(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞または前駆細胞の分化および増殖能力を調節するインビトロの方法であって、前記細胞においてＴＲＩＭ３２タンパク質の発現および／または活性のレベルを、ＴＲＩＭ３２タンパク質のヌクレオチド阻害剤を用いてインビトロで調節することを含む方法。
【請求項２】
前記細胞がヒト細胞であり、前記ＴＲＩＭ３２タンパク質がヒトＴＲＩＭ３２タンパク質（配列番号２）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＴＲＩＭ３２タンパク質の発現および／または活性のレベルを減少させ、それによって前記細胞の増殖能力を促進し、分化能力を減少させることを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＴＲＩＭ３２タンパク質のヌクレオチド阻害剤を含有する培地中で前記細胞を培養する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、ＴＲＩＭ３２タンパク質のヌクレオチド阻害剤で形質移入される請求項３に記載の方法であって、前記ヌクレオチド阻害剤が、アンチセンス分子またはリボザイムもしくはｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ分子から選択される阻害性オリゴデオキシリボヌクレオチド分子であり、前記阻害性オリゴデオキシリボヌクレオチド分子が、配列番号１に示したＴＲＩＭ３２タンパク質をコードする配列に特異的である方法。
【請求項６】
前記阻害性オリゴデオキシリボヌクレオチド分子が配列番号７で示した配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が神経幹細胞、造血幹細胞、間葉幹細胞、皮膚幹細胞および臍帯血幹細胞から選択される体性ヒト幹細胞である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
幹細胞または前駆細胞の増殖能力を促進するための培地であって、前記細胞の培養に必要な栄養素および栄養補助物に加えて、ＴＲＩＭ３２タンパク質のヌクレオチド阻害剤を含有する培地。
【請求項９】
試験化合物が、幹細胞または前駆細胞の増殖および／または分化能力を調節する能力を有するかどうかを決定する方法であって、前記試験化合物がＴＲＩＭ３２タンパク質の活性を調節する能力について前記試験化合物を試験する方法。
【請求項１０】
前記活性が、
ａ．前記ＴＲＩＭ３２タンパク質によるユビキチン結合酵素Ｅ２からＭｙｃへのユビキチンの転移、
ｂ．前記ＴＲＩＭ３２タンパク質のアルゴノート−１への結合、または
ｃ．前記ＴＲＩＭ３２タンパク質による細胞分化の誘導から選択され、
試験化合物非存在下でのＴＲＩＭ３２活性レベルと比較して、試験化合物存在下での前記ＴＲＩＭ３２タンパク質の活性レベルの変化が、幹細胞または前駆細胞の増殖および／または分化能力を調節する前記化合物の能力の指標となる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
試験化合物が前記ＴＲＩＭ３２タンパク質に対して阻害効果を有するかどうかを測定することによって、前記試験化合物が幹細胞または前駆細胞の増殖能力を促進する能力について、前記試験化合物を試験する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
幹細胞または前駆細胞の増殖能力を促進する能力を有する薬剤を同定するためのスクリーニング方法である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
対象において体性幹細胞または前駆細胞の分化および／または増殖能力を調節するための医薬組成物であって、治療有効量の１種または複数のＴＲＩＭ３２タンパク質のヌクレオチド阻害剤を含む医薬組成物。
【請求項１４】
対象において体性幹細胞または前駆細胞の増殖能力を促進するための、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１３または１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記細胞がヒト細胞であり、前記ＴＲＩＭ３２タンパク質がヒトＴＲＩＭ３２タンパク質（配列番号２）である、請求項１３〜１５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記ＴＲＩＭ３２タンパク質の発現および／または活性のレベルを減少させ、それによって前記細胞の増殖能力を促進し、分化能力を減少させるものである、請求項１３〜１６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記ヌクレオチド阻害剤がアンチセンス分子またはリボザイムもしくはｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ分子から選択される阻害性オリゴデオキシリボヌクレオチド分子である、請求項１３〜１７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記阻害性オリゴデオキシリボヌクレオチド分子が配列番号７で示した配列を含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記細胞が神経幹細胞、造血幹細胞、間葉幹細胞、皮膚幹細胞および臍帯血幹細胞から選択される体性ヒト幹細胞である、請求項１３〜１９のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２１】
ＴＲＩＭ３２タンパク質の生物学的機能の調節因子を作製するための、
ａ）配列番号１のＤＮＡ分子、または配列番号２のポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、またはそれらの断片またはそれらの相補体、あるいは、
ｂ）配列番号２のＴＲＩＭ３２タンパク質またはその断片の使用。
【請求項２２】
幹細胞および前駆細胞の増殖能力を促進する能力を有するＴＲＩＭ３２タンパク質阻害剤を作製するための、請求項２１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞および前駆細胞の増殖および分化に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、自己再生能力および任意の成熟細胞型への分化能力が特徴である多能性細胞である。
【０００３】
前駆細胞は、分化はできるが、自己再生能力に限界がある、幹細胞の早期子孫であり、それ以上は自己再生することができない。前駆細胞は多分化能を備えており、すなわち、分化できる細胞型に関して幹細胞よりも能力が低い。
【０００４】
胚幹細胞は、全細胞型に分化できる細胞で、早期胚である胚盤胞の内部細胞塊から生じる。多くの組織では、幹細胞は成人期を通して存続し、このような幹細胞は「成体幹細胞」または「体性幹細胞」と呼ばれる。成体幹細胞は、胚幹細胞とは対照的に、多能性が低く、したがって、幹細胞ではなく、前駆細胞と定義されることも時々ある。
【０００５】
神経幹細胞を含む成体幹細胞の主な役割は、それらの存在する組織を維持し、修復すること、例えば、代謝回転、損傷または疾患によって失われた成熟細胞を補充することである。しかし、幹細胞の再生力は年齢と共に低下する。結果として、老化した組織は修復能力の低下および変性疾患に対する感受性の増加を示す。
【０００６】
多分化能幹細胞、例えば神経幹細胞（ＮＳＣ）の特性、特に、それらが位置する組織を修復する能力は、慢性疾患および変性疾患を治療するための新たな治療法、例えば、細胞補充療法またはｉｎ  ｓｉｔｕでの成体幹細胞の能力を促進する薬剤の直接投与の開発に非常に有望である。
【０００７】
特に、パーキンソン病、アルツハイマー病、または脳卒中後（神経細胞の補充）または糖尿病、心臓疾患または白血病などの疾患におけるこのような治療は非常に見込みがあると考えられる。神経変性疾患において、再生アプローチの概念の１つは、疾患脳における死んだ神経細胞のＮＳＣによる補充である。ＮＳＣは最終的に分裂終了ニューロンに分化し、神経ネットワークに組み込まれ、それによって疾患によって引き起こされたニューロンの欠如を補う。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、インビトロおよびインビボの両方において幹細胞の増殖を制御する能力を備えた薬剤が必要とされている。したがって、本発明の目的は、幹細胞増殖の機構を探求し、これらの機構に因果関係のあるタンパク質を同定することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の実験では、ＴＲＩＭ３２を用いて、驚くべきことに、ＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質ファミリーの構成要素が幹細胞分化において重要な役割を果たすことを見出した。幹細胞分化におけるＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質の役割についての本発明での発見は、幹細胞の増殖および／または分化を調節することができる化合物を同定し、使用する基礎となる。
【００１０】
ＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質ファミリーの明確な特徴は、特殊なドメイン構成、いわゆる３要素モチーフ(tripartite motif)（ＴＲＩＭ）である。このモチーフは、ＲＩＮＧドメイン（ＴＲＩＭ２：２３位アミノ酸から６６位アミノ酸、ＴＲＩＭ３：２２位アミノ酸から６５位アミノ酸、ＴＲＩＭ３２：２１位アミノ酸から６５位アミノ酸）、Ｂ−Ｂｏｘおよびコイルドコイル領域から構成される。これらのドメインに加えて、ＴＲＩＭ３２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１２２１０およびＮＭ＿０５３０８４）、ＴＲＩＭ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１５２７１）およびＴＲＩＭ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３３２７８）は、大きなＣ末端ＮＨＬドメイン（ＴＲＩＭ２：４９０位アミノ酸から７３５位アミノ酸、ＴＲＩＭ３：４８１位アミノ酸から７４１位アミノ酸、ＴＲＩＭ３２：４４６位アミノ酸から６４６位アミノ酸、頭字語ＮＨＬは、このタンパク質ファミリーの基本構成要素の３つ、すなわち、ＮＣＬ−１、ＨＴ２ＡおよびＬＩＮ−４１に由来する）を有する。
【００１１】
本発明の意味では、ＴＲＩＭ２、ＴＲＩＭ３およびＴＲＩＭ３２に加えて、ＮＨＬドメインならびにＢ−Ｂｏｘおよびコイルドコイル領域を含むドメイン構造を含有するその他のタンパク質は、総称して「ＴＲＩＭ−ＮＨＬ」タンパク質と呼ばれる。このようなその他のＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質の一例は、ＬＩＮ４１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ２３２８８１）である。
【００１２】
ＴＲＩＭ−ＮＨＬ遺伝子によって媒介される生物学的および分子的機構についてはほとんど知られていない。ＲＩＮＧドメインは、ＴＲＩＭ３２がＥ３−ユビキチンリガーゼであり、したがって特定の標的タンパク質のユビキチン化および分解を媒介することを強く示唆する。今まで、ＴＲＩＭ３２は主に、筋ジストロフィーおよびバルデ−ビードル症候群（ＢＢＳ）に関連して記載されてきた（Ｃｈｉａｎｇら、２００６、Ｋｕｄｒｙａｓｈｏｖａら、２００５）。ＴＲＩＭＳ３２はタンパク質アクチンおよびＰｉａｓｙのユビキチンリガーゼとして作用できることが示された（Ｋｕｄｒｙａｓｈｏｖａら、２００５、Ａｌｂｏｒら、２００６）。さらに、最近の研究では、ＴＲＩＭ３２はアルツハイマー病患者の脳において調節解除されていることが示された（Ｙｏｋｏｔａら、２００６）。今まで、ＴＲＩＭ３２が幹細胞増殖および分化に関して研究されたことはない。
【００１３】
ＴＲＩＭ３２が神経幹細胞で発現するかどうかを確かめるために、抗ＴＲＩＭ３２抗体を作製した。この抗体は、マウス脳切片（胎生１２．５日目から１８．５日目）の免疫蛍光染色のために使用した。脳室帯（神経幹細胞が局在する領域）および皮質板（分裂終了ニューロンが局在する領域）において陽性染色が得られた。上記抗体の特異性は、上記抗体を、この抗体の作製に使用したペプチドと予めインキュベーションすることによって示された。このようなペプチド遮断の後では、特異的なＴＲＩＭ３２は検出できなかった。さらに、ＴＲＩＭ３２シグナルは、ネスチン染色と共局在していた。ネスチンは、神経幹細胞で特異的に発現し、したがって、抗ネスチン抗体は神経幹細胞マーカーとして広く使用されている。陽性ＴＲＩＭ３２シグナルはまた、神経幹細胞の永久培養およびインビトロにおける分裂終了ニューロンで検出することができた。これらの結果から、ＴＲＩＭ３２は、インビボおよびインビトロにおいて、神経幹細胞で発現すると結論づけることができる。ニューロンを生成するために、神経幹細胞は非対称的に分裂することができる。このような神経形成細胞分裂においては、より頂端側の娘細胞が幹細胞の特性を保持し、一方、より基底側の娘細胞は細胞周期を離れ、分裂終了ニューロンになる。これらの細胞分裂では、ＴＲＩＭ３２は通常、基底側の娘細胞において豊富で、したがって、ニューロンになる細胞では非対称的に分配される。
【００１４】
豊富なＴＲＩＭ３２の効果を調べるために、本発明者らは、ＮＩＨ３Ｔ３、神経芽細胞腫細胞（Ｎ２ａ）、結腸癌細胞（ＣＴ２６）および初代神経幹細胞においてＴＲＩＭ３２を過剰発現させた。これらの細胞種のいずれにおいても、ＴＲＩＭＳ３２の発現は増殖の阻害を導くことが見出された［強化緑色蛍光蛋白質（ＥＧＦＰ）の発現ベクターだけで形質移入した対照細胞と比較して］。増殖は、増殖抗原Ｋｉ６７および有糸分裂マーカーＰ−Ｈ３による免疫蛍光染色によって測定した。初代神経幹細胞については、増殖はまた、一定時間中に１個の形質移入細胞によって形成され得るコロニーの大きさによって測定することができた。また、本明細書では、ＥＧＦＰ−ＴＲＩＭ３２を形質移入した細胞のコロニーの大きさは、ＥＧＦＰを形質移入した細胞よりもずっと小さいことが見出された。さらに、ＴＲＩＭ３２に対する低分子ヘアピン型ＲＮＡの発現ベクターの形質移入によるＴＲＩＭ３２のノックダウンは、これらの細胞の増殖を促進することが示された。また、このアッセイでは、増殖は増殖抗原Ｋｉ６７および有糸分裂マーカーＰ−Ｈ３による免疫蛍光染色によって測定した。
【００１５】
増殖および分化は、密接に結びついたプロセスである。したがって、本発明者らは、ＴＲＩＭ３２の発現またはノックダウンがどのように神経幹細胞の分化に影響を及ぼすかを調べた。神経幹細胞の分化状態を測定するために、様々なマーカー、すなわち、神経幹細胞用マーカーとしてのネスチンならびに分化したニューロンのマーカーとしてのＴｕＪ１およびＭＡＰ２を使用した。ＴＲＩＭ３２が神経幹細胞で発現したとき、これらの細胞の大部分はＭＡＰ２およびＴｕＪ１が陽性になり、これらの細胞がニューロンに分化することが示唆された。これとは対照的に、ＴＲＩＭ３２をノックダウンした後、神経幹細胞はネスチン陽性のままで、ニューロンには分化しなかった。さらに、ＴＲＩＭ３２のノックダウン構築物で形質移入した神経幹細胞は、対照神経幹細胞［遺伝子を標的としない対照低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）ベクターで形質移入されている］が容易に分裂終了ニューロンに分化する培養条件（成長因子ＥＧＦの投与を中止）に曝露してもニューロンに分化しなかった。
【００１６】
さらに、本発明者らは、繊維芽細胞においてＴＲＩＭ２およびＴＲＩＭ３が過剰発現すると細胞増殖の阻害が生じることを示すことができ、これらのＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質はＴＲＩＭ３２と類似の能力を有することが示唆された。幹細胞の結果を確認し、その他のＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質、例えば、ＬＩＮ４１のこのような特性を測定するため、ＴＲＩＭ３２について実施例で説明した実験（神経幹細胞における過剰発現または阻害それぞれ）をＴＲＩＭ２、ＴＲＩＭ３およびＬＩＮ４１のようなその他のＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質について類似の、または同様の方法で実施することができる（例えば、その他の幹細胞に実験を適用する）。
【００１７】
これらの結果によって、ＴＲＩＭ２、ＴＲＩＭ３およびＴＲＩＭ３２から選択したＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質の活性が増殖の停止および分化の増強をもたらし、一方、ＴＲＩＭ−ＮＨＬが存在しないと増殖が促進され、分化が阻害されることが裏付けられる。
【００１８】
第１の態様では、本発明は、前駆細胞または幹細胞の増殖および／または分化能力を調節する方法であって、前記細胞においてＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質ファミリーのタンパク質の発現および／または活性のレベルを調節することを含み、前記タンパク質がＴＲＩＭ３２（配列番号２）、ＴＲＩＭ２（配列番号４）またはＴＲＩＭ３（配列番号６）から選択される方法に関する。
【００１９】
「ＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質ファミリーのタンパク質の発現および／または活性のレベルを調節する」という用語はまた、例えば、１種のＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質には厳密には特異的ではないが、複数のＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質に阻害または活性効果を有する薬剤によって、複数のＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質の発現／活性を調節することを包含する。
【００２０】
特定の態様では、本発明の方法は、幹細胞におけるＴＲＩＭ２、ＴＲＩＭ３またはＴＲＩＭ３２から選択されたＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質の発現および／または活性のレベルを減少させ、それによって前記幹細胞の分化能力を阻害し、増殖能力を促進することを含む。
【００２１】
簡略にするために、特記しなければ、以下において、「幹細胞」という用語はまた、一般的に、ならびに特定の幹細胞およびそれらから生じる前駆細胞に関して、多分化能前駆細胞を包含する。
【００２２】
簡略にするために、以下において、ＴＲＩＭ３２に関することは、特記しなければ、ＴＲＩＭ２、ＴＲＩＭ３またはその他のＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質に関することを含む。また、「ＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質」という用語は、ＴＲＩＭ２、ＴＲＩＭ３、ＴＲＩＭ３２または任意のその他のＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質から選択されたタンパク質を表す。
【００２３】
幹細胞の分化能力を阻害し、増殖能力を促進すること、すなわち、細胞を未分化の状態に維持することはまた、「幹細胞の維持」と理解される。
【００２４】
特定の実施形態では、本発明の方法は、幹細胞を維持するインビトロ法である。このような方法では、幹細胞を、１種または複数のＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質の阻害剤、例えば、ＴＲＩＭ３２阻害剤を含有する幹細胞培地で維持する。このような阻害剤は、ヌクレオチド型阻害剤または以下に記載したような本発明のアッセイ方法で同定された、および／または最適化された化合物、特に低分子化合物であってもよい。ＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質阻害剤で処理された幹細胞および前駆細胞は、移植治療に有用である。
【００２５】
本発明はさらに、幹細胞を維持するための培地であって、幹細胞の培養に必要な栄養素、栄養補助剤および成長因子に加えて、ＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質の１種または複数の阻害剤を含有する方法に関する。前記阻害剤は、以下に記載したような本発明のアッセイ方法で同定された、かつ／または最適化された低分子阻害剤であることが好ましい。
【００２６】
幹細胞維持に適切な培地は、当業界で公知であり、市販されている。例は、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）などの抗生物質、牛胎児血清（ＦＢＳ）、ＬＩＦ（白血病抑制因子）、２５％（ｗ／ｖ）トリプシン−ＥＤＴＡを含有する培地である。上記培地に含有される他の因子は、ヒトトランスフェリン、プトレシン２塩酸塩、ヒト組換えインシュリン、Ｌ−チロキシン、トリヨードチロニン、プロゲステロン、亜セレン酸ナトリウム、ヘパリンおよびコルチコステロンであってもよい。
【００２７】
神経幹細胞の維持のために他に詳しく記載されている培地は、改変Ｎ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｎ２はインシュリン、ヒトトランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、プトレシンおよびプロゲステロンを補充した無血清合成培地である）と、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦおよびＦＧＦ−２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ、Ｃｏｎｔｉら、２００５）両方とを補充したＮＳ−Ａ培地（Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ、Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）である。
【００２８】
ＵＳ２００７０２１８５４８で記載された多能性幹細胞のためのさらに他の維持培地は、血清、ＬＩＦ、Ｌ−グルタミン、２−メルカプトエタノールなどを補充した細胞培養用最少培地を含有し、適切な組成物の一例は、８５％ノックアウトＤ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５％ＦＢＳ、２−ＭＥ  １０−４Ｍ、Ｌ−グルタミン  ２ｍＭ、ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）０．１ｍＭ、およびＬＩＦ  １０００Ｕ／ｍｌである。
【００２９】
好ましくは、培地は、限定された成分および栄養補助物質のみを含有する無血清培地である。
【００３０】
神経幹細胞維持用の培地は通常、Ｎ２、ｂＦＧＦ−２およびＥＧＦなどの補充物を含有する。
【００３１】
培地中にＴＲＩＭ３２阻害剤を入れる代わりに、細胞におけるＴＲＩＭ３２の発現を阻害することができる。アンチセンス分子、リボザイムまたは低分子阻害ＲＮＡ分子（低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、本発明の意味においては、「マイクロＲＮＡ」［「ｍｉＲＮＡ」）および「低分子ヘアピンＲＮＡ（「ｓｈＲＮＡ」）などの調節ＲＮＡは、「ｓｉＲＮＡ」という用語と同義に使用される］から選択された１種または複数のヌクレオチド分子によってＴＲＩＭ３２機能を妨害する戦略では、ＴＲＩＭ３２ＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズすることができる合成オリゴヌクレオチドを投与する。以下において、前記に挙げたＴＲＩＭ−ＮＨＬ阻害剤はまた、「ヌクレオチド型ＴＲＩＭ−ＮＨＬ阻害剤」と呼ばれる。
【００３２】
ヌクレオチド型ＴＲＩＭ−ＮＨＬ阻害剤の特定の実施形態では、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の適用を使用する。ＲＮＡｉは、サイレンシングした遺伝子と配列が相同な２重鎖ＲＮＡによって開始される配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスである。２１個から２２個のヌクレオチドの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）２本鎖は、哺乳類細胞において遺伝子機能を阻害する強力な新規手段であることが示されている（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１）。Ｓｕｉ  ら（２００２）およびＢｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら（２００２ａ、２００２ｂ）は最近、低分子干渉ＲＮＡを安定的に発現させるためのベクターをベースにした系を報告した。これらの系は、ｓｉＲＮＡをコードする合成された遺伝子特異的標的配列が、低分子非コーディングＲＮＡの転写に適したプロモーターの制御下で発現するベクターに基づいている。したがって、ｓｉＲＮＡは、標準的形質移入方法（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）またはウイルス感染方法（例えば、レトロウイルス感染）によってベクターが哺乳類細胞に導入された後ベクターから生成される。
【００３３】
他の実施形態では、本発明は、ＴＲＩＭ３２ｓｉＲＮＡ分子に関する。ＴＲＩＭ３２のＲＮＡ配列をベースにして、ＴＲＩＭ３２活性をノックダウンする能力を備えたｓｉＲＮＡ分子は、化学的合成またはヘアピンｓｉＲＮＡ発現ベクター（Ｙｕら、２００２によって記載された通り）によって得ることができるか、あるいは、例えば、完全長標的配列からの多数のｓｉＲＮＡの作製を可能にする市販のＤｉｃｅｒ  ｓｉＲＮＡ作製キット（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって、特別設計することができる。Ｄｉｃｅｒ  ｓｉＲＮＡ作製キットは、組換えヒトＤｉｃｅｒ酵素を使用することによって天然のＲＮＡ干渉プロセスを模倣して、インビトロ転写されたｄｓＲＮＡ鋳型を切断して２２ｂｐ  ｓｉＲＮＡのプールにする。所与のＲＮＡ配列に対して特別設計したｓｉＲＮＡを供給する会社は数多くあり、例えば、Ａｍｂｉｏｎ、Ｉｍｇｅｎｅｘ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎである。標的配列の選択、ｓｉＲＮＡ２本鎖の調製、ベクターの設計およびデリバリーを含むｓｉＲＮＡの設計の選択方法は、当業界では周知で、例えば、ＵＳ７，２３５，６５４に詳細に記載されている。
【００３４】
本発明のＴＲＩＭ３２ｓｉＲＮＡは、例えば、ＵＳ２００３／０１４７３２に記載されたように、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチドおよび反転デオキシ脱塩基残基（inverted deoxyabasic residue)を組み込むことによって化学的に修飾することができる。
【００３５】
ｓｉＲＮＡの代わりとして、アンチセンスオリゴヌクレオチドをＴＲＩＭ３２タンパク質（または別のＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質それぞれ）の発現を妨害するヌクレオチド型ＴＲＩＭ−ＮＨＬ阻害剤として使用することができる。
【００３６】
したがって、他の実施形態では、本発明は、ＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質に特異的なアンチセンス分子に関する。
【００３７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡの領域に相補的で、その特定の転写物の発現を特異的に抑制できる短いヌクレオチド鎖である。アンチセンスオリゴヌクレオチドならびに実験および臨床の場でのそれらの用途の例は、概説されている（ＢｒａａｓｃｈおよびＣｏｒｅｙ、２００２、Ａｇｒａｗａｌら、１９９８、Ｇａｌｄｅｒｉｓｉら、１９９９、Ｇｅｗｉｒｔｚ、１９９８）。アンチセンス核酸は、細胞に形質移入されたベクターから発現したＲＮＡの形態を取ることができるか、または様々な手段、例えば、カチオンリポソーム、カチオンポルフィリン、膜融合性ペプチドおよび人工ビロソームによって、またはストレプトリジン−Ｏによる細胞透過化およびエレクトロポレーションによって細胞内に導入できるＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドの形態を取ることができる。陽イオン性脂質は、オリゴヌクレオチドと共に安定な複合体を形成し、細胞摂取の改善を示し（Ｂｅｎｎｅｔｔら、１９９２、Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎら、１９９４）、したがって、増強されたアンチセンス活性を生じる。
【００３８】
あるいは、ＴＲＩＭ３２は、リボザイムヌクレオチド型ＴＲＩＭ−ＮＨＬ阻害剤によって不活性化することができる。
【００３９】
他の実施形態では、本発明は、ＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質に特異的なリボザイムに関する。アンチセンスオリゴヌクレオチドと同様に、リボザイムは、ワトソン−クリック塩基対によって基質ＲＮＡに結合し、それによって、転写物の配列特異的切断をもたらす。２種類のリボザイム、ハンマーヘッド型リボザイムおよびヘアピン型リボザイムは、大きさが小さくて、反応速度が迅速なので詳細に研究されている。それらの適用はいくつかの出版物で概説されている（Ｈａｍｐｅｌ、１９９８、Ｖａｉｓｈら、１９９８、Ｂｉｒｉｋｈら、１９９７、ＥａｒｎｓｈａｗおよびＧａｉｔ、１９９７、ＫｏｒｅおよびＥｃｋｓｔｅｉｎ、１９９９）。
【００４０】
リボザイムは、アンチセンスオリゴヌクレオチドについて前述したように、様々な手段によって細胞に移入することができるか、またはベクターから発現することができ、これには、これらの分子の細胞内産生の継続という利点がある（Ｉｒｉｅら、１９９９、Ｓｍｉｔｈら、１９９７）。
【００４１】
好ましくは、ヌクレオチド型ＴＲＩＭ−ＮＨＬ阻害剤は、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターから産生される。
【００４２】
前述した遺伝子機能阻害法および公表されたヒトＴＲＩＭ−ＮＨＬ遺伝子の配列に基づいて、当業者はＴＲＩＭ−ＮＨＬｓｉＲＮＡ、アンチセンスまたはリボザイム標的配列および幹細胞を形質移入もしくは感染させるための構築ベクター、例えば、配列ＧＡＴＣＴＴＣＡＧＧＣＡＡＧＧＴＡＴＡ（配列番号７）を含有するＴＲＩＭ３２ＲＮＡｉ構築物を決定することができる。
【００４３】
前述したような１種または複数のヌクレオチド型阻害剤の作用によってＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質の発現が減少しているか、または発現していない幹細胞および前駆細胞は、移植治療に有用である。
【００４４】
前述のヌクレオチド型分子の代わりに、ＴＲＩＭ３２の活性をインビトロまたはインビボで調節するために低分子化合物を使用することができる。本発明は、このような化合物を同定および／または特徴付ける方法を提供する。本発明の方法は、ＴＲＩＭ３２の分化調節効果が、ＴＲＩＭ３２の２つの結合パートナー、すなわち癌原遺伝子ＭｙｃおよびｍｉＲＮＡ関連タンパク質アルゴノート−１（Ａｇｏ−１）によって媒介され得るという本発明の発見に基づいている。
【００４５】
したがって、本発明は、試験化合物が幹細胞の増殖および／または分化能力を調節する能力を有するかどうかを決定する方法であって、前記試験化合物が、ＴＲＩＭ３２（配列番号２）、ＴＲＩＭ２（配列番号４）またはＴＲＩＭ３（配列番号６）から選択されたＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質の活性を調節する能力について前記試験化合物と試験し、前記活性が、
ａ）前記ＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質によるユビキチン結合酵素Ｅ２からＭｙｃへのユビキチンの転移、または
ｂ）前記ＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質のアルゴノート−１への結合から選択され、
試験化合物非存在下でのＴＲＩＭ−ＮＨＬ活性レベルと比較して、試験化合物存在下での前記ＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質の活性レベルの変化が、幹細胞の増殖および／または分化能力を調節する前記化合物の能力の指標となる方法に関する。
【００４６】
ａ）で定義された活性、すなわち、ＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質（例えば、ＴＲＩＭ３２）のＭｙｃへの結合およびＭｙｃのユビキチン化は、ユビキチンプロテアソーム系によるＭｙｃの分解をもたらす。
【００４７】
ａ）で定義された活性、すなわち、ＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質（例えば、ＴＲＩＭ３２）のＭｙｃへの結合およびＭｙｃのユビキチン化は、ユビキチンプロテアソーム系によるＭｙｃの分解をもたらす。
【００４８】
ａ）の変法による本発明のアッセイ方法では、好ましい実施形態では、ＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質、例えば、ＴＲＩＭ３２は、Ｍｙｃ、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）、ユビキチンおよびＡＴＰと一緒に、Ｍｙｃに結合したユビキチンの測定可能なレベルを得るために十分な時間インキュベートし、試験化合物の存在下または非存在下でのＭｙｃのユビキチン化のレベルを比較し、試験化合物の非存在下でのＭｙｃユビキチン化のレベルと比較した試験化合物存在下でのＭｙｃユビキチン化のレベルの変化が幹細胞の増殖および／または分化能力を調節する化合物の能力の指標となる。化合物がＴＲＩＭ３２の阻害剤である場合、それは幹細胞維持剤の候補である。
【００４９】
本発明では、「Ｍｙｃ」という用語は、ｃ−ＭｙｃまたはＴＲＩＭ３２によって媒介されるユビキチン化反応に感受性のあるｃ−Ｍｙｃ関連物、すなわち、ｎ−Ｍｙｃまたはｌ−Ｍｙｃのいずれも包含する。
【００５０】
アッセイのための成分は以下の通りに入手することができる。スクリーニングアッセイで使用するタンパク質は、好ましくは組換えタンパク質で、タンパク質をコードする配列を有するプラスミドで適切な宿主を形質転換することによって従来の方法によって得ることができる。タンパク質成分ＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質（ＴＲＩＭ３２：配列番号１、ＴＲＩＭ２：配列番号３、ＴＲＩＭ３：配列番号５）、Ｅ１、Ｅ２、ＭｙｃおよびユビキチンをコードするｃＤＮＡ配列は、文献およびデータベースから入手できる。
【００５１】
アッセイ成分ＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質［例えば、ＴＲＩＭ３２（配列番号２、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１２２１０およびＮＭ＿０５３０８４）］またはＲＩＮＧフィンガードメインＥ２を含有するそれらの断片およびユビキチンは通常融合タンパク質として産生され、精製される。このタンパク質は、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、キチン結合ドメイン（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ｍｙｃエピトープ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）またはＨｉｓ（６）タグ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｎｏｖａｇｅｎｅ）などのアフィニティータグ、すなわちアフィニティー精製に適したタンパク質と融合させることができる。融合タンパク質は、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させ、標準的方法によって精製することができる。
【００５２】
基質タンパク質ＭｙｃおよびそれをコードするＤＮＡ配列は、文献およびデータベースにより公知で、例えば、ｃ−Ｍｙｃ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０１１０６）、ｌ−ｍｙｃ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＯ３８６７２）またはｎ−ｍｙｃ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０４１９８）である。完全長タンパク質を使用する代わりに、ＴＲＩＭ３２によるユビキチン化に関連した部位を含有する断片を使用することができる。適切な断片およびその大きさは、所望するアッセイ様式において様々な大きさのＴＲＩＭ３２ペプチド断片を使用し、ユビキチン化反応に適した適切なペプチドを決定することによって、予備実験で容易に決定することができる。
【００５３】
Ｅ１は、ユビキチンとの可逆的相互作用により、公知の方法（例えば、Ｈａｔｆｉｅｌｄら、１９９０、ＨａｔｆｉｅｌｄおよびＶｉｅｒｓｔｒａ、１９９２）に従って精製することができる。Ｅ１はまた、市販されている（例えば、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）。タグの付いていないユビキチンを使用する場合、市販の製品（例えば、Ｓｉｇｍａ、Ｆｌｕｋａ製）をこのアッセイ成分として使用することができる。
【００５４】
好ましくは、天然に生じるタンパク質を使用するが、このタンパク質は、機能的活性を損なわない限り、天然のアミノ酸配列からの変更を含有してもよい。適切なユビキチン活性化酵素（Ｅ１）は、コムギＵＢＡ１Ｅ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ５５６０４）であるが、その他の種、例えば、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）のＵＢＡ１Ｅ１も使用できる。Ｅ１は、公表された方法によってユビキチンアフィニティー基質上で精製することができる（例えば、Ｈａｔｆｉｅｌｄら、１９９０、ＨａｔｆｉｅｌｄおよびＶｉｅｒｓｔｒａ、１９９２）。
【００５５】
ユビキチン結合酵素（Ｅ２）として、好ましい実施形態では、ヒト変異体ＵＢＣＨ５ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ３９３１７）を使用するが、この場合、その他の種、例えば、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＵＢＣＨ５ｂホモログも使用できる。あるいは、ＵＢＣＨ５ａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＨ０５９８０）またはＵＢＣＨ５ｃ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＨ６６９１７）を使用できる。あるいは、ＵＢＣＨ５ａ、ｂまたはｃとは異なるユビキチン結合酵素は、これらの酵素がユビキチンのＭｙｃへの転移を支持する限り、使用することができる。好ましくは、ユビキチン結合酵素Ｅ２は、アフィニティータグと融合され、このタグは、ＴＲＩＭ３２に適したものとして前掲したタグから選択されるが、ＴＲＩＭ３２について選択されたタグとは異なる。例えば、ＧＳＴ−ＴＲＩＭ３２が使用されている場合、Ｅ２にタグ付けするのには、Ｈｉｓ（６）、またはＧＳＴとは異なる別のタグを使用する。
【００５６】
ユビキチン化反応全体を通じて十分なＡＴＰレベルを持続するために、いわゆる「ＡＴＰ再生系」（例えば、ＡＴＰ  ０．５ｍＭ、クレアチンホスホキナーゼ  ６０μｇ／ｍｌ、ホスホクレアチン  ６．６ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ０．５ｍＭ、ＫＣｌ  １ｍＭ、ＤＴＴ  ０．０５ｍＭ）を有利に使用してもよい（Ｍｕｒｒａｙ、１９９１）。
【００５７】
ユビキチンは市販されており（Ｓｉｇｍａ）、組換えによって生成してもよく、この場合、精製用の様々なタグ、すなわち、Ｈｉｓ（６）、ＧＳＴ、または検出用の様々なタグ、すなわち、ｍｙｃ−エピトープ、ＨＡ−エピトープと融合させてもよい。いずれの場合も、ユビキチンは機能に必要なＮ末端の７６個のアミノ酸を含む。好ましくは、タグ付けしたユビキチンをアッセイに使用する。アッセイに使用するユビキチンはまた、非タンパク質性タグ、例えば、ビオチンを有してもよい。
【００５８】
前述のアッセイは本質的に、ユビキチン化反応自体の工程およびＭｙｃへのユビキチン転移の程度を測定する工程を含む。第１の工程は、ユビキチン化反応を可能にするために十分な時間、例えば、３０分間、前掲のアッセイ化合物と反応させることを含む。この反応は、アッセイ成分を単純に混合することによって溶液中で実施してもよく、あるいは、この反応は固定したＭｙｃを使用することによって実施してもよい。この場合、Ｍｙｃはアフィニティータグ（ＧＳＴまたは前述の他のタグの１つ）を有し、このタグは、それぞれのアフィニティー部分に対するリガンドを有する固相、例えば、グルタチオンアガロースもしくはセファロースビーズ、またはアフィニティー部分に対する抗体、例えば、市販の抗ＧＳＴ抗体をコーティングしたマイクロタイタープレートに結合させるために使用する。
【００５９】
反応が完了した後で、Ｍｙｃに結合したユビキチンの量を様々な方法で測定することができる。ユビキチン化反応が溶液中で実施された場合、アフィニティータグ付きＭｙｃ、例えば、ＧＳＴタグ付きＭｙｃが、ＧＳＴに対する抗体でコーティングされたマイクロタイタープレート上に捕捉される（この工程は、固相に結合したＴＲＩＭ３２で反応が実施された場合は省略することができる）。結合しなかったＧＳＴ−ＭＹｃ、取り込まれなかったユビキチンおよびその他の反応パートナーは、その後、洗浄除去した。その後、固定されたユビキチンは、タグエピトープ、例えば、タグ付きの組換えユビキチンに存在するｍｙｃエピトープに特異的で、検出可能な標識を有する抗体を使用して、視覚化することができる。適切な標識は、放射活性標識、例えば、１２５Ｉ、酵素標識、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、または蛍光定量標識である。好ましい実施形態では、消光されたフルオロフォア、例えば、増強溶液（Ｗａｌｌａｃ／ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）とインキュベートすると脱消光するユーロピウム（Ｗａｌｌａｃ／ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用する。得られた値は、Ｍｙｃを含まない反応から得られた値（陰性対照、バックグラウンド）および溶媒（通常はＤＭＳＯ）のみの存在下でインキュベートした反応混合物から得られた値（陽性対照）と比較する。
【００６０】
結合したユビキチンの量を検出するために前述したＥＬＩＳＡ型アッセイを使用する代わりに、３７℃でインキュベートしたときのＭｙｃに結合したユビキチン分子の物理的接近は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ、Ｇｅｒｓｈｋｏｖｉｃｈら、１９９６またはＭａｔａｙｏｓｈｉら、１９９０、Ｈｅら、２００３による記載またはＳｅｌｖｉｎ、２０００による概説の通りである）によってＭｙｃとのユビキチンの結合の程度を測定するために利用することができる。ＦＲＥＴは、特定の条件が満たされた場合のみ、すなわち、フルオロフォア対が重複する発光波長と励起波長を有するもの、例えば、ユーロピウム／アロフィコシアニン、ユーロピウム／Ｃｙ５、ユーロピウム／ＰＥ（全てＷａｌｌａｃ／ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒから市販されている）であり、かつこれらのフルオロフォアの最小接近が５〜１０ｎＭ未満である場合のみ、実現され得る。これらのフルオロフォアは、アフィニティー標識、例えば、ＧＳＴ、またはエピトープ、例えば、ｍｙｃエピトープに特異的な抗体に結合させて添加できるか、あるいはＭｙｃまたはユビキチンに直接結合することができる（Ｗａｌｌａｃの特注サービス）。抗体に結合させる場合、フルオロフォアは反応完了後に添加する。さらに洗浄する必要はなく、シグナル（ＦＲＥＴ対がアロフィコシアニンとユーロピウムの場合、３４０ｎｍで励起して、６６５ｎｍで発光測定する）は、４℃で３０分インキュベートして、抗体の結合およびその後のフルオロフォア間のエネルギー移動を可能にした後、測定する。反応成分、すなわち、ユビキチンまたはＭｙｃを直接標識する場合、実時間測定を実施して、反応中の動力学的差異を検出することが可能である。
【００６１】
他の態様では、本発明の方法は、ハイスループット様式で実施する。例として、このようなアッセイは、９６ウェルまたは３８４ウェルプレートにおいて、適切な反応容量、例えば、５０μｌで、通常はＤＭＳＯに溶解した試験化合物の非存在下または存在下で実施する。スクリーニングアッセイの場合、陽性と同定された化合物は次に、ＴＲＩＭ３２活性の特異的阻害剤であること、および反応混合物中に存在するその他の酵素の阻害剤ではないことを確認する。このような２次アッセイは、ＷＯ２００５／１１３７８９で記載されたように実施することができる。
【００６２】
前述したようなアッセイ変法ｂ）は、ＴＲＩＭ３２タンパク質とアルゴノート−１−との相互作用に基づいている。
【００６３】
この実施形態では、ＴＲＩＭ３２またはアルゴノート−１と相互作用するＴＲＩＭ３２のドメイン、すなわちＮＨＬドメインを含有するか、またはそれから構成されるＴＲＩＭ３２の断片を直接、またはタグによって固体支持体に固定する。（適切なタグは、市販されており、例えば、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ＭＹＣ、ＨＩＳ、ＭＢＰタグなどである）。固体支持体の例は、それぞれのアフィニティー部分に対するリガンドを有する市販のイムノビーズ、イムノプレートまたはマイクロチップ、例えば、グルタチオンアガロースまたはセファロースビーズあるいはアフィニティー部分に対する抗体、例えば、市販の抗ＧＳＴ抗体などをコーティングしたマイクロタイタープレートである。
【００６４】
アルゴノート−１タンパク質、好ましくはヒトＡｇｏ−１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｑ９ＵＬ１８）またはＴＲＩＭ３２と相互作用するドメインを含有するか、またはそれから構成されるそれらの断片は、迅速な検出を可能にするために適した標識で修飾され（すなわち、放射標識、蛍光標識、ハプテン標識など）、試験化合物の存在下または非存在下でインキュベートする。適切な標識の例は、ユーロピウムまたはその他のランタニドのような市販の放射活性標識または蛍光標識、ハプテン標識、ペプチド標識または緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、酵素標識、例えば、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼなどである。
【００６５】
タンパク質の相互作用を可能にするインキュベート期間後、例えば、２５℃で約２０分後、固定したＴＲＩＭ３２に結合したアルゴノート−１の量を、前記に概略した標識を使用して、またはＥＬＩＳＡ型アッセイで適切な抗体を使用して測定する。このアッセイはまた、逆に設定することもでき、例えば、ＴＲＩＭ３２を標識して、アルゴノート−１を固定するか、溶液中で結合反応を実施し、その後固体支持体に成分の１つを捕捉させ、一緒に固定されたその他の成分の量を測定する。この種類の市販のアッセイの例は、標識としてユーロピウムまたは別のランタノイドを使用するＤｅｌｆｉａアッセイ（Ｗａｌｌａｃ／ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）である。
【００６６】
ＴＲＩＭ３２とアルゴノート−１との間の相互作用をベースにしたアッセイ変法ｂ）はまた、蛍光タンパク質対、例えば、ＣＦＰとＹＦＰを使用する蛍光共鳴エネルギー移動によって分子レベルでタンパク質相互作用を測定し、ＣＦＰの発光スペクトルがＹＦＰの励起スペクトルと著しく重複する前述したようなＦＲＥＴアッセイの様式であってもよい。ドナーＣＦＰタンパク質から発光して得られたエネルギーは、アクセプターＹＦＰタンパク質が極めて近くにあるとき、タンパク質を直接励起することができる。ＦＲＥＴ中には、ドナーＣＦＰタンパク質の発光の消光が生じ、これは、エネルギー移動の効率に直接関与し、ドナータンパク質と受容体タンパク質との間の距離の６乗に逆比例する。
【００６７】
ＣＦＰおよびＹＦＰを使用する代わりに、市販の合成フルオロフォア対、例えば、アロフィコシアニンとユーロピウム（Ｗａｌｌａｃ／ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用することができる。簡単に説明すると、組換えによって生じた結合パートナーのそれぞれはフルオロフォアに応じて、直接、または、アロフィコシアニンの場合は通常間接的に、フルオロフォアの１つで標識することができる。フルオロフォアの結合を容易にするために、タグ付けした相互作用相手（ＧＳＴ、Ｍｙｃ、Ｈｉｓ、ＭＢＴ）およびフルオロフォアを有する抗タグ抗体を使用してもよい。このようなアッセイは市販されており、例えば、ＬＡＮＣＥ  ＵＬＴＲＡ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）である。ＦＲＥＴをベースにしたアッセイは通常、インビトロで実施されるが、Ｈｅら、２００３によって記載されたように、生細胞中で実施することもできる。
【００６８】
類似のタイプのアッセイ方法は、Ａｌｐｈａ  Ｓｃｒｅｅｎ技術（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用し、ドナーおよび受容体ビーズの使用をベースにしている。シグナルは、ＦＲＥＴアッセイのように、いずれもビーズが結合できるタグを有する結合パートナーの物理的近接に応じる。このアッセイ技術は、相互作用の相手が極めて近くになくても、信頼できるシグナルが生じるという利点を備えている。
【００６９】
ＴＲＩＭ３２／アルゴノート−１相互作用に対する化合物の効果を測定する別のアッセイ系は、低濃度でも、蛍光標識されている結合相手の１つからの蛍光シグナルのゆらぎを測定する高分解能の空間的および時間的分析法である蛍光相関分光法（ＦＣＳ；Ｍａｇｄｅら、１９７４；Ｒｉｇｌｅｒら、１９９３；Ｍａｉｔｉら、１９９７）をベースにしている。その他の蛍光技術とは対照的に、第一に関心のあるパラメータは発光強度自体ではなく、自然発生的な強度のゆらぎである。ＦＣＳはよく確立された方法で、ハイスループットスクリーニングにおいても使用されてきた（ＥｉｇｅｎおよびＲｉｇｌｅｒ、１９９４；Ａｕｅｒら、１９９８；Ｒｏｇｅｒｓ、１９９７）。本発明の別の適切な方法は、ＦＣＳのさらなる発展である２色蛍光相互相関分光法（２色ＦＣＳ、Ｓｃｈｗｉｌｌｅら、１９９７；Ｋｅｔｔｌｉｎｇら、１９９８）を適用する。２種類の異なるフルオロフォアを一緒にするので、２色ＦＣＳは、分析速度、特異性および感度に関して従来のＦＣＳに改良を加えている。
【００７０】
さらに他の実施形態では、アッセイ方法は、ＦＣＳ技術から派生した、異なる蛍光標識を有する２種類の生体分子の同時運動を検出する蛍光相互相関分光法（ＦＣＣＳ）である。この方法は、例えば、Ｔｈｅｗｓら、２００５によって記載されているように、インビトロおよび生細胞中で実施することができる。ＦＣＳおよびＦＣＣＳのいずれについても、特殊な検出装置が市販されており、例えば、（Ｅｖｏｔｅｅ  Ｃｌａｒｉｎａ  ＩＩ）である。
【００７１】
別の実施形態では、ＴＲＩＭ３２とアルゴノート−１との間の相互作用に対する化合物の効果を検出するアッセイは、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイである。Ｂｉａｃｏｒｅバイオセンサーは広く使用されており、２分子が一緒に結合して、検出表面の質量の増加が生じたときに生じる屈折率の変化を検出し、それによって結合および解離現象を実時間で測定する、「表面プラズモン共鳴」と称される非標識技術に基づいている。
【００７２】
Ｂｉａｃｏｒｅ法の他に、その他の最近市販されている非標識光学的バイオセンサー技術（Ｃｏｏｐｅｒ、２００６に概説されている）も、本発明の方法におけるアッセイ様式として適しており、これは、例えば、特殊化したマイクロタイタープレート上に結合相手の１つを固定し、第２の相手を添加し、発生するシグナルを測定することによって、局所的な屈折率の変化を検出し、非標識結合パートナーの相互作用に対する化合物の効果のアッセイを可能にする、ＨＴＳ様式での方法である。このような系は、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｅｐｉｃ（商標）系として市販されており、共振導波路回折格子（ＲＷＧ）センサーは、タンパク質標的の共有結合を可能にする表面層で化学的に修飾される。この表面化学特性は、非特異的結合レベルが低く、結合能力が高い表面を形成する。結合パートナーの１つを固定した後、読み取り装置が基準測定値を得る。その後、その他のタンパク質が固定パートナーに結合すると、局所的屈折率の変化が誘導され、センサーから反射した光の波長の変化が生じる。この波長変化の大きさは、固定された結合パートナーに結合したタンパク質の量に比例する。
【００７３】
ＴＲＩＭ３２とアルゴノート−１との相互作用に対する試験化合物の効果を測定する別の市販の非標識系は、特殊化された検出装置を備えたマイクロタイタープレートから構成されるＳＲＵ  ＢＩＮＤ（商標）系である。フォトニック結晶光学バイオセンサーをマイクロプレートウェルの底面に組み込み、広い帯域の入射光波長で照射したとき、非常に狭い帯域の波長のみが反射するように設計されている。フォトニック結晶は、装置表面に共鳴結合した光をきつく限定し、バイオセンサー表面に生体分子が結合したとき、反射波長（「ピーク波長値」または「ＰＷＶ」）の変化が生じる。
【００７４】
別の適切な非標識法は、「バイオレイヤーインターフェロメトリ［ＢｉｏＬａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ）］」をベースにした、いわゆるＯｃｔｅｔ系（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用する。この系は、各センサーの先端に光学的コーティング層を有する使い捨てセンサーを使用する。この光学表面は、周囲の溶液の分子と相互作用できる生体適合性マトリクスでコーティングされている。次に、装置はバイオセンサーを白色光で照らし、反射した光を収集する。反射光の干渉パターンを、波長ピークおよびトラフの特徴プロファイルとして分光器によって捕捉する。生体分子がバイオセンサー表面に結合すると、厚さが増加し、結合は分光器における干渉パターンの変化を分析することによってモニターすることができる。
【００７５】
上述のアッセイは、ＨＴＳ様式に最もなじみやすく、したがって、ＴＲＩＭ３２／アルゴノート−１相互作用の調節因子をスクリーニングするために使用することができる。
【００７６】
別の実施形態では、本発明のアッセイは、ＴＲＩＭ３２のアルゴノート−１への結合が特定のマイクロＲＮＡへのアルゴノート−１の特異性および／または活性を変化させ得る効果に基づいていてもよい。神経幹細胞におけるＴＲＩＭ３２の発現は、マイクロＲＮＡ、１４６ｂ、４８９、６１５、２６ａ、１２９−３ｐ、３４ａおよび９２のレベルに影響を及ぼすことが見出されている。したがって、定量的ＰＣＲ、ノザンブロットまたはマイクロアレイによってｍｉＲＮＡレベルを測定すると、このような変化はＴＲＩＭ３２−Ａｇｏ１相互作用阻害の測定値となり得る。
【００７７】
さらに、本発明者らは、ＴＲＩＭ３２が特定のセットのｍｉＲＮＡに物理的に結合することを示すことができた。この発見はまた、試験化合物の存在下および非存在下でＴＲＩＭ３２を免疫沈降させ、その後、マイクロアレイ上の結合ｍＲＮＡＳの量を測定することよってＴＲＩＭ３２に対する化合物の効果を測定するアッセイのために利用することができる。［ｍｉＲＮＡは、ヌクレオチドの長さが約２２個で、標的ｍＲＮＡとの配列特異的塩基対形成によって遺伝子発現を調節すると考えられる非コーティングＲＮＡである。今まで、数百のｍｉＲＮＡが虫（ｗｏｒｍ）、ハエおよび哺乳類で同定されてきた。マイクロＲＮＡは、約８０塩基のステムループ構造を含有する長いＲＮＡ前駆体（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）として転写される。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、ＲｎアーゼＩＩＩ酵素ＤｒｏｓｈａおよびＤＧＣＲ８／Ｐａｓｈａによって核内で処理され、ステムループが切断され、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡが形成される。次に、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、エクスポーチン−５によって核から運び出される。細胞質において、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡはＲＮアーゼＩＩＩ  Ｄｉｃｅｒによって切断され、短いＲＮＡ２本鎖の一部として成熟ｍｉＲＮＡが生じる。このＲＮＡはその後巻き戻され、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれる。このＲＩＳＣ複合体は、アルゴノートファミリータンパク質を含有する。動物におけるマイクロＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域と不完全な塩基対を形成することによって標的遺伝子の効果的なｍＲＮＡ翻訳を阻害するか、または完全な塩基対を形成して標的ｍＲＮＡの分解を媒介することによって機能すると考えられる。マイクロＲＮＡ標的はあまり知られていないが、所与のｍｉＲＮＡについて１個から数百個の範囲の標的があると推定される。］
【００７８】
様々な病的状態において、特に神経幹（ＮＳ）細胞を使用した幹細胞移植治療の治療における可能性が期待されたにも関わらず、移植後の免疫拒絶の可能性に関連して、およびＥＳ細胞を得るためにヒト胚の使用に関する倫理上の問題のために、懸念が広がっている。後者の懸念は、成体幹細胞ではあまり重大とはならないが、関与する組織において増殖能力を維持し、かつ／または増加させるために、体内において成体幹細胞に直接作用し得る薬剤が必要である。
【００７９】
したがって、一実施形態では、対象において前駆細胞および幹細胞の増殖および／または分化能力を調節する方法であって、前記細胞における、ＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質ファミリーのタンパク質の発現および／または活性のレベルを調節する、治療有効量の薬剤および薬学的に許容される担体を投与することを含む方法を提供する。
【００８０】
本発明はまた、このような方法に有用な医薬組成物に関する。
【００８１】
幹細胞の増殖の促進の観点から、薬剤はＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質の阻害剤である。
【００８２】
特定の実施形態では、ＴＲＩＭ−ＮＨＬファミリーのタンパク質は、ＴＲＩＭ２、ＴＲＩＭ３、特にＴＲＩＭ３２から選択される。
【００８３】
治療上活性のある薬剤は、ＴＲＩＭ３２調節剤のインビトロ使用で前述した任意の薬学的に許容される薬剤であってもよい。したがって、特定の態様では、ＴＲＩＭ３２調節剤は、インビトロ阻害について前述したように、細胞においてＴＲＩＭ３２発現を妨害するか、または減少させるヌクレオチド型分子、例えば、アンチセンス、リボザイムもしくはｓｉＲＮＡ分子である。
【００８４】
ヌクレオチド型阻害剤をデリバリーする方法は当業界では周知である。
【００８５】
一実施形態では、ヌクレオチド型ＴＲＩＭ−ＮＨＬ阻害剤をコードする構築物は、形質移入によって、すなわち、「裸の」ＤＮＡまたはコロイド分散系との複合体のデリバリーによって、細胞にデリバリーされる。コロイド系には、高分子複合体、ナノカプセル、小球体、ビーズおよび、水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、デンドリマーおよびリポソームを含む脂質をベースにした系が含まれる。コロイド系は、脂質と複合した、またはリポソームで製剤化したヌクレオチド型阻害剤であってもよい。例えば、様々な脂質またはリポソーム物質による阻害剤の製剤化は、次に、公知の方法および物質を使用して実施し、受容体細胞または哺乳類にデリバリーすることができる。
【００８６】
本発明の好ましい方法では、核酸分子は、ウイルスベクターによってデリバリーされる。核酸は、遺伝子治療に有用な様々なウイルスベクター、例えば、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）または単純疱疹ウイルス−１のいずれかに組み込むことができる。
【００８７】
ウイルスによるデリバリーのため、レンチウイルスベクターは、初代細胞の感染に成功することが示されたので（Ｌｕｔｈｅｒ−Ｗｙｒｓｃｈら、２００１）、特に有用と考えられてきた。さらに、レンチウイルスベクターは既に、以下の特性によりインビボにおける遺伝子治療への応用に適していることがわかっている（Ｂｕｃｈｓｃｈａｃｈｅｒら、２０００、ＶａｎｄｅｎＤｒｉｅｓｓｃｈｅら、２００２）。レンチウイルス（レトロウイルスファミリーの１種である）は、染色体ＤＮＡに安定して組み込まれ、後成的にサイレンスされる傾向がほとんどないので、長期発現の可能性をもたらす。さらに、レンチウイルスベクターは、分裂細胞および非分裂細胞に効率よく形質導入することができる。
【００８８】
ＴＲＩＭ３２阻害を実現するために、ＴＲＩＭ３２阻害オリゴヌクレオチド分子をコードする発現カセットをレンチウイルスベクターに挿入する（Ｌｅｖｅｒ、１９９６、Ｆｏｌｌｅｎｚｉら、２００２）。次に、これらのベクターを標準的方法（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）によって特殊化したパッケージング細胞に形質移入し（Ｋａｆｒｉら、１９９９）、ヒト幹細胞感染のためのシュードタイプレンチウイルスを作製する。
【００８９】
ヌクレオチド型ＴＲＩＭ−ＮＨＬ阻害剤、例えば、ｓｉＲＮＡまたはそれをコードする核酸は、関心のある組織、すなわち、脳室下帯に局所的に投与することが好ましく、例えば、治療有効量のＴＲＩＭ３２ｓｉＲＮＡまたはそれをコードする核酸は、患者の脳に投与することができる。
【００９０】
ヌクレオチド型阻害剤をデリバリーする別の方法は、間葉幹細胞の骨形成分化を促進するために最近記載された３Ｄ組織工学足場に被包されたＤＮＡナノ粒子によるものである（Ｈｏｓｓｅｉｎｋｈａｎｉら、２００７）。
【００９１】
ヌクレオチド型阻害剤を関心のある成体幹細胞に標的化するために、ベクター構築物中で組織特異的プロモーターを使用することができる。これらの特異的プロモーターは、ヌクレオチド型阻害剤が関心のある幹細胞においてのみ確実に産生されるようにする。このようなプロモーターの例は、神経幹細胞用のネスチンプロモーターまたはＳｏｘ２プロモーター、筋肉幹細胞用のＰａｘ７プロモーターおよび皮膚幹細胞用のＰａｘ３プロモーターである。
【００９２】
ＴＲＩＭ−ＮＨＬ調節因子候補、例えば、阻害剤（ヌクレオチド型阻害剤または本発明のアッセイ方法で同定され、かつ／または最適化された低分子として設計された）が、例えば、神経幹細胞プールの維持のために効果的であるかどうか、およびどの濃度が効果的であるかを測定するために、Ｃｏｎｔｉら、２００５によって記載されたように神経幹細胞を培養物中に移す。候補化合物を試験するために、ニューロンの分化を適切な細胞培養条件によって誘導する。この過程は、効果的なＴＲＩＭ−ＮＨＬ阻害剤を添加することによって遮断されるだろう。様々な濃度の候補化合物を使用することによって、ニューロン分化を阻害することができる最少濃度を決定することができる。
【００９３】
対照的に、効果的な活性化因子は、細胞が通常幹細胞状態を維持する条件下であっても（すなわち、ＥＧＦおよびＦＧＦ−２による増殖条件下である）、ニューロン分化を誘導するであろう。ニューロン分化または幹細胞維持は、ネスチン（幹細胞マーカー）およびＴｕＪ１（ニューロンマーカー）に対する抗体で免疫蛍光染色することによって視覚化することができる。
【００９４】
ＴＲＩＭ−ＮＨＬの活性化因子は、未分化組織の過剰増殖が関与するとわかっている、または推測される疾患の治療に有用である。これには、限定はしないが、肺線維症およびその他の種類の繊維性疾患全てが含まれる。
【００９５】
この組織培養アッセイで測定された濃度は、動物実験および臨床試験の開始点として使用することができる。
【００９６】
神経幹細胞増殖および吻側細胞移動系による移動に対するＴＲＩＭ−ＮＨＬ調節因子のインビボ活性は、Ｈｏｅｇｌｉｎｇｅｒら、２００４、Ｗｉｎｎｅｒら、２００６によって記載されたようにドーパミン受容体アゴニストによる実験に類似した実験で試験することができる。その他のモデルは、Ｒ６／１もしくはＲ６／２モデルのようなハンチントン病マウスモデル（Ｌｉら、２００５によって概説されている）またはてんかんモデル（例えば、Ｍｏｒｇａｎら、２００６によって記載されている）に関与することができる。
【００９７】
ＴＲＩＭ−ＮＨＬ調節因子、特に阻害剤を含有する医薬組成物は、単位用量で調製し、投与することが好ましい。対象の治療のためには、例えば、ヒト対象に限定はしないが、化合物の活性、投与方法、障害の特性および重症度、患者の年齢および体重に応じて様々な１日用量が必要である。しかし、特定の環境下では、より多い、または少ない１日用量が適切であってもよい。１日用量の投与は、単一の用量単位もしくはいくつかのより少ない用量単位の形態で単回投与することによって、また細分割された用量を特定の間隔で複数回投与することによって、実施することができる。
【００９８】
医薬組成物は、全身的または局所的に、例えば、限定はしないが、関心のある組織に直接注射することによって投与することができる。組成物は一般的に、静脈内に、筋肉内に、植込錠として、または局所的に、例えば、皮膚病変に投与する。
【００９９】
適切な医薬品調製物の形態は、例えば、アンプル形態の注射可能な溶液、エマルジョン、懸濁液、クリーム、エアロゾル、活性化合物を持続的に放出する調製物である。
【０１００】
ＴＲＩＭ−ＮＨＬ調節因子およびそれらを含有する医薬組成物は、様々な種類の幹細胞に対するインビトロおよびインビボ適用に有用である。例は、限定はしないが、血液細胞を生じる造血幹細胞、例えば、骨の細胞（骨細胞）および軟膏の細胞（軟骨細胞）を生じる骨髄間質細胞（間葉幹細胞）、多分化能末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）、肝細胞、心筋細胞、神経細胞および筋肉細胞を生じる能力を有する成人骨髄幹細胞、神経細胞（ニューロン）および非ニューロン細胞（星状膠細胞および乏突起膠細胞）を生じる脳内の神経幹細胞、例えば、吸収細胞、杯状細胞、パネート細胞および腸内分泌細胞を生じる上皮幹細胞、皮膚幹細胞（角化細胞を生じる上皮幹細胞および毛嚢を生じる濾胞幹細胞）、臍帯血幹細胞、膵内分泌ホルモン産生細胞を生じる肝幹細胞、島細胞を生じる膵臓幹細胞および前駆細胞、目の幹細胞および前駆細胞（角膜および網膜幹細胞）、中胚葉性血管芽（血管関連幹細胞）である。
【０１０１】
例として、骨髄細胞および臍帯血幹細胞は白血病、多発骨髄腫およびリンパ腫などの血液疾患の治療に有用である。
【０１０２】
骨髄および末梢血から得られる幹細胞は、重篤な虚血性心疾患を治療するために冠状動脈または心筋に直接注射することができ、移植可能な細胞には骨髄の間葉幹細胞および末梢血のＣＤ３４＋細胞が含まれる。治療の利点は、心筋の血管新生の増加および新たな心筋細胞の形成であってもよい。
【０１０３】
神経幹細胞に対するＴＲＩＭ−ＮＨＬ阻害剤の適用は、パーキンソン病、アルツハイマー病、統合失調症、ハンチントン病のような神経変性疾患の治療、損傷からの神経系の再生ならびに筋ジストロフィーの治療および創傷治癒のために有益であり得る。これらの疾患の多くでは、この薬剤は病変部位に直接注射することによって適用される。しかし、血流への適用または軟膏としての適用（例えば、皮膚の治癒のため）も可能である。この薬剤の投薬量はナノモルからピコモルの範囲内であるべきである。
【０１０４】
膵臓の幹細胞または前駆細胞の適用は、１型糖尿病の治療に見込みがある。目の幹細胞への適用は、角膜および網膜の変性疾患、例えば、黄斑変性のために示唆されてきた。中胚葉性血管芽幹細胞は、イヌでの実験が成功した後、筋ジストロフィーの治療に非常に有望で、皮膚幹細胞（上皮および濾胞幹細胞）は創傷治癒および脱毛に有望である。
【０１０５】
他の態様では、本発明は、ＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質の生物学的機能の調節因子を作製するための、
ａ）配列番号１、配列番号３もしくは配列番号５のＤＮＡ分子、または配列番号２、配列番号４もしくは配列番号６のＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質と少なくとも約８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする変異体、またはそれらの断片またはそれらの相補体、あるいは、
ｂ）配列番号２、配列番号４もしくは配列番号６のＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質または少なくとも約８０％の同一性を有する変異体またはそれらの断片の使用に関する。
【０１０６】
特に、この使用は、幹細胞の維持に有用なＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質阻害剤の作製に関する。
【０１０７】
本発明は主にヒト幹細胞および前駆細胞に対する適用のために考慮され、開発されているが、動物細胞への適用のためにも有用である。ヒトＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質の調節因子、例えば、低分子ＴＲＩＭ３２阻害剤も動物細胞、例えば、マウス幹細胞に効果的であることが決定されて、このような調節因子は、例えば、マウス幹細胞を維持するために培地中に組み込むことができる。あるいは、それぞれのマウスＴＲＩＭ−ＮＨＬタンパク質ホモログに特異的なヌクレオチド阻害剤を設計することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】非対称的および対称的細胞分裂中のＴＲＩＭ３２の分布を比較した図である。
【図２】ＴＲＩＭ３２による神経分化の誘導およびＴＲＩＭ３２ＲＮＡｉによる分化の阻害を示した図である。
【図３】ＴＲＩＭ３２によるＭｙｃユビキチン化を示した図である。
【図４】アルゴノート１へのＴＲＩＭ３２の結合およびマイクロＲＮＡに対する効果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【０１０９】
材料および方法
実施例において、特に記載がなければ、以下の材料および方法を使用する。
【０１１０】
ｉ）組織化学
パラホルムアルデヒド固定胚の１０μｍ凍結切片に対する免疫組織化学は、Ｃａｌｅｇａｒｉら、２００２によって記載されたように実施する。
【０１１１】
胚は、１２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４に溶かした４％パラホルムアルデヒドで４℃で一晩固定し、ＰＢＳに溶かした３０％スクロースで平衡化し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋに包埋する。凍結切片（１０μｍ）を調製し、ＰＢＳに溶かした０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過処理し、ＮＨ４Ｃｌ  １０ｍＭで消光し、標準的方法にしたがって免疫組織化学を行う。ＬＳＭソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）を使用して画像を収集し、限定した領域の蛍光を、ＩＭＡＧＥ  Ｊソフトウェアを使用して定量する。
【０１１２】
ｉｉ）神経幹細胞の形質移入
神経幹細胞は、子宮内エレクトロポレーションによって形質移入する（Ｓｈｕら、２００６）。エレクトロポレーション後、完全な脳を分解し、分離した細胞を、Ｌ−グルタミン  ２ｍＭ、ペニシリン  １００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン  １００μｇ／ｍｌ、ｂＦＧＦ−２  １０ｎｇ／ｍＬ、ＥＧＦ  １０ｎｇ／ｍｌを含み、１％  Ｎ２を補充したＮＳＡ培地中で培養する。エレクトロポレーションおよび培養のプロセスは、既に記載されている（Ｓｈｉｕら、２００６）、形質移入して４日後または６日後、細胞を４％ＰＦＡで固定し、免疫組織化学のために処理する。以下の抗体、抗ネスチン抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗ＴｕＪ１抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ）を免疫組織化学のために使用する。
【０１１３】
以下のプラスミド、ＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ＥＧＦＰ−ＴＲＩＭ３２（ｐｃＤＮＡ３．１ベクター、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＴＲＩＭ３２−ＲＮＡｉ（ｐＳＭ２ベクター、Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用する。
【０１１４】
ｉｉｉ）細胞培養
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０％熱不活性化ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン  ２ｍＭ、ペニシリン  １００Ｕ／ｍｌおよびストレプトマイシン  １００μｇ／ｍｌを補充したＤＭＥＭで増殖させる。製造者の指示にしたがってＦｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ）で形質移入する。
【０１１５】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、形質移入して４８時間後、溶解緩衝液１［ＰＢＳに溶かした２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびコンプリートプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）］で４℃で３０分間溶解する。プロテオソームを阻害するため、薬剤クラスト−ラクタシスチンβ−ラクトン（β−ラクトン、Ｓｉｇｍａ）を指示通り使用する。ウェスタンブロットには、以下の抗体、抗Ｍｙｃ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＨＡ抗体（Ｒｏｃｈｅ）、抗Ａｇｏ１抗体（ラットポリクローナル抗体）、抗ＴＲＩＭ３２抗体（実施例１参照）を使用する。
【０１１６】
ｉｖ）ｍＲＮＡ実験
神経幹細胞は、前述のように、ＥＧＦＰまたはＥＧＦＰ−ＴＲＩＭ３２用のベクターで形質移入する。培養して４日後、形質移入した細胞を蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）によって収集する。これらの細胞から、全ＲＮＡをｍｉＲＮｅａｓｙキット（Ｑｕｉａｇｅｎ）で単離する。これらの試料から、別個に調節されたｍｉＲＮＡをＬＮＡ（ロックド核酸）マイクロアレイ（Ｅｘｉｑｏｎ）によって測定する。
【実施例１】
【０１１７】
ＴＲＩＭ３２の非対称的分布
胚性マウス脳は胎生１２．５日目（Ｅ１２．５）に採取し、固定して（５％パラホルムアルデヒドで１６時間）脱水した後（２０％スクロースで１６時間）、脳を厚さ１０μｍの切片にスライスする。発生中の前脳の脳室帯における分裂神経幹細胞は、細胞の輪郭を強調するアクチン繊維を染色するためにファロイジン−アレキサ（Ａｌｅｘａ）−５５５で染色し、ＤＮＡを標識するためにＨＯＥＣＨＳＴで染色し、ＴＲＩＭ３２に対する抗体で染色する。抗体は、ＴＲＩＭ３２ペプチド鎖（配列のアミノ酸２５からアミノ酸３９）でウサギを免疫処置して、得られた血清をアフィニティー精製することによって生成する。
【０１１８】
ニューロンを生成するために、神経幹細胞は非対称的に分裂することができる（水平分裂面で）。このような神経形成細胞分裂においては、より頂端側の娘細胞が幹細胞の特性を保持し、一方、より基底側の娘細胞は細胞周期を離れ、分裂終了ニューロンになる。この染色によって、ＴＲＩＭ３２は通常、基底側の娘細胞に豊富で、したがって、ニューロンになる細胞では非対称的に分離されることが示される。神経幹細胞はまた、対称的に分裂することができる（水平分裂面で）。このような対称的な細胞分裂の２個の娘細胞はいずれも幹細胞の特性を保持する。図において（図１）、非対称（頂端側および基底側の娘細胞）および対称（内側および外側の娘細胞）細胞分裂におけるＴＲＩＭ３２の分布を比較する。ＴＲＩＭ３２は対称細胞分裂では均一に分布し、一方、非対称細胞分裂では基底側の娘細胞に豊富であることが示される。したがって、ＴＲＩＭ３２の基底側への局在は、基底娘細胞がニューロンに分化する指標となるシグナルであると推測できる。
【実施例２】
【０１１９】
ＴＲＩＭ３２による神経分化の誘導およびＴＲＩＭ３２ＲＮＡｉによる分化の阻害。
ＴＲＩＭ３２が神経幹細胞の運命にどのような影響を及ぼすかを調べるために、これらの細胞を機能獲得型のＴＲＩＭ３２構築物（ＥＧＦＰタグＴＲＩＭ３２の発現ベクター、Ｅ／ＴＲＩＭ３２）および機能欠如型のＴＲＩＭ３２構築物（ＴＲＩＭ３２に特異的な低分子ヘアピン型ＲＮＡの発現ベクター、ＴＲＩＭ３２−ＲＮＡｉ）で形質移入する。対照として、ＮＳＣをＥＧＦＰ発現プラスミドで形質移入する。これらの実験で明らかにすべき問題は、機能を獲得した、または機能を欠如したＴＲＩＭ３２がＮＳＣの分化状態に影響を及ぼすかどうかである。
【０１２０】
ＮＳＣを子宮内（ｉｎ  ｕｔｅｒｏ）エレクトロポレーションによって形質移入し、その後、ニューロン分化を可能にする限定された培養条件下（以前にＳｈｕら、２００６によって記載された通りである）で４日間（図２ａおよびｂ）または６日間（図２ｃおよびｄ）インキュベートする。このインキュベーションの後、細胞を固定し、形質移入された細胞の分化状態をネスチン（幹細胞マーカーとして役立つ中間径繊維タンパク質）またはＴｕＪ１（ニューロンに特異的なチューブリンアイソフォーム、したがって、この染色はニューロンマーカーとして役立つ）に対する抗体で免疫蛍光染色することによって測定する。
【０１２１】
４日間培養後、ＴＲＩＭ３２を発現するほんの少数の細胞がまだ幹細胞であり、一方、ＥＧＦＰまたはＴＲＩＭ３２−ＲＮＡｉを発現する細胞のほぼ７５％がまだ幹細胞である（ａ）。このＴＲＩＭ３２を発現する細胞の約５０％がニューロンに分化することとは対照的に、ＥＧＦＰまたはＴＲＩＭ３２−ＲＮＡｉを発現する細胞は少数のみがニューロンの特性を示す（ｂ）。４日間培養後、ＥＧＦＰを発現する細胞とＴＲＩＭ３２−ＲＮＡｉを発現する細胞との間には運命の違いはなく、したがって、ＴＲＩＭ３２が存在しなくても細胞の運命には影響はないものと考えられる。しかし、分化を可能にする条件下において６日後、ＴＲＩＭ３２非存在の影響が明らかになる。６日後、ＥＧＦＰ発現細胞の２５％がまだ幹細胞である一方、ＴＲＩＭ３２を発現しない細胞（ＴＲＩＭ３２−ＲＮＡｉ）の５０％超はまだ幹細胞状態である（ｃ）。さらに、ＥＧＦＰを発現する細胞の約２５％超がニューロンに分化する一方、ＴＲＩＭ３２−ＲＮＡｉを発現する細胞の１０％未満がニューロン分化を示す（ｄ）。この結果から、ＴＲＩＭ３２活性はニューロンへの分化を促進し、一方、ＴＲＩＭが存在しないと幹細胞特性の維持に有利であると結論づけられる。
【実施例３】
【０１２２】
Ｍｙｃユビキチン化
以前の実験から、ＴＲＩＭ３２は神経幹細胞においてニューロンの運命を誘導できることが明らかになる。解明する必要がある次の問題は、この機能を実現するためにどの機構がＴＲＩＭ３２によって利用されるかである。ＴＲＩＭ３２が過剰発現すると、転写因子および癌遺伝子Ｍｙｃが陽性のいわゆるアグリソームの形成が認められ得る（データは示さず）。ＴＲＩＭ３２はＲｉｎｇフィンガードメインを有し、それによってユビキチンリガーゼとして機能する潜在力があるので、ＴＲＩＭ３２がＭｙｃをユビキチン化するかどうかを試験し、それによってユビキチン−プロテオソーム系（ＵＰＳ）による分解について注目する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、ＨＡ−ユビキチン、ＥＧＦＰ、ＴＲＩＭ３２およびＭｙｃの発現プラスミドは図３に示したように一緒に発現する。ＭｙｃがＴＲＩＭ３２によってユビキチン化されるならば、ＵＰＳの阻害は高分子量型のＭｙｃ［Ｍｙｃ−（ユビキチン）ｎ］の蓄積を導くだろう。したがって、形質移入した細胞においてＵＰＳは、図３に示したようにクラスト−ラクタシステイン（Ｃｌａｓｔｏ−Ｌａｃｔａｃｙｔｅｉｎ）β−ラクトン（β−ラクトン）で処理することによって阻害される。Ｍｙｃを抗Ｍｙｃ抗体で予め沈殿させた後、Ｍｙｃ関連ユビキチンを抗ＨＡ抗体で検出する（上のパネル）。ＴＲＩＭ３２が存在しないと、ほんの少量のポリユビキチン化Ｍｙｃが検出され得る（レーン１および２）。これとは対照的に、ＴＲＩＭ３２が発現し、ＵＰＳが阻害されないと、ポリユビキチン−Ｍｙｃは検出できず、これは、ＵＰＳが活性である限りＴＲＩＭ３２が触媒するユビキチン化がＭｙｃの分解を導くためである（第２のパネルにおいて、ＴＲＩＭ３２の発現後Ｍｙｃレベルが減少することを参照せよ）。しかし、ＴＲＩＭ３２が発現し、ＵＰＳが阻害されると、ポリユビキチン化Ｍｙｃの大量の蓄積が認められ得る。
【０１２３】
これらの実験によって、ＴＲＩＭ３２はＭｙｃをユビキチン化し、それによって、ＵＰＳによる分解のためにＭｙｃを標識することが明らかに示される。
【実施例４】
【０１２４】
アルゴノート１へのＴＲＩＭ３２の結合およびマイクロＲＮＡに対する効果
ＴＲＩＭ３２が細胞で発現するとき、通常、細胞質の明瞭に強調された箇所に局在する。この分布は、タンパク質アルゴノート−１（Ａｇｏ１）の局在パターンと似ている。したがって、ＥＧＦＰタグＴＲＩＭ３２およびＭｙｃタグＡｇｏ１は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞で一緒に発現させる。興味深いことに、ＴＲＩＭ３２陽性箇所とＡｇｏ１陽性箇所が完全に一緒に局在することが見出された。この局在の一致が実際に物理的な相互作用を示すかどうかをさらに明らかにするために、胚性マウス脳（Ｅ１４．５）からタンパク質抽出物を調製し、ＴＲＩＭ３２およびＡｇｏ１を特異的抗体でこれらの脳から沈殿させる。対照ＩＰとして、対応するＴＲＩＭ３２ペプチドで既に遮断したＴＲＩＭ３２抗体を使用する。抗ＴＲＩＭ３２抗体で沈殿させた後、Ａｇｏ１を検出することができ、Ａｇｏ１で沈殿後はＴＲＩＭ３２を検出することができる。これらの結果は、ＴＲＩＭ３２およびＡｇｏ１が互いに相互作用することを示している（図４ａ）。Ａｇｏ１タンパク質は、ＲＩＳＣの一部で、この複合体はマイクロＲＮＡ経路の必須成分である。したがって、ＴＲＩＭ３２の発現が特異的ｍｉＲＮＡのレベルを調節するかどうかを試験する。このために、神経幹細胞を前述のようにＥＧＦＰまたはＥＧＦＰタグＴＲＩＭ３２用の発現プラスミドで形質移入する。４日間培養後、形質移入した細胞のｍｉＲＮＡプロファイルをｍｉＲＣＵＲＹ  ＬＮＡアレイマイクロＲＮＡ（Ｅｘｉｑｏｎ）で測定する。検出したｍｉＲＮＡのほとんどは発現レベルに変化がないが、ｍｉＲＮＡの１４６ｂ、４８９および６１５は著しく下方制御されており（図４ｂ）、一方、ｍｉＲＮＡの２６ａおよび１２９−３−ｐは著しい上方制御を示す（図４ｃ）。これらの結果は、定量的ＰＣＲ法によって確認される（データは示さず）。
【０１２５】
これらの実験は、ＴＲＩＭ３２がアルゴノート−１タンパク質と相互作用し、それによって特異的なマイクロＲＮＡのレベルを調節することを示している。
【０１２６】
参考文献
【表１】
0005395084.tif 000002
【表２】
0005395084.tif 000003
【表３】
0005395084.tif 000004
【表４】
0005395084.tif 000005
【図１】
0005395084.tif 000006
【図２−１】
0005395084.tif 000007
【図２−２】
0005395084.tif 000008
【図３】
0005395084.tif 000009
【図４】
0005395084.tif 000010
【配列表】
0005395084000001.app