(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
結腸直腸癌を有する哺乳動物対象が第１または第２のグループのいずれに属するかを決定する方法であって、第１のグループの対象の予後が第２のグループの対象の予後よりも良く、
ａ）対象由来の早期に得られたサンプルの少なくとも一部におけるＲＢＭ３タンパク質の量を評価し、評価された量に対応するサンプル値を決定し、
ｂ）該サンプル値をあらかじめ決められた参照値と比較し、
該サンプル値が該参照値よりも高いとき、
ｃ１）該対象が第１のグループに属すると結論づけ、
該サンプル値が該参照値以下であるとき、
ｃ２）該対象が第２のグループに属すると結論づける
工程を含む方法。
【請求項２】
結腸直腸癌を有する対象が結腸直腸の処置レジメンでの処置の必要性がないか否かを決定する方法であって、
ａ）対象由来の早期に得られたサンプルの少なくとも一部に存在するＲＢＭ３タンパク質の量を評価し、該評価された量に対応するサンプル値を決定し、
ｂ）工程ａ）において得られたサンプル値を参照値と比較し、
該サンプル値が該参照値よりも高いとき、
ｃ）該対象が結腸直腸癌の処置レジメンでの処置の必要性がないと結論づける
工程を含む方法。
【請求項３】
結腸直腸癌を有する対象に対する非処置戦略方法であって、
ａ）対象由来の早期に得られたサンプルの少なくとも一部に存在するＲＢＭ３タンパク質の量を評価し、該評価された量に対応するサンプル値を決定し、
ｂ）工程ａ）において得られたサンプル値を参照値と比較し、
該サンプル値が該参照値よりも高いとき、
ｃ）結腸直腸癌の処置レジメンでの該対象の処置を控える
ことを含む方法。
【請求項４】
該結腸直腸癌がデュークスステージＢであり、該結腸直腸癌の処置レジメンが化学療法剤でのアジュバント全身的処置である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
該結腸直腸癌がデュークスステージＣであり、該結腸直腸癌の処置が
第１の化学療法剤、および
第２の化学療法剤または免疫療法剤
を含むアジュバント併用療法である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項６】
該結腸直腸癌がＳ状結腸に位置する、請求項１−５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
工程ａ）が
ａｌ）評価されるＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能である定量化可能なアフィニティーリガンドを該サンプルに適用し、該適用は、サンプルに存在するＲＢＭ３タンパク質へのアフィニティーリガンドの結合を可能にする条件下で実施し、
ａｌｌ）該サンプルに結合したアフィニティーリガンドを定量し、該量を評価する
ことを含む、請求項１−６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
請求項１−７のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、
ａ）２０以下のアミノ酸からなり、配列番号：６のアミノ酸配列を含む、ＲＢＭ３タンパク質フラグメントと選択的相互作用が可能である定量化可能なアフィニティーリガンド、および
ｂ）該定量化可能なアフィニティーリガンドの量を定量するために必要な試薬
を含むキット。
【請求項９】
結腸直腸癌に対する予後診断マーカーとしてのＲＢＭ３タンパク質のインビトロでの使用。
【請求項１０】
結腸直腸癌を有する哺乳動物対象に対する予後を確立するための予後診断薬の選択または精製のための、ＲＢＭ３タンパク質またはその抗原的に活性なフラグメントのインビトロでの使用。
【請求項１１】
結腸直腸癌を有する哺乳動物対象に対する予後を確立するための予後診断薬の生産のための、ＲＢＭ３タンパク質またはその抗原的に活性なフラグメントの使用。
【請求項１２】
２０以下のアミノ酸からなり、配列番号：６のアミノ酸配列を含む、ＲＢＭ３タンパク質フラグメントと選択的相互作用が可能であるアフィニティーリガンド。
【請求項１３】
結腸直腸癌に対する予後診断薬としての、ＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能であるアフィニティーリガンドのインビトロでの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、結腸直腸癌の予後診断および結腸直腸癌の処置の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
癌
癌は、西欧諸国において最も一般的な疾患および死の原因の１つである。一般的に、発生率は、癌の多数の形態に対して年齢とともに増加する。一般健康状態の増加によってヒト集団が長生きし続けるため、癌はより多くの個体に影響し得る。多数の一般的な癌型の原因は、未だほとんど知られていないが、環境因子（食生活、タバコの煙、ＵＶ放射など）ならびに遺伝因子（ｐ５３、ＡＰＣ、ＢＲＣＡ１、ＸＰなどのような「癌遺伝子」の生殖細胞株変異）と癌の発症の危険性の関連を提供する知識体系が増加している。
【０００３】
癌は本質的に細胞疾患であり、網状の細胞増殖および反社会的行動を有する形質転換細胞集団として定義されるという事実にもかかわらず、細胞生物学的観点から完全に満足する癌の定義がない。悪性転換は、不可逆性遺伝子変化に基づく悪性表現型への移行を示す。これは正式に証明されていないが、悪性転換は１つの細胞に起こり、次に、これから腫瘍が生じると考えられている（「癌のクローン」ドグマ）。発癌は、癌が産生することによるプロセスであり、一般的に、最終的に悪性腫瘍の増殖を生じる多数の事象を含むことが認められる。この多工程プロセスは、いくつかの律速工程、例えば、変異の付加および恐らくエピジェネティック事象を含み、前癌性増殖の工程の後の癌形成を引き起こす。工程的変化は、細胞分裂、反社会的行動および細胞死を決定する生命維持に必要な調節経路における誤り（変異）の蓄積を含む。これらそれぞれの変化は、周囲細胞と比較して、増殖においてダーウィン的な選択優位性利点が与えられ、腫瘍細胞集団の網状の増殖をもたらし得る。悪性腫瘍は、必ずしも形質転換された腫瘍細胞それら自体だけからならず、支持的基質として作用する周囲正常細胞からもなる。この動員された癌の基質は、形質転換された腫瘍細胞に継続している腫瘍増殖のために必要なシグナルを提供するために共同する結合組織、血管および種々の他の正常細胞、例えば、炎症性細胞からなる。
【０００４】
癌の最も一般的な形態は、体細胞で生じ、主に上皮性起源、例えば、前立腺、乳房、結腸、尿路上皮および皮膚、次に造血系起源の癌、例えば、白血病およびリンパ腫、神経外胚葉、例えば、悪性神経膠腫、および軟組織腫瘍、例えば、肉腫である。
【０００５】
癌診断および予後診断
腫瘍から得られる組織切片の顕微鏡的評価は、癌の診断の決定のためのすばらしい標準を維持している。例えば、顕微鏡的診断のために、疑わしい腫瘍由来の生検材料を回収し、顕微鏡下で試験する。確定診断を得るために、腫瘍組織をホルマリンに固定し、組織処理し(histo-processed)、パラフィン包埋する。得られるパラフィンブロックから、組織切片を生産し、組織化学的な、すなわち、ヘマトキシリン−エオシン染色、および免疫組織化学的（ＩＨＣ）方法の両方を使用して染色することができる。次に、外科的標本を肉眼的および顕微鏡分析を含む病理学的技術で評価する。この分析は、しばしば、特定の診断への割り当て、すなわち、腫瘍型の分類および悪性腫瘍、腫瘍の程度の等級付けの基礎を形成する。
【０００６】
悪性腫瘍は、それぞれの癌型に対して特異的な分類体系にしたがって、いくつかの期に分類することができる。固形腫瘍に対する最も一般的な分類系は、腫瘍−リンパ節−転移（ＴＮＭ）病期分類システムである。Ｔ期は、原発性腫瘍の局所程度、すなわち、腫瘍が周囲組織へ増殖が侵入および浸潤している程度を示し、Ｎ期およびＭ期は、リンパ節への腫瘍の広がりを示すＮ期および他の遠隔臓器における腫瘍の増殖を示すＭ期で、腫瘍が転移を発症しているかどうかを示す。初期工程は、陰性リンパ節で限局性腫瘍を示すＴ０−１、Ｎ０、Ｍ０を含む。さらに進行した工程は、より広い増殖を含む限局性腫瘍を示すＴ２−４、Ｎ０、Ｍ０、およびリンパ節へ転移した腫瘍を示すＴ１−４、Ｎ１−３、Ｍ０、および遠隔臓器において検出される転移を有する腫瘍を示すＴ１−４、Ｎ１−３、Ｍ１を含む。腫瘍の病期分類は、しばしば、外科的、放射線学的および組織病理学的分析を含む検査のいくつかの形態に基づく。病期分類に加えて、多数の腫瘍型に対して、また、悪性腫瘍のレベルを等級付けするための分類系がある。評点方式は、腫瘍組織サンプルの形態学的評価に頼り、所定の腫瘍において見られる顕微鏡的特徴に基づく。これらの評点方式は、腫瘍細胞の分化、増殖および非典型的な外観の程度に基づき得る。一般的に使用される評点方式の例は、前立腺癌腫に対するグリーソン分類および乳房癌腫に対するノッティンガム組織学的グレード（ＮＨＧ）等級付けを含む。
【０００７】
正確な病期分類および等級付けは、正しい診断のために重要であり、予後を予測するための道具を提供し得る。特異的な腫瘍に対する診断および予後診断情報は、次に、所定の癌患者に対する十分な治療戦略を決定する。腫瘍に関するさらなる情報を得るために、組織切片の組織化学的染色に加えて、一般的に使用される方法は、免疫組織化学的染色である。ＩＨＣは、特異的抗体を使用して、組織および細胞におけるタンパク質発現パターンの検出を可能にする。臨床診断におけるＩＨＣの使用は、組織化学的に染色された腫瘍組織切片から評価される組織構造学および細胞形態学に関する情報に加えて、異なる細胞集団における免疫反応の検出を可能にする。ＩＨＣは、原発性腫瘍の正確な診断、例えば、病期分類および等級付けのサポートに、ならびに未知の起源の転移の診断に関与することができる。今日、臨床診療において最も一般的に使用される抗体は、細胞型「特異的な」タンパク質に対する抗体、例えば、ＰＳＡ（前立腺）、ＭｅｌａｎＡ（メラニン細胞）およびサイログロブリン（甲状腺）および中間径フィラメントを認識する抗体（上皮性、間葉性、グリア）、分化の一群（ＣＤ）の抗原（造血、リンパ細胞の下位分類）ならびに悪性度のマーカー、例えば、Ｋｉ６７（増殖）、ｐ５３（一般的に変異した腫瘍抑制遺伝子）およびＨＥＲ−２（増殖因子受容体）を含む。
【０００８】
ＩＨＣを除いて、遺伝子増幅を検出するためのインサイチュハイブリダイゼーションおよび変異分析のための遺伝子シーケンシングの使用は、癌診断の発展している科学技術である。加えて、転写産物、タンパク質または代謝産物のグローバル分析の全てを関連情報に加える。しかしながら、多数のこれらの分析は未だ基礎研究であり、臨床医学における使用に対して評価され、標準化されていない。
【０００９】
結腸および直腸由来の腺癌（結腸直腸癌）
結腸直腸癌は、世界中でヒトの癌の最も一般的な形態の１つである腺癌として存在する悪性上皮性腫瘍である。Ｐａｒｋｉｎらにより提示されたＧＬＯＢＯＣＡＮ  ２００２データベースからのデータは、結腸直腸癌の約１００万の新たな症例が毎年同定されることを示している（Parkin DM et al (2005) CA Cances J Clin 55, 74-108）。さらに、世界における結腸直腸癌の発生率はすべての癌の約９．４％であり、結腸直腸癌は西欧諸国における一般的な死亡原因としては２番目である。結腸直腸癌の５年生存率は西欧諸国において約６０％であるが、東欧およびインドにおいて３０％の低さである。
【００１０】
腫瘍の早期検出および切除を伴う手術は、現在、処置の成功のために極めて重要である。限局性腫瘍、すなわち転移性疾患に進行していない腫瘍において、腫瘍および周囲の腸および組織の根治的切除を伴う外科的介入が実施される。結腸直腸腫瘍は、デュークスステージ(Dukes' stage)Ａ−Ｄまたは最近のＴＮＭ分類にしたがっていくつかのステージに分類される。初期工程の腫瘍（デュークスステージＡおよびＢ）は一般的に比較的好ましい結果と関連するが、転移を示す後期腫瘍（デュークスステージＣおよびＤ）は乏しい生存率である。不幸なことに、結腸直腸癌は、しばしば、検出前にかなりの大きさに増殖しており、したがって転移は珍しくない。腫瘍は、一般的に、局所リンパ節に転移するが、肝臓および肺への遠隔転移も一般的である。
【００１１】
症状は遠位胃腸管における腫瘍が位置する場所に依存し、腸の苦痛、下痢、便秘、疼痛および貧血（腫瘍から腸への出血に続発）を含む。現行の診断は、患者の病歴、臨床および内視鏡検査（直腸鏡検査および結腸鏡検査）と、所望によりその後の腫瘍増殖の広がりを判定するための放射線学的マッピングに基づく。内視鏡検査と共に、組織生検は疑わしい病変から行われる。
【００１２】
鑑別診断において、ＧＩ管の腺細胞において富んでいる中間径フィラメントマーカーであるサイトケラチン２０（ＣＫ２０）は、一般的に、結腸直腸癌を含むＧＩ管における原発性腫瘍を診断するために使用される。ＣＫ２０マーカーは、いくつかの他の腺癌もＣＫ２０抗体に対して陽性でありうる一方、すべての結腸直腸癌が陽性であるとは限らない。さらなる予後診断データを提供する評点方式またはタンパク質マーカーが認められていないため、予後診断情報は主に腫瘍病期分類から得られる。今日、生存率の減少を伴う高度に悪性な腫瘍と、転移疾患への発症に関して低い悪性の腫瘍グレードおよび低い危険性の腫瘍を区別することができる利用できるマーカーがない。したがって、患者の結果を予測し、治療的介入を含む患者管理を案内するために使用することができる分子マーカーの必要性がある。
【００１３】
エンドポイント分析
癌に対するアジュバント処置での試験に関するエンドポイント分析は、患者が特定の治療に応答するかについての重要な情報を与える。全生存（ＯＳ）は、標準一次エンドポイントと長期にわたって考えられている。ＯＳは、原因、例えば、死が癌によるか否かにかかわらず、死までの時間を説明するために取り入れる。追跡調査を打ち切ると、局所再発、遠隔転移、二次原発性結腸直腸癌および二次の他の原発性癌が黙認される。
【００１４】
今日、多数の型の癌において増加している利用できる有効な処置は、アジュバント処置の効果のより良い評価を可能にするために、代理エンドポイントの必要性をもたらす。したがって、アジュバント処置がＯＳを改善することを証明するために必要とされる非常に長い追跡調査は、しばしば、処置が成功するかについての早期適応を与える他の臨床エンドポイントで補足される。
【００１５】
本明細書において、患者コホートはＯＳ分析により評価され、しかしながら、代理エンドポイントも、すなわち無疾患生存（ＤＦＳ）も考慮される。ＤＦＳの分析は、同じ癌に関連するあらゆる事象に対する時間を含む。すなわち、全ての癌の再発および同じ癌による死が事象である。
【００１６】
簡単な説明
結腸直腸癌の予後を確立するための方法を提供することが、本明細書のいくつかの局面の目的である。
【００１７】
さらに、結腸直腸癌の処置関連情報を提供すること、いくつかの局面において、処置を実施することが、本明細書のいくつかの局面の目的である。
【００１８】
また、予後診断または処置関連情報を得るために有用な、上記方法および他の方法の一方または両方を実施するためのキットを提供することが、本明細書のいくつかの他の局面の目的である。
【００１９】
以下は、その局面において本発明により提供される種々の特徴および組合せを提供する目的のために示される、非限定的かつ項目別の本明細書の態様である。
【発明の概要】
【００２０】
項目
１．結腸直腸癌を有する哺乳動物対象が第１または第２のグループのいずれに属するかを決定する方法であって、第１のグループの対象の予後が第２のグループの対象の予後よりも良く、
ａ）対象由来の早期に得られたサンプルの少なくとも一部におけるＲＢＭ３タンパク質の量を評価し、評価された量に対応するサンプル値を決定し、
ｂ）該サンプル値をあらかじめ決められた参照値と比較し、
該サンプル値が該参照値よりも高いとき、
ｃ１）該対象が第１のグループに属すると結論づけ、
該サンプル値が該参照値以下であるとき、
ｃ２）該対象が第２のグループに属すると結論づける
工程を含む方法。
【００２１】
２．結腸直腸癌を有する哺乳動物対象に対する予後が参照予後よりも良いか否かを決定する方法であって、
ａ）対象由来の早期に得られたサンプルの少なくとも一部に存在するＲＢＭ３タンパク質の量を評価し、該評価された量に対応するサンプル値を決定し、
ｂ）工程ｂ）において得られたサンプル値を該参照予後と関連する参照値と比較し、
該サンプル値が該参照値よりも高いとき、
ｃ）該対象に対する予後が該参照予後よりも良いと結論づける
工程を含む方法。
【００２２】
３．結腸直腸癌を有する哺乳動物対象に対する予後が参照予後以上に悪いか否かを決定する方法であって、
ａ）対象由来の早期に得られたサンプルの少なくとも一部に存在するＲＢＭ３タンパク質の量を評価し、該評価された量に対応するサンプル値を決定し、
ｂ）工程ｂ）において得られたサンプル値を該参照予後と関連する参照値と比較し、
該サンプル値が参照値以下であるとき、
ｃ）該対象に対する予後が該参照予後以上に悪いと結論づける
工程を含む方法。
【００２３】
４．結腸直腸癌を有する対象が結腸直腸の処置レジメンでの処置の必要性がないか否かを決定する方法であって、
ａ）対象由来の早期に得られたサンプルの少なくとも一部に存在するＲＢＭ３タンパク質の量を評価し、該評価された量に対応するサンプル値を決定し、
ｂ）工程ｂ）において得られたサンプル値を参照値と比較し、
該サンプル値が該参照値よりも高いとき、
ｃ）該対象が結腸直腸癌の処置レジメンでの処置の必要性がないと結論づける
工程を含む方法。
【００２４】
５．結腸直腸癌を有する対象に対する非処置戦略方法であって、
ａ）対象由来の早期に得られたサンプルの少なくとも一部に存在するＲＢＭ３タンパク質の量を評価し、該評価された量に対応するサンプル値を決定し、
ｂ）工程ｂ）において得られたサンプル値を参照値と比較し、
該サンプル値が該参照値よりも高いとき、
ｃ）結腸直腸癌の処置レジメンでの該対象の処置を控える
工程を含む方法。
【００２５】
６．結腸直腸癌を有する対象の処置の方法であって、
ａ）対象由来のサンプルの少なくとも一部に存在するＲＢＭ３タンパク質の量を評価し、該評価された量に対応するサンプル値を決定し、
ｂ）工程ｂ）において得られたサンプル値を参照値と比較し、
該サンプル値が該参照値以下であるとき、
ｃ）該対象を結腸直腸癌の処置レジメンで処置する
工程を含む方法。
【００２６】
７．該結腸直腸癌の処置レジメンがネオアジュバント療法および／またはアジュバント療法である、項目４−６のいずれかに記載の方法。
【００２７】
８．該ネオアジュバント療法が放射線療法であり、該アジュバント療法が結腸直腸癌化学療法、結腸直腸癌免疫療法、放射線療法およびそれらの組合せから選択される、項目７に記載の方法。
【００２８】
９．該結腸直腸癌がデュークスステージＢであり、該結腸直腸癌の処置レジメンが化学療法剤でのアジュバント全身的処置である、項目７または８に記載の方法。
【００２９】
１０．該結腸直腸癌がデュークスステージＣであり、該結腸直腸癌の処置が
第１の化学療法剤および
第２の化学療法剤または免疫療法剤
を含むアジュバント併用療法である、項目７または８に記載の方法。
【００３０】
１１．該結腸直腸癌がＳ状結腸(sigmoideum)に位置する、前記項目のいずれかに記載の方法。
【００３１】
１２．該予後が生存、例えば、全生存または無病生存の可能性であり、該参照予後が生存、例えば、全生存または無病生存の参照可能性であり、両方の生存が同じ型の生存である、項目１−３のいずれかに記載の方法。
【００３２】
１３．生存の可能性が５年、１０年または１５年生存の可能性である、項目１２に記載の方法。
【００３３】
１４．該結腸直腸癌がデュークスステージＡまたはＢである、項目１−９および１１−１３のいずれかに記載の方法。
【００３４】
１５．該結腸直腸癌がデュークスステージＣまたはＤである、項目１−８および１０−１３のいずれかに記載の方法。
【００３５】
１６．該結腸直腸癌が結腸直腸癌腫である、前記項目のいずれかに記載の方法。
【００３６】
１７．該サンプルが体液サンプル、糞便サンプルまたは細胞学サンプルである、前記項目のいずれかに記載の方法。
【００３７】
１８．該体液サンプルが血液、血漿、血清、脳脊髄液、尿、精液および滲出液からなる群から選択される、項目１７に記載の方法。
【００３８】
１９．該サンプルが該対象由来の細胞、例えば、腫瘍細胞または間質細胞を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
【００３９】
２０．該サンプルが組織サンプルである、項目１−１６のいずれかに記載の方法。
【００４０】
２１．該組織サンプルが腫瘍細胞または間質細胞を含む、項目２０に記載の方法。
【００４１】
２２．該組織サンプルが結腸または直腸由来である、項目２１に記載の方法。
【００４２】
２３．該組織サンプルがＳ字結腸由来である、項目２２に記載の方法。
【００４３】
２４．工程ａ）の評価が該サンプルの細胞の核および／または細胞質に限定される、項目１９−２３のいずれかに記載の方法。
【００４４】
２５．工程ａ）の評価が該サンプルの腫瘍細胞の核および／または細胞質に限定される、項目２４に記載の方法。
【００４５】
２６．該対象がヒトである、前記項目のいずれかに記載の方法。
【００４６】
２７．該対象が男性または女性である、前記項目のいずれかに記載の方法。
【００４７】
２８．該参照値が参照サンプルにおけるあらかじめ決められた量のＲＢＭ３タンパク質に対応する値である、前記項目のいずれかに記載の方法。
【００４８】
２９．工程ａ）のサンプル値が、サンプルにおける検出可能なＲＢＭ３タンパク質の存在に対応する１、またはサンプルにおける検出可能なＲＢＭ３タンパク質の非存在に対応する０のいずれかであると決定される、前記項目のいずれかに記載の方法。
【００４９】
３０．工程ｂ）の参照値が検出可能なＲＢＭ３タンパク質を有さない参照サンプルに対応する、前記項目のいずれかに記載の方法。
【００５０】
３１．工程ｂ）の参照値が０である、前記項目のいずれかに記載の方法。
【００５１】
３２．該参照値が核画分、核強度、または核画分および核強度の画分(function)である、前記項目のいずれかに記載の方法。
【００５２】
３３．該参照値が５０−９０％のＲＢＭ３タンパク質陽性細胞の核画分である、項目３２に記載の方法。
【００５３】
３４．該参照値が０−１０％のＲＢＭ３タンパク質陽性細胞の核画分である、項目３２に記載の方法。
【００５４】
３５．該参照値が中程度の核強度である、項目３２に記載の方法。
【００５５】
３６．該参照値が存在しない核強度である、項目３２に記載の方法。
【００５６】
３７．該参照値が細胞質画分、細胞質強度、または細胞質画分および細胞質強度の画分である、項目１−３１のいずれかに記載の方法。
【００５７】
３８．該参照値が５０−９０％のＲＢＭ３タンパク質陽性細胞の細胞質画分である、項目３７に記載の方法。
【００５８】
３９．該参照値が０−１０％のＲＢＭ３タンパク質陽性細胞の細胞質画分である、項目３７に記載の方法。
【００５９】
４０．該参照値が中程度の細胞質強度である、項目３７に記載の方法。
【００６０】
４１．該参照値が存在しない細胞質強度である、項目３７に記載の方法。
【００６１】
４２．ＲＢＭ３タンパク質のアミノ酸配列が
ｉ）配列番号１、および
ｉｉ）配列番号１と少なくとも８５％同一である配列
から選択される配列を含むか、またはそれからなる、前記項目のいずれかに記載の方法。
【００６２】
４３．ＲＢＭ３タンパク質のアミノ酸配列が
ｉ）配列番号：２、および
ｉｉ）配列番号２と少なくとも８５％同一である配列．
から選択される配列を含むか、またはそれからなる、前記項目のいずれかに記載の方法。
【００６３】
４４．工程ａ）が
ａＩ）評価されるＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能である定量化可能なアフィニティーリガンドを該サンプルに適用し、該適用は、サンプルに存在するＲＢＭ３タンパク質へのアフィニティーリガンドの結合を可能にする条件下で実施し、
ａＩＩ）該サンプルに結合したアフィニティーリガンドを定量し、該量を評価する
ことを含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
【００６４】
４５．工程ａ）が
ａ１）評価されるＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能である定量化可能なアフィニティーリガンドを該サンプルに適用し、該適用は、サンプルに存在するＲＢＭ３タンパク質へのアフィニティーリガンドの結合を可能にする条件下で実施し、
ａ２）非結合アフィニティーリガンドを除去し、
ａ３）サンプルと共に残っているアフィニティーリガンドを定量し、該量を評価する
ことを含む、項目１−４３のいずれかに記載の方法。
【００６５】
４６．定量化可能なアフィニティーリガンドが抗体、そのフラグメントおよびその誘導体からなる群から選択される、項目４４または４５に記載の方法。
【００６６】
４７．該定量化可能なアフィニティーリガンドが、アミノ酸配列が配列番号：１の配列からなるペプチドで動物を免疫化する工程を含むプロセスにより得ることができる、項目４６に記載の方法。
【００６７】
４８．該定量化可能なアフィニティーリガンドが、アミノ酸配列が配列番号：４および配列番号：５から選択される配列からなるペプチドで動物を免疫化する工程を含むプロセスにより得ることができる、項目４６に記載の方法。
【００６８】
４９．該定量化可能なアフィニティーリガンドが、２０以下のアミノ酸、例えば、１５以下のアミノ酸からなり、配列番号：６−１９から選択される配列を含むＲＢＭ３フラグメントで動物を免疫化する工程を含むプロセスにより得ることができる、項目４６に記載の方法。
【００６９】
５０．該定量化可能なアフィニティーリガンドが、２０以下のアミノ酸、例えば、１５以下のアミノ酸からなり、配列番号：８、１６および１７から選択される配列を含むＲＢＭ３フラグメントで動物を免疫化する工程を含むプロセスにより得ることができる、項目４６に記載の方法。
【００７０】
５１．該定量化可能なアフィニティーリガンドがオリゴヌクレオチド分子である、項目４４または４５に記載の方法。
【００７１】
５２．定量化可能なアフィニティーリガンドが、ブドウ球菌タンパク質Ａおよびそのドメイン、リポカリン、アンキリン反復ドメイン、セルロース結合ドメイン、γ結晶、緑色蛍光タンパク質、ヒト細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原４、プロテアーゼ阻害剤、ＰＤＺドメイン、ペプチドアプタマー、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、テンダミスタット、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインおよび亜鉛フィンガーからなる群から選択される骨格由来のタンパク質リガンドである、項目４４または４５に記載の方法。
【００７２】
５３．該定量化可能なアフィニティーリガンドが、アミノ酸配列が配列番号：１の配列からなるペプチドと選択的相互作用が可能である、項目４４−５２のいずれかに記載の方法。
【００７３】
５４．該定量化可能なアフィニティーリガンドが、アミノ酸配列が配列番号４および配列番号：５から選択される配列からなるペプチドと選択的相互作用が可能である、項目４４−５３のいずれかに記載の方法。
【００７４】
５５．該定量化可能なアフィニティーリガンドが、２０以下のアミノ酸、例えば、１５以下のアミノ酸からなり、配列番号：６−１９から選択されるアミノ酸配列を含むＲＢＭ３フラグメントと選択的相互作用が可能である、項目４４−５３のいずれかに記載の方法。
【００７５】
５６．該定量化可能なアフィニティーリガンドが、２０以下のアミノ酸、例えば、１５以下のアミノ酸からなり、配列番号：８、１６および１７から選択される配列を含むＲＢＭ３フラグメントと選択的相互作用が可能である、項目４４−５３のいずれかに記載の方法。
【００７６】
５７．定量化可能なアフィニティーリガンドが、蛍光色素および金属、発色色素、化学発光化合物および生物発光タンパク質、酵素、放射性同位体、粒子および量子ドットからなる群から選択される標識を含む、項目４４−５６のいずれかに記載の方法。
【００７７】
５８．該定量化可能なアフィニティーリガンドを、定量化可能なアフィニティーリガンドを認識することが可能である二次アフィニティーリガンドを使用して検出する、項目４４−５７のいずれかに記載の方法。
【００７８】
５９．定量化可能なアフィニティーリガンドを認識することが可能である該二次アフィニティーリガンドが、蛍光色素および金属、発色色素、化学発光化合物および生物発光タンパク質、酵素、放射性同位体、粒子および量子ドットからなる群から選択される標識を含む、項目５８に記載の方法。
【００７９】
６０．前記項目のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、
ａ）ＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能である定量化可能なアフィニティーリガンド、および
ｂ）該定量化可能なアフィニティーリガンドの量を定量するために必要な試薬
を含むキット。
【００８０】
６１．該定量化可能なアフィニティーリガンドが、抗体、そのフラグメントおよびその誘導体からなる群から選択される、項目６０に記載のキット。
【００８１】
６２．該定量化可能なアフィニティーリガンドが、アミノ酸配列が配列番号：１からなるタンパク質で動物を免疫化する工程を含むプロセスにより得ることができる、項目６１に記載のキット。
【００８２】
６３．該定量化可能なアフィニティーリガンドが、アミノ酸配列が配列番号：４および配列番号：５から選択される配列からなるタンパク質で動物を免疫化する工程を含むプロセスにより得ることができる、項目６１に記載のキット。
【００８３】
６４．該定量化可能なアフィニティーリガンドが、２０以下のアミノ酸、例えば、１５以下のアミノ酸からなり、配列番号：６−１９から選択されるアミノ酸配列を含むＲＢＭ３フラグメントで動物を免疫化する工程を含むプロセスにより得ることができる、項目６１に記載のキット。
【００８４】
６５．該定量化可能なアフィニティーリガンドが、２０以下のアミノ酸、例えば、１５以下のアミノ酸からなり、配列番号：８、１６および１７から選択されるアミノ酸配列を含むＲＢＭ３フラグメントで動物を免疫化する工程を含むプロセスにより得ることができる、項目６１に記載のキット。
【００８５】
６６．該定量化可能なアフィニティーリガンドが、ブドウ球菌タンパク質Ａおよびそのドメイン、リポカリン、アンキリン反復ドメイン、セルロース結合ドメイン、γ結晶、緑色蛍光タンパク質、ヒト細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原４、プロテアーゼ阻害剤、ＰＤＺドメイン、ペプチドアプタマー、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、テンダミスタット、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインおよび亜鉛フィンガーからなる群から選択される骨格由来のタンパク質リガンドである、項目６０に記載のキット。
【００８６】
６７．該定量化可能なアフィニティーリガンドがオリゴヌクレオチド分子である、項目６０に記載のキット。
【００８７】
６８．該定量化可能なアフィニティーリガンドが
ｉ）配列番号：１、および
ｉｉ）配列番号：１と少なくとも８５％同一である配列
から選択される配列を含むか、またはそれからなるＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能である、項目６０−６７のいずれかに記載のキット。
【００８８】
６９．該定量化可能なアフィニティーリガンドが
ｉ）配列番号：２、および
ｉｉ）配列番号２と少なくとも８５％同一である配列．
から選択される配列を含むか、またはそれからなるＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能である、項目６０−６７のいずれかに記載のキット。
【００８９】
７０．該定量化可能なアフィニティーリガンドが、配列番号４および配列番号：５から選択される配列を含むＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能である、項目６０−６９のいずれかに記載のキット。
【００９０】
７１．該定量化可能なアフィニティーリガンドが、配列番号：４および配列番号：５から選択される配列からなるＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能である、項目６０−６９のいずれかに記載のキット。
【００９１】
７２．該定量化可能なアフィニティーリガンドが、２０以下のアミノ酸、例えば、１５以下のアミノ酸からなり、配列番号：６−１９から選択されるアミノ酸配列を含むＲＢＭ３フラグメントと選択的相互作用が可能である、項目６０−６９のいずれかに記載のキット。
【００９２】
７３．該定量化可能なアフィニティーリガンドが、２０以下のアミノ酸、例えば、１５以下のアミノ酸からなり、配列番号：８、１６および１７から選択されるアミノ酸配列を含むＲＢＭ３フラグメントと選択的相互作用が可能である、項目６０−６９のいずれかに記載のキット。
【００９３】
７４．該定量化可能なアフィニティーリガンドが、蛍光色素および金属、発色色素、化学発光化合物および生物発光タンパク質、酵素、放射性同位体、粒子および量子ドットからなる群から選択される標識を含む、項目６０−７３のいずれかに記載のキット。
【００９４】
７５．該定量化可能なアフィニティーリガンドの該量を定量するために必要な該試薬が、該定量化可能なアフィニティーリガンドを認識することが可能である二次アフィニティーリガンドを含む、項目６０−７４のいずれかに記載のキット。
【００９５】
７６．該二次アフィニティーリガンドが、蛍光色素または金属、発色色素、化学発光化合物および生物発光タンパク質、酵素、放射性同位体、粒子および量子ドットからなる群から選択される標識を含む、項目７５に記載のキット。
【００９６】
７７．参照値の提供のために少なくとも１つの参照サンプルをさらに含む、項目６０−７６のいずれかに記載のキット。
【００９７】
７８．少なくとも１つの参照サンプルが、組織検出可能なＲＢＭ３タンパク質を含まないサンプルである、項目７７に記載のキット。
【００９８】
７９．少なくとも１つの参照サンプルがＲＢＭ３タンパク質を含む、項目７７または７８に記載のキット。
【００９９】
８０．少なくとも１つの参照サンプルが、５０−９０％の細胞質画分に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を含む、項目７７−７９のいずれかに記載のキット。
【０１００】
８１．少なくとも１つの参照サンプルが、０−１０％の細胞質画分に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を含む、項目７７−７９のいずれかに記載のキット。
【０１０１】
８２．少なくとも１つの参照サンプルが、中程度の細胞質強度に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を含む、項目７７−７９のいずれかに記載のキット。
【０１０２】
８３．少なくとも１つの参照サンプルが、存在しない細胞質強度に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を含む、項目７７−７９のいずれかに記載のキット。
【０１０３】
８４．少なくとも１つの参照サンプルが、該参照値よりも高い値に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を含む、項目７７−８３のいずれかに記載のキット。
【０１０４】
８５．少なくとも１つの参照サンプルが、強い細胞質強度に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を含む、項目８４に記載のキット。
【０１０５】
８６．少なくとも１つの参照サンプルが、７５％以上の細胞質画分に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を含む、項目８４または８５に記載のキット。
【０１０６】
８７．参照値より高い値（陽性参照値）に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を含む第１の参照サンプル、および
参照値以下である値（陰性参照値）に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を含む第２の参照サンプル
を含む、項目７７−８６のいずれかに記載のキット。
【０１０７】
８８．該参照サンプルが細胞株を含む、項目７７−８７のいずれかに記載のキット。
【０１０８】
８９．５０以下のアミノ酸からなり、配列番号：４−１９から選択されるアミノ酸配列を含む、ＲＢＭ３タンパク質フラグメント。
【０１０９】
９０．２９以下のアミノ酸からなる、項目８９に記載のＲＢＭ３タンパク質フラグメント。
【０１１０】
９１．２０以下のアミノ酸からなり、配列番号：６−１９から選択されるアミノ酸配列を含む、項目８９または９０に記載のＲＢＭ３タンパク質フラグメント。
【０１１１】
９２．２０以下のアミノ酸からなり、配列番号：８、１６および１７から選択されるアミノ酸配列を含む、項目９１に記載のＲＢＭ３タンパク質フラグメント。
【０１１２】
９３．１５以下のアミノ酸からなる、項目９１または９２に記載のＲＢＭ３タンパク質フラグメント。
【０１１３】
９４．予後診断マーカーとしてのＲＢＭ３タンパク質のインビトロでの使用。
【０１１４】
９５．該予後診断マーカーが癌に対する予後診断マーカーである、項目９４に記載の使用。
【０１１５】
９６．該癌が結腸直腸癌である、項目９５に記載の使用。
【０１１６】
９７．該タンパク質が結腸直腸癌を有する対象由来のサンプルにおいて提供される、項目９６に記載の使用。
【０１１７】
９８．該サンプルが結腸直腸腫瘍組織サンプルである、項目９７に記載の使用。
【０１１８】
９９．該予後診断マーカーが結腸直腸癌に対する比較的良好な予後に対するマーカーである、項目９６−９８のいずれかに記載の使用。
【０１１９】
１００．結腸直腸癌を有する哺乳動物対象に対する予後を確立するための予後診断薬の選択または精製のための、ＲＢＭ３タンパク質またはその抗原的に活性なフラグメントのインビトロでの使用。
【０１２０】
１０１．結腸直腸癌を有する哺乳動物対象に対する予後を確立するための予後診断薬の生産のための、ＲＢＭ３タンパク質またはその抗原的に活性なフラグメントの使用。
【０１２１】
１０２．該予後診断薬が、ＲＢＭ３タンパク質またはその抗原的に活性なフラグメントと選択的相互作用が可能であるアフィニティーリガンドである、項目１００または１０１に記載の使用。
【０１２２】
１０３．ＲＢＭ３タンパク質のアミノ酸配列が
ｉ）配列番号１、および
ｉｉ）配列番号１と少なくとも８５％同一である配列
から選択される配列を含むか、またはそれからなる、項目９４−１０２のいずれかに記載の使用。
【０１２３】
１０４．ＲＢＭ３タンパク質のアミノ酸配列が
ｉ）配列番号：２、および
ｉｉ）配列番号２と少なくとも８５％同一である配列．
から選択される配列を含むか、またはそれからなる、項目９４−１０２のいずれかに記載の使用。
【０１２４】
１０５．フラグメントが項目８９−９３のいずれかに記載のフラグメントである、項目１００−１０２のいずれかに記載の抗原的に活性なフラグメントの使用。
【０１２５】
１０６．ＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能であるアフィニティーリガンド。
【０１２６】
１０７．抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体である、項目１０６に記載のアフィニティーリガンド。
【０１２７】
１０８．アミノ酸配列が配列番号：１の配列からなるペプチドで動物を免疫化する工程を含むプロセスにより得ることができる、アフィニティーリガンド。
【０１２８】
１０９．アミノ酸配列が、配列番号４または５の配列、または２０以下のアミノ酸、例えば、１５以下のアミノ酸からなり、配列番号：６−１９から選択されるアミノ酸配列を含むＲＢＭ３タンパク質フラグメントからなるペプチドで動物を免疫化する工程を含むプロセスにより得ることができる、アフィニティーリガンド。
【０１２９】
１１０．アミノ酸配列が配列番号：５からなるペプチド、または２０以下のアミノ酸、例えば、１５以下のアミノ酸からなり、配列番号：８、１６および１７から選択される配列を含むＲＢＭ３タンパク質フラグメントで動物を免疫化する工程を含むプロセスにより得ることができる、項目１０９に記載のアフィニティーリガンド。
【０１３０】
１１１．アミノ酸配列が配列番号：１の配列からなるペプチドと選択的相互作用が可能である、アフィニティーリガンド。
【０１３１】
１１２．アミノ酸配列が配列番号４または５からなるペプチド、または２０以下のアミノ酸、例えば、１５以下のアミノ酸からなり、配列番号：６−１９から選択されるアミノ酸配列を含むＲＢＭ３フラグメントと選択的相互作用が可能であるアフィニティーリガンド。
【０１３２】
１１３．アミノ酸配列が配列番号：５からなるペプチド、または２０以下のアミノ酸、例えば、１５以下のアミノ酸からなり、配列番号：８、１６および１７から選択されるアミノ酸配列を含むＲＢＭ３フラグメントと選択的相互作用が可能であるアフィニティーリガンド。
【０１３３】
１１４．結腸直腸癌を有する哺乳動物対象に対する予後を確立するためのインビボでの使用のための、項目１０６−１１３のいずれかに記載のアフィニティーリガンド。
【０１３４】
１１５．予後診断薬としての項目１０６−１１３のいずれかに記載のアフィニティーリガンドのインビトロでの使用。
【０１３５】
１１６．結腸直腸癌に対する予後診断薬としての項目１１５に記載の使用。
【０１３６】
１１７．該予後診断薬が、ＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能であるアフィニティーリガンド、またはその抗原的に活性なフラグメントである、項目１１５または１１６に記載の使用。
【０１３７】
１１８．結腸直腸癌を有する哺乳動物対象に対する予後のインビボでの確立のための予後診断薬の製造における、項目１０６−１１３のいずれかに記載のアフィニティーリガンドの使用。
【０１３８】
１１９．結腸直腸癌を有する哺乳動物対象に対する予後を確立するための、項目１０６−１１３のいずれかに記載のアフィニティーリガンドの使用。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】図１は、Ｓ字結腸癌と診断された２７４人の対象の生存分析の結果を示す。図１ａはすべての患者における全生存（ＯＳ）を示し、推定５年生存はこのコホートにおけるすべての患者に対して５５％である。図１ｂはすべての患者における無病生存（ＤＦＳ）を示し、推定５年生存はこのコホートにおけるすべての患者に対して６４％である。
【図２】図２は、すべての２７４人の対象を核画分（ＮＦ）染色に基づくグループに分けるときの、ＯＳにおけるＲＢＭ３レベルの影響を示す。簡潔には、すべての対象を、ＮＦ状態に基づく４つのグループ、すなわち＜２％、２−２５％、＞２５−７５％または＞７５％に分けた。
【図３】図３は、すべての２７４人の対象を含むＯＳ分析の結果を示す。ＲＢＭ３発現を、２つの方法において高い、または低いに二分した。図３ａにおいて、低いＲＢＭ３レベルは実線により示されるＮＦ＜２％に等しく、高いＲＢＭ３レベルは点線により示されるＮＦ＞２％に等しい。図３ｂにおいて、低いＲＢＭ３レベルは実線により示されるＮＦ＜７５％に等しく、高いＲＢＭ３レベルは点線により示されるＮＦ＞７５％に等しい。
【図４】図４は、すべての２７４人の対象を核画分（ＮＦ）染色に基づくグループに分けるときの、ＤＦＳにおける影響を示す。簡潔には、すべての対象を、ＮＦ状態に基づく４つのグループ、すなわち＜２％、２−２５％、＞２５−７５または＞７５％に分けた。
【図５】図５は、ＲＢＭ３の核画分（ＮＦ）レベルに基づいてすべての２７４人の対象に対するＤＦＳ分析の結果を示す。ＲＢＭ３発現を、２つの方法において高い、および低いカテゴリーに二分した。図５ａにおいて、実線は低いＲＢＭ３レベル（ＮＦ＜２％）を示し、点線は高いＲＢＭ３レベル（ＮＦ＞２％）を示す。図５ｂにおいて、実線は低いＲＢＭ３レベル（ＮＦ＜７５％）を示し、点線は高いＲＢＭ３レベル（ＮＦ＞７５％）を示す。
【０１４０】
【図６】図６は、ＲＢＭ３の核強度（ＮＩ）レベルに基づいてすべての２７４人の対象に対する生存分析の結果を示す。ＲＢＭ３発現を、２つの方法において高い、および低いカテゴリーに二分した。実線は低いＲＢＭ３レベル（ＮＩ＝０）を示し、点線は高いＲＢＭ３レベル（ＮＩ＞０）を示す。図６ａはＯＳを示す。図６ｂはＤＦＳを示す。
【図７】図７は、ＲＢＭ３の細胞質強度（ＣＩ）レベルに基づいてすべての２７４人の対象に対するＤＦＳ分析の結果を示す。ＲＢＭ３発現を、２つの方法において高い、および低いカテゴリーに二分した。図７ａにおいて、低いＲＢＭ３レベルは実線により示されるＣＩ＝０に等しく、高いＲＢＭ３レベルは点線により示されるＣＩ＞０に等しい。図７ｂにおいて、低いＲＢＭ３レベルは実線により示されるＣＩ＜２に等しく、高いＲＢＭ３レベルは点線により示されるＣＩ＝２に等しい。
【図８】図８は、ＲＢＭ３の細胞質強度（ＣＩ）レベルに基づいてすべての２７４人の対象に対するＯＳ分析の結果を示す。ＲＢＭ３発現を、２つの方法において高い、および低いカテゴリーに二分した。図８ａにおいて、低いＲＢＭ３レベルは実線により示されるＣＩ＝０に等しく、高いＲＢＭ３レベルは点線により示されるＣＩ＞０に等しい。図８ｂにおいて、低いＲＢＭ３レベルは実線により示されるＣＩ＜２に等しく、高いＲＢＭ３レベルは点線により示されるＣＩ＝２に等しい。
【図９】図９は、ＲＢＭ３の核画分（ＮＦ）レベルに基づいてデュークスステージＡまたはＢと診断された１５８人の対象に対するＯＳ分析の結果を示す。ＲＢＭ３発現を、２つの方法において高い、および低いカテゴリーに二分した。図９ａにおいて、低いＲＢＭ３レベルは実線により示されるＮＦ＜２％に等しく、高いＲＢＭ３レベルは点線により示されるＮＦ＞２％に等しい。図９ｂにおいて、低いＲＢＭ３レベルは実線により示されるＮＦ＜７５％に等しく、高いＲＢＭ３レベルは点線により示されるＮＦ＞７５％に等しい。
【図１０】図１０は、ＲＢＭ３の核画分（ＮＦ）レベルに基づいてデュークスステージＢと診断された１２４人の対象に対する生存分析の結果を示す。組織核を、高い、および低いＲＢＭ３発現により二分した。実線は低いＲＢＭ３レベル（ＮＦ＜２％）を示し、点線は高いＲＢＭ３レベル（ＮＦ＞２％）を示す。図１０ａはＯＳを示す。図１０ｂはＤＦＳを示す。
【０１４１】
【図１１】図１１は、デュークスステージＣと診断された７５人の対象を核画分（ＮＦ）染色に基づくグループに分けるとき、ＤＦＳにおける影響を示す。対象を、ＮＦ状態に基づく４つのグループ、すなわち＜２％、２−２５％、＞２５−７５％または＞７５％に分けた。
【図１２】図１２は、ＲＢＭ３の核画分（ＮＦ）レベルに基づいてデュークスステージＣと診断された７６人の対象に対するＤＦＳ分析の結果を示す。ＲＢＭ３発現を、２つの方法において高い、および低いに二分した。図１２ａにおいて、低いＲＢＭ３レベルは実線により示されるＮＦ＜２％に等しく、高いＲＢＭ３レベルは点線により示されるＮＦ＞２％に等しい。図１２ｂにおいて、低いＲＢＭ３レベルは実線により示されるＮＦ＜７５％に等しく、高いＲＢＭ３レベルは点線により示されるＮＦ＞７５％に等しい。
【図１３】図１３は、ＲＢＭ３の細胞質強度（ＣＩ）レベルに基づいてデュークスステージＣと診断された７６人の対象に対する生存分析の結果を示す。組織核を、高い、および低いＲＢＭ３発現により二分した。実線は低いＲＢＭ３レベル（ＣＩ＝０）を示し、点線は高いＲＢＭ３レベル（ＣＩ＞０）を示す。図１３ａはＯＳを示す。図１３ｂはＤＦＳを示す。
【図１４】図１４は、抗−ＲＢＭ３、１Ｂ５および６Ｆ１１に対するウエスタンブロット結果を示す。
【図１５】図１５は、すべての２４５人の対象を核画分（ＮＦ）染色に基づくグループに分けるときの、ＯＳにおけるモノクローナル抗体１Ｂ５を使用するＲＢＭ３レベルの影響を示す。図１５Ａにおいて、すべての対象をＮＦ状態に基づく４つのグループ、すなわち＜２％、２−２５％、＞２５−７５％または＞７５％に分けた。図１５Ｂにおいて、ＲＢＭ３発現を、高いおよび低いカテゴリーに二分し、実線は低いＲＢＭ３レベル（ＮＦ＜７５％）を示し、点線は高いＲＢＭ３レベル（ＮＦ＞７５％）を示す。
【０１４２】
【図１６】図１６は、すべての２４５人の対象を核画分（ＮＦ）染色に基づくグループに分けるときの、ＤＦＳにおけるモノクローナル抗体１Ｂ５を使用するＲＢＭ３レベルの影響を示す。図１６Ａにおいて、すべての対象をＮＦ状態に基づく４つのグループ、すなわち＜２％、２−２５％、＞２５−７５％または＞７５％に分けた。図１６Ｂにおいて、ＲＢＭ３発現を、高いおよび低いカテゴリーに二分し、実線は低いＲＢＭ３レベル（ＮＦ＜７５％）を示し、点線は高いＲＢＭ３レベル（ＮＦ＞７５％）を示す。
【図１７】図１７は、ＲＢＭ３の核画分（ＮＦ）レベルに基づいてすべての２４５人の対象に対する生存分析の結果を示す。組織核を、高い、および低いＲＢＭ３発現により二分した。実線は低いＲＢＭ３レベル（ＮＦ＜２５％）を示し、点線は高いＲＢＭ３レベル（ＮＦ＞２５％）を示す。図１７ＡはＯＳを示す。図１７ＢはＤＦＳを示す。
【図１８】図１８は、ＲＢＭ３の核強度（ＮＩ）レベルに基づいてすべての２４５人の対象に対する生存分析の結果を示す。組織核を、高い、および低いＲＢＭ３発現により二分した。実線は低いＲＢＭ３レベル（ＮＩ＜２）を示し、点線は高いＲＢＭ３レベル（ＮＩ＝２）を示す。図１８ＡはＯＳを示す。図１８ＢはＤＦＳを示す。
【図１９】図１９は、ＲＢＭ３の細胞質強度（ＣＩ）レベルに基づいてすべての２４５人の対象に対するＤＦＳを示す。組織核を、高い、および低いＲＢＭ３発現により二分した。図１９Ａにおいて、実線は低いＲＢＭ３レベル（ＣＩ＜２）を示し、点線は高いＲＢＭ３レベル（ＣＩ＝２）を示す。図１９Ｂにおいて、実線は低いＲＢＭ３レベル（ＣＩ＝０  ２）を示し、点線は高いＲＢＭ３レベル（ＣＩ＞０）を示す。
【図２０】図２０は、ＲＢＭ３発現の核画分（ＮＦ）分析に基づいてデュークスステージＣと診断された６６人の対象に対するＤＦＳ分析の結果を示す。図２０Ａにおいて、対象をＮＦ状態に基づく４つのグループ、すなわち＜２％、２−２５％、＞２５−７５％または＞７５％に分けた。図２０Ｂにおいて、組織核を、高い、および低いＲＢＭ３発現により二分した。実線は低いＲＢＭ３レベル（ＮＦ＜３）を示し、点線は高いＲＢＭ３レベル（ＮＦ＝３）を示す。図２０Ｃにおいて、組織核を、高い、および低いＲＢＭ３発現により二分した。実線は低いＲＢＭ３レベル（ＮＦ＝０）を示し、点線は高いＲＢＭ３レベル（ＮＦ＞０）を示す。
【図２１】図２１は、ＲＢＭ３発現の強度に基づいてデュークスステージＣと診断された６６人の対象に対するＤＦＳ分析の結果を示す。組織核を、高い、および低いＲＢＭ３発現により二分した。図２１Ａにおいて、実線は低い細胞質ＲＢＭ３レベル（ＣＩ＝０）を示し、点線は高い細胞質ＲＢＭ３レベル（ＣＩ＞０）を示す。図２１Ｂにおいて、実線は低い核ＲＢＭ３レベル（ＮＩ＝０）を示し、点線は高い核ＲＢＭ３レベル（ＮＩ＞０）を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１４３】
詳細な説明
したがって、本明細書の第１の局面の第１の構成として、結腸直腸癌を有する哺乳動物対象に対する予後が参照予後よりも良いか否かを決定する方法であって、
ａ）対象由来の早期に得られたサンプルの少なくとも一部に存在するＲＢＭ３タンパク質の量を評価し、該評価された量に対応するサンプル値を決定し、
ｂ）工程ｂ）において得られたサンプル値を該参照予後と関連する参照値と比較し、
該サンプル値が該参照値よりも高いとき、
ｃ）該対象に対する予後が該参照予後よりも良いと結論づける
工程を含む方法を提供する。
【０１４４】
さらに、第１の局面の第２の構成として、結腸直腸癌を有する哺乳動物対象に対する予後が参照予後以上に悪いか否かを決定する方法であって、
ａ）対象由来の早期に得られたサンプルの少なくとも一部に存在するＲＢＭ３タンパク質の量を評価し、該評価された量に対応するサンプル値を決定し、
ｂ）工程ａ）において得られたサンプル値を該参照予後と関連する参照値と比較し、
該サンプル値が参照値以下であるとき、
ｃ）該対象に対する予後が該参照予後以上に悪いと結論づける
工程を含む方法を提供する。
【０１４５】
第１および第２の態様を組み合わせてもよい。したがって、第１の局面にしたがって、結腸直腸癌を有する哺乳動物対象に対する予後を決定する方法であって、
ａ）対象由来の早期に得られたサンプルの少なくとも一部に存在するＲＢＭ３タンパク質の量を評価し、該評価された量に対応するサンプル値を決定し、
ｄ）工程ａ）において得られたサンプル値を参照予後と関連する参照値と比較し、
該サンプル値が該参照値よりも高いとき、
ｃ１）該対象に対する予後が該参照予後よりも良いと結論づけ、および／または
該サンプル値が参照値以下であるとき、
ｃ２）該対象に対する予後が該参照予後以上に悪いと結論づける
工程を含む方法を提供する。
【０１４６】
同じ概念により密接に関連しており、覆われているが、ｃ１）およびｃ２）は、２つのいずれかの結論を提供する。
【０１４７】
本発明の概念は、また、特定の処置レジメンを控えることを決定するための基準を形成し得る。
【０１４８】
例えば、図２−１３および１５−２１に示されているとおり、高いＲＢＭ３タンパク質レベルを示す対象に対する予後は、低いＲＢＭ３タンパク質レベルを示す対象に対する予後よりも一般的に良い。本明細書の教示で提供されるとおり、医師は、ＲＢＭ３タンパク質の高い対象の予後を、一方のアジュバント処置レジメンを避け、もう一方のあまり侵襲性でないアジュバント処置レジメンを代わりに選択することが好ましいと考えられ得る。例えば、単剤療法を併用療法の代わりに選択し得る。さらに、決定は任意のアジュバント療法を控えることであり得る。したがって、本明細書は、対象を過剰処置から軽減し得る。
【０１４９】
したがって、第１の局面の第３の構成として、結腸直腸癌を有する対象が結腸直腸の処置レジメンでの処置の必要性がないか否かを決定する方法であって、
ａ）対象由来の早期に得られたサンプルの少なくとも一部に存在するＲＢＭ３タンパク質の量を評価し、該評価された量に対応するサンプル値を決定し、
ｂ）工程ｂ）において得られたサンプル値を参照値と比較し、
該サンプル値が該参照値よりも高いとき、
ｃ）該対象が結腸直腸癌の処置レジメンでの処置の必要性がないと結論づける
工程を含む方法を提供する。
【０１５０】
また、第１の局面の第４の構成として、結腸直腸癌を有する対象に対する非処置戦略方法であって、
ａ）対象由来の早期に得られたサンプルの少なくとも一部に存在するＲＢＭ３タンパク質の量を評価し、該評価された量に対応するサンプル値を決定し、
ｂ）工程ｂ）において得られたサンプル値を参照値と比較し、
該サンプル値が該参照値よりも高いとき、
ｃ）結腸直腸癌の処置レジメンでの該対象の処置を控える
工程を含む方法を提供する。
【０１５１】
第１の局面の第３および第４の処置構成の結腸直腸の処置レジメンは、例えば、特異的治療剤または治療剤の組合せでのアジュバント全身的処置であり得、薬剤は化学療法剤および免疫療法剤から選択され得る。
【０１５２】
例えば、第４の構成の工程ｃ）の控えることは、工程ａ）−ｂ）の完了から少なくとも１週、例えば、工程ａ）−ｂ）の完了から少なくとも１月、例えば、工程ａ）−ｂ）の完了から少なくとも３月、例えば、工程ａ）−ｂ）の完了から少なくとも６月、例えば、工程ａ）−ｂ）の完了から少なくとも１年、例えば、工程ａ）−ｂ）の完了から少なくとも２年の間、処置を控えることであり得る。
【０１５３】
あるいは、工程ｃ）の控えることは、該方法が行われる次のとき、または結腸直腸癌腫瘍の再発まで処置を控えることであり得る。
【０１５４】
第１の局面の第５の構成として、結腸直腸癌を有する哺乳動物対象が第１または第２のグループのいずれに属するかを決定する方法であって、第１のグループの対象の予後が第２のグループの対象の予後よりも良く、
ａ）対象由来の早期に得られたサンプルの少なくとも一部におけるＲＢＭ３タンパク質の量を評価し、評価された量に対応するサンプル値を決定し、
ｂ）該サンプル値をあらかじめ決められた参照値と比較し、
該サンプル値が該参照値よりも高いとき、
ｃ１）該対象が第１のグループに属すると結論づけ、
該サンプル値が該参照値以下であるとき、
ｃ２）該対象が第２のグループに属すると結論づける
工程を含む方法を提供する。
【０１５５】
第１の局面の第５の構成の方法において、結腸直腸癌対象が第１または第２のグループのいずれに属するかを決定することであって、第１のグループの対象が、一般的に、第２のグループの対象よりもより良い予後を有すると決定する。結腸直腸癌対象の２つのグループへの分配は、対象由来のサンプル値を参照値と比較することにより決定される。本明細書において、種々の参照値が、一般的に比較的に長い期間生存した対象（より上の曲線により示される）と一般的に比較的に短い期間生存した対象（より下の曲線により示される）を区別するために使用され得ることを示す（図、参照）。したがって、該参照値は、それぞれのグループのサイズに対する決定因子であり、参照値をより高くすると、第１のグループにおける対象がより少なくなり、試験される対象が第１のグループに属する可能性がより小さくなる。一般的に、サンプル値が増加すると予後は改善するため、場合によっては、特に良好な予後を有する対象を同定するために比較的高い参照値が選択され得る。本明細書により導かれると、当業者は、過度の負荷なしに関連参照値を選択し得る。これは、さらに以下に記載されている。
【０１５６】
第１および第２のグループは、もっぱら、試験される対象と同じまたは同様の段階の結腸直腸癌を有する対象からなり得る。さらに、該グループは、同じまたは同様の年齢、人種、性、遺伝的特性および／または医学的状態または病歴、例えば、結腸直腸癌歴を有する対象のみからなり得る。
【０１５７】
第１の局面の別の構成にしたがって、結腸直腸癌を有する哺乳動物対象に対する予後を確立するための方法であって、
ａ）対象由来のサンプルの少なくとも一部に存在するＲＢＭ３タンパク質の量を評価し、評価された量に対応するサンプル値を決定し、
ｂ）工程ｂ）のサンプル値を対象に対する予後と相関させる
工程を含む方法を提供する。
【０１５８】
本明細書の文脈において、「予後を確立する」は、特異的予後または予後間隔を確立することを示す。
【０１５９】
別の構成の態様において、サンプルは早期に得られたサンプルであり得る。
【０１６０】
工程ｂ）の相関は、対象に対する予後を確立するように、得られたサンプル値と生存データを関連づけるあらゆる方法を示す。
【０１６１】
結腸直腸癌状態の指標としてＲＢＭ３タンパク質レベルに基づく本発明は、多くの利益を有する。一般的に、結腸直腸癌の攻撃性の同定は、適当な処置戦略を選択する医師を手助けするため、生命維持に重要である。例えば、特に癌の侵襲性形態が同定されたとき、通常、避けられる苦痛、または他のあらゆる感覚の不快な処置がどうしても考えられ得る。さらに、あまり侵襲性でない形態が同定することができたとき、過剰な処置を避け得る。さらなる例として、発現の特定のレベルが疾患進行の特定のパターンと相関しているマーカーとしてのＲＢＭ３タンパク質は、例えば、予測もしくは予後の形成または処置レジメンの選択のための一団(panel)において大きな可能性を有する。
【０１６２】
Ｓｕｒｅｂａｎ  ＳＭらは、ヒトの癌におけるＲＢＭ３タンパク質の役割を議論し、該タンパク質が腫瘍において有意に上方調節され、結腸直腸癌においてステージ依存的な増加を示すと結論づけている（Sureban SM et al (2008) Oncogene 27, 4544-4566）。結果として、ＲＢＭ３タンパク質発現は、主にインビトロでのデータに基づく該文献における望ましくない結腸直腸癌特性と関連し、このような見出したことは本明細書の教示と対照的である。
【０１６３】
本明細書において、種々の予後に対応する異なるＲＢＭ３タンパク質値（サンプル値）を与える。一般的に、低いサンプル値は高いサンプル値よりも乏しい予後と関連する。第１の局面の第１の構成の方法において、サンプル値を参照値と比較して、サンプル値が参照値以下であるとき、対象に対する予後が参照値と関連する参照予後以下の悪さであると結論づける。
【０１６４】
結果として、上記方法は参照値に適合させ得る。このような場合、状況が関連すると考えられる下でサンプル値から出発し、サンプル値と同等である参照値が選択され得る。次に、参照予後を、参照値が確立され得ることと関連させる。本明細書に導かれると、当業者は、所定の参照値に対応する参照予後を確立する方法を理解できる。例えば、癌患者の関連グループにおけるサンプル値と生存データ間の関係を以下の実施例の部４に記載されている系において試験され得る。本明細書に記載されている処理は、所定の参照値に適合させ得る。次に、所定の参照値に対応する予後は、参照予後として選択され得る。
【０１６５】
また、上記方法は、所定の参照予後に適合させ得る。このような場合、状況が、例えば、適当な治療を選択するために関連すると考えられる下で参照予後から出発し、対応する参照値が確立され得る。本明細書に導かれると、当業者は、所定の参照予後に対応する参照値を確立する方法を理解できる。例えば、癌患者のグループにおけるサンプル値と生存データ間の関係を以下の実施例の部４のとおりに試験され得るが、本明細書に記載されている処理は、所定の参照予後に対応する参照値を確立することに適合させ得る。例えば、所定の参照予後と相関関係であるものが見出されるまで、異なる参照値が試験され得る。
【０１６６】
したがって、上記局面の方法の態様において、参照予後は、例えば、対象の関連集団の試験により得られる以前に確立されている予後に基づき得る。このような参照集団は、試験される対象の年齢、性、人種、結腸直腸癌ステージおよび／または医学的状態および病歴が合うように選択され得る。さらに、予後は、一般的な集団における背景リスク、統計的予後／危険性、または対象の試験に基づく仮定に適合させ得る。このような試験は、また、対象の年齢、性、人種、結腸直腸癌ステージおよび／または医学的状態および病歴を含み得る。したがって、医師は、例えば、参照予後を、対象の結腸直腸癌歴、腫瘍のステージ、腫瘍の形態、腫瘍の位置、転移の存在および広がりおよび／またはさらなる癌の特性に適合させ得る。
【０１６７】
一般的に、結腸直腸癌を有する患者に対する適当な処置戦略を決定するとき、処置に関与する医師は、いくつかのパラメーター、例えば、免疫組織化学的評価の結果、患者年齢、ホルモン受容体状態、全身状態および病歴、例えば、結腸直腸癌歴を考慮し得る。決定に導くために、該医師は、第１の局面にしたがって、ＲＢＭ３タンパク質試験を実施するか、または実施されるＲＢＭ３タンパク質試験を指示し得る。さらに、医師は、工程ｃ）および所望によりｂ）を医師自身で実施するが、工程ａ）および所望により工程ｂ）を実施することを他の誰か、例えば、研究員に割り当ててもよい。
【０１６８】
本発明の概念は、また、種々の処置レジメンを提供するための基準を形成し得る。
【０１６９】
例えば、図２−１３および１５−２１において示されているとおり、低いＲＢＭ３タンパク質レベルを示す対象に対する予後は、高いＲＢＭ３タンパク質レベルを示す対象に対する予後よりも一般的に悪い。本明細書の教示で提供されるとおり、したがって、医師は、ＲＢＭ３タンパク質の低い対象の予後を、特定のアジュバント処置レジメンが適当であることが乏しいと考え得る。したがって、本明細書は、以前に処置されていないグループの正確な処置のために提供され得る。
【０１７０】
本明細書の第２の局面の第１の構成として、したがって、結腸直腸癌を有する対象の処置の方法であって、
ａ）対象由来のサンプルの少なくとも一部に存在するＲＢＭ３タンパク質の量を評価し、該評価された量に対応するサンプル値を決定し、
ｂ）工程ｂ）において得られたサンプル値を参照値と比較し、
該サンプル値が該参照値以下であるとき、
ｃ）該対象を結腸直腸癌の処置レジメンで処置する
工程を含む方法を提供する。
【０１７１】
１つの態様にしたがって、該方法は
ｄ）該サンプル値が該参照値よりも高いとき、結腸直腸癌の処置レジメンで該対象を処置することを控える
さらなる工程を含み得る。
【０１７２】
対象は、アジュバント療法が、通常、余分な不必要な苦痛と考えられる進行した工程における結腸直腸癌を有し得る。しかしながら、このような場合において、医師は、問題の対象が高いＲＢＭ３タンパク質値によって長期生存の可能性が高いとき、アジュバント療法を適用することをどうしても決定し得る。
【０１７３】
したがって、第２の局面の第２の構成として、進行した工程、例えば、デュークスステージＤの結腸直腸癌を有する対象の処置の方法であって、
ａ）対象由来のサンプルの少なくとも一部に存在するＲＢＭ３タンパク質の量を評価し、該評価された量に対応するサンプル値を決定し、
ｂ）工程ｂ）において得られたサンプル値を参照値と比較し、
該サンプル値が該参照値よりも高いとき、
ｃ）該対象を長期生存のための結腸直腸癌の処置レジメンで処置する
工程を含む方法を提供する。
【０１７４】
さらに、該サンプル値が該参照値以下であるとき、対象は、一時的処置のみで処置され得る。
【０１７５】
第２の局面の方法の１つの態様において、工程ｂ）の参照値は参照予後と関連し得、工程ｃ）の該処置レジメンは参照予後以下の悪い予後に適合させ得る。第２の局面の第１の構成のこのような態様において、方法は、ｄ）該サンプル値が該参照値よりも高いとき、該対象を参照予後よりも良い予後に適している処置レジメンで処置し、適当な処置レジメンが処置をしないことであり得る、さらなる工程を含み得る。
【０１７６】
処置の方法は、意思決定および処置に限定され得る。したがって、第２の局面の別の構成として、結腸直腸癌を有する対象の処置の方法であって、
α）対象由来のサンプルにおけるＲＢＭ３タンパク質のレベルに対応するサンプル値を参照値と比較し、
該サンプル値が該参照値以下であるとき、
β）該対象をアジュバント結腸直腸癌の処置レジメンで処置する
工程を含む方法を提供する。
【０１７７】
対象由来のサンプルにおけるＲＢＭ３タンパク質のレベルに対応するサンプル値を得る多数の方法が、本明細書に記載されている。
【０１７８】
第２の局面の処置に関与する医師は、工程ｃ）および所望によりｂ）を医師自身で実施するが、工程ａ）および所望により工程ｂ）を実施することを他の誰か、例えば、研究員に割り当ててもよい。
【０１７９】
本明細書の方法の工程ａ）に関して、ＲＢＭ３タンパク質の量の増加は、一般的に、サンプル値の増加をもたらし、反対にはならない。しかしながら、いくつかの態様において、評価された量は、別々のサンプル値の任意のあらかじめ決められた数のいずれかに対応し得る。このような態様において、第１の量および第２の増加した量は、同じサンプル値に対応し得る。とにかく、ＲＢＭ３タンパク質の量の増加は、本明細書の文脈においてサンプル値の減少をもたらさない。
【０１８０】
しかしながら、不便なことに、同等の様式において、工程ｂ）とｃ）間の制限が逆であるとき、評価された量はサンプル値と逆に関連し得る。例えば、句「サンプル値が参照値以下であるとき」が「サンプル値が参照値以上であるとき」と置き換えられると、工程ｂ）とｃ）間の制限は逆になる。
【０１８１】
本明細書の文脈において、「予後」は、疾患の経過または結果およびその処置の予測を示す。例えば、予後は、また、疾患からの生存率または回復率の決定、ならびに対象の予期される生存時間の予測を示し得る。予後は、特に、将来の期間、例えば、３年、５年、１０年または他のあらゆる期間の対象の生存の可能性を確立することを含み得る。さらに、予後は、単一の値または広範な値により示され得る。
【０１８２】
さらに、本明細書の方法の文脈において、「早期に得られた」は、該方法が実施される前に得られることを示す。結果として、対象由来の早期に得られたサンプルが方法において使用されるとき、該方法は対象由来のサンプルを得ることを含まない、すなわち、該サンプルは該方法から離れている工程において該対象からあらかじめ得た。
【０１８３】
さらに、本明細書の文脈において、「結腸直腸癌を有する哺乳動物対象」は、一次または二次結腸直腸腫瘍を有する哺乳動物対象または結腸および／または直腸から腫瘍を除去されている哺乳動物対象を示し、腫瘍の除去は手術または治療のあらゆる適当な型により腫瘍を殺すか、または除去することを示す。本明細書の方法および使用局面において、「結腸直腸癌を有する哺乳動物対象」は、また、哺乳動物対象が使用または方法の実施時に結腸直腸を有することが疑われ、結腸直腸癌診断が後に確立される場合を含む。
【０１８４】
さらに、本明細書の文脈において、「参照値」は、対象に対する予後または適当な処置戦略に関して、決定の作成または結論の引き出しに関連することが見出されているあらかじめ決められた値を示す。
【０１８５】
また、本明細書の文脈において、参照予後と「関連する」参照値は、経験的データおよび／または臨床的に関連した仮定に基づいて対応する参照予後に割り当てられる参照値を示す。例えば、参照値は、対象の関連グループにおける平均ＲＢＭ３タンパク質値であり得、参照予後は同じグループにおける平均生存であり得る。さらに、参照値は、参照値を示す対象のグループの予後データに直接由来する参照予後に割り当てなくてもよい。参照予後は、例えば、参照値以下を示す対象に対する予後に対応し得る。すなわち、参照値が０から２の尺度で１であるとき、参照予後は値０または１を示す対象の予後であり得る。結果として、参照予後は、また、利用できるデータの性質に適合され得る。さらに上記されているとおり、参照予後は同様に他のパラメーターにさらに適合し得る。
【０１８６】
上記局面の方法の工程ａ）は、サンプルの少なくとも一部に存在するＲＢＭ３タンパク質の量を評価すること、および該量に対応するサンプル値を決定することを含む。「サンプルの少なくとも一部」は、適当な処置に関して、予後の確立または結論の引き出しのためのサンプルの関連部分を示す。当業者は、方法を実施するときに、環境下で関連するどの部分が存在するか理解している。例えば、細胞を含むサンプルを評価するとき、当業者は、サンプルの腫瘍細胞または腫瘍細胞の細胞質または核のみを考えてもよい。
【０１８７】
さらに、工程ａ）において、量が評価され、量に対応するサンプル値が決定される。結果として、ＲＢＭ３タンパク質の量の正確な測定は、サンプル値を得るために必要でない。例えば、ＲＢＭ３タンパク質の量は、染色された組織サンプルの目視検査により評価され得、次に、サンプル値は、例えば、評価された量に基づいて高いまたは低いとして分類され得る。
【０１８８】
当業者は、このような評価および決定を実施する方法を理解している。さらに、本明細書はこのような評価および決定のための助言を提供する。
【０１８９】
第１および第２の局面の処置レジメンは、例えば、アジュバントおよび／またはネオアジュバント療法であり得る。ネオアジュバント療法は、とりわけ経直腸癌の場合において、例えば放射線療法であり得る。適当なアジュバント療法は、主に化学療法および免疫療法である。さらに、アジュバント処置は、放射線療法と組み合わせられた化学療法および／または免疫療法であり得る。
【０１９０】
一般的な戦略は、対象が高いＲＢＭ３タンパク質であると見出されたときよりも、対象が低いＲＢＭ３タンパク質であると見出されたときにさらなる包括的な処置を適用することである。
【０１９１】
例えば、対象がデュークスステージＢの結腸直腸癌の結腸直腸癌を有するとき、アジュバント処置レジメンは化学療法であり得る。上記方法のいくつかにしたがって、対象が低いＲＢＭ３タンパク質であるとき、化学療法剤を対象に投与することを意味する。しかしながら、対象が高いＲＢＭ３タンパク質であるとき、化学療法剤での処置が不必要であると考えられ、したがって、対象に投与されないことも考慮される。
【０１９２】
別の例として、対象がデュークスステージＣの結腸直腸癌を有するとき、処置レジメンは、２つ以上の化学療法剤の組合せであり得る。上記方法のいくつかにしたがって、対象が低いＲＢＭ３タンパク質であるとき、組合せを対象に投与することを意味する。しかしながら、対象が高いＲＢＭ３タンパク質であるとき、組合せは不必要であると考えられ、したがって、対象に適用しない。後者の場合、１つの治療剤での処置が必要であると考えられ得る。
【０１９３】
化学療法剤の非限定的な例は、５フルオロウラシル、カペシタビン、Ｘｅｌｏｄａ（登録商標）、イリノテカンおよびオキサリプラチンである。５フルオロウラシル、カペシタビンおよびＸｅｌｏｄａ（登録商標）は、一般的に、単剤療法として単独で、または他の薬剤と組み合わせて与えられるが、イリノテカンおよびオキサリプラチンは、通常、他の薬剤と組み合わせて与えられる。
【０１９４】
免疫療法剤の非限定的な例は、ベバシズマブおよびセツキシマブである。
【０１９５】
第１および第２の局面の態様において、予後は生存の可能性であり得、該参照予後は、両方の生存が同じタイプの生存である生存の参照可能性であり得る。背景のセクションにおいて説明されているとおり、「生存」を測定するためにいくつかの方法がある。第１および第２の局面の生存は、例えば、全生存または無病生存であり得る。さらに、「生存」は、異なる期間、例えば、５、１０または１５年にわたって測定され得る。したがって、生存は、５年、１０年または１５年生存であり得る。
【０１９６】
上記局面の方法の態様において、対象は、異なる形態および／またはステージにおける結腸直腸癌を有し得る。
【０１９７】
これらの局面のいくつかの態様において、問題の結腸直腸癌は、リンパ節陰性の結腸直腸癌、すなわちリンパ節転移ステージまで進行していない結腸直腸癌である。他の類似の態様において、問題の結腸直腸癌は、デュークスステージＡまたはＢのいずれかである。さらに他の態様において、問題の結腸直腸癌は、結腸直腸腺腫または結腸直腸癌腫である。これらの態様において、対象が低いＲＢＭ３タンパク質発現を示すことを決定することは、疾患の将来の進行の予後に対して大きな価値があり得、したがって将来の疾患管理に関して十分な情報を得た上での決定にとっての基礎を形成し得る。このような比較的に初期の工程の疾患に罹患している対象のグループ内において、低いＲＢＭ３タンパク質発現を有する対象は、侵襲性疾患を発症する比較的に高い危険性がある。したがって、リンパ節陰性の結腸直腸癌またはデュークスステージＡまたはＢの結腸直腸癌を有する対象中の低いＲＢＭ３タンパク質発現は、これらの対象が低いＲＢＭ３タンパク質発現を示さない対象より、より注意深く監視されおよび／または異なる治療がなされるべきであることを示し得る。したがって、本発明の方法は、ＲＢＭ３タンパク質マーカーによって与えられるさらなる予後診断情報のおかげで、このような対象に対する特定の期間を超える生存および／またはより長い生存時間といった機会が高まる可能性をもたらす。さらに、図９に示されるとおり、高いＲＢＭ３タンパク質レベルは、デュークスステージＡまたはＢの結腸直腸癌を有する対象中の特に良好な予後と関連する。したがって、第１の局面の方法は、何らかのアジュバント処置の必要性がないデュークスステージＡまたはＢの結腸直腸癌を有する対象を同定するために使用され得る。
【０１９８】
デュークスステージＡの結腸直腸癌を有する対象は、従来、アジュバント化学療法で処置されない。しかしながら、本明細書の教示に導かれ、医師は、低い、または存在しないＲＢＭ３タンパク質発現を示すこのような対象を何らかのアジュバント処置を与えることを決定し得る。
【０１９９】
結果として、上記局面の方法の態様において、結腸直腸癌はデュークスステージＡである。別の、または相補的態様において、該結腸直腸癌は、上記ＴＮＭ病期分類システムにしたがってＴ１−２、Ｎ０およびＭ０である。
【０２００】
デュークスステージＢの癌を有する対象に関して、アジュバント療法を提供するか否かを決定することが特に困難であり得る。結果として、デュークスステージＢの対象は、特に、有益な予後がＲＢＭ３タンパク質測定の手段により決定された後の処置から明らかになり得る。したがって、いくつかの態様において、上記局面の方法の結腸直腸癌はデュークスステージＢであり得る。
【０２０１】
デュークスステージＣの結腸直腸癌を有する対象は、通常、アジュバント処置で処置される。このような対象が比較的不良な予後を有することが見出されたとき、組合せ処置がさらなる副作用を引き起こし、より費用もかかるが、組合せアジュバント処置が単剤処置よりもより適当であると考えられる。
【０２０２】
したがって、いくつかの態様において、上記局面の方法の結腸直腸癌は、転移結腸直腸癌であり得る。同様の態様において、問題の結腸直腸癌は、デュークスステージＣまたはＤ、好ましくはＣであり得る。
【０２０３】
上記局面の方法の態様において、サンプルは体液サンプルであり得る。例えば、体液サンプルは、血液、血漿、血清、脳脊髄液、尿、精液、リンパ液および滲出液からなる群から選択され得る。あるいは、サンプルは、細胞学的サンプルまたは糞便サンプルであり得る。
【０２０４】
ＲＢＭ３タンパク質発現のレベルは、好ましくは、細胞内的に測定される。したがって、体液、細胞学的または糞便サンプルは、例えば、細胞、例えば、腫瘍細胞を含み得る。
【０２０５】
上記局面の方法のさらなる態様において、サンプルは、組織サンプル、例えば、結腸直腸の組織サンプル、例えば、結腸または直腸由来のサンプルであり得る。組織サンプルは、免疫組織化学の手段によりＲＢＭ３タンパク質発現分析を容易にする。
【０２０６】
実施例の部４の結果は、Ｓ字結腸由来の組織サンプルにおける試験に基づく。したがって、上記局面の方法の態様において、サンプルは、Ｓ字結腸由来の組織サンプルであり得る。
【０２０７】
しかしながら、本発明者らは、また、主に左結腸癌および経直腸癌由来のサンプル基づくコホートにおけるＲＢＭ３タンパク質発現と予後の相関関係を観察した。
【０２０８】
本発明者らは、ＲＢＭ３タンパク質が腫瘍組織および間質の両方において発現していることを見出した。したがって、組織は該対象由来の腫瘍細胞または間質細胞を含み得る。
【０２０９】
さらに、本発明者らは、ＲＢＭ３タンパク質の核および細胞質の両方の発現が、予後の決定または処置の選択に関連することについて述べている（例えば、核発現に関して図２−６、９−１２、１５−１８および２１Ｂ、ならびに細胞質発現に関して図７−８、１３、１９および２１Ａ、参照）。したがって、工程ａ）の評価は、該サンプルの細胞、例えば、腫瘍細胞または間質細胞の核および／または細胞質に限定され得る。結果として、組織サンプルが試験されるとき、腫瘍細胞の核または細胞質のみが考慮され得る。このような試験は、例えば、免疫組織化学的染色により補助され得る。
【０２１０】
実施例の部４における組織サンプルは、男性および女性のヒト由来である。したがって、上記局面の方法の対象はヒトであり得、さらに、上記局面の方法の対象は男性または女性であり得る。
【０２１１】
本発明者らは、結腸直腸癌に罹患しており、ＲＢＭ３タンパク質発現を本質的に示さない対象が、一般的に、特に不良な予後を有することを見出した（図２、３ａ、４、５ａ、６、７ａ、８ａ、９ａ、１０、１１、１２ａ、１３、１９Ｂ、２０Ｃおよび２１参照）。結果として、対象が高いＲＢＭ３タンパク質または低いＲＢＭ３タンパク質であるかを決定する「カットオフ値」はゼロであり得る。
【０２１２】
したがって、上記局面の方法の態様において、工程ｂ）のサンプル値は、サンプルにおける検出可能なＲＢＭ３タンパク質の存在に対応する１、またはサンプルにおける検出可能なＲＢＭ３タンパク質の非存在に対応する０のいずれかであり得る。結果として、このような態様において、サンプルの評価はデジタルであり、すなわち、ＲＢＭ３タンパク質が存在するか否かのいずれかを考える。本明細書の文脈において、「検出可能なＲＢＭ３タンパク質がない」は、通常の操作可能な状況中に、上記局面のいずれかの方法の関連工程を実施する者または装置により検出可能でないごく少量であるＲＢＭ３タンパク質の量を示す。「通常の操作可能な状況」は、当業者が本明細書の方法を実施するために適当であると認める実験室的方法および技術を示す。
【０２１３】
したがって、本明細書の方法の態様において、工程ｂ）の参照値は０であり得る。本明細書の方法のさらなる態様において、工程ｂ）の参照値が検出可能なＲＢＭ３タンパク質を有さない参照サンプルに対応し得るということになる（以下参照）。
【０２１４】
参照値よりも高いＲＢＭ３タンパク質のサンプル値、またはこのようなサンプル値が得られる対象は、ときどき本明細書において「高いＲＢＭ３タンパク質であると称される。さらに、参照値以下であるＲＢＭ３タンパク質のサンプル値、またはこのようなサンプル値が得られる対象は、ときどき本明細書において「低いＲＢＭ３タンパク質」であると称される。
【０２１５】
本明細書の文脈において、「サンプル値」および「参照値」なる用語は、広く解釈するべきである。これらの値を得るためのＲＢＭ３タンパク質の定量化は、自動方法を介して、サンプルの視覚的または顕微鏡的検査に基づく採点システムを介して、またはそれらの組合せを介して行われ得る。しかしながら、また、例えば、ＲＢＭ３タンパク質発現のために染色された組織スライドの検査により単にサンプルおよび参照値を決定することが、当業者、例えば、組織病理学的の当業者に可能である。したがって、サンプル値が参照値よりも高いことの決定は、サンプル組織スライドが、参照組織スライドの場合よりも、より密に染色されている、および／または染色された細胞のより広い画分を示すことの視覚的または顕微鏡的検査での決定に対応し得る。サンプル値は、また、文献参照により得られる参照値、例えば、言葉において記載されている、または参照図による参照値と比較され得る。結果として、サンプルおよび／または参照値は、いくつかの場合において、当業者が検査および比較時に決定する精神的な(mental)値であり得る。
【０２１６】
例えば、当業者は、以前に検査された参照サンプルよりも多くＲＢＭ３タンパク質を含むとき高いと、以前に検査された参照サンプル以下のＲＢＭ３タンパク質を含むとき低いと、サンプルを高いまたは低いＲＢＭ３タンパク質であると分類し得る。このような評価は、サンプル、必要なとき、例えば、ＲＢＭ３タンパク質に対して選択的な抗体を含む染色溶液で参照サンプルを染色することにより支援され得る。
【０２１７】
対象由来のサンプル値との比較としての使用のための、結腸直腸癌対象に関して予後の確立または処置決定の作成に関連することが見出されている参照値は、種々の方法において提供され得る。本明細書の教示の知識で、当業者は、過度の負荷を強いることなく、本明細書の方法を実施するための関連参照値を提供することができる。
【０２１８】
上記局面の方法を実施する者は、例えば、参照値を所望の情報に適合させ得る。例えば、参照値は、非常に重要な予後診断情報、例えば、ＲＢＭ３タンパク質が高い生存曲線とＲＢＭ３タンパク質が低い生存曲線間の最も大きな分離を得るために適合され得る。あるいは、参照値は、特に良い予後または特に不良な予後を有するグループを選ぶように選択され得る。存在しない細胞質強度（図８ａ、１３、１９ｂ、２１ａ）、存在しない核強度（図６、２１ｂ）および＜２％の核画分（図２、３ａ、４、５ａ、９ａ、１０、１１、１２ａ、２０ｃ）は、特に乏しい予後を有するグループに選ばれるために使用され得る参照値の例であり、弱い／中程度の細胞質強度（図７ｂ、１９ａ）、弱い／中程度の核強度（図１８）および７５％の核画分（図２、３ｂ、４、５ｂ、９ｂ、１１、１２ｂ、１５ｂ、１６ｂ、２０ｂ）は、特に良好な予後を有するグループに選ばれるために使用され得る参照値の例である。
【０２１９】
上記局面の方法の態様において、参照値は、方法の対象の健常組織、例えば、健常結腸直腸組織、または間質組織におけるＲＢＭ３タンパク質発現の量に対応し得る。別の例として、参照値は、別の比較できる対象由来の正常組織の標準サンプルにおいて測定されるＲＢＭ３タンパク質発現の量により提供され得る。別の例として、参照値は、腫瘍細胞を含む参照サンプル、例えば、腫瘍組織、例えば、結腸直腸癌組織の参照サンプルにおいて測定されるＲＢＭ３タンパク質の量発現により提供され得る。参照サンプルのタンパク質発現の量は、好ましくは以前に確立されていてもよい。結果として、該参照値は、あらかじめ決められた量のＲＢＭ３タンパク質を発現する細胞を含む参照サンプルにおいて測定されるＲＢＭ３タンパク質の量により提供され得る。
【０２２０】
さらに、参照値は、例えば、あらかじめ決められた、または制御されたＲＢＭ３タンパク質の量を発現する細胞株、例えば、癌細胞株を含む参照サンプルにおいて測定されたＲＢＭ３タンパク質発現の量により提供され得る。当業者は、例えば、Rhodes et al. (2006) The biomedical scientist, p 515-520の記載により導かれて、このような細胞株を提供する方法を理解している。
【０２２１】
結果として、本明細書の方法の態様において、参照値は、参照サンプルにおけるＲＢＭ３タンパク質発現の量に対応するあらかじめ決められた値であり得る。
【０２２２】
しかしながら、以下にさらに記載されているとおり、参照サンプルにおけるＲＢＭ３タンパク質の量は、参照値に直接対応しなくてもよい。参照サンプルは、また、種々の参照値を評価するための方法を実施する者を手助けするＲＢＭ３タンパク質の量を提供し得る。例えば、該参照サンプルは、「陽性」参照値および／または「陰性」参照値を提供することにより、参照値の心像(mental image)の創造において手助けとなり得る。
【０２２３】
サンプル、例えば、対象由来の早期に得られたサンプルまたは参照サンプルにおけるＲＢＭ３タンパク質発現の定量化のための別の方法は、特定のレベルを越えるＲＢＭ３タンパク質発現を示すサンプルにおける細胞の画分の決定である。画分は、例えば、全細胞のＲＢＭ３タンパク質発現が考慮される「細胞画分」、細胞の細胞質のみのＲＢＭ３タンパク質発現が考慮される「細胞質画分」、または細胞の核のみのＲＢＭ３タンパク質発現が考慮される「核画分」であり得る。核または細胞質画分は、例えば、関連細胞集団の免疫反応細胞が＜２％、２−２５％、＞２５−７５％または＞７５％として分類され得る。「細胞質画分」は、細胞質において陽性染色を示すサンプルにおける関連細胞のパーセントに対応し、細胞質における中位の、またははっきりとしたおよび強い免疫反応は陽性と考え、細胞質における存在しない、またはわずかな免疫反応は陰性と考える。「核画分」は、核において陽性染色を示すサンプルにおける関連細胞のパーセントに対応し、核における中位の、またははっきりとしたおよび強い免疫反応は陽性と考え、核における存在しない、またはわずかな免疫反応は陰性と考える。病理学的の当業者は、方法を実施するとき、条件と関連するどの細胞が存在するか理解しており、一般知識および本明細書の教示に基づいて細胞質または核画分を決定し得る。該関連細胞は、例えば、腫瘍細胞であり得る。さらに、当業者は、「細胞画分」を使用して対応する測定を実施する方法を理解している。
【０２２４】
サンプル、例えば、対象由来の早期に得られたサンプルまたは参照サンプルにおけるＲＢＭ３タンパク質発現の定量化のための別の方法は、サンプルの全染色強度の決定である。強度は、例えば、全細胞のＲＢＭ３タンパク質発現が考慮される「細胞強度」、細胞の細胞質のみのＲＢＭ３タンパク質発現が考慮される「細胞質強度」、または細胞の核のみのＲＢＭ３タンパク質発現が考慮される「核強度」であり得る。細胞質および核強度は、臨床的組織病理学的診断において使用される標準にしたがって主観的に評価される。細胞質強度決定の結果は、存在しない＝サンプルの関連細胞の細胞質において全免疫反応がない、弱い＝サンプルの関連細胞の細胞質においてわずかな全免疫反応、中程度＝サンプルの関連細胞の細胞質において中位の全免疫反応、または強い＝サンプルの関連細胞の細胞質においてはっきりとしたおよび強い全免疫反応として分類され得る。核強度決定の結果は、存在しない＝サンプルの関連細胞の核において全免疫反応がない、弱い＝サンプルの関連細胞の核においてわずかな全免疫反応、中程度＝サンプルの関連細胞の核において中位の全免疫反応、または強い＝サンプルの関連細胞の核においてはっきりとしたおよび強い全免疫反応として分類され得る。いくつかの態様において、弱いおよび中程度の値は、弱い／中程度の値に組み合わされ得る（実施例の部４も参照）。当業者は、方法を実施するとき、条件と関連するどの細胞が存在するか理解しており、一般知識および本明細書の教示に基づいて核または細胞質強度を決定し得る。該関連細胞は、例えば、腫瘍細胞であり得る。さらに、当業者は、「細胞強度」を使用して対応する測定を実施する方法を理解している。
【０２２５】
本発明者らは、ＲＢＭ３タンパク質の細胞質および核発現の両方が予後の確立に関連することを見出した。
【０２２６】
したがって、上記局面の方法の態様において、参照値は、細胞質画分、細胞質強度またはそれらの組合せであり得る。したがって、サンプル値は、細胞質画分、細胞質強度またはそれらの組合せであり得る。
【０２２７】
上記局面の方法のさらなる態様において、参照値は、したがって、核画分、核強度またはそれらの組合せであり得る。したがって、サンプル値は、核画分、核強度またはそれらの組合せであり得る。
【０２２８】
図面、特に図２、４、１１、１５ａ、１６ａおよび２０ａに示されているとおり、ほとんどすべての細胞質画分、細胞質強度、核画分または核強度は、生存に対する予後が比較的に良いか、または比較的に悪いかを決定するための関連参照値として機能し得る。
【０２２９】
したがって、上記局面の方法の態様において、工程ｃ）における結論の基準は、サンプル値が０％、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％または９５％の核または細胞質画分よりも高いことである。
【０２３０】
上記局面の方法の別の、または相補的態様において、工程ｂ）の参照値は、９５％以下、例えば、９０％以下、例えば、８５％以下、例えば、８０％以下、例えば、７５％以下、例えば、７０％以下、例えば、６５％以下、例えば、６０％以下、例えば、５５％以下、例えば、５０％以下、例えば、４５％以下、例えば、４０％以下、例えば、３５％以下、例えば、３０％以下、例えば、２５％以下、例えば、２０％以下、例えば、１５％以下、例えば、１０％以下、例えば、５％以下、例えば、２％以下、例えば、１％以下、例えば、０％の核または細胞質画分である。
【０２３１】
さらに、上記局面の方法の態様において、工程ｃ）における結論の基準は、存在しない細胞質または核強度より高い、例えば、弱い細胞質または核強度より高い、例えば、中程度の細胞質または核強度より高いサンプル値であり得る。上記局面の方法の別の、または相補的態様において、工程ｂ）の参照値は、ＲＢＭ３タンパク質発現の中程度の細胞質または核強度またはそれ未満、例えば、ＲＢＭ３タンパク質発現の弱い細胞質または核強度またはそれ未満、例えば、存在しない細胞質または核強度であり得る。
【０２３２】
より高い参照値は、目的が、試験される対象が特に良好な予後を有すると、またはアジュバント処置の必要性がないと決定することであるときに特に関連し得る。例えば、より高い参照値は、「非処置戦略」に対する対象を選択するために使用され得る。したがって、上記局面の方法の態様において、参照値は、４０−９０％のＲＢＭ３タンパク質陽性細胞、例えば、５０−９０％のＲＢＭ３タンパク質陽性細胞、例えば、６０−９０％のＲＢＭ３タンパク質陽性細胞、例えば、６５−８５％のＲＢＭ３タンパク質陽性細胞の核画分または細胞画分であり得る。上記局面および同じ理由の方法のさらなる態様において、参照値は、弱い／中程度または中程度の細胞質または核強度であり得る。
【０２３３】
より低い参照値は、目的が、試験される対象が特に不良な予後を有すると、または比較的に積極的な処置の必要性がないと決定することであるときに特に関連し得る。例えば、より低い参照値は、深刻な副作用を引き起こす組合せアジュバント処置の必要性がある対象を同定するために使用され得る。したがって、上記局面の方法の態様において、参照値は、０−２５％のＲＢＭ３タンパク質陽性細胞、例えば、０−１５％のＲＢＭ３タンパク質陽性細胞、例えば、０−１０％のＲＢＭ３タンパク質陽性細胞、例えば、０−５％のＲＢＭ３タンパク質陽性細胞、例えば、０−２％のＲＢＭ３タンパク質陽性細胞の核画分または細胞画分であり得る。上記局面および同じ理由の方法のさらなる態様において、参照値は、存在しない細胞質または核強度であり得る。
【０２３４】
したがって、参照値は、あらゆる型の強度または画分であり得る。しかしながら、本発明者らは、参照値が核画分、核強度および細胞質強度から選択されるとき、特に予後に関して、結論との関連を描き得ることを見出した（図、参照）。
【０２３５】
あるいは、上記局面の方法の態様において、参照値は、画分値および強度値の組合せであり得る。
【０２３６】
また、上記局面の方法の態様において、参照値は、画分値および強度値の組合せであり得る。例えば、このような関数は染色スコアであり得る。「染色スコア」は、以下の実施例の部４および表１に記載されているとおりに計算される。例えば、参照値は、２以下、例えば、１以下、例えば、０の染色スコアであり得る。
【０２３７】
当業者は、強度値または画分値である別の参照値が、また、本発明の範囲内であると理解される。同様に、当業者は、画分および強度の他の組合せが、また、本発明の範囲内であると理解される。結果として、参照値は、２つ、恐らくそれ以上の基準を含み得る。
【０２３８】
一般的に、参照値としての強度値および／または画分値の選択は、染色処理、例えば、使用される抗ＲＢＭ３抗体および染色試薬に依存し得る。
【０２３９】
本明細書により導かれると、当業者、例えば、病理学者は、画分、例えば、細胞、細胞質または核画分、または、強度、例えば、細胞、細胞質または核強度を得て、評価を行う方法を理解している。例えば、当業者は、特定の画分または強度の外観を確立するために、あらかじめ決められた量のＲＢＭ３タンパク質を含む参照サンプルを使用し得る。
【０２４０】
しかしながら、参照サンプルは、実際の参照値の提供のために使用されるだけでなく、参照値に対応する量より高いＲＢＭ３タンパク質の量を有するサンプルの例の提供のためにもまた使用され得る。一例として、組織化学的染色において、例えば、免疫組織化学的染色において、当業者は、高い量のＲＢＭ３タンパク質を有する染色されたサンプルの外観を確立するための参照サンプル、例えば、陽性参照を使用し得る。次に、当業者は、より少ない量のＲＢＭ３タンパク質を有するサンプルの外観、例えば、参照値に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を有するサンプルの外観を評価し得る。言い換えれば、当業者は、参照サンプルを使用して、参照サンプルのＲＢＭ３タンパク質の量よりも少ないＲＢＭ３タンパク質の量に対応する参照値の心像を創造し得る。あるいは、または相補的に、このような評価において、当業者は、このようなサンプルの外観を確立するために少量のＲＢＭ３タンパク質を有する、または検出可能なＲＢＭ３タンパク質を欠いている別の参照サンプル、例えば、「陰性参照」を使用し得る。
【０２４１】
例えば、１０％核画分の参照値が使用されるとき、２つの参照サンプルは、参照値よりも低い、検出可能なＲＢＭ３タンパク質を有さず、したがって０の核画分に対応する第１の参照サンプル、および、参照値よりも高い、７５％以上の核画分に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を有する第２の参照サンプルを使用され得る。
【０２４２】
結果として、評価において、当業者は、高い量のＲＢＭ３タンパク質を有するサンプルの外観を確立するために参照サンプルを使用し得る。このような参照サンプルは、高い量のＲＢＭ３タンパク質を発現する組織を含むサンプル、例えば、以前に確立されている高い発現のＲＢＭ３タンパク質を有する結腸直腸腫瘍組織を含むサンプルであり得る。
【０２４３】
したがって、参照サンプルは、強い細胞質強度（ＣＩ）の一例を提供し得る。強いＣＩを有するサンプルの外観が分かると、次に当業者はサンプルをＣＩカテゴリー、存在しない、弱い、中程度および強いに分け得る。この分配は、さらに、検出可能なＲＢＭ３タンパク質を欠いている参照サンプル（陰性参照）、すなわち、存在しない細胞質強度を提供する参照サンプルにより補助され得る。また、参照サンプルは、７５％以上の核画分（ＮＦ）を有するサンプルの一例を提供し得る。７５％以上の陽性細胞を有するサンプルの外観が分かると、次に、当業者は、例えば、より低いパーセントの陽性細胞を有する他のサンプルのＮＦを評価し得る。この分配は、さらに、本質的にＲＢＭ３タンパク質を欠いている参照サンプル（陰性参照）、すなわち、低いＮＦ（例えば、＜５％、例えば、＜２％）、または０のＮＦを提供する参照サンプルにより補助され得る。
【０２４４】
上記のとおり、制御された量のＲＢＭ３タンパク質を発現する細胞株は、参照、特に陽性参照として使用され得る。
【０２４５】
１つ以上の図(picture)は、また、「参照サンプル」として提供され得る。例えば、このような図は、特定の条件で特定の抗体で染色され、特定の細胞強度および／または画分を示す腫瘍組織スライドの一例を示し得る。「参照サンプル」に対する上記載は、図に変更すべきところは変更して適用する。
【０２４６】
さらに、当業者は、タンパク質が関連遺伝子によってコードされ、発現の関連パターンを示す限り、上記局面の方法の有用性が問題の対象に存在するＲＢＭ３タンパク質の特定の変異体の定量化に限定されないことを認識すべきである。非限定的な例として、ＲＢＭ３タンパク質は
ｉ）配列番号：１、および
ｉｉ）配列番号：１と少なくとも８５％同一である配列
から選択される配列を含むか、またはそれからなり得る。
【０２４７】
いくつかの態様において、上記配列ｉｉ）は、配列番号：１と少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一である。
【０２４８】
別の非限定的な例として、ＲＢＭ３タンパク質は、
ｉ）配列番号：２、および
ｉｉ）配列番号２と少なくとも８５％同一である配列
から選択される配列を含むか、またはそれからなり得る。
【０２４９】
いくつかの態様において、上記配列ｉｉ）は、配列番号：２と少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一である。
【０２５０】
本明細書の文脈において使用される「％同一」なる用語は、以下のとおりに計算される。質問(query)配列は、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ  アルゴリズム（Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J., Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680 (1994)）を使用して、標的配列にアラインされる。それぞれの位置でアミノ酸残基を比較し、標的配列において同一一致を有する質問配列における位置のパーセントを％同一として報告する。また、標的配列は、比較される位置の数を決定する。結果として、本明細書の文脈において、標的配列よりも短い質問配列は、標的配列と１００％同一であり得ない。例えば、８５個のアミノ酸の質問配列は、１００個のアミノ酸の標的配列と最大で８５％同一であり得る。
【０２５１】
いくつかの態様において、上記局面の方法は、対象由来の生物学的材料を得て、生物学的材料の関連部分を切除または選択し、該サンプルを得て、所望によりサンプルを固相上に配置し、工程ａ）の評価を容易にすることを含む、工程ａ）に先立つさらなる工程を含み得る。例えば、このようなさらなる工程は、該対象の結腸または直腸由来の組織材料を得て、所望によりパラフィンまたはホルマリンにおいて組織材料を固定し、該組織材料を組織処理し、該サンプルを構成する切片を得て、透明なスライド、例えば、顕微鏡のスライドガラス上に該サンプルを置くことを含み得る。
【０２５２】
上記局面の方法の態様において、ＲＢＭ３タンパク質は、ＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能である検出可能および／または定量化可能なアフィニティーリガンドのサンプルへの適用を介して、検出および／または定量され得る。アフィニティーリガンドの適用は、サンプルにおける任意のＲＢＭ３タンパク質へのアフィニティーリガンドの結合を可能にする条件下で実施される。
【０２５３】
具体化するために、上記局面の方法の態様において、工程ａ）は
ａ１）評価されるＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能である定量化可能なアフィニティーリガンドを該サンプルに適用し、該適用は該サンプルに存在するＲＢＭ３タンパク質への該アフィニティーリガンドの結合を可能にする条件下で実施され、
ａ２）非結合アフィニティーリガンドを除去し、
ａ３）該サンプルと共に残っているアフィニティーリガンドを定量し、該量を評価する
ことを含み得る。
【０２５４】
「サンプルと共に残っているアフィニティーリガンド」は、工程ａ２）において除去されなかったアフィニティーリガンド、例えば、サンプルへ結合したアフィニティーリガンドを示す。ここで、結合は、例えば、抗体と抗原間の相互作用であり得る。
【０２５５】
しかしながら、いくつかの態様において、ａ２）の非結合アフィニティーリガンドの除去、例えば、洗浄は、いつも必要ではない。したがって、上記局面の方法のいくつかの態様において、工程ａ）は
ａＩ）評価されるＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能である定量化可能なアフィニティーリガンドを該サンプルに適用し、該適用は該サンプルに存在するＲＢＭ３タンパク質への該アフィニティーリガンドの結合を可能にする条件下で実施され、
ａＩＩ）該サンプルに結合したアフィニティーを定量し、該量を評価する
ことを含み得る。
【０２５６】
本明細書の文脈において、例えば、その標的または抗原とアフィニティーリガンドの、「特異的」または「選択的」相互作用は、相互作用が、特異的と非特異的、または選択的と非選択的の相互作用間の区別が意味を成すということであることを意味する。２つのタンパク質間の相互作用は、ときどき、解離定数により測定される。解離定数は、２つの分子間の結合（またはアフィニティー）の強度を示す。一般的に、抗体とその抗原間の解離定数は、１０−７から１０−１１Ｍである。しかしながら、高い特異性／選択性は、必ずしも高いアフィニティーを必要としない。その対応物に対して低いアフィニティー（モル範囲において）を有する分子は、さらに高いアフィニティーを有する分子と同程度の選択的／特異的を示している。本明細書の場合において、特異的または選択的相互作用は、特定の方法が、組織サンプルまたは天然の、または処理された生物学的液体の液体サンプルにおける他のタンパク質の存在における所定の条件下で特異的タンパク質、標的タンパク質の存在および／または量を決定するために使用することができる程度を示す。言い換えれば、特異性または選択性は、関連タンパク質間で区別する能力である。特異的および選択的は、ときどき本説明において互換的に使用される。例えば、抗体の特異性または選択性は、以下の実施例の部２において決定され、分析は、それぞれタンパク質アレイ設定、懸濁液ビーズアッセイおよび多重競合アッセイを使用して実施され得る。特異性および選択性決定は、また、Nilsson P et al. (2005) Proteomics 5:4327-4337に記載されている。
【０２５７】
適当なアフィニティーリガンドを選択または製造する、および検出および／または定量化のための適当な形式および条件を選択することは当業者の能力の範囲内と考えられる。それにもかかわらず、有用であることが認められ得るアフィニティーリガンドの例、ならびに検出および／または定量化のための形式および条件の例は、説明のために以下に挙げられている。
【０２５８】
したがって、本明細書の態様において、アフィニティーリガンドは、抗体、そのフラグメントおよびその誘導体、すなわち、免疫グロブリン骨格に基づくアフィニティーリガンドからなる群から選択され得る。抗体およびそのフラグメントまたは誘導体は単離され得るか、および／または単一特異的であり得る。抗体は、マウス、ウサギ、ヒトおよび他の抗体、ならびに異なる種由来の配列を含むキメラ抗体、例えば、部分的ヒト化抗体、例えば、部分的ヒト化マウス抗体を含む、あらゆる起源のモノクローナルおよびポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体は、選択した抗原で動物の免疫化により生産される。定義された特異性のモノクローナル抗体は、Kohler and Milstein (Koehler G and Milstein C (1976) Eur. J. Immunol. 6:511-519)により開発されたハイブリドーマ科学技術を使用して生産することができる。本明細書の抗体フラグメントおよび誘導体は、フラグメントまたは誘導体である抗体と同じ抗原（例えば、ＲＢＭ３タンパク質）と選択的相互作用が可能である。抗体フラグメントおよび誘導体は、完全な免疫グロブリンタンパク質の重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）からなるＦａｂフラグメント；２つの可変抗体ドメインＶＨおよびＶＬからなるＦｖフラグメント(Skerra A and Pluckthun A (1988) Science 240:1038-1041)；フレキシブルな(flexible)ペプチドリンカーにより一緒に連結された２つのＶＨおよびＶＬドメインからなる一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）(Bird RE and Walker BW (1991) Trends Biotechnol. 9:132-137)；ベンズ・ジョーンズ(Bence Jones)ダイマー(Stevens FJ et al. (1991) Biochemistry 30:6803-6805)；ラクダ重鎖ダイマー(Hamers-Casterman C et al. (1993) Nature 363:446-448)および単一可変ドメイン(Cai X and Garen A (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:6280-6285; Masat L et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:893-896)、および単一ドメイン骨格、例えば、テンジクザメ由来の新規抗原受容体（ＮＡＲ）(Dooley H et al. (2003) Mol. Immunol. 40:25-33)および可変重鎖ドメインに基づくミニボディー(minibody)(Skerra A and Pluckthun A (1988) Science 240:1038-1041)を含む。
【０２５９】
成熟型タンパク質において開裂されるため、配列番号：１は、免疫化のために、例えば、大腸菌において効率的な発現を保証するために膜貫通領域を欠くように、任意のシグナルペプチドを欠くように設計された。結果として、本明細書の抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体は、例えば、アミノ酸配列が配列番号：１の配列を含む、好ましくはそれからなるタンパク質で動物、例えば、ウサギを免疫化する工程を含むプロセスにより得ることができる。例えば、免疫化工程は、フロイント完全アジュバント中のタンパク質での一次免疫化を含み得る。また、免疫化処理は、さらに、２−６週間の間隔をおいてフロイント不完全アジュバント中のタンパク質で少なくとも２回の追加免役を含み得る。所定の標的に対する抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体の生産の工程は、当分野で知られている。
【０２６０】
さらに、本明細書の抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体は、アミノ酸配列が配列番号４および配列番号：５から選択される配列からなるペプチドで動物を免疫化する工程を含むプロセスにより得ることができる。また、抗体またはフラグメントは、２０以下のアミノ酸、例えば、１５以下のアミノ酸からなり、配列番号：６−１９から選択される配列を含むＲＢＭ３フラグメントで動物を免疫化する工程を含むプロセスにより得ることができる。配列番号４−１９についてさらなる議論のために、以下を参照。
【０２６１】
本明細書の文脈において「単一特異的抗体」は、それ自体の抗原におけるアフィニティー精製され、それにより、他の抗血清タンパク質および非特異的抗体からこのような単一特異的抗体を分離されたポリクローナル抗体の集団の１つである。このアフィニティー精製は、その抗原に選択的に結合する抗体をもたらす。本明細書の場合において、ポリクローナル抗血清は、２工程免疫アフィニティーに基づくプロトコールにより精製され、標的タンパク質に対して選択的な単一特異的抗体を得る。抗原フラグメントの一般的なアフィニティータグに対する抗体は、捕獲剤として固定されたタグタンパク質を使用する第１の枯渇工程において除去される。第１の枯渇工程後、血清を捕獲剤として抗原を有する第２のアフィニティーカラムに負荷し、抗原に対して特異的な抗体を豊富にする（Nilsson P et al. (2005) Proteomics 5:4327-4337も参照）。
【０２６２】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、ならびにそれらのフラグメントおよび誘導体は、選択的生体分子認識を必要とする適用における、例えば、上記方法の局面のＲＢＭ３タンパク質の検出および／または定量化におけるアフィニティーリガンドの従来の選択性を示す。しかしながら、当業者は、選択的結合リガンドのハイスループット産生および低コスト生産系の要求の増加によって、新規生体分子多様性科学技術がこの１０年間に開発されていることを知っている。これは、免疫グロブリンならびに生体分子認識適用における結合リガンドとして有用であることが認められ、免疫グロブリンの代わりに、または一緒に使用することができる非免疫グロブリン起源の両方のアフィニティーリガンドの新規型の産生を可能にしている。
【０２６３】
アフィニティーリガンドの選択性に必要な生体分子の多様性は、複数の可能性ある骨格分子の１つの組み合わせ操作により産生され得、次に、特異的および／または選択的アフィニティーリガンドは、適当な選択基盤を使用して選択される。骨格分子は、免疫グロブリンタンパク質起源(Bradbury AR and Marks JD (2004) J. Immunol. Meths. 290:29-49)、非免疫グロブリンタンパク質起源(Nygren PA and Skerra A (2004) J. Immunol. Meths. 290:3-28)、またはオリゴヌクレオチド起源(Gold L et al. (1995) Annu. Rev. Biochem. 64:763-797)のものであり得る。
【０２６４】
多くの非免疫グロブリンタンパク質骨格は、新規結合タンパク質の開発における支持構造として使用されている。本明細書の使用のためにＲＢＭ３タンパク質に対するアフィニティーリガンドを産生するために有用なこのような構造の非限定的な例は、ブドウ球菌タンパク質Ａおよびそのドメインおよびこれらのドメインの誘導体、例えば、タンパク質Ｚ(Nord K et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15:772777)；リポカリン(Beste G et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:18981903)；アンキリン反復ドメイン(Binz HK et al. (2003) J. Mol. Biol. 332:489503)；セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）(Smith GP et al. (1998) J. Mol. Biol. 277:317-332; Lehtio J et al. (2000) Proteins 41:316-322)；γ結晶(Fiedler U and Rudolph R, W001/04144)；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）(Peelle B et al. (2001) Chem. Biol. 8:521-534)；ヒト細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ−４）(Hufton SE et al. (2000) FEBS Lett. 475:225-231; Irving RA et al. (2001) J. Immunol. Meth. 248:31-45)；プロテアーゼ阻害剤、例えば、ノッティン(Knottin)タンパク質(Wentzel A et al. (2001) J. Bacteriol. 183:7273-7284; Baggio R et al. (2002) J. Mol. Recognit. 15:126-134)およびクニッツ(Kunitz)ドメイン(Roberts BL et al. (1992) Gene 121:9-15; Dennis MS and Lazarus RA (1994) J. Biol. Chem. 269:22137-22144)；ＰＤＺドメイン(Schneider S et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17:170-175)；ペプチドアプタマー、例えば、チオレドキシン(Lu Z et al. (1995) Biotechnology 13:366-372; Klevenz B et al. (2002) Cell. Mol. Life Sci. 59:1993-1998)；ブドウ球菌ヌクレアーゼ(Norman TC et al. (1999) Science 285:591-595)；テンダミスタット(McConell SJ and Hoess RH (1995) J. Mol. Biol. 250:460-479; Li R et al. (2003) Proteins Eng. 16:65-72)；フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインに基づくトリネクチン(Koide A et al. (1998) J. Mol. Biol. 284:11411151; Xu L et al. (2002) Chem. Biol. 9:933-942)；および亜鉛フィンガー(Bianchi E et al. (1995) J. Mol. Biol. 247:154-160; Klug A (1999) J. Mol. Biol. 293:215218; Segal DJ et al. (2003) Biochemistry 42:2137-2148)である。
【０２６５】
非免疫グロブリンタンパク質骨格の上記の例は、新規結合特異性の産生のために使用される単一の無作為化ループを提供する骨格タンパク質、タンパク質表面から突出している側鎖が新規結合特異性の産生のために無作為化されている強固な二次構造を有するタンパク質骨格、および新規結合特異性の産生のために使用される非連続の超可変ループ領域を示す骨格を含む。
【０２６６】
非免疫グロブリンタンパク質に加えて、オリゴヌクレオチドは、また、アフィニティーリガンドとして使用され得る。アプタマーまたはデコイと呼ばれる一本鎖核酸は、明確に定義された三次元構造に折りたたまれ、高いアフィニティーおよび特異性を有するその標的に結合する（Ellington AD and Szostak JW (1990) Nature 346:818-822; Brody EN and Gold L (2000) J. Biotechnol. 74:5-13; Mayer G and Jenne A (2004) BioDrugs 18:351-359)。オリゴヌクレオチドリガンドは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであってよく、広範な標的分子クラスに結合することができる。
【０２６７】
任意の上記骨格構造の変異体のプールから所望のアフィニティーリガンドの選択性のために、多くの選択基盤が、選択された標的タンパク質に対する特異的新規リガンドの単離のために利用できる。選択基盤は、ファージディスプレイ(Smith GP (1985) Science 228:1315-1317)、リボソームディスプレイ(Hanes J and Pluckthun A (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:4937-4942)、酵母ツーハイブリッド系(Fields S and Song O (1989) Nature 340:245-246)、酵母ディスプレイ(Gai SA and Wittrup KD (2007) Curr Opin Struct Biol 17:467-473)、ｍＲＮＡディスプレイ(Roberts RW and Szostak JW (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:12297-12302)、細菌ディスプレイ(Daugherty PS (2007) Curr Opin Struct Biol 17:474-480, Kronqvist N et al. (2008) Protein Eng Des Sel 1-9, Harvey BR et al. (2004) PNAS 101(25):913-9198)、ミクロビーズディスプレイ(Nord O et al. (2003) J Biotechnol 106:1-13、W001/05808)、ＳＥＬＥＸ（試験管内進化法(System Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)）(Tuerk C and Gold L (1990) Science 249:505-510)およびタンパク質フラグメント相補性アッセイ（ＰＣＡ）(Remy I and Michnick SW (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:5394-5399)を含むが、これらに限定されない。
【０２６８】
したがって、本明細書の態様において、アフィニティーリガンドは、任意の上記タンパク質骨格由来の非免疫グロブリンアフィニティーリガンド、またはオリゴヌクレオチド分子であり得る。
【０２６９】
配列番号：１のＲＢＭ３タンパク質フラグメントは、他のヒトタンパク質と低い相同性を有するユニークな配列からなり、産生されたアフィニティー試薬の交差反応性を最小限にするように設計された。結果として、本明細書の態様において、アフィニティーリガンドは、配列番号：１の配列からなるポリペプチドと選択的相互作用が可能であり得る。
【０２７０】
以下の実施例の部５の下に記載されるとおり、２つのエピトープ領域（配列番号：４および配列番号：５）は、配列番号：１の範囲内に同定されている。したがって、いくつかの態様において、本明細書のアフィニティーリガンドは、配列番号：４および配列番号：５から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドと選択的相互作用が可能である。
【０２７１】
一例として、配列番号：４および配列番号：５と選択的相互作用が可能である抗体は、配列番号：１のアミノ酸配列からなる抗原での動物の免疫化、次に配列番号：４および配列番号：５のそれぞれのアミノ酸配列からなるペプチドを使用する抗血清のアフィニティー精製により得ることができる。
【０２７２】
さらに、実施例の部６の下に記載されているとおり、別の４つのエピトープ領域（配列番号：６−９）が特定されている。したがって、いくつかの態様において、本明細書のアフィニティーリガンドは、２０以下のアミノ酸、例えば、１５以下のアミノ酸からなり、配列番号：６−９から選択される配列を含むＲＢＭ３フラグメントと選択的相互作用が可能である。
【０２７３】
また、実施例の部７の下に記載されているとおり、別の１０個のエピトープ領域（配列番号：１０−１９）が特定されている。したがって、いくつかの態様において、本明細書のアフィニティーリガンドは、２０以下のアミノ酸、例えば、１５以下のアミノ酸からなり、配列番号：１０−１９から選択される配列を含むＲＢＭ３フラグメントと選択的相互作用が可能である。
【０２７４】
単一のエピトープ領域に対する選択性を有する抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、より長いペプチド配列（例えば、ＰｒＥＳＴまたは全長タンパク質）に対して産生された抗体と比較して、検出分析における再現性が高いため提供され得る。単一のエピトープ領域に対して選択的な抗体は、また、免疫組織化学的分析における染色を明瞭に、および強くするために提供され得る。これらの利益は、独立して、または共同で、本明細書の処置に関して予後を確立および決定するときに重要であり得る。図１４において、ポリクローナル抗体と比較しての本明細書のモノクローナル抗体の利益（選択性の増加）を説明している。
【０２７５】
モノクローナル抗体６Ｆ１１および１Ｂ５は、特に有益であると考えられる。図１４において、６Ｆ１１および１Ｂ５の両方は、ポリクローナル抗ＲＢＭ３抗体よりもさらに選択的であることを示す。さらに、１Ｂ５は、６Ｆ１１よりもさらに選択的であることを示す。１Ｂ５は、また、以下の実施例の部４において使用されている。
【０２７６】
１Ｂ５が実施例の部７において結合することが示されている配列番号：１７は、配列番号：５の範囲内である。本明細書の好ましい態様において、アフィニティーリガンドは、したがって、配列番号：５からなるＲＢＭ３フラグメントと選択的相互作用が可能であり、本明細書の特に好ましい態様において、アフィニティーリガンドは、２０以下のアミノ酸、例えば、１５以下のアミノ酸からなり、配列番号：１７の配列を含むＲＢＭ３フラグメントと選択的相互作用が可能である。
【０２７７】
６Ｆ１１は、配列番号：８および配列番号：１６に結合することを示す。本明細書の他の好ましい態様において、アフィニティーリガンドは、したがって、２０以下のアミノ酸、例えば、１５以下のアミノ酸からなり、配列番号：８および１６から選択される配列を含むＲＢＭ３フラグメントと選択的相互作用が可能である。配列番号：８および１６が重複しており、このようなフラグメントが配列番号：８および１６の両方の配列を含み得ることに注意すること。
【０２７８】
ＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能であるアフィニティーリガンドの検出および／または定量化は、生物学的相互作用に基づくアッセイにおける結合試薬の検出および／または定量化のための当業者に知られている任意の方法において成し遂げられ得る。したがって、上記のあらゆるアフィニティーリガンドが、ＲＢＭ３タンパク質の存在を定量的および／または定性的に検出するために使用され得る。これらの「一次」アフィニティーリガンドは、それ自体を種々のマーカーで標識させてもよく、また、検出、視覚化および／または定量化を可能にする標識化された二次アフィニティーリガンドにより同様に検出され得る。これは、ＲＢＭ３タンパク質との相互作用が可能であるアフィニティーリガンドへ、または任意の二次アフィニティーリガンドへ接合することができる任意の１つまたはそれ以上の多数の標識を使用して、任意の１つまたはそれ以上の多数の当業者に既知の技術を使用して、それ自体何ら過度の実験を必要とせず成し遂げることができる。
【０２７９】
一次および／または二次アフィニティーリガンドに接合することができる標識の非限定的な例は、蛍光色素または金属（例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、フルオレスカミン）、発色色素（例えば、ロドプシン）、化学発光化合物（例えば、ルミナール、イミダゾール）および生物発光タンパク質（例えば、ルシフェリン、ルシフェラーゼ）、ハプテン（例えば、ビオチン）を含む。種々の他の有用な蛍光剤および発色団は、Stryer L (1968) Science 162:526-533およびBrand L and Gohlke JR (1972) Annu. Rev. Biochem. 41:843-868に記載されている。アフィニティーリガンドは、また、酵素（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ラクタマーゼ）、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉ）および粒子（例えば、金）で標識化することができる。本明細書の文脈において、「粒子」は、分子の標識化のために適当な粒子、例えば、金属粒子を示す。さらに、アフィニティーリガンドは、また、蛍光半導体ナノ結晶（量子ドット）で標識化され得る。量子ドットは、上位の量子収量を有し、有機フルオロフォアと比較してさらに光安定であり、したがってさらに容易に検出される（Chan et al. (2002) Curr Opi Biotech. 13: 40-46）。異なる型の標識は、種々の化学、例えば、アミン反応またはチオール反応を使用してアフィニティーリガンドに接合することができる。しかしながら、アミンおよびチオール以外の反応基は、例えば、アルデヒド、カルボン酸およびグルタミンを使用することができる。
【０２８０】
上記の方法の局面は、限定されない選択が以下に記載されているいくつかの知られている形式および設定のいずれかにおいて使用され得る。
【０２８１】
組織学に基づく設定において、そのＲＢＭ３タンパク質標的に結合する標識化されたアフィニティーリガンドの検出、局在化および／または定量化は、視覚化技術、例えば、光学顕微鏡検査または免疫蛍光顕微鏡検査に関連し得る。他の方法は、フローサイトメトリーまたはルミノメトリーを介する検出に関連し得る。
【０２８２】
対象から取り出された、生物学的サンプル、例えば、結腸直腸組織由来の、例えば、腫瘍組織サンプル（生検）は、ＲＢＭ３タンパク質の検出および／または定量化のために使用され得る。生物学的サンプル、例えば、生検は早期に得られたサンプルであり得る。方法において早期に得られたサンプルを使用するとき、方法の工程はヒトまたは動物体で実施されない。アフィニティーリガンドは、ＲＢＭ３タンパク質の検出および／または定量化のためのサンプルに適用され得る。この処理は、ＲＢＭ３タンパク質の検出を可能にするだけでなく、加えて、その発現の分布および相対レベルを示し得る。
【０２８３】
該アフィニティーリガンドにおける標識の視覚化の方法は、蛍光、発光および／または酵素技術を含むが、これらに限定されない。蛍光は、蛍光標識を特定の波長の光に暴露することにより検出および／または定量され、その後、特定の波長領域の放射光が検出および／または定量される。発光的にタグを付けたアフィニティーリガンドの存在は、化学反応中に生じた発光により検出および／または定量され得る。酵素反応の検出は、化学反応を生じるサンプルにおける色の変化による。当業者は、種々の異なるプロトコールを適当な検出および／または定量化のために修飾することができることを知っている。
【０２８４】
上記局面の方法の態様において、生物学的サンプルは、固相支持体または担体、例えば、ニトロセルロースまたは適用される生物学的サンプルに存在するＲＢＭ３タンパク質を固定することが可能であるあらゆる他の固体支持体マトリックス上に固定され得る。本発明において有用ないくつかのよく知られている固体支持材は、ガラス、炭水化物（例えば、セファロース）、ナイロン、プラスチック、ウール、ポリスチレン、ポリエテン、ポリプロピレン、デキストラン、アミラーゼ、フィルム、樹脂、セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、アルミナ、斑糲岩および磁鉄鉱を含む。生物学的サンプルの固定化後、ＲＢＭ３タンパク質に特異的な一次アフィニティーリガンドは、例えば、本明細書の実施例の４に記載されているとおりに適用され得る。一次アフィニティーリガンドがそれ自体標識化されていないとき、支持マトリックスは、当分野で知られている１つ以上の適当なバッファーで洗浄され、次に標識化された二次アフィニティーリガンドへ暴露され、再びバッファーで洗浄され、結合していないアフィニティーリガンドを除去され得る。その後、選択的アフィニティーリガンドは、慣用の方法で検出および／または定量され得る。アフィニティーリガンドに対する結合特性は、１つの固体支持体から他のものへ変化し得るが、当業者は、日常の実験によりそれぞれの決定のための機能的な、および最適なアッセイ条件を決定することができるはずである。
【０２８５】
結果として、上記局面の方法の態様において、ａ１）またはａＩ）の定量化可能なアフィニティーリガンドは、該定量化可能なアフィニティーリガンドを認識することが可能である二次アフィニティーリガンドを使用して検出され得る。したがって、ａ３）またはａＩＩ）の定量化は、定量化可能なアフィニティーリガンドに対するアフィニティーを有する二次アフィニティーリガンドの手段により実施され得る。一例として、二次アフィニティーリガンドは、抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体であり得る。
【０２８６】
一例として、ＲＢＭ３タンパク質の検出および／または定量化のための１つの利用できる方法は、アフィニティーリガンドを、次に酵素免疫測定法（例えば、ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）において後に検出および／または定量することができる酵素に連結させることによるものである。このような技術はよく確立されており、それらの実現には当業者に何ら過度の困難性が存在しない。このような方法において、生物学的サンプルを、固体材料、または、次に酵素的に標識化された二次アフィニティーリガンドで検出および／または定量される、ＲＢＭ３タンパク質に対するアフィニティーリガンドへ接合した固体材料と接触させる。この後、適当な基質を、例えば、分光光度計、蛍光光度計、照度計を使用して、または視覚化手段により検出および／または定量される化学部分を生産するように適当なバッファー中で酵素標識と反応させるために提供する。
【０２８７】
上記のとおり、一次およびあらゆる二次アフィニティーリガンドは、検出および／または定量化を可能にするために放射性同位体で標識化することができる。本明細書における適当な放射性同位体の非限定的な例は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉである。標識化されたアフィニティーリガンドの比活性は、放射性同位体の半減期、同位体純度、および標識がアフィニティーリガンドに組み込まれているかどうかに依存する。アフィニティーリガンドは、好ましくは、よく知られている技術（Wensel TG and Meares CF (1983) in: Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy (Burchiel SW and Rhodes BA eds.) Elsevier, New York, pp 185-196）を使用して標識化される。したがって、放射性標識されたアフィニティーリガンドは、インビボまたはインビトロにおいて放射能の検出によりＲＢＭ３タンパク質を可視化するために使用することができる。例えば、ガンマカメラを有する放射性核種スキャン、磁気共鳴分光学または放出断層撮影は、インビボおよびインビトロにおいて機能するが、ガンマ／ベータカウンター、シンチレーションカウンターおよびＸ線撮影は、インビトロにおいて使用される。
【０２８８】
本明細書の第３の局面として、上記局面の方法を実施するためのキットであって、
ａ）ＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能である定量化可能なアフィニティーリガンド、および
ｂ）該定量化可能なアフィニティーリガンドの量を定量するために必要な試薬
を含むキットを提供する。
【０２８９】
第３の局面のキットの種々の成分は、本明細書の方法の局面に関連して上記されているとおりに選択され、特定され得る。
【０２９０】
したがって、本明細書のキットは、ＲＢＭ３タンパク質に対するアフィニティーリガンド、ならびにＲＢＭ３タンパク質に特異的および／または選択的に結合した後に特異的および／または選択的アフィニティーリガンドを定量する手助けをする他の手段を含む。例えば、キットは、ＲＢＭ３タンパク質およびＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能であるアフィニティーリガンドにより形成される複合体を検出する、および／または定量するための二次アフィニティーリガンドを含み得る。また、該キットは、キットを容易および効率的に使用することができるように、アフィニティーリガンド以外の種々の補助物質を含み得る。補助物質の例は、キットの凍結乾燥されたタンパク質成分を溶解または再構成するための溶媒、洗浄バッファー、酵素を標識として使用する場合において酵素活性を測定するための基質、パラフィンまたはホルマリン固定された組織サンプルを使用する場合において、抗原への接近性を増強するための標的回復溶液(target retrieval solution)、および物質、例えば、免疫測定試薬キットにおいて一般的に使用される、染色対比を増加させるために背景染色および／または対比染色溶液を減少させるための反応防止剤、例えば、内因性酵素遮断溶液を含む。
【０２９１】
キットの局面の態様において、アフィニティーリガンドは、方法の局面に関連して上記されているとおり選択され得る。
【０２９２】
さらに、方法の局面に関連して上記されていることにしたがって、検出可能なアフィニティーリガンドは、キットの局面の態様において、蛍光色素および金属、発色色素、化学発光化合物および生物発光タンパク質、酵素、放射性同位体、粒子および量子ドットからなる群から選択される標識を含み得る。あるいは、アフィニティーリガンドの量を定量するために必要な試薬は、定量化可能なアフィニティーリガンドを認識することが可能である二次アフィニティーリガンドを含む。一例として、定量化可能なアフィニティーリガンドを認識することが可能である二次アフィニティーリガンドは、蛍光色素または金属、発色色素、化学発光化合物および生物発光タンパク質、酵素、放射性同位体、粒子および量子ドットからなる群から選択される標識を含む。
【０２９３】
キットの局面のキットは、また、有利には、サンプル値と比較するために使用される参照値を提供する、またはもたらすための参照サンプルを含み得る。例えば、参照サンプルは、あらかじめ決められた量のＲＢＭ３タンパク質を含み得る。このような参照サンプルは、例えば、あらかじめ決められた量のＲＢＭ３タンパク質を含む組織サンプルにより構成され得る。次に、該組織参照サンプルは、参照組織サンプルおよび対象サンプルにおける発現レベルの手動、例えば、肉眼的、または自動比較により、試験されるサンプルにおけるＲＢＭ３発現状態の決定において当業者により使用され得る。別の例として、参照サンプルは、あらかじめ決められた、または制御されたＲＢＭ３タンパク質の量を発現する細胞株、例えば、癌細胞株を含み得る。当業者は、例えば、Rhodes et al. (2006) The biomedical scientist, p 515-520の記載により導かれる、このような細胞株を提供する方法を理解している。一例として、細胞株はホルマリン固定されていてもよい。また、このようなホルマリン固定された細胞株は、パラフィン包埋されていてもよい。
【０２９４】
「参照値の提供のための参照サンプル」なる用語は、本明細書の文脈において広く解釈されるべきである。該参照サンプルは、参照値に実際に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を含み得るが、また、参照値よりも高い値に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を含み得る。後者の場合は、「高い」値は、方法を実施する者により、例えば、「高い」値より低い参照値の外観を評価するために上位の参照（陽性参照）として使用され得る。免疫組織化学の当業者は、このような評価の仕方を理解している。さらに、別の、または相補的な例として、当業者は、このような評価において「低い」値の提供のために少量のＲＢＭ３タンパク質を含む別の参照サンプルを、例えば、陰性参照として使用し得る。これは、方法の局面に関連してさらに上記されている。
【０２９５】
結果として、キットの局面の態様において、参照サンプルは、参照値に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を含み得る。一例として、参照サンプルは、９５％以下、例えば、９０％以下、例えば、８５％以下、例えば、８０％以下、例えば、７５％以下、例えば、７０％以下、例えば、６５％以下、例えば、６０％以下、例えば、５５％以下、例えば、５０％以下、例えば、４５％以下、例えば、４０％以下、例えば、３５％以下、例えば、３０％以下、例えば、２５％以下、例えば、２０％以下、例えば、１５％以下、例えば、１０％以下、例えば、５％以下、例えば、２％以下、例えば、１％以下、例えば、０％の核または細胞質画分に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を含み得る。
【０２９６】
あるいは、または相補的に、該参照サンプルは、中程度の核または細胞質強度発現またはそれ以下、例えば、ＲＢＭ３タンパク質発現の弱い核または細胞質強度またはそれ以下、例えば、非存在の核または細胞質強度に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を含み得る。
【０２９７】
上記のとおり、より高い参照値は、目的が、試験される対象が特に良好な予後を有すると、またはアジュバント処置の必要性がないと決定することであるときに特に関連し得る。したがって、参照サンプルは、４０−９０％、例えば、５０−９０％、例えば、６０−９０％、例えば、６５−８５％の核または細胞質画分に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を含み得る。さらなる態様において、参照サンプルは、弱い／中程度または中程度の核または細胞質強度に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を含み得る。また、上記のとおり、より低い参照値は、目的が、試験される対象が特に不良な予後を有すると、または侵襲性アジュバント処置の必要性があると決定することであるときに特に関連し得る。したがって、参照サンプルは、０−２５％、例えば、０−１５％、例えば、０−１０％、例えば、０−５％、例えば、０−２％の核または細胞質画分に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を含み得る。さらなる態様において、参照サンプルは、非存在の核または細胞質強度に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を含み得る。さらに、参照サンプルは、０、１または２の染色スコアに対応するＲＢＭ３タンパク質の量を含み得る（表１参照）。
【０２９８】
画分値および強度値の提供は、方法の局面に関連して上記されている。
【０２９９】
キットの局面のさらに別の、または相補的態様において、該キットは、参照値よりも高い値に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を含む参照サンプルを含み得る。これらの態様において、参照サンプルは、例えば、７５％以上の核または細胞質画分および／または強い核または細胞質強度に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を含み得る。
【０３００】
キットの局面の別の、または相補的態様において、該キットは、参照値以下である値に対応するＲＢＭ３タンパク質の量、例えば、非存在の核または細胞質強度および／または＜２％のＲＢＭ３タンパク質の陽性細胞、例えば、０％のＲＢＭ３タンパク質の陽性細胞の核または細胞質画分を含む参照サンプルを含み得る。
【０３０１】
したがって、該キットは、あらかじめ決められた参照値に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を含む参照サンプル、あらかじめ決められた参照値よりも高い値に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を含む参照サンプル、および／またはあらかじめ決められた参照値以下である値に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を含む参照サンプルを含み得る。
【０３０２】
結果として、キットの態様は、あらかじめ決められた参照値よりも高いＲＢＭ３タンパク質の量を含む第１の参照サンプル、およびあらかじめ決められた参照値以下であるＲＢＭ３タンパク質の量を含む第２の参照サンプルを含み得る。
【０３０３】
キットの局面の態様において、該参照サンプルは、組織サンプル、例えば、肉眼的または顕微鏡的評価に適している組織サンプルであり得る。一例として、該組織参照サンプルは、パラフィンで固定されるか、またはホルマリンで緩衝され、および／または顕微鏡的スライドガラス上に乗せられる切片（例えば、μｍ−薄片）に組織処理され得る。組織参照サンプルは、ＲＢＭ３タンパク質に対するアフィニティーリガンド、例えば、抗体での染色にさらに適している可能性がある。
【０３０４】
結果として、キットの局面の態様において、該参照サンプルは、いずれかの関連参照値、例えば、上記いずれか１つの参照値を直接的または間接的に提供するために、適当であり得る。
【０３０５】
キットの局面の参照サンプルのさらなる態様は、方法の局面の参照値および参照サンプルに関連して上記されている。
【０３０６】
上記見出したことにしたがって、本発明者らは、ＲＢＭ３タンパク質およびそのフラグメントに対するいくつかの使用を十分に理解している。
【０３０７】
したがって、本明細書の第４の局面の第１の構成として、結腸直腸癌を有する哺乳動物対象に対する予後診断マーカーとしてのＲＢＭ３タンパク質、例えば、サンプルにおけるＲＢＭ３タンパク質の使用を提供する。
【０３０８】
同様の様式において、結腸直腸癌を有する哺乳動物対象に対する比較的良好な予後のマーカーとしてのＲＢＭ３タンパク質、例えば、サンプルにおけるＲＢＭ３タンパク質の使用を提供する。
【０３０９】
本明細書の文脈において、「予後診断マーカー」は、存在が予後を示すあらゆる物質を示す。したがって、該マーカーは、バイオマーカー、例えば、ヒトタンパク質であり得る。
【０３１０】
第４の局面の第２の構成として、結腸直腸癌を有する哺乳動物対象に対する予後診断薬の生産、選択または精製のためのＲＢＭ３タンパク質またはその抗原的に活性なフラグメントの使用を提供する。
【０３１１】
本明細書の文脈において、「予後診断薬」は、予後、例えば、結腸直腸癌を有する哺乳動物対象に対する予後の確立において重要である少なくとも１つの特性を有する薬物を示す。例えば、該予後診断薬は、予後診断マーカーと選択的相互作用が可能であり得る。
【０３１２】
予後診断薬は、ＲＢＭ３タンパク質またはその抗原的に活性なフラグメントと選択的相互作用が可能であるアフィニティーリガンドであり得る。このようなアフィニティーリガンドの例は、方法の局面に関連して上記されている。
【０３１３】
本明細書の教示によって導かれると、当業者は、予後診断薬の生産、選択または精製におけるＲＢＭ３タンパク質の使用の仕方を理解している。例えば、該使用は、ＲＢＭ３タンパク質が固定されている固体支持体におけるアフィニティー精製を含み得る。例えば、該固体支持体はカラム中に配置され得る。さらに、該使用は、ＲＢＭ３タンパク質が固定されている固体支持体を使用して、ＲＢＭ３タンパク質に対する特異性を有するアフィニティーリガンドの選択性を含み得る。このような固体支持体は、ウェルプレート（例えば、９６ウェルプレート）、電磁ビーズ、アガロースビーズまたはセファロースビーズであり得る。さらに、該使用は、例えば、デキストランマトリックス、または表面プラズモン共鳴装置、例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ装置において使用して可溶性マトリックス上のアフィニティーリガンドの分析を含み、該分析は、例えば、固定されたＲＢＭ３タンパク質に対する多くの可能なアフィニティーリガンドのアフィニティーをモニタリングすることを含み得る。
【０３１４】
また、予後診断薬の生産のために、ＲＢＭ３タンパク質またはその抗原的に活性なフラグメントは、動物の免疫化において使用され得る。
【０３１５】
このような使用は
ｉ）抗原としてＲＢＭ３タンパク質またはその抗原的に活性なフラグメントを使用して動物を免疫化し、
ｉｉ）免疫化動物から予後診断薬を含む血清を得、所望により
ｉｉｉ）血清から予後診断薬を単離する
工程を含む方法を含み得る。
【０３１６】
あるいは、第１の工程の次の工程は
ｉｉ’）免疫化動物から予後診断薬をコードするＤＮＡを含む細胞を得、
ｉｉｉ’）細胞を骨髄腫細胞と融合し、少なくとも１つのクローンを得、
ｉｖ’）クローンにより発現される予後診断薬を得る
であり得る。
【０３１７】
第４の局面の態様において、ＲＢＭ３タンパク質のアミノ酸配列は
ｉ）配列番号：１、および
ｉｉ）配列番号：１と少なくとも８５％同一である配列
から選択される配列を含むか、またはそれからなり得る。
【０３１８】
いくつかの態様において、配列ｉｉ）は、配列番号：１と少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一である。
【０３１９】
さらに、第４の局面の態様において、ＲＢＭ３タンパク質のアミノ酸配列は
ｉ）配列番号：２、および
ｉｉ）配列番号２と少なくとも８５％同一である配列
から選択される配列を含むか、またはそれからなり得る。
【０３２０】
いくつかの態様において、配列ｉｉ）は、配列番号：２と少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一である。
【０３２１】
なおさらに、第４の局面の態様において、ＲＢＭ３タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４−１９から選択される配列を含み得る。
【０３２２】
いくつかの態様において、第４の局面のＲＢＭ３タンパク質またはその抗原的に活性なフラグメントは、わずか１５０個のアミノ酸、例えば、わずか１４０個のアミノ酸、例えば、わずか１３５個のアミノ酸、例えば、わずか５０個のアミノ酸、例えば、わずか２９個のアミノ酸からなる。
【０３２３】
第４の局面のさらなる態様において、フラグメントは２０以下のアミノ酸、例えば、１５以下のアミノ酸からなり、配列番号：６−１９から選択される配列を含む。本明細書のアフィニティーリガンドについての上記議論から明らかなとおり、配列番号：８、１６または１７を含むフラグメントが特に関連すると考えられ得る。
【０３２４】
本明細書の第５の局面として、ＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能であるアフィニティーリガンドを提供する。
【０３２５】
このようなアフィニティーリガンドの異なる態様は、方法の局面に関連して上記されている。
【０３２６】
該アフィニティーリガンドは、インビボ診断、例えば、インビボ画像のために使用され得る。
【０３２７】
したがって、第５の局面の第１の構成として、結腸直腸癌を有する哺乳動物対象における予後診断薬としてのインビボでの使用のための、ＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能であるアフィニティーリガンドを提供する。
【０３２８】
したがって、１つの態様において、アフィニティーリガンドは、結腸直腸癌を有する哺乳動物対象に対する予後を確立するための、またはこのような対象が特定の処置レジメンを受けるべきであるか否かを決定するための、インビボ方法において使用するためであり得る。このような態様において、アフィニティーリガンドは、例えば、画像化可能に標識され得、すなわち検出可能な標識で標識され得る。アフィニティーリガンドを標識するために適当な標識、例えば、抗体は当業者によく知られている。予後を確立するためのインビボ方法は、例えば、インビボで腫瘍におけるＲＢＭ３タンパク質発現を明らかにし、同様に、処置決定の基準を形成し得る。この態様の文脈において使用され得る種々のインビボ方法、標識および検出技術は、さらに上記されている。
【０３２９】
第５の局面の同様の構成において、結腸直腸癌を有する対象におけるＲＢＭ３タンパク質の量のインビボ評価のための、ＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能であるアフィニティーリガンドを提供する。例えば、結腸直腸腫瘍におけるＲＢＭ３発現レベルを評価し得る。
【０３３０】
本明細書の第６の局面として、結腸直腸癌を有する哺乳動物対象に対する予後診断薬としての第５の局面のアフィニティーリガンドの使用を提供する。結果として、アフィニティーリガンドは、結腸直腸癌対象に対する予後を確立するために使用され得る。このような使用は、例えば、対象由来の早期に得られたサンプルの少なくとも一部におけるＲＢＭ３の量の決定を含むインビトロで実施され得る。
【実施例】
【０３３１】
実施例
ＲＢＭ３に対する単一特異的抗体の産生ならびに正常および癌性サンプルにおけるＲＢＭ３を検出するためのその使用
ポリクローナル抗体
１．抗原の産生
ａ）材料および方法
ＥｎｓＥＭＢＬ遺伝子ＩＤ  ＥＮＳ００００００１０２３１７によってコードされる標的タンパク質の適当なフラグメントを、生物情報学的ツールを使用して鋳型としてヒトゲノム配列で選択した(Lindskog M et al (2005) Biotechniques 38:723-727, EnsEMBL、www.ensembl.org)。該フラグメントを、ＲＢＭ３タンパク質（配列番号：２；ＥｎｓＥＭＢＬエントリー番号ＥＮＳＰ０００００３６５９４６）のアミノ酸１８−１５１（配列番号：１）に対応する１３４アミノ酸長フラグメントの生産のために鋳型として使用した。
【０３３２】
ＥｎｓＥＭＢＬエントリー番号ＥＮＳＴ０００００３７６７５５（配列番号：３）のヌクレオチド２８１−６８２を含むＲＢＭ３遺伝子転写産物のフラグメントを、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ（Invitrogen）および鋳型としてヒト全ＲＮＡプールパネル（Human Total RNA, BD Biosciences Clontech）で、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ増幅キットにより単離した。フランキング制限酵素認識部位ＮｏｔＩおよびＡｓｃＩを、発現ベクターへのインフレームクローニングが可能なＰＣＲ増幅プライマー（フォワードプライマー：ＧＡＣＧＡＧＣＡＧＧＣＡＣＴＧＧＡＡＧ（配列番号：２０）、リバースプライマー：ＧＴＡＡＴＴＴＣＣＴＣＣＴＧＡＧＴＡＧＣ（配列番号：２１））を介してフラグメントに導入した。次に、下流プライマーを、以前に記載されているとおりに、固相クローニングを可能にするためにビオチン化し、得られたビオチン化ＰＣＲ産物をＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ２８０  ストレプトアビジン（Dynal Biotech）（Larsson M et al (2000) J. Biotechnol. 80:143-157）上に固定化した。該フラグメントを、Ｎｏｔｌ−Ａｓｃｌ消化（New England Biolabs）により固体支持体から遊離させ、固定化金属イオンクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）精製のためのヘキサヒスチジルタグおよび連鎖球菌タンパク質Ｇ由来の免疫強化アルブミン結合タンパク質（ＡＢＰ）からなるデュアル(デュアル)アフィニティータグと共にインフレームにｐＡｆｆ８ｃベクター（Larsson M et al.（上記））へライゲートし（Sjolander A et al (1997) J. Immunol. Methods 201:115-123; Stahl S et al (1999) Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation (Fleckinger MC and Drew SW, eds) John Wiley and Sons Inc., New York, pp 49-63）、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Novagen）へ形質転換した。クローンの配列は、製造業者の推奨にしたがってＴｅｍｐｌｉＰｈｉ  ＤＮＡシーケンシング増幅キット（GE Healthcare, Uppsala, Sweden）を使用して、増幅したプラスミドＤＮＡのダイ・ターミネーターサイクルシーケンシングにより証明した。
【０３３３】
発現ベクターを含むＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、同じ培養培地における１ｍｌの一晩培養物の添加により、５ｇ／ｌの酵母抽出物（Merck KGaA）および５０ｍｇ／ｌのカナマイシン（Sigma-Aldrich）を補った１００ｍｌの３０ｇ／ｌのトリプシン大豆汁（Merck KGaA）に播種した。細胞培養物を、１リットル振とうフラスコにおいて、６００ｎｍの光学濃度が０．５−１．５に達するまで、３７℃および１５０ｒｐｍでインキュベートした。次に、１ｍＭの最終濃度にイソプロピル−Ｒ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（Apollo Scientific）の添加により、タンパク質発現を誘導し、インキュベーションを２５℃および１５０ｒｐｍで一晩インキュベーションを続けた。細胞を２４００ｇで遠心分離により回収し、ペレットを５ｍｌの溶解バッファー（７Ｍの塩酸グアニジン、４７ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２．６５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのβ−メルカプトエタノール；ｐＨ＝８．０）に再懸濁し、３７℃および１５０ｒｐｍで２時間インキュベートした。３５３００ｇで遠心分離後、変性および可溶化タンパク質を含む上清を回収した。
【０３３４】
Ｈｉｓ６−タグ融合タンパク質を、ＡＳＰＥＣ  ＸＬ４ＴＭ（Gilson）において自動化タンパク質精製処理（Steen J et al (2006) Protein Expr. Purif. 46:173-178）を使用して、１ｍｌのＴａｌｏｎ（登録商標）金属（Ｃｏ２＋）アフィニティー樹脂（BD Biosciences Clontech）を有するカラムにおける固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により精製した。樹脂を、２０ｍｌの変性洗浄バッファー（６Ｍの塩酸グアニジン、４６．６ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、３．４ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０−８．２）で平衡化した。次に、浄化された細胞溶解物をカラムに加えた。その後、樹脂を最小量の３１．５ｍｌの洗浄バッファーで洗浄し、２．５ｍｌの溶離バッファー（６Ｍの尿素、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１００ｍＭのＮａＣｌ、３０ｍＭの酢酸、７０ｍＭの酢酸Ｎａ、ｐＨ５．０）で溶離した。溶離した物質を５００、７００および１３００μｌの３つのプールに分画した。抗原を含む７００μｌの画分、ならびにプールした５００および１３００μｌの画分をさらなる使用のために保存した。
【０３３５】
抗原画分を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１．９ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、８．１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１５４ｍＭのＮａＣＩ）で１Ｍのウレアの最終濃度に希釈し、次に７５００Ｄａの分子量カットオフでＶｉｖａｐｏｒｅ  １０／２０ｍｌ濃縮機（Vivascience AG）を使用してタンパク質濃度を増加させる濃度工程に付した。タンパク質濃度を、製造業者の推奨にしたがって、ウシ血清アルブミン標準でビシンコニン酸（ＢＣＡ）マイクロアッセイプロトコール（Pierce）を使用して決定した。タンパク質の質を、Ｐｒｏｔｅｉｎ５０または２００アッセイ（Agilent Technologies）を使用してＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ装置で分析した。
【０３３６】
ｂ）結果
ＲＢＭ３の全長転写産物（配列番号：３）のヌクレオチド２８１−６８２に対応する遺伝子フラグメントは、特異的プライマーを使用してヒトＲＮＡプールからＲＴ−ＰＣＲにより成功裏に単離した。フラグメントは、標的タンパク質ＲＢＭ３（配列番号：２）のアミノ酸１８から１５１をコードする。標的タンパク質（配列番号：２）の１３４個のアミノ酸フラグメント（配列番号：１）は、成熟型タンパク質において開裂されるため、大腸菌において効率的な発現を保証するために膜貫通領域を欠くように、任意のシグナルペプチドを欠くように設計された。加えて、タンパク質フラグメントは、他のヒトタンパク質と低い相同性を有するユニークな配列からなり、産生されたアフィニティー試薬との交差反応性を最小限にし、立体構造エピトープの形成やさらには細菌系における効率的なクローニングおよび発現を可能にするのに適当なサイズであるように設計された。
【０３３７】
正しいアミノ酸配列をコードするクローンを同定し、大腸菌における発現時に、正しいサイズの単一のタンパク質を生産し、次に、固定化金属イオンクロマトグラフィーを使用して精製した。溶離したサンプルを１Ｍの尿素の最終濃度に希釈、およびサンプルを１ｍｌに濃縮後、タンパク質フラグメントの濃度は１０．４ｍｇ／ｍｌであると測定され、純度分析によって９６．０％純度であった。
【０３３８】
２．抗体の産生
ａ）材料および方法
上記のとおりに得られた精製されたＲＢＭ３フラグメントを抗原として使用して、国の指針にしたがってウサギを免疫化した（スウェーデン許認可番号Ａ８４−０２）。ウサギを、一次免疫化としてフロイント完全アジュバント中の２００μｇの抗原で筋肉内投与して免疫化し、４週間の間隔をおいてフロイント不完全アジュバント中の１００μｇの抗原で３回追加免役した。
【０３３９】
免疫化動物由来の抗血清を、３工程の免疫アフィニティーに基づくプロトコールにより精製した（Agaton C et al (2004) J. Chromatogr. A 1043:33-40; Nilsson P et al (2005) Proteomics 5:4327-4337）。第１の工程において、７ｍｌの全抗血清を、１×ＰＢＳ（１．９ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、８．１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１５４ｍＭのＮａＣＩ）の最終濃度に１０×ＰＢＳで緩衝し、０．４５μｍの細孔径フィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標）、Life Science）を使用して濾過し、ｐＡｆｆ８ｃベクターから発現されたデュアルアフィニティータグタンパク質Ｈｉｓ６−ＡＢＰ（ヘキサヒスチジルタグおよびアルブミン結合タンパク質タグ）と結合した、５ｍｌのＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（GE Healthcare）を含むアフィニティーカラムに適用し、抗原タンパク質フラグメントに対して上記と同じ方法で精製した。第２の工程において、デュアルアフィニティータグＨｉｓ６−ＡＢＰに対する抗体が枯渇したフロースルーを、免疫化のための抗原として使用されるＲＢＭ３タンパク質フラグメント（配列番号：１）と結合した１ｍｌのＨｉ−Ｔｒａｐ  ＮＨＳ−活性化ＨＰカラム（GE Healthcare）に流速０．５ｍｌ／分で負荷した。Ｈｉｓ６−ＡＢＰタンパク質およびタンパク質フラグメント抗原を、製造業者により推奨されるとおりにＮＨＳ活性化マトリックスと結合させた。非結合物質を１×ＰＢＳＴ（１×ＰＢＳ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２５）で洗い流し、捕獲された抗体を低ｐＨのグリシンバッファー（０．２Ｍのグリシン、１ｍＭのＥＧＴＡ、ｐＨ２．５）を使用して溶離した。第３の工程において、溶離した抗体画分を自動的に回収し、効率的なバッファー交換のために順番に接続した２つの５ｍｌのＨｉＴｒａｐＴＭ脱塩カラム（GE Healthcare）上に負荷した。第２および第３の精製工程を、ＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓＴＭ基盤（GE Healthcare）上で実施した。抗原選択的（単一特異的）抗体（ｍｓＡｂｓ）を、−２０℃での長期保存のために、それぞれ４０％および０．０２％の最終濃度にグリセロールおよびＮａＮ３を補ったＰＢＳバッファーで溶離した（Nilsson P et al (2005) Proteomics 5:4327-4337）。
【０３４０】
タンパク質アレイ設定において、アフィニティー精製された抗体画分の特異性および選択性を、抗原それ自体および９４の他のヒトタンパク質フラグメントに対する結合分析により分析した（Nilsson P et al (2005) Proteomics 5:4327-4337）。タンパク質フラグメントを０．１Ｍの尿素および１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で４０μｇ／ｍｌに希釈し、それぞれ５０μｌを９６ウェルのスポッティングプレートのウェルに移した。タンパク質フラグメントを、ピン・アンド・リング(pin-and-ring)のアレイヤー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ４２７）を使用して、デュプリケート(duplicate)でスポットし、エポキシ製スライド（SuperEpoxy, TeleChem）上に固定した。スライドを１×ＰＢＳで洗浄し（５分）、次に表面を３０分間ブロックした（SuperBlock(登録商標)、Pierce）。接着性の１６ウェルシリコーンマスク（Schleicher & Schuell）を、単一特異的抗体を添加する（１×ＰＢＳＴにおいて１：２０００に希釈し、約５０ｎｇ／ｍｌにする）前にスライドガラスに適用し、６０分間、振とう器でインキュベートした。各スポットにおけるタンパク質の量を定量するために、アフィニティータグ特異的ＩｇＹ抗体を単一特異的抗体と共インキュベートした。スライドをそれぞれ１０分間で１×ＰＢＳＴおよび１×ＰＢＳで２回洗浄した。二次抗体（Ａｌｅｘａ  ６４７と接合されたヤギ抗−ウサギ抗体およびＡｌｅｘａ  ５５５と接合されたヤギ抗−ニワトリ抗体、Molecular Probes）を、１×ＰＢＳＴで３０ｎｇ／ｍｌに１：６００００希釈し、６０分インキュベートした。第１のインキュベーションと同じ洗浄処理後、スライドを脱水し、スキャンし（G2565BA array scanner, Agilent）、その後、画像を画像分析ソフトウェア（GenePix 5.1, Axon Instruments）を使用して、定量した。
【０３４１】
加えて、アフィニティー精製された抗体の特異性および選択性をウエスタンブロットにより分析した。還元条件下で予め成形された１０−２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配ゲル（Bio-Rad Laboratories）上で選択されたヒト細胞株由来の全タンパク質抽出物を単離し、次に製造業者の推奨にしたがって、ＰＶＤＦ膜（Bio-Rad Laboratories）に電子移動することにより、ウエスタンブロットを実施した。膜を室温で１時間ブロックし（５％のドライミルク、１×ＴＢＳＴ；０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ、０．５ＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０）、アフィニティー精製された一次抗体とインキュベートし（ブロッキングバッファーにおいて１：５００に希釈された）、ＴＢＳＴで洗浄した。ＨＲＰと接合された二次抗体（ブタ抗−ウサギ免疫グロブリン／ＨＲＰ、DakoCytomation）をブロッキングバッファーにおいて１：３０００に希釈し、化学発光検出を、製造業者のプロトコールにしたがって、ＣｈｅｍｉｄｏｃＴＭＣＣＤカメラ（Bio-Rad Laboratories）およびＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  基質（Pierce）を使用して実施した。
【０３４２】
ｂ）結果
ポリクローナル抗体調製物の質は、抗体精製におけるストリンジェンシーの程度に依存することが証明されており、標的タンパク質由来でないエピトープに対する抗体の枯渇が、他のタンパク質との交差反応性およびバックグラウンド結合を回避するために必要であることが以前に示されている（Agaton C et al (2004) J. Chromatogr. A 1043:33-40）。したがって、タンパク質マイクロアレイ分析によって、高い特異性の単一特異的ポリクローナル抗体がＨｉｓ６−タグに対する抗体ならびにＡＢＰ−タグに対する抗体の枯渇により産生されていることが確認された。
【０３４３】
タンパク質アレイの各スポットにおけるタンパク質の量を定量するため、一次および二次抗体を組み合わせて、二色の色素標識系を使用した。ニワトリにおいて産生されたＴａｇ−特異的ＩｇＹ抗体をＡｌｅｘａ  ５５５蛍光色素で標識した二次ヤギ抗ニワトリ抗体で検出した。アレイ上のその抗原へのウサギｍｓＡｂの特異的結合を、蛍光的にＡｌｅｘａ  ６４７で標識したヤギ抗−ウサギ抗体で検出した。それぞれのタンパク質フラグメントをデュプリケートでスポットした。タンパク質アレイ分析は、ＲＢＭ３に対するアフィニティー精製された単一特異的抗体が正しいタンパク質フラグメントに対して高度に選択的であり、アレイ上で分析される他のすべてのタンパク質フラグメントに対して非常に低いバックグラウンドを有することを示す。
【０３４４】
ウエスタンブロット分析の結果は、抗体が２つの乳房腫瘍細胞株、Ｔ４７ＤおよびＭＣＦ−７において約１６ｋＤａの単一バンドを特異的に検出することを示す。ＲＢＭ３の理論分子量は、１６ｋＤａ（配列番号：２のＲＢＭ３アミノ酸配列から計算される）であり、得られた結果に十分に対応している。
【０３４５】
モノクローナル抗体
３．モノクローナル抗体の産生
ａ）材料および方法
部１において得られた精製されたフラグメント（配列番号：１）を、モノクローナル抗体の生産のための抗原として使用した。抗原をAbSea Biotechnology Ltd (Beijing, China)に送り、簡潔には、抗原を３週間隔でＢＡＬＢ／ｃマウス（４−６週齢、メス）に皮下的に注射した。抗原を第１の注射のために完全フロイントアジュバントおよび後の注射のために不完全フロイントアジュバントと混合した。融合の３日前に、最後にマウスに静脈内的に抗原投与した。ハイブリドーマをＳｐ２／０骨髄腫細胞株とマウス脾細胞の融合により産生した。ＥＬＩＳＡを使用するいくつかの細胞株のスクリーニングにより、抗原（配列番号：１）に対して特異的な抗体を分泌する細胞を同定し、さらなる特性化のためにAtlas Antibodies ABに送達した。ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット（ＷＢ）および免疫組織化学（ＩＨＣ）において陽性結果を示す細胞株を、AbSea Biotechnology Ltdにより実施されるサブクローニングのために選択した。
【０３４６】
加えて、モノクローナル抗体の免疫組織化学的染色パターンを、部２において産生したポリクローナル抗ＲＢＭ３抗体と比較した。このポリクローナル抗体は、ときどき、本明細書において「抗−ＲＢＭ３」と称される。
【０３４７】
ｂ）結果
抗原（配列番号：１）を認識するが、アフィニティータグＨｉｓ−ＡＢＰを認識しないモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を生産する系を同定するために、細胞株をＥＬＩＳＡ（ＡｂＳｅａで）によりスクリーニングした。８つの細胞株は、ＥＬＩＳＡにおいて配列番号：１の抗原への特異的結合を示し、さらなる試験のために選択した。選択された８つのクローンのそれぞれに対して、１５０−３００μｌの上清を回収し、アジドを加え、上清を湿性氷上でAtlas Antibodies ABに送達した。上清を、ＡｂＳｅａの指示にしたがって到着時に＋４℃で保存した。細胞株のさらなる試験は、ウエスタンブロットおよびＩＨＣ分析の両方において陽性結果を与える３つの興味ある細胞株、クローン１Ｂ５、６Ｆ１１および７Ｇ３の同定をもたらした。これらのクローンを、AbSea Biotechnology Ltdにより実施されるサブクローニングおよび拡大のために選択した。
【０３４８】
組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）分析
４．結腸癌腫ＴＭＡ（Ｓ字結腸コホート）
ａ）材料および方法
１９９３から２００３年にＳ字結腸癌に関して外科的に処置された３０５人の患者（１４８人の女性および１５７人の男性）由来の記録(保存)ホルマリン固定されたパラフィン包埋組織を、Department of Pathology, Malmo University Hospital, Swedenから回収した。患者の中央年齢は、７４（３９−９７）歳であった。４７の腫瘍がデュークスステージＡであり、１２９がデュークスステージＢであり、８４がデュークスステージＣであり、４５がデュークスステージＤであった。死亡日に関する情報をすべての患者に対する死亡原因における地方登録所から得た。倫理的認可をLocal Ethics Committeeから得た。
【０３４９】
全３０５症例を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色されたスライド上で組織病理学的に再評価した。次に、ＴＭＡを、１症例当たり２×１．０ｍｍのコアをＳ字結腸癌腫の典型的な領域からサンプリングすることにより構築した。
【０３５０】
自動化免疫組織化学を、以前に記載されている（Kampf C et al (2004) Clin. Proteomics 1:285-300）とおりに実施した。簡潔には、スライドガラスを６０℃で４５分インキュベートし、キシレンで脱パラフィン処理し（２×１５分）、等級アルコールで水和した。抗原回復のために、スライドをＴＲＳ（Target Retrieval Solution, pH6.0, Dako, Copenhagen, Denmark）中に浸し、Ｄｅｃｌｏａｋｉｎｇ  ｃｈａｍｂｅｒ（登録商標）（Biocare Medical）中で１２５℃で４分間沸騰させた。スライドを、Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ（登録商標）（Dako）中に置き、内因性ペルオキシダーゼを最初にＨ２Ｏ２（Dako）でブロックした。スライドを、実施例の部２において得られるＲＢＭ３一次抗体と室温で３０分間、次にヤギ抗ウサギペルオキシダーゼ接合Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（登録商標）と室温で３０分間インキュベートした。すべての工程間、スライドを洗浄バッファー(Dako)で濯いだ。最後に、ジアミノベンジジン(Dako)をクロモゲンとして使用し、Ｈａｒｒｉｓヘマトキシリン(Sigma-Aldrich)を対比染色のために使用した。スライドをＰｅｒｔｅｘ（登録商標）(Histolab)で固定した。
【０３５１】
免疫組織化学的に染色された組織の全てのサンプルを、顕微鏡下で手動で評価し、認定された病理学者により注釈を付けた。それぞれのサンプルの注釈を、ＩＨＣ結果の分類のための簡易化スキームを使用して行った。それぞれの組織サンプルを、典型性および免疫反応に関して試験した。
【０３５２】
基本注釈パラメーターは、ｉ）細胞内局在性（核および／または細胞質／膜）、ｉｉ）染色強度（ＳＩ）およびｉｉｉ）染色された細胞の画分（ＦＳＣ）の評価を含んだ。染色強度を、臨床組織病理学的診断において使用される標準にしたがって主観的に評価し、結果を、存在しない＝免疫反応がない、弱い−中程度＝わずかなから中程度の免疫反応、または強い＝はっきりとしたおよび強い免疫反応として分類した。また、染色された細胞の画分を、臨床組織病理学的診断において使用される標準にしたがって主観的に評価し、結果を関連細胞集団の免疫反応細胞の＜２％、２−２５％、＞２５−７５％または＞７５％として分類した。当業者は、この注釈処理がＡｌｌｒｅｄスコアの計算と同様であることを理解する、例えば、Allred et al (1998) Mod Pathol 11(2), 155参照。したがって、組織注釈は、染色された細胞の染色強度および画分を組み合わせずに「染色スコア」を得ることを除いて、本質的に上記部３において記載されているとおりに行った。
【０３５３】
統計分析のために、核画分（ＮＦ）、核強度（ＮＩ）レベルおよび細胞質強度（ＣＩ）レベルを評価した。個々の層における生存傾向に基づき、さらなる統計分析のために二分変数を作成した。ＲＢＭ３抗体を使用する分析について、高い核画分を、染色された細胞の２−１００％（ＮＦ＞０）または＞７５％（ＮＦ＝３）の画分のいずれかと定義し、低い核画分を、染色された細胞の＜２％（ＮＦ＝０）または０−７５％（ＮＦ＜３）の画分と定義した。さらに、高いタンパク質発現レベルを、弱い−中程度および強い核強度（ＮＩ＞０）または強い核強度（ＮＩ＝２）のいずれかと定義し、低いタンパク質発現レベルを、存在しない核強度（ＮＩ＝０）または存在しない−弱いおよび中程度の核強度（ＮＩ＜２）と定義した。また、高いタンパク質発現レベルを、弱い−中程度および強い細胞質強度（ＣＩ＞０）または強い細胞質強度（ＣＩ＝２）のいずれかと定義し、低いタンパク質発現レベルを、存在しない細胞質強度（ＣＩ＝０）または存在しない−弱いおよび中程度の細胞質強度（ＣＩ＜２）のいずれかと定義した。サンプルの上記の分類を、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ方法にしたがって全生存（ＯＳ）および無病生存（ＤＦＳ）分析のために使用し、対数順位検定を使用し、異なる層内で生存を比較した。すべての統計的検定は両側であり、＜０．０５％のｐ値を有意と考えた。すべての計算を統計パッケージＳＰＳＳ１７．０（SPSS Inc. Illinois, USA）を用いて行った。
【０３５４】
ｂ）結果
Ｓ字結腸コホートの最初の分析は、それぞれ図１Ａおよび１Ｂに示されるとおり、すべての患者に対するＯＳが約５５％であり、ＤＦＳが約６４％であることを示した。
【０３５５】
ＲＢＭ３発現の免疫組織化学的分析を、２７４人の腫瘍サンプルにおいて行うことができた。残っている核は、腫瘍細胞を含まないか、または組織処理中に喪失した。ＲＢＭ３発現分析を核および細胞質染色から得たが、１４５人の対象（５９％）が発現（ＮＦ＜２％）を欠いていた。
【０３５６】
全コホートの生存分析は、腫瘍組織におけるＲＢＭ３の発現が全および無病生存（ＯＳおよびＤＦＳ）と有意に相関していたことを示した（図２−８）。図２および４において、対象を、ＮＦに基づいて４つの異なるカテゴリーに分けた。ＮＦ＞７５％の画分値を有する患者において、５年ＯＳは約７５％であったが、ＲＭＢ３発現を欠いている患者は約４５％のＯＳであった（図２）。図４において、ＤＦＳの分析は、高いＮＦ値を有する患者が約８０％の５年ＤＦＳを有したが、ＲＭＢ３タンパク質発現を欠いている患者は約５５％のＤＦＳを有したことを示した。図２および４の両方は、ＲＢＭ３に対する細胞染色陽性の画分が高いほど、より長い生存が該患者について期待され得ることを明白に示す。したがって、高いＮＦは比較的良好な予後を示すが、低いＮＦは比較的不良な予後を示す。二分された可変でのＯＳおよびＤＦＳの分析は、これらの見出したことをさらにサポートする（図３ａ、３ｂ、５ａおよび５ｂ）。さらに、これらの図は、比較的低いおよび比較的高いカットオフの両方でのＯＳおよびＤＦＳ分析が有意な結果を生むことを示す。核強度および細胞質強度に基づいてＯＳおよびＤＦＳを分析したとき、同様の結果が得られた（図６−８）。すなわち、強度がより強いと、生存がより長くなる。
【０３５７】
デュークスステージＡおよびＢまたはステージＢのみと診断された対象を試験したとき、ＯＳにおける有意な違いが、まだ観察される（図９および１０）。この見出されたことは、ＲＢＭ３が疾患の初期工程ですでに予後診断予測因子としての価値を有することを示す。さらに、デュークスステージＣと診断された対象を試験したとき、予期される生存の違いはさらにより明白に考えられ得る。高いＮＦ（すなわち＞７５％）を有する患者に関して、患者の約８８％が５年後にまだ生存したが、低いＮＦ（すなわちＮＦ＜２％）を有する患者はわずか約３２％が同じ期間後に生存した（図１１参照）。二分された可変での分析は、これらの見出したことをさらにサポートする（図１２）。図１３に示されるとおり強度に基づいてＯＳおよびＤＦＳを分析したとき、ＯＳおよびＤＦＳ分析が細胞質強度に対して示されるとき、同様の結果が得られた。細胞質強度がより強いと、より長い生存が期待され得る。
【０３５８】
結論として、結腸直腸癌、例えば、Ｓ字結腸癌腫と診断された患者に対して、抗ＲＢＭ３タンパク質抗体の使用は、図１から１３において見ることができるとおり、患者に対する予後、例えば、生存、例えば、５年生存の可能性を確立するための有意な価値があり得る。
【０３５９】
エピトープマッピング
５．細菌ディスプレイＩを使用するエピトープマッピング
配列番号：１（すなわち、ＥＮＳＰ０００００３６５９４６のａａ１８−１５１またはＥＮＳＴ０００００３７６７５５のｂｐ２６１−６８２）に対応するＲＢＭ３  ＤＮＡを、鋳型としてベクターｐＡｆｆ８ｃを使用してＰＣＲにより増幅した。増幅したＤＮＡを、超音波処理により種々の長さ（約５０−１５０ｂｐ）に破砕し、次にブドウ球菌ディスプレイベクター（ｐＳＣＥＭ２）にライゲーションし、Ｓ．  Ｃａｒｎｏｓｕｓを形質転換し、約１０００００個の形質転換体を得た。インフレームのＤＮＡフラグメントがブドウ球菌表面上にペプチドとして示した。抗体（上記部２において得られる配列番号：１に対して選択的）および蛍光的に標識された二次試薬とインキュベーション後、陽性および陰性細胞をフローサイトメトリーを使用して別々に分類し、エピトープおよび非エピトープ提示細胞を単離した。単離された細胞をパイロシーケンシングによりシーケンシングし、最後にエピトープの同定のために配列をＲＢＭ３抗原とアラインした。
【０３６０】
表面発現レベルのリアルタイムモニタリングを有するデュアル標識戦略を使用した（Loefblom, J et al (2005) FEMS Microbiol Lett 248, 189-198）。それは、発現レベルで結合シグナルの標準化を可能にし、低い細胞間変動を提供し、異なるエピトープ集団の区別を可能にさせた。さらに、それは、また、表面上に示される非結合ペプチドを測定するための平行アッセイを可能にした。
配列番号：１内の２つのエピトープ領域、配列番号：４（ＲＧＦＧＦＩＴＦＴＮＰＥＨＡＳＶＡＭＲＡＭＮＧＥＳＬＤＧＲ）および配列番号：５（ＲＳＹＳＲＧＧＧＤＱＧＹＧＳＧＲＹＹＤＳＲＰＧＧ）を同定した。
【０３６１】
６．Ｌｕｍｉｎｅｘを使用するエピトープマッピング
ａ）合成ペプチド調製物
ＲＢＭ３におけるＰｒＥＳＴ  ＨＰＲＲ２３２６３１（配列番号：１）に対応する２５個のビオチン化ペプチドからなるＰＥＰスクリーンライブラリーをＳｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）により合成した。これらのペプチドは、１０個のアミノ酸重複を有する１５アミノ酸長であり、共に全ＰｒＥＳＴ配列を含む。ペプチドを１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度に８０％のＤＭＳＯに溶解させた。
【０３６２】
ｂ）ビーズ結合
ニュートラアビジン（Pierce, Rockford, IL）を、製造業者のプロトコールにしたがって、カルボキシル化ビーズ（COON Microspheres, Luminex-Corp., Austin, TX）上に固定した。１０６個のビーズの結合を、以前に記載されているとおりに（Larsson et al (2009) J Immunol Methods 15;34(1-2):20-32、Schwenk et al (2007) Mol Cell Proteomics 6(1) 125:32）、フィルター膜底マイクロタイタープレート（MultiScreen-HTS, Millipore, Billerica, MA）を使用して実施した。異なる色コードＩＤを有する２５個の異なるグループのビーズを、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドを使用して活性化させた。ニュートラアビジン（ＭＥＳ中で１００μｇ／ｍｌ）をビーズに加え、振とう器で１２０分間インキュベートした。最後に、ビーズを洗浄し、再懸濁し、ＮａＮ３を補ったタンパク質含有バッファー（BRE, Blocking Reagent for ELISA, Roche, Basel, Switzerland）中で４℃で保存のために微小遠心管に移した。すべての結合したビーズ集団を５分間、超音波洗浄器（Branson Ultrasonic Corporation, Danbury, CT）において超音波処理で処理した。ビオチン化ペプチドを２０μＭの濃度にＢＲＥで希釈し、１００μｌのそれぞれのペプチドを結合反応に使用し、これを室温で６０分間振とうしながら行った。最後に、ビーズを３×１００μｌのＢＲＥバッファーで洗浄し、さらなる使用まで４℃で保存した。
【０３６３】
ｃ）結合特異性の決定
すべての２５個のビーズＩＤを含むビーズ混合物を調製し、ＰＢＳで５０ｎｇ／ｍｌに希釈した４５μｌのそれぞれの抗体を５μのビーズ混合物と混合し、室温で６０分間インキュベートした。フィルター底マイクロタイタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を洗浄および次のそれぞれのインキュベーションのために利用し、すべてのウェルを３×１００μｌのＰＢＳＴで洗浄した。５０μｌのＲ−フィコエリトリン標識抗ウサギＩｇＧ抗体（０．５μｇ／ｍｌ、Jackson ImmunoResearch）または５０μｌのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５  ヤギ抗マウスＩｇＧを室温で６０分の最終インキュベーションのために加えた（０．４ｕｇ／ｍｌ）。
【０３６４】
測定を、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ｘＰＯＮＥＮＴ  ソフトウェアを備えたＬｕｍｉｎｅｘ  ＬＸ２００装置を使用して実施した。それぞれの実験のために、ビーズＩＤあたり５０個の事象をカウントし、中央蛍光強度（ＭＦＩ）を個々のビーズ集団への抗体結合の測定として使用した。
【０３６５】
ｄ）結果
モノ特異的ポリクローナル抗体（抗−ＲＢＭ３、ＨＰＡ００３６２４）およびモノクローナル抗体６Ｆ１１の特異性を、合成ビオチン化ペプチドと結合したビーズを使用して、アッセイで試験した。抗ＲＢＭ３は、３つの異なる領域、ＰｒＥＳＴ配列、コンセンサス配列、配列番号：６、７、８および９に対応する８個のペプチド、すなわち６、７、８、１４、１５、１６、２４および２５に強い結合を示した。特に、配列番号：９に対応するペプチド２４および２５は強いシグナルを生じた。モノクローナル抗体６Ｆ１１は、ＰｒＥＳＴ配列、コンセンサス配列、配列番号：８において１つの異なる領域に対応する２つのペプチド：１５および１６と反応した。抗−ＲＢＭ３および６Ｆ１１の両方がペプチド１５および１６に結合するため、これは、これらの抗体がこの領域内の１つ以上のエピトープを共有していることを示す。配列番号：６は配列番号：４内であり、配列番号：８は配列番号：５内とある程度重複していることに注目すべきである。
【０３６６】
７．細菌ディスプレイＩＩを使用するエピトープマッピング
配列番号：１（すなわち、ＥＮＳＰ０００００３６５９４６のａａ１８−１５１またはＥＮＳＴ０００００３７６７５５のｂｐ２６１−６８２）に対応するＲＢＭ３  ＤＮＡを、鋳型としてベクターｐＡｆｆ８ｃを使用してＰＣＲにより増幅した。増幅したＤＮＡを、超音波処理により種々の長さ（約５０−１５０ｂｐ）に破砕し、次にブドウ球菌ディスプレイベクター（ｐＳＣＥＭ２）にライゲーションし、Ｓ．  Ｃａｒｎｏｓｕｓを形質転換し、約１０００００個の形質転換体を得た。インフレームのＤＮＡフラグメントがブドウ球菌表面上にペプチドとして示した。抗体（部２において得られる抗−ＲＢＭ３および部３において得られるモノクローナル抗体）および蛍光的に標識された二次試薬とインキュベーション後、陽性および陰性細胞をフローサイトメトリーを使用して別々に分類し、エピトープおよび非エピトープ提示細胞を単離した。単離された細胞由来のプラスミドＤＮＡをＳａｎｇｅｒシーケンシングによりシーケンシングし、エピトープの同定のために配列をＲＢＭ３抗原とアラインした。
【０３６７】
表面発現レベルのリアルタイムモニタリングを有するデュアル標識戦略を使用した（Loefblom, J et al (2005) FEMS Microbiol Lett 248, 189-198）。それは、発現レベルで結合シグナルの標準化を可能にし、低い細胞間変動を提供し、異なるエピトープ集団の区別を可能にさせた。さらに、それは、また、表面上に示される非結合ペプチドを測定するための平行アッセイを可能にした。
【０３６８】
ポリクローナル抗体において、配列番号：１内の領域、配列番号：１０−１５を同定した。早期に同定された領域、配列番号：４内に見出されたため、特に、領域、配列番号：１１および配列番号：１２は興味があった。さらに、以前に同定された配列番号：６および７のそれぞれとかなりの程度重複しているため、領域配列番号：１３および１４は特に興味があった。
【０３６９】
モノクローナル抗体６Ｆ１１において、配列番号：１内の領域、配列番号：１６を同定し、この領域（配列番号：１６）は、早期に同定された領域、配列番号：５内において見出された。部７においてここで同定された６Ｆ１１のエピトープ領域は、部６において同定された６Ｆ１１エピトープ領域で１つのアミノ酸重複を有する。しかしながら、部６および７の結果は対照的ではない。部６において６Ｆ１１に結合することが見出された１つのペプチド（ペプチド１６）は配列番号：１６（および配列番号：１９）を含む。したがって、部６および７の結果は相補的であると考えられ得る。
【０３７０】
モノクローナル抗体１Ｂ５において、配列番号：１内の領域、配列番号：１７を同定し、この領域（配列番号：１７）は、また、早期に同定された領域、配列番号：５内において見出された。モノクローナル抗体７Ｇ３において、配列番号：１内の領域、配列番号：１８を同定した。この領域（配列番号：１８）は、また、早期に同定された領域、配列番号：５内において見出された。この領域（配列番号：１８）は、６Ｆ１１抗体（配列番号：１６）に対するエピトープと重複している。モノクローナル抗体９Ｂ１１において、配列番号：１内の領域、配列番号：１９を同定した。
【０３７１】
８．抗体特異性の評価
ａ）材料および方法
ポリクローナル抗体（抗ＲＢＭ３）および２つのモノクローナル抗体（６Ｆ１１および１Ｂ５）の特異性をウエスタンブロットにより分析した。還元条件下で１７％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で選択されたヒト細胞株由来の全タンパク質抽出物を単離し、次に製造業者の推奨にしたがって、ＰＶＤＦ膜（Bio-Rad Laboratories）に電子移動することにより、ウエスタンブロットを実施した。膜を室温で１時間ブロックし（０．１％のＴｗｅｅｎ２０を有する１×ＰＢＳ中の５％のＢＳＡ）、アフィニティー精製された一次抗体（ブロッキングバッファーで１：１０００に希釈された）とインキュベートし、ＰＢＳＴで洗浄した。ＨＲＰと接合された二次抗体（ヒツジ抗マウス免疫グロブリン／ＨＲＰ、ＧＥ）をブロッキングバッファーにおいて１：１００００に希釈し、化学発光検出を、製造業者のプロトコールにしたがって、ＣｈｅｍｉｄｏｃＴＭＣＣＤカメラ（Bio-Rad Laboratories）およびWestern Blotting Luminol Reagent（Santa Cruz Biotechnologies, Inc）を使用して実施した。
【０３７２】
ｂ）結果
ウエスタンブロット分析の結果は、抗体が細胞株において約１６ｋＤａのバンドを特異的に検出することを示す。ＲＢＭ３の理論分子量は、１６ｋＤａ（配列番号：２のＲＢＭ３アミノ酸配列から計算される）であり、得られた結果に十分に対応している。さらなるバンドが抗−ＲＢＭ３および６Ｆ１１に対して観察された。概して、結果は、モノクローナル抗体がポリクローナル抗体よりもより特異的であり、１Ｂ５抗体が６Ｆ１１抗体よりもさらにより特異的であったことを示す（図１４参照）。
【０３７３】
ＴＭＡ分析
９．結腸癌腫ＴＭＡ（Ｓ字結腸コホート）−１Ｂ５抗体
ａ）材料および方法
１９９３から２００３年にＳ字結腸癌に関して外科的に処置された３０５人の患者（１４８人の女性および１５７人の男性）由来の記録(保存)ホルマリン固定されたパラフィン包埋組織を、Department of Pathology, Malmo University Hospital, Swedenから回収した。患者の中央年齢は、７４（３９−９７）歳であった。４７の腫瘍がデュークスステージＡであり、１２９がデュークスステージＢであり、８４がデュークスステージＣであり、４５がデュークスステージＤであった。死亡日に関する情報をすべての患者に対する死亡原因における地方登録所から得た。倫理的認可をLocal Ethics Committeeから得た。
【０３７４】
全３０５症例を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色されたスライド上で組織病理学的に再評価した。次に、ＴＭＡを、１症例当たり２×１．０ｍｍのコアをＳ字結腸癌腫の典型的な領域からサンプリングすることにより構築した。
【０３７５】
自動化免疫組織化学を、以前に記載されている（Kampf C et al (2004) Clin. Proteomics 1:285-300）とおりに実施した。簡潔には、スライドガラスを６０℃で４５分インキュベートし、キシレンで脱パラフィン処理し（２×１５分）、等級アルコールで水和した。抗原回復のために、スライドをＴＲＳ（Target Retrieval Solution, pH6.0, Dako, Copenhagen, Denmark）中に浸し、Ｄｅｃｌｏａｋｉｎｇ  ｃｈａｍｂｅｒ（登録商標）（Biocare Medical）中で１２５℃で４分間沸騰させた。スライドを、Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ（登録商標）（Dako）中に置き、内因性ペルオキシダーゼを最初にＨ２Ｏ２（Dako）でブロックした。スライドを、実施例の部３において得られるＲＢＭ３一次モノクローナル抗体１Ｂ５と室温で３０分間、次にヤギ抗マウスペルオキシダーゼ接合Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（登録商標）と室温で３０分間インキュベートした。すべての工程間、スライドを洗浄バッファー(Dako)で濯いだ。最後に、ジアミノベンジジン(Dako)をクロモゲンとして使用し、Ｈａｒｒｉｓヘマトキシリン(Sigma-Aldrich)を対比染色のために使用した。スライドをＰｅｒｔｅｘ（登録商標）(Histolab)で固定した。
【０３７６】
免疫組織化学的に染色された組織の全てのサンプルを、顕微鏡下で手動で評価し、認定された病理学者により注釈を付けた。それぞれのサンプルの注釈を、ＩＨＣ結果の分類のための簡易化スキームを使用して行った。それぞれの組織サンプルを、典型性および免疫反応に関して試験した。
【０３７７】
基本注釈パラメーターは、ｉ）細胞内局在性（核および／または細胞質／膜）、ｉｉ）染色強度（ＳＩ）およびｉｉｉ）染色された細胞の画分（ＦＳＣ）の評価を含んだ。染色強度を、臨床組織病理学的診断において使用される標準にしたがって主観的に評価し、結果を、存在しない＝免疫反応がない、弱い−中程度＝わずかなから中程度の免疫反応、または強い＝はっきりとしたおよび強い免疫反応として分類した。また、染色された細胞の画分を、臨床組織病理学的診断において使用される標準にしたがって主観的に評価し、結果を関連細胞集団の免疫反応細胞の＜２％、２−２５％、＞２５−７５％または＞７５％として分類した。当業者は、この注釈処理がＡｌｌｒｅｄスコアの計算と同様であることを理解する、例えば、Allred et al (1998) Mod Pathol 11(2), 155参照。したがって、組織注釈は、染色された細胞の染色強度および画分を組み合わせずに「染色スコア」を得ることを除いて、本質的に実施例の部３において記載されているとおりに行った。
【０３７８】
統計分析のために、核画分（ＮＦ）、核強度（ＮＩ）レベルおよび細胞質強度（ＣＩ）レベルを評価した。個々の層における生存傾向に基づき、さらなる統計分析のために二分変数を作成した。１Ｂ５抗体を使用する分析について、高い核画分を、染色された細胞の＞２５−１００％（ＮＦ＞１）または＞７５％（ＮＦ＝３）の画分のいずれかと定義し、低い核画分を、染色された細胞の＜２５％（ＮＦ＝０）または０−７５％（ＮＦ＜３）の画分と定義した。さらに、高いタンパク質発現レベルを、強い核強度（ＮＩ＞０）と定義し、低いタンパク質発現レベルを、存在しない−弱いまたは中程度の核強度（ＮＩ＜２）と定義した。また、高いタンパク質発現レベルを、強い細胞質強度（ＣＩ＝２）と定義し、低いタンパク質発現レベルを、存在しない−弱いまたは中程度の細胞質強度（ＣＩ＜２）と定義した。サンプルの上記の分類を、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ方法にしたがって全生存（ＯＳ）および無病生存（ＤＦＳ）分析のために使用し、対数順位検定を使用し、異なる層内で生存を比較した。すべての統計的検定は両側であり、＜０．０５％のｐ値を有意と考えた。すべての計算を統計パッケージＳＰＳＳ１７．０（SPSS Inc. Illinois, USA）を用いて行った。
【０３７９】
ｂ）結果
１Ｂ５抗体でのＲＢＭ３発現の免疫組織化学的分析を、２４５人の腫瘍サンプルにおいて行うことができた。残っている核は、腫瘍細胞を含まないか、または組織処理中に喪失した。ＲＢＭ３発現分析を１５９の分析された対象において核および細胞質染色から得、６５％の対象が発現（ＮＦ＜２％）を欠いていた。
【０３８０】
全コホートの生存分析は、腫瘍組織におけるＲＢＭ３のＮＦ発現レベルが全および無病生存（ＯＳおよびＤＦＳ）と有意に相関していたことを示した（図１５−１７）。図１５Ａおよび１６Ａにおいて、対象を、ＮＦに基づいて４つの異なるカテゴリーに分けた。ＮＦ＞７５％の画分値を有する患者において、５年ＯＳは約６５％であったが、ＲＭＢ３発現を欠いている患者は約４４％のＯＳであった（図１５）。図１６において、ＤＦＳの分析は、高いＮＦ値を有する患者が約７３％の５年ＤＦＳを有したが、ＲＭＢ３タンパク質発現を欠いている患者は約５３％のＤＦＳを有したことを示した。図１５および１６の両方は、ＲＢＭ３に対する細胞染色陽性の画分が高いほど、より長い生存が該患者について期待され得ることを明白に示す。したがって、高いＮＦは比較的良好な予後を示すが、低いＮＦは比較的不良な予後を示す。二分された可変でのＯＳおよびＤＦＳの分析は、これらの見出したことをさらにサポートする（図１５Ｂ、１６Ｂ、１７Ａおよび１７Ｂ）。さらに、これらの図は、比較的低いおよび比較的高いカットオフの両方でのＯＳおよびＤＦＳ分析が有意な結果を生むことを示す。核強度および細胞質強度に基づいてＯＳおよびＤＦＳを分析したとき、同様の結果が得られた（図１８−１９）。すなわち、強い強度はより長い生存を予測する。
【０３８１】
デュークスステージＣと診断された６６人の対象を試験したとき、生存の違いはさらにより明白に考えられ得る。高いＮＦ（すなわち＞７５％）を有する患者に関して、患者の約７１％が５年後にまだ生存したが、低いＮＦ（すなわちＮＦ＜２％）を有する患者はわずか約２２％が同じ期間後に生存した（図２０Ａ参照）。二分された可変での分析は、これらの見出したことをさらにサポートする（図２０Ｂ−２０Ｃ）。図２１に示されるとおり強度に基づいてＯＳおよびＤＦＳを分析したとき、ＤＦＳ分析が細胞質および核強度に対して示されるとき、同様の結果が得られた。強度がより強いと、より長い生存が期待され得る。
【０３８２】
結論として、結腸直腸癌、例えば、Ｓ字結腸癌腫と診断された患者に対して、１Ｂ５抗体の使用は、図１５から２１において見ることができるとおり、患者に対する予後、例えば、生存、例えば、５年生存の可能性を確立するための有意な価値があり得る。
【０３８３】
結腸癌患者に対する予後の確立
９．非限定的な例
癌患者は、腫瘍増殖からの症状または徴候、腫瘍が増殖する領域からの疼痛および苦痛を含む局所症状、または、さらなる全身的症状、例えば、体重減少および疲労を示し得る。結腸直腸腫瘍の増殖からの徴候は、また、血便および／または機能障害、例えば、下痢／便秘を介して明らかになり得る。
【０３８４】
患者における結腸直腸癌診断の確立後、腫瘍組織サンプルを得る。腫瘍組織サンプルは、癌の診断中に早期に行われた生検、または腫瘍の早期外科的除去からの試料から得ることができる。さらに、「陰性参照」の提供のために、サンプルは、低い、または本質的に欠いているＲＢＭ３タンパク質発現を有する組織を含む保存材料から得る。このような保存組織は、例えば、以前に確立されている低いＲＢＭ３タンパク質発現レベルを有する結腸直腸癌組織、または表２における０の染色スコアを有する適当な組織であり得る。さらに、「陽性参照」の提供のために、サンプルは、高いＲＢＭ３タンパク質発現を有する組織、例えば、以前に確立されている高いＲＢＭ３タンパク質発現レベルを有する結腸直腸癌組織を含む保存材料から得る。
【０３８５】
サンプル材料を緩衝ホルマリンで固定し、組織処理し、サンプル材料の薄片（４μｍ）を得る。
【０３８６】
免疫組織化学を実施例の部４に記載されているとおりに実施する。それぞれのサンプル由来の１つ以上のサンプル切片をスライドガラスに乗せ、６０℃で４５分インキュベートし、キシレンで脱パラフィン処理し（問題のサンプルがパラフィン処理されたとき）（２×１５分）、等級アルコールで水和する。抗原回復のために、スライドをＴＲＳ（Target Retrieval Solution, pH6.0, DakoCytomation）中に浸し、Ｄｅｃｌｏａｋｉｎｇ  ｃｈａｍｂｅｒ（登録商標）（Biocare Medical）中で１２５℃で４分間沸騰させる。スライドを、Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ（登録商標）（DakoCytomation）中に置き、内因性ペルオキシダーゼを最初にＨ２Ｏ２（DakoCytomation）でブロックした。多数のサンプル切片を乗せる理由は結果の精度を増加させるためである。
【０３８７】
一次ＲＢＭ３タンパク質の特異的抗体をスライドに加え、室温で３０分間インキュベートし、次に標識された二次抗体、例えば、ヤギ−抗ウサギペルオキシダーゼ接合Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（登録商標）と室温で３０分間インキュベートする。一次抗体は、例えば、上記実施例の部２または３に記載されているとおりに生産され得る。二次抗体を検出するために、ジアミノベンジジン（DakoCytomation）をクロモゲンとして使用し、Ｈａｒｒｉｓヘマトキシリン（Sigma-Aldrich）対比染色で対比染色する。すべての工程間、スライドを洗浄バッファー（DakoCytomation）で濯ぐ。次に、スライドをＰｅｒｔｅｘ（登録商標）（Histolab）マウンティング媒体(mounting media)に乗せる。
【０３８８】
染色処理を確認する道具として、２つのコントロール細胞株、例えば、ＲＢＭ３タンパク質を発現する細胞（陽性細胞株）を有する１つのスライド、および不明確に弱いまたは非存在のＲＢＭ３タンパク質発現を有する細胞（陰性細胞株）を有するもう１つのスライドを使用し得る。当業者は、このような細胞株を提供する方法を、例えば、Rhodes et al. (2006) The biomedical scientist, p 515-520の記載により理解できる。コントロール系スライドは、結腸直腸癌のスライドと同じ処理において同時に染色され得、すなわち、同じ一次および二次抗体とインキュベートされ得る。
【０３８９】
例えば、結腸直腸癌腫瘍のスライド、染色参照スライド、および所望により、コントロール細胞株を有するスライドを、ＳｃａｎＳｃｏｐｅ  Ｔ２自動スライドスキャンニングシステム（Aperio Technologies）を使用して光学顕微鏡において×２０拡大でスキャンし得る。しかしながら、このスキャンニング工程は必ずしも必要としないが、例えば、スライドの調製および染色ならびに染色されたスライドの評価（以下参照）が種々の位置で、または種々の個体により実施されるとき、処理を簡単にさせ得る。
【０３９０】
コントロール細胞株を使用するとき、これらを染色処理を確認するために検査する。細胞株が許容される基準外の染色結果、例えば、当業者により認識される染色人工物を示すとき、生検サンプルの染色は有効でないと考え、全染色処理を新しいスライドで繰り返す。陽性および陰性細胞株が、それぞれ、強い染色強度および不明確に弱いか、または非存在の染色強度を示すとき、染色は有効であると考える。
【０３９１】
腫瘍組織由来の染色されたサンプルスライドを臨床組織病理学的診断に使用される標準にしたがって目視検査により手動で評価し、結腸直腸癌スライドの免疫反応を実施例の部３に記載されているとおりに等級付けする。
【０３９２】
すなわち、細胞質強度（ＣＩ）、核強度（ＮＩ）および／または核画分（ＮＦ）を決定する。
【０３９３】
ＣＩ、ＮＩおよび／またはＮＦの決定において、評価および等級付けを行う個体を、染色された参照スライド、すなわち「陽性参照」および「陰性参照」の目視検査により補助する。
【０３９４】
次に、腫瘍組織生検由来のサンプルスライドのサンプル値、すなわちＣＩおよび／またはＣＦを参照値と比較する。
【０３９５】
サンプル値またはサンプル値平均が参照値以下であるとき、予後が参照値と関連する参照予後以上に悪いという結論を示す。このような場合、参照値が約５３％の無病５年生存の可能性と関連し得るＮＦ＜２％であるとき、結論は患者に対する予後が約５３％の無病５年生存の可能性であり得る（図１Ｂ参照）。
【０３９６】
サンプル値またはサンプル値平均が参照値よりも高いとき、予後が参照値と関連する参照予後よりも良いと結論を出す。このような場合、参照値がＮＦ＜２％であるとき、結論は患者に対する予後が約５３％よりも高い無病５年生存の可能性であり得る（図１Ｂ参照）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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