(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
静脈注射用第ＩＸ因子製剤を調製する方法であって、２５ｍＭから１５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液を、塩化ナトリウムを含まない凍結乾燥第ＩＸ因子製剤に添加し、それにより静脈注射用に調製された製剤を得ることを含み、ここで調製された製剤が血漿に関して等張である２７０ｍＯｓｍ／Ｌから３３０ｍＯｓｍ／Ｌのオスモル濃度を有するか、または血漿に関して低張である２２０ｍＯｓｍ／Ｌから２７０ｍＯｓｍ／Ｌのオスモル濃度を有するまたは高張である３３０ｍＯｓｍ／Ｌから６００ｍＯｓｍ／Ｌのオスモル濃度を有し、その調製された製剤が静脈注射において赤血球凝集反応を防止することを特徴とする、方法。
【請求項２】
調製された製剤が少なくとも２５ｍＥｑ／ＬのＮａ＋およびＣｌ−イオンのイオン強度を有する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
調製された製剤が少なくとも３０ｍＥｑ／ＬのＮａ＋およびＣｌ−イオンのイオン強度を有する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
調製された製剤が少なくとも３６ｍＥｑ／ＬのＮａ＋およびＣｌ−イオンのイオン強度を有する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
調製された製剤が少なくとも４０ｍＥｑ／ＬのＮａ＋およびＣｌ−イオンであるイオン強度を有する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
調製された製剤が少なくとも４０ｍＥｑ／ＬのＮａ＋およびＣｌ−イオンであり、１５０ｍＥｑ／Ｌ未満のＮａ＋およびＣｌ−イオンであるイオン強度を有する請求項１に記載の方法。
【請求項７】
調製された製剤が、伝導率で測定すると少なくとも２．５ｍＳ／ｃｍであるイオン強度を有する請求項１に記載の方法。
【請求項８】
調製された製剤が、伝導率で測定すると少なくとも４．０ｍＳ／ｃｍであるイオン強度を有する請求項１に記載の方法。
【請求項９】
塩化ナトリウム溶液が４０ｍＭから１５０ｍＭである請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
塩化ナトリウム溶液が３６ｍＭから４４ｍＭである請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
塩化ナトリウム溶液が４０ｍＭである請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
凍結乾燥第ＩＸ因子製剤が、水中で復元された後に、５ｍＭより多いイオン化塩を含有しない請求項７記載の方法。
【請求項１３】
凍結乾燥第ＩＸ因子製剤が、水中で復元された後に、２５ｍＭより多いイオン化塩を含有しない請求項７記載の方法。
【請求項１４】
塩化ナトリウム溶液添加前に、凍結乾燥第ＩＸ因子製剤がヒスチジン、グリシン、シュークロース、およびポリソルベートを含む請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
塩化ナトリウム溶液の添加前に、凍結乾燥第ＩＸ因子製剤がヒスチジン、グリシン、シュークロース、ポリソルベート、および治療用タンパク質を含む請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
塩化ナトリウム溶液の添加前に、凍結乾燥第ＩＸ因子製剤がヒスチジン、グリシン、シュークロースおよびポリソルベートを含む請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
塩化ナトリウム溶液の添加前に、凍結乾燥第ＩＸ因子製剤が、水中で復元された後に：
（ａ）５ｍＭから３０ｍＭのヒスチジン；
（ｂ）０．１Ｍから０．３Ｍのグリシン；
（ｃ）０．５から２パーセントのシュークロース；および
（ｄ）０．００１から０．０５パーセントのポリソルベート
を含む請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
塩化ナトリウム溶液の添加前に、凍結乾燥第ＩＸ因子製剤が、水中で復元された後に：
（ｅ）５０ＩＵ／ｍＬから２０００ＩＵ／ｍＬの第ＩＸ因子を含む請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）凍結乾燥ケーキが５ｍＬの水中で復元された後に、溶液が：
（ｉ）５ｍＭから３０ｍＭのヒスチジン；
（ｉｉ）          ０．１Ｍから０．３Ｍのグリシン；
（ｉｉｉ）０．５から２パーセントのシュークロース；
（ｉｖ）          ０．００１から０．０５パーセントのポリソルベート；および
（ｖ）５０ＩＵ／ｍＬから２０００ＩＵ／ｍＬの第ＩＸ因子
を含むような、凍結乾燥ケーキを含有するバイアル；
（ｂ）２５ｍＭから１５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液；および
（ｃ）復元後、得られた溶液が、血漿に関して等張である２７０ｍＯｓｍ／Ｌから３３０ｍＯｓｍ／Ｌのオスモル濃度であり、静脈注射に際して赤血球凝集を防止するように、凍結乾燥ケーキを塩化ナトリウム溶液で復元するための使用説明書を含む医薬キット。
【請求項２０】
（ａ）凍結乾燥ケーキが４ｍＬの水中で復元された後に、溶液が：
（ｉ）１０ｍＭのヒスチジン；
（ｉｉ）０．２６Ｍのグリシン；
（ｉｉｉ）１パーセントのシュークロース；
（ｉｖ）          ０．００５パーセントのポリソルベート８０；および
（ｖ）５０ＩＵ／ｍＬから２０００ＩＵ／ｍＬの第ＩＸ因子
を含むような、凍結乾燥ケーキを含有するバイアル；
（ｂ）４０ｍＭの塩化ナトリウム溶液；および
（ｃ）復元後に、得られる溶液が：
（ｉ）８ｍＭのヒスチジン；
（ｉｉ）２０８ｍＭのグリシン；
（ｉｉｉ）０．８％のシュークロース；
（ｉｖ）          ０．００４％のポリソルベート８０；
（ｖ）５０ＩＵ／ｍＬから２０００ＩＵ／ｍＬの第ＩＸ因子；
（ｖｉ）４０ｍＭのＮａＣｌ
を含むように、バイアル中の凍結乾燥ケーキを５ｍＬ塩化ナトリウム溶液で復元するための使用説明書を含む請求項１９に記載の医薬キット。
【請求項２１】
静脈注射に際しての赤血球凝集反応を防止するための、凍結乾燥第ＩＸ因子製剤であるBeneFIX（登録商標）の復元における２５ｍＭから１５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液の使用であって、ここで復元されたBeneFIX（登録商標）製剤が、血漿に関して等張である２７０ｍＯｓｍ／Ｌから３３０ｍＯｓｍ／Ｌのオスモル濃度を有するか、または血漿に関して低張である２２０ｍＯｓｍ／Ｌから２７０ｍＯｓｍ／Ｌのオスモル濃度を有するまたは高張である３３０ｍＯｓｍ／Ｌから６００ｍＯｓｍ／Ｌのオスモル濃度を有するものである、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００５年１１月１日に出願された米国特許番号６０／７３２，２２１（その全体において本発明の一部として参照される）の優先権を主張する。
【０００２】
本明細書において記載される全ての特許、特許出願および刊行物は、全体として本発明の一部として参照される。これらの刊行物の開示は、本明細書において記載され、主張される発明の日付において当業者に公知の先端技術をより完全に記載するために、全体として本出願の一部として参照される。
【０００３】
本特許文書の開示の一部は、著作権保護される要素を含む。著作権所有者は、特許庁包袋または記録においてみられるような特許文書または特許開示のいずれかによる複製に異議はないが、それ以外はどんなものであれ全ての著作権を留保する。
【背景技術】
【０００４】
ＩＶ注射剤の投与中に全血が、例えば、静脈内（ＩＶ）ラインなどの薬剤溶液と混合される場合、薬剤溶液が十分なイオン強度を含有しないならば、連銭または赤血球集合（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）（赤血球凝集反応（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ  ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ）とも呼ばれる）が起こり得る。赤血球集合は、例えば、５％水中デキストロース（通常の大容積非経口溶液）および低イオン強度を有する多くの医薬品に関して起こる。
【０００５】
医薬品はしばしば凍結乾燥され、従って、非経口注射前に溶液で復元する必要がある。しかしながら、凍結乾燥製品が低イオン強度溶液で復元される場合、得られる製剤は赤血球集合も引き起こし得る。凍結乾燥ケーキを注射用滅菌水（ｓＷＦＩ）ではなく生理食塩水（０．９％  ＮａＣｌ）で復元すると、さらなるイオン強度が得られるが、得られる薬剤溶液は高張であり、注射後に望ましくない副作用を有し得る。
【特許文献１】米国特許番号６０／７３２，２２１明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このように、凍結乾燥ケーキを復元するか、または医薬溶液を希釈して、血漿に関して等張であり、赤血球集合を引き起こさないために十分なイオン強度を有するようにするために使用できる溶液が依然として必要とされている。  
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、赤血球凝集反応が、血液と接触するようになる低イオン強度溶液により引き起こされることを見出した。従って、医薬製剤が低イオン強度溶液、例えば、５％デキストロース、３％デキストラン、またはｓＷＦＩ中での復元または希釈により静脈注射用に調製される場合、得られる製剤は血液に関してほぼ等張であるために必要なオスモル濃度を有するが、しばしば凝集反応を防止するために十分なイオン強度を有さない。一方、医薬製剤が高イオン強度溶液、例えば、塩溶液（０．９％ＮａＣｌまたは１５４ｍＭ  ＮａＣｌ）での復元または希釈により静脈注射用に調製される場合、得られる製剤は、凝集反応を防止するために十分なイオン強度を有し得るが、血液に関して高張であるオスモル濃度を有し、その結果、反復注射が頻繁または慢性的であるならば、赤血球（ＲＢＣ）の脱水、静脈炎、および／またはおそらくは静脈血栓症を引き起こし得る。
【０００８】
一つの態様において、本発明は静脈注射用医薬製剤を調製する方法であって、約２５ｍＭから約１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液を医薬製剤に添加し、その結果、静脈注射用に調製された製剤を得ることを含む方法を提供し、ここで、調製された製剤は血漿に関してほぼ等張であるか、または血漿に関して若干低張または若干高張であり、調製された製剤は、赤血球凝集反応（または赤血球集合）を防止するために十分なイオン強度を有する。
【０００９】
調製された製剤は、例えば、約２７０ｍＯｓｍ／Ｌから約３３０ｍＯｓｍ／Ｌのオスモル濃度を有する場合に、血漿に関してほぼ等張である。調製された製剤は、例えば、約２２０ｍＯｓｍ／Ｌから約２７０ｍＯｓｍ／Ｌのオスモル濃度を有する場合に、血漿に関して若干低張である。調製された製剤は、たとえば、約３３０ｍＯｓｍ／Ｌから約６００ｍＯｓｍ／Ｌのオスモル濃度を有する場合に、血漿に関して若干高張である。
【００１０】
一つの態様において、調製された製剤は、例えば、少なくとも約２５ｍＥｑ／ＬのＮａ＋およびＣｌ−イオンを有する場合に．赤血球凝集反応を防止するために十分なイオン強度を有する。もう一つ別の態様において、調製された製剤は、例えば、少なくとも約４０ｍＥｑ／ＬのＮａ＋およびＣｌ−イオンを有する場合、赤血球凝集反応を予防するために十分なイオン強度を有する。もう一つ別の態様において、調製された製剤は、例えば、少なくとも約４０ｍＥｑ／ＬのＮａ＋およびＣｌ−イオン、約１５０ｍＥｑ／Ｌ未満のＮａ＋およびＣｌ−イオンを有する場合、赤血球凝集反応を防止するために十分なイオン強度を有する。もう一つ別の態様において、調製された製剤は、例えば、伝導率で測定して、少なくとも約２．５ｍＳ／ｃｍのイオン強度を有する場合、赤血球凝集反応を防止するために十分なイオン強度を有する。もう一つ別の態様において、調製された製剤は、例えば、伝導率で測定して、少なくとも約４．０ｍＳ／ｃｍのイオン強度を有する場合、赤血球凝集反応を防止するために十分なイオン強度を有する。
【００１１】
注射用に調製される医薬製剤は、例えば、非液体製剤であってもよいし、あるいは溶液製剤であってもよい。非液体製剤は、従って、約２５−１５０ｍＭ、２５−１００ｍＭ、２５−８０ｍＭ、２５−４０ｍＭ、２５−３５ｍＭ、２５−３０ｍＭ、または約４０ｍＭの塩かナトリウム濃度を有する塩化ナトリウム溶液により溶液に復元することができる。液体または溶液製剤は、従って、約２５−１５０ｍＭ、２５−１００ｍＭ、２５−８０ｍＭ、２５−４０ｍＭ、２５−３５ｍＭ、２５−３０ｍＭ、または約４０ｍＭの塩化ナトリウム濃度を有する塩化ナトリウム溶液により希釈することができる。非液体製剤は、例えば、凍結乾燥製剤であり得る。
【００１２】
一つの態様において、添加される塩化ナトリウム溶液は、約４０ｍＭから約１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む。一つの態様において、添加される塩化ナトリウム溶液は、本質的に  、約４０ｍＭから約１５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる。一つの態様において、添加される塩化ナトリウム溶液は、約４０ｍＭ塩化ナトリウムを含む。一つの態様において、添加される塩化ナトリウム溶液は、本質的に４０ｍＭ塩化ナトリウム溶液からなる。一つの態様において、添加される塩化ナトリウム溶液は、本質的に、約４０ｍＭ±１０ｍＭ塩化ナトリウムである塩化ナトリウム溶液を有する溶液からなる。
【００１３】
塩化ナトリウム溶液の添加前の一つの態様において、医薬製剤は相当量のイオン化塩を含有しない。イオン化塩の相当量とは、例えば、約５ｍＭより多い量であり得る。もう一つ別の態様において、イオン化塩の相当量とは、例えば、約２５ｍＭより多い量であり得る。医薬製剤が凍結乾燥製剤であるならば、これは、凍結乾燥製剤が水中で復元される場合、例えば、５ｍＭまたは２５ｍＭより多いイオン化塩を含有しないならば、相当量のイオン化塩を含有しない。
【００１４】
塩化ナトリウム溶液を添加する前の一つの態様において、医薬製剤は、ヒスチジン、グリシン、シュークロース、およびポリソルベートを含む。塩化ナトリウム溶液を添加する前の塩化ナトリウム溶液の添加前のもう一つ別の態様において、医薬製剤はヒスチジン、グリシン、シュークロース、ポリソルベート、および治療用タンパク質を含む。ここで、治療用タンパク質は、例えば、凝固障害を治療するため、または止血のために使用されるタンパク質、例えば、これに限定されないが、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＸＩＩＩ因子、抗体、その関連する類似体、およびその誘導体である。塩化ナトリウム溶液を添加する前のもう一つ別の態様において、医薬製剤は、ヒスチジン、グリシン、シュークロース、ポリソルベート、および第ＩＸ因子（組み換え第ＩＸ因子（ｒＦＩＸ）を包含する）を含む。本明細書において用いられる場合、第ＩＸ因子は例えば、ＰＥＧ化第ＩＸ因子を包含する第ＩＸ因子、第ＩＸ因子を含むタンパク質融合物、例えば、アルブミン−第ＩＸ因子または免疫グロブリン（全体またはその領域）−第ＩＸ因子、およびグリコシル化第ＩＸ因子の修飾体を含み得る。
【００１５】
医薬製剤が凍結乾燥製剤である一つの態様において、塩化ナトリウム溶液の添加前に、製剤は、水中で復元されたかのように測定すると（フィル体積（ｆｉｌｌ  ｖｏｌｕｍｅ）と同じ容積、即ち、凍結乾燥前の製剤の容積）：（ａ）約５ｍＭから約３０ｍＭのヒスチジン；（ｂ）約０．１Ｍから約０．３Ｍのグリシン；（ｃ）約０．５から約２パーセントのシュークロース；および（ｄ）約０．００１から約０．０５パーセントのポリソルベート（または約０．００５から約０．０５パーセント）を含む。一つの態様において、製剤は、水中で復元されたかのように測定すると、（ｅ）約０．１ｍｇ／ｍＬから約１００ｍｇ／ｍＬまたはそれ以上の治療用タンパク質、あるいは約１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００ＩＵ／ｍＬ（国際単位／ｍＬ）またはそれ以上の治療用タンパク質をさらに含む。一つの態様において、製剤は、水中で復元さえたかのように測定すると（ｅ）約０．１ｍｇ／ｍＬから約１００ｍｇ／ｍＬまたはそれ以上の第ＩＸ因子、または約０．４ｍｇ／ｍＬから約２０ｍｇ／ｍＬの第ＩＸ因子、または約１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００ＩＵ／ｍＬ（国際単位／ｍＬ）またはそれ以上の第ＩＸ因子をさらに含み得る。
【００１６】
一つの態様において、本発明は、静脈注射により引き起こされる赤血球凝集反応を防止する方法であって、復元または希釈された医薬製剤が静脈注射により対象に投与される場合に、復元または希釈された医薬製剤が赤血球凝集反応を防止するために十分なイオン強度を有するように、医薬製剤を約２５ｍＭから約１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液で復元または希釈することを含む方法を提供する。
【００１７】
一つの態様において、本発明は、静脈注射用凍結乾燥医薬製剤を調製する方法であって、復元後に、赤血球凝集反応を予防するために十分なイオン強度および製剤がほぼ等張（または若干高張または若干低張）であるオスモル濃度を有するように、約２５ｍＭから約１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液で凍結乾燥医薬製剤を復元することを含む方法を提供する。
【００１８】
一つの態様において、凍結乾燥製剤は塩化ナトリウム溶液で復元され、ここで、復元に使用される塩化ナトリウム溶液の体積は、凍結乾燥前の製剤の体積（即ち、フィル体積）よりも少ない。このように、本発明は、注射される製剤の体積を減じる方法を提供する。
【００１９】
一つの態様において、凍結乾燥製剤は塩化ナトリウム溶液で復元され、ここで、復元に使用される塩化ナトリウム溶液の体積は、凍結乾燥前の製剤の体積（即ち、フィル体積）よりも大きい。このように、本発明は、注射される製剤の等張性を維持する方法を提供する。
【００２０】
例えば、凍結乾燥製剤は、５ｍＬの塩化ナトリウムでの復元（ここで、凍結乾燥前の製剤体積は４ｍＬである）など、凍結乾燥前の製剤の体積よりも大きい体積の塩化ナトリウムで復元することができる。例えば、４ｍＬの水中で復元された、凍結乾燥された４ｍＬの製剤は、１０ｍＭヒスチジン、２６０ｍＭグリシン、１％シュークロース、０．００５％ポリソルベートを含有する等張溶液を含有する等張溶液（約３００ｍＯｓｍ／Ｌ）である。しかし、凍結乾燥製剤が４ｍＬの４０ｍＭ  ＮａＣｌ（８０ｍＯｓｍ／Ｌ）溶液で復元されるならば、得られる製剤は若干高張溶液（３００ｍＯｓｍ／Ｌ＋８０ｍＯｓｍ／Ｌ＝３８０ｍＯｓｍ／Ｌ）を有する。しかし、凍結乾燥製剤が５ｍＬの４０ｍＭのＮａＣｌ溶液で復元されるならば、得られる溶液は約８ｍＭ（８ｍＯｓｍ／Ｌ）ヒスチジン、２０８ｍＭ（２０８ｍＯｓｍ／Ｌ）グリシン、０．８％（２４ｍＯｓｍ／Ｌ）シュークロース、０．００４％（無視できるオスモル濃度）ポリソルベート、および４０ｍＭ（８０ｍＯｓｍ／Ｌ）ＮａＣｌであり、これは約３２０ｍＯｓｍ／Ｌである。従って、フィル体積よりも大きな体積の塩化ナトリウム溶液でほぼ等張である凍結乾燥前製剤を復元することにより、本発明は、依然としてほぼ等張である溶液を提供することができる。言い換えると、フィル体積よりも少ないか、あるいはほぼ同じ体積の塩化ナトリウム溶液でほぼ等張である凍結乾燥前製剤を復元することにより、若干低張である溶液が生じ得る。これを回避するために、本発明は、凍結乾燥前製剤の体積よりも大きな体積の塩化ナトリウムで凍結乾燥製剤を復元することにより等張性を維持するための方法を提供する。
【００２１】
一つの態様において、本発明は、復元後に凍結乾燥剤の等張性を維持する方法であって、凍結乾燥前製剤の体積よりも少なくとも２０％大きな体積の凍結乾燥製剤を復元することを含む方法を提供し、ここで、凍結乾燥前製剤はほぼ等張であるので、復元された製剤はほぼ等張であり、赤血球凝集反応を防止するために十分なイオン強度を有する。その凍結乾燥前体積よりも大きな体積の凍結乾燥製剤を復元することにより、凍結乾燥ケーキのオスモル濃度に対する寄与は、凍結乾燥前と比較して、復元からの体積の増加と正比例して減少する。例えば、３００ｍＯｓｍ／Ｌの等張性を有する体積Ｘの凍結乾燥前製剤は、体積Ｘよりも２０％大きい体積Ｙの溶液中で復元されるならば、３００ｍＯｓｍ／Ｌは体積Ｙ中２４０ｍＯｓｍ／Ｌである（体積が２０％増加するために浸透圧が２０％減少する）。体積Ｙの溶液が塩化ナトリウム溶液であるならば、この塩化ナトリウム溶液の張性に対する寄与は溶液中の塩化ナトリウム濃度の２倍である。例えば、体積Ｙの溶液が４０ｍＭであるならば、復元された溶液は２４０ｍＯｓｍ／Ｌ＋８０ｍＯｓｍ／Ｌの張性を有し、これはほぼ等張であり、赤血球集合を防止するために十分なイオン強度を有する。
【００２２】
一つの態様において、本発明は、静脈注射用の凍結乾燥された第ＩＸ因子製剤を調製する方法であって、約２５ｍＭから約１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液を凍結乾燥された第ＩＸ因子製剤に添加して、静脈注射用に調製された製剤を得ることを含む方法を提供し、ここで、調製された製剤は血漿に関してほぼ等張であるか、あるいは血漿に関して若干低張または若干高張であり、調製された製剤は赤血球凝集反応を防止するために十分なイオン強度を有する。一つの態様において、凍結乾燥された第ＩＸ因子製剤は、水中で復元されたかのように測定される場合、（ａ）約５ｍＭから約３０ｍＭのヒスチジン；（ｂ）約０．１Ｍから約０．３Ｍのグリシン；（ｃ）約０．５から約２パーセントのシュークロース；（ｄ）約０．００１から約０．０５パーセントのポリソルベート；および（ｅ）約０．４ｍｇ／ｍＬから約２０ｍｇ／ｍＬの第ＩＸ因子、または約０．１ｍｇ／ｍＬから約１００ｍｇ／ｍＬまたは他の可溶性量の第ＩＸ因子、または約１０ＩＵ／ｍＬから約５００ＩＵ／ｍＬの第ＩＸ因子、または約１０ＩＵ／ｍＬから約５０００ＩＵ／ｍＬの第ＩＸ因子を含む。一つの態様において、約４０ｍＭ塩化ナトリウム溶液が凍結乾燥された第ＩＸ因子製剤に添加される。一つの態様において、約５ｍＬの約４０ｍＭ塩化ナトリウム溶液が凍結乾燥された第ＩＸ因子製剤に添加される。一つの態様において、凍結乾燥された第ＩＸ因子製剤は、水中で復元されたかのように測定されるならば、約１０ｍＭのヒスチジン、約０．２６Ｍのグリシン、約１％のシュークロース、および約０．００５％のポリソルベートを含む。
【００２３】
一つの態様において、本発明は：（ａ）凍結乾燥されたケーキを含むバイアル（ここで、凍結乾燥されたケーキが約５ｍＬの水で復元されるならば、溶液は：（ｉ）約５ｍＭから約３０ｍＭのヒスチジン；（ｉｉ）約０．１Ｍから約０．３Ｍグリシン；（ｉｉｉ）約０．５から約２パーセントのシュークロース；（ｉｖ）約０．００１から約０．０５パーセントのポリソルベート；および（ｖ）約０．４ｍｇ／ｍＬから約２０ｍｇ／ｍＬの第ＩＸ因子、または約０．１ｍｇ／ｍＬから約１００  ｍｇ／ｍＬまたは他の可溶性量の第ＩＸ因子、または約５０ＩＵ／ｍＬから約５００ＩＵ／ｍＬの第ＩＸ因子、または約１０ＩＵ／ｍＬから約５０００ＩＵ／ｍＬの第ＩＸ因子を含む）；（ｂ）２５ｍＭから約１５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液；および（ｃ）得られる溶液がほぼ等張であり、静脈注射後の赤血球集合を防止するために十分なイオン強度を有するように、凍結乾燥されたケーキを塩化ナトリウム溶液で復元するための使用説明書を含む医薬キットを提供する。
【００２４】
一つの態様において、本発明は：（ａ）凍結乾燥されたケーキを含むバイアル（ここで、凍結乾燥されたケーキが約４ｍＬの水で復元されるならば、溶液は：（ｉ）約１０ｍＭのヒスチジン；（ｉｉ）約０．２６Ｍのグリシン；（ｉｉｉ）約１パーセントのシュークロース；（ｉｖ）約０．００５パーセントのポリソルベート８０；および（ｖ）約５０ＩＵ／ｍＬから約５０００ＩＵ／ｍＬの第ＩＸ因子を含む）；（ｂ）約４０ｍＭ塩化ナトリウム溶液；および（ｃ）復元後に、得られる溶液が：（ｉ）  約７または８から約１０ｍＭのヒスチジン；（ｉｉ）約２００から約２１０ｍＭのグリシン；（ｉｉｉ）約０．７％から約０．９％のシュークロース；（ｉｖ）約０．００４％のポリソルベート８０；（ｖ）約５０ＩＵ／ｍＬから約５０００ＩＵ／ｍＬの第ＩＸ因子；および（ｖｉ）約４０ｍＭのＮａＣｌを含むように、バイアル中の凍結乾燥されたケーキを約５ｍＬの約４０ｍＭ塩化ナトリウム溶液で復元するための使用説明書を含む医薬キットを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明は、注射用医薬製剤（特に、すぐに静脈注射できる製剤）を調製する方法であって赤血球凝集反応、溶血反応、および／または細胞収縮を起こさない方法を提供する。凝集反応を防止するためには、すぐに注射できる医薬製剤は、十分なイオン強度を有する必要がある。溶血反応または細胞収縮を防止するためには、すぐに注射できる医薬製剤は血漿に関してほぼ等張である必要がある。本発明は、凝集を防止するために十分なイオン強度および顕著な溶血反応もしくは細胞脱水または収縮を防止するために必要な等張性の両方を有する注射用医薬製剤を調製する方法を提供する。本発明の方法は、凍結乾燥されたケーキ（または他の非液体医薬製剤）を溶液に復元するか、または医薬製剤溶液を希釈するために、約２５ｍＭから約１５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液の使用を含む。塩化ナトリウム溶液が復元のために使用されるか、希釈のために使用されるかいずれにせよ、特定の塩化ナトリウム溶液の添加の結果、血漿または血液に関してほぼ等張であり、注射後、特に静脈注射後の赤血球集合を防止するために十分なイオン強度を有する医薬製剤が得られる。
【００２６】
用語
【００２７】
本明細書において用いられる場合、溶液の「重量モル濃度」は、溶媒１キログラムあたりの溶質のモル数である。
【００２８】
本明細書において用いられる場合、溶液の「モル濃度」は、溶液１リットルあたりの溶質のモル数である。
【００２９】
本明細書において用いられる場合、「オスモル」は、理想溶液中、溶媒の凝固点を１．８６Ｋ降下させる粒子数（アボガドロ数）を生じる物質の量である。
【００３０】
本明細書において用いられる場合、溶液の「オスモル濃度」は、溶媒１キログラムあたりのオスモル数である。オスモル濃度は、溶液中に存在する粒子数の尺度であり、粒子のサイズまたは重量に無関係である。これは、粒子濃度にのみ依存する溶液の性質の使用によってのみ測定できる。これらの性質は、蒸気圧降下、凝固点降下、沸点上昇、および浸透圧であり、まとめて束一性と呼ばれる。
【００３１】
本明細書において用いられる場合、溶液の「オスモル濃度」は、溶液１リットルあたりのオスモル数である。
【００３２】
本明細書において用いられる場合、注射用にすぐ使用できるか、または注射用に調製された「医薬製剤」は対象に投与されることを意図した任意の医薬であり得る。例えば、医薬製剤は凍結乾燥されたケーキ、溶液、粉末、または固体であり得る。製剤は、液体形態でなくても、本発明のＮａＣｌ溶液で溶液に復元される。製剤が液体形態であるならば、製剤は本発明のＮａＣｌ溶液で希釈されるか、または本発明のＮａＣｌ溶液と混合される。
【００３３】
イオン強度
【００３４】
イオン強度は電解質溶液（正電荷および負電荷を有するイオンが溶解した液体）の特徴である。これは典型的には、電解質のイオン間での平均静電相互作用として表される。電解質のイオン強度は、各イオンの重量モル濃度（溶媒の単位質量あたりの物質の量）にその価数の二乗をかけることにより得られる合計の半分である。
【００３５】
イオン強度は電解質の濃度に密接に関連し、特定のイオン上の電荷がどれほど有効に電解質中の他のイオン（いわゆる、イオン雰囲気）により遮蔽または安定化されるかを示す。イオン強度と電解質濃度間の主な違いは、イオンの一部がより高度に荷電しているならば前者の方がより高いことである。例えば、完全に解離した（分解した）硫酸マグネシウム（Ｍｇ２＋ＳＯ４２−）の溶液は、同じ濃度の塩化ナトリウム（Ｎａ＋Ｃｌ−）の溶液よりも４倍高いイオン強度を有する。２つの間の別の違いは、どれほど多くの塩が溶液に添加されたかだけではなく、遊離イオンの濃度をイオン強度が反映することである。塩は溶解する場合もあるが、それぞれの塩は依然として対になって結合し、溶液中の荷電していない分子と類似している。この場合、イオン強度は塩濃度よりもかなり低い。
【００３６】
本発明に関して、医薬製剤は等張であるだけでなく、ＲＢＣ凝集反応を防止するために十分なイオン強度も有するように注射用に調製される。注射にすぐ使用できる製剤（即ち、本発明のＮａＣｌで復元された凍結乾燥されたケーキ、または本発明のＮａＣｌ溶液で希釈された医薬溶液）の十分なイオン強度は、例えば、少なくとも約２５ミリ当量／リットル（ｍＥｑ／Ｌ）のＮａ＋およびＣｌ−イオンを有し得る。一つの実施形態において、十分なイオン強度は少なくとも約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または少なくとも約４０ｍＥｑ／ＬのＮａ＋およびＣｌ−イオンである。
【００３７】
イオン強度は、溶液の伝導率で記載することもできる。伝導率は物質または溶液の電流を伝導する能力である。装置が伝導率を測定する原則は簡単である。即ち、２つのプレートをサンプル中に設置し、プレート全体に電位（通常、正弦波電圧）を加え、電流を測定する。伝導率（Ｇ）、すなわち、抵抗率（Ｒ）の逆数は、オームの法則に従って、電圧および電流から決定される。Ｇ＝Ｉ／Ｒ＝Ｉ（アンペア）／Ｅ（ボルト）。
【００３８】
溶液中のイオン上の電荷は電流の伝導性を促進するので、溶液の伝導率はそのイオン強度に比例する。しかしながら、ある状況においては、伝導率は濃度に直接相関しない。しかしながら、塩化ナトリウム溶液に関して、伝導率はイオン濃度に正比例する。伝導率の基本単位はジーメンス（Ｓ）であり、以前はモーと呼ばれた。試験サンプルの形状は伝導率値に影響を及ぼすので、標準化された測定値は、電極寸法における変動を相殺するために比伝導率単位（Ｓ／ｃｍ）で表される。比伝導率（Ｃ）は単に測定された伝導率（Ｇ）および電極セル定数（Ｌ／Ａ）の積であり、ここで、Ｌは電極間の液体のカラムの長さであり、Ａは電極の面積である。Ｃ＝Ｇｘ（Ｌ／Ａ）。セル定数が１ｃｍ−１であるならば、比伝導率は溶液の測定された伝導率と同じである。電極形状は変わるが、電極は常に同等の理論的セルにより表される。
【００３９】
したがって、一つの実施形態において、すぐに注射できる製剤のイオン強度は、例えば、少なくとも約４ｍＳ／ｃｍまたはそれ以上の伝導率を有し得る。もう一つ別の実施形態において、すぐに注射できる溶液の十分なイオン強度は、少なくとも約２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、または少なくとも約３．９ｍＳ／ｃｍである。
【００４０】
溶液が赤血球凝集反応を防止するために十分なイオン強度を有するかどうかの操作上の定義は、「十分なイオン強度」なる用語を説明するためにも使用できる。例えば、これは、試験溶液を全血に添加する実験および赤血球沈降（実施例２参照；変更されたＷｅｓｔｅｒｇｒｅｎ法を適用）の移動量を観察することに基づく。一つの実施形態において、試験溶液が全血と４：１の比で混合される場合、６０分で約１０ｍＭ（例えば、実施例２、図１および２参照）未満の赤血球沈降が生じ、試験溶液は赤血球凝集反応を防止するために十分なイオン強度を有する。もう一つ別の実施形態において、試験溶液が全血と４：１の比で混合される場合に６０分で約５ｍＭ未満の赤血球沈降を引き起こすならば、試験溶液は赤血球凝集反応を防止するために十分なイオン強度を有する。
【００４１】
溶液オスモル濃度
【００４２】
本発明の方法は、血液に関してほぼ等張である注射用医薬製剤を提供する。医薬製剤が血液に関してほぼ等張であるかどうかを決定するために、希釈剤を含む溶液の全化学成分についてのオスモル濃度を計算する。注射用医薬製剤（非経口溶液）の浸透圧濃度は、ヒトの身体の血球および血管に対して悪影響を及ぼし得る。張性は液体および溶解または希釈された薬剤について計算することができ、液体１リットルあたりのミリオスモルの数値（ｍＯｓｍ／Ｌ）で表される。この値はオスモル濃度とも呼ばれる。血液のオスモル濃度は２８５から３１０ｍＯｓｍ／Ｌの範囲である。低張または高張溶液は血液中に注入され、液体は細胞中または細胞から移動し、これは様々な悪影響を引き起こし得る。
【００４３】
溶液オスモル濃度は一部には浸透作用および浸透圧の概念に基づく。浸透作用は溶質（溶解した粒子）の拡散あるいは血管または細胞膜などの半透膜を通した液体の移動である。膜を横断する分子の輸送を促進する浸透圧は、オスモル濃度で表され、血液または血漿などの生体液と比較した場合に、低浸透圧（低張）、等浸透圧（等張）、または高浸透圧（高張）と呼ばれる。「張性」および「浸透圧」なる用語はしばしば同義と見なされる。
【００４４】
浸透圧は、「浸透勾配」（即ち、膜の両面上の異なる粒子濃度）に応答して半透膜を通る水の動きに対抗するために必要な静水圧（または水圧）である。血清オスモル濃度は、浸透圧計の使用により測定できるか、または溶液中に存在する溶質の濃度の合計として計算できる。実験室において測定される値は、通常、オスモル濃度と呼ばれる。溶質濃度から計算される値は、実験室によりオスモル濃度として報告される。オスモルギャップは、これらの２つの値の差である。
【００４５】
本明細書において、張性および浸透圧は同義と見なされ、広義に理解されるべきである。張性は有効なオスモル濃度を意味し、細胞膜をはじめとする膜全体に浸透力を及ぼす能力を有する溶液中の溶質の濃度の合計に等しい。厳密に言うと、オスモル濃度は特定の溶液の特性であり、膜と無関係である。張性は特定の膜に関連した溶液の特性である。しかしながら、本発明は、血液または血漿などの生体液に関して溶液が等張であることを意味し、このことは、特定の溶液が、血液または血漿または他の生体液中の細胞膜に関して血液または血漿と等張であるという意味を包含する。
【００４６】
張性の操作上の定義は、この用語を説明するために使用できる。これは、全血に試験溶液を添加し、結果を観察する実験に基づき得る。全血中のＲＢＣが膨張し、破裂するならば、試験溶液は正常な血漿と比較して低張であると言われる。ＲＢＣが収縮し、円鋸歯状になるならば、試験溶液は正常な血漿と比較して高張であると言われる。ＲＢＣが同じ状態のままであるならば、試験溶液は血漿と等張であると言われる。ＲＢＣ細胞膜は参考膜である。例えば、生理食塩水（即ち、０．９％塩化ナトリウム）中に入れられた全血は膨潤せず、従って、生理食塩水は等張であると言われる。
【００４７】
等張溶液の特性
【００４８】
本発明は、対象に注入するための医薬製剤を調製または準備する方法を提供し、ここで、前記製剤は、（１）血液（または血漿または他の生体液）に関してほぼ等張であるか、もしくは顕著な溶血反応、血栓症、または血管刺激を引き起こすほど高張または低張でなく、（２）赤血球集合を防止するために十分なイオン強度を有する溶液に調製される。
【００４９】
一つの実施形態において、すぐに注射できる（血液に関して）等張な医薬製剤は、約２７０ｍＯｓｍ／Ｌより高く、約３３０ｍＯｓｍ／Ｌより低い張性またはオスモル濃度を有する。一つの実施形態において、すぐに注射できる等張医薬製剤は、約２７０ｍＯｓｍ／Ｌより高く、約３２８ｍＯｓｍ／Ｌより低い張性または浸透圧を有する。
【００５０】
０．９％塩化ナトリウムおよび５％デキストロースなどの溶液は等張であるが、これらが多くの医薬製剤を復元または希釈するために使用される場合、得られる溶液は、赤血球凝集反応を防止するために十分なイオン強度を有さない（５％デキストロースに関して）またはイオン強度が高すぎるので、得られる溶液は高張である。従って、本発明の方法は、（ａ）赤血球集合を軽減するために十分なイオン強度、および（ｂ）溶血反応を防止するために十分な張性を提供するための最低濃度の塩化ナトリウム、および（ｃ）高張溶液であるほど高くない張性を提供するための最大濃度の塩化ナトリウムを含有する希釈または復元のための溶液を使用する。さらに、本発明の方法は、医薬製剤の実際的な注入体積も維持しつつ、血液に関して十分なイオン強度および等張性を提供できる、希釈または復元用溶液を使用する。
【００５１】
低張溶液の特性
【００５２】
本発明は対象に注入される医薬製剤を調製する方法を提供し、ここで、製剤は、血液に関して低張でないか、または顕著な溶血反応を引き起こすほど低張でない（即ち、血液に関して若干低張である）溶液に調製される。一つの実施形態において、血液に関して若干低張であるとみなされる、すぐに注射できる医薬製剤は、約２７０ｍＯｓｍ／Ｌより低く、約２４０ｍＯｓｍ／Ｌより高い張性またはオスモル濃度を有し得る。一つの実施形態において、血液に関して若干低張であると見なされる、すぐに注射できる医薬製剤は、約２７０ｍＯｓｍ／Ｌより低く、約２２０ｍＯｓｍ／Ｌより高い張性または浸透圧を有し得る。
【００５３】
低張溶液の例は、滅菌水で注射用に準備された多くの医薬製剤を包含する。低張溶液が注射される場合、体液移動が起こり、水が血管の内皮細胞および血球中に移動する。非常に多くの水を吸収する細胞は破裂し、従って低張溶液の注射は、刺激、静脈炎、および溶血反応を引き起こし得る。
【００５４】
高張溶液の特性
【００５５】
本発明は対象に注射される医薬製剤を調製する方法を提供し、ここで、製剤は、血液に関して高張でないか、または顕著な血栓症および／または血管刺激を引き起こすほど高張でない（即ち、若干高張である）溶液に調製される。一つの実施形態において、若干高張であると見なされる、すぐに注射できる医薬製剤は、約３４０ｍＯｓｍ／Ｌより高く、約６００ｍＯｓｍ／Ｌより低い張性またはオスモル濃度を有し得る。一つの実施形態において、若干高張であると見なされる、すぐに注射できる医薬製剤は、約３４０ｍＯｓｍ／Ｌより高く、約３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、または約５７５ｍＯｓｍ／Ｌより低い張性またはオスモル濃度を有し得る。一般に、高張溶液は約３４０ｍＯｓｍ／Ｌより高い張性を示す。約６００ｍＯｓｍ／Ｌより高いオスモル濃度を有する溶液は注射において注意して使用すべきである。
【００５６】
望ましくない高張溶液の例は、１０％デキストロースを有する注射用に準備された多くの医薬製剤、またはオスモル濃度に影響を及ぼす複数の添加剤を有する製剤を包含する。高張溶液が注射される場合、体液移動が起こり、血管の内皮細胞および血球から水が抜かれる。非常に多くの水を失った細胞は収縮し、従って、高張溶液は血管刺激、静脈炎、および血栓症を引き起こし得る。
【００５７】
ｐＨ
【００５８】
血液のｐＨは約７．３５から約７．４５の範囲であり、これは中性と見なされる。ｐＨ値が７より低い製剤は酸性薬物と見なされ、４．１より低いｐＨ値を有するものは非常に酸性と見なされる。７．５より高いｐＨ値を有する薬剤は塩基性またはアルカリ性薬剤と見なされ、９．０より高いｐＨ値を有するものは非常に塩基性またはアルカリ性と見なされる。非常に酸性または非常にアルカリ性の薬剤溶液は静脈炎および血栓症を引き起こし得る。したがって、一つの実施形態において、本発明は静脈注射用にこれらの製剤を準備するために、凍結乾燥された薬剤製剤を復元するか、または液体薬剤製剤を希釈するための塩化ナトリウム溶液を提供し、ここで、注射用に準備された製剤は（１）４．１より低いか、または９．０より高いｐＨを有さず、（２）赤血球凝集を防止するために十分なイオン強度を有し、（３）血液に関してほぼ等張（もしくは若干高張または低張）であるので、ＲＢＣに対して溶血反応または円鋸歯状形成は起こらない。しかしながら、溶液のｐＨは、溶液が赤血球凝集を防止するために十分なイオン強度を有するかどうかに関して考慮すべき事項でない。言い換えると、凍結乾燥製剤が水で復元される場合に４．１より低いか、または９．０より高いｐＨを有するならば、このことは、赤血球凝集反応を防止するために、復元に塩化ナトリウムを使用することを妨げない。
【００５９】
オスモル濃度の計算
【００６０】
任意の製剤の浸透圧は次式を用いることにより計算できる：浸透圧＝（物質の重量（ｇ）を物質の分子量で割ったもの（ｇ／Ｌ））×種の数×１０００（ミリオスモル濃度）。「種」なる用語は、溶解が起こる場合に形成されるイオンまたは化学種の数を意味する。
【００６１】
注射用に準備または調製された医薬製剤
【００６２】
本発明は、対象に注射するための製剤を調製するために、凍結乾燥された製剤を溶液に復元するための方法を提供する。復元された製剤は、十分なイオン強度および血液に関してほぼ等張である張性を有することにより、注射用に準備される。
【００６３】
本発明の方法はまた、対象に注射される薬剤溶液を調製するために、薬剤溶液を希釈することにも関する。希釈された薬剤溶液は、十分なイオン強度を有し、血液に関してほぼ等張であることにより、注射用に準備される。
【００６４】
一つの実施形態において、凍結乾燥または乾燥製剤／処方は、水中で復元されるならば、約１００ｍＯｓｍ／Ｌから約３６０ｍＯｓｍ／Ｌのオスモル濃度を有する。本発明は約２５ｍＭから約１５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液を用いた復元法を提供するので、実施者は、塩化ナトリウム溶液に復元される凍結乾燥製剤の予想される合計オスモル濃度に基づいて特定の塩化ナトリウム溶液を使用すべきである。従って、例えば、凍結乾燥製剤が水中で復元される場合、約３００ｍＯｓｍ／Ｌのオスモル濃度を有するならば、復元用のＮａＣｌ溶液は約２５ｍＭから約３０ｍＭであるべきである。もう一つ別の例において、凍結乾燥製剤が水中で復元される場合、約１００ｍＯｓｍ／Ｌのオスモル濃度を有するならば、復元用のＮａＣｌ溶液は約２５ｍＭから約１３０ｍＭであるべきである。
【００６５】
一つの実施形態において、本発明の方法により注射用に調製される製剤（凍結乾燥されているか、または溶液であるか、いずれにせよ）はＨＥＳ（ヒドロキシエチルデンプン）を含有しない。ＨＥＳ含有製剤は、イオン強度のためにＮａＣｌ溶液で復元または希釈されるにもかかわらず、インビトロ実験において赤血球沈降および凝集反応を引き起こし得る。もう一つ別の実施形態において、本発明の方法により注射用に調製される製剤はデキストランを含有せず、これは、適合修飾Ｗｅｓｔｅｒｇｒｅｎ法（実施例２参照）が、ＮａＣｌの添加は、デキストランが引き起こし得る向上された沈降の効果に対抗しないことを示すためである。
【００６６】
一つの実施形態において、本発明は静脈注射用の製剤を調製する方法を提供し、ここで、製剤は第一増量剤を含む凍結乾燥されたケーキである。第一増量剤は、例えば、大部分は非イオン化である。非イオン化増量剤は、これに限定されないが、マンニトール、グリシン、シュークロース、ラクトース、他の二糖類、治療用タンパク質または製剤自体の活性成分、または当該分野において公知の増量剤を包含する。非イオン化増量剤の濃度は、溶液が凝集反応を防止するために十分なイオン強度を有するかどうかに顕著な影響を及ぼさない。しかしながら、その濃度はオスモル濃度に影響を及ぼし、従って、その濃度は張性に影響を及ぼし得る。グリシンの濃度は、例えば、オスモル濃度に対するその寄与に等しく、従って、１０ｍＭグリシンは１０ｍＯｓｍ／Ｌに等しい。
【００６７】
活性成分を包含する製剤中のタンパク質成分は、溶液のイオン強度または溶液の浸透圧に著しい影響を及ぼさない。例えば、タンパク質について、５０，０００の分子量を前提とし、１〜２ｍＬ溶液中２．５ｍｇのタンパク質が注射されると仮定する。これは、０．０５ｍＭに等しく、従って、タンパク質はオスモル濃度にはっきりとは寄与しない。
【００６８】
製剤はしばしば界面活性剤、例えば、ポリソルベート−８０も含有する。ポリソルベート−８０および他の界面活性剤は高分子量分子であり、従って、製剤中に通常存在する量、例えば、０．００１％〜０．０１％は、オスモル濃度またはイオン強度に明らかに寄与するには小さすぎる。他の界面活性剤は、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５、Ｂｒｉｊ（登録商標）３０、Ｌｕｂｒｏｌ−ｐｘ（商標）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７、およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を包含する。
【００６９】
医薬製剤中に少量で存在し得る他の高分子量分子であって、はっきりとは浸透圧またはイオン性に寄与しないものは、硫酸デキストランのような塩でない性質を備えたポリマーである。ポリマーの例は、デキストラン、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ゼラチン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を包含する。
【００７０】
医薬製剤はしばしばシュークロースまたは他の糖またはポリオールを、しばしば０−２、０−５、または０−１０％またはそれ以上の量で含有する。例えば、製剤が増量剤を含まない場合、５−１０％シュークロースを使用できる。一般に、製剤が凍結乾燥され、製剤の量が本明細書においてパーセンテージまたはオスモル濃度量で特定される場合、これは凍結乾燥前の溶液のパーセンテージまたはモル濃度量（即ち、フィル量）に関連する。従って、溶液が１％シュークロースを有する場合、これは２９．２ｍＭに等しい。シュークロースは明らかには溶液中でイオン化または解離しないので、２９ｍＭのシュークロースは２９ｍＯｓｍ／Ｌに等しい。溶液中で明らかにイオン化または解離しない他の糖またはポリマールとしては、グリセロール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール（増量剤としても使用できる）、グルコース、イノシトール、ラフィノース、マルトトリオース、ラクトース、およびトレハロースが挙げられる。
【００７１】
医薬製剤はまた緩衝剤も含有し得る。緩衝剤としては、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、グリシン、ヒスチジン、リン酸塩（ナトリウムまたはカリウム）、ジエタノールアミンおよびｉｓが挙げられる。緩衝剤は、溶液ｐＨを許容できる範囲内に維持する薬剤を包含する。緩衝剤、例えば、グリシン、ヒスチジン、およびジエタノールアミンはほとんど非イオン化であり、従って、その濃度はオスモル濃度に等しく、すぐに注射できる製剤がほぼ等張であるかどうかを考慮する場合に留意すべきである。緩衝剤、例えば、酢酸塩およびクエン酸塩は通常、塩であり、従ってイオン化し、その濃度は、溶液のオスモル濃度に対するその寄与の計算に関して増大する。
【００７２】
医薬製剤は本質的に、タンパク質、核酸、ウイルス、および化合物をはじめとする任意の活性成分を含み得る。これらの分子はほとんど注射される溶液のイオン強度または浸透圧に明らかには影響を及ぼさない。これらの分子が塩であるならば、小分子化合物は医薬塩であることが多いので、これらはイオン強度および／またはオスモル濃度に明らかに影響を及ぼし得る。
【００７３】
あるアミノ酸もいくつかの製剤においては見出され、抗凍結剤、抗凍結乾燥剤および／または増量剤として使用される。いくつかのアミノ酸、例えば、ヒスチジンはたいてい非イオン化であり、従って、製剤中のアミン酸の濃度は、すぐに注射できる製剤が血液に関してほぼ等張であるように溶液の浸透圧を計算する場合に留意すべきである。
【００７４】
ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）
【００７５】
ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）は、広く特徴づけられ、感染体がないことが証明された、遺伝子操作されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系により製造される。貯蔵された細胞バンクは、血液製剤または血漿製剤がない。ＣＨＯ細胞系は、組み換え第ＩＸ因子（ｒＦＩＸ）を、動物またはヒト起源のタンパク質を含有しない規定の細胞培地中に分泌し、組み換え第ＩＸ因子は、モノクローナル抗体段階を必要とせず、高純度活性生成物を産するクロマトグラフィー精製プロセスにより精製される。みかけの分子量＞７００００を有する分子（例えば、大タンパク質およびウイルス粒子）を保持する能力を有する膜濾過段階が、さらなるウイルス安全性のために含められる。ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動評価によると、主に単一成分である。効力（国際単位、Ｉ．Ｕ．（ＩＵ））は、世界保健機構（ＷＨＯ）の第ＩＸ因子濃縮物についての国際基準に対してインビトロ一段階凝固分析を用いて決定される。１国際単位は、１ｍＬのプールされた正常ヒト血漿中に存在する第ＩＸ因子活性の量である。ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）の比活性は、タンパク質１ミリグラムあたり１８０ＩＵ以上である。ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）はヒト血液由来でなく、保存料または追加された動物またはヒト成分を含有しない。
【００７６】
ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）は無菌、非発熱性の凍結乾燥粉末製剤として処方される。ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）は静脈内（ＩＶ）注射に提供することが意図される。これは、表示された量の第ＩＸ因子活性（国際単位（ＩＵ）で表示）を含有する使い捨てバイアル中で入手可能である。各バイアルは、例えば、通常、２５０、５００、または１０００ＩＵ（またはそれ以上、たとえば、２０００ＩＵ）の凝固第ＩＸ因子（組み換え体）を含有する。凍結乾燥された製剤を滅菌水で復元した後、５００および１０００ＩＵ用量強度（ｄｏｓａｇｅ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ）中の賦形剤の濃度は、１０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン、１％シュークロース、２６０ｍＭグリシン、０．００５％ポリソルベート８０である。２５０ＩＵ用量強度中での復元後の濃度は、他の２つの用量強度のものの半分である。５００および１０００ＩＵ用量強度は復元後に等張であり、２５０ＩＵ用量強度は、復元後の他の２用量強度の半分の張性を有する。すべての用量強度は、復元後に無色透明の溶液を生成する。
【００７７】
一つの実施形態において、本発明は対象に注射されるＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）を調製する方法を提供し、ここで、ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）は塩化ナトリウム溶液中に復元され、塩化ナトリウム溶液は約約２５ｍＭより高く、約１５０ｍＭより低い。一つの実施形態において、ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）を復元するために使用される塩化ナトリウム溶液は約４０ｍＭである。一つの実施形態において、凍結乾燥ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）の１バイアルは、約４−５ｍＬの２５ｍＭ−１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液中に復元される。
【００７８】
改質されたＢｅｎｅＦｉｘ（登録商標）（ＢｅｎｅＦｉｘ（登録商標）−Ｒ）
【００７９】
水中で復元されたＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）の低いイオン強度のために、様々な改質がなされた（改質ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）（ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）−Ｒ））。ＲＢＣ凝集の可能性を軽減するためにＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）製剤に十分なイオン強度を加えることが目的であった。ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）のイオン強度を増大させるために、ｓＷＦＩを復元溶液として置換することにより復元された生成物に塩化ナトリウムを組み入れることができる。別法として、ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）はＮａＣｌを凍結乾燥前製剤に添加することにより改質することができ、水で復元を達成できるが、凍結乾燥塩溶液はさらに困難であり、凍結乾燥されたケーキをＮａＣｌ溶液で単に復元することがより実際的である。これはまた、凝集反応を防止するためにｓＷＦＩで復元される場合、十分なイオン強度を有さない凍結乾燥された他の製剤についても当てはまる。
【００８０】
一つの実施形態において、ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）−ＲはＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）と同じ処方（１０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン、２６０ｍＭグリシン、１％シュークロース、０．００５％ポリソルベート８０）において凍結乾燥でき、ｒＦＩＸ濃度のみが異なる。ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）−Ｒバルク製剤を次に、例えば、４ｍＬ／バイアルで、１０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン、２６０ｍＭ  グリシン、１％  シュークロース、０．００５％  ポリソルベート８０とともに充填し、凍結乾燥できる。ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）−Ｒを５ｍＬ／バイアルに２５−１５０ｍＭのＮａＣｌ溶液、例えば、４０ｍＭ  ＮａＣｌで復元して、賦形剤の濃度を、凍結乾燥前の最新のＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）製剤と比較した場合、２０％減少させる。この方法の結果、（１）等張であり、（２）ＲＢＣ凝集反応の可能性を減少させるために十分なイオン強度を有し、（３）高用量のｒＦＩＸの注射容積を減少させる製剤が得られる。例えば、バイアル用量強度あたり２５０、５００、１０００、および２０００ＩＵのｒＦＩＸのＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）−Ｒを提供できる。従って、５ｍＬの２５−１５０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液で復元した後、得られるＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）−Ｒ製剤溶液は、約７から約９ｍＭ  ヒスチジン；約１８８から約２２０ｍＭグリシン；約０．７％から約０．９％シュークロース；および約０．００４％ポリソルベート８０であり得る。バイアル中のｒＦＩＸの量、例えば、２５０、５００、１０００、または２０００ＩＵに応じて、５ｍＬのＮａＣｌ溶液中での復元の結果、それぞれ約５０、１００、２００、または４００ＩＵ／ｍＬのｒＦＩＸ濃度が得られる。５ｍＬの４０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液中で復元されたＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）−Ｒ製剤のオスモル濃度は、約３２０ｍＯｓｍ／Ｌである。
【００８１】
注射用に調製される製剤の例
【００８２】
組み換え第ＩＸ因子は、米国特許第６，３７２，７１６号（全ての目的に関して、本発明の一部として参照される）において記載される製剤、例えば本明細書に記載されている製剤において凍結乾燥することもできる。この特許において記載される製剤は、本発明に関して使用でき、ここで、製剤はｒＦＩＸを活性成分として有することに限定されない。従って、例えば、注射用に調製するために２５ｍＭ−１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液で復元できる凍結乾燥製剤は、グリシン、ポリソルベート、シュークロース、ヒスチジン、および活性成分を含む製剤を包含する。活性成分は、本質的に、例えばタンパク質、ウイルス、核酸、または化合物であり得る。グリシンは、例えば、約０．１Ｍから０．３Ｍの濃度を有し得る。ポリソルベートは、例えば、約０．００１から約０．０５％の濃度を有し得る。シュークロースは、例えば、約０．５％から約２％の濃度を有し得る。ヒスチジンは、例えば、約５ｍＭから約３０ｍＭの濃度を有し得る。
【００８３】
一つの実施形態において、２５−１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液で復元される凍結乾燥製剤は、約０．１から０．３Ｍグリシン、約０．５から２％シュークロース、０．００１から約０．０５％ポリソルベート、約５から約３０ｍＭヒスチジン、および約０．１から約２０ｍｇ／ｍＬの活性成分を含む。活性成分は、例えば、ｒＦＩＸである。もう一つ別の実施形態において、２５−１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液で復元されるｒＦＩＸ凍結乾燥剤は、約０．１３から約３ｍｇ／ｍｌのｒＦＩＸまたは約５０から約６００ＩＵ／ｍＬのｒＦＩＸ、約０．２６Ｍグリシン、約１０ｍＭヒスチジン、約１％シュークロース、および約０．００５％ポリソルベートを含む。
［実施例］
【００８４】
以下に記載する実施例は、本発明の態様を説明するために提供され、本発明を制限する目的ではない。
【実施例１】
【００８５】
抗凝固剤および製剤成分のＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）関連性ＲＢＣ凝集反応に対する影響
バタフライカテーテルラインおよびシリンジにおけるＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）関連性ＲＢＣ凝集反応が時折報告されている。血友病のイヌからの血液における最近の研究により、処方緩衝液中で組み換えヒトＦＩＸの不在下で凝集反応が起こることが証明されている。従って、この研究は、標準的抗凝固剤、様々なＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）成分、およびイオン強度がＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）関連性凝集減少に影響を及ぼすかどうかを調べた。
【００８６】
血液を匿名のヒトボランティアのプールから入手し、標準的抗凝固剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸ナトリウム、またはヘパリンを含有するＶａｃｕｔａｉｎｅｒ試験管（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）中に集めた。
【００８７】
凝集反応を試験するために、Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ試験管中の血液サンプルをまずｎｕｔａｔｏｒ上で連続して混合した。血液（１２．５μＬ）を４８ウェル細胞培養プレート中８７．５μＬの試験溶液中で希釈し、室温で２分間インキュベートした後、逆位相差顕微鏡（倍率４００ｘ）下で観察した。各ウェルをビデオ録画して、下記の表１に記載される基準に従ってＲＢＣ凝集反応を採点するための静止画像を得た。
【表１】
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【００８８】
ＲＢＣ凝集に対する標準的抗凝固剤の効果：第一の実験は、３人のドナーからの血液サンプルの分析を含んでいた。血液を各ドナーについてＥＤＴＡ、ヘパリン、およびクエン酸ナトリウムＶａｃｕｔａｉｎｅｒ試験管中に集めた。試験品は、ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）、１００  ＩＵ／ｍＬを含み、次のＮａＣｌ濃度で復元された：０ｍＭ（ｓＷＦＩ）、２０ｍＭ、４０ｍＭ、６０ｍＭ、および７７ｍＭ  ＮａＣｌ。加えて、デキストロース（水中５％）（Ｄ５Ｗ）を正の対照として含めた。サンプルを血液対ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）または血液対Ｄ５Ｗ比１：８で希釈した。画像を取得し、デジタル保存し、マスクし、凝集反応に関して採点した。血液をｓＷＦＩで復元されたＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）に添加した２分後、使用された抗凝固剤の種類に関係なく３人のドナー全てからのサンプルにおいて凝集反応が見られた。濃度が増加するＮａＣｌを使用したので、凝集応答は弱められた。血液がＤ５Ｗに添加された場合、著しい凝集が見られた。
【００８９】
スクリーン前のドナーにおけるＲＢＣ凝集に対するＮａＣｌの効果：ドナーサンプルをヘパリン化Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ試験管中に集めた。いくつかの先のサンプルにおいて自発的凝集反応が観察されたので、１５４ｍＭ  ＮａＣｌを用いて全てのドナーを最初にスクリーンした。凝集反応が観察されたならば、サンプルをさらなる分析からはずした。各ドナーからの残りのサンプルを１：８で次の２つの製剤のうちの１つに希釈した：（１）ｓＷＦＩで復元された１００ＩＵ／ｍＬ  ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）、および（２）１５４ｍＭ  ＮａＣｌで復元された１００ＩＵ／ｍＬ  ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）。画像を取得し、デジタル保存し、マスクし、凝集について採点した。ｓＷＦＩで復元されたＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）に関して凝集反応が見られ、一方、１５４ｍＭ  ＮａＣｌでの復元は、凝集反応を軽減または排除した（得点については表２を参照）。
【表２】
0005555425.tif 000003
【実施例２】
【００９０】
製剤成分およびＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）濃度の効果：ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）のいくつかの製剤を、ＲＢＣ凝集反応に対する異なる成分の影響を究明するために評価した。８の異なる混合物を（１５４ｍＭ  ＮａＣｌを含むか、または含まない）を、合計１６混合物について調製した（表３）。１２人のドナーを自発的凝集についてスクリーンし、２人をさらなる研究に不適格とした。１０人の残りのドナーのうち５人からの血液サンプルを最初の８製剤（サンプル１−Ａから１−Ｈ）について使用し、他の５人のドナーのサンプルを第二の８製剤（サンプル２−Ｉから２−Ｐ）について使用した。サンプルを前記のように１：８に希釈し、画像を取得し、すでに記載したように採点した。
【表３−１】
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【表３−２】
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【００９１】
表３において提示された実験の凝集得点を下記の表４Ａおよび４Ｂに示す。活性成分または賦形剤であるかどうかによらず、ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）製剤の特定の成分は凝集反応と関係しない。予想されるように、グリシンの除去は、溶液の低張性のためにＲＢＣ溶解を引き起こした。しかしながら、１５４ｍＭ  ＮａＣｌでの復元は、インビトロ凝集および溶解を軽減または排除した。
【表４−１】
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【表４−２】
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【００９２】
スクリーン前のドナーにおけるＲＢＣ凝集反応に対する低濃度ＮａＣｌの効果：ドナーサンプルをヘパリン化Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ試験管中に集めた。凝集がいくつかの先のサンプルにおいて観察されたので、全てのドナーをまず１５４ｍＭ  ＮａＣｌでスクリーンした。凝集反応が観察されたならば、サンプルをさらなる分析からはずした。各ドナーからの残りのサンプルを前記のように１：８に希釈して３つの製剤にした：（１）１００ＩＵ／ｍＬ  ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）＋ｓＷＦＩ；（２）１００ＩＵ／ｍＬ  ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）＋４０ｍＭ  ＮａＣｌ；または（３）１００ＩＵ／ｍＬ  ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）＋７７ｍＭ  ＮａＣｌ。前記のように、画像を取得し、集め、採点した。結果を下記の表５に示す。水で復元されたＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）に関して、５つのサンプル全てにおいて凝集反応が見られたが、ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）の４０ｍＭまたは７７ｍＭ  ＮａＣｌでの復元は、凝集反応を軽減または排除した。
【表５】
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【００９３】
分析：ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）と、血液対復元されたＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）の体積比１：８で混合された場合に、ヘパリン、ＥＤＴＡ、またはクエン酸ナトリウムで抗凝固処理された血液中でＲＢＣ凝集反応が起こった。凝集反応に対して抗凝固剤の種類の影響は見られず；従って、ヘパリンは物質評価において抗凝固剤として使用された。いくつかのサンプルにおいて、凝集は、０．９％ＮａＣｌ単独の存在下において起こった（凝集反応についての負の対照）。従って、その後の評価は、０．９％ＮａＣｌ対照に関して凝集反応を示さないサンプルのみを用いて行った。
【００９４】
ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）の３つの濃度（１００、３００、または６００ＩＵ／ｍＬ）およびＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）の各成分（ｓＷＦＩまたはＮａＣｌ溶液中で復元）を次に、ヘパリン抗凝固処理血液と、血液対ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）体積比１：８で混合した場合にＲＢＣ凝集反応について評価した。組み換えヒトＦＩＸタンパク質を包含する任意の特定の成分の排除は凝集反応に影響を及ぼさなかった。これは、広範囲の異なる医薬製剤を、静脈注射用にＮａＣｌ溶液を用いて準備（復元または希釈）できることを示す。グリシンの除去の結果、ＲＢＣ溶解が起こった。しかしながら、復元についての、４０ｍＭ（０．２３４％ＮａＣｌ、注射可能）、７７ｍＭ（０．４５％ＮａＣｌ、注射可能）または１５４ｍＭ  ＮａＣｌ（０．９％ＮａＣｌ、注射可能）の使用は、凝集反応および溶解を軽減または排除した。
【００９５】
従って、これらの結果は、ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）製剤の特定の成分は観察される凝集反応に関係ないことを示す。ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）製剤からのグリシンの除去および水での復元の結果、溶解を引き起こす低張溶液が得られるが、オスモル濃度および張性は、イオン強度および凝集と異なる懸案事項である。結果は、凝集反応がｓＷＦＩ中で復元された組み換え第ＩＸ因子（ｒＦＩＸ）の低イオン強度と関連し、ＮａＣｌでの復元は、凝集反応を弱めるか、または排除することを示す。従って、他の医薬製剤のＮａＣｌ溶液での復元、さらには１５４ｍＭより低い濃度を有するＮａＣｌ溶液での復元は、静脈注射後の凝集および溶解をどちらも防止することができる。
【実施例３】
【００９６】
医薬品または医薬製剤により誘発される赤血球凝集を評価するための赤血球沈降速度測定の修飾Ｗｅｓｔｅｒｇｒｅｎ法の適用
現在市販されているＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）製剤は非イオン性製剤である。ｓＷＦＩ中で復元されたＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）製剤の投与の間、患者の血液が復元されたＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）と例えば静脈内チュービング中で混合された場合に赤血球集合（即ち、凝集反応）はほとんど観察されない。本発明は、赤血球集合がｒＦＩＸではなく製剤と関連し、少なくとも約４０ｍＭのＮａＣｌを含有する希釈剤を用いることにより防止されることを見出した。少なくとも約４０ｍＭのＮａＣｌを含有するカスタム希釈剤の設計を補助するために、インビトロの赤血球集合を評価するための確立された方法である、赤血球沈降を測定するために使用できる定量化可能な分析を設計した。血液が生理食塩水中４：５で希釈される修飾Ｗｅｓｔｅｒｇｒｅｎ法を、塩溶液または試験溶液（即ち、カスタム希釈剤）で１：４または１：８に希釈された血液中の凝集を評価するために適応させた。
【００９７】
ヒト血液を健常成人ボランティアから入手し、ＥＤＴＡを含有する試験管中に集めた。沈降実験のための血液サンプルの適合性を証明するために、臨床的に定義された赤血球沈降速度ＥＳＲ６０を修飾Ｗｅｓｔｅｒｇｒｅｎ法により測定した。簡単に言うと、十分に混合された血液を１５４ｍＭ  ＮａＣｌで４：５に希釈し、次いでカスタム１０試験管ラック中に入れた自己ゼロ点調節Ｗｅｓｔｅｒｇｒｅｎ試験管上に直ちにロードした。６０分後に試験管の最上部のゼロ点から血漿：赤血球界面までの距離（ｍｍ）を測定し、記録した。ＥＳＲ６０結果を確立された標準値と比較した（Ｍｏｒｒｉｓ、Ｍ．Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｂａｓｉｃ  ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ、ｉｎ  Ｈｅｎｒｙ、Ｊ．Ｂ．、ｅｄ．、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｂｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ、２００１：４７９−５１９）。
【００９８】
医薬製剤と関連する赤血球集合を評価するために適応された修飾Ｗｅｓｔｅｒｇｒｅｎ  法の適合性を示すために２つの実験を行った。ヒト血液サンプルは、すべて通常範囲内のＥＳＲ６０値を有するので３つの分析における使用に適していた。これらのサンプルを第一実験において１：４に希釈し、第二実験において１：８に希釈した。
【００９９】
第一実験において、赤血球沈降は、５％デキストラン７０もしくはｓＷＦＩまたは１０ｍＭ  ＮａＣｌで復元されたＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）により向上された。５分以内に、３％デキストラン７０またはｓＷＦＩ中で復元されたＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）のいずれかで希釈された血液をロードされた試験管内で凝集物が見られた。６０分までに、これらの試験管中の赤血球沈降は、塩溶液対照と比較した場合、著しく向上された（表６）。９０分までに、１０ｍＭ  ＮａＣｌ中で復元されたＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）中で希釈された１人のドナーからの血液は、ゼロ点から８ｍｍの位置にある透明な赤血球：血漿界面ならびにゼロ点から１４９ｍｍに位置する密に充填された赤血球とあまり密に充填されていない赤血球の間の別の界面を有する二相沈降パターンを有していた。
【表６】
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ＮａＣｌ濃度はＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）を復元するために使用されるものである。
【０１００】
第二の実験において、赤血球沈降は、５％デキストロース、「ＭＦＲ−９２７」（ｒＦＩＸが欠損したＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）の処方緩衝液）、および１０ｍＭ  ＮａＣｌで復元されたＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）により向上された（表７）。第一実験と異なり、これらの試験管中の沈降は急速で、１５から３０分までに最大またはほぼ最大沈降に達した。
【表７】
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ＮａＣｌ濃度はＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）を復元するために使用されるものである；ＭＦＲ−９２７はｒＦＩＸが欠損したＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）の処方緩衝液である。
【０１０１】
これらの実験の結果は、赤血球沈降を測定するために使用される修飾Ｗｅｓｔｅｒｇｒｅｎ法が製剤または処方により誘発される赤血球集合を評価するために適応させることができることを示す。例えば、試験溶液で１：４に希釈された血液をロードした６０分後、Ｗｅｓｔｅｒｇｒｅｎ試験管中の赤血球沈降の測定は、凝集を向上させる薬剤（即ち、５％デキストロース、３％デキストラン７０、ＭＦＲ−９２７、およびｓＷＦＩ中で復元されたＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標））を向上させないもの（即ち、塩溶液および約２５ｍＭまたはそれ以上のＮａＣｌを含有する希釈剤中で復元されたＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標））から区別するために十分である。
【実施例４】
【０１０２】
希釈液中４０ｍＭ  ＮａＣｌの製剤に関連する赤血球凝集を改善するための改質されたＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）の適性
現在市販されているＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）の非イオン性製剤は、患者血液が静脈内チュービング中でＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）と混合された場合に、投与の間に起こり得るインビトロ赤血球凝集と関連する。本発明は、赤血球集合が組み換え第ＩＸ因子でなく、製剤と関連し、凝集はＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）を、少なくとも４０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する希釈剤で復元することにより防止できることを見出した。
【０１０３】
この実施例の目標は、改質されたＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）（ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）−Ｒ）製剤を復元するための４０ｍＭ希釈剤のロバスト性（ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ）を試験することである。特に、実験は、４０ｍＭから１０％も逸脱したＮａＣｌ濃度が、赤血球沈降速度（ＥＳＲ）を測定するための適応させた修飾Ｗｅｓｔｅｒｇｒｅｎ法により評価される、製剤に関連する赤血球集合を防止するために十分であるかどうかを決定するために設計された。加えて、ＮａＣｌ濃度の背血球沈降に対するロバスト性は、ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）−Ｒの高用量（即ち、２０００ＩＵ）および低用量（即ち、２５０ＩＵ）バイアルの両方において評価された。
【０１０４】
ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）−Ｒ製剤、ＭＦＲ−９２７、および３％デキストラン７０の赤血球沈降に対する効果を、実施例２において記載される修飾Ｗｅｓｔｅｒｇｒｅｎ法の適応を用いて室温で測定した。研究デザインの概略を表８に記載する。
【表８】
0005555425.tif 000011
【０１０５】
実験当日に、高用量（〜２０００ＩＵのｒＦＩＸを含有する凍結乾燥されたＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）−Ｒのバイアル）および低容量バイアルのＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）−Ｒ（〜２５０ＩＵのｒＦＩＸを含有する凍結乾燥されたＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）−Ｒのバイアル）の両方を、使用直前に５ｍＬの３６ｍＭ、４０ｍＭ、または４４ｍＭ  ＮａＣｌで復元した。正の対照溶液３％（ｗ／ｖ）デキストラン７０を無菌Ｄｕｌｂｅｃｃｏ修飾無カルシウムおよび無マグネシウムリン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ−ＣＭＦ；ｐＨ７．４）中で調製した。ヒト血液をドナーから入手し、ＥＤＴＡを含有するＶａｃｕｔａｉｎｅｒ試験管中に集めた。血液サンプルを集めた３時間以内に赤血球沈降実験のために使用した。
【０１０６】
全血を試験溶液中で１：４に希釈（即ち、４００μＬの全血を１．２ｍＬの試験溶液に添加）し、よく混合し、次に、専用カスタムラック中の確実に垂直に保持された自己ゼロ調節使い捨てガラスＷｅｓｔｅｒｇｒｅｎ試験管中にロードした。６０分後の赤血球沈降（試験管の最上部の０点から血漿−赤血球界面までの距離（ｍｍ））を測定し、記録した。
【０１０７】
全１２人のドナーからの結果は類似していた。現在市販されているＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）処方緩衝液であって、ｒＦＩＸ（ＭＦＲ−９２７）および３％デキストラン７０が欠損したもの（標準的な正の対照溶液）は、ＮａＣｌ試験溶液と混合された血液と比較して向上した赤血球沈降を示した（図１参照）。緩衝液中のＮａＣｌ濃度（３６ｍＭ、４０ｍＭ、または４４ｍＭ）または生成物中のｒＦＩＸ濃度と関係なく、ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）−Ｒは、ＮａＣｌ希釈剤で復元される限り、赤血球沈降を向上させなかった。
【０１０８】
この研究からの結果は、ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）−Ｒ希釈剤中４０ｍＭより１０％高いか、または低いＮａＣｌ濃度は、赤血球沈降または集合（凝集反応）を防止するために十分であることを示す。結果はさらに、製剤に関連する赤血球集合の改善効果は、活性成分（即ち、ｒＦＩＸ）の濃度により影響を受けなかったことを示す。
【実施例５】
【０１０９】
ＲＢＣ凝集反応を引き起こす際にＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）を復元するための緩衝液中のイオン強度の役割
ヒト血液を４人の異なるドナーから静脈穿刺により、標準的ヘパリン化集合管中に集めた。２．６ｍＬの緩衝液または復元されたＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）タンパク質をシリンジ中に抜き取り、続いて０．６ｍＬのヘパリン添加血液を抜き取ることによりＲＢＣ凝集物の形成を試験した。凝集物の混合／沈降挙動がこれらのシリンジにおいて長時間にわたって観察され、デジタルカメラを用いて写真に記録した。
【０１１０】
凍結乾燥前の最新のＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）製剤の組成は、ｒＦＩＸ、約１０ｍＭ  ヒスチジン、約２６０ｍＭグリシン、約１％シュークロース、および約０．００５％  ポリソルベート−８０、ｐＨ６．８である。ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）製剤は凍結乾燥され、注射前に、ｓＷＦＩ中で復元される。当初、シュークロースが凝集反応の原因であると考えられた。従って、試験緩衝液は１％、０．５％、または０％シュークロースを用いて処方された。各シュークロース試験緩衝液をシリンジ中に抜き取り、続いて少量のヘパリン添加血液を抜き取った。ＲＢＣの凝集反応およびその後の急速な沈降は、３つの緩衝液について同じであることが見出され、このことは、ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）製剤のシュークロース含量が観察される凝集反応の原因ではなかったことを示唆する。滅菌水中ではなく、生理食塩水中で復元されたＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）は、凝集反応を引き起こさなかった。これらのデータは、ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）製剤のイオン強度は、ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）が水中で復元された場合に凝集を防止するために十分でないことを示す。
【０１１１】
凝集反応を排除するために必要な最小イオン強度を決定するために、ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）を様々なＮａＣｌ濃度（０、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、および１３７ｍＭ）を有する溶液で復元した（あるいはＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）の凍結乾燥前製剤を、塩化ナトリウムを含むように変更することができるが、塩化ナトリウム製剤を凍結乾燥する方法は、塩化ナトリウムを有さない製剤の凍結乾燥と比較して、より困難である）。ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）はまた、１５４ｍＭ  ＮａＣｌを含有する生理食塩水中でも復元した。ＲＢＣ凝集反応および沈降挙動を３つの溶液全てにおいて調べた。表９は、これらの溶液のいくつかのオスモル濃度およびイオン強度（伝導率で表す）を他の一般的な静脈内溶液とともに示す。塩化ナトリウムをＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）製剤に添加すると、凍結乾燥前の直接添加によるか、または凍結乾燥物を塩化ナトリウムの溶液で復元するかに関わらず、ＮａＣｌは、当濃度のＮａ＋およびＣｌ−イオンに完全に解離することが予想される。このように、処方緩衝液＋ＮａＣｌのイオン強度（Ｎａ＋およびＣｌ−のｍＥｑ／Ｌ（ミリ等量／Ｌ）で表す）は、処方緩衝液が他のイオンを含有しないならば、ＮａＣｌ濃度と等しいと予想される。
【表９】
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【０１１２】
血液がシリンジ中の表９における溶液と接触すると、ＲＢＣ凝集反応が個々に観察され、その後、シリンジを穏やかに混合し、反転させて、血液沈降を観察した。凝集塊形成は少なくとも４０ｍＭ  ＮａＣｌで復元されたＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）の全ての製剤において観察されなかった（先の実施例において、約３６ｍＭ  ＮａＣｌは凝集を防止するために十分であったことに注意）。少なくとも４０ｍＭ  ＮａＣｌを含有するこれらの溶液中の血球の挙動は、生理食塩水におけるものと区別できなかった。
【０１１３】
血液沈降は、反転後に濃度が減少するＮａＣｌ（４０ｍＭから出発）中で１５分間希釈（凍結乾燥前ならば）／復元（凍結乾燥されているならば）されたＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）製剤を含有する一連のシリンジ中で試験した。凝集形成およびその後の沈降の速度に関する一貫した濃度依存性応答（緩衝液中のＮａＣｌ濃度が減少するにつれて凝集が増大し、沈降が速くなる）が存在していた。≦２５ｍＭ  ＮａＣｌを含有する緩衝液中の血液サンプルおよび≦３０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する緩衝液中の別の血液サンプルに関して、明らかな凝集反応が見られた。≧４０ｍＭ  ＮａＣｌを有する全ての緩衝液調製物において、血球の挙動は、生理食塩水または生理食塩水中で復元されたＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）におけるものと区別できなかった。４０ｍＭ  ＮａＣｌで復元されたＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）は４ｍＳ／ｃｍの伝導率計算値に相当する。
【０１１４】
５％デキストロース注射溶液（１ｍＬにつき、注射用水中５０ｍｇ含水デキストロースＵＳＰを含有する）は、オスモル濃度の計算値が２５０ｍＯｓｍ／Ｌであり、イオン強度の計算値が０ｍＳ／ｃｍである。この溶液は、通常、静脈内投与されるが、これも、水中で復元されたＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）製剤に関して観察されるのと同様に、ＲＢＣ凝集反応および非常に迅速な血液沈降を引き起こした。
【０１１５】
従って、これらの結果は、水中で復元されたＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）により引き起こされるＲＢＣ凝集反応は、ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）製剤の低いイオン強度（０ｍＥｑ／Ｌ  イオン強度計算値、＜０．２ｍＳ／ｃｍ伝導率測定値）によるものであることを示す。この問題は、≧４０ｍＭ  ＮａＣｌを有するＮａＣｌ溶液中で復元することにより修正でき、注射用の復元された溶液は、イオン強度計算値が約４０ｍＥｑ／Ｌ（凝集を防止するために十分なイオン強度は、約４ｍＳ／ｃｍ以上の伝導率としても計算できる）またはそれ以上になる。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】実施例３において記載される実験から得られる赤血球沈降結果を示す図である。赤血球沈降は、変更されたウェスタン法（実施例２参照）を適用して６０分で測定し、ここで、ＥＤＴＡ中に集められたヒト血液を１：４で試験溶液と混合した。６０分後、０点と赤血球：血漿界面間の距離（ｍｍ）を測定した。水平線は平均を表し、垂直線は合計１２人のドナーからの標準偏差を包含する。そのそれぞれが３人のドナーからの血液を評価する４の独立した実験からの結果を合わせた。
【０１１７】
【図２】ＮａＣｌ溶液で復元されたＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）製剤に関する赤血球沈降評価を示す図である。４０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液は、現在市販されているＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）製品またはＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）の新規製剤（凍結乾燥前のフィル溶液が４ｍＬであり、１０ｍＭヒスチジン、２６０ｍＭグリシン、１％シュークロース、０．００５％ポリソルベート８０の濃度を有し；凍結乾燥後に、ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）−Ｒが、４０ｍＭ  ＮａＣｌ、８ｍＭ  ヒスチジン、２０８ｍＭグリシン、０．８％シュークロース、および０．００４％ポリソルベートを含むように、５ｍＬの４０ｍＭ塩化ナトリウム中で復元される）のいずれかを復元するために使用される場合、赤血球凝集反応を防止するために十分である。
【図１】
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【図２】
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