(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の方法工程を含む、パンクレアチン試験体からウイルス負荷を分離するための方法であって、
ａ）パンクレアチン試験体のウイルス負荷を変えることなく、パンクレアチン試験体から、遠心分離に適した液体パンクレアチン試験試料を調製する方法工程、
ｂ）方法工程ａ）から得られるパンクレアチン試験試料のうち定義された少なくとも一部を、≧１２０Ｓの沈降定数を有するウイルスがなおペレットを形成しない条件下で少なくとも１回の低速遠心分離にかける方法工程、
ｃ）任意の固体堆積物を廃棄し、かつパンクレアチン試験試料の上清を保持する方法工程、
ｄ）方法工程ｃ）で得られたパンクレアチン試験試料の上清のうち定義された少なくとも一部を、不連続勾配媒体中で第一の超遠心分離にかけ、この際に第一の超遠心分離の持続時間を少なくとも９時間行い、及び第一の超遠心分離のための相対遠心力を、少なくとも５０，０００×ｇで、かつ、１５０，０００×ｇ未満とすることにより、前記ウイルス負荷がパンクレアチン試験試料の上清から、上方に位置している第一の目的画分へと、又は上にある最低濃度の勾配成分と、下にある次に濃度の高い勾配成分との間の境界層へと定量的に移動させて、第一の目的画分を定量的に分離する方法工程、
ｅ）工程ｄ）で得られた第一の目的画分を第二の超遠心分離にかけ、この際前記第二の超遠心分離は、第一の超遠心分離の相対遠心力よりも高い相対遠心力で、第一の超遠心分離で使用したのと同じ種類の勾配媒体上で行う方法工程であり、この際、前記勾配媒体は、第一の目的画分中で最低濃度の勾配成分の濃度よりも濃度が高い勾配媒体であり、及び
ｆ）第一の目的画分に相応する上部層の上部７５％（容量／容量）又はそれより多くの液体を廃棄し、上部層の下部２５％（容量／容量）又はそれ未満の液体に相応する下部画分と、任意のペレットを除く濃度が高い方の勾配媒体の完全層とを得ることによって、ウイルス負荷を含有する第二の目的画分を得る方法工程
を含む方法。
【請求項２】
工程ｃ）において、前記固体堆積物が、方法工程ｂ）で低速遠心分離の間に生じるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ｄ）において、前記第一の目的画分が、パンクレアチン試験試料の上清から得られるウイルス負荷を含有する、遠心分離後に存在する任意のペレットを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程ｆ）において、前記ペレットが、遠心分離後に存在するものである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
方法工程ｆ）の後、方法工程ｇ）で付加的に、ウイルス負荷を含有する第二の目的画分中でウイルス感染価を測定することによって、パンクレアチン試験体のウイルス負荷の定量的な測定を行う、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ウイルス負荷を定量的に測定にする前に、希釈された、又は希釈されていない第二の目的画分を、マイクロフィルターを通して濾過する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
方法工程ａ）でパンクレアチン試験体を、調査すべきウイルス種を培養するために使用される細胞系に適した細胞培養培地と、又は生理食塩水と、及び１つ又は１つより多い抗生物質と合して、パンクレアチン試験試料をパンクレアチン試験試料懸濁液として調製する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
工程ａ）〜ｆ）の少なくとも１つの工程を、０〜１５℃の温度に冷却しつつ行う、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
方法工程ｂ）における低速遠心分離を、それぞれの場合で１５，０００×ｇ未満の相対遠心力で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
方法工程ｂ）における低速遠心分離を、それぞれの場合で８，０００〜１５，０００×ｇの相対遠心力で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
方法工程ｂ）における低速遠心分離を、少なくとも５分の持続時間で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
方法工程ｅ）における第二の超遠心分離を、少なくとも２時間の持続時間で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
方法工程ｅ）における第二の超遠心分離で、相対遠心力が１５０，０００×ｇ超である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
方法工程ｄ）で導入される不連続勾配媒体が、２相の不連続スクロース勾配である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記不連続勾配媒体が、５０％（質量／容量）スクロース緩衝液と、２０％（質量／容量）スクロース緩衝液とを含有する勾配である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
方法工程ｅ）における、濃度が高い方の勾配媒体が、５０％（質量／容量）スクロース緩衝液の勾配媒体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記パンクレアチン試験体がブタパンクレアチン試験体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
パンクレアチン試験試料のウイルス負荷が、ウシロタウイルスＡ、脳心筋炎ウイルス、ブタサーコウイルス、ブタパルボウイルス、ブタロタウイルスＡ、ブタテシオウイルス、ブタＥ型肝炎ウイルス、及び／又はブタ水泡病ウイルスを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
開始材料として使用されるパンクレアチン試験体が、パンクレアチンを少なくとも５ｇ含む、請求項１から１８までのいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パンクレアチン試験体からウイルス負荷をほぼ定量的に分離するための方法、及び当該パンクレアチン試験体のウイルス負荷を定量的に高感度で測定するための方法に関する。
【０００２】
パンクレアチンとは、以前から公知の、哺乳類の膵腺から得られる様々な生理活性成分の混合物である。パンクレアチンの主成分は、消化酵素、とりわけパンクレアチンリパーゼであり、またアミラーゼ、及びプロテアーゼである。これらの有用な治療特性、及び使用時の安全性が高いお陰で、パンクレアチンは酵素置換療法における医薬組成物として、長い間非常に成功裏に使用されてきた。ここで最も重要となるのはパンクレアチンリパーゼだが、アミラーゼとプロテアーゼもまた、パンクレアチンの治療利点にかなり貢献する。治療目的のパンクレアチンは通常、ウシ（ウシパンクレアチン）又はブタ（ブタパンクレアチン）から得られ、量的な観点では、ブタパンクレアチンが最も重要である。治療目的のためのパンクレアチン製造方法はそれ自体公知であり、例えばＥＰ０１１５０２３Ａの公報から公知である。
【０００３】
動物由来というパンクレアチンの性質が原因で、開始材料は通常、不所望の生物的成分、例えばバクテリア若しくはウイルスによる汚染物質を伴うことがある。しかしながら、パンクレアチンを含有する医薬製品は１００年以上にわたり市販されてきたが、ウイルスに汚染されたパンクレアチンによって患者が感染したことは一例も報告されていない。にもかかわらず、生物の組織及び／又は体液由来の医薬製品を製造している会社は、あらゆる関連汚染物質がヒト病原体であるかないかに関わらず、すべての汚染物質を可能な限り低いレベルに減少させることによって、自社の製品の安全性レベルを向上させるよう、取締機関からの圧力をますます受けている。従って医薬製品中でのパンクレアチンの適用にとっては、そのような生物汚染物質を検知し、かつ定量化するための信頼性のある分析方法があることが望ましい。
【０００４】
近年まで、パンクレアチン試料内でウイルス汚染物質を定量的に検知、又は分離するための、信頼性のある方法は開発されていなかった。これは、パンクレアチンの酵素活性成分が、当業者に公知の技術を用いたウイルス増殖のために通常使用される細胞系と相容れないという事実が原因のようである。このことが、パンクレアチン試料中のウイルス力価測定をより困難に、又はさらには不可能にしている。
【０００５】
近年ようやく、パンクレアチン試料中でウイルス負荷を分離及び検知可能にする１つの方法が開発された。これについては、公報未公開の出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５４８８０を参照のこと。しかしながら、動物由来の組成物、例えばパンクレアチンのウイルス負荷は非常に低いので、医薬組成物、とりわけ医薬用パンクレアチン組成物中のウイルス負荷を分離及び測定するための高感度の方法を提供することに対して、継続的な需要がある。
【０００６】
従って本発明の対象は、パンクレアチン試験体からウイルス負荷をほぼ定量的に分離するための高感度な方法、及び当該パンクレアチン試験体のウイルス負荷を定量的に測定するための方法を提供することであった。とりわけ本発明の対象は、パンクレアチン試験体から感染性ウイルス負荷をほぼ定量的に分離するための方法、及び当該パンクレアチン試験体の感染性ウイルス負荷を定量的に測定するための方法を提供することであった。
【０００７】
意外なことに、パンクレアチン試験体のウイルス負荷、とりわけ感染性ウイルス負荷は、感染負荷をまずパンクレアチン試験体から多段階の遠心分離工程で分離し、そしてこの後、分離されたウイルス負荷をそれ自体公知のウイルス学的方法を用いて定量的に測定すれば、高感度でほぼ定量的に測定できることが判明した。
【０００８】
ＪＰ１２８５６９９０公報は既に、低速遠心分離と超遠心分離との非特異的な組み合わせにより、肝炎ウイルスを濃縮又は単離する方法を開示している。
【０００９】
第一の実施態様において本発明は、以下の方法工程を含む、パンクレアチン試験体からウイルス負荷を分離するための方法に関する：
ａ）パンクレアチン試験体のウイルス負荷を変えることなく、パンクレアチン試験体から、遠心分離に適した液体パンクレアチン試験試料を調製する方法工程、
ｂ）方法工程ａ）から得られるパンクレアチン試験試料のうち定義された少なくとも一部を、≧１２０Ｓの沈降定数を有するウイルスがなおペレットを形成しない条件下で少なくとも１回の低速遠心分離にかける方法工程、
ｃ）方法工程ｂ）で低速遠心分離の間に場合により生じる任意の固体堆積物を廃棄し、かつパンクレアチン試験試料の上清を保持する方法工程、
ｄ）方法工程ｃ）で得られたパンクレアチン試験試料の上清のうち定義された少なくとも一部を、不連続勾配媒体中で第一の超遠心分離にかけ、この際に第一の超遠心分離の持続時間、及び第一の超遠心分離のための相対遠心力は、前記ウイルス負荷がパンクレアチン試験試料の上清から、上方に位置している第一の目的画分へと、又は上にある最低濃度の勾配成分と、下にある次に濃度の高い勾配成分との間の境界層へと定量的に移動するように選択し、そして、パンクレアチン試験試料の上清から得られるウイルス負荷を含有する、遠心分離後に存在する任意のペレットを場合により含む、第一の目的画分を定量的に分離する方法工程、
ｅ）工程ｄ）で得られた第一の目的画分を第二の超遠心分離にかけ、この際前記第二の超遠心分離は、第一の超遠心分離の相対遠心力よりも高い相対遠心力で、第一の超遠心分離で使用したのと同じ種類の勾配媒体上で行う方法工程（この際、前記勾配媒体は、第一の目的画分中で最低濃度の勾配成分の濃度よりも濃度が高い勾配媒体である）、及び
ｆ）第一の目的画分に相応する上部層の上部７５％（容量／容量）又はそれより多くの液体を廃棄し、上部層の下部２５％（容量／容量）又はそれ未満の液体に相応する下部画分と、遠心分離後に場合により存在する任意のペレットを除く濃度が高い方の勾配媒体の完全層とを得ることによって、ウイルス負荷を含有する第二の目的画分を得る方法工程
を含む方法。
【００１０】
第二の実施態様において本発明は、パンクレアチン試験体のウイルス負荷、とりわけパンクレアチン試験体の感染性ウイルス負荷を定量的に測定するための方法に関する。例えば第二の実施態様においては、第一の実施態様に従った方法に加えて、方法工程ｆ）の後にさらなる方法工程ｇ）を行い、この方法工程は、ウイルス負荷を含有する目的画分中でのウイルス感染価測定によってパンクレアチン試験体のウイルス負荷の定量測定を行い、これにより試験試料中の感染性ウイルス負荷を測定することができるものである。
【００１１】
本願で特に限定されていなければ、以下で述べるあらゆる技術用語、及び科学用語はその都度、当業者により慣用的に理解されるものと同じ意味を有する。以下で言及する温度範囲、例えば「０〜１５℃」という形式は、この範囲の限界値をそれぞれ含む０℃から１５℃の温度範囲のことである。以下で言及する例えば「３０〜１２０分」という形式は、この範囲の限界値をそれぞれ含む３０分から１２０分の時間範囲のことである。以下で言及する例えば「２〜８時間」という形式は、この範囲の限界値をそれぞれ含む２時間から８時間の時間範囲のことである。以下で例えば「１，５００〜５，０００×ｇ」という形式で言及する相対遠心力とは、この範囲の限界値をそれぞれ含む１，５００×ｇから５，０００×ｇの範囲での相対遠心力である。以下で例えば「１０〜１５ｍｌ」という形式で言及する容量範囲とは、この範囲の限界値をそれぞれ含む１０ミリリットルから１５ミリリットルの範囲での容量範囲である。以下で例えば「８０〜１００ｍｍ」という形式で言及する長さ範囲の尺度は、この範囲の限界値をそれぞれ含む８０ミリメートルから１００ミリメートルの長さ範囲の尺度である。
【００１２】
本発明による方法は、動物由来のあらゆる種類のパンクレアチンに適したものであり、かつとりわけ、市販で慣用のブタパンクレアチン、及びウシパンクレアチンについて実施することができる。この方法は好ましくは、パンクレアチン試験体について行う。
【００１３】
ここで記載する方法は一般的に、パンクレアチン試験体からウイルス負荷を分離するため、及びパンクレアチン試験体のウイルス負荷を引き続き定量的に測定するために適している。とりわけ本方法は、パンクレアチン試験体のウイルス負荷を分離、及び定量的に測定するために適しており、この際前記ウイルス負荷は、ウシロタウイルスＡ、脳心筋炎ウイルス（＝ＥＮＣＶ）、ブタサーコウイルス（＝ＰＣＶ）、ブタパルボウイルス（＝ＰＰＶ）、ブタロタウイルスＡ、ブタテシオウイルス、及び／又はブタ水泡病ウイルス（＝ＳＶＤＶ）を含む。特性が似ているお陰で、ヒトコクサッキーウイルスＢ５／１を、本発明に従った、ＳＶＤＶを分離及び／又は定量的に測定するための方法の適切さを証明するためのモデルとして使用することができる。特性が似ているお陰で、ウシロタウイルスＡ（例えばＢ２２３の株）を、本発明に従った、ブタロタウイルスＡを分離及び／又は定量的に測定するための方法の適切さを証明するためのモデルとして使用することができる。ここで記載する方法はまた、前述のようにウイルス負荷を分離し、そして引き続き公知の技術を用いたさらなる分析を用いること、例えばポリメラーゼ連鎖反応（＝「ＰＣＲ」）などによって、パンクレアチン試験体内でＥ型肝炎（＝ＨＥＶ）を有するウイルス負荷を測定するために適している。
【００１４】
本願で記載する方法の方法工程ａ）において、ウイルス負荷、とりわけ感染性ウイルス負荷をその間に変える、又は変性させることなく、遠心分離に適した液体パンクレアチン試験試料をパンクレアチン試験体から調製する。これは例えば、パンクレアチン試験体からパンクレアチン試験試料懸濁液を調製することにより進めることができる。例えば、パンクレアチン試験試料懸濁液は、パンクレアチン試験体を、調査すべきウイルス種を培養するために使用される細胞系に適した細胞培養培地、及びこの目的に適した１つ又は１つより多い抗生物質と合することによって調製する。他の実施態様では、パンクレアチン試験体を生理食塩水、とりわけリン酸緩衝生理食塩水（＝「ＰＢＳ」、ｐＨ７．２）と合することによって、パンクレアチン試験試料懸濁液を調製する。一般的にすべての抗生物質が、方法工程ａ）で場合により使用される抗生物質溶液を調製するために適している。概して、幅広い範囲の抗生物質、又はこのような幅広い範囲の抗生物質の混合物が使用される。適切な抗生物質は例えば、β−ラクタム抗生物質、例えばペニシリン、セファロスポリン（オキサセフェム及びカルバセファムを含む）、カルバペネム及びモノバクタム；ストレプトマイシン（硫酸ストレプトマイシンを含む）；ネオマイシン（ネオマイシンＡ、ネオマイシンＢ及びパロモマイシンを含む）；カナマイシン（カナマイシン、ゲンタマイシン、アミカシン及びトブラマイシンを含む）；スペクチノマイシン；テトラサイクリン（テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、ドキシサイクリン及びミノサイクリンを含む）；マクロライド抗生物質（エリスロマイシン、クラリスロマイシン、ロキシスロマイシン、アジスロマイシン、ジョサマイシン及びスピラマイシンを含む）；ジャイレース阻害剤（ナリジクス酸、シノキサシン、ピペミジン酸、ノルフロキサシン、ペフロキサシン、シプロフロキサシン、オフロキサシン及びフレロキサシンを含む）；葉酸アンタゴニスト（スルホンアミド抗生物質、ジアミノベンジルピリミジン及びその組み合わせを含む）；クロラムフェニコール；リコサミド；グリコペプチド抗生物質（バンコマイシン及びタイコプラニンを含む）；ホスホマイシン；ポリペプチド抗生物質（ポリミキシンＢ、コリスチン、バシトラシン及びチロチシンを含む）及びムピロシンを含む群から選択することができる。好ましい抗生物質は、硫酸ストレプトマイシンとペニシリン、及び硫酸ストレプトマイシンとペニシリンとの混合物、例えば抗生物質「カクテル」としての混合物である。それぞれの場合において１つ又は１つより多くの抗生物質を、例えば１つ又は１つより多くの抗生物質に適している溶媒の溶液中で、即ち抗生物質溶液として使用することができる。
【００１５】
パンクレアチン試験試料懸濁液は通常、０〜１５℃の温度、例えば４〜１０℃の温度に冷却しながら調製される。パンクレアチン試験試料懸濁液を調製するための成分は通常、氷冷しながら、かつ少なくとも３０分の持続時間で、例えば３０〜１２０分間、好ましくは４５〜９０分、とりわけ５０分又は６０分間撹拌する。パンクレアチン試験試料懸濁液を冷却する目的、及びすべてのさらなる工程で冷却する目的は、それぞれの場合において、パンクレアチン試験体の酵素活性成分によるウイルス負荷の不所望のあらゆる不活性化を避ける、又は少なくとも実質的に減少させることである。
【００１６】
パンクレアチン試験試料懸濁液を調製するための細胞培養培地の場合、それぞれの場合、方法工程ａ）でパンクレアチン試験試料懸濁液の調製の際に使用される細胞培養培地は、本発明による方法によってどのウイルス種を分離すべきか、及び／又は定量的に測定するべきかにより決まる。調査されるウイルス種が細胞変性効果（＝ＣＰＥ）を（できるなら）開始する許容性（ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ）細胞培養を、特定のウイルス種を培養及び検知するために使用する。ＣＰＥは、ウイルスに感染した細胞の変性であり、これは光顕微鏡により認識可能である。もしウイルス種が培養細胞内でＣＰＥ無しで増殖したとしても、このような増殖は一般的に、それ自体公知の間接的な検知法により認識することができる。
【００１７】
例えばウシロタウイルスＡを分離、及び／又は定量測定すべき場合、例えばサル胎児腎臓細胞（＝ＭＡ−１０４細胞）を、これらの培養に使用することができる。この場合、例えばそれ自体公知のダブレッコ改質イーグル培地（＝ダブレッコ培地）が、細胞培養培地として適している。ＥＭＣＶを分離、及び／又は定量測定すべき場合、ブタ腎臓細胞（ＰＫ−１５細胞）、又は胚性のブタ腎臓細胞（＝ＳＰＥＶ細胞）を、これらの培養のために使用することができる。ＰＫ−１５細胞の場合、それ自体公知の最小必須培地（＝ＭＥＭ）が、例えば細胞培養培地として適している。ＳＰＥＶ細胞の場合、例えばダブレッコ培地が、細胞培養培地として適している。例えば、ＰＣＶを分離、及び／又は定量測定すべき場合、例えばＰＫ−１５細胞をこれらの培養のために使用することができる。例えばＰＰＶを分離、及び／又は定量測定すべき場合、例えばブタ腎臓細胞（ＳＫ−６細胞）を、これらの培養のために使用することができる。この場合、例えばダルベッコ培地が、細胞培養媒体として適している。例えばブタロタウイルスＡを分離、及び／又は定量測定すべき場合、例えばＭＡ−１０４細胞をこれらの培養のために使用することができる。例えばブタテシオウイルスを分離、及び／又は定量測定すべき場合、例えばＰＫ−１５細胞を、それらの培養のために使用することができる。ＳＶＤＶを分離、及び／又は定量測定すべき場合、例えばＳＰＥＶを、これらの培養のために使用することができる。当業者は、特定のウイルス種を培養するための適切な細胞系、及び相応する適切な細胞培養培地については充分認識している。本発明に従って使用可能なウイルス種及び相応する細胞系は、適切な情報源、例えば「Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ」，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＵＳＡ（＝ＡＴＣＣ）、「Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ」，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，ドイツ国（＝ＤＳＭＺ）、「Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ−Ｌｏｅｆｆｌｅｒ−ｌｎｓｔｉｔｕｔ」，Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｉｎｓｅｌ  Ｒｉｅｍｓ，ドイツ国（＝ＦＬＩ）、又は「Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｒｕｒａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」の「Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ」，Ｂｅｌｆａｓｔ，英国（＝ＤＡＲＤ）から得られる。
【００１８】
方法工程ｂ）において、方法工程ａ）で得られるパンクレアチン試験試料を全量で、又はパンクレアチン試験試料のうちの定義された一部、とりわけパンクレアチン試験試料のうち定義された容量を、使用することができる。方法工程ａ）で得られるこのパンクレアチン試験試料は、好ましくは全量で使用する。
【００１９】
方法工程ｂ）において低速遠心分離の場合、≧１２０Ｓ、とりわけ≧１２０Ｓから５，０００Ｓの沈降定数を有するウイルスが、なおペレットを形成しない条件を確立する。≧１２０Ｓの沈降定数を有する通常のウイルス、とりわけ≧１２０Ｓから５，０００Ｓの沈降定数を有するウイルスは、それぞれの場合で１５，０００×ｇ未満の相対遠心力、好ましくはそれぞれの場合で８，０００〜１５，０００×ｇ、とりわけ好ましくはそれぞれの場合で１０，０００〜１３，５００×ｇの相対遠心力、例えばそれぞれの場合で１０，８００×ｇの相対遠心力で低速遠心分離を実施しても、なおペレットを形成しない。低速遠心分離工程の持続時間は通常、少なくとも５分間、通常５〜６０分、とりわけ１０〜４５分、好ましくは１０〜３０分、例えば１５分である。方法工程ｂ）の好ましい実施態様では、低速遠心分離を、０〜１５℃の温度、例えば４〜１０℃の温度に冷却しながら、好ましくは冷却遠心機内で行う。
【００２０】
方法工程ｂ）における低速遠心分離工程の目的は、パンクレアチン懸濁液からこれらのパンクレアチン成分、例えば不溶性粒子など（これらは、さらなる加工に適した試験試料上清を得るための、パンクレアチン試験体のウイルス負荷の分離及び／又は定量測定の際に壊れやすい）をまず取り除くことである。低速遠心分離工程で場合により得られる固体堆積物は、一般的に方法工程ｃ）で廃棄され、一方その上清は次の方法工程ｄ）のために使用される。場合により得られる固体堆積物の引き続いた廃棄を伴う低速遠心分離工程は通常、固体堆積物の形成が見られなくなるまで繰り返される。通常は１〜３回、とりわけただ１回繰り返した後、場合により得られる固体堆積物の引き続いた廃棄を伴う低速遠心分離工程のさらなる繰り返しが必要でなくなる。本発明の１つの実施態様では、方法工程ｂ）で得られる固体堆積物は、沈降物でも、ペレットでもよい。
【００２１】
本発明の１つの実施態様では、低速遠心分離工程で得られる堆積物は、廃棄前に１回又はそれ以上、例えば１〜３回、適切な洗浄液で洗浄する。適切な洗浄液は例えば、低速遠心分離後に得られるパンクレアチン試験試料上清自体であり、これはこの後、方法工程ｄ）で使用することができる。パンクレアチン試験試料上清自体以外の洗浄液を使用する場合、まず堆積物の洗浄が終わってから、前記洗浄液をパンクレアチン試験試料上清と合して、その後に方法工程ｄ）で使用する。パンクレアチン試験体がＥＭＣＶを含む場合、とりわけ有利には、方法工程ｄ）で使用する前に、前述のやり方で堆積物を洗浄する。
【００２２】
特定の実施態様において本発明はまた、パンクレアチン試験試料上清を含み、これは先に述べたように方法工程ａ）〜ｃ）に従って調製することができる。
【００２３】
２相の不連続スクロース勾配は通常、方法工程ｄ）における不連続勾配媒体として使用される。不連続勾配媒体は好ましくは、５０％（質量／容量）スクロース緩衝液と、２０％（質量／容量）スクロース緩衝液とから調製される勾配を含む。中性緩衝液（すなわち約７のｐＨ値に緩衝するもの）は例えば、スクロース溶液のための緩衝液として使用することができる。好ましくは、ＰＢＳ緩衝液を使用する。通常は、滅菌された勾配媒体が使用される。上記の種類の２相の不連続スクロース勾配は、見つかる可能性のあるウイルスの適切な沈降、ひいては分離条件をもたらす。不連続スクロース勾配、とりわけ上記のように５０％（質量／容量）スクロース緩衝液と、場合により２０％（質量／容量）スクロース緩衝液とから調製された勾配は、場合により存在する任意のウイルス負荷を不活性化しないための、さらに適切な浸透圧条件を示す。方法工程ｄ）による超遠心分離によって例えば、パンクレアチン試験体に由来するウイルス負荷が、パンクレアチン試験試料上清から、不連続勾配媒体へとほぼ定量的に移動することが保証される。ここで「ほぼ定量的」とは、事前に試験試料に添加されていたウイルス負荷が完全に回復して、添加されたウイルス負荷における力価と、超遠心分離が行われた後に回復された力価との違いが、ウイルス力価の常用対数の２分の１ステップ（ｓｔｅｐ）であることを言う（＝０．５ｌｏｇステップ）。方法工程ｄ）による第一の超遠心分離はさらに、ウイルス負荷が第一の目的画分（この画分はパンクレアチン試験試料から充分に離れているので、パンクレアチン試験試料から前記画分を機械的に分離することが可能であり、分離を阻害する相のあらゆる再混合は起こり得ない）に移動することを保証する。
【００２４】
方法工程ｄ）は通常、最も濃度が高い勾配媒体の容量を、超遠心管に導入することによって行い、この管を介して次に低い濃度の勾配媒体の容量を積層させる。この工程を、最終的な（表）層を有する多相勾配媒体が得られるまで所望の回数繰り返し、当該層は遠心分離に適した、ウイルス負荷を分離すべき液体パンクレアチン試験試料の容量である。２相の勾配媒体の場合、次に低い濃度の勾配媒体容量が、この後直ちに液体パンクレアチン試験試料の容量により、又は遠心分離に適したパンクレアチン試験試料懸濁液（パンクレアチン試験試料容量）により覆われる。２相勾配媒体の場合、これにより得られる遠心管における層の連続は上から順に、パンクレアチン試験試料容量を含有する第一層（表層）、その次に最も低い濃度の勾配媒体の容量（中層；例えば２０％（質量／容量）スクロース緩衝液）、そして最後に最も濃度が高い勾配媒体の容量（底層、超遠心管の底を覆うもの；例えば５０％（質量／容量）スクロース緩衝液）である。個々の容量を覆う時には、それぞれの境界において乱流又は混合が起こらないように注意しなければならない。
【００２５】
方法工程ｄ）における第一の目的画分は通常、（ｉ）パンクレアチン試験試料容量から充分に離れていて、かつ遠い、濃度が最も低い勾配媒体の一部、及び（ｉｉ）次に高い濃度の勾配媒体の完全容量を含む。２相の勾配媒体の場合、目的画分は例えば、パンクレアチン試験試料容量から充分に離れていて、かつ遠い最も低い濃度の勾配媒体の一部と、場合により前記管の底部にあるペレットとともに、超遠心分離管の底部に向かって下方に広がる、最も濃度が高い勾配媒体の完全容量とを含む。
【００２６】
パンクレアチン試験試料容量から充分に遠い第一又は第二の目的画分の位置を計算する場合（これにより引き続いた分離が可能になる）、粒子の位置に対する計算値（すなわちパンクレアチン試料から分離されたウイルス粒子の位置）は通常、ガウス分布の頂点であることに留意すべきである。粒子はそれ自体、計算された自身の位置の上にも下にも分布する。従って、パンクレアチン試験試料容量からの目的画分の所望の距離を測定する場合、粒子位置のガウス分布を考慮するための付加的な余白を含むことが必要である。≧１２０Ｓ、とりわけ≧１２０Ｓ〜５，０００Ｓの粒子の沈降定数を有する粒子が、パンクレアチン試験試料容量から少なくとも１０ｍｍ、例えば少なくとも１５ｍｍ、少なくとも２０ｍｍ、少なくとも２５ｍｍ、又は少なくとも３０ｍｍ、超遠心分離が原因で濃度が最も低い勾配媒体の中に移行していれば、ウイルス負荷は通常、引き続いた分離のためにパンクレアチン試験試料容量から充分に距離を置いた目的画分に移動する。前述の２相の勾配媒体の場合、濃度が最も低い勾配媒体は、２０％（質量／容量）スクロース緩衝液である。超遠心分離工程の１つのバリエーションでは、≧１２０Ｓの、とりわけ≧１２０Ｓ〜５，０００Ｓの沈降定数を有するほぼすべての粒子が、濃度が最も低い勾配媒体を完全に通過し、そして境界層のところで次に濃度の高い勾配媒体へと濃縮される（つまり、「スクロースクッション」）。当業者は、超遠心分離のための相応する条件を計算及び実施するための適切な方法を、よく知っている。適切な超遠心分離条件は、パンクレアチン試料から分離されるべきウイルスの特性（例えば、密度、及び沈降定数）に基づいて決定することができ、ここで適用可能な仮定は、それ自体公知の単純化である（例えば、Ｌｅｂｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ、「Ｍｏｄｅｒｎ  ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｕｌｔｒａｃｅｎｔｉｆｕｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｃｉｅｎｃｅ：Ａ  ｔｕｔｏｒｉａｌ  ｒｅｖｉｅｗ」；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１（２００２年）２０６７〜２０７９参照）。
【００２７】
第一の超遠心分離を慣用の容量比を用いて、かつ不連続勾配媒体中、好ましくは２相の不連続スクロース勾配中で行うとすると、第一の超遠心分離を少なくとも１時間、通常は少なくとも４時間、例えば少なくとも９時間、例えば９〜２０時間の間、とりわけ１２〜１８時間の持続時間で行えば、ウイルス負荷は通常、第二の超遠心分離による引き続いた分離に適した第一の目的画分に移動する。ここで記載する第一の超遠心分離に適切な相対遠心力とは、少なくとも５０，０００×ｇ、及び／又は１５０，０００×ｇ未満である。第一の超遠心分離工程の１つの実施態様において前記工程は、１２〜１８時間の持続時間、相対遠心力５０，００〜１５０，０００×ｇ、超遠心分離を行うために慣用の容量比で、及び５０％（質量／容量）スクロース緩衝液と、２０％（質量／容量）スクロース緩衝液とから調製された勾配中で行う。第一の超遠心分離工程の他の実施態様では、前記工程を１５〜１７時間の持続時間、相対遠心力７０，００〜１２０，０００×ｇ、超遠心分離を行うために慣用の容量比で、及び５０％（質量／容量）スクロース緩衝液と、２０％（質量／容量）スクロース緩衝液とから調製された勾配中で行う。超遠心分離を行うために慣用の容量比は例えば、慣用の超遠心管を用いれば得られる。ここで慣用の超遠心管とは例えば、容量が１０〜５０ｍｌのもの、とりわけ２５〜５０ｍｌのものと理解される。方法工程ｄ）において慣用の超遠心管を用いる場合、最も濃度が高い勾配媒体（例えば５０％（質量／容量）スクロース緩衝液）は、総計で例えば２ｍｌであってよく、次に低い濃度の勾配媒体の容量（例えば２０％（質量／容量）スクロース緩衝液）は、総計で例えば１４ｍｌであってよく、そしてパンクレアチン試験試料容量は、総計で例えば１７ｍｌであってよい。
【００２８】
工程ｅ）において、工程ｄ）で得られる第一の目的画分を用い、そして前記第一の目的画分を勾配媒体クッション上に移して、第二の超遠心分離を行う。前記勾配媒体クッションは例えば、第一の超遠心分離で使用したのと同じ種類の勾配媒体から成り、この際前記勾配媒体は、第一の目的画分の最も低い濃度の勾配成分よりも、濃度が高い勾配媒体である。例えば第一の超遠心分離が、２０％（質量／容量）スクロース緩衝液と、５０％（質量／容量）スクロース緩衝液とから成る上記システムを用いた不連続勾配遠心分離である場合、生成する第一の目的画分は、２０％（質量／容量）スクロース緩衝液と、５０％（質量／容量）スクロース緩衝液とを含有するシステムである。この場合、スクロースクッションは、５０％（質量／容量）スクロース緩衝液であってよい。工程ｄ）で使用される第一の目的画分は通常、第一の遠心分離後に場合により存在する任意のペレットも含む。
【００２９】
第二の超遠心分離は、少なくとも１時間の持続時間、通常少なくとも２時間、例えば２〜８時間の持続時間、とりわけ３〜６時間の持続時間で行う。ここで記載する第二の超遠心分離に適切な相対遠心力は、少なくとも１００，０００×ｇ、例えば１５０，０００×ｇ超、例えば１５０，０００〜３５０，０００×ｇである。第二の超遠心分離工程の１つの実施態様では、前記工程を３〜６時間の持続時間、２００，０００〜３５０，０００×ｇの相対遠心力で、超遠心分離を行うのに慣用の容量比で実施する。第二の超遠心分離工程の他の実施態様では、前記工程を４．５〜５．５時間の持続時間、相対遠心力２５０，０００〜３００，０００×ｇで、超遠心分離を行うのに慣用の容量比で実施する。超遠心分離を行うのに慣用の容量比は例えば、慣用の超遠心管を使用すれば得られる。ここで慣用の超遠心管とは例えば、容量が１０〜１５ｍｌのもの、とりわけ１２〜１３ｍｌのもの；内径が６〜８ｍｍ、とりわけ７ｍｍのもの；そして高さが８０〜１００ｍｍのもの、とりわけ８５〜９５ｍｍのものと理解される。方法工程ｄ）で慣用の超遠心管を用いるとすると、勾配クッションの容量（例えば５０％（質量／容量）スクロース緩衝液）は、例えば総計０．５ｍｌであってよく、そして第一の目的画分容量は、例えば１０ｍｌであってよい。
【００３０】
本発明により、開始材料として使用されるパンクレアチン試験体１ｇあたりの感染単位１つの検出限界値まで検出することができる。
【００３１】
方法工程ｄ）及びｅ）の実施態様の好ましい変法では、その他の選択条件にかかわらず、超遠心分離を０〜１５℃の温度、好ましくは４〜１０℃の温度に冷却しつつ行う。
【００３２】
この方法工程で使用可能な慣用の冷却遠心機は、当業者に公知である。市販で慣用の超遠心機、例えばスイング型バケットロータを備える冷却可能な超遠心機、例えば「ＴＨ−６４１」スイング型バケットロータを備えるＳｏｒｖａｌｌ（登録商標）の遠心機が、方法工程ｄ）及びｅ）で通常使用される。
【００３３】
本発明による低速遠心分離工程及び超遠心分離工程の上記記載は、当業者に所望のあらゆる程度で、とりわけ本発明の明細書で言及されているさらなる技術情報を用いて拡大又は縮小してよい。
【００３４】
方法工程ｄ）及びｆ）において、ウイルス負荷を含有する第一又は第二の目的画分は、それぞれの場合において、パンクレアチン試験試料上清から、及び第一の目的画分から定量的に分離されている。分離は通常、超遠心管上に、事前に決められた目的画分の境界高度に目印をつけることによって進行する。この後、前記境界を越える全容量は、例えば吸引によって残りの容量から分離する。吸引は例えば、慣用の蠕動ポンプ（当該ポンプのチューブと毛細管が、事前によく滅菌されているもの）を用いて進行させてよい。適切なポンプ比は例えば、２ｍｌ／分の比である。吸引の間、蠕動ポンプ毛細管が常に液体の上部境界に位置していることが保証されるよう、注意するべきである。超遠心管内に残っている目的画分は、この後に超遠心管から、慣用のシングルチャンネルピペットを用いるそれ自体公知の方法で、好ましくは滅菌チップにより除去することができる。超遠心管内に未だ残っている可能性のある任意の沈降物は、例えば繰り返しの吸い上げ、及びシングルチャンネルピペットを用いた再懸濁によって、同時に取り除いてよい。
【００３５】
１つの実施態様において本発明はまた、方法工程ａ）〜ｆ）に従って製造することができる、単離された第二の目的画分を提供する。
【００３６】
パンクレアチン試験体のウイルス負荷を定量的に測定するための方法を実施したい場合、方法工程ｆ）の後に方法工程ｇ）を行う。方法工程ｇ）では、パンクレアチン試験体のウイルス負荷を、ウイルス負荷を含有する目的画分中のウイルス感染価の測定によって定量的に測定する。ここで、目的画分中のウイルス感染価の定量的な測定は、ウイルス学でそれ自体公知の作業工程に従って、例えばそれ自体公知の感染価測定の原則（＝ＶＩＴＤ）に従って進めることができる。
【００３７】
第二の目的画分は例えば、適切な細胞培養培地又は生理食塩水、例えばＰＢＳを用いて、適切な比で希釈することができ、これによりウイルス測定試験試料が得られる。適切な細胞培養培地は、それぞれの場合において、調査されるウイルス種の機能として先に使用可能と挙げたものである。ウイルス感染に対する擬似陽性反応を排除するための本発明の１つの態様において、希釈された、又は希釈されていない目的画分は、ウイルス測定の定量測定を方法工程ｇ）で実施する前に、マイクロフィルターを通して濾過することができる。
【００３８】
適切な希釈は例えば、目的画分を細胞培養培地又は生理食塩水を用いて、方法工程ｄ）で使用されたパンクレアチン試験試料上清のもともとの容量まで希釈することによって得られる。この後、第一工程で、ウイルス測定試験試料の希釈群を、まずそれ自体公知の方法、例えば１：２、１：５若しくは１：１０、又はこれらの希釈工程の組合せで調製することができ、これにより定量的なＶＩＴＤを実施することができる。この後、第二工程で、適切な細胞懸濁液をそれ自体公知の方法で、希釈群から異なる濃度のウイルス測定試験試料を用いて接種することができ、その結果、濃度が異なるウイルス測定試験試料上に、細胞層を形成することができる。不活性の細菌又はマイコプラズマのような微生物の存在によって引き起こされることがある、ウイルス感染に対する擬似陽性反応を排除するために、検知体である細胞への接種前に、通常はウイルス測定試験試料を濾過することが好都合である。この目的のため、ウイルス測定試験試料、又は希釈されたウイルス測定試験試料は、適切な孔径のフィルター、例えばマイクロフィルター、例えば０．１〜１０μｍ（限界値を含む；＝マイクロ濾過）の、好ましくは０．１〜０．４５μｍの孔径（すなわち孔の直径）のマイクロフィルター、通常は孔径（すなわち孔の直径）０．１μｍのマイクロフィルターを通して、濾過することができる。この後この濾液は、さらなる調査のための試験試料として使用することができる。そして第三工程では、感染が示される方法に基づいて、接種された試験試料から感染度を読取る。例えばＣＰＥを細胞層の感染指標として使用することができ、このＣＰＥを、それ自体公知の方法で約４〜７日間後に読む。ここでウイルス測定試験試料の滴下（最終点希釈）により、もともと存在していた感染量の定量測定が可能になる。滴定は通常１０の倍数での希釈、すなわち常用対数に基づいて行う。実際に通常計算するのは、５０％の感染量（＝ＩＤ50）である。並行的な多数のバッチの場合、同定されたＩＤ50値は、この後ウイルス測定試験試料の最高（逆数）希釈のＩＤ50値に相応し、この値でＣＰＥがバッチのちょうど半分で検知可能となる。これらの結果は、選択的、付加的に、コンピューター計算により修正するか、又はそれ自体公知の方法で内挿してもよい。ここで最も一般的に用いられるウイルス価計算方法は、Ｓｐｅａｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｋａｅｒｂｅｒ（Ｃ．Ｓｐｅａｒｍａｎ、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｓｙｃｈｏｌ．２（１９０８年）２２７〜２４２、及びＧ．Ｋａｅｒｂｅｒ，Ａｒｃｈ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈ．Ｐｈａｒｍａｋ．１６２（１９３１年）４８０〜４８３；そしてＢｕｎｄｅｓａｎｚｅｉｇｅｒ［Ｆｅｄｅｒａｌ  ｇａｚｅｔｔｅ］ｎｏ．８４、１９９４年５月４日を参照）に従った、或いはＲｅｅｄ  ａｎｄ  Ｍｕｅｎｃｈ（Ｒｅｅｄ，Ｌ．Ｊ．，Ｍｕｅｎｃｈ．Ｈ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｖｇ．２７（１９３８年）４９３〜４９７）に従った計算法である。
【００３９】
細胞層の感染の他の指標、例えばウイルス抗原導入、又はプラーク導入を使用することもできる。これらの方法、及び本願の場合におけるこれらの適用については、例えば「Ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｅ」、Ｈ．Ｗ．Ｄｏｅｒｒ  ａｎｄ  Ｗ．Ｈ  Ｇｅｒｌｉｃｈ，Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、初版、２００２年、のようなウイルス学の教科書、又はそれぞれの場合でこの最新版から、当業者によく知られている。
【００４０】
本発明による方法はとりわけ、開始材料としてより大量のパンクレアチン試験体を分析するために有用である。より大量の開始材料の使用によって通常は、ウイルス負荷をより高い感度で測定する、すなわち１ｇあたりの感染単位がこれまでより低くても測定することができる。従って、本発明による方法はとりわけ、少なくとも５ｇ、例えば８ｇ、１０ｇ、又は１２ｇの開始材料に対して有用である。
【００４１】
実施例
以下の実施例で述べるすべての作業は、滅菌した作業台上で滅菌条件下で行った。ウイルス学研究室で慣用の手順、例えば安全上の手順を守らなければならない。とりわけ、以下の材料を使用した：
１．抗生物質溶液：ストレプトマイシン硫酸塩１．０ｇ、及びペニシリン１．２ｇを、二度蒸留した水２０ｍｌに溶解させ、そして０．２μｍのフィルターを通して濾過する。この後、濾液を１ｍｌのアリコートに分け、そして場合により使用まで−２０℃で貯蔵する；
２．ダルベッコ培地：ＳＫ６細胞、ＳＰＥＶ細胞、及びＭＡ１０４細胞のための細胞培養培地；
３．滅菌チップを有するシングルチャンネルピペット；
４．ＦＣＳ、ウシ胎児血清（例えばＢｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社のもの；＝血清）
５．組織培養フラスコ、滅菌済み、フラスコ底部面積はそれぞれ、２５、７５、又は１７５ｃｍ2；
６．ＭＥＭ、ナトリウムジカルボン酸塩１．５ｇ／ｍｏｌ、及びピルビン酸塩１ｍＭを有するＰＫ１５細胞用の細胞培養培地；
７．ウェルが９６個の、蓋付き滅菌済みマイクロタイタープレート；
８．ＰＡＮ懸濁液、１０％のパンクレアチン懸濁液；ブタパンクレアチン８．０ｇ（特に言及しない場合）を滅菌条件下でビーカーに秤量し、抗生物質溶液８ｍｌ、及び（特に言及しない場合）特定の相応する細胞培養培地又はＰＢＳ６４．０ｍｌと一緒にし、そして（特に言及しない場合）撹拌しながら氷浴で６０分以内に懸濁させる；
９．パーディー（Ｐａｒｄｅｅ）緩衝液、パーディー二酸化炭素緩衝液；
１０．ＰＢＳ、滅菌した「リン酸塩緩衝生理食塩水」溶液（ｐＨ７．２）；
１１．ピペット、滅菌済み
１２．ピペットチップ、滅菌トレー中で滅菌済み；
１３．プラスチック製ポーチ（ｐｌａｓｔｉｃｓ  ｐｏｕｃｈ）、ジッパー付きでＣＯ2不透過性のもの（「Ａｎａｅｒｏｃｕｌｔ（登録商標）」Ｍｅｒｃｋ社製）：
１４．多クローン性の、抗ＰＰＶ抗体、蛍光イソチオシアネート（＝ＦＩＴＣ）共役体、Ｎａｔｕ  Ｔｅｃ  ＧｍｂＨ社製）；
１５．試験管、滅菌済み、１５ｍｌと５０ｍｌのもの；
１６．２０％のスクロース溶液、ＰＢＳで緩衝、滅菌済み；濃度はそれ自体公知の方法で慣用の屈折計を用いた方法で調整；
１７．５０％のスクロース溶液、ＰＢＳで緩衝、滅菌済み；濃度はそれ自体公知の方法で慣用の屈折計を用いた方法で調整；
１８．スクリューキャップ試験管、滅菌済み；
１９．トリプシン溶液、「ＴｒｙｐＬ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）、」ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製；
２０．蠕動ポンプ、「ｉｓｍａ  Ｔｅｃ」社製、ポンプ比最大５．８ｍｌ／分；
２１．冷却超遠心機「Ｓｏｒｖａｌｌ（登録商標）Ｐｒｏ  ８０」、「ＴＨ−６４１」ローター付きのもの；
２２．超遠心管、滅菌済み、容量１１ｍｌ、寸法９×９０ｍｍ
２３．希釈ブロック、それぞれ１．０ｍｌのウェルを９６個有するもの；
２４．ＭＡ−１０４細胞：供給元はＦＬＩ；
２５．ＰＫ−１５細胞：供給元はＤＡＲＤ；
２６．ＳＫ−６細胞：供給元はＦＬＩ；
２７．ＳＰＥＶ細胞：供給元はＦＬＩ；
２８．細胞培養培地中に２００，０００細胞／ｍｌを有する、ＦＣＳ１０％の試験すべきＳＫ６、ＳＰＥＶ、及びＰＫ−１５細胞の細胞懸濁液、
２９．滅菌されたファルコン型マイクロチューブ、容量１５ｍｌ
【００４２】
実施例１：ウイルス細胞系へのパンクレアチンの有害作用の調査
細胞培養を用いた材料試験試料中のウイルスを検知するという目的のためには、調査すべきパンクレアチン試験試料の、細胞への有害作用が突き止められるべきであり、これによりＣＰＥ評価の際の擬似陰性結果を排除することができる。以下で述べるように、パンクレアチン試験試料懸濁液の有害作用をつきとめるための調査は、様々な細胞系について適切に実施する。
【００４３】
上記のように調製したＰＡＮ懸濁液の部分量０．５ｍｌを、有害作用を試験するために取り、これを「パンクレアチン懸濁液試験試料」と呼んだ。
【００４４】
低速遠心分離：残りのＰＡＮ懸濁液を１５分間、１０，０００回転／分（１０，８００×ｇ）で、かつ４℃で慣用の冷却遠心機（Ｂｉｏｆｕｇｅ（登録商標）２２Ｒ  Ｈｅｒａｅｕｓ  ＳＥＰＡＴＥＣＨ（登録商標）、固定角度ロータ付き、ｎｏ．３７４５）で遠心分離した。この後、低速遠心分離後の上清を、さらに１５分間、１０，０００回転／分で、かつ４℃で遠心分離し、ウイルス価及び超遠心分離のために用いるこの上清は、「低速遠心分離後の上清」と呼んだ。低速遠心分離後にそれぞれの場合で得られる２つの沈降物を合し（合わせて１ｍｌ）、個々に適切な細胞培養培地９ｍｌ中に再懸濁させ、これを「沈降物」又はペレットと呼んだ。
【００４５】
第一の超遠心分離：試験試料「低速遠心分離後の上清」を、超遠心機内で第一の遠心分離にかけた。このために、５０％（質量／容量）のスクロース溶液２ｍｌを、ピペットを用いて試験を行うために必要な数の超遠心管に導入した。超遠心管は斜角に保ったまま、２０％のスクロース溶液１４ｍｌを注意深く、５０％のスクロース層の上に置き、２つの溶液の間の分離層が見分けられるようにした。上記のように取った「低速遠心分離後の上清」試験試料の層１７ｍｌをこの後、再び注意しながら、そして乱流と混合を避けながら、２０％（質量／容量）スクロース溶液の上に置いた。その後、超遠心管を、超遠心分離ロータ内につり下げた。このために、ロータの反対側にある２つの超遠心管を、それぞれの場合でＰＢＳを用いて平衡させ、相応する保持部に挿入し、そして連結している蓋でしっかりと封止した。保持部をロータ内に挿入した後、試験試料を１６時間の間１０℃で、かつ２２，０００回転／分（８７，０００×ｇ）で遠心分離した。超遠心分離後、超遠心管を滅菌したワークベンチ上の保持部から取り外し、そして５ｃｍの高さに印を付け、超遠心管の底部から測定した。チューブと毛細管を事前に滅菌した蠕動ポンプを用いて、毛細管を常に液体の上部境界に位置させながら、印より上の液体を２ｍｌ／分のポンプ比で超遠心管から吸引した。こうして得られた第一の画分は、「第一の超遠心分離後の上部画分」と呼んだ。超遠心管内に残っている「第一の遠心分離後の下部画分」（１．５ｍｌ）は、それぞれの場合で、シングルチャネルピペットを用いて超遠心管から取り除いた。超遠心管の底部に残っている可能性のある任意の沈降物は、シングルチャンネルピペットを用いて繰り返し吸い上げることにより再懸濁させ、そして同様に除去した。「第一の超遠心分離後の下部画分」は、すべての管についてまとめ、そして第二の超遠心機で直接使用した。さらに加工するまで、生成画分を４℃で貯蔵、又は延長貯蔵の場合には、−２０℃で貯蔵した。
【００４６】
第二の遠心分離を、１１ｍｌの管内で５時間、４℃でかつ２７２，０００×ｇで実施した。勾配媒体クッションである５０％（質量／容量）のスクロース溶液を、管に最初に導入した（０．５ｍｌ）。その後、第一の目的画分５ｍｌを勾配クッション上に積層させ、そして指示通りに超遠心分離を実施した。上部画分を廃棄した後、ペレットを除く各管の底部から１．５ｍｌの容量を取り除いた。
【００４７】
試験試料「パンクレアチン懸濁液試験試料」、「低速遠心分離後の上清」、「沈降物」（低速遠心分離後のもの）、「第一の超遠心分離後の上部画分」、及び「第一の超遠心分離後の下部画分」（５．０ｍｌにした後）、並びに「第二の超遠心分離後の上部画分」、及び「第二の超遠心分離後の下部画分」を、この後、様々な細胞系に関して有害作用について試験した。このため、試験すべき試験試料の希釈群を、それぞれの場合で調製した。試験すべき試験試料をすべて、個々の適切な細胞培養培地によって、１：５の希釈から２の倍数でさらに希釈した。マイクロタイタープレート中で、ＰＫ１５、ＳＰＥＶ、又はＳＫ６細胞を含有する、ウェル１つあたり８列の細胞懸濁液の部分量１００μｌに、それぞれの場合について新たに調製された細胞懸濁液１００μｌになるように調製された、試験試料希釈液１００μｌを加えた。ＭＡ１０４細胞を試験した時には、２４時間経過した細胞層を有するマイクロタイタープレートを使用した。このために、細胞培養培地を、それぞれの場合でウェルから取り除き、そして血清のない新しい細胞培養培地１００μｌで置き換え、最終的な試験試料希釈まで１：１０、１：２０、１：４０、１：８０、１：１６０等まで上げる。コントロールとして細胞培養培地１００μｌを、１００μｌの希釈群の代わりに各マイクロタイタープレートの８つのウェルに導入した。パーディー緩衝液４ｍｌと濾紙とを含む管と一緒に２枚のプレートを気密性ポーチに入れ、そして封止クリップでしっかりと封止した。この後プレートを、最大７日間、３６±１℃でインキュベーションした。インキュベーションの間、これらのプレートを毎日ＣＰＥの程度、すなわちパンクレアチンの有害作用の結果としての細胞溶解物、及び／又は細胞の分解、及び細胞層の形成欠如について顕微鏡を用いて調べた。最終的な評価は、７日後に行った。最終的な読取り時に、コントロールで細胞分解が既に起こっていた場合には、滴定を繰り返した。
【００４８】
様々な細胞系に関する有害作用に対する、異なる試験試料の試験結果により明らかになったのは、パンクレアチンから誘導された「第二の超遠心分離後の下部画分」には、様々な細胞系に対して有害作用が全くないということである。
【００４９】
この結果が示しているのは、「第一の超遠心分離後の下部画分」と「第二の超遠心分離後の下部画分」（それぞれ、本発明による第一の、又は第一及び第二の超遠心分離工程に供されたものであり、かつその中にウイルス負荷が濃縮されている）には、調査される細胞系に対する有害作用が、調査された他のすべての試験試料と比べてかなり減少しているということである。
【００５０】
実施例２：ウイルス負荷に関する、異なるパンクレアチンバッチ試験
上記の本発明による２工程の超遠心分離処理を適用して、パンクレアチン粉末の異なるバッチの懸濁液からウイルスを単離した。パンクレアチンからのウイルスの分離は、影響されやすい（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ）細胞系に対する滴定によって低いウイルス負荷を検知するための前提条件であった。
−薬理物質８ｇを、抗菌性溶液（滅菌したＰＢＳ  ２０ｍｌあたり、ストレプトマイシン硫酸塩１．０ｇとペニシリンＧ  １．２ｇ）８ｍｌ、及びＰＢＳ  ６４ｍｌと混合し、そして氷水浴中で６０分間撹拌した。
−得られる懸濁液を、４℃で１５分間、１０，８００×ｇで遠心分離した。
−第一の遠心分離後の上清を、４℃で１５分間、１０，８００×ｇで再度遠心分離した。
【００５１】
得られる低速遠心分離後の上清を、第一の超遠心分離のために使用した。第一の超遠心分離は、不連続スクロース勾配と共に行った（５０％（質量／容量）のスクロース２ｍｌ、及び２０％（質量／容量）のスクロース１４ｍｌを有する４つの遠心管を、低速遠心分離後の上清１７ｍｌで覆った）。この技術によって、パンクレアチン懸濁液の主要部から相応する条件でウイルス粒子を分離することが可能になる。ウイルス／パンクレアチン懸濁液混合物から得られるウイルスは、適切な遠心分離条件で５０％（質量／容量）のスクロースと２０％（質量／容量）のスクロースとの境界層に濃縮される。溶解性パンクレアチン成分は遠心分離後、ウイルス層の上にある上清に残る。スクロース勾配の分別吸引により、ウイルス画分をパンクレアチン層から分離する。５０％（質量／容量）のスクロースクッション上にウイルスをさらに濃縮させるため、得られたウイルス画分を再度超遠心分離にかけた。
【００５２】
第一の遠心分離は、３６ｍｌの管４本の中で１６時間にわたって４℃で、かつ８７，０００×ｇで行った。遠心分離後に、５ｍｌの容量を各管の底部から取り除いた。
【００５３】
引き続き第二の遠心分離を、１１ｍｌの管２本の中で５時間にわたって４℃で、かつ２７２，０００×ｇで行った。１．５ｍｌの容量を各管の底部から取り除いた。こうして８ｇのパンクレアチン粉末から、ウイルス濃縮物が３ｍｌ得られる。これらの試料を−２０℃で貯蔵した。
【００５４】
伝染力評価
伝染力評価は、影響されやすい細胞系を通じて、試料を連続して三世代継代させることによって試料の低ウイルス負荷が可視化できるという前提に基づいて行う。含有されるウイルスは新たな細胞を感染させることができ、そしてこれらの継代の間、増幅されて初スル力価の上昇につながる。大容量プレーティング技術と合わせると、第三継代後の細胞叢（ｃｅｌｌ  ｌａｗｎ）上に約１０００のプラークを形成する３世代の細胞継代の間に、１０という低増幅比（インキュベーション後６日以内に感染性ウイルス１つあたりウイルス１０個）を有するたった１つの感染性ウイルスでさえも検知することが可能になる。
【００５５】
そこで、感染力のあるブタパルボウイルスを検知するため、パンクレアチン試料から抽出されるウイルス画分を、ＳＫ６細胞について３世代にわたる連続的な継代に適用した。
【００５６】
１．第一継代（ウイルス画分１ｍｌ＝パンクレアチン２．６６ｇ）
５％のＦＣＳと、２４時間経過した準集約状態のＳＫ６細胞の細胞叢とを有する細胞培養培地３０ｍｌを含む７５ｃｍ2の組織培養フラスコに、個々のウイルスの各濃縮物の３分の１（３ｍｌのうち１ｍｌ）を接種した。細胞培養フラスコを、３７±１℃で６日間インキュベーションした。
【００５７】
細胞変性効果の形成（プラーク）を、インキュベーションの間、及びインキュベーション時間の終わりに、倒立型顕微鏡を用いて検査した。全組織培養フラスコ含分の凍結融解サイクル２回によるウイルス／細胞溶解物の生成で、継代を終える。ウイルス／細胞溶解物に低速遠心分離（２，８００×ｇで１５分間）を適用し、細胞のない上清を得る。低速遠心分離後のこの上清（１ロットあたり３０ｍｌ）は、マイコプラズマによる溶解物という汚染可能性を減少させるための安全工程として、孔径０．１μｍのフィルターを通して濾過した。
【００５８】
２．第二継代
５％のＦＣＳと、２４時間経過した準集約状態のＳＫ６細胞の細胞叢とを有する細胞培養培地を２２．５ｍｌ含む、７５ｃｍ2の組織培養フラスコを、各ロットの第二継代のために調製した。第一継代からの細胞培養上清７．５ｍｌ（＝２５％）を添加した。フラスコは６日間、３７℃±１℃でインキュベーションし、そして倒立型顕微鏡を用いて細胞変性効果を検査した。
【００５９】
ウイルス／細胞培養溶解物（ロット１つあたり３０ｍｌ）は、第一継代で記載したように得た。
【００６０】
３．第三継代
上記のように各ロットに対して、７５ｃｍ2の組織培養フラスコを調製した。第二継代からのウイルス／細胞培養溶解物７．５ｍｌ（＝２５％）、及び５％のＦＣＳを有する細胞培養培地２２．５ｍｌを、フラスコごとに添加した。フラスコは６日間、３７℃±１℃でインキュベーションし、そして倒立型顕微鏡を用いて、細胞変性効果について調べた。
【００６１】
ウイルス／細胞培養溶解物（ロット１つあたり３０ｍｌ）は、第一及び第二継代で記載したように得た。
【００６２】
４．ＦＩＴＣ共役抗ＰＰＶ抗体を有するイムノステインによる、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）の検知
ウェルを９６個と、２４時間経過したＳＫ６細胞の細胞叢とを有するマイクロタイタープレートを調製した。３０個のキャビティを、第三継代からの各ウイルス／細胞培養溶解物１００μｌ（＝１０％）で感染させ、そして３７±１℃で２４時間インキュベーションした。
【００６３】
インキュベーション後に、細胞培養上清を細胞から取り除き、そしてアセトン８０％とメタノール２０％との氷冷混合物により、細胞叢を固定した。キャビティ１つあたりＦＩＴＣ共役抗ＰＰＶ抗体溶液１００μｌを添加し、そしてこれらのプレートを４５分間、３７℃±１℃でインキュベーションした。抗体溶液の除去後、細胞叢をＰＢＳで三回洗浄し、そしてＰＢＳ中で１５％のグリセリンで覆った。パルボウイルスにより感染された細胞の検知は、ＵＶ光中で倒立型顕微鏡を用いて行った。
【００６４】
パンクレアチン試料と並行して、力価が分かっているブタパルボウイルスＮＡＤＬ−２を陽性対照と同一のマイクロタイタープレート上で滴定した。
【００６５】
あらゆる試験項目は、上記の陽性対照と並行してＳＫ６細胞について継代した。このようにして、ブタパルボウイルスに典型的なプラークの形成／細胞変性効果を、パンクレアチン試料と陽性対照との間で比較することができた。
【００６６】
培養の結果を表１に示す。
【表１】
0005473929.tif 000002
【００６７】
３つの試験項目の第一の継代では、感染後６日間、ＣＰＥは検知されなかった。
【００６８】
試料０４３６の３代の継代の間、ＣＰＥは検知できなかった。試料０４３６の第三継代でのみ、僅かな細胞分解が見られたが、しかしながらこれは試料０４３７及び０４３８で観察された細胞変性効果と同じものではない。
【００６９】
試料０４３７の第二継代の間、感染後４日でプラークが１つだけ細胞叢中に観察された。感染後６日間、フラスコ中の細胞叢の約２０％がＣＰＥを示した。試料の第三継代後、約３０％の細胞叢が細胞変性効果／プラークを示した。
【００７０】
試料０４３８の第二継代の間、感染後３日でプラークが１つだけ観察された。さらに継代の過程でプラーク形成は継続し、ほとんど集約状態のＣＰＥにつながった。
【００７１】
第三継代では、感染後２日で明らかなＣＰＥが検知された。インキュベーションは感染後４日で、集約状態のＣＰＥによって終えた。
【００７２】
組織培養フラスコ内での第三継代に引き続き、ＳＫ６細胞叢を有するマイクロタイタープレートに、第三継代からのウイルス／培養溶解物を移した：
ロット１つあたり１００μｌを３０回、２列のウェル３０個に移した。ブタパルボウイルスＮＡＤＬ−２の陽性対照は、同じプレート上で滴定した。
【００７３】
プレートは３７±１℃でインキュベーションし、第一プレートは細胞変性効果を観察するためのもの、そして第二プレートは、イムノステインによるブタパルボウイルスの検知のためのものである。
【００７４】
第一プレートは６日間インキュベーションした。インキュベーション終了時に試料０４３７と０４３８は、陽性対照ＰＰＶ  ＮＡＤＬ−２と同じ細胞変性を示した。試料０４３６は、いかなるＣＰＥも示さなかった。
【００７５】
第二のマイクロタイタープレートからの培養上清は、インキュベーション開始後２４時間で取り除いた。インキュベーション時間が短いと、一次感染した細胞から放出されるパルボウイルスによる二次感染によって、細胞検知能力の減少につながりかねない。細胞叢を固定し、そしてＦＩＴＣ共役抗ＰＰＶ抗体で着色し、そして倒立型顕微鏡を用いてＵＶ光中で感染した細胞を検査した。これはプラーク滴定に相応するものであり、かつ第三継代溶解物のウイルス力価を検知する可能性をもたらす。
【００７６】
以下の結果が観察された。
【００７７】
試料０４３６の第三継代からの、細胞のないウイルス溶解物で感染させたキャビティ３０個のうち、はっきりとした蛍光色の細胞を含むものはなかった。
【００７８】
試験された３ｍｌ（＝１０％）に加えて、細胞のないウイルス溶解物のさらなる３０×１００μｌを、ＳＫ６細胞叢を有するマイクロタイタープレートに移し、２４時間、３７±１℃でインキュベーションし、固定し、そして抗ＰＰＶ抗体で着色した。これらの３０の付加的なキャビティには、感染した細胞は見られなかった。
【００７９】
この結果は、組織培養フラスコ内にあり、そして第三継代後は細胞変性効果を検知するためのマイクロタイタープレート内にある、試料０４３６の継代結果と対応する。
【００８０】
試料０４３７と０４３８の場合、抗ＰＣＶ抗体で着色された３０個のキャビティはすべて、陽性対照ＰＰＶ  ＮＡＤＬ−２のような明らかな蛍光色の細胞を含んでいた。
【００８１】
上記の通り、本発明による方法により、パンクレアチン１ｇあたりの感染単位を同定することができ、そしてこれにより、パンクレアチン試験体からウイルス負荷を分離及び測定するための非常に感度の高い方法を得ることができる。さらに、ＰＣＲのような増幅法に基づく核酸分子検知といった分子生物学的手法に基づく方法とは対照的に、本発明による方法によって感染単位を測定することが可能になる。従って、感染性と非感染性のウイルス負荷を、或いは分子生物学技術により測定された総ウイルス負荷を、弁別することができる。
【００８２】
さらなる態様では、継代と検知を段階的に（上記のように）、又は並行アプローチで行うことができる。並行アプローチとは、１つの継代を行う間に、以前の継代のウイルス負荷を既に測定できてしまうということである。このアプローチを用いると、すべての継代から結果を得ることができ、そして第一継代から結果が得られる場合、段階的アプローチを用いるよりも早い時点で結果が得られる。このことは、例えば時間効率の上昇のため、及び／又は例えば製造工程における品質保証のために、個々の試料又は製品をより早い時点で放出できるように、重要となることがある。