(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉａ
【化１】
0005611045.tif 000028
〔式中：
Ａ）Ｒ１２及びＲ２６は、それぞれ独立して−ＯＨ又はグリコシド官能基を表し；Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立してＨ、−ＯＨ、グリコシド官能基、Ｃ１−６アルコキシ−、又はヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル−を表し；且つ環Ｂは、一つ以下のグリコシド官能基を含有し；
Ｂ）
Ｒ２０は、Ｈ又はＣ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖を表し；
Ｒ２１は、
ｉ）Ｈを表すか；又は
ｉｉ）Ｒ２２と一緒になってＣ１とＣ２の間の第二の結合を提供し；
Ｒ２２は、
ｉ）Ｈを表すか；
ｉｉ）Ｒ２１と一緒になってＣ１とＣ２の間の第二の結合を提供し；
Ｒ２３は、
ｉ）ＨあるいはＣ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖を表し；
この場合にＲ２０及びＲ２３の少なくとも一つは、Ｃ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、
Ｃ）ｎは１であり、Ｒ２４及びＲ２５は、一緒になって＝Ｏを形成し、且つＲ２７及びＲ２８は、Ｈを表すか、若しくはＲ２７はＲ２８と一緒になってＣ４とＣ５の間の第二の結合を提供し；
Ｄ）Ｘは、−Ｏ−であり、
前記Ｒ２０又はＲ２３のＣ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖は、任意に及び独立して、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｃ１−６アルキル、−Ｓ（Ｏ）２Ｃ１−６アルキル、−Ｓ（Ｏ）２フェニル、−ＳＣ１−６アルキル、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＣＦ３、−Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）、イミン及び置換又は非置換トリフェニルホスホニウムから選択される一つ以上の基で置換され；且つＲ２０又はＲ２３のＣ２−３０炭化水素鎖に存在する一つ以上の利用可能な−ＣＨ２−基は、任意に及び独立して、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）ｐ−又は−Ｎ（Ｒ２）−で置換され（但し、常に、得られる鎖は、Ｃ１又はＣ２に結合する−ＣＨ２−基を含み、且つ二つのこのような置換が連続していないことを条件とする）；この場合のＲ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣ１−６アルキルを表し、且つｐは０〜２であり；
並びに環Ｃ上の＝Ｏの総数は１を超えない〕
の化合物又はその塩。
【請求項２】
Ｒ１２及びＲ２６が共に−ＯＨを表す、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１２及びＲ２６の一方が−ＯＨを表し、且つＲ１２及びＲ２６の他方がグリコシド官能基を表す、請求項１記載の化合物。
【請求項４】
前記Ｒ２０又はＲ２３のＣ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖が、Ｃ１又はＣ２に結合する−ＣＨ２−基を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
前記Ｒ２０又はＲ２３のＣ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖が置換されない、請求項４記載の化合物。
【請求項６】
前記Ｒ２０又はＲ２３のＣ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖が飽和される、請求項５記載の化合物。
【請求項７】
前記Ｒ２０又はＲ２３のＣ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖が６〜１５個の炭素原子を含有する直鎖炭化水素である、請求項５又は６に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ２１は、Ｒ２２と一緒になってＣ１とＣ２の間の第二の結合を提供する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ２７は、Ｒ２８と一緒になってＣ４とＣ５の間の第二の結合を提供する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ１１及びＲ１３は、それぞれ独立して−ＯＨ、グリコシド官能基、Ｃ１−６アルコキシ−、又はヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル−を表す、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
動物生細胞を生存可能な非最終分化状態で生体外保存する方法であって、非最終分化動物生細胞を、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物又はその塩と接触させることを含む、方法。
【請求項１２】
前記動物生細胞が幹細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記幹細胞が、胚幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞及び誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記胚幹細胞がヒト胚幹細胞又はマウス胚幹細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記幹細胞が誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記動物生細胞が脱分化細胞である、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む、動物生細胞を生存可能な非最終分化状態で生体外保存するために用いる保存剤。
【請求項１８】
前記動物生細胞が幹細胞である、請求項１７に記載の保存剤。
【請求項１９】
前記幹細胞が、胚幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞及び誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞からなる群から選択される、請求項１８に記載の保存剤。
【請求項２０】
前記胚幹細胞がヒト胚幹細胞又はマウス胚幹細胞である、請求項１９に記載の保存剤。
【請求項２１】
前記幹細胞が誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項１９に記載の保存剤。
【請求項２２】
前記動物生細胞が脱分化細胞である、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の保存剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物生細胞の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）保存及び動物生細胞の保存に使用するのに適した化合物に関する。特に、限定しないが、本発明は、幹細胞の生体外保存、及び幹細胞の保存に使用するのに適した化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、いったん採取すると、生存可能な状態であり続けるために及びその未分化状態を保つために、医療又は研究の目的に使用する前に保存しなければならない。
【０００３】
幹細胞は、液体窒素の温度（−１９６℃）で保存した場合にはいつまでも保存できることは周知である。しかし、凍結方法は、細胞に回復できない損傷を引き起こすかもしれず、そのようなものとして、種々の凍結保存剤を凍結方法に先立って細胞懸濁液に加えることができることが文献で十分に立証されている。米国特許出願公開第２００５／０１０６５５４号明細書には、多能性細胞、特にヒト胚幹細胞を凍結保存するための方法及び組成物が開示されている。米国特許出願公開第２００５／０１０６５５４号明細書に開示されている方法は、従来の方法と比較すると細胞生存率の上昇及び細胞分化の低下を示すことが明らかにされている。米国特許出願公開第２００５／０１０６５５４号明細書に開示されている凍結保存方法は、固体支持マトリックスの二つの層の間に細胞を封入し、得られるマトリックス−細胞−マトリックス組成物に凍結保存剤を加え、前記組成物を、細胞を凍結保存するのに十分な温度まで冷却することからなる。米国特許出願公開第２００５／０１０６５５４号明細書には、適当な凍結保存剤として、炭水化物系媒体、好ましくはトレハロースが開示されている。国際公開第ＷＯ２００５／１１８７８５号明細書には、幹細胞を凍結保存する方法であって、細胞懸濁液について、幹細胞の長期保存を可能にするのに十分な温度に下げる前に、氷核形成を行うことを含む、幹細胞を凍結保存する方法が開示されている。国際公開第ＷＯ２００５／１１８７８５号明細書には、さらに、細胞懸濁液は外因性生物学的凍結保護剤、例えば血清を含有していてもよいし又は含有していなくてもよいことが開示されている。
【０００４】
また、幹細胞の保存について多数の非低温方法も知られている。このような方法では、幹細胞は、一般に、組織細胞培養増殖培地を含有する水溶液に細胞分散液として保存される。多くの場合、このような水溶液には、細胞生存率が低下する割合を下げるように、防腐剤化合物を含有させる。典型的な例において、米国特許第５，９１２，１７４号明細書には、前記の細胞の集団をゼラチン含有水性混合物に懸濁させることによって複製及び分化できる哺乳動物細胞の集団を保存する方法が開示されている。好ましい混合物は、標準組織細胞培養増殖培地、例えばＲＭＰＩ培地又はイーグルの培地を含有する。場合によっては、細胞特異的増殖因子を、細胞生存率を保持するために加えてもよく、最適保存寿命のために、保存温度は０〜４℃の間に維持されるべきである。また、欧州特許出願公開第ＥＰ−Ａ−１０５７４０５号明細書には、特に、移植用の幹細胞、組織又は器官の生体外非凍結保存のための、ポリフェノールと、ユーロ・コリンズ（Ｅｕｒｏ−Ｃｏｌｌｉｎｓ）溶液、ＵＷ溶液、血清及び抗生物質溶液から選択される保存液とを含有する水性保存液の使用が開示されている。欧州特許出願公開第ＥＰ−Ａ−１０５７４０５号明細書に開示されているポリフェノールは、カテキン類、例えばエピガロカテキン、タンニン酸、プロアント−ジアニシジン、レゾルシノール、ヒドロキノン、ピロガロール、フロログルシノール、オイゲノール及びケルセチンを包含する。欧州特許出願公開第ＥＰ−Ａ−１０５７４０５号明細書には、開示されている化合物のいずれも未分化細胞の生存能力を保存し得るという効果は、何ら示唆されていない。
【０００５】
酸化的損傷を伴う疾患又は障害、例えば癌、心疾患、神経障害、自己免疫疾患、虚血再灌流障害、糖尿病性合併症、敗血症性ショック、肝炎、アテローム性動脈硬化症、及びＨＩＶ又はＢ型肝炎により生じる合併症を有する患者の治療用の酸化防止剤としてある種のフラボノイド化合物の治療使用可能性が、国際公開第ＷＯ２００４／００７４７５号明細書から知られている。国際公開第ＷＯ２００４／００７４７５号明細書にはまた、日焼け止め組成物及びスキンケア組成物におけるフラボノイド化合物の応用可能性も開示されている。また、国際公開第ＷＯ２００４／００７４７５号明細書には、フラボノイド化合物の食品安定剤としての使用可能性が開示されており、この場合には該化合物のフリーラジカルを除去する能力は、保存中の食品の品質の劣化を防ぐか又は遅らせることに有用であると考えられる。しかし、国際公開第ＷＯ２００４／００７４７５号明細書には、生命体（ｌｉｖｉｎｇ  ｍａｔｔｅｒ）の生体内治療処置及び無機物（ｄｅａｄ  ｍａｔｔｅｒ）の生体外安定化処置のためのフラボノイド化合物の使用が開示されているが、フラボノイド化合物が生命体物の生体外保存に有用であろうということは開示も示唆もない。
【０００６】
Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．、第４８巻、第３８７６−３８８４頁（Ｍｉｒａｎｄａら）には、ヒト低比重リポタンパク質の生体外酸化を抑制するためにある種のフラボノイド化合物の試験が開示されている。Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、２００３年、第８９（２）巻、第３５７−３６２頁及び第８９（１１）巻、第２１４０−２１４６頁には、ヒト臍帯血管内皮細胞及び新生児ラット心臓粘液細胞それぞれの保護に基づいて、生体外でのドキソルビシン誘発性炎症作用に対する保護及び生体外でのドキソルビシン誘発性心臓毒性に対する保護を提供するとしてモノＨＥＲの使用が開示されている。両方の細胞型は、完全に分化している。Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００２年、第３２（７）巻、第５９６−６０４頁には、ある種のフラボノイドについて酸化ストレスからラット皮質細胞の一次培養物を保護するための試験が開示されている。これらの細胞型は、完全に分化している。Ｂｉｏ．＆  Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、２００１年、第２４（１２）巻、第１３７３−１３７９頁には、ヒト皮膚細胞に対する酸化ストレスに対してある種の植物由来の抽出物、例えば幾つかのフラボノイドの混合物の生体外保護効果が開示されている。これらの細胞型は、完全に分化している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／０１０６５５４号明細書
【特許文献２】国際公開第ＷＯ２００５／１１８７８５号明細書
【特許文献３】欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ−１０５７４０５号明細書
【特許文献４】国際公開ＷＯ２００４／００７４７５号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．、第４８巻、第３８７６−３８８４頁
【非特許文献２】Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、２００３年、第８９（２）巻、第３５７−３６２頁
【非特許文献３】Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、２００３年、第８９（１１）巻、第２１４０−２１４６頁
【非特許文献４】Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００２年、第３２（７）巻、第５９６−６０４頁
【非特許文献４】Ｂｉｏ．＆  Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、２００１年、第２４（１２）巻、第１３７３−１３７９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、動物生細胞の改良された生体外保存方法を提供することにある。特に、本発明の目的は、研究又は医療の目的、例えば移植のための哺乳動物の細胞、組織又は器官の改良された生体外保存方法を提供することにある。さらに好ましくは、本発明の目的は、幹細胞の改良された生体外保存方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
その種々の態様における発明は、付属の特許請求の範囲に記載の通りである。
【００１１】
第一の態様において、本発明は、動物生細胞を生体外保存する方法であって、前記動物生細胞を、式Ｉ
【００１２】
【化１】
0005611045.tif 000002
〔式中：
Ａ）Ｒ１２及びＲ２６は、それぞれ独立して−ＯＨ又はグリコシド官能基を表し；Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立してＨ、−ＯＨ、ニトロ、ハロゲン、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、グリコシド官能基、Ｃ１−６アルコキシ−、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル−、Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルキル−を表すか、あるいはニトロ、ハロゲン、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、ヒドロキシル、ケトン又はアルデヒド基の一つ以上で置換されていてもよい飽和又は不飽和Ｃ１−６炭化水素鎖を表し；且つ環Ｂは、一つ以下のグリコシド官能基を含み；
Ｂ）ａ）：
Ｒ２０は、Ｈ又はＣ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖を表し；
Ｒ２１は、
ｉ）Ｈを表すか；
ｉｉ）Ｒ２２と一緒になってＣ１とＣ２の間の第二の結合を提供するか；又は
ｉｉｉ）Ｘが−ＮＲ１−であり且つＲ１がＨ又はＣ１−６アルキルでない場合には、Ｒ１と一緒になってＣ１とＮの間の第二の結合を提供し；
Ｒ２２は、
ｉ）Ｈを表すか；
ｉｉ）Ｒ２３と一緒になって＝Ｏを形成するか；又は
ｉｉｉ）Ｒ２１と一緒になってＣ１とＣ２の間の第二の結合を提供し；
Ｒ２３は、
ｉ）ＨあるいはＣ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖を表すか；
ｉｉ）Ｒ２２と一緒になって＝Ｏを形成し；
この場合にＲ２０及びＲ２３の少なくとも一つは、Ｃ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖であるか；あるいは、
ｂ）：
Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２及びＲ２３は、Ｃ１とＣ２とを含む５員、６員又は７員不飽和環の一部分を形成し、この環は、Ｃ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖である基で置換され、この環は、任意に及び独立して、ニトロ、ハロゲン、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、ヒドロキシル、ケトン、アルデヒド及び飽和又は不飽和Ｃ２−１５炭化水素鎖から選択される一つ以上の基でさらに置換され、Ｃ２−１５炭化水素鎖は、ニトロ、ハロゲン、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、ヒドロキシル、ケトン、アルデヒド又はニトロン基の一つ以上で置換されていてもよく；
Ｃ）ｎは０又は１であり、ｎが０である場合には、ｉ）Ｒ２７及びＲ２８は、Ｈを表すか、又はｉｉ）Ｒ２７はＲ２８と一緒になって、Ｃ４とＣ５の間の第二の結合を提供し；あるいはｎが１である場合には、ｉ）Ｒ２４及びＲ２５は、一緒になって＝Ｏを形成し且つＲ２７及びＲ２８は、Ｈを表すか、又はＲ２７はＲ２８と一緒になって、Ｃ４とＣ５の間の第二の結合を提供するか、又はｉｉ）Ｒ２４及びＲ２５はＨを表し且つＲ２７及びＲ２８はＨを表すか、又はＲ２７はＲ２８と一緒になって、Ｃ４とＣ５の間の第二の結合を提供するか；又はｉｉｉ）Ｒ２４はＨを表し、Ｒ２５はＲ２７と一緒になって、Ｃ３とＣ４の間の第二の結合を提供し、Ｒ２８は−ＯＨを表し且つＸは−Ｏ−であり；
Ｄ）Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ１−であり、Ｒ１は、ｉ）Ｈ又はＣ１−６アルキルを表すか、あるいはｉｉ）Ｒ２１と一緒になってＣ１とＮの間の第二の結合を提供し；
前記のＲ２０、Ｒ２３及び５員、６員又は７員不飽和環のＣ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖は、任意に及び独立して、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｃ１−６アルキル、−Ｓ（Ｏ）２Ｃ１−６アルキル、−Ｓ（Ｏ）２フェニル、−ＳＣ１−６アルキル、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＣＦ３、−Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）、イミン及び置換又は非置換トリフェニルホスホニウムから選択される一つ以上の基で置換され；且つＲ２０、Ｒ２３及び５員、６員又は７員不飽和環のＣ２−３０炭化水素鎖に存在する一つ以上の利用可能な−ＣＨ２−基は、任意に及び独立して、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）ｐ−又は−Ｎ（Ｒ２）−で置換され（但し、常に、得られる鎖中の二つのこのような置換が連続していないことを条件とする）；この場合のＲ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣ１−６アルキルを表し且つｐは０〜２であり；
並びに環Ｃ上の＝Ｏの総数は、１を越えない〕
の化合物又はその塩と接触させることを含む、方法を提供する。
【００１３】
一実施形態において、本発明は、動物生細胞を生存可能な非最終分化状態で生体外保存する方法であって、非最終分化動物生細胞を、式Ｉ
【００１４】
【化２】
0005611045.tif 000003
〔式中：
Ａ）Ｒ１２及びＲ２６は、それぞれ独立して−ＯＨ又はグリコシド官能基を表し；Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立してＨ、−ＯＨ、ニトロ、ハロゲン、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、グリコシド官能基、Ｃ１−６アルコキシ−、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル−、Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルキル−を表すか、あるいはニトロ、ハロゲン、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、ヒドロキシル、ケトン又はアルデヒド基の一つ以上で置換されていてもよい飽和又は不飽和Ｃ１−６炭化水素鎖を表し；且つ環Ｂは、一つ以下のグリコシド官能基を含み；
Ｂ）ａ）：
Ｒ２０は、Ｈ又はＣ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖を表し；
Ｒ２１は、
ｉ）Ｈを表すか；
ｉｉ）Ｒ２２と一緒になってＣ１とＣ２の間の第二の結合を提供するか；又は
ｉｉｉ）Ｘが−ＮＲ１−であり且つＲ１がＨ又はＣ１−６アルキルでない場合には、Ｒ１と一緒になってＣ１とＮの間の第二の結合を提供し；
Ｒ２２は、
ｉ）Ｈを表すか；
ｉｉ）Ｒ２３と一緒になって＝Ｏを形成するか；又は
ｉｉｉ）Ｒ２１と一緒になってＣ１とＣ２の間の第二の結合を提供し；
Ｒ２３は、
ｉ）ＨあるいはＣ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖を表すか；
ｉｉ）Ｒ２２と一緒になって＝Ｏを形成し；
この場合にＲ２０及びＲ２３の少なくとも一つは、Ｃ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖であるか；あるいは、
ｂ）：
Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２及びＲ２３は、Ｃ１とＣ２とを含む５員、６員又は７員不飽和環の一部分を形成し、この環は、Ｃ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖である基で置換され、この環は、任意に及び独立して、ニトロ、ハロゲン、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、ヒドロキシル、ケトン、アルデヒド及び飽和又は不飽和Ｃ２−１５炭化水素鎖から選択される一つ以上の基でさらに置換され、Ｃ２−１５炭化水素鎖は、ニトロ、ハロゲン、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、ヒドロキシル、ケトン、アルデヒド又はニトロン基の一つ以上で置換されていてもよく；
Ｃ）ｎは０又は１であり、ｎが０である場合には、ｉ）Ｒ２７及びＲ２８は、Ｈを表すか、又はｉｉ）Ｒ２７はＲ２８と一緒になって、Ｃ４とＣ５の間の第二の結合を提供し；あるいはｎが１である場合には、ｉ）Ｒ２４及びＲ２５は、一緒になって＝Ｏを形成し且つＲ２７及びＲ２８は、Ｈを表すか、又はＲ２７はＲ２８と一緒になって、Ｃ４とＣ５の間の第二の結合を提供するか、又はｉｉ）Ｒ２４及びＲ２５はＨを表し且つＲ２７及びＲ２８はＨを表すか、又はＲ２７はＲ２８と一緒になって、Ｃ４とＣ５の間の第二の結合を提供するか；又はｉｉｉ）Ｒ２４はＨを表し、Ｒ２５はＲ２７と一緒になって、Ｃ３とＣ４の間の第二の結合を提供し、Ｒ２８は−ＯＨを表し且つＸは−Ｏ−であり；
Ｄ）Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ１−であり、Ｒ１は、ｉ）Ｈ又はＣ１−６アルキルを表すか、あるいはｉｉ）Ｒ２１と一緒になってＣ１とＮの間の第二の結合を提供し；
前記のＲ２０、Ｒ２３及び５員、６員又は７員不飽和環のＣ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖は、任意に及び独立して、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｃ１−６アルキル、−Ｓ（Ｏ）２Ｃ１−６アルキル、−Ｓ（Ｏ）２フェニル、−ＳＣ１−６アルキル、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＣＦ３、−Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）、イミン及び置換又は非置換トリフェニルホスホニウムから選択される一つ以上の基で置換され；且つＲ２０、Ｒ２３及び５員、６員又は７員不飽和環のＣ２−３０炭化水素鎖に存在する一つ以上の利用可能な−ＣＨ２−基は、任意に及び独立して、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）ｐ−又は−Ｎ（Ｒ２）−で置換され（但し、常に、得られる鎖中の二つのこのような置換が連続していないことを条件とする）；この場合のＲ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣ１−６アルキルを表し且つｐは０〜２であり；
並びに環Ｃ上の＝Ｏの総数は、１を越えない〕
の化合物又はその塩と接触させることを含む、方法を提供する。
【００１５】
別の実施形態において、本発明は、組織又は器官として存在する動物生細胞を生体外保存する方法であって、前記動物生細胞を、式Ｉ
【００１６】
【化３】
0005611045.tif 000004
〔式中：
Ａ）Ｒ１２及びＲ２６は、それぞれ独立して−ＯＨ又はグリコシド官能基を表し；Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立してＨ、−ＯＨ、ニトロ、ハロゲン、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、グリコシド官能基、Ｃ１−６アルコキシ−、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル−、Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルキル−を表すか、あるいはニトロ、ハロゲン、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、ヒドロキシル、ケトン又はアルデヒド基の一つ以上で置換されていてもよい飽和又は不飽和Ｃ１−６炭化水素鎖を表し；且つ環Ｂは、一つ以下のグリコシド官能基を含み；
Ｂ）ａ）：
Ｒ２０は、Ｈ又はＣ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖を表し；
Ｒ２１は、
ｉ）Ｈを表すか；
ｉｉ）Ｒ２２と一緒になってＣ１とＣ２の間の第二の結合を提供するか；又は
ｉｉｉ）Ｘが−ＮＲ１−であり且つＲ１がＨ又はＣ１−６アルキルでない場合には、Ｒ１と一緒になってＣ１とＮの間の第二の結合を提供し；
Ｒ２２は、
ｉ）Ｈを表すか；
ｉｉ）Ｒ２３と一緒になって＝Ｏを形成するか；又は
ｉｉｉ）Ｒ２１と一緒になってＣ１とＣ２の間の第二の結合を提供し；
Ｒ２３は、
ｉ）ＨあるいはＣ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖を表すか；
ｉｉ）Ｒ２２と一緒になって＝Ｏを形成し；
この場合にＲ２０及びＲ２３の少なくとも一つは、Ｃ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖であるか；あるいは、
ｂ）：
Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２及びＲ２３は、Ｃ１とＣ２とを含む５員、６員又は７員不飽和環の一部分を形成し、この環は、Ｃ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖である基で置換され、この環は、任意に及び独立して、ニトロ、ハロゲン、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、ヒドロキシル、ケトン、アルデヒド及び飽和又は不飽和Ｃ２−１５炭化水素鎖から選択される一つ以上の基でさらに置換され、Ｃ２−１５炭化水素鎖は、ニトロ、ハロゲン、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、ヒドロキシル、ケトン、アルデヒド又はニトロン基の一つ以上で置換されていてもよく；
Ｃ）ｎは０又は１であり、ｎが０である場合には、ｉ）Ｒ２７及びＲ２８は、Ｈを表すか、又はｉｉ）Ｒ２７はＲ２８と一緒になって、Ｃ４とＣ５の間の第二の結合を提供し；あるいはｎが１である場合には、ｉ）Ｒ２４及びＲ２５は、一緒になって＝Ｏを形成し且つＲ２７及びＲ２８は、Ｈを表すか、又はＲ２７はＲ２８と一緒になって、Ｃ４とＣ５の間の第二の結合を提供するか、又はｉｉ）Ｒ２４及びＲ２５はＨを表し且つＲ２７及びＲ２８はＨを表すか、又はＲ２７はＲ２８と一緒になって、Ｃ４とＣ５の間の第二の結合を提供するか；又はｉｉｉ）Ｒ２４はＨを表し、Ｒ２５はＲ２７と一緒になって、Ｃ３とＣ４の間の第二の結合を提供し、Ｒ２８は−ＯＨを表し且つＸは−Ｏ−であり；
Ｄ）Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ１−であり、Ｒ１は、ｉ）Ｈ又はＣ１−６アルキルを表すか、あるいはｉｉ）Ｒ２１と一緒になってＣ１とＮの間の第二の結合を提供し；
前記のＲ２０、Ｒ２３及び５員、６員又は７員不飽和環のＣ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖は、任意に及び独立して、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｃ１−６アルキル、−Ｓ（Ｏ）２Ｃ１−６アルキル、−Ｓ（Ｏ）２フェニル、−ＳＣ１−６アルキル、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＣＦ３、−Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）、イミン及び置換又は非置換トリフェニルホスホニウムから選択される一つ以上の基で置換され；且つＲ２０、Ｒ２３及び５員、６員又は７員不飽和環のＣ２−３０炭化水素鎖に存在する一つ以上の利用可能な−ＣＨ２−基は、任意に及び独立して、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）ｐ−又は−Ｎ（Ｒ２）−で置換され（但し、常に、得られる鎖中の二つのこのような置換が連続していないことを条件とする）；この場合のＲ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣ１−６アルキルを表し且つｐは０〜２であり；
並びに環Ｃ上の＝Ｏの総数は、１を越えない〕
の化合物又はその塩と接触させることを含む、方法を提供する。
【００１７】
動物生細胞の生体外保存方法に関する他に、本発明はまた、新規化合物にも関する。意外にも、これらの新規化合物は、動物生細胞用の保存剤として使用するのに適していることが見出された。
【００１８】
従って、本発明の別の態様において、式Ｉａ
【００１９】
【化４】
0005611045.tif 000005
〔式中：
Ａ）Ｒ１２及びＲ２６は、それぞれ独立して−ＯＨ又はグリコシド官能基を表し；Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立してＨ、−ＯＨ、ニトロ、ハロゲン、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、グリコシド官能基、Ｃ１−６アルコキシ−、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル−、Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルキル−を表すか、あるいはニトロ、ハロゲン、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、ヒドロキシル、ケトン又はアルデヒド基の一つ以上で置換されていてもよい飽和又は不飽和Ｃ１−６炭化水素鎖を表し；且つ環Ｂは、一つ以下のグリコシド官能基を含有し；
Ｂ）ａ）：
Ｒ２０は、Ｈ又はＣ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖を表し；
Ｒ２１は、
ｉ）Ｈを表すか；
ｉｉ）Ｒ２２と一緒になってＣ１とＣ２の間の第二の結合を提供するか；又は
ｉｉｉ）Ｘが−ＮＲ１−であり及びＲ１がＨ又はＣ１−６アルキルでない場合には、Ｒ１と一緒になってＣ１とＮの間の第二の結合を提供し；
Ｒ２２は、
ｉ）Ｈを表すか；
ｉｉ）Ｒ２３と一緒になって＝Ｏを形成するか；又は
ｉｉｉ）Ｒ２１と一緒になってＣ１とＣ２の間の第二の結合を提供し；
Ｒ２３は、
ｉ）ＨあるいはＣ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖を表すか；
ｉｉ）Ｒ２２と一緒になって＝Ｏを形成し；
この場合にＲ２０及びＲ２３の少なくとも一つは、Ｃ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖であるか；あるいは、
ｂ）：
Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２及びＲ２３は、Ｃ１とＣ２とを含む５員、６員又は７員不飽和環の一部分を形成し、この環は、Ｃ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖である基で置換され、この環は、任意に及び独立して、ニトロ、ハロゲン、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、ヒドロキシル、ケトン、アルデヒド及び飽和又は不飽和Ｃ２−１５炭化水素鎖から選択される一つ以上の基でさらに置換され、Ｃ２−１５炭化水素鎖は、ニトロ、ハロゲン、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、ヒドロキシル、ケトン、アルデヒド又はニトロン基の一つ以上で置換されていてもよく；
Ｃ）ｎは０又は１であり、ｎが０である場合には、ｉ）Ｒ２７及びＲ２８は、Ｈを表すか、又はｉｉ）Ｒ２７は、Ｒ２８と一緒になってＣ４とＣ５の間の第二の結合を提供し；あるいはｎが１である場合には、ｉ）Ｒ２４及びＲ２５は、一緒になって＝Ｏを形成し且つＲ２７及びＲ２８は、Ｈを表すか、又はＲ２７はＲ２８と一緒になってＣ４とＣ５の間の第二の結合を提供するか、又はｉｉ）Ｒ２４及びＲ２５は、Ｈを表し且つＲ２７及びＲ２８は、Ｈを表すか、又はＲ２７はＲ２８と一緒になってＣ４とＣ５の間の第二の結合を提供するか；又はｉｉｉ）Ｒ２４はＨを表し、Ｒ２５はＲ２７と一緒になってＣ３とＣ４の間の第二の結合を提供し、Ｒ２８は−ＯＨを表し且つＸは−Ｏ−であり；
Ｄ）Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ１−であり、Ｒ１は、ｉ）Ｈ又はＣ１−６アルキルを表すか、あるいはｉｉ）Ｒ２１と一緒になってＣ１とＮの間の第二の結合を提供し；
前記のＲ２０、Ｒ２３及び５員、６員又は７員不飽和環のＣ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖は、任意に及び独立して、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｃ１−６アルキル、−Ｓ（Ｏ）２Ｃ１−６アルキル、−Ｓ（Ｏ）２フェニル、−ＳＣ１−６アルキル、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＣＦ３、−Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）、イミン及び置換又は非置換トリフェニルホスホニウムから選択される一つ以上の基で置換され；且つＲ２０、Ｒ２３及び５員、６員又は７員不飽和環のＣ２−３０炭化水素鎖に存在する一つ以上の利用可能な−ＣＨ２−基は、任意に及び独立して、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）ｐ−又は−Ｎ（Ｒ２）−で置換され（但し、常に、得られる鎖は、Ｃ１、Ｃ２あるいは５員、６員又は７員環に結合する−ＣＨ２−基を含み且つ二つのこのような置換が連続していないことを条件とする）；この場合のＲ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣ１−６アルキルを表し且つｐは０〜２であり；
並びに環Ｃ上の＝Ｏの総数は１を超えない；
但し、ｉ）ｎ＝１であり、ｉｉ）Ｘが−Ｏ−を表し、ｉｉｉ）Ｒ１２が−ＯＨを表し、ｉｖ）Ｒ２４がＲ２５と一緒になって＝Ｏを表し、ｖ）Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２及びＲ２３が、Ｃ１とＣ２とを含むベンゼン環を形成し、且つｖｉ）前記ベンゼン環が、Ｃ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖である少なくとも一つの基で置換される場合には、前記Ｃ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖は、Ｃ１−６アルコキシ、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、スルホニル、−ＣＯ２Ｃ１−６アルキル、−Ｓ（Ｏ）２Ｃ１−６アルキル、−Ｓ（Ｏ）２フェニル、−ＳＣ１−６アルキル、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＣＦ３、−Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）、イミン及び置換又は非置換トリフェニルホスホニウムから選択される一つ以上の基で置換され；及び／又は前記Ｃ２−３０炭化水素鎖に存在する一つ以上の利用可能な−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）ｐ−又は−Ｎ（Ｒ２）−で置換され；この場合のＲ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣ１−６アルキルを表し且つｐは０〜２であり；及び／又は前記ベンゼン環は、ニトロ、ハロゲン、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、ケトン、アルデヒド及び飽和又は不飽和Ｃ１−６炭化水素鎖から選択される一つ以上の基で置換され、Ｃ１−６炭化水素鎖は、ニトロ、ハロゲン、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、ヒドロキシル、ケトン、アルデヒド又はニトロン基の一つ以上で置換されることを条件とする〕
の化合物又はその塩が提供される。
【００２０】
本発明のそれぞれの態様において、式Ｉ又はＩａの化合物又はその塩は、式ＩＩ
【００２１】
【化５】
0005611045.tif 000006
〔式中：
Ａ）Ｒ１２及びＲ２６は、それぞれ独立して−ＯＨ又はグリコシド官能基を表し；Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立してＨ、−ＯＨ、ニトロ、ハロゲン、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、グリコシド官能基、Ｃ１−６アルコキシ−、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル−、Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルキル−を表すか、あるいはニトロ、ハロゲン、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、ヒドロキシル、ケトン又はアルデヒド基の一つ以上で置換されていてもよい飽和又は不飽和Ｃ１−６炭化水素鎖を表し；且つ環Ｂは、一つ以下のグリコシド官能基を含有し；
Ｂ）ａ）：
Ｒ２０は、Ｈ又はＣ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖を表し；
Ｒ２１は、
ｉ）Ｈを表すか；
ｉｉ）Ｒ２２と一緒になってＣ１とＣ２の間の第二の結合を提供するか；又は
ｉｉｉ）Ｘが−ＮＲ１−であり及びＲ１がＨ又はＣ１−６アルキルでない場合には、Ｒ１と一緒になってＣ１とＮの間の第二の結合を提供し；
Ｒ２２は、
ｉ）Ｈを表すか；
ｉｉ）Ｒ２３と一緒になって＝Ｏを形成するか；又は
ｉｉｉ）Ｒ２１と一緒になってＣ１とＣ２の間の第二の結合を提供し；
Ｒ２３は、
ｉ）ＨあるいはＣ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖を表すか；
ｉｉ）Ｒ２２と一緒になって＝Ｏを形成し；
この場合にＲ２０及びＲ２３の少なくとも一つは、Ｃ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖であるか；あるいは、
ｂ）：
Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２及びＲ２３は、Ｃ１とＣ２とを含む５員、６員又は７員不飽和環の一部分を形成し、この環は、Ｃ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖である基で置換され、この環は、任意に及び独立して、ニトロ、ハロゲン、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、ヒドロキシル、ケトン、アルデヒド及び飽和又は不飽和Ｃ２−１５炭化水素鎖から選択される一つ以上の基でさらに置換され、Ｃ２−１５炭化水素鎖は、ニトロ、ハロゲン、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、ヒドロキシル、ケトン、アルデヒド又はニトロン基の一つ以上で置換されていてもよく；
Ｃ）ｎは０又は１であり、ｎが０である場合には、ｉ）Ｒ２７及びＲ２８は、Ｈを表すか、又はｉｉ）Ｒ２７は、Ｒ２８と一緒になってＣ４とＣ５の間の第二の結合を提供し；あるいはｎが１である場合には、ｉ）Ｒ２４及びＲ２５は、一緒になって＝Ｏを形成し且つＲ２７及びＲ２８は、Ｈを表すか、又はＲ２７はＲ２８と一緒になってＣ４とＣ５の間の第二の結合を提供するか、又はｉｉ）Ｒ２４及びＲ２５は、Ｈを表し且つＲ２７及びＲ２８は、Ｈを表すか、又はＲ２７はＲ２８と一緒になってＣ４とＣ５の間の第二の結合を提供するか；又はｉｉｉ）Ｒ２４はＨを表し、Ｒ２５はＲ２７と一緒になってＣ３とＣ４の間の第二の結合を提供し、Ｒ２８は−ＯＨを表し且つＸは−Ｏ−であり；
Ｄ）Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ１−であり、Ｒ１は、ｉ）Ｈ又はＣ１−６アルキルを表すか、あるいはｉｉ）Ｒ２１と一緒になってＣ１とＮの間の第二の結合を提供し；
前記のＲ２０、Ｒ２３及び５員、６員又は７員不飽和環のＣ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖は、任意に及び独立して、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｃ１−６アルキル、−Ｓ（Ｏ）２Ｃ１−６アルキル、−Ｓ（Ｏ）２フェニル、−ＳＣ１−６アルキル、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＣＦ３、−Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）、イミン及び置換又は非置換トリフェニルホスホニウムから選択される一つ以上の基で置換され；且つＲ２０、Ｒ２３及び５員、６員又は７員不飽和環のＣ２−３０炭化水素鎖に存在する一つ以上の利用可能な−ＣＨ２−基は、任意に及び独立して、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）ｐ−又は−Ｎ（Ｒ２）−で置換され（但し、常に、得られる鎖は、Ｃ１、Ｃ２あるいは５員、６員又は７員環に結合する−ＣＨ２−基を含み且つ二つのこのような置換が連続していないことを条件とする）；この場合のＲ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣ１−６アルキルを表し且つｐは０〜２であり；
並びに環Ｃ上の＝Ｏの総数は１を超えない〕
の化合物又はその塩であってよい。
【００２２】
本発明のそれぞれの態様において、ＸはＯであり得る。
【００２３】
本発明のそれぞれの態様の幾つかの実施形態において、ｎ＝０である。本発明のそれぞれの態様の別の実施形態において、ｎ＝１である。
【００２４】
本発明のそれぞれの態様において、Ｒ１２及びＲ２６は、両方共にＯＨを表し得るか又は両方共にグリコシド官能基を表し得る；及び／又はＲ１２及びＲ２６の両方ではなく一方は、グリコシド官能基を表し得、例えば、Ｒ２６がグリコシド官能基である場合には、Ｒ１２はＯＨであり得るし又は逆も同様である；及び／又はＲ１１及びＲ１３の一つ又は両方は、ＯＨを表し得る；及び／又はＲ１０及びＲ１４は、それぞれ独立してＨ、ＯＨ又はＣ１−６アルコキシ−を表す。Ｘ＝Ｏであり且つＲ２７がＲ２８と一緒になってＣ４とＣ５の間の第二の結合を提供するこのような化合物の例は、式ＩＩＩ
【００２５】
【化６】
0005611045.tif 000007
〔式中：
Ａ）Ｒ１０及びＲ１４は、それぞれ独立してＨ、−ＯＨ、ニトロ、ハロゲン、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、グリコシド官能基、Ｃ１−６アルコキシ−、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル−、Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルキル−を表すか、あるいはニトロ、ハロゲン、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、ヒドロキシル、ケトン又はアルデヒド基の一つ以上で置換されていてもよい飽和又は不飽和Ｃ１−６炭化水素鎖を表し；且つ環Ｂは、一つ以下のグリコシド官能基を含有し；
Ｂ）ａ）：
Ｒ２０は、Ｈ又はＣ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖を表し；
Ｒ２１は、
ｉ）Ｈを表すか；又は
ｉｉ）Ｒ２２と一緒になってＣ１とＣ２の間の第二の結合を提供し；
Ｒ２２は、
ｉ）Ｈを表すか；
ｉｉ）Ｒ２３と一緒になって＝Ｏを形成するか；又は
ｉｉｉ）Ｒ２１と一緒になってＣ１とＣ２の間の第二の結合を提供し；及び
Ｒ２３は、
ｉ）ＨあるいはＣ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖を表すか；又は
ｉｉ）Ｒ２２と一緒になって＝Ｏを形成し；
この場合にＲ２０及びＲ２３の少なくとも一つは、Ｃ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖であるか；あるいは、
ｂ）：
Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２及びＲ２３は、Ｃ１とＣ２とを含有する５員、６員又は７員不飽和環（「Ａ」環）の一部分を形成し、この環は、Ｃ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖である基で置換され、この環は、場合により及び独立してニトロ、ハロゲン、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、ヒドロキシル、ケトン、アルデヒド及び飽和又は不飽和Ｃ２−１５炭化水素鎖から選択される一つ以上の基でさらに置換され、Ｃ２−１５炭化水素鎖は、ニトロ、ハロゲン、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、ヒドロキシル、ケトン、アルデヒド又はニトロン基の一つ以上で置換されていてもよく；
Ｃ）ｎは０又は１であり、ｎが１である場合には、ｉ）Ｒ２４及びＲ２５は、一緒になって＝Ｏを形成するか、又はｉｉ）Ｒ２４及びＲ２５はＨを表し；
前記のＲ２０、Ｒ２３又は５員、６員又は７員不飽和環のＣ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖は、場合により及び独立してＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｃ１−６アルキル、−Ｓ（Ｏ）２Ｃ１−６アルキル、−Ｓ（Ｏ）２フェニル、−ＳＣ１−６アルキル、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＣＦ３、−Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）、イミン及び置換又は非置換トリフェニルホスホニウムから選択される一つ以上の基で置換され；Ｒ２０、Ｒ２３あるいは５員、６員又は７員不飽和環のＣ２−３０炭化水素鎖に存在する一つ以上の利用可能な−ＣＨ２−基は、場合により及び独立して−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）ｐ−又は−Ｎ（Ｒ２）−で置換され（但し、常に、得られる鎖中の二つのこのような置換が連続していないことを条件とする）；この場合のＲ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣ１−６アルキルを表し且つｐは０〜２であり；並びに
環Ｃ上の＝Ｏの総数は、１を越えない〕
の化合物又はその塩である。Ｘ＝Ｏであり、ｎ＝１であり、Ｒ２４がＲ２５と一緒になって＝Ｏを形成し且つＲ２７がＲ２８と一緒になってＣ４とＣ５の間の第二の結合を提供するこのような化合物のさらなる例は、式ＶＩ
【００２６】
【化７】
0005611045.tif 000008
〔式中：
Ａ）Ｒ１０及びＲ１４は、それぞれ独立してＨ、−ＯＨ、ニトロ、ハロゲン、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、グリコシド官能基、Ｃ１−６アルコキシ−、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル−、Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルキル−を表すか、あるいはニトロ、ハロゲン、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、ヒドロキシル、ケトン又はアルデヒド基の一つ以上で置換されていてもよい飽和又は不飽和Ｃ１−６炭化水素鎖を表し；及び環Ｂは、一つ以下のグリコシド官能基を含有し；且つ−Ｏ−ｇｌｙは、グリコシド官能基を表し；
Ｂ）ａ）：
Ｒ２０は、Ｈ又はＣ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖を表し；
Ｒ２１は、
ｉ）Ｈを表すか；又は
ｉｉ）Ｒ２２と一緒になってＣ１とＣ２の間の第二の結合を提供し；
Ｒ２２は、
ｉ）Ｈを表すか；
ｉｉ）Ｒ２１と一緒になってＣ１とＣ２の間の第二の結合を提供し；及び
Ｒ２３は、ＨあるいはＣ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖を表し；
この場合のＲ２０及びＲ２３の少なくとも一つは、Ｃ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖であるか；あるいは、
ｂ）：
Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２及びＲ２３は、Ｃ１とＣ２とを含有する５員、６員又は７員不飽和環の一部分を形成し、この環は、Ｃ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖である基で置換され、この環は、場合により及び独立してニトロ、ハロゲン、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、ヒドロキシル、ケトン、アルデヒド及び飽和又は不飽和Ｃ２−１５炭化水素鎖から選択される一つ以上の基でさらに置換され、Ｃ２−１５炭化水素鎖は、ニトロ、ハロゲン、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、ヒドロキシル、ケトン、アルデヒド又はニトロン基の一つ以上で置換されていてもよく；
前記のＲ２０、Ｒ２３あるいは５員、６員又は７員不飽和環のＣ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖は、場合により及び独立してＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｃ１−６アルキル、−Ｓ（Ｏ）２Ｃ１−６アルキル、−Ｓ（Ｏ）２フェニル、−ＳＣ１−６アルキル、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＣＦ３、−Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）、イミン及び置換又は非置換トリフェニルホスホニウムから選択される一つ以上の基で置換され；Ｒ２０、Ｒ２３あるいは５員、６員又は７員不飽和環のＣ２−３０炭化水素鎖に存在する一つ以上の利用可能な−ＣＨ２−基は、場合により及び独立して−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）ｐ−又は−Ｎ（Ｒ２）−で置換され（但し、常に、得られる鎖中の二つのこのような置換が連続していないことを条件とする）；及びこの場合のＲ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣ１−６アルキルを表し且つｐは０〜２である〕
の化合物又はその塩である。
【００２７】
Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２及びＲ２３が５員、６員又は７員環の一部分を形成する本発明の第一の態様に有用な化合物の例は、式ＶＩＩ
【００２８】
【化８】
0005611045.tif 000009
（式中、
ＲＡはＣ２〜Ｃ３０飽和又は不飽和炭化水素鎖であり；
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ２６は、それぞれ独立してＨ、ＯＨ、Ｃ１−６アルコキシを表すか、あるいはニトロ、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシル、ケトン又はアルデヒド基の一つ以上で置換されていてもよい飽和又は不飽和Ｃ１−６炭化水素鎖を表し；
場合によりＣ環のＣ４とＣ５の間に二重結合が存在し；及び
ｎは、０又は１を表し；並びに
ＲＢは、Ｃ２〜Ｃ１５飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、ＲＢが存在する場合にはＲＡ及びＲＢは共にＣ２〜Ｃ１２脂肪族アルキル鎖である）
の化合物又はその塩である。
【００２９】
ＲＡ基は、環Ａ上でＣ２に対してパラ位で置換されるのが好ましい。ＲＡ基は、Ｃ６−１５飽和又は不飽和炭化水素鎖であることが好ましい。
【００３０】
式ＶＩＩの化合物は、国際公開第ＷＯ２００４／００７４７５号明細書に開示されており、それ自体は、具体的には本発明の第二の態様の範囲から除外される。
【００３１】
本発明の両方の態様において、式Ｉ又はＩａの化合物あるいはこれらの塩は、アントシアニンであってもよい。アントシアニン類は、一般に、これらの水和ヘミケタール体とこれらのフラビリウムカチオン体との間で平衡で存在することが知られており、水和ヘミケタール体及びフラビリウムカチオン体の両方は、本発明の範囲内に入るとみなされる。本発明の範囲内のアントシアニン類は、式Ｉの化合物又はその塩であって、
Ｒ１２がＯＨを表し、
Ｒ２６がグリコシド官能基を表し、
Ｒ２５が、Ｒ２７と一緒になってＣ３とＣ４の間の第二の結合を提供し、  
Ｒ２８がＯＨを表し、
Ｘ＝Ｏであり、
ｎ＝１であり、並びに
Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２及びＲ２３が、Ｃ１とＣ２とを含有する６員不飽和環の一部分を形成し、この環が、Ｃ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖である少なくとも一つの基で置換され、この環が、場合により及び独立してニトロ、ハロゲン、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、ヒドロキシル、ケトン、アルデヒド及び飽和又は不飽和Ｃ１−６炭化水素鎖から選択される一つ以上の基でさらに置換され、Ｃ１−６炭化水素鎖が、ニトロ、ハロゲン、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、ヒドロキシル、ケトン、アルデヒド又はニトロン基の一つ以上で置換されていてもよい、式Ｉの化合物又はその塩である。本発明の範囲内のアントシアニン類は、式ＶＩＩＩＨＨ（これは、その水和ヘミアセタール型の化合物の構造式である）及び式ＶＩＩＩＦＣ（これは、そのフラビリウムカチオン型の化合物の構造式である）で表すことができる。フラビリウムカチオン型はまた、式ＶＩＩＩＦＨで表される非イオン性フラビリウム型と平衡状態にある。
【００３２】
【化９】
0005611045.tif 000010
式ＶＩＩＩＨＨ
【００３３】
【化１０】
0005611045.tif 000011
式ＶＩＩＩＦＣ
【００３４】
【化１１】
0005611045.tif 000012
式ＶＩＩＩＦＨ
【００３５】
本発明のそれぞれの態様において、式Ｉ又はＩａの化合物あるいはその塩においてＲ２０、Ｒ２１、Ｒ２２及びＲ２３が、Ｃ１とＣ２とを含有する５員、６員又は７員不飽和環の一部分を形成する場合には、その環は、前記で定義された通り、オルト位、メタ位又はパラ位のいずれかでＣ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖で置換される。環は、独立して、ニトロ、ハロゲン、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、ヒドロキシル、ケトン、アルデヒド及び飽和又は不飽和Ｃ１−６炭化水素鎖から選択される一つ以上の基でさらに置換されていてもよく、Ｃ１−６炭化水素鎖は、ニトロ、ハロゲン、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、ヒドロキシル、ケトン、アルデヒド又はニトロン基の一つ以上で置換されていてもよい。オルト位での置換とは、環のＣ１に隣り合った炭素上での置換を意味する。メタ位での置換とは、Ｃ１から離れたオルト位に隣り合った炭素上での置換を意味する。パラ位での置換とは、Ｃ１から離れたメタ位に隣り合った炭素上での置換を意味する。当業者には、５員環の場合には、パラ位は、メタ位としても定義し得ることが分かるであろう。一つの実施形態において、式Ｉの化合物又はその塩は、５員、６員又は７員環であってそのメタ位又はパラ位で置換されたＣ２−３０炭化水素鎖を有する５員、６員又は７員環からなる。例えば、式Ｉの化合物又はその塩は、６員環であってそのメタ位又はパラ位で置換されたＣ２−３０炭化水素鎖を有する６員環からなり得る。
【００３６】
「グリコシド官能基」という用語は、当該技術において周知であり、本明細書の構造式において−Ｏ−ｇｌｙとして表される。しかし、誤解を避けるために、本発明者らは、主要構造にグリコシド官能基結合によって結合された炭水化物基を意味する。炭水化物は、糖であることが好ましい。糖は、グルコース、ラムノース又はルチノースであることが好ましい。
【００３７】
本発明のそれぞれの実施形態において、Ｒ２０、Ｒ２３及び５員、６員又は７員不飽和環のＣ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖は、２〜２０個の炭素原子、好ましくは６〜１５個の炭素原子を有していてもよい。前記炭化水素鎖は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個又は１８個の連続した炭素原子を有する主鎖を有することが適切である。
【００３８】
Ｒ２０、Ｒ２３及び５員、６員又は７員不飽和環のＣ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖は、Ｃ１、Ｃ２あるいは５員、６員又は７員環に結合する−ＣＨ２−を含有していてもよい。これは、例えば、前記Ｃ２−３０炭化水素鎖はアルコキシ基でなくてもよいが、Ｃ２−３０炭化水素鎖内の一つ以上の炭素原子がアルコキシ基で置換されていてもよいことを意味する。
【００３９】
Ｒ２０、Ｒ２３及び５員、６員又は７員不飽和環のＣ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖は、非置換であってもよく、飽和されることが好ましい。Ｒ２０、Ｒ２３及び５員、６員又は７員不飽和環のＣ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖は、好ましくは６〜１５個の炭素原子を含有する直鎖炭化水素鎖であることが好ましい。
【００４０】
Ｃ２−３０飽和又は不飽和炭化水素鎖が５員、６員又は７員不飽和環上に存在する場合には、この環は、場合により及び独立してニトロ、ハロゲン、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、ケトン、アルデヒド及び飽和又は不飽和Ｃ２−１５炭化水素鎖から選択される一つ以上の基でさらに置換され、Ｃ２−１５炭化水素鎖は、ニトロ、ハロゲン、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、ヒドロキシル、ケトン、アルデヒド又はニトロン基の一つ以上で置換されていてもよい。一つの実施形態において、前記の環は、Ｃ２−３０炭化水素鎖を除いて非置換である。別の実施形態において、この環は、−ＮＨ２及び飽和又は不飽和Ｃ２−１５炭化水素鎖から選択される一つ以上の基で置換されていてもよく、Ｃ２−１５炭化水素鎖は、ニトロ、ハロゲン、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、ヒドロキシル、ケトン、アルデヒド又はニトロン基の一つ以上で置換されていてもよい。
【００４１】
動物生細胞を保存することができる具体的な化合物又はその塩の例としては、
【００４２】
【化１２】
0005611045.tif 000013
0005611045.tif 000014
が挙げられる。
【００４３】
本発明の化合物は、動物生細胞の生体外保存に有用である。当業者には、ある状況においては、保存は永続的な状態ではないかもしれないが、ここでは保存とは個々の細胞又は細胞の群の生存率の低下の割合の減少を包含することを意図することが、分かるであろう。「動物生細胞の生体外保存」という表現は、当業者には十分に理解されるであろうが、万が一何らかの疑念が生じる場合には、組織及び器官を含め個々の細胞又は細胞の群の生体外保存を意味することを意図する。生体外での研究目的に有用である他に、当業者には、細胞又は細胞の群のこのような生体外保存は、結果として生じる自己移植、同系移植、同種移植又は異種移植のためのものであり得ることが分かるであろう。
【００４４】
例えば、本発明の化合物は、生存可能な最終分化細胞、例えば赤血球細胞、及びｔ−細胞及びｂ−細胞等のリンパ球細胞の生体外保存において使用し得る。前記の一つ以上の最終分化細胞は、個々の単能性幹細胞の形態であるか又は組織、すなわち生体内で同様の機能を果たすことができる相互結合細胞の集まりの形態であることができる。保存に適した組織としては、上皮組織、結合組織、筋肉組織及び神経組織が挙げられるが、これらに限定されない。また、前記の一つ以上の完全に分化した細胞は、器官、すなわち特定の機能又は機能の群を生体内で果たすことができる組織の群を形成でき、又はその一部であることができる。保存に適した器官としては、心臓、肺、脳、眼、胃、脾臓、骨、膵臓、腎臓、肝臓、腸、皮膚及び膀胱が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
本発明の方法は、動物生細胞を生存可能な非最終分化状態で保存するのに使用される。「生存可能な非最終分化状態での動物生細胞の保存」という表現は、当業者には十分に理解されるであろうが、万が一何らかの疑念が生じる場合には、細胞が分裂する能力を保ち且つ少なくとも一つの非最終分化細胞型を生じるような、非最終分化動物生細胞の保存を包含することを意図する。
【００４６】
分化とは、未分化細胞が分化するプロセスであり、実際には、未分化細胞が特定の細胞系統になる、及び／又はその特定の細胞型に分化する元の能力を失うことを意味する。
【００４７】
非最終分化した細胞は、種々の異なる細胞型を生じ、また部分的分化細胞として記載することができる。このような細胞としては、三つの胚生殖細胞層：内胚葉、中胚葉及び外胚葉の細胞が挙げられる。本発明の方法を使用して保存される細胞としては、未分化細胞も挙げられ、これらは多数の細胞型に分化する能力を有する。本発明の方法を使用して保存される未分化細胞は、典型的には幹細胞である。本発明の方法を使用して保存される細胞としてはまた、脱分化細胞も挙げられ、これらは、部分的分化又は最終分化細胞が初期発育段階に戻る場合に産生される。従って、脱分化細胞は、分化されていないか又は部分的に分化されることができる。この態様において、本発明の方法は、脱分化神経細胞の保存に特に有用である。また、本発明の方法は、脱分化している細胞培養における細胞の保存に有用である。
【００４８】
非最終分化細胞としては、分化プロセス又は脱分化プロセスの特定の段階で停止している細胞が挙げられる。従って、非最終分化細胞としては、特定の細胞系統になりながら特定の段階で停止している細胞、非最終分化又は最終分化した後に初期発育段階に戻りながら特定の段階で停止している細胞、及び脱分化した後に再分化する細胞が挙げられる。
【００４９】
一つの実施形態において、本発明は、輸送又は保存される前に、分化の非最終状態まで分化している細胞、すなわち部分的分化細胞の保存に用途が見出される。細胞は、この場合に、必要とされる場合には最終分化状態に誘導することができる。
【００５０】
本発明のこの態様において、本発明の方法で保存される細胞は、移植に使用できる。典型的には、このような細胞は、部分的に分化しており、多数の異なる細胞型に分化する能力を保有する。
【００５１】
本発明の方法を使用して保存できる未分化動物細胞は、典型的には幹細胞である。幹細胞は、種々の異なる型の細胞に分化することができ且つ自己再生できる未分化細胞である。本発明の方法を使用して保存できる幹細胞としては、全能性幹細胞（胚及び胚外細胞型に分化することができる）、多分化能幹細胞（内胚葉、中胚葉及び外胚葉に分化することができる）、及び多能性幹細胞（複数の密接に関連した細胞に分化することができる）が挙げられる。
【００５２】
本発明の方法を使用して保存できる幹細胞の型としては、胚幹（ＥＳ）細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞及び誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞が挙げられる。胚幹細胞は、哺乳動物胚の胚盤胞から誘導され、全能性である。胚幹細胞は、ＥｖａｎｓとＫａｕｆｍａｎによって初めて記載された（Ｎａｔｕｒｅ、２９２（５８１９）：１５４−１５６、１９８１）。成体幹細胞は、多能性であり、造血幹細胞及び間葉幹細胞を包含する。誘導多能性細胞は、非多能性細胞、例えば成体体細胞からある種の遺伝子を挿入することによって人工的に誘導され、胚幹細胞に極めて類似している（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ、１３１（５）：８６１−８７２、２００７；及びＹｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８（５８５８）、１９１７−１９２０、２００７）。幹細胞はまた、臍帯血中にも見出され、このような臍帯血幹細胞も本発明の方法を使用して保存できる。
【００５３】
本発明の方法を使用して保存できる幹細胞は、ヒト又は非ヒト幹細胞であり得る。典型的には、幹細胞は、マウス胚幹細胞又はヒト胚幹細胞である。本発明の方法を使用して保存できる幹細胞としては、トランスジェニック幹細胞が挙げられる。本発明の方法を使用して保存できる幹細胞としてはまた、ハイブリッド胚又は細胞質ハイブリッド（サイブリッド）胚から産生される幹細胞も挙げられる。
【００５４】
本発明の方法を使用して保存できる他の型の未分化細胞としては、胚性生殖（ＥＧ）細胞及び胚性癌（ＥＣ）細胞が挙げられる。
【００５５】
未分化細胞は、例えば、特定の標識遺伝子の発現によって同定することができる。例えば、幹細胞は、標識遺伝子Ｏｃｔ３／４及びＮａｎｏｇの発現によって同定することができる。このような標識遺伝子の発現は、当該技術において知られている適当な方法、例えば、ｑＰＣＲで調べることができる。
【００５６】
本発明の方法を使用して保存できる未分化動物細胞は、典型的には哺乳動物細胞である。このような哺乳動物細胞としては、ヒト細胞及び非ヒト細胞が挙げられる。例えば、非ヒト細胞は、齧歯類、例えばマウス、ラット及びモルモット；有蹄類、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ及びブタ；又はその他の哺乳動物、例えばネコ、イヌ、ウマ又はウサギ由来の細胞であり得る。動物細胞は、あるいは、鳥細胞、例えばニワトリ又は七面鳥由来の細胞、又は魚細胞、例えばゼブラフィッシュ又はサケ由来の細胞であり得る。
【００５７】
式Ｉの化合物又はその塩は、欧州特許出願公開第ＥＰ−Ａ−１０５７４０５号明細書に開示されている関連方法のいずれかで動物生細胞を保存するのに使用し得る。
代表的な化合物の合成
Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２及びＲ２３がＣ１とＣ２とを含有する６員不飽和環の一部分を形成する式Ｉ及びＩａの化合物は、国際公開第ＷＯ２００４／００７４７５号明細書に記載の方法で形成し得る。当業者は、この方法を５員又は７員環を含有する式Ｉ又はＩａの化合物の製造に容易に適合させることができるであろう。
【００５８】
Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２及びＲ２３がＣ１とＣ２とを含有する６員不飽和環の一部分を形成しない式Ｉ又はＩａの化合物は、以下の方法で形成し得る。
【００５９】
その場での急冷プロトコールの使用により、最終的に目的化合物のＢ環を形成するのに使用される所望のボロン酸を得た（スキーム１）。
【００６０】
【化１３】
0005611045.tif 000015
スキーム１．試薬及び条件：ｉ．ＢＢｒ３（１．０Ｍ ＣＨ２Ｃｌ２溶液、１０当量）、ＣＨ２Ｃｌ２、０℃〜室温、１６時間（９７％）；ｉｉ．ＢｎＢｒ（３．３０当量）、Ｋ２ＣＯ３（４．００当量）、ＤＭＦ、１００℃、１８時間。（５７％）；ｉｉｉ．ｔ−ＢｕＬｉ（２．２０当量）、Ｂ（Ｏ−ｉＰｒ）３、ＴＨＦ、−７８℃〜室温、１６時間、（６０％）。
【００６１】
ホスホン酸エステル（１１）を、次の通りに調製した：
【００６２】
【化１４】
0005611045.tif 000016
【００６３】
ＴＨＦ（５０ｍＬ）に溶解した５（１．８８ｇ、８．５２ミリモル、１．００当量）の攪拌溶液に、ベンジルアルコール（４．４０ｍＬ、４．６０ｇ、４２．６ミリモル、５．００当量）を加え、次いでトリフェニルホスフィン（２．２３ｇ、８．５２ミリモル、１．００当量）を加えた。反応物を０℃に冷却し、ＤＩＡＤ（１．７ｍＬ、１．７２ｇ、８．５２ミリモル、１．００当量）を滴加した。反応物を室温まで温め、４時間攪拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（１０％ＥｔＯＡｃ：９０％石油→２０％ＥｔＯＡｃ：８０％石油→３０％ＥｔＯＡｃ：７０％石油→５０％ＥｔＯＡｃ：５０％石油）で精製して、ベンジル化化合物を約３０％低減したＤＩＡＤを含有する黄色油状物として得た（１．０１ｇ、３８％、不純物を含有）。得られた粗製ベンジル化化合物（５３５ｍｇ、１．７２ミリモル、１．００当量）をＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）で希釈し、ＳＯＣｌ２（１８８μＬ、２．５８ミリモル、１．５０当量）を０℃で加えた。反応物を、室温まで温めながら、ＨＰＬＣで反応が完結するときまで２．５時間攪拌した。反応混合物を、真空中で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（１０％ＥｔＯＡｃ：９０％石油→２０％ＥｔＯＡｃ：８０％石油）で精製して、褐色油状物を得た（２７６ｍｇ、４９％）。得られた塩化物（２６１ｍｇ、０．７９ミリモル、１．００当量）をトリメチルホスファイト（２ｍＬ）に溶解し、反応物を加熱還流し、１６時間攪拌した。反応物を室温まで冷却し、真空中で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（７０％ＥｔＯＡｃ：３０％石油→１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、表題ホスホン酸エステル１１を褐色油状物として得た（２３３ｍｇ、７３％）。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）７．４７−７．４３（２Ｈ，ｍ，２ｘＡｒＨ），７．３８  ７．３１（３Ｈ，ｍ，３ｘＡｒＨ），６．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ３．０，ビニルＨ），５．２５（２Ｈ，ｓ，ＯＣＨ２Ａｒ），３．８０（６Ｈ，ｄ，Ｊ１１．１，２ｘＯＣＨ３），３．０７（２Ｈ，ｄ，Ｊ２１．７，ＣＨ２Ｐ）。
【００６４】
【化１５】
0005611045.tif 000017
【００６５】
１：１のＤＭＦ／ＴＨＦ（８ｍＬ）に溶解した１１（４００ｍｇ、０．９９ミリモル、１．００当量）に、−７８℃で、ＬＨＭＤＳ（１．０Ｍ ＴＨＦ溶液；１．１０ｍＬ、１．０９ミリモル、１．１０当量）を加え、反応物をその温度で１０分間攪拌した（黄色／橙色）。ＤＭＦ（４ｍＬ）に溶解したヘプトアルデヒド（１１３ｍｇ、０．９９ミリモル、１．００当量）を−７８℃で一度に加え、反応物をその温度で４５分間攪拌した。反応物を０℃まで温め、ＨＰＬＣで反応が完結するまで、１０分間攪拌した。反応物を、飽和塩化アンモニウム水溶液（５ｍＬ）を用いて急冷し、ＥｔＯＡｃ（３×１０ｍＬ）に抽出した。一緒にした有機抽出液を、水（１０ｍＬ）及び食塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、真空中で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィーで精製し（１０％ＥｔＯＡｃ：９０％石油）、アルケン１２ｂを無色油状物及びＥ異性体とＺ異性体それぞれの２．５：１．０混合物として得た（２５１ｍｇ、６５％）。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）７．５０−７．４５（２Ｈ，ｍ，２ｘＡｒＨ），７．４０−７．３０（３Ｈ，ｍ，３ｘＡｒＨ），６．６２（０．７Ｈ，ｄｔ，Ｊ１５．７及び７．１，ビニルＨ），６．２４（０．３Ｈ，ｓ，ＨＣ＝ＣＯ）；６．１６（０．７Ｈ，ｓ，ＨＣ＝ＣＯ），６．０８−５．９８（０．３Ｈ，ｍ，ビニルＨ），６．０１（０．７Ｈ，ｄｔ，Ｊ１５．７及び１．５，ビニルＨ），５．９２（０．３Ｈ，ｄｔ，Ｊ１２．１及び１．５２，ビニルＨ），５．２８（０．６Ｈ，ｓ，ＯＣＨ２Ａｒ），５．２６（１．５Ｈ，ｓ，ＯＣＨ２Ａｒ），２．４６（０．６Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ１３．１，７．５及び１．５，アリルＣＨ２），２．２４（１．５Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ１３．１，７．５及び１．５，アリルＣＨ２），１．５２−１．４４（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２），１．４０−１．２４（６Ｈ，ｍ，ＣＨ２），０．９３−０．８８（３Ｈ，ｍ，ＣＨ３）。
【００６６】
【化１６】
0005611045.tif 000018
【００６７】
１：１のＤＭＦ／ＴＨＦ（８ｍＬ）に溶解した１１（４００ｍｇ、０．９９ミリモル、１．００当量）に、−７８℃で、ＬＨＭＤＳ（１．０Ｍ ＴＨＦ溶液；１．１０ｍＬ、１．０９ミリモル、１．１０当量）を加え、反応物をその温度で１０分間攪拌した（黄色／橙色）。ＤＭＦ（４ｍＬ）に溶解したウンデカナール（１６８ｍｇ、０．９９ミリモル、１．００当量）を−７８℃で一度に加え、反応物をその温度で４５分間攪拌した。反応物を０℃まで温め、ＨＰＬＣで反応が完結するまで、１０分間攪拌した。反応物を、飽和塩化アンモニウム水溶液（５ｍＬ）を用いて急冷し、ＥｔＯＡｃ（３×１０ｍＬ）に抽出した。一緒にした有機抽出液を、水（１０ｍＬ）及び食塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、真空中で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィーで精製し（５％ＥｔＯＡｃ：９５％石油→１０％ＥｔＯＡｃ：石油）、アルケン１２ｃを無色油状物及びＥ異性体とＺ異性体それぞれの約３：１混合物として得た（３３６ｍｇ、７６％）。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）７．５０−７．４５（２Ｈ，ｍ，２ｘＡｒＨ），７．４０−７．３０（３Ｈ，ｍ，３ｘＡｒＨ），６．６１（０．７Ｈ，ｄｔ，Ｊ１５．７及び７．１，ビニルＨ），６．２４（０．３Ｈ，ｓ，ＨＣ＝ＣＯ），６．１６（０．７Ｈ，ｓ，ＨＣ＝ＣＯ），６．０７−５．９９（０．３Ｈ，ｍ，ビニルＨ），６．００（０．７Ｈ，ｄｔ，Ｊ１６．１及び１．５，ビニルＨ），５．９２（０．３Ｈ，ｄｔ，Ｊ１１．６及び１．５，ビニルＨ），５．２８（０．６Ｈ，ｓ，ＯＣＨ２Ａｒ），５．２５（１．４Ｈ，ｓ，ＯＣＨ２Ａｒ），２．４６（０．５Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ１５．２，７．６及び１．５，アリルＨ），２．２４（１．５Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ１５．２，７．６及び１．５，アリルＨ），１．５２−１．４２（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２），１．４０−１．２２（１４Ｈ，ｍ，７ｘＣＨ２），０．９０（３Ｈ，ｔ，Ｊ７．１，ＣＨ３）。
【００６８】
【化１７】
0005611045.tif 000019
【００６９】
ＤＭＦ／Ｈ２Ｏ（２：１、５．１ｍＬ）中の１２ｂ（２５１ｍｇ、０．６４ミリモル、１．００当量）、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（６９ｍｇ、０．０６ミリモル、１０モル％）及びＫ２ＣＯ３（２８３ｍｇ、２．０５ミリモル、３．２０当量）の懸濁液を５分間脱気し、次いでＤＭＦ（１．８ｍＬ）に溶解したボロン酸（３１０ｍｇ、０．７１ミリモル、１．１０当量）の脱気溶液を加え、反応物を６０℃に加熱し、４時間攪拌した。反応物を室温に冷却し、水（２０ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（２×２０ｍＬ）で抽出した。一緒にした有機抽出液を、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、真空中で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィーで精製し（１０％ＥｔＯＡｃ：９０％石油→２０％ＥｔＯＡｃ：８０％石油→３０％ＥｔＯＡｃ：７０％石油→４０％ＥｔＯＡｃ：６０％石油）、表題化合物を黄色油状物として得た（３３２ｍｇ、７４％）。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）７．４８−７．２０（２２Ｈ，ｍ，２２ｘＡｒＨ），６．５２−５．９０（３Ｈ，ｍ，ビニルＨ及びピラノンＨ），５．３２−４．９２（８Ｈ，ｍ，４ｘＯＣＨ２Ａｒ），２．６０−２．２０（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２），１．５８−１．４０（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２），１．４０−１．２０（６Ｈ，ｍ，３ｘＣＨ２），１．００−０．８０（３Ｈ，ｍ，ＣＨ３）。
【００７０】
【化１８】
0005611045.tif 000020
【００７１】
ＤＭＦ／Ｈ２Ｏ（２：１、５．１ｍＬ）中の１２ｃ（２０４ｍｇ、０．４６ミリモル、１．００当量）、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（５３ｍｇ、０．０５ミリモル、１０モル％）及びＫ２ＣＯ３（２０３ｍｇ、１．４７ミリモル、３．２０当量）の懸濁液を５分間脱気し、次いでＤＭＦ（１．８ｍＬ）に溶解したボロン酸（２２１ｍｇ、０．５０ミリモル、１．１０当量）の脱気溶液を加え、反応物を６０℃に加熱し、４時間攪拌した。反応物を室温に冷却し、水（２０ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（２×２０ｍＬ）で抽出した。一緒にした有機抽出液を、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、真空中で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィーで精製し（１０％ＥｔＯＡｃ：９０％石油→２０％ＥｔＯＡｃ：８０％石油→３０％ＥｔＯＡｃ：７０％石油→４０％ＥｔＯＡｃ：６０％石油）、表題化合物を黄色油状物として得た（２６０ｍｇ、７４％）。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）７．５０−７．２０（２２Ｈ，ｍ，２２ｘＡｒＨ），６．５０−６．００（３Ｈ，ｍ，３ｘビニルＨ），５．３０−４．９０（６Ｈ，ｍ，ＯＣＨ２Ａｒ），２．５６−２．４８（０．４Ｈ，ｍ，ＣＨ２），２．２８−２．２０（１．４Ｈ，ｍ，ＣＨ２），１．５７−１．４０（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２），１．４０−１．２０（１４Ｈ，ｍ，７ｘＣＨ２），０．９２−０．８４（３Ｈ，ｍ，ＣＨ３）。
【００７２】
【化１９】
0005611045.tif 000021
【００７３】
１３ｂ（３２０ｍｇ、０．４５ミリモル、１．００当量）を、必要最少量の酢酸エチルに溶解し、ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）に溶解した。１０％Ｐｄ／Ｃ（１８０ｍｇ）を、ＭｅＯＨ（１ｍＬ）を用いてスラリー化し、前記溶液に加えた。得られた溶液を、排気し、Ｈ２で３回充填し直し、１時間攪拌した。得られた懸濁物を、セライト（Ｃｅｌｉｔｅ）（登録商標）に通して濾過し、真空中で濃縮し、１４ｂを黄褐色固体として得た（１０５ｍｇ、６７％）。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ／Ｄ２Ｏ  ｓｈａｋｅ）７．０６（２Ｈ，ｓ，２ｘＡｒＨ），６．２４（１Ｈ，ｓ，ビニルＨ），２．５９（２Ｈ，ｔ，Ｊ７．１，ＣＨ２），１．６４（２Ｈ，クインテット，Ｊ７．１，ＣＨ２），１．３０−１．１０（１０Ｈ，ｍ，５ｘＣＨ２），０．８１（３Ｈ，ｔ，Ｊ７．１，ＣＨ３）。
【００７４】
【化２０】
0005611045.tif 000022
【００７５】
１３ｃ（２５０ｍｇ、０．３３ミリモル、１．００当量）を、必要最少量の酢酸エチルに溶解し、ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）に溶解した。１０％Ｐｄ／Ｃ（１５０ｍｇ）を、ＭｅＯＨ（１ｍＬ）を用いてスラリー化し、前記溶液に加えた。溶液を、排気し、Ｈ２で３回充填し直し、１時間攪拌した。得られた懸濁物を、セライト（Ｃｅｌｉｔｅ）（登録商標）に通して濾過し、真空中で濃縮し、１４ｃを黄褐色固体として得た（８４ｍｇ、６３％）。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ／Ｄ２Ｏ  ｓｈａｋｅ）７．０８（２Ｈ，ｓ，２ｘＡｒＨ），６．２４（１Ｈ，ｓ，ビニルＨ），２．５９（２Ｈ，ｔ，Ｊ７．１，ＣＨ２），１．６４（２Ｈ，クインテット，Ｊ７．１，ＣＨ２），１．３７−１．００（１８Ｈ，ｍ，９ｘＣＨ２），０．８１（３Ｈ，ｔ，Ｊ７．１，ＣＨ３）。
【００７６】
実験
次の実験を、マウス胚幹細胞における酸化ストレス誘発細胞毒性に関してある種の抗酸化化合物の保護効果を実証するために行った：
酸化ストレス及び関連フリーラジカル損傷を、細胞、例えば幹細胞において、培養培地中でｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドに細胞を暴露することによって誘発させた。ある時間にわたる過酸化物の分解は、活性酸素種の規則的な発生をもたらす。これは、次々にフリーラジカル介在事象のカスケードを誘発し、最終的に回復不可能な損傷をもたらし、最終的に天然抗酸化防御として細胞死を負わせる。
【００７７】
過酸化物暴露によって誘発される細胞毒性の程度は、多数の十分に文献で立証されたアッセイ、例えばＭＴＴプロトコールを使用して定量することができる。これは、ＭＴＴのホルマザンへの還元、すなわち細胞が生存可能である場合にだけ生じることができるプロセスを測定する比色アッセイである。従って、対照細胞中で産生されるホルマザンの量を、細胞毒性物質、例えばｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドで処理した細胞と比較することによって、細胞毒性物質によって誘発された細胞生存率の低下を測定できる。
【００７８】
このアッセイは、細胞毒性物質に対して保護を提供する化合物の有効性を調べるためにさら拡張できる。新規な抗酸化剤（本特許の主題）の場合には、これは、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドによる酸化ストレスの誘発の前に細胞の抗酸化剤とのプレインキュベーションによって達成できる。従って、対照細胞と、細胞毒性過酸化物を存在させ新規抗酸化剤とのプレインキュベーションを行うか又は行わない細胞との、産生されるホルマザンの量の比較により、化合物が細胞生存率を保持できる程度を調べることができる。
ＭＴＴアッセイのメカニズム
【００７９】
【化２１】
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【００８０】
９６ウエルプレートに、ウエル当たり約２０，０００個のマウス胚幹細胞を接種し、３７℃（５％ＣＯ２）で一夜増殖させた。抗酸化剤（実験１、実験２及び実験３として表示した）を、ＤＭＳＯに溶解し、ウエルに三重反復で加え、その３０分後にｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドを用いて酸化ストレスを誘導した。ウエルの供試抗酸化剤の得られた濃度は、０．１μＭ、０．５μＭ及び１μＭであった。対照もまた、細胞培地（ＤＭＥＭ＋）／ＤＭＳＯを使用して開始させた。３０分のプレインキュベーション時間の後に、ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシドをウエルに加えて４００μＭの最終濃度を得た。平板培養細胞を、インキュベーター（３７℃）に９０分間戻した。この時間の後に、２０μＬのＭＴＴ試薬溶液を全てのウエルに加えた。次いで、プレートをさらに３時間インキュベートした。上清をウエルから除去し、２００μｌのＤＭＳＯを全てのウエルに加えて還元されたＭＴＴ（ホルマザン）を可溶化させた。プレートを光から保護し、１０分間振盪した。上清をウエルから除去し、比色測定用に新たな９６ウエルプレートに分注した。吸光度を５４０ｎｍで測定した。
【００８１】
結果及び考察
ＤＭＥＭ＋対照（これは、抗酸化化合物又はｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドを含有していなかった）についての平均補正吸光度（０．７３７）は、１００％生存率基準を表した。種々のウエル処理レジームの補正吸光度と、ＤＭＥＭ＋対照の補正吸光度との比較は、細胞生存率に対して得られる効果を算出することを可能にした。ｔＢＨＰ＝ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド。
【００８２】
表１から、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドに対する暴露は、細胞生存率を対照の３７％まで低下させる。過酸化物を存在させない培養培地の１μＭの濃度では、実験１も実験２も、生存率に悪影響を及ぼさず、化合物はその暴露の濃度で細胞毒性を誘発しないことを示す。
【００８３】
実験１、実験２及び実験３は全て、ｔｅｒｔ−ヒドロペルオキシドの酸化ストレス誘発細胞毒性からの強い保護効果を示した。実験２は、この点で特に注目すべきであり、ｔｅｒｔ−ヒドロペルオキシドによって誘発される細胞生存率の減少をほぼ完全に反転させることができた（９６．９％±３．９標準偏差）。濃度依存効果が観察された。
【００８４】
構造活性相関について、実験２のドデシル鎖は、実験３のオクチル鎖よりも大きい効果を付与することが明らかである。これらの結果の重要な所見は、天然フラボノイドに関する文献に関連しており、そこでは多数の著者が、フラボノイドのＡ環の重要性について分子の抗酸化活性の不可欠な構成要素であるとさりげなく言及している（「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  Ｏｆ  Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｈｅｎｏｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ；  Ｒｉｃｅ−Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、；Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｐｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｖｏｌ．２０、Ｎｏ．７、ｐｐ９３３−９５６、１９９６」に例示されているように）。
【００８５】
ここに示したデータは、Ａ環構成要素は、必ずしも必須ではなく、強い抗酸化生物活性を保持しながら分子から完全に取り除くことができることを明確に実証している。この細胞生存率酸化ストレスアッセイにおける実験１と実験の２の比較は、活性はＡ環を取り除くことによって保ち得るだけではなく、高め得ることも示している。
【００８６】
【表１】
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試験化合物
実験１：
【００８７】
【化２２】
0005611045.tif 000025
実験２：
【００８８】
【化２３】
0005611045.tif 000026
実験３：
【００８９】
【化２４】
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