(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
刺激対象に特異的に付着または発現する蛍光物質を供給した標本を観察するための第１から第３の波長の照明光を発する少なくとも１つの光源と、
該光源から発せられた照明光を前記標本に照射する照明光学系と、
前記標本上における照明光の照射領域を変化させる偏向手段と、
前記標本からの光を集光する観察光学系と、
該観察光学系により集光された光を検出する少なくとも１つの光検出器と、
該光検出器により検出された光から画像を生成する画像生成部と、
これらを制御するとともに、前記第１から第３の波長のうち前記標本に照射する照明光の波長を選択する制御部と備え、
前記制御部が、
前記標本中の刺激対象に特異的に付着または発現する前記蛍光物質を励起させる第１の波長の光を選択し、前記第１の波長の光の照射によって前記蛍光物質から発せられた蛍光に基づいて前記画像生成部により生成された蛍光画像を画像処理して該蛍光画像内における前記蛍光物質の位置を抽出する蛍光物質抽出処理と、
前記刺激対象を刺激する第２の波長の光を選択し、前記偏向手段により、前記蛍光物質抽出処理により抽出された前記蛍光物質の位置に対して、前記第２の波長の光を前記照明光学系から照射させる刺激処理と、
前記標本の画像を取得するための第３の波長の光を選択し、前記第３の波長の光を前記標本に照射して得られる標本からの光に基づいて、前記刺激対象を含む前記標本の画像を前記画像生成部により生成させる画像生成処理とを行う観察装置。
【請求項２】
前記第３の波長の光は、前記標本内の観察対象から蛍光を発生させ、
前記第１の波長の光および前記第３の波長の光を発する第１の光源と、
前記第２の波長の光を発する第２の光源とを備え、
前記光検出器が、前記第１の波長の光および前記第３の波長の光を照射することで前記標本から発せられる蛍光を検出する請求項１に記載の観察装置。
【請求項３】
前記第３の波長の光は、前記標本内の観察対象から蛍光を発生させ、
前記第３の波長の光を発する第１の光源と、
前記第１の波長および前記第２の波長の光を発する第２の光源と、
前記第３の波長の光を照射することで前記標本から発せられる蛍光を取得する第１の光検出器と、
前記第１の波長の光により前記標本から発せられる蛍光を検出する第２の光検出器とを備え、
前記制御部が、前記第２の検出器により検出された蛍光に基づいて前記画像生成部により生成された画像から前記刺激対象を抽出する請求項１に記載の観察装置。
【請求項４】
前記第３の波長の光は、前記標本内の観察対象から蛍光を発生させ、
前記第３の波長の光を発する第１の光源と、
前記第２の波長の光を発する第２の光源と、
前記第１の波長の光を発する第３の光源と、
前記第３の波長の光を照射することで前記標本から発せられる蛍光を検出する第１の光検出器と、
前記第１の波長の光を照射することで前記標本から発せられる蛍光を検出する第２の光検出器とを備え、
前記制御部が、前記第２の検出器により検出された蛍光に基づいて前記画像生成部により生成された蛍光画像を画像処理して前記蛍光画像内における前記蛍光物質の位置を抽出する請求項１に記載の観察装置。
【請求項５】
前記観察光学系がガルバノミラーを有する請求項１に記載の観察装置。
【請求項６】
前記偏向手段がガルバノミラーである請求項１に記載の観察装置。
【請求項７】
前記偏向手段は、前記照明光学系から照射される光を反射又は透過する微小素子が複数配列された微小素子アレイである請求項１に記載の観察装置。
【請求項８】
前記画像生成部により生成された画像を記録する記録部を備え、
前記制御部が、前記第１の波長の光が照明されることで、前記画像生成部により生成される前記標本の蛍光画像を前記記録部に記録する請求項１に記載の観察装置。
【請求項９】
刺激対象に特異的に付着または発現する蛍光物質を供給した標本に対して、前記蛍光物質を励起させる第１の波長の光を前記標本に照射して取得された蛍光画像を画像処理して前記蛍光画像内における前記蛍光物質の位置を抽出する蛍光物質抽出ステップと、
該蛍光物質抽出ステップにおいて抽出された前記蛍光物質の位置に応じて前記標本中の刺激位置を自動的に選択する自動設定ステップと、
前記刺激対象を刺激する第２の波長の光を、前記自動設定ステップにおいて選択された刺激位置であり、前記蛍光物質抽出ステップにより抽出された前記蛍光物質の位置に照射する刺激ステップと、
前記標本の画像を取得するための第３の波長の光を前記標本に照射して、前記刺激ステップにより刺激された前記刺激対象を含む前記標本の画像を生成する画像生成ステップとを有する観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば細胞等の生体組織を観察する観察装置および観察方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞の位置や形状が継時的に変化する様子を観察するための観察装置が知られている（例えば、特許文献１から３参照）。これらの観察装置は、特定の細胞・組織を刺激することができるようになっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００８−２８１７２０号公報
【特許文献２】特開平１０−２０６７４２号公報
【特許文献３】特開２００６−２２０８１８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところで、上記のような観察装置において、特定の細胞・組織を刺激するためには、細胞の位置や形状に合わせて刺激位置も変化させる必要がある。また、特定の細胞・組織を刺激した際には、刺激直後の反応を観察することが重要である。
【０００５】
しかしながら、特許文献１に開示されている観察装置では、標本の観察と平行してステージ制御により観察対象物を画角から外れないように追尾することはできるものの、対象物の変化に応じて刺激位置を変化させることはできない。
【０００６】
また、特許文献２に開示されている観察装置では、第１のレーザーと検出器の組合せで観察対象物を観察するのと同時に、第２のレーザーで観察対象物を刺激することはできるものの、対象物の変化に応じて刺激位置を変化させることはできない。
【０００７】
また、特許文献３に開示されている観察装置では、標本の変化に応じてＤＭＤで照明領域を変更できるものの、標本の観察と同時に刺激ができる構成ではないため、標本の刺激と観察にタイムラグが生じ、刺激直後の標本の反応を観察することができない。
【０００８】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、細胞の位置や形状に合わせて刺激位置も変化させるとともに、刺激直後の細胞を観察することができる観察装置および観察方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明の第１の態様は、刺激対象に特異的に付着または発現する蛍光物質を供給した標本を観察するための第１から第３の波長の照明光を発する少なくとも１つの光源と、該光源から発せられた照明光を前記標本に照射する照明光学系と、前記標本上における照明光の照射領域を変化させる偏向手段と、前記標本からの光を集光する観察光学系と、該観察光学系により集光された光を検出する少なくとも１つの光検出器と、該光検出器により検出された光から画像を生成する画像生成部と、これらを制御するとともに、前記第１から第３の波長のうち前記標本に照射する照明光の波長を選択する制御部と備え、前記制御部が、前記標本中の刺激対象に特異的に付着または発現する前記蛍光物質を励起させる第１の波長の光を選択し、前記第１の波長の光の照射によって前記蛍光物質から発せられた蛍光に基づいて前記画像生成部により生成された蛍光画像を画像処理して該蛍光画像内における前記蛍光物質の位置を抽出する蛍光物質抽出処理と、前記刺激対象を刺激する第２の波長の光を選択し、前記偏向手段により、前記蛍光物質抽出処理により抽出された前記蛍光物質の位置に対して、前記第２の波長の光を前記照明光学系から照射させる刺激処理と、前記標本の画像を取得するための第３の波長の光を選択し、前記第３の波長の光を前記標本に照射して得られる標本からの光に基づいて、前記刺激対象を含む前記標本の画像を前記画像生成部により生成させる画像生成処理とを行う観察装置である。
【００１０】
上記態様によれば、波長選択手段により標本上に照射される照明光の波長が選択され、選択された波長の光が照明光学系により標本に照射される。これにより発生した標本からの光は、観察光学系により集光されて光検出器により検出され、検出された光から画像生成部により画像が生成される。この際、画像生成部は、偏向手段と光検出器により走査画像を取得してもよく、あるいは、偏向手段を用いずに光検出器に例えばカメラ（ＣＣＤ）を採用して画像を取得してもよい。
【００１１】
この場合において、制御部により上記の各部が制御され、蛍光物質抽出処理、刺激処理、および画像生成処理が行われる。
蛍光物質抽出処理では、標本中の刺激対象に特異的に付着または発現する蛍光物質を励起させる第１の波長の光を波長選択手段により選択させ、画像生成部により生成された蛍光画像から蛍光物質が抽出される。すなわち、蛍光物質抽出処理では、第１の波長の光が標本に照射されることで、標本中の蛍光物質が励起されて蛍光が発生し、この蛍光を検出することで刺激対象に特異的に付着または発現する蛍光物質の蛍光画像が生成される。そして、このように生成された蛍光画像から、刺激対象の領域が抽出される。
【００１２】
刺激処理では、刺激対象を刺激する第２の波長の光を波長選択手段により選択させ、偏向手段により、蛍光物質抽出処理により抽出された刺激対象の領域に対して、第２の波長の光が照明光学系から照射される。すなわち、刺激処理では、蛍光物質抽出処理により生成された蛍光画像に基づいて刺激対象の位置が特定され、偏向手段を動作させて、この刺激対象の位置に対して第２の波長の光が照射される。これにより、刺激対象に刺激が与えられる。
【００１３】
画像生成処理では、標本の画像を取得するための第３の波長の光を波長選択手段により選択させ、刺激対象を含む標本の画像を画像生成部により生成させる。すなわち、画像生成処理では、刺激処理により刺激対象に対して刺激が与えられた状態の標本の画像が取得される。
【００１４】
上記のように各部を制御することで、第１の波長の光を用いて刺激対象の位置を検出して、第２の波長の光を用いて刺激対象に刺激を与え、第３の波長の光を用いてその際の標本の画像を取得することができる。これにより、標本中の刺激対象の位置や形状に合わせて刺激位置も変化させるとともに、刺激直後の標本を観察することができ、標本の観察精度を向上することができる。
なお、上記の処理において、励起とは、その物質を観察するための蛍光を発生させることであり、刺激とは、その物質に光化学的変化を生じさせることで活性化させて周囲に影響（作用）を与えることである。
また、偏向手段は、第２の波長の光に対しては必須であるが、第１の波長の光および第３の波長の光に対してはあってもなくてもよく、例えば通常の顕微鏡の観察としてもよい。
【００１５】
上記態様において、前記第３の波長の光は、前記標本内の観察対象から蛍光を発生させ、前記第１の波長の光および前記第３の波長の光を発する第１の光源と、前記第２の波長の光を発する第２の光源とを備え、前記光検出器が、前記第１の波長の光および前記第３の波長の光を照射することで前記標本から発せられる蛍光を検出することとしてもよい。
【００１６】
このようにすることで、第２の光源から刺激対象を刺激する第２の波長の光を発すると同時に、第１の光源から標本の画像を取得するための第３の波長の光を発することができる。これにより、刺激を与えた際の標本をリアルタイムで観察することができ、標本の観察精度を向上することができる。
【００１７】
上記態様において、前記第３の波長の光は、前記標本内の観察対象から蛍光を発生させ、前記第３の波長の光を発する第１の光源と、前記第１の波長および前記第２の波長の光を発する第２の光源と、前記第３の波長の光を照射することで前記標本から発せられる蛍光を取得する第１の光検出器と、前記第１の波長の光により前記標本から発せられる蛍光を検出する第２の光検出器とを備え、前記制御部が、前記第２の検出器により検出された蛍光に基づいて前記画像生成部により生成された画像から前記刺激対象を抽出することとしてもよい。
【００１８】
このようにすることで、第２の光検出器により検出した光から刺激対象の位置を特定するための画像を生成するとともに、第１の光検出器により検出した光から刺激対象に対して刺激が与えられた状態の標本の画像を生成することができ、画像処理を同時に行って標本の観察を継続することができる。また、第２の光源から刺激対象を刺激する第２の波長の光を発すると同時に、第１の光源から標本の画像を取得するための第３の波長の光を発することができる。これにより、刺激を与えた際の標本を観察することができ、標本の観察精度を向上することができる。
【００１９】
上記態様において、前記第３の波長の光は、前記標本内の観察対象から蛍光を発生させ、前記第３の波長の光を発する第１の光源と、前記第２の波長の光を発する第２の光源と、前記第１の波長の光を発する第３の光源と、前記第３の波長の光を照射することで前記標本から発せられる蛍光を検出する第１の光検出器と、前記第１の波長の光を照射することで前記標本から発せられる蛍光を検出する第２の光検出器とを備え、前記制御部が、前記第２の検出器により検出された蛍光に基づいて前記画像生成部により生成された蛍光画像を画像処理して前記蛍光画像内における前記蛍光物質の位置を抽出することとしてもよい。
【００２０】
このようにすることで、第２の光検出器により検出した光から刺激対象の位置を特定するための蛍光画像を生成するとともに、第１の光検出器により検出した光から刺激対象に対して刺激が与えられた状態の標本の画像を生成することができ、画像処理を同時に行って標本の観察を継続することができる。また、同時に、第３の光源から刺激対象の位置を特定するための第１の波長の光と、第２の光源から刺激対象を刺激する第２の波長の光と、第１の光源から標本の画像を取得するための第３の波長の光とを発することができる。これにより、位置や形状の変化が大きな標本に対しても、刺激を与えた際の標本を観察することができ、標本の観察精度を向上することができる。
【００２１】
上記態様において、前記観察光学系がガルバノミラーを有することとしてもよい。
このようにすることで、ガルバノミラーを動作させて光源からの照明光を標本上において走査し、その走査位置と光検出器により検出された標本からの光の強度とを対応付けることにより、標本の画像を生成することができる。これにより、光検出器の小型化を図ることができる。
【００２２】
上記態様において、前記偏向手段がガルバノミラーであることとしてもよい。
ガルバノミラーを動作させることで、照明光学系により照射される照明光の標本上における照射領域を変化させることができる。
【００２３】
上記態様において、前記偏向手段は、前記照明光学系から照射される光を反射又は透過する微小素子が複数配列された微小素子アレイであることとしてもよい。
このようにすることで、照明光学系から照射される光を反射又は透過する微小素子を切り替えることにより、照明光学系により照射される照明光の標本上における照射領域を変化させることができる。
【００２４】
上記態様において、前記画像生成部により生成された画像を記録する記録部を備え、前記制御部が、前記第１の波長の光が照明されることで、前記画像生成部により生成される前記標本の蛍光画像を前記記録部に記録することとしてもよい。
このようにすることで、刺激対象の位置を特定するための第１の波長の光が照明されることで生成される標本の蛍光画像を記録部に記録することができる。これにより、刺激対象の位置や形状の時間変化を観察することができる。
【００２５】
本発明の第２の態様は、刺激対象に特異的に付着または発現する蛍光物質を供給した標本に対して、前記蛍光物質を励起させる第１の波長の光を前記標本に照射して取得された蛍光画像を画像処理して前記蛍光画像内における前記蛍光物質の位置を抽出する蛍光物質抽出ステップと、該蛍光物質抽出ステップにおいて抽出された前記蛍光物質の位置に応じて前記標本中の刺激位置を自動的に選択する自動設定ステップと、前記刺激対象を刺激する第２の波長の光を、前記自動設定ステップにおいて選択された刺激位置であり、前記蛍光物質抽出ステップにより抽出された前記蛍光物質の位置に照射する刺激ステップと、前記標本の画像を取得するための第３の波長の光を前記標本に照射して、前記刺激ステップにより刺激された前記刺激対象を含む前記標本の画像を生成する画像生成ステップとを有する観察方法である。
【００２６】
上記態様によれば、蛍光物質抽出ステップ、刺激ステップ、画像生成ステップの順で標本の観察が行われる。
蛍光物質抽出ステップでは、第１の波長の光が標本に照射されることで、標本中の刺激対象に特異的に付着または発現する蛍光物質が励起され、該蛍光物質から蛍光が発生し、この蛍光を検出することで前記蛍光物質の蛍光画像が生成される。そして、このように生成された蛍光画像に基づいて前記蛍光物質の存在する位置を抽出することにより刺激対象の位置が特定される。
【００２７】
刺激ステップでは、蛍光物質抽出ステップにより特定された刺激対象の位置に対して、第２の波長の光が照射される。これにより、刺激対象に刺激が与えられる。
【００２８】
画像生成ステップでは、刺激ステップにより刺激対象に対して刺激が与えられた状態の標本の画像が取得される。
上記のように各ステップの順で標本を観察することで、標本中の刺激対象の位置や形状に合わせて刺激位置も変化させるとともに、刺激直後の標本を観察することができ、標本の観察精度を向上することができる。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、細胞の位置や形状に合わせて刺激位置も変化させるとともに、刺激直後の細胞を観察することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡の概略構成図である。
【図２】図１の顕微鏡により実行される処理を示すフローチャートである。
【図３】図２の各処理における照明光の波長と照射領域を説明する図である。
【図４】図２の各処理において取得される画面例を示す図であり、（ａ）はＳＴＥＰ０、（ｂ）はＳＴＥＰ１，２、（ｃ）はＳＴＥＰ３、（ｄ）はＳＴＥＰ６における画面例を示している。
【図５】本発明の第２の実施形態に係る顕微鏡の概略構成図である。
【図６】図５の第１の変形例に係る顕微鏡の概略構成図である。
【図７】図５の第２の変形例に係る顕微鏡の概略構成図である。
【図８】図５の第３の変形例に係る第１の光学系の概略構成図である。
【図９】図５の第４の変形例に係る第２の光学系の概略構成図である。
【図１０】図５の第５の変形例に係る第２の光学系の概略構成図である。
【図１１】本発明の第３の実施形態に係る顕微鏡システムの概略構成図である。
【図１２】図１１の変形例に係る顕微鏡システムの概略構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
［第１の実施形態］
本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡１について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１は、図１に示されるように、照明光を発する光源１１と、標本Ａを載置するステージ１２と、光源１１から発せられた照明光を標本Ａに照射する照明光学系１０と、標本Ａからの光を集光する観察光学系２０と、観察光学系２０により集光された標本Ａからの光から画像を生成する画像処理部（画像生成部）１３と、これらを制御する制御部１４とを備えている。
顕微鏡１は、例えば脳神経系を観察するための顕微鏡であり、ＣｈＲ（チャネルロドプシン）を刺激して、その直後のカルシウムの反応の観察するものである。
【００３２】
光源１１は、刺激対象に特異的に付着または発現する蛍光物質を供給した標本Ａを観察するための照明光を発する光源である。
具体的には、光源１１は、後述する制御部１４からの指示に基づいて、標本Ａ中の刺激対象（チャネルロドプシン）に特異的に付着または発現する蛍光物質を励起させる波長λ１の光と、刺激対象（チャネルロドプシン）を刺激する波長λ２の光と、観察対象（カルシウム）を検出するための（すなわち、標本Ａの画像を取得するための）波長λ３の光とを選択的に発するようになっている。
なお、上記の処理において、励起とは、その物質を観察するための蛍光を発生させることであり、刺激とは、その物質に光化学的変化を生じさせることで活性化させて周囲に影響（作用）を与えることである。
【００３３】
照明光学系１０は、光源１１から発せられた照明光を偏向する偏向素子（偏向手段）１５と、所定の波長域の光を透過させるＥｘフィルタ（励起フィルタ）１６と、標本Ａに対向して配置された対物レンズ１８と、光源１１の光軸と対物レンズ１８の光軸との交点に配置されたダイクロイックミラー１７とを備えている。
【００３４】
偏向素子１５は、例えば、微小可動ミラー（微小素子）が複数配列されたＤＭＤ（Digital Mirror Device）である。このような構成を有することで、偏向素子１５は、微小可動ミラーを動作（ＯＮ／ＯＦＦ）させることによって、光源１１から発せられた照明光の一部または全部を選択的にダイクロイックミラー１７に向けて反射させ、標本Ａ上における照明光の照射領域を変化させるようになっている。
【００３５】
対物レンズ１８は、Ｅｘフィルタ１６を透過した照明光を標本Ａに照射する一方、標本Ａからの光を集光するようになっている。ここで、標本Ａからの光とは、例えば、標本Ａからの戻り光や、標本Ａにおいて発生した蛍光である。
【００３６】
ダイクロイックミラー１７は、Ｅｘフィルタ１６を透過した光源１１からの照明光を対物レンズ１８に向けて反射する一方、対物レンズ１８により集光された標本Ａからの光を透過させるようになっている。これにより、ダイクロイックミラー１７は、光源１１からの照明光と、標本Ａからの光とを分岐するようになっている。
【００３７】
観察光学系２０は、所定の波長域の光を透過させるＥｍフィルタ（蛍光フィルタ）２３と、Ｅｍフィルタ２３を透過してきた標本Ａからの光を検出器２５に結像させる結像レンズ２４と、結像レンズ２４により結像された標本Ａからの光を検出する検出器（光検出器）２５とを備えている。
【００３８】
Ｅｍフィルタ２３は、ダイクロイックミラー１７を透過してきた標本Ａからの光のうち、標本Ａにおいて発生した蛍光を透過させる一方、光源１１からの照明光を遮断するようになっている。
検出器２５は、例えばＣＣＤ（Charge Coupled Device）であり、検出した光を光電変換して得られた電気信号を画像処理部１３に出力するようになっている。
【００３９】
画像処理部１３は、偏向素子１５により動作される標本Ａ上における照明光の照射領域と、検出器２５により検出された光の強度とに基づいて、標本Ａの画像を生成するようになっている。
【００４０】
制御部１４は、光源１１を制御して、標本Ａに照射される照明光の波長を選択するようになっている。また、制御部１４は、光源１１を含む各部を制御して、標本Ａにおける刺激対象を抽出する蛍光物質抽出処理と、標本Ａにおける刺激対象を刺激する刺激処理と、刺激対象を含む標本Ａの画像を生成する画像生成処理とを行うようになっている。これら処理において、制御部１４により実行される具体的な処理について以下に説明する。
【００４１】
蛍光物質抽出処理では、制御部１４は、光源１１により照射される照明光として、標本Ａ中の刺激対象（チャネルロドプシン）に特異的に付着または発現する蛍光物質を励起させる波長λ１の光を選択し、波長λ１の光を照射することによって蛍光物質から発せられた蛍光に基づいて画像処理部１３により生成された蛍光画像から蛍光物質（刺激対象の位置）を抽出する。
【００４２】
刺激処理では、制御部１４は、光源１１により照射される照明光として、刺激対象（チャネルロドプシン）を刺激する波長λ２の光を選択し、蛍光物質抽出処理により抽出された蛍光物質の位置に対して、波長λ２の光を照明光学系１０により照射させる。
【００４３】
画像生成処理では、制御部１４は、光源１１により照射される照明光として、観察対象（カルシウム）を検出するための（すなわち、標本Ａの画像を取得するための）波長λ３の光を選択し、刺激対象を含む標本Ａの画像を画像処理部１３により生成させる。
【００４４】
上記構成を有する顕微鏡１の作用について、図２に示すフローチャートに従って以下に説明する。
ここでは、具体例として、脳神経系を観察する際に、Ｆｌｕｏ３（標本Ａにおいて発生した蛍光）で観察対象（カルシウム）を見ながら、刺激対象（ＣｈＲ２）を刺激する場合について説明する。また、刺激対象（ＣｈＲ２）は、ｍＣｈｅｒｒｙ（刺激対象であるチャネルロドプシンＣｈＲ２に特異的に付着または発現する蛍光物質）で標識する。
【００４５】
上記構成を有する顕微鏡１によれば、制御部１４により光源１１から照射される照明光の波長が選択され、選択された波長の光が照明光学系１０により標本Ａに照射される。この際、偏向素子１５により標本Ａ上における照明光の照射領域が変化させられる。標本Ａにおいて発生した光は、観察光学系２０により集光されて検出器２５により検出され、検出された光から画像処理部１３により画像が生成される。
【００４６】
この場合において、制御部１４により各部が制御され、蛍光物質抽出処理、刺激処理、および画像生成処理が行われる。
まず、初期状態においては（ＳＴＥＰ０）、図３に示すように、照射する照明光として、標本Ａの画像を取得するための波長λ３が選択されている。また、その照射領域として、例えば画角全体の領域Ｐ１が選択されている。この場合には、波長λ３の光が領域Ｐ１に照射され、刺激対象を含む標本Ａの画像が画像処理部１３により生成される。この場合に取得された画像が、図４（ａ）に示されている。
【００４７】
次に、観察設定の変更が行われ（ＳＴＥＰ１）、蛍光物質抽出処理が実行される。この場合には、図３に示すように、照射する照明光として、標本Ａ中の刺激対象に特異的に付着または発現する蛍光物質を励起させる波長λ１の光が選択される。また、その照射領域として、領域Ｐ１が選択される。これにより、画像処理部１３により生成された画像から蛍光物質（刺激対象の位置）が抽出される（ＳＴＥＰ２）。すなわち、蛍光物質抽出処理では、波長λ１の光が領域Ｐ１に照射されることで、領域Ｐ１中の蛍光物質が励起され、蛍光物質から蛍光が発生し、この蛍光を検出することで蛍光物質の蛍光画像が生成される。この場合に取得された画像が、図４（ｂ）に示されている。そして、このように生成された蛍光物質の蛍光画像から、刺激対象の領域として領域Ｐ２が抽出される。
【００４８】
次に、観察設定の変更が行われ（ＳＴＥＰ３）、刺激処理が実行される。この場合には、図３に示すように、刺激対象を刺激する波長λ２の光が選択される。また、その照射領域として、蛍光物質抽出処理により抽出された蛍光物質（刺激対象の領域）Ｐ２が選択される。これにより、蛍光物質抽出処理により抽出された刺激対象の位置に対して、波長λ２の光が照明光学系１０により照射される。すなわち、刺激処理では、蛍光物質抽出処理により生成された蛍光物質の蛍光画像に基づいて刺激対象の位置が特定され（ＳＴＥＰ４）、この刺激対象に対して波長λ２の光が照射されて刺激対象に刺激が与えられる（ＳＴＥＰ５）。この場合に取得された画像が、図４（ｃ）に示されている。
【００４９】
次に、観察設定の変更が行われ（ＳＴＥＰ６）、画像生成処理が実行される。この場合には、図３に示すように、標本Ａの画像を取得するための波長λ３の光が選択される。また、その照射領域として、領域Ｐ１が選択される。これにより、刺激対象を含む標本Ａの画像が画像処理部１３により生成される。すなわち、画像生成処理では、刺激処理により刺激対象に対して刺激が与えられた状態の標本Ａの画像が取得される（ＳＴＥＰ７）。この場合に取得された画像が、図４（ｄ）に示されている。
【００５０】
以上のように、本実施形態に係る顕微鏡１によれば、上記のように各部を制御することで、波長λ１の光を用いて刺激対象の位置を検出して、波長λ２の光を用いて刺激対象に刺激を与え、波長λ３の光を用いてその際の標本Ａの画像を取得することができる。これにより、標本Ａ中の刺激対象の位置や形状に合わせて刺激位置も変化させるとともに、刺激直後の標本Ａを観察することができ、標本Ａの観察精度を向上することができる。
【００５１】
［第２の実施形態］
以下に、第２の実施形態に係る顕微鏡２について、図面を参照して説明する。以降では、本実施形態および各変形例に係る顕微鏡について、第１の実施形態に係る顕微鏡１と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
【００５２】
本実施形態に係る顕微鏡２は、図５に示されるように、照明光を発する第１の光学系３０と、照明光を発する第２の光学系４０と、標本Ａを載置するステージ１２と、標本Ａに対向して配置された対物レンズ１８と、対物レンズ１８により集光された標本Ａからの光から画像を生成する画像処理部（画像生成部）１３と、これらを制御する制御部１４とを備えている。
【００５３】
第１の光学系３０は、標本Ａを観察するための光学系であり、照明光を発する第１の光源３１と、所定の波長域の光を透過させるＥｘフィルタ（励起フィルタ）３２と、照明光と標本Ａからの光とを分岐するダイクロイックミラー３３，３４と、所定の波長域の光を透過させるＥｍフィルタ（蛍光フィルタ）３５と、Ｅｍフィルタ３５を透過してきた標本Ａからの光を検出器３７に結像させる結像レンズ３６と、結像レンズ３６により結像された標本Ａからの光を検出する検出器（光検出器）３７とを備えている。
【００５４】
第２の光学系４０は、標本Ａ中の刺激対象を刺激するための光学系であり、照明光を発する第２の光源４１と、所定の波長域の光を透過させるＥｘフィルタ（励起フィルタ）４２と、第２の光源４１から発せられた照明光を偏向する偏向素子（偏向手段）４３と、偏向素子４３により偏向された照明光を反射するミラー４４，４５とを備えている。
【００５５】
第１の光源３１は、刺激対象に特異的に付着または発現する蛍光物質を供給した標本Ａを観察するための照明光を発する光源である。
具体的には、第１の光源３１は、制御部１４からの指示に基づいて、標本Ａ中の刺激対象（チャネルロドプシン）に特異的に付着または発現する蛍光物質を励起させる波長λ１の光と、観察対象（カルシウム）を検出するための（すなわち、標本Ａの画像を取得するための）波長λ３の光とを選択的に発するようになっている。
【００５６】
第２の光源４１は、刺激対象を刺激するための照明光を発する光源である。
具体的には、第２の光源４１は、制御部１４からの指示に基づいて、刺激対象（チャネルロドプシン）を刺激する波長λ２の光を発するようになっている。
【００５７】
制御部１４は、第１の光源３１および第２の光源４１を制御して、標本Ａに照射される照明光の波長を選択するようになっている。また、制御部１４は、第１の光源３１および第２の光源４１を含む各部を制御して、標本Ａ中の蛍光物質を抽出する蛍光物質抽出処理と、標本Ａにおける刺激対象を刺激する刺激処理と、刺激対象を含む標本Ａの画像を生成する画像生成処理とを行うようになっている。これら処理において、制御部１４により実行される具体的な処理について以下に説明する。
【００５８】
蛍光物質抽出処理では、制御部１４は、第１の光源３１を動作させる。ここでは、制御部１４は、第１の光源３１により照射される照明光として、標本Ａ中の刺激対象（チャネルロドプシン）に特異的に付着または発現する蛍光物質を励起させる波長λ１の光を選択し、画像処理部１３により生成された画像から蛍光物質（刺激対象の位置）を抽出する。
【００５９】
刺激処理では、制御部１４は、第２の光源４１を動作させる。これにより、制御部１４は、標本Ａに照射される照明光として、刺激対象（チャネルロドプシン）を刺激する波長λ２の光を選択し、蛍光物質抽出処理により抽出された刺激対象の位置に対して、波長λ２の光を照射させる。
【００６０】
画像生成処理では、制御部１４は、第１の光源３１を動作させる。ここでは、制御部１４は、第１の光源３１により照射される照明光として、標本Ａの画像を取得するための波長λ３の光を選択し、刺激対象を含む標本Ａの画像を画像処理部１３により生成させる。
【００６１】
上記構成を有する顕微鏡２の作用について以下に説明する。
上記構成を有する顕微鏡２によれば、制御部１４により標本Ａ上に照射される照明光の波長が選択され、選択された波長の光が対物レンズ１８により標本Ａに照射される。この際、偏向素子４３により標本Ａ上における照明光の照射領域が変化させられる。標本Ａにおいて発生した光は、対物レンズ１８により集光されて検出器３７により検出され、検出された光から画像処理部１３により画像が生成される。
【００６２】
この場合において、制御部１４により第１の光源３１および第２の光源４１を制御して、蛍光物質抽出処理、刺激処理、および画像生成処理が行われる。
具体的には、制御部１４により第１の光源３１および第２の光源４１が制御されることで、標本Ａに照射される照明光を切り替えるとともに、切り替えた照明光に応じて各部を、前述の第１の実施形態と同様に制御することで、以下のように蛍光物質抽出処理、刺激処理、および画像生成処理が行われる。
【００６３】
蛍光物質抽出処理では、第１の光源３１を動作させ、標本Ａ中の刺激対象（チャネルロドプシン）に特異的に付着または発現する蛍光物質を励起させる波長λ１の光を標本Ａに照射し、画像処理部１３により生成された画像から蛍光物質（刺激対象の位置）を抽出する。
【００６４】
刺激処理では、第２の光源４１を動作させ、標本Ａに照射される照明光として、刺激対象（チャネルロドプシン）を刺激する波長λ２の光を、蛍光物質抽出処理により抽出された刺激対象の位置に対して照射する。
【００６５】
画像生成処理では、第１の光源３１を動作させ、標本Ａの画像を取得するための波長λ３の光を標本Ａに照射し、刺激対象を含む標本Ａの画像を画像処理部１３により生成する。なお、刺激処理と画像生成処理は、異なる光源を用いているため、同時に行うことができる。
【００６６】
以上のように、本実施形態に係る顕微鏡２によれば、第１の実施形態に係る顕微鏡１と同様の効果に加え、第２の光源４１から刺激対象を刺激する波長λ２の光を発すると同時に、第１の光源３１から標本Ａの画像を取得するための波長λ３の光を発することができる。これにより、刺激を与えた際の標本Ａをリアルタイムで観察することができ、標本Ａの観察精度を向上することができる。
【００６７】
［第１の変形例］
以下に、本実施形態に係る顕微鏡２の第１の変形例について図６を参照して説明する。
本変形例に係る顕微鏡３において、第１の光学系３０は、標本Ａを観察するための光学系であり、前述の実施形態に係る顕微鏡２と同様の構成を有している。
【００６８】
第２の光学系４０は、図６に示すように、標本Ａ中の刺激対象を刺激するための光学系であり、照明光を発する第２の光源４１と、所定の波長域の光を透過させるＥｘフィルタ（励起フィルタ）４２と、第２の光源４１から発せられた照明光を偏向する偏向素子４３と、偏向素子４３により偏向された照明光を反射するミラー４５と、照明光と標本Ａからの光とを分岐するダイクロイックミラー４６と、所定の波長域の光を透過させるＥｍフィルタ（蛍光フィルタ）４８と、Ｅｍフィルタ４８を透過してきた標本Ａからの光を第２の検出器４７に結像させる結像レンズ４９と、結像レンズ４９により結像された標本Ａからの光を検出する第２の検出器（光検出器）４７とを備えている。
【００６９】
上記構成を有する本変形例に係る顕微鏡３によれば、第２の検出器４７により検出した光から刺激対象の位置を特定するための画像を生成するとともに、第１の検出器３７により検出した光から刺激対象に対して刺激が与えられた状態の標本Ａの画像を生成することができ、画像処理を同時に行って標本Ａの観察を継続することができる。また、第２の光源４１から刺激対象を刺激する波長λ２の光を発すると同時に、第１の光源３１から標本Ａの画像を取得するための波長λ３の光を発することができる。これにより、刺激を与えた際の標本Ａをリアルタイムで観察することができ、標本Ａの観察精度を向上することができる。
【００７０】
［第２の変形例］
以下に、本実施形態に係る顕微鏡２の第２の変形例について図７を参照して説明する。
本変形例に係る顕微鏡４において、第１の光学系３０は、標本Ａを観察するための光学系であり、前述の実施形態に係る顕微鏡２と同様の構成を有している。
【００７１】
第２の光学系４０は、図７に示すように、標本Ａ中の刺激対象を刺激するための光学系であり、照明光を発する第２の光源４１と、所定の波長域の光を透過させるＥｘフィルタ（励起フィルタ）４２と、照明光を発する第３の光源５１と、所定の波長域の光を透過させるＥｘフィルタ（励起フィルタ）５２と、第２の光源４１と第３の光源５１との光路を合成するダイクロイックミラー５３と、第２の光源４１および第３の光源５１から発せられた照明光を偏向する偏向素子４３と、偏向素子４３により偏向された照明光を反射するミラー４５と、照明光と標本Ａからの光とを分岐するダイクロイックミラー４６と、所定の波長域の光を透過させるＥｍフィルタ（蛍光フィルタ）４８と、Ｅｍフィルタ４８を透過してきた標本Ａからの光を検出器４７に結像させる結像レンズ４９と、結像レンズ４９により結像された標本Ａからの光を検出する第２の検出器（光検出器）４７とを備えている。
【００７２】
上記構成を有する本変形例に係る顕微鏡４によれば、第２の検出器４７により検出した光から刺激対象の位置を特定するための画像を生成するとともに、第１の検出器３７により検出した光から刺激対象に対して刺激が与えられた状態の標本Ａの画像を生成することができ、画像処理を同時に行って標本Ａの観察を継続することができる。また、同時に、第３の光源５１から刺激対象の位置を特定するための波長λ１の光と、第２の光源４１から刺激対象を刺激する波長λ２の光と、第１の光源３１から標本Ａの画像を取得するための波長λ３の光とを発することができる。これにより、位置や形状の変化が大きな標本Ａに対しても、刺激を与えた際の標本Ａを観察することができ、標本Ａの観察精度を向上することができる。
【００７３】
［第３の変形例］
以下に、本実施形態に係る顕微鏡２の第３の変形例について図８を参照して説明する。
本変形例において、第１の光学系３０は、図８に示すように、レーザ光を走査する光学系であり、レーザ光を発するレーザ光源６１と、レーザ光源６１からのレーザ光を走査するガルバノミラー６２と、レーザ光の瞳を投影する瞳投影レンズ６３と、レーザ光を結像する結像レンズ６４と、照明光と標本Ａからの光とを分岐するダイクロイックミラー３４，６５と、所定の波長域の光を透過させるＥｍフィルタ（蛍光フィルタ）６６と、Ｅｍフィルタ６６を透過してきた標本Ａからの光を検出する検出器（光検出器）６７と、Ｅｍフィルタ６６と検出器６７との間に配置されたピンホール６８とを備えている。
【００７４】
上記構成を有することで、ガルバノミラー６２を動作させてレーザ光源６１からのレーザ光を標本Ａ上において走査し、その走査位置と検出器６７により検出された標本Ａからの光の強度とを対応付けることにより、標本Ａの画像を生成することができる。これにより、検出器の小型化を図ることができる。
【００７５】
［第４の変形例］
以下に、本実施形態に係る顕微鏡２の第４の変形例について図９を参照して説明する。
本変形例において、第２の光学系４０は、図９に示すように、レーザ光を走査する光学系であり、レーザ光を発するレーザ光源７１と、レーザ光源７１からのレーザ光を走査するガルバノミラー（偏向手段）７２と、レーザ光の瞳を投影する瞳投影レンズ７３と、レーザ光を結像する結像レンズ７４と、レーザ光を反射するミラー４５とを備えている。
上記構成を有することで、ガルバノミラー７２を動作させることで、対物レンズ１８により照射されるレーザ光の標本Ａ上における照射領域を変化させることができる。
【００７６】
［第５の変形例］
以下に、本実施形態に係る顕微鏡２の第５の変形例について図１０を参照して説明する。
本変形例において、第２の光学系４０は、図１０に示すように、レーザ光を発するレーザ光源８１と、レーザ光源８１からのレーザ光の瞳を投影する瞳投影レンズ８２と、レーザ光をＤＭＤ８３に向けて反射するミラー８４と、レーザ光の一部または全部を選択的に反射するＤＭＤ（偏向手段）８３と、レーザ光を結像する結像レンズ８６と、レーザ光を反射するミラー４５，８５とを備えている。
【００７７】
ＤＭＤ８３は、レーザ光源８１からのレーザ光を反射又は透過する微小素子が複数配列された微小素子アレイである。
上記構成を有することで、ＤＭＤ８３の図示しない微小可動ミラーを動作（ＯＮ／ＯＦＦ）させることによって、レーザ光源８１からのレーザ光の一部または全部を選択的にミラー８５に向けて反射させ、標本Ａ上における照明光の照射領域を変化させることができる。
【００７８】
［第３の実施形態］
以下に、第３の実施形態として、上記の各実施形態に係る顕微鏡を、モニタや入力部等を有する顕微鏡システムに適用した場合について説明する。ここでは、第２の実施形態に係る顕微鏡２を適用した例について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システム１００は、図１１に示されるように、顕微鏡本体ユニット１０７と、標本Ａを観察するための観察ユニット１１０と、標本Ａ中の刺激対象を刺激するための光刺激ユニット１２０と、観察ユニット１１０により取得される標本Ａの画像を表示するモニタ１０２と、標本Ａの観察条件等を入力する入力部１０３と、これらを制御するコントロールユニット１０１とを備えている。
【００７９】
顕微鏡本体ユニット１０７は、標本Ａを載置するステージ１２と、標本Ａに対向して配置された対物レンズ１８とを備えている。
コントロールユニット１０１は、対物レンズ１８により集光された標本Ａからの光から画像を生成する画像処理部（画像生成部）１３と、画像処理部１３により生成された画像を記録する記録部１０５と、各部を制御する制御部１４とを備えている。
【００８０】
観察ユニット１１０は、図１１において各構成要素を省略しているが、例えば図５から図８の第１の光学系３０と同様の構成を有している。
光刺激ユニット１２０は、照明光を発する第２の光源１２１と、所定の波長域の光を透過させるＥｘフィルタ（励起フィルタ）１２２と、Ｅｘフィルタ１２２を透過してきた照明光を集光する集光レンズ１２３と、集光レンズ１２３により集光された照明光をＤＭＤ１２５に向けて反射するミラー１２４と、レーザ光の一部または全部を選択的に反射するＤＭＤ（偏向手段）１２５と、レーザ光の瞳を投影する瞳投影レンズ１２６と、照明光と標本Ａからの光とを分岐するダイクロイックミラー４５と、所定の波長域の光を透過させるＥｍフィルタ（蛍光フィルタ）１２９と、Ｅｍフィルタ１２９を透過してきた標本Ａからの光を検出器１２７に結像させる結像レンズ１２８と、結像レンズ１２８により結像された標本Ａからの光を検出する検出器（光検出器）１２７とを備えている。
【００８１】
上記構成を有する本実施形態に係る顕微鏡システム１００によれば、第２の実施形態に係る顕微鏡２を有しているため、波長λ１の光を用いて刺激対象の位置を検出して、波長λ２の光を用いて刺激対象に刺激を与え、波長λ３の光を用いてその際の標本Ａの画像を取得することができる。これにより、標本Ａ中の刺激対象の位置や形状に合わせて刺激位置も変化させるとともに、刺激直後の標本Ａを観察することができ、標本Ａの観察精度を向上することができる。
なお、本実施形態に係る顕微鏡システム１００として、第２の実施形態に係る顕微鏡２を適用した例について説明したが、第１の実施形態に係る顕微鏡１を適用することとしてもよい。
【００８２】
［変形例］
以下に、本実施形態に係る顕微鏡システム１００の変形例について図１２を参照して説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１００において、光刺激ユニット１２０は、図１１に示す構成要素に加えて、照明光を発する第３の光源１３１と、所定の波長域の光を透過させるＥｘフィルタ（励起フィルタ）１３２と、第２の光源１２１の光軸上に設けられたシャッタ１３３と、第３の光源１３１の光軸上に設けられたシャッタ１３４と、第２の光源１２１の光路と第３の光源１３１の光路とを合成するダイクロイックミラー１３５とを備えている。
【００８３】
シャッタ１３３，１３４は、図示しない駆動機構により開閉動作を行うようになっており、第２の光源１２１からの照明光と第３の光源１３１からの照明光とを切り替えて標本Ａに照射するようになっている。
【００８４】
本変形例に係る顕微鏡システム２００によれば、３つの光源を有しているため、同時に、刺激対象の位置を特定するための波長λ１の光と、刺激対象を刺激する波長λ２の光と、標本Ａの画像を取得するための波長λ３の光とを発することができる。これにより、位置や形状の変化が大きな標本Ａに対しても、刺激を与えた際の標本Ａを観察することができ、標本Ａの観察精度を向上することができる。
【００８５】
以上、本発明の各実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記の各実施形態および変形例に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。
【符号の説明】
【００８６】
Ａ  標本
１，２，３，４  顕微鏡
１０  照明光学系
１１  光源
１２  ステージ
１３  画像処理部（画像生成部）
１４  制御部
１５  偏向素子（偏向手段）
１７  ダイクロイックミラー
１８  対物レンズ
２０  観察光学系
２５  検出器（光検出器）
３０  第１の光学系
３１  第１の光源
３３，３４  ダイクロイックミラー
３７  第１の検出器（光検出器）
４０  第２の光学系
４１  第２の光源
４３  偏向素子（偏向手段）
４７  第２の検出器（光検出器）
５１  第３の光源
６２，７２  ガルバノミラー
８３  ＤＭＤ
１００，２００  顕微鏡システム
１０１  コントロールユニット
１０２  モニタ
１０３  入力部
１０５  記録部
１０７  顕微鏡本体ユニット
１１０  観察ユニット
１２０  光刺激ユニット
【図１】
0005555061.tif 000002
【図２】
0005555061.tif 000003
【図３】
0005555061.tif 000004
【図４】
0005555061.tif 000005
【図５】
0005555061.tif 000006
【図６】
0005555061.tif 000007
【図７】
0005555061.tif 000008
【図８】
0005555061.tif 000009
【図９】
0005555061.tif 000010
【図１０】
0005555061.tif 000011
【図１１】
0005555061.tif 000012
【図１２】
0005555061.tif 000013