ下、この抗体液をアフィニティゲル（インビトロジェン社製、ＭＥＰ−ＨｙｐｅｒＣｅｌ）と混和し、抗ＨＭＧＢ１抗体をゲルへ特異的に結合させた。特異的にゲルに結合した抗体を、グリシン−塩酸バッファー（ｐＨ４）により溶出した。溶出液を限外濾過装置により濃縮した後、セファロースＣＬ６Ｂゲル濾過カラム（直径２ｃｍ×長さ９７ｃｍ）によって、得られた抗体を単離精製した。
【００３４】
得られたモノクローナル抗体のうちの一つは、ＨＭＧＢ１のＣテイル中のアミノ酸配列である２０８ＥＥＥＤＤＤＤＥ２１５（Ｅはグルタミン酸を示し、Ｄはアスパラギン酸を示す）をエピトープとして特異的に認識する抗体であった。例えば、ＨＭＧＢ１に類似するタンパク質としてＨＭＧＢ２があるが、ＨＭＧＢ２には２１１以下のＤＤＤＤＥの配列が存在しないため、本発明に係るモノクローナル抗体はＨＭＧＢ２に結合せず、ＨＭＧＢ１のみを特異的に認識して結合することができる。
【００３５】
比較例１  ＨＭＧＢ１のＢボックスに結合する抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体の調製
上記実施例１と同様にして、ＨＭＧＢ１のＢボックス（配列：ＬＫＥＫＹＥＫＤＩＡ）をエピトープとして認識する抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を単離精製した。
【００３６】
試験例１  抗体の結合部位の決定
上記実施例１および比較例１のモノクローナル抗体のＨＭＧＢ１における結合部位を、改めて決定した。
【００３７】
具体的には、ＨＭＧＢ１のアミノ酸配列のうちＮ末端から１〜１５、６〜２０、１１〜２５・・・といった１５個のアミノ酸配列を有する４１のペプチドを合成した。これらペプチドの１ｍｇ／ｍＬ溶液を、Ｕｌｔｒａ Ｂｉｎｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＰＡＬＬ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）に、０．５μＬずつ重ならないように滴下した。また、ポジティブコントロールとして、ウシ胸腺由来の精製ＨＭＧ−１，２の１ｍｇ／ｍＬ溶液も０．５μＬ滴下した。滴下後、当該Ｍｅｍｂｒａｎｅを室温で１時間風乾した。風乾後、２０％スキムミルク／ＰＢＳ溶液で１時間ブロッキングした。次いで、ＭｅｍｂｒａｎｅをＰＢＳで５分間ずつ２回洗浄した後、室温で１時間風乾した。当該ＭｅｍｂｒａｎｅをＰＢＳに浸した後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で５００倍に希釈した各抗体溶液（１ｍＬ）をナイロン膜に入れてパッキングし、４℃で一晩反応させた。その後、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ溶液で５分間ずつ３回洗浄した。ペルオキシダーゼ標識された抗ＲＡＴ抗体を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で１０００倍に希釈し、当該溶液（１ｍＬ）を加え、室温で一晩反応させた。次いで、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ溶液で５分間ずつ３回洗浄した後、ケミルミネッセンス法により発色させた。
【００３８】
発色が認められたスポットのアミノ酸配列から、上記実施例１で得られた抗体はＨＭＧＢ１のＣテイル（配列：ＥＥＥＤＤＤＤＥ）へ特異的に結合し、上記比較例１で得られた抗体はＨＭＧＢ１のＢボックス（配列：ＬＫＥＫＹＥＫＤＩＡ）へ特異的に結合することを確認することができた。
【００３９】
試験例２  血管透過性試験
アテローム動脈硬化は、血液中の単球が動脈血管内皮細胞間隙を通過して、内皮細胞の基底膜下に侵入することから始まるといわれており、ＨＭＧＢ１は単球の活性化と血漿タンパク質の漏出に関与していると考えられている。そこで、ＨＭＧＢ１による血管透過性亢進の阻害試験を行い、各抗体の活性を調べた。
【００４０】
８匹のウィスター系雄性ラット（体重：３００〜４００ｇ）を、２％ハロタン、４９％酸素、４９％笑気ガスからなる混合ガスで麻酔した。麻酔中、ラットは自発呼吸させた。麻酔したラットをうつ伏せにして背中の毛を剃り、脊椎を中線として、１ｃｍの間隔で両側１０箇所に印を付けた。別途、昆虫細胞Ｓｆ９を用い、ヒトＨＭＧＢ１組換え体を調製した。ラットの印を付けた箇所へ、生理食塩水のみ（０．１ｍＬ）、ＨＭＧＢ１の２．５μｇ／ｍＬ溶液のみ（０．１ｍＬ）、ＨＭＧＢ１の２．５μｇ／ｍＬ溶液（０．１ｍＬ）とＣテイルに結合する抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体（実施例１）の２５μｇ／ｍＬ溶液（０．１ｍＬ）、またはＨＭＧＢ１の２．５μｇ／ｍＬ溶液（０．１ｍＬ）とＢボックスに結合する抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体（比較例１）の２５μｇ／ｍＬ溶液（０．１ｍＬ）を、２箇所ずつ皮下注射した。
【００４１】
皮下注射から１時間後、エヴァンスブルーの２％生理食塩水溶液を、体重ｋｇ当たり２ｍＬの割合で静脈注射した。エヴァンスブルーの静脈注射から２時間後、体重ｋｇ当たり５０ｍｇの割合でペントバルビタールナトリウムを腹腔内投与して深麻酔状態とした。左心室から生理食塩水（１００ｍＬ）を還流し、右心房から脱血した。背部の皮膚を剥離し、裏面から写真撮影した。得られた写真を医療用画像解析ソフト（ＩｍａｇｅＪ，ＮＩＨ）により解析し、血液中から血管外へ漏出した色素の濃度と面積を測定し、その量を計算した。ＨＭＧＢ１を単独投与した場合における色素の血管外漏出量を１００％とした場合の割合を、図１に示す。
【００４２】
図１のとおり、ＨＭＧＢ１のみを投与した場合においては、生理食塩水のみを投与した場合に比べて、血液中から血管内皮細胞を透過して漏出した色素の量は当然に増加している。しかし、ＨＭＧＢ１に加えて、Ｂボックスに結合する抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を投与した場合であっても、有意差こそないものの、血管外へ漏出した色素の量はかえって増加する傾向にあった。
【００４３】
それに対して、ＨＭＧＢ１に加えて、Ｃテイルに結合する抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を投与した場合、ＨＭＧＢ１を単独投与した場合のみならず、さらにＢボックスに結合する抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を投与した場合に比べても、ｐ＜０．００１の危険率で色素の血管透過を有意に抑制している。
【００４４】
従って、本発明に係るＣテイルに結合する抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体は、血漿タンパク質のアテローム硬化プラークへの漏出を顕著に低減し、アテローム動脈硬化の発生や進行を抑制できることが実証された。
【００４５】
試験例３  動脈硬化症病態のマウスの大動脈壁におけるＨＭＧＢ１の免疫組織化学染色
（１）  アテローム動脈硬化モデルマウスの作製
一般的な実験用マウスであるＣ５７ＢＬに由来する雄性ＡｐｏＥ−／−マウス（６週齢）をＰｒｅｃｉｎｃｔ Ａｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＡＭＲＥＰ，メルボルン，オーストラリア）から入手し、コレステロール０．１５％と脂肪分２１％を含む高脂肪餌を８週間にわたり与えた。
【００４６】
（２）  免疫染色
過剰量のペントバルビタール（１２０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与することにより上記マウスを殺し、心臓と近位大動脈を切除し、ＯＣＴコンパウンド（製品名「Ｔｉｓｓｕｅ−ｔｅｋ）に包埋し、−８０℃で凍結した。大動脈洞の６μｍ厚スライスを作製した。
【００４７】
当該大動脈洞スライスを、−２０℃のアセトンで２０分間固定化した。次いで、３％過酸化水素、１０％血清およびビオチン／アビジンブロッキング剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を含むＰＢＳ溶液中でインキュベートした。当該スライスを、血清中、一次抗体と１時間インキュベートした。使用した一次抗体は、ウサギ由来の抗ＨＭＧＢ１抗体（０．１２５μｇ／ｍＬ，ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製，ｃａｔ＃５５６５２８）または非特異的なウサギ由来ＩｇＧ抗体である。次いで、当該スライスを洗浄した後、二次抗体と４０分間インキュベートした。使用した二次抗体は、ビオチン化抗ウサギ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製，ｃａｔ＃ＢＡ−１０００）である。続いて、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）とインキュベートした。抗原を、３，３−ジアミノベンジジンを用いて可視化した。各スライスを、ヘマトキシリンで対比染色した。両写真を図２として示す。
【００４８】
抗ＨＭＧＢ１抗体により免疫染色された部分は、動脈血管内膜層に限局しており、この部分に存在する細胞核と細胞質が広範囲で陽性に染色された。一方、血管中膜層には、陽性細胞はほとんどなかった。以上の結果は、アテローム動脈硬化巣において、浸潤するマクロファージ、リンパ球、遊走し形質転換した平滑筋細胞などがＨＭＧＢ１を発現していることを示唆し、ＨＭＧＢ１が細胞外へ供給される状態になっていることが分かる。
【００４９】
試験例４  抗アテローム動脈硬化試験
本発明に係る抗ＨＭＧＢ１抗体の実際のアテローム動脈硬化に対する効果を、アテローム動脈硬化モデルマウスを用いて試験した。なお、この実験は、ｔｈｅ Ａｌｆｒｅｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｐｒｅｃｉｎｃｔ（ＡＭＲＥＰ）Ａｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに認可されたものである。
【００５０】
（１）  アテローム動脈硬化モデルマウスの作製
一般的な実験用マウスであるＣ５７ＢＬに由来する雄性ＡｐｏＥ−／−マウス（６週齢）をＰｒｅｃｉｎｃｔ Ａｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＡＭＲＥＰ，メルボルン，オーストラリア）から入手し、コレステロール０．１５％と脂肪分２１％を含む高脂肪餌を８週間にわたり与えた。また、当該期間中、実施例１で得た抗ＨＭＧＢ１抗体、または
対照としてヘモシアニンの一種であるＫｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎに対するＩｇＧ２ａを、それぞれマウス１匹当たり４００μｇの用量で１週間当たり２回静脈注射した。
【００５１】
（２）  Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色
過剰量のペントバルビタール（１２０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与することにより上記マウスを殺し、心臓と近位大動脈を切除し、ＯＣＴコンパウンド（製品名「Ｔｉｓｓｕｅ−ｔｅｋ）に包埋し、−８０℃で凍結した。大動脈洞の６μｍ厚スライスを作製し、大動脈内膜断面におけるアテローム動脈硬化病巣部位を、脂肪変性部位を特定できるＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏで染色した。各マウスの上行大動脈において、大動脈弁尖から１８０μｍの間で６０μｍごとの内膜断面において、染色されたアテローム動脈硬化病巣部位の面積を測定し、その平均値を算出した。代表的な断面写真を図３に示す。
【００５２】
（３）  免疫染色
上記の大動脈洞スライスを、−２０℃のアセトンで２０分間固定化した。次いで、３％過酸化水素、１０％血清およびビオチン／アビジンブロッキング剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を含むＰＢＳ溶液中でインキュベートした。当該スライスを、血清中、一次抗体と１時間インキュベートした。使用した一次抗体は、ラット由来の抗マウスＣＤ６８抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ製，ｃａｔ＃ＭＣＡ１９５７）、ラット由来の抗マウスＶＡＣＭ−１抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製，ｃａｔ＃５５０５４７）、ウサギ由来の抗ラットＭＣＰ−１抗体（Ａｂｃａｍ製，ｃａｔ＃ａｂ７２０２）、アルメニアンハムスター由来の抗マウスＣＤ１１ｃ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製，ｃａｔ＃１４−０１１４）、ラット由来の抗マウスＣＤ８３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製，ｃａｔ＃１４−０８３１）、ラット由来の抗マウスＣＤ４抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製，ｃａｔ＃５５０２７４）、またはウサギ由来の抗ヒトＰＣＮＡ抗体（Ａｂｃａｍ製，ｃａｔ＃ａｂ２４２６）である。次いで、当該スライスを洗浄した後、由来動物に応じた二次抗体と４０分間インキュベートした。使用した二次抗体は、マウス由来のビオチン化抗ラット抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製，ｃａｔ＃５５０３２５）、マウス由来のビオチン化抗アルメニアンハムスター抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製，ｃａｔ＃１３−４１１３−８５）、またはビオチン化抗ウサギ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製，ｃａｔ＃ＢＡ−１０００）である。続いて、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）とインキュベートした。各抗原を、３，３−ジアミノベンジジンを用いて可視化した。各スライスを、ヘマトキシリンで対比染色した。
【００５３】
Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏによる染色部位および各抗原の発現状況を、Ｏｐｔｉｍｕｓ６．２ ＶｉｄｅｏＰｒｏ−３２により染色範囲を測定するか、或いは対応する細胞を計数することにより、定量化した。
【００５４】
Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏで染色した写真を図３に、ＣＤ６８、ＶＣＡＭ−１、ＭＣＰ−１、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８３、ＣＤ４、ＰＣＮＡを免疫染色した写真を図４〜１０に示す。なお、図３〜１０中、（１）は対照であるＩｇＧを投与した結果であり、（２）は本発明に係る抗ＨＭＧＢ１抗体を投与した結果である。また、各例において、アテローム動脈硬化病巣部位の面積、陽性領域の面積比または陽性細胞数を定量化した結果のグラフを図１１に示す。図１１中、（１）はＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏで染色した結果であり、（２）〜（８）はそれぞれＣＤ６８、ＶＣＡＭ−１、ＭＣＰ−１、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８３、ＣＤ４、ＰＣＮＡを免疫染色した結果である。また、図１１において、「＊」はｔ−テストより危険率ｐ＜０．０５で有意差がある場合を示す。
【００５５】
Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏは脂肪変性部位を染色できるため、図３の写真中の染色部位はアテローム動脈硬化病巣部位を示す。図３のとおり、ＩｇＧ抗体を投与した場合に比して、本発明に係るＨＭＧＢ１抗体を投与した場合には、アテローム動脈硬化病巣部位が顕著に低減されていることが分かる。
【００５６】
ＣＤ６８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８３およびＣＤ４は白血球抗原であり、それぞれマクロファージ、未熟樹状細胞、成熟樹状細胞、Ｔ−リンパ球で高発現している。図４、図７〜９および図１１のとおり、対照であるＩｇＧ抗体を投与した場合に比して、本発明に係るＨＭＧＢ１抗体を投与した場合にはこれら白血球抗原の発現が顕著に抑制されており、血管内膜層におけるマクロファージ、樹状細胞およびＣＤ４陽性Ｔ−リンパ球の浸潤が顕著に抑制されていることが分かる。
【００５７】
ＶＣＡＭ−１は、血管内皮細胞の活性化によりその細胞形質膜における発現量が増大する。特に動脈硬化の形成に関与すると考えられている。従って、免疫組織化学染色によりＶＣＡＭ−１陽性細胞数の増減を調べることにより、内皮細胞の活性化に対する抗体の効果を評価できる。図５と図１１のとおり、本発明に係るＨＭＧＢ１抗体を投与した場合には対照に比してＶＣＡＭ−１陽性細胞数がおよそ半減しており、当該抗体により動脈硬化の形成に関与する血管内皮細胞の活性化を抑制できることが明らかにされた。
【００５８】
ＭＣＰ−１は、単球、マクロファージおよび樹状細胞の遊走因子である。図６のとおり、本発明に係るＨＭＧＢ１抗体を投与した場合には対照に比してＭＣＰ−１陽性の領域が約３０％にまで低減されているので、当該抗体は動脈硬化の形成に関与する単球等の遊走を抑制できることが証明された。
【００５９】
ＰＣＮＡは、ＤＮＡの合成と修復に関与する核内因子である。血管壁内では、遊走平滑筋の増殖性細胞で多く発現していると考えられる。図１０と図１１のとおり、本発明に係るＨＭＧＢ１抗体を投与した場合には対照に比してＰＣＮＡ陽性の細胞数が約３５％低下しているので、当該抗体により動脈硬化が抑制されることが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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