(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
ａ１−Ｒ１−Ｘ１−ＦＧＲＫＭＤＲ−Ｘ２−Ｒ２−ａ２  （Ｉ）
を有するヒトＢＮＰ（１−３２）エピトープを担持するポリペプチドであって、
式中
−ａ１は、Ｈであってもよいし、チオール官能基、アルコール官能基、アミノキシ官能基、第一級アミンまたは第二級アミン官能基、アミノカルボキシル基、ビオチニル基およびアセチル基から選択される官能基または化学基を表していてもよく；
−ａ２は、ＯＨ官能基、ＮＨ２官能基またはアルコキシル基を表していてもよく；
−Ｘ１は、存在しないかまたは存在し、存在する場合はＣとＧＣの中から選択され；
−Ｘ２は、存在しないかまたは存在し、存在する場合はＩとＩＳの中から選択され；
−Ｒ１およびＲ２は、同一であっても異なっていてもよく、存在しても存在しなくてもよく、式（Ｉ）の前記ポリペプチドが、配列ＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳを含むヒトＢＮＰ（１−３２）の１１個を超えるアミノ酸の部分を含まないという条件で、任意のアミノ酸、または２個から１５個のアミノ酸のペプチド鎖を表す、ポリペプチド。
【請求項２】
ヒトＢＮＰ（１−３２）またはヒトプロＢＮＰ（１−１０８）ならびに配列ＦＧＲＫＭＤＲを含んでなるそれらの個々の断片に対するリガンドの調製のための請求項１に記載のポリペプチドの使用であって、該リガンドが、請求項１に定義されるエピトープを認識する抗体または抗体断片、アプタマー、およびファージディスプレーによって得られる請求項１に定義されるエピトープを特異的に認識するポリペプチドからなる群から選択されるところの、使用。
【請求項３】
ヒトＢＮＰ（１−３２）またはヒトプロＢＮＰ（１−１０８）ならびに配列ＦＧＲＫＭＤＲを含んでなるそれらの個々の断片に対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの調製のための請求項１に記載のポリペプチドの使用。
【請求項４】
ヒトＢＮＰ（１−３２）またはヒトプロＢＮＰ（１−１０８）ならびに配列ＦＧＲＫＭＤＲを含んでなるそれらの個々の断片に対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製する方法であって、ハイブリドーマを得るために、
−請求項１に記載のポリペプチドにより免疫化された動物由来の免疫グロブリンを分泌するリンパ球を骨髄腫細胞と融合させる、
方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法から得ることができるハイブリドーマ。
【請求項６】
登録番号ＣＮＣＭ  Ｉ−３７４６でＣＮＣＭ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、２５、ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、７５  ７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５、仏国）に２００７年４月１３日に寄託されたハイブリドーマ。
【請求項７】
配列ＦＧＲＫＭＤＲのエピトープに特異的なリガンドであって、該エピトープを認識する抗体または抗体断片、アプタマー、およびファージディスプレーによって得られる該エピトープを特異的に認識するポリペプチドによって構成される群から選択される、リガンド。
【請求項８】
配列ＦＧＲＫＭＤＲのエピトープを特異的に認識する抗体、または前記エピトープを特異的に認識する前記抗体の断片によって構成される請求項７に記載のリガンド。
【請求項９】
生体サンプルにおいて、ヒトＢＮＰ（１−３２）またはヒトプロＢＮＰ（１−１０８）ならびに配列ＦＧＲＫＭＤＲを含んでなるそれらの個々の断片を検出するための、請求項７または８に記載のリガンドの使用。
【請求項１０】
生体サンプルにおいて、ヒトＢＮＰ（１−３２）、または配列ＦＧＲＫＭＤＲを含有するヒトプロＢＮＰ（１−１０８）の誘導体を検出する方法であって：
１）抗原−リガンド複合体の形成を可能にする条件下、請求項７または８に記載の少なくとも１つのリガンドと前記生体サンプルとを接触させること、および
２）形成した可能性のある複合体をいずれも検出すること、
を含んでなる方法。
【請求項１１】
個体における少なくとも１つの心臓病態および／または血管病態の診断、予後、または危険性の層別化、あるいは少なくとも１つの心臓病態および／または血管病態に対する治療を受けている個体の治療モニタリングを補助するためのイン・ビトロでの方法であって、
１）抗原−リガンド複合体の形成を可能にする条件下、請求項７または８に記載の少なくとも１つのリガンドと前記個体からの生体サンプルとを接触させるステップと、
２）形成した可能性のある複合体をいずれも検出するステップと、
を含んでなる方法。
【請求項１２】
前記病態が、
−鬱血性心不全、
−急性冠動脈症候群、
−脳血管性発作、
−腎不全、
−呼吸困難、
−高血圧、
−じゅく状斑破裂、
−未熟新生児における動脈管開存症、および／または
−糖尿病、
を含んでなる群から選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
以下の一般式（ＩＩＩ）：
ｔ１−Ｅ１−Ｌ１−Ｅ２［−Ｌｋ−１−Ｅｋ］ｎ−ｔ２  （ＩＩＩ）
を有するマルチエピトープ標準物質であって、
式中：
−ｎは、０〜８の間の整数であり；
−ｋは、ｎ＞０の場合、３〜ｎ＋２の間の整数であり；
−Ｅ１、Ｅ２、およびＥｋは、互いに異なり、１つは、Ｒ１−Ｘ１−ＦＧＲＫＭＤＲ−Ｘ２−Ｒ２ペプチド配列を表し、式中Ｘ１、Ｘ２、Ｒ１およびＲ２は、請求項１に定義されたとおりであり、他は、ヒトプロＢＮＰ（１−１０８）の配列から選択される３個から１５個のアミノ酸の配列を表し；
−ｔ１は、水素原子、アセチル基、１個から１０個のアミノ酸のペプチド配列、１個〜１０個のＮ−αアセチル化アミノ酸のペプチド配列、ビオチニル基またはビオシチニル基、ビオチニル基またはビオシチニル基を担持する１個から１０個のアミノ酸のペプチド配列、または線状アミノアルキル（Ｃ１−Ｃ１０）カルボニル鎖を表し；
−ｔ２は、ヒドロキシル基、アミノ基、１個から１０個のアミノ酸のペプチド配列、末端アミノ基を担持する１個から１０個のアミノ酸のペプチド配列、または線状または分枝状アミノアルキル（Ｃ１−Ｃ１０）カルボニル鎖を表し；
−Ｌ１およびＬｋは、同一であっても異なっていてもよく、ペプチド鎖の結合基を表す、
マルチエピトープ標準物質。
【請求項１４】
ヒトＢＮＰ（１−３２）またはヒトプロＢＮＰ（１−１０８）ならびに配列ＦＧＲＫＭＤＲを含んでなるそれらの個々の断片を検出するためのキットであって、少なくとも
−請求項７または８に記載のリガンド；および
−請求項１３に記載のマルチエピトープ標準物質、
を含んでなるキット。
【請求項１５】
個体における脳卒中の診断を補助するためのイン・ビトロでの方法であって、
１）抗原−リガンド複合体の形成を可能にする条件下、請求項７または８に記載の少なくとも１つのリガンドと前記個体からの生体サンプルとを接触させるステップと、
２）形成した可能性のある複合体をいずれも検出するステップと、
を含み、ここに、標識形態で存在するプロＢＮＰ（１−１０８）のＲＡＰＲ７６Ｓ７７Ｐ配列に対するモノクローナル抗体と組み合わせて、前記ステップ１の少なくとも１つのリガンドが固相上に固定された形態で使用されるか、または固相上に固定された形態で存在するプロＢＮＰ（１−１０８）のＲＡＰＲ７６Ｓ７７Ｐ配列に対するモノクローナル抗体と組み合わせて、前記ステップ１の少なくとも１つのリガンドが標識形態で使用される、方法。
【請求項１６】
個体における少なくとも１つの心臓病態および／または血管病態の診断、予後、または危険性の層別化、あるいは少なくとも１つの心臓病態および／または血管病態に対する治療を受けている個体の治療モニタリングを目的とした診断キットの製造のための請求項７または８に記載の少なくとも１つのリガンドの使用であって、ここに、該診断、予後、危険性の層別化、または治療モニタリングが、
１）抗原−リガンド複合体の形成を可能にする条件下、請求項７または８に記載の少なくとも１つのリガンドと前記個体からの生体サンプルとを接触させるステップと、
２）形成した可能性のある複合体をいずれも検出するステップと、
を含んでなるところの、使用。
【請求項１７】
個体における脳卒中の診断を目的とした診断キットの製造のための請求項７または８に記載の少なくとも１つのリガンドの使用であって、ここに、該診断が、
１）抗原−リガンド複合体の形成を可能にする条件下、請求項７または８に記載の少なくとも１つのリガンドと前記個体からの生体サンプルとを接触させるステップと、
２）形成した可能性のある複合体をいずれも検出するステップと、
を含み、前記ステップ１の少なくとも１つのリガンドが固相上に固定された形態で、標識形態で存在するプロＢＮＰ（１−１０８）のＲＡＰＲ７６Ｓ７７Ｐ配列に対するモノクローナル抗体と組み合わせて使用されるか、または前記ステップ１の少なくとも１つのリガンドが標識形態で、固相上に固定された形態で存在するプロＢＮＰ（１−１０８）のＲＡＰＲ７６Ｓ７７Ｐ配列に対するモノクローナル抗体と組み合わせて使用されるところの、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００７年８月３日に出願された米国仮特許出願第６０／９３５，２６９号明細書（本明細書に援用）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、ヒト脳のナトリウム排泄増加ペプチド（ＢＮＰ）ならびにヒトにおける鬱血性心不全のインビトロ診断に関する。より具体的には、本発明は、ＢＮＰ（１−３２）分子に存在する新規エピトープ、前記エピトープに対する抗体、特に２０Ｇ７モノクローナル抗体、このような抗体を用いたＢＮＰ（１−３２）およびプロＢＮＰ（１−１０８）ならびにそれら個々の断片の免疫学的アッセイに関する方法、および前記アッセイを実施するための試験キットに関する。
【０００３】
鬱血性心不全は、特に高齢者によく見られる一般的な臨床的症候群である。それは通常、身体的労作時の咳、倦怠、末梢浮腫の発現などの非特異的症状の潜伏性トリガリングの形態で発現する。疾患重症度（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  ＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎによるＩ〜ＩＶ  ＮＨＹＡの段階に等級分けされている）の診断および評価は、臨床的徴候と特定の試験および検査（エコー心電図、シンチグラフィー、運動試験など）の結果を組み合わせた解釈に基づく。
【背景技術】
【０００４】
鬱血性心不全の重症度および高額な患者管理費用のため、この症候群の早期診断がきわめて望ましいことは明らかである。早期診断によって、この症候群がより重症の鬱血性心不全になることを避けたり、それへの急速な進行を遅らせたりする上で好適な治療の実施に寄与すると考えられるからである。したがって、鬱血性心不全および／または好ましくない予後または引き続く合併症の危険性がある人々を同定することが必要である。またこのことにより、治療を受けている患者を治療的にモニタリングする（速やかに、簡便に、そして低コストで）ために同じ手段を提案することが可能になるであろう。今日、鬱血性心不全の診断、予後およびモニタリングのためのこのような方法は用いられており、下記に記載されているが、それらはやや不十分であることが実証されており、また完全に有益とは限らない。
【０００５】
急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）もまた、現代の大きな健康問題である。それらは、以下の心臓疾患を含んでなる：Ｑ波心筋梗塞、ＳＴ部分の上昇を有する、または有さない心筋梗塞、心筋梗塞の恐れまたは不安定なアンギナ。
【０００６】
ＡＣＳの診断、予後およびモニタリングはまた、医療界において最も重要である。ナトリウム排泄増加ペプチド（ＢＮＰ（１−３２）、ＮＴ−プロＢＮＰ（１−７６）、およびプロＢＮＰ（１−１０８）のアッセイは、これらの適用においてきわめて高い関心が寄せられている。
【０００７】
同じことは、息切れ（呼吸困難を特徴とする疾患）、脳血管発作（ＣＶＡ）（「脳卒中」または「脳溢血」としても知られている）、および腎不全などの関連病態ならびにこれらの病態に関連した糖尿病の場合にも当てはまる。
【０００８】
鬱血性心不全を予測し得る前駆症状マーカーは長い間求められていた。これに関して、心筋細胞が、ナトリウム排泄活性を有するペプチド：心耳を出所源とするペプチド、ラットにおいて非特許文献１によって発見されたＡＮＰ（心房ナトリウム排泄ペプチド）、およびブタおよびヒトにおいて特許文献１の発明者らによっておよび非特許文献２によって発見されたＢＮＰ（脳ナトリウム排泄性ペプチド）として知られている心耳−心室起源のナトリウム排泄ペプチドを産生し分泌することが示されている。
【０００９】
ＢＮＰの前駆体であるプレプロＢＮＰ（１−１３４）は、心筋細胞内でのこの分子の貯蔵形態である。前記前駆体は、シグナルペプチドおよびプロＢＮＰ（１−１０８）の放出のために、その分泌中および／または分泌後に開裂する。プロＢＮＰ（１−１０８）は、配列：
Ｈ１ＰＬＧＳＰＧＳＡＳＤＬＥＴＳＧＬＱＥＱＲＮＨＬＱＧＫＬＳＥＬＱＶＥＱＴＳＬＥＰＬＱＥＳＰＲＰＴＧＶＷＫＳＲＥＶＡＴＥＧＩＲＧＨＲＫＭＶＬＹＴＬＲＡＰＲ７６Ｓ７７ＰＫＭＶＱＧＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＫＶＬＲＲＨ１０８（配列番号１）
である１０８個のアミノ酸のポリペプチドで構成されている。
【００１０】
それは、分泌中および／または分泌後に、アミノ酸Ａｒｇ７６とアミノ酸Ｓｅｒ７７との間で、一方はＢＮＰ（７７−１０８）またはＢＮＰ−３２またはＢＮＰ（１−３２）（以下この用語を用いる）としても知られているＢＮＰへ、そしてプロＢＮＰのＮ末端断片またはＮＴ−プロＢＮＰ（１−７６）（以下この用語を用いる）としても知られているプロホルモンＢＮＰ（１−７６）のＮ末端部分へと開裂する。
【００１１】
この分子の血管活性形態であるＢＮＰ（１−３２）は、配列：
Ｓ１ＰＫＭＶＱＧＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＫＶＬＲＲＨ３２（配列番号２）
である３２個のアミノ酸のペプチドで構成されている。
【００１２】
１７個のアミノ酸は２つの酸化システイン残基（Ｃ１０およびＣ２６）の間のジスルフィド結合によって閉じたループを形成し、前記ループは、上流を９個のアミノ酸（これがＮ末端部分を構成する）、下流を６個のアミノ酸（これがＣ末端部分を構成する）で囲まれている。
【００１３】
良好な生物活性を得るためにはこのループの完全性が重要である。ループを形成する１７個の残基のうち、１１個は２つの他のナトリウム排泄ペプチドであるＡＮＰ（Ａ型のナトリウム排泄ペプチド）とＣＮＰ（Ｃ型のナトリウム排泄ペプチド）においても保存されている。
【００１４】
ＮＴ−プロＢＮＰ（１−７６）は、プロＢＮＰ（１−１０８）の７６個のＮ末端アミノ酸によって形成され、以下の配列：
Ｈ１ＰＬＧＳＰＧＳＡＳＤＬＥＴＳＧＬＱＥＱＲＮＨＬＱＧＫＬＳＥＬＱＶＥＱＴＳＬＥＰＬＱＥＳＰＲＰＴＧＶＷＫＳＲＥＶＡＴＥＧＩＲＧＨＲＫＭＶＬＹＴＬＲＡＰＲ７６（配列番号３）
を有する。
【００１５】
興味深いことに、これら３つのポリペプチド、プロＢＮＰ（１−１０８）、ＮＴ−プロＢＮＰ（１−７６）およびＢＮＰ（１−３２）は、抗体の特定の組み合せを用いた種々のアッセイが開発された方法において鬱血性心不全の良好なマーカーであることが実証されている。
【００１６】
実際、非特許文献３の初期の研究以来、プロＢＮＰ（１−１０８）が血液中を循環していることが認められていたため、プロＢＮＰ（１−１０８）を検出するための種々の免疫学的アッセイが提案されている。特許文献２には、プロＢＮＰ（１−１０８）の１−７６の部分を認識する抗体および抗ＢＮＰ（１−３２）抗体の助けによるプロＢＮＰ（１−１０８）のサンドイッチアッセイが記載されている。このタイプのアッセイは、捕捉抗体により認識されるエピトープを有する開裂プロＢＮＰ（１−１０８）の副産物、すなわちＮＴ−プロＢＮＰ（１−７６）およびその進行的開裂から生じる産物の固相（捕捉抗体）へ結合することにより、感度が不足である。
【００１７】
特許文献３には、一方ではＮＴ−プロＢＮＰ（１−７６）およびＢＮＰ（１−３２）（ヒンジ７６抗体とも称される）のヒンジに位置する配列ＲＡＰＲＳＰのエピトープを認識する抗体、他方では抗ＢＮＰ（１−３２）抗体の助けによるプロＢＮＰ（１−１０８）の検出が記載されており、このタイプのアッセイのこのような方法において、アッセイはプロホルモンのみに特異的である。すなわち、ＮＴ−プロＢＮＰ（１−７６）のとＢＮＰ（１−３２）との２つの形態の交差反応性はない。
【００１８】
ＮＴ−プロＢＮＰ（１−７６）
ＮＴ−プロＢＮＰ（１−７６）のアッセイに関して、特許文献４には、ＮＴ−プロＢＮＰ（１−７６）の検出に基づいた鬱血性心不全のインビトロ診断のための方法が記載されている。しかしながら、特許文献４に記載されている方法は、血液サンプル中のＮＴ−プロＢＮＰ（１−７６）に対して、容易には実施されないようである。実際、ヒトの血清に対してではなく、合成ペプチドであるペプチドＮＴ−プロＢＮＰ（４７−６４）を用いて得られた標準的な範囲に対して実施された例のみが示されている。この欠点を克服するためには、きわめて高度な自動システムが必要であることが分かっている。
【００１９】
最後に、ＢＮＰ（１−３２）の複数のアッセイが種々の抗体を用いて開発されている。例えば、特許文献５には、ＢＮＰ（１−３２）の環状構造を認識する２つのモノクローナル抗体（ＫＹ−ｈＢＮＰＩおよびＫＹ−ｈＢＮＰＩＩ）が記載されているが、他の詳細は記載されていない。
【００２０】
また、特許文献６には、ＢＮＰ（１−３２）のＣ末端Ｋ２７ＶＬＲＲＨ３２エピトープの最後のアミノ酸であるヒスチジンＨ３２を認識するモノクローナル抗体が記載されている。ＢＮＰ（１−３２）上に存在する他のエピトープが知られている：配列１ＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣ１０（配列番号２２）、５ＶＱＧＳＧＣＦＧＲ１３（配列番号２１）および１５ＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧ２５（配列番号２３）の３つのエピトープもまた、特許文献７および特許文献８に、高度に免疫原性なものとして記載されている。前記文書には、これらのエピトープに対する単一特異的抗体も記載されている。
【００２１】
２００５年に、ＨｙＴｅｓｔ社（Ｔｕｒｋｕ、フィンランド国）は、ＢＮＰ（１−３２）に特異的な種々の抗体を市場に出した。非特許文献４による論文に記載されたこれらの抗ＢＮＰ（１−３２）抗体のいくつかは、ＢＮＰ（１−３２）の１−１０、１１−２２、１７−２３または２６−３２の領域を標的にしている。ＢＮＰ（１−３２）の１１ＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳ２２（配列番号６１）ペプチドを用いて、Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫化することによって得られた１７の抗体のうち、２４Ｃ５と２６Ｅ２のモノクローナル抗体のみが記載されている。しかし、それらのエピトープは正確には特徴付けされておらず、それらが、ＢＮＰ（１−３２）の上記のアミノ酸１１から２２の配列に対するものであることが示されているのみである。
【００２２】
特許文献９には、ＢＮＰ（１−３２）に存在する別のエピトープが記載されている。これは、ヒトＢＮＰ（１−３２）の環状構造の一部を形成するアミノ酸１３−２０に含まれるアミノ酸Ｒ１３（Ｋ１４）（Ｍ１５）Ｄ１６Ｒ１７Ｉ１８（配列番号２４）の配列を有する。この出願には、このエピトープを特異的に認識する３−６３１−４３６と称されるモノクローナル抗体も記載されている。４つのアミノ酸、Ｒ１３、Ｄ１６、Ｒ１７、およびＩ１８が、このエピトープへの３−６３１−４３６抗体の結合に関して機能的に重要であるとして述べられている。このエピトープの上流に位置するアミノ酸（フェニルアラニンＦ１１やグリシンＧ１２など）は記載されていない。
【００２３】
ＢＮＰ（１−３２）ホルモンの欠点の１つは、血漿中および血清中で不安定なことである。実際、プロテアーゼタイプの酵素がＢＮＰ（１−３２）を開裂するようである。例えば、非特許文献５は、ＢＮＰ（１−３２）のＣ末端位のＡｒｇ３０−Ａｒｇ３１ 結合と同様に、プロテアーゼによってＢＮＰ（１−３２）のＮ末端部分、より具体的にはＰｒｏ２−Ｌｙｓ３結合が開裂すると考えられることを報告している。非特許文献６および非特許文献７は、特にＮ末端位におけるＢＮＰ（１−３２）の分解を記載している。
【００２４】
同様に、エンドペプチダーゼによって生じたいくつかの結合開裂が、報告されている（非特許文献８）。したがって、ＢＮＰ（１−３２）のアッセイには、特別な注意が必要であり（非特許文献９；非特許文献１０）、抗体の好適な選択を暗示している。
【００２５】
最近、いくつかのチームにより、ナトリウム排泄ペプチドがグリコシル化形態および／または切断形態で循環する可能性が示されている（非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２６】
【特許文献１】ＥＰ４１８３０８
【特許文献２】国際公開第９９／１３３３１号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００４／１４９５２号パンフレット
【特許文献４】国際公開第９３／２４５３１号パンフレット
【特許文献５】ＪＰ２６７６１１４Ｂ２
【特許文献６】ＥＰ５４２２５５
【特許文献７】国際公開第９７／３２９００号パンフレット
【特許文献８】米国特許第６，１６２，９０２号明細書
【特許文献９】国際公開第２００６／８８７００号パンフレット
【非特許文献】
【００２７】
【非特許文献１】de Boldら Life Science 1981, vol. 28(1): 89-94
【非特許文献２】Sudohら(1988) Nature 332:78-81
【非特許文献３】Tateyama ら (1992) Biochemical and Biophysical Research Communications 185: 760-767
【非特許文献４】Seferianら (2007) Clinical Chemistry 53:5, 866-873
【非特許文献５】Shimizuら (2002) Clinica Chimica Acta 316: 129-135
【非特許文献６】Boerrigterら (2007) Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 292: R897-90
【非特許文献７】Hawkridgeら (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102:17442-7
【非特許文献８】Davidson & Struthers (1994) J. Hypertension 13: 329-336
【非特許文献９】Davidsonら (1995) Circulation 91:1276-7
【非特許文献１０】Gobinet-Georgesら (2000) Clin. Chem.  Lab. Med. 38:519-23
【非特許文献１１】Schellenberger (2006) Arch. Biochem. Biophys. 451: 160-6
【非特許文献１２】Liangら (2007) Journal of the American College of Cardiology 49: 1071-8
【非特許文献１３】Lamら (2007) Journal of the American College of Cardiology 49: 1193-292
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
鬱血性心不全、ＡＣＳ、呼吸困難、および他の心欠陥疾患、ならびにＣＶＡおよび糖尿病や腎不全などの関連病態の早期診断に関して、特にＢＮＰ（１−３２）の不安定性を考慮して、ＢＮＰ（１−３２）およびプロＢＮＰ（１−１０８）を検出するための試薬および方法の改善が常に求められている。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明は主に、ヒトＢＮＰ（１−３２）分子に存在する未知の予想されなかったエピトープおよび前記エピトープを認識する特異的なモノクローナル抗体の本発明者らによる全く予想外の発見から導かれている。全ての予想に反して、発明者らは、ＢＮＰ（１−３２）の配列Ｆ１１ＧＲＫＭＤＲ１７（配列番号５１）は、ＢＮＰ（１−３２）の環状構造（アミノ酸１０−２６）を認識する抗体を作出するための有益なエピトープを構成することを発見し、前記Ｆ１１Ｇ１２ＲＫ１４ＭＤＲ１７（配列番号５１）エピトープを特異的に認識する２０Ｇ７と称するモノクローナル抗体を得た。言い換えると、２０Ｇ７抗体は、ＢＮＰ（１−３２）のＦ１１ＧＲＫＭＤＲ１７（配列番号５１）エピトープに特異的なモノクローナル抗体である。
【００３０】
本発明はまた、２０Ｇ７モノクローナル抗体および前記抗体を含有する試薬を用いてＢＮＰ（１−３２）およびプロＢＮＰ（１−１０８）ならびにそれらの循環性断片を検出するための免疫アッセイ法を提供する。
【００３１】
実際、ヒトＢＮＰ（１−３２）の環状領域（アミノ酸１０−２６）に位置するペプチドを合成し、前記ペプチドによりマウスを免疫化した際、前記ペプチドがフェニルアラニンＦ１１残基、リジンＫ１４残基およびアルギニンＲ１７残基を含有する場合は、得られたいくつかの抗体はこのタイプのペプチドにのみ反応すること、また国際出願国際公開第２００６／８８７００号パンフレットに記載されたエピトープにおいて特に重要なイソロイシンＩ１８は、本発明によるエピトープに属していなかったことを、本発明者らは認めた。
【００３２】
例えば、本発明者らは、何匹かのマウスをＴＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＴＳＴＡＩＧＣＫＶＬ（配列番号４）ペプチドで、他のマウスをＳＧＣＹＧＲＫＭＤＲＩＳＴＳＴＡＩＧＣＫＶＬ（配列番号５）ペプチドで免疫化した。ＳＧＣＹＧＲＫＭＤＲＩＳＴＳＴＡＩＧＣＫＶＬ（配列番号５）ペプチドで免疫化したマウスにおいてよりも、ＴＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＴＳＴＡＩＧＣＫＶＬ（配列番号４）ペプチドで免疫化したマウスにおいて、ＢＮＰ（１−３２）に対する免疫応答がはるかに大きいことが観察された。双方の場合とも、システインは鎖内ジスルフィド結合を介して酸化形態で存在していることに注意されたい。
【００３３】
免疫化マウスの脾臓細胞と骨髄腫細胞とのリンパ球融合後、本発明者らは、種々のハイブリッドクローンを作製することができた。特に、フェニルアラニンＦ１１残基、リジンＫ１４残基およびアルギニンＲ１７残基を含有するＢＮＰ（１−３２）およびプロＢＮＰ（１−１０８）のペプチドのみを認識する２０Ｇ７−１５／０３／２００７と称されるモノクローナル抗体（以下、便宜上「２０Ｇ７」と称する）を得た。実際、これらのアミノ酸、Ｆ１１、Ｋ１４およびＲ１７は、ＢＮＰ（１−３２）およびプロＢＮＰ（１−１０８）ならびにそれらそれぞれの断片に対する２０Ｇ７モノクローナル抗体の最適な結合にとって重要であることが実証された。
【００３４】
２０Ｇ７−１５／０３／２００７モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマは、ＣＮＣＭ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、２５、ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、７５  ７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５、仏国）において、Ｂｉｏ−Ｒａｄにより、２００７年４月１３日に、登録番号ＣＮＣＭ  Ｉ−３７４６で寄託された。
【００３５】
驚くべきことに、また予想外なことに、本発明者らの観察によると、２０Ｇ７抗体は、その残基、Ｆ１１、Ｋ１４およびＲ１７が個々に、または一緒にアラニンによって置換されると、このペプチドの抗原反応性は、天然のＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＫＶＬ（配列番号６）ペプチドの抗原反応性に比較してかなりの影響を受けるが、このエピトープの他のアミノ酸を置換した場合は、このペプチドの抗原反応性にほとんど影響がなかった。また、２０Ｇ７抗体についての詳細な研究により、２０Ｇ７抗体が、Ｆ１１ＧＲＫＭＤＲ１７（配列番号５１）エピトープを認識するが、Ａ１１ＧＲＫＭＤＲ１７（配列番号６２）配列も、ＧＲＫＭＤＲ１７ＩＩ８（配列番号５２）配列も、Ｃ１０Ｆ１１ＧＲＫＭＤ（配列番号５０）配列も認識しないことが示された。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
したがって、２０Ｇ７モノクローナル抗体は、ＢＮＰ（１−３２）のＦ１１ＧＲＫＭＤＲ１７（配列番号５１）エピトープ配列を認識するが、出願国際公開第９７／３２９００号パンフレットの上記ＶＱＧＳＧＣＦＧＲ（配列番号２１）、ＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣ（配列番号２２）およびＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧ（配列番号２３）のエピトープも、出願国際公開第２００６／８８７００号パンフレットのＲ（Ｋ）（Ｍ）ＤＲＩ（配列番号２４）のエピトープも実質的に認識しない。
【００３７】
したがって、本発明は、式（Ｉ）：
ａ１−Ｒ１−Ｘ１−ＦＧＲＫＭＤＲ−Ｘ２−Ｒ２−ａ２  （Ｉ）
を有するヒトＢＮＰ（１−３２）エピトープを担持するポリペプチドに関するものであり、
−ａ１は、Ｈであってもよいし、チオール官能基、アルコール官能基、アミノキシ官能基、第一級アミンまたは第二級アミン官能基、アミノカルボキシル基、ビオチニル基およびアセチル基から選択される官能基または化学基を表していてもよく；
−ａ２は、ＯＨ官能基、ＮＨ２官能基またはアルコキシル基を表していてもよく（当業者には明白であろうが、ａ２はこのポリペプチド最後のアミノ酸の酸性官能基にあるカルボニル（−ＣＯ−）部分に結合している）；
−Ｘ１は、存在しないか、または存在し、存在する場合は、ＣとＧＣの中から選択され；
−Ｘ２は、存在しないか、または存在し、存在する場合は、ＩとＩＳの中から選択され；
−Ｒ１およびＲ２は、同一であっても異なっていてもよく、存在しても存在しなくてもよく、式（Ｉ）の前記ポリペプチドが、配列ＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳ（配列番号６３）など、ヒトＢＮＰ（１−３２）の１１を超えるアミノ酸の部分を含まないという条件で、任意のアミノ酸または２個から１５個のアミノ酸のペプチド鎖を表す。
【００３８】
同等な代替物として、式（Ｉ）はまた以下のように定義することもできる：
ａ１−（Ｒ１）−（Ｇ）−（Ｃ）−ＦＧＲＫＭＤＲ−（Ｉ）−（Ｓ）−（Ｒ２）−ａ２
式中、ａ１、ａ２、Ｒ１およびＲ２は上記の定義のとおりである。
【００３９】
「エピトープ」または「エピトープ部位」は、少なくとも１種の抗体によって認識されかつその抗体を前記アミノ酸配列に結合させるアミノ酸配列を意味する。
【００４０】
好ましい実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、担体分子、試薬またはマーカー分子に結合できる。
【００４１】
別の好ましい実施形態において、前記ポリペプチドは、ａ１−ＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲ−ａ２（配列番号３３）、ａ１−ＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩ−ａ２（配列番号３４）、ａ１−ＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳ−ａ２（配列番号３５）およびａ１−ＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳ−ａ２（配列番号３６）からなる群において選択され、式中、ａ１およびａ２は上記に定義されたとおりである。
【００４２】
別の好ましい実施形態において、上記に定義されたポリペプチドは、式（ＩＩ）
ａ１−ＦＧＲＫＭＤＲ−ａ２（ＩＩ）
に相当し、式中、ａ１およびａ２は上記に定義されたとおりである。
【００４３】
本発明はまた、ヒトＢＮＰ（１−３２）またはヒトプロＢＮＰ（１−１０８）ならびに配列ＦＧＲＫＭＤＲ（配列番号５１）を含んでなるそれらの個々の断片に対するリガンドを調製するための、上記に定義したポリペプチドの使用に関する。
【００４４】
本発明による「プロＢＮＰ（１−１０８）の断片」は、特にＢＮＰ（１−３２）を含む、プロＢＮＰ（１−１０８）よりも小さな任意の断片を意味する。例えば、Lam ら (2007) J. Am. Coll. Cardiol. 49:1193-1202に記載され、ジペプチダーゼによる開裂によって作製されるプロＢＮＰ（３−１０８）断片である。本発明による用語「プロＢＮＰ（１−１０８）の断片」にはまた、リン酸化、グリコシル化など、プロＢＮＰ（１−１０８）の少なくとも１つの翻訳後修飾に供された任意のポリペプチドも含まれる。例えば、Schellenberger ら(2006) Arch. Biochem. Biophys. 51:160-6は、プロＢＮＰ（１−１０８）が、完全に、または部分的にＯ−グリコシル化されている糖タンパク質であることを示した。
【００４５】
本発明による「ＢＮＰ（１−３２）の断片」は、ＢＮＰ（１−３２）よりも小さい任意の断片を意味する。またこの場合、ＢＮＰ（１−３２）の分解が既に文献に報告されている：例えば、ＢＮＰ（３−３２）断片は、Lamら（上記）およびHawkridge ら(2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:17442-7により記載されている。
【００４６】
用語「プロＢＮＰ（１−１０８）」および「ＢＮＰ（１−３２）」ならびに「プロＢＮＰ（１−１０８）の断片」および「ＢＮＰ（１−３２）の断片」には、リン酸化、グリコシル化などの少なくとも１つの翻訳後修飾に供された任意のポリペプチドが含まれる。例えば、Schellenbergerら(2006) Arch. Biochem. Biophys. 51:160-6は、プロＢＮＰ（１−１０８）が、完全に、または部分的にＯ−グリコシル化されている糖タンパク質であることを示している。
【００４７】
「ヒトＢＮＰ（１−３２）またはヒトプロＢＮＰ（１−１０８）ならびに配列ＦＧＲＫＭＤＲを含んでなるそれらの個々の断片に対するリガンド」とは、ヒトＢＮＰ（１−３２）、ヒトプロＢＮＰ（１−１０８）またはそれらの断片に特異的に結合することのできる任意の分子のことである。
【００４８】
リガンドの認識または標的に対する結合を言う場合の用語「特異的」は、リガンドが、標的に構造的に類似していない他の標的に実質的に相互作用することなく、標的と相互作用することを意味する。ＦＧＲＫＭＤＲエピトープの「特異的」な認識とは、そのエピトープを含んでなる標的とリガンドとの相互作用が、そのエピトープのもの以外に、抗原性の決定因子、特にアミノ酸を実質的に含まないことを意味する。特にこれは、リガンドが、ＢＮＰ（１−３２）および／またはプロＢＮＰ（１−１０８）配列のアミノ酸配列ならびにＦＧＲＫＭＤＲエピトープを含んでなるアミノ酸を含んでなるそれらの個々の断片に結合することはできるが、その全体にＦＧＲＫＭＤＲエピトープを含まないＢＮＰ（１−３２）および／またはプロＢＮＰ（１−１０８）配列のアミノ酸配列に結合することができないことを意味する。
【００４９】
また、Launeら (2002) Journal of Immunological Methods 267:53-70によると、アラニンによる置換によってエピトープの抗原性の少なくとも５０％減少に至ると、前記エピトープに存在するアミノ酸は、「重要」であると言われる。
【００５０】
さらに、アラニンによる置換によってエピトープの抗原性の少なくとも８０％減少に至ると、前記エピトープに存在するアミノ酸は、「必須」であると言われる。
【００５１】
本発明によるＦＧＲＫＭＤＲエピトープを特異的に認識するリガンドは、配列ＶＱＧＳＧＣＦＧＲ（配列番号２１）、ＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣ（配列番号２２）、ＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧ（配列番号２３）、ＲＫＭＤＲＩ（配列番号２４）およびＲＫＭＤＲＩＳＳ（配列番号２５）を有するペプチドと実質的に相互作用しないことが好ましい。
【００５２】
「配列ＶＱＧＳＧＣＦＧＲ、ＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣ、ＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧ、ＲＫＭＤＲＩおよびＲＫＭＤＲＩＳＳを有するペプチドと実質的に相互作用しない」という表現は、そのリガンドの、これらの配列の１つまたは他の１つとの交差反応が、２０％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満、特に好ましくは２％未満であることを意味する。
【００５３】
標的の特異的認識の範囲内で、１０６Ｍ−１超の結合定数が好ましく、１０８Ｍ−１超の結合定数がより好ましく、１０１０Ｍ−１超の結合定数が特に好ましい。
【００５４】
残基Ｆ１１、Ｋ１４およびＲ１７のアラニンによる置換は、エピトープペプチドに対する、登録番号ＣＮＣＭ  Ｉ−３７４６でのＣＮＣＭ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、２５、ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、７５  ７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５、仏国)においてＢｉｏ−Ｒａｄにより２００７年４月１３日に寄託されたハイブリドーマにより作製されたモノクローナル抗体の結合におけるそれぞれ８２％、９５％および８５％の減少が特徴であるから、残基Ｆ１１、Ｋ１４およびＲ１７もまた本発明によるリガンドの結合にとって必須であることが好ましい。
【００５５】
エピトープを認識する抗体または前記抗体の断片、アプタマー、およびファージディスプレーによって得られたエピトープを特異的に認識するポリペプチドによって構成される群からリガンドが選択されることが好ましい。
【００５６】
この文脈において、用語「抗体」とは、任意のポリクローナルまたはモノクローナル抗体のことである。
【００５７】
断片ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ‘、Ｆ（ａｂ’）２、ならびにラクダ一本鎖抗体は、エピトープを認識する抗体断片の例である。
【００５８】
「アプタマー」は当業者によく知られている。アプタマーはヌクレオチドの化合物、特にリボヌクレオチドまたはデスオキシリボヌクレオチド、または標的、特にタンパク質標的に特異的に結合する天然ペプチドである。天然ヌクレオチドのアプタマーおよびそれらの製造は、特にEllington ら(1990) Nature 346:818-22 およびBock ら(1992) Nature 355:564-6に記載されている。天然ペプチドのアプタマーおよびそれらの作製は、特に Hoppe-Seyler ら (2000) J. Mol Med. 78:426-30に記載されている。
【００５９】
「ファージディスプレー」は、バクテリオファージのカプシド上に発現させ、カプシドコード遺伝子内に挿入された核酸配列によってコードされたポリペプチドリガンドを選択するための技法を表す。この技法は、当業者によく知られており、特にScott & Smith (1990) Science 249:386-390および Marksら (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597により記載されている。ファージディスプレーによって入手可能なポリペプチドは、ｓｃＦｖタイプのポリペプチド（一本鎖可変断片）であることが好ましい。この技法は特に、Winter ら (1994) Annu. Rev. Immunol. 12:433-455により記載されている。
【００６０】
リガンドは、化学合成または遺伝子工学によって得ることもできる。
【００６１】
上記に定義されたポリペプチドは、抗体、特にモノクローナル抗体の調製に用いられることが好ましい。
【００６２】
この文脈において本発明はまた、ヒトＢＮＰ（１−３２）またはヒトプロＢＮＰ（１−１０８）ならびに配列ＦＧＲＫＭＤＲを含んでなるそれらの個々の断片に対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの調製のための上記に定義したポリペプチドの使用に関する。
【００６３】
したがって本発明はまた、ヒトＢＮＰ（１−３２）またはヒトプロＢＮＰ（１−１０８）ならびに配列ＦＧＲＫＭＤＲを含んでなるそれらの個々の断片に対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの調製のための方法であって、ハイブリドーマを得るために、
−免疫グロブリンを分泌するリンパ球のサンプルを、上記のポリペプチドにより免疫化されたマウス、ウサギまたはラットなどの動物から採取され、
−次いでこれらのリンパ球を、Ｓｐ２骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８１）などの骨髄腫細胞と融合させる
方法に関する。
【００６４】
本発明はまた、上記に定義したハイブリドーマを調製するための方法により得ることのできるハイブリドーマに関する。
【００６５】
より具体的には、本発明は、登録番号ＣＮＣＭ  Ｉ−３７４６でＣＮＣＭ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、２５、ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、７５  ７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５、仏国)にＢｉｏ−Ｒａｄにより２００７年４月１３日に寄託されたハイブリドーマに関する。
【００６６】
一般に、ハイブリドーマおよびモノクローナル抗体を得るために用いられる方法論は、Ｋｏｈｌｅｒ  & Milstein (1975) Nature 256:495-497により記載されたリンパ球融合およびハイブリドーマ培養の慣例的方法に従うことができる。モノクローナル抗体を調製するための他の方法も知られている（例えば、Harlow ら編、1988 "Antibodies: a laboratory manual"）。
【００６７】
この慣例的方法に代替法も存在する。モノクローナル抗体は例えば、ハイブリドーマからクローン化した核酸を発現させることによって産生させることができる。
【００６８】
本発明はまた、配列ＦＧＲＫＭＤＲのエピトープに特異的なリガンドに関する。
【００６９】
このリガンドは、エピトープ、アプタマー、およびファージディスプレーによって得られたエピトープを特異的に認識するポリペプチドを認識する抗体または前記抗体の断片によって構成される群から選択されることが好ましい。
【００７０】
このリガンドは、配列ＦＧＲＫＭＤＲのエピトープを特異的に認識する抗体、またはこのエピトープを特異的に認識する前記抗体の断片によって構成されることがより好ましい。このリガンドは、モノクローナル抗体、特に上記に定義されたハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体によって構成されることがさらに好ましい。
【００７１】
したがって本発明は特に、登録番号ＣＮＣＭ  Ｉ−３７４６でＣＮＣＭ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、２５、ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、７５  ７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５、仏国)において２００７年４月１３日に寄託されたハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体により構成された上記に定義されたリガンドに関する。
【００７２】
本発明はさらに具体的に、登録番号ＣＮＣＭ  Ｉ−３７４６でＣＮＣＭ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、２５、ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、７５  ７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５、仏国）に２００７年４月１３日に寄託されたハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体により構成された上記に定義されたリガンドの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、特に全てのＣＤＲを有する上記に定義されたリガンドに関する。ＣＤＲ、および抗体からＣＤＲをリガンドに、好ましくは他の抗体に転移させる方法は当業者によく知られており、特に、例えば、Nicaise ら(2004) Protein Science 13:1882-1891 または Kettleborough ら(1991) Protein Engineering 4:773-783に記載されている。
【００７３】
また、上記に定義したリガンドを、担体分子、試薬または標識分子に結合させることができる。
【００７４】
本発明はまた、生体サンプル中に、ヒトＢＮＰ（１−３２）またはヒトプロＢＮＰ（１−１０８）ならびに配列ＦＧＲＫＭＤＲを含んでなるそれら個々の断片を検出するための上記に定義したリガンドに関する。
【００７５】
実際、本発明はまた、
１）生体サンプルを、好ましくは、抗原−リガンド複合体を形成させる条件下、上記に定義した少なくとも１種のリガンドに接触させること、および
２）形成した可能性のある複合体をいずれも検出すること
を含んでなる、ヒトＢＮＰ（１−３２）またはヒトプロＢＮＰ（１−１０８）ならびに配列ＦＧＲＫＭＤＲを含有するそれら個々の断片を生体サンプル中に検出するための方法に関する。
【００７６】
本発明の文脈において、「生体サンプル」またはさらに「生体液サンプル」は、血液、血漿、血清、脳脊髄液、唾液、尿および涙液などの生体液体によって構成されることが好ましい（例えば、Michielsenら (2008) Ann Clin Biochem 45:389-94; Cortes ら(2006) Eur J Heart Fail 8:621-7; Kirchhoff ら(2006) J Neurotrauma 23:943-9; Kaneko ら(1993) Brain Res 612:104-9を参照）。この場合、用語「生体サンプル」には、採取したサンプルと種々の処置、特に、本発明による処理および方法における使用に好適にする処置に供したサンプルとの双方が含まれることを意味する。
【００７７】
好ましい一実施形態において、上記の検出方法は、ヒトＢＮＰ（１−３２）またはヒトプロＢＮＰ（１−１０８）ならびにそれらの個々の断片に特異的であって、かつ本発明によるリガンドの特異性とは異なる特異性を有する少なくとも１つの追加リガンドに生体サンプルを接触させる少なくとも１つの追加ステップを含んでなる。
【００７８】
追加リガンドは抗体であることが好ましい。
【００７９】
本発明はまた、
１）個体からの生体サンプルを、好ましくは、抗原−リガンド複合体を形成可能とする条件下、上記に定義した少なくとも１種のリガンドに接触させるステップ、
２）形成した可能性のある複合体をいずれも検出するステップ、および
３）ステップ２における検出結果に基づいて、個体における病態の診断、予後、発現の危険性または治療的追跡を判定するステップ
を含んでなる、個体における心臓および／または血管の少なくとも１つの病態の診断、予後、危険性の層別化または治療的追跡の方法に関する。
【００８０】
特定の一実施形態において、上記に定義した方法は、生体サンプルを、ヒトＢＮＰ（１−３２）、または本発明によるリガンドの特異性とは異なる特異性を有するヒトプロＢＮＰ（１−１０８）誘導体に特異的な少なくとも１種の追加リガンドに接触させる少なくとも１つの追加ステップを含んでなる。
【００８１】
追加リガンドは抗体であることが好ましい。
【００８２】
病態は、
−鬱血性心不全
−急性冠動脈症候群
−脳血管性発作
−腎不全
−呼吸困難
−高血圧
−じゅく状斑破裂
−未熟新生児における動脈管開存症、および／または
−糖尿病
からなる群から選択されることが好ましい。
【００８３】
「鬱血性心不全」は、器官の代謝的要求を満足させる上で十分な血液を心臓が送り出すことのできない原因が心機能の異常にあり、および／または心臓が要求を満たしてはいるが、異常に高い吸い入れ圧を伴う病態を意味する。これは特に、左心室および／または右心室の不全に関連し得る。
【００８４】
「急性冠動脈症候群」は、特に二つに分類される：
−一般に、急性全冠動閉塞に対応するＱ波壁内梗塞の形成が現れる、ＳＴ部分の持続的なアップスロープ（すなわち上昇）を伴う急性冠動脈不全、および
−プラーク破裂および不完全な血栓形成に対応しかつ異なる治療を必要とする不安定アンギナとしても知られている、非Ｑ波梗塞に対応するＳＴ部分のアップスロープを伴わない（すなわち上昇がない）急性冠動脈不全。
【００８５】
「呼吸困難」は、緊張感または閉塞感を伴う呼吸困難を特徴とする病態を意味する。これは幾つかの原因による可能性があるきわめて一般的な症状である。適切な治療を可能にするのは、系統的アプローチのみである。
【００８６】
世界保健機構の定義によると、「脳血管性偶発症状」または「ＣＶＡ」または「脳卒中」または「脳溢血」は、２４時間超継続する症状を伴う脳機能障害の局所的または全体的な臨床的徴候の急速な発現を特徴とし、血管起源以外には原因が明らかではなく、死に至り得る病態を意味する。
【００８７】
上記の処置および方法は、当業者に周知の種々の様式に従って、例えば、サンドイッチ法または競合法により、１ステップまたは２ステップで、固相または均質相において実施することができる。
【００８８】
１つは捕捉リガンド、他方は検出リガンドである２つのリガンド（好ましくは抗体）間で固相におけるサンドイッチ法を用いることが好ましい。このタイプの免疫アッセイは当業者に特によく知られている。例えば、Seferian ら(2007) Clin. Chem. 53:866-873による論文は、各回に一対の抗体（固相に固定した抗体および検出に標識化抗体）を用いた、ＢＮＰ（１−３２）およびプロＢＮＰ（１−１０８）をアッセイするためのサンドイッチ免疫アッセイ（または２部位での免疫定量アッセイ）の一例を提供している。
【００８９】
「捕捉リガンド」は、生体サンプルに存在するＢＮＰ（１−３２）および／またはプロＢＮＰ（１−１０８）抗原、ならびにそれらそれぞれの断片に結合することのできるリガンドを意味する。
【００９０】
生体サンプル中の抗原の存在は、検出手段、特に「検出リガンド」によって明らかにされる。標識化された検出リガンドは、捕捉リガンドによって認識されるエピトープ部位とは異なるエピトープ部位を認識することによって、捕捉された抗原に結合することができる。
【００９１】
用語「標識化」とは、直接的な標識化および間接的な標識化（例えば、それら自体が標識化されている他のリガンドにより、または、限定的ではないが標識化されたアビジン−ビオチン対などの標識化された「親和対」の試薬を用いて）の双方を言う。
【００９２】
サンドイッチ法の場合、捕捉リガンドは、患者生来の抗原上のエピトープを特異的に認識するように選択されることが好ましく、一方検出リガンドは、患者生来の抗原上の他のエピトープを特異的に認識するように選択されることが好ましい。
【００９３】
捕捉リガンドは固相状に固定されることが好ましい。固相の非限定的な例として、マイクロプレート、特にＮｕｎｃ（デンマーク国）によって販売されているものなどのポリスチレンマイクロプレートを使用し得る。固体粒子またはビーズ、Ｄｙｎａｌ、Ｍｅｒｃｋ−Ｅｕｒｏｌａｂ（仏国）により（商標ＥｓｔａｐｏｒＴＭ）およびＰｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにより製造されたものなどの常磁性ビーズ、またはさらに、ポリスチレンまたはポリプロピレンの試験管、ガラス、プラスチックまたはシリコンのチップなども使用できる。
【００９４】
形成した抗原−抗体複合体の存在を明らかにするために、ＥＬＩＳＡアッセイ、放射線免疫アッセイ、または他の任意の検出方法を用いることができる。したがって、リガンド、特に抗体の種々のタイプの標識化が可能である（放射性、酵素的、蛍光など）。
【００９５】
検出はまた、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などの質量蓄積に基づいた新規方法により、圧電検出により、また、質量分光分析または第二の標識リガンドの非存在下でリガンド−抗原タイプ相互作用の試験を可能にすると確定された他の任意の方法によっても実施できる。
【００９６】
上記の処置または方法の好ましい実施は、標識形態で存在するＢＮＰ（１−３２）のＮ末端部分に対する少なくとも１種のモノクローナルまたはポリクローナル抗体と組み合わせて、固相上に固定した上記のリガンドを用いることにある。
【００９７】
上記の処置または方法の他の好ましい実施は、ＨｙＴｅｓｔから入手可能な標識形態で存在する５０Ｂ７抗体（ＢＮＰ（１−３２）の２６−３２のペプチドに特異的）などのＢＮＰ（１−３２）のＣ末端部分に対する少なくとも１種のモノクローナルまたはポリクローナル抗体と組み合わせて、固相上に固定した上記のリガンドを用いることにある。
【００９８】
あるいは、上記の方法または処置のさらに別の好ましい実施により、固相上の固定化形態で存在するＢＮＰ（１−３２）のＮ末端またはＣ末端部分に対する少なくとも１種のモノクローナルまたはポリクローナル抗体と組み合わせて、上記に定義したリガンドを標識形態で用いることができる。
【００９９】
上記の方法または処置の好ましい実施は、標識形態で存在する、ＨｙＴｅｓｔから入手可能な１６Ｆ３抗体（ＮＴ−プロＢＮＰの１３−２０ペプチドに特異的）などのＮＴ−プロＢＮＰ（１−１０８）のＮ末端部分に対する少なくとも１種のモノクローナルまたはポリクローナル抗体と組み合わせて、固相上に固定した上記のリガンドを用いることにある。
【０１００】
あるいは、上記の方法または処置の好ましい実施は、固相上の固定化形態で存在する、ＨｙＴｅｓｔから入手可能な１６Ｆ３抗体（ＮＴ−プロＢＮＰの１３−２０ペプチドに特異的）などのプロＢＮＰ（１−１０８）のＮ末端部分に対する少なくとも１種のモノクローナルまたはポリクローナル抗体と組み合わせて、上記に定義したリガンドを標識形態で用いることにある。
【０１０１】
上記の方法または処置の他の好ましい実施は、標識形態で存在する、プロＢＮＰ（１−１０８）のＲＡＰＲ７６Ｓ７７Ｐ（配列番号５５）配列に対するモノクローナル抗体（特許出願国際公開第２００４／１４９５２号パンフレット、またはGiulianiら(2006) Clin. Chem..52:1054-1061 に記載されたものなど）と組み合わせて、固相上に固定した上記のリガンドを用いることにある。
【０１０２】
あるいは、上記の方法または処置の好ましい実施は、固相上の固定化形態で存在する、プロＢＮＰ（１−１０８）のＲＡＰＲ７６Ｓ７７Ｐ（配列番号５５）配列に特異的なモノクローナル抗体（特許出願国際公開第２００４／１４９５２号パンフレット、またはGiulianiら(2006) Clin. Chem..52:1054-1061 に記載されたものなど）と組み合わせて、上記に定義したリガンドを標識形態で用いることにある。
【０１０３】
本発明はまた、以下の一般式（ＩＩＩ）
ｔ１−Ｅ１−Ｌ１−Ｅ２［−Ｌｋ−１−Ｅｋ］ｎ−ｔ２（ＩＩＩ）
を有するマルチエピトープ標準物質に関するものであり、
式中
−ｎは、０〜８の間の整数であり；
−ｋは、ｎ＞０の場合、３〜ｎ＋２の間の整数であり；
−Ｅ１、Ｅ２、およびＥｋは互いに異なっており、１つは、Ｒ１−Ｘ１−ＦＧＲＫＭＤＲ−Ｘ２−Ｒ２ペプチド配列を表し、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ１およびＲ２は上記で定義したとおりであり、他は、ヒトプロＢＮＰ（１−１０８）の配列から選択される３個から１５個のアミノ酸の配列を表し；
−ｔ１は、水素原子、アセチル基、１個から１０個のアミノ酸のペプチド配列、１個から１０個のＮ−αアセチル化アミノ酸のペプチド配列、ビオチニル基またはビオシチニル基、ビオチニル基またはビオシチニル基を担持する１個から１０個のアミノ酸のペプチド配列または線状アミノアルキル（Ｃ１−Ｃ１０）カルボニル鎖を表し；
−ｔ２は、ヒドロキシル基、アミノ基、１個から１０個のアミノ酸のペプチド配列、末端アミノ基を担持する１個から１０個のアミノ酸のペプチド配列、または線状または分枝状のアミノアルキル（Ｃ１−Ｃ１０）カルボニル鎖を表し（当業者には明白であろうが、ｔ２は、Ｅｎペプチド鎖における最後のアミノ酸の酸性官能基のカルボニル（−ＣＯ−）部分に結合している）；
−Ｌ１およびＬｋは、同一であっても異なっていてもよく、ペプチド鎖の結合基を表す。
【０１０４】
上記のマルチエピトープ標準物質は、以下の一般式（ＩＶ）：
ｔ１−Ｅ１−Ｌ１−Ｅ２−Ｌ２−Ｅ３−ｔ２（ＩＶ）
に対応することが好ましく、
式中、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｌ１、Ｌ２、ｔ１およびｔ２は上記に定義したとおりである。
【０１０５】
上記のマルチエピトープ標準物質は、以下の一般式（Ｖ）：
ｔ１−Ｅ１−Ｌ１−Ｅ２−ｔ２      （Ｖ）
に対応することが好ましく、
式中、Ｅ１、Ｅ２、Ｌ１、ｔ１およびｔ２は上記に定義したとおりである。
【０１０６】
上記の標品（または標準物質）は、ＢＮＰ（１−３２）、プロＢＮＰ（１−１０８）および／またはそれらの上記断片の１つをアッセイするための標準曲線を確立するために用いられる。前記標準物質の利点の１つは、特にそれらの安定性である。
【０１０７】
ＢＮＰ（１−３２）のアッセイに用いられる場合、本発明によるバイエピトープ標準物質は、本発明によるＦＧＲＫＭＤＲエピトープ、およびプロＢＮＰ（１−１０８）の７７から１０８のアミノ酸配列から選択される別の異なるエピトープを含んでなることが好ましい。
【０１０８】
プロＢＮＰ（１−１０８）のアッセイに用いられる場合、本発明によるバイエピトープ標準物質は、本発明によるＦＧＲＫＭＤＲエピトープ、およびプロＢＮＰ（１−１０８）の特異性を確実にするために、プロＢＮＰ（１−１０８）の１−７６のアミノ酸配列から選択される別の異なるエピトープを含んでなることが好ましい。
【０１０９】
ＢＮＰ（１−３２）のアッセイに用いられる場合、本発明によるトリエピトープ標準物質は、本発明によるＲ１−Ｘ１−ＦＧＲＫＭＤＲ−Ｘ２−Ｒ２エピトープ、およびプロＢＮＰ（１−１０８）の７７−１０８のアミノ酸配列から選択される別の異なる２つのエピトープを含んでなることが好ましい。
【０１１０】
プロＢＮＰ（１−１０８）のアッセイに用いられる場合、本発明によるトリエピトープ標準物質は、本発明によるＲ１−Ｘ１−ＦＧＲＫＭＤＲ−Ｘ２−Ｒ２エピトープ、およびプロＢＮＰ（１−１０８）の１−１０８のアミノ酸配列から選択される別の異なる２つのエピトープを含んでなることが好ましい。
【０１１１】
上記の標準物質において、Ｒ１−Ｘ１−ＦＧＲＫＭＤＲ−Ｘ２−Ｒ２は、ＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲ（配列番号３３）、ＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩ（配列番号３４）、ＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳ（配列番号３５）、ＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳ（配列番号３６）、ＦＧＲＫＭＤＲ（配列番号８）、ＳＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳ（配列番号６４）、およびＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＫ（配列番号６５）によって構成される群から選択されるペプチド配列を表すことが好ましい。
【０１１２】
Ｒ１−Ｘ１−ＦＧＲＫＭＤＲ−Ｘ２−Ｒ２と異なる配列は、ＰＲＳＰＫＭＶＱＧ（配列番号５６）、ＡＰＲＳＰＫＭＶ（配列番号５７）、ＳＧＬＧＣＫＶＬ（配列番号５８）、ＳＰＫＭＶＱＧＳＧ（配列番号５９）、ＹＴＬＲＡＰＲＳＰＫＭＶＧ（配列番号６０）、ＹＴＬＲＡＰＲＳＰＫＭＶ（配列番号６６）、ＹＴＬＲＡＰＲＳＰＫＭＶＱＧ（配列番号６７）、ＳＧＬＧＣＫＶＬＲＲＨ（配列番号６８）、およびＳＧＬＧＣＫＶＬＲ（配列番号６９）によって構成される群から選択されることが好ましい。
【０１１３】
本発明によるマルチエピトープ標準物質は、以下の式：
Ａｃ−ＹＴＬＲＡＰＲＳＰＫＭＶ−Ｌ１−ＳＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＹＴＬＲＡＰＲＳＰＫＭＶ−Ｌ１−ＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＫ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＹＴＬＲＡＰＲＳＰＫＭＶＱＧ−Ｌ１−ＦＧＲＫＭＤＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＦＧＲＫＭＤＲ−Ｌ１−ＳＧＬＧＣ＊ＫＶＬＲＲＨ−ＯＨ；
Ａｃ−ＦＧＲＫＭＤＲ−Ｌ１−ＳＧＬＧＣ＊ＫＶＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＳＰＫＭＶＱＧＳＧ−Ｌ１−ＦＧＲＫＭＤＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＹＴＬＲＡＰＲＳＰＫＭＶ−Ｌ１−ＦＧＲＫＭＤＲ−Ｌ２−ＳＧＬＧＣ＊ＫＶＬＲＲＨ−ＯＨ；
およびＡｃ−ＹＴＬＲＡＰＲＳＰＫＭＶ−Ｌ１−ＦＧＲＫＭＤＲ−Ｌ２−ＳＧＬＧＣ＊ＫＶＬＲ−ＮＨ２；
によって定義されるマルチエピトープ標準物質からなる群から選択されることが好ましく、
式中、Ａｃはアセチル基を表し、Ｃ＊はアセトアミドメチルブロック化システインを表す。
【０１１４】
Ｌ１およびＬ２は、
−ＮＨ−（ＣＨ２）５−ＣＯ−
を表すことが好ましい。
【０１１５】
この基は、特にヘキサンアミノ酸として知られるカップリング剤に由来する。
【０１１６】
Ｅ１、Ｅ２およびＥ３が存在する場合、標準物質はトリエピトープと言われ、Ｅ１とＥ2 のみが存在する場合、標準物質はバイエピトープと言われる。
【０１１７】
さらに本発明は、少なくとも
−上記のリガンド；および
−上記のマルチエピトープ標準物質および／または上記のポリペプチド
を含んでなる、ヒトＢＮＰ（１−３２）またはヒトプロＢＮＰ（１−１０８）ならびに配列ＦＧＲＫＭＤＲを含んでなるそれらそれぞれの断片を検出するためのキットに関する。
【０１１８】
特定の一実施形態において、上記のキットはまた、陽性の生体対照サンプルを含んでなる。
【０１１９】
本発明によるキットは、少なくとも、登録番号ＣＮＣＭ  Ｉ−３７４６でＣＮＣＭ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、２５、ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、７５  ７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５、仏国）においてＢｉｏ−Ｒａｄにより２００７年４月１３日に寄託されたハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体を含んでなることが好ましい。
【０１２０】
以下の実施例および図は、限定することなく本発明を例示するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】２０Ｇ７抗体と、Ｓｐｏｔ法により合成されたＢＮＰ（１−３２）の配列（左から右へ、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７）を表す固定化ペンタデカペプチドとの反応性を示す図である。
【図２】ＦＧＲＫＭＤＲエピトープ（ペプチドの各残基をアラニンにより置換）に対する２０Ｇ７抗体の結合のＡｌａｓｃａｎ分析結果を示し、Ｆ残基、Ｋ残基、およびＲ残基の重要性を示す図である。
【図３】配列番号５１（「ＡＡ１１−ＡＡ１７」、菱形）、配列番号６２（「変異ＡＡ１１−ＡＡ１７」、円形）または配列番号９（「欠失ＡＡ１１−ＡＡ１７」、三角形）の可溶性ペプチドの濃度を増加させた存在下、ＢＮＰ（１−３２）に対する抗体２０Ｇ７および２４Ｃ５の結合阻害を表す図である。
【図４】ＦＧＲＫＭＤＲエピトープ（ペプチドの各残基をアラニンにより置換）に対する１１Ａ８抗体の結合のＡｌａｓｃａｎ分析結果を示し、Ｆ残基、Ｇ残基、Ｋ残基、およびＲ残基の重要性を示す図である。
【図５】２０Ｇ７抗体により検出されたＢＮＰ（１−３２）の標準的範囲を表す図である。
【図６】２０Ｇ７抗体により検出された組換えプロＢＮＰ（１−１０８）の標準的範囲を表す図である。
【図７】鬱血性心不全を有する患者における２０Ｇ７抗体によるＢＮＰ（１−３２）とプロＢＮＰ（１−１０８）の検出間の相関関係を示す図である。
【図８】ＮＹＨＡクラスＩ（図８Ａ）、ＮＹＨＡクラスＩＩ（図８Ｂ）およびＮＹＨＡクラスＩＩＩ（図８Ｃ）の鬱血性心不全を有する対象からのサンプルにおける２０Ｇ７抗体によるＢＮＰ（１−３２）とプロＢＮＰ（１−１０８）の検出間の相関関係を示す図である。
【図９】健常な対象からのサンプルにおける２０Ｇ７抗体によるＢＮＰ（１−３２）とプロＢＮＰ（１−１０８）の検出間の相関関係を示す図である。
【図１０】腎不全を有する対象からのサンプルにおける２０Ｇ７抗体によるＢＮＰ（１−３２）とプロＢＮＰ（１−１０８）の検出間の相関関係を示す図である。
【図１１】虚血性発作および対照のクエン酸塩添加血漿サンプル中のＢｉｏＰｌｅｘ（商標）２２００プロＢＮＰの濃度を示す図である。ギザギザ状のボックスは、最小値、第一四分位数、中央値、第三四分位数および最大値を示す。
【図１２】急性冠動脈症候群を有する対象からのサンプルにおける２０Ｇ７抗体によるＢＮＰ（１−３２）とプロＢＮＰ（１−１０８）の検出間の相関関係を示す図である。
【図１３】固定化ヒンジ７６抗体および本発明により発見した２０Ｇ７抗体を用いた免疫アッセイにより、グリコシル化プロＢＮＰ（１−１０８）のアッセイと非グリコシル化プロＢＮＰ（１−１０８）のアッセイとの相関関係を示す図である。
【図１４】ＢｉｏＰｌｅｘ（商標）２２００装置の使用による、バイエピトープ標準物質ＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ１の標準範囲を示す図である。
【図１５】ＢｉｏＰｌｅｘ（商標）２２００装置の使用による、バイエピトープ標準物質ＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ３の標準範囲を示す図である。
【図１６】固定化ポリクローナル抗体Ｌ２１０１６および本発明により発見した２０Ｇ７抗体を用いた免疫アッセイにより、バイエピトープ標準物質ＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ５、プロＢＮＰ（１−１０８）およびＢＮＰ（１−３２）の標準範囲を示す図である。
【図１７】２つの免疫アッセイ様式（第１のものは、ヒンジ７６抗体の固定および本発明により発見した２０Ｇ７抗体に基づき、（白色円形と黒色円形）、第２のものは、ヒンジ７６抗体の固定およびＢＮＰ（１−３２）のＣ末端部分に位置するエピトープに対する抗体の発見に基づいている（白色三角形と黒色三角形））におけるトリエピトープ標準物質ＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ６およびプロＢＮＰ（１−１０８）の標準範囲を示す図である。
【実施例】
【０１２２】
実施例１：ペプチド合成
材料および方法
当業者に周知の標準的方法により合成ペプチドを調製した。本法の一例は、容易に実施できるという事実のため有利であるＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ合成である（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、（１９６３）；Ｒ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ（１９７１）；Ａｔｈｅｒｔｏｎら（１９８９））。Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅからの「Ｐｉｏｎｅｅｒ」シンセサイザー、またはＡＢＩからの「４３３」シンセサイザーを、自動シンセサイザーとして使用することができる。これらのペプチド類を、均質相合成によっても得ることができる。
【０１２３】
以下の合成は、「Ｆｍｏｃ」化学（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）を用いるＰｉｏｎｅｅｒシンセサイザー内で実施された：各ステップにおいて、試薬（すなわち、保護アミノ酸およびカップリング活性化剤（ＴＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート）／ＨＯＢｔ（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール））を過剰に（「樹脂上で置換できる基の試薬／モルのモル」比＝５で）添加した。合成工程の最後に、ペプチドを、トリフルオロ酢酸液（試薬Ｋ）により樹脂から分離した。次いで、ペプチドを、冷却エーテル中に沈殿させ、凍結乾燥してから、引き続きＨＰＬＣにより精製した。
【０１２４】
本法において、本発明者らは、以下のアミノ酸配列を含有するペプチドを合成した：
配列番号４：Ａｃ−ＴＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＴＳＴＡＩＧＣＫＶＬＣｙｓ−ＣＯＮＨ２、
配列番号５：５：Ａｃ−ＳＧＣＹＧＲＫＭＤＲＩＳＴＳＴＡＩＧＣＫＶＬ−ＣｙｓＣＯＮＨ２
配列番号６：Ａｃ−ＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＫＶＬ−ＣｙｓＣＯＮＨ２
配列番号７：Ａｃ−ＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＡＴＳＴＡＩＧＣＫＶＬ−ＣｙｓＣＯＮＨ２
配列番号８：        Ａｃ−ＦＧＲＫＭＤＲ−ＣＯＮＨ２
配列番号９：          Ａｃ−ＧＲＫＭＤＲ−ＣＯＮＨ２
配列番号１０：      Ａｃ−ＦＧＲＫＭＤ−ＣＯＮＨ２
配列番号１１：            Ａｃ−ＲＫＭＤＲＩ−ＣＯＮＨ２
【０１２５】
実施例２−免疫原の調製：免疫化のために担体タンパク質へのペプチドのカップリング
これらのペプチドによりマウスを免疫化するために、ペプチドをより免疫原性にする目的で、種々の官能基（チオール、アミン、アルデヒドなど）を介して、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）、チログロブリン、またはＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）などの担体タンパク質に前記ペプチドを結合させる必要がある。ペプチドをタンパク質に結合させるために用いられるカップリング剤は、ヘテロ二官能性であってもホモ二官能性であってもよい。最も頻繁に用いられる試薬は、ＢＳ３、ｓＳＭＣＣ、ＳＰＤＰ、グルタルアルデヒドなどである。
【０１２６】
使用されるカップリング法は、化学的カップリング剤としてＮＨＳエステル官能基およびマレイミド基、および担体タンパク質としてＫＬＨ（Ｐｉｅｒｃｅ、＃７７６００）を有する二官能性ｓＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ、＃２２３２２）を含んだ。
【０１２７】
２−ａ．ＫＬＨの活性化
方法：
１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得るために、２０ｍｇのＫＬＨを、２ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（２０ｍＭのリン酸塩、０．９ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に溶解した（ボルテックスせず）。並行して、４ｍｇのｓＳＭＣＣを、４００μｌの注射用水に溶解して１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得た。引き続き２ｍｌのＫＬＨ（２０ｍｇ）を、２００μｌのｓＳＭＣＣ（２ｍｇ）と混合し、この混合物を、緩やかに攪拌しながら（１分当り２０回転）室温（２０℃）で１時間インキュベートした。
【０１２８】
２−ｂ．活性化ＫＬＨの脱塩：
方法：
ＰＤ１０  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＴＭ  Ｇ−２５ｍカラム（Ｇｅ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国、参照先；１７−０８５１−０１）を、リン酸緩衝生理食塩水（２０ｍＭのリン酸塩、０．９ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２、１００ｍＭのＥＤＴＡ）で平衡にした。２ｍｌの活性化ＫＬＨを、カラムに沈着させ、引き続き０．９ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２および１００ｍＭのＥＤＴＡで補足された２０ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液の３．５ｍｌで溶出を開始し；５００μｌのフラクションを集めた。１／２５に希釈された各フラクションに対して、光学密度（ＯＤ）を２８０ｎｍで測定し、次いで活性化ＫＬＨを含有するフラクションを同定し、Ｂｅｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ則：ＯＤ＝εＣｌに従って測定した、
式中ＯＤは光学密度であり、
ε＝１．４９９であり、
Ｃは濃度であり、ｌ＝１ｃｍであり、活性化ＫＬＨの濃度を測定することができ、リン酸緩衝生理食塩水中７．４ｍｇ／ｍｌに換算される。
【０１２９】
２−ｃ．活性化ＫＬＨに対するペプチドのカップリング
方法：
１０ｍｇの凍結乾燥ペプチドを１ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解し、超音波ディスインテグレータ内で脱気して１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得、次いで７．４ｍｇの活性化ＫＬＨ（すなわち、２−ｂで得られた１ｍｌの溶液）と混合した。この混合物を、緩やかに攪拌しながら（２０ｒｐｍ）室温（２０℃）で２時間インキュベートした。引き続き２０ｍＭのＰＢＳ緩衝液＋０．９ＭのＮａＣｌ  ｐＨ７．２中、５ｍｇ／ｍｌの濃度でのシステイン溶液を導入してペプチド／ＫＬＨ溶液中１ｍＭの最終濃度が得られ、全混合物を、緩やかに攪拌しながら（２０ｒｐｍ）室温（２０℃）で２０分間インキュベートした。
【０１３０】
２−ｄ．結合ペプチドの特徴付け
方法：
次に結合ペプチドの濃度を、以下のとおりＢｒａｄｆｏｒｄ法（Bradford M., Anal. Biochem., 1976; 72: 248-54）により測定した：５９５ｎｍでのＯＤから当サンプルのＫＬＨ濃度を測定するために、ＫＬＨの５０μｇ／ｍＬから１０００μｇ／ｍＬの標準範囲を調製した。この標準範囲を作製し、本アッセイを実施するために、サンプルの５０μＬの各ポイントを、１．５ｍＬのクーマシーブルー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、＃１８５６２１０）中に希釈した。
【０１３１】
濃度を測定したら、ＰＢＳを、ＫＬＨ結合ペプチドに加えて、結合ペプチドの濃度を１ｍｇ／ｍＬにした。
【０１３２】
実施例３−マウスの免疫化およびモノクローナル抗体の産生
３−ａ）マウスの免疫化：
モノクローナル抗体を産生させるために、以下のペプチド：
Ａｃ−ＴＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＴＳＴＡＩＧＣＫＶＬ−Ｃｙｓ−ＣＯＮＨ２、（配列番号４）
Ａｃ−  ＳＧＣＹＧＲＫＭＤＲＩＳＴＳＴＡＩＧＣＫＶＬ−ＣｙｓＣＯＮＨ２（配列番号５）
のうちの１つを用いて、
１０匹のマウス（Ｂａｌｂ／ｃ株メス、５週齢、参照：ＳＩＦＥ０５５、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ、ＭＡ、米国）を免疫化し、実施例２に従ってＫＬＨに結合させた（各ペプチドに対して５匹のマウス）。
【０１３３】
最初の注射に関しては、フロイント完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ、＃Ｆ−５８８１）中で１／２に希釈した１００μｇのＫＬＨ結合ペプチド（１ｍｇ／ｍｌの濃度で）の乳濁液を調製し、２００μＬの前記乳濁液（すなわち、１００μｇのペプチド）を各マウスに皮下注射した。２０日の間隔で、各マウスにＫＬＨ結合ペプチド（すなわち、１００μｇのペプチド）およびフロイント不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ、＃Ｆ−５５０６）の乳濁液の２００μＬのブースターショットを３回、皮下に、次いで腹腔内に注射した。
【０１３４】
最後のブースターショットの２０日後、得られた抗体をＥＬＩＳＡ法（下記の実施例４に従って）により評価した後、以下のプロトコルに従って高度免疫処置を受けさせるために、ＢＮＰ（１−３２）に対して最大の反応を示したマウスを保持した：
−ＰＢＳで１／２０に希釈した１ｍｇ／ｍＬのペプチド−ＫＬＨを２００μＬ皮下注射、
−４５分の待機、
−ＰＢＳで１／２０に希釈した１ｍｇ／ｍＬのペプチド−ＫＬＨを２００μＬ、最初の注射とは異なった部位での皮下注射、
−４５分の待機、
−ＰＢＳで１／１０に希釈した１ｍｇ／ｍＬのペプチド−ＫＬＨを２００μＬ、前の注射とは異なった部位での皮下注射、
−３０分の待機、
−ＰＢＳで１ｍｇ／ｍＬに希釈したプロメタジン（２．５％Ｐｈｅｎｅｒｇａｎ、注射液、ＵＣＢ）の１００μＬを腹腔内注射、
−１５分の待機、
−ＰＢＳで３／１０に希釈した１ｍｇ／ｍＬで２００μＬのペプチド−ＫＬＨを、前の注射とは異なった部位での腹腔内注射。
【０１３５】
これらの免疫化後、配列番号４ペプチドで免疫化したマウスＳ２は、以下の実施例４に記載された抗体検出用プロトコルを用いると、ＢＮＰ（１−３２）に対して極めて反応性の抗血清を産生することが判明した。前記マウスの脾臓からのリンパ球を、引き続きリンパ球融合に供し、下記３ｂのプロトコルに従って実施した。
【０１３６】
３−ｂ）モノクローナル抗体の産生：
骨髄腫ＳＰ２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８１）で免疫化されたマウスＳ２の脾臓細胞のリンパ球融合は、ＫｏｈｌｅｒおよびMilstein  の周知のプロトコル(1975) Nature 56:495- 497に従って実施した。
【０１３７】
このようにして、本発明者らは、種々のハイブリッドクローンを産生させることができた。特に、２０Ｇ７−１５／０３／２００７（以下、便宜上「２０Ｇ７」と称す）と称されるモノクローナル抗体を得た。２０Ｇ７−１５／０３／２００７（２０Ｇ７）モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマは、登録番号ＣＮＣＭ  Ｉ−３７４６でＣＮＣＭ（Ｆｒｅｎｃｈ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、２５、ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、７５  ７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５、仏国）に２００７年４月１３日に寄託された。
【０１３８】
当業者に周知のモノクローナル抗体を得るための他のプロトコルを使用できることは言うまでもない。
【０１３９】
実施例４−免疫化の際のマウスの応答を評価するために抗ＢＮＰ（１−３２）抗体の検出
４．１材料：
以下の試薬を用いた：
−Ｍａｘｉｓｏｒｐの９６ウェル平底マイクロプレート（Ｎｕｎｃ、デンマーク国）
−ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）緩衝液、ｐＨ７．４、Ｇｉｂｃｏ錠剤。参照：１８９１２−０１４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
−ＢＮＰ（１−３２）：合成ペプチド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国、＃Ｂ−５９００）
または
−プロＢＮＰ（１−１０８）（大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）中で産生された組換えタンパク質、ＨｙＴｅｓｔ、フィンランド国）
−Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国、＃Ｐ１３７９）
−ウサギ中で産生され、ペルオキシダーゼに結合された抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｓｉｇｍａ、米国、＃Ａ９０４４）
−Ｈ２Ｏ２（０．１Ｍのクエン酸緩衝液中０．０４％、ｐＨ４）
−ＯＰＤ（オルト−フェニレンジアミン、Ｓｉｇｍａ、米国＃Ｐ８４１２）
−硫酸（Ｈ２ＳＯ４、４Ｎ）
−実施例３で免疫化されたマウスからの血清
【０１４０】
４．２方法と原理：
マウス血清サンプル中の抗ＢＮＰ（１−３２）抗体の存在を検出するために、ＥＬＩＳＡ試験を固体支持上で実施した。
幾つかの抗原を、９６ウェルマイクロプレートの腔内での吸着により固定化した。残りの空の部位を飽和してブロックし、免疫血清をインキュベートし、存在していると考えられる抗体（《Ａｃ》）を抗原（《Ａｇ》）に結合させ、Ａｇ−Ａｃ複合体を形成した。この複合体を、酵素に結合させた免疫複合体（抗マウスＩｇＧ抗体）を用いて検出した。この場合の酵素は、無色の基質を所望の抗体の存在を示す着色産物に変換するＨＲＰ（西洋わさびペルオキシダーゼ）であった。最終着色産物の形成は、４９０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）の読取りを実施することによって定量化した。当業者に周知であるこの方法に従って、得られたＯＤは、試験したマウス血清サンプル中の抗体の存在（高いＯＤ）または非存在（低いＯＤ）を示す。この試験には、当業者によく知られている多くの変型（抗原捕捉、競合アッセイなど）がある。
【０１４１】
１）マイクロプレート上での抗原の固定
ＢＮＰ（１−３２）またはプロＢＮＰ（１−１０８）の各抗原を、ＰＢＳ中、０．５μｇ／ｍＬの最終濃度になるように溶解し、次いで４℃で一晩インキュベートすることによって、Ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロプレート上で１ウェル当り１００μＬを基準に固定化した。ＰＢＳ０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄後、マイクロプレートを、１％ミルク（半脱脂乳）を含有する０．１％ＰＢＳ−Ｔの溶液（１００μＬ／ウェル）で飽和し、次いで３７℃で１時間インキュベートした。
【０１４２】
２）マウスにより産生した抗体の免疫学的検出：
マイクロプレートを、０．１％ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。先に免疫化したマウスからの各血清を、引き続き０．１％ミルク（半脱脂乳）を含有する０．１％ＰＢＳ−Ｔで１０倍希釈し、次いで１ウェル当り１００μＬを基準に沈着させ、３７℃で２時間インキュベートした。このマイクロプレートを再び０．１％ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、次いで１ウェル当り１００μＬを基準に、０．１％ミルク（半脱脂乳）を含有する０．１％ＰＢＳ−Ｔ中で１／３，０００に希釈したペルオキシダーゼに結合した複合体の存在下、３７℃で１時間インキュベートした。最後に、このマイクロプレートを０．１％ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、次いでペルオキシダーゼ基質を、１ウェル当り１００μＬを基準に沈着させた。このマイクロプレートを、室温で２０分間暗所に置いた。この酵素反応は、１ウェル当り５０μＬの硫酸（Ｈ２ＳＯ４、４Ｎ）を添加することによって中止させ、引き続き４９０ｎｍでのＯＤを各ウェルごとに測定した。
【０１４３】
抗体を検出するためにこの方法を用いることによって、マウスＳ２（配列番号４のペプチドで免疫化された）からの血清は、ＢＮＰ（１−３２）およびプロＢＮＰ（１−１０８）と極めて反応性であることを本発明者らは見出した。引き続き、前記高度免疫マウスからのリンパ球とＳｐ２骨髄腫との間で実施されたリンパ球融合後、本法はまた、重要なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ：２０Ｇ７モノクローナル抗体を産生する２０Ｇ７ハイブリドーマの同定も可能にした。
【０１４４】
実施例５：２０Ｇ７モノクローナル抗体のエピトープの特徴付け
５．１《Ｓｐｏｔ》技法によるエピトープの特徴付け
５．１．１材料：
装置および試薬は全て、C. Granier, S. Villard, D. Laune（Mapping and Characterization of Epitopes using the SPOT method. Cells/Cell Biology: A Laboratory Handbook, third edition (Volume 1), chapter 62, editor: Julio Celis, Elsevier, 2005）に記載されている。
【０１４５】
５．１．２方法：
「ＳＰＯＴ」または「エピトープマッピング」法を用いて、２０Ｇ７モノクローナル抗体のエピトープを特徴付けした。Frank（Tetrahedron, 1992; 48: 9217-32）により記載されたこの方法は、官能化された支持体（アミノポリエチレングリコール−セルロース）上で、予め決められた配列を有する多数のペプチド類をセルロース膜上で合成することを可能にし、またこの場合、２０Ｇ７抗体である可溶性リガンドに対するそれらの反応性の試験を可能にする。
【０１４６】
５．１．２．１ペプチド合成
ペプチド合成の全工程（アミノ酸の活性化、化学反応など）は、Molinaら（Pept Res. 1996, Vol. 9: p 151-5)、およびC. Granier, S. Villard, D. Laune （Mapping and Characterization of Epitopes using the SPOT method. Cells/Cell Biology: A Laboratory Handbook, third Edition (Volume 1), chapter 62, Editor: Julio Celis, Elsevier, 2005）に詳述されている。
【０１４７】
ＢＮＰ（１−３２）配列は、２つのアミノ酸のオフセットを有する重なりペンタデカペプチド（配列番号１２から２０）：
配列番号１２    ＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣＦＧＲＫＭ
配列番号１３        ＫＭＶＱＧＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲ
配列番号１４            ＶＱＧＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳ
配列番号１５                ＧＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳ
配列番号１６                    ＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧ
配列番号１７                        ＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧ
配列番号１８                            ＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＫ
配列番号１９                                ＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＫＶＬ
配列番号２０                                    ＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＫＶＬＲＲ
の形態で全体的に合成された。
【０１４８】
他の以下のペプチド：
配列番号２１                ＶＱＧＳＧＣＦＧＲ
配列番号２２                ＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣ
配列番号２３                ＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧ
配列番号２４                ＲＫＭＤＲＩ
配列番号２５                ＲＫＭＤＲＩＳＳ
もまた合成された。
【０１４９】
ＢＮＰ（１−３２）配列はまた、１つのアミノ酸のオフセットを有する重なりデカペプチド（配列番号２６から４８）：
配列番号２６      ＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣ
配列番号２７        ＰＫＭＶＱＧＳＧＣＦ
配列番号２８          ＫＭＶＱＧＳＧＣＦＧ
配列番号２９             ＭＶＱＧＳＧＣＦＧＲ
配列番号３０              ＶＱＧＳＧＣＦＧＲＫ
配列番号３１                ＱＧＳＧＣＦＧＲＫＭ
配列番号３２                  ＧＳＧＣＦＧＲＫＭＤ
配列番号３３                    ＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲ
配列番号３４                      ＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩ
配列番号３５                        ＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳ
配列番号３６                          ＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳ
配列番号３７                            ＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳ
配列番号３８                              ＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳ
配列番号３９                                ＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧ
配列番号４０                                  ＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬ
配列番号４１                                    ＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧ
配列番号４２                                      ＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ
配列番号４３                                        ＩＳＳＳＳＧＬＧＣＫ
配列番号４４                                          ＳＳＳＳＧＬＧＣＫＶ
配列番号４５                                            ＳＳＳＧＬＧＣＫＶＬ
配列番号４６                                              ＳＳＧＬＧＣＫＶＬＲ
配列番号４７                                                ＳＧＬＧＣＫＶＬＲＲ
配列番号４８                                                  ＧＬＧＣＫＶＬＲＲＨ
の形態で合成された。
【０１５０】
１つのアミノ酸のオフセットを有するヘプタペプチドの選択（配列番号４９から５３）：
配列番号４９            ＧＣＦＧＲＫＭ
配列番号５０              ＣＦＧＲＫＭＤ
配列番号５１                ＦＧＲＫＭＤＲ
配列番号５２                  ＧＲＫＭＤＲＩ
配列番号５３                    ＲＫＭＤＲＩＳ
もまた合成された。
【０１５１】
５．１．２．２免疫学的試験
免疫活性に関する以下の試験は、Launeら（J. Immunol. Methods, 2002, Vol. 267(1), p 53-70）に詳細に記載されている。手短に言うと、この原理は以下のとおりであった。膜を、各々１０分間づつ３回、ＴＢＳ浴（トリス緩衝生理食塩水、ｐＨ７．０）により再水和させ、引き続き１５ｍｌの１０％飽和緩衝液（「ブロック用緩衝液」、Ｒｏｃｈｅ）およびＴＢＳ０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０（ＴＢＳ−Ｔ）中５％のショ糖の存在下、攪拌しながら室温で一晩インキュベートすることにより飽和させた。この膜を１０分間、０．１％のＴＢＳ−Ｔにより３回洗浄した後、この膜を、試験する抗体（この場合２０Ｇ７）および飽和緩衝液で希釈したアルカリホスファターゼに結合した複合体の存在下、攪拌しながら３７℃で９０分間インキュベートした。この膜を各浴１０分間づつ０．１％のＴＢＳ−Ｔで２回、次いでＣＢＳ（クエン酸緩衝生理食塩水）で２回の洗浄後、アルカリホスファターゼ基質を添加し、膜を室温で、シグナルが出現する速度に依って１分間から３０分間インキュベートした。
【０１５２】
５．１．２．３結果
この場合、ＢＮＰ（１−３２）配列は、２つのアミノ酸のオフセットを有する重なりペンタデカペプチド（配列番号１２から２０）の形態で全体的に合成された。図１に示されるように、これらのペプチドを、精製２０Ｇ７抗体と接触させると、５種の連続ペプチドだけが抗体と反応し、それらの共通配列は、Ｆ１１ＧＲＫＭＤＲ１７（図１）である：
配列番号１３  ＫＭＶＱＧＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲ
配列番号１４      ＶＱＧＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳ
配列番号１５          ＧＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳ
配列番号１６              ＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧ
配列番号１７                  ＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧ
【０１５３】
このパターンだけが、ＢＮＰ（１−３２）に対する抗体の結合に実際に関与することを保証するために、このエピトープを確認し、正当性を立証する目的で、１つのアミノ酸だけのオフセットを有するより短いペプチド（デカペプチド（配列番号２６から４８）およびヘプタペプチド（配列番号４９から５３）もまた合成した。各々の実験において、２０Ｇ７により同定された共通のペプチド配列は、Ｆ１１ＧＲＫＭＤＲ１７であった（デカペプチドに関しては、配列番号３３から３６、およびヘプタペプチドに関しては配列番号５１）。
【０１５４】
エピトープの認識のためにどの残基が重要であり、必須であるかを判定するために、よく知られており上述の（Ｌａｕｎｅら、上記）「Ａｌａｓｃａｎ」法に従って各個々の残基の関与を評価する目的で、最少の配列であるＦ１１ＧＲＫＭＤＲ１７の各々の残基をアラニン（Ａ）により連続的に置換した。図２に示されるように、Ｆ１１、Ｋ１４およびＲ１７残基を、それぞれアラニンにより置換すると、結合が８２％、９５％および８５％へと減少し、これらの残基が必須であることを示している。
【０１５５】
１１位、１４位および１７位におけるこれらのアミノ酸は、２０Ｇ７モノクローナル抗体によるエピトープの認識のために必須である。これらのデータは、複数（ｎ＝４）の反復実験の平均値である。したがってこの理由から、必須のＦ１１、Ｋ１４およびＲ１７アミノ酸を含んでなる本発明によるＦ１１ＧＲＫＭＤＲ１７エピトープは、重要なアミノ酸がＲ１３、Ｄ１６、Ｒ１７およびＩ１８である別のエピトープ（Ｒ１３（Ｋ１４）（Ｍ１５）Ｄ１６Ｒ１７Ｉ１８）を開示する特許出願国際公開第２００６／８８７００に認められたものとは異なっていることが明白である。
【０１５６】
２０Ｇ７抗体の結合過程に対するこれら残基の寄与効果のより十分な理解を得るために、Ｆ１１、Ｋ１４およびＲ１７アミノ酸を、生化学的性質の近いアミノ酸と置換した。例えば、Ｆ１１を他の芳香族アミノ酸（トリプトファンおよびチロシン）と置換した。これら「相同性」アミノ酸からなる配列が、同じ方法で２０Ｇ７抗体により認識されたという事実により、抗体結合にとって必須であるのは１１位におけるペプチドの芳香族性であることが示唆されている。Ｋ１４およびＲ１７に関しては、それら双方をアルギニンおよびリジンにより置換して、アミノ酸の側鎖の効果、また正電荷の存在を調べた。またこの場合、２０Ｇ７に対する結合が保持されることから、この置換は、事実上保存的であることが判明し、正電荷の重要性を強く示している。
【０１５７】
異なる必須残基を有するＨｙＴｅｓｔからの２４Ｃ５抗体には、同じことが当てはまらない。
【０１５８】
やはり膜上で合成されたヒトＢＮＰ（１−３２）のＶＱＧＳＧＣＦＧＲ、ＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣ、ＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧ、Ｒ１３ＫＭＤＲＩ１８およびＲ１３ＫＭＤＲＩＳＳ２０（配列番号２１から配列番号２５）ペプチド配列を、Ｓｐｏｔ法を用いて２０Ｇ７抗体により試験した。２０Ｇ７の結合に必須である残基が無いことから、前記抗体は前記ペプチドに全く結合せず、２０Ｇ７が、これらのペプチドと２％未満の交差反応を示す結果となった。
【０１５９】
５．２可溶性ペプチドによる特徴付け
第二のステップにおいて、Ｆ１１ＧＲＫＭＤＲ１７ペプチドが、実際に２０Ｇ７抗体のエピトープであったことを確かめるために、このペプチドとＢＮＰ（１−３２）との間の競合アッセイを実施する目的で、この配列を可溶性形態で合成した。並行して２０Ｇ７抗体への結合におけるＦ１１残基の寄与の高さを確認するために、他の２種の追加ペプチド（１つは、ＦをＡにより置換したもの、他方は、Ｆを単に欠失させたもの）もまた、可溶性形態で合成した。さらに、同様の競合アッセイをＨｙｔｅｓｔの２４Ｃ５抗体と実施して、この残基の重要性が２０Ｇ７抗体に特異的であることを立証した。
１−配列番号５１：天然エピトープの配列：Ｆ１１ＧＲＫＭＤＲ１７
２−配列番号６２：エピトープの変異配列：Ａ１１ＧＲＫＭＤＲ１７
３−配列番号９：Ｆ１１残基の欠失した配列：Ｇ１２ＲＫＭＤＲ１７
【０１６０】
５．２．１材料
−Ｍａｘｉｓｏｒｐの９６ウェル平底マイクロプレート（Ｎｕｎｃ、デンマーク国）、
−ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）緩衝液、ｐＨ７．４、Ｇｉｂｃｏ錠剤。照会先：１８９１２−０１４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、
−ＢＮＰ（１−３２）：合成ペプチド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国、＃Ｂ−５９００）、
−Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国、＃Ｐ１３７９）、
−モノクローナル２０Ｇ７抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、
−モノクローナル２４Ｃ５抗体（ＨｙＴｅｓｔ、Ｔｕｒｋｕ、フィンランド国）、
−ウサギ中で産生され、ペルオキシダーゼに結合された抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｓｉｇｍａ、米国、＃Ａ９０４４）、
−Ｈ２Ｏ２（０．１Ｍのクエン酸緩衝液中０．０４％、ｐＨ４）、
−ＯＰＤ（オルト−フェニレンジアミン、Ｓｉｇｍａ、米国＃Ｐ８４１２）、
−硫酸（Ｈ２ＳＯ４、４Ｎ）。
【０１６１】
５．２．２方法
免疫アッセイの原理は、４．２に記載されたものと同一であった。手短に言うと、合成ＢＮＰ（１−３２）を、ＰＢＳ緩衝液中で希釈して０．５μｇ／ｍｌでＭａｘｉｓｏｒｐマイクロプレート上で直接固定化した。各可溶性ペプチドＡＡ１１−ＡＡ１７（天然、変異、または欠失）の２０ｎｇ／ｍｌから１０，０００ｎｇ／ｍｌの標準範囲を、緩衝液／血清中に調製し、０．１％のミルク（半脱脂乳）を含有するＰＢＳ０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０（ＰＢＳ−Ｔ）中０．５μｇ／ｍｌの最終濃度で、１００μｌのモノクローナル抗体液（２０Ｇ７抗体または２４Ｃ５抗体）に混合した。次に抗体の結合を、ペルオキシダーゼで標識された抗マウス複合体により検出した。２０Ｇ７抗体の応答強度を、ＨｙＴｅｓｔからのモノクローナル２４Ｃ５抗体の１つと比較した。１）配列Ｆ１１ＧＲＫＭＤＲ１７が、実際に２０Ｇ７抗体エピトープであることを表し、および２）Ｆ１１残基が、２０Ｇ７によるＢＮＰ（１−３２）の認識にとって必須であることを判定するために、可溶性ペプチドの存在下、ＢＮＰ（１−３２）の認識の減少に相当する阻害パーセントを各可溶性ペプチドに関して測定した。
【０１６２】
５．２．３結果
図３は、濃度を増加させた可溶性ペプチド（天然；配列番号５１、変異；配列番号６２、欠失：配列番号９）の存在下、ＢＮＰ（１−３２）に対するモノクローナル抗体（２０Ｇ７または２４Ｃ５）結合の阻害パーセントを示している。
【０１６３】
変異（配列番号６２）または欠失（配列番号９）させた可溶性ＡＡ１１−ＡＡ１７ペプチドの存在下、本発明の２０Ｇ７抗体が、ＢＮＰ（１−３２）の認識において２４Ｃ５抗体とは異なる挙動をすることが認められることは大いに注目される。変異（Ａ１１ＧＲＫＭＤＲ１７）または欠失（Ｇ１２ＲＫＭＤＲ１７）させた可溶性ペプチドの添加により、添加されたいずれのペプチド濃度（２０μｇ／ｍｌまで）でも、２０Ｇ７によるＢＮＰ（１−３２）の認識は阻害されなかったが、一方、天然ペプチド（配列番号５１に相当するＦ１１ＧＲＫＭＤＲ１７）が添加されると、完全な阻害が見られる。この実験により、２４Ｃ５抗体に反して、ＢＮＰ（１−３２）に対する２０Ｇ７抗体の結合においてＦ１１残基の重要性が確認されている。
【０１６４】
実施例６−他の抗ＢＮＰ（１−３２）モノクローナル抗体のエピトープの特徴付け−２０Ｇ７抗体との比較
６．１材料、方法およびプロトコル：
実施例５に記載されたものと同じニトロセルロース膜および同じ反応性条件を用いて、これらの抗体を試験した。
【０１６５】
６．２結果：
本発明者らは、以下の特徴付けされた一連のモノクローナル抗体：２０Ｇ７、１１Ａ８、１７Ｆ１０、Ｍａｂ１、Ｍａｂ２およびＭａｂ３を得た。表１に示されるように、他のモノクローナル抗体は、本発明のモノクローナル２０Ｇ７と同じエピトープすなわち、ＦＧＲＫＭＤＲを有するが、２０Ｇ７と比較して異なった必須のアミノ酸を有する。
【０１６６】
【表１】
0005458011.tif 000002
【０１６７】
図４は、例えば、１１Ａ８抗体に関してａｌａｓｃａｎ分析（上記５．１．２．３に記載された方法で、各残基の個々の関連を評価するための、アラニンによる配列Ｆ１１ＧＲＫＭＤＲ１７の各残基の連続置換）の結果を示す。４つの残基（Ｆ、Ｇ、ＫおよびＲ）の置換は、配列Ｆ１１ＧＲＫＭＤＲ１７の重大な結合減少が生じ、４つの残基がＢＮＰ（１−３２）への結合に必須であることを立証している。
【０１６８】
実施例７−表面プラスモン共鳴技術によるモノクローナル抗体の抗体−抗原相互作用の特徴付け
７．１材料：
−ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００および３０００の分析器（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン国）、
−ＢＮＰ（１−３２）（合成ペプチド、Ｓｉｇｍａ、米国、＃Ｂ−５９００）、
−プロＢＮＰ（１−１０８）（大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）中で産生された組換えタンパク質、ＨｙＴｅｓｔ、フィンランド国）、
−抗Ｆｃ断片抗体（Ｓｉｇｍａ、米国）、
−モノクローナル抗体２０Ｇ７、１１Ａ８、１７Ｆ１０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｍａｒｎｅｓ  ｌａ  Ｃｏｑｕｅｔｔｅ、仏国）、
−ＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水）、ｐＨ７．４。
【０１６９】
７．２方法：
７．２．１．原理：
ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００および３０００の分析器（その原理は、表面プラスモン共鳴技術（ＳＰＲ）に基づく）を用いて、２０Ｇ７モノクローナル抗体および他のモノクローナル抗体と、ＢＮＰ（１−３２）またはプロＢＮＰ（１−１０８）との相互作用の反応速度論および親和性を明らかにした。本発明者らは製造元の取扱説明書に従った。
【０１７０】
表面プラスモン共鳴ＳＰＲ技術（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）は、Ｆｅｒｒｉｅｒｅｓら（2000, FEBS Letters, 479(3): 99-105）にその全体が記載されている。モノクローナル抗体は、抗Ｆｃ断片抗体を用いることによりバイオセンサーまたは固体表面上に固定されたが、一方、可溶性抗原（ＢＮＰ（１−３２）またはプロＢＮＰ（１−１０８））は、室温でバイオセンサーの表面上で一定流量で濃度を増加させて（０．００１２５６μｇ／ｍｌから０．１２５μｇ／ｍｌまで）循環させた。ＳＰＲシグナルが検出される角度は、消滅波が伝播する媒体の屈折率に直接比例する。屈折率の変化は、共鳴単位で表される（ＲＵ、１０００共鳴単位は、活性領域の１ｍｍ２当り１ｎｇの固定化タンパク質に相当する）。抗原とモノクローナル抗体との間の相互作用および親和性の定量化は、製造元のソフトウェアＢＩＡｅｖｌｕａｔｉｏｎ（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン国）を用い、全体的なデータ処理により会合速度定数（ｋａ）および解離速度定数（ｋｄ）を算出することによって評価される。ｍｏｌ／ｌでの平衡解離定数（ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）は、モノクローナル抗体に対するＢＮＰ（１−３２）抗原またはプロＢＮＰ（１−１０８）抗原の親和性を反映する。
【０１７１】
７．２．２．結果：
表２は、モノクローナル抗ＢＮＰ抗体（２０Ｇ７を含む）と、２つの組換え抗原ＢＮＰ（１−３２）およびプロＢＮＰ（１−１０８）との間の相互作用の特性を示す。
【０１７２】
【表２】
0005458011.tif 000003
【０１７３】
表２に、ＢＮＰ（１−３２）またはプロＢＮＰ（１−１０８）とモノクローナル抗体との間の相互作用の平衡解離定数（Ｍ中のＫＤ）の算出を可能にする種々の特性（会合速度定数（ｋａ）および解離速度定数（ｋｄ））を要約してある。２０Ｇ７モノクローナル抗体が、優れた会合定数（ｋａ）および低い解離定数（ｋｄ）を示すため、相互作用に関するこれらの結果で、ＢＮＰ（１−３２）アッセイおよびプロＢＮＰ（１−１０８）アッセイにより得られたデータが確認され、ＢＮＰ（１−３２）およびプロＢＮＰ（１−１０８）に関して同一である１．７０−１０Ｍの優れた親和性定数により特徴付けされる（表２）。
【０１７４】
他のモノクローナル抗体（１１Ａ８および１７Ｆ１０）に関する例も提供されており、その親和性定数は、ナノモル範囲（２×１０−１０Ｍから９．３５×１０−１０Ｍまで、表２）にある。
【０１７５】
実施例８−２０Ｇ７モノクローナル抗体を用いるＢＮＰ（１−３２）アッセイ
８．１材料：
−Ｍａｘｉｓｏｒｐの９６ウェル平底マイクロプレート（Ｎｕｎｃ、デンマーク国）、
−ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）緩衝液、ｐＨ７．４、Ｇｉｂｃｏ錠剤。照会先：１８９１２−０１４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、
−ＢＮＰ（１−３２）：合成ペプチド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国、＃Ｂ−５９００）、
−プロＢＮＰ（１−１０８）（大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）中で産生された組換えタンパク質、ＨｙＴｅｓｔ、フィンランド国）、
−Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国、＃Ｐ１３７９）、
−ウサギを、ＢＮＰ（１−３２）の１−１０の領域を標的とする免疫原で免疫化することにより得られたＬ２１０１６ウサギポリクローナル抗体、そのエピトープは、ＢＮＰ（１−３２）の配列Ｓ１ＰＫＭＶ５（配列番号５４）である、
−２０Ｇ７モノクローナル抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、
−２４Ｃ５および２６Ｅ２モノクローナル抗体（ＨｙＴｅｓｔ、Ｔｕｒｋｕ、フィンランド国）、
−ウサギ中で産生され、ペルオキシダーゼに結合された抗マウスＩｇＧ抗体複合体（Ｓｉｇｍａ、米国、＃Ａ９０４４）、
−０．１Ｍのクエン酸緩衝液中、０．０４％のＨ２Ｏ２、ｐＨ４、
−ＯＰＤ（オルト−フェニレンジアミン、Ｓｉｇｍａ、米国、＃Ｐ８４１２）、
−硫酸（Ｈ２ＳＯ４、４Ｎ）。
【０１７６】
８．２．方法と原理：
最初に、ＢＮＰ（１−３２）の２０ｐｇ／ｍｌから１０，０００ｐｇ／ｍｌまでの標準範囲を、合成ＢＮＰ（１−３２）から緩衝液／血清中で調製した。
【０１７７】
このアッセイは、固相上での捕捉にＬ２１０１６のウサギポリクローナル抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用い、マイクロプレート上のサンドイッチＥＬＩＳＡ原理に基づいた。そのエピトープは、１ウェル当り５μｇ／ｍｌ溶液１００μｌによる受動的吸着によって固定されたＢＮＰ（１−３２）のＳ１ＰＫＭＶ５配列であった。
【０１７８】
０．１％ミルク（半脱脂乳）を含有するＰＢＳの０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ＰＢＳ−Ｔ）緩衝液中、０．５μｇ／ｍｌの濃度での溶液中１００μｌのモノクローナル抗体液（２０Ｇ７、２４Ｃ５または２６Ｅ２抗体）を、検出用試薬として用いた。したがって２０Ｇ７の応答強度を、２４Ｃ５および２６Ｅ２のモノクローナル抗体の強度と比較した。
【０１７９】
表３に、４９０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）で表されかつ標準濃度のＢＮＰ（１−３２）の存在下、前記抗体により得られたＢＮＰ（１−３２）の分析アッセイ結果を要約してある。
【０１８０】
【表３】
0005458011.tif 000004
【０１８１】
２種の抗体２４Ｃ５および２６Ｅ２は、本発明の２０Ｇ７抗体とは全く異なる挙動をすることが認められることは大いに注目される。したがって、これらの結果により、後者のアッセイ様式において、２０Ｇ７は、ＢＮＰ（１−３２）アッセイに関して２４Ｃ５および２６Ｅ２抗体よりもはるかに好適であることが確認される。
【０１８２】
図５に示され、２０Ｇ７モノクローナル抗体で得られた標準範囲は、２０ｐｇ／ｍｌから１０，０００ｐｇ／ｍｌまで線形である（ｒ２＝０．９６）。２種の市販の抗体２４Ｃ５および２６Ｅ２は、検体が高濃度でもＢＮＰ（１−３２）を検出する上であまり有効でないか、または全く有効でない（表３）。
【０１８３】
実施例９−サンドイッチＥＬＩＳＡにおけるモノクローナル抗体の相補性試験
９．１．材料：
−ＢＮＰ（１−３２）の配列Ｓ１ＰＫＭＶ５（配列番号５４）を認識するＬ２１０１６ウサギポリクローナル抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によりプライムされたＭａｘｉｓｏｒｐの９６ウェル平底マイクロプレート（Ｎｕｎｃ、デンマーク国）、
−ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）緩衝液、ｐＨ７．４、Ｇｉｂｃｏ錠剤。参照：１８９１２−０１４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、
−Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国、＃Ｐ１３７９）、
−ＢＮＰ（１−３２）の合成ペプチド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国、＃Ｂ−５９００）、
−プロＢＮＰ（１−１０８）（大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）中で産生された組換えタンパク質、ＨｙＴｅｓｔ、フィンランド国）、
−２０Ｇ７抗体（０．００１μｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌまでの種々の濃度に調製されたエピトープＦ１１ＧＲＫＭＤＲ１７（配列番号８）に対して特異的）、
−０．５μｇ／ｍｌの単一濃度でＢＮＰ（１−３２）のＣ−末端部分を認識する５０Ｂ７モノクローナル抗体（ＨｙＴｅｓｔ、フィンランド国）、
−ウサギ中で産生され、ペルオキシダーゼに結合させた抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｓｉｇｍａ、米国、＃Ａ９０４４）、
−０．０４％のＨ２Ｏ２（０．１Ｍのクエン酸緩衝液中、ｐＨ４、Ｓｉｇｍａ、米国）、
−ＯＰＤ（オルト−フェニレンジアミン、Ｓｉｇｍａ、米国、＃Ｐ８４１２）、
−硫酸（Ｈ２ＳＯ４、４Ｎ）。
【０１８４】
９．２方法：
９．２．１原理：
このアッセイは、固相上での捕捉にＬ２１０１６のウサギポリクローナル抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用い、マイクロプレート上のサンドイッチＥＬＩＳＡ原理に基づいた。そのエピトープは、受動的吸着により固定されたＢＮＰ（１−３２）の配列Ｓ１ＰＫＭＶ５（配列番号５４）であり（実施例８参照）、検出用には２種のモノクローナル抗体（エピトープＦ１１ＧＲＫＭＤＲ１７（配列番号８）に対する２０Ｇ７モノクローナル抗体およびＢＮＰ（１−３２）のＣ−末端部分を標的とする５０Ｂ７モノクローナル抗体（ＨｙＴｅｓｔ、フィンランド国））の組合わせであった。しかしながら、２０Ｇ７抗体は、濃度を変えて使用し、一方、５０Ｂ７モノクローナル抗体は、０．５μｇ／ｍｌの一定濃度で使用した。
【０１８５】
２０Ｇ７抗体および５０Ｂ７抗体のエピトープ相補性を、２０Ｇ７抗体の濃度を変えて試験した。ＢＮＰ（１−３２）の検出を改善するために、この様式により、評価される２種のモノクローナル抗体の協同作用が可能になる。
【０１８６】
９．２．２．プロトコル：
５ｎｇ／ｍｌのＢＮＰ（１−３２）溶液１００μｌを各マイクロプレートウェルに添加し、そこでＬ２１０１６のポリクローナル抗体を吸着させ、３７℃で２時間インキュベートした。このマイクロプレートを０．１％ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、次いで５０Ｂ７抗体および２０Ｇ７抗体希釈物の１つを含有する１００μｌの混合物をそれに配分し、３７℃で２時間インキュベートした。０．１％ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、１ウェル当り１００μＬを基準にペルオキシダーゼ−ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体複合体（０．１％ミルク（半脱脂乳）を含有する０．１％ＰＢＳ−Ｔ中で１／３，０００に希釈）を、３７℃で１時間インキュベートした。最後に、０．１％ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、１００μＬ／ウェルを基準に、Ｈ２Ｏ２＋ＯＰＤ溶液を沈着させた。このマイクロプレートを、室温で２０分間暗所に置いた。この酵素反応は、１ウェル当り５０μＬの硫酸（Ｈ２ＳＯ４、４Ｎ）を添加することによって中止させ、引き続き４９０ｎｍでのＯＤを各ウェルで測定した。
【０１８７】
９．２．３．結果
表４は、２０Ｇ７および５０Ｂ７モノクローナル抗体を用いて、４９０ｎｍでの光学密度で表されたＢＮＰの分析アッセイ結果を示している。
【０１８８】
【表４】
0005458011.tif 000005
【０１８９】
２種の抗体間で相乗作用があることが認められた。言い換えれば、２種の抗体の効果が加算された：２０Ｇ７が無いと、シグナル（ＯＤ）が１．２９６に制限され、２０Ｇ７の添加が増すにつれて、得られるシグナル（ＯＤ）が増加した。
【０１９０】
本発明によるＦ１１ＧＲＫＭＤＲ１７（配列番号８）エピトープ（ＢＮＰ（１−３２）のループ内に位置する）を標的とする２０Ｇ７モノクローナル抗体、およびＢＮＰ（１−３２）のＣ−末端領域を標的とする５０Ｂ７モノクローナル抗体の双方を用いることによって、ＢＮＰ（１−３２）の検出は有意に改善される。このことから、検出に使用される２種のモノクローナル抗体の累積または協同的な寄与が立証される。
【０１９１】
この種の相補性はまた、２０Ｇ７モノクローナル抗体と、ＢＮＰ（１−３２）配列の他の位置（主としてＮ−末端位置、Ｃ−末端位置における）に位置したエピトープを認識する他の抗体との間でも想定することができる。使用される抗体数は、立体障害問題に遭遇しない限り、３つ以上であってもよい。
【０１９２】
実施例１０−２０Ｇ７モノクローナル抗体を用いるプロＢＮＰ（１−１０８）アッセイ
１０．１．材料：
−ＢＮＰ（１−３２）の合成ペプチド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国、＃Ｂ−５９００）、
−プロＢＮＰ（１−１０８）（大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）中で産生された組換えタンパク質、ＨｙＴｅｓｔ、フィンランド国）、
−プロＢＮＰ（１−１０８）のヒンジ配列：エピトープＲＡＰＲ７６Ｓ７７Ｐ（配列番号５５）（Giulianiら、Clin. Chem., 52: 6, 1054-1061, 2006）を認識するモノクローナル抗体（例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄからのヒンジ７６抗体）によりプライムされたＭａｘｉｓｏｒｐの９６ウェル平底マイクロプレート（Ｎｕｎｃ、デンマーク国）、
−ペルオキシダーゼに結合した２０Ｇ７モノクローナル抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、
−ペルオキシダーゼに結合した２４Ｃ５モノクローナル抗体（ＨｙＴｅｓｔ、フィンランド国）、
−ペルオキシダーゼに結合した２６Ｅ２モノクローナル抗体（ＨｙＴｅｓｔ、フィンランド国）、
−ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）緩衝液、ｐＨ７．４、Ｇｉｂｃｏ錠剤。照会先：１８９１２−０１４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、
−Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国、＃Ｐ１３７９）。
【０１９３】
１０．２方法：
１０．２．１．プロＢＮＰ（１−１０８）の分析アッセイの原理
最初に、プロＢＮＰ（１−１０８）の２０ｐｇ／ｍｌから１０，０００ｐｇ／ｍｌまでの標準範囲を、０．１％ＰＢＳ−Ｔ緩衝液中、組換えプロＢＮＰ（１−１０８）から調製した。
【０１９４】
このアッセイは、固相上での捕捉にモノクローナル抗体（例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄからのヒンジ７６抗体）を用い、マイクロプレート上のサンドイッチＥＬＩＳＡ原理に基づき、プロＢＮＰ（１−１０８）のヒンジ配列：１ウェル当り０．５μｇ／ｍｌ溶液１００μｌによる受動的吸着により固定されたエピトープＲＡＰＲ７６Ｓ７７Ｐ（配列番号５５）を認識する。
【０１９５】
０．５μｇ／ｍｌの濃度でかつ０．１％ＰＢＳ−Ｔ緩衝液（０．１％の半脱脂乳を含有する）の溶液中でペルオキシダーゼに結合させた１００μｌのモノクローナル抗体液（２０Ｇ７、２４Ｃ５または２６Ｅ２抗体）を、検出用抗体として用いた。この技術的ポイント以外では、プロトコルは、実施例８におけるＥＬＩＳＡのものと同一であった。したがって２０Ｇ７の検出特性を、２４Ｃ５および２６Ｅ２のモノクローナル抗体の特性と比較した。
【０１９６】
表５は、光学密度（ＯＤ）で表され、標準濃度のプロＢＮＰ（１−１０８）の存在下、前記抗体を用いることにより得られたプロＢＮＰ（１−１０８）の分析アッセイ結果を示している。
【０１９７】
１０．３．結果：
【０１９８】
【表５】
0005458011.tif 000006
【０１９９】
本発明の２０Ｇ７抗体が、ＢＮＰ（１−３２）のみならずプロＢＮＰ（１−１０８）を検出することが認められることは大いに注目される。さらに、この場合もまた、これらの２種のＨｙＴｅｓｔ抗体は、２０Ｇ７抗体とは全く異なった挙動をする。このことから、ＢＮＰ（１−３２）およびプロＢＮＰ（１−１０８）アッセイにおける２０Ｇ７抗体の重要な利点が確認される。
【０２００】
図６は、２０Ｇ７モノクローナル抗体によって得られた、２０ｐｇ／ｍｌから１０，０００ｐｇ／ｍｌのプロＢＮＰ（ｒ２＝０．９９、図６）の線形標準範囲を示しており、一方、ＨｙＴｅｓｔからの２種の市販の抗体は、高濃度のプロＢＮＰ（１−１０８）であってもプロＢＮＰ（１−１０８）を検出する上であまり有効性でないか、または全く有効でない（表５）。
【０２０１】
実施例１１−本発明者らにより得られた他のモノクローナル抗体を用いたプロＢＮＰ（１−１０８）およびＢＮＰ（１−３２）アッセイ
表６は、１１Ａ８および１７Ｆ１０モノクローナル抗体を用い、実施例８および１０からの２つのＥＬＩＳＡプロトコルに従って生じた結果を示す。
【０２０２】
検出に用いられたこれらの標識モノクローナル抗体は、それぞれ１ＳＰＫＭＶ５領域またはヒンジ７６抗体を標的とするウサギポリクローナル（Ｌ２１０１６）を捕捉のために使用する場合、ＢＮＰ（１−３２）およびプロＢＮＰ（１−１０８）を高度に検出することができる。
【０２０３】
表６は、それぞれ標準濃度のプロＢＮＰ（１−１０８）およびＢＮＰ（１−３２）の存在下、光学密度で表され、前記抗体により得られたプロＢＮＰ（１−１０８）およびＢＮＰ（１−３２）の分析アッセイ結果を示す。
【０２０４】
【表６】
0005458011.tif 000007
【０２０５】
本発明の１７Ｆ１０および１１Ａ８抗体が、ＢＮＰ（１−３２）のみならずプロＢＮＰ（１−１０８）を検出することが認められることは大いに注目される。
【０２０６】
実施例１２−鬱血性心不全被験者および正常な被験者におけるＢＮＰ（１−３２）アッセイおよびプロＢＮＰ（１−１０８）アッセイ
１２．１．サンプル：
−民間供給源（ＰｒｏＭｅｄｅｘ、ＮＹ、米国）に由来し、ＮＹＨＡ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）クラスのＩからＩＩＩのうちの１つに属し、志願者の同意文書に署名した鬱血性心不全被験者からの５５検体のＥＤＴＡ血漿。被験集団は以下のとおりである：ＮＹＨＡクラスＩが１０人の患者、ＮＹＨＡクラスＩＩが２１人の患者およびＮＹＨＡクラスＩＩＩが２４人の患者。
−正常被験者（健常志願者、ＰｒｏＭｅｄｅｘ、ＮＹ、米国）からの４８検体のＥＤＴＡ血漿。
【０２０７】
１２．２．ＢＮＰ（１−３２）アッセイおよびプロＢＮＰ（１−１０８）アッセイに関する材料と方法
使用される材料と方法は、ＢＮＰ（１−３２）に関しては上記８．２に記載されたもの、プロＢＮＰ（１−１０８）に関しては上記１０．２に記載されたものと同一であった。
【０２０８】
１２．３結果
１２．３．１．鬱血性心不全患者におけるＢＮＰ（１−３２）アッセイおよびプロＢＮＰ（１−１０８）のアッセイの結果
８．２に開示されたＢＮＰ（１−３２）アッセイにより、鬱血性心不全患者の血漿から得られたＢＮＰ（１−３２）の値は、本発明によるプロＢＮＰ（１−１０８）アッセイの値と相関性があることが判明した（ｒ２＝０．９３５、図７）。
【０２０９】
より詳細には、患者が彼らのＮＹＨＡクラスに従って試験される場合に相関性が維持される（ＮＹＨＡクラスＩ、ＩＩおよびＩＩＩに関してそれぞれｒ２＝０．９９７、ｒ２＝０．９０３、ｒ２＝０．８３２、それぞれ８Ａ、８Ｂおよび８Ｃを参照）。
【０２１０】
このように、２０Ｇ７抗体によるこれらの結果によって、鬱血性心不全のマーカーとしてのＢＮＰ（１−３２）アッセイまたはプロＢＮＰ（１−１０８）アッセイの有用性が再確認される。
【０２１１】
これらの実験を、標識形態での２４Ｃ５抗体および２６Ｅ２抗体（ＨｙＴｅｓｔ）により再現したが、相関性は見られなかった。
【０２１２】
１２．３．２．健常被験者におけるＢＮＰ（１−３２）アッセイおよびプロＢＮＰ（１−１０８）のアッセイの結果
固相におけるモノクローナルヒンジ７６抗体および検出用に２０Ｇ７抗体−ペルオキシダーゼ複合体を用いるプロＢＮＰ（１−１０８）アッセイによって、健常被験者からの血漿より得られたプロＢＮＰ（１−１０８）の値は、検出に２０Ｇ７抗体を用いるＢＮＰ（１−３２）アッセイの値と相関性が高い（ｒ２＝０．７０２）ことが判明した（図９）。
【０２１３】
したがって結論として、健常被験者よりも鬱血性心不全患者の方が多量のＢＮＰ（１−３２）およびプロＢＮＰ（１−１０８）を検出することによって、本発明による２０Ｇ７抗体が、鬱血性心不全患者におけるＢＮＰ（１−３２）アッセイおよびプロＢＮＰ（１−１０８）アッセイに全く適切であることは極めて明白である（表７）。
【０２１４】
【表７】
0005458011.tif 000008
【０２１５】
実施例１３−腎不全患者におけるＢＮＰ（１−３２）アッセイおよびプロＢＮＰ（１−１０８）アッセイ
１３．１サンプル：
Ｌａｐｅｙｒｏｎｉｅ病院、Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ、仏国に由来し、志願者の同意文書に署名した３３人の腎不全患者からのＥＤＴＡ血漿。
【０２１６】
１３．２．ＢＮＰ（１−３２）アッセイおよびプロＢＮＰ（１−１０８）アッセイに関する材料と方法
使用される材料と方法は、ＢＮＰ（１−３２）に関しては上記８．２に記載されたもの、およびプロＢＮＰ（１−１０８）に関しては上記１０．２に記載されたものと同一であった。
【０２１７】
１３．３結果
固相におけるヒンジ７６抗体および検出に２０Ｇ７抗体−ペルオキシダーゼ複合体を用いるプロＢＮＰ（１−１０８）アッセイによって、腎不全患者の血漿より得られたプロＢＮＰ（１−１０８）の値は、本発明の２０Ｇ７抗体を用いるＢＮＰ（１−３２）アッセイの値と相関性が高い（ｒ２＝０．８９９）ことが判明した（図１０）。本発明による２０Ｇ７抗体は、腎不全患者におけるＢＮＰ（１−３２）アッセイおよびプロＢＮＰ（１−１０８）アッセイに極めて適切である。
【０２１８】
実施例１４−虚血性脳卒中患者におけるプロＢＮＰ（１−１０８）アッセイ
１４．１．患者サンプル：
−脳卒中発症の３時間以内に救急診療部に入院した虚血性脳卒中患者から３２のクエン酸塩添加血漿サンプルを試験した。脳卒中の重症度は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｔｒｏｋｅ  Ｓｃａｌｅ（ＮＩＨＳＳ）により評価した。
−脳卒中集団からの患者に性別および年令を適合させた、明らかに健常の血液供与者から４２のクエン酸塩添加血漿サンプルを試験した。
クエン酸塩添加血漿サンプルの全てを−８０℃に保存した。分析前に、サンプルを解凍し、４℃で１５分間３０００ｇで遠心分離した。
【０２１９】
１４．２．材料と方法：
サンプルの全てを、ＢｉｏＰｌｅｘ（商標）２２００プロＢＮＰアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により試験した。
【０２２０】
１４．２．１．技術の原理：
ＢｉｏＰｌｅｘ（商標）２２００は、マルチプレックスの磁気ビーズ技術とフローサイトメトリー技術とを組合わせて、完全自動化ランダムアクセスプラットフォーム上でマルチ検体検出を提供する。磁気粒子（直径８μｍ、カルボキシル修飾表面）を、互いに異なる波長で放射し、６３５ｎｍで有意に吸着する２つの蛍光体で染色する（クラス染料ＣＬ１およびＣＬ２）。レポーター蛍光体であるβ−フィコエリトリン（ＰＥ）は、高モルの吸光係数、量子収率、耐光退色性があり、自己消光が無く安定性であるため選択された。この検出器により、３つの波長：２つのクラス染料およびレポーター染料での光が同時に測定される。
【０２２１】
１４．２．２．ＢｉｏＰｌｅｘ（商標）２２００のプロＢＮＰ：アッセイ原理
ＢｉｏＰｌｅｘ（商標）２２００のプロＢＮＰアッセイは、二段階サンドイッチ蛍光免疫学的アッセイである。第一ステップにおいて、ＢｉｏＰｌｅｘ（商標）２２００システムにより、反応器内に５０μＬの患者サンプル、抗プロＢＮＰ（１−１０８）モノクローナル抗体（エピトープＲＡＰＲ７６Ｓ７７Ｐ（配列番号５８）を認識するヒンジ７６モノクローナル抗体、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でコーティングされた磁気染色ビーズおよびアッセイ用緩衝液が組合わされる。次いで、１１分のインキュベーションおよび洗浄サイクル後、フィコエリトリン（ＰＥ）に結合した抗ヒトＢＮＰモノクローナル抗体２０Ｇ７複合体を添加し、２分間インキュベートした。過剰の複合体を除去後、ビーズ混合物は、ＰＥの蛍光により染色ビーズおよびビーズ上に捕捉された抗原量を識別する検出器を通過させる。６つの異なる標準物質の１組を用いて較正後、３つのレベルの品質管理および患者のサンプル結果を、ｐｇ／ｍＬで表す。
【０２２２】
２つの品質管理ビーズも各サンプルで試験して、システム全体の安全性を高める。
【０２２３】
１４．３．結果：
対照および虚血性脳卒中集団に関するＢｉｏＰｌｅｘ（商標）２２００のプロＢＮＰ値の分布を、表８および図１１に示している。プロＢＮＰ（１−１０８）のレベルは、対照群と比較して虚血性脳卒中群において有意に高い（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ、ｐ＜０．０００１）。この結果は、プロＢＮＰ（１−１０８）もまた、虚血性脳卒中の早期の診断のための有用な血漿バイオマーカーであることを立証している。
【０２２４】
【表８】
0005458011.tif 000009
【０２２５】
本発明に記載されたモノクローナル抗体２０Ｇ７を用いたプロＢＮＰ（１−１０８）サンドイッチアッセイが、脳卒中患者におけるプロＢＮＰ（１−１０８）濃度を測定できることを、本発明者らは明瞭に立証している。
【０２２６】
実施例１５−急性冠動脈患者におけるプロＢＮＰ（１−１０８）アッセイ
１５．１．サンプル：
−民間供給源（ＰｒｏＭｅｄｅｘ、ＮＹ、米国）に由来する２７人の急性冠動脈障害患者（Ｔｒｏｐｏｎｉｎｅ  Ｉ血漿平均値は１２．５±６．９ｎｇ／ｍｌに達する）からのＥＤＴＡ血漿、
−４８人の健常被験者（健常志願者、ＰｒｏＭｅｄｅｘ、ＮＹ、米国）からのＥＤＴＡ血漿。
【０２２７】
１５．２．材料と方法
ＢＮＰ（１−３２）アッセイに関して使用される材料と方法は、上記８．２に記載されたもの、およびプロＢＮＰ（１−１０８）に関しては上記１０．２に記載されたものと同一であった。
【０２２８】
１５．３結果
救急医療部に入院し、上記のプロＢＮＰ（１−１０８）アッセイにより急性冠動脈障害と診断された患者の血漿から得られたプロＢＮＰ（１−１０８）の値は、本発明による２０Ｇ７抗体を用いるＢＮＰ（１−３２）アッセイにより得られた値と相関性が高い（ｒ２＝０．９５６）ことが判明した（図１２）。急性冠動脈障害患者のＢＮＰ（１−３２）およびプロＢＮＰ（１−１０８）のレベル（プロＢＮＰ（１−１０８）およびＢＮＰ（１−３２）に関してそれぞれ６６８±６１９および１，５１８±１，５３３ｐｇ／ｍｌで、本発明によりアッセイされた）は、健常被験者のレベル（プロＢＮＰ（１−１０８）およびＢＮＰ（１−３２）に関してそれぞれ３７±３２および２２７±１７２ｐｇ／ｍｌで、本発明によりアッセイされた）よりも高かった。
【０２２９】
したがって、本発明による２０Ｇ７抗体（ペルオキシダーゼに結合した）を用いるサンドイッチアッセイにより、ＢＮＰ（１−３２）のレベルに比例するプロＢＮＰ（１−１０８）の濃度を測定できることは極めて明白である。これらの結果により、マーカーとして、特に急性冠動脈障害のマーカーとしてのプロＢＮＰ（１−１０８）およびＢＮＰ（１−３２）のアッセイの有用性が再度証明されている。
【０２３０】
実施例１６−２０Ｇ７モノクローナル抗体を用いるグリコシル化形態におけるプロＢＮＰ（１−１０８）のアッセイ
１６．１．材料：
−プロＢＮＰ（１−１０８）（非グリコシル化形態に関しては大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）で産生された組換えタンパク質、およびグリコシル化形態に関して再プログラム化されたＨＥＫ２９３細胞からの組換えタンパク質、ＨｙＴｅｓｔ、フィンランド国）、
−Ｍａｘｉｓｏｒｐの９６ウェル平底マイクロプレート（Ｎｕｎｃ、デンマーク国）、
−ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）緩衝液、ｐＨ７．４、Ｇｉｂｃｏ錠剤。参照：１８９１２−０１４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、
−Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国、＃Ｐ１３７９）、
−プロＢＮＰ（１−１０８）のヒンジ配列：エピトープＲＡＰＲ７６Ｓ７７Ｐ（配列番号５５）を認識するヒンジ７６モノクローナル抗体（Giuliani ら、Clin. Chem., 52: 6, 1054-1061, 2006）、
−ペルオキシダーゼに結合した２０Ｇ７モノクローナル抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）。
【０２３１】
１６．２方法：
１６．２．１．グリコシル化プロＢＮＰの分析アッセイの原理：
グリコシル化プロＢＮＰ（１−１０８）の２０ｐｇ／ｍｌから１０，０００ｐｇ／ｍｌの標準範囲を、０．１％のＰＢＳ−Ｔ緩衝液中で調製した。非グリコシル化プロＢＮＰ（１−１０８）の２０ｐｇ／ｍｌから１０，０００ｐｇ／ｍｌの標準範囲を、同じ方法で０．１％のＰＢＳ−Ｔ緩衝液中で調製した。
【０２３２】
本アッセイは、固相上での捕捉にモノクローナル抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄからのヒンジ７６抗体）を用い、プロＢＮＰ（１−１０８）のエピトープ配列ＲＡＰＲ７６Ｓ７７Ｐ（配列番号５５）を認識し、１ウェル当り０．５μｇ／ｍｌの１００μｌによる受動的吸着により固定化されるマイクロプレート上のサンドイッチＥＬＩＳＡ原理に基づいている。
【０２３３】
１％ミルク（半脱脂乳）を含有する０．１％のＰＢＳ−Ｔの溶液中、０．５μｇ／ｍｌの濃度でペルオキシダーゼに結合した本発明による２０Ｇ７モノクローナル抗体の溶液１００μｌを、検出試薬として用いた。残りのプロトコルは、実施例１０のＥＬＩＳＡと同一であった。したがって、２０Ｇ７抗体の検出特性を、２つの形態：グリコシル化および非グリコシル化形態のプロＢＮＰ（１−１０８）に関して比較した。
【０２３４】
１６．３．結果：
表９および図１３に示された結果は、固定化ヒンジ７６抗体および検出に２０Ｇ７抗体を用いる免疫アッセイによりグリコシル化プロＢＮＰ（１−１０８）および非グリコシル化プロＢＮＰ（１−１０８）アッセイに対応する。
【０２３５】
【表９】
0005458011.tif 000010
【０２３６】
プロＢＮＰ（１−１０８）は、２０Ｇ７を用いることにより非グリコシル化形態と同様にグリコシル化形態も検出することができる。シグナル／バックグラウンド比は、非グリコシル化プロＢＮＰの方がそのグリコシル化形態よりも僅かに大きい（２０ｐｇ／ｍｌでそれぞれ３および１．８のシグナル／バックグラウンド比が得られる）。
【０２３７】
実施例１７−グリコシル化形態でのプロＢＮＰ（１−１０８）の免疫活性およびヒンジ７６抗体によるプロＢＮＰ（１−１０８）アッセイに対する関連性
１７．１．材料：
−ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６分析器（表面プラスモン共鳴ＳＰＲ技術、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、米国）
−グリコシル化形態および非グリコシル化形態（１３ｎＭから２００ｎＭ）でのプロＢＮＰ（１−１０８）（組換えタンパク質、ＨｙＴｅｓｔ、フィンランド国）、
−抗Ｆｃ断片抗体（Ｓｉｇｍａ、米国）
−エピトープＲＡＰＲ７６Ｓ７７Ｐ（配列番号５５）を認識し、０．１％のＰＢＳ−Ｔ中３０μｇ／ｍｌの濃度で使用されるモノクローナルヒンジ７６抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、
−ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）緩衝液、ｐＨ７．４。
【０２３８】
１７．２．方法：
１７．２．１．原理：
ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６分析器（その原理は、表面プラスモン共鳴技術（ＳＰＲ）に基づく）を用いて、２０Ｇ７モノクローナル抗体とグリコシル化および非グリコシル化プロＢＮＰ（１−１０８）形態との相互作用の速度論および親和性を確定する。本発明者らは製造元の取扱説明書に従った。モノクローナル抗体は、抗Ｆｃ断片抗体を用いることによりバイオセンサー（固体表面）上に固定し、一方、グリコシル化または非グリコシル化可溶性抗原プロＢＮＰ（１−１０８）は、室温でバイオセンサーの表面上に一定流量で濃度を増加させて（１３ｎＭから２００ｎＭまで）循環させた。ＳＰＲシグナルが検出される角度は、消滅波が伝播する媒体の屈折率に直接比例した。屈折率の変化は、共鳴単位（ＲＵ、１０００共鳴単位は、表面領域の１ｍｍ２当り１ｎｇの固定化タンパク質に相当する）で表される。抗原とモノクローナル抗体との間の相互作用および親和性の定量化は、デバイスのソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて全体的なデータ処理により会合速度定数（ｋａ）および解離速度定数（ｋｄ）を算出することによって評価される。ｍｏｌ／ｌでの平衡解離定数（ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）は、モノクローナル抗体に関してグリコシル化および非グリコシル化プロＢＮＰ（１−１０８）抗原の親和性を反映する。
【０２３９】
１７．２．２．結果：
表１０は、抗ヒンジ抗体（エピトープＲＡＰＲ７６Ｓ７７Ｐ（配列番号５５）を有するヒンジ７６抗体、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と、グリコシル化および非グリコシル化プロＢＮＰ（１−１０８）との間の相互作用の特性を示す。抗ヒンジ抗体と非グリコシル化プロＢＮＰ（１−１０８）との間の親和性定数（１．７３．１０−１０）は、グリコシル化プロＢＮＰ（１−１０８）に関するもの（２．３５．１０−８）よりも大きかったが、プロＢＮＰ（１−１０８）のヒンジ領域を標的とする抗体は、グリコシル化および非グリコシル化双方の形態を高親和性で認識した。
【０２４０】
【表１０】
0005458011.tif 000011
【０２４１】
実施例１８−バイエピトープおよびトリエピトープの標準物質
１８．１．組み込まれるエピトープの免疫活性が保存されるという条件で、本発明によるバイエピトープおよびトリエピトープの標準物質全ての構造は、線状であっても分枝状であってもよい。
【０２４２】
これらの標準物質を製造するために使用できる合成プロトコルは、当業者に周知のペプチド類の有機化学分野のものである（この文脈において、実施例１の「ペプチド合成」を参照されたい）。
【０２４３】
エピトープＥ２およびＥ３に関して、本発明による線状ペプチド配列は、非限定的様式で以下の配列：
配列番号５６：ＰＲＳＰＫＭＶＱＧ
配列番号５７：ＡＰＲＳＰＫＭＶ
配列番号５８：ＳＧＬＧＣＫＬＶ
配列番号５９：ＳＰＫＭＶＱＧＳＧ
配列番号６０：ＹＴＬＲＡＰＲＳＰＫＭＶＧ
よりなる群から選択することができる。
【０２４４】
１８．２．本発明による合成エピトープの例
本発明者らは、以下の標準物質を合成した。
【０２４５】
１８．２．１．バイエピトープの標準物質：
ＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ１：Ａｃ−ＹＴＬＲＡＰＲＳＰＫＭＶ−Ａｈｘ−ＳＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳ−ＣＯＮＨ２
ＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ２：Ａｃ−ＹＴＬＲＡＰＲＳＰＫＭＶ−Ａｈｘ−ＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＫ−ＣＯＮＨ２
ＣａｌｉＰｒｏＢＮＰ３：Ａｃ−ＹＴＬＲＡＰＲＳＰＫＭＶＱＧ−Ａｈｘ−ＦＧＲＫＭＤＲ−ＣＯＮＨ２。
【０２４６】
これら３つのバイエピトープ標準物質を使用して、ＲＡＰＲＳＰ（配列番号５５）を認識するモノクローナルヒンジ７６抗体（Giulianiら、上記）の固相での固定化、ならびに検出の際には、例えば、モノクローナル２０Ｇ７抗体−ペルオキシダーゼに基づき、上記１０．２のとおりにプロＢＮＰ（１−１０８）アッセイを検量することができる。
【０２４７】
ＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ４：Ａｃ−ＦＧＲＫＭＤＲ−Ａｈｘ−ＳＧＬＧＣ＊ＫＶＬＲＲＨ−ＣＯＯＨ
ＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ４ｂ：Ａｃ−ＦＧＲＫＭＤＲ−Ａｈｘ−ＳＧＬＧＣ＊ＫＶＬＲ−ＣＯＮＨ２
これら２つのバイエピトープ標準物質を使用して、例えば、モノクローナル抗体５０Ｂ７または５０Ｅ１（ＨｙＴｅｓｔ、フィンランド国）など、ＢＮＰ（１−３２）のＣ−末端に特異的なモノクローナル抗体の固相での固定化、ならびに検出の際には、例えば、モノクローナル２０Ｇ７抗体−ペルオキシダーゼに基づき、ＢＮＰ（１−３２）アッセイを検量することができる。
【０２４８】
ＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ５：Ａｃ−ＳＰＫＭＶＱＧＳＧ−Ａｈｘ−ＦＧＲＫＭＤＲ−ＣＯＮＨ２
このバイエピトープ標準物質を使用して、ポリクローナル抗体Ｌ２１０１６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の固相での固定化、ならびに、検出の際には、例えば、モノクローナル２０Ｇ７抗体−ペルオキシダーゼに基づき、上記８．２の通りにＢＮＰ（１−３２）アッセイを検量することができる。
【０２４９】
上記の標準物質の配列において、Ａｈｘ基の構造式はＮＨ−（ＣＨ２）５−ＣＯである。
【０２５０】
式−ＮＨ−（ＣＨ２）５−ＣＯ−の結合基は、２つのペプチド配列を一緒に共有結合させることのできる周知のカップリング剤であるアミノ−ヘキサン酸（ＡＨＸ）に由来する。
【０２５１】
Ｃ＊＝Ｃ（Ａｃｍ）＝アセトアミドメチル（当業者に周知の保護基）によりブロックされたシステイン。
【０２５２】
トリエピトープ標準物質：
ＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ６：Ａｃ−ＹＴＬＲＡＰＲＳＰＫＭＶ−Ａｈｘ−ＦＧＲＫＭＤＲ−Ａｈｘ−ＳＧＬＧＣ＊ＫＶＬＲＲＨ−ＣＯＯＨ、
ＣＡｌｉｐｒｏＢＮＰ６ｂ：Ａｃ−ＹＴＬＲＡＰＲＳＰＫＭＶ−Ａｈｘ−ＦＧＲＫＭＤＲ−Ａｈｘ−ＳＧＬＧＣ＊ＫＶＬＲ−ＣＯＮＨ２。
【０２５３】
これら２つのトリエピトープ標準物質を使用して、ＲＡＰＲＳＰ（配列番号５５）を認識するモノクローナルヒンジ７６抗体（Giulianiら、上記）などの抗体および本発明のモノクローナル２０Ｇ７抗体、ならびに、例えば、ＢＮＰ（１−３２）のＣ−末端部分に対するエピトープを有する抗体を用いて、プロＢＮＰ（１−１０８）アッセイおよびＢＮＰ（１−３２）アッセイの双方を検量することができる。
【０２５４】
１８．３．材料と方法
これら標準物質の有用性を示すために、検量および安定性の結果を、２つの異なる様式、すなわちＢｉｏＰｅｘ（商標）アッセイおよびＥＬＩＳＡアッセイにおいて表示する。
−プロＢＮＰ（１−１０８）バイエピトープ、ＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ１およびＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ３化合物を、実施例１４に記載されたＢｉｏＰｅｘ（商標）２２００プロＢＮＰアッセイにより試験した。
−ＢＮＰ（１−３２）バイエピトープ、ＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ５化合物は、実施例８．２に記載されたアッセイにより試験し、トリエピトープ、ＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ６化合物は、実施例１０．２に記載されたアッセイにより試験した。
【０２５５】
１８．４．プロトコル
種々の化合物を、５％のＢＳＡ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１０％のアンチプロテーゼのカクテル（Ｓｉｇｍａ参照Ｐ２７１４）、０．１％のプロクリン、０．０９５％のＮａＮ３および０．１％の安息香酸ナトリウムを含有する０．１Ｍのコハク酸緩衝液、ｐＨ７．６で希釈した種々の濃度で試験した。
【０２５６】
同じ０．１Ｍのコハク酸緩衝液、ｐＨ７．６で、ＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ１の標準物質を、１μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、および０．０２μｇ／ｍＬに希釈し、ＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ３の標準物質を、１．６μｇ／ｍＬ、０．８μｇ／ｍＬ、０．３μｇ／ｍＬ、０．０６μｇ／ｍＬに希釈し、ＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ５およびＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ６の標準物質を、１００ｎｇ／ｍｌから０．０１ｎｇ／ｍｌに希釈した。
【０２５７】
化合物の安定性を、以下の方法で加速条件（室温）で試験し、合成ＢＮＰ（１−３２）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｅｔａｔｓ−Ｕｎｉｓ、＃Ｂ−５９００）および組換えプロＢＮＰ（１−１０８）（ＨｙＴｅｓｔ参照８ＰＲＯ８）と比較した：
【０２５８】
組換えプロＢＮＰ（１−１０８）、合成ＢＮＰ（１−３２）および標準物質のペプチドを、上記の０．１Ｍのコハク酸緩衝液、ｐＨ７．６で希釈した。各溶液を、１０本のチューブに分けて室温（２０℃±５℃）に置いた。次に各溶液のうちの１本のチューブを、Ｊ０、Ｊ＋７、Ｊ＋１４、Ｊ＋２１において凍結した。Ｊ＋２１において、種々の溶液を解凍し、実施例１４に記載されたＢｉｏＰｌｅｘ（商標）２２００プロＢＮＰアッセイ、または実施例８．２および１０．２に記載された免疫アッセイによりアッセイした。
【０２５９】
ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、プロＢＮＰ（１−１０８）、ＢＮＰ（１−３２）およびＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ６の２５ｎｇ／ｍＬから０．０４ｎｇ／ｍＬの範囲を試験した。ＣａｌｉＢＮＰ４およびＣａｌｉＢＮＰ５に関するこれらの試験範囲は、２ｎｇ／ｍＬから０．００４ｎｇ／ｍＬであった。
【０２６０】
ＢｉｏＰｌｅｘ（商標）２２００プロＢＮＰアッセイにおいて、プロＢＮＰ（１−１０８）の２つの濃度、１０ｎｇ／ｍＬならびに１ｎｇ／ｍＬ、ＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ１の２つの濃度、２μｇ／ｍＬならびに０．１２５μｇ／ｍＬ、およびＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ３の２つの濃度、１μｇ／ｍＬならびに０．３μｇ／ｍＬの安定性を分析した。ＥＬＩＳＡ様式において、プロＢＮＰ（１−１０８）およびＢＮＰ（１−３２）の３つの濃度、１．５６ｎｇ／ｍＬ、０．７８ｎｇ／ｍＬおよび０．３９ｎｇ／ｍＬ、ならびにＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ５の３つの濃度、６２．５ｐｇ／ｍＬ、３１ｎｇ／ｍＬおよび１５．６ｎｇ／ｍＬを分析した。
【０２６１】
１８．５．結果
１８．５．１．ＢｉｏＰｌｅｘ（商標）２２００プロＢＮＰアッセイにおけるＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ１およびＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ３の標準物質
【０２６２】
種々の濃度範囲におけるＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ１およびＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ３の化合物のアッセイ結果を、それぞれ図１４および１５に表示してある。
【０２６３】
ＢｉｏＰｌｅｘ（商標）２２００プロＢＮＰアッセイにおいて、ＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ１およびＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ３の化合物は、化合物の濃度と共にシグナルの増加を生じさせることができる。したがって、これらの化合物は、プロＢＮＰ（１−１０８）分子に対して標準化して、プロＢＮＰ（１−１０８）アッセイの標準物質として使用することができる。
【０２６４】
種々の濃度範囲での組換えプロＢＮＰ（１−１０８）およびＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ１ならびにＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ３化合物の加速安定性試験の結果を、表１１に表示してある。
【０２６５】
【表１１】
0005458011.tif 000012
＊安定性の受け入れ規格：ＪＯ適格後のＸ日目における安定性にするために、J0+Xにおけるシグナル/ J0におけるシグナル比は、１．００±０．２に等しくなければならない。
＊＊室温：２０℃±５℃
＊＊＊５％のＢＳＡ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１０％のアンチプロテーゼのカクテル（Ｓｉｇｍａ参照Ｐ２７１４）、０．１％のプロクリン、０．０９５％のＮａＮ３および０．１％の安息香酸ナトリウムを含有する０．１Ｍのコハク酸緩衝液、ｐＨ７．６。
【０２６６】
バイエピトープ標準物質ＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ１およびＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ３は、明らかに組換えプロＢＮＰ（１−１０８）よりも高い安定性を示す。
【０２６７】
１８．５．２．２０Ｇ７抗体の使用に基づいた免疫アッセイにおけるＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ５およびＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ６標準物質
種々の濃度範囲におけるＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ５およびＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ６の化合物の試験結果を、それぞれ図１６および１７に表示してある。
【０２６８】
ＢＮＰ（１−３２）およびプロＢＮＰ（１−１０８）アッセイにおいて、バイエピトープ化合物ＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ５およびトリエピトープ化合物ＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ６は、化合物の濃度と共にシグナルの増加を生じさせることができる。したがって、これらの化合物は、プロＢＮＰ（１−１０８）およびＢＮＰ（１−３２）アッセイの標準物質として使用することができる。
【０２６９】
種々の濃度範囲での組換えプロＢＮＰ（１−１０８）、ＢＮＰ（１−３２）およびＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ５化合物の加速安定性アッセイの結果を、表１２に表示してある。
【０２７０】
【表１２】
0005458011.tif 000013
＊安定性の受け入れ規格：ＪＯ適格後のＸ日目における安定性にするために、J0+Xにおけるシグナル/ J0におけるシグナル比は、１．００±０．２に等しくなければならない。
＊＊室温：２０℃±５℃
＊＊＊５％のＢＳＡ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１０％のアンチプロテーゼのカクテル（Ｓｉｇｍａ参照Ｐ２７１４）、０．１％のプロクリン、０．０９５％のＮａＮ３および０．１％の安息香酸ナトリウムを含有する０．１Ｍのコハク酸緩衝液、ｐＨ７．６。
【０２７１】
再度、ＣａｌｉｐｒｏＢＮＰ５のバイエピトープ標準物質は、組換えプロＢＮＰ（１−１０８）およびＢＮＰ（１−３２）よりも高い安定性を示す。
【０２７２】
【表１３−１】
0005458011.tif 000014
【表１３−２】
0005458011.tif 000015
【表１３−３】
0005458011.tif 000016
【図１】
0005458011.tif 000017
【図２】
0005458011.tif 000018
【図３】
0005458011.tif 000019
【図４】
0005458011.tif 000020
【図５】
0005458011.tif 000021
【図６】
0005458011.tif 000022
【図７】
0005458011.tif 000023
【図８】
0005458011.tif 000024
【図９】
0005458011.tif 000025
【図１０】
0005458011.tif 000026
【図１１】
0005458011.tif 000027
【図１２】
0005458011.tif 000028
【図１３】
0005458011.tif 000029
【図１４】
0005458011.tif 000030
【図１５】
0005458011.tif 000031
【図１６】
0005458011.tif 000032
【図１７】
0005458011.tif 000033
【配列表】
0005458011000001.app