(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を複数段階に傾斜させる試料傾斜部と、
前記試料傾斜部によって設定された傾斜角度ごとに得られる前記試料の透過電子顕微鏡像を取得する像取得部と、
取得した前記傾斜角度ごとの前記試料の透過電子顕微鏡像に基づいて、前記試料の３次元像を構築する３次元像構築処理を行う３次元像構築部と、
前記試料にマーカーを形成するマーカー形成部と、
を含み、
前記像取得部は、
前記マーカーが形成される前の前記試料の透過電子顕微鏡像を、前記傾斜角度ごとに取得することにより、第１傾斜像シリーズを取得する第１処理と、
前記マーカーが形成された前記試料の透過電子顕微鏡像を、前記傾斜角度ごとに取得することにより、第２傾斜像シリーズを取得する第２処理と、
を行い、
前記３次元像構築部は、
前記第２傾斜像シリーズに基づいて、前記第１傾斜像シリーズを構成する複数の透過電子顕微鏡像間の位置あわせを行うアライメント処理を行い、位置合わせされた前記第１傾斜像シリーズを構成する複数の透過電子顕微鏡像に対して、前記３次元構築処理を行う、電子顕微鏡。
【請求項２】
請求項１において、
前記３次元像構築部は、
前記第２傾斜像シリーズに基づいて、前記マーカーの位置情報を前記傾斜角度ごとに取得し、
取得された前記傾斜角度ごとの前記マーカーの位置情報を、対応する傾斜角度で得られた前記第１傾斜像シリーズの透過電子顕微鏡像に適用することにより、前記第１傾斜像シリーズを構成する複数の透過電子顕微鏡像間の位置あわせを行う、電子顕微鏡。
【請求項３】
請求項１または２において、
前記マーカー形成部は、電子線を前記試料の所定の領域に照射して、前記マーカーを形成する、電子顕微鏡。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、
前記３次元像構築部は、位置合わせされた前記第１傾斜像シリーズを構成する複数の透過電子顕微鏡像にＣＴ法を適用して前記３次元構築処理を行う、電子顕微鏡。
【請求項５】
試料を複数段階に傾斜させて、前記試料の透過電子顕微鏡像を、傾斜角度ごとに取得することにより、第１傾斜像シリーズを取得する工程と、
前記第１傾斜像シリーズを取得する工程の後に、前記試料にマーカーを形成する工程と、
前記マーカーが形成された前記試料を複数段階に傾斜させて、前記マーカーが形成された前記試料の透過電子顕微鏡像を、前記傾斜角度ごとに取得することにより、第２傾斜像シリーズを取得する工程と
前記第２傾斜像シリーズに基づいて、前記第１傾斜像シリーズを構成する複数の透過電子顕微鏡像間の位置合わせを行う工程と、
位置合わせされた前記第１傾斜像シリーズを構成する複数の透過電子顕微鏡像に基づいて、３次元像を構築する工程と、
を含む、３次元像構築方法。
【請求項６】
請求項５において、
前記第１傾斜像シリーズを構成する複数の透過電子顕微鏡像間の位置合わせを行う工程では、
前記第２傾斜像シリーズに基づいて、前記マーカーの位置情報を前記傾斜角度ごとに検出し、
検出された前記傾斜角度ごとの前記マーカーの位置情報を、対応する傾斜角度で得られた前記第１傾斜像シリーズの透過電子顕微鏡像に適用することにより、前記第１傾斜像シリーズを構成する複数の透過電子顕微鏡像間の位置あわせを行う、３次元像構築方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電子顕微鏡および３次元像構築方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
透過型電子顕微鏡（Transmission Electron Microscope，ＴＥＭ）や走査透過型電子顕微鏡（Scanning Transmission Electron Microscope，ＳＴＥＭ）にＣＴ法（Computerized Tomography Method）を適用することで、ナノメートルスケールの３次元構造物に対して、３次元的に構造観察・構造解析を可能とする手法として、ＴＥＭトモグラフィーやＳＴＥＭトモグラフィーが、一般的に知られている（例えば特許文献１参照）。トモグラフィーは、まず、ＴＥＭやＳＴＥＭを用いて試料をさまざまな角度で傾斜させ、透過電子顕微鏡像（ＴＥＭ像もしくはＳＴＥＭ像）を取得する。例えば、傾斜角度範囲を±６０度とし１度ずつ試料を傾斜させ、傾斜角度ごとに透過電子顕微鏡像を取得すれば、１２１枚の透過電子顕微鏡像から構成される傾斜像シリーズを取得できる。そして、傾斜像シリーズを構成する透過電子顕微鏡像に対してＣＴ法を適用することで、再構成断面像（２次元像）が得られる。得られた一連の断面像を重ね合わせることで３次元像が得られる。
【０００３】
ここで、定量性のある再構成像を得るためには、得られた傾斜像シリーズを構成する一連の透過電子顕微鏡像を精度よく位置合わせする必要がある。精度よく位置合わせを行う方法として、試料の特徴的な形状がある場合、その特徴的な形状をもとにFiducial Marker法で位置合わせを行う。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−１９２１８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
また、例えば、試料に特徴的な形状がない場合には、試料の表面に金粒子等をまいてマーカーを形成し、このマーカーをもとにFiducial Marker法で位置合わせを行う。
【０００６】
しかし、観察したい領域上に金粒子等のマーカーがあると、再構成断面像に虚像が現れる場合がある。このように、試料にマーカーが形成されると、この形成されたマーカーが構築された３次元像に影響を与えてしまうことがあり、観察の妨げになる場合がある。一方、金粒子等のマーカーをまかなければ、位置あわせの精度不足により、３次元像の空間分解能が低下してしまう。
【０００７】
本発明は、以上のような問題点に鑑みてなされたものであり、本発明のいくつかの態様によれば、ＣＴ法によって得られる３次元像の像質を向上させることが可能な、電子顕微鏡および３次元像構築方法を提供することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（１）本発明に係る電子顕微鏡は、
試料を複数段階に傾斜させる試料傾斜部と、
前記試料傾斜部によって設定された傾斜角度ごとに得られる前記試料の透過電子顕微鏡像を取得する像取得部と、
取得した前記傾斜角度ごとの前記試料の透過電子顕微鏡像に基づいて、前記試料の３次元像を構築する３次元像構築処理を行う３次元像構築部と、
前記試料にマーカーを形成するマーカー形成部と、
を含み、
前記像取得部は、
前記マーカーが形成される前の前記試料の透過電子顕微鏡像を、前記傾斜角度ごとに取得することにより、第１傾斜像シリーズを取得する第１処理と、
前記マーカーが形成された前記試料の透過電子顕微鏡像を、前記傾斜角度ごとに取得することにより、第２傾斜像シリーズを取得する第２処理と、
を行い、
前記３次元像構築部は、
前記第２傾斜像シリーズに基づいて、前記第１傾斜像シリーズを構成する複数の透過電子顕微鏡像間の位置あわせを行うアライメント処理を行い、位置合わせされた前記第１傾斜像シリーズを構成する複数の透過電子顕微鏡像に対して、前記３次元構築処理を行う。
【０００９】
このような電子顕微鏡によれば、マーカーが３次元像に与える影響をなくすことができ、かつ、３次元像を構築するための第１傾斜像シリーズを構成する一連の透過電子顕微鏡像を、精度よく位置合わせすることができる。したがって、ＣＴ法によって得られる３次元像の像質を向上させることができる。
【００１０】
（２）本発明に係る電子顕微鏡において、
前記３次元像構築部は、
前記第２傾斜像シリーズに基づいて、前記マーカーの位置情報を前記傾斜角度ごとに取得し、
取得された前記傾斜角度ごとの前記マーカーの位置情報を、対応する傾斜角度で得られた前記第１傾斜像シリーズの透過電子顕微鏡像に適用することにより、前記第１傾斜像シリーズを構成する複数の透過電子顕微鏡像間の位置あわせを行ってもよい。
【００１１】
このような電子顕微鏡によれば、マーカーが３次元像に与える影響をなくすことができ、かつ、３次元像を構築するための第１傾斜像シリーズを構成する一連の透過電子顕微鏡像を、精度よく位置合わせすることができる。
【００１２】
（３）本発明に係る電子顕微鏡において、
前記マーカー形成部は、電子線を前記試料の所定の領域に照射して、前記マーカーを形成してもよい。
【００１３】
このような電子顕微鏡によれば、複数のマーカーを、所望の位置に形成することができる。さらに、マーカーを電子顕微鏡内で形成することができる。
【００１４】
（４）本発明に係る電子顕微鏡において、
前記３次元像構築部は、位置合わせされた前記第１傾斜像シリーズを構成する複数の透過電子顕微鏡像にＣＴ法を適用して前記３次元構築処理を行ってもよい。
【００１５】
（５）本発明に係る３次元像構築方法は、
試料を複数段階に傾斜させて、前記試料の透過電子顕微鏡像を、傾斜角度ごとに取得することにより、第１傾斜像シリーズを取得する工程と、
前記第１傾斜像シリーズを取得する工程の後に、前記試料にマーカーを形成する工程と、
前記マーカーが形成された前記試料を複数段階に傾斜させて、前記マーカーが形成された前記試料の透過電子顕微鏡像を、前記傾斜角度ごとに取得することにより、第２傾斜像シリーズを取得する工程と、
前記第２傾斜像シリーズに基づいて、前記第１傾斜像シリーズを構成する複数の透過電子顕微鏡像間の位置合わせを行う工程と、
位置合わせされた前記第１傾斜像シリーズを構成する複数の透過電子顕微鏡像に基づいて、３次元像を構築する工程と、
を含む。
【００１６】
このような３次元像構築方法によれば、マーカーが３次元像に与える影響をなくすことができ、かつ、３次元像を構築するための第１傾斜像シリーズを構成する一連の透過電子顕微鏡像を、精度よく位置合わせすることができる。したがって、ＣＴ法によって得られる３次元像の像質を向上させることができる。
【００１７】
（６）本発明に係る３次元像構築方法において、
前記第１傾斜像シリーズを構成する複数の透過電子顕微鏡像間の位置合わせを行う工程では、
前記第２傾斜像シリーズに基づいて、前記マーカーの位置情報を前記傾斜角度ごとに検出し、
検出された前記傾斜角度ごとの前記マーカーの位置情報を、対応する傾斜角度で得られた前記第１傾斜像シリーズの透過電子顕微鏡像に適用することにより、前記第１傾斜像シリーズを構成する複数の透過電子顕微鏡像間の位置あわせを行ってもよい。
【００１８】
このような３次元像構築方法によれば、マーカーが３次元像に与える影響をなくすことができ、かつ、３次元像を構築するための第１傾斜像シリーズを構成する一連の透過電子顕微鏡像を精度よく位置合わせすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本実施形態に係る透過電子顕微鏡の構成を説明するための図。
【図２】本実施形態に係る３次元構築工程の一例を示すフローチャート。
【図３】本実施形態に係るマーカーの作製方法を説明するための図。
【図４】傾斜角度ごとの試料およびマーカーを模式的に示す断面図。
【図５】傾斜角度ごとの試料およびマーカーを模式的に示す断面図。
【図６】ＡＢＳ樹脂の透過電子顕微鏡像。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の好適な実施形態について図面を用いて詳細に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を不当に限定するものではない。また以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要件であるとは限らない。
【００２１】
１．  電子顕微鏡の構成
まず、本実施形態に係る電子顕微鏡の構成について説明する。図１は、本実施形態に係る透過電子顕微鏡１００の構成を説明するための図である。ここでは、電子顕微鏡が、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）の構成を有する場合について説明するが、電子顕微鏡は、走査透過型電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）の構成を有していてもよい。なお本実施形態に係る電子顕微鏡は、図１の構成要素（各部）の一部を省略した構成としてもよい。
【００２２】
電子顕微鏡１００は、図１に示すように、電子線源１と、照射レンズ系２と、照射レンズ系制御装置３と、偏向器４と、試料Ｓを保持するステージ６と、ステージ制御装置７と、対物レンズ８と、投影レンズ１０と、検出器１２と、鏡筒１４と、処理部２０と、操作部３０と、表示部３２と、記憶部３４と、情報記憶媒体３６とを含んでいる。
【００２３】
電子線源１、照射レンズ系２、偏向器４、ステージ６、対物レンズ８、投影レンズ１０、検出器１２は、鏡筒１４の内部に収容されている。鏡筒１４の内部は、排気装置（図示省略）によって減圧排気されている。
【００２４】
電子線源１は、陰極から放出された電子を陽極で加速し電子線を放出する。電子線源１の例として、公知の電子銃を挙げることができる。
【００２５】
照射レンズ系２は、電子線源１の後段に配置されている。照射レンズ系２は、複数の集束レンズ（図示省略）を含んで構成されている。照射レンズ系２は、試料Ｓに照射される電子線（入射電子線）の収束角を調整する。例えば、照射レンズ系２によって電子線の収束角を調整することにより、電子線を絞ることができる。また、照射レンズ系２によって絞られた電子線を試料Ｓの所定の領域に照射することにより、試料Ｓ上にカーボンを主成分とするマーカーを形成することができる。照射レンズ系２は、照射レンズ系制御装置３により制御される。
【００２６】
偏向器４は、照射レンズ系２の後段に配置されている。偏向器４は、複数の偏向コイルと、当該複数の偏向コイルに流れる電流量を制御するための電流制御部（図示省略）とを有する。偏向器４は、電流制御部で各偏向コイルに流れる電流を制御することにより入射電子線を２次元的に偏向させる。
【００２７】
ステージ６は、試料Ｓを偏向器４の後段に位置させるように保持している。ステージ６は、ステージ制御装置７により制御され、試料Ｓを水平方向や垂直方向に移動させ、また試料Ｓを回転、傾斜させる。ステージ６は、光軸ＯＡに直交する傾斜軸ＴＡを中心（軸）として傾斜可能に構成されている。ステージ６は、試料Ｓが傾斜軸ＴＡを中心（軸）として傾斜するように、試料Ｓを保持している。
【００２８】
対物レンズ８は、試料Ｓの後段に配置されている。対物レンズ８は、対物レンズ制御装置（図示省略）により制御され、試料Ｓを透過した電子線を結像させる。投影レンズ１０は、対物レンズ８の後段に配置されている。投影レンズ１０は、対物レンズ８によって結像された像をさらに拡大し、検出器１２上に結像させる。
【００２９】
検出器１２は、投影レンズ１０の後段に配置されている。検出器１２は、投影レンズ１０によって結像された透過電子顕微鏡像を検出する。検出器１２の例として、２次元的に配置されたＣＣＤ（Charge Coupled Device）を受光部とするＣＣＤカメラを挙げることができる。検出器１２が検出した透過電子顕微鏡像の像情報は、処理部２０に出力される。
【００３０】
操作部３０は、ユーザーが操作情報を入力するためのものであり、入力された操作情報を処理部２０に出力する。操作部３０の機能は、キーボード、マウス、タッチパネル型ディスプレイなどのハードウェアにより実現することができる。
【００３１】
表示部３２は、処理部２０によって生成された画像を表示するものであり、その機能は、ＬＣＤ、ＣＲＴなどにより実現できる。表示部３２は、処理部２０により生成された、透過電子顕微鏡像や、再構成断面像、３次元像を表示する。
【００３２】
記憶部３４は、処理部２０のワーク領域となるもので、その機能はＲＡＭなどにより実現できる。情報記憶媒体３６（コンピュータにより読み取り可能な媒体）は、プログラムやデータなどを格納するものであり、その機能は、光ディスク（ＣＤ、ＤＶＤ）、光磁気ディスク（ＭＯ）、磁気ディスク、ハードディスク、或いはメモリ（ＲＯＭ）などにより実現できる。処理部２０は、情報記憶媒体３６に格納されるプログラムに基づいて本実施形態の種々の処理を行う。情報記憶媒体３６には、処理部２０の各部としてコンピューターを機能させるためのプログラムを記憶することができる。
【００３３】
処理部２０は、ステージ制御装置７、照射レンズ系制御装置３等を制御する処理や、透過電子顕微鏡像を取得する処理、試料Ｓの３次元像を構築する処理等の処理を行う。処理部２０の機能は、各種プロセッサ（ＣＰＵ、ＤＳＰ等）、ＡＳＩＣ（ゲートアレイ等）などのハードウェアや、プログラムにより実現できる。処理部２０は、制御信号生成部２２と、像取得部２４と、３次元像構築部２６とを含む。
【００３４】
制御信号生成部２２は、各種制御信号を生成してステージ制御装置７や照射レンズ系制御装置３等に出力する。例えば、制御信号生成部２２は、ステージ６（試料Ｓ）を複数段階に傾斜させるための制御信号を生成してステージ制御装置７に出力する。すなわち、本発明の試料傾斜部は、例えば、ステージ６とステージ制御装置７と制御信号生成部２２により構成される。また、制御信号生成部２２は、電子線を試料Ｓの所定の領域に照射させてマーカーを形成するための制御信号を生成し、照射レンズ系制御装置３に出力する。すなわち、本発明のマーカー形成部は、例えば、照射レンズ系２と照射レンズ系制御装置３と制御信号生成部２２により構成される。
【００３５】
像取得部２４は、検出器１２から出力された像情報を取り込むことで透過電子顕微鏡像（ＴＥＭ像）を取得する処理を行う。像取得部２４は、ステージ６（試料Ｓ）が各傾斜角度に設定されたときに得られる傾斜角度ごとの透過電子顕微鏡像を取得する。例えば、像取得部２４は、ステージ６（試料Ｓ）が−６０°から＋６０°まで１°ステップで１２１段階に傾斜されたときに得られる１２１枚の透過電子顕微鏡像を取得する。
【００３６】
また、像取得部２４は、マーカーが形成される前の試料Ｓの透過電子顕微鏡像を、傾斜角度ごとに取得することにより、第１傾斜像シリーズを取得する第１処理を行い、マーカーが形成された試料Ｓの透過電子顕微鏡像を傾斜角度ごとに取得することにより、第２傾斜像シリーズを取得する第２処理を行う。
【００３７】
３次元像構築部２６は、像取得部２４によって取得された傾斜角度ごとの透過電子顕微鏡像に基づいて、試料Ｓの３次元像を構築するための３次元像構築処理を行う。具体的には、３次元像構築部２６は、傾斜角度ごとの透過電子顕微鏡像から断面像を再構成し、得られた再構成断面像のシリーズを重ね合わせることで３次元像を構築する。
【００３８】
また、３次元像構築部２６は、第２傾斜像シリーズに基づいて、第１傾斜像シリーズを構成する複数の透過電子顕微鏡像間の位置合わせを行うアライメント処理を行い、位置合わせされた第１傾斜像シリーズを構成する複数の透過電子顕微鏡像に対して、３次元構築処理を行う。このアライメント処理は、例えば、第２傾斜像シリーズに基づいて、マーカーの位置情報を傾斜角度ごとに取得し、取得された傾斜角度ごとのマーカーの位置情報を、対応する傾斜角度（例えば、同じ傾斜角度）で得られた第１傾斜像シリーズの透過電子顕微鏡像に適用することにより行われる。そして、３次元像構築部２６は、位置合わせされた第１傾斜像シリーズを構成する複数の透過電子顕微鏡像にＣＴ法を適用して３次元構築処理を行う。
【００３９】
２．  ３次元像構築方法
次に、本実施形態に係る３次元像構築方法について、説明する。図２は、本実施形態に係る３次元構築工程の一例を示すフローチャートである。以下、図１に示す透過型電子顕微鏡１００および図２に示すフローチャートを参照しながら説明する。
【００４０】
まず、試料Ｓを複数段階に傾斜させて、試料Ｓの透過電子顕微鏡像を、傾斜角度ごとに取得することにより、第１傾斜像シリーズを取得する（工程Ｓ１０）。
【００４１】
具体的には、制御信号生成部２２が、ステージ６を複数段階に傾斜させるための制御信号を生成してステージ制御装置７に出力する。ステージ制御装置７は、この制御信号に基づいて、ステージ６を複数段階に傾斜させる。ステージ６は、光軸ＯＡに直交する傾斜軸ＴＡを中心として傾斜する。これにより、ステージ６に保持された試料Ｓが複数段階に傾斜する。ステージ制御装置７は、ステージ６を、例えば、−６０°から＋６０°まで１°ステップで１２１段階に傾斜させる。
【００４２】
そして、像取得部２４が、ステージ６が各傾斜角度に設定されたときに得られる傾斜角度ごとの試料Ｓの透過電子顕微鏡像を取得する。このようにして、第１傾斜像シリーズを取得することができる。すなわち、第１傾斜像シリーズは、互いに異なる傾斜角度で撮像された複数の透過電子顕微鏡像で構成されている。また、第１傾斜像シリーズは、例えば、同じ観察倍率で撮像されている。像取得部２４は、例えば、ステージ６（試料Ｓ）が−６０°から＋６０°まで１°ステップで１２１段階に傾斜されたときに得られる１２１枚の透過電子顕微鏡像を取得する。この場合、第１傾斜像シリーズは、１２１枚の透過電子顕微鏡像で構成される。像取得部２４は、第１傾斜像シリーズを構成する一連の透過電子顕微鏡像情報を３次元構築部２６に出力する。
【００４３】
次に、試料Ｓにマーカーを形成する（工程Ｓ１１）。
【００４４】
具体的には、制御信号生成部２２が、電子線を試料Ｓの所定の領域に照射させるための制御信号を生成し、照射レンズ系制御装置３に出力する。照射レンズ系制御装置３は、この制御信号に基づいて、照射レンズ系２を制御して電子線を絞り、この絞った電子線を試料Ｓの所定の領域に照射させる。試料Ｓに絞った電子線を所定時間照射すると、試料Ｓ上にカーボン等が堆積し、マーカーが形成される。マーカーの大きさは、電子線の径に対応し、例えば、電子線を絞ることによりナノサイズに形成することが可能である。また、電子線を照射することによりマーカーを形成するため、電子顕微鏡内でマーカーを形成できる。さらに、マーカーを、所望の位置に所望の数だけ形成することができる。なお、試料Ｓにマーカーを形成するときの試料Ｓの傾斜角度は、特に限定されない。例えば、試料Ｓの傾斜角度が０度のとき、すなわち、試料Ｓが光軸ＯＡと直交する位置にあるときに、マーカーを形成してもよい。
【００４５】
図３は、マーカーの作製方法を説明するための図である。図３（ａ）は、試料Ｓの透過電子顕微鏡像を表示部３２に表示している状態を示す模式図である。図３（ｂ）は、マーカーが形成される様子を示す模式図である。
【００４６】
マーカーの作製は、まず、表示部３２上でマーカーを形成する位置を指定する。具体的には、図３（ａ）に示すように、表示部３２に表示された試料Ｓの透過電子顕微鏡像上で、マーカーを形成したい位置（マーカー形成位置Ａ１〜Ａ４）に、操作部３０を用いて目印（図示の例では×印）をつけることにより行う。これにより、マーカー形成位置Ａ１〜Ａ４の位置情報が制御信号生成部２２に入力される。
【００４７】
次に、マーカー形成位置Ａ１〜Ａ４の位置情報に基づいて、マーカーを形成する。具体的には、制御信号生成部２２が、この位置情報に基づいて、電子線を試料Ｓのマーカー形成位置Ａ１〜Ａ４に照射させるための制御信号を生成し、照射レンズ系制御装置３に出力する。照射レンズ系制御装置３は、この制御信号に基づいて、図３（ｂ）に示すように、照射レンズ系２を制御して、マーカー形成位置Ａ１〜Ａ４に絞った電子線を照射する。電子線の照射は、例えば、まず、マーカー形成位置Ａ１に絞った電子線を所定時間照射し、マーカー形成位置Ａ１にマーカーを形成する。所定時間経過後、電子線の照射を停止し、次のマーカー形成位置Ａ２に電子線を照射し、マーカー形成位置Ａ２にマーカーを形成する。これをマーカー形成位置Ａ３，Ａ４に対しても行い、マーカー形成位置Ａ１〜Ａ４にマーカーを形成する。
【００４８】
このようなマーカー作成方法によれば、容易に、所望の位置に所望の数だけマーカーを形成することができる。
【００４９】
なお、マーカーの作製は、ユーザーが、直接、照射レンズ系制御装置３を操作し、マーカー形成位置に電子線を絞ることにより行ってもよい。
【００５０】
次に、マーカーが形成された試料Ｓを複数段階に傾斜させて、マーカーが形成された試料Ｓの透過電子顕微鏡像を、傾斜角度ごとに取得することにより、第２傾斜像シリーズを取得する（工程Ｓ１２）。
【００５１】
この工程Ｓ１２は、試料Ｓにマーカーが形成されている点を除いて、工程Ｓ１０と同様に行うことができる。また、工程Ｓ１２は、例えば、工程Ｓ１０と同じ観察条件で行われる。すなわち、工程Ｓ１０と工程Ｓ１２では、例えば、傾斜角度範囲、および傾斜角度ステップは、同じである。また、工程Ｓ１０と工程Ｓ１２では、例えば、観察倍率、観察領域等が同じである。
【００５２】
工程Ｓ１２では、像取得部２４が、マーカーが形成された試料Ｓに対して、ステージ６が各傾斜角度に設定されたときに得られる傾斜角度ごとの透過電子顕微鏡像を取得する。これにより、第２傾斜像シリーズを取得することができる。像取得部２４は、例えば、ステージ６（マーカーが形成された試料Ｓ）が−６０°から＋６０°まで１°ステップで１２１段階に傾斜されたときに得られる１２１枚の透過電子顕微鏡像を取得する。第２傾斜像シリーズは、例えば、この１２１枚の透過電子顕微鏡像で構成される。像取得部２４は、第２傾斜像シリーズの像情報を３次元構築部２６に出力する。
【００５３】
次に、第２傾斜像シリーズに基づいて、第１傾斜像シリーズを構成する複数の透過電子顕微鏡像間の位置合わせを行う（工程Ｓ１３）。
【００５４】
工程Ｓ１３では、３次元像構築部２６が、第２傾斜像シリーズに基づいて、第１傾斜像シリーズを構成する複数の透過電子顕微鏡像間の位置合わせを行うアライメント処理を行う。
【００５５】
このアライメント処理は、例えば、第２傾斜像シリーズに基づいて、マーカーの位置情報を傾斜角度ごとに取得し、取得された傾斜角度ごとのマーカーの位置情報を、対応する傾斜角度で得られた第１傾斜像シリーズの透過電子顕微鏡像に適用することにより行われる。
【００５６】
ここで、傾斜角度ごとのマーカーの位置情報は、第２傾斜像シリーズを構成する一連の透過電子顕微鏡像のそれぞれに対して、マーカーの位置を検出することで取得できる。例えば、第２傾斜像シリーズを構成する１２１枚の透過電子顕微鏡像のそれぞれに対して、マーカーの位置を検出し、傾斜角度ごとのマーカーの位置情報を取得する。
【００５７】
また、取得されたマーカーの位置情報の適用は、例えば、まず、対応する（例えば、同じ）傾斜角度で得られた第１傾斜像シリーズの透過電子顕微鏡像と第２傾斜像シリーズの透過電子顕微鏡像に対して、２次元相関処理を行い、位置あわせを行う。そして、位置あわせされた第２傾斜像シリーズの透過電子顕微鏡像から取得したマーカーの位置情報を、位置あわせされた第１傾斜像シリーズの透過電子顕微鏡像に適用する。この処理を、傾斜角度ごとに行い、傾斜角度ごとのマーカーの位置情報を、対応する傾斜角度で得られた第１傾斜像シリーズを構成する一連の透過電子顕微鏡像に適用する。
【００５８】
このように第１傾斜像シリーズを構成する透過電子顕微鏡像に、マーカーの位置情報を適用することにより、３次元像構築部２６は、第１傾斜像シリーズを構成する一連の透過電子顕微鏡像間の位置合わせを、適用されたマーカーをもとにFiducial Marker法を用いて行うことができる。すなわち、試料Ｓ上にマーカーが形成されていない状態で撮像された一連の透過電子顕微鏡像間の位置合わせを、試料Ｓ上にマーカーが形成されている場合と同様に行うことができる。以下、マーカーを用いた位置合わせ方法について詳細に説明する。
【００５９】
図４および図５は、傾斜角度ごとの試料Ｓおよび試料Ｓ上に形成されたマーカーＭを模式的に示す断面図である。図４は、試料Ｓがドリフトしない理想的な場合を示し、図５は、試料Ｓがドリフトした場合を示している。なお、図４および図５は、傾斜軸ＴＡ方向から試料Ｓの断面を見た図である。電子線Ｌは、上から下に向けて試料Ｓに入射する。
【００６０】
ステージ６に保持された試料Ｓは、傾斜軸ＴＡを中心として傾斜する。これに伴いマーカーＭの軌跡は、理想的には、図４に示すように、傾斜軸ＴＡを中心とする円弧を描く。しかし、試料Ｓがドリフトすると、図５に示すように、マーカーＭの軌跡は、傾斜軸ＴＡを中心とする円弧からずれる。したがって、図５において、マーカーＭの軌跡が、図４に示すような、理想的な円弧を描くように、傾斜角度ごとに取得された一連の透過電子顕微鏡像の位置を補正することにより、複数の透過電子顕微鏡像間の位置あわせを行うことができる。なお、図示はしないが、マーカーＭを複数形成してもよい。これにより、位置合わせ精度を向上できる。
【００６１】
次に、位置合わせされた第１傾斜像シリーズを構成する複数の透過電子顕微鏡像に対して、３次元構築処理を行う（工程Ｓ１４）。
【００６２】
３次元像構築部２６は、位置合わせされた第１傾斜像シリーズを構成する複数の透過電子顕微鏡像にＣＴ法（Computerized Tomography Method）を適用して、３次元構築処理を行う。
【００６３】
３次元構築処理は、まず、位置合わせされた第１傾斜像シリーズを構成する一連の透過電子顕微鏡像に対してＣＴ法を適用することで、再構成断面像（２次元像）を得る。そして、得られた一連の断面像を重ね合わせることで３次元像を得ることができる。
【００６４】
以上の工程により、試料の３次元像を構築することができる。
【００６５】
本実施形態では、第２傾斜像シリーズに基づいて、第１傾斜像シリーズを構成する複数の透過電子顕微鏡像間の位置合わせを行うアライメント処理を行い、位置合わせされた前記第１傾斜像シリーズを構成する複数の透過電子顕微鏡像に対して、３次元構築処理を行う。これにより、試料Ｓ上にマーカーが形成されていない状態で撮像された一連の透過電子顕微鏡像間の位置合わせを、試料Ｓ上にマーカーが形成されている場合と同様に行うことができる。したがって、マーカーが３次元像に与える影響をなくすことができ、かつ、第１傾斜像シリーズを構成する一連の透過電子顕微鏡像を精度よく位置合わせすることができる。したがって、ＣＴ法によって得られる３次元像の像質を向上させることができる。
【００６６】
例えば、観察したい領域上に金粒子等のマーカーがあると、再構成断面像に虚像（メタルアーティファクト）が現れる場合があり、良好な像質の３次元像を構築できない。このように、試料にマーカーが形成されると、再構築された３次元像に影響を与えてしまうことがあり、観察の妨げになる場合がある。本実施形態によれば、３次元像を構築するための第１傾斜像シリーズは、試料Ｓ上にマーカーが形成されていない状態で撮像されているため、メタルアーティファクトの影響を受けず、マーカーが３次元像に与える影響をなくすことができる。さらに、本実施形態によれば、試料Ｓ上にマーカーが形成されていない状態で撮像された一連の透過電子顕微鏡像間の位置合わせを、試料Ｓ上にマーカーが形成されている場合と同様に行うことができる。これにより、アライメント不足による空間分解能の低下を抑えることができる。したがって、本実施形態によれば、空間分解能が高く、かつマーカーが形成されることによる影響がない、像質のよい３次元像を構築することができる。
【００６７】
本実施形態では、第２傾斜像シリーズに基づいて、マーカーの位置情報を傾斜角度ごとに取得し、取得された傾斜角度ごとのマーカーの位置情報を、対応する傾斜角度で得られた第１傾斜像シリーズの透過電子顕微鏡像に適用することにより、第１傾斜像シリーズを構成する複数の透過電子顕微鏡像間の位置合わせを行う。これにより、マーカーが３次元像に与える影響をなくすことができ、かつ、３次元像を構築するための第１傾斜像シリーズを構成する一連の透過電子顕微鏡像を精度よく位置合わせすることができる。
【００６８】
本実施形態によれば、電子線を試料の所定の領域に照射して、マーカーを形成することができるため、電子顕微鏡内でマーカーを形成できる。さらに、マーカーを、所望の位置に所望の数だけ形成することができる。
【００６９】
３．  実験例
本実験例では、マーカーの形成例を示す。
【００７０】
マーカーを形成する際に、試料の種類、形状、試料厚みに制限はないが、今回は、汎用的な高分子材料のひとつとして、アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン重合合成樹脂（ＡＢＳ樹脂）を用いて実験を行った。
【００７１】
実験は、まず、ＡＢＳ樹脂を試料Ｓとして、汎用的な高分子材料の１つである、アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン重合合成樹脂（ＡＢＳ樹脂）を用いた。まず、ＡＢＳ樹脂からウルトラミクロトームを用いて１μｍ厚みの試料切片を切り出し、ＴＥＭ・ＳＴＥＭ観察用銅製のグリッドの上に乗せた。その後、四酸化オスミウム溶液の蒸気により、ポリブタジエン（ＰＢ）相を金属染色させ、ＴＥＭを用いて、染色した試料の透過電子顕微鏡像を得た。
【００７２】
図６は、ＡＢＳ樹脂の透過電子顕微鏡像である。なお、図６（ａ）に示す観察視野と図６（ｂ）に示す観察視野は、同じである。また、図６（ａ）は、絞った電子線を照射する前の透過電子顕微鏡像であり、図６（ｂ）は、絞った電子線を照射した後の透過電子顕微鏡像である。
【００７３】
図６に示す透過電子顕微鏡像において、黒色の相がブタジエン相であり、マトリックスと黒色の内部の小さな円形の相がアクリロニトリルとスチレンの混合相である。図６（ａ）に示す透過電子顕微鏡像の中心付近の領域に電子線を絞って、数分試料に照射した。この結果、図６（ｂ）に示すように、透過電子顕微鏡像の中心付近の領域に黒い円形状のものが観察された。この黒い円形状のものがカーボン等を含むコンタミネーションで形成されたマーカーである。以上の結果から、試料上の任意の領域にナノマーカーを形成できることが確認できた。
【００７４】
なお、本発明は、実施の形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法および結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【符号の説明】
【００７５】
１  電子線源、２  照射レンズ系、３  照射レンズ系制御装置、４  偏向器、６  ステージ、７  ステージ制御装置、８  対物レンズ、１０  投影レンズ、１２  検出器、１４  鏡筒、２０  処理部、２２  制御信号生成部、２４  像取得部、２６  ３次元像構築部、３０  操作部、３２  表示部、３４  記憶部、３６  情報記憶媒体、１００  透過型電子顕微鏡
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図３】
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【図６】
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