(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＲＨ１関連視覚状態を治療するための薬剤であって、
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡ、及び薬学的に許容される担体を含み、前記干渉ＲＮＡが
配列番号２及び配列番号１３〜配列番号５０のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端の最後から２番目からの１３ヌクレオチドと少なくとも９０％の配列相補性、又は少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続したヌクレオチドの領域、
配列番号２及び配列番号１３〜配列番号５０のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端の最後から２番目からの１４ヌクレオチドと少なくとも８５％の配列相補性、又は少なくとも８５％の配列同一性を有する少なくとも１４個の連続したヌクレオチドの領域、及び
配列番号２及び配列番号１３〜配列番号５０のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端の最後から２番目からの１５、１６、１７、又は１８ヌクレオチドのそれぞれと少なくとも８０％の配列相補性、又は少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１５、１６、１７、又は１８個の連続したヌクレオチドの領域からなる群から選択されるＲＮＡを含み、
ヒスタミン受容体Ｈ１のｍＲＮＡの発現がそれによって減弱する上記薬剤。
【請求項２】
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有し、配列番号２及び配列番号１３〜配列番号５０のいずれか１つに対応する第二のｍＲＮＡの３’末端の最後から２番目からの１３ヌクレオチドと少なくとも９０％の配列相補性、又は少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続したヌクレオチドの領域を含む第二の干渉ＲＮＡをさらに含む、請求項１に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒスタミン受容体Ｈ１（ＨＲＨ１）関連状態を治療するための干渉ＲＮＡ組成物の分野に関する。このような状態には、例えばアレルギー性結膜炎、眼炎症、皮膚炎、鼻炎、喘息、又はアレルギーがある。
【背景技術】
【０００２】
アレルギー性結膜炎、眼炎症、皮膚炎、鼻炎、喘息、及びアレルギーは歴史的に、経口、鼻腔内又は局所抗ヒスタミン剤、又は経口又は鼻腔内ステロイド剤、或いはアレルギーの場合、アレルゲン注射治療のレジメンで治療されてきた。全身治療は、典型的には、高濃度の薬剤化合物を投与して有効濃度を必要な治療部位に到達させることを必要とする。抗ヒスタミン剤化合物は中枢神経系活性を有することが知られており、眠気及び粘膜の乾燥は抗ヒスタミン剤使用の一般的な副作用である。
【０００３】
組織のヒスタミン受容体Ｈ１とのヒスタミンの結合は、例えば血管漏出（浮腫）、平滑筋収縮（気管支収縮）、又は神経線維活性化（掻痒症、くしゃみ）をもたらす。ＰＡＴＡＮＯＬ（登録商標）及びＥＭＡＤＩＮＥ（登録商標）を含めた多くの薬剤は、この受容体と結合することによってそれらの治療効果の一部又は全部を発揮する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
さらなる作用物質及び治療法は、ヒスタミンＨ１受容体を標的とし、全身抗ヒスタミン剤治療の副作用を避けながら、それによって局部環境中の内因性ヒスタミンの作用を遮断するのに望ましいはずである。本発明の実施形態は、このような作用物質及び治療法に関する当技術分野の必要性に対処するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の実施形態は、ＨＲＨ１関連状態の非常に強力且つ有効な治療、予防又は介入を提供することによって、従来技術のこれら及び他の欠点を克服する。一態様では、本発明の方法は、ＨＲＨ１のｍＲＮＡの発現を抑制する干渉ＲＮＡを投与し、それによってＧタンパク質共役受容体シグナル伝達経路に干渉し、ＨＲＨ１関連状態におけるヒスタミン介在型炎症応答と関係がある一連の事象を妨げることにより、ＨＲＨ１関連状態を有するか又はＨＲＨ１関連状態を発症する危険性がある対象を治療することを含む。
【０００６】
本発明は、ＨＲＨ１のｍＲＮＡを標的としそれによってＨＲＨ１のｍＲＮＡの発現に干渉する干渉ＲＮＡを対象とする。本発明の干渉ＲＮＡは、ＨＲＨ１関連状態を有するか又はＨＲＨ１関連状態を発症する危険性がある患者を治療するのに有用である。
【０００７】
本発明の一実施形態は、対象のヒスタミン受容体Ｈ１のｍＲＮＡの発現を減弱させる方法であって、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡ、及び薬学的に許容される担体を含む組成物を対象に投与することを含む方法である。ヒスタミン受容体Ｈ１のｍＲＮＡの発現はそれによって減弱する。
【０００８】
本発明の他の実施形態は、治療の必要がある対象におけるＨＲＨ１関連状態を治療する方法である。この方法は、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡ、及び薬学的に許容される担体を含む組成物を対象に投与することを含む。ＨＲＨ１関連状態はそれによって治療される。一実施形態では、対象はヒトであり、ヒトはＨＲＨ１関連状態を有し、他の実施形態では、対象はヒトであり、ヒトはＨＲＨ１関連状態を発症する危険性がある。
【０００９】
前述の実施形態に関して、干渉ＲＮＡは、配列番号２及び配列番号１３〜配列番号５０のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端の最後から２番目からの（ｐｅｎｕｌｔｉｍａｔｅ）１３ヌクレオチドと少なくとも９０％の配列相補性、又は少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続したヌクレオチドの領域を含む。
【００１０】
前述の方法の他の実施形態では、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有し配列番号２及び配列番号１３〜配列番号５０のいずれか１つに対応する第二のｍＲＮＡの３’末端の最後から２番目からの１３ヌクレオチドと少なくとも９０％の配列相補性、又は少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続したヌクレオチドの領域を含む第二の干渉ＲＮＡを、組成物はさらに含む。
【００１１】
本発明のさらに他の実施形態では、対象のヒスタミン受容体Ｈ１のｍＲＮＡの発現を減弱させる方法は、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡ、及び薬学的に許容される担体を含む組成物を対象に投与することを含み、干渉ＲＮＡはセンスヌクレオチド鎖、アンチセンスヌクレオチド鎖、及び少なくとも１９ヌクレオチドの少なくとも完全に近い連続した相補性のある領域を含み、アンチセンス鎖は配列番号１に対応するｍＲＮＡの一部分と生理的条件下でハイブリダイズし、配列番号１に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズ部分と少なくとも１９ヌクレオチドの少なくとも完全に近い連続した相補性のある領域を有する。ヒスタミン受容体Ｈ１のｍＲＮＡの発現はそれによって減弱する。
【００１２】
治療の必要がある対象におけるＨＲＨ１関連状態を治療する方法は、本発明の一実施形態であり、この方法は１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡ、及び薬学的に許容される担体を含む組成物を対象に投与することを含み、干渉ＲＮＡはセンスヌクレオチド鎖、アンチセンスヌクレオチド鎖、及び少なくとも１９ヌクレオチドの少なくとも完全に近い連続した相補性のある領域を含み、アンチセンス鎖は配列番号１に対応するｍＲＮＡの一部分と生理的条件下でハイブリダイズし、配列番号１に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズ部分と少なくとも１９ヌクレオチドの少なくとも完全に近い連続した相補性のある領域を有する。ＨＲＨ１関連状態はそれによって治療される。
【００１３】
前述の方法では、干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖を、ヌクレオチド２８５、３２４、４１０、５８１、５８４、６６０、６７２、８０１、８１７、１０４５、１０５９、１０８９、１１５７、１２０９、１２２３、１２４１、１２５３、１２６５、１３６３、１３９１、１４８８、１５２１、１６２４、１６７０、１６７３、１７８４、１８７３、１８７５、１９８５、２０８６、２０８７、２２２６、２２９７、２４２０、２４２１、２４８５、２６０３、２６４７、又は３４３１を含む配列番号１に対応するｍＲＮＡを標的とするように設計する。
【００１４】
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する第二の干渉ＲＮＡを対象に投与することもでき、この第二の干渉ＲＮＡは、センスヌクレオチド鎖、アンチセンスヌクレオチド鎖、及び少なくとも１９ヌクレオチドの少なくとも完全に近い相補性のある領域を含み、第二の干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号１に対応するｍＲＮＡの第二の部分と生理的条件下でハイブリダイズし、アンチセンス鎖は、配列番号１に対応するｍＲＮＡの第二のハイブリダイズ部分と少なくとも１９ヌクレオチドの少なくとも完全に近い連続した相補性のある領域を有する。
【００１５】
対象のヒスタミン受容体Ｈ１のｍＲＮＡの発現を減弱させる方法であって、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の一本鎖干渉ＲＮＡ、及び薬学的に許容される担体を含む組成物を対象に投与することを含み、一本鎖干渉ＲＮＡが、上記で特定したヌクレオチドを含む配列番号１に対応するｍＲＮＡの一部分と生理的条件下でハイブリダイズする方法は、本発明の他の実施形態である。
【００１６】
治療の必要がある対象におけるＨＲＨ１関連状態を治療する方法は、本発明の一実施形態である。この方法は、ＲＮＡ干渉によってＨＲＨ１遺伝子の発現を下方制御する二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含む組成物を対象に投与することを含み、ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は独立して約１９〜約２７ヌクレオチドの長さであり、ｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖はＨＲＨ１遺伝子に対応するｍＲＮＡと実質的相補性を有するヌクレオチド配列を含み、その結果ｓｉＲＮＡ分子はＲＮＡ干渉によるｍＲＮＡの切断を誘導する。この方法の他の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は独立して約１９ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドの長さ、又は約１９ヌクレオチド〜約２１ヌクレオチドの長さである。
【００１７】
ＲＮＡ干渉によってＨＲＨ１遺伝子の発現を下方制御する二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含む組成物は、本発明の一実施形態である。ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は独立して約１９〜約２７ヌクレオチドの長さであり、ｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖はＨＲＨ１遺伝子に対応するｍＲＮＡと実質的相補性を有するヌクレオチド配列を含み、その結果ｓｉＲＮＡ分子はＲＮＡ干渉によるｍＲＮＡの切断を誘導する。この組成物の他の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は独立して約１９ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドの長さ、又は約１９ヌクレオチド〜約２１ヌクレオチドの長さである。
【００１８】
本発明はさらなる実施形態として、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する干渉ＲＮＡを含み、配列番号２及び配列番号１３〜配列番号５０のいずれか１つに対応するヌクレオチド配列、又はその相補配列、及び薬学的に許容される担体を含む組成物を含む。
【００１９】
本明細書に示すＨＲＨ１のｍＲＮＡの発現を減弱させるための薬剤を調製する際の、本明細書に記載する実施形態のいずれかの使用も、本発明の一実施形態である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本明細書に列挙する参照文献は、それらが本明細書に示すものを補足する例示的手順又は他の詳細を提供する程度で、具体的に参照により本明細書に組み込まれる。
【００２１】
当業者は、本開示に照らして、本明細書に開示する実施形態の明らかな改変を、本発明の精神及び範囲から逸脱せずに作成することができることを理解するはずである。本明細書に開示する全ての実施形態は、本開示に照らして過度の実験なしで作成し実施することができる。本発明の全範囲は、本開示及びその同等の実施形態中に示される。本明細書を、本発明が権利を与えられた全保護範囲を過度に狭めるものとして解釈すべきではない。
【００２２】
本明細書で使用するように、且つ他に示さない限り、用語「ａ」及び「ａｎ」は「１つ」、「少なくとも１つ」或いは「１つ又は複数」を意味すると考える。
【００２３】
本明細書で使用する用語「ＨＲＨ１関連状態」は、アレルギー性結膜炎、眼炎症、皮膚炎、鼻炎、喘息、及びアレルギーなどの状態と関係があるヒスタミン介在型の炎症応答を含み、ＨＲＨ１関連状態を直接的又は間接的にもたらすＨＲＨ１−ｍＲＮＡの発現から生じる細胞の変化を含む。本明細書で提供する干渉ＲＮＡは、非特異的物質による望ましくない副作用を回避しながら、このようなサイレンシングをもたらす。
【００２４】
本明細書で使用する用語「アレルギー性結膜炎」は、まぶたの裏を覆い強膜の露出表面を覆うデリケートな膜である結膜の炎症を指す。用語「アレルギー性結膜炎」は、例えばアトピー性角結膜炎、巨大乳頭結膜炎、枯草熱結膜炎、通年性アレルギー性結膜炎、及び春季性角結膜炎を含む。
【００２５】
本明細書で使用する用語「皮膚炎」は皮膚の炎症を指し、例えばアレルギー性接触皮膚炎、蕁麻疹、乾皮性皮膚炎（下肢における乾燥皮膚）、アトピー性皮膚炎、刺激性接触皮膚炎及びウルシオール誘導性接触皮膚炎を含めた接触皮膚炎、湿疹、沈下性皮膚炎、貨幣状皮膚炎、外耳炎、口囲皮膚炎、及び脂漏性皮膚炎を含む。
【００２６】
本明細書で使用する用語「鼻炎」は鼻の粘膜の炎症を指し、例えばアレルギー性鼻炎、アトピー性鼻炎、刺激性鼻炎、エオシン好性非アレルギー性鼻炎、薬物性鼻炎、及び好中性鼻副鼻腔炎を含む。
【００２７】
本明細書で使用する用語「喘息」は、鼻及び口から肺に空気を運ぶ気道の狭窄をもたらす気道の炎症を指し、例えばアレルギー性喘息、アトピー性喘息、アトピー性気管支ＩｇＥ介在型喘息、気管支喘息、細気管支炎、気腫性喘息、本態性喘息、運動誘発性喘息、環境要因によって引き起こされる外因性喘息、初期喘息、病態生理的障害によって引き起こされる内因性喘息、非アレルギー性喘息、非アトピー性喘息、及び呼吸困難な幼児の症候群を含む。
【００２８】
語句「（配列識別子）のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端の最後から２番目からの１３ヌクレオチドと少なくとも９０％の配列相補性、又は少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続したヌクレオチドの領域」は、１つのヌクレオチド置換を与える。２つのヌクレオチド置換（即ち、１１／１３＝８５％の同一性／相補性）は、このような語句には含まれない。
【００２９】
用語「同一率」は、第二の核酸分子中の同じ長さの一組の連続したヌクレオチドと同じである第一の核酸分子中の連続したヌクレオチドの割合を記載する。用語「相補率」は、第二の核酸分子中の一組の連続したヌクレオチドとワトソン−クリックの意味において塩基対形成することができる、第一の核酸分子中の連続したヌクレオチドの割合を記載する。
【００３０】
「ハイブリダイゼーション」は、相補的又はほぼ相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸が相互作用して、ハイブリッドと呼ばれる水素結合複合体を形成するプロセスを指す。ハイブリダイゼーション反応は高感度且つ選択的である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、ハイブリダイゼーションの特異性（即ち、ストリンジェンシー）は、例えばプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション溶液中の塩又はホルムアミドの濃度によって、及びハイブリダイゼーション温度によって制御され、このような手順は当技術分野でよく知られている。特に、塩の濃度を低下させること、ホルムアミドの濃度を増大させること、又はハイブリダイゼーション温度を上昇させることによってストリンジェンシーが増大する。
【００３１】
例えば、高ストリンジェンシー条件は約５０％のホルムアミド、３７℃〜４２℃で生じる可能性がある。低ストリンジェンシー条件は約３５％〜２５％のホルムアミド、３０℃〜３５℃で生じる可能性がある。ハイブリダイゼーションに関するストリンジェンシー条件の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ、１９８９、「分子クローニング：研究室用マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．中に与えられている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の他の例には、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ  ｐＨ６．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃又は７０℃で１２〜１６時間、次いで洗浄、或いは１×ＳＳＣ中７０℃又は１×ＳＳＣ、５０％のホルムアミド中５０℃におけるハイブリダイゼーション、次いで０．３×ＳＳＣ中７０℃での洗浄、或いは４×ＳＳＣ中７０℃又は４×ＳＳＣ、５０％のホルムアミド中５０℃におけるハイブリダイゼーション、次いで１×ＳＳＣ中６７℃での洗浄がある。ハイブリダイゼーションに関する温度は、ハイブリッドの溶解温度（Ｔｍ）より約５〜１０℃低く、この場合Ｔｍは以下の計算式を使用して１９塩基対長と４９塩基対長の間のハイブリッドに関して測定する：Ｔｍ℃＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）、前式でＮはハイブリッド中の塩基の数であり、且つ［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーションバッファー中のナトリウムイオンの濃度である。
【００３２】
本明細書で使用する用語「アレルギー」は、通常有害ではない物質に対する免疫系の異常な反応を指し、例えばアトピー性皮膚炎、蕁麻疹、及び血管浮腫などの皮膚アレルギー；アレルギー性鼻炎、ホコリ又はカビに対する反応などの呼吸アレルギー；牛乳、卵白、ピーナッツ、コムギ、ダイズ、ベリー、甲殻類、コーン、マメ、黄色い食用色素Ｎｏ．５及びアラビアゴム中のタンパク質に対する反応などの食物アレルギー；ペニシリン、サルファ剤、バルビツレート、抗けいれん剤、インシュリン、局所麻酔薬及び造影剤に対する反応などの薬剤アレルギー；及びミツバチ、ジガバチ、スズメバチ、イエロージャケット及びフシアリの針中の毒素に対する反応などの虫刺れアレルギーを含む。
【００３３】
ｍＲＮＡの発現の減弱：本明細書で使用する語句「ｍＲＮＡの発現の減弱」は、ｍＲＮＡ切断又は直接的な翻訳の阻害のいずれかによって標的ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を低下させるための、一定量の干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の投与又は発現を意味する。標的ｍＲＮＡ又は対応するタンパク質の発現の低下は一般に「ノックダウン」と呼ばれ、投与後に存在するレベル又は非標的対照ＲＮＡ（例えば、非標的対照ｓｉＲＮＡ）の発現と比較して報告される。５０％と１００％の間を含めた一定量の発現のノックダウンは、本明細書の実施形態によって企図される。しかしながら、このようなノックダウンレベルを本発明の目的で達成することは必要ではない。一実施形態では、１つの干渉ＲＮＡ標的ＨＲＨ１のｍＲＮＡを投与する。他の実施形態では、２つ以上の干渉ＲＮＡ標的ＨＲＨ１のｍＲＮＡを投与する。
【００３４】
ノックダウンは一般に、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）増幅を使用してｍＲＮＡレベルを測定することによって、或いはウエスタンブロット又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によりタンパク質レベルを測定することによって評価される。タンパク質レベルを分析することによって、ｍＲＮＡ切断と翻訳阻害の両方の評価を与える。ノックダウンを測定するための他の技法には、ＲＮＡ溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリダイゼーション、マイクロアレイを用いた遺伝子発現モニタリング、抗体結合、ラジオイムノアッセイ、及び蛍光活性化細胞分析がある。
【００３５】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を使用して遺伝子発現を抑制するプロセスである。理論に拘泥するものではないが、ＲＮＡｉはＲＮａｓｅＩＩＩ様酵素、ダイサーによる小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）への長いｄｓＲＮＡの切断で始まる。ｓｉＲＮＡは通常約１９〜２８ヌクレオチド、又は２０〜２５ヌクレオチド、又は２１〜２２ヌクレオチドの長さであるｄｓＲＮＡであり、２ヌクレオチドの３’突出部分、及び５’リン酸及び３’ヒドロキシル末端を含むことが多い。ｓｉＲＮＡの一本の鎖は、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られるリボ核タンパク質複合体中に取り込まれている。ＲＩＳＣはこのｓｉＲＮＡ鎖を使用して、取り込まれたｓｉＲＮＡ鎖と少なくとも部分的に相補的であるｍＲＮＡ分子を特定し、次いでこれらの標的ｍＲＮＡを切断し或いはそれらの翻訳を阻害する。したがって、ＲＩＳＣ中に取り込まれたｓｉＲＮＡ鎖はガイド鎖又はアンチセンス鎖として知られる。パッセンジャー鎖又はセンス鎖として知られる他のｓｉＲＮＡ鎖はｓｉＲＮＡから排除され、標的ｍＲＮＡと少なくとも部分的に相同的である。当業者は、原則として、ｓｉＲＮＡの一方の鎖はＲＩＳＣ中に取り込ませ、ガイド鎖として働かせることが可能であることを理解しているはずである。しかしながら、ｓｉＲＮＡの設計（例えば、アンチセンス鎖の５’末端における低下したｓｉＲＮＡ二本鎖の安定性）によって、ＲＩＳＣへのアンチセンス鎖の取り込みを助長することができる。
【００３６】
ガイド鎖と少なくとも部分的に相補的である配列を有するｍＲＮＡのＲＩＳＣ介在型切断は、そのｍＲＮＡ及びこのｍＲＮＡによってコードされる対応するタンパク質の安定状態レベルの低下をもたらす。或いはＲＩＳＣは、標的ｍＲＮＡを切断せずに翻訳を抑制することによって、対応するタンパク質の発現を低下させることも可能である。他のＲＮＡ分子及びＲＮＡ様分子も、ＲＩＳＣと相互作用し遺伝子発現を抑制することができる。ＲＩＳＣと相互作用することができる他のＲＮＡ分子の例には、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、一本鎖ｓｉＲＮＡ、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及びダイサー基質である２７塩基の二本鎖がある。本明細書で使用する用語「ｓｉＲＮＡ」は、他に示さない限り二本鎖干渉ＲＮＡを指す。ＲＩＳＣと相互作用することができるＲＮＡ様分子の例には、１つ又は複数の化学的に修飾されたヌクレオチド、１つ又は複数のデオキシリボヌクレオチド、及び／又は１つ又は複数の非ホスホジエステル結合を含むＲＮＡ分子がある。本発明の考察の目的で、ＲＩＳＣと相互作用しＲＩＳＣ介在型の遺伝子発現の変化に関与することができる全てのＲＮＡ又はＲＮＡ様分子を、「干渉ＲＮＡ」と呼ぶことにする。したがってｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びダイサー基質である２７塩基の二本鎖は、「干渉ＲＮＡ」の部分集合である。
【００３７】
本発明の実施形態の干渉ＲＮＡは標的ｍＲＮＡの切断に関して触媒式に作用するようである、即ち、干渉ＲＮＡは化学量論量未満の量で標的ｍＲＮＡの阻害に影響を与えることができる。アンチセンス療法と比較して、有意に少ない干渉ＲＮＡがこのような切断条件下で治療効果を与えるために必要とされる。
【００３８】
本発明は一般に、ヒスタミン受容体Ｈ１（ＨＲＨ１）のｍＲＮＡの発現を阻害するための干渉ＲＮＡの使用に関する。ヒスタミンＨ１受容体（ＨＲＨ１）は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）スーパーファミリーのメンバーである。ヒスタミンとＨＲＨ１の結合はその関連ヘテロ三量体Ｇタンパク質、Ｇｑ／１１を活性化させ、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）及びタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化、イノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）及び１，２−ジアシルグリセロールの合成をもたらし、細胞内Ｃａ２＋の上昇、及び他のシグナル伝達事象をもたらす。ＨＲＨ１のｍＲＮＡの標的化はそれによってＨＲＨ１の局所発現を低下させ、したがって局所環境中のヒスタミンの作用を阻害し、ヒスタミン介在型の炎症応答を遮断する。本発明によれば、細胞外に提供或いは内因性発現した干渉ＲＮＡは、ＨＲＨ１のｍＲＮＡの発現抑制において特に有効である。
【００３９】
本明細書に挙げる核酸配列は、他に示さない限り５’から３’方向に書く。本明細書で使用する用語「核酸」は、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれか、或いはＤＮＡ（アデニン「Ａ」、シトシン「Ｃ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」）中又はＲＮＡ（アデニン「Ａ」、シトシン「Ｃ」、グアニン「Ｇ」、ウラシル「Ｕ」）中に存在するプリン又はピリミジン塩基を含むその修飾形を指す。「Ｔ」塩基はＲＮＡ中には本来存在しないが、本明細書で提供する干渉ＲＮＡは特に３’末端に「Ｔ」塩基を含み得る。「核酸」は用語「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」を含み、一本鎖分子又は二本鎖分子を指すことができる。二本鎖分子はＡ塩基とＴ塩基の間、Ｃ塩基とＧ塩基の間、及びＡ塩基とＵ塩基の間のワトソン−クリックの塩基対形成によって形成される。二本鎖分子の鎖は互いに部分的、実質的又は完全な相補性を有する可能性があり、二本鎖ハイブリッドを形成するはずであり、その結合の強度は塩基の配列の相補性の性質及び程度に依存する。
【００４０】
ｍＲＮＡの配列は、対応するＤＮＡ配列の配列から容易に推測される。例えば、配列番号１はＨＲＨ１のｍＲＮＡに対応するＤＮＡのセンス鎖配列を提供する。ｍＲＮＡの配列は、「Ｕ」塩基で置換された「Ｔ」塩基を有するＤＮＡのセンス鎖配列と同一である。したがって、ＨＲＨ１のｍＲＮＡの配列は配列番号１から知られる。
【００４１】
ヒスタミン受容体Ｈ１（ＨＲＨ１）のｍＲＮＡ：ＧｅｎＢａｎｋデータベースは、「配列表」中に配列番号１として提供される、アクセッション番号ＮＭ＿０００８６１としてＨＲＨ１に関するＤＮＡ配列を提供する。配列番号１はＨＲＨ１をコードするｍＲＮＡに対応するＤＮＡのセンス鎖配列を提供する（「Ｕ」塩基である「Ｔ」塩基は除く）。ＨＲＨ１のコード配列はヌクレオチド１７９〜１６４２由来である。
【００４２】
前述のＨＲＨ１のｍＲＮＡ配列の相当物は、選択的スプライス形、対立遺伝子形、アイソザイム、又はその同族である。同族は配列番号１と相同的である他の哺乳動物種由来のヒスタミン受容体のｍＲＮＡ（即ち、オルソログ）である。配列番号１と関係があるＨＲＨ１核酸配列には、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ１４４３６、ＢＣ０６０８０２、Ｚ３４８９７、Ｄ２８４８１、ＡＢ０４１３８０、Ｘ７６７８６、ＡＦ０２６２６１、ＡＹ１３６７４３、及びＤＱ０４７３０８を有する配列がある。
【００４３】
ＨＲＨ１の阻害は、ＨＲＨ１を発現するヒト細胞集団を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定することもできる。これらの細胞は、Ｃｏｏｋら、（Ｃｏｏｋ  ＥＢら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．１９９８Ｆｅｂ、３９（２）：３３６〜４３）によって記載された初代ヒト結膜上皮細胞、又は形質転換されたヒト角膜上皮細胞系ＣＥＰＩ−１７−ＣＬ４（Ｏｆｆｏｒｄ  ＥＡら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．１９９９  Ｍａｙ、４０（６）：１０９１〜１０１）だけには限られないが、これらであることが好ましいはずである。ＨＲＨ１干渉ＲＮＡ又は対照の活性の評価は、放射性リガンド結合によって実施することができ（Ｓｈａｒｉｆ  ＮＡら、Ｊ  Ｏｃｕｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ、１９９６  Ｗｉｎｔｅｒ、１２（４）：４０１〜７）、この場合干渉ＲＮＡでトランスフェクトした細胞は、非標的対照の干渉ＲＮＡでトランスフェクトした細胞と比較して低下した結合を示す。ヒスタミン刺激に応答するカルシウム感受性色素を用いて測定したカルシウム動員を使用して、或いは受容体活性化の指標として［３Ｈ］イノシトールリン酸（［３Ｈ］ＩＰ）の生成を使用して（Ｓｈａｒｉｆ  ＮＡら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．１９９８  Ｄｅｃ、３９（１３）：２５６２〜７１）、機能評価を実施することができる。対照と比較した干渉ＲＮＡで治療した細胞における低下した読み取り値は、ＨＲＨ１機能の阻害を示す。
【００４４】
ＨＲＨ１の阻害は、ＨＲＨ１標的干渉ＲＮＡを用いた予備治療によって、モルモット中のヒスタミン誘導型の血管透過性の変化を予防することによってｉｎ  ｖｉｖｏで測定することもできる。ｉｎ  ｖｉｖｏ試験用の方法は、Ｙａｎｎｉら（Ｊ．Ｏｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １０：６６５〜６７５、１９９４）によって提供されている。簡潔に言うと、Ｄｕｎｋｉｎ  Ｈａｒｔｌｅｙ異系交配モルモットに、耳翼辺縁静脈を介して１．０ｍｌのエバンスブルー色素を静脈内注射する。色素注射後４５分で、動物はヒスタミンを用いて結膜下を攻撃する。青色色素の領域が結膜の組織に浸出したとき、ヒスタミン注射後３０分間、局所組織の応答性を次いで観察することができる。干渉ＲＮＡは、ヒスタミン注射の４８〜７２時間前に目に局所適用する。干渉ＲＮＡで治療した組織中の血管透過性の低下した変化は、ＨＲＨ１機能の阻害を実証する。
【００４５】
ＨＲＨ１の阻害は、アレルギー性結膜炎、眼炎症、皮膚炎、鼻炎、喘息、又はアレルギーと関係がある症状における改善などの、ＨＲＨ１関連状態の症状の改善を観察することによって、ヒト又は哺乳動物においても推測される。例えば浮腫、かゆみ、炎症、又は環境課題に対する耐性のいずれかにおける改善は、ＨＲＨ１機能の阻害を示す。
【００４６】
干渉ＲＮＡ：本発明の一実施形態では、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）はセンス鎖及びアンチセンス鎖を有し、そのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくとも完全に近い連続した相補性のある領域を含む。本発明のさらなる実施形態では、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）はセンス鎖及びアンチセンス鎖を有し、アンチセンス鎖はＨＲＨ１のｍＲＮＡの標的配列に対して少なくとも１９ヌクレオチドの少なくとも完全に近い連続した相補性のある領域を含み、センス鎖はＨＲＨ１のｍＲＮＡの標的配列と少なくとも１９ヌクレオチドの少なくとも完全に近い連続した同一性のある領域を含む。本発明のさらなる実施形態では、干渉ＲＮＡはｍＲＮＡ内の対応する標的配列の３’末端の最後から２番目からの１３、１４、１５、１６、１７、又は１８のヌクレオチドのそれぞれとある割合の配列相補性、又はある割合の配列同一性を有する、少なくとも１３、１４、１５、１６、１７、又は１８個の連続したヌクレオチドの領域を含む。
【００４７】
干渉ＲＮＡの各鎖の長さは１９〜４９ヌクレオチドを含み、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、又は４９ヌクレオチドの長さを含み得る。
【００４８】
ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖がＲＩＳＣ中に取り込まれ、したがってＲＩＳＣによって切断又は翻訳抑制に関してアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖と少なくとも部分的な相補性を有する標的ｍＲＮＡを同定することができる点で、ｓｉＲＮＡの活性誘導物質である。
【００４９】
本発明の実施形態では、標的ｍＲＮＡ配列内の干渉ＲＮＡ標的配列（例えば、ｓｉＲＮＡ標的配列）は、利用可能な設計ツールを使用して選択する。ＨＲＨ１標的配列に対応する干渉ＲＮＡは、次いで標的ｍＲＮＡを発現する細胞のトランスフェクションによって試験し、次に前に記載したようにノックダウンを評価する。
【００５０】
ｓｉＲＮＡの標的配列を選択するための技法は、Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙのウエブサイトで入手可能な２００４年５月６日に改訂されたＴｕｓｃｈｌ、Ｔら、「ｓｉＲＮＡのユーザーガイド（Ｔｈｅ  ｓｉＲＮＡ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ）」によって、ＡｍｂｉｏｎのウェブサイトのＴｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ＃５０６、「ｓｉＲＮＡの設計ガイドライン（ｓｉＲＮＡ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ）」、Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．によって、及び例えば他のウエブベースの設計ツール、ｔｈｅ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、「組み込みＤＮＡ技術（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）」、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、又はＰｒｏｌｉｇｏウエブサイトによって提供される。初期検索パラメータは、３５％と５５％の間のＧ／Ｃ含有率、及び１９ヌクレオチドと２７ヌクレオチドの間のｓｉＲＮＡの長さを含み得る。標的配列はコード領域中、或いはｍＲＮＡの５’又は３’非翻訳領域に位置する可能性がある。
【００５１】
ＨＲＨ１のｍＲＮＡに関する１９ヌクレオチドのＤＮＡ標的配列の実施形態は、配列番号１のヌクレオチド２８５〜３０３に存在する：
【化１】
0005473594.tif 000002
【００５２】
２１ヌクレオチドの鎖及び２ヌクレオチドの３’突出部分を有する配列番号２の対応するｍＲＮＡ配列を標的とするための本発明のｓｉＲＮＡは以下の通りである：
【化２】
0005473594.tif 000003
【００５３】
それぞれの「Ｎ」残基は任意のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ｔ）又は修飾ヌクレオチドであってよい。３’末端は１、２、３、４、５、及び６個の間及びこれを含めた数の「Ｎ」残基を有し得る。一方の鎖上の「Ｎ」残基は同じ残基であってよく（例えば、ＵＵ、ＡＡ、ＣＣ、ＧＧ、又はＴＴ）、或いはそれらは異なってよい（例えば、ＡＣ、ＡＧ、ＡＵ、ＣＡ、ＣＧ、ＣＵ、ＧＡ、ＧＣ、ＧＵ、ＵＡ、ＵＣ、又はＵＧ）。３’突出部分は同じであってよく、或いはそれらは異なってよい。一実施形態では、両方の鎖が３’ＵＵ突出部分を有する。
【００５４】
各鎖上に２１ヌクレオチドの鎖及び３’ＵＵ突出部分を有する配列番号２の対応するｍＲＮＡ配列を標的とするための本発明のｓｉＲＮＡは以下の通りである：
【化３】
0005473594.tif 000004
【００５５】
干渉ＲＮＡはヌクレオチドの５’突出部分を有する可能性もあり、或いはそれは平滑末端を有する可能性がある。１９ヌクレオチドの鎖及び平滑末端を有する配列番号２の対応するｍＲＮＡ配列を標的とするための本発明のｓｉＲＮＡは以下の通りである：
【化４】
0005473594.tif 000005
【００５６】
二本鎖干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の鎖を結合させて、ヘアピン又はステム−ループ構造（例えば、ｓｈＲＮＡ）を形成することが可能である。１９ｂｐの二本鎖ステム領域及び３’ＵＵ突出部分を有する配列番号２の対応するｍＲＮＡ配列を標的とする本発明のｓｈＲＮＡは以下の通りである：
【化５】
0005473594.tif 000006
【００５７】
ＮはヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ又は当業者によって知られている修飾形である。ループ中のヌクレオチドＮの数は３〜２３、又は５〜１５、又は７〜１３、又は４〜９、又は９〜１１個の間及びこれを含めた数であり、或いはヌクレオチドＮの数は９である。ループ中のヌクレオチドの数個は、ループ中の他のヌクレオチドとの塩基対相互作用に関与している可能性がある。ループを形成するために使用することができるオリゴヌクレオチド配列の例には、５’−ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ−３’（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ、Ｔ．Ｒ．ら、（２００２）「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」２９６：５５０）及び５’−ＵＵＵＧＵＧＵＡＧ−３’（Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏ、Ｄ．ら、（２００２）ＲＮＡ８：１４５４）がある。生成する一本鎖オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡｉ機構と相互作用することができる二本鎖領域を含むステム−ループ又はヘアピン構造を形成することは、当業者によって理解されるはずである。
【００５８】
上記で特定したｓｉＲＮＡ標的配列を３’末端で伸長して、ダイサー基質である２７塩基の二本鎖の設計を容易にすることができる。ＨＲＨ１のＤＮＡ配列（配列番号１）において特定した１９ヌクレオチドのＤＮＡ標的配列（配列番号２）の６ヌクレオチドの伸長によって、配列番号１のヌクレオチド２８５〜３０９に存在する２５ヌクレオチドのＤＮＡ標的配列が生成する：
【化６】
0005473594.tif 000007
【００５９】
配列番号１０の対応するｍＲＮＡ配列を標的とするための本発明のダイサー基質である２７塩基の二本鎖は以下の通りである：
【化７】
0005473594.tif 000008
【００６０】
センス鎖の３’末端における２つのヌクレオチド（即ち、配列番号１１のＣＵヌクレオチド）は、増強プロセシング用のデオキシヌクレオチド（即ち、ＴＧ）であってよい。本明細書で提供するような１９〜２１ヌクレオチドの標的配列からのダイサー基質である２７塩基の二本鎖の設計は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）のウエブサイト及びＫｉｍ、Ｄ．−Ｈら、（２００５年２月）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３：２；２２２〜２２６によってさらに論じられている。
【００６１】
干渉ＲＮＡを化学合成によって生成するとき、ヌクレオチドの５’位置、（存在する場合）一方又は両方の鎖の５’末端におけるリン酸化は、結合したＲＩＳＣ複合体のｓｉＲＮＡの有効性及び特異性を増大させる可能性があるが必要とはされない、何故ならリン酸化は細胞内で起こり得るからである。
【００６２】
さらなる実施形態は、対象のヒスタミン受容体Ｈ１のｍＲＮＡの発現を減弱させる様々な方法であって、
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡ、及び薬学的に許容される担体を含む組成物を対象に投与することを含み、干渉ＲＮＡが
配列番号２及び配列番号１３〜配列番号５０のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端の最後から２番目からの１３ヌクレオチドと少なくとも９０％の配列相補性、又は少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続したヌクレオチドの領域、
配列番号２及び配列番号１３〜配列番号５０のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端の最後から２番目からの１４ヌクレオチドと少なくとも８５％の配列相補性、又は少なくとも８５％の配列同一性を有する少なくとも１４個の連続したヌクレオチドの領域、及び
配列番号２及び配列番号１３〜配列番号５０のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端の最後から２番目からの１５、１６、１７、又は１８ヌクレオチドのそれぞれと少なくとも８０％の配列相補性、又は少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１５、１６、１７、又は１８個の連続したヌクレオチドの領域からなる群から選択されるＲＮＡを含み、
ヒスタミン受容体Ｈ１のｍＲＮＡの発現がそれによって減弱する様々な方法を開示する。
【００６３】
治療の必要がある対象におけるＨＲＨ１関連状態を治療する方法であって、
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡ、及び薬学的に許容される担体を含む組成物を対象に投与することを含み、
干渉ＲＮＡが配列番号２及び配列番号１３〜配列番号５０のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端の最後から２番目からの１３ヌクレオチドと少なくとも９０％の配列相補性、又は少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続したヌクレオチドの領域、
配列番号２及び配列番号１３〜配列番号５０のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端の最後から２番目からの１４ヌクレオチドと少なくとも８５％の配列相補性、又は少なくとも８５％の配列同一性を有する少なくとも１４個の連続したヌクレオチドの領域、又は
配列番号２及び配列番号１３〜配列番号５０のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端の最後から２番目からの１５、１６、１７、又は１８ヌクレオチドのそれぞれと少なくとも８０％の配列相補性、又は少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１５、１６、１７、又は１８の連続したヌクレオチドの領域を含み、
ＨＲＨ１関連状態がそれによって治療される方法も開示する。
【００６４】
他の実施形態は、対象のヒスタミン受容体Ｈ１のｍＲＮＡの発現を減弱させる様々な方法であって、
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡ、及び薬学的に許容される担体を含む組成物を対象に投与することを含み、干渉ＲＮＡが
センスヌクレオチド鎖、アンチセンスヌクレオチド鎖、及び少なくとも１９ヌクレオチドの少なくとも完全に近い連続した相補性のある領域を含み、
アンチセンス鎖が、配列番号１に対応するｍＲＮＡの一部分と生理的条件下でハイブリダイズし、配列番号１に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズ部分と少なくとも１９ヌクレオチドの少なくとも完全に近い連続した相補性のある領域を有し、
ヒスタミン受容体Ｈ１のｍＲＮＡの発現がそれによって減弱する様々な方法を開示する。
【００６５】
様々な実施形態が、治療の必要がある対象におけるＨＲＨ１関連状態を治療するための方法であって、
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡ、及び薬学的に許容される担体を含む組成物を対象に投与することを含み、干渉ＲＮＡがセンスヌクレオチド鎖、アンチセンスヌクレオチド鎖、及び少なくとも１９ヌクレオチドの少なくとも完全に近い連続した相補性のある領域を含み、
アンチセンス鎖が、配列番号１に対応するｍＲＮＡの一部分と生理的条件下でハイブリダイズし、配列番号１に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズ部分と少なくとも１９ヌクレオチドの少なくとも完全に近い連続した相補性のある領域を有し、
ＨＲＨ１関連状態がそれによって治療される方法を開示する。
【００６６】
対象のヒスタミン受容体Ｈ１のｍＲＮＡの発現を減弱させる方法であって、
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の一本鎖干渉ＲＮＡ、及び薬学的に許容される担体を含む組成物を対象に投与することを含み、
一本鎖干渉ＲＮＡが、ヌクレオチド２８５、３２４、４１０、５８１、５８４、６６０、６７２、８０１、８１７、１０４５、１０５９、１０８９、１１５７、１２０９、１２２３、１２４１、１２５３、１２６５、１３６３、１３９１、１４８８、１５２１、１６２４、１６７０、１６７３、１７８４、１８７３、１８７５、１９８５、２０８６、２０８７、２２２６、２２９７、２４２０、２４２１、２４８５、２６０３、２６４７、又は３４３１を含む配列番号１に対応するｍＲＮＡの一部分と生理的条件下でハイブリダイズし、干渉ＲＮＡが配列番号１に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズ部分と少なくとも完全に近い連続した相補性のある領域を有し、
ヒスタミン受容体Ｈ１のｍＲＮＡの発現がそれによって減弱する方法も開示する。
【００６７】
治療の必要がある対象におけるＨＲＨ１関連状態を治療する方法であって、
ＲＮＡ干渉によってＨＲＨ１遺伝子の発現を下方制御する二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含む組成物を対象に投与することを含み、
ｓｉＲＮＡ分子の各鎖が独立して約１９〜約２７ヌクレオチドの長さであり、
ｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖がＨＲＨ１遺伝子に対応するｍＲＮＡと実質的相補性を有するヌクレオチド配列を含み、その結果ｓｉＲＮＡ分子がＲＮＡ干渉によるｍＲＮＡの切断を誘導する方法も開示する。
【００６８】
さらなる実施形態は、ＲＮＡ干渉によってＨＲＨ１遺伝子の発現を下方制御する二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含む組成物であって、
ｓｉＲＮＡ分子の各鎖が独立して約１９〜約２７ヌクレオチドの長さであり、
ｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖がＨＲＨ１遺伝子に対応するｍＲＮＡと実質的相補性を有するヌクレオチド配列を含み、その結果ｓｉＲＮＡ分子がＲＮＡ干渉によってｍＲＮＡの切断を誘導する組成物を開示する。
【００６９】
本発明の個々の実施形態を示し記載してきたが、多数の変形及び他の実施形態が当業者には思い浮かぶはずである。したがって、本発明を添付の特許請求の範囲の事項のみに限定することを目的とする。
【００７０】
本発明はその精神又は必要な特性から逸脱せずに、他の特定の形に具体化することができる。記載した実施形態は、全ての点において単に例示的であり制限的ではないと考えられよう。したがって、本発明の範囲は、前述の記載によってではなく添付の特許請求の範囲によって示される。特許請求の範囲の均等物の意味及び範囲の範疇内の特許請求の範囲に対する全ての変更は、その範囲内に包含される。さらに、本明細書で言及する全ての公開済み文書、特許、及び出願は、それらの全容を示すが如く参照として本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００７１】
表１は配列番号１のＨＲＨ１のＤＮＡ標的配列の例を列挙し、そこから本発明のｓｉＲＮＡを前述したような方法で設計する。ＨＲＨ１は前述のようにヒスタミン受容体Ｈ１をコードする。
表１．ｓｉＲＮＡのＨＲＨ１標的配列
【表１】
0005473594.tif 000009
【００７２】
前の実施例中に列挙したように、当業者は表１中に与えられた標的配列の情報を使用して、配列番号１中の配列位置を参照することによって、及び配列番号１と相補的又はほぼ相補的なヌクレオチドの付加又は欠失によって、表１中に与えられた配列より短い又は長い長さを有する干渉ＲＮＡを設計することができる。
【００７３】
ｓｉＲＮＡ及び他の形の干渉ＲＮＡによって誘導される標的ＲＮＡ切断反応は、非常に配列特異的である。一般に、標的ｍＲＮＡの一部分と配列が同一であるセンスヌクレオチド鎖、及び標的ｍＲＮＡの一部分と厳密に相補的であるアンチセンスヌクレオチド鎖を含むｓｉＲＮＡは、本明細書に列挙するｍＲＮＡの阻害に関するｓｉＲＮＡの実施形態である。しかしながら、アンチセンスｓｉＲＮＡ鎖と標的ｍＲＮＡの間、又はアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖とセンスｓｉＲＮＡ鎖の間の１００％の配列相補性は、本発明を実施するために必要とされない。したがって、例えば本発明は、遺伝的突然変異、系統の多様性、又は進化的分岐が原因であると予想され得る配列の変形を与える。
【００７４】
本発明の一実施形態では、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、標的ｍＲＮＡと少なくとも１９ヌクレオチドの少なくとも完全に近い連続した相補性を有する。本明細書で使用する「完全に近い」は、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が標的ｍＲＮＡの少なくとも一部分と「実質的に相補的」であり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖が標的ｍＲＮＡの少なくとも一部分と「実質的に同一」であることを意味する。当業者によって知られている「同一性」は、配列間のヌクレオチドの順序及び同一性を一致させることによって決定される、ヌクレオチド配列間の配列関連性の程度である。一実施形態では、標的ｍＲＮＡ配列と８０％、及び８０％と１００％までの間の相補性、例えば８５％、９０％又は９５％の相補性を有するｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、完全に近い相補性であると考えられ、本発明中で使用することができる。「完全な」連続した相補性は、連続した塩基対の標準的なワトソン−クリックの塩基対形成である。「少なくとも完全に近い」連続した相補性は、本明細書で使用する「完全な」相補性を含む。同一性又は相補性を決定するためのコンピュータ手法、例えばＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０）を設計して、ヌクレオチド配列の最大整合度を同定する。
【００７５】
標的ｍＲＮＡ（センス鎖）とｓｉＲＮＡの一本の鎖（センス鎖）の間の関係が、その同一性である。存在する場合、ｓｉＲＮＡのセンス鎖はパッセンジャー鎖とも呼ばれる。標的ｍＲＮＡ（センス鎖）とｓｉＲＮＡの他方の鎖（アンチセンス鎖）の間の関係が、その相補性である。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖はガイド鎖とも呼ばれる。
【００７６】
５’から３’方向に書かれる核酸配列中の最後から２番目の塩基は、最後の塩基、即ち３’塩基の隣の塩基の隣に位置する。５’から３’方向に書かれる核酸配列の最後から２番目からの１３塩基は、３’塩基の隣の配列の最後の１３塩基であり、３’塩基は含まない。同様に、５’から３’方向に書かれる核酸配列の最後から２番目からの１４、１５、１６、１７、又は１８塩基は、３’塩基の隣のそれぞれ配列の最後の１４、１５、１６、１７、又は１８塩基であり、３’塩基は含まない。
【００７７】
本発明の一実施形態では、連続したヌクレオチドの領域は、各配列識別子によって特定された配列に対応するｍＲＮＡの３’末端の最後から２番目からの１４ヌクレオチドと少なくとも８５％の配列相補性、又は少なくとも８５％の配列同一性を有する少なくとも１４の連続したヌクレオチドの領域である。２つのヌクレオチド置換（即ち、１２／１４＝８６％の同一性／相補性）は、このような語句に含まれる。
【００７８】
本発明の他の実施形態では、連続したヌクレオチドの領域は、配列識別子の配列に対応するｍＲＮＡの３’末端の最後から２番目からの１４ヌクレオチドと少なくとも８０％の配列相補性、又は少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１５、１６、１７、又は１８の連続したヌクレオチドの領域である。３つのヌクレオチド置換は、このような語句に含まれる。
【００７９】
配列番号１に対応するｍＲＮＡ中の標的配列は、ｍＲＮＡの５’又は３’非翻訳領域中、及びｍＲＮＡのコード領域中に存在する可能性がある。
【００８０】
二本鎖干渉ＲＮＡの鎖の一方又は両方は１〜６ヌクレオチドの３’突出部分を有することが可能であり、それはリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド又はそれらの混合物であってよい。突出部分のヌクレオチドは塩基対形成していない。本発明の一実施形態では、干渉ＲＮＡはＴＴ又はＵＵの３’突出部分を含む。本発明の他の実施形態では、干渉ＲＮＡは少なくとも１つの平滑末端を含む。末端は通常５’リン酸基又は３’ヒドロキシル基を有する。他の実施形態では、アンチセンス鎖は５’リン酸基を有し、センス鎖は５’ヒドロキシル酸基を有する。さらに他の実施形態では、末端は他の分子又は官能基の共有結合によってさらに修飾される。
【００８１】
二本鎖ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、前に記載したように２本の一本鎖の二本鎖形であってよく、或いは相補的領域が塩基対形成しており、ヘアピンループにより共有結合して一本鎖を形成する場合は単分子であってよい。ヘアピンはダイサーと呼ばれるタンパク質によって細胞内で切断されて、２つの別個の塩基対形成ＲＮＡ分子の干渉ＲＮＡを形成すると考えられる。
【００８２】
干渉ＲＮＡは１つ又は複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換又は修飾によって本来存在するＲＮＡと異なる可能性がある。非ヌクレオチド物質は５’末端、３’末端のいずれかで、或いは内部で干渉ＲＮＡと結合する可能性がある。このような修飾体を一般的に設計して、干渉ＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を増大させ、細胞の取り込みを改善し、細胞の標的化を向上させ、干渉ＲＮＡの追跡を手助けし、安定性をさらに改善し、或いはインターフェロン経路の活性化の可能性を低下させる。例えば、干渉ＲＮＡは突出部分の両末端にプリンヌクレオチドを含み得る。ピロリジンリンカーによるｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖の３’末端とコレステロールの結合は、例えばｓｉＲＮＡに対する安定性ももたらす。
【００８３】
他の修飾体には、例えば３’末端ビオチン分子、細胞透過性を有することが知られているペプチド、ナノ粒子、ペプチド模倣体、蛍光色素、又はデンドリマーがある。
【００８４】
本発明の幾つかの実施形態では、ヌクレオチドはそれらの塩基部分で、それらの糖部分で、又は分子及び官能基のリン酸部分で修飾することができる。修飾は、例えばアルキル、アルコキシ、アミノ、デアザ、ハロ、ヒドロキシル、チオール基、又はこれらの組合せによる置換を含む。高い安定性を有する類似体で、デオキシリボヌクレオチドによるリボヌクレオチドの置換、或いは例えば２’アミノ基、２’Ｏ−メチル基、２’メトキシエチル基、又は２’−Ｏ、４’−Ｃメチレン架橋による２’ＯＨ基などの糖修飾基の置換などで、ヌクレオチドを置換することができる。ヌクレオチドのプリン又はピリミジン類似体の例には、キサンチン、ヒポキサンチン、アザプリン、メチルチオアデニン、７−デアザ−アデノシン及びＯ−及びＮ−修飾ヌクレオチドがある。ヌクレオチドのリン酸基は、１つ又は複数のリン酸基の酸素と窒素又はイオウの置換によって修飾することができる（ホスホロチオエート）。修飾は例えば機能を向上させ、安定性又は透過性を改善し、或いは局在化又は標的化を誘導するのに有用である。
【００８５】
配列番号１の一部分と相補的ではない、アンチセンス干渉ＲＮＡ鎖の１つ又は複数の領域が存在し得る。非相補的領域は相補的領域の３’、５’又は両末端に、或いは２つの相補的領域の間に存在し得る。
【００８６】
干渉ＲＮＡは化学合成によって細胞外で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって、或いはダイサー又は類似の活性を有する他の適切なヌクレアーゼを用いた、長い二本鎖ＲＮＡの切断によって生成することができる。従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を使用して保護リボヌクレオシドホスホラミダイトから生じる化学合成された干渉ＲＮＡは、Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、又はＤｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）などの供給業者から入手することができる。干渉ＲＮＡは例えば溶媒又は樹脂を用いた抽出、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィー、又はこれらの組合せによって精製される。或いは、サンプル処理による損失を避けるための何らかの精製が存在する場合、干渉ＲＮＡはほとんど使用しなくてよい。
【００８７】
干渉ＲＮＡはプラスミド又はウイルス発現ベクターから、或いは最小発現カセット、例えば１つ又は複数のプロモーター及び干渉ＲＮＡに適した１つ又は複数の鋳型を含むＰＣＲ生成断片から、内因性発現される可能性もある。ｓｈＲＮＡ用の市販のプラスミド系発現ベクターの例は、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒシリーズ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）及びｐＣｐＧ−ｓｉＲＮＡ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）のメンバーを含む。干渉ＲＮＡの発現用のウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＦＩＶ、及びＥＩＡＶ）、及びヘルペスウイルスを含めた様々なウイルスに由来してよい。ｓｈＲＮＡ発現用の市販のウイルスベクターの例は、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒアデノ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）及びｐＬｅｎｔｉ６／ＢＬＯＣＫ−ｉＴ（商標）−ＤＥＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含む。ウイルスベクターの選択、ベクターから干渉ＲＮＡを発現させるための方法、及びウイルスベクターを送達する方法は、当業者の範疇にある。ＰＣＲ生成ｓｈＲＮＡ発現カセットを生成するためのキットの例は、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）及びｓｉＸｐｒｅｓｓ（Ｍｉｒｕｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を含む。第一の干渉ＲＮＡは、第一の干渉ＲＮＡを発現することができる第一の発現ベクターからのｉｎ  ｖｉｖｏ発現を介して投与することができ、第二の干渉ＲＮＡは、第二の干渉ＲＮＡを発現することができる第二の発現ベクターからのｉｎ  ｖｉｖｏ発現を介して投与することができ、或いは両方の干渉ＲＮＡを、両方の干渉ＲＮＡを発現することができる１つの発現ベクターからのｉｎ  ｖｉｖｏ発現を介して投与することができる。
【００８８】
干渉ＲＮＡは、ｐｏｌＩＩＩプロモーター、Ｕ６又はＨ１プロモーターなど、又はｐｏｌＩＩプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーターなどを含めた、当業者に知られている様々な真核生物プロモーターから発現させることが可能である。当業者は、これらのプロモーターを適合させて、干渉ＲＮＡを誘導的に発現させることも可能であることを理解しているはずである。
【００８９】
生理的条件下でのハイブリダイゼーション：本発明の幾つかの実施形態では、干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖は、ＲＩＳＣ複合体の一部としてｉｎ  ｖｉｖｏでｍＲＮＡとハイブリダイズする。
【００９０】
前に記載したｉｎ  ｖｉｔｒｏハイブリダイゼーションアッセイは、候補ｓｉＲＮＡと標的の間の結合が特異性を有し得るかどうかを予想する方法を与える。しかしながら、ＲＩＳＣ複合体の状況では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏハイブリダイゼーションに関して高ストリンジェンシーを示さないアンチセンス鎖で、標的の特異的切断が起こる可能性もある。
【００９１】
一本鎖干渉ＲＮＡ：前述のように、干渉ＲＮＡは結局一本鎖として機能する。一本鎖（ｓｓ）干渉ＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡほど有効ではないが、ｍＲＮＡサイレンシングに影響を与えることが分かってきている。したがって、本発明の幾つかの実施形態は、配列番号１の一部分と生理的条件下でハイブリダイズし、配列番号１のハイブリダイズ部分と少なくとも１９ヌクレオチドの少なくとも完全に近い連続した相補性のある領域を有するｓｓ干渉ＲＮＡの投与も提供する。ｓｓ干渉ＲＮＡは、前述のｄｓ干渉ＲＮＡと同様に１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する。ｓｓ干渉ＲＮＡは５’リン酸を有するか、或いはｉｎ  ｓｉｔｕ又はｉｎ  ｖｉｖｏにおいて５’位置でリン酸化する。用語「５’リン酸化」を使用して、例えばポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの５’末端で糖（例えば、リボース、デオキシリボース、又はこれらの類似体）のＣ５ヒドロキシルとエステル結合を介して結合したリン酸基を有する、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを記載する。
【００９２】
ｄｓ干渉ＲＮＡと同様に、ｓｓ干渉ＲＮＡを化学的又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって合成し、或いはベクター又は発現カセットから内因性発現される。５’リン酸基はキナーゼによって加えることができ、或いは５’リン酸はＲＮＡのヌクレアーゼ切断の結果である可能性がある。送達はｄｓ干渉ＲＮＡと同様である。一実施形態では、保護末端及びヌクレアーゼ耐性修飾を有するｓｓ干渉ＲＮＡをサイレンシング用に投与する。ｓｓ干渉ＲＮＡは保存用に乾燥するか、或いは水溶液に溶かすことができる。溶液はアニーリングの阻害又は安定化のためにバッファー又は塩を含むことができる。
【００９３】
ヘアピン干渉ＲＮＡ：ヘアピン干渉ＲＮＡは、ステム−ループ又はヘアピン構造の干渉ＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を含む単分子（例えば、１本のオリゴヌクレオチド鎖）である（例えば、ｓｈＲＮＡ）。例えば、センス干渉ＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドが短いスペーサーによって逆方向の相補性アンチセンス干渉ＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドと結合しているＤＮＡベクターから、ｓｈＲＮＡを発現させることが可能である。選択発現ベクターが必要とされる場合、３’末端のＴ及びヌクレオチド形成制限部位を加えることができる。生成したＲＮＡ転写産物自体が再度フォールディングして、ステム−ループ構造を形成する。
【００９４】
投与形式：干渉ＲＮＡは例えばエアロゾル、口内、皮膚、皮内、吸入、筋肉内、鼻腔内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、鼻、眼、経口、耳、非経口、パッチ、皮下、舌下、局所、又は経皮経路によって送達することができる。
【００９５】
投与は眼周囲、結膜、臍下、嚢内、硝子体内、眼球内、網膜下、結膜下、眼球後方、管腔内、又は脈絡膜上投与などの眼部組織への投与；注射、カテーテル、又は網膜用ペレット、眼球内挿入体、坐薬や、多孔性、非多孔性、又はゼラチン状物質を含むインプラントなどの他の配置デバイスを使用した眼への直接適用；眼部局所点滴剤又は軟膏；或いは円蓋中又は強膜近辺に移植した（経強膜）又は眼内の徐放化デバイスによる眼への直接投与であってよい。嚢内注射を角膜から前房にして、小柱網に物質を到達させることが可能である。管腔内注射は、シュレム管に排出する静脈のコレクターチャンネル又はシュレム管にすることが可能である。他の投与形式には錠剤、ピル、及びカプセルがある。
【００９６】
投与は、例えば耳部局所点滴剤又は軟膏、耳中又は耳近辺に移植した徐放化デバイスによる耳への直接投与であってよい。局所投与には耳筋肉内、鼓室内腔及び蝸牛管内注射による投与経路がある。さらに、中耳／内耳の窓膜又は連続した構造に対してジェルフォーム、又は干渉ＲＮＡを含ませた類似の吸収剤及び粘着製品を施すことによって、内耳に物質を投与することができる。
【００９７】
投与は、例えばエアロゾル調製物によって、及び例えば吸入器を介した吸入又は噴霧器によって、肺に直接投与することができる。
【００９８】
対象：ＨＲＨ１関連状態に関する治療が必要である対象、又はＨＲＨ１関連状態を発症する危険性がある対象は、例えば本明細書に列挙するＨＲＨ１の望ましくないか或いは不適切な発現又は活性と関係がある、アレルギー性結膜炎、眼炎症、皮膚炎、鼻炎、喘息、又はアレルギーなどのＨＲＨ１関連状態を有するか又はＨＲＨ１関連状態を発症する危険性があるヒト又は他の哺乳動物である。
【００９９】
このような障害と関係がある眼部構造は、例えば眼、網膜、脈絡膜、レンズ、角膜、小柱網、虹彩、視神経、視神経頭、強膜、眼房、硝子体腔、毛様体、又は後眼部を含み得る。
【０１００】
このような障害と関係がある耳部構造は、例えば内耳、中耳、外耳、鼓室腔又は膜、蝸牛管、又はエウスタキー管を含み得る。
【０１０１】
このような障害と関係がある肺構造は、鼻、口、咽頭、喉頭、気管支、気管、竜骨（右主気管支の開口部と左主気管支の開口部を隔てる隆起）、及び肺、特に細気管支及び肺胞などの下肺を含み得る。
【０１０２】
対象は耳細胞、肺細胞、眼細胞、細胞培養物、臓器又はｅｘ  ｖｉｖｏ臓器又は組織であってもよい。
【０１０３】
配合物及び用量：製剤配合物は、例えば水、バッファー、生理食塩水、グリシン、ヒアルロン酸、マンニトールなどの生理的に許容される担体媒体と混合した、９９重量％までの本発明の干渉ＲＮＡ、又はその塩を含む。
【０１０４】
本発明の干渉ＲＮＡは、固体、溶液、懸濁液、又は乳濁液として投与する。以下は、本発明によって具体化する可能な配合物の例である。
【表２】
0005473594.tif 000010
【０１０５】
一般に、本発明の実施形態の有効量の干渉ＲＮＡは、標的細胞の表面において１００ｐＭ〜１００ｎＭ、又は１ｎＭ〜５０ｎＭ、又は５ｎＭ〜約１０ｎＭ、又は約２５ｎＭの細胞外濃度をもたらす。この局所濃度を得るのに必要とされる用量は、送達法、送達部位、送達部位と標的細胞又は組織の間の細胞層の数、送達が局所的であるか或いは全身性であるかなどを含めた幾つかの要因に応じて変わるはずである。送達部位における濃度は、標的細胞又は組織の表面における濃度より大幅に高い可能性がある。局所用組成物は、当業者の通常の裁量に従い、１日当たり１〜４回、或いは１日１回、１週間に１回、２週間に１回、１月に１回以上などの長期の送達スケジュールで標的臓器の表面に送達する。配合物のｐＨは約ｐＨ４〜９、又はｐＨ４．５〜ｐＨ７．４である。
【０１０６】
ＨＲＨ１のｍＲＮＡを対象とするｓｉＲＮＡを用いた患者の療法治療は、作用期間を増大させ、それによって低頻度の投与及び高い患者のコンプライアンスを与えることにより、小分子を用いた治療より有益であると予想される。
【０１０７】
配合物の有効量は、例えば対象の年齢、人種、及び性別、ＨＲＨ１関連状態の重度、標的遺伝子の転写／タンパク質代謝回転の割合、干渉ＲＮＡの有効性、及び干渉ＲＮＡの安定性などの要因に依存する可能性がある。一実施形態では、干渉ＲＮＡを標的臓器に局所送達し、治療用量でヒスタミン受容体含有組織に到達し、それによってＨＲＨ１関連プロセスを改善する。
【０１０８】
許容される担体：許容される担体は、せいぜいわずかな眼の炎症を引き起こすか或いは全く引き起こさず、必要な場合は適切な保存を与え、且つ均一な用量で本発明の１つ又は複数の干渉ＲＮＡを送達する担体を指す。本発明の実施形態の干渉ＲＮＡの投与に許容される担体には、カチオン性脂質ベースのトランスフェクション試薬ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ＴＫＯ（Ｍｉｒｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、又はＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）；ポリエチレンイミンなどのポリカチオン；Ｔａｔ、ポリアルギニン、又はＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ（Ａｎｔｐペプチド）などのカチオン性ペプチド；又はリポソームがある。リポソームは標準的な小胞形成脂質及びコレステロールなどのステロールから形成され、例えば内皮細胞表面抗原に対する結合親和性を有するモノクローナル抗体などの標的分子を含むことができる。さらに、リポソームはＰＥＧ化リポソームであってよい。
【０１０９】
干渉ＲＮＡは溶液、懸濁液、或いは生体侵食性又は非生体侵食性送達デバイスで送達することができる。干渉ＲＮＡは単独で、或いは明確な共有結合体の要素として送達することができる。干渉ＲＮＡはカチオン性脂質、カチオン性ペプチド、又はカチオン性ポリマーと複合体形成し、タンパク質、融合タンパク質、又は核酸結合性を有するタンパク質ドメイン（例えば、プロタミン）と複合体形成し、或いはナノ粒子中に封入することもできる。組織又は細胞特異的送達は、抗体又は抗体断片などの適切な標的成分を封入することによって実施することができる。
【０１１０】
眼部、耳部、又は肺送達用に、干渉ＲＮＡは眼科学的に、光学的に、又は肺に許容される防腐剤、共溶媒、界面活性剤、増粘剤、浸透促進剤、バッファー、塩化ナトリウム、又は水と組み合わせて、水性、滅菌懸濁液又は溶液を形成することができる。溶液配合物は、生理的に許容される等張水性バッファー中に干渉ＲＮＡを溶かすことによって調製することができる。さらに、阻害剤の溶解を助長するために、溶液は許容される界面活性剤を含むことができる。例えばヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの増粘剤を本発明の組成物に加えて、化合物の保持を改善することができる。
【０１１１】
滅菌軟膏配合物を調製するために、干渉ＲＮＡを鉱油、液状ラノリン、又は白色ワセリンなどの適切な媒体中で防腐剤と組み合わせる。滅菌ゲル配合物は、当技術分野で知られている方法に従い、例えばＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）−９４０（ＢＦ  Ｇｏｏｄｒｉｃｈ、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ、ＮＣ）などの組合せから調製した親水性基剤中に干渉ＲＮＡを懸濁させることによって調製することができる。ＶＩＳＣＯＡＴ（登録商標）（Ａｌｃｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｆｏｒｔ  Ｗｏｒｔｈ、ＴＸ）は、例えば眼内注射に使用することができる。干渉ＲＮＡが当該の臓器又は組織中で浸透性が低い場合、本発明の他の組成物はクレモフォア及びＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）などの浸透促進剤を含むことができる。
【０１１２】
キット：本発明の幾つかの実施形態は、細胞中での本明細書に列挙するｍＲＮＡの発現を減弱させるための試薬を含むキットを提供する。キットはｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ発現ベクターを含む。ｓｉＲＮＡ及び非ウイルスｓｈＲＮＡ発現ベクター用に、キットはトランスフェクション試薬又は他の適切な送達媒体を含むこともできる。ウイルスｓｈＲＮＡ発現ベクター用に、キットはウイルスベクター及び／又はウイルスベクター生成に必要な要素（例えば、パッケージング細胞系、及びウイルスベクターの鋳型を含むベクター、及びパッケージング用の他のヘルパーベクター）を含むことができる。キットは陽性及び陰性対照ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ発現ベクター（例えば、非標的対照ｓｉＲＮＡ又は無関係なｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ）を含むこともできる。キットは目的とする標的遺伝子のノックダウンを評価するための試薬を含むこともできる（例えば、ウエスタンブロット用の標的ｍＲＮＡ及び／又は対応するタンパク質に対する抗体を検出するための定量ＰＣＲ用のプライマー及びプローブ）。或いは、キットはｓｉＲＮＡ配列又はｓｈＲＮＡ配列、並びにｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によってｓｉＲＮＡを生成し或いはｓｈＲＮＡ発現ベクターを構築するのに必要な教示書及び材料を含むことができる。
【０１１３】
容器手段を厳重に閉じ込めた状態で支えるように適合させた担体手段と、干渉ＲＮＡ組成物及び許容される担体を含む第一の容器手段をパッケージされた組合せで含む、キットの形の薬剤の組合せをさらに提供する。当業者には容易に明らかであるように、このようなキットは、望むならば、１つ又は複数の様々な従来の薬剤キット要素、例えば１つ又は複数の薬学的に許容される担体を含む容器、他の容器などをさらに含むことができる。投与する要素の量、投与に関するガイドライン、及び／又は要素の混合に関するガイドラインを示す挿入物又はラベルのいずれかとして印刷された教示書もキット中に含まれ得る。
【０１１４】
例えばヒト角膜上皮細胞中での、内因性ＨＲＨ１の発現のレベルをノックダウンするＨＲＨ１干渉ＲＮＡの能力は、以下のようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価される。形質転換させたヒト角膜上皮細胞、例えばＣＥＰＩ−１７細胞系（Ｏｆｆｏｒｄら、（１９９９）Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．４０：１０９１〜１１０１）を、ＫＧＭケラチン生成細胞培地（Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｅａｓｔ  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ、ＮＪ）中でのトランスフェクション前に２４時間平板培養する。０．１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲のＨＲＨ１干渉ＲＮＡ濃度で製造者の教示書に従い、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）１（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）を使用してトランスフェクションを実施する。非標的対照干渉ＲＮＡ及びラミンＡ／Ｃ干渉ＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）は対照として使用する。標的ｍＲＮＡのレベルは、例えばＴＡＱＭＡＮ（登録商標）正方向及び逆方向プライマー並びに標的部位を含むプローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して、トランスフェクション後２４時間ｑＰＣＲによって評価する。標的タンパク質のレベルは、例えばウエスタンブロットによって、トランスフェクション後約７２時間評価することができる（実際の時間はタンパク質の代謝回転率に依存する）。培養細胞からＲＮＡ及び／又はタンパク質を単離するための標準的な技法は、当業者によく知られている。非特異的な、オフターゲット効果の可能性を低下させるために、望ましいレベルの標的遺伝子の発現のノックダウンをもたらし得る最少の可能な濃度のＨＲＨ１干渉ＲＮＡを使用すべきである。
【０１１５】
本明細書に挙げる参照文献は、それらが本明細書で述べる参照文献を補足する例示的手順又は他の詳細を与える程度で、具体的に参照として本明細書に組み込まれる。
【０１１６】
当業者は、本開示に照らして、本明細書に開示する実施形態の明らかな改変を、本発明の精神及び範囲から逸脱せずに作成することができることを理解するはずである。本明細書に開示する全ての実施形態は、本開示に照らして過度の実験なしで作成し実施することができる。本発明の全範囲は、本開示及びその同等の実施形態中に示される。本明細書を、本発明が権利を与えられた全保護範囲を過度に狭めるものとして解釈すべきではない。
【配列表】
0005473594000001.app