(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．対象から得られた検査試料中において、少なくとも１つの抗体と少なくとも１つの抗原を含むパネル中の２つ又はそれ以上のバイオマーカーの量を定量する工程；
ｂ．前記パネル中で定量された各バイオマーカーの量を前記バイオマーカーに対する所定のカットオフと比較し、該比較に基づいて、各バイオマーカーに対してスコアを割り当てる工程；
ｃ．前記対象に対する合計スコアを得るために、工程ｂにおいて定量された各バイオマーカーに対して割り当てられたスコアを合算する工程；
ｄ．工程ｃにおいて決定された合計スコアを所定の合計スコアと比較する工程；および
ｅ．工程ｄにおける合計スコアの比較に基づいて、前記対象が肺癌のリスクを有するかどうかを決定する工程；
を含む、肺癌と疑われる対象の診断を補助する方法であって、
前記パネルは、少なくとも４つの自己抗原ｐ５３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＰＫＡＰＫ３およびサイクリンＥ２を全て含む、前記方法。
【請求項２】
（ｉ）パネルが、抗ＴＭＰ２１、抗ＨＤＪ１、抗ＮＰＣ１Ｌ１Ｃドメイン、抗ＴＭＯＤ１、抗ＣＡＭＫ１、抗ＲＧＳ１、抗ＰＡＣＳＩＮ１、および抗ＲＣＶ１からなる群から選択される少なくとも１つの抗体をさらに含む；
（ｉｉ）パネルが、サイトケラチン８、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１９−９、ＣＡ１５−３、ＳＣＣ、プロＧＲＰ、血清アミロイドＡ、α−１−アンチトリプシン、アポリポタンパク質ＣＩＩＩおよびチモシンβ４からなる群から選択される少なくとも１つの抗原をさらに含む；
（ｉｉｉ）パネルが、Ａｃｎ６３９９、Ａｃｎ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｐｕｂ６４５３、Ｐｕｂ２９５１、Ｐｕｂ２４３３、Ｐｕｂ１７３３８、ＴＦＡ６４５３およびＨＩＣ３９５９からなる群から選択される少なくとも１つの関心領域をさらに含む；
（ｉｖ）パネルが、ＴＭＰ２１、ＨＤＪ１、ＮＰＣ１Ｌ１Ｃドメイン、ＴＭＯＤ１、ＣＡＭＫ１、ＲＧＳ１、ＰＡＣＳＩＮ１、およびＲＣＶ１からなる群から選択される少なくとも１つの抗原をさらに含む；
（ｖ）パネルが、抗サイトケラチン８、抗サイトケラチン１９、抗サイトケラチン１８、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ１２５、抗ＣＡ１９−９、抗ＣＡ１５−３、抗ＳＣＣ、抗プロＧＲＰ、抗血清アミロイドＡ、抗α−１−アンチトリプシン、抗アポリポタンパク質ＣＩＩＩおよび抗チモシンβ４からなる群から選択される少なくとも１つの抗体をさらに含む；又は
（ｖｉ）パネルが、Ａｃｎ６３９９、Ａｃｎ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｐｕｂ６４５３、Ｐｕｂ２９５１、Ｐｕｂ２４３３、Ｐｕｂ１７３３８、ＴＦＡ６４５３およびＨＩＣ３９５９からなる群から選択される少なくとも１つの関心領域を定量するための試薬をさらに含む、
請求項１の方法。
【請求項３】
肺癌に関するバイオマーカーのＤＦＩが０．４未満であり、前記ＤＦＩは、［（１−感受性）２＋（１−特異性）２］１／２である、請求項１の方法。
【請求項４】
工程ｂが、パネル中の各バイオマーカーの量を、前記バイオマーカーに対する多数の所定のカットオフと比較し、および該比較に基づいて各バイオマーカーに対してスコアを割り当てることを含み、工程ｃが、前記対象に対する合計スコアを得るために、工程ｂにおいて定量された各バイオマーカーに対する割り当てられたスコアを合算することを含み、工程ｄが、工程ｃにおいて決定された合計スコアを所定の合計スコアと比較することを含み、および工程ｅが、工程ｄにおける合計スコアの比較に基づいて、前記対象が肺癌を有するかどうかを決定することを含む、請求項１の方法。
【請求項５】
対象の少なくとも１つのバイオメトリックパラメータに対して値を取得する工程；および
各前記バイオメトリックパラメータに対する所定のカットオフに対して、前記少なくとも１つのバイオメトリックパラメータの値を比較し、および該比較に基づいて各バイオメトリックパラメータに対してスコアを割り当てる工程；
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
バイオメトリックパラメータが対象の喫煙歴、年齢、発癌性物質への曝露および性別からなる群から選択される、請求項５の方法。
【請求項７】
バイオメトリックパラメータが喫煙のパック・年である、請求項６の方法。
【請求項８】
前記方法が、各バイオメトリックパラメータの値を、前記バイオメトリックパラメータに対する多数の所定のカットオフに対して比較し、該比較に基づいて各前記バイオメトリックパラメータに対して多数の可能なスコアの１つを割り当てることを含み、
工程ｂが、パネル中の各バイオマーカーの量を前記バイオマーカーに対する多数の所定のカットオフと比較し、および該比較に基づいて各バイオマーカーに対してスコアを割り当てることを含み、
工程ｃが、前記対象に対する合計スコアを得るために、工程ｂにおいて定量された各バイオマーカーに対する割り当てられたスコアを、バイオメトリックパラメータに対する割り当てられたスコアと合計することを含み、
工程ｄが工程ｃにおいて決定された合計スコアを所定の合計スコアと比較することを含み、および
工程ｅが、工程ｄにおける合計スコアの比較に基づいて、前記対象が肺癌を有するかどうかを決定することを含む、請求項５の方法。
【請求項９】
サイクリンＥ２が、配列番号３、配列番号４又は配列番号５である、請求項１の方法。
【請求項１０】
ａ．検査試料中の１つ又はそれ以上の抗原を定量するための少なくとも１つの抗体を含有する試薬（前記抗原は、サイトケラチン８、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＳＣＣ、ＣＡ１９−９、プロＧＲＰ、血清アミロイドＡ、α−１−アンチトリプシン、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ又はチモシンβ４である。）、
ｂ．検査試料中の少なくとも１つの抗体を定量するための１つ又はそれ以上の抗原を含有する試薬（前記抗体は、抗ｐ５３、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１、抗ＭＡＰＫＡＰＫ３および抗サイクリンＥ２である。）；並びに
ｃ．検査試料中の定量された各抗原および抗体の量を合算し、所定のカットオフに対して比較し、並びに該比較に基づいて、定量された各抗原および抗体に対するスコアを割り当て、合計スコアを得るために、定量された各抗原および抗体に対する割り当てられたスコアを合算し、合計スコアを所定の合計スコアと比較し、および対象が肺癌を有するかどうかを決定する上での補助として前記比較を使用するためのアルゴリズム；
を含む、キット。
【請求項１１】
Ａｃｎ６３９９、ＡＣＮ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｐｕｂ６４５３、Ｐｕｂ２９５１、Ｐｕｂ２４３３、Ｐｕｂ１７３３８、Ｔｆａ６４５３およびＨｉｃ３９５９からなる群から選択される１つ又はそれ以上の関心領域を定量するための試薬をさらに含む、請求項１０のキット。
【請求項１２】
ａ．検査試料中の１つ又はそれ以上の抗原を定量するための少なくとも１つの抗体を含有する試薬（前記抗原は、サイトケラチン１９、ＣＥＡ、ＣＡ１２５およびプロＧＲＰである。）；
ｂ．検査試料中の少なくとも１つの抗体を定量するための１つ又はそれ以上の抗原を含有する試薬（前記抗体は、抗ｐ５３、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１、抗ＭＡＰＫＡＰＫ３および抗サイクリンＥ２である。）；並びに
ｃ．検査試料中の定量された各抗原および抗体の量を合算し、所定のカットオフに対して比較し、並びに該比較に基づいて、定量された各抗原および抗体に対するスコアを割り当て、合計スコアを得るために、定量された各抗原および抗体に対する割り当てられたスコアを合算し、合計スコアを所定の合計スコアと比較し、および対象が肺癌を有するかどうかを決定する上での補助として前記比較を使用するためのアルゴリズム；
をさらに含む、請求項１０のキット。
【請求項１３】
検査試料中のサイトケラチン１９、ＣＥＡ、ＣＡ１２５およびプロＧＲＰの各々を定量するための試薬を含有する、請求項１２のキット。
【請求項１４】
検査試料中の抗ｐ５３、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１、抗ＭＡＰＫＡＰＫ３および免疫反応性サイクリンＥ２に対する少なくとも１つの抗体の各々を定量するための試薬を含有する、請求項１２のキット。
【請求項１５】
検査試料中のサイトケラチン１９、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、プロＧＲＰ、抗ｐ５３、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１、抗ＭＡＰＫＡＰＫ３および抗サイクリンＥ２の各々を定量するための試薬を含有する、請求項１２のキット。
【請求項１６】
検査試料中の少なくとも１つの抗体を定量するための１つ又はそれ以上の抗原を含有する試薬をさらに含み、前記抗体が、抗ＴＭＰ２１、抗ＮＰＣ１Ｌ１Ｃドメイン、抗ＴＭＯＤ１、抗ＨＤＪ１、抗ＣＡＭＫ１、抗ＲＧＳ１、抗ＰＡＣＳＩＮ１、または抗ＲＣＶ１である、請求項１０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の情報
本願は、２００５年１２月２２日に出願された米国特許出願６０／７５３，３３１号の優先権を主張する２００６年１２月２１日に出願された米国出願１１／６４４，３６５号の一部継続出願である２００７年６月２９日に出願された米国出願１１／７７１，７２７号の優先権を主張する（全ての内容が、参照により、本明細書中に組み込まれる。）。
【背景技術】
【０００２】
肺癌は、米国において、男性および女性ともに二番目に多い癌であり、２００５年の間に、１７２，５００の新たな症例が診断されると推定されている（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙの統計）。肺癌は、両性における最も一般的な癌の死因であり、１６３，０００を超える肺癌関連の死が２００５年に予想されている。肺癌は、世界の他の地域でも大きな健康上の問題である。ＥＵでは、約１３５，０００の新たな症例が毎年発生している（Ｇｅｎｅｓｉｓ  Ｒｅｐｏｒｔ，１９９５年２月）。男性の喫煙率が世界で最も高い中欧および東欧でも発症率が急速に増加している（Ｔ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，  Ｊ．  Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８７：１３４８−１３４９（１９９５）参照）。タバコ単独で、肺、気管および気管支の癌の全症例の９０％超の原因となっている（ＣＰＭＣｎｅｔ，  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ参照）。国際保健機構の国際癌研究機関は、２００２年に世界で、１，３５２，０００の肺癌症例が存在し、この疾患によって１，１７９，０００が死亡したと推定した。
【０００３】
初期の肺癌は、胸部レントゲンおよび痰の細胞学的検査によって検出することができるが、これらの手法は無症候の個体に対するスクリーニング検査として日常的に使用するのに十分な精度を有していない。胸部レントゲンの感度を制約し得る潜在的な技術的問題には、最適でない技量、不十分な露出並びに患者の配置および協力が含まれる（Ｔ．Ｇ．  Ｔａｐｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１０４：６６３−６７０  （１９８６）参照）。放射線医の胸部レントゲンに関する解釈はしばしば一致せず、これらの４０％超が重要であり、又は重要な可能性がある（Ｐ．Ｇ．  Ｈｅｒｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｓｔ  ６８：２７８−２８２  （１９７５））参照）。偽陰性の解釈が多くの誤りの原因であり、確定的でない結果には、確定のための追跡検査が必要である（Ｔ．Ｇ．Ｔａｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照）。
【０００４】
痰の細胞学は、初期の肺癌を検出する上で、胸部レントゲンより感度が低い（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｅａｒｌｙ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ，  Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐ．Ｄｉｓ．１３０：５６５−５６７（１９８４）参照）。痰の細胞学が肺癌を診断する能力に影響を及ぼす要因には、患者が十分な痰を排出する能力、腫瘍の大きさ、主な気道への腫瘍の近接、腫瘍の組織学的種類並びに細胞病理学者の経験および訓練が含まれる（Ｒ．Ｊ．Ｇｉｎｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ：Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｐｐ．６７３−７２３，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ：Ｊ／Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．（１９９３）参照）。
【０００５】
多くの新たな肺癌は、疾病が肺を超えて広がった時点で検出される。アメリカでは、５年生存率が４９．７％で最高である局所的段階で、新たな非小細胞肺癌の１６％が検出されるに過ぎない。これに対して、新たな症例の６８％は、疾病が既に局所的に広がっているか、又は離れた部位に転移した時点で検出され、５年生存率は、それぞれ、１８．５％および１．８％である。同様に、新たに検出される小細胞肺癌の８０％は、局所的な浸潤又は遠隔転移を有することが発見され、５年生存率は、それぞれ、９．５％および１．７％である（Ｓｔａｔ  Ｂｉｔｅ，  Ｊ．  Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８７：１６６２  （１９９５）参照）。これらの統計は、現行の手続きは、疾病の治療可能な初期段階で肺癌を検出することができないこと、並びに死亡率を低下させるために、改善された検出および治療法が必要とされていることを示している。
【０００６】
一次療法後に肺癌患者をモニタリングするために最も頻繁に使用される方法は、通院、胸部Ｘ線、全血球算定、肝機能検査および胸部コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）である。しかしながら、定期的なモニタリングによる再発の検出は治療様式および全体的な生存期間に大きく影響を及ぼすものではなく、現行のモニタリング法は費用対効果に優れていないと結論付けられる（Ｋ．Ｓ．  Ｎａｕｎｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．６０：１６１２−１６１６（１９９５）；Ｇ．Ｌ．Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｔｈｏｒａｃ．  Ｓｕｒｇ．  ６０：１５６３−１５７２（１９９５））。
【０００７】
より最近になって、肺癌に対して高いリスクを有する無症候性の者をスクリーニングするために、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）を使用することが再び調査されてきた。Ｃ．Ｉ．Ｈｅｎｓｃｈｋｅら（Ｃｌｉｎ．Ｉｍａｇｉｎｇ２８：３１７−３２１（２００４））は、ＣＴスキャンは、過度の偽陽性を生じることなく、無症候性の肺癌を検出できることを示唆する２つの研究を報告した。Ｊ．Ｇｏｈｇａｎら（Ｃｈｅｓｔ  １２６：１１４−１２１（２００４））は、胸部Ｘ線を低線量ら線形ＣＴと比較する無作為研究のための試験プロトコールを評価し、肺癌をスクリーニングするための大規模な無作為臨床試験は実行可能であると結論付けた。しかしながら、臨床業務において実行されたとしても、ＣＴスクリーニングの費用は高く、追加検査をもたらす偽陽性の数も高い。優れた特異性を有する低コスト血液検査は、癌の初期検出に関してＣＴを補完する。ＣＴの有用性を改善するための別の戦略は、初期段階の肺癌に対する高感度血液検査を使用することである。ＣＴ又はＸ線の代用として、このような検査を患者に施すことができる。検査が陽性であれば、患者には画像診断が行われる。検査が陰性であれば、患者にはスキャンは行われないが、将来、再検査が行われ得る。血液検査が高い感受性若しくは高い特異性又は理想的には両方を与えるかどうかに関わらず、このような検査は、初期段階の肺癌を検出するために使用される現行のプロトコールに有用性を見出す。
【０００８】
さらに、肺癌のリスクが高い個体を特定するためにパネルへと組み合わせた場合の腫瘍マーカーおよびその有用性について再検討が最近行われた。しかしながら、個々のマーカーの特徴となる感受性が欠如しているために、腫瘍マーカーのパネルは肺癌の初期検出に未だ有用でない。古典的な生化学的方法によって見出された腫瘍抗原には、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、サイトケラチン８、サイトケラチン１８、サイトケラチン１９断片（ＣＹＦＲＡ２１−１）、神経細胞特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、プログラストリン放出ペプチド（ｐｒｏＧＲＰ）および扁平上皮細胞癌抗原（ＳＣＣ）が含まれる。これらのマーカーは、診断が為された後に、肺癌患者の段階を決定し、分類し、転帰を予想し、およびモニタリングする上で有用であることが見出されている。しかしながら、これらのマーカーは、単独で又はパネルで、肺癌の初期検出のために有用であることは明らかとなっていない（Ｓ．  Ａｎｄｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２１  ：３０８５−３０９２  （２００１）；  Ｕ．  Ｓ．  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｔａｓｋ  Ｆｏｒｃｅ，  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １４０：７３８−７３９  （２００４）参照）。これに対して、公知のイムノアッセイマーカーのパネル、とりわけ、ＣＥＡ、ＣＹＦＲＡ２１−１、ＳＣＣ、ＮＳＥおよびＰｒｏＧＲＰは、生検試料の取得が困難な状況において、肺癌の組織学的診断を行う上で有用であることが知られている（Ｃ．  Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２７（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ１）：７１（２００６）およびＰ．Ｓｔｉｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．２７（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ２）：Ｓ５−４（２００６）参照）。
【０００９】
正常な肺組織と比べて、肺腫瘍組織中で異なって発現されている細胞成分をまず特定することによって、肺癌に対する改善された腫瘍マーカーを発見する試みが為されてきた。ポリペプチド組成の定量的および定性的な差を特徴付けるために、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動が使用されてきた（Ｔ．Ｈｉｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ７２：８４０−８４８（１９９５）；Ａ．  Ｔ．  Ｅｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ  Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４：９８１−９９２（１９８６）参照）。しかしながら、二次元電気泳動工程のタンパク質分離の程度によって、およびゲル中でのタンパク質の染色に依存する検出工程によって、この技術の感度は制約を受ける。また、ポリペプチドの不安定性は、二次元パターンに人工的な誤差をもたらす。
【００１０】
国際特許公開ＷＯ２００５／０９８４４５Ａ２中に記載されているものなど、肺癌の診断を補助する上で、バイオマーカーおよびその使用を特定する試みも為されてきた。ＷＯ２００５／０９８４４５号に論述されているバイオマーカーは、表面増強レーザー脱離／イオン化質量分析法（ＳＥＬＤＩ）を用いて同定された。様々なマーカー、キット、方法および決定木解析法が開示されている。しかしながら、これらのマーカーおよび方法は何れの研究室においても再現されていないので、これらのマーカー、キットおよび方法は、日常的な業務で使用するために採用されていない。
【００１１】
ヒトの免疫系は、癌の発達と調節に関与していることが以前から知られている（Ｋ．  ｄｅ  Ｖｉｓｓｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，  ６：２４−３７  （２００６）参照）。従って、自然免疫応答および養子免疫応答を体現するタンパク質が肺癌に対する腫瘍マーカーとして探索されてきたことは驚くべきことではない。
【００１２】
血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）およびＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、α−１−アンチキモトリプシン（α−１−ＡＣＴ）、α−１−アンチトリプシン（α−１−ＡＴ）、α−２−マクログロブリン（α−２−Ｍ）、セルロプラスミン（Ｃｐ）、ハプトグロビン（Ｈｐ）およびトランスフェリン（Ｔｆ）などの、タンパク質の自然免疫ファミリーの一員である急性期タンパク質は、初期の切除可能な肺癌のバイオマーカーとして評価されてきた（Ｍ．  Ｋａｓｐｒｚｙｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｚｅｇｌ．Ｌｅｋ．６３：９３６−９４０  （２００６）参照）。フィブリノーゲンおよびＣＲＰは、切除可能な肺癌に対する生物マーカーとして研究されてきた（Ｊ．  Ｊｏｎｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ，  ５３：９７−１０１（２００６）参照）。アポリポタンパク質ＣＩＩＩ（アポＣＩＩＩ）は、肺癌の生物マーカーであると報告されていないが、膵臓癌と関連していると報告されている（Ｊ．  Ｃｈｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．（２００７），  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｈｒｏｍａ．２００７．０３．０９６参照）。急性期タンパク質と肺癌の関連は、２０年以上にわたって知られているが（Ｐ．  Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃａｎｄ．Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：１９３−１９８  （１９８４）参照）、初期肺癌の診断において日常的に使用されている急性期タンパク質は存在しない。
【００１３】
急性期タンパク質であると一般的に考えられていないが、対象に対するストレスに応答して上昇するタンパク質が存在する。このようなタンパク質は、自然又は養子免疫タンパク質より広いカテゴリーである、宿主応答タンパク質と称することができる。１つのこのようなタンパク質は、創傷治癒に関与する４４アミノ酸ペプチドであるチモシンβ−４（Ｔβ４）である。腫瘍組織中でのチモシンβ−４の発現は、浸潤性および転移性がより大きな腫瘍の表現型を予測すると考えられている。高いレベルでチモシンβ−４ｍＲＮＡを発現する初期の肺癌患者は、より低い発現を有する患者より生存率が劣る（Ｃ．  Ｍｕｌｌｅｒ−Ｔｉｄｏｗ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  ４５：Ｓ  １４５−１５０  （２００４）参照）。
【００１４】
自己抗体（患者自身のタンパク質（自己抗原と称される。）と反応する免疫グロブリン）は、養子免疫系の作用を実行するタンパク質を含む。肺癌患者中の自己抗体の存在に関する科学的な文献は、４０年前に遡る（Ｇ．Ｌｅｖｉｎｅ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．６９：７４９−７５７（１９６７）参照）。時折、特に、小細胞肺癌において、腫瘍随伴症候群として特徴付けられる神経学的症候を呈する患者中に神経系成分に対する自己抗体が生じる（Ｕ．Ｓｅｎｅｖｉｒａｔｎｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｏｓｔｇｒａｄ．Ｍｅｄ．Ｊ．７５：５１６−５２０参照）。劇的ではあるが、腫瘍随伴症候群を呈する患者はほとんど存在しないので、腫瘍随伴症候群および神経細胞又はタンパク質に対する自己抗体は何れも、大規模な集団に対する診断においては有用でない。自己抗体の初期の文献は、循環抗ｐ５３抗体に数多く言及している。ｐ５３は腫瘍抑制タンパク質であり、多くの癌において変異により不活化されている。患者の抗ｐ５３抗体は固有のｐ５３および変異を受けたｐ５３の何れとも反応するが、変異を受けたｐ５３の組織半減期はより長いので、肺癌患者の約３０％にこの自己抗体が出現すると考えられている（Ｒ．  Ｌｕｂｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．１  ：７０１−７０２  （１９９５）参照）。癌において自己抗体を生ずる細胞機構の制御に関与している細胞内タンパク質の報告が存在する。ヒト熱ショックタンパク質４０（Ｈｓｐ４０）に対する抗体が、肺癌患者の血清中に見出されることが報告されている（Ｍ．  Ｏｋａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９２：３１６−３２０  （２００１）参照）。このタンパク質は、ＤｎａＪＢ１又はｈＤＪ１としても知られる。肺癌中に循環する自己抗体を生じさせる自己抗原になる多くのタンパク質が記載されているが、百万又はそれ以上のタンパク質がヒト対象中に存在すると考えられていることに鑑みれば、肺癌および他の慢性疾患を有する患者中に、診断的に有用な自己抗体を引き起こすことが証明され得る、さらに多くの公知および非公知のタンパク質が残存している。
【００１５】
患者を分類し、又は診断を下すために、複数の自己抗体が使用される場合には、データ解析プロトコールが必要とされる。Ｊ．  Ｋｏｚｉｏｌら（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９：５１２０−５１２６  （２００３））は、様々な腫瘍の最適な診断のために自己抗体を選択するために再帰分割を使用した。Ｊ．Ｋｏｚｉｏｌらは、ｃ−ｍｙｃ、サイクリンＢ１、ＩＭＰ２、Ｋｏｃ、ｐ５３、ｐ６２およびサバイビンという７つの腫瘍関連抗原を使用し、肺癌患者の小さなグループ（５６）に対して優れた結果を得た。
【００１６】
診断的に有用な自己抗体を見出すための系統的アプローチには、反応性自己抗体に対して患者の血清および無疾病血清をスクリーニングするために、タンパク質アレイを使用することが含まれる。アレイは、腫瘍細胞可溶化液から構築され（Ｊ．Ｑｕｉ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．３：２６１−２６７  （２００４））、診断的に有用な自己抗体シグナチャーを患者の血清中に生じさせる新規自己抗原の探索のために使用されてきた。アレイは、組換え発現されたタンパク質からも構築することができる（Ｄ．  Ｍａｔｔｏｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐｅｒｔ．Ｒｅｖ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２：８７９−８８９  （２００５）参照）。診断用自己抗体を発見するのに有用である可能性を有するアフィニティークロマトグラフィー法が記載されている（（Ｊ．Ｓｅｐ．Ｓｃｉ．３０：３５２−３５８（２００７））。現在のところ、これらのアプローチは何れも、肺癌の初期検出のために有用な新規自己抗体をもたらしていない。
【００１７】
診断的に有用な自己抗体を発見するための別の体系的アプローチは、いわゆるＳＥＲＥＸ法である。ＳＥＲＥＸは、Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃＤＮＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（組換えｃＤＮＡ発現ライブラリーの血清学的分析）を表し、様々な癌において異常発現されている新規精巣抗原を発見するために使用されてきた（Ｙ．  Ｃｈｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９４：１９１４−１９１８  （１９９７）参照）。ＮＹ−ＥＳＯ−１は約１８ｋＤのタンパク質であり、腫瘍自己抗体として広く研究されてきた。ＥＬＩＳＡによって測定された場合に、非小細胞肺癌患者の約２０％は、このタンパク質に対する循環抗体を有する（Ｏ．  Ｔｕｒｅｃｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．２３６：６４−７１  （２００６）参照）。
【００１８】
罹患個体および非罹患個体から得た血清を用いて、酵母又は細菌中で発現されたペプチドライブラリーを調査することによって、肺癌に特異的な免疫応答を発見するための試みが行われてきた。Ｈｉｒｓｃｈｏｗｉｔｚの研究室から発表された文献（Ｌ．  Ｚｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｓｔ  １２５：１０５−１０６  （２００４），  Ｌ．  Ｚｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１５：１３０８−１３１４  （２００５）参照）は、肺癌患者に対する自己抗原であるタンパク質を発見するためにファージライブラリーを使用することを記載している。これらの著者は、対照化された研究において、症候性および無症候性肺癌患者の両方の特定に成功したことを報告している。しかしながら、症例および対照の数は限定されており（合計２００人未満の被験者）、この方法は、より大きな集団で検証する必要がある。
【００１９】
現在、肺癌のリスクを有する個体の特定は、主として、個体の喫煙歴に基づいている。アスベスト、粒状物などの他の環境的曝露も、肺癌発症リスクを増加させ得る。これらの公知のリスク因子は１つ又はそれ以上のアルゴリズム中に統合されており、肺癌に対する個体のリスクを評価するために、医療従事者および公衆の利用に供されている（Ｐ．  Ｂ．  Ｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９５：４７０−４７８  （２００３）参照）。残念なことに、このアルゴリズムは、初期段階の肺癌の検出に有用であるほど十分な感受性および特異性を有していない。実際、前記アルゴリズムに基づくと、著しい喫煙歴を有する個体は、肺癌の発症に関して、１／５００から１／１００の相対リスクを有している。このことは、Ｂａｃｈらの方法を用いた場合でさえ、５００のＣＴスキャンのうち最大４９９は、肺癌の症例の発見に結び付かないことを意味している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】国際公開第２００５／０９８４４５号
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Ｇｅｎｅｓｉｓ  Ｒｅｐｏｒｔ，１９９５年２月
【非特許文献２】Ｔ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，  Ｊ．  Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８７、１９９５年、ｐｐ．１３４８−１３４９
【非特許文献３】ＣＰＭＣｎｅｔ，  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ
【非特許文献４】Ｔ．Ｇ．Ｔａｐｅ他、Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１０４、１９８６年、ｐｐ．６６３−６７０
【非特許文献５】Ｐ．Ｇ．Ｈｅｒｍａｎ他、Ｃｈｅｓｔ  ６８、１９７５年、ｐｐ．２７８−２８２
【非特許文献６】Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｅａｒｌｙ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ，Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐ．Ｄｉｓ．１３０、１９８４年、ｐｐ．５６５−５６７
【非特許文献７】Ｒ．Ｊ．Ｇｉｎｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ：Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｐｐ．６７３−７２３，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ：Ｊ／Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．（１９９３）
【非特許文献８】Ｓｔａｔ  Ｂｉｔｅ，  Ｊ．  Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８７、１９９５年、ｐｐ．１６６２
【非特許文献９】Ｋ．Ｓ．  Ｎａｕｎｈｅｉｍ他、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．６０、１９９５年、ｐｐ．１６１２−１６１６
【非特許文献１０】Ｇ．Ｌ．Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｔｈｏｒａｃ．  Ｓｕｒｇ．  ６０、１９９５年、ｐｐ．１５６３−１５７２
【非特許文献１１】Ｃ．Ｉ．Ｈｅｎｓｃｈｋｅ他、Ｃｌｉｎ．Ｉｍａｇｉｎｇ２８、２００４年、ｐｐ．３１７−３２１
【非特許文献１２】Ｓ．  Ａｎｄｏ他、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２１、２００１年、ｐｐ．３０８５−３０９２
【非特許文献１３】Ｕ．  Ｓ．  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｔａｓｋ  Ｆｏｒｃｅ，  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １４０、２００４年、ｐｐ．７３８−７３９
【非特許文献１４】Ｃ．  Ｇｒｕｂｅｒ他、Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２７（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ１）、７１、２００６年
【非特許文献１５】Ｐ．Ｓｔｉｅｂｅｒ他、Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．２７（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ２）、２００６年、Ｓ５−４
【非特許文献１６】Ｔ．Ｈｉｒａｎｏ他、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ７２、１９９５年、ｐｐ．８４０−８４８
【非特許文献１７】Ａ．  Ｔ．  Ｅｎｄｌｅｒ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ  Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４、１９８６年、ｐｐ．９８１−９９２
【非特許文献１８】Ｋ．  ｄｅ  Ｖｉｓｓｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，  ６、２００６年、ｐｐ．２４−３７
【非特許文献１９】Ｍ．  Ｋａｓｐｒｚｙｋ他、Ｐｒｚｅｇｌ．Ｌｅｋ．６３、２００６年、ｐｐ．９３６−９４０
【非特許文献２０】Ｊ．  Ｊｏｎｅｓ他、Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ，５３、２００６年、ｐｐ．９７−１０１
【非特許文献２１】Ｊ．  Ｃｈｅｎ他、Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．（２００７），  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｈｒｏｍａ．２００７．０３．０９６
【非特許文献２２】Ｐ．  Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ他、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９、１９８４年、ｐｐ．１９３−１９８
【非特許文献２３】Ｃ．  Ｍｕｌｌｅｒ−Ｔｉｄｏｗ他、Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  ４５、２００４年、Ｓ１４５−１５０
【非特許文献２４】Ｇ．Ｌｅｖｉｎｅ他、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．６９、１９６７年、ｐｐ．７４９−７５７
【非特許文献２５】Ｕ．Ｓｅｎｅｖｉｒａｔｎｅ他、Ｐｏｓｔｇｒａｄ．Ｍｅｄ．Ｊ．７５、ｐｐ．５１６−５２０
【非特許文献２６】Ｒ．  Ｌｕｂｉｎ他、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．１、１９９５年、ｐｐ．７０１−７０２
【非特許文献２７】Ｍ．  Ｏｋａ他、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９２、２００１年、ｐｐ．３１６−３２０
【非特許文献２８】Ｊ．  Ｋｏｚｉｏｌ他、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９、２００３年、ｐｐ．５１２０−５１２６
【非特許文献２９】Ｊ．Ｑｕｉ他、Ｊ．  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．３、２００４年、ｐｐ．２６１−２６７
【非特許文献３０】Ｄ．  Ｍａｔｔｏｏｎ他、Ｅｘｐｅｒｔ．Ｒｅｖ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２、２００５年、ｐｐ．８７９−８８９
【非特許文献３１】Ｊ．Ｓｅｐ．Ｓｃｉ．３０、２００７年、ｐｐ．３５２−３５８
【非特許文献３２】Ｙ．  Ｃｈｅｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４、１９９７年、ｐｐ．１９１４−１９１８
【非特許文献３３】Ｏ．  Ｔｕｒｅｃｉ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．２３６、２００６年、ｐｐ．６４−７１
【非特許文献３４】Ｌ．  Ｚｈｏｎｇ他、Ｃｈｅｓｔ  １２５、２００４年、ｐｐ．１０５−１０６
【非特許文献３５】Ｌ．  Ｚｈｏｎｇ他、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１５、２００５年、ｐｐ．１３０８−１３１４
【非特許文献３６】Ｐ．  Ｂ．  Ｂａｃｈ他、Ｊ．  Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９５、２００３年、ｐｐ．４７０−４７８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
従って、実施が迅速、便利で、費用対効果に優れている、肺癌を検出するのに有用な方法およびマーカーが本分野でなお必要とされている。ある患者が肺癌を発症するリスクがあるか、又は肺癌を有しているかどうかを決定するために使用することができる特異的方法およびマーカーのある組み合わせを提供することも有利である。このような方法には、肺癌の指標となる１つ又はそれ以上のマーカーに対して試料を検査し、このようなマーカーを検出するための方法が含まれる。このような方法には、マーカーに関して生物学的試料の質量スペクトルを分析し、又は試料をアッセイした後、肺癌を発症するリスクとして、又は肺癌の指標としてマーカーを検出するための改善された方法が含まれ得る。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
（発明の要旨）
本発明は、肺癌を有することが疑われる対象中の肺癌の検出を補助するための迅速で感度が高い方法は、バイオマーカーのある種の組み合わせおよびバイオマーカー並びにバイオメトリックパラメータのある種の組み合わせに基づき得るという発見に部分的に基づくものである。
【００２４】
一態様において、前記方法は、以下の工程を含むことができる。
【００２５】
ａ．対象から得られた検査試料中において、パネル中の１つ又はそれ以上のバイオマーカーの量を定量すること；
ｂ．前記パネル中の各バイオマーカーの量を前記バイオマーカーに対する所定のカットオフと比較し、該比較に基づいて、各バイオマーカーに対してスコアを割り当てること；
ｃ．前記対象に対する合計スコアを得るために、工程ｂにおいて決定された各バイオマーカーに対して割り当てられたスコアを合計すること；
ｄ．工程ｃにおいて決定された合計スコアを所定の合計スコアと比較すること；および
ｅ．工程ｄにおける合計スコアの比較に基づいて、前記対象が肺癌のリスクを有するかどうかを決定すること。
【００２６】
上記方法において、肺癌に関するバイオマーカーのＤＦＩは、好ましくは、約０．４未満である。
【００２７】
必要に応じて、上記方法は、少なくとも１つのバイオメトリックパラメータに対する値を対象から取得する工程をさらに含み得る。取得され得るバイオメトリックパラメータの例は、対象の喫煙歴である。上記方法が対象から得られた少なくとも１つのバイオメトリックパラメータに対して値を取得する工程をさらに含む場合には、前記方法は、各前記バイオメトリックパラメータに対する所定のカットオフに対して少なくとも１つのバイオメトリックパラメータの値を比較する工程と、および該比較に基づいて、各バイオメトリックパラメータに対してスコアを割り当てる工程と、工程ｃにおいて前記対象に対する合計スコアを得るために、各バイオメトリックパラメータに対する割り当てられたスコアを、工程ｂにおいて定量された各バイオマーカーに対する割り当てられたスコアと組み合わせる工程と、工程ｄにおいて前記合計スコアを所定の合計スコアと比較する工程と、および工程ｅにおいて、合計スコアに基づいて、前記対象が肺癌のリスクを有するかどうかを決定する工程をさらに含むことができる。
【００２８】
上記方法において定量され得るバイオマーカーの例は、抗体、抗原、関心領域又はこれらのあらゆる組み合わせの群から選択される１つ又はそれ以上のバイオマーカーである。より具体的には、定量され得るバイオマーカーには、抗ｐ５３、抗ＴＭＰ２１、抗ＮＹＥＳＯ−１、抗ＨＤＪ１、抗ニーマンピックＣ１様タンパク質１、Ｃ末端ペプチドドメイン（抗ＮＰＣ１Ｌ１Ｃドメイン）、抗ＴＭＯＤ１、抗ＣＡＭＫ１、抗ＲＧＳ１、抗ＰＡＣＳＩＮ１、抗ＲＣＶ１、抗ＭＡＰＫＡＰＫ３、抗サイクリンＥ２（すなわち、免疫反応性サイクリンＥ２に対する少なくとも１つの抗体）、サイトケラチン８、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＳＣＣ、ＣＡ１９−９、プロＧＲＰ、血清アミロイドＡ、α−１−アンチトリプシン、アポリポタンパク質ＣＩＩＩおよびＴβ４、Ａｃｎ６３９９、Ａｃｎ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｐｕｂ６４５３、Ｐｕｂ２９５１、Ｐｕｂ２４３３、Ｐｕｂ１７３３８、ＴＦＡ６４５３およびＨＩＣ３９５９の１つ又はそれ以上が含まれるが、これらに限定されない。
【００２９】
必要に応じて、上記方法において使用されるパネルは、２つ若しくはそれ以上のバイオマーカー、３つ若しくはそれ以上のバイオマーカー、４つ若しくはそれ以上のバイオマーカー、５つ若しくはそれ以上のバイオマーカー、６つ若しくはそれ以上のバイオマーカー、７つ若しくはそれ以上のバイオマーカー、８つ若しくはそれ以上のバイオマーカー、９つ若しくはそれ以上のバイオマーカー、１０若しくはそれ以上のバイオマーカー、１１若しくはそれ以上のバイオマーカー、１２若しくはそれ以上のバイオマーカー、１３若しくはそれ以上のバイオマーカー、１４若しくはそれ以上のバイオマーカー、１５若しくはそれ以上のバイオマーカー、１６若しくはそれ以上のバイオマーカー、１７若しくはそれ以上のバイオマーカー、１８若しくはそれ以上のバイオマーカー、１９若しくはそれ以上のバイオマーカー又は２０のバイオマーカー又はそれ以上などの量を定量することを含み得る。
【００３０】
別の態様において、前記方法は、以下の工程を含むことができる。
【００３１】
ａ．対象の少なくとも１つのバイオメトリックパラメータに対して値を取得すること；
ｂ．各前記バイオメトリックパラメータに対する所定のカットオフに対して、前記少なくとも１つのバイオメトリックパラメータの値を比較し、該比較に基づいて各バイオメトリックパラメータに対してスコアを割り当てること；
ｃ．対象から得られた検査試料中において、少なくとも１つの抗体と少なくとも１つの抗原を含むパネル中の２つ又はそれ以上のバイオマーカーの量を定量すること；
ｄ．前記パネル中で定量された各バイオマーカーの量を前記バイオマーカーに対する所定のカットオフと比較し、該比較に基づいて、各バイオマーカーに対してスコアを割り当てること；
ｅ．前記対象に対する合計スコアを得るために、工程ｄにおいて決定された各バイオマーカーに対して割り当てられたスコアを工程ｂにおいて決定された各バイオメトリックパラメータに対して割り当てられたスコアを合計すること；
ｆ．工程ｅにおいて決定された合計スコアを所定の合計スコアと比較すること；および
ｇ．工程ｆにおいて決定された合計スコアの比較に基づいて、前記対象が肺癌のリスクを有するかどうかを決定すること。
【００３２】
上記方法において、肺癌に関するバイオマーカーのＤＦＩは、好ましくは、約０．４未満である。
【００３３】
上記方法において、前記パネルは、抗ｐ５３、抗ＴＭＰ２１、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１、抗ＨＤＪ１、抗ＮＰＣ１Ｌ１Ｃドメイン、抗ＴＭＯＤ１、抗ＣＡＭＫ１、抗ＲＧＳ１、抗ＰＡＣＳＩＮ１、抗ＲＣＶ１、抗ＭＡＰＫＡＰＫ３および抗サイクリンＥ２からなる群から選択される少なくとも１つの抗体並びにサイトケラチン８、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＳＣＣ、ＣＡ１９−９、プロＧＲＰ、血清アミロイドＡ、α−１−アンチトリプシン、アポリポタンパク質ＣＩＩＩおよびＴβ４からなる群から選択される少なくとも１つの抗原を含み得る。
【００３４】
上記方法において、対象から得られたバイオメトリックパラメータは、対象の喫煙歴、年齢、発癌性物質への曝露および性別からなる群から選択される。好ましくは、バイオメトリックパラメータは、対象の喫煙のパック・年である。
【００３５】
必要に応じて、前記方法は、検査試料中の少なくとも１つの関心領域を定量することをさらに含み得る。検査試料中において、関心領域を定量すべき場合には、前記パネルは、Ａｃｎ６３９９、Ａｃｎ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｐｕｂ６４５３、Ｐｕｂ２９５１、Ｐｕｂ２４３３、Ｐｕｂ１７３３８、ＴＦＡ６４５３およびＨＩＣ３９５９からなる群から選択される少なくとも１つの関心領域をさらに含むことができる。
【００３６】
必要に応じて、上記方法は、対象が肺癌を発症するリスクを有するかどうかを決定するために、重み付けされたスコアリング法も使用することができる。上記方法がこのような重み付けされたスコアリング法を使用する場合には、前記方法において、工程ｂは、少なくとも１つのバイオメトリックパラメータの値を、前記バイオメトリックパラメータに対する多数の所定のカットオフと比較し、該比較に基づいて各バイオメトリックパラメータに対してスコアを割り当てることを含み、工程ｄは、パネル中の各バイオマーカーの量を前記バイオマーカーに対する多数の所定のカットオフと比較し、該比較に基づいて各バイオマーカーに対してスコアを割り当てることを含み、工程ｅは、前記対象に対する合計スコアを得るために、工程ｂにおける各バイオメトリックパラメータに対する割り当てられたスコアを工程ｄにおける各バイオマーカーに対する割り当てられたスコアと合計することを含み、工程ｆは工程ｅにおいて決定された合計スコアを所定の合計スコアと比較することを含み、および工程ｇは、工程ｆにおいて決定された合計スコアの比較に基づいて、前記対象が肺癌を有するかどうかを決定することを含む。
【００３７】
別の態様において、前記方法は、以下の工程を含むことができる。
【００３８】
ａ．対象から得られた検査試料中において、少なくとも１つの抗体と少なくとも１つの抗原を含むパネル中の２つ又はそれ以上のバイオマーカーの量を定量すること；
ｂ．前記パネル中の定量された各バイオマーカーの量を前記バイオマーカーに対する所定のカットオフと比較し、該比較に基づいて、各バイオマーカーに対してスコアを割り当てること；
ｃ．前記対象に対する合計スコアを得るために、工程ｂにおいて定量された各バイオマーカーに対して割り当てられたスコアを合計すること；
ｄ．工程ｃにおいて決定された合計スコアを所定の合計スコアと比較すること；および
ｅ．工程ｄにおいて決定された合計スコアの比較に基づいて、前記対象が肺癌のリスクを有するかどうかを決定すること。
【００３９】
上記方法において、肺癌に関するバイオマーカーのＤＦＩは、好ましくは、約０．４未満である。
【００４０】
上記方法において、前記パネルは、抗ｐ５３、抗ＴＭＰ２１、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１、抗ＨＤＪ１、抗ＮＰＣ１Ｌ１Ｃドメイン、抗ＴＭＯＤ１、抗ＣＡＭＫ１、抗ＲＧＳ１、抗ＰＡＣＳＩＮ１、抗ＲＣＶ１、抗ＭＡＰＫＡＰＫ３および抗サイクリンＥ２からなる群から選択される少なくとも１つの抗体を含み得る。前記パネルは、サイトケラチン８、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＳＣＣ、ＣＡ１９−９、プロＧＲＰ、血清アミロイドＡ、α−１−アンチトリプシン、アポリポタンパク質ＣＩＩＩおよびＴβ４からなる群から選択される少なくとも１つの抗原を含み得る。
【００４１】
必要に応じて、前記方法は、検査試料中の少なくとも１つの関心領域を定量することをさらに含み得る。関心領域を定量すべき場合には、前記パネルは、Ａｃｎ６３９９、Ａｃｎ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｐｕｂ６４５３、Ｐｕｂ２９５１、Ｐｕｂ２４３３、Ｐｕｂｌ７３３８、ＴＦＡ６４５３およびＨＩＣ３９５９からなる群から選択される少なくとも１つの関心領域をさらに含むことができる。
【００４２】
必要に応じて、上記方法は、対象が肺癌を発症するリスクを有するかどうかを決定するために、重み付けされたスコアリング法も使用することができる。上記方法がこのような重み付けされたスコアリング法を使用する場合には、前記方法において、工程ｂは、パネル中の各バイオマーカーの量を、前記バイオマーカーに対する多数の所定のカットオフと比較し、該比較に基づいて各バイオマーカーに対してスコアを割り当てることを含み、工程ｃは、前記対象に対する合計スコアを得るために、工程ｂにおいて定量された各バイオマーカーに対する割り当てられたスコアを合計することを含み、工程ｄは、工程ｃにおいて決定された合計スコアを所定の合計スコアと比較することを含み、工程ｅは、工程ｄにおいて決定された合計スコアの比較に基づいて、前記対象が肺癌を有するかどうかを決定することを含む。
【００４３】
別の態様において、前記方法は、以下の工程を含むことができる。
【００４４】
ａ．少なくとも１つの抗サイクリンＥ２を含むパネル中の少なくとも１つのバイオマーカーの量を、対象から得られた検査試料中において定量すること；
ｂ．前記パネル中で定量された各バイオマーカーの量を前記バイオマーカーに対する所定のカットオフと比較し、該比較に基づいて、各バイオマーカーに対してスコアを割り当てること；
ｃ．前記対象に対する合計スコアを得るために、工程ｂにおいて定量された各バイオマーカーに対して割り当てられたスコアを合計すること；
ｄ．工程ｃにおいて決定された合計スコアを所定の合計スコアと比較すること；および
ｅ．工程ｄにおいて決定された合計スコアの比較に基づいて、前記対象が肺癌のリスクを有するかどうかを決定すること。
【００４５】
上記方法において、肺癌に関するバイオマーカーのＤＦＩは、好ましくは、約０．４未満である。
【００４６】
必要に応じて、上記方法は、検査試料中の少なくとも１つの抗原を定量すること、検査試料中の少なくとも１つの抗体を定量すること、又は検査試料中の少なくとも１つの抗原と少なくとも１つの抗体の組み合わせを定量することをさらに含むことができる。従って、検査試料中の少なくとも１つの抗原、少なくとも１つの抗体又は少なくとも１つの抗原と少なくとも１つの抗体の組み合わせが定量されるべき場合には、前記パネルは、サイトケラチン８、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＳＣＣ、ＣＡ１９−９、プロＧＲＰ、血清アミロイドＡ、α−１−アンチトリプシン、アポリポタンパク質ＣＩＩＩおよびＴβ４からなる群から選択される少なくとも１つの抗原、抗ｐ５３、抗ＴＭＰ２１、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１、抗ＨＤＪ１、抗ＮＰＣ１Ｌ１Ｃドメイン、抗ＴＭＯＤ１、抗ＣＡＭＫ１、抗ＲＧＳ１、抗ＰＡＣＳＩＮ１、抗ＲＣＶ１、抗ＭＡＰＫＡＰＫ３又はこれらのあらゆる組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの抗体をさらに含むことができる。
【００４７】
必要に応じて、前記方法は、検査試料中の少なくとも１つの関心領域を定量することをさらに含み得る。関心領域を定量すべき場合には、前記パネルは、Ａｃｎ６３９９、Ａｃｎ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｐｕｂ６４５３、Ｐｕｂ２９５１、Ｐｕｂ２４３３、Ｐｕｂ１７３３８、ＴＦＡ６４５３およびＨＩＣ３９５９からなる群から選択される少なくとも１つの関心領域をさらに含むことができる。
【００４８】
必要に応じて、上記方法は、対象が肺癌を発症するリスクを有するかどうかを決定するために、重み付けされたスコアリング方法も使用することができる。上記方法がこのような重み付けされたスコアリング方法を使用する場合には、前記方法において、工程ｂは、パネル中の各バイオマーカーの量を、前記バイオマーカーに対する多数の所定のカットオフと比較し、該比較に基づいて各バイオマーカーに対してスコアを割り当てることを含み、工程ｃは、前記対象に対する合計スコアを得るために、工程ｂにおいて定量された各バイオマーカーに対する割り当てられたスコアを合計することを含み、工程ｄは、工程ｃにおいて決定された合計スコアを所定の合計スコアと比較することを含み、および工程ｅは、工程ｄにおいて決定された合計スコアの比較に基づいて、前記対象が肺癌を有するかどうかを決定することを含む。
【００４９】
必要に応じて、上記方法は、少なくとも１つのバイオメトリックパラメータに対する値を対象から取得する工程をさらに含み得る。対象から取得することが可能なバイオメトリックパラメータは、対象の喫煙歴、年齢、発癌性物質への曝露および性別からなる群から選択され得る。取得される好ましいバイオメトリックパラメータは、対象の喫煙のパック・年である。上記方法が対象から得られた少なくとも１つのバイオメトリックパラメータに対して値を取得する工程をさらに含む場合には、前記方法は、各前記バイオメトリックパラメータに対する所定のカットオフに対して少なくとも１つのバイオメトリックパラメータの値を比較する工程と、および該比較に基づいて、各バイオメトリックパラメータに対するスコアを割り当てる工程と、前記対象に対する合計スコアを得るために、各バイオメトリックパラメータに対する割り当てられたスコアを、工程ｂにおいて定量された各バイオマーカーに対する割り当てられたスコアと合計する工程と、工程ｃにおいて、前記合計スコアを所定の合計スコアと比較する工程と、および工程ｄにおける合計スコアの比較に基づいて、前記対象が肺癌のリスクを有するかどうかを決定する工程をさらに含むことができる。
【００５０】
別の態様において、前記方法は、以下の工程を含むことができる。
【００５１】
ａ．対象から得られた検査試料中において、サイトケラチン８、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＳＣＣ、ＣＡ１９−９、プロＧＲＰ、血清アミロイドＡ、α−１−アンチトリプシン、アポリポタンパク質ＣＩＩＩおよびＴβ４からなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーを含むパネル中の少なくとも１つのバイオマーカーを定量すること；
ｂ．前記パネル中の定量された各バイオマーカーの量を前記バイオマーカーに対する所定のカットオフと比較し、該比較に基づいて、各バイオマーカーに対してスコアを割り当てること；
ｃ．前記対象に対する合計スコアを得るために、工程ｂにおいて定量された各バイオマーカーに対して割り当てられたスコアを合計すること；
ｄ．工程ｃにおいて定量された合計スコアを所定の合計スコアと比較すること；および
ｅ．工程ｄにおける合計スコアの比較に基づいて、前記対象が肺癌を有するかどうかを決定すること。
【００５２】
上記方法において、肺癌に関するバイオマーカーのＤＦＩは、好ましくは、約０．４未満である。
【００５３】
必要に応じて、上記方法は、検査試料中の少なくとも１つの抗体を定量することをさらに含み得る。従って、前記パネルは、抗ｐ５３、抗ＴＭＰ２１、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１、抗ＨＤＪ１、抗ＮＰＣ１Ｌ１Ｃドメイン、抗ＴＭＯＤ１、抗ＣＡＭＫ１、抗ＲＧＳ１、抗ＰＡＣＳＩＮ１、抗ＲＣＶ１、抗ＭＡＰＫＡＰＫ３および抗サイクリンＥ２又はこれらのあらゆる組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの抗体をさらに含み得る。
【００５４】
必要に応じて、前記方法は、検査試料中の少なくとも１つの関心領域を定量することをさらに含み得る。関心領域を定量すべき場合には、前記パネルは、Ａｃｎ６３９９、Ａｃｎ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｐｕｂ６４５３、Ｐｕｂ２９５１、Ｐｕｂ２４３３、Ｐｕｂ１７３３８、ＴＦＡ６４５３およびＨＩＣ３９５９からなる群から選択される少なくとも１つの関心領域をさらに含むことができる。
【００５５】
必要に応じて、上記方法は、対象が肺癌を発症するリスクを有するかどうかを決定するために、重み付けされたスコアリング法も使用することができる。上記方法がこのような重み付けされたスコアリング法を使用する場合には、前記方法において、工程ｂは、パネル中の各バイオマーカーの量を、前記バイオマーカーに対する多数の所定のカットオフと比較し、該比較に基づいて各バイオマーカーに対してスコアを割り当てることを含み、工程ｃは、前記対象に対する合計スコアを得るために、工程ｂにおいて定量された各バイオマーカーに対する割り当てられたスコアを合計することを含み、工程ｄは、工程ｃにおいて決定された合計スコアを所定の合計スコアと比較することを含み、工程ｅは、工程ｄにおいて決定された合計スコアの比較に基づいて、前記対象が肺癌を有するかどうかを決定することを含む。
【００５６】
必要に応じて、上記方法は、少なくとも１つのバイオメトリックパラメータに対する値を対象から取得する工程をさらに含み得る。対象から取得することが可能なバイオメトリックパラメータは、対象の喫煙歴、年齢、発癌性物質への曝露および性別からなる群から選択され得る。取得される好ましいバイオメトリックパラメータは、対象の喫煙のパック・年である。上記方法が対象から得られた少なくとも１つのバイオメトリックパラメータに対して値を取得する工程をさらに含む場合には、前記方法は、各前記バイオメトリックパラメータに対する所定のカットオフに対して少なくとも１つのバイオメトリックパラメータの値を比較する工程と、および該比較に基づいて、各バイオメトリックパラメータに対するスコアを割り当てる工程と、前記対象に対する合計スコアを得るために、各バイオメトリックパラメータに対する割り当てられたスコアを、工程ｂにおいて定量された各バイオマーカーに対する割り当てられたスコアと合計する工程と、工程ｃにおいて、前記合計スコアを所定の合計スコアと比較する工程と、および工程ｄにおける合計スコアの比較に基づいて、前記対象が肺癌のリスクを有するかどうかを決定する工程をさらに含むことができる。
【００５７】
別の態様において、前記方法は、以下の工程を含むことができる。
【００５８】
ａ．対象から得られた検査試料中において、Ａｃｎ６３９９、Ａｃｎ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｐｕｂ６４５３、Ｐｕｂ２９５１、Ｐｕｂ２４３３、Ｐｕｂ１７３３８、ＴＦＡ６４５３およびＨＩＣ３９５９からなる群から選択される関心領域である少なくとも１つのバイオマーカーを含むパネル中の少なくとも１つのバイオマーカーを定量すること；
ｂ．前記パネル中の定量された各バイオマーカーの量を前記バイオマーカーに対する所定のカットオフと比較し、該比較に基づいて、各バイオマーカーに対してスコアを割り当てること；
ｃ．前記対象に対する合計スコアを得るために、工程ｂにおいて定量された各バイオマーカーに対して割り当てられたスコアを合計すること；
ｄ．工程ｃにおいて定量された合計スコアを所定の合計スコアと比較すること；および
ｅ．工程ｄにおいて決定された合計スコアの比較に基づいて、前記対象が肺癌を有するかどうかを決定すること。
【００５９】
上記方法において、肺癌に関するバイオマーカーのＤＦＩは、好ましくは、約０．４未満である。
【００６０】
必要に応じて、上記方法は、検査試料中の少なくとも１つの抗原を定量すること、検査試料中の少なくとも１つの抗体を定量すること、又は検査試料中の少なくとも１つの抗原と少なくとも１つの抗体の組み合わせを定量することをさらに含むことができる。従って、検査試料中において、少なくとも１つの抗原、少なくとも１つの抗体又は少なくとも１つの抗原と抗体の組み合わせが定量されるべき場合には、前記パネルは、サイトケラチン８、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＳＣＣ、ＣＡ１９−９、プロＧＲＰ、血清アミロイドＡ、α−１−アンチトリプシン、アポリポタンパク質ＣＩＩＩおよびＴβ４からなる群から選択される少なくとも１つの抗原、抗ｐ５３、抗ＴＭＰ２１、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１、抗ＨＤＪ１、抗ＮＰＣ１Ｌ１Ｃドメイン、抗ＴＭＯＤ１、抗ＣＡＭＫ１、抗ＲＧＳ１、抗ＰＡＣＳＩＮ１、抗ＲＣＶ１、抗ＭＡＰＫＡＰＫ３および抗サイクリンＥ２又はこれらのあらゆる組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの抗体をさらに含むことができる。
【００６１】
必要に応じて、上記方法は、対象が肺癌を発症するリスクを有するかどうかを決定するために、重み付けされたスコアリング法も使用することができる。上記方法がこのような重み付けされたスコアリング法を使用する場合には、前記方法において、工程ｂは、パネル中の各バイオマーカーの量を、前記バイオマーカーに対する多数の所定のカットオフと比較し、該比較に基づいて各バイオマーカーに対してスコアを割り当てることを含み、工程ｃは、前記対象に対する合計スコアを得るために、工程ｂにおいて定量された各バイオマーカーに対する割り当てられたスコアを合計することを含み、工程ｄは、工程ｃにおいて決定された合計スコアを所定の合計スコアと比較することを含み、工程ｅは、工程ｄにおいて決定された合計スコアの比較に基づいて、前記対象が肺癌を有するかどうかを決定することを含む。
【００６２】
必要に応じて、上記方法は、少なくとも１つのバイオメトリックパラメータに対する値を対象から取得する工程をさらに含み得る。対象から取得することが可能なバイオメトリックパラメータは、対象の喫煙歴、年齢、発癌性物質への曝露および性別からなる群から選択され得る。取得される好ましいバイオメトリックパラメータは、対象の喫煙のパック・年である。上記方法が対象から得られた少なくとも１つのバイオメトリックパラメータに対して値を取得する工程をさらに含む場合には、前記方法は、各前記バイオメトリックパラメータに対する所定のカットオフに対して少なくとも１つのバイオメトリックパラメータの値を比較する工程と、および該比較に基づいて、各バイオメトリックパラメータに対するスコアを割り当てる工程と、前記対象に対する合計スコアを得るために、各バイオメトリックパラメータに対する割り当てられたスコアを、工程ｂにおいて定量された各バイオマーカーに対する割り当てられたスコアと合計する工程と、工程ｃにおいて、前記合計スコアを所定の合計スコアと比較する工程と、および工程ｄにおける合計スコアの比較に基づいて、前記対象が肺癌のリスクを有するかどうかを決定する工程をさらに含むことができる。
【００６３】
別の態様において、前記方法は、以下の工程を含むことができる。
【００６４】
ａ．対象から得られた検査試料中において、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＣＡ１５−３、ＣＡ１２５、ＳＣＣ、プロＧＲＰ、ＡＣＮ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｔｆａ６４５３およびＨｉｃ３９５９の２つ又はそれ以上を含むパネル中の２つ又はそれ以上のバイオマーカーの量を定量すること；
ｂ．前記パネル中の各バイオマーカーの量を前記バイオマーカーに対する所定のカットオフと比較し、該比較に基づいて、各バイオマーカーに対してスコアを割り当てること；
ｃ．前記対象に対する合計スコアを得るために、工程ｂにおいて決定された各バイオマーカーに対して割り当てられたスコアを合計すること；
ｄ．工程ｃにおいて決定された合計スコアを所定の合計スコアと比較すること；および
ｅ．工程ｄにおいて決定された合計スコアの比較に基づいて、前記対象が肺癌のリスクを有するかどうかを決定すること。
【００６５】
上記方法において、肺癌に関するバイオマーカーのＤＦＩは、好ましくは、約０．４未満である。
【００６６】
必要に応じて、上記方法中のパネルは、（１）サイトケラチン１９、ＣＥＡ、ＡＣＮ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９およびＴＦＡ２７５９；（２）サイトケラチン１９、ＣＥＡ、ＡＣＮ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９およびＴＦＡ９１３３；（３）サイトケラチン１９、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＣＡ１５−３、ＣＡ１２５、ＳＣＣ、サイトケラチン１８およびプロＧＲＰ；（４）Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｔｆａ６４５３およびＨｉｃ３９５９又は（５）サイトケラチン１９、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＳＣＣ、サイトケラチン１８、プロＧＲＰ、ＡＣＮ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３を含むことができる。
【００６７】
必要に応じて、上記方法は、対象が肺癌を発症するリスクを有するかどうかを決定するために、重み付けされたスコアリング法も使用することができる。上記方法がこのような重み付けされたスコアリング法を使用する場合には、前記方法において、工程ｂは、パネル中の各バイオマーカーの量を、前記バイオマーカーに対する多数の所定のカットオフと比較し、該比較に基づいて各バイオマーカーに対してスコアを割り当てることを含み、工程ｃは、前記対象に対する合計スコアを得るために、工程ｂにおいて定量された各バイオマーカーに対する割り当てられたスコアを合計することを含み、工程ｄは、工程ｃにおいて決定された合計スコアを所定の合計スコアと比較することを含み、工程ｅは、工程ｄにおいて決定された合計スコアの比較に基づいて、前記対象が肺癌を有するかどうかを決定することを含む。
【００６８】
別の態様において、前記方法は、以下の工程を含むことができる。
【００６９】
ａ．対象から得られた検査試料中において、抗ｐ５３、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１、抗ＭＡＰＫＡＰＫ３、抗サイクリンＥ２、サイトケラチン１９、ＣＥＡ、ＣＡ１２５およびプロＧＲＰを含むパネル中の２つ又はそれ以上のバイオマーカーの量を定量すること；
ｂ．前記パネル中で定量された各バイオマーカーの量を前記バイオマーカーに対する所定のカットオフと比較し、該比較に基づいて、各バイオマーカーに対してスコアを割り当てること；
ｃ．前記対象に対する合計スコアを得るために、工程ｂにおいて定量された各バイオマーカーに対して割り当てられたスコアを合計すること；
ｄ．工程ｃにおいて決定された合計スコアを所定の合計スコアと比較すること；および
ｅ．工程ｄにおいて決定された合計スコアの比較に基づいて、前記対象が肺癌のリスクを有するかどうかを決定すること。
【００７０】
必要に応じて、パネルは、３つ若しくはそれ以上のバイオマーカー、４つ若しくはそれ以上のバイオマーカー、５つ若しくはそれ以上のバイオマーカー、６つ若しくはそれ以上のバイオマーカー、７つ若しくはそれ以上のバイオマーカー又は８つのバイオマーカーの量を定量することを含み得る。
【００７１】
必要に応じて、上記方法において、抗サイクリンＥ２は、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に対する抗体であり得る。
【００７２】
必要に応じて、上記方法は、少なくとも１つのバイオメトリックパラメータに対する値を対象から取得する工程をさらに含み得る。対象から取得することが可能なバイオメトリックパラメータは、対象の喫煙歴、年齢、発癌性物質への曝露および性別からなる群から選択され得る。取得される好ましいバイオメトリックパラメータは、対象の喫煙のパック・年である。上記方法が対象から得られた少なくとも１つのバイオメトリックパラメータに対して値を取得する工程をさらに含む場合には、前記方法は、各前記バイオメトリックパラメータに対する所定のカットオフに対して少なくとも１つのバイオメトリックパラメータの値を比較する工程と、および該比較に基づいて、各バイオメトリックパラメータに対するスコアを割り当てる工程と、前記対象に対する合計スコアを得るために、各バイオメトリックパラメータに対する割り当てられたスコアを、工程ｂにおいて定量された各バイオマーカーに対する割り当てられたスコアと合計する工程と、工程ｄにおいて、前記合計スコアを所定の合計スコアと比較する工程と、工程ｅにおける合計スコアの比較に基づいて、前記対象が肺癌のリスクを有するかどうかを決定する工程をさらに含むことができる。
【００７３】
必要に応じて、上記方法は、対象が肺癌を発症するリスクを有するかどうかを決定するために、重み付けされたスコアリング法も使用することができる。上記方法がこのような重み付けされたスコアリング法を使用する場合には、前記方法において、工程ｂは、パネル中の各バイオマーカーの量を、前記バイオマーカーに対する多数の所定のカットオフと比較し、該比較に基づいて各バイオマーカーに対してスコアを割り当てることを含み、工程ｃは、前記対象に対する合計スコアを得るために、工程ｂにおいて定量された各バイオマーカーに対する割り当てられたスコアを合計することを含み、工程ｄは、工程ｃにおいて決定された合計スコアを所定の合計スコアと比較することを含み、工程ｅは、工程ｄにおいて決定された合計スコアの比較に基づいて、前記対象が肺癌のリスクを有するかどうかを決定することを含む。
【００７４】
本発明は、上記方法において使用することができる様々な異なるキットにも関する。一態様において、キットは、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５又はこれらのあらゆる組み合わせからなる群から選択されるペプチドを含むことができる。別の態様において、キットは、免疫反応性サイクリンＥ２に対して反応性を有する少なくとも１つの抗原又はこれらのあらゆる組み合わせを含むことができる。別の態様において、キットは、免疫反応性サイクリンＥ２に対して反応性を有する少なくとも１つの抗原又はこれらのあらゆる組み合わせを含むことができる。さらなる態様において、キットは、（ａ）検査試料中の１つ又はそれ以上の抗原を定量するための少なくとも１つの抗体を含有する試薬（前記抗原は、サイトケラチン８、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＳＣＣ、ＣＡ１９−９、プロＧＲＰ、血清アミロイドＡ、α−１−アンチトリプシン、アポリポタンパク質ＣＩＩＩおよびＴβ４である。）、（ｂ）検査試料中の少なくとも１つの抗体を定量するための１つ又はそれ以上の抗原を含有する試薬（前記抗体は、抗ｐ５３、抗ＴＭＰ２１、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１、抗ＨＤＪ１、抗ＮＰＣ１Ｌ１Ｃドメイン、抗ＴＭＯＤ１、抗ＣＡＭＫ１、抗ＲＧＳ１、抗ＰＡＣＳＩＮ１、抗ＲＣＶ１、抗ＭＡＰＫＡＰＫ３および抗サイクリンＥ２である。）；並びに（ｃ）検査試料中の各抗原および抗体の量を合計し、所定のカットオフに対して比較し、並びに該比較に基づいて、各抗原および抗体に対するスコアを割り当て、合計スコアを得るために、各抗原および抗体に対する割り当てられたスコアを合計し、合計スコアを所定の合計スコアと比較し、および対象が肺癌を有するかどうかを決定する上での補助として前記比較を使用するための１つ又はそれ以上のアルゴリズムを含み得る。さらなる態様において、キットは、（ａ）検査試料中の１つ又はそれ以上の抗原を定量するための少なくとも１つの抗体を含有する試薬（前記抗原は、サイトケラチン８、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＳＣＣ、ＣＡ１９−９、プロＧＲＰ、血清アミロイドＡ、α−１−アンチトリプシン、アポリポタンパク質ＣＩＩＩおよびＴβ４である。）、（ｂ）検査試料中の少なくとも１つの抗体を定量するための１つ又はそれ以上の抗原を含有する試薬（前記抗体は、抗ｐ５３、抗ＴＭＰ２１、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１、抗ＨＤＪ１、抗ＮＰＣ１Ｌ１Ｃドメイン、抗ＴＭＯＤ１、抗ＣＡＭＫ１、抗ＲＧＳ１、抗ＰＡＣＳＩＮ１、抗ＲＣＶ１、抗ＭＡＰＫＡＰＫ３および抗サイクリンＥ２である。）、（ｃ）ＡＣＮ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｔｆａ６４５３およびＨｉｃ３９５９からなる群から選択される１つ又はそれ以上の関心領域を定量するための試薬；並びに（ｄ）検査試料中の定量された各抗原、抗体および関心領域の量を合計し、所定のカットオフに対して比較し、並びに該比較に基づいて定量された各抗原、抗体および関心領域に対するスコアを割り当て、合計スコアを得るために、定量さ���た各抗原、抗体および関心領域に対する割り当てられたスコアを合計し、合計スコアを所定の合計スコアと比較し、および対象が肺癌を有するかどうかを決定する上での補助として前記比較を使用するための１つ又はそれ以上のアルゴリズムを含み得る。さらに別の態様において、キットは、（ａ）検査試料中の１つ又はそれ以上の抗原を定量するための少なくとも１つの抗体を含有する試薬（前記抗原は、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＣＡ−１５−３、ＣＡ１２５、ＳＣＣおよびプロＧＲＰである。）、（ｂ）ＡＣＮ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｔｆａ６４５３およびＨｉｃ３９５９からなる群から選択される１つ又はそれ以上の関心領域を定量するための試薬；並びに（ｃ）検査試料中の定量された各抗原および関心領域の量を合計し、所定のカットオフに対して比較し、該比較に基づいて、定量された各抗原およびバイオマーカーに対するスコアを割り当て、合計スコアを得るために、定量された各抗原および関心領域に対する割り当てられたスコアを合計し、合計スコアを所定の合計スコアと比較し、および対象が肺癌を有するかどうかを決定する上での補助として前記比較を使用するための１つ又はそれ以上のアルゴリズムを含み得る。定量可能な抗原および関心領域の例は、（ａ）サイトケラチン１９およびＣＥＡおよびＡｃｎ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９およびＴｆａ２７５９；（ｂ）サイトケラチン１９およびＣＥＡおよびＡｃｎ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、Ｔｆａ２７５９およびＴｆａ９１３３；並びに（ｃ）サイトケラチン１９、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＳＣＣ、サイトケラチン１８およびプロＧＲＰおよびＡＣＮ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９およびＴｆａ２７５９である。別の態様において、キットは、（ａ）検査試料中の１つ又はそれ以上の抗原を定量するための少なくとも１つの抗体を含有する試薬（前記抗原は、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＣＡ１５−３、ＣＡ１２５、ＳＣＣおよびプロＧＲＰである。）、並びに（ｂ）検査試料中の定量された各抗原の量を合計し、所定のカットオフに対して比較し、並びに該比較に基づいて、定量された各抗原に対するスコアを割り当て、合計スコアを得るために、定量された各抗原に対する割り当てられたスコアを合計し、合計スコアを所定の合計スコアと比較し、および対象が肺癌を有するかどうかを決定する上での補助として前記比較を使用するための１つ又はそれ以上のアルゴリズムを含み得る。キットを用いて定量することが可能な抗原の例は、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＣＡ１５−３、ＣＡ１２５、ＳＣＣおよびプロＧＲＰである。別の態様において、キットは、（ａ）１つ又はそれ以上のバイオマーカーを定量するための試薬（前記バイオマーカーは、ＡＣＮ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９���、Ｔｆａ６４５３およびＨｉｃ３９５９からなる群から選択される関心領域である。）、並びに（ｂ）検査試料中の定量された各バイオマーカーの量を合計し、所定のカットオフに対して比較し、並びに該比較に基づいて、定量された各バイオマーカーに対するスコアを割り当て、合計スコアを得るために、定量された各バイオマーカーに対する割り当てられたスコアを合計し、合計スコアを所定の合計スコアと比較し、および対象が肺癌を有するかどうかを決定する上での補助として前記比較を使用するための１つ又はそれ以上のアルゴリズムを含み得る。キットを用いて定量可能な関心領域の例は、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｔｆａ６４５３およびＨｉｃ３９５９からなる群から選択され得る。さらに別の態様において、キットは、（ａ）検査試料中の１つ又はそれ以上の抗原を定量するための少なくとも１つの抗体を含有する試薬（前記抗原は、サイトケラチン１９、ＣＥＡ、ＣＡ１２５およびプロＧＲＰである。）、（ｂ）検査試料中の少なくとも１つの抗体を定量するための１つ又はそれ以上の抗原を含有する試薬（前記抗体は、抗ｐ５３、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１、抗ＭＡＰＫＡＰＫ３および抗サイクリンＥ２である。）並びに（ｃ）検査試料中の定量された各抗原および抗体の量を合計し、所定のカットオフに対して比較し、並びに該比較に基づいて、定量された各抗原および抗体に対するスコアを割り当て、合計スコアを得るために、定量された各抗原および抗体に対する割り当てられたスコアを合計し、合計スコアを所定の合計スコアと比較し、および対象が肺癌を有するかどうかを決定する上での補助として前記比較を使用するための１つ又はそれ以上のアルゴリズムを含み得る。必要に応じて、キットは、検査試料中のサイトケラチン１９、ＣＥＡ、ＣＡ１２５およびプロＧＲＰの各々を定量するための試薬、検査試料中の抗ｐ５３、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１、抗ＭＡＰＫＡＰＫ３および抗サイクリンＥ２の各々を定量するための試薬又は検査試料中のサイトケラチン１９、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、プロＧＲＰ、抗ｐ５３、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１、抗ＭＡＰＫＡＰＫ３および抗サイクリンＥ２の各々を定量するための試薬を含み得る。
【００７５】
本発明は、単離された又は精製されたポリペプチドにも関する。本発明によって想定される単離された又は精製されたポリペプチドは、以下のものである。（ａ）配列番号３および配列番号３のアミノ酸配列と６０％の相同性を有するポリペプチドからなる群から選択されたアミノ酸配列を有する（含む）単離された又は精製されたポリペプチド；（ｂ）配列番号３および配列番号３のアミノ酸配列と６０％の相同性を有するポリペプチドからなる群から選択されたアミノ酸配列から実質的になる単離された又は精製されたポリペプチド；（ｃ）配列番号３のアミノ酸からなる単離された又は精製されたポリペプチド；（ｄ）配列番号４および配列番号４のアミノ酸配列と６０％の相同性を有するポリペプチドからなる群から選択されたアミノ酸配列を有する単離された又は精製されたポリペプチド；（ｅ）配列番号４および配列番号４のアミノ酸配列と６０％の相同性を有するポリペプチドからなる群から選択されたアミノ酸配列から実質的になる単離された又は精製されたポリペプチド；（ｆ）配列番号４のアミノ酸配列からなる単離された又は精製されたポリペプチド；（ｇ）配列番号５および配列番号５のアミノ酸配列と６０％の相同性を有するポリペプチドからなる群から選択されたアミノ酸配列を有する単離された又は精製されたポリペプチド；（ｈ）配列番号５および配列番号５のアミノ酸配列と６０％の相同性を有するポリペプチドからなる群から選択されたアミノ酸配列から実質的になる単離された又は精製されたポリペプチド；並びに（ｉ）配列番号５のアミノ酸配列からなる単離された又は精製されたポリペプチド。
【００７６】
本発明は、特有な重み付けされたスコアリング法にも関する。この方法は、対象から得られた１つ又はそれ以上のマーカーをスコアリングするために使用することができる。この方法は、以下の工程を含むことができる。
【００７７】
ａ．対象の検査試料から得られたマーカーの量を定量すること；
ｂ．定量された各マーカーの量を前記マーカーに対する多数の所定のカットオフと比較し、該比較に基づいて、各マーカーに対してスコアを割り当てること；および
ｃ．前記対象に対する合計スコアを得るために、工程ｂにおいて定量された各マーカーに対して割り当てられたスコアを合計すること。
【００７８】
上記方法において、所定のカットオフはＲＯＣ曲線に基づき、各マーカーに対するスコアは、マーカーの特異性に基づいて計算される。さらに、上記方法中のマーカーは、バイオマーカー、バイオメトリックパラメータ又はバイオマーカーとバイオメトリックパラメータの組み合わせであり得る。
【００７９】
さらに、本発明は、重み付けられたスコアリング法を用いて、医学的症状を発症する対象のリスクを測定する方法を提供する。この方法は、以下の工程を含むことができる。
【００８０】
ａ．対象から得られた検査試料中において、少なくとも１つのマーカーの量を定量すること；
ｂ．定量された各マーカーの量を前記マーカーに対する多数の所定のカットオフと比較し、該比較に基づいて、各マーカーに対してスコアを割り当てること；
ｃ．前記対象に対する合計スコアを得るために、工程ｂにおいて定量された各マーカーに対して割り当てられたスコアを合計すること；
ｄ．工程ｃにおいて決定された合計スコアを所定の合計スコアと比較すること；および
ｅ．工程ｄにおいて決定された合計スコアの比較に基づいて、前記対象が医学的症状を発症するリスクを有するかどうかを決定すること。
【００８１】
上記方法において、所定のカットオフはＲＯＣ曲線に基づき、各マーカーに対するスコアは、マーカーの特異性に基づいて計算される。さらに、上記方法中のマーカーは、バイオマーカー、バイオメトリックパラメータ又はバイオマーカーとバイオメトリックパラメータの組み合わせであり得る。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】図１は、バイオインフォマティクス作業の流れの模式図である。具体的には、ＭＳデータおよびＩＡデータを様々な統計的方法に供した。各マーカーに対して受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を作成し、曲線下面積（ＡＵＣ）を得るために、ロジスティック回帰を使用した。最高のＡＵＣを有する最高のマーカーを候補マーカーとして選択した。判別分析（ＤＡ）、主成分分析（ＰＣＡ）および決定木（ＤＴ）などの多変量解析（ＭＶＡ）によって、モデルに入力するためのさらなるマーカーが同定された。バイオメトリックパラメータを含めることもできる。分離およびスコア法／アルゴリズム（ＳＳＭ）によって、訓練セットの少なくとも５０％に出現する頑強なマーカーが同定され、バイオマーカーの候補として選択される。最終予測モデルに対してマーカーの適切な数が得られるまで、この工程をｎ回繰り返す。
【図２】図２は、ａ）プールされたＨＰＬＣ画分を濃縮した後、およびｂ）濃縮過程の前における、Ｐｕｂ１１５９７バイオマーカー候補を示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳプロファイルである。試料は、ＨＰＬＣ分画後でさえ、なお複雑な混合物である。
【図３】図３は、ゲル中に搭載された様々な試料の成分を示す染色されたゲルである。レーンａ、ｆおよびｇは、較正用の分子量既知の標準タンパク質の混合物を示している。さらに、レーンｂおよびｅは、市販されているヒト血清アミロイドＡ（ＨＳＡＡ）として知られる候補タンパク質の高度に精製された形態を示す。レーンｃおよびｄは、バイオマーカー候補を含有する分画された試料を示している。ＨＳＳＡ標準と同じ距離を移動する混合物中の成分が存在する。ＨＳＡＡと同じ移動距離を有するバンドをゲルから切り出し、その正体を確認するために、ゲル内消化およびＭＳ／ＭＳ分析に供した。
【図４ａ】図４ａは、Ｐｕｂ１１５９７のトリプシン消化物のＬＣ／ＭＳ／ＭＳである。パネルａからｄは、４つの主要な前駆体イオンのＭＳ／ＭＳを示している。ｂおよびｙ生成物イオンには注釈が付されており、４つの前駆体イオンの各々に対して、誘導されたアミノ酸配列が与えられている。生成されたｂおよびｙイオンの分子量を用いたデータベース検索によって、源タンパク質はＨＳＡＡと同定された。観察された断片（ＭＷ＝１１５２６．５１）の完全な配列は、配列番号６に与えられている。
【図４ｂ】図４ｂは、Ｐｕｂ１１５９７のトリプシン消化物のＬＣ／ＭＳ／ＭＳである。パネルａからｄは、４つの主要な前駆体イオンのＭＳ／ＭＳを示している。ｂおよびｙ生成物イオンには注釈が付されており、４つの前駆体イオンの各々に対して、誘導されたアミノ酸配列が与えられている。生成されたｂおよびｙイオンの分子量を用いたデータベース検索によって、源タンパク質はＨＳＡＡと同定された。観察された断片（ＭＷ＝１１５２６．５１）の完全な配列は、配列番号６に与えられている。
【図４ｃ】図４ｃは、Ｐｕｂ１１５９７のトリプシン消化物のＬＣ／ＭＳ／ＭＳである。パネルａからｄは、４つの主要な前駆体イオンのＭＳ／ＭＳを示している。ｂおよびｙ生成物イオンには注釈が付されており、４つの前駆体イオンの各々に対して、誘導されたアミノ酸配列が与えられている。生成されたｂおよびｙイオンの分子量を用いたデータベース検索によって、源タンパク質はＨＳＡＡと同定された。観察された断片（ＭＷ＝１１５２６．５１）の完全な配列は、配列番号６に与えられている。
【図４ｄ】図４ｄは、Ｐｕｂ１１５９７のトリプシン消化物のＬＣ／ＭＳ／ＭＳである。パネルａからｄは、４つの主要な前駆体イオンのＭＳ／ＭＳを示している。ｂおよびｙ生成物イオンには注釈が付されており、４つの前駆体イオンの各々に対して、誘導されたアミノ酸配列が与えられている。生成されたｂおよびｙイオンの分子量を用いたデータベース検索によって、源タンパク質はＨＳＡＡと同定された。観察された断片（ＭＷ＝１１５２６．５１）の完全な配列は、配列番号６に与えられている。
【図５】図５は、実施例１に記載されている７５１人の患者の試料に対して行われた８イムノアッセイバイオマーカーパネルから作成されたＲＯＣ曲線を与える。影が付された菱形は、重み付けされたスコアリング法を用いて、合計スコアから作成されたＲＯＣ曲線を表す。四角は、大きなコホート分離点（カットオフ）を使用する二分スコアリング法を用いて、合計スコアから作成されたＲＯＣ曲線を表す。影が付された三角は、小さなコホート分離点（カットオフ）を使用する二分スコアリング法を用いて、合計スコアから作成されたＲＯＣ曲線を表す。
【図６】図６は、肺癌、良性および正常対象に対して検査された７つの自己抗体パネルに対するＡＵＣ並びに中央値の倍数（ＭｏＭ）法および分離およびスコアリング法（ＳＳＭ）を用いて求められた全ての測定に対する値を与える。図６において、−白抜き菱形−は、最大精度を与える分離点に基づくＳＳＭスコアであり、−黒塗り四角−は、９８％特異性を与える分離点に基づくＳＳＭスコアであり、および−黒丸−は、ＭｏＭスコアである。
【図７】図７は、高い喫煙歴（２０パック・年超）を有する対象、低い喫煙歴又は無喫煙歴（２０パック・年未満）を有する対象および喫煙歴が不明の対象に対して検査された４イムノアッセイおよび４自己抗原パネルに対するＡＵＣを与える。図７において、−は、２０パック年未満の喫煙であり、−白抜き四角−は２０パック・年超であり、および−黒丸−は、パック・年不明である。
【図８】図８は、初期段階の肺癌および良性肺疾患を有する対象に対して検査された４イムノアッセイおよび４自己抗原パネルに対するＡＵＣを与える。図８は、検査された各個別のバイオマーカーが正常な対象および良性肺疾患対象から初期および後期段階の肺癌を識別する能力を示している。図８において、−黒丸−は、初期対正常を示し、−白丸−は初期対良性を示し、−は後期対正常を示し、−−−−−は後期対良性を示す。
【図９】図９は、初期段階および後期段階の肺癌を良性肺疾患を識別する上での、４イムノアッセイ、４自己抗原、４イムノアッセイおよび１免疫応答マーカー（ハプトグロビン、血清アミロイドＡ、Ｃ反応性タンパク質およびアポリポタンパク質Ａ）、４自己抗原および１免疫応答マーカー並びに４イムノアッセイ、４自己抗原および１免疫応答マーカーのパネルに対するＡＵＣを与える。各バイオマーカーパネルに対して、４つのバーがプロットされている。第一のバーは良性肺疾患患者から初期段階の肺癌を識別するためのＡＵＣを表し、第二のバーは正常から初期段階の肺癌を識別するためのＡＵＣを表し、第三のバーは良性肺疾患患者から後期段階の肺癌を識別するためのＡＵＣを表し、第四のバーは正常から後期段階の肺癌を識別するためのＡＵＣを表す。
【図１０】図１０は、正常、良性および癌患者の試料を含有する合計１１８試料（肺癌４４および非癌７４）に対して実施されたＴβ４アッセイに対するＡＵＣを与える。ＡＵＣ＝０．８３９３。
【発明を実施するための形態】
【００８３】
定義
本願において使用される場合、以下の用語は以下の意味を有する。他の全ての技術および科学用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。
【００８４】
「吸着物」という用語は、生物分子を蓄積（結合）することができるあらゆる物質を表す。吸着物は、典型的には、生物学的に活性な表面を被覆し、その物理的特性に基づいて、１つの生物分子又は様々な生物分子を結合することができる単一の物質又は複数の異なる物質から構成される。このような物質には、陰イオン交換材料、陽イオン交換材料、金属キレート物質、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、抗体、ポリマー（合成又は天然）、紙などが含まれるが、これらに限定されない。
【００８５】
本明細書において使用される「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子又は免疫学的に活性を有するその部分、すなわち抗原結合部分を表す。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性を有する部分の例には、抗体をペプシンなどの酵素で処理することによって作製することができるＦ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２断片が含まれる。抗体の例には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、組換え抗体、一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）、アフィニティー成熟された抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合されたＦｖ（「ｓｄＦｖ」）および抗イディオタイプ（「抗Ｉｄ」）抗体および上記の何れかの機能的に活性なエピトープ結合断片が含まれるが、これらに限定されない。本明細書において使用される「抗体」という用語には自己抗体が含まれる（自己抗体とは、ｐ５３、カルレチキュリン、α−エノラーゼおよびＨＯＸＢ７などの（但し、これらに限定されない。）正常な自己タンパク質（又は自己抗原）に対して誘導された、対象又は患者が合成する抗体である。）。幅広い範囲の自己抗原に対する自己抗体は当業者に周知であり、とりわけ肺癌、乳癌、前立腺癌および膵臓癌を含む多くの悪性疾患において記載されている。抗体は、バイオマーカーの一種である。
【００８６】
本明細書において使用される「抗原」という用語は、抗体によって結合されることができ、さらに、当該抗原の少なくとも１つのエピトープに結合することができる抗体を産生するように動物を誘導することができる分子を表す。さらに、関心領域は、抗原でもあり得る（換言すれば、関心領域は、最終的に、抗原であることが決定される場合があり得る。）。抗原は、バイオマーカーの一種である。
【００８７】
「ＡＵＣ」という用語は、ＲＯＣ曲線の曲線下面積を表す。ＡＵＣは、所定の試料集団に対する検査に関する性能指数として使用され、完全な検査に対する１から当該検査が検査対象を分類する上で完全に無作為な応答を与える０．５までの値を与える。ＡＵＣの範囲は０．５から１．０に過ぎないので、ＡＵＣの小さな変化は、０から１又は０から１００％の範囲を有する判定基準の同様の変化より大きな重要性を有する。ＡＵＣの％変化が与えられる場合、ＡＵＣの％変化は、判定基準の全範囲が０．５から１．０であるという事実に基づいて計算される。ＪＭＰＴＭ統計パッケージは、作成された各ＲＯＣ曲線に対するＡＵＣを報告する。ＡＵＣ手法は、全データ範囲にわたって分類アルゴリズムの精度を比較するための価値ある手段である。より大きなＡＵＣを有する分類アルゴリズムは、定義上、未知のものを関心が持たれる２つの群（罹病および非罹病）の間に正確に分類する能力がより大きい。分類アルゴリズムは、単一分子の測定のように単純なものであり得、又は複数分子の測定および統合のように複雑なものであり得る。
【００８８】
「良性肺疾患」又は「良性」という用語は、ある対象の肺系に伴う病状を表す。本発明において、良性肺疾患には、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性又は慢性炎症、良性小結節、良性新生物、異形成、過形成、異型、気管支拡張症、ヒストプラズマ症、サルコイドーシス、繊維症、肉芽腫、血腫、肺気腫、無気肺、組織球増殖症および他の非癌性疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【００８９】
「生物学的に活性な表面」という用語は、当該材料の特異的生化学的特性および生物分子の生化学的特性のために、生物分子が結合し、又は相互作用することができる材料のあらゆる二次元又は三次元的広がりを表す。このような生化学的特性には、イオン特性（電荷）、疎水性又は親水性が含まれるが、これらに限定されない。
【００９０】
「生物学的試料」および「検査試料」という用語は、ある対象から単離される全ての生物学的流体および排泄物を表す。本発明において、このような試料には、血液、血清、血漿、乳頭吸引液、尿、精液（ｓｅｍｅｎ）、精液（ｓｅｍｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ）、精漿、前立腺液、排泄物、涙、唾液、汗、生検、腹水、脳脊髄液、乳、リンパ、気管支および他の洗浄試料又は組織抽出試料が含まれるが、これらに限定されない。典型的には、血液、血清、血漿および気管支洗浄が、本発明において使用するための好ましい検査試料である。
【００９１】
「バイオマーカー」という用語は、身体の状態と相関する生物分子（又は生物分子の断片）を表す。例えば、本発明のバイオマーカーは、癌、好ましくは、肺癌と相関し、肺癌の存在、不存在又はリスクを検出する上での補助として使用することができる。このようなバイオマーカーには、ヌクレオチド、アミノ酸、糖、脂肪酸、ステロイド、代謝物、ポリペプチド、タンパク質（抗原および抗体など（但し、これらに限定されない。））、炭水化物、脂質、ホルモン、抗体、生物分子の代理としての役割を果たす関心領域、これらの組み合わせ（例えば、糖タンパク質、リボ核タンパク質、リポタンパク質）を含む生物分子並びに抗原と該抗原上の利用可能なエピトープに結合する自己抗体との間で形成される複合体などの（但し、これに限定されない。）あらゆるこのような生物分子を含むあらゆる複合体が含まれるが、これらに限定されない。「バイオマーカー」という用語は、少なくとも５つの連続するアミノ酸残基、好ましくは、少なくとも１０の連続するアミノ酸残基、より好ましくは、少なくとも１５の連続するアミノ酸残を含み、親ポリペプチドの生物学的活性および／又は幾つかの機能的特徴（例えば、抗原性又は構造的ドメインの特徴）を保持するポリペプチド（親）配列の一部も表すことができる。
【００９２】
「バイオメトリックパラメータ」という用語は、患者が十分に確定されたグループ又は集団に属することを一意的に特定するために使用される１つ又はそれ以上の内在的な身体的又は行動的形質を表す。本発明において、「バイオメトリックパラメータ」には、患者の身体的記述因子が含まれるが、これに限定されない。バイオメトリックパラメータの例には、患者の身長、患者の体重、患者の生物、喫煙歴、職業歴、発癌性物質への曝露、受動喫煙への曝露、肺癌の家族歴などが含まれるが、これらに限定されない。喫煙歴は、通常、パック・年（Ｐｋｙｒｓ）の観点で定量化される。本明細書において使用される「パック・年」という用語は、一日当りに喫煙されたパックの平均数が乗じられた、ある者が喫煙していた年数を表す。平均して、１日にタバコ１パックを３５年間喫煙していた者は、喫煙歴の３５パック・年を有すると称される。バイオメトリックパラメータ情報は、定型的な患者質問票又は健康歴質問票などを使用することによって、対象自身からなど、本分野において公知の定型的技術を用いて対象から取得することができる。あるいは、バイオメトリックパラメータは、看護師、看護従事者、医師の補助者若しくは医師から、対象から得ることができる。
【００９３】
「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられている置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが、本分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、帯電していない極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐した側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。従って、タンパク質中の予想される非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーから得られる別のアミノ酸残基で置換される。
【００９４】
「決定木分析」という用語は、一連の単純な二分法規則（又は症候）が、決定木を通じて、最終的な分類結果又は決定木の末端結節点までの誘導を与える古典的アプローチを表す。その本質的に単純且つ直感的な性質のために、再帰的な分割が診断プロセスにとって極めて適したものとなる。
【００９５】
この方法には、因子変数（Ｘ）および応答変数（Ｙ）という変数の２種類が必要とされる。実行される際に、変数Ｘは連続的であり、変数Ｙは分類的（名目的）である。このような場合には、ＪＭＰ統計パッケージはカットオフ値を生成し、これによって結節点の純度を最大化するアルゴリズムを使用する。このカットオフ値の上および下にある値に基づいて、試料を枝又は結節点に分割する。
【００９６】
分類的応答変数に関しては、この事例におけるように、適合された値は各応答レベルに対する推定確率となる。この場合には、分割は最大尤度比χ二乗統計（Ｇ２）によって決定される。これは、分割の２つの分岐間で応答の差を最大化する効果を有する。この方法のより詳しい論述およびその実施は、「ＪＭＰｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ｇｕｉｄｅ」中に見出すことができる。
【００９７】
しかしながら、樹木の構築は、それに関連する独自の問題を有している。一般的な問題は、データを過剰適合することなく、最良の予測モデルを与える樹木の最適なサイズを決定することである。このことを念頭に置きながら、ＲＯＣ曲線を構築するために、樹木の様々な結節点において抽出可能な情報を使用する方法が開発されてきた。実施される場合、この方法は、モデル化されているデータ群を確実に過剰適合する十分な結節点を有する参照樹を構築することを含む。続いて、樹木から不要な部分を取り除き、引き続き、結節点の最少数に到達するまで（２つの末端結節点）、各工程で最悪の結節点を除去する。これによって、複雑度が減少した（より少ない結節点）樹木の系列又はファミリーが作製される。
【００９８】
再帰的分割プログラムは、純粋な末端結節点を作製することを試みる。すなわち、１つの分類種類の標本のみが含まれる。しかしながら、これは常に可能であるとは限らない。時には、末端結節点は混合された集団を有する。従って、各末端結節点は癌に対して異なる確率を有する。癌に対する純粋な末端結節点では、癌標本である可能性は１００％であり、逆に、非癌に対する純粋な末端結節点に関しては、癌標本である可能性は０％である。各末端結節点での癌の確率は、各結節点において、（１−非癌の確率）に対してプロットされる。
【００９９】
これらの値は、その木を代表するＲＯＣ曲線を作成するためにプロットされる。各木に対する計算されたＡＵＣは、木又はモデルの「良好度」を表す。あらゆる診断用途におけると同様、ＡＵＣが高いほど、アッセイ（又はこの事例では、モデル）はより優れている。樹木サイズ（結節の数）に対するＡＵＣのプロットは、訓練セットに対する最良のモデルをその最大限として有する。結果を検証するために、別のより小さなデータのサブセットを用いて類似の操作が実施される。訓練セットと検証セットの両方で同様の成績を有するモデルが最適であると推定され、従って、さらなる分析および／又は検証のために選択される。
【０１００】
「発展的データセット」又は「データセット」という用語は、一群の生物学的試料に対して収集された完全なバイオマーカー又はバイオマーカーとバイオメトリックパラメータデータを含む特徴（ｆｅａｔｕｒｅｓ）を表す。これらの試料自体は、公知の診断結果を有する患者から採取される。公知の患者の結果に相関する２つ又はそれ以上の異なる標本群（例えば、癌および非癌）へ試料を分類することを目的として、一つの特徴又は特徴の組を統計解析に供する。質量スペクトルを使用する場合、当該セット内の質量スペクトルは強度が異なり得るが、器具類の精度内で、見かけの分子量は異ならない。
【０１０１】
「分類器」という用語は、試料と関連する疾病を決定するために、試料の組に対して得られた特徴を使用するあらゆるアルゴリズムを表す。分類器の１つの種類は、訓練セットから得られたデータを用いてアルゴリズムを「訓練する」ことによって作製され、その成績は検査セットデータを用いて評価される。本発明とともに使用される分類器の例は、判別分析、決定木分析、受信者動作曲線又は分離およびスコア分析である。
【０１０２】
「決定木」という用語は、分類のために使用されるフローチャート様の樹状構造を有する分類器を表す。決定木は、データセットをサブセットへ繰り返し分離することからなる。各分離は、１つの変数に対して適用される単純なルールからなる。例えば、「‘変数１’が‘閾値１’より大きな値であれば、左に進み、そうでなければ右に進む。」従って、与えられた特徴空間は、各矩形が１つのクラスへ割り付けられた矩形の群へ分割される。
【０１０３】
「診断アッセイ」および「診断法」という用語は、病的状態の存在又は性質の検出を表す。診断アッセイは、感受性および特異性において異なる。肺癌に対して陽性の検査結果を示し、実際に罹病している対象は、「真正陽性」と考えられる。本発明において、診断アッセイの感受性は、罹病集団中の真正陽性のパーセントとして定義される。肺癌を有するが、診断アッセイによって検出されない対象は、「偽陰性」と考えられる。罹病しておらず、且つ診断アッセイにおいて陰性の検査結果を有する対象は、「真正陰性」と考えられる。本明細書において使用される診断アッセイの特異性という用語は、非罹病集団中の真正陰性のパーセントと定義される。
【０１０４】
「判別分析」という用語は、２つ又はそれ以上の天然に存在する群間を最適に判別する特徴を選択するために使用される一群の統計学的方法を表す。データセットに対して判別分析を適用することによって、使用者は、さらなる解析のために、最も判別力が高い特徴に対して焦点を当てることが可能となる。
【０１０５】
「理想からの距離」又は「ＤＦＩ」という用語は、理想からの距離であるＲＯＣ曲線から取られるパラメータを表し、これは感受性と特異性の両方を取り込み、［（１−感受性）２＋（１−特異性）２］１／２として定義される。１００％の感受性と１００％の特異性の成績を有するアッセイに対して、ＤＦＩは０であり、０％の感受性および０％の特異性を有するアッセイに対して、１．４１４まで増加する。決定のために完全なデータ範囲を使用するＡＵＣとは異なり、ＤＦＩは、ＲＯＣ曲線上の特定の点における検査の成績を測定する。より低いＤＦＩ値を有する検査は、より高いＤＦＩ値を有する検査より成績が優れている。ＤＦＩは、米国特許出願公開２００６／０２１１０１９Ａ１において詳しく論述されている。
【０１０６】
「アンサンブル」、「ツリーアンサンブル」又は「アンサンブル分類器」という用語は互換的に使用することができ、多くのより単純な初歩的分類器からなる分類器（例えば、決定木のアンサンブルは、決定木からなる分類器である。）を表す。アンサンブル分類器の結果は、その構成要素の分類器の結果を全て合算することによって、例えば、全ての構成要素の分類器を等しく重み付けする多数決投票によって得られる。構成要素の分類器が、次いで、その生成頻度によって自然に重み付けられる場合に、多数決投票は特に合理的である。
【０１０７】
「エピトープ」という用語は、抗体によって結合されることができ、その抗体によって認識されることもできる抗原の一部を表すものとする。エピトープ決定基は、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基から通常なり、特異的な三次元構造特性および特異的な電荷特性を有する。
【０１０８】
「特徴」および「変数」という用語は互換的に使用され得、試料の特徴の指標値を表す。これらの指標は、試料の物理的、化学的又は生物学的特徴に由来し得る。指標の例には、質量スペクトルのピーク、質量スペクトルのシグナル、ＲＯＩの強度の関数が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０９】
配列間の相同性又は配列同一性（これらの用語は、本明細書において互換的に使用される。）の計算は、以下のように行われる。
【０１１０】
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の％同一性を決定するために、最適な比較のために、配列を並置する（例えば、最適な並置のために、第一および第二のアミノ酸又は核酸配列の一方又は両方にギャップを導入することができ、非相同的な配列は、比較のために無視することができる。）。好ましい実施形態において、比較のために並置される基準配列の長さは少なくとも３０％であり、基準配列アミノ酸残基の長さの好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは７０％、８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％が並置される。次いで、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第一の配列中の位置が第二の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められている場合には、これらの分子はその位置において同一である（本明細書において使用されるアミノ酸又は核酸の「同一性」は、アミノ酸又は核酸の「相同性」と等しい。）。２つの配列間の％同一性は、２つの配列の最適な並置のために導入することが必要なギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れて、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。
【０１１１】
２つの配列間での配列の比較と％同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。好ましい実施形態において、２つのアミノ酸配列間の％同一性は、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスおよび１６、１４、１２、１０、８、６又は４のギャップウェイトおよび１、２、３、４、５又は６の長さウェイトを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに取り込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））のアルゴリズムを使用して決定される。さらに別の好ましい実施形態において、２つのヌクレオチド配列間の％同一性は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ、ＣＭＰマトリックスおよび４０、５０、６０、７０又は８０のギャップウェイトおよび１、２、３、４、５又は６の長さウェイトを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを使用して決定される。パラメータの特に好ましい組（およびある分子が本発明の配列同一性又は相同性限界内にあるかどうかを決定するために、実施者がどのパラメータを適用すべきかについて不明である場合に、使用すべきもの）は、１２のギャップオープンペナルティ、４のギャップ伸長ペナルティおよび５のフレムシフトギャップペナルティとともに、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２スコアリングマトリックスを使用する。
【０１１２】
２つのアミノ酸又はヌクレオチド配列間の％同一性は、ＰＡＭ１２０ウェイト残基表、１２のギャップ長ペナルティおよび４のギャップペナルティを用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に取り込まれたＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ．４：１１−１７  （１９８９））のアルゴリズムを使用して決定することができる。
【０１１３】
本明細書中に記載されている核酸およびタンパク質配列は、例えば、他のファミリーの一員又は関連配列を同定するために、公表されたデータベースに対する検索を行うための「照会配列」として使用することができる。このような検索は、「Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（１９９０）」のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明の免疫反応性サイクリンＥ２タンパク質に対して相同的なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行うことができる。比較のためにギャップが介在する並置を得るために、「Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２  （１９９７）」中に記載されているように、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴを使用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の初期設定パラメータを使用することができる。
【０１１４】
本明細書において使用される「免疫反応性サイクリンＥ２」という用語は、（１）配列番号１、配列番号３、配列番号４又は配列番号５の何れかのアミノ酸配列を有するポリペプチド、（２）配列番号１、配列番号３、配列番号４又は配列番号５の何れかのあらゆる組み合わせ、（３）配列番号１と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％相同であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号３と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％相同であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号４と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％相同であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号５と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％相同であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、およびこれらのあらゆる組み合わせ、（４）配列番号１、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に対して類似の免疫反応性を示すサイクリンＥ２ポリペプチド並びに（５）配列番号１、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に対して類似の免疫反応性を示すポリペプチドを表す。
【０１１５】
「単離された」又は「精製された」ポリペプチド又はタンパク質は、そのタンパク質が得られた細胞又は組織源に由来する細胞性物質若しくは他のきょう雑タンパク質を実質的に含まず、又は化学的に合成された場合、化学的前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まない。タンパク質又は生物学的に活性なその一部が組換え的に産生される場合、タンパク質又は生物学的に活性なその一部は、好ましくは、培地を実質的に含まない。すなわち、培地は、タンパク質調製物の容量の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満および最も好ましくは、約５％未満を占める。
【０１１６】
本明細書において使用される「線形判別分析」という用語は、試料を正しく分類する上で最も優れた変数又は特徴を特定するためのツールを与え、例えば、ＪＭＰＴＭ統計パッケージによって実装され得る解析の種類を表す。ソフトウェアの段階的な特徴を使用して、全ての試料を正しく分類するまで、変数がモデルに付加され得る。一般に、このようにして選択された変数の組は、データセット中の変数の元の数より大幅に小さい。特徴の数のこの減少は、その後のあらゆる解析、例えば、樹状木、人工的なニューラルネットワークなどを用いたより一般的な分類エンジンの開発を簡略化する。
【０１１７】
「肺癌」という用語は、ある対象の肺系統と関連する癌状態を表す。本発明において、肺癌には、腺癌、類上皮癌、扁平上皮細胞癌、大細胞癌、小細胞癌、非小細胞癌および気管支肺胞癌が含まれるが、これらに限定されない。本発明において、肺癌は異なる段階および等級の異なる度数であり得る。肺癌の段階又はその等級の度数を決定するための方法は、当業者に周知である。
【０１１８】
「質量分析」という用語は、表面上に試料から気相イオンを生成させるためにイオン化源を使用し、質量分析装置を用いて気相イオンを検出することを表す。「レーザー脱離質量分析」という用語は、表面上に試料から気相イオンを生成させるためにイオン化源としてレーザーを使用し、質量分析装置を用いて気相イオンを検出することを表す。生物分子に対する質量分析の好ましい方法は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析又はＭＡＬＤＩである。ＭＡＬＤＩにおいて、分析物は、乾燥したときに、分析物と共結晶化するマトリックス材料と典型的に混合される。マトリックス材料は、吸収がなければ分解されやすい生物分子又は分析物を断片化するエネルギーをエネルギー源から吸収する。別の好ましい方法は、表面増強レーザー脱離／イオン化質量分析又はＳＥＬＤＩである。ＳＥＬＤＩでは、分析物がその上に適用された表面が分析物の捕捉および／又は脱離において積極的な役割を果たしている。本発明において、試料は、クロマトグラフィー又は他の化学的加工を行い得る生物学的試料および適切なマトリックス基材を含む。
【０１１９】
質量分析において、「見かけの分子量」とは、検出されたイオンの（ダルトンの）分子量対電荷値ｍ／ｚを表す。見かけの分子量を導出する方法は、使用される質量分析装置の種類に依存する。飛行時間質量分析装置では、見かけの質量はイオン化から検出までの時間の関数である。
【０１２０】
「マトリックス」という用語は、質量分析装置中で適切な光源（例えば、ＵＶ／Ｖｉｓ又はＩＲレーザー）からの光子としてエネルギーを吸収することにより、表面からの生物分子の脱離を可能とする分子を表す。α−シアノ桂皮酸、シナピン酸およびジヒドロキシ安息香酸を含む桂皮酸誘導体は、生物分子のレーザー脱離において、エネルギー吸収分子としてしばしば使用される。エネルギー吸収分子は、米国特許第５，７１９，０６０号に記載されている。
【０１２１】
「正常化」という用語およびその派生表現は、質量スペクトルとともに使用された場合、主として装置のパラメータに起因する、スペクトルの全体的強度の差を除去又は最少化するために、一群の質量スペクトルに適用される数学的方法を表す。
【０１２２】
「関心領域」又は「ＲＯＩ（ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」という用語は、質量スペクトルのサブセットの統計的な適合を表す。ＲＯＩは、連続するシグナルの固定された最少長さを有する。連続するシグナルは、ＲＯＩがどのようにして選択されるかに応じて、固定された最大長のギャップを含有し得る。関心領域は、バイオマーカーに関連しており、バイオマーカーに対する代用物としての役割を果たし得る。関心領域は、その後、タンパク質、ポリペプチド、抗原、抗体、脂質、ホルモン、炭水化物などを代表することが決定され得る。
【０１２３】
「受信者動作特性曲線」又は「ＲＯＣ曲線」という用語は、その最も簡易な用法において、２つの集団、例えば、ケース（すなわち、肺癌に罹患している対象）およびコントロール（すなわち、肺癌に関して正常な又は良性な対象）間で区別する上で特定の特徴（例えば、バイオマーカー又はバイオメトリックパラメータ）の成績のプロットを表す。集団全体（すなわち、ケースおよびコントロール）にわたる特徴データは、単一の特徴の値に基づいて、昇順に並べ替えられる。次いで、その特徴の各値に関して、データに対する真正陽性および偽陽性率が計算される。真正陽性率は、検討されている特長に対する値を上回るケースの数を計数した後、ケースの総数で除することによって求められる。偽陽性率は、検討されている特徴に対する値を上回るコントロールの数を計数した後、コントロールの総数で除することによって求められる。この定義は、コントロールと比較してケースにおいてある特徴が上昇している状況を記載しているが、この定義は、コントロールと比較してケースにおいてある特徴が低下している状況も包含する。この状況では、検討されている特徴に対する値を下回る試料が計数される。
【０１２４】
ＲＯＣ曲線は、単一の特長に対して、および他の単一の出力に対して作製することが可能であり、例えば、２つ又はそれ以上の特徴の組み合わせを数学的に合算して（加算、減算、乗算など）、単一の合計値を得、この単一の合計値をＲＯＣ曲線中にプロットすることができる。さらに、単一の出力値を導出する複数の特徴のあらゆる組み合わせをＲＯＣ曲線中にプロットすることができる。特徴のこれらの組み合わせは、検査を含み得る。ＲＯＣ曲線は、検査の偽陽性率（１−特異性）に対する検査の真正陽性率（感受性）のプロットである。ＲＯＣ曲線下の面積は、ある標本集団に関する、その特徴に対しての性能指数であり、完全な検査に対する１から当該検査が検査対象を分類する上で完全に無作為な応答を与える０．５までの値を与える。ＲＯＣ曲線は、データセットを迅速にスクリーニングするための別の手段を提供する。巨大な特徴空間のサイズを低下させるために、診断的であると思われる特徴を優先的に使用することが可能である。
【０１２５】
「スクリーニング」という用語は、肺癌に対する患者の素因に関する診断的決定を表す。患者は、陽性の「スクリーニング検査」によって、肺癌の高いリスクを有すると決定される。その結果、その患者には、さらなる検査、例えば、画像診断、喀痰検査、肺機能検査、気管支鏡検査法および／又は生検法および最終の診断を施すことができる。
【０１２６】
「シグナル」という用語は、調査されている生物分子によって生じたあらゆる応答を表す。例えば、シグナルという用語は、質量分析装置の検出器に衝突する生物分子によって生じた応答を表す。シグナル強度は、生物分子の量又は濃度と相関する。シグナルは、記載されているとおり、２つの値、すなわち、見かけの分子量値および生成された強度の値によって規定される。質量の値は生物分子の基本的な特徴であるのに対して、強度の値は対応する見掛けの分子量値を有する生物分子のある量又は濃度と一致する。従って、「シグナル」は、生物分子の特性を常に表す。
【０１２７】
「分離およびスコア法」という用語は、「Ｍｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ．１０２（２１）：７６７７−７６８２  （２００５）」から適切に改変された方法を表す。この方法では、全ての試料に対して、複数の測定が行われる。カットオフ値は、各測定に対して決定される。このカットオフ値は、関心がもたれる群（例えば、罹病および非罹病）間での正しい分類の精度を最大化するように設定され得、又は１つの群の感受性若しくは特異性を最大化するように設定され得る。各測定に対して、関心がもたれる群（例えば、罹病）がカットオフの上又はカットオフ値の下に位置するかどうかが決定される。各測定に関して、その測定の値がカットオフ値の罹病側に位置することが見出される場合には常に、スコアがその試料に割り当てられる。１つの試料に対して、全ての測定を行った後、測定のパネルに対する合計スコアを得るためにスコアを合計する。１０の測定のパネルが１０の最大スコア（各測定は、１又は０の何れかのスコアを有する。）および０の最低スコアを有し得るように、全ての測定を等しく重み付けることが一般的である。しかしながら、より重要な指標に対しては、より高い個別スコアで測定を不均等に重み付けすることに価値がある場合があり得る。
【０１２８】
合計スコアが決定された後、再度、測定のパネルに基づいて、罹病を非罹病試料から分離するためにカットオフが決定される。ここでも同じく、１０の最大スコアおよび０の最少スコアを有する測定のパネルに対して、感受性を最大化するために（カットオフとして０のスコア）又は特異性を最大化するために（カットオフとして１０のスコア）又は分類の精度を最大化するために（カットオフとして、０から１０の間のスコア）カットオフが選択され得る。
【０１２９】
本明細書において使用される「重み付けられたスコアリング法」という用語は、検査試料中に同定および定量された１つの生物マーカー又はバイオメトリックパラメータ（本明細書において、「マーカー」と総称される。）の測定を多くの潜在スコアの１つへ変換させることを含む方法を表す。スコアは、以下の式を用いて得られる。
【０１３０】
スコア＝ＡＵＣ＊係数／（１−特異性）（「係数」は、（０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５などの）整数であり、「特異性」は１以下の選択された値である。「係数」の大きさは、より高いＡＵＣ値、相対的に小さな標準偏差、高い特異性若しくは感受性又は低いＤＦＩなどの（但し、これらに限定されない。）、改善された臨床成績を有するマーカーに対して増加する。従って、１つのマーカーの測定は、所望される限り最も多くの又は少ないスコアへ変換され得る。この方法は、関心が持たれる集団中のマーカー／検査成績を反映する受信者動作特性曲線に基づく。ＲＯＣ曲線は、検査の偽陽性率（１−特異性）に対する検査の真正陽性率（感受性）のプロットである。曲線上の各点は、測定されている特徴／検査（マーカー）の単一の値に相当する。従って、幾つかの値は関心が持たれる集団（すなわち、肺癌を発症するリスクを有する対象）中で低い偽陽性率を有するのに対して、特徴の他の値はその集団中で高い偽陽性率を有する。この方法は、関心が持たれる対象の集団に対して低い偽陽性率を有する（従って、高い特異性を有する）特徴の値（すなわち、バイオマーカー又はバイオメトリックパラメータ）に対してより高いスコアを与える。この方法は、それ以下において検査が増加したスコアをもたらす偽陽性率（１−特異性）の所望されるレベルを選択することを含む。換言すれば、高度に特異的であるマーカーには、より低い特異性のマーカーより大きなスコア又はより大きなスコアの範囲が与えられる。
【０１３１】
本明細書において使用される「対象」という用語は、動物、好ましくは、ヒト又は非ヒトを含む哺乳動物を表す。患者および対象という用語は、本明細書において、互換的に使用され得る。
【０１３２】
「ＤＴモデルの１０倍検証」という用語は、優れた分析手技はモデルの予測値を評価するために新たな集団に対してモデルを検証することを必要とするという事実を表す。新たな集団に代えて、独立の訓練セットおよび検証セットへデータを分割することができる。検証セットとして使用するために、１０個の無作為なサブセットが作製される。各検証セットに対して、試料を共通して有さない対応する独立の訓練セットが存在する。１０のＤＴモデルは、上述のように１０の訓練セットから作製され、検証セットともに調査される。
【０１３３】
「検査セット」又は「未知」又は「検証セット」という用語は、訓練セット中に含まれないエントリーからなる利用可能なデータセット全体のサブセットを表す。検査セットは、分類器の成績を評価するために適用される。
【０１３４】
「訓練セット」又は「既知のセット」又は「参照セット」という用語は、利用可能なそれぞれの全データセットのサブセットを表す。このサブセットは、通例、無作為に選択され、専ら、分類器を構築する目的で使用される。
【０１３５】
「変換されたロジスティック回帰モデル」という用語は、ＪＭＰＴＭ統計パッケージ中にも実装されている、特徴の数を合算し、ＲＯＣ曲線解析を可能とする手段を提供するモデルを表す。このアプローチは、特徴相互の関係に対する単純なモデルを採用しているので、特徴の減少したセットに対して適用されるのが最良である。陽性結果は、より洗練された分類法が成功を収めるはずであることを示唆する。陰性結果は、落胆すべき結果であるが、他の方法が失敗することを必ずしも示唆するとは限らない。
【０１３６】
サイクリンＥ２ポリペプチド
一実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されている方法において使用することができる抗体を産生し、又は検査する（又はより一般的には、結合する）ための免疫原又は抗原として使用することができる、単離された又は精製された免疫反応性サイクリンＥ２ポリペプチド又は生物学的に活性なその断片に関する。本発明の免疫反応性サイクリンＥ２ポリペプチドは、標準的なタンパク質精製技術を用いて、細胞又は組織源から単離することができる。あるいは、単離された又は精製された免疫反応性サイクリンＥ２ポリペプチドおよび生物学的に活性なその断片は、組換えＤＮＡ技術によって作製することが可能であり、又は化学的に合成することが可能である。本発明の単離された又は精製された免疫反応性サイクリンＥ２ポリペプチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５に示されているアミノ酸配列を有する。配列番号１は、ヒトサイクリンＥ２のｃＤＮＡ発現された形態のアミノ酸配列である（Ｇｅｎｂａｎｋ受付番号ＢＣ００７０１５．１）。配列番号３は、ＢＣ００７０１５．１のＣ末端に１つのアミノ酸（システイン）が加わった３８アミノ酸配列であり、本明細書において「Ｅ２−１」とも称される。配列番号４は３７アミノ酸長であり、配列番号４が配列番号３の最も最初のシステインをそのアミノ酸末端に含有しないことを除き、配列番号３と同じである。配列番号５は、ＢＣ００７０１５．１のＣ末端を含む１９アミノ酸配列であり、本明細書において、「Ｅ２−２」と称される。実施例中により詳しく記載されているように、配列番号１の免疫反応性は配列番号２の免疫反応性と比較された。配列番号２は、ヒトサイクリンＥ２の別のｃＤＮＡ発現された形態である（Ｇｅｎｂａｎｋ受付番号ＢＣ０２０７２９．１）。配列番号１は、癌試料の幾つかのプールと強い免疫反応性を示すことが見出され、良性および正常な（非癌）プールとずっと低い反応性を示した。これに対して、配列番号２は、あらゆる癌又は非癌のプールされた試料とほとんど反応性を示さなかった。配列番号１の免疫反応性は、配列番号２には存在しない配列番号１のＣ末端に存在する最初の３７アミノ酸の結果であることが決定された。配列番号３および５（何れも、配列番号１のＣ末端に由来する。）は、癌又は非癌プールの間で強い免疫反応性を示すことが見出された。従って、配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５又はこれらの配列のあらゆる組み合わせに対して作製された抗体（配列番号１および配列番号３に対して作製された抗体、配列番号１および配列番号４に対して作製された抗体、配列番号１および配列番号５に対して作製された抗体、配列番号１、配列番号３および配列番号４に対して作製された抗体、配列番号１、配列番号３および配列番号５に対して作製された抗体、配列番号１、配列番号４および配列番号５に対して作製された抗体、配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５に対して作製された抗体、配列番号３および配列番号４に対して作製された抗体、配列番号３および配列番号５に対して作製された抗体、配列番号３、配列番号４および配列番号５に対して作製された抗体、配列番号４および配列番号５に対して作製された抗体（本発明において、全て「抗サイクリンＥ２」と総称される。）など）を、本明細書に記載されている方法において使用することができる。例えば、このような抗体は、配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５の何れか又はこれらの配列のあらゆる組み合わせに対して作製された主題抗体であり得る。このような抗体は、本明細書中に記載されている本発明の方法において使用するために１つ又はそれ以上のキット中に含めることができる。
【０１３７】
本発明は、本明細書中に記載されているポリペプチド（すなわち、配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５）と１つ又はそれ以上の保存的アミノ酸置換だけ異なるポリペプチドも包含する。さらに、本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは少なくとも７５、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％又はそれ以上の全体的配列類似性（同一性）又は相同性を有するポリペプチドも包含する。
【０１３８】
肺癌の存在又はリスクを検出する上でのバイオマーカーおよびバイオメトリックパラメータの使用
別の実施形態において、本発明は、正常な対象と癌を有する対象又は医学的症状を発症するリスクを有する対象との識別を効果的に補助する方法に関する。医学的症状は、好ましくは癌、さらに好ましくは肺癌である。正常な対象は、何れかの医学的症状（癌など）を有すると診断されていない対象、より好ましくは肺癌を有すると診断されていない対象であると考えられる。
【０１３９】
本発明は、医学的症状、好ましくは癌、さらに好ましくは肺癌の診断を補助するための迅速で、感度が高く、使いやすい方法を有利に提供する。さらに、本発明は、医学的症状を発症するリスクを有する個体を特定するために、医学的症状に対してリスクを有する対象をスクリーニングするために、および医学的症状を有すると診断され、又は医学的症状に対して治療されている患者をモニターするために使用することができる。本発明は、医学的症状に対して治療されている患者の治療の有効性をモニターするためにも使用することができる。好ましくは、医学的症状は癌であり、より好ましくは肺癌である。特に本明細書に記載されている方法に関して本明細書を通じて使用される、関心が持たれる医学的症状を有する対象（肺癌を有する対象など）は、関心が持たれる医学的症状の高いリスクを有する対象（肺癌の高いリスクを有する対象など）と同じであると考えられる。
【０１４０】
一般に、本発明の方法は、対象から検査試料を取得することを含む。典型的には、検査試料は、対象から取得され、当業者に公知の標準的方法を用いて処理される。血液試料および血液試料から得られる血清又は血漿に関しては、試料は、静脈穿刺によって肘正中静脈（ａｎｔｅｃｕｂｅｔａｌ  ｖｅｉｎ）から、又はより小さい容量が必要とされる場合には、掌での採血によって都合よく取得することができる。何れの場合にも、形成された要素および血餅は遠心によって除去される。尿又は便は、患者から直接収集することが可能であるが、但し、迅速に処理され、又は直ちに処理を実施できない場合には、防腐剤で安定化される。気管支洗浄液又は胸膜液などのより特殊化された試料は、気管支鏡検査法の間に又は経皮若しくは開放生検によって収集し、遠心によって粒状物が除去されたら、血清又は血漿と同様に処理することができる。
【０１４１】
処理後に、肺癌の診断と相関し得る１つ又はそれ以上のバイオマーカーの存在および量に関して、対象から得られた検査試料を調べる。具体的には、出願人は、１つ若しくはそれ以上のバイオマーカー又はバイオマーカーとバイオメトリックパラメータの組み合わせ（少なくとも１つのバイオマーカー、少なくとも１つのバイオマーカーと少なくとも１つのバイオメトリックパラメータ、少なくとも２つのバイオマーカー、少なくとも２つのバイオマーカーと１つのバイオメトリックパラメータ、少なくとも１つのバイオマーカーと少なくとも２つのバイオメトリックパラメータ、少なくとも２つのバイオマーカーと少なくとも２つのバイオメトリックパラメータ、少なくとも３つのバイオマーカーなど）の検出および定量が、患者中の肺癌を診断する上での補助として有用であることを見出した。本明細書中に記載されている方法において同定および定量された１つ又はそれ以上のバイオマーカーが、１つ又はそれ以上のパネル中に含有され得る。パネルを含むバイオマーカーの数には、１つのバイオマーカー、２つのバイオマーカー、３つのバイオマーカー、４つのバイオマーカー、５つのバイオマーカー、６つのバイオマーカー、７つのバイオマーカー、８つのバイオマーカー、９つのバイオマーカー、１０のバイオマーカー、１１のバイオマーカー、１２のバイオマーカー、１３のバイオマーカー、１４のバイオマーカー、１５のバイオマーカー、１６のバイオマーカー、１７のバイオマーカー、１８のバイオマーカー、１９のバイオマーカー、２０のバイオマーカーなどが含まれ得る。しかしながら、パネル中に含めるためのバイオマーカーを選択する場合には、選択されたバイオマーカーの組み合わせが、個別の組み合わせより優れた性能（ＡＵＣ、ＤＦＩ感受性および特異性又はＡＵＣ、ＤＦＩ感受性および特異性のあらゆる組み合わせに関して）を与えるように、このようなバイオマーカーを相補性に関して選択すべきである。
【０１４２】
上述されているように、検査試料を取得した後、本発明の方法は、検査試料中の１つ又はそれ以上のバイオマーカーの存在を特定し、次いで定量することを含む。肺癌のリスクを有すると疑われる患者の診断を補助するのに有用である又は有用であると考えられるあらゆるマーカーを本明細書中に記載されている方法において定量することが可能であり、１つ又はそれ以上のパネル中に含めることができる。従って、一態様において、パネルは、１つ又はそれ以上のバイオマーカーを含むことができる。パネル中に含めることができるバイオマーカーの例には、抗ｐ５３、抗ＴＭＰ２１、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１、抗ＨＤＪ１、抗ニーマンピックＣ１様タンパク質１、Ｃ末端ペプチドドメイン（抗ＮＰＣ１Ｌ１Ｃドメイン）、抗ＴＭＯＤ１、抗ＣＡＭＫ１、抗ＲＧＳ１、抗ＰＡＣＳＩＮ１、抗ＲＣＶ１、抗ＭＡＰＫＡＰＫ３、抗サイクリンＥ２（すなわち、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５又はこれらのあらゆる組み合わせに対する少なくとも１つの免疫反応性抗体）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、癌抗原１２５（ＣＡ１２５）、癌抗原（ＣＡ１５−３）、プロガストリン放出ペプチド（プロＧＲＰ）、扁平上皮細胞抗原（ＳＣＣ）、サイトケラチン８、サイトケラチン１９ペプチド又はタンパク質（本明細書において、単に、「ＣＫ−１９、ＣＹＦＲＡ２１−１、Ｃｙｆｒａ」とも称される。）およびサイトケラチン１８ペプチド又はタンパク質（ＣＫ−１８、ＴＰＳ）などの抗原（但し、これらに限定されない。）、付加されたシアル酸残基を有するルイスＡ血液群である癌抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、血清アミロイドＡ、α−１−アンチトリプシン、アポリポタンパク質ＣＩＩＩおよびチモシンβ４（Ｔβ４）などの炭水化物抗原、Ａｃｎ６３９９、Ａｃｎ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｐｕｂ６４５３、Ｐｕｂ２９５１、Ｐｕｂ２４３３、Ｐｕｂ１７３３８、ＴＦＡ６４５３およびＨＩＣ３９５９などの関心領域（但し、これらに限定されない。）およびこれらのあらゆる組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。必要に応じて、上記方法において使用されるパネルは、２つ若しくはそれ以上のバイオマーカー、３つ若しくはそれ以上のバイオマーカー、４つ若しくはそれ以上のバイオマーカー、５つ若しくはそれ以上のバイオマーカー、６つ若しくはそれ以上のバイオマーカー、７つ若しくはそれ以上のバイオマーカー、８つのバイオマーカー、９つ若しくはそれ以上のバイオマーカー、１０若しくはそれ以上のバイオマーカー、１１若しくはそれ以上のバイオマーカー、１２若しくはそれ以上のバイオマーカー、１３若しくはそれ以上のバイオマーカー、１４若しくはそれ以上のバイオマーカー、１５若しくはそれ以上のバイオマーカー、１６若しくはそれ以上のバイオマーカー、１７若しくはそれ以上のバイオマーカー、１８若しくはそれ以上のバイオマーカー、１９若しくはそれ以上のバイオマーカー又は２０のバイオマーカー又はそれ以上などの量を定量することを含み得る。
【０１４３】
別の態様において、パネルは、少なくとも１つの抗体、少なくとも１つの抗原、少なくとも１つの関心領域、少なくとも１つの抗原と少なくとも１つの抗体、少なくとも１つの抗原と少なくとも１つの関心領域および少なくとも１つの抗体と少なくとも１つの関心領域を含有することができる。パネル中に含まれ得る少なくとも１つの抗体の例には、抗ｐ５３、抗ＴＭＰ２１、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１、抗ＨＤＪ１、抗ＮＰＣ１Ｌ１Ｃ、抗ＴＭＯＤ１、抗ＣＡＭＫ１、抗ＲＧＳ１、抗ＰＡＣＳＩＮ１、抗ＲＣＶ１、抗ＭＡＰＫＡＰＫ３又は抗サイクリンＥ２が含まれるが、これらに限定されない。パネル中に含まれ得る少なくとも１つの抗原の例には、サイトケラチン８、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＳＣＣ、ＣＡ１９−９、プロＧＲＰ、血清アミロイドＡ、α−１−アンチトリプシン、アポリポタンパク質ＣＩＩＩおよびＴβ４がであるが、これらに限定されない。パネル中に含まれ得る少なくとも１つの関心領域の例には、Ａｃｎ６３９９、Ａｃｎ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｐｕｂ６４５３、Ｐｕｂ２９５１、Ｐｕｂ２４３３、Ｐｕｂ１７３３８、ＴＦＡ６４５３およびＨＩＣ３９５９が含まれるが、これらに限定されない。さらに、ある種の関心領域は、他のある種の関心領域と高度に相関しており（これらの関心領域は、互いに高い相関係数を有することを意味する。）、従って、本発明において互いに置換され得ることが見出された。具体的には、これらの高度に相関する関心領域は、ある種の相関ファミリー又は「グループ」へまとめられている。これらの「グループ」内に含まれる関心領域は、本発明の方法およびキットにおいて、互いに置換することができる。関心領域のこれらの相関ファミリー又は「グループ」が、以下に記載されている。
【０１４４】
グループＡ：関心領域：Ｐｕｂ３４４８およびＰｕｂ３４９３。
【０１４５】
グループＢ：関心領域：Ｐｕｂ４４８７およびＰｕｂ４６８２。
【０１４６】
グループＣ：関心領域：Ｐｕｂ８７６６、Ｐｕｂ８９３０、Ｐｕｂ９１４２、Ｐｕｂ９２１６、Ｐｕｂ９３６３、Ｐｕｂ９４３３、Ｐｕｂ９４９５、Ｐｕｂ９６４８およびＰｕｂ９７２２。
【０１４７】
グループＤ：関心領域：Ｐｕｂ５０３６、Ｐｕｂ５１３９、Ｐｕｂ５２６４、Ｐｕｂ５３５７、Ｐｕｂ５４８３、Ｐｕｂ５５７３、Ｐｕｂ５５９３、Ｐｕｂ５６１５、Ｐｕｂ６７０２、Ｐｕｂ６７１８、Ｐｕｂ１０７５９、Ｐｕｂ１１０６６、Ｐｕｂ１２１９３、Ｐｕｂ１３４１２、Ａｃｎ１０６７９およびＡｃｎ１０８７７。
【０１４８】
グループＥ：関心領域：Ｐｕｂ６３９１、Ｐｕｂ６５３３、Ｐｕｂ６５８７、Ｐｕｂ６７９８、Ｐｕｂ９３１７およびＰｕｂ１３５７１。
【０１４９】
グループＦ：関心領域：Ｐｕｂ７２１８、Ｐｕｂ７２５５、Ｐｕｂ７３１７、Ｐｕｂ７４１３、Ｐｕｂ７４９９、Ｐｕｂ７７１１、Ｐｕｂ１４４３０およびＰｕｂ１５５９９。
【０１５０】
グループＧ：関心領域：Ｐｕｂ８４９６、Ｐｕｂ８５４６、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ８６６２、Ｐｕｂ８７３４、Ｐｕｂ１７１２１およびＰｕｂ１７３３８。
【０１５１】
グループＨ：関心領域：Ｐｕｂ６２４９、Ｐｕｂ１２５０１およびＰｕｂ１２７１７。
【０１５２】
グループＩ：関心領域：Ｐｕｂ５６６２、Ｐｕｂ５７７７、Ｐｕｂ５８９８、Ｐｕｂ１１５９７およびＡｃｎ１１５５９。
【０１５３】
グループＪ：関心領域：Ｐｕｂ７７７５、Ｐｕｂ７９４４、Ｐｕｂ７９８０、Ｐｕｂ８００２およびＰｕｂ１５８９５。
【０１５４】
グループＫ：関心領域：Ｐｕｂ１７８５８、Ｐｕｂ１８４２２、Ｐｕｂ１８７６６およびＰｕｂ１８９８６。
【０１５５】
グループＬ：関心領域：Ｐｕｂ３０１８、Ｐｕｂ３６４０、Ｐｕｂ３６５８、Ｐｕｂ３６８２、Ｐｕｂ３７０５、Ｐｕｂ３８３９、Ｈｉｃ２４５１、Ｈｉｃ２６４６、Ｈｉｃ３０３５、Ｔｆａ３０１６、Ｔｆａ３６３５およびＴｆａ４３２１。
【０１５６】
グループＭ：関心領域：Ｐｕｂ２３３１およびＴｆａ２３３１。
【０１５７】
グループＮ：関心領域：Ｐｕｂ４５５７およびＰｕｂ４５９２。
【０１５８】
グループＯ：関心領域：Ａｃｎ４６３１、Ａｃｎ５０８２、Ａｃｎ５２６２、Ａｃｎ５３５５、Ａｃｎ５４４９およびＡｃｎ５４５５。
【０１５９】
グループＰ：関心領域：Ａｃｎ６３９９、Ａｃｎ６５９２、Ａｃｎ８８７１、Ａｃｎ９０８０、Ａｃｎ９３７１およびＡｃｎ９６６２。
【０１６０】
グループＱ：関心領域：Ａｃｎ９４５９およびＡｃｎ９４７１。
【０１６１】
グループＲ：関心領域：Ｈｉｃ２５０６、Ｈｉｃ２９８０、Ｈｉｃ３１７６およびＴｆａ２９８４。
【０１６２】
グループＳ：関心領域：Ｈｉｃ２７２８およびＨｉｃ３２７６。
【０１６３】
グループＴ：関心領域：Ｈｉｃ６３８１、Ｈｉｃ６３８７、Ｈｉｃ６４５０、Ｈｉｃ６６４９、Ｈｉｃ６８１６およびＨｉｃ６８２３。
【０１６４】
グループＵ：関心領域：Ｈｉｃ８７９１およびＨｉｃ８８９７。
【０１６５】
グループＶ：関心領域：Ｔｆａ６４５３およびＴｆａ６６５２。
【０１６６】
グループＷ：関心領域：Ｈｉｃ６００５およびＨｉｃ５３７６。
【０１６７】
グループＸ：関心領域：Ｐｕｂ４７１３、Ｐｕｂ４７５０およびＰｕｂ４８６１。
【０１６８】
本発明の方法において使用することができる好ましいパネルには、以下のものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１６９】
１．少なくとも２つのバイオマーカーを含み、該バイオマーカーが少なくとも１つの抗体および少なくとも１つの抗原であるパネル。このパネルは、少なくとも１つの関心領域などのさらなるバイオマーカーをさらに含むこともできる。
【０１７０】
２．少なくとも１つのバイオマーカーを含み、該バイオマーカーが抗サイクリンＥ２を含むパネル。さらに、前記パネルは、（ａ）少なくとも１つの抗原；（ｂ）少なくとも１つの抗体；（ｃ）少なくとも１つの抗原および少なくとも１つの抗体；（ｄ）少なくとも１つの関心領域；（ｅ）少なくとも１つの抗原と少なくとも１つの関心領域；（ｆ）少なくとも１つの抗体と少なくとも１つの関心領域；又は（ｇ）少なくとも１つの抗原、少なくとも１つの抗体および少なくとも１つの関心領域などのさらなるバイオマーカーを必要に応じてさらに含むこともできる。
【０１７１】
３．少なくとも１つのバイオマーカーを含み、該バイオマーカーがサイトケラチン８、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＳＣＣ、プロＧＲＰ、血清アミロイドＡ、α−１−アンチトリプシンおよびアポリポタンパク質ＣＩＩＩからなる群から選択されるパネル。前記パネルは、検査試料中に少なくとも１つの抗体、少なくとも１つの関心領域、並びに少なくとも１つの関心領域および少なくとも１つの抗体などのさらなるバイオマーカーを必要に応じてさらに含むことができる。
【０１７２】
４．少なくとも１つのバイオマーカーを含み、該バイオマーカーがＡｃｎ６３９９、Ａｃｎ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｐｕｂ６４５３、Ｐｕｂ２９５１、Ｐｕｂ２４３３、Ｐｕｂ１７３３８、ＴＦＡ６４５３およびＨＩＣ３９５９からなる群から選択される少なくとも１つの関心領域であるパネル。前記パネルは、検査試料中に少なくとも１つの抗原、少なくとも１つの抗体並びに少なくとも１つの抗原および少なくとも１つの抗体などのさらなるバイオマーカーを必要に応じてさらに含むこともできる。
【０１７３】
５．パネル中に少なくとも１つのバイオマーカーを含み、少なくとも１つの該バイオマーカーがサイトケラチン８、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＳＣＣ、プロＧＲＰ、血清アミロイドＡ、α−１−アンチトリプシン、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、Ａｃｎ６３９９、Ａｃｎ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｐｕｂ６４５３、Ｐｕｂ２９５１、Ｐｕｂ２４３３、Ｐｕｂ１７３３８、ＴＦＡ６４５３およびＨＩＣ３９５９からなる群から選択されるパネル。前記パネルは、少なくとも１つの抗体などのさらなるバイオマーカーを必要に応じてさらに含むこともできる。好ましいパネルは、（ａ）サイトケラチン１９、ＣＥＡ、ＡＣＮ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９およびＴＦＡ２７５９；（ｂ）サイトケラチン１９、ＣＥＡ、ＡＣＮ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９およびＴＦＡ９１３３；（ｃ）サイトケラチン１９、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＣＡ１５−３、ＣＡ１２５、ＳＣＣ、サイトケラチン１８およびＰｒｏＧＲＰ；（ｄ）Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｔｆａ６４５３およびＨｉｃ３９５９；および（ｅ）サイトケラチン１９、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＳＣＣ、サイトケラチン１８、プロＧＲＰ、ＡＣＮ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３を含むパネルである。
【０１７４】
６．パネル中の少なくとも２つのバイオマーカーを含み、該少なくとも２つのバイオマーカーが抗ｐ５３、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１、抗ＭＡＰＫＡＰＫ３、免疫反応性サイクリンＥ２、サイトケラチン１９、ＣＥＡ、ＣＡ１２５およびプロＧＲＰに対する１つ又はそれ以上の抗体からなる群から選択されるパネル。前記パネルは、上記群から選択される少なくとも３つのバイオマーカー、上記群から選択される少なくとも４つのバイオマーカー、上記群から選択される少なくとも５つのバイオマーカー、上記群から選択される少なくとも６つのバイオマーカー、上記群から選択される少なくとも７つのバイオマーカー又は上記バイオマーカーの８つ全て（すなわち、抗ｐ５３、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１、抗ＭＡＰＫＡＰＫ３、免疫反応性サイクリンＥ２、サイトケラチン１９、ＣＥＡ、ＣＡ１２５およびプロＧＲＰに対する１つ又はそれ以上の抗体の各々）を含むこともできる。好ましくは、パネルは、上記バイオマーカーの８つ全てを含む。
【０１７５】
検査試料中の１つ又はそれ以上のバイオマーカーの存在および量は、当業者に公知の定型的な技術を用いて取得し、定量することができる。例えば、検査試料中の抗原又は抗体を定量するための方法は、当業者に周知である。例えば、検査試料中の１つ又はそれ以上の抗原又は抗体の存在および定量は、本分野において公知である１つ又はそれ以上のイムノアッセイを用いて決定することができる。イムノアッセイは、典型的には、以下のことを含む。（ａ）バイオマーカー（すなわち、抗原又は抗体）に特異的に結合する抗体（又は抗原）を準備すること；（ｂ）検査試料を抗体又は抗原と接触させること；および（ｃ）検査試料中の抗原に結合した抗体の複合体の存在又は検査試料中の抗体に結合された抗原の複合体の存在を検出すること。
【０１７６】
抗原に特異的に結合する抗体を調製するために、精製された抗原又はその核酸配列を使用することができる。抗原に対する核酸およびアミノ酸配列は、これらの抗原のさらなる性質決定によって取得することができる。例えば、抗原は多数の酵素（例えば、トリプシン、Ｖ８プロテアーゼなど）を用いてペプチドマッピングを行うことができる。各抗原から得られた消化断片の分子量は、様々な酵素によって作製された消化断片の分子量に合致する配列に対して、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースなどのデータベースを検索するために使用することができる。この方法を用いて、これらの抗原がデータベース中の公知のタンパク質であれば、他の抗原の核酸およびアミノ酸配列を同定することができる。
【０１７７】
あるいは、タンパク質ラダー配列決定を用いてタンパク質配列を配列決定することができる。タンパク質ラダーは、例えば、分子を断片化し、酵素消化又は断片の末端から単一のアミノ酸を順次除去するその他の方法へ断片を供することによって作製することができる。タンパク質ラダーを調製する方法は、例えば、国際公開ＷＯ９３／２４８３４号および米国特許第５，７９２，６６４号中に記載されている。次いで、質量分析法によってラダーを分析する。ラダー断片の質量の差によって、分子の末端から除去されたアミノ酸を特定する。
【０１７８】
抗原がデータベース中の公知のタンパク質でなければ、核酸およびアミノ酸配列は抗原のアミノ酸配列の一部の知識を用いて決定することができる。例えば、抗原のＮ末端アミノ酸配列に基づいて、縮重プローブを作製することができる。次いで、抗原が最初にそこから検出された試料から作製されたゲノム又はｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために、これらのプローブを使用することができる。陽性クローンは、同定し、増幅することができ、周知の技術を用いて、組換えＤＮＡ配列をサブクローニングすることができる。例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ，  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  １９８９）  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．  （Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  ＮＹ  １９８９）」を参照されたい。
【０１７９】
精製された抗原又はその核酸配列を用いて、抗原へ特異的に結合する抗体は、本分野において公知のあらゆる適切な方法を用いて調製することができる（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （１９９１）；Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８）；Ｇｏｄｉｎｇ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  （２ｄ  ｅｄ．  １９８６）；およびＫｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）を参照されたい。）。このような技術には、ファージ又は類似のベクター中の組換え抗体のライブラリーから抗体を選択することによる抗体調製並びにウサギ又はマウスを免疫化することによってポリクローナルおよびモノクローナル抗体の調製が含まれるが、これらに限定されない（例えば、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）；  Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６（１９８９）を参照されたい。）。
【０１８０】
抗体が提供された後、抗原は、十分に認知された多数の免疫学的結合アッセイの何れを用いても検出および／又は定量することができる（例えば、米国特許第４，３６６，２４１号、同第４，３７６，１１０号、同第４，５１７，２８８号、同第４，８３７，１６８号を参照されたい。）。本発明において使用することができるアッセイには、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）（「サンドイッチアッセイ」としても知られる。）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）、計数イムノアッセイ（ＣＩＡ；ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ろ材酵素イムノアッセイ（ＭＥＩＡ；ｆｉｌｔｅｒ  ｍｅｄｉａ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、蛍光結合免疫吸着検定法（ＦＬＩＳＡ）、膠着イムノアッセイおよび多重蛍光イムノアッセイ（ＬｕｍｉｎｅｘＴＭＬａｂＭＡＰなど）などが含まれる。一般的なイムノアッセイの総説に関しては、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌｕｍｅ  ３７  （Ａｓａｉ，  ｅｄ．  １９９３）；  Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （Ｓｔｉｔｅｓ  ＆  Ｔｅｒｒ，  ｅｄｓ．，  ７ｔｈ  ｅｄ．１９９１）」も参照されたい。
【０１８１】
一般に、対象から得られた検査試料は、抗原を特異的に結合する抗体と接触させることができる。必要に応じて、複合体の洗浄およびその後の単離を容易にするために、抗体を検査試料と接触させる前に、抗体を固体支持体に固定することができる。固体支持体の例には、例えば、ミクロタイタープレート、ガラス顕微鏡スライド又はカバーガラス、棒、ビーズ又はミクロビーズの形態のガラス又はプラスチックが含まれる。プローブ基材又は上述されているＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐＴＭアレイに抗体を付着させることもできる（例えば、Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６２：６０２９−６０３３（２００１）を参照されたい。）。
【０１８２】
試料を抗体とともに温置した後、混合物を洗浄し、形成された抗体−抗原複合体を検出することができる。これは、洗浄された混合物を検出試薬とともに温置することによって達成することができる。この検出試薬は、例えば、検出可能な標識で標識された第二の抗体であり得る。検出可能な標識に関しては、本分野において公知のあらゆる検出可能な標識を使用することが可能である。例えば、検出可能な標識は、放射線標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐおよび３３Ｐなど）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース６−リン酸脱水素酵素など）、化学発光標識（例えば、アクリジニウムエステル、アクリジニウムチオエステル、アクリジニウムスルホンアミド、フェナントリジニウムエステル、ルミナール、イソルミノールなど）、蛍光標識（例えば、（例えば、５−フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、３，６−カルボキシフルオレセイン、５（６）−カルボキシフルオレセイン、６−ヘキサクロロ−フルオレセイン、６−テトラクロロフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナートなどの）フルオレセイン）、ローダミン、フィコビリタンパク質、Ｒ−フィコエリトリン、量子ドット（例えば、硫化亜鉛がキャップされたセレン化カドミウム）、温度測定標識又は免疫ポリメラーゼ連鎖反応標識であり得る。標識への導入、標識化の手順および標識の検出は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｅｕｇｅｎｅ，  Ｏｒｅｇｏｎによって発行されたハンドブック兼カタログである「Ｐｏｌａｋ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｎｏｏｒｄｅｎ，  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎ．Ｙ．（１９９７）」および「Ｈａｕｇｌａｎｄ，  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  （１９９６）」中に見出される。あるいは、試料中のマーカーは、例えば、結合されたマーカー特異的抗体を検出するために第二の標識された抗体が使用される間接的アッセイを用いて、および／又は例えば、抗原の異なるエピトープに結合するモノクローナル抗体が混合物とともに同時に温置される競合又は阻害アッセイにおいて検出することができる。
【０１８３】
アッセイを通じて、試薬の各組み合わせの後に、温置および／又は洗浄工程が必要とされ得る。温置工程は、約５秒から数時間まで、好ましくは約５分から約２４時間までを変動することができる。しかしながら、温置時間は、アッセイのフォーマット、バイオマーカー（抗原）、溶液の容量、濃度などに依存する。通常、アッセイは周囲温度で実施されるが、１０℃から４０℃などの温度の範囲にわたって実施することが可能である。
【０１８４】
イムノアッセイ技術は本分野において周知であり、適用可能な技術の一般的な概要は、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、上記に見出すことができる。
【０１８５】
対象から得た試料中の抗原の検査量を測定するために、イムノアッセイを使用することができる。第一に、上記イムノアッセイ法を用いて、試料中の抗原の検査量を検出することができる。抗原が試料中に存在する場合には、抗原は、上記の適切な温置条件下で、該抗原を特異的に結合する抗体とともに抗体−抗原複合体を形成する。抗体−抗原複合体の量は、標準に比較することによって決定することができる。次いで、抗原に対するＡＵＣは、ＲＯＣ分析などの（但し、これらに限定されない。）公知の技術を用いて計算することができる。あるいは、ＤＦＩを計算することができる。ＡＵＣが約０．５より大きく又はＤＦＩが約０．５より小さい場合には、疾病又は疾病のリスク（癌、好ましくは肺癌など）を有する対象を正常な（又は良性の）対象から識別するために、イムノアッセイを使用することができる。
【０１８６】
多数の抗原に対するイムノアッセイキットが市販されている。例えば、サイトケラチン１９を定量するためのキットは、Ｆ．  Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  Ｌｔｄ．（Ｂａｓｅｌ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびＢｒａｈｍｓ  Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｃｅｌｌｓｃｈａｆｔ  （Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手可能であり、サイトケラチン１８を定量するためのキットは、ＩＤＬ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＤ（Ｂｒｏｍｍａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）およびＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，  ＣＡ）から入手可能であり、ＣＡ１２５、ＣＥＡＳＣＣおよびＣＡ１９−９を定量するためのキットは、それぞれ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，  ＩＬ）およびＦ．  Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  Ｌｔｄ．から入手可能であり、血清アミロイドＡおよびアポリポタンパク質ＣＩＩＩを定量するためのキットは、Ｌｉｎｃｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｉｎｃ．（Ｓｔ．  Ｃｈａｒｌｅｓ，  ＭＯ）から入手可能であり、プロＧＲＰを定量するためのキットは、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｉｎｃ．（Ｗａｋｏ，  Ｊａｐａｎ）およびＩＢＬ  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈａｍｂｕｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手可能であり、α１アンチトリプシンを定量するためのキットは、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  ＧＭＢＨ  （Ｓｔｒａｓｓｂｅｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＧｅｎＷａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）から入手可能であり、並びにＴβ４を定量するためのキットは、ＡＬＰＣＯ  （Ｓａｌｅｍ，  ＮＨ）から入手可能である。
【０１８７】
検査試料中の１つ又はそれ以上の抗体の存在又は定量は、上述されているものと類似のイムノアッセイを用いて決定することができる。このようなイムノアッセイは、上記されているアッセイにおいて抗体および抗原の役割が逆転しているという事実を除き、上記イムノアッセイと類似の様式で実施される。例えば、実施可能なイムノアッセイの１つの種類は、自己抗体ビーズアッセイである。このアッセイでは、市販の抗原ｐ５３（ＢｉｏＭｏｌＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌ．Ｐ．，  Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｌａｎｄｉｎｇ，  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａから購入可能）のような抗原は、本分野において公知の定型的な技術を用いて又は本明細書中の実施例３に記載されている技術および方法を用いて、固体支持体、例えば、ビーズ、プラスチックマイクロプレート、ガラス顕微鏡スライド又はカバーガラス又はタンパク質抗原を結合するニトロセルロースなどの素材から作製された膜へ固定することができる。あるいは、抗原が市販されていない場合には、抗原は、癌細胞株（好ましくは、肺癌細胞株）若しくは対象自身の癌組織（好ましくは、肺癌組織）（Ｓ−Ｈ  Ｈｏｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６４：５５０４−５５１０（２００４）を参照されたい。）から精製され得、又はｃＤＮＡクローンから発現され得る（Ｙ−Ｌ  Ｌｅｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ３４９：８７−９６  （２００４）参照）。次いで、抗原を含有するビーズを検査試料と接触させる。結合された抗原を含有するビーズとともに検査試料を温置した後、ビーズを洗浄し、形成されたあらゆる抗体−抗原複合体を検出する。この検出は上述のように、すなわち、洗浄されたビーズを検出試薬とともに温置することによって実施することができる。この検出試薬は、例えば、検出可能な標識で標識された第二の抗体（抗ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、抗ヒト免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、抗ヒト免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）など（但し、これらに限定されない。））であり得る。検出後、抗体−抗原複合体の量は、上述されているように、シグナルを標準によって生成されたものと比較することによって測定することができる。あるいは、抗体−抗原複合体は、免疫グロブリンの多価の性質を活用することによって検出することができる。抗体−抗原複合体を抗ヒト抗体と反応させることとは逆に、固相に付着された抗原と同じエピトープを含有する検出可能な標識で標識された可溶性抗原へ、抗体−抗原複合体を曝露させることができる。全ての占拠されていない抗体結合部位が、（検出可能な標識で標識された）可溶性抗原に結合する。洗浄後、当業者に公知の定型的な技術を用いて、検出可能な標識が検出される。上記方法の何れかもが、検査試料中の特異的抗体の高感度で、特異的な定量を可能とする。次いで、ＲＯＣ分析などの（但し、これに限定されない。）当業者に公知の定型的な技術を用いて、抗体に対するＡＵＣ（従って、対象中の肺癌を検出するための抗体（自己抗体など）の使用）を計算することができる。あるいは、ＤＦＩを計算することができる。ＡＵＣが約０．５より大きく又はＤＦＩが約０．５より小さい場合には、疾病又は疾病のリスク（癌、好ましくは肺癌など）を有する対象を正常な（又は良性の）対象から識別するために、イムノアッセイを使用することができる。
【０１８８】
関心領域の存在および量は、質量分析技術を用いて測定することができる。質量分析法を用いて、出願人は、検査試料中の肺癌の診断およびスクリーニングの補助として有用な２１２の関心領域を見出した。具体的には、検査試料中の１つ又はそれ以上のバイオマーカーを検出および定量するために、質量分析技術が使用される場合には、まず、質量分析のために検査試料を調製しなければならない。試料の調製は、様々な方法で行うことができるが、最も一般的に使用されているのは、固相に付着された１つ又はそれ以上の吸着物質に試料を接触させることを含む。吸着物質は、陰イオン又は陽イオン性の基、疎水性基、金属リガンドあり又はなしの金属キレート基、抗体（ポリクローナル又はモノクローナルの何れか）又は同族抗体を結合するのに適した抗原であり得る。固相は、金属、ガラス又はプラスチックから作製された平面であり得る。固相は、表面積を増加させるために、微小粒状物（マイクロビーズ、非晶質粒状物の何れか）又は不溶性ポリマーの性質とすることもできる。さらに、微小粒状材料は、操作を容易にするために磁性であり得る。関心が持たれるバイオマーカーは固相に吸着され、バルク分子は洗浄によって除去される。質量分析のために、関心が持たれるバイオマーカーは、吸着物質に対するバイオマーカーの親和性を低下させる溶媒を用いて固相から溶出される。次いで、分析のために、バイオマーカーを質量分析装置中に導入する。好ましくは、上に重なっているスペクトルを同定し、スペクトルを評価する上では無視する。さらに、上述されているようなイムノアッセイを使用することもできる。イムノアッセイが完了したら、免疫学的表面から分析物を溶出し、分析のために質量分析装置中に導入することができる。
【０１８９】
検査試料が一旦調製されたら、検査試料を質量分析装置中に導入する。レーザー脱離イオン化（例えば、ＭＡＬＤＩ又はＳＥＬＤＩ）は、固体形態で与えられる試料に対する一般的な技術である。この技術では、レーザーエネルギーを吸収し、試料に転移させる上で効率的なマトリックスとともに、標的プレート上で試料を共結晶化させる。生成されたイオンを分離し、計数し、公知の質量および電荷のイオンに対して較正する。何れかの試料に対して収集された質量データは、特異的な質量／電荷（ｍ／ｚ）比でのイオンカウントである。異なる質量調製法および異なるイオン化技術は異なるスペクトルを与えることが予想される。
【０１９０】
質量スペクトルデータに対する認定検査は、元のデータの事前加工を最小限にした外れ値分析の厳格なプロセスを典型的に含む。外れ値を同定する方法は、原スペクトルの総イオン電流（ＴＩＣ）の計算から始まる。ＴＩＣ計算の前に、原スペクトルに対して、円滑化又はベースライン補正アルゴリズムが適用されない。ＴＩＣは、検出された質量（ｍ／ｚ）範囲にわたり、各ｍ／ｚ値における強度を加算することによって計算される。これは、装置の不具合、試料のスポッティングの問題および他の類似の欠陥をスクリーニングする。ＴＩＣの他に、各試料に関して、スペクトル全体にわたる平均％ＣＶ（％変動計数）が計算される。各試料に対する反復測定の数を用いて、検出された質量範囲にわたる全てのｍ／ｚ値において、％ＣＶを計算する。次いで、その試料の代表となる平均％ＣＶを得るために、これらの％ＣＶを一緒に平均する。平均％ＣＶは、外れ値を同定するための最初のフィルター工程として使用してよく、又は使用しなくてもよい。一般に、高い平均％ＣＶ（３０％超又は他のあらゆる許容可能な値）での反復は、乏しい再現性を示す。
【０１９１】
上述されているように、各スペクトルの計算されたＴＩＣおよび平均％ＣＶは、スペクトルの再現性および「良好度」を認定するための予測因子として使用することができる。しかしながら、これらの測定はスペクトルの全体特性に対する優れた記述子を与えるが、各ｍ／ｚ値での個別の強度など、スペクトルの顕著な特徴の再現性に関する情報を一切与えない。このハードルは、「Ｗａｎ他（Ｊ．  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．  ２００２．  １３，  ８５−８８）」によって報告されたスペクトルコントラスト角（ＳＣＡ）計算の改変によって克服された。ＳＣＡ計算において、スペクトル全体は、その成分が各ｍ／ｚの値であるベクターとして処理される。この解釈を用いて、２つのベクター間の角度シータ（θ）は、標準的な数学式によって与えられる。
【０１９２】
【数１】
0005611821.tif 000002
【０１９３】
類似のスペクトルに対して、θは小さく、ゼロに近い。
【０１９４】
使用に際して、計算および比較の総数は、試料の反復に対して又は特定の群（例えば、癌）内の全試料に対して平均スペクトルをまず計算することによって低下する。次に、各スペクトルと計算された平均スペクトルとの間のＳＣＡを計算する。平均スペクトルと大幅に異なるスペクトルは、下記の基準を満たす限り、外れ値と考える。
【０１９５】
１つの予測因子は質量スペクトルを完全に記述するのに十分でないので、外れ値を選択するために２以上の予想因子を使用することが好ましい。多変量外れ値解析は、複数の予想因子を用いて実施することができる。これらの予想因子は、ＴＩＣ、平均％ＣＶおよびＳＣＡであり得るが、これらに限定されない。ＪＭＰＴＭ統計パッケージ（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．，  Ｃａｒｙ，  ＮＣ）を用いて、群（例えば、癌）中の各反復測定に対して、マハラノビス距離を計算する。観察の約９５％がこの値を下回るように、臨界値（信頼限界ではない。）を計算することができる。臨界値を上回る残りの５％は外れ値と考え、さらなる分析から除外される。
【０１９６】
質量スペクトルデータの認定後、データセット中の全てのスペクトルに対してＴＩＣが同一であるように強度を拡大し、又は全てのスペクトル中の１つのピークに対して強度を拡大して、通常、スペクトルは標準化される。
【０１９７】
標準化後、質量スペクトルは一群の強度特性まで低減される。他の用途では、これらは、生物分子と関連するｍ／ｚ値でスペクトル強度のリストまで低減する。好ましくは、特徴の別の種類、関心領域又はＲＯＩが使用される。
【０１９８】
関心領域は、２つ又はそれ以上の関心対象のデータセット間での比較によって得られる。これらのデータセットは、関心対象の群（例えば、罹病および非罹病）に相当する。各ｍ／ｚにおける、全ての試料にわたる強度値に対して、ｔ検定を行う。操作者によって指定された閾値を下回るｔ検定ｐ値を有するｍ／ｚの値を特定する。特定されたｍ／ｚ値のうち、連続するｍ／ｚ値を一緒のグループに入れ、関心領域と定義される。ＲＯＩおよびその連続する群内に何れかの許容されるギャップを形成するために必要とされる連続するｍ／ｚ値の最少数は、使用者によって定義され得る。ＲＯＩに対する別の限定子は、２つの群の平均の比の対数の絶対値である。この値が何らかの閾値カットオフ値（すなわち、１０を底とする対数が使用される場合には０．６）より大きいときには、質量対電荷位置はＲＯＩ中に含める候補となる。ＲＯＩ法を使用する利点は、２つのクラスのスペクトル間の高い強度のパターンの差の印になるのみならず、肩のようなより微弱な差およびピーク発見法によって見逃される極めて低い強度を発見することである。
【０１９９】
一旦、関心領域が決定されたら、ＲＯＩの範囲の平均又は中央ｍ／ｚ値が、しばしば、領域に対する識別子として使用される。各領域は、データセットを識別するマーカーの候補である。様々なパラメータ（例えば、全強度、最大強度、中央値強度又は平均強度）を標本データから抽出し、ＲＯＩと関連付けることができる。従って、何千ものｍ／ｚ、強度対から２１２のＲＯＩおよびそれらの識別子、強度関数対まで各標本スペクトルが低下する。これらの記述子は、データ解析技術のための入力変数として使用される。
【０２００】
必要に応じて、検査試料を得る前に又は検査試料を得た後に並びに検査試料中の１つ若しくはそれ以上のバイオマーカーを同定および定量する前に又は検査試料中の１つ若しくはそれ以上のバイオマーカーを同定および定量した後に、本発明の方法は、対象から少なくとも１つのバイオメトリックパラメータの値を得る工程を含むことができる。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０などのバイオメトリックパラメータを対象から取得することができる。あるいは、本発明の方法は、対象から得た何れかのバイオメトリックパラメータに対して何れかの値を得る工程を含む必要はない。対象から得られた好ましいバイオメトリックパラメータは、対象の喫煙歴、具体的には、対象の喫煙のパック・年である。対象から取得することができる他のバイオメトリックパラメータには、年齢、発癌性物質への曝露、性別、喫煙の家族歴などが含まれるが、これらに限定されない。
【０２０１】
上述されているように、本発明の方法において、パネル中に含有される１つ又はそれ以上のバイオマーカーの存在を決定するために、検査試料が分析される。検査試料中にバイオマーカーが存在することが決定された場合には、検出されたこのような各バイオマーカーの量を（本明細書中に前述されている技術を用いて）定量する。検査試料中の各バイオマーカーの量が定量されたら、定量された各バイオマーカーの量を、その特定のバイオマーカーに対する所定のカットオフ（通例、整数などの値又は数字であり、本明細書において、「カットオフ」又は「分離点」とも別称される。）と比較する。本発明の方法において使用される所定のカットオフは、多変量解析（図１参照）、変形ロジスティック回帰、分離およびスコア法又はこれらのあらゆる組み合わせなどの（但し、これらに限定されない。）本分野において公知の定型的技術を用いて決定することができる。例えば、分離およびスコア法が使用される場合、所定のカットオフの値又は数は達成されるべき所望の結果に依存する。達成されるべき所望の結果が、関心対象の群中の各マーカーの正しい分類の精度を最大化すること（すなわち、肺癌を発症するリスクを有する対象および肺癌を発症するリスクを有さない対象を正しく同定すること）であれば、所望されるその結果に基づいて、そのバイオマーカーに対する所定のカットオフに対して、特定の値又は数が選択される。これに対して、所望される結果は各マーカーの感度を最大化することであれば、その所望される結果に基づいて、そのバイオマーカーに対して、所定のカットオフに対する異なる値又は数を選択し得る。同様に、所望される結果が各マーカーの特異性を最大化することであれば、その所望される結果に基づいて、そのバイオマーカーに対して、所定のカットオフに対する異なる値を選択し得る。検査試料中に存在するあらゆるバイオマーカーの量が定量されたら、所望される結果に応じて、ＲＯＣ曲線、ＡＵＣおよび各バイオマーカーに対する適切な所定のカットオフを決定するために、定型的な技術を用いて、当業者によって使用することができる他の情報を作製するために、この情報を使用することができる。各バイオマーカーの量を所定のカットオフと比較した後に、次いで、比較に基づいて、各バイオマーカーにスコア（すなわち、０から１００までなどのあらゆる整数であり得る数）を割り当てる。さらに、１つ又はそれ以上のバイオマーカーのほかに、１つ又はそれ以上のバイオメトリックパラメータの値が対象に対して取得される場合には、各バイオメトリックパラメータの値を前記パラメータに対する所定のカットオフに対して比較する。何れのバイオメトリックパラメータに対する所定のカットオフも、１つ又はそれ以上のバイオマーカーに対する所定のカットオフを決定することに関して、本明細書に記載されている同じ技術を用いて決定することができる。バイオマーカーの比較と同様に、次いで、前記比較に基づいて、そのバイオメトリックパラメータに対して、スコア（すなわち、０から１００などのあらゆる整数であり得る数）を割り当てる。
【０２０２】
あるいは、上記スコアリング法を使用することに代えて、重み付けされたスコアリング法を使用することができる。重み付けされたスコアリング法が使用されるのであれば、検査試料中の各バイオマーカーの量が定量されたら、次いで、検査試料中の検出された各バイオマーカーの量を、その特異的バイオマーカーに対する多数の所定のカットオフと比較する。利用可能な異なる所定のカットオフの全てから、次いで、単一のスコア（すなわち、０から１００などのあらゆる整数であり得る数）がそのバイオマーカーに割り当てられる。この重み付けされたスコアリング法は、１つ又はそれ以上のバイオメトリックパラメータとともに使用することもできる。
【０２０３】
定量されたバイオマーカーの各々に対して、および必要に応じて、対象から得られた何れかのバイオメトリックに対してスコアが割り当てられたら、対象に対する合計スコアを得るために、各バイオマーカー又は各バイオマーカーと各バイオメトリックパラメータに対するスコアを合わせる。次いで、この合計スコアを所定の合計スコアと比較する。この比較に基づいて、対象が肺癌のリスクを有するか否かの決定を行うことができる。対象が肺癌を発症するリスクを有するかどうかという決定は、合計スコアが所定の合計スコアより高い又はより低いか否かを基礎とし得る。例えば、所定の合計スコアに対して割り当てられた値に応じて、所定の合計スコアより高い合計スコアを有する対象はより高いリスクを有すると考えることができ、従って、さらなる検査又は追跡手続きを受け得る。この方法において使用されるべき所定の合計スコア（あるいは、本明細書において「閾値」と称される。）は、バイオマーカーに対する所定のスコアに関して上述されている同じ技術を用いて決定することができる。例えば、図５は、３つのＲＯＣ曲線を与える。これらのＲＯＣ曲線の各々は組み合わされたマーカーの単一の出力を表すが、単一のマーカーは類似のＲＯＣ曲線を与える。ＲＯＣ曲線は、一方の末端における低い感受性および低い偽陽性率（１−特異性）から他方の末端における高い感受性および高い偽陽性率まで広がる。これら２つの末端の間の曲線の形状は、著しく変動し得る。方法が少なくとも９０％の感受性を有することが必要とされるのであれば、図５に示されているＲＯＣ曲線に基づいて、選択された曲線に応じて、偽陽性率は６０から７０％である。前記方法がせいぜい１０％の偽陽性率を有することが必要とされるのであれば、選択された曲線に応じて、感受性は、４０から５５％である。これらの方法の何れもがマーカーの同一パネルから得られるものであるが、異なる臨床成績特性を与えるために、パネルの閾値（又は所定の合計スコア）は変更されている。計算のために、ＲＯＣ曲線上の各点の下に位置するのは、データ範囲の一方末端からデータ範囲の他方末端までを移動する閾値（又は所定の合計スコア）である。閾値（又は所定の合計スコア）がデータ範囲の小さい末端に位置する場合には、全ての試料は陽性であり、これは、高い感受性と高い偽陽性率を有する点をＲＯＣ曲線上に与える。閾値（又は所定の合計スコア）がデータ範囲の高い末端に位置する場合には、全ての試料は陰性であり、これは、低い感受性と低い偽陽性率を有する点をＲＯＣ曲線上に与える。しばしば、方法は、感受性の最低レベル（すなわち、９０％）、特異性の最低レベル（すなわち、９０％）又は両方などの所望の臨床特性を有することが必要とされる。マーカーの閾値（又は所定の合計スコア）を変化させることは、所望の臨床的特性を達成させるのに役立ち得る。
【０２０４】
（ａ）パネル中の各バイオマーカーの量を所定のカットオフ（又は重み付けされたスコアリング法が使用される場合には、多数の所定のカットオフ）と比較し、該比較に基づいて各バイオマーカーに対してスコア（又は重み付けされたスコアリング法が使用される場合には、多数の可能なスコアのうちの１つから得たスコア）を割り当て、対象に対する合計スコアを得るために、パネル中の各バイオメトリックパラメータに対する割り当てられたスコアを合わせ、合計スコアを所定の合計スコアと比較し、および所定のスコアとの合計スコアの比較に基づいて、対象が肺癌のリスクを有するかどうかを決定する上記の工程、又は（ｂ）少なくとも１つのバイオメトリックパラメータの値を各バイオメトリックパラメータに対する所定のカットオフ（重み付けされたスコアリング法が使用される場合には、多数の所定のカットオフ）に対して比較し、該比較に基づいて各バイオメトリックパラメータに対してスコア（又は重み付けされたスコアリング法が使用される場合には、多数の可能なスコアのうちの１つから得たスコア）を割り当て、パネル中の各バイオマーカーの量を所定のカットオフと比較し、該比較に基づいて、各バイオマーカーに対してスコアを割り当て、対象に対して合計スコアを得るために、各バイオメトリックパラメータに対する割り当てられたスコアを定量された各バイオマーカーに対する割り当てられたスコアと合算すること、合計スコアを所定の合計スコアと比較し、所定のスコアとの合計スコアの比較に基づいて、対象が肺癌のリスクを有するかどうかを決定する上記工程は、ヒトによるなど手動で実施することができ、又は入力、記憶、演算処理、ディスプレイおよび出力装置などの必要なハードウェアと一緒に、完全に若しくは部分的に、コンピュータプログラム又はアルゴリズムによって実施することができる。
【０２０５】
単なる例示として、本発明の方法をどのようにして実施できるかという例をここに記載する。この例において、８つのバイオマーカーを含むパネルと分離およびスコア法を用いて、患者が肺癌を有する確率を決定するために、患者を検査する。パネル中のバイオマーカーは、サイトケラチン１９、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＳＣＣ、プロＧＲＰおよびサイトケラチン１８である。このパネルに対する所定の合計スコア（又は閾値）は３である。検査試料を患者から得た後、患者の検査試料中の８つのバイオマーカー（サイトケラチン１９、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＳＣＣ、プロＧＲＰおよびサイトケラチン１８）の各々の量を定量する。この実施例において、検査試料中の８つのバイオマーカーの各々の量は、サイトケラチン１９：１．９５、ＣＥＡ：２．７５、ＣＡ１２５：１５．２６、ＣＡ１５−３：１１．９２、ＣＡ１９−９：９．２４、ＳＣＣ：１．０６、プロＧＲＰ：２５．２９およびサイトケラチン１８：６１．１３であると測定される。次いで、これらのバイオマーカーの各々の量を対応する所定のカットオフ（又は分離点）と比較する。バイオマーカーの各々に対する所定のカットオフは、サイトケラチン１９：１．８９、ＣＥＡ：４．８２、ＣＡ１２５：１３．６５、ＣＡ１５−３：１３．０７、ＣＡ１９−９：１０．８１、ＳＣＣ：０．９２、プロＧＲＰ：１４．６２およびサイトケラチン１８：５７．３７である。その対応する所定のカットオフ（分離点）より高い量を有する各バイオマーカーに対して、１のスコアを与え得る。その対応する所定のカットオフ以下の量を有する各バイオマーカーに対して、０のスコアを与え得る。従って、前記比較に基づき、各バイオマーカーには、以下のようなスコアが割り振られる。サイトケラチン１９：１、ＣＥＡ：０、ＣＡ１２５：１、ＣＡ１５−３：０、ＣＡ１９−９：０、ＳＣＣ：１、プロＧＲＰ：１およびサイトケラチン１８：１。次いで、患者に対する合計スコアを得るために、８つのバイオマーカーの各々に対するスコアを（すなわち、バイオマーカーのスコアの各々を一緒に加算することによって）数学的に合算する。患者に対する合計スコアは５である（合計スコアは、以下のように１＋０＋１＋０＋０＋１＋１＋１＝５として計算される。）。患者に対する合計スコアを所定の合計スコア（３である。）と比較する。３の所定の合計スコアより大きい合計スコアは、患者に対する陽性の結果を示唆する。３以下の合計スコアは、患者に対する陰性の結果を示唆する。この例では、患者の合計スコアが３より大きいので、患者は陽性結果を有すると考えられ、従って、肺癌の兆候又は疑いに対するさらなる検査を受ける。これに対して、仮に患者の合計スコアが２であるとすると、患者は陰性結果を有すると考えられ、さらなる検査を一切受けない。
【０２０６】
さらなる例では、上記８バイオマーカーパネルが再び使用されるが、この例では、重み付けられたスコアリング法を使用する。この例では、パネルに対する所定の合計スコア（又は閾値）は１１．２であり、検査試料中の定量されるバイオマーカーの量は上記と同じである。次いで、バイオマーカーの各々の量をバイオマーカーの各々に対する３つの異なる所定のカットオフと比較する。例えば、バイオマーカーの各々に対する所定のカットオフが、以下の表Ａ中に挙げられている。
【０２０７】
【表１】
0005611821.tif 000003
【０２０８】
従って、４つの可能なスコアが、各バイオマーカーに対して付与され得る。定量された各バイオマーカーの量を、上記表Ａに挙げられている所定のカットオフ（分離点）と比較する。例えば、ＣＥＡに関しては、検査試料中の定量されるＣＥＡの量が２．７５であったので、表Ａ中の５０％特異性に対する２．０２および７５％特異性に対する３．３の所定のカットオフの間にある。従って、ＣＥＡには、２．６８のスコアが割り当てられる。同様に評価される残りのバイオマーカーに対してこれを反復し、それぞれに、以下のスコアが割り当てられる。サイトケラチン１８：２．６、プロＧＲＰ：４．９６、ＣＡ１５−３：０、ＣＡ１２５：０、ＳＣＣ：２．４８、サイトケラチン１９：８．４およびＣＡ１９−９：０。次いで、患者に対する合計スコアを得るために、８つのバイオマーカーの各々に対するスコアを（すなわち、バイオマーカーのスコアの各々を一緒に加算することによって）数学的に合算する。患者に対する合計スコアは２１．１２である（合計スコアは、以下のように２．６８＋２．６＋４．９６＋０＋０＋２．４８＋８．４＋０＝２１．１２として計算される。）。患者に対する合計スコアを所定の合計スコア（１１．２である。）と比較する。１１．２の所定の合計スコアより大きい合計スコアは、患者に対する陽性の結果を示唆する。１１．２以下の合計スコアは、患者に対する陰性の結果を示唆する。この例では、患者の合計スコアが１１．２より大きかったので、患者は陽性結果を有すると考えられ、従って、肺癌の兆候又は疑いに対するさらなる検査を受ける。
【０２０９】
さらに、別の実施形態において、本明細書中に記載されている重み付けされたスコアリング法は、対象から得られた１つ又はそれ以上のマーカーにスコア付けするために使用することもできる。好ましくは、１つ若しくはそれ以上のバイオマーカー、１つ若しくはそれ以上のバイオメトリックパラメータ又はバイオマーカーとバイオメトリックパラメータの組み合わせであるかどうかを問わず、このようなマーカーは、対象が癌又は他の何らかの疾病などの医学的症状を発症するリスクを有するかどうかを診断又は評価する上での補助として使用することができる。重み付けされたスコアリング法は、対象がこのような医学的症状に対するリスクを有するかどうかを評価するために、マーカーが使用され又は使用されることができるあらゆる医学的症状に関して広く使用することができる。このような方法は、以下の工程を含むことができる。
【０２１０】
ａ．対象から得られた検査試料中において、少なくとも１つのマーカーの量を定量すること；
ｂ．定量された各マーカーの量を前記マーカーに対する多数の所定のカットオフと比較し、該比較に基づいて、各マーカーに対してスコアを割り当てること；および
ｃ．前記対象に対する合計スコアを得るために、工程ｂにおいて定量された各マーカーに対して割り当てられたスコアを合算すること。
【０２１１】
好ましくは、前記方法は、以下の工程を含む。
【０２１２】
ａ．対象から得られた検査試料中において、少なくともマーカーの量を定量すること；
ｂ．定量された各マーカーの量を前記マーカーに対する多数の所定のカットオフと比較し、該比較に基づいて、各マーカーに対してスコアを割り当てること；
ｃ．前記対象に対する合計スコアを得るために、工程ｂにおいて定量された各マーカーに対して割り当てられたスコアを合算すること；
ｄ．工程ｃにおいて決定された合計スコアを所定の合計スコアと比較すること；および
ｅ．工程ｄにおいて決定された合計スコアの比較に基づいて、前記対象が医学的症状を発症するリスクを有するかどうかを決定すること。
【０２１３】
ＤＦＩ
本明細書中に前述されているように、出願人は、１つ若しくはそれ以上のバイオマーカー又はバイオマーカーとバイオメトリックパラメータの組み合わせの検出および定量が患者中の肺癌を診断する上での補助として有用であることを見出した。さらに、出願人は、本明細書中に記載されている１つ又はそれ以上のバイオマーカーおよび１つ又はそれ以上のバイオマーカーと１つ又はそれ以上のバイオメトリックパラメータの組み合わせが、肺癌に対して、約０．５未満、好ましくは約０．４未満、より好ましくは約０．３未満、さらに好ましくは約０．２未満のＤＦＩを有する。表２５から２９は、約０．５未満、約０．４未満、約０．３未満および約０．２未満であるＤＦＩを示す様々なバイオマーカー又はバイオマーカーとバイオメトリックパラメータの組み合わせを含有するパネルの例を与える。
【０２１４】
キット
１つ又はそれ以上のバイオマーカー、免疫反応性サイクリンＥ２ポリペプチドの１つ又はそれ以上、バイオメトリックパラメータおよびこれらのあらゆる組み合わせが、本発明の方法を実施する上で使用するためのキット（パネルなど）の形成に適している。一態様において、キットは、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５又はこれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチドを含むことができる。
【０２１５】
別の態様において、キットは、抗サイクリンＥ２又はそのあらゆる組み合わせを含むことができる。
【０２１６】
さらなる態様において、キットは、（ａ）検査試料中の１つ又はそれ以上の抗原を定量するための少なくとも１つの抗体を含有する試薬（前記抗原は、サイトケラチン８、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＳＣＣ、ＣＡ１９−９、プロＧＲＰ、血清アミロイドＡ、α−１−アンチトリプシン、アポリポタンパク質ＣＩＩＩおよびＴβ４である。）、（ｂ）検査試料中の少なくとも１つの抗体を定量するための１つ又はそれ以上の抗原を含有する試薬（前記抗体は、抗ｐ５３、抗ＴＭＰ２１、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１、抗ＨＤＪ１、抗ＮＰＣ１Ｌ１Ｃドメイン、抗ＴＭＯＤ１、抗ＣＡＭＫ１、抗ＲＧＳ１、抗ＰＡＣＳＩＮ１、抗ＲＣＶ１、抗ＭＡＰＫＡＰＫ３および抗サイクリンＥ２である。）、並びに必要に応じて、（ｃ）検査試料中の定量された各抗原および抗体の量を合計し、所定のカットオフに対して（又は多数の所定のカットオフに対して）比較すること、並びに該比較に基づいて、各抗原および抗体に対するスコア（又は可能な多数のスコアの１つから得られたスコア）を割り当てる工程、合計スコアを得るために、定量された各抗原および抗体に対する割り当てられたスコアを合算する工程、合計スコアを所定の合計スコアと比較する工程および対象が肺癌を有するかどうかを決定する上での補助として前記比較を使用する工程を実施するための１つ又はそれ以上のアルゴリズム又はコンピュータプログラムを含み得る。あるいは、１つ又はそれ以上のアルゴリズム又はコンピュータプログラムに代えて、ヒトが手動で上記工程を実施するための１つ又はそれ以上の指示書を提供することができる。
【０２１７】
さらに別の態様において、キットは、（ａ）検査試料中の１つ又はそれ以上の抗原を定量するための少なくとも１つの抗体を含有する試薬（前記抗原は、サイトケラチン８、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＳＣＣ、ＣＡ１９−９、プロＧＲＰ、血清アミロイドＡ、α−１−アンチトリプシン、アポリポタンパク質ＣＩＩＩおよびＴβ４である。）、（ｂ）検査試料中の少なくとも１つの抗体を定量するための１つ又はそれ以上の抗原を含有する試薬（前記抗体は、抗ｐ５３、抗ＴＭＰ２１、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１、抗ＨＤＪ１、抗ＮＰＣ１Ｌ１Ｃドメイン、抗ＴＭＯＤ１、抗ＣＡＭＫ１、抗ＲＧＳ１、抗ＰＡＣＳＩＮ１、抗ＲＣＶ１、抗ＭＡＰＫＡＰＫ３および抗サイクリンＥ２である。）、（ｃ）ＡＣＮ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｔｆａ６４５３およびＨｉｃ３９５９からなる群から選択される１つ又はそれ以上の関心領域を定量するための試薬；並びに、必要に応じて、（ｄ）検査試料中の定量された各抗原、抗体および関心領域の量を合算し、所定のカットオフに対して（又は多数の所定のカットオフに対して）比較すること、並びに該比較に基づいて、定量された各抗原、抗体および関心領域に対するスコア（又は可能な多数のスコアの１つから得られたスコア）を割り当てる工程、合計スコアを得るために、定量された各抗原、抗体および関心領域に対する割り当てられたスコアを合算する工程、合計スコアを所定の合計スコアと比較する工程および対象が肺癌を有するかどうかを決定する上での補助として前記比較を使用する工程を実施するための１つ又はそれ以上のアルゴリズム又はコンピュータプログラムを含み得る。あるいは、１つ又はそれ以上のアルゴリズム又はコンピュータプログラムに代えて、ヒトが手動で上記工程を実施するための１つ又はそれ以上の指示書を提供することができる。１つ又はそれ以上の関心領域を定量するためのキット中に含まれる試薬には、パネル中に含有される少なくとも１つの関心領域を結合および保持する吸着物質、該吸着物質と一緒に使用される固体支持体（ビーズなど）、１つ又はそれ以上の検出可能な標識などが含まれ得る。吸着物質は、金属キレート、陽イオン性の基、陰イオン性の基、疎水性の基、抗原および抗体などの分析的化学および免疫化学において使用される多くの吸着物質の何れでもあり得る。さらに別の態様において、キットは、（ａ）検査試料中の１つ又はそれ以上の抗原を定量するための少なくとも１つの抗体を含有する試薬（前記抗原は、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＣＡ１５−３、ＣＡ１２５、ＳＣＣおよびプロＧＲＰである。）、（ｂ）ＡＣＮ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｔｆａ６４５３およびＨｉｃ３９５９からなる群から選択される１つ又はそれ以上の関心領域を定量するための試薬；並びに、必要に応じて、（ｃ）検査試料中の定量された各抗原および関��領域の量を合算し、所定のカットオフに対して（又は多数の所定のカットオフに対して）比較すること、並びに該比較に基づいて、定量された各抗原および関心領域に対するスコア（又は可能な多数のスコアの１つから得られたスコア）を割り当てる工程、合計スコアを得るために、定量された各抗原および関心領域に対する割り当てられたスコアを合算する工程、合計スコアを所定の合計スコアと比較する工程および対象が肺癌を有するかどうかを決定する上での補助として前記比較を使用する工程を実施するための１つ又はそれ以上のアルゴリズム又はコンピュータプログラムを含み得る。あるいは、１つ又はそれ以上のアルゴリズム又はコンピュータプログラムに代えて、ヒトが手動で上記工程を実施するための１つ又はそれ以上の指示書を提供することができる。１つ又はそれ以上の関心領域を定量するためのキット中に含まれる試薬には、パネル中に含有される少なくとも１つの関心領域を結合および保持する吸着物質、該吸着物質と一緒に使用される固体支持体（ビーズなど）、１つ又はそれ以上の検出可能な標識などが含まれ得る。好ましくは、キットは、以下の抗原および関心領域を定量するための必要な試薬を含有する。（ａ）サイトケラチン１９およびＣＥＡおよびＡｃｎ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９およびＴｆａ２７５９；（ｂ）サイトケラチン１９およびＣＥＡおよびＡｃｎ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、Ｔｆａ２７５９およびＴｆａ９１３３；並びに（ｃ）サイトケラチン１９、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＳＣＣ、サイトケラチン１８およびプロＧＲＰおよびＡＣＮ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９およびＴｆａ２７５９を含有する。
【０２１８】
別の態様において、キットは、（ａ）検査試料中の１つ又はそれ以上の抗原を定量するための少なくとも１つの抗体を含有する試薬（前記抗原は、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＣＡ１５−３、ＣＡ１２５、ＳＣＣおよびプロＧＲＰである。）、並びに必要に応じて、（ｂ）検査試料中の定量された各抗原の量を合算し、所定のカットオフに対して（又は多数の所定のカットオフに対して）比較すること、並びに該比較に基づいて、定量された各抗原に対するスコア（又は可能な多数のスコアの１つから得られたスコア）を割り当てる工程、合計スコアを得るために、定量された各抗原に対する割り当てられたスコアを合算する工程、合計スコアを所定の合計スコアと比較する工程および対象が肺癌を有するかどうかを決定する上での補助として前記比較を使用する工程を実施するための１つ又はそれ以上のアルゴリズム又はコンピュータプログラムを含み得る。あるいは、１つ又はそれ以上のアルゴリズム又はコンピュータプログラムに代えて、ヒトが手動で上記工程を実施するための１つ又はそれ以上の指示書を提供することができる。キットは、１つ又はそれ以上の検出可能な標識も含有し得る。好ましくは、キットは、以下の抗原、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＣＡ−１５−３、ＣＡ１２５、ＳＣＣおよびプロＧＲＰを定量するために必要な試薬を含有する。
【０２１９】
別の態様において、キットは、（ａ）１つ又はそれ以上のバイオマーカーを定量するための試薬（前記バイオマーカーは、ＡＣＮ９４５９、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ４７８９、ＴＦＡ２７５９、ＴＦＡ９１３３、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｔｆａ６４５３およびＨｉｃ３９５９からなる群から選択される関心領域である。）、並びに必要に応じて、（ｂ）検査試料中の定量された各バイオマーカーの量を合算し、所定のカットオフに対して（又は多数の所定のカットオフに対して）比較すること、並びに該比較に基づいて、定量された各バイオマーカーに対するスコア（又は可能な多数のスコアの１つから得られたスコア）を割り当てる工程、合計スコアを得るために、定量された各バイオマーカーに対する割り当てられたスコアを合算する工程、合計スコアを所定の合計スコアと比較する工程および対象が肺癌を有するかどうかを決定する上での補助として前記比較を使用する工程を実施するための１つ又はそれ以上のアルゴリズム又はコンピュータプログラムを含み得る。あるいは、１つ又はそれ以上のアルゴリズム又はコンピュータプログラムに代えて、ヒトが手動で上記工程を実施するための１つ又はそれ以上の指示書を提供することができる。好ましくは、キット中の定量すべき関心領域は、Ｐｕｂ１１５９７、Ｐｕｂ３７４３、Ｐｕｂ８６０６、Ｐｕｂ４４８７、Ｐｕｂ４８６１、Ｐｕｂ６７９８、Ｔｆａ６４５３およびＨｉｃ３９５９からなる群から選択される。１つ又はそれ以上の関心領域を定量するためのキット中に含まれる試薬には、パネル中に含有される少なくとも１つの関心領域を結合および保持する吸着物質、該吸着物質と一緒に使用される固体支持体（ビーズなど）、１つ又はそれ以上の検出可能な標識などが含まれ得る。
【０２２０】
さらに別の態様において、キットは、（ａ）検査試料中の１つ又はそれ以上の抗原を定量するための１つ又はそれ以上の抗体を含有する試薬（前記抗原は、サイトケラチン１９、ＣＥＡ、ＣＡ１２５およびプロＧＲＰである。）；（ｂ）検査試料中の少なくとも１つの抗体を定量するための１つ又はそれ以上の抗原を含有する試薬（前記抗体は、抗ｐ５３、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１、抗−ＭＡＰＫＡＰＫ３および抗サイクリンＥ２である。）、並びに必要に応じて、（ｃ）検査試料中の定量された各抗原、抗体および関心領域の量を合算し、所定のカットオフに対して（又は多数の所定のカットオフに対して）比較すること、並びに該比較に基づいて、定量された各抗原、抗体および関心領域に対するスコア（又は可能な多数のスコアの１つから得られたスコア）を割り当てる工程、合計スコアを得るために、定量された各抗原、抗体および関心領域に対する割り当てられたスコアを合算する工程、合計スコアを所定の合計スコアと比較する工程および対象が肺癌を有するかどうかを決定する上での補助として前記比較を使用する工程を実施するための１つ又はそれ以上のアルゴリズム又はコンピュータプログラムを含み得る。あるいは、１つ又はそれ以上のアルゴリズム又はコンピュータプログラムに代えて、ヒトが手動で上記工程を実施するための１つ又はそれ以上の指示書を提供することができる。キットは、サイトケラチン１９、ＣＥＡ、ＣＡ１２５およびプロＧＲＰの各々を定量するための抗体、抗ｐ５３、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１、抗ＭＡＰＫＡＰＫ３および抗サイクリンＥ２の各々を定量するための抗原又はサイトケラチン１９、ＣＥＡ、ＣＡ１２５およびプロＧＲＰの各々を定量するための抗体および抗ｐ５３、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１、抗ＭＡＰＫＡＰＫ３および抗サイクリンＥ２の各々を定量するための抗原を含有し得る。
【０２２１】
バイオマーカーの同定
本発明のバイオマーカーは、当業者に周知の技術によって、単離し、精製し、および同定することができる。これらには、クロマトグラフィー、電気泳動および遠心技術が含まれる。これらの技術は、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ）  （２００２）」および「Ｈａｒｒｉｓ，  Ｅ．Ｌ．Ｖ．，  Ｓ．  Ａｎｇａｌ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ（１９９０）」およびその他の文献に論述されている。
【０２２２】
限定ではなく、例として、本発明の実施例をここに記載する。
【０２２３】
実施例
患者の血清の臨床的試料を集め（実施例１）、イムノアッセイ抗原マーカーに関して（実施例２）、ビーズ（実施例３）又はスライド（実施例４）を用いたイムノアッセイ抗体マーカーに関して、並びに質量分析によって同定されたバイオマーカーに関して（実施例５）分析した。様々なアルゴリズムを用いて、同定されたマーカーを並べ替え、優先順位を決定した（実施例６）。臨床的有用性を評価するための予想モデルを同定するために（実施例８）スコアリング法（実施例７）を用いて、これらの優先順位が決定されたマーカーを組み合わせた。肺癌を有することが疑われる患者中の肺癌の検出を補助する方法の使用例が、実施例９に例示されている。組成および正体を決定するために、質量分析の関心領域によって同定されたバイオマーカーを分析した（実施例１０）。実施例１１は、イムノアッセイ技術および免疫質量分析技術を用いて、本発明に従って同定されたバイオマーカーをどのようにして検出および測定できるかについて記載する予見的な実施例である。
【実施例１】
【０２２４】
臨床試料
治験審査委員会によって承認されたプロトコールに基づいて、患者血清の臨床試料を集めた。試料を提供した全ての対象は、試料を収集され、このプロジェクトにおいて使用されることに関して、インフォームドコンセントを与えた。血清試料を血清分離管の中に引き込み、室温で１５分間、凝血させた。凝血塊を遠心して沈降させ、試料を２ｍＬへ分注した。２４時間以内に、試料を−８０℃で凍結させ、さらなる加工処理を行うまで、その温度に維持した。受領した時点で、試料を融解し、便宜のために、より小さな容量へ再び分取し、再度凍結した。次いで、分析の直前に、試料を最後に融解した。従って、セット中の全ての試料は、分析前に、２回凍結および融解された。
【０２２５】
合計７５１の試料を収集し、分析した。グループは、肺癌患者であることが確認された２５０の生検、良性肺疾患患者であることが確認された２７４の生検および正常と思われる被験者２２７から構成された。癌および良性患者は全て、診断において、確定的な生検によって確認された。正常な被験者には、このような確定的な診断操作を行わず、明確な悪性疾患が存在しないことによって、「正常」と判断された。この確定的診断操作の後、５０歳以上の年齢の患者のみを次いで選択した。この選択後、癌２３１人、良性１８２人および正常１５５人が残った。癌、良性肺疾患および正常と思われる対象のこの大きなコホートは、以下で、「大きなコホート」と総称される。良性肺疾患と肺癌の間での識別に関して焦点を当てるために、大きなコホートのサブセットを使用した。以下で「小さなコホート」と称されるこのコホートは、癌１３８人、良性１０６人および正常と思われる対象１３人からなった。「大きなコホート」から「小さなコホート」を取り除いた後、癌１０７人、良性７４人および正常と思われる対象１４２人が残った。このコホート（以下、「検証コホート」と称される。）は小さなコホートとは独立しており、作製された予想モデルを検証するために使用した。上記のように調製された臨床的試料を実施例２から１０において使用した。
【実施例２】
【０２２６】
バイオマーカーのイムノアッセイの検出
Ａ．Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，  ＩＬ，  ｈｅｒｅｉｎａｆｔｅｒ「Ａｂｂｏｔｔ」）ＡｒｃｈｉｔｅｃｔＴＭアッセイ
以下の抗原に対して、ＡｒｃｈｉｔｅｃｔＴＭキットを獲得した。ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＳＣＣ、ＣＡ１９−９およびＣＡ１５−３。全てのアッセイは、製造業者の指示に従って実行した。試料中の分析物の濃度は、ＡｒｃｈｉｔｅｃｔＴＭ装置によって与えられた。これらの濃度は、下表１中に示されているＡＵＣデータを作製するために使用した。
【０２２７】
【表２】
0005611821.tif 000004
【０２２８】
Ｂ．Ｒｏｃｈｅ  ＥｌｅｃｓｙｓＴＭアッセイ
製造業者の指示書に従って、ＥｌｅｃｓｙｓＴＭ２０１０システム（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ，  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）に対して、Ｃｙｆｒａ２１−１（サイトケラチン１９、ＣＫ−１９）測定を行った。Ｃｙｆｒａ２１−１の濃度は、ＥｌｅｃｓｙｓＴＭ装置によって与えられた。大きなコホートと小さなコホートに対するデータとＡＵＣを用いてＲＯＣ曲線を作成し、下表２中に報告されている。
【０２２９】
【表３】
0005611821.tif 000005
【０２３０】
Ｃ．マイクロタイタープレートアッセイ
以下のＥＬＩＳＡキットを購入した。Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｉｎｃ．  （Ｊａｐａｎ）からプロＧＲＰ、ＩＤＬ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ（Ｂｒｏｍｍａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）からＴＰＳ（サイトケラチン１８、ＣＫ−１８）およびＩＢＬ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  （Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，  ＭＮ，  ＵＳＡ）からパラインフルエンザ１／２／３  ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ。アッセイは、製造業者の指示に従って実行した。分析物の濃度は、製造業者のプロトコール中に指示され、提供された計算から求めた。各アッセイに対して得られたＡＵＣが、下表３に示されている。
【０２３１】
【表４】
0005611821.tif 000006
【実施例３】
【０２３２】
自己抗体ビーズアレイ
Ａ．市販のヒトタンパク質（表４、下記参照）をＬｕｍｉｎｅｘＴＭＳｅｒｏＭａｐＴＭビーズ（Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ）に付着させ、試薬を調製するために、各ビーズセットを合わせた。存在する全ての抗体がタンパク質に結合できる条件下で、試薬の一部をヒト血清試料に曝露させた。結合していない物質を洗浄除去し、次いで、ヒトＩｇＧに特異的に結合する抗体に連結されたＲ−フィコエリトリンの蛍光性連結物へビーズを曝露させた。洗浄後、ビーズの内部色素に従って各ビーズを特定するＬｕｍｉｎｅｘＴＭ１００装置にビーズを通過させ、ビーズに結合された蛍光（ビーズに結合された抗体の量に対応する。）を測定した。このようにして、２１のヒトタンパク質および対照用の７つの非ヒトタンパク質（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および破傷風トキシン）に対する７７２の試料（肺癌２５１、正常２４４、良性２７７）の免疫応答を評価した。
【０２３３】
抗原ＭＵＣ−Ｉ（Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＩＮＣ，  Ｍａｌｖｅｒｎ，  ＰＡ）、サイトケラチン１９（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，  Ｓａｃｏ，  ＭＥ）およびＣＡ−１２５（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，  Ｓａｃｏ，  ＭＥ）を、細胞培養のイオン交換画分として取得した（表４参照、以下）。０．４ｍＬ／分で移動相＝ＰＢＳとともに、サイズ排除カラム（ＢｉｏＲａｄ  ＳＥＣ−２５０，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）を用いるＨＰＬＣを使用して、これらの相対的に未精製の調製物を分子量によるさらなる分画に供した。１５分に開始して、各抗原に対して１分ずつ、各抗原に対して合計２３の画分に対して、画分を集めた。ＭＵＣ−Ｉに関しては、２５０μＬを注入し、サイトケラチンおよびＣＡ−１２５に関しては、１５０μＬを注入した。３つの試料全てが、より低い分子量の物質の高い濃度を示唆する、高すぎて測定できない２４分より長い時点でのシグナルとともに、１５から２４分から溶出する、より高い分子量のタンパク質の様々な濃度を示すシグナルを示した。ビーズ上のコーティングに関しては、以下の画分を合わせた。ＭＵＣ−Ｉ−Ａ画分６，７；ＭＵＣ−Ｉ−Ｂ画分１０，１１；ＭＵＣ−Ｉ−Ｃ画分１２，１３；サイトケラチン１９−Ａ画分４，５；サイトケラチン１９−Ｂ画分８，９；サイトケラチン１９−Ｃ画分１６，１７；ＣＡ１２５−Ａ画分５，６；ＣＡ１２５−Ｂ画分１２，１３。
【０２３４】
【表５】
0005611821.tif 000007
【０２３５】
Ｂ．抗原を有するＬｕｍｉｎｅｘＳｅｒｏＭａｐＴＭビーズのコーティング
Ｏｍｅｇａ１０Ｋ限外ろ過プレート（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，  Ｍｉｃｈｉｇａｎ）のウェルに、水５０μＬを添加した。１０分後、プレートを真空上に配置した。ウェルが空になったら、水分を保持するために水１０μＬを添加した。５ｍＭモルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）ｐＨ５．６の５０から１００μＬ、表記されているＬｕｍｉｎｅｘＴＭＳｅｒｏＭＡＰＴＭビーズ５０μＬおよび表４中に示されている各抗原１０から２０μｇに対応する適切な容量を各ウェルに添加した。ピペットで、ビーズを懸濁した。ビーズに、ＥＤＡＣ（５ｍＭＭＥＳｐＨ５．６の１．０ｍＬ中２．０ｍｇ）１０μＬを添加した。プレートに蓋い、暗所で振盪装置上に置いた。１４時間後、プレートを真空によって吸引し、水で洗浄し、最後に、２０ｍＭトリエタノールアミン（ＴＥＡ）ｐＨ５．６の５０μＬ中にビーズを再懸濁した。暗所で、振盪装置によってプレートを撹拌した。各ウェルに、ＥＤＡＣ（５ｍＭＭＥＳｐＨ５．６の１．０ｍＬ中２．０ｍｇ）１０μＬをさらに添加し、暗所で１時間、プレートを振盪装置上に配置した。洗浄後、１％ＢＳＡおよび０．０８％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ緩衝液（ＰＢＮ）２００μＬを各ウェルに添加した後、プローブとともに音波処理し、暗所に配置した。
【０２３６】
Ｃ．被覆されたビーズでの血清試料の検査
マイクロプレート当り８０の試料を用いて、ＰＢＮ中へ１：２０希釈して、血清試料をマイクロプレート中に調製した。上記ビーズセット５０μＬに、（ここで検査されている抗原とは無関係の抗原で免疫されたウサギから得た）ウサギ血清５μＬを添加した。ビーズセットを渦巻き撹拌し、３７℃に配置した。３５分後、５％ウサギ血清および１％ＣＨＡＰＳ（ＢＲＣ）を含有するＰＢＮ１ｍＬを添加した。ビーズセットを渦巻き撹拌し、遠心によって沈殿させ、ＢＲＣ１．０５ｍＬ中に再懸濁した。Ｓｕｐｏｒ１．２μフィルタープレート（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のウェルをＰＢＮ１００μＬで洗浄した。各ウェルに、ＢＲＣ５０μＬ、それぞれ１：２０の血清試料１０μＬおよび再懸濁されたビーズ１０μＬを添加した。暗所にて室温で１時間、プレートを振盪し、ろ過し、次いで、ＢＲＣ１００μＬで１０分間、３回洗浄した。（ＢＲＣ５．０ｍＬ中のＲＰＥ抗ヒトＩｇＧ２０μＬ）の検出連結物５０μＬを添加し、ピペットによって、ビーズを再懸濁した後、プレートを暗所で３０分間振盪させた。次いで、ＢＲＣ１００μＬを添加し、ピペットによってビーズを撹拌し、ＬｕｍｉｎｅｘＴＭ１００装置上で試料を分析した。
【０２３７】
ＲＯＣ分析によって、結果（各試料および抗原に対するビーズの中央値強度）を評価し、大きなコホートおよび小さなコホートに対する以下の結果が、下表５に示されている。
【０２３８】
【表６】
0005611821.tif 000008
【実施例４】
【０２３９】
自己抗体スライドアレイ
Ａ．抗原の調製
ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＵｌｔｉｍａｔｅＯＲＦＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  ＮＹ）から得られた約５，０００のタンパク質を、完全長ヒトタンパク質とのグルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）配列の組換え融合物として調製した。ＧＳＴタグによって、タンパク質の他の特徴とは独立して、アレイに結合された各タンパク質の量を評価することが可能となった。
【０２４０】
Ｂ．スライドの抗原コーティング
ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙは、上記の約５，０００タンパク質が点状に付与されたニトロセロロースで被覆されたガラス表面（スライド）および数多くの調節機構からなる。
【０２４１】
Ｃ．被覆されたスライドでの血清試料の検査
まず、４℃で１時間、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０でアレイをブロックした。次いで、これを、４℃で９０分間、プロファイリング緩衝液（本明細書中に論述されている「プロファイリング緩衝液」は、ＰＢＳ、５ｍＭＭｇＣｌ２、０．５ｍＭジチオスレイトール、０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５％グリセロール、１％ＢＳＡを含有した）中の１：１２０希釈された血清試料に曝露した。次いで、洗浄ごとに８分間、プロファイリング緩衝液でアレイを３回洗浄した。次いで、４４℃で９０分間、プロファイリング緩衝液中において、０．５μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒが連結された抗ヒトＩｇＧにアレイを曝露した。次いで、洗浄ごとに８分間、プロファイリング緩衝液でアレイを３回洗浄した。遠心装置上で乾燥させた後、Ａｘｏｎ  ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂ蛍光マイクロアレイスキャナ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）を用いて走査した。
【０２４２】
Ｄ．バイオマーカーの選択
正常な患者から得られた血清の陽性シグナルの分布と癌患者から得られた血清の陽性シグナル分布を比較することによって、癌患者に特徴的な自己抗体を示すタンパク質の正体を決定した。アレイの限られた数を用いて癌特異的自己抗体を発見する確率を増加させるために、試料の以下のプールを使用した。それぞれ４又は５人の肺癌患者から得られた血清を含有する１０のプール、それぞれ４又は５人の正常な患者から得られた血清を含有する１０のプール、それぞれ良性肺疾患を有する４又は５人の患者から得られた血清を含有する１０のプール。上記のように処理するために、これらのプールをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎに送った。各プールに対する各タンパク質に対応する蛍光強度をスプレッドシート中に与えた。各タンパク質は、２回提示された（アレイ上の２つ組みのスポットに対応する。）。
【０２４３】
あるタンパク質に関して免疫応答の癌特異性を評価するための１つのアルゴリズムでは、非癌試料のシグナル強度から癌試料のシグナル強度を最もよく区別するカットオフ値は製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって与えられた。このカットオフを上回る強度を有する各群からの試料の数（それぞれ、癌カウントおよび非癌カウント）を測定し、パラメータとして、スプレッドシート中に入力した。さらに、他の群と比べてある群のシグナルの増加が存在しない確率に相当するｐ値を計算した。次いで、非癌群中に陽性が最も少なく、癌群中に陽性が最も多いタンパク質が上位にくるように、データを並べ替え、ｐ値によって、低い方から高い方へさらに並べ替えた。この式による並べ替えによって、下表７中に与えられている以下の情報が得られた。
【０２４４】
【表７】
0005611821.tif 000009
0005611821.tif 000010
0005611821.tif 000011
【０２４５】
第二のアルゴリズムは、あるタンパク質に対する免疫応答の癌特異性を、非癌試料のシグナル強度の標準偏差によって除された、癌に対する平均シグナルと非癌に対する平均シグナル間の差として計算した。これには、強い免疫応答が弱い免疫応答より結果に大きな影響を与えるという利点がある。次いで、最も高い値を有するタンパク質が上位にくるように、データを並べ替える。この並べ替えによって同定された上位１００のリストが、下表８に示されている。
【０２４６】
【表８】
0005611821.tif 000012
0005611821.tif 000013
0005611821.tif 000014
【０２４７】
表７および８の並べ替えの結果を比較し、各タンパク質に対して癌および非癌試料によって生じたシグナルを調べることによって、下表９に示されている以下の２５のタンパク質をさらなる調査のために選択した。
【０２４８】
【表９】
0005611821.tif 000015
【０２４９】
Ｅ．サイクリンＥ２
サイクリンＥ２の２つの形態が、ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙＴＭ上に存在することが見出された。Ｇｅｎｂａｎｋ受付ＢＣ００７０１５．１（配列番号１）として同定された形態が癌試料のプールの幾つかと強い免疫反応性を示し、良性および正常（非癌）プールとずっと低い反応性を示した。これに対して、Ｇｅｎｂａｎｋ受付番号ＢＣ０２０７２９．１（配列番号２）として同定された形態は、癌又は非癌のプールされた試料の何れともほとんど反応性を示さなかった。以下に示されているように、２つの形態の配列の並置は、２５９アミノ酸にわたって同一性を示し、Ｎ末端およびＣ末端の両領域中が異なっていた。ＢＣ０２０７２９．１は、１１０個のアミノ酸をＮ末端に有しており、ＢＣ００７０１５．１中に存在しない７個のアミノ酸をＣ末端に有する。ＢＣ００７０１５．１は、ＢＣ０２０７２９．１中に存在しない３７のアミノ酸をＣ末端に有する。形態ＢＣ００７０１５．１のみが免疫反応性を示すので、これは、Ｃ末端の３７個のアミノ酸部分が原因である。
【０２５０】
ＢＣ００７０１５．１のＣ末端から２つのペプチドを合成した。Ｅ２−１（配列番号３）は、ＢＣ００７０１５．１のＣ末端の３７アミノ酸を含有する。Ｅ２−２（配列番号５）は、ＢＣ００７０１５．１のＣ末端の１８個のアミノ酸を含有する。担体タンパク質又は表面へ特定の共有結合に対する反応性部位を与えるために、両ペプチドは、Ｎ末端にシステインを含むように合成した。
【０２５１】
【化１】
0005611821.tif 000016
【０２５２】
【化２】
0005611821.tif 000017
【０２５３】
ＢＳＡをマレイミドで活性化した後に、ペプチドを結合することによって、ペプチドＥ２−１およびＥ２−２を、それぞれ、ＢＳＡに連結した。以下のプロトコールに従って、活性化されたＢＳＡを調製した。ＰＢＳ２００μＬ中のＢＳＡ８．０ｍｇに、ＤＭＦ２０μＬおよび１ＭトリエタノールアミンｐＨ８．４１０μＬ中のＧＭＢＳ１ｍｇ（Ｎ−（γ−マレイミド−ブチリルオキシ）スクシンイミド、Ｐｉｅｒｅｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を加えた。６０分後に、４００μＬの画分を集めながら、ＰＢＳ緩衝液を用いたＳｅｐｈａｄｅｘＧ５０カラムに混合物を通過させた。活性化されたＢＳＡ−Ｍａｌ（１００μＬ）に、ペプチドＥ２−１の２．５ｍｇ又はペプチドＥ２−２の３．２ｍｇを添加した。何れの場合にも、混合物を渦巻き撹拌し、氷の上に１５分間配置し、その後、混合物を室温に２５分間移動した。結合された産物ＢＳＡ−Ｍａｌ−Ｅ２−１（ＢＭ−Ｅ２−１）およびＢＳＡ−Ｍａｌ−Ｅ２−２（ＢＭ−Ｅ２−２）を、清浄化のために、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ５０カラムに通過させた。
【０２５４】
２つの方法を用いて、ＬｕｍｉｎｅｘＴＭ小球体に、タンパク質およびペプチドを結合した。第一の方法は、実施例１０Ｃに記載されており、「直接法」と称される。第二の方法は、「事前活性化法」と称され、以下のプロトコールを使用する。Ｏｍｅｇａ１０ｋ限外ろ過プレートのウェルに、水１００μＬを添加し、１０分後に、真空上に配置した。ウェルが空になった時点で、ＭＥＳ（１００ｍＭ）ｐＨ５．６の２０μＬおよびそれぞれＬｕｍｉｎｅｘＴＭＳｅｒｏＭａｐＴＭビーズセット５０μＬを下表１０に示されているように添加した。行１列Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ中のウェルに、並びに行２列Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ中のウェルに、ＭＥＳ中のＮＨＳ（２０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬおよびＭＥＳ中のＥＤＡＣ（１０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを添加した。暗所で４５分間振盪した後、緩衝液および未反応の試薬を通して吸引するために真空上にプレートを配置した。ウェルが空になった時点で、ＭＥＳ１００μＬを添加し、膜を通過させた。プレートを真空から除去し、ＭＥＳ２０μＬおよび水５０μＬを添加した。表１０中に示されているウェルに、４μＬの各タンパク質又はペプチド（２μＬを添加したＤＮＡＪＢ１を除く。）を添加し、ビーズを分散させるために、ピペットで撹拌した。振盪装置上でプレートを３０分間撹拌し、次いで、行１にＭＥＳ中の１０ｍｇ／ｍＬＥＤＡＣ５μＬを添加し、列ＥＦＧＨ（直接結合のため）を添加し、振盪装置上でプレートを３０分間撹拌した後、緩衝液および未反応の試薬を除去するために、真空上に配置した。ウェルが空になった時点で、ＰＢＳ５０μＬを添加し、混合物を撹拌し、プレートを真空上に配置した。ウェルが空になった時点で、ＰＢＳ５０μＬを添加し、ビーズを分散するために混合物をピペットで撹拌し、振盪装置上で６０分間温置した。反応を停止するために、ＰＢＮ２００μＬを添加し、混合物を音波処理した。
【０２５５】
下表１０は、様々なビーズセット上へのサイクリンＥ２ペプチドおよびタンパク質の様々な提示を要約している。ペプチドＥ２−１およびＥ２−２をＢＳＡに結合し、次いで、事前活性化法（ビーズ番号２５および２６）又は直接法（ビーズ番号３０および３１）を用いて、ビーズにこれを結合させた。また、事前活性化法（ビーズ番号２８および２９）又は直接法（ビーズ番号３３および３４）を用いて、ＢＳＡなしで、ペプチドＥ２−１およびＥ２−２をビーズに結合させた。事前活性化法を用いて、ビーズ３５、３７、３８、３９および４０をタンパク質で被覆した。
【０２５６】
【表１０】
0005611821.tif 000018
【０２５７】
以下のようにして、患者の血清を用いてビーズを検査した。ＰＢＮ１ｍＬに、各ビーズ調製物５μＬを添加した。混合物を音波処理および遠心し、沈降されたビーズをＰＢＳ中のＢＳＡ１％の１ｍＬで洗浄し、同じ緩衝液１ｍＬ中に再懸濁した。１．２μＳｕｐｏｒフィルタープレート（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ，  ＮＹ）に、ＰＢＮ／Ｔｗｅｅｎ（０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ中の１％ＢＳＡ）１００μＬを添加した。１０分後に、プレートをろ過し、ＰＢＮ０．２％Ｔｗｅｅｎ（０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ中の１％ＢＳＡ）５０μＬを添加した。各ウェルに、表１１に示されているように、ビーズミックス２０μＬおよび血清（１：５０）２０μＬを添加した。血清は、ヒト患者血清又はウサギ抗ＧＳＴ血清の何れかであった。プレートを暗所で振盪装置上に配置した。１時間後、プレートをろ過し、ＰＢＮ／Ｔｗｅｅｎ１００μＬで３回洗浄した。ヒト抗体を検出するために、ＲＰＥ−抗ヒト−ＩｇＧ（１：４００）（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）５０μＬを添加したのに対して、ウサギ抗ＧＳＴ抗体を検出するために、ＲＰＥ−抗ウサギＩｇＧ（１：２００）５０μＬを添加した。３０分間暗所で、プレートを振盪装置上に配置した後、ビーズをろ過し、洗浄し、ＬｕｍｉｎｅｘＴＭ上で走行させた。
【０２５８】
６つの血清試料およびウサギ抗ＧＳＴの結果が、下表１１に示されている。
【０２５９】
【表１１】
0005611821.tif 000019
【０２６０】
ＢＳＡに連結され、それぞれ、直接的に（直接法を用いて）又はビーズの事前活性化を介して（すなわち事前活性化法）結合されたペプチドＥ２−１を含有するビーズ２５および３０が最も強いシグナルを与えたことが表１１から明らかである。ＢＳＡキャリアなしに結合されたペプチドＥ２−１も強いシグナルを与えたが、ＢＳＡキャリアありで与えられたシグナルの約半分に過ぎなかった。ペプチドＥ２−２は、ＢＳＡキャリアを通じて結合された場合、ずっと低いシグナルを与え、ＢＳＡキャリアなしの場合、ほぼ検出不能なシグナルを与えた。（Ｎ末端のＧＳＴ融合タグを含有する）完全長タンパク質ＣＣＮＥ２は、ペプチドＥ２−２の何れの形態のシグナルをも十分に上回るシグナルを示したが、ペプチドＥ２−１のシグナルよりずっと低く、完全長タンパク質ＣＣＮＥ２は、配列の免疫反応性部分を含有しているが、ビーズ上でより低い密度で含有していることを示唆している。ウサギ抗ＧＳＴとのそのシグナルは、このＧＳＴ融合タンパク質が小球体へ首尾よく結合されたことを示している。
【０２６１】
上述の事前活性化および直接法によって並びに受動コーティングによって、下表１２に示されているタンパク質を、ＬｕｍｉｎｅｘＳｅｒｏＭａｐＴＭビーズ上に被覆した。受動コーティングのために、業者から供給された溶液中の前記タンパク質５μｇをＳｅｒｏＭａｐＴＭビーズ２００μＬに添加し、混合物を渦巻き撹拌し、室温で５時間、次いで、４℃で１８時間温置し、次いで、遠心して沈降させ、沈降物を洗浄し、ＰＢＮ中に再懸濁した。
【０２６２】
【表１２】
0005611821.tif 000020
【０２６３】
患者２３４人（癌８７人、良性７０人および正常７７人）から得られた血清試料を検査した。ＲＯＣ曲線によって、この検査から得られた結果を分析した。各抗原に対する計算されたＡＵＣが、下表１３に示されている。
【０２６４】
【表１３】
0005611821.tif 000021
【実施例５】
【０２６５】
質量スペクトル
Ａ．混合された時期ビーズ（ＭＭＢ）の逐次溶出による試料の調製
血清試料を融解し、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｏｌＢ緩衝液の等容量と混合した。混合物を渦巻き撹拌し、さらなる処理の前に、清澄化し、破砕物を除去するために、０．８μｍフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を通してろ過した。Ｄｙｎａｌ（Ｒ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）強陰イオン交換およびＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ，  Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，  ＩＬ）の弱陽イオン交換磁気ビーズの混合物を用いて、９６ウェルプレートＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（Ｒ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ）上で、自動化された試料の調製を行った。典型的には、陰イオン交換ビーズは、機能的な末端基としてアミンをベースとする炭化水素−四級アミン又はジエチルアミン基を有し、弱陽イオン交換ビーズは、典型的には、スルホン酸（カルボン酸）ベースとする官能基を有する。Ａｂｂｏｔｔの陽イオン交換ビーズ（ＣＸビーズ）は２．５％（質量／容積）の濃度であり、Ｄｙｎａｌ（Ｒ）強陰イオン交換ビーズ（ＡＸビーズ）は１０ｍｇ／ｍＬの濃度であった。試料調製の直前に、２０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１％の還元されたＴｒｉｔｏｎＸ１００（Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉｔｏｎ緩衝液）で陽イオン交換ビーズを一回洗浄した。この試料調製において使用された他の試薬２０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ７．５（Ｔｒｉｓ緩衝液）、０．５％トリフルオロ酢酸（以下、「ＴＦＡ溶液」）および５０％アセトニトリル（以下、「アセトニトリル溶液」）は、社内で調製した。  試薬および試料は、以下のようにして、９６ウェルプレート中に設定した。
【０２６６】
列Ａは、ＡＸビーズ３０μＬ、ＣＸビーズ２０μＬおよびＴｒｉｓ緩衝液５０μＬの混合物を含有した。
【０２６７】
列Ｂは、Ｔｒｉｓ緩衝液１００μＬを含有した。
【０２６８】
列Ｃは、Ｔｒｉｓ緩衝液１２０μＬおよび試料３０μＬを含有した。
【０２６９】
列Ｄは、Ｔｒｉｓ緩衝液１００μＬを含有した。
【０２７０】
列Ｅは、脱イオン水１００μＬを含有した。
【０２７１】
列Ｆは、ＴＦＡ溶液５０μＬを含有した。
【０２７２】
列Ｇは、アセトニトリル溶液５０μＬを含有した。
【０２７３】
列Ｈは、空であった。
【０２７４】
列Ａ中のビーズおよび緩衝液を予め混合し、３のコレクトカウント（磁気ビーズを集めるために、磁気プローブが何回溶液中に入るかを示す装置のパラメータ）でビーズを収集し、放出設定を「迅速」に、洗浄設定を中に、および２０秒の洗浄時間に設定して、Ｔｒｉｓ緩衝液中での洗浄のために、列Ｂに移した。ビーズ洗浄工程が終了したら、３のコレクトカウントでビーズを収集し、試料を結合するために、列Ｃに移した。ビーズの放出設定は迅速である。試料結合は、「遅い」設定、５分の結合時間で行う。結合工程の終了時に、３のコレクトカウントでビーズを集める。放出設定が「迅速」、洗浄設定が「中」、２０秒の洗浄時間での第一の洗浄工程のために、収集されたビーズを列Ｄに移す。第一の洗浄工程の終了時に、３のコレクトカウントでビーズを集める。放出設定が「迅速」、洗浄設定が「中」、２０秒の洗浄時間での第二の洗浄工程のために、収集されたビーズを列Ｅに移す。第二の洗浄工程の終了時に、３のコレクトカウントでビーズを集める。放出設定が「迅速」、溶出設定が「迅速」、２分の溶出時間でのＴＦＡ溶液中における溶出のために、収集されたビーズを列Ｆに移す。ＴＦＡ溶出工程の終了時に、３のコレクトカウントでビーズを集める。このＴＦＡ溶出液を収集し、質量分析によって分析した。放出設定が「迅速」、溶出設定が「迅速」、２分の溶出時間でのアセトニトリル溶液中における溶出のために、収集されたビーズを列Ｇに移す。溶出後、３のコレクトカウントでビーズを除去し、列Ａ中に廃棄した。アセトニトリル（ＡｃＮ）溶出液を収集し、質量分析によって分析した。
【０２７５】
全ての試料は２つ組みで実施したが、系統的誤差を避けるために、同じプレート上では実施しなかった。溶出された試料を手動で吸引し、自動化されたＭＡＬＤＩ標的試料調製のために、９６ウェルプレート中に配置した。従って、各試料は、質量スペクトル分析のための２つの溶出液を与えた。
【０２７６】
ＭＳ検査の前に、ＭＡＬＤＩ標的を調製するためにＣＬＩＮＰＲＯＴロボット（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  Ｉｎｃ．，  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，  ＭＡ）を使用した。簡潔に述べると、この過程は、溶出された血清試料を含有する試料プレートおよびＭＡＬＤＩマトリックス溶液（７０％アセトニトリル中の１０ｍｇ／ｍＬシナピン酸）を含有するバイアルを、ロボット上の指定された位置に搭載することを含んだ。スポット付与操作を含有するファイルが搭載され、ロボットを調節するコンピュータから開始した。この場合には、スポット付与操作は、マトリックス溶液５μＬを吸引すること、マトリックスプレート中にこれを分配すること、続いて、試料５μＬを分配することを含んだ。試料とマトリックスの事前混合は、混合物５μＬを吸引し、マトリックスプレート中にこれを数回分配することによって行った。事前混合後、混合物５μＬを吸引し、アンカーチップ標的（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  Ｉｎｃ．，  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，  ＭＡ）上の４つの連続するスポット上に、０．５μＬを堆積させた。残りの溶液３μＬは、廃棄容器中に廃棄した。必要とされる以上の試料を吸引することによって、アンカーチップ標的上への試料の堆積中に、脱落したスポットをもたらし得る使い捨て可能チップ中での気泡の形成が最少化された。
【０２７７】
Ｂ．Ｃ８磁気ビーズ疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｃ８ＭＢ−ＨＩＣ）による試料の調製
血清試料をＳＯＬＢ緩衝液と混合し、実施例５Ａに記載されているように、フィルターで清澄化した。１００ＭＢ−ＨＩＣ８として知られるＣＬＩＮＰＲＯＴ精製キット（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  Ｉｎｃ．，  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，  ＭＡ）を用いて、９６ウェルプレートＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（Ｒ）上で、自動化された試料調製を行った。キットは、Ｃ８磁気ビーズ、結合溶液および洗浄溶液を含む。別段の記載がなければ、他の全ての試薬はＳｉｇｍａＣｈｅｍ．Ｃｏ．から購入した。試薬および試料は、以下のようにして、９６ウェルプレート中に設定した。
【０２７８】
列Ａは、ＢｒｕｋｅｒのＣ８磁気ビーズ２０μＬおよび脱イオン水８０μＬの混合物を含有した。
【０２７９】
列Ｂは、血清試料１０μＬと結合溶液４０μＬの混合物を含有した。
【０２８０】
列ＣからＥは、洗浄溶液１００μＬを含有した。
【０２８１】
列Ｆは、７０％アセトニトリル５０μＬを含有した（有機溶媒の蒸発を最小限に抑えるために、溶液工程の直前に添加した。）。
【０２８２】
列Ｇは、脱イオン水１００μＬを含有した。
【０２８３】
列Ｈは、空であった。
【０２８４】
列Ａ中のビーズを事前混合し、３の「コレクトカウント」で収集し、試料を結合するために列Ｂに移した。ビーズ放出設定を、１０秒の放出時間を用いて、「迅速」に設定した。「遅い」に設定して、試料結合を５分間行った。結合工程の終了時に、３の「コレクトカウント」でビーズを収集し、第一の洗浄工程のために、列Ｃに移した（放出設定＝時間１０秒で迅速、洗浄設定＝時間２０秒で中）。第一の洗浄工程後に、３の「コレクトカウント」でビーズを収集し、第一の洗浄工程と同じパラメータで、第二の洗浄工程のために、列Ｄに移した。第二の洗浄工程の終了時に、もう一度、ビーズを集め、前述のように、第三および最終洗浄工程のために、列Ｅに移した。第三の洗浄工程の終了時に、列Ｅから列Ｆへの移動工程の間、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒＴＭを停止し、７０％アセトニトリル５０μＬを列Ｆに添加した。アセトニトリルを添加した後、プロセスを再開した。溶出工程のために、列Ｅから収集したビーズを列Ｆに移した（放出設定＝時間１０秒で迅速、溶出設定＝時間２分で迅速）。溶出工程後に、ビーズを取り除き、列Ｇ中に廃棄した。実施例５ａに上述されているように、全ての試料は２つ組みで実施した。
【０２８５】
使用されたＭＡＬＤＩマトリックスに僅かな改変のみを施して、前セクションに記載されているように、ＭＳ検査の前に、ＭＡＬＤＩ標的を調製するために、ＣＬＩＮＰＲＯＴロボット（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  Ｉｎｃ．，  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，  ＭＡ）を使用した。この事例では、ＳＡに代えて、ＨＣＣＡを使用した（４０％ＡＣＮ／５０％ＭｅＯＨ／１０％水、ｖ／ｖ／ｖ中の１ｍｇ／ｍＬＨＣＣＡ）。他の全てのパラメータは、同じままであった。
【０２８６】
Ｃ．ＳＥＬＤＩチップを用いた試料の調製
以下の試薬を使用した。
【０２８７】
１．脱イオン水２５０ｍＬを２００ｍＭリン酸二ナトリウム溶液１５２．５ｍＬおよび２００ｍＭリン酸一ナトリウム溶液９７．５ｍＬと混合することによって調製された、１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０。
【０２８８】
２．シナピン酸１０ｍｇ／ｍＬ溶液の最終濃度を与えるために、アセトニトリルと０．４％トリフルオロ酢酸（ｖ／ｖ）水溶液の等容積を混合することによって調製された溶液の十分量の中にシナピン酸の秤量された量を溶解することによって調製された１０ｍｇ／ｍＬシナピン酸溶液。
【０２８９】
３．脱イオン水、シナピン酸およびトリフルオロ酢酸は、ＦｌｕｋａＣｈｅｍｉｃａｌｓから入手した。アセトニトリルは、ＢｕｒｄｉｃｋおよびＪａｃｋｓｏｎから入手した。
【０２９０】
８スポット構成のＱ１０ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐアレイおよび標準的マイクロプレートと同じフットプリントを有する１２×８アレイ中にアレイを保持するために使用されたＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓｏｒは、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎから入手した。Ｑ１０活性表面は、四級アミン強陰イオン交換体である。チップ表面に結合されたペプチドを分析するために、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ  Ｓｙｓｔｅｍ，  Ｓｅｒｉｅｓ  ４０００  Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  （ＭＡＬＤＩ）飛行時間質量分析装置を使用した。全てのＣｉｐｈｅｒｇｅｎ製品は、ＣｉｐｈｅｒｇｅｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄｕｍｂａｒｔｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手した。
【０２９１】
全ての液体の移動、希釈および洗浄は、ＨａｍｉｌｔｏｎＣｏｍｐａｎｙ，Ｒｅｎｏ，ＮｅｖａｄａのＨａｍｉｌｔｏｎ  Ｍｉｃｒｏｌａｂ  ＳＴＡＲロボットピペット装置によって行った。
【０２９２】
血清試料を室温で融解し、穏やかな渦巻き撹拌によって混合した。試料を含有する容器を、Ｈａｍｉｌｔｏｎピペット装置上の２４位置試料固定装置中に搭載した。合計９６試料とともに４つの試料固定装置を搭載した。Ｑ１０チップを保持する２つのＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（合計１９２のスポット）を、Ｈａｍｉｌｔｏｎピペット装置のデッキ上に置いた。１００ｍＭリン酸緩衝液および脱イオン水を加えた容器を、Ｈａｍｉｔｌｏｎピペット装置上に搭載した。使い捨て用のピペットチップも、装置のデッキ上に置いた。
【０２９３】
全ての試料処理は、完全に自動化された。Ｈａｍｉｔｏｎピペット装置のデッキ上のマイクロプレートの２つの別個のウェル中に、血清５μＬをリン酸緩衝液４５μＬと混合することによって、２つの別個の分取試料中に、各試料を１から１０倍希釈した。各スポットをリン酸緩衝液の２つの１５０μＬ分取試料へ各スポットを曝露することによって、Ｑ１０チップを活性化した。各添加後に５分間、緩衝液に表面を活性化させた。第二の分取試料を各スポットから吸引した後、希釈された血清２５μＬを各スポットに添加し、室温で３０分間温置した。Ｑ１０チップのスポット上に配置された各希釈から得られた単一の分取試料を用いて、各試料を２回希釈した。希釈された血清の吸引後、リン酸緩衝液１５０μＬで４回各スポットを洗浄し、最後に、脱イオン水１５０μＬで洗浄した。処理されたチップを風乾し、シナピン酸で処理し、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ４０００中でのＭＡＬＤＩプロセスを可能とするために、マトリックスを使用した。９６ウェルマイクロプレート（各ウェルは、シナピン酸溶液で満たされている。）を装置のデッキ上に配置することによって、シナピン酸マトリックス溶液をＨａｍｉｔｏｎピペット装置上に搭載した。Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｏｒ上の各スポットへ、シナピン酸マトリックス１μＬを同時に添加するために、９６ヘッドピペット装置を使用した。１５分の乾燥期間後に、各スポットへ第二の１μＬ分取試料を添加し、乾燥させた。
【０２９４】
Ｄ．混合されたビーズ試料調製物のＡｕｔｏＦｌｅｘＭＡＬＤＩ−ＴＯＦデータ取得
この装置の取得範囲は、ｍ／ｚ４００から１００，０００までに設定された。２から１７ｋＤａの質量範囲に及ぶＢｒｕｋｅｒの較正標準を用いて、線形モードで、この装置を外部から較正した。高品質スペクトルを収集するために、レーザーを除き、ファジー調節をオンにして、取得は完全に自動化した。レーザー出力が実験の間に一定に保たれるように、レーザーのファジー調節を停止させた。一般に、固定されたレーザー出力で装置を較正するので、一定のレーザー出力を維持することが、精度にとって有益である。他のファジー調節設定は、２から１０ｋＤａの質量範囲中のピークの分離およびＳ／Ｎを調節した。これらの値を各取得前に最適化し、試料ごとの又はスポットごとの取得の失敗数を最小限に抑えながら、スペクトルの品質を最大化するように選択した。低分子量イオン（＜４００ｍ／ｚ）を偏向させて、マトリックスイオンでの検出装置の飽和および試料から生じたシグナルの最大化を抑制するために、偏向装置も作動させた。さらに、レーザー光線が試料表面を横切ってラスターデータ化されるので、あらゆる過剰なマトリックスを除去するために、各取得の前に、５つの加温ショット（ＬＰ閾値の約５から１０％以上）を発火させた。各質量スペクトルに関して、上で設定されている分解およびＳ／Ｎ基準を満たした場合にのみ、６００のレーザーショットを同時に添加した。質が劣る全ての他のスペクトルは無視および廃棄し、生のスペクトルの取得の間に、ベースライン補正又は円滑化アルゴリズムは使用しなかった。
【０２９５】
データを編纂し、比較を容易にするために、共通のｍ／ｚ軸へ変換し、様々な統計的ソフトウェアパッケージによって分析することが可能なポータブルＡＳＣＩＩフォーマット中にエクスポートした。共通のｍ／ｚ軸への転換は、社内で開発された内挿アルゴリズムを使用することによって行った。
【０２９６】
Ｅ．Ｃ８ＭＢ−ＨＩＣのＡｕｔｏＦｌｅｘ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦデータ取得
この装置の取得範囲はｍ／ｚ１０００から２０，０００までに設定させ、感度および分離能に関して最適化した。各質量スペクトルに対して、４００のレーザーショットを同時添加したことを除き、他の全ての取得パラメータおよび較正法は、実施例５ｄに上述されているように設定した。
【０２９７】
Ｆ．Ｑ−１０チップのＣｉｐｈｅｒｇｅｎ４０００ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦデータ取得。
０から５０，０００Ｄａの間の質量範囲に対して最適化されたパラメータを用いて、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ４０００ＭＡＬＤＩ飛行時間質量分析装置上にＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓｏｒを搭載した。イオン電流対質量／電荷（ｍ／ｚ）の単一スペクトルを得るために、スポット当り５３０の取得にわたって、データをデジタル化し、平均した。各スペクトルをサーバにエクスポートし、続いて、取得後分析のために、ＡＳＣＩＩファイルとして読み出した。
【０２９８】
Ｇ．質量スペクトルデータの関心領域分析
質量スペクトルデータは、０から５０，０００までの質量／電荷値および対応する強度値からなる。癌および非がんデータセットを構築した。癌データセットは、全ての癌試料から得られた質量スペクトルからなるのに対して、非癌データセットは、全ての非癌試料（正常対象および良性肺疾患を有する患者を含む。）から得られた質量スペクトルからなる。以下のことを実行するソフトウェアプログラム中に、癌および非癌データセットを別個にアップロードした。
【０２９９】
ａ）ｐ値を与えるために、あらゆる記録された質量／電荷値において、スチューデントのｔ検定を決定する。
【０３００】
ｂ）癌および非癌スペクトルを各群に対して１つの代表へ平均化した。
【０３０１】
ｃ）平均癌スペクトルおよび平均非癌スペクトルの強度の対数比（Ｌｏｇ比）を決定する。
【０３０２】
ＲＯＩが、０．０１未満のｐ値および０．１より大きな絶対対数比を有する１０又はそれ以上の連続する質量値を有することが特定された。それぞれ、ＭＭＢ−ＴＦＡ、ＭＭＢ−ＡｃＮおよびＭＢ−ＨＩＣデータセット中に、１８、３６および２６のＲＯＩが見出された（表１４ａから１４ｃ）。さらに、表１４ｄに示されているように、ＳＥＬＤＩデータ中に、１２４のＲＯＩ（＜２０ｋＤａ）が見出された。表１４ａから１４ｄは、平均質量値が増加するように並べ替えられた本発明のＲＯＤを列記している。表中に記載されているＲＯＩは、計算された間隔（ある間隔に対する最初および最後の質量値の平均）に対する平均質量値である。平均ＲＯＩ質量は、以下、単にＲＯＩと称される。各試料に対する各ＲＯＩの強度をＲＯＣ分析に供した。各マーカーに対するＡＵＣは、下表１４ａから１４ｄ中にも報告されている。下表１４ａから１４ｃでは、計算されたＲＯＩは、罹病および非罹病群のＭＳプロファイルの分析から得られた。３つの異なる方法を用いて、すなわち、ａ）ＴＦＡ（ｔｆａ）で溶出され、続いて、ｂ）アセトニトリル（ａｃｎ）で順次溶出され、ｃ）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ｈｉｃ）を使用する、混合された磁気ビーズ陰イオン／陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、各試料を処理した。ＲＯＩを取得する目的で、各試料調製法を独立に分析した。ＢｒｕｋｅｒＡｕｔｏＦｌｅｘＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置を用いて、全てのスペクトルを収集した。下表１４ｄにおいて、計算されたＲＯＩは、罹病および非罹病群のＭＳプロファイルの分析から得られた。全ての試料は、Ｑ−１０チップを用いて処理した。全てのスペクトルは、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ４０００ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置を用いて収集した。
【０３０３】
【表１４】
0005611821.tif 000022
【０３０４】
【表１５】
0005611821.tif 000023
【０３０５】
【表１６】
0005611821.tif 000024
【０３０６】
【表１７】
0005611821.tif 000025
0005611821.tif 000026
0005611821.tif 000027
【０３０７】
Ｈ．ＲＯＩのファミリーの同定：高度に相関されたＲＯＩを同定するために、ＪＭＰＴＭ統計パッケージ（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．，  Ｃａｒｙ，  ＮＣ）プログラムの多変量解析関数を使用した。二次元相関係数マトリックスをＪＭＰプログラムから抽出し、ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌによってさらに分析した。全てのＲＩＯに対して、相関係数が０．８を超えるＲＯＩの組を同定した。これらのＲＩＯは一緒に、相関付けられたＲＯＩのファミリーとなる。表１５は、大きなコホート中の相関するファミリー、対応するメンバーＲＯＩ、メンバーＲＯＩに対するＡＵＣ値およびファミリーの他のメンバーに対する相関係数の平均を示している。従って、３４４９および３４９４の質量を有するＲＯＩは高度に相関しており、本発明において互いに置換できることが理解できる。
【０３０８】
【表１８】
0005611821.tif 000028
0005611821.tif 000029
0005611821.tif 000030
0005611821.tif 000031
【実施例６】
【０３０９】
判別分析、決定木分析および主成分分析を用いたバイオマーカーの多変量解析
イムノアッセイバイオマーカーおよび関心領域に対して、多変量解析を実施した。全ての異なる分析は、ＪＭＰ統計パッケージを用いて実施した。単純化のために、本明細書において、判別分析（ＤＡ）、主成分分析（ＰＣＡ）および決定木（ＤＴ）は、全般的に、多変量法（ＭＶＭ）と称される。ＰＣＡでは、データ中の全変動性の９０％超に相当する最初の１５の主成分のみが抽出されたことを述べることに価値がある。各主成分に最も寄与する１つの因子（バイオマーカー）のみを抽出するために、因子加重および／又は平等分配を使用した。因子加重の二乗は各主成分中の各因子の相対的寄与を反映するので、各主成分に対して最も寄与するマーカーを選択するための基礎として、これらの値を使用した。従って、最初の１５の主成分に最も寄与する１５の因子（バイオマーカー）を抽出した。ＤＡでは、さらなるマーカーの付加が分類結果に対して影響を及ぼさなくなるまで、マーカーを選択するプロセスを実施した。一般に、ＤＡは、５と８バイオマーカーの間を使用した。ＤＴの場合には、約５つのバイオマーカーを有する６結節点の木を構築し、評価した。
【０３１０】
十分に確立されたブートストラップおよびリーブ・ワン・アウト検証法（Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｏ．  Ｄｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｐｐ．  ４８５，  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  （２０００））を使用することによって、バイオマーカーを評価した。定期的に出現する頑強なバイオマーカーを特定するために、１０回訓練プロセスを使用した。訓練セットの少なくとも５０％に出現するマーカーを頑強なバイオマーカーとして定義した。従って、本発明者らの１０回訓練プロセス中で５以上の頻度を有するバイオマーカーをさらなる評価のために選択した。下表１６は、各コホート中の各方法において定期的に出現したバイオマーカーを要約する。
【０３１１】
様々な統計法を用いてバイオマーカーを発見するためのアプローチは、候補バイオマーカーのより幅広いレパートリーを与えることによって、異なる利点を与える（図１）。ＤＡおよびＰＣＡなどの幾つかの方法は正規分布したデータとともに良好に機能するのに対して、ロジスティック回帰および決定木などの他のノンパラメトリック法は、離散的で、均一に分布していないデータ又は極端な変動を有するデータを用いて、よりよく機能する。マーカーは集団中において正規分布し得、又はし得ないので、多様な源（質量分析、イムノアッセイ、臨床歴など）からのマーカー（バイオマーカーおよびバイオメトリックパラメータなど）が単一のパネル中に組み合わされる場合には、このようなアプローチは理想的である。
【０３１２】
【表１９】
0005611821.tif 000032
【実施例７】
【０３１３】
分離およびスコア法（以下、「ＳＳＭ」）
Ａ．改善された分離およびスコア法（ＳＳＭ）
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（Ｃ）Ｗｉｎｄｏｓの下で実行するために、Ｍｏｒ他（ＰＮＡＳ，  １０２（２１）：７６７７  （２００５）参照）によって記載されている分離点（カットオフ）スコアリング法を実施する双方向的ソフトウェアを記述した。このソフトウェアは、一群の試料に対するマーカー（バイオマーカーおよびバイオメトリックパラメータ）分析の結果を保存するための通常の手段であるＭｉｃｒｏｓｏｆｔ（Ｃ）Ｅｘｃｅｌスプレッドシートを読み取る。データは、試料の疾病を表記するためのフィールドを有する単一のワークシート上に保存し、２つのワークシート（一方は罹病試料に対するものであり、他方は非罹病試料に対するものである。）上に保存し、又は４つのワークシート（一方は罹病および非罹病試料を訓練するためのペア並びに他方は罹病および非罹病試料を検査するためのペア）上に保存することができる。最初の２つの事例では、使用者は、無作為に選択された訓練および検査対を入力から自動的に作製するためにソフトウェアを使用し得る。最後の事例では、複数のＥｘｃｅｌファイルを一度に読み取り、単一の実行で分析し得る。
【０３１４】
ソフトウェアは、データ上に収集された全てのマーカーのリストを提示する。使用者は、分析中で使用されるべきこのリストから一群のマーカーを選択する。ソフトウェアは、罹病および非罹病訓練データセットから各マーカーに対して分離点（カットオフ）を自動的に計算する他、罹病群が非罹病群と比べて増加又は減少したかどうかを決定する。それぞれの単一マーカーの精度を最大化するために、分離点（カットオフ）を選択する。カットオフ（又は分離点）は、手動でも設定および調整し得る。
【０３１５】
全ての分析において、選択されたマーカーの組を用いて、それぞれの可能な閾値での精度、特異性および感受性が訓練セットおよび検査セットの両方に対して計算される。複数の結果を与える分析では、これらの結果は、訓練セットの精度によって順番に並べられる。
【０３１６】
分析の３つのモードが利用可能である。最も単純なモードは、選択されたマーカーのみを使用する標準的な結果を計算する。第二のモードは、選択されたリスト中の最も価値が低いマーカーを決定する。複数の計算（１つの計算は、単一のマーカーを除去することによって形成されるマーカーの各可能なサブセットに対するもの）を行う。最も大きな精度を有するサブセットは、サブセットを作製するために除去されたマーカーがセット全体において最も低い寄与を為すことを示唆する。これらの最初２つのモードに対する結果は、実質的に即時である。最も複雑な計算は、選択されたマーカーの全ての可能な組み合わせを調査する。２つの最も優れた結果が報告される。この最終選択肢は、多数の候補を含むことができる。従って、これは、演算的に極めて大規模であり、完了のために幾らかの時間を要し得る。使用される追加マーカーごとに、実行時間が倍増する。
【０３１７】
約２０マーカーに対して、２０の最も優れた結果の全てに、６から１０のマーカーが通常存在することがしばしば見出されている。次いで、このセットから得られた２から４個の他のマーカーとこれらをマッチさせる。これは、診断パネルに対するマーカーを選択する上で幾つかの柔軟性が存在し得ることを示唆する。上位２０の最も優れた結果は、一般に、精度の点で類似しているが、感受性および特異性の点で著しく異なり得る。このようにして、マーカーの可能な全ての組み合わせを観察することは、臨床的に最も有用であり得る組み合わせへの洞察を与える。
【０３１８】
Ｂ．重み付けされたスコアリング法
本明細書中に先述されているように、この方法は、１つのマーカーの測定を多くの潜在的スコアの１つへ変換することを含む重み付けられたスコアリング法である。スコアは、以下の方程式を用いて得られる。
【０３１９】
スコア＝ＡＵＣ＊係数／（１−特異性）
【０３２０】
マーカーサイトケラチン１９を例として使用することができる。サイトケラチン１９のレベルは、小さなコホートにおいて、０．４から８９．２ｎｇ／ｍＬの範囲である。Ａｎａｌｙｚｅ−ｉｔソフトウェアを用いて、癌が陽性であるようにサイトケラチン１９のデータを用いて、ＲＯＣ曲線を作成した。偽陽性率（１−特異性）をｘ軸上にプロットし、真正陽性率（感受性）をｙ軸上にプロットし、曲線上の各点に対応するサイトケラチン１９の値を有するスプレッドシートを作製した。３．３ｎｇ／ｍＬのカットオフで、特異性は９０％であり、偽陽性率は１０％であった。そのＡＵＣが０．７より大きく、０．８未満であったので、このマーカーに対して、３の係数を任意に与えた（表２参照）。しかしながら、あらゆる整数を係数として使用することができる。この場合、より優れた臨床成績を示唆するより高いＡＵＣを有するバイオマーカーとともに、増加する数字が使用される。３．３ｎｇ／ｍＬ以上のサイトケラチン１９の値を有する個体に対するスコアをこのように計算した。
【０３２１】
スコア＝ＡＵＣ＊係数／（１−特異性）
スコア＝０．７０＊３／（１−０．９０）
スコア＝２１
【０３２２】
３．３ｎｇ／ｍＬを上回るサイトケラチンの何れの値に関しても、２１のスコアがこのようにして与えられた。１．９より大きく、３．３より小さいサイトケラチン１９の何れの値に対しても、８．４のスコアなどが得られた（下表１７ａ参照）。
【０３２３】
【表２０】
0005611821.tif 000033
【０３２４】
スコアの値は、特異性のレベルが増加するにつれて増加する。特異性の選択された値は、何れの１つのマーカーに対しても適合させることができる。何れかの１つのマーカーに対して選択された特異性レベルの数値を適合させることができる。この方法によって、特異性がパネルへのバイオマーカーの貢献を改善することが可能となる。
【０３２５】
重み付けられたスコアリング法の比較は、上記実施例７Ａ中に記載されている二分スコアリング法に対して行った。この実施例では、パネルは、８つのイムノアッセイバイオマーカー：ＣＥＡ、サイトケラチン１９、サイトケラチン１８、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、プロＧＲＰおよびＳＣＣを構成した。これらの特異性レベルの各々におけるＡＵＣ、係数、選択された特異性レベルおよびスコアが、表１７ｂ中の以下のマーカーの各々に対して表として記載されている。これらの各カットオフおよびスコアを用いて、８つのバイオマーカーに対して、各試料の表を作成した。各試料に対する全スコアを合計し、ＲＯＣ曲線中にプロットした。このＲＯＣ曲線を、表１８に与えられている小さなコホートカットオフ（分離点）又は大きなコホートカットオフ（分離点）の何れかを用いた二分スコアリング法を用いて作製されたＲＯＣ曲線と比較した。重み付けられたスコアリング法に対するＡＵＣの値、二分スコアリング法の大きなコホートカットオフ（分離点）および二分スコアリング法の小さなカットオフ（分離点）は、それぞれ、０．７８、０．７６および０．７３であった。ＡＵＣ値によって示されるパネルの改善された全般的成績を別にして、重み付けられたスコアリング法は、パネルに対して、より多数の可能なスコア値を与える。可能なパネルスコアがより多くなることの１つの利点は、陽性検査に対するカットオフを設定するためにより多くの選択肢が存在する（図５参照）。８バイオマーカーパネルに対して適用された二分スコアリング法は、パネル出力として、１ずつ増加しながら、０から８の範囲の値を有することができる（図５参照）。
【０３２６】
【表２１】
0005611821.tif 000034
【０３２７】
２００７年６月２９日にＤｏｃｋｅｔ番号８６２１．ＵＳ．Ｐ１として電子出願された「Ｗｅｉｇｈｔｅｄ  Ｓｃｏｒｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ  Ｉｎ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ」という名称の特許出願は、特に、重み付けされたスコアリング法について記載している。
【実施例８】
【０３２８】
分離およびスコア法（ＳＳＭ）を用いた肺癌の予測モデル
Ａ．イムノアッセイバイオマーカーのＳＳＭ
実施例２に論述されているように、免疫学的アッセイによって、幾つかのバイオマーカーを検出した。これらには、サイトケラチン１９、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＳＣＣ、プロＧＲＰ、サイトケラチン１８、ＣＡ１９−９およびＣＡ１５−３が含まれた。これらのデータは、ＳＳＭを用いて評価した。一緒にされたこれらのバイオマーカーは、限定された臨床的有用性を示した。良性肺疾患および肺癌を呈する小さなコホートでは、陽性の結果として４又はそれ以上の閾値を有する８バイオマーカーパネルの精度は、１０の小コホート検査セットにわたって６４．８％の平均精度（ＡＵＣ０．６９）を達成した。正常並びに良性肺疾患および肺癌を呈する大きなコホートでは、陽性の結果として４又はそれ以上の閾値を有する８バイオマーカーパネルの精度は、１０の大コホート検査セットにわたって７７．４％の平均（ＡＵＣ０．７９）を達成した。
【０３２９】
パック・年のバイオメトリックパラメータを含めることによって、これらのバイオマーカーの予想精度がほぼ５％向上した。従って、陽性結果として４又はそれ以上の閾値を有する８バイオマーカーおよび１バイオメトリックパラメータパネルの精度は、１０の小コホート検査セットにわたって６９．６％の平均（ＡＵＣ０．７５）を達成した。
【０３３０】
【表２２】
0005611821.tif 000035
【０３３１】
Ｂ．ＲＯＣ／ＡＵＣによって選択されたバイオマーカーおよびバイオメトリックパラメータのＳＳＭ
多変量統計法を用いてバイオマーカー候補が同定された実施例６とは異なり、この事例では、バイオマーカー候補を同定するために、ＲＯＣ／ＡＵＣ解析を用いる単純なノンパラメトリック法を使用した。この方法を適用することによって、許容され得る臨床成績（ＡＵＣ＞０．６）を有する各マーカーをさらなる解析のために選択した。上位１５のバイオマーカーおよびバイオメトリックパラメータ（パック・年）のみを選択し、以下、このグループは１６ＡＵＣ群（小および大）と称される。これらのマーカーは、下表１９に列記されている。
【０３３２】
【表２３】
0005611821.tif 000036
【０３３３】
１０の訓練サブセットの各々に対してＳＳＭを使用して、１６ＡＵＣ小コホートマーカーの最適化された組み合わせ（パネル）を決定した。この工程は、ＳＳＭを用いて、バイオメトリックパラメータ喫煙歴（パック・年）の不存在下（表２０ａ）および存在下（表２０ｂ）の両方で行われた。従って、１５バイオマーカー（バイオメトリックパラメータであるパック・年を除く。）又は１５バイオマーカーおよび１バイオメトリックパラメータ（パック・年）（１６ＡＵＣ）が、分離およびスコア法に対する入力変数であった。全体的な精度に基づいて、１０の訓練セットの各々に対する最適なパネルを決定した。残りの未検査試料に対して各パネルを検査し、成績の統計を記録した。次いで、１０のパネルを比較し、各バイオマーカーの頻度に注目した。このプロセスは、バイオメトリックであるパック・年を含めておよび除外して、２回行った。これらの２つのプロセスの結果は、下表２０ａおよび２０ｂに示されている。同じく、さらなる検討のために、５以上の頻度を有する頑強なマーカーを選択した。大きなコホートに対して、このプロセスを繰り返し、結果が表２０ｃに示されている。表２０ａおよび２０ｂは、ａ）１５ＡＵＣバイオマーカーのみ並びにｂ）１５ＡＵＣバイオマーカーおよびバイオメトリックパラメータであるパック・年に対するマーカーの頻度を示す小コホートのＳＳＭの結果の部分的なリストを含有する。最初の表（２０ａ）では、５つのマーカーが５以上の頻度を有するに過ぎないことに注意。表２０ｂでは、７つのマーカーがこの基準に適合する。表２０ｃは、１５ＡＵＣマーカーに対するマーカーの頻度を示す大きなコホートのＳＳＭの結果の部分的リストを含有する。１１のマーカーが５以上の頻度を有することに注目されたい。
【０３３４】
【表２４】
0005611821.tif 000037
【０３３５】
【表２５】
0005611821.tif 000038
【０３３６】
【表２６】
0005611821.tif 000039
【０３３７】
Ｃ．ＭＶＭによって選択されたバイオマーカーのＳＳＭ
１つの多変量法の例は、決定木解析である。決定木解析のみを用いて同定されたマーカーを統合し、ＳＳＭにおいて使用した。バイオマーカーのこの群は、１６ＡＵＣと表記されるバイオマーカーの群と同様の臨床的有用性を示した。一例として、バイオメトリックパラメータであるパック・年なしで、（１０のうちの）検査セット１が０．９０のＡＵＣ（検査）を有し、バイオメトリックパラメータであるパック・年ありで０．９１のＡＵＣ（検査）を有する。
【０３３８】
ＰＣＡおよびＤＡを用いて同定されたバイオマーカーとＤＴバイオマーカーを合わせて、ＭＶＭ群を作製した。ＳＳＭを用いて、バイオメトリックパラメータである喫煙歴（パック・年）ありおよびなしで、１４ＭＶＭ群を評価した。同じく、さらなる検討のために、５以上の頻度を有する頑強なマーカーを選択した（結果は示されていない。）。上記表から明らかなように、パック・年（喫煙歴）は、頑強なマーカーとして現れるバイオマーカーの数および種類に対して影響を有する。幾つかのバイオマーカーは他のバイオマーカーに対して相乗効果又は有害効果を有し得るので、これは完全に予想できないわけではない。本発明の一態様は、モデルの予想能力を改善する上で、パネルとして協同するマーカーを発見することを含む。同様の道筋に沿って、より優れたマーカーのパネルを同定することを目指して、両方法（ＡＵＣおよびＭＶＭ）において、バイオメトリックパラメータであるパック・年と相乗的に機能することが同定されたバイオマーカーを組み合わせた（実施例８Ｄ参照）。
【０３３９】
大きなコホートに対して同定された多変量マーカーを、ＳＳＭを用いて評価した。同じく、さらなる検討のために、５以上の頻度を有するマーカーのみを選択した。下表２１は、大きなコホートに対するＳＳＭの結果を要約する。
【０３４０】
【表２７】
0005611821.tif 000040
【０３４１】
Ｄ．組み合わされたマーカー（ＡＵＣ＋ＭＶＭ＋パック・年）のＳＳＭ
続く工程において、両コホートに対するＡＵＣおよびＭＶＭ両群から得られるマーカーを含有するマーカーの第二のリストを作成するために、（１０の訓練セット中の）５以上の頻度を有する全てのマーカー（バイオマーカーおよびバイオメトリックパラメータ）を組み合わせた。ＳＳＭの結果から、５以上の頻度を有する特有のマーカーを小さんコホートから１６、大きなコホートから１５選択した。下表２２は、選択されたマーカーを要約する。
【０３４２】
【表２８】
0005611821.tif 000041
【０３４３】
ＳＳＭを用いた最終評価サイクルに、マーカーの上記リストを供した。前述のように、１０の訓練サブセットに対してマーカーの組み合わせを最適化し、各バイオマーカーおよびバイオメトリックパラメータの頻度を決定した。マーカーが訓練セットの少なくとも５０％中に存在するという選択基準を適用することによって、小さなコホートに対して、１６マーカーのうち１３を選択し、大きなコホートに対して、１５マーカーのうち９を選択した。
【０３４４】
【表２９】
0005611821.tif 000042
【０３４５】
マーカーのレベルが最適化されるので、各マーカーに対して、分類に対する最高の精度に関して各訓練データセットを評価することによって、分離点（カットオフ）を決定した。小さなコホートにおいて使用された上位８つの高頻度マーカーに対する分離点（カットオフ）が、以下に列記されている。
【０３４６】
【表３０】
0005611821.tif 000043
【０３４７】
表２３ｂは、平均（Ａｖｅ）分離点（それぞれ、所定のカットオフ）とともに、上位８つの高頻度マーカーのリストを示している。各分離点（カットオフ）に対する標準偏差も含まれている（Ｓｔｄｅｖ）。分離点（カットオフ）に対する対照群の位置が、左から二番目の列に記されている。一例として、サイトケラチン１９では、正常群又は対照群（非癌）は、１．８９の分離点（カットオフ）以下である。
【実施例９】
【０３４８】
予想モデルの検証
小さなコホートに対する１３バイオマーカーおよびバイオメトリックパラメータのリストのサブセット（上記表２３ａ参照）は、優れた臨床的有用性を与える。例えば、分離およびスコア法において、パネルとして一緒に使用された上位８つの高頻度バイオマーカーおよびバイオメトリックパラメータは、検査サブセット１に対して、０．９０のＡＵＣを有する（上記表２３ｂ参照）。
【０３４９】
１０の無作為な検査セットを用いて、７マーカーパネル（マーカー１から７、表２３ｂ）および８マーカーパネル（マーカー１から８、表２３ｂ）を含む予想モデルの有効性を検証した。下表２４ａおよび２４ｂは、２つのモデルに対する結果を要約する。各モデル中のマーカーの数を除き、両ケースにおいて、全ての条件および計算パラメータは同一であった。
【０３５０】
【表３１】
0005611821.tif 000044
【０３５１】
表２４ａは、１０の無作為な検査セットを用いた、７マーカーパネルの臨床成績を示している。計算において使用された７マーカーおよび平均分離点（カットオフ）を表１６ｂに記載した。非罹病群から罹病群を分離するために、３の閾値を使用した。このモデルに対する平均ＡＵＣは０．９０であり、これは、８３．９％の平均精度並びに、それぞれ、７９．１％および８９．４％の感受性および特異性に対応する。
【０３５２】
【表３２】
0005611821.tif 000045
【０３５３】
表２４ｂは、１０の無作為な検査セットを用いた、８マーカーパネルの臨床成績を示している。計算において使用された８マーカーおよび平均分離点（カットオフ）を表１６ｂに記載した。非罹病群から罹病群を分離するために、３の閾値（所定の合計スコア）を使用した。このモデルに対する平均ＡＵＣは０．９１であり、これは、８４．１％の平均精度並びに、それぞれ、９１．５％および７１．５％の感受性および特異性に対応する。
【０３５４】
表２４ａと２４ｂの比較は、ＡＵＣおよび精度の観点で両モデルが同等であり、感受性および特異性のみが異なっていることを示す。表２４ａから明らかなように、７マーカーパネルは、より大きな特異性を示す（８９．４％対７５．１％）。これに対して、８マーカーパネルは、これらの平均値（Ａｖｅ）から判断した場合、より優れた感受性（９１．５％対７９．１％）を示す。分類の精度を最大化する閾値（又は所定の合計スコア）が選択されたこと（ＲＯＣ曲線のＡＵＣを最大化することと似ている。）に留意すべきである。従って、選択された３の閾値（所定の合計スコア）は、精度を最大化したのみならず、モデルの感受性および特異性の間で最良のバランスを与えた。実際に、このことが意味するのは、このモデル中の７つのマーカー候補のうち３以下（又は第二のモデルでは、８つのうち３つ以下）に対して正常個体が陽性結果を示せば、この個体は、肺癌を発症する「リスク」が低いと考えられる。設定閾値（又は所定の合計スコア）より大きなスコア（合計スコア）を有する個体は、より大きなリスクを有すると考えられ、さらなる検査又は追跡措置の候補となる。モデルの閾値（すなわち、所定の合計スコア）は、（精度を犠牲にして）モデルの感受性又は特異性を最大化するために、増加又は減少させ得ることに留意すべきである。様々な診断上の問題および／又はリスクを有する集団に対処するためにモデルを調整することができる（例えば、正常個体を症候性個体および／又は無症候性（ａｓｙｍｔｏｍａｔｉｃ）個体と区別する。）ので、この柔軟性は有利である。
【０３５５】
様々な予想モデルが、下表２５ａおよび２５ｂに要約されている。各予想モデルに対して、モデルを構成するバイオマーカーおよびバイオメトリックパラメータが、１０の検査セットにわたって、対応する標準偏差（カッコ内に記載）とともに、閾値（すなわち、所定の合計スコア）、平均ＡＵＣ、精度、感受性および特異性と一緒に記されている。上に概説されている８マーカーパネルは混合モデル２であり、上に概説されている７マーカーパネルは混合モデル３である。混合モデル１Ａおよび混合モデル１Ｂは、同じマーカーを含有する。混合モデル１Ａと混合モデル１Ｂ間の唯一の差は、閾値（すなわち、所定の合計スコア）である。同様に、混合モデル１０Ａおよび混合モデル１０Ｂは、同じマーカーを含有する。混合モデル１０Ａと混合モデル１０Ｂ間の唯一の差は、閾値（すなわち、所定の合計スコア）である。
【０３５６】
【表３３】
0005611821.tif 000046
【０３５７】
【表３４】
0005611821.tif 000047
【０３５８】
同様に、大きなコホートに関して、様々な予想モデルを全体的な精度、感受性又は特異性に関して最適化することができる。４つの候補モデルが、下表２６に要約されている。
【０３５９】
【表３５】
0005611821.tif 000048
【０３６０】
同様に、サイクリンコホート（測定された抗サイクリンＥ２タンパク質抗体および抗サイクリンＥ２ペプチド抗体を有する個体のサブセット）に対する予想モデルが、下表２７ａおよび２７ｂに要約されている。
【０３６１】
【表３６】
0005611821.tif 000049
【０３６２】
【表３７】
0005611821.tif 000050
【０３６３】
同様に、自己抗体アッセイを用いた予想モデルが、下表２８に要約されている。
【０３６４】
【表３８】
0005611821.tif 000051
【０３６５】
検証コホートに対して、これらのモデルの５つを使用した。下表２９は、独立コホート、小コホートおよび検証コホートに対する予想モデルの各々の臨床成績を要約している。
【０３６６】
【表３９】
0005611821.tif 000052
【実施例１０】
【０３６７】
バイオマーカーの同定
Ａ．ＨＰＬＣ分画
表２２中のＭＳバイオマーカー候補を特定するために、標準的なプロトコールを用いる逆相ＨＰＬＣによって、プールされた血清試料および／又は個別の血清試料をまず分画することが必要であった。ゲル電気泳動およびＭＳ分析に対して十分な材料を得るには、複数の分画サイクルが必要であった。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによって、各画分の特性を決定し、目的ピークを含有する画分を一緒にプールし、ｓｐｅｅｄｖａｃ中で濃縮した。全ての他のバイオマーカーの候補を上述のように処理した。
【０３６８】
図２は、濃縮前および後のバイオマーカー候補（ｐｕｂ１１５９７）を示している。最初の試料中の１１ｋＤａのバイオマーカー候補は、極めて低濃度であることに注目されたい。濃縮後、強度はより高くなるが、試料は分析に十分な純度ではなく、目的のバイオマーカーを単離するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるさらなる分離が必要であった。
【０３６９】
Ｂ．ゲル内消化およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析
濃縮後、候補バイオマーカーに対応する分子量を有する所望のタンパク質／ペプチドを単離するために、候補バイオマーカーを含有する画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。製造業者によって提供された標準的な方法を用いて、ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を実施した。要約すれば、操作は、候補バイオマーカーと分子量公知の標準タンパク質を含有する試料を、図３に示されているように、同じゲル中の異なるウェル中に搭載することを含んだ。標準タンパク質の移動距離を「未知の」試料の移動距離と比較することによって、所望の分子量を有するバンドを同定し、ゲルから切り出した。
【０３７０】
次いで、ＷａｔｅｒｓＭａｓｓＰＲＥＰＴＭステーションを用いて、切り出されたゲルバンドを自動化されたゲル内トリプシン消化に供した。続いて、消化された試料をゲルから抽出し、オンライン逆相ＥＳＩ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳに供した。次いで、生成物イオンのスペクトルをデータベース検索のために使用した。可能な場合には、同定されたタンパク質を商業的に入手し、先述のように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびゲル内消化に供した。２つの試料間でのゲル電気泳動、ＭＳ／ＭＳの結果およびデータベース検索における良好な一致は、バイオマーカーが正しく同定されたというさらなる証拠であった。図３から明らかなように、市販のヒト血清アミロイドＡ（ＨＳＡＡ）と分画された試料中の１１．５ｋＤａのバイオマーカー候補の間には、良好な一致が存在する。ＭＳ／ＭＳ分析およびデータベース検索は、両試料が同じタンパク質であることを確認した。図４は、候補バイオマーカーＰｕｂ１１５９７のＭＳ／ＭＳスペクトルを示している。ｂおよびｙイオンから得られたアミノ酸配列には、各パネルの上部に注釈が付されている。バイオマーカー候補は、ヒト血清アミロイドＡ（ＨＳＡＡ）タンパク質の断片と同定された。
【０３７１】
消化に適していない小さな候補バイオマーカーは、配列情報およびタンパク質ＩＤを得るために、ＥＳＩ−ｑ−ＴＯＦおよび／又はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ断片化後に、デノボ配列決定およびデータベース検索（ＢＬＡＳＴ）に供された。
【０３７２】
Ｃ．データベース検索およびタンパク質ＩＤ
バイオマーカーの候補を完全に性質決定するために、バイオマーカーが由来したタンパク質を同定することが不可欠であった。未知のタンパク質の同定には、ゲル内消化に続く、トリプシン断片の直列質量分析法が含まれた。源タンパク質を同定するために、ＭＳ／ＭＳプロセスから得られた生成物イオンを、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔタンパク質データベースに対して検索した。低分子量を有するバイオマーカー候補に関しては、直列質量分析後のデノボ配列決定およびデータベース検索が、源タンパク質を同定するために選択した方法であった。検索は、ホモ・サピエンスのゲノムのみを検討し、前駆体イオンに対する質量精度は±１．２Ｄａおよび生成物イオンに対する質量精度は±０．８Ｄａ（ＭＳ／ＭＳ）であった。トリプシンに関しては、１つの喪失した切断のみが許容された。データベース検索に関して許容された唯２つの可変的修飾は、カルバミドメチル化（Ｃ）および酸化（Ｍ）であった。最終タンパク質ＩＤは、Ｍａｓｃｏｔ検索エンジンの結果を編纂し、関連するＭＳおよびＭＳ／ＭＳスペクトルを手動で解釈した後に帰属させた。結果の精度は、反復測定によって確認した。
【０３７３】
【表４０】
0005611821.tif 000053
【０３７４】
上記表３０は、タンパク質ＩＤとともに、様々な候補バイオマーカーの源タンパク質を与える。マーカーは、ゲル内消化およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳおよび／又はデノボ配列決定によって同定された。観察された断片のアミノ酸配列のみが示されており、記されている場合、平均ＭＷはＰＴＭを含むことに注意されたい。受付番号はＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースから取得され、参考として挙げられているに過ぎない。ＴＦＡ９１３３がグリコシル化された部分からシアル酸を喪失した（−２９１．３Ｄａ）ことを除き、ＡＣＮ９４５９およびＴＦＡ９１３３は同じタンパク質断片であることに注目するのは興味深い。ＡＣＮ９４５９およびＴＦＡ９１３３は何れも、アポリポタンパク質ＣＩＩＩの変形物として同定された。本発明者らの発見は、このタンパク質の公表されている公知の配列および分子量と一致する（Ｂｏｎｄａｒｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．４０：５４３−５５５  （１９９９））。Ｐｕｂ４７８９は、α−１−アンチトリプシンタンパク質と同定された。生成物イオンスペクトルの詳細な調査は、表３０中に示されている部位にＫからＥへの置換が存在し得ることを示唆する。質量精度の不明確さによって、帰属が妨害された。さらに、上表３０中のバイオマーカーは、急性期タンパク質（本明細書中において、「急性期応答物質（ＡＰＲ）」又は「免疫応答バイオマーカー」とも称される。）として知られている。本明細書中に先述されているように、急性期タンパク質は、タンパク質の自然免疫ファミリーの一員である。
【実施例１１】
【０３７５】
肺癌の検出
Ａ．ペプチド又はタンパク質に対するイムノアッセイ：上記実施例９に記載されているバイオマーカーは、イムノアッセイ技術によって検出および測定することができる。例えば、本発明のバイオマーカーを含有していることが疑われる試料中における未知の物質の自動アッセイのために、Ａｂｂｏｔｔ  ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓのＡｒｃｈｉｔｅｃｔＴＭイムノアッセイシステムが使用される。本分野において公知であるように、このシステムは、目的のバイオマーカーに結合することができる抗体で被覆された磁性微粒子を使用する。機器制御下で、試料の一部を抗体被覆された磁気微粒子の等量並びに緩衝液、塩、界面活性剤および可溶性タンパク質を含有する試料希釈液の２倍容量と混合する。温置後、緩衝液、塩、界面活性剤および防腐剤を含む洗浄緩衝液を用いて、微粒子を洗浄する。試料希釈液の等量とともにアクリジニウム標識された連結物の分取試料を添加し、粒子を再分散する。混合物を温置し、次いで、洗浄緩衝液で洗浄する。微粒子からアクリジニウム連結物を解離させるために、硝酸および過酸化水素を含有する酸性プレトリガー中に、洗浄された粒子を再分散する。次いで、化学発光反応を惹起するために、ＮａＯＨの溶液を添加する。光増倍管によって光を測定し、標準曲線を構築するために使用されたバイオマーカーペプチドの既知量を含有する試料の系列によって発せられた光との比較によって、未知の結果を定量する。次いで、同様に処理された臨床試料中のバイオマーカーの濃度を推定するために、標準曲線を使用する。結果は、単独で、又は以下に記載されているような他のマーカーと組み合わせて使用することができる。
【０３７６】
Ｂ．ペプチド又はタンパク質に対する多重化されたイムノアッセイ：単一の試料から複数のバイオマーカーを検出することが必要とされる場合、多重化されたアッセイを実施するのがより経済的であり、便利であり得る。問題となる各分析物に対して、一対の特異的抗体が必要とされ、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００ＴＭ分析装置上で使用するために特有に染色された微粒子が必要とされる。前記対の各捕捉抗体は、特有の微粒子上に個別に被覆される。前記対の他の抗体は、Ｒ−フィコエリトリンなどの蛍光色素体へ連結される。微粒子をプールし、約１０００の特有な粒子／μＬの濃度（約０．０１％ｗ／ｖに対応する。）になるように希釈する。希釈剤は、緩衝液、塩および界面活性剤を含有する。１０のマーカーがパネル中に存在すれば、固体の合計は、約１０，０００粒子／μＬ又は約０．１％固体ｗ／ｖである。連結物をプールし、それぞれ、微粒子希釈液中約１から１０ｎＭの最終濃度になるように調整する。アッセイを実施するために、分析物の１つ又はそれ以上を含有すると疑われる試料の一部を温置ウェル中に配置し、続いて、プールされた微粒子の半分容量を配置する。懸濁液を３０分間温置した後、プールされた連結物溶液の半分容量を添加する。３０分のさらなる温置後、塩および界面活性剤を含有する緩衝化された溶液の２倍容量を添加することによって、反応を希釈する。懸濁物を混合し、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００ＴＭ装置によって、試料の約２倍の容積を分析のために吸引する。必要に応じて、各温置後に、微粒子を洗浄し、次いで、分析のために再懸濁することが可能である。各個別の粒子の蛍光を３つの波長で測定する。２つは粒子およびその会合された分析物を同定するために使用され、３つ目は粒子に結合された分析物の量を定量するために使用される。各種類の１００の微粒子を測定し、各分析物に対する中央値蛍光を計算する。必要に応じて、精度の低下およびそれに伴う感受性の低下が殆どなしに、各種類の５０又はそれ以下の微粒子を測定することができる。ペプチド又はタンパク質の既知量を含有する一連の試料に対して同じ分析を行い、既知濃度に対して既知試料の中央値蛍光をプロットすることによって作成された標準曲線と比較することによって、試料中の分析物の量を計算する。実施例７に記載されているような分離およびスコア法又は分離および重み付けされたスコア法などのモデルを用いて、既知の癌又は非癌試料との比較における分析物の濃度（上昇又は下降したかどうか）に基づいて、未知の試料は、癌又は非癌であると分類される。必要に応じて、分析物のパネルに対するスコア付け法として、実施例１２に記載されている中央値の倍数などの他の方法を使用することが可能である。
【０３７７】
例えば、表１８並びに分離およびスコア法の８つのイムノアッセイ（ＩＡ）パネルを用いて、患者が肺癌を有する可能性を決定するために患者を検査し得る。患者から検査試料を得た後、患者の検査試料（すなわち、血清）中の８つのバイオマーカーの各々の量を定量し、次いで、バイオマーカーの各々の量を、表１８に列記されているような（すなわち、サイトケラチン１９に対して使用することができる所定のカットオフは、１．８９又は２．９である。）、バイオマーカーに対する対応する所定の分離点（所定のカットオフ）と比較する。その対応する所定の分離点（所定のカットオフ）より高い量を有する各バイオマーカーに対して、１のスコアを与え得る。その対応する所定の分離点（所定のカットオフ）以下の量を有する各バイオマーカーに対して、０のスコアを与え得る。次いで、患者に対する合計スコアを得るために、８つのバイオマーカーの各々に対するスコアを（すなわち、バイオマーカーのスコアの各々を一緒に加算することによって）数学的に合算する。この合計スコアがパネルスコアとなる。パネルスコアを、表２５ａの８ＩＡモデルの所定の閾値（所定の合計スコア）、すなわち１と比較する。１より大きいパネルスコアは、患者に対する陽性結果である。１以下のパネルスコアは、患者に対する陰性結果である。実施例９に記載されている集団研究において、このパネルは、３０％の特異性、７０％の偽陽性率および９０％の感受性を示した。患者に対する陽性パネルの結果は、偽陽性である７０％の確率を有している。さらに、肺癌患者の９０％が陽性パネルの結果を有している。従って、陽性パネルの結果を有する患者を、肺癌の兆候又は疑いに関するさらなる検査に供し得る。
【０３７８】
さらなる例として、再度、８ＩＡパネルおよび重み付けされたスコア法を用いて、患者から検査試料を取得した後、患者の検査試料（すなわち、血清）中の８バイオマーカーの各々の量を定量し、次いで、バイオマーカーの各々の量を、表１７ｂ中に列記されている分離点（カットオフ）（すなわち、サイトケラチン１９に対して使用することができる所定のカットオフは、１．２、１．９および３．３である。）などの所定の分離点（所定のカットオフ）と比較する。この例では、各バイオマーカーは、３つの所定の分離点（所定のカットオフ）を有する。従って、４つの可能なスコアが、各バイオマーカーに対して付与され得る。次いで、患者に対する合計スコアを得るために、８つのバイオマーカーの各々に対するスコアを（すなわち、バイオマーカーのスコアの各々を一緒に加算することによって）数学的に合算する。次いで、合計スコアがパネルスコアとなる。パネルスコアは、１１．２であると計算された８ＩＡモデルに対する所定の閾値（又は所定の合計スコア）と比較することができる。１１．２より大きい患者のパネルスコアは、陽性結果である。１１．２以下のパネルスコアは、陰性結果である。実施例９に記載されている集団研究において、このパネルは、３４％の特異性、６６％の擬陽性率および９０％の感受性を示した。陽性パネルの結果は、偽陽性である６６％の確率を有する。さらに、肺癌患者の９０％が陽性パネルの結果を有している。従って、陽性パネルの結果を有する患者を、肺癌の兆候又は疑いに関するさらなる検査に供し得る。
【０３７９】
Ｃ．患者の自己抗体に対する多重化されたイムノアッセイ：臨床診断を行うために使用される一又は複数のバイオマーカーが循環自己抗体である場合には、実施例１１Ａおよび１１Ｂに上述されているものと類似のアプローチを使用することができる。単一の又は少数の自己抗体が使用されるべき場合には、アッセイは、Ａｂｂｏｔｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，  Ｉｌｌｉｎｏｉｓから入手可能なＡｒｃｈｉｔｅｃｔＴＭイムノアッセイシステムなどの自動化された分析装置上で行うことができる。バイオマーカーに対する患者の血清の陽性又は陰性は、標準又は対照血清を用いて、検査血清によって生じたシグナルを比較することによって決定され、値がカットオフを超えていれば、患者は陽性と決定される。決定を行うために複数の自己抗体が使用される場合には、Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ａｕｓｔｉｎ，  Ｔｅｘａｓから入手可能なＬｕｍｉｎｅｘ１００ＴＭ分析装置又は関連する装置が使用される。以下の実施例１２に記載されているような選択された自己抗原で被覆された、プールされた微粒子を、患者の血清（又は血漿）の希釈された分取試料に曝露する。最初の温置後、粒子を洗浄し、検出可能な標識がタグ付加されたヒトＩｇＧに対する抗体を含む検出試薬に曝露する。第二の温置後、粒子を再度洗浄し、蛍光標識の使用によって、検出可能な試薬が検出される、検出可能な標識がビオチンであれば、蛍光標識は、抗ビオチン、アビジン又はＲ−フィコエリトリンに付着されたストレプトアビジンの何れかであり得る。第三の温置および洗浄（又は吸引）後、緩衝液中に粒子を再懸濁し、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００ＴＭ分析装置中に導入する。非特異的結合（陰性対照）および特異的結合（陽性対照）を検査するために、対照粒子はこのプロセスを通じて存続され得る。同様に、操作的対照、例えば、抗ヒトＩｇＧで被覆された粒子を含めることができる。患者の試料から得られた値を陰性試料と比較することによって、単一のバイオマーカーを陽性又は陰性であると決定することができる。複数の自己抗体を測定する場合、各バイオマーカーを順次測定し、患者に対する陽性又は陰性の全体的な評価に到達するために、結果を合算する。複数の結果は、上記実施例１１Ｂに記載されている分離およびスコア法又は実施例１２に記載されている中央値の倍数（ＭＯＭ）などのデータ解析ツールを用いることによって、最適に組み合わせることができる。
【０３８０】
抗原および自己抗体の両方を各患者の試料上に流すことが所望され、抗原の濃度が自己抗体測定において使用される濃度と同等の希釈を可能にするほど十分に高ければ、全ての微粒子を１つの試薬中に組み合わせ、患者の血清又は血漿の１つの分取試料に対して検査を実施することができる。自己抗体プロトコールに対する唯一の改変は、抗ヒトＩｇＧ試薬の他に、抗原分析物の各々に対する検出可能に標識された抗体を第二の試薬中に含めなければならないということである。最後の段階で、適切なｒ−フィコエリトリン試薬を用いて全てを検出することができる。抗原アッセイには、高い感度が必要とされ得るので、自己抗体測定のために試料を適切に希釈することができない。この場合には、最小限に希釈された血清試料中で抗原を測定し、高度に希釈された血清試料中で自己抗体を測定する。測定の数を倍増させるが、測定の両種類はＬｕｍｉｎｅｘ装置のファミリー上で容易に実施することが可能である。あるいは、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能なものなど、他のフローサイトメーター上で測定を行うことができる。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣａｌｉｆｏｒｎｉａのＰｒｏｔｏＡｒｒａｙに類似するアレイへフォーマットを変更することによって、個別に調製された微粒子試薬の利便性が失われるが、技術的には実行可能である。
【０３８１】
Ｄ．免疫質量スペクトル分析：質量スペクトルのための試料の調製は、免疫学的方法およびクロマトグラフィー又は電気泳動法を使用することもできる。ペプチドバイオマーカーに対して特異的な抗体で被覆された超常磁性微粒子を、塩を含有する緩衝溶液中の約０．１％の濃度になるように調整する。患者の血清試料の一部を抗体で被覆された微粒子の等量および希釈液の２倍量と混合する。温置後、緩衝塩、並びに必要に応じて、塩および界面活性剤を含有する洗浄緩衝液で微粒子を洗浄する。次いで、脱イオン化水で微粒子を洗浄する。トリフルオロ酢酸を含有する水性アセトニトリルの所定容量を添加することによって、免疫精製された分析物を微粒子から溶出する。次いで、試料をシナピン酸マトリックス溶液の等量と混合し、飛行時間質量分析のためのＭＡＬＤＩ標的へ、少量（約１から３μＬ）を適用する。所望のｍ／ｚでのイオン電流を、同一の様式で処理されたペプチドバイオマーカーの既知量を含有する試料に由来するイオン電流と比較する。
【０３８２】
イオン電流は、濃度と直接関係しており、特定のｍ／ｚ値（又はＲＯＩ）でのイオン電流（又は強度）は、所望であれば、濃度へ変換することができることに留意すべきである。次いで、実施例７に記載されているモデル構築アルゴリズムの何れかへの入力として、このような濃度又は強度を使用することができる。
【０３８３】
Ｅ．ＲＯＩに対する質量分析：患者から血液試料を取得し、血清試料を形成させるために凝血させた。ＳＥＬＤＩ質量分析のために試料を調製し、バイオプロセッサ中のタンパク質チップ上に搭載し、実施例２に記載されているように処理した。Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ４０００ＭＡＬＤＩ飛行時間質量分析計上にＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐを搭載し、実施例３のように分析した。多変量解析を用いて、受容性に関して各スペクトルを検査する。例えば、総イオン電流および（未知の試料と既知の基準集団の間の）スペクトルコントラスト角を計算する。次いで、マハラノビス距離を求める。そのマハラノビス距離が確定された臨界値を下回るスペクトルに関して、定量を行う。そのマハラノビス距離が確定された臨界値を上回るスペクトルに関しては、スペクトルをさらなる分析から除外し、試料を再度実行すべきである。判定後、質量スペクトルを標準化する。
【０３８４】
選択されたデータ解析モデルに適した関心領域中のイオン電流を測定することによって、得られた質量スペクトルを評価する。分析の結果に基づいて、患者は肺癌に対するリスクがあると判断され、又は肺癌を有する可能性が高いと判断され、さらなる診断処置を続行すべきである。
【０３８５】
分離およびスコア法を使用するために、表５中に与えられているｍ／ｚ値のＲＯＩ中の強度が患者に対して測定される。患者の値が、表７に与えられている平均分離点の値の癌の側にあるか又は癌でない側にあるかどうかに注目することによって、患者の結果にスコアが与えられる。分離点の癌の側にあることが明らかとなった各ＲＯＩ値に対して、１のスコアが与えられる。３およびそれ以上のスコアは、患者が癌に対して上昇したリスクを有しており、さらなる診断処置を受けるべきであることを示唆する。
【実施例１２】
【０３８６】
中央値倍数法
データ積算の中央値倍数（ＭｏＭ；ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｏｆ  ｍｅｄｉａｎ）法は、バイオマーカーのパネルのスコア付けを可能とする。中央値倍数法では、正常コホート中の各バイオマーカーの中央値を求める。その特定のバイオマーカーの全ての測定を標準化するために、この中央値を使用する。ＭｏＭは、血清抗体および血清抗原の両者のレベルを解析するために使用されてきた。Ｗ．Ｋｕｔｔｅｃｈら（Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ．８４；８１１−８１５（１９９４））は、患者中の抗リン脂質抗体レベルを報告するために、ＭｏＭを使用した。さらに、Ｇ．Ｐａｌｏｍａｋｉら（Ｃｌｉｎｃ．Ｃｈｅｍ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．）  ３９：１１３７−１１４５（２００１））は、血清タンパク質レベルを解析するためにＭｏＭを使用した。従って、測定されたあらゆるバイオマーカーのレベルが正常群の中央値によって除され、中央値の倍数が得られる。これらの中央値の倍数値は、パネル中の各バイオマーカーに関して合算され（すなわち、合計又は加算され）、各試料に対してパネルＭｏＭ値又はＭｏＭスコアが得られる。臨床目的のために、疾病の存在又はリスクを示唆するパネルＭｏＭ値に対してカットオフを決定することができる。
【０３８７】
ＭｏＭ法の特徴は、集団中のデータの分布が保持されることである。一例として、１０５９人の個体（２９１の肺癌、３８７の良性肺疾患および３８１の健康者）において、７つの自己抗体を測定した。正常コホートに対して、７つの自己抗体測定の中央値を求め、全ての測定を中央値の倍数へ変換した。１０５９人の個体全員に関して、７つの中央値の倍数値を合計した。これらの１０５９のパネルＭｏＭ値を受信者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線；ｒｅｃｅｉｖｅｒ−ｏｐｅｒａｔｏｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  ｃｕｒｖｅ）に供した。得られた曲線が図６に示されている。最大精度によって又は９８％特異性要件によって求められた分割点を用いる二分割スコアリング法から得られた曲線も、図６にプロットされている。
【実施例１３】
【０３８８】
自己抗体ビーズアレイ
Ａ．市販のヒトタンパク質（表３１、下記参照）をＬｕｍｉｎｅｘＴＭＳｅｒｏＭａｐＴＭビーズ（Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ）に結合し、試薬を調製するために、各ビーズセットを合わせる。存在する全ての抗体がタンパク質に結合できる条件下で、試薬の一部をヒト血清試料に曝露させた。結合していない物質を洗浄除去し、次いで、ヒトＩｇＧに特異的に結合する抗体に連結されたＲ−フィコエリトリンの蛍光性連結物へビーズを曝露させた。洗浄後、ビーズの内部色素に従って各ビーズを特定するＬｕｍｉｎｅｘＴＭ１００装置にビーズを通過させ、ビーズに結合された蛍光（ビーズに結合された抗体の量に対応する。）を測定した。このようにして、２１のヒトタンパク質および対照用の７つの非ヒトタンパク質（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および破傷風トキシン）に対する７７２の試料（肺癌２５１、正常２４４、良性２７７）の免疫応答を評価した。
【０３８９】
Ｂ．抗原でのＬｕｍｉｎｅｘＳｅｒｏＭａｐＴＭビーズのコーティング
本研究のためのビーズは、実施例３Ｂに記載されている直接法、実施例４Ｅに記載されている事前活性化法又はここで記載されている受動吸着によって示されるとおりに被覆した。
【０３９０】
ＬｕｍｉｎｅｘＳｅｒｏＭａｐビーズ１００μＬに、被覆されるべきタンパク質の２．５μｇに対応する適切な容量を添加し、混合物を渦巻き撹拌し、室温で暗所に放置した。９０分後に、混合物を３７℃に６０分間配置した後、ＰＢＮ／Ｔｗｅｅｎ１ｍＬを添加し、混合物を渦巻き撹拌し、遠心して沈殿させた。ＰＢＮ／Ｔｗｅｅｎ１ｍＬ中に沈降物を再懸濁し、混合物を音波処理した。ビーズを遠心して沈降させ、ＰＢＮ／Ｔｗｅｅｎ５００μＬ中に沈降物を再懸濁した。
【０３９１】
Ｃ．被覆されたビーズを用いた血清試料の検査
マイクロプレート当り８０の試料を用いて、ＰＢＮ中へ１：３０希釈して、血清試料をマイクロプレート中に調製した。プロトコール：１．２μＳｕｐｏｒフィルタープレートのウェルに、ＰＢＮ／Ｔｗｅｅｎ１００μＬを添加した。約５分後、真空にした。ウェルが空になった時点で、プレートの底を紙タオルで吸収し、ウェル当り１ＸＭａｓｔｅｒＭｉｘ５０μＬを添加した。各ウェルに、１；３０試料２０μＬを試料プレートから添加し、次いで、最大振盪数で振盪装置上において６０分間温置した。全ての液体を除去するために、真空にした。ＰＢＮ／Ｔｗｅｅｎ１００μＬを添加し、全ての液体を除去するために真空にした。ＰＢＮ／Ｔｗｅｅｎ１００μＬを添加し、振盪装置上に１０分間配置し、次いで、全ての液体を除去するために真空にした。ＰＢＮ／Ｔｗｅｅｎ１００μＬを添加し、振盪装置上に１０分間配置し、全ての液体を除去するために真空にした。１：５００連結物（ＰＢＮ／Ｔｗｅｅｎ１０．４ｍＬ中のＲＰＥ抗ヒトＩｇＧ２０．８μＬ）１００μＬを各ウェルに添加し、ピペットで撹拌し、振盪装置上に３０分間配置し、全ての液体を除去するために真空にした。ＰＢＮ／Ｔｗｅｅｎ１００μＬを添加し、ピペットで撹拌し、マイクロプレートに移し、Ｌｕｍｉｎｅｘ上で走行させた。
【０３９２】
Ｄ．自己抗体パネルの解析
ａ．ＲＯＣ解析
各試料を用いて検査された各自己抗原に対して記録された生の結果は、中央値であった。これらの結果を受信者動作特性（ＲＯＣ）解析に供し、癌を非癌群から区別するために、曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。下表３１は、各自己抗原に対するＡＵＣ値を報告する。
【０３９３】
【表４１】
0005611821.tif 000054
【０３９４】
ｂ．スコアリング法
癌を非癌群から識別する際のバイオマーカーの複数パネルを評価するために、二分スコアリング法を使用した。下表３２は、各バイオマーカーに対して使用された分離点（カットオフ）を列記する。下表３３は、各パネル中の各マーカーおよび各パネルに対するＡＵＣを特定する。
【０３９５】
【表４２】
0005611821.tif 000055
【０３９６】
ｃ．中央値の倍数
「正常」群の中央値で除することによって、各バイオマーカーに対する生データを中央値の倍数へ変換した。各パネルに対して中央値の倍数を合計して、各試料に対する中央値の倍数のパネルを得る。これらの中央値の倍数のパネルを、受信者動作特性分析に供し、下表３３ａおよび３３ｂ中にＡＵＣが報告されている。
【０３９７】
【表４３】
0005611821.tif 000056
【０３９８】
【表４４】
0005611821.tif 000057
【０３９９】
上記表３３ａおよび３３ｂ中のパネルを、バイオマーカーとして自己抗原のみと比較すると明らかなように、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｐ５３、ｍａｐｋａｐｋ３およびサイクリンＥ２−１ペプチドを含む４／０／０パネルは、さらに４つの自己抗原を含む８／０／０パネルと同程度に優れていた。さらに、少なくとも３つの自己抗原（すなわち、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｐ５３およびサイクリンＥ２−１ペプチド）をパネル中に含めたときに、最高のＡＵＣ値が得られた。
【０４００】
ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ解析（上記表３３ｂ）では、中央値の倍数（ＭｏＭ）および二分スコアリング法によって、同じＡＵＣが達成された。しかしながら、ＭｏＭ解析法と比べて、二分スコア法では、バイオマーカーのより大きなパネルが必要とされた。この方法（中央値の倍数）は、最も少ないバイオマーカーで、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｐ５３およびサイクリンＥ２−１に対する自己抗体並びに腫瘍抗原ＣＫ１９、ＣＥＡ、ＣＡ１２５およびプロＧＲＰを含むパネル３／４／０が達成可能な最高のＡＵＣを与えることを明らかにした。少なくとも本実施例では、さらなるバイオマーカーを付加することによって、ＡＵＣは変化しなかった。しかしながら、二分スコア法を用いると、最高のＡＵＣおよび最小のバイオマーカーを有するパネルは、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｐ５３、サイクリンＥ２−１およびｍａｐｋａｐｋ３に対する自己抗体並びに腫瘍抗原ＣＫ１９、ＣＥＡ、ＣＡ１２５およびプロＧＲＰ並びに質量分析バイオマーカーＰＵＢ４７８９、Ｔｆａ２７５９およびＡＣＮ９４５９を含む４／４／３であった。
【０４０１】
喫煙数が多い喫煙者群（＞２０パック・年）、喫煙数が少ない喫煙者および非喫煙者群（＜２０パック・年）並びにパック・年歴が未知の群において、パネル４／４／０（上記表３３ａおよび３３ｂ）を検査した。各患者は、１つの群中のみに動員された（表３４）。全ての個体が喫煙数の多い喫煙者であるか、全ての個体が喫煙数の少ない喫煙者若しくは非喫煙者であるか、又は喫煙歴が不明であるかどうかを問わず、同様に、パネルは癌を非癌から識別した（図７参照）。検査は、３つの群全てにおいて、同様に優れた成績を収め、結果が喫煙歴とは独立していることを示している。喫煙数が多いコホート中の非癌患者から癌を区別する能力は、０．８４であり、喫煙数が少ないコホート又は非喫煙コホートでは０．８５、喫煙歴不明のコホートでは０．８８であった。
【０４０２】
【表４５】
0005611821.tif 000058
【０４０３】
診断している肺癌の段階に従って、各癌患者をグループ分けした。初期段階の肺癌を段階ＩおよびＩＩと定義した。後期段階の肺癌を段階ＩＩＩおよびＩＶと定義した。対照として良性肺疾患コホート又は対照として正常コホートの何れかを用いて、癌を非癌から識別する能力に関して、４／４／０パネルを検査した。各患者は、１つの群中にのみ動員された。下表３５は、各群中の患者の数およびそれぞれの比較のためのＡＵＣを特定する。
【０４０４】
【表４６】
0005611821.tif 000059
【０４０５】
４／４／０パネルおよび同様に構成された他のパネルを用いると、初期段階の肺癌および良性肺疾患の識別が著しく改善された。図８および表３６ａでは、正常コホートおよび良性肺疾患コホートから初期および後期段階の肺癌を識別する能力に関して、それぞれの各バイオマーカーを検査した。幾らかの能力（ＡＵＣ−０．７から０．８）で、後期疾病が正常および良性から識別されたが、正常および良性からの初期段階の肺癌の識別能は、より低かった（ＡＵＣ約０．５から０．７）点で、腫瘍抗原（ＣＫ１９、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＣＡ１５−３、ＣＡ１２５、ＳＣＣ、ＣＫ１８およびプロＧＲＰ）は全て、有意な段階依存性を示すことが明瞭である。
【０４０６】
ハプトグロビン、血清アミロイドＡ、Ｃ反応性タンパク質およびアポリポタンパク質ＣＩＩＩを含む免疫応答マーカーは、腫瘍抗原と同様の段階依存性を示す（図８）。
【０４０７】
個別のバイオマーカーとしての自己抗体は、段階依存性がずっと低い。初期および後期段階の肺癌は、ほぼ等しい能力で、正常および良性から識別される。より成績が良好な自己抗原には、ｐ５３、ｍａｐｋａｐｋ３、サイクリンＥ２−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＤＪ１およびｔｍｏｄが含まれ、０．６から０．７５の範囲のＡＵＣを有する。
【０４０８】
ＭＳマーカー（４７８９、１１５９７、２７５９およびＡＣＮ９４５９（これらの各々はＡＰＲである。））は、その挙動の段階依存性がより低いという点で、自己抗体と同様に振舞う。
【０４０９】
これらの組み合わせの能力は、図９および表３６ｂにおいて明確となる。腫瘍抗原を免疫応答マーカーと組み合わせることによって、著しく増強された段階依存性を有し、初期段階肺癌を良性肺疾患から一貫して識別することができないパネルが得られる（ＡＵＣ約０．６５から０．６８）。初期段階の肺癌は、ＡＵＣ約０．７５から０．８を有する正常なコホートから識別される。
【０４１０】
自己抗原バイオマーカーを免疫応答マーカーと組み合わせることによって、癌を非癌から（初期および後期段階の肺癌を正常および良性肺疾患からなど）識別する上でより大きな全般的一貫性を有するパネルが得られる（図９）。初期段階の肺癌は、約０．７５から０．８２のＡＵＣで、正常および良性肺疾患から首尾よくに識別される。後期段階の疾病および正常又は良性肺疾患に対するＡＵＣは同様であり（０．７５から０．８５）、腫瘍抗原を使用した場合ほどは良好でない。
【０４１１】
腫瘍抗原と自己抗体の組み合わせは、優れたパネルを与える。図９中に４ＩＡ＋４ａｂとして記載されている４／４／０パネルは、ＡＵＣ約０．８２で、初期段階肺癌を良性肺疾患から識別する。免疫応答マーカー（Ｃ反応性タンパク質、血清アミロイドＡ又はハプトグロビン）をさらに組み合わせることによって、ほとんど改善は見られない。実際には、４／４／０パネルへ３つの免疫応答マーカーを付加することによって、パネルの性能が実際に低下する。
【０４１２】
【表４７】
0005611821.tif 000060
【０４１３】
【表４８】
0005611821.tif 000061
【実施例１４】
【０４１４】
チモシンβＥＩＡ（Ｔβ４）
チモシンβ４ＥＩＡキットは、ＡＬＰＣＯＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓａｌｅｍ，  ＮＨ）から購入した。
アッセイは、製造業者の指示に従って実行した。血清試料は、希釈せずに直接使用した。正常、良性および癌患者試料を含有する１１８の試料の選択された群を実施した。分析物の濃度は、製造業者のプロトコール中に指示されているとおりに、既知の標準濃度の４−パラメータロジスティック曲線の適合（４ＰＬＣ）から得た。全ての計算は、ＪＭＰ５．０統計パッケージ中に提供されている非線形曲線フィッティングアルゴリズムを用いて行った。Ｔβ４アッセイに対して得られたＡＵＣが図１０に示されている。
【０４１５】
上に示されているように、Ｔβ４単独で、比較的良好に、罹患群および非罹患群を識別することができた。しかしながら、下表３７に示されているように、高い特異性では、その感受性は比較的不良である（特異性＝９０％、感受性＝５３％）。ここでは、Ｔβ４がパネル中に含められた場合の、幾つかの好ましいマルチマーカーパネルの性能の改善を評価した。マーカーパネルの３つの異なる群（４ＩＡ（ＣＫ１９、ＣＥＡ、ＣＡ１２５およびプロＧＲＰ）、４Ａａｂ（サイクリンＥ２−１、ＭＡＰＫＡＰＫ３、Ｐ５３およびＮＹ−ＥＳＯ−１）および３ＡＰＲ（血清アミロイドＡ（ｐｕｂ１１５９７）、Ｃ反応性タンパク質およびハプトグロビン（１７８５８質量であると推測される。））を使用した。下表３７は、Ｔβ４ありのパネルおよびＴβ４なしのパネルの性能を比較する。２つの異なる特異性（ＨｓｐｅｃおよびＬｓｐｅｃ）でのＡＵＣおよび感受性も比較した。パネルの性能を高い特異性と低い特異性で比較するために、それぞれ、Ｈｓｐｅｃは９０％に設定し、Ｌｓｐｅｃは７０％に設定した。
【０４１６】
【表４９】
0005611821.tif 000062
【０４１７】
上記表３７から明らかなように、Ｔβ４なしで最良のパネルは４Ａａｂであり、０．９のＡＵＣであった。このパネルの感受性は、それぞれ、高い特異性および低い特異性で、約８０％および９０％である。しかしながら、Ｔβ４をこのパネルに加えると、感受性が８０％から７５％へ低下するので、性能は高い特異性（Ｈｓｐｅｃ）で僅かに悪化する。ＡＵＣは同じのままなので、このことは、幾らかの特性を得ることによって、パネルが喪失を補い得ることを示唆する。しかしながら、４ＩＡパネルは、高い特異性および低い特異性において、ＡＵＣおよび感受性の両方で全般的な改善を示す。このことは、このパネルの性能に対して、Ｔβ４が相乗効果を有することを示唆する。上記表３７に示されているように、ＡＵＣは０．８６から０．９２まで向上し、高い特異性での感受性は約１０％向上する。低い特異性において、この向上はさらに大きい（約１５％）。しかしながら、Ｔβ４が含められたときに、３ＡＰＲパネルは幾らかの改善を示すが、罹患状態と非罹患状態とを識別するための臨床的アッセイとして使用するには十分頑強でない可能性があり得る。パネルの感受性は、高い特異性および低い特異性の両方で、比較的不良である。
【０４１８】
従って、上記結果は、Ｔβ４は高い特異性と低い特異性の両方でパネルの識別力を改善するので、４ＩＡパネルとともにＴβ４を使用し得ることを示唆している。その後、このような組み合わされたパネルは、単独で使用されるパネルより有用となる。成績パラメータを注意深く検査すると、組み合わされたパネルの成績は相対的に頑強な臨床アッセイにとって十分であることが示唆される（特異性＝９０％、感受性＝８３％で、ＡＵＣ＝０．９２）。さらに、Ｔβ４とパネルの一員間での相関分析は全く相関を示さず、マーカーの独立性を確認する。
【０４１９】
当業者は、目的を実行し、記載されている目標および利点並びにその中に内在する目標および利点を得るために、本発明が上手く適合されることを容易に理解する。本明細書中に記載されている組成物、製剤、方法、操作、処理、分子、特異的化合物は、好ましい実施形態を現在代表する、例示的なものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本明細書中に開示されている本発明に様々な置換および修飾を施し得ることが当業者に自明である。
【０４２０】
本明細書中に記載されている全ての特許および公報は、本発明が属する分野の当業者のレベルの指標となる。
【図１】
0005611821.tif 000063
【図２】
0005611821.tif 000064
【図３】
0005611821.tif 000065
【図４ａ】
0005611821.tif 000066
【図４ｂ】
0005611821.tif 000067
【図４ｃ】
0005611821.tif 000068
【図４ｄ】
0005611821.tif 000069
【図５】
0005611821.tif 000070
【図６】
0005611821.tif 000071
【図７】
0005611821.tif 000072
【図８】
0005611821.tif 000073
【図９】
0005611821.tif 000074
【図１０】
0005611821.tif 000075
【配列表】
0005611821000001.app