(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
痛みに関連する、患者の脊柱の椎間板の細胞の第1領域の特性を示唆する診断情報を供するように備えられる医療診断システムであって、
コンピュータで読み取り可能な形式で書かれたコンピュータで読み取り可能なソフトウエアプログラムであって、NMRスペクトルに関連するデータを処理するように処理装置によって実行され、かつ前記処理されたデータに基づく前記診断情報を供するように備えられているソフトウエアプログラム；及び
前記プログラムを動作させるように備えられた処理装置；
を有し、
前記診断情報は、前記NMRスペクトルから得られた、乳酸関連共鳴及びプロテオグリカン関連共鳴に少なくとも部分的に基づく、
医療診断システム。
【請求項２】
前記診断情報が前記細胞組織の前記第1領域の特性の程度を示唆する、請求項1に記載のシステム。
【請求項３】
前記システムがさらに、前記第1領域での特性と、他の細胞組織の領域での特性との空間的関係を供するように備えられた、請求項2に記載のシステム。
【請求項４】
前記細胞組織の前記第1領域のNMRスペクトルを生成し、かつ前記細胞組織の前記第1領域の特性を示唆する診断情報が供されるような処理が可能な形式で、前記スペクトルに関連するデータを処理するように備えられた核磁気共鳴(NMR)分光システム、
を有する、
請求項1に記載のシステム。
【請求項５】
前記スペクトルに関連する曲線を表示するように備えられたシステムであって、前記曲線の一部は前記診断情報を供する、請求項1に記載のシステム。
【請求項６】
前記情報が、前記椎間板変性の程度を区別するように備えられている、請求項1に記載のシステム。
【請求項７】
前記特性が痛み及び該痛みとの相関を有する痛みの因子のうちの少なくとも1を有する、請求項1に記載のシステム。
【請求項８】
前記診断情報が、前記細胞組織の前記第1領域中のコリンの組成に関連する、請求項1に記載のシステム。
【請求項９】
前記診断情報が、前記細胞組織の前記第1領域中のコンドロイシン硫酸塩に少なくとも部分的に基づく、請求項4に記載のシステム。
【請求項１０】
前記特性が、前記椎間板の水和の程度、前記椎間板に関連するプロテオグリカンマトリックスの破壊程度、及び前記椎間板に関連するコラーゲンマトリックスの破壊程度のうちの少なくとも1を有する、請求項1に記載のシステム。
【請求項１１】
前記NMR分光システムが、前記NMRスペクトルを生成するように備えられたプロトン高分解能マジック角回転法(HR-MAS)分光システムを有する、請求項1に記載のシステム。
【請求項１２】
前記診断情報が、前記第1領域内の、2の化学的因子の各々に関連する少なくとも1の測定されたパラメータの値の比に少なくとも部分的に基づく、請求項1に記載のシステム。
【請求項１３】
前記診断情報がプロテオグリカン関連因子に関連する、請求項1に記載のシステム。
【請求項１４】
前記診断情報が乳酸関連因子に関連する、請求項1に記載のシステム。
【請求項１５】
前記プロテオグリカン関連因子がN-アセチルを有する、請求項13に記載のシステム。
【請求項１６】
前記診断情報がコラーゲン関連因子を有する、請求項1に記載のシステム。
【請求項１７】
前記コラーゲン関連因子がコラーゲンの破壊を示唆する化学物質を有する、請求項16に記載のシステム。
【請求項１８】
前記診断情報が、前記第1領域内の炭水化物に関連する、請求項1に記載のシステム。
【請求項１９】
前記細胞組織の前記第1領域で磁場を発生させるように備えられた磁気コイルをさらに有するシステムであって、
前記診断情報が少なくとも部分的に基づくデータを供するため、
前記磁場は少なくとも1の共鳴を引き起こすのに十分で、かつ
前記少なくとも1の共鳴は前記第1領域のNMRスペクトルに従って十分に特定可能でかつ強い、
請求項1に記載のシステム。
【請求項２０】
乳酸共鳴及びプロテオグリカン関連共鳴のうちの少なくとも1を解析する手段；並びに
前記細胞組織の第1領域中の変性及び痛みのうちの少なくとも1つとの相関を有する前記解析に関連するパラメータの値を生成する手段；
をさらに有する、
請求項1に記載のシステム。
【請求項２１】
前記パラメータが、前記プロテオグリカン関連共鳴についての測定された特徴と他の化学的パラメータの測定された特徴との比を有する、請求項20に記載のシステム。
【請求項２２】
前記パラメータが、前記プロテオグリカン関連共鳴についての測定された特徴と前記乳酸関連共鳴についての測定された特徴との比を有する、請求項20に記載のシステム。
【請求項２３】
前記プロテオグリカン関連共鳴がN-アセチル共鳴を有し、かつ
前記パラメータが、前記N-アセチル共鳴について測定された特徴と、前記乳酸共鳴について測定された特徴との比を有する、
請求項20に記載のシステム。
【請求項２４】
前記解析手段が前記プロテオグリカン関連共鳴を解析するように備えられ、かつ
前記プロテオグリカン関連共鳴がn-アセチル共鳴を有する、
請求項20に記載のシステム。
【請求項２５】
前記細胞の第1領域が前記椎間板の線維輪部分及び髄核部分のうちの少なくとも1を有する、請求項1に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は全般的に、骨格関節に関連する細胞組織の画像化に関し、より詳細には骨格関節、痛み又はそれら両方に関連する医学的条件の特定及び/又は評価に関する。さらに具体的には、本発明は、たとえば骨格関節（たとえば脊椎）に関連する変性又は痛みのような、細胞組織の医学的条件に関連する化学信号、分子信号、構造信号又は他の信号を特定し、局限し、及び/又は評価するための核磁気共鳴(NMR)分光法の利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
椎間板疾患(IVDD)は、腰椎が関連する腰痛の主要原因であり、60%から80%のアメリカ人高齢者に影響を及ぼしているよく知られた医療問題である。椎間板は、力を支え、かつ脊椎の運動を補助する柔軟性の線維軟骨構造である。健康な椎間板は、以下の3の特定組織細胞成分で構成される。それは、1)線維輪、これは柔軟するために椎間板周囲で密に詰められたコラーゲン領域である、2)髄核、これは椎間板中心部に位置し、圧迫されるときに、半径方向に広がることで線維輪を補強して不撓性を維持し、かつ圧迫下で線維輪が座屈しないようにする水和プロテオグリカンである、及び3)髄核と隣接する椎骨とを隔離する終板軟骨、である。
【０００３】
椎間板変性は、複雑な一連の物理的変性過程及び化学的変性過程によって特徴づけられる。IVDDの程度すなわち深刻さは、トンプソングレーディングスケール(Thompson  Grading  Scale)を用いて表されるのが臨床上最も一般的である。トンプソングレーディングスケールでは、1組のパラメータに従って、X線写真による椎間板の検査が行われ、巨視的な形態が変性の程度を判断するのに用いられる。ある調査グループは、椎間板の力学的特性の変化が、変性を伴って“流体状”から“固体状”の振る舞いにシフトすることを示唆していると結論づけた。固定電荷密度(FCD)及び周辺水の生化学的環境もまた、変性に大きく影響を及ぼすということを示した。大きく帯電したプロテオグリカンが水を引き付けて細胞組織を膨張させるので、椎間板の加圧及び脊椎負荷の支持体が直接影響を受ける。トンプソングレードの差異は、たとえば線維輪と髄核の両方に含まれるコラーゲン及びプロテオグリカンのような構成物質の濃度変化を反映する。生化学的破壊、コラーゲンマトリックスの破壊に関連する遺伝子の上方調節、及び力学的負荷の累積的効果のすべてが椎間板の変性過程に影響を及ぼしていると提唱された。
【０００４】
よって椎間板変性の特定及び評価には、何年にもわたる幅広い技術開発及び努力が含まれている。しかしそれでもなお、痛み、痛みの発生又は椎間板の変性に関する因子を評価する、適切で、再現可能な、非侵襲のシステム及び方法が、有効な医療用道具として供されなければならない。
【０００５】
現在の医療では、痛みは、診断すること及び局限することが非常に難しい現象であることが十分に理解されている。このことは特に、骨格関節及び背痛について当てはまる。たとえば痛みを伴う侵害神経を局所的に除去する有向エネルギー源のような、特定の対象である痛みを緩和する治療が可能になったとはいえ、処置する箇所を特定してそこに局限させることが重要な要件となるが、大抵の場合要求される精度を十分に満たすことができない。よって、全体としての痛みの処置において、そのような治療を成功させるのは、かなり困難なことである。
【０００６】
変性椎間板疾患は、衰弱化する背の痛みの主要な原因であるにもかかわらず、適切に治療を行うために条件を評価及び特定する、より良い道具及び方法が強く求められる医療状況の単なる1例に過ぎない。たとえば慢性背痛は、複数の根本原因から生じていると考えられる。たとえばこれらの原因には、脊椎圧迫骨折、変性椎間板疾患、及び椎間板ヘルニアが含まれる。それに加えて、たとえば脊椎のような他の関節痛、又は他の骨格関節（たとえば指関節、足関節、ひざ、尻、肩、手首、ひじ）もまた多くの異なる根本原因（又はそれらの組み合わせ）の結果であると考えられる。これもまた、局限した治療を行うほどに局限するのは非常に難しい。これらの関節すべてに関わる痛みは、その関節自身の結合組織又は緩衝細胞組織(cushioning  tissue)（たとえば脊椎関節の椎間板）、又は骨内部、又は過渡領域（たとえば椎間板と境界をなす椎体の終板）に存在すると考えられる。
【非特許文献１】Haro  H,  Crawford,  H.  J.  Clin.  Invest.  2000年、105巻、pp.143-150
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【非特許文献３】Thompson  JP,  Pearce,  R.H.,  Schechter,  M.  T.,  Adams,  M.  E.,  Tsang,  I.  K.,  Bishop,  P.  B.  Preliminary  evalutation  of  a  scheme  for  grading  the  gross  morphology  of  the  human  intervertebral  disc.  Spine  1990年、15巻、pp.411-415.
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【非特許文献２４】Boos  N,  Wallin,  A.,  Boesch,  CH.  ,  Aebi,  M.  Quantitative  MR  Imaging  of  diurnal  water  content  variations  in  lumbar  intervertebral  disc.  ln:38th  Annual  Meeting,  Orthopeadic  Research  Society.  Washington,  D.  C:  The  Orthopaedic  Research  Society,  1992年、pp.165.
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【非特許文献２６】Burstein  D1  Gray,  M.  L.  et  al.  Diffusion  of  small  solutes  in  cartilage  as  measured  by  nuclear  magnetic  resonance  (NMR)  spectroscopy  and  imaging.  Journal  of  orthopaedic  research  1993年、pp.465-478.
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【非特許文献２８】Koh  K,  Kusaka,  Y.  et  al.  Self  diffusion  coefficient  of  water  in  human  intervertebral  discs  analyzed  by  pulsed  gradient  NMR  method.  ln:39th  Annual  Meeting  Orthopaedic  Research  Society.  San  Francisco,  CA,  1993年
【非特許文献２９】Abdulkarim  JA,  Dhingsa,  R.,  Finlay,  D.  B.  Magnetic  Resonance  Imaging  of  the  Cervical  Spine:  Frequency  of  Degenerative  Changes  in  the  Intervertebral  Disc  with  Relation  to  Age.  Clinical  Radiology  2003年、pp.980-  984.
【非特許文献３０】Swanson  MG,  Vigneron  DB,  Tabatabai  ZL,  et  al.  Proton  HR-MAS  spectroscopy  and  quantitative  pathologic  analysis  of  MRI/3D-MRSI-  targeted  postsurgical  prostate  tissues.  Magnetic  Resonance  in  Medicine  2003年、50巻、pp.944-954.
【非特許文献３１】Schiller  J,  Naji,  L.,  Huster,  D.,  Kaufmann,  J.,  Arnold,  K.  1  H  and  13C  HR-MAS  NMR  investigations  on  native  and  enzymatically  digested  bovine  nasal  cartilage.  Magnetic  Resonance  Materials  in  Physics,  Biology  and  Medicine  2001  :19-27.
【非特許文献３２】Carr  HY,  Purcell,  E.  M.  Effects  of  Diffusion  on  Free  Precession  in  Nuclear  Magnetic  Resonance  Experiments.  Physical  Review  1954年、94巻、pp.630-638.
【非特許文献３３】Kupce  E.  Applications  of  adiabatic  pulses  in  biomolecular  nuclear  magnetic  resonance.  ln:Methods  in  Enzymology,  2001年、pp.82-111.
【非特許文献３４】Mucci  A,  Schenetti,  L.,  Volpi,  N.  1  H  and  13C  nuclear  magnetic  resonance  identification  and  characterization  of  components  of  chondroitin  sulfates  of  various  origin.  Carbohydrate  Polymers  2000年、pp.37-45.
【非特許文献３５】Goupille  P,  Jayson,  M.  I.,  Valat,  J.  P.,  Freemont,  A.J.  Matrix  metalloproteinases:  the  clue  to  intervertebral  disc  degeneration?  Spine  1998年、  23巻、pp.1612-1626.
【非特許文献３６】Kang  JD,  Stefanovic-Racic,  M.,Mclntyre,  L.A.,  Georgescu,  H.I.,  Evans,  CH.  Toward  a  biochemical  understanding  of  human  intervertebral  disc  degeneration  and  herniation.  Contributions  of  nitric  oxide,  interleukins,  prostaglandin  E2,  and  matrix  metalloproteinases.  Spine  1997年、22巻、pp.1065-  1073.
【非特許文献３７】Weiler  C,  Nerlich,  A.G.,  Zipperer,  J.,  Bachmeier,  B.E.,  Boos,  N.  2002  SSE  Award  Competition  in  Basic  Science:  Expression  of  major  matrix  metalloproteinases  is  associated  with  intervertebral  disc  degradation  and  resorption.  European  Spine  Journal  2002年、pp.308-320.
【非特許文献３８】Urban  JP,  Roberts,  S.,  Ralphs,  J.  R.  The  Nucleus  of  the  Intervertebral  Disc  from  Development  to  Degeneration.  ln:American  Zoologist,  2000年、pp.53-61.
【非特許文献３９】Weidenbaum  M,  Foster,  R.J.,  Best,  BA,  Saed-Nejad,  F.,  Nickoloff,  E.,Newhouse  ,  J.,  Ratcliffe,  A.,  Mow,  V.C.  Correlating  magnetic  resonance  imaging  with  the  biochemical  content  of  the  normal  human  intervertebral  disc.  Journal  of  orthopaedic  research  1992年、10巻、pp.552.
【非特許文献４０】Keshari  KR,  Zektzer  AS,  Swanson  MG,  Majumdar  S,  Lotz  JC,  Kurhanewicz  J.  Characterization  of  intervertebral  disc  degeneration  by  high-  resolution  magic  angle  spinning  (HR-MAS)  spectroscopy.  Magn  Reson  Med  2005年、53巻、pp.519-527.
【非特許文献４１】Urban  JP,  Smith  S,  Fairbank  JC.  Nutrition  of  the  intervertebral  disc.Spine  2004年、29巻、pp.2700-2709.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
体内の細胞組織の変性を特定及び評価する改善された非侵襲の道具及び方法が強く求められている。このことは特に、骨格関節、脊椎の椎間関節、並びに椎間板それ自身の内部及び周囲について当てはまる。
【０００８】
体内の痛みを特定、評価及び局限する改善された非侵襲の道具及び方法が強く求められている。このことは特に、骨格関節、脊椎の椎間関節、並びに椎間板それ自身の内部及び周囲について当てはまる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一の態様(aspect)は、有用な情報を供するように備えられた非侵襲の画像診断法を有する医療診断システムを供する。その有用な情報は細胞組織領域の特性の程度を示唆し、その程度はその特性に関連する因子の化学信号に基づく。
【００１０】
NMR分光法を用いて得られるスペクトルは、椎間板の線維輪及び髄核から得られるスペクトルと非常に似ている。トンプソングレードが増大するに従って、視覚的に明らかな違いが、椎間板の線維輪及び髄核のスペクトル中で観測される。N-アセチルとコリン領域との領域比、及びコリンと炭水化物領域との領域比は、個々の比の重なりが最小の状態にしながら、トンプソングレードが増大する椎間板間での区別を可能にする。
【００１１】
この態様の一の形態(mode)に従うと、その特性は痛みに関連する。
【００１２】
この態様の別な形態に従うと、その特性は細胞組織の変性に関連する。
【００１３】
この態様の別な形態に従うと、そのシステムは骨格関節に関連する特性を示唆する有用な情報を供する。
【００１４】
この態様の別な形態に従うと、そのシステムは椎間節に関連する特性を示唆する有用な情報を供する。
【００１５】
この態様の別な形態に従うと、そのシステムは椎間板に関連する特性を示唆する有用な情報を供する。
【００１６】
この態様の別な形態に従うと、そのシステムは椎間板の変性の程度を示唆する有用な情報を供する。
【００１７】
この態様の別な形態に従うと、そのシステムは、患者が痛みを経験している位置を示唆する有用な情報を供する。
【００１８】
この態様の別な形態に従うと、そのシステムは、細胞組織領域のNMRスペクトルに少なくとも部分的に基づいて有用な情報を供する。
【００１９】
以降で説明する別な態様は医療診断システムである。その医療診断システムは、細胞組織の第1領域に係る特性を示唆する有用な情報を供するように備えられていて、その信号は、その第1領域の核磁気共鳴(NMR)スペクトルに基づく。その特性は細胞組織の変性及び痛みのうちの少なくとも1に関連する。
【００２０】
以降で説明する別な態様は医療診断システムである。その医療診断システムは、細胞組織の第1領域に係る特性を示唆する有用な情報を供するように備えられていて、その信号は、その第1領域の核磁気共鳴(NMR)スペクトルに基づく。その特性は細胞組織の変性に関連する。
【００２１】
以降で説明する別な態様は医療診断システムである。その医療診断システムは、細胞組織の第1領域に係る特性を示唆する有用な情報を供するように備えられていて、その信号は、その第1領域の核磁気共鳴(NMR)スペクトルに基づく。その特性は痛みに関連する。
【００２２】
以降で説明する別な態様は、骨格関節に関連する細胞組織の第1領域に係る特性を特定又は評価するシステムである。この態様は、細胞組織のNMRスペクトルに関連するデータを処理するように備えられた処理装置を有する。その処理は、細胞組織の第1領域に係る特性を示唆する有用な情報が供されるように行われる。
【００２３】
以降で説明する別な態様は、骨格関節に関連する細胞組織の第1領域に係る特性を特定又は評価するシステムである。この特別な態様はNMR分光システムを有し、そのNMR分光システムは、細胞組織の第1領域に係るNMRスペクトルを供し、かつ、そのスペクトルに関連するデータを、細胞組織の第1領域に係る特性を示唆する有用な情報を供するように処理できる形式で供するように備えられている。
【００２４】
以降で説明する別な態様は、骨格関節に関連する細胞組織の第1領域に係る特性を特定又は評価するシステムである。この態様は実質的に非侵襲の画像診断法を有し、その画像診断法は、細胞組織の第1領域に関連する画像データを、その細胞組織の第1領域に係る特性を示唆する有用な情報を供するように処理できる形式で供するように備えられている。
【００２５】
以降で説明する別な態様は、少なくとも椎間板の第1領域に係る特性を特定するシステムである。この態様はNMR分光システムを有し、そのNMR分光システムは、細胞組織の第1領域に係るNMRスペクトルに関連するデータを、その細胞組織の第1領域に係る特性を示唆する有用な情報を供するように処理できる形式で供するように備えられている。
【００２６】
以降で説明する別な態様は、細胞組織の第1領域に係る特性を診断するのに有用な情報を供するシステムである。その特性は、細胞組織の変性又は痛みに関連する。この態様は、コンピュータで読み取り可能な媒体中にコンピュータでの読み取りが可能なソフトウエアプログラムを有する。そのプログラムは、細胞組織の第1領域から取られた核磁気共鳴(NMR)スペクトルからのデータを処理するように備えられている。そのプログラムはさらに、その処理されたデータから有用な情報を供するように備えられている。
【００２７】
本発明の他の態様は、骨格関節に関連する細胞組織の特性を特定、評価、及び/又は局限するシステムである。係る態様はさらに、様々な態様、形態、実施例、変化型、若しくは特徴、又はこれらの結合のうちの任意の1以上を有して良い。
【００２８】
この態様の一形態に従うと、そのシステムは、椎間板の少なくとも一部に係る特性の程度を示唆する有用な情報を供するように備えられている。
【００２９】
別な態様は、患者の骨格関節に関連する細胞組織に係る特性を特定又は評価するシステムである。これは：特性の程度を特定又は評価することを可能にするように、細胞組織のNMR分光に関連する情報を処理するように備えられた処理装置；特性の程度が特定又は評価可能となるように細胞組織に関する分光情報を供するように備えられたNMR分光システム、又は、特性の程度が特定又は評価可能となるように細胞組織に関する情報を供するように備えられた、実質的に非侵襲の画像化診断装置；のうちの少なくとも1を有する。又はそのシステムは上記のうちの2以上を組み合わせたものを有しても良い。
【００３０】
この態様の一形態に従うと、情報は、椎間板の少なくとも一部に係る特性の程度に関する。
【００３１】
本発明の別な態様は、椎間板の少なくとも一部を、その特性の程度について評価するシステムである。このシステムは、その一部に関するスペクトルを取得するように備えられたNMR分光システムを有する。そのスペクトルは、その特性の程度の少なくとも一部を示唆するのに有用な情報を供する。
【００３２】
前述の態様及び形態に係る一の実施例(embodiment)に従うと、各システムは、椎間板の線維輪若しくは髄核のいずれか又は両方に基づく情報を生成するように備えられている。
【００３３】
別な実施例に従うと、そのシステムは、そのスペクトルに関連する曲線を表示するように備えられている。その曲線の一部は情報を供する。
【００３４】
別な実施例に従うと、その情報は、椎間板の変性程度を区別するように備えられている。一の特に有利である別な実施例に従うと、その情報は、トンプソンスケールを参照することによって、変性程度を区別するように備えられている。
【００３５】
別な実施例に従うと、その特性は、痛み、又は痛みとの相関を有する少なくとも1の因子のうちの少なくとも1を有する。
【００３６】
別な実施例に従うと、その情報は、スペクトルに係る、N-アセチルとコリン領域との共鳴比、及びコリンと炭水化物領域との共鳴比に関連する。
【００３７】
別な実施例に従うと、その情報は、コンドロイタン硫酸塩(condroitan  sulfate)若しくは代謝体、又はその変性物に関する。
【００３８】
別な実施例に従うと、その情報は、椎間板の化学成分の緩和時間T1及びT2のうちの少なくとも1に関する。
【００３９】
別な実施例に従うと、その特性は、椎間板の脱水の程度、椎間板のプロテオグリカンマトリックスの衰弱の程度、及びコラーゲンマトリックスの衰弱の程度のうちの少なくとも1を有する。
【００４０】
別な実施例に従うと、そのシステムは、その情報を生成するように備えられたプロトン高分解能マジック角回転法分光システムをさらに有する。
【００４１】
本発明の別な態様は、骨格関節に関連する細胞組織の特性を特定又は評価する方法である。本明細書で説明された、前述の方法に係る態様、形態、実施例、変化型若しくは特徴又はこれらの結合のうちの少なくとも1以上は、この方法を進化させるのに用いられて良い。
【００４２】
この態様の一の別な形態は、椎間板の少なくとも一部に係る特性の程度を示唆する情報を供する手順をさらに有する。
【００４３】
別な態様は、患者の骨格関節に関連する細胞組織の特性を特定又は評価する方法に関する。その別な態様は以下の手順のうちの少なくとも1を有する：特性の程度の特定又は評価を可能にするように、その細胞組織のNMR分光に関する情報を処理する手順；その特性の程度が特定又は評価可能となるように、その細胞組織に関する分光情報をNMR分光システムから供する手順；又は、その特性の程度が特定又は評価可能となるように、その細胞組織に対して実質的に非侵襲である画像化診断装置からその細胞組織に関する情報を供する手順、又は前述のうちの1以上を組み合わせたものが用いられても良い。
【００４４】
この態様の一形態は、その情報に基づく椎間板の少なくとも一部に係る特性の程度を決定する手順を有する。
【００４５】
本発明の別な態様は、椎間板の少なくとも一部に係る特性を評価する方法である。またその別な態様は、NMR分光システムを用いて、その一部に関するスペクトルを得る手順を有する。そのスペクトルは、その特性の程度の少なくとも一部を表す情報を供する。
【００４６】
説明した様々な方法態様及び形態に係る一の実施例に従うと、生成される情報は、椎間板の線維輪部分及び/又は髄核部分に基づいている。
【００４７】
別な実施例では、スペクトルに関する曲線が表示される。その曲線の一部はその情報を供する。
【００４８】
別な実施例は、その情報に基づく椎間板の変性程度を区別する手順を有する。さらに別な実施例は、その情報に基づくトンプソングレードに関連して椎間板の変性程度を区別する手順をさらに有する。
【００４９】
別な実施例は、その情報に基づいて、椎間板と、痛みの程度又は痛みとの相関がある少なくとも1の因子との相関を与える手順を有する。
【００５０】
別な実施例に従うと、その情報は、そのスペクトルの、N-アセチルでの共鳴のうちの少なくとも1とコリン領域との比、及びコリンと炭水化物領域との比に関する。
【００５１】
別な実施例に従うと、その情報は、コンドロチン硫酸塩若しくは代謝体又はこれらの変性生成物に関する。
【００５２】
別な実施例に従うと、その情報は、椎間板スペクトルの化学成分に係る緩和時間T1及びT2のうちの少なくとも1に関する。
【００５３】
別な実施例に従うと、その特性は、椎間板の脱水程度、椎間板のプロテオグリカンマトリックスの衰弱程度、及びコラーゲンマトリックスの衰弱程度のうちの少なくとも1に関する。
【００５４】
別な実施例は、プロトン高分解能マジック角回転法分光システムを少なくとも部分的に用いてその情報を生成する手順を有する。
【００５５】
さらに以降で説明される様々な態様については、別な形態が、細胞組織内で認識される、乳酸、プロテオグリカン、又はコラーゲンに関する化学成分のうちの少なくとも1に基づいて細胞組織の特性を有利に非侵襲解析する手順を有する。たとえば特定の有利な形態は、これらの信号の認識された特徴の比を比較する手順を有する。一の非常に有利な実施例は、そのような因子のNMR共鳴に基づく。本実施例中で与えられたような他の利点のうち、2以上の係る共鳴（たとえば具体的には共鳴ピーク又は共鳴の存在する範囲を示唆する他の特徴）を比較することで、対象となる細胞組織の特定状態の程度（たとえば変性又は痛みの程度）を示唆する特徴的な結果が供される。
【００５６】
以降で供される態様に係る他の特に有利な一形態は、NMR分光法の利用を含む。一の実施例では、係る分光法は8テスラよりも大きな値で動作する装置を有し、別な実施例では、約11テスラから12テスラの間で動作する装置を有する。別な実施例では、その装置は約4テスラから10テスラの間で動作し、具体的には約7テスラで動作する。別な実施例では、その装置は約2テスラから4テスラの間で動作し、具体的には約3テスラで動作する。別な実施例では、その装置は約3テスラ未満で動作し、具体的には約1.5テスラで動作する。テスラの値が低い装置では、狙っている特定範囲内に収まる信号の、パスフィルタの増強、増幅、又はゲインを用いるさらに別な実施例も考えられる。その信号はたとえば、意図した非侵襲治療で検討される特定の因子と相関を有する認識された信号として狙っている特定のピーク共鳴周波数のようなものである。
【００５７】
本明細書で説明される、各態様、形態、実施例、変化型又は特徴は、他との併用を必要とせずに、それぞれが独立して有利なものと考えられている。しかしこれらの係る結合もまた、さらに別に独立した本発明の態様と考えられる。
【００５８】
本発明の他の態様は、本明細書の以降の箇所で明らかにされる。その態様は、請求項中に表されているような限定を含まない。たとえ係る好適実施例が、特に価値ある利点及び利用を供するものとして説明できるとしても、詳細な説明は、必ずしも本発明に限定することなく、本発明の典型的かつ好適実施例を説明することを目的とする。
【００５９】
図をより詳細に参照すると、例として、本発明は一般に、図1Xから図6B、及び表1に示される装置で実施され、図7A-B及び表2に反映されている特定形態に従ってさらに発展する。本明細書で開示された基本的な考え方から逸脱することなく、装置に係る部品の配置及び詳細が変化して良いこと、及び方法に係る特定の手順及び順序が変化して良いことは、明らかである。
【発明の効果】
【００６０】
ここでNMR分光を用いて特定の材料又は化学成分についての椎間板変性評価を行う能力について開示する。NMRスペクトルとの兆候とトンプソングレードとの間で、非侵襲の場合での関連が得られることで、医療及び調査での様々な用途にとって非常に大きな利点が得られる。本発明は、椎間板変性に係る特定の状態又は位置に、さらには痛み又は痛みを発生させる因子の特定について関連するマーカーの特定及び評価を非侵襲で行う能力を供するという点で非常に有利である。
【００６１】
本発明の様々な態様、形態、実施例、変化型、及び特徴は、後述する1以上の例で供されているように、実行された1以上の実験及び本明細書でなされている議論を参照することによって明らかとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６２】
1.序論
本調査の目標は、椎間板変性の様々な段階を区別する高分解能マジック角回転法NMR分光法の能力を判断することである。17の椎間板が、人の死体から取り出され、かつ化学組成及び変性レベル（トンプソングレード）の増大に対する椎間板の化学的環境変化を決定する、1次元及び2次元の(TOCSY)1HによるHR-MAS分光法、並びに緩和時間T1及びT2計測を用いて解析された。重要な発見は、線維輪から取られた試料に係るスペクトルと、髄核から取られた試料に係るスペクトルとは非常に似ていること、並びに椎間板の線維輪及び髄核試料に係るスペクトルにおいて、トンプソングレードの増大に対して視覚的に明らかな変化が観測されたこと、である。N-アセチルとコリン領域との領域比、及びコリンと炭水化物領域との領域比によって、個々の比の重なりを最小にしながら、トンプソングレードが増大する椎間板間での区別が可能となる。椎間板スペクトルの化学成分に係る緩和時間T1及びT2の変化は、トンプソングレードの増加に対する椎間板の脱水並びにプロテオグリカン及びコラーゲンマトリックスの衰弱程度の変化を反映しているように思われる。この調査結果は、椎間板の変性に関連する化学変化を検出する生体内分光法の利用を支持している。
【００６３】
複数の生体内MRI調査は、IVDDをよりよく評価する試みとして行われてきた。T1及びT2で重みづけられたMRIは、椎間板の構造を解析するのに用いられた。椎間板変性が進むことで、T2で重みづけられた信号強度が減少することが示された。劣化した軟骨中の水のT1値は、変性した試料では大きく減少する。関節軟骨の変性による水の緩和時間T2の変化も観測されるものと思われる。拡散で重みづけられた画像化もまた、椎間板及び軟骨を調査するのに用いられてきた。その画像化によって、変性した状態と相関するものとして、水の量が減少するのが示された。頸椎のMRIでは、年齢が増加するに従って、どの椎間板でも一様に脱水が起こる。我々の調査グループは、これは、損傷又は繰り返されるストレスよりも、より均一な変性によるものに起因していると予測している。3のMR画像化による発見は、巨視的形態の差異化の精度を増大させるが、変性状態は、生体内分光法によって検出可能な化学成分の計測に基づいた方法を用いることによって、より効率的かつより定量的に計測されて良い。
【００６４】
現在、生体内でそのままの状態の椎間板細胞組織の代謝成分を、よりよく評価する非侵襲の方法が強く求められている。化学組成を決定する従来方法は、生化学的手段によるタンパク質の抽出が必要となる。それにより、細胞組織は破壊され、それ以上の調査を行うことができなくなる（たとえば生化学的アッセイ法又は機械的試験）。HR-MAS  NMR分光法は、様々なそのままの状態の生体細胞組織の組成を首尾良く評価するのに用いられる非破壊的方法である。軟骨の変性は、牛の鼻軟骨を変性させるコラゲナーゼを用いてモデル化された。変性生成物は、高分解能マジック角回転法(HR-MAS)NMR分光法を用いて調査された。これにより、コラーゲンの3重螺旋状構造を有するアミノ酸生成物と牛の細胞組織の自然変性とを比較することが可能となり、人の細胞組織の変性に係るモデルを供する。しかし中間状態の変性の様々な段階に関連する生化学的及び機械的変性の様々な異なるレベルは、依然として、単一のトンプソングレードを用いて評価される。このことは、現在の方法よりも、より記述的な差異化スケールが必要であることを強調している。
【００６５】
本調査の目的は、椎間板変性に関連する化学変化を評価するのにHR-MAS分光法を用いることを示すことである。よって椎間板変性の程度を評価する生体内磁気共鳴分光法を行うとき、同様の代謝変化を計測し、かつ相関させるために、これらのHR-MAS道具及び方法が適切に修正及び調整されて良い。
【００６６】
HR-MAS分光法は、NMRで観測可能な化学物質を特定するため、及び様々な変性段階での椎間板間でのこれらの化学物質の比の差異を決定するため、ある範囲のトンプソングレードにわたって椎間板について行われた。緩和時間測定もまた、椎間板の化学成分の周囲の変化及びその分子の自由度変化を評価するために実行された。
【００６７】
2.材料及び方法
A.細胞組織の取得
本調査は、我々の調査所の審査委員会による承認を得た。腰椎は、n=17体の死体（範囲：22歳から85歳）から外科的手法によって取り出され、-80℃に冷却された。得られた腰椎は、死体解剖用のこぎり及び外科用メスで分離された。椎間板の周りの骨は、椎間板から除去及び分離された。3mmの組織診が、取り出された椎間板の線維輪及び髄核領域で開けられた。これらの組織診は、互いに近接するように開けられ、円柱対称であった。平均質量は15.2±3.4mgだった。所与の位置から並んだ3の試料はまた、スペクトルの再現性をテストするのにも用いられた。トンプソングレーディングは、それに忠実であるという大多数の見解が得られている表示器で実行される。全体では、8のトンプソングレード1を有する試料、6のトンプソングレード3を有する試料、及び6のトンプソングレード5を有する試料について調査された。
【００６８】
B.HR-MASデータ取得
HR-MASデータは、バリアンのINOVA分光計を用いて、1.0±0.5℃で、かつ回転速度2250Hzで得られた。INOVA分光計は11.75Tで動作する。またその分光計には4mmのgHXナノプローブが備えられている。1次元スペクトルでは、20000Hz(40ppm)のスペクトル幅にわたり、40000の複合点(complex  point)が得られた。その際の条件は、90°のパルス幅、2秒のHOD分子のプリサチュレーション周期、32の過渡状態、8秒の繰り返し時間（>最長の緩和時間T1の5倍）、2秒の取得時間（>最長の緩和時間T2の5倍）、及び3:36分の全取得時間であった。楕円形状の試料チャンバ及び漏れを防ぐ気密性ねじの上部プラグを有する、特別に設計された18μlのジルコニウム回転子を用いて、試料は解析された。各試料について、0.75wt%のトリメチルシリルプロピオン酸ナトリウム(3-(trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3-d4acid)（D2O+TSP、シグマ-アルドリッヒ社製）を含む3.0μlの酸化重水素がピペットによって回転子の底部に注入された。その後、細胞組織試料の質量が測定され、加えられた。
【００６９】
縦の(T1)緩和時間測定が、0.01秒から2.00秒の可変遅延時間を有する反転回復パルスシーケンスを用いて行われた。横の(T2)緩和時間測定が、回転子で同期された（つまり遅延τ=n/（回転速度）、nは偶数）、10ミリ秒から128ミリ秒範囲のエコー時間を有するCarr-Purcell-Meilboom-Gillパルスシーケンスを用いて行われた。2次元のTOCSYスペクトルについては、4096の複合点が、直接観測軸(F2)で20000Hzのスペクトル幅にわたって得られた。その一方で、256の複合点が、間接観測軸(F1)で6500Hzのスペクトル幅にわたって得られた。TOCSYスペクトルが、2秒のHOD分子のプリサチュレーション/緩和遅延、0.2秒の取得時間、32の定常状態パルス（第1の増分のみ）、16の過渡状態/増分、10から80ミリ秒の範囲の混合時間、States-Habercorn法を用いた位相感度、約5時間12分の全実験時間で得られた。B0とB1の不均一性の効果を最小にするため、回転子で同期された一定の断熱性を有するWURST-8断熱パルス(33)が、等方的混合に用いられた。その断熱パルスは、6500Hzの磁場B1及び444ミリ秒の間隔（1/回転時間）を有する“パンドラの箱”パルス形状発生装置（Pbox、バリアン社製）を用いて発生させた。1次元スペクトルは、代謝体の変性を評価する各2次元実験の前後で得られた。緩和時間T1及びT2の計測は、健康な椎間板及び変性した椎間板の髄核(n=9)及び線維輪(n=12)で行われた。
【００７０】
C.データ処理
データは、バリアン社製VNMR6.1Cソフトウエア（バリアン社製）をオンラインで用いるか、又はACD/ラボ1D及び2DNMR処理用ソフトウエア、バージョン7.0（アドバンストケミストリー社）をオフラインで用いることによって処理された。1次元のFIDsソフトウエアは、指数関数でアポダイゼーションされた。その指数関数は、取得時間の逆数に等しい線広がりを有し、フーリエ変換され、位相が補正され、かつ0.0ppmでのTSPが参照された。緩和時間は、指数関数の最小2乗法による回帰解析を用いて計算された。表の（最小）2乗フィットが有する標準エラーが10%未満の場合にのみ緩和時間は用いられた。TOCSYデータは、F1について3×Nの線形予測を用いて処理され、1024の複合点にゼロが入り（F1のみ）、かつ両方の観測軸についてガウシアンによる重み付けを用いてアポダイゼーションが行われた。
【００７１】
文献から過去に報告された化学シフトを用いて、クロスピークが割り当てられた。データの視覚的評価に基づいて、1Dデータからの3のスペクトル領域が以下のように得られた：N-アセチル領域(1.90-2.10ppm)；コリン頭部基(Cho)領域(3.15-3.30ppm)；及び炭水化物(Carb)領域(3.50-4.20ppm)。N-アセチル/Cho、Cho/Carb及びN-アセチル/Carbで標記されたこれらの比は、炭水化物の領域の合計を1.00に設定した後、各スペクトルについて計算された。各トンプソングレードでは、平均の比及び標準偏差が計算され、かつステューデントのt検定が実行されて、データの統計的有意性が判断された。ここでp値が0.05未満であれば有意であるものとみなした。
【００７２】
3.結果
A.トンプソングレード微分
トンプソングレード1、３，及び5を有する椎間板の線維輪及び髄核に係る代表的な1次元HR-MASスペクトルが、図1-3に図示されている。
【００７３】
図1X、図1Y、及び図1Zは、トンプソングレード1の椎間板から得られた代表的な1次元HR-MASスペクトル（図1X）、そのうちの線維輪領域から得られたスペクトル（図1Y）、及び髄核領域から得られたスペクトル（図1Z）を図示している。矢印は、図1Y、1Zに図示された様々なスペクトルと、図1Xで評価及び図示された椎間板の（複数の）各代表的部分との間の関連を図示している。円は椎間板から取られた3mmの組織診の代表的位置を示している。分解可能なピークには：A:イソロイシン、ロイシン、バリン；B:乳酸、イソロイシン；C:アラニン；F:コンドロイシン硫酸塩のN-アセチル共鳴；G:グルタミン酸；J:リシン；K:コリン；L:ホスホコリン、が含まれる。角カッコで示された領域はコンドロイシン硫酸塩のC-Hピークを示す。
【００７４】
トンプソングレード1の椎間板材料は、非常に柔軟な輪及び水和したゲルの核によって評価される（図１X）。3mmの組織診が、椎間板の線維輪及び髄核領域から取られ、対応するHR-MASスペクトルが図示されている（線維輪は図1Y、髄核は図1Z）。2のHR-MASスペクトルは、2.04ppmを中心とする大きなN-アセチル共鳴、及び3.5から4.0ppmの領域内のコンドロイシン硫酸塩に起因する炭水化物共鳴を示している。それに加えて、乳酸(1.33ppm)、脂質(ppm)、コリン頭部基(3.21-3.25ppm)、及び複数のアミノ酸（アラニン(1.49ppm)、イソロイシン、ロイシン及びバリン）も観測できる。興味深いことに、低トンプソングレードの椎間板では、線維輪（図1Y）と比較して髄核（図1Z）で、一貫して高いスペクトル分解能が観測された。
【００７５】
図2X、図2Y、及び図2Zは、穏やかに変性したトンプソングレード3の椎間板（図2X）、並びに、線維輪（図2Y）及び髄核（図2Z）から取られた対応するHR-MASスペクトルを図示している。トンプソングレード3に関連する形態変化は、椎間板マトリックスの機械的破砕に結びつく脱水である。分光学的には、トンプソングレード3の髄核及び線維輪では、トンプソングレード1の椎間板（それぞれ図1X、図1Y）と比較して、スペクトルの炭水化物領域でのスペクトル分解能が増大する。コリン頭部基を含む共鳴(3.21ppm)でも増大する。
【００７６】
トンプソングレード5の椎間板（図3X）は、その椎間板のさらなる脱水、線維輪での粘液浸潤及び発展する乱れ、髄核の線維組織置換、並びに線維輪と髄核領域との間での視覚的区別の喪失を病理学的に示している。分光学的には、スペクトルのコリン及び炭水化物領域での共鳴の分解能及び強度がさらに増大する。N-アセチル共鳴強度が視覚的に減少し、自由アミノ酸による共鳴の数及び強度が増加する。
【００７７】
表1は、線維輪(A)及び髄核(B)の積分比、並びにステューデントt検定を示している。トンプソングレード1、3及び5の椎間板についての個々の平均±標準偏差のN-アセチル/コリン、コリン/炭水化物、及びN-アセチル/炭水化物の比が統計的に比較されている。トンプソングレード2及び4は、トンプソングレードが主観的であるため、本調査からは省略された。髄核と線維輪の両方について、平均のN-アセチル/コリン及びコリン/炭水化物の比は、全3のトンプソングレード間で大きな違いを示した。その一方で、N-アセチル/炭水化物の比は、トンプソングレード3の髄核から取られた試料とトンプソングレード5の髄核から取られた試料との間でのみ大きく異なった。
【００７８】
グレード1とグレード3については、線維輪と髄核の両方についての比1と比2の差異は、如何なる2のグレード間で比較しても、大きかった。N-アセチル/炭水化物は、グレード1の髄核とグレード5の髄核とを比較したときのみ大きかった。N-アセチル/コリン=積分(1.90-2.10ppm)/積分(3.15-3.30ppm)、コリン/炭水化物=積分(3.15-3.30ppm)/積分(3.50-4.20ppm)で、N-アセチル/炭水化物=積分(1.90-2.10ppm)/積分(3.50-4.20ppm)であった。
【００７９】
図4A-4Dでは、個々の測定結果の重なりを評価するため、3のトンプソングレードについての線維輪（上）及び髄核（下）から得られた個々のN-アセチル/コリン（図4A及び図4B）、及びコリン/炭水化物の比がプロットされている。N-アセチル/コリンの比については、トンプソングレード1の椎間板とトンプソングレード5の椎間板との間では、髄核についての個々の値は重ならなかった。他すべての比較については、個々の値は実質的に重なっていた。コリン/炭水化物の比については、全3のトンプソングレードの線維輪についての個々の値は重ならず、トンプソングレード1とトンプソングレード5の間の髄核についての個々の値も重ならなかった。
【００８０】
B.全相関分光(TOCSY)
1次元のプロトンスペクトルで観測される共鳴を特定するため、2次元のTOCSYスペクトルが得られ、観測されたクロスピークの化学シフトは、これまでに報告されてきた化学シフト値と比較された。図5Aは、トンプソングレード1の椎間板に係るTOCSYスペクトルを図示している。調査された全部で8のトンプソングレード1の椎間板では、限られた数のクロスピークのみが観測できた。そのクロスピークには、アラニン(1.49,1.79ppm)、乳酸(1.35,4.16ppm)及びプロテオグリカンポリマーの炭水化物部分に関連するプロトン、が含まれる。対照的に、調査された6の変性したトンプソングレード5の椎間板に係るTOCSYスペクトルは、より多くの検出可能なクロスピークを示した。そのクロスピークには、イソロイシン(0.92,1.32ppm)、ロイシン(0.98,1.72ppm)、リシン(1.73,3.04ppm)、プロリン(1.73,1.93ppm)、グルタミン(2.14,2.46ppm及び2.14,3.79ppm)、グルタミン酸(2.1,2.36ppm)、ヒドロキシプロリン(2.45,3.45ppm)、及びエタノールアミン(3.15,3.83ppm)が含まれる。TOCSY実験は、1DHR-MASスペクトルでの炭水化物領域(3.5-4.2ppm)での分解可能な共鳴は、多数のアミノ酸、エタノールアミン含有化合物、及びコンドロイシン硫酸塩の崩壊産物に係る砂糖のC-Hプロトンから生じる複合ピークであった。全椎間板の1DHR-MASスペクトルは、3.21ppm及び3.23ppmで2の一重項を示した。3.21ppm及び3.23ppmの一重項は、自由コリン(Cho)及びホスホコリン(PC)の化学シフトにそれぞれ対応する。TOCSY実験はまた、3.55×4.07ppmでのメチレンプロトンのクロスピーク、及び3.62×4.18ppmでのPCのメチレンプロトンのクロスピークをも示した。またスペクトルのコリン領域では、複数の他の小さく、広い共鳴も存在する。これら特定されていない。
【００８１】
C.緩和時間T1及びT2
図6A及び図6Bは、トンプソングレード1、3及び5の椎間板で分解可能な共鳴の平均緩和時間T1及びT2をそれぞれ示す。全トンプソングレードの髄核及び線維輪で分解可能な共鳴の緩和時間T1及びT2のみが測定された。この結果、0.9,1.32,1.49,2.04,3.21及び3.67ppmでの共鳴の緩和時間T1及びT2が測定された。髄核及び線維輪領域で測定された緩和時間T1とT2との間には大きな違いはなかった。従ってこれらの領域の緩和時間は、椎間板のグレード比較に係る統計学的有意性を増大させるために追加された。各トンプソングレードからのこれらの共鳴に係る平均のT1及びT2測定は、大きな変化を示した。そのため、椎間板変性の増大に対する代謝体でのT1及びT2について明らかな傾向は得られなかった。T1の値についての観測可能な傾向は、最初にトンプソングレード3の椎間板で減少し、続いてトンプソングレード5の椎間板で増大した。T2については、すべての観測された共鳴について一貫した傾向は存在しないが、N-アセチル(2.04ppm)、コリン(3.21ppm)及び炭水化物C-H共鳴(3.67ppm)については、トンプソングレードの増加と共に増加する傾向を示した。
【００８２】
4.考察
プロトンHR-MASスペクトルは、椎間板の線維輪及び髄核領域から取られたスペクトルと非常に似ていた。2のスペクトルは、主としてコンドロイシン硫酸塩からの大きなN-アセチル共鳴及び炭水化物共鳴、並びにコリン含有化合物、脂質/乳酸及び複数のアミノ酸からの共鳴を示した。髄核の性質がよりゲル状であるため、トンプソングレード1の椎間板についての線維輪と比べて、髄核内では一貫して高いスペクトル分解能が観測された。
【００８３】
この調査で観測された重要な結果は、トンプソングレードの増加に従って、重要でかつ視覚的に明らかな変化が、椎間板の線維輪及び髄核試料に係るプロトンHR-MASスペクトルで観測されたことである。具体的には、スペクトルでの3.5-4.0ppmでの観測可能な共鳴数がグレードに依存して増加し、かつそのスペクトルの共鳴幅が鮮鋭化した。その鮮鋭化は、この領域での“広い成分”の損失に対応する。それに加えて、スペクトルのコリン含有化合物領域での共鳴に係る信号強度が、トンプソングレードの増大と共に増大し、かつN-アセチル共鳴は相対的に減少した。
【００８４】
同様に、TOCSY椎間板スペクトルでのクロスピークの数及び強度は、トンプソングレードが増大するに従って増加した。変性した髄核及び線維輪のTOCSYスペクトル中に現れる多数のクロスピークは、アミノ酸ヒドロキシプロリン、プロリン、グリシン、リシン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、バリン、グルタミン及びグルタミン酸、並びにエタノールアミンに起因した。これらの多くはコラーゲンの化合物である。アミノ酸共鳴もまた、トンプソングレード5の椎間板の髄核及び線維輪の両方に係る1DプロトンHR-MASスペクトルで著しく大きく見える。コラーゲン崩壊に起因するアミノ酸の観察は、メタロプロテイナーゼを用いた軟骨の温浸に係るNMR調査で過去に観察された。メタロプロテイナーゼ(MMPs)は、椎間板を支えるコラーゲンマトリックスを乱すことによって、椎間板の変性に重要な役割をしていることが疑われている。コラーゲンマトリックスが破壊し、かつコラーゲンの螺旋がその基本構成要素であるアミノ酸に分裂することで、これらの共鳴は、1D及び2DのHR-MASスペクトルでよりよく見えるようになる。
【００８５】
椎間板変性によるコンドロイシン硫酸塩が破壊する代謝体による証拠が存在する。この結論は、炭水化物C-H共鳴(3.5-4.0ppm)の強度及び分解能が増大すること、並びにトンプソングレード1に対してトンプソングレード3及び5では、線維輪及び髄核から取られたプロトンHR-MASスペクトル中でのコンドロイシン硫酸塩のN-アセチル共鳴(2.04ppm)が減少することに基づく。生来の、酵素によって消化された牛の鼻軟骨への従来の1H及び13CのHR-MASによるNMR検査は、N-アセチル共鳴の組成変化を示した。その変化では、最初は未消化の軟骨でのN-アセチル共鳴からN-アセチル及びアミノ酸共鳴を含む複合ピークとなる。コンドロイシン硫酸塩の濃度は椎間板の変性と共に減少する。TOCSY調査は、変性した椎間板スペクトルの3.5-4.0ppm領域内での分解可能な共鳴もまた、多数のアミノ酸を含む化合物、エタノールアミン含有化合物、及び炭水化物のC-H共鳴からなる複合体から生じることを示した。従って変性した椎間板スペクトルでの共鳴の完全な特定は、人の椎間板消化についての調査、並びにコンドロイシン硫酸塩の生化学的アッセイ法（たとえばジメチルメチレンブルー(DMBB)アッセイ法）及びコラーゲン（コラゲナーゼ）の生化学的アッセイ法との相関を必要とする。
【００８６】
N-アセチル共鳴、並びにHR-MASスペクトルのコリン及び炭水化物/アミノ酸領域での共鳴で観測される変化に基づいて、N-アセチル/コリン、コリン/炭水化物、及びN-アセチル/炭水化物の比が調べられて、トンプソングレードの差異をもっと良く供する比が決定された。N-アセチル/コリンの平均比、とコリン/炭水化物の平均比の両方は、全部で3のトンプソングレード間での大きな差異を示した。コリン/炭水化物の比は、全部で3のトンプソングレードについての個々の値についての重なりが最小であることを示す。
【００８７】
コリン/炭水化物の比は、3のトンプソングレードについて、線維輪から取られたスペクトルでは重ならず、髄核から取られたスペクトルでは最小の重なりを有する。このことは、生体内分光では、椎間板の髄核又は線維輪のいずれかから単独でのスペクトル取得は、多くの場合において必要ないので特に有利である。これは、これらが互いに近接していること、及び信号対する雑音の点の両方に起因する利点である。
【００８８】
N-アセチル/コリンの比もまた、椎間板変性の生体内分光にとって有用であると考えられる。その理由は、N-アセチル共鳴は、トンプソングレード1及び3の椎間板では最大のピークであるが、トンプソングレード5の椎間板に係るスペクトルでのコリン及び炭水化物領域以下のレベルにまで減少するからである。実際、髄核と線維輪の両方から得られたトンプソングレード5のスペクトルは、N-アセチルのピークがコリン及び炭水化物領域へ相対的に減少することに基づいて、トンプソングレード1及び3の椎間板スペクトルから、視覚上容易に分離されて良い。
【００８９】
従来の調査では、椎間板及び軟骨変性を評価するため、調査者は水のスピン-格子及びスピン-スピン緩和時間について調査してきた。より水和した細胞組織は、より長い水のT1及びT2を有することが知られ、それらは椎間板変性と共に短くなる。それは細胞組織の水が失われるためだと考えられる。椎間板変性した生成物のT1及びT2の変化とトンプソングレードとの相関についてこれまでに報告はない。
【００９０】
本調査では、椎間板の分解生成物の平均T1及びT2の測定は大きな変化を示した。しかし緩和時間T1での傾向は観測可能であった。T1についての傾向は、最初にトンプソングレード3の椎間板で減少し、続いてトンプソングレード5の椎間板で増大した。トンプソングレード3での破壊生成物に係るT1が最初短くなる様子が観測されたのは、たとえば椎間板変性で水が失われたことに起因すると考えることができる。続くトンプソングレード5でのT1の増大は、たとえば破壊生成物の移動度の増大に起因すると考えることができる。なぜならそれらの生成物はプロテオグリカン及びコラーゲンマトリックスから解放されるからである。
【００９１】
観測されたT2の変化については、破壊生成物すべてにわたって明確な傾向が存在しない。多数の変性椎間板での水と変性生成物の両方に係るT1及びT2を測定することで、本調査で測定された緩和時間を理解するのに有用な情報が供される。
【００９２】
5.まとめ
まとめると、プロトンHR-MASは、椎間板の線維輪及び髄核領域から取られたスペクトルと非常に似たスペクトルを供する。トンプソングレードの増大に対する重要でかつ視覚上明らかな変化が、椎間板からの線維輪及び髄核試料に係るプロトンHR-MASスペクトル内で観測可能である。定量的には、Nアセチル領域での共鳴に係る代謝体のピーク領域とコリン領域での共鳴に係る代謝体のピーク領域との比は、個々の比の重なりを最小にしながらトンプソングレードが増大する椎間板を差別化するのに有用である。椎間板に係るスペクトルの化学成分の緩和時間T1及びT2の変化は、椎間板変性についてこれまでに報告されてきた水の緩和時間の変化とは似ていない。変性の増大に対する椎間板スペクトルの化学成分に係る緩和時間変化は、変性の増大に対する、椎間板の脱水及びプロテオグリカンとコラーゲンマトリックスの破壊程度の両方を反映する。NMR分光の生体内撮像装置は、椎間板変性に関連する化学変化の検出に有用である。
【実施例１】
【００９３】
1.序論
痛みを伴う変性椎間板を評価する従来の画像化法では、形態に係る基準に焦点が当てられてきた。しかし、形態上の知見と患者の症状との間の関連が弱いということはよく知られていることである。この生体調査の目的は、外科手術が行われた患者から取られた椎間板の組織片内の生化学的マーカーを正確に評価する道具として、定量的高分解能マジック角回転法(HR-MAS)NMR分光法を利用することである。痛みを伴う椎間板変性の生化学的兆候を特定するため、背痛のために椎間板切除が行われた患者から得られた椎間板のスペクトルと、脊椎側弯症のために外科手術が行われた患者からなる参照用母集団のスペクトルとが比較された。
【００９４】
2.材料及び方法
スペクトルデータは、4mmのgHXナノプローブが備えられたバリアン(Varian)社製INOVA分光計を用いて、11.7T(500MHz)、1℃、及び2250Hzの回転速度で得られた。特別に設計された35ulの回転子を用いて、椎間板の痛みを伴う患者(n=6)、並びに前部及び/又は後部の脊椎固定術が行われた患者(n=4)、での外科手術で除去された椎間板細胞組織について調査された。基準として、D2O+0.75%TSPを有する細胞組織試料（シグマ-アルドリッヒ(Sigma-Aldrich)社）についての定量的プロトンスペクトルが得られた。各細胞組織試料について、スピンエコー回転子で同期されたCarr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)パルスシーケンス(nt=128,at=2.0s,TR=5s,エコー時間=80ms)が得られた。乳酸共鳴（1.31ppm、二重項）、プロテオグリカン(PG)に関連するn-アセチル共鳴（2.04ppm、一重項）、及びコラーゲン破壊領域(col)(3.30-4.00ppm)が解析され、椎間板の組織片が比較された。これらの領域は、図7A及び図7Bで図示されたより詳細なスペクトル部分で注釈が与えられている。
【００９５】
3.結果
図7A及び図7Bは、(A)椎間板に起因する痛みを伴う患者、及び(B)脊椎側弯症の患者、の典型的な80msの1HのCPMGスペクトルを図示している。プロテオグリカンのn-アセチル共鳴(PG)、乳酸、及びコラーゲン破壊領域(col)が示されている。
【００９６】
奇形の患者と比較して、背痛の患者では、PG/乳酸、及びPG/col比がかなり小さくなっている（p<0.05；図7参照）ことが示された。それに加えて表2は、図7A及び図7Bで示された典型的なスペクトルを生成するために行われた実験に関連する情報の表を示している。
【００９７】
4.考察
本実験から得られた結果は、生化学マーカーが椎間板の痛みと相関する過程を評価するのに有用であることを示唆している。これまでの調査は、プロテオグリカン合成及び全体の健康へのpHの影響について報告している。乳酸濃度が増大することで、椎間板材料の実効的pHは、水溶液中の自由H+の増大に起因して減少する。このことにより、プロテオグリカンの合成が妨げられているものと思われる。
【００９８】
乳酸濃度と痛みとの間の直接的因果関係はこれまで分かっておらず、本実験に関連して、精細生化学的(fine  biochemical)に詳細な説明が与えられた。しかし痛みに対して統計的相関を供するのに乳酸濃度を有利に用いることが、本明細書で実行され、かつまとめられた方法に従って示されている。これは、2のパラメータ間での物理的相関に係る機構に関係なく、痛みの局所的位置を診断する実質的に有用な道具を与える。本明細書で説明された非常に有利なシステム及び方法は、これらの結果の基礎となっている特定の生物学的“因果”についての化学的又は生物学的関係に関係なく、測定された因子を痛みに関連づける非侵襲の道具を可能にするという独自の利点を供する。それにも関わらず、増加した乳酸は、椎間板の治療に関連して細胞組織が粒状をなす際に、神経線維を刺激するものと考えられている。変性段階に一致する、多数の治療上有用な試料を用いたさらなる調査は、本明細書の概要及び他の入手可能な情報に基づいて当業者による実行が可能である。生化学的変性を評価し、椎間板の痛みに関連する分光学的マーカーを特定かつ利用する際に、これら及び他の関心領域の裏付けが取られる。
【００９９】
先の開示に基づいて、NMR分光法が、特に直接的かつ予測可能で、再現可能な、椎間板間のトンプソングレードの相関によって、椎間板の変性の程度に対応させて、椎間板材料を特定及び評価するのに有用であることは明らかである。従ってこれは、本発明に係る1の非常に有利かつ一般的な態様を表す。詳細に説明された1の特別な実施例は、高分解能マジック角回転(HR-MAS)分光法に関する。HR-MAS分光法は、その診療環境で観察される外部から移植された椎間板材料にとって特に有用であることが示された。しかし、他の非常に有利な実施例もまた結果として、生体内の生きている組織の区別される特性に関して、本明細書で開示されている一般的な態様を表す。そのことはたとえば、生きている組織片を利用するように特別に備えられたマジック角回転法分光システムの他の型、又は以降で説明される道具及び方法に係る適切に修正及び調節された態様及び形態に基づく、患者にとって有用な他のNMR分光システムを利用することによって実現されて良い。
【０１００】
たとえば上でまとめられている実施例1で行われたように、診療上の痛みの相関についての大きな信号ピークを分離することによって、係る特定ターゲットは、11.7TのMAS  MRIから十分に拡張され、医療行為で患者に直接的に用いられる装置、たとえば医療現場でより一般的に用いられている3又は1.5TのMRI装置となる。これは特に、たとえば腰椎の特定領域のような関心領域に従って高い局所磁場を生成する特別設計された局所コイルについての追加的利用について当てはまるだろう。
【０１０１】
さらに、細胞組織試料は、たとえば組織診を介して患者から取り出され、かつ高磁場MRI装置のような実験装置で調べられる。高磁場MRI装置とはたとえば、供された例及び説明によって例示された様々なシステム及び方法に従った、有用な患者への治療に用いられる、11.7TでのMAS  MRIである。
【０１０２】
それに加えて、様々な典型的化学物質、及び/又はそれらの特定成分因子は、細胞組織に関連する医療状態に係る非侵襲診断のターゲットとして、本明細書では説明されている。係る化学“因子”は、特定された化学若しくは分子構造それ自身、又はその一部、又は代謝体、変性生成物、又は特定された化学物質とある程度の相関を有するそれらの副生成物を有して良い。しかも本開示は、細胞組織の特定の特性を示唆する診療道具及び方法によって生成される情報を処理する。係る特性はたとえば、痛み又は細胞組織の変性それ自体をそれぞれ有して良い。あるいは、前記第1特性と相関又は因果関係を有する別な第2の特性を有しても良い。たとえば損傷を受けた神経、関連する成長因子、特定型の炎症等は、痛み及び/又は細胞組織変性との因果関係を有すると思われる。これらは、本実施例によって生成される情報によって直接的に示唆される特性であって良い。他方、その示唆された特性から、関連する痛み又は変性についての他の有用な診療及び結論が導かれる。痛み及び変性は、本明細書で説明された診断道具及び方法の分離された結果又はターゲットであって良く、及び結合した結果又はターゲット中で1つになって良い、ということも考えられる。さらに係る特性の程度は、本明細書で説明された新規なシステム及び方法によって特定可能である。これにより、細胞組織内部での係る特性の空間的関係についての別な結果及び結論が導かれる。空間的関係とは、たとえば椎間板、又は椎間板（又は他の細胞組織構造）の一部の高さ位置であって、細胞組織の他の周囲の関節、高さ、又は領域に対して、より痛みを伴っているか、又は変性している。係る位置の特定は、それ自体によって生成される有用な情報の性質であって良い。あるいは係る位置の特定は、生成された有用な情報に基づいて実行される別な解析及び処理によって特定されて良い。
【０１０３】
当業者には、本明細書で供された開示全体に基づく関係が分かる。同様に、以降で開示される方法は、その開示によって明確に検討される各対応するシステム及び装置態様をさらに検討する。係るシステム又は装置態様に対する特定の参照が、方法に関する説明とは別に供されているか否かが検討される。上記は、以降で供される説明、及び「特許請求の範囲」の請求項に関する。たとえ、明示的に記述されていない限りは、必ずしも具体的に特定された態様及び関連する形態及び実施例への限定として適用されるわけではないが、たとえば限定しなくても、「特許請求の範囲」で供されるシステム又は装置クレームに係る特定の機能態様（又は構成要素間での説明された協働）は、係る機能を、本明細書で検討される他の独立した態様として実行する方法としても検討していることが分かる。
【０１０４】
【表１】
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【０１０５】
【表２】
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【０１０６】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】X、Y、Zは、トンプソングレード1の椎間板から得られた代表的な1次元HR-MASスペクトル（図1X）、そのうちの線維輪領域から得られたスペクトル（図1Y）、及び髄核領域から得られたスペクトル（図1Z）を図示している。
【図２】X、Y、Zは、トンプソングレード3の椎間板から得られた代表的な1次元HR-MASスペクトル（図2X）、そのうちの線維輪領域から得られたスペクトル（図2Y）、及び髄核領域から得られたスペクトル（図2Z）を図示している。分解可能なピークには：A:イソロイシン、ロイシン、バリン；B:乳酸、イソロイシン；C:アラニン；D:イソロイシン、ロイシン；E:リシン、ロイシン；F:コンドロイシン硫酸塩のN-アセチル共鳴；G:グルタミン；H:グルタミン酸塩、プロリン；I:グルタミン、ヒドロキシプロリン；J:リシン；K:コリン；L:ホスホコリン；M:ヒドロキシプロピン；N:グリシン；F:コンドロイシン硫酸塩のO:C-H共鳴；P:エタノールアミン；が含まれる。角カッコのついた領域は、コンドロイシン硫酸塩のC-H共鳴を示す。
【図３】X、Y、Zは、トンプソングレード5の椎間板から得られた代表的な1次元HR-MASスペクトル（図2X）、そのうちの線維輪領域から得られたスペクトル（図2Y）、及び髄核領域から得られたスペクトル（図2Z）を図示している。分解可能なピークには：A:イソロイシン、ロイシン、バリン；B:乳酸、イソロイシン；C:アラニン；D:イソロイシン、ロイシン；E:リシン、ロイシン；F:コンドロイシン硫酸塩のN-アセチル共鳴、プロリン、グルタミン酸塩；G:グルタミン；H:グルタミン酸塩、プロリン；I:グルタミン、ヒドロキシプロリン；J:リシン；K:コリン；L:ホスホコリン；M:ヒドロキシプロピン；N:グリシン；F:コンドロイシン硫酸塩のO:C-H共鳴；P:エタノールアミン；が含まれる。
【図４】A-Dは、表1で説明されているように、トンプソングレードに対し、線維輪のN-アセチル/コリン（図4A）及びコリン/炭水化物（図4B）、並びに髄核のN-アセチル/コリン（図4C）及びコリン/炭水化物（図4D）をそれぞれまとめたもの、及びその分布を表すグラフを示している。コリン/炭水化物が最大の統計的有意性を示している。
【図５Ａ】混合時間が80msである、健康な椎間板材料の回転同期した断熱TOCSYスペクトルを図示している。横軸は投影の総和で、縦軸は高分解能1Dスペクトルである。3文字のアミノ酸コードは、アミノ酸のクロスピークを指定する。
【図５Ｂ】混合時間が80msである、指定された椎間板材料の回転同期した断熱TOCSYスペクトルを図示している。指定されたスペクトルでは、健康な状態でのスペクトルには存在しないアミノ酸及びコリン含有化合物の信号が増大している。
【図６Ａ】次の化合物に係る平均のスピン-格子緩和時間を表すグラフを図示している。0.9ppmのイソロイシン、ロイシン及びバリン、1.32ppmの乳酸、1.49ppmのアラニン、2.04ppmのコンドロイチン硫酸塩のN-アセチル部分、3.21ppmのコリン含有化合物、3.67ppmのコンドロイチン硫酸塩に関連する炭化水素残余物のC-H。
【図６Ｂ】図6Aで述べた化合物に係る平均のスピン-スピン緩和時間を表すグラフを図示している。(*)は信号強度が小さすぎるために標準偏差が非常に大きくなっているピークを示している。
【図７】A、Bは、特定の椎間板についてNMR分光を用いて行われた実験から得られた典型的スペクトルを図示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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