(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚類病原体からの抗原をコードする異種コード配列にインフレームで融合したアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０をコードする核酸を含んでなるキメラ核酸であって、該アルスロバクターｈｓｐ６０をコードする核酸が配列番号１の核酸配列、配列番号１の核酸９５３〜２５７８のＯＲＦ、および配列番号２のアミノ酸配列をコードする配列からなる群から選択される、キメラ核酸。
【請求項２】
アルスロバクターｈｓｐ６０をコードする核酸が、受託番号ＡＴＣＣ  ５５９２１として寄託されているアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）株からのものである、請求項１に記載のキメラ核酸。
【請求項３】
転写調節配列に機能しうる形で連結された請求項１または２に記載のキメラ核酸を含んでなるＤＮＡ発現ベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のＤＮＡ発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項５】
融合タンパク質を形成するよう異種分子に共有結合または非共有結合により連結された単離されたアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０ポリペプチドであって、該ポリペプチドが配列番号２のアミノ酸配列からなり、および該異種分子が、魚類に影響する病原体である細菌、ウイルス、真菌、原生動物および線虫から選ばれる、ポリペプチド。
【請求項６】
単離されたアルスロバクターｈｓｐ６０ポリペプチドが、受託番号ＡＴＣＣ  ５５９２１として寄託されているアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）株からのものである、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
単離されたアルスロバクターｈｓｐ６０ポリペプチドが、ノナペプチド配列ＫＬＡＧＧＶＡＶＩを含む配列番号２の免疫原性断片を含む、請求項５または６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求項１または２に記載のキメラ核酸分子によりコードされる単離されたポリペプチド。
【請求項９】
請求項５から８のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項１０】
請求項１または２に記載のキメラ核酸、または請求項３に記載のＤＮＡ発現ベクター、または請求項５から８のいずれか１項に記載のポリペプチドと、製薬上許容される担体とを含んでなる該魚類病原体に対する魚類用ワクチン。
【請求項１１】
魚類病原体からの少なくとも１つの異種抗原、または異種抗原をコードする核酸を更に含む、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
請求項１０または請求項１１に記載のワクチンと、別々の投与または順次投与または同時投与のための魚類病原体からの異種抗原または異種抗原コード化核酸とを含んでなるキット。
【請求項１３】
請求項１または２に記載のキメラ核酸、または請求項３に記載のＤＮＡ発現ベクター、または請求項５から８のいずれか１項に記載のポリペプチドの、魚類病原体に対して硬骨魚類を免疫するための医薬の製造における使用。
【請求項１４】
該医薬が、細菌性腎疾患（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ）（ＢＫＤ）、サケ科リケッチア性敗血症（Ｓａｌｍｏｎｉｄ  Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌ  Ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）（ＳＲＳ）、伝染性サケ貧血ウイルス（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｓａｌｍｏｎ  Ａｎａｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）（ＩＳＡＶ）および伝染性膵臓壊死症ウイルス（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）（ＩＰＮＶ）のいずれかの予防のための魚類用ワクチンである、請求項１３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）からの熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）遺伝子およびコード化タンパク質に関する。特に、本発明は、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属のｈｓｐ６０の単離されたＤＮＡ配列およびアミノ酸配列ならびに関連配列に関する。さらに、本発明は、ワクチン（特に、魚類用ワクチン）の製造における、およびアジュバントとしての、および抗原用担体としてのアルスロバクターｈｓｐ６０の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内病原体に対する有効なワクチンは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ経路により体液性免疫応答を刺激するだけではなく、（より重要なことに）ＭＨＣクラスＩ経路の活性化により感染細胞の破壊をも誘導する。後者の応答は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）に対する提示のために外来物質の断片が細胞表面まで往復するよう、感染細胞内の外来タンパク質のサイトゾル分解により達成される。精製組換え抗原に基づくワクチンの一般的な欠点は、ＭＨＣクラスＩ経路を活性化できないことである。
【０００３】
熱ショックタンパク質（「Ｈｓｐ」）は、原核細胞および真核細胞により産生される分子シャペロンタンパク質のファミリーであり、これは、多数の細胞内および細胞間過程、特に、抗原プロセシングおよびＭＨＣ  Ｉ系に対する抗原断片の提示において極めて重要な役割を果たしている。
【０００４】
細菌性腎疾患（ＢＫＤ）に対してサケおよび他の養殖魚類を防御することを意図したワクチンとして、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）の生非ビルレント株（コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）のファミリーメンバー）が「レノゲン（Ｒｅｎｏｇｅｎ）」なる名称で販売されている。この株の特徴はＷＯ  ９８／３３８８４に開示されている。このワクチンは、水産養殖における使用が許可された最初の生培養体である点で特有である。
【０００５】
驚くべきことに、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０が種々の病原体に対する魚類用ワクチンにおいて有効に使用されうることが本発明において示された。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
第１の態様において、本発明は、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０遺伝子の配列、その断片または相同配列を含んでなる単離された核酸配列を提供する。該遺伝子は、ＯＲＦ、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲならびに任意の成分プロモーター、エンハンサー、調節、終結および局在化要素を含む。
【０００７】
第２の態様において、本発明は、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０タンパク質の配列、その免疫原性断片または相同配列もしくは誘導体を含んでなる単離されたアミノ酸配列を提供する。
【０００８】
もう１つの態様において、本発明は、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０タンパク質をコードする核酸配列を含んでなる、またはアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０ポリペプチド分子を、もしくはｈｓｐ６０に富むアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）細胞抽出物を含んでなるワクチン組成物を提供する。該ワクチン組成物は、ヒト用または獣医用（水産養殖における使用を含む）の医薬の製造において使用することが可能である。
【０００９】
もう１つの実施形態において、本発明は、本発明のワクチン組成物と、別々の投与または連続的投与または同時投与のための異種抗原または異種抗原コード化核酸配列とを含んでなるキットを提供する。
【００１０】
本発明のもう１つの態様においては、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）のｈｓｐ６０タンパク質の全部または一部と異種ポリペプチドとの融合タンパク質をコードする核酸配列を提供する。該融合タンパク質自体も提供する。
【００１１】
本発明は、キメラ配列を含むアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０配列を運搬するＤＮＡ発現ベクター、およびそのようなＤＮＡ発現ベクターで形質転換された宿主細胞も提供する。
【００１２】
本発明の更にもう１つの態様においては、異種分子に共有結合または非共有結合したアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）のｈｓｐ６０タンパク質の全部または一部を含むポリペプチドを含んでなる実体（ｅｎｔｉｔｙ）を提供する。
【００１３】
本発明のもう１つの態様においては、動物疾患を治療または予防するための、ワクチン抗原としての又はアジュバントとしての又は異種分子用の担体としてのアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０タンパク質または核酸配列の使用を提供する。アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０に対して産生させた抗体およびその医学的用途も提供する。
【００１４】
もう１つの態様においては、免疫原またはハプテンを含む異種分子に共有結合または非共有結合した本発明のｈｓｐ６０アミノ酸配列を含む医薬組成物を動物に投与することを含んでなる、該動物における該免疫原またはハプテンに対する免疫応答を誘導または増強するための方法を提供する。
【００１５】
もう１つの態様においては、本発明は、本発明のｈｓｐ６０核酸配列またはアミノ酸配列を含む処理用組成物を魚類に投与することを含んでなる、魚類における感染症の治療または予防方法を提供する。
【００１６】
本発明のもう１つの態様においては、インビトロまたはインビボにおける異種遺伝子の発現を駆動するためのアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０プロモーターの使用を提供する。
【００１７】
配列表の説明
配列番号１は、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＡＴＣＣ５５９２１から単離されたｈｓｐ６０遺伝子のコードＤＮＡ配列（５’から３’）（ｎｔ．９５３−２５７８）、および５’ＵＴＲ配列部分（ｎｔ．１−９５２）である。
【００１８】
配列番号２は、配列番号１のｈｓｐ６０遺伝子配列のＯＲＦから推定したアミノ酸配列である。
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明のｈｓｐ６０遺伝子の新規配列および単離または精製されたコード化タンパク質をそれぞれ配列番号１および配列番号２として提供する。驚くべきことに、本発明者らは、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０が、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）の特異的ノナペプチド（Ｍｈｓｐ６５（３６９−３７７））と、ＣＴＬ刺激性エピトープを共有することを見出した。このエピトープの配列はＫＬＡＧＧＶＡＶＩである。これは、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０がＭＨＣ  Ｉクラス経路を活性化することが可能であり、したがって、非常に有望な免疫刺激剤であることを強く示唆している。
【００２０】
本発明は、配列番号１および配列番号２に実質的に相同な核酸配列およびアミノ酸配列を含む。「実質的に相同」は、配列が、基準配列と比較された場合に、該基準配列に対して少なくとも６０％の相同性、好ましくは少なくとも７０％の相同性、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上の相同性を有することを意味する。
【００２１】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の相同性（％）を決定するためには、それらの配列を、最適な比較目的で整列（アライン）させる（例えば、第２のアミノ酸または核酸配列との最適なアライメントのために第１のアミノ酸または核酸配列の配列内にギャップを導入することが可能であり、ギャップ内の介在非相同配列は比較目的においては無視されうる）。それらの２つの配列が同じ長さである必要はない。一般に、それらの配列が比較される配列の長さはアライメントの全範囲である。場合によっては、比較目的で整列させる基準配列の長さは、基準配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも６０％、より一層好ましくは少なくとも７０％、８０％または９０％である。基準配列の任意の特定の部分に相同性解析を限定することが可能である。
【００２２】
第１（基準）配列内の或る位置が、該配列内の対応位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占拠されている場合には、該分子はその位置において相同である（すなわち、その位置に同一性が存在する）。核酸配列比較の場合には、比較されている両方の分子において、遺伝暗号の縮重により、該ヌクレオチドを含むコドントリプレットが同一アミノ酸をコードしている場合にも、その位置に相同性が存在する。
【００２３】
２つの配列間の相同性は、それらの配列により共有される相同位置の数の関数である（すなわち、相同性＝相同位置の数／位置の総数）。場合によっては、配列の比較および相同性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することが可能である。適当なアルゴリズムはＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４３０−１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。
【００２４】
ストリンジェントな条件下で基準配列番号１にハイブリダイズする相同核酸配列も、本発明の核酸配列内に含まれる。本発明の場合の「ストリンジェント」なハイブリダイゼーション条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９），１．１０１−１．１０４に記載されているものとして定義される。すなわち、陽性ハイブリダイゼーションシグナルは、１×ＳＳＣバッファーおよび０．１％  ＳＤＳで５５℃（好ましくは６２℃、最も好ましくは６８℃）で１時間洗浄した後、特に、０．２×ＳＳＣバッファーおよび０．１％  ＳＤＳで５５℃（好ましくは６２℃、最も好ましくは６８℃）で１時間洗浄した後に、尚も観察される。
【００２５】
本発明の配列は基準核酸配列またはアミノ酸配列の断片を含む。ｈｓｐ６０核酸基準配列の「断片」は、少なくとも５０、場合によっては少なくとも７５または少なくとも１００個の連続的ヌクレオチドを含むその配列の任意の部分である。核酸断片のクラスの１つは、６００、好ましくは多くても３００ヌクレオチド、より好ましくは多くても１５０ヌクレオチドの最大長を有する。１つの実施形態においては、本発明の核酸配列断片は配列番号１のＯＲＦを含む。もう１つの実施形態においては、本発明の核酸配列断片はｈｓｐ６０の免疫原性タンパク質断片をコードする。
【００２６】
ｈｓｐ６０タンパク質の「断片」は、基準ｈｓｐ６０アミノ酸配列の少なくとも５、１０、１５または場合によっては少なくとも２５、３５もしくは４５個の連続的アミノ酸を有する任意のペプチド分子を意味する。アミノ酸断片のクラスの１つは、２００アミノ酸、好ましくは多くても１００アミノ酸、より好ましくは多くても５０アミノ酸の最大長を有する。「免疫原性」タンパク質断片は、免疫された宿主の防御をもたらすよう病原体の感染力を中和する抗体を惹起しうる及び／または抗体−補体もしくは抗体依存性細胞傷害性を媒介しうるものである。好ましいｈｓｐ６０免疫原性断片は、アミノ酸配列ＫＬＡＧＧＶＡＶＩのノナペプチドエピトープを含むものである。
【００２７】
本発明のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列の誘導体、またはその配列のホモログの誘導体をも含む。アミノ酸配列の「誘導体」は、アミノ酸配列レベル（例えば、ある天然に存在するアミノ酸が合成アミノ酸置換体により置換された相同配列）または３Ｄレベル（すなわち、基準アミノ酸配列とほぼ同じ形状およびコンホメーションを有する分子）で基準配列に関連した配列である。したがって、誘導体には、突然変異体、模擬体、ミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）、類似体、単量体形態および機能的等価体が含まれる。アミノ酸配列誘導体は、アール・サルモニナルム（Ｒ．ｓａｌｍｏｎｉｎａｒｕｍ）のような魚類病原体の抗原を認識しこれと（交差）反応する抗体の産生を誘導する能力、および／またはこれらの病原体の感染を防御する、魚類において免疫応答を誘導する能力を保有する。
【００２８】
誘導体には、特に、分子の免疫学的特性を改変しない保存的アミノ酸置換、欠失、挿入、逆位または付加を含む類似分子が含まれる。保存的アミノ酸置換には、Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、ｌｌｅ／Ｖａｌが含まれる。
【００２９】
本発明のｈｓｐ６０核酸配列はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むことが可能であり、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）またはその任意の部分をも含みうる。本発明は、配列番号１の任意の成分プロモーター、エンハンサー、調節、終結および局在化要素、ならびにこれらの要素と異種遺伝子との併用を含む。特に、本発明は、異種遺伝子に連結された、その遺伝子の発現を駆動するための、（配列番号１からの）アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０または実質的に相同な配列のプロモーター配列を含むＤＮＡ発現ベクターに拡張される。
【００３０】
本明細書に記載のアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０配列（配列番号１）は、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）に存在することがゲノムクローニングにより確認された遺伝子の配列であり、配列番号２は、それから推定したアミノ酸配列である。起源アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）株の培養物は１９９６年１２月２０日付けでＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９）に受託番号ＡＴＣＣ  ５５９２１として寄託されている。
【００３１】
同じ属の種のｈｓｐタンパク質は、一般には、非常に高度に保存されており、したがって、他のコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、特に、他のアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）種に固有のｈｓｐ６０の遺伝子およびタンパク質の配列は、それぞれ配列番号１および配列番号２から大きくは異ならないと予想される。したがって、本発明はこれらの関連ｈｓｐ６０分子にも拡張される。１つのコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）種からのｈｓｐ６０遺伝子の配列の知見は、関連生物からの同じ遺伝子の単離を促進する。これらの遺伝子の単離のための方法は当技術分野でよく知られている。
【００３２】
「単離（された）」ｈｓｐ６０遺伝子または核酸配列は、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ゲノム内の天然環境における以外の該遺伝子または配列を意味すると理解される。ｈｓｐ６０をコードするＤＮＡは、ｈｓｐ６０を発現する細胞から調製したｃＤＮＡライブラリーから得ることができる（ｈｓｐは遍在性であり、豊富に発現される）。また、ｈｓｐ６０をコードする遺伝子は、ゲノムライブラリーから、例えば実施例１に記載の工程に従うことにより、またはオリゴヌクレオチド合成により得ることができる。
【００３３】
天然ｈｓｐ６０タンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を用いる適当な精製方法により、細菌細胞源から単離することが可能である。該タンパク質の同一性は、例えば、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＡＴＣＣ  ５５９２１  ｈｓｐ６０抗原に対する抗体を使用するウエスタンブロット法または免疫沈降により確認することができる。Ｎ末端アミノ酸配列を使用して、部分的または完全なアミノ酸配列を決定することができる。これは、プローブの設計がｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーからの天然ｈｓｐ６０配列の単離を促進することを可能にする。
【００３４】
ライブラリーは、関心のある遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質を同定するよう設計されたプローブ（例えば、ｈｓｐ６０に対する抗体、または少なくとも約２０〜８０塩基のオリゴヌクレオチド）でスクリーニングすることが可能である。例えば、本明細書に開示されているアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）遺伝子配列の一部に相同となるよう、プローブを設計することが可能である。あるいは、プローブはビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）ｈｓｐ６０遺伝子配列のような他の細菌ｈｓｐ遺伝子に対して高度の相同性を有しうる。選択されたプローブでのｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーのスクリーニングは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されているような標準的な方法を用いて行うことができる。ｈｓｐ６０をコードする遺伝子を単離するためのもう１つの手段はＰＣＲ法の利用である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈら，ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５））。
【００３５】
そのようなライブラリースクリーニング法において同定した配列を、配列番号１に開示されているｈｓｐ６０、またはＧｅｎＢａｎｋのような公的なデータベースに寄託されており入手可能な他の公知ｈｓｐ配列と比較し、整列させることが可能である。相同性を測定するために種々のアルゴリズムを使用するＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＤＮＡｓｔａｒおよびＩＮＨＥＲＩＴのようなコンピュータープログラムを使用する配列アライメントにより、分子の一定領域内の又は完全長配列にわたる配列同一性（アミノ酸または核酸レベル）を決定することが可能である。
【００３６】
アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０は、純粋な又は単離された形態でアジュバントとして、抗原と共に使用することが可能である。本明細書中で定義する「アジュバント」は、投与前に抗原と混合された場合または同一部位へ別々に投与された場合に、抗原に対する特異的免疫応答を非特異的に増大させる物質である。本発明の１つの態様においては、単離または精製されたアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０タンパク質は、動物ワクチン用、特に魚類用ワクチンのアジュバントとして使用する。好ましい用途においては、核酸ワクチンをアジュバント化するために、ｈｓｐ６０遺伝子またはその一部をＤＮＡベクター上に配置する。本発明の範囲においては、本発明のアミノ酸または核酸配列を、少なくとも１つの他の抗原または抗原コード化核酸配列、および１以上の製薬上許容される賦形剤と共に含んでなるワクチン組成物を提供する。前記の、他の抗原は、組換え又は単離された単一の抗原であることが可能であり、あるいはそれは病原体由来の抗原分子の混合物でありうる。
【００３７】
アジュバントとしてのアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０の使用は、ビルレント細菌株への復帰の危険性により動物の健康にリスクを与える伝統的な弱毒化生マイコバクテリウムアジュバントの使用を医師および獣医が避けることを可能にする。魚類へのアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０核酸または単離タンパク質の注入は、通常のアジュバントには一般的であり魚類の商業的価値を低下させる注入部位における醜い腫脹または結節を引き起こさないという、水産養殖にとっての更なる利点がある。
【００３８】
アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０タンパク質は、他の抗原を含むワクチンをアジュバント化するのに有効であるばかりでなく、それはそれ自体で免疫原性活性をも有する。アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０は、魚類病原体により引き起こされる種々のヒト疾患および獣医学的疾患（特に、ＳＲＳおよびＢＫＤが挙げられるが、これらに限定されるものではない）を予防または治療するためのワクチンの有効成分となりうる。本発明のもう１つの態様においては、ワクチン組成物は、唯一の抗原性または免疫原性成分としての単離または精製されたｈｓｐ６０タンパク質と、１以上の製薬上許容される賦形剤とを含む。ワクチン組成物の唯一の抗原性または免疫原性成分である抗原をコードする本発明のｈｓｐ６０核酸配列を含む発現ベクターと、１以上の製薬上許容される賦形剤とを含んでなる核酸ワクチン組成物をも提供する。
【００３９】
アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０の高免疫原性は、ｈｓｐ６０タンパク質と異種（非ｈｓｐ６０）分子（通常は非ｈｓｐタンパク質、例えばハプテンであるが、これに限定されるものではない）との遺伝子またはペプチド共有結合体（例えば、キメラまたは融合体）の製造の可能性を示唆している。このように、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０タンパク質は、付随異種分子に対する体液性および細胞性免疫応答を刺激するためのアジュバント非含有担体として作用する。本明細書中で用いる「担体」なる語は、（タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたはオリゴ糖でありうる）第２分子に共有結合している場合に第２分子に対する免疫応答の惹起および増強を助けるＴ細胞エピトープ含有分子を意味する。
【００４０】
ワクチン開発のためのこのアプローチは、関心のある抗原性ペプチドがそれほど大きくなく低免疫原性であるが適切なワクチン標的となる場合に、特に有利である。アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０により担持される異種分子は、好ましくは、タンパク質ハプテンまたは非タンパク質分子、例えば炭水化物部分である。
【００４１】
本明細書中で用いるｈｓｐ６０「融合タンパク質」は、異なるポリペプチド（「異種ポリペプチド」）に機能しうる形で連結されたｈｓｐ６０ポリペプチドを含む。「異種ポリペプチド」または「非ｈｓｐ６０ポリペプチド」は、ｈｓｐ６０タンパク質と実質的に相同でないタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。ｈｓｐ６０融合タンパク質において、ｈｓｐ６０ポリペプチドはｈｓｐ６０タンパク質の全部または一部に相当しうる。該融合タンパク質において、「機能しうる形で連結された」なる語は、ｈｓｐ６０ポリペプチドと非ｈｓｐ６０ポリペプチドとが互いにインフレームで融合していることを示す。非ｈｓｐ６０ポリペプチドはｈｓｐ６０ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合されていることが可能であり、あるいはｈｓｐ６０ポリペプチド内に埋め込まれていることが可能である。
【００４２】
融合タンパク質を作製することによってではなく、共有結合または非共有結合により、ｈｓｐ６０ポリペプチドと異種分子とを連結することが可能である。「異種分子」は、ｈｓｐ６０以外の任意のタンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたはオリゴ糖分子である。例えば、ポリペプチド間に化学的スペーサー基を挿入して、例えば、一般式ｈｓｐ６０−Ｘ−異種ポリペプチド（式中、Ｘはスペーサー基、例えば、１以上のアミノ酸の短い配列である）の分子を作製することが可能である。あるいは、アミノ酸の直鎖において、アミド結合以外の様態、例えば化学的結合により、または非ｈｓｐ分子に対する化学、光（例えば、ＵＶ）もしくは放射能誘発性架橋により、ｈｓｐ６０ポリペプチドを共有結合させることが可能である。グルタルアルデヒドおよびメルカプト結合リンカーは、適当な化学的架橋リンカーの例である。考えられうる具体例としては、ＥＤＣ＋ＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳ、スルホ−ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＢＥＤおよびＳＡＥＤが挙げられ、これらはキット形態で商業的に入手可能である。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態においては、ｈｓｐ６０ポリペプチドをハプテンに結合させる。抗体に結合しうるが、大きな担体分子に共有結合している場合にのみ免疫応答を誘導する低分子量の物質（例えば、ペプチドまたはオリゴ糖）が、ハプテンである。
【００４４】
細胞ライセート、画分、抽出物、ウイルス粒子などのインビトロ複合体化により、ｈｓｐ６０を抗原性細胞または粒子からのタンパク質の全集団と結合させることが可能である。
【００４５】
異種分子またはポリペプチドは任意の起源に由来しうるが、十中八九は病原性生物の成分である。特に、それらは動物（特に水生動物）のウイルス、細菌、原虫、ぜん虫または真菌病原体からのポリペプチドでありうる。
【００４６】
アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）からの単離ｈｓｐ６０遺伝子は、大量の精製または単離組換えｈｓｐ６０タンパク質（またはｈｓｐ６０融合タンパク質）を得るために該遺伝子を発現ベクター内にクローニングすることにより、通常の方法で利用することが可能である。精製ｈｓｐ６０抗原は非組換え技術によっても得ることができる。該タンパク質は細胞内に豊富に存在し、通常の精製方法により細胞から抽出することが可能である。あるいは、標準的なペプチド合成技術を用いて、ｈｓｐ６０タンパク質またはポリペプチドを化学合成することが可能である。この精製または単離された組換えまたは非組換えタンパク質を含むワクチンは、抗原に基づくワクチンと称されうる。
【００４７】
「単離（された）」または「精製（された）」タンパク質は、ｈｓｐ６０タンパク質が由来する細胞または組織源からの細胞物質または他の混入タンパク質を実質的に含有せず、あるいは化学合成された場合には、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含有しないことと定義される。「細胞物質を実質的に含有しない」なる表現は、ｈｓｐ６０タンパク質の調製物であって、該タンパク質が、それが単離または組換え的に製造された細胞の細胞成分から分離されている調製物を包含する。１つの実施形態においては、「細胞物質を実質的に含有しない」は、約３０％（乾燥重量比）未満の非ｈｓｐ６０タンパク質（本明細書中では「混入タンパク質」とも称される）、より好ましくは約２０％未満の混入タンパク質、より一層好ましくは約１０％未満の混入タンパク質、最も好ましくは約５％未満の混入タンパク質を含有するｈｓｐ６０タンパク質の調製物を包含する。ｈｓｐ６０タンパク質またはその生物学的に活性な部分を組換え的に製造した場合には、それはまた、好ましくは、培地を実質的に含有しない。すなわち、培地は、タンパク質調製物の体積の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満に相当する。
【００４８】
単離または精製ｈｓｐ６０の代わりに、ｈｓｐ６０「富化（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）」アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）細胞抽出物を、本発明の実施において使用することも可能である。「富化」細胞抽出物は、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）細胞を全不活性化または殺し、該細胞を細胞溶解し、得られた細胞ライセートを通常手段により分画し、ｈｓｐ６０タンパク質が他の画分に比べて豊富な画分を（例えば、ウエスタンブロット法により）同定することにより得ることが可能である。ｈｓｐ６０富化細胞抽出物は、熱ショックタンパク質の発現の上昇をもたらす条件下（すなわち、加熱または他の細胞ストレス条件下）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）細胞を培養し、該細胞を不活性化または殺し、該細胞を細胞溶解することによっても製造することが可能である。場合によっては、得られた細胞抽出物（ライセート）を分画し、ｈｓｐ６０に富む画分を同定する。
【００４９】
好ましくは、本発明のｈｓｐ６０キメラまたは融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術により製造する。例えば、種々のポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片を、通常の技術により、例えば、平滑末端化または付着末端化末端を連結に使用し、制限酵素消化を行って適当な末端を得、適宜、付着末端を埋め、アルカリホスファターゼ処理を行って、望ましくない連結を回避し、酵素による連結を行うことにより、互いにインフレームで連結する。もう１つの実施形態においては、自動ＤＮＡ合成装置を含む通常の技術により、融合遺伝子を合成することが可能である。あるいは、２つの連続的遺伝子断片の間に相補的突出部を与えるアンカープライマーを使用して、遺伝子断片のＰＣＲ増幅を行い、ついでそれらをアニールさせ、再増幅してキメラ遺伝子配列を得ることが可能である（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編集，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９９２を参照されたい）。
【００５０】
本発明のもう１つの態様は、ｈｓｐ６０（またはその一部）をコードする核酸配列を含んでなるベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書中で用いる「ベクター」なる語は、もう１つの核酸を運搬しうる、それに連結された核酸分子を意味する。１つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは、追加的なＤＮＡセグメントが挿入連結されうる環状二本鎖ＤＮＡループを意味する。もう１つのタイプのベクターはウイルスベクターであり、この場合は、追加的なＤＮＡセグメントがウイルスゲノム内に挿入連結されうる。あるベクターは、それに機能しうる形で連結された遺伝子の発現を導きうる。そのようなベクターは本明細書中では「発現ベクター」と称される。一般には、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターはプラスミドの形態である。しかし、本発明は、同等の機能を果たす他の形態の発現ベクター、例えばウイルスベクター（例えば、複製欠損型レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を包含すると意図される。
【００５１】
本発明の発現ベクターは、宿主細胞内での核酸の発現に適した形態で本発明の核酸を含む。これは、発現に使用する宿主細胞に基づき選択された、発現させる核酸配列に機能しうる形で連結された１以上の調節配列を組換え発現ベクターが含むことを意味する。本発明の発現ベクターは、（ＤＮＡワクチンとしての）ｈｓｐ６０抗原の、意図される被投与体における発現のために、または（組換え抗原ベクターの製造のために）最終的な被投与体以外の宿主生物における発現のために使用することが可能である。
【００５２】
発現ベクターにおける、「機能しうる形で連結された」は、関心のあるヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロ転写／翻訳系において、またはベクターを宿主細胞内に導入する場合には該宿主細胞において）ヌクレオチド配列の発現を可能にするよう調節配列に連結されていることを意味すると意図される。「調節配列」なる語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むと意図される。そのような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節配列には、多数の宿主細胞型においてヌクレオチド配列の構成的発現を導くもの、および或る宿主細胞においてのみ、ヌクレオチド配列の発現を導くもの（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換する宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベルなどのような要因に左右されうる、と当業者に理解されるであろう。本発明の発現ベクターを宿主細胞内に導入して、本明細書に記載の核酸によりコードされる、融合タンパク質またはペプチドを含むタンパク質またはペプチド（例えば、ｈｓｐ６０タンパク質、ｈｓｐ６０の突然変異体、ｈｓｐ６０と異種ペプチドとの融合タンパク質など）を産生させることが可能である。
【００５３】
本発明のもう１つの態様は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。宿主細胞は任意の原核細胞または真核細胞（多細胞真核生物内の真核細胞を含む）でありうる。例えば、細菌細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞または哺乳類細胞内でｈｓｐタンパク質を発現させることが可能である。他の適当な宿主細胞は当業者に公知である（例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，前掲）。組換え発現ベクターは、（ＤＮＡワクチン接種後）宿主魚類細胞内で発現されるよう設計することが可能である。あるいは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して、組換え発現ベクターをインビトロで転写し翻訳することが可能である。
【００５４】
原核生物におけるタンパク質の発現は、融合または非融合タンパク質の発現を導く構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターで、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で行われることが最も多い。融合ベクターは、それにおいてコードされるタンパク質（通常は、組換えタンパク質のアミノ末端）に多数のアミノ酸を付加する。融合タンパク質の精製の後に融合部分からの組換えタンパク質の分離が可能となるよう、融合発現ベクター内の融合部分と組換えタンパク質との結合部にタンパク質分解切断部位を導入することが多い。そのような酵素およびその対応認識配列には、Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが含まれる。典型的な融合発現ベクターには、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；  Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．およびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が含まれ、これらは、それぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質またはプロテインＡを標的組換えタンパク質に融合させる。
【００５５】
ｈｓｐ６０遺伝子を核酸ワクチン（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｖａｃｃｉｎｅ）（ＮＡＶ）内に組み込むことが可能であり、これにより、ＮＡＶが、生きた動物の宿主細胞により取り込まれ、サイトゾル内でｈｓｐ６０遺伝子の発現が生じる。細胞内ｈｓｐ６０抗原の短いペプチドは細胞表面に輸送され、その部位で、該ペプチドはＭＨＣ  Ｉ系と接触しうるため、ＮＡＶ由来のｈｓｐ６０抗原は、細胞性免疫応答を誘導するために理想的に配置される。
【００５６】
ＤＮＡベクター内に挿入されたｈｓｐ６０遺伝子を魚類内に直接接種して（例えば、経口、筋肉内または腹腔内）、魚類細胞内でインビボで発現させることが可能である。ＤＮＡワクチン接種は、他の動物種においても行うことが可能である。したがって、本発明の１つの態様においては、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０をコードする核酸配列が転写調節配列に機能しうる形で連結されたＤＮＡプラスミドと製薬上許容される担体とを含んでなる核酸ワクチンを提供する。転写調節配列には、プロモーター、ポリアデニル化配列、および他のヌクレオチド配列、例えば、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを有する免疫刺激オリゴヌクレオチド、または他の抗原性タンパク質もしくはアジュバント性サイトカインをコードするヌクレオチド配列が含まれる。真核生物またはウイルス転写調節配列の存在は魚類細胞内でのｈｓｐ６０遺伝子の発現を可能にする。ワクチン組成物を製造するために、ＤＮＡプラスミド自体を細菌細胞内で複製することが可能であるが、一般には、該ＤＮＡプラスミドは、原核細胞内でのｈｓｐ６０遺伝子の発現を可能にする転写調節配列を欠く。最適なインビボ発現のためには、ワクチン接種される魚類にとって内因性である転写調節配列を選択することが好ましいであろう。例えば、内因性サイトカインまたはアクチン遺伝子プロモーターが考慮されうる。該ＤＮＡは裸形態で存在しうる。あるいは、それは、細胞取り込みを促進する物質（例えば、リポソームまたは陽イオン脂質）と共に投与されうる。魚類のＤＮＡワクチン接種の技術は米国特許第５，７８０，４４８号（これを参照により本明細書に組み入れることとする）に更に詳しく説明されている。
【００５７】
本発明はまた、分子に結合したｈｓｐ６０タンパク質の結合体（コンジュゲート）を使用する、該分子に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体の製造方法に関する。この実施形態においては、動物宿主内で該物質に対する抗体の産生をもたらす該結合体の有効量（すなわち、宿主内で免疫応答をもたらす量）を該動物宿主内に導入する。抗体を宿主から取り出し、公知技術（例えば、クロマトグラフィー）により精製して、ポリクローナル抗体を得る。あるいは、公知技術を用いて、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製するために、本発明の方法を用いて産生させた抗体を使用することが可能である。
【００５８】
本発明の１つの実施形態においては、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０遺伝子のプロモーター配列を使用して、異種遺伝子（すなわち、アルスロバクターｈｓｐ６０をコードする遺伝子以外の遺伝子）の発現を駆動させる。生物の染色体ＤＮＡ内の異種遺伝子の上流に、または染色体外プラスミドもしくは発現ベクター内に、該プロモーターを挿入する。例えば、内因性アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０を過剰発現させたい場合またはアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）の内因性プラスミド内に外来遺伝子を挿入したい場合には、上流ｈｓｐ６０プロモーターが、熱ショックのような刺激に応答してその異種遺伝子の発現を駆動しうる。
【００５９】
本発明の方法に従い製造したワクチンは、哺乳類に類似した体液性および／または細胞性免疫系を有する任意の動物種への投与に適している。ヒトは、この場合の「動物」および「哺乳類」の意義に含まれる。アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０は、哺乳類、鳥類、爬虫類または魚類用の任意のワクチンをアジュバント化するために使用することが可能である。同様に、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０は、場合によっては任意の通常のアジュバント（いわゆる、「非アジュバント」ワクチン）を除外して、共有結合抗原の担体としてワクチンにおいて使用することが可能である。アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０は、特定の疾患、特に、サケ科リケッチア性敗血症（Ｓａｌｍｏｎｉｄ  Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌ  Ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）（ＳＲＳ）、細菌性腎疾患（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ）（ＢＫＤ）および魚類における他の感染症に対する免疫応答を惹起させるための、ワクチン中の免疫原（場合によっては、唯一の免疫原）としても使用されうる。
【００６０】
「ワクチン」なる語は広義に用いられており、病原体に対する免疫化に使用される組成物だけでなく、抗腫瘍ワクチン、自己抗原に基づくワクチン（例えば、化学的去勢（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ）のため）などをも含む。獣医学用ワクチン接種において、免疫化の考慮対象となる陸上動物の主な種には、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタおよび家禽が含まれる。水産養殖の場合には、甲殻類動物または有鰭魚類（ｆｉｎｆｉｓｈ）において、特に、硬骨魚類、例えばサケ、マス、コイ、タイ、ハタ科魚、ブリ、ナマズ目魚、オヒョウ、コダラの治療のために、または場合によっては、甲殻類（例えば、シュリンプ、プローン、ロブスター、カーブ（ｃａｒｂ））および軟体動物（例えば、カキ、イガイ）のような他の水生種の治療のために、本発明のワクチンを使用することが可能である。ワクチンにおけるアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０配列との組合せに適した候補抗原は何ら限定されない。病原性抗原は細菌、ウイルス、原生動物、線虫および真菌に由来しうる。１つの特に注目されるものは、魚類病原性生物の抗原、特に表面抗原である。
【００６１】
ｈｓｐ６０のアミノ酸または核酸配列は、甲殻類動物または有鰭魚類を侵す疾患からの細菌、原生動物、ウイルスまたは真菌抗原と組合わせて又はそのような抗原に結合させて、ワクチン組成物中で使用することが可能である。そのような抗原には、以下のものに由来する抗原（またはそれらのコード配列）が含まれる：伝染性サケ貧血ウイルス（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｓａｌｍｏｎ  Ａｎａｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）（ＩＳＡＶ）、伝染性膵臓壊死症ウイルス（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）（ＩＰＮＶ）、伝染性造血組織壊死症ウイルス（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）（ＩＨＮＶ）、イリドウイルス（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓ）、神経壊死ウイルス（ＮＮＶ）、サケ膵臓疾患ウイルス（Ｓａｌｍｏｎ  Ｐａｎｃｒｅａｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｖｉｒｕｓ）（ＳＰＤＶ）、コイ春ウイルス血症ウイルス（Ｓｐｒｉｎｇ  Ｖｉｒｅｍｉａ  ｏｆ  Ｃａｒｐ  Ｖｉｒｕｓ）（ＳＶＣＶ）、ウイルス性出血性敗血症ウイルス（Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  Ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）（ＶＨＳＶ）、黄色頭ウイルス（Ｙｅｌｌｏｗ−ｈｅａｄ  ｖｉｒｕｓ）（ＹＨＶ）、タウラ症候群ウイルス（Ｔａｕｒａ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｖｉｒｕｓ）（ＴＳＶ）、白斑症候群ウイルス（Ｗｈｉｔｅ  Ｓｐｏｔ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｖｉｒｕｓ）（ＷＳＳＶ）、レニバクテリウム・サルモニナルム（Ｒｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｌｍｏｎｉｎａｒｕｍ）（細菌性腎臓疾患の原因因子）、ピシリケッチア・サルモニス（Ｐｉｓｃｉｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓａｌｍｏｎｉｓ）（サケ科リケッチア性敗血症の原因因子）、ビブリオ属細菌種（Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ）、エロモナス属細菌種（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ）、エルシニア・ラッケリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｒｕｃｋｅｒｉｉ）、シュードモナス属細菌種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ）、フォトバクテリウム・ダムセラエ（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅｌａｅ）など。これらの及び他の病原性生物からの多数の、そして益々多くのポリペプチドが精製されており、および／またはクローニングされており、発現されており、ワクチン組成物中のアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０またはそのコード配列に結合したものとして入手可能であり、あるいはそれと組合わされたものとして提供されている。好ましい具体例には、ＩＰＮＶタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＮＳならびにそれらのコードヌクレオチド配列；ＷＯ  ０１／１０４６９に開示されているＩＳＡＶタンパク質、例えば赤血球凝集素、ヌクレオキャプシド、ポリメラーゼおよびセグメント７  Ｐ４およびＰ５タンパク質、ならびにそれらのコードヌクレオチド配列；ＷＯ  ０１／６８８６５に開示されているピー・サルモニス（Ｐ．ｓａｌｍｏｎｉｓ）タンパク質、例えばＯｓｐＡおよびＩｃｍＥならびにそれらのコードヌクレオチド配列；ノダウイルスタンパク質、例えばヌクレオキャプシド；ならびにＳＰＤＶからの構造ポリペプチドおよびそのコードヌクレオチド配列（ＷＯ  ９９／５８６３９に開示されている）が含まれる。本発明の好ましいワクチン組成物は、ＩＰＮＶ  ＶＰ２配列またはＩＰＮＶ  ＶＰ３配列にインフレームで融合したｈｓｐ６０ヌクレオチド配列を担持するＤＮＡ発現ベクターを含む。場合によっては、該ワクチンは、ｈｓｐ６０−ＶＰ２融合体を担持する第１プラスミドと、ｈｓｐ６０−ＶＰ３融合体を担持する第２プラスミドとを含む。
【００６２】
ｈｓｐ６０配列は、ウシ下痢症ウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｄｉａｒｒｈｅａ  Ｖｉｒｕｓ）（ＢＶＤＶ）、ウシヘルペスウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）（ＢＨＶ）、口蹄疫ウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  Ｖｉｒｕｓ）（ＢＲＳＶ）、パラインフルエンザ３型ウイルス（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｔｙｐｅ  ３  ｖｉｒｕｓ）（ＰＩ３）、ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ）（ＩＢＲ）、ブタ呼吸繁殖症候群（Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｖｉｒｕｓ）（ＰＲＲＳＶ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、エールリキア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）、エイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）（例えば、マイコプラズマ・ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、マイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、ブラキスピラ（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、ネオスポラ（Ｎｅｏｓｐｏｒａ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、フゾバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ロタウイルス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）、コロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、マンヘイミア・ヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）ヘモフィルス・ソムヌス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｕｓ）、アクチノバシラス・プリゥロニュウモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、アナプラズマ（Ａｎａｐｌａｓｍａ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）などを含む他の動物病原体および寄生生物からの抗原（またはそのコード配列）と共に又はそれに結合させて使用することが可能である。
【００６３】
本発明は、前記抗原またはそれらのコード配列のいずれかと組合わされたｈｓｐ６０配列の、該抗原が由来する病原因子による感染により引き起こされる疾患の治療または予防のための医薬組成物の製造における使用を含む。
【００６４】
本発明の１つの実施形態においては、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０のタンパク質または核酸配列が、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ７０のタンパク質または核酸配列を更に含むワクチン中に含まれる。単一ワクチン組成物中のこれらの２つの遺伝子または抗原の組合せはワクチン効力における相加的または相乗的な改善をもたらしうる。アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ７０は、２００３年７月１４日付け出願の同時係属出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／０７６０２の主題である。
【００６５】
ｈｓｐ６０遺伝子またはタンパク質と共に提供されるワクチン抗原は、（キメラまたは融合タンパク質において）ｈｓｐ６０に化学的に結合していることが可能であり、あるいはそれらは、単一のワクチン組成物において別々の分子として一緒に提供されうる。もう１つの選択肢として、ｈｓｐ６０遺伝子またはタンパク質は、別々の投与または順次投与または同時投与のためのキットにおいて、抗原または抗原コード化核酸配列と共に提供されうる。ｈｓｐ６０遺伝子またはタンパク質と共に提供されるワクチン抗原は、細菌ワクチン、細胞抽出物、組換えタンパク質、プラスミド担持遺伝子、または生／弱毒化病原体株でありうる。
【００６６】
単独で又は製薬上許容されるビヒクルもしくは賦形剤と共に投与される本発明の融合タンパク質または単離ｈｓｐ６０タンパク質の中性または塩形態で対象を免疫化することが可能である。典型的には、ワクチンは、液体溶液または懸濁液として製造される。また、投与前に液体ビヒクルに溶解し又は懸濁させるのに適した固体形態（例えば、凍結乾燥体）も製造されうる。該製剤を乳化することが可能であり、あるいは有効成分をリポソームビヒクル中に封入することが可能である。本発明の医薬組成物は、即時放出または徐放用の形態として投与することが可能である。
【００６７】
ワクチン組成物の製造において本発明の抗原または核酸分子と混合する製薬上許容される賦形剤またはビヒクルとしては、例えば、水、塩類液、デキストロース、グリセロール、補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、希釈剤、滑沢剤、ｐＨ緩衝化剤、またはアジュバント、例えばムラミルジペプチチド、アブリジン、水酸化アルミニウム、油、サポニン、ブロック共重合体および当技術分野で公知の他の物質が挙げられる。
【００６８】
対象を免疫化するためには、ｈｓｐ６０抗原またはｈｓｐ融合タンパク質またはｈｓｐ６０遺伝子ベクターを、適当なビヒクル中で、非経口的に、通常は筋肉内注射により投与するが、場合によっては、皮下経路、静脈内注射、または皮内もしくは鼻腔内運搬により投与することも可能である。魚類の抗原免疫化の場合には、典型的な投与経路は、腹膜腔内への注射、筋肉内注射、食餌に含ませて経口的に、または浸漬によるものである。本発明の好ましい抗原ワクチン組成物は、注射または浸漬による投与に適した形態である。ＤＮＡワクチン接種は、一般には、筋肉内注射によるものである。
【００６９】
有効量は、対象のサイズおよび種ならびに投与方法に応じて様々となりうる。最適な投与量は医師または獣医により試行錯誤で決定されうる。典型的には、ｈｓｐ６０抗原の１回量は約０．０１〜１０００μｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．５〜５００μｇ／ｋｇ、より好ましくは、０．１〜１００μｇ／ｋｇである。ＤＮＡワクチンの場合、プラスミド１０ｐｇ／動物の最少投与量から１０００μｇ／動物の投与量がインビボでの該抗原の発現を可能にする。
【００７０】
本発明の一部として開示されている新規抗原は、病原性タンパク質に対する抗体に関するスクリーニング、ならびに毒性および環境ストレス／ストレス効果に関するスクリーニングにおいても有用である。本発明は更に、例えば、疾患を引き起こす生物の存在に関して動物を試験するのに有用な診断キットの製造における、これらの抗原の診断的使用を含む。
【００７１】
本明細書に開示されている精製ｈｓｐ６０抗原および／またはｈｓｐ６０融合タンパク質に対して産生した抗体も本発明に含まれる。そのような抗体は疾患の処置および魚類の健康における診断用途および治療用途の両方を有しうると予想される。この点においては、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方が有用でありうる。タンパク質で動物、例えばマウスを免疫化するための方法、および免疫原特異的モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択は当技術分野でよく知られている（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７を参照されたい）。診断アッセイの具体例として、サンドイッチアッセイおよびＥＬＩＳＡが挙げられうる。
【００７２】
本発明のｈｓｐ６０核酸配列は、例えば、ＰＣＲ増幅アッセイ用のプライマーの設計における診断用途を有する。
【００７３】
（実施例）
【実施例１】
【００７４】
アルスロバクターＡＴＣＣ  ５５９２１のゲノムからのｈｓｐ６０遺伝子の単離および配列決定
アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＡＴＣＣ  ５５９２１の５ｍｌ培養物を、カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ中、３０℃で振とうしながら一晩成長させる。ついで、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ単離キット（Ｇｅｎｔｒａ）またはＩｎｓｔａｇｅｎｅ  ＴＭ  Ｒｅｓｉｎを該製造業者の説明に従い使用して、ＤＮＡ抽出を行う。
【００７５】
保存されたマイコバクテリウム配列を使用するＰＣＲ
いくつかのマイコバクテリウムおよびストレプトマイセスｈｓｐ６０（ｇｒｏＥＬ）配列間のヌクレオチドレベルでの最大類似性の領域を使用して、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０遺伝子のＰＣＲおよび配列決定用のプライマーを設計する。選択したプライマーはｇｒｏＥＬ−ＯＦＰ  （５’−ＧＴＣＣＧＴＣＧＣＧＧＧＣＡＣＴ−３’）、ｇｒｏＥＬ−１Ｆ（５’−ＣＣＣＡＣＧＡＴＣＡＣＣＡＡＣＧＡ−３’）、ｇｒｏＥＬ−１Ｒ（５’−ＣＣＴＣＧＡＴＧＣＧＧＴＧＣＴＴＧ−３’）、ｇｒｏＥＬ−２Ｒ（５’−ＣＣＴＴＧＴＣＣＡＴＳＧＣＣＴＣｇ−３’を含む。５０℃または６０℃のアニーリング温度ならびに種々の量のマグネシウムおよびＤＭＳＯを用いるＰＣＲ反応におけるアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＤＮＡの増幅に、これらのプライマーを使用する。プライマーＯＦＰ／２Ｒおよび１Ｆ／１Ｒを使用して、それぞれ約５９５ｂｐおよび１０５０ｂｐのＤＮＡ断片を増幅する。Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲクリーンアップキットを（該製造業者の説明に従い）使用して、ＰＣＲ産物をクリーニング（ｃｌｅａｎ）し、該ＰＣＲに使用したプライマーのそれぞれを使用するＢｉｇＤｙｅプライマー化学（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて該製造業者の説明に従い配列決定する。簡潔に説明すると、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（８μｌ）ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ混合物、〜６００ｎｇのＤＮＡ鋳型、３．２ｐｍｏｌの適当なプライマーおよびｄｄＨ２Ｏ（２０μｌの調整）を使用して、伸長反応混合物を調製する。サイクルシークエンシングのための条件は以下のとおりである。サーマルサイクラーを、９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間および６０℃で４分間よりなる２５サイクルに設定する。該配列は、この断片が、いくつかのマイコバクテリウムのｇｒｏＥＬ遺伝子に対する高い相同性を含むことを示し、それをゲノム歩行の出発点として使用する。
【００７６】
ゲノム歩行
ゲノム歩行を用いて、既に同定された配列の５’側および３’側に配列を伸長させる。Ｇｅｎｏｍｅ  Ｗａｌｋｅｒマニュアル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に記載されているとおりに、前記のｈｓｐ６０様配列からプライマーを設計する。まず、４つのゲノムライブラリーを作製し（ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰｖｕｌＩ、ＳｔｕＩ）、ついで３つの追加的なライブラリーを作製する（ＡｌｕＩ、ＳｃａＩおよびＳｎａＦＩ）。すべてのライブラリーおよび後続のＰＣＲ反応は、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｗａｌｋｅｒマニュアルに記載されているとおりである。数ラウンドのゲノム歩行を行って、該遺伝子配列を伸長させる。
【００７７】
Ｇｅｎｅｃｏｄｅ’ｓ  Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒソフトウェアを使用して配列を整列させてコンティグを得る。該コンティグ化配列を使用するＧｅｎｂａｎｋ検索は、該コンティグがｈｓｐ６０遺伝子を含有することを証明している。
【００７８】
アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０タンパク質（および遺伝子）は、他の属（特に、細菌種）のホモログに対する類似性を有すると理解されうる。
【実施例２】
【００７９】
ｈｓｐ６０との遺伝子融合体に基づくＩＰＮＶに対する核酸ワクチン
流動する新鮮な水中に維持された初めて海へ下る前（ｐｒｅ−ｓｍｏｌｔ）の大西洋サケ（Ｓａｌｍｏ  ｓａｌａｒ）（３５〜４０ｇ）を、清潔なアクアリウム水中で希釈されたベンゾカインで麻酔する。ワクチン接種前に、６匹の魚を麻酔薬の致死的過剰投与により安楽死させ、免疫前血清として尾静脈から血液を採取する。
【００８０】
該核酸ワクチンおよびＰＢＳ対照を、背側鰭の直下の左背側側腹部の筋肉内にワクチン接種（５０μｌのワクチン）する。２通りの４０匹の魚をワクチン接種する（８０匹／群、２つの水槽で分けられている）。ワクチン接種後、魚を新鮮な水中に回収し、それらの適切な水槽に割当てる。
【００８１】
被検核酸ワクチンはｐＵＫｒｓｘＨＳＰ６０−ｉｐｎＶＰ２およびｐＵＫｒｓｘＨＳＰ６０−ｉｐｎＶＰ３である。これらのプラスミドは、ＣＭＶプロモーターの制御下、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０の完全なコード配列とそれぞれＩＰＮＶ  ＶＰ２またはＩＰＮＶ  ＶＰ３とのインフレーム融合体を担持する。ｐＵＫｒｓｘＨＳＰ６０−ｉｐｎＶＰ２を単独で試験し、また、両方のプラスミドを一緒に試験する。
【００８２】
比較のために、ＶＰ２成分の免疫防御効力を約２０％増強することがこれまでの研究から知られている配列の３’側に融合したＩＰＮ  ＶＰ２タンパク質を含むプラスミドをも調製する（すなわち、「ゴールドスタンダード（ｇｏｌｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ）」ＶＰ２  ＩＰＮＶ核酸ワクチン）。
【００８３】
ワクチン接種の６週間後、魚を海水に移す。チャレンジの前日に、重複群当たり４匹の魚から血清を採取する。注射部位の筋肉のサンプルも採取し、ホルマリン固定して、ワクチンの存在を調べる。チャレンジの２１日後、重複群当たり最大４匹の生存魚から血清を採取する。チャレンジ後、毎日、最初の観察の際に死亡魚を取り出し、ＥＬＩＳＡによる分析のために腎臓を採取し凍結する。
【００８４】
ビルレントＩＰＮＶ（１０６  ｃｆｕ）の腹腔内注射によりチャレンジされている標識された同胞魚との同棲により、海水に移して４〜６週間たった後にチャレンジを行う。この試験は２０週間後に終了する。
【００８５】
結果は、ＩＰＮＶのＶＰ２配列に基づく核酸ワクチンのすべてが、ｈｓｐ６０−ＶＰ２融合体を含む該ウイルスによるチャレンジに対して防御性であることを示している。
【実施例３】
【００８６】
ＩＳＡＶに対するワクチン中の組換えｈｓｐ６０
大西洋サケ幼魚（ｐａｒｒ）を、通気流動井戸水（１０℃）が供給された０．５ｍの待機（ｈｏｌｄｉｎｇ）水槽に、実験の開始前の１週間にわたり順応させ、実験の全体を通じて毎日、餌を与える。５５匹の魚の各群を２５匹の２個の水槽に分割して、重複処理群を得る。ＩＳＡＶでチャレンジした場合には、大西洋サケ幼魚のうちの６０〜８０％が死亡する。
【００８７】
該魚を麻酔し、ついで食塩水０．２ｍｌまたは特定の組換えタンパク質を含有する食塩水０．２ｍｌの腹腔内注射によりワクチン接種する。陰性対照はＰＢＳ注射（食塩水）である。処理群は以下のものである：（Ａ）Ｈｉｓタグ付き精製アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０組換えタンパク質１２μｇ、（Ｂ）ＩＳＡＶ組換えＨｉｓタグ付きヌクレキャプシドタンパク質（ＮＣ）１２μｇ、（Ｃ）Ｈｉｓタグ付きＩＳＡＶ  ＮＣ１２μｇと混合された、Ｈｉｓタグ付き精製アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０組換えタンパク質１２μｇ、（Ｄ）Ｈｉｓタグ付きＩＳＡＶ  ＮＣ  １２μｇと架橋された、Ｈｉｓタグ付き精製アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ６０組換えタンパク質１２μｇ。
【００８８】
処理群Ｄには、共有結合により架橋されたタンパク質を与える。架橋剤として、ＥＤＣおよびスルホ−ＮＨＳを使用し、これらは、標準的なプロトコールに従い使用する。
【００８９】
同棲チャレンジを行う。この場合、少数のサケに０．１ｍｌの培養ビルレントＩＳＡＶ（〜１０４  ＴＣＩＤ５０／魚）を与え、それらのサケを処理魚の各水槽に加える。各水槽における死亡を毎日監視する。
【００９０】
特定の時点における種々の処理群と対照と間の死亡率を比較することにより、相対生存率を評価する。
【配列表】
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