(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イースト抽出物を製造する方法であって、以下のステップ：
ａ）タンパク質を含むイーストに、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有するプロテアーゼを添加し；および
ｂ）前記タンパク質を加水分解するために培養すること
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記イーストが、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）またはカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記イーストが、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはサッカロマイセス・ウバルム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍ）である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記プロテアーゼが、０．００５〜１ｍｇ酵素／ｇイースト乾物の濃度である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記プロテアーゼが、０．０１〜０．５ｍｇ酵素／ｇイースト乾物の濃度である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
水性溶液中に前記イーストを懸濁させることをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記イースト懸濁液のｐＨを、より塩基性になるように調整することをさらに含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ステップｂ）の後に、沈殿物および上清を得るために、遠心分離を行うことをさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
加水分解されたタンパク質が、前記上清から回収される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法により製造されたイースト抽出物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、外因性のプロテアーゼを使用して、イースト抽出物を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
イースト抽出物は、たとえば、食品産業における香味料として、微生物の発酵培地中において、および健康食品として広範囲に使用される。イースト抽出物の製造は、刊行物に記載されている（たとえば、Ｋｅｌｌｙ，Ｍ．（１９８２）イースト抽出物（Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｇｏｄｆｒｅｙ，Ｔ編集）または、Ｃｈａｅ，  Ｈ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７６，２５３〜２５８を参照）。それは通常、細胞の酸加水分解または機械的もしくは化学的破壊によるイーストの破壊の後、イーストの巨大分子構造、特にタンパク質、を分解して最大量の溶解性物質とする、内因性酵素を用いた自己融解によって製造される。場合により、パパインのようなプロテアーゼを含む外因性酵素が、イースト自身の酵素の効果を増大させるために添加される。酵素的加水分解の後、イースト抽出物は、細胞残屑物から分離され、そして場合により低温殺菌および濃縮される。濁度は、イースト抽出物の品質基準である。低い濁度は、濃縮および分離をより簡便なものとする。したがって、低濁度のイースト抽出物を製造する方法に対する要求がある。
【０００３】
本発明に適用可能であると分かったプロテアーゼは、以前に記述されている。例えば、ノカルジオプシス種（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ１８２６２由来のプロテアーゼが、国際公開第８８／０３９４７号（ここで前記株は、ノカルジオピシス種株１０Ｒと呼ばれている）および国際公開第０１／５８２７６号に開示されている。有用である、本発明の他の関連するプロテアーゼは、国際公開第８８／０３９４７号、国際公開第０４／１１１２２０号、国際公開第０４／１１１２２２号、国際公開第０４／１１１２２３号、国際公開第０５／１２３９１１号、および国際公開第０４／０７２２７９号に開示されている。
【発明の概要】
【０００４】
発明の概要
本発明は、非常に低濁度のイースト抽出物の、高収率での製造に適用可能であると認められる酵素を特定した。同量の酵素タンパク質で比較した場合、そのようなプロテアーゼは、当技術分野で使用されてきた他のプロテアーゼよりも有効であり、そしてそれは、イースト抽出物の製造者にとって、よりよい製造経済となる。さらに、イースト抽出物が本発明の酵素を用いて調製された時、全乾燥固体のタンパク質含有量は高く、そしてそれは高い純度を反映している。結果的に、本発明は、イースト抽出物を製造する方法であって、以下のステップ、ａ）タンパク質を含むイーストに、配列番号１と少なくとも５０％の同一性を有するプロテアーゼを添加すること；およびｂ）前記タンパク質を加水分解するために培養すること、を含む前記方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
本発明のプロテアーゼの詳細な開示
プロテアーゼ
本明細書で使用される用語「プロテアーゼ」は、ペプチド結合を加水分解する（プロテアーゼ活性を有する）酵素である。プロテアーゼはまた、例えば、ペプチダーゼ、プロテイナーゼ、ペプチドヒドロラーゼまたはタンパク質分解酵素と呼ばれる。
【０００６】
本発明の使用のためのプロテアーゼは、ポリペプチド鎖の内部で作用するエンド型である（エンドペプチダーゼ）。
【０００７】
本発明の使用のためのプロテアーゼの起源について制限はない。したがって、前記用語「プロテアーゼ」は、天然または野生型のプロテアーゼのみならず、シャッフルドプロテアーゼ（ｓｈｕｆｆｌｅｄ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ）およびコンセンサスプロテアーゼ（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ）のような、合成プロテアーゼと同様に、プロテアーゼ活性を示す全ての変異体、変形体、断片なども含む。そのような遺伝子操作されたプロテアーゼは、当技術分野で一般的に知られているとおりに、例えば、ＰＣＲ（ＰＣＲ反応中におけるプライマーの一つとして、所望の変異を含むＰＣＲフラグメントを使用すること）による部位特異的変異誘発によって、またはランダム変異誘発によって調製され得る。コンセンサスタンパク質の調製は、例えば、欧州特許第８９７９８５号明細書に記載されている。本明細書中で使用されているプロテアーゼ変形体の例は、一またはそれ以上のアミノ酸が除去された、導入された、または他のアミノ酸と置換されたプロテアーゼである。
【０００８】
本発明の使用のためのプロテアーゼの例は、
（ｉ）国際公開第０１／５８２７６号に開示されている、ノカルジオプシス種ＮＲＲＬ１８２６２由来のプロテアーゼであって、その配列が本明細書の配列番号１であるもの、
（ii）（ｉ）のプロテアーゼと少なくとも、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０または９５％のアミノ酸の同一性を有するプロテアーゼ。
（iii）プロテアーゼ活性を示す（ｉ）また（ii）の変異体、変形体、または断片である。
【０００９】
本発明の目的のため、２つのアミノ酸配列のアライメントは、エンボス（ＥＭＢＯＳＳ）パッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｏｒｇ）バージョン  ２．８．０からのニードルプログラムを使用して決定され得る。前記ニードルプログラムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３〜４５３に記載されているグローバルアライメントアルゴリズムを実行する。使用された置換行列はブロサム（ＢＬＯＳＵＭ）６２であり、ギャップ・オープニング・ペナルティは１０、ギャップ・エクステンション・ペナルティは０．５である。
【００１０】
二つのアミノ酸配列間の同一性度は、二つの配列のアライメント中における完全一致の数を、前記二つの配列のもっとも短い長さで割ったものとして計算される。結果は、パーセント同一性で表現される。
【００１１】
完全一致は、重なりの同じ場所において二つの配列が同一のアミノ酸残基を有している時に起こる。配列の長さは、配列中のアミノ酸残基の数である（例えば、配列番号１の長さは１８８である）。
【００１２】
本発明の使用に適用可能な細菌性プロテアーゼの例として、国際公開第８８／０３９４７号に開示されているノカルジオプシス・アルバ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ａｌｂａ）（以前のノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ）ＮＲＲＬ１８１３３由来のプロテアーゼ、４つ全て国際公開第０４／１１１２２０号に開示されているノカルジオプシス・ダッソンビレイ亜種・ダッソンビレイＤＳＭ４３２３５、ノカルジオプシス・アルバＤＳＭ１５６４７、ノカルジオプシス亜種ＤＳＭ１６４２４由来のプロテアーゼおよび合成プロテアーゼ２２、国際公開第０４／１１１２２２号に開示されているノカルジオプシス・プラシナ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｐｒａｓｉｎａ）ＤＳＭ１５６４８由来のプロテアーゼ、国際公開第０４／１１１２２３号に開示されているノカルジオプシス・プラシナＤＳＭ１５６４９由来のプロテアーゼ、３つ全て国際公開第０５／１２３９１１号に開示されているノカルジオプシス・プラシナ（以前のノカルジオプシス・アルバ）ＤＳＭ１４０１０、ノカルジオプシス・アルカリフィラ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ａｌｋａｌｉｐｈｉｌａ）ＤＳＭ４４６５７およびノカルジオプシス・ルセンテンシス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｌｕｃｅｎｔｅｎｓｉｓ）ＤＳＭ４４０４８由来のプロテアーゼ、６つ全て国際公開第０４／０７２２７９に開示されているブラキスポリエラ・ガヤナ（Ｂｒａｃｈｙｓｐｏｒｉｅｌｌａ  ｇａｙａｎａ）ＣＧＭＣＣ０８６５、メタリジウム・アニソプリー（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）、グリオクラディウム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ）亜種ＣＢＳ１１４００１、ペリコニア（Ｐｅｒｉｃｏｎｉａ）亜種ＣＢＳ１１４００２、ペリコニア亜種ＣＢＳ１１４０００およびカルブラリア・ルナタＣＢＳ１１４００３、ならびにプロテアーゼ活性を示すこれら全ての変異体、変形体、または断片が挙げられ得る。
【００１３】
本発明の使用のためのプロテアーゼは、細菌性プロテアーゼであって、用語「細菌性」は、前記プロテアーゼが細菌に由来する、または起源を有することを、あるいは細菌由来の類似体、断片、変異体，変形体または合成プロテアーゼであることを示している。それは原型の野生型の細菌株中で、別の細菌株中で、または植物中で産生または発現されてもよい；すなわち、前記用語は、リコンビナントの、遺伝子操作された、または合成されたプロテアーゼの全ての宿主中における発現と同様、野生型、天然で生じるプロテアーゼの発現を含む。
【００１４】
本発明の過程において、プロテアーゼは精製されてもよい。本明細書で使用される用語「精製された」は、それが由来する生物体からの成分が本質的にない酵素タンパク質を含む。用語「精製された」はまた、それが得られる天然の生命体からの成分がない酵素タンパク質を含み、これはまた、「本質的に純粋な」酵素とも呼ばれ、そして特に、天然に生じる酵素であって、一またはそれ以上のアミノ酸残基の除去、置換または導入のように、遺伝的に修飾されていない酵素と関連があってもよい。
【００１５】
したがって、プロテアーゼは精製されてもよく、すなわち少量の他のタンパク質のみが存在している。表現「他のタンパク質」とは、特に他の酵素のことに関する。本明細書で使用される用語「精製された」はまた、他の構成成分、特に他のタンパク質、および何よりも特にプロテアーゼの起源の細胞中に存在する他のタンパク質の除去に関する。プロテアーゼは、「実質的に純粋」、すなわち、それが産生された生物体、例えば組み換えで酵素を産生した宿主生物体、からの他の成分が実質的に無い状態であってもよい。好ましくは、プロテアーゼは少なくとも７５％（ｗ／ｗ）純粋であり、より好ましくは、少なくとも８０％、８５％、９０％、またはさらに少なくとも９５％純粋である。より好ましいもう一つの実施形態において、プロテアーゼは少なくとも９８％純粋な酵素タンパク質調製物である。
【００１６】
しかし、本発明の使用のために、プロテアーゼは純粋である必要は無い。それは、例えば、他の酵素、他のプロテアーゼさえ含んでも良く、そしてその場合には、プロテアーゼ調製物と呼ばれ得る。
【００１７】
本発明のプロテアーゼの使用は、他の酵素、例えば他のプロテアーゼの使用と併用されても良い。一の好ましい実施形態において、エンド型のプロテアーゼ、例えばノカルジオプシス種ＮＲＲＬ１８２６２由来のものは、エキソペプチダーゼ、またはエキソペプチダーゼ活性を有するプロテアーゼ調製物、例えば国際公開第９４／２５５８０号に開示されている、フレーバーザイム（Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ）（登録商標）（ノボエンザイムズ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）Ａ／Ｓ、デンマーク）のようなアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来のプロテアーゼ調製物と併用される。
【００１８】
一の特定の実施形態において、本発明の使用のためのプロテアーゼは、中性に近いｐＨ−活性最適条件を有し、そしてそれは、カゼインの加水分解およびその後のｏ−フタルジアルデヒドおよび２−メルカプトエタノールとのＴＣＡ可溶性ペプチドの反応の後に、生じた複合体の吸光度を３４０ｎｍで測定することによって決定される。
【００１９】
用語「中性に近いｐＨ−活性最適条件」とは、以下の一またはそれ以上を意味する：最適ｐＨは、ｐＨ５．５〜１１．０の間、またはｐＨ７．０〜１１．０の間、またはｐＨ６．０〜１０．０の間、またはｐＨ７．０〜１０．０の間、またはｐＨ８．０〜１１．０の間、またはｐＨ８．０〜１０．０の間である。
【００２０】
別の特定の実施形態において、本発明の使用のためのプロテアーゼは耐熱性である。
【００２１】
用語「耐熱性」とは、以下の一またはそれ以上を意味する：最適温度は、少なくとも５０℃、５２℃、５４℃、５６℃、５８℃、６０℃、６２℃、６４℃、６６℃、６８℃、または少なくとも７０℃であり、そしてそれは、上記のようにガゼインの加水分解によって決定される。
【００２２】
イースト
本明細書における用語「イースト」は、いずれの種のイーストであってもよい。それは、サッカロミセタセア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）科に属していてもよい。一の特定の実施形態において、イーストはサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはサッカロマイセス・ウバルム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍ）である。別の実施形態において、イーストはクリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、例えば、クリベロマイセス・フラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）である。さらに別の実施形態において、イーストはカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、例えば、トルライースト（Ｔｏｒｕｌａ  ｙｅａｓｔ）としても知られているカンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）である。
【００２３】
適用されるイーストは、特に成長したイースト、例えば糖蜜、もしくは廃ビールイースト、またはアルコール発酵から集められたイーストのように、いずれの形態であってもよい。
【００２４】
適用されるイーストは、イースト細胞全体、またはその全部もしくは一部が破壊され、もしくは分解されたイースト細胞であってもよい。
【００２５】
イースト抽出物
イースト抽出物は、そしてそれは本明細書においてイーストの加水分解産物またはイーストの自己融解物と同義であるが、加水分解されたタンパク質を含む、イーストからの溶解性抽出物であって、それは例えば調味料として広く使用される。
【００２６】
本発明に従って、イースト抽出物は、タンパク質加水分解のための外因性プロテアーゼを使用して製造される。添加されるプロテアーゼに加えて、イースト自身は、リパーゼ、ヌクレアーゼ、マンナナーゼ、グルカナーゼおよびプロテアーゼを含む、様々な分解酵素を含有する。これらの外因性酵素の最適温度およびｐＨ値は変化し、そしてそれらは、本発明の方法の条件の下において多かれ少なかれ活性があってもよい。
【００２７】
プロテアーゼの添加前に、イーストは水性懸濁液の形態であってもよい。イースト懸濁液の乾物含量は、５〜５０％の範囲、例えば１０〜３０％の範囲であってもよい。イースト懸濁物のｐＨおよび温度は、問題になっているプロテアーゼの特性に十分に気を遣いながら調整されてもよい。一の実施形態において、イースト懸濁液のｐＨは、より塩基性になるように、例えば、ｐＨ５．５〜９の範囲に、好ましくはｐＨ６〜８の範囲に、またはより好ましくはｐＨ６〜７の範囲になるように調製される。ｐＨおよび温度の調整は、プロテアーゼが添加される前に、添加されるのと同時に、または添加された後に行われてもよい。
【００２８】
プロテアーゼは有効量で、すなわち十分なタンパク質加水分解のために適した量で適用されるべきである。酵素は、以下の量（用量域）の一またはそれ以上で投与されるものと本明細書では考えられる：０．００１〜１；０．００５〜１；０．０１〜０．５；０．０１〜０．２；または０．０１〜０．１、これら全ての範囲は、ｍｇ酵素タンパク質／ｇイースト乾物で表される。
【００２９】
酵素添加の前または後において、イースト細胞は、すなわち温度を上げることにより、分解されてもよい。場合により、塩または有機溶媒のような化学物質が添加されてもよい。この過程は一般的に、原形質分離と呼ばれる。原形質分離および外因性プロテアーゼにより引き起こされるタンパク質加水分解は、同時に行われてもよい。
【００３０】
イースト細胞含有物の自己消化は一般的に、自己融解と呼ばれる。そのような自己消化は、外因性プロテアーゼによって引き起こされるタンパク質加水分解の前に、またはそれと同時に行われ、その程度を変動させてもよい。
【００３１】
一の好ましい実施形態において、原形質分離、外因性プロテアーゼにより引き起こされるタンパク質加水分解、および特定の程度の自己消化は、同時に行われてもよい。
【００３２】
別の実施形態において、原形質分離およびイースト自身の酵素を用いた自己消化は、最初に行われ、そして添加されたプロテアーゼを用いた加水分解が、別の浄化過程において行われる。
【００３３】
培養後のプロテアーゼの付加は、所望のタンパク質加水分解度を得るために必要な、任意の適切な温度および培養時間で行われてもよい。本明細書におけるタンパク質加水分解は、基本的にプロテアーゼを付加することによって行われてもよく、またはそれは、付加されたプロテアーゼおよびイーストの自己消化性内因性プロテアーゼの作用との併用であってもよい。すなわち、用語「タンパク質加水分解」は、付加されたプロテアーゼによって行われるタンパク質加水分解、および一般的に自己融解と呼ばれる、イースト自身のプロテアーゼにより行われるタンパク質加水分解を含む。
【００３４】
好ましい実施形態において、培養温度は約２０℃から約７０℃の範囲内に、好ましくは４０℃から６０℃の範囲内にあり、そして培養時間は１時間から４８時間の範囲内に、好ましくは１２時間から３０時間の範囲内にある。
【００３５】
ｐＨおよび温度のいずれも、場合により、培養過程でのいずれかの時点で、より高くまたはより低くなるように調整され得る。
【００３６】
プロテアーゼを用いた培養は、所望の結果が達成されるまで続けられ、その後にそれは酵素を失活させることにより、例えば熱処理過程により、停止されてもまたはされなくてもよい。そのような熱処理はまた、イースト抽出物を殺菌する役目を果たしてもよい。
【００３７】
タンパク質分解処理の後、イースト抽出物は細胞残屑物から、例えば遠心分離および上清のデカンテーションにより分離されてもよい。したがって、得られたイースト抽出物は、当技術分野で知られた任意の手法によって濃縮されてもよい。
【００３８】
イースト抽出物の質は、例えば以下のパラメーターによって特徴付けられ得る。
【００３９】
タンパク質収率は、イースト抽出物中で回収された、加水分解前におけるイースト乾物中のタンパク質のパーセンテージである。本発明のプロテアーゼを使用して得られるタンパク質収率の例は以下のとおりである：少なくとも４０％、少なくとも５０％または少なくとも６０％。
【００４０】
加水分解度（ＤＨ）は、前記方法により得られたタンパク質加水分解の程度を示す。本明細書において、加水分解度（ＤＨ）は以下の式：
ＤＨ＝（開裂されたペプチド結合の数／ペプチド結合の総量）×１００％
で定義される。
【００４１】
タンパク質率は、タンパク質由来のイースト抽出物中における、乾燥固体の割合である。本発明のプロテアーゼを使用して得られるタンパク質率は、以下のとおりである：少なくとも４５％、少なくとも５０％、または少なくとも５５％。
【００４２】
イースト抽出物の濁度は、当技術分野で知られている任意の方法によって決定されても良い。それはＮＴＵ（ネフェロ濁度ユニット）として測定されてもよい。本発明のプロテアーゼを使用して得られるイースト抽出物濁度の例は、以下のとおりである：２０００ＮＴＵ未満、１５００ＮＴＵ未満、１０００ＮＴＵ未満、または５００ＮＴＵ未満。
【００４３】
本発明の一実施形態は、上述の方法によって製造されるイースト抽出物である。
【実施例】
【００４４】
実施例１
配列番号１に示される配列を有するノルカルジオプシス種ＮＲＲＬ１８２６２由来のプロテアーゼは、アルカラーゼおよび外因性プロテアーゼの無いイースト対照との比較により評価された。
ノカルジオプシスプロテアーゼおよびアルカラーゼ（登録商標）２．４Ｌ（ノボザイムズＡ／Ｓ、デンマーク）を、サッカロマイセス・セレビシエ由来のブロックイーストで試験した。前記イーストを、乾物含量が１３．７％に達するまで脱イオン水と混合し、そして室温で６０分攪拌した（磁気攪拌）。イースト混合物を５５℃に加熱し、そして一の画分をｐＨ６．５に調整した。別の一の画分を、ｐＨを調整せずに対照として適用した（「イースト対照」の加水分解物中のｐＨは約ｐＨ５である）。酵素を、ｐＨ調製画分からの試料に加えた。酵素を、ｍｇ酵素タンパク質／イースト乾物（ＹＤＭ）ｇ単位で投入した。２０ｍｌの試料を取り、そして正確な重量を測定した。「ブランク」と書かれている試料には酵素を加えなかった。加水分解を５５℃で２２時間行った。前記試料を、８５℃で１０分間かけて失活させた。失活化の後、前記試料を１０分間、３５００ｒｐｍでヘレウス（Ｈｅｒａｅｕｓ）社製のマルチフュージ（Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ）３Ｓ−Ｒを用いて遠心分離した。デカンテーションの後、抽出物の重さを測定した。（１０５℃で乾燥させた後に、）抽出物中の乾燥固体を秤量により測定した。抽出物中の窒素の量を、Ｌｅｃｏ  ＦＰ−５２８を用いた燃焼法により測定した。タンパク質量を、窒素の量の６．２５倍として計算した。遊離のアミノ窒素をＯＰＡ（ｏ−フタルジアルデヒド）法を用いて測定した。上記測定に基づき、以下を計算した：
％抽出物収率＝（ｇ遠心分離後の抽出物）／（ｇ遠心分離前のイースト混合物）×１００
％タンパク質収率＝（ｇ遠心分離後の抽出物×抽出物中のタンパク質含量）／（ｇ遠心分離前のイースト混合物×イースト混合物中のタンパク質含量）×１００
％タンパク質／ＤＳ＝（ｇ遠心分離後の抽出物×抽出物中のタンパク質含量）／（ｇ抽出物中の乾燥固体）×１００
加水分解度＝（開裂されたペプチド結合の数／ペプチド結合の総量）×１００＝（ｈ／ｈｔｏｔ）×１００
ここでｈは、ｍｅｑｖセリンＮＨ2の関数として表現される：ｈ＝（セリンＮＨ2量−０．４）／１；そしてｈｔｏｔ＝７．８である。３４０ｎｍで吸光度測定することにより、セリンＮＨ2量を、１００ｍｇ／Ｌ含有のセリン標準液と比較して測定した。
抽出物の濁度を、ＵＳＥＰＡフィルターを使用したＨＡＣＨ２１００ＡＮ濁度計により、ＮＴＵ（ネフェロ濁度ユニット）として測定した。較正を、ホルマジン濁度標準液４０００ＮＴＵ（ＨＡＣＨ  Ｃｏｍｐａｎｙ、アメリカ、から入手可能）に対して行った。より高いＮＴＵは、より高い濁度の目安である。
【００４５】
【表１】
0005421117.tif 000002
【００４６】
ノカルジオプシス種ＮＲＲＬ１８２６２由来のプロテアーゼは、低用量レベル（０．０２２〜０．０４４ｍｇ  ＥＰ／ｇ  ＹＤＭ）で、非常に高いタンパク質収率となった。ノカルジオプシス種ＮＲＲＬ１８２６２プロテアーゼ処置をした抽出物の濁度は、同じ用量範囲で非常に澄んでおり、そしてより大きい乾燥固体画分は、タンパク質由来である。
【配列表】
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