(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＬＵＴ９発現細胞に加えた物質が、ＧＬＵＴ９による尿酸の電位駆動性輸送による尿酸排出を促進するかどうかを測定することを特徴とする、腎臓からの尿酸排出を促進する作用を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
ＧＬＵＴ９発現細胞に加えた物質が、ＧＬＵＴ９による尿酸の電位駆動性輸送による尿酸排出を抑制するかどうかを測定することを特徴とする、尿酸の血液濃度を低める作用を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項３】
ＧＬＵＴ９による尿酸の電位駆動性輸送による腎臓からの尿酸排出を促進する作用を有する物質のスクリーニング方法であって、
ａ）ＧＬＵＴ９が発現した細胞を準備し、
ｂ）上記細胞の細胞外カリウム濃度を上昇させ、細胞内外のイオン環境を逆転させた状態において上記細胞を物質と尿酸の存在下で培養し、
ｃ）細胞による尿酸の取り込み量に基いて、上記物質がＧＬＵＴ９による腎臓からの尿酸排出を促進する作用を有するか否かを決定する、スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は腎臓尿酸トランスポーター、特にヒトGLUT9、すなわち直接的に血中尿酸値を制御する電位駆動型腎臓尿酸トランスポーター、および低尿酸血症の原因となる新規遺伝子に関し、これが痛風の有望な治療的標的であることを提案している。
【背景技術】
【０００２】
尿酸塩（尿酸）は、人体においては肝臓ウリカーゼの遺伝子欠損のため、プリン代謝の最終産物であるが、現在は神経保護の特性を持つ内因性抗酸化物として評価されている。低い血中尿酸値は、多発性硬化症、パーキンソン病およびアルツハイマー病と結びつけて考えられている（１）。その有益な役割にもかかわらず、血中尿酸値の上昇は、痛風、高血圧、心血管疾患（例えば心筋梗塞および脳卒中）、および腎疾患（例えば急性尿酸腎症および腎石症（１、２）と相関している。腎臓は、排出プロセスを通じて血中尿酸値の維持において、優位な役割を果たす：それは、それは１日の尿酸生産（３）のほぼ70%を除去する。従って、大多数の高尿酸血症患者が尿酸排泄低下を示すこと（４）から、腎臓における尿酸処理の機構を理解することは重要である。
【０００３】
尿酸は生理的pHにおいて弱酸であるので（pKa、5.75）、それは輸送タンパク質（４）の非存在下では細胞膜をほとんど透過しない。尿酸トランスポーターがキー分子であることが提案されたにもかかわらず、腎臓尿酸輸送の正確な機構はその種違いおよびその多様性のため、不明であった：ネフロンの尿酸の双方向性輸送は、「４−コンポーネントモデル」（５）として古典的に説明される。2002年に、我々は長くその存在が推測されていた尿酸アニオン交換体、すなわち腎臓近位尿細管管腔側に局在している、SLC22A12に分類されるURAT1を同定した（６）。現在まで、URAT1は、その遺伝子変異による機能喪失によって、腎性低尿酸血症（６）が生じるという事実に基づいて腎臓尿酸再吸収での生理的役割が実証されている、唯一のトランスポーターである。しかしながら、URAT1を介して尿細管細胞に入った尿酸がどのように細胞から出るかは、わかっていない。さらに、URAT1とは異なる尿酸再吸収システムの存在が、イチダ等、ワキダ等により示唆されている。彼等は、SLC22A12に突然変異のない腎性低尿酸血症患者を報告した（７、８）。
同様に、Slc22a12遺伝子欠損マウスを使用している最近の研究で、腎臓尿酸再吸収の大半が維持されていることが分かった（９）が、ヒトの腎臓での尿酸処理に対するこの発見の生理的関連は不明のままである。URAT1の同定後、尿酸輸送を担ういくつかの有力候補タンパク質が提案された：UAT、OAT1、OAT3、OAT4、OATv1/NPT1、MRP4、および最近同定されたOAT10もまた、インビトロで尿酸輸送を媒介することが示された（１０−１２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】１．M. K. Kutzing、B. L. Firestein、J. Pharmacol. Exp. Ther、第324巻、第1-7頁（2008年）
【非特許文献２】2．M. A. Becker, M. Jolly, Rheum. Dis. Clin. N. Am.  第32巻, 第275-293頁(2006年)
【非特許文献３】3．D. A. Sica, A. C. Schoolwerth, in The Kidney(WB Saunders, Philadelphia, ed.), pp. 第680-700頁（2000年）
【非特許文献４】４．N. Anzai, H. Endou, Expert Opin. Drug Discov. 第2巻, 第1251−1261頁 (2007年)
【非特許文献５】５．D. B. Mount, Curr. Opin. Nephrol. Hypertens.   第14巻,第460−463頁 (2005年)
【非特許文献６】６．A.Enomoto, H. Kimura, A. Chairoungdua, et al. Nature     第417巻,  第 447−452 頁(2002年)
【非特許文献７】７．K.Ichida, M. Hosoyamada, I. Hisatome, et al. J. Am. Soc. Nephrol. 第15巻, 第164−173 頁(2004年).
【非特許文献８】８．N. Wakida, D. G. Tuyen, M. Adachi, et al. J.Clin. Endocrinol. Metab. 第90巻, 第2169−2174頁 (2005年).
【非特許文献９】９．S. A. Eraly, V. Vallon, T. Rieg, et al. Physiol.Genomics   第33巻, 第180−192頁 (2008年).
【非特許文献１０】10．M. A. Hediger, R. J. Johnson, H. Miyazaki, H. Endou, Physiology  第20巻, 第125−133頁(2004年).
【非特許文献１１】11.  M. A. Rafey, M. S. Lipkowitz, E. Leal-Pinto, R. G.Abramson, Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 第12巻、第511−516 頁(2003年)
【非特許文献１２】12．A. Bahn, Y. Hagos, S. Reuter, et al. J. Biol. Chem.in press
【非特許文献１３】13．K. Mori, Y. Ogawa, K. Ebihara, et al. FEBS Lett.第417巻,第371−374頁 (1997年).
【非特許文献１４】14． S. H. Cha,T. Sekine, H. Kusuhara, et al. J. Biol. Chem.  第275号,第4507−4512号 (2000年).
【非特許文献１５】15．M. Uldry, B. Thorens, Pflugers Arch. 第447号、第480−489号(2004年).
【非特許文献１６】16．J. E. Phay, H. B. Hussain, J. F. Moley, Genomics 第66巻, 第217-220頁(2000年).
【非特許文献１７】17．H. Doege, A. Bocianski, H.-G. Joost, A. Schurmann, Biochem.J. 第350号,第771-776頁(2000年).
【非特許文献１８】18．R. Augustin, M. O. Carayannopoulos, L. O. Dowd, etal. J. Biol. Chem. 第279巻, 第16229-16236頁 (2004年).
【非特許文献１９】19．B. T. Emmerson,N. Engl. J. Med. 第334巻, 第445-451頁 (1996年).
【非特許文献２０】20．O. Sperling, Mol. Genet. Metab. 第89巻, 第14-18頁 (2006年)
【非特許文献２１】21．T.H. Steele, Ann. Intern. Med. 第79巻, 第734-737頁(1973年)
【非特許文献２２】22．Y. Kikuchi, H. Koga, Y. Yasutomo, et al. Clin.Nephrol. 第53巻,第467-472頁(2000年)
【非特許文献２３】23．H.-G. Joost, B. Thorens, Mol. Membr. Biol. 第18号, 第247-256頁(2001年)
【非特許文献２４】24．D. M. Papazian, L. C. Timpe, Y. N. Jan, L. Y. Jan, Nature第349巻,第305-310頁(1991年)
【非特許文献２５】25．S. Li, S. Sanna, A. Maschio, et al. PLoS Genet.第3巻,第194頁(2007年)
【非特許文献２６】26．A. Doring, C. Gieger, D. Mehta, et al. Nat Genet.第40巻,第430-436頁(2008年)
【非特許文献２７】27．V. Vitart, I. Rudan, C. Hayward, et al. Nat Genet.第40巻,第437-442頁(2008年)
【発明の概要】
【０００５】
ここで、我々は腎臓近位尿細管の基底側に局在する、これまで未知の尿酸トランスポーターを報告する。それは、ヒト体内において、尿酸再吸収のためURAT1とタンデムで、その生理的役割を発揮するだろう。
【０００６】
新規な腎臓尿酸トランスポーターを同定するために、我々は、NCBIのSwissprotタンパク質データベースに対して、尿酸の輸送を伝達することが知られている、ヒトおよびマウスURAT1/Urat1（SLC22A12/Slc22a12）ならびにヒトOAT4（SLC22A11）シーケンス（６、１３、１４）を使用してホモロジー検索（blastp）を実行した。驚くべきことに、我々は、促進グルコーストランスポーター（SLC2）ファミリー（GLUT6、9、10、12、および14）のいくつかのものにはSLC22A11にリモート類似があることを発見した。これらの分子の中で、我々は、拡張した（クラスII）SLC2ファミリーに属するもののうちの1つである、SLC2A9によってコードされたGLUT9が主に、肝臓と同様に腎臓に局在するので、その解析を行うことに決めた（１５）。ヒトGLUT9は、最初は機能未知の遺伝子として同定された（１６）。GLUT9のグルコーストランスポーター活性が示されたにもかかわらず、それは古典的（クラスＩ）グルコーストランスポーターGLUT4（１７、１８）ほど効率的なようでない。ヒトGLUT9は、異なるアミノ末端を有する2つのスプライスバリアントを有する：アイソフォーム1（トランスクリプトバリアント1：GenbankアクセッションNM_020041）および、アイソフォーム2（トランスクリプトバリアント2：GenbankアクセッションNM_001001290）。これらの2つのアイソフォームの違いは、アイソフォーム1だけの第一エキソンがあり、分極化したMDCK細胞において、ターゲティングの違いとなる。
【０００７】
第一に、我々は、アフリカツメガエル卵細胞発現システムを使用してGLUT9の両方のアイソフォームの細胞膜発現および尿酸輸送活性を調べた。GLUT9の両方のアイソフォームの細胞膜発現は、GLUT9相補RNA（cRNAs）を注入した卵母細胞の、免疫蛍光分析（図４Ａ）により確認された。両方のそのアイソフォームが同程度の尿酸輸送活性（図４Ｂ）を示すことを確認したあと、我々は更なる特性解析のためのアイソフォーム2を使用した。GLUT9が発現している卵母細胞の［14C］尿酸の取り込み率はコントロール卵母細胞のそれより９倍高かった。その一方で、［14C］グルコースおよび［14C］フルクトースの非常に低い取り込み率が観察された。GLUT9は、ＰＡＨ（パラアミノ馬尿酸）、硫酸エストロン、サリチル酸のような代表的な有機陰イオン基質や、例えば、乳酸、ニコチン酸、β-ヒドロキシ酪酸、サリチル酸（図４Ｃ）のような、古典的な腎臓尿酸輸送システム（URAT1を含む）との相互作用物質を有意に取り込まなかった。このように、GLUT9は、URAT1より狭い基質特異性を有した。
【０００８】
次に、我々は、GLUT9の尿酸輸送特性を調べた。GLUT9 cRNAを注入されたアフリカツメガエル属卵母細胞は、時間依存性の［14C］尿酸の輸送活性を示した（図１Ａ）。GLUT9により媒介される尿酸取り込みは、飽和動態を示し、ミカエリス−メンテン式に従った。
【０００９】
イーディー−ホフステープロットは、尿酸に対して、Km  365±42μMおよびVmax  5,521±291pmol/hr/oocyte（５つの別々の実験の平均±S.E.）となり、GLUT9はURAT1と同様に尿酸に対して高い親和性を有することが示唆された（図１Ｂ）。細胞外Na+の除去がGLUT9によって、尿酸輸送に影響を及ぼさなかったという事実は、それが直接的なNa+−尿酸共輸送に関与しないことを示した。
【００１０】
細胞外液のK+上昇（アフリカツメガエル卵細胞の原形質膜を脱分極する）が、尿酸の取り込みを促進するため、GLUT9活性は、膜電位に影響された（図１Ｃ）。この電位駆動性は、細胞内部の電気陰性のため、尿細管細胞から細胞外への尿酸排出に有利に働く。我々は、それから外向きのCl-勾配（細胞内から細胞外へ）の尿酸取り込みへの効果を測定した。外部のCl-の完全な除去によって、Cl-勾配を課すことはGLUT9を介した尿酸取り込みを加速せず、GLUT9はURAT1において観察される無機Cl-のための交換メカニズムを有しないことを示した（図１Ｃ）。加えて、URAT1とは異なり、GLUT9において、尿酸輸送活性が細胞外pHに依存していることが、観察された（図１Ｄ）。
【００１１】
更にGLUT9の基質選択性を調査するために、阻害研究は、GLUT9を発現している卵母細胞を使用して実行された。GLUT9により媒介される［14C］尿酸（10μM）取り込みに対する1mM（ベンズブロマロンのみ50μM）のさまざまな物質のシス阻害効果（すなわち、阻害剤は放射性同位元素で識別された尿酸と同じ側に加えられた。）を検討した（表１）。GLUT9は、再びURAT1のそれらと異なる薬理学的特性を呈した（６）。我々は、GLUT9を経た尿酸輸送が尿酸によって、強く抑制され、そして、硫酸エストロンによって、弱く抑制されることがわかった。
【００１２】
グルコースおよびフルクトースのようなヘキソース、乳酸塩、ニコチン酸塩、オロト酸塩およびケトン体（例えばアセト酢酸塩およびβ−ヒドロキシ酪酸塩）のようなモノカルボン酸は、GLUT9を介して尿酸取り込みを阻害しなかった。これらの結果は、尿酸が、図４Ｃで示すように、GLUT9の唯一の基質であることを示す初期の観察と合致している。我々はまた、尿酸排泄物質の影響を試験した（３、１９）。プロベネシドおよびベンズブロマロン（50μＭ）は中程度に尿酸取り込みをシス阻害したが、フェニルブタゾンおよびスルフィンピラゾンは弱くそれをシス阻害した。利尿薬は、GLUT9を介した尿酸取り込みを阻害しなかった。非ステロイド性の抗炎症剤の中で、インドメタシンは強く尿酸取り込みをシス阻害し、そして、ナプロキセンは弱くそれをした。面白いことに、ピラジノアート（PZA）（広く抗結核薬として使用されており、URAT1に対する相互作用物質として公知であるピラジンアミドの活性代謝物質（６））は、GLUT9を介した尿酸取り込みに対して、いかなる阻害効果も及ぼさなかった。アンギオテンシンＩＩ受容体ブロッカ（ARB）であるロサルタンは、中程度に尿酸取り込みをシス阻害した。これらの結果は、尿酸が実質的に唯一のGLUT9の輸送基質であること、またGLUT9がURAT1と比較して、潜在的に腎の尿酸処理に影響を与える様々な薬物に対して異なる反応性を示すことを証明し、さらにGLUT9が新規な尿酸排泄薬の潜在的標的となりうることを示唆した。
【００１３】
GLUT9の輸送モードを明らかにするために、我々は、トランス促進実験（すなわち、基質は、［14C］尿酸取り込みの前に、卵母細胞に注入された）を行った。細胞内に負荷した尿酸（100mM）は、GLUT9を介する［14C］尿酸取り込みを、著しく促進した（図５Ａ）。グルコース、フルクトース、乳酸塩、ニコチン酸塩、PZA、オロト酸塩、β−ヒドロキシ酪酸塩およびサリチル酸塩による尿酸取り込みのシス阻害を示さない結果から予想されるように、これらの物質の細胞内への負荷は、トランス促進作用を示さなかった（図５Ａ）。
【００１４】
図１Ｃに示される尿酸の電位駆動性輸送を考えると、尿酸は、生理的状態（すなわち細胞内部で負）の電気勾配に従って、細胞内区画から細胞外区画へと輸送されることもできる。図２Ａに示すように、標準取り込み溶液において培養されるときに、［14C］尿酸があらかじめ負荷されているGLUT9を発現している卵母細胞は、時間依存的に放射能の細胞外流出を示した。この機能的な特徴は、細胞からの尿酸排出経路にかなり適している。以前の報告（それはヒトGLUT9が近位尿細管細胞の基底外膜に局在していることを示した（１８））からみて、我々はGLUT9がURAT1によって媒介される初期ステップの後、再吸収の第二段階として細胞から尿細管間質へと尿酸を動かす役割を果たすことを提案する（図２Ｂ）。
【００１５】
GLUT9が交換輸送体か促進トランスポーターであるかを決定するために、［14C］尿酸が前負荷された卵母細胞からの放射能の流出を、細胞外尿酸、グルコースおよびフルクトースの不存在下および存在下において、比較した。放射能の流出は細胞外尿酸に影響を受けたが、細胞外グルコースまたはフルクトースに影響を受けず（図５Ｂ）、このことから、尿酸の基質結合部位がグルコースおよびフルクトースに対するものと異なることを示唆した。従って、GLUT9を経た尿酸輸送は、これらの糖の血中濃度によって、変わらないだろう。
【００１６】
特発性腎性低尿酸血症（または、単に、腎性低尿酸血症：MIM220150）は、腎臓近位尿細管の尿酸の膜輸送の先天的な欠陥によって引き起こされる、腎臓尿酸クリアランスの異常亢進を特徴とする遺伝病である（２１）。SLC22A12の突然変異が腎性低尿酸血症と関係していることはよく知られているにもかかわらず、SLC22A12の突然変異がない腎性低尿酸血症患者がいる（７、８）。GLUT9がURAT1に相前後して尿酸再吸収経路において作用する場合、この種の患者がSLC2A9遺伝子変異を有するかもしれない。従って、我々は、SLC22A12のコード領域に突然変異のない日本人の腎性低尿酸血症患者のSLC2A9の配列変異を検索した。これらの患者のうちの１人（43歳の男性）は、2.7mg/dlの血中尿酸濃度を有していた（正常範囲は、〜5mg/dlである）。これは、URAT1異種接合体突然変異（例えばW258X）をもつ腎性低尿酸血症患者と同程度の範囲であった。そのフラクションの尿酸排出率は、14.6％であった（通常<10％）、そして、患者は、ピラジンアミドを負荷する試験において通常の反応を有したため（２１、２２）、彼はPZAの既知の標的であるURAT1の機能変化はなかったことを示す。患者のゲノムDNAからのGLUT9−コード領域のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）産物の分析は、アルギニン380（CGG）をトリプトファン（TGG）に変えた、SLC2A9（図３Ａ）のエクソン10の範囲内のヌクレオチド1138でCからTへ移行した異種接合体の存在を示した。この残基（R380）は、細胞質側に面するループ8に位置して（図６）、すべてのSLC2ファミリーメンバー（２３）の保存されたモティーフ（D/E-X-X-G-R-R）の中にあった。我々は、正電荷の損失（R380W）が、GLUT9（電位駆動性トランスポーター）の尿酸輸送機能を変えると推測した。このアルギニン残基と、電位依存的なシェーカーK+チャネルにおけるS4部分のアルギニン残基によって、興味深い比較が見られるかもしれない。そこではアルギニンが電位センサとして作用することが示される（２４）。この突然変異は、50人のランダムに選ばれたコントロールの日本人の個人において、確認されなかった。変異体GLUT9の機能を確認するために、我々は、野生型または変異したGLUT9のcRNAを卵母細胞への注入の後、尿酸輸送活性を分析して、この置換（R380W）が、細胞膜上の発現を変えることなく、尿酸輸送活性を消失することがわかった（図３Ｂ、Ｃ）。これらのインビボおよびインビトロデータは、GLUT9の突然変異によって、この患者の腎性低尿酸血症が生じることを示した。図２Ｂに示される我々のモデルに基づいて、両方のトランスポーターは相前後して同じ経路で作用するので、我々はURAT1およびGLUT9の完全な機能が腎臓近位尿細管の通常の尿酸再吸収のために必要であると予測する。従って、正常なURAT1は、GLUT9機能およびその逆の損失を補うことができないかもしれない。我々のデータは、腎性低尿酸血症の遺伝子の異質性を立証して、生体内での尿酸の腎臓再吸収におけるGLUT9の重要な役割を示した。
【００１７】
リ等は、最近、血中尿酸濃度と、第４染色体上のGLUT9（SLC2A9）遺伝子領域の一般の遺伝子の多型との関連性を報告し、その領域のSNPが、糖代謝および尿酸合成および／または腎臓再吸収に影響を及ぼし、血中尿酸濃度に影響を及ぼすことを示唆した（２５）。我々の所見は、GLUT9が腎臓尿酸排出に影響を及ぼすというその第３の考えと整合している。加えて、我々の結果は、血中尿酸濃度がSNPsと相関があること又はSLC2A9に非常に近いことを証明する、二つの新しいゲノム全体の関連研究への非常に強い（病理）生理学的な後押しとなるだろう。合わせて考えると、SLC2A9によりコードされるタンパク質は、腎臓において管状細胞から再吸収された尿酸を排出する尿酸トランスポーターとして機能するように作動し、またそれらの尿酸輸送活性は血中尿酸値に影響を与えた。従って、我々は、SLC2A9がコードするタンパク質を、GLUT9の代わりに、URATv1（電位駆動尿酸トランスポーター１）と呼ぶことを提案する。
【００１８】
【表１】
0005574357.tif 000002
【実施例】
【００１９】
タンパク質データ
免疫細胞化学のために、cRNAs注入アフリカツメガエル卵母細胞はパラホルムアルデヒドで固定され、抗GLUT9抗体（alfaDiagnostics）（1:500）によって培養し、続いてAlexa546のラベルのヤギ抗ウサギイムノグロブリン（IgG）で処理した（和光；1:200で希釈）。区画は、共焦点レーザースキャン顕微鏡（Fluoview FV500、オリンパス）の下で観察された。Alexa546の蛍光は、波長543nmの緑色のHeNeレーザー光により励起されていた。
【００２０】
発現および輸送試験
GLU9のアイソフォーム１と２のcDNAは、オリジーンテクノロジーズ（OriGene Technologies）（アイソフォーム２）とオープンバイオシステムズ（Open Biosystems）（アイソフォーム１）から購入した。インビトロ転写およびキャップされたcRNA（１卵母細胞あたり３０−５０ｎｇ）の卵細胞への注入は、既報の通り実行された（１、２）。卵母細胞は、使用の前に１８℃で２−３日間、バースバッファー１２浴漕の中で維持された。ND96バッファー１２は、96 NaCl、2 KCl、1
MgCl2、1.8 CaCl2および5 HEPESバッファー（pH7.4）（単位はｍＭ）を含んでいた。0 Cl-浴槽において、Cl-は、グルコン酸塩の等モルの量と置き換えられた。輸送試験およびGLUT9を経た尿酸取り込みの動力学的パラメータの評価は、既報の通り実行された（１、２）。実験は３つのバッチの卵母細胞を使用して実行された、そして、代表的な実験からの結果は平均±SEM.として表される。統計的有意性は、スチューデントｔ−テストにより決定された。
【００２１】
突然変異分析および突然変異ｃＤＮＡの構造
GLUT9シーケンスの決定のために、我々は、S.リにより記載されたプライマーを、わずかに変更して使用した（表２）。いくつかのプライマー配列は、ヒトGLUT9のゲノム構造に従って、新しく選択された（図６を参照）。高分子量ゲノムDNAは、末梢全血細胞（３、４）から抽出されて（３、４）、PCRにより増幅された。PCR産物は、3130xl遺伝子アナライザ（アプライドバイオシステム）を使用して、両方の方向から配列決定された（３）。GLUT9（R380W）のエクソン10の突然変異は、50人のコントロールの日本人の個人の中からランダムに選ばれた分析のためのBtsCIを有するPCR産物（表２）の制限酵素処理により検出された。R380W変異体の生成のための突然変異誘発性オリゴヌクレオチドプライマは、5'-GGTGTGCGGGACTG(A)ACACTGCTGCAGC-3'および5'-GGGGCCTGCAGGA（T）CTGTGGAGGGTGGCTG-3'であった。変異するcDNAの適当な構造は、完全な塩基配列決定により確認された。
【００２２】
【表２】
0005574357.tif 000003
【００２３】
実施例における参考文献
1.  A. Enomoto, H. Kimura, A. Chairoungdua, et al.  Nature  第417巻、第447-452頁 （2002年）
2.  Jutabha P, Kanai Y, Hosoyamada M, et al.  J. Biol. Chem.  第278巻、第27930-27938頁（2003年）
3.  H. Matsuo, K. Kamakura, S. Matsushita, et al.  Am. J. Med. Genet.  第88巻、第733-737頁（1999年）
4.  H. Matsuo, K. Kamakura, M. Saito, et al.  Arch. Neurol.  第56巻、第721-726頁（1999年）
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】アフリカツメガエル卵細胞におけるGLUT9の機能的発現。（Ａ）GLUT9による尿酸取り込みの経時変化。水を注入された卵母細胞（コントロール）およびGLUT9を発現している卵母細胞の20μM［14C］尿酸の取り込みは、120分の培養の間、測定された。（Ｂ）GLUT9の輸送動力学。尿酸輸送は、10−1,500μMの尿酸濃度範囲で、コントロール卵母細胞およびGLUT9を発現している卵母細胞において、測定された。GLUT9を発現している卵母細胞のGLUT9特異的輸送活性は、コントロール卵母細胞の基質輸送活性を減算することにより算出された。これらのGLUT9特異的輸送活性が、動力学的分析に使われた。Inset、Eadie−Hofsteeプロット。（Ｃ）GLUT9による［14C］尿酸取り込みは、細胞外液Na+のK+置換により促進される。コントロール卵母細胞およびGLUT9を発現している卵母細胞の［14C］尿酸（20μM）の輸送率は、細胞外Na+、K+およびCl-の存在下および非存在下で、１時間測定された。***, ND96と比較してP<0.001。（Ｄ）GLUT9により媒介される尿酸輸送のpH依存が観察された。尿酸輸送率（20μM）は、ND96溶液を使用しているコントロール卵母細胞（白四角）およびGLUT9を発現している卵母細胞（黒四角）において、測定された。異なるpH値を有する取り込み溶液を準備するために、MES-NaOH、HEPES-NaOHおよびTris-HClが、バッファシステムとして用いられた。ND96溶液の細胞外酸性pHにおいて、正味の尿酸取り込み率は、増加した。***, pH7.4と比較してP<0.001。すべてのデータは、n = 8−10を有する平均値±SEM（エラーバー）である。
【図２】（Ａ）GLUT9による［14C］尿酸排出の媒介。GLUT9を発現している卵母細胞（黒丸）からの放射能の流出は、標準培養溶液において、コントロール（白丸）と比較して測定された。値は、卵母細胞に詰められる全体の放射能のパーセンテージとして表される。（Ｂ）URAT1およびURATv1（GLUT9から名前を変えられた）を経た尿酸の経細胞輸送の提案されたモデル。ピラジンカルボン酸（PZA）を含むモノカルボン酸塩（Monocarboxylates：MCs）は、近位尿細管の管腔（頂点をなす）側にあって、ナトリウムに依存するモノカルボン酸系トランスポーター１（SMCT1）および２（SMCT2）を経由してセルの中で蓄積される。尿酸は、管腔側に位置するURAT1を介してPZAを含む細胞内MCsと引きかえに、細胞の中に入る。再吸収された尿酸は、基底外面に存在するURATv1（GLUT9）を介して、電気化学的勾配によって、細胞を出る。
【図３】SLC2A9の中の突然変異は、特発性腎性低尿酸血症と関係している。（Ａ）患者（43歳の男性）で見つかる異型の点突発変異（R380W）を示しているSLC2A9のエクソン10の部分的な配列の電気泳動図。このR380W突然変異は、腎性低尿酸血症と類似性を持つ臨床特徴を呈している患者において、保有されていた。（Ｂ）患者からの疾患関連のGLUT9変異体は、完全に尿酸輸送活性を失う。尿酸の取り込み（20μM）は、野生型又は変異させたｃＲＮＡの注入された卵母細胞において、測定された。データは、グループにつき８つまたは１０の卵母細胞の平均値±ＳＥＭである。（Ｃ）野生型又はR380W変異卵母細胞の細胞内局在。抗GLUT9抗体の免疫検出は、野生型およびR380Wタンパク質が細胞膜で発現されることを示したが、蛍光レベルは水が注入された卵母細胞において、検知されなかった。
【図４】（Ａ）水及びGLUT9のcRNAの２つのアイソフォームが注入された卵母細胞の免疫組織化学的な分析。コントロール（水を注入された）、GLUT9 cRNAのアイソフォーム１およびアイソフォーム２が注入された卵母細胞を示す。（Ｂ）GLUT9のアイソフォーム1及びアイソフォーム２の尿酸輸送活性の比較。（Ｃ）GLUT9のアイソフォーム２によるさまざまな放射性同位元素で識別された化合物の取り込み。***,コントロールと比較してP<0.001。
【図５】（Ａ）GLUT9により媒介される尿酸取り込みに対する前負荷された有機陰イオンのトランス促進効果。コントロールまたはGLUT9を発現している卵母細胞は、50nlの水または非標識の試験陰イオン（100mＭ、pH7.4）をファインチップドマイクロピペットを使用して、注入されて、それから、20μM［14C］尿酸を含んでいるND96溶液へ移されて、１時間の取り込み率が決定された。*,水を注入されるものと比較してp<0.05。（Ｂ）GLUT9が媒介する尿酸排出における、細胞外尿酸、グルコースおよびフルクトースのトランス促進効果。コントロールまたはGLUT9を発現している卵母細胞は、50nlの［14C］尿酸を注入されて、非標識の化合物（0.5および1mMの尿酸ならびに0.5および3mMのグルコースおよびフルクトース）の存在下または非存在下のND96溶液へ移されて、室温で、培養された。60分間の［14C］尿酸排出量は、前負荷されている量のパーセンテージとして示される。コントロールと比較して**, p<0.01、***,p<0.001。すべてのデータは、n = 8−10を有する平均値±SEMである。
【図６】（Ａ）SLC2A9の予測された膜−トポロジーモデルにおける突然変異の位置。（Ｂ）GLUT9/SLC2A9遺伝子のゲノム構造。（Ｃ）GLUT9/SLC2A9遺伝子のエクソン−イントロン境界。
【図７】配列１
【図８】配列２
【図９】配列３
【図１０】配列４
【図１】
0005574357.tif 000004
【図２】
0005574357.tif 000005
【図３】
0005574357.tif 000006
【図４】
0005574357.tif 000007
【図５】
0005574357.tif 000008
【図６】
0005574357.tif 000009
【図７】
0005574357.tif 000010
【図８】
0005574357.tif 000011
【図９】
0005574357.tif 000012
【図１０】
0005574357.tif 000013
【配列表】
0005574357000001.app