(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗凝固処理された血液を、少なくとも内面の一部に血小板易接着面を備えたキャピラリーを通過させ、該血液のキャピラリー内での挙動を観察又は測定することによって、血小板の機能を検査することを特徴とする、血小板機能検査方法であって、前記キャピラリー内の少なくとも一部が、該キャピラリーにおける血液の流れる方向に沿って延在し且つ該キャピラリーの幅を５つ以上に分割する流路分割壁を備えた流路分割部を有し、該流路分割部の各流路の幅が200μｍ以下であり、前記血小板易接着面が該流路分割部に設けられたことを特徴とする、血小板機能検査方法。
【請求項２】
前記抗凝固処理がクエン酸又はヘパリン又はヒルジンによるものである、請求項１記載の検査方法。
【請求項３】
前記血小板易接着面はコーティングされたコラーゲンからなる、請求項１または２記載の検査方法。
【請求項４】
前記血小板易接着面はガラスからなる、請求項１または２記載の検査方法。
【請求項５】
前記抗凝固処理された血液は微弱な血小板活性化処理がなされたものである、請求項１ないし４のいずれかに記載の検査方法。
【請求項６】
前記微弱な血小板活性化処理は、不可逆的な血小板凝集を引き起こさない量の血小板活性化試薬を抗凝固処理された血液に混合することによる請求項５記載の検査方法
【請求項７】
前記血小板活性化試薬がアデノシン２リン酸であり、０．００１〜５μＭの濃度になるように抗凝固処理された血液と混合される、請求項６記載の検査方法。
【請求項８】
前記血小板活性化処理がアラキドン酸であり、０．００１〜１ｍＭの濃度になるように抗凝固処理された血液と混合される、請求項６記載の検査方法。
【請求項９】
前記キャピラリーがマイクロチップ内に形成された、請求項１ないし８のいずれかに記載の検査方法。
【請求項１０】
前記マイクロチップは、キャピラリーとなる溝および該溝の一部に形成された流路分割壁を有する第１の基板と、血小板易接着面を有する第２の基板とを、第１の基板の溝と第２の基板の血小板易接着面が内側になるように積層させることによって得られ、前記第２の基板の血小板易接着面は、第１の基板と積層させた時に、前記流路分割部に被せられる位置に形成された、請求項９記載の検査方法。
【請求項１１】
前記抗凝固処理された血液は、ポンプによってキャピラリー内に導入され、該ポンプにかかる該血液のキャピラリーへの流入圧を圧力センサーによって測定することによって血小板機能を検査する、請求項１ないし１０のいずれかに記載の検査方法。
【請求項１２】
前記抗凝固処理された血液は、キャピラリー及びポンプに接続された血液収容部内に貯蔵され、ポンプによって血液より比重の小さい液体を血液収容部に導入することで、血液をキャピラリーへ導入し、該液体の流入圧を測定することで血液のキャピラリーへの流入圧を間接的に測定する、請求項１１記載の検査方法。
【請求項１３】
前記抗凝固処理された血液は、キャピラリー及びポンプに接続された血液収容部内に貯蔵され、ポンプによって血小板活性化試薬を血液収容部に導入することで該血液収容部内で血小板活性化試薬と抗凝固処理された血液を混合し、該血小板活性化試薬と混合された血液をキャピラリーへ導入し、該血小板活性化試薬の流入圧を測定することで血液のキャピラリーへの流入圧を間接的に測定する、請求項１１記載の検査方法。
【請求項１４】
前記血小板活性化試薬は、抗凝固処理された血液と血小板活性化試薬との混合液中の血小板活性化試薬の濃度が直線的濃度勾配又は段階的濃度勾配で増加するように抗凝固処理された血液と混合される、請求項１３記載の検査方法。
【請求項１５】
抗凝固処理された血液と血小板活性化試薬との混合液が撹拌される、請求項１３または１４記載の検査方法。
【請求項１６】
少なくとも内面の一部に血小板易接着面を有するキャピラリーと、該キャピラリー内の少なくとも一部に設けられ、該キャピラリーにおける血液の流れる方向に沿って延在し且つ該キャピラリーの幅を５つ以上に分割する流路分割壁を備えた流路分割部とを有し、該流路分割部の各流路の幅が200μｍ以下であり、前記血小板易接着面が該流路分割部に設けられたことを特徴とする、血小板機能検査装置。
【請求項１７】
前記キャピラリーがマイクロチップ内に形成された、請求項１６記載の血小板機能検査装置。
【請求項１８】
前記マイクロチップは、キャピラリーとなる溝および該溝の一部に形成された流路分割壁を有する第１の基板と、血小板易接着面を有する第２の基板とを、第１の基板の溝と第２の基板の血小板易接着面が内側になるように積層させることによって得られ、前記第２の基板の血小板易接着面は、第１の基板と積層させた時に、前記流路分割部に被せられる位置に形成された、請求項１７記載の血小板機能検査装置。
【請求項１９】
前記マイクロチップ内に2本以上のキャピラリーが形成された、請求項１７または１８記載の血小板機能検査装置。
【請求項２０】
キャピラリーの幅が１０〜１５０μｍ及び５０〜２００μｍの2種以上である、請求項１９記載の血小板機能検査装置。
【請求項２１】
送液ポンプを備えた、請求項１６ないし２０のいずれかに記載の血小板機能検査装置。
【請求項２２】
前記マイクロチップの内部を撮影するカメラを備えた、請求項１６ないし２１のいずれかに記載の血小板機能測定装置。
【請求項２３】
マイクロチップ内部の血小板易接着面の下流に血小板易接着面を通過した血液廃液を貯留する廃液貯留部を備えた、請求項１６ないし２２のいずれかに記載の血小板機能検査装置。
【請求項２４】
廃液貯留部の深さが100μｍ以上である、請求項２３記載の血小板機能検査装置。
【請求項２５】
廃液貯留部の一箇所にマイクロチップの外部に貫通する穴を設けた、請求項２３または２４記載の血小板機能検査装置。
【請求項２６】
マイクロチップ表面の前記穴に相当する位置に血液吸収材を設けた、請求項２５記載の血小板機能検査装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微量血液を用いて血液の血小板機能を調べるための方法および検査装置に関し、より詳しくは血液の血小板機能検査を行うためのマイクロチップを用いた方法および検査装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
（血小板凝集検査の従来技術の問題点）
動脈における血栓形成（白色血栓）又は一次止血において血小板の活性化及び凝集は中心的機能を果たす。
血小板は血管が障害を受けた場合に、血管内皮細胞下に存在するコラーゲンに対し、直接的、非直接的に結合する。血流の緩やかな環境下（低ずり応力下）ではGPVIなどコラーゲン受容体により直接的な結合が主となり、血流の早い環境下（高ずり応力下）ではコラーゲンにvWFが結合し、vWFに対し血小板のGPIbα受容体が結合することで間接的にコラーゲンに結合する。コラーゲンとの直接的、間接的相互作用は血小板を活性化し、この刺激により濃染顆粒及びα顆粒からADP,セロトニンなど様々な血小板活性化物質が放出される。
これら放出された血小板活性化因子は自己の血小板及び周囲の血小板を活性化させる。活性化を受けた血小板はフィブリノゲン受容体であるＧＰＩＩb、ＩＩＩａが活性化型に構造変化を受け、フィブリノゲンに対し高親和性型となる。２量体であるフィブリノゲンを介して活性化血小板が次々架橋を受け血小板凝集を形成する。【０００３】
しかしながら、従来の血小板凝集能測定装置の多くは、多量の血小板活性化試薬の刺激による血小板の活性化及び凝集過程を測定する方法であった（非特許文献１）。
その為、生理的血小板活性化条件とはかけ離れた、環境下での血小板活性化反応であり、各受容体の先天的機能異常など明らかな機能の違いを測定することは可能であったが、より生理的な血小板機能を測定することは困難であった。【０００４】
PFA-100（Platelet Function Analyzer：非特許文献２）は固層化されたコラーゲンへの接触、ずり応力、血小板惹起物質との接触による総合的な血小板の活性化により穴の閉塞を測定する系であり、従来の単独の血小板活性化惹起物質の刺激による血小板凝集よりは生理的に近い環境下での測定系である。しかしながらデータのバラツキ、及び、穴を通過する血液に含まれる惹起物質の濃度の調整が出来ず、血栓症発症により血小板が既に活性化を受けている患者において見られる血小板活性化惹起物質が非常に低い濃度又は存在しない状況で惹起される血小板凝集及び、血小板機能不全患者の血小板機能測定の場合における非常に高い濃度の血小板惹起物質の刺激による血小板凝集能を適切に測定することは出来なかった。
また、特許文献１には、血液を毛細管中に通過させ、そして次に、仕切部材の開口部を通過させ；そして仕切部材の開口部で、血栓の形成が開口部を閉止するまでに必要な時間を測定することを特徴とする血小板機能の測定方法が開示されているが、この方法では、血小板活性化試薬が大量に加えられており、生体内で血小板が活性化されているが血小板数が減少している場合や、血小板数は正常であるが血小板機能が弱い場合など、生体を反映した詳細な血小板機能を測定することが困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2007-298511号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】「血小板凝集能検査」Thrombosis and Circulation, vol. 12, No.4, p17-20, 2004
【非特許文献２】「PFA−１００による血小板凝集能測定」Thrombosis and Circulation, vol. 13, No. 3, p90-94, 2005
【発明の概要】
【０００７】
例えば、敗血症、播種性血管内凝固症候群（DIC）などの疾患においては、血管内皮障害及び血栓形成により血小板は活性化された状態にあり、さらに、血小板と白血球の複合体なども形成される。さらには持続的な血栓形成により血小板は著しく消耗され生体内で血栓が形成されるにも関わらず、同時に出血症状をきたすことがある。
従来の血小板機能試験においては、このような症状を厳密に反映した検査を行うことは困難であった。
例えば、濁度法では、血小板数が減少していても、血小板惹起物質に対する反応性が亢進しているならば、血小板機能亢進（強い）と判定された。また生体内の炎症反応などで形成され血栓形成に大きな影響を与える血小板・白血球の複合体は多血小板血漿を作成するための遠心分離にて赤血球とともに沈殿してしまうので多血小板血漿には含まれない。
また、PFA−１００を用いた場合には、血小板の機能が強い患者においても弱い患者においても同じ惹起物質の濃度で測定するので、惹起物質のないまたは非常に薄い状態で起こる自然凝集惹起又は抗血小板薬投与患者に対し惹起物質濃度が非常に高い状態でその薬剤効果を確認するような検査が適切に実施出来ない。また、PFA-100による測定で閉塞時間が延長された場合においても血小板機能が弱い場合と血小板機能が亢進している（生体内で活性化を受けている）が、血小板数が少ない場合のデータの比較等が困難であった。
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、血流と同等環境下における血小板機能を微量の血液を用いて効率よく正確に評価することのできる装置および方法を提供することを課題とする。
【０００９】
前記課題を解決するため、本発明は、抗凝固処理された血液を、少なくとも内面の一部に血小板易接着面を有したキャピラリーを通過させ、該血液のキャピラリー内での挙動を観察又は測定することによって、血小板の機能を検査することを特徴とする、血小板機能検査方法を提供する。
ここで、前記抗凝固処理がクエン酸又はヘパリン又はヒルジンによるものであることが好ましい。
また、前記血小板易接着面はコーティングされたコラーゲンまたはガラスからなることが好ましい。
また、前記抗凝固処理された血液は微弱な血小板活性化処理がなされたものであることが好ましく、微弱な血小板活性化処理は、不可逆的な血小板凝集を引き起こさない量の血小板活性化試薬を抗凝固処理された血液に混合することによるものであることが好ましい。
ここで、血小板活性化処理が血小板活性化試薬によって行われ、前記血小板活性化試薬がアデノシン２リン酸であり、０．００１〜５μＭの濃度になるように抗凝固処理された血液と混合されるか、あるいは、前記血小板活性化試薬がアラキドン酸であり、０．００１〜１ｍＭの濃度になるように抗凝固処理された血液と混合されることが好ましい。
また、前記キャピラリー内の少なくとも一部が、該キャピラリーにおける血液の流れる方向に沿って延在し且つ該キャピラリーの幅を複数に分割する流路分割壁を備えた流路分割部を有することが好ましい。
前記流路分割部の各流路の幅は10〜200μｍであることが好ましい。
前記血小板易接着面はキャピラリーの流路分割部に設けられていることが好ましい。
前記キャピラリーはマイクロチップ内に形成されていることが好ましい。
本発明の血小板機能検査方法においては、前記抗凝固処理された血液、好ましくは微弱な血小板活性化処理がなされた抗凝固処理された血液が、ポンプによってキャピラリー内に導入され、該ポンプにかかる該血液のキャピラリーへの流入圧を圧力センサーによって測定することによって、血小板機能を検査することが好ましい。ここで、前記抗凝固処理された血液は、キャピラリー及びポンプに接続された血液収容部内に貯蔵され、ポンプによって血液より比重の軽い液体を血液収容部に導入することで、血液をキャピラリーへ導入し、該液体の流入圧を測定することで血液のキャピラリーへの流入圧を間接的に測定することが好ましい。
また、前記抗凝固処理された血液は、キャピラリー及びポンプに接続された血液収容部内に貯蔵され、ポンプによって血小板活性化試薬を血液収容部に導入することで該血液収容部内で血小板活性化試薬と抗凝固処理された血液を混合し、該血小板活性化試薬と混合された血液をキャピラリーへ導入して、該血小板活性化試薬の流入圧を測定することで血液のキャピラリーへの流入圧を間接的に測定することが好ましい。
また、本発明の血小板機能検査方法においては、前記キャピラリーは血液収容部に接続されており、該血液収容部内で血小板活性化試薬と混合された抗凝固処理された血液がキャピラリーを通過するように構成されていることが好ましい。ここで、血小板活性化試薬は、測定直前に抗凝固処理された血液に混合されることが望ましい。または血小板活性化試薬は抗凝固処理された血液と血小板活性化試薬との混合液中の血小板活性化試薬の濃度が直線的濃度勾配又は段階的濃度勾配で増加するように、抗凝固処理された血液と混合されることが好ましい。また、抗凝固処理された血液と血小板活性化試薬との混合液が撹拌されることが好ましい。
【００１０】
本発明はまた、少なくとも内面の一部に血小板易接着面を備えたキャピラリーと、該キャピラリー内の少なくとも一部に設けられ、該キャピラリーにおける血液の流れる方向に沿って延在し且つ該キャピラリーの幅を複数に分割する流路分割壁を備えた流路分割部とを有する、血小板機能検査装置を提供する。
ここで、前記キャピラリーがマイクロチップ内に形成されていることが好ましく、2本以上のキャピラリーがマイクロチップ内に形成されていることがより好ましい。後者の場合、キャピラリーの幅が10〜１５０及び５０〜２００μｍの2種以上であることが好ましい。
また、前記血小板機能検査装置は、送液ポンプを備えたものであることが好ましい。また、前記マイクロチップの内部を撮影するカメラを備えたものであることが好ましい。
また、前記血小板機能検査装置は、マイクロチップ内部の血小板易接着面の下流に血小板易接着面を通過した血液廃液を貯留する廃液貯留部を備えたものであることが好ましい。この場合、廃液貯留部の深さが100μｍ以上であることがより好ましい。廃液貯留部の一箇所にマイクロチップの外部に貫通する穴が設けられていることがさらに好ましく、マイクロチップ表面の当該穴に相当する位置に血液吸収材が設けられていることが特に好ましい。
【００１１】
本発明の請求項１に係る血小板機能検査方法によれば、抗凝固処理された血液を、少なくとも内面の一部に血小板易接着面を備えたキャピラリーを通過させ、該血液のキャピラリー内での挙動を観察又は測定することによって、血小板易接着面を通過するときのずり応力による血小板活性化を指標にして、血小板の機能を検査することができる。
本発明の請求項２に係る血小板機能検査方法によれば、前記抗凝固処理がクエン酸又はヘパリン又はヒルジンによるものであるため、安価に抗凝固処理を行うことができる。
血小板易接着面としてコーティングしたコラーゲンを用いる場合において、用いる抗凝固剤がクエン酸などのカルシウムキレート剤の場合には、血小板活性化試薬を混合した血液をコーティングしたコラーゲン上を通過させ血小板機能測定がより適している。一方、カルシウムキレート剤以外の抗凝固剤特にヒルジンを用いた場合はクエン酸で抗凝固処理した場合に比べ、コラーゲン上でより迅速に強固な血小板凝集が置き、キャピラリーを閉塞させるので血小板活性化試薬を用いずとも安定な血小板機能検査も可能となる。その際においても血小板機能の異常、抗血小板剤の使用などで血小板凝集が見られない場合においては血小板活性化試薬を混合したのち測定することで血小板機能の低下具合や抗血小板剤の効果を測定することが可能となる。１枚のチップに流路溝幅の異なる流路を配置し、ヒルジン及びクエン酸によって抗凝固処理された血液を用い測定することで、血小板凝集能の強さ及び血小板惹起物質への感受性、抗血小板剤の効果などを総合的に測定することが可能となる。
本発明の請求項３に係る血小板機能検査方法によれば、前記血小板易接着面がコーティングされたコラーゲンからなるため、より生理的な血小板機能の測定が可能である。
本発明の請求項４に係る血小板機能検査方法によれば、前記血小板易接着面がガラスからなるため、より安価な物質で血小板機能の測定が可能である。
本発明の請求項５に係る血小板機能検査方法によれば、前記抗凝固処理された血液は微弱な血小板活性化処理がなされたものであるため、より生理的な条件で血小板機能の測定を行うことができ、また、様々な疾患を反映した検査結果を得ることができる。
本発明の請求項６に係る血小板機能検査方法によれば、微弱な血小板活性化処理は、不可逆的な血小板凝集を引き起こさない量の血小板活性化試薬を抗凝固処理された血液に混合することによるため、簡便に微弱な血小板活性化処理を施すことができ、また、血小板活性化試薬による血小板活性化と血小板易接着面でのずり応力による血小板活性化を合わせてより生理的な血小板活性化を見ることができる。
本発明の請求項７に係る血小板機能検査方法によれば、前記血小板活性化試薬がアデノシン２リン酸であり、０．００１〜５μＭの濃度になるように抗凝固処理された血液と混合されるため、より生理的条件下での血小板機能が検査でき、様々な疾患を反映した結果を得ることができる。
本発明の請求項８に係る血小板機能検査方法によれば、前記血小板活性化試薬がアラキドン酸であり、０．００１〜１ｍＭの濃度になるように抗凝固処理された血液と混合されるため、より生理的条件下での血小板機能が検査でき、様々な疾患を反映した結果を得ることができる。
【００１２】
本発明の請求項９に係る血小板機能検査方法によれば、前記キャピラリー内の少なくとも一部が、該キャピラリーにおける血液の流れる方向に沿って延在し且つ該キャピラリーの幅を複数に分割する流路分割壁を備えた流路分割部を有するため、ずり応力による血小板の活性化が起こりやすい。
本発明の請求項１０に係る血小板機能検査方法によれば、前記流路分割部の各流路の幅が10〜200μｍであるため、小さな血小板凝集塊が形成された場合その足場となり、高血流、高ずり応力下においても血流に飛ばされず内部圧力を上昇させることが可能である。
本発明の請求項１１に係る血小板機能検査方法によれば、血小板易接着面が、キャピラリーの流路分割部に設けられているため、流路分割部でより血小板凝集塊が保持されやすい。
本発明の請求項１２に係る血小板機能検査方法によれば、前記キャピラリーがマイクロチップ内に形成されたものであるため、微量の血液で検査を行うことができる。
本発明の請求項１３に係る血小板機能検査方法によれば、前記抗凝固処理された血液は、ポンプによってキャピラリー内に導入され、該ポンプにかかる該血液のキャピラリーへの流入圧を圧力センサーによって測定することによって、血小板機能を検査するため、血小板機能を定量的に測定できる。
本発明の請求項１４に係る血小板機能検査方法によれば、前記抗凝固処理された血液は、キャピラリー及びポンプに接続された血液収容部内に貯蔵され、ポンプによって血液より比重の軽い液体を血液収容部に導入することで、血液をキャピラリーへ導入し、該液体の流入圧を測定することで血液のキャピラリーへの流入圧を間接的に測定するため、ポンプが血液で汚染されることがないので好ましい。
本発明の請求項１５に係る血小板機能検査方法によれば、前記抗凝固処理された血液は、キャピラリー及びポンプに接続された血液収容部内に貯蔵され、ポンプによって血小板活性化試薬を血液収容部に導入することで該血液収容部内で血小板活性化試薬と抗凝固処理された血液を混合し、該血小板活性化試薬と混合された血液をキャピラリーへ導入して、該血小板活性化試薬の流入圧を測定することで血液のキャピラリーへの流入圧を間接的に測定するため、素早い検査が可能となる。
本発明の請求項１６に係る血小板機能検査方法によれば、血小板活性化試薬は、抗凝固処理された血液と血小板活性化試薬との混合液中の血小板活性化試薬の濃度が直線的濃度勾配又は段階的濃度勾配で増加するように、抗凝固処理された血液と混合されるため、幅広い血小板活性化試薬の濃度における血小板活性化を測定することが可能であり、血小板の機能亢進及び機能低下を一度の実験で測定することが出来て望ましい。
本発明の請求項１７に係る血小板機能検査方法によれば、抗凝固処理された血液と血小板活性化試薬との混合液が撹拌されるため、より正確な検査結果を得ることができる。
【００１３】
本発明の請求項１７に係る血小板機能検査装置によれば、少なくとも内面の一部に血小板易接着面を備えたキャピラリーと、該キャピラリー内の少なくとも一部に設けられ、該キャピラリーにおける血液の流れる方向に沿って延在し且つ該キャピラリーの幅を複数に分割する流路分割壁を備えた流路分割部とを有するため、血小板を効率よく活性化できて上記血小板検査方法に適している。
本発明の請求項１８に係る血小板機能検査装置によれば、前記キャピラリーがマイクロチップ内に形成されたものであるため、作成が容易であり、また、微量サンプルでの検査が可能である。
本発明の請求項１９に係る血小板機能検査装置によれば、前記マイクロチップ内に2本以上のキャピラリーが形成されたものであるため、複数の検査を同時に行うことができる。
本発明の請求項２０に係る血小板機能検査装置によれば、キャピラリーの幅が１０〜１５０及び５０〜２００μｍの2種以上であるため、微量のサンプルで複数の検査を同時に行うことができる。
本発明の請求項２１に係る血小板機能検査装置によれば、送液ポンプを備えたものであるため、キャピラリー内への血液の流入速度を制御でき、好ましい。
本発明の請求項２２に係る血小板機能検査装置によれば、前記マイクロチップの内部を撮影するカメラを備えたものであるため、血小板の活性化を観察ができる。設置されるカメラは動画、静止画を撮影可能であることが望ましい。一定時間間隔で自動的に内部の動画及び静止画を撮影し保存すると、測定後に血小板の活性化の状態を経時的に視覚的に評価でき好ましい。流路内をパノラマ写真又は静止画の連続として全体を撮影できると保存および客観的比較が容易でありより望ましい。静止画、動画を撮影するにあたり、透過型の光源、即ちカメラと反対側に光源を設置して撮影するとより鮮明な画像の撮影が可能である。
本発明の請求項２３に係る血小板機能検査装置によれば、マイクロチップ内部の血小板易接着面の下流に血小板易接着面を通過した血液廃液を貯留する廃液貯留部を備えたものであるため、血液廃液を吸引して除去する必要がなく、簡便に検査を行うことができる。
本発明の請求項２４に係る血小板機能検査装置によれば、廃液貯留部の深さが100μｍ以上であるため、血液廃液を十分収容できる。
本発明の請求項２５に係る血小板機能検査装置によれば、廃液貯留部の一箇所にマイクロチップの外部に貫通する穴を設けたものであるため、廃液貯留部の空気が外部に抜け、内圧が上昇することなく貯留部に血液を貯留することが可能となる。
本発明の請求項２６に係る血小板機能検査装置によれば、マイクロチップ表面の前記穴に相当する位置に血液吸収材を設けたものであるため、血液吸収材に血液廃液を吸収させることができ、血液廃液が飛散することがなく好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の血小板観測装置を構成するマイクロチップの第１の形態例を示す図。
【図２】本発明の血小板観測装置の第１の形態例を示す図。
【図３】本発明の血小板観測装置を構成するマイクロチップの第２の形態例を示す図。
【図４】本発明の血小板観測装置の第２の形態例を示す図。
【図５】実施例１におけるポンプ１０９の圧力変化を示す図。
【図６】実施例２におけるポンプ１０９の圧力変化を示す図。
【図７】実施例３におけるポンプ１０９の圧力変化を示す図。
【図８】実施例４におけるポンプ１０９の圧力変化を示す図。
【図９】実施例５におけるポンプ１０９の圧力変化を示す図。
【図１０】実施例６におけるポンプ１０９の圧力変化を示す図。
【図１１】実施例７における、血小板活性化の様子を示す図（写真）。Ａ：ADP無し、Ｂ：0.025μM ADP、Ｃ：0.05μM ADP、Ｄ：0.1μM ADP。
【図１２】実施例８〜１０におけるポンプ２０９の圧力変化を示す図。
【図１３】本発明の血小板観測装置の第３の形態例を示す図。
【図１４】実施例１１〜１３におけるポンプ２０９の圧力変化を示す図。
【図１５】実施例１４及び１５におけるポンプ２０９の圧力変化を示す図。
【図１６】アラキドン酸添加血液の２０μｌ/minにおける圧力上昇結果を示す図。Aは実施例１６aの検体Gのアラキドン酸添加血液の２０μｌ/minにおける圧力上昇結果を示し、Bは検体Gのアスピリン１００ｍｇ服用後における１６a同様の実験における圧力上昇を示す。
【図１７】アラキドン酸添加血液の１０μｌ/minにおける圧力上昇結果を示す図。Cは実施例１６bの検体Gのアラキドン酸添加血液の１０μｌ/minにおける圧力上昇結果を示し、Dは検体Gのアスピリン１００ｍｇ服用後における１６ｂ同様の実験における圧力上昇を示す。
【図１８】アラキドン酸添加血液の５μｌ/minにおける圧力上昇結果を示す図。Eは実施例１６Cの検体Gのアラキドン酸添加血液の5μｌ/minにおける圧力上昇結果を示し、Fは検体Gのアスピリン１００ｍｇ服用後における16c同様の実験における圧力上昇を示す。
【図１９】コラーゲン添加血液の20μｌ/minにおける圧力上昇結果を示す図。Aは実施例１６dの検体Gのコラーゲン６μl添加血液の20μｌ/minにおける圧力上昇結果を示し、Bは実施例１８のコラーゲン1８μｌ添加血液、Cは実施例１８の１２μｌ添加血液、Dは検体Gのアスピリン１００ｍｇ服用後の、実施例１６d同様の実験における圧力上昇を示す。
【図２０】コラーゲン添加血液の10μｌ/minにおける圧力上昇結果を示す図。Eは実施例１６eの検体Gのコラーゲン添加血液の10μｌ/minにおける圧力上昇結果を示し、Fは検体Gのアスピリン１００ｍｇ服用後における16e同様の実験における圧力上昇を示す。
【図２１】コラーゲン添加血液の5μｌ/minにおける圧力上昇結果を示す図。Fは実施例１６fの検体Gのコラーゲン添加血液の5μｌ/minにおける圧力上昇結果を示し、Gは検体Gのアスピリン１００ｍｇ服用後における16f同様の実験における圧力上昇を示す。
【図２２】実施例２１の０．４μｇ／ｍｌまたは０．８μｇ／ｍｌのＲｅｏＰｒｏで処理された血液の２０μｌ/minにおける圧力上昇結果を示す図。controlは実施例１９の血液（ＲｅｏＰｒｏ処理なし）の２０μｌ/minにおける圧力上昇結果を示す。
【図２３】実施例２１の０．４μｇ／ｍｌまたは０．８μｇ／ｍｌのＲｅｏＰｒｏで処理された血液の７μｌ/minにおける圧力上昇結果を示す図。controlは実施例２０の血液（ＲｅｏＰｒｏ処理なし）の７μｌ/minにおける圧力上昇結果を示す。
【図２４】実施例２２の０．０１μｇ／ｍｌまたは０．１μｇ／ｍｌのＯＳ−１で処理された血液の２０μｌ/minにおける圧力上昇結果を示す図。controlはＯＳ−１処理なしの血液の２０μｌ/minにおける圧力上昇結果を示す。
【図２５】実施例２２の０．０１μｇ／ｍｌまたは０．１μｇ／ｍｌのＯＳ−１で処理された血液の７μｌ/minにおける圧力上昇結果を示す図。controlはＯＳ−１処理なしの血液の７μｌ/minにおける圧力上昇結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
まず、図面を参照して本発明の血小板検査装置を説明する。なお、本発明において、「血液」とは、全血及び多血小板血漿を含む。
図１は、本発明の血小板検査装置を構成するマイクロチップの第１の形態例を示す概念図である。以下、図１に基づいて説明する。
【００１６】
図１（Ａ）は、マイクロチップ１のキャピラリー１０１となる溝が表面に掘られた第１の基板１００の平面図である。この溝の断面形状は、凹字状、Ｕ字状、Ｖ字状等任意である。血小板凝集塊は脆いため、圧力上昇を測定するためには溝の深さは１０〜２００μｍ以下であることが望ましい。溝の幅は１０〜１００μｍであることが好ましい。
そして、キャピラリー１０１となる溝の第１の端部（流入口側端部）と第２の端部（排出口側端部）の間の一部には、血液の流れる方向に沿って延在する複数の流路分割壁１０３が設けられ、該キャピラリーの幅を複数に分割する流路分割部１０２を形成している。
また、流路分割壁１０３の間隔は200μｍ以下であることが望ましい。幅が200μｍ以下であれば血小板凝集塊が形成された場合、高血流、高ずり応力下においても血流に飛ばされず内部圧力を上昇させることが可能である。また、流路分割部１０２において、キャピラリー１０１の幅は流路分割壁１０３によって５つ以上に分割されていることが望ましい。すなわち、流路の幅が５本以上に分割されていれば、各分割流路の閉塞が平均化され、バラツキの少ないデータが得られやすい。
なお、流路分割壁１０３の形状は、キャピラリー１０１の幅を複数に分割できさえすれば特に制限されない。
【００１７】
図１（Ｂ）は、マイクロチップ１の流入口１０４および排出口１０５となる貫通孔が掘られた第２の基板１１０の平面図である。流入口１０４となる貫通孔および排出口１０５となる貫通孔の位置は、第１の基板１００と積層されたときに、それぞれ、第１の基板１００上の、キャピラリー１０１の第１の端部に相当する位置、キャピラリー１０１の第２の端部に相当する位置となっている。また、第１の基板１００上の流路分割部１０２に被せられる第２の基板１１０の裏面にコラーゲン等をコーティングすることで血小板易接着面１０６が形成される。具体的には、図１（Ｃ）に示す様に、血小板易接着面１０６にする位置に、安全を見て広幅に塗布される。
なお、血小板易接着面は図３（第２の形態例）のようにキャピラリーの全長に及んでもよい。第２の形態例では第２の基板２１０がガラスを素材としており、マイクロチップ２のキャピラリー２０１内部の第２の基板側全長が血小板易接着面２０６となる。
なお、図１や３のように第２の基板においてキャピラリーの第２の端部に相当する位置に貫通孔を設けて排出口とする代わりに、図１３（第３の形態例）に示されるように、第２の基板３１０においてキャピラリー３０１の第２の端部に相当する位置を取り囲むように溝を設けて、第１の基板３００と貼り合わせることにより、血小板易接着面３０６を通過した血液廃液を貯留する廃液貯留部３０７としてもよい。廃液貯留部３０７の容積を試験に用いる血液量よりも大きくすることにより、第１および第２の形態例のように血液廃液を排出口からポンプ等で吸引して排出する必要がなく、より簡便な検査が可能である。なお、廃液貯留部３０７には貫通孔を設けてこれを空気穴３０５としてもよい。そして、マイクロチップ３の表面の貫通孔３０５に相当する位置に血液吸収材３０８を設置すれば、血液サンプルの量が多い場合でもマイクロチップ外に血液廃液が飛散することがない。血液吸収材としては、例えば、スポンジや布などを貼り付けることができる。
【００１８】
図１（Ｃ）は、第１の基板１００の溝と第２の基板１１０の血小板易接着面が内側になるように、第１の基板１００と第２の第２の基板１１０が積層されたマイクロチップ１の平面図である。波線は、キャピラリー１０３がマイクロチップ１の内部に存在することを示す。
【００１９】
血小板易接着面としては、コーティングされたコラーゲンやガラスなどを挙げることができる。これらのうち、入手が容易で、取り扱いやすく、実際の血管に近いモデルとなることからコラーゲンが特に好ましく、コラーゲンと組織トロンボプラスチンを含むものでも良い。血小板易接着面は血流によって流出しないようコラーゲン等の物質は、血小板易接着面１０６に高い接着強度でコーティングされている。
コラーゲンのコーティングは、例えば、特開平０５−２６０９５０号公報やＢｌｏｏｄ．１９９５  Ａｐｒ  １；８５（７）：１８２６−３５．に記載されているように、コラーゲンを酸性溶液に溶解し、これを親水性が付与されたガラスやポリスチレン等の基板の所定の位置に塗布し、洗浄、乾燥するなどの方法にて簡便に高い接着強度でコーティングが可能である。
疎水性の樹脂等にコートする場合には、樹脂表面をプラズマ処理等で親水化した後、所望の領域にコラーゲン溶液を塗布し、自然乾燥ないしは減圧下にて乾燥することでコーティングすることが出来る。
基材としてプラスチックを用いた場合はプラズマ処理等で親水化し、所望の領域にコラーゲン溶液をピペットやシリンジ等のディスペンサーで塗布し、自然乾燥または減圧下で乾燥することでコラーゲンまたは組織トロンボプラスチンを含むコラーゲンを容易にコーティングすることが可能である。
血小板易接着面としてガラスを用いる場合、第２の基板１１０上の血小板易接着面１０６に相当する位置のみガラスで、それ以外の部分はプラスチック、シリコーン等で形成された第２の基板１１０を用いてもよいが、図３のように、第２の基板２１０としてガラス基板を用い、プラスチック、シリコーン等で形成された第１の基板２００と積層したときに血小板易接着面２０６がキャピラリー２０１の全長に及ぶようにしてもよい。
【００２０】
マイクロチップ１の材質は、金属、ガラスやプラスチック、シリコーン等が好ましい。また、血液観測（特に画像解析）に使用する観点からは透明な材質が好ましい。さらに、回路を形成する観点からはプラスチックが好ましく、透明なプラスチックが特に好ましい。材質をＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）等のシリコーン製とした場合には、基板同士の密着性に優れるため、第１の基板１００と第２の基板１１０を接着剤などで接着しなくても圧着することで積層することが出来るが、マイクロチップ１の内部に高い圧力がかかる場合は、接着剤を用いることが好ましい。また、ポリ２−メトキシエチルアクリレート（ＰＭＥＡ）によっても簡便かつ効果的に意図しない部位での血液凝固を抑制する事が可能である。なお、マイクロチップ１の基板に設けられる溝や穴は、刃物やレーザー光線で堀ることもできるが、マイクロチップ１の材質がプラスチックである場合は、射出成型で形成することもできる。射出成型で形成すると、一定した品質のマイクロチップ１が効率よく作成できるので好ましい。
【００２１】
本形態例のマイクロチップ１を用いた血小板機能検査の一例を図１（Ｃ）に基づき説明する。第１の流入口１０４には図示しないチューブが接続され、チューブを介して図示しない血液リザーバー（血液収容部）１０７及び送液ポンプ１０９が接続される。そして、接続されたポンプ１０９より該ポンプ内の液体をリザーバー１０７に注入することで、該リザーバー内の血液がマイクロチップ１に注入される。この時ポンプ内の液体が血小板活性化試薬であるとリザーバー内の抗凝固処理された血液の血小板が活性化され、さらに、血小板易接着面を通過するときにずり効力により活性化を受ける。さらにリザーバー内の血小板活性化試薬の濃度を持続的に上昇させてもよい。血液リザーバー内に攪拌子を入れ内部血液を攪拌すると血小板活性化試薬が常に血液に混合され好ましい。
また送液ポンプの液体はミネラルオイル又は生理食塩水などの血液より比重の小さい液体とし、送液ポンプで当該液体を抗凝固処理された血液があらかじめ充填されたリザーバーに導入することで、血液がキャピラリーへ導入されるようにしてもよい。該液体の流入圧を測定することで血液のキャピラリーへの流入圧を間接的に測定することができる。なお、リザーバーに予め充填された抗凝固処理された血液は血小板活性化試薬が混合されたものであることが好ましい。また、血小板活性化試薬を乾燥又は液体状態でリザーバー内に予め入れておき、血液と混合することも可能である。又、送液ポンプの流速を段階的に高めることで、ずり応力を段階的に上昇させることも可能である。
【００２２】
ここで、血液の凝固を抑制する抗凝固処理に用いる抗凝固処理剤としては、クエン酸ナトリウムまたはカリウム、シュウ酸ナトリウムまたはカリウム、ＡＣＤ（Ａｃｉｄ  Ｃｉｔｒａｔｅ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）塩などを挙げることができる。このような抗凝固処理剤は、粉末、凍結乾燥品、水溶液などの溶液として使用することができる。これらの抗凝固処理剤のうち、一般的な３．２％クエン酸ナトリウムが容易に入手できることから好ましい。この場合、血液９容に対してこの抗凝固処理剤１容とするのが好ましい。
その他の抗凝固処理剤としてはへパリン、ヒルジン、トロンビンアプタマー、コーン由来トリプシンインヒビター（１９７７．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２５２．８１０５）等の利用が可能である。なお、抗凝固処理剤は、複数用いられてもよい。用いる抗凝固剤がヒルジンの場合には、クエン酸による抗凝固処理の場合に比べ、血小板活性化試薬の処理が無くとも、より強固な血小板凝集が引き起こされるので、ずり応力依存的な血小板機能を測定するのに適している。クエン酸による抗凝固処理血液の場合には、血小板活性化試薬の刺激依存的な血小板機能測定が精度良く測定でき、抗血小板剤の評価などにより適している。
【００２３】
抗凝固処理された血液を得る方法としては、シリンジまたは真空採血管に予め上記の抗凝固処理剤を入れて採血を行うか、または、採血直後の血液に抗凝固処理剤を速やかに加える等の方法で抗凝固処理した血液を得ることができる。
さらに、ヘパリンを含む真空採血管等で採血した後、へパリナーゼと観測目的に適した抗凝固処理剤を加え、ヘパリナーゼでヘパリンを分解させ、測定目的に適した抗凝固処理剤と置き換えることも可能である。
【００２４】
抗凝固処理された血液と混合する血小板活性化試薬としては、ＡＤＰ、コラーゲン、トロンビン、アラキドン酸およびリストセチン等が挙げられる。血小板活性化試薬は、微弱な血小板活性化が起こるような濃度で抗凝固処理された血液と混合する。微弱な血小板活性化が起こるような濃度とは、静止状態では不可逆的血小板凝集（血小板二次凝集）を引き起こさないような濃度、例えば、ＡＤＰの場合、０．００１〜５μＭであり、アラキドン酸の場合、０．００１〜１ｍＭである。但し、血小板機能の異常及び抗血小板剤の投与によりこれら血小板活性化試薬に対する反応性が明らかに低下している場合には、その低下具合を測定する場合には、これらの濃度を超えた血小板活性化試薬を加えて測定することが望ましい。特にクロピドグレル及びアスピリンの効果の程度を測定する場合には、それぞれADP,アラキドン酸の濃度を上げて測定することが望ましい。
【００２５】
流入口１０４から導入され、キャピラリー１０１を通過した、微弱な血小板活性化試薬と抗凝固処理された血液の混合液は、流路分割部１０２を通過することで、ずり応力が生じ、血小板の活性化が増強され、血小板易表面にて粘着・積層される。流速及びマイクロチップを調整して高ずり応力と低ずり応力下における比較実験を行うことで、より詳細な血小板機能評価及び抗血小板剤の薬効の評価などが可能である。なお、流路分割部１０２を通過する混合液の流速や性状を観測することによって、血小板機能の観測を行うことができる。観測に供した血液は、キャピラリー１０１の終端に設けられた排出口１０５から排出される。
【００２６】
次に、マイクロチップ１を用いた本発明の血小板検査装置について説明する。
図２は、マイクロチップ１を透明な基板で構成して組み込んだ本発明の血小板検査装置の第１の形態例である血小板検査装置Ａの模式図である。以下、図２に基づいて第１の形態例を説明する。
【００２７】
マイクロチップ１の流入口１０４には、抗凝固処理された血液が収容され、攪拌子１０８を内包するリザーバー１０７（血液収容部）が倒立して接続されており、リザーバー１０７はチューブを介して血小板活性化試薬を供給する送液ポンプ１０９が接続されている。送液ポンプ１０９には図示しない圧力センサーが接続されている。
そして、送液ポンプ１０９から、血小板活性化試薬がリザーバー１０７内に圧入され、血小板活性化試薬と抗凝固処理された血液とが、磁力スターラー１１３によって回転される攪拌子１０８により混合される。
【００２８】
送液ポンプ１０９からリザーバー１０７内に血小板活性化試薬を導入する際、ポンプの流速を調節することによって、血液と混合された際の血小板活性化試薬の濃度が、0〜血小板を十分惹起しうる濃度まで自動的に上昇ようにすれば、血小板の機能亢進及び機能低下を一度の実験で測定することが出来て望ましい。例えば、ADP濃度０〜０．１μＭに濃度勾配的に上昇させるか、0, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.1μMと段階的に惹起物質の濃度が上昇されても良い。
【００２９】
血小板活性化試薬と混合された抗凝固処理血液は、マイクロチップ１のキャピラリー１０１内に押し出される。混合液はキャピラリー１０１を通過し、コラーゲンやガラス等の血小板易接着表面を有する流路分割部１０２に到達する。
流路分割部１０２における血小板の活性化（血小板の粘着・凝集など）やそれに伴うキャピラリーの閉塞をカメラ１１１で観察することで血小板機能の検査を行うことができる。あるいは、流路内の圧力を送液ポンプ１０９に接続された圧力センサーによって測定することでより定量的な血小板機能検査が可能となる。また、血液と血小板活性化試薬との混合液のキャピラリー１０１の通過時間または通過量を測定することによっても血小板機能検査を行うことができる。
カメラ１１１は画像解析装置１１４に接続されており、それによって血小板活性化の様子を画像化したりすることができる。内部の血小板活性化を撮影することにより視覚的評価及び圧力上昇による血小板活性化の定量的検査の併用は、患者血液の状態を総合判断する上で非常に重要である。例えば、DIC等の病態において血小板が生体内で既に活性化を受けるとともに血小板が消耗し著しく減少しているケースにおいては、圧力上昇や閉塞時間は遅延される。そのようなケースにおいても、内部をカメラにより撮影することで検査開始直後から血小板易接着表面への血小板の粘着及び凝集の上昇などを確認することができ、患者の血小板の状態を総合的に判断することが可能となる。
カメラ１１１はキャピラリー１０１の血流方向に沿って移動可能なものでもよい。
なお、キナクリン等によって血小板を蛍光標識して解析することもでき、その場合、蛍光発色による単位面積あたりの輝度を画像解析で観測することで観測結果を数値化し、データとして取得することが可能である。
【００３０】
なお、マイクロチップ１はステージ状のヒーター１１５の上に設置されており、ヒーター１１５によって３７℃に加温することでより生体内に近い条件で測定を行うことができる。
流路分割部１０２を通過した血液混合液は、排出口１０５から排出管１１２により円滑に排出される。
【００３１】
撹拌子は、抗凝固処理されていることが好ましい。抗凝固処理としては、ヘパリン、ポリビニルラクトンアミド（ＰＶＬＡ）やポリ２−メトキシエチルアクリレート（ＰＭＥＡ）等を磁性体の表面に溶融樹脂への浸漬による被覆やインモールド射出成型等の樹脂加工を用いて攪拌子の表面を形成する処理とすることが可能である。
【００３２】
以上のとおり、マイクロチップ外のリザーバーで血小板活性化試薬と抗凝固処理血液が混合され、マイクロチップ内のキャピラリーに導入される態様を例示して説明したが、本発明の血小板機能検査装置は上記態様に限定されない。
例えば、マイクロチップ内に、抗凝固処理血液と血小板活性化試薬を混合する混合部が設けられたマイクロチップを用い、マイクロチップ内で血液と血小板活性化試薬が混合され、該混合液が混合部からキャピラリーへと流れるように構成することもできる。
【実施例】
【００３３】
以下に、具体的な実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。【００３４】
〔マイクロチップおよび血小板機能検査装置の作成〕
図１（Ａ）に示す第１の基板１００および図１（Ｂ）に示す第２の基板１１０の２枚の透明な基板（株式会社リッチェル製射出成型品）を用意した。第１の基板１００のキャピラリー１０１となる溝が開口する面と第２の基板１１０の血小板易接着面１０６を有する面を対向させてシランカップリング剤及び60度16時間の熱圧着により貼り合せ、図１（Ｃ）に示すマイクロチップ１とした。なお、第１の基板１００においては、流路（キャピラリー）１０１の長さは２０ｍｍ、深さは５０μｍ、幅は２ｍｍとし、流路分割部１０２には、長さ２ｍｍ、幅25μｍ、高さ５０μｍの流路分割壁１０３を２５μｍの等間隔で設置し、この部分を流路分割部１０２とした。第２の基板１００においては、流入口１０４および排出口１０５となる穴は内径２ｍｍ深さ２ｍｍの断面円形の貫通孔とした。また、第２の基板１１０の、第１の基板１００の流路分割部１０２と重なる位置に３ｍｇ/mlのコラーゲンタイプI（新田ゼラチン製）を塗布し真空乾燥して血小板易接着面１０６とした。
図２のように、作成したマイクロチップ１を、ステージ状のヒーター１１５の上に設置し、マイクロチップ１の流入口１０４にリザーバー１０７を接続し、リザーバー１０７にはチューブを介してポンプ１０９を接続し、ポンプにかかる圧力を図示しない圧力センサーで測定した。リザーバー１０７内には、鉄製の円柱をＰＭＥＡで被覆した直径２ｍｍ、長さ５ｍｍの円柱形状の撹拌子１０８を収納した。撹拌子１０８は、３７℃に加温したヒーター１１５の下に設置されたスターラー１１３の磁力によって６０〜１８０ｒｐｍで回転するようにした。排出口には排出管１１２を接続し、解析終了後の血液を排出できるようにした。また、マイクロチップ１の流路分割部１０２の上方には画像解析装置１１４が接続したカメラ１１１を設置し、流路分割部１０２における血小板活性化の様子を観察できるようにした。【００３５】
実施例１）
図１に示すマイクロチップ１及び図２に示す血小板検査システムＡを用いて測定を行った。クエン酸によって抗凝固処理を行った血液を被験者Aより採血した。
リザーバー１０７にはクエン酸で抗凝固処理された全血を満たし、接続されるポンプ１０９によって生理食塩水を注入口よりリザーバー１０７内に注入することで血液をリザーバー１０７から押し出しマイクロチップ１内に流入させた。リザーバー１０７内には攪拌子１０８が入っており血液は攪拌子１０８によって攪拌されている。
ポンプ１０９の流速は最初の10秒間100μl/分で流し、以降は3μl/minで流した。
ポンプ１０９の圧力変化を図５に示す。【００３６】
実施例２）
実施例１の実験で、3μl/minの流速を6μ/minで流した以外は全く同様の実験を行った
（実施例1と同じ被験者の血液検体Aを用いた。）。ポンプ１０９の圧力変化を図６に示す。
（考察）同一検体において流速を３μl/min〜６μl/minに上昇させることでずり応力の上昇が起き、圧力上昇が確認された。【００３７】
実施例３）
ポンプ１０９に生理食塩水の代わりに0.5μMのADP溶液を充填した以外は実施例２と全く同様の実験を行った。（実施例と同じ被験者Aの血液検体を用いた。）ポンプ１０９の圧力変化を図７に示す。【００３８】
実施例４〜６）
実施例１〜３の実験を別被験者検体（検体B）を用いて測定した。ポンプ１０９の圧力変化を図８，９，１０にそれぞれ示す。【００３９】
比較実験）
被験者A及びBの血液を８００ｒｐｍで遠心分離を行い多血小板血漿を得、両検体について血小板凝集能測定装置（PA-20興和株式会社）によってADP惹起血小板凝集能を測定した。１μMのADPによる大凝集は被験者Aに比し被験者Bの血液は半分程度であった。【００４０】
考察）
被験者AとBの結果より、被験者Aはずり応力下におけるコラーゲンの粘着・凝集による圧力上昇は被験者Bに比べて弱めであるが、ADPによる凝集能は強めで、ADP添加時には被験者Bと同等のコラーゲンへの粘着・凝集による圧力上昇が確認された。【００４１】
実施例７）
画像による診断実施例１のマイクロチップ１及びシステムＡを用いて実験を行った。ポンプ１０９にはミネラルオイルを充填し、リザーバー１０７にはクエン酸で抗凝固処理された血液を満たした。流速8μl/minでポンプ１０９よりリザーバー１０７にミネラルオイルを送液し、血液をマイクロチップ１に流した。全く同様の実験をそれぞれクエン酸血液に終濃度0.025μM、0.05μM、0.１μMのADPを添加した血液を用いて実施した。図１１はそれぞれ約１分後のマイクロチップ１内の様子をカメラ１１１により撮影したものである。【００４２】
考察）
ADP添加時はADPの濃度依存的に、櫛部分に付着する血小板の量の上昇が確認され圧力上昇を伴わないレベルにおいても血小板の付着を視覚的に確認することが出来た。【００４３】
〔マイクロチップおよび血小板機能検査装置の作成〕図３Ａに示す第１の基板２００と図３Ｂに示す第２の基板２１０を積層して接着させて図３Ｃに示すマイクロチップ２を作成した。基板２００はPDMS製の基板（フルイドウェア社）と、全ての流路の深さを１２０μｍとし、流路幅は１ｍｍ、櫛の長さ１ｍｍ、櫛の幅５０μｍ、溝幅を５０μｍとした。基板２１０にはスライドガラスを用い、基板１１０と同様に、流入口と排出口に相当する貫通孔は設けたが、ガラスが血小板易接着面の役割を果たすため、基板１１０と異なりコラーゲンは塗布していない。すなわち、キャピラリー２０１内部の第２の基板側が全長にわたって血小板易接着面２０６となる
図４に示す血小板機能検査装置Ｂは、マイクロチップ１の代わりにマイクロチップ２を用いたこと、および、撹拌子とスターラーを備えていないこと以外は、図２の血小板機能検査装置Ａと同じである。以下の実施例ではあらかじめＡＤＰと混合した抗凝固処理血液をリザーバーに入れたため、撹拌子とスターラーは不要である。【００４４】
実施例８）
図３に示されるマイクロチップ２と図４に示される血小板機能検査装置Ｂを用いた。
血液リザーバー２０７にクエン酸により抗凝固処理した血液約６００μｌ充填した。ポンプ２０９にミネラルオイルを充填し、ポンプ２０９とリザーバー２０７を接続しリザーバー２０７の先端はさらにマイクロチップ２の流入口２０４に接続した。ポンプ２０９からミネラルオイルを２０μｌ/分の流速でマイクロチップ２に注入し、図示しない圧力センサーによってミネラルオイルの流入圧力を測定した。【００４５】
実施例９)
リザーバー２０７内にクエン酸によって抗凝固処理した血液にさらに終濃度２nMになるようにADP（和光純薬製）を加えた血液を用いた以外は全く実施例８と同様の実験を行い圧力の変化を測定した。【００４６】
実施例１０)
７５ｍｇクロピドグレル（Sanofi-aventis社）を服用3時間後の血液を用いた以外は実施例９と全く同様の実験を行い圧力変化を測定した。【００４７】
実施例８〜１０におけるポンプ２０９の圧力変化を図１２に示す。ごく微量のADP添加により圧力上昇がおき、その上昇はクロピドグレルの服用によって抑えられた。【００４８】
〔マイクロチップおよび血小板機能検査装置の作成〕図１（A）に示す第１の基板１００および図１（B）に示す第２の基板１１０の２枚の透明な基板（株式会社リッチェル製射出成型品）を用意した。第１の基板１００のキャピラリー１０１となる溝が開口する面と第２の基板１１０の血小板易接着面１０６を有する面を対向させてシランカップリング剤及び熱圧着により貼り合せ、図１（Ｃ）に示すマイクロチップ１とした。なお、第１の基板１００においては、流路（キャピラリー）１０１の長さは２０ｍｍ、深さは５０μｍ、幅は２ｍｍとし、流路分割部１０２には、長さ1.5ｍｍ、幅50μｍ、高さ５０μｍの流路分割壁１０３を50μｍの等間隔で設置し、この部分を流路分割部とした。第２の基板においては、流入口および排出口となる穴は内径２ｍｍ深さ２ｍｍの断面円形の貫通孔とした。また、第２の基板１１０の、第１の基板１００の流路分割部１０２と重なる位置に３ｍｇ/mlのコラーゲンタイプＩ（新田ゼラチン製）を約10μl塗布し真空乾燥して血小板易接着面１０６とした。コラーゲンは櫛を含み、櫛より上流に４ｍｍ下流に２ｍｍの領域に塗布されている。
図４のように、作製したマイクロチップ１をヒーター２１５上に設置し、実施例８同様にポンプ２０９及びリザーバー２０７を接続した。【００４９】
実施例１１）
（ａ）検体Dからヒルジン採血管（Multiplate Services GmbH）を用いて採血を行ったヒルジンによって抗凝固処理された血液をリザーバー２０７に約６００μｌ充填した。ポンプ２０９にミネラルオイルを充填し、ポンプ２０９とリザーバー２０７を接続し、リザーバー２０７の先端はさらにマイクロチップ１の流入口１０４に接続した。ポンプ２０９からミネラルオイルをはじめの5秒間は２００μl/分、それ以降は２０μｌ/分の流速でリザーバーに注入することで、リザーバー内の血液を同様の流速にてマイクロチップ１に注入し、図示しない圧力センサーによってミネラルオイルの流入圧力を測定した。【００５０】
（ｂ）ポンプ２０９からミネラルオイルをはじめの5秒間は２００μl/分、それ以降は１０μｌ/分の流速でリザーバーに注入することで、リザーバー内の血液を同様の流速にてマイクロチップ１に注入した以外は、（ａ）と同様にして実験を行い、ミネラルオイルの流入圧力を測定した。【００５１】
（ｃ）ポンプ２０９からミネラルオイルをはじめの5秒間は２００μl/分、それ以降は５μｌ/分の流速でリザーバーに注入することで、リザーバー内の血液を同様の流速にてマイクロチップ１に注入した以外は、（ａ）と同様にして実験を行い、ミネラルオイルの流入圧力を測定した。【００５２】
実施例１１（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の結果を図１４（Ａ）に示す。横軸は時間、縦軸はチップ閉塞による圧力上昇を示す。圧力上昇は検体Dにおいて実施例（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の順、即ちずり応力の高い順に起こった。【００５３】
実施例１２）
実施例１１と同様の実験を検体Eに対しても実施した。結果を図１４（Ｂ）に示す。【００５４】
実施例１３）実施例１１同様の実験を検体Ｆに対して実施した。結果を図１４（Ｃ）に示す。【００５５】
参考例）
検体D、E、Fに対し、全血血小板凝集能測定装置multiplate(ダイナバイト社)を用いて血小板凝集能を測定した。採血はヒルジン採血管を使用し、6μＭのADPによる凝集能を測定した。結果を以下に示す。D  691AU/min、 E 525AU/min、 F 652AU/minADP凝集は検体D、F、Eの順に強かった。【００５６】
考察検体D、E、Fいずれにおいても高、中、低ずり応力の順番に圧力上昇が起こった。また、圧力上昇はD、F、Eの順番で起こり、この結果はmultiplateで実施したADP凝集能と相関性を示した。【００５７】
なお、実施例１１aと同様の実験を、クエン酸採血管にて採血し、クエン酸ナトリウムにより抗凝固処理して行ったところ、10分後も圧力上昇は確認されなかった。【００５８】
実施例１４）
クエン酸で抗凝固処理した検体Eの血液約600μlと１００μMのADP試薬（クロノログ社）を６μｌとを混和した直後の血液をリザーバーに満たし、これを、実施例１１a同様に、ミネラルオイルを満たしたポンプを接続しマイクロチップに接続した。マイクロチップ１はヒーター上で、はじめの5秒を200μｌ/分で流し、以降20μl/分で流した。【００５９】
実施例１５）
a)実施例１４同様の実験を検体Dの血液を用いて実施した。b)実施例１４同様の実験を、100mgのクロピドグレルを経口投与し6時間後の検体Dの血液を用いて実施した。【００６０】
実施例１５、１４の結果を図１５に示す。図１５において、Aは実施例１５a)の結果、Bは実施例１５ｂの結果、Cは実施例１４の結果である。検体Dにおいてクロピドグレル投与により圧力上昇が遅れ、クロピドグレル投与後は検体Eの血液に比べても圧力上昇が遅れていることが分かる。【００６１】
実施例１６）
a)クエン酸で抗凝固処理した検体Gの血液約600μlと５０ｍMのアラキドン酸（クロノログ社）６μｌとを混和した直後の血液をリザーバーに満たし、これを、実施例１１a同様に、ミネラルオイルを満たしたポンプを接続しマイクロチップに接続した。マイクロチップ１はヒーター上に設置され、はじめの5秒を200μｌ/分で流し、以降20μl/分で流した。【００６２】
b)クエン酸で抗凝固処理した検体Gの血液約600μlと５０ｍMのアラキドン酸（クロノログ社）６μｌとを混和した直後の血液をリザーバーに満たし、これを、実施例１１a同様に、ミネラルオイルを満たしたポンプを接続しマイクロチップに接続した。マイクロチップ１はヒーターに設置され、はじめの5秒を200μｌ/分で流し、以降10μl/分で流した。【００６３】
c)クエン酸で抗凝固処理した検体Gの血液約600μlと５０ｍMのアラキドン酸（クロノログ社）６μｌとを混和した直後の血液をリザーバーに満たし、これを、実施例１１a同様に、ミネラルオイルを満たしたポンプを接続しマイクロチップに接続した。マイクロチップ１はヒーターに設置され、はじめの5秒を200μｌ/分で流し、以降5μl/分で流した。【００６４】
d) クエン酸で抗凝固処理した検体Gの血液約600μlと１００μｇ/mlのコラーゲン（クロノログ社）６μｌとを混和した直後の血液をリザーバーに満たし、これを、実施例１１a同様に、ミネラルオイルを満たしたポンプを接続しマイクロチップに接続した。マイクロチップ１はヒーターに設置され、はじめの5秒を200μｌ/分で流し、以降20μl/分で流した。【００６５】
e) クエン酸で抗凝固処理した検体Gの血液約600μlと１００μｇ/mlのコラーゲン（クロノログ社）６μｌとを混和した直後の血液をリザーバーに満たし、これを、実施例１１a同様に、ミネラルオイルを満たしたポンプを接続しマイクロチップに接続した。マイクロチップ１はヒーターに設置され、はじめの5秒を200μｌ/分で流し、以降10μl/分で流した。【００６６】
f) クエン酸で抗凝固処理した検体Gの血液約600μlと１００μｇ/mlのコラーゲン（クロノログ社）６μｌとを混和した直後の血液をリザーバーに満たし、これを、実施例１１a同様に、ミネラルオイルを満たしたポンプを接続しマイクロチップに接続した。マイクロチップ１はヒーター上に設置され、はじめの5秒を200μｌ/分で流し、以降5μl/分で流した。【００６７】
実施例１７）
実施例１６のa〜ｆの実験を検体Gがアスピリン１００mgを服用してから６時間後に実施した。【００６８】
実施例１８）
検体Gのアスピリン１００ｍｇ服用６時間後の血液を用い、実施例１６ｄ〜ｆ同様の実験を、添加するコラーゲン１２μｌ及び１８μｌに増量して実施した。【００６９】
実施例１６〜１８の結果を図１６〜２１に示す。
これらの結果よりアスピリンの抗血小板効果がアラキドン酸、コラーゲンをクエン酸血液に添加し、マイクロチップに流し圧力上昇を測定することで解析することが可能であった。また図１９に示すようにアスピリンを服用した血液においても添加するコラーゲンを増量することで圧力上昇することが分かった。このことより本手法でアスピリンの効果の有無のみならず、血小板機能の抑制具合も評価可能であることが分かった。【００７０】
この様に画能による活性化血小板凝集塊の視覚的確認と圧力上昇の併用的な診断によって、患者血小板の状態をより詳細に把握することが可能である。【００７１】
実施例１９）
検体Ｈの血液を用いて実施例１１（ａ）同様の実験を行った。【００７２】
実施例２０）
ポンプ２０９からミネラルオイルをはじめの5秒間は２００μl/分、それ以降は７μｌ/分の流速でリザーバーに注入することで、リザーバー内の血液を同様の流速にてマイクロチップ１に注入した以外は、実施例１９と同様にして実験を行い、ミネラルオイルの流入圧力を測定した。【００７３】
実施例２１）
実施例１９及び実施例２０と同様の測定をヒルジンによって抗凝固処理した血液に対し０．４μｇ／ｍｌ、０．８μｇ／ｍｌの血小板膜上の受容体ＧＰＩＩｂＩＩＩａに対する抗体であるＲｅｏＰｒｏ（Eli lilly社）を添加してそれぞれ実施した。【００７４】
実施例２２）
実施例１９及び実施例２０と同様の測定をヒルジンによって抗凝固処理した血液に対し、血小板膜上の受容体ＧＰＩｂに対する阻害剤であるＯＳ−１（Biochemistry. 2008 Apr 22;47(16):4674-82）を０．０１μｇ／ｍｌ及び  ０．１μｇ／ｍｌ添加してぞれぞれ実施した。【００７５】
実施例１９、２０、２１の結果を図２２及び図２３に示す。
図２２は流速２０μｌ／ｍｉｎにおけるＲｅｏＰｒｏの抑制効果、図２３は流速７μｌ／ｍｉｎにおけるＲｅｏＰｒｏの抑制効果を示す。【００７６】
実施例２２の結果を図２４、図２５に示す。
図２４は流速２０μｌ／分におけるＯＳ−１の抑制効果、図２５は流速７μｌ／分におけるＯＳ−１の抑制効果を示す。【００７７】
考察）
ＧＰＩＩｂＩＩＩａは主にフィブリノゲンと結合し血小板凝集に関与し、ＧＰＩｂはｖＷＦと結合し高ずり応力下の血小板粘着反応に関与する受容体である。【００７８】
血小板の粘着反応を抑制するＯＳ−１は高ずり応力下においてより強い抗血小板作用を示したのに対し、ＲｅｏＰｒｏは低ずり応力下においてやや強い抗血小板効果を示した。
【符号の説明】
【００７９】
Ａ、Ｂ…血小板観測装置、１、２、３…マイクロチップ、１００，２００，３００…第１の基板、１０１，２０１，３０１…キャピラリー、１０２，２０２，３０２…流路分割部、１０３、２０３，３０３…流路分割壁、１０４，２０４，３０４…流入口、１０５，２０５…排出口、１０６，２０６，３０６…血小板易接着面、１０７，２０７…リザーバー、１０８…撹拌子、１０９，２０９…ポンプ、１１０，２１０…第２の基板、１１１，２１１…カメラ、１１２，２１２…排出管、１１３…スターラー、１１４，２１４…画像解析装置、１１５，２１５…ヒーター、３０５…空気穴、３０７…廃液貯留部、３０８…血液吸収材
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図１１】
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