(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
緑豆発酵−酵素抽出液を有効成分として含む皮膚老化防止用化粧料組成物であって、
前記緑豆発酵−酵素抽出液は、緑豆を酵母又は発酵菌で培養して得られた緑豆発酵液をタンパク質分解酵素で処理して得られることを特徴とする化粧料組成物。
【請求項２】
緑豆発酵−酵素抽出液を有効成分として含む皮膚しわ改善用化粧料組成物であって、
前記緑豆発酵−酵素抽出液は、緑豆を酵母又は発酵菌で培養して得られた緑豆発酵液をタンパク質分解酵素で処理して得られることを特徴とする化粧料組成物。
【請求項３】
緑豆発酵−酵素抽出液を有効成分として含む皮膚保湿用化粧料組成物であって、
前記緑豆発酵−酵素抽出液は、緑豆を酵母又は発酵菌で培養して得られた緑豆発酵液をタンパク質分解酵素で処理して得られることを特徴とする化粧料組成物。
【請求項４】
前記タンパク質分解酵素は、ペプシン、トリプシン、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、及びジペプチダーゼから構成された群から選択されることを特徴とする請求項１乃至３の何れか一項に記載の化粧料組成物。
【請求項５】
前記緑豆発酵−酵素抽出液は、化粧料組成物の総重量に対し、０．０００１〜３０％（ｗ／ｗ）含有されることを特徴とする請求項１乃至３の何れか一項に記載の化粧料組成物。
【請求項６】
前記化粧料組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤‐含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション、及びスプレーから構成された群から選択される剤形を有することを特徴とする請求項１乃至３の何れか一項に記載の化粧料組成物。
【請求項７】
前記した請求項１乃至３の何れか一項に記載の化粧料組成物を人間の皮膚に塗布して皮膚老化を改善することを特徴とする化粧方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、緑豆発酵−酵素抽出液を含有する化粧料組成物に関するものであって、さらに詳しくは、緑豆を酵母又は乳酸菌で培養して得た発酵抽出液をタンパク質分解酵素を用いて2次的に処理して得た発酵−酵素抽出液を有効成分とする化粧料組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
人の皮膚は老化が進行するにつれて多様な老化現象が現れる。一般的な現象としては、皮膚が乾燥になり、弾力低下、しわ生成などが起こり、皮膚にくすみが出る。また、外部の弱い刺激にもすぐ敏感になり、回復にも長い時間がかかる。このような老化現象は時間の経過によって自然に起こる現象であって、１００％防ぐことはできないが、多様な方法によって老化現象が起こることを遅らせるか、予防することができ、殆どの化粧品がこのような老化現象を予防するのに重点を置いている。
【０００３】
化粧品を用いて皮膚老化現象を抑制するための最も有用な方法は、多様な皮膚老化防止成分を化粧品に添加して使用することによって予防することである。このために、多くの化粧品会社が皮膚老化防止成分を開発するのにかなりの努力を注いでおり、最近は、発酵を通じて得た有効成分を製品に適用することもある。
【０００４】
例えば、チョンクッジャン及び納豆といった代表的な発酵食品に用いられる枯草菌による発酵産物を用いて、生産した発酵液を利用し、化粧料組成物を提供する場合がある。このような発酵液は、微生物によって刺激成分が分解されるか、他の物質に転換されることによって皮膚刺激が低下される利点があり、微生物による発酵産物がまた皮膚に良い影響を与えるため、多く利用されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これに、本発明者らは老化によって発生する多様な皮膚現象を解決するために鋭意努力した結果、緑豆を酵母又は乳酸菌などを用いて発酵させた緑豆発酵抽出液が老化予防効果に優れており、特に緑豆発酵抽出液をタンパク質分解酵素で2次処理した場合、皮膚老化によって発生する皮膚の問題、特に皮膚乾燥、皮膚しわ生成などをさらに効果的に改善できることを確認することによって、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
従って、本発明の目的は、緑豆発酵−酵素抽出液を含む皮膚老化防止用化粧料組成物を提供することである。
【０００７】
また、本発明の目的は、緑豆発酵−酵素抽出液を含む皮膚しわ改善用化粧料組成物を提供することである。
【０００８】
また、本発明の目的は、緑豆発酵−酵素抽出液を含む皮膚保湿用化粧料組成物を提供することである。
【０００９】
また、本発明の他の目的は、緑豆発酵−酵素抽出液を含む化粧料組成物を皮膚に塗布してコラーゲンの生合成を促進する効果、皮膚細胞の活性を促進する効果、及び皮膚保湿効果を示すことを特徴とする化粧方法を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的及び利点は、下記の実施例及び請求範囲によってさらに明確になる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、緑豆発酵−酵素抽出液を含む皮膚老化防止用化粧料組成物に関するものである。本発明の化粧料組成物に含まれた有効成分である緑豆発酵−酵素抽出液は、緑豆を酵母又は乳酸菌で培養して得た発酵液をまた、タンパク質分解酵素を用いて2次処理することによって獲得でき、この抽出液は細胞活性及びコラーゲン合成を促進し、細胞刺激緩和効果に優れており、これを含有する化粧料の場合、優れたしわ改善効果及び皮膚保湿効果を有しており、これを化粧料の素材として開発する場合、優れた皮膚老化防止効果を期待することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
前記目的を達成するために、本発明は緑豆発酵−酵素抽出液を含む皮膚老化防止用化粧料組成物を提供する。
【００１３】
また、本発明は緑豆発酵−酵素抽出液を含む皮膚しわ改善用、及び皮膚保湿用化粧料組成物を提供する。
【００１４】
本発明の組成物において有効成分として用いられる緑豆(Phaseolus radiatus、Mung bean)は安豆または吉豆とも言い、マメ科の一年生植物である緑豆の種子であって、暖かい気候の壌土(砂と粘土が適当に混ざった黒色の土)でよく育ち、高さは30〜80cmである。茎が細く、縦方向に脈があり、10個余りの節があって、枝を伸ばす。葉は、一対の二葉と生まれたての葉が出た後、3つの小さな複葉が出る。
【００１５】
このような緑豆は、マメ科の他の豆類とは違って、漢方で皮膚病治療、解熱、及び解毒剤として使用されてきただけでなく、東医宝鑑によれば、緑豆粉にして顔に塗ったとき、美容効果が得られると知られてきた。最近までも緑豆は、乾燥粉末の形態で、あるいはこれを水や蜂蜜でこねてフェイスマッサージに使用するか、又は緑豆粉を水に混ぜて作る緑豆チヂミや、緑豆から澱粉を取って作る清泡ムク、 ビンデトック、緑豆粥、もやしなどの食品として昔から使用してきただけである。
【００１６】
本明細書において「緑豆」は緑豆の多様な器官(例：種(実)、葉、花、茎、及び根など)を意味し、好ましくは緑豆の種(実)を意味する。
【００１７】
一方、本明細書における用語、緑豆発酵−酵素抽出液は、緑豆抽出物を発酵菌で発酵させて1次的に緑豆発酵抽出液を得た後、これにまたタンパク質分解酵素を処理して得られた抽出液を意味するものであって、発酵菌の種類によって緑豆酵母発酵−酵素抽出液、又は緑豆乳酸菌発酵−酵素抽出液に分かれる。ここで、緑豆抽出液の発酵菌には酵母と乳酸菌が主に使用され、発酵菌として酵母を使用する場合を緑豆酵母発酵−酵素抽出液、発酵菌として乳酸菌を使用する場合を緑豆乳酸菌発酵−酵素抽出液として理解することができる。
【００１８】
また、これと反対の用語である緑豆酵素−発酵抽出液は、前記緑豆発酵−酵素抽出液の製造過程において、発酵段階と酵素処理段階の処理を逆順に実施して得られた抽出液を意味するものであって、緑豆抽出物をまず、タンパク質分解酵素で処理した後、発酵菌で発酵させて得た抽出液を指す。
【００１９】
本発明の緑豆を発酵させるのに使用される酵母は、真核微生物(核と細胞質が核膜によって分かれている生物)に属して、細胞壁、細胞膜、核、糸粒体、顆粒などの細胞小器官を備えている。性の区別のないこれらは、主にbudding(出芽法)で繁殖するが、分離された多くの酵母の中には、発酵能のないもの、buddingの代わりにfission(分裂)、あるいはbud-fission方法で増殖するもの、子嚢胞子(ascospore)ではない射出胞子(ballistospore）を形成するか、胞子(spore)形成が観察されないものなど、多様なグループの酵母も存在する。大きさは普通5-10 μｍ × 5-12μｍで、細菌の5−10倍の大きさであり、適正pHは4.5-5.5であるが、1-10でも生存する。pH 1で12時間生存する酵母はバクテリアより酸に強いため、培地のpHを3.5〜3.8程度に合わせると、バクテリアの汚染をある程度抑制することができる。
【００２０】
酵母は菌種によって少しずつ差異があるが、殆どは20〜25℃でよく育つ。普通は50℃以上では死滅すると言われるが、その温度以上で合成されない成長要素を培地に直接添加することによって、ある程度は克服可能である。サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)の場合、40℃以上で死滅するが、培地にオレイン酸(oleic acid)とエルゴステロール(ergosterol)を添加することによって、これを防止することができる。酵母菌体自体は単細胞植物であって、タンパク質と微量元素を多量含有している。本発明の緑豆を発酵させるのに適した酵母はサッカロマイセス・セレビシエである。
【００２１】
本発明において、緑豆を発酵させるのに使用された発酵菌としての乳酸菌は、ブドウ糖又は乳糖のような炭水化物を分解して乳酸や酢酸のような有機酸を生成する人体に非常に有益な微生物の一種である。一般的に乳酸菌が糖から乳酸を作ることを発酵と言い、このような発酵過程を経て発酵食品が作られる。本発明に使用できる乳酸菌は、例えば、ラクトバシラス(Lactobacillus)、ストレプトコッカス、ビフィドバクテリウム、リューコノストック、ペディオコッカス、ラクトコッカスを含み、好ましくはラクトバシラス(Lactobacillus)である。
【００２２】
本発明の緑豆発酵−酵素抽出液は次の段階によって製造される。
a)緑豆を粉末にする段階；、
b)前記段階 a)で製造された緑豆粉末を精製水に希釈した後、酵母又は乳酸菌を用いて発酵させる段階；、
c)前記段階b)の発酵によって得た発酵液を濾過してタンパク質分解酵素で分解する段階；及び、
d)前記段階c)の酵素分解液を低温熟成、及び濾過して緑豆発酵−酵素抽出液を製造する段階。
【００２３】
前記緑豆発酵−酵素抽出液の製造段階において、前記段階ａ)の緑豆の粉末化は100乃至500メッシュサイズ以下に製造されるが、これに限定される必要はない。
【００２４】
また、前記段階ｂ)の発酵は、緑豆粉末と精製水を1：10に混合し、121℃で滅菌させた後、乳酸菌(Lactobacillus sp)又は酵母菌(Sacharomyces sp)を接種して培養することによって達成される。
【００２５】
また、発酵段階で使用された酵母又は乳酸菌は、総培養液1Lを基準として、 1 × 104 乃至 1 × 105 細胞数の量で接種されることが好ましく、各菌株の性状によって通常的な条件、及び好気的又は通常嫌気(anaerobic)的な条件で培養されることができる。また、発酵菌の培養をさらに活性化させるために、追加的な炭素源、及び/又はPH調節剤を添加することもできる。このときに適合した培養条件は、30 - 37℃、pH 5-7の好気又は通常嫌気的な条件で約1乃至15日間培養され、好ましくは1乃至7日であり、さらに好ましくは1乃至5日であり、最も好ましくは2乃至4日間培養される。
【００２６】
前記段階ｃ)は、段階ｂ)で得た発酵液を1次濾過した後、その濾過液をタンパク質分解酵素で分解する段階であって、このとき、濾過は0.25乃至0.45μmサイズの濾過膜で濾過して、余分の緑豆粉末粒及び発酵菌を除去することができる。1次濾過膜で分離された濾過液は、タンパク質分解酵素で分解して、酵母又は乳酸菌による発酵によっても分解又は転換されなかった成分を2次的に分解又は転換させるために実施される。このとき、使用されるタンパク質分解酵素としては、ペプシン、トリプシン、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ 、ジペプチダーゼなどがあり、好ましくはペプシン、トリプシン、カルボキシペプチダーゼであり、最も好ましくはペプシンである。上記において、段階ｄ)は、タンパク質分解酵素による生物転換方法によって得られた抽出液を低温熟成して安定化させることができ、1次濾過膜と比べてより細密な濾過膜で2次濾過した後、濃縮して保管することができ、この濃縮物を適切に希釈して使用する。ここで、前記分解−濾過−濃縮の過程は、さらに有効な効果のある緑豆発酵−酵素抽出液を得るための工程段階であって、低温熟成過程は5乃至10日間行われることが好ましく、濾過膜の大きさは0.25μｍ以下であることが好ましい。
【００２７】
さらに好ましい具現例によると、緑豆粉末を300メッシュサイズ以下に粉末化した後、培養液に10 g/L添加し、酵母菌株又は乳酸菌などを50,000 cfu/Lで添加して、それぞれ酵母は30℃、乳酸菌は37℃で、pH 5-7、好ましくは約pH 5.5の好気的又は通常嫌気的な条件で、発酵槽で約1日乃至7日間培養して発酵させる。培養後、前記発酵液は0.45μmの濾過膜を用いて1次濾過した後、この濾過液にまたタンパク質分解酵素を処理する。この処理液はまた10日間低温熟成させた後、0.25μm膜で2次濾過して濃縮した後、本発明の緑豆発酵−酵素抽出液を製造する。使用する前に最終固形粉の濃度を10g/Lとなるように維持する。
【００２８】
このように製造された本発明の緑豆発酵−酵素抽出液は、イソフラボン含量の増加(実験例1)、コラーゲン生合成の増進(実験例2)、細胞活性促進(実験例3)、及び皮膚細胞刺激緩和(実験例4)の効果があり、これを含有する化粧料組成物は、しわ改善効果(実験例5）、及び皮膚保湿の維持に優れた効能(実験例6)がある。従って、本発明の緑豆発酵−酵素抽出液を化粧料の素材として開発することによって、皮膚老化を防止する効果を期待することができる。
【００２９】
本発明において、緑豆発酵−酵素抽出液の含量は全体化粧料組成物に対して 0.0001 - 30.0 %(v/v)であり、さらに好ましくは0.001-20%(v/v)である。ここで、 緑豆発酵−酵素抽出液の含量が0.0001 %(v/v)未満である場合には、明らかな皮膚しわ改善効果、及び皮膚保護効果を期待することができなく、緑豆発酵−酵素抽出液の含量が30.0%(v/v)を超過する場合には、含有量増加による明らかな効果の増加が現れなく、皮膚刺激を誘発するか、剤形の安定性において問題が生じる。
【００３０】
本発明の緑豆発酵−酵素抽出液は皮膚に局所的に塗るか、撒くことによってその効果を達成することができる。従って、本発明の好ましい一様態によると、本発明の組成物はクリーム、ローション及び柔軟水などの化粧料組成物、又はスプレー及び軟膏などの薬剤学的組成物の形態で製造されることができる。
【００３１】
本発明の化粧品組成物に含まれる成分は、有効成分としての緑豆発酵−酵素抽出液以外に、化粧品組成物に通常的に利用される成分を含み、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ヴィタミン、顔料、及び香料といった通常の補助剤、そして担体を含む。
【００３２】
本発明の化粧料組成物は、当業界で通常的に製造されるいかなる剤形にも製造でき、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤‐含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション、及びスプレー等に剤形化することができるが、これに限定されるものではない。より詳しくは、柔軟化粧水(スキン)、栄養化粧水(ミルクローション)、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレー、又はパウダーの剤形に製造されることができる。
【００３３】
本発明の剤形がペースト、クリーム又はゲルである場合は、担体成分として、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、滑石、又は酸化亜鉛などが用いられる。
【００３４】
本発明の剤形がパウダー又はスプレーである場合は、担体成分として、ラクトース、滑石、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、又はポリアミドパウダーが用いられ、特にスプレーである場合は、追加的にクロロフルオロヒドロカーボン、プロパン/ブタン、又はジメチルエーテルのような推進体を含むことができる。
【００３５】
本発明の剤形が溶液又は乳濁液である場合は、担体成分として、溶媒、溶解化剤又は乳濁化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、1，3−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール、又はソルビタンの脂肪酸エステルがある。
【００３６】
本発明の剤形が懸濁液である場合は、担体成分として、水、エタノール、或いはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天 、又はトラカントなどが用いられる。
【００３７】
本発明の剤形が界面活性剤−含有クレンジングである場合は、担体成分として、脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホコハク酸モノエステル、イセチオネート、イミダゾリウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体、又はエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが用いられる。
【００３８】
また、本発明は、緑豆発酵−酵素抽出液を含む化粧料組成物を人間の皮膚に塗布して、皮膚老化によって損傷された多様な皮膚トラブルを改善(細胞活性促進、コラーゲン生合成増進、皮膚細胞刺激緩和、皮膚保湿維持など)することを特徴とする化粧方法を提供する。
【００３９】
本発明の化粧方法は、本発明の化粧料組成物を人間の皮膚に塗布する全ての化粧方法を言う。即ち、化粧料組成物を皮膚に塗布する当業界に公知されている全ての方法が本発明の化粧方法に属する。
【００４０】
本発明の化粧料組成物は単独又は重複塗布して使用するか、本発明以外の他の化粧料組成物と重複塗布して使用することができる。また、本発明による皮膚保護効果に優れた化粧料組成物は、通常的な使用方法によって使用することができ、使用者の皮膚状態又は好みによってその使用回数を異ならせることもできる。
【００４１】
本発明の化粧料組成物が石鹸、界面活性剤含有クレンジング、又は界面活性剤非含有クレンジング剤形である場合、皮膚に塗布した後、拭き取るか、外すか、水で洗うこともできる。具体的な例として、前記石鹸は、液状石鹸、粉石鹸、固形石鹸、及びオイル石鹸であり、前記界面活性剤含有クレンジング剤形は、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、クレンジングタオルおよびクレンジングパックであり、前記界面活性剤非含有クレンジング剤形は、クレンジングクリーム、クレンジングローション、クレンジングウォーターおよびクレンジングゲルであり、これに限定されるものではない。
【００４２】
本発明の緑豆発酵−酵素抽出液を含む化粧料組成物を人間の皮膚に塗布する化粧方法を行うと、皮膚老化予防、皮膚しわ改善、及び皮膚保湿効果を効果的に改善することができる。
【００４３】
以下、実施例を通して本発明を更に詳細に説明する。これらの実施例はただ本発明を更に具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨により、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないということは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明である。
【００４４】
比較製造例1.緑豆抽出物の製造
緑豆を精製水で洗滌して乾燥させ、粉末化した後、100gを70％エタノール溶液0.6Lに添加し、冷却コンデンサが装着された還流抽出器で4時間、加熱抽出した。その後、得られた抽出液を300メッシュ濾過布で濾過し、ワットマン5番濾過紙で濾過した後、減圧濃縮器を用いて溶媒を除去し、凍結乾燥して乾燥重量5.5gを得た。このように得られた抽出物を以下、「緑豆抽出物」と通称し、緑豆抽出物は最終濃度が1g/100mLとなるようにして使用した。
【００４５】
比較製造例2.酵母を用いた緑豆酵母発酵液の製造
精製水で洗滌して乾燥させた緑豆を粉末化した後、300メッシュを用いて微細にした。緑豆と精製水を1：10に混合して121℃で滅菌させた後、酵母を接種した。ここで、酵母はサッカロマイセス・セレビシエ(Sacharomyces cerevisiae)を使用し、培養液当たり50,000 cfu/Lで添加した。培養は5L発酵槽を用いて3日間、30℃、pH 5.5を維持して培養した。培養後、培養液を遠心分離して培養菌を１次除去した後、0.25 μm濾過膜を用いて最終濾過した。このように得た濾過液を濃縮して得られた液を適正溶媒を用いて希釈した後、本発明に使用した。このように製造した発酵液を以下、「緑豆酵母発酵液」と通称する。以下、実験例に使用された緑豆酵母発酵液は最終濃度が1g/100mLとなるように維持して使用した。
【００４６】
比較製造例3.ラクトバシラス(Lactobacillus)属菌株を用いた緑豆乳酸菌発酵液の製造
精製水で洗滌して乾燥させた緑豆を粉末化した後、300メッシュを用いて微細にした。緑豆と精製水を1：10に混合して121℃で滅菌させた後、乳酸菌を接種した。ここで、乳酸菌はラクトバシラス(Lactobacillus sp)を使用し、培養液当たり50,000 cfu/Lで添加した。培養は5L発酵槽を用いて3日間、37℃、pH 5.5を維持して培養した。培養後、培養液を遠心分離して培養菌を１次除去した後、0.25 μm濾過膜を用いて最終濾過した。このように得た濾過液を濃縮して得られた液を適正溶媒を用いて本発明に使用した。このように製造した発酵液を以下、「緑豆乳酸菌発酵液」と通称する。以下、実験例に使用された緑豆乳酸菌発酵液は最終濃度が1g/100mLとなるように維持して使用した。
【００４７】
比較製造例4.酵素処理後、酵母を用いた緑豆酵素−酵母発酵液の製造
精製水で洗滌して乾燥させた緑豆を粉末化した後、300メッシュを用いて微細にした。緑豆と精製水を1：10に混合して121℃で滅菌させた後、タンパク質分解酵素(ペプシン、シグマ、米合衆国)を2時間処理した。処理後、この試料に酵母を接種した。ここで、酵母はサッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae)を使用した(50,000 cfu/Lで添加)。培養は5L発酵槽を用いて3日間、30℃、pH 5.5を維持して培養し、培養後、培養液を遠心分離及び1次濾過して培養菌及びかすを除去した後、0.25 μm濾過膜を用いて2次濾過した。このように得た濾過液を濃縮して得られた液を適正溶媒を用いて本発明に使用した。このように製造した発酵液を以下、「緑豆酵素−酵母発酵液」と通称する。以下、実験例に使用された緑豆酵母発酵液は最終濃度が1g/100mLとなるように維持して使用した。
【００４８】
比較製造例5.酵素処理後、ラクトバシラス(Lactobacillus)属菌株を用いた緑豆酵素−乳酸菌発酵液の製造
精製水で洗滌して乾燥させた緑豆を粉末化した後、300メッシュを用いて微細にした。緑豆と精製水を1：10に混合して121℃で滅菌させた後、タンパク質分解酵素(ペプシン、シグマ、米合衆国)を2時間処理した。この試料に乳酸菌を接種して発酵させた後、緑豆発酵液として使用する。ここで、乳酸菌はラクトバシラスを使用した(50,000 cfu/Lで添加)。培養は5L発酵槽を用いて3日間、37℃、pH 5.5を維持して培養した。培養後、培養液を遠心分離及び1次濾過して培養菌及びかすを除去した後、0.25 μm濾過膜を用いて2次濾過した。このように得た濾過液を濃縮して得られた液を適正溶媒を用いて本発明に使用した。このように製造した発酵液を以下、「緑豆酵素−乳酸菌発酵液」と通称する。以下、実験例に使用された緑豆乳酸菌発酵液は最終濃度が1g/100mLとなるように維持して使用した。
【００４９】
製造例1.緑豆酵母発酵−酵素抽出液の製造
精製水で洗滌して乾燥させた緑豆を粉末化した後、300メッシュを用いて微細にした。緑豆と精製水を1：10に混合して121℃で滅菌させた後、酵母(Saccharomyces cerevisiae)を接種した。ここで、酵母はサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)を使用し、培養液当たり50,000 cfu/Lで添加した。培養は5L発酵槽を用いて3日間、30℃、pH 5.5を維持して培養した。培養後、培養液を遠心分離して培養菌を除去した後、0.45 μm濾過膜を用いて1次濾過した。このように得た濾過液をまたタンパク質分解酵素(ペプシン、シグマ、米合衆国)で2時間処理した後、この液を0.25 μm濾過膜を用いて2次濾過した。この濾過液をまた濃縮した後、適正溶媒を用いて希釈して使用した。このように製造した発酵−酵素抽出液を以下、「緑豆酵母発酵−酵素抽出液」と通称する。以下、実験例に使用された緑豆酵母発酵酵素液は最終濃度が1g/100mLとなるように維持して使用した。
【００５０】
製造例2.緑豆乳酸菌発酵−酵素抽出液の製造
精製水で洗滌して乾燥させた緑豆を粉末化した後、300メッシュを用いて微細にした。緑豆と精製水を1：10に混合して121℃で滅菌させた後、乳酸菌を接種した。ここで、乳酸菌としてはラクトバシラス(Lactobacillus sp)を使用し、培養液当たり50,000 cfu/Lで添加した。培養は5L発酵槽を用いて3日間、37℃、pH 5.5を維持して培養した。培養後、培養液を遠心分離して培養菌を除去した後、0.45 μm濾過膜を用いて1次濾過した。このように得た濾過液をまたタンパク質分解酵素(ペプシン、シグマ、米合衆国)で2時間処理した後、この液を0.25 μm濾過膜を用いて2次濾過した。この濾過液をまた濃縮した後、適正溶媒を用いて希釈して使用した。このように製造した発酵−酵素抽出液を以下、「緑豆乳酸菌発酵−酵素抽出液」と通称する。以下、実験例に使用された緑豆酵母発酵酵素液は最終濃度が1g/100mLとなるように維持して使用した。
【００５１】
実験例1：緑豆発酵−酵素抽出液のイソフラボン含量分析
イソフラボン含量を分析するために、上記製造例で作った試料を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて分析した。その結果は、下記表１に示した。
【００５２】
【表１】
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上記の結果は、イソフラボン類の含量が、発酵後、酵素処理して得た本発明の製造例1及び2の試料で、他試料と比べて顕著に増加したことを示している。
【００５３】
実験例2：緑豆発酵−酵素抽出液のコラーゲン生合成増進効果
人体正常繊維芽細胞を48−ウェルマイクロプレートの各ウェルに1 x 106細胞となるように接種し、DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培地で37℃で24時間培養した。次いで、比較製造例1の緑豆抽出物、比較製造例2の緑豆酵母発酵液、比較製造例3の緑豆乳酸菌発酵液、比較製造例4の緑豆酵素−酵母発酵液、比較製造例5の緑豆酵素−乳酸菌発酵液、製造例1の緑豆酵母発酵−酵素抽出液、及び製造例2の緑豆乳酸菌発酵−酵素抽出液を、それぞれ最終濃度1.0％にして血清のないDMEM培地に交替した実験群と、緑豆培養液が含まれていない、血清のないDMEM培地に交替した対照群とを24時間さらに培養した。培養後、各ウェルの上澄液を集め、プロコラーゲン(procollagen)タイプ I C−ペプチド (PICP)量をキット(Takara、日本)を利用して測定した。PICP量はng/Ｍｌに換算し、陽性対照群としては250uMのアスコルビン酸 (ascrobic acid)を使用した。コラーゲン生合成増加率は下記の数学式1によって計算した後、その結果を表２に示した。
【００５４】
【数１】
0005467106.tif 000003
【００５５】
【表２】
0005467106.tif 000004
以上の実験例2によると、本発明の緑豆発酵−酵素抽出液である製造例1、2は緑豆抽出物(比較製造例1)と比べて、その効果が優れていることはもちろん、緑豆の単純発酵液である緑豆酵母発酵液と緑豆乳酸菌発酵液(比較製造例2及び3)、及び緑豆抽出物を酵素処理した後、発酵させた緑豆酵素−発酵液(比較製造例4及び5)と比べても、コラーゲン生合成増進効果が優れた。しかも、陽性対照群であるアスコルビン酸と比較しても、その効果が優れた。
【００５６】
実験例3. 緑豆発酵−酵素抽出液の繊維芽細胞増殖効果
人体正常繊維芽細胞を96−ウェルマイクロプレートの各ウェルに1 x 104細胞となるように接種し、DMEM培地で37℃で24時間培養した。次いで、比較製造例1の緑豆抽出物、比較製造例2の緑豆酵母発酵液、比較製造例3の緑豆乳酸菌発酵液、比較製造例4の緑豆酵素−酵母発酵液、比較製造例5の緑豆酵素−乳酸菌発酵液、製造例1の緑豆酵母発酵−酵素抽出液、及び製造例2の緑豆乳酸菌発酵−酵素抽出液を、それぞれ1.0％にして血清のないDMEM培地に交替した実験群と、緑豆発酵−酵素抽出液が含まれていない、血清のないDMEM培地に交替した対照群とを24時間さらに培養した。培養後、細胞の生存率を比較するためにMTT(シグマ、米合衆国)ソリューション(3mg/Ｍｌ)を添加し、細胞生存率をELISA READER (Molecular Devices, 米合衆国)を利用して570nmで吸光度を測定し、下記の数学式2によって繊維芽細胞増殖率(％)を計算し、実験結果は下記表3に記載した。ここで、陽性対照群としてTGF-βを使用した。
【００５７】
【数２】
0005467106.tif 000005
【００５８】
【表３】
0005467106.tif 000006
前記表3の結果から分かるように、本発明の緑豆発酵−酵素抽出液である製造例1、2は緑豆抽出物(比較製造例1)と比べて、その効果が優れていることはもちろん、緑豆の単純発酵液である緑豆酵母発酵液及び緑豆乳酸菌発酵液(比較製造例2及び3)、及び緑豆抽出物を酵素処理した後、発酵させた緑豆酵素−発酵液(比較製造例4及び5)と比べても、細胞生成促進効果が優れた。しかも、陽性対照群であるTGF-βほど優れた細胞生成増加率を示すことが分かった。
【００５９】
実験例4.緑豆発酵−酵素抽出液のラクティック酸による細胞刺激緩和効果実験
人間皮膚細胞である繊維芽細胞(韓国細胞株銀行、大韓民国)をT-75フラスコ (Falcon、米合衆国)で80％程度成長するまで培養した。これをまた96−ウェルマイクロプレート(Falcon、米合衆国)に3×104 cells/wellとなるように移して、24時間培養した。培養後、顕微鏡を通して細胞が完全に付着されてよく育つのかを確認し、皮膚細胞刺激源としてラクティック酸を用いて実験を進行した。ここで、ラクティック酸は0.2％を使用した。すなわち、96ウェルのそれぞれに0.2％ラクティック酸が含有されたDMEM(シグマ、米合衆国)培地、及びラクティック酸無添加DMEM培地を200 μｌずつ添加し、比較製造例1-5の緑豆抽出物、緑豆酵母発酵液及び緑豆乳酸菌発酵液、緑豆酵素酵母発酵液、緑豆酵素乳酸菌発酵液、製造例1、2の緑豆発酵酵素抽出液を各々1.0 %(v/v)に調節して添加した。ここで、ラクティック酸、緑豆発酵液及び緑豆発酵−酵素抽出液を全て添加しなかったものを対照群にし、ラクティック酸のみ添加したものを比較群にした。試験物質を添加してから12時間が経過した後、細胞の生存率を比較するためにMTT(シグマ、米合衆国)ソリューション(3mg/Ｍｌ)を添加し、細胞生存率をELISA READER(Molecular Devices、米合衆国)を用いて 570nmで吸光度を測定し、下記の数学式３によって細胞生存率(％)を計算して、実験結果は下記の表４に記載した。
【００６０】
【数３】
0005467106.tif 000007
【００６１】
【表４】
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上記表４の結果から分かるように、ラクティック酸を処理、及び無処理した後、本発明の緑豆発酵−酵素抽出液を処理した製造例1、2の実験結果は、緑豆抽出物を処理した比較製造例1の場合と比べて、ラクティック酸処理による細胞毒性を緩和して細胞生存率を大きく増加させる効果に優れたことはもちろん、ラクティック酸処理及び無処理の後、緑豆の単純発酵液である緑豆酵母発酵液、及び 緑豆乳酸菌発酵液を処理した比較製造例2と3、及び緑豆抽出物を酵素処理した後、発酵させた比較製造例4と5の場合と比べても、細胞生存率がずっと優れており、細胞刺激緩和効果に優れていることが分かった。
【００６２】
以下、上記した実験例の結果に基づいて、本発明の緑豆発酵−酵素抽出液を含む化粧料を組成して提示する。しかし、本発明の組成物が下記の処方例によって限定されるのではない。下記の処方例に使用した緑豆発酵−酵素抽出液は、緑豆酵母発酵抽出液や緑豆乳酸菌発酵抽出液のいずれを使用しても良い。
【００６３】
処方例1：柔軟化粧水
緑豆発酵−酵素抽出液を含有した化粧料のうち、柔軟化粧水の処方例は次のようである。
【００６４】
【表５】
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【００６５】
処方例2：栄養化粧水
緑豆発酵−酵素抽出液を含有した化粧料のうち、栄養化粧水の処方例は次のようである。
【００６６】
【表６】
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【００６７】
処方例3：栄養クリーム
緑豆発酵−酵素抽出液を含有した化粧料のうち、栄養クリームの処方例は次のようである。
【００６８】
【表７】
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【００６９】
実験例5：緑豆発酵−酵素抽出液を含有した化粧料のしわ改善効果評価
本発明の化粧料のしわ改善効果を実際使用テストを通じて評価した。製造例2の緑豆乳酸菌発酵−酵素抽出液を3%(v/v)含有している処方例3の栄養クリームと、処方例3で緑豆乳酸菌発酵−酵素抽出液を比較製造例5の緑豆酵素−乳酸菌発酵液に代替したクリームを比較処方例、及び精製水に代替したクリームを対照例として使用した。90名の女性を対象にして、顔の両面を使用して6週後のしわ改善効果を肉眼で評価してしわ改善程度を確認した。この評価に基づいたしわ改善効果の結果は下記の表８に示した。
【００７０】
【表８】
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前記表８の実験結果によると、緑豆発酵−酵素抽出液を含有した本発明の処方例3のクリーム化粧料は、緑豆発酵−酵素抽出液の代わりに比較製造例5の緑豆酵素−乳酸菌発酵液を含有する比較処方例、及び緑豆発酵−酵素抽出液の代わりに精製水を含有する対照例と比べて非常に高いしわ改善効果を示し、本化粧料を皮膚に塗布した殆どの被検者から皮膚刺激は観察されなかった。
【００７１】
実験例6：緑豆発酵−酵素抽出液を含有した化粧料の保湿評価
本発明の化粧料の保湿効果を実際使用テストを通じて評価した。製造例2の 緑豆発酵−酵素抽出液を3%(v/v)含有している処方例3の栄養クリームと、処方例3で緑豆発酵−酵素抽出液を比較製造例5の緑豆酵素−乳酸菌発酵液に代替したクリームを比較処方例、及び精製水に代替したクリームを対照例として使用した。30名の女性を対象にして、上膊にそれぞれの製品が適用できるように正方形の製品適用部位を決めた後、2週間塗布しながら皮膚保湿量の変化をスキンコルネオメーター(skin corneometer; C+K courage、ドイツ)を利用して測定した後、10％以上改善された被検者の数を下記表９に示し、皮膚保湿改善率を計算した。その結果は下記の表９に示した。
【００７２】
【表９】
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上記表９の実験結果からも分かるように、緑豆発酵−酵素抽出液を含有した本発明の処方例3のクリーム化粧料は、緑豆発酵−酵素抽出液の代わりに比較製造例5の緑豆酵素−乳酸菌発酵液を含有する比較処方例、及び緑豆発酵−酵素抽出液のかわりに精製水を含有する対照例と比べて非常に高い皮膚保湿効果を示した。
【００７３】
以上、本発明の特定部分を詳細に記述したが、当業界で通常の知識を有する者にとってこのような具体的な技術はただ好ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が制限されないということは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付された請求項とその等価物によって定義されるものである。