(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ｉ）および（ｉｉ）から選択される単離されたポリペプチド：
（ｉ）配列番号５または配列番号９または配列番号１３または配列番号１７または配列番号２１に示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドであって、ＭＥＫ２活性を阻害するポリペプチド、および
（ｉｉ）配列番号３３に示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、ＭＥＫ１および／またはＭＥＫ２活性を阻害するポリペプチド。
【請求項２】
ポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端で、細胞内局在シグナル、レポーター、および／またはエピトープタグへ連結される、請求項１に記載のポリペプチド。 
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。 
【請求項５】
請求項４に記載のベクターを含む組み換えホスト細胞。 
【請求項６】
細胞内でＭＥＫを阻害する方法であって、請求項４に記載のベクターをホスト細胞内へトランスフェクトすること、および前記ポリペプチドの少なくとも１コピーを産生するための適切な条件下で前記トランスフェクトされたホスト細胞を培養することを含む方法。
【請求項７】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドの１末端に第１の制限酵素によって切断可能な配列が隣接し、かつ前記ポリヌクレオチドのもう１つの末端に第２の制限酵素によって切断可能な配列が隣接し、かつ第１および第２の制限酵素が非互換性の付着末端を生じるポリヌクレオチド。 
【請求項８】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドの１末端にＮｇｏＭ  ＩＶによって切断可能な配列が隣接し、かつ前記ポリヌクレオチドのもう１つの末端にＸｍａＩおよびＣｌａＩによって切断可能な配列が隣接するポリヌクレオチド。 
【請求項９】
前記少なくとも９０％の同一性が、少なくとも９５％の同一性である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記少なくとも９０％の同一性が、少なくとも９６％の同一性である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記少なくとも９０％の同一性が、少なくとも９７％の同一性である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記少なくとも９０％の同一性が、少なくとも９８％の同一性である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記少なくとも９０％の同一性が、少なくとも９９％の同一性である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号５または配列番号９または配列番号１３または配列番号１７または配列番号２１または配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は哺乳類のキナーゼリガンド、基質および修飾因子に関する。特に本発明は、ポリペプチド、ポリペプチド組成物、ならびにリガンド、基質、および／またはＭＥＫの修飾因子であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、ホモポリリガンドまたはＭＥＫ活性を調節するヘテロポリリガンドであるポリリガンドにも関する。本発明はまた、細胞内（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ）領域へと局在するリガンドおよびポリリガンドにも関する。
【０００２】
本出願は、米国特許出願第１０／７２４，５３２号（現在、米国特許第７，０７１，２９５号）、第１０／６８２，７６４号（ＵＳ２００４／０１８５５５６号、ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１３５１７号、国際公開第２００５／０４０３３６号）、米国特許出願第１１／２３３，２４６号、およびＵＳ２００４０５７２０１１Ｐ号（国際公開第２００５１１６２３１号）に関する主題を有する。これらの特許および出願は、それぞれが参照によりここに取り込まれる。
【背景技術】
【０００３】
キナーゼは、分子へのリン酸の付加を触媒する酵素である。キナーゼによるリン酸の付加は、リン酸化と呼ばれる。キナーゼの基質がタンパク質分子であるとき、通常リン酸化されるアミノ酸はセリン、スレオニン、およびチロシンである。ホスファターゼは、分子からリン酸を取り除く酵素である。リン酸の除去は、脱リン酸化と呼ばれる。キナーゼおよびホスファターゼは、伝達、減弱、またその他には細胞シグナルおよび細胞制御の機序を調節するため、細胞内でしばしば競合する力を示す。キナーゼおよびホスファターゼの両方は、重複する固有の天然基質を有する。キナーゼ、ホスファターゼ、およびそれらの天然基質により調節される細胞シグナルおよび制御機序は、研究手段の計画およびドラッグデザインの標的である。
【０００４】
ＭＡＰ／ＥＲＫキナーゼ１、ＭＥＫ１、ＰＲＫＭＫ１、ＭＡＰＫＫ１、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＫＫ１は、ＭＥＫ１として知られている同じ酵素である。ＭＡＰ／ＥＲＫキナーゼ２、ＭＥＫ２、ＰＲＫＭＫ２、ＭＡＰＫＫ２、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＫＫ２は、ＭＥＫ２として知られている同じ酵素である。ＭＥＫ１およびＭＥＫ２は、タンパク質またはペプチド基質中のセリン、スレオニン、およびチロシン残基をリン酸化できる。今日までに、ＭＥＫアイソフォームのわずかな細胞基質が同定されている。個々の基質またはリガンドは同定され研究されてきたが、ＭＥＫアイソフォーム活性を調節するポリリガンドとしての、共に連結した混合リガンドについては本発明以前には示されなかった。
【０００５】
カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼを調節し、かつ心臓の筋小胞体に局在するポリペプチドリガンドの設計および合成が、Ｊｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（２００３）２７８：２５０６３−７１）により行なわれた。Ｊｉ  ｅｔ  ａｌ．は、ホスホランバン由来の筋小胞体局在シグナルをポリペプチドリガンドへ融合させることにより、カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ抑制性ポリペプチドリガンドを筋小胞体へ局在させる発現コンストラクトを作製してこれを達成した。米国特許第７，０７１，２９５号も参照のこと。
【発明の概要】
【０００６】
ポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列の詳細な説明
配列番号１〜３６は、ポリリガンドおよびそれらをコードするポリヌクレオチドの例である。
【０００７】
特に、配列番号１のＭＥＫポリリガンドは配列番号２、配列番号３、および配列番号４によりコードされ、ここでコドンは哺乳類での発現およびベクター挿入のために最適化され、かつ配列番号３〜４はモジュール式のクローニング方法に適用できる別の隣接した制限酵素部位を含む。配列番号１は構造Ａ−Ｓ１−Ｂ−Ｓ２−Ｃ−Ｓ３−Ｄのポリリガンドの実施形態であり、ここでＡは配列番号４１、Ｂは配列番号４２、Ｃは配列番号４９、およびＤは配列番号４３であり、Ｘａａはアラニンまたはフェニルアラニンであり、Ｓ１はアミノ酸配列ＰＧＡＡＧのスペーサー、Ｓ２はアミノ酸配列ＰＡＧＧＡのスペーサー、およびＳ３はアミノ酸配列ＰＧＡＡＧのスペーサーである。図４Ｄに一般的に示す構造Ａ−Ｓ１−Ｂ−Ｓ２−Ｃ−Ｓ３−Ｄのポリリガンドもまた、ここではヘテロポリリガンドと呼ばれる。
【０００８】
配列番号５は構造Ｘ−Ｓ１−Ｘ−Ｓ２−Ｙ−Ｓ３−Ｚのポリリガンドの実施形態であり、ここでＸは配列番号４４、Ｙは配列番号４２、Ｚは配列番号４３であり、Ｘａａはアラニンまたはフェニルアラニンであり、Ｓ１はアミノ酸配列ＰＧＡＡＧのスペーサー、Ｓ２はアミノ酸配列ＰＡＧＧＡのスペーサー、およびＳ３はアミノ酸配列ＰＧＡＡＧのスペーサーである。配列番号５のＭＥＫポリリガンドは配列番号６、配列番号７、および配列番号８によりコードされ、ここでコドンは哺乳類での発現およびベクター挿入のために最適化され、かつ配列番号７〜８はモジュール式のクローニング方法に適用できる別の隣接した制限酵素部位を含む。図４Ｅに一般的に示す構造Ｘ−Ｓ１−Ｘ−Ｓ２−Ｙ−Ｓ３−Ｚのポリリガンドもまた、ここではヘテロポリリガンドと呼ばれる。
【０００９】
配列番号９は配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２によりコードされ、ここでコドンは哺乳類での発現およびベクター挿入のために最適化され、かつ配列番号１１〜１２はモジュール式のクローニング方法に適用できる別の隣接した制限酵素部位を含む。配列番号１は構造Ａ−Ｓ１−Ｂ−Ｓ２−Ｃ−Ｓ３−Ｄのポリリガンドの実施形態であり、ここでＡは配列番号４１、Ｂは配列番号４２、Ｃは配列番号４９、およびＤは配列番号４３であり、Ｘａａはセリン、スレオニンまたはチロシンであり、Ｓ１はアミノ酸配列ＰＧＡＡＧのスペーサー、Ｓ２はアミノ酸配列ＰＡＧＧＡのスペーサー、およびＳ３はアミノ酸配列ＰＧＡＡＧのスペーサーである。図４Ｄに一般的に示す構造Ａ−Ｓ１−Ｂ−Ｓ２−Ｃ−Ｓ３−Ｄのポリリガンドもまた、ここではヘテロポリリガンドと呼ばれる。
【００１０】
配列番号１３は構造Ｘ−Ｓ１−Ｘ−Ｓ２−Ｙ−Ｓ３−Ｚのポリリガンドの実施形態であり、ここでＸは配列番号４４、Ｙは配列番号４２、Ｚは配列番号４３であり、Ｘａａはセリン、スレオニンまたは１０チロシンであり、Ｓ１はアミノ酸配列ＰＧＡＡＧのスペーサー、Ｓ２はアミノ酸配列ＰＡＧＧＡのスペーサー、およびＳ３はアミノ酸配列ＰＧＡＡＧのスペーサーである。配列番号１３のＭＥＫポリリガンドは配列番号１４、配列番号１５、および配列番号１６によりコードされ、ここでコドンは哺乳類での発現およびベクター挿入のために最適化され、かつ配列番号１５〜１６はモジュール式のクローニング方法に適用できる別の隣接した制限酵素部位を含む。図４Ｅに一般的に示す構造Ｘ−Ｓ１−Ｘ−Ｓ２−Ｙ−Ｓ３−Ｚのポリリガンドもまた、ここではヘテロポリリガンドと呼ばれる。
【００１１】
配列番号１７は配列番号１８、配列番号１９、および配列番号２０によりコードされ、ここでコドンは哺乳類での発現およびベクター挿入のために最適化され、かつ配列番号２０、１９〜２０はモジュール式のクローニング方法に適用できる別の隣接した制限酵素部位を含む。配列番号１７は構造Ａ−Ｓ１−Ｂ−Ｓ２−Ｃ−Ｓ３−Ｄのポリリガンドの実施形態であり、ここでＡは配列番号５１、Ｂは配列番号４３、Ｃは配列番号４２、およびＤは配列番号４４であり、Ｘａａはアラニンまたはフェニルアラニンであり、Ｓ１はアミノ酸配列ＰＧＡＡＧのスペーサー、Ｓ２はアミノ酸配列ＰＡＧＧＡのスペーサー、およびＳ３はアミノ酸配列ＰＧＡＡＧのスペーサーである。図４Ｄに一般的に示す構造Ａ−Ｓ１−Ｂ−Ｓ２−Ｃ−Ｓ３−Ｄのポリリガンドもまた、ここではヘテロポリリガンドと呼ばれる。
【００１２】
配列番号２１は配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４によりコードされ、ここでコドンは哺乳類での発現およびベクター挿入のために最適化され、かつ配列番号３０、２３〜２４はモジュール式のクローニング方法に適用できる別の隣接した制限酵素部位を含む。配列番号２１は構造Ａ−Ｓ１−Ａ−Ｓ２−Ａのポリリガンドの実施形態であり、ここでＡは配列番号４５であり、Ｘａａはアラニンまたはフェニルアラニンであり、Ｓ１はアミノ酸配列ＰＧＡＡＧのスペーサー、Ｓ２はアミノ酸配列ＰＡＧＧＡのスペーサー、およびＳ３はアミノ酸配列ＰＧＡＡＧのスペーサーである。図２Ｄに一般的に示す構造Ａ−Ｓ１−Ａ−Ｓ２−Ａのポリリガンドもまた、ここではホモポリリガンドと呼ばれる。
【００１３】
配列番号２５は配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２８によりコードされ、ここでコドンは哺乳類での発現およびベクター挿入のために最適化され、かつ配列番号２７〜２８はモジュール式のクローニング方法に適用できる別の隣接した制限酵素部位を含む。配列番号２５は単量体リガンドの実施形態であり、ここでＸａａはアラニンまたはフェニルアラニンである。
【００１４】
配列番号２９は配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２によりコードされ、ここでコドンは哺乳類での発現およびベクター挿入のために最適化され、かつ配列番号３１〜３２はモジュール式のクローニング方法に適用できる別の隣接した制限酵素部位を含む。配列番号２９は単量体リガンドの実施形態であり、ここでＸａａはアラニンである。
【００１５】
配列番号３３は配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６によりコードされ、ここでコドンは哺乳類での発現およびベクター挿入のために最適化され、かつ配列番号３５〜３６はモジュール式のクローニング方法に適用できる別の隣接した制限酵素部位を含む。配列番号３３は構造Ａ−Ｓ４−Ｂ−Ｓ５−Ａ−Ｓ４−Ｂのポリリガンドの実施形態であり、ここでＡは配列番号４８、Ｂは配列番号５０であり、Ｘａａはアラニンであり、Ｓ４はアミノ酸配列ＲＲＰＡＡＡのスペーサー、およびＳ５はアミノ酸配列ＰＧＧＧのスペーサーである。図４Ｃに一般的に示す構造Ａ−Ｓ４Ｂ−Ｓ５−Ａ−Ｓ４−Ｂのポリリガンドもまた、ここではヘテロポリリガンドと呼ばれる。
【００１６】
配列番号３７〜４０は完全長ＭＥＫタンパク質基質または阻害物質である。ＭＥＫは自己リン酸化することから、ＭＥＫは基質として含まれる。これらの配列は以下の公開受入番号を有する：ＮＰ＿００２７４６、ＮＰ＿００２７３７、ＸＰ＿０５５７６６、ＮＰ＿００２７３６、ＮＰ＿００１７４４。これらの受入番号によって表される配列のそれぞれは、参照によりここに取り込まれる。配列番号３７〜４０において、ＭＥＫによるリン酸化が可能なアミノ酸の位置をＸａａで表す。野生型タンパク質において、Ｘａａはセリン、スレオニン、またはチロシンである。本発明のリガンドにおいて、Ｘａａはいずれのアミノ酸でもある。
【００１７】
配列番号４１〜４８は配列番号３７〜３９の部分配列であり、キナーゼ活性部位ブロッカーペプチドリガンド配列を含む配列の例を表しており、ここにおいて天然ポリペプチド中のＭＥＫによるリン酸化が可能なセリン、チロシン、またはスレオニンの位置はＸａａとして示される
【００１８】
配列番号４９〜５１は配列番号３８または配列番号４０の部分配列であり、ペプチドキナーゼ阻害物質の例を表す。５配列番号４１〜５１は単量体ポリペプチドリガンド配列の例を表す。
【００１９】
Ｘａａを含むアミノ酸配列は、Ｘａａがいずれのアミノ酸でもあるポリペプチドを包含する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】スペーサーなしのホモ重合体リガンドの例を示す。
【図２】スペーサーのあるホモ重合体リガンドの例を示す。
【図３】スペーサーなしのヘテロ重合体リガンドの例を示す。
【図４】スペーサーのあるヘテロ重合体リガンドの例を示す。
【図５】任意のエピトープタグに連結したリガンドおよび重合体リガンドの例を示す。
【図６】任意のレポーターに連結したリガンドおよび重合体リガンドの例を示す。
【図７】任意の局在シグナルに連結したリガンドおよび重合体リガンドの例を示す。
【図８】任意の局在シグナルおよび任意のエピトープタグに連結したリガンドおよび重合体リガンドの例を示す。
【図９】リガンドおよびポリリガンドが任意の局在シグナル、任意のエピトープタグ、および任意のレポーターに連結した遺伝子コンストラクトの例を示す。
【図１０Ａ】リガンド遺伝子コンストラクトを含むベクターの例を示す。
【図１０Ｂ】リガンド遺伝子コンストラクトを含むベクターの例を示す。
【図１０Ｃ】リガンド遺伝子コンストラクトを含むベクターの例を示す。
【図１０Ｄ】リガンド遺伝子コンストラクトを含むベクターの例を示す。
【図１１】ポリリガンドの組み合わせ合成に有用な連続的クローニング工程の例を示す。
【図１２】本発明のリガンド−ベータ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の遺伝子コンストラクトを含むベクターの図を示す。
【図１３】本発明のリガンド−ベータ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の遺伝子コンストラクトを含むベクターの図を示す。
【図１４】本発明のリガンド−ベータ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の遺伝子コンストラクトを含むベクターの図を示す。
【図１５】本発明のリガンド−ベータ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の遺伝子コンストラクトを含むベクターの図を示す。
【図１６】本発明のリガンド−ベータ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の遺伝子コンストラクトを含むベクターの図を示す。
【図１７】本発明のリガンド−ベータ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の遺伝子コンストラクトを含むベクターの図を示す。
【図１８】本発明のリガンド−ベータ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の遺伝子コンストラクトを含むベクターの図を示す。
【図１９】本発明のリガンド−ベータ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の遺伝子コンストラクトを含むベクターの図を示す。
【図２０】本発明のリガンド−ベータ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の遺伝子コンストラクトを含むベクターの図を示す。
【図２１】本発明のリガンド−ベータ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の遺伝子コンストラクトを含むベクターの図を示す。
【図２２】本発明のリガンド−ベータ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の遺伝子コンストラクトを含むベクターの図を示す。
【図２３】本発明のリガンド−ベータ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の遺伝子コンストラクトを含むベクターの図を示す。
【図２４】本発明のリガンド−ベータ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の遺伝子コンストラクトを含むベクターの図を示す。
【図２５】形質移入されたＨＴ−１０８０細胞の溶解物中の、リガンド−ベータ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の平均タンパク質濃度を示す。
【図２６】ＭＥＫ１およびＭＥＫ２タンパク質標的に対するリガンド−ベータ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の、タンパク質ドットブロット結合アッセイの画像分析の結果を示す。
【００２１】
本発明はＭＥＫに対するポリペプチドリガンドおよびポリリガンドに関する。本発明の態様は、切断および／またはアミノ酸置換によって１以上の天然基質または阻害物質を修飾することによる、新規なモジュール式のＭＥＫ（ここでＭＥＫとの語は、ＭＥＫ１および／またはＭＥＫ２に適用される）３０活性の阻害物質を提供する。本発明のさらなる態様は、細胞内局在シグナルへの連結によるＭＥＫ阻害物質、リガンド、またはポリリガンドの細胞内局在である。ＭＥＫリガンドおよびポリリガンドの様々な実施形態を配列番号１〜５１に示す。さらに詳細には、本発明はリガンド、ホモポリリガンド、および配列番号４１〜５１のいずれを１以上含むヘテロリガンドに関する。加えて、本発明は配列番号３７〜４０の部分配列の１以上、またはそのいずれの一部を含むリガンドおよびポリリガンドに関する。さらに、本発明は配列番号４１〜５１の１以上、またはそのいずれの一部を含むポリリガンドに対し、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％の配列同一性を有するポリリガンドに関する。さらに、本発明は配列番号３７〜４０の部分配列の１以上を含むポリリガンドに対し、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％の配列同一性を有するポリリガンドに関する。
【００２２】
ホモポリリガンドまたはヘテロポリリガンドであり得るポリリガンドは、２以上の単量体ポリペプチドリガンドにより構成されるキメラリガンドである。ここで用いられるキメラとの語は、２個の異なるポリペプチドから、または同じポリペプチドの異なる領域からのアミノ酸配列を含む、人工の複合、または融合ポリペプチドに適用される。単量体リガンドの例は配列番号４３に示されるポリペプチドであり、ここでＸａａはいずれのアミノ酸でもある。配列番号４３は、野生型完全長である配列番号３９の選択された部分配列であり、ここで野生型配列におけるＸａａに相当するアミノ酸はＭＥＫによるリン酸化が可能なセリン、チロシン、またはスレオニンである。ホモポリリガンドの例は、Ｘａａがいずれのアミノ酸でもある、配列番号４３の二量体または多量体を含むポリペプチドである。ヘテロポリリガンドの例は、Ｘａａがいずれのアミノ酸でもある、配列番号５１および配列番号４１〜５０の１以上を含むポリペプチドである。配列番号４１〜５１を、ホモ重合体またはヘテロ重合体リガンドへと組み合わせるための多数の方法が存在する。さらに、配列番号３７〜４０のさらなる部分配列を互いに、および配列番号４１〜５１と組み合わせて重合体リガンドを作製するための多数の方法が存在する。
【００２３】
本発明のポリリガンドは、単量体の前、後、またはそれらの間にスペーサーアミノ酸を任意に含む。配列番号１は構造Ａ−Ｓ１−Ｂ−Ｓ２−Ｃ−Ｓ３−Ｄのポリリガンドの実施形態であり、ここでＡは配列番号４１、Ｂは配列番号４２、Ｃは配列番号４９、およびＤは配列番号４３であり、Ｘａａはアラニンまたはフェニルアラニンであり、Ｓ１、Ｓ２、およびＳ３はスペーサーである。本発明は、上記または下記の例に限定されることなく、ホモポリリガンドおよびヘテロポリリガンドの全ての組み合わせを捕捉することを企図する。本明細書における「リガンド」との語の使用は、単量体リガンド、重合体リガンド、ホモ重合体リガンドおよび／またはヘテロ重合体リガンドを包含する。
【００２４】
単量体リガンドは型に分類できる。単量体リガンドの一型は、少なくともポリペプチドの一部が、基質または偽基質（活性部位ブロッカー）としてＭＥＫにより認識され得るポリペプチドである。認識され得るポリペプチドの一部は、認識モチーフと称される。本発明において、認識モチーフは天然または合成であり得る。認識モチーフの例は当該技術分野で周知であり、天然ＭＥＫ基質および偽基質モチーフ（配列番号４１〜４８および認識モチーフを含む配列番号３７〜３９の部分配列）を含むがこれらに限定されない。単量体リガンドの別の型は、少なくともポリペプチドの一部がＭＥＫと結合し、かつＭＥＫ活性部位以外の部位でＭＥＫを阻害し得るポリペプチドである。
【００２５】
重合体リガンドは、共に連結してキメラを作る２以上の単量体リガンドを含む。
【００２６】
ホモ重合体リガンドは、１以上の単量体リガンドにおいてリン酸化が可能な残基が置換または修飾され得ることを除いては、それぞれの単量体リガンドがアミノ酸配列において同一な重合体リガンドである。
【００２７】
ヘテロ重合体リガンドは、幾つかの単量体リガンドが同一のアミノ酸配列をもたない重合体リガンドである。
【００２８】
本発明のリガンドは、エピトープタグ、レポーター、および／または細胞局在シグナルを提供するさらなる分子またはアミノ酸へ任意に連結される。細胞局在シグナルは、リガンドを細胞の領域へと向ける。エピトープタグおよび／またはレポーターおよび／または局在シグナルは同分子であってよい。エピトープタグおよび／またはレポーターおよび／または局在シグナルはまた、異なる分子であってもよい。
【００２９】
本発明はまた、リガンド、ホモポリリガンド、およびヘテロポリリガンドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも包含する。本発明の核酸は、エピトープタグ、レポーター、および／または細胞局在シグナルのようなさらなる特性を持つポリペプチドをコードするさらなるヌクレオチド配列へ任意に連結される。当該ポリヌクレオチドには、制限酵素部位およびその他の制限酵素活性に必要なヌクレオチドを含むヌクレオチド配列が任意に隣接する。隣接の配列はベクター内の固有のクローニング部位を任意に提供し、かつ続くクローニングの方向性を任意に提供する。さらに、本発明の核酸はベクターポリヌクレオチド内に任意に取り込まれる。本発明のリガンド、ポリリガンド、およびポリヌクレオチドは、研究手段および／または治療法としての有用性を持つ。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明はＭＥＫ修飾因子であるリガンドおよびポリリガンドに関する。本発明の態様は、切断および／またはアミノ酸置換によって１以上の天然基質または阻害物質を修飾することによる、新規な、単量体かつキメラの、モジュール式のＭＥＫ活性の阻害物質を提供する。本発明のさらなる態様は、細胞内局在シグナルへの連結によるＭＥＫ阻害物質、リガンド、またはポリリガンドの細胞内局在である。リガンドおよびポリリガンドの様々な実施形態を配列番号１〜５１に示す。ポリリガンドは、２以上の単量体ポリペプチドリガンドを含むキメラリガンドである。単量体リガンドの例は配列番号４２に示されるポリペプチドであり、ここでＸａａはいずれのアミノ酸でもある。配列番号４２は、親である完全長の配列番号３７の選択された部分配列であり、ここで親配列におけるＸａａに相当するアミノ酸はＭＥＫによるリン酸化が可能なセリン、チロシン、またはスレオニンである。単量体リガンドの別の例は、配列番号４９に示されるポリペプチドである。単量体リガンドの別の例は、配列番号４６に示されるポリペプチドである。配列番号４１〜５１のそれぞれは単量体の形である個々のポリペプチドリガンドを表し、ここでＸａａはいずれのアミノ酸でもある。配列番号４１〜５４は、配列番号３７〜４０の部分配列の選択された例であるが、認識モチーフまたは結合関連モチーフを含む、配列番号３７〜４０のその他の部分配列もまた単量体リガンドとして利用されてよい。配列番号３７〜４０の単量体リガンド部分配列は、野生型部分配列であってよい。加えて、配列番号３７〜４０の単量体リガンド部分配列は、他のアミノ酸によって置換された、ＭＥＫによるリン酸化が可能なアミノ酸を有してよい。さらに、単量体リガンドおよびポリリガンドは、配列番号４１〜５１の１以上のアミノ酸配列を含むリガンドに対し、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有してよい。さらに、単量体リガンドおよびポリリガンドは、配列番号３７〜４０の部分配列に対し少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％の配列同一性を有してよい。
【００３１】
ホモポリリガンドの例は、配列番号５０の二量体または多量体を含むポリペプチドである。ホモポリリガンドの別の例は、配列番号５１の二量体または多量体を含むポリペプチドである。ヘテロポリリガンドの例は、Ｘａａがいずれのアミノ酸でもある、配列番号４１および配列番号４２〜５１の１以上を含むポリペプチドである。配列番号４１〜５１を、ホモ重合体またはヘテロ重合体リガンドへと組み合わせるための多数の方法が存在する。さらに、配列番号３７〜４０のさらなる部分配列を互いに、および配列番号４１〜５１と組み合わせて重合体リガンドを作製するための多数の方法が存在する。ポリリガンドは配列番号４１〜５１のいずれの２以上を含んでよく、ここでＸａａはいずれのアミノ酸でもある。配列番号４１〜５１は、配列番号３７〜４０の部分配列の選択された例であるが、野生型または変異型のさらなる部分配列もポリリガンドの形成に利用されてよい。本発明は、ホモポリリガンドおよびヘテロポリリガンドの、限定のない全ての可能な組み合わせに関する。
【００３２】
配列番号４１〜４８は、ＭＥＫによるリン酸化が可能な少なくとも１のセリンまたはスレオニン残基を含むタンパク質を示し、この位置はＸａａで表される。ＭＥＫは自己リン酸化することから、ＭＥＫそれ自体が基質として含まれる。配列番号４１〜４８は配列番号３７〜３９の部分配列であり、ここで再び、ＭＥＫによるリン酸化が可能な残基の位置はＸａａで表される。本来Ｘａａは、一般的にはセリン、チロシン、またはスレオニンである。本発明の一実施形態において、Ｘａａはいずれのアミノ酸でもあり得る。Ｘａａがセリン、チロシン、またはスレオニンであるリガンドはポリリガンドの一部として使用できるが、一実施形態において、少なくとも１のリン酸化可能なセリン、チロシン、またはスレオニンは、アラニン、アスパラギン酸塩、アスパラギン、システイン、グルタミン酸塩、グルタミン、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、プロリン、アルギニン、バリン、またはトリプトファンを含む天然アミノ酸のうちの一つのような別のアミノ酸に置換される。Ｘａａはまた、非天然のアミノ酸であってもよい。別の実施形態において、ＭＥＫによるリン酸化が可能な残基はアラニンにより置換される。別の実施形態において、ＭＥＫによるリン酸化が可能な残基はフェニルアラニンにより置換される。本発明のリガンドおよびポリリガンドは、ＭＥＫの内在性の効果を調節するために設計された。
【００３３】
一般に、天然ＭＥＫ基質に基づくリガンド単量体は、ＭＥＫ基質中の推定されるＭＥＫリン酸化認識モチーフを同定することにより構築される。時々、リン酸化可能な残基をセリン、チロシン、またはスレオニン以外のアミノ酸に改変することが望ましい。さらなる単量体は、ＭＥＫ認識モチーフ、ならびにＭＥＫ認識モチーフのいずれかの側に隣接および接触するアミノ酸を含む。単量体リガンドはそれ故、ＭＥＫ認識モチーフを含む単量体を与えるどのような長さであってもよい。例えば、単量体はＭＥＫ認識モチーフ、および認識モチーフに隣接する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０−１００以上のアミノ酸を含んでよい。
【００３４】
例えば一実施形態において本発明は、
ａ）配列番号３９のアミノ酸残基１６５〜２０３に相当するアミノ酸残基を含むペプチドに少なくとも８０％同一であり、ここで配列番号３９のアミノ酸残基１８５および／または１８７に相当するアミノ酸残基がセリン、チロシン、またはスレオニン以外のアミノ酸残基であるペプチド；
ｂ）配列番号３９のアミノ酸残基１６９〜２００に相当するアミノ酸残基を含むペプチドに少なくとも８０％同一であり、ここで配列番号３９のアミノ酸残基１８５および／または１８７に相当するアミノ酸残基がセリン、チロシン、またはスレオニン以外のアミノ酸残基であるペプチド；
ｃ）配列番号３９のアミノ酸残基１７４〜１９６に相当するアミノ酸残基を含むペプチドに少なくとも８０％同一であり、ここで配列番号３９のアミノ酸残基１８５および／または１８７に相当するアミノ酸残基がセリン、チロシン、またはスレオニン以外のアミノ酸残基であるペプチド；および
ｄ）配列番号３９のアミノ酸残基１７９〜１９４に相当するアミノ酸残基を含むペプチドに少なくとも８０％同一であり、ここで配列番号３９のアミノ酸残基１８５および／または１８７に相当するアミノ酸残基がセリン、チロシン、またはスレオニン以外のアミノ酸残基であるペプチドからなる群から選択されるペプチドの少なくとも１コピーを含む、ＭＥＫのポリペプチド阻害物を含む。
【００３５】
ここで用いられる「相当する」および「相当している」との語は、それらが配列アラインメントに関する時、参照タンパク質、例えばＥＲＫ１（配列番号３８）内の列挙された位置、および参照タンパク質における当該位置と共に整列させた位置を意味することを企図する。従って、対象ペプチドの２５アミノ酸配列を参照ペプチド、例えば配列番号３８のアミノ酸配列と共に整列させる時、参照ペプチド配列のある列挙された位置に「相当する」対象ペプチド配列中のアミノ酸は参照ペプチド配列のこれらの位置と共に整列させたものであるが、必ずしも参照配列のこれらの正確な数的位置にはない。配列間の相当するアミノ酸を決定するための、配列の整列方法を以下に述べる。
【００３６】
本発明のさらなる実施形態は、配列番号３７〜３９により同定される基質のような、いずれの推定される、または実在のＭＥＫの基質に基づいた単量体（上記のような）を含む。さらに、基質が１を超える認識モチーフを有するとき、そこにおいて１を超える単量体が同定されてよい。
【００３７】
本発明の別の実施形態は、少なくとも１コピーのリガンドペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子である。
【００３８】
本発明の別の実施形態は、単離されたポリペプチドホモポリリガンドであり、ここで当該ホモポリリガンドはＭＥＫ活性を調節する。
【００３９】
本発明の別の実施形態は、単離されたポリペプチドヘテロポリリガンドであり、ここで当該へテロポリリガンドはＭＥＫ活性を調節する。
【００４０】
本発明の別の実施形態は、ポリヌクレオチド配列１５が、１以上のペプチドリガンドの１以上のコピーをコードする核酸分子である。
【００４１】
本発明の別の実施形態は、ポリヌクレオチド配列が、少なくとも２，３，４，５，６，７，８，９または１０からなる群より選択されるペプチドのコピー数をコードする核酸分子である。
【００４２】
本発明の別の実施形態は、リガンドまたはポリリガンドの少なくとも１コピーをコードする核酸分子を含むベクターである。
【００４３】
本発明の別の実施形態は、リガンドまたはポリリガンドの少なくとも１コピーをコードする２５核酸分子を含むベクターを含む、組み換えホスト細胞である。
【００４４】
本発明の別の実施形態は、リガンドまたはポリリガンドの少なくとも１コピーをコードする核酸分子を含むベクターをホスト細胞内へトランスフェクトすること、およびリガンドまたはポリリガンドの少なくとも１コピーを産生するための適切な条件下で、当該トランスフェクトされたホスト細胞を培養することを含む、細胞内でＭＥＫを阻害する方法である。
【００４５】
本発明はまた、参照阻害物質に対し少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一な、改変阻害物質にも関する。「改変阻害物資」は、阻害物資タンパク質またはポリペプチドの一次構造（アミノ酸配列）における１以上のアミノ酸の付加、欠失または置換により作製できるペプチドを意味するために用いられる。「改変認識モチーフ」は、モチーフの一次構造（アミノ酸配列）における１以上のアミノ酸の付加、欠失または置換により改変された天然ＭＥＫ認識モチーフである。例えば改変ＭＥＫ認識モチーフは、リン酸化可能なアミノ酸がリン酸化されないアミノ酸に改変されたモチーフであってよい。ここで「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」の語は互換的に用いられる。参照阻害物質は、必ずしも野生型タンパク質またはその一部ではない。従って参照阻害物質は、その配列が予め野生型タンパク質に対して改変されたタンパク質またはペプチドであってよい。参照阻害物質は、特定の生物由来の野生型タンパク質であるかまたはそうでない可能性がある。
【００４６】
参照アミノ酸配列に対して少なくとも、例えば、約９５％「同一」なアミノ酸配列を有するポリペプチドは、当該ポリペプチドのアミノ酸配列が、当該アミノ酸配列が参照ペプチドをコードする参照アミノ酸配列の各１００アミノ酸あたり約５の改変までを含むかもしれないことを除いては、参照配列と同一であることを意味すると理解される。言い換えれば、参照アミノ酸配列に対し少なくとも約９５％同一なアミノ酸配列を有するペプチドを得るためには、参照配列のアミノ酸残基の約５％までが欠失しているかもしくは別のアミノ酸で置換されてよく、または参照配列中の全アミノ酸の約５％までの幾つかのアミノ酸が参照配列中に挿入されてよい。参照配列のこれらの改変は、参照アミノ酸配列のＮ−末端もしくはＣ−末端位置に、またはこれら末端位置の間のどこにでも、参照配列中のアミノ酸の間に個々に散在するか、もしくは参照配列内に１以上の接触する集団として散在するかのいずれかにより生じてよい。
【００４７】
ここで用いられる「同一性」は、参照ヌクレオチドまたはアミノ酸配列に比較した、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度である。一般に、配列は最も高い程度の一致が得られるように整列される。「同一性」それ自体は当該技術分野において認識される意味を持ち、公表された技術を用いて算出できる（例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｌｅｓｋ，  Ａ．  Ｍ．，  ｅｄ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８８）；  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．Ｗ．，  ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９３）；  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｐａｒｔ  Ｉ，  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ａ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｈ．  Ｇ．，  ｅｄｓ．，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ  （１９９４）；  ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，  Ｇ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８７）；  および  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．，  ｅｄｓ．，  Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９１）を参照のこと）。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の間で同一性を評価するための幾つかの方法が存在するのと同時に、「同一性」との語は当業者に公知である（Ｃａｒｉｌｌｏ，  Ｈ．  ＆  Ｌｉｐｔｏｎ，  Ｄ．，  Ｓｉａｍ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ  ４８：１０７３  （１９８８））。２つの配列間の同一性または類似性を決定するため一般に用いられる方法は、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｈｕｇｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，  Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．  Ｂｉｓｈｏｐ，  ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  （１９９４）  および  Ｃａｒｉｌｌｏ，  Ｈ．  ＆  Ｌｉｐｔｏｎ，  Ｄ．，  Ｓｉａｍ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ  ４８：１０７３  （１９８８）  に開示される方法を含むがこれらに限定されない。コンピュータプログラムもまた、同一性および類似性を算出する方法およびアルゴリズムを含んでよい。２つの配列間の同一性および類似性を決定するためのコンピュータプログラム法の例は、ＧＣＧ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｐａｃｋａｇｅ  （Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（ｉ）：３８７  （１９８４）），  ＢＬＡＳＴＰ，  ＥｘＰＡＳｙ，  ＢＬＡＳＴＮ，  ＦＡＳＴＡ  （Ａｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍｏｌｅｃ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３  （１９９０））  および  ＦＡＳＴＤＢ  を含むがこれらに限定されない。同一性および類似性を決定するための方法の例は、参照により取り込まれる  Ｍｉｃｈａｅｌｓ，  Ｇ．  ａｎｄ  Ｇａｒｉａｎ，  Ｒ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｖｏｌ  １，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．  （２０００）  において論じられている。���発明の一実施形態によれば、２以上のポリペプチド間の同一性を決定するために用いられるアルゴリズムはＢＬＡＳＴＰである。
【００４８】
本発明の別の実施形態によれば、２以上のポリペプチド間の同一性を決定するために用いられるアルゴリズムは、Ｂｒｕｔｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｃｏｍｐ．  Ａｐｐ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  ６：２３７−２４５  （１９９０）、参照により取り込まれる）のアルゴリズムに基づいたＦＡＳＴＤＢである。ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントにおける、クエリーおよび対象配列はアミノ配列である。配列アラインメントの結果はパーセント同一性による。パーセント同一性を算出するために、アミノ酸配列のＦＡＳＴＤＢアラインメントにおいて用いられてよいパラメータは、Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ，  ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２，  Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１，  Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０，  Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｎｇｔｈ＝０，  Ｃｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ＝１，  Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝５，  Ｇａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ  ０．０５，  Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ＝５００または対象アミノ配列の長さのどちらかより短い方、を含むがこれらに限定されない。
【００４９】
内部での付加または欠失のためではなく、Ｎ−末端またはＣ−末端の付加または欠失のために対象配列がクエリー配列よりも短いかまたは長い場合、ＦＡＳＴＤＢプログラムはパーセント同一性の算出の際に対象配列のＮ−末端およびＣ−末端の切断または付加を説明しないため、手動での補正がなされ得る。クエリー配列に対し両端が切断された対象配列のためにパーセント同一性は、一致／整列されない参照配列に対するＮ−およびＣ−末端であるクエリー配列のアミノ酸数を、クエリー配列の全アミノ酸のパーセントとして算出することにより補正される。ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果は、一致／整列を決定する。次いで、最終的なパーセント同一性スコアに至るため、上記のＦＡＳＴＤＢプログラムにより特定のパラメータを用いて算出されたパーセント同一性から整列パーセンテージを差し引く。この補正されたスコアはパーセンテージ同一性と同様に、整列がどのように互いに「対応する」か、決定する目的のために使用できる。参照または対象配列それぞれのＮ−もしくはＣ−末端を越えて拡張するクエリー（対象）配列または参照配列の残基は、パーセント同一性のスコアを手動で調整する目的のために考慮されてよい。すなわち、比較配列のＮ−またはＣ−末端と一致／整列しない残基は、パーセント同一性スコアまたは整列番号付けを手動で調節する際に考慮されてよい。
【００５０】
例えば、パーセント同一性を決定するために対象配列の９０アミノ酸が参照配列の１００残基と整列される。対象配列のＮ−末端に欠失が生じ、そのためにＦＡＳＴＤＢアラインメントはＮ−末端において最初の１０残基の一致／整列を示さない。１０の不対残基は配列の１０％を表し（Ｎ−およびＣ−末端における不一致の残基数／クエリー配列中の全残基数）、従って、１０％がＦＡＳＴＤＢプログラムにより算出されたパーセント同一性スコアから差し引かれる。もし残りの９０残基が完全に一致すれば、最終的なパーセント同一性は９０％となり得る。別の例において、対象配列の９０残基が参照配列の１００残基と比較される。このときの欠失は内部の欠失であり、従って対象配列のＮ−またはＣ−末端において、クエリーと一致／整列しない残基は存在しない。
【００５１】
この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算出されたパーセント同一性は手動では補正されない。
【００５２】
本発明のポリリガンドは、単量体の前、後、またはそれらの間にスペーサーアミノ酸を任意に含む。スペーサーの長さおよび組成は様々である。スペーサーの例はグリシン、アラニン、ポリグリシンまたはポリアラニンである。配列番号１においてモノマーの間に使用されるスペーサーの特定の例は、５のアミノ酸スペーサーであるＰＧＡＡＧおよびＰＡＧＧＡである。配列番号１の例において、プロリン含有スペーサーは２次構造の破壊を企図する。スペーサーアミノ酸はいずれのアミノ酸でもあってよく、これらのアラニン、グリシン、およびプロリンを含有の例に限定されない。本発明は、スペーサーを有するかまたは有さないホモポリリガンドおよびヘテロポリリガンドの全ての組み合わせに関し、上記または下記の例に限定されない。
【００５３】
本発明のリガンドおよびポリリガンドは、エピトープタグ、レポーターを提供し、および／またはリガンドを細胞の領域へ局在化させるさらなる分子またはアミノ酸へ任意に連結される（図５Ａ−５Ｇ、図６Ａ−６Ｇ、図７Ａ−７Ｇ、および図８Ａ−８Ｇを参照のこと）。エピトープタグの例はＦＬＡＧ（商標）、ＨＡ（赤血球凝集素）、ｃ−ＭｙｃおよびＨｉｓ６であるがこれらに限定されない。レポーターの例はアルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼおよび蛍光タンパク質であるがこれらに限定されない。細胞局在の例は筋小胞体、小胞体、ミトコンドリア、ゴルジ体、核、細胞膜、頂端膜、および側底膜であるがこれらに限定されない。エピトープ、レポーターおよび局在シグナルは例としての目的で示され、これらに限定されない。エピトープタグ、レポーターおよび／または局在シグナルは同分子であってよい。エピトープタグ、レポーターおよび／または局在シグナルはまた、異なる分子であってもよい。
【００５４】
リガンドおよびポリリガンドおよびそれらに連結される任意のアミノ酸は、当該技術分野で公知の技術を用いて化学的に、または組み換えにより合成できる。化学的合成技術は、しばしば自動化ペプチド合成装置を用いて行なわれるペプチド合成を含むがこれに限定されない。ペプチドはまた、当該技術分野で公知の非自動化ペプチド合成法を利用しても合成できる。組み換え技術はリガンドをコードする核酸の発現ベクターへの挿入を含み、ここで核酸発現産物は細胞因子および工程を用いて合成される。
【００５５】
細胞局在シグナル、エピトープタグ、またはレポーターのリガンドまたはポリリガンドへの結合は、リガンドへの共有結合または酵素的結合を含み得る。局在シグナルが脂質または炭水化物のようなポリペプチド以外の物質を含む時、分子結合のための化学反応が利用されてよい。
【００５６】
加えて、非標準アミノ酸および脂質、炭水化物、リン酸塩、またはその他の分子により修飾されたアミノ酸は、ペプチド合成への前駆体として用いられてよい。
【００５７】
本発明のリガンドは、局在シグナルと共に、または局在シグナルなしで治療上の有用性を有する。しかしながら、局在シグナルに連結されたリガンドは、細胞内での手段または治療法としての有用性を持つ。例えば、図７Ａ−７Ｇに一般的に示された２５リガンドは、細胞内での手段または治療法としての有用性を持つリガンドを表す。ＭＥＫリガンドを含む遺伝子コンストラクトもまた、遺伝子治療を通じて送達される。図１０Ｂおよび１０Ｃは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの送達およびポリペプチド発現の制御のための遺伝子治療ベクターの実施形態を示す。図１０Ｂおよび１０Ｃの遺伝子コンストラクトに連結したポリヌクレオチド配列は、導入遺伝子のウィルスゲノムおよび／またはホストゲノム中への組み込みを促進するためのゲノム組み込みドメインを含む。
【００５８】
図１０ＡはＭＥＫリガンド遺伝子コンストラクトを含むベクターを示し、ここで当該ＭＥＫリガンド遺伝子コンストラクトは、トランスジェニック動物の作製に有用な単位としてベクターから遊離可能である。例えばリガンド遺伝子コンストラクトまたはトランスジーンは、制限酵素消化によりベクター骨格から遊離される。遊離されたトランスジーンはその後マウス受精卵の前核内へ注入されるか、または当該トランスジーンは胚性幹細胞を形質転換するために使用される。図１０Ａのリガンド遺伝子コンストラクトを含むベクターはまた、トランスジーンの一過性導入にも有用であり、ここでトランスジーンのプロモーターおよびコドンはホスト生物に対して最適化される。図１０Ａのリガンド遺伝子コンストラクトを含むベクターはまた、少量または大量の産生に適応可能な発酵性の生物におけるポリペプチドの組み換え発現にも有用であり、ここでトランスジーンのプロモーターおよびコドンは発酵ホスト生物に対して最適化される。図１０Ｄは、安定細胞株を作製するために有用なＭＥＫリガンド遺伝子コンストラクトを含むベクターを示す。
【００５９】
本発明はまた、リガンド、ホモポリリガンド、およびヘテロポリリガンドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも包含する。本発明のポリヌクレオチドは、エピトープ、レポーター、および／または局在シグナルをコードするさらなるヌクレオチド配列へ任意に連結される。さらに、本発明の核酸はベクターポリヌクレオチド中に任意に取り込まれる。当該ポリヌクレオチドには、制限酵素部位およびその他の制限酵素活性に必要なヌクレオチドを含むヌクレオチド配列が任意に隣接する。隣接の配列はベクター内のクローニング部位を任意に提供する。制限酵素部位は、市販のほとんどのクローニングベクター中の一般的に使用される部位のいずれも含み得るが、これらに限定されない。このような部位の例は、ＢａｍＨＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＳｐｅＩ、ＡｆｌＩＩ、ＮｄｅＩ、ＮｈｅＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ、ＳｐｈＩ、ＮａｅＩ、ＳｅｘＡＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｐａＩ、およびＰｓｔＩ制限酵素により認識される部位である。ホーミングエンドヌクレアーゼを含むその他の制限酵素で切断される部位もまた、この目的のために使用される。ポリヌクレオチドの隣接配列はまた、部分配列クローニングの方向性も任意に提供する。二重鎖ＤＮＡがクローニングベクターの対応する相補的部位へ方向性にクローン化できるように、５’および３’制限酵素部位は互いに異なることが好ましい。
【００６０】
局在シグナル、エピトープもしくはレポーターを有するかまたは有さない、リガンドおよびポリリガンドは、一方で組み換え技術により合成される。ポリヌクレオチド発現コンストラクトは求められる構成要素を含んで作られ、発現ベクター中に挿入される。発現ベクターはその後細胞内にトランスフェクトされ、ポリペプチド産物が発現され分離される。組み換えＤＮＡ技術により作られたリガンドは、研究手段および／または治療法としての有用性を持つ。
【００６１】
以下は、ポリヌクレオチドによりコードされるリガンドおよびポリリガンドがどのように産生されるかについての例である。リガンドをコードする相補的なオリゴヌクレオチドおよび隣接する配列を、合成およびアニールする。得られた二重鎖ＤＮＡ分子を、当該技術分野で公知の方法を用いてクローニングベクター中に挿入する。リガンドおよびポリリガンドを、タンパク質産物に翻訳されるトランス遺伝子コンストラクトの配列に隣接してインフレームで配置すると、これらは細胞またはトランスジェニック動物内に発現されたときに融合タンパク質の一部を形成する。
【００６２】
本発明の別の実施形態は、求められる細胞または生物内のトランス遺伝子発現の選択的制御に関する。組み換え遺伝子のプロモーター部は恒常的プロモーター、非恒常的プロモーター、組織特異的プロモーター（恒常的もしくは非恒常的）または選択的制御プロモーターであり得る。異なる選択的制御プロモーターは、異なる機序により制御される。例えば、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（登録商標）はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓより入手可能な誘導プロモーターシステムである。
【００６３】
温度感受性プロモーターもまた、遺伝子発現の増加または減少のために使用できる。本発明の実施形態は、その発現が誘導プロモーターにより制御されるリガンドまたはポリリガンド遺伝子コンストラクトを含む。一実施形態によれば、誘導プロモーターはテトラサイクリンにより制御可能である。
【００６４】
ポリリガンドは本来モジュール式である。本発明の態様は、開示されたポリリガンドの組み合わせのモジュール方式である。本発明の別の態様は、これらモジュール式のポリリガンドの容易かつ簡便な作製方法である。この点において本発明の実施形態は、遺伝的な発現成分のモジュール式部分配列クローニング方法を含む。リガンド、ホモポリリガンド、ヘテロポリリガンドおよび任意のアミノ酸発現成分が組み換え式に合成される際、それぞれのクローン化可能な要素はモジュールとみなすことができる。迅速かつ簡便なクローニングのため、付着末端が互換性で、かつ挿入および連続的なクローン化が容易なモジュール式要素の作製が望ましい。これは制限酵素部位の認識および切断の自然特性を利用することにより達成される。本発明の一態様は、モジュールの１末端が１度の制限酵素消化に利用され、かつもう１つの末端が求められる回数の制限酵素消化に利用されるモジュール隣接配列を包含する。言い換えれば、モジュール式要素の連続的クローニングを達成するため、モジュールの１末端の制限酵素部位が利用されかつ破壊される。翻訳領域モジュールに隣接する制限酵素部位の例は、制限酵素ＮｇｏＭＩＶおよびＣｌａＩ、あるいはＸｍａＩおよびＣｌａＩにより認識される配列である。５’ＮｇｏＭＩＶ突出および３’ＣｌａＩ突出の直鎖状ＤＮＡを得るために第１の環状ＤＮＡをＮｇｏＭＩＶおよびＣｌａＩで切断し、５’  ＣｌａＩ突出および３’ＸｍａＩ突出の直鎖状ＤＮＡを得るために第２の環状ＤＮＡをＸｍａＩおよびＣｌａＩで切断することで、互換性の付着末端を有する第１および第２のＤＮＡ断片が生じる。第３の環状ＤＮＡ断片を形成するため、これら第１および第２のＤＮＡ断片を共に混合、アニール、および連結すると、第１のＤＮＡ中に存在したＮｇｏＭＩＶ部位、および第２のＤＮＡ中に存在したＸｍａＩ部位は第３の環状ＤＮＡ中で破壊される。このＤＮＡの痕跡領域はここで、さらなるＸｍａＩまたはＮｇｏＭＩＶ消化から保護されるが、第３の環状ＤＮＡ中に残る隣接配列はなお未変化の５’ＮｇｏＭＩＶおよび３’ＣｌａＩ部位を含む。方向性の、連続的なモジュール式クローニング事象を達成するため、この工程は多数回反復できる。ＮｇｏＭＩＶ、ＸｍａＩおよびＣｌａＩ制限酵素により認識される制限酵素部位は、隣接配列として使用する際に連続的なクローニングを可能にする部位のグループを表す。
【００６５】
翻訳領域モジュールを方向性および連続的に構築するための別の方法は、環状ＤＮＡに加えて直鎖状ＤＮＡを利用する。例えば上記の連続的クローニング工程のように、翻訳領域モジュールに隣接する制限酵素部位は、制限酵素ＮｇｏＭＩＶおよびＣｌａＩ、あるいはＸｍａＩおよびＣｌａＩにより認識される配列である。５’ＮｇｏＭＩＶ突出および３’ＣｌａＩ突出の直鎖状ＤＮＡを得るために第１の環状ＤＮＡをＮｇｏＭＩＶおよびＣｌａＩで切断する。第２の直線状二重鎖ＤＮＡを、ＰＣＲ増幅あるいは合成および相補的なオリゴヌクレオチドをアニールすることによって作製する。第２の直線状二重鎖ＤＮＡは、直線化された第１のＤＮＡと互換性のある付着末端である、５’ＣｌａＩ突出および３’ＸｍａＩ突出を有する。第３の環状ＤＮＡ断片を形成するため、これら第１および第２のＤＮＡ断片を共に混合、アニール、および連結すると、第１のＤＮＡ中に存在したＮｇｏＭＩＶ部位、および第２のＤＮＡ中に存在したＸｍａＩ部位は第３の環状ＤＮＡ中で破壊される。第３の環状ＤＮＡ中に残る隣接配列はなお未変化の５’ＮｇｏＭＩＶおよび３’ＣｌａＩ部位を含む。方向性の、連続的なモジュール式クローニング事象を達成するため、この工程は多数回反復できる。ＮｇｏＭＩＶ、ＸｍａＩおよびＣｌａＩ制限酵素により認識される制限酵素部位は、隣接配列として使用する際に連続的なクローニングを可能にする部位のグループを表す。この工程を図１１に示す。
【００６６】
当業者は、ここで述べるように他の制限酵素部位グループが連続的な方向性のクローニングを達成できることを認識する。制限酵素選択の好ましい基準は、互換性のある突出末端を作り出すが、その部位が互いの連結により破壊されるエンドヌクレアーゼの対を選択することである。別の基準は、最初の２つのいずれかと互換性のある粘着末端を作らない、第３のエンドヌクレアーゼ部位を選択することである。このような基準が連続的な方向性のクローニングのためのシステムとして利用される際、リガンド、ポリリガンド、およびその他の翻訳領域もしくは発現成分は望まれる通りに組み合わせて構築できる。同じ連続的工程は、５エピトープ、レポーター、および／または局在シグナルのために利用できる。
【００６７】
ＭＥＫ活性を調節するための、ポリリガンドおよびポリリガンドの作製法が開示される。治療法は、局在シグナルのある、もしくは無い、精製されたリガンドまたはポリリガンドの細胞への送達を含む。あるいは、局在シグナルのある、もしくは無い、リガンドおよびポリリガンドは、細胞内にタンパク質産物を発現するアデノウィルス、レンチウィルス、アデノ随伴ウィルス、またはその他のウィルス性コンストラクトを通して送達される。
【実施例】
【００６８】
実施例１
ヘテロポリリガンド、小胞体細胞局在シグナル、およびＨｉｓ６エピトープを含むポリペプチドが合成される。このようなポリペプチドの例を、図８Ａ、８Ｂ、８Ｄ、８Ｅおよび８Ｆに一般的に示す。ポリペプチドは自動ペプチド合成装置において合成するか、または組み換え的に発現し、精製される。精製ポリペプチドを培地中で可溶化し、細胞に加える。ポリペプチドは細胞により飲食され、小胞体へ輸送される。検証は抗Ｈｉｓ６抗体を用いた免疫組織化学染色により行なわれる。
【００６９】
実施例２
Ｘａａがアラニンである、配列番号４９、配列番号４８、配列番号４１（ポリリガンド）、緑色蛍光タンパク質（レポーター）、および細胞膜局在シグナル（局在シグナル）を含む融合タンパク質の発現を導くため、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーターを用いてトランス遺伝子を構築する。このようなトランス遺伝子を図９Ｃに一般的に示す。当該トランス遺伝子は、一過性発現のため細胞内にトランスフェクトされる。発現および位置の検証は、共焦点顕微鏡法による緑色蛍光タンパク質の可視化によって行なわれる。
【００７０】
実施例３
組織特異的プロモーターによって駆動される発現によるタンパク質産物を産生するため、トランス遺伝子コンストラクトが構築される。トランス遺伝子は、３個のドメインをコードするために設計された合成遺伝子発現単位を含む。これらの３個のドメインはそれぞれ、溶液中でアニールされ、連結され、ベクター中に挿入された相補的なポリヌクレオチドの対として合成される。アミノ末端から始まり、発現単位中の３つのドメインは、ＭＥＫリガンド、ＦＬＡＧ（商標）エピトープ、および核局在シグナルをコードするヌクレオチド配列である。ここで述べられるように、ＭＥＫリガンドは単量体リガンド、ホモ重合体リガンド、またはヘテロ重合体リガンドである。ＦＬＡＧ（商標）エピトープをコードするヌクレオチド配列は、ＭＥＫリガンドをコードするヌクレオチド配列の下流に配置される。最後に、局在シグナルをコードするヌクレオチド配列は、ＦＬＡＧ（商標）エピトープをコードするヌクレオチド配列の下流に配置される。図１０Ａに示すように、構築された遺伝子発現単位は続いて発現ベクター中へサブクローニングされ、一過性トランスフェクション細胞に使用される。検証は抗ＦＬＡＧ（商標）抗体を用いた免疫組織化学染色により行なわれる。
【００７１】
実施例４
細胞内に局在するＭＥＫポリリガンドによるＭＥＫ細胞機能の調節を例証する。ポリリガンド融合タンパク質、エピトープ、および小胞体局在シグナルをコードする核酸を含むトランス遺伝子コンストラクトを作製する。発現単位は、配列番号２５（ポリリガンド）、ｃ−Ｍｙｃエピトープ（エピトープ）、および核局在シグナル（局在シグナル）をコードするヌクレオチドを含む。この発現単位は続いてベクターのＥＦ１アルファプロモーターとＳＶ４０ポリアデニル化シグナルの間へサブクローニングされる。完成したトランス遺伝子を含む発現ベクターは、その後細胞のトランスフェクションに使用される。ＭＥＫ活性の阻害は、内在性基質のリン酸化をコントロールおよび／または観察される表現型に対して測定することにより示される。
【００７２】
実施例５
核を標的とするリガンド融合タンパク質を発現するマウスの作出に使用したトランス遺伝子コンストラクトの作製により、リガンド機能および局在をｉｎ  ｖｉｖｏで示す。このトランス遺伝子コンストラクトを図１０Ｂに一般的に示す。発現単位は、配列番号３３のテトラマー、赤血球凝集素エピトープ、および核局在シグナルをコードするヌクレオチドを含む。この発現単位は続いてベクターの誘導性プロモーターを含むヌクレオチド配列の間とＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含むヌクレオチド配列の間へサブクローニングされる。完成したトランス遺伝子は、その後受精したマウスの卵母細胞の前核内へ注入される。得られた仔を、トランス遺伝子の存在についてＰＣＲによりスクリーニングする。トランスジェニックのファウンダーマウスを野生型マウスと共に繁殖させる。少なくとも第３世代からのヘテロ接合トランスジェニック動物は、コントロールとして供給される非トランスジェニック同腹仔と共に以下の試験に使用される。
【００７３】
試験１：コピー数の決定のため、サザンブロット分析を行なう。サザンブロットは、トランス遺伝子の断片から作られた放射性標識プローブとハイブリダイズさせる。プローブはトランスジェニックマウスからのＤＮＡを含むバンドを検出するが、非トランスジェニックマウスからのＤＮＡを含むバンドは検出しない。コピー数を推定するため、トランスジェニックマウスのバンドの強度を測定し、トランス遺伝子プラスミドコントロールバンドと比較する。これは、実施例５のマウスがトランス遺伝子をそのゲノム中に取り込んでいることを示す。
【００７４】
試験２：ウェスタンブロット分析のため、組織ホモジネートを調製する。この実験は、赤血球凝集素エピトープがトランスジェニックホモジネート中には検出されるが非トランスジェニックホモジネート中には検出されないことから、トランス遺伝子がトランスジェニックマウスの組織中に発現することを示す。
【００７５】
試験３：発現誘導の後、コントロールに対する表現型の観察または分析によって機能を評価する。
【００７６】
これらの実施例は、治療または実験の目的による、細胞の局在領域へのリガンドの送達を示す。精製されたポリペプチドリガンドは、経口もしくは非経口投与、局所投与のために、または錠剤、カプセル、もしくは液剤の形態、鼻腔内もしくは吸入エアロゾルとして、皮下、筋肉内、腹腔内、もしくはその他の注射；静脈内点滴；またはその他のいずれの投与経路のために処方できる。さらに、リガンドをコードするヌクレオチド配列は、細胞内に遺伝子産物を送達および発現するために設計されたベクター中への取り込みを可能にする。このようなベクターはプラスミド、コスミド、人工染色体、および改変ウィルスを含む。真核細胞への送達はｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにて達成できる。ｅｘ  ｖｉｖｏでの送達方法は、目的のレシピエント細胞またはドナー細胞の分離、およびこれらの細胞へのベクターの送達に続き、レシピエントを細胞で治療することを含む。
【００７７】
実施例６
本発明のリガンドをベータ−ガラクトシダーゼに融合させ、融合タンパク質を構築した。
【００７８】
図１２に、配列番号３３のポリリガンドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを示す。リガンド融合タンパク質コーディング配列を作り出すため、図１２のベクターにおいて、配列番号３３のリガンドをコードするポリヌクレオチドは、ベータ−ガラクトシダーゼをコードするポリヌクレオチドに連結される。
【００７９】
図１３に、配列番号１のリガンドをコードする、配列番号２のポリヌクレオチドを含むベクターを示す。リガンド融合タンパク質コーディング配列を作り出すため、図１３のベクターにおいて、配列番号２のポリヌクレオチドは、ベータ−ガラクトシダーゼをコードするポリヌクレオチドに連結される。
【００８０】
図１４に、配列番号５のリガンドをコードする、配列番号６のポリヌクレオチドを含むベクターを示す。リガンド融合タンパク質コーディング配列を作り出すため、図１４のベクターにおいて、配列番号６のポリヌクレオチドは、ベータ−ガラクトシダーゼをコードするポリヌクレオチドに連結される。
【００８１】
図１５に、配列番号９のリガンドをコードする、配列番号１０のポリヌクレオチドを含むベクターを示す。リガンド融合タンパク質コーディング配列を作り出すため、図１５のベクターにおいて、配列番号１０のポリヌクレオチドは、ベータ−ガラクトシダーゼをコードするポリヌクレオチドに連結される。
【００８２】
図１６に、配列番号１３のリガンドをコードする、配列番号１４のポリヌクレオチドを含むベクターを示す。リガンド融合タンパク質コーディング配列を作り出すため、図１６のベクターにおいて、配列番号１４のポリヌクレオチドは、ベータ−ガラクトシダーゼをコードするポリヌクレオチドに連結される。
【００８３】
図１７に、配列番号１７のリガンドをコードする、配列番号１８のポリヌクレオチドを含むベクターを示す。リガンド融合タンパク質コーディング配列を作り出すため、図１７のベクターにおいて、配列番号１８のポリヌクレオチドは、ベータ−ガラクトシダーゼをコードするポリヌクレオチドに連結される。
【００８４】
図１８に、配列番号２１のリガンドをコードする、配列番号２２のポリヌクレオチドを含むベクターを示す。リガンド融合タンパク質コーディング配列を作り出すため、図１８のベクターにおいて、配列番号２２のポリヌクレオチドは、ベータ−ガラクトシダーゼをコードするポリヌクレオチドに連結される。
【００８５】
図１９に、配列番号２５のリガンドをコードする、配列番号２６を含むベクターを示す。リガンド融合タンパク質コーディング配列を作り出すため、図１９のベクターにおいて、配列番号２６のポリヌクレオチドは、ベータ−ガラクトシダーゼをコードするポリヌクレオチドに連結される。
【００８６】
図２０に、配列番号２５のリガンドをコードする、配列番号２６を含む別のベクターを示す。リガンド融合タンパク質コーディング配列を作り出すため、図２０のベクターにおいて、配列番号２６のポリヌクレオチドは、ベータ−ガラクトシダーゼをコードするポリヌクレオチドに連結される。
【００８７】
図２１に、配列番号２９のリガンドをコードする、配列番号３０を含むベクターを示す。リガンド融合タンパク質コーディング配列を作り出すため、図２１のベクターにおいて、配列番号３０のポリヌクレオチドは、ベータ−ガラクトシダーゼをコードするポリヌクレオチドに連結される。
【００８８】
図２２に、配列番号２９のリガンドをコードする、配列番号３０を含む別のベクターを示す。融合タンパク質コーディング配列を作り出すため、図２２のベクターにおいて、配列番号３０のポリヌクレオチドは、ベータ−ガラクトシダーゼをコードするポリヌクレオチドに連結される。
【００８９】
図２３に、配列番号３３のリガンドをコードする、配列番号３４を含むベクターを示す。リガンド融合タンパク質コーディング配列を作り出すため、図２３のベクターにおいて、配列番号３４のポリヌクレオチドは、ベータ−ガラクトシダーゼをコードするポリヌクレオチドに連結される。
【００９０】
図２４に、配列番号３３のリガンドをコードする、配列番号３４を含む別のベクターを示す。リガンド融合タンパク質コーディング配列を作り出すため、図２４のベクターにおいて、配列番号３４のポリヌクレオチドは、ベータ−ガラクトシダーゼをコードするポリヌクレオチドに連結される。
【００９１】
図１２〜２４のベクターを、哺乳類細胞株ＨＴ１０８０内へトランスフェクトした。ＭＥＫの基質であるＥＲＫをコードするポリヌクレオチドを含むベクターもまた、ＨＴ１０８０細胞内へトランスフェクトした。トランスフェクションは、Ｒｏｃｈｅ（バーゼル、スイス）より購入したＦｕｇｅｎｅ６試薬を用い、製造者の仕様書に従って行なった。簡単に述べると、細胞を６ウェルプレートへ、ウェルあたり、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ２ｍｌ中に３００，０００の濃度でまいた。２４時間後、各ウェルのトランスフェクション複合体を、１μｇのプラスミドＤＮＡを３μｇのＦｕｇｅｎｅ６と混合し、無血清ＤＭＥＭ中に溶解した１００μｌのＤＮＡ／脂質複合体を得ることにより調製した。複合体を適切に形成する３０分間のインキュベーションの後、１００μｌの混合物を、２ｍｌの培地中で増殖している細胞の各ウェルへ加えた。細胞をＤＮＡ／脂質複合体に２４時間曝露し、続いてＲＮＡおよびタンパク質分析のために溶解した。
【００９２】
図２５に、図１２〜１８および図２０，２２および２４のベクターによりコードされるリガンド融合タンパク質の溶解物の、タンパク質分析の結果を示す。リガンド融合タンパク質は、Ｒｏｃｈｅからのベータ−ガラクトシダーゼＥＬＩＳＡキット（＃１１５３９４２６００１）を用い、キットのプロトコルに従って定量した。値は２回の反復の平均を示すが、ＶＶＮ−４０６４７は１回の反復の値を示す。
【００９３】
リガンド融合タンパク質を含む溶解物は、ＭＥＫ１タンパク質またはＭＥＫ２タンパク質への結合を検出するため、以下のプロトコルを用いてタンパク質ドット−ブロット結合アッセイによりアッセイした。
１．ニトロセルロース膜をＴＢＳ中に５分間浸漬する。
２．予め浸漬したニトロセルロース膜をドット−ブロット装置の中へ配置し、減圧してねじを固く締めることにより装置を密閉する。
３．１００μＬのＴＢＳを各ウェルに加えることにより、ニトロセルロース膜を再水和する。短い間減圧するが、ウェルを完全に乾燥させてはならない。
４．ドット−ブロット装置の流量バルブ／減圧チャンバーが外気へ開いていることを確認し、ウェルあたりの標的タンパク質の最終アッセイ量が５０ｎｇになるように、０．５ｎｇ／μＬのＭＥＫ１またはＭＥＫ２標的タンパク質溶液のいずれか１００μＬでウェルを満たす。
５．標的タンパク質を室温で４０分間、重力流により膜を通して濾過した後、残余の液体を減圧濾過により膜を通して排水する。
６．３００μＬの５％脱脂粉乳ＴＢＳ溶液を加え、室温で１時間ウェルをブロッキングする。
７．各ウェルから５％ブロッキング溶液を注意深く吸引する。
８．１００μＬのＴＢＳを加え、各ウェルを１回洗浄する。減圧濾過により、膜を通してＴＢＳを除去する。
９．試験される各ＭＥＫ阻害剤溶解物の０．１ｎｇ／μＬ溶液を、各ウェルの阻害剤の最終アッセイ量が１０ｎｇになるように、ＭＥＫ１タンパク質を含む１ウェルおよびＭＥＫ２タンパク質を含む１ウェルへ１００μＬずつ加える。阻害剤溶解物をＭＥＫ１／２標的タンパク質と共に室温で４０分間インキュベートした後、残余の溶解物を減圧濾過により膜を通して排水する。
１０．１００μＬの、１％ＳＤＳ、ＴＢＳ溶液を加えて各ウェルを洗浄する。減圧濾過により、膜を通して１％ＳＤＳ、ＴＢＳ溶液を除去する。全３回の洗浄のため、この洗浄過程をさらに２回繰り返す。
１１．減圧し、ペンまたは鉛筆で膜に印を付ける（装置から取り出した後、膜が再び整列できるように）。
１２．減圧を停止して、装置から膜を取り外す。
１３．膜をペトリ皿（または均等容器）中に配置し、１％ＳＤＳ、ＴＢＳ溶液で穏やかに攪拌しながら５分間洗浄する（膜全体を覆うため、十分な１％ＳＤＳ、ＴＢＳ溶液を加える）。全５回の洗浄のため、この洗浄過程をさらに４回繰り返す。
１４．膜から過剰のＳＤＳ界面活性剤を除くため、膜をＴＢＳ中で１回（工程１３に記述したように）洗浄する。
１５．工程２に記述したように、膜をドット−ブロット装置に戻す。
１６．各ウェルに１００μＬのＢｅｔａ−Ｇｌｏベータ−ガラクトシダーゼ基質を加え、室温で３０分間インキュベートする。
１７．膜を通してＢｅｔａ−Ｇｌｏ基質を減圧濾過し、装置から膜を取り外して、化学発光検出のためにＦｌｕｏｒＣｈｅｍイメージャーセット中で膜を１５分間曝露する。
【００９４】
このアッセイでは以下の材料を使用した：
１．ドット−ブロット装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄまたは均等物）
２．トリス（Ｓｉｇｍａ＃２５２８５９または均等物）
３．ＳＤＳ（ＩＣＮ＃８１１０３４または均等物）
４．ＮａＣｌ（ＥＭＤ＃７６４７−１４−５または均等物）
５．Ｂｅｔａ−Ｇｌｏアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｅ４７４０）
６．Ｍｅｋ１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ＃Ｍ０２−１０Ｇ−１０または均等物）
７．Ｍｅｋ２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ＃Ｍ０３−１０Ｇ−１０または均等物）
８．ＦｌｕｏｒＣｈｅｍイメージャー（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈまたは均等物）。
【００９５】
その後イメージデータを以下のプロトコルを用いて定量化した：
１．ソフトウェアアプリケーション、ＩｍａｇｅＪにてドットブロットイメージを開く。
２．第１の列の輪郭を描くため、四角のｓｅｌｅｃｔｉｏｎツールを用いる。
３．スペシャルメニューの中のＭａｒｋ  Ｆｉｒｓｔ  Ｌａｎｅを選択する。
４．四角のｓｅｌｅｃｔｉｏｎを移動させ（中をクリックし、ドラッグすることにより）、連続的にその他の各レーンの輪郭を描く（Ｍａｒｋ  Ｎｅｘｔ  Ｌａｎｅを使用する）。
５．レーンプロファイルプロットを作成するため、Ｐｌｏｔ  Ｌａｎｅｓを使用する。
６．上に示したように各ピークが近接の領域を限定できるよう、ベースラインおよびドロップラインを描くためにｌｉｎｅ  ｄｒａｗｉｎｇツールを使用する。
７．ｗａｎｄツールで連続的に、それぞれの内部をクリックすることにより、ピークの面積を測定する。
８．ピーク測定のデータファイル（ドット強度の値）はその後、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ｅｘｃｅｌファイルとして保存でき、標準化およびグラフ化される。
【００９６】
図２６はタンパク質ドットブロット結合アッセイのイメージ分析の結果を表し、幾つかの融合タンパク質がＭＥＫ１および／またはＭＥＫ２に対して結合活性を示すことを表す。
【００９７】
ＭＥＫ活性を調節するリガンドおよびポリリガンド、ならびにこれらのリガンドの作製法および使用法が開示される。リガンドおよびポリリガンドは、化学的に、または組み換えにより合成され、研究手段または治療法として利用される。本発明は細胞内での治療法のための、リガンドおよびポリリガンドの細胞局在シグナルへの連結を含む。
本発明は以下の態様を含み得る。
［１］
配列番号１または配列番号５または配列番号９または配列番号１３または配列番号１７または配列番号２１または配列番号２５または配列番号２９または配列番号３３に少なくとも約８０％同一なアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
［２］
単離されたキメラポリペプチドホモポリリガンドであって、その単量体が、Ｘａａがいずれのアミノ酸でもある配列番号４１〜５１のいずれか１に少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群より選択される、キメラポリペプチドホモポリリガンド。
［３］
単離されたキメラポリペプチドヘテロポリリガンドであって、その単量体が、Ｘａａがいずれのアミノ酸でもある配列番号４１〜５１のいずれか１に少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群より選択される、キメラポリペプチドヘテロポリリガンド。
［４］
Ｘａａとして示される少なくとも１のアミノ酸がセリン、チロシン、またはスレオニン以外のアミノ酸である配列番号４１〜５１のいずれから選択される２以上のポリペプチドを含む、単離されたキメラポリペプチド。
［５］
前記２以上のポリペプチドが配列番号４１〜４８から選択される、請求項４に記載の単離されたキメラポリペプチド。
［６］
前記２以上のポリペプチドが配列番号４９〜５１から選択される、請求項４に記載の単離されたキメラポリペプチド。
［７］
単離されたキメラポリペプチドホモポリリガンドであって、前記ホモポリリガンドがＭＥＫ活性を調節するキメラポリペプチドホモポリリガンド。
［８］
単離されたキメラポリペプチドヘテロポリリガンドであって、前記ヘテロポリリガンドがＭＥＫ活性を調節するキメラポリペプチドヘテロポリリガンド。
［９］
ａ）配列番号３７のアミノ酸残基２１８および／または２２２に相当するアミノ酸残基がセリン、チロシン、またはスレオニン以外のアミノ酸残基へ変異している、配列番号３７のアミノ酸残基２１３〜２２５に相当するアミノ酸残基を含むペプチドに少なくとも８０％同一なペプチド；
ｂ）配列番号３７のアミノ酸残基２１８および／または２２２に相当するアミノ酸残基がセリン、チロシン、またはスレオニン以外のアミノ酸残基へ変異している、配列番号３７のアミノ酸残基２１１〜２２７に相当するアミノ酸残基を含むペプチドに少なくとも８０％同一なペプチド；
ｃ）配列番号３７のアミノ酸残基２１８および／または２２２に相当するアミノ酸残基がセリン、チロシン、またはスレオニン以外のアミノ酸残基へ変異している、配列番号３７のアミノ酸残基２０８〜２２９に相当するアミノ酸残基を含むペプチドに少なくとも８０％同一なペプチド；および
ｄ）配列番号３７のアミノ酸残基２１８および／または２２２に相当するアミノ酸残基がセリン、チロシン、またはスレオニン以外のアミノ酸残基へ変異している、配列番号３７のアミノ酸残基２１０〜２３１に相当するアミノ酸残基を含むペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドからなる群より選択されるペプチドの少なくとも１コピーを含む、ＭＥＫのポリペプチド阻害物質。
［１０］
ａ）配列番号３７のアミノ酸残基２９８および／または３００に相当するアミノ酸残基がセリン、チロシン、またはスレオニン以外のアミノ酸残基へ変異している、配列番号３７のアミノ酸残基２９３〜３０５に相当するアミノ酸残基を含むペプチドに少なくとも８０％同一なペプチド；
ｂ）配列番号３７のアミノ酸残基２９８および／または３００に相当するアミノ酸残基がセリン、チロシン、またはスレオニン以外のアミノ酸残基へ変異している、配列番号３７のアミノ酸残基２９１〜３０８に相当するアミノ酸残基を含むペプチドに少なくとも８０％同一なペプチド；
ｃ）配列番号３７のアミノ酸残基２９８および／または３００に相当するアミノ酸残基がセリン、チロシン、またはスレオニン以外のアミノ酸残基へ変異している、配列番号３７のアミノ酸残基２９０〜３０９に相当するアミノ酸残基を含むペプチドに少なくとも８０％同一なペプチド；および
ｄ）配列番号３７のアミノ酸残基２９８および／または３００に相当するアミノ酸残基がセリン、チロシン、またはスレオニン以外のアミノ酸残基へ変異している、配列番号３７のアミノ酸残基２８９〜３１０に相当するアミノ酸残基を含むペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドからなる群より選択されるペプチドの少なくとも１コピーを含む、ＭＥＫのポリペプチド阻害物質。
［１１］
ａ）配列番号３８のアミノ酸残基２０２および／または２０４に相当するアミノ酸残基がセリン、チロシン、またはスレオニン以外のアミノ酸残基へ変異している、配列番号３８のアミノ酸残基１９９〜２１０に相当するアミノ酸残基を含むペプチドに少なくとも８０％同一なペプチド；
ｂ）配列番号３８のアミノ酸残基２０２および／または２０４に相当するアミノ酸残基がセリン、チロシン、またはスレオニン以外のアミノ酸残基へ変異している、配列番号３８のアミノ酸残基１９８〜２１７に相当するアミノ酸残基を含むペプチドに少なくとも８０％同一なペプチド；
ｃ）配列番号３８のアミノ酸残基２０２および／または２０４に相当するアミノ酸残基がセリン、チロシン、またはスレオニン以外のアミノ酸残基へ変異している、配列番号３８のアミノ酸残基１８７〜２１１に相当するアミノ酸残基を含むペプチドに少なくとも８０％同一なペプチド；および
ｄ）配列番号３８のアミノ酸残基２０２および／または２０４に相当するアミノ酸残基がセリン、チロシン、またはスレオニン以外のアミノ酸残基へ変異している、配列番号３８のアミノ酸残基１９１〜２１１に相当するアミノ酸残基を含むペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドからなる群より選択されるペプチドの少なくとも１コピーを含む、ＭＥＫのポリペプチド阻害物質。
［１２］
ａ）配列番号３９のアミノ酸残基１８５および／または１８７に相当するアミノ酸残基がセリン、チロシン、またはスレオニン以外のアミノ酸残基へ変異している、配列番号３９のアミノ酸残基１７０〜１９４に相当するアミノ酸残基を含むペプチドに少なくとも８０％同一なペプチド；
ｂ）配列番号３９のアミノ酸残基１８５および／または１８７に相当するアミノ酸残基がセリン、チロシン、またはスレオニン以外のアミノ酸残基へ変異している、配列番号３９のアミノ酸残基１７４〜１９８に相当するアミノ酸残基を含むペプチドに少なくとも８０％同一なペプチド；
ｃ）配列番号３９のアミノ酸残基１８５および／または１８７に相当するアミノ酸残基がセリン、チロシン、またはスレオニン以外のアミノ酸残基へ変異している、配列番号３９のアミノ酸残基１７６〜１９７に相当するアミノ酸残基を含むペプチドに少なくとも８０％同一なペプチド；および
ｄ）配列番号３９のアミノ酸残基１８５および／または１８７に相当するアミノ酸残基がセリン、チロシン、またはスレオニン以外のアミノ酸残基へ変異している、配列番号３９のアミノ酸残基１７９〜１９３に相当するアミノ酸残基を含むペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドからなる群より選択されるペプチドの少なくとも１コピーを含む、ＭＥＫのポリペプチド阻害物質。
［１３］
細胞内局在シグナル、レポーター、および／またはエピトープタグへ連結される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［１４］
少なくとも２の単量体リガンドを含む組成物であって、前記リガンドそれぞれの少なくとも１部分がＭＥＫにより認識可能であり、かつ前記リガンドの少なくとも１がＭＥＫによりリン酸化可能なアミノ酸を含まない組成物。
［１５］
前記組成物がホモ重合体リガンドである、請求項１４に記載の組成物。
［１６］
少なくとも２の前記単量体リガンドの間にスペーサーアミノ酸をさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
［１７］
局在シグナル、レポーター、および／またはエピトープタグをさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
［１８］
前記組成物がヘテロ重合体リガンドである、請求項１４に記載の組成物。
［１９］
少なくとも２の前記単量体リガンドの間にスペーサーアミノ酸をさらに含む、請求項１８に記載の組成物。
［２０］
局在シグナル、レポーター、および／またはエピトープタグをさらに含む、請求項１８に記載の組成物。
［２１］
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
［２２］
請求項２１に記載の核酸分子を含むベクター。
［２３］
請求項２２に記載のベクターを含む組み換えホスト細胞。
［２４］
細胞内でＭＥＫを阻害する方法であって、請求項２２に記載のベクターをホスト細胞内へトランスフェクトすること、および前記ポリペプチドの少なくとも１コピーを産生するための適切な条件下で前記トランスフェクトされたホスト細胞を培養することを含む方法。
［２５］
請求項２４に記載のポリペプチドのそれぞれをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドの１末端に第１の制限酵素によって切断可能な配列が隣接し、かつ前記ポリヌクレオチドのもう１つの末端に第２の制限酵素によって切断可能な配列が隣接し、かつ第１および第２の制限酵素が非互換性の付着末端を生じるポリヌクレオチド。
［２６］
請求項２４に記載のポリペプチドのそれぞれをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドの１末端にＮｇｏＭ  ＩＶによって切断可能な配列が隣接し、かつ前記ポリヌクレオチドのもう１つの末端にＸｍａＩおよびＣｌａＩによって切断可能な配列が隣接するポリヌクレオチド。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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