(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコロニトリルをグリコール酸に酵素的に変換する場合、酵素触媒の比活性を改善する方法であり、該方法は、以下：
（ａ）以下を含む一連の反応成分を備えること：
（ｉ）少なくとも０.０１ｐｐｍのホルムアルデヒドを含むグリコロニトリルの水溶液；
（ii）ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドを含む酵素触媒、ここで該ポリペプチドは、配列番号１の触媒シグネチャーモチーフを含み；ここで、該酵素触媒はグリコロニトリルをグリコール酸に加水分解する比活性を含む；および
（iii）以下からなる群から選択される有効量の少なくとも１つのアミン保護剤：
ａ）式
［Ｒ3］(1+X)−ＮＨ(2-X)
［式中、Ｘは０または１であり、そしてＲ3は独立してＣ１〜Ｃ２０ヒドロカルビル基または置換ヒドロカルビル基であり、ここでＲ3は場合により、１つまたはそれ以上のエーテル結合を含む；ただし（ｉ）置換基は酵素触媒と反応し得るシアノ基でないのが好ましく、そして（ii）Ｒ３はカルボニル基でない］の化合物、
ｂ）少なくとも１つの遊離アミン基を含むポリアミンポリマーであって、該ポリアミンポリマーは、２−アミノ−２−デオキシ−（１→４）−β−Ｄ−グルコピラナン、２〜１２の炭素原子のアルキレン部分を有するポリアルキレンアミンポリマー、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルアルコール／ポリビニルアミンコポリマー、Ｄ−ポリリシン、Ｌ−ポリリシン、Ｄ／Ｌポリリシンの混合物、グルタルアルデヒドと架橋したポリエチレンイミン、およびそれらの混合物からなる群から選択されるもの、
ｃ）多糖、グリカン、アガロース、カラゲナン、アルギナート、デキストラン、セルロース、キチン、メタクリレート、ポリウレタン、ポリエステル、ナイロン、アルミナおよびシリカからなる群から選択されるポリマーであって、該ポリマーは、少なくとも1つの遊離アミン基に化学的に結合され、ホルムアミドまたはホルムアミド由来の不純物と反応することができるもの；および
ｄ）１つまたはそれ以上の第一級または第二級アミン基を含む弱塩基性アニオン交換樹脂、アミノプロピルシラン化ガラスビーズ、ω−アミノヘキシルアガロース、ω−アミノドデシルアガロースおよびω−アミノエチルアガロースからなる群から選択されるアミ
ノ材料；
（ｂ）適した水性反応条件下、一連の反応成分を混合し、これによりグリコール酸を生産すること；ここで、少なくとも１つの該アミン保護剤の添加により、上記比活性を増加させる；および
（ｃ）（ｂ）において生産されたグリコール酸またはその塩を回収することを含む、上記方法。
【請求項２】
ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドが配列番号２の触媒シグネチャーモチーフを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アミン保護剤が適した水性反応条件下で可溶である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
アミン保護基が適した水性反応条件下で不溶である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
酵素触媒が、アミン保護剤を含むマトリクス中に固定化されていない、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
酵素触媒が、アミン保護剤を含む不溶性マトリクス中に固定化されている、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
酵素触媒が、ポリエチレンイミンを含む不溶性マトリクス中に、または上に固定化されている、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
酵素触媒が、グルタルアルデヒド−ポリエチレンイミン架橋カラギーナン粒子またはビーズ中にまたは上に固定化されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ポリアミンポリマーが、１,０００ダルトン〜２,０００,０００ダルトンの範囲の平均分子量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの遊離アミン基に化学的に結合されたポリマーが、ポリエチレンイミンに化学的結合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
アミノ材料が、ポリエチレンイミンに化学的結合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの遊離アミン基に化学的に結合されたポリマーが、シリカに化学的結合されたポリエチレンイミンおよびポリスチレンに化学的結合されたポリエチレンイミンからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドが、アシドボラクス属、ロドコッカス属、ノカルジア属、バシラス属、およびアルカリゲネス属からなる群から選択される属由来の宿主細胞から誘導される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
酵素触媒が、全微生物細胞、透過性微生物細胞、微生物細胞抽出物の１つまたはそれ以上の細胞成分、部分精製酵素、または精製酵素の形態である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
酵素触媒が、コマモナス・エスピー、コリネバクテリア・エスピー、ブレビバクテリウム・エスピー、ロドコッカス・エスピー、アゾトバクター・エスピー、シロトバクター・エスピー、エンテロバクター・エスピー、クロストリジウム・エスピー、クレブシエラ・エスピー、サルモネラ・エスピー、ラクトバシラス・エスピー、アスペルギルス・エスピー、サッカロミセス・エスピー、ヤロウイア・エスピー、ザイゴサッカロミセス・エスピー、ピキア・エスピー、クルイベロマイセス・エスピー、カンジダ・エスピー、ハンゼヌラ・エスピー、ドナリエラ・エスピー、デバリオマイセス・エスピー、ムコール・エスピー、トルロプシス・エスピー、メチロバクテリア・エスピー、バシラス・エスピー、エシュリキア・エスピー、シュードモナス・エスピー、リゾビウム・エスピー、およびストレプトミセス・エスピーからなる群から選択される形質転換微生物宿主細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
形質転換微生物宿主細胞が、バシラス・エスピー、シュードモナス・エスピー、およびエシュリキア・エスピーからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
形質転換微生物宿主細胞が大腸菌である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ポリペプチドが、配列番号５１に対して少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号：４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、および５７からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号：４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、および５７からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号：４、２４、２５、および５１からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドが配列番号：５１である、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機酸合成、分子生物学、および微生物学の分野に関係する。より詳しくは、アミン保護剤の存在下、反応を実施することにより、グリコロニトリルをグリコール酸に変換する場合、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドを含む酵素触媒の比活性を保護および／または増加させるための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
グリコール酸（ＨＯＣＨ2ＣＯＯＨ；ＣＡＳ登録番号は７９−１４−１である）は、カルボン酸のα−ヒドロキシ酸ファミリーの最も単純なメンバーである。その特性は、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）の調製におけるモノマーとして、およびパーソナルケア製品における成分として、井戸修復、皮革産業、オイルおよびガス産業、洗濯および繊維産業における使用を含む広範囲の消費者および産業用途に理想的である。グリコール酸は、種々の産業（乳および食品加工装置洗浄剤、家庭用および業務用洗浄剤、産業用洗浄剤［輸送設備、石造、プリント基板、ステンレス鋼ボイラーおよび加工装置、冷却塔／熱交換器用のための］、および金属加工［金属酸洗い、銅光沢、エッチング、電気メッキ、電解研磨用のための］）における洗浄剤の主成分でもある。最近、ポリグリコール酸が、食品および炭酸飲料を包装するためのガスバリヤ材として有用である（すなわち、高い酸素バリヤ特性を示す）ことが報告されている（特許文献１）。しかし、グリコール酸の伝統的な化学合成では、ガスバリヤ材用のポリグリコール酸の調製に使用する前に除去しなければならない相当な量の不純物が生産される。グリコール酸を商業的に生産する新しい技術、特に高純度かつ低費用でグリコール酸を生産する技術は、産業により熱心に受入れられる。
【０００３】
対応するアミドの中間生成がないニトリラーゼ（ＥＣ３．５．５．７）を使用して（式１）、またはニトリルヒドラターゼ（ＮＨａｓｅ）が最初にニトリルをアミドに変換し、次いでアミドがその後にアミダーゼにより対応するカルボン酸に変換されるニトリルヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．８４）とアミダーゼ（ＥＣ３．５．１．４）との酵素の組合せにより（式２）、微生物触媒はニトリル（例えば、グリコロニトリル）を直接、対応するカルボン酸（例えば、グリコール酸）に加水分解し得る。
【化１】
0005604303.tif 000002
【０００４】
グリコール酸の酵素合成は、典型的に、グリコロニトリルの実質的に純粋な形態を必要とする。ホルムアルデヒドおよびシアン化水素の水溶液を反応させることにより、グリコロニトリルを合成する方法が以前に報告されている（特許文献２；特許文献３；および特許文献４；式３）。
【化２】
0005604303.tif 000003
【０００５】
しかし、不純物および／または反応の副産物（過剰な反応性ホルムアルデヒドを含む）の多くが、グリコロニトリルのグリコール酸への酵素変換を妨害し得る（触媒活性の抑制（すなわち、比活性の減少）を含む）ので、これらの方法は、典型的に、大幅な精製（例えば、蒸留精製）を必要とする水性グリコロニトリル反応生成物をもたらす。特に、Ｎ末端アミノ酸残基由来のアミノ基とアルギニン、システイン、ヒスチジン、およびリシン残基の側鎖との反応により、ホルムアルデヒドがタンパク質における所望でない修飾を生成し得ることが周知である（非特許文献１）。触媒活性の抑制は、触媒の全体的な生産性（すなわち、触媒１グラムあたりに形成されるグリコール酸の総グラム）を減少させ、全体的な方法に多大な費用を追加させ、これが化学合成と比較した場合、酵素産生を経済的に実行不可能にし得る。このように、触媒の活性を減少させると報告された所望でない不純物から酵素活性を保護するのに役立ち得る反応条件が必要である。
【０００６】
高純度のグリコロニトリルを生産する方法が、グリコロニトリル合成反応の前に、ホルムアルデヒドを加熱処理に供することを報告している（特許文献５および特許文献６；式３）。しかし、グリコロニトリルは、ホルムアルデヒドとシアン化水素に可逆的に解離され得る。このように、遊離ホルムアルデヒドの所望でない効果からニトリラーゼ活性を有する触媒を保護する必要性が残っている。
【０００７】
開始物質として対応するα−ヒドロキシニトリルおよび触媒として微生物を使用するα−ヒドロキシ酸を調製するための種々の方法が公知である。生産されるα−ヒドロキシ酸の例としては、グリコール酸、乳酸、２−ヒドロキシイソ酪酸、２−ヒドロキシ−２−フェニルプロピオン酸、マンデル酸、２−ヒドロキシ−３，３−ジメチル−４−ブチロラクトン、および４−メチルチオ酪酸が挙げられる。これらの生成物は、ノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オーレオバクテリウム属（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、カセオバクター属（Ｃａｓｅｏｂａｃｔｅｒ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、マイコプラナ属（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ）、セルロモナス属（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）、エルビニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、バクテリジウム属（Ｂａｃｔｅｒｉｄｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、コクリオボルス属（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ロドシュードモナス属（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オブサムバクテリウム属（Ｏｂｓｕｍｂａｃｔｅｒｉｕｍ）およびゴルドナ属（Ｇｏｒｄｏｎａ）に属するもののような微生物を使用して合成される。（特許文献１０に対応するおよび特許文献７、特許文献８および特許文献９；特許文献１２に対応する特許文献１１；特許文献１４に対応する特許文献１３；特許文献１５；特許文献１７に対応する特許文献１６；特許文献１９に対応する特許文献１８；特許文献２１に対応する特許文献２０；特許文献２３に対応する特許文献２２）。
【０００８】
しかし、上記の対応するα−ヒドロキシニトリルからα−ヒドロキシ酸を調製するための最も公知の方法では、商業的要求を満たす十分に高濃度な生成物が生産されず、そして蓄積されない。これはしばしば、反応期間の早期の酵素不活性化の結果である。特許文献２４は、「α−ヒドロキシニトリルがニトリラーゼまたはニトリルヒドラターゼを使用して酵素的に加水分解または水和され、α−ヒドロキシ酸またはα−ヒドロキシアミドを生産する場合、酵素は短時間内で不活性化されるという点で問題が生じる。従って、α−ヒドロキシ酸またはα−ヒドロキシアミドを高濃度および高収率で得ることは困難である。」と教示する（第１欄、４９〜５４行）。反応混合物におけるアルデヒド濃度（アルデヒドおよびシアン化水素へのα−ヒドロキシニトリルの解離により形成される）および／またはα−ヒドロキシニトリル濃度を指定範囲内に維持することが、この問題を回避する１つの方法である。
【０００９】
特許文献２３はさらに、迅速な酵素不活性化に関する難点に対処する。具体的には、特許文献２３は、解離平衡（ｄｉｓａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）に従って、α−ヒドロキシニトリル化合物が対応するアルデヒドに部分的に解離することに言及している。これらのアルデヒドは、タンパク質に結合することにより短時間で酵素を不活性化し、それによって、α−ヒドロキシニトリルから高い生産性とともに高濃度でα−ヒドロキシ酸またはα−ヒドロキシアミドを得ることを困難にすると報告していた（第２欄、１６〜２９行）。アルデヒドの蓄積による酵素不活性化を阻止する解決法として、リン酸または次亜リン酸イオンが反応混合物に添加された。特許文献１７では、亜硫酸イオン、二亜硫酸イオン、または亜ジチオン酸イオンが使用され、アルデヒドを封鎖し、そして酵素不活性化を阻止することが報告されているが、しかし、上記のこのような添加剤を使用することによっても生産され、そして蓄積されるα−ヒドロキシ酸の濃度は大きくないと結論を下す。
【００１０】
特許文献２５は、α−ヒドロキシ酸生成物の低い蓄積が解離アルデヒド蓄積による短時間内での酵素不活性化に関係していることを教示する。これらの発明者らは、酵素活性が、対応するアルデヒドまたはケトンと共に水中でα−ヒドロキシニトリルの部分解離において生成されるシアン化水素の存在下、阻害される（非特許文献２）ことを示唆する（非特許文献３）。この発明者らは、酵素活性が、反応混合物にシアン化物を添加することによって改善され得る微生物を使用することにより、アルデヒド誘導性酵素不活性化の問題を解決した。シアン化物の添加は、アルデヒドおよびシアン化水素へのα−ヒドロキシニトリルの解離を制限した。
【００１１】
特にグリコール酸の生産に関して、グリコロニトリルが、シアン化水素およびホルムアルデヒドに可逆的に解離することが公知であり、そのいずれかが触媒活性の低下に関与し得る。特許文献２６は、「ニトリラーゼ（ｎｉｔｒｉｌａｓｉｃ）」活性を有する細菌を使用して対応するニトリルから有機酸を調製する方法を記載し、そして基質としてのグリコロニトリルを記載する。特に、この特許は、この目的のためのバチルス属、バクテリジウム属、ミクロコッカス属、およびブレビバクテリウム属の使用を記載する。ニトリラーゼ活性を有すると記載されているが、ブレビバクテリウム  Ｒ３１２は、特許文献２６の実施例の全てにおいて使用される唯一の株である。ブレビバクテリウム  Ｒ３１２は、ニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ活性を有するが、ニトリラーゼ活性を有さないことが公知である（非特許文献４）。
【００１２】
コリネバクテリウム種に属する微生物を使用することにより、乳酸、グリコール酸、および２−ヒドロキシイソ酪酸を調製する方法が、特許文献２７に開示されている。特許文献２８は、ロドコッカス属またはゴルドナ属のヒドロラーゼの作用によりグリコロニトリルからグリコール酸を生成するための方法を開示する。グリコール酸の選択性は、グリコール酸アミドが形成することなく、ほぼ１００％と報告されている。特許文献２５は、グリコール酸を含む、α−ヒドロキシニトリルからα−ヒドロキシ酸を生産するための方法の実施例を開示する。この開示は、全ての微生物触媒が前記問題により高濃度のグリコール酸を生産できるわけではないことを認め、産業上、有利な微生物を見出すためにスクリーニング試験が実施されなければならないことが示す。特許文献２５は、具体的には、バリオボラックス種（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｓｐｐ．）およびアルスロバクター種を同定する。α−ヒドロキシニトリルまたはα−ヒドロキシ酸の抑制効果に耐性である微生物は、永続的な活性を有し、そして高濃度で所望の生成物を生産し得る。
【００１３】
アシドボラックス  ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ（ＡＴＣＣ５５７４６）は、脂肪族ニトリラーゼ（ＥＣ３．５．５．７）活性、さらにニトリルヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．８４）活性およびアミダーゼ（ＥＣ３．５．１．４）活性の組合せによって特徴付けられる。Ａ．ファシリス  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ５５７４６）ニトリラーゼをコードする遺伝子はクローニングされ、そして組換え発現される（特許文献３０に対応する特許文献２９および非特許文献５）。
【００１４】
Ａ．ファシリス  ７２Ｗニトリラーゼは、α−ヒドロキシニトリルを対応するα−ヒドロキシカルボン酸（グリコール酸（特許文献３２）を含む）に高い収率で変換する（特許文献３１）。Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ由来の突然変異を使用するグリコロニトリルからグリコール酸を生産する改善された方法が、特許文献３３および特許文献３４に開示される（それぞれ、特許文献３５および特許文献３６に対応する）。同時係属および共同所有された特許文献３６において、グリコール酸の生産を改善する種々の方法が開示され、その方法としては、（１）改善された活性を有するＡ．ファシリス７２Ｗ突然変異の使用、（２）少なくとも１つの安定剤（例えば、チオ硫酸カリウム、亜ジチオン酸ナトリウム、過剰量のＨＣＮ）の添加、（３）無酸素状態下での反応の実行、（４）グリコロニトリル供給量の制御、および（５）高純度グリコロニトリルの使用が挙げられる。これらの方法の多くがグリコール酸生産性を改善したにもかかわらず、酵素活性の減少が、一般に、徐々に観察された。この活性の減少は、典型的に、少なくとも部分的に、反応混合物中のホルムアルデヒドの存在（たとえ低レベルでも）に起因する。ホルムアルデヒドの存在下、グリコロニトリルをグリコール酸に変換する場合、ニトリラーゼ活性を有する酵素触媒の比活性を保護する方法は、グリコール酸合成の実用性を有意に改善する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】ＷＯ  ２００５／１０６００５  Ａ１
【特許文献２】米国特許第２，１７５，８０５号
【特許文献３】米国特許第２，８９０，２３８号
【特許文献４】米国特許第５，１８７，３０１号
【特許文献５】米国特許第１１／３１４３８６号
【特許文献６】米国特許第１１／３１４９０５号
【特許文献７】ＪＰ−Ａ−４−９９４９５
【特許文献８】ＪＰ−Ａ−４−９９４９６
【特許文献９】ＪＰ−Ａ−４−２１８３８５
【特許文献１０】米国特許第５，２２３，４１６号
【特許文献１１】ＪＰ−Ａ−４−９９４９７
【特許文献１２】米国特許第５，２３４，８２６号
【特許文献１３】ＪＰ−Ａ−５−９５７９５
【特許文献１４】米国特許第５，２９６，３７３号
【特許文献１５】ＪＰ−Ａ−５−２１９８７
【特許文献１６】ＪＰ−Ａ−５−１９２１８９
【特許文献１７】米国特許第５，３２６，７０２号
【特許文献１８】ＪＰ−Ａ−６−２３７７８９
【特許文献１９】ＥＰ−Ａ−０６１００４８
【特許文献２０】ＪＰ−Ａ−６−２８４８９９
【特許文献２１】ＥＰ−Ａ−０６１００４９
【特許文献２２】ＪＰ−Ａ−７−２１３２９６
【特許文献２３】米国特許第５，５０８，１８１号
【特許文献２４】米国特許第５，７５６，３０６号
【特許文献２５】米国特許第６，０３７，１５５号
【特許文献２６】米国特許第３，９４０，３１６号
【特許文献２７】特開昭６１５６０８６号
【特許文献２８】ＪＰ０９０２８３９０
【特許文献２９】ＷＯ  ０１／７５０７７
【特許文献３０】米国特許第６，８７０，０３８号
【特許文献３１】米国特許第６，３８３，７８６号
【特許文献３２】米国特許第６，４１６，９８０号
【特許文献３３】ＷＯ２００６／０６８１１０
【特許文献３４】ＷＯ２００６／０６９１１４
【特許文献３５】米国特許第７，１９８，９２７号
【特許文献３６】米国特許第１１／３１４９０５号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｍｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（８）：６２３５−６２４３（２００４）
【非特許文献２】Ａｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．４６，ｐａｇｅｓ１１６５−１１７４（１９８２）
【非特許文献３】Ｍｏｗｒｙ，Ｄａｖｉｄ  Ｔ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．４２，ｐａｇｅｓ  １８９−２８３（１９４８）
【非特許文献４】Ｔｏｕｒｎｅｉｘ  ｅｔａｌ．，Ａｎｔｏｎｉｅ  ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ，５２：１７３１８２（１９８６）
【非特許文献５】Ｃｈａｕｈａｎ  ｅｔａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，６１：１１８−１２２（２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
解決すべき課題は、ホルムアルデヒドの存在下、グリコロニトリルをグリコール酸に変換する場合、ニトリラーゼ活性を有する酵素触媒の比活性を安定化するおよび／または増加させる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
発明の要旨
グリコロニトリルをグリコール酸に酵素的に変換する場合、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドを含むニトリラーゼ触媒の比活性を安定および／または増加させる方法を提供することにより、本発明の問題を解決し、該方法は、以下：
（ａ）以下を含む一連の反応成分を備えること：
（ｉ）少なくとも０．０１ｐｐｍの  ホルムアルデヒドを含むグリコロニトリルの水溶液；
（ｉｉ）ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドを含む酵素触媒、ここで該ポリペプチドは、配列番号１の触媒シグネチャーモチーフを含み；ここで、該酵素触媒はグリコロニトリルをグリコール酸に加水分解する比活性を含む；および
（ｉｉｉ）以下からなる群から選択される有効量の少なくとも１つのアミン保護剤：
ａ）式
［Ｒ3］(1+X)−ＮＨ(2-X)
［式中、Ｘは０または１であり、そしてＲ3は独立してＣ１〜Ｃ２０ヒドロカルビル基または置換ヒドロカルビル基であり；ここでＲ3は場合により、１つまたはそれ以上のエーテル結合を含む；ただし（ｉ）置換基は酵素触媒と反応し得るシアノ基でないのが好ましく、そして（ｉｉ）Ｒ3はカルボニル基でない］の化合物、
ｂ）有効遊離アミン基数を含むポリアミンポリマー；および
ｃ）有効遊離アミン基数を含むアミン官能化材料；
ここで、アミン保護剤は、上記酵素触媒により天然で生産されない；
（ｂ）適した水性反応条件下、一連の反応成分を混合し、これによりグリコール酸を生産すること；ここで、少なくとも１つの該アミン保護剤の添加により、上記比活性を増加させる；および
（ｃ）（ｂ）において生産されたグリコール酸またはその塩を回収することを含む。
【００１９】
図面、配列表、および生物寄託の簡単な説明
本発明は、配列表、生物寄託、図面、および本願を共に形成する詳細な説明から、より十分に理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】パネルＡは、種々のニトリラーゼ配列のＣＬＵＳＴＡＬＷアライメント（デフォルトパラメータを使用するバージョン１．８３）である。触媒システイン残基を取り囲む保存的触媒シグネチャー配列を、グレーのシェーディングで強調する。触媒トライアドを表わすアミノ酸（Ｇｌｕ48、Ｌｙｓ130、およびＣｙｓ164；アミノ酸配列  配列番号４に基づいて番号付け）に下線を引く。
【図１Ｂ】パネルＢは、種々のニトリラーゼ配列のＣＬＵＳＴＡＬＷアライメント（デフォルトパラメータを使用するバージョン１．８３）である。触媒システイン残基を取り囲む保存的触媒シグネチャー配列を、グレーのシェーディングで強調する。触媒トライアドを表わすアミノ酸（Ｇｌｕ48、Ｌｙｓ130、およびＣｙｓ164；アミノ酸配列  配列番号４に基づいて番号付け）に下線を引く。
【図１Ｃ】パネルＣは、種々のニトリラーゼ配列のＣＬＵＳＴＡＬＷアライメント（デフォルトパラメータを使用するバージョン１．８３）である。触媒システイン残基を取り囲む保存的触媒シグネチャー配列を、グレーのシェーディングで強調する。触媒トライアドを表わすアミノ酸（Ｇｌｕ48、Ｌｙｓ130、およびＣｙｓ164；アミノ酸配列  配列番号４に基づいて番号付け）に下線を引く。
【図１Ｄ】パネルＤは、種々のニトリラーゼ配列のＣＬＵＳＴＡＬＷアライメント（デフォルトパラメータを使用するバージョン１．８３）である。触媒システイン残基を取り囲む保存的触媒シグネチャー配列を、グレーのシェーディングで強調する。触媒トライアドを表わすアミノ酸（Ｇｌｕ48、Ｌｙｓ130、およびＣｙｓ164；アミノ酸配列  配列番号４に基づいて番号付け）に下線を引く。
【図１Ｅ】パネルＥは、種々のニトリラーゼ配列のＣＬＵＳＴＡＬＷアライメント（デフォルトパラメータを使用するバージョン１．８３）である。触媒システイン残基を取り囲む保存的触媒シグネチャー配列を、グレーのシェーディングで強調する。触媒トライアドを表わすアミノ酸（Ｇｌｕ48、Ｌｙｓ130、およびＣｙｓ164；アミノ酸配列  配列番号４に基づいて番号付け）に下線を引く。
【図１Ｆ】パネルＦは、種々のニトリラーゼ配列のＣＬＵＳＴＡＬＷアライメント（デフォルトパラメータを使用するバージョン１．８３）である。触媒システイン残基を取り囲む保存的触媒シグネチャー配列を、グレーのシェーディングで強調する。触媒トライアドを表わすアミノ酸（Ｇｌｕ48、Ｌｙｓ130、およびＣｙｓ164；アミノ酸配列  配列番号４に基づいて番号付け）に下線を引く。
【図１Ｇ】パネルＧは、種々のニトリラーゼ配列のＣＬＵＳＴＡＬＷアライメント（デフォルトパラメータを使用するバージョン１．８３）である。触媒システイン残基を取り囲む保存的触媒シグネチャー配列を、グレーのシェーディングで強調する。触媒トライアドを表わすアミノ酸（Ｇｌｕ48、Ｌｙｓ130、およびＣｙｓ164；アミノ酸配列  配列番号４に基づいて番号付け）に下線を引く。
【００２１】
配列表
本明細書に添付された以下の配列の説明および配列表は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１〜１．８２５に示される特許出願におけるヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列の開示を規定する規則に従う。配列の説明は、参照により本明細書に加入される、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３：３０２１３０３０（１９８５）およびＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２１９（Ｎｏ．２）：３４５３７３（１９８４）に記載されたＩＵＰＡＣ−ＩＹＵＢ標準に従って定義される通りヌクレオチド配列文字についての１文字表記およびアミノ酸についての３文字表記を含む。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに使用される記号および形式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に示される規則に従う。
【００２２】
配列番号１は、ニトリラーゼ酵素の必須システイン残基を包含する触媒シグネチャーモチーフのアミノ酸配列である（式１）。
【００２３】
配列番号２は、ニトリラーゼ酵素の必須システイン残基を包含する好ましい触媒シグネチャーモチーフのアミノ酸配列である（式２）。
【００２４】
配列番号３は、大腸菌中での組換え発現を容易にするＴＴＧからＡＴＧへの開始コドンの変化を含むアシドボラクス  ファシリス７２Ｗニトリラーゼコード配列のヌクレオチド配列である。
【００２５】
配列番号４は、アシドボラクス  ファシリス７２Ｗニトリラーゼ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）の推定アミノ酸配列である。
【００２６】
配列番号５は、アルカリゲネス  フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）ＪＭ３ニトリラーゼ（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)  ＢＡＡ０２６８４．１）のアミノ酸配列である。
【００２７】
配列番号６は、ロドコッカス  ロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ１ニトリラーゼ（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)  Ｑ０３２１７）のアミノ酸配列である。
【００２８】
配列番号７は、ロドコッカス  ロドクロス  Ｋ２２ニトリラーゼ（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)
Ｑ０２０６８）のアミノ酸配列である。
【００２９】
配列番号８は、ノカルジア・エスピー（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｐ．）Ｃ−１４−１ニトリラーゼ（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)  ＡＡＸ１８１８２．１）のアミノ酸配列である。
【００３０】
配列番号９は、ボルデテラ  ブロンキセプティカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）ＲＢ５０ニトリラーゼ（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)  ＮＰ＿８８７６６２．１）のアミノ酸配列である。
【００３１】
配列番号１０は、アラビドプシス  タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ニトリラーゼ（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)  ＡＡＢ６０２７５．１およびＡＡＡ１９６２７．１）のアミノ酸配列である。
【００３２】
配列番号１１は、シネココッカス  エロンガタス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）ＰＣＣ  ７９４２ニトリラーゼ（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)  ＹＰ＿３９９８５７．１）のアミノ酸配列である。
【００３３】
配列番号１２は、シネココッカス  エロンガタスＰＣＣ  ６３０１ニトリラーゼ（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)  ＹＰ＿１７１４１１．１）のアミノ酸配列である。
【００３４】
配列番号１３は、シネコシスティス・エスピー（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．）ＰＣＣ  ６８０３ニトリラーゼ（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)  ＮＰ＿４４２６４６．１）のアミノ酸配列である。
【００３５】
配列番号１４は、シュードモナス  エントモフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）Ｌ４８ニトリラーゼ（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)  ＹＰ＿６０９０４８ｌ．１）のアミノ酸配列である。
【００３６】
配列番号１５は、ザイモモナス  モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｌｉｓ）ニトリラーゼ（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)  ＹＰ＿１６２９４２．１）のアミノ酸配列である。
【００３７】
配列番号１６は、バシラス・エスピーＯｘＢ−１ニトリラーゼ（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)  ＢＡＡ９０４６０．１）のアミノ酸配列である。
【００３８】
配列番号１７は、コマモナス  テストテローニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）ニトリラーゼ（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)  ＡＡＡ８２０８５．１）のアミノ酸配列である。
【００３９】
配列番号１８は、シネココッカス・エスピー（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＣＣ９６０５ニトリラーゼ（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)  ＹＰ＿３８１４２０．１）のアミノ酸配列である。
【００４０】
配列番号１９は、シュードモナス  フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）Ｐｆ−５ニトリラーゼ（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)  ＹＰ＿２６００１５．１）のアミノ酸配列である。
【００４１】
配列番号２０は、ノカルジア  ファルシニカ（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｆａｒｃｉｎｉｃａ）ＩＦＭ  １０１５２ニトリラーゼ（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)  ＹＰ＿１１９４８０．１）のアミノ酸配列である。
【００４２】
配列番号２１は、アルカリゲネス  フェカリス  １６５０ニトリラーゼ（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)  ＡＡＹ０６５０６．１）のアミノ酸配列である。
【００４３】
配列番号２２は、シュードモナス  シリンガエ亜種シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）Ｂ７２８ａニトリラーゼ（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)  ＡＡＹ３５０８１．１）のアミノ酸配列である。
【００４４】
配列番号２３は、ブラディリゾビウム・エスピー（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）ＢＴＡｉｌニトリラーゼ（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)  ＺＰ＿００８５９９４８．１）のアミノ酸配列である。
【００４５】
配列番号２４は、ロドコッカス  ロドクロス  ＮＣＩＭＢ  １１２１６ニトリラーゼ（ＧＥＮＢＡＮＫ(R)  ＣＡＣ８８２３７）のアミノ酸配列である。
【００４６】
配列番号２５は、ロドコッカス  ロドクロス  ＡＴＣＣTM３９４８４のアミノ酸配列である。
【００４７】
配列番号２６は、残基位置２０１で単一アミノ酸置換をもたらすコドン変化（Ｌ２０１Ｑ；Ｌｅｕ→Ｇｌｎ）を含むＡ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ突然変異のヌクレオチド配列である。
【００４８】
配列番号２７は、Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼの残基位置２０１で単一アミノ酸置換（Ｌｅｕ２０１→Ｇｌｎ）を含む突然変異ニトリラーゼ（配列番号２６）の推定アミノ酸配列である。
【００４９】
配列番号２８は、残基位置２０１で単一アミノ酸置換をもたらすコドン変化（Ｌ２０１Ａ；Ｌｅｕ→Ａｌａ）を含むＡ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ突然変異のヌクレオチド配列である。
【００５０】
配列番号２９は、Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼの残基位置２０１で単一アミノ酸置換（Ｌｅｕ２０１→Ａｌａ）を含む突然変異ニトリラーゼ（配列番号２８）の推定アミノ酸配列である。
【００５１】
配列番号３０は、残基位置２０１で単一アミノ酸置換をもたらすコドン変化（Ｌ２０１Ｃ；Ｌｅｕ→Ｃｙｓ）を含むＡ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ突然変異のヌクレオチド配列である。
【００５２】
配列番号３１は、Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼの残基位置２０１で単一アミノ酸置換（Ｌｅｕ２０１→Ｃｙｓ）を含む突然変異ニトリラーゼ（配列番号３０）の推定アミノ酸配列である。
【００５３】
配列番号３２は、残基位置２０１で単一アミノ酸置換をもたらすコドン変化（Ｌ２０１Ｔ；Ｌｅｕ→Ｔｈｒ）を含むＡ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ突然変異のヌクレオチド配列である。
【００５４】
配列番号３３は、Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼの残基位置２０１で単一アミノ酸置換（Ｌｅｕ２０１→Ｔｈｒ）を含む突然変異ニトリラーゼ（配列番号３２）の推定アミノ酸配列である。
【００５５】
配列番号３４は、残基位置２０１で単一アミノ酸置換をもたらすコドン変化（Ｌ２０１Ｇ；Ｌｅｕ→Ｇｌｙ）を含むＡ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ突然変異のヌクレオチド配列である。
【００５６】
配列番号３５は、Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼの残基位置２０１で単一アミノ酸置換（Ｌｅｕ２０１→Ｇｌｙ）を含む突然変異ニトリラーゼ（配列番号３４）の推定アミノ酸配列である。
【００５７】
配列番号３６は、残基位置２０１で単一アミノ酸置換をもたらすコドン変化（Ｌ２０１Ｈ；Ｌｅｕ→Ｈｉｓ）を含むＡ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ突然変異のヌクレオチド配列である。
【００５８】
配列番号３７は、Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼの残基位置２０１で単一アミノ酸置換（Ｌｅｕ２０１→Ｈｉｓ）を含む突然変異ニトリラーゼ（配列番号３６）の推定アミノ酸配列である。
【００５９】
配列番号３８は、残基位置２０１で単一アミノ酸置換をもたらすコドン変化（Ｌ２０１Ｋ；Ｌｅｕ→Ｌｙｓ）を含むＡ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ突然変異のヌクレオチド配列である。
【００６０】
配列番号３９は、Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼの残基位置２０１で単一アミノ酸置換（Ｌｅｕ２０１→Ｌｙｓ）を含む突然変異ニトリラーゼ（配列番号３８）の推定アミノ酸配列である。
【００６１】
配列番号４０は、残基位置２０１で単一アミノ酸置換をもたらすコドン変化（Ｌ２０１Ｎ；Ｌｅｕ→Ａｓｎ）を含むＡ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ突然変異のヌクレオチド配列である。
【００６２】
配列番号４１は、Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼの残基位置２０１で単一アミノ酸置換（Ｌｅｕ２０１→Ａｓｎ）を含む突然変異ニトリラーゼ（配列番号４０）の推定アミノ酸配列である。
【００６３】
配列番号４２は、残基位置２０１で単一アミノ酸置換をもたらすコドン変化（Ｌ２０１Ｓ；Ｌｅｕ→Ｓｅｒ）を含むＡ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ突然変異のヌクレオチド配列である。
【００６４】
配列番号４３は、Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼの残基位置２０１で単一アミノ酸置換（Ｌｅｕ２０１→Ｓｅｒ）を含む突然変異ニトリラーゼ（配列番号４２）の推定アミノ酸配列である。
【００６５】
配列番号４４は、残基位置１６８で単一アミノ酸置換をもたらすコドン変化（Ｆ１６８Ｋ；Ｐｈｅ→Ｌｙｓ）を含むＡ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ突然変異のヌクレオチド配列である。
【００６６】
配列番号４５は、Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼの残基位置１６８で単一アミノ酸置換（Ｐｈｅ１６８→Ｌｙｓ）を含む突然変異ニトリラーゼ（配列番号４４）の推定アミノ酸配列である。
【００６７】
配列番号４６は、残基位置１６８で単一アミノ酸置換をもたらすコドン変化（Ｆ１６８Ｍ；Ｐｈｅ→Ｍｅｔ）を含むＡ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ突然変異のヌクレオチド配列である。
【００６８】
配列番号４７は、Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼの残基位置１６８で単一アミノ酸置換（Ｐｈｅ１６８→Ｍｅｔ）を含む突然変異ニトリラーゼ（配列番号４６）の推定アミノ酸配列である。
【００６９】
配列番号４８は、残基位置１６８で単一アミノ酸置換をもたらすコドン変化（Ｆ１６８Ｔ；Ｐｈｅ→Ｔｈｒ）を含むＡ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ突然変異のヌクレオチド配列である。
【００７０】
配列番号４９は、Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼの残基位置１６８で単一アミノ酸置換（Ｐｈｅ１６８→Ｔｈｒ）を含む突然変異ニトリラーゼ（配列番号４８）の推定アミノ酸配列である。
【００７１】
配列番号５０は、残基位置１６８で単一アミノ酸置換をもたらすコドン変化（Ｆ１６８Ｖ；Ｐｈｅ→Ｖａｌ）を含むＡ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ突然変異のヌクレオチド配列である。
【００７２】
配列番号５１は、Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼの残基位置１６８で単一アミノ酸置換（Ｐｈｅ１６８→Ｖａｌ）を含む突然変異ニトリラーゼ（配列番号５０）の推定アミノ酸配列である。
【００７３】
配列番号５２は、残基位置１６８で単一アミノ酸置換をもたらすコドン変化（Ｔ２１０Ａ；Ｔｈｒ→Ａｌａ）を含むＡ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ突然変異のヌクレオチド配列である。
【００７４】
配列番号５３は、Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼの残基位置２１０で単一アミノ酸置換（Ｔｈｒ２１０→Ａｌａ）を含む突然変異ニトリラーゼ（配列番号５２）の推定アミノ酸配列である。
【００７５】
配列番号５４は、残基位置１６８で単一アミノ酸置換をもたらすコドン変化（Ｔ２１０Ｃ；Ｔｈｒ→Ｃｙｓ）を含むＡ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ突然変異のヌクレオチド配列である。
【００７６】
配列番号５５は、Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼの残基位置２１０で単一アミノ酸置換（Ｔｈｒ２１０→Ｃｙｓ）を含む突然変異ニトリラーゼ（配列番号５４）の推定アミノ酸配列である。
【００７７】
配列番号５６は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＳＳ１００１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７７）で発現したＡ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼのヌクレオチド配列である。
【００７８】
配列番号５７は、大腸菌ＳＳ１００１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７７）で発現した突然変異Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００７９】
（生物寄託）
以下の生物寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の下に為されている：
【表１】
0005604303.tif 000004
【００８０】
本明細書で使用される場合、「ＡＴＣＣ」は、ＡＴＣＣ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０２２０９，ＵＳＡにあるアＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ国際寄託当局をいう。「国際寄託の名称」はＡＴＣＣに寄託した培養物に対するアクセッション番号である。
【００８１】
リストされた寄託物は、表示された国際寄託機関において少なくとも３０年間保管され、そしてそれを開示する特許の付与の際に公衆に利用可能とされる。寄託物の利用可能性に、政府の行為によって付与された特許権の特例（derogation）において主題発明を実施するための許諾が構成要素とされることはない。
【００８２】
発明の詳細な説明
適した水性反応条件下でグリコロニトリルをグリコール酸に変換する場合、ニトリラーゼ活性を有する酵素触媒の比活性を安定化および／または増大させるための方法が提供され、ここで反応条件は有効量の少なくとも１つのアミン保護剤を含む。
【００８３】
（定義）
本開示において、多数の用語および略語が使用される。他に特に規定されない限り、以下の定義が適用される。
【００８４】
本明細書中で使用される場合、用語「含む」とは、特許請求の範囲において言及されるような規定された特徴、整数、ステップ、または成分の存在を意味するが、１つまたはそれ以上の他の特徴、整数、ステップ、成分、またはそれらの群の存在または付加を排除することはない。
【００８５】
本明細書中で使用される場合、利用される発明の構成要素または反応物の量を変える、用語「約」とは、例えば現実に濃縮物を作成するためまたは溶液使用のために用いた典型的な測定および液体取扱手順を通して；これらの手順におけるふとした誤りを通して；その組成物を作成するか、またはその方法を実行するために利用される構成要素の製造、供給源、または純度の差；などを通して、生じ得る数量の変化をいう。
【００８６】
用語「約」とはまた、特定の最初の混合から生ずる組成についての異なる平衡条件に起因して異なる量をも包含する。用語「約」により変えられているかどうかに関係なく、特許請求の範囲は、量の均等物を含む。１つの実施形態において、用語「約」とは、報告された数値の１０％以内、好ましくは、報告された数値の５％以内を意味する。
【００８７】
本明細書中で使用される場合、用語「アミン保護剤」、「外から加えられたアミン保護剤」、および「保護基」は、天然で生産されず、単離されず、または天然のニトリラーゼ触媒の一部ではない反応混合物中に含まれる化合物を言うために交換可能に用いられ、ここで、アミン保護剤は、有効量の少なくとも１つの第一級アミン基（Ｒ−ＮＨ2）および／または第二級アミン基（Ｒ−ＮＨ−Ｒ2）（式中、ＲおよびＲ1は同一か、または異なり得、そしてここでＲまたはＲ2のどちらもカルボニル基でない（すなわち、第一級または第二級アミン基は、アミド基の一部でない））を含む。好ましい実施形態おいて、アミン保護剤は、有効数の第一級アミン基を含む。１つの実施形態において、アミン保護剤は、ポリアミンポリマーならびにアミン官能化支持材料およびアミン官能化ポリマーを含むアミン官能化材料からなる群から選択される。
【００８８】
本明細書中で使用される場合、用語「有効量のアミン保護剤」または「有効量の少なくとも１つのアミン保護剤」は、グリコロニトリルをグリコール酸（またはそれらのアンモニウム塩）に変換する場合、ニトリラーゼ触媒安定性、比活性、および／または触媒生産性を改善するアミン保護剤の量をいう。１つの実施形態において、「有効量のアミン保護剤」とは、同一の反応条件化、アミン保護剤の非存在下での同じ触媒の比活性と比較した場合、触媒の比活性の実測の増大をもたらす反応混合物中に存在するアミン保護剤の量をいう。グリコロニトリルの水溶液は、典型的に、グリコロニトリルの合成の間に生成したか、またはグリコロニトリル解離の結果として生成される遊離ホルムアルデヒドおよびホルムアルデヒド−誘導性不純物を含むことが公知である。アミン保護剤は、ホルムアルデヒドまたはホルムアルデヒド−誘導性不純物と反応し得る「有効量の遊離第一級および／または第二級アミン基」を有することが理解される。ただし、アミン保護剤は、ニトリラーゼ触媒により天然で生産されるか、またはニトリラーゼ触媒中に天然で存在する化合物（例えば、全細胞触媒または全細胞抽出物内に見出されるものにより生産される、またはそれらの中で生産される天然の化合物）を含まない。
【００８９】
本明細書中で使用される場合、用語「アミン官能化」または「アミン官能化材料」とは、１つまたはそれ以上の第一級および／または第二級アミン基を有するように化学的に修飾されている化合物または材料をいう。１つの実施形態において、アミン官能化材料は、アミン官能化支持材料およびアミン官能化ポリマーからなる群から選択される。１つまたはそれ以上のアミン基を含むように化合物を化学的に官能化するための手段は、当該分野でよく知られている（例えば、Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ，Ｇ．Ｆ．，Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １．１９９７．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，およびＷｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ，１９９１．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬを参照のこと）。
【００９０】
本明細書中で使用される場合、「アミン官能化支持材料」としては、制御ポアガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）およびガラスビーズ（例えば、アミノプロピルシラン化（ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌａｔｅｄ）ガラスビーズ）、シリカ、マグネタイト、およびアルミナのような無機材料、さらに弱塩基性アニオン交換樹脂にしばしば使用される支持材料さらにω−アミノヘキシルアガロース、ω−アミノドデシルアガロース、およびω−アミノエチルアガロースが挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、アミン官能化材料としては、ポリエチレンイミン（すなわち、「ポリエチレンイミン−官能化材料」）を含む。
【００９１】
本明細書中で使用される場合、用語「アミン官能化ポリマー」とは、１つまたはそれ以上の第一級および／または第二級アミン基を含むように修飾されているポリマーをいう。典型的に、非−官能化ポリマーは、通常有効数の遊離アミン基を含まない。
【００９２】
本明細書中で使用される場合、用語「遊離アミン基」とは、ホルムアルデヒドと反応し得るアミン保護剤上の第一級アミン基（Ｒ−ＮＨ2）および／または第二級アミン基（Ｒ−ＮＨ−Ｒ2）をいう。
【００９３】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリアミンポリマー」とは、１つまたはそれ以上の遊離アミン基を含むポリマーをいう。ポリアミンポリマーは、少なくとも１つの第一級および／または少なくとも１つの第二級アミン基を含む少なくとも１つのモノマーから製造される。１つの実施形態において、ポリアミンポリマーは、少なくとも１つの遊離アミン基を含むコポリマーを含む。ポリアミンポリマーは、オリゴマー（典型的に、１，０００ダルトン未満）からより大きい分子量のポリマー、１，０００ダルトン〜１０，０００，０００ダルトン、好ましくは１，０００ダルトン〜２，０００，０００ダルトン、より好ましくは１，０００ダルトン〜１，０００，０００ダルトン、およびより好ましくは、１０，０００ダルトン〜１，０００，０００ダルトンのサイズ範囲であり得る。
【００９４】
本明細書中で使用される場合、用語「グリコロニトリル」とは「ＧＬＮ」と略され、そしてヒドロキシアセトニトリル、２−ヒドロキシアセトニトリル、ヒドロキシメチルニトリル、およびＣＡＳ登録番号１０７−１６−４の全ての他の同義語と同義である。
【００９５】
本明細書中で使用される場合、用語「グリコール酸」とは「ＧＬＡ」と略され、そしてヒドロキシ酢酸、ヒドロキシエタン酸、およびＣＡＳ登録番号７９−１４−１の全ての他の同義語と同義である。本方法により生産されるグリコール酸は、プロトン化したカルボン酸および／または対応するアンモニウム塩の形態であり得る。
【００９６】
本明細書中で使用される場合、用語「グリコール酸アンモニウム」とは、「ＮＨ4ＧＬＡ」と略される。
【００９７】
本明細書中で使用される場合、用語「グリコールアミド」とは、アンモニアとグリコール酸との反応から誘導されるアミドであり、そしてＣＡＳ登録番号５９８−４２−５を有する化合物の全ての他の同義語をいう。
【００９８】
本明細書中で使用される場合、用語「グリコリド」とは、ＣＡＳ登録番号５０２−９７−６の化合物をいう。
【００９９】
本明細書中で使用される場合、用語「ホルムアルデヒド」とは「ＦＡ」と略され、そしてギ酸アルデヒド、メチルアルデヒド、オキソメタン、およびＣＡＳ登録番号５０−００−０の全ての他の同義語と同義である。市販のホルムアルデヒドは、典型的に、モノマーホルムアルデヒド（「遊離ホルムアルデヒド」）およびいくらかのメタノール（典型的に、約１ｗｔ％〜約１５ｗｔ％）を伴なうホルムアルデヒドの種々のオリゴマーの混合物を含む。
【０１００】
本明細書中で使用される場合、用語「シアン化水素」とは、青酸、シアン化水素酸、およびＣＡＳ登録番号２００−８２１−６の全ての他の同義語と同義である。
【０１０１】
本明細書中で使用される場合、用語「回収（すること）」とは、本方法により形成される生成物を単離、精製すること、または移すことを意味する。当該分野でよく知られている反応混合物から生成物を単離し、そして精製する方法としては、選択的沈殿、結晶化、濾過、反応性溶媒抽出、イオン交換、電気透析、重合、蒸留、熱分解、アルコール分解、カラムクロマトグラフィー、およびそれらの組合せが挙げられ得るが、これらに限定されない。１つの実施形態において、用語「回収（すること）」とはまた、生成混合物（典型的に、酵素触媒を濾去した後）を別の反応に移し、１つまたはそれ以上のさらなる生成物を作出することを含み得る。好ましい実施形態において、イオン交換を使用してグリコール酸を回収する。
【０１０２】
本明細書中で使用される場合、用語「酵素触媒」、「ニトリラーゼ触媒」または「微生物細胞触媒」とは、グリコロニトリルをグリコール酸およびアンモニアに変換するためのニトリラーゼ活性により特徴付けられる触媒（すなわち、ニトリラーゼ活性を有する少なくとも１つのポリペプチドを含む）をいう。ニトリラーゼ酵素は、中間体として対応するアミドを形成することなく、ニトリル（好ましくは、脂肪族ニトリル）を対応するカルボン酸に直接変換する（式１を参照のこと）。ニトリラーゼは、本明細書中で「触媒シグネチャー配列」または「シグネチャー配列」と呼ばれるシグネチャードメインを含む、当該分野で公知のいくつかの保存されたシグネチャードメインを共有する。この領域は、必須システイン残基（例えば、配列番号４のＣｙｓ164）を含む。このようにして、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドは、触媒ドメインシグネチャー配列（配列番号１）の存在によって同定され得る。好ましい実施形態において、シグネチャー配列は、配列番号２である。酵素触媒は、全微生物細胞、透過性微生物細胞、微生物細胞抽出物の１つまたはそれ以上の細胞成分、部分的精製酵素、または精製酵素の形態であり得る。酵素触媒は、遊離（非固定化（ｕｎｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ））であり得るか、または可溶性または不溶性支持材料中または上に固定化され得る。本明細書中で使用される場合、用語「リサイクル酵素触媒」とは、バッチ反応で酵素触媒として再利用される酵素触媒をいう。好ましい実施形態において、酵素触媒は、ニトリラーゼ活性を有する少なくとも１つの酵素を組換え発現する形質転換微生物宿主細胞であり；ここで、該酵素は、配列番号１または配列番号２の触媒シグネチャーモチーフを含む。
【０１０３】
本明細書中で使用される場合、用語「アシドボラックス  ファシリス」および「Ａ．ファシリス」とは、交換可能に用いられ、そしてアクセッション番号５５７４６を有するＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（国際寄託機関）に寄託されたアシドボラックス  ファシリス７２Ｗをいう（「ＡＴＣＣ  ５５７４６」）。グリコロニトリルをグリコール酸に変換する場合、改善されたニトリラーゼ活性により特徴付けられるＡ．ファシリス７２Ｗ由来の突然変異ニトリラーゼが、これまで報告されている（共有の米国特許第７，１９８，９２７を参照のこと）。これらのＡ．ファシリス７２Ｗ−由来突然変異ニトリラーゼの例は、配列番号：２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、および５５により与えられている。
【０１０４】
本明細書中で使用される場合、用語「大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）」および「大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）」とは、交換可能に用いられる。組換え発現に適した大腸菌のいくつかの株は、本明細書中に記載され、これらとしては、国際寄託番号ＡＴＣＣ  ４７０７６を有する大腸菌  ＭＧ１６５５、国際寄託番号ＡＴＣＣ  ５３９１１を有する大腸菌  ＦＭ５、国際寄託番号ＡＴＣＣ  ２７３２５を有する大腸菌  Ｗ３１１０、国際寄託番号ＡＴＣＣ  ３５６９５を有する大腸菌  ＭＣ４１００、および国際寄託番号ＡＴＣＣ  １２４３５を有する大腸菌  Ｗ１４８５が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、適した大腸菌株としては、大腸菌  ＦＭ５（ＡＴＣＣ  ５３９１１）および大腸菌  ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ  ４７０７６）が挙げられる。
【０１０５】
本明細書中で使用される場合、用語「大腸菌  ＳＳ１００１」または「ＳＳ１００１」とは、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１１７７を有するアシドボラクス  ファシリス７２Ｗニトリラーゼを発現する形質転換大腸菌株をいう（米国特許第６，８７０，０３８号を参照のこと；参照によりその全体が本明細書に加入される）。組換え発現大腸菌  ＳＳ１００１ニトリラーゼ（配列番号５７）は、野生型７２Ｗニトリラーゼ配列（配列番号４）と比較して２つの小さな配列変化を含む。開始コドンは、組換え発現を促進するためにＧＴＧからＡＴＧに変えられ、そしてアーチファクトがクローニング中に導入され、結果としてＣ末端近くに単一アミノ酸変化をもたらした（Ｐｒｏ３６７［ＣＣＡ］→Ｓｅｒ［ＴＣＡ］）。
【０１０６】
本明細書中で使用される場合、用語「適した水性グリコロニトリル反応混合物」、「適した水性反応混合物」、および「適した反応条件」とは、本方法を実施する材料（少なくとも１つのアミン保護剤を含む）および反応条件をいう。適した水性反応混合物の成分は本明細書中に与えられ、そして当業者はこの方法に適した成分変動の範囲を正しく認識する。
【０１０７】
本明細書中で使用される場合、用語「水性グリコール酸アンモニウム溶液」、「グリコール酸アンモニウムを含む水溶液」、および「グリコール酸アンモニウムの水溶液」とは、典型的な酵素反応条件下（すなわち、約６〜約８のｐＨ範囲）、グリコロニトリルの酵素加水分解により生産されるグリコール酸アンモニウムを含む水溶液を記載するために使用される。グリコール酸アンモニウムの水溶液は、少なくとも約０．１質量パーセント（ｗｔ％）〜約９９ｗｔ％グリコール酸アンモニウムの濃度でグリコール酸アンモニウムを含む。別の実施形態において、グリコール酸アンモニウムの水溶液は、少なくとも約１０ｗｔ％〜約７５ｗｔ％グリコール酸アンモニウムを含む。さらなる実施形態において、グリコール酸アンモニウムの水溶液は、少なくとも約２０ｗｔ％〜約５０ｗｔ％グリコール酸アンモニウムを含む。グリコール酸アンモニウムの水溶液のｐＨは、約２〜約１２、好ましくは、５〜約１０、より好ましくは、６〜約８であり得る。ｐＨは、グリコール酸アンモニウム水溶液からグリコール酸（酸または塩の形態で）の回収に関する工程を開始する前に必要に応じて調整され得る。
【０１０８】
本明細書中で使用される場合、用語「触媒生産性」および「酵素触媒生産性」とは、触媒１グラムあたりで生産される生成物の総量をいう。本方法において、触媒はニトリラーゼ酵素（ＥＣ３．５．５．７）を含み、そして形成される生産物はグリコール酸および／またはグリコール酸アンモニウムである（反応のｐＨに依存）。一般に、生産されるグリコール酸が主にグリコール酸の対応する塩の形態（すなわち、グリコール酸アンモニウム）となるように、本方法は本質的にｐＨが中性である条件下で行なわれる。一般に、触媒リサイクルと伴なうバッチ反応において、触媒活性は各リサイクル反応とともに減少する（酵素不活化）。実施例６に示されるように、そして１つの実施形態において、触媒の比活性は、多リサイクル反応にわたって増大し、触媒生産性の増大をもたらす。
【０１０９】
用語「触媒比活性」、「比活性」、および「ニトリラーゼ比活性」とは、グリコロニトリルをグリコール酸（または対応するグリコール酸アンモニウム）に変換する場合、タンパク質の単位質量（例えば、ミリグラム）、乾燥細胞質量、またはビーズ質量（固定化触媒）あたりの酵素活性をいう。ニトリラーゼ活性の比較は、乾燥細胞質量またはビーズ質量に比例して測定された。同じ触媒および発現系を使用して、アミン保護剤を含むか、または含まない（すなわち、対照）反応間において比活性を比較したので、ニトリラーゼ比活性の比較および報告されている改善／増大は、乾燥細胞質量（ｄｃｗ）またはビーズ質量（ｂｗ）に対して測定された。本明細書中で使用される場合、用語「改善された触媒比活性」、および「改善された比活性」とは、対応する対照の比活性に対して観察される比活性の増大をいう。比活性の改善は、アミン保護剤の含有または省略のみが異なる同一反応条件下測定される。１つの実施形態において、比活性の改善は、多リサイクル反応にわたって測定される。別の実施形態において、本方法を使用する触媒比活性の改善または増大は、少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、なおより好ましくは少なくとも２５％増大する。
【０１１０】
本明細書中で使用される場合、用語「酵素活性の１単位」または「ニトリラーゼ活性の１単位」または「Ｕ」とは、特定温度（例えば、２５℃）で毎分１μｍｏｌのグリコール酸生成物の生産に必要とされる酵素活性の量（ＧＬＡ  Ｕ／ｇ乾燥細胞質量またはビーズ質量）と定義される。
【０１１１】
本明細書中で使用される場合、用語「組換え生物」、「形質転換宿主細胞」、「宿主細胞」、「形質転換体」、「トランスジェニック生物」、および「形質転換微生物宿主」とは、異種または外来ＤＮＡで形質転換されている宿主生物をいう。本発明の組換え生物は、活性ニトリラーゼ酵素をコードする外来コード配列または遺伝子を発現する。「形質転換」は、ＤＮＡフラグメントの宿主生物への導入をいう。トランスファーＤＮＡフラグメントは、宿主生物中の染色体にまたは染色体外に（ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｌｙ）に（すなわち、ベクターを介して）組込まれ得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換カセット」とは、通常、プラスミドの一部として宿主細胞中に挿入するために都合よく配置された一連の遺伝要素を含むＤＮＡの特異的フラグメントをいう。
【０１１２】
本明細書中で使用される場合、用語「発現カセット」とは、宿主における遺伝子発現の増強をも可能にする、通常、プラスミドの一部として宿主細胞中に挿入するために都合よく配置された一連の遺伝要素を含むＤＮＡの特異的フラグメントをいう。
【０１１３】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸フラグメント」および「核酸分子」とは、コード配列に先行する（５’、上流）またはこれに続く（３’、下流）全遺伝子、コード配列、および／または調節配列をコードし得るＤＮＡ分子をいう。１つの局面において、本核酸分子は、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコード化する。
【０１１４】
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」とは、特定のタンパク質を発現する核酸分子をいう。本明細書中で使用される場合、これはコード配列に先行する（５’非コード配列）およびこれに続く（３’非コード配列）調節配列を含んでも含まなくてもよい。「キメラ遺伝子」とは、天然には一緒に見出されない調節およびコード配列を含む天然遺伝子ではない任意の遺伝子をいう。従って、キメラ遺伝子は、異なる起源由来である調節配列およびコード配列、または同一の起源由来であるが、天然に見出されるものと異なる様式で配置された調節配列およびコード配列を含み得る。「内在性遺伝子」とは、生物のゲノム中のその天然の位置における天然遺伝子をいう。「外来」遺伝子とは、宿主生物には通常見出されないが、遺伝子導入により宿主生物中に導入される遺伝子をいう。外来遺伝子は、非天然生物、またはキメラ遺伝子中に挿入される天然遺伝子を含み得る。「導入遺伝子」は、形質転換手順によりゲノム中に導入されている遺伝子である。
【０１１５】
本明細書中で使用される場合、用語「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をいう。本明細書中で使用される場合、「適した調節配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、範囲内、または下流（３’非コード配列）に位置し、そして関連コード配列の転写、ＲＮＡプロセッシングもしくは安定性、または翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列をいう。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位、およびステムループ構造を含み得る。
【０１１６】
「プロモーター」とは、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御し得るＤＮＡ配列をいう。一般に、コード配列はプロモーター配列に対して３’に位置している。プロモーターは、全体として、天然遺伝子由来であるか、または天然に見出される種々のプロモーター由来の種々の要素からなるか、または合成ＤＮＡ断片でさえ含み得る。ほとんどの細胞型において、ほとんどの時間にまたはほとんどの環境条件下で遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に、「構成的プロモーター」と呼ばれる。特定の化合物または環境条件の存在下のみで遺伝子に発現させるプロモーターは、一般に、「誘導的プロモーター」と呼ばれる。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は完全に定義されていないので、異なる長さのＤＮＡフラグメントが同一のプロモーター活性を有し得る。
【０１１７】
本明細書中で使用される場合、用語「機能可能に連結した」とは、１つの配列の機能が他のものによって影響されるような単一核酸分子上の核酸配列の結合（association）をいう。例えば、プロモーターは、そのコード配列の発現に影響を及ぼし得る（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある）場合、コード配列と機能可能に連結されている。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で調節配列に機能可能に連結され得る。
【０１１８】
本明細書中で使用される場合、用語「３’非コード配列」とは、コード配列の下流に位置したＤＮＡ配列をいい、そしてポリアデニル化認識配列（通常、真核生物に限定される）およびｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼし得る調節シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナル（通常、真核生物に限定される）は、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラクト（ｔｒａｃｔ）の付加に影響を及ぼすことにより特徴付けられる。
【０１１９】
当業者は、所定のアミノ酸を特定するヌクレオチドコドンの使用における、特定の宿主細胞により示される「コドン−バイアス」を十分理解している。従って、宿主細胞において改善された発現のために遺伝子を合成する場合、そのコドンの使用が宿主細胞の好ましいコドンバイアスを反映するように遺伝子を設計することが望ましい。配列情報が入手可能である宿主細胞由来の遺伝子の調査により、そのコドンバイアスが決定され得る。コドン最適化が当該分野でよく知られており、そして種々の系に記載されており、この系としては、酵母（Ｏｕｔｃｈｋｏｕｒｏｖ  ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ，２４（１）：１８−２４（２００２））および大腸菌（Ｆｅｎｇ  ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９（５０）：１５３９９−１５４０９（２０００））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２０】
ニトリラーゼ触媒
全てのニトリラーゼ（ＥＣ  ３．５．５．７）が保存された触媒トライアド（Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、およびＣｙｓ）を共有する（Ｃｈａｕｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６１：１１８−１２２（２００３）；Ｐａｃｅ，Ｈ．ａｎｄ  Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｃ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２（１）：レビュー０００１．１−０００１．９（２００１））。公知の全てのニトリラーゼは、酵素活性部位に求核システインを有し（Ｃｏｗａｎ  ｅｔａｌ．，Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ，２：２０７２１６（１９９８）；Ｐａｃｅ，Ｈ．ａｎｄ  Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｃ．，前出；およびＣｈａｕｈａｎ  ｅｔａｌ．，前出）、そして全てがチオール試薬により不活化されやすい（１．０ｍＭ濃度の塩化銅、硝酸銀、酢酸第二水銀、または塩化鉄の各々が、Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ酵素活性を主に減少させる）。システイン残基はまた、スルフィン酸に不可逆的に酸化され、酵素活性の減少をもたらし得る。種々の不活化機構に対するニトリラーゼ酵素の感受性にかかわらず、多数のリサイクル反応後、多くのそれらのニトリラーゼ活性を保持し得る固定化Ａ．ファシリス７２Ｗ細胞は頑健である（米国特許第６，８７０，０３８号；同第７，１４８，０５１号；同第７，１９８，９２７号；およびＣｈａｕｈａｎ  ｅｔａｌ．，前出）。Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ由来のニトリラーゼ触媒はまた、α−ヒドロキシニトリル（すなわち、グリコロニトリル）のα−ヒドロキシカルボン酸（すなわち、グリコール酸）への変換を触媒することが示唆されている（米国特許第６，３８３，７８６号；同第６，４１６，９８０号；および同第７，１９８，９２７号を参照のこと）。
【０１２１】
他の細菌性ニトリラーゼに対してのＡ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼの配列比較が報告されている（米国特許第６，８７０，０３８号；Ｃｈａｕｈａｎ  ｅｔａｌ．，前出）。７２Ｗニトリラーゼは、アミの末端近くに１６アミノ酸領域（配列番号４のアミノ酸残基４０〜５５）および必須システイン残基を含む１２アミノ酸触媒領域（配列番号４のアミノ酸残基１６０〜１７１）を含むいくつかの保存的シグネチャードメインを有する。保存されたグルタミン酸（配列番号４のＧｌｕ48）およびリシン残基（配列番号４のＬｙｓ130）と共に、この必須システイン残基（配列番号４のＣｙｓ164）は、全てのニトリラーゼにおいて見出される触媒トライアドモチーフを形成する（Ｐａｃｅ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｃ．，前出）。
【０１２２】
各々の触媒トライアド残基の周囲の領域、特に触媒システイン残基の周囲の領域は、高度に保存される。必須触媒システイン残基は、「触媒シグネチャーモチーフ」または「シグネチャーモチーフ」と呼ばれる高度に保存された領域に位置する。このように、本方法は、式１により定義される触媒シグネチャーモチーフを含む任意のニトリラーゼの酵素活性を保護するのに有用である（太字は、正確な保存アミノ酸残基を示し、イタリック体の残基は、最小変動（ｍｉｎｉｍａｌ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）［すなわち、３またはそれより少ないアミノ酸残基の最小変動］を示すものであり、触媒システイン残基には下線を引く）：
式１（配列番号１）
【化４】
0005604303.tif 000005
ここで、
Ｘａａ1＝ＡｌａまたはＧｌｙ；
Ｘａａ2＝Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＡｌａ；
Ｘａａ3＝Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｃｙｓ、Ｖａｌ、またはＧｌｎ；
Ｘａａ4＝ＨｉｓまたはＡｓｎ；
Ｘａａ5＝Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、またはＡｒｇ；
Ｘａａ6＝Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、またはＳｅｒ；
Ｘａａ7  ＝ＰｒｏまたはＴｈｒ；および
Ｘａａ8＝ＬｅｕまたはＶａｌ。
【０１２３】
好ましい実施形態において、式１のニトリラーゼシグネチャーモチーフは、Ｘａａ1＝ＡｌａまたはＧｌｙ；Ｘａａ2＝Ｌｅｕ；Ｘａａ3＝Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｃｙｓ、Ｖａｌ、またはＧｌｎ；Ｘａａ4＝Ｈｉｓ；Ｘａａ5＝Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、ＴｈｒまたはＡｒｇ；Ｘａａ6＝Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、またはＭｅｔ；Ｘａａ7＝Ｐｒｏ；およびＸａａ8＝Ｌｅｕであり；以下により示される触媒シグネチャーモチーフをもたらす：
【化５】
0005604303.tif 000006
【０１２４】
対応する触媒シグネチャーモチーフ配列の配列および位置を含むニトリラーゼの例が、表１に提供される。
【表２】
0005604303.tif 000007
【０１２５】
【表３】
0005604303.tif 000008
【０１２６】
１つの実施形態において、ニトリラーゼ触媒は、アシドボラクス属、ロドコッカス属、ノカルジ属、バシラス属、およびアルカリゲネス属からなる群から選択される属から単離されるニトリラーゼ活性を有するポリペプチドを含む。１つの実施形態において、ニトリラーゼ触媒は、アシドボラクス属およびロドコッカス属からなる群から選択される属から単離されるニトリラーゼ活性を有するポリペプチドを含む。
【０１２７】
別の実施形態において、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドは、アシドボラクス  ファシリス７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）またはアシドボラクス  ファシリス７２Ｗニトリラーゼ（配列番号４）または配列番号５１により示されるＡ．ファシリス７２Ｗ由来酵素と実質的に類似するポリペプチド（ニトリラーゼ活性を有する）由来である。
【０１２８】
１つの実施形態において、ニトリラーゼ触媒は、ニトリラーゼ活性を有する少なくとも１つのポリペプチドを発現するために形質転換された微生物宿主細胞である。１つの実施形態において、形質転換宿主細胞は、コマモナス・エスピー（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、コリネバクテリア・エスピー（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、ブレビバクテリウム・エスピー（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、アゾトバクター・エスピー（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、シロトバクター・エスピー（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、エンテロバクター・エスピー（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、クロストリジウム・エスピー（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）、クレブシエラ・エスピー（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．）、サルモネラ・エスピー（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．）、
ラクトバシラス・エスピー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、アスペルギルス・エスピー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、サッカロミセス・エスピー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ヤロウイア・エスピー（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．）、ザイゴサッカロミセス・エスピー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ピキア・エスピー（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、クルイベロマイセス・エスピー（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、カンジダ・エスピー（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ．）、ハンゼヌラ・エスピー（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐ．）、ドナリエラ・エスピー（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓｐ．）、デバリオマイセス・エスピー（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ムコール・エスピー（Ｍｕｃｏｒ  ｓｐ．）、トルロプシス・エスピー（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）、メチロバクテリア・エスピー（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｐ．）、バシラス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、エシュリキア・エスピー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、リゾビウム・エスピー（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）、およびストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）からなる群から選択される。好ましい実施形態において、微生物宿主細胞は、バシラス・エスピー、シュードモナス・エスピー、およびエシュリキア・エスピーからなる群から選択される。好ましい実施形態において、触媒は、ニトリラーゼ活性を有する１つまたはそれ以上のポリペプチドを組換え的に発現する大腸菌宿主細胞である。
【０１２９】
別の実施形態において、ニトリラーゼ触媒は、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドを含み、ここで前記ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号５１に対して少なくとも６０％の同一性、好ましくは、配列番号５１に対して少なくとも７０％の同一性、なおより好ましくは、配列番号５１に対して少なくとも８０％の同一性、さらになおより好ましくは、配列番号５１に対して少なくとも９０％の同一性、そして最も好ましくは、配列番号５１に対して少なくとも９５％の同一性を有する。
【０１３０】
Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ由来の触媒を含む種々の起源由来のニトリラーゼ活性を有する種々の触媒の裏付けのある実施例が、本明細書で開示される。アシドボラクス  ファシリス７２Ｗニトリラーゼ酵素由来の種々の突然変異が当該分野で報告されている（米国特許第７，１４８，０５１号および同第７，１９８，９２７号）。
【０１３１】
１つの実施形態において、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号：４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、および５７からなる群から選択される。別の実施形態において、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドは、４、２４、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、および５７からなる群から選択される。別の実施形態において、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドは、４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、および５７からなる群から選択される。別の実施形態において（ｎ  ａｎｏｔｈｅｒ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドは、４、２４、２５、および５１からなる群から選択される。別の実施形態において、ニトリラーゼ触媒は、配列番号５１のポリペプチドを含む。
【０１３２】
アミン保護剤
アミン保護剤は、ホルムアルデヒドと反応し得る少なくとも１つの第一級アミン基（Ｒ−ＮＨ2）および／または第二級アミン基（Ｒ−ＮＨ−Ｒ2）を含む水性反応混合物に外から加えられた任意の化合物（例えば、酵素触媒により天然に生産されないか、酵素触媒と共に天然に見出されないか、または酵素触媒から天然で単離されない）であり、ここでＲおよびＲ1は同一かまたは異なり得、そしてここで、ＲもＲ2ともカルボニル基でない（すなわち、アミド基でない）。また、当然ながら、本発明の酵素触媒がニトリル基を加水分解し、従ってアミン保護剤は、好ましくはニトリラーゼ触媒により加水分解され得るニトリル基を含まない。好ましい実施形態において、アミン保護剤は、少なくとも１つの第一級アミン基を含む反応混合物中の化合物または成分に外から加えられる。
【０１３３】
本発明の１つの実施形態において、有効量の少なくとも１つのアミン保護剤が、反応混合物に添加される。本明細書中で使用される場合、「有効量のアミン保護剤」は、グリコロニトリルをグリコール酸に酵素的に変換する場合、触媒特異的活性、安定性、または触媒生産性において、検出可能な改善をもたらすのに必要なアミン保護剤の量である。所望の効果を達成するために、水性反応混合物中のアミン保護剤の量を調節することは当業者の十分な範囲内に属する。１つの局面において、反応混合物に添加されるアミン保護剤の量は、反応混合物中に存在するホルムアルデヒドの量に関連して、モル過剰の遊離アミン基を含む。１つの局面において、反応混合物は、少なくとも０．０１ｐｐｍのホルムアルデヒドを含む。別の局面において、反応混合物中のアミン保護剤の量は、反応混合物中に存在する遊離ホルムアルデヒド（ＨＣＨＯ）の量に対して、０．００１：１．０〜１．０：０．００１、好ましくは少なくとも０．５：１．０の範囲のモル比の遊離アミン基（第一級、第二級、またはそれらの組み合わせ）を含む。
【０１３４】
１つの局面において、アミン保護剤は、以下：
ａ）式：
［Ｒ3］(1+X)−ＮＨ(2-X)
［式中、Ｘは０または１であり、そしてＲ3は、独立してＣ１〜Ｃ２０ヒドロカルビル基または置換ヒドロカルビル基であり、ここでＲ3は場合により、１つまたはそれ以上のエーテル結合を含む、ただし（ｉ）置換基はニトリラーゼ触媒と反応し得るシアノ基でないのが好ましく、そして（ｉｉ）Ｒ3はカルボニル基でない］の化合物、
ｂ）有効遊離アミン基数を含むポリアミンポリマー；および
ｃ）有効遊離アミン基数を含むアミン官能化材料；
（ここで、アミン保護剤は、酵素触媒により天然で生産されない）
からなる群から選択される。
【０１３５】
Ｒ3のヒドロカルビル基は、直鎖、分枝鎖、環式、多環式、または芳香族であり得る。本明細書中で使用される場合、用語「ヒドロカルビル」、「ヒドロカルビル基」、および「ヒドロカルビル部分」とは、一重、二重、または三重炭素−炭素結合により、および／またはエーテル結合により結合され、そして水素原子によって置換されている炭素原子の直鎖、分枝鎖、または環式配置を意味する。このようなヒドロカルビル基は、脂肪族および／または芳香族であり得る。ヒドロカルビル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、シクロプロピル、シクロブチル、ペンチル、シクロペンチル、メチルシクロペンチル、へキシル、シクロへキシル、ベンジル、およびフェニルが挙げられる。好ましい実施形態において、ヒドロカルビル部分は、一重炭素−炭素結合により、および／またはエーテル結合により結合され、そして水素原子によって置換されている炭素原子の直鎖、分枝鎖、または環式配置である。本明細書中で使用される場合、「置換ヒドロカルビル」とは、意図される使用または反応に対して不安定または不適当な基質、触媒、または生成物をもたらさない１つまたはそれ以上の置換基で置換されているか、またはそれらを含む基を意味する。一般に有用な置換基としては、エーテル、エステル、ハロ、アミノ（第一級、第二級および第三級アミン基を含む）、ヒドロキシ、ビニリデンまたは置換ビニリデン、シリルまたは置換シリル、ニトロ、ニトロソ、スルフィニル、スルホニル、スルホン酸アルカリ金属塩、ボラニル（ｂｏｒａｎｙｌ）または置換ボラニル、およびチオエーテルが挙げられる。
【０１３６】
１つの実施形態において、アミン保護剤は、有効遊離アミン基数を含むポリアミンポリマーである。別の実施形態において、ポリアミンポリマーとしては、有効遊離アミン基数を含むコポリマーが挙げられる。ポリアミンポリマーは、オリゴマー（典型的に、１，０００ダルトン未満）からより大きい分子量のポリマー、１，０００ダルトン〜１０，０００，０００ダルトン、好ましくは、１，０００ダルトン〜２，０００，０００ダルトン、より好ましくは、１，０００ダルトン〜１，０００，０００ダルトン、およびより好ましくは、１０，０００ダルトン〜１，０００，０００ダルトンのサイズ範囲であり得る。
【０１３７】
１つの実施形態において、ポリアミンポリマーは、２−アミノ−２−デオキシ−（１→４）−β−Ｄ−グルコピラナン（すなわち、キトサン）、２〜１２炭素原子のアルキレン部分を有するポリアルキレンアミンポリマー、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルアルコール／ポリビニルアミンコポリマー、Ｄ−ポリリシン、Ｌ−ポリリシン、Ｄ／Ｌ  ポリリシンの混合物、グルタルアルデヒドと架橋したポリエチレンイミン、およびそれらの混合物からなる群から選択される。好ましい実施形態において、ポリアミンポリマーは、ポリエチレンイミンポリマー（直鎖または分枝鎖）およびポリエチレンイミンを含むコポリマーである。別の好ましい実施形態において、ポリアミンポリマーは、グルタルアルデヒドと架橋したポリエチレンイミンである。さらに好ましい実施形態において、酵素触媒は、グルタルアルデヒドと架橋したポリエチレンイミンを含む粒子またはビーズ中に、または上に固定化されている。
【０１３８】
アミン保護剤は、水性反応混合物に可溶であっても、または不溶であってもよい。可溶性アミン保護剤は、当該分野でよく知られた任意の数の分離方法（例えば、イオン交換またはクロマトグラフィー技術）を使用して、生じた生成物混合物から分離され得る。可溶性アミン保護剤の化学的性質に依存して、生成混合物由来の１つまたはそれ以上の成分を選択的に沈殿させまたは吸着させるために反応後処理条件を調整することにより、当業者は、グリコール酸（またはグリコール酸アンモニウム）生成物からアミン保護剤を分離し得る。一定の適用にとっては、特に、高純度のグリコール酸および／またはグリコール酸アンモニウムを必要としない適用にとって、生成混合物から可溶性アミン保護剤を除去する必要がない。
【０１３９】
好ましい実施形態において、アミン保護剤は、水性反応混合物に実質的に不溶である。不溶性アミン保護剤の使用は、得られた水性生成混合物からの単純な分離／単離（すなわち、濾過、遠心分離など）を容易にする。別の好ましい実施形態において、アミン保護剤は、水性反応混合物に不溶であるポリアミンポリマーである。
【０１４０】
別の実施形態において、アミン保護剤は、不溶性アミン官能化材料であり、そしてこれらとしては、アミン官能化支持材料およびアミン官能化ポリマーが挙げられ得る。少なくとも１つの第一級アミン基を含むように不溶性材料を化学的に修飾する方法は、当該分野でよく知られている（例えば、Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ，Ｇ．Ｆ．，Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １．１９９７．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，およびＷｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ，１９９１．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬを参照のこと）。
【０１４１】
本方法に有用な有効遊離アミン基数を含む（または有効遊離アミン基数を含むように官能化されている）アミン官能化材料としては、１つまたはそれ以上のアミノ基を含むように化学的に官能化されている多糖（例えば、アミン官能性グリカン、アガロース、カラゲナン、アルギナート、デキストラン、およびセルロース）、メタクリレート、ポリウレタン、ポリエステル、ナイロン、アルミナ、シリカ、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、マグネタイト、および制御ポアガラスが挙げられ得るが、これらに限定されない。ポリアルキレンアミンポリマー（典型的に、２〜１２個の炭素原子のアルキレン部分を有する）およびポリアルキレンアミン官能化支持材料が使用され得、同様に、可溶性または不溶性ポリエチレンアミンポリマー、ポリエチレンアミン官能化支持材料、ポリエチレンイミン、ポリエチレンイミンポリマー（直鎖または分枝鎖）、グルタルアルデヒドと架橋したポリエチレンイミン、ポリエチレンイミンイオン交換樹脂、弱塩基性アニオン交換樹脂（例えば、ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ(  弱塩基性アニオン交換樹脂  ＩＲＡ−９５、ＩＲＡ−９６、ＩＲＡ−６７、およびＩＲＡ−９２（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡから入手可能である）、およびＤＩＡＩＯＮ(R)  ＷＡ２０もしくはＷＡ２１Ｊ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎから入手可能である）、ポリエチレンイミン−セルロース、ポリエチレンイミン−シリカ、ポリアリルアミン、ポリビニルアルコール／ポリビニルアミンコポリマー、ポリリシン（Ｄ、Ｌ、もしくはＤ／Ｌ混合物）、ω−アミノヘキシルアガロース、ω−アミノドデシルアガロース、ω−アミノエチルアガロース、アミノプロピルシラン化ガラスビーズ、およびそれらの組み合わせが使用され得る。好ましい実施形態において、アミン保護剤は、ニトリラーゼ触媒により加水分解され得るシアノ基を含まない。
【０１４２】
１つの実施形態において、セルロース、キチンおよび他の天然に存在する炭水化物のアミノアルキル−、アミノ（ヒドロキシアルキル）−、アミノアルキル−エーテル−、およびアミノ（ヒドロキシアルキル）−エーテル誘導体が、好ましくは：
Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）n−［炭水化物］（ここで、ｎ＝１〜１０、アルキル異性体を含む）、
Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）m−ＣＨＯＨ−（ＣＨ2）n−［炭水化物］（ここで、ｍ＝０〜１０およびｎ＝０〜１０）、
Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）n−Ｏ−［炭水化物］（ここで、ｎ＝１〜１０）、および
Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）m−ＣＨＯＨ−（ＣＨ2）n−Ｏ−［炭水化物］（ここで、ｍ＝０〜１０およびｎ＝０〜１０）からなる群から選択される。
【０１４３】
別の実施形態において、セルロース、キチンおよび他の天然に存在する炭水化物のアミノフェニルまたはアミノベンジル誘導体が、好ましくは：
Ｈ2Ｎ−Ｃ6Ｈ4−（ＣＨ2）n−［炭水化物］、
Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−Ｃ6Ｈ4−（ＣＨ2）n−［炭水化物］、
Ｈ2Ｎ−Ｃ6Ｈ4−（ＣＨ2）n−Ｏ−［炭水化物］（ここで、ｎ＝０〜１０）、および
Ｈ2Ｎ−Ｃ6Ｈ4−（ＣＨ2）m−ＣＨＯＨ−（ＣＨ2）n−Ｏ−［炭水化物］
（式中、ｍ＝０〜１０およびｎ＝０〜１０、それらのｐ−、ｏ−  およびｍ−ベンゼン環アミノ−異性体、アミノメチル−異性体およびアルキル基異性体を含む）からなる群から選択される。
【０１４４】
アミン官能化材料は、さらに、混合多糖−ポリマー誘導体として製造され得、ここで、第一級アミン、アミノアルキル（アルキル基あたり１〜１０の炭素）、アミノヒドロキシアルキル（アルキル基あたり１〜１０の炭素およびアルキル基あたり１〜１０のヒドロキシル基）、アミノベンゼンおよび／またはアミノアルキルベンゼン（アルキル基あたり１〜１０の炭素）の官能基は、材料（例えば、セルロースまたはキチンのエピクロルヒドリンコポリマー）に共有結合され、そして炭化水素スペーサー基は、アルケンさらにアルキル基を含み得る。
【０１４５】
非多糖ポリマー誘導体（ここで、第一級アミン、アミノアルキル（アルキル基あたり１〜１０の炭素）、アミノヒドロキシアルキル（アルキル基あたり１〜１０の炭素およびアルキル基あたり１〜１０のヒドロキシル基）、アミノベンゼンおよび／またはアミノアルキルベンゼン（アルキル基あたり１〜１０の炭素）の官能基は、様々な合成ポリマー（ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼンコポリマー、ポリビニルアルコールおよびそれらの架橋誘導体を含む）のうちのいずれか１つに共有結合され、そして炭化水素スペーサー基は、アルケンさらにアルキル基を含み得る）。
【０１４６】
別の実施形態において、酵素触媒は、少なくとも１つのアミン保護剤を含むマトリクス中に固定化される。別の実施形態において、酵素触媒は、有効遊離アミン基数を含む不溶性マトリクス中に固定化される。好ましい実施形態において、不溶性マトリクスは、有効第一級アミン基数（すなわち、グルタルアルデヒドおよびポリエチレンイミンと架橋したカラゲナンビーズ）を備える。
【０１４７】
不溶性アミン保護剤添加物を最終生成物から除去する必要のない、または（例えば、イオン交換または蒸留により）該添加物が生成混合物から既に除去されている適用において、可溶性アミン保護剤が使用され得る。可溶性アミン保護剤の例としては、上記の不溶性ポリマーの可溶性形態（例えば、可溶性低分子モノマー）、１つもしくはそれ以上の第一級アミノ基を含むＣ1−Ｃ12  脂肪族、脂環式、または芳香族化合物、１−アミノ−２−エタノール、１−アミノ−２−プロパノール、Ｔｒｉｓ緩衝剤、エチレンジアミンおよび少なくとも１つの第一級アミノ基を含む類似の可溶性アミン保護剤が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０１４８】
好ましい実施形態において、アミン保護剤は、ポリエチレンイミンである。さらに好ましい実施形態において、ニトリラーゼ触媒は、グルタルアルデヒドおよびポリエチレンイミンで架橋した不溶性マトリクス中に固定化される。
【０１４９】
所望の効果を達成するために、反応混合物中アミン保護剤の量を当業者は調節し得る（すなわち、ニトリラーゼ活性の改善；本明細書中で「有効量」ともいう）。１つの実施形態において、アミン保護剤の濃度は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、少なくとも０．１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは、少なくとも１ｍｇ／ｍＬ、および最も好ましくは、少なくとも５ｍｇ／ｍＬである。
【０１５０】
ニトリラーゼ触媒を使用するグリコロニトリルのグリコール酸への加水分解
グリコロニトリルのグリコール酸（酸および／または対応するアンモニウム塩の形態で）への酵素変換を、以下に記載される適切な一連の酵素反応条件（ｐＨ範囲、温度、濃度など）を使用して、グリコロニトリルを含む適切な水性反応混合物と酵素触媒（ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドを含む）を接触させることにより行なった。１つの実施形態において、組換え全微生物細胞は、いかなる前処理をすることなく酵素触媒として使用され得る。別の実施形態において、微生物細胞触媒は、反応混合物に直接添加されるか、または中空繊維膜カートリッジまたは限外濾過膜を使用してバルク反応混合物とは別に維持され得る。さらなる実施形態において、微生物細胞は、ポリマーマトリックス（例えば、カラゲナンまたはポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧ）粒子）中に、または不溶性固体支持体（例えば、セライト）上に固定化され、酵素触媒の回収および再利用を容易にし得る（米国特許第６，８７０，０３８号；参照により本明細書に加入される）。なおさらなる実施形態において、精製酵素または部分的精製酵素もまた、全細胞から単離され、そして触媒として直接使用され得るか、または酵素は、ポリマーマトリックス中に、または不溶性支持体上に固定化され得る。細胞の固定化または単離酵素のための方法は広く報告されており、そして当業者によく知られている（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１：Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ；Ｇｏｒｄｏｎ  Ｆ．Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ，Ｅｄｉｔｏｒ；Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ＵＳＡ；１９９７）。Ａ．ファシリス  ７２Ｗニトリラーゼ触媒の固定化は、これまで報告されている（米国特許第６，８７０，０３８号）。
【０１５１】
水性反応混合物中の酵素触媒の濃度は、酵素触媒の比活性に依存し、そして反応の所望の速度を得るために選択される。加水分解反応における触媒として使用される微生物細胞の湿細胞（ｗｅｔ  ｃｅｌｌ）質量は、典型的に、総反応体積１ｍＬあたり０．００１グラム〜０．２５０グラムの湿細胞、好ましくは、１ｍＬあたり０．００２グラム〜０．０５０グラムの湿細胞の範囲である。
【０１５２】
グリコロニトリル加水分解反応の温度は、反応速度および酵素触媒活性の安定性の両方を制御するように選択される。反応の温度は、反応混合物の凝固点よりわずかに上（およそ０℃）〜約６５℃の範囲であり得るが、好ましい反応温度の範囲は約５℃〜約３５℃である。微生物細胞触媒懸濁液は、蒸留水中、または約５．０〜約１０．０、好ましくは約５．５〜約８．０、より好ましくは約５．５〜約７．７、および最も好ましくは約６．０〜約７．７の反応の初期ｐＨを維持する緩衝剤の水溶液中に細胞を懸濁することにより調製され得る。反応が進行するにつれて、反応混合物のｐＨは、対応するニトリル官能性からのカルボン酸のアンモニウム塩の形成に依存して変化し得る。反応は、ｐＨ制御なしにグリコロニトリルの変換を完了するように実行され得るか、または適切な酸または塩基が反応の経過にわたって添加され、所望のｐＨを維持し得る。
【０１５３】
グリコロニトリルは、２５℃で全ての部分において水と完全に混和性であることが見出された。基質（すなわち、α−ヒドロキシニトリル）の可溶性がまた水相中の溶液の温度および／または塩濃度（緩衝液またはグリコール酸アンモニウムとしても公知の生成物グリコール酸アンモニウム塩）に依存するように反応条件が選択される場合、反応混合物は最初に２相で構成され得る：酵素触媒および溶解α−ヒドロキシニトリルを含む水相、および有機相（非溶解α−ヒドロキシニトリル）。反応が進行するにつれて、α−ヒドロキシニトリルは水相中に溶解し、そして最終的に単一相の生成混合物が得られる。反応はまた、酵素加水分解反応速度とほぼ同等の速度で反応混合物にα−ヒドロキシニトリルを添加することによって実行され、それにより、単一相の水性反応混合物を維持し、そして高い出発物質濃度での酵素の基質阻害という潜在的な問題を回避し得る。
【０１５４】
グリコール酸は、プロトン化カルボン酸および／またはその対応するアンモニウム塩の混合物として生成混合物に存在し得（生成混合物のｐＨに依存；グリコール酸のｐＫａは約３．８３である）、そして生成混合物にさらに存在し得る任意の緩衝剤とともにカルボン酸の塩としてさらに存在し得る。典型的に、生産されるグリコール酸は、主にアンモニウム塩の形である（グリコロニトリル加水分解反応のｐＨは、典型的に、約５．５〜約７．７である）。グリコール酸生成物は、プロトン化カルボン酸として、または所望である場合、カルボン酸の塩として、反応混合物から単離され得る。
【０１５５】
グリコロニトリルの完全変換時の生成混合物におけるグリコール酸の最終濃度は、０．００１Ｍからグリコール酸生成物の可溶性限界までの範囲であり得る。１つの実施形態において、グリコール酸の濃度は、約０．１０Ｍ〜約５．０Ｍの範囲である。別の実施形態において、グリコール酸の濃度は約０．２Ｍ〜約３．０Ｍの範囲である。
【０１５６】
グリコール酸は、種々の技術を使用して、酸または対応する塩の形態で回収され得、この技術としては、イオン交換、電気透析、反応性溶媒抽出、重合、熱分解、アルコール分解、およびそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない（同時係属の米国特許出願公報番号第２００６−０２４７４６７号を参照のこと）  。
【０１５７】
微生物発現
ニトリラーゼ触媒は、異種宿主細胞、好ましくは微生物宿主において生産され得る。大規模な発酵方法に容易に適合され得る細胞が、本発明において特に有用である。このような生物は、産業バイオプロセスの当該分野でよく知られており、この例は、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍｕｒｏｏｋａ  ｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９４）に見出され得、そして発酵性細菌さらに酵母および糸状菌を含む。宿主細胞としては、コマモナス・エスピー、コリネバクテリア・エスピー、ブレビバクテリウム・エスピー、ロドコッカス・エスピー、アゾトバクター・エスピー、シロトバクター・エスピー、エンテロバクター・エスピー、クロストリジウム・エスピー、クレブシエラ・エスピー、サルモネラ・エスピー、ラクトバシラス・エスピー、アスペルギルス・エスピー、サッカロミセス・エスピー、ヤロウイア・エスピー、ザイゴサッカロミセス・エスピー、ピキア・エスピー、クルイベロマイセス・エスピー、カンジダ・エスピー、ハンゼヌラ・エスピー、ドナリエラ・エスピー、デバリオマイセス・エスピー、ムコール・エスピー、トルロプシス・エスピー、メチロバクテリア・エスピー、バシラス・エスピー、エシュリキア・エスピー、シュードモナス・エスピー、リゾビウム・エスピー、およびストレプトミセス・エスピーが挙げられる得が、これらに限定されない。大腸菌が特に好ましい。突然変異ニトリラーゼ遺伝子が発現され得る適した大腸菌宿主細胞の例としては、本明細書に特定されている宿主細胞ならびにＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ  ４７０７６）、ＦＭ５（ＡＴＣＣ  ５３９１１）、Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７３２５）、ＭＣ４１００（ＡＴＣＣ  ３５６９５）、Ｗ１４８５（ＡＴＣＣ  １２４３５）、およびそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。別の局面において、好ましい大腸菌宿主株は、ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ  ４７０７６）またはＦＭ５（ＡＴＣＣ  ５３９１１）である。
【０１５８】
Ａ．ファシリス  ７２Ｗニトリラーゼの異種発現は、これまで報告されている（Ｃｈａｕｈａｎ  ｅｔａｌ．，前出；米国特許第６，８７０，０３８号；同第７，１４８，０５１号；および同第７，１９８，９２７）。Ｃｈａｕｈａｎ  ｅｔａｌ．は、活性Ａ．ファシリス  ７２Ｗニトリラーゼ（配列番号５７）を発現する大腸菌株（大腸菌  ＳＳ１００１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７７））を報告している。組換え発現（大腸菌  ＳＳ１００１）ニトリラーゼのコード配列は、野生型７２Ｗニトリラーゼ配列（配列番号３および４）と比較して、２つの小さな配列変化を含んだ。開始コドンは組換え発現を促進するためにＧＴＧからＡＴＧに変えられ、そしてクローニング中にアーチファクトが導入され、結果としてＣ末端近くに単一アミノ酸変化をもたらした（Ｐｒｏ３６７［ＣＣＡ］→Ｓｅｒ［ＴＣＡ］）。
【０１５９】
産業上適した宿主における組換え発現はいくつかの利点を有する。第一に、一般的に使用される多くの生産宿主のための遺伝子ツールボックスは、通常、目的の遺伝子が得られた多くの微生物のために利用可能な遺伝子ツールボックスと比較して十分に開発されている。これらの宿主における組換え発現は、通常、天然宿主における発現よりも費用効果がある。例えば、Ａ．ファシリス  ７２Ｗ細胞は、発酵によって増殖される場合、割高な炭素基質であるグリセリン上で増殖し、そして安価なグルコースを使用して有効に増殖しないことが示されている。対照的に、大腸菌形質転換体は、約半分の時間でＡ．ファシリス  ７２Ｗ細胞と同一の細胞密度にグルコース上で増殖し、バイオ触媒生産費用を大幅に削減し得る（米国特許第６，８７０，０３８号）。
【０１６０】
外来タンパク質の高レベルの発現に向ける調節配列を含む微生物発現系および発現ベクターは、当業者によく知られている。これらを使用して、遺伝子産物の生産のためのキメラ遺伝子を構築し得る。その場合、これらのキメラ遺伝子は、形質転換を介して適した微生物に導入され、所望のニトリラーゼの高レベルの発現を提供し得る。
【０１６１】
キメラ遺伝子は、宿主細胞の特性の改変に有効である。例えば、適切なプロモーターの制御下に本発明のニトリラーゼをコード化するキメラ遺伝子の少なくとも１つのコピーを宿主細胞に導入することにより、グリコロニトリルをグリコール酸に変換する改善された能力を宿主細胞に与え得る。キメラ遺伝子は、本発明の突然変異ニトリラーゼ配列の遺伝子発現を促進するのに有用な適した調節配列を含む。適した調節配列としては、プロモーター、翻訳リーダー配列、およびリボソーム結合部位が挙げられ得るが、これらに限定されない。これらの配列が宿主生物由来であるのが好ましいが、しかし当業者は異種調節配列もまた使用され得ることを認識する。
【０１６２】
キメラ遺伝子は、適した発現ベクターにそれらをクローニングすることにより適した宿主中に導入され得る。適した宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはカセットが、当該分野でよく知られている。典型的に、ベクターまたはカセットは、関連遺伝子の転写および翻訳に向ける配列、選択可能なマーカー、および自己複製または染色体の組込みを可能にする配列を含む。適したベクターは、転写開始制御を有する（ｈａｒｂｏｒ）コード配列の領域５’および転写終結を制御するＤＮＡフラグメントの領域３’を含む。両方の制御領域が宿主細胞と同種の遺伝子由来であることが最も好ましいが、このような制御領域が生産宿主として選択される特定の種にネイティブな遺伝子由来である必要はない。
【０１６３】
１つの実施形態において、調節配列はプロモーターを含む。プロモーターは、構成的または誘導的であり得る。誘導的プロモーターは、一般に、特定の刺激物（例えば、ＩＰＴＧまたはｌａｃプロモーターを含む乳糖）に反応する。誘導的プロモーターは、２〜３だけ例を挙げると、化学品、増殖サイクル、温度の変化、ｐＨの変化およびオスモル濃度の変化を含む、種々の刺激物に反応し得る。
【０１６４】
所望の宿主細胞におけるニトリラーゼの発現を促進するのに有用である開始制御領域またはプロモーターは多数あり、当業者によく知られており、これらとしては、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセスの発現に有用）、ＡＯＸ１（ピキアの発現に有用）、およびｌａｃ、ｔｒｐ、ｌＰL、ｌＰR、Ｔ７、ｔａｃ、ＰBAD、ｎｐｒ、およびｔｒｃ（特に大腸菌の発現に有用）が挙げられるが、これらに限定されない。大腸菌における発現を促進するのに特に適切なプロモーターのさらなる例としては、大腸菌のトリプトファンオペロンプロモーターＰｔｒｐ、大腸菌の乳糖オペロンプロモーターＰｌａｃ、大腸菌のＰｔａｃプロモーター、ラムダファージライトプロモーターＰR、ラムダファージレフトプロモーターＰL、Ｔ７プロモーター、およびピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）由来のＧＡＰ遺伝子のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されないか、またはコマモナス属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ロドコッカス属、アゾトバクター属、シトロバクター属、エンテロバクター属、クロストリジウム属、クレブシエラ属、サルモネラ属、ラクトバシラス属、アスペルギルス属、サッカロミセス属、ピキア属、ザイゴサッカロミセス属、クルイベロミセス属、カンジダ属、ハンゼヌラ属、ドナリエラ属、デバリオミセス属、ムコール属、トルロプシス属、メチロバクテリア属、バチルス属、エシェリキア属、シュードモナス属、リゾビウム属、およびストレプトミセス属からなる群から選択される微生物の群から単離される少なくとも１つのプロモーターである。
【０１６５】
終結制御領域はまた、好ましい宿主にネイティブの種々の遺伝子由来であり得る。場合により、終結部位は不必要であり得るが；しかし、含まれることが最も好ましい。
【０１６６】
さらに、挿入遺伝物質は、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含み得る。リボソーム結合部位は、ラムダファージＣＩＩ遺伝子由来であり得るか、またはコマモナス属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ロドコッカス属、アゾトバクター属、シトロバクター属、エンテロバクター属、クロストリジウム属、クレブシエラ属、サルモネラ属、ラクトバシラス属、アスペルギルス属、サッカロミセス属、ザイゴサッカロミセス属、ピキア属、クルイベロミセス属、カンジダ属、ハンゼヌラ属、ドナリエラ属、デバリオミセス属、ムコール属、トルロプシス属、メチロバクテリア属、バチルス属、エシェリキア属、シュードモナス属、リゾビウム属、およびストレプトミセス属の遺伝子由来のリボソーム結合部位からなる群から選択される。
【０１６７】
場合により、遺伝子産物は、好ましくは形質転換宿主の分泌産物であり得る。増殖培地中への所望のタンパク質の分泌は、精製手順を簡易化し、そして費用を削減する。分泌シグナル配列は、しばしば、細胞膜を横切る発現可能なタンパク質の能動輸送を促進するのに有用である。分泌可能な形質転換宿主は、分泌シグナルをコードするＤＮＡ配列を宿主に組込むことにより作出され得る。適切なシグナル配列を選択する方法が、当該分野でよく知られている（例えば、欧州特許第５４６０４９号；ＷＯ９３／２４６３１を参照のこと）。分泌シグナルＤＮＡは、発現制御ＤＮＡと本発明のコード配列またはコード配列フラグメントとの間、および後者を有するリーディングフレームに位置し得る。
【０１６８】
微生物触媒の産業生産
ニトリラーゼ触媒の商業生産が望まれる場合、種々の培養方法が使用され得る。発酵操作は、バッチ、フェドバッチ、または連続的様式、当該分野でよく知られた方法で行なわれ得る（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ，（１９８９）；Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６（３）：２２７−２３４（１９９２））。
【０１６９】
伝統的なバッチ培養方法は、培地の組成が培養の開始時に設定され、そして培養プロセスの間に人工的な変更にさらされない閉鎖系である。従って、培養プロセスの開始時に、培地に所望の生物（単数および複数）を接種し、そして増殖または代謝活性が系に何も添加することなく起こることを可能にする。しかし、典型的に、「バッチ」培養は、炭素源の添加に関するバッチであり、そしてしばしばｐＨおよび酸素濃度のような因子を制御する試みが為されている。バッチ系において、系の代謝産物およびバイオマス組成は培養が終了する時まで常に変化する。バッチ内で培養細胞は静止遅滞期（ｓｔａｔｉｃ  ｌａｇ  ｐｈａｓｅ）から高い対数増殖期まで、そして最終的に静止期まで抑制され、増殖速度は低下または停止される。未処理の場合、静止期における細胞は最終的に死滅する。対数期における細胞は、しばしば、いくつかの系において最終生成物または中間体の生産の嵩の原因となる。静止または後対数期生産は他の系で得ることができる。
【０１７０】
標準バッチ系での変形はフェドバッチ系である。フェドバッチ培養プロセスも本発明において適しており、そして基質が培養の進行につれて除々に添加されることを除いて典型的なバッチ系を含む。フェドバッチ系は、カタボライトリプレッションが細胞の代謝を阻害する傾向にあり、そして培地において限定された量の基質を有することが望ましい場合に有用である。フェドバッチ系における実際の基質濃度の測定は困難であり、従って測定可能な因子（例えば、ｐＨ、溶存酸素、およびＣＯ2のような排ガスの分圧）の変化に基づいて推定される。バッチおよびフェドバッチ培養方法が一般的であり、そして当該分野ではよく知られており、そしてこれらの例は、Ｂｒｏｃｋ（前出）およびＤｅｓｈｐａｎｄｅ（前出）において見出され得る。
【０１７１】
ニトリラーゼ触媒の商業生産はまた、連続培養で達成され得る。連続培養は開放系であり、ここでは規定の培地が連続的にバイオリアクターに添加され、そして等量の馴化培地がプロセッシングのため同時に除去される。連続培養は、一般に、一定の高い液相密度で細胞を維持し、細胞は主に対数増殖期にある。あるいは、連続培養は、固定化細胞で行なわれ得、炭素および栄養は連続的に添加され、そして有益な生成物、副産物、または廃棄物が連続的に細胞マスから取り出される。細胞固定化は、天然および／または合成材料からなる広範囲の固体支持体を使用して達成され得る。
【０１７２】
連続または半連続培養は、細胞増殖または最終細胞濃度に影響を及ぼす１つの因子または多くの因子の調節を可能にする。例えば、１つの方法は、炭素源また窒素レベルのような制限栄養を固定速度で維持し、そして他の全てのパラメータの抑制を可能にする。他の系において、増殖に影響を及ぼす多数の因子が連続的変更され得るが、培地濁度により測定される細胞濃度は一定に保たれる。連続系は、恒常的増殖条件の維持をめざし、従って除去される培地による細胞消失は、培養における細胞増殖速度に対してバランスを取られなければならない。連続培養方法のために栄養および増殖因子を調節する方法、さらに細胞形成の速度を最大限にする技術は、工業微生物学の当該分野でよく知られており、種々の方法がＢｒｏｃｋ（前出）により詳述されている。
【０１７３】
本発明における発酵培地は、適した炭素基質を含まなければならない。適した基質としては、単糖（例えば、グルコースおよびフルクトース）、二糖（例えば、乳糖またはショ糖）、多糖（例えば、でんぷんまたはセルロースまたはそれらの混合物）、ならびに再生可能な原料からの非精製混合物（例えば、チーズホエー浸透液（ｃｈｅｅｓｅ  ｗｈｅｙ  ｐｅｒｍｅａｔｅ）、コーンスティープリカー、サトウダイコン糖蜜、および大麦モルト）が挙げられ得るが、これらに限定されない。従って、本発明において利用される炭素源は、種々の炭素含有基質を含み得、そして生物の選択によってのみ限定されることになる。
【０１７４】
出願人は、特に、全ての引用される参考文献の全体の内容を本開示に加入する。さらに、量、濃度、または他の値もしくはパラメーターが、範囲、好ましい範囲、または好ましい上限値および好ましい下限値のリストのいずれかとして示されている場合、これは具体的には、範囲が個別に開示されているかどうかに関係なく、一対の上限範囲または好ましい値および下限範囲または好ましい値から形成される全ての範囲を開示していると理解すべきである。数値の範囲が本明細書で挙げられている場合、別段の記述がない限り、範囲はその終点、および範囲内の全ての整数および分数を含むものとする。本発明の範囲は、範囲を定義する場合に挙げられた特定の値に限定されることを意図するものではない。
【０１７５】
一般的方法
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために提供される。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において十分に機能するために発明者によって発見された技術を表し、従ってその実施のための好ましい様式を構成するとされ得ることが、当業者により正しく評価されるべきである。しかし、当業者は、開示され、そして本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果をさらに得る特定の実施形態において、多くの変更がなされ得ることを本開示に照して、正しく評価すべきある。
【０１７６】
細菌培養の維持および増殖に適した材料および方法は、当該分野でよく知られている。以下の実施例における使用に適した技術は、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ，Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ，Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ，Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ  ａｎｄ  Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，ｅｄｓ．），Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．）またはＴｈｏｍａｓ  Ｄ．ＢｒｏｃｋによるＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（１９８９）Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ）に記載されている通りに見出され得る。酵素触媒を固定化する方法は、Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ，Ｇ．Ｆ．，（前出）に見出され得る。
【０１７７】
ゲノムＤＮＡ調製、ＰＣＲ増幅、ＤＮＡのクローニング用の所望の末端を生成させるためのエンドおよびエキソヌクレアーゼによるＤＮＡ修飾、ライゲーション、および細菌形質転換のために必要な手順は、当該分野でよく知られている。本明細書中で使用される標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該分野でよく知られており、そしてＭａｎｉａｔｉｓ，前出；およびＴ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ，ａｎｄ  Ｌ．Ｗ．ＥｎｑｕｉｓｔによるＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，（１９８４）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ，ＮＹ；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．によるＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（１９９４−１９９８）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。
【０１７８】
全ての試薬および材料は、別段の特定がない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、またはＳｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。
【０１７９】
明細書における略語は、以下の通りの測定単位、技術、性質、または化合物に対応する：「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」または「ｈｒ」は時間を意味し、「ｄ」はｇ／ｍＬでの密度を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「Ｍ」はモルを意味し、「ｍｗ」は平均分子量を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「ｗｔ」は質量を意味し、「ｗｔ％」は質量パーセントを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィーを意味し、「Ｏ．Ｄ．」は指定波長での光学密度を意味し、「ｄｃｗ」は乾燥細胞質量を意味し、「Ｕ」はニトリラーゼ活性の単位を意味し、「ＥＤＴＡ」はエチレンジアミン四酢酸を意味し、「ＤＴＴ」はジチオスレイトールを意味し、「ＤＩ」は蒸留および脱イオン化を意味し、そして「ＮＣＩＭＢ」はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＵＫを意味する。ニトリラーゼ活性の１Ｕは、１μｍｏｌ  グリコロニトリル／分の加水分解に相当する。
【０１８０】
分析方法
ＨＰＬＣ分析
別段の註記がない限り、以下のＨＰＬＣ法を使用した。反応生成物混合物を、以下のＨＰＬＣ法により分析した。反応混合物のアリコート（０．０１ｍＬ）を水（１．５０ｍＬ）に添加し、そしてＨＰＬＣ（ＨＰＸ  ８７Ｈカラム、３０ｃｍ×７．８ｍｍ、０．０１
Ｎ  Ｈ2ＳＯ4移動相；５０℃で１．０ｍＬ／分の流れ；１０μＬ注入体積；ＲＩ検出器、分析時間２０分）により分析した。Ａｌｄｒｉｃｈから購入した市販のグリコロニトリルを使用して、一連の濃度でのグリコロニトリルについて方法を較正した。
【実施例】
【０１８１】
実施例１
添加ポリエチレンイミンに対する非固定化大腸菌  ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−１６８Ｖのニトリラーゼ比活性の依存性
磁気撹拌棒を備えた２０−ｍＬのガラス製バイアルに、２５℃で、０．１  Ｍ  ＫＨ2ＰＯ4緩衝液（ｐＨ  ７．５）中の大腸菌  ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−１６８Ｖ（配列番号５１）の２５．０ｍｇ（乾燥細胞質量）／ｍＬ懸濁液（１．０ｍＬ）、および０．３Ｍ  ＫＨ2ＰＯ4緩衝液（ｐＨ  ７．５）（１．０ｍｌ）または０．３Ｍ  ＫＨ2ＰＯ4緩衝液（ｐＨ  ７．５）中の１０．２ｍｇ／ｍＬ  ポリエチレンイミン溶液（ＢＡＳＦ  ＬＵＰＡＳＯＬ(R)  ＰＳ，７５０，０００ｍｗ；ＢＡＳＦ  Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（１．０ｍＬ）のいずれかを添加した。撹拌しながら、２５℃で、イオン化蒸留水中のグリコロニトリル（１．０Ｍ）およびホルムアルデヒド（８ｍＭ、１ｍＭ、または０．０４ｍＭ）を含む水溶液（２．０ｍＬ）を添加し、そして反応混合物を温度浴で２５℃に維持した。５、１０、１５、および３０分で、反応混合物のアリコート（１００μｌ）を取り出し、そして水（１００μｌ）、６．０  Ｎ  ＨＣｌ（１０μｌ）および水中の０．２５Ｍ  ｎ−プロパノール（２００μｌ）（ＨＰＬＣ  外部標準）と混合し、混合物を遠心分離し、そして得られた上清をＨＰＬＣにより分析し、反応初速度および触媒比活性（Ｕ／ｇ  ｄｃｗ）を決定した（表２）。
【０１８２】
【表４】
0005604303.tif 000009
【０１８３】
実施例２
コポリ（ビニルアルコール／ビニルアミン）の調製
脱イオン化水（８０ｍＬ）中のドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  カタログ＃  ２８９９５７）（０．２ｇ）およびリン酸二水素ナトリウム（０．２ｇ）の溶液を、冷却器ならびに窒素入口、温度計、滴下漏斗および磁気撹拌棒を備えた２５０−ｍＬの４ツ口  ＲＢフラスコに入れた。フラスコを窒素でスイープし（ｓｗｅｅｐ）、そして７２℃の水浴中で溶液温度が６５℃になるまで撹拌し；次いで、ＶＡＺＯ(R)−６４（２，２’−アゾビスイソブチロニトリル；ｍｗ：１６４．２；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  カタログ＃  ４４１０９０）開始剤（０．１ｇ）を添加した。酢酸ビニル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  カタログ＃Ｖ１５０３、塩基性アルミナに通して濾過し、阻害剤を除去した）（４０ｇ）、Ｎ−ビニルホルムアミド（Ｓｉｇｍａｎ−Ａｌｄｒｉｃｈ  カタログ＃  ４４７３３１、さらに精製することなく使用した）（４ｇ）およびＶＡＺＯ(R)  ６４（０．３ｇ）の溶液を滴下漏斗に入れ、そしてこのモノマー溶液（５ｍＬ）をフラスコに添加した。混合物を２０分間撹拌し、そしてさらにモノマー（５ｍＬ）を添加した。２０ｍＬが添加されるまで（１時間）モノマーのアリコート（５ｍＬ）を２０分毎に添加し；次いで、混合物を７０℃で１時間撹拌した。この後、モノマーの残りを２０分毎に５ｍＬの速度で添加した。モノマーの添加が４時間で完了し、次いで、混合物を７０℃で３時間撹拌し、そして室温（約２２℃）に冷却するにまかせた。得られたポリマービーズを熱水で数回洗浄し、次いで７２時間水中で放置した。次いでビーズをジエチルエーテルで洗浄し、そして１５分間エーテル中で放置し、ビニルモノマーを抽出し、続いて濾過し、そして窒素ブランケットで真空下で乾燥させ、次いで窒素スイープで、真空オーブン中、３５０ｍｍ  Ｈｇ、７０℃で一晩乾燥させ、ポリ（酢酸ビニル−ビニルホルムアミド）コポリマー（３９．０ｇ）を得た。
【０１８４】
ポリ（酢酸ビニル−ビニルホルムアミド）コポリマー（２５．１ｇ）を、濃ＨＣｌ（６ｍＬ）および水（５ｍＬ）を含むメタノール（２００ｍＬ）と共に５時間環流しながら撹拌し、透明溶液を得、これをＲＴで一晩放置した。溶液はゴム状ゲルになり；これを数回交換（ｃｈａｎｇｅｓ）のアセトンとブレンドし、加水分解ポリマーＨＣｌ塩を沈殿させ、これを窒素下、真空オーブン中、７５℃で乾燥させた（収量：１５ｇ）。1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）による分析は、未加水分解で残っている約２０％のアセテートを指示したので、生成物をメタノール（１５０ｍＬ）および濃ＨＣｌ（５ｍＬ）の混合物と共に一晩環流しながら撹拌し、加水分解を完了させた。メタノールを濾過して除去し、そしてゴム状のメタノール不溶性生成物をＤＩ水（１００ｍＬ）と共に９０℃で撹拌し；この溶液を始めにスクリーンに通して濾過し、少量のゲルを除去し、次いで加圧下Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  セルロースプレフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に通した。１０％  ＮａＯＨを用いて、濾過した溶液をｐＨ  ９．０に塩基性化し、次いでＭＥＭＢＲＡ−ＣＥＬ(R)  ３．５Ｋ  分子量カットオフ透析膜チューブ（Ｖｉｓｋａｓｅ  Ｃｏ．，Ｗｉｌｌｏｗｂｒｏｏｋｅ，ＩＬ）中でＤＩ水に対して一晩透析した。凍結乾燥により、コポリ（ビニルアルコール／ビニルアミン）（８．７ｇ）を得た。
【０１８５】
実施例３
添加アミン保護剤に対する非固定化大腸菌  ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−１６８Ｖのニトリラーゼ比活性の依存性
磁気撹拌棒を備えた２０−ｍＬのガラス製バイアルに、アミン保護剤（２０ｍｇから４００ｍｇ）（表２を参照のこと）、次いで脱イオン化水（１．８２５ｍＬ）および０．３Ｍ  ＫＨ2ＰＯ4緩衝液（ｐＨ  ７．５）（１．０ｍＬ）を添加した。得られた混合物のｐＨを確認し、そして６  Ｎ  ＨＣｌでｐＨ  ７．５に再調整した。得られた混合物のｐＨがｐＨ  ７．５に安定したら、０．１Ｍ  ＫＨ2ＰＯ4緩衝液（ｐＨ  ７．５）中の大腸菌ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−１６８Ｖ（配列番号５１）の約２５．０ｍｇ（乾燥細胞質量）／ｍＬ懸濁液（１．０ｍＬ）を添加し、次いで水性グリコロニトリル（水中６１ｗｔ％  ＧＬＮ、グリコロニトリルに対して０．８０ｍｏｌ％または０．１０ｍｏｌ％のいずれかのホルムアルデヒドも含む溶液中の２．００ｍｍｏｌ  グリコロニトリル）（０．１７５ｍＬ（０．１８７ｇ））を添加することにより、反応を開始し、そして反応混合物を温度浴で２５℃に維持した。５、１０、１５、および３０分で、反応混合物のアリコート（１００μｌ）を取り出し、そして水（１００μｌ）、６．０  Ｎ  ＨＣｌ（１０μｌ）および水中の０．２５Ｍ  ｎ−プロパノール（２００μｌ）（ＨＰＬＣ  外部標準）と混合し、混合物を遠心分離し、そして得られた上清をＨＰＬＣにより分析し、反応初速度および触媒比活性（Ｕ／ｇ  ｄｃｗ）を決定した（表３）。表３に掲記される実験の各セットを、新たに調製した細胞懸濁液（細胞懸濁液Ａ〜Ｇ）で行ない、ここで各細胞懸濁液についての対照反応の細胞の比活性における差は、個々の細胞懸濁液の乾燥細胞質量濃度の差に起因した。
【０１８６】
【表５】
0005604303.tif 000010
【０１８７】
【表６】
0005604303.tif 000011
【０１８８】
実施例４
ＧＡ／ＰＥＩ−架橋カラゲナン／大腸菌  ＭＧ１６５５／ｐＮＭ１８−１６８Ｖビーズの調製
素早く撹拌しながらカラゲナン（ＦＭＣ  ＧＰ９１１；ＦＭＣ  Ｃｏｒｐ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）（１２ｇ）を５０℃で脱イオン化蒸留水（２２８ｇ）にゆっくりと添加し、カラゲナンが完全に溶解するまで、得られた混合物を８０℃に加熱し、そして得られた溶液を撹拌しながら５２℃に冷却した。撹拌棒を備えたセパレートビーカー（ｓｅｐａｒａｔｅ  ｂｅａｋｅｒ）中、凍結大腸菌  ＭＧ１６５５／ｐＮＭ１８−１６８Ｖ（配列番号５１）細胞（２５．２％  ｄｃｗ）（８３．２ｇ）を、約２５℃で０．３５Ｍ  Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ  ７．３）（８４．８ｇ）に添加し、そして細胞が懸濁されるまで混合し、次いでデオキシリボヌクレアーゼＩ溶液（１２，５００  Ｕ／ｍＬ  ＤＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１０μＬ）／細胞懸濁液（１００ｍＬ））を添加した。細胞懸濁液を、連続して２３０ミクロンおよび１４０ミクロン  ＮＵＰＲＯ(R)  ＴＦストレーナー（Ｓｗａｇｅｌｏｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ）エレメントフィルターに通して濾過し、そして撹拌しながら５０℃に加熱した。撹拌しながら、５０℃で大腸菌  ＭＧ１６５５／ｐＮＭ１８−１６８Ｖ細胞懸濁液（１６０．０ｇ）を５２℃でカラゲナン溶液に添加し、そして得られた細胞／カラゲナン懸濁液を、電気的に加熱した２０ゲージ針に通して４７℃で送り出し、そして撹拌しながら約３７〜３８℃で０．２５Ｍ  ＫＨＣＯ3（ｐＨ＝７．３）内に滴下し；針を通る流速は、５〜８ｍＬ／分に設定した。得られたビーズを、同じ緩衝液中で撹拌しながら、１時間室温で硬化させ、そして０．２５Ｍ炭酸水素カリウム（ｐＨ  ７．３）中で保存した。
【０１８９】
水中の２５％  グルタルアルデヒド（ＧＡ）（Ｓｉｇｍａ  Ｍ  ７５２−０７）（１．０ｇ）を０．２５Ｍ  炭酸水素カリウム（ｐＨ  ７．３）（４８ｍＬ）に懸濁したビーズ（２０ｇ）を添加することにより、固定化細胞／カラゲナンビーズの一部の化学的架橋を行ない、そして室温で１時間撹拌した。次いで、ビーズの懸濁液に水中の１２．５ｗｔ％  ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、ＢＡＳＦ  ＬＵＰＡＳＯＬ(R)  ＰＳ）（４．０ｇ）を添加し、そしてビーズ懸濁液を室温でさらに１８時間撹拌した。ＧＡ／ＰＥＩ−架橋ビーズを懸濁液から回収し、０．２５Ｍ  炭酸水素カリウム（ｐＨ  ７．３）（４８ｍＬ）中１５分間を２回撹拌し、次いで５℃で１．０Ｍ  重炭酸アンモニウム（ｐＨ  ７．３）で保存した。使用の前に、ビーズを室温の０．１Ｍ  グリコール酸アンモニウム（ｐＨ  ７．０）（１８０ｍＬ）で１５分間を２回洗浄した。
【０１９０】
実施例５
カラゲナン−固定化大腸菌  ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−１６８Ｖ形質転換体（Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼを発現する）のグルタルアルデヒド／ポリエチレンイミン架橋に対する生体触媒比活性の依存性
典型的な手順において、オーバーヘッド攪拌（ｏｖｅｒｈｅａｄ  ｓｔｉｒｒｉｎｇ）および温度制御を備えた５０−ｍＬジャケット付き反応槽に、Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ突然変異Ｆ１６８Ｖ（配列番号５１）を発現する５％（ｄｃｗ）形質転換体を含むＧＡ／ＰＥＩ架橋大腸菌  ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−１６８Ｖ／カラゲナンビーズ（実施例４に記載される方法を使用して調製した）（４．０ｇ）を仕込んだ。次いで、この槽に蒸留水（１０．８５ｍＬ）および水性グリコール酸アンモニウム（４．０Ｍ、ｐＨ  ７．０）（３．０ｍＬ）を添加した。混合物を２５℃で撹拌しながら、水中の６０．８ｗｔ％  グリコロニトリル（ＧＬＮ）（１．８７６ｇ、２０．０ｍｍｏｌ  ＧＬＮ、０．１６０ｍｍｏｌ  ホルムアルデヒド；０．７ｗｔ％  グリコール酸で安定化させた）（１．７５ｍＬ）および含水水酸化アンモニウム（１．８７５ｗｔ％  ＮＨ3）（０．４０ｍＬ）を同時に添加した（最終ｐＨ  ７．５）。４つの反応サンプル（０．０５０−ｍＬ）を、ＧＬＮの添加後所定時間で取り出し、そしてＨＰＬＣにより分析し、反応初速度および触媒比活性（μｍｏｌ  グリコール酸／分／ｇ  ｄｃｗ  生体触媒）を決定した。
【０１９１】
【表７】
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【０１９２】
実施例６
触媒リサイクルを伴なう連続バッチ反応における未架橋およびグルタルアルデヒド／ポリエチレンイミン架橋カラゲナン−固定化大腸菌  ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−１６８Ｖ形質転換体（Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼを発現する）についての生体触媒比活性の比較
オーバーヘッド攪拌および温度制御を備えた５０−ｍＬジャケット付き反応槽に、Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ突然変異Ｆ１６８Ｖ（配列番号５１）を発現する５％（ｄｃｗ）形質転換体を含むＧＡ／ＰＥＩ架橋大腸菌  ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−１６８Ｖ／カラゲナンビーズ（実施例４に記載される方法を使用して調製した）（８ｇ）を仕込んだ。次いで、この槽に蒸留水（１４．７８ｍＬ）および水性グリコール酸アンモニウム（４．０Ｍ、ｐＨ  ７．０）（６．０ｍＬ）を添加し、そして反応槽を窒素でフラッシュした。混合物を２５℃で撹拌しながら、プログラム可能なシリンジポンプを使用して、水中の６０ｗｔ％  グリコロニトリル（ＧＬＮ）（１２．０ｍｍｏｌ  ＧＬＮ、０．０８４ｍｍｏｌ  ホルムアルデヒド；Ｆｌｕｋａ（再蒸留し、０．５ｗｔ％  グリコール酸で安定化させた、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）（１．０７ｍＬ）および含水水酸化アンモニウム（１．８７５ｗｔ％）（０．１５０ｍＬ）を同時に添加し；ＧＬＮの１等価体積（equivalent volume）および水酸化アンモニウム溶液を２時間毎に同時に添加し、ＧＬＮ≦４００ｍＭの濃度および６．５〜７．５の範囲のｐＨに維持した。４つの反応サンプル（０．０５０−ｍＬ）を、最初のＧＬＮの添加後所定時間で取り出し、そしてＨＰＬＣにより分析し、反応初速度および触媒比活性（μｍｏｌ  グリコール酸／分／ｇ  ｄｃｗ  生体触媒）を決定した。反応の完了時、＞９９％収率でグリコール酸（アンモニウム塩として）を生産するＧＬＮの１００％変換があり、そして添加ＧＬＮから生産されたグリコール酸アンモニウムの濃度は、約２．５Ｍであった（約３８．０ｍＬの最終反応体積において、初期グルコール酸アンモニウム緩衝液を含む場合、３．１Ｍ  総グリコール酸アンモニウム）。
【０１９３】
第一の反応の終わりで、水性生成混合物を触媒からデカントし（窒素下）、固定化細胞触媒（８．０ｇ）および残りの生成混合物（約２．３ｇ）の混合物（約１０．３ｇ）を残した。次いで、反応槽に脱イオン化蒸留水（２０．７８ｍＬ）を添加し、そして直前に記載したように、水性ＧＬＮおよび水酸化アンモニウムのアリコートを添加することにより、第二の反応を２５℃で行なった。触媒リサイクルを伴ない連続バッチ反応における回収した生体触媒の比活性を表５に掲記する。比活性に対するカラゲナン−固定化細胞のグルタルアルデヒド／ポリエチレンイミン架橋の効果を比較するために、大腸菌  ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−１６８Ｖ／カラゲナンビーズがグルタルアルデヒドおよびポリエチレンイミンで化学的に架橋されていないことを除いて、上記のようにリサイクル反応の第二シリーズを行なった（表５）。
【０１９４】
【表８】
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【０１９５】
実施例７
添加ポリエチレンイミンに対する非固定化ロドコッカス・エスピー（ＡＴＣＣ  ３９４
８４TM）のニトリラーゼ比活性の依存性
ロドコッカス・エスピー  ＡＴＣＣ  ３９４８４（配列番号２５）の凍結培養物を５０−ｍＬ円錐型試験管中栄養ブロス（Ｄｉｆｃｏ；カタログ＃  ０００３−０１−６）（５ｍｌ）に懸濁し、そして３０℃、６０  ｒｐｍで３日間インキュベートした後、回復させ、グリセリン（１０％  ｖ／ｖ）の添加後、−８０℃で保存した。回復した培養物（１ｍＬ）をミラーのルリア−ベルターニブロス（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．；４６−０５０−ＣＭ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）（５０ｍＬ）を含むバッフルのない（ｕｎｂａｆｆｌｅｄ）１２５−ｍＬ振とうフラスコ中に接種し、そして３０℃、および２００  ｒｐｍ、６００  ｎｍで９．０のＯＤまで１６時間増殖させ、次いでグリセリン（１０％  ｖ／ｖ）を添加し、そして接種材料を−８０℃で保存した。接種材料（２ｍＬ）を、ポリペプトン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；カタログ＃  １１９１０；Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）（１ｇ）、麦芽エキス（Ｄｉｆｃｏ；０１８６−０２−４）（０．６ｇ）、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ；０１２７−１７）（０．６ｇ）、グリセリン（２ｇ）、およびイソバレロニトリル（Ｔ．Ｎａｇａｓａｗａ，Ｍ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｈ．Ｙａｍａｄａ，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（１９８８）１５０：８９−９４）（０．２ｍＬ）からなる培地（ｐＨ  ７．０）（２００ｍＬ）を含むバッフルのない１−Ｌ振とうフラスコに移し、次いで３０℃、２００  ｒｐｍ撹拌で増殖させた。５０時間および７０時間で、培養物に、０．１％（ｖ／ｖ）および０．２％（ｖ／ｖ）のイソバレロニトリルをそれぞれ与えた。１３，０００×ｇ（５℃）の遠心分離により、細胞ペーストを９６時間で採取し、そして−８０℃で保存した。
【０１９６】
磁気撹拌棒を備えた２０−ｍＬのガラス製バイアルに、２５℃で０．１Ｍ  ＫＨ2ＰＯ4緩衝液（ｐＨ  ７．５）中のロドコッカス・エスピー（ＡＴＣＣ  ３９４８４TM）の７３．０ｍｇ（乾燥細胞質量）／ｍＬ懸濁液（１．０ｍＬ）、および０．３Ｍ  ＫＨ2ＰＯ4緩衝液（ｐＨ  ７．５）（１．０ｍｌ）または０．３Ｍ  ＫＨ2ＰＯ4緩衝液（ｐＨ  ７．５）中の１０．２ｍｇ／ｍＬ  ポリエチレンイミン溶液（ＢＡＳＦ  ＬＵＰＡＳＯＬ(R)  ＰＳ，７５０，０００ｍｗ）（１．０ｍＬ）のいずれかを添加した。撹拌しながら、２５℃の脱イオン化蒸留水中のグリコロニトリル（１．０Ｍ）およびホルムアルデヒド（８ｍＭまたは０．０４ｍＭ）を含む水溶液（２．０ｍＬ）を添加し、そして反応混合物を２５℃に維持した。５、１０、１５、および３０分で、反応混合物のアリコート（１００μｌ）を取り出し、そして水（１００μｌ）、６．０  Ｎ  ＨＣｌ（１０μｌ）および水中の０．２５Ｍ  ｎ−プロパノール（２００μｌ）（ＨＰＬＣ  外部標準）と混合し、混合物を遠心分離し、そして得られた上清をＨＰＬＣにより分析し、反応初速度および触媒比活性（Ｕ／ｇ  ｄｃｗ）を決定した（表６）。
【０１９７】
【表９】
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【０１９８】
実施例８
添加ポリエチレンイミンに対する非固定化ロドコッカス  ロドクロス（ＮＣＩＭＢ  １１２１６）のニトリラーゼ比活性の依存性
生理食塩水（１００μＬ）中に保存培養物を懸濁した後、ロドコッカス  ロドクロス（ＮＣＩＭＢ  １１２１６；配列番号２４）を回復させ、続いて、酵母エキス（２ｇ／Ｌ；Ｄｉｆｃｏ  カタログ＃  ０１２７−１７）および塩化ナトリウム（５ｇ／Ｌ）を補充した栄養寒天培地（Ｄｉｆｃｏ  カタログ＃  ０００１−０１−８）を含むプレート上に、生理食塩水細胞懸濁液で画線した（ｓｔｒｅａｋｅｄ）。Ｒ．ロドクロス  ＮＣＩＭＢ  １１２１６由来のニトリラーゼ配列が報告されている（米国特許出願公告番号２００３／０１５７６７２およびＧＥＮＢＡＮＫ(R)  受入番号ＣＡＣ８８２３７；配列番号２４）。プレートを３０℃で４８時間インキュベートし、そしてコロニーをアジピン酸（０．８ｗｔ％；炭素源）およびプロピオニトリル（０．２ｗｔ％；窒素源）を補充した水性Ｅ２基礎培地に接種し、そして３０℃、２００  ｒｐｍ  撹拌で４８時間インキュベートした。Ｅ２基礎培地は、以下からなる：ＫＨ2ＰＯ4、１．４ｇ／Ｌ；ＮａＨ2ＰＯ4、０．６９ｇ／Ｌ；クエン酸ナトリウム、０．１ｇ／Ｌ；ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０２５ｇ／Ｌ；ＫＣｌ、０．５ｇ／Ｌ；ＮａＣｌ、１．０ｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５ｇ／Ｌ；ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０５ｇ／Ｌ；ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、０．０１ｇ／Ｌ；ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、０．００１ｇ／Ｌ；ＺｎＣｌ2、０．０００５ｇ／Ｌ；ＮａＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、０．００２５ｇ／Ｌ；ＮｉＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、０．０１ｇ／Ｌ；ＣｕＳＯ4・２Ｈ2Ｏ、０．００５ｇ／Ｌ；ビオチン、０．０００２ｇ／Ｌ；葉酸、０．０００２ｇ／Ｌ；ピリドキシン・ＨＣｌ、０．００１ｇ／Ｌ；リボフラビン、０．０００５ｇ／Ｌ；チアミン・ＨＣｌ、０．００００５ｇ／Ｌ；ニコチン酸、０．０００５ｇ／Ｌ；パントテン酸、０．０００５ｇ／Ｌ；ビタミンＢ12、０．００００１ｇ／Ｌ；ｐ−アミノ安息香酸、０．０００５ｇ／Ｌ。４８時間増殖させた後、湿細胞ペースト（１．５９ｇ）を１３，０００×ｇの遠心分離により採取し、そして得られた細胞ペーストを−８０℃で保存した。
【０１９９】
磁気撹拌棒を備えた２０−ｍＬのガラス製バイアルに、２５℃の０．１Ｍ  ＫＨ2ＰＯ4緩衝液（ｐＨ  ７．５）中のロドコッカス  ロドクロス（ＮＣＩＭＢ  １１２１６）の７９．０ｍｇ（乾燥細胞質量）／ｍＬ懸濁液（１．０ｍＬ）、および０．３Ｍ  ＫＨ2ＰＯ4緩衝液（ｐＨ  ７．５）（１．０ｍｌ）または０．３Ｍ  ＫＨ2ＰＯ4緩衝液（ｐＨ  ７．５）中の１０．２ｍｇ／ｍＬ  ポリエチレンイミン溶液（ＢＡＳＦ  ＬＵＰＡＳＯＬ(R)  ＰＳ，７５０，０００ｍｗ）（１．０ｍＬ）のいずれかを添加した。撹拌しながら、２５℃の脱イオン化蒸留水中のグリコロニトリル（１．０Ｍ）およびホルムアルデヒド（８ｍＭまたは０．０４ｍＭ）を含む水溶液（２．０ｍＬ）を添加し、そして反応混合物を２５℃に維持した。５、１０、１５、および３０分で、反応混合物のアリコート（１００μｌ）を取り出し、そして水（１００μｌ）、６．０Ｎ  ＨＣｌ（１０μｌ）および水中の０．２５Ｍ  ｎ−プロパノール（２００μｌ）（ＨＰＬＣ  外部標準）と混合し、混合物を遠心分離し、そして得られた上清をＨＰＬＣにより分析し、反応初速度および触媒比活性（Ｕ／ｇ  ｄｃｗ）を決定した（表７）。
【０２００】
【表１０】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【配列表】
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