(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ１ＰまたはＳ１Ｐ受容体を活性化することができるＳ１Ｐのフラグメントを含む、急性の痛み、心因性の痛み、侵害受容性疼痛および神経障害性の痛みからなる群より選択される痛みであって、炎症性疼痛ではない痛みの予防または治療に使用するための医薬品。
【請求項２】
痛みを調節、および／または、予防するのに有用な医薬をスクリーニングする方法であって、
ａ．アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）活性を阻害することができるＰＡＭのフラグメントを含み、Ｓ１Ｐを含まないサンプルを提供する工程、
ｂ．アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）活性を阻害することができるＰＡＭのフラグメントを含み、同様に、Ｓ１Ｐも含む第二のサンプルを提供する工程、
ｃ．両方のサンプル中のＰＡＭ活性を測定する工程、
ｄ．第一のサンプルと化合物とを接触させる工程、
ｅ．上記化合物のＳ１Ｐの機能を模擬する能力を測定する工程
を含み（ただし、ＰＡＭの前記フラグメントは、配列番号２の４００〜１４００からなるフラグメント、配列番号２の４４６〜１０６２からなるフラグメント、配列番号２の４９９〜１０６５からなるフラグメント、配列番号２の１０２８〜１２３１からなるフラグメント、配列番号２の１０００〜１３００からなるフラグメント、配列番号２の１０００〜１１００からなるフラグメント、配列番号２の１０２８〜１０６５からなるフラグメント、配列番号２の４９８〜１０６６からなるフラグメント、または配列番号２の１０３８〜１２３１からなるフラグメントではないものとする。）、そして、
Ｓ１Ｐの機能を模擬する能力は、Ｓ１Ｐ受容体と相互作用して、および／または、Ｓ１Ｐ受容体を活性化して、ＰＡＭのトランスロケーションを媒介する、ＰＡＭの機能を活性化する、または、アデニリルシクラーゼの機能を不活性化する能力である、
上記方法。
【請求項３】
痛み（ただし、偏頭痛により引き起こされる痛みを除く）を軽減する、止める、および／または、予防するのに有用な医薬をスクリーニングする方法であって、
ａ）Ｓ１Ｐ受容体またはＳ１Ｐの相互作用によって発生する前記受容体に典型的なシグナルを媒介する能力を有するＳ１Ｐ受容体のフラグメントを発現する細胞を含む２つのサンプルを提供すること、
ｂ）一方のサンプルと、化合物とを接触させる工程、および、
ｃ）両方のサンプル中の受容体活性を測定する工程
を含み、そして、
化合物がＳ１Ｐ活性を有する場合には、前記化合物が選択され、ここでＳ１Ｐ活性は、Ｓ１Ｐ受容体と相互作用して、および／または、Ｓ１Ｐ受容体を活性化して、ＰＡＭのトランスロケーションを媒介する、ＰＡＭの機能を活性化する、または、アデニリルシクラーゼの機能を不活性化する能力に関し、そして、
Ｓ１Ｐ受容体に典型的なシグナルを媒介する能力は、ＰＡＭのトランスロケーションを媒介する、ＰＡＭの機能を活性化する、または、アデニリルシクラーゼの機能を不活性化する能力である、
上記方法。
【請求項４】
痛み（ただし、偏頭痛により引き起こされる痛みを除く）を軽減する、止める、および／または、予防するのに有用な医薬をスクリーニングする方法であって、
ａ）Ｓ１Ｐ受容体またはＳ１Ｐの相互作用によって発生する前記受容体に典型的なシグナルを媒介する能力を有するＳ１Ｐ受容体のフラグメントを発現する細胞を含む２つのサンプルを提供する工程、および、
ｂ）サンプルと、Ｓ１Ｐとを接触させる工程、および、
ｃ）他方のサンプルと、化合物とを接触させる工程、および、
ｄ）両方のサンプル中のＳ１Ｐおよび受容体の受容体活性または相互作用を測定する工程
を含み、そして、
化合物がＳ１Ｐ活性を有するか、模擬するか、または増強する場合には、前記化合物が選択され、ここでＳ１Ｐ活性は、Ｓ１Ｐ受容体と相互作用して、および／または、Ｓ１Ｐ受容体を活性化して、ＰＡＭのトランスロケーションを媒介する、ＰＡＭの機能を活性化する、または、アデニリルシクラーゼの機能を不活性化する能力に関し、そして、
Ｓ１Ｐ受容体に典型的なシグナルを媒介する能力は、ＰＡＭのトランスロケーションを媒介する、ＰＡＭの機能を活性化する、または、アデニリルシクラーゼの機能を不活性化する能力である、
上記方法。
【請求項５】
痛みを調節、および／または、予防するのに有用な医薬をスクリーニングする方法であって、
ａ．Ｓ１Ｐ受容体またはＳ１Ｐの相互作用によって発生する前記受容体に典型的なシグナルを媒介する能力を有するＳ１Ｐ受容体のフラグメントを発現し、そして、ＰＡＭまたはアデニリルシクラーゼ（ＡＣ）活性を阻害することができるＰＡＭのフラグメントを発現する細胞を提供する工程、
ｂ．上記細胞と化合物とを接触させる工程、
ｃ．化合物の存在下でＳ１Ｐ受容体活性を測定する工程、
ｄ．化合物の非存在下でＳ１Ｐ受容体活性を測定する工程、および、
ｅ．ｃ）によるＳ１Ｐ受容体活性と、ｄ）によるＳ１Ｐ受容体活性とを比較する工程
を含み（ただし、細胞がＳ１Ｐ受容体を発現するものである場合は、前記細胞はＰＡＭ、または配列番号２の４００〜１４００からなるフラグメント、配列番号２の４４６〜１０６２からなるフラグメント、配列番号２の４９９〜１０６５からなるフラグメント、配列番号２の１０２８〜１２３１からなるフラグメント、配列番号２の１０００〜１３００からなるフラグメント、配列番号２の１０００〜１１００からなるフラグメント、配列番号２の１０２８〜１０６５からなるフラグメント、配列番号２の４９８〜１０６６からなるフラグメント、および配列番号２の１０３８〜１２３１からなるフラグメントから選択さ
れるＰＡＭのフラグメントを発現するものではないものとする。）、
ここでＳ１Ｐ受容体活性は、Ｓ１Ｐと相互作用して、および／または、Ｓ１Ｐにより活性化されて、ＰＡＭのトランスロケーションを媒介する、ＰＡＭの機能を活性化する、または、アデニリルシクラーゼの機能を不活性化する能力に関し、そして、
Ｓ１Ｐ受容体に典型的なシグナルを媒介する能力は、ＰＡＭのトランスロケーションを媒介する、ＰＡＭの機能を活性化する、または、アデニリルシクラーゼの機能を不活性化する能力である、
上記方法。
【請求項６】
細胞を、化合物の代わりにＳ１Ｐと接触させ、ｃ）およびｄ）に記載のＳ１Ｐ受容体活性を、Ｓ１Ｐの存在下でのＳ１Ｐ受容体活性と比較する工程をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
痛み（ただし、偏頭痛により引き起こされる痛みを除く）を軽減する、止める、および／または、予防するのに有用な医薬をスクリーニングする方法であって、
ａ．２つのサンプル（各サンプルは、Ｓ１ＰまたはＳ１Ｐ受容体を活性化することができるＳ１Ｐのフラグメントを含み、そして、Ｓ１Ｐ受容体またはＳ１Ｐの相互作用によって発生する前記受容体に典型的なシグナルを媒介する能力を有するＳ１Ｐ受容体のフラグメントを含むものとする）を提供する工程、
ｂ．上記サンプルの一方と、化合物とを接触させる工程、
ｃ．両方のサンプル中のＳ１Ｐ活性を測定し、比較する工程
を含み、そして
化合物がＳ１Ｐ活性を有するか、模擬するか、または増強する場合には、前記化合物が選択され、ここでＳ１Ｐ活性は、Ｓ１Ｐ受容体と相互作用して、および／または、Ｓ１Ｐ受容体を活性化して、ＰＡＭのトランスロケーションを媒介する、ＰＡＭの機能を活性化する、または、アデニリルシクラーゼの機能を不活性化する能力に関し、そして、
Ｓ１Ｐ受容体に典型的なシグナルを媒介する能力は、ＰＡＭのトランスロケーションを媒介する、ＰＡＭの機能を活性化する、または、アデニリルシクラーゼの機能を不活性化する能力である、
上記方法。
【請求項８】
アデニリルシクラーゼは、アデニリルシクラーゼＩ、ＶまたはVI型である、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
急性の痛み、心因性の痛み、侵害受容性疼痛および神経障害性の痛みからなる群より選択される痛みを調節する化合物を同定する方法であって、
ａ）試験化合物として、Ｓ１Ｐの活性を増強または模擬する化合物を選択すること、および、
ｂ）上記試験化合物を被検体に投与すること、および、
ｃ）被検体において痛みが調節されているかどうかを測定すること
を含み、
ここで、前記被検体は、非ヒト哺乳類であり、前記痛みは、炎症性疼痛ではないものとする、
上記方法。
【請求項１０】
少なくとも１種のＳ１Ｐ受容体を活性化する能力を有する、および／または、ＰＡＭの機能を活性化する能力を有する化合物を含む医薬品であって、前記化合物がＦＴＹ７２０、もしくはそれらのリン酸化された誘導体、または、該誘導体化合物の塩である、急性の痛み、心因性の痛み、侵害受容性疼痛および神経障害性の痛みからなる群より選択される痛みであって、炎症性疼痛ではない痛みを軽減するか、止めるか、または予防するのに使
用するための医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｓ１Ｐ（スフィンゴシン−１−リン酸）の使用に関する。本発明の他の形態は、医薬のスクリーニング方法、および、痛みを治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
痛みは、実際の、または潜在的な組織のダメージに反応して起こる複雑で主観的な感覚であり、それに対する感情的な応答である。急性の痛みは、潜在的な、または実際の外傷を示す生理学的なシグナルである。慢性の痛みは、体性性（器質性）または心因性のいずれかであり得る。慢性の痛みはしばしば、自律神経性の徴候を伴うか、または、その後に自律神経性の徴候が続くため、場合によっては、うつ状態に陥る。
【０００３】
体性性の痛みは、侵害受容性、炎症性、または、神経障害性によるものと考えられる。侵害受容性疼痛は、体性または内臓の痛みを感じる神経線維の継続的な活性化と同じと判断されている。神経障害性の痛みは、神経系の機能障害から生じる；末梢神経系、ＣＮＳ、または、その両方における異常な体性感覚のプロセスによって持続すると考えられている。（痛みのメカニズムの総論については、例えば、ＳｃｈｏｌｚおよびＷｏｏｌｆ，２００２年；ＪｕｌｉｕｓおよびＢａｓｂａｕｍ，２００１年，ＷｏｏｌｆおよびＭａｎｎｉｏｎ，１９９９年；Ｗｏｏｄ，Ｊ.Ｄ.，２０００年；ＷｏｏｌｆおよびＳａｌｔｅｒ，２０００年を参照）。
【０００４】
慢性の痛みは、個人が被る、加えて社会的、経済的な途方もない費用を発生させる。現存する薬理学的な痛みの治療は、有効性と安全性の両方に関してはなはだ満足のいくものではない。
【０００５】
これまで、痛みの治療には、２つのクラスの鎮痛薬が主として用いられている：非オピオイド鎮痛薬、大部分がアセトアミノフェンとＮＳＡＩＤ（非ステロイド系抗炎症薬）、および、オピオイド（麻酔性）アゴニスト（ここにおいて、「オピオイド」は、ＣＮＳ中の特異的なオピオイド受容体に結合し、アゴニスト作用を生じさせる天然または合成物質の一般名称である）。遺憾ながら、両方の鎮痛薬クラスであるオピオイドおよび非オピオイドは、いくつかの不要な副作用がある。オピオイドの最も重篤な副作用は、呼吸器系を阻害する可能性と、長期の治療の後に依存症になる可能性である（Ｓｃｈａｉｂｌｅ  Ｈ.Ｇ.，Ｖａｎｅｇａｓ  Ｈ.，２０００年）。一方で、非オピオイドの主要なクラスであ
るＮＳＡＩＤは、多種多様な潰瘍や出血のような胃腸の合併症、加えて腎臓障害を誘導する可能性がある（Ｓｃｈａｉｂｌｅ  Ｈ.Ｇ.，Ｖａｎｅｇａｓ  Ｈ.；２０００年）。米
国では毎年、従来のＮＳＡＩＤによって引き起こされる重度の胃腸の合併症のために約１６,０００人の患者が死亡していると推測されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
最先端の痛みの治療に関連する深刻な欠点を考慮すると、痛みを調節する薬物の新規のクラスの多大な必要性がある。特別には、急速に進む痛みの神経生物学の理解と、最先端の治療の欠点がない有効な治療を提供するという未だ満たされていない臨床上の必要性との間にある大きなギャップを考慮すると、新規の鎮痛薬のクラスに関する新しい標的の発見に努力を向ける必要がある。従って、本発明の目的は、痛みを調節する薬物の新しいクラスを開発し、提供する新しい手段を提供することである。
【０００７】
この目的は、痛みを調節する医薬化合物を製造するための、Ｓ１Ｐまたはそれらの機能
的フラグメントもしくは誘導体の使用によって解決される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、侵害受容過程におけるＳ１Ｐの関連と、その痛みを減少させる能力を初めて実証した発明者等の発見に基づく。Ｓ１Ｐに関して機能的な、という用語、または、Ｓ１Ｐの機能という用語は、Ｓ１Ｐが、その受容体の少なくとも１種と相互作用する能力、好ましくはその受容体を活性化する能力、または、細胞内のｃＡＭＰレベルを低める能力、または、ＰＡＭ（Ｍｙｃ関連タンパク質）の小胞体から細胞膜へのトランスロケーションを媒介する能力を意味し；より好ましくは、Ｓ１Ｐの機能という用語は、そのＰＡＭ活性を増強する能力（すなわち、ＰＡＭが、ＡＣと相互作用する能力、および／または、ＡＣ活性を低める能力、および／または、痛みを減少させる能力）、および／または、ＡＣ活性を阻害する能力、さらにより好ましくはその痛みを減少させる能力を意味する。Ｓ１Ｐ受容体に関して機能的という用語、または、Ｓ１Ｐ受容体の機能という用語は、Ｓ１Ｐ受容体が、Ｓ１Ｐと相互作用する能力、より特定には、Ｓ１Ｐの相互作用によって発生する前記受容体に典型的なシグナルを媒介する能力、さらに特定には、Ｓ１Ｐの相互作用によって発生する痛みのプロセシングに影響を与える能力を意味する。
【０００９】
Ｓ１Ｐのフラグメントは、図１５に記載の野生型分子より小さいあらゆるフラグメントであり得る。ＰＡＭのフラグメントは、対応する野生型より短いあらゆるポリペプチド、または、ポリヌクレオチド断片であり得る。Ｓ１Ｐ受容体のフラグメントは、対応する野生型より短いあらゆるポリペプチド、または、ポリヌクレオチド断片であり得る。
【００１０】
Ｓ１ＰまたはＳ１Ｐフラグメントの誘導体は、Ｓ１Ｐの機能を有する分子のあらゆる改変、または、化学的もしくは生物学的な改変のようなその他のあらゆる種類の改変を含んでもよく、このような改変としては、例えば、分子を安定化すること、または、それらの例えば所定の細胞への特異的なターゲティングを調節すること、または、その細胞への進入もしくは細胞による摂取を容易にすることが挙げられ；既知の改変の一つとしては、Ｓ１Ｐの水酸化またはメチル化が挙げられる。それらの必要な部位へのターゲティングと細胞への進入を確実にする、または、容易にするのに適した改変または添加剤が有用である。一方で、それらの脊髄へのターゲティングを確実にするために、適切なカテーテルなどを用いた脊髄内への適用のような局所的な適用なども考えられる。その他の有用な添加剤としては、それらの安定化等のための、塩（生理学的に許容できる有機または無機塩のための塩、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１４１８頁，１９８５年を参照）、緩衝液などが挙げられる。
【００１１】
Ｓ１Ｐは、特異的な受容体を介して細胞に吸収されるため、外部からの適用が可能であり、特異的に吸収されると予想される。Ｓ１Ｐターゲティングの調節は、例えば、Ｓ１Ｐ受容体をクローニングし、所望の細胞で発現させることにより実現することができる。細胞型に特異的な発現は、適切な遺伝子のプロモーター／エンハンサーを用いて確実にすることができ、これらは、当業界で既知である。
【００１２】
本発明は、発明者等の脊髄および後根神経節（ＤＲＧ）内での感作メカニズムにおけるＳ１Ｐの驚くべき関連を初めて実証した研究に基づく。
【００１３】
Ｓ１Ｐ（スフィンゴシン−１−リン酸）は、スフィンゴシンのリン酸化された誘導体であり、全てのスフィンゴ脂質の構造上の主鎖である。この細胞外（血清介在）スフィンゴ脂質は、異なる組織で差異的に発現され、それぞれ特異的な細胞の作用を調節するＳ１Ｐ1〜Ｓ１Ｐ5という５種の特異的なＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の一つに結合することによって多種多様な細胞性プロセスを調節することがわかっている（総論のために、例えばＰａｙｎｅ等，２００２年；および、ＳｐｉｅｇｅｌおよびＭｉｌｓｔｉｅｎ，２
０００年を参照）。細胞外Ｓ１Ｐの既知の機能としては、例えば、細胞の移動、細胞の生存または血管新生の調節が挙げられる。その細胞外の作用のほかに、細胞内メッセンジャーとして作用することも知られている（総論のために、例えばＰａｙｎｅ等，２００２年；および、ＳｐｉｅｇｅｌおよびＭｉｌｓｔｉｅｎ，２０００年を参照）。しかしながら、その侵害受容プロセスにおける関連は未だわかっていない。
【００１４】
ＰＡＭ（Ｍｙｃ関連タンパク質）は、５１０ｋＤａの巨大タンパク質である。ＰＡＭのタンパク質、ゲノムおよびコードポリヌクレオチド配列は当業界で既知であり、例えば、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ３８Ａ，ベセスダ，メリーランド州２０８９４，米国；www.ncbi.nhm.nih.gov）データベースより、登録番号ＡＡＣ３９９２８（コード配列；配列番号１）、ＡＦ０７５５８７（タンパク質配列；配列番号２）で公けに利用可能である。ヒトＰＡＭは、染色体１３ｑ２２上に位置する；そのゲノム配列は、ＮＴ＿０２４５２４.１１（始点：２４６７９８６１位；終点：２４９６２２４５位；配列番号３）で、公けに利用可能である。あるいは、これらのタンパク質およびコード配列は、ＫＩＡＡ０９１６、タンパク質登録番号ＮＰ＿０５５８７２（タンパク質配列）、および、ＮＭ＿０１５０５７（コード配列）で、公けに利用可能である。
【００１５】
ラットＰＡＭについて、以下のＥＳＴ−クローンをコードする配列が公開された形で利用可能である：
ＡＷ９２１３０３（ｈｓｃＤＮＡのｂｐ９６０〜１３９４に対応する；配列番号４）、
ＡＷ９１８７１１（ｈｓｃＤＮＡのｂｐ８１８８〜８６３２に対応する；配列番号５）、
ＢＱ２０１４８５（ｈｓｃＤＮＡのｂｐ８９６６〜９６３３に対応する；配列番号６）、
ＢＥ１１２８８１（ｈｓｃＤＮＡのｂｐ１０３１１〜１０８３０に対応する；配列番号７）、
ＡＷ４４１１３１（ｈｓｃＤＮＡのｂｐ１３５６９〜１４１５２に対応する；配列番号８）、
ＢＦ４０９８７２（ｈｓｃＤＮＡのｂｐ１３５６９〜１４８０７に対応する；配列番号９）。
【００１６】
ＰＡＭはもともと、ＭｙｃのＮ末端における転写活性化ドメインと特異的に相互作用する能力によって同定された（Ｇｕｏ  Ｑ.等，１９９８年）。ＰＡＭは近年、強力なＡＣ
活性阻害剤と説明されているが（Ｓｃｈｏｌｉｃｈ  Ｋ．，Ｐｉｅｒｒｅ  Ｓ.，Ｐａｔ
ｅｌ  Ｔ.Ｂ.：Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｙｃ（ＰＡＭ）ｉｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｄｅｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ.  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１年１２月１４日；２７６(５０)：４７５８３〜９）、侵害受容過程および感作におけるそれらの機能に関する証拠は未だ示されていない。
【００１７】
むしろ、ＰＡＭは、シナプス前部の成長の調節において役割を果たすと考えられている：ＰＡＭのｍＲＮＡは、海馬、歯状回および小脳などの特定の解剖学的な領域で高度に発現されることがわかっている。成体ラットおよびマウスの脳におけるＰＡＭおよびＭｙｃ発現の両方は、小脳の成熟したプルキンエ細胞、ならびに、海馬の顆粒および錐体細胞に限定される（Ｒｕｐｐｅｒｔ  Ｃ.等，１９８６年；Ｙａｎｇ  Ｈ.等，２００２年）。しかしながら、これら細胞型のいずれも、痛みのプロセシングおよび感作に関与することはわかっていない。
【００１８】
ショウジョウバエにおけるＰＡＭ相同体（ｈｉｇｈｗｉｒｅ）、および、Ｃ.エレガン
スにおけるＰＡＭ相同体（ｒｐｍ−１）は、シナプス前終末の組織化（Ｚｈｅｎ等，２０００年）、シナプスの成長の調節（Ｗａｎ等，２０００年）、シナプス形成、ならびに、軸索成長およびターゲティング（Ｓｃｈａｅｆｅｒ等，２０００年）において重要な役割を果たすことが示されている。これらの発見により、ｈｉｇｈｗｉｒｅ、ｒｐｍ−１およびそれらの哺乳動物相同体ＰＡＭは、シナプスの成長の負の調節因子として作用する可能性があるという仮説に至った（Ｃｈａｎｇ等，２０００年；Ｊｉｎ  Ｙ．２００２年）。それに沿って、小脳、海馬および歯状回におけるＰＡＭ発現の劇的な増加が、これら構造体における主要なシナプス形成期の際に観察された（Ｙａｎｇ等，２００２年）。
【００１９】
齧歯類における脳の発達の際に、ＰＡＭ発現は、誕生直後に開始し、最初の２週間の間中アップレギュレートされ、その後、ＰＡＭ発現は、成人期の間中高いレベルを保つ（Ｙａｎｇ等，２００２年）。これまで、脊髄およびＤＲＧにおけるＰＡＭの発現および調節、ならびに、痛みの感作メカニズムおよび調節におけるその機能についてはわかっていない。
【００２０】
これまで、ヒトＰＡＭは、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）シグナル伝達の強力な調節因子であり、数種のアデニリルシクラーゼ（ＡＣ；Ｅ.Ｃ.４.６.１.１）アイソフォーム
の酵素活性をナノモル濃度で阻害する（Ｓｃｈｏｌｉｃｈ等，２００１年）ことが実証されている。
【００２１】
遍在的なサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）のセカンドメッセンジャーシステムは、細胞外の刺激を細胞内のシグナルおよび応答に翻訳する様々なシグナル変換メカニズムの一つである。細胞外の刺激を受けると、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、三量体ＧＴＰ結合調節タンパク質（Ｇタンパク質）を介して細胞質膜に結合した酵素またはイオンチャンネルを調節する。ＧＰＣＲによって活性が調節される酵素の一つは、アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）、ｃＡＭＰ生成酵素である。このようにして、入ってくる細胞外の刺激は、細胞内のメディエイターであるサイクリックＡＭＰの細胞内の濃度に影響を与える。ｃＡＭＰレベルの上昇は、タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）を刺激し、特異的な細胞内の標的タンパク質をリン酸化し、それによってそれらの活性を改変することによって細胞に影響を与える。
【００２２】
それぞれのタイプの細胞は、特徴的な一連のＧＰＣＲ、これらＧＰＣＲによって調節される酵素、アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）の特異的なサブセットおよび標的タンパク質を有し、これらは、比較的非特異的な、または一般的に生じるプレイヤー（例えば遍在的なｃＡＭＰ）と共に作用して、各細胞が、入ってくる細胞外シグナルに対してそれらに特有の応答を生じさせるようにできる。例えば、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）セカンドメッセンジャーは、シナプス形成性の調節において主要な役割を果たすことがわかっている（Ｂａｉｌｅｙ等，１９９６年；Ｘｉａ等，１９９７年；Ｂｒａｎｄｏｎ等，１９９７年）；一方で、ｃＡＭＰは、代謝プロセスおよび細胞の増殖に関与する。このようにして、遍在的なｃＡＭＰメッセンジャーシステムの役割と、その様々な成分は、様々な組織および細胞型の様々な特殊化に従って多様である。
【００２３】
これまで、Ｓ１Ｐ受容体として作用する、Ｓ１Ｐ1〜Ｓ１Ｐ5という５種の異なるＧＰＣＲは当業界で既知である（総論のために、例えば、Ｓｐｉｅｇｅｌ，Ｓ．およびＭｉｌｓｔｉｅｎ，Ｓ.，２０００年を参照）。様々なＳ１Ｐ受容体のタンパク質およびコードポ
リヌクレオチド配列が当業界で既知であり、例えばＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ３８Ａ，ベセスダ，メリーランド州２０８９４，米国；www.ncbi.nhm.nih.gov）データベースより、登録番号：ＮＭ＿００１４００（配列番号３２；ホモサピエンスの内皮分化、スフィンゴ脂質Ｇ
タンパク質共役受容体、１ｍＲＮＡ（ＥＤＧ１／Ｓ１Ｐ1）のヌクレオチド配列；ＮＰ＿００１３９１（配列番号３１，ホモサピエンスの内皮分化、スフィンゴ脂質Ｇタンパク質共役受容体（ＥＤＧ１／Ｓ１Ｐ1）のタンパク質配列；ＮＭ：＿００４２３０（配列番号３４，ホモサピエンスの内皮分化、スフィンゴ脂質Ｇタンパク質共役受容体、５（ＥＤＧ５／Ｓ１Ｐ2）ｍＲＮＡのヌクレオチド配列；ＮＰ＿００４２２１（配列番号３３，ホモサピエンスの内皮分化、スフィンゴ脂質Ｇタンパク質共役受容体、５（ＥＤＧ５／Ｓ１Ｐ2）のタンパク質配列；ＮＭ＿００５２２６（配列番号３６，ホモサピエンスの内皮分化、スフィンゴ脂質Ｇタンパク質共役受容体３（ＥＤＧ３／Ｓ１Ｐ3）ｍＲＮＡのヌクレオチド配列；ＮＰ：００５２１７（配列番号３５，ホモサピエンスの内皮分化、スフィンゴ脂質Ｇタンパク質共役受容体３（ＥＤＧ３／Ｓ１Ｐ3）のタンパク質配列；ＮＭ：００３７７５（配列番号３８，ホモサピエンスの内皮分化、Ｇタンパク質共役受容体６（ＥＤＧ６／Ｓ１Ｐ4）ｍＲＮＡのヌクレオチド配列；ＣＡＡ０４１１８（配列番号３７，ホモサピエンスの内皮分化、１３−タンパク質共役受容体６（ＥＤＧ６／Ｓ１Ｐ4）のタンパク質配列；ＮＭ＿０３０７６０（配列番号４０，ホモサピエンスの内皮分化、スフィンゴ脂質Ｇタンパク質共役受容体８（ＥＤＧ８／Ｓ１Ｐ5）ｍＲＮのＡヌクレオチド配列；ＮＰ＿１１０３８７（配列番号３９，ホモサピエンスの内皮分化、スフィンゴ脂質Ｇタンパク質共役受容体８（ＥＤＧ８／Ｓ１Ｐ5）のタンパク質配列で公けに利用可能である。
【００２４】
本発明のその他の形態は、医薬品、好ましくは痛みを予防または治療するための医薬品として使用するための、Ｓ１Ｐまたはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体に関する。
【００２５】
本発明のさらなる形態は、痛みの調節のための、Ｓ１Ｐまたはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体の使用に関する。この調節は、好ましくは軽減または予防または全体的な抑制である。
【００２６】
その上、本発明は、痛みを調節する化合物を同定するためのＳ１Ｐまたはそれらの誘導体の機能的フラグメントの使用を包含する。上記調節する化合物は、好ましくは、Ｓ１Ｐ活性を模擬または増強する化合物である。最も好ましくは、それらは、痛みを予防する、減らす、または、止める能力を有する。
【００２７】
上記化合物は、例えば、それらの以下の能力によって同定することが可能である；
ａ）Ｓ１Ｐの機能（すなわち、その受容体またはそれらのフラグメントの少なくとも１種と相互作用する能力、好ましくは受容体を活性化する能力、または、細胞内のｃＡＭＰレベルを低める能力、または、ＰＡＭの小胞体から細胞膜へのトランスロケーションを媒介する能力；より好ましくは、そのＰＡＭ活性を増強する能力、および／または、ＡＣ活性を阻害する能力、さらにより好ましくは、その痛みを減少させる能力）、または、ＰＡＭの機能（すなわち、その、細胞内ｃＡＭＰレベルを低める能力、ＡＣのようなその他のファクター、特にＡＣと相互作用する能力、ＡＣを阻害する能力、または、その痛みの感覚を低める能力）を模擬する、回復させる、活性化する、または、増強することを意味しており、または、
ｂ）Ｓ１Ｐの血清レベルを増加させること（例えば、Ｓ１Ｐの生産を活性化または増強することによって、または、その細胞外の分解を減少させることによって）、または、
ｃ）少なくとも１つのＳ１Ｐ受容体の発現を増強すること（すなわち、その転写、転写物の安定化、翻訳またはその翻訳後プロセシングの活性化によって；その翻訳後修飾の調節によって、または、その安定化の活性化、または、その分解の阻害などによって）、または、
ｄ）Ｓ１Ｐの生産または分解に関与する酵素と相互作用すること。
【００２８】
本発明のその他の形態は、十分な量のＳ１Ｐまたはそれらの機能的フラグメントもしく
は誘導体を個体に投与することを含む、痛みを予防する、または、減らす方法に関する。
【００２９】
投与は、Ｓ１Ｐの作用部位（ＤＲＧまたは脊髄）へのターゲティングを可能にする方法で適切に予備的に行われるべきであり、例えば、Ｓ１Ｐ誘導体または製剤の血流への全身投与（例えば、静脈内または経口での適用）によって、または、Ｓ１Ｐまたはそれらのフラグメントもしくは誘導体の局所的な（例えば脊髄内の）適用によってなされる。
【００３０】
本発明のその他の形態は、痛みを調節、および／または、予防するのに有用な医薬をスクリーニングする方法に関し、以下の工程を含む：
ａ．ＰＡＭまたはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体を含み、Ｓ１Ｐを含まないサンプルを提供する工程、
ｂ．ＰＡＭまたはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体を含み、同様に、Ｓ１Ｐを含む第二のサンプルを提供する工程、
ｃ．少なくとも第一のサンプルと、化合物とを接触させる工程、
ｄ．サンプル中のＰＡＭ活性を測定する工程、
ｅ．前記化合物のＳ１Ｐの機能を模擬する能力を測定する工程。
【００３１】
本方法は、前記細胞を、前記化合物の代わりにＳ１Ｐと接触させ、上記のｃ）およびｄ）に係るＰＡＭ活性を、Ｓ１Ｐの存在下でのＰＡＭ活性と比較する工程をさらに含んでもよい。
【００３２】
その他の例としては、以下の工程を含む方法が示される：
ａ）Ｓ１Ｐ受容体またはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体を発現する細胞を含む２つのサンプルを提供する工程、および、
ｂ）一方のサンプルと、前記化合物とを接触させる工程、および、
ｃ）両方のサンプル中の受容体活性を測定する工程。
【００３３】
本発明のその他の形態に係る方法は、以下の工程を含む：
ａ）Ｓ１Ｐ受容体またはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体を発現する細胞を含む２つのサンプルを提供する工程、および、
ｂ）一方のサンプルと、Ｓ１Ｐとを接触させる工程、および、
ｃ）他方のサンプルと、化合物とを接触させる工程、および、
ｄ）両方のサンプル中の受容体活性またはＳ１Ｐおよび受容体の相互作用を測定する工程。
【００３４】
ＰＡＭまたはＳ１Ｐ受容体は、本発明の様々な形態に係る特定の目的が実現されるようなあらゆる配列から得られたものが利用可能である。好ましくは、ＰＡＭまたはＳ１Ｐ受容体はヒト由来である。
【００３５】
本発明の様々な形態に関して、ＰＡＭまたはＳ１Ｐ受容体が、単離されたポリペプチド、または、オリゴもしくはポリヌクレオチドである場合も好ましい。本発明の様々な形態の環境で「単離された」とは、自然源から少なくとも部分的に精製されているか、または、組換え分子（これらは当然ながら、精製されていてもよいし、または部分的に精製されていてもよい）を意味する。
【００３６】
アッセイとは、生物学的プロセスをモニターすることができるあらゆるタイプの分析方法のことである。薬物のスクリーニングで使用するためには、このようなアッセイは、再現可能でなければならず、好ましくは拡張可能で、頑強でもある。このようなアッセイは、好ましくは、化学物質の、痛みを調節する（好ましくは減少させる）および／または痛みを予防する能力に関するハイスループットスクリーニングに適している。ハイスループ
ットスクリーニングの大部分は、特定の能力に関して異なる約５００,０００種の化合物をスクリーニングすることを含む。このアッセイのタイプは、例えば、用いられる分子のタイプ（ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれか）と「読み出し」、すなわちＳ１Ｐ、ＰＡＭまたはＳ１Ｐ受容体活性が測定される方法によって様々である（以下を参照）。
【００３７】
このようなアッセイの様々なタイプが一般的に当業界で既知であり、商業的な供給元から市販されている。適切なアッセイは、標識された構成要素と標識されていない構成要素との相互作用を測定するための（例えば、ＰＡＭまたはそれらのフラグメントは、標識することができ、それらのＡＣとの相互作用は、モニターすることができる）、放射性同位体分析、または、蛍光分析、例えば蛍光偏光分析を包含する（例えば、パンベラ(Ｐａｎ
ｖｅｒａ)、パーキン・エルマー・ライフサイエンス(Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ)(例えばＬＡＮＣＥ)、または、パッカード・バイオサイエンス（
Ｐａｃｋａｒｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）（例えば、ＨＴＲＦまたはアルファスクリーン(ＡＬＰＨＡｓｃｒｅｅｎ)TM）によって商業的に供給されているもの）。
【００３８】
例えば医薬候補化合物と、受容体または機能的受容体フラグメントもしくは誘導体との相互作用を測定するためには、簡単な生化学的分析が適切である。また、より手の込んだ分析によれば、化合物が、特定の受容体を活性化し、それによりＳ１Ｐ活性を模倣することができるかどうかを決定することができる。
【００３９】
さらなる例としては、細胞に基づくアッセイが挙げられ、この場合、細胞系は、対象の組換えタンパク質を、安定して（誘導的に、または非誘導的に；染色体の、またはエピソームの）、または、一時的に発現する。これらのアッセイは、例えばレポーター遺伝子アッセイを含み、この場合、特定のプロモーター、または、シグナル変換カスケードの構成要素のシグナル伝達経路の調節が、レポーター酵素の活性に従って測定され、このレポーター酵素の発現は、前記特定のプロモーターの制御下にある。このタイプのアッセイにとって、組換え細胞系は、それ自体が調査されるか、または、調査中のシグナル伝達カスケードによって調節される特定のプロモーターの制御下に、レポーター遺伝子が含まれるように構築されていなければならない。適切なレポーター酵素は、当業界で一般的に既知であり、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ（例えば、パッカード・リージェント(Ｐａｃｋａｒｄ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ)より市販されている）、β−ガラクトシダーゼが挙げられる。適切な細胞系は、アッセイ目的に応じて様々であるが、たいていは、トランスフェクトが簡単であり、培養が簡単な細胞系が挙げられ、例えばＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＮＩＨ−３Ｔ３などである。
【００４０】
細胞内イオン濃度を測定するアッセイとしては、例えばＦＬＩＰＲ（蛍光測定イメージングプレートリーダー、モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）から市販されている）アッセイが挙げられ、この場合、冷却ＣＣＤカメラと連結されたアルゴンレーザー光源は、３８４ウェルプレートで、細胞（例えば、ニューロンの細胞、または、例えば、組換えもしくは自然に特定のイオンチャンネルを発現する細胞などの細胞）内で、一過性のイオンシグナル（例えばＣａ2+など）を同時測定することを可能にする。ＦＬＩＰＲアッセイは、例えば、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−４のような所定の蛍光色素を用いた細胞内のカルシウムのモニタリング、または、ＢＣＥＣＦもしくはＢＣＰＣＦもしくは特異的なＦＬＩＰＲアッセイキットを用いた細胞内のｐＨのモニタリング、または、例えばＤｉＢＡＣもしくは特異的なＦＬＩＰＲアッセイキットを用いた膜電位の変化の検出、または、膜の分極のモニタリングを可能にする。その他の細胞内のイオン、例えば亜鉛またはナトリウムをモニタリングするために、当業界で既知のその他の色素を用いることができる。その他のタイプのアッセイ、および、その他のタイプの読み出しは、一般的に当業者既知である。
【００４１】
ｃＡＭＰレベルの測定のためには、例えばアルファスクリーン、蛍光偏光法またはＨＴＲＦ技術が適切である。
【００４２】
イオンチャンネル活性（これは、例えば細胞内のイオン濃度を制御するため、細胞内のイオン濃度の測定に用いることができる）の測定のためには、例えば、膜電位感応性アッセイおよび色素を用いることができ、例えば、ＤｉＢＡＣ、または、ＦＬＩＰＲ技術に基づくモレキュラーデバイスの膜電位分析キット；ＦＬＩＰＲ技術を用いたミトコンドリア膜の分極を測定するＪＣ−１色素；細胞内のカルシウム濃度測定のための、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−４のようなイオン感応性色素、または、モレキュラーデバイスのカルシウム分析キット；細胞内のナトリウムを測定するための、ナトリウム感受性色素（例えばモレキュラープローブス製）；細胞内のカリウム濃度を決定するための、パッチ−クランピングに基づくアッセイ、または、原子吸光分光分析法に基づくルビジウムイオン流出測定などを用いることができる。さらに、細胞内の所定の変化および状態を検出するための自動装置および分析方法は当業者既知であり、例えばアキュメン・バイオサイエンス（ＡＣＵＭＥＮ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のアキュメン（Ａｃｕｍｅｎ）検出器（適切に標識された目的物の分布の３次元再構築を可能にする蛍光ベースのレーザースキャニングリーダー）が挙げられる。
【００４３】
ＧＰＣＲ活性の測定については、例えばｃＡＭＰ測定、例えばパッカード・バイオサイエンス製のアルファスクリーンTMｃＡＭＰ検出システムによる、Ｃａ2+動員アッセイまたはレポーター遺伝子アッセイが適切である。
【００４４】
ＰＡＭポリペプチドは、好ましくは、配列番号２に記載の配列を含む、または、それからなるポリペプチド、または、配列番号１または３に記載の配列を含む、または、それからなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドである。Ｓ１Ｐ受容体ポリペプチドは、好ましくは配列番号３１、３３、３５、３７または３９に記載のアミノ酸配列のいずれか一つを含む、または、それからなるポリペプチド、または、配列番号３２、３４、３６、３８または４０に記載のヌクレオチド配列のいずれか１つを含む、または、それからなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または、これらｍＲＮＡ配列に含まれるコード配列によってコードされるポリペプチドである。
【００４５】
ＰＡＭポリヌクレオチドは、好ましくは配列番号１または３に記載の配列を含む、または、それからなるポリヌクレオチド、または、上記のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる配列を含む、または、それからなるポリヌクレオチドである。Ｓ１Ｐ受容体ポリヌクレオチドは、好ましくは配列番号３２、３４、３６、３８または４０に記載の配列を含む、または、それからなるポリヌクレオチド、配列番号３２の２４４〜１３９２位、配列番号３４の１〜１１３７位、配列番号３６の１〜１０６２位、配列番号３８の２３〜１１７７位、または、配列番号４０の１０〜１２０６位を含む、または、それに対応するポリヌクレオチド、または、これらポリヌクレオチドのいずれか一つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる配列を含む、または、それからなるポリヌクレオチドである。
【００４６】
ストリンジェンシーとは、２本の一本鎖の核酸分子のハイブリダイゼーションまたはアニールの特異性に影響を与える反応条件を説明する。ストリンジェンシー、すなわち反応の特異性は、特に、反応に用いられる温度と緩衝液条件に依存する：ストリンジェンシー、すなわち特異性は、例えば、反応温度を高める、および／または、反応緩衝液のイオン強度を低めることによって増加させることができる。低いストリンジェント条件（すなわち低い反応およびハイブリダイゼーション特異性）とは、例えば、室温で、２×ＳＳＣ溶液中で、ハイブリダイゼーションが行われる場合に生じる。高いストリンジェンシー条件
は、例えば、６８℃、０.１×ＳＳＣ、および、０.１％ＳＤＳ溶液中でのハイブリダイゼーション反応を含む。
【００４７】
本発明の様々な形態の範囲内のストリンジェンシー条件下におけるハイブリダイゼーションは、好ましくは、以下のように理解される：
１）標識されたプローブと解析しようとする核酸サンプルとを、６５℃で、または、オリゴヌクレオチドプローブの場合、オリゴヌクレオチドとサンプルとからなる二本鎖のアニーリング温度または融解温度より５℃低い温度で（アニーリング温度および融解温度は、以下では同義語とする）、一晩、５０ｍＭトリス（ｐＨ７.５）、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン、０.５ｍｇ／ｍｌの変性サケまたはニシン精子ＤＮＡ中で、ハイブリダイズする。
２）２×ＳＳＣ中で、室温で１０分間洗浄する。
３）１×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳ中で、６５℃（または、オリゴヌクレオチドの場合：
アニーリング温度より５℃低い温度）で、３０分間洗浄する。
４）０.１×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳ中で、６５℃（または、オリゴヌクレオチドの場合：アニーリング温度より５℃低い温度）で、３０分間洗浄する。
【００４８】
ハイブリダイゼーションプローブとしての使用するためのオリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドであり、好ましくはＤＮＡフラグメントであって、長さが、１５〜３０個、好ましくは２０個のヌクレオチドを有する。アニーリング温度は、式Ｔｍ＝２×（Ａ＋Ｔの数）＋４×（Ｇ＋Ｃの数）℃に従って決定される。
【００４９】
２×ＳＳＣ、または、０.１×ＳＳＣ（または、その他のあらゆる種類のＳＳＣ希釈液
）を製造するためには、例えば、２０×ＳＳＣ溶液を適宜希釈する。２０×ＳＳＣは、３ＭのＮａＣｌ／０.３Ｍクエン酸Ｎａ×２Ｈ2Ｏからなる。
【００５０】
ハイブリダイゼーション反応を行う前に、上記ポリヌクレオチドは、必要に応じて、電気泳動による分離を行った後に（次に：サザンブロット(ＤＮＡ)、または、ノーザンブロット(ＲＮＡ)）、または、電気泳動による分離を行わないで（次に：スロットまたはドットブロット）、適切なメンブレン（例えばナイロンまたはニトロセルロースメンブレン）にトランスファーする。ハイブリダイゼーションは、適切に標識されたプローブを用いて行われる。適切な標識技術は、例えば、放射性標識、または、蛍光色素を用いた標識である。上記プローブは、一本鎖ポリリボまたはポリデスオキシリボヌクレオチドであり、自然状態では一本鎖であるか、または、通常は二本鎖で変性によって一本鎖にされる。このプローブは、ＤＮＡまたはＲＮＡサンプル（これらも一本鎖状態である）に、塩基対形成によって結合する。
【００５１】
ＰＡＭフラグメントは、好ましくは上記の配列番号１、２または３に含まれるフラグメントであり、その誘導体は、好ましくは、上記の配列番号１、２もしくは３、または、それらのフラグメントから得られる。Ｓ１Ｐ受容体フラグメントは、好ましくは上記の配列番号３１〜４０に含まれるフラグメント、より好ましくは、配列番号３２の２４４〜１３９２位、配列番号３４の１〜１１３７位、配列番号３６の１〜１０６２位、配列番号３８の２３〜１１７７位、または、配列番号４０の１０〜１２０６位を含む、または、それからなるフラグメントであり、その誘導体は、好ましくは、これらの配列から得られる。
【００５２】
それらの機能的フラグメントまたは誘導体は、好ましくは、アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）活性、より好ましくはＡＣのＩ、ＶまたはVI型の活性を阻害することができる（Ｓ１Ｐ受容体に関して、最も好ましくは、Ｓ１Ｐが結合することによって、または、Ｓ１Ｐを模倣する分子が結合することによって活性化される場合に、ＡＣ活性を阻害することができる）。
【００５３】
本発明の様々な形態の好ましい実施形態によれば、ＰＡＭの機能的フラグメントまたは誘導体は、ヒトＰＡＭ配列の、好ましくは配列番号２に記載のヒトＰＡＭ配列の、アミノ酸４００〜１４００、好ましくは４４６〜１０６２、４９９〜１０６５または１０２８〜１２３１、より好ましくは１０００〜１３００、さらにより好ましくは１０００〜１１００、さらにより好ましくは１０２８〜１０６５を含む、もしくは、それからなり、または、それらが上記それぞれのポリヌクレオチドフラグメントによってコードされる場合、特別には、配列番号２もしくは３に記載の配列に含まれる場合である。
【００５４】
ＰＡＭの機能的フラグメントまたは誘導体が、ポリヌクレオチドである場合、それらは、上記のポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む、または、それからなる場合が好ましい。より特定には、それらが、ヒトＰＡＭｃｄｓの１４８２〜３３３２位（アミノ酸４４６〜１０６２をコードする）、または、１６４１〜３３４１（アミノ酸４９８〜１０６６をコードする）、または、３２２８〜３８３９（アミノ酸１０３８〜１２３１をコードする）を含む、または、それからなる場合が好ましい。上記フラグメントが得られるヒトＰＡＭｃｄｓが、配列番号２に記載の配列を有する場合がさらにより好ましい。
【００５５】
痛みを調節する化合物を同定するための本発明の方法の好ましい一実施形態によれば、Ｓ１Ｐ受容体および／またはＰＡＭを発現する細胞、好ましくは組換えＳ１Ｐ受容体および／またはＰＡＭを発現する細胞が用いられる。
【００５６】
上記細胞は、あらゆるタイプの細胞が可能であり、例えば、真核性または原核性の単細胞生物（例えば細菌、例えばＥ.ｃｏｌｉ、または、酵母、例えばＳ．ポンベ(Ｓ.ｐｏｍ
ｂｅ)またはＳ．セレビジエ(Ｓ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ)）、または、多細胞生物から得られた細胞系（例えばＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＣＨＯなど）が挙げられ、なかでも哺乳動物細胞系が好ましい。
【００５７】
その他の好ましい実施形態によれば、改変されていない状態と比較して低いＳ１Ｐ受容体活性を有する改変された細胞が用いられる。この方法において、このような細胞は、それらの痛みを調節する（好ましくは減少させる）および／または痛みを予防する能力に関して試験しようとする化学物質が、低められた、または完全に止められたＳ１Ｐ受容体活性を増強する、または回復させることができる場合、試験することができる。
【００５８】
上記改変は、あらゆるタイプの改変（安定な、または、一過性の、好ましくは安定な）が可能であり、それにより、Ｓ１Ｐ受容体活性および／またはＰＡＭ活性（すなわち、それらの細胞内ｃＡＭＰレベルを低める能力、ＰＡＭのトランスロケーション、ＡＣを阻害する能力、または、それらの痛みの感覚を低める能力）の減少、Ｓ１Ｐ受容体またはＰＡＭ転写物の定常状態レベルの減少（すなわち、Ｓ１Ｐ受容体またはＰＡＭ転写の阻害、または、転写物の安定化によって）、または、Ｓ１Ｐ受容体またはＰＡＭタンパク質の定常状態レベルの減少（すなわち、Ｓ１Ｐ受容体、または、ＰＡＭ翻訳もしくはその翻訳後プロセシングの不活性化によって；その翻訳後修飾の調節によって、または、その安定化の不活性化によって、または、その分解を増加させることによって）が起こる。これは、例えば、Ｓ１Ｐ受容体またはＰＡＭの優性の負変異体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉコンストラクトを用いることによって、機能的またはゲノムＳ１Ｐ受容体またはＰＡＭノックアウト（これらは、例えば誘導型が可能である）を生成することによって、または、当業界既知のその他の適切な技術によって達成することができる。上記の技術の総論としては、例えば、以下を参照：Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００年）Ｊ.Ｇ.Ｓｅｉｄｍａｎ，第２３章，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ５２，ジョン・ワイリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ
Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９５年），編集者：Ａ.Ｌ.Ｊｏｙｎｅｒ，ＩＲＬプレス（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，２０００年；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１９９６年；Ｓｃｈｅｒｒ等，２００３年。好ましい実施形態によれば、ＰＡＭノックアウト細胞が用いられる。ノックアウトを作製するのに適した細胞系は当業界周知であり、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００年）Ｊ.Ｇ.Ｓｅｉｄｍａｎ，第２３章，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ５２，ジョン・ワイリー＆サンズ社；または、ＧｅｎｅＴａｒｇｅｔｉｎｇ  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ．（１９９５年）編集者Ａ.Ｌ.Ｊｏｙｎｅｒ，ＩＲＬプレスが挙げられる。
【００５９】
Ｓ１Ｐ活性は、例えば、その（または、そのフラグメントおよび誘導体の）受容体またはそれらの機能的フラグメントの少なくとも１種と相互作用する能力、または、ＰＡＭの細胞膜へのトランスロケーションを開始させる能力によって、直接決定することができ、または、Ｓ１Ｐ活性は、例えば、その（または、その機能的フラグメントおよび誘導体の）細胞内ｃＡＭＰレベルを低める能力、ニューロン内のイオン濃度を調節する能力、ＡＣの機能を阻害する能力、または、その痛みの感覚を調節する能力、特別には減少させる能力によって、間接的に決定することもできる。上記のパラメーターを測定するのに適した技術は当業界周知である（上記も参照）：ｃＡＭＰレベルは、例えば、ＨＴＲＦまたはアルファスクリーンTMによって測定することができ、イオン濃度は、例えば、パッチ−クランピングまたは適切な色素によって推定することができ、痛みの感覚は、例えば、ホルマリン試験、または、機械刺激もしくは温熱性痛覚過敏の試験、または、ホットプレート試験などによって測定することができる。その受容体との相互作用は、例えば、ｃＡＭＰ測定、Ｃａ2+動員またはレポーター遺伝子アッセイによって測定することができる。
【００６０】
本発明のその他の形態は、痛みを調節する化合物を同定する方法に関し、以下を含む：
ａ）試験化合物として、Ｓ１Ｐの活性を調節または模倣する化合物を選択すること、および、
ｂ）前記試験化合物を被検体に投与して、痛みが調節されているかどうかを測定すること。
【００６１】
被検体は、痛みを知覚する能力を有するあらゆる被検体が可能であり、好ましくは哺乳動物であり、すなわちヒト以外の哺乳動物またはヒト（すなわち、患者の研究の範囲内で）のいずれかである。
【００６２】
上記調節は、好ましくは、痛みを予防、軽減または止めることである。本発明の好ましい一実施形態によれば、上記化合物は、Ｓ１Ｐ受容体アゴニスト（総論のために、例えば、Ｍａｎｄａｌａ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２年を参照）、より好ましくはＦＴＹ７２０（２−アミノ−２−(４−オクチルフェニル)エチル）プロパン−１,３−ジオール、図１７を参照）、または、それらの機能的な誘導体または類似体（類似体は当業界で既知であり、例えば、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ等，ＪＢＣ，２００２年を参照）（すなわち、上述の痛みを調節する能力を有する誘導体または類似体）、好ましくはリン酸化された誘導体（Ｍａｎｄａｌａ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２年を参照）である。また、上記化合物またはその誘導体もしくは類似体の生理学的に許容できる塩も適切である。
【００６３】
本発明のさらなるその他の観点によれば、痛みを減らす、または予防する方法は、少なくとも１種のＳ１Ｐ受容体に結合し、活性化する能力、および／または、ＰＡＭの機能を活性化する活性を有する医薬化合物の十分な量を個体に投与することを含み、これも、本願の範囲内に含まれる。このような化合物の適切な例の一つは、Ｓ１Ｐ受容体アゴニスト
（総論のために、例えば、Ｍａｎｄａｌａ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２年を参照）、より好ましくはＦＴＹ７２０、または、上述したような機能的な誘導体または類似体、好ましくはそれらのリン酸化された誘導体、または、上記化合物またはその機能的な誘導体もしくは類似体の生理学的に許容できる塩である。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】ＰＡＭは、脊髄ニューロンで高度に発現される。
【図２Ａ】ＰＡＭは、ＤＲＧニューロンで、同様に、ラット脊髄中のニューロンの細胞で発現される。
【図２Ｂ】ＰＡＭは、ＤＲＧニューロンで、同様に、ラット脊髄中のニューロンの細胞で発現される。
【図３】ＰＡＭは、ＤＲＧおよび脊髄において、異なる発生段階で差異的に発現される。
【図４】ＰＡＭは、ラットの脊髄において、ザイモサンおよびホルマリン処理の後にアップレギュレートされた。
【図５】ＰＡＭは、脊髄溶解産物中でＧαｓで刺激されたＡＣ活性を阻害する。
【図６】ＰＡＭに対するアンチセンスＯＤＮの髄腔内への適用により、侵害受容の挙動が増加する。
【図６−１】図６の続きである。
【図７】ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＣ３９９２８（タンパク質配列；配列番号１）、ＡＦ０７５５８７（コード配列；配列番号２）による、ヒトＰＡＭのタンパク質、ゲノムおよびコードヌクレオチド配列である。
【図７−１】図７の続きである。
【図７−２】図７−１の続きである。
【図７−３】図７−２の続きである。
【図７−４】図７−３の続きである。
【図７−５】図７−４の続きである。
【図７−６】図７−５の続きである。
【図７−７】図７−６の続きである。
【図７−８】図７−７の続きである。
【図７−９】図７−８の続きである。
【図７−１０】図７−９の続きである。
【図７−１１】図７−１０の続きである。
【図７−１２】図７−１１の続きである。
【図７−１３】図７−１２の続きである。
【図７−１４】図７−１３の続きである。
【図７−１５】図７−１４の続きである。
【図７−１６】図７−１５の続きである。
【図７−１７】図７−１６の続きである。
【図７−１８】図７−１７の続きである。
【図７−１９】図７−１８の続きである。
【図７−２０】図７−１９の続きである。
【図７−２１】図７−２０の続きである。
【図７−２２】図７−２１の続きである。
【図７−２３】図７−２２の続きである。
【図７−２４】図７−２３の続きである。
【図７−２５】図７−２４の続きである。
【図７−２６】図７−２５の続きである。
【図７−２７】図７−２６の続きである。
【図７−２８】図７−２７の続きである。
【図７−２９】図７−２８の続きである。
【図７−３０】図７−２９の続きである。
【図７−３１】図７−３０の続きである。
【図７−３２】図７−３１の続きである。
【図７−３３】図７−３２の続きである。
【図７−３４】図７−３３の続きである。
【図７−３５】図７−３４の続きである。
【図７−３６】図７−３５の続きである。
【図７−３７】図７−３６の続きである。
【図７−３８】図７−３７の続きである。
【図７−３９】図７−３８の続きである。
【図７−４０】図７−３９の続きである。
【図７−４１】図７−４０の続きである。
【図７−４２】図７−４１の続きである。
【図７−４３】図７−４２の続きである。
【図７−４４】図７−４３の続きである。
【図７−４５】図７−４４の続きである。
【図７−４６】図７−４５の続きである。
【図７−４７】図７−４６の続きである。
【図７−４８】図７−４７の続きである。
【図７−４９】図７−４８の続きである。
【図７−５０】図７−４９の続きである。
【図７−５１】図７−５０の続きである。
【図７−５２】図７−５１の続きである。
【図７−５３】図７−５２の続きである。
【図７−５４】図７−５３の続きである。
【図７−５５】図７−５４の続きである。
【図７−５６】図７−５５の続きである。
【図７−５７】図７−５６の続きである。
【図７−５８】図７−５７の続きである。
【図７−５９】図７−５８の続きである。
【図７−６０】図７−５９の続きである。
【図７−６１】図７−６０の続きである。
【図７−６２】図７−６１の続きである。
【図７−６３】図７−６２の続きである。
【図７−６４】図７−６３の続きである。
【図７−６５】図７−６４の続きである。
【図７−６６】図７−６５の続きである。
【図７−６７】図７−６６の続きである。
【図７−６８】図７−６７の続きである。
【図７−６９】図７−６８の続きである。
【図７−７０】図７−６９の続きである。
【図７−７１】図７−７０の続きである。
【図７−７２】図７−７１の続きである。
【図７−７３】図７−７２の続きである。
【図７−７４】図７−７３の続きである。
【図７−７５】図７−７４の続きである。
【図７−７６】図７−７５の続きである。
【図７−７７】図７−７６の続きである。
【図７−７８】図７−７７の続きである。
【図７−７９】図７−７８の続きである。
【図７−８０】図７−７９の続きである。
【図７−８１】図７−８０の続きである。
【図７−８２】図７−８１の続きである。
【図７−８３】図７−８２の続きである。
【図７−８４】図７−８３の続きである。
【図７−８５】図７−８４の続きである。
【図７−８６】図７−８５の続きである。
【図７−８７】図７−８６の続きである。
【図７−８８】図７−８７の続きである。
【図７−８９】図７−８８の続きである。
【図７−９０】図７−８９の続きである。
【図７−９１】図７−９０の続きである。
【図７−９２】図７−９１の続きである。
【図７−９３】図７−９２の続きである。
【図７−９４】図７−９３の続きである。
【図７−９５】図７−９４の続きである。
【図７−９６】図７−９５の続きである。
【図７−９７】図７−９６の続きである。
【図７−９８】図７−９７の続きである。
【図７−９９】図７−９８の続きである。
【図７−１００】図７−９９の続きである。
【図７−１０１】図７−１００の続きである。
【図７−１０２】図７−１０１の続きである。
【図７−１０３】図７−１０２の続きである。
【図７−１０４】図７−１０３の続きである。
【図７−１０５】図７−１０４の続きである。
【図７−１０６】図７−１０５の続きである。
【図７−１０７】図７−１０６の続きである。
【図７−１０８】図７−１０７の続きである。
【図７−１０９】図７−１０８の続きである。
【図７−１１０】図７−１０９の続きである。
【図７−１１１】図７−１１０の続きである。
【図７−１１２】図７−１１１の続きである。
【図７−１１３】図７−１１２の続きである。
【図７−１１４】図７−１１３の続きである。
【図７−１１５】図７−１１４の続きである。
【図７−１１６】図７−１１５の続きである。
【図７−１１７】図７−１１６の続きである。
【図７−１１８】図７−１１７の続きである。
【図７−１１９】図７−１１８の続きである。
【図７−１２０】図７−１１９の続きである。
【図７−１２１】図７−１２０の続きである。
【図７−１２２】図７−１２１の続きである。
【図７−１２３】図７−１２２の続きである。
【図７−１２４】図７−１２３の続きである。
【図７−１２５】図７−１２４の続きである。
【図７−１２６】図７−１２５の続きである。
【図８】ラットＰＡＭに関するＥＳＴ−クローンをコードする配列である。
【図８−１】図８の続きである。
【図８−２】図８−１の続きである。
【図９】Ｇｕｏ等，１９８８年／Ｇｒｏｓｓｂｅｒｇｅｒ等，ＪＢＣ  １９９９年、および、Ｓｃｈｏｌｉｃｈ等，ＪＢＣ  ２００１年）によるヒトＰＡＭのドメイン構造の概観である。
【図１０】ラットＰＡＭＲＴ−ＰＣＲのためのＰＣＲプライマーである。
【図１１】ラットＰＡＭ発現を阻害するためのアンチセンスオリゴデゾキシヌクレオチド、および、コントロールオリゴヌクレオチドである。
【図１２】本発明の環境で使用するための、様々なＰＡＭｈｓポリペプチド。これらのポリペプチドは、配列番号２に記載のポリペプチドから得られたフラグメントであるである。
【図１２−１】図１２の続きである。
【図１２−２】図１２−１の続きである。
【図１３】本発明の環境で使用するための、異なるＰＡＭｈｓポリヌクレオチドである。
【図１３−１】図１３の続きである。
【図１３−２】図１３−１の続きである。
【図１３−３】図１３−２の続きである。
【図１３−４】図１３−３の続きである。
【図１４】上記の発見によるＰＡＭシグナル伝達である。
【図１５】スフィンゴシン−１−リン酸の構造である。
【図１６】Ｓ１Ｐ受容体のｍＤＮＡおよびアミノ酸配列である。
【図１６−１】図１６の続きである。
【図１６−２】図１６−１の続きである。
【図１６−３】図１６−２の続きである。
【図１６−４】図１６−３の続きである。
【図１６−５】図１６−４の続きである。
【図１６−６】図１６−５の続きである。
【図１７】ＦＴ７２０の構造である。
【図１８】ＰＡＭは、ＨｅＬａ細胞において、血清での刺激の後に、ＥＲから細胞質膜へトランスロケーションする。
【図１９】ＨｅＬａ細胞の血清処理により、ＰＡＭ依存性プロセスを介してＡＣ活性が減少する。
【図１９−１】ＨｅＬａ細胞の血清処理により、ＰＡＭ依存性プロセスを介してＡＣ活性が減少する。
【図２０】Ｓ１Ｐは、ＰＡＭの細胞質膜へのトランスロケーションを誘発させ、ＰＡＭ依存性のＡＣ酵素活性を阻害する。
【図２１】ＨｅＬａ細胞のＳ１Ｐ処理により、ＰＡＭ依存性プロセスを介してＡＣ活性が減少する。
【図２２】ＰＡＭのトランスロケーション、および、ＡＣ酵素活性のＰＡＭ依存性阻害に、ＰＬＣ／ＰＫＣシグナル伝達経路が介在する。
【図２２−１】図２２の続きである。
【図２３】ＰＡＭのトランスロケーション、および、ＡＣ酵素活性のＰＡＭ依存性阻害に至る提唱されたシグナル伝達経路の模式図である。
【図２４】ホルマリン分析における、６０分間にわたるＳ１Ｐ適用を行った場合と、行わない場合の成体ラットの痛み行動である。
【００６５】
以下で、本発明を実施例と図によってより詳細に説明する。しかしながら、これら実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００６６】
実施例：ＰＡＭ発現パターン、ならびに、ＰＡＭおよびＳ１Ｐの機能の調査
１．材料
Ｓ１Ｐは、トクリス（Ｔｏｃｒｉｓ，エリスヴィル，ミズーリ州）から購入し、抗Ｈｓｐ７０抗体と抗カルネキシン抗体は、ＢＤトランスダクション・ラボ（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｓ）（ベッドフォード，マサチューセッツ州）から購入した。抗活性ＥＲＫ１／２抗体を、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（マディソン，ウィスコンシン州）から得て、百日咳毒素、Ｕ０１２６、Ｕ７３１２２、および、ワートマニンは、トクリス（エリスヴィル，ミズーリ州）から得て、ＲＯ３１−２２３、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ、および、ＧＦ１０９２０３Ｘは、シグマ（Ｓｉｇｍａ）（セントルイス，ミズーリ州）から得た。
【００６７】
２．動物切片標本の製造：
野生型スプラギー・ダーレー（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）ラットを、チャールス・リバー・ウィガ社（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｗｉｇａ  ＧｍｂＨ，ズルツフェルト，ドイツ）から購入した。実験の前は、動物は、えさと水を自由に摂取できるようにした。それらを環境と光を制御した部屋（２４＋０.５℃）で維持した。各動物は、１回の実験のみで用いられた。全ての実験において、意識のある動物を研究するための倫理ガイドラインに従い、その手法は、地域倫理委員会で認証された。殺した後に、成体ラットを、０.１Ｍリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７.２）中の４％パラホルムアルデヒドで、１時間潅流することによって固定した。組織を、クライオスタットを用いて、水平面で厚さ１４〜１６μｍの切片標本にした。切片標本を、スーパーフロスト・プラス・スライド（Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓ  Ｓｌｉｄｅｓ）（フィッシャー・サイエンティフィック社（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ.），ピッツバーグ，ペンシルベニア
州）にマウントし、使用するまで−８０℃で保存した。
【００６８】
３．リボプローブの製造：
リボプローブを、これまで説明した通りにして作成した（Ｙａｎｇ等，２００２年）。ラットＰＡＭのアンチセンス、および、センスリボプローブを、プラスミドをＨｉｎｄIII（アンチセンス）およびＢａｍＨＩ（センス）で線状化した後に、それぞれＴ７および
Ｔ３ポリメラーゼを用いて得た（Ｙａｎｇ等，２００２年を参照）。インビトロでの転写を、製造元（プロメガ、マディソン，ウィスコンシン州）の推奨に従って、［３５Ｓ］ＵＴＰ−αＳ（ＩＣＮ，アーバイン，カリフォルニア州）、線状化したＰＡＭｃＤＮＡ、ＮＴＰの存在下で、３７℃で１時間行った。ＲＮＡの転写物を、ＲＮＡプローブ精製キット（Ｐｅｑｕｌａｂ，エルランゲン，ドイツ）を用いて精製した。
【００６９】
４．インサイチュハイブリダイゼーション：
インサイチュハイブリダイゼーションを、前述した通りに行った（Ｙａｎｇ等，２００２年）：切片標本を、０.１Ｍリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７.２）中の４％パラホルムアルデヒドで固定し、０.２５％無水酢酸と０.１Ｍトリエタノールアミンで前処理し、０.２×
ＳＳＣでリンスし、アルコール濃度を連続的に高めて脱水させた。切片標本を、プレハイブリダイゼーション溶液（５０％脱イオン化ホルムアミド、０.６Ｍ塩化ナトリウム、１
０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７.６）、５０ｍＭのＥＤＴＡ、０.０２５％ピロリン酸ナトリウム、０.０２％フィコール、０.０２％ＢＳＡ、０.０２％ポリビニルピロリドン、１０
ｍＭのＤＴＴ、および、熱変性させた異種核酸（０.００５％の酵母ｔＲＮＡ、タイプＸ
、０.０５％の酵母全ＲＮＡ、タイプＩ、０.０５％サケ精巣ＤＮＡ、タイプIII））で、
室温で２時間プレハイブリダイズさせ；ハイブリダイゼーション溶液（２.５×１０６ｃ
ｐｍ／切片標本）、５０％脱イオン化ホルムアミド、および、５０％ハイブリダイゼーション緩衝液［０.６Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７.６）、５０ｍＭのＥＤＴＡ、０.０２５％ピロリン酸ナトリウム、０.０２％フィコール、０.０２％ＢＳＡ
、０.０２％ポリビニルピロリドン、熱変性させた異種核酸（０.００５％の酵母ｔＲＮＡ、タイプＸ、０.００５％の酵母全ＲＮＡ、タイプＩ、０.０５％サケ精巣ＤＮＡ、タイプ
III）、１００ｍＭのＤＴＴ、０.０００５％ポリアデニル酸、１０％硫酸デキストランを含む］中で、５０℃で一晩、リボプローブとハイブリダイズさせた。切片標本を、ＲＴ（室温）で、２×、１×、０.５×ＳＳＣでリンスした。２０μｇ／ｍｌのＲＮアーゼＡ（
シグマ，セントルイス，ミズーリ州）中で消化させた後、切片標本を、室温で、１×ＲＮアーゼ緩衝液、２×、１×、０.５×ＳＳＣ中で、および、４５℃で、０.１×ＳＳＣ中で一晩洗浄した。切片標本をアルコール濃度を連続的に高めて脱水させ、コダック（Ｋｏｄａｋ）のバイオマックスＭＲフィルム（Ｂｉｏｍａｘ  ＭＲ  ｆｉｌｍ）（コダック，ロチェスター，ニューヨーク州）に−８０℃で３〜７日間露光した。
【００７０】
５．抗体の生成、および、免疫蛍光法による染色：
ヒトＰＡＭのアミノ酸残基１３５〜１５３および４６０１〜４６１４（それぞれ配列番号１に対応する）からなるペプチド（バイオトレンド(ＢｉｏＴｒｅｎｄ)，ケルン，ドイツ）を用いて、抗血清をウサギで商業的に生成させた。その抗血清を、標準的な手法に従って、バイオトレンド（ケルン，ドイツ）で商業的に生産させた。脊髄とＤＲＧの切片におけるＰＡＭの分布をモニターするために、切片を、０.１％トリトンＸ−１００中で５
分間浸透させた。切片を、ＰＢＳ中の３％ＢＳＡ中で１時間ブロッキングし、次に、抗ＰＡＭ抗血清（１：５０希釈）と共に１時間インキュベートした。続いて、これを、３％ＢＳＡを含むＰＢＳ中のＦＩＴＣ標識したヤギ抗ウサギ抗体と共にインキュベートした。次に、切片をＰＢＳで洗浄し、フルオマウント(ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ)TMを用いてマウントした。
【００７１】
６．ＲＴ−ＰＣＲ：
ラットの脊髄およびＤＲＧからの全ＲＮＡを、グアニジンイソチオシアネート／フェノール／クロロホルム抽出によって単離した（ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ，１９８７年）。全ＲＮＡ２μｇを、０.６μＭのそれぞれのオリゴ（ｄＴ）プライマー
とアニールし、逆転写酵素（プロメガ，マディソン，ウィスコンシン州）を用いて３７℃で３０分間逆転写した。次に、即座にｃＤＮＡを増幅に用いた。ラットＧＡＤＰＨの増幅に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーは、５’−ＧＡＡＧＧＧＴＧＧＧＧＣＣＡＡＡＡＧ−３’（センス；配列番号１０）、および、５’−ＧＧＡＴＧＣＡＧＧＧＡＴＧＡＴＧＴＴＣＴ−３’（アンチセンス；配列番号１１；Ｔｒａｊｋｏｖｉｃ等，２０００年）であった。ＡＣアイソフォームを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーを、Ｘｕ等によって公開されているようにして選択した（Ｘｕ等，２００１年）。ラットＰＡＭのためのプライマーは、５’−ＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＣＴＣＧＣＴＧＴＧＡＴＧＣＴ−３’（センス；配列番号１２）、および、５’−ＣＧＴＧＴＧＡＧＣＡＴＴＴＣＴＧＣＡＣＡＣＴＣＣ−３’（アンチセンス；配列番号１３）であった。そのＰＣＲ産物は、ヒトＰＡＭｃＤＮＡヌクレオチド１３６９２〜１４０６４に対応する。それに対応するラット配列は、ＥＳＴクローンＡＷ４４１１３１（配列番号８）から得た。半定量ＰＣＲのために、ＳＡＷＤＡＹ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｑｌａｂ，エルランゲン，ドイツ）を用いた。最初の９５℃で５分間での変性工程の後に、９５℃で１分間、５５℃で３０秒間、および、７２℃で１０秒間の３０サイクルを行い、その後、最終に７２℃で１０分の伸長工程を行った。定量ＰＣＲを、ＴａｑＭａｎTMシステムおよび試薬（アプライド・バイオシステムズ，ヴァイターシュタット，ドイツ）を製造元の説明書に従って用いて行った。
【００７２】
７．全長ＰＡＭの精製：
以前に公開されたように、ただし数箇所を改変してＰＡＭ精製を行った（Ｓｃｈｏｌｉｃｈ等。２００１年）。簡単に言えば、ＨｅＬａ細胞を、１０％ウシ胎仔血清と１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地中で増殖させた。４０個の１５０ｍｍ培養皿の密集した細胞を、１×ＰＢＳ、１ｍＭのＥＤＴＡを用いて回収し、４００×ｇで５分間沈殿させた。細胞を、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２０μｇ／ｍｌのアプロチニン、２０μｇ／ｍｌのロイペプチン、１ｍＭのベンズアミジン、５μｇ／ｍｌのダイズトリプシン
インヒビターを含むＴＥＤ緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８.０）、１ｍＭのＥＤ
ＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ）に再懸濁させ、超音波破砕を２×５秒間行い溶解させた。ホモジネートを、２７０００×ｇで、４℃で３０分間で遠心分離し、上清を、Ｑ−セファロースＸＫ１６カラム（アマシャム・ファルマシア(Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ)，ピスカタウェイ，ニュージャージー州）にローディングし、製造元の説明書に従って、ＴＥＤ中で、１５０〜３５０ｍＭのＮａＣｌの濃度勾配で溶出させた。標準的な手法に従ってウェスタンブロッティングで分画を解析した；陽性の分画をプールし、そのＮａＣｌ濃度を１Ｍに調節した。次に、タンパク質を、フェニル−セファロースＸＫ１６カラム（アマシャム・ファルマシア，ピスカタウェイ，ニュージャージー州）にローディングし、製造元の説明書に従って、ＴＥＤ中の３００ｍＭのＮａＣｌで洗浄した。流出液分画および洗浄分画にＰＡＭが含まれていた。それらをプールし、製造元の説明書に従って、セントリコン(Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ)５０（アミコン(Ａｍｉｃｏｎ)，ビバリー，マサチューセッツ州）を用いて緩衝液を上述の１００ｍＭのＮａＣｌを含むＴＥＤ緩衝液で交換した。次に、タンパク質を、モノＳ（Ｍｏｎｏ  Ｓ）５／５ＦＰＬＣカラム（アマシャム・ファルマシア，ピスカタウェイ，ニュージャージー州）にローディングし、製造元の説明書に従って、ローディング緩衝液（ＴＥＤ中、１００ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄した。流出液を回収し、モノＱ（Ｍｏｎｏ  Ｑ）５／５ＦＰＬＣカラム（アマシャム・ファルマシア，ピスカタウェイ，ニュージャージー州）にアプライした。タンパク質を、ＴＥＤ中の１５０〜４００ｍＭのＮａＣｌの濃度勾配で溶出させた。陽性の分画をプールし、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）５０（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ），ビバリー，マサチューセッツ州）を用いて緩衝液を５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８.０）、１ｍＭのＤＴＴで交換し、−
８０℃で保存した。保存したＰＡＭは、３週間以内に用いた。
【００７３】
８．組換えＧｓαの発現および精製：
ヘキサヒスチジルタグを有する構成的に活性なＧｓαのＱ２１３Ｌ突然変異体（Ｇｓα＊）を、発現させ、Ｇｒａｚｉａｎｏ等，１９９１年で説明されている通りに精製した。Ｇｓα＊の最大活性化を確認するために、ＡＣ活性分析で使用する前に、ＭｇＣｌ2（２
５ｍＭ）の存在下で、３０分間、Ｇタンパク質を、１μＭのＧＴＰγＳとインキュベートした。
【００７４】
９．アデニリルシクラーゼ活性アッセイ（ＡＣ活性アッセイ）：
脊髄を、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７.４）、１ｍＭのＥＧＴＡ中で溶解させ、Ｋａ
ｓｓｉｓおよびＦｉｓｈｍａｎによって説明された通りに細胞膜を調製した。アリコートを使用するまで−８０℃で保存した。ＡＣ活性分析を、以前に説明された通りに、容積１００μｌで、室温で１５分間、１００μＭのＭｇＣｌ2の存在下で行った（Ｐａｔｅｌ等，２００２年）。Ｇｓα＊（８０ｎＭ）、または、フォルスコリン（１００μＭ）を用いて、膜中のＡＣ酵素活性（タンパク質１０μｇ）を刺激した。
【００７５】
１０．ＰＡＭのアンチセンス、および、センスオリゴヌクレオチドの脊髄への搬送：
ラットを、ケタミン（６０ｍｇ／ｋｇ，腹腔内）と、ミダゾラム（０.５〜１ｍｇ／ｋ
ｇ，腹腔内）で麻酔した。椎骨Ｔｈ１３からＬ３までの脊柱の上で皮膚を切開した。Ｌ２〜３周辺の筋肉組織を取り除いた。Ｌ３の棘突起を除去し、Ｌ２で椎弓切除術を施した。次に、ポリエチレン製カテーテル（ＩＤ０.２８ｍｍ、ＯＤ０.６１ｍｍ）を、カテーテルの先端がＴｈ９〜１０に達するように硬膜外腔に挿入した。カテーテルをシアノアクリレート系接着剤で固定し、頚部の領域で外部に露出させ、皮膚を縫合した。
【００７６】
１１．ＰＡＭオリゴヌクレオチドの注入：
オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の配列を、以下のようにラットＰＡＭ配列から選択した。センス：５’−ＧＡＣＴＧＧＴＴＴＡＧＣＡＡＴＧＧＣ−３’（配列番号１４）、アンチセンス：５’−ＧＣＣＡＴＴＧＣＴＡＡＡＣＣＡＧＴＣ−３’（配列番号１５
）、および、３つの突然変異（３Ｍ−ａｓ；突然変異は下線で示した）を含むアンチセンスＯＤＮ：５’−ＧＣＡＡＴＴＧＣＴＡＡＡＴＣＡＧＴＡ−３’（配列番号１６）。外科手術の３日後に、ラットを「自由行動系」（ＣＭＡ，ストックホルム，スウェーデン）の状態に置き、アンチセンス（ｎ＝５）、または、センス（ｎ＝５）オリゴヌクレオチド（人工髄液中、２.５ｍｇ／ｍｌ）をカテーテルを通じて、微量注入ポンプ（ＣＭＡ，ストックホルム，スウェーデン）を用いて、０.０５〜０.１μｌ／分の低速で、１００時間注入した。
【００７７】
１２．ホルマリン試験：
注入を止めた後１５分以内に、ホルマリン試験を行った。５％ホルムアルデヒド溶液５０μｌを、１本の後肢の背面の皮下に（ｓ.ｃ.）注射した。ホルマリン注射の直後に開始して、１分間のインターバルで６０分間まで、フリンチ行動をカウントした。５分間のインターバルのフリンチ行動を、１分あたりの平均フリンチ行動として要約した。グループ間の侵害受容の挙動を比較するために、フリンチ行動の、１時間の観察期間の第二相の合計を、スチューデントのｔ検定で処理した。ａを０.０５に設定した。
【００７８】
ホルマリン試験の最後にラットを殺し、腰髄および後根神経節（ＤＲＧ）を切り出し、液体窒素中で急速冷凍し、さらなる解析まで−８０℃で保存した。ＰＡＭ発現を決定するために、脊髄切片を、上記の抗ＰＡＭ抗体を用いて免疫組織化学的に解析した。
【００７９】
１３．ザイモサン誘発性の炎症：
炎症を誘発させるために、０.０３Ｍのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７.５）３０μｌに懸濁したザイモサンＡ２.５ｍｇ（シグマ，セントルイス，ミズーリ州）を、右の後
肢の足底の中央部の領域に皮下注射した。このような足底内部へのザイモサン注射は、信頼できる温熱性および機械刺激痛覚過敏ラットのモデルを誘導することがわかっている（ＭｅｌｌｅｒおよびＧｅｂｈａｒｔ，１９９７年）。ラットを、ザイモサン注射の２４〜９６時間後に、深いイソフルラン麻酔下で心臓穿刺を行うことにより殺した。腰髄および後根神経節（ＤＲＧ）を切り出し、液体窒素中で急速冷凍し、さらなる解析まで−８０℃で保存した。
【００８０】
１４．免疫蛍光法による染色：
ＨｅＬａ細胞におけるＰＡＭの分布をモニターするために、カバーガラス上で、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ），カールスルーエ，ドイツ）を含むＤＭＥＭ中で細胞を増殖させた。ＨｅＬａにおけるＰＡＭのトランスロケーションを可視化するために、細胞を、一晩、血清欠乏状態にし、その後、１０％血清で２時間処理した。指示されている場合は、細胞を、様々な阻害剤濃度の存在下で３０分間プレインキュベートした。ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド（シグマ，タウフキルヒェン，ドイツ）で、細胞を１０分間固定し、次に、さらに５分間、０.１％トリトンＸ−１００中に浸透させた。カバーガラスを、ＰＢＳ中の３％ＢＳＡで１時間ブロッキングし、次に、抗ＰＡＭ抗体（１：５０希釈）と共に１時間インキュベートした。続いて、これを、３％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で、ＦＩＴＣ標識したヤギ抗ウサギ抗体と共にインキュベートした。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、マウントした。解析のために、共焦点（バイオ・ラッド，ハーキュリーズ，カリフォルニア州）、および、標準蛍光顕微鏡（ニコン(Ｎｉｋｏｎ)，デュッセルドルフ，ドイツ）を用いた。
【００８１】
１５．ｃＡＭＰの蓄積
脊髄サンプルを超音波破砕し、１８.０００×ｇで、４℃で２０分間遠心分離した。上
清をｃＡＭＰ測定に用いた。細胞中のｃＡＭＰの蓄積を、ｃＡＭＰ検出キット（Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｉｎｃ，アナーバー，ミシガン州）によって、製造元の説明書に従って決定した。
【００８２】
１６．アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド
オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の配列を、以前に公開されたようにして選択した（Ｓｃｈｏｌｉｃｈ等，２００１年）。センス：５’−ＣＴＧＴＴＣＡＴＧＣＣＧＧＴＴ−３’、アンチセンス：５’−ＡＡＣＣＧＧＣＡＴＧＡＡＣＡＧ−３’、および、３つの突然変異（３Ｍ−ａｓ；突然変異は下線で示した）を含むアンチセンスＯＤＮ：５’−ＡＡＴＣＣＧＴＡＴＧＡＡＣＡＣ−３’。ＨｅＬａ−細胞を３５ｍｍ培養皿で平板培養し（３００，０００細胞）、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地（ギブコ，カールスルーエ，ドイツ）中で２４時間増殖させた。ＯＤＮ（それぞれ３μＭ）を、無血清培地１ｍｌ中で、Ｔｆ×２０（プロメガ，マディソン，ウィスコンシン州）を製造元の説明書に従って用いてトランスフェクトすることによって細胞に導入した。２時間後、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（ギブコ，カールスルーエ，ドイツ）１ｍｌを添加した。次に、細胞を６時間インキュベートした。次に、培地を無血清ＤＭＥＭ（ギブコ，カールスルーエ，ドイツ）で交換し、続いて、無血清ＤＭＥＭ（ギブコ，カールスルーエ，ドイツ）中で１６時間インキュベートし、その後、１０％血清または５００ＭのＳ１Ｐで処理した。次に、細胞を、沸騰した１×レムリー緩衝液を添加することによってウェスタンブロットに用い、または、上述のようなＡＣ活性分析のためにそれらを回収した。
【００８３】
１７．精製またはＰＡＭの血清因子の活性化：
ウシ胎仔血清（ギブコ，カールスルーエ，ドイツ）１８８ｍｌを、ＮａＣｌの最終濃度が０.３Ｍになるように調節した。次に、血清を、フェニル−セファロース１５／１０カ
ラム（アマシャム・ファルマシア，ピスカタウェイ，ニュージャージー州）にローディングした。このカラムから溶出させた後に、同様に、それに続く全てのカラムの後に、流出液と全ての溶出した分画を回収し、そのＨｅＬａ細胞でＰＡＭのトランスロケーションを誘導する能力について解析した。次に、流出液を、Ｑ−セファロース１５／１０カラム（アマシャム・ファルマシア，ピスカタウェイ，ニュージャージー州）にローディングした。カラムを、ＴＥ（５０ｍＭトリス／Ｃｌ（ｐＨ７.４）、０.５ｍＭのＥＤＴＡ）中の４００ｍＭのＮａＣｌで洗浄し、ＴＥ中の１ＭのＮａＣｌで溶出させた。溶出液を、スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）２００ｐｇゲルろ過カラム（アマシャム・ファルマシア，ピスカタウェイ，ニュージャージー州）にローディングした。製造元の説明書に従ってタンパク質をＴＥで溶出させ、分画を、ＨｅＬａ細胞中でＰＡＭのトランスロケーションを誘導する能力に関して解析した。陽性の分画をプールし、モノＱ５／５ＦＰＬＣ．カラム（アマシャム・ファルマシア，ピスカタウェイ，ニュージャージー州）にローディングし、ＴＥ中の４００ｍＭのＮａＣｌで洗浄した。タンパク質をＴＥＤ中、ＮａＣｌが４００〜１０００ｍＭの濃度勾配で溶出させた。陽性の分画をプールし、スーパーデックス５０ｐｇゲルろ過カラム（アマシャム・ファルマシア，ピスカタウェイ，ニュージャージー州）に製造元の説明書に従ってローディングした。タンパク質を、製造元の説明書に従ってＴＥで溶出させ、分画を、ＨｅＬａ細胞中でＰＡＭのトランスロケーションを誘導する能力に関して解析した。陽性の分画をプールし、−８０℃で保存し、マススペクトロメトリーまたは生化学的アッセイのためには２週間以内に用いた。フタルアルデヒド標識を用いてＳ１Ｐを検出し、続いて、Ｃａｌｉｇａｎ等によって説明されているように、ＨＰＬＣで分離した。
【００８４】
１８．侵害受容過程におけるＰＡＭの関連を示す結果：
上記の発明者等によるＲＴ−ＰＣＲ、免疫組織化学およびインサイチュハイブリダイゼーションを用いた実験で、ＰＡＭは、成体ラットの脊髄の感覚ニューロン、同様に、後根神経節（ＤＲＧ）で発現されることがが初めて実証された。ＲＴ−ＰＣＲによれば、ＰＡＭのｍＲＮＡは、脊髄と後根神経節とで発達を通して（Ｅ１４〜成体）同様のレベルで検出された。ＰＡＭ発現は、ウェスタンブロットおよびＲＴ−ＰＣＲで示されるように、ラ
ットのザイモサン処理の２４〜４８時間後にアップレギュレートされる。
【００８５】
脊髄とＤＲＧで発現される主要なアデニリルシクラーゼアイソフォームは、それぞれＡＣ５および６型、ならびに、ＡＣ４および６型である。脊髄をザイモサン処理した後は、ＡＣアイソフォーム発現における主要な変化は観察されなかった。従って、脊髄およびＤＲＧからの膜調製物におけるＧαｓによって刺激されたＡＣ活性は、ＰＡＭによって阻害された。その結果として、成体ラットにおいて、ＰＡＭに対するセンスオリゴヌクレオチドではなくアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理により、ホルマリンで誘発される足のフリンチ行動が増加したことを発見した。従って、ＰＡＭに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理したラットの脊髄におけるｃＡＭＰの蓄積は、コントロールラットと比較して上昇した。
【００８６】
精製されたＰＡＭを脊髄溶解産物へ添加することにより、コントロールとザイモサン処理動物からの脊髄溶解産物のＧαｓで刺激されたＡＣ活性が阻害された（図５ｂ）。３０ｎＭのＧαｓで刺激されたＡＣ活性は、コントロール動物の脊髄溶解産物において５０％、ザイモサンで９６時間処理されたラットから得られた溶解産物で７０％減少した。
【００８７】
脊髄でＰＡＭが発現されるかどうかを測定するために、第一のインサイチュハイブリダイゼーションを行った。これにより、成体ラットの脊髄の白質ではなく灰白質の至る所に、ＰＡＭのｍＲＮＡに関する明らかなシグナルが検出された（図１）。脊髄およびＤＲＧでＰＡＭを発現する細胞集団をより正確に明らかにするために、ヒトＰＡＭのアミノ酸残基１３５〜１５３および４６０１〜４６１４に対応するペプチドを用いて、ＰＡＭに対する抗体を作成した。免疫組織化学的な解析により、ＰＡＭは、抗ＧＦＡＰ免疫反応性ではなく、抗ＮｅｕＮ免疫反応性と共存することが明らかになった（図２ａ）。より特定には、ＰＡＭ発現は、後角ニューロンで優勢に検出されたが（図２ａ）、ニューロンではない細胞集団では極めてわずかなＰＡＭ発現しか示さなかった。特に、ＤＲＧニューロンでは、高いＰＡＭ発現を検出することができた（図２ｂ）。ここで、ＰＡＭの免疫反応性は、軸索に、同様に、直径が大きいニューロンと小さいニューロンの両方の細胞体に存在していた（図２ｂ）。興味深いことに、抗ヒストン抗体で共染色することによって実証されたように、細胞の核では、ＰＡＭは検出されなかった（図２ｂ）。脊髄でも観察されるように、ＧＦＡＰ発現細胞では、ＰＡＭ発現は、検出されなかった。
【００８８】
ラットおよびマウスの発達中に、脳におけるＰＡＭ発現は差異的に調節されるために（Ｙａｎｇ等，２００２年）、発明者等は、ラットの脊髄およびＤＲＧの発達中にＰＡＭのｍＲＮＡ発現も変化するかどうかを調査した。この目的を達成するために、ＰＡＭのｍＲＮＡ発現を、定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて決定した。ＰＡＭのｍＲＮＡは、後期胚形成期（Ｅ１６）から、誕生直後まで（Ｐ０.５；図３）、脊髄とＤＲＧで高度に発現されることを発見した。興味深いことに、発現は、誕生直後に胚発生の３０〜４０％に減少し、続いて、成人期中は一定を保った（図３）。
【００８９】
次に、脊髄におけるＰＡＭ発現は、侵害受容の刺激によって調節されるかどうかを試験した。そこで、成体ラットの後肢へのザイモサンおよびホルマリン注射の後に、脊髄のＰＡＭ発現をモニターした。ザイモサン処理の２４および４８時間後に、ＰＡＭのｍＲＮＡが約２倍アップレギュレートされた（図４ａ）。それにより、ザイモサン注射の２４時間後に、ＰＡＭ発現は、タンパク質レベルでアップレギュレートされ、９６時間上昇し続けた（図４ｂ）。ザイモサン注射の９６時間後に、ＰＡＭのｍＲＮＡ発現は減少した。このＰＡＭのｍＲＮＡ発現における減少は、タンパク質レベルには反映されていなかった（図４ａおよびｂを比較）。特に、ラットの脊髄においても、ホルマリン注射の１時間後にＰＡＭのｍＲＮＡがアップレギュレートされた（図４ｃ）。
【００９０】
ＰＡＭは、アデニリルシクラーゼ１、５および６型の強力な阻害剤であることがわかっているため（Ｓｃｈｏｌｉｃｈ等。２００１年）、ＰＡＭが、脊髄およびＤＲＧ溶解産物中でＡＣ活性を阻害できるかどうかを調べた。脊髄において、２種の主要なＡＣアイソフォームが半定量ＲＴ−ＰＣＲにより検出された。これらのＡＣアイソフォームは、５および６型である（図５ａ）。特に、アイソフォームはいずれも、ナノモル濃度のＰＡＭで阻害される（Ｓｃｈｏｌｉｃｈ等，２００１年）。ザイモサン注射の２４〜９６時間後に、脊髄におけるＡＣアイソフォーム発現パターンは、有意に改変されなかった。興味深いことに、ホルマリン注射の１時間後に、ＡＣアイソフォーム発現におけるシフトが検出された（図５ａ）。ＡＣ５型のｍＲＮＡは、ダウンレギュレートされ、ＡＣ３および９型のｍＲＮＡはアップレギュレートされる。
【００９１】
上記の実験により示されたように、精製されたＰＡＭを脊髄溶解産物へ添加することにより、脊髄調製物において、Ｇαｓで刺激されたＡＣ活性が阻害された。３０ｎＭのＰＡＭの添加により、Ｇαｓで刺激されたＡＣ活性が、コントロール動物の脊髄溶解産物において４９％減少した（図５ｂ）。ザイモサン注射の９６時間後の、ラットから得られた脊髄溶解産物におけるＧαｓで刺激されたＡＣ活性は、ＰＡＭの阻害に対して、未処理動物と比較して高い感受性を示した（３０ｎＭで、７０％阻害；図５ｂ）。それに対して、ホルマリンで１時間処理された動物からの脊髄溶解産物におけるＰＡＭによるＡＣ活性の阻害の程度は、より少なかった（３０ｎＭで２５％阻害；図５ｂ）。
【００９２】
ＤＲＧにおいて、優勢に発現されたＡＣアイソフォームは、ＡＣ４および６型である（図５ａ）。ＤＲＧ溶解産物におけるＧαｓで刺激されたＡＣ活性は、脊髄溶解産物と比較して３０ｎＭのＰＡＭの存在下で３２％減少した（図５ｂ）。
【００９３】
脊髄の侵害受容伝達におけるＰＡＭの可能性のある役割を試験するために、ホルマリン分析を行う前に、動物に、ＰＡＭのセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを、腰髄内へのカテーテルにより注入した。免疫組織化学で観察されたように、脊髄ニューロンにおいて、ＰＡＭ発現は減少した（図６ａ）。ＰＡＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドの注入により、ホルマリン注射後の侵害刺激反応が、ＰＡＭのセンス処理と比較して顕著に増加した（ｐ＝０.００７；図６ｂおよびｃ）。ＰＡＭのアンチセンス処理ラットにお
ける痛覚過敏には、足をなめる挙動、および噛みつき挙動の増加が伴った。ＰＡＭは、ＡＣ活性阻害剤であるため（Ｓｃｈｏｌｉｃｈ等，２００１年）、センスおよびアンチセンスＯＤＮで処理されたラットの脊髄溶解産物における、基礎的なＧαｓおよびフォルスコリン刺激によるＡＣ活性を測定した。この実験により、アンチセンスで処理されたラットにおいて、基礎的なＡＣ活性の顕著な増加（２０.７％）が示された（表１）。それに対
して、Ｇαｓおよびフォルスコリン刺激によるＡＣ活性において顕著な変化は検出されず、これは、ＯＤＮ処理によってＡＣの総量が変化しなかったことを示す（表１）。
【００９４】
上記の実験より、ＰＡＭは、脊髄とＤＲＧニューロンの両方の細胞体と軸索に局在化していることが示された（図２ａ，ｂ）。細胞核では、ほんのわずかな免疫活性しか検出できず、これは、ニューロンおよびガン細胞系において、ＰＡＭに関する機能が異なることを示している。
【００９５】
持続的な侵害受容の刺激の後の中枢性感作は、脊髄におけるニューロンおよびシナプスの変化に基づく（ＷｏｏｌｆおよびＣｏｓｔｉｇａｎ  １９９９年；ＷｏｏｌｆおよびＳａｌｔｅｒ２０００年；ＪｉおよびＷｏｏｌｆ  ２００１年）。発明者等による、ＰＡＭは、脊髄およびＤＲＧの感覚ニューロンで発現されるという発見により、ＰＡＭは、脊髄の侵害受容過程の際のシナプスの変化に関与する可能性があるという新たな仮説が構築された。上記の、ＰＡＭは、侵害受容の刺激の後にアップレギュレートされるという発見は（図４ａ）、この、脊髄の侵害受容過程の際のシナプスの変化においてＰＡＭは役割を果
たす可能性があるという仮説を裏付けている。
【００９６】
さらに、発明者等の、ＰＡＭは、脊髄およびＤＲＧの知覚神経で発現されるという驚くべき発見により、同様に、脊髄およびＤＲＧにおいて、ＰＡＭは、ＡＣ活性を阻害することができるかどうかという疑問に至った。
【００９７】
上記の実験より、ＰＡＭは、脊髄調製物におけるＧαｓで刺激されたＡＣ活性の有力な阻害剤であることが初めて示された（図５ｂ）。ＡＣ活性は、３０ｎＭのＰＡＭを添加した後に、５０％減少した。抑制性Ｇタンパク質のαサブユニット、Ｇαｉを用いて匹敵する阻害を達成するために、２００〜８００ｎＭのＧαｉを用いなければならない（Ｗｉｔｔｐｏｔｈ等，１９９９年）。ザイモサンで９６時間処理された動物の脊髄調製物において、ＰＡＭの阻害作用はいっそう強く（図５ｂ）、ザイモサン注射の後に、脊髄における内因性ＰＡＭの量が上昇したことで説明することができる（図４ａ，ｂ）。ホルマリンで処理した動物からの脊髄調製物におけるＧαｓで刺激されたＡＣ活性の阻害（２５％阻害）は、コントロール動物またはザイモサンで処理した動物と比較してそれほど顕著ではなかった（それぞれ５０％および７５％）。
【００９８】
特に、ホルマリンで１時間処理した動物において、ＡＣアイソフォーム発現におけるシフトを観察した（図５ａ）。ＡＣ３および９型はアップレギュレートされるが、ＡＣ型５は、ダウンレギュレートされた。これまで、ＰＡＭが、ＡＣ３および９型の阻害剤であるかどうかはわかっていない。それゆえに、これらアイソフォームは、ＰＡＭによって阻害されないか、または、試験されたＰＡＭ濃度が、阻害作用を達成するには低すぎる可能性がある。ＰＡＭは、５１０ｋＤａの巨大タンパク質であるため、３０ｎＭを超えるＰＡＭ濃度を試験することは技術的に不可能である。それにもかかわらず、図５ｂに示される用量反応曲線によれば、試験された脊髄調製物において、より高いＰＡＭ濃度により、Ｇαｓで刺激されたＡＣ活性のより強い阻害が引き起こされる可能性がある。
【００９９】
興味深いことに、ＰＡＭは、ＤＲＧにおいて、脊髄調製物においてより有効性が弱いＡＣ酵素活性の阻害剤であった。脊髄およびＤＲＧ調製物においてＰＡＭの阻害効率が異なるのは、観察されたＡＣアイソフォーム発現の差による可能性が最も高い。脊髄で発現される主要なＡＣアイソフォームは、５および６型であり、いずれもＰＡＭによって強く阻害される（図５ａ；(Ｓｃｈｏｌｉｃｈ等，２００１年)）。ＤＲＧにおいて、ＡＣ４および６型は、優勢なＡＣアイソフォームである（図５ａ）。ＰＡＭがＡＣ４型を阻害するかどうかはわかっていないため、このアイソフォームは、ＰＡＭによって阻害されないか、または、それに加えて、試験されたＰＡＭ濃度が、阻害作用を達成するには低すぎる。しかしながら、図５ｂに示される用量反応曲線によれば、ＤＲＧ調製物において、より高いＰＡＭ濃度により、Ｇαｓで刺激されたＡＣ活性のより強い阻害が引き起こされる可能性が高いようである。
【０１００】
しかしながら、最も驚くべきことは、ＰＡＭ活性は、試験動物の侵害受容の挙動に影響を与えるという発見であった：これは、基礎的なＡＣ活性における顕著な増加（表１）、および、より重要なことは、ホルマリン注射後、侵害刺激反応がＰＡＭのセンス処理と比較して顕著に増加したこと（図６ｂおよびｃ）、その際、脊髄におけるＰＡＭの内因性の発現は、動物にＰＡＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドを注入することによって減少したこと（図６ａ）を示す発明者等の実験によって初めて実証された。
【０１０１】
１９．ＰＡＭの鎮痛作用の測定
上述したＰＡＭの鎮痛作用に関する証拠は、例えば、以下の仮想的実験によって裏付けることができるだろう：例えば急性の痛みのホルマリンモデルにおけるＰＡＭの鎮痛作用は、例えば、アミノ酸残基１０２８〜１０６５に対応するペプチドの髄腔内への適用によ
って直接決定することができるだろう。このペプチドは、酵母ツーハイブリッドシステムとＡＣ活性分析で測定されるように、ＰＡＭ−アデニリルシクラーゼの相互作用に介在できることが発見された最小の領域を示す。このペプチドは、バイオポーター（ｂｉｏｐｏｒｔｅｒ）リポフェクション試薬（Ｐｅｑｌａｂ，ドイツで市販されている）との複合体として適用され得る。このアプローチにより、ペプチドを組織に進入させ、ＡＣに対する生理学的なＰＡＭの作用を模擬することが可能になる。
【０１０２】
２０．ＰＡＭシグナル伝達に対するＳ１Ｐの影響を示す結果
ＨｅＬａ細胞におけるＰＡＭ発現と局在化を調査するために、ヒトＰＡＭのアミノ酸残基１３５〜１５３および４６０１〜４６１４に対応するペプチドに対して向けられた２種のＰＡＭに対する抗体が用いられた。ラット脳の免疫組織学的染色の比較により、両方の抗体が、同じ脳の領域（同様にＰＡＭのｍＲＮＡ発現を示す）を認識することが示された（Ｙａｎｇ等，２００２年）。血清欠乏状態にしたＨｅＬａ細胞において、両方の抗体は、ＰＡＭとカルネキシン、小胞体マーカーとの共存を示した（図１８ａ）。血清を細胞に添加した後に、部分的なＰＡＭの細胞質膜へのトランスロケーションが観察された（図１８ｂ）。ＰＡＭは、血清処理の２０〜３０分後に膜に出現し、血清とインキュベートして１時間後に膜から消失し始めた。用いられた抗体で観察されたＨｅＬａにおけるＰＡＭの細胞分布は、Ｇｕｏ等によって説明されている細胞分布とは異なっている。Ｇｕｏ等は、ＰＡＭの一部を用いて、核タンパク質に共通のモチーフを含む抗体を生産させているため、この抗体による核タンパク質との交差反応が起こる可能性がある。
【０１０３】
ＰＡＭは、ＡＣ酵素活性の強力な阻害剤なので、次に、ＥＲから細胞質膜へのＰＡＭのトランスロケーションにより、ＡＣ活性が阻害されるかどうかを調べた。ＨｅＬａ細胞の血清処理により、細胞内ｃＡＭＰの蓄積が減少した（図１９ａ）。加えて、血清処理により、Ｇαｓおよびフォルスコリン刺激によるＡＣ活性が、未処理細胞と比較してそれぞれ５６.７％および６４.７％減少した（図１９ｂ）。観察されたＡＣ活性の減少は、ＡＣアイソフォームのｍＲＮＡ発現における変化が検出されなかったことから、ＡＣアイソフォーム発現における変化、または、ＡＣ発現の増加によるものではなかった（図１９ｃ）。これまでにＳｃｈｏｌｉｃｈ等，２００１年で説明された通りに、刺激したＡＣ活性の減少に、ＰＡＭが介在するかどうかを決定するために、ＰＡＭに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて内因性ＰＡＭの量を減少させた。図１９ｄに示すように、アンチセンスＯＤＮで処理されたＨｅＬａ細胞において、ＰＡＭの量（ウェスタンブロット解析によって決定された）は、センスまたは突然変異アンチセンスＯＤＮで処理した細胞と比較して減少した。抗Ｈｓｐ７０抗体を用いて同じブロットを再度検査したところ、タンパク質のローディングは同じであることが示された（図１９ｄ）。しかしながら、アンチセンスＯＤＮでＨｅＬａ細胞を処理すると、Ｇαｓおよびフォルスコリン刺激によるＡＣ活性の血清誘発性の阻害が、著しく減少した（図１９ｅ）。重要なのは、ＨｅＬａ細胞のセンスまたは突然変異ＯＤＮでのトランスフェクトは、Ｇαｓおよびフォルスコリン刺激によるＡＣ活性の血清誘発性の阻害に影響しないことである（図１９ｅ）。これらのデータにより、血清でＨｅＬａ細胞を刺激した後、内因性ＰＡＭは、ＡＣ活性に阻害作用を与えることが示される。
【０１０４】
ＰＡＭの細胞質膜へのトランスロケーションを誘発する血清因子を同定するために、血清因子を、逆相カラム、陰イオン交換カラム、およびゲルろ過カラムを用いて精製した。各精製工程の後に、分画のＰＡＭのトランスロケーションを誘導しＡＣを阻害する能力に関して試した。精製の特性によれば、血清因子は、わずかに疎水性であり（フェニル−セファロースカラムから０.３ＭのＮａＣｌで溶出）、強い負電荷を有し（モノＱ、および
、Ｑ−セファロースカラムから０.７ＭのＮａＣｌで溶出した）、および、スーパーデッ
クス３０ゲルろ過カラムでの保持時間によれば推定分子量が５００未満と同定された。物理的な特性に従って、数種の候補物質が試験されたが、そのうちスフィンゴシン−１−リ
ン酸のみがＰＡＭのトランスロケーションを誘発した。
【０１０５】
Ｓ１Ｐは、５種のＧタンパク質共役受容体のファミリーに結合できる。それゆえに、半定量的ＲＴ−ＰＣＲで、ＨｅＬａ細胞がＳ１Ｐ受容体を発現するかどうかを調べた。ＨｅＬａ細胞で、５種のＳ１Ｐ受容体アイソフォームのうち４種のｍＲＮＡ（Ｓ１Ｐ1〜Ｓ１
Ｐ4）が検出された（図２０ａ）。次に、精製されたＳ１Ｐが、ＰＡＭの活性化／トラン
スロケーションに対して血清と同じ特性を示すかどうかを試した。まず、精製されたＳ１Ｐの濃度を徐々に高めてＨｅＬａ細胞を処理した。０.１〜５μＭのＳ１Ｐで処理した細
胞で処理した細胞の７０〜９０％で、ＰＡＭの細胞質膜へのトランスロケーションが起こった。ＰＡＭは、５００ｎＭのＳ１Ｐと１０分間インキュベートした後に細胞質膜で出現し、インキュベートして１時間後に消失し始めた（図３ｂ，ｃ）。最も重要なことには、ＨｅＬａ細胞を０.５μＭのＳ１Ｐで処理することによって、細胞内のｃＡＭＰ含量が減少し（図２１ａ）、同様に、Ｇαｓで刺激されたＡＣ活性が減少した（図２１ｂ）。Ｇαｓで刺激したＡＣ活性は、Ｓ１Ｐとインキュベートした後３分以内、かつ部分的に回復する前に減少した。Ｓ１Ｐ処理を開始して５〜１０分後に、Ｇαｓで刺激したＡＣ活性は、再び減少した（図４ｂ）。ＰＡＭに対するアンチセンスＯＤＮは、Ｓ１Ｐとインキュベートして６０分後に、Ｇαｓで刺激されたＡＣ活性の阻害を消滅させた（図２１ｃ）。総合すると、これらデータにより、ＨｅＬａ細胞におけるＳ１ＰによるＡＣ活性の阻害は、２つの異なるメカニズム：迅速なＰＡＭ非依存性のＡＣ阻害（３〜１０分のＳ１Ｐ処理）、および、遅延性のＰＡＭ依存性のＡＣ阻害（１０〜６０分のＳ１Ｐ処理）によって達成されることが初めて実証された。
【０１０６】
それぞれの受容体に結合することによって、Ｓ１Ｐは、４種の異なるＧタンパク質、Ｇｉ、Ｇｑ、Ｇ１２およびＧ１３を活性化する可能性を有することが実証された（Ｈｌａ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１年；Ｋｌｕｋ等，ＢＢＡ，２００２年；ＳｉｅｈｌｅｒおよびＭａｎｎｉｎｇ，ＢＢＡ，２００２年；ＳｐｉｅｇｅｌおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，ＪＢＣ，２００２年）。これらから、Ｇｉのみが百日咳毒素感応性である。百日咳毒素処理は、Ｇαｓで刺激されたＡＣ活性に対するＳ１Ｐの阻害作用（図２２ａ）、および、ＰＡＭの細胞質膜へのトランスロケーション（図２２ｂ）を消滅させた。このようにして、抑制性Ｇタンパク質Ｇｉは、Ｓ１Ｐによる迅速なＰＡＭ非依存性阻害に関与する可能性が高いようである。
【０１０７】
次に、ＰＡＭのトランスロケーションと活性化を引き起こすシグナル伝達経路のさらなる構成要素を研究した。Ｓ１Ｐ1〜Ｓ１Ｐ4受容体は、Ｇｉ、ＧｑおよびＧ12/13に共役し
ており（Ｈｌａ等，２００１年；Ｋｌｕｋ等，２００２年；Ｓｉｅｈｌｅｒ等，２００２年；Ｓｐｉｅｇｅｌ等，２００２年）、ＰＡＭのトランスロケーション、同様に、ＡＣ阻害は百日咳毒素依存性であると説明されているため（図２２ａ）、上記のデータにより、ＨｅＬａ細胞におけるＰＡＭの活性化は、Ｇｉ活性化に依存していることが示される。これまで、Ｓ１Ｐは、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）、同様に、Ｇｉの活性化を介したＥＲＫ１／２シグナル伝達を活性化できることが説明されている（Ｋｌｕｋ等，２００２年；Ｓｉｅｈｌｅｒ等，２００２年；Ｓｐｉｅｇｅｌ等，２００２年）。このようにして、ＰＬＣ活性化が、ＰＡＭのトランスロケーションに関与しているかどうかを試したところ、ＰＬＣ阻害剤Ｕ７３１２２の存在下で、ＰＡＭのトランスロケーションと後期のＡＣ阻害が止められることを発見できた（図２２ａ）。ＰＬＣは、ホスファチジルイノシトール４,
５−二リン酸を、イノシトール１,４,５−三リン酸（ＩＰ3）、カルシウム動員セカンド
メッセンジャーと、１,２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、タンパク質キナーゼＣ（
ＰＫＣ）の活性化因子に変換する（Ｒｅｂｅｃｃｈｉ等，２０００年；Ｗｉｌｄｅ等，２００１年）。カルシウムのイメージングにより、Ｓ１Ｐは、ＨｅＬａ細胞におけるＰＬＣ依存性のカルシウムの増加を誘発することが示された。しかしながら、ＢＡＰＴＡ−ＡＭでの前処理は、ＰＡＭのトランスロケーションを妨害しないため、ＰＡＭのトランスロケ
ーションにこのようなカルシウムの減少は必要ない（図２２ａ）。その上、ＰＫＣ阻害剤ＧＦ１０９２０３Ｘと、ＲＯ３１−８２２０は、それぞれＰＡＭのトランスロケーションとＡＣ阻害を消滅させた（図２２ａ）。これらのデータにより、Ｓ１Ｐは、抑制性Ｇタンパク質Ｇｉを介してＰＬＣを活性化することが示される。その後、ＰＬＣ作用により、ＰＡＭのトランスロケーションを媒介するのに必要なカルシウム非依存性のＰＫＣ活性化と、遅延性のＳ１Ｐ誘発性ＡＣ阻害が起こる。
【０１０８】
Ｓ１Ｐは、ＥＲＫ１／２シグナル伝達経路を活性化できることも示されているため（Ｋｌｕｋ等，２００２年；Ｓｉｅｈｌｅｒ等，２００２年；Ｓｐｉｅｇｅｌ等，２００２年）、ＨｅＬａにおいて、ＥＫ１／２は、Ｓ１Ｐによって活性化されるかどうかを試した。抗活性ＥＲＫと抗ホスホＴｙｒ183ＥＲＫ抗体を用いて、ＨｅＬａをＳ１Ｐとインキュベートした後、ＥＲＫ１／２のリン酸化が検出できた（図２２ｂ）。驚くべきことに、ＥＲＫ１／２のリン酸化は、ＰＬＣ活性化（図２２ｂ）、ＧｉおよびＰＫＣ活性依存性であったが（データ示さず）、細胞内のカルシウムの増加には非依存性であった。しかしながら、ＥＲＫ１／２の活性化は、ＰＡＭのトランスロケーションまたはＡＣ活性の阻害に必要なかった（図２２ａ）。総じて、これら発見により、Ｓ１Ｐは、ＰＡＭのトランスロケーション、それに続く、Ｇｉ、ＰＬＣおよびＰＫＣを含むシグナル伝達カスケードを介したＡＣ酵素活性の阻害を誘発することが初めて示された。興味深いことに、Ｓ１Ｐはさらに、ＥＲＫ１／２の活性化と、細胞内のカルシウム濃度の増加を誘発し、これらは両方、ＰＡＭのトランスロケーションまたはＧαｉで刺激したＡＣ活性の阻害に必要なかった。
【０１０９】
Ｓ１Ｐで調節されたシグナル伝達経路は、集中的な調査の焦点である（Ｋｌｕｋ等，２００２年；Ｓｉｅｈｌｅｒ等，２００２年；Ｓｐｉｅｇｅｌ等，２００２年）。Ｓ１Ｐ受容体は、Ｇｉ依存性メカニズムによってＡＣ活性を阻害できることは周知である（Ｋｌｕｋ等，２００２年；Ｓｉｅｈｌｅｒ等，２００２年；Ｓｐｉｅｇｅｌ等，２００２年）。しかしながら、ここで、遅延性のＡＣ阻害は、ＰＬＣおよびＰＫＣ活性化に依存しているため、Ｓ１Ｐで刺激した後の長期にわたるＡＣ活性の阻害は、抑制性Ｇタンパク質によるＡＣの直接的な阻害によるものではないことが初めて示された。その上、発明者等のデータにより、Ｓ１Ｐ処理後のＨｅＬａ細胞における持続性のＡＣ活性の阻害は、ＰＡＭの細胞質膜へのトランスロケーション／活性化に依存することが示される。このトランスロケーションは、Ｇｉ活性化と、ＰＬＣ／ＰＫＣシグナル伝達によって調節される。ＰＡＭは、ＡＣ酵素活性の有力な阻害剤であるため、Ｓ１Ｐ誘導性のＰＡＭ依存性のＡＣ阻害は、ＰＡＭとＡＣとの直接的な相互作用の結果と考えられるが、このことはなお証明の必要がある。上記の発明者等の実験により、ＨｅＬａ細胞において、ＰＡＭは、小胞体に局在しており、血清処理の後に細胞質膜へトランスロケーションすることが初めて発見された。ＰＡＭのトランスロケーションには、未処理のＨｅＬａ細胞と比較して、Ｇαｓおよびフォルスコリン刺激によるＡＣ活性の減少が伴った。細胞をＰＡＭに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドで前処理すると、ＡＣ阻害を妨害したことから、ＡＣ阻害にはＰＡＭが介在されていた。以下で、我々は、ＰＡＭのトランスロケーションに関与する血清因子としてスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）を同定した。ＨｅＬａ細胞を０.１〜５μＭのＳ１Ｐで処理することにより、１０〜３０分以内に細胞の８０％においてＰＡＭの細胞質膜へのトランスロケーションが誘発された。２つの別個のメカニズムによって、Ｓ１Ｐは、ＡＣ活性を減少させた。最初のＡＣ阻害にＰＡＭは介在していないが、百日咳毒素感応性であった。長期のＳ１Ｐ処理の後、ＡＣ阻害は、ＰＡＭのトランスロケーションに依存性であった。ＰＡＭのトランスロケーションに対するＳ１Ｐの作用と、ＰＡＭが介在するＡＣ阻害は、百日咳毒素感応性であり、ＰＬＣおよびＰＫＣの活性化を必要とした。総合すると、これらデータにより、ＰＡＭ活性の調節因子が初めて同定された。その上、Ｓ１Ｐによる長期のＡＣ活性の阻害は、ＥＲから細胞質膜へのＡＣ阻害タンパク質ＰＡＭのトランスロケーションが介在することを示すことができた。
【０１１０】
２１．Ｓ１Ｐの鎮痛作用の測定
Ｓ１Ｐの鎮痛の作用を測定するために、Ｓ１Ｐを髄腔内への投与によって脊髄へ搬送した。
【０１１１】
２１ａ）腰髄内へのカテーテル埋め込み：
ラットを、ケタミン（６０ｍｇ／ｋｇ，腹腔内）と、ミダゾラム（０.５〜１ｍｇ／ｋ
ｇ，腹腔内）で麻酔した。脊椎骨Ｔｈ１３からＬ３までの脊柱の上で皮膚を切開した。Ｌ２〜３周辺の筋肉組織を取り除いた。Ｌ３の棘突起を除去し、Ｌ２で椎弓切除術を施した。次に、ポリエチレン製カテーテル（ＩＤ０.２８ｍｍ、ＯＤ０.６１ｍｍ）を、カテーテルの先端がＴｈ９〜１０に達するように硬膜外腔に挿入した。カテーテルをシアノアクリレート系接着剤で固定し、頚部の領域で外部に置き、皮膚を縫合した。
【０１１２】
２１ｂ）ＰＡＭオリゴヌクレオチドの注入。
外科手術の３日後に、ラットを「自由行動系」（ＣＭＡ，ストックホルム，スウェーデン）の状態に置き、カテーテルを通じて、１０μＭのＳ１Ｐ２０μｌを注入した。
【０１１３】
２１ｃ）ホルマリン試験：
注入を止めた後１５分以内に、ホルマリン試験を行った。５％ホルムアルデヒド溶液５０μｌを、１本の後肢の背面の皮下に（ｓ.ｃ.）注射した。ホルマリン注射の直後に開始して、１分間のインターバルで６０分間まで、フリンチ行動をカウントした。５分間のインターバルのフリンチ行動を、１分あたりの平均フリンチ行動として要約した。グループ間の侵害受容の挙動を比較するためにフリンチ行動の１時間の観察期間の合計を、スチューデントのｔ検定で処理した。ホルマリン試験の最後に、腰髄および後根神経節（ＤＲＧ）を切り出し、液体窒素中で急速冷凍し、さらなる解析まで−８０℃で保存した。
【０１１４】
２１ｄ）結果：
成体ラットに、ホルマリン注射の１５分前に、１０μＭのＳ１Ｐ２０μｌまたはＰＢＳ／ＤＭＳＯ２０μｌを髄腔内へ投与した。次に、５分間のインターバルのフリンチ行動を、６０分間にわたりカウントした。第２Ａ相（ホルマリン注射の２０〜３５分後）における侵害受容性の反応の数が、ＰＢＳ／ＤＭＳＯ処理動物と比較して、顕著に減少したことが検出された（図２４を参照）。これら実験により、外因性のＳ１Ｐが、鎮痛薬として作用することが証明された。
【０１１５】
２２．Ｓ１Ｐ受容体アゴニストの鎮痛／抗侵害受容作用の測定
Ｓ１Ｐ受容体アゴニスト（例えばＦＴＹ７２０）の鎮痛／抗侵害受容作用、は、例えば、以下の仮想的実験により裏付けることができるだろう：例えばＦＴＹ７２０の、例えば急性の痛みのホルマリンモデルにおける鎮痛／抗侵害受容作用は、例えばＦＴＹ７２０を髄腔内または静脈内投与し、例えばフリンチ試験によってその鎮痛／抗侵害受容作用を連続的に試験することによって直接決定することができるだろう。このアプローチにより、分子を、組織に進入させ、ＡＣに対する生理学的なＳ１Ｐの作用を模倣させることが可能になると思われる。
【０１１６】
文献
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【０１２０】
実験方法に関する標準的な文献：
特に他の規定がない限り、実験方法は、以下の標準的な文献で列挙された標準的な方法に従って行われた、または、行うことができる：
Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second edition.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 545 pp or Current Protocols in Molecular Biology;
Current Protocols in Molecular Biology; regularly updated, e.g. Volume 2000; John Wiley & Sons, Inc; Editors: Fred M. Ausubel, Roger Brent, Robert Eg. Kingston, David D. Moore, J.G.Seidman, John A. Smith, Kevin Struhl.
Current Protocols in Human Genetics; regularly uptdated, e.g. Volume 2003; John Wiley & Sons, Inc; Editors: Nicholas C. Dracopoli, Honathan L. Haines, Bruce R. Korf, Cynthia C. Morton, Christine E. Seidman, J.G. Seigman, Douglas R. Smith.
Current Protocols in Protein Science; regularly updated, e.g. Volume 2003; John Wiley & Sons, Inc; Editors: John E. Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L. Ploegh, David W. Speicher, Paul T. Wingfield.
Molecular Biology of the Cell; third edition; Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Watson, J.D.; Garland Publishing, Inc. New York & London, 1994;
Gene Targeting: a practical approach (1995), Editor: A.L. Joyner, IRL Press
Genetic Manipulation of Receptor Expression and Function; D. Accili, Wiley-Liss., USA, 2000; ISBN: 0-471-35057-5.
Antisense Therapeutics, S. Agrawal, Humana Press, USA, 1996, ISBN: 0-89603-305-8.
Remington's Pharmaceutical Sciences, Edition 17, 1985
【０１２１】
用いられた略語：
ＡＣ、アデニリルシクラーゼ；Ｇαｓ、アデニリルシクラーゼの促進性Ｇタンパク質のαサブユニット、Ｇαｓ＊、Ｇαｓの構成的に活性な（Ｑ２１３Ｌ）突然変異体；Ｇαｉ、抑制性Ｇタンパク質Ｇｉのαサブユニット；Ｇβγ、ヘテロ三量体Ｇタンパク質のβγサブユニット；ＯＤＮ、オリゴデオキシヌクレオチド；ＰＡＭ、Ｍｙｃ関連タンパク質；ＲＣＣ１、染色体凝縮の調節因子；Ｓ１Ｐ、スフィンゴシン−１−リン酸；ＴＥＤ、５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８.０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ；ＲＴ、室温。
【０１２２】
図面
図１：ＰＡＭは、脊髄ニューロンで高度に発現される。脊髄の水平切片標本を用いたインサイチュハイブリダイゼーションを、上述したように、ラットＰＡＭに対するセンスまたはアンチセンスプローブとハイブリダイズさせた。
図２：ＰＡＭは、ＤＲＧニューロンで、同様に、ラット脊髄中のニューロンの細胞で発現される。
パネルＡ：ラットの脊髄切片標本の免疫組織化学的な解析。切片標本を、抗ＰＡＭ抗体
（緑）、および、抗ＮｅｕＮまたは抗ＧＦＡＰ（赤）で染色し、ニューロンまたはグリア細胞をそれぞれ可視化した。両方のシグナルの重ね合わせは、右のパネルに示される。対物を２０×に拡大した。
パネルＢ：ラットＤＲＧ切片標本の免疫組織化学的な解析。切片標本を、抗ＰＡＭ抗体（緑）、および、抗Ｎｅｕ６８、抗ヒストンまたは抗ＧＦＡＰ（赤）で染色し、それぞれニューロン、核またはグリア細胞を可視化した。両方のシグナルの重ね合わせは、右のパネルに示される。対物を４０×に拡大した（ただし、ヒストン染色は、６３×に拡大した）。
【０１２３】
図３：ＰＡＭは、ＤＲＧおよび脊髄において、異なる発生段階で差異的に発現される。定量ＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑｍａｎTM）を用いて、１６日齢のラット胎児（Ｅ１６）、出生後の日数が０.５（Ｐ０.５）、３（Ｐ３）、５（Ｐ５）、９（Ｐ９）のラット、および、成体ラットの脊髄およびＤＲＧのＲＮＡ（４０ｎｇ）中のＰＡＭを検出した。少なくとも３回の測定の平均±ＳＥＭを示す。
図４：ＰＡＭは、ラットの脊髄において、ザイモサンおよびホルマリン処理の後にアップレギュレートされた。
パネルＡ：コントロール動物、または、ザイモサンで処理して２４時間、４８時間および９６時間後の動物からの脊髄のＲＮＡ（４０ｎｇ）を用いたＲＴ−ＰＣＲ解析。下部のパネルは、７回の実験の平均±ＳＥＭを示す。スチューデントのｔ検定：＊ｐ＜０.００
１。
パネルＢ：コントロール動物、または、ザイモサンで処理して２４時間、４８時間および９６時間後の動物のラットの脊髄溶解産物（４０μｇ）を用いた、抗ＰＡＭ抗体および抗ＥＲＫ１／２を用いた、７％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いたウェスタンブロット解析。
パネルＣ：コントロール動物、または、ホルマリンで１時間処理した動物からの脊髄のＲＮＡ（４０ｎｇ）を用いた定量ＲＴ−ＰＣＲ解析。
【０１２４】
図５：ＰＡＭは、脊髄溶解産物中でＧαｓで刺激されたＡＣ活性を阻害する。
パネルＡ：ＲＴ−ＰＣＲを用いて、脊髄およびＤＲＧのＲＮＡ（４０ｎｇ）におけるＡＣアイソフォーム発現を決定した。
パネルＢ：材料および方法で説明したように、脊髄またはＤＲＧの溶解産物（１０μｇ）を、８０ｎＭのＧαｓの存在下で、ＡＣ活性に関して分析した。三連で行われた少なくとも３回の測定の平均±ＳＥＭを示す。
図６：ＰＡＭに対するアンチセンスＯＤＮの髄腔内への適用により、侵害受容の挙動が増加する。
パネルＡ：説明されているように、成体ラットに、センスおよびアンチセンスＯＤＮを髄腔内投与した。ホルマリン処理の後に、脊髄を除去し、抗ＰＡＭ抗体（緑）、または、抗ＮｅｕＮ（赤）を用いて免疫組織学的な解析で処理した。
パネルＢ：材料の章において説明されているように、センスまたはアンチセンスＯＤＮで処理した動物のホルマリンアッセイ。
１時間にわたるフリンチ行動の合計を示す。少なくとも４回の測定の平均±ＳＥを示す。
パネルＣ：材料の章において説明されているように、センスまたはアンチセンスＯＤＮで処理した動物のホルマリンアッセイ。
１時間にわたるフリンチ行動の回数を示す。
少なくとも４回の測定の平均±ＳＥを示す。
【０１２５】
図７：ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＣ３９９２８（タンパク質配列；配列番号１）、ＡＦ０７５５８７（コード配列；配列番号２）による、ヒトＰＡＭのタンパク質、ゲノムおよびコードヌクレオチド配列。ヒトＰＡＭは、染色体１３ｑ２２上に位置する；そのゲノム配列は、ＮＴ＿０２４５２４.１１（始点：２４６７９８６１位；終点：２４９６２２４５位
；配列番号３）で公開された形で利用可能である；
図７Ｃは、２４６７９８６１〜２４９６２２４５位の連続した配列を示す。
図８：ラットＰＡＭに関するＥＳＴ−クローンをコードする配列：
図８Ａ：ＡＷ９２１３０３（ｈｓｃＤＮＡのｂｐ９６０〜１３９４に対応する；配列番号４）
図８Ｂ：ＡＷ９１８７１１（ｈｓｃＤＮＡのｂｐ８１８８〜８６３２に対応する；配列番号５）
図８Ｃ：ＢＱ２０１４８５（ｈｓｃＤＮＡのｂｐ８９６６〜９６３３に対応する；配列番号６）
図８Ｄ：ＢＥ１１２８８１（ｈｓｃＤＮＡのｂｐ１０３１１〜１０８３０に対応する；配列番号７）
図８Ｅ：ＡＷ４４１１３１（ｈｓｃＤＮＡのｂｐ１３５６９〜１４１５２に対応する；配列番号８）
図８Ｆ：ＢＦ４０９８７２（ｈｓｃＤＮＡのｂｐ１３５６９〜１４８０７に対応する）。（配列番号９）
【０１２６】
図９：Ｇｕｏ等，１９８８年／Ｇｒｏｓｓｂｅｒｇｅｒ等，ＪＢＣ  １９９９年、および、Ｓｃｈｏｌｉｃｈ等，ＪＢＣ  ２００１年）によるヒトＰＡＭのドメイン構造の概観。
図１０：ラットＰＡＭ  ＲＴＰＣＲのためのＰＣＲプライマー。
図１１：ラットＰＡＭ発現を阻害するためのアンチセンスオリゴデスオキシヌクレオチド、および、コントロールオリゴヌクレオチド。
図１２：本発明の環境で使用するための、様々なＰＡＭｈｓポリペプチド。これらのポリペプチドは、配列番号２に記載のポリペプチドから得られたフラグメントである。
図１３：本発明の環境で使用するための、異なるＰＡＭｈｓポリヌクレオチド。
図１３Ａ：ｈｓＰａｍｃＤＮＡのヌクレオチドの１３１７〜４３６６位を含む、配列番号１７に記載のタンパク質フラグメントをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号２４）；
図１３Ｂ：ｈｓＰａｍｃＤＮＡのヌクレオチドの１４８２〜３３３２位を含む、配列番号１８に記載のタンパク質フラグメントをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号２５）；
図１３Ｃ：ｈｓＰａｍｃＤＮＡのヌクレオチドの１６４１〜３３４１位を含む、配列番号１９に記載のタンパク質フラグメントをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号２６）；
図１３Ｄ：ｈｓＰａｍｃＤＮＡのヌクレオチドの３１４２〜４０４６位を含む、配列番号２０に記載のタンパク質フラグメントをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号２７）；
図１３Ｅ：ｈｓＰａｍｃＤＮＡのヌクレオチドの３１４２〜３４４６位を含む、配列番号２１に記載のタンパク質フラグメントをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号２８）；
図１３Ｆ：ｈｓＰａｍｃＤＮＡのヌクレオチドの３２２８〜３８３９位を含む、配列番号２２に記載のタンパク質フラグメントをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号２９）；
図１３Ｇ：ｈｓＰａｍｃＤＮＡのヌクレオチドの３２２８〜３３４１位を含む、配列番号２３に記載のタンパク質フラグメントをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号３０）；
【０１２７】
図１４：上記の発見によるＰＡＭシグナル伝達。
図１５：スフィンゴシン−１−リン酸の構造；
図１６：Ｓ１Ｐ受容体のｍＲＮＡおよびアミノ酸配列、
１６ａ）Ｓ１Ｐ1のアミノ酸配列（配列番号３１）；
１６ｂ）Ｓ１Ｐ1のｍＲＮＡ配列（配列番号３２）；コード配列は、２４４位で始まり
、１３９２位で終わる、
１６ｃ）Ｓ１Ｐ2のアミノ酸配列（配列番号３３）；
１６ｄ）Ｓ１Ｐ2のｍＲＮＡ配列（配列番号３４）；コード配列は、１位で始まで始ま
り、１０６２位で終わる；
１６ｅ）Ｓ１Ｐ3のアミノ酸配列（配列番号３５）
１６ｆ）Ｓ１Ｐ3のｍＲＮＡ配列（配列番号３６）、コード配列は、１位で始まり、１
１３７位で終わる；
１６ｇ）Ｓ１Ｐ4のアミノ酸配列（配列番号３７）
１６ｈ）Ｓ１Ｐ4のｍＲＮＡ配列（配列番号３８）、コード配列は、２３位で始まり、
１１７７位で終わる；
１６ｉ）Ｓ１Ｐ5のアミノ酸配列（配列番号３９）
１６ｊ）Ｓ１Ｐ5のｍＲＮＡ配列（配列番号４０）、コード配列は、１０位で始まり、
１２０６位で終わる：
図１７：ＦＴ７２０の構造
図１８：ＰＡＭは、ＨｅＬａ細胞において、血清での刺激の後に、ＥＲから細胞質膜へトランスロケーションする。
パネルＡ：上述したように、血清欠乏状態にしたＨｅＬａ細胞（２４時間）を固定し、抗ＰＡＭ抗体（緑）と、抗カルネキシン抗体（赤）で染色した。
パネルＢ：ＨｅＬａ細胞を、様々な時間で１０％ウシ胎仔血清で処理し、抗ＰＡＭ抗体で染色し、細胞内局在をモニターした。
【０１２８】
図１９：ＨｅＬａ細胞の血清処理により、ＰＡＭ依存性プロセスを介してＡＣ活性が減少する。
パネルＡ：上述したように、血清の非存在および存在で、ＨｅＬａ細胞におけるｃＡＭＰの蓄積を測定した。３回の測定の平均±ＳＥＭ（標準誤差）を示す。
パネルＢ：材料および方法の章で説明したように、血清の非存在および存在で、ＨｅＬａ細胞溶解産物のアデニリルシクラーゼ活性を測定した。Ｇｓα＊（８０ｎＭ；灰色のバー）で、および、フォルスコリン（１００μＭ；黒いバー）で刺激した、ＡＣＶの特異的活性は、それぞれ１２４±１０ｐｍｏｌ／ｍｇ／分、および、４６４±８９ｐｍｏｌ／分／ｍｇであった。基礎的な活性は、１１.７５±２ｐｍｏｌ／ｍｇ／分であった。少なく
とも２回の実験（それぞれ三連で行われた）の平均±ＳＥを示す。スチューデントのｔ検定：＊ｐ＜０.００１。
パネルＣ：血清欠乏状態にしたＨｅＬａ細胞において、１０％ＦＢＳで１時間インキュベートした後の、ＡＣアイソフォーム発現のＲＴ−ＰＣＲ解析。
パネルＤ：上述したように、血清欠乏状態にしたＨｅＬａ細胞を、アンチセンス、センスおよび３つの点突然変異（３Ｍ−ａｓ）を含むアンチセンスＯＤＮをそれぞれ３□Ｍで用いてトランスフェクトした。細胞を回収し、７％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（タンパク質３０μｇ）を用いて、抗ＰＡＭ抗体および抗Ｈｓｐ７０抗体を用いてウェスタン解析に付した。
パネルＥ：上述したように、血清欠乏状態にしたＨｅＬａ細胞を、センス、アンチセンス、および、３Ｍ−ａｓ  ＯＤＮで処理した。
２４時間後、細胞を、１０％ＦＢＳと３０分間インキュベートした。上述したように、細胞を回収し、Ｇαｓ＊（８０ｎＭ；灰色のバー）、および、フォルスコリン（１００μＭ；黒いバー）の存在下でＡＣ活性を決定した。少なくとも３回の実験（三連で測定された）からのデータを、平均±ＳＥＭとして示す。スチューデントのｔ検定：＊ｐ＜０.０
１、＊＊ｐ＜０.０５。
【０１２９】
図２０：Ｓ１Ｐは、ＰＡＭの細胞質膜へのトランスロケーションを誘発させ、ＰＡＭ依存性のＡＣ酵素活性を阻害する。
パネルＡ：血清欠乏状態にしたＨｅＬａ細胞におけるＳ１Ｐ受容体アイソフォーム発現のＲＴ−ＰＣＲ解析。
パネルＢ：ＨｅＬａ細胞を、０.５μＭのＳ１Ｐで３０分間処理し、抗ＰＡＭ抗体で染
色し、細胞内局在をモニターした。
パネルＣ：ＨｅＬａ細胞におけるＰＡＭのトランスロケーションの時間依存性。血清欠乏状態にしたＨｅＬａ細胞を、０.５μＭのＳ１Ｐで様々な時間で処理し、抗ＰＡＭ抗体
で染色し、細胞内局在をモニターした。ＰＡＭのトランスロケーションを示す細胞のパー
センテージを示す。
図２１：ＨｅＬａ細胞のＳ１Ｐ処理により、ＰＡＭ依存性プロセスを介してＡＣ活性が減少する。
パネルＡ：材料および方法の章で説明したように、０.５μＭのＳ１Ｐが非存在下（黒
いバー）、および、０.５μＭのＳ１Ｐが存在下（灰色のバー）での、様々な時間での、
ＨｅＬａ細胞におけるｃＡＭＰの蓄積を測定した。３回の測定の平均±ＳＥＭを示す。
パネルＢ：血清欠乏状態にしたＨｅＬａ細胞を、０.５μＭのＳ１Ｐで様々な時間で処
理した。材料および方法で説明したように、細胞を回収し、８０ｎＭのＧαｓ＊の存在下でＡＣ活性を決定した。少なくとも４回の実験（三連で測定された）からのデータを、平均±ＳＥとして示す。
パネルＣ：材料および方法の章で説明されているように、血清欠乏状態にしたＨｅＬａ細胞を、センス、アンチセンス、および、３Ｍ−ａｓ  ＯＤＮで処理した。２４時間後、細胞を、０．５μＭのＳ１Ｐと指定された時間インキュベートした。
細胞を回収し、上述したように、Ｇαｓ＊（８０ｎＭ）の存在下でＡＣ活性を決定した。データを、３回の測定の平均±ＳＥＭとして示す。
【０１３０】
図２２：ＰＡＭのトランスロケーション、および、ＡＣ酵素活性のＰＡＭ依存性阻害に、ＰＬＣ／ＰＫＣシグナル伝達経路が介在する。
パネルＡ：血清欠乏状態にしたＨｅＬａ細胞を、０.５μＭのＳ１Ｐで、３分間（灰色
のバー）、または、６０分間（黒いバー）処理した。
Ｓ１Ｐとのインキュベートの前に、細胞を、１μｇ／μｌの百日咳毒素（ＰＴＸ）と２４時間インキュベートした。８０ｎＭのＧαｓ＊の存在で、ＡＣ活性を決定した。少なくとも２回の実験（三連で測定された）からのデータを、平均±ＳＥとして示す。
パネルＢ：血清欠乏状態にしたＨｅＬａ細胞を、０.５μＭのＳ１Ｐで処理した。Ｓ１
Ｐとのインキュベートの前に、細胞を、１０μＭのＵ７３１２２、ＲＯ３１−８２２０、ＢＡＰＴＡ−ＡＭまたはＵ０１２６と２０分間インキュベートした。８０ｎＭのＧαｓ＊の存在下で、ＡＣ活性を決定した。少なくとも２回の実験（三連で測定された）からのデータを、平均±ＳＥとして示す。
パネルＣ：０.５μＭのＳ１Ｐで１０分間処理したＨｅＬａ細胞のウェスタンブロット
解析。Ｓ１Ｐとのインキュベートの前に、細胞を、１０μＭのＵ７３１２２、ＢＡＰＴＡ−ＡＭまたはＵ０１２６と２０分間インキュベートした。沸騰したレムリー緩衝液中で細胞を回収し、抗活性ＥＲＫ１／２抗体を用いてウェスタン解析で処理した。ローディングコントロールとして抗Ｈｓｐ７０抗体を用いた。
パネルＤ：ＨｅＬａ細胞を、０.５μＭのＳ１Ｐで２０分間処理し、抗ＰＡＭ抗体で染
色し、細胞内局在をモニターした。Ｓ１Ｐ処理の前に、細胞を、１μｇ／μｌの百日咳毒素（ＰＴＸ）と２４時間、１μＭのＧＦ１０９２０３Ｘ、１０μＭのＵ０１２６、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ、Ｕ７３１２２またはＲｏ３１−２２３と２０分間、インキュベートした。
図２３：ＰＡＭのトランスロケーション、および、ＡＣ酵素活性のＰＡＭ依存性阻害に至る提唱されたシグナル伝達経路の模式図。
図２４：ホルマリン分析における、６０分間にわたるＳ１Ｐ適用を行った場合と、行わない場合の成体ラットの痛み行動。
【０１３１】
ホルマリン注射の前に、成体ラットに、１０μＭのＳ１Ｐ２０μｌ、または、ＰＢＳ／ＤＭＳＯ２０μｌを髄腔内へ１５分間適用することによって投与した。ホルマリン注射の後に、フリンチ行動を６０分間にわたり５分間のインターバルでカウントした。６回の動物実験の平均＋ＳＥＭを示す。
【０１３２】
【表１】
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【０１３３】
アンチセンス処理ラットの脊髄溶解産物において、基礎的なＡＣ活性は上昇する。上述したように、脊髄溶解産物（２０μｇ）を、８０ｎＭのＧαｓ、または、１００μＭのフォルスコリンの非存在下、または存在下でＡＣ活性に関して分析した。グループあたり少なくとも３匹のラットからの脊髄溶解産物の平均ＡＣ活性±ＳＥＭ（それぞれ三連で２回測定された）を示す（ｎｓ＝有意差なし）。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図６−１】
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【図７】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図７−７】
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【図７−８】
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【図７−９】
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【図７−１０】
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【図７−１１】
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【図７−１２】
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【図７−１３】
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【図７−１４】
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【図７−１５】
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【図７−１６】
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【図７−１７】
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【図７−１８】
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【図７−１９】
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【図７−２０】
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【図７−２１】
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【図７−２２】
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【図７−２３】
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【図７−２４】
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【図７−２５】
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【図７−２６】
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【図７−２７】
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【図７−２８】
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【図７−２９】
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【図７−３０】
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【図７−３１】
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【図７−３２】
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【図７−３３】
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【図７−３４】
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【図７−３５】
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【図７−３６】
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【図７−３７】
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【図７−３８】
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【図７−３９】
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【図７−４０】
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【図７−４１】
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【図７−４２】
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【図７−４３】
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【図７−４４】
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【図７−４５】
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【図７−４６】
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【図７−４７】
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【図７−４８】
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【図７−４９】
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【図７−５０】
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【図７−５１】
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【図７−５２】
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【図７−５３】
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【図７−５４】
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【図７−５５】
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【図７−５６】
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【図７−５７】
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【図７−５８】
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【図７−５９】
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【図７−６０】
0005460627.tif 000071
【図７−６１】
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【図７−６２】
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【図７−６３】
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【図７−６４】
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【図７−６５】
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【図７−６６】
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【図７−６７】
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【図７−６８】
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【図７−６９】
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【図７−７０】
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【図７−７１】
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【図７−７２】
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【図７−７３】
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【図７−７４】
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【図７−７５】
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【図７−７６】
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【図７−７７】
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【図７−７８】
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【図７−７９】
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【図７−８０】
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【図７−８１】
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【図７−８２】
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【図７−８３】
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【図７−８４】
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【図７−８５】
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【図７−８６】
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【図７−８７】
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【図７−８８】
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【図７−８９】
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【図７−９０】
0005460627.tif 000101
【図７−９１】
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【図７−９２】
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【図７−９３】
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【図７−９４】
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【図７−９５】
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【図７−９６】
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【図７−９７】
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【図７−９８】
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【図７−９９】
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【図７−１００】
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【図７−１０１】
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【図７−１０２】
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【図７−１０３】
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【図７−１０４】
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【図７−１０５】
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【図７−１０６】
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【図７−１０７】
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【図７−１０８】
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【図７−１０９】
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【図７−１１０】
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【図７−１１１】
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【図７−１１２】
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【図７−１１３】
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【図７−１１４】
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【図７−１１５】
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【図７−１１６】
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【図７−１１７】
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【図７−１１８】
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【図７−１１９】
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【図７−１２０】
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【図７−１２１】
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【図７−１２２】
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【図７−１２３】
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【図７−１２４】
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【図７−１２５】
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【図７−１２６】
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【図８】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１６−５】
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【図１６−６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図１９−１】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２２−１】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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