(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコール鎖ブロックである非荷電性親水性ポリマー鎖ブロックと、ポリリシン、ポリオルニチン、ポリアルギニン、ポリホモアルギニン及びポリヒスチジンからなる群より選ばれるカチオン性ポリアミノ酸鎖ブロックとを含んでなるブロック共重合体であって、
親水性ポリマー鎖ブロックが該ポリアミノ酸鎖ブロックの主鎖のいずれか一方の末端に共有結合を介して結合しており、かつ、
該ポリアミノ酸鎖ブロックにおけるアミノ酸単位の１０パーセント以上７０パーセント以下の側鎖に、ステロール誘導体残基及びＣ１２−２４ヒドロカルビル基から選択される疎水性基が、−ＮＨ−、−ＮＨＣＯＯ−又は−ＮＨＣＯ−を介して結合している、上記ブロック共重合体。
【請求項２】
一般式Ｉ
【化１】
0005467366.tif 000014
又は一般式II
【化２】
0005467366.tif 000015
式中、Ａは水素原子、または式Ｒ１（Ｒ２）ＣＨ（ＣＨ２）ｑ−で表される基を表し、Ｒ１及びＲ２は独立して水素原子、Ｃ１−６アルコキシ基、アリールオキシ基、シアノ基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ２−７アシルアミド基、トリ−Ｃ１−６アルキルシロキシ基、シリルアミノ基を示すか、またはＲ１およびＲ２は一緒になってＣ１−３アルキル基で置換されていているかもしくは未置換のエチレンジオキシまたはプロピレンジオキシ基を表し、またはＲ１およびＲ２はそれらが結合しているＣＨ基と一緒になってホルミル基を表し、
ｑは０〜１０の整数を表し、
Ｌは−（ＣＨ２）ｒＮＨ−、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−または−ＣＯＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−を表し、但し、ｒは０〜５の整数を表し、
Ｌ’は、−ＣＯ−、−ＯＣＯ−（ＣＨ２）ｒ’−ＣＯ−および−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）ｒ’−ＣＯ−を表し、但し、ｒ’は１〜５の整数を表し、
Ｂは−ＮＨ−、−ＮＨＣＯＯ−、又は−ＮＨＣＯ−を介して結合するステロール誘導体残基、またはＣ１２−２４ヒドロカルビル基を表し、
ＱはＮＨ２、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２または式IVで表される置換基を表し、
【化３】
0005467366.tif 000016
Ｚは水素原子、Ｃ２−１２アルキルカルボニル基、Ｃ３−１２アルケニルカルボニル基、Ｃ３−１２アルケニルカルボニル基、アリールカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、またはＢについて規定する基であり、
Ｚ’は−ＮＨ−Ｒ３を表し、但し、Ｒ３は未置換または置換された直鎖もしくは分枝のＣ１−１２アルキル基であり、
ｍは５５〜５，０００の整数を表し、
ｎは１０〜１００の整数を表し、
ｐは４の整数を表し、
ｘはポリアミノ酸鎖ブロックに含有される置換基Ｑを有するユニットの数、
ｙはポリアミノ酸鎖ブロックに含有される置換基Ｂを有するユニットの数であるが、ｘ＋ｙ＝ｎであり、ｙはｎの１０パーセント以上７０パーセント以下までを占める整数である、
で表される請求項１記載のブロック共重合体。
【請求項３】
ステロール誘導体残基がコレステロール、コレスタノール、ジヒドロキシコレステロール、コール酸よりなる群から選ばれる化合物に由来する、請求項２記載のブロック共重合体。
【請求項４】
ヒドロカルビル基がＣ１２−２０アルキル基よりなる群から選ばれる、請求項２記載のブロック共重合体。
【請求項５】
ヒドロカルビル基がフェニルまたはナフチルであるフェニルとＣ１−５のアルキルからなるアリールアルキル基よりなる群から選ばれる、請求項２記載のブロック共重合体。
【請求項６】
核酸と請求項１〜５のいずれか一項に記載のブロック共重合体との複合体。
【請求項７】
核酸がオリゴもしくはポリ二本鎖ＲＮＡ、オリゴもしくはポリ二本鎖ＤＮＡ、オリゴもしくはポリ一本鎖ＤＮＡおよびオリゴもしくはポリ一本鎖ＲＮＡからなる群より選ばれる、請求項６記載の複合体。
【請求項８】
核酸がプラスミドＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ、アンチセンス核酸、デコイ核酸、アプタマーおよびリボザイムからなる群より選ばれる請求項７記載の複合体。
【請求項９】
コア−シェル型高分子ミセル構造を有し、コア部に核酸を内包した請求項６〜８のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１０】
ブロック共重合体と核酸が、［ブロック共重合体中のカチオン残基の濃度］／［核酸中のリン酸基濃度］ので定義されるＮ／Ｐ比が１〜５０となるように含有されることを特徴とする請求項６〜９のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１１】
平均粒子径が１０〜３００ｎｍの粒子である、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、親水性ポリマー鎖ブロックと、側鎖の一部に疎水性基が導入されたカチオン性ポリアミノ酸鎖ブロックを含んでなるブロック共重合体ならびに該共重合体と核酸分子から形成される複合体、特にミセル型粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチドを始めとする生理活性を有する核酸医薬は、癌やウイルス性疾患等に対する次世代の治療薬として期待されている。しかし、これらの核酸は本質的に生体内で不安定であり、生体利用効率の低さから現在のところ実用的な用途は限定されている。核酸医薬をより幅広い疾患の治療に応用するためには、全身投与を可能とする効率的で安全な核酸デリバリーシステムが必要である（下記の非特許文献１及び２参照）。ウイルスベクターは高効率で核酸を標的部位にデリバリーできることが知られているが、免疫原性、発癌性等により臨床上の利用は制限されている（下記の非特許文献３及び４参照）。そのため、カチオン性のポリマーやカチオン性脂質から構成される非ウイルスベクターに注目が集まっている（下記の非特許文献５及び６参照）。
カチオン性ポリマーは静電的相互作用により核酸と複合体を形成するが、それだけでは標的に効率よくデリバリーできる粒子径の制御及び血中での安定性に問題があるため、カチオン性ポリマーにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの生体親和性の高い水溶性高分子を結合させる方法が提案されている（下記の特許文献１、特許文献２、特許文献３、非特許文献７及び８参照）。これらの複合体はＰＥＧからなる親水性のシェルと核酸の結合したコアを有するコア−シェル型の粒子となるため粒子径の制御は可能となるが、静脈投与した場合には速やかに血中から除去されてしまうことが報告されており（下記の非特許文献９及び１０参照）、さらなる安定化が望まれる。
概説すれば、特許文献１は、例えば荷電性分子であるＤＮＡの標的デリバリー用担体として親水性セグメントおよび荷電性セグメントを含むブロック共重合体を記載しているが、該共重合体から形成された核酸複合体は上述したような血中での安定性に問題がある場合がある。特許文献２では、かような問題点を改善すること、具体的には、水性媒体中での該ブロック共重合体の複数分子から形成される高分子ミセルを安定化すること等を目的として該重合体分子間にジスルフィド架橋が形成されるようにメルカプト基が該ブロック共重合体の荷電性セグメント中に導入されている。また、特許文献３では、例えば、ポリ−Ｌ−リシンの側鎖のε−アミノ基を介して親水性基としてのＰＥＧ鎖および疎水性基としてのパルミトイル基を導入したグラフト重合体が提供されている。
他方、一方の末端にＰＥＧ鎖を導入したカチオン性ポリマー（例えば、ＰＥＧ化ポリ（Ｎ−メチルジエタンアミン  セバケート））に対し、側鎖として疎水性基であるコレステロールをグラフトして、ポリマーミセルを安定化する方法が提案されている（下記の非特許文献１１参照）。この文献では血中滞留性の評価は報告されていないが、疎水基の導入により粒子はある程度安定化されたと考えられる。しかし、このポリマーの調製には過酷な条件（１２０℃、２４時間）を用いる必要があり、ポリマーの分解が生じることから、ポリマーの分子量及びＰＥＧ、コレステロールの導入率を安定に制御することは困難と考えられる。また、この方法ではｐＨ４．６という酸性条件において核酸との複合体を調製する必要があるが、そのような酸性条件ではＤＮＡは不安定である（下記の非特許文献１２参照）。これらの点で、このポリマーを使う場合には製剤化に問題が生じる可能性がある。さらに、該文献で用いられているＰＥＧは分子量が最大で２０００であり、またポリマー中のＰＥＧ含量は１．８〜８．２％である。この条件では親水性シェルの形成は不十分と考えられ、ＤＮＡとの複合体の粒子径は２００ｎｍ以上と大きく、また粒子のゼータ電位はコアの性質を反映して負または正の値を示している。このような性質は高い血中滞留性を実現するための障害となる（当該技術分野に関するその他の情報も含めて下記の非特許文献６及び１３〜１７参照）。
引用文献の一覧：
【特許文献１】特開平８−１８８５４１号公報
【特許文献２】特開２００１−１４６５５６号公報
【特許文献３】ＷＯ９９／６１５１２
【非特許文献１】Ｃ．Ｄ．Ｎｏｖｉｎａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００４，４３０，１６１−１６４．
【非特許文献２】Ｗ．Ｐｕｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６，９８，１４−３５．
【非特許文献３】Ｒ．Ｇ．Ｃｒｙｓｔａｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，２７０，４０４−４１０．
【非特許文献４】Ｓ．Ｋ．Ｔｒｉｐａｔｈｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９６  ２，５４５−５５０．
【非特許文献５】Ａ．ｄｅ  Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２００７，６，４４３−４５３．
【非特許文献６】Ｓ．Ａｋｈｔａｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，２００７，１１７，３６２３−３６３２．
【非特許文献７】Ｒ．Ｍ．Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，３２，ｅ１４９．
【非特許文献８】Ｓ．Ｈｕ−Ｌｉｅｓｋｏｖａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５，６５，８９８４−８９９２．
【非特許文献９】Ｈ．Ｋ．ｄｅ  Ｗｏｌｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２００７，３３１，１６７−１７５．
【非特許文献１０】Ｊ．Ｄ．Ｈｅｉｄｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００７，１０４，５７１５−５７２１．
【非特許文献１１】Ｙ．Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００７，２８，５３５８−５３６８．
【非特許文献１２】Ｅ．Ｗａｌｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１９９９，６１，３６１−３７４．
【非特許文献１３】Ｃ．Ｎｉｃｏｌａｚｚｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２００３，８８，４２９−４４３．
【非特許文献１４】Ｂ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５，１６，６０８−６１４．
【非特許文献１５】Ｄ．Ｏｕｐｉｃｋｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２００１，８，７１３−７２４．
【非特許文献１６】Ｙ．Ｔａｋａｋｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，１９９４，１０５，１９−２９．
【非特許文献１７】Ｙ．Ｙａｍａｓａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２００２，３０１，４６７−４７７．
【発明の開示】
【０００３】
上述したとおり、核酸のベクターとして、ウイルスベクター以外について、今日でも、多種多様な開発研究または取り組みがなされている。しかし、医療用の材料として有利に使用でき、しかも効率よく標的に核酸をデリバリーできるベクターまたは担体に対するニーズは未だ存在する。例えば、非特許文献１１に記載されたＰＥＧ化ポリ（Ｎ−メチルジエタンアミン  セバケート）−ｃｏ−（（コレステリルオキソカルボニルアミドエチル）メチルビス（エチレン）アンモニウムブロミドセバケート））はそれらから形成されるミセル型粒子が一定の安定性を有することが記載されているものの、医薬用材料に要求される材料の均質性、また、医薬それ自体の均質性を確立することが容易にできる系を提供するとの観点からは、さらなる改良が望まれるであろう。
本発明者等の一部は、上記の特許文献２に記載されているとおり、ブロック共重合体から形成される高分子ミセル（またはミセル型粒子）の安定化が該共重合体分子間にジスルフィド架橋を形成（共有結合を形成）することにより飛躍的に向上できることを明らかにした。しかし、材料の多様性を図るべく、さらなる異なる核酸デリバリー用の材料を探索してきた。
その結果、特許文献２に記載された非荷電性親水性ポリマー鎖ブロック及びカチオン性ポリアミノ酸鎖ブロックを含んでなるブロック共重合体は、非特許文献１１に記載された共重合体とは本質的に構造を異にするが、ポリアミノ酸反復単位（ユニット）の側鎖の一部に疎水性基を導入して修飾したブロック共重合体は、前記のブロック共重合体分子のポリマー主鎖間をジスルフィド結合した場合以上の利点を高分子ミセルに付与し得ることを見出した。
こうして、本願発明では、非荷電性親水性ポリマー鎖ブロック及びカチオン性ポリアミノ酸鎖ブロックを含んでなるブロック共重合体であって、親水性ポリマー鎖ブロックが該ポリアミノ酸鎖ブロックの主鎖のいずれか一方の末端に共有結合を介して結合しており、かつ、該ポリアミノ酸鎖ブロックにおけるアミノ酸単位の１０パーセント以上７０パーセント以下の側鎖に疎水性基が共有結合を介して結合している、上記ブロック共重合体が提供される。
また、本願発明は、かような共重合体と核酸の複合体も提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、実施例２で合成されたＰＰＬＣ１の１Ｈ  ＮＭＲスペクトラムである。なお、図中ａはポリエチレングリコールのメチレン基由来のピークであり、ｂはコレステロール基中のメチル基由来のピークである。
図２は、実施例２で合成されたＰＰＬＳ１の１Ｈ  ＮＭＲスペクトラムである。なお、図中ａはポリエチレングリコールのメチレン基由来のピークであり、ｂはステアロイル基中のメチル基由来のピークである。
図３は、ＰＰＬＣ１〜ＰＰＬＣ４及びＰＥＧ−Ｐ（Ｌｙｓ）の各ポリマーとｓｉＲＮＡを用い、各Ｎ／Ｐ比において形成させた粒子溶液の電気泳動の結果得られた写真である（但し、Ｎ／Ｐ比０とは、ｓｉＲＮＡのみを泳動したレーンを指す。）。
図４は、動的光散乱法により測定したＰＰＬＣ１〜ＰＰＬＣ４及びＰＥＧ−Ｐ（Ｌｙｓ）の各ポリマーとｓｉＲＮＡからなる会合体の多分散度（ｐＤＩ）を示すグラフである。
図５は、動的光散乱法により測定したＰＰＬＣ１〜ＰＰＬＣ４及びＰＥＧ−Ｐ（Ｌｙｓ）の各ポリマーとｓｉＲＮＡからなる会合体のキュムラント粒径（ｄｉａｍｅｔｅｒ）を示すグラフである。
図６は、動的光散乱法により測定した、ＰＰＬＣ２を用いｓｉＲＮＡとＮ／Ｐ比６で形成させた粒子の粒子径分布のヒストグラムである。
図７は、ＰＰＬＣ２とｓｉＲＮＡからなる会合体のゼータ電位（ｚｅｔａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）の測定結果を示すグラフである。
図８は、ＰＰＬＣ２を用いＮ／Ｐ比１．５〜１０で調製した粒子、ＰＰＬＳ１を用いＮ／Ｐ比６で調製した粒子及び粒子化していないｓｉＲＮＡ（ｎａｋｅｄ）の投与後１時間における血中滞留性を評価した結果を示すグラフである。
図９は、ＰＰＬＣ１〜４及びＰＥＧ−ＰＬｙｓを用い、Ｎ／Ｐ比６で調製した粒子及び粒子化していないｓｉＲＮＡ（ｎａｋｅｄ）の、投与後２時間における血中滞留性を評価した結果を示すグラフである。
図１０は、ＰＰＬＺを用いＮ／Ｐ比８で調製した粒子、ＰＰＬＺｂを用いＮ／Ｐ比８で調製した粒子及び粒子化していないｓｉＲＮＡ（ｎａｋｅｄ）の投与後２時間における血中滞留性を評価した結果を示すグラフである。
図１１は、ＰＰＬＣ２を用いＮ／Ｐ比６で調製した粒子及び粒子化していないｓｉＲＮＡ（ｎａｋｅｄ）の、投与後１５分〜４時間までの血中滞留性を評価した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明について使用する用語または技術用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で使用されている通常の意味を有するものと理解される。
非荷電性親水性ポリマー鎖ブロックは、ポリエチレングリコール（またはポリ（オキシエチレン）からなる水溶性ポリマー由来である。ポリアミノ酸鎖ブロックがポリリシン、ポリオルニチン、ポリアルギニン、ポリホモアルギニン又はポリヒスチジンからなる群より選ばれるポリマー由来であることができる。かかる非荷電性親水性ポリマー鎖ブロックの分子量は、ブロック共重合体が薬物内包高分子ミセルを形成できる限り、限定できるものでないが、約２５００〜２００，０００Ｄａ、好ましくは５，０００〜２０，０００Ｄａ、より好ましくは８，０００〜１５，０００Ｄａであり、オキシエチレンの反復単位の数では、５５〜４，５００の整数であり、好ましくは１１０〜４５０、より好ましくは１８０〜３４０の整数である。
ブロック共重合体のもう一方のブロックであるポリアミノ酸鎖ブロックは、ポリリシン、ポリオルニチン、ポリアルギニン、ポリホモアルギニン又はポリヒスチジンからなる群より選ばれるポリマー由来の反復単位を含んでなるか、または該反復単位からなることができる。これらのブロックは該反復単位が１０〜１００の整数にあり、好ましくは２０〜８０の整数にあり、より好ましくは２０〜６０の整数にある。このポリアミノ酸鎖ブロックのアミノ酸残基のうち、全反復単位数（ｎで表される整数）の１０％〜７０％に相当する数のアミノ酸残基は、疎水性基をその側鎖に担持する。疎水性基を担持するアミノ酸残基は、ポリアミノ酸ブロック中にどのように配置されていても良く、例えば無秩序またはランダムに配置されている場合、およびブロックとして配置されている場合（すなわち、ポリエチレングリコールブロックと、疎水基を担持するポリアミノ酸からなるブロックと、疎水基を担持しないポリアミノ酸からなるブロックがトリブロックを形成する場合）が挙げられる。疎水性基としては、ステロール誘導体の残基またはＣ４−２４ヒドロカルビル基が挙げられる。ステロールとは、シクロペンタノンヒドロフェナントレン環（Ｃ１７Ｈ２８）をベースとする天然、半合成または合成の化合物を意味し、例えば、天然のステロールとしては、限定されるものではないが、コレステロール、コレスタノール、ジヒドロコレステロール、コール酸等が挙げられ、その半合成または合成の化合物としては、これら天然物の例えば、合成前駆体（必要により、存在する場合には、一定の官能基、ヒドロキシ基の一部もしくは全部が当該技術分野で既知のヒドロキシ保護基により保護されているか、またはカルボキシル基がカルボキシル保護により保護されている化合物を包含する）であることができる。また、ステロール誘導体とは、本発明の目的に悪影響を及ぼさない範囲内で、シクロペンタノンヒドロフェナントレン環にＣ１−１２アルキル基、ハロゲン原子、例えば、塩素、臭素、フッ素、が導入されていてもよく、該環系は飽和、部分不飽和、であることができること等を意味する。ステロール誘導体の残基は、好ましくは、コレステロール、コレスタノール、ジヒドロキシコレステロールの３位ヒドロキシ基の水素原子が除去された基である。さらに好ましくは、コレステロール３位ヒドロキシ基の水素原子が除去された基である。Ｃ４−２４ヒドロカルビル基に言う、ヒドロカルビルとは、炭素原子と水素原子からなり、直鎖もしくは分岐のＣ４−２４、好ましくはＣ１２−２４アルキル、直鎖もしくは分岐のＣ４−２４、好ましくはＣ１２−２４アルケニル、直鎖もしくは分岐のＣ４−２４、好ましくはＣ１２−２４アルキニル、Ｃ４−２４、好ましくはＣ１２−２４の籠状化合物、例えば、アダマンチル等、およびアリールアルキルで、アリールがフェニルまたはナフチルであり、アルキルがＣ１−Ｃ５であるもの、例えば、ベンジル基等を挙げることができるが、好ましくは、直鎖もしくは分岐Ｃ４−２０、より好ましくはＣ１２−２０アルキル、直鎖もしくは分岐のＣ４−２０、好ましくはＣ１２−２０アルケニル、およびベンジル基である。なお、上述のアルケニル及びアルキニル基には複数の不飽和結合が含まれていても良い。
このような、ブロック共重合体のより具体的なものとしては、一般式Ｉ又はＩＩ
0005467366.tif 000002
で表される共重合体を挙げることができる。
上式中、式中、Ａは水素原子、または式Ｒ１（Ｒ２）ＣＨ（ＣＨ２）ｑ−で表される基を表し、Ｒ１及びＲ２は独立して水素原子、Ｃ１−６アルコキシ基、アリールオキシ基、アリールＣ１−３オキシ基、シアノ基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ２−７アシルアミド基、トリ−Ｃ１−６アルキルシロキシ基、シロキシ基、シリルアミノ基を示すか、またはＲ１およびＲ２は一緒になってＣ１−３アルキル基で置換されていているかもしくは未置換のエチレンジオキシまたはプロピレンジオキシ基を表し、またはＲ１およびＲ２はそれらが結合している＝ＣＨ−基と一緒になってホルミル基を表し、
ｑは０〜１０の整数を表し、
Ｌは−（ＣＨ２）ｒＮＨ−、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−または−ＣＯＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−を表し、但し、ｒは０〜５の整数を表し、
Ｌ’は、−ＣＯ−、−ＯＣＯ−（ＣＨ２）ｒ’−ＣＯ−および−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）ｒ’−ＣＯ−を表し、但し、ｒ’は１〜５の整数を表し、
Ｂは−ＮＨ−、−ＮＨＣＯＯ−、−ＮＨＣＯ−または式ＩＩＩで表される置換基を介して結合するステロール誘導体残基またはＣ４−２４ヒドロカルビル基を表し、
0005467366.tif 000003
ＱはＮＨ２、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２または式ＩＶで表される置換基を表し、
0005467366.tif 000004
Ｚは水素原子、Ｃ２−１２アルキルカルボニル基、Ｃ３−１２アルケニルカルボニル基、Ｃ３−１２アルケニルカルボニル基、アリールカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アリールＣ１−３カルボニル基またはＢについて規定する基であり、
Ｚ’は−ＮＨ−Ｒ３を表し、但し、Ｒ３は未置換または置換された直鎖もしくは分枝のＣ１−１２アルキル基であり、
ｍは５５〜５，０００の整数を表し、
ｎは１０〜１００の整数を表し、
ｐは１、３または４の整数を表し、
ｘはポリアミノ酸鎖ブロックに含有される置換基Ｑを有するユニットの数、ｙはポリアミノ酸鎖ブロックに含有される置換基Ｂを有するユニットの数であるが、
ｘ＋ｙ＝ｎであり、ｙはｎの１０パーセント以上７０パーセント以下までを占める整数である。
上式中のＣ１−１２アルキル、Ｃ１−３アルキル、または本明細書に言うアルキルとしては、それぞれに該当する炭素数を有する、例えば、メチル、エチル、プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタンデカン、ウンデシル等の直鎖もしくは分岐のアルキルを挙げることができる。
上式中のＢが水素原子であるブロック共重合体をはじめとする疎水性基を導入する前のブロック共重合体は、一部はそれ自体公知であるか、それ自体公知の方法で製造できる。一般的に、本発明で使用できるブロック共重合体は、それ自体公知のまたは市販されている非荷電性親水性ポリマー鎖を有するポリマー及びカチオン性ポリアミノ酸鎖を有するポリマーをそのまま、または必要により、分子量分布を狭くするように精製した後、それ自体公知の方法によりカップリングして製造することができる。ポリアミノ酸側鎖への疎水性基の導入は、非荷電性親水性ポリマー鎖とのカップリングによるブロック共重合体の製造の前に行っても良く、または後に行っても良い。これらの場合共重合体の構造は一般式ＩまたはＩＩとなる。別法としては、例えば、非荷電性親水性ポリマー鎖がポリエチレングリコール鎖であり、ポリアミノ酸鎖がリシンまたはオルニチンである場合、前者を例えば、一般式ＩのＡをもたらすことのできる開始剤を用いてアニオンリビング重合を行うことにより製造し、次いで、成長末端側にアミノ基を導入し、そのアミノ末端から、Ｎε−ＴＦＡ−Ｌ−リシン、Ｎε−Ｚ−Ｌ−リシン、Ｎδ−Ｚ−Ｌ−オルニチン、１−ベンジル−Ｌ−ヒスチジン、Ｎδ，Ｎω−ジ−Ｚ−Ｌ−アルギニン等の保護されたアミノ酸のＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）を重合させてブロック共重合体を合成し、次いで、ポリアミノ酸側鎖に疎水性基を導入することにより、本発明のブロック共重合体を提供できる。この場合共重合体の構造は一般式Ｉとなる。また、必要により、かような側鎖基の導入と同時に一般式ＩのＺ基として、水素原子以外に該側鎖基と同一の基を導入してもよい。
また、Ｚが水素原子、該側鎖基以外の基である場合には、対応する酸無水物等を反応体として用いて、それ自体公知の縮合反応により目的とする基をＺ基として導入することができる。
上記式中のＱはＮＨ２、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２または式ＩＩＩで表される置換基を示すが、これらは同一の分子中で混在して存在していても良い。
0005467366.tif 000005
上記式中のＱに−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２で表される置換基を導入する方法としては、例えば、ブロック共重合体中のリシン及びオルチニン残基の側鎖に存在するアミノ基に対し３，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｙｒａｚｏｌｙｌｆｏｒｍａｍｉｎｉｄｉｕｍ  ｎｉｔｒａｔｅを反応させる方法や、水酸化アンモニウム等の塩基存在下でＯ−メチルイソ尿素を反応させる方法を用いることができる。これらの反応は、Ｂに疎水基を導入する前、導入した後のいずれにおいても行うことができる。
こうして提供できる本発明のブロック共重合体は、カチオン荷電性基を有するため、例えば、アニオン荷電性化合物、核酸またはアニオン荷電性薬物とイオンコンプレックスを形成することができる。このようなイオンコンプレックは水性媒体中で、自律的に会合してミセル、所謂、高分子ミセルを形成することができる。かようなミセルは、コア部に核酸または薬物を内包し、シェル部として非荷電性親水性ポリマー鎖を有するコア−シェル型構造であることができる。ブロック共重合体には、必要により、一般式Ｉで示されるブロック共重合体のＲ１Ｒ２ＣＨ−で示される特定の官能基、例えば、ホルミル基、アミノ基もしくはカルボキシル基を介し、必要に応じて活性エステル基、マレイミド基等を有する結合基を導入した後に、特定の受容体タンパク質等に対するリガンドまたは抗体（その断片：Ｆ（ａｂ‘）２、Ｆ（ａｂ）等）を結合して、当該ミセルに標的指向性を付与してもよい。
上記イオンコンプレックスを生成することのできる核酸または薬物は安定性が向上するものであれば何ら制限されることなく使用できる。しかし、好ましくは核酸を使用できるので、説明を簡潔にする目的で、以下では、核酸について説明する。本発明にいう核酸は、プリンまたはピリミジン塩基、ペントース、リン酸からなるヌクレオチドを基本単位とするポリもしくはオリゴヌクレオチドを意味し、オリゴもしくはポリ二本鎖ＲＮＡ、オリゴもしくはポリ二本鎖ＤＮＡ、オリゴもしくはポリ一本鎖ＤＮＡおよびオリゴもしくはポリ一本鎖ＲＮＡを挙げることができ、また同一の鎖にＲＮＡとＤＮＡが混在したオリゴもしくはポリ２本鎖核酸、オリゴもしくはポリ１本鎖核酸も含まれる。また核酸に含有されるヌクレオチドは天然型であっても、化学修飾された非天然型のものであっても良く、またアミノ基、チオール基、蛍光化合物などの分子が付加されたものであっても良い。限定されるものでないが、該核酸は、４〜２０，０００塩基、好ましくは１０〜１０，０００塩基、さらに好ましくは１８〜３０塩基からなるものであることができる。また、機能もしくは作用を考慮すると、プラスミドＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ、アンチセンス核酸、デコイ核酸、アプタマーおよびリボザイムを挙げることができる。ｓｉＲＮＡは標的とする遺伝子またはポリヌクレオチドに対し、公知の方法で設計されたすべてのものを用いることができる。ｓｉＲＮＡは長さがヌクレオチド約１８〜３０個にある一本鎖もしくは二本鎖のいずれかであることができ、当該技術分野で公知の化合物、また、それらと同様な作用または機能を有するすべてのヌクレオチドを包含する。限定されるものでないが、ｓｉＲＮＡの具体例は、遺伝子療法の対象となりうる遺伝子を参照して設計することができる。このような遺伝子としては、限定されるものでないが、非小細胞肺癌等に関係のあるＰＫＣα、悪性黒色腫等に関係のあるＢＣＬ−２、クローン病に関係のあるＩＣＡＭ−１、Ｃ型肝炎に関係のあるＨＣＶ、関節リュウマチもしくは乾癬に関係のあるＴＮＦα、喘息に関係のあるアデノシンＡＩ受容体、卵巣癌等に関係のあるｃ−ｒａｆ  ｋｉｎａｓｅ、膵臓癌等に関係のあるＨ−ｒａｓ、冠動脈疾患に関係のあるｃ−ｍｙｃ、大腸癌に関係のあるＰＫＡ  Ｒｉａ、エイズに関係のあるＨＩＶ、固形癌に関係のあるＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、癌に関係のあるＶＥＧＦ受容体、腎臓癌に関係のあるリボヌクレオチド還元酵素、ＣＭＶ性網膜炎に関係のあるＣＭＶ  ＩＥ２、前立腺癌に関係のあるＭＭＰ−９、悪性グリオーマに関係のあるＴＧＦβ２、多発性硬化症に関係のあるＣＤ４９ｄ、糖尿病に関係のあるＰＴＰ−１Ｂ、癌に関係のあるｃ−ｍｙｂ、乳癌等に関係のあるＥＧＦＲ、癌に関係のあるｍｄｒ１、ａｕｔｏｔａｘｉｎ及びＧＬＵＴ−１の遺伝子を挙がることができる。
アンチセンス核酸も当該術分野で公知ものまたはそれらと同様の機能または作用を有するすべてのものを用いることができる。かような機能は、ｍＲＮＡに対してハイブリッドを形成し、二本鎖分子を形成して遺伝子の翻訳を阻害する。他方、リボザイムは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼト同様内その他の一本鎖ＲＮＡを特異的に分解できる能力を有するＲＮＡ分子を意味する。
本発明のブロック共重合体と核酸との複合体を形成させる方法としては、ブロック共重合体および核酸が溶解した極性有機溶媒含有水溶液中の極性有機溶媒の含有率を低下させる方法を用いることができる。該極性有機溶媒としては、限定されるものではないが、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、アセトン、メチルエチルケトン、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−メチル−１−プロパノール、２−ブタノール、２−メチル−２−プロパノール、テトラヒドロフラン、ジオキサンからなる群より、１又は複数を用いることができる。極性有機溶媒含有水溶液中の極性有機溶媒の含有率を低下させる方法としては、限定されるものではないが、透析又は留去による方法や、水溶液で希釈した後、必要に応じて限外ろ過等の方法により濃縮する方法などが挙げられる。
本発明の複合体を形成させる際のブロック共重合体と核酸は、［ブロック共重合体中のカチオン残基のモル濃度］／［核酸中のリン酸基のモル濃度］で定義されるＮ／Ｐ比が、１〜５０となるように混合されることが好ましく、より好ましくは２〜２０の場合であり、さらに好ましくは４〜１０の場合である。ここで、ブロック共重合体中のカチオン残基のモル濃度とは、ブロック共重合体中のポリアミノ酸鎖ブロックに含有される、リシン残基のモル数、オルニチン残基のモル数、アルギニン残基のモル数、ホモアルギニン残基のモル数及びヒスチジン残基のモル数、リシン又はオルニチン残基に疎水性基が結合し、結合により二級アミノ基が生成する場合には該疎水性基が結合したリシン又はオルニチン残基のモル数、ヒスチジン残基に疎水性基が結合している場合には該疎水性基が結合したヒスチジン残基のモル数、の総和として算出することができる。例えば、ブロック共重合体が一般式Ｉ又はＩＩで表される場合のカチオン残基のモル濃度は、ＱにおけるＮＨ２で表される置換基のモル数、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２で表される置換基のモル数、式ＩＶで表される置換基のモル数、Ｂにおける−ＮＨ−を介してポリアミノ酸ブロックに結合している疎水性置換基のモル数、Ｂにおける式ＩＩＩで表される置換基を介してポリアミノ酸ブロックに結合している疎水性置換基のモル数、の総和から算出することができる。
0005467366.tif 000006
本発明のブロック共重合体と核酸との複合体は、平均粒子径が１０〜３００ｎｍの粒子であることが好ましいが、より好ましくは平均粒子径が２０ｎｍ〜２００ｎｍの場合である。
本発明のブロック共重合体と核酸との複合体は、ゼータ電位が−１０〜１０ｍＶであることが好ましい。さらに好ましくは−５〜５ｍＶである。
本発明によれば、ブロック共重合体と核酸の複合体は、以下のような特性及び利点を有する。
特性
核酸と緩やかな条件で調製が可能であることから核酸を不安定化することなく安定に生産できる。更に核酸との結合状態は可逆的であることから核酸の化学的構造変化を伴わないため核酸の持つ特性、作用を損なわない。
利点
製造が簡単であるため工業的な生産性に優れているため医療経済上の利点ともなる。生体内などでの安定性が高く、例えば注射剤として投与された後の有効利用される率が格段に改善されるため投与量の大幅な軽減による医療経済上の改善や効果的な薬理作用の発現が期待される。投与量の低減は、核酸に対する免疫応答の惹起や化学修飾オリゴ核酸による血液凝固系への影響などの副作用の抑制などの観点でも有用である。
以下、具体例を挙げて本発明をさらに説明するが、これらは本発明の理解を容易にするためのものであり、本発明をこれらに限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０００６】
実施例１：  ポリエチレングリコール−ポリ（Ｌ−リシン）ブロック共重合体の合成及び該重合体へのコレステロール基の導入
（１）Ｍｗ（重量平均分子量）１２０００のα−メトキシ−ω−アミノポリ（エチレングリコール）（日油株式会社）１．５ｇをジメチルスルホキシド２２．５ｍｌに溶解し、ε−トリフルオロアセチル−Ｌ−リシンのＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）１．５ｇ（ポリエチレングリコールに対し４５等量）のジメチルスルホキシド溶液２２．５ｍｌを加え、３５℃で４８時間反応を行った。こうして得られたポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（ε−トリフルオロアセチル−Ｌ−リシン）（ＰＥＧ−Ｐ（Ｌｙｓ（ＴＦＡ）））をメタノール３００ｍｌ、１Ｎ  ＮａＯＨ３０ｍｌに溶解し、３５℃で６時間撹拌することによって脱保護を行った。この溶液は、分画分子量６０００〜８０００の再生セルロース製透析チューブ（Ｓｐｅｔｒａ／Ｐｏｒ  １、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用い、０．０１Ｎ  ＨＣｌに対して３回透析を行うことにより精製した。透析膜内の溶液を凍結乾燥し、２．２ｇのポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（Ｌ−リシン）（ＰＥＧ−Ｐ（Ｌｙｓ））の塩酸塩を得た。１Ｈ−ＮＭＲによる解析から、Ｐ（Ｌｙｓ）部分の重合度は４０であった。
（２）コレステロール基の導入（その１）
ＰＥＧ−Ｐ（Ｌｙｓ）の塩酸塩５０ｍｇをメタノール２．５ｍｌに溶解し、コレステリルクロロホルメート４．８ｍｇ（リシンユニットに対するモル分率１０％）の塩化メチレン溶液２．５ｍｌを加え、さらにトリエチルアミン３０μｌを添加した後に室温で２４時間攪拌した。反応溶液をジエチルエーテル溶液１５０ｍｌへ滴下することで、ポリマーを析出させた。このポリマーを減圧濾過により回収した後、０．０１Ｎ塩酸水溶液５ｍｌ及びメタノール５ｍｌを加えて溶解させ、分画分子量６０００−８０００の透析膜を用いて、５００ｍｌの０．０１Ｎ塩酸水溶液に対し２時間の透析を２回行った。透析外液を５００ｍｌの水に交換し、さらに２時間透析を行った後に、透析膜内の溶液を凍結乾燥することにより白色固体の目的物であるＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）の塩酸塩３８ｍｇを得た（以下、ＰＰＬＣ１と称す）。
得られたポリマーの構造は、１Ｈ−ＮＭＲにより分析した（スペクトラムは図１参照）。
ＮＭＲ用の溶媒としては、メタノール−ｄ４とクロロホルム−ｄを体積比１：１で混合したものを用いた。コレステロール基の導入率は、コレステロール基に由来するメチル基のプロトン（ＣＨ３：０．６ｐｐｍ）とＰＥＧのメチレン基のプロトン（ＯＣＨ２ＣＨ２：３．５ｐｐｍ）のピークの強度比から算出した。本実施例で得られたＰＰＬＣ１では、全リシンユニット中の１１％に対し、コレステロール基が導入されていた。
実施例２：  ポリエチレングリコール−ポリ（Ｌ−リシン）ブロック共重合体へのコレステロール基の導入（その２）
コレステリルクロロホルメートの添加量を変えた以外は実施例２と同様にして、ＰＰＬＣ（２）〜（５）を得た。コレステリルクロロホルメートの添加量、リシンユニットに対するコレステリルクロロホルメートのモル分率および１Ｈ−ＮＭＲにより分析したリシンユニットに対するコレステロール基の導入率を表１に示した。なお、コレステリルクロロホルメートをリシンユニットに対し７０％添加したＰＰＬＣ５はＮＭＲ溶媒に溶解せず、導入量の算出はできなかった。
【表１】
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実施例３：  ポリエチレングリコール−ポリ（Ｌ−リシン）ブロック共重合体へのステアロイル基の導入
ステアリン酸１．８７ｇをジクロロメタン５０ｍｌに溶解させ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド０．７６ｇ及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩１．２５ｇを添加し室温で２４時間撹拌した。反応後の溶液に水１００ｍｌを加え、分液漏斗により分液を行った。得られた有機層は硫酸マグネシウムを加え脱水し、エバポレーターにより濃縮を行った。この溶液を２０倍体積のエタノール中に滴下することで、白色の沈殿が生成した。ろ過により沈殿を回収し、減圧乾燥を行いＮ−スクシンイミジルステアレートを得た。
ＰＥＧ−Ｐ（Ｌｙｓ）の塩酸塩５０ｍｇをメタノール２．５ｍｌに溶解し、Ｎ−スクシンイミジルステアレート１６．４ｍｇ（リシンユニットに対するモル分率４０％）の塩化メチレン溶液２．５ｍｌを加え、さらにジイソプロピルエチルアミン３７．５μｌを添加した後に室温で２４時間攪拌した。反応溶液をジエチルエーテル溶液６００ｍｌへ滴下することで、ポリマーを析出させた。このポリマーを減圧濾過により回収した後、０．０１Ｎ塩酸水溶液５ｍｌ及びメタノール５ｍｌを加えて溶解させ、分画分子量６０００−８０００の透析膜を用いて０．０１Ｎ塩酸水溶液５００ｍｌに対し２時間の透析を２回行った。透析外液を５００ｍｌの水に交換し、さらに２時間透析を行った後に、透析膜内の溶液を凍結乾燥することにより白色固体の目的物であるＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ｓｔｅａｒｏｙｌ）の塩酸塩を得た（以下、ＰＰＬＳ１と称す）。
実施例１と同様に、１Ｈ−ＮＭＲによりＰＰＬＳ１の分析を行った（スペクトラムは図２参照）。ステアロイル基の導入率はメチル基のプロトン（ＣＨ３：０．８ｐｐｍ）とＰＥＧのメチレン基のプロトン（ＯＣＨ２ＣＨ２：３．５ｐｐｍ）のピークの強度比から算出した。本実施例で得られたＰＰＬＳ１では、全リシンユニット中の４０％に対し、ステアロイル基が導入されていた。
実施例４：  ポリエチレングリコール−ポリ（Ｌ−リシン−ε−ベンジルオキシカルボニル）−ポリ（Ｌ−リシン）ブロック共重合体の合成
（１）Ｍｗ（重量平均分子量）１２０００のα−メトキシ−ω−アミノポリ（エチレングリコール）（日油株式会社）１．５ｇをジメチルスルホキシド２２．５ｍｌに溶解し、ε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リシンのＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）１．０３ｇ（ポリエチレングリコールに対し２７等量）およびε−トリフルオロアセチル−Ｌ−リシンのＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）６０３ｍｇ（ポリエチレングリコールに対し１８等量）のジメチルスルホキシド溶液２４．５ｍｌを加え３５℃で４８時間反応を行った。こうして得られたポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（ε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リシン／ε−トリフルオロアセチル−Ｌ−リシン）（ＰＥＧ−Ｐ（Ｌｙｓ（Ｚ）／Ｌｙｓ（ＴＦＡ））をメタノール３００ｍｌ、１Ｎ  ＮａＯＨ３０ｍｌに溶解し、３５℃で６時間撹拌することによって脱保護を行った。この溶液は、分画分子量６０００〜８０００の再生セルロース製透析チューブ（Ｓｐｅｔｒａ／Ｐｏｒ  １、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用い、０．０１Ｎ  ＨＣｌに対して３回透析を行うことにより精製した。透析膜内の溶液を凍結乾燥することにより、ポリアミノ酸ブロックとして、ランダムにε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リシン基とＬ−リシン基が重合されたポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（ε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リシン／Ｌ−リシン）（ＰＥＧ−Ｐ（Ｌｙｓ（Ｚ）／Ｌｙｓ）の塩酸塩２．０ｇを得た（以下ＰＰＬＺと称す）。１Ｈ−ＮＭＲによる解析から、ポリマー当たりのε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リシンユニットの含有数は２４であり、Ｌ−リシンユニットの含有数は１６であった。
実施例５：  ポリエチレングリコール−ポリ（Ｌ−リシン−ε−ベンジルオキシカルボニル）−ポリ（Ｌ−リシン）ブロック共重合体の合成
（１）Ｍｗ（重量平均分子量）１２０００のα−メトキシ−ω−アミノポリ（エチレングリコール）（日油株式会社）１．５ｇをジメチルスルホキシド２２．５ｍｌに溶解し、ε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リシンのＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）１．０３ｇ（ポリエチレングリコールに対し２７等量）のジメチルスルホキシド溶液１５．５ｍｌを加え３５℃で２４時間反応を行った後、ε−トリフルオロアセチル−Ｌ−リシンのＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）６０３ｍｇ（ポリエチレングリコールに対し１８等量）のジメチルスルホキシド溶液９ｍｌを加え、３５℃でさらに２４時間反応を行った。こうして得られたポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（ε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リシン）−ブロック−ポリ（ε−トリフルオロアセチル−Ｌ−リシン）（ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（Ｚ）−ｂｌｏｃｋ−ＰＬｙｓ（ＴＦＡ））をメタノール３００ｍｌ、１Ｎ  ＮａＯＨ３０ｍｌに溶解し、３５℃で６時間撹拌することによって脱保護を行った。この溶液は、分画分子量６０００〜８０００の再生セルロース製透析チューブ（Ｓｐｅｔｒａ／Ｐｏｒ  １、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用い、０．０１Ｎ  ＨＣｌに対して３回透析を行うことにより精製した。透析膜内の溶液を凍結乾燥し、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リシン）、及びポリ（Ｌ−リシン）がトリブロックを形成したポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（ε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リシン）−ブロック−ポリ（Ｌ−リシン）（ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（Ｚ）−ＰＬｙｓ）の塩酸塩２．０ｇを得た（以下ＰＰＬＺｂと称す）。１Ｈ−ＮＭＲによる解析から、ポリ（ε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リシン）部分の重合度は２４であり、ポリ（Ｌ−リシン）部分の重合度は１６であった。
実施例４：  粒子の調製
本実施例で用いるｓｉＲＮＡは、ウミホタルルシフェラーゼ遺伝子を標的として設計されたものであり、センス鎖として５’−ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡｄＴｄＴ−３’、アンチセンス鎖として５’−ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＡＡＧｄＴｄＴ−３’を用い、常法により２重鎖を形成させたものであり、株式会社日本イージーティーに合成を依頼し、購入したものである。
ｓｉＲＮＡをｐＨ７．４の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（１．０ｍｌ）に溶解させ、２０μＭに調製した。このｓｉＲＮＡ溶液２５０μｌに対し、目的のＮ／Ｐ比を満たすように濃度を調製したＰＰＬＣ１のＤＭＦ溶液を２５０μｌ加え、混合した。なおＮ／Ｐ比とは、［ブロック共重合体中のカチオン残基の濃度］／［核酸中のリン酸基濃度］である。この溶液を分画分子量１００００の透析キット（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔ、Ｐｉｅｒｃｅ）を用い、ｐＨ７．４の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ５０ｍｌに対し、４時間の透析を３回行うことで、ｓｉＲＮＡを内包した粒子の溶液を得た。粒子の溶液は、ｐＨ７．４の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒにより希釈するか、または遠心ろ過ユニット（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により濃縮を行い、適宜濃度を調製した。
また、ＰＰＬＣ２〜ＰＰＬＣ４、ＰＰＬＳ１、ＰＰＬＺ、ＰＰＬＺｂ及びＰＥＧ−Ｐ（Ｌｙｓ）についても同様に粒子を調製した。
実施例５：  電気泳動によるキャラクタリゼーション
ポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ  ２０％  ＴＢＥ  Ｇｅｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、１００ｎｇのｓｉＲＮＡを含有する各粒子の溶液をロードし、ＴＢＥ溶液を泳動バッファーとして用い、引加電圧１００Ｖ、泳動時間１時間の条件で泳動を行った。終了後、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により染色を行い、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により画像化した。
図３に結果を示す。ｓｉＲＮＡが粒子に取り込まれた場合には電気泳動での泳動度が小さくなるため、フリーのｓｉＲＮＡ由来のバンドは消失する。全てのポリマーにおいて、Ｎ／Ｐ比が１．５以上の場合にフリーのｓｉＲＮＡ由来のバンドは確認できなくなり、ほぼ全てのｓｉＲＮＡが粒子に取り込まれていた。
実施例６：  動的光散乱法（ＤＬＳ）によるキャラクタリゼーション
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用い、動的光散乱法により各粒子の多分散度（ＰＤＩ）、キュムラント平均粒径及び粒子径分布のヒストグラムの測定を行った。各粒子溶液は、それぞれｓｉＲＮＡ濃度が５μＭとなるように調製したものを用いた。
結果を図４〜６に示す。図４の結果から、疎水基を持たないＰＥＧ−ＰＬｙｓを用いて形成させた粒子はＰＤＩが大きく、不均一な会合体が形成されていた。これに対しＰＰＬＣ１〜ＰＰＬＣ４を用いて形成させた粒子においてはＰＤＩの値は小さく、より分布の狭い粒子が形成されていた。特にリシンユニットに対しコレステロールが２４％以上導入されたＰＰＬＣ２〜４を用いて形成させた粒子の場合には、ＰＤＩは０．２５以下となり、単分散な粒子を得ることができた。
また、図５の結果からＰＰＬＣ１〜ＰＰＬＣ４を用いて形成させた粒子では、いずれのＮ／Ｐ比においてもキュムラント平均粒子径は４０〜１００ｎｍであった。代表的な例として、ＰＰＬＣ２を用いｓｉＲＮＡとＮ／Ｐ比６で形成させた粒子の粒子径分布のヒストグラムを図６に示した。
実施例７：  ゼータ電位測定によるキャラクタリゼーション
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用い、ＰＰＬＣ２を用いて形成させた粒子のゼータ電位を測定した結果を図７に示す。Ｎ／Ｐ比１においては負の値を示したものの、Ｎ／Ｐ比１．５〜１０においてはゼータ電位の絶対値は非常に小さく、ほぼ０ｍＶに近いものであった。このようにカチオンの電荷が過剰な条件においてもゼータ電位が小さく保たれていることから、粒子の表面にはＰＥＧ層が存在し、粒子内部の電荷をほぼ完全に遮蔽できていることがわかる。
実施例８：  血中滞留性の評価
本実施例で用いるｓｉＲＮＡは、ウミホタルルシフェラーゼ遺伝子を標的として設計されたｓｉＲＮＡにおいて、アンチセンス鎖の５’末端にＣｙ３標識したものであり、センス鎖として５’−ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡｄＴｄＴ−３’、アンチセンス鎖として５’−Ｃｙ３−ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＡＡＧｄＴｄＴ−３’を用い、常法により２重鎖を形成させたものであり、株式会社日本バイオサービスに合成を依頼し、購入したものである。
各ポリマーを用い、実施例５と同様にしてＣｙ３標識ｓｉＲＮＡを内包する粒子の溶液を得た。これらの溶液に対し、１／２０体積の３Ｍ塩化ナトリウム水溶液を加えることで、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含有する等張液としたものを評価に用いた。
Ｂａｌｂ／ｃマウス（日本チャールズリバー）に対し、尾静脈よりＣｙ３修飾ｓｉＲＮＡ２０μｇを含有する粒子溶液を投与し、一定時間後に下大静脈より血液２００μｌを採取した。次に血液を４℃、２０００Ｇで１０分遠心し、上清から７０μｌの血漿を得た。この血漿に５μｌの１／４００Ｎポリビニル硫酸カリウム溶液（和光純薬工業）を加えた後、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  ＦＬ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｌａｂ  ｓｙｓｔｅｍｓ）により、蛍光強度を測定した（励起波長５４４ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍ）。この蛍光強度から、血中に残存するＣｙ３の定量を行い、血中滞留性を評価した。なお、投与量に対する血漿中の残存率は、マウスの血液量を体重の８０％として算出した。
ＰＰＬＣ２を用いＮ／Ｐ比１．５〜１０で調製した粒子、ＰＰＬＳ１を用いＮ／Ｐ比６で調製した粒子及び粒子化していないｓｉＲＮＡ（ｎａｋｅｄ）の投与後１時間における血中滞留性を評価した結果を表２及び図８に示す。ＰＰＬＣ２ではＮ／Ｐ比１．５〜４に比べ、６〜１０で形成させた粒子は高い滞留性を示した。また、ＰＰＬＳ１を用いてＮ／Ｐ比６で形成させた粒子についても、ＰＰＬＣ２にはやや劣るものの良好な滞留性を示した。
【表２】
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ＰＰＬＣ１〜４及びＰＥＧ−ＰＬｙｓを用い、Ｎ／Ｐ比６で調製した粒子及び粒子化していないｓｉＲＮＡ（ｎａｋｅｄ）の、投与後２時間における血中滞留性を評価した結果を表３及び図９に示す。ｎａｋｅｄ、ＰＥＧ−ＰＬｙｓと比較し、各ＰＰＬＣは高い滞留性を示した。また、ＰＰＬＣ１に比べＰＰＬＣ２〜４はより高い滞留性を示した。
【表３】
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ＰＰＬＺ及びＰＰＬＺｂを用い、Ｎ／Ｐ比８で調製した粒子及び粒子化していないｓｉＲＮＡ（ｎａｋｅｄ）の、投与後２時間における血中滞留性を評価した結果を表４及び図１０に示す。ポリリシンユニット中にランダムにベンジルオキシカルボニル基が導入されたＰＰＬＺは、ｎａｋｅｄに対し約２０倍の高い滞留性を示した。一方、トリブロックポリマーであるＰＰＬＺｂは１００倍以上の非常に高い滞留性を示した。ＰＰＬＺｂを用いて調製した粒子では、ポリエチレングリコールからなるシェル層の内側に疎水性のポリアミノ酸ブロックからなる保護層が形成され、さらにその内側にｓｉＲＮＡが担持されるため、安定にｓｉＲＮＡを保持できると考えられる。
【表４】
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ＰＰＬＣ２を用いＮ／Ｐ比６で調製した粒子及び粒子化していないｓｉＲＮＡ（ｎａｋｅｄ）の、投与後１５分〜４時間までの血中滞留性を評価した結果を表５及び図１１に示す。ＰＰＬＣ２で粒子化したｓｉＲＮＡは、少なくとも投与後２時間まで有意にｎａｋｅｄよりも高い滞留性を示した。
【表５】
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【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明に従う、親水性ポリマー鎖ブロックと、側鎖の一部に疎水性基が導入されたカチオン性ポリアミノ酸鎖ブロックを含んでなるブロック共重合体は、上述した利点ともに、例えば、小分子核酸である、ｓｉＲＮＡとの安定な会合体を形成し、しかもこのような会合体は平均粒径が数十ｎｍ〜数百ｎｍの間で単分散性の粒子を形成し、血流中で長期間滞留性を示すとともに高い細胞導入効率を示す。したがって、限定されるものでないが、治療用遺伝子の標的細胞への送達キャリヤーとして有用であり、製薬または医療産業で利用できる。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図３】
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