(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−４を産生するＴ細胞を眼中に蓄積させる作用物質を含む、乾燥型加齢性黄斑変性症の治療のための薬剤であって、
前記作用物質が、コポリマー−１である、上記薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、加齢性黄斑変性症を治療するための方法及び組成物に関する。
【０００２】
略語：Ａβ、アミロイドβ−ペプチド；ＡＤ、アルツハイマー病；ＡＭＤ、加齢性黄斑変性症；ＡＰＣ、抗原提示細胞；ＢｒｄＵ、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン；ＣＮＳ、中枢神経系；ＣＯＰ−１、コポリマー１；ＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質；ＩＢ−４、バンデイラエア・シンプリシフォリア（Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ）のイソレクチンＢ４；ＩＧＦ、インシュリン様増殖因子；ＩＬ、インターロイキン；ＭＧ、ミクログリア；ＭＨＣ−ＩＩ、クラスＩＩ主要組織適合複合体；ＭＷＭ、モリス水迷路；ＮＰＣ、神経幹／前駆細胞；ＲＧＣ、網膜神経節細胞；Ｔｇ、トランスジェニック；Ｔｈ、Ｔ−ヘルパー；ＴＮＦ−α、腫瘍壊死因子−α。
【背景技術】
【０００３】
加齢性黄斑変性症
加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）は、鮮明な視界が得られる網膜内の領域である眼の黄斑部に影響を与える疾患である。黄斑変性症は、本発明者らが見る画像を記録し眼から脳に視神経を介してそれらを送る、網膜中心部分、眼の内側の後層の劣化によって引き起こされる。黄斑として知られる網膜の中心部分は、眼の中心視野の焦点合わせを担い、それは読み、車を運転し、顔や色を認識し、詳しく物体を見る本発明者らの能力を制御する。
【０００４】
ＡＭＤは先進工業国における高齢者間の回復不可能な失明の主な原因であり、６０歳を超える集団中でその有病率が増大する（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９２；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５）。この疾患の病因、疾患の進行と関係があるその病態生理学及び要因を理解するために、多数の試みがなされてきている。ＡＭＤの一般的な初期徴候は、眼の網膜又は視神経頭部における、ドルーゼ、小さな黄色又は白色の脂肪球及び細胞外物質の形成である。ドルーゼは硬質ドルーゼ（無傷に見える小さな、固体沈着物）、又は不明瞭な境界を有する軟質ドルーゼのさらに大きな沈着物として生じる。網膜色素上皮（ＲＰＥ）とブルッフ膜の間に蓄積する軟質ドルーゼは、この２つの構造を切り離す。
【０００５】
４０歳を超える大部分の人々が少量の硬質ドルーゼを有しており、ＡＭＤの症例ではこれらが接合して軟質ドルーゼを形成し得る。しかしながら、全ての軟質ドルーゼが硬質ドルーゼに由来する訳ではない。
【０００６】
２つの型の黄斑変性症：乾燥又は萎縮型、及び湿性又は滲出型が存在する。全ＡＭＤ患者の８０％を構成する乾燥型のＡＭＤは、ドルーゼの出現によって特徴付けられる。ドルーゼの存在は、疾患の進行と進行性乾燥型ＡＭＤ又は湿性型ＡＭＤのいずれかを関連付ける、既存の要因であると考えられる。
【０００７】
アルツハイマー病
アルツハイマー病（ＡＤ）は、記憶喪失及び重度の認識衰退によって特徴付けられる加齢性の進行性神経変性障害である（Ｈａｒｄｙ＆Ｓｅｌｋｏｅ、２００２）。臨床的な特徴は、ニューロン消失をもたらす、脳実質、特に海馬及び大脳皮質中のアミロイドプラークの形のアミロイドβ−ペプチド（Ａβ）の細胞外凝集体の過剰な蓄積によって形態的に示される（Ｓｅｌｋｏｅ、１９９１）。さらに、アルツハイマー病の大部分のマウスモデルでは、成体脳の海馬中で生存中に通常起こるニューロン新生が混乱する（Ｈａｕｇｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００２）。アルツハイマー患者では、トランスジェニックマウス（ＰＤＧＦ−ＡＰＰＳｗ、Ｉｎｄ）中と同様に、ニューロン新生の幾らかの増大が起こるが、明らかにこの疾患を克服するほど十分ではない（Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００４ａ、ｂ）。
【０００８】
ＡＭＤとアルツハイマー病の間の類似性
ＡＭＤとアルツハイマー病は、いずれも相当な割合の老人に影響を与える慢性神経変性障害である。これらの障害に特徴的なのは機能の不可逆的消失であり、そのための治療法は存在しない。ＡＭＤ及びアルツハイマー病において生じる変性は、ある程度共通の病因を有する可能性がある（Ｋｌａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９）。ＡＭＤとアルツハイマー病の両方の病因は大部分が知られていないが、この２つの疾患の発病はある程度顕著な類似性を示す。ＡＭＤでは、初期の病理組織学的所見は、細胞外のドルーゼの沈着及び基底層の沈着である（Ｈａｇｅｍａｎ＆Ｍｕｌｌｉｎｓ、１９９９）。これらの病巣は脂質、糖タンパク質及びグリコースアミノグリカンを含み、これらはおそらく変性神経網膜に由来する（Ｋｌｉｆｆｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５）。これらの沈着物の蓄積は、光受容体の消失及び黄斑機能のその後の悪化と関係がある（Ｈｏｌｚ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４）。前述のように、アルツハイマー病における初期の病的特徴は、細胞外の老人性プラークの存在である（Ｓｅｌｋｏｅ、１９９１）。これらのプラークは、アミロイド前駆体タンパク質として知られる膜貫通型ポリペプチドのファミリーのタンパク質分解的切断によって生成する小さなペプチドを含めた、多くの構成要素からなる。アルツハイマー病の病状の主な原因として広く考えられている２つのペプチドは、アミロイド−β（Ａβ）ペプチドとして知られる。アミロイド沈着物及びドルーゼの共通の構成要素には、ビトロネクチン、アミロイドＰ、アポリポタンパク質Ｅなどのタンパク質、及びさらにアルツハイマー病におけるアミロイドプラークと関係があるＡβペプチド及びアミロイドオリゴマーがある（Ｌｕｉｂｌ  ｅｔ  ａｌ．、２００６；Ｍｕｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、２０００；Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）。
【０００９】
アルツハイマー病において存在するＡβペプチドはミクログリア細胞を活性化して、神経変性の変化をもたらす、活性酸素及び窒素種、前炎症性サイトカイン、補体タンパク質、及び他の炎症性メディエーターなどの、潜在的な神経毒性物質を産生する（Ａｋｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．、２０００）。アルツハイマー病と関係している炎症応答は、ＣＤ１１ｂ＋活性化ミクログリアと関係があることが多く、中枢神経系（ＣＮＳ）における免疫系の先天的部分を表す（Ｓｔｒｅｉｔ、２００４）。ＣＤ１１ｂ＋ミクログリアは加齢性の通常のヒトの脳と関係があることが報告されており（Ｓｔｒｅｉｔ、２００４）、このようなミクログリアは、加齢性の認識消失と異常なニューロン新生の両方に寄与するミクログリアであると考えられる（Ｍｏｎｊｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）。ＣＤ１１ｂはアルツハイマー病を有する患者においても見られている（Ａｋｉｙａｍａ＆ＭｃＧｅｅｒ、１９９０）。さらに、炎症性メディエーターはアミロイド沈着物及びドルーゼ中に存在し、ＡＭＤ及びアルツハイマー病における炎症経路に関する、おそらく共通の役割を示唆する（Ｈａｇｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００１）。ドルーゼの生合成における局所炎症の役割は、それがアルツハイマー病において起こるプロセスと類似していることを示唆し、その場合細胞外プラーク及び沈着物の蓄積が、初期の病的刺激の影響を悪化させる局所の慢性的炎症応答を誘導する（Ａｋｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．、２０００）。
【００１０】
神経変性におけるミクログリアの活性化
ミクログリアは、成体ヒト網膜の全層内に存在する骨髄由来のグリア細胞である（Ｐｅｎｆｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１）。ニューロン又は血管と結合し得る幾つかの型が存在し、これらの幾つかは抗原提示細胞（ＡＰＣ）である（Ｐｅｎｆｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１；Ｐｒｏｖｉｓ、２００１）。損傷したニューロン組織における、有益又は有害のいずれかであるミクログリアの活性化の性質は、ミクログリアがどのように脅威をとらえるかに依存する（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）。正常な非損傷ニューロン組織中のミクログリア細胞の存在は数年間議論されてきているが、眼中のそれらの存在を含めて、それは現在認められている事実である（Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）。炎症プロセスにおけるミクログリアの役割については意見が分かれている。一方では、眼の炎症プロセスにおけるミクログリアの関与は、成熟した網膜神経節細胞（ＲＧＣ）を刺激してそれらの軸索を再生する可能性がある（Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）。他方では、神経変性プロセスにおけるミクログリアの役割はニューロン組織に有害である可能性がある。Ｒｏｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）は、ミクログリア細胞は、培養した光受容体細胞の変性を誘導する（複数の）可溶性産物を放出することを示した。抗原特異的細胞介在免疫応答の重大な要因である抗原提示細胞の存在に関する矛盾する報告によって、この議論を説明することができる。神経網膜ミクログリアにおける免疫応答は、網膜色素上皮の色素化及びドルーゼ形成の初期の病的変化と関係がある。活性化したミクログリアは、ＡＭＤ及び遅発性網膜変性における桿体細胞の死とも関連し得る。近年の研究は、初期の桿体細胞死によって活性化されたミクログリアは外核層に移動し、桿体細胞の残骸を除去し、近隣の錐体光受容体を殺傷し得ると提案している（Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）。
【００１１】
血液由来マクロファージと同様に、ミクログリアは細胞外沈着物のスカベンジング、及びアルツハイマー病における異常なアミロイド沈着物のファゴサイトーシスを示す。このようなミクログリアは、食細胞として有効に作用する一方で、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）のようなメディエーターの分泌によるニューロン死を引き起こし（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）、したがって、食細胞として作用する一方で（Ｆｒｅｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）、それらは明らかにアルツハイマー病の症状を撃退するほど十分に効率的ではない。これらの定住ミクログリアとは対照的に、対応する野生型マウスの骨髄由来のミクログリアは、プラークを効率的に除去することができる（Ｓｉｍａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、２００６）。さらに、正常に機能するマクロファージの不在は臨床的ＡＭＤの発症をもたらす（Ａｍｂａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）。したがって、アルツハイマー病と同様にＡＭＤは、異常な沈着物のスカベンジングが食細胞自体によって媒介される疾患進行の自己永続化を必然的に誘導する疾患を例示する（Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）。
【００１２】
防御性自己免疫
数年前に、本発明者らのグループは「防御性自己免疫」（Ｍｏａｌｅｍ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９）の概念を考案した。前炎症性サイトカインと抗炎症性サイトカインの両方が、Ｔ細胞活性のタイミング及び強度が適切に制御されるという条件で（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００５；Ｓｈａｋｅｄ  ｅｔ  ａｌ．、２００４）、且つ疾患の性質に応じて（Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、２００６）、Ｔ細胞媒介性の有益な自己免疫応答の重要な構成要素であることが分かった。本発明者らの概念によれば、制御不能な自己免疫は、以下で論じるように、ミクログリアの圧倒的な活性化と関係がある自己免疫疾患の一般に知られている状態をもたらす（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００６ａ）。自己反応性Ｔ細胞の有益な効果は、抗原を提示することができる（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００１；Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００５；Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、２００６；Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００６ａ；Ｓｈａｋｅｄ  ｅｔ  ａｌ．、２００４）、表現型をとるようにＣＮＳ定住ミクログリアを誘導する、増殖因子を発現することができる（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００５；Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００６ａ；ｂ）、及びグルタミン酸を緩衝することができる（Ｓｈａｋｅｄ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）、それらの能力によって発揮されることが分かった。
【００１３】
防御自己反応性Ｔ細胞の有効性の増大を試みる際に、本発明者らは神経保護に安全且つ適した抗原の検索において多くの化合物を試験した。本発明者らは次いで、コポリマー１又はＣｏｐ−１（Ｋｉｐｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、２０００；Ａｖｉｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００４；Ａｎｇｅｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）、安全であることが知られており１日１回の投与レジメンによる多発性硬化症の治療用作用物質として現在使用されている合成４−アミノ酸コポリマー（Ｃｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）、Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．、イスラエル）としても知られる、酢酸グラチラマーの使用を示唆した。本発明者らの研究では、広範囲のＣＮＳ自己抗原とのその低親和性の交差反応を実証した。交差反応の親和性は低いので、Ｃｏｐ−１活性化Ｔ細胞は、ＣＮＳに浸潤した後、自己免疫疾患の付随リスクをほとんど又は全く伴わずに、局部的に活性化した状態になる可能性がある（Ｋｉｐｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、２０００）。
【００１４】
Ｃｏｐ−１の単回注射は、ＣＮＳ損傷の急性モデルにおいて防御性があり（Ｋｉｐｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、２０００；Ａｖｉｄａｎ  ｅｔ  ａｔ．、２００４；Ｋｉｐｎｉｓ．＆  Ｓｃｈｗａｒｔｚ、２００２）、一方慢性モデルでは、時折の追加抗原刺激が長期の防御効果に必要とされる（Ａｎｇｅｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）。慢性的に高い眼内圧のラットモデルでは、Ｃｏｐ−１を用いた予防接種は、圧力が高い状態である場合でさえＲＧＣ消失を有意に低下させる。予防接種が疾患の発症を予防するわけではないが、神経及び網膜の局所細胞外環境を調節し、それをニューロンの生存に有利にし、ストレスに耐えることができるようにＲＧＣを改善することによって、疾患の進行を遅らせることができることに留意されたい（Ｓｃｈｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００１；Ｂｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００４；Ｋｉｐｎｉｓ＆Ｓｃｈｗａｒｔｚ、２００２；Ｋｉｐｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、２０００）。
【００１５】
慢性状態には時折の追加抗原刺激が必要とされる。例えば、慢性的に高い眼内圧のモデルでは、無アジュバントＣｏｐ−１の１週間に１回の投与が、神経防護作用をもたらしたことが分かった（Ｂａｋａｌａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）。Ｃｏｐ−１の神経防御効果は脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の産生に部分的に起因している（Ｋｉｐｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、２００４ｂ；Ｚｉｅｍｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００２）。
【００１６】
凝集したＡβは定住ミクログリアにおいて毒性を誘導し、細胞の再生を阻害する
本発明者らの研究室で実施した最近の研究は、凝集したＡβに曝されたミクログリアは、プラークを除去する際には有効であるが、ニューロンに対して毒性でありニューロン細胞の再生を阻害し（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００６ａ）；（ＬＰＳに対するそれらの応答によって例証されたように）（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００５；Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、２００６）これらの影響は侵入する微生物に対するミクログリアの応答を連想させることを示唆した。このような活性は、ＴＮＦ−αの産生増大、インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ）の下方制御、クラスＩＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ−ＩＩ）タンパク質及びＣＤ１１ｃ（樹状細胞のマーカー）を発現する能力、したがって抗原提示細胞（ＡＰＣ）として作用する能力の阻害、及びニューロン組織の生存及び再生をサポートできないことによって示される（（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００６ａ；Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００５；Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００６ｂ）。さらに本発明者は、ミクログリアが凝集したβ−アミロイドに遭遇するとき、隣接するニューロンに毒性の影響を与えず或いはニューロン新生を阻害せずに、これらの凝集体を除去するミクログリアの能力は、それらが表現型の変化を受けることに依存することを見出した。ミクログリアの表現型の変化は、インターロイキン（ＩＬ）−４などのＴ細胞由来のサイトカインによって媒介される、ミクログリアとＴ細胞の間の局所相互作用によって起こる可能性がある。ＩＬ−４、Ｔ−ヘルパー（Ｔｈ）−２細胞由来のサイトカイン以外に、凝集したＡβによって活性化されるミクログリアは、ＩＧＦ−Ｉ発現の下方制御、ＴＮＦ−α発現の上方制御を逆転させ、ＡＰＣとして作用することができない可能性がある（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）。ｉｎ−ｖｉｖｏのニューロン細胞再生に関するミクログリアの有意性は、ＩＬ−４活性化ミクログリアの脳室内注射後のラットの歯状回における増大したニューロン新生によって、及び高密度環境で飼育したラットの歯状回におけるＩＧＦ−Ｉ発現ミクログリアの存在によって実証された（Ｚｉｖ  ｅｔ  ａｌ．、２００６）。急性又は慢性ＥＡＥを有するげっ歯類では、脳脊髄液へのＩＬ−４活性化ミクログリアの注射は、脊髄における増大したオリゴデンドロサイト形成をもたらし、臨床症状を改善した。新たに形成されたオリゴデンドロサイトは、ＭＨＣ−ＩＩ及びＩＧＦ−Ｉを発現するミクログリアと空間的に結合していた（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００６ｃ）。
【００１７】
アルツハイマー病とＡＭＤの両方で、全身の構成要素が存在する
全身免疫細胞は（幾つかの自己抗原を対象とするＴ細胞の形で）損傷ニューロンを死から保護することができるという本発明者らの最初の観察結果は、ミエリン塩基性タンパク質に特異的なＴ細胞の受動伝達は外傷性視神経損傷の後にＲＧＣの消失を低下させることを示したげっ歯類の研究（Ｍｏａｌｅｍ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９）から導いた。これらのＴ細胞は、ミエリン塩基性タンパク質の潜在性又は病原性エピトープのいずれか、及び他のミエリン抗原又はそれらのエピトープ（Ｍｉｚｒａｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００２）を対象とするときも有効であることを、本発明者らは見出した。これらの発見は幾つかの重大な問題を提起した。例えば、ミエリン抗原は任意の型の急性又は慢性損傷から神経系を保護することができるのか。観察した免疫細胞の神経防護活性は本発明者らの実験条件を示す単なる事例的発見なのか、或いはそれは、一般に視覚系及びＣＮＳにおける有害状態を撃退する際の免疫系の重大な関与を指摘するのか。後者の場合、それは神経変性疾患が全身疾患であることを意味するのか。そうである場合、この発見は脳、眼、及び脊髄を保護する全身療法に変えることはできるのか。
【００１８】
最近数年間で実施した一連の実験において、防御性Ｔ細胞応答は、重度の損傷において十分でない可能性があるか、或いは常に適切に制御される可能性があるわけではない生理的に誘発される応答であることを、本発明者らは最初に学習している。さらに本発明者らは、このような防御性Ｔ細胞の特異性は損傷の部位に依存することを発見した。したがって例えば、ミエリン結合抗原を用いた予防接種の防御効果は白質の傷害、即ち有髄軸索に限られる（Ｍｉｚｒａｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００２；Ａｖｉｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００４；Ｓｃｈｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００１）。損傷がミエリンを含まない網膜に対する損傷である場合、ミエリン抗原には全く効果がない。第二に本発明者らは、ストレスの部位（眼又は脳）に存在する特異的自己抗原に反応性があるＴ細胞の傷害誘導型応答は、自発的生理応答であることを観察した（Ｙｏｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、２００１）。次いで本発明者らは、有益な自己免疫Ｔ細胞の表現型を同定すること、及びＣＮＳ傷害に対するＴ細胞介在応答の有益な（神経防護の）結果と自己免疫疾患を引き起こす破壊的影響の間のバランスを、何が決定するのか理解することを試みた。本発明者らは有益な応答を緑内障の治療に反映させる方法も調べた。本発明者らは、免疫不全動物では、眼、脊髄又は脳の損傷後の生存ＲＧＣの数は完全な免疫系を有する適合対照中より著しく少ないことを見出し、ＣＮＳに対する損傷に耐える能力は免疫系の完全性に、及び特に免疫系内の特異的集団、部位特異的自己抗原を認識する集団に依存することが示唆された。興味深いことに、ステロイドの使用はＲＧＣの有意な消失を引き起こした（Ｂａｋａｌａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）。
【００１９】
損傷部位に定住する抗原に特異的なＴ細胞は除去及び治癒に助力する
防御的であるためには、抗自己Ｔ細胞は損傷部位に存在し、局部的に活性化されるべきである。これが、病巣部において提示される抗原のみを予防接種に使用することができる理由である。ひとたび活性化されると、Ｔ細胞は定住する眼の前哨細胞−ミクログリアを形成するサイトカイン及び増殖因子の供給源を与えて、それらを眼が許容し得る活性のある防御細胞にする。即ち、このような活性化ミクログリアは、脳と同様に眼が低い耐性を有するそれらの殺傷機構の一部分である作用物質（例えばＴＮＦ−α）の産生を抑制しながら、グルタミン酸を摂取し、残骸を除去し、増殖因子を産生することができる（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００５；Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００１；Ｂａｒｏｕｃｈ＆Ｓｃｈｗａｒｔｚ、２００２；Ｍｏａｌｅｍ  ｅｔ  ａｌ．、２０００；Ｓｈａｋｅｄ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）。このようなＴ細胞は、必要時にそれ自体が調節されやすい生理的に存在する制御Ｔ細胞によって構造的に調節される（Ｋｉｐｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、２００４ａ；Ｋｉｐｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、２００２）。
【００２０】
その内容が本発明の範囲から明らかに除外される、同日にイスラエルＰＣＴ受理官庁（ＲＯ／ＩＬ）で出願人によって出願された、「組織修復を促進し損傷組織を検出するための活性化ミエロイド細胞（Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｐａｉｒ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄａｍａｇｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ）」という表題の、同時係属の国際特許出願ＰＣＴ／ＩＬ２００７／．．．．．．を参照。
【００２１】
本明細書における如何なる文書の引用も、それらの文書が関連ある従来技術、又は本出願の任意の特許請求の範囲の特許性に対して考えられる題材であることを認めるものではない。任意の文書の内容又は日付に関する任意の記述は、出願時に出願人が入手可能であった情報に基づくものであり、このような記述の正確性に関する承認となるものではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明の目的は、加齢性黄斑変性症のための免疫系療法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
一態様では、本発明は、加齢性黄斑変性症を治療するための方法であって、必要性のある患者の眼中にＩＬ−４を産生するＴ細胞を蓄積させ、それによって黄斑変性症の進行を停止又は遅延させることを含む方法に関する。
【００２４】
一実施形態では、眼中のＴ細胞の蓄積を、
（ｉ）コポリマー−１、コポリマー−１関連ペプチド、又はコポリマー−１関連ポリペプチド、
（ｉｉ）ＩＬ−４、
（ｉｉｉ）ＩＬ−４によって活性化される樹状細胞、単球、骨髄由来ミエロイド細胞又は末梢血単核細胞、
（ｉｖ）ＩＬ−４を産生する遺伝子操作細胞、
（ｖ）ＩＬ−１３又は２０ｎｇ／ｍｌまでのＩＦＮ−γで活性化される骨髄由来ミエロイド細胞又は末梢血由来ミエロイド細胞、
（ｖｉ）眼のＴ細胞媒介性の特定の自己免疫疾患と関係がある病原性自己抗原、
（ｖｉｉ）配列が（ｖｉ）の病原性自己抗原の配列内に含まれるペプチド、又は前記ペプチドの改変によって得られるペプチドであって、改変が、異なるアミノ酸残基によるペプチドの１つ又は複数のアミノ酸残基の置換にあり（以下「改変ペプチド」）、前記改変ペプチドが、低い親和性ではあるが、親ペプチドによって認識されるＴ細胞受容体を依然として認識することができるペプチド、
（ｖｉｉｉ）（ｖｉ）の病原性自己抗原又は（ｖｉｉ）のペプチド若しくは改変ペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｉｘ）（ｉ）、（ｖｉ）又は（ｖｉｉ）の作用物質によって活性化されるＴ細胞、及び
（ｘ）（ｉ）〜（ｉｘ）の任意の組合せ
からなる群から選択される作用物質を前記患者に投与することによって引き起こす。
【００２５】
他の態様では、本発明は、加齢性黄斑変性症の治療用の薬剤を調製するための、前の（ｉ）〜（ｘ）で定義した作用物質の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】成体マウスのニューロン前駆細胞におけるミクログリアの毒性及びニューロン新生の促進に対する凝集したＡβの悪影響を、ＩＬ−４が相殺することができることを実証する図である。Ｉｎ−ｖｉｔｒｏの治療パラダイムの図である。
【図１Ｂ】成体マウスのニューロン前駆細胞におけるミクログリアの毒性及びニューロン新生の促進に対する凝集したＡβの悪影響を、ＩＬ−４が相殺することができることを実証する図である。ミクログリア無しで（ＭＧ、対照）、或いは未処理ミクログリアと、或いは凝集したＡβ（１−４０）（５μＭ）によって４８時間予め活性化し（ＭＧ（Ａβ１−４０））、ＩＦＮ−γ（１０ｎｇ／ｍｌ）で（ＭＧ（Ａβ１−４０／ＩＦＮγ））、或いはＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）で（ＭＧ（Ａβ１−４０／ＩＬ−４））、或いはＩＦＮ−γ（１０ｎｇ／ｍｌ）とＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）の両方でその後活性化した（ＭＧ（Ａβ１−４０／ＩＦＮγ＋ＩＬ−４））ミクログリアと１０日間共培養した、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びβＩＩＩ−Ｔ（ニューロンマーカー）を発現するニューロン前駆細胞（ＮＰＣ）の代表的な共焦点顕微鏡画像である。凝集したＡβはミクログリアがアメーバ状の形態をとるのを誘導したが、ＩＬ−４を加えた後にそれらは分枝構造を示したことに留意されたい。
【図１Ｃ】成体マウスのニューロン前駆細胞におけるミクログリアの毒性及びニューロン新生の促進に対する凝集したＡβの悪影響を、ＩＬ−４が相殺することができることを実証する図である。ＣＤ１１ｂ＋ミクログリアに隣接するＧＦＰとβＩＩＩ−Ｔを共発現するＮＰＣの別個の共焦点画像である。
【図１Ｄ】成体マウスのニューロン前駆細胞におけるミクログリアの毒性及びニューロン新生の促進に対する凝集したＡβの悪影響を、ＩＬ−４が相殺することができることを実証する図である。共焦点画像から得たＧＦＰとβＩＩＩ−Ｔで二重染色した細胞の定量化の図である（ＧＦＰ＋細胞の割合として表す）。結果は同型培養での３回の独立した実験の結果であり、バーは平均±ＳＥＭを表す。バーの上の星印は、未処理（対照）ＮＰＣと比較した差の有意性を示す（＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１；スチューデントの両側ｔ−検定）。それらの上の水平線及びＰ値は、示した群の間の差を示す（ＡＮＯＶＡ）。
【図２Ａ】Ｃｏｐ−１予防接種はβ−アミロイドの減少をもたらし、ミクログリアの重要な役割である、トランスジェニックアルツハイマー病マウスの脳内の海馬ニューロンの消失を相殺することを示す図である。ＮｅｕＮ（成熟ニューロン）及びヒトＡβを染色した、非トランスジェニック（Ｔｇ）、未治療−Ｔｇ−アルツハイマー病（ＡＤ）、及びＣｏｐ−１−予防接種Ｔｇ−ＡＤマウス由来の脳の海馬切片の代表的な共焦点顕微鏡画像である。非Ｔｇマウスは、ヒトＡβに関する染色を示さない。未治療−Ｔｇ−ＡＤマウスは多量の細胞外Ａβプラークを示し、一方Ｃｏｐ−１治療Ｔｇ−ＡＤマウスではＡβ免疫反応性は低い。弱いＮｅｕＮ＋染色が、その非Ｔｇ同腹子と比較して未治療−Ｔｇ−ＡＤマウスの海馬ＣＡ１及び歯状回領域中で見られ、一方Ｃｏｐ−１−予防接種Ｔｇ−ＡＤマウス中でのＮｅｕＮ＋染色はほぼ正常である。
【図２Ｂ】Ｃｏｐ−１予防接種はβ−アミロイドの減少をもたらし、ミクログリアの重要な役割である、トランスジェニックアルツハイマー病マウスの脳内の海馬ニューロンの消失を相殺することを示す図である。抗ＣＤ１１ｂ抗体を使用した活性化ミクログリアの染色の図である。低倍率及び高倍率での画像は、未治療−Ｔｇ−ＡＤマウスの海馬のＣＡ１及び歯状回領域中のＡβとＣＤ１１ｂで二重染色したミクログリアの高い割合を示すが、Ｃｏｐ−ｌ−予防接種Ｔｇ−ＡＤマウス中にはＣＤ１１ｂ＋ミクログリアがごくわずかに存在する。以下に示すように、矢印は高倍率の領域を示す。
【図２Ｃ】Ｃｏｐ−１予防接種はβ−アミロイドの減少をもたらし、ミクログリアの重要な役割である、トランスジェニックアルツハイマー病マウスの脳内の海馬ニューロンの消失を相殺することを示す図である。Ａβプラークと結合したＣＤ１１ｂ＋ミクログリアは未治療−Ｔｇ−ＡＤマウス中でＴＮＦ−αを強く発現することを示す図である。
【図２Ｄ】Ｃｏｐ−１予防接種はβ−アミロイドの減少をもたらし、ミクログリアの重要な役割である、トランスジェニックアルツハイマー病マウスの脳内の海馬ニューロンの消失を相殺することを示す図である。Ａβに関して陽性染色された領域中の、Ｃｏｐ−１−予防接種Ｔｇ−ＡＤマウスから得た低温切片におけるＭＨＣ−ＩＩ（抗原提示のマーカー）の染色は、高い割合のＭＨＣ−ＩＩ＋ミクログリアを示すが、ＴＮＦ−α＋ミクログリアはほとんど示さないことを示す図である。
【図２Ｅ】Ｃｏｐ−１予防接種はβ−アミロイドの減少をもたらし、ミクログリアの重要な役割である、トランスジェニックアルツハイマー病マウスの脳内の海馬ニューロンの消失を相殺することを示す図である。Ｃｏｐ−１−予防接種Ｔｇ−ＡＤマウスにおいてＡβに関して陽性染色された脳領域中の全てのＭＨＣ−ＩＩ＋ミクログリア（矢じり）は、ＣＤ１１ｃ（樹状細胞のマーカー）を共発現するが、ごくわずかなＣＤ１１ｃ＋／ＭＨＣ−ＩＩ＋ミクログリアが、未治療−Ｔｇ−ＡＤマウスの脳内の対応する領域中で見られることを示す図である。
【図２Ｆ】Ｃｏｐ−１予防接種はβ−アミロイドの減少をもたらし、ミクログリアの重要な役割である、トランスジェニックアルツハイマー病マウスの脳内の海馬ニューロンの消失を相殺することを示す図である。Ｃｏｐ−１−予防接種Ｔｇ−ＡＤマウス中のＭＨＣ−ＩＩ＋ミクログリアは、ＩＧＦ−Ｉを共発現することを示す図である。
【図２Ｇ】Ｃｏｐ−１予防接種はβ−アミロイドの減少をもたらし、ミクログリアの重要な役割である、トランスジェニックアルツハイマー病マウスの脳内の海馬ニューロンの消失を相殺することを示す図である。ＣＤ３＋Ｔ細胞がＡβ−プラークの非常に近くに見られることを示す図である。
【図２Ｈ】Ｃｏｐ−１予防接種はβ−アミロイドの減少をもたらし、ミクログリアの重要な役割である、トランスジェニックアルツハイマー病マウスの脳内の海馬ニューロンの消失を相殺することを示す図である。ＣＤ３＋Ｔ細胞がＭＨＣ−ＩＩ＋ミクログリアと結合することを示す図である。枠で囲んだ領域は、高倍率のＴ細胞（ＣＤ３＋）とＭＨＣ−ＩＩを発現するミクログリア細胞の間の免疫学的シナプスを示す。
【図２Ｉ】Ｃｏｐ−１予防接種はβ−アミロイドの減少をもたらし、ミクログリアの重要な役割である、トランスジェニックアルツハイマー病マウスの脳内の海馬ニューロンの消失を相殺することを示す図である。（３０μｍ海馬切片中の）Ａβ−プラークの合計数を示すヒストグラムである。
【図２Ｊ】Ｃｏｐ−１予防接種はβ−アミロイドの減少をもたらし、ミクログリアの重要な役割である、トランスジェニックアルツハイマー病マウスの脳内の海馬ニューロンの消失を相殺することを示す図である。Ａβ−免疫反応性に関する染色を示すヒストグラムである。Ｃｏｐ−１−予防接種Ｔｇ−ＡＤマウスと未治療−Ｔｇ−ＡＤマウスの間の有意な差を記し、予防接種マウス中のＡβ−プラークの減少した存在を確認した。
【図２Ｋ】Ｃｏｐ−１予防接種はβ−アミロイドの減少をもたらし、ミクログリアの重要な役割である、トランスジェニックアルツハイマー病マウスの脳内の海馬ニューロンの消失を相殺することを示す図である。未治療−Ｔｇ−ＡＤマウスと比較したＣｏｐ−１−予防接種Ｔｇ−ＡＤマウスにおける、活性化ミクログリア及び炎症を示すＣＤ１１ｂに関して染色した細胞の顕著な減少を示すヒストグラムである。非Ｔｇ同腹子における加齢に伴うＣＤ１１ｂ＋ミクログリアの増大を記す。
【図２Ｌ】Ｃｏｐ−１予防接種はβ−アミロイドの減少をもたらし、ミクログリアの重要な役割である、トランスジェニックアルツハイマー病マウスの脳内の海馬ニューロンの消失を相殺することを示す図である。未治療−Ｔｇ−ＡＤマウスより有意に多量の、Ｃｏｐ−１−予防接種Ｔｇ−ＡＤマウスにおけるＡβ−プラークと結合したＣＤ３＋細胞を示すヒストグラムである。ＣＤ３＋細胞の定量化は、この実験で試験したそれぞれのマウスの３０〜５０プラークから分析した。エラーバーは平均±ＳＥＭを示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１対非Ｔｇ同腹子（スチューデントのｔ−検定）。図中に示すＰ値は、ＡＮＯＶＡによって分析した群の比較を表す。この実験中の全てのマウスを分析に含めた（マウス当たり６〜８切片）。
【図３Ａ】Ｃｏｐ−１予防接種は、ミクログリアのＣＤ１１ｃ発現を誘導することを示す図である。ＣＤ１１ｃを共発現するＣＤ１１ｂ＋ミクログリアは、Ｃｏｐ−１−予防接種Ｔｇ−ＡＤマウス中ではＡβ−プラークを包囲していることを示す図である。全てのＣＤ１１ｃ発現ミクログリアは、ＣＤ１１ｂに関して共標識する。別の共焦点像を右図に示す。
【図３Ｂ】Ｃｏｐ−１予防接種は、ミクログリアのＣＤ１１ｃ発現を誘導することを示す図である。Ａβ−プラークと結合したＣＤ１１ｂ＋細胞の数を示すヒストグラムである。
【図３Ｃ】Ｃｏｐ−１予防接種は、ミクログリアのＣＤ１１ｃ発現を誘導することを示す図である。Ａβ−プラークと結合したＣＤ１１ｂ＋及びＣＤ１１ｃ＋細胞の合計数の割合として、ＣＤ１１ｃ＋細胞の定量化を示すヒストグラムである。この分析のために、試験したそれぞれのマウスの３０〜５０プラーク周辺の細胞を計数した。エラーバーは平均±ＳＥＭを表す。バーの上の星印は、群間の差の有意性を示す（＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；スチューデントの両側ｔ−検定）。
【図４Ａ】Ｃｏｐ−１予防接種は、ＩＬ−４の役割である、ミクログリアのＣＤ１１ｃ発現を誘導することを示す図である。ＩＬ−４活性化ミクログリア（ＭＧ（ＩＬ−４））は、活性化後５日でマウスミクログリアの初代培養物においてＣＤ１１ｃの発現を誘導することを示す図である。未処理ミクログリア（ＭＧ（−））は、如何なるＣＤ１１ｃもほとんど発現しない。
【図４Ｂ】Ｃｏｐ−１予防接種は、ＩＬ−４の役割である、ミクログリアのＣＤ１１ｃ発現を誘導することを示す図である。凝集したＡβ（１−４０）で３日間事前処理したミクログリア（ＭＧ（Ａβ））に対する（形態及びＣＤ１１ｃの発現の点における）ＩＬ−４の影響、及びＡβへの事前露出無しの１０日間のＩＬ−４処理と比較して１０日後にそれを評価したことを示す図である。Ａβで事前処理したミクログリアのみＩＬ−４を加えると樹状様形態をとり、一方ＣＤ１１ｃの発現は、Ａβ事前処理有りと無しの両方でＩＬ−４によって誘導されたことに留意されたい。
【図４Ｃ】Ｃｏｐ−１予防接種は、ＩＬ−４の役割である、ミクログリアのＣＤ１１ｃ発現を誘導することを示す図である。いずれもＩＬ−４有り又は無しの培養における時間の関数として表した、（ＩＢ−４標識ミクログリアの割合として表した）ＣＤ１１ｃ＋ミクログリアのミクログリア発現、及び細胞当たりのＣＤ１１ｃ強度の定量分析の図である。
【図４Ｄ】Ｃｏｐ−１予防接種は、ＩＬ−４の役割である、ミクログリアのＣＤ１１ｃ発現を誘導することを示す図である。（図４Ｂ）中に示した培養による（ＩＢ−４標識ミクログリアの割合として計算した）ＣＤ１１ｃの発現の定量分析の図である。結果は同型培養での３回の独立した実験の結果であり、バーは平均±ＳＥＭを表す。バーの上の星印は、それぞれの時間地点で未処理ミクログリアと比較した差の有意性を示す（＊＊＊Ｐ＜０．００１；スチューデントの両側ｔ−検定）。
【図５Ａ】活性化ミクログリアによる凝集Ａβの取り込みを示す図である。ミクログリアは接種後２４時間ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理したか（ＭＧ（ＩＬ−４））、或いは４８時間未治療状態で放置した（ＭＧ（−））。次いで培地を標識培地（１０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含むＤＭＥＭ）と交換し、凝集したＡβ（１―４０）を１時間加えた（５μｇ／ｍｌ）。インキュベーション後、培養物を固定し、ヒトＡβを対象とする抗体で免疫染色し、ミクログリアを同時染色した（ＩＢ−４）。共焦点顕微鏡写真である。
【図５Ｂ】活性化ミクログリアによる凝集Ａβの取り込みを示す図である。ミクログリアは接種後２４時間ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理したか（ＭＧ（ＩＬ−４））、或いは４８時間未治療状態で放置した（ＭＧ（−））。次いで培地を標識培地（１０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含むＤＭＥＭ）と交換し、凝集したＡβ（１―４０）を１時間加えた（５μｇ／ｍｌ）。インキュベーション後、培養物を固定し、ヒトＡβを対象とする抗体で免疫染色し、ミクログリアを同時染色した（ＩＢ−４）。細胞当たりの強度として表した定量分析の図である。群当たり８個の同型（同型当たり２０〜３０細胞）をそれぞれが含む２回の実験の１つの結果を表す（平均±ＳＤ）。
【図６Ａ】成体トランスジェニック（Ｔｇ）ＡＤマウスの海馬歯状回におけるＣｏｐ−１予防接種によって誘導された、増大したニューロン新生を示す図である。最初のＣｏｐ−１予防接種後３週間で、それぞれの実験群中のマウスに、２．５日間１日２回５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を腹腔内注射した。最後の注射後３週間で、それらの脳を切除し、ＢｒｄＵ、ＤＣＸ（神経細胞系の早期分化のマーカー）、及びＮｅｕＮ（成熟ニューロンのマーカー）で海馬を分析した。（図６Ａ〜６Ｃ）増殖細胞の定量化を示すヒストグラムである（ＢｒｄＵ＋）。新たに形成された成熟ニューロンを示すヒストグラムである（ＢｒｄＵ＋／ＮｅｕＮ＋）。
【図６Ｂ】成体トランスジェニック（Ｔｇ）ＡＤマウスの海馬歯状回におけるＣｏｐ−１予防接種によって誘導された、増大したニューロン新生を示す図である。最初のＣｏｐ−１予防接種後３週間で、それぞれの実験群中のマウスに、２．５日間１日２回５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を腹腔内注射した。最後の注射後３週間で、それらの脳を切除し、ＢｒｄＵ、ＤＣＸ（神経細胞系の早期分化のマーカー）、及びＮｅｕＮ（成熟ニューロンのマーカー）で海馬を分析した。（図６Ａ〜６Ｃ）増殖細胞の定量化を示すヒストグラムである（ＢｒｄＵ＋）。全ての未熟（ＤＣＸ＋染色）ニューロンを示すヒストグラムである。
【図６Ｃ】成体トランスジェニック（Ｔｇ）ＡＤマウスの海馬歯状回におけるＣｏｐ−１予防接種によって誘導された、増大したニューロン新生を示す図である。最初のＣｏｐ−１予防接種後３週間で、それぞれの実験群中のマウスに、２．５日間１日２回５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を腹腔内注射した。最後の注射後３週間で、それらの脳を切除し、ＢｒｄＵ、ＤＣＸ（神経細胞系の早期分化のマーカー）、及びＮｅｕＮ（成熟ニューロンのマーカー）で海馬を分析した。（図６Ａ〜６Ｃ）増殖細胞の定量化を示すヒストグラムである（ＢｒｄＵ＋）。この実験において試験した全てのマウスの脳の両側由来の６個の等しく配置した冠状切片（３０μｍ）から計算した、歯状回（ＤＧ）当たりのＢｒｄＵ＋、ＢｒｄＵ＋／ＮｅｕＮ＋及びＤＣＸ＋細胞の数を示すヒストグラムである。エラーバーは平均±ＳＥＭを表す。バーの上の星印は、非Ｔｇ同腹子と比較した差の有意性を示す（＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；スチューデントの両側ｔ−検定）。それらの上の水平線及びＰ値は、示した群の間の差を示す（ＡＮＯＶＡ）。
【図６Ｄ】成体トランスジェニック（Ｔｇ）ＡＤマウスの海馬歯状回におけるＣｏｐ−１予防接種によって誘導された、増大したニューロン新生を示す図である。最初のＣｏｐ−１予防接種後３週間で、それぞれの実験群中のマウスに、２．５日間１日２回５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を腹腔内注射した。最後の注射後３週間で、それらの脳を切除し、ＢｒｄＵ、ＤＣＸ（神経細胞系の早期分化のマーカー）、及びＮｅｕＮ（成熟ニューロンのマーカー）で海馬を分析した。未治療−Ｔｇ−ＡＤマウスにおける免疫染色と比較した、Ｃｏｐ−１−予防接種Ｔｇ−ＡＤマウス及び非Ｔｇ同腹子におけるＢｒｄＵ／ＤＣＸ／ＮｅｕＮに関する免疫染色を示す、歯状回の代表的な共焦点顕微鏡画像である。
【図６Ｅ】成体トランスジェニック（Ｔｇ）ＡＤマウスの海馬歯状回におけるＣｏｐ−１予防接種によって誘導された、増大したニューロン新生を示す図である。最初のＣｏｐ−１予防接種後３週間で、それぞれの実験群中のマウスに、２．５日間１日２回５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を腹腔内注射した。最後の注射後３週間で、それらの脳を切除し、ＢｒｄＵ、ＤＣＸ（神経細胞系の早期分化のマーカー）、及びＮｅｕＮ（成熟ニューロンのマーカー）で海馬を分析した。分枝型ＤＣＸ＋細胞が、Ｃｏｐ−１−予防接種Ｔｇ−ＡＤマウスの海馬歯状回の粒状帯下（ＳＧＺ）に位置するＭＨＣ−ＩＩ＋ミクログリアの近辺に見られることを示す図である。
【図７Ａ−Ｂ】Ｃｏｐ−１予防接種は、トランスジェニック（Ｔｇ）ＡＤマウスにおける認識衰退を相殺することを示す図である。海馬依存性の認識活動はモリス水迷路（ＭＷＭ）で試験した。Ｃｏｐ−１−予防接種Ｔｇ−ＡＤマウス（菱形；ｎ＝６）は、獲得及び逆転学習中に未治療−Ｔｇ−ＡＤマウス（四角形；ｎ＝７）より有意に優れた学習／記憶能力を示したことを示す図である。未治療−Ｔｇ−ＡＤマウスは、一貫した長期にわたる空間記憶課題の障害を示した。対照的に、Ｃｏｐ−１−予防接種Ｔｇ−ＡＤマウスによるＭＷＭ試験のパフォーマンスは、平均して、それらの年齢適合非投薬非Ｔｇ同腹子（三角形；ｎ＝６）のパフォーマンスとかなり類似していた（３元配置ＡＮＯＶＡ、反復測定：獲得段階に関して、群、ｄｆ（２，１６）、Ｆ＝２２．３、Ｐ＜０．０００２；試験、ｄｆ（３，４８）、Ｆ＝６７．９、Ｐ＜０．０００１；日数、ｄｆ（３，４８）、Ｆ＝３．１、Ｐ＜０．０３５、及び逆転学習段階に関して、群、ｄｆ（２，１６）、Ｆ＝１４．９、Ｐ＜０．０００３；試験、ｄｆ（３，４８）、Ｆ＝２１．７、Ｐ＜０．０００１；日数、ｄｆ（１，１６）、Ｆ＝１６．９、Ｐ＜０．０００８）。
【図８Ａ】ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４によって活性化したミクログリアにおけるＣＤ１１ｃ発現の時間的経過を示す図である。ミクログリアを、１、３、５、１０及び１８日間、ＩＦＮ−γ（１０ｎｇ／ｍｌ；ＭＧ（ＩＦＮ−γ））又はＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ；ＭＧ（ＩＬ−４））で処理したことを示す図である。未治療状態ミクログリア（ＭＧ（−））は対照として使用した。
【図８Ｂ】ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４によって活性化したミクログリアにおけるＣＤ１１ｃ発現の時間的経過を示す図である。処理の５日後に、ＩＢ４に関する染色、βＩＩＩ−Ｔ、及びＣＤ１１ｃに関する免疫標識によって同定した、ミクログリアの共焦点画像である。ＭＧ（−）はＣＤ１１ｃを発現しなかった。ＩＦＮ−γ又はＩＬ−４に曝した後、ミクログリアはＣＤ１１ｃを発現し、それらの特徴的な形態を示した。
【図８Ｃ】ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４によって活性化したミクログリアにおけるＣＤ１１ｃ発現の時間的経過を示す図である。５日間ＩＦＮ−γ（１０ｎｇ／ｍｌ）で活性化したミクログリアにおける、βＩＩＩ−ＴとＣＤ１１ｃの共発現を示す図である（ＩＢ４／βＩＩＩ−Ｔ／ＣＤ１１ｃ）。共焦点のチャネルは別々に表されていることに留意されたい。
【図８Ｄ】ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４によって活性化したミクログリアにおけるＣＤ１１ｃ発現の時間的経過を示す図である。（ＩＢ４＋（ミクログリアマーカー）細胞の割合として表した）ＣＤ１１ｃ＋ミクログリアの数の定量分析を、全時間地点において全ての処理で実施したことを示す図である。結果は２連又は３連ウエルでの４回の独立した実験の結果であり、バーは平均±ＳＥＭを表す。バーの上の星印は、ＭＧ（−）と比較した差の有意性を示す（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；スチューデントの両側ｔ−検定）。それらの上の水平線及びＰ値は、示した群の間の差を示す（ＡＮＯＶＡ）。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
ＡＭＤを治療するためのＴ細胞ベースの予防接種の可能性を模索する際に、以下の考慮事項が関連し得る。
【００２８】
一般に、血液脳関門が抗体の受動的沈着に耐え抗原特異的リンパ球の動員を減らす（Ｓｔｒｅｉｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９２）という意味で、脳は網膜と同様に免疫特権を有すると考えられる。逆説的に、変性疾患に対して防御するために抗原特異的な免疫が実際働く可能性がある。近年、アルツハイマー病のマウスモデルにおいて、異常アミロイドに関する免疫処置、又は異常タンパク質に対する抗体の受動投与は、遺伝子改変マウスの脳内の沈着の量を大幅に減らし、実験室の試験でそれらの記憶及び認知機能のパフォーマンスを改善したことが示された（例えばＭｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０００）。そのメカニズムは明らかではないが、増大したファゴサイトーシス、毒性分子の中和、又はアミロイドフィブリルの凝集への干渉と関係がある可能性がある。しかしながらアルツハイマー病では、患者はアミロイドに対して免疫寛容性があり、異常にプロセシングされたタンパク質に対する防御的自己免疫を妨げ、したがって自己免疫性脳脊髄炎を発症する可能性がある（Ｆｕｒｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）。
【００２９】
最近数年間にわたる本発明者らの研究室の試験は、ＣＮＳ障害からの回復は、特異的ＣＮＳ自己抗原を対象とするＴ細胞の十分制御された活性に主に依存することを示している（Ｍｏａｌｅｍ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９；Ｙｏｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、２００１；Ｋｉｐｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、２００２）。損傷部位に存在した後、これらの自己反応性Ｔ細胞は、それがニューロンの生存及びニューロン組織修復を支援する状態になるような形式でミクログリアを明らかに制御する（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００５；Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、２００６；Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００１；Ｓｈａｋｅｄ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）。
【００３０】
本明細書における本発明者らの結果は、ＡＭＤ用のＴ細胞ベースの療法としての、ＡβペプチドではなくＣｏｐ−１などのミエリン関連抗原の使用に賛同する。Ａβなどのドルーゼ結合ペプチドのＴ細胞受容体を発現する任意のＴ細胞がＣＮＳ病巣の部位に存在する場合でも（Ｍｏｎｓｏｎｅｇｏ  ｅｔ  ａｌ．、２００６）、それらがその場所でその関連ＡＰＣに遭遇する可能性はなく、したがってそれらは局所活性化状態にはなり得ないはずである。
【００３１】
他方で、ミエリン特異的Ｔ細胞が容易に相互作用し得るミエリン提示ミクログリアは、損傷部位に存在する可能性がある。ミエリン関連抗原、又はミエリンとわずかに交差反応する抗原（Ｃｏｐ−１など）は、したがって治療予防接種用に選択される抗原である可能性がある（Ａｖｉｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００４）。これらの抗原によって活性化されるＴ細胞はしたがってＣＮＳに存在するはずであり、その場所でその関連ＡＰＣに遭遇すると、局所活性化状態になり、サイトカイン及び増殖因子を供給して、（凝集Ａβによって活性化される；Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）有害なミクログリアの表現型を樹状様の特性を有するミクログリアに変える。次いで、得られたＴ細胞とミクログリアの間の免疫学的シナプスは、成体幹細胞の群からニューロン新生を促進することによって、細胞再生の支援適所を次いで形成する（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００６ａ）。
【００３２】
本発明者らの結果は、Ｔ細胞はＡＭＤ用に選択される免疫ベースの療法の構成要素となることを示す。これは、Ａβペプチドに対する抗体を用いるアルツハイマー病の動物モデルにおいて示されたのと同様の（Ｂａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、２０００）補充療法としての抗体の潜在的利点を除外するわけではない。さらにＴ細胞は、サイトカイン及び神経栄養因子を含めた様々な化合物を産生することができる、小工場として機能することができる（Ｚｉｅｍｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００２）。特にそれらは、脳の老化をもたらす加齢状態を相殺するのに助力し得る生理的なメンテナンス及び修復系となる。
【００３３】
したがって、本発明によるＡＭＤ用の免疫ベースの療法を開発する際に、本発明者らは、同様の病原性を有する神経変性疾患からの教訓を考慮した。
【００３４】
ミスフォールディングしたタンパク質からなる細胞外沈着物の形成は、多くの神経変性疾患の特徴である。ドルーゼ及びアルツハイマー病におけるアミロイドの蓄積、両方の神経変性状態における炎症メディエーターとしての活性化ミクログリアの存在は、ＡＭＤとアルツハイマー病における考えられる共通の慢性炎症経路を示唆する。アルツハイマー病の文脈では、凝集したβ−アミロイド（Ａβ）はミクログリアを活性化して、微生物によって活性化されるそれを連想させる表現型を得ることを、本発明者らは近年実証している。このようなミクログリア／マクロファージは食細胞として働くことができるが、それらの全体的な活性は細胞毒性であり、脳によってほとんど許容され得ない。結果として、Ａβによって活性化されるミクログリアは罹患組織を救済するのではなく、混乱状態にさらに寄与する。本発明において本発明者らは、細胞の生存及び再生をサポートするその能力を与えながらミクログリアの食作用活性を維持することを目標とする、アルツハイマー病及びＡＭＤにおけるミクログリア活性を調節するための考えられる免疫ベースの療法を探索する。
【００３５】
本明細書に示すように、凝集したＡβはミクログリアが細胞毒性状態になるのを誘導し、成体げっ歯類のニューロン前駆細胞（ＮＰＣ）からのニューロン新生を阻害する。ＩＬ−４、Ｔ−ヘルパー（Ｔｈ）−２細胞由来のサイトカイン以外に、Ａβによって活性化されるミクログリアは、障害、ＩＧＦ−Ｉ発現の下方制御、ＴＮＦ−α発現の上方制御を逆転させ、ＡＰＣとして作用することができない可能性がある。プレセニリン１及びキメラマウス／ヒトアミロイド前駆体タンパク質をコードする突然変異ヒト遺伝子を発現する、アルツハイマー病のダブルトランスジェニックマウスを使用して、ここではコポリマー−１を用いたＴ細胞ベースの予防接種によって達成される、ＩＧＦ−Ｉを産生する専門的ＡＰＣへのミクログリアの表現型の変化は、アミロイド凝集の低下並びにニューロン生存及びニューロン新生の誘導をもたらしたことを本発明者らは示す。
【００３６】
したがって本発明は、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を治療するための方法であって、必要性のある個体の眼中にＩＬ−４を産生するＴ細胞を蓄積させ、それによって黄斑変性症の進行を停止又は遅延させることを含む方法に関する。この効果は、幾つかの自己抗原及びサイトカイン活性化細胞によって影響を受ける可能性がある。
【００３７】
一実施形態では、眼中にＩＬ−４を産生するＴ細胞を蓄積させることができる作用物質には：
（ｉ）コポリマー−１、コポリマー−１関連ペプチド、又はコポリマー−１関連ポリペプチド、
（ｉｉ）ＩＬ−４、
（ｉｉｉ）ＩＬ−４によって活性化される樹状細胞、単球、骨髄由来ミエロイド細胞又は末梢血単核細胞、
（ｉｖ）ＩＬ−４を産生する遺伝子操作細胞、
（ｖ）ＩＬ−１３又は２０ｎｇ／ｍｌまでのＩＦＮ−γで活性化される骨髄由来ミエロイド細胞又は末梢血由来ミエロイド細胞、
（ｖｉ）眼のＴ細胞媒介性の特定の自己免疫疾患と関係がある病原性自己抗原、
（ｖｉｉ）配列が（ｖｉ）の病原性自己抗原の配列内に含まれるペプチド、又は前記ペプチドの改変によって得られるペプチドであって、改変が、異なるアミノ酸残基によるペプチドの１つ又は複数のアミノ酸残基の置換にあり（以下「改変ペプチド」）、前記改変ペプチドが、低い親和性ではあるが、親ペプチドによって認識されるＴ細胞受容体を依然として認識することができるペプチド、
（ｖｉｉｉ）（ｖｉ）の病原性自己抗原又は（ｖｉｉ）のペプチド若しくは改変ペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｉｘ）（ｉ）、（ｖｉ）又は（ｖｉｉ）の作用物質によって活性化されるＴ細胞、及び
（ｘ）（ｉ）〜（ｉｘ）の任意の組合せ
があるが、これらだけには限られない。
【００３８】
好ましい一実施形態では、この作用物質はコポリマー１、コポリマー１関連ペプチド又はコポリマー１関連ポリペプチドである。
【００３９】
本発明の目的のために、「コポリマー１又はコポリマー１関連ペプチド又はポリペプチド」は、ＭＢＰと機能上交差反応し抗原提示中にＭＨＣクラスＩＩ上のＭＢＰと競合することができるランダムコポリマーを含めた、任意のペプチド又はポリペプチドを含むものとする。
【００４０】
Ｃｏｐ１又はＣｏｐ１関連ペプチド又はポリペプチドは、（好ましくはより少量の）マイナスに帯電したグルタミン酸又はアスパラギン酸などのアミノ酸と組み合わせた、場合によっては充填剤として働く非帯電状態のアラニン又はグリシンなどの中性アミノ酸と組み合わせた、及び場合によっては免疫原性をコポリマーに与えるように適合したチロシン又はトリプトファンのような芳香族アミノ酸などのアミノ酸と組み合わせた、適切な比のプラスに帯電したリシン又はアルギニンなどのアミノ酸からなるランダムコポリマーによって表される。このようなコポリマーは、例えばその全容が参照として本明細書に組み込まれるＷＯ００／０５２５０中に開示されている。
【００４１】
より詳細には、コポリマー１又はコポリマー１関連ペプチド又はポリペプチドは、以下の群：（ａ）リシン及びアルギニン、（ｂ）グルタミン酸及びアスパラギン酸、（ｃ）アラニン及びグリシン、並びに（ｄ）チロシン及びトリプトファンの少なくとも３個のそれぞれから選択される１個のアミノ酸を含むランダムコポリマーからなる群から選択されるコポリマーである。アミノ酸はＬ−又はＤ−アミノ酸或いはその混合物であってよい。本発明は、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸の両方を含むコポリマー、及びＬ−又はＤ−アミノ酸のいずれかから本質的になるコポリマーの使用を企図する。
【００４２】
本発明の一実施形態では、コポリマーは、それぞれが（ａ）〜（ｄ）の群の異なる１つに由来する４個の異なるアミノ酸を含む。
【００４３】
より好ましい実施形態では、作用物質は、正味の全体正電荷及び約２ＫＤａ〜約４０ＫＤａの分子量を有する、１．５：４．８：１：３．６の概算比のアミノ酸Ｌ−グルタミン酸（Ｅ）、Ｌ−アラニン（Ａ）、Ｌ−チロシン（Ｙ）及びＬ−リシン（Ｋ）から本質的になるランダムポリペプチドの混合物から構成されるコポリマー１である。
【００４４】
好ましい一実施形態では、Ｃｏｐ１は約２ＫＤａ〜約２０ＫＤａ、より好ましくは約４，７ＫＤａ〜約１３ＫＤａ、さらにより好ましくは約４ＫＤａ〜約８．６ＫＤａ、約５ＫＤａ〜９ＫＤａ、又は約６．２５ＫＤａ〜８．４ＫＤａの平均分子量を有する。他の好ましい実施形態では、Ｃｏｐ１は約１３ＫＤａ〜約２０ＫＤａ、より好ましくは約１３，５ＫＤａ〜約１８ＫＤａの平均分子量、及び約１５ＫＤａ〜約１６ＫＤ、好ましくは１６ｋＤａの平均分子量を有する。４０ＫＤａより小さいＣｏｐ１に関する他の平均分子量も、本発明によって含まれる。前記分子量範囲のコポリマー１は、当技術分野で知られている方法によって、例えばその全容が参照として本明細書に組み込まれる米国特許第５，８００，８０８号中に記載された方法によって調製することができる。コポリマー１は、約１５〜約１００、好ましくは約４０〜約８０アミノ酸長を含むポリペプチドであってよい。
【００４５】
本発明のより好ましい一実施形態では、作用物質は一般名酢酸グラチラマーで知られるその酢酸塩又はその商標名Ｃｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）（Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．、Ｐｅｔａｃｈ  Ｔｉｋｖａ、イスラエルの商標）の形のＣｏｐ１である。本出願の明細書で使用する用語「Ｃｏｐ１」、「コポリマー１」、「酢酸グラチラマー」及び「ＧＡ」は相互に使用する。
【００４６】
他の実施形態では、コポリマー１関連ペプチドは、コポリマーの同じ活性を有すると予想される、１つ又は複数の以下の置換：アスパラギン酸とグルタミン酸、グリシンとアラニン、アルギニンとリシン、及びトリプトファンとチロシンが施された４アミノ酸のランダムコポリマーである。
【００４７】
本発明の他の実施形態では、Ｃｏｐ１関連ペプチド又はポリペプチドは、それぞれが３群の（ａ）〜（ｄ）の異なる群由来の３個の異なるアミノ酸のコポリマーである。これらのコポリマーは本明細書ではターポリマーと呼ぶ。一実施形態では、ターポリマーはチロシン（Ｙ）、アラニン（Ａ）、及びリシン（Ｋ）を含み、これは本明細書で以後ＹＡＫと示し、その中ではアミノ酸の平均モル分率は変わる可能性があり、Ｙ、Ａ及びＫはそれぞれ約０．０５〜０．２５０、０．３〜０．６；及び０．１〜０．５のモル分率で存在する可能性があり、Ｙ、Ａ及びＫのモル比はそれぞれ約０．１０：０．５４：０．３５であることがより好ましい。アルギニンとリシン、グリシンとアラニン、及び／又はトリプトファンとチロシンを置換することが可能である。
【００４８】
他の実施形態では、ターポリマーはチロシン（Ｙ）、グルタミン酸（Ｅ）、及びリシン（Ｋ）を含み、これは本明細書で以後ＹＥＫと示し、その中ではアミノ酸の平均モル分率は変わる可能性があり、Ｅ、Ｙ及びＫはそれぞれ約０．００５〜０．３００、０．００５〜０．２５０、及び０．３〜０．７のモル分率で存在する可能性がある。Ｅ、Ｙ及びＫのモル比はそれぞれ約０．２６：０．１６：０．５８であることがより好ましい。アスパラギン酸とグルタミン酸、アルギニンとリシン、及び／又はトリプトファンとチロシンを置換することが可能である。
【００４９】
他の実施形態では、ターポリマーはリシン（Ｋ）、グルタミン酸（Ｅ）、及びアラニン（Ａ）を含み、これは本明細書で以後ＫＥＡと示し、その中ではアミノ酸の平均モル分率は変わる可能性があり、Ｅ、Ａ及びＫはそれぞれ約０．００５〜０．３００、０．００５〜０．６００、及び０．２〜０．７のモル分率で存在する可能性がある。Ｅ、Ａ及びＫのモル比はそれぞれ約０．１５：０．４８：０．３６であることがより好ましい。アスパラギン酸とグルタミン酸、グリシンとアラニン、及び／又はアルギニンとリシンを置換することが可能である。
【００５０】
他の実施形態では、ターポリマーはチロシン（Ｙ）、グルタミン酸（Ｅ）、及びアラニン（Ａ０を含み、これは本明細書で以後ＹＥＡと示し、その中ではアミノ酸の平均モル分率は変わる可能性があり、Ｙ、Ｅ及びＡはそれぞれ約０．００５〜０．２５０、０．００５〜０．３００、及び０．００５〜０．８００のモル分率で存在する可能性がある。Ｅ、Ａ、及びＹのモル比はそれぞれ約０．２１：０．６５：０．１４であることがより好ましい。トリプトファンとチロシン、アスパラギン酸とグルタミン酸、及び／又はグリシンとアラニンを置換することが可能である。
【００５１】
ターポリマーＹＡＫ、ＹＥＫ、ＫＥＡ及びＹＥＡの平均分子量は、約２ＫＤａ〜４０ＫＤａの間、好ましくは約３ＫＤａ〜３５ＫＤａの間、より好ましくは約５ＫＤａ〜２５ＫＤａの間で変わる可能性がある。
【００５２】
コポリマー１及び関連ペプチド及びポリペプチドは、当技術分野で知られている方法によって、例えば米国特許第３，８４９，５５０号中で開示された方法によって調製することができる。コポリマーの分子量は、ポリペプチドの合成中、又はコポリマーを作製した後に調節することができる。ポリペプチドの合成中に分子量を調節するためには、ポリペプチドが望ましい大まかな長さに達すると合成が停止するように、合成条件又はアミノ酸の量を調節する。合成後、望ましい分子量を有するポリペプチドを、分子量サイジング用カラム又はゲルにおけるポリペプチドのクロマトグラフィー、及び望ましい分子量範囲の回収などの、任意の利用可能なサイズ選択手順によって得ることができる。例えば酸又は酵素加水分解によって、コポリマーを部分的に加水分解して高分子量種を除去し、次いで精製して酸又は酵素を除去することもできる。
【００５３】
一実施形態では、保護ポリペプチドと臭化水素酸を反応させて望ましい分子量プロファイルを有するトリフルオロアセチル−ポリペプチドを形成することを含む方法によって、望ましい分子量を有するコポリマーを調製することができる。その反応は、１つ又は複数の試験反応によって予め決定される時間及び温度で実施する。試験反応中に、時間及び温度を変え、試験ポリペプチドの所与のバッチの分子量範囲を測定する。ポリペプチドのバッチに最適な分子量範囲を与える試験条件を、そのバッチに使用する。したがって、望ましい分子量プロファイルを有するトリフルオロアセチル−ポリペプチドは、試験反応によって予め決定される時間及び温度で保護ポリペプチドと臭化水素酸を反応させることを含む方法によって生成することができる。望ましい分子量プロファイルを有するトリフルオロアセチル−ポリペプチドを、次いでピペリジン水溶液でさらに処理して、望ましい分子量を有する低毒性ポリペプチドを形成する。一実施形態では、所与のバッチからの保護ポリペプチドの試験サンプルを、約２０〜２８℃の温度で約１０〜５０時間、臭化水素酸と反応させる。そのバッチに関する最良の条件は、数回の試験反応を実施することによって決定する。例えば、一実施形態では、約２６℃の温度で約１７時間、保護ポリペプチドを臭化水素酸と反応させる。
【００５４】
Ｃｏｐ１とＭＳ結合ＨＬＡ−ＤＲ分子の結合モチーフは知られているので（Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ、１９９９）、Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）の刊行物中に記載されたように、明確な配列を有するＣｏｐ１由来のポリペプチドを容易に調製し、ＨＬＡ−ＤＲ分子のペプチド結合溝との結合に関して試験することができる。
【００５５】
このようなペプチドの例は、その全容が参照として本明細書に組み込まれるＷＯ００／０５２４９及びＷＯ００／０５２５０中に開示されたペプチドであり、本明細書の以下の配列番号１〜３２のペプチドを含む。
配列番号:1   AAAYAAAAAAKAAAA
配列番号:2   AEKYAAAAAAKAAAA
配列番号:3   AKEYAAAAAAKAAAA
配列番号:4   AKKYAAAAAAKAAAA
配列番号:5   AEAYAAAAAAKAAAA
配列番号:6   KEAYAAAAAAKAAAA
配列番号:7   AEEYAAAAAAKAAAA
配列番号:8   AAEYAAAAAAKAAAA
配列番号:9   EKAYAAAAAAKAAAA
配列番号:10  AAKYEAAAAAKAAAA
配列番号:11  AAKYAEAAAAKAAAA
配列番号:12  EAAYAAAAAAKAAAA
配列番号:13  EKKYAAAAAAKAAAA
配列番号:14  EAKYAAAAAAKAAAA
配列番号:15  AEKYAAAAAAAAAAA
配列番号:16  AKEYAAAAAAAAAAA
配列番号:17  AKKYEAAAAAAAAAA
配列番号:18  AKKYAEAAAAAAAAA
配列番号:19  AEAYKAAAAAAAAAA
配列番号:20  KEAYAAAAAAAAAAA
配列番号:21  AEEYKAAAAAAAAAA
配列番号:22  AAEYKAAAAAAAAAA
配列番号:23  EKAYAAAAAAAAAAA
配列番号:24  AAKYEAAAAAAAAAA
配列番号:25  AAKYAEAAAAAAAAA
配列番号:26  EKKYAAAAAAAAAAA
配列番号:27  EAKYAAAAAAAAAAA
配列番号:28  AEYAKAAAAAAAAAA
配列番号:29  AEKAYAAAAAAAAAA
配列番号:30  EKYAAAAAAAAAAAA
配列番号:31  AYKAEAAAAAAAAAA
配列番号:32  AKYAEAAAAAAAAAA
【００５６】
配列番号１〜３２のこのようなペプチド、及びＣｏｐ１由来の他の同様のペプチドは、Ｃｏｐ１と同様の活性を有すると予想され得る。このようなペプチド、及び他の同様のペプチドもＣｏｐ１関連ペプチド又はポリペプチドの定義内にあると考えられ、及びそれらの使用、並びに（多発性硬化症を治療するための候補として）Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉ  ｅｔ  ａ１．、２００２によって記載されたランダムな４アミノ酸のコポリマー、即ちアミノ酸フェニルアラニン、グルタミン酸、アラニン及びリシン（ポリＦＥＡＫ）、又はチロシン、フェニルアラニン、アラニン及びリシン（ポリＹＦＡＫ）を含むコポリマー（１４、３５及び５０量体）などの他の合成アミノ酸コポリマー、及びＣｏｐ１と同様の共通抗原と考えることができる発見済みの任意の他の同様のコポリマーは本発明によって含まれる。
【００５７】
本発明の他の好ましい実施形態では、眼中にＩＬ−４を産生するＴ細胞を蓄積させる作用物質は、経鼻投与することができるＩＬ−４、好ましくはヒト組換えＩＬ−４である。
【００５８】
他の実施形態では、作用物質はＩＬ−４活性化樹状細胞、ＩＬ−４活性化単球、ＩＬ−４活性化骨髄由来ミエロイド細胞又はＩＬ−４活性化末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。この点において、ＩＬ−１３はＩＬ−４と同じ効果を有する、何故なら、ＩＬ−４とＩＬ−１３は共通の受容体を利用し、Ｂ細胞活性化及びＴｈ−１細胞の抑制などの多くの作用を共有し得ることは、サイトカインの分野で十分立証されているからである。
【００５９】
他の実施形態では、作用物質はＩＬ−１３又は狭い濃度範囲のＩＦＮ−γ、より好ましくは２０ｎｇ／ｍｌまでのＩＦＮ−γで活性化される骨髄由来ミエロイド細胞又は末梢血由来ミエロイド細胞である。
【００６０】
他の実施形態では、作用物質は哺乳動物の光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）、Ｓ−抗原（Ｓ−Ａｇ）、又はロドプシンから選択される病原性ブドウ膜炎惹起抗原だけには限られないが、これらなどの、眼のＴ細胞媒介性の特定の自己免疫疾患と関係がある哺乳動物の病原性自己抗原である。哺乳動物のブドウ膜炎惹起抗原は、ヒトＩＲＢＰ（配列番号３３）又はウシＩＲＢＰ（配列番号３４）、ヒトＳ−Ａｇ（配列番号３５）又はウシＳ−Ａｇ（配列番号３６）、又はヒトロドプシン（配列番号３７）であることが好ましい。
【００６１】
さらに他の実施形態では、作用物質は、配列が前記病原性自己抗原の配列内に含まれるペプチド；前記ペプチドの改変によって得られるペプチドであって、改変が、異なるアミノ酸残基によるペプチドの１つ又は複数のアミノ酸残基の置換にあり（以下「改変ペプチド」）、前記改変ペプチドが、低い親和性ではあるが、親ペプチドによって認識されるＴ細胞受容体を依然として認識することができるペプチド；又は前記病原性自己抗原、前記ペプチド又は前記改変ペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
【００６２】
一実施形態では、作用物質は（ａ）配列がウシＩＲＢＰ（配列番号３４）の配列内に含まれるペプチド、（ｂ）（ａ）のペプチドの改変によって得られる前に定義した改変ペプチド、又は（ｃ）ヒト又はウシのＩＲＰＢ、（ａ）のペプチド、又は（ｂ）の改変ペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
【００６３】
配列がウシＩＲＢＰ（配列番号３４）の配列内に含まれるペプチドは、ペプチドＲ１６（ＩＲＢＰの配列１１７７〜１１９１）、ＡＤＧＳＳＷＥＧＶＧＶＶＰＤＶ（配列番号３８）；ペプチドＰＴＡＲＳＶＧＡＡＤＧＳＳＷＥＧＶＧＶＶＰＤＶ（配列番号３９）；又はペプチドＨＶＤＤＴＤＬＹＬＴＩＰＴＡＲＳＶＧＡＡＤＧＳ（配列番号４０）であってよい。
【００６４】
他の実施形態では、作用物質は（ａ）配列がウシＳ−Ａｇ（配列番号３６）の配列内に含まれるペプチド、（ｂ）（ａ）のペプチドの改変によって得られる前に定義した改変ペプチド、又は（ｃ）ヒト又はウシのＳ−Ａｇ、（ａ）のペプチド、又は（ｂ）の改変ペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
【００６５】
配列がウシＳ−Ａｇの配列内に含まれるペプチド（ａ）は、配列ＴＳＳＥＶＡＴＥ（配列番号４１）のペプチドＧ−８（Ｓ−Ａｇの配列３４７〜３５４）；ペプチドＭ−８（Ｓ−Ａｇの配列３０７〜３１４）、ＤＴＮＬＡＳＳＴ（配列番号４２；又は以下の配列のペプチドであってよい：
DTNLASSTIIKEGIDKTV        (配列番号:43);
VPLLANNRERRGIALDGKIKHE    (配列番号:44);
TSSEVATEVPFRLMHPQPED      (配列番号:45);
SLTKTLTLVPLLANNRERRG      (配列番号:46);
SLTRTLTLLPLLANNRERAG      (配列番号:47);
KEGIDKTVMGILVSYQIKVKL     (配列番号:48);及び
KEGIDRTVLGILVSYQIKVKL     (配列番号:49).
【００６６】
ウシＳ−Ａｇ由来の改変ペプチド（ｃ）はＧ−８類似体、ＴＳＳＥＡＡＴＥ（配列番号５０）又はＭ−８類似体、ＤＴＡＬＡＳＳＴ（配列番号５１）であってよい。
【００６７】
他の実施形態では、作用物質は眼のＴ細胞媒介性の特定の自己免疫疾患と関係がある病原性自己抗原をコードするヌクレオチド配列、又は本明細書で定義するそれらに由来するペプチド又は改変ペプチドである。
【００６８】
他の実施形態では、作用物質は、コポリマー１によって、又は眼のＴ細胞媒介性の特定の自己免疫疾患と関係がある病原性自己抗原によって活性化されるＴ細胞、又は本明細書で定義するそれらに由来するペプチド又は改変ペプチドである。
【００６９】
さらに他の実施形態では、作用物質は前に定義した作用物質の任意の組合せである。
【００７０】
本発明はさらに、加齢性黄斑変性症を治療するため、又は加齢性黄斑変性症の治療用の薬剤を製造するための、本明細書で定義する作用物質から選択される作用物質の使用に関する。
【００７１】
作用物質が前に記載した活性化細胞であるとき、細胞は好ましくは自己のものであってよく、或いは細胞は適合ドナー由来であってよく、静脈内投与することが好ましい。
【００７２】
好ましい一実施形態では、作用物質は投与ステップの寸前に調製することができるコポリマー１によって活性化されるＴ細胞であり、或いは必要に応じて、細胞バンクを設立して、後期の個体の治療用にコポリマー１感作Ｔ細胞を保存することができる。自己のＴ細胞は個体から得ることができ、同種又は半同種Ｔ細胞は、最も一般的なＭＨＣクラスＩＩ型が存在するそれぞれの保存Ｔ細胞のバンクから得ることができる。患者はその自己の保存Ｔ細胞で治療することが好ましいが、自己のＴ細胞が入手できない場合、したがって、患者とＭＨＣＩＩ型分子を共有する細胞を使用すべきであり、これらはその患者において操作可能であると予想される。Ｔ細胞は、コポリマー１に曝した後の活性化状態で保存することが好ましい。しかしながら、Ｔ細胞は休止状態で保存することもでき、ひとたびそれらを使用するために解凍及び調製した後、コポリマー１で活性化することができる。
【００７３】
Ｔ細胞系は当技術分野でよく知られている任意の方法で調製される。バンクの細胞系は凍結保存することが好ましい。ひとたび細胞を解凍した後、注射前にそれらを培養して非生存細胞を除去することが好ましい。この培養中、Ｔ細胞を活性化することができ、或いは最初の活性化で使用したのと同じコポリマー１抗原を使用して再活性化することができる。或いは、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）又はコンカナバリンＡなどのマイトジェン（前者が好ましい）の存在下で培養することによって、活性化を実施することができる。これは細胞をさらに高次の活性化状態にするはずである。
【００７４】
本発明中で使用するための骨髄由来ミエロイド細胞は、自己又はドナーの末梢血又は骨髄から得ることができ、当技術分野でよく知られている技法によって処理することができる。ドナーは適合性、即ちＨＬＡ適合性ドナーであるべきである。得た後、それらが患者への再移植に必要とされるレベルに増殖するまでミエロイド細胞を培養することができ、次いでＣＤ１１ｃの発現を上方制御するのに必要な時間サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１３又はＩＦＮ−γ）で活性化する。例えば、２０ｎｇ／ｍｌまでのＩＦＮ−γによる活性化は、ＣＤ１１ｃの発現のピークに達するまで２〜３日を要する可能性がある。
【００７５】
実施例中に、ＣＤ１１ｃ＋ミクログリア細胞を記載する。ミクログリアは、骨髄由来のミエロイド前駆細胞に由来するＣＮＳの免疫細胞である。したがって、ミクログリアは定住ＣＮＳ細胞であり、一方骨髄由来ミエロイド細胞は浸潤細胞である。
【００７６】
本発明によって使用するための医薬組成物／薬剤は、使用する作用物質に応じて、１つ又は複数の薬剤として／生理的に許容される担体又は賦形剤を使用して従来の方法で配合することができる。担体は、組成物の他の成分と適合性がありそのレシピエントに有害でないという意味で、「許容可能」でなければならない。
【００７７】
投与の方法及び用量は使用する作用物質に依存するはずであり、アジュバント有り又は無しの、非経口、例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、粘膜、例えば経口、鼻腔内、口腔、膣、直腸、又は眼内、クモ膜下、局所及び皮内経路があるが、これらだけには限られない。投与は全身又は局部であってよい。
【００７８】
投与する作用物質の用量は、作用物質、患者の年齢及び疾患の段階に応じて、医師によって決定されるはずである。例えば、Ｃｏｐ１に関しては、１〜８０ｍｇ、好ましくは２０ｍｇの範囲から用量を選択することができるが、任意の他の適切な用量が本発明によって含まれる。疾患の段階、患者の年齢及び状態に応じた、適切な時間間隔での反復用量の投与によって、治療を実施することができる。一実施形態では、Ｃｏｐ１を１日１回投与することができる。他の好ましい実施形態では、例えば少なくとも１週間に１回、１カ月に１回又は２又は３カ月毎に少なくとも１回、或いはそれより低い頻度で、免疫処置に適したレジメンに従い投与を施すことができるが、免疫処置間の任意の他の適切な間隔が、患者の状態に応じて本発明により想定される。
【００７９】
作用物質がＩＬ−４を産生する遺伝子操作細胞であるとき、細胞は、ＩＬ−４を発現する、操作された骨髄由来樹状細胞（ＤＣ）であることが好ましく、それらはＭｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．、２００１によって記載されたのと同様に得ることができる。ＤＣは末梢からリンパ組織に移動する特化ＡＰＣであり、そこでＤＣはＴ細胞を活性化し調節するので、ＩＬ−４などの免疫系調節サイトカインを発現させるためのＤＣの遺伝的改変は、ＡＭＤ及び他の疾患を治療するための新たな免疫療法戦略をもたらす。
【００８０】
ここで本発明を、以下の非制限的な実施例によって例示する。
【実施例】
【００８１】
材料及び方法
（ｉ）動物。新生児（Ｐ０〜Ｐ１）マウス、近交系成体オスＣ５７Ｂ１／６Ｊマウス（８〜１０週齢）は、Ａｎｉｍａｌ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエルによって供給された。
【００８２】
（ｉｉ）神経前駆細胞の培養。側脳室の脳室下帯を含む組織の冠状切片（２ｍｍ厚）を、成体Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウスの脳から得た。組織を分割し、次いで０．９４ｍｇ／ｍｌのパパイン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ）及び０．１８ｍｇ／ｍｌのＬ−システイン及びＥＤＴＡを含むＥａｒｌｅの平衡塩類溶液中での３７℃、５％ＣＯ２における４５分間の消化用にインキュベートした。室温における１５分間の１１０×ｇでの遠心分離後、ピペットによる粉砕によって組織を機械的に解離させた。単細胞懸濁液から得た細胞を、７５ｃｍ２のファルコン組織培養フラスコ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンディエゴ、ＣＡ）中、神経幹／前駆細胞（ＮＰＣ）培養培地［ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．６％のグルコース、９．６μｇ／ｍｌのプトレシン、６．３ｎｇ／ｍｌのプロゲステロン、５．２ｎｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウム、０．０２ｍｇ／ｍｌのインシュリン、０．１ｍｇ／ｍｌのトランスフェリン、２μｇ／ｍｌのヘパリン（いずれもＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエルから）、線維芽細胞増殖因子−２（ヒト組換え体、２０ｎｇ／ｍｌ）、及び上皮細胞増殖因子（ヒト組換え体、２０ｎｇ／ｍｌ；いずれもＰｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）を含む］中に播いた（３５００細胞／ｃｍ２）。細胞球体は４〜６日毎に継代し、単一の細胞として再び播いた。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するＮＰＣは、以前に記載されたのと同様に得た（Ｐｌｕｃｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）。
【００８３】
（ｉｉｉ）初代ミクログリア培養。新生児（Ｐ０〜Ｐ１）Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウス由来の脳を、それらの髄膜を剥ぎ取り、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ−１５培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｋｉｂｂｕｔｚ  Ｂｅｉｔ  Ｈａ−Ｅｍｅｋ、イスラエル）において解剖顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、ＳｔｅｍｉＤＶ４、ドイツ）の下でハサミを用いて刻んだ。トリプシン処理（０．５％のトリプシン、１０分間、３７℃／５％ＣＯ２）の後、組織を粉砕した。細胞浮遊物を、グリア細胞用の培養培地［１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｈｏｖｏｔ）、Ｌ−グルタミン（１ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、及びストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）を補充したＤＭＥＭ］で洗浄し、１時間ホウ酸塩バッファー（５００ｍｌの滅菌水に溶かした２．３７ｇのホウ砂及び１．５５ｇのホウ酸、ｐＨ８．４）中、ポリ−Ｄ−リシン（ＰＤＬ）（１０ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｈｏｖｏｔ）でコーティングした７５ｃｍ２のファルコン組織培養フラスコ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中において３７℃／５％ＣＯ２で培養し、次いで滅菌した試験管の蒸留水で完全にすすいだ。培地の半分は、１０〜１４日間の合計培養時間中、培養６時間後、及びその後は第２日に始めて２日毎に交換した。ミクログリアは初代混合脳グリア細胞培養物を攪拌除去し（１５０ｒｐｍ、３７℃、６時間）、最高収率は第１０日と第１４日の間であり、ＰＤＬ予備処理２４ウエルプレート（１ｍｌ／ウエル；Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク、ＮＹ）に接種し（１０５細胞／ｍｌ）、ミクログリア用の培養培地［１０％のＦＣＳ、Ｌ−グルタミン（１ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、β−メルカプトエタノール（５０ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、及びストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｈｏｖｏｔ）］で増殖させた。細胞はＰＤＬコーティング培養フラスコの表面に接着させ（３０分間、３７℃／５％ＣＯ２）、非接着細胞はすすぎ落とした。
【００８４】
（ｉｖ）免疫細胞化学法及び免疫組織化学法。一次抗体：バンデリアエアシンプリシフォリア（Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ）のイソレクチンＢ４（ＩＢ−４；１：５０；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｈｏｖｏｔ）；マウス抗β−チューブリン（抗βＩＩＩ−Ｔ）イソ型Ｃ末端抗体（１：５００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）、ラット抗ＣＤ１１ｂ（ＭＡＣ１；１：５０；ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）、ハムスター抗ＣＤ１１ｃ（１：１００；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、サンディエゴ、ＣＡ）、ラット抗ＭＨＣ−ＩＩ抗体（クローンＩＢＬ−５／２２；１：５０）、マウス抗Ａβ（ヒトアミノ酸残基１〜１７；クローン６Ｅ１０；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ラット抗ＢｒｄＵ（１：２００；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｋｉｄｌｉｎｇｔｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、ＵＫ）、ヤギ抗ダブルコルチン（抗ＤＣＸ）（１：４００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、マウス抗ニューロン核タンパク質（ＮｅｕＮ；１：２００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ヤギ抗ＩＧＦ−Ｉ抗体（１：２０；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヤギ抗ＴＮＦ−α抗体（１：１００；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ウサギ抗ＣＤ３ポリクローナル抗体（１：１００；ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、ＣＡ）。二次抗体：ＦＩＴＣ結合ロバ抗ヤギ、Ｃｙ−３結合ロバ抗マウス、及びＣｙ−３又はＣｙ−５結合ロバ抗ラット、ビオチン結合抗ハムスター抗体及びＣｙ−３又はＣｙ−５結合ストレプトアビジン抗体（いずれもＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈから）。
【００８５】
ＮＰＣとマウスミクログリアの共培養物由来のカバーガラス用切片をＰＢＳで洗浄し、前に記載したのと同様に固定し、１０％のＦＣＳ、２％のウシ血清アルブミン、１％のグリシン、及び０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｈｏｖｏｔ）を含む透過処理／ブロッキング溶液で処理し、マウス抗β−チューブリン（抗βＩＩＩ−Ｔ）イソ型Ｃ末端抗体（１：５００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）、ラット抗ＣＤ１１ｂ（ＭＡＣ１；１：５０；ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）、及びハムスター抗ＣＤ１１ｃ（１：１００；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、サンディエゴ、ＣＡ）の組合せで染色した。ミクログリアを捕捉するために、ＦＩＴＣ−又はＣｙ３−結合バンデリアエアシンプリシフォリア（Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ）のイソレクチンＢ４（ＩＢ−４；１：５０；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｈｏｖｏｔ）を使用した。ヒトＡβの発現を検出するために、抗Ａβ（ヒトアミノ酸残基１〜１７）（マウス、クローン６Ｅ１０；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を使用した。
【００８６】
ＢｒｄＵ染色用に、切片をＰＢＳで洗浄し、３０分間３７℃において２ＮのＨＣｌ中でインキュベートした。切片はブロッキング溶液［２０％の正常ウマ血清及び０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳ、又はＶｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）から入手したマウス免疫グロブリンブロッキング試薬を含むＰＢＳ］で１時間ブロッキングした。
【００８７】
免疫組織化学法用に、１０％のＦＣＳ、２％のウシ血清アルブミン、１％のグリシン、及び０．０５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を含む透過処理／ブロッキング溶液で組織切片を処理した。組織切片は、以下の一次抗体：ラット抗ＢｒｄＵ（１：２００；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｋｉｄｌｉｎｇｔｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、ＵＫ）、ヤギ抗ダブルコルチン（抗ＤＣＸ）（１：４００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、及びマウス抗ニューロン核タンパク質（抗ＮｅｕＮ）（１：２００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）の特定の組合せを用いて４℃において一晩染色した。二次抗体は、ＦＩＴＣ結合ロバ抗ヤギ、Ｃｙ−３結合ロバ抗マウス、及びＣｙ−３又はＣｙ−５結合ロバ抗ラット（１：２００；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）であった。ＣＤ１ｌｂ（ＭＡＣ１；１：５０；ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）又はＦＩＴＣ結合ＩＢ−４は、ミクログリアの標識用に使用した。抗ＭＨＣ−ＩＩ抗体（ラット、クローンＩＢＬ−５／２２；１：５０）を使用して、細胞表面ＭＨＣ−ＩＩタンパク質の発現を検出した。ＣＤ１１ｃの発現を検出するために、ハムスター抗ＣＤ１１ｃ（１：１００；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、サンディエゴ、ＣＡ）を使用した。抗Ａβ（ヒトアミノ酸残基１〜１７）（マウス、クローン６Ｅ１０；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を使用して、ヒトＡβの発現を検出した。ＩＧＦ−Ｉの発現はヤギ抗ＩＧＦ−Ｉ抗体（１：２０；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって検出した。ＴＮＦ−αの発現はヤギ抗ＴＮＦ−α抗体（１：１００；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって検出した。Ｔ細胞は抗ＣＤ３ポリクローナル抗体（ウサギ、１：１００；ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、ＣＡ）を用いて検出した。ヨウ化プロピジウム（１μｇ／ｍｌ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）は、核染色用に使用した。
【００８８】
（一次抗体で処理しなかった）対照切片を使用して、非特異的抗体又は自動蛍光性構成要素の染色と特異的染色を区別した。次いで切片をＰＢＳで洗浄し、ポリビニルアルコール及び抗フェーディング剤としてのジアザバイシクロ−オクタンでカバーガラス用に処理した。
【００８９】
（ｖ）トランスジェニックマウス。Ｂ６Ｃ３−Ｔｇ（ＡＰＰｓｗｅ、ＰＳＥＮ１ｄＥ９）８５Ｄｂｏ／Ｊ系統（Ｂｏｒｃｈｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７）の１９匹の成体ダブルトランスジェニックＡＰＰＫ５９５Ｎ，Ｍ５９６Ｌ＋ＰＳ１ΔＥ９マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入し、飼育して、Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＳｃｉｅｎｃｅのＡｎｉｍａｌ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒで維持した。全ての動物はＷｅｉｚｍａｎｎ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＡｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって策定された規制にしたがって取り扱い、全ての実験及び手順はＷｅｉｚｍａｎｎ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＡｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されていた。
【００９０】
（ｖｉ）遺伝子型決定。この実験で使用した全てのマウスは、以前に記載されたのと同様に（Ｊａｎｋｏｗｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００４）ＰＣＲによってトランス遺伝子の存在に関して遺伝子型を決定した。
【００９１】
（ｖｉｉ）試薬。組換えマウスＩＦＭ−γ及びＩＬ−４はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から得た。β−アミロイドペプチド［断片１〜４０（Ａβ１−４０）］はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから購入した。Ａβペプチドはエンドトキシンを含まない水に溶かし、記載されたように（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）ＡβのインキュベーションによってＡβ凝集体が形成された。
【００９２】
（ｖｉｉｉ）コポリマー−１予防接種。それぞれのマウスに、第１週中は週２回及びそれ以後は週１回、実験第０日から第２４日まで、合計１００μｇの高分子量（ＴＶ−５０１０  ＤＳ、バッチｎｏ．４８６２２０２０５由来；Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｐｅｔａｃｈ  Ｔｉｋｖａ、イスラエル）を２００μｌのＰＢＳに乳濁させた乳濁液を５回皮下注射した。
【００９３】
（ｉｘ）行動実験。空間学習／記憶を、記載されたのと同様に実施した（Ｌｉｃｈｔｅｎｗａｌｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００１）モリス水迷路（ＭＷＭ）における海馬依存性の空間視覚学習課題に関するパフォーマンスによって評価した。
【００９４】
（ｘ）５−ブロモ−２’−デオキシウリジンの投与及び組織調製。細胞増殖のマーカー５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中での超音波処理によって溶かし、それぞれのマウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した（５０ｍｇ／体重１ｋｇ；２００μｌのＰＢＳに溶かした１．２５ｍｇのＢｒｄＵ）。最初のＣｏｐ−１予防接種後の実験第２２日から始めて、ＢｒｄＵを２．５日間１２時間毎に１日２回腹腔内注射して、増殖細胞を標識した。最初のＢｒｄＵ注射後３週間で、マウスに深く麻酔をかけ、最初にＰＢＳ、次いで４％のパラホルムアルデヒドを心臓経由で灌流させた。脳全体を除去し、一晩後固定し、リン酸緩衝３０％スクロース中で次いで平衡状態にした。浮動性の３０μｍ切片を凍結ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ  ＳＭ２０００Ｒ）で回収し、免疫組織化学法の前に４℃で保存した。
【００９５】
（ｘｉ）ニューロン前駆細胞とミクログリアの共培養。処理済み及び未処理ミクログリアの培養物を、新たなＮＰＣ分化培地（０．０２ｍｇ／ｍｌのインシュリン及び２．５％のＦＣＳ以外ＮＰＣ用の培養培地と同じ、ただし増殖因子含まず）で２回洗浄して、試験した試薬の全痕跡を除去し、次いで１５分間氷上でインキュベートし、室温において２０分間３５０ｒｐｍで攪拌した。ミクログリアをフラスコから除去し、ＮＰＣ分化培地の存在下において２４ウエルプレート中のＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をコーティングしたカバーガラス上で、１０日間ＮＰＣ（５×１０４細胞／ウエル）と即座に共培養した（５×１０４細胞／ウエル）。次いで培養物を、室温で３０分間２．５％のパラホルムアルデヒドを溶かしたＰＢＳで固定し、ニューロン及びグリアマーカー用に染色した。
【００９６】
（ｘｉｉ）定量化及び立体的計数手順。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０共焦点レーザー走査顕微鏡（倍率４０倍）を顕微鏡分析に使用した。実験用に、０．０５３ｍｍ２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ領域（ｎ＝８〜１６、少なくとも２つの異なるカバーガラス由来）をそれぞれの実験群に関してスキャンした。それぞれのマーカー用に、５００〜１０００の細胞をサンプル採取した。ＧＦＰとβＩＩＩ−Ｔを共発現した細胞を数えた。
【００９７】
ｉｎ−ｖｉｖｏ実験用に、海馬中のＡβプラーク及びＣＤ１１ｂ＋ミクログリアの数を、３００μｍ間隔、それぞれのマウス由来の６〜８の冠状切片（３０μｍ）で数えた。歯状回におけるニューロン新生は、マウスの脳当たり６個の冠状切片（３７０μｍ間隔）中の、未熟ニューロン（ＤＣＸ＋）、増殖細胞（ＢｒｄＵ＋）、及び新たに形成された成熟ニューロン（ＢｒｄＵ＋／ＮｅｕＮ＋）を数えることによって評価した。歯状回当たりの標識細胞の合計数の推定値を得るために、それぞれの脳由来の選択した冠状切片中で数えた細胞の合計数に、容積指数（歯状回の容積と選択した切片の合計組合せ容積の間の比）を掛けた。ＢｒｄＵ＋／ＮｅｕＮ＋共発現の特異性を、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ５１０）を使用して１μｍ間隔の光学切片においてアッセイした。ＣＤ３＋、ＣＤ１１ｂ＋及びＣＤ１１ｃ＋細胞の定量化は、この実験で試験したそれぞれのマウスの３０〜５０のＡβプラークから分析した。細胞数、Ａβプラークの数、プラーク面積、及び歯状回中の単位面積当たりのＮｅｕＮ染色の強度は、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  ４．５ソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して自動的に評価した。
【００９８】
（ｘｉｉｉ）統計分析。ＭＷＭの行動実験の値を、３元配置ＡＮＯＶＡを使用して分析した。治療群及び臨床群は変動源として使用して、ＭＷＭにおける獲得臨床群中の平均値間の差の有意性を評価した。得られたＰ値が有意であったとき、ペアワイズのフィッシャーの最小有意差多重比較検定を実施して、どの群が有意に異なっていたかを決定した。
【００９９】
ｉｎ−ｖｉｔｒｏの結果はスチューデントの両側非対応ｔ−検定、及びＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒの多重比較検定（ＡＮＯＶＡ）により分析して、平均±ＳＥＭとして表す。ｉｎ  ｖｉｖｏの結果はスチューデントの両側非対応ｔ−検定又は１元配置ＡＮＯＶＡによって分析し、平均±ＳＥＭとして表す。
【０１００】
（実施例１）
凝集したβ−アミロイドはミクログリアがニューロン新生を阻害する表現型を発現するのを誘導し、且つその阻害はＩＬ−４によって相殺される。
本発明者らの研究室からの前述のｉｎ  ｖｉｔｒｏの発見は、炎症及び神経変性疾患と関係があることが分かったミクログリア（例えば、ＬＰＳ又は凝集したＡβ（１−４０）によって活性化されたミクログリア）は低い抗原提示能力を有し、一方ニューロン組織の生存と関係があることが示されたＩＬ−４活性化されたミクログリアは、ＭＨＣ−ＩＩを発現し、ＩＧＦ−Ｉを産生し、且つＴＮＦ−αの発現を低下させることを示唆している（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）。ここで本発明者らは、Ａβ活性化ミクログリアがニューロン新生を阻害し、そうである場合、Ｔ細胞由来サイトカインはその阻害効果を相殺することができるかどうかを最初に調べた。この目的のために本発明者らは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する神経幹／前駆細胞（ＮＰＣ）と、凝集したＡβペプチド１−４０（Ａβ（１−４０）；５μＭ）の存在又は不在下においてそれらの最適増殖培地（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）で４８時間プレインキュベートし、ＩＦＮ−γ（１０ｎｇ／ｍｌ）又はＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）或いはＩＬ−４とＩＦＮ−γ（１０ｎｇ／ｍｌ）の両方でその後さらに４８時間処理したミクログリアを共培養した。Ａβ（１−４２）ではなくＡβ（１−４０）、及びその濃度の選択は、この化合物はミクログリアにおいて細胞毒性活性を誘導するという本発明者らの以前の実証に基づいた（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）。増殖培地及びサイトカイン残渣は、共培養したミクログリアを次いで洗浄除去し、それぞれの処理したミクログリア調製物を、分化培地（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００６ａ）の存在下においてＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）をコーティングしたカバーガラス上で、解離状態の成体脳室下帯由来のＮＰＣ球体（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００６ａ）と新たに共培養した（図１Ａ）。ＮＰＣによるＧＦＰの発現によって、培養物中に見られた任意の分化ニューロンは、初代ミクログリア培養物の汚染ではなくＮＰＣに由来したことを確認した。１０日後本発明者らは、ミクログリアを含まない培養物（対照）中でニューロンマーカーβＩＩＩ−Ｔを発現する数個のＧＦＰ陽性ＮＰＣを識別することができた。ＩＦＮ−γ（１０ｎｇ／ｍｌ；ＭＧ（ＩＦＮ−γ））とのインキュベーションによって事前に活性化したミクログリアとＮＰＣの共培養では、ＧＦＰ＋／βＩＩＩ−Ｔ＋細胞の数の劇的な増大が見られた。対照的に、凝集したＡβ（１−４０）によって活性化されたミクログリア（ＭＧ（Ａβ１−４０））はニューロン新生を阻害し、ＮＰＣの数を減少させた。ＩＦＮ−γをＡβ活性化ミクログリアに加えることによって（ＭＧ（Ａβ１−４０／ＩＦＮ−γ））、ニューロン新生に対するそれらの悪影響を無効にすることはできなかった。対照的に、ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）を凝集したＡβ（１−４０）で予め処理したミクログリア（ＭＧ（Ａβ１−４０／ＩＬ−４））に加えることによって、ＮＰＣの生存及び分化に対する凝集Ａβの悪影響を部分的に相殺し、その結果これらのミクログリアは、ＮＰＣがニューロンに分化するのを誘導することができた。しかしながら、ＩＦＮ−γをＩＬ−４と組み合わせて加えると（ＭＧ（Ａβ１−４０／ＩＦＮ―γ＋ＩＬ−４））、ＮＰＣの生存及び分化に対するＡβ活性化ミクログリアの負の活性を相殺する際のそれらの影響は、ＩＬ−４単独の影響より強かった（図１Ｂ）。全ての場合においてβＩＩＩ−Ｔ＋細胞もＧＦＰを発現したことを、本発明者らは確認した（図１Ｃ）。脅威的刺激がミクログリアに対して示される程度は、これらの細胞が刺激に耐える能力に非常に影響を与えるという本発明者らの以前の実証を鑑みると、この発見は特に興味深い（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）。図１Ｄ中に表す定量化分析は図１Ｂ中に示すデータを要約し、未処理ミクログリアの存在下での分化はわずかな程度でのみ起こったことをさらに示す。特に、ＮＰＣなしで培養したミクログリアでは、βＩＩＩ−Ｔ＋細胞は見られなかった（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００６ａ）。
【０１０１】
（実施例２）
コポリマー−１を用いたＴ細胞ベースの予防接種はミクログリアの免疫活性を調節し、β−アミロイドプラークの形成を排除し、ニューロン新生を誘導する。
前述の発見によって本発明者らは、Ｔ細胞ベースの予防接種はアルツハイマー病におけるミクログリアのデフォルトの表現型を変え、したがってプラーク除去及びニューロン新生をもたらし得るかどうか調べる気になった。本発明者らが予防接種用に選択した抗原は、広範囲のＣＮＳ自己抗原とわずかに交差反応性があり、レジメンに応じて急性と慢性神経変性の両方の条件下で神経防護作用がある（Ｋｉｐｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、２０００；Ｓｃｈｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００１；Ａｎｇｅｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）ことが本発明者らによって示されたＣｏｐ−１（Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．、１９９６）であった。本発明者らは、いずれも早期発症家族性アルツハイマー病の特有な特徴である（Ｂｏｒｃｈｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７）学習／記憶障害、並びに大脳皮質及び海馬中に主に沈着する凝集Ａβプラークの蓄積に苦しむＴｇ−ＡＤマウスにおける、Ｃｏｐ−１の影響を調べた。Ｃｏｐ−１投与に関するレジメンは、眼内圧の慢性上昇のモデル（Ｂａｋａｌａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）において神経防護作用を誘導するために使用されたレジメンと同様であった。
【０１０２】
本発明者らはゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅によって、それぞれのマウスにおいて両方のトランス遺伝子の存在を確認した。約８カ月齢のＴｇ−ＡＤマウスに、第１週中は週に２回、及びその後は週に１回、Ｃｏｐ−１を次いで皮下に予防接種した（ｎ＝６）。年齢適合未治療−Ｔｇ−ＡＤマウス（ｎ＝７）及び非Ｔｇ同腹子（ｎ＝６）は、それぞれ未治療−Ｔｇ及び野生型対照として働いた。最初のＣｏｐ−１注射後７週間で、全てのマウスを安楽死させ分析した。ヒトＡβに特異的な抗体を用いたＴｇ−ＡＤマウス由来の脳の低温切片の染色によって、未治療−Ｔｇ−ＡＤマウスにおける多数のプラークが明らかになったが、Ｃｏｐ−ｌを予防接種したＴｇ−ＡＤマウスでは非常に少数であった（図２Ａ）。それらのそれぞれの非Ｔｇ同腹子においてプラークは見られなかった（図２Ａ）。
【０１０３】
ｉｎ−ｖｉｔｒｏの発見と相まって、前述の結果から、本発明者らは予防接種Ｔｇ−ＡＤマウスにおけるミクログリアの特徴の変化を調べるように促された。未治療−Ｔｇ−ＡＤマウスにおけるプラークは、ＴＮＦ−αを発現する（図２Ｃ）ＣＤ１１ｂ＋ミクログリアの多量の存在（図２Ａ及び図２Ｂ）と関係があることが分かった。Ｃｏｐ−１−予防接種Ｔｇ−ＡＤマウスでは少量のＣＤ１１ｂ＋ミクログリアが検出可能であった（図２Ａ）。ＣＤ１１ｂ＋ミクログリアは未治療−Ｔｇ−ＡＤマウスにおいて比較的少ない分枝状突起を示したことを、記すことは重要である（図２Ｃ）。抗ＭＨＣ−ＩＩ抗体を用いた染色によって、Ｃｏｐ−１−予防接種Ｔｇ−ＡＤマウスでは、残留Ａβプラークに隣接する大部分のミクログリアがＭＨＣ−ＩＩを発現し、それらのほとんどはＴＮＦ−αを発現せず（図２Ｄ）、一方未治療−Ｔｇ−ＡＤマウスでは、ほとんど全てのミクログリアがＭＨＣ−ＩＩを発現しない（図２Ｅ）ことが明らかになり、ＡＰＣとして機能するそれらの能力は限られていることが示唆された。全てのＭＨＣ−ＩＩ＋細胞をＩＢ−４で同時標識し（データ示さず）、ミクログリアとしてのそれらの同一性を確認した。Ｃｏｐ−１−予防接種Ｔｇ−ＡＤマウスにおいて見られたＭＨＣ−ＩＩ＋ミクログリアの樹状様の形態（図２Ｄ）によって、本発明者らは、それらが特徴的な樹状細胞のマーカー、即ちＣＤ１１ｃを発現するかどうか調べる気になった。未治療−Ｔｇ−ＡＤマウスでは、Ａβ＋プラークと結合したＣＤ１１ｃ＋ミクログリアがごくわずかに見られ、一方Ｃｏｐ−１−予防接種マウスにおいて見られた任意の残留Ａβ染色プラークは、ＭＨＣ−ＩＩ＋／ＣＤ１１ｃ＋ミクログリアに囲まれていた（図２Ｅ）。特に、これらのＣＤ１１ｃ＋ミクログリアはＣＤ１１ｂに関しても陽性染色されており（図３Ａ）、さらにそれらはＡβが充填されており、このペプチドのその取り込みを示す（図２Ｅ）。定量分析によって、Ａβ−プラークと結合したＣＤ１１ｂ＋細胞の数はＣｏｐ−１−予防接種Ｔｇ−ＡＤマウスにおいて有意に減少したこと（図３Ｂ）、及び予防接種の結果として、未治療−Ｔｇ−ＡＤマウスにおける２５％と比較して、８７％のＣＤ１１ｂ＋がＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１１ｃ＋細胞になったこと（図３Ｃ）が明らかになった。
【０１０４】
（ＩＬ−４によって活性化される）ＭＨＣ−ＩＩ＋ミクログリアはＩＧＦ−Ｉを多量に発現するという（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００５；Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００６ａ；ｂ）本発明者らの最近の発見に鑑みて、本発明者らは予防接種Ｔｇ−ＡＤマウスにおけるＩＧＦ−Ｉの発現を調べた。これらのマウス中のＭＨＣ−ＩＩ＋ミクログリアは、実際ＩＧＦ−Ｉを発現していたことが分かった（図２Ｆ）。抗ＣＤ３抗体によって確認したＴ細胞の存在に関する染色によって、未治療−Ｔｇ−ＡＤマウス中と異なり、Ｃｏｐ−１−予防接種Ｔｇ−ＡＤマウスでは、Ａβ−プラークと結合した多数のＴ細胞が存在したことが明らかになった（図２Ｇ）。さらに、Ｃｏｐ−１−予防接種Ｔｇ−ＡＤマウス中の大部分のＴ細胞は、ＭＨＣ−ＩＩ＋ミクログリアの近くに位置していたことが分かった。これらのマウスにおいて検出した任意のＡβ免疫反応性はＭＨＣ−ＩＩ＋ミクログリアと関係があったようであり、これらのミクログリアとＣＤ３＋Ｔ細胞の間の免疫学的シナプスの存在が示唆された（図２Ｈ）。定量分析によって、未治療−Ｔｇ−ＡＤマウス中より有意に少ないＣｏｐ−１−予防接種Ｔｇ−ＡＤマウス中のプラークの存在を確認し（図２Ｉ）、プラークによって占められた領域は、それらの年齢適合未治療対照物中より予防接種Ｔｇ−ＡＤマウス中で有意に小さかったことを示した（図２Ｊ）。さらに、有意に少ないＣＤ１１ｂ＋ミクログリア（図２Ｋ）及びＡβ−プラークと結合した有意に多いＴ細胞を、対応する未治療−Ｔｇ−ＡＤマウスの群よりＣｏｐ−１−予防接種Ｔｇ−ＡＤマウス中で観察した（図２Ｌ）。
【０１０５】
本発明者らの以前の発見に基づいて、Ｃｏｐ−１−予防接種Ｔｇ−ＡＤマウスにおけるＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１１ｃ―／ＩＧＦ−１―からＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１１ｃ＋／ＩＧＦ−１＋へのミクログリアの表現型の変化は、ＩＬ−４に原因がある可能性があると本発明者らは疑った。本発明者らはこの可能性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで調べた。第５日のミクログリア培養物をＣＤ１１ｃマーカーで染色することによって、ＣＤ１１ｃは未処理によってほぼ完全に発現されなかったが、ＩＬ−４により活性化されたミクログリアによって多量に発現されたことを示した（図４Ａ）。さらにＩＬ−４は、ミクログリアをＡβに曝した後３日間だけ加えた場合でさえも、それらにＣＤ１１ｃを発現させるのを誘導することができた（図４Ｂ）。ミクログリアの分化活性は形態的な差でも示された、Ａβにより活性化されたミクログリアはアメーバ状の形態を示し、一方でＣＤ１１ｃ＋ミクログリアの丸い形状は樹状細胞を連想させた（図４Ｂ）。最も重要なことに、Ａβ染色ミクログリアのアメーバ状の形態はＩＬ−４の添加によって可逆的であり、そのときそれらは樹状様細胞の形態的概観を再度とった（図４Ｂ）。ミクログリアに施した様々な処理はそれらのＣＤ１１ｂの発現に影響を与えず、ミクログリアがＣＤ１１ｃを発現したときそれらはそのＣＤ１１ｂ特性を失わなかったことが示唆された（図４Ｂ）。培養における時間の関数としてＣＤ１１ｃ＋細胞の数及びそれらの染色の強度により評価した、ＣＤ１１ｃ発現の定量分析によって、接種直後（第０日）に未処理ミクログリアは低レベルのＣＤ１１ｃを発現し、それは徐々に消失したことが明らかとなった（図４Ｃ）。対照的に、ＩＬ−４によって誘導されたＣＤ１１ｃの発現は一時的ではなかった。ミクログリアをＡβで事前処理した後でもＣＤ１１ｃの発現を誘導するＩＬ−４の能力の定量化は、図４Ｄ中に示す。
【０１０６】
Ｃｏｐ−１予防接種によって誘導されることが分かった表現型と、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのミクログリアに対するＩＬ−４の影響の間の相関関係によって、本発明者らは凝集したＡβ（１−４０）を捕食するＩＬ−４活性化ミクログリアの能力を調べる気になった。ＩＬ−４処理及び未処理ミクログリアによって取り込まれた免疫反応性Ａβの（細胞内染色による）定量比較は、ＩＬ−４がＡβを取り込むミクログリアの能力に干渉しなかったことを示した（図５）。
【０１０７】
ＣＤ１１ｃ、ＭＨＣ−ＩＩ、及びＴＮＦ−αの発現に対するＩＬ−４の観察した影響によって本発明者らは、Ｃｏｐ−１−予防接種Ｔｇ−ＡＤマウスはｉｎ  ｖｉｖｏで増大したニューロン新生を示すかどうか調べる気になった。組織切除の３週間前に、全てのマウスに増殖細胞マーカーＢｒｄＵを注射し、新たなニューロンの検出を可能にした。海馬歯状回の同じ領域由来の他の切片の定量分析によって、Ｃｏｐ−１−予防接種Ｔｇ−ＡＤマウス中の、それらの未治療−Ｔｇ対照物中より有意に多量のＢｒｄＵ＋細胞が明らかになった（図６Ａ）。さらに、そのそれぞれの非Ｔｇ同腹子中で新たに形成された成熟ニューロン（ＢｒｄＵ＋／ＮｅｕＮ＋）の数と比較すると、未治療−Ｔｇ−ＡＤ群中のその数は有意に少ないが、Ｃｏｐ−１−予防接種Ｔｇ−ＡＤ群中では同等であり、Ｃｏｐ−１予防接種によってニューロン新生能力が少なくとも部分的に回復したことが示された（図６Ｂ）。ＤＣＸ、成体の歯状回中で新たに生じた未熟ニューロンの絶対数を分析するのに有用なマーカー（Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．、２００４）の対応する切片の分析によって、非Ｔｇ同腹子と比較して、未治療−Ｔｇ−ＡＤマウスの歯状回中には有意に少数のＤＣＸ＋細胞が存在し、Ｃｏｐ−１を予防接種したＴｇ−ＡＤマウスの歯状回中には、わずかではあったが有意に多量に存在したことが明らかになった（図６Ｃ）。共焦点顕微鏡画像は、非Ｔｇ同腹子、未治療−Ｔｇ−ＡＤマウス、及びＣｏｐ−１−予防接種Ｔｇ−ＡＤマウス間のＢｒｄＵ＋／ＮｅｕＮ＋細胞の数、並びにＤＣＸ＋細胞及びそれらの樹状突起の数の差を示す（図６Ｄ）。これらの結果は、ニューロン新生は未治療−Ｔｇ−ＡＤマウス中より、Ｃｏｐ−１治療Ｔｇ−ＡＤマウス中で実際有意に多かったことを示した。しかしながら興味深いことに、未治療とＣｏｐ−１予防接種Ｔｇ−ＡＤマウスの両方で、歯状回の粒状帯下中のＤＣＸ染色ニューロンの突起は、ＤＣＸ＋細胞がＭＨＣ−ＩＩ＋ミクログリアの近辺に位置していたＣｏｐ−１予防接種Ｔｇ−ＡＤマウス中以外は短かった（図６Ｅ）。
【０１０８】
考察
ここで本発明者らは、Ｃｏｐ−１を用いたＴｇ−ＡＤマウスの予防接種はプラーク形成を減らし、認識衰退を低下させたことを示した。抗ＣＤ１１ｂ抗体を用いた活性化ミクログリアの標識によって、染色は未治療−Ｔｇ−ＡＤマウス中で強く、年齢適合Ｃｏｐ−１予防接種Ｔｇ−ＡＤマウス中では有意に低い強度であったことが明らかになった。Ｃｏｐ−１予防接種マウス中でのＣＤ１１ｂ＋ミクログリアの数の減少は、脳内でのその沈着が最初の段階でミクログリアの活性化をもたらしたＡβ−プラークの、減少の結果であった可能性がある。
【０１０９】
アルツハイマー病及び他の神経変性疾患におけるミクログリアの役割は、最近数年間で集中的に調べられてきており、明らかに矛盾する結果である（Ｓｔｒｅｉｔ、２００４）。健康である高齢野生型マウス中の幾つかのＣＤ１１ｂ＋ミクログリアの検出は、正常なヒト脳内の活性化ミクログリアの報告された加齢性の増大（Ｓｔｒｅｉｔ、２００４）と一致する。このようなミクログリアは、加齢性の認識衰退と低下したニューロン新生の両方の原因であるミクログリアであると考えられる（Ｍｏｎｊｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）。ＣＤ１１ｂはアルツハイマー病を有する患者においても見られた（Ａｋｉｙａｍａ＆ＭｃＧｅｅｒ、１９９０）。これらのミクログリアは食作用を有するが（Ｆｒｅｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）、それらは明らかにアルツハイマー症状を撃退するほど十分有効ではない。対照的に、且つ本発明者らの本試験と一致して、適合野生型マウスの骨髄由来のミクログリアは、プラークを効率よく除去することができる（Ｓｉｍａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、２００６）。これらのミクログリアは抗原提示に必要とされるより高レベルのタンパク質を発現し、したがって定住ミクログリアより有効な食細胞である可能性がある。本発明者らの本試験の結果に基づいて、脳のメンテナンスをサポートしアルツハイマー病と格闘するのに必要とされるミクログリアは、樹状様細胞（ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１１ｃ＋）であると本発明者らは示唆する。ＣＤ１１ｃ＋ミクログリアは、過剰なＡβの緩衝を促進しニューロン生存（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）とニューロン再生（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００６ｂ）の両方をサポートすることによって、悪条件の撃退に助力することができるＴ細胞との相互作用に携わる可能性がある。ＩＦＮ−γではなくＩＬ−４はＡβ関係ミクログリア（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）の表現型を変えることができるという、本発明者らの以前の発見を鑑みると、本試験でＡβプラークの近辺に見られたＭＨＣ−ＩＩ＋ミクログリアは、おそらくＩＬ−４によって活性化された可能性がある。この可能性は、本試験の２つのｉｎ−ｖｉｔｒｏでの発見：第一に、ニューロン新生のＡβ誘導型阻害が、ＩＦＮ−γ単独によってではなく、ＩＬ−４単独、或いはＩＦＮ−γと組み合わせたＩＬ−４によって部分的に相殺されたこと；及び第二に、Ｃｏｐ−１−予防接種Ｔｇ−ＡＤマウスにおいて残留Ａβプラークの非常に近くに見られたＭＨＣ−ＩＩ＋／ＣＤ１１ｃ＋ミクログリアが、ＩＧＦ−Ｉも発現したことによってさらに支持される。総合すると、これらの発見は、用語「有益」及び「有害」は一般にミクログリアの活性に適用することはできないという主張（Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）を補張するものである。
【０１１０】
ＩＬ−４は抗炎症性サイトカインとして記載されていることが多い（Ｃｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３）。本発明者らの結果はこの見識とは非常に相反するものであり、ＩＬ−４はミクログリアを活性化して、アルツハイマー病又はＭＳにおいて一般に見られる完全活性化ミクログリア又は活性化ミクログリアのそれと異なる形態及び異なる活性を得るような、表現型をとることを代わりに示唆する。後者の疾患では、アルツハイマー病と異なり、ミクログリアは適応免疫の攻撃によって圧倒されるようである（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００６ａ）。興味深いことに、ミクログリアが凝集Ａβの表現型特性を既に示した（（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）、及び（本試験）、或いはＩＦＮ−γによって圧倒された（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００６ａ）後でも、ＩＬ−４は好ましい活性化の表現型を回復させることが可能であるようである。他の興味深い発見は、ＬＰＳ及びＡβはミクログリアにおいて類似した型のＭＡＰＫ活性化を示すことである（Ｐｙｏ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８）。ＩＬ−４はＬＰＳによって活性化されるＭＡＰＫ経路、セリン／スレオニンホスファターゼ活性と明らかに関係がある影響を弱めることができる（Ｉｒｉｂａｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）。後者の現象は実際に分子機構として働く可能性があり、ＩＬ−４がＡβ活性化ミクログリアの有害な影響を弱めるという本発見の根底にある。したがって本発明者らは、ＩＬ−４の活性は抗炎症性としてでなく、免疫調節性としてみなすべきであると示唆する。
【０１１１】
ミクログリアの表現型に対するＩＬ−４の影響、及びＩＬ−４偏向でＴ細胞応答を誘導するために本試験で選択したレジメンの可能性に関する、本発明者らのｉｎ−ｖｉｔｒｏでの発見に基づいて、本試験におけるＴｇ−ＡＤマウスに対するＣｏｐ−１予防接種の観察した有益な影響は、それらのミクログリアの表現型に対する誘導されたＴ細胞の影響の結果であったことを本発明者らは示唆する。
【０１１２】
（実施例３）
コポリマー−１を用いた予防接種はアルツハイマー病における認識衰退を相殺する。
実験の終了前の２週間、海馬依存性の空間学習／記憶課題のそれらのパフォーマンスによって表した認識活動に関して、モリス水迷路（ＭＷＭ）で全てのマウスを試験した。未治療−Ｔｇ−ＡＤマウスのＭＷＭのパフォーマンスは、それらの年齢適合非Ｔｇ同腹子のパフォーマンスより平均して著しく悪化した（図７Ａ〜７Ｂ）。しかしながら、Ｃｏｐ−１−予防接種Ｔｇ−ＡＤマウスのパフォーマンスは未治療−Ｔｇ−ＡＤマウスのパフォーマンスより優れており、非Ｔｇ−ＡＤマウスのパフォーマンスと著しく異なっておらず、Ｃｏｐ−１予防接種がさらなる認識衰退を妨げたことが示唆された。認識パフォーマンスの差は、獲得（図７Ａ）と逆転学習課題（図７Ｂ）の両方で示された。
【０１１３】
本試験における予防接種マウスによって、弱まった認識衰退（モリス水迷路中で試験した）及び増大したニューロン新生を実証した。海馬の可塑性のこの２つの態様は、ＩＧＦ−Ｉの存在及び認識活性及び細胞再生と明らかに関係がある（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００６ａ；ｂ）。高密度環境で飼育したＴｇ−ＡＤマウスにおいて報告された観察結果も、ニューロン新生（Ｚｉｖ  ｅｔ  ａｌ．、２００６）及びプラーク減少（Ｌａｚａｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）と関係がある機構間の関係を支持する。
【０１１４】
凝集したＡβは、Ｔ細胞との相互作用に関与するミクログリアの能力に明らかに干渉するので、脳内のその存在は、認識能力の消失及びニューロン新生の障害を引き起こすと予想することができる。このような場合における疾患又は損傷部位へのＣＮＳ自己反応性Ｔ細胞の宿主化は重大であるが、これらのＴ細胞が凝集したＡβの破壊活性を相殺することができる場合だけは、有効であるはずである。ここで示すように、ＩＦＮ−γ自体は、凝集したＡβの表現型に既に傾いているミクログリアの活性に対して無力であるが、ＩＬ−４と一緒に加えると有効である。したがって、本試験の結果は、成体海馬中のニューロン新生の発生は、ミクログリアのＩＧＦ−Ｉ及びＢＤＮＦなどの増殖因子の産生と関係がある、十分制御された局所免疫活性に依存する（Ｚｉｖ  ｅｔ  ａｌ．、２００６）ことを強く示唆する。この考えと一致して、ニューロン新生はＬＰＳで治療した動物では阻害され（Ｍｏｎｊｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）、ミクログリアのＩＧＦ−Ｉの産生を阻害しミクログリアのＴＮＦ−αの分泌を誘導することが示されたという発見を報告する（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）。
【０１１５】
（実施例４）
ＩＦＮ−γ活性化ミエロイド細胞、及び組織修復を促進し、損傷組織を検出し、及び損傷組織に薬剤を送達するためのそれらの使用。
本発明者らは、ＩＦＮ−γをＩＬ−４と組み合わせて加えると、ＮＰＣの生存及び分化に対するＡβ活性化ミクログリアの負の活性を相殺する際のそれらの影響は、ＩＬ−４単独の影響より強かったことを示している（図１Ｂ）。しかしながら、本発明者らのデータは、ＩＦＮ−γ単独はＩＬ−４と同様に、２０ｎｇ／ｍｌまでの狭い濃度範囲でＩＦＮ−γで細胞を処理する場合、一時的であるがＣＤ１１ｃを誘導し、神経防護作用を誘導し（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）、神経幹／前駆細胞からのニューロン新生をサポートすることができることを実証する（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００６ｂ）。ＣＤ１１ｃは上方制御され、ミクログリア（図８Ａ〜８Ｄ）又は骨髄由来ミエロイド細胞（データ示さず）におけるＩＦＮ−γ活性化後２〜３日でピークに達する。したがって、ＩＦＮ−γによる骨髄由来ミエロイド細胞におけるＣＤ１１ｃの上方制御は、それらの細胞を損傷部位に到達させ、有益な影響を誘導するはずである。
【０１１６】
（実施例５）
乾燥型加齢性黄斑変性症に関して考えられる療法としての、Ｃｏｐａｘｏｎｅを用いた週１回の予防接種
前の実施例の結果は、神経防護作用をもたらすことが以前に分かったレジメンでの、Ｃｏｐ−１を用いたＴｇ−ＡＤマウスの予防接種は、ＣＤ１１ｂ＋からＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１１ｃ＋へのミクログリアの表現型の変化をもたらしたこと、及びこれはプラーク除去、ニューロン新生、及び弱まった認識衰退と関係があったことを示した。有益な影響は、浸潤ミクログリアの表現型の変化及び血液媒介の単球の動員に起因した。
【０１１７】
これらの発見、及びアルツハイマー病とＡＭＤの間で一般的な多くの特徴に基づいて、ＡＭＤではアルツハイマー病と同様に、週１回のＣｏｐ−１治療はドルーゼの除去をおそらくもたらし、これはその後、乾燥型ＡＭＤから湿性型ＡＭＤへの進行を抑制する可能性があると本発明者らは仮定した。異なるレジメンで与えるＣｏｐ−１は異なる治療をもたらし、１日１回の治療は数例の神経変性疾患において有益な影響がないが、多発性硬化症のような患者における炎症疾患を抑制する際は有効であることは強調しなければならない。したがって本発明者らは、週１回投与のプロトコルでＡＭＤ患者に関する臨床試験を実施することを決めた。
【０１１８】
本発明者らの患者集団におけるドルーゼの妥当な最終結果を、未登録及び未治療の乾燥型ＡＭＤ患者の眼底写真を分析することによって調べた。これらの患者は観測群を含んでいた。
【０１１９】
ドルーゼに対するＣｏｐ−１（Ｃｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）、Ｔｅｖａ）の影響を、プロスペクティブ、パイロット、ランダム化、二重盲検、プラセボ対照、比較臨床試験中に調べた。両眼に中程度の乾燥型ＡＭＤを有する５０歳を超える患者を登録した。
【０１２０】
登録患者は、週１回ベースで１２週間の間、Ｃｏｐａｘｏｎｅ（２０ｍｇ）の皮下注射又はプラセボ注射のいずれかで、ランダムに（比２対１で）治療した。包括的な眼の検査、及び眼底写真の検査は、ベースライン、６週間及び１２週間の訪問で実施した。最初の結果は全ドルーゼ領域の変化であり、それはＩｍａｇｅ−Ｐｒｏソフトウェアを使用して計算した。観測群からの患者（１７個の眼）の分析によって、全ドルーゼ領域の２５．２％の増大を示した。
【０１２１】
第１２週で、Ｃｏｐａｘｏｎｅで治療した８個の眼は、５３．６％のベースラインからの全ドルーゼ領域の減少を示した（範囲、５〜８９％）。プラセボ注射を与えた２個の眼は、全ドルーゼ領域の０．６％の減少を示した。
【０１２２】
したがって本試験は、ＡＭＤを治療するためのＣｏｐａｘｏｎｅの考えられる有益な影響を示す。登録患者の限られた数のために、統計上有意な結論を出すことはできない。しかしながらこれらの結果は、ドルーゼを撃退するための本試験の拡大及び継続を正当化し奨励するものである。神経変性疾患の動物モデルにおけるＣｏｐａｘｏｎｅを用いた週１回の治療の根底の機構を鑑みると、ＡＭＤに対するその影響は、ニューロンの保護及び修復の促進においてドルーゼの除去を超える可能性がある。
【０１２３】
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【図１Ａ】
0005412280.tif 000002
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図２Ｋ】
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【図２Ｌ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
0005412280.tif 000030
【図６Ｅ】
0005412280.tif 000031
【図７Ａ−Ｂ】
0005412280.tif 000032
【図８Ａ】
0005412280.tif 000033
【図８Ｂ】
0005412280.tif 000034
【図８Ｃ】
0005412280.tif 000035
【図８Ｄ】
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【配列表】
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