(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）バシルス  スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルファ‐アミラーゼ（ＡｍｙＥ）をオリゴサッカロイド又はポリサッカロイド基質と接触させること、及び
（ｉｉ）基質溶液をグルコースを含む溶液へ転換させること、
を含む、
バシルス  スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルファ‐アミラーゼ（ＡｍｙＥ）を用い、オリゴサッカロイド又はデンプン基質溶液からグルコースを生成する方法であり、
ここで、ＡｍｙＥが、配列番号２と同一のアミノ酸配列、又は配列番号１のＡｍｙＥに少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、を含み、
転換させる間、基質溶液のｐＨがｐＨ５．６からｐＨ５．８である、
方法。
【請求項２】
オリゴサッカロイド溶液が主にマルトヘプタオース（ＤＰ７）又は高級オリゴサッカロイドを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
デンプン溶液が未処理のトウモロコシデンプンであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
転換させることが基質溶液をグルコアミラーゼと接触させることを含まないことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｉ）がデンプン基質をグルコアミラーゼと接触させることをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
グルコアミラーゼを０．５ＧＡＵ／ｇ  ｄｓ未満の濃度で添加することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
グルコアミラーゼを０．０２ＧＡＵ／ｇ  ｄｓ未満の濃度で添加することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
グルコースを含む溶液が少なくとも０．２ｇ／Ｌのグルコースを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
グルコースを含む溶液が少なくとも０．４ｇ／Ｌのグルコースを含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
グルコースを含む溶液が少なくとも１．４ｇ／Ｌのグルコースを含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＡｍｙＥが配列番号１及び配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＡｍｙＥからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
（ｉｉｉ）グルコースを含む溶液を発酵させて、エタノールを生成することをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
エタノール濃度が少なくとも６％ｖ／ｖのエタノールであることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
エタノール濃度が少なくとも１４％ｖ／ｖのエタノールであることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
（ｉｉｉ）グルコースを含む溶液をグルコース  イソメラーゼと接触させて、高フルクトーストウモロコシシロップを生成することをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連文献
本出願は２００８年６月６日提出の米国仮出願番号61/059,535に基づいて優先権を主張する。この米国仮出願は、ここに参照することにより本明細書に取り込まれる。
【０００２】
配列表
配列番号１から２４を含む配列表を添付する。ここに、その全体を参照することにより本明細書に取り込む。
【背景技術】
【０００３】
本発明は、バシルス  スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来アルファ‐アミラーゼ（ＡｍｙＥ）、その変異体、それらをコードする核酸、核酸を含む宿主細胞を提供する。ＡｍｙＥ又はその変異体の使用方法を開示し、とりわけ、デンプンの液化及び／又は糖化方法を含む。そのような方法は例えば、エタノール生産又は高フルクトーストウモロコシシロップ生産に有用な糖を生産できる。
【０００４】
背景
野菜デンプン、例えば、トウモロコシデンプンはシロップ及びバイオ燃料など工業製造製品に広く用いられる。例えば、高フルクトーストウモロコシシロップ（ＨＦＣＳ）は高いフルクトース含有量を有するトウモロコシシロップの処理された形態であり、糖に匹敵する甘味料であり、ＨＦＣＳはソフトドリンク及び他の加工食品における糖の代替品として有用になっている。現在、ＨＦＣＳ生産は１０億ドル産業となっている。また、バイオ燃料としてのエタノールの生産も成長中の産業である。
【０００５】
シロップ及びバイオ燃料をデンプンのグルコースへの分解を触媒する酵素的処理によってデンプンから生産できる。この酵素処理は一般的に一連の酵素―触媒反応を含む。
【０００６】
（１）液化：アルファ‐アミラーゼ(EC  3.2.1.1)は最初にデンプン懸濁液のマルトデキストランへの分解を触媒する。デンプン懸濁液は、３０‐４０％ｗ／ｗ  乾燥固体（ｄｓ）を含むことができる。アルファ‐アミラーゼは内部のアルファ‐１，４‐Ｄ−グルコシド結合の不規則な切断を触媒するエンドヒドロラーゼ類である。一般的に液化は高い温度、例えば９０‐１００℃にて行なわれるので、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）由来アルファ‐アミラーゼなど熱安定性アルファ‐アミラーゼがこの工程に好ましい。現在この工程に用いるアルファ‐アミラーゼ、例えば、バシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシルス  アミロリケファシエンス（Ｂ．  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、及びバシルス  ステアロテルモフィルス（Ｂ．  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＡｍｙＳ）由来アルファ‐アミラーゼは、大量のグルコースを生産していない。それどころか、得られる液化物は低いデキストロース当量（ＤＥ）であり、マルトース及び高い重合度（ＤＰｎ）を有する糖類を含む。
【０００７】
（２）糖化：グルコアミラーゼ及び／又はマルトジェニックアルファ‐アミラーゼは、液化後形成されたマルトデキストランの非還元末端の加水分解を触媒し、Ｄ−グルコース、マルトース、及びイソマルトースを放出する。糖化はグルコースリッチシロップ又は高マルトースシロップのいずれかを生産する。前者の場合、一般的にグルコアミラーゼは例えば、６０℃、ｐＨ４．３のように、酸性条件下で上昇温度にて糖化を触媒する。このプロセスで用いるグルコアミラーゼは、典型的には、菌類から得られ、その菌類は、例えば、Ｏｐｔｉｄｅｘ（商標）L400中に用いられるアスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ又はフミコーラ  グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）グルコアミラーゼである。プルラナーゼのような脱分岐酵素は糖化を助けることができる。
【０００８】
あるいは、マルトジェニックアルファ‐アミラーゼは高マルトースシロップを生成するために糖化を触媒してよい。一般的にマルトジェニックアルファ‐アミラーゼは、グルコアミラーゼより高い最適ｐＨ及び低い最適温度を有し、一般的にマルトジェニックアミラーゼはＣａ２＋を必要とする。現在この用途に用いるマルトジェニックアルファ‐アミラーゼはバシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルファ‐アミラーゼ、植物アミラーゼ、Clarase（商標）Lの活性成分であるアスペルギルス  オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来アルファ‐アミラーゼを含む。多様な産物を生産するために使用する糖化反応の例を下記に示す。
0005560266.tif 000002
【０００９】
（３）さらなる処理：プロセスにおける分岐点は、上記反応経路の左側に示すグルコースリッチシロップの生産後に生じる。もし最終の所望の製品がバイオ燃料の場合、酵母はグルコースリッチシロップをエタノールへ発酵できる。一方、最終の所望の製品がフルクトースリッチシロップの場合、グルコース  イソメラーゼはグルコースリッチシロップのフルクトースへの転換を触媒できる。
【００１０】
糖化はグルコースリッチシロップの生産における律速段階である。一般的に糖化は４８−７２時間かけておこり、その時間により多くの菌類グルコアミラーゼは著しく活性を消失する。さらに、マルトジェニックアルファ‐アミラーゼ及びグルコアミラーゼ両者は糖化を触媒するけれども、一般的に酵素は、上記に示すように、異なる最適ｐＨ及び温度にて操作する。両酵素を連続的に用いる場合、両酵素間の反応条件における違いによりｐＨ及び温度の調整を余儀なくされ、全体のプロセスを遅延し、不溶性アミロース凝集物の形成を生じうる。
【００１１】
従って、当分野において、デンプンから工業的製品を製造する改良された方法の必要性が存在する。特に糖化段階における改善された効率性が必要とされる。
【発明の概要】
【００１２】
バシルス  スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来アルファ‐アミラーゼ(ＡｍｙＥ)は、野菜デンプン、マルトヘプタオース、及びマルトトリオースを含む多様な炭水化物基質からかなりの量のグルコースを生成する。とりわけ、この有利な特性によりＡｍｙＥ又はその変異体はグルコアミラーゼの必要性を低減又は除去する糖化反応に用いられる。グルコアミラーゼの必要性の低減又は除去は、例えば、エタノール又は高フルクトーストウモロコシシロップ（ＨＦＣＳ）の生産の効率性を顕著に改善する。
【００１３】
本発明は、
（ｉ）ＡｍｙＥ又はその変異体をマルトース、マルトヘプタオース、又はマルトトリオースを含む基質溶液と接触させること、及び
（ｉｉ）基質溶液をかなりの量のグルコースへ転換させること、
を含む、
バシルス  スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルファ‐アミラーゼ（ＡｍｙＥ）又はその変異体を用いるかなりの量のグルコースを含む溶液を生成する方法であり、
ここで、ＡｍｙＥ又はその変異体が配列番号１のアミノ酸配列を有し、又は配列番号１と少なくとも約８５％の配列同一性であるアミノ酸配列を有し、及びアルファ‐アミラーゼ活性を有する方法に関する。溶液中のグルコースの最終濃度は２０％  ｗ／ｗ以上であり得る。基質溶液はグルコアミラーゼを添加しないで、ＡｍｙＥ又はその変異体と有利に接触させてよい。ある実施態様においては、基質溶液をグルコアミラーゼ存在下ＡｍｙＥ又はその変異体と接触させてよい。ここで、溶液のｐＨは約ｐＨ４．０からｐＨ４．５であり、任意にＣａ２＋非添加としてよい。
【００１４】
ある実施態様においては、オリゴサッカロイド溶液は主にマルトヘプタオース（ＤＰ７）又は高級オリゴサッカロイドを含む。別の実施態様においては、デンプン溶液は未処理のトウモロコシデンプンである。
【００１５】
さらに別の実施態様においては、基質溶液の転換の間、基質溶液のｐＨは約５．６から約ｐＨ５．８である。ある実施態様においては、基質溶液の転換は基質溶液をグルコアミラーゼと接触させることを含まない。
【００１６】
ある実施態様においては、工程（ｉ）がデンプン基質をグルコアミラーゼと接触させることをさらに含む。ある実施態様においては、グルコアミラーゼを約０．５ＧＡＵ／ｇ  ｄｓ未満の濃度で添加する。さらなる実施態様においては、グルコアミラーゼを約０．０２ＧＡＵ／ｇ  ｄｓ未満の濃度で添加する。
【００１７】
ある実施態様においては、グルコースを含む溶液が少なくとも約０．２ｇ／Ｌのグルコースを含む。別の実施態様においては、グルコースを含む溶液が少なくとも約０．４ｇ／Ｌのグルコースを含む。さらなる実施態様においては、グルコースを含む溶液が少なくとも約１．４ｇ／Ｌのグルコースを含む。
【００１８】
自然に発生するＡｍｙＥは、すべて本発明の方法に有用である。例えば、ＡｍｙＥは配列番号１のアミノ酸配列を含んでよく、又は配列番号３（Ａｍｙ３１Ａ）のアミノ酸配列を有するＡｍｙＥなど、デフォルトマッチングパラメーターを有するＢＬＡＳＴ配列アライメントアルゴリズムで測定して、配列番号１と少なくとも約８５％、９０％、９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。Ａｍｙ３１Ａは、Ohdan他、“Characteristics  of  two  forms  of  alpha-amylases  and  structural  implication,”  Appl.  Environ.  Microbiol.  65(10):  4652-58  (1999)に開示される。Ａｍｙ３１Ａは、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて計測すると、配列番号１のＡｍｙＥと約８６％の配列同一性を有する。また、ＡｍｙＥ変異体も有用であり、自然に発生するＡｍｙＥの配列と異なるアミノ酸配列を有する。変異体はＣ末端デンプン結合領域の欠失を有するＡｍｙＥを含む。これは例えば、配列番号２（ＡｍｙＥ‐ｔｒ）のアミノ酸配列を有する欠失ＡｍｙＥであり、これは配列番号１のＤ４２５残基から欠失したＡｍｙＥである。また、本発明はＡｍｙＥ及びＡｍｙＥ変異体をコードするポリヌクレオチドも提供する。さらに、ポリヌクレオチドを発現するのに有用なベクター及び宿主細胞も提供する。
【００１９】
ある実施態様においては、ＡｍｙＥは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、ＮＣＢＩ  アクセション番号  ＡＢＷ７５７６９、ＮＣＢＩ  アクセション番号  ＡＢＫ５４３５５、ＮＣＢＩ  アクセション番号  ＡＡＦ１４３５８、ＮＣＢＩ  アクセション番号  ＡＡＴ０１４４０、ＮＣＢＩ  アクセション番号  ＡＡＺ３００６４、ＮＣＢＩ  アクセション番号  ＮＰ＿３８８１８６、ＮＣＢＩ  アクセション番号  ＡＡＱ８３８４１、及びＮＣＢＩ  アクセション番号ＢＡＡ３１５２８に記載のアミノ酸配列を含むＡｍｙＥからなる群から選択される。
【００２０】
デンプンを糖化する方法は、糖化デンプン溶液を発酵させて、エタノールなどバイオ燃料を生成することをさらに含む。ある実施態様においては、バッチ発酵プロセスをクローズドシステムで用いてよく、培地組成を発酵の最初にセットし、発酵の間変更しない。別の実施態様においては、「流加培養法」システムを用い、物質を発酵進行にともない複数回に分けて加える。さらに別の実施態様においては、連続発酵システムを用い、規定発酵培地を連続的にバイオリアクターに添加し、同量の調整培地を処理のために同時に除く。
【００２１】
ある実施態様においては、さらなる工程は、（ｉｉｉ）グルコースを含む溶液を発酵させて、エタノールを生成することを含む。ある実施態様においては、エタノール濃度が少なくとも約６％ｖ／ｖのエタノールである。別の実施態様においては、エタノール濃度が少なくとも約１４％ｖ／ｖのエタノールである。
【００２２】
また、方法は、糖化デンプン溶液をグルコース  イソメラーゼと接触させることをさらに含むことも提供する。従って、ある実施態様においては、さらなる工程（ｉｉｉ）グルコースを含む溶液をグルコース  イソメラーゼと接触させて、高フルクトーストウモロコシシロップを生成することを含む。ある実施態様においては、糖化デンプン溶液は、外から加えられたＣa２＋を含まない。糖化デンプン溶液をHFCSなど、フルクトース‐デンプンベースシロップ（HFSS）に転換してよい。糖化デンプンのHFSSへの転換は、ｐＨ約６．０から約８．０、例えば、ｐＨ７．５にて触媒されてよい。ある実施態様においては、生産物は約４０−４５％のフルクトースを含む。
【００２３】
また、本発明は、ＡｍｙＥ又はその変異体及び任意にグルコアミラーゼ、プルラナーゼ、ベータ‐アミラーゼ、菌類アルファ‐アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、イソアミラーゼ、又はそれらの組み合わせを含むデンプン処理組成物を提供する。
【００２４】
また、本発明は、溶液中またはゲル中にＡｍｙＥ又はその変異体を含む焼成組成物も提供する。焼成の方法は、焼成組成物を焼かれるべき物質に添加すること及びその物質を焼くことを含む。
【００２５】
また、本発明は、水溶液中にＡｍｙＥ又はその変異体を含む、及び任意に別の酵素ともに含む織物湯通し組成物を提供する。織物を湯通しする方法は、織物を湯通しするのに十分な時間、湯通し組成物を織物と接触させることを含む。ある実施態様においては、織物を湯通しする方法は、
(i)織物をＡｍｙＥと接触させること、及び
（ii）織物を湯通しすることを
含み、
ここで、ＡｍｙＥは、配列番号１のＡｍｙＥと少なくとも約８５％の配列同一性であるアミノ酸配列を含む。
【００２６】
また、本発明は、水溶液中ＡｍｙＥ又はその変異体、及び任意に別の酵素、洗剤及び／又は漂白剤を含む洗浄組成物を提供する。洗浄溶液を例えば、洗濯又は食器洗浄に用いる。本発明の方法は、洗浄するのに十分な時間、洗浄組成物を洗浄すべきもの、例えば、食器又は洗濯物と接触させることを含む。
【００２７】
ある実施態様においては、物を洗浄する方法を提供し、
(i)洗浄すべき物をＡｍｙＥを含む洗剤組成物と接触させること、及び
（ii）物を洗浄すること
を含み、
ここで、ＡｍｙＥは配列番号１のＡｍｙＥと少なくとも約８５％の配列同一性であるアミノ酸配列を含む。
【００２８】
ある実施態様においては、洗浄すべき物は食器又は衣料である。別の実施態様においては、洗剤組成物は非粉塵粒質物又は安定化溶液である。さらなる実施態様においては、洗剤組成物は、セルラーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ、又はそれらの組み合わせを含む。ある実施態様においては、アミラーゼはアルファ‐アミラーゼ、ベータ‐アミラーゼ、又はグルコアミラーゼである。さらなる実施態様においては、洗剤組成物はリパーゼ、ペルオキシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチン  リアーゼ、又はそれらの組み合わせをさらに含む。ある実施態様においては、洗剤組成物は手作業又は自動食器洗浄洗剤組成物である。別の実施態様においては、洗剤組成物はプロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、マンナナーゼ、ペクチン  リアーゼ、又はそれらの組み合わせをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
添付図面は本明細書に取り込まれるが、多様な実施態様の説明を限定するものではない。
【００３０】
図１は配列番号１（「ＡｍｙＥ完全長」）のアミノ酸配列を有するＡｍｙＥと配列番号２５（成熟「Ａｍｙ３１Ａ」）のアミノ酸配列を有するＡｍｙＥとの間の配列アライメントを示す。アミノ酸配列中の相違を太字で示す。残基は酵素の成熟体における最初のアミノ酸から数える。
【００３１】
図２はＡｍｙＥ‐ｔｒ（配列番号２）をコードするポリヌクレオチド（「ＳＡＭＹ４２５ａａ」と示す）を含むプラスミドｐＭＥ６３０−７を示す。プラスミドは、バシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ‐アミラーゼ（「ｐｒｅＬＡＴ」と示す）由来シグナル配列をコードするＳＡＭＹ遺伝子を有するポリヌクレオチドインフレームを含む。
【００３２】
図３は、ｐＨ４．３及びｐＨ５．８にて従来の発酵におけるＡｍｙＥ‐ｔｒ（「欠失ＡｍｙＥ」）及びスペザイム（商標）エクストラ（Spezyme（商標）Xtra）アミラーゼ（「Ｘｔｒａ」）によるエタノール発酵を示す。
【００３３】
図４は、アスペルギルス  カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ）アルファ‐アミラーゼ（ＡｋＡＡ）単独又はアスペルギルス  カワチ（Ａ．  ｋａｗａｃｈｉｉ）アルファ‐アミラーゼ及びトリコデルマ  レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ（ＴｒＧＡ）の混合物と比較した、ｐＨ４．３及びｐＨ５．８での完全長ＡｍｙＥ（「ＡｍｙＥ  ＦＬ」）及びＡｍｙＥ‐ｔｒによる不溶性粒状（未処理）デンプンのエタノールへの加水分解を示す。
【００３４】
図５は、ゲオバシルス  ステアロテルモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼ（ＡｍｙＳ、配列番号４）と比較した、ｐＨ４．５及びｐＨ５．６でのＡｍｙＥ（「ＡｍｙＥ完全長」）、ＡｍｙＥ‐ｔｒ（「欠失ＡｍｙＥ」）、及びＡｍｙ３１Ａによるグルコース発酵を示す。
【００３５】
図６は、マルトヘプタオース（ＤＰ７）を用いるＡｍｙＥ‐ｔｒの０時間（上図）及び７２時間インキュベーション（下図）のＨＰＬＣによる検出された分解産物を示す。
【００３６】
図７は、ＤＰ７基質を用いるＡｍｙＳの０時間、２時間、４時間及び２４時間（上から下の図）インキュベーション（下図）のＨＰＬＣによる検出された分解産物を示す。
【００３７】
図８は、ＤＰ７基質を用いるスペザイム（商標）フレッド（SPEZYME（商標）FRED）(「フレッド（Fred）」)の０時間、１時間、２時間及び３時間（上から下の図）インキュベーションのＨＰＬＣによる検出された分解産物を示す。
【００３８】
図９は、生トウモロコシ粉デンプンを用いるＡｍｙＥ（配列番号１）の０分、３０分、及び９０分（上から下の図）インキュベーションのＨＰＬＣにより検出された分解産物を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
詳細な説明
バシルス  スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来アルファ‐アミラーゼ（ＡｍｙＥ）は多様な炭水化物基質であって、野菜デンプン、マルトヘプタオース、及びマルトトリオースを含む炭水化物基質から大量のグルコースを生成する。とりわけ、この有利な特性はＡｍｙＥ又はその変異体をグルコアミラーゼを低減する又は除く必要性を有する糖化反応において用いることができる。グルコアミラーゼの必要性を低減又は除去することにより、例えば、エタノール又は高フルクトーストウモロコシシロップの生産の効率性を顕著に改善する。
【００４０】
１．定義及び略語
本明細書の詳細な説明に従って、次の略語及び定義を適用する。本明細書にて使用する単数形「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、内容が明らかに他の事を指し示していない限り、複数の指示対象を含む。すなわち、例えば、「酵素」の意味は該当酵素の複数を含み、「製剤（ｔｈｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）」の意味は一以上の製剤及び当業者に公知のこれらに均等な製剤を含む。
【００４１】
別段の指示がない限り、本明細書にて用いるすべての技術用語及び科学用語は当業者が通常理解するものと同様の意味を有する。次の用語を以下に示す。
【００４２】
１．１．  定義
本明細書にて用いる「アミノ酸配列」は用語「ポリペプチド」及び／又は用語「タンパク質」と同義語である。ある場合は、用語「アミノ酸配列」は用語「ペプチド」と同義語である。ある場合は、用語「アミノ酸配列」は用語「酵素」と同義語である。
【００４３】
本明細書にて用いる「ハイブリダイゼーション」は、核酸の一本鎖が塩基対を通して相補鎖に結合する過程及びポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）において実施する場合の増幅する過程も含む。ハイブリダイズした核酸は、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡへテロ二本鎖又はＲＮＡ／ＤＮＡコポリマーを含んでよい。本明細書にて用いる「コポリマー」は、リボヌクレオチド及びデオキシヌクレオチド両者を含む１本鎖核酸をいう。核酸は「高いストリンジェンシー条件」下にて本明細書に記載の核酸にハイブリダイズするものを含む。「高いストリンジェンシー条件」は５０℃、０．２ＸＳＳＣ又は６５℃、０．１ＸＳＳＣ（１ＸＳＳＣ＝０．１５ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）でのハイブリダイゼーションとして定義される。
【００４４】
本明細書にて用いる用語「ヌクレオチド配列」又は「核酸配列」は、ゲノム、合成又は組み換え体由来をいい、センス鎖又はアンチセンス鎖を表すかどうかで、二本鎖又は一本鎖でよい。本明細書にて用いるように、その用語「核酸」はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及びＲＮＡをいう。核酸の残基は、通常知られ、当分野で用いる任意の化学的修飾を含んでよい。
【００４５】
「単離される」は物質が、それが自然に結合している少なくとも一つの自然の成分から少なくとも実質的に除去されることを意味する。
【００４６】
用語「精製される」は、物質が相対的に純粋状態、例えば少なくとも約９０％純粋、又は少なくとも約９５％純粋、又は少なくとも約９８％純粋であることを意味する。
【００４７】
用語「熱安定性」は、高い温度にさらされた後、酵素が活性を維持することを意味する。ＡｍｙＥの熱安定性はその半減期（ｔ１／２）によって測定され、半減期により半分の酵素活性が消失する。半減期は所定の温度、特に具体的な適用に用いる温度にて一定時間経過後残存する具体的なアルファ‐アミラーゼ活性を測定することにより計算される。
【００４８】
本明細書にて用いる「食品」は消費者に任意の良い効果を提供できる調製食品及び小麦粉のような食品用原料を含む。「食品原料」は食品又は食品（ｆｏｏｄｓｔｕｆｆ）に添加する又は添加できる製剤を含み、例えば、酸性化又は乳液化に必要な広範囲の製品において低いレベルにて用いる製剤を含む。食品原料は使用及び／又は適用様式及び／又は投与様式により液体の形態又は固体としての形態であってよい。
【００４９】
「オリゴサッカロイド」は３‐２０モノサッカライドから構成される炭水化物分子を意味する。
【００５０】
「相同体」は、対象アミノ酸配列及び対象ヌクレオチド配列とある度合いの同一性又は相同性を有する物を意味する。「相同配列」は対象配列に対して少なくとも８５％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、例えば、対象配列に少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有する。一般的に、相同体は対象アミノ酸配列と同様の活性部位を含む。
【００５１】
本明細書に用いる「形質転換細胞」は組み換えＤＮＡ技術を用いて形質転換された細胞を含む。一般的に形質転換は細胞への一以上のヌクレオチド配列の挿入により起こる。挿入されたヌクレオチド配列は異種のヌクレオチド配列、即ち、融合タンパク質のような形質転換された細胞に本来有していない配列でもよい。
【００５２】
本明細書にて用いる「作動可能に結合する」は、記載する成分が意図する機能を行うような関係であることを意味する。例えば、コード配列に作動可能に結合する調節配列は、コード配列の発現がコントロール配列に適合する条件下に行われるようなライゲーションである。
【００５３】
本明細書にて用いる「生物学的活性な」とは、同じ程度とは必ずしも限らないが、自然に発生する配列と同様な構造機能、調節機能又は生物学的機能を有する配列をいう。
１．２．略語
次の略語は、他に示していない限り、以下の意味を有する。
AE    アルコール  エトキシレート（alcohol  ethoxylate）
AEO   アルコール  エトキシレート（alcohol  ethoxylate）
AEOS  アルコール  エトキシ硫酸塩（alcohol  ethoxysulfate）
AES   アルコール  エトキシ硫酸塩（alcohol  ethoxysulfate）
AGU   グルコアミラーゼ活性単位（glucoamylase  activity  unit）
AkAA  アスペルギルス  カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ）アルファ‐アミラーゼ
AmyE  バシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルファ‐アミラーゼ
AmyR  スペザイム（商標）エクストラ（Ｓｐｅｚｙｍｅ（商標）Ｘｔｒａ）アミラーゼ
AmyS  ゲオバシルス  ステアロテルモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼ
AS    アルコール硫酸塩（alcohol  sulfate）
BAA   細菌のアルファ‐アミラーゼ（bacterial  α-amylase）
cDNA  相補的ＤＮＡ（complementary  DNA）
CMC   カルボキシメチルセルロース（carboxymethylcellulose）
DE    デキストロース等量（Dextrose  Equivalent）
DI    蒸留された、脱イオンされた（distilled,  deionized）  
DNA   デオキシリボ核酸（deoxyribonucleic  acid）
DP3   ３つのサブユニットを有する重合度（degree  of  polymerization  with  three  subunits）
DPn   ｎ個のサブユニットを有する重合度（degree  of  polymerization  with  n  subunits）
DS  又は  ds    乾燥固体（dry  solid）
DTMPA ジエチルトリアミンペンタ酢酸（diethyltriaminepentaacetic  acid）
EC    酵素委員会（enzyme  commission  for  enzyme  classification）
EDTA  エチレンジアミンテトラ酢酸（ethylenediaminetetraacetic  acid）
EDTMPA エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸（ethylenediaminetetramethylene  phosphonic  acid）
EO    エチレンオキシド（ethylene  oxide）
F&HC  繊維及び家庭用ケア（fabric  and  household  care）
GAU   グルコアミラーゼ単位（glucoamylase  units）
HFCS  高いフルクトーストウモロコシシロップ（high  fructose  corn  syrup）
HFSS  高フルクトースデンプンベースシロップ（high  fructose  starch  based  syrup）
IPTG  イソプロピル  ベータ‐Ｄ‐チオガラクトシド（isopropyl  β-D-thiogalactoside）
LA    ラウリア寒天（Lauria  agar）
LB    ラウリア培養液（Lauria  broth）
LU    リパーゼ単位（Lipase  Units）
L1T   １位にてロイシン(L)残基がトレオニン(T)残基で置換され、アミノ酸は、当分野で通常知られている１文字の略語により記される。
MW    分子量（molecular  weight）
NCBI  ナショナルセンターフォーバイオテクノロジーインフォメーション（National  Center  for  Biotechnology  Information）
nm    ナノメーター（nanometer）
NOBS  ノナノイルオキシベンゼンスルホン酸塩nonanoyloxybenzenesulfonate
NTA   ニトリロ三酢酸（nitrilotriacetic  acid）
OD    吸光度（optical  density）
PCR   ポリメラーゼチェーン反応polymerase  chain  reaction
PEG   ポリエチレングリコール（polyethylene  glycol）
pI    等電点（isoelectric  point）
ppm   百万分の一（parts  per  million）
PVA   ポリ（ビニル  アルコール）（poly(vinyl  alcohol)）
PVP   ポリ（ビニルピロリドン）（poly(vinylpyrrolidone)）
RAU   リファレンスアミラーゼ単位（Reference  Amylase  Units）
RNA   リボ核酸（ribonucleic  acid）
SAS   第二級アルカンスルホン酸塩（secondary  alkane  sulfonates）
1X  SSC      0.15  M  NaCl,  0.015  M  クエン酸ナトリウム,  pH  7.0
SSF   同時糖化発酵（simultaneous  saccharification  and  fermentation）
SSU   可溶性デンプン単位、１分あたり放出される１ｍｇのグルコースの還元パウダーに相当
TAED  テトラアセチルエチレンジアミン（tetraacetylethylenediamine）
TNBS  トリニトロベンゼンスルホン酸（trinitrobenzenesulfonic  acid）
TrGA  トリコデルマ  レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ
w/v   質量／体積（weight/volume）
w/w   質量／質量（weight/weight）
wt    野生型（wild-type）
μL   マイクロリットル（microliter）
μNm  マイクロニュートンｘメーター（microNewton  ×  meter）
【００５４】
２．  ＡｍｙＥ及びその変異体
本明細書に記載の方法を実施するのに有用なＡｍｙ酵素及びその変異体を提供する。ＡｍｙＥ及びその変異体をコードする核酸も提供し、その核酸を含むベクター及び宿主細胞を提供する。
【００５５】
本明細書に記載の目的である「ＡｍｙＥ」は自然に発生するバシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来アルファ‐アミラーゼ(EC  3.2.1.1;  1,4-α-D-グルカン  グルカノヒドロラーゼ)を意味する。代表的なＡｍｙＥ配列を配列番号１に記載する。配列番号１に示すＡｍｙＥのアミノ酸配列は天然のシグナル配列を含まない成熟型のものである。このＡｍｙＥの天然シグナル配列のアミノ酸配列を配列番号１７に示す。このＡｍｙＥの成熟型は「ＡｍｙＥ完全長」として本明細書において他の個所に記載される。他のＡｍｙＥ配列は、デフォルトアライメントパラメーターを有するＢＬＡＳＴ配列アライメントを用いて配列番号１のＡｍｙＥに対して少なくとも約８５％の配列同一性を有する。例えば、UniProtKB/TrEMBLアクセション番号O82953  (配列番号3)に開示されるＡｍｙ３１Ａとして知られるＡｍｙＥは配列番号１のＡｍｙＥに８６％の配列同一性を有する。配列番号３のＮ末端４５アミノ酸残基はＡｍｙ３１Ａのシグナル配列である。ＡｍｙＥ（配列番号１）及びＡｍｙ３１Ａ（シグナル配列が無い）間の配列アライメントを図１に示す。ＡｍｙＥ酵素はNCBIアクセション番号ABW75769に開示のアミノ酸配列を有するＡｍｙＥを含むが、これに限定されない。さらにＡｍｙＥタンパク質配列はNCBIアクセション番号ABK54355、AAF14358、AAT01440、AAZ30064、NP_388186、AAQ83841、及びBAA31528に開示のものを含み、その内容は、参照により本明細書に取り込まれる。
【００５６】
ＡｍｙＥ「変異体」は自然に発生するＡｍｙＥ配列のアミノ酸配列修飾を含む。本明細書にて用いるように、自然に発生するＡｍｙＥも「親酵素」、「親配列」、又は「野生型ＡｍｙＥ」である。アミノ酸修飾はアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を含んでよい。ＡｍｙＥ変異体におけるアミノ酸修飾は自然に発生する変異の結果又は下記にさらに記載するようにこの目的のために当分野で周知の方法の一つを用いてアミノ酸配列の意図的な修飾の結果得られるものでよい。代表的なＡｍｙＥ変異体は同時係属出願代理人書類番号48452-0019-P1-USに記載され、その全体を本明細書に取り込む。
【００５７】
ＡｍｙＥ変異体は、特に特定しない限り、少なくとも一つのアミノ酸の修飾を含み、しかし変異体は、デフォルトアライメントパラメーターを有するタンパク質配列のＢＬＡＳＴアライメントにより測定して配列番号１のＡｍｙＥと少なくとも８５％の配列同一性を維持している。ＡｍｙＥ変異体は、配列番号１のＡｍｙＥに少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸同一性を有する。例えば、変異体は、配列番号１のアミノ酸配列に比較して、１、２、３、５まで、１０まで、又は２０までアミノ酸置換を有してよい。一般的に、修飾は生物学的機能を要求されないアミノ酸残基に対してなされる。修飾すべきアミノ酸残基の選択はＡｍｙＥ配列間で配列相同性により導かれる。一般的に、ＡｍｙＥ配列においてよく保存されるアミノ酸は生物学的活性に必要とされる可能性が高い。反対に、ＡｍｙＥ配列の間で異なるアミノ酸の位置は生物学的活性に必要性とされる可能性が低い。例えば、ＡｍｙＥ及びＡｍｙ３１Ａの間のアライメントにおいて異なるアミノ酸残基を図１において太字で示しているが、それは生物学的活性の消失なしにＡｍｙＥ変異体において修飾される可能性が高い。
【００５８】
ＡｍｙＥ又はその変異体を例えば、発現、検出、及び／又はシグナル配列又はＨｉｓ−タグのような精製を機能するＡｍｙＥの成熟型のＮ−及び／又はＣ−末端の配列を含む融合タンパク質として発現してよい。そのような配列はシグナル配列を含み、宿主生物体においてＡｍｙＥの分泌及び発現を機能する。Yang他、“Nucleotide  sequence  of  the  amylase  gene  from  Bacillus  subtilis,”  Nucleic  Acids  Res.  11:  237-49  (1983)に記載のように、追加的なアミノ酸残基をシグナル配列の切断に続いてＡｍｙＥのＮ−末端から切断してよい。ＡｍｙＥの「成熟型」は発現されたＡｍｙＥ配列の翻訳後修飾のすべての産物として定義される。成熟型ＡｍｙＥに形成するために切断される一次翻訳産物のＮ−末端を代替的に「シグナル配列」、「リーダー配列」、又は「プロ‐配列」と称し得る。
【００５９】
シグナル配列はＡｍｙＥと同じ遺伝子によりコードされてよい。例えば、配列番号１に記載のＡｍｙＥはシグナル配列及び
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASAETANKSNE  (配列番号17)
の配列を有する追加的Ｎ末端アミノ酸とともに自然に発現される。代替的にシグナル配列は異なるＡｍｙＥ由来バシルス  スブチリス種（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓｐ．）シグナル配列でもよく又は異なるタンパク質でもよい。さらに、シグナル配列は異なる種、例えばバシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来でもよい。例えば、シグナル配列を特定の宿主細胞においてＡｍｙＥ又はその変異体の最適な発現を提供するために選択してよい。成熟ＡｍｙＥはシグナル配列ではないＮ末端由来追加的な配列がタンパク質分解される結果として生成してよい。例えば、バシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（「ＬＡＴリーダー配列」）由来３１のアミノ酸残基シグナル配列をＡｍｙＥ配列とフレームにおいて結合してよい。
【００６０】
本明細書においては、ＡｍｙＥ変異体は、自然に発生するＡｍｙＥと比較して、少なくとも部分的な１，４‐α‐Ｄ−グルカン  グルカノヒドロラーゼ活性を有する。変異体は野生型ＡｍｙＥと同じ活性及び特性を有してよく、又は変異体は野生型ＡｍｙＥと比較して改善された特性を有してよい。改変される特性を例えば、マルトヘプタオース及び／又はマルトトリオース基質に対して２倍又は３倍高い特異的活性を有するように改変されたものでよい。代替的に又は追加的に、タンパク質の熱安定性を改変してよい。例えば、変異体はＡｍｙＥより高い熱安定性を有してよい。代替的に又は追加的に改変された特性は酵素活性に対する最適ｐＨでもよい。例えば、変異体はより酸性の又はよりアルカリ性の最適ｐＨを有してよい。
【００６１】
「欠失」ＡｍｙＥ（「ＡｍｙＥ‐ｔｒ」）はＣ‐末端デンプン結合領域の全部又は一部の欠失配列を有するＡｍｙＥを意味する。例えば、配列番号２のＡｍｙＥ‐ｔｒにおいて、配列番号１のＡｍｙＥがＤ４２５残基で欠失されている。このＡｍｙＥ‐ｔｒの２．５Å分解能結晶構造はタンパク質データバンクアクセション番号1BAGにて入手でき、それはFujimoto他、“Crystal  structure  of  a  catalytic-site  mutant  alpha-amylase  from  B.  subtilis  complexed  with  maltopentaose,”  J.  Mol.  Biol.  277:  393-407  (1998)に開示される。Ｃ‐末端デンプン結合領域のすべて又は一部の除去をする場合、ＡｍｙＥ‐ｔｒは他の場所、例えば、配列番号１のＡｍｙＥのY423、P424、D426又はI427にて欠失されてよい。
【００６２】
ＡｍｙＥ又はその変異体をコードする核酸は、配列番号１のＡｍｙＥ及びＡｍｙＥ‐ｔｒ（配列番号２）をそれぞれコードする配列番号９及び１０に開示のポリヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。さらに、代表的なポリヌクレオチドは、Ａｍｙ３１Ａ（配列番号３）をコードする配列番号１１に開示のものを含む。同様に、NCBIアクセション番号ABK54355、AAF14358、AAT01440、AAZ30064、NP_388186、AAQ83841、及びBAA31528に開示されるＡｍｙＥは公的に入手可能なデータベース中に記載のポリヌクレオチドによりコードされ、配列は、参照により本明細書に取り込まれる。核酸はＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はｃＤＮＡ配列でよい。核酸は、上述の核酸のいずれかの「縮重配列」をさらに含んでよい。縮重配列は同じアミノ酸残基をコードする少なくとも一つのコドンを含むが、前述の核酸配列と異なるヌクレオチド配列を有する。例えば、核酸は、ＡｍｙＥ又はその変異体をコードする任意の核酸配列を含む。縮重配列特定の宿主生物体により好ましいコドンを用いることにより最適な発現を設計してよい。
【００６３】
本発明は、ＡｍｙＥ又はその変異体をコードする核酸を含むベクターも提供する。また、ベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、ＡｍｙＥ変異体をコードするポリヌクレオチドを発現してよい。宿主細胞は、例えば、バシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のようなバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）でよい。
【００６４】
２．１．ＡｍｙＥ変異体の特徴
ＡｍｙＥ変異体をそれらの核酸及び一次ポリペプチド配列により、３Ｄ構造モデリングにより、及び／又はそれらの特異的活性により特徴づけできる。ＡｍｙＥ変異体のさらなる特徴は安定性、Ｃａ２＋依存性、ｐＨ範囲、酸化安定性、及び熱安定性を含む。ある態様においては、野生型ＡｍｙＥの性能特徴を維持しながらＡｍｙＥ変異体は野生型ＡｍｙＥより高いレベルで発現される。発現及び酵素活性のレベルを当業者に周知の標準試験を用いて評価できる。別の態様においては、変異体は、高温での改善された安定性又は例えば、ｐＨ４．０から６．０又はｐＨ８．０から１１．０のような多様なｐＨ値での改善された活性のような野生型酵素と比較して改善された性能特徴をあきらかとする。
【００６５】
ＡｍｙＥ変異体はＡｍｙＥに比較して宿主細胞において改変されたレベルにて発現されてよい。一般的に、発現は、所定の時間に対して当業者が周知の標準方法を用いる発酵培養液から回収される活性変異体の量に関係する。また、発現は、宿主細胞内で生成される又は宿主細胞により分泌される変異体の量又は割合に関連し得る。また、発現は、変異体酵素をコードするｍＲＮＡの翻訳の割合にも関係し得る。
【００６６】
更なる態様においては、重要な変異は、改変された安定性又は特異的活性であって、特に例えば５０℃から７０℃のような、約６０℃の温度にて例えば、糖化における使用に関して存在する。変異体は、変異体が他の適用及び組成物において用いられるかどうかに依存して他の温度にて改変された安定性又は特異的活性を有してよい。例えば、焼成製品において、変異体は高い温度の範囲にて改変された特異的活性を有してよい。
【００６７】
また、ＡｍｙＥ変異体は、親ＡｍｙＥと比較して、改変された酸化安定性、特に、高い酸化安定性を有してよい。例えば、増加された酸化安定性は洗剤組成物において有利であり、減少される酸化安定性はデンプン液化用組成物において有利であり得る。
【００６８】
また、本明細書に記載のＡｍｙＥ変異体は、約５５℃から約９５℃以上の上昇温度、特に約８０℃にて親酵素に比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％以上半減期が延びた変異を有することができる。ある実施態様においては、ＡｍｙＥ変異体は８０℃以上にて約１‐１０分間加熱できる。
【００６９】
ＡｍｙＥ変異体は、本明細書に記載のエキソ特異性指標により測定されるエキソ‐特異性を有してよい。ＡｍｙＥ変異体は親酵素又は親酵素由来のポリペプチドに比較してエキソ‐特異性が高い又は増加しているものを含む。すなわち、例えば、ＡｍｙＥ変異体ポリペプチドはそれらの親ポリペプチドと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、５００％、１０００％、５０００％、１０，０００％より高いエキソ特異性指標を有し得る。
【００７０】
ある態様においては、ＡｍｙＥ変異体は親配列と同じｐＨ安定性を有してよい。別の態様においては、変異体は、より大きなｐＨ安定性範囲を獲得する又は酵素の最終の商業的目的のための所望な領域へｐＨをシフトする変異を含む。例えば、ある実施態様においては、変異体は約ｐＨ５．０から約ｐＨ１０．５にてデンプンを分解できる。ＡｍｙＥ変異体ポリペプチドは、同一の条件下にて親ポリペプチドに比較してより長い半減期又はより高い活性（試験に依存）を有してよいし、ＡｍｙＥ変異体は親ポリペプチドと同じ活性を有してよい。また、ＡｍｙＥ変異体ポリペプチドは、同一のｐＨ条件下にてそれらの親ペプチドに比較して、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％又はそれ以上長い半減期を有してよい。あるいは、又はさらに、ＡｍｙＥ変異体は同一のｐＨ条件下にて親ポリペプチドと比較して高い特異的活性を有してよい。
【００７１】
別の態様においては、本明細書に記載のＡｍｙＥ変異体のいずれかをコードする核酸に相補的な核酸を提供する。さらに、相補的核酸にハイブリダイズできる核酸を提供する。別の実施態様においては、本明細書に記載の方法及び組成物に用いる配列は合成配列である。それは特定の宿主生物体の発現のための最適使用コドンをもちいて合成される配列を含むがこれらに限定されない。
【００７２】
３．  ＡｍｙＥ及びその変異体の生成
本明細書に記載の方法により又は当分野にて知られる任意の代替的方法により生成される酵素変異体をコードするＤＮＡ配列は、適切なプロモーター、オペレーター、リボゾーム結合部位、翻訳開始シグナル、及び任意にリプレッサー遺伝子又は多様なアクティベーター遺伝子をコードする制御配列を一般的に含む発現ベクターを用いて、酵素の形態で発現できる。
【００７３】
３．１．  ベクター
ＡｍｙＥ又はその変異体をコードするＤＮＡ配列を保持する組み換え発現ベクターは、便宜的に組み換えＤＮＡ手法の施される任意のベクターでよく、ベクターの選択は、しばしば、それが導入される宿主細胞で決まる。つまり、ベクターは自律的に複製するベクターでもよく、即ち、染色体外に存在するベクターでもよく、その複製はプラスミド、バクテリオファージ、又は染色体外因子、小染色体、又は人工染色体のような染色体複製から独立した複製であるものでもよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入される場合、宿主細胞染色体に組み込まれ、及び組み込まれてしまった染色体とともに複製されるベクターでもよい。また、組み込まれた遺伝子を抗体の選択又は必須調節遺伝子など他の選択圧により又は必須代謝経路遺伝子の補完により働く増幅可能な構築体の使用により染色体において遺伝子の複数コピーを創製するために増幅できる。
【００７４】
一般的に発現ベクターは例えば、選択された宿主生物体におけるベクターの自律複製をさせる要素及び一以上の選別目的のために用いる表現型的検出マーカーのような、クローニングベクターの成分を含む。通常発現ベクターはプロモーター、オペレーター、リボゾーム結合部位、翻訳開始シグナル、及び任意にリプレッサー遺伝子又は一以上のアクティベーター遺伝子をコードする制御ヌクレオチド配列を含む。ある態様においては、用いるすべてのシグナル配列は酵素の容易な回収及び任意的な精製のために物質を細胞培養培地へ移動する。ＡｍｙＥ又はその変異体、プロモーター、ターミネーター、及び他の要素をそれぞれコードするＤＮＡ構築体をライゲーションし、複製に必要な情報を含む適切なベクターにそれらを挿入するために用いる方法は当業者によく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、  ２ｎｄ  ｅｄ．,  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  １９８９及び３ｒｄ  ｅｄ．，  ２００１を参照願いたい）。
【００７５】
ベクターおいて、ＤＮＡ配列は適切なプロモーター配列に作動可能に結合する。プロモーターは選択された宿主細胞での転写活性を示す任意のＤＮＡ配列でよく、宿主細胞に相同のまたは異種のいずれかであるタンパク質をコードする遺伝子由来でもよい。ＡｍｙＥ又はその変異体をコードするＤＮＡ配列の転写を方向付ける適切なプロモーターの例は、特に細菌の宿主において、バシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシルス  ステアロテルモフィルス（Ｂ．  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、又はバシルス  アミロリケファシエンス（Ｂ．  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来アルファ‐アミラーゼプロモーターのような、多様なバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来プロモーターを含み、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）のｌａｃオペロンのプロモーター、ストレプトミセス  セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ    ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子ｄａｇＡ又はｃｅｌＡプロモーター、バシルス  スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子等である。菌類の宿主における転写のために、有用なプロモーターの例は、アスペルギルス  オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール  ミエヘイ(Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ)アスパラギン酸プロティナーゼ、アスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性アルファ‐アミラーゼ、アスペルギルス  ニガー（Ａ．  ｎｉｇｅｒ）酸安定アルファ‐アミラーゼ、アスペルギルス  ニガー（Ａ．  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、リゾムコール  ミエヘイ(Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ)リパーゼ、アスペルギルス  オリザエ（Ａ．  ｏｒｙｚａｅ）アルカリプロテアーゼ、アスペルギルス  オリザエ（Ａ．  ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ又はアスペルギルス  ニドゥラン（Ａ．  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセタミダーゼをコードする遺伝子由来のプロモーターである。ＡｍｙＥ又はその変異体をコードする遺伝子が大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）など細菌種において発現する場合、例えば、Ｔ７プロモーター及びファージラムダプロモーターを含むバクテリオファージプロモーターから適切なプロモーターを選択できる。酵母種において発現するために適切なプロモーターの例は、サッカロミセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧａｌ１及びＧａｌ１０及びピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１及びＡＯＸ２プロモーターを含むが、これらに限定されない。
【００７６】
発現ベクターはまた、適切な転写ターミネーター及び、真核生物において、アルファ‐アミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列に作動可能に結合するポリアデニル化配列を含んでもよい。ターミネーション及びポリアデニル化配列はプロモーターとして同じ供給源から適切に由来してもよい。さらに、ベクターは宿主細胞内でベクターを複製可能とするＤＮＡ配列を含んでもよい。そのような配列の例は、プラスミドｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１、ｐＩＣａｔＨ、及びｐＩＪ７０２の複製の原型である。
【００７７】
また、ベクターは、選択マーカーを含んでもよい。例えば、バシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はバシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来ｄａｌ遺伝子のような、宿主細胞中の欠失を補完する材料を生産する遺伝子、又は例えば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン耐性のような抗生物質耐性を与える遺伝子である。さらに、ベクターは、ａｍｄＳ、ａｒｇＢ、ｎｉａＤ、及びｘｘｓＣのようなアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）選択マーカー、ハイグロマイシン耐性を増加するマーカー、又は当分野に知られる同時形質転換によって行われる選択マーカーを含んでよい。ＷＯ  ９１／１７２４３を参照願いたい。
【００７８】
３．２  変異体発現及び宿主生物体
一般的にＡｍｙＥ又はその変異体が培養培地へ分泌されるならば、宿主細胞において発現する場合有利である。この目的を達成するために、ＡｍｙＥ又はその変異体は発現酵素を培養培地へ分泌させるシグナル配列を含んでよい。所望ならば、このオリジナルシグナル配列を異なるシグナル配列により置換してよく、これは便宜的に個々のシグナル配列をコードするＤＮＡ配列の置換により達成される。例えば、ＡｍｙＥをコードする核酸は図２に示す発現ベクターにおいてバシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）シグナル配列に作動可能に結合する。シグナル配列はすでに詳しく述べている。
【００７９】
ＤＮＡ構築体又は発現ベクターのいずれかを含む単離される細胞は、ＡｍｙＥ又はその変異体の組み換えの生産での宿主細胞として有効に用いられる。宿主染色体にＤＮＡ構築体（一以上のコピー）を任意に組み込むことにより、細胞はＡｍｙＥ又はその変異体をコードするＤＮＡ構築体で形質転換される。ＤＮＡ配列が細胞で安定的に維持される可能性が高い場合、この組み込みは有効であると一般的に考えられる。宿主染色体へのＤＮＡ構築体の組み込みは、例えば、相同の又は異種の組み換えによる、従来の方法により行われる。あるいは、細胞は、宿主細胞の異なる型について上述したように発現ベクターで形質転換されてもよい。
【００８０】
適切な細菌微生物宿主生物体の例は、バシラス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）のようなグラム陽性菌であって、例えば、バシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシルス  レンツス（Ｂ．  ｌｅｎｔｕｓ）、バシルス  ブレビス（Ｂ．  ｂｒｅｖｉｓ）、バシルス  ステアロテルモフィルス（Ｂ．  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バシルス  アルカロフィリス（Ｂ．  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バシルス  アミロリケファシエンス（Ｂ．  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バシルス  コアグランス（Ｂ．  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシルス  ラウツス（Ｂ．  ｌａｕｔｕｓ）、バシルス  メガテリウム（Ｂ．  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、及び  バシルス  ツリンギエンシス（Ｂ．  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）
ストレプトミセス  ムリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｕｒｉｎｕｓ）のようなストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、
ラクトコッカス  ラクティス（Ｌ.  ｌａｃｔｉｓ）のようなラクトコッカス種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.）を含む乳酸菌種
ラクトバシラス  ロイテリ（Ｌ.  ｒｅｕｔｅｒｉ）を含むラクトバシラス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ.）
リューコノストック種（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．）
ペディオコッカス種（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、及び
ストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）である。さらに他の有用な宿主は、例えば、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）Ａ７−７である。あるいは、例えば、シュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）又は大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）を含むエンテロバクター科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）に属するグラム陰性菌を宿主生物体に選択できる。
【００８１】
適切な酵母宿主生物体はバイオテクノロジー的に有効な酵母種から選択でき、これらはピキア種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）ハンゼヌラ種（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐ．）、クルイベロミセス種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ヤロウィニア種（Ｙａｒｒｏｗｉｎｉａ  ｓｐ．）、サッカロミセス  セレビシエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を含むサッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）又はシゾサッカロミセス  ポムベ（Ｓ.  ｐｏｍｂｅ）のようなシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する種を含むが、これらに限定されない。メチロトローフ酵母種（ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）を宿主生物体として用いることができる。あるいは、宿主生物体はハンゼヌラ種（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐ．）でもよい。糸状菌間の適切な宿主生物体は例えば、アスペルギルス  ニガー（Ａ．  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス  オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス  ツビゲンシス（Ａ．  ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス  アワモリ（Ａ．  ａｗａｍｏｒｉ）又はアスペルギルス  ニドゥラン（Ａ．  ｎｉｄｕｌａｎｓ）のようなアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の種を含む。あるいは、例えば、フザリウム  オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のようなフザリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）の菌株、リゾムコール  ミエヘイ（Ｒ．  ｍｉｅｈｅｉ）などリゾムコール種（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｓｐ．）を宿主生物体として用いてよい。他の適切な酵母はトリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．）及びムコール種（Ｍｕｃｏｒ  ｓｐ.）を含む。菌細胞はプロトプラスト形成及びプロトプラストの形質転換とそれに続く細胞壁の再生を含む公知のプロセスにより形質転換してよい。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主細胞の形質転換にかかる適切な方法は、例えば、ＥＰ２３８０２３に記載されている。
【００８２】
さらなる実施態様においては、本明細書に記載のアルファ‐アミラーゼＡｍｙＥ又はその変異体を生成する方法は、変異体の生成をもたらす条件下、上述のように、宿主細胞を培養すること及び細胞及び／又は培養培地から変異体を回収する方法を含んでいる。細胞を培養のために用いる培地は、ＡｍｙＥ又はその変異体の発現が得られ、本発明の宿主細胞の成長に適した任意の従来の培地でよい。適切な培地及び培地成分は業者から入手可能であり、又は刊行物に記載された手順、例えば、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）のカタログの記載の手順に従って調製してよい。培養培地の例としては３０００Ｌに撹拌タンク発酵装置で実施する流加培養用のものを含むが、これに限定されない。その場合、培養培地はナトリウム、カリウム、リン酸、マグネシウム、及び硫酸、並びに微量元素の供給源としての無機塩とともに、有機化合物の供給源としてトウモロコシ浸漬固形物及び大豆粉から構成できる。一般的に、グルコースなど炭水化物供給源も初期培地の一部である。一度培養がそれ自体確立し培養が開始すると、炭水化物が、測定後タンクへ入り当技術分野で周知なように培養を維持する。サンプルを規定の間隔にて発酵装置から採取し、例えば、比色分析法を用いて酵素力価を測定する。測定に従って酵素生成速度の増加が止まった時、発酵方法を停止する。
【００８３】
宿主細胞から分泌されるＡｍｙＥ又はその変異体は周知の方法により、培養培地から便利に回収されてよく、遠心分離又はろ過によって培地から細胞を分離すること、及び硫酸アンモニウムのような塩を用いて培地のタンパク質成分を沈殿させ、引き続き、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー等のようなクロマトグラフィーの方法を用いて分離することを含む。
【００８４】
宿主細胞は、ＡｍｙＥ又はその変異体を発現させる適切な条件下にて培養してよい。タンパク質の発現は、酵素が連続的に生産されるように、又は発現開始のため刺激を誘導するように構成してもよい。誘導発現の場合、タンパク質の生産は、例えば、必要により、デキサメタゾン又はＩＰＴＧ又はセファロースのような誘導物質が、培養培地へ添加されることによって開始される。また、ポリペプチドを、ＴｎＴ（商標）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））ウサギ網赤血球システムのようなインビトロ、無細胞システムで組み換え的に生産できる。
【００８５】
ＡｍｙＥ又はその変異体を発現する宿主は好気状態の下、宿主に適切な培地で培養することができる。振盪又は攪拌と給気の組み合わせは、例えば、宿主の必要とする条件及び所望のアルファ‐アミラーゼ変異体の生成に応じて約３０℃から約７５℃のような宿主に適切な温度で生成が得られるように提供することができる。培養は、約１２から約１００時間（及びそれらの間任意の時間）またはそれ以上好ましくは、２４から７２時間行うことができる。典型的に、培養培地は、ＡｍｙＥ又はその変異体の生成に関与する宿主の必要とする培養条件に応じて、ｐＨ約５．５から約８．０とする。
【００８６】
発現酵素のデンプン分解活性を例えば、基質としてジャガイモデンプンを用いて測定してよい。この方法は酵素による修飾ジャガイモデンプンの分解に基づき、反応後、デンプン／酵素溶液のサンプルをヨウ素溶液と混合する。最初、黒い青色が形成されるが、デンプンの分解の間に青色が次第に弱くなり徐々に赤茶色にかわる。これを色ガラススタンダードと比較する。
【００８７】
４．  ＡｍｙＥ及びその変異体の精製
精製ＡｍｙＥ又はその変異体を調製するために従来の方法を用いてよい。発酵後、発酵培地を得て、原発酵材料残渣を含む微生物細胞及び種々の懸濁した固体物は、アミラーゼ溶液を得るために従来の分離方法によって除かれる。ろ過、遠心分離、マイクロろ過、回転式ドラム真空ろ過、引き続き、限外ろ過、抽出、又はクロマトグラフィー等、一般的に用いられる。
【００８８】
回収の最適化を図るために発現されたＡｍｙＥまたはその変異体を含む溶液を濃縮することが望ましい。非濃縮溶液を使用すると、精製酵素を含む沈殿物を回収するためにインキュベーション時間の増加が必要となるからである。所望の酵素レベルが得られるまで、溶液を従来の方法を用いて濃縮する。酵素含有溶液の濃縮は本明細書に記載される任意の方法により行うことができる。ある実施態様においては、回転式真空ろ過及び／又は限外ろ過を用いる。あるいは、限外ろ過を用いてよい。
【００８９】
精製の目的において「沈殿剤」は、溶液からＡｍｙＥ又はその変異体を沈殿するのに効果的な化合物を意味し、沈殿の性質であれば何であってもよい。つまり、結晶、非結晶、又はこれらの両者の混合のいずれでもよい。沈殿は例えば、金属ハロゲン沈殿剤を用いて行われる。金属ハロゲン沈殿剤はアルカリ金属塩化物、アルカリ金属臭化物、及び二以上のこれらの金属ハロゲン化物の混合を含む。金属ハロゲン化物は塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、及び二以上のこれらの金属ハロゲン化物の混合からなる群から選択できる。適切な金属ハロゲン化物は、塩化ナトリウム及び塩化カリウムを含み、特に、保存剤としてさらに用いることができる塩化ナトリウムを含む。インキュベーション時間、ｐＨ、温度、及びＡｍｙＥ又はその変異体の濃度を含む最大量の回収のための沈殿条件の選択は、通常の試験後、当業者にとって容易に明らかである。
【００９０】
一般的に金属ハロゲン化物の少なくとも約５％ｗ／ｖ（重量／体積）から約２５％ｗ／ｖ、通常少なくとも８％ｗ／ｖが濃縮酵素変異体溶液に添加される。一般的に、約２５％ｗ／ｖ以下、普通約２０％ｗ／ｖ以下の金属ハロゲン化物が濃縮酵素変異体溶液に添加される。金属ハロゲン沈殿剤の最適濃度は特に、とくに、特定のＡｍｙＥ又はその変異体の性質及び溶液中のその濃度によって決まる。
【００９１】
酵素の沈殿を行うもう一つの方法は濃縮酵素変異体溶液に添加できる有機化合物を用いることである。有機化合物沈殿剤は４‐ヒドロキシ安息香酸、４‐ヒドロキシ安息香酸のアルカリ金属塩、４‐ヒドロキシ安息香酸のアルキルエステル、及び二以上のこれらの有機化合物の混合を含み得る。前記有機化合物沈殿剤の添加は、金属ハロゲン沈殿剤の添加の前に、同時に、又は続いて行うことが可能であり、及び有機化合物及び金属ハロゲン化物の両者の沈殿剤の添加は、連続、又は同時に行われてもよい。さらなる記載は、例えば、Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓの米国特許第５、２８１、５２６を参照願いたい。
【００９２】
一般的に、有機沈殿剤は、ナトリウム又はカリウム塩のような４‐ヒドロキシ安息香酸のアルカリ金属塩、及び４‐ヒドロキシ安息香酸の直鎖、分岐鎖のようなアルキルエステルであって、ここでアルキル基は１から１２の炭素原子を含み、二以上のこれらの有機化合物の混合からなる群から選択される。有機化合物沈殿剤は、例えば、４‐ヒドロキシ安息香酸の直鎖又は分岐鎖アルキルエステルであり、ここでアルキル基は１から１０炭素原子を含み、及び二以上のこれらの有機化合物の混合でもよい。適切な有機化合物沈殿剤は、４‐ヒドロキシ安息香酸の直鎖アルキルエステルであり、ここでアルキル基は１から６炭素原子を含み、及び二以上のこれらの有機化合物の混合でもよい。４‐ヒドロキシ安息香酸のメチルエステル、４‐ヒドロキシ安息香酸のプロピルエステル、４‐ヒドロキシ安息香酸のブチルエステル、４‐ヒドロキシ安息香酸のエチルエステル、及び二以上のこれらの有機化合物の混合もまた用いることができる。またさらなる有機化合物は４‐ヒドロキシ安息香酸のメチルエステル（メチルパラベン（ｍｅｔｈｙｌＰＡＲＡＢＥＮ）、４‐ヒドロキシ安息香酸のプロピルエステル（プロピルパラベン（ｐｒｏｐｙｌＰＡＲＡＢＥＮ）を含むがこれらに限定されない。この両者はアミラーゼ保存剤でもある。そのような有機化合物沈殿剤の添加によって、ｐＨ、温度、酵素の濃縮、沈殿剤の濃度、及びインキュベーション時間に関する沈殿条件に対して高い柔軟性という有益性をもたらす。一般的に少なくとも約０．０１％ｗ／ｖ、通常少なくとも約０．０２％ｗ／ｖの有機化合物沈殿剤が濃縮酵素変異体溶液に加えられる。一般的に、約０．３％ｗ／ｖ以下の有機化合物沈殿剤が濃縮酵素変異体溶液に加えられる。通常は約０．２％ｗ／ｖ以下である。
【００９３】
濃縮酵素溶液は、金属ハロゲン沈殿剤及びある態様において、有機化合物沈殿剤を含有し、精製すべき酵素変異体に応じて、そのｐＨが調整される。一般的にｐＨはアミラーゼの等電点（ｐＩ）に近いレベルに調整する。例えば、ｐＨは、等電点（ｐＩ）の下は約２．５ｐＨ単位から等電点の上は約２．５ｐＨ単位までの範囲のｐＨに調整する。変異体のｐＩが野生型のｐＩと異なる場合、それに応じてｐＨを調整する。
【００９４】
精製酵素沈殿を得るために必要なインキュベーション時間は、特定の酵素の性質、酵素濃度、及び特定の沈殿剤とその濃度によって決まる。一般的に酵素変異体を沈殿するのに効果的な時間は約１時間から約３０時間の間である。通常、約２５時間を超えない。有機化合物沈殿剤存在下では、インキュベーション時間は、約１０時間以下に減少することができ、多くの場合は約６時間にまで減少することができる。
【００９５】
一般的に、インキュベーション間の温度は約４℃から約５０℃の間である。通常、この方法は、約１０℃から約４５℃までの温度、特に、約２０℃から約４０℃までの温度で行う。沈殿を誘発する最適温度は溶液条件及び用いた酵素又は沈殿剤に応じて変化する。
【００９６】
精製酵素沈殿の全般的な回収、及び実施過程での効率は酵素、添加金属ハロゲン化物及び添加有機化合物含有溶液を攪拌することによって改善される。攪拌段階は金属ハロゲン化物と有機化合物の添加の間及びその後のインキュベーションの間に行われる。適切な攪拌方法は機械的な攪拌若しくは振盪、激しい給気、又は任意の同様な方法を含む。
【００９７】
精製酵素を、ろ過、遠心分離、マイクロろ過、回転式ドラム真空ろ過、限外ろ過、加圧ろ過、クロスメンブラン（ｃｒｏｓｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）マイクロろ過、クロスフローメンブラン（ｃｒｏｓｓ  ｆｌｏｗ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）マイクロろ過等のような、従来の分離方法によりさらに精製する。クロスメンブランマイクロろ過は用い得る方法のひとつである。さらに、精製酵素沈殿物の精製は水で沈殿物を洗浄することで得られる。例えば、精製酵素沈殿物は金属ハロゲン沈殿剤を含有する水、例えば、金属ハロゲン及び有機化合物沈殿剤を含有する水で洗浄してよい。
【００９８】
培養の間、発現酵素を培養培地中に蓄積する。発現酵素の単離及び精製のために、培養培地は細胞を除くために、遠心分離又はろ過され、得られた細胞のない溶液は酵素精製のために用い得る。ある実施態様おいては、細胞のない培養液で約７０％飽和硫酸アンモニウムを用いる塩析を行う。それから、７０％飽和沈殿分画を緩衝液に溶解し、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ)Ｇ−１００カラムのようなカラムにて処理し、酵素活性分画を回収するために溶出する。さらに精製するために、イオン交換クロマトグラフィーのような従来の方法を用いてよい。
【００９９】
精製酵素は酵素が一般的に利用されるすべての適用に有用である。例えば、洗濯洗剤及び染み取り剤中に用いられ、食品業界では、デンプン処理及びパンの焼成に、また薬品組成物中に消化剤として用いられる。それらは、液体（液状、スラリー）又は固体（粒状、粉状）のいずれかの形で最終製品に用いられてよい。
【０１００】
あるいは、酵素生成物を回収でき、更なる酵素の精製をせずにろ過又は遠心分離によって細胞又は細胞くずを除くために凝集剤を培地に添加する。
【０１０１】
上述の方法により生成及び精製されたＡｍｙＥ及びその変異体を有用な産業的適用に用いてよい。酵素は繊維及び家庭用ケア（Ｆ＆ＨＣ）に関連する利用を促進する価値ある特性を有する。例えば、ＡｍｙＥ又はその変異体を洗浄、食器洗浄、及び硬い表面のクリーニング洗剤組成物中の成分として用いることができる。ＡｍｙＥ又はその変異体は、デンプンからの甘味料及びエタノールの生産において、及び／又は織物の湯通しにも有用である。ＡｍｙＥ及びその変異体は特にデンプン転換プロセスであって、例えば、WO  2005/111203及びU.S.  Published  Application  No.  2006/0014265  (Danisco  A/S)に記載のように、デンプン液化及び／又は糖化プロセスに有用である。ＡｍｙＥ及びその変異体のこれらの使用は下記に詳しく述べる。
【０１０２】
５．  ＡｍｙＥ及びその変異体の組成物及び使用
５．１．  デンプンプロセス組成物及び使用
ある態様においては、ＡｍｙＥ又はその変異体はデンプン液化及び／又は糖化に用いてよい。プロセスはゼラチン化又は粒状デンプンのスラリーの加水分解、特に粒状デンプンの初期のゼラチン化温度未満の温度で粒状デンプンを可溶性デンプン加水分解物へ加水分解することを含んでよい。デンプンプロセスは甘味料を生産する、燃料用又は飲料用（即ち、飲料用アルコール）アルコールの生産、飲料水の生産、サトウキビの処理、又は所望の有機化合物、例えば、クエン酸、イタコン酸、乳酸、グルコン酸、ケトン、アミノ酸、抗体、酵素、ビタミン、及びホルモンの生産に有用である。デンプンのフルクトースシロップへの転換は通常三つの連続的な酵素的プロセス、液化プロセス、糖化プロセス、及び異性化プロセスからなる。
【０１０３】
本明細書にて用いる用語「液化（Ｌｉｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ）」又は「液化する（ｌｉｑｕｅｆｙ）」は、デンプンがより短い鎖及びより低い粘性のデキストリンに転換するプロセスを意味する。一般的に、このプロセスはＡｍｙＥ又はその変異体を同時に又はその後に添加して行なうデンプンのゼラチン化を含む。本明細書にて用いる用語「第一液化（ｐｒｉｍａｒｙ  ｌｉｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ）」はスラリーの温度がそのゼラチン化温度又はそれに近い温度に上昇した場合に生ずる液化の段階をいう。温度上昇に引き続き、スラリーは熱交換器又はジェットを通して送られ、約９０℃から約１５０℃、例えば１００‐１１０℃の温度となる。熱交換器又はジェットの温度にさらされた後、スラリーを３‐１０分間その温度で維持する。スラリーを９０℃―１５０℃に維持するこの段階を第一液化という。
【０１０４】
本明細書にて用いる用語「第二液化（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｌｉｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ）」は第一液化（９０℃から１５０℃に加熱）に引き続く液化段階をいい、このときスラリーは室温に冷やされる。この冷却段階は、３０分から１８０分であってよく、例えば９０分から１２０分である。本明細書にて用いる用語「第二液化の時間（ｍｉｎｕｔｅｓ  ｏｆ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｌｉｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ）」は第二液化の開始からデキストロース当量（ＤＥ）が測定される時間までの経過時間をいう。
【０１０５】
液化プロセス後、デキストリンはグルコアミラーゼ（例、ＡＭＧ（商標））及び任意に、イソアミラーゼ又はプルラナーゼ（例、Ｐｒｏｍｏｚｙｍｅ（商標））のような脱分岐酵素の添加によりデキストロースへ転換する。この段階の前に、ｐＨは約４．５未満の値に下げられ、９５℃以上の温度に維持され、液化アルファ‐アミラーゼ変異体の活性は変性される。それから、温度を６０℃に下げ、グルコアミラーゼ及び脱分岐酵素を加える。一般的に糖化プロセスは約２４時間から約７２時間で行う。
【０１０６】
ＡｍｙＥ及びその変異体の利点はマルトース、マルトトリオース、及びマルトヘプタオースなど、複合糖類の分解を触媒できるＡｍｙＥの能力である。この理由により、反応は任意にグルコアミラーゼを用いずに、ＡｍｙＥ又はその変異体の単独により触媒されることができる。ＡｍｙＥ又はその変異体の更なる利点は、グルコアミラーゼに最適な同じ反応条件下にて、ＡｍｙＥ又はその変異体の一以上の作用により、デキストリンがデキストロースへ転換され得ることである。ＡｍｙＥ及びその変異体のこの有利な特性は同時係属出願代理人番号48452-0019-P1-USに開示され、参照によりその全体を本明細書に取り込まれる。ＡｍｙＥ及びその変異体はグルコアミラーゼと同じｐＨ及び温度にて操作するので、ＡｍｙＥ及びその変異体をグルコアミラーゼとともに追加触媒の前又は後に添加してよく、またはＡｍｙＥ又はその変異体及びグルコアミラーゼのカクテルにより添加してよい。即ち、グルコアミラーゼの使用を提供するために反応のｐＨ及び温度を調整により余儀なくさせる遅れを回避できる。
【０１０７】
グルコアミラーゼを添加するときは、これは好ましくは、０．５グルコアミラーゼ活性単位（ＡＧＵ）／ｇ  ＤＳ（即ち、乾燥固体１グラム当りのグルコアミラーゼ活性単位）以下又は未満の量で存在する。グルコアミラーゼは０．０２‐２．０ＡＧＵ／ｇ  ＤＳ又は０．１‐１．０ＡＧＵ／ｇ  ＤＳ、例えば、０．２ＡＧＵ／ｇ  ＤＳの量で加えてよい。グルコアミラーゼは微生物又は植物由来である。例えば、グルコアミラーゼは、菌類又は細菌由来である。細菌のグルコアミラーゼの例は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）グルコアミラーゼであり、特に、アスペルギルス  ニガー（Ａ．  ｎｉｇｅｒ）Ｇ１又はＧ２グルコアミラーゼ（Boel  他、(1984)、EMBO  J.  3(5):  1097-1102）又はＷＯ  ９２／００３８１及びＷＯ  ００／０４１３６に記載のようなその変異体、アスペルギルス  アワモリ（Ａ．  ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ(ＷＯ８４／０２９２１)、アスペルギルス  オリザエ（Ａ．  ｏｒｙｚａｅ）グルコアミラーゼ(Agric.  Biol.  Chem.,    (1991)  55(4):  941-949)、又はその変異体又はフラグメントである。ある実施態様においては、また、プロセスは、WO98/22613に記載のタイプの炭水化物‐結合領域の使用を含む。他の考えられるアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）グルコアミラーゼ変異体は熱安定性を増強する変異体を含み、これらの変異体の例は、
Ｇ１３７Ａ及びＧ１３９Ａ(Chen他、(1996)  Prot.  Eng.  9:  499-505)、
D257E及びD293E/Q  (Chen他、  (1995)Prot.  Eng.  8:  575-582)、
N182(Chen他、  (1994)  Biochem.  J.  301:  275-281)、
ジスルフィド結合、A246C(Fierobe他、  (1996)Biochemistry,  35:  8698-8704)及び
A435及びS436位へのＰｒｏ残基の導入(Li他、  (1997)Protein  Eng.  10:  1199-1204)である。他の考えられるグルコアミラーゼはタラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）グルコアミラーゼ、特に、
タラロミセス  エマーソニー（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）(ＷＯ  ９９／２８４４８)、
タラロミセス  レイセタヌス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｌｅｙｃｅｔｔａｎｕｓ）  (Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．  ＲＥ  ３２，１５３)、
タラロミセス  デュポンチ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｕｐｏｎｔｉ）、又は
タラロミセス  サーモフィリス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）(Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．  ４，５８７，２１５)
由来のものである。考えられる細菌由来グルコアミラーゼはクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属由来のグルコアミラーゼであり、特に、
クロストリジウム  サーモアミロリティカム（Ｃ．  ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）(ＥＰ  １３５１３８)及び
クロストリジウム  サーモヒドロスルフリカム（Ｃ．  ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｍ）(ＷＯ  ８６／０１８３１)
である。適切なグルコアミラーゼはアスペルギルス  オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来グルコアミラーゼを含み、ＷＯ  ００／０４１３６中配列番号２に示されるアミノ酸配列と５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％の相同性を有するグルコアミラーゼなどである。また、適切なグルコアミラーゼは、ＡＭＧ  ２００Ｌ、ＡＭＧ  ３００Ｌ、ＳＡＮ（商標）ＳＵＰＥＲ及びＡＭＧ（商標）Ｅ(Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ)、ＯＰＴＩＤＥＸ（商標）３００(Genencor  Division,  Danisco  US  Inc.製)、  ＡＭＩＧＡＳＥ（商標）及びＡＭＩＧＡＳＥ（商標）ＰＬＵＳ  (ＤＳＭ製)、Ｇ‐ＺＹＭＥ（商標）Ｇ９００(Ｅｎｚｙｍｅ  Ｂｉｏ‐Ｓｙｓｔｅｍｓ製)、Ｇ‐ＺＹＭＥ（商標）Ｇ９９０  ＺＲ(アスペルギルス  ニガー（Ａ.  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ及び低プロテアーゼ含有量)など、商業的に入手可能なグルコアミラーゼである。
【０１０８】
ＡｍｙＥ又はその変異体は、単独で用いてよく、又は活性の広いスペクトルをもつ「カクテル」を提供するために他のＡｍｙＥ変異体、他のアルファ‐又はベータ‐アミラーゼ、又は他の酵素と組み合わせて用いてよい。例えば、デンプンを菌類のアルファ‐アミラーゼ(ＥＣ  ３．２．１．１)、細菌類のアルファ‐アミラーゼ、例えば、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼ又は非バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼ、ベータ‐アミラーゼ(ＥＣ  ３．２．１．２)、及び／又はグルコアミラーゼ  (ＥＣ  ３．２．１．３)からなる群から選択される酵素一以上と接触させてよい。さらなる実施態様においては、イソアミラーゼ(ＥＣ  ３．２．１．６８)又はプルラナーゼ(ＥＣ  ３．２.１．４１)のような別のデンプン分解酵素又は脱分岐酵素をＡｍｙＥ又はその変異体に添加してよい。イソアミラーゼはアミロペクチン及びβ‐限界デキストリン中のα‐１，６‐Ｄ‐グルコシド分岐結合を加水分解する。また、イソアミラーゼがプルランを攻撃できない点及びα‐限界デキストリンに対する作用が限られている点がプルラナーゼと異なる。脱分岐酵素は当業者が周知の効果的な量で加えてよい。
【０１０９】
ベータ‐アミラーゼはエキソ作用を有するマルトジェニックアミラーゼ（ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ  ａｍｙｌａｓｅｓ）であり、アミロース、アミロペクチン、及び関連するグルコースポリマー中の１，４‐α‐グルコシド結合の加水分解し、それにより、マルトースを放出するプロセスを触媒する。ベータ‐アミラーゼは種々の植物及び微生物（Fogarty他、  PROGRESS  IN  INDUSTRIAL  MICROBIOLOGY,  vol.  15,  pp.  112-115,  1979）から単離されてきた。これらのベータ‐アミラーゼは４０℃から６５℃の範囲の最適温度及び約４．５から約７．０の範囲の最適ｐＨを有することで特徴付けられる。考えられるベータ‐アミラーゼはオオムギ由来のベータ‐アミラーゼ、Ｓｐｅｚｙｍｅ（商標）ＢＢＡ  １５００、Ｓｐｅｚｙｍｅ（商標）ＤＢＡ、Ｏｐｔｉｍａｌｔ（商標）ＭＥ、Ｏｐｔｉｍａｌ（商標）ＢＢＡ(Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓ)及びＮｏｖｏｚｙｍ（商標）ＷＢＡ(Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ)を含むがこれらに限定されない。
【０１１０】
糖化プロセス後、デキストロースシロップを例えば固定化グルコース  イソメラーゼ（Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ（商標）など）を用いて高いフルクトースシロップへ転換してよい。ある場合、プロセスの可溶性デンプン加水分解物を高フルクトーストウモロコシシロップ（ＨＦＣＳ）のような高フルクトースデンプンベースシロップ（ＨＦＳＳ）へ転換させる。この転換はグルコース  イソメラーゼを用いて実施でき、特に、固体支持体に坦持されるグルコース  イソメラーゼにより実施される。考えられるイソメラーゼは市販用製品Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ（商標）ＩＴ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、Ｇ‐ｚｙｍｅ（商標）ＩＭＧＩ及びＧ‐ｚｙｍｅ（商標）Ｇ９９３,  Ｋｅｔｏｍａｘ（商標）Ｇ‐ｚｙｍｅ（商標）Ｇ９９３、Ｇ‐ｚｙｍｅ（商標）Ｇ９９３  ｌｉｑｕｉｄ、ＧｅｎＳｗｅｅｔ（商標）ＩＧＩを含む。
【０１１１】
典型的に、１ｍＭ  Ｃａ２＋以上の添加がアルファ‐アミラーゼの適度の安定性を確実に維持するために必要であるが、遊離Ｃａ２＋はグルコース  イソメラーゼの活性を強く阻害する。即ち、典型的に、Ｃａ２＋は、異性化の前に３‐５ｐｐｍ未満の遊離Ｃａ２＋レベルに低減する範囲になるまで、高価な単位操作手段で除去する必要がある。もし、そのような操作が避けられるならば、節約ができる。
【０１１２】
ＡｍｙＥ又はその変異体は、有利なことに、安定性のために添加されるＣａ２＋がほとんど必要ないか必要ない。この理由により、液化及び／又は糖化反応に加えるＣａ２＋を低減又は完全に除去できる。つまり、反応混合物をグルコース  イソメラーゼと接触する前にイオン交換によるＣａ２＋の除去が回避でき、時間及びコストを節約でき、高フルクトースシロップを生産するプロセスの効率性が上がる。
【０１１３】
処理されるデンプンは特に塊茎、根、茎、鞘、穀物又は未精白の穀物から得られる。より具体的には、粒状デンプンはトウモロコシ、トウモロコシの穂軸、小麦、大麦、ライ麦、ミロ、サゴ、カッサバ、タピオカ、ソルガム、米、エンドウ豆、豆、バナナ、又はジャガイモから得られる。特に、トウモロコシ及び大麦のろう様又は非ろう様タイプ両方を含む。デンプンは高度に精製されるデンプン品質でよく、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９．５％の純度である。あるいは、デンプンは、麦芽残留及び繊維のような非デンプン分画を有する粉砕全粒穀物を含む材料を含有する未精製デンプンでよい。全粒穀物のような生原料の構造を破壊し、さらに処理するために、これを粉砕する。
【０１１４】
二つの適切な粉砕プロセスは湿式及び乾式粉砕である。乾式粉砕において、実全体を粉砕し用いる。湿式粉砕は胚芽と粉末（デンプン粒子及びタンパク質）のよい分離をもたらし、通常、シロップの生産に用いられる。乾式及び湿式粉砕両方ともデンプン処理の周知の技術であり、開示される組成物及び方法に用いるために考えられる。プロセスは限外ろ過システムで行われ、同システムにおいて、未透過の残留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）は、酵素、生デンプン及び水の存在下再循環条件で維持され、透過物は可溶性デンプン加水分解物である。別の方法は、未透過の残留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）が酵素、生デンプン及び水の存在下再循環条件で維持され、透過物が可溶性デンプン加水分解物である限外ろ過膜を有する連続的膜反応器を導入するプロセスである。また、未透過の残留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）が酵素、生デンプン及び水の存在下再循環条件で維持され、透過物が可溶性で加水分解物であるマイクロろ過膜を有する連続的膜反応器を導入するプロセスも考えられる。
【０１１５】
乾式粉砕穀物はデンプンに加えて、大量の非デンプン炭水化物化合物を含む。そのような異種の材料がジェットクッキングにより処理される場合、しばしば一部のデンプンゼラチン化のみしか行われない。従って、非ゼラチン化デンプンへの高い活性を有するＡｍｙＥ又はその変異体は、乾式粉砕デンプンをジェットクッキング処理する液化及び／又は糖化を含むプロセスに積極的に適用してよい。
【０１１６】
任意の上記態様に用いるデンプンスラリーは約２０％から約５５％乾燥固体粒状デンプン、約２５％から約４０％乾燥固体粒状デンプン、又は約３０％から約３５％乾燥固体粒状デンプンを有してよい。酵素変異体は可溶性デンプンを少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の量の粒状デンプンの可溶性デンプン加水分解物へ転換する。
【０１１７】
別の実施態様においては、ＡｍｙＥ又はその変異体を、例えばエタノールなどの発酵産物を生産するための発酵に用いる。発酵によりデンプン含有材料からエタノールを生産するためのそのようなプロセスは
ｉ）ＡｍｙＥ又はその変異体とデンプン含有材料を液化させる、
ｉｉ）得られる液化マッシュを糖化させる、及び
ｉｉｉ）発酵生物存在下（ｉｉ）段階で得られる材料を発酵する
ことを含む。さらに、プロセスは任意にエタノールを回収することを含む。発酵の間、エタノール含有量は少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、又は少なくとも約１６％のエタノールに達する。
【０１１８】
糖化及び発酵プロセスは同時糖化発酵（ＳＳＦ）プロセスとして行ってよい。発酵を加水分解と同時に行う場合、温度は３０℃と３５℃の間、特に、３１℃と３４℃の間である。プロセスは未透過の残留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）が酵素、生デンプン、酵母、酵母の栄養成分及び水の存在下再循環条件で維持され、透過物がエタノールを含む液体である限外ろ過システムを導入してよい。また、未透過の残留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）が酵素、生デンプン、酵母、酵母の栄養成分及び水の存在下再循環条件で維持され、透過物がエタノール含有液体である限外ろ過膜を有する連続的膜反応器を導入するプロセスも考えられる。
【０１１９】
また、プロセスの可溶性デンプン加水分解物は、クエン酸、グルタミン酸１ナトリウム、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、グルコノデルタラクトン、又はエリソルビン酸ナトリウムのような発酵産物へ処理デンプンを発酵することを含む発酵産物の生産のために用いてよい。
【０１２０】
５．２．  洗浄及び食器洗浄組成物及び使用
例えば、本明細書に記載のＡｍｙＥ又はその変異体は、食器を洗浄する際に使用するための洗剤組成物又は他の洗浄組成物中に製剤設計されてよい。これらはゲル、粉、又は液体でよい。組成物はアルファ‐アミラーゼ変異体単独、他のデンプン分解酵素、他の洗浄酵素、及び他の洗浄組成物に共通する成分を含んでよい。
【０１２１】
つまり、食器洗浄洗剤組成物は界面活性剤を含んでよい。界面活性剤は陰イオン性、非イオン性、陽イオン性、両性の又はこれらのタイプの混合でもよい。洗剤は、低い泡立ちから泡立ちがないようなエトキシ化プロポキシレート直鎖アルコールのような非イオン性界面活性剤の０ｗｔ．％から約９０ｗｔ．％を含んでよい。
【０１２２】
洗剤適用において、ＡｍｙＥ又はその変異体は通常プロピレングリコール含有液体組成物に用いられる。例えば、ＡｍｙＥ又はその変異体は、１０％塩化カルシウム含有プロピレングリコール溶液を２５％体積／体積で混合することによりプロピレングリコール中で安定化させ得る。
【０１２３】
食器洗浄洗剤組成物は、無機及び／又は有機タイプの洗剤ビルダー塩を含んでよい。洗剤ビルダーは、リン酸を含む及びリン酸を含まないタイプに細分化される。洗剤組成物は通常約１％から約９０％の洗剤ビルダーを含む。リン酸を含む無機アルカリ性洗剤ビルダーは、本発明の場合、水溶性塩、特に、アルカリ金属ピロリン酸塩、オルトリン酸塩、及びポリリン酸塩を含む。リン酸を含む有機アルカリ性洗剤ビルダーは、本発明の場合、ホスホン酸塩の水溶性塩である。リン酸を含まない無機ビルダーは、本発明の場合、水溶性アルカリ金属炭酸塩、ホウ酸、及びケイ酸塩、並びに非水溶性結晶又はアモルファスアルミノシリケートの多様なタイプを含み、ゼオライトが最もよく知られている。
【０１２４】
適切な有機ビルダーの例は、アルカリ金属、アンモニウムや置換アンモニウム、クエン酸塩、コハク酸塩、マロン酸塩、脂肪酸スルホン酸塩、カルボキシメトキシコハク酸塩、アンモニウムポリアセテート、カルボン酸塩、ポリカルボン酸塩、アミノポリカルボン酸塩、ポリアセチルカルボン酸塩、及びポリヒドロキシスルホン酸塩を含む。
【０１２５】
他の適切な有機ビルダーは、ビルダーの特性を有している周知の高分子量ポリマーとコポリマー、例えば、適切なポリアクリル酸、ポリマレイン酸、及びポリアクリル／ポリマレイン酸コポリマー及びそれらの塩を含む。
【０１２６】
洗浄組成物は塩素／ホウ素タイプ又は酸素タイプの漂白剤を含んでもよい。無機塩素／ホウ素タイプ漂白剤の例は、次亜塩素酸リチウム、次亜塩素酸ナトリウム、又は次亜塩素酸カルシウム、及び次亜臭素酸塩、並びに塩化リン酸三ナトリウムもある。有機塩素／ホウ素タイプ漂白剤の例は、トリクロロイソシアヌル酸、トリブロモイソシアヌル酸、ジブロモイソシアヌル酸、及びジクロロイソシアヌル酸、及びカリウム及びナトリウムのような水溶性陽イオンを伴うそれらの塩のような複素環Ｎ‐ブロモ‐及びＮ‐クロロ‐イミド類である。ヒダントイン化合物もまた有用である。
【０１２７】
洗浄組成物は酸素漂白剤を含み、例えば、無機過酸塩の形態、任意に漂白前駆体又は過酸化合物としての形態である。一般的な、適切な過酸漂白化合物の例は、アルカリ金属過ホウ酸塩、四水和物及び一水和物の両方、アルカリ金属過炭酸塩、過ケイ酸塩、及び過リン酸塩である。典型的な活性剤はテトラアセチルエチレンジアミン(ＴＡＥＤ)及びグリセロールトリアセテートである。また、酵素漂白活性化システムは、例えば、ＷＯ２００５／０５６７８３に記載のように、過ホウ酸塩、過炭酸塩、グリセロールトリアセテート、及びペルヒドロラーゼなどである。
【０１２８】
洗浄組成物は、酵素用の従来の安定化剤を用いて安定化してよく、例えば、プロピレングリコールのようなポリオール、糖、糖アルコール、乳酸、ホウ酸又はホウ酸誘導体（例えば、芳香族ホウ酸エステル）である。また、洗浄組成物は他の従来の洗剤成分を含んでもよく、例えば、解膠剤、賦形剤、泡抑制剤、抗腐食剤、泥懸濁剤、金属イオン封鎖剤、抗泥再堆積剤、脱水剤、染料、抗菌剤、蛍光剤、増粘剤、及び香料を含んでよい。
【０１２９】
最後に、ＡｍｙＥ又はその変異体が、本明細書に列挙した特許及び公開された出願に開示された任意のアルファ‐アミラーゼのかわりに、又は、に加えて用いることを考慮すると、ＡｍｙＥ又はその変異体を従来の食器洗浄洗剤、例えば、次の特許公報に記載の任意の洗剤に用いてよい。それは、CA  2006687、GB  2200132、GB  2234980、GB  2228945、DE  3741617、DE  3727911、DE  4212166、DE  4137470、DE  3833047、DE  4205071、WO  93/25651、WO  93/18129、WO  93/04153、WO  92/06157、WO  92/08777、  WO  93/21299、WO  93/17089、WO  93/03129、EP  481547、EP  530870、EP  533239、EP  554943、EP  429124、EP  346137、EP  561452、EP  318204、EP  318279、EP  271155、EP  271156、EP  346136、EP  518719、EP  518720、EP  518721、EP  516553、EP  561446、EP  516554、EP  516555、EP  530635、EP  414197、及び米国特許第5,112,518、5,141,664、及び5,240,632である。
【０１３０】
５．３．  洗濯洗浄組成物及び使用
実施態様によれば、ＡｍｙＥ又はその変異体の一以上を洗剤組成物の成分としてよい。そのような場合、非粉塵化（ｄｕｓｔｉｎｇ）粒質物、安定化した液体、又は保護された酵素の形態での洗浄組成物を含んでもよい。非粉塵化（ｄｕｓｔｉｎｇ）粒質物は例えば米国特許第４，１０６，９９１、及び４，６６１，４５２に記載されるように生産されてよく、任意的に周知の方法で表面を覆ってもよい。ワックスのコーティング原料の例は、ポリ（エチレンオキシド）産物、平均分子量１、０００から２０、０００である（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）、１６から５０のエチレンオキシドの単位を有するエトキシ化ノニルフェノール、１２から２０炭素原子を含むアルコール及び１５から８０のエチレンオキシド単位が存在するエトキシ化脂肪アルコール、脂肪アルコール、脂肪酸、脂肪酸のモノ‐、ジ‐、トリグリセリドである。流動層技術による適用に有用なフィルムコーティング材料の例は、例えばＧＢ特許第１４８３５９１に記載される。例えば、液体酵素の調製物は、確立した方法に従って、プロピレングリコールのようなポリオール、糖又は糖アルコール、乳酸又はホウ酸を添加することにより安定化される。他の酵素の安定化剤は周知の技術である。被保護酵素を例えば、US  5,879,920（Danisco  A/S)又はＥＰ  ２３８２１６に記載される方法に従って調製してよい。ポリオールはタンパク質の安定化剤としても、タンパク質溶解性の改善としても長い間認められている。例えば、  Ｋａｕｓｈｉｋ他、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７８：  ２６４５８−６５  （２００３）及び  そこに引用されている文献Ｍｏｎｉｃａ  Ｃｏｎｔｉ他、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ７５７：  ２３７−２４５  （１９９７）を参照願いたい。
【０１３１】
洗剤組成物は例えば、ゲル、粉体、粒体、ペースト、又は液体として、いずれかの有用な形態でよい。一般的に、液体洗剤は、約７０％までの水及び０％から約３０％の有機溶剤を含有する液体でよい。また、約３０％の水のみを含むコンパクトゲルタイプの形態における洗剤組成物でもよい。
【０１３２】
洗剤組成物はそれぞれ陰イオン、非イオン、陽イオン、又は両性イオンである界面活性剤の一以上を含む。洗剤は、通常、リニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、アルファ‐オレフィンスルホン酸塩（α‐ｏｌｅｆｉｎｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、アルキル硫酸塩（ａｌｋｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）（(脂肪アルコール硫酸塩（ｆａｔｔｙ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）)（ＡＳ）、アルコール  エトキシ硫酸塩（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｓｕｌｆａｔｅ）（ＡＥＯＳ又はＡＥＳ）第二級アルカンスルホネート（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｌｋａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅｓ）（ＳＡＳ）、アルファ‐スルホ脂肪酸メチルエステル（α‐ｓｕｌｆｏ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒｓ）、アルキル‐又はアルケニルコハク酸（ａｌｋｙｌ‐  ｏｒ  ａｌｋｅｎｙｌｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）又は石鹸のような０％から約５０％の陰イオン界面活性剤を含む。また、組成物は、例えばＷＯ  ９２／０６１５４に記載されるように、アルコール  エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（ＡＥＯ又はＡＥ）、カルボキシル化アルコール  エトキシレート（ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｄ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｓ）、ノニルフェノール  エトキシレート（ｎｏｎｙｌｐｈｅｎｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）、アルキルポリグリコシド（ａｌｋｙｌｐｏｌｙｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）、アルキルジメチルアミンオキシド（ａｌｋｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅｏｘｉｄｅ）、エトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド（ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｍｏｎｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｄｅ）、脂肪酸モノエタノールアミド（ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｍｏｎｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｄｅ）、又はポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙ  ａｌｋｙｌ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ａｍｉｄｅ）のような０％から約４０％の非イオン界面活性剤を含んでもよい。
【０１３３】
さらに、洗剤組成物は、リパーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、及び／又は任意の組み合わせのラッカーゼのような一以上の酵素を含んでもよい。
【０１３４】
洗剤は、約１％から約６５％の洗剤ビルダー又は錯化剤を含んでよく、例えば、ゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、クエン酸塩、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＭＰＡ）、アルキル又はアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩又は層状ケイ酸塩（ｌａｙｅｒｅｄ  ｓｉｌｉｃａｔｅｓ）（例えば、ヘキスト製ＳＫＳ−６）である。また、洗剤は、アンビルト（ｕｎｂｕｉｌｔ）でもよい。即ち、実質的に洗剤ビルダーがなくてもよい。酵素は酵素の安定性に適合する任意の組成物中に用いてよい。一般的に、酵素は、カプセル化という既知の形態によって有害な成分から保護され、例えば、ハイドロゲルでの粒状化及び封入である。酵素及びデンプン結合領域を有する又は有しない特定のアルファ‐アミラーゼは、洗濯及び食器洗浄に適用に限定されず、また、表面洗浄剤での使用、デンプン又はバイオマスからのエタノール生産でも用いられる。
【０１３５】
洗剤は、一以上のポリマーを含んでよい。例えば、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ），ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ビニル  アルコール）（ＰＶＡ）、ポリアクリレート、マレイン／アクリル酸コポリマー、及びラウリル  メタアクリレート／アクリル酸コポリマーのようなポリカルボン酸塩を含む。
【０１３６】
洗剤は、漂白システムを含んでよく、それは、過ホウ酸塩、過炭酸塩のようなＨ２Ｏ２供給源を含んでよく、任意に、ＴＡＥＤ又はノナノイルオキシベンゼンスルホネート（ＮＯＢＳ）のような過酸形成漂白活性化剤と組み合わせてもよい。あるいは、漂白システムは、例えば、アミド、イミド、又はスルホン型のペルオキシ酸を含んでよい。また、漂白システムは、例えば、ＷＯ  ２００５／０５６７８３に記載される、ペルヒドロラーゼが過酸を活性化する酵素的漂白システムでもよい。
【０１３７】
洗剤組成物の酵素は、例えば、プロピレングリコール又はグリセロールのようなポリオール、糖又は糖アルコール、乳酸、ホウ酸又は芳香族ホウ酸エステルなどのホウ酸誘導体のような従来の安定化剤を用いて安定化されてよく、組成物が例えばＷＯ  ９２／１９７０９及びＷＯ  ９２／１９７０８に記載のように製剤設計されてもよい。
【０１３８】
また、洗剤は、例えばクレイ、発泡剤、石鹸泡抑制剤、抗腐食剤、泥懸濁剤、抗泥再堆積剤、染料、抗菌剤、蛍光増白剤、又は香料を含む繊維コンディショナーのような他の従来の洗剤成分を含んでもよい。ｐＨ（用いる濃度での水溶液で測定）は通常中性又はアルカリ性であり、例えば、ｐＨ約７．０から約１１．０である。
【０１３９】
アルファ‐アミラーゼ変異体は洗剤中に従来使用される濃度で含まれてよい。本発明において、洗剤組成物中アルファ‐アミラーゼ変異体は洗浄液のリットル当たり０．００００１‐１．０ｍｇ（純粋酵素タンパク質として計算）に相当する量を加えることを意図する。アルファ‐アミラーゼ変異体を含む洗剤組成物の特定の形態は次を含むように製剤設計され得る。
【０１４０】
１）約７％から約１２％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約１％から約４％のアルコール  エトキシ硫酸塩（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｓｕｌｆａｔｅ）（例えば、Ｃ１２−１８アルコール、１−２エチレンオキシド（ＥＯ））、又はアルキル硫酸塩（ａｌｋｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）（例えば、Ｃ１６−１８）、約５％から約９％のアルコール  エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ１４−１５アルコール、７ＥＯ）、約１４％から約２０％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ２ＣＯ３）、約２から約６％の可溶性ケイ酸塩、約１５％から約２２％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ４）、０％から約６％の硫酸ナトリウム（例、Ｎａ２ＳＯ４）、約０％から約１５％のクエン酸ナトリウム／クエン酸（例、Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７／Ｃ６Ｈ８Ｏ７）、約１１％から約１８％の過ホウ酸ナトリウム（例、ＮａＢＯ３・Ｈ２Ｏ）、約２％から約６％のＴＡＥＤ、０％から約２％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＣＭＣ）、０−３％のポリマー（例、マレイン／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）、０．０００１から０．１％のタンパク質の酵素（純粋酵素として計算）、及び０−５％の少量の成分（例、石鹸泡抑制剤、香料、蛍光増白剤、光退色）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒質物として製剤設計される洗剤組成物。
【０１４１】
２）約６％から約１１％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約１％から約３％のアルコール  エトキシ硫酸塩（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｓｕｌｆａｔｅ）（例えば、Ｃ１２−１８アルコール、１−２ＥＯ）、又はアルキル硫酸塩（ａｌｋｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）（例えば、Ｃ１６−１８）、約５％から約９％のアルコール  エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ１４−１５アルコール、７ＥＯ）、約１５％から約２１％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ２ＣＯ３）、約１％から約４％の可溶性ケイ酸塩、約２４％から約３４％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ４）、約４％から約１０％の硫酸ナトリウム（例、Ｎａ２ＳＯ４）、０％から約１５％のクエン酸ナトリウム／クエン酸（例、Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７／Ｃ６Ｈ８Ｏ７）、０％から約２％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＣＭＣ）、１−６％のポリマー（例、マレイン／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）、０．０００１から０．１％のタンパク質の酵素（純粋酵素タンパク質として計算）、及び０から約５％の少量の成分（例、石鹸泡抑制剤、香料、）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒質物として製剤設計される洗剤組成物。
【０１４２】
３）約５％から約９％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約７％から約１４％のアルコール  エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ１２−１５アルコール、７ＥＯ）、約１から約３％脂肪酸（例、Ｃ１６−２２脂肪酸）としての石鹸、約１０％から約１７％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ２ＣＯ３）、約３％から約９％の可溶性ケイ酸塩、約２３％から約３３％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ４）、０％から約４％の硫酸ナトリウム（例、Ｎａ２ＳＯ４）、約８％から約１６％の過ホウ酸ナトリウム（例、ＮａＢＯ３・Ｈ２Ｏ）、約２％から約８％のＴＡＥＤ、０％から約１％のホスホン酸塩（例、ＥＤＴＭＰＡ）、０％から約２％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＣＭＣ）、０−３％のポリマー（例、マレイン／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）、０．０００１から０．１％のタンパク質の酵素（純粋酵素タンパク質として計算）、及び０から５％の少量の成分（例、石鹸泡抑制剤、香料、蛍光増白剤）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒質物として製剤設計される洗剤組成物。
【０１４３】
４）約８％から約１２％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約１０％から約２５％のアルコール  エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ１２−１５アルコール、７ＥＯ）、約１４％から約２２％の炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３として）、約１％から約５％の可溶性ケイ酸塩、約２５％から約３５％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ４）、０％から約１０％の硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）、０％から約２％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＣＭＣ）、１−３％のポリマー（例、マレイン／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素タンパク質として計算）、及び０から５％の少量の成分（例、石鹸泡抑制剤、香料）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒質物として製剤設計される洗剤組成物。
【０１４４】
５）約１５％から約２１％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約１２％から約１８％のアルコール  エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ１２−１５アルコール、７ＥＯ又はＣ１２−１５アルコール、５ＥＯ）、約３％から約１３％脂肪酸（例、オレイン酸）としての石鹸、０％から約１３％のアルケニルコハク酸（ａｌｋｅｎｙｌｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）（Ｃ１２−１４）、約８％から約１８％のアミノエタノール、約２％から約８％のクエン酸、０％から約３％のホスホン酸塩、０％から約３％のポリマー（例、ＰＶＰ、ＰＥＧ）、０％から約２％のホウ酸塩（例、Ｂ４Ｏ７）、０％から約３％のエタノール、約８％から約１４％のプロピレングリコール、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素タンパク質として計算）、及び０から約５％の少量の成分（例、分散剤、石鹸泡抑制剤、香料、蛍光増白剤）を含む水性液体洗剤組成物。
【０１４５】
６）約１５％から約２１％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、３−９％のアルコール  エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ１２−１５アルコール、７ＥＯ又はＣ１２−１５アルコール、５ＥＯ）、約３％から約１０％脂肪酸（例、オレイン酸）としての石鹸、約１４％から約２２％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ４）、約９％から約１８％のクエン酸カリウム、０％から約２％のホウ酸塩（例、Ｂ４Ｏ７）、０％から約２％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＣＭＣ）、０から約３％のポリマー（例、ＰＥＧ、ＰＶＰ）、０から約３％の固着用ポリマー（例えば、ラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマー；モル比２５：１、分子量３８００）、０％から約５％のグリセロール、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素タンパク質として計算）、及び０から５％の少量の成分（例、分散剤、石鹸泡抑制剤、香料、蛍光増白剤）を含む水性構造化液体洗剤組成物。
【０１４６】
７）約５％から約１０％の脂肪アルコール硫酸塩、約３％から約９％のエトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド（ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｍｏｎｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｄｅ）、０−３％脂肪酸としての石鹸、約５％から約１０％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ２ＣＯ３）、約１％から約４％の可溶性ケイ酸塩（例、Ｎａ２Ｏ,  ２ＳｉＯ２）、約２０％から約４０％のゼオライト、約２％から約８％の硫酸ナトリウム（例、Ｎａ２ＳＯ４）、約１２％から約１８％の過ホウ酸ナトリウム（例、ＮａＢＯ３・Ｈ２Ｏ）、約２％から約７％のＴＡＥＤ、約１％から約５％のポリマー（例、マレイン／アクリル酸コポリマー、ＰＥＧ）、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素タンパク質として計算）、及び０から５％の少量の成分（例、蛍光増白剤、石鹸泡抑制剤、香料）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒質物として製剤設計される洗剤組成物。
【０１４７】
８）約８％から約１４％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約５％から約１１％のエトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド（ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｍｏｎｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｄｅ）、０％から約３％脂肪酸としての石鹸、約４％から約１０％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ２ＣＯ３）、約１％から約４％の可溶性ケイ酸塩、約３０％から約５０％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ４）、約３％から約１１％の硫酸ナトリウム（例、Ｎａ２ＳＯ４）、約５％から約１２％のクエン酸ナトリウム（例、Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７）、約１％から約５％のポリマー（例、ＰＶＰ、マレイン／アクリル酸コポリマー、ＰＥＧ）、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素タンパク質として計算）、及び０から５％の少量の成分（例、石鹸泡抑制剤、香料）を含む粒質物として製剤設計される洗剤組成物。
【０１４８】
９）約６％から約１２％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約１％から約４％の非イオン界面活性剤、約２％から約６％脂肪酸としての石鹸、約１４％から約２２％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ２ＣＯ３）、約１８％から約３２％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ４）、約５％から約２０％の硫酸ナトリウム（例、Ｎａ２ＳＯ４）、約３％から約８％のクエン酸ナトリウム（例、Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７）、約４％から約９％の過ホウ酸ナトリウム（例、ＮａＢＯ３・Ｈ２Ｏ）、約１％から約５％の漂白活性剤（例、ＮＯＢＳ又はＴＡＥＤ）、０％から約２％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＣＭＣ）、約１％から約５％のポリマー（例、ポリカルボン酸塩、ＰＥＧ）、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素タンパク質として計算）、及び０から５％の少量の成分（例、蛍光増白剤、香料）を含む粒質物として製剤設計される洗剤組成物。
【０１４９】
１０）約１５％から約２３％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約８％から約１５％のアルコール  エトキシ硫酸塩（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｓｕｌｆａｔｅ）（例えば、Ｃ１２−１５アルコール、２−３ＥＯ）、約３％から約９％のアルコール  エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ１２−１５アルコール、７ＥＯ又はＣ１２−１５アルコール、５ＥＯ）、０％から約３％脂肪酸（例、ラウリン酸）としての石鹸、約１％から約５％のアミノエタノール、約５％から約１０％のクエン酸ナトリウム、約２％から約６％のハイドロトロープ（ｈｙｄｒｏｔｒｏｐｅ）（例トルエンスルホン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｔｏｌｕｅｎｓｕｌｆｏｎａｔｅ））、０％から約２％のホウ酸塩（例、Ｂ４Ｏ７）、０％から約１％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、約１％から約３％のエタノール、約２％から約５％のプロピレングリコール、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素タンパク質として計算）、及び０から５％の少量の成分（例、ポリマー、分散剤、香料、蛍光増白剤）を含む水性液体洗剤組成物。
【０１５０】
１１）約２０％から約３２％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、６−１２％のアルコール  エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ１２−１５アルコール、７ＥＯ又はＣ１２−１５アルコール、５ＥＯ）、約２％から約６％のアミノエタノール、約８％から約１４％のクエン酸、約１％から約３％のホウ酸塩（例、Ｂ４Ｏ７）、０％から約３％のポリマー（例、マレイン／アクリル酸コポリマー、例えば、ラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマーのような固着用ポリマー）、約３％から約８％のグリセロール、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素タンパク質として計算）、及び０から５％の少量の成分（例、ヒドロトロープ（ｈｙｄｒｏｔｒｏｐｅ）、分散剤、香料、蛍光増白剤）を含む水性液体洗剤組成物。
【０１５１】
１２）約２５％から約４０％の陰イオン界面活性剤（リニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、アルキル硫酸塩、アルファ‐オレフィンスルホン酸塩、アルファ‐スルホ脂肪酸メチルエステル、アルカンスルホン酸、石鹸）、約１％から約１０％の非イオン界面活性剤（例、アルコールエトキシレート）、約８％から約２５％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ２ＣＯ３）、約５％から約１５％の可溶性ケイ酸塩、０％から約５％の硫酸ナトリウム（例、Ｎａ２ＳＯ４）、約１５％から約２８％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ４）、０％から約２０％の過ホウ酸ナトリウム（例、ＮａＢＯ３Ｈ２Ｏ）、約０％から約５％の漂白活性剤（例、ＴＡＥＤ又はＮＯＢＳ）、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素タンパク質として計算）、及び０から３％の少量の成分（例、香料、蛍光増白剤）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒質物として製剤設計される洗剤組成物。
【０１５２】
１３）上記組成物１）−１２）に記載の洗剤組成物であって、すべて又は一部のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩が（Ｃ１２−Ｃ１８）アルキル硫酸塩により置換される洗剤組成物。
【０１５３】
１４）約９％から約１５％の（Ｃ１２−Ｃ１８）アルキル硫酸塩、約３％から約６％のアルコール  エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）、約１％から約５％のポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙ  ａｌｋｙｌ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ａｍｉｄｅ）、約１０％から約２０％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ４）、約１０％から約２０％の層状２ケイ酸塩（ｌａｙｅｒｅｄ  ｄｉｓｉｌｉｃａｔｅｓ）（例、ヘキストからＳＫ５６）、約３％から約１２％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ２ＣＯ３）、０％から約６％の可溶性ケイ酸塩、約４％から約８％のクエン酸ナトリウム、約１３％から約２２％の過ホウ酸ナトリウム、約３％から約８％のＴＡＥＤ、０％から約５％のポリマー（例、ポリカルボン酸塩、及びＰＶＰ）、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素タンパク質として計算）、及び０から５％の少量の成分（例、蛍光増白剤、光退色、香料、石鹸泡抑制剤）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒質物として製剤設計される洗剤組成物。
【０１５４】
１５）約４％から約８％の（Ｃ１２−Ｃ１８）アルキル硫酸塩、約１１％から約１５％のアルコール  エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）、約１％から約４％の石鹸、約３５％から約４５％のゼオライトＭＡＰ又はゼオライトＡ、約２％から約８％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ２ＣＯ３）、０％から約４％の可溶性ケイ酸塩、約１３％から約２２％の過炭酸ナトリウム、１―８％のＴＡＥＤ、０％から約３％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＣＭＣ）、０％から約３％のポリマー（例、ポリカルボン酸塩、及びＰＶＰ）、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素タンパク質として計算）、及び０から３％の少量の成分（例、蛍光増白剤、ホスホン酸塩、香料、）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒質物として製剤設計される洗剤組成物。
【０１５５】
１６）追加的成分か又はすでに特定された漂白系に置換するかどちらか一方として、安定化又は封入された過酸を含むことを特徴とする、上述１）から１５）に記載の洗剤製剤。
【０１５６】
１７）過ホウ酸塩が過炭酸塩に置き換えられることを特徴とする、１）、３）、７）、９）、及び１２）に上述するような洗剤製剤。
【０１５７】
１８）マンガン触媒を追加的に含有することを特徴とする、１）、３）、７）、９）、１２）、１４）、及び１５）に上述するような洗剤製剤。
【０１５８】
１９）例えば、直鎖アルコキシル化第一級アルコールのような液体非イオン性界面活性剤、ビルダーシステム（例、リン酸塩）、酵素、及びアルカリを含む非水性洗剤液として製剤設計される洗剤組成物。洗剤は陰イオン界面活性剤及び／又は漂白システムを含んでもよい。
【０１５９】
別の実施態様おいては、２，６‐β−Ｄ−フルクタンヒドロラーゼ（２，６‐β−Ｄ−ｆｒｕｃｔａｎ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）は洗剤組成物に含まれてよく、家庭用及び／又は産業用の繊維／洗濯に存在するバイオフィルムの除去／洗浄に用いてよい。
【０１６０】
例えば、洗剤組成物は、染みが付いた布地の前処理に適した洗濯用添加組成物及びすすぎに添加される布地用柔軟組成物を含む手作業又は機械用の洗濯洗剤組成物として製剤設計されてよく、又は、一般的な家庭用の固い表面洗浄処理に用いるための洗剤組成物として製剤設計されてよく、又は手作業又は機械食器洗浄処理のために製剤設計されてよい。
【０１６１】
特定の態様においては、洗剤組成物は、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、ラッカーゼ、及び／又はペルオキシダーゼ、及び／又はこれらの組み合わせのような一以上の他の洗浄酵素、２，６‐β−Ｄ−フルクタンヒドロラーゼ（２，６‐β−Ｄ−ｆｒｕｃｔａｎ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、一以上のアルファ‐アミラーゼを含んでもよい。一般的に選択される酵素の特性は、選択される洗剤（例えば、最適ｐＨ、他の酵素及び非酵素成分等との適合性）と適合すべきであり、酵素は、効果的な量で存在すべきである。
【０１６２】
プロテアーゼ：適切なプロテアーゼは、動物、野菜、又は微生物のものを含む。化学的に修飾され、又はタンパク質工学的に処理される変異体も適切である。プロテアーゼはアルカリ微生物プロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼのような、セリンプロテアーゼ又はメタロプロテアーゼでもよい。アルカリプロテアーゼの例はサブチリシン類であり、特に、例えばサブチリシンノボ（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  Ｎｏｖｏ）、サブチリシンカールスバーグ（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）、サブチリシン３０９（例えば、米国特許第６，２８７，８４１号参照）、サブチリシン１４７、及びサブチリシン１６８  (例えば、ＷＯ  ８９／０６２７９を参照願いたい)のようなバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）由来のものである。トリプシン様プロテアーゼの例は、トリプシン（例、豚又は牛由来の）、及びフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）プロテアーゼ（例えば、ＷＯ  ８９／０６２７０及びＷＯ  ９４／２５５８３を参照願いたい）である。また、有用なプロテアーゼの例はＷＯ  ９２／１９７２９、ＷＯ  ９８／２０１１５に記載される変異体を含むが、これらに限定されない。好適な商業的に入手可能なプロテアーゼ酵素はアルカラーゼ（商標）（Ａｌｃａｌａｓｅ）、サビナーゼ（商標）（Ｓａｖｉｎａｓｅ）、プリマーゼ（商標）（Ｐｒｉｍａｓｅ）、ドゥララーゼ（商標）（Ｄｕｒａｌａｓｅ）、エスペラーゼ（商標）（Ｅｓｐｅｒａｓｅ）、及びカンナーゼ（商標）（Ｋａｎｎａｓｅ）(ノボ  ノルディスク（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ)）、マキサターゼ（商標）（Ｍａｘａｔａｓｅ）、マキサカール（商標）（ＭａｘａｃａｌＴＭ）、マキサペム（商標）（Ｍａｘａｐｅｍ）、プロペラーゼ（商標）（Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ）、プラフェクト（商標）（Ｐｕｒａｆｅｃｔ）、プラフェクトＯＸＰ（商標）（Ｐｕｒａｆｅｃｔ  ＯｘＰ）、ＦＮ２（商標）、及びＦＮ３（商標）(Danisco  A/S）を含むが、これらに限定されない。
【０１６３】
リパーゼ：適切なリパーゼは細菌又は菌類由来のものを含む。化学的に修飾され、又はタンパク質工学的に処理される変異体が含まれる。有用なリパーゼの例は、例えば、フミコーラ  ラヌギノサ（Ｈ．  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ  (Ｔ．  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ)）（例えば、ＥＰ  ２５８０６８及びＥＰ  ３０５２１６を参照願いたい。）及びフミコーラ  インソレンス（Ｈ．  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）（例えばＷＯ  ９６／１３５８０を参照願いたい)のようなフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）（同義語  サーモミセス(Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ)）由来のリパーゼ、又はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）リパーゼ（例えば、シュードモナス  アルカリゲネス（Ｐ．  ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）又はシュードモナス  シュードアルカリゲネス（Ｐ．  ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）由来、例えばＥＰ  ２１８  ２７２を参照願いたい)、  シュードモナス  セパシア（Ｐ．  ｃｅｐａｃｉａ）(例えばＥＰ  ３３１  ３７６を参照願いたい)、シュードモナス  スタッチェリ（Ｐ．  ｓｔｕｔｚｅｒｉ）（例えば、ＧＢ  １，３７２，０３４を参照)、シュードモナス  フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）菌株ＳＤ  ７０５（例えば、ＷＯ  ９５／０６７２０及びＷＯ  ９６／２７００２を参照)、シュードモナス  ウィスコンシネンシス（Ｐ．  ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ）（例えば、ＷＯ  ９６／１２０１２を参照)由来）、又は  バシルス  （Ｂａｃｉｌｌｕｓ）リパーゼ（例えば、バシルス  スブチリス由来（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）例えばＤａｒｔｏｉｓ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，  １１３１  ：  ２５３−３６０  （１９９３）を参照)、バシルス  ステアロテルモフィルス（Ｂ．  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、（例えばＪＰ  ６４／７４４９９２を参照)、又はバシルス  プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ（例えばＷＯ  ９１／１６４２２を参照)由来）を含むが、これらに限定されない。製剤設計の使用が考えられる更なるリパーゼ変異体は、例えば  ＷＯ  ９２／０５２４９、ＷＯ  ９４／０１５４１、ＷＯ  ９５／３５３８１、ＷＯ  ９６／００２９２、ＷＯ  ９５／３０７４４、ＷＯ  ９４／２５５７８、ＷＯ  ９５／１４７８３、ＷＯ  ９５／２２６１５、ＷＯ  ９７／０４０７９、ＷＯ  ９７／０７２０２、ＥＰ  ４０７２２５、及びＥＰ  ２６０１０５に記載のものも含む。商業的に入手可能なリパーゼ酵素はリポラーゼ（商標）（Ｌｉｐｏｌａｓｅ）及びリポラーゼウルトラ（商標）（Ｌｉｐｏｌａｓｅ  Ｕｌｔｒａ）（ノボ  ノルディスク  (Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ)）である。
【０１６４】
ポリエステラーゼ：適切なポリエステラーゼは、例えば、ＷＯ  ０１／３４８９９（Danisco  A/S）及びＷＯ  ０１／１４６２９（Danisco  A/S）に記載のものを含むがこれらに限定されない。および本明細書に記載の他の酵素との組み合わせを含んでよい。
【０１６５】
アミラーゼ：組成物は、非変異体アルファ‐アミラーゼのような他のアミラーゼとの組み合わせでもよい。これらは、デュラミル（商標）（Ｄｕｒａｍｙｌ）、ターマミル（商標）（Ｔｅｒｍａｍｙｌ）、ファンガミル（商標）（Ｆｕｎｇａｍｙｌ）、及びバン（商標）（ＢＡＮ）(ノボ  ノルディスク（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／S)）又はラピダーゼ（商標）（Ｒａｐｉｄａｓｅ）、及びプラスター（商標）（Ｐｕｒａｓｔａｒ）(Danisco  A/S）のような商業的に入手可能なアミラーゼを含むがこれらに限定されない。
【０１６６】
セルラーゼ：セルラーゼを組成物に添加してよい。適切なセルラーゼは細菌又は菌類を含む。化学的に修飾され、又はタンパク質工学的に処理される変異体が含まれる。適切なセルラーゼは、バシルス  属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）由来のセルラーゼを含む。例えば、米国特許第４，４３５，３０７、５，６４８，２６３、５，６９１，１７８、５，７７６，７５７、及びＷＯ  ８９／０９２５９に開示されるフミコーラ  インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、ミセリオフトラ  サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、及びフザリウム  オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から生産される菌類のセルラーゼである。一般的に使用を意図するセルラーゼは繊維に有益な色のケアを有している。そのようなセルラーゼの例は、例えば、ＥＰ  ０４９５２５７、ＥＰ  ０５３１３７２、ＷＯ  ９９/２５８４６  （Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ/Ｓ）、ＷＯ  ９６/３４１０８  （Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ/Ｓ）、ＷＯ  ９６／１１２６２、ＷＯ  ９６／２９３９７、及びＷＯ  ９８／０８９４０に記載のセルラーゼである。他の例では、ＷＯ  ９４／０７９９８、ＷＯ  ９８／１２３０７、ＷＯ  ９５／２４４７１、ＰＣＴ／ＤＫ９８／００２９９、ＥＰ  ５３１３１５、米国特許第５，４５７，０４６、５，６８６，５９３、及び５，７６３，２５４に記載のようなセルラーゼ変異体である。商業的に入手可能なセルラーゼはセルザイム（商標）（Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ）及びケアザイム（商標）（Ｃａｒｅｚｙｍｅ）（ノボ  ノルディスク  (Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ)）又はクラジネース（商標）（Ｃｌａｚｉｎａｓｅ）及びプラダックス  ＨＡ（商標）（Ｐｕｒａｄａｘ  ＨＡ）（Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ/Ｓ）及びＫＡＣ−５００（Ｂ）（商標）（花王社）を含む。
【０１６７】
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：組成物での使用が意図される適切なペルオキシダーゼ／オキシダーゼは、植物、細菌又は菌類由来のものを含む。化学的に修飾され、又はタンパク質工学的に処理される変異体が含まれる。有用なペルオキシダーゼ例は、コプリナス  シネレウス（Ｃ．  ｃｉｎｅｒｅｕｓ）由来のようなコプリナス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）由来のペルオキシダーゼ及びＷＯ  ９３／２４６１８、ＷＯ  ９５／１０６０２、及びＷＯ  ９８／１５２５７に記載のようなそれらの変異体由来のペルオキシダーゼを含む。商業的に入手可能なペルオキシダーゼは、例えば、ガードザイム（商標）（Ｇｕａｒｄｚｙｍｅ）（ノボ  ノルディスク  (Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ)）を含む。
【０１６８】
洗剤酵素を一以上の酵素を含む分離添加物を加えることによって又はこれらの酵素すべてを含む組合せ添加物を加えることによって洗剤組成物中に含有してもよい。洗剤添加物、すなわち、分離添加物又は組合せ添加物は、例えば粒質物、液体、スラリー等として製剤設計される。適切な粒状洗剤添加物製剤は、非粉塵化粒質物を含む。
【０１６９】
非粉塵化（ｄｕｓｔｉｎｇ）粒質物を、例えば、米国特許第４，１０６，９９１及び４，６６１，４５２に記載のように調製してよく、任意に周知の方法でコーティングしてよい。ワックスコーティング材の例は、平均分子量１、０００から２０、０００を有するポリ（エチレンオキシド）製品（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）、１６から５０のエチレンオキシド単位を有するエトキシ化ノニルフェノール、１２から２０炭素原子を含むアルコール及び１５から８０のエチレンオキシド単位であるエトキシ化脂肪アルコール、脂肪アルコール、脂肪酸、及び脂肪酸のモノ‐、ジ‐、トリグリセロールである。流動層技術による適用に有用なフィルム形状コーティング材の例は、例えば、ＧＢ  １４８３５９１に記載される。例えば、液体酵素の調製物は、プロピレングリコールのようなポリオール、糖、糖アルコール、乳酸、ホウ酸を確立した方法に従って加えることにより、安定化されてよい。被保護酵素はＥＰ２３８，２１６に記載の方法に従って調製されてよい。
【０１７０】
洗剤組成物は例えば棒状、錠剤、粉、ゲル、粒体、ペースト、又は液体のような任意の便利な形態でよい。液体洗剤は水性、典型的には、約７０％水分まで、及び０％から約３０％の有機溶剤まで含んでよい。約３０％以下の水分を含むコンパクト洗剤ゲルもまた本発明に含まれる。洗剤組成物は一以上の界面活性剤を含み、それは、非イオン性でもよく、半極性及び／又は陰イオン性及び／又は陽イオン性及び／又は両性イオン性、又はこれらの組み合わせを含んでもよい。界面活性剤は、典型的には、約０．１ｗｔ．％から約６０ｗｔ．％含んでよい。
【０１７１】
界面活性剤が含まれる場合、洗剤は通常約１％から約４０％の陰イオン性界面活性剤を含み、例えば、リニアアルキルベンゼンスルホン酸塩、アルファ‐オレフィンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩（脂肪アルコール硫酸塩）、アルコール  エトキシ硫酸塩、第二級アルカンスルホン酸塩、アルファ‐スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル‐又はアルケニルコハク酸又は石鹸である。
【０１７２】
界面活性剤を含む場合、洗剤は通常、約０．２％から約４０％の非イオン性界面活性剤を含み、例えば、アルコールエトキレート、ノニルフェノール  エトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、  エトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、又はグルコサミンのＮ‐アシル‐Ｎ‐アルキル誘導体（「グルカミド」）である。
【０１７３】
洗剤は０％から約６５％の洗剤ビルダー又は錯化剤を含んでよく、例えば、ゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸、アルキル又はアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩又は層状ケイ酸塩（例、ヘキスト社製ＳＫＳ−６）である。
【０１７４】
洗剤は一以上のポリマーを含んでよい。一般的にポリマーは、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ），ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（エチレン  グリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（ビニル  アルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピリジン‐Ｎ‐オキシド）、ポリ（ビニルイミダゾール）、ポリアクリレート、マレイン／アクリル酸コポリマー、及びラウリル  メタアクリレート／アクリル酸コポリマーのようなポリカルボン酸塩を含む。
【０１７５】
洗剤は、過酸形成漂白活性化剤（例えば、テトラアセチルエチレンジアミン又はノナノイルオキシベンゼンスルホネート）と結合する過ホウ酸塩又は過炭酸塩のようなＨ２Ｏ２供給源を含む漂白システムを含んでよい。あるいは、漂白システムは、ペルオキシ酸（例えば、アミド、イミド、又はスルホン型のペルオキシ酸）を含んでよい。また、漂白システムは、酵素的漂白システムでもよい。
【０１７６】
洗剤組成物の酵素を、従来の安定化剤を用いて安定化してよい。例えば、ポリオール（例えば、プロピレングリコール又はグリセロールのような）、糖又は糖アルコール、乳酸、ホウ酸、又はホウ酸誘導体（例えば、芳香族ホウ酸エステルのような）、又はフェニルホウ酸誘導体（例えば、４−ホルミルフェニルホウ酸のような）である。組成物はＷＯ  ９２／１９７０９及びＷＯ  ９２／１９７０８に記載のように製剤設計されてよい。
【０１７７】
また、洗剤組成物は他の従来の洗剤成分を含んでもよく、例えば、クレイ、泡増進剤、石鹸泡抑制剤、抗腐食剤、泥懸濁剤、抗泥再堆積剤、染料、抗菌剤、蛍光増白剤、ヒドロトープ、曇り防止剤、及び／又は香料を含む布地コンディショナーである。
【０１７８】
洗剤組成物には、酵素変異体を洗浄液１リットル当たり約０．０１から約１００ｍｇの酵素タンパク質、特に、洗浄液１リットル当たり約０．０５から約５．０ｍｇの酵素タンパク質、又は特に、洗浄液１リットル当たり約０．１から約１．０ｍｇの酵素タンパク質に相当する量を添加してよいことが本発明にて意図される。
【０１７９】
ＡｍｙＥ又はその変異体を含む洗浄組成物の有効性を試験するために用いられる代表的な試験は見本試験を含む。「見本（ｓｗａｔｃｈ）」は、布地に着いた染みを有する布地のような材料の一片をいう。例えば、材料を綿、ポリエステル又は天然と合成繊維の混合物から作製してよい。あるいは、材料は、フィルター紙又はニトロセルロースのような紙、又はセラミック、金属、又はグラスのような固い材料でもよい。アルファ‐アミラーゼにとって、汚れはデンプンベースであるが、血液、牛乳、インク、草、紅茶、ワイン、ホウレンソウ、肉汁、チョコレート、卵、チーズ、泥、染料、油又はこれらの化合物の混合物を含み得る。これらに限定されない。ある実施態様においては、ＡｍｙＥ又はその変異体はＢＭＩ（血液／牛乳／インク）試験で実施される。
【０１８０】
「小さな見本（ｓｍａｌｌｅｒ  ｓｗａｔｃｈ）」は、一穴式の穴開け器でカットされている見本の切断部であり、又はカスタムメードの９６穴用穴開け器であって、多数の穴が標準９６穴マイクロタイタープレートに対応するようになっている穴開け器でカットされる見本の切断部、又は見本から別な方法で取り出されている部分である。見本は織物、紙、金属、又は他の適切な材料である。小さな見本は、その見本が、２４‐、４８‐、又は９６‐穴マイクロタイタープレートに置かれる前又は後のいずれか一方にて染みが付着される。小さな見本（ｓｍａｌｌｅｒ  ｓｗａｔｃｈ）はまた少量の材料に染みを適用して作成してもよい。例えば、小さな見本は、汚れが付いた直径５／８″又は０．２５″の布地のものでよい。カスタムメード穴開け器は９６穴プレートのすべてに同時に９６個の見本が挿入されるように設計されている。装置は、単に同じ９６穴プレートに複数回挿入することにより、穴ごとに二以上の見本の搬送をさせる。複数穴用穴開け器は、任意の設定プレートに見本の同時挿入をすることができるものであり、２４‐、４８‐、又は９６‐穴プレートを含むがこれらに限定されない。他の考えられる方法は、汚れ試験プラットフォームが金属、プラスティック、グラス、セラミック又は汚れ物質でコートされる他の適切な材料から作られるビーズである。一以上のコートされるビーズは適切な緩衝液と酵素を含んだ９６‐、４８‐、又は２４‐穴プレート又はより大きい穴型式のプレートに挿入される。この場合、上清は直接吸光度の測定をすることにより、又は二次的な色の発色反応後のどちらかの方法で分離する汚れを測定する。また、分離する汚れの分析を質量スペクトル解析によって処理する。
【０１８１】
ある実施態様においては、染みの固定度合いを制御する処理手順を提供する。結果として、例えば、試験されるべき酵素の不存在下で洗浄するとき、汚れの量を変えて放出することのできる見本の作製が可能となる。固定化見本の使用によって、洗浄試験における信号対雑音の比に劇的な改善が得られる。さらに、固定度合いの変化によって、種々の洗浄条件下、最適な結果が得られる染みの付着を与えることができる。
【０１８２】
種々のタイプの材料の周知の「強度（ｓｔｒｅｎｇｔｈ）」の汚れを有する見本は商業的に入手可能であり（ＥＭＰＡ，  Ｓｔ．  Ｇａｌｌｅｎ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；  ｗｆｋ-Ｔｅｓｔｇｅｗｅｂｅ  ＧｍｂＨ，  Ｋｒｅｆｅｌｄ  Ｇｅｒｍａｎｙ;又はＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，  Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、及び／又は、専門家（Ｍｏｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｔｏ，  Ｔｅｘｔｉｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ５２（４）：  ２８０  ２８６  （１９８２））によっても作成される。例えば、見本は、血液／牛乳／インク（ＢＭI）染み、ホウレンソウの染み、草、又はチョコレート／牛乳／すすにより作成された汚れを含む綿を含む布地を含んでよい。例えば、ＢＭＩ染みは０．０００３％から０．３％の過酸化水素で綿に固定される。他の組み合わせは０．００１％から１％のグルタルアルデヒドで固定される草又はホウレンソウ、０．００１％から１％のグルタルアルデヒドで固定されるゼラチン及びクーマシィー染色又は０．００１％から１％のグルタルアルデヒドで固定されるチョコレート、牛乳やすすを含む。
【０１８３】
また、見本は酵素及び／又は洗剤製剤でインキュベーションする間、攪拌され得る。洗浄能力データはウェル、特に９６穴プレートにおける見本の方向（水平対垂直）に依存する。これは、インキュベーション期間に混合が不十分であったことを示すであろう。インキュベーション期間の十分な攪拌を確認する多くの方法があるけれども、アルミニウムの二つのプレートの間でマイクロタイタープレートを挟むプレートホルダーが設計され得る。これの設置の仕方は単純で、例えば、接着プレート用シールでウェルを覆い、二つのアルミニウムプレートを適切なタイプの商業的に入手可能なクランプで９６穴プレートに固定すれば足りる。それは商業的なインキュベーター振盪機に設置可能である。振盪機を約４００ｒｐｍで設定することによって非常に効率のよい攪拌が得られ、一方、漏れ又は交互の汚染がホルダーによって効果的に防止される。
【０１８４】
トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）は洗浄液体中アミノ基の濃度を定量するために用いる。これは、見本から除去されたタンパク質の量の測定に役立つ（例えば、Ｃａｙｏｔ  ａｎｄ  Ｔａｉｎｔｕｒｉｅｒ，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２４９：  １８４−２００  （１９９７）を参照願いたい）。しかしながら、洗剤又は酵素のサンプルが非常に小さいペプチド断片（例えば、サンプル中のペプチダーゼの存在から）を生じる場合、より大きなＴＮＢＳシグナル、即ち「ノイズ」が生じる。
【０１８５】
血液／牛乳／インクの洗浄能力を測定する他の手段は、洗浄液の吸光度を測定することにより定量できるインク放出に基づく。吸光度を３５０ｎｍと８００ｎｍの間の任意の波長で測定する。ある実施態様においては、波長を４１０ｎｍ又は６２０ｎｍで測定する。また、洗浄液体を用いて、草、ホウレンソウ、ゼラチン、又はクーマシィー染色を含む汚れにおける洗浄能力を決定するために試験を行う。これらの汚れに対する適切な波長は、ホウレンソウ又は草について６７０ｎｍ及びゼラチン又はクーマシィーについては６２０ｎｍを含む。例えば、洗浄液（例えば、一般的に９６穴プレートから１００‐１５０μＬ）のアリコートを除き、キュベット又はマルチウェルマイクロプレートに移す。その時これを分光光度計にセットし、吸光度を適切な波長にて測定する。またシステムを例えば衣服、プラスティック、又はセラミックのような適切な物質上の血液／牛乳／インク染みを用いて食器洗浄用の適切な酵素及び／又は洗剤組成物を決定するために用いる。
【０１８６】
ある態様においては、０．３％過酸化水素をＢＭＩ／綿見本に３０分間２５℃で処理してＢＭＩ染みを綿に固定し、又は０．０３％過酸化水素をＢＭＩ／綿見本に３０分間６０℃で処理してＢＭＩ染みを綿に固定する。約０．２５″の小さな見本をＢＭＩ／綿見本から切り離し、９６穴マイクロタイタープレートのウェルに移す。各ウェルに洗剤組成物及び変異タンパク質のような酵素の周知の混合物を添加する。マイクロタイタープレートの上に粘着プレート用シールを固定した後、マイクロタイタープレートをアルミニウムプレートに挟み、約１０から６０分間、約２５０ｒｐｍでオービタルシェーカー（ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｈａｋｅｒ）で攪拌する。この時間の最終時点で、上清は新しいマイクロタイタープレートに移され、６２０ｎｍでインクの吸光度を測定する。これは０．０１％グルタルアルデヒドをホウレンソウ／綿見本又は草／綿見本に３０分間２５℃で処理によるホウレンソウ又は草染み固定綿で同様に試験される。同様にチョコレート、牛乳、及び／又はすすの染みで行われる。
【０１８７】
５．４．  織物の湯通し組成物及び使用
また、本発明は、一以上のＡｍｙＥ又はその変異体を用いる布地を処理する（例えば、織物を湯通しする）組成物及び方法を含む。ＡｍｙＥ又はその変異体は、任意の布地処理方法を用いてよく、それは周知技術である（例えば、米国特許第６，０７７，３１６を参照願いたい）。例えば、ある態様においては、布地の手触り及び外観が、溶液中布地を酵素変異体と接触することを含む方法により改善される。ある態様においては、布地を加圧下その溶液で処理する。
【０１８８】
ある態様においては、酵素を織物の製織の間又は後、又は湯通し段階、又は一以上の追加する布地処理段階の間に適用してよい。織物の製織の間、糸に相当な機械的負荷がかかる。機械織機で製織する前に、伸長強度の増加及び切断防止のために、縦糸をしばしばサイジングデンプン又はデンプン誘導体でコートする。ＡｍｙＥ又はその変異体をこれらのサイジングデンプン又はデンプン誘導体を除去するために適用する。織物が織られた後、布地を湯通し段階へ進めてよい。これは一以上の布地処理段階を伴う。湯通しは織物からサイズを除く作用がある。製織後、さらに布地を処理する前に均一で洗浄にたえる結果物を確保するためにサイズのコーティングは除かなければならない。また、本発明は、酵素変異体の作用によりサイズの酵素的加水分解を含む湯通しの方法を提供する。
【０１８９】
ＡｍｙＥ又はその変異体を綿素材の布地を含む布地を湯通しするため単独又は他の湯通し用化学試薬及び／又は湯通し用酵素と共に用いてよく、例えば液体組成物中の洗剤添加剤として用いてよい。また、ＡｍｙＥ又はその変異体をインディゴ染色デニム生地及び衣類に見られるストーンウォッシュを生産する方法に及び組成物中に用いてよい。衣類製造のために、布地は衣服及び衣類に裁断及製縫され、その後完成する。特に、デニムのジーンズの製造のために種々の酵素的仕上げ方法が開発されている。衣類がデンプン分解酵素の作用を受けている間布地に柔軟性を与え、綿が次の酵素仕上げ段階をより受けやすくするためにデニム衣類の仕上げは通常酵素的湯通し段階で始まる。アルファ‐アミラーゼ変異体をデニム衣類の仕上げ（例えば、「バイオ‐ストーン処理」（ｂｉｏ‐ｓｔｏｎｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｓｓ）、酵素的湯通し及び布地に柔軟性を与え、及び／又はプロセスの仕上げに用いてよい。
【０１９０】
５．５．  焼成及び食品調製のための組成物及び方法
また、本明細書に記載のＡｍｙＥ又はその変異体を焼成及び食品調製のための組成物及び方法に用いてよい。焼成及び食品生産ための商業用及び家庭用の使用には、穀粉中のアルファ‐アミラーゼ活性の適切なレベルを維持することが重要である。あまりに高い活性のレベルは粘性が高く及び／又はたるんだ及び商品にならない製品をもたらすが、不十分なアルファ‐アミラーゼ活性を有する穀粉は適切な酵母機能のための十分な糖を含有せず、その結果乾燥したもろいパンとなる。従って、ＡｍｙＥ又はその変異体は、それ自身又は他のアルファ‐アミラーゼと組み合わせて、穀粉中内因性アルファ‐アミラーゼ活性のレベルを増大するために穀粉に添加してよい。ＡｍｙＥ又はその変異体は、デンプン存在下、例えば３０−９０℃、５０−８０℃、５５−７５℃、又は６０−７０℃の範囲の最適温度を有する。最適温度はｐＨ５．５にて可溶性デンプン１％溶液中で測定できる。
【０１９１】
焼成における穀物及び他の植物製品の使用に加えて、オオムギ、オートムギ、小麦、のような穀物や、トウモロコシ、ホップ、及び米のような植物成分は産業用及び家庭用醸造両方の醸造のために用いる。醸造に用いる組成物は麦芽未処理又は麦芽処理されてよく、これは部分的発芽がアルファ‐アミラーゼ含有酵素のレベルを増加をもたらすことを意味する。連続醸造のために、十分なアルファ‐アミラーゼ酵素活性が発酵のための適切な糖のレベルを確保するのに必要である。従って、ＡｍｙＥ又はその変異体を、それ自身により、又は別のアルファ‐アミラーゼとの組み合わせにより、醸造のために用いる成分に添加してよい。
【０１９２】
本明細書にて用いる用語「穀粉（ｆｌｏｕｒ）」は粉砕又は製粉された穀物をいう。また、用語「穀粉（ｆｌｏｕｒ）」は、粉砕又はつぶされたサゴ又は塊茎産物を意味する。いくつかの実施態様においては、また、穀粉はさらに、粉砕またはつぶされた穀物または植物の成分を含んでよい。追加的成分の例はパン種剤であるが、これに限定されない。穀類は、小麦、オートムギ、ライ麦、及びオオムギを含むが、これに限定されない。塊茎産物はタピオカ粉、キャッサバ粉、及びカスタード粉を含む。また、用語「穀粉（ｆｌｏｕｒ）」は粉砕トウモロコシ粉、トウモロコシミール、米粉、全粒ミール粉、セルフライジングフラワー、タピオカ粉、キャッサバ粉、粉砕米、補強粉、及びカスタード粉を含む。
【０１９３】
本明細書にて用いる、「原料（ｓｔｏｃｋ）」は粉砕又は破壊された穀物及び植物成分をいう。例えば、ビール生産で用いるオオムギは発酵用マッシュを生産するのにふさわしい濃度を得るために荒く粉砕又はつぶした穀物である。本明細書にて用いる用語「原料（ｓｔｏｃｋ）」はつぶされ又は荒く粉砕した形態の植物及び穀物の任意の前述のタイプを含む。本明細書にて述べる方法は穀粉及び原料両者におけるアルファ‐アミラーゼ活性レベルを検出するために用いてよい。
【０１９４】
パン製品の劣化、即ちパンの中身部分の硬化を防ぎ又は遅らせるために、ＡｍｙＥ又はその変異体は単独に又は他のアミラーゼとの組み合わせで添加してよい。抗劣化アミラーゼの量は、典型的に穀粉１ｋｇあたり０．０１−１０ｍｇの酵素タンパク質の範囲でよく、例えば、１−１０ｍｇ／ｋｇである。アルファ‐アミラーゼ変異体ポリペプチドと組み合わせて用いることができる追加的な抗劣化アミラーゼはエンド‐アミラーゼを含み、例えば、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来細菌性エンド‐アミラーゼである。追加的なアミラーゼはマルトジェニックアルファ‐アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１３３）、例えば、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のものである。Ｎｏｖａｍｙｌ（商標）は、バシルス  ステアロテルモフィルス（Ｂ．  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）菌株ＮＣＩＢ  １１８３７由来のマルトジェニックアルファ‐アミラーゼ（ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ  ａｌｐｈａ‐ａｍｙｌａｓｅｓ）であり及びC.  Christophersen他、  Starch  50(1):  39-45（１997）に記載される。抗劣化エンドアミラーゼの他の例はバシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）又はバシルス  アミロリケファシエンス（Ｂ．  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）など、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来の細菌類のアルファ‐アミラーゼを含む。抗劣化アミラーゼは例えば、大豆など、植物源由来又はバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）など微生物源由来のベータ‐アミラーゼのようなエキソアミラーゼである。
【０１９５】
ＡｍｙＥ又はその変異体を含む焼成組成物は、さらにホスホリパーゼを含んでよい。ホスホリパーゼはリン脂質から脂肪酸を除去するためにＡ１又はＡ２活性を有し、溶解リン脂質を形成する。それはリパーゼ活性、即ちトリグリセリドに対する活性を有しても有さなくてもよい。ホスホリパーゼは３０−９０℃の範囲、例えば３０−７０℃の範囲で最適温度を有してよい。添加ホスホリパーゼは動物由来、例えば、膵臓、例えば、ウシ又はブタ膵臓、ヘビ毒又はハチ毒由来である。あるいは、ホスホリパーゼは微生物由来、例えば、糸状菌、酵母又は細菌由来でよく、例えば、
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属又はその種のアスペルギルス  ニガー（Ａ.  ｎｉｇｅｒ）のような、
タマホコリカビ（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）属又はその種のキイロタマホコリカビ（Ｄ.  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）のような、
ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属又はその種のムコール  ジャバニカス（Ｍ.  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、ムコール  ムセド（Ｍ.  ｍｕｃｅｄｏ）、ムコール  サブチリシムス（Ｍ.  ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ）のような、
ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属又はその種のニューロスポラ  クラッサ（Ｎ.  ｃｒａｓｓａ）のような、
リゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）属又はその種のリゾムコール  プシラス（Ｒ.  ｐｕｓｉｌｌｕｓ）、
リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属又はその種のリゾプス  アルヒズス（Ｒ.  ａｒｒｈｉｚｕｓ）、リゾプス  ジャポニカス（Ｒ.  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、リゾプス  ストロニファー（Ｒ.  ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ）のような、
スクレロティニア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）属又はその種のスクレロティニア  リベルチアナ（Ｓ.  ｌｉｂｅｒｔｉａｎａ）のような、
トリコフィトン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）属又はその種のトリコフィトン  ルブルム（Ｔ.  ｒｕｂｒｕｍ）のような、
ウェトゼリニア（Ｗｈｅｔｚｅｌｉｎｉａ）属又はその種のウェトゼリニア  スクレロチニア（Ｗ.ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）のような、
バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属又はその種のバシルス  メガトリウム（Ｂ.  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような、
サイトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属又はその種のサイトロバクター  フレウンディイ（Ｃ.  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）のような、
エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属又はその種のエンテロバクター  アエロゲネス（Ｅ.  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エンテロバクター  クロアカエ（Ｅ.  ｃｌｏａｃａｅ）のような、
エドワージエラ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）属又はその種のエドワージエラ  タルダ（Ｅ.  ｔａｒｄａ）のような、
エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属又はその種のエルウィニア  ヘルビコラ（Ｅ.  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）のような、
エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属又はその種の大腸菌（Ｅ.  ｃｏｌｉ）のような、
クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属又はその種のクレブシエラニューモニアエ（Ｋ.  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のような、
プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属又はその種のプロテウス  ブルガリス（Ｐ.  ｖｕｌｇａｒｉｓ）のような、
プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属又はその種のプロビデンシア  スチュアーティイ（Ｐ.  ｓｔｕａｒｔｉｉ）のような、
サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属又はその種のサルモネラティフィムリウム（Ｓ.  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のような、
セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属又はその種のセラチア  リクファシエンス（Ｓ.  ｌｉｑｕｅｆａｓｃｉｅｎｓ）、セラチア  マルセッセンス（Ｓ.  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）のような、
シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属又はその種のシゲラ  フレクスネリ（Ｓ.  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）のような、
ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属又はその種のストレプトミセス  バイオラセオルバー（Ｓ.  ｖｉｏｌｅｃｅｏｒｕｂｅｒ）のような、
エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属又はその種のエルシニアエンテロコリティカ（Ｙ.  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）のような、
フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属又はその種のフザリウム  オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）（例えば、ＤＳＭ２６７２菌株）のようなものでよい。
【０１９６】
ホスホリパーゼは焼成後初期の期間、特に、最初の２４時間パンのやわらかさを改善する量を加えてよい。ホスホリパーゼの量は一般的に、穀粉のｋｇ当たり０．０１−１０ｍｇ酵素タンパク質、例えば、０．１−５ｍｇ／ｋｇである。つまり、ホスホリパーゼ活性は一般的に２０−１０００リパーゼ単位（ＬＵ）／ｋｇ穀粉の範囲であり、ここで、リパーゼ単位は乳化剤としてアラビアゴム及び基質としてトリブチリンを有し、ｐＨ７．０、３０℃で１分当たり１μｍｏｌ酪酸を放出するために必要な酵素の量として定義される。
【０１９７】
一般的にパン生地の組成物は、小麦全粒粉又は小麦粉及び／又は他のタイプの全粒粉、トウモロコシ粉、コーンスターチ、ライ麦の全粒粉、ライ麦の粉、エンバク粉、オートミール、大豆粉、ソルガム全粒粉、ソルガム粉、ジャガイモ全粒粉、ジャガイモ粉又はジャガイモデンプンなどの粉、又はデンプンを含む。パン生地は生、冷凍又は標準的焼成（ｐａｒ‐ｂａｋｅｄ）状態でよい。パン生地は発酵生地又は発酵されるパン生地である。パン生地は種々の方法で発酵される。薬の化学膨張剤、例えば、重曹の添加により、又はイーストを添加して、パン生地を発酵する。パン生地は例えば市場にて入手可能なサッカロミセス  セレビジアエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の菌株であるサッカロミセス  セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（パン用イースト）の培養物のような適切な酵母培養を添加することにより発酵される。
【０１９８】
また、パン生地は他の従来のパン生地成分、例えば、牛乳粉、グルテン、及び大豆、のようなタンパク質、卵（全卵、黄卵、又は卵白）、アスコルビン酸、臭素酸カリウム、ヨウ素酸カリウム、アゾジカ−ボンアミド（ＡＤＡ）又は過硫酸アンモニウムのような酸化剤、Ｌ‐システインのようなアミノ酸、糖、塩化ナトリウム、酢酸カルシウム、硫酸ナトリウム、又は硫酸カルシウムのような塩を含む。さらに、パン生地は粒状脂肪又はショートニングなど、脂肪、例えば、トリグリセリドを含んでよい。パン生地は、モノ‐又はジグリセリド、モノ‐又はジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル（ｄｉａｃｅｔｙｌ  ｔａｒｔａｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｅｓｔｅｒｓ）、脂肪酸の糖エステル、脂肪酸のポリグリセロールエステル、モノグリセリドの乳酸エステル、モノグリセリドの酢酸エステル、ポリオキシエチレンステアレート（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｌｉｙｌｅｎｅ  ｓｔｅａｒａｔｅｓ）、又は、リゾレシチンのような乳化剤を含む。特に、パン生地は、乳化剤の添加せずに作ることができる。
【０１９９】
任意に、追加的な酵素を抗劣化アミラーゼ及びホスホリパーゼと共に用いてよい。追加的な酵素はアミログルコシダーゼ、ベータ‐アミラーゼ、シクロデキストリン  グルカノトランスフェラーゼのような第二のアミラーゼでよく、又は追加的酵素はペプチダーゼであり、特に、エキソペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、特に、ペントサナーゼ、例えば、キシラナーゼ、プロテアーゼ、プロテインジスルフィドイソメラーゼであって、例えば、ＷＯ  ９５／００６３６記載のプロテインジスルフィドイソメラーゼ、グルカノトランスフェラーゼ、分岐酵素（１，４‐アルファ‐グルカン分岐酵素）、４‐アルファ‐グルカノトランスフェラーゼ（デキストリン  グリコシルトランスフェラーゼ）又はオキシドレダクターゼ、例えば、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、グルコース  オキシダーゼ、ピラノース  オキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ又は炭水化物オキシダーゼでもよい。追加的酵素は哺乳類及び植物由来や特に微生物（細菌類、酵母、又は菌類）由来を含む任意の原型に由来するものでよく、従来技術により得られる。
【０２００】
一般的に、キシラナーゼは微生物由来でよく、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の菌株、特に、セルロース高分解糸状菌（Ａ.  ａｃｕｌｅａｔｕ）、アスペルギルス  ニガー（Ａ．  ｎｉｇｅｒ）(例、  ＷＯ  ９１／１９７８２)、アスペルギルス  アワモリ（Ａ．  ａｗａｍｏｒｉ）(例、ＷＯ  ９１／１８９７７）、又はアスペルギルス  ツビゲンシス（Ａ．  ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）(例、ＷＯ  ９２／０１７９３)由来、例えばトリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）のようなトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株由来、又は例えばフミコーラ  インソレンス（Ｈ．  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）(例、ＷＯ  ９２／１７５７３)のようなフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）の菌株由来の細菌類又は菌類由来でよい。Ｐｅｎｔｏｐａｎ（商標）及びＮｏｖｏｚｙｍ  ３８４（商標）はトリコデルマ  レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）から生産される商業的に入手可能なキシラナーゼ調製品である。アミログルコシダーゼはアスペルギルス  ニガー（Ａ．  ｎｉｇｅｒ）アミログルコシダーゼ（ＡＭＧ（商標）のような）でよい。他の有用なアミラーゼ製品はＧｒｉｎｄａｍｙｌ（商標）Ａ  １０００又はＡ  ５０００(Ｇｒｉｎｄｓｔｅｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ製、Ｄｅｎｍａｒｋ)及びＡｍｙｌａｓｅ（商標）Ｈ又はＡｍｙｌａｓｅ（商標）Ｐ(Ｇｉｓｔ‐Ｂｒｏｃａｄｅｓ製、  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ)である。グルコース  オキシダーゼは菌類のグルコース  オキシダーゼ、特にアスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコース  オキシダーゼ（Ｇｌｕｚｙｍｅ（商標）のような）でよい。典型的なプロテアーゼはＮｅｕｔｒａｓｅ（商標）である。典型的なリパーゼはサーモミセス(Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ)  (フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）)、リゾムコール(Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ)、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）または  シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌株由来であり、特にサーモミセス  ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）  (フミコーラ  ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ)）、リゾムコール  ミエヘイ(Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ)、カンジダ  アンタルティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、アスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、リゾプス  デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ）又はリゾプス  アルヒズス（Ｒ.  ａｒｒｈｉｚｕｓ）又はシュードモナス  セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐａｃｉａ）由来である。特定の実施態様においては、リパーゼは、ＷＯ  ８８／０２７７５記載のカンジダ  アンタルティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来リパーゼＡ又はリパーゼＢでよく、又はリパーゼは、例えば、ＥＰ  ２３８，０２３記載のリゾムコール  ミエヘイ(Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ)又は例えば、ＥＰ  ３０５，２１６記載のフミコーラ  ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）又は例えば、ＥＰ  ２１４，７６１及びＷＯ  ８９／０１０３２記載のシュードモナス  セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐ��ｃｉａ）由来でよい。
【０２０１】
本発明のプロセスは白色、ライト、ダークタイプの如何を問わず、ソフトとクリスピーとを問わず、これらのタイプのパン生地から調製される焼成生産物の任意の種類に用いてよい。その例は、パン、特に、白、全粒又はライ麦パンで、典型的にはローフ又はロール上のパン、フレンチバケットタイプのパン、ピタパン、トルティーヤ、ケーキ、パンケーキ、ビスケット、クッキー、パイクラスト、クリスプパン、蒸しパン、ピザ等の形状のパンである。
【０２０２】
別の実施態様においては、ＡｍｙＥ又はその変異体を抗劣化アミラーゼ、ホスホリパーゼ及びリン脂質とともに穀粉を含む予混合中に用いてよい。予混合は他のパン生地改善及び／又はパン改善添加剤、例えば、上述の酵素を含む任意の添加剤を含んでよい。ある態様においては、ＡｍｙＥ又はその変異体は、焼成添加剤として用いるために、抗劣化アミラーゼ及びホスホリパーゼを含む酵素調製物の成分である。
【０２０３】
酵素調製物は粒質物又は凝集粉の形態でよい。それは２５から５００μｍの範囲の中に粒子の９５ｗｔ．％以上が分布する狭い粒子サイズ分布を有してよい。粒質物及び凝集粉は従来の方法により、例えば、流動層造粒装置において担体にＡｍｙＥ又はその変異体をスプレーすることにより、調製してよい。担体は適切な粒子サイズを有する粒子の核からなってよい。担体は可溶性又は不溶性でもよく、例えば、塩（ＮａＣｌ又は硫酸ナトリウムのような）、糖（スクロース又はラクトースのような）、糖アルコール（ソルビトールのような）、デンプン、米、ひき割りトウモロコシ、又は大豆でもよい。
【０２０４】
別の態様は、ＡｍｙＥ又はその変異体を含む粒子の被包、つまり、アルファ‐アミラーゼ粒子を含む。被包されるアルファ‐アミラーゼ粒子を調製するために、すべてのアルファ‐アミラーゼ粒子を懸濁するために十分な量で、酵素を食品用の脂質と接触させる。本明細書にて用いる食用脂質は、水に溶けないが、炭化水素又はジエチルエーテルのような非極性有機溶剤中に溶ける任意の自然の有機化合物でよい。適切な食用脂質は飽和又は不飽和いずれかの脂肪又は油のいずれかの形態であるトリグリセリドを含むがこれに限定されない。飽和トリグリセリドを作る脂肪酸及びそれらの組み合わせの例は、酪酸（乳脂肪由来）、パルミチン酸（動物及び植物脂肪由来）、及び／又はステアリン酸（動物及び植物脂肪由来）を含むが、これに限定されない。不飽和トリグリセリドを作る脂肪酸及びそれらの組み合わせの例は、パルミトレイン酸（動物及び植物脂肪由来）、オレイン酸（動物及び植物脂肪由来）、リノール酸（植物油由来）及び／又はリノール酸（亜麻仁油由来）を含むが、これらに限定されない。他の適切な食用脂質は上述するトリグリセリド由来のモノグリセリド及びジグリセリド、リン脂質及びグリコリピッドを含むが、これらに限定されない。
【０２０５】
食用脂質、とりわけ液体の形態は、アルファ‐アミラーゼ粒子の粉状形態と接触し、脂質の材料がアルファ‐アミラーゼ粒子表面の少なくとも大半、例えば１００％覆うようにされる。すなわち、各アルファ‐アミラーゼ粒子は個別に脂質に包まれる。例えば、アルファ‐アミラーゼ粒子のすべて、又は実質的にすべては薄く、連続的な脂質のフィルム膜を有する。これは、まず容器に多量の脂質を注ぎ、それから脂質が各アルファ‐アミラーゼ粒子の表面を全面的に濡らすようにアルファ‐アミラーゼをスラリー化することにより実施される。短時間の撹拌後、被包されるアルファ‐アミラーゼ粒子は表面に相当量の脂質を有するように覆われる。コーティングの厚みは、アルファ‐アミラーゼ粒子が用いる脂質のタイプの選択により及び必要ならば、より厚い膜を構築するためにその操作を繰り返すことにより制御できるように適用できる。
【０２０６】
封入輸送粒子の貯蔵、取扱い及び取り込みはパッケージ混合物の方法により実施できる。パッケージ混合物は被包アルファ‐アミラーゼを含むことができる。しかしながら、さらに、パッケージ混合物には製造業者又はパン職人が、必要に応じて、追加的な成分を加えることができる。被包アルファ‐アミラーゼをパン生地に取り込み後、職人は製パンのための通常の生産工程を続ける。
【０２０７】
被包されるアルファ‐アミラーゼ粒子の有利な効果は２点ある。第一に、食用脂質は焼成プロセスの間酵素が熱に不安定な場合酵素を熱変性から保護する。続いて、アルファ‐アミラーゼはプルーフィング及び焼成段階の間安定化及び保護されている間に、最終焼成産物中に保護コーティングから放出され、ポリグルカンのグルコシド結合を加水分解する。また、封入輸送媒体によって焼成産物へ活性酵素の多量な放出ができる。つまり、焼成プロセスに続いて、活性アルファ‐アミラーゼが劣化作用を弱める速度で保護コーティングから連続的に放出され、それ故、劣化作用の速度を低減できる。
【０２０８】
一般的に、アルファ‐アミラーゼ粒子に適用する脂質の量は、アルファ‐アミラーゼの全量の数パーセントから重量の何倍までと多様であり、これは脂質の性質、アルファ‐アミラーゼ粒子の適用方法、処理されるパン生地混合物の組成物、及び関係するパン生地混合操作の激しさで決定される。
【０２０９】
封入輸送媒体、即ち、脂質で被包される酵素は、焼成品の保存期間を延長できる効果的な量で焼成品を調製するために用いる成分を加えてよい。パン職人は上述のように調製する被包される所望の抗劣化効果を得るために必要なアルファ‐アミラーゼの量を計算する。被包されるアルファ‐アミラーゼの必要量を包まれる酵素の濃度に基づき及び具体的な穀粉に対するアルファ‐アミラーゼの割合に基づいて計算する。広い範囲の濃度が効果を有するが、上述のように、抗劣化に見られる改善はアルファ‐アミラーゼの濃度に正比例しない。特定の最小限レベルより上ではアルファ‐アミラーゼ濃度における大量の増加は、追加的改善があまりない。職人による不用意な測定誤差が影響しないようパン職人にある程度の保障を与えるために、特定のパン生産にて実際に用いるアルファ‐アミラーゼ濃度は必要最小限よりかなり高くてよい。酵素濃度の最低限度はパン職人が望む最小の抗劣化効果によって決定される。
【０２１０】
焼成品を調製する方法は、
ａ）脂質でコートされるアルファ‐アミラーゼ粒子の調製であって、実質的にアルファ‐アミラーゼ粒子の１００％がコーティングされ、
ｂ）穀粉を含むパン生地を混合し、
ｃ）混合が完全になる前に脂質コーティングアルファ‐アミラーゼをパン生地に添加し、及び脂質膜がアルファ‐アミラーゼを放出する前に混合を終了し、
ｄ）パン生地をプルーフィングし、ｅ）パン生地を焼いて焼成品を提供することであって、アルファ‐アミラーゼは混合、プルーフィング、及び焼成段階では不活性であり、焼成品中にて活性である。
【０２１１】
被包アルファ‐アミラーゼを混合サイクル、例えば、混合サイクルの最終段階で生地に添加してよい。被包アルファ‐アミラーゼをパン生地全体に被包アルファ‐アミラーゼが十分に分布できる混合段階のある時点で添加し、保護膜がアルファ‐アミラーゼ粒子から剥がれる前に混合段階を終了する。パン生地のタイプ及び体積、混合作用及びスピード次第で、１分から６分以上の間が被包アルファ‐アミラーゼをパン生地に混合するために必要となるが、平均は２分から４分間である。つまり、いくつかの変数が正確な手法を決定する。第一に、被包アルファ‐アミラーゼの量は、被包アルファ‐アミラーゼをパン生地混合全体に拡散させるのに十分な全体積を有さなければならない。被包アルファ‐アミラーゼの調製品が高い濃度の場合、被包アルファ‐アミラーゼがパン生地に追加される前に、追加油を予混合物に添加する必要性がある。レシピ及び製法プロセスは具体的な改変が必要とされることがある。しかしながら、パン生地製品の処方に用いられる２５％の油をパン生地に提供し、ほぼ最終の混合サイクルで添加し、濃縮被包アルファ‐アミラーゼ用の担体として用いる場合に一般的に良い結果がもたらされる。かなり低脂肪含有量（フレンチスタイルのパンのような）を有するパン又は他の焼成品レシピにおいて、約１％乾燥粉末重量の被包アルファ‐アミラーゼ混合物が被包アルファ‐アミラーゼをパン生地と適切に混合するのに十分であることがわかるが、作用するパーセントの範囲はかなり広く製造設計、最終産物、及び個別のパン職人が必要とする生産方法に依存する。第二に、パン生地への混合を仕上げるために混合サイクルを維持する十分な時間をかけて、被包アルファ‐アミラーゼ懸濁液を混合物に添加しなければならないが、過度な機械的作用が被包アルファ‐アミラーゼ粒子の大部分から保護脂質膜をはがす前でなければならない。
【０２１２】
別の実施態様においては、細菌のアルファ‐アミラーゼ（ＢＡＡ）をＡｍｙＥ又はその変異体を含む脂質コーティング酵素粒子に添加してよい。ＢＡＡは過度な耐熱性及び完全に焼いたパンの塊中で維持された活性により、パンの粘着性を低減する。しかしながら、ＢＡＡが脂質コーティング粒子に取り込まれる場合、極めて低いＢＡＡの用量においてさえも、実質的な追加的抗劣化保護が得られる。例えば、穀粉１００パウンド当たり１５０ＲＡＵ（リファレンスアミラーゼユニット）のＢＡＡ用量は効果的である。ある実施態様においては、約５０から２０００ＲＡＵ間のＢＡＡを脂質コーティング酵素産物に加える。この低いＢＡＡ用量レベルは、完全に焼けたパンの塊中で酵素が自由にデンプンと接触することを避ける（水蒸気が酵素をそのコーティングから不規則に放出する場合を除く）ために保護コーティング能力を備えており、ＢＡＡのよくない副作用をもたらさずに抗劣化活性の非常に高いレベルを達成するために役立つ。
【０２１３】
多様な修飾及び変異が、意図する使用の特許請求の範囲を逸脱せずに組成物及びそれを使用する方法にされることは当業者にとって明らかである。つまり修飾及び変異は添付した特許請求の範囲及びその均等の範囲内である。
【０２１４】
本明細書に引用するすべての参照はすべての目的のためにそれら全体において参照により取り込まれる。
【実施例】
【０２１５】
実施例１
配列番号１のＡｍｙＥ又はＣ末端欠失のＡｍｙＥ変異体、ＡｍｙＥ‐ｔｒ（配列番号２）、をコードする核酸を米国特許第5,024,943に記載のように、バシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｐＨＰＬＴ発現ベクターへクローン化する。図２はＡｍｙＥ‐ｔｒをコードする核酸を含むベクターを示す。
【０２１６】
図２に示すように、ｐＨＰＬＴベクターはバシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＬＡＴプロモーター（「Ｐｌａｔ」）、ＬＡＴシグナル配列をコードする配列（「ｐｒｅＬＡＴ」）、続いてクローニング用のＰｓｔＩ及びＨｐａＩを含む。McKenzie  他、Plasmid  15(2):  93-103  (1986)に記載のプラスミドｐＵＢ１１０さらなるプラスミドエレメントとして、
「ｏｒｉ−ｐＵＢ」はｐＵＢ１１０由来複製のオリジンである。
「ｒｅｐｐＵＢ」はｐＵＢ１１０由来レプリカーゼ遺伝子である。
「ｎｅｏ」はｐＵＢ１１０由来ネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子である。
「ｂｌｅｏ」はブレオマイシン耐性マーカーである。
「Ｔｌａｔ」はバシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アミラーゼ由来転写ターミネーターである。
【０２１７】
ＡｍｙＥ及びＡｍｙＥ‐ｔｒの発現用のプラスミド構築体をYang他、「Nucleotide  sequence  of  the  amylase  gene  from  Bacillus  subtilis」、Nucl.  Acids  Res.  11(2):  237-49  (1983)に記載のＡｍｙＥをコードする配列を用いて構築した。プラスミドｐＭＥ６２９．５は配列番号１の完全長ＡｍｙＥをコードする核酸を含む。Yang他により記載される配列と比較して、遺伝子はデンプン結合領域をコードする配列中に３つの塩基の欠失を含む。
【０２１８】
プラスミドｐＭＥ６３０．７は欠失ＡｍｙＥ配列、ＡｍｙＥ‐ｔｒ、を含み、図２に示す。ＡｍｙＥ‐ｔｒは配列番号１のＤ４２５にて欠失される。ＡｍｙＥ‐ｔｒをFujimoto  他、「Crystal  structure  of  a  catalytic-site  mutant  alpha-amylase  from  Bacillus  subtilis  complexed  with  maltopentaose」、J.  Mol.  Biol.  277:  393-407(1998)に記載されるデンプン結合領域を欠損するＡｍｙＥ変異体の結晶構造から設計した。ＲＣＳＢ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（商標）  アクセション番号1BAG、「Alpha-Amylase  From  Bacillus  Subtilis  Complexed  With  Maltopentaose.」を参照願いたい。
【０２１９】
プラスミド構築体の発現のために、ＡｍｙＥをコードする核酸をHerculase（商標）  (Stratagene,  California)を用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をQiagen  QIAquik（商標）PCR精製キット(Qiagen,  Valencia,  California)にて提供されるカラムを用いて精製し、５０μＬのMilli-Q（商標）精製水で再懸濁した。５０μＬの精製ＤＮＡをＨｐａＩ(Roche)及びＰｓｔＩ(Roche)を用いて連続して消化し、得られたＤＮＡを３０μＬのMilli-Q（商標）精製水中に再懸濁した。１０−２０ｎｇ／μＬのＤＮＡをＰｓｔＩ及びＨｐａＩクローニング部位を用いてプラスミドｐＨＰＬＴへクローン化した。ライゲーション混合物をコンピテントバシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞（ゲノタイプ：DaprE,  DnprE,  degUHy32  oppA,  DspoIIE3501,  amyE::xylRPxylAcomK-phleo）へ直接形質転換した。ＳＣ６．１バシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞は、コンピテンシー遺伝子（comK）有し、それはキシロース誘導プロモーター下にて置かれる。ＤＮＡ結合及び取り込みのコンピテンシーはキシロースの添加により誘発される。親プラスミドにおけるＡｍｙＥ遺伝子は二つのＰｓｔＩ部位を有するので、クローニング前にＰＣＲ融合反応をこれらの部位を除去するために実施した。ＰＣＲ融合を二つの分離したＰＣＲ反応後行った。次のプライマーをＨｐａＩ及びＰｓｔＩ部位を用いてｐＨＰＬＴ構築体を作るために用いた。
配列番号:  18:  プライマーPSTAMYE-F'
CTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCTTCAGCACTTACAGCACCGTCGATCAAAAGCGGAAC  3'
配列番号:  19:  プライマー  AMYENOPST-R'
CTGGAGGCACTATCCTGAAGGATTTCTCCGTATTGGAACTCTGCTGATGTATTTGTG
配列番号:  20:  プライマー  AMYENOPST-F'
CACAAATACATCAGCAGAGTTCCAATACGGAGAAATCCTTCAGGATAGTGCCTCCAG
配列番号:  21：  プライマーHPAIAMYE-R'
CAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTCAATGGGGAAGAGAACCGCTTAAGCCCGAGTC
配列番号:  22:  プライマー  HPAIAMYE-R'
CAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTCAATCAGGATAAAGCACAGCTACAGACCTGG
配列番号:  23:  プライマー  AMYE  SEQ-F'
TACACAAGTACAGTCCTATCTG  3'
配列番号:  24:  プライマー  AMYE  SEQ-F'
CATCCTCTGTCTCTATCAATAC  3'
【０２２０】
プラスミドｐＭＥ６２９．５及びｐＭＥ６３０．７は翻訳後切断される３１残基のシグナル配列を有するＡｍｙＥを発現する。それに続く１０のＮ末端アミノ酸をYang他、(1983)により提案されるように別々に処理した。
【０２２１】
１．２．  タンパク質発現
ＡｍｙＥ完全長及び欠失クローンに対する形質転換体を１０μｇ／ｍＬネオマイシン、１％不溶性デンプン含有ＬＡ上で選別し、３７℃にて終夜インキュベートした。コロニーの周りのクリアリング（又はハロー）を示す形質転換体を選別し、バイアルを更なる研究のために作成した。形質転換体の前培養を１０μｇ／ｍＬネオマイシン含有ＬＢにて８時間行った。それから３０μＬのこの前培養物を１０μｇ／ｍＬのネオマイシン及び５ｍＭＣａＣｌ２を補給した３０ｍＬの培養培地（下記に記載）を満たした２５０ｍＬのフラスコに添加した。培養培地は主要な窒素源として尿素、主な炭素源としてグルコース、及び活発な細胞増殖のために１％ソイトンを補給したＭＯＰｓ緩衝液に基づく富栄養半規定培地であった。振盪フラスコを２５０ｒｐｍにて撹拌しながら３７℃にて６０−６５時間インキュベートした。培養物を円錐管中５０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離により採取した。ＡｍｙＥ完全長及びＡｍｙＥ欠失タンパク質両方とも高いレベルにて発現したので、培養上清をさらなる精製をせずに試験ように用いた。
【０２２２】
実施例２
次の試験を下記に示すように実施例中にもちいた。下記に与えられる手順からのずれはいずれも実施例に示される。これらの実験において、分光光度計を反応終了後形成される生成物の吸光度を測定するために用いた。
【０２２３】
２．１．９６穴マイクロタイタープレートにおけるタンパク質含有量決定のためのブラッドフォード試験
サンプルの上清におけるタンパク質濃度をブラッドフォードクイック  スタート（商標）染色試薬（Bio-Rad、California）を用いて測定した。サンプルを２８０ｒｐｍ及び加湿空気で振盪しながら３７℃にて３日間マイクロタイタープレート（ＭＴＰｓ）中で培養した培養物から培地をろ過することにより得た。１０μＬのろ過ずみ培地を第二のＭＴＰのウェルにおいて２００μＬのブラッドフォードクイック  スタート（商標）染色試薬に混合した。混合後、ＭＴＰｓを室温にて少なくとも１０分間インキュベートした。気泡を除き、吸光度（ＯＤ）を５９５ｎｍで測定した。タンパク質濃度を決定するために、バックグラウンド値（つまり、イノキュレートしていないウェルから）をサンプル値から差し引いた。
【０２２４】
２．２．  従来のエタノール発酵
４００ｐｐｍの尿素を含むIllinois  River  Energyから入手した液化物（３１％ＤＳ）の二つのバッチをｐＨ４．３及びｐＨ５．８（５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を用いて）に調整した。１００ｇの基質を１２５ｍＬの三角フラスコに添加した。ＡｍｙＥ‐ｔｒ及びスペザイム（商標）エクストラ（Spezyme（商標）Xtra）アミラーゼを０．２０ｍｇ／ｇ  ＤＳにて投与した。発酵をＤＩ水中４５分まで前もって水を補給した０．２ｍｌの１０％（ｗ／ｖ）レッドスターエタノールレッド酵母で植菌した。フラスコを４８時間の発酵で３２０ｒｐｍにて撹拌棒を用いて３２℃にてインキュベートした。
【０２２５】
２．３．  全粒トウモロコシでのエタノール発酵
４００ｐｐｍの尿素を含む３２％ＤＳトウモロコシ粉基質の二つのバッチをｐＨ４．３及びｐＨ５．８（５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を用いて）にて調製した。１００ｇの基質を１２５ｍＬ三角フラスコに添加した。完全長ＡｍｙＥ（配列番号１）及びＡｍｙＥ‐ｔｒ（配列番号２）を０．２０ｍｇ／ｇ  ＤＳにて投与し、アスペルギルス  カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ）アルファ‐アミラーゼ（ＡｋＡＡ、配列番号６）を１．５ＳＳＵ／ｇ  ＤＳにて投与した。ＡｋＡＡのアミノ酸配列は米国特許第7,332,319の配列番号４に記載されている。また、全粒トウモロコシを加水分解するＡｍｙＥ及びＡｍｙＥ‐ｔｒの能力を０．５ＧＡＵ／ｇのトリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ（ＴｒＧＡ、配列番号７）と１．５ＳＳＵ／ｇＤＳアスペルギルス  カワチ（Ａ．  ｋａｗａｃｈｉｉ）の混合物と比較した。ＴｒＧＡのアミノ酸配列はWO  2006/060062の配列番号３に記載されている。発酵をＤＩ水中４５分まで前もって水を補給した０．２ｍｌの１０％（ｗ／ｖ）レッドスターエタノールレッド酵母で植菌した。フラスコを７２時間の発酵で３００ｒｐｍにて撹拌棒を用いて３２℃にてインキュベートした。
【０２２６】
２．４．  ＨＰＬＣ測定によるグルコース生成測定
マルトース及びマルトヘプタオースの加水分解
０．５％マルトース又はマルトヘプタオース溶液を各実験で特定するように、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５又は５．６又は５０ｍＭマレイン酸ｐＨ５．６で調製した。すべての酵素サンプルを１ｍｇ／ｍＬに最初に希釈した。反応混合物を最終酵素濃度が１ｐｐｍになるように適切な基質溶液を用いて酵素を希釈することにより調製し、それから２００μＬのアリコートを滅菌スクリュー管に移し、３７℃インキュベーターに置いた。反応を１０ｍＭ水酸化ナトリウムへ１０倍希釈することにより示した時間にて停止した。
【０２２７】
不溶性デンプンの加水分解
不溶性顆粒デンプンの加水分解を測定するために精製ＡｍｙＥ（２４．５ｇ／Ｌ）を最終濃度が２０．４ｐｐｍになるようにマレイン酸緩衝液ｐＨ５．６に希釈した。それからタンパク質を最終濃度が１ｐｐｍになるようにマレイン酸緩衝液ｐＨ５．６に調製した５％トウモロコシ粉溶液に添加し、混合物を３２℃にてシェーカーでインキュベートした。サンプルを定期的に採取し、５０ｍＭＮａＯＨへ１０倍希釈し、反応を止めた。
【０２２８】
ＨＰＬＣ検出方法
グルコース及び基質の他の分解産物の生成をDionex  PA-1カラム及び電気化学的検出器を備えるAgilent  1100  LCシステムを用いてＨＰＬＣにより分析した。１０μＬのサンプルを注入し、ＮａＯＨ及び酢酸ナトリウムの勾配を１．０ｍＬ／分及び２５℃にて適用した。サッカライドの分布をすでに実施したスタンダードから測定した。溶出プロファイルを４５分にわたって得た。生成されたグルコースの定量（ｇ／Ｌとして述べる）を確認されたグルコース標準スタンダード(Sigma,  MO)を用いて得、糖のピーク面積を実際の糖濃度へ変換した。
【０２２９】
実施例３
従来のエタノール発酵における欠失ＡｍｙＥの性能を実施例２．２に記載の従来のエタノール発酵試験を用いてIllinois  River  Energy液化物（３１％ＤＳ）で試験した。ＡｍｙＥ‐ｔｒ（配列番号２）の性能をｐＨ４．３及びｐＨ５．８にてスペザイム（商標）エクストラ（Spezyme（商標）Xtra）アミラーゼ（ＡｍｙＲ、配列番号５）と比較した。発酵を４８時間行った。ＡｍｙＥ‐ｔｒ及びスペザイム（商標）エクストラ（Spezyme（商標）Xtra）アミラーゼを０．２ｍｇ／ｇ  ＤＳで投与した。図３に示すように、ｐＨ５．８にてＡｍｙＥ‐ｔｒにより生成された最終エタノール収率は１２．０％（ｖ／ｖ）である。ｐＨ４．３でのＡｍｙＥ‐ｔｒは７．３％（ｖ／ｖ）の最終エタノール収率であった。スペザイム（商標）エクストラ（Spezyme（商標）Xtra）アミラーゼ存在下最終エタノール収率はｐＨ４．３にて２．７％（ｖ／ｖ）及びｐＨ５．８にて３．９％（ｖ／ｖ）であった。すなわち、ＡｍｙＥ‐ｔｒはスペザイム（商標）エクストラ（Spezyme（商標）Xtra）アミラーゼより従来のエタノール発酵の液化物においてエタノールを顕著に生成する。また、この実施例はＡｍｙＥ‐ｔｒがｐＨ４．３よりｐＨ５．８にてより多くのエタノールを生成することも証明する。
【０２３０】
実施例４
ｐＨ４．３及びｐＨ５．８にて不溶性顆粒状（未処理）デンプンのエタノールへの加水分解を触媒するＡｍｙＥ（配列番号１）及びＡｍｙＥ‐ｔｒ（配列番号２）の能力を実施例２．３に記載の全粒トウモロコシ試験でのエタノール発酵を用いて比較した。ＡｍｙＥ及びＡｍｙＥ‐ｔｒのエタノール生成性能をアスペルギルス  カワチ（Ａ．  ｋａｗａｃｈｉｉ）アルファ‐アミラーゼ（ＡｋＡＡ、配列番号６）を１．５ＳＳＵ／ｇ用量にて、０．５ＧＡＵ／ｇ用量のトリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ（ＴｒＧＡ、配列番号７）と１．５ＳＳＵ／ｇＤＳ用量のアスペルギルス  カワチ（Ａ．  ｋａｗａｃｈｉｉ）アルファ‐アミラーゼの混合物と比較した。ＡｍｙＥ完全長及び欠失ＡｍｙＥ両方とも０．２ｍｇ／ｇ  ＤＳの投与量であった。
【０２３１】
図４はｐＨ４．３及びｐＨ５．８にて酵素により生成された最終エタノール収率を示す。ｐＨ５．８にて試験した場合、ＡｍｙＥがＴｒＧＡ／ＡｋＡＡで観察されたエタノール収率を実際にこえながら、ＡｍｙＥ（−●‐）及びＡｍｙＥ‐ｔｒ（‐■‐）両者はＴｒＧＡ／ＡｋＡＡ（‐▲‐）と同様な性能であった。ＡｍｙＥ（−○‐）及びＡｍｙＥ‐ｔｒ（‐□‐）はｐＨ４．３にてエタノールを生成したが、収率はＴｒＧＡ／ＡｋＡＡ（‐△‐）を用いて得られたほど高くなかった。比較すると、ＡｋＡＡは試験した両ｐＨ（‐◆◇‐）にてほとんど性能が良くなかった。この実施例はＡｍｙＥがｐＨ５．８あたりにて糖化反応において完全にグルコアミラーゼの代わりになると実証した。また、ＡｍｙＥはｐＨ４．３にて糖化反応において部分的または完全にグルコアミラーゼの代わりになることも実証した。
【０２３２】
実施例５
ｐＨ４．５及びｐＨ５．６（酢酸ナトリウム緩衝液を用いて）にてマルトースをグルコースへ転換するＡｍｙＥの能力を実施例２．４に記載のグルコース発酵試験を用いて試験した。反応を２、５、及び８日後分析した。図５に示すように、ＡｍｙＥ（配列番号１）、ＡｍｙＥ‐ｔｒ（配列番号２）、及びＡｍｙ３１Ａ（配列番号３）はマルトースをグルコースへ効率的に転換し、ゲオバシルス  ステアロテルモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼ、ＡｍｙＳ（配列番号４、３４アミノ酸リーダー配列を用いて示される）がこれらの条件下にて最少量のグルコース形成を示した。
【０２３３】
実施例６
ＤＰ７又は不溶性、未処理顆粒状デンプンの加水分解を触媒するＡｍｙＥ（配列番号１）及びＡｍｙＥ‐ｔｒ（配列番号２）の能力を試験した。不溶性デンプンから生成されるサッカライドの検出のために用いるＨＰＬＣ法は実施例２．４に記載する。分解産物を反応を開始後多様な時間にてＨＰＬＣ分析により定量した。
【０２３４】
図６は、７２時間１ｐｐｍＡｍｙＥ‐ｔｒ存在下にて０．５％マルトヘプタオース基質をインキュベートした後、得られた加水分解産物を示す。図６の下の図にて見られるように、ＡｍｙＥ‐ｔｒは７２時間でＤＰ７基質のほとんどすべてをグルコースへ転換する。結果は、ＡｍｙＥはＤＰ７基質をグルコースへ効率的に分解できることを実証する。
【０２３５】
比較のために、ＡｍｙＳ（配列番号４）又はスペザイム（商標）フレッド（SPEZYME（商標）FRED）  (「フレッド（Fred）」配列番号８)のいずれも１ｐｐｍによるＤＰ７基質の分解を図７及び図８にそれぞれ示す。反応からのサンプルを上記実施例２．４に記載のＨＰＬＣ法を用いて分析した。図７の上から下の図はＡｍｙＳ添加後の０時間、２時間、４時間、及び２４時間での反応産物を示す。図８の上から下の図はスペザイム（商標）フレッド（SPEZYME（商標）FRED）添加後０時間、１時間、２時間、３時間での反応産物を示す。結果は示された時間にてＡｍｙＳ及びスペザイム（商標）フレッド存在下、ＤＰ７基質のかなりの量がＤＰ２またはそれ以上の重合度にて維持されることを示す。
【０２３６】
図９は実施例２．４に記載の手法に従って、３２℃にて１ｐｐｍＡｍｙＥ（配列番号１）を用いる５％トウモロコシ粉溶液をインキュベートする結果を示す。結果はＡｍｙＥそれ自身により、不溶性顆粒状デンプンを効率的にグルコースへ転換することを示す。
【０２３７】
[配列表]
配列リスト
配列番号１：完全長バシルス  スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡｍｙＥアミノ酸配列。天然シグナル配列を示していない。
0005560266.tif 000003
配列番号２:欠失バシルス  スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡｍｙＥ（ＡｍｙＥ−ｔｒ）アミノ酸配列。天然シグナル配列を示していない。
0005560266.tif 000004
配列番号３:  バシルス  スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルファ‐アミラーゼ変異体Ａｍｙ３１Ａアミノ酸配列。(UniProtKB/TrEMBLアクセション番号Ｏ82953)天然シグナル配列を太字で示す。
0005560266.tif 000005
配列番号4:欠失ゲオバシルス  ステアロテルモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼ(AmyS,  a/k/a  「エチル３（Ethyl3）」)  タンパク質配列。シグナル配列を太字で示す。
0005560266.tif 000006
配列番号5:ゲオバシルス  ステアロテルモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼ  (AmyR、スペザイム（商標）エクストラ（Spezyme（商標）Xtra）アミラーゼ)  アミノ酸配列。
0005560266.tif 000007
配列番号  6:アスペルギルス  カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ）アルファ‐アミラーゼ  (AkAA)アミノ酸配列。
0005560266.tif 000008
配列番号7:トリコデルマ  レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ(TrGA)アミノ酸配列(WO  2006/060062の配列番号３)。プロ配列をイタリック体で示す。
0005560266.tif 000009
0005560266.tif 000010
配列番号8:スペザイム（商標）フレッド（SPEZYME（商標）FRED）アルファ‐アミラーゼアミノ酸配列。
0005560266.tif 000011
配列番号9:  配列番号１のＡｍｙＥをコードするヌクレオチド配列。
0005560266.tif 000012
0005560266.tif 000013
配列番号10:  AmyE-tr  (配列番号２)をコードするヌクレオチド配列。
0005560266.tif 000014
配列番号  11:バシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Amy31A  (配列番号3)をコードするヌクレオチド配列。
0005560266.tif 000015
0005560266.tif 000016
配列番号12:ゲオバシルス  ステアロテルモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）AmyS  (配列番号4)をコードするヌクレオチド配列。
0005560266.tif 000017
配列番号13:スペザイム（商標）エクストラ（Spezyme（商標）Xtra）アミラーゼ遺伝子（配列番号５）のヌクレオチド配列。
0005560266.tif 000018
0005560266.tif 000019
配列番号:  14:アスペルギルス  カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ）アルファ‐アミラーゼ(AkAA)遺伝子(配列番号:６)のヌクレオチド配列。
0005560266.tif 000020
配列番号15:トリコデルマ  レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ遺伝子(配列番号:  7)のヌクレオチド配列。
0005560266.tif 000021
配列番号16:  AmyL遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号8）。
0005560266.tif 000022
0005560266.tif 000023
配列番号17:配列番号１のＡｍｙＥの天然シグナル配列。
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASAETANKSNE  
配列番号18:  プライマー  PSTAMYE-F'  
CTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCTTCAGCACTTACAGCACCGTCGATCAAAAGCGGAAC'
配列番号19:プライマー  AMYENOPST-R'
CTGGAGGCACTATCCTGAAGGATTTCTCCGTATTGGAACTCTGCTGATGTATTTGTG'
配列番号20:プライマー  AMYENOPST-F'
CACAAATACATCAGCAGAGTTCCAATACGGAGAAATCCTTCAGGATAGTGCCTCCAG'
配列番号21:プライマー  HPAIAMYE-R'
CAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTCAATGGGGAAGAGAACCGCTTAAGCCCGAGTC'
配列番号  22:プライマー  HPAIAMYE-R'
CAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTCAATCAGGATAAAGCACAGCTACAGACCTGG'
配列番号23:プライマー  AMYE  SEQ-F'
TACACAAGTACAGTCCTATCTG'
配列番号24:プライマー  AMYE  SEQ-F'
CATCCTCTGTCTCTATCAATAC
【図１】
0005560266.tif 000024
【図２】
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【図３】
0005560266.tif 000026
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0005560266.tif 000030
【図８】
0005560266.tif 000031
【図９】
0005560266.tif 000032
【配列表】
0005560266000001.xml