(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３つのポリペプチドを含む三量体可溶性抗体であって、各ポリペプチドが、
（ａ）少なくとも１０個のＧ−Ｘ−Ｙリピートを含むコラーゲン足場ドメインと、
（式中、Ｇはグリシンであり、Ｘは任意のアミノ酸であり、かつＹは任意のアミノ酸であり、
前記Ｇ−Ｘ−Ｙリピートのうちの少なくとも１０個はＧ−Ｐ−ＰまたはＧ−Ｐ−Ｏであり、
前記Ｇ−Ｘ−Ｙリピートのうちの少なくとも６個がＧ−Ｐ−Ｏであり、かつ、
ＰはプロリンでありかつＯはヒドロキシプロリンである）
（ｂ）抗体ドメインと、を含み、
各ポリペプチドが、コラーゲン足場ドメインの内部に存在するかまたはそれに隣接する鎖間ジスルフィド架橋を含まず、
前記３つのポリペプチドの前記コラーゲン足場ドメインが互いに相互作用して少なくとも１０７Ｍ−１のアビディティーでリガンドに特異的に結合する三量体可溶性抗体を形成する、三量体可溶性抗体。
【請求項２】
前記三量体可溶性抗体に対する前記リガンドがヒト表皮成長因子受容体である、請求項１に記載の三量体可溶性抗体。
【請求項３】
前記三量体可溶性抗体に対する前記リガンドがヒトＣＤ３である、請求項１に記載の三量体可溶性抗体。
【請求項４】
前記三量体可溶性抗体に対する前記リガンドがヒトＴＮＦ−αである、請求項１に記載の三量体可溶性抗体。
【請求項５】
前記抗体が、少なくとも１０７Ｍ−１のアビディティーでヒトＣＤ３に特異的に結合する二重特異性抗体である、請求項３に記載の三量体可溶性抗体。
【請求項６】
前記ポリペプチドがマーカーポリペプチドのコード配列をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の三量体可溶性抗体。
【請求項７】
前記マーカーポリペプチドがルシフェラーゼポリペプチドまたは緑色蛍光ポリペプチドである、請求項６に記載の三量体可溶性抗体。
【請求項８】
前記コラーゲン足場ドメインが配列（Ｇ−Ｐ−Ｐ／Ｏ）１０を含む、請求項１に記載の三量体可溶性抗体。
【請求項９】
前記Ｇ−Ｘ−ＹリピートのすべてがＧ−Ｐ−ＰまたはＧ−Ｐ−Ｏである、請求項１に記載の三量体可溶性抗体。
【請求項１０】
コラーゲン様ドメインが配列（Ｇ−Ｐ−Ｐ／Ｏ）５ＧＫＰＧＫＰ（Ｇ−Ｐ−Ｐ／Ｏ）６を含む、請求項１に記載の三量体可溶性抗体。
【請求項１１】
各ポリペプチドが２つの抗体ドメインを含む、請求項１に記載の三量体可溶性抗体。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の三量体可溶性抗体をコードする核酸。
【請求項１３】
宿主細胞内に導入される場合、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の三量体可溶性抗体を発現する発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１５】
三量体可溶性抗体を生成する方法であって、
（ａ）１０〜３０個のＧ−Ｘ−Ｙリピートを含むコラーゲン足場ドメインをコードする核酸を、リガンドに対する抗体ドメインをコードする核酸にインフレームに連結するステップと、
（式中、Ｇはグリシンであり、Ｘは任意のアミノ酸であり、かつＹは任意のアミノ酸であり、かつ、
前記Ｇ−Ｘ−Ｙリピートのうちの少なくとも１０個はＧ−Ｐ−Ｐである）
（ｂ）細胞内で前記コードされたポリペプチドを発現させて、前記Ｇ−Ｐ−Ｐリピートのうちの少なくとも６個をＹ位置でヒドロキシプロリネート化するステップと、を含み、
各ポリペプチドが、コラーゲン足場ドメインの内部に存在するかまたはそれに隣接する鎖間ジスルフィド架橋を含まず、
３つのポリペプチドの前記ヒドロキシプロリネート化コラーゲン足場ドメインが互いに相互作用して少なくとも１０７Ｍ−１のアビディティーでリガンドに特異的に結合する三量体可溶性抗体を形成する、方法。
【請求項１６】
前記三量体可溶性抗体に対する前記リガンドがヒト表皮成長因子受容体、ヒトＣＤ３、またはヒトＴＮＦ−αである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
リガンドの生物学的活性を調節するための医薬組成物であって、
３つのポリペプチドを含む三量体可溶性抗体を含み、
各ポリペプチドが、
（ａ）少なくとも１０個のＧ−Ｘ−Ｙリピートを含むコラーゲン足場ドメインと、
（式中、Ｇはグリシンであり、Ｘは任意のアミノ酸であり、かつＹは任意のアミノ酸であり、
前記Ｇ−Ｘ−Ｙリピートのうちの少なくとも１０個はＧ−Ｐ−ＰまたはＧ−Ｐ−Ｏであり、
前記Ｇ−Ｘ−Ｙリピートのうちの少なくとも６個がＧ−Ｐ−Ｏであり、かつ、
ＰはプロリンでありかつＯはヒドロキシプロリンである）
（ｂ）抗体ドメインと、を含み、
各ポリペプチドが、コラーゲン足場ドメインの内部に存在するかまたはそれに隣接する鎖間ジスルフィド架橋を含まず、
３つのポリペプチドの前記コラーゲン足場ドメインが互いに相互作用して少なくとも１０７Ｍ−１のアビディティーでリガンドに特異的に結合する三量体可溶性抗体を形成し、
かつ、
前記リガンドへの前記三量体可溶性抗体の結合が前記リガンドの生物学的活性を調節する、医薬組成物。
【請求項１８】
前記三量体可溶性抗体に対する前記リガンドがヒト表皮成長因子受容体、ヒトＣＤ３、またはヒトＴＮＦ−αである、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
リガンドを検出する方法であって、
（１）３つのポリペプチドを含む三量体可溶性抗体をリガンドとインキュベートするステップと、
各ポリペプチドが、
（ａ）少なくとも１０個のＧ−Ｘ−Ｙリピートを含むコラーゲン足場ドメインと、
（式中、Ｇはグリシンであり、Ｘは任意のアミノ酸であり、かつＹは任意のアミノ酸であり、
前記Ｇ−Ｘ−Ｙリピートのうちの少なくとも１０個はＧ−Ｐ−ＰまたはＧ−Ｐ−Ｏであり、
前記Ｇ−Ｘ−Ｙリピートのうちの少なくとも６個がＧ−Ｐ−Ｏであり、かつ、
ＰはプロリンでありかつＯはヒドロキシプロリンである）
（ｂ）抗体ドメインと、を含み、
各ポリペプチドが、コラーゲン足場ドメインの内部に存在するかまたはそれに隣接する鎖間ジスルフィド架橋を含まず、
３つのポリペプチドの前記コラーゲン足場ドメインが互いに相互作用して少なくとも１０７Ｍ−１のアビディティーでリガンドに特異的に結合する三量体可溶性抗体を形成し、
（２）前記リガンドへの前記三量体可溶性抗体の結合を検出するステップと、を含む、方法。
【請求項２０】
前記３つのポリペプチドの各々がルシフェラーゼポリペプチドまたは緑色蛍光ポリペプチドを含む、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００５年１２月１５日出願の米国特許仮出願第６０／７５０，７４６号明細書に対して優先権を主張する、２００６年１２月１２日出願の米国特許出願第１１／６０９，４１０号明細書の一部継続出願であり、それらは双方ともに参照により本明細書中に援用される。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
タンパク質に基づく結合試薬は、治療または診断用途において様々な使用法を有する。抗体はかかる試薬における優れたパラダイムであることが判明している。実際、多数のモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）の癌、感染性疾患および炎症性疾患の治療における使用が奏功している（非特許文献１）。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
抗体親和性は、治療物質としての抗体の成功を握る主要な因子である。高親和性を有する抗体は、抗体の、標的化された受容体における天然リガンドとの有効な競合、それによる用量、毒性、およびコストの低減を可能にする。抗原結合部位の多量体化が、抗体アビディティー（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｖｉｄｉｔｙ）（機能的親和性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｆｆｉｎｉｔｙ））として定義される、抗体の抗原に対する全体的な結合力を高める有効な手段であることが示されている（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。多価抗体が抗癌活性をインビボで高めている（非特許文献７；非特許文献８）。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）が二価の性質を有することから、従来式に設計されたＩｇＧを３つ以上の異なる抗原に対する同時結合として用いることはできない。したがって、多価または多重特異的タンパク質に基づく結合試薬としての需要が存在する。
【０００４】
いくつかの場合では、Ｆｃ領域の設計を通じて抗体依存性の細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）などのエフェクター機能を回避することは、分裂促進性（ｍｉｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）の副作用の低減に必要である。例えば、マウス抗−ヒトＣＤ３  ｍＡｂ（オルソクローン（Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ）ＯＫＴ３、ムロモナブ（ｍｕｒｏｍｏｎａｂ）−ＣＤ３）は、ヒトＴ細胞上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）を標的化する強力な免疫抑制物質である。同種移植片拒絶の予防または治療がここ２０年間にわたり利用されている（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）。しかし、この治療の利用に対する１つの大きな欠点がＴＮＦ−α、ＩＬ−２、およびＩＦＮ−γなどのサイトカインの全身放出であり、その結果、インフルエンザ様症状、呼吸困難、神経症状、および急性尿細管壊死を含む一連の逆マイトジェン効果がもたらされる（非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５）。ＯＫＴ３および他の抗−ＣＤ３  ｍＡｂのマイトジェン活性がＦｃＲ−陽性細胞（例えば単球）への結合を介する広域のＴＣＲ／ＣＤ３架橋に依存することから、最近ではＦｃＲへの結合性の改変によって非マイトジェン形態の抗−ＣＤ３抗体を開発することに努力がなされている。したがって、高親和性、低いマイトジェン効果、および高いインビボでの安定性を有する、タンパク質に基づく結合試薬に対する需要が存在する。
【０００５】
コラーゲンは哺乳類において最も豊富に存在するタンパク質である。トリプレット配列Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ（式中、ＸおよびＹはプロリン（アミノ酸コードでＰもしくはＰｒｏ）およびヒドロキシプロリン（アミノ酸コードでＯもしくはＨｙｐ）であることが多い）のリピートを有する１つもしくは複数の三重らせん領域（コラーゲンドメイン）を有する細胞外マトリックスタンパク質である。かかるトリプレットの存在は、３つのコラーゲンポリペプチド鎖（α−鎖）における三重らせん高次構造への折り畳みを可能にする。コラーゲンドメインを有する多数のコラーゲン様タンパク質はヒト血清中に存在し、感染性生物からの防御における先天性免疫系としての機能を果たす。これらは、補体タンパク質Ｃｌｑ、マクロファージ受容体、コレクチンファミリータンパク質−マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）、フィコリンならびにサーファクタントプロテインＡおよびＤ（ＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｄ）を含む。これら「防御コラーゲン（ｄｅｆｅｎｓｅ  ｃｏｌｌａｇｅｎ）」分子の中で見られる共通の構造的特徴は、それらのすべてがＣ末端に標的結合ドメインを有する多重三量体タンパク質を単位とする点である。結果として、多量体化によりこれらの防御コラーゲン分子の結合ドメインにおける機能的親和性が有意に高まる。
【０００６】
コラーゲンドメインを有する異種融合タンパク質の三量体化が、コラーゲンドメインに融合される同種または異種いずれかの三量体化ドメインを用いてコラーゲン三重らせんの形成を駆動することによって実現されている。三量体−オリゴマー化ドメインの例として、プロコラーゲンのＣ−プロペプチド、コレクチンファミリータンパク質のコイルドコイルネックドメイン、ＦａｓＬのＣ末端部分およびバクテリオファージＴ４フィブリチンのフォルドン（ｆｏｌｄｏｎ）ドメインが挙げられる（非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８）。
【０００７】
線維性コラーゲン（タイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、およびＸＩ）およびコレクチンファミリータンパク質の三量体構築は、それらの大きい球状のＣ末端ドメイン（Ｃ−プロペプチド、約２５０個のアミノ酸）およびＣ末端コイルドコイルネックドメイン（約３５個のアミノ酸）の各々における三量体の会合により開始され、次いでＣ末端からＮ末端にかけてのジッパー様形態でのコラーゲンドメインの伝播が生じる（非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４）。
【０００８】
配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐはコラーゲンにおける最も安定化しかつ最も一般的なトリプレットであり、かつペプチド（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）１０は高度に安定な三重らせん構造に自己会合可能である（非特許文献２５；非特許文献２６；非特許文献２７；非特許文献２８）。化学合成された（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）１０ペプチドと異なり、（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）１０ペプチドは生理的条件下で安定な三重らせんに自己会合することはない（非特許文献２６）。熱的に安定な（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）１０の三重らせんを得るため、２つのアプローチの記載がなされている。第１に、鎖間ジスルフィド結合された（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）１０の三重らせんが、コラーゲン様ペプチドに隣接するタイプＩＩＩコラーゲンのＣ末端またはＮ末端のジスルフィドノット（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｋｎｏｔ）の２０℃でのレドックス−シャッフリングプロセスによりインビトロで得られた（非特許文献２９；非特許文献３０）。第２に、バクテリオファージＴ４フィブリチン（ｆｉｂｒｉｔｉｎ）由来の安定な異種の三量体化フォルドンドメインが（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）１０ペプチドのＣ末端に融合されることで、コラーゲン様ペプチドの三量体化および正確な折り畳みがＰ４Ｈ欠乏性の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現系内で駆動された（非特許文献１６）。多数の研究にてＧ−Ｘ−Ｙリピートの融解温度／安定性が試験されている。（非特許文献１６；非特許文献３１；非特許文献３２；および非特許文献３３）。これらの研究に基づき、様々なリピート構造の安定性が予測可能である。
【０００９】
上記のアプローチは、異種ポリペプチドの正常な三量体化および折り畳みを支持することなく、潜在的な治療用途を極端に限定しうると思われる免疫応答のリスクに関連した異種抗遺伝子断片を導入しうることからその使用が限定されている。したがって、三量体融合タンパク質の形成を駆動する熱的に安定な三重らせん構造を形成可能であり、インビトロとインビボの双方でかかる三量体化されたポリペプチドの使用を可能にするインビボ発現系が必要である。
【００１０】
機能的な三重らせん高次構造を有するコラーゲンおよびヒドロキシプロリンを含有するペプチドの組換え発現は、特異的な翻訳後酵素、特にプロリル４−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ）を必要とする（非特許文献２２）。コラーゲンのＧｌｙ−Ｘ−ＹモチーフのＹ位置内で特定されたプロリンは、一般にプロリル４−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ）により４−ヒドロキシプロリンに翻訳後修飾されることで、コラーゲンの三重らせん構造が安定化される。プロリンの水酸化の非存在下では、コラーゲンに必須の三重らせん高次構造は、生理的温度未満で熱的に不安定である（非特許文献３４；非特許文献３５）。原核生物はＰ４Ｈ活性を全く有していない。外因性のＰ４Ｈ遺伝子（αおよびβサブユニットの双方）が同時に導入されることで活性α２β２四量体が形成されない限り、酵母および昆虫細胞は、組換えコラーゲンの発現を行うのに不十分な酵素活性を示す。
【００１１】
非線維性ＦＡＣＩＴ（三重らせんが中断された状態の線維結合型コラーゲン）コラーゲン（タイプＩＸ、ＸＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶＩ、ＸＩＸ、ＸＸ、ＸＸＩおよびＸＸＩＩ）は、コラーゲンファミリー内のサブグループである。それらは線維性コラーゲンおよび他のマトリックス成分または細胞と結合するように見える（非特許文献３６）。ＦＡＣＩＴでは、４つのアミノ酸によって分離される２つの保存されたシステインはＣＯＬ１およびＮＣ１ドメインの接合部位に位置し、３つの構築されたコラーゲン鎖内の鎖間ジスルフィド結合を担っており（非特許文献３７）、詳細にはその全体が参照により本明細書中に援用される。
【００１２】
Ｃ末端先端（ｅｘｔｒｅｍｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ）のコラーゲン（ＣＯＬ１）および非コラーゲン（ＮＣ１）ドメインをヒトＰ４Ｈ遺伝子の２つのサブユニットとともに含むタイプＸＩＩおよびＸＸＩミニコラーゲンは、それぞれバキュロウイルスに感染したイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）およびショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２昆虫細胞内で同時発現されている（非特許文献３７；非特許文献３８）。鎖間ジスルフィド結合されたミニコラーゲンＸＩＩおよびＸＸＩの形成は、コラーゲン鎖のヒドロキシプロリン含量に依存し、それは三重らせんの折り畳みがジスルフィド結合の形成に先行することを示唆している。ミニコラーゲンＸＸＩ内での不十分なプロリルの水酸化は、鎖間ジスルフィド結合された二量体および鎖間ジスルフィド結合された単量体の生成をもたらす（非特許文献３８）。ニワトリコラーゲンＸＩＩのＣＯＬ１ドメイン全体を有するコンストラクトが三量体を形成可能であった。マッツォラーナ（Ｍａｚｚｏｒａｎａ）は、ニワトリコラーゲンＸＩＩのＮＣ１ドメイン全体およびＣＯＬ１ドメインの５つの末端Ｇ−Ｘ−Ｙリピートのみを有するコンストラクトが三量体を形成できなかったことを示している。ＣＯＬ１ドメインにおける５つの追加のＣ末端Ｇ−Ｘ−Ｙリピートの存在は、三量体の形成を可能にした。マッツォラーナ（Ｍａｚｚｏｒａｎａ）によって用いられたコンストラクトは、タグとしてヒトｃ−ｍｙｃタンパク質の短い断片を含んでいた。そのようなものとして、マッツォラーナ（Ｍａｚｚｏｒａｎａ）は、これらの配列による三量体化の、付着分子の折り畳みまたは機能性に対する効果、またはより大きな付着分子の自己三量体化に対する効果については言及しなかった。
【００１３】
【特許文献１】国際公開第９８／５６９０６号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９４／４６７８号パンフレット
【特許文献３】米国特許第５，２２３，４０９号明細書
【特許文献４】国際公開第９２／１８６１９号パンフレット
【特許文献５】国際公開第９１／１７２７１号パンフレット
【特許文献６】国際公開第９２／２０７９１号パンフレット
【特許文献７】国際公開第９２／１５６７９号パンフレット
【特許文献８】国際公開第９３／０１２８８号パンフレット
【特許文献９】国際公開第９２／０１０４７号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第９２／０９６９０号パンフレット
【特許文献１１】国際公開第９０／０２８０９号パンフレット
【特許文献１２】国際公開第９１／００９０６号パンフレット
【特許文献１３】国際公開第９１／１０７４１号パンフレット
【特許文献１４】国際公開第９２／０３９１８号パンフレット
【特許文献１５】国際公開第９２／０３９１７号パンフレット
【特許文献１６】国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号明細書
【特許文献１７】欧州特許出願公開第１８４，１８７号明細書
【特許文献１８】欧州特許出願公開第１７１，４９６号明細書
【特許文献１９】欧州特許出願公開第１７３，４９４号明細書
【特許文献２０】国際公開第８６／０１５３３号パンフレット
【特許文献２１】米国特許第４，８１６，５６７号明細書
【特許文献２２】欧州特許出願公開第１２５，０２３号明細書
【特許文献２３】米国特許第５，５８５，０８９号明細書
【特許文献２４】米国特許第５，６９３，７６１号明細書
【特許文献２５】米国特許第５，６９３，７６２号明細書
【特許文献２６】欧州特許出願公開第５１９５９６Ａｌ号明細書
【特許文献２７】米国特許第５，２０８，０２０号明細書
【特許文献２８】米国特許第５，４７５，０９２号明細書
【特許文献２９】米国特許第５，５８５，４９９号明細書
【特許文献３０】米国特許第５，８４６，５４５号明細書
【特許文献３１】米国特許第６，２３５，８８３号明細書
【特許文献３２】米国特許第６，２３２，１０７号明細書
【非特許文献１】Adams et al.,「ナショナル・バイオテクノロジー」 2005 Sep;23:1147-57
【非特許文献２】Miller et al.,「ジャナール・オブ・イミュノロジー」 170:4854-4861, 2003
【非特許文献３】Rheinnecker et al.,「ジャナール・オブ・イミュノロジー」  157:2989-2997, 1996
【非特許文献４】Shopes,「ジャナール・オブ・イミュノロジー」 148:2918-2922,  1992
【非特許文献５】Shuford et al,「サイエンス」 252:724-727, 1991
【非特許文献６】Wolff et al.,「ジャナール・オブ・イミュノロジー」 148:2469-2474, 1992
【非特許文献７】Liu et al., 「インターナショナル・イムノファーマコロジー」6:79 1-799, 2006
【非特許文献８】Wolff et al.,「キャンサー・リサーチ」 53:2560-2565, 1993
【非特許文献９】Cosimi et al.,「ニュー・イングランド・ジャーナル・メディシン」 305:308-314, 1981
【非特許文献１０】Group,「ニュー・イングランド・ジャーナル・メディシン」313:337-342, 1985
【非特許文献１１】Kung et al,「サイエンス」 206:347-349, 1979
【非特許文献１２】Abramowicz et al.,「トランスプランテーション」47:606-608, 1989
【非特許文献１３】Chatenoud et al.,「ニュー・イングランド・ジャーナル・メディシン」 320:1420-1421, 1989
【非特許文献１４】Goldman et al,「トランスプランテーション」 50:158-159, 1990
【非特許文献１５】Toussaint et al,「トランスプランテーション」 48:524-526, 1989
【非特許文献１６】Frank et al, (2001) 「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー」 308: 1081-1089
【非特許文献１７】Holler et al, (2003) 「モレキュラー・セル・バイオロジー」  23:1428-1440
【非特許文献１８】Hoppe et al., (1994) 「フェブス・レターズ」 344: 191-195
【非特許文献１９】Bachinger et al, (1980) 「ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー」 106: 619-632
【非特許文献２０】Hakansson et al, (1999) 「ストラクチャー」 7: 255-264
【非特許文献２１】Hakansson and Reid, (2000) 「プロテイン・サイエンス」 9: 1607-1617
【非特許文献２２】Prockop and Kivirikko, (1995) 「アニュアル・レビュー・バイオケミストリー」 64: 403-434
【非特許文献２３】Sheriff et al, (1994) 「ネイチャー・ストラクチャー・バイオロジー」 1: 789-794
【非特許文献２４】Weis and Drickamer, (1994) 「ストラクチャー」 2: 1227-1240
【非特許文献２５】Chopra and Ananthanarayanan, (1982) 「プロシーディングズ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・アメリカ」 79: 7180-7184
【非特許文献２６】Engel et al, (1977) 「バイオポリマー」 16: 601-622
【非特許文献２７】Sakakibara et al, (1973) 「バイオケミカル・バイオフィジカル・アクタ」 303:198-202
【非特許文献２８】Yang et al, (l997) 「ジャーナル・オブ・ケミストリー」 272: 28837-28840
【非特許文献２９】Boudko et al, (2002) 「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー」 317: 459-470
【非特許文献３０】Frank et al,(2003) 「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」 278: 7747-7750
【非特許文献３１】Persikov et al, (2000) 「バイオケミストリー」 39, 14960-14967
【非特許文献３２】Persikov et al, (2004) 「プロテイン・サイエンス」  13: 893-902
【非特許文献３３】Mohs et al, (2007) 「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」  282: 29757-29765
【非特許文献３４】Berg and Prockop, (1973) 「バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ」 52: 115-120
【非特許文献３５】Rosenbloom et al, (1973) 「アーカイブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス」 158: 478-484
【非特許文献３６】Shaw and Olsen, (1991) 「トレンド・バイオケミストリー・サイエンス」 16: 191-194
【非特許文献３７】Mazzorana et al, (2001) 「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」 276: 27989-27998
【非特許文献３８】Li et al, (2005) 「バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ」 336: 375-385
【非特許文献３９】Harbury et al, (1993) 「サイエンス」 262:1401-1407
【非特許文献４０】「ニュクレイック  アシッド  リサーチ」 12:387, 1984
【非特許文献４１】「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー」 48:443, 1970
【非特許文献４２】「アドブァンス・アプライド・マス」 2:482, 1981
【非特許文献４３】Schwartz and Dayhoff, eds., 「タンパク質配列および構造のアトラス」、National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979
【非特許文献４４】「ニュクレイック  アシッド  リサーチ」, 14:6745, 1986
【非特許文献４５】Goeddel, (1990) 「遺伝子発現技術：酵素学における方法」 185, Academic Press, San Diego, CA
【非特許文献４６】Queen et al, (1989) 「プロシーディングズ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・アメリカ」 86: 10029-10033
【非特許文献４７】Riechmann et al , (1988) 「ネーチャー」 332: 323-327
【非特許文献４８】Holliger and Hudson, (2005) 「ナショナル・バイオテクノロジー」 23: 1126-1136
【非特許文献４９】Binz et al, (2005) 「ナショナル・バイオテクノロジー」 23: 1257-1268
【非特許文献５０】Ito and Kurosawa, (1993) 「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」 268: 20668-20675
【非特許文献５１】Dubel et al., (1995) 「ジャーナル・オブ・イミュノロジー・メソッド」 178: 201-209
【非特許文献５２】Skerra, (2000) 「バイオケミカル・バイオフィジカル・アクタ」 1482: 337-350
【非特許文献５３】Binz et al, (2004) 「ナショナル・バイオテクノロジー」 22: 575-582
【非特許文献５４】Nord et al, (1997) 「ナショナル・バイオテクノロジー」 15: 772-777
【非特許文献５５】Graversen et al, (2000) 「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」 275: 37390-37396
【非特許文献５６】Kabat et al. (1991) 「シークエンス・オブ・プロテイン・オブ・イミュノロジカル・インテレスト」, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242
【非特許文献５７】Chothia et al. (1987) 「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー」 196:901-917
【非特許文献５８】Ward et al., (1989) 「ネーチャー」 341:544-546
【非特許文献５９】Bird et al. (1988) 「サイエンス」 242:423-426
【非特許文献６０】Huston et al. (1988) 「プロシーディングズ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・アメリカ」 85:5879-5883
【非特許文献６１】Fuchs et al. (1991) 「バイオ／テクノロジー」 9:1370-1372
【非特許文献６２】Hay et al. (1992) 「ハム・アンティボディ・ハイブリドーマ」 3: 81-85
【非特許文献６３】Huse et al. (1989) 「サイエンス」 246: 1275-1281
【非特許文献６４】Griffths et al. (1993) 「ＥＭＢＯ・ジャーナル」 12: 725-734
【非特許文献６５】Hawkins et al. (1992) 「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー」 226: 889-896
【非特許文献６６】Clackson et al. (1991) 「ネーチャー」 352: 624-628
【非特許文献６７】Gram et al. (1992) 「プロシーディングズ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・アメリカ」 89: 3576-3580
【非特許文献６８】Garrad et al. (1991) 「バイオ／テクノロジー」 9: 1373-1377
【非特許文献６９】Hoogenboom et al.(1991) 「ニュクレイク  アシッド  リサーチ」 19: 4133-4137
【非特許文献７０】Barbas et al. (1991) 「プロシーディングズ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・アメリカ」 88: 7978-7982
【非特許文献７１】Lonberg, et al. (1994) 「ネーチャー」 368: 856-859
【非特許文献７２】Green, L.L. et al. (1994) 「ネーチャー・ジェネティクス」 7: 13-21
【非特許文献７３】Morrison et al. (1994) 「プロシーディングズ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・アメリカ」81: 6851-6855
【非特許文献７４】Bruggeman et al. (1993) 「イヤー・イミュノロジー」   7: 33-40
【非特許文献７５】Tuaillon et al. 1993 「プロシーディングズ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・アメリカ」 90: 3720-3724
【非特許文献７６】Bruggeman et al. (1991) 「ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イミュノロジー」 21: 1323-1326
【非特許文献７７】Better et al. (1988) 「サイエンス」 240: 1041-1043
【非特許文献７８】Liu et al. (1987) 「プロシーディングズ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・アメリカ」 84: 3439-3443
【非特許文献７９】Liu et al, (1987)    「ジャーナル・オブ・イミュノロジー」 139:3521-3526
【非特許文献８０】Sun et al. (1987) 「プロシーディングズ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・アメリカ」84: 214-218
【非特許文献８１】Nishimura et al, (1987) 「キャンサー・リサーチ」 47: 999-1005
【非特許文献８２】Wood et al, (1985) 「ネーチャー」 314: 446-449
【非特許文献８３】Shaw et al, (1988) 「ジャーナル・オブ・ナショナル・キャンサー・インテレスト」 80: 1553-1559
【非特許文献８４】Winnaker,「遺伝子からクローンまで」(Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987)
【非特許文献８５】Morrison, S. L., (1985) 「サイエンス」 229: 1202-1207
【非特許文献８６】Oi et al, (1986) 「バイオ・テクニックス」 4: 214
【非特許文献８７】Smith, D. B. and Johnson, K. S. (1988) 「ジーン」 67: 31-40
【非特許文献８８】Gottesman, S., (1990) 「遺伝子発現技術：酵素学における方法」185, Academic Press, San Diego, Calif. 119-128
【非特許文献８９】Wada et al, (1992) 「ニュクレイック  アシッド  リサーチ」 20: 2111-2118
【非特許文献９０】Gluzman (1981) 「セル」 23: 175-182
【非特許文献９１】Carter et al. (1992) 「プロシーディングズ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・アメリカ」 89, 4285-4289
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の簡単な概要
本発明は、三量体抗体を含む組成物、方法、およびキットに関する。抗体は、高いアビディティー、低いマイトジェン効果、および高いインビボでの安定性を有しうる。抗体は多価または多重特異的でありうる。
【００１５】
本発明は、３つのポリペプチドを含む三量体可溶性抗体を包含し、各ポリペプチドは、少なくとも１０個のＧ−Ｘ−Ｙリピート（式中、Ｇはグリシンであり、Ｘは任意のアミノ酸であり、かつＹは任意のアミノ酸であり、Ｇ−Ｘ−Ｙリピートのうちの少なくとも１０個はＧ−Ｐ−ＰまたはＧ−Ｐ−Ｏであり、Ｇ−Ｘ−Ｙリピートのうちの少なくとも６個はＧ−Ｐ−Ｏであり、ＰはプロリンでありかつＯはヒドロキシプロリンである）を含むコラーゲン足場ドメインと抗体ドメインとを含み、ここで３つのポリペプチドのコラーゲン様ドメインが互いに相互作用することで少なくとも１０７Ｍ−１のアビディティー（平衡会合定数ＫＡによって示される）でリガンドに結合する三量体可溶性抗体が形成される。
【００１６】
本発明はまた、３つのポリペプチドを含む三量体可溶性抗体を包含し、各ポリペプチドは、少なくとも１０個のＧ−Ｘ−Ｙリピート（式中、Ｇはグリシンであり、Ｘは任意のアミノ酸であり、かつＹは任意のアミノ酸であり、Ｙ残基のうちの少なくとも６個はヒドロキシプロリンである）を含むコラーゲン足場ドメインと抗体ドメインとを含み、ここで３つのポリペプチドのコラーゲン足場ドメインが互いに相互作用することで少なくとも１０７Ｍ−１のアビディティーでリガンドに特異的に結合する三量体可溶性抗体が形成される。
【００１７】
本発明はまた、３つのポリペプチドを含む三量体可溶性抗体を包含し、各ポリペプチドは、少なくとも６個、少なくとも７個、または少なくとも８個のＧ−Ｐ−Ｏリピートを含むコラーゲン足場ドメインと抗体ドメインとを含み、ここで３つのポリペプチドのコラーゲン足場ドメインが互いに相互作用することで少なくとも１０７Ｍ−１のアビディティーでリガンドに特異的に結合する三量体可溶性抗体が形成される。
【００１８】
特定の実施形態では、三量体可溶性抗体は、少なくとも１０８Ｍ−１のアビディティーまたは少なくとも１０９Ｍ−１のアビディティーでそのリガンドに結合する。
【００１９】
特定の実施形態では、三量体可溶性抗体に対するリガンドは、ヒト表皮成長因子受容体、ヒトＣＤ３、ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ、またはヒトＴＮＦ−αである。
【００２０】
三量体可溶性抗体は、マーカーポリペプチドのコード配列をさらに含みうる。好ましい実施形態では、マーカーポリペプチドはルシフェラーゼポリペプチドである。別の好ましい実施形態では、マーカーポリペプチドは緑色蛍光ポリペプチドである。
【００２１】
一実施形態では、コラーゲン様ドメインは配列（Ｇ−Ｐ−Ｐ／Ｏ）１０を含む。一実施形態では、各ポリペプチドは１３個未満のＧ−Ｘ−Ｙリピートを含む。一実施形態では、各ポリペプチドは２０個未満のＧ−Ｘ−Ｙリピートを含む。一実施形態では、各ポリペプチドは３０個未満のＧ−Ｘ−Ｙリピートを含む。一実施形態では、各ポリペプチドは５０個未満のＧ−Ｘ−Ｙリピートを含む。
【００２２】
一実施形態では、各ポリペプチドはコラーゲンＮＣ１ドメインを含まない。一実施形態では、各ポリペプチドはジスルフィドノットを含まない。一実施形態では、各ポリペプチドはバクテリオファージＴ４のフィブリチンフォルドンドメインを含まない。
【００２３】
一実施形態では、各ポリペプチドは４２ｋＤ未満の分子量を有する。一実施形態では、三量体可溶性抗体は１３０ｋＤ未満の分子量を有する。
【００２４】
一実施形態では、１／３を超えるＧ−Ｘ−ＹリピートはＧ−Ｐ−ＰまたはＧ−Ｐ−Ｏである。一実施形態では、１／２を超えるＧ−Ｘ−ＹリピートはＧ−Ｐ−ＰまたはＧ−Ｐ−Ｏである。一実施形態では、２／３を超えるＧ−Ｘ−ＹリピートはＧ−Ｐ−ＰまたはＧ−Ｐ−Ｏである。一実施形態では、３／４を超えるＧ−Ｘ−ＹリピートはＧ−Ｐ−ＰまたはＧ−Ｐ−Ｏである。一実施形態では、すべてのＧ−Ｘ−ＹリピートはＧ−Ｐ−ＰまたはＧ−Ｐ−Ｏである。一実施形態では、コラーゲン様ドメインは配列（Ｇ−Ｐ−Ｐ／Ｏ）５ＧＫＰＧＫＰ（Ｇ−Ｐ−Ｐ／Ｏ）６を含む。
【００２５】
本発明は、三量体可溶性抗体をコードする核酸を包含する。本発明は、宿主細胞に導入される場合、三量体可溶性抗体を発現する発現ベクターをさらに包含する。本発明は、三量体可溶性抗体を発現する発現ベクターを含む宿主細胞も包含する。
【００２６】
本発明は、１０〜３０個のＧ−Ｘ−Ｙリピート（式中、Ｇはグリシンであり、Ｘは任意のアミノ酸であり、かつＹは任意のアミノ酸であり、Ｇ−Ｘ−Ｙリピートのうちの少なくとも１０個はＧ−Ｐ−Ｐである）を含むコラーゲン足場ドメインをコードする核酸を、リガンドに対する抗体ドメインをコードする核酸にインフレームに連結するステップと、Ｇ−Ｐ−Ｐリピートのうちの少なくとも６個をＹ位置でヒドロキシプロリネート化する、細胞内のコードされたポリペプチドを発現するステップと、を含む、三量体可溶性抗体を生成する方法およびキットであって、ここで３つのポリペプチドのヒドロキシプロリネート化コラーゲン様ドメインが互いに相互作用することで少なくとも１０７Ｍ−１のアビディティーでリガンドに結合する三量体可溶性抗体が形成される方法およびキットを包含する。
【００２７】
本発明は、３つのポリペプチドを含む三量体可溶性抗体をリガンドとともにインキュベートするステップを含む、リガンドの生物学的活性を調節する（すなわち阻害または増大する）方法およびキットであって、各ポリペプチドは、少なくとも１０個のＧ−Ｘ−Ｙリピート（式中、Ｇはグリシンであり、Ｘは任意のアミノ酸であり、かつＹは任意のアミノ酸であり、Ｇ−Ｘ−Ｙリピートのうちの少なくとも１０個はＧ−Ｐ−ＰまたはＧ−Ｐ−Ｏであり、Ｇ−Ｘ−Ｙリピートのうちの少なくとも６個はＧ−Ｐ−Ｏであり、ＰはプロリンでありかつＯはヒドロキシプロリンである）を含むコラーゲン足場ドメインと抗体ドメインとを含み、ここで３つのポリペプチドのヒドロキシプロリネート化コラーゲン様ドメインが互いに相互作用することで少なくとも１０７Ｍ−１のアビディティーでリガンドに結合する三量体可溶性抗体が形成され、かつ三量体可溶性抗体のリガンドへの結合によりリガンドの生物学的活性が阻害される方法およびキットを包含する。
【００２８】
本発明は、３つのポリペプチドを含む三量体可溶性抗体をリガンドとともにインキュベートするステップを含む、リガンドを検出するための方法およびキットであって、各ポリペプチドは、少なくとも１０個のＧ−Ｘ−Ｙリピート（式中、Ｇはグリシンであり、Ｘは任意のアミノ酸であり、かつＹは任意のアミノ酸であり、Ｇ−Ｘ−Ｙリピートのうちの少なくとも１０個はＧ−Ｐ−ＰまたはＧ−Ｐ−Ｏであり、Ｇ−Ｘ−Ｙリピートのうちの少なくとも６個はＧ−Ｐ−Ｏであり、ＰはプロリンでありかつＯはヒドロキシプロリンである）を含むコラーゲン足場ドメインと抗体ドメインとを含み、ここで３つのポリペプチドのヒドロキシプロリネート化コラーゲン様ドメインが互いに相互作用することで少なくとも１０７Ｍ−１のアビディティーでリガンドに結合する三量体可溶性抗体が形成され、かつ三量体可溶性抗体のリガンドへの結合が検出される方法およびキットを包含する。
【００２９】
特定の実施形態では、三量体可溶性抗体はルシフェラーゼポリペプチドまたは緑色蛍光ポリペプチドを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
発明の詳細な説明
本発明は、部分的にはコラーゲン足場ドメインにインフレームで融合された抗体ドメインが足場ドメインの三量体化による三量体抗体の産生を可能にするという試験結果に基づいており、得られる三量体抗体の結合アビディティー（ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｖｉｄｉｔｙ）は二価ＩｇＧおよび一価ｓｃＦｖの形式の場合よりも高められる。本発明に従って作製された三量体抗体は、そのリガンドに対して１０９Ｍ−１よりも大きい機能親和性（アビディティー）を有しうる。
【００３１】
一実施形態では、コラーゲン足場ドメインが融合ポリペプチドの三量体化を駆動するようにコラーゲン足場ドメインを融合ポリペプチド内で結合タンパク質にインフレームで融合させてもよく、ここではそのリガンドに対するその結合能が保持される。結合ドメインは、例えばサイトカインドメイン、サイトカイン受容体ドメイン、または抗体ドメインであってもよい。一実施形態では、サイトカインはＴＮＦ−αである。一実施形態では、コラーゲン足場ドメインを抗体ドメインにインフレームで融合することで三量体抗体を産生してもよい。好ましい実施形態では、三量体抗体は可溶性抗体である。可溶性抗体とは、生理的条件下で可溶性の抗体である。好ましい実施形態では、可溶性三量体抗体は分泌抗体である。分泌抗体とは、細胞によって分泌される抗体である。抗体の分泌を、抗体ドメインを含むポリペプチド上にシグナル配列を有することにより標的化してもよい。
【００３２】
一実施形態では、可溶性三量体抗体はそのリガンドに対して１０７Ｍ−１を超えるアビディティーを有する。一実施形態では、可溶性三量体抗体はそのリガンドに対して１０８Ｍ−１を超えるアビディティーを有する。一実施形態では、可溶性三量体抗体はそのリガンドに対して１０９Ｍ−１を超えるアビディティーを有する。特定の実施形態では、可溶性三量体抗体は、そのリガンドに対して１０７Ｍ−１〜１０１０Ｍ−１、１０７Ｍ−１〜１０９Ｍ−１、１０７Ｍ−１〜１０８Ｍ−１、１０８Ｍ−１〜１０１０Ｍ−１、１０８Ｍ−１〜１０９Ｍ−１、および１０９Ｍ−１〜１０１０Ｍ−１のアビディティーを有する。
【００３３】
一実施形態では、（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）１０などの熱的に安定な短いコラーゲン様ペプチドは、足場ドメインとして用いられることで、抗体ドメインの三量体化が十分なＰ４Ｈ活性を有する系内での融合コンストラクトの発現により駆動される。このアプローチにより、インビボでのタンパク質の価数、安定性、および機能に作用する安定な三重らせん構造の導入が促進される。
【００３４】
本発明は、異種融合タンパク質のＣ末端もしくはＮ末端方向からの自己核形成（ｓｅｌｆ−ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ）および伝播を可能にするコラーゲン足場ドメインとして、コラーゲン配列、例えばミニコラーゲンタイプＸＩＩまたはＸＸＩ、あるいはコラーゲン様配列、例えば（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）１０または（ＧＰＰ）５ＧＫＰＧＫＰ（ＧＰＰ）６の使用を包含する。本発明では、任意の他の三量体化構造ドメインに対する需要が回避される。
【００３５】
コラーゲン足場ドメインの融合タンパク質は、プロリル４−ヒドロキシラーゼを有する系内での融合コンストラクトの発現により熱的に安定な三重らせん構造を形成しうる。さらに、本発明の自己三量体化コラーゲン足場は、融合パートナーの一方の末端ならびに両末端への付着を同時に可能にする。これは、自己三量体化コラーゲン足場を、２つの大きな結合パートナーと同時に相互作用可能な分子（各末端が最大３または６の結合価数を有する）を作成するのに使用することができるという重要な結果を有する。本発明は、三量体抗体が正確に折り畳み、かつ高い溶解度、アビディティー、および安定性を示しうることも示している。
【００３６】
本明細書で用いられる「コラーゲン足場ドメイン」という用語は、それ自体で三重らせん構造の形成を可能にするコラーゲンまたはコラーゲン様ドメインであり、「三重らせん構造」は３つのサブユニットの共有結合または非共有結合された複合体である。本明細書で用いられる「コラーゲン足場ドメイン」という用語は、足場ドメインの自己三量体化を指示するコラーゲンまたはコラーゲン様ドメインを示す。
【００３７】
本明細書で用いられる「コラーゲン足場ドメイン」という用語は、プロコラーゲンのＣ−プロペプチド、コレクチンまたはフィコリンファミリータンパク質のコイルドコイルネックドメイン、テトラネクチンのＣ型レクチン様ドメイン、β−ガラクトシダーゼ三量体化ドメイン、ＧＣＮ４ロイシンジッパー突然変異体の３つのコイルドコイルヘリックス構造（（非特許文献３９））、ＣｌｑおよびＴＮＦスーパーファミリータンパク質のＣｌｑおよびＴＮＦドメイン、ならびにバクテリオファージＴ４フィブリチンのフォルドンドメインを示すものではない。
【００３８】
「コラーゲン足場抗体」または「ＣＳＡ」は、抗体ドメインに融合されるコラーゲン足場ドメインを含む抗体である。ＣＳＡおよびそのコード配列は、以下に示す配列番号の任意の組み合わせを含みうる。これらの各組み合わせは詳細に検討されている。例えば、ＣＳＡは配列番号１、３、５および９の１つもしくは複数を有しうる。
【００３９】
したがって、本発明の一態様は、第１のコラーゲン足場ドメインと第１のコラーゲン足場ドメインの一端にインフレームで融合された第１の抗体ドメインとを有する第１の融合ポリペプチド鎖、第２のコラーゲン足場ドメインを有する第２の融合ポリペプチド鎖、ならびに第３のコラーゲン足場ドメインを有する第３の融合ポリペプチド鎖を含む単離された組換えタンパク質複合体を特徴とする。第１、第２、および第３のコラーゲン足場ドメインは、三重らせんコイルを形成するように整列される。第１のコラーゲン足場ドメインおよび第１の抗体ドメインは、インフレームにかつ同じペプチド鎖上に融合される。
【００４０】
融合ポリペプチド鎖は、酵素ドメインまたは蛍光タンパク質の配列を含みうる。蛍光タンパク質の例として、ＧＦＰおよびｄｓＲｅｄ、ならびにそれらの変異体が挙げられる。酵素ドメインの例として、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびβ−ラクタマーゼのドメインが挙げられる。
【００４１】
融合ポリペプチド鎖は、本発明の融合タンパク質の検出および精製を目的とするアフィニティータグの配列を含むんでも含まなくてよい。アフィニティータグの例として、ポリヒスチジン−タグ、ｍｙｃ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、ＦＬＡＧ、Ｅ−タグ、ヘマグルチン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎ）タグ、Ｔ７、Ｓ−タグ、ＨＳＶ、ＶＳＶ−Ｇ、抗−Ｘｐｒｅｓｓ、およびＶＳ−タグが挙げられる。
【００４２】
「抗体ドメイン」は、免疫グロブリンの１つもしくは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。したがって、抗体ドメインはＶＨドメインおよびＦａｂなどの抗体の抗原結合部分を含みうる。一実施形態では、第１の抗体ドメインは、例えばＣｌｕｓｔｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ  ３（ＣＤ３）、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ２／ｎｅｕまたは腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）に特異的な抗原結合断片または一本鎖抗体の配列を有する。第１のポリペプチド鎖は、第１の足場ドメインの他端にインフレームで融合される第２の抗体ドメインをさらに有しうる。
【００４３】
一実施形態では、第２の融合ポリペプチド鎖は第２の抗体ドメインを有する。好ましい実施形態では、第１および第２の抗体ドメインは互いに同一である。第１および第２の抗体結合ドメインは、同一の結合パートナーまたは２つの異なる結合パートナーに結合しうる。例えば、第１の抗体ドメインおよび第２の抗体ドメインは、ＣＤ３およびＥＧＦＲにそれぞれ特異的に結合する第１の一本鎖抗体および第２の一本鎖抗体の配列を有しうる。一実施形態では、第１および第２の融合ポリペプチドはいずれも第１および第２の抗体結合ドメインを有する。
【００４４】
第２の融合ポリペプチド鎖は、第２の足場ドメインの一端にインフレームで融合された第３の抗体ドメイン、第２の足場ドメインの他端にインフレームで融合された第４の抗体ドメイン、または２つの末端にインフレームで融合された両ドメインを有しうる。同様に、第３の融合ポリペプチド鎖は、第３の足場ドメインの一端にインフレームで融合された第５の抗体ドメイン、第３の足場ドメインの他端にインフレームで融合された第６の抗体ドメイン、または双方を有しうる。６つのすべての抗体ドメインは互いに同一であるかまたは異なりうる。したがって、それらは１、２、３、４、５、または６つの結合パートナーに結合しうる。換言すれば、タンパク質複合体は一価、二価、三価、四価、五価、または六価でありうる。
【００４５】
三重らせんコイルを形成するための第１、第２、および第３の足場ドメインにおいては、３つの足場ドメインの各々は、コラーゲンまたはコラーゲン様ドメインとして知られる１つもしくは複数の三重らせんリピートを有し、各リピートは以下の式（Ｇ−Ｘ−Ｙ）ｎ（式中、ＧはＧｌｙ残基であり、ＸおよびＹは任意のアミノ酸残基、および好ましくはアミノ酸プロリンまたはヒドロキシプロリンであり、かつｎは５もしくはそれより大きい）の配列を有する。本明細書中で参照される「リピート」は、２つ以上の連続的なＧ−Ｘ−Ｙ配列を示す。
【００４６】
足場ドメインは完全な反復Ｇ−Ｘ−Ｙトリプレットを含む可能性があり、それは短い欠陥によって中断され、その場合、Ｇｌｙの第１の位置またはＹ残基の第３の位置が欠けており、それは多数の天然コラーゲンおよびコラーゲン様ドメインを有するタンパク質にて見出される。例えば、本発明の足場ドメインのヒトタイプＸＸＩミニコラーゲンは、コラーゲンドメイン内にＧＦおよびＫＥという２つの欠陥を有する。
【００４７】
特定の実施形態では、コラーゲン足場ドメインは、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０個のＧ−Ｘ−Ｙリピート（式中、Ｇはグリシンであり、Ｘは任意のアミノ酸であり、かつＹは任意のアミノ酸である）を含むコラーゲン足場ドメインである。特定の実施形態では、Ｇ−Ｘ−Ｙリピートのうちの少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０個はＧ−Ｐ−ＰまたはＧ−Ｐ−Ｏである。特定の実施形態では、Ｇ−Ｘ−Ｙリピートのうちの少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０個はＧ−Ｐ−Ｏである（式中、ＰはプロリンでありかつＯはヒドロキシプロリンである）。コラーゲン足場ドメインは自己三量体化を指示する。
【００４８】
一実施形態では、コラーゲン足場ドメインは配列（Ｇ−Ｐ−Ｐ／Ｏ）１０を含む。一実施形態では、コラーゲン足場ドメインは１０個のＧ−Ｘ−Ｙリピートを含む。特定の実施形態では、コラーゲン足場ドメインは１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２５、２７、３０、３５、４０、４５、または５０個未満のＧ−Ｘ−Ｙリピートを含む。特定の実施形態では、コラーゲン足場ドメインは１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、６０、５０、または４０個未満のアミノ酸長である。一実施形態では、コラーゲン足場ドメインは本質的に１０〜３０個のＧ−Ｘ−Ｙリピートからなり、それらは自己三量体化を引き起こす。
【００４９】
一実施形態では、１／３を超えるＧ−Ｘ−ＹリピートはＧ−Ｐ−ＰまたはＧ−Ｐ−Ｏである。一実施形態では、１／２を超えるＧ−Ｘ−ＹリピートはＧ−Ｐ−ＰまたはＧ−Ｐ−Ｏである。一実施形態では、２／３を超えるＧ−Ｘ−ＹリピートはＧ−Ｐ−ＰまたはＧ−Ｐ−Ｏである。一実施形態では、３／４を超えるＧ−Ｘ−ＹリピートはＧ−Ｐ−ＰまたはＧ−Ｐ−Ｏである。一実施形態では、すべてのＧ−Ｘ−ＹリピートはＧ−Ｐ−ＰまたはＧ−Ｐ−Ｏである。一実施形態では、足場ドメインは配列（Ｇ−Ｐ−Ｐ／Ｏ）５ＧＫＰＧＫＰ（Ｇ−Ｐ−Ｐ／Ｏ）６を含む。一実施形態では、足場ドメインは配列（Ｇ−Ｐ−Ｐ／Ｏ）１０（式中、Ｐ／ＯはＹ位置がＰまたはＯであることを示す）を含む。
【００５０】
好ましい実施形態では、コラーゲン足場ドメインは、少なくとも１０個のＧ−Ｘ−Ｙリピートを含み、ここでＹ残基のうちの少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０個はヒドロキシプロリンである。コラーゲン足場ドメインは自己三量体化を指示する。
【００５１】
好ましい実施形態では、コラーゲン足場ドメインは、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０個のＧ−Ｐ−Ｏリピートおよび抗体ドメインを含み、ここで３つのポリペプチドのコラーゲン足場ドメインが互いに相互作用することで少なくとも１０７Ｍ−１のアビディティーでリガンドに特異的に結合する三量体可溶性抗体が形成される。好ましい実施形態では、コラーゲン足場ドメインは６または７個のＧ−Ｐ−Ｏリピートを含む。Ｇ−Ｐ−Ｏリピートは連続的であってもまたは間隔を空けてもよい。例えば、Ｇ−Ｐ−Ｐリピートは、１、２、３、４、または５個のＧＸＹリピートで分離され、３、４、または５個のＧ−Ｐ−Ｏリピートを含む２つのインフレームのアミノ酸配列として間隔を空けてもよい。一実施形態では、コラーゲン足場ドメインは（Ｇ−Ｐ−Ｏ）３ＧＸＹ（ＧＰＯ）４を含む。
【００５２】
一実施形態では、コラーゲン足場ドメインは、非線維性ＦＡＣＩＴ（三重らせんが中断された状態の線維結合型コラーゲン）コラーゲンのコラーゲン（ＣＯＬ１）ドメインである。好ましくは、非線維性ＦＡＣＩＴのＣＯＬ１ドメインを含む三量体抗体はＦＡＣＩＴの非コラーゲン（ＮＣ１）ドメインを有さない。好ましい実施形態では、ＣＯＬ１ドメインはタイプＩＸ、ＸＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶＩ、ＸＩＸ、ＸＸ、ＸＸＩまたはＸＸＩＩコラーゲンに由来する。好ましい実施形態では、三量体抗体は配列番号７を含む。
【００５３】
一実施形態では、コラーゲン足場ドメインは、タイプＩＸ、ＸＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶＩ、ＸＩＸ、ＸＸ、ＸＸＩまたはＸＸＩＩコラーゲンに由来する完全なＣＯＬ１ドメインと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する。一実施形態では、コラーゲン足場ドメインは、タイプＩＸ、ＸＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶＩ、ＸＩＸ、ＸＸ、ＸＸＩまたはＸＸＩＩコラーゲンに由来するＣＯＬ１ドメインのＧ−Ｘ−Ｙリピートと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する。
【００５４】
好ましい実施形態では、コラーゲン足場ドメインは、タイプＩＸ、ＸＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶＩ、ＸＩＸ、ＸＸ、ＸＸＩまたはＸＸＩＩコラーゲンに由来するＣＯＬ１ドメインの１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または３０個のＧ−Ｘ−Ｙリピートと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する。特に好ましい実施形態では、コラーゲン足場ドメインは、タイプＸＸＩＩコラーゲンに由来するＣＯＬ１ドメインの１０個のＧ−Ｘ−Ｙリピートと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する。
【００５５】
好ましい実施形態では、コラーゲン足場ドメインのＧ−Ｘ−Ｙ配列は、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０個のヒドロキシプロリンをＹ位置に含む。
【００５６】
同一性の割合（％）は、例えばDevereuxらにより記載され（非特許文献４０）、かつユニバーシティ・オブ・ウィスコンシン・ジェネティクス・コンピューター・グループ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）（ＵＷＧＣＧ）より入手できるＧＡＰコンピュータプログラム、バージョン６．０を用いて配列情報を比較することにより判定可能である。ＧＡＰプログラムでは、NeedlemanおよびWunschのアラインメント方法（非特許文献４１）であってSmithおよびWatermanによって修正されたもの（非特許文献４２）が利用される。ＧＡＰプログラムにおける好ましいデフォルトパラメータは、（１）非特許文献４３に記載される、ヌクレオチドについての単一（ｕｎａｒｙ）比較マトリックス（同一に対して１および非同一に対して０の値を有する）およびグリブスコフ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ）およびブルゲス（Ｂｕｒｇｅｓｓ）の加重比較マトリックス、（非特許文献４４）；（２）各ギャップにおける３．０のペナルティおよび各ギャップ内の各シンボルにおける追加の０．１０のペナルティ；ならびに（３）エンドギャップにおいてペナルティなしを含む。
【００５７】
一実施形態では、上記の第１、第２、および第３の融合ポリペプチドは実質的に同一であり、互いに少なくとも７５％（例えば、７５％〜１００％の任意の数を含む）の配列同一性を有する。３つの同一の融合ポリペプチドによって形成された複合体はホモ三量体である。３つの融合ポリペプチドは機能的等価物でありうる。「機能的等価物」は、共通のポリペプチドのポリペプチド誘導体、例えば１つもしくは複数の点突然変異、挿入、欠失、切断を有するタンパク質、融合タンパク質、またはそれらの組み合わせを示し、実質的に三重らせんコイルに対する形成能や、リガンドへの結合など、異種ドメインの活性を保持するものである。
【００５８】
異種のポリペプチド、核酸、または遺伝子は、自然に会合することのない別のポリペプチド、核酸、または遺伝子に関連したポリペプチド、核酸、または遺伝子である。２つの融合ドメインまたは配列は、もしそれらが天然タンパク質または核酸内で互いに隣接しない場合、互いに異種である。
【００５９】
本発明は、（ｉ）三重らせんコイルを形成するためのコラーゲン足場ドメインと、（ｉｉ）足場ドメインの一端にインフレームで融合された第１の異種ドメインまたは足場ドメインの他端にインフレームで融合された第２の異種ドメインと、を有する単離された組換え融合ポリペプチド（例えば、上記の３つの融合ポリペプチドの各々）も含む。異種ドメインは、上記の抗体ドメインの１つを含みうるとともに、ファージディスプレイスクリーニングなどの様々な当該技術分野で認識された方法によって取得されうる。
【００６０】
「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質複合体は、天然に関連した分子を実質的に含有さないポリペプチドまたはタンパク質複合体を示す、すなわちそれは乾燥重量に対して少なくとも７５％（すなわち７５％〜１００％の任意の数を含む）の純度である。純度は、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析といった任意の適切な標準的方法により測定可能である。本発明の単離されたポリペプチドまたはタンパク質複合体は、天然ソースから精製され、組換えＤＮＡ技術によって生成可能である。
【００６１】
好ましくは、三量体化して三量体抗体を形成する３つのポリペプチドは隣接していない。別の実施形態では、三量体化して三量体抗体を形成する３つのポリペプチドは隣接している、すなわち単一の翻訳産物として翻訳される。この実施形態では、３つのポリペプチドは２つ以上の柔軟なヒンジ領域によって連結されうる。
【００６２】
本発明は、直前に記載の融合ポリペプチドをコードする配列または同配列の相補体を有する単離核酸も包含する。核酸は、ＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡ類似体を示す。ＤＮＡまたはＲＮＡ類似体は、ヌクレオチド類似体から合成可能である。核酸分子は一本鎖または二本鎖でありうるが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。「単離核酸」は、構造が任意の天然核酸の構造または天然ゲノム核酸の任意の断片の構造と同一ではない核酸である。したがって同用語は、例えば、（ａ）天然ゲノムＤＮＡ分子のある部分の配列を有するが、それが天然に生じる生物のゲノム内の分子のその部分に隣接する両コード配列によって隣接されないＤＮＡ、（ｂ）得られる分子が任意の天然ベクターまたはゲノムＤＮＡと同一でないように原核生物または真核生物のベクター内またはゲノムＤＮＡ内に取り込まれる核酸、（ｃ）ｃＤＮＡ、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成される断片、または制限断片などの分離分子、および（ｄ）雑種遺伝子すなわち融合タンパク質をコードする遺伝子の一部である組換えヌクレオチド配列を網羅している。上記の核酸を用いることで本発明のポリペプチドを発現可能である。この目的のため、核酸を適切な調節配列に作動可能に連結することで、発現ベクターの生成が可能である。
【００６３】
ベクターは、それが連結されている別の核酸を輸送可能である核酸分子を示す。ベクターは、自動複製または宿主ＤＮＡへの統合における能力を有しうる。ベクターの例として、プラスミド、コスミド、またはウイルスベクターが挙げられる。本発明のベクターは、宿主細胞内での核酸の発現に適する形態をなす核酸を含む。好ましくは、ベクターは、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結される１つもしくは複数の調節配列を含む。「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現調節因子（例えばポリアデニル化シグナル）を含む。調節配列は、ヌクレオチド配列、ならびに組織特異的な調節および／または誘導配列の構成的発現を指示するものである。発現ベクターの設計は、形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの要素に依存しうる。発現ベクターを宿主細胞に導入することで、本発明のポリペプチドの生成が可能である。本発明の範囲内には、上記の核酸を有する宿主細胞も含まれる。例として、大腸菌細胞、昆虫細胞（例えば、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２細胞またはバキュロウイルスに感染された昆虫細胞を使用）、酵母細胞、または哺乳類細胞（例えば、マウス骨髄腫ＮＳ０細胞）が挙げられる。例えば、非特許文献４５を参照のこと。
【００６４】
本発明の融合ポリペプチドの生成を目的に、培地内で宿主細胞を本発明の核酸によってコードされたポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養し、かつ培養された細胞または細胞の培地からポリペプチドを精製することができる。あるいは、本発明の核酸に対し、例えばＴ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転写および翻訳を行うことが可能である。
【００６５】
本発明のタンパク質複合体の生成を目的に、培地内で上記の第１、第２、および第３の融合ポリペプチドを各々コードする第１、第２、および第３の核酸を有する宿主細胞を３種の核酸によってコードされたポリペプチドの発現および発現されたポリペプチドの間の三重らせんコイルの形成を可能にする条件下で培養し、かつ培養された細胞または細胞の培地からタンパク質複合体を精製することができる。好ましくは、宿主細胞はプロリン残基をヒドロキシル化する酵素活性を有する真核細胞である。
【００６６】
本発明の１つもしくは複数の実施形態の詳細が添付の図面および下記に示される。本発明の他の特徴、目的、および利点が、明細書および図面ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００６７】
本発明の可溶性三量体抗体は、従来の抗体に勝る利点を有する。一方では、６つのうちの２つ以上の抗体ドメインが互いに同一である場合、タンパク質複合体は従来の抗体と比較して１つの結合パートナー（例えば抗原）に特異的である２〜６つの抗体ドメインを有する可能性があり、それが有するかかるドメインは２つだけである。換言すれば、抗原に対して二価にすぎない従来の抗体と異なり、タンパク質複合体は二価、三価、四価、五価、または六価でありうる。結果として、それを従来の抗体よりも高い親和性を有するように作製可能である。より高い親和性故に、望ましい目標、例えば治療効果を達成することによって治療コストを低減しかつ副作用（例えば望ましくない免疫応答）を最小にするのに、従来の抗体の場合と比較し、必要とされるタンパク質複合体はより少なくかつインキュベーション時間はより短い。
【００６８】
他方では、６つのうちの２つ以上の抗体ドメインが互いに異なる場合、本発明のタンパク質複合体は２〜６つの異なる結合パートナーに特異的である２〜６つの抗体ドメインを有しうる。それは異なる特異性の多重結合パートナー部位を１つのユニットに統合し、多重結合パートナーを結集させる能力を有し、それ故にナノメーターレベルでの治療、組織再構築、および活性タンパク質機構（例えば多重サブユニット酵素）の構築において望ましい用途を有する。
【００６９】
ヒトにおけるインビボでの使用においては、本発明の三量体抗体は、好ましくはヒトに由来する。例えば、それはヒトに由来するコラーゲン足場ドメインにインフレームで融合されるヒト化一本鎖抗体配列を含みうる。コラーゲンドメインを有する多数のコラーゲン様タンパク質が血中でかなり安定であることから、足場ドメインの融合タンパク質も同様に血中での構造的完全性を保持する必要がある。
【００７０】
配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐは概ね三重らせん構造の形成および安定化に寄与し、かつＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐトリペプチドリピートは高度に安定な三重らせんに自己組織化する。それ故、ミニコラーゲンＸＸＩのコラーゲンドメインは、本明細書中に記載のＣＳＡにおける足場鋳型として熱的に安定な短いコラーゲン様ペプチド（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）１０に置換され、それらが十分なＰ４Ｈ活性を有する哺乳類系内で発現されることで安定な三重らせん構造の導入が促進された。実際、ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−ＣｏｌとＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌの双方は三量体構造に構築され、かつｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌは、おそらくは２つの三量体内で２つのＣ末端のシステイン残基間の鎖間ジスルフィド架橋を介して六量体にさらにオリゴマー化されうる。還元された三量体構造がｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌの六量体形態で一般に見出される濃度よりも高い濃度でより高次の構造に組織化しないことから、ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌの三量体から六量体へのオリゴマー化は細胞内プロセスである。
【００７１】
マウス骨髄腫ＮＳ０細胞は、組換えコラーゲンまたはコラーゲン様タンパク質の生成にとって良好な発現系である。（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）１０のコラーゲンＧＸＹトリプレット配列のＹ位置におけるプロリン残基の総数の約６１％が組換えｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌ内でヒドロキシル化される。したがって、少なくとも６個のＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏリピートがこの系内でヒドロキシル化される。ウエスタンブロット分析による試験によるとＣＳＡの単量体形態が培地内にほとんど存在しなかったことから、プロリルヒドロキシル化された（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）１０モチーフがＣＳＡ分子の三量体構築に対して寄与することは顕著であった。最大４５℃の温度でＣＳＡの精製試料中に存在する２Ｍの尿素は、図６Ｂおよび図１４Ｂにて示される融解した単量体のレベルから判定すると、２％  ＳＤＳローディング緩衝液の添加後、ＣＳＡの三量体形態を解離させるほど十分に強力ではなかった。様々なｅｒｂ抗体形式がヒト血清中、３７℃で最大７日間インキュベートされた血清安定性アッセイでは、ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌに対してＥＬＩＳＡにて用いられた抗体濃度は、二価ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｆｖおよび一価ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ対応物の各々についてのサブミクロモル範囲内およびミクロモル範囲内ではなくナノモル範囲内であった。したがって、ＣＳＡは生理的条件下でその多価の標的との結合形式を保持しうる。
【００７２】
ＣＳＡの熱的に安定な三量体構造は、将来のインビボ用途に対する多目的の多量体化する系における要件を満たす。コラーゲンドメインを有する多数のコラーゲン様タンパク質がヒト血清中に存在し、感染性生物からの保護における先天性免疫系としての機能を果たす。これらは、補体タンパク質Ｃｌｑ、コレクチンファミリータンパク質−マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）、フィコリンならびにサーファクタントプロテインＡおよびＤ（ＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｄ）を含む。これらの「防御コラーゲン」分子内で共通の構造的特徴は、それらすべてがＣ末端に標的との結合ドメインを有する多重三量体タンパク質ユニット内に存在するという点である。これら多重三量体構造を形成するための駆動力は、線維性コラーゲンの場合に類似している。３つのポリペプチド鎖はまず、標的との結合ドメインに隣接するＮ末端であるそれらのコイルドコイルネックドメインを用いて三量体化され、次いでコラーゲン様ドメインの三重らせん状の折り畳みがＣ末端からＮ末端にかけてジッパー様に進行し、その後に最終的にそれらのＮ末端のシステイン残基を用いて三量体分子の重層または鎖間ジスルフィド架橋が生じた（非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２３；非特許文献２４）。その結果、多量体化はこれらの防御コラーゲン分子の結合ドメインの機能的親和性を有意に増大させる。
【００７３】
標的との結合アビディティーの影響は、様々なｅｒｂおよびＯＫＴ３抗体種が表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および競合フローサイトメトリー分析を用いて比較される場合に明らかであった。結合データは、ＣＳＡ分子における価数の増加がインビボでの標的化の程度および特異性を改善する結果、標的保持が促進されうることを示した。Ｔ細胞活性化を免疫抑制するための三価ＯＫＴ３  ＣＳＡの有効用量が混合されたリンパ球反応において試験された親ＯＫＴ３  ＩｇＧの有効用量よりも少ない。
【００７４】
ＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌは、ヒトＰＢＭＣ内でＴ細胞の増殖またはＩＬ−２の産生を誘発することはなく、一過性のＴ細胞活性化の結果としてのサイトカインの放出によって誘発されるＯＫＴ３の初回用量症候群の効果を顕著に低下させる。この新たな抗−ＣＤ３形式は、治療における用量、毒性、およびコストが低下した強力な免疫抑制剤を提供しうる。ＣＤＲ残基をマウスからヒトへ形質転換することを目的とした構造に基づく設計の有無にかかわらず、ＣＤＲ−移植によるマウスｍＡｂのヒト化によって結合親和性の低下または喪失がもたらされることが多い（非特許文献４６；非特許文献４７）。好ましい実施形態では、三量体可溶性抗体はＦｃドメインを有さない。
【００７５】
高親和性結合剤におけるファージディスプレイｓｃＦｖライブラリースクリーニングを用いた鎖シャッフリングによる親和性成熟は扱いが困難なプロセスであり、現状では結合親和性を改善する結果については不確実である。したがって、多数の治療抗体がヒト化後における標的抗原に対する親和性が低いことによって阻害される場合がある。いくつかの場合では、抗体の特性は一層改良されるにちがいない。抗原−結合パートナーの重合により、標的細胞に極めて接近した特異的な同一のリガンド群への結合に対するそれらの有用性が格段に高まる。機能的親和性を改善するための多価分子を取得することを目的として、異なるアプローチが提案されている。その一部は、免疫グロブリンを有する足場（非特許文献４８）または完全に異なるタンパク質のトポロジー（非特許文献４９）に基づいて別の結合タンパク質を生成するステップを含む。例えば、プロテインＡのＦｃ−結合ドメインと融合されたＦｖ断片（非特許文献５０）、四量体複合体を形成するためのコア−ストレプトアビジン（非特許文献５１）、または転写因子ｐ５３のヒト四量体化ドメイン（非特許文献３）の使用についての報告がなされている。「アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ）」（非特許文献５２）、「アンキリン（Ａｎｋｙｒｉｎ）リピート」（非特許文献５３）、「アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）分子」（非特許文献５４）、およびテトラネクチンのＣ−タイプレクチン様ドメイン（Christian et al. 国際公報、特許文献１；非特許文献５５）などの非ＩｇＧタンパク質足場断片は、最近では標的の結合親和性、熱安定性、および感受性を高めるのに利用されている。しかし、これらの分子の一部は、ヘテロアンティジェネティック（ｈｅｔｅｒｏａｎｔｉｇｅｎｅｔｉｃ）断片であるかまたは血漿の天然成分ではなく、治療適用の可能性を著しく限定しうると思われる免疫応答のリスクに関連している。
【００７６】
熱的に安定な多価タンパク質結合剤の形成を目的に三重らせんを形成するコラーゲン様ペプチドの融合足場を用いることで、本明細書においてＣＳＡが治療抗体の機能的親和性および分裂促進性に対する改善を可能にする新たなプラットフォームであることが示された。より重要なことには、ＣＳＡ内でのｓｃＦｖとコラーゲン様足場ドメインの融合により、標的に結合する活性または三重らせん構造の三量体構築を危うくすることなく各ドメインの正確な折り畳みがもたらされることが判明している。三重らせんを形成するコラーゲン様ドメインは、融合タンパク質のアプローチで活性タンパク質を三量体化する（さらに防御コラーゲンファミリーの場合と類似する、コラーゲン線維性の重層または三量体分子の鎖間ジスルフィド架橋を介してオリゴマー化する）ことにより既存または新規のタンパク質薬剤に対する足場として使用可能であり、それはタンパク質ホルモン、サイトカイン、リンホカイン、成長因子、レクチン、酵素および可溶性の受容体断片、またはセレクチンおよびインテグリンなどの接着分子を含む。
【００７７】
本発明のタンパク質複合体またはポリペプチドは、組換え技術によって取得可能である。核酸によりコードされるポリペプチドの発現およびポリペプチド間の三重らせんコイルの形成を可能にする条件下で、適切な宿主細胞に複合体のポリペプチドをコードする核酸を導入しかつポリペプチドを発現することができる。三重らせんコイルの足場の形成を促進するため、宿主細胞内でコラーゲンの生合成における鍵酵素であるプロリル４−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ）を共発現することができる。
【００７８】
異種タンパク質ドメインは、抗体またはその断片（例えばその抗原結合断片）を含むがこれらに限定されない「結合ドメイン」を有しうる。本明細書で用いられる「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子またはその免疫学的活性部分すなわち抗原結合部分を示す。それは少なくとも１つおよび好ましくは２つの重（Ｈ）鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに少なくとも１つおよび好ましくは２つの軽（Ｌ）鎖可変領域（ＶＬ）を含むタンパク質を示す。したがって、「抗体ドメイン」は、抗体または抗体の抗原結合部分を示し、 ＶＨ、ＶＬ、またはＦａｂドメイン、一本鎖抗体のＦｖ断片（ｓｃＦｖ）、およびＶＨＨドメイン（特許文献２を参照）を含む。
【００７９】
ＶＨおよびＶＬ領域は、超可変領域にさらに細分割され、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と称され、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と称されるより保持された領域とともに散在されうる。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は正確に定義されている（非特許文献５６、および非特許文献５７を参照、これらは参照により本明細書中に援用）。ＶＨおよびＶＬの各々は、通常は３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなり、 アミノ末端からカルボキシ末端にかけてＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配列される。抗体は、重鎖および軽鎖の定常領域をさらに含み、それにより免疫グロブリン重鎖および軽鎖をそれぞれ形成しうる。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３よりなる。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬよりなる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを有する。抗体の定常領域は通常、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織または因子への抗体の結合を媒介する。
【００８０】
本明細書で用いられる「免疫グロブリン」という用語は、実質的に免疫グロブリン遺伝子によってコードされた１つもしくは複数のポリペプチドよりなるタンパク質を示す。認識されたヒト免疫グロブリン遺伝子は、カッパー、ラムダ、アルファ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）、デルタ、イプシロン、およびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。完全長免疫グロブリン「軽鎖」（約２５ｋＤまたは２１４のアミノ酸）は、ＮＨ２末端（約１１０アミノ酸）での可変領域遺伝子およびＣＯＯＨ末端でのカッパーまたはラムダ定常領域遺伝子によってコードされる。完全長免疫グロブリン「重鎖」（約５０ｋＤまたは４４６のアミノ酸）は、可変領域遺伝子（約１１６のアミノ酸）および上記の他の定常領域遺伝子の１つ、例えば（約３３０アミノ酸をコードする）ガンマによって同様にコードされる。
【００８１】
本明細書で用いられる抗体（または「抗体部分」または「断片」）の「抗原結合断片」という用語は完全長抗体の１つもしくは複数の断片を示し、同抗体はそのリガンドまたは抗原、例えばＥＧＦＲまたはＣＤ３ポリペプチドまたはその断片に特異的に結合する能力を保持する。
【００８２】
抗体の抗原結合断片の例として、（ｉ）ＶＬ、 ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインよりなる一価断片のＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片のＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインよりなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインよりなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインよりなるｄＡｂ断片（非特許文献５８）、（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびに（ｖｉｉ）ＶＬまたはＶＨドメインが挙げられるがこれらに限定されない。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬおよびＶＨが別々の遺伝子によってコードされるが、それらを、ＶＬおよびＶＨ領域が対合して一価分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られ、例えば、（非特許文献５９；および非特許文献６０を参照）を形成する場合の単一のタンパク質鎖としての作製を可能にする合成リンカーによる組換え方法を用いて連結してもよい。かかる一本鎖抗体は、抗体の「抗原結合断片」という用語の範囲内にも包含される。これらの抗体断片を当業者に既知の従来の技術を用いて取得してもよく、同断片における有用性は無傷抗体の場合と同様にスクリーニングされる。
【００８３】
抗体はモノクローナル抗体でありうる。一実施形態では、抗体を、例えばファージディスプレイまたはコンビナトリアルな方法によって組換え産生してもよい。抗体を産生するためのファージディスプレイおよびコンビナトリアルな方法は、当該技術分野で既知である（例えば、Ladner et al. 特許文献３；Kang et al. 国際公報、特許文献４；Dower et al. 国際公報２５号、特許文献５；Winter et al. 国際公報、特許文献６；Markland et al. 国際公報、特許文献７；Breitling et al. 国際公報、特許文献８；McCafferty et al. 国際公報、特許文献９；Garrard et al. 国際公報、特許文献１０；Ladner et al. 国際公報、特許文献１１；非特許文献６１；非特許文献６２；非特許文献６３；非特許文献６４；非特許文献６５；非特許文献６６；非特許文献６７；非特許文献６８；非特許文献６９；ならびに非特許文献７０を参照、これらすべての内容は参照により本明細書中に援用される）。
【００８４】
一実施形態では、抗体は完全ヒト抗体（例えば、遺伝子操作されてヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体が産生されているマウス内で作製される抗体）、あるいは非ヒト抗体、例えば齧歯類（マウスまたはラット）、ヤギ、霊長動物（例えばサル）、またはラクダの抗体である。好ましくは、非ヒト抗体は齧歯類抗体（マウスまたはラット抗体）である。齧歯類抗体を産生する方法は当該技術分野で既知である。
【００８５】
ヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスを用いて産生可能である。目的の抗原で免疫されたこれらのトランスジェニックマウスに由来する脾細胞を用いることで、ヒトタンパク質に由来するエピトープに対して特異的な親和性を有するヒトｍＡｂを分泌するハイブリドーマが生成される（例えば、Wood et al. 国際公報、特許文献１２、Kucherlapati et al. ＰＣＴ１５公報、特許文献１３）；Lonberg et al. 国際公報、特許文献１４；Kay et al. 国際公報、特許文献１５；非特許文献７１；非特許文献７２；非特許文献７３；非特許文献７４；非特許文献７５；非特許文献７６を参照）。
【００８６】
抗体は、可変領域またはその一部、例えばＣＤＲ領域が非ヒト生物、例えばラットまたはマウスにおいて生成される場合の抗体であってもよい。キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、およびヒト化抗体を用いてもよい。非ヒト生物、例えばラットまたはマウスにおいて産生される抗体、次いでヒト内での抗原性を低下させるための、例えば可変フレームワークまたは定常領域内での修飾抗体については本発明に含まれる。
【００８７】
キメラ抗体は、当該技術分野で既知の組換えＤＮＡ技術により産生可能である。例えば、マウス（または他の種）のモノクローナル抗体分子のＦｃ定常領域をコードする遺伝子を制限酵素で消化することでマウスＦｃをコードする領域が除去され、ヒトＦｃ定常領域をコードする遺伝子に相当する部分は置換される（Robinson et al, 国際特許公報、特許文献１６；Akira, et al,特許文献１７；Taniguchi, M.,特許文献１８；Morrison et al,特許文献１９；Neuberger et al 国際出願、特許文献２０；Cabilly et al.特許文献２１；Cabilly et al,特許文献２２；非特許文献７７；非特許文献７８；非特許文献７９；非特許文献８０；非特許文献８１；非特許文献８２；および非特許文献８３）。
【００８８】
ヒト化またはＣＤＲ移植抗体は、ドナーＣＤＲと置換された（免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖の）少なくとも１つもしくは２つであるが一般的には全部で３つのレシピエントＣＤＲを有することになる。抗体は非ヒトＣＤＲの少なくとも一部と置換可能であるか、またはＣＤＲのほんの一部が非ヒトＣＤＲと置換可能である。ＣＤＲのヒト化抗体またはその断片の結合にとって必要な多数のＣＤＲを置換することがあくまで必要とされる。好ましくは、ドナーは齧歯類抗体、例えばラットまたはマウス抗体となり、かつレシピエントはヒトフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークとなる。典型的には、ＣＤＲを提供する免疫グロブリンは「ドナー」と称され、かつフレームワークを提供する免疫グロブリンは「アクセプター」と称される。一実施形態では、ドナー免疫グロブリンは非ヒト（例えば齧歯類）である。アクセプターフレームワークは天然（例えばヒト）フレームワークまたはコンセンサスフレームワークであるか、あるいはそれに対して約８５％もしくはそれより高い、好ましくは９０％、９５％、９９％もしくはそれらより高い割合で同一の配列である。本明細書で用いられる「コンセンサス配列」という用語は、関連配列のファミリー内で最も頻繁に現れるアミノ酸（またはヌクレオチド）から形成される配列を示す（例えば、非特許文献８４を参照）。タンパク質のファミリー内でのコンセンサス配列内の各位置は、ファミリー内のその位置で最も頻繁に現れるアミノ酸によって占められる。もし２つのアミノ酸が表れる頻度が等しい場合、コンセンサス配列内にいずれかを含めてもよい。「コンセンサスフレームワーク」は、コンセンサス免疫グロブリン配列内のフレームワーク領域を示す。
【００８９】
抗体を当該技術分野で既知の方法によってヒト化してもよい。ヒト化抗体を、抗原結合に直接関与しないＦｖ可変領域の配列をヒトＦｖ可変領域からの対応する配列と置き換えることによって産生してもよい。ヒト化抗体を産生するための一般的方法は、非特許文献８５；非特許文献８６；ならびにQueen et al.特許文献２３、特許文献２４および特許文献２５（これらすべての内容は参照により本明細書中に援用される）によって提供されている。それらの方法は、重鎖または軽鎖の少なくとも一方に由来する免疫グロブリンＦｖ可変領域のすべてまたは一部をコードする核酸配列を単離するステップと、操作するステップと、発現するステップとを含む。かかる核酸のソースは当業者にとって周知であり、例えば、目的のポリペプチドまたはその断片に対する抗体を産生するハイブリドーマから取得可能である。次いで、ヒト化抗体をコードする組換えＤＮＡまたはその断片を適切な発現ベクターにクローニングしてもよい。
【００９０】
特定のアミノ酸が置換、削除、または添加されているヒト化抗体についても足場に融合可能である。好ましいヒト化抗体は、例えば抗原に対する結合を改善するための、フレームワーク領域内にアミノ酸置換基を有する。例えば、ヒト化抗体は、ドナーのフレームワーク残基またはレシピエントのフレームワーク残基以外の別のアミノ酸と同一のフレームワーク残基を有することになる。かかる抗体を産生するため、ヒト化免疫グロブリン鎖の選択された小数のアクセプターのフレームワーク残基を対応するドナーのアミノ酸と置き換え可能である。置換基の好ましい位置は、ＣＤＲに隣接するかまたはＣＤＲと相互作用可能なアミノ酸残基を含む。アミノ酸をドナーから選択するための基準は、特許文献２３（その内容は参照により本明細書中に援用される）中に記載されている。抗体をヒト化するための他の技術は、Padlan et al.特許文献２６中に記載されている。
【００９１】
一実施形態では、三量体抗体の各ポリペプチドはコラーゲンのＮＣ１ドメインを有していない。一実施形態では、三量体抗体の各ポリペプチドはジスルフィドノットを有していない。一実施形態では、三量体抗体の各ポリペプチドはバクテリオファージＴ４フィブリチンのフォルドンドメインを有していない。
【００９２】
好ましくは、三量体抗体の足場は最小サイズである。一実施形態では、コラーゲン様ドメインは配列（Ｇ−Ｐ−Ｐ／Ｏ）１０を含む。一実施形態では、各ポリペプチドは１３個未満のＧ−Ｘ−Ｙリピートを含む。特定の実施形態では、三量体抗体は１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２５、２７、３０、３５、４０、４５、または５０個未満のＧ−Ｘ−Ｙリピートを含む。特定の実施形態では、三量体抗体の各ポリペプチドは３５、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ｋＤ未満の分子量を有する。一実施形態では、三量体可溶性抗体は１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、または１５０ｋＤ未満の分子量を有する。
【００９３】
好ましい実施形態では、三量体可溶性抗体は３つのポリペプチドを含み、ここで各ポリペプチドは少なくとも１０個のＧ−Ｘ−Ｙリピート（式中、Ｙ残基のうちの少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０個はヒドロキシプロリンである）を含むコラーゲン足場ドメインと抗体ドメインとを含み、３つのポリペプチドのコラーゲン様ドメインが互いに相互作用することで少なくとも１０７Ｍ−１のアビディティーでリガンドに特異的に結合する三量体可溶性抗体が形成される。
【００９４】
本発明は、本発明のタンパク質複合体を形成する融合ポリペプチドをコードする核酸も含む。核酸をファージディスプレイライブラリからスクリーニングするか、または上記の適切な抗体または抗体誘導体を発現する細胞系から（例えばＲＴ−ＰＣＲにより）単離してもよい。核酸を発現ベクターに機能的にライゲートしてもよい。核酸またはベクターで形質転換された細胞を用い、本発明の融合ポリペプチドまたはタンパク質複合体を生成してもよい。抗体の産生に有用な細胞は、昆虫細胞および哺乳類細胞を含む。これらの細胞は、骨髄腫ＮＳ０細胞、ＣＨＯ細胞、およびリンパ細胞を含むがこれらに限定されない。
【００９５】
本発明は、例えば従来の分子技術を用いたコラーゲン足場ドメインを含む核酸と抗体ドメインを含む核酸との連結による三量体可溶性抗体を生成するための方法を包含する。コラーゲン足場ドメインを、抗体ドメインに直接連結するかまたはヒンジ領域をコードするヌクレオチド配列などの追加の配列によって分離してもよい。核酸を、ＮＳ０細胞など、ヒドロキシプロリネート化を可能にする細胞系内で発現してもよい。
【００９６】
一実施形態では、本発明は、コラーゲン様ドメインをコードする核酸と抗体ドメインをコードする核酸とをインフレームに連結することによって三量体可溶性抗体を生成するための方法を包含する。好ましい実施形態では、コラーゲン様ドメインは１０個を超えるＧ−Ｘ−Ｙリピートを含む。一実施形態では、コラーゲン様ドメインは１０〜３０個のＧ−Ｘ−Ｙリピートを含む（式中、Ｇはグリシンであり、Ｘは任意のアミノ酸であり、かつＹは任意のアミノ酸であり、Ｇ−Ｘ−Ｙリピートのうちの少なくとも１０個はＧ−Ｐ−Ｐである）。一実施形態では、コラーゲン様ドメインは、リガンドに対する抗体ドメインをコードし、かつＧ−Ｐ−Ｐリピートのうちの少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０個をＹ位置でヒドロキシプロリネート化する、細胞内のコードされたポリペプチドを発現する核酸にインフレームに連結され、ここで３つのポリペプチドのヒドロキシプロリネート化コラーゲン様ドメインが互いに相互作用することでリガンドに少なくとも１０７Ｍ−１のアビディティーで特異的に結合する三量体可溶性抗体が形成される。
【００９７】
一実施形態では、可溶性三量体抗体はそのリガンドに対して１０７Ｍ−１を超えるアビディティーを有する。一実施形態では、可溶性三量体抗体はそのリガンドに対して１０８Ｍ−１を超えるアビディティーを有する。一実施形態では、可溶性三量体抗体はそのリガンドに対して１０９Ｍ−１を超えるアビディティーを有する。特定の実施形態では、可溶性三量体抗体はそのリガンドに対して１０７Ｍ−１〜１０１０Ｍ−１、１０７Ｍ−１〜１０９Ｍ−１、１０７Ｍ−１〜１０８Ｍ−１、１０８Ｍ−１〜１０１０Ｍ−１、１０８Ｍ−１〜１０９Ｍ−１、および１０９Ｍ−１〜ｌ０１０Ｍ−１のアビディティーを有する。
【００９８】
一実施形態では、三量体可溶性抗体に対するリガンドはヒト表皮成長因子受容体である。一実施形態では、三量体可溶性抗体に対するリガンドはヒトＨＥＲ２／ｎｅｕである。一実施形態では、三量体可溶性抗体に対するリガンドはヒトＣＤ３である。一実施形態では、三量体可溶性抗体に対するリガンドはヒトＨＥＲ２／ｎｅｕである。一実施形態では、三量体可溶性抗体に対するリガンドはヒトＴＮＦ−αである。
【００９９】
足場ドメインタンパク質および足場ドメイン融合タンパク質は、本発明のポリペプチドをコードする核酸を有するベクター、好ましくは発現ベクターから発現可能である。本明細書で用いられる「ベクター」という用語は、その連結されている別の核酸を輸送可能な核酸分子を示し、プラスミド、コスミド、またはウイルスベクターを含みうる。ベクターは、自動複製可能でありうるかまたは宿主ＤＮＡ内に統合されうる。ウイルスベクターは、例えば複製不能レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスを含む。原核生物内でのタンパク質の発現は、融合または非融合タンパク質の発現を指示する構成または誘導プロモーターを含有するベクターを有する大腸菌内で行われることが最も多い。
【０１００】
融合ベクターでは、多数のアミノ酸がその内部にコードされたタンパク質、通常は組換えタンパク質のアミノ末端に添加されうる。かかる融合ベクターは、典型的には、１）組換えタンパク質の発現を高め、２）組換えタンパク質の溶解度を高め、かつ３）親和性精製におけるリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製にて寄与するという３つの目的に役立つ。タンパク質分解の切断部位が融合部分と組換えタンパク質の接合部に導入されることで、融合タンパク質の精製後、組換えタンパク質の融合部分からの分離が可能になることが多い。かかる酵素およびそれらの同族認識配列は、因子Ｘａ、トロンビン、およびエンテロキナーゼを含む。
【０１０１】
典型的な融合発現ベクターは、ｐＧＥＸ（ファルマシア・バイオテック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）；非特許文献８７）、ｐＭＡＬ（ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ベバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）、マサチューセッツ州）およびｐＲＩＴ５（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ニュージャージー州）を含み、これらはそれぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを標的組換えタンパク質に融合させる。
【０１０２】
大腸菌内での組換えタンパク質の発現を最大にすることは、組換えタンパク質をタンパク質分解切断する能力が低下した宿主細菌内でタンパク質を発現することである（非特許文献８８）。別の戦略は、各アミノ酸に対する個々のコドンが大腸菌内で優先的に利用されるものであるように核酸の核酸配列を改変して発現ベクターに挿入することである（非特許文献８９）。本発明の核酸配列のかかる改変を標準のＤＮＡ合成技術によって行ってもよい。
【０１０３】
宿主細胞は任意の原核細胞または真核細胞であってもよい。本発明のタンパク質は、細菌細胞（大腸菌など）、昆虫細胞、酵母、または哺乳類細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞など（アフリカ緑ザルの腎臓細胞ＣＶ−１由来のＳＶ４０細胞；非特許文献９０）において発現可能である。他の適切な宿主細胞は当業者にとって既知である。
【０１０４】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換または形質移入技術を介して宿主細胞に導入可能である。本明細書で用いられる「形質転換」および「形質移入」という用語は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介形質移入、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含む、外来核酸（例えばＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための種々の当該技術分野で認識された技術を示すように意図されている。
【０１０５】
本発明は、３つのポリペプチドを含む三量体可溶性抗体をリガンドとともにインキュベートするステップを含む、リガンドの生物学的活性を阻害するための方法を包含し、三量体可溶性抗体のリガンドへの結合はリガンドの生物学的活性を阻害する。好ましい実施形態では、各ポリペプチドは、少なくとも１０個のＧ−Ｘ−Ｙリピート（式中、Ｇはグリシンであり、Ｘは任意のアミノ酸であり、かつＹは任意のアミノ酸であり、Ｇ−Ｘ−Ｙリピートのうちの少なくとも１０個はＧ−Ｐ−ＰまたはＧ−Ｐ−Ｏであり、Ｇ−Ｘ−Ｙリピートのうちの少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０個はＧ−Ｐ−Ｏであり、ＰはプロリンでありかつＯはヒドロキシプロリンである）のコラーゲン足場ドメインと抗体ドメインとを含み、ここで３つのポリペプチドのヒドロキシプロリネート化コラーゲン様ドメインが互いに相互作用することで少なくとも１０７Ｍ−１のアビディティーでリガンドに結合する三量体可溶性抗体が形成される。
【０１０６】
一実施形態では、可溶性三量体抗体はそのリガンドに対して１０７Ｍ−１を超えるアビディティーを有する。一実施形態では、可溶性三量体抗体はそのリガンドに対して１０８Ｍ−１を超えるアビディティーを有する。一実施形態では、可溶性三量体抗体はそのリガンドに対して１０９Ｍ−１を超えるアビディティーを有する。特定の実施形態では、可溶性三量体抗体はそのリガンドに対して１０７Ｍ−１〜１０１０Ｍ−１、１０７Ｍ−１〜１０９Ｍ−１、１０７Ｍ−１〜１０８Ｍ−１、１０８Ｍ−１〜１０１０Ｍ−１、１０８Ｍ−１〜１０９Ｍ−１、および１０９Ｍ−１〜ｌ０１０Ｍ−１のアビディティーを有する。
【０１０７】
特定の実施形態では、三量体可溶性抗体に対するリガンドは、ヒト表皮成長因子受容体、ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ、ヒトＣＤ３、ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ、またはヒトＴＮＦ−αである。
【０１０８】
本発明のタンパク質複合体は、細胞毒素などの治療部分、治療物質、または放射性イオンに抱合されうる。細胞毒素または細胞毒性物質は、細胞に対して有害な任意の作用物質を含む。例として、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）、例えばメイタンシノール（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｌ）（特許文献２７を参照）、ＣＣ−１０６５（特許文献２８、特許文献２９、および特許文献３０を参照）およびその類似体またはホモログが挙げられる。治療物質は、代謝拮抗物質（例えばメトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオエパクロラムブシル（ｔｈｉｏｅｐａ  ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、ＣＣ−１０６５、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（旧ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン、（旧アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗分裂剤（例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソールおよびメイタンシノイド）を含むがこれらに限定されない。
【０１０９】
本発明の実施形態にて検討された放射性イオンは、１１１インジウム、１１３Ｉｎｄｉｕｍ、９９レニウム、１０５レニウム、１０１レニウム、９９Ｍテクネチウム、１２１Ｍテルリウム、１２２Ｍテルリウム、１２５Ｍテルリウム、１６５ツリウム、１６７ツリウム、１６８ツリウム、１２３ヨード、１２５ヨード、１２６ヨード、１３１ヨード、１３３ヨード、８１クリプトン、３３キセノン、９０イットリウム、２１３ビスマス、７７臭素、１８フッ素、９５ルテニウム、９７ルテニウム、１０３ルテニウム、１０５ルテニウム、１０７Ｍ水銀、２０３水銀、６７ガリウム、６８ガリウム、３５硫黄、および１４炭素を含むがこれらに限定されない。
【０１１０】
所定の生物学的応答を改良するため、抱合体の宿主への投与を通じて抱合体を用いてもよい。薬剤部分は、古典的な化学治療物質に限定されるものとして解釈されるべきではない。例えば、薬剤部分は所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドでありうる。かかるタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナスエクソトキシン、またはジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノゲン活性化因子などのタンパク質；あるいは、例えばリンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の成長因子などの生物学的応答修飾因子を含みうる。
【０１１１】
本発明のさらなる実施形態では、足場ドメインの融合タンパク質は高分子に抱合されうる。かかる高分子は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびポリオキシエチル化ポリオールを含むがこれらに限定されない。
【０１１２】
上記のタンパク質複合体および抱合体は、異種結合ドメインの特異性に基づき、癌、炎症性疾患、代謝疾患、線維性疾患、および心血管疾患を含む様々な障害を治療するために使用可能である。したがって、本発明は、例えば治療を必要とする被験者に有効量の本発明のタンパク質複合体を投与することで疾患を治療するといったかかる疾患を治療する方法を特徴とする。治療対象の被験者は、疾患に特徴的な症状を有するか、または同症状にかかるおそれがある者として同定可能である。この方法を単独または他の薬剤または治療と併せて実施してもよい。
【０１１３】
本発明のタンパク質複合体の多重特異的な特徴故に、通常互いに関連しない架橋分子または細胞に対してそれを使用することができる。この特徴は、細胞に基づく治療にとって特に有用である。一例では、タンパク質複合体内の１つの異種ドメインが細胞毒性細胞（例えば細胞毒性Ｔ細胞）を、細胞毒性細胞上のエフェクター抗原に特異的に結合することによって活性化可能である一方、別の異種ドメインが破壊対象の病原体細胞上または悪性細胞上の標的抗原に特異的に結合する。このようにして、タンパク質複合体は病原体または悪性細胞によって誘発される障害を治療可能である。
【０１１４】
「治療」という用語は、疾患、疾患の症状、疾患に伴う病状、または疾患への素因に対する治癒、緩和、軽減、修復、予防、または改善を目的とした、被験者への組成物の投与として定義される。「有効量」は、治療を受ける被験者において例えば上記のような医学的に望ましい結果を提供可能な組成物の量である。
【０１１５】
細胞毒性Ｔ細胞の活性化が、本発明のタンパク質複合体による細胞毒性Ｔ細胞の表面上のエフェクター抗原としてのＣＤ３抗原の結合を介して生じうる。他のリンパ球様細胞に関連したエフェクター抗原は、ヒトＣＤ１６抗原、ＮＫＧ２Ｄ抗原、ＮＫｐ４６抗原、ＣＤ２抗原、ＣＤ２８抗原、ＣＤ２５抗原、ＣＤ６４抗原、およびＣＤ８９抗原を含む。これらのエフェクター抗原への結合の結果、単球、好中球、および樹状細胞などのエフェクター細胞の活性化がもたらされる。次いで、これらの活性化細胞は標的細胞上に細胞毒性効果またはアポトーシス効果を発揮する。
【０１１６】
標的抗原は、疾患状態に関連した標的細胞上に固有に発現されるが、健常状態では発現されないか、低レベルで発現されるか、または取得不能な抗原である。悪性細胞に関連したかかる標的抗原の例として、ＥｐＣＡＭ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１（ムチン）、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５．ｓｕｂ．ＡＣ、ＭＵＣ５．ｓｕｂ．Ｂ、ＭＵＣ７、β−ｈＣＧ、ルイス−Ｙ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ガングリオシドＧＤ３，９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、フコシルＧＭ１、ポリＳＡ、ＧＤ２、カルボアンヒドラーゼ（Ｃａｒｂｏａｎｈｙｄｒａｓｅ）ＩＸ（ＭＮ／ＣＡ  ＩＸ）、ＣＤ４４ｖ６、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、Ｗｕｅ−１、形質細胞抗原、（膜結合性）ＩｇＥ、メラノーマコンドロイチンサルフェートプロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ８、ＴＮＦ−α前駆体、ＳＴＥＡＰ、メソテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、Ａ３３抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｌｙ−６、デスモグレイン４、Ｅ−カドヘリンネオエピトープ、胎児アセチルコリン受容体、ＣＤ２５、ＣＡ１９−９マーカー、ＣＡ−１２５マーカーおよびミュラー管抑制物質（ＭＩＳ）受容体タイプＩＩ、ｓＴｎ（シリル化Ｔｎ抗原；ＴＡＧ−７２）、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化抗原）、エンドシアリン（ｅｎｄｏｓｉａｌｉｎ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＬＧ、ＳＡＳならびにＣＤ６３が挙げられる。
【０１１７】
１つのインビボアプローチでは、治療組成物（例えば本発明のタンパク質複合体を含有する組成物）が被験者に投与される。一般に、複合体は医薬的に許容できる担体（例えば生理食塩水）中に懸濁され、かつ経口的にまたは静脈内注入によって投与されるか、あるいは皮下、筋肉内、髄腔内、腹腔内、直腸内、膣内、鼻内、胃内、気管内、または肺内に注射または移植される。
【０１１８】
必要用量は、投与経路の選択；剤形の性質；被験者の疾患の性質；被験者の身長、体重、表面積、年齢、および性別；投与されている他の薬剤；ならびに主治医の判断に依存する。適切な用量は０．０１〜１００．０ｍｇ／ｋｇの範囲内である。適切な用量は、０．０１〜１００．０ｍｇ／ｋｇまたはより詳細には０．１〜１００、０．１〜７５、０．１〜５０、０．１〜２５、０．１〜１０、０．５〜１００、０．５〜７５、０．５〜５０、０．５〜２５、０．５〜１０、１〜１００、１〜７５、１〜５０、または１〜２５ｍｇ／ｋｇの範囲内である。好ましい用量は、１〜１０、１０〜１００、１０〜７５、１０〜５０、１０〜２５、２５〜５０、５０〜７５、２５〜１００、２５〜５０、５０〜１００、または７５〜１００ｍｇ／ｋｇを含む。最も好ましくは、用量は１〜２、３〜４、５〜６、７〜８、または９〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。本発明の治療組成物を、約１〜１０週、好ましくは２〜８週、より好ましくは約３〜７週、およびさらにより好ましくは約４、５、もしくは６週にわたり毎日、週に１回、２回、もしくは３回またはそれより頻回に投与してもよい。必要用量におけるばらつきは、使用可能な種々の組成物および投与の様々な経路の異なる効率を考慮して想定されるべきである。例えば、経口投与であれば静脈内注射による投与よりも高用量が必要であると想定されることになる。これらの用量レベルにおけるばらつきは、当該技術分野で十分に理解されているように最適化のための標準の経験的なルーチンを用いて調節してもよい。適切な送達媒体（例えば高分子微粒子または移植可能なデバイス）中での組成物のカプセル化により、特に経口送達において送達の効率が増大しうる。
【０１１９】
医薬的に許容できる担体は、溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、ならびに等張化剤および吸収遅延剤を含む。具体的には、これらの作用物質は、生理食塩溶液、固定オイル、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝液；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性を調節するための作用物質を含んでもよい。医薬組成物ｐＨを、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調節してもよい。
【０１２０】
本発明の範囲内に、医薬的に許容できる担体および有効量の本発明のタンパク質複合体を含有する医薬組成物も含まれる。医薬組成物の使用により、上掲の障害を治療してもよい。医薬的に許容できる担体は、溶剤、分散媒、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、ならびに等張化剤および吸収遅延剤を含む。医薬組成物を、従来の方法を用いて異なる投与経路における製剤形態に調合してもよい。
【０１２１】
本発明の組成物の有効性をインビトロとインビボの双方で評価してもよい。インビボ研究においては、組成物を動物（例えばマウスモデル）に注射してもよく、そこでその治療効果が得られる。その結果に基づき、適切な用量範囲および投与経路の判定が可能である。
【０１２２】
本明細書で用いられる「特異的な」および「特異的に結合する」という用語は、抗体または抗体の断片がそのリガンドに対して少なくとも１０−６Ｍのアビディティーを有することを意味する。
【０１２３】
本発明の実施形態では、第１の足場ドメインの融合タンパク質は（ＧＰＰ）１０とＥＧＦＲに特異的な抗体との融合物である。本発明のさらなる実施形態では、コラーゲン足場ドメインの融合タンパク質は（ＧＰＰ）１０とＥＧＦＲに特異的な抗体の断片との融合物であり、この場合の断片はｓｃＦｖ、 ＶＬ、 ＶＨ、またはＦａｂ断片であってもよいがこれらに限定されない。
【０１２４】
本発明の別の実施形態では、第１のコラーゲン足場ドメインの融合タンパク質は（ＧＰＰ）１０とＣＤ３に特異的な抗体との融合物である。本発明のさらなる実施形態では、コラーゲン足場ドメインの融合タンパク質は（ＧＰＰ）１０とＣＤ３に特異的な抗体の断片との融合物であり、この場合の断片はｓｃＦｖ、 ＶＬ、 ＶＨ、またはＦａｂ断片であってもよいがこれらに限定されない。
【０１２５】
本発明のさらに別の実施形態では、第１の足場ドメインの融合タンパク質は、（ＧＰＰ）１０と、ＥＧＦＲに特異的な抗体または抗体の断片およびＣＤ３に特異的な抗体または融合タンパク質との二重特異性融合タンパク質である。ＥＧＦＲに特異的な抗体または抗体の断片は（ＧＰＰ）１０のＮ末端に融合され、かつＣＤ３に特異的な抗体または抗体の断片は（ＧＰＰ）１０のＣ末端に融合されうる。この実施形態は、二重特異性コラーゲン足場ドメインの融合タンパク質７６３ＣＳＡＯＫＴ３を含むがこれに限定されない。本発明の別の実施形態では、ＣＤ３に特異的な抗体または抗体の断片は（ＧＰＰ）１０のＮ末端に融合され、かつＥＧＦＲに特異的な抗体または抗体の断片は（ＧＰＰ）１０のＣ末端に融合されうる。
【０１２６】
本発明のさらに他の実施形態では、第１のコラーゲン足場ドメイン融合タンパク質は（ＧＰＰ）１０とＥＧＦＲに特異的な抗体または抗体の断片との間の融合物であり、ここで抗体または抗体の断片は（ＧＰＰ）１０のＮ末端またはＣ末端に融合される。第２のコラーゲン足場ドメイン融合タンパク質は（ＧＰＰ）１０とＣＤ３に特異的な抗体または抗体の断片との間の融合物であってもよく、ここで抗体または抗体の断片は（ＧＰＰ）１０のＮ末端またはＣ末端に融合される。
【０１２７】
本発明の実施形態では、抗−ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖコラーゲン足場ドメインのタンパク質は７６３＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌである。
【０１２８】
本発明の実施形態では、抗−ＣＤ３  ｓｃＦｖコラーゲン足場ドメインの融合タンパク質はＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌである。
【０１２９】
本発明の別の実施形態では、第１のコラーゲン足場ドメインの融合タンパク質は（ＧＰＰ）１０とＴＮＦ−αに特異的な抗体との融合物である。本発明のさらなる実施形態では、コラーゲン足場ドメインの融合タンパク質は（ＧＰＰ）１０とＴＮＦ−αに特異的な抗体の断片との融合物であり、ここで断片はｓｃＦｖ、 ＶＬ、 ＶＨ、またはＦａｂ断片であってもよいがこれらに限定されない。
【０１３０】
本発明の実施形態では、抗−ＴＮＦ−α  ｓｃＦｖコラーゲン足場ドメインの融合タンパク質は３５７＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌである。
【０１３１】
本発明のさらに別の実施形態では、第１のコラーゲン足場ドメインの融合タンパク質は、ＴＮＦ−α、ＥＧＦＲに特異的な抗体または抗体の断片とＣＤ３に特異的な抗体または融合タンパク質の双方を有する（ＧＰＰ）１０の二重特異性融合タンパク質である。ＴＮＦ−α、ＥＧＦＲに特異的な抗体または抗体の断片を（ＧＰＰ）１０のＮ末端に融合し、かつＣＤ３に特異的な抗体または抗体の断片を（ＧＰＰ）１０のＣ末端に融合してもよい。本発明の別の実施形態では、ＣＤ３に特異的な抗体または抗体の断片を（ＧＰＰ）１０のＮ末端に融合し、かつＴＮＦ−α、ＥＧＦＲに特異的な抗体または抗体の断片を（ＧＰＰ）１０のＣ末端に融合してもよい。
【０１３２】
本発明のさらに他の実施形態では、第１のコラーゲン足場ドメインの融合タンパク質は（ＧＰＰ）１０とＴＮＦ−αに特異的な抗体または抗体の断片の間の融合物であり、ここで抗体または抗体の断片は（ＧＰＰ）１０のＮ末端またはＣ末端に融合される。第２の足場ドメインの融合タンパク質は（ＧＰＰ）１０とＣＤ３に特異的な抗体または抗体の断片の間の融合物であってもよく、ここで抗体または抗体の断片は（ＧＰＰ）１０のＮ末端またはＣ末端に融合される。
【０１３３】
本発明のさらに別の実施形態では、第１のコラーゲン足場ドメインの融合タンパク質は、ＥＧＦＲに特異的な抗体および抗体の断片とＣＤ３に特異的な抗体または融合タンパク質の双方を有する（ＧＰＰ）１０の二重特異性融合タンパク質である。ＥＧＦＲに特異的な抗体または抗体の断片を（ＧＰＰ）１０のＮ末端に融合し、ＣＤ３に特異的な抗体または抗体の断片を（ＧＰＰ）１０のＣ末端に融合してもよい。本発明の別の実施形態では、ＣＤ３に特異的な抗体または抗体の断片を（ＧＰＰ）１０のＮ末端に融合し、ＥＧＦＲに特異的な抗体または抗体の断片を（ＧＰＰ）１０のＣ末端に融合してもよい。
【０１３４】
本発明のさらに他の実施形態では、第１のコラーゲン足場ドメインの融合タンパク質は（ＧＰＰ）１０とＥＧＦＲに特異的な抗体または抗体の断片との間の融合物であり、ここで抗体または抗体の断片は（ＧＰＰ）１０のＮ末端またはＣ末端に融合される。第２のコラーゲン足場ドメインの融合タンパク質は（ＧＰＰ）１０とＣＤ３に特異的な抗体または抗体の断片との間の融合物であってもよく、ここで抗体または抗体の断片は（ＧＰＰ）１０のＮ末端またはＣ末端に融合される。
【０１３５】
本発明のさらなる実施形態では、コラーゲン足場ドメインの融合タンパク質はマーカータンパク質に対する融合物を含んでもよい。マーカータンパク質は、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、および増強された緑色蛍光タンパク質を含むがこれらに限定されない。これらの実施形態は、ＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的なコラーゲン足場ドメインの融合タンパク質ｈ４Ｄ５ＣＳＡ−Ｌｕｃを含むがこれらに限定されない。
【０１３６】
マーカータンパク質を含むコラーゲン足場ドメインの融合タンパク質を診断および分子イメージングにおいて用いてもよい。本発明の実施形態では、マーカータンパク質または放射性イオンを含むコラーゲン足場ドメインの融合タンパク質あるいは他の融合部分を、足場ドメインの融合タンパク質および特異的分子のイメージングに必要な他の試薬を含むキット内にパッケージ化してもよい。これらの試薬は、生物学的試料を調製するための試薬およびマーカータンパク質を可視化するための試薬を含んでもよいがこれらに限定されない。
【０１３７】
本発明は、リガンドを検出するための方法であって、３つのポリペプチドを含む三量体可溶性抗体をリガンドとともにインキュベートするステップと、三量体可溶性抗体のリガンドへの結合を検出するステップとを含む、方法を包含する。好ましい実施形態では、各ポリペプチドは、少なくとも１０個のＧ−Ｘ−Ｙリピート（式中、Ｇはグリシンであり、Ｘは任意のアミノ酸であり、かつＹは任意のアミノ酸であり、Ｇ−Ｘ−Ｙリピートのうちの少なくとも１０個はＧ−Ｐ−ＰまたはＧ−Ｐ−Ｏであり、Ｇ−Ｘ−Ｙリピートのうちの少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０個はＧ−Ｐ−Ｏであり、ＰはプロリンでありかつＯはヒドロキシプロリンである）を含むコラーゲン様ドメインと抗体ドメインとを含み、ここで３つのポリペプチドのヒドロキシプロリネート化コラーゲン様ドメインが互いに相互作用することで少なくとも１０７Ｍ−１のアビディティーでリガンドに結合する三量体可溶性抗体が形成される。好ましい実施形態では、各ポリペプチドは、少なくとも１０個のＧ−Ｘ−Ｙリピート（式中、Ｇはグリシンであり、Ｘは任意のアミノ酸であり、かつＹは任意のアミノ酸であり、Ｇ−Ｘ−Ｙリピートのうちの少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０個はＧ−Ｘ−Ｏであり、Ｏはヒドロキシプロリンである）を含むコラーゲン足場ドメインと抗体ドメインとを含み、ここで３つのポリペプチドのヒドロキシプロリネート化コラーゲン足場ドメインが互いに相互作用することで少なくとも１０７Ｍ−１のアビディティーでリガンドに結合する三量体可溶性抗体が形成される。
【０１３８】
一実施形態では、可溶性三量体抗体はそのリガンドに対して１０７Ｍ−１を超えるアビディティーを有する。一実施形態では、可溶性三量体抗体はそのリガンドに対して１０８Ｍ−１を超えるアビディティーを有する。一実施形態では、可溶性三量体抗体はそのリガンドに対して１０９Ｍ−１を超えるアビディティーを有する。特定の実施形態では、可溶性三量体抗体は、そのリガンドに対して１０７Ｍ−１〜１０１０Ｍ−１、１０７Ｍ−１〜１０９Ｍ−１、１０７Ｍ−１〜１０８Ｍ−１、１０８Ｍ−１〜１０１０Ｍ−１、１０８Ｍ−１〜１０９Ｍ−１、および１０９Ｍ−１〜１０１０Ｍ−１のアビディティーを有する。
【０１３９】
特定の実施形態では、三量体可溶性抗体はルシフェラーゼポリペプチドを含む。
【０１４０】
本発明の実施形態は、第１のコラーゲン足場ドメインおよび第１の足場ドメインの一端に融合された第１の異種ドメインを有する第１の融合ポリペプチド鎖、第２のコラーゲン足場ドメインを有する第２の融合ポリペプチド鎖、および第３の足場ドメインを有する第３の融合ポリペプチド鎖を含む組換えタンパク質複合体を含み、ここで第１、第２、および第３の足場ドメインを整列することで三重らせんコイルが形成される。
【０１４１】
さらなる実施形態では、本発明は、第１の融合ポリペプチド鎖が第１のコラーゲン足場ドメインの他端に融合される第２の異種ドメインをさらに有する場合のタンパク質複合体を提供する。本発明の他の実施形態は、第１の異種ドメインがＣＤ３に特異的に結合する第１の一本鎖抗体の配列を有するかまたは第２の異種ドメインがＥＧＦＲに特異的に結合する第２の一本鎖抗体の配列を有する場合のタンパク質複合体を含んだ。
【０１４２】
本発明のさらなる実施形態では、タンパク質複合体は、第２の足場ドメインの一端に融合される第３の異種ドメインを含む第２の融合ポリペプチド鎖および第２の足場ドメインの他端に融合される第４の異種ドメインを含む第２の融合ポリペプチド鎖を含み、第３の融合ポリペプチド鎖は第３の足場ドメインの一端に融合される第５の異種ドメインおよび第３の足場ドメインの他端に融合される第６の異種ドメインを有し、ここで各リピートは（ＧＰＰ）１０の配列を有する。
【０１４３】
下記の具体例は、あくまで図示目的であって開示の残りの部分がどのような内容であっても決して限定するものではないとして解釈されるべきである。当業者は、さらなる検討を行うことなく本明細書中の記載に基づいて本発明をその最大限の範囲で利用できると考えられる。本明細書で引用されるすべての発行物は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
【実施例】
【０１４４】
実施例１
抗−ＥＧＦＲ抗体ドメインに対するファージライブラリの選択
表皮成長因子受容体細胞外ドメイン（ＥＧＦＲ−ＥＣＤ）に結合する可変断片（ｓｃＦｖ）を含有するｅｒｂファージミドを、ヒトシングルフォールドｓｃＦｖファージディスプレイライブラリ（トムリンソン  Ｉ＋Ｊ（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  Ｉ＋Ｊ）；親切にもＩ．Ｍ．トムリンソン（Ｉ．Ｍ．Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ）およびＧ．ウインター（Ｇ．Ｗｉｎｔｅｒ）、ＭＲＣ  ラボラトリー・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）、英国から提供を受けた）のスクリーニングにより単離した。選択を、１０μｇのＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ−ＥＣＤ；リサーチ・ダイアグノスティクス（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．））の精製された組換え細胞外ドメインでコートされたイムノチューブ（ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅｓ）（マキシソープ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）；ヌンク（Ｎｕｎｃ）、ロスキレ（Ｒｏｓｋｉｌｄｅ）、デンマーク）を用いて行った。溶出されたファージのブロッキング、パニング、洗浄、溶出、および再増幅を製造業者のプロトコルに従って行った。多数のクローンを同定した。ウエスタンブロッティングおよびＥＬＩＳＡによる確認後、１つのクローンｅｒｂ＿ｓｃＦｖを追加の実験用に選択した。ｅｒｂ＿ｓｃＦｖをコードするｃＤＮＡを取得し、標準的方法により発現ベクターにライゲートした。以下にｅｒｂ＿ｓｃＦｖのポリペプチド配列（配列番号ｌ）およびそれをコードするヌクレオチド配列（配列番号２）を挙げる。
【０１４５】
【化１】
0005543070.tif 000002
【０１４６】
次いで、発現ベクターを昆虫細胞系ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２内で発現させた。抗−ＥＧＦＲ  ｅｒｂ＿ｓｃＦｖを精製し、それに対してウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡを行い、ＥＧＦＲに対するその特異性を確認した。
【０１４７】
実施例２
ＣＤ３抗体ドメイン
ＲＴ−ＰＣＲを実施し、抗−ＣＤ３モノクローナル抗体ＯＫＴ３の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするハイブリドーマ細胞系ｃＤＮＡを取得した。次いで、その２つのｃＤＮＡをライゲートし、ＯＫＴ３のＶＨ−ＶＬの融合タンパク質をコードする融合配列を生成した。以下に、この融合タンパク質のポリペプチド配列（配列番号３）およびそれをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号４）を挙げる。
【０１４８】
【化２】
0005543070.tif 000003
【０１４９】
実施例３
ＥＧＦＲ抗体ドメイン
同じ手順を実施し、抗−ＥＧＦＲモノクローナル抗体５２８のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡおよび抗−ＥＧＦＲ  ５２８のＶＨ−ＶＬの融合タンパク質をコードする融合配列を取得した。５２８モノクローナル抗体は、細胞膜、例えばヒト表皮癌Ａ４３１細胞上のＥＧＦＲに結合する。この５２８一本鎖抗体のポリペプチド配列（配列番号５）およびそれをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号６）を以下に挙げる。
【０１５０】
【化３】
0005543070.tif 000004
【０１５１】
実施例４
抗体ドメインのヒトミニコラーゲンＸＸＩへの融合
上記の抗−ＥＧＦＲ  ｅｒｂ、ＯＫＴ３  ＶＨ−ＶＬ、および抗−ＥＧＦＲ  ５２８ＶＨ−ＶＬをコードするｃＤＮＡを、それぞれヒトＩｇＧのヒンジ領域、５’末端のＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＲＳＩＰ、および３’末端のヒスチジンタグ配列を有するヒトミニコラーゲンＸＸＩ  ｃＤＮＡにインフレームで融合した。下記にヒトミニコラーゲンＸＸＩポリペプチドの足場ドメインおよびｃＤＮＡ配列（各々、配列番号７および８）が示される。
【０１５２】
【化４】
0005543070.tif 000005
【０１５３】
アミノ末端のＯＫＴ３  ＩｇＧに由来する抗−ＣＤ３  ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧのヒンジ領域、ヒトミニコラーゲンＸＸＩポリペプチド、その後にＴ４フィブリチンフォルドンドメインおよびヒスチジンタグを有するＯＫＴ３ｍＣ２１ｆｄを作成した。２７個のアミノ酸ＮＨ２−ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ−ＣＯＯＨからなり、疎水性の内部を有するβ−プロペラ様構造を形成するバクテリオファージＴ４のフィブリチンフォルドンドメインは、三量体化およびコラーゲンドメインの正確な折りたたみを駆動するのに十分である（非特許文献１６）。
【０１５４】
ＯＫＴ３ｍＣ２１とＯＫＴ３ｍＣ２１ｆｄの双方に対して得られた発現ベクターを、安定的に発現されたヒトプロリル４−ヒドロキシラーゼ遺伝子をそれぞれ有するショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２細胞内に形質移入した。細胞をブラスティシジンの存在下で培養し、ブラスティシジン耐性細胞を選択した。細胞培養上清を回収し、ウエスタンブロッティングにより、α（ＸＸＩ）コラーゲンのＣ末端ＮＣ１ドメインを認識するモノクローナル抗体３Ｅ２で分析した。図２に示されるように、ＯＫＴ３ｍＣ２１とＯＫＴ３ｍＣ２１ｆｄの双方が非還元条件下で三量体構造（Ｔとして示される）を形成することが見出された。鎖間ジスルフィド結合された三量体（Ｍｔとして示される）もまたＯＫＴ３ｍＣ２１とＯＫＴ３ｍＣ２１ｆｄの双方にて検出された。結果は、ＯＫＴ３＿ｓｃＦｖの異種融合タンパク質がＴ４フォルドンドメインなどの任意の三量体化構造さえ伴うことなくミニコラーゲンＸＸＩの足場ドメインの三量体化特性に影響を与えないことを示している。
【０１５５】
実施例５
抗体ドメインのコラーゲン様ドメインに対する融合
ミニコラーゲンＸＸＩのコラーゲンドメインを、ＣＳＡに対する足場鋳型としての熱的に安定な短いコラーゲン様ペプチド（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）１０と置換した。ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌ、ＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌ、７６３＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌ、３５７＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌ、ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−ＧＰＰ１０、Ｃｏｌ−ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ、７６３ＣＳＡ−ＯＫＴ３、およびｈ４Ｄ５ＣＳＡ−Ｌｕｃといった８種の融合ポリペプチドを生成した。別のコラーゲン様ペプチドの（ＧＰＰ）５ＧＫＰＧＫＰ（ＧＰＰ）６を７６３＿ＣＳＡ２を作成するための足場を三量体化するものとして用いた。これらの足場ドメインの融合タンパク質を、マウス骨髄腫ＮＳ０細胞内で可溶性分泌タンパク質として安定的に発現させた。
【０１５６】
組換えプラスミドの作成
ｅｒｂのｓｃＦｖをコードするｃＤＮＡをｅｒｂファージミドからＰＣＲ増幅した。マウスＩｇＧ２ａ抗−ＣＤ３  ｍＡｂ  ＯＫＴ３（オーソ・ファーマシューティカル・コーポレーション（Ｏｒｔｈｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））をコードする配列をＯＫＴ３ハイブリドーマ（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−８００１）由来の逆転写産物により取得した。ＯＫＴ３  ｍＡｂのＶＨおよびＶＬに対するｃＤＮＡを公開されたヌクレオチド配列に基づくＲＴ−ＰＣＲにより取得した。ｅｒｂおよびＯＫＴ３のｓｃＦｖ  ＰＣＲ融合物を、ＶＬおよびＶＨ鎖をグリシン−リンカー（ＧＧＧＧＳ）３に連結させることにより生成した。
【０１５７】
ｍＡｂ７６３のＶＬおよびＶＨをコードするｃＤＮＡを、公開されたヌクレオチド配列（特許文献３１）に基づくパニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）（ベクティビックス（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）、アムジェン（Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．））のｃＤＮＡに由来するプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅した。７６３のｓｃＦｖ  ＰＣＲ融合物を、ＶＬおよびＶＨ鎖をグリシン−リンカー（ＧＧＧＧＳ）３に連結させることにより生成した。
【０１５８】
ＲＴ−ＰＣＲを実施し、ハイブリドーマ３５７−１０１−４細胞系（ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．９２０３０６０３）に由来する抗−ＴＮＦ−αモノクローナル抗体３５７、強力な中和活性を有するマウス抗−ヒトＴＮＦ−α  ｍＡｂの軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするｃＤＮＡを取得した。次いで、２つのｃＤＮＡをグリシン−リンカー（ＧＧＧＧＳ）３（イタリック体）と連結させ、３５７  ｓｃＦｖの融合タンパク質をコードする融合配列を生成した。以下に、この融合タンパク質のポリペプチド配列（配列番号９）およびそれをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号１０）を挙げる。
【０１５９】
【化５】
0005543070.tif 000006
【０１６０】
ｓｃＦｖ−Ｃｏｌを生成するため、ｓｃＦｖ−Ｃｏｌのコード領域は、Ｎ末端のｓｃＦｖヌクレオチド配列と、Ｃ末端のＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＲＳＩＰ（ＧＰＰ）１０ＧＩＣＤＰＳＬＣＦＳＶＩＡＲＲＤＰＦＲＫＧＰＮＹ（配列番号１１）（ヒトＩｇＧのヒンジ領域（イタリック体）、コラーゲン様足場ドメイン（太字）、およびタイプＸＸＩコラーゲンのＮＣ１ドメインを含む）のペプチド配列をコードする遺伝子を含んだ。下記に合成コラーゲン足場を有するポリペプチドおよびｃＤＮＡ配列（各々、配列番号１１および１２）を示す。
【０１６１】
【化６】
0005543070.tif 000007
【０１６２】
この合成配列（配列番号１２）を重複型（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）ＰＣＲにより調製し、ＮｏｔＩおよびＸｈｏｌ部位に隣接するＰＣＲ産物を発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２／Ｈｙｇｒｏ（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））の同じ部位にクローニングした。次いで、ｅｒｂ、ＯＫＴ３、７６３および３５７のｓｃＦｖｓを上記のＣ末端のコラーゲン足場を有するコンストラクトのＡｓｃＩおよびＮｏｔＩ部位にインフレームにクローニングし、それぞれｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌ、ＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌ、７６３＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌおよび３５７＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌの発現コンストラクトを作製した。
【０１６３】
次いで、ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−ＧＰＰ１０を生成し、ＣＳＡのコラーゲン−足場ペプチド（ＧＰＰ）１０がそれ自体でコラーゲン様ドメインの内部に存在するかまたはそれに隣接する鎖間架橋アミノ酸残基（ＣｙｓおよびＬｙｓなど）の援助なしに非共有結合された三量体融合タンパク質の形成を駆動しうることを示した。ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−ＧＰＰ１０のコード領域は、Ｎ末端のｅｒｂ＿ｓｃＦｖのヌクレオチド配列と、Ｃ末端のＧＳＰ（ＧＰＰ）１０ＧＰＳＳＧＧ（コラーゲン様足場ドメイン（太字）を含む）のペプチド配列をコードする合成遺伝子を含んだ。下記に合成コラーゲン足場を有するポリペプチドおよびｃＤＮＡ配列（各々、配列番号１３および１４）を示す。
【０１６４】
【化７】
0005543070.tif 000008
【０１６５】
ｅｒｂ＿ｓｃＦｖのｃＤＮＡを重複型ＰＣＲにより上記のＣ末端のコラーゲン足場配列にインフレームにクローニングし、ＡｓｃＩおよびＡｇｅＩ部位に隣接するＰＣＲ産物を発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２／Ｈｙｇｒｏ（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローニングしてｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−ＧＰＰ１０の発現コンストラクトを作製した。
【０１６６】
次いで、Ｃｏｌ−ｅｒｂ＿ｓｃＦｖを作製した。Ｃｏｌ−ｅｒｂ＿ｓｃＦｖのコラーゲン足場領域は、ＴＣＰＰＣＰＲＳＩＰおよびＧＩＣＤＰＳＬＣという２つのジスルフィドノットに隣接するコラーゲン様ドメイン（ＧＰＰ）１０を含むＴＣＰＰＣＰＲＳＩＰ（ＧＰＰ）１０ＧＩＣＤＰＳＬＣのペプチド配列を有する。下記に合成コラーゲン足場を有するポリペプチドおよびｃＤＮＡ配列（各々、配列番号１５および１６）を示す。
【０１６７】
【化８】
0005543070.tif 000009
【０１６８】
ｅｒｂ＿ｓｃＦｖのｃＤＮＡを重複型ＰＣＲにより上記のＮ末端のコラーゲン足場配列（配列番号１６）にインフレームにクローニングし、ＢａｍＨＩおよびＡｇｅＩ部位に隣接するＰＣＲ産物を発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２／Ｈｙｇｒｏ（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローニングしてＣｏｌ−ｅｒｂ＿ｓｃＦｖの発現コンストラクトを作製した。
【０１６９】
次いで、７６３ＣＳＡ２を作製した。７６３ＣＳＡ２のコード領域は、アミノ末端の７６３＿ｓｃＦｖ（抗−ＥＧＦＲ）と、Ｃ末端のＥＰＫＳＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＲＳＩＰ（ＧＰＰ）５ＧＫＰＧＫＰ（ＧＰＰ）６ＧＩＣＤＰＳＬＣ（配列番号１７）（ヒトＩｇＧの変異ヒンジ領域（イタリック体）、コラーゲン様ドメイン（太字）、およびタイプＸＸＩコラーゲンのジスルフィドノット（ＧＩＣＤＰＳＬＣ）を含む）のペプチド配列をコードする合成コラーゲン足場遺伝子を含んだ。下記に合成コラーゲン足場を有するポリペプチドおよびｃＤＮＡ配列（各々、配列番号１７および１８）を示す。
【０１７０】
【化９】
0005543070.tif 000010
【０１７１】
この合成配列（配列番号１７）を重複型ＰＣＲにより調製し、ＮｏｔＩおよびＸｈｏｌ部位に隣接するＰＣＲ産物を発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２／Ｈｙｇｒｏ（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））の同じ部位にクローニングした。次いで、７６３のｓｃＦｖｓを上記のＣ末端のコラーゲン足場を有するコンストラクトのＡｓｃＩおよびＮｏｔＩ部位にインフレームにクローニングして７６３ＣＳＡ２の発現コンストラクトを作製した。
【０１７２】
二重特異性ＣＳＡ、７６３ＣＳＡＯＫＴ３を以下のように生成した。ＯＫＴ３のｓｃＦｖを７６３＿ｓｃＦｖ−ＣｏｌのＣ末端のＡｇｅＩおよびＢａｍＨＩ部位にインフレームにクローニングして７６３ＣＳＡＯＫＴ３の発現コンストラクトを作製した。この場合、７６３の抗−ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖがＮ末端に配置され、それにコラーゲン足場ポリペプチド（配列番号１１）およびＣ末端にＯＫＴ３の抗−ＣＤ３  ｓｃＦｖが続いた。
【０１７３】
別の二機能性結合パートナーのｈ４Ｄ５ＣＳＡ−Ｌｕｃを以下のように作成した。まず、ｈ４Ｄ５ＣＳＡを、７６３ＣＳＡ２の作成のセクションで述べたように、ヒト化抗−ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＩｇＧ（非特許文献９１）に由来するアミノ末端のｈ４Ｄ５＿ｓｃＦｖをＣ末端のコラーゲン足場を有する発現ベクターに融合することによって作製した。次いで、ガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）ルシフェラーゼｃＤＮＡ（特許文献３２）をｈ４Ｄ５＿ｓｃＦｖ−ＣｏｌのＣ末端のＡｇｅＩおよびＢａｍＨＩ部位にインフレームで融合した。
【０１７４】
様々なｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、およびＣＳＡ分子の各オープンリーディングフレームは、分泌、検出、および精製目的で、Ｎ末端のリーダー配列およびＣ末端のｍｙｃエピトープ／ポリヒスチジンタグをコードする配列を有する。
【０１７５】
下記表に上記の発現コンストラクトによってコードされた様々な組換えタンパク質／抗体をまとめる。
【０１７６】
【表１】
0005543070.tif 000011
【０１７７】
実施例６
組換えタンパク質の発現
組換えタンパク質複合体／抗体を産生するため、上記のｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、およびＣＳＡコンストラクトを、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用い、製造業者の使用説明書に従い、マウス骨髄腫ＮＳ０細胞に形質移入した。ハイグロマイシン（４００μｇ／ｍｌ）を用いた選択の４週間後、安定な各クローンを、２％のウシ胎仔血清を含有する化学的組成の明らかな（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ）培地ＨｙＱＣＤＭ４ＮＳ０（ハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ））内で初期播種密度を５×１０５細胞／ｍｌとして振とうフラスコ内で培養した。培養物を１５０ｒｐｍ、３７℃で５日間維持した。アスコルビン酸ナトリウム（８０μｇ／ｍｌ）を、上記の抗体ドメインおよびコラーゲン足場ドメインすなわちコラーゲン足場抗体（ＣＳＡ）を有するタンパク質をコードする発現コンストラクトを有する細胞用培地に毎日添加した。
【０１７８】
実施例７
組換えタンパク質の精製
表１上に列挙されたＣＳＡタンパク質を精製するため、約２Ｌの濾過された培地の各々を、０．５ＭのＫＣ１、ｐＨ８．０を含有する５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液で平衡化したＴ−ゲルカラム（１．５×８ｃｍ、ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ））に６０ｍｌ／時間の流速で適用した。同じ緩衝液で洗浄後、組換えタンパク質またはタンパク質複合体を５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．０で溶出した。それらのＵＶ吸光度を２８０ｎｍで監視し、ピーク画分を０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０を含有する５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液で平衡化したＺｎＳＯ４で帯電、キレート化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｔｒａｐカラム（ベッド容量で１ｍｌ、ＧＥ  ヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））上に流速６０ｍｌ／時間で適用した。まずカラムを２０ｍＭのイミダゾールで洗浄し、次いで結合タンパク質またはタンパク質複合体を同じ緩衝液中の０．２５Ｍのイミダゾールで溶出した。最終調製物を５０ｍＭのヘペス緩衝液、ｐＨ７．０に対して透析した。次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥをランニング緩衝液（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））としてＭＯＰＳを有する１０％ＮｕＰＡＧＥビス−トリスポリアクリルアミドゲルまたは酢酸ナトリウムを有する７％  ＳＤＳ／トリス−酢酸塩ポリアクリルアミドゲルを用いて実施した。次いで、タンパク質をクマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色した。タンパク質バンドの密度を、Ｃｈｅｍｉｌｍａｇｅｒ  ５５００（アルファ（Ａｌｐｈａ）Ｉｎｎ８）を用いるデンシトメトリーによって定量した。
【０１７９】
三量体化試験
三重らせんの性質を試験するため、精製ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌ（１ｍｇ／ｍｌ）を１０ｍＭ  ＤＴＴの非存在下または存在下、３７℃で１時間インキュベートした。ＤＴＴで処理した試料からの一定分量を５０ｍＭのＮ−エチル−マレイミド（ＮＥＭ）と周囲温度で３０分間さらに反応させ、遊離スルフヒドリルおよび三量体の再構築を永久的にブロッキングした。各試料から等量のタンパク質を、ランニング緩衝液として酢酸ナトリウムを有する７％  ＳＤＳ／トリス−酢酸塩ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。ゲルをクマシーブルーで染色した。精製ＣＳＡがホモ三量体または鎖間ジスルフィド結合された六量体であり、緩和な還元条件下で２つの三量体に解離されうることが見出された。
【０１８０】
ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌの三量体構造の熱安定性を試験した。２Ｍ尿素を含有する５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の精製ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌを、１０ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の非存在下または存在下で、周囲温度で処理した。次いで、還元試料を５０ｍＭのＮＥＭで周囲温度でアルキル化した。等量のタンパク質を有する各試料を、ＳＤＳ−ローディング緩衝液との混合前に３５、４５、５５、６５、７５、および８５℃で１０分間加熱した。試料を、非還元条件下でＭＯＰＳ緩衝液を有する１０％  ＳＤＳ／ビス−トリスポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。ゲルをクマシーブルーで染色した。結果は、ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌ三量体が高い熱安定性を示すことを示した。実際、６５℃で１０分間処理後、５０％を超える三量体が残存した。ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌのコラーゲン様ドメインの三量体構造がプロリルヒドロキシル化されることも見出された。
【０１８１】
ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−ＣｏｌまたはＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌの一次構造は、ヒトまたはマウス一本鎖Ｆｖの標的化ドメイン、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）１０コラーゲン様ペプチド、およびタイプＸＸＩコラーゲンのＮＣ１ドメインを含む。ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌ、ＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌ、ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｆｃおよびｅｒｂ＿ｓｃＦｖの組換え抗体をマウス骨髄腫ＮＳ０細胞内の可溶性分泌タンパク質として発現させ、上記のようにカラムクロマトグラフィーにより培地から別々に精製した。図５Ａはこれらの精製抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。非還元条件下で、２つの主要バンドがｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌ（レーン２）において分解された一方、１つの主要バンドのみがＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌ（レーン３）において観察された。ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−ＣｏｌとＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌの双方の下のバンドは、両ｓｃＦｖ−Ｃｏｌ単量体（４１ｋＤ）の三量体形態の計算された分子量の近似値に対応する１２５ｋＤの位置に移動した。ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌ（レーン２）にて示される上のバンドは、三量体の鎖間ジスルフィド結合された二量体であるように見られる。
【０１８２】
この試験結果を図５Ｂに示される緩和な還元条件下で試料をインキュベートすることによって確認し、ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌの鎖間ジスルフィド結合された六量体（２５０ｋＤ）を２つの三量体（１２５ｋＤ）に解離させた。図５Ａでは、試料を５０ｍＭのＤＴＴを有する還元条件下で７０℃で１０分間処理し、ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌの鎖間ジスルフィド結合された六量体を三量体形態に完全に還元する一方、ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌ三量体のほんの一部を単量体にさらに解離させた（レーン７）。興味深いことに、ＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌの三量体高次構造は、これらの還元条件下で単量体形態への解離に抵抗性を示した（レーン８）。ｅｒｂ抗体の二価対応物、ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｆｃが明らかに１２５ｋＤの分子量を有する非還元条件下での二量体として移動することで（レーン４）、鎖間ジスルフィド結合の還元後に明らかに５７ｋＤの分子量を有するほぼ単量体の形態が出現した（レーン９）。
【０１８３】
これらの結果は、ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−ＣｏｌおよびＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ−ＣｏｌのＣＳＡ分子内の短いコラーゲン様ペプチド（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）１０は熱的に安定な三量体高次構造への組織化を担いうることを示唆している（下記参照）。ｅｒｂ抗体の一価対応物であるｅｒｂ＿ｓｃＦｖは、非還元条件下または還元条件下で明らかに２８ｋＤの分子量を有する単一バンドとして移動した。図５に示されるｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌの鎖間ジスルフィド結合種の六量体および三量体構造を、その三重らせんの熱安定性を判定するためにさらに特徴づけた。鎖間ジスルフィド橋のＣＳＡ分子の三量体構築に対する寄与を除外するため、ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌ内のシステイン残基をまず強力な還元剤ＴＣＥＰを室温で用いて完全に還元し、次いでＮＥＭでアルキル化し、ジスルフィド結合の再構築を阻止した。等量の非還元または還元／アルキル化された試料を２Ｍ尿素を含有するトリス−ＨＣｌ（５０ｍＭ、ｐＨ８）中で指示温度でインキュベートし、三重らせんの解離について非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによりアッセイし、コラーゲンの三重らせんの熱安定性を評価した。予想どおり、鎖間ジスルフィド結合された六量体種は３５℃で容易に三量体に解離した（図６Ａ、レーン１および４を比較）。インキュベーション温度が高まるにつれ、三量体は単量体に有意に解離した（図６Ａ、レーン４〜９）。還元／アルキル化後における２Ｍ尿素下でのｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌの中間転位温度（Ｔｍ）が６６℃であると測定され、同温度で三量体の半分がほどかれて単量体になった（図６Ａ）。非還元条件下での同じ実験（図６Ａ、レーン１〜３）では、六量体または三量体の構造上の変化が全く示されなかったが、ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌは高いインキュベーション温度で部分的に分解された。
【０１８４】
この現象は、ＧＰＰを有するペプチドが９０℃での加熱に感受性を示し、部分的に分解され、かつ２．５ＭのグアニジウムＨＣｌのコラーゲン様試料への導入によってＴｍが２７℃低下することを示した他の研究に一致している。
【０１８５】
ヒドロキシプロリンは、コラーゲンの三重らせん構造の熱安定性にとって重要である。アミノ酸組成物分析を精製試料上で行い、ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌ中でのヒドロキシプロリンの存在について検討した。精製ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌを５０ｍＭ酢酸に対して透析し、６ＮのＨＣｌ中、１１０℃で２４時間加水分解し、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）Ｐｉｃｏ・Ｔａｇ（登録商標）システム内でアミノ酸分析を行った。測定されたアミノ酸組成物とｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌの推定上のｃＤＮＡ配列に基づく予測データ（表２）がほぼ一致することが観察された。さらに、ヒドロキシプロリン誘導体のピーク位置がＨＰＬＣ溶出特性上で検出され、それは（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）１０内のコラーゲンのＧｌｙ−Ｘ−ＹトリプレットのＹ位置内のＰｒｏ残基が水酸化されたことを示唆している（図７）。
【０１８６】
ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌ中でのプロリルの水酸化の範囲は、その（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）１０モチーフ内の完全にヒドロキシル化された１０個のプロリン残基の理論値から判定すると６１％である（表２中のＨｙｐ残基を参照）。結果は、ＣＳＡ分子内の（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）１０モチーフがプロリル４−ヒドロキシラーゼにおける良好な基質であり、かつマウス骨髄腫ＮＳ０細胞がコラーゲン分子の生合成において十分なプロリルヒドロキシラーゼ活性を示すことを示している。
【０１８７】
【表２】
0005543070.tif 000012
【０１８８】
培養上清中での高レベルの三量体可溶性抗体の存在から、抗体ドメインおよび足場ドメインを有する単量体サブユニットが三量体化されかつ分泌されうることが示された。足場ドメインと同じポリペプチド内での抗体ドメインの存在により、三量体化が阻止されず、可溶性抗体の形成が阻止されず、かつ抗体の培地への分泌が阻止されなかった。したがって、本発明は、抗体の三量体化、可溶性抗体の形成、および可溶性三量体抗体の分泌を可能にする。
【０１８９】
実施例９
結合試験
ｅｒｂ抗体変異体のＥＧＦＲ−ＥＣＤへの結合速度をランニング緩衝液ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭヘペス、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）中でのＢＩＡｃｏｒｅ  Ｘバイオセンサー（ビアコア（ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）、ウップサーラ（Ｕｐｐｓａｌａ）、スウェーデン）を用いて測定した。つまり、ＥＧＦＲ−ＥＣＤをアミン共役を介してＣｌセンサーチップ上に固定化して１７００のレベルの応答ユニット（ＲＵ）にし、異なる濃度を有する精製抗体を１０μｌ／分の流速で注射した。表面を１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ５μｌ、ｐＨ３．５の注射により再生した。センサーグラムを各濃度で取得し、プログラムＢＩＡ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．２を用いて評価した。結合データに１：１ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合モデルというタイトルを付け、平衡解離定数ＫＤを計算し、それを解離速度（ｋｏｆｆ）／結合速度（ｋｏｎ）の比として定義した。結果を下記の表３に示した。
【０１９０】
【表３】
0005543070.tif 000013
【０１９１】
表３に示されるように、ＥＧＦＲ−ＥＣＤに対するｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌの結合アビディティーは二価（ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｆｃ）および一価（ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ）ｍＡｂ対応物よりもそれぞれ約２０倍および約１０００倍強力である。
【０１９２】
抗体結合分析では、ＣＳＡ分子の構造設計によりｓｃＦｖドメインのアビディティーが改変されないことが示されている。表面プラズモン共鳴および細胞フローサイトメトリーを用い、ｓｃＦｖ結合アビディティーがｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−ＣｏｌおよびＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌにおいてそれぞれ保持されるか否かを試験した。さらに、ＣＳＡ分子内での三価ｓｃＦｖによる抗原−結合アビディティーの増大をそれらの二価および／または一価対応物による場合と比較した。ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌ、ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｆｃおよびｅｒｂ＿ｓｃＦｖという３種のｅｒｂ抗体変異体とＥＧＦＲ−ＥＣＤとの相互作用を表面プラズモン共鳴アッセイを用いて試験し、平衡解離定数ＫＤを解離速度定数と結合速度定数の間の比（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）として判定した。一価ｅｒｂ＿ｓｃＦｖとＥＧＦＲ−ＥＣＤリガンドの結合におけるＫＤが１０−６Ｍの桁である一方、二価ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｆｃおよび三価ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−ＣｏｌとＥＧＦＲの結合におけるＫＤはそれぞれ１０−７Ｍおよび１０−９Ｍの桁である（図８および表３）。二価および一価の対応物の明確なアビディティーを超える三価ｅｒｂ  ＣＳＡの同アビディティーにおける増大はそれぞれ約２０倍および約１０００倍である。注目すべきことに、ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌの解離速度定数（ｋｏｆｆ）が８．２２×１０−４ｓ−１でありかつｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｆｃにおいては９４．４×１０−４ｓ−１であり、それは三価種でのオフレートにおいて１１倍改善することを示している。
【０１９３】
ＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ−ＣｏｌおよびＯＫＴ３  ＩｇＧの、ヒトＣＤ３（＋）Ｔ細胞の細胞表面上のＣＤ３分子への結合における機能的親和性を、競合相手として飽和濃度（０．２５μｇ／ｍｌ）のＯＫＴ３−ＦＩＴＣを伴う抗体変位アッセイを用いるフローサイトメトリー分析により測定した。以下のすべての手順を４℃で実施した。ヒトＴ細胞を、ＦＣＭ緩衝液（２％ＦＢＳおよび０．１％アジ化ナトリウムを有するリン酸塩緩衝生理食塩水）中に１×１０６細胞／ｍｌの密度で懸濁した。細胞をすべてのマウスＩｇＧ（２μｇ／ｍｌ、ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））で３０分間処理し、次いで連続希釈したＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ−ＣｏｌまたはＯＫＴ３抗体とともに１時間インキュベートした。確定した（フローサイトメトリーによって決定した）飽和量のＦＩＴＣと抱合したＯＫＴ３（０．２５μｇ／ｍｌ、イーバイオサイエンス（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）から購入）を直接添加した。１時間のインキュベーション後、細胞をＦＣＭ緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、サンホセ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）、カリフォルニア州）上でのフローサイトメトリーにより免疫蛍光について分析した。データを、ブロッキング抗体の非存在下でのＴ細胞のＯＫＴ３−ＦＩＴＣによる染色によって得られる平均蛍光強度として定義される、最大蛍光強度の阻害率（％）として示した。最大蛍光強度の半分（ＩＣ５０）を阻害するのに必要とされる各ｍＡｂの濃度を計算した。
【０１９４】
ＯＫＴ３  ＩｇＧおよびＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ−ＣｏｌのヒトＣＤ３（＋）Ｔ細胞に対する結合アビディティーはＯＫＴ３  ＩｇＧにおいて１．３３ｎＭ、ＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌにおいて０．４５ｎＭであると評価された。したがって、ＩＣ５０値は三価ＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ−ＣｏｌのＣＤ３（＋）Ｔ細胞に対するアビディティーが二価ＯＫＴ３  ＩｇＧの場合よりも約３倍大きいことを示した（図９）。結果は、ＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ−ＣｏｌがヒトＣＤ３＋Ｔ細胞に天然マウスＯＫＴ３  ｍＡｂよりも強力に結合することを示した。
【０１９５】
したがって、表面プラズモン共鳴および細胞結合アッセイを用いて得られた結合分析結果は、三価ｅｒｂとＯＫＴ３  ＣＳＡの双方が結合アビディティーをそれらの二価対応物と比べて有意に改善することを示す。結合分析は、本発明の三量体可溶性抗体がナノモル範囲内の結合親和性を示しうることも示す。結果として、本発明の場合、可溶性三量体抗体におけるそのリガンドに対する高親和性が実現可能である。
【０１９６】
実施例１０
安定性および薬物動態アッセイ
血清安定性アッセイにおいては、様々な形態のｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌ、ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｆｃ、またはｅｒｂ＿ｓｃＦｖ抗体の安定性を、ヒト血清とともに３７℃でインキュベートすることにより測定した。異なる期間のインキュベーション時間経過後に残存する活性抗−ＥＧＦＲの量を定量ＥＬＩＳＡにより測定した。ＥＬＩＳＡを、（捕捉試薬として）組換えＥＧＦＲ−ＥＣＤおよび抗−ｃ−ｍｙｃ  ｍＡｂ（９Ｅ１０、シグマ・ケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、その後にＨＲＰと抱合した親和性精製されたポリクローナルヤギ抗−マウスＩｇＧおよび化学発光基質（ピアス・バイオテクノロジー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．））を用いて実施した。薬物動態アッセイにおいては、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス３匹を用いてｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌクリアランスを分析した。つまり、各マウスに、事前の採血（ｐｒｅ−ｂｌｅｅｄ）を行った後、２５μｇ（２ｍｇ／体重キログラム）のｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌを皮下注射した。次の７０時間にわたり、血液試料を定期的に採取し、同試料中のｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌの含量をＥＬＩＳＡにより評価した。
【０１９７】
コラーゲンドメインの三重らせん構造は、通常、非特異的なタンパク質分解酵素に抵抗性を示すコラーゲンを作る。ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌの血清安定性について試験し、ヒト血清中の各精製抗体変異体を３７℃で様々な期間インキュベートすることにより、ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｆｃおよびｅｒｂ＿ｓｃＦｖの血清安定性と比較した。様々なｅｒｂ抗体の免疫反応性をＥＬＩＳＡにより測定した。図１０Ａに示されるように、ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌは生理的温度でのヒト血清中でｅｒｂ＿ｓｖＦｖ−Ｆｃよりも安定であり、インキュベーションの７２時間以内でのその初期アビディティーは６０％保持された。ｅｒｂ＿ｓｃＦｖはヒト血清中で速やかに分解され、インキュベーションの１時間以内に保持されたその初期アビディティーは４０％未満であった。結果はｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌの三重らせんコラーゲン様ペプチドおよびｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−ＦｃのＦｃ領域が血清プロテアーゼによる消化に対してｅｒｂ＿ｓｃＦｖよりも抵抗性を示すことを示した。したがって、本発明の可溶性三量体抗体は、単量体抗体または二量体抗体よりも高い血清安定性を有しうる。
【０１９８】
図１０Ｂは、マウス内でのｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌの薬物動態学的特性を示す。ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌ２ｍｇ／ｋｇの単回静脈内投与後での２区画モデルの動態について測定した。免疫反応性の血漿レベルは、０．２１時間の分布相半減期（ｔ１／２α）および４．７８時間の最終消失相半減期（ｔ１／２β）の場合、二相的に低下した。
【０１９９】
Ｔ細胞増殖アッセイおよび混合リンパ球反応（ＭＬＲ）
５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の細胞増殖アッセイを実施した。つまり、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、６６時間かけて１０倍に連続希釈したＯＫＴ３（イーバイオサイエンス（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．））またはＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌの存在下で、３７℃で、１０％ＦＢＳを含有する１００μｌのＲＰＭＩ−１６４０培地内、ブラック９６ウェル平底組織培養プレート内に２×１０５細胞／ウェルで蒔いた。次いで、細胞に１０μＭのＢｒｄＵで６時間パルスした。培地を取り出した後、細胞を固定し、ＤＮＡをＦｉｘＤｅｎａｔを用いて１ステップで変性させた。その後、細胞をペルオキシダーゼで標識した抗−ＢｒｄＵ抗体（抗−ＢｒｄＵ  ＰＯＤ、Ｆａｂ断片）とともに室温で１．５時間インキュベートした。化学発光検出および定量をマイクロプレート−ルミノメータ（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）（ハイデックス（Ｈｉｄｅｘ）、ＣＨＡＭＥＬＥＯＮ検出プラットフォーム、フィンランド）を用いて行った。
【０２００】
一方向の混合リンパ球反応におけるＴ細胞の増殖および免疫抑制について以下のように評価した。ヒトＰＢＭＣを健常ドナー２名から得た（刺激物質（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）および応答物質（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ））。刺激物質または応答物質の細胞を、５％ＣＯ２を含有する３７℃の加湿空気中、完全培地（１０％ヒトＡＢ血清、２ｍＭグルタミン、５０ｎＭ  ２−メルカプトエタノール、および１００単位／ｍｌのペニシリンおよびストレプトマイシンの各々を補充したＲＰＭＩ１６４０）内で２５μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））で３０分間処理した後、ＲＰＭＩ１６４０培地内で３回洗浄した。応答物質細胞を、２００μｌの完全培地内、２×１０５細胞／ウェルで、単独かあるいはマイトマイシンＣで処理した刺激物質またはマイトマイシンＣの応答物質細胞と１：１の比で混合して培養した。精製ＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ−ＣｏｌまたはＯＫＴ３を、応答物質細胞を蒔いた直後に異なる濃度で培養物に添加した。５日後、培養細胞に１０μＭのＢｒｄＵをパルスし、２４時間後に採取した。次いで、細胞増殖アッセイを上記のように実施した。
【０２０１】
ＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ−ＣｏｌがＣＤ３（＋）Ｔ細胞に対する結合アビディティーの増大時に親ＯＫＴ３  ＩｇＧの場合を上回る免疫抑制活性を示しうるか否かを判定するため、双方における一方向の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）でのＴ細胞マイトジェン活性化について試験した。抗体治療を受けずに５日間インキュベートされた混合ＰＢＭＣ培養物（マイトマイシンＣで処理された刺激物質＋応答物質）中で、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）がＴ細胞活性化の同種刺激の結果として生じた（図１１Ｂ、塗りつぶした四角）。混合ＰＢＭＣ培養物をＯＫＴ３  ＩｇＧで処理することで、Ｔ細胞の増殖がさらに刺激される（図１１Ｂ、塗りつぶした丸）。それに対し、ＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌは用量依存的にＭＬＲを抑制し、１００ｎｇ／ｍｌの濃度でバックグラウンドレベルに達した（図１１Ｂ、白丸）。これらの結果は、ＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ−ＣｏｌがＴ細胞増殖の強力な免疫抑制剤である一方、インビトロで分裂促進性の低下を示すことを示している。
【０２０２】
サイトカインの測定
マウスＯＫＴ３のマイトジェン活性は、ＦｃＲ−陽性細胞への結合を介する広範囲のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）−ＣＤ３の架橋により誘発される。したがって、最近ではＦｃ受容体への結合を改変することにより抗−ＣＤ３の非マイトジェン形態を生じさせる努力がなされている。ＣＳＡ分子のモデルとしてＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌを生成し、それがＯＫＴ３  ＩｇＧのＦｃ領域とコラーゲン様ペプチドとの置換えにより非マイトジェンを示すか否かを試験した。ヒトＰＢＭＣを、１０倍に連続希釈したＯＫＴ３またはＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌの存在下、３７℃で１０％ＦＢＳを有する０．１ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０培地内に２×１０５細胞／ウェルで蒔いた。上清を異なる時点で回収し、複数のサイトカインをヒトサイトカインイムノアッセイキット（イーバイオサイエンス（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．））を用いて測定した。
【０２０３】
ＯＫＴ３  ＩｇＧおよびＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌにおける、Ｔ細胞増殖を誘発しかつ炎症性サイトカインおよび他のサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α）を放出する能力を測定した。予想どおり、ＯＫＴ３  ＩｇＧが極めて低用量でＴ細胞増殖およびサイトカイン産生を誘発する一方、検出不能なＴ細胞増殖またはサイトカイン産生がＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌによりそれが高濃度であっても誘発された（図１１Ａおよび図１２）。したがって、これらの結果は、ＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ−ＣｏｌがＯＫＴ３  ＩｇＧと異なりＴ細胞活性化特性を示さないことを示している。結果は、ＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌの投与により誘発されるサイトカイン放出がマウスＯＫＴ３  ＩｇＧの場合よりも極めて少ないことを示した。
【０２０４】
これらの結果は、ＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ−ＣｏｌがＴ細胞増殖の免疫抑制にてより有効である一方、Ｔ細胞増殖の刺激にて示されるマイトジェン活性は無視できることを示している。したがって、本発明の可溶性三量体抗体は分裂促進性を低下させている可能性がある。結果として、コラーゲン足場抗体は、抗腫瘍および免疫調節の用途のいずれであっても治療抗体の設計において望ましい構造でありうる。
【０２０５】
実施例１１
異種ドメインのＣ末端足場ドメインへの付着
先行研究によると、鎖間ジスルフィド結合された（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）１０の三重らせんが、コラーゲン様ペプチドに隣接するＣ末端またはＮ末端のタイプＩＩＩコラーゲンのジスルフィドノットにおける２０℃でのレドックス−シャッフリングプロセスによりインビトロで取得可能であることが報告された（非特許文献３０）。（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）１０がインビボでＣ末端の融合パートナーの三量体化を駆動可能であるか否かを検討するため、Ｎ末端のＴＣＰＰＣＰＲＳＩＰ（ＧＰＰ）１０ＧＩＣＤＰＳＬＣのペプチド配列をコードする合成コラーゲン足場遺伝子よりなるＣＳＡ分子、Ｃｏｌ−ｅｒｂ＿ｓｃＦｖおよびＣ末端のｅｒｂ＿ｓｃＦｖを生成した（図１３Ａ）。結果は、Ｃｏｌ−ｅｒｂ＿ｓｃＦｖにおける六量体の量がｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌのそれより少ないこと以外では、精製Ｃｏｌ−ｅｒｂ＿ｓｃＦｖがｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌにて観察された構造の特徴と類似した特徴を示すことを示した（図１３Ｂ）。したがって、（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）１０のペプチド足場はそれ自体でｓｃＦｖのＮ末端またはＣ末端における融合パートナーの三量体化を駆動することが可能である。
【０２０６】
実施例１２
ＣＳＡの三量体化を駆動するための要件
ＣＳＡ分子、ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−ＧＰＰ１０を生成することで、（ＧＰＰ）１０を含むコラーゲン様ペプチドがそれ自体でコラーゲン様ドメインの内部に存在するかまたはそれに隣接する任意の他の三量体化ドメインまたは鎖間架橋アミノ酸残基（ＣｙｓおよびＬｙｓなど）の援助なしに非共有結合状態の三量体融合タンパク質の形成を駆動しうることを実証した。ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−ＧＰＰ１０のコード領域は、Ｎ末端のｅｒｂ＿ｓｃＦｖのヌクレオチド配列およびＣ末端のＧＳＰ（ＧＰＰ）１０ＧＰＳＳＧＧのペプチド配列をコードする合成コラーゲン足場遺伝子を含んでいた（図１４Ａ）。図１４Ｂに示されるように、ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−ＧＰＰ１０は、ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌの還元／アルキル化された鎖間ジスルフィド結合構造の場合に類似した融解温度を有する、熱的に安定な三量体のみを形成する（図６Ａ）。その一方で、ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−ＧＰＰ１０はＥＧＦＲ−ＥＣＤに対して強力な結合アビディティーを保持し、それはｅｒｂ＿ｓｃＦｖが正確に折り畳まれることを示している（図１４Ｃ）。
【０２０７】
実施例１３
足場ドメインとして異なるコラーゲン様ペプチドを有するＣＳＡ分子の生成
ベクティビックス（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）（パニツムマブ；アムジェン（Ａｍｇｅｎ）、サウザンド・オークス（Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ）、カリフォルニア州、米国）から入手したｓｃＦｖである治療用の完全−ヒト抗−ＥＧＦＲ  ｍＡｂを用い、２つの異なるタイプのＣＳＡ、すなわち足場ドメインとして（ＧＰＰ）１０（図１５Ａ）および（ＧＰＰ）５ＧＫＰＧＫＰ（ＧＰＰ）６（図１６Ａ）という異なるコラーゲン様ペプチドをそれぞれ有する７６３＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌおよび７６３ＣＳＡ２を作成した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析によると、両ＣＳＡは三量体に組織化した（図１５Ｂおよび１６Ｂ）。７６３＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌは、親パニツムマブに等しい濃度でＥＧＦＲシグナル伝達を有効に遮断した（図１５Ｃ）。その一方で、７６３ＣＳＡ２は（ヒト上皮癌Ａ４３１細胞系から精製した）ＥＧＦＲに対する強力な結合アビディティーを保持し、それはｅｒｂ＿ｓｃＦｖが正確に折り畳まれることを示している（図１６Ｃ）。
【０２０８】
実施例１４
二重特異性ＣＳＡ分子の生成
二重特異性ＣＳＡ分子７６３ＣＳＡＯＫＴ３を生成することで、コラーゲン足場の自己三量体化が融合パートナーの両末端への付着を同時に可能にするという点で用途がより広いことを実証した（図１７Ａ）。４つの異なる安定なクローンに由来する分泌性７６３ＣＳＡＯＫＴ３を含有する培地をウエスタンブロット分析により試験した。７６３ＣＳＡＯＫＴ３分子は三量体構造内に構築されたものであり、同分子はおそらくは２つの三量体内の２つのＣ末端システイン残基間の鎖間ジスルフィド架橋を介してさらに六量体にオリゴマー化されうる（図１７Ｂ）。精製後、主要な形態の７６３ＣＳＡＯＫＴ３は非還元条件下で三量体として存在する（図１７Ｃ、レーン１）。
【０２０９】
自己三量体化コラーゲン足場の配置により、２つの大きい結合パートナーと同時に相互作用可能な分子の作成が可能である（各末端は最大３または６の結合価数を有する）ことから、上記の結果は重要な結果を有している。図１８に示されるように、二重特異性７６３ＣＳＡＯＫＴ３はＡ４３１（ＥＧＦＲ−陽性）とヒトＣＤ３（＋）Ｔ細胞を架橋可能である。結果として、７６３ＣＳＡＯＫＴ３は、様々なＥＧＦＲを発現する癌細胞に対してＴ細胞の細胞毒性を再び指示することが可能なＴ細胞のエンゲージャ（ｅｎｇａｇｅｒ）としての機能を果たしうる。
【０２１０】
実施例１５
二機能性ＣＳＡ分子の生成
二機能性ＣＳＡ分子、ｈ４Ｄ５ＣＳＡ−Ｌｕｃを図１９Ａに示されるように生成した。分泌性ｈ４Ｄ５ＣＳＡ−Ｌｕｃを含有する培地をクロマトグラフィーにより精製した。ｈ４Ｄ５ＣＳＡ−Ｌｕｃ分子は三量体構造内に構築されたものであり、同分子はおそらくは２つの三量体内の２つのＣ末端システイン残基間の鎖間ジスルフィド架橋を介してさらに六量体にオリゴマー化されうる（図１９Ｂ）。生物発光ＥＬＩＳＡを実施することで、ｈ４Ｄ５ＣＳＡ−ＬｕｃがＨＥＲ２／ｎｅｕの結合と生物発光活性の双方を保持することを実証した。図１９Ｃに示されるように、ＨＥＲ２／ｎｅｕを過剰発現するヒト卵巣ＳＫＯＶ−３癌細胞でコートされたウェル内に捕捉された精製ｈ４Ｄ５ＣＳＡ−Ｌｕｃがセレンテラジンに対する触媒能および濃度依存的な発光能を保持した。
【０２１１】
自己三量体化コラーゲン足場の配置により、結合パートナーと相互作用可能な分子の作成が可能であり（各末端は最大３または６の結合価数を有する）、かつ相互作用はＣ末端の二機能性ＣＳＡ分子のルシフェラーゼドメインを生物発光基質とともにインキュベートすることにより直接検出可能であることから、上記結果は重要な結果を有している。おそらくは、ｈ４Ｄ５ＣＳＡ−Ｌｕｃは、分子診断用または光学イメージング用の試薬としての機能を果たしうる。
【０２１２】
実施例１６
抗−ＴＮＦ−α  ＣＳＡの生成
ハイブリドーマ３５７−１０１−４細胞系（ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．９２０３０６０３）に由来するｓｃＦｖである、強力な中和活性を有するマウス抗−ヒトＴＮＦ−α  ｍＡｂを用い、ＣＳＡ分子３５７ｓｃＦｖ−Ｃｏｌを作成した。精製３５７＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌは、ｓｃＦｖ−Ｃｏｌの形式において観察される構造の特徴に類似した特徴を示す（図２０Ａ）。ＴＮＦ−αに誘発されるＬ９２９細胞のアポトーシスの３５７＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌおよび３５７ＩｇＧによる中和の程度を比較した。図２０Ｂに示されるように、３５７＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌは二価３５７ＩｇＧよりも約４倍強力な中和活性を示す。
【０２１３】
本明細書中に開示されるすべての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせ可能である。本明細書中に開示される各特徴は、同一、等価、または類似の目的に役立つ別の特徴によって置換え可能である。したがって、他に明示的に記述されない限り、開示される各特徴は一般的な一連の等価または類似の特徴の一例にすぎない。
【０２１４】
上記から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に確認し、かつその精神および範囲から逸脱することなく本発明の様々な変更および改良を行い、それを様々な使用および条件に適合させることができる。したがって、他の実施形態もまた添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれる。
【０２１５】
引用文献
Bachinger, H. P., Bruckner, P., Timpl, R., Prockop, D. J., and Engel, J. (1980). Folding mechanism of the triple helix in type-III collagen and type-III pN-collagen. Role of disulfide bridges and peptide bond isomerization. Eur J Biochem 106, 619-632.
【０２１６】
Berg, R. A., and Prockop, D. J. (1973). The thermal transition of a non-hydroxylated form of collagen. Evidence for a role for hydroxyproline in stabilizing the triple-helix of collagen. Biochem Biophys Res Commun 52, 115-120.
【０２１７】
Binz, H. K., Amstutz, P., Kohl, A., Stumpp, M. T., Briand, C, Forrer, P., Grutter,M. G, and Pluckthun, A. (2004). High-affinity binders selected from designed ankyrin repeat protein libraries. Nat Biotechnol 22, 575-582.
【０２１８】
Binz, H. K., Amstutz, P., and Pluckthun, A. (2005). Engineering novel binding proteins from nonimmunoglobulin domains. Nat Biotechnol 23, 1257-1268.
【０２１９】
Boudko, S., Frank, S., Kammerer, R. A., Stetefeld, J., Schulthess, T., Landwehr, R., Lustig, A., Bachinger, H. P., and Engel, J. (2002). Nucleation and propagation of the collagen triple helix in single-chain and trimerized peptides: transition from third to first order kinetics. J Mol Biol 317, 459-470.
【０２２０】
Carter, P., Presta, L., Gorman, C. M., Ridgway, J. B., Henner, D., Wong, W. L., Rowland, A. M., Kotts, C, Carver, M. E., and Shepard, H. M. (1992). Humanization of an anti-pl85HER2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci U S A 89, 4285-4289.
【０２２１】
Chopra, R. K., and Ananthanarayanan, V. S. (1982). Conformational implications of enzymatic proline hydroxylation in collagen. Proc Natl Acad Sci U S A 79, 7180-7184.
【０２２２】
Chou, M. Y., and Li, H. C. (2002). Genomic organization and characterization of the human type XXI collagen (COL21A1) gene. Genomics 79, 395-401.
【０２２３】
Dubel, S., Breitling, F, Kontermann, R., Schmidt, T., Skerra, A., and Little, M. (1995). Bifunctional and multimeric complexes of streptavidin fused to single-chain antibodies (scFv). J Immunol Methods 178, 201-209.
【０２２４】
Engel, J., Chen, H. T., Prockop, D. J., and Klump, H. (1977). The triple helix in equilibrium with coil conversion of collagen-like polytripeptides in aqueous and nonaqueous solvents. Comparison of the thermodynamic parameters and the binding of water to (L-Pro-L-Pro-Gly)n and (L-Pro-L-Hyp-Gly)n. Biopolymers 16, 601-622.
【０２２５】
Fietzek, P. P., and Kuhn, K. (1976). The primary structure of collagen. Int Rev Connect Tissue Res 7, 1-60.
【０２２６】
Frank, S., Boudko, S., Mizuno, K., Schulthess, T., Engel, J., and Bachinger, H. P. (2003). Collagen triple helix formation can be nucleated at either end. J Biol Chem 278, 7747-7750.
【０２２７】
Frank, S., Kammerer, R. A., Mechling, D., Schulthess, T., Landwehr, R., Bann, J.,Guo, Y., Lustig, A., Bachinger, H. P., and Engel, J. (2001). Stabilization of short collagen-like triple helices by protein engineering. J Mol Biol 308, 1081-1089.
【０２２８】
Graversen, J. H., Jacobsen, C., Sigurskjold, B. W., Lorentsen, R. H., Moestrup, S.K., Thogersen, H. C., and Etzerodt, M. (2000). Mutational analysis of affinity and selectivity of kringle-tetranectin interaction. Grafting novel kringle affinity ontp the tetranectin lectin scaffold. J Biol Chem 275, 37390-37396.
【０２２９】
Hakansson, K., Lim, N. K., Hoppe, H. J., and Reid, K. B. (1999). Crystal structure of the trimeric alpha-helical coiled-coil and the three lectin domains of human lung surfactant protein D. Structure 7, 255-264.
【０２３０】
Hakansson, K., and Reid, K. B. (2000). Collectin structure: a review. Protein Sci 9, 1607-1617.
【０２３１】
Harbury, P. B., Zhang, T., Kim, P. S., and Alber, T. (1993). A switch between two-, three-, and four-stranded coiled coils in GCN4 leucine zipper mutants. Science 262, 1401-1407.
【０２３２】
Holler, N., Tardivel, A., Kovacsovics-Bankowski, M., Hertig, S., Gaide, O., Martinon, F, Tinel, A., Deperthes, D., Calderara, S., Schulthess, T., et al. (2003). Two adjacent trimeric Fas ligands are required for Fas signaling and formation of a death-inducing signaling complex. Mol Cell Biol 23, 1428-1440.
【０２３３】
Holliger, P., and Hudson, P. J. (2005). Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nat Biotechnol 23, 1126-1136.
【０２３４】
Hoppe, H. J., Barlow, P. N., and Reid, K. B. (1994). A parallel three stranded alpha-helical bundle at the nucleation site of collagen triple-helix formation. FEBS Lett 344, 191-195.
【０２３５】
Ito, W., and Kurosawa, Y. (1993). Development of an artificial antibody system with multiple valency using an Fv fragment fused to a fragment of protein A. J Biol Chem 268, 20668-20675.
【０２３６】
Kivirikko, K. I., Myllyla, R., and Pihlajaniemi, T. (1992). Hydroxylation of proline and lysine residues in collagens and other animal and plant proteins. In Post-Translational Modifications of Proteins (Harding, J. J., and Crabbe, M. J. C, Eds.). CRC Press, Boca Raton, FL., 1-51.
【０２３７】
Li, H. C, Huang, C. C, Chen, S. F., and Chou, M. Y. (2005). Assembly of homotrimeric type XXI minicollagen by coexpression of prolyl 4-hydroxylase in stably transfected Drosophila melanogaster S2 cells. Biochem Biophys Res Commun 336, 375-385.
【０２３８】
Lynn, A. K., Yannas, I. V., and Bonfield, W. (2004). Antigenicity and immunogenicity of collagen. J Biomed Mater Res B Appl Biomater 71, 343-354.
【０２３９】
Mazzorana, M., Cogne, S., Goldschmidt, D., and Aubert-Foucher, E. (2001). Collagenous sequence governs the trimeric assembly of collagen XII. J Biol Chem 276, 27989-27998.
【０２４０】
Mohs, A., Silva, T., Yoshida, T., Amin, R., Lukomski, S., Inouye, M., and Brodsky, B. (2007). Mechanism of stabilization of a bacterial collagen triple helix in the absence of hydroxyproline. J. Biol. Chem. 282, 29757-29765.
【０２４１】
Nord, K., Gunneriusson, E., Ringdahl, J., Stahl, S., Uhlen, M., and Nygren, P. A. (1997). Binding proteins selected from combinatorial libraries of an alpha-helical bacterial receptor domain. Nat Biotechnol 15, 772-777.
【０２４２】
Persikov, A. V., Xu, Y., and Brodsky, B. (2004). Equilibrium thermal transitions of collagen model peptides. Protein Sci. 13:893-902.
【０２４３】
Persikov, A. V., Ramshaw, J. A. M., Kirkpatrick, A., and Brodsky, B. (2000). Amino acid propensities for the collagen triple-helix. Biochemistry 39, 14960-14967.
【０２４４】
Prockop, D. J., and Kivirikko, K. I. (1995). Collagens: molecular biology, diseases, and potentials for therapy. Annu Rev Biochem 64, 403-434.
【０２４５】
Queen, C, Schneider, W. P., Selick, H. E., Payne, P. W., Landolfi, N. E, Duncan, J.F., Avdalovic, N. M., Levitt, M., Junghans, R. P., and Waldmann, T. A. (1989). A humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor. Proc Natl Acad Sci U S A 86, 10029-10033.
【０２４６】
Rheinnecker, M., Hardt, C, Ilag, L. L., Kufer, P., Gruber, R., Hoess, A., Lupas, A., Rottenberger, C., Pluckthun, A., and Pack, P. (1996). Multivalent antibody fragments with high functional affinity for a tumor-associated carbohydrate antigen. J Immunol 157, 2989-2997.
【０２４７】
Riechmann, L., Clark, M., Waldmann, H., and Winter, G. (1988). Reshaping human antibodies for therapy. Nature 332, 323-327.
【０２４８】
Rosenbloom, J., Harsch, M., and Jimenez, S. (1973). Hydroxyproline content determines the denaturation temperature of chick tendon collagen. Arch Biochem Biophys 158, 478-484.
【０２４９】
Sakakibara, S., Inouye, K., Shudo, K., Kishida, Y., Kobayashi, Y., and Prockop, D.J. (1973). Synthesis of (Pro-Hyp-Gly) n of defined molecular weights. Evidence for the stabilization of collagen triple helix by hydroxypyroline. Biochim Biophys Acta 303, 198-202.
【０２５０】
Shaw, L. M., and Olsen, B. R. (1991). FACIT collagens: diverse molecular bridges in extracellular matrices. Trends Biochem Sci 16, 191-194.
【０２５１】
Sheriff, S., Chang, C. Y, and Ezekowitz, R. A. (1994). Human mannose-binding protein carbohydrate recognition domain trimerizes through a triple alpha-helical coiled-coil. Nat Struct Biol 1, 789-794.
【０２５２】
Skerra, A. (2000). Lipocalins as a scaffold. Biochim Biophys Acta 1482, 337-350.
【０２５３】
Weis, W. I., and Drickamer, K. (1994). Trimeric structure of a C-type mannose-binding protein. Structure 2, 1227-1240.
【０２５４】
Yang, W., Chan, V. C, Kirkpatrick, A., Ramshaw, J. A., and Brodsky, B. (1997). Gly-Pro-Arg confers stability similar to Gly-Pro-Hyp in the collagen triple-helix of host-guest peptides. J Biol Chem 272, 28837-28840.
【図面の簡単な説明】
【０２５５】
図面の簡単な説明
【図１】例えばヒトタイプＸＸＩミニコラーゲンまたは（ＧＰＰ）１０のコラーゲン様ドメインに由来するものなどの自己組織化した三重らせんコイルのコラーゲン足場ドメインおよび異種ドメインを有するタンパク質複合体を示す図面である。
【図２】図２Ａおよび２Ｂの各々は、（Ａ）ＯＫＴ３（抗−ＣＤ３）、５２８（抗−ＥＧＦＲ）、またはｅｒｂ（抗−ＥＧＦＲ）（各々、インフレームにヒトＩｇＧのヒンジ領域に融合される）に由来するアミノ末端ｓｃＦｖと、ヒトタイプＸＸＩミニコラーゲンのコラーゲン足場ドメインと、その次のヒスチジンタグとを有する三量体コラーゲン足場抗体（ＣＳＡ）の略図（点線：鎖間ジスルフィド結合）、および（Ｂ）タンパク質複合体のウエスタンブロッティングの結果の図面である。ＯＫＴ３ｍＣ２１は、ＯＫＴ３  ＩｇＧに由来するアミノ末端抗−ＣＤ３  ｓｃＦｖと、ヒトＩｇＧのヒンジ領域と、ヒトミニコラーゲンＸＸＩポリペプチドと、その次のヒスチジンタグとを有し、ＯＫＴ３ｍＣ２１ｆｄは、ＯＫＴ３  ＩｇＧに由来するアミノ末端抗−ＣＤ３  ｓｃＦｖと、ヒトＩｇＧのヒンジ領域と、ヒトミニコラーゲンＸＸＩポリペプチドと、その次のＴ４フィブリチンフォルドンドメインおよびヒスチジンタグとを有する。安定的に形質移入されたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２細胞由来の培地は、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動され、次いでタイプＸＸＩコラーゲン、３Ｅ２のＣ末端に対するモノクローナル抗体で免疫ブロットされた（Ｔ：鎖間ジスルフィド結合された三量体；Ｍｔ：鎖間ジスルフィド結合された三量体を有する単量体）。
【図３】アミノ末端ＯＫＴ３一本鎖抗体（ＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ）、ヒトＩｇＧのヒンジ領域、ヒトタイプＸＸＩミニコラーゲンのコラーゲン足場ドメイン、その次のＣ末端５２８一本鎖抗体（５２８＿ｓｃＦｖ）を有する二重特異性三量体ＣＳＡを示す図面である。
【図４】図４Ａ（ａ〜ｅ）および４Ｂ（ａ〜ｃ）は抗体の異なる形式の略図である。（Ａ）アミノ末端ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧのヒンジ領域、コラーゲン様ドメイン（ＧＰＰ）１０、およびタイプＸＸＩコラーゲンのカルボキシル末端ＮＣ１ドメインを有する三量体コラーゲン足場抗体ｓｃＦｖ−Ｃｏｌ（ａ）；アミノ末端ｓｃＦｖおよびコラーゲン様ドメインＧＳＰ（ＧＰＰ）１０ＧＰＳを有するｓｃＦｖ−ＧＰＰ１０（ｂ）；アミノ末端ジスルフィドノット（ＴＣＰＰＣＰＲＳＩＰ）、コラーゲン様ドメイン（ＧＰＰ）１０、その次のタイプＸＸＩコラーゲンのＮＣ１ドメインに由来するカルボキシル末端ジスルフィドノット（ＧＩＣＤＰＳＬＣ）およびｓｃＦｖを有するＣｏｌ−ｓｃＦｖ（ｃ）；アミノ末端ｓｃＦｖ１、ヒトＩｇＧのヒンジ領域、コラーゲン様ドメイン（ＧＰＰ）１０、その次のカルボキシル末端ジスルフィドノット（ＧＩＣＤＰＳＬＣ）およびｓｃＦｖ２を有するＢｉｓｃＦｖ−Ｃｏｌ（ｄ）；アミノ末端ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧのヒンジ領域、コラーゲン様ドメイン（ＧＰＰ）１０、その次のカルボキシル末端ジスルフィドノット（ＧＩＣＤＰＳＬＣ）およびルシフェラーゼを有するｓｃＦｖ−Ｃｏｌ−Ｌｕｃ（ｅ）；（Ｂ）左から右に、（ａ）免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、（ｂ）キメラ（ｓｃＦｖ−Ｆｃ）、および（ｃ）一本鎖抗体（ｓｃＦｖ、灰色領域）。点線：鎖間ジスルフィド結合。
【図５】図５Ａ〜Ｂは哺乳類細胞内での様々な抗体分子の精製および構造の特徴づけを示す。（Ａ）指示抗体は哺乳類細胞内で安定的に発現され、カラムクロマトグラフィーにより培地から精製された。試料は非還元条件下（レーン１〜５）および試料が５０ｍＭのＤＴＴで７０℃で１０分間処理される場合の還元条件下（レーン６〜１０）でＭＯＰＳ緩衝液を有する１０％  ＳＤＳ／ビス−トリスポリアクリルアミドゲル上で電気泳動された。（Ｂ）ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌ六量体が２つの三量体分子の鎖間ジスルフィド結合により形成される。精製されたｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌ（１ｍｇ／ｍｌ）は、１０ｍＭ  ＤＴＴの非存在下（レーン１）または存在下（レーン３）、３７℃で１時間インキュベートされた。さらにＤＴＴで処理された試料からの一定分量が５０ｍＭ  Ｎ−エチル−マレイミド（ＮＥＭ）と周囲温度で３０分間反応された（レーン２）。等量のタンパク質を有するすべての試料が、ランニング緩衝液として酢酸ナトリウムを有する７％  ＳＤＳ／トリス−酢酸塩ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動された。ゲルはクマシーブルーで染色された。「Ｍ」は分子量標準を示す。
【図６】図６Ａ〜Ｂはｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌの三量体構造の熱安定性を示す。（Ａ）２Ｍ尿素を含含有する５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中で精製されたｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌが周囲温度、１０ｍＭ  ＴＣＥＰの非存在下（レーン１〜３）または存在下（レーン４〜９）で処理された。還元された試料は周囲温度、５０ｍＭ  ＮＥＭでアルキル化された。等量のタンパク質を有するすべての試料が指示温度で１０分間加熱され、その直後にＳＤＳ−ローディング緩衝液が添加された。試料は、非還元条件下でＭＯＰＳ緩衝液を有する１０％  ＳＤＳ／ビス−トリスポリアクリルアミドゲル上で電気泳動された。ゲルはクマシーブルーで染色された。（Ｂ）（レーン４〜９からの）（ａ）における異なるインキュベーション温度での還元／アルキル化されたｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌの三量体レベルを定量化したものである。タンパク質バンドの密度が密度計を用いて定量された。各温度点での三量体および単量体の全体量が１００に正規化された。
【図７】図７は、酸加水分解後でのｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌのフェニルチオカルバミル（ＰＴＣ）アミノ酸誘導体のＨＰＬＣ溶出プロファイルを示す。酸加水分解後にｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌのフェニルイソチオシアネート（ｐｈｅｎｙｌｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）（ＰＩＴＣ）で誘導体化されたアミノ酸が逆相Ｃ１８シリカカラム上で分離され、ＰＴＣ発色団が２５４ｎｍで検出された。ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）誘導体のピーク位置が矢印で示される。
【図８】図８Ａ〜Ｃは、ＥＧＦＲの細胞外ドメインとｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌ（Ａ）、ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｆｃ（Ｂ）またはｅｒｂ＿ｓｃＦｖ（Ｃ）の間の相互作用の表面プラズモン共鳴分析を示す。各抗体は指示濃度で注射され、１０μｌ／分の流速で固定化ＥＧＦＲ細胞外ドメインを有する表面チップ上に流された。
【図９】ＯＫＴ３の変位アッセイを示す。ヒトＣＤ３（＋）Ｔ細胞が連続希釈したＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ−ＣｏｌまたはＯＫＴ３  ＩｇＧとともに１時間インキュベートされた。飽和量のＯＫＴ３−ＦＩＴＣが添加され、さらに１時間インキュベートされた。細胞が洗浄されて結合され、ＯＫＴ３−ＦＩＴＣがフローサイトメトリーにより定量された。値は、予め抗体のブロッキングを行わずにＯＫＴ３−ＦＩＴＣを添加することにより測定された最大蛍光の阻害率（％）として表される。
【図１０】図１０Ａ〜ＢはＣＳＡ分子の安定性を示す。（Ａ）ヒト血清中の様々な形態のｅｒｂ抗体の安定性。ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌ、ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｆｃまたはｅｒｂ＿ｓｃＦｖの安定性がヒト血清中、３７℃でのインキュベーションによって測定された。様々な期間のインキュベーション後に残存する活性を示す抗−ＥＧＦＲの量が抗−ｃ−ｍｙｃ  ｍＡｂを用いたＥＬＩＳＡにより測定された。（Ｂ）マウスにおけるｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌの薬物動態。雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対し、２ｍｇ／Ｋｇのｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌが静脈内注射された。血液試料が異なる時刻に採取された。血漿中のｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌレベルが、ＨＲＰと抱合したウサギ抗−ｃ−ｍｙｃ抗体を用いるＥＬＩＳＡにより測定された。結果は各時刻において動物３匹から平均化されたもので、エラーバー（ｅｒｒｏｒ  ｂａｒ）は標準偏差を示す。
【図１１】図１１Ａ〜ＢはＯＫＴ３に由来するＣＳＡが有効な免疫抑制活性で細胞分裂を引き起こさないことを示す。（Ａ）ＯＫＴ３  ＩｇＧおよびＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌに応答するＴ細胞増殖。ヒトＰＢＭＣが３つの健常ドナーから採取され、対数にて連続希釈したＯＫＴ３  ＩｇＧまたはＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌとともに個別に７２時間インキュベートされ、１０μＭのＢｒｄＵでさらに８時間パルスされた。細胞増殖が、化学発光イムノアッセイを用いるＢｒｄＵ−ＥＬＩＳＡにより測定され、ＤＮＡ合成の間でのＢｒｄＵの取込みが定量された。各点は３つのドナーの平均±標準偏差を示す。（Ｂ）混合リンパ球反応のＯＫＴ３  ＩｇＧおよびＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌによる阻害。マイトマイシンＣで処理された刺激物質ＰＢＭＣと混合された応答物質ＰＢＭＣが異なる濃度のＯＫＴ３  ＩｇＧ（黒丸）またはＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌ（白丸）の存在下で５日間共培養され、ＢｒｄＵでさらに１６時間パルスされた。細胞増殖はＢｒｄＵ−ＥＬＩＳＡにより測定された。抗体の非存在下でのマイトマイシンＣで処理された刺激物質ＰＢＭＣと混合された応答物質ＰＢＭＣおよび応答物質ＰＢＭＣの各々が塗りつぶした四角および塗りつぶした三角で示された。抗体の非存在下での未処理の刺激物質ＰＢＭＣの細胞増殖が白四角で示される。
【図１２】図１２Ａ〜Ｆは、ＯＫＴ３  ＩｇＧおよびＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌにより誘発されるサイトカインの放出を示す。ヒトＰＢＭＣが健常ドナー３名から採取され、対数にて連続希釈したＯＫＴ３  ＩｇＧ（黒丸）またはＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌ（白丸）とともに個別にインキュベートされた。培養上清中のＩＬ−２および残りの指示サイトカインのレベルが、ＥＬＩＳＡによりそれぞれ２４時間および７２時間経過した時点で測定された。各点は３つのドナーの平均±標準偏差を示す。
【図１３】図１３Ａ〜ＢはＣｏｌ−ｅｒｂ＿ｓｃＦｖの精製を示す。（Ａ）アミノ末端のジスルフィドノット（ＴＣＰＰＣＰＲＳＩＰ）、コラーゲン様ドメイン（ＧＰＰ）１０、その次のカルボキシル末端のタイプＸＸＩコラーゲンのＮＣ１ドメインに由来するジスルフィドノット（ＧＩＣＤＰＳＬＣ）およびｅｒｂ＿ｓｃＦｖ（抗−ＥＧＦＲ）を有するコラーゲン足場抗体、Ｃｏｌ−ｅｒｂ＿ｓｃＦｖの略図。（Ｂ）Ｃｏｌ−ｅｒｂ＿ｓｃＦｖの精製。マウス骨髄腫ＮＳ０細胞内で安定的に発現された組換えＣｏｌ−ｅｒｂ＿ｓｃＦｖがカラムクロマトグラフィーにより培地から精製された。試料は、非還元条件下（レーン１）および試料が５０ｍＭのＤＴＴで７０℃で１０分間処理される場合の還元条件下（レーン２）でＭＯＰＳ緩衝液を有する１０％  ＳＤＳ／ビス−トリスポリアクリルアミドゲル上で電気泳動された。ゲルはＩｍｐｅｒｉａｌ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎ溶液（ピアス・バイオテクノロジー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．））で染色された。
【図１４】図１４Ａ〜Ｃは、（ＧＰＰ）１０を含むＣＳＡのコラーゲン足場ペプチドがそれ自体で熱的に安定な非共有結合された三量体融合タンパク質の形成を駆動しうることを示す。（Ａ）ＣＳＡ、すなわちアミノ末端ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ（抗−ＥＧＦＲ）およびコラーゲン様ドメインＧＳＰ（ＧＰＰ）１０ＧＰＳを有するｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−ＧＰＰ１０の略図。（Ｂ）ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−ＧＰＰ１０の三量体構造の熱的安定性。２Ｍ尿素を含有する５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の精製ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−ＧＰＰ１０が、１０ｍＭ  ＴＣＥＰの非存在下（レーン１〜３）または存在下（レーン４〜９）で周囲温度で処理された。等量のタンパク質を有するすべての試料が指示温度で１０分間加熱され、その直後にＳＤＳ−ローディング緩衝液が添加された。試料は、非還元条件下でＭＯＰＳ緩衝液を有する１０％  ＳＤＳ／ビス−トリスポリアクリルアミドゲル上で電気泳動された。ゲルはＩｍｐｅｒｉａｌ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎ溶液（ピアス・バイオテクノロジー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．））で染色された。（Ｃ）ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−ＧＰＰ１０のＥＧＦＲ−ＥＣＤに対するＥＬＩＳＡによる結合。９６ウェルマイクロタイタープレートが１μｇ／ｍｌのＥＧＦＲ−ＥＣＤでコートされ、次いで様々な濃度の精製ｅｒｂ＿ｓｃＦｖ−ＧＰＰ１０およびＨＲＰと抱合した抗−ｃ−ｍｙｃ抗体とともにインキュベートされた。４５０ｎｍでの吸光度が測定された。
【図１５】図１５Ａ〜Ｃは７６３＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌの精製および特徴づけを示す。（Ａ）アミノ末端７６３＿ｓｃＦｖ（抗−ＥＧＦＲ）、変異ヒトＩｇＧのヒンジ領域、コラーゲン様ドメイン（ＧＰＰ）１０、その次のタイプＸＸＩコラーゲンのジスルフィドノット（ＧＩＣＤＰＳＬＣ）を有する７６３＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌの略図。（Ｂ）抗体は、マウス骨髄腫ＮＳ０細胞内で安定的に発現され、培地からカラムクロマトグラフィーにより精製された。試料は、非還元条件下（レーン１）および還元条件下（レーン２）で、ＭＯＰＳ緩衝液を有する１０％  ＳＤＳ／ビス−トリスポリアクリルアミドゲル上で電気泳動された。（Ｃ）ＥＧＦＲのＥＧＦに誘発されるチロシンリン酸化の７６３＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌによる阻害。Ａ４３１細胞が、７６３＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌ（０．２〜１５０ｎＭ）の非存在下または存在下で１６ｎＭ  ＥＧＦを伴う場合または伴わない場合に３０分間インキュベートされた。細胞溶解物が、還元条件下でＭＯＰＳ緩衝液を有する１０％  ＳＤＳ／ビス−トリスポリアクリルアミドゲル上で分離された。異なる細胞溶解物に由来する等量のタンパク質全体が各レーンにて負荷された。細胞溶解物中でのＥＧＦＲリン酸化が、抗−ホスホチロシンｍＡｂを用いるウエスタンブロッティングにより検出された。抗−β−アクチンがローディング対照として用いられた。抗体の非存在下でのＥＧＦに誘発されるＥＧＦＲチロシンリン酸化が１００％として指定された。
【図１６】図１６Ａ〜Ｃは７６３＿ＣＳＡ２の精製および特徴づけを示す。（Ａ）アミノ末端７６３＿ｓｃＦｖ（抗−ＥＧＦＲ）、変異ヒトＩｇＧのヒンジ領域、コラーゲン様ドメイン（ＧＰＰ）５ＧＫＰＧＫＰ（ＧＰＰ）６、その次のタイプＸＸＩコラーゲンのジスルフィドノット（ＧＩＣＤＰＳＬＣ）を有する７６３ＣＳＡ２の略図。（Ｂ）三量体の同定。試料は、非還元条件下（レーン２）で、ＭＯＰＳ緩衝液を有する１０％  ＳＤＳ／ビス−トリスポリアクリルアミドゲル上で電気泳動された。レーン１は分子量マーカーである。（Ｃ）７６３ＣＳＡ２のＥＧＦＲに対するＥＬＩＳＡによる結合。９６ウェルマイクロタイタープレートが１μｇ／ｍｌのＥＧＦＲでコートされ、次いで様々な濃度の精製７６３ＣＳＡ２およびＨＲＰと抱合した抗−ｃ−ｍｙｃ抗体とともにインキュベートされた。４５０ｎｍでの吸光度が測定された。
【図１７】図１７Ａ〜Ｃは二重特異性ＣＳＡ、７６３ＣＳＡＯＫＴ３の精製および特徴づけを示す。（Ａ）アミノ末端７６３＿ｓｃＦｖ（抗−ＥＧＦＲ）、変異ヒトＩｇＧのヒンジ領域、コラーゲン様ドメイン（ＧＰＰ）１０、その次のタイプＸＸＩコラーゲンのジスルフィドノット（ＧＩＣＤＰＳＬＣ）およびカルボキシル末端ＯＫＴ３＿ｓｃＦｖ（抗−ＣＤ３）を有する７６３ＣＳＡＯＫＴ３の略図。（Ｂ）組換え二重特異性７６３ＣＳＡＯＫＴ３抗体を含有する培地のウエスタンブロット分析。（１〜４に番号付けされた）４つの異なる安定なクローンに由来する一定分量２０μｌの培地が、非還元条件下および還元条件下でＭＯＰＳ緩衝液を有する１０％  ＳＤＳ／ビス−トリスポリアクリルアミドゲル上で分離され、次いで抗−ｃ−ｍｙｃ  ｍＡｂで免疫ブロットされた。結合抗体がペルオキシダーゼと抱合した抗−マウス二次抗体を用いて検出された。（Ｃ）７６３ＣＳＡＯＫＴ３の精製。マウス骨髄腫ＮＳ０細胞内で安定的に発現された組換え７６３ＣＳＡＯＫＴ３がカラムクロマトグラフィーにより培地から精製された。試料は、非還元条件下（レーン１）および試料が５０ｍＭのＤＴＴで７０℃で１０分間処理される場合の還元条件下（レーン２）で、ＭＯＰＳ緩衝液を有する１０％  ＳＤＳ／ビス−トリスポリアクリルアミドゲル上で電気泳動された。ゲルはＩｍｐｅｒｉａｌ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎ溶液（ピアス・バイオテクノロジー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．））で染色された。
【図１８】図１８Ａ〜Ｃは、二重特異性ＣＳＡ、７６３ＣＳＡＯＫＴ３、架橋Ａ４３１（ＥＧＦＲ−陽性）およびヒトＣＤ３（＋）Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析を示す。等量（１×１０６細胞）のＰＫＨ−６７で標識されたＡ４３１細胞とＰＫＨ−２６で標識されたＣＤ３（＋）Ｔ細胞が、組換え二重特異性７６３ＣＳＡＯＫＴ３抗体を有する培地の非存在下（Ａ）または１：４希釈物の存在下（Ｂ）；１：２希釈物の存在下（Ｃ）で混合された。
【図１９】図１９Ａ〜Ｂは、二機能性ＣＳＡ、ｈ４Ｄ５ＣＳＡ−Ｌｕｃの精製および特徴づけを示す。（Ａ）アミノ−末端ｈ４Ｄ５＿ｓｃＦｖ（抗−ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、変異ヒトＩｇＧのヒンジ領域、コラーゲン様ドメイン（ＧＰＰ）１０、その次のタイプＸＸＩコラーゲンのジスルフィドノット（ＧＩＣＤＰＳＬＣ）およびカルボキシル末端ガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）ルシフェラーゼを有するｈ４Ｄ５ＣＳＡ−Ｌｕｃの略図。（Ｂ）ｈ４Ｄ５ＣＳＡ−Ｌｕｃの精製。マウス骨髄腫ＮＳ０細胞内で安定的に発現された組換えｈ４Ｄ５ＣＳＡ−Ｌｕｃが、カラムクロマトグラフィーにより培地から精製された。試料は、非還元条件下（レーン２）および試料が５０ｍＭのＤＴＴで７０℃で１０分間処理される場合の還元条件下（レーン３）で、ＭＯＰＳ緩衝液を有する１０％  ＳＤＳ／ビス−トリスポリアクリルアミドゲル上で電気泳動された。ゲルはＩｍｐｅｒｉａｌ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎ溶液（ピアス・バイオテクノロジー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．））で染色された。レーン１は分子量マーカーである。（Ｃ）ｈ４Ｄ５ＣＳＡ−ＬｕｃのＳＫＯＶ−３細胞上で過剰発現されたＨＥＲ２／ｎｅｕに対するＥＬＩＳＡによる結合。９６ウェルマイクロプレートが５×１０４細胞／ウェルでコートされ、２倍に連続希釈した精製ｈ４Ｄ５ＣＳＡ−Ｌｕｃとともにインキュベートされた。ＰＢＳ／１％  ＢＳＡでのプレートの洗浄後、結合抗体がセレンテラジンの添加により検出され、生物発光値がマイクロプレートルミノメータを用いて取得された。試料が３通りにアッセイされた。
【図２０】図２０Ａ〜Ｂは３５７＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌの精製および特徴づけを示す。（Ａ）抗体は、マウス骨髄腫ＮＳ０細胞内で安定的に発現され、カラムクロマトグラフィーにより培地から精製された。試料は、非還元条件下（レーン１）および還元条件下（レーン２）で、ＭＯＰＳ緩衝液を有する１０％  ＳＤＳ／ビス−トリスポリアクリルアミドゲル上で電気泳動された。（Ｂ）ＴＮＦ−αに誘発されるＬ９２９細胞のアポトーシスの３５７＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌおよび３５７  ＩｇＧによる中和。Ｌ９２９マウス線維芽細胞（５×１０３細胞）が、２μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤおよび１０ｎｇ／ｍｌのヒト組換えＴＮＦ−αを含有する、異なる濃度の３５７＿ｓｃＦｖ−Ｃｏｌまたは３５７  ＩｇＧのいずれかとともに２４時間インキュベートされた。ＴＮＦ−αに誘発される細胞の細胞毒性がＭＴＴアッセイにより測定された。生存細胞の数が４６０ｎｍでの光学密度の測定により判定された。抗体によるＴＮＦ−αの中和については、式％中和＝１００×（細胞毒性ｃｔｒｌ−細胞毒性Ａｂ）／細胞毒性ｃｔｒｌ；％細胞毒性＝１００×（Ａｃｔｒｌ−Ａｔｅｓｔ）／Ａｃｔｒｌ（式中、Ａｃｔｒｌは（ＴＮＦ−αを伴わない）対照ウェル内の吸光度であり、ＡｔｅｓｔはＴＮＦ−α（細胞毒性ｃｔｒｌ）またはＴＮＦ−α＋抗体（細胞毒性Ａｂ）を伴う場合のウェル内の吸光度であった）を用いて計算された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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