(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）で表されるベンズアミド誘導体を含むヒドロゲル化剤。
【化１】
0005604714.tif 000013
（式中で、ｋ１は０から４までの整数を、ｍ１は１から１００までの整数を、ｎ１は１から６までの整数を表す。また、Ｒ１は酸素原子を介して結合した炭素数８から２２までの炭化水素基を、Ｒ２はＨ、又は、酸素原子を介して結合した炭素数１から２２までの炭化水素基を、Ｒ３はＨ、又は、酸素原子を介して結合した炭素数１から２２までの炭化水素基を表し、Ｒ２とＲ３は同時にＨではない。）
【請求項２】
請求項１に記載のヒドロゲル化剤と水とを含むヒドロゲル。
【請求項３】
式（１）で表されるベンズアミド誘導体と、式（２）で表されるベンズアミド誘導体とを含むヒドロゲル化剤。
【化２】
0005604714.tif 000014
（式中で、ｋ１は０から４までの整数を、ｍ１は１から１００までの整数を、ｎ１は１から６までの整数を表す。また、Ｒ１は酸素原子を介して結合した炭素数８から２２までの炭化水素基を、Ｒ２はＨ、又は、酸素原子を介して結合した炭素数１から２２までの炭化水素基を、Ｒ３はＨ、又は、酸素原子を介して結合した炭素数１から２２までの炭化水素基を表し、Ｒ２とＲ３は同時にＨではない。）
【化３】
0005604714.tif 000015
（式中で、ＸはＯＨ又はＮＨ２を、ｋ２は０から４までの整数を、ｍ２は１から１００までの整数を、ｎ２は１から６までの整数を表す。また、Ｒ４は酸素原子を介して結合した炭素数８から２２までの炭化水素基を、Ｒ５はＨ、又は、酸素原子を介して結合した炭素数１から２２までの炭化水素基を、Ｒ６はＨ、又は、酸素原子を介して結合した炭素数１から２２までの炭化水素基を表し、Ｒ５とＲ６は同時にＨではない。）
【請求項４】
請求項３に記載のヒドロゲル化剤と水とを含むヒドロゲル。
【請求項５】
式（３）で表されるベンズアミド誘導体。
【化４】
0005604714.tif 000016
（式中で、ｋ１は０から４までの整数を、ｍ１は７から１００までの整数を、ｎ１は２から６までの整数を表す。また、Ｒ１及びＲ３は酸素原子を介して結合した炭素数１２から１８までの炭化水素基を、Ｒ２はＨ、又は、酸素原子を介して結合した炭素数１から１８までの炭化水素基を表す。）
【請求項６】
請求項５に記載のベンズアミド誘導体を含むヒドロゲル化剤。
【請求項７】
請求項６に記載のヒドロゲル化剤と水とを含むヒドロゲル。
【請求項８】
式（３）で表されるベンズアミド誘導体と、式（４）で表されるベンズアミド誘導体とを含むヒドロゲル化剤。
【化５】
0005604714.tif 000017
（式中で、ｋ１は０から４までの整数を、ｍ１は７から１００までの整数を、ｎ１は２から６までの整数を表す。また、Ｒ１及びＲ３は酸素原子を介して結合した炭素数１２から１８までの炭化水素基を、Ｒ２はＨ、又は、酸素原子を介して結合した炭素数１から１８までの炭化水素基を表す。）
【化６】
0005604714.tif 000018
（式中で、ＸはＯＨ又はＮＨ２を、ｋ２は０から４までの整数を、ｍ２は７から１００までの整数を、ｎ２は２から６までの整数を表す。また、Ｒ４及びＲ６は酸素原子を介して結合した炭素数１２から１８までの炭化水素基を、Ｒ５はＨ、又は、酸素原子を介して結合した炭素数１から１８までの炭化水素基を表す。）
【請求項９】
請求項８に記載のヒドロゲル化剤と水とを含むヒドロゲル。
【請求項１０】
請求項２、４、７又は９に記載のヒドロゲルであって、昇温によるゾルからゲルへの転移温度が１０℃以上４０℃以下である上記ヒドロゲル。
【請求項１１】
式（５）で表されるベンズアミド誘導体と式（６）で表されるベンズアミド誘導体とを含むヒドロゲル化剤。
【化７】
0005604714.tif 000019
（式中で、ｋ１は０、ｍ１は４２〜４５、ｎ１は２であり、Ｒ１はＯＣ１４Ｈ２９、Ｒ２はＯＣＨ３、Ｒ３はＯＣ１４Ｈ２９である。）
【化８】
0005604714.tif 000020
（式中で、ＸはＯＨ、ｋ２は０、ｍ２は４２〜４５、ｎ２は２であり、Ｒ４はＯＣ１４Ｈ２９、Ｒ５はＯＣＨ３、Ｒ６はＯＣ１４Ｈ２９である。）
【請求項１２】
請求項１１に記載のヒドロゲル化剤と水を含む、昇温によるゾルからゲルへの転移温度が１０℃以上４０℃以下であるヒドロゲル。
【請求項１３】
昇温によるゾルからゲルへの転移温度が２０℃以上３５℃以下である請求項１２記載のヒドロゲル。
【請求項１４】
請求項１０、１２、又は１３記載のヒドロゲルを用いる細胞の培養方法。
【請求項１５】
請求項２、４、７又は９に記載のヒドロゲルであって、降温によるゾルからゲルへの転移温度が−５℃以上３５℃以下であるヒドロゲル。
【請求項１６】
式（７）で表されるベンズアミド誘導体と式（８）で表されるベンズアミド誘導体を含むヒドロゲル化剤。
【化９】
0005604714.tif 000021
（式中で、ｋ１は０、ｍ１は２９〜３２、ｎ１は２であり、Ｒ１はＯＣ１４Ｈ２９、Ｒ２はＯＣＨ３、Ｒ３はＯＣ１４Ｈ２９である。）
【化１０】
0005604714.tif 000022
（式中で、ＸはＯＨ、ｋ２は０、ｍ２は２９〜３２、ｎ２は２であり、Ｒ４はＯＣ１４Ｈ２９、Ｒ５はＯＣＨ３、Ｒ６はＯＣ１４Ｈ２９である。）
【請求項１７】
請求項１６に記載のヒドロゲル化剤と水を含む、降温によるゾルからゲルへの転移温度が−５℃以上３５℃以下であるヒドロゲル。
【請求項１８】
降温によるゾルからゲルへの転移温度が０℃以上２０℃以下である請求項１７記載のヒドロゲル。
【請求項１９】
請求項１５、１７又は１８記載のヒドロゲルを用いる細胞の保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な化学構造及び組成を有するヒドロゲル化剤、及び、それらに基くヒドロゲルに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
低分子ゲルは、低分子化合物が分子間力による自己組織化により３次元ネットワークを形成することによって、溶媒分子を捕捉したゲルである（例えば、非特許文献１参照）。【０００３】
低分子ゲルは、ゲルを形成する低分子化合物の分子設計が可能なことから、分離膜、センサー、触媒、電子材料、バイオ素材等、様々な分野への応用が期待されている（例えば、非特許文献２参照）。【０００４】
我々も、新規な構造を有する３，４，５−長鎖アルキルオキシベンズアミド誘導体を合成し（特許文献１参照）、その一部の化合物が有機溶媒をゲル化することを見出し、さらに、その化学構造を改変することでゲル化能が高まることを見出している（特許文献２参照）。【０００５】
しかし、バイオ素材への応用を考えた場合、有機溶媒をゲル化したオルガノゲルよりも、水をゲル化したヒドロゲルが望ましいことは明らかであるが、低分子が形成するヒドロゲルの報告は少ない（例えば、非特許文献３参照）。また、得られたヒドロゲルをバイオ素材として利用する場合、ヒドロゲル自体が生体適合性を持つことが望ましいが、こうした観点からの報告は数少ない。【０００６】
我々は、これまでに、エチレングリコールのオリゴマー又はポリマー誘導体を結合した３，４，５−長鎖アルキルオキシベンズアミド誘導体を合成し、これらの化合物が医療用材料等に生体適合性を付与する目的で使用できること（特許文献３参照）、また、これらの化合物が有機溶媒をゲル化すること（特許文献４参照）を開示したばかりでなく、さらに、これらの化合物がヒドロゲルを形成することを見出した（特許文献５、６参照）。しかし、目的や用途に応じてヒドロゲルの物性や調製法等を最適化するために、さらに新規な分子構造を有するヒドロゲル化剤の開発が望まれている。【０００７】
近年の幹細胞研究の進歩により、ヒドロゲルの細胞培養への応用が注目されている（例えば、非特許文献４参照）。ヒドロゲルを細胞培養に用いる場合、細胞を培養する温度でヒドロゲルを形成する必要がある。特に、室温付近より低温で溶液状態（ゾル）で、細胞培養温度でゲル化するヒドロゲルは、細胞培養後に温度を下げることにより培養した細胞を回収できることから、有用性が高い（例えば、特許文献７参照）。また、細胞保存に用いる場合は、逆に、室温付近から細胞培養温度で液体状態（ゾル）で、細胞保存温度でゲル化するヒドロゲルが好ましい。その様なゲル化挙動の制御が可能なヒドロゲルが望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００１−１２２８８９号公報
【特許文献２】特開２００４−２６２８０９号公報
【特許文献３】特開２００５−２３２０６１号公報
【特許文献４】特開２００５−２３２２７８号公報
【特許文献５】特開２００７−２１７５５１号公報
【特許文献６】特開２００９−８４２７２号公報
【特許文献７】特開平６−１４１８５１号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ケミカル・レビュー（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．）、１９９７年、９７巻、ｐ．３１３３−３１５９
【非特許文献２】アンゲバンテ・ヘミー・インターナショナル・エディション（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．）、２０００年、３９巻、ｐ．２２６３−２２６６
【非特許文献３】ケミカル・レビュー（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．）、２００４年、１０４巻、ｐ．１２０１−１２１７
【非特許文献４】ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２００９年、４６２巻、ｐ．４３３−４４１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、新規な化学構造及び組成を有するヒドロゲル化剤、及び、それらに基くヒドロゲルを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、式（０）で表されるエチレングリコールのオリゴマー又はポリマーを結合し、長鎖アルキルオキシ基を有するベンズアミド誘導体が、ヒドロゲルを形成することを見出し、その誘導体合成を行ってきた（特開２００９−８４２７２号公報）。
今回本発明者らは、新たに式（１）で表されるエチレングリコールのオリゴマー又はポリマーを介して両末端にベンズアミド誘導体を結合した化合物を別途合成し、そのヒドロゲル形成の挙動を確認すると、式（０）で表される化合物とは全く異なる挙動を示し、さらに、両者を混合することによりゲル化の温度、ゲルの強度を制御できることを見出して、本発明を完成するに至った。
【化１】
0005604714.tif 000002
（式中で、ｋ１は０から４までの整数を、ｍ１は１から１００までの整数を、ｎ１は１から６までの整数を表す。また、Ｒ１は酸素原子を介して結合した炭素数８から２２までの炭化水素基を、Ｒ２はＨ、又は、酸素原子を介して結合した炭素数１から２２までの炭化水素基を、Ｒ３はＨ、又は、酸素原子を介して結合した炭素数１から２２までの炭化水素基を表し、Ｒ２とＲ３は同時にＨではない。）【００１２】
【化２】
0005604714.tif 000003
（式中で、ＸはＯＨ又はＮＨ２を、ｋ２は０を、ｍ２は１０から１００までの整数を、ｎ２は２を表す。また、Ｒ４とＲ６は酸素原子を介して結合した炭素数１２から１８までの炭化水素基を、Ｒ５は酸素原子を介して結合した炭素数１から１８までの炭化水素基を表し、Ｒ４とＲ５は異なる炭化水素基である。）
すなわち、本発明は、式（１）で表されるベンズアミド誘導体を提供し、該誘導体を含むヒドロゲル化剤、及びそのヒドロゲル化剤と水を含んでなるヒドロゲルを提供する。【００１３】
【化３】
0005604714.tif 000004
（式中で、ｋ１は０から４までの整数を、ｍ１は１から１００までの整数を、ｎ１は１から６までの整数を表す。また、Ｒ１は酸素原子を介して結合した炭素数８から２２までの炭化水素基を、Ｒ２はＨ、又は、酸素原子を介して結合した炭素数１から２２までの炭化水素基を、Ｒ３はＨ、又は、酸素原子を介して結合した炭素数１から２２までの炭化水素基を表し、Ｒ２とＲ３は同時にＨではない。）
また、本発明は式（１）で表されるベンズアミド誘導体と、式（２）で表されるベンズアミド誘導体とを含むヒドロゲル化剤:【００１４】
【化４】
0005604714.tif 000005
（式中で、ＸはＯＨ又はＮＨ２を、ｋ２は０から４までの整数を、ｍ２は１から１００までの整数を、ｎ２は１から６までの整数を表す。また、Ｒ４は酸素原子を介して結合した炭素数８から２２までの炭化水素基を、Ｒ５はＨ、又は、酸素原子を介して結合した炭素数１から２２までの炭化水素基を、Ｒ６はＨ、又は、酸素原子を介して結合した炭素数１から２２までの炭化水素基を表し、Ｒ５とＲ６は同時にＨではない。）
を提供し、また、そのヒドロゲル化剤と水とを含んでなるヒドロゲルを提供する。
また、本発明は、式（３）で表されるベンズアミド誘導体：【００１５】
【化５】
0005604714.tif 000006
（式中で、ｋ１は０から４までの整数を、ｍ１は７から１００までの整数を、ｎ１は２から６までの整数を表す。また、Ｒ１及びＲ３は酸素原子を介して結合した炭素数１２から１８までの炭化水素基を、Ｒ２はＨ、又は、酸素原子を介して結合した炭素数１から１８までの炭化水素基を表す。）
を提供し、該誘導体を含むヒドロゲル化剤、及びそのヒドロゲル化剤と水とを含んでなるヒドロゲルを提供する。【００１６】
また本発明は、式（３）で表されるベンズアミド誘導体と、式（４）で表されるベンズアミド誘導体とを含むヒドロゲル化剤：【００１７】
【化６】
0005604714.tif 000007
【００１８】
（式中で、ＸはＯＨ又はＮＨ２を、ｋ２は０から４までの整数を、ｍ２は７から１００までの整数を、ｎ２は２から６までの整数を表す。また、Ｒ４及びＲ６は酸素原子を介して結合した炭素数１２から１８までの炭化水素基を、Ｒ５はＨ、又は、酸素原子を介して結合した炭素数１から１８までの炭化水素基を表す。）
を提供し、また、そのヒドロゲル化剤と水とを含んでなるヒドロゲルを提供する。【００１９】
また、本発明は、式（１）で表されるベンズアミド誘導体を含むヒドロゲル、式（１）で表されるベンズアミド誘導体と式（２）で表されるベンズアミド体を含むヒドロゲル、式（３）で表されるベンズアミド誘導体を含むヒドロゲル、または式（３）で表されるベンズアミド誘導体と式（４）で表されるベンズアミド体を含むヒドロゲルであって、昇温によるゾルからゲルへの転移温度が１０℃以上４０℃以下であるヒドロゲル、及び、そのヒドロゲルを用いる細胞の培養方法を提供する。【００２０】
特に、式（５）で表されるベンズアミド誘導体と式（６）で表されるベンズアミド誘導を含むヒドロゲル化剤、及び、そのヒドロゲル化剤と水を含み、昇温によるゾルからゲルへの転移温度が１０℃以上４０℃以下、好ましくは、２０℃以上３５℃以下であるヒドロゲル、そのヒドロゲルを用いる細胞の培養方法を提供する。【００２１】
【化７】
0005604714.tif 000008
【００２２】
（式中で、ｋ１は０、ｍ１は４２〜４５、ｎ１は２であり、Ｒ１はＯＣ１４Ｈ２９、Ｒ２はＯＣＨ３、Ｒ３はＯＣ１４Ｈ２９である。）
【００２３】
【化８】
0005604714.tif 000009
（式中で、ＸはＯＨ、ｋ２は０、ｍ２は４２〜４５、ｎ２は２であり、Ｒ４はＯＣ１４Ｈ２９、Ｒ５はＯＣＨ３、Ｒ６はＯＣ１４Ｈ２９である。）
【００２４】
また、本発明は、式（１）で表されるベンズアミド誘導体を含むヒドロゲル、式（１）で表されるベンズアミド誘導体と式（２）で表されるベンズアミド体を含むヒドロゲル、式（３）で表されるベンズアミド誘導体を含むヒドロゲル、または式（３）で表されるベンズアミド誘導体と式（４）で表されるベンズアミド体を含むヒドロゲルであって、降温によるゾルからゲルへの転移温度が−５℃以上３５℃以下であるヒドロゲル、及び、それを用いる細胞の保存方法を提供する。【００２５】
特に、式（７）で表されるベンズアミド誘導体と式（８）で表されるベンズアミド誘導体を含むヒドロゲル化剤、及び、そのヒドロゲル化剤と水を含み、降温によるゾルからゲルへの転移温度が−５℃以上３５℃以下、好ましくは、０℃以上２０℃以下であるヒドロゲル、及び、そのヒドロゲルを用いる細胞の保存方法を提供する。【００２６】
【化９】
0005604714.tif 000010
（式中で、ｋ１は０、ｍ１は２９〜３２、ｎ１は２であり、Ｒ１はＯＣ１４Ｈ２９、Ｒ２はＯＣＨ３、Ｒ３はＯＣ１４Ｈ２９である。）
【００２７】
【化１０】
0005604714.tif 000011
（式中で、ＸはＯＨ、ｋ２は０、ｍ２は２９〜３２、ｎ２は２であり、Ｒ４はＯＣ１４Ｈ２９、Ｒ５はＯＣＨ３、Ｒ６はＯＣ１４Ｈ２９である。）
【発明の効果】
【００２８】
本発明は、分子の自己組織化により、エチレングリコールのオリゴマー又はポリマーを部分構造とする化合物がヒドロゲル化する分子種に、新たな分子構造の多様性を加えるものであり、細胞の３次元培養等に適している。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】実施例１で得られたヒドロゲル化剤が与えるヒドロゲルの粘弾性測定結果。
【図２】実施例３で得られたヒドロゲル化剤が与えるヒドロゲルの粘弾性測定結果。
【図３】実施例５で得られたヒドロゲル化剤が与えるヒドロゲルの粘弾性測定結果。
【図４】実施例３と実施例５で得られたヒドロゲル化剤の混合物（ヒドロゲル化剤濃度：２０ｗｔ％）が与えるヒドロゲルの粘弾性測定結果。
【図５】実施例３と実施例５で得られたヒドロゲル化剤の混合物（ヒドロゲル化剤濃度：１０ｗｔ％）が与えるヒドロゲルの粘弾性測定結果。
【図６】実施例３と実施例５で得られたヒドロゲル化剤の混合物（ヒドロゲル化剤濃度：５ｗｔ％）が与えるヒドロゲルの粘弾性測定結果。
【図７】実施例７と同様の合成法で得られたヒドロゲル化剤が与えるヒドロゲルの粘弾性測定結果。式（１）に相当する化合物と式（２）に相当する化合物の比が約０．４８：１のもの。
【図８】実施例１１と同様の合成法で得られたヒドロゲル化剤が与えるヒドロゲルの粘弾性測定結果。式（１）に相当する化合物と式（２）に相当する化合物の比が約０．１６：１のもの。
【図９】実施例１１と同様の方法で得られたヒドロゲル化剤が与えるヒドロゲルの粘弾性測定結果。式（１）に相当する化合物と式（２）に相当する化合物の比が約０．４５：１のもの。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は、下記式（９）で表されるベンズアミド誘導体に関する。
【化１１】
0005604714.tif 000012
（式中で、ｋ１は０から４までの整数を、ｍ１は１から、好ましくは７から、１００までの整数を、ｎ１は１から、好ましくは２から、６までの整数を表す。また、Ｒ１は酸素原子を介して結合した炭素数８から２２まで、好ましくは１２から１８までの炭化水素基を、Ｒ２はＨ、又は、酸素原子を介して結合した炭素数１から２２まで、好ましくは１８までの炭化水素基を、Ｒ３はＨ、又は、酸素原子を介して結合した炭素数１から２２まで、好ましくは１８までの炭化水素基を表し、Ｒ２とＲ３は同時にＨではない。また、好ましくはＲ１及びＲ３は酸素原子を介して、結合した炭素数１２から１８までの炭化水素基を、Ｒ２はＨ、又は酸素原子を介して結合した炭素数１から１８までの炭化水素基を表す。
【００３１】
以下、式（１）、式（３）、式（５）、式（７）又は式（９）で表される両端にベンズアミド基を有する化合物を「両端アミド型化合物」若しくは「両端アミド体」、式（２）、式（４）、式（６）、又は式（８）で表される一端のみにベンズアミド基を有する化合物を「片端アミド型化合物」若しくは「片端アミド体」とも言う。
【００３２】
なお、室温付近でのヒドロゲル形成の観点からｍ１は７以上、Ｒ１の炭素数は１２から１８まで、Ｒ２とＲ３の炭素数は１８以下が好ましく、合成工程の観点からｎ１は２以上が好ましい。
【００３３】
式（１）で表されるベンズアミド誘導体は、例えば、酸素を介して炭化水素基と結合した安息香酸誘導体とエチレングリコールのオリゴマー又はポリマーの両端アミン誘導体とをアミド縮合することによって得られる。縮合には、例えば、カルボジイミド誘導体等の縮合剤を用いることができるし、安息香酸誘導体の酸無水物、酸塩化物、活性化エステル等を用いることもできる。
【００３４】
その際、ｋ１とｎ１は下に記載のエチレングリコールのオリゴマー又はポリマーの両端がアミノ化された誘導体の合成法に準じて調整が可能である。また、原料あるいは反応条件等によっては、両端にベンズアミド基を有する化合物と、一端にのみベンズアミド基を有する化合物との混合物が生成することもあるが、その場合でも当該混合物から、必要に応じて公知の分取方法、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより、一方を分取するか、又は、一方の割合を高めた組成物を得ることが可能である。
【００３５】
エチレングリコールのオリゴマー又はポリマーの両端がアミノ化された誘導体は、例えば、市販のエチレングリコールのオリゴマー又はポリマーの両端を、順次、トシル化又はメシル化、トシル基又はメシル基のヨウ素化、ヨウ素基のフタルイミドへの変換、ヒドラジンによる脱保護によって得られる。あるいは、トシル化又はメシル化に続いて、トシル基又はメシル基のアジド化、それに引き続く還元によっても同様の化合物が得られる。特に、エチレングリコールのオリゴマー又はポリマーをメシル化することにより、その両端にアミノ基を導入した化合物を得ることが容易となる（ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカルソサエティ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、２００９年、１３１巻、ｐ．２１１０−２１１２）。
【００３６】
また、市販で入手できない長さのオリゴマーについては、オリゴエチレングリコールの一端を保護し、他の一端をトシル化して、合計が必要な長さとなるオリゴエチレングリコールと縮合の後、脱保護して得られる化合物（ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）、２００４年、６９巻、ｐ．６３９−６４７）の両端を、順次、トシル化又はメシル化、トシル基又はメシル基のヨウ素化、ヨウ素基のフタルイミドへの変換、ヒドラジンによる脱保護によって得られる（バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９８０年、１９巻、ｐ．４５９５−４６００）。
【００３７】
３位、４位、及び５位に酸素原子を介して同じ炭化水素基を結合した安息香酸誘導体は、３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸エステルをエーテル化の後、エステルを加水分解することによって得られる。
【００３８】
５位が水素で、３位と４位に酸素原子を介して同じ炭化水素基を結合した安息香酸誘導体は、３，４−ジヒドロキシ安息香酸エステルを原料に、３位と４位を同時にエーテル化した後、エステルを加水分解することによって得られる。また、３位と４位に酸素原子を介して異なる炭化水素基を結合した安息香酸誘導体は、例えば、３位と４位の反応性の違いを利用して、４位を選択的にエーテル化し、続いて、３位を４位とは異なる炭化水素基によってエーテル化した後、エステルを加水分解することによって得られる。
【００３９】
５位に酸素原子を介して３位と４位とは異なる炭化水素基を有する安息香酸誘導体は、例えば、３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸エステルの３位と４位をボロン酸誘導体の選択的な架橋を用いて保護し、５位をエーテル化の後、該ボロン酸誘導体を脱保護し、上記と同様の方法で、３位と４位のエーテル化と、それに続くエステルの加水分解によって得られる。
【００４０】
４位が水素で、３位と５位に酸素原子を介して同じ炭化水素基を結合した安息香酸誘導体は、３，５−ジヒドロキシ安息香酸エステルを原料に、３位と５位を同時にエーテル化した後、エステルを加水分解することによって得られる。また、３位と５位に酸素原子を介して異なる炭化水素基を有する安息香酸誘導体は、例えば、エーテル化の際の炭化水素化剤の当量を抑えて、片側がエーテル化されたものを単離し、残りの水酸基を異なる炭化水素化剤でエーテル化した後、エステルを加水分解することによって得られる。
【００４１】
４位に酸素原子を介して３位と５位とは異なる炭化水素基を有する安息香酸誘導体は、例えば、３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸エステルの４位の反応性の差を利用して、まず、４位をエーテル化の後、上記と同様の方法で、３位と５位のエーテル化と、それに続くエステルの加水分解によって得られる。
【００４２】
式（１）で表される両端アミド型化合物は、単独でヒドロゲル化剤として用いることができ、あるいは、例えば、式（２）で表される片端アミド型化合物との混合物でヒドロゲル化剤（以下、「混合ヒドロゲル化剤」とも言う。）として用いることができる。なお、混合物の場合、式（２）で表されるベンズアミド誘導体は式（１）で表されるベンズアミド誘導体と同じ合成ルートを経て合成することができるが、両者を各々単独で合成して両者を混合してもよいし、あるいは前者又は後者の合成過程で両者が混合物として得られればそれを混合物として用いてもよい。
【００４３】
混合ヒドロゲル化剤は、式（１）で表される両端アミド型化合物と式（２）で表される片端アミド型化合物とを任意の混合比で組合せることができるが、顕著な両端アミド型化合物混合の効果を得るには、両端アミド体：片端アミド体＝１：８より両端アミド体が多い混合比が好ましい。
【００４４】
ヒドロゲルは、式（１）で表されるベンズアミド誘導体を有効成分として含むヒドロゲル化剤、又は式（１）及び式（２）で表されるベンズアミド誘導体の混合物を有効成分として含むヒドロゲル化剤を、適当量、水に懸濁させ、そのままヒドロゲルを用いる温度まで加熱するか、又は、一旦、ヒドロゲル化剤が溶解する温度まで加熱の後、室温まで冷却するか、その冷却後再度加熱するか、若しくは、その冷却後さらに低い温度まで冷却することによって製造することができるが、ヒドロゲルの調製方法はこれらに限定されない。
ヒドロゲルにおけるヒドロゲル化剤の割合は、ヒドロゲル形成能とコストの観点から、０．５〜２５ｗｔ％の範囲内であることが好ましい。また、ヒドロゲルにおける水の割合は７５〜９９．５ｗｔ％の範囲内であることが好ましい。また、ヒドロゲル形成能に大きな影響を与えない範囲でヒドロゲル化剤と水以外の成分、例えば防腐剤、を添加してもよい。
【００４５】
式（１）で表される両端アミド型化合物と式（２）で表される片端アミド型化合物との混合比を調節することによって、ゲル化の転移温度を制御することが可能になる。例えば、式（１）においてｋ１＝０、ｍ１＝４２〜４５、ｎ１＝２、Ｒ１＝Ｒ３＝ＯＣ１４Ｈ２９、Ｒ２＝ＯＣＨ３である両端アミド型化合物１と、その両端アミド型化合物１と式（２）においてＸ＝ＮＨ２、ｋ２＝０、ｍ２＝４２〜４５、ｎ２＝２、Ｒ４＝Ｒ６＝ＯＣ１４Ｈ２９、Ｒ５＝ＯＣＨ３である片端アミド型化合物１との約１：８の混合物１（片端アミド：両端アミド＝８９：１１）とを、１：３で含むヒドロゲル化剤１（片端アミド：両端アミド＝６７：３３）は、１０ｗｔ％の濃度で、混合物１では５２℃であったゲル転移温度を４０℃に低下させることができる（実施例６）。
また、ヒドロゲル化剤の濃度を下げることによって、降温ゲル化の転移温度を下げることが可能になる。例えば、式（１）においてｋ１＝０、ｍ１＝２９〜３２、ｎ１＝２、Ｒ１＝Ｒ３＝ＯＣ１４Ｈ２９、Ｒ２＝ＯＣＨ３である両端アミド型化合物２と、式（２）においてＸ＝ＯＨ、ｋ２＝０、ｍ２＝２９〜３２、ｎ２＝２、Ｒ４＝Ｒ６＝ＯＣ１４Ｈ２９、Ｒ５＝ＯＣＨ３である片端アミド型化合物２とを、０．４８：１で含むヒドロゲル化剤２は、８ｗｔ％の濃度で５２℃であったゲル転位温度（低温側ゲル、高温側ゾル）を、２ｗｔ％の濃度とすることによって３２℃に低下させることができる（実施例８）。
【００４６】
また、ヒドロゲル化剤の濃度を上げることによって、昇温ゲル化の転移温度を下げることが可能になる。例えば、式（１）においてｋ１＝０、ｍ１＝４２〜４５、ｎ１＝２、Ｒ１＝Ｒ３＝ＯＣ１４Ｈ２９、Ｒ２＝ＯＣＨ３である両端アミド型化合物１と、式（２）においてＸ＝ＯＨ、ｋ２＝０、ｍ２＝４２〜４５、ｎ２＝２、Ｒ４＝Ｒ６＝ＯＣ１４Ｈ２９、Ｒ５＝ＯＣＨ３である片端アミド型化合物１とを、０．４５：１で含むヒドロゲル化剤３は、８ｗｔ％の濃度で４１℃であったゲル転位温度（低温側ゾル、高温側ゲル）を、１５ｗｔ％の濃度にすることによって２３℃に低下させることができる（実施例１２）。
このように、両端アミド型化合物と片端アミド型化合物の組成比、ヒドロゲル剤の濃度を適宜変えることにより、望ましいゲル転移温度を有するヒドロゲルを得ることができる。
【００４７】
本発明の提供するヒドロゲルは、細胞の培養や保存に使用できるが、ここで、「細胞」とは、「単独の細胞に分けられた細胞」、「細胞の凝集体」、「細胞からなる組織の一部」、「細胞からなる組織」等の意味を包含している。
【００４８】
細胞の培養は、細胞を培養する温度でゲル化しているヒドロゲル上で行うこともできるし、あるいは、低温でゾルである場合には、ゾル状態で細胞を播種して、細胞培養温度でゲル化させて細胞をヒドロゲル内に封入した形で行うことも可能である。ヒドロゲル上で培養を行った場合には、表面から細胞を剥離することにより、ヒドロゲル内で培養を行った場合には温度を下げて、ヒドロゲルをゾル化させることにより、培養した細胞を分離・回収することが可能である。
【００４９】
例えば、式（５）で表される両端アミド型化合物と式（６）で表される片端アミド型化合物とを含む混合ヒドロゲル化剤の組成比、及び該ヒドロゲル化剤と水を含むヒドロゲルの組成比を、昇温によるゾルからゲルへの転移温度が室温（２５℃）付近となるように選択することが可能であり、このヒドロゲルを用いて上記の細胞培養方法が実現できる。
【００５０】
具体的には、例えば、式（１）においてｋ１＝０、ｍ１＝４２〜４５、ｎ１＝２、Ｒ１＝Ｒ３＝ＯＣ１４Ｈ２９、Ｒ２＝ＯＣＨ３である両端アミド型化合物と、式（２）においてＸ＝ＯＨ、ｋ２＝０、ｍ２＝４２〜４５、ｎ２＝２、Ｒ４＝Ｒ６＝ＯＣ１４Ｈ２９、Ｒ５＝ＯＣＨ３である片端アミド型化合物とを、０．４５：１で含むヒドロゲル化剤は、１５ｗｔ％の濃度で、２３℃付近にゲル転移温度を有し、高温側の動物細胞の培養に適した３７℃ではゲル、低温側では細胞回収に適したゾルとなる（実施例１２）。
【００５１】
細胞の保存には、降温によりゾルからゲルへ転移するヒドロゲル化剤を用いる。例えば、細胞の上にゾル状態のヒドロゲル化剤溶液を注ぎ、温度を冷やしてゲル化させることにより、あるいは、柔らかいヒドロゲル中に細胞を混入することにより、あるいは、細胞を室温から細胞培養温度までのゾル状態で細胞を播種した後、温度を下げて、ヒドロゲル化することによって細胞の保存を行うことができる。ヒドロゲル下で保存した細胞は、ヒドロゲルを物理的に取り去るか、あるいは、培養液で希釈することにより、回収することができる。ヒドロゲル中で保存した細胞は、ヒドロゲルを培養液で希釈するか、温度を上げてゾル化させることによって回収することができる。
【００５２】
例えば、式（７）で表される両端アミド型化合物と式（８）で表される片端アミド型化合物とを含む混合ヒドロゲル化剤の組成比、及び該ヒドロゲル化剤と水を含むヒドロゲルの組成比を、降温によるゾルからゲルへの転移温度が室温（２５℃）付近となるように選択することが可能であり、このヒドロゲルを用いて上記の細胞培養方法が実現できる。
具体的には、例えば、式（１）においてｋ１＝０、ｍ１＝２９〜３２、ｎ１＝２、Ｒ１＝Ｒ３＝ＯＣ１４Ｈ２９、Ｒ２＝ＯＣＨ３である両端アミド型化合物と、式（２）においてＸ＝ＯＨ、ｋ２＝０、ｍ２＝２９〜３２、ｎ２＝２、Ｒ４＝Ｒ６＝ＯＣ１４Ｈ２９、Ｒ５＝ＯＣＨ３である片端アミド型化合物とを、０．４８：１で含むヒドロゲル化剤は、２ｗｔ％の濃度で、３７℃ではゾル、３０℃以下ではゲルとなる特性を示し、３０℃以下の低温ではゲル中に細胞を保存でき、細胞培養温度の３７℃で細胞を回収する細胞保存法が実現できる（実施例８）。
【００５３】
以下に、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の記述に限定されるものではない。
【００５４】
なお、以下において、ＥＤＣ・ＨＣｌは水溶性カルボジイミド塩酸塩の、ＨＯＢｔは１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物の、ＰＥＧはポリエチレングリコールの略号である。
【実施例】
【００５５】
＜実施例１＞
（式（１）で、ｋ１＝０、ｍ１＝２９〜３２、ｎ１＝２、Ｒ１＝Ｒ３＝ＯＣ１４Ｈ２９、Ｒ２＝ＯＣＨ３で表される両端アミド型化合物の合成）
分子量１５４０のＰＥＧを原料に、文献（ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカルソサエティ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、２００９年、１３１巻、ｐ．２１１０−２１１２）の方法に従って、両末端の水酸基のメシル化、それに続くアジド化、アジドの還元を経て得られた分子量１５４０のＰＥＧジアミン（80.0g, 52.0mmol）を塩化メチレン（350ml）に溶解した後、トリエチルアミンを加えて、ｐＨ６に調整した。その溶液に、文献（オーガニック・レターズ（Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．）、２００４年、６巻、ｐ．４１７１−４１７４）の方法に従って、３，５−ビス（テトラデシルオキシ）−４−メトキシ安息香酸（バイオオーガニック・メディシナル・ケミストリー（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．）、２００２年、１０巻、ｐ．４０１３−４０２２）と塩化チオニルとの反応で得られた酸塩化物（65.0g, 109mmol）の塩化メチレン溶液（350ml）を２０分使って滴下した。トリエチルアミンを追加してｐＨ９付近に保ったまま、さらに、室温で２時間、撹拌を行った。反応液を１Ｎ塩酸、飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去し、さらに活性炭処理を行い、目的化合物（116.7g, 収率84%)を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ = 7.02 (4H, s, 2,6-H), 6.92 (2H, br-t, NH), 4.02 (8H, t, J = 6.6 Hz, 3,5-OCH2), 3.84 (6H, s, 4-OCH3), 3.70〜3.55 (〜128H, m, CH2OCH2), 1.80 (8H, quintet, J = 7.6 Hz, 3,5-OCCH2), 1.44 (8H, quintet, J = 7.2 Hz, 3,5-OC2CH2), 1.36〜1.22 (80H, m, 3,5-OC3C10H20), 0.86 (12H, t, J = 6.8 Hz, 3,5-OC13CH3)。【００５６】
＜実施例２＞
（実施例１で得られた両端アミド型化合物の粘弾性測定）
実施例１で得られた両端アミド型化合物のゾル−ゲル転移挙動の解析を行うために試料水溶液の粘弾性測定を行った。試料濃度を５ｗｔ％、１０ｗｔ％、１５ｗｔ％、２０ｗｔ％にそれぞれ調整し、十分に撹拌した後、冷凍庫で保存した。測定にはＡＲＥＳ−Ｇ２（TA Instruments, Japan）を使用した。５０ｍｍパラレルプレートを用い、周波数は１Ｈｚとした。試料水溶液を０℃から８０℃まで、昇温速度を３℃／分として測定した。
測定結果を図１に示す。図中でＧ′は貯蔵弾性率を、Ｇ″は損失弾性率を表しており、Ｇ′＞Ｇ″がゲル状態、Ｇ′＜Ｇ″がゾル状態、Ｇ′＝Ｇ″がゲル転移点である。【００５７】
この結果、実施例１で得られたヒドロゲル化剤は、少なくとも５ｗｔ％以上の広い濃度範囲でゲル化し、５ｗｔ％の濃度では４８℃以上でのみゲル化するが、他の濃度では広い温度範囲でヒドロゲルを与えることが明らかになった。
＜実施例３＞
（式（１）で、ｋ１＝０、ｍ１＝４２〜４５、ｎ１＝２、Ｒ１＝Ｒ３＝ＯＣ１４Ｈ２９、Ｒ２＝ＯＣＨ３で表される両端アミド型化合物の合成）
分子量２０００のＰＥＧを原料に、文献（ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカルソサエティ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、２００９年、１３１巻、ｐ．２１１０−２１１２）の方法に従って、両末端の水酸基のメシル化、それに続くアジド化、アジドの還元を経て得られた分子量２０００のＰＥＧジアミン（80.0g,40.0mmol）を塩化メチレン（３５０ｍｌ）に溶解した後、トリエチルアミンを加えて、ｐＨ６に調整した。その溶液に、文献（オーガニック・レターズ（Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．）、２００４年、６巻、ｐ．４１７１−４１７４）の方法に従って、３，５−ビス（テトラデシルオキシ）−４−メトキシ安息香酸と塩化チオニルとの反応で得られた酸塩化物（50.0g,84.1mmol）の塩化メチレン溶液（３５０ｍｌ）を２０分使って滴下した。トリエチルアミンを追加してｐＨ９付近に保ったまま、さらに、室温で２時間、撹拌を行った。反応液を１Ｎ塩酸、飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去し、さらに活性炭処理を行い、目的化合物（１０１．２ｇ，収率８１％）を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ = 7.01 (4H, s, 2,6-H), 6.80 (2H, br-t, NH), 4.02 (8H, t, J = 6.6 Hz, 3,5-OCH2), 3.84 (6H, s, 4-OCH3), 3.70〜3.50 (〜180H, m, CH2OCH2), 1.79 (8H, quintet, J = 7.2 Hz, 3,5-OCCH2), 1.44 (8H, quintet, J = 7.6 Hz, 3,5-OC2CH2), 1.38〜1.20 (80H, m, 3,5-OC3C10H20), 0.87 (12H, t, J = 6.8 Hz, 3,5-OC13CH3)。【００５８】
＜実施例４＞
（実施例３で得られた化合物の粘弾性測定）
実施例３で得られた化合物のゾル−ゲル転移挙動の解析を行うために試料水溶液の粘弾性測定を行った。試料濃度を５ｗｔ％、１０ｗｔ％、１５ｗｔ％、２０ｗｔ％にそれぞれ調整し、実施例２に記載の方法と同様の測定を行った。測定結果を図２に示す。
この結果、実施例３で得られた化合物（ヒドロゲル化剤）は、少なくとも５ｗｔ％以上の広い濃度範囲でゲル化し、また、広い温度範囲でヒドロゲルを与えることが明らかになった。【００５９】
＜実施例５＞
（式（２）で、Ｘ＝ＮＨ２、ｋ２＝０、ｍ２＝４２〜４５、ｎ２＝２、Ｒ４＝Ｒ６＝ＯＣ１４Ｈ２９、Ｒ５＝ＯＣＨ３で表される化合物と、式（１）で、ｋ１＝０、ｍ１＝４２〜４５、ｎ１＝２、Ｒ１＝Ｒ３＝ＯＣ１４Ｈ２９、Ｒ２＝ＯＣＨ３で表される化合物からなる組成物の合成）
文献（オーガニック・レターズ（Org.Lett.）、２００４年、６巻、ｐ．４１７１−４１７４）の方法に従って、３，５−ビス（テトラデシルオキシ）−４−メトキシ安息香酸と塩化チオニルとの反応で得られた酸塩化物（52.4g, 88.1mmol）の塩化メチレン溶液（５２５ｍｌ）に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（10.2g, 88.6mmol）を加え室温で２時間撹拌し、溶媒を蒸去して活性化エステル（７５．２ｇ）を得た。【００６０】
未精製のまま、この活性エステル（５９．３ｇ）をピリジン（３５０ｍｌ）に溶解し、分子量２０００のＰＥＧを原料に、文献（ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカルソサエティ（J.Am.Chem.Soc.）、２００９年、１３１巻、ｐ．２１１０−２１１２）の方法に従って、両末端の水酸基のメシル化、それに続くアジド化、アジドの還元を経て得られた分子量２０００のＰＥＧジアミン（88.0g, 44.0mmol）のピリジン溶液（４００ｍｌ）と混合して、さらに、ジメチルアミノピリジン（528mg, 4.32mmol）を加え、４℃で２時間、さらに、室温で２時間、撹拌を行った。
この反応混合物を、氷冷下、１Ｎ塩酸（１０００ｍｌ）に注ぎ、クロロホルムで抽出した。有機層を１Ｎ塩酸、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去して得た残渣をメタノールに溶解して、ヘキサンで洗浄した。メタノールを留去して目的組成物（４３．９ｇ）を得た。【００６１】
1H-NMR (CDCl3) δ = 7.02 (2H, s, 2,6-H), 6.92 (1H, br-t, NH), 4.02 (4H, t, J = 6.6 Hz, 3,5-OCH2), 3.84 (3H, s, 4-OCH3), 3.70〜3.50 (〜180H, m, CH2OCH2), 1.80 (4H, quintet, J = 7.2 Hz, 3,5-OCCH2), 1.44 (4H, quintet, J = 7.6 Hz, 3,5-OC2CH2), 1.38〜1.20 (40H, m, 3,5-OC3C10H20), 0.86 (6H, t, J = 6.8 Hz, 3,5-OC13CH3)。
ＨＰＬＣ解析（カラム：DAISO PAK SP-200-5-C4-P、カラム温度：４０℃、溶媒：７０−９９％アセトニトリル水溶液、０．１％ＴＦＡ、線形濃度勾配、流速：１．０ｍｌ／分）の結果、この生成物には、式（２）で、Ｘ＝ＮＨ２、ｋ２＝０、ｍ２＝４２〜４５、ｎ２＝２、Ｒ４＝Ｒ６＝ＯＣ１４Ｈ２９、Ｒ５＝ＯＣＨ３で表される片端アミド型化合物と、式（１）で、ｋ１＝０、ｍ１＝４２〜４５、ｎ１＝２、Ｒ１＝Ｒ３＝ＯＣ１４Ｈ２９、Ｒ２＝ＯＣＨ３で表される両端アミド型化合物とがモル比で約８：１で含まれている組成物であることがわかった。【００６２】
＜実施例６＞
（実施例５で得られた組成物、及び該組成物と実施例３で得られた両端アミド型化合物との混合物の粘弾性測定）
実施例５で得られた組成物のゾル−ゲル転移挙動の解析を行うために試料水溶液の粘弾性測定を行った。試料濃度を５ｗｔ％、１０ｗｔ％、１５ｗｔ％、２０ｗｔ％にそれぞれ調整し、実施例２に記載の方法と同様の測定を行った。測定結果を図３に示す。【００６３】
この結果、実施例５で得られた組成物（ヒドロゲル化剤）は、少なくとも５ｗｔ％以上の広い濃度範囲でヒドロゲルを与えることが明らかになった。いずれも、昇温によって、ゾルからゲルに変化するタイプのヒドロゲルで、そのゲル転移点は濃度に依存して、６６℃、５２℃、４４℃、４１℃と低下した。
同様に、実施例３で得られた化合物と実施例５で得られた組成物とを単独又は混合物として粘弾性測定を行った。両者の混合比を０：４、１：３、２：２、３：１、４：０とした試料を調製し、合計の試料濃度を５ｗｔ％、１０ｗｔ％、２０ｗｔ％とした結果を図４から図６に示す。【００６４】
混合により、それぞれ単独のヒドロゲル化剤とは異なった温度挙動を示すヒドロゲル化剤が得られることが明らかになった。特に、実施例５で得られたヒドロゲル化剤のゲル転移温度から見ると、例えば、混合ヒドロゲル化剤の濃度１０ｗｔ％では、実施例５で得られたヒドロゲル化剤単独ではゾルからゲルへの転移温度が５２℃であったものが、実施例３で得られたヒドロゲル化剤を２５％混合することにより、４０℃に低下しており、混合によって、ゲル化温度が制御可能であることが明らかになった。また、Ｇ′に相関するゲルの強度も、混合比により制御可能であることが示された。【００６５】
＜実施例７＞
（式（２）で、Ｘ＝ＯＨ、ｋ２＝０、ｍ２＝２９〜３２、ｎ２＝２、Ｒ４＝Ｒ６＝ＯＣ１４Ｈ２９、Ｒ５＝ＯＣＨ３で表される片端アミド型化合物と、式（１）で、ｋ１＝０、ｍ１＝２９〜３２、ｎ１＝２、Ｒ１＝Ｒ３＝ＯＣ１４Ｈ２９、Ｒ２＝ＯＣＨ３で表される両端アミド型化合物の組成物の合成）
分子量１５４０のＰＥＧ（3.08 g, 2.00 mmol）をピリジン（10 ml）に溶解し、ｐ−トルエンスルホニルクロリド（0.76 g, 4.00 mmol）を加え、室温で２時間撹拌した。反応終了後クロロホルム（100 ml）を加え、１Ｍ  ＨＣｌ（100 ml）で中和し、溶液を４％  ＮａＨＣＯ３、飽和ＮａＣｌの順で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで脱水した。乾燥剤をろ別して、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１０：１）で精製し、水酸基がトシル化された分子量１５４０のＰＥＧ（3.346 g, 1.95 mmol, 98%）を得た。【００６６】
1H-NMR (CDCl3) δ = 7.80 (2H, d, J = 8.4 Hz, 2,6-H of TsO), 7.34 (2H, d, J = 8.0 Hz, 3,5-H of Ts), 4.16 (2H, t, J = 5.0 Hz, CH2OTs), 3.83〜3.45 (〜138H, m, OCH2 × 69), 2.45 (3H, s, 4-CH3 of Ts)。【００６７】
水酸基がトシル化された分子量１５４０のＰＥＧ（3.346 g, 1.95 mmol）をアセトニトリル（15 ml）に溶解し、アジ化ナトリウム（0.1904 g, 2.93 mmol）を加え、３２時間加熱還流した。反応終了後室温に戻し、水（20 ml）を加えた。ジクロロメタンを加え、有機相を抽出し、有機相を無水硫酸ナトリウムで脱水した。乾燥剤をろ別し、溶媒を留去して、水酸基がアジド化された分子量１５４０のＰＥＧ（2.889 g, 1.82 mmol, 93%）を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ = 3.83〜3.45 (〜138H, m, OCH2 × 69), 3.39 (2H, t, J = 5.0 Hz, CH2N3)。
水酸基がアジド化された分子量１５４０のＰＥＧ（2.889 g, 1.82 mmol）をメタノール（100 ml）に溶解し、触媒量の二酸化白金を加えＨ２気流下、室温で２時間撹拌した。反応終了後、二酸化白金をセライトを用いて除去した。溶媒を留去し、水酸基をアミノ基に変換した分子量１５４０のＰＥＧ（2.351 g, 1.51 mmol, 83%）を得た。【００６８】
1H-NMR (CDCl3) δ = 3.83〜3.45 (〜138H, m, OCH2 × 69), 2.86 (2H, t, J = 5.2 Hz, CH2N)。【００６９】
３，５−ビス（テトラデシルオキシ）−４−メトキシ安息香酸（0.173 g, 0.300 mmol）をジクロロメタン（5 ml）に溶解し、ＨＯＢｔ（0.0504 g, 0.360 mmol）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（0.0690 g, 0.360 mmol）を加え、室温で１時間撹拌した。ジクロロメタン（5 ml）に、水酸基をアミノ基に変換した分子量１５４０のＰＥＧ誘導体（0.490 g, 0.314 mmol）を溶解し、滴下ロートを用いて反応溶液に滴下しながら、さらに１時間撹拌した。反応終了後、溶液を４％ＮａＨＣＯ３、飽和ＮａＣｌの順で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで脱水した。乾燥剤をろ別して、溶媒を留去した。残渣を分取用シリカゲル薄層クロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９：１）で精製し、生成物（0.370 g, 0.175 mmol, 58%）（式（２）で表される化合物として計算）を得た。【００７０】
1H-NMR (CDCl3) δ = 7.04 (2H, s, 2,6-H), 6.97 (1H, br-t, NH), 4.03 (4H, t, J = 6.6 Hz, 3,5-OCH2), 3.85 (3H, s, 4-OCH3), 3.71〜3.50 (〜128H, m, CH2OCH2), 1.81 (4H, quintet, J = 7.6 Hz, 3,5-OCCH2), 1.46 (4H, quintet, J = 7.2 Hz, 3,5-OC2CH2), 1.36〜1.22 (40H, m, 3,5-OC3C10H20), 0.88 (6H, t, J = 6.8 Hz, 3,5-OC13CH3)。【００７１】
島津ＡＸＩＭＡ  ＣＦＲ  ｐｌｕｓを用い、窒素レーザー（337 nm）、リフレクトロンモード、正イオン検出、積算回数５００回、イオン化助剤をヨウ化ナトリウムアセトン溶液（１ｍｇ／ｍｌ）、マトリクスをジスラノールクロロホルム溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）、試料濃度１ｍｇ／ｍｌ（クロロホルム溶液）、スキャンレンジｍ／ｚ  １−５０００の条件で、生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ測定を行った。【００７２】
原料の分子量１５４０のＰＥＧと類似する分子量分布を有し、式（２）で、Ｘ＝ＯＨ、ｋ２＝０、ｍ２＝２９〜３２、ｎ２＝２、Ｒ４＝Ｒ６＝ＯＣ１４Ｈ２９、Ｒ５＝ＯＣＨ３で表される化合物に相当する分子量分布を有するピークの他に、分子量が５５７大きい、式（１）で、ｋ１＝０、ｍ１＝２９〜３２、ｎ１＝２、Ｒ１＝Ｒ３＝ＯＣ１４Ｈ２９、Ｒ２＝ＯＣＨ３で表される化合物に相当する分子量分布を有するピークが検出され、両端アミド体の生成を確認した。
解析を行ったロットでは、そのピークの高さの比（片端アミド体：両端アミド体）は約５：１であった。【００７３】
＜実施例８＞
（実施例７と同様の合成法で得られた組成物の粘弾性測定）
実施例７と同様の合成法によって、ＨＰＬＣ解析（カラム：ＤＡＩＳＯ  ＰＡＫ  ＳＰ−２００−５−Ｃ４−Ｐ、カラム温度：４０℃、溶媒：７０−９９％アセトニトリル水溶液、０．１％ＴＦＡ、線形濃度勾配、流速：１．０ｍｌ／分）の結果、式（１）に相当する両端アミド型化合物と式（２）に相当する片端アミド型化合物の比が０．４８：１である組成物を得た。該組成物を用いて、そのゾル−ゲル転移挙動の解析を行うために試料水溶液の粘弾性測定を行った。組成物濃度を１ｗｔ％、２ｗｔ％、８ｗｔ％、１５ｗｔ％にそれぞれ調整し、十分に撹拌した後、冷凍庫で保存した。測定にはＡＲ−Ｇ２（TA Instruments, Japan）を使用した。４０ｍｍパラレルプレートを用い、周波数は１Ｈｚとした。試料水溶液を０℃から８０℃まで、昇温速度を３℃／分として測定した。結果を図７に示す。【００７４】
このヒドロゲル化剤は、少なくとも２ｗｔ％以上の広い濃度範囲、また、広い温度範囲でヒドロゲルを与えることが明らかになった。特に、２ｗｔ％の濃度では、通常、動物細胞培養に用いられる３７℃ではゾルで、３０℃以下ではゲルになる特性を有し、細胞保存に適した温度特性を持つことが示された。【００７５】
＜実施例９＞
（実施例７と同様の合成法で得られた組成物の肝細胞保存効果）
実施例７と同様の合成法で得られたヒドロゲル化剤のうち、実施例８で粘弾性測定を行ったものと同一ロットの試料を用いて肝細胞保存の検討を行った。
ラット肝細胞６×１０５ｃｅｌｌｓを、培地と共に調製した濃度２ｗ／ｖ％（１００ｍｌの水中ヒドロゲル化剤２ｇ）の試料中に封入し，エッペンチューブ内で１夜冷蔵保存した。翌日、細胞を回収して、２４穴プレートに播種し、肝細胞用メディウムによる培養を行った。培地交換は毎日行い、培養上清を回収後、新しいメディウムを１ｍｌ加え、３日間培養した。細胞を超音波破砕しＤＮＡ量の測定を行った。その結果、何も加えなったコントロールのＤＮＡ量が１４．７±２．６μｇ／ｍｌであったのに対し、ヒドロゲル化剤を加えたものでは１７．４±１．５μｇ／ｍｌであった。このＤＮＡ量は細胞数に比例すると考えられるため、ヒドロゲルが肝細胞保存剤として利用できることが示された。【００７６】
＜実施例１０＞
（実施例７と同様の合成法で得られた組成物の軟骨細胞保存効果）
実施例７と同様の合成法で得られたヒドロゲル化剤のうち、実施例８で粘弾性測定を行ったものと同一ロットの試料を用いて軟骨細胞保存の検討を行った。
ウサギ軟骨細胞１．２×１０６ｃｅｌｌｓを２ｗ／ｖ％に培地と共に調製した試料中に封入し、エッペンチューブ内で一夜冷蔵保存した。翌日、細胞を回収して、２４穴プレートに播種し、軟骨細胞用メディウムによる培養を行った。培地交換は１週間に２回の頻度で行い、培養上清を吸引除去後、新しいメディウムを１ｍｌ加え、３週間培養した。最終日は、培養液を吸引除去した後、培地を０．５ｍｌのＰＢＳ（−）で洗浄して，細胞を１ｍｌのプロテアーゼ（ブロメライン）溶液で６０℃、３０分間酵素分解し、その処理液からＤＮＡ量を測定した。その結果、何も加えなったコントロールのＤＮＡ量が１０．５±０．０μｇ／ｍｌであったのに対し、ヒドロゲル化剤を加えたものでは１７．８±１．７μｇ／ｍｌであった。このＤＮＡ量は細胞数に比例すると考えられるため、ヒドロゲルが軟骨細胞保存剤として利用できることが示された。【００７７】
＜実施例１１＞
（式（２）で、Ｘ＝ＯＨ、ｋ２＝０、ｍ２＝４２〜４５、ｎ２＝２、Ｒ４＝Ｒ６＝ＯＣ１４Ｈ２９、Ｒ４＝ＯＣＨ３で表される片端アミド型化合物と、式（１）で、ｋ１＝０、ｍ１＝４２〜４５、ｎ１＝２、Ｒ１＝Ｒ３＝ＯＣ１４Ｈ２９、Ｒ２＝ＯＣＨ３で表される両端アミド型化合物の組成物の合成）
分子量２０００のＰＥＧ（4.00 g, 2.00 mmol）をピリジン（10 ml）に溶解し、ｐ−トルエンスルホニルクロリド（0.76 g, 4.00 mmol）を加え、室温で３時間撹拌した。反応終了後クロロホルム（100 ml）を加え、１Ｍ  ＨＣｌ（100 ml）で中和し、４％  ＮａＨＣＯ３、飽和ＮａＣｌの順に洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで脱水した。乾燥剤をろ別して、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１０：１）で精製し、水酸基がトシル化された分子量２０００のＰＥＧ（4.140 g, 1.92 mmol, 96%）を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ = 7.79 (2H, d, J = 8.0 Hz, 2,6-H of TsO), 7.34 (2H, d, J = 8.0 Hz, 3,5-H of Ts), 4.16 (2H, t, J = 5.2 Hz, CH2OTs), 3.83〜3.45 (〜178H, m, OCH2 × 89), 2.45 (3H, s, 4-CH3 of Ts)。【００７８】
水酸基がトシル化された分子量２０００のＰＥＧ（4.140 g, 1.92 mmol）をアセトニトリル（20 ml）に溶解し、アジ化ナトリウム（0.195 g, 3.00 mmol）を加え、３２時間加熱還流した。反応終了後室温に戻し、水（20 ml）を加えた。ジクロロメタンを加え、有機相を抽出し、有機相を無水硫酸ナトリウムで脱水した。乾燥剤をろ別し、溶媒を留去して、水酸基がアジド化された分子量２０００のＰＥＧ（3.280 g, 1.62 mmol, 84%）を得た。【００７９】
1H-NMR (CDCl3) δ = 3.83〜3.45 (〜178H, m, OCH2 × 89), 3.39 (2H, t, J = 5.2 Hz, CH2N3)。【００８０】
水酸基がアジド化された分子量２０００のＰＥＧ（1.537 g, 0.759 mmol）をピリジン（5 ml）に溶解し、トリフェニルホスフィン（0.394 g, 1.50 mmol）を加え、室温で２時間撹拌した。反応終了後、２８％ＮＨ４ＯＨ（10 ml）を加え２時間静置した。溶媒を留去し、水酸基をアミノ基に変換した分子量２０００のＰＥＧを含んだ生成物を得た。【００８１】
1H-NMR (CDCl3) δ = 3.83〜3.45 (〜178H, m, OCH2 × 89), 2.86 (2H, t, J = 5.2 Hz, CH2N)。【００８２】
３，５−ビス（テトラデシルオキシ）−４−メトキシ安息香酸（0.202 g, 0.350 mmol）をジクロロメタン（5 ml）に溶解し、ＨＯＢｔ（0.060 g, 0.420 mmol）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（0.081 g, 0.420 mmol）を加え、室温で１時間撹拌した。ジクロロメタン（5 ml）に水酸基をアミノ基に変換した分子量２０００のＰＥＧ誘導体（過剰量の未精製物）を溶解し、滴下ロートを用いて反応溶液に滴下しながら、さらに１時間撹拌した。反応終了後、溶液を４％ＮａＨＣＯ３、飽和ＮａＣｌの順で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで脱水した。乾燥剤をろ別して、溶媒を留去した。残渣を分取用シリカゲル薄層クロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９：１）で精製し、（0.439 g, 0.172 mmol, 49%）（式（２）で表される化合物として計算）を得た。【００８３】
1H-NMR (CDCl3) δ = 7.03 (2H, s, 2,6-H), 6.89 (1H, br-t, NH), 4.03 (4H, t, J = 6.6 Hz, 3,5-OCH2), 3.85 (3H, s, 4-OCH3), 3.71〜3.50 (〜180H, m, CH2OCH2), 1.81 (4H, quintet, J = 7.2 Hz, 3,5-OCCH2), 1.46 (4H, quintet, J = 7.6 Hz, 3,5-OC2CH2), 1.36〜1.22 (40H, m, 3,5-OC3C10H20), 0.88 (6H, t, J = 6.8 Hz, 3,5-OC13CH3)。
実施例７と同様の条件で、生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ測定を行った。【００８４】
原料の分子量２０００のＰＥＧと類似する分子量分布を有し、式（２）で、Ｘ＝ＯＨ、ｋ２＝０、ｍ２＝４２〜４５、ｎ２＝２、Ｒ４＝Ｒ６＝ＯＣ１４Ｈ２９、Ｒ５＝ＯＣＨ３で表される片端アミド型化合物に相当する分子量分布を有するピークの他に、分子量が５５７多い、式（１）で、ｋ１＝０、ｍ１＝４２〜４５、ｎ１＝２、Ｒ１＝Ｒ３＝ＯＣ１４Ｈ２９、Ｒ２＝ＯＣＨ３で表される化合物に相当する分子量分布を有するピークが検出され、両端アミド型化合物の生成を確認した。
解析を行ったロットでは、ピークの高さの比（片端アミド体：両端アミド体）は約４：１であった。【００８５】
＜実施例１２＞
（実施例１１と同様の合成法で得られた組成物の粘弾性測定）
実施例１１と同様の合成法によって、ＨＰＬＣ分析（カラム：ＤＡＩＳＯ  ＰＡＫ  ＳＰ−２００−５−Ｃ４−Ｐ、カラム温度：４０℃、溶媒：７０−９９％アセトニトリル水溶液、０．１％ＴＦＡ、線形濃度勾配、流速：１．０ｍｌ／分）の結果、式（１）に相当する両端アミド型化合物と式（２）に相当する片端アミド型化合物の比が０．１６：１である組成物１を得た。該組成物１を用いてそのゾル−ゲル転移挙動の解析を行うために試料水溶液の粘弾性測定を行った。組成物１の濃度を１ｗｔ％、２ｗｔ％、８ｗｔ％、１５ｗｔ％にそれぞれ調整し、十分に撹拌した後、冷凍庫で保存した。実施例８に記載の方法と同様の粘弾性測定を行い、その測定結果を図８に示す。
同様に、式（１）に相当する両端アミド型化合物と式（２）に相当する片端アミド型化合物の比が０．４５：１である組成物２を得た。該組成物２を用いてそのゾル−ゲル転移挙動の解析を行うために試料水溶液の粘弾性測定を行った。組成物２の濃度を１ｗｔ％、２ｗｔ％、８ｗｔ％、１５ｗｔ％にそれぞれ調整し、十分に撹拌した後、冷凍庫で保存した。実施例８に記載の方法と同様の粘弾性測定を行い、その測定結果を図９に示す。【００８６】
実施例６で得られた混合比によるゲル転移温度制御の結果に対応して、片端アミド体と両端アミド体の混合比の違いにより、ゲル転移温度が制御できることが示された。特に、式（１）に相当する化合物と式（２）に相当する化合物の比が０．４５：１である組成物２の１５ｗｔ％濃度のゲル転移温度は２３℃付近にあり、通常の動物細胞の培養温度である３７℃ではゲル、細胞を回収する低温ではゾルとなる、細胞培養担体として理想的なヒドロゲルを与えることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明が提供するヒドロゲルは、生体適合性が知られるエチレングリコールのオリゴマー又はポリマー構造を有し、３次元細胞培養、細胞や蛋白質の分離・精製、蛋白質医薬品の徐放等に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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