(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のコヒーシン若しくはドッケリンドメイン、又は
１若しくは複数のコヒーシン及びドッケリンドメイン
に連結した抗原特異的結合ドメインを含むモジュールｒＡｂ担体であって、前記抗原特異的結合ドメインが樹状細胞の細胞表面マーカーに結合できる、モジュールｒＡｂ担体。
【請求項２】
抗原特異的結合ドメインが抗体の少なくとも一部分を含む、請求項１に記載のｒＡｂ担体。
【請求項３】
抗原特異的結合ドメインが、コヒーシン及び／又はドッケリンドメインに融合した抗体の少なくとも一部分を含む、請求項１に記載のｒＡｂ担体。
【請求項４】
コヒーシン及び／又はドッケリンドメインに結合した抗原を更に含み、モジュールｒＡｂ担体中の相補的コヒーシン及び／又はドッケリンドメインに結合することにより、前記抗原が前記ｒＡｂ担体との複合体を形成する、請求項１に記載のｒＡｂ担体。
【請求項５】
コヒーシン及び／又はドッケリンドメインに融合した抗原を更に含み、モジュールｒＡｂ担体中の相補的コヒーシン及び／又はドッケリンドメインに結合することにより、前記抗原が前記ｒＡｂ担体との複合体を形成する、請求項１に記載のｒＡｂ担体。
【請求項６】
抗原特異的結合ドメインが、全長抗体、抗体可変領域ドメイン、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆｖ断片、又はＦｃドメインの部分を伴うＦａｂ断片を含む、請求項１に記載のｒＡｂ担体。
【請求項７】
コヒーシン及び／又はドッケリンドメインが、クロストリジウム・サーモセラム、クロストリジウム・ジョスイ、クロストリジウム・セルロリティクム及びバクテロイデス・セルロソルベンス、並びにそれらの組合せから選択される、請求項１に記載のｒＡｂ担体。
【請求項８】
抗原特異的結合ドメインが、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＡＳＰＧＲ、ＣＬＥＣ−６、ＣＤ４０、ＢＤＣＡ−２、ＭＡＲＣＯ、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ランゲリン、ＤＥＣＴＩＮ−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体、ＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、及びＦｃγ受容体から選択される細胞表面マーカーに結合する、請求項１に記載のｒＡｂ担体。
【請求項９】
ｒＡｂ．（Ｃｏｈ）ｘ、ｒＡｂ．（Ｄｏｃ）ｘ、ｒＡｂ．（Ｃｏｈ．Ｄｏｃ）ｙ、又はｒＡｂ．（Ｃｏｈ）ｙ（Ｄｏｃ）ｙ（式中、ｘは２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であり、ｙは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である）とさらに特定される、請求項１に記載のｒＡｂ担体。
【請求項１０】
以下の複合体：
ｒＡｂ．（Ｃｏｈ）ｘ：（Ｄｏｃ．抗原）ｘ、
ｒＡｂ．（Ｄｏｃ）ｘ：（Ｃｏｈ．抗原）ｘ、
ｒＡｂ．（Ｃｏｈ．Ｄｏｃ）ｙ：（Ｄｏｃ．抗原１）（Ｃｏｈ．抗原２）、又は
ｒＡｂ．（Ｃｏｈ）ｙ（Ｄｏｃ）ｙ：（Ｄｏｃ．抗原１）ｙ（Ｃｏｈ．抗原２）ｙ
（式中、ｘは２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であり、ｙは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である）
の一部とさらに特定される、請求項１に記載のｒＡｂ担体。
【請求項１１】
複数のコヒーシン若しくはドッケリンドメイン、又は
１若しくは複数のコヒーシン及びドッケリンドメイン
に連結した抗原特異的結合ドメインを含むモジュールｒＡｂ担体及び抗原を含むワクチンであって、前記抗原特異的結合ドメインが樹状細胞の細胞表面マーカーに結合でき、前記抗原がコヒーシン又はドッケリンドメインと結合し、前記モジュールｒＡｂ担体中の相補的コヒーシン及び／又はドッケリンドメインに結合することにより前記ｒＡｂ担体との複合体を形成する、ワクチン。
【請求項１２】
抗原特異的結合ドメインが、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＡＳＰＧＲ、ＣＬＥＣ−６、ＣＤ４０、ＢＤＣＡ−２、ＭＡＲＣＯ、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ランゲリン、ＤＥＣＴＩＮ−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体、ＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、及びＦｃγ受容体から選択される免疫細胞表面タンパク質に対して特異的である、請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１３】
抗原が、細菌、ウイルス、真菌、原虫又は癌のタンパク質である、請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１４】
モジュールｒＡｂ担体が、
ｒＡｂ．（Ｃｏｈ）ｘ：（Ｄｏｃ．抗原）ｘ、
ｒＡｂ．（Ｄｏｃ）ｘ：（Ｃｏｈ．抗原）ｘ、
ｒＡｂ．（Ｃｏｈ．Ｄｏｃ）ｙ：（Ｄｏｃ．抗原１）（Ｃｏｈ．抗原２）、又は
ｒＡｂ．（Ｃｏｈ）ｙ（Ｄｏｃ）ｙ：（Ｄｏｃ．抗原１）ｙ（Ｃｏｈ．抗原２）ｙ
（式中、ｘは２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であり、ｙは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である）
とさらに特定される、請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１５】
複数のコヒーシン若しくはドッケリンドメイン、又は
１若しくは複数のコヒーシン及びドッケリンドメイン
に連結した抗原特異的結合ドメインに対するコードセグメントを含み、前記抗原特異的結合ドメインが樹状細胞の細胞表面マーカーに結合できる、単離された核酸。
【請求項１６】
抗原特異的結合ドメインに対するコードセグメントが、抗体の少なくとも一部分をコードする、請求項１５に記載の核酸。
【請求項１７】
核酸が、
複数のコヒーシンドメイン、
複数のドッケリンドメイン、或いは
コヒーシンドメイン及びドッケリンドメインの１又は複数による組合せ
をコードする、請求項１５に記載の核酸。
【請求項１８】
コードセグメントが、ｒＡｂ．（Ｃｏｈ）ｘ、ｒＡｂ．（Ｄｏｃ）ｘ、ｒＡｂ．（Ｃｏｈ．Ｄｏｃ）ｙ、又はｒＡｂ．（Ｃｏｈ）ｙ（Ｄｏｃ）ｙ（式中、ｘは２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であり、ｙは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である）に対するコードセグメントと更に特定される、請求項１５に記載の核酸。
【請求項１９】
複数のコヒーシン若しくはドッケリンドメイン、又は
１若しくは複数のコヒーシン及びドッケリンドメイン
に連結した抗原特異的結合ドメインと抗原をコードする核酸を含むベクターであって、前記抗原特異的結合ドメインが樹状細胞の細胞表面マーカーに結合でき、前記抗原が
複数のコヒーシン若しくはドッケリンドメイン、又は
１若しくは複数のコヒーシン及びドッケリンドメイン
を含む、ベクター。
【請求項２０】
抗原特異的結合ドメイン及び抗原が、同じプロモーターの制御下にあり、又は異なるプロモーターの制御下にあり、一連となって転写され、又は、逆方向に転写される、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２１】
複数のコヒーシン若しくはドッケリンドメイン、又は
１若しくは複数のコヒーシン及びドッケリンドメイン
に連結した抗原特異的結合ドメインをコードする核酸を含んだベクターを含む宿主細胞であって、前記抗原特異的結合ドメインが樹状細胞の細胞表面マーカーに結合できる、宿主細胞。
【請求項２２】
複数のコヒーシン若しくはドッケリンドメイン、又は
１若しくは複数のコヒーシン及びドッケリンドメイン
に連結した抗原特異的結合ドメインと、相補的コヒーシン及び／又はドッケリンドメインと結合した抗原とを組み合わせることを含み、前記抗原特異的結合ドメインが樹状細胞の細胞表面マーカーに結合できる、モジュールｒＡｂ担体複合体を作製する方法。
【請求項２３】
ｒＡｂ担体が、ｒＡｂ．（Ｃｏｈ）ｘ、ｒＡｂ．（Ｄｏｃ）ｘ、ｒＡｂ．（Ｃｏｈ．Ｄｏｃ）ｙ、又はｒＡｂ．（Ｃｏｈ）ｙ（Ｄｏｃ）ｙ（式中、ｘは２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であり、ｙは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である）と更に特定される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ｒＡｂ担体が、相補的コヒーシン及び／又はドッケリンドメインに結合した抗原と複合し、結果的に得られるｒＡｂ担体複合体が、
ｒＡｂ．（Ｃｏｈ）ｘ：（Ｄｏｃ．抗原）ｘ、
ｒＡｂ．（Ｄｏｃ）ｘ：（Ｃｏｈ．抗原）ｘ、
ｒＡｂ．（Ｃｏｈ．Ｄｏｃ）ｙ：（Ｄｏｃ．抗原１）（Ｃｏｈ．抗原２）、又は
ｒＡｂ．（Ｃｏｈ）ｙ（Ｄｏｃ）ｙ：（Ｄｏｃ．抗原１）ｙ（Ｃｏｈ．抗原２）ｙ
（式中、ｘは２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であり、ｙは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である）
から選択される、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全体的に新規なワクチンの分野に関し、より具体的には、ヒト化ターゲティングモノクローナル抗体と複合体を形成する複数の可変（multivariable）抗原の設計、製造及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の範囲を限定せずに、ワクチン開発に関してその背景を説明する。
【０００３】
モノクローナル抗体に関わるタンパク質工学技術は、ヒト化（即ち、例えばげっ歯類ｍＡｂ配列を、その元のｍＡｂの特定の抗原結合部位を保持しながら、ヒトｍＡｂ配列に翻訳すること）及び産生（通常、哺乳動物細胞系から分泌される）に関して非常に進歩している。ワクチン接種に関わるｒＡｂの新たな応用が、研究開発中であり、現在のところ、組換え（engineered）ｒＡｂ−抗原融合タンパク質に基づいている（通常、ｒＡｂ重鎖即ちＨ鎖のＣ末端コドンとインフレームに配置した抗原コード領域を用いて）。この技術に対する障害は、完全に機能するｒＡｂ−抗原の発現及び産生を成功させることである。多くの場合、おそらく大抵の場合、所望の抗原は、組換えｒＡｂ−抗原の分泌を交絡（confound）させる。所望の構成体が複数の抗原コード領域を含む場合、不良な発現又は発現皆無の確率も増加する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、成分同士の単なる混合により、制御した様式でｒＡｂ抗原複合体を構築する方法を提供し、個々のｒＡｂ及び特定の抗原に最も適した異なる発現−産生系において、ｒＡｂ及び抗原（複数可）を発現し、産生する能力を提供する。それに加え、本発明は、分泌される哺乳動物発現系に対する、高親和性及び高特異性のコヒーシン（cohesin）−ドッケリン（dockerin）相互作用の新たな応用を示し、したがってタンパク質工学の独自方式の開発、並びに研究及び臨床応用のための新たなタンパク質ツールの産生を可能にする。
【０００５】
より特定すれば、本発明は、コヒーシン−ドッケリンタンパク質のドメイン及びその周辺リンカーを使用する。例えば、本発明は、抗原、毒素又は細胞性活性化剤と複合体を形成する組換えモノクローナル抗体（ｒＡｂ）の制御された構築を可能にする。本発明は、ワクチン接種及び癌治療において広い潜在的用途を有する。また、他のタンパク質に対して特異的な親和性を有する新規なタンパク質の産生を可能にする、この技術の派生技術の保護も主張する。
【０００６】
本発明は、セルロソームと呼ばれる十分に研究されたセルロース分解性細菌タンパク質複合体の特定成分に基づいている。具体的には、２種のタンパク質ドメイン（コヒーシン及びドッケリン）並びに天然のタンパク質リンカー配列が、本発明を介して新たな状況及び応用において利用される。
【０００７】
本発明は、特定のコヒーシン及びドッケリンドメインが、特異的で高親和性のコヒーシン−ドッケリンタンパク質間相互作用を維持しながら、融合タンパク質として哺乳動物細胞から首尾よく、効率的に分泌できるという発見に基づいている。コヒーシン及びドッケリンに関する広範な文献から、このような融合タンパク質がこの機能性を有するはずであるとの予想は教示されるが、このような融合タンパク質の哺乳動物分泌系における産生については記載がない。科学的知識の現状からすれば、首尾よい分泌の法則（シグナルペプチドなどの特徴以外に）が十分には確立されていないので、この発見の予測は不可能である。更に、コヒーシンリンカー領域は、天然細菌ではグリコシル化されていることが知られており、コヒーシン及びドッケリンドメインは、予測されるグリコシル化部位を含有している。このことは、哺乳動物細胞からの分泌を実際に促進し得るが、「非天然」のグリコシル化が、コヒーシン−ドッケリン相互作用を混乱させるか否かは不明確である。
【０００８】
様々な商業用途を対象としたコヒーシン−ドッケリン相互作用が公表されてきたが、本発明は、特異的なタンパク質複合体の構築を中心として構成されたこの相互作用について、従来未実現であった可能性に基づいており、構築が制御された酵素の利用とは関係がない。
【０００９】
本発明は、多様なセルロース分解微生物由来のすべてのコヒーシン−ドッケリン配列の使用を包含するが、微生物クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）由来の特異的なコヒーシン及びドッケリン並びにリンカー配列の応用について説明する。例えば、本明細書に記載の配列は、クロストリジウム・サーモセラムのドッケリン配列にＣ末端コドンで連結したヒトＩｇＧ４のＨ鎖をコードする（ｒＡｂ．ｄｏｃと呼ぶ）。ｒＡｂ．ｄｏｃタンパク質の他の実施形態も、ＤＮＡ断片としてのドッケリンコード領域を異なるＨ鎖構成体をコードするベクターへ移入するだけで作製される例を用いて、同様に説明される。
【００１０】
より特定すれば、本発明は、１又は複数の抗原担体ドメインに連結した抗原特異的結合ドメイン、及びコヒーシン−ドッケリン結合対の半分を含むモジュールｒＡｂ担体を包含する。抗原特異的結合ドメインは、抗体の少なくとも一部分になり得るものであり、その抗体は、融合タンパク質中にコヒーシン−ドッケリン結合対の半分を有する結合対との融合タンパク質である。該ｒＡｂは、モジュールｒＡｂ担体と複合体を形成する抗原に結合した、コヒーシン−ドッケリン結合対の相補的半分も含む。コヒーシン−ドッケリン結合対の相補的半分は、それ自体が、複合体の一部として担持される抗原との融合タンパク質でもよい（モジュールｒＡｂ担体（コヒーシン／ドッケリン）抗原複合体）。抗原特異ドメインの例には、全長抗体、抗体可変領域ドメイン、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片及びＦｖ断片、並びにＦａｂｃ断片及び／又はＦｃドメインの部分を伴うＦａｂ断片が挙げられる。コヒーシン−ドッケリン結合対の供給源の非限定例には、クロストリジウム・サーモセラム、クロストリジウム・ジョスイ（Clostridium josui）、クロストリジウム・セルロリティクム（Clostridium cellulolyticum）及びバクテロイデス・セルロソルベンス（Bacteroides cellulosolvens）、並びにそれらの組合せが挙げられる。
【００１１】
抗原特異的結合ドメインによるターゲティングの非限定例には、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＡＳＰＧＲ、ＣＬＥＣ−６、ＣＤ４０、ＢＤＣＡ−２、ＭＡＲＣＯ、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ランゲリン、ＤＥＣＴＩＮ−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｆｃγ受容体、又は抗原提示細胞が比較的特異的に発現する他の受容体から選択される、細胞表面マーカーが挙げられる。
【００１２】
本発明のｒＡｂは、ｒＡｂ．Ｄｏｃ、ｒＡｂ．Ｃｏｈ、ｒＡｂ．（Ｃｏｈ）ｘ、ｒＡｂ．（Ｄｏｃ）ｘ、ｒＡｂ．（Ｃｏｈ．Ｄｏｃ）ｘ、又はｒＡｂ．（Ｃｏｈ）ｘ（Ｄｏｃ）ｘ（式中、ｘは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより大）と特定されるドメインの組合せも包含し得る。複合体におけるモジュールｒＡｂ担体の例には、
ｒＡｂ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．抗原、
ｒＡｂ．Ｃｏｈ：Ｄｏｃ．抗原、
ｒＡｂ．（Ｃｏｈ）ｘ：（Ｄｏｃ．抗原）ｘ、
ｒＡｂ．（Ｄｏｃ）ｘ：（Ｃｏｈ．抗原）ｘ、
ｒＡｂ．（Ｃｏｈ．Ｄｏｃ）ｘ：（Ｄｏｃ．抗原１）（Ｃｏｈ．抗原２）、又は
ｒＡｂ．（Ｃｏｈ）ｘ（Ｄｏｃ）ｘ：（Ｄｏｃ．抗原１）ｘ（Ｃｏｈ．抗原２）ｘ
（式中、ｘは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０）
が挙げられる。
【００１３】
本発明は、コヒーシン−ドッケリン結合対の、抗原に結合した相補的半分に結合している、コヒーシン−ドッケリン結合対の半分を含んだ１又は複数のドメインに連結した抗原特異ドメインを含む、モジュールｒＡｂ担体のワクチンも包含する。ｒＡｂ抗体をターゲティングするための非限定例には、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＡＳＰＧＲ、ＣＬＥＣ−６、ＣＤ４０、ＢＤＣＡ−２、ＭＡＲＣＯ、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ランゲリン、ＤＥＣＴＩＮ−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｆｃγ受容体、又は抗原提示細胞がかなり特異的に発現する他の受容体から選択される、免疫細胞表面タンパク質が挙げられる。ｒＡｂ抗原担体によるワクチン接種の標的には、例えば、細菌、ウイルス、真菌、原虫又は癌のタンパク質、及びその断片が挙げられる。請求項１１に記載のワクチンでは、モジュールｒＡｂ担体が、ｒＡｂ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．抗原、ｒＡｂ．Ｃｏｈ：Ｄｏｃ．抗原、ｒＡｂ．（Ｃｏｈ）ｘ：（Ｄｏｃ．抗原）ｘ、ｒＡｂ．（Ｄｏｃ）ｘ：（Ｃｏｈ．抗原）ｘ、ｒＡｂ．（Ｃｏｈ．Ｄｏｃ）ｘ：（Ｄｏｃ．抗原１）（Ｃｏｈ．抗原２）、又はｒＡｂ．（Ｃｏｈ）ｘ（Ｄｏｃ）ｘ：（Ｄｏｃ．抗原１）ｘ（Ｃｏｈ．抗原２）ｘ（式中、ｘは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０）と更に特定される。
【００１４】
本発明は、標的特異ドメイン並びに１又は複数のドメイン及びコヒーシン−ドッケリン結合対の半分に対するコードセグメントを含む単離核酸も包含する。例えば、標的は抗原の場合もあり、標的特異ドメインは、抗体の少なくとも一部分をコードし得る。１又は複数の該ドメインは、１又は複数のコヒーシンドメイン、１又は複数のドッケリンドメイン、或いはコヒーシン及びドッケリンの１又は複数のドメインの組合せをコードすることができる。そのｒＡｂは、ｒＡｂ．Ｄｏｃ、ｒＡｂ．Ｃｏｈ、ｒＡｂ．（Ｃｏｈ）ｘ、ｒＡｂ．（Ｄｏｃ）ｘ、ｒＡｂ．（Ｃｏｈ．Ｄｏｃ）ｘ、又はｒＡｂ．（Ｃｏｈ）ｘ（Ｄｏｃ）ｘ（式中、ｘは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０）と更に規定される。
【００１５】
本発明は、抗原特異ドメインと、コヒーシン−ドッケリン結合対の半分、タンパク質分子を担持するコヒーシン−ドッケリン結合対の半分、及びそれらの組合せを含む１又は複数のドメインとをコードする核酸を含むベクターも包含する。コヒーシン−ドッケリン結合対の半分、タンパク質分子を担持するコヒーシン−ドッケリン結合対の半分、及びそれらの組合せは、同じプロモーター、異なるプロモーターの制御下にあり、一連となって転写され、逆方向に転写される。
【００１６】
本発明は、抗原特異ドメインと、１又は複数のドメイン及びコヒーシン−ドッケリン結合対の半分とをコードする核酸を含んだベクターを含む、宿主細胞も包含する。
【００１７】
コヒーシン−ドッケリン結合対の半分の１又は複数のドメインに連結する抗原特異ドメインを組み合わせることによる、モジュールｒＡｂ担体を作製する方法。前記ｒＡｂは、ｒＡｂ．Ｄｏｃ、ｒＡｂ．Ｃｏｈ、ｒＡｂ．（Ｃｏｈ）ｘ、ｒＡｂ．（Ｄｏｃ）ｘ、ｒＡｂ．（Ｃｏｈ．Ｄｏｃ）ｘ、又はｒＡｂ．（Ｃｏｈ）ｘ（Ｄｏｃ）ｘ（式中、ｘは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０）と更に特定される。前記ｒＡｂの例は、抗原に結合したコヒーシン：ドッケリン対の相補的半分と複合し、ｒＡｂ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．抗原、ｒＡｂ．Ｃｏｈ：Ｄｏｃ．抗原、ｒＡｂ．（Ｃｏｈ）ｘ：（Ｄｏｃ．抗原）ｘ、ｒＡｂ．（Ｄｏｃ）ｘ：（Ｃｏｈ．抗原）ｘ、ｒＡｂ．（Ｃｏｈ．Ｄｏｃ）ｘ：（Ｄｏｃ．抗原１）（Ｃｏｈ．抗原２）、又はｒＡｂ．（Ｃｏｈ）ｘ（Ｄｏｃ）ｘ：（Ｄｏｃ．抗原１）ｘ（Ｃｏｈ．抗原２）ｘ（式中、ｘは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０）から選択される。
【００１８】
本発明は、ｒＡｂが細胞標的に特異的であるｒＡｂ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．毒素の自己組織化（self-assembly）コンジュゲートを含む免疫毒素の場合もある。毒素の例には、放射性同位体、金属、酵素、ボツリヌス、破傷風、リシン、コレラ、ジフテリア、アフラトキシン、パーフリンゲンス毒素、マイコトキシン、シガトキシン、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ、Ｔ２、セグイトキシン、サキシトキシン、アブリン、シアノギノシン、アルファトキシン、テトロドトキシン、アコノトキシン、蛇毒及びクモ毒が挙げられる。免疫毒素の細胞標的には、疾患又は感染細胞が含まれる。ターゲティングをする疾患細胞の例には、例えば、白血病、リンパ腫などの血液癌、星状細胞種やグリア芽腫などの神経腫瘍、メラノーマ、乳癌、肺癌、頭頚部癌、胃癌や結腸癌などの消化器腫瘍、肝癌、膵臓癌、子宮頚部癌、子宮癌、卵巣癌、膣癌、睾丸癌、前立腺癌若しくは陰茎癌などの泌尿生殖器腫瘍、骨腫瘍、血管腫瘍、又は口唇、鼻咽頭、咽頭及び口腔、食道、直腸、胆嚢、胆道系、喉頭、肺及び気管支、膀胱、腎臓、脳及び他の神経系部分、甲状腺の癌、ホジキン病、非ホジキン病リンパ腫、多発性骨髄腫及び白血病が挙げられる。免疫毒素は、病原体、例えば細菌、原虫、蠕虫、ウイルス感染細胞又は真菌を直接、標的とし得る。
【００１９】
本発明は、基材に結合した相補的なコヒーシン又はドッケリンにコンジュゲートしているｒＡｂとコヒーシン又はドッケリン融合タンパク質とを相互作用させることにより、該融合タンパク質を分離する、タンパク質を精製する方法も包含する。本発明は、活性なコヒーシン・毒素融合タンパク質の容易な精製を促進する有益な生化学的性質を付与するために、毒素の融合相手としてコヒーシンを使用することもなし得る。本発明は、治療用途でＤＣを除去する場合にＤＣを標的として抗ＤＣ  ｒＡｂ．Ｄｏｃを使用することもなし得る。本発明は、樹状細胞の生存促進に十分な量で与えられる抗ＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｌ抗体であって、免疫のために樹状細胞を成熟させ、活性化する抗体も包含する。該抗体は、ワクチンのアジュバントとして、インビボでの細胞、例えば樹状細胞を標的としてもよい。
【００２０】
２価及び多価（ｒＡｂ１．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．ｒＡｂ２）の自己組織化コンジュゲートも、治療剤、診断剤及び工業用作用剤として発明した。或いは、本発明は、治療剤、細胞増殖剤又は成熟化剤としての２価及び多価（ｒＡｂ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．サイトカイン）、（ｒＡｂ．Ｃｏｈ：Ｄｏｃ．サイトカイン）又は（サイトカイン１．Ｃｏｈ：サイトカイン２．Ｄｏｃ）の自己組織化コンジュゲートである。モジュールｒＡｂ担体は、標的細胞に特異的に結合し、サイトカインを標的細胞に作用するように送達できる、多価ｒＡｂ及び／又はｒＡｂ．サイトカイン及び／又はサイトカイン．サイトカインの１又は複数の組合せをスクリーニングすることを含む方法によって、作製し得る。本発明で使用するサイトカインには、インターロイキン、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、結合組織活性化ペプチド（ＣＴＡＰ）、造骨因子、並びにこのような成長因子の生物活性な類縁体、断片及び誘導体、Ｂ／Ｔ細胞分化因子、Ｂ／Ｔ細胞増殖因子、マイトジェンサイトカイン、走化性サイトカイン、コロニー刺激因子、血管形成因子、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８等、レプチン、ミオスタチン、マクロファージ刺激タンパク質、血小板由来成長因子、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＮＧＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ／４−１ＢＢＬ、ヒトリンホトキシンβ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ１−β、ＩＰ−１０、ＰＦ４、ＧＲＯ、９Ｅ３、エリスロポエチン、エンドスタチン、アンジオスタチン、ＶＥＧＦ、β形質転換成長因子（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３）、骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９）、ヘパリン結合成長因子（線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ））、インヒビン（例えば、インヒビンＡ、インヒビンＢ）、増殖分化因子（例えば、ＧＤＦ−１）、及びアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ）を含めた形質転換成長因子（ＴＧＦ）スーパー遺伝子ファミリーが挙げられる。
【００２１】
本発明の特徴及び利点をより完全に理解するために、以下に、添付した図と共に、本発明の詳細な説明に言及する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】従来技術（上部）と、操作・作製した同じヒト化ｍＡｂと同時に複合体中で標的指向化した多重抗原（ＭＡＴＣＨＭＡＢ）の例（下部）とを比較する図である。
【図２】二重特異性ｍＡｂを形成するために、本発明の使用を示す図である。
【図３】還元的ＳＤＳ．ＰＡＧＥ及びクーマシーブリリアントブルー染色で分析した、プロテインＧアフィニティ精製後の分泌ｒＡｂタンパク質を示す図である。レーンは左から右へ進む。
【図４】各種ｒＡｂ．融合タンパク質の分泌量に関する抗ヒトＩｇＦｃ  ＥＬＩＳＡによる測定を示す図である（図４Ａ及び４Ｂ）。
【図５】分泌タンパク質の抗ＬＯＸ１＿１５Ｃ４  ｒＡｂ（青色記号）及び抗ＬＯＸ１＿１５Ｃ４．ｄｏｃ  ｒＡｂ（赤色記号）に関する、抗ヒトＩｇＦｃ  ＥＬＩＳＡ（ＨＲＰ活性）及びＬＯＸ−１．アルカリホスファターゼ結合（ＡＰ活性）による測定を示す図である。
【図６】ｍＩｇＧκ発現プラスミドと共に同時トランスフェクションした際、ｒＡＢ−ｐＣＭＶ（ｍＩｇＧ２ｂＨ−ドッケリン）プラスミドがｒＡＢ−ｍＩｇＧ２ｂ．ドッケリン融合タンパク質の効率的な分泌を指示することを示す図である。
【図７】分泌ｃｏｈ．アルカリホスファターゼ（ｃｏｈ．ＡＰ）は、プラスチック上に固定化したｒＡｂ．Ｄｏｃに効率的で特異的に結合するが、ＡＰはそのように結合しないことを示す図である（図７Ａ及び７Ｂ）。
【図８】固定化したｍＩｇＧ２ａ及びｍＩｇＧ２ｂに結合するが、ｒＡｂ．ｄｏｃには結合しない分泌Ｇ．ＡＰを含有する上清の各種希釈液を示す一方、ｃｏｈ．ＡＰは特異的にｒＡｂ．ｄｏｃに結合したことを示す図である（図８Ａ及び８Ｂ）。
【図９】ｐｒｏＧ．ＡＰ又はｃｏｈ．ＡＰ又はｃｏｈ２．ＡＰの所定量（０．１μｇ）と、固定化したｍＩｇＧ２ｂ又はｒＡｂ．ｄｏｃ（０．２５μｇ）との間で、マイクロタイタープレート中、１時間インキュベーションすることにより会合した複合体の差次的安定性を示す図である。
【図１０】ｐｒｏＧ．ＡＰ又はｃｏｈ．ＡＰの所定量（０．１μｇ）と、固定化したｍＩｇＧ２ｂ又はｒＡｂ．ｄｏｃ（０．２５μｇ）との間で、マイクロタイタープレート中、１時間インキュベーションすることにより会合した複合体の、ヒト血清中における差次的安定性を示す図である。
【図１１】ｒＡｂ．ｄｏｃ上清及びｃｏｈ．ＡＰ上清を同じプロテインＧアフィニティカラムへ逐次適用することにより生成した、ｒＡｂ．ｄｏｃ：Ｃｏｈ２．ＡＰ複合体の還元的対非還元的なＳＤＳ．ＰＡＧＥ分析を示したゲルを示す図である。
【図１２】ｒＡｂ．ｄｏｃ上清及びｃｏｈ．Ｆｌｕ  ＨＡ５−１上清を同じプロテインＧアフィニティカラムへ逐次適用することにより生成した、ｒＡｂ．ｄｏｃ：Ｃｏｈ．Ｆｌｕ  ＨＡ５−１複合体の非還元的なＳＤＳ．ＰＡＧＥ分析を示す図である。
【図１３】個々の精製成分の混合により形成された抗ＤＣ＿ｒＡｂ．ｄｏｃ：ｃｏｈ．Ｆｌｕ  Ｍ１複合体は、Ｆｌｕ  Ｍ１特異的Ｔ細胞の増殖にインビトロで有効であったことを示す図である。
【図１４】個々の精製成分の混合により形成された複合体のうち、抗ＤＣ＿ｒＡｂ．ｄｏｃ：ｃｏｈ．Ｆｌｕ  Ｍ１は、Ｆｌｕ  Ｍ１特異的Ｔ細胞の増殖にインビトロで有効であったが、ｍＩｇＧ２ｂ．ｄｏｃ：ｃｏｈ．Ｆｌｕ  Ｍ１は有効でなかったことを示す図である。
【図１５】ＣＤ３４＋ヒトＤＣをＣＤ１ａ＋及びＣＤ１４＋の各サブタイプに選別し、３ｎＭの抗ＤＣ＿ｒＡｂ．Ｆｌｕ  Ｍ１  ＰＥＰ又は抗ＤＣ＿ｒＡｂと共に及びそれなしで培養したことを示す図である。
【図１６】ｃｏｈ．ｐｅｐタンパク質の合成を指示する発現プラスミドを保持した大腸菌を増殖させ、特異タンパク質の産生を誘発させたことを示す図である。細胞を採集し、超音波で破壊した。
【図１７】ＤＣＩＲ．Ｄｏｃ  ｒＡｂだけではＤＣの生存に効果がなかったが、ＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｌ．Ｄｏｃ  ｒＡｂはその生存を促進することを示す図である。
【図１８】Ｃｏｈ．ＰＥ３８だけでは、７−ＡＡＤスコアによるアポトーシス細胞数を僅かに増加させるが（２２．１〜２９．８％から）、ＤＣＩＲ又はＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｌ．Ｄｏｃ  ｒＡｂに連結すると、Ｃｏｈ．ＰＥ３８は７−ＡＡＤスコアによるアポトーシス細胞数を著しく増加させたことを示す図である。
【図１９】抗ＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｌ性及び抗ＤＣ−ＡＳＰＧＲ性のｒＡｂ．Ｃｏｈ及びｒＡｂ．Ｄｏｃの発現が、効率的に分泌されたことを示す図である。
【図２０】ヒトＢ細胞の増殖に対するＩＬ−２１及びＣｏｈ．ＩＬ−２１の効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の多様な実施形態の作出及び使用を以下に詳細に考察するが、本発明が、多種多様な特定の状況で具体化できる多くの適用可能な発明概念を提供することは理解されたい。本明細書で考察する特定の実施形態は、本発明を作出し、使用する特定の方法を単に例示するだけであって、本発明の範囲を制限するものではない。
【００２４】
本発明の理解を深めるために、各種の用語を以下に定義する。本明細書に定義する用語は、本発明関連の分野の当業者が通常理解している意味を有する。単数で記載されている用語は、単一体だけを指すことを意図しているのではなく、例示のために具体例で使用し得る部類一般を包含する。本発明における専門用語は、本発明の特定の実施形態を説明するために使用するが、その用法は、特許請求の範囲で概説される場合を除き、本発明を制限するものではない。
【００２５】
現在では、タンパク質工学技術によって、組換えｍＡｂ（Ｈ又はＬ、普通ＨのＣ末端を使用することが多い）へ１つの抗原（又は、連鎖の１本へ異なる抗原）を容易に、制御して付加することが可能である。異なる抗原又は異なる抗原セットをｍＡｂに連結する必要がある場合は、ｍＡｂを再組換えして発現させ、異なる構成体として精製する必要がある。
【００２６】
本発明は、複数の抗原又はタンパク質（一次ｍＡｂとは独立に組換え、発現、精製したもの）を、制御された、複数の可変形式で、単一の一次組換えｍＡｂに、複合化することを提供する。現在、部位特異的なビオチニル化部位を組換え、単一の一次ｍＡｂに異なるタンパク質を付加する（各々が別々にストレプトアビジンに連結されるように組み換える）方法が存在する。しかし、本発明は、別々の組換えによるタンパク質の複数の組合せを、所定の等モル比及び箇所において一次ｍＡｂに付加することを提供する。
【００２７】
本明細書で使用する場合、用語「モジュールｒＡｂ担体」とは、単一の組換えモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に対して、多様な抗原、活性化タンパク質又は他の抗体の制御されたモジュール式付加を行うように組み換えられた、組換え抗体系を記述するために使用される。該ｒＡｂは、標準的なハイブリドーマ技法、組換え抗体ディスプレーを用いて作製したモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体などでよい。モジュールｒＡｂ担体は、例えば、多重抗原、及び／又は抗原と活性化サイトカインが、（細胞内取込性受容体、例えばヒト樹状細胞受容体に対する１つの一次組換え抗体を介して）樹状細胞（ＤＣ）を標的とするように使用することができる。モジュールｒＡｂ担体は、制御及び特定された方法で、異なる２種の組換えｍＡｂを末端間で結合するためにも使用し得る。
【００２８】
「モジュールｒＡｂ担体」の抗原結合部分は、１又は複数の可変ドメイン、１又は複数の可変ドメインと第１定常ドメイン、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片及びＦｖ断片、並びにＦａｂｃ断片及び／又はＦｃドメインの部分を伴うＦａｂ断片でもよく、Ｆｃドメインの前記部分に対しては、同族性のモジュール結合部分が、アミノ酸配列に付加しており、及び／又は結合している。モジュールｒＡｂ担体に使用する抗体は、任意のイソ型若しくはクラス、サブクラスでもよく、又は任意の供給源でもよい（動物及び／又は組換え）。
【００２９】
非限定的な一例では、モジュールｒＡｂ担体は、操作組換えｍＡｂに関し、特異的で規定されたタンパク質複合体を作製するために、１又は複数のモジュールコヒーシン−ドッケリンタンパク質ドメインを有するように操作されている。該ｍＡｂは、該ｍＡｂの抗原結合ドメイン由来のカルボキシと共に、１又は複数のモジュールコヒーシン−ドッケリンタンパク質ドメインを含む融合タンパク質の一部分である。コヒーシン−ドッケリンタンパク質ドメインは、翻訳後に、例えば、化学的な架橋剤及び／又はジスルフィド結合の使用によって結合してもよい。
【００３０】
モジュールｒＡｂ担体は、異なる分子、例えばペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、核酸（塩基若しくは主鎖の修飾の有無に関係なく、オリゴヌクレオチド、アプタマー、ベクター）又はそれらの組合せを、コヒーシン−ドッケリン対の相補的半分にその異なる分子を結合することにより担持するのに使用される。例えば、ドッケリン、コヒーシンのどちらか一方は、抗原、ペプチド、タンパク質、毒素、サイトカイン、酵素、構造タンパク質、細胞外マトリックスタンパク質、別の抗体、細胞、又はその断片との融合タンパク質にされるか、又化学的に結合される。モジュールｒＡｂ担体は、１又は複数のコヒーシンドメイン若しくはドッケリンドメイン、又はコヒーシン及びドッケリンの両ドメインを有する場合があり、これにより、１又は複数の相補的コヒーシン／ドッケリン分子との複合体形成が可能になり、モジュールｒＡｂ担体の抗原認識ドメインを介した送達ができる。
【００３１】
本明細書で使用する場合の用語「抗原」とは、抗原のレシピエントにおいて体液性及び／又は細胞性の免疫応答を開始できる分子を指す。抗原は、本発明を用いた異なる２つの状況で、即ち、抗体又はｒＡｂの他の抗原認識ドメインに対する標的として、或いはモジュールｒＡｂ担体に対するドッケリン／コヒーシン−分子相補体の一部として、ｒＡｂにより細胞又は標的へ及び／又はその中へ運搬される当該分子として、使用し得る。抗原は、普通、ワクチン接種が有利な治療になると思われる疾患を起こす作用剤である。抗原がＭＨＣ上に提示されるとき、そのペプチドは約８〜約２５アミノ酸であることが多い。抗原には、例えば、単純な中間代謝物、糖類、脂質及びホルモン、並びに複合炭水化物、リン脂質、核酸、タンパク質などの高分子を含めた、任意種の生体分子が含まれる。抗原の一般的種類には、それだけに限らないが、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原虫及び他の寄生虫抗原、腫瘍抗原、自己免疫疾患、アレルギー及び移植片拒絶に関わる抗原、並びに他の種々の抗原が挙げられる。
【００３２】
モジュールｒＡｂ担体は、任意数の活性剤、例えば、抗生物質、感染症治療剤、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、解熱剤、鎮痛剤、抗炎症剤、骨粗鬆症用治療剤、酵素、サイトカイン、抗凝固剤、多糖類、コラーゲン、細胞、及び前記活性剤の２種以上の組合せを運搬することができる。本発明を用いて送達する抗生物質の例には、限定はしないが、テトラサイクリン、アミノ糖、ペニシリン、セファロスポリン、スルホンアミド薬、コハク酸クロラムフェニコールナトリウム、エリスロマイシン、バンコマイシン、リンコマイシン、クリンダマイシン、ナイスタチン、アンホテリシンＢ、アマンチジン、イドクスウリジン、ｐ−アミノサリチル酸、イソニアジド、リファンピン、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、ダウノマイシン、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、プロカルバジン、イミダゾールカルボキサミドなどが挙げられる。
【００３３】
本発明を用いて送達する抗腫瘍剤の例には、限定はしないが、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、メソトレキセートなどが挙げられる。解熱剤及び鎮痛剤の例には、アスピリン、Motrin（登録商標）、Ibuprofen（登録商標）、ナプロシン、アセトアミノフェンなどが挙げられる。
【００３４】
本発明を用いて送達する抗炎症剤の例には、限定はしないが、ＮＳＡＩＤ、アスピリン、ステロイド、デキサメタゾン、ヒドロコーチゾン、プレドニゾロン、ジクロフェナックＮａなどが挙げられる。
【００３５】
本発明を用いて送達する、骨粗鬆症治療の治療剤並びに骨及び骨格に作用する他の因子の例には、限定はしないが、カルシウム、アレンドロネート、骨ＧＬａペプチド、甲状腺ホルモン及びその活性断片、ヒストンＨ４関連骨形成増殖ペプチド、並びにそれらの変異体、誘導体及び類縁体が挙げられる。
【００３６】
本発明を用いて送達する酵素及び酵素補因子の例には、限定はしないが、パンクレアーゼ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ヒアルロニダーゼ、キモトリプシン、トリプシン、ｔＰＡ、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、パンクレアチン、コラゲナーゼ、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、プラスミノーゲン、ストレプトキナーゼ、アデニルシクラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）などが挙げられる。
【００３７】
本発明を用いて送達するサイトカインの例には、限定はしないが、インターロイキン、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、結合組織活性化ペプチド（ＣＴＡＰ）、造骨因子、並びに前記成長因子の生物活性な類縁体、断片及び誘導体が挙げられる。サイトカインは、Ｂ／Ｔ細胞分化因子、Ｂ／Ｔ細胞増殖因子、マイトジェンサイトカイン、走化性サイトカイン、コロニー刺激因子、血管形成因子、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８等、レプチン、ミオスタチン、マクロファージ刺激タンパク質、血小板由来成長因子、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＮＧＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ／４−１ＢＢＬ、ヒトリンホトキシンβ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ１−β、ＩＰ−１０、ＰＦ４、ＧＲＯ、９Ｅ３、エリスロポエチン、エンドスタチン、アンジオスタチン、ＶＥＧＦ、又はそれらの任意の断片若しくは組合せでもよい。他のサイトカインには、β形質転換成長因子（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３）、骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９）、ヘパリン結合成長因子（例えば、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ））、インヒビン（例えば、インヒビンＡ、インヒビンＢ）、増殖分化因子（例えば、ＧＤＦ−１）、及びアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ）を含めた、形質転換成長因子（ＴＧＦ）スーパー遺伝子ファミリーの構成員が挙げられる。
【００３８】
本発明を用いて送達する成長因子の例には、限定はしないが、哺乳動物細胞などの自然源若しくは天然源から単離できる成長因子、又は組換えＤＮＡ技法若しくは各種化学法などにより合成で調製できる成長因子が挙げられる。それに加え、こうした因子の類縁体、断片又は誘導体も、その自然分子の生物活性の少なくとも一部を示す限り、使用することができる。例えば、部位特異的変異誘発又は他の遺伝子工学技法で改変した遺伝子の発現により、類縁体を調製することができる。
【００３９】
本発明を用いて送達する抗凝固剤の例には、限定はしないが、ワルファリン、ヘパリン、ヒルジンなどが挙げられる。本発明を用いて送達する、免疫系に作用する因子の例には、限定はしないが、化学走性ペプチド、ブラジキニンなど、炎症及び悪性新生物を抑制する因子、並びに感染性微生物を攻撃する因子が挙げられる。
【００４０】
ウイルス抗原及び／又はウイルス抗原性標的の例には、それだけに限らないが、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子の遺伝子産物、Ｎｅｆタンパク質、逆転写酵素、並びに他のＨＩＶ成分などのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来レトロウイルス抗原などのレトロウイルス抗原；Ｂ型肝炎ウイルスのＳ、Ｍ及びＬプロテイン、Ｂ型肝炎ウイルスのプレＳ抗原、並びにＣ型肝炎ウイルスＲＮＡなどの他の肝炎、例えばＡ型、Ｂ型及びＣ型肝炎のウイルス成分などの肝炎ウイルス抗原；ヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ並びに他のインフルエンザウイルス成分などのインフルエンザウイルス抗原；麻疹ウイルス融合タンパク質及び他の麻疹ウイルス成分などの麻疹ウイルス抗原；プロテインＥ１及びＥ２並びに他の風疹ウイルス成分などの風疹ウイルス抗原；ＶＰ７ｓｃ及び他のロタウイルス成分などのロタウイルス抗原；エンベロープ糖タンパク質Ｂ及び他のサイトメガロウイルス抗原成分などのサイトメガロウイルス抗原；ＲＳＶ融合タンパク質、Ｍ２プロテイン、及び他の呼吸器合胞体ウイルス抗原成分などの呼吸器合胞体ウイルス抗原；前初期タンパク質、糖タンパク質Ｄ、及び他の単純疱疹ウイルス抗原成分などの単純疱疹ウイルス抗原；ｇｐＩ、ｇｐII及び他の水疱瘡ウイルス抗原成分などの水疱瘡ウイルス抗原；プロテインＥ、Ｍ−Ｅ、Ｍ−Ｅ−ＮＳ１、ＮＳ１、ＮＳ１−ＮＳ２Ａ、８０％Ｅ及び他の日本脳炎ウイルス抗原成分などの日本脳炎ウイルス抗原；狂犬病糖タンパク質、狂犬病核タンパク質及び他の狂犬病ウイルス抗原成分などの狂犬病ウイルス抗原が挙げられる。ウイルス抗原の追加例については、Fundamental Virology, Second Edition, eds. Fields, B. N. and Knipe, D. M. (Raven Press, New York, 1991) を参照されたい。
【００４１】
本発明のｒＡｂ−ＤＣ／ＤＣ−抗原ワクチンを用いて送達し得る抗原及び／又は抗原性標的には、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原又は寄生虫抗原などの抗原をコードする遺伝子が含まれる。ウイルスには、ピコルナウイルス、コロナウイルス、トガウイルス、フラビルウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、オルトミクソウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス、及び海綿状ウイルスが挙げられる。他のウイルス標的には、インフルエンザ、１型及び２型単純疱疹ウイルス、麻疹、デング熱、天然痘、ポリオ又はＨＩＶが挙げられる。病原体には、トリパノゾーマ、サナダムシ、回虫、蠕虫、マラリアが挙げられる。胎児抗原や前立腺特異抗原などの腫瘍マーカーは、このようにして標的とし得る。他の例には、ＨＩＶのｅｎｖタンパク質及びＢ型肝炎表面抗原が含まれる。ワクチン接種用に本発明によるベクターを投与するには、強い免疫応答が望ましいと思われる移入遺伝子の長期発現を可能とするに十分に、ベクター関連抗原が非免疫原性である必要があろう。いくつかの事例では、個人へのワクチン接種は、毎年又は２年毎など、まれにしか必要とされずに、感染体から長期の免疫防御を与え得る。本発明と共にベクター中に使用し、最終的には抗原として使用する微生物、アレルゲン、並びに核酸及びアミノ酸の配列の具体例は、米国特許第６５４１０１１号明細書に見出し得るが、その関連部分、特に、本発明と共に使用し得る微生物及び特定の配列に適合する各表が、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４２】
本明細書で開示するｒＡｂワクチンと共に使用する細菌抗原には、それだけに限らないが、例えば、百日咳毒素、線維状ヘマグルチニン、パータクチン、ＦＩＭ２、ＦＩＭ３、アデニル酸シクラーゼ、及び他の百日咳菌抗原成分などの細菌抗原；ジフテリア毒素又はトキソイド、及び他のジフテリア菌抗原成分などのジフテリア菌抗原；破傷風毒素又はトキソイド、及び他の破傷風菌抗原成分などの破傷風菌抗原；Ｍプロテイン及び他の連鎖球菌抗原成分などの連鎖球菌抗原；リポ多糖類及び他のグラム陰性細菌抗原成分などのグラム陰性バチルス菌抗原；ミコール酸、熱ショックタンパク質６５（ＨＳＰ６５）、３０ｋＤａ主要分泌タンパク質、抗原８５Ａ、及び他のマイコバクテリア抗原成分などの結核菌（Mycobacterium tuberculosis）抗原；ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）菌抗原成分；ニューモリシン、肺炎球菌莢膜多糖類、及び他の肺炎球菌抗原成分などの肺炎球菌抗原；莢膜多糖類、及び他のインフルエンザ菌（haemophilus influenza）抗原成分などのインフルエンザ菌抗原；炭疽菌防御抗原、及び他の炭疽菌抗原成分などの炭疽菌抗原；ロンプＡ及び他のリケッチア細菌抗原成分などのリケッチア細菌抗原が挙げられる。他の任意の細菌、マイコバクテリア、マイコプラズマ、リケッチア又はクラミジアの抗原も、本明細書に記載の細菌抗原と共に含まれる。部分又は完全病原体としては、インフルエンザ菌、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、髄膜炎菌（neisseria meningitidis）、肺炎連鎖球菌（streptococcus pneumoniae）、淋菌（neisseria gonorrhoeae）、サルモネラ血清型チフス菌（salmonella serotype typhi）、赤痢菌（shigella）、コレラ菌（vibrio cholerae）、デング熱、脳炎、日本脳炎、ライム病、ペスト菌（Yersinia pestis）、西ナイルウイルス、黄熱病、野兎病（tularemia）、肝炎（ウイルス性、細菌性）、ＲＳＶ（呼吸器合胞体ウイルス）、ＨＰＩＶ１及びＨＰＩＶ３、アデノウイルス、天然痘、アレルギー並びに癌も該当し得る。
【００４３】
本発明の組成物及び方法と共に使用する真菌抗原には、それだけに限らないが、例えば、カンジダ真菌抗原成分；熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）及び他のヒストプラズマ真菌抗原成分などのヒストプラズマ真菌抗原；莢膜多糖類及び他のクリプトコッカス真菌抗原成分などのクリプトコッカス真菌抗原；小球抗原及び他のコクシジオデス（coccidiodes）真菌抗原成分などのコクシジオデス真菌抗原；並びにトリコフィチン及び他のコクシジオデス真菌抗原成分などの白癬真菌抗原が挙げられる。
【００４４】
原虫抗原及び他の寄生虫抗原の例には、それだけに限らないが、例えば、メロゾイト表面抗原、スポロゾイト表面抗原、スポロゾイト周囲抗原、生殖母細胞／配偶子表面抗原、血液期抗原ｐｆ１５５／ＲＥＳＡ、及び他のプラスモジウム抗原成分などの熱帯熱マラリア原虫抗原；ＳＡＧ−１、ｐ３０及び他のトキソプラズマ抗原成分などのトキソプラズマ抗原；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、パラミオシン、及び他の住血吸虫抗原成分などの住血吸虫抗原；ｇｐ６３、リン脂質グリカン及びその付随タンパク質、並びに他のリーシュマニア抗原成分などのリーシュマニア主要抗原及び他のリーシュマニア抗原；更に７５〜７７ｋＤａ抗原、５６ｋＤａ抗原及び他のトリパノゾーマ抗原成分などのトリパノゾーマ・クルージ（trypanosoma cruzi）抗原が挙げられる。
【００４５】
本発明のｒＡｂの抗体部分の抗原認識部位を用いて標的にできる、免疫細胞上の標的抗原は、細胞内取込の見込み、免疫細胞の特異性レベル、標的とする免疫細胞の型、免疫細胞の成熟度及び／又は活性化度などを含めた多数の要因に基づいて、一般に選択されよう。樹状細胞にとっての細胞表面マーカーの例には、それだけに限らないが、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＡＳＰＧＲ、ＣＬＥＣ−６、ＣＤ４０、ＢＤＣＡ−２、ＭＡＲＣＯ、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ランゲリン、ＤＥＣＴＩＮ−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｆｃγ受容体、又は抗原提示細胞がかなり特異的に発現する他の受容体が挙げられる。抗原提示細胞にとっての細胞表面マーカーの例には、それだけに限らないが、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＡＳＰＧＲ、ＣＬＥＣ−６、ＣＤ４０、ＢＤＣＡ−２、ＭＡＲＣＯ、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ランゲリン、ＤＥＣＴＩＮ−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｆｃγ受容体、又は抗原提示細胞がかなり特異的に発現する他の受容体が挙げられる。Ｔ細胞にとっての細胞表面マーカーの例には、それだけに限らないが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ４５及びＨＬＡ−ＤＲが挙げられる。
【００４６】
腫瘍抗原に特徴的な標的抗原を含む、送達対象となる細胞表面上の標的抗原は、腫瘍組織細胞の細胞表面、細胞質、核、細胞小器官などに由来することになろう。本発明の抗体部分に対する腫瘍標的の例には、限定はしないが、白血病、リンパ腫などの血液癌、星状細胞種やグリア芽腫などの神経腫瘍、メラノーマ、乳癌、肺癌、頭頚部癌、胃癌や結腸癌などの消化器腫瘍、肝癌、膵臓癌、子宮頚部癌、子宮癌、卵巣癌、膣癌、睾丸癌、前立腺癌若しくは陰茎癌などの泌尿生殖器腫瘍、骨腫瘍、血管腫瘍、又は口唇、鼻咽頭、咽頭及び口腔、食道、直腸、胆嚢、胆道系、喉頭、肺及び気管支、膀胱、腎臓、脳及び他の神経系部分、甲状腺の癌、ホジキン病、非ホジキン病リンパ腫、多発性骨髄腫及び白血病が挙げられる。
【００４７】
本発明を用いた抗原提示のために免疫細胞へ、単独又は組み合わせて送達し得る抗原の例には、腫瘍タンパク質、例えば変異した癌遺伝子；腫瘍に付随するウイルスタンパク質；並びに腫瘍のムチン及び糖脂質が挙げられる。腫瘍に付随するウイルスタンパク質とし得る抗原は、上記した部類のウイルスに由来するものとなろう。ある種の抗原は、腫瘍に特徴的なこともあり（腫瘍前駆細胞が普通発現しないタンパク質の１サブセット）、又は、腫瘍前駆細胞中で通常発現するが、腫瘍に特徴的な変異を有するタンパク質のこともある。他の抗原には、変化した活性又は細胞内分布、例えば、腫瘍抗原を生じる遺伝子の変異を有する、正常タンパク質の変異体（複数も）が含まれる。
【００４８】
腫瘍抗原の非限定的な具体例には、ＣＥＡ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＭＡＧＥ１〜４、６及び１２、ＭＵＣ（ムチン）（例えば、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２など）、ＧＭ２及びＧＤ２ガングリオシド、ｒａｓ、ｍｙｃ、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ（メラノーマ抗原）、Ｐｍｅｌ１７（ｇｐ１００）、ＧｎＴ−ＶのイントロンＶ配列（Ｎ−アセチルグルコアミニルトランスフェラーゼＶのイントロンＶ配列）、前立腺Ｃａ  ｐｓｍ、ＰＲＡＭＥ（メラノーマ抗原）、β−カテニン、ＭＵＭ−１−Ｂ（メラノーマの遍在性変異遺伝子産物）、ＧＡＧＥ（メラノーマ抗原）１、ＢＡＧＥ（メラノーマ抗原）２〜１０、ｃ−ＥＲＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＥＢＮＡ（エプスタイン・バーウイルス核抗原）１〜６、ｇｐ７５、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６及びＥ７、ｐ５３、肺耐性タンパク質（ＬＲＰ）、Ｂｃｌ−２、並びにＫｉ−６７が挙げられる。それに加え、免疫原性分子には、自己免疫疾患の開始及び／又は展開に関与する自己抗原がなることができ、その病状は、関連する標的の器官、組織又は細胞、例えばＳＬＥ若しくはＭＧが発現する分子に特異的な抗体の活性に起因するところが大きい。このような疾患では、当該自己抗原に対する進行中の抗体媒介（即ち、Ｔｈ２型）免疫応答を、細胞性（即ち、Ｔｈ１型）免疫応答へ誘導することが望ましいこともある。或いは、当該自己免疫疾患に罹ってはいないが、罹り易いと疑われる対象において、適当な自己抗原に対してＴｈ１応答を予防的に誘発することにより、自己抗原に対するＴｈ２応答の開始を予防し、又はその応答レベルを低下させることが望ましいこともある。所望の自己抗原には、限定はしないが、（ａ）ＳＬＥに関しては、Smithタンパク質、ＲＮＰリボ核タンパク質、並びにＳＳ−Ａ及びＳＳ−Ｂタンパク質と、（ｂ）ＭＧに関しては、アセチルコリン受容体とが挙げられる。１又は複数種の自己免疫応答に関与する他の種々の抗原の例には、例えば、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、テストステロン、成長ホルモン、プロラクチン及び他のホルモンなどの内因性ホルモンが挙げられる。
【００４９】
自己免疫疾患、アレルギー及び移植片拒絶に関与する抗原は、本発明の組成物及び方法において使用することができる。以下の自己免疫疾患又は障害のいずれか１又は複数に関与する抗原は、本発明において使用することができる。即ち、糖尿病、真性糖尿病、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎を含む）、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎及び湿疹性皮膚炎を含む）、乾癬症、ショーグレン症候群に続発する乾性角結膜炎を含むショーグレン症候群、円形脱毛症、節足動物虫刺され反応によるアレルギー応答、クローン病、アフター性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、ハンセン病反転反応、癩性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性感音難聴、再生不良性貧血、真正赤血球性貧血、特発性血小板減少、多発軟骨炎、ウェゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、クローン病、グレーブス眼球症、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎、及び間質性肺線維症である。自己免疫疾患に関与する抗原の例には、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）、自然ＤＮＡ、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、アセチルコリン受容体成分、サイログロブリン、及び甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体が挙げられる。アレルギーに関与する抗原の例には、杉花粉抗原、ブタクサ花粉抗原、ホソムギ花粉抗原などの花粉抗原、チリダニ抗原及びネコ抗原などの動物由来抗原、組織適合性抗原、並びにペニシリン及び他の治療薬が挙げられる。移植片拒絶に関与する抗原の例には、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓、及び神経の移植片成分などの、移植片受容者に移植される移植片の抗原性成分が挙げられる。この抗原は、自己免疫疾患の治療に有用な改変ペプチドリガンドの場合もある。
【００５０】
本明細書で使用する場合、用語「エピトープ（複数可）」とは、病原性ＤＮＡ又はＲＮＡがコードする多数の病原性ポリペプチドのいずれか内にあるエピトープに類似の一次、二次又は三次構造を含む、ペプチド前記又はタンパク質抗原を指す。それらは一般的に、前記ポリペプチドに対するモノクローナル又はポリクローナル抗体が、前記ペプチド抗原又はタンパク質抗原に結合、反応するか、又はそれ以外の方法でその抗原を認識する程度に類似している。各種の免疫アッセイ法、例えば、すべて当業者に公知のウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなどが、このような抗体と共に使用し得る。ワクチンでの使用に適した病原性エピトープ及び／又はそれらの機能的等価物の同定は、本発明の一部である。分離し、同定後は、機能的等価物を容易に取得し得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４５５４１０１号明細書中で教示され、心親水性に基づいてアミノ酸配列からのエピトープの同定及び調製を教示するHoppの方法を採用してもよい。エピトープコア配列を同定するために、他の数件の論文に記載の方法、及びそれらに基づくソフトウェアプログラムも使用することができる（例えば、Jameson and Wolf, 1988；Wolf et al., 1988；米国特許第４５５４１０１号明細書を参照されたい）。次いで、こうした「エピトープコア配列」のアミノ酸配列は、ペプチド合成、組換え技術のいずれかを適用することにより、ペプチド中に容易に取り込み得る。
【００５１】
本明細書で使用する場合、用語「プロモーター」とは、転写の開始及び速度を制御する核酸配列の一領域をなす制御配列を指す。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ及び他の転写因子等の、調節性のタンパク質及び分子が結合し得る遺伝要素を含有することもある。「作動的に配置された」、「作動的に連結した」及び「転写制御下にある」という語句は、プロモーターが、核酸配列（即ちＯＲＦ）に関して、その配列の転写開始及び／又は発現を制御するために、適正な機能的位置及び／又は方向性を取っていることを意味する。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性調節配列を指す「エンハンサー」とコンジュゲートして使用されることも、そうでないこともある。本発明と共に使用し得るプロモーター及び／又はエンハンサーのリストは、例えば、関連する記述及び各表が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６４１０２４１号明細書に記載されている。
【００５２】
本明細書で使用する場合、用語「細胞」、「細胞系」及び「細胞培養物」は、互換的に使用し得る。こうした用語はすべて、インビボ、エクスビボ又はインビトロのあらゆる後世代である子孫も包含する。すべての子孫は、意図的又は偶発的な変異のために同一ではないこともあることが理解される。異種の核酸配列の発現に関しては、「宿主細胞」とは、原核又は真核細胞を指し、本発明のｒＡｂタンパク質ベクターを用いて送達されるようなベクターがコードする、異種遺伝子を発現できる任意の形質転換可能な生物を包含する。宿主細胞は、ベクターの受容細胞として使用でき、これまでそのように使用されてきた。宿主細胞は、本明細書に開示するような抗原を発現する外因性核酸を、宿主細胞に移入又は導入する過程を指す「トランスフェクション」又は「形質転換」を受け得る。形質転換された細胞には、一次対象細胞及びその子孫が含まれる。
【００５３】
活性成分として本発明の抗原をコードする核酸を含んだワクチン組成物の製剤は、溶液、懸濁液いずれかの注射剤として調製し得るが、感染前の液中溶解又は懸濁に適した固形も、調製することができる。該製剤は、乳化してもよく、リポソーム中に封入してもよい。免疫原性活性成分は、薬学的に許容され、その活性成分と適合する担体と混合することがしばしばある。
【００５４】
用語「薬学的に許容される担体」とは、投与される対象においてアレルギー反応又は他の有害作用を起こさない担体を指す。薬学的に許容される適切な担体には、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、及びそれらの組合せが挙げられる。それに加え、所望であれば、ワクチンは、湿潤剤若しくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、及び／又はワクチンの有効性を高めるアジュバントなどの少量の補助物質を含有することができる。有効になり得るアジュバントの例には、それだけに限らないが、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、ＭＴＰ−ＰＥ、並びに細菌から抽出した３成分、モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレート及び細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％スクワレン／Tween 80乳濁液中に含有するＲＩＢＩが挙げられる。アジュバントの他の例には、ＤＤＡ（臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム）、フロイントの完全及び不完全アジュバント、並びにＱｕｉｌＡが挙げられる。それに加え、リンホカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２及びＩＬ−１２）又はポリＩ：Ｃなどの合成ＩＦＮ−γ誘導因子などの免疫調節物質も、本明細書に記載のアジュバントと併用することができる。
【００５５】
医薬品は、本発明中に記載するように、血漿リポタンパク質上に存在するアポリポタンパク質の特異的なＤＮＡ結合部位に結合する、特定のヌクレオチド配列を単一又は複数のコピーで有する裸ポリヌクレオチドを含み得る。このポリヌクレオチドは、生物活性ペプチド、アンチセンスＲＮＡ又はリボザイムをコードすることもあり、生理学的に許容される投与形態で与えられる。本発明から生じ得る別の医薬品は、本明細書に記載の手順に従って、患者の血液又は他の供給源から単離した高精製度の血漿リポタンパク質分画と、血漿リポタンパク質上に存在するアポリポタンパク質の特異的なＤＮＡ結合部位に結合する、特定のヌクレオチド配列を単一又は複数のコピーで含有する、該精製リポタンパク質分画に予め結合させたポリヌクレオチドとを生理学的に許容される投与形態で含み得る。
【００５６】
さらに別の医薬品は、特定のヌクレオチド配列を単一又は複数のコピーで含有するポリヌクレオチドに予め結合させた、特異的なＤＮＡ結合モチーフを単一又は複数のコピーで含有する組換えアポリポタンパク質断片を含んだ、高精製度の血漿リポタンパク質分画を生理学的に許容される投与形態で含み得る。更に別の医薬品は、特定のヌクレオチド配列を単一又は複数のコピーで含有するポリヌクレオチドに予め結合させた、特異的なＤＮＡ結合モチーフを単一又は複数のコピーで含有する組換えアポリポタンパク質断片を含んだ、高精製度の血漿リポタンパク質分画を生理学的に許容される投与形態で含み得る。
【００５７】
投与すべき用量は、治療する対象の体重及び健康状態、並びに投与経路及び治療頻度に大いに依存する。高精製度のリポタンパク質分画に予め結合させた該裸ポリヌクレオチドを含む医薬組成物は、ポリヌクレオチド１μｇ〜１ｍｇ及びタンパク質１μｇ〜１００ｍｇの範囲の量で投与し得る。
【００５８】
患者に対する治療用ウイルス粒子の投与は、そのベクターの毒性が仮にあればそれを考慮して、化学療法剤を投与するための一般手順に従うことになろう。必要な場合、治療サイクルを繰り返すことになると予想される。各種の標準療法並びに外科的介入を、上記遺伝子療法と組み合わせて適用し得ることも想定される。
【００５９】
遺伝子療法の臨床的適用を想定する場合、意図した適用に適した医薬組成物として、該複合体を調製することが必要となろう。一般に、これには、発熱物質、並びに人間や動物に有害な恐れがある他の任意の不純物を本質的に含まない医薬組成物が伴われる。複合体を安定化させ、複合体の標的細胞による取込みを可能とするために、適当な塩及び緩衝剤を使用することも一般に望まれる。
【００６０】
本発明の水性組成物は、薬学的に許容される担体又は水性媒体中に溶解又は分散された有効量の化合物を含み得る。このような組成物は、接種液と呼ぶこともできる。医薬活性物質に対するこのような媒体及び作用剤の使用は、当技術分野で周知である。従来の任意の媒体又は作用剤が、活性成分と適合しない場合を除き、治療組成物におけるその使用が想定される。補助的な活性成分も、組成物中に取り込むことができる。本発明の組成物は、古典的な医薬製剤を包含し得る。分散液は、グリセロール、液状ポリエチレングリコール及びそれらの混合物、並びに油中でも調製することができる。保存及び使用の通常の条件下で、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するために防腐剤を含有している。
【００６１】
疾患状態
治療する特定の疾患に応じて、本発明による治療組成物の投与は、最大の（又は、いくつかの症例では最小の）免疫応答を受ける部位へ抗原の送達量を最大化させるために、標的組織がその経路を介して利用できる限り、任意の経路を介してよい。投与は、一般に、同所的な皮内、皮下、筋肉内、腹腔内又は静脈内の注射によるものとなる。他の送達域には、経口、鼻腔、口腔、直腸、膣又は局所が挙げられる。局所投与は、皮膚癌の治療には特に有利となる。このような組成物は、生理学的に許容される担体、緩衝剤又は他の賦形剤を含んだ、薬学的に許容される組成物として通常投与される。
【００６２】
本発明のワクチン又は治療組成物は、非経口的に、例えば、皮下又は筋肉内いずれかの注射により投与し得る。他の投与方式に適した追加の製剤には、坐剤、及び一部の症例では、経口製剤、又はエアロゾルとしての分配に適した製剤が含まれる。経口製剤の場合、アジュバントを用いたＴ細胞サブセットの操作、抗原パッケージング、又は個々のサイトカインの各種製剤への添加により、免疫応答が最適化された改良型経口ワクチンを生じる。坐剤の場合、従来の結合剤及び担体には、例えば、ポリアルキレングリコール又はトリグリセリドを含み得る。このような坐剤は、活性成分を０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲で含有する混合物から形成し得る。経口製剤は、例えば、各医薬等級のマンニトール、ラクトース、澱粉ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの通常使用される賦形剤を含む。こうした組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放製剤又は散剤の形態を取り、活性成分を１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％含有する。
【００６３】
本発明の抗原コード核酸は、中性又は塩形態としてワクチン又は治療組成物に製剤化し得る。薬学的に許容される塩には、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基と形成される）が含まれ、それらは、例えば塩酸やリン酸などの無機酸、又は酢酸、蓚酸、酒石酸、マレイン酸などの有機酸で形成される。遊離カルボキシル基と形成される塩も、例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は第二鉄の各水酸化物などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することができる。
【００６４】
ワクチン又は治療組成物は、投与製剤に合致した方法、並びに予防的及び／又は治療的に有効と見込まれるような量で投与される。投与すべき量は、例えば、対象の免疫系の抗体合成能を含めた治療される対象、及び所望する防御又は治療の程度に依存する。適切な用量範囲は、約１ｍｇ〜３００ｍｇの範囲、好ましくは約１０ｍｇ〜５０ｍｇの範囲などの約０．１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲のワクチン接種当たり、活性成分がほぼ数百μｇ程度である。初回投与及び追加抗原注射に対する適切な投与計画も変化し得るが、初回投与に続き、後続の接種又は他の投与を行うのが代表的である。投与が必要な活性成分の厳密な量は、担当医の判断次第であり、対象毎に特異な量となり得る。本発明の核酸分子又は融合ポリペプチドの有効量が、とりわけ、投与スケジュール、投与する抗原の単位用量、核酸分子又は融合ポリペプチドを他の治療剤と組み合わせて投与するか否か、受容者の免疫状態及び健康状態、並びに特定の核酸分子又は融合ポリペプチドの治療活性に依存することは、当業者には明らかであろう。
【００６５】
該組成物は、単回用量スケジュール又は多回用量スケジュールで投与することができる。多回用量スケジュールは、ワクチン接種の一次クールが、例えば１〜１０回の個別用量を含み、続いて免疫応答の維持及び／又は強化に必要なその後の間隔で、例えば第２用量に対して１〜４カ月に、必要であれば数カ月後にその後の用量（複数も）に対して、他の用量を投与し得るスケジュールである。１〜５年、普通は３年の間隔での周期的な追加抗原注射が、防御免疫の所望レベルを維持するために望ましい。免疫接種の期間後、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）をＥＳＡＴ６又はＳＴ−ＣＦと共培養するインビトロ増殖アッセイ、及び初回抗原刺激を受けたリンパ球から放出されるＩＦＮ−γ量の測定を行うことができる。該アッセイは、放射性核種、酵素、蛍光標識などの従来の標識を用いて行い得る。こうした技法は、当業者に公知であり、関連部分が参照により組み込まれる米国特許第３７９１９３２号、第４１７４３８４号及び第３９４９０６４号の各明細書に見出すことができる。
【００６６】
モジュールｒＡｂ担体、並びに／或いはコンジュゲートｒＡｂ担体−（コヘション／ドッケリン及び／又はドッケリン−コヒーシン）−抗原複合体（ｒＡｂ−ＤＣ／ＤＣ−抗原ワクチン）は、核酸ベクターが使用されるか否か、最終的な精製済みタンパク質又は最終的なワクチン形態が使用されるか否かに応じて、１又は複数の「単位用量」で与え得る。単位用量は、投与、即ち適当な経路及び治療計画に伴って所望の応答を生じると計算された、治療組成物の所定量を含有するものと定義される。投与すべき量、並びに特定の経路及び製剤は、臨床技術者の技術に入る。治療を受ける対象も、特に、対象の免疫系の状態及び所望の防御について評価を受け得る。単位用量は、単回注射として投与する必要はなく、設定した期間に亘る連続注入を包含し得る。本発明の単位用量は、ＤＮＡ／ｋｇ（又はタンパク質／ｋｇ）体重に換算して都合よく表現し得るが、ＤＮＡ又はタンパク質／ｋｇ体重で約０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、０．５、１、１０、５０、１００、１０００ｍｇ、又はそれより多量の間の範囲が投与される。同様に、ｒＡｂ−ＤＣ／ＤＣ−抗原ワクチンの送達量は、約０．２〜約８．０ｍｇ／ｋｇ体重で変化することができる。したがって、特定の実施形態では、ワクチン０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．８ｍｇ、１．０ｍｇ、１．５ｍｇ、２．０ｍｇ、２．５ｍｇ、３．０ｍｇ、４．０ｍｇ、５．０ｍｇ、５．５ｍｇ、６．０ｍｇ、６．５ｍｇ、７．０ｍｇ及び７．５ｍｇをインビボで個体へ送達し得る。投与すべきｒＡｂ−ＤＣ／ＤＣ−抗原ワクチンの用量は、治療される対象の体重及び体調、並びに投与経路及び治療頻度に大いに左右される。リポソーム又はウイルス送達ベクターに予め結合した裸ポリヌクレオチドを含む医薬組成物は、ポリヌクレオチド１μｇ〜１ｍｇ乃至タンパク質１μｇ〜１００ｍｇの範囲の量で投与し得る。したがって、特定の組成物は、ポリヌクレオチド又はタンパク質約１μｇ、５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ又は１０００μｇの間を、独立に１μｇ、５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、１ｍｇ、１．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ又は１００ｍｇのベクターに結合させた状態で含む。
【００６７】
本発明を、Ｆｌｕ抗原の標的となった樹状細胞によるヒトＦｌｕ特異的Ｔ細胞の免疫刺激を測定するインビトロ細胞系で試験した。本明細書に示す結果は、この系でそれ自体は無効である抗原の用量における、このような抗原特異細胞の特異的増殖を示している。
【００６８】
本発明は、例えば、リシン、炭疽毒素及びブドウ球菌Ｂ型エンテロトキシン由来の防御抗原と複合した組換えヒト化ｍＡｂ（ヒト樹状細胞の特異的受容体へ導かれる）である、モジュールｒＡｂ担体を作製するためにも使用し得る。この構成体の潜在的市場は、全軍人のワクチン接種、及びこうした作用剤が関連する任意の生物性脅威に応じて人口密集地へ投与するために蓄えられる貯蔵ワクチンである。本発明は、人間、動物双方で使用するためのワクチン一般の設計に対して、広い用途を有する。
【００６９】
本発明の商業的一用途は、防御抗原をコードすることが知られている、又は推測されている抗原に、Ａｂ重鎖を介して融合された組換えヒト化ｍＡｂ（ヒト樹状細胞の特異的受容体ＤＣＩＲへ導かれる）である。こうしたものには、各種の作用剤、即ちインフルエンザＨ５Ｎ１からのヘマグルチニン；リシン、炭疽毒素及びブドウ球菌Ｂ型エンテロトキシン由来の弱毒化毒素からのＨＩＶ  ｇａｇ；メラノーマ抗原からの抗原ペプチドの「連鎖（string）」などに対する、例えばワクチン接種が挙げられる。この構成体の潜在的市場は、危険に瀕している、又は感染している人々の予防的又は治療的ワクチン接種である。本発明は、人間、動物双方で使用するための、多くの疾患及び癌に対するワクチン接種に対して、広い用途を有する。所望の産業は、医薬及び生物工学の産業である。それに加え、本発明は、組換え抗体の分泌を増強するために特に好ましい配列を同定する方法を記載しているので、抗ＤＣＩＲ抗体の用途を超えた意味を有する。
【００７０】
潜在的な治療的又は予防的ワクチン接種剤としての、抗原に融合した操作組換えモノクローナル抗体を作製するための抗ＤＣＩＲ抗体結合領域の適用。Ｈ鎖Ｃ末端に連結した抗原又は他のタンパク質配列の効率的発現に最も適合するＶ領域配列を見出すための、同じ結合特異性に対する異なるＶ領域配列の使用。
【実施例１】
【００７１】
同じ組換えヒト化ｍＡｂとの複合体中で同時に標的化した多重抗原（ＭＡＴＣＨＭＡＢ）
想定される治療（この場合はワクチン接種）構成体の１種は、ＤＣターゲティング用ヒト化ｍＡｂ−抗原融合タンパク質であり、その中の抗体可変領域特異性は、細胞内取込性ヒト樹状細胞受容体に対している。その現状技術は、ｍＡｂ  Ｈ鎖のＣ末端との所望する抗原の融合を操作することである。このパラダイムは、異なる抗原（Ａ１、Ａ２、Ａ３）を同じ証明済みターゲティングｍＡｂ主鎖（下図におけるＹ）に操作し、したがって異なる病原体に対する免疫に１つのｍＡｂの利用を拡張することを可能にすることが明らかである。この概念は、ＩｇＧＦｃのＣ末端コード領域に末端間で融合した、例えばＡ１、Ａ２、Ａ３コード領域を操作することにより、更に拡張することができる。
【００７２】
本発明は、抗原をターゲティング用ｍＡｂに連結するための新たなパラダイムであって、操作した同じヒト化ｍＡｂと同時に複合体中で標的指向化した多重抗原（ＭＡＴＣＨＭＡＢ）へと初めてその概念を拡張するパラダイムを開示した。
【００７３】
図１は、従来技術（上部）と、操作・作製した同じヒト化ｍＡｂとの複合体中で同時に標的化した多重抗原（ＭＡＴＣＨＭＡＢ）の例（下部）とを比較している。Ｙは、抗ＤＣターゲティング用ヒト化ｍＡｂを表し、Ａ１、Ａ２、Ａ３は、独立した防御抗原、又は他の任意の所望するタンパク質ドメインであり、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３は、ドッキングドメインＤ１、Ｄ２、Ｄ３各々のための特異的な高親和性捕捉ドメインであり、ＤｎＡｎは、対応するドッキング−抗原融合タンパク質である。各種ドメインは、寸法どおりに描かれてないことに留意されたい。ｍＡｂ自体は約１５０ｋＤａであり、Ｃは約１７Ｄａであり、Ｄは約８ｋＤａであり、Ａは変動するが、普通＞２０ｋＤａである。
【００７４】
ＭＡＴＣＨＭＡＢは、セルロソーム集合体のコヒーシン−ドッケリン配列を使用して、モジュールで非共有結合性のターゲティングｍＡｂ−抗原複合体を形成することに基づいている。相対的に小さく、特異的なコヒーシン−ドッケリンタンパク質間の相互作用ドメインは、ターゲティングｍＡｂ−抗原複合体の単純でカスタム化された作製を実現することができる。したがって、製造した単一のヒト化ｍＡｂ（上の表記ではＹ．Ｃ１．Ｃ２．Ｃ３．Ｃｎ）を、多様であるが、厳密に規定された組合せの多重抗原を送達する基礎として、使用することができる。
【００７５】
Ｃ１．Ｃ２．Ｃ３．Ｃｎをコードする配列の例は、セルロソームのアンカー用スキャフォルディン（scaffoldin）Ｂ前駆体（バクテロイデス・セルロソルベンス（Bacteroides cellulosolvens））の公表配列＞ｇｉ｜５０６５６８９９｜ｇｂ｜ＡＡＴ７９５５０．１｜から採用される。以下では、青色でリーダー分泌配列を示し、黄色及び灰色が各種のコヒーシンドメインを強調している。赤色領域は、コヒーシンドメインのいくつかを隔てるリンカーである。
【００７６】
【表１】
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【００７７】
コヒーシンドメイン（Ｃ）は、ドッケリン（Ｄ）と呼ばれる小さなドメイン（例えば５６残基）と相互作用をする。こうしたドメインは、二重対称性を有するＣａ＋＋含有構造であり、様々な親和性（例えば、６Ｅ６Ｍ、２Ｅ７Ｍ）で同族性コヒーシンと結合することができる。ドッケリンと多重コヒーシン（スキャフォルディン上に見出されるようなもの）との親和性は、はるかに高くなることができる（例えば、＞Ｅ９Ｍ）。この相互作用は、非共役結合性であり、少なくとも１つのＣ−Ｄ対について明確になっている（構造解析による）。ドッケリンは、異なるドメイン（性質上は酵素）に連結するドメインとなるように設計されており、コヒーシン同士は、線状配列を取って（直接末端間で、又はサイズ多様な（例えば、１２、１７、２５、２８、３６）柔軟な多ＰＴリンカーで結合されて）機能するように設計されている。特定のドッケリンは、特定のコヒーシンに対して特異性を有することができる（例えば、１細菌種のＣ−Ｄ対は、異種のＣ−Ｄ対と互換し得ないこともある）ことは知られている。この特徴のために、各種Ｄ−抗原融合タンパク質と、特異性様々なコヒーシンを含有する組換えｍＡｂとの特異的で厳密な相互作用を保証することが可能になる。
【００７８】
実際には、本発明は、文献既知の、自然から新たに閃いた、又はファージディスプレイ技術を用いて新たな特異性を伴って発展した、Ｃ−Ｄ対を適合させることを含む。後者の技術は、Ｃ−Ｄ相互作用の親和性を強化する（「成熟させる」）ことが所望であれば、そうするために使用することができる。また、Ｃ−Ｄ相互作用の反対面（公表されたＣ−Ｄ構造からのモデル作成に基づく）にあるシステイン残基の操作を使用すれば、その相互作用を強めるためにＣ−Ｄ間に共有結合を作ることもできる。さらに、ｍＡｂ（及び、したがって連結Ｃドメイン）の二量体性を、親和性強化のために有利に使用することもできる。この実施形態では、例えばＤ−抗原融合タンパク質を操作して、第２の同一ドッケリンドメイン（Ｄ−抗原−Ｄ若しくはＤ−Ｄ−抗原）、又はホモ二量化ドメインのいずれかと結合させる。この配置は、ドメイン間のリンカーがもし束縛的でなければ、両Ｄドメインの同じｍＡｂへの好ましい同時結合が起こり、単一相互作用と比較して安定性が大いに強化される。
【００７９】
コヒーシン−ドッケリン複合体の結晶構造（例えば、PNAS 2003, 13809-13814, Cellulosome assembly revealed by the crystal structure of the cohesin-dockerin complex, Ana L. Carvalho*, Fernando M. V. Dias, Jose A. M. Prates, Tibor Nagy, Harry J. Gilbert, Gideon J. Davies, Luis M. A. Ferreira, Maria J. Romao and Carlos M. G. A. Fonte を参照されたい）に基づけば、一実施形態が抗原−ドッケリン融合タンパク質（即ち、ドッケリンのＮ末端に融合した抗原）であることは明白である。しかし、スキャフォルディン内にあるコヒーシンドメインの組織の構造及び性質の双方から、コヒーシン同士は、スペーサー配列がない場合でも末端間で融合できることは明白である。更に、コヒーシン及びドッケリンドメインの小型版を操作するために、十分に説明のなされた技法が利用できることも明白である（例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 94, pp. 10080-10085, September 1997. Structural mimicry of a native protein by a minimized binding domain. Melissa A. Starovasnik, Andrew C. Braisted, And James A. Wellsを参照されたい）。
【００８０】
本明細書では、リンカー配列は、豊富なＳＴから生じるＯ連結グリコシル化の傾向を有することが認識されている。Ｃ及びＤ両ドメインは、潜在的なＮ連結部位を有することもできる。こうした特徴は、哺乳動物細胞に発現した操作ｍＡｂの溶解度を糖鎖で修飾することにより高める上で有利になり得る。当然ながら、Ｃドメインのグリコシル化の結果は、機能的（同系Ｄとの結合）に確認し、必要ならば、部位特異的変異誘発によって修正する必要がある。本発明の興味深い特徴は、Ｄ−Ａが、最良であることが知られている任意の系において発現できることである。例えば、腫瘍抗原ＭＡＲＴ１は、膜タンパク質であり、大腸菌封入体を介して高収率に最良に調製される。ｍＡｂに直接融合した抗原を使用する図式は、哺乳動物細胞での発現に適合した抗原に限定される。
【００８１】
本発明の別の実施形態は、尾部間で結合した二重特異性ｍＡｂを作製するためのＤ−Ｃ相互作用の使用である。図２は、二重特異性ｍＡｂを形成するための本発明の使用を示す。ｍＡｂ１（黒色）はＣ１のＣ末端と共に発現し、ｍＡｂ２（マゼンタ）はＤ１のＣ末端と共に発現している。ｍＡｂ１及びｍＡｂ２を等モル混合すると、二重特異性の１：１複合体が生じることになる。各ｍＡｂ分子はＣ又はＤを２モル当量含有する（ｍＡｂ自体は二量体構造である）ので、二重特異性ｍＡｂは、同時進行の２つのＣ−Ｄ相互作用によって大いに安定化される。殊に、低い方の（ｍＡｂ）では、これが最も安定な配置となる。
【実施例２】
【００８２】
抗体と、コヒーシン／ドッケリンドメイン及び抗原との組合せ
実施例２は、特定のコヒーシン及びドッケリンドメインが、特異的で高親和性のコヒーシン−ドッケリンタンパク質間相互作用を維持しながら、融合タンパク質として哺乳動物細胞から首尾よく、効率的に分泌できることを示す。広範なコヒーシン−ドッケリン文献は、このような融合タンパク質がこの機能性を有するはずであるとの予想を教示しているが、哺乳動物分泌系におけるこのような融合タンパク質の産生については記載していない。科学知識の現状からすれば、首尾よい分泌の法則（シグナルペプチドなどの特徴以外に）が十分に確立されていないので、この発見を予測することはできない。更に、コヒーシンリンカー領域は、天然の細菌ではグリコシル化されていることが知られており、コヒーシン及びドッケリンドメインは、予測されたグリコシル化部位を含有している。このことは、哺乳動物細胞からの分泌に実際に有利になり得るが、「非天然」グリコシル化が、コヒーシン−ドッケリン相互作用を混乱させるか否かは、不明である。
【００８３】
各種商業用途を対象としたコヒーシン−ドッケリン相互作用が公表されてきたが、本発明は、想定された制御構築酵素用途と無関係な特異的タンパク質複合体の構築を中心に構成した、この相互作用に対してこれまで実現されたことのない利用に基づいている。
【００８４】
本発明は、多様なセルロース分解微生物からのすべてのコヒーシン−ドッケリン配列の使用を包含するが、微生物クロストリジウム・サーモセラムからの特定のコヒーシン及びドッケリン並びにリンカー配列の適用について記載する。例えば、表１に記載の配列は、クロストリジウム・サーモセラムのドッケリン配列に、Ｃ末端コドンで連結されたヒトＩｇＧ４のＨ鎖（ｒＡｂ．ｄｏｃと呼ぶ）をコードする。ｒＡｂ．ｄｏｃタンパク質の他の実施形態は、同様に表２に記載されており、こうしたタンパク質は、様々なＨ鎖構成体をコードするベクターへ、ＤＮＡ断片としてのドッケリンコード領域を単に移入するだけで作製される。
【００８５】
表１は、ｒＡＢ−ｐＩＲＥＳ２（ｈＩｇＧ４Ｈ−ドッケリン）又はＣ５２の核酸配列及びアミノ酸配列を示す。ヒトＩｇＧ４Ｈ．ｄｏｃ融合タンパク質のＤＮＡ（全コード領域）及びアミノ酸配列（予測される分泌産物）が、以下に示されている。クロストリジウム・サーモセラムのｃｅｌＤから得たドッケリンドメインは、黄色で強調し、Ｈ鎖及びドッケリンの結合配列には下線を引いてある。ドッケリンドメイン内の高度に予測されるＮ連結グリコシル化部位は、赤色で強調している。
【００８６】
【表２】
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【００８７】
表２は、ｒＡＢ−ｐＩＲＥＳ２（ｍ抗ＤＣＩＲ２Ｃ９Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−ドッケリン）又はＣ８２の核酸配列及びアミノ酸配列を示す。ＤＮＡ（全コード領域）及びアミノ酸配列（予測される分泌産物）が、以下に示されている。ドッケリンドメインは、黄色で強調し、Ｈ鎖及びドッケリンの結合配列には下線を引いてある。ＩｇＧ可変領域は、青色で強調している。ドッケリンドメイン内の高度に予測されるＮ連結グリコシル化部位は、赤色で強調している。
【００８８】
【表３】
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【００８９】
表３は、ｒＡＢ−（ｍ抗ＡＳＧＰＲ＿４９Ｃ１１＿７Ｈ−ＳＬＡＭＬ−Ｖ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−ドッケリン）又はＣ１５３の核酸配列及びアミノ酸配列を示す。ＤＮＡ（全コード領域）及びアミノ酸配列（予測される分泌産物）が、以下に示されている。ドッケリンドメインは、黄色で強調し、Ｈ鎖及びドッケリンの結合配列には下線を引いてある。ＩｇＧ可変領域は、青色で強調している。ドッケリンドメイン内の高度に予測されるＮ連結グリコシル化部位は、赤色で強調している。
【００９０】
【表４】
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【００９１】
表４は、ｒＡＢ−ｐＩＲＥＳ２（ｍ抗ＤＣ−ＳＩＧＮＬ１６Ｅ７Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−ドッケリン）又はＣ９２の核酸配列及びアミノ酸配列を示す。ＤＮＡ（全コード領域）及びアミノ酸配列（予測される分泌産物）が、以下に示されている。ドッケリンドメインは、黄色で強調し、Ｈ鎖及びドッケリンの結合配列には下線を引いてある。ＩｇＧ可変領域は、青色で強調している。ドッケリンドメイン内の高度に予測されるＮ連結グリコシル化部位は、赤色で強調している。
【００９２】
【表５】
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【００９３】
このようなｒＡｂ．ｄｏｃ  ＩｇＧ  Ｈ鎖タンパク質をコードする哺乳動物発現プラスミドは、分子生物学の標準技法を用いて創製され、ｐＩＲＥＳ２−ＤｓＲｅｄ２（BD Biosciences）などの市販されている発現プラスミドベクターに基づくことができる。分泌ｒＡｂ．ｄｏｃを産生するために、哺乳動物細胞に、この発現プラスミド、及び相補的なＩｇＧ  Ｌ鎖をコードする発現プラスミドを同時にトランスフェクションする（表３に例示されている）。哺乳動物細胞、トランスフェクション試薬及び培地に関しては、標準的な手順（FreeStyle（商標）293 Expression System, Invitrogen）を用いる。トランスフェクション済み細胞は３〜７日間培養し、培養上清を遠心分離により採集し、ろ過で清澄にし、ｒＡｂ．ｄｏｃタンパク質を、カラム製造業者（GE Pharmacia）の手順を用いたプロテインＧアフィニティクロマトグラフィーで精製する。
【００９４】
図３は、クーマシーブリリアントブルーで染色する還元的ＳＤＳ．ＰＡＧＥによる、典型的な分泌ｒＡｂ．ｄｏｃ産物の分析を示す。この分析は、ｒＡｂ．ｄｏｃが、分泌Ｈ＋Ｌ鎖二量体として効率的に産生されていることを示す。Ｈ鎖における不均一性は、ドッケリン配列内の高度に予測される（ポテンシャル０．６４２６、NetNGlyc 1.0 Server - Technical University of Denmark）部位におけるＮ連結グリコシル化を恐らく反映している。
【００９５】
表５は、ｒＡＢ−ｐＩＲＥＳ２（ｍ抗ＤＣ−ＳＩＧＮＬ１６Ｅ７Ｋ−ＬＶ−ｈＩｇＧＫ−Ｃ）又はＣ７３の核酸配列及びアミノ酸配列を示す。ｍ抗ＤＣ−ＳＩＧＮＬ１６Ｅ７ハイブリドーマのＶ領域（青色で強調）をヒトＣ領域（黄色で強調）と融合したＩｇＧκタンパク質のＤＮＡ（全コード領域）及びアミノ酸配列（予測される分泌産物）。
【００９６】
【表６】
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【００９７】
図３は、還元的ＳＤＳ．ＰＡＧＥ及びクーマシーブリリアントブルー染色で分析した、プロテインＧアフィニティ精製後の分泌ｒＡｂタンパク質を示す。レーンは左から右へ進む。
【００９８】
本発明は、グリコシル化に伴うことがよく知られている望ましい溶解性及び薬物動態特性を、哺乳動物細胞が分泌するドッケリン融合タンパク質に付与している可能性がある、このグリコシル化部位の意外な存在及び使用を具体化している。図２は、同じＩｇＧ  Ｈ及びＬ配列を用いたｒＡｂ．抗原融合タンパク質が、分泌効率において著しく異なり得ることを示している。配置した両方の例において、ｒＡｂ．ｄｏｃ構成体は、通常発現が非常に不足するインフルエンザＨＡ５配列融合ｒＡｂと比較して、良好に発現している。本発明は、結合しているｒＡｂ構成体の分泌をさほど阻害しないドッケリンドメインの意外な能力も具体化している。更に、本発明は、ｒＡｂ特異抗原結合領域の機能性を阻害しないドッケリンドメインの特性も具体化している。この特性は、抗ＬＯＸ１＿１５Ｃ４  ｒＡｂタンパク質と抗ＬＯＸ１＿１５Ｃ４．ｄｏｃとの間における、ＩｇＦｃ反応性及びＬＯＸ−１反応性間の一致を示す図５に例示されている。
【００９９】
図４Ａ及び４Ｂは、各種ｒＡｂ．融合タンパク質の分泌量に関する抗ヒトＩｇＦｃ  ＥＬＩＳＡによる測定を示す。Ｈ鎖及びＬ鎖発現プラスミドを各々２．５μｇ、２９３Ｆ細胞中にトランスフェクトし、３日間の培養後に上清試料の２倍希釈液を検定した。Ｙ軸の値は、任意のＨＲＰ活性である。
【０１００】
図５は、分泌タンパク質の抗ＬＯＸ１＿１５Ｃ４  ｒＡｂ（青色記号）及び抗ＬＯＸ１＿１５Ｃ４．ｄｏｃ  ｒＡｂ（赤色記号）に関する、抗ヒトＩｇＦｃ  ＥＬＩＳＡ（ＨＲＰ活性）及びＬＯＸ−１．アルカリホスファターゼ結合（ＡＰ活性）による測定を示す。Ｈ鎖及びＬ鎖発現プラスミド合計５μｇを相異なる比率で２９３Ｆ細胞中にトランスフェクトし、３日間の培養後に上清試料を検定した。
【０１０１】
本発明は、ｈＩｇＧ４及びその近縁誘導体以外の融合タンパク質に関して、ドッケリンドメインが効率的で機能的に発現される特性を具体化している。例えば、表６は、マウスＩｇＧ２ｂ  Ｈ鎖の融合タンパク質に基づくｒＡｂ．ｄｏｃ構成体の配列を示している。
【０１０２】
表６は、ｒＡＢ−ｐＣＭＶ（ｍＩｇＧ２ｂＨ−ドッケリン）又はＣ１９の核酸配列及びアミノ酸配列を示す。ＤＮＡ（全コード領域）及びアミノ酸配列（予測される分泌産物）が、示されている。ドッケリンドメインは、黄色で強調し、Ｈ鎖及びドッケリンの結合配列には下線を引いてある。ドッケリンドメイン内の高度に予測されるＮ連結グリコシル化部位は、赤色で強調している。
【０１０３】
【表７】
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【０１０４】
図６は、ｍＩｇＧκ発現プラスミドと同時トランスフェクションをした際、ｒＡＢ−ｐＣＭＶ（ｍＩｇＧ２ｂＨ−ドッケリン）プラスミドが、ｒＡＢ−ｍＩｇＧ２ｂ．ドッケリン融合タンパク質の効率的分泌を指示することを示している。図６では、還元的ＳＤＳ．ＰＡＧＥ及びクーマシーブリリアントブルー染色で分析した、トランスフェクション済み２９３Ｆ細胞から分泌された、プロテインＧアフィニティ精製後のｒＡｂタンパク質。レーン１１及び１２は、ｍＩｇＧ２ｂ．ｄｏｃ産物を示す。
【０１０５】
上に詳述したｒＡｂ．ｄｏｃの使用発明は、ドッケリン−コヒーシン相互作用の特異性及び強靭性によるｒＡｂと抗原、毒素、活性化剤、酵素いずれかとの複合体の会合である。表５は、コヒーシン．アルカリホスファターゼ融合タンパク質（ｃｏｈ．ＡＰ）の形態をした本発明の一実施形態を示す。２個のコヒーシンドメインを含有するアルカリホスファターゼ融合タンパク質（ｃｏｈ．ｃｏｈ．ＡＰ）などの追加の実施形態も記載しており、他のタンパク質として、ヒト前立腺特異抗原（ｃｏｈ．ｈＰＳＡ）の成熟配列などの他の配列、及びＡ型インフルエンザＨＡ５のＨＡ１ドメイン（ｃｏｈ．Ｆｌｕ  ＨＡ５−１）に融合した単一コヒーシンドメインなどは、本発明の一般性の例である。
【０１０６】
表７は、Ｍａｍ−ｐＣＤＭ８（コヒーシン−ＳＬＡＭＬ−ＡＰ−６ｘＨｉｓ）又はＣ１６の核酸配列及びアミノ酸配列を示す。ＤＮＡ（全コード領域）及びアミノ酸配列（予測される分泌産物）が、以下に示されている。コヒーシンドメインは、黄色で強調し、コヒーシン及びアルカリホスファターゼの結合配列には下線を引いてある。コヒーシンドメイン内及びコヒーシンドメインに対して末尾にあるリンカー内の高度に予測される（Ｇスコア＞０．５、NetOGlyc 3.1 Server - Technical University of Denmark）Ｏ連結グリコシル化部位は、赤色で強調している。灰色で強調した残基は、金属アフィニティクロマトグラフィーによる精製を促進するためのＣ末端Ｈｉｓタグである。
【０１０７】
【表８】
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【０１０８】
表８は、Ｍａｍ−ｐＣＤＭ８（コヒーシン−コヒーシン−ＳＬＡＭＬ−ＡＰ−６ｘＨｉｓ）又はＣ１７の核酸配列及びアミノ酸配列を示す。ＤＮＡ（全コード領域）及びアミノ酸配列（予測される分泌産物）が、以下に示されている。コヒーシンドメインは、黄色で強調し、コヒーシン及びアルカリホスファターゼの結合配列には下線を引いてある。コヒーシンドメインに対して末尾にあるリンカー内の高度に予測されるＯ連結グリコシル化部位は、単一の高度に予測されるＮ連結グリコシル化部位（ＮＰＴ）同様に赤色で強調している。灰色で強調した残基は、金属アフィニティクロマトグラフィーによる精製を促進するためのＣ末端Ｈｉｓタグである。
【０１０９】
【表９】
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【０１１０】
表９は、Ｍａｍ−ｐＣＤＭ８（ＳＬＡＭＬ−コヒーシン−ｈＰＳＡ）又はＣ１４９の核酸配列及びアミノ酸配列を示す。ＤＮＡ（全コード領域）及びアミノ酸配列（予測される分泌産物）が、以下に示されている。コヒーシンドメインは、黄色で強調し、コヒーシン及びｈＰＳＡの結合配列には下線を引いてある。コヒーシンドメインに対して末尾にあるリンカー内の高度に予測されるＯ連結グリコシル化部位、及びコヒーシンドメイン内の単一の高度に予測されるＮ連結グリコシル化部位（ＮＰＴ）は、赤色で強調している。
【０１１１】
【表１０】
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【０１１２】
表１０は、Ｍａｍ−ｐＣＤＭ８（ＳＬＡＭＬ−コヒーシン−ＦｌｕＨＡ５−１−６ｘＨｉｓ）又はＣ２４の核酸配列及びアミノ酸配列を示す。ＤＮＡ（全コード領域）及びアミノ酸配列（予測される分泌産物）が、以下に示されている。コヒーシンドメインは、黄色で強調し、コヒーシン及びＦｌｕ  ＨＡ５−１の結合配列には下線を引いてある。コヒーシンドメインに対して末尾にあるリンカー内の高度に予測されるＯ連結グリコシル化部位、及びコヒーシンドメイン内の単一の高度に予測されるＮ連結グリコシル化部位は、赤色で強調している。灰色で強調した残基は、金属アフィニティクロマトグラフィーによる精製を促進するためのＣ末端Ｈｉｓタグである。
【０１１３】
【表１１】
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【０１１４】
上記のｒＡｂ．ｄｏｃ構築物と同様に、本発明は、機能的なコヒーシン融合タンパク質（本明細書ではｃｏｈ．融合体と呼ぶ）の哺乳動物細胞からの効率的分泌を具体化している。コヒーシンドメインが、ドッケリン結合機能を保持しながら非常に首尾よく分泌できることは明確ではなかった。図５は、分泌ｃｏｈ．アルカリホスファターゼ（ｃｏｈ．ＡＰ）を含有する上清が、プラスチック表面上に固定化したｒＡｂ．ｄｏｃタンパク質に特異的に結合することを明示している。
【０１１５】
図７Ａ及び７Ｂは、分泌されるアルカリホスファターゼ（ＡＰ）又はｃｏｈ．ＡＰをコードする発現プラスミドが、トランスフェクション済み２９３Ｆ細胞からの機能性タンパク質の分泌を指示したことを示している。３日間の培養後、上清を採集した後、９６ウェルマイクロタイタープレートに結合したｒＡｂ．ｄｏｃ（上部パネル）又はｒＡＢ（下部パネル）のいずれか０．２５μｇに結合する能力について検定した。１時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、発色性ＡＰ基質で現像した。
【０１１６】
本発明は、コヒーシン．ドッケリン相互作用に基づく特異的タンパク質複合体の構築の応用を具体化している。特異的な抗体．抗原複合体は、プロテインＡ又はプロテインＧのＩｇＦｃ結合ドメインの確立した相互作用を用いて構築することもできる。本発明は、例えば、プロテインＧのＩｇＧとの相互作用と比較して、著しく優れた複合体形成を起こすコヒーシン．ドッケリン相互作用の独特な特性を具体化している。図６及び７では、コヒーシン．ＡＰ（Ｃｏｈ．ＡＰと呼ぶ）タンパク質の相互作用が、ｒＡｂ．Ｄｏｃタンパク質に特異的であることが示されている。
【０１１７】
図８Ａ及び８Ｂは、分泌Ｇ．ＡＰを含有する上清の各種希釈液を、固定化したｍＩｇＧ２ａ、ｍＩｇＧ２ｂ又はｍＩｇＧ２ｂ系ｒＡｂ．ｄｏｃを０．２５μｇ含有するマイクロタイターウェル中で、１時間インキュベートしたことを示している。洗浄後、発色性ＡＰ基質を用いて結合ＡＰ活性を現像した。ｒＡｂ．ｄｏｃが、ｐｒｏＧ．ＡＰ構築物中に使用されている特定のプロテインＧドメインと相互作用しないｍＩｇＧ２ｂのアイソタイプ変異体であったので、このｐｒｏＧ．ＡＰは、ｒＡｂ．ｄｏｃと結合しなかった。図８Ｂは、同一であるが、分泌Ｃｏｈ．ＡＰを含有する上清の各希釈液を用いた試験を示す。Ｃｏｈ．ＡＰはｒＡｂ．ｄｏｃだけに結合し、ｃｏｈ．ｄｏｃ相互作用の特異性をやはり示している。
【０１１８】
図９は、ｐｒｏＧ．ＩｇＧＦｃ相互作用に比較して、ｃｏｈ．ｄｏｃ相互作用に基づいて予め構築した複合体の極めて優れた安定性を示す。図９は、一定量のｐｒｏＧ．ＡＰ又はｃｏｈ．ＡＰ又はｃｏｈ２．ＡＰ（０．１μｇ）と、固定化したｍＩｇＧ２ｂ又はｒＡｂ．ｄｏｃ（０．２５μｇ）との複合体の形成が、マイクロタイタープレート中で１時間インキュベーションすることにより構築されたことを示している。様々な時間に可溶性のｍＩｇＧ２ｂ又はｒＡｂ．ｄｏｃを２０倍過剰に添加し、インキュベーションを様々な時間の間継続した。次いで、プレートを洗浄し、結合ＡＰ活性を発色性ＡＰ基質の添加によって明らかにした。
【０１１９】
この例は、血清を含有する環境（例えば、組織培養培地及びインビボでの投与）におけるこのようなｃｏｈ．ｄｏｃ複合体の使用を示している。図１０は、ｐｒｏＧ．ＩｇＧＦｃ複合体と比較した、このような環境におけるｃｏｈ．ｄｏｃ複合体の甚大な優位性を示す。用いた条件下で、結合ｐｒｏＧ．ＡＰを完全に置き換えるのに、Ｉｇ約１５μｇ／ｍｌで十分であったが、ｃｏｈ．ＡＰは、純粋な血清（１５ｍｇ／ｍｌのＩｇ）の存在下でも、ｒＡｂ．ｄｏｃに安定に結合したままであった。
【０１２０】
図１０は、一定量のｐｒｏＧ．ＡＰ又はｃｏｈ．ＡＰ（０．１μｇ）と、固定化したｍＩｇＧ２ｂ又はｒＡｂ．ｄｏｃ（０．２５μｇ）との複合体の形成が、マイクロタイタープレート中で１時間インキュベーションすることにより構築されたことを示している。ヒト血清の様々な希釈液を添加し、インキュベーションを４時間の間継続した。次いで、プレートを洗浄し、結合ＡＰ活性を発色性ＡＰ基質の添加によって明らかにした。
【０１２１】
本発明は、完全な複合体形成を保証し、ｃｏｈ．融合タンパク質構成体の精製工程と同時に進めることができる産生工程を可能にする、ｃｏｈ．ｄｏｃ相互作用の特別な利用も具体化している。本発明は、図１１及び１２に例示され、これらの図は、プロテインＧアフィニティクロマトグラフィーによる培養上清からのｒＡｂ．ｄｏｃの逐次捕捉、続いてプロテインＧ：ｒＡｂ．ｄｏｃカラムによる培養上清からのｃｏｈ．抗原の捕捉を経るこのプロセスを例示している。次いで、低ｐＨでの溶出により、純粋なｒＡｂ．ｄｏｃ：ｃｏｈ．抗原が放出される。ｒＡｂ．ｄｏｃよりｃｏｈ．抗原が過剰にあれば、十分で完全な複合体が生じるはずである。本発明の関連する実施形態は、過剰の純粋な、又は部分精製されたｃｏｈ．融合タンパク質のプロテインＧ捕捉ｒＡｂ．ｄｏｃへの適用となる。
【０１２２】
図１１は、ｒＡｂ．ｄｏｃ上清及びｃｏｈ．ＡＰ上清を同じプロテインＧアフィニティカラムへ逐次適用することにより生成した、ｒＡｂ．ｄｏｃ：Ｃｏｈ２．ＡＰ複合体の還元的対非還元的なＳＤＳ．ＰＡＧＥ分析のゲルを示す。レーン２及び４は、Ｃｏｈ２．ＡＰがｒＡｂ．ｄｏｃで共精製されることを示している。
【０１２３】
図１２は、ｒＡｂ．ｄｏｃ上清及びｃｏｈ．Ｆｌｕ  ＨＡ５−１上清を同じプロテインＧアフィニティカラムへ逐次適用することにより生成した、ｒＡｂ．ｄｏｃ：Ｃｏｈ．Ｆｌｕ  ＨＡ５−１複合体の非還元的なＳＤＳ．ＰＡＧＥ分析である。左から右へレーン１〜４は、Ｃｏｈ．Ｆｌｕ  ＨＡ５−１がｒＡｂ．ｄｏｃで共精製されることを示している。
【０１２４】
コヒーシンドメインのよく記載された特徴は、標準的な大腸菌発現系との適合性である。本発明は、哺乳動物分泌系におけるドッケリン融合タンパク質の発現の新規な使用を具体化しており、それは、異なる成分（即ち、ｃｏｈ及びｄｏｃ）が異なる系に発現するｃｏｈ．ｄｏｃ複合体の形成も包含する。これは、各成分にとって最も好ましい発現系を使用する可能性が得られるので、大きな利点である。例えば、ｃｏｈ．Ｆｌｕ  Ｍ１発現構築物は、トランスフェクション済み哺乳動物細胞からの分泌産物の合成を効率的に指示することができなかった。しかし、ｃｏｈ．Ｆｌｕ  Ｍ１は、大腸菌中の可溶タンパク質として非常に効率的に発現された。表６は、この例で用いたｃｏｈ．Ｆｌｕ  Ｍ１の配列を示している。
【０１２５】
表１１は、以下に示す、大腸菌−ｐＥＴ２８（コヒーシン−ＦｌｕＭ１−６ｘＨｉｓ）又はＣ３２の核酸配列及びアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列では、コヒーシンドメインが黄色で強調され、コヒーシンとＡ型インフルエンザＭ１タンパク質との融合点には下線が引かれている。灰色で強調した残基は、金属アフィニティクロマトグラフィーによる精製を促進するためのＣ末端Ｈｉｓタグである。
【０１２６】
【表１２】
0005543785.tif 000023
0005543785.tif 000024
【０１２７】
本発明は、治療又はワクチン接種の多様な目的のために、規則正しく特異的な複合体を会合するためのドッケリン．コヒーシン相互作用の使用を具体化している。一例が、ｃｏｈ．Ｆｌｕ  Ｍ１タンパク質と複合体を形成した内部移行性のヒト樹状細胞（ＤＣ）受容体に対して、結合特異性を有するｒＡｂ．ｄｏｃの使用である。図１１は、インビトロ試験によるこの利用を示す。ＤＣを抗ＤＣ＿ｒＡｂ．ｄｏｃ：ｃｏｈ．Ｆｌｕ  Ｍ１と培養し、次いで自己Ｔ細胞と共培養して、Ｆｌｕ  Ｍ１を特異的に記憶するＴ細胞を増殖させた。ｃｏｈ．Ｆｌｕ  Ｍ１単独の同等な用量では、このような効果はなかった。この試験は、ｃｏｈ．Ｆｌｕ  Ｍ１単独と比較して、抗ＤＣ＿ｒＡｂ．ｄｏｃ：ｃｏｈ．Ｆｌｕ  Ｍ１によりＦｌｕ  Ｍ１特異Ｔ細胞の増殖が少なくとも５０倍強化されたことを示す。
【０１２８】
図１３は、個々の精製済み成分の混合により、機能性の抗ＤＣ＿ｒＡｂ．ｄｏｃ：ｃｏｈ．Ｆｌｕ  Ｍ１複合体が形成されたことを示している。様々な量の複合体又はｃｏｈ．Ｆｌｕ  Ｍ１単独を、５Ｅ４ヒトＤＣ（ＨＬＡ２０１ドナーに由来）及び１０Ｅ５自己Ｔ細胞と共に培地中でインキュベートした。２４時間後、ＤＣをＣＤ４０Ｌで活性化し、インキュベーションを更に９日間継続した。細胞を採集し、ＰＥ標識Ｆｌｕ  Ｍ１ペプチドのＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号２４）ＨＬＡ−Ａ２四量体で染色し、抗原特異的ＣＤ８＋細胞の頻度について分析した。
【０１２９】
図１４は、ヒトＤＣに結合性がないアイソタイプ一致ｍＡｂ．ｄｏｃに複合したｃｏｈ．Ｆｌｕ  Ｍ１の追加対照を組み入れた類似例を示す。図１２は、Ｆｌｕ  Ｍ１  ＧＩＬＧＦＶＦＴＬエピトープを包含するペプチド断片へＨ鎖融合により直接連結した抗ＤＣ＿ｒＡｂも、ＤＣ標的抗原送達を誘発し、Ｆｌｕ  Ｍ１特異Ｔ細胞の増殖を起こす上で有効であることを示している。しかし、抗ＤＣ＿ｒＡｂ．Ｆｌｕ  Ｍ１  ＰＥＰ構成体は、哺乳動物細胞からの分泌が非常に不良であったため、このようなワクチンの製造は恐らく除外される。この問題は、（この場合では）ワクチン抗原に適当な発現系の使用により、製造問題の解決を可能にする本発明の実施形態を例示している。
【０１３０】
図１４は、個々の精製済み成分の混合により、抗ＤＣ＿ｒＡｂ．ｄｏｃ：ｃｏｈ．Ｆｌｕ  Ｍ１又はｍＩｇＧ２ｂ．ｄｏｃ：ｃｏｈ．Ｆｌｕ  Ｍ１の各複合体が形成されたことを示している。様々な量の複合体又はｃｏｈ．Ｆｌｕ  Ｍ１単独を、５Ｅ４ヒトＤＣ（ＨＬＡ２０１ドナーに由来）及び１０Ｅ５自己Ｔ細胞と共に培地中でインキュベートした。２４時間後、ＤＣをＣＤ４０Ｌで活性化し、インキュベーションを更に９日間継続した。細胞を採集し、ＰＥ標識Ｆｌｕ  Ｍ１ペプチドのＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号２４）ＨＬＡ−Ａ２四量体で染色し、抗原特異的ＣＤ８＋細胞の頻度について分析した。ｍＩｇＧ２ｂ．ｄｏｃ複合体の濃度は、抗ＤＣ＿ｒＡｂ複合体の濃度と同じであった。
【０１３１】
図１５は、ＣＤ３４＋ヒトＤＣをＣＤ１ａ＋及びＣＤ１４＋の各サブタイプに選別し、抗ＤＣ＿ｒＡｂ．Ｆｌｕ  Ｍ１  ＰＥＰ若しくは抗ＤＣ＿ｒＡｂの３ｎＭと共に、又はそれらなしで培養した。自己Ｔ細胞を１日後に添加し、培養を更に８日間継続した。分析は上記の通りであった。ＣＤ１ａ＋細胞は、抗ＤＣ＿ｒＡｂ．Ｆｌｕ  Ｍ１  ＰＥＰで処理した場合のみ、Ｆｌｕ  Ｍ１特異ＣＤ８＋細胞の増殖に非常に効率的であった。
【０１３２】
本発明の１種の実施形態は抗ＤＣ＿ｒＡｂ．ｄｏｃ：ｃｏｈ．抗原複合体からなるワクチンであるが、いくつかの事例では、好ましいＤＣターゲティングワクチンは、恐らくは一連の防御抗原を抗原とする抗ＤＣ＿ｒＡｂ．抗原になると想定される。製造系における効率的発現に適合する、有効な組合せの中のこのような抗原の同定は、極めて問題が多い。本発明の一実施形態は、このようなワクチンを開発するために、抗原エピトープの組合せの試験を合理化する方法を提供する。具体的には、本発明は、所望の抗ＤＣ＿ｒＡｂ．抗原の製造に対処する手始めとして、見込みのある抗原エピトープの有効性を単独及び組合せでスクリーニングする方法を教示する。例えば、表１３は、大腸菌系を介して容易に発現できる例示的なコヒーシン．ペプチド構築物の配列を示す。図１１に表示した技法と類似の技法を用いて、ｃｏｈ．ｐｅｐタンパク質の多様な集合体に対し、単一の抗ＤＣ＿ｒＡｂ．ｄｏｃ構成体との複合体として、有効性の試験を容易に行うことができる。次いで、最も有効なｃｏｈ．ｐｅｐ化合物を抗ＤＣ＿ｒＡｂ．ペプチド融合タンパク質として直接、操作・作製することができる。図１６は、大腸菌中で発現した精製済みのｃｏｈ．ＰＥＰタンパク質の例を示している。
【０１３３】
表１２は、メラノーマ関連抗原ｇｐ１００のアミノ酸配列を示す。周知のＨＬＡ−Ａ２０１制限主要ペプチドには、陰影を付け、その配列の下に詳述している。Ｍと標識したペプチド配列は、ＨＬＡ−Ａ２０１に対する親和性が増加した変異体である。Ｃ１８０は、コヒーシンドメインに青色の陰影を付け、ｇｐ１００ペプチドに灰色の陰影を付けた、下記に示す配列をコードする大腸菌発現構築物である。このペプチドの境界を示す下線付き残基は、ｇｐ１００に固有である。Ｃ末端Ｈｉｓタグは、金属アフィニティクロマトグラフィーによる精製を促進するためである。
【０１３４】
上記に言及したｇｐ１００配列及び関連ペプチドを下記に示す。
【０１３５】
【表１３】
0005543785.tif 000025
【０１３６】
ＨＬＡ−Ａ０２０１制限ペプチドの各配列は、次の通りである。
ＧＰ１００  ＷＴ：１５４〜１６２：KTWGQYWQV（配列番号２６）
ＧＰ１００  Ｍ：２０９〜２１７（２Ｍ）：IMDQVPFSV（配列番号２７）；２０９〜２１７  ＷＴ：ITDQVPFSV（配列番号２８）
ＧＰ１００  Ｍ：２８０〜２８８（９Ｖ）：YLEPGPVTV（配列番号２９）；２８０〜２８８  ＷＴ：YLEPGPVTA（配列番号３０）
【０１３７】
Ｃ１８０は、次の通りの大腸菌−ｐＥＴ２８（コヒーシン−ｈｇｐ１００−ペプチドＡ−６ｘＨｉｓ）である。
【０１３８】
【表１４】
0005543785.tif 000026
【０１３９】
表１３は、メラノーマ抗原ＭＡＲＴ−１のアミノ酸配列を示す。周知のＨＬＡ−Ａ２０１制限主要ペプチドには、陰影を付け、その配列の下に詳述している。Ｍペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２０１に対する親和性が増加したペプチド配列変異体を示す。Ｃ１８１は、コヒーシンドメインに黄色の陰影を付け、ＭＡＲＴ−１ペプチドに灰色の陰影を付けた、下記に示す配列をコードする大腸菌発現構築物である。このペプチドの境界を示す下線付き残基は、ＭＡＲＴ−１に固有である。Ｃ１７２及びＣ１７４は、抗ＤＣ＿ｒＡｂ．ＭＡＲＴ−１ペプチド及び一致対照のｒＡｂ．ＭＡＲＴ−１ペプチドＨ鎖の発現を指示する２種の構築物である。Ｃ末端残基に付加した配列だけが示されている。Ｃ末端Ｈｉｓタグは、金属アフィニティクロマトグラフィーによる精製を促進するためである。
【０１４０】
ＭＡＲＴ−１は次の通りである。
【０１４１】
【表１５】
0005543785.tif 000027
【０１４２】
ＨＬＡ−Ａ０２０１制限ペプチド配列は次の通りである。
【０１４３】
【表１６】
0005543785.tif 000028
【０１４４】
Ｃ１８１は、大腸菌−ｐＥＴ２８（コヒーシン−ｈＭＡＲＴ−１−ペプチドＢ−６ｘＨｉｓ）である。
【０１４５】
【表１７】
0005543785.tif 000029
【０１４６】
Ｃ１８６は、大腸菌−ｐＥＴ２８（コヒーシン−Ｆｌｅｘ−ｈＭＡＲＴ−１−ペプチドＡ−６ｘＨｉｓ）である。
【０１４７】
【表１８】
0005543785.tif 000030
【０１４８】
Ｃ１７２は、ｒＡＢ−ｐＩＲＥＳ２（ｍ抗ＡＳＧＰＲ＿４９Ｃ１１＿７Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−ｈＭＡＲＴ−１−ペプチドＡ）である。
Ｃ１７４は、ｒＡＢ−ｐＩＲＥＳ２（ｈＩｇＧ４Ｈ−ｈＭＡＲＴ−１−ペプチドＡ）である。
【０１４９】
【表１９】
0005543785.tif 000031
【０１５０】
図１６は、ｃｏｈ．ｐｅｐタンパク質の合成を指示する発現プラスミドを保持した大腸菌が、増殖し、特異的タンパク質を産生するように誘導されたことを示している。細胞を採集し、超音波処理で破壊した。上清分画を適用し、金属アフィニティクロマトグラフィーにより精製した。分析は、クーマシーブリリアントブルーで染色した還元的ＳＤＳ．ＰＡＧＥゲルによった。図では、左から右へ標識した典型的な産物のｃｏｈ．ｐｅｐタンパク質が示されている。
【０１５１】
この実施例は、哺乳動物細胞から分泌されるコヒーシン及びドッケリン融合タンパク質の優れた使用を示している。両融合相手が特異性の異なるｒＡｂ（即ち、ｒＡｂ１．ｄｏｃ及びｒＡｂ２．ｃｏｈ）であれば、混合するだけで二重特異性抗体のｒＡｂ１．ｄｏｃ：ｒＡｂ２．ｃｏｈが生じる。二重特異性抗体は、治療的及び技術的に多くの潜在的用途を有する。本発明は、ｄｏｃ：ｃｏｈ相互作用を介してこのような構成体を会合するための単純で予測可能な手段を提供する。或いは、ｒＡｂ１．ｄｏｃ：ｒＡｂ１．ｃｏｈが会合されるのであれば、このような構成体は、潜在的に独特の生物学的特性を有する制御された架橋ｍＡｂを表現する。
【０１５２】
コヒーシン．ドッケリンモジュールは、多様なセルロース分解性生物種の中に存在する。そうしたモジュールは配列類似性を有するが、生物種間で交差しない特異性を有することができる。これによって、特異性の異なるコヒーシンからなる新規な足場を構築し、この足場を用いて、空間的及び個数的に制御しながら高次複合体を構築する機会が得られる。他の人々は、生物工学用途にこの概念を用いるための中核技術について述べている（Fierobe, H.-P., Mechaly, A., Tardif, C., Belaich, A., Lamed, R., Shoham, Y., Belaich, J.-P., and Bayer, E. A. (2001) Design and production of active cellulosome chimeras: Selective incorporation of dockerin-containing enzymes into defined functional complexes. J. Biol. Chem. 276, 21257-21261を参照されたい）。本発明は、ｒＡｂ．（ｄｏｃ：ｃｏｈ．融合体）ｎ複合体の製造関連の用途のために、この技術の特定の使用を具体化しているが、前式中ｎは、独特の特異性を有するｄｏｃ：ｃｏｈ相互作用の対形成が＞１であることを表す。したがって、本発明は、ｒＡｂ．ｄｏｃ１．ｄｏｃ２．ｄｏｃ３．などと、ｃｏｈ１．融合体Ａ、ｃｏｈ２．融合体Ｂ、ｃｏｈ３．融合体３などとの空間的に規則的な複合体の会合（成分同士の単純な混合による）を想定している。ｃｏｈ．融合タンパク質は、異なる抗原、又は抗原とサイトカインのような活性化剤との組合せを表すことができよう。
【０１５３】
拡張して考えれば、より高次の抗原特異性を有する２価ｒＡｂを作製するために、ｃｏｈ：ｄｏｃの多重特異性を使用することもできよる。セルロース分解細菌及び類似の生物は、分解機構を組織するためにセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）も使用する。クロストリジウム・サーモセラムのＣＢＤの構造は、Ｎ及びＣ末端が、近接しており、ＣＢＤ機能構造の不可欠な部分ではないことを示している。実際、ＣＢＤは、ｃｉｐＡにおけるｃｏｈ．ＣＢＤ．ｃｏｈのように他のドメインに連結して現れる。本発明は、抗体及び多重サブユニット受容体を模倣した空間的、個数的に規則正しい複合体を構築するための、ｃｏｈ．ＣＢＤ．ｃｏｈなどの構成体の使用を包含する。例えば、ｄｏｃ１に融合したＩｇＧκ鎖ｖ領域、及びｄｏｃ２に連結したＩｇＧＨ鎖Ｖ領域は、ｃｏｈ１．ＣＢＤ．ｃｏｈ２と会合して、ＶＬ．ｄｏｃ１：ｃｏｈ１．ＣＢＤ．ｃｏｈ２：ＶＨ．ｄｏｃ２を産生し、元のｍＡｂに類似した親和性及び結合特異性を有する構成体を産生することもできる。このような構成体は、特に、ＶＬ及びＶＨ成分が、独立に変異させ、混合により様々な組合せに組み合わせることができると思われるので、例えば、変異誘発手順を介したｍＡｂ特異性の絞り込みに、非常に有用なスクリーニング手段となるはずである。上記の通り、この技術は、極めて高い特異性及び親和性を有する結合性構成体を潜在的に産生する、制御されたｃｏｈ：Ｖ．ｄｏｃの多重組合せに容易に拡張することができる。これを拡張することは、ｃｙｔｏＲ１．ｄｏｃ＋ｃｙｔｏＲ２．ｄｏｃ＋ｃｙｔｏＲ３．ｄｏｃ（式中ｃｙｔｏＲは、複合サイトカイン受容体の１サブユニットの外部ドメインを表す）を構築するための鋳型として、例えばｃｏｈ１．ｃｏｈ２．ＣＢＤ．ｃｏｈ３を使用することとなる。このような構成体は、治療のために、及び複雑な上清中のサイトカインを測定する生物工学において、サイトカイン相互作用の阻止に有用となる。
【実施例３】
【０１５４】
免疫毒素療法に対するコヒーシン−ドッケリン技術の使用
現在、１２０万人のアメリカ人が毎年癌を発症し、大部分の癌は一旦転移すると治癒できないため、約５０万人がこの疾患で死亡する。転移癌の新たな治療法を開発するために、遺伝子工学を用いて、正常細胞を死滅させる代わりに癌細胞を選択的に死滅させるように、強力な細菌毒のシュードモナスエンテロトキシンＡ（ＰＥ）が改変されてきた。ＰＥは、アミノ酸６１３個からなる３ドメインタンパク質である。抗癌剤は、その結合ドメイン（アミノ酸１〜２５２）を欠失させ、抗体のＦｖ断片、又は癌細胞上に存在する抗原に結合する成長因子で置き換えることにより、生成される。こうした抗癌剤は、組換え免疫毒素（ＲＩＴ）と称する。ＲＩＴとして、結腸癌、乳癌、肺癌及び他の上皮癌上に存在するレイ（Ley）を標的とするもの（Ｂ３（Ｆｖ）−ＰＥ３８）、グリア芽腫上に過剰発現するＥＧＦ受容体を標的とするもの（ＴＧＦ−α−ＰＥ３８）、グリア芽腫上に存在する変異ＥＧＦ受容体を標的とするもの（ＭＲ−１（Ｆｖ）−ＰＥ３８ＫＤＥＬ）、並びに多くのＴ及びＢ細胞性白血病及びリンパ腫上に存在するＩＬ−２受容体を標的とするもの、ＬＭＢ−２又は抗Ｔａｃ（Ｆｖ）−ＰＥ３８、更に悪性Ｂ細胞上のＣＤ２２を標的とするもの、更にＢＬ２２又はＲＦＢ４（ｄｓＦｖ）−ＰＥ３８の卵巣癌及び中皮腫（ＳＳ１Ｐ）を標的とするものが作製されてきた。こうした抗癌剤は、大腸菌中で産生されるが、その理由は、この供給源から多量を容易に精製できること、及び毒素自体が、それを発現する哺乳動物細胞を死滅させると思われることである。適当な人癌の異種移植片を有するマウスに投与した際、こうしたＲＩＴはすべて、腫瘍の完全な緩解を生じる。こうした抗癌剤の大部分は、人間において臨床試験中であり、数種のものは、癌患者に完全な及び部分的な寛解をもたらした。
【０１５５】
理想的な免疫毒素は、腫瘍の緩解を起こす投与量がごく少量で済むように非常に活性であり、腫瘍内部への到達に要する５〜１０時間の間、機能を維持するように安定であり、繰返し投与できるように非免疫原性であるべきである。当初、組換え免疫毒素は、ＰＥのアミノ酸２５３〜６１３（ドメインII及びIII）を含有していた。アミノ酸３６４〜３９５は、活性を損なわずに欠失できると判定された。安定性の増加は、長い半減期を有することが周知の抗体全体に毒素を連結することにより、対処することができ、本発明における技術は、この解決法を提供する。
【０１５６】
ｒＡｂ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．毒素の技術は既知の癌抗原に適用できるが、免疫の監視からの腫瘍の逃避を助長すると疑われる腫瘍内ＤＣを死滅させるためにも、この技術を試験することができる。この後者の場合、投与毒素自体に対する免疫の蓄積は抑制されるはずなので、抗ＤＣ毒療法は二重に有利となり得よう（即ち、ＤＣ自体が、抗原の取込み及びプロセシングを介したこの免疫応答の開始の鍵となるため。この療法では、抗原を取り込むＤＣは死滅し、免疫毒素応答を開始することができない）。
【０１５７】
Frankel（Clinical Cancer Research, 8, 942-944, 2002）は、免疫毒素の適用拡大を妨げる問題について記述している。こうした問題には、ミスフォールディング汚染物質が問題となる、大腸菌封入体発現物質の復元（refolding）がしばしば必要な産生問題が挙げられる。また、免疫毒素の標的に対する親和性も、十分な強度で得ることがしばしば困難である。本発明の技術基盤は、こうした問題の双方に対処している。第１に、本発明者等は、コヒーシン．ＰＥ３８融合タンパク質が、複雑な復元を要しない単純な生化学的手段により、完全に機能的な状態で（コヒーシン、毒素の活性とも損なわれていない）精製できる可溶性タンパク質として大腸菌中に発現されることを見出した。第２に、標的抗原に対する高親和性のモノクローナル抗体は、当業者により日常的に得ることができる。困難なことは、毒素と融合し、標的への結合に完全に機能する形態で、抗体の可変領域を操作することである。普通の操作手段（例えばｓＦｖ形態）は、当初のモノクローナル抗体と比較して、標的に対する親和性を必ず相当程度失わせる。ｒＡｂ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．毒素の技術は、この問題を回避して、当初のｍＡｂの高親和性結合部位も（マウスｍＡｂのＶ領域をヒト化すると同時に、高い特異的な結合活性を維持することは、当業者にとって日常的であることに留意されたい）、並びに完全な組換えｈＩｇＧ状況の長い半減期及び非抗原性という有益な特性も保持する手段を提供する。
【０１５８】
さらに、コヒーシン．毒素は独自に産生されるので、患者に注射する前に成分を混合するだけで、一製剤の毒素を、別途産生したターゲティング用ｒＡｂ．Ｄｏｃタンパク質の任意の個数へコンジュゲートすることができる。これにより、製造並びに研究開発時間が著しく簡略化される。本発明に記載の技術は、任意の毒素及び任意のｒＡｂ特異性に容易に適用することができる。
【０１５９】
ｒＡｂ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．毒素の技術の詳細。ｐＲＢ３９１（Pastan博士の供与品）（Pastan, Chief of the Laboratory of Molecular Biology, Division of Basic Sciences. NCI, NIH）を鋳型として用いて、ＰＥ３８−Ｎ３ （cacggtcaccgtctccaaagcttccggagctagcGAGGGGGGCAGCCTGGCCGCGCT（配列番号３９））及びＰＥ３８−Ｃ３（GGCCGGCTCCTGCGAAGGGAGCCGGCCGGTCGCGGCCGCTTACTTCAGGTCCTCGCGCGGCGGTTTGCCG（配列番号４０））のプライマーと共にＰＣＲを行った。
【０１６０】
クローニングを前に樹立した構築物Ｃ２１又は大腸菌−ｐＥＴ２８（コヒーシン−６ｘＨｉｓ）を施して、以下に示すアミノ酸配列に対応するコヒーシン−ＰＥ３８をコードする融合タンパク質を生成した（灰色残基はコヒーシンであり、黄色残基は、コヒーシンドメインに固有のリンカー配列で隔てられたＰＥ３８である）。
【０１６１】
【表２０】
0005543785.tif 000032
【０１６２】
組換えＣｏｈ．ＰＥ３８タンパク質の発現及び精製。各発酵液１Ｌからの大腸菌細胞を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０で、プロテアーゼ阻害剤Cocktail II（Calbiochem）０．１ｍｌ入りの氷冷液２５ｍｌ中に再浮遊させた。その細胞を氷上で２×５分、設定１８（Fisher Sonic Dismembrator 60）で休止期間５分を入れて超音波処理し、次いで１７０００ｒｐｍ（Sorvall SA-600）で４℃、２０分間回転させた。上清を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中で平衡化した１ｍｌのANX Sepharoseカラムに通し、Buffer B中の０〜１Ｍ  ＮａＣｌ勾配で溶出した。Ｃｏｈ．ＰＥ３８を含有する分画をＳＤＳ．ＰＡＧＥで同定し、更にプールした分画を、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７で溶出する抗コヒーシンｍＡｂアフィニティクロマトグラフィーによる精製によって、精製した。
【０１６３】
ｒＡｂ．Ｄｏｃ標的指向化Ｃｏｈ．ＰＥ３８によるヒトＤＣの選択的死滅。ヒトＤＣは、血液単球からＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４と共に６日間培養することにより調製した。次いで、ＤＣをＣｏｈ．ＰＥ３８単独、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｌ  １６Ｅ７  ｒＡｂ．Ｄｏｃ単独、抗ＤＣＩＲ  ２４Ａ５．Ｄｏｃ単独、又はｒＡｂ．ＤｏｃとＣｏｈ．ＰＥ３８との共存のいずれかと培養した（各作用剤１．２５μｇ／ｍｌを添加した）。４８時間後、アポトーシス細胞を検出する試薬（７−ＡＡＤ）で細胞を染色し、前方対側方散乱及び７−ＡＡＤ蛍光を記録するＦＡＣＳで分析した。
【０１６４】
図１７は、ＤＣＩＲ．Ｄｏｃ  ｒＡｂ単独ではＤＣの生存に何ら作用がなかったことを示している。しかし、ＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｌ単独は、ＤＣに対して生存増強作用を有する（散乱分析、７−ＡＡＤ染色の双方により証明される）。図１８は、Ｃｏｈ．ＰＥ３８単独が、７−ＡＡＤ記録アポトーシス細胞の数を僅かに増加させる（２２．１〜２９．８％）ことを示している。しかし、ＤＣＩＲ．Ｄｏｃを介してＣｏｈ．ＰＥ３８毒素を標的指向化すると、７−ＡＡＤ陽性集団が５５．３％に増加した。散乱分析は、生存ＤＣに特徴的な集団のほぼ完全な喪失をはるかに劇的に示した。ＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｌ．Ｄｏｃを介してＣｏｈ．ＰＥ３８毒素を標的指向化すると、７−ＡＡＤ陽性集団が５３．７％に増加し、散乱生存ＤＣ集団が同様に失われた。しかし、後者のこの結果は、ＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｌ．Ｄｏｃ  ｒＡｂの生存作用との関係で見るべきであり、この死滅は、３．１〜５３．１％の７−ＡＡＤ陽性と見なし得ることを意味する。
【０１６５】
多価抗体を作製するためのコヒーシン−ドッケリン技術の使用。鋳型としてＣ１７（Ｍａｍ−ｐＣＤＭ８（コヒーシン−コヒーシン−ＳＬＡＭＬ−ＡＰ−６ｘＨｉｓ））に基づくＰＣＲを用いて、コヒーシンドメインをｒＡｂ  Ｈ鎖のＣ末端とインフレームで操作した。生成した分泌Ｈ鎖の配列を以下に示す（コヒーシンドメインは灰色で強調し、Ｃ末端Ｈ鎖は太字にしてある）。
【０１６６】
【表２１】
0005543785.tif 000033
【０１６７】
この発現構築物を適当なｒＡｂ  Ｌ鎖と共に２９３Ｆ細胞中に同時トランスフェクトし、分泌ｒＡｂの発現を３日目の抗ｈＩｇＧＦｃ  ＥＬＩＳＡで評価した。図１９は、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｌ及び抗ＤＣ−ＡＳＰＧＲ  ｒＡｂ．Ｃｏｈの発現が、効率的に分泌されたことを示している。
【０１６８】
したがって、コヒーシン及びドッケリン両ドメインは、ｒＡｂ融合タンパク質として容易に発現される。この特性は、２価抗体（即ち、１つのタンパク質中に異なる２種の結合特異性を有する）としての（ｒＡｂ１．Ｃｏｈ：ｒＡｂ２．Ｄｏｃ）複合体の使用に必須である。２価抗体は、工業的、分析的及び治療的な用途に適した多くの望ましい特徴を有する。しかし、該抗体は開発するのが困難であり、それらの操作に使用される分子ツールは、モノクローナル親抗体に固有の高い親和性及び特異性という望ましい特徴を通常弱めてしまう。（ｒＡｂ１．Ｃｏｈ：ｒＡｂ２．Ｄｏｃ）技術は、この障害を回避し、その上、本出願の他所に記載のように、対をなす特異性を有するコヒーシン又はドッケリンの多重連鎖を取り込むことにより、より多い（２より多い）価数の結合力に拡張できる。さらに、この技術は、例えばサイトカインを用いる追加の価数の提供に拡張することができる（即ち、ｒＡｂ１．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．サイトカイン）。
【０１６９】
例えば、コヒーシンドメインとＩＬ−２１との融合タンパク質を発現構築物として操作し、このＣｏｈ．ＩＬ−２１を一時的にトランスフェクトした２９３Ｆ細胞から効率的に分泌させ、逐次的なQ Sepharose及び抗コヒーシンアフィニティクロマトグラフィーにより容易に精製した。分泌産物の配列は、以下に示してあり、コヒーシンドメインを灰色、ＩＬ−２１ドメインを黄色で示す。この産物は、ヒトＢ細胞の増殖を維持する上での効力で決定した場合、完全に機能していた。
【０１７０】
Ｍａｍ−ｐＣＤＭ８（ＳＬＡＭＬ−コヒーシン−ｈＩＬ−２１）
【０１７１】
【表２２】
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【０１７２】
したがって、ｒＡｂ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．ＩＬ−２１は、Ｂ細胞に増殖及び活性化のシグナルを同時に送達することができる（即ち、ｒＡｂ自体が活性化特性を有する場合）。この概念は、特定の細胞型を対象とする生物学的特性を有する任意のｒＡｂ、及び同じ細胞型を対象とする活性を有する任意のサイトカインに拡張することができる。図２０は、ヒトＢ細胞の増殖に対するＩＬ−２１及びＣｏｈ．ＩＬ−２１の効果を示す。
【０１７３】
本明細書で考察した任意の実施形態は、本発明の任意の方法、キット、試薬又は組成物に関して実施することができ、その逆もできることを企図している。更に、本発明の組成物は、本発明の方法を実現するために使用することができる。
【０１７４】
本明細書に記載の特定の実施形態は、例示のために示しており、本発明の限定として示しているのでないことは理解されよう。本発明の主要な特徴は、本発明の範囲から逸脱せずに多様な実施形態で使用することができる。当業者であれば、単なる日常的実験を用いて、本明細書に記載の特定の手順に等価な多数の手順を認識し、又は確認することができよう。このような等価な手順は、本発明の範囲に入り、特許請求の範囲で網羅されると考えられる。
【０１７５】
本明細書で言及したすべての刊行物及び特許出願は、本発明が関係する当業者の技術水準を示している。すべての刊行物及び特許出願は、個々の刊行物又は特許出願の各々が、参照により組み込まれると明確に個別に示されている場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７６】
特許請求の範囲及び／又は本明細書において、用語「含む（comprising）」と共に使用される場合の単数の単語の使用は、「１」を意味し得るが、「１又は複数」、「少なくとも１つ」及び「１又は２以上」の意味とも合致する。特許請求の範囲における用語「又は」の使用は、代替物だけを指すことを明確に示していない限り、又は代替物が相互に排他的でない限り、「及び／又は」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物だけ及び「及び／又は」を指す定義を支持する。本出願を通して、用語「約」は、ある値が、その値を決定するために使用されている装置、方法の固有の誤差変化、又は試験対象の間に存在する変動を包含することを示すために、使用される。
【０１７７】
本明細書及び請求項（複数も）で使用する場合、単語「含む（comprising）」（及び“comprise”、“comprises”などのcomprisingの任意の形態）、「有する（having）」（及び“have”、“has”などのhavingの任意の形態）、「含む（including）」（及び“includes”、“include”などのincludingの任意の形態）、又は「含有する（containing）」（及び“contains”、“contain”などのcontainingの任意の形態）は、包括的又は非制限的であり、挙げられていない追加の要素又は方法ステップを排除しない。
【０１７８】
本明細書で使用する場合の用語「又はそれらの組合せ」は、その用語に先立つ列挙項目のあらゆる順列及び組合せを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ又はそれらの組合せ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ又はＡＢＣの少なくとも１つを含み、特定の文脈において順序が重要な場合、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ又はＣＡＢの少なくとも１つを含むことも意図している。この例を続ければ、１又は複数の項目又は用語の繰返しを含有する、ＢＢ、ＡＡＡ、ＭＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなどの組合せも、明らかに含まれる。当業者であれば、文脈からそうではないことが明らかでない限り、任意の組合せにおいて項目又は用語の数に制限が通常ないことは理解されよう。
【０１７９】
本明細書に開示し、主張する組成物及び／又は方法はすべて、本開示に照らせば過度の実験をせずに作製し、実行することができる。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態に関して説明してきたが、組成物及び／又は方法に対して、並びに本明細書に記載の方法のステップ又は一連のステップにおいて、本発明の概念、趣旨及び範囲から逸脱せずに変更を加え得ることは、当業者には明らかとなろう。当業者には明らかなそのようなすべての類似した代用及び改変は、付随する特許請求の範囲に規定するような本発明の趣旨、範囲及び概念に入ると見なされる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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