(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コリネバクテリウム属微生物由来の配列番号１及び配列番号２からなるトランスポゾン遺伝子とマルチクローニングサイトを含むこと、並びに
前記マルチクローニングサイトが配列番号１からなるトランスポゾン遺伝子と配列番号２からなるトランスポゾン遺伝子との間に存在することを特徴とする形質転換用ベクター。
【請求項２】
前記マルチクローニングサイトに、コリネバクテリウム属微生物由来のアスパラギン酸キナーゼを暗号化するｌｙｓＣ遺伝子、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼを暗号化するａｓｄ遺伝子、ジヒドロジピコリネートシンターゼを暗号化するｄａｐＡ遺伝子及びジヒドロジピコリネートリダクターゼを暗号化するｄａｐＢ遺伝子からなる群から選択された一つまたはそれ以上の遺伝子が挿入されていることを特徴とする、請求項１に記載の形質転換用ベクター。
【請求項３】
前記マルチクローニングサイトに外来のフルクトキナーゼを暗号化するｓｃｒｋ遺伝子が挿入されていることを特徴とする、請求項１に記載の形質転換用ベクター。
【請求項４】
前記ｓｃｒｋ遺伝子は、クロストリジウムアセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ８２４由来のものであることを特徴とする、請求項３に記載の形質転換用ベクター。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の形質転換用ベクターを使用して形質転換されたことを特徴とする、Ｌ−リジン生産能を有するコリネバクテリウムグルタミクム。
【請求項６】
形質転換される微生物は、コリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＫＣＣＭ１０７７０Ｐであることを特徴とする、請求項５に記載のＬ−リジン生産能を有するコリネバクテリウムグルタミクム。
【請求項７】
前記コリネバクテリウムグルタミクムは、コリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ−ＣＪ２（受託番号：ＫＣＣＭ１０９３９Ｐ）であることを特徴とする、請求項５に記載のＬ−リジン生産能を有するコリネバクテリウムグルタミクム。
【請求項８】
前記形質転換用ベクターのマルチクローニングサイトに挿入された遺伝子は、２次クロスオーバーにより染色体に統合されることを特徴とする、請求項５に記載のＬ−リジン生産能を有するコリネバクテリウムグルタミクム。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれかに記載の微生物を培養して、細胞または培養物中にリジンを生産する段階と、
前記細胞または培養物からリジンを回収する段階と、を含むことを特徴とする、Ｌ−リジンを生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスポゾン遺伝子を利用した形質転換用ベクター、前記ベクターを利用して形質転換された微生物、及び前記微生物を利用してリジンを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コリネバクテリウム(Corynebacterium)、特にコリネバクテリウムグルタミクム(Corynebacterium glutamicum)は、Ｌ−アミノ酸生産によく利用されているグラム陽性の微生物である。Ｌ−アミノ酸、特に、Ｌ−リジンは、動物飼料、人間の医薬品及び化粧品産業に使用されており、コリネバクテリウム菌株を利用した発酵により生産されている。
【０００３】
従来Ｌ−リジンの生産方法において、Ｌ−リジン生合成関連遺伝子が強化されたコリネバクテリウム菌株及びこれを利用したＬ−リジン生産方法が知られている。例えば、特許文献１には、リジン排出キャリア遺伝子であるｌｙｓＥ遺伝子が強化されて、ジヒドロジピコリネートシンターゼ(dihydrodipicolinate synthase)を暗号化するｄａｐＡ遺伝子、アスパラギン酸キナーゼ(aspartate kinase)を暗号化するｌｙｓＣ遺伝子、ピルビン酸カルボキシラーゼ(pyruvate carboxylase)を暗号化するｐｙｃ遺伝子及びジヒドロピコリネートリダクターゼ(dihydropicolinate reductase)を暗号化するｄａｐＢ遺伝子から構成される群から選択された遺伝子が追加的に導入されたコリネバクテリウム属微生物を培養してＬ−リジンを生産する方法が開示されている。また、特許文献２には、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによるフィードバック阻害に対して実質的に脱感作化された(insensitive)アスパルトキナーゼ(aspartokinse)を暗号化するＤＮＡ配列及びジアミノピメレートジカルボキシラーゼ(diaminopimelate dicarboxylase)をコーディングするＤＡＮ配列を含む組換えＤＮＡで形質転換されたコリネバクテリアが開示されている。
【０００４】
上記のＬ−リジン生合成関連遺伝子を抗生剤抵抗性塩基配列無しに強化する方法としては、遺伝子のコピー数を増加させる方法と突然変異による酵素活性の増加による方法がある。その中で、コピー数を増加させる方法としては、今まで二つの方法が報告されている。
【０００５】
第一に、追加的に挿入させる遺伝子を自己遺伝子のすぐ隣に挿入させるような特定区間同一反復(Tandem repeat)の方法がある。第二に、コリネバクテリウム属微生物の染色体部位の一つまたはそれ以上の部位に、追加的に挿入させる遺伝子を挿入させる方法がある(特許文献３)。しかしながら、このような方法は、遺伝子の挿入位置が限定されているという短所があって、多数の遺伝子を挿入し難いという問題点がある。これを克服するために、挿入させようとする遺伝子を、ゲノム上で多数のコピーで存在するｒＤＮＡ位置に挿入させる方法が試みられた。この方法は、既存の方法より成功率が高いと報告されているが、ｒＤＮＡの２コピー以上の破壊は、微生物成長に影響を与えるという制限性がある。
【０００６】
トランスポゾン(Transposon)は、挿入配列(Insertional Sequence)要素ともいうが、染色体やプラスミド上で動くことのできる塩基配列を意味する。トランスポゾンには、トラスポザーゼ(transposase)という転位酵素があって、特異塩基配列を感知して挿入させることができる活性を有している。現在までに、多様なバクテリアにおいて数百個のトランスポゾンが知られている(非特許文献１)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第６，７４６，８５５号
【特許文献２】米国特許第６，２２１，６３６号
【特許文献３】米国特許第７，１６０，７１１号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】TRANSPOSON-BASED STRATEGIES FOR MICROBIAL FUNCTIONAL GENOMICS AND PROTEOMICS(2003) Annual Review of Genetics 37:3-29 Finbarr Hayes
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、微生物の成長に影響を与えることなく、二つ以上の目的とする遺伝子コピー(copy)を、位置に関係なく挿入できる形質転換用ベクターを利用して、リジンを高濃度で生産できる菌株を開発するために鋭意研究した結果、トランスポゾン遺伝子を利用した形質転換用ベクターが外来遺伝子の導入に有用であるということを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、トランスポゾン遺伝子を利用した形質転換用ベクターを提供することである。
【００１１】
本発明の他の目的は、前記形質転換用ベクターで形質転換させることにより、リジンの生産能が向上されたコリネバクテリウム属微生物を提供することである。
【００１２】
本発明のまた他の目的は、前記コリネバクテリウム属微生物を培養し、その培養液からリジンを生産する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記のような目的を達成するために、本発明は、トランスポゾン遺伝子及びマルチクローニングサイトを含む形質転換用ベクターを提供する。
【００１４】
また、本発明は、前記形質転換用ベクターで形質転換させることにより、リジンの生産能が向上されたコリネバクテリウム属微生物を提供する。
【００１５】
また、本発明は、前記コリネバクテリウム属微生物を培養して、その培養液からリジンを生産する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、コリネバクテリウム属微生物のゲノム上で多数のコピーで存在するトランスポゾン遺伝子の位置にアスパラギン酸キナーゼ(ｌｙｓＣ)、アスパラギン酸セミアルデヒドジヒドロゲナーゼ(ａｓｄ)、ジヒドロジピコリネートシンターゼ(ｄａｐＡ)、ジヒドロジピコリネートリダクターゼ(ｄａｐＢ)遺伝子を連続挿入させることにより、その活性が内在的活性より増加されており、コリネバクテリアに存在しないフルクトキナーゼ(ｓｒｋ)遺伝子をトランスポゾン遺伝子の位置にさらに挿入させて、新しい活性を有するリジンを高濃度で生産できるコリネバクテリウム属微生物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】コリネバクテリウム染色体挿入用ベクターｐＤＺＴｎを示す図面である。
【図２】コリネバクテリウム染色体挿入用ベクターｐＤＺＴｎ−ｌｙｓＣ/ａｓｄを示す図面である。
【図３】コリネバクテリウム染色体挿入用ベクターｐＤＺＴｎ−ｄａｐＡ/ｄａｐＢベクターを示す図面である。
【図４】ｐＤＺＴｎ−ｓｒｋベクターを示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、トランスポゾン遺伝子及びマルチクローニングサイトを含む形質転換用ベクターを提供する。
【００１９】
前記トランスポゾン遺伝子は、コリネバクテリウム属由来である。コリネバクテリウム属微生物は、多数の多様なのトランスポゾンを有している。例えば、コリネバクテリウムグルタミクム(corynebacterium glutamicum)ＡＴＣＣ１３０３２の場合は、２４個のトランスポゾンを有しており、このようなトランスポゾンは、９個のグループに分類できる(The complete Corynebacterium glutamicum ATCC 13032  genome sequence and its impact on the production of -  aspartate-derived amino acids  and vitamins (2003) Journal of Biotechnology 104, 5-25 Jorn Kalinowski et al)。その中で、ＩＳＣｇ１とＩＳＣｇ２グループは、それぞれ４個、５個のコピー数を有しており、それぞれのコピーは、９９％以上の相同性を有している。
【００２０】
好ましくは、本発明のトランスポゾン遺伝子は、コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ１３０３２由来のトランスポゾン(GenBank assession number : NC_003450、NCgl1021)の中、ＩＳＣｇ１グループ(配列番号２２)に属して、特に好ましくは、配列番号１及び２のヌクレオチド配列を有するトランスポゾン遺伝子である。
【００２１】
前記マルチクローニングサイトは、多数の制限酵素が認識できるように人為的に挿入したヌクレオチド配列であって、所望の遺伝子の挿入を容易にする機能をする。
【００２２】
本発明で前記マルチクローニングサイトに挿入できる遺伝子としては、Ｌ−アミノ酸の生産に関与するコリネバクテリウム属微生物に内在するａｓｐＢ(アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼを暗号化する遺伝子)、ｌｙｓＣ(アスパラギン酸キナーゼを暗号化する遺伝子)、ａｓｄ(アスパラギン酸セミアルデヒドジヒドロゲナーゼを暗号化する遺伝子)、ｄａｐＡ(ジヒドロジピコリネートシンターゼを暗号化する遺伝子)、ｄａｐＢ(ジヒドロジピコリネートリダクターゼを暗号化する遺伝子)及びｌｙｓＡ(ジアミノジピメレートジカルボキシラーゼを暗号化する遺伝子)遺伝子がある。また、外来遺伝子としては、ｓｒｋ(フルクトキナーゼを暗号化する遺伝子)遺伝子がある。
【００２３】
好ましくは、前記マルチクローニングサイトには、前記ａｓｐＢ，ｌｙｓＣ、ａｓｄ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ及びｌｙｓＡ遺伝子からなる群から選択された遺伝子の一つまたはそれ以上を挿入することができる。また、当該マルチクローニングサイトには、前記内在的遺伝子と外来遺伝子とを組み合わせて挿入することもできる。さらに好ましくは、本発明は、前記マルチクローニングサイトにｌｙｓＣ／ａｓｄ、ｄａｐＡ／ｄａｐＢ遺伝子を連続に挿入するか、コリネバクテリウム属微生物に存在しないｓｒｋ遺伝子を挿入することができる。
【００２４】
本発明の好ましい様態において、前記ｌｙｓＣ、ａｓｄ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ遺伝子は、コリネバクテリウムグルタミクム(Corynebacterium glutamicum) KCCM10770P(GenBank assession number: NC_003450, NCgl0247〜0248及びNCgl1896〜1898)由来のそれぞれ配列番号１７、１８、１９、２０のヌクレオチド配列を有するものである。また、外来遺伝子ｓｒｋ遺伝子は、クロストリジウムアセチルブチリクム(Clostridium acetylbutyricum)ＡＴＣＣ８２４(GenBank assessionnumber: NP_347064)由来の配列番号２１のヌクレオチド配列を有するものである。
【００２５】
本発明の形質転換用ベクター内に挿入された遺伝子は、２次クロスオーバーによりコリネバクテリウム属微生物の染色体に統合できる。
【００２６】
本発明によるトランスポゾン遺伝子を利用した形質転換用ベクターは、内在的遺伝子を２コピー以上増幅することができるだけではなく、数個のトランスポゾンが存在するため、高い確率のクロスオーバー作用により容易に遺伝子を導入できて、同じベクターを利用して多様な遺伝子をシリーズで増幅させる菌株を作ることができる。また、トランスポゾンは、微生物生長に何の影響も与えない遺伝子であって、却ってトランスポゾンによる遺伝子不安定性を減少させることができるという長所がある。さらに、外来遺伝子の導入時、特定標的サイト(Target site)がなくても可能であって、これも同様にシリーズで製作が可能であるという長所がある。
【００２７】
また、本発明は、前記形質転換用ベクターで形質転換させることにより、リジンの生産能が向上されたコリネバクテリウム属微生物を提供する。
【００２８】
本発明において、前記形質転換用ベクターで形質転換させることのできるリジン生産能を有する微生物は、コリネバクテリウム属微生物であれば何でも可能である。例えば、前記コリネバクテリウム属微生物は、 コリネバクテリウムグルタミクム(Corynebacterium glutamicum)ＡＴＣＣ １３０３２、コリネバクテリウムテルモアミノゲネス(Corynebacterium  thermoaminogenes)ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９である。また、これらから製造されたＬ−アミノ酸生産突然変異体または菌株、例えば、コリネバクテリウムグルタミクムＫＦＣＣ１０８８１、コリネバクテリウムグルタミクムＫＦＣＣ１１００１及びＬ−リジン生合成遺伝子強化菌株であるコリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７７０が含まれ、最も好ましくは、コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ  １０７７０Ｐである。
【００２９】
本発明の好ましい様態において、本発明のコリネバクテリウム属微生物は、それぞれ図２、３及び４の開裂地図を有する形質転換用ベクターｐＤＺＴｎ−ｌｓｃＣ／ａｓｄ、ｐＤＺＴｎ−ｄａｐＡ／ｄａｐＢ及びｐＤＺＴｎ−ｃｒｋで形質転換されたものである。前記形質転換用ベクターは、順にまたは同時に前記コリネバクテリウム属微生物に導入できる。前記遺伝子の染色体内への挿入は、当業界に知られた任意の方法、例えば、相同組換えによりなされる。
【００３０】
また、本発明は、前記コリネバクテリウム属微生物を培養して、その細胞または培養液からリジンを生産する方法を提供する。
【００３１】
前記培養は、コリネバクテリウム属微生物を利用してＬ−リジンを培養する、当業界に広く知られている方法が使用できる。前記培養は、バッチ工程または注入バッチまたは反復注入バッチ工程(fed batch or repeated fed batch process)において連続式で培養できる。
【００３２】
培養に使用される培地は、適切な方式で特定菌株の要件を満たさなければならない。コリネバクテリウム属菌株に対する培養培地は公知である(例えば、Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981)。
【００３３】
使用できる糖源としては、グルコース、サカロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、澱粉、セルロースのような糖及び炭水化物、大豆油、ひまわり油、蓖麻子油、ココナッツ油などのようなオイル及び脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、アセト酸のような有機酸が含まれる。これらの物質は、単独で、または混合物として使用できる。
【００３４】
使用できる窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、玉蜀黍浸漬液、大豆ミール及び尿素または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが含まれる。窒素源も同様に単独または混合物として使用できる。
【００３５】
使用できるリン源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウム含有塩が含まれる。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含有しなければならない。最後に、前記物質に加えて、アミノ酸及びビタミンのような必須成長物質が使用できる。また、培養培地に適切な前駆体が使用できる。上記の原料は、培養過程で培養物に適切な方式により回分式または連続式で添加できる。水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアのような基礎化合物、またはリン酸または硫酸のような酸化合物を適切な方式で使用し、培養物のｐＨを調節することができる。また、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用して気泡生成を抑制することができる。好気状態を維持するために、培養物内に酸素または酸素含有気体(例えば、空気)を注入する。培養物の温度は、普通２０℃〜４５℃、好ましくは、２５℃〜４０℃である。培養は所望のＬ−アミノ酸の生成量が最大に得られるまで続ける。このような目的で、通常１０〜１６０時間で達成される。Ｌ−リジンは、培養培地中に排出されるか、細胞中に含まれる。
【００３６】
以下、本発明を実施例を通じてより詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を例示的に実施するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３７】
（実施例）
実施例１：トランスポゾン遺伝子が挿入されたベクター(ｐＤＺＴｎ)の製作及びこれを利用した遺伝子の挿入方法
本実施例では、コリネバクテリウム属微生物の染色体挿入用ベクターｐＤＺを基本ベクターとして使用し、コリネバクテリウム属微生物におけるトランスポゾン遺伝子が挿入されたベクターｐＤＺＴｎを製作した。製作過程は、以下の通りである。
【００３８】
トランスポゾン遺伝子を確保するために、ＮＩＨ遺伝子銀行(NIH GenBank)を根拠として、コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ１３０３２由来の全体塩基配列の中、トランスポゾン遺伝子の塩基配列情報(NCBI登録番号NC_003450, NCgl1021)を確保して、これに基づいて２対のプライマー(表１、配列番号３〜６)を合成した。
【００３９】
コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡを鋳型として、前記配列番号３〜６のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行った。重合酵素は、PfuUltra（登録商標）高信頼DNAポリメラーゼ(Stratagene)を使用して、ＰＣＲ条件は、変性９６℃、３０秒間；アニーリング５８℃、３０秒間；及び重合反応７２℃、１分間；を３０回繰り返した。
【００４０】
【表１】
0005412446.tif 000002
【００４１】
その結果、約５００ｂｐのプロモーター部位を含んだトランスポゾン遺伝子２対(Tn-A、Tn-B)を得た。Tn-A(配列番号1)は、配列番号3と4をプライマーとして使用して増幅されたもので、Tn-B(配列番号2)は、配列番号5と6をプライマーとして使用して増幅されたものである。前記増幅産物をBD In-Fusion kit(BD)を利用して、予めSalI制限酵素で処理したｐＤＺベクターにクローニングしてｐＤＺＴｎベクターを得た。二つの増幅された産物間には、プライマー製作時に人為的に挿入した多数の制限酵素認識部位を含んでいる。
【００４２】
図１は、コリネバクテリウム染色体挿入用ベクターｐＤＺＴｎを示す図面である。
【００４３】
上記の所望の遺伝子(Tn-A及びTn-B)を挿入させて製作されたｐＤＺＴｎベクターを用いて既特許菌株であるリジン生産菌株コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７７０Ｐを形質転換した後((Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545による形質転換法利用)、カナマイシン(kanamycin)２５ｍｇ/Ｌを含有した選別培地において染色体上の同遺伝子の相同性により挿入された菌株を選別した。ベクターの成功的な染色体挿入は、Ｘ−ｇａｌ(５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド)を含んだ固体培地で青色を示すかどうかを確認することにより可能であった。１次染色体挿入された菌株を栄養培地で振とう培養(３０℃、８時間)した後、それぞれ１０−４から１０−１０まで希釈し、Ｘ−ｇａｌを含んでいる固体培地に塗抹した。大部分のコロニーが青色を帯びるに対し、低い比率で表れる白色のコロニーを選別することにより、２次クロスオーバー(crossover)により挿入された染色体上のベクター配列が除去された菌株を選別した。
【００４４】
実施例２：リジン生産菌株コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ由来のｌｙｓＣ/ａｓｄ遺伝子クローニング及び組換えベクター(ｐＤＺＴｎ−ｌｙｓＣ/ａｓｄ)製作、ｌｙｓＣ/ａｓｄ挿入菌株の開発
コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ由来のｌｙｓＣ/ａｓｄ遺伝子を確保するために、ＮＩＨ  ＧｅｎＢａｎｋを根拠にしてｌｙｓＣ/ａｓｄ遺伝子の塩基配列情報(NCBI登録番号NC_003450, Ncgl0247〜0248)を確保して、これに基づいて１対のプライマー(表２、配列番号７〜８)を合成した。
【００４５】
コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７７０Ｐの染色体ＤＮＡを鋳型として、前記配列番号７〜８のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行った。重合酵素は、PfuUltra（登録商標）高信頼DNAポリメラーゼ(Stratagene)を使用して、ＰＣＲ条件は、変性９６℃、３０秒間；アニーリング５２℃、３０秒間；及び重合反応７２℃、３分間；を３０回繰り返した。
【００４６】
【表２】
0005412446.tif 000003
【００４７】
その結果、２，８０５ｂｐのプロモーター部位を含んだlysC/asd遺伝子を分離した。増幅された産物を、制限酵素SpeIとXhoIが処理されたpDZTnベクターにBD In-Fusion kitを利用してクローニングし、最終的にpDZTn-lysC/asd組換えベクターを得た。図２は、コリネバクテリウム染色体挿入用ベクターpDZTn-lysC/asdを示す図面である。
【００４８】
製作されたpDZTn-lysC/asdベクターを用いて既特許菌株であるリジン生産菌株コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７７０Ｐを形質転換後、２次クロスオーバー過程を経て、染色体上でトランスポゾン遺伝子の間に１コピーのlysC/asd遺伝子をさらに挿入してコピー数を３個に増加させたリジン生産菌株コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ−ＣＪ１を得た。トランスポゾンとｌｙｓＣ/ａｓｄ遺伝子の連結部位を増幅できるプライマー９及び１０(表３)を利用したＰＣＲで最終確認した。
【００４９】
【表３】
0005412446.tif 000004
【００５０】
実施例３：リジン生産菌株コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ由来のｄａｐＡ/ｄａｐＢクローニング及び染色体挿入用組換えベクター(ｐＤＺＴｎ−ｄａｐＡ/ｄａｐＢ)の製作、ｄａｐＡ/ｄａｐＢ挿入菌株の開発
実施例２と同様な方法により、コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ由来のｄａｐＡ/ｄａｐＢ遺伝子を確保するために、ＮＩＨ  ＧｅｎＢａｎｋを根拠にしてｄａｐＡ/ｄａｐＢ遺伝子の塩基配列情報(NCBI登録番号NC_003450, Ncgl1896〜1898)を確保した。その結果、ｄａｐＡ遺伝子は、ｄａｐＢ遺伝子とオペロンを構成しており、その間に、機能が明かされていないＯＲＦ(Ncg11987)が存在していたため、ｄａｐＢ遺伝子のプロモーター部位を含んだｄａｐＢ−ＯＲＦ(Ncgl1897)-dapA遺伝子全体を増幅するために、２対のプライマー(表４、配列番号１１〜１２)を合成した。
【００５１】
コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７７０Ｐの染色体ＤＮＡを鋳型として、前記配列番号１１〜１２のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行った。重合酵素は、PfuUltra（登録商標）高信頼DNAポリメラーゼ(Stratagene)を使用して、ＰＣＲ条件は、変性９６℃、３０秒間；アニーリング５２℃、３０秒間；及び重合反応７２℃、３分間；を３０回繰り返した。
【００５２】
【表４】
0005412446.tif 000005
【００５３】
その結果、３，２１０ｂｐのプロモーター部位を含んだdapA/dapB遺伝子を分離した。増幅された産物を、制限酵素SpeIとXhoIが処理されたpDZTnベクターにBD In-Fusion kitを利用してクローニングし、最終的にpDZTn-dapA/dapB組換えベクターを得た。図３は、コリネバクテリウム染色体挿入用ベクターpDZTn-dapA/dapBを示す図面である。
【００５４】
製作されたpDZTn-dapA/dapBベクターを用いて、実施例２で製作されたリジン生産菌株コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ−ＣＪ１を形質転換後、２次クロスオーバー過程を経て、染色体上でトランスポゾン遺伝子の間に１コピーのdapA/dapB遺伝子をさらに挿入して、コピー数を３個に増加させたリジン生産株コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ−ＣＪ２を得た。トランスポゾンとdapA/dapB遺伝子の連結部位を増幅できるプライマー９及び１３(表５)を利用したＰＣＲで最終確認した。
【００５５】
前記コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ−ＣＪ２を２００８年３月３１日付にて大韓民国ソウル特別市西大門区ホンゼ１ドン３６１−２２１番地に所在する国際寄託機関である韓国種菌協会付設韓国微生物保存センターに受託番号ＫＣＣＭ１０９３９Ｐとして寄託した。
【００５６】
【表５】
0005412446.tif 000006
【００５７】
実施例４：クロストリジウムアセトブチリクム由来のｓｒＫ遺伝子クローニング及び染色体挿入用組換えベクター(pDZTN-scrK)製作、ｓｒｋ挿入菌株の開発
クロストリジウムアセトブチリクム(Clostridium acetobutylicum)ＡＴＣＣ８２４由来のフルクトキナーゼ遺伝子の塩基配列は、既に明白に明かされて公開されている。米国国立保健院ジェンバンク(NIH GenBank)からクロストリジウムアセトブチリクムＡＴＣＣ８２４のフルクトキナーゼ遺伝子情報(登録番号NP_347064)を確保した。報告された塩基配列に基づいて、一対のプライマー(表６、配列番号１４及び１５)を合成して、クロストリジウムアセトブチリクムＡＴＣＣ  ８２４菌株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法を通じて前記遺伝子を増幅した。 ＰＣＲ条件は、変性９４℃、２０秒間；アニーリング５２℃、２０秒間；及び重合７２℃、１分１０秒間；を３０回繰り返した。
【００５８】
【表６】
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【００５９】
その結果、１，２００ｂｐのプロモーター部位を含んだｓｒｋ遺伝子を分離した。増幅された産物を、制限酵素SpeIとXhoIが処理されたpDZTnベクターにBD In-Fusion kitを利用してクローニングし、最終的にpDZTn-srk組換えベクターを得た。図４は、コリネバクテリウム染色体挿入用ベクターpDZTn-srkを示す図面である。
【００６０】
製作されたpDZTn-srkベクターを用いて既特許菌株であるリジン生産菌株コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７７０Ｐを形質転換後、２次クロスオーバー過程を経て、染色体上でトランスポゾン遺伝子の間に１コピーのｓｒｋ遺伝子を挿入したリジン生産株コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ−ＣＪ３を得た。トランスポゾンとｓｒｋ遺伝子の連結部位を増幅できるプライマー９及び１６(表７)を利用したＰＣＲで最終確認した。
【００６１】
【表７】
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【００６２】
実施例５：Ｌ−リジン生合成遺伝子複合挿入菌株におけるアスパラギン酸キナーゼ活性の測定
Ｌ−リジン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ−ＣＪ２のアスパラギン酸キナーゼ活性をアスパルチルヒドロキサメートを利用した測定法(Pecher J-F, Capony J-P (1968) On the colorimetric determination of acyl phosphates.Anal Biochem 22: 536〜539)で測定した結果、コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ−ＣＪ２菌株が、母菌株であるコリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７７０Ｐより２．１倍高い活性を有することを確認した。
【００６３】
【表８】
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【００６４】
実施例６：ｓｒｋ遺伝子挿入菌株におけるフルクトキナーゼ活性の測定
フルクトキナーゼ発現ベクターから細胞内にフルクトキナーゼが発現されて、活性があるかを、公知文献に記載された方法により測定した(Andreas Pikisなど、Microbiology, 148, 843-852(2002))。コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ−ＣＪ３をＬＢ培地で一日間培養した後、遠心分離して、細胞のみを獲得した。得られた細胞を適切なバッファに懸濁した後、超音波破砕法により細胞を破壊して、再び高速遠心分離して上澄み液を得た。上記の方法により得られた上澄み液をフルクトース、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコース−６−ホスフェートジヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ及びＮＡＤＰ＋が入っている反応液と反応して生成されるＮＡＤＰＨの量を、波長３４０ｎｍで吸光光度計を利用して間接的にフルクトキナーゼの活性を計算した結果を表９に示した。表１１に示したように、コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ−ＣＪ３は、母菌株であるコリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ菌株より約２倍以上の活性を示すことから、フルクトキナーゼ遺伝子が発現されていることを確認した。
【００６５】
【表９】
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【００６６】
実施例７：Ｌ−リジン生合成遺伝子複合挿入菌株におけるＬ−リジンの生産
実施例３で最終的に製作されたＬ−リジン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ−ＣＪ２を、Ｌ−リジン生産のために、下記のような方法で培養した。
【００６７】
下記の種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナー−バッフルフラスコにコリネバクテリウムグルタミクム母菌株ＫＣＣＭ１０７７０ＰとコリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ−ＣＪ２を接種して、３０℃で２０時間２００ｒｐｍで振とう培養した。下記の生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナー−バッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種して、３０℃で１２０時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。
【００６８】
培養終了後、ＨＰＬＣを利用した方法により、Ｌ−リジンの生産量を測定した。コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７７０ＰとコリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ−ＣＪ２に対する培養液中のＬ−リジンに対する結果は、下記表１０の通りである。
【００６９】
【表１０】
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【００７０】
種培地(pH7.0)
原糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ８ｇ、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ  ０．５ｇ、バイオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ  １０００μｇ、カルシウム−パントテン酸２０００μｇ、ニコチンアミド２０００μｇ(蒸留水１ｌ基準)
生産培地(pH7.0)
ブドウ糖１００ｇ、(ＮＨ４)２ＳＯ４  ４０ｇ、大豆蛋白質２．５ｇ、玉蜀黍浸漬固形分(Corn Steep Solids)５ｇ、尿素３ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  １ｇ、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ  ０．５ｇ、バイオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、カルシウム−パントテン酸２０００μｇ、ニコチンアミド３０００μｇ、ＣａＣＯ３  ３０ｇ(蒸留水１ｌ基準)
上記の表１０で示したように、二つのリジン生合成遺伝子が挿入されたコリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ−ＣＪ２は、コリネバクテリウムグルタミクム母菌株ＫＣＣＭ１０７７０Ｐに比べ、リジン生産が１０％増加されたことを確認することができた。
【受託番号】
【００７１】
ＫＣＣＭ１０９３９Ｐ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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