(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザウイルスの製造方法であって、
ａ．インフルエンザワクチンを雌鶏に投与する工程、
ｂ．免疫した雌鶏から卵を採取する工程、
ｃ．胚形成プロセスを引き起こす工程、
ｄ．インフルエンザウイルスを尿膜腔に接種することによって、胚形成卵を感染させる工程、
ｅ．感染した胚形成卵を、ウイルスの複製を可能にする温度および湿度条件下でインキュベートする工程、ならびに
ｆ．ウイルスを含む尿膜液を回収する工程を含む方法。
【請求項２】
ワクチンがトリインフルエンザから雌鶏を防御する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
インフルエンザワクチンが、その組成物において、タンパク質および／または該タンパク質をコードする遺伝子の形態でインフルエンザウイルスの赤血球凝集素を含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
インフルエンザワクチン組成物が不活化されたインフルエンザウイルス全体を含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
インフルエンザワクチン組成物がインフルエンザウイルス全体由来の産物を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ワクチン組成物がアジュバントも含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
インフルエンザワクチン組成物が弱毒化インフルエンザウイルスを含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
インフルエンザワクチンがインフルエンザウイルスの赤血球凝集素をコードする遺伝子を含むベクターを含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
ベクターがポックスウイルスである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ベクターがインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼをコードする遺伝子も含む、請求項８または９記載の方法。
【請求項１１】
ワクチン組成物がアジュバントも含む、請求項８〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
雌鶏に投与するワクチン組成物に含まれる、タンパク質および／または該タンパク質をコードする遺伝子の形態のインフルエンザウイルスの赤血球凝集素、ならびに免疫した雌鶏由来の胚形成卵の尿膜腔に感染させるために使用するインフルエンザウイルスの赤血球凝集素が異なるサブタイプを有する、請求項３〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
雌鶏に投与するワクチン組成物に含まれる、タンパク質および／または該タンパク質をコードする遺伝子の形態のインフルエンザウイルスの赤血球凝集素、ならびに免疫した雌鶏由来の胚形成卵の尿膜腔に感染させるために使用するインフルエンザウイルスの赤血球凝集素が同じサブタイプを有する、請求項３〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
雌鶏に投与するワクチン組成物に含まれる、タンパク質および／または該タンパク質をコードする遺伝子の形態のインフルエンザウイルスの赤血球凝集素、ならびに免疫した雌鶏由来の胚形成卵の尿膜腔に感染させるために使用するインフルエンザウイルスの赤血球凝集素が同一である、請求項３〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
雌鶏に投与するワクチン組成物に含まれるインフルエンザウイルスが、免疫した雌鶏由来の胚形成卵の尿膜腔に感染させるために使用するインフルエンザウイルスと同一である、請求項４、６または７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
雌鶏に投与するワクチン組成物に含まれる、タンパク質および／または該タンパク質をコードする遺伝子の形態のインフルエンザウイルスの赤血球凝集素、ならびに免疫した雌鶏由来の胚形成卵の尿膜腔に感染させるために使用するインフルエンザウイルスの赤血球凝集素がＨ５、Ｈ６、Ｈ７またはＨ９サブタイプを有する、請求項１２〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
雌鶏をインフルエンザに対して免疫するために使用するワクチン組成物に含まれる、タンパク質および／または該タンパク質をコードする遺伝子の形態のインフルエンザウイルスの赤血球凝集素、ならびに免疫した雌鶏由来の胚形成卵の尿膜腔に感染させるために使用するインフルエンザウイルスの赤血球凝集素がＨ５またはＨ７サブタイプを有する、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ウイルスを精製するさらなる工程を含む、請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
ウイルスを不活化するさらなる工程を含む、請求項１〜１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
インフルエンザの予防における使用のためのワクチンの製造のための、請求項１〜１９のいずれか１項記載の方法の使用。
【請求項２１】
汎発性ヒトインフルエンザの予防における使用のためのワクチンの製造のための、請求項１〜１９のいずれか１項記載の方法の使用。
【請求項２２】
流行性ヒトインフルエンザの予防における使用のためのワクチンの製造のための、請求項１〜１９のいずれか１項記載の方法の使用。
【請求項２３】
ウマ科のメンバー、ブタ科のメンバー、イヌ科のメンバー、ネコ科のメンバー、イタチ科およびトリ種でのインフルエンザの予防における使用のためのワクチンの製造における、請求項１〜１９のいずれか１項記載の方法の使用。
【請求項２４】
インフルエンザウイルスの製造のための、インフルエンザに対して免疫した雌鶏由来の卵の使用。
【請求項２５】
インフルエンザワクチンの製造のための、インフルエンザに対して免疫した雌鶏由来の卵の使用。
【請求項２６】
卵がインフルエンザウイルスの赤血球凝集素に対する抗体を含む、請求項２４または２５記載のインフルエンザに対して免疫した雌鶏由来の卵の使用。
【請求項２７】
抗体がＨ５、Ｈ６、Ｈ７またはＨ９サブタイプを有するインフルエンザウイルスの赤血球凝集素に対するものである、請求項２６記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザ（flu）に対して免疫した雌鶏から得られた卵を使用するインフルエンザウイルスの製造方法、およびインフルエンザワクチンの製造ための該方法の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
３つの型のインフルエンザウイルス（Ａ、ＢおよびＣ）がこれまでに知られており、Ａ型ウイルスが動物およびヒトの状態の原因である一方、Ｂ型およびＣ型ウイルスはヒトにとって特に病原性である。Ａ型ウイルスは、ウイルスエンベロープの主要な糖タンパク質である赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）の抗原性構造に従って、サブタイプにさらに分けられる。ＨＡの１６個のサブタイプ（Ｈ１〜Ｈ１６）およびＮＡの９個のサブタイプ（Ｎ１〜Ｎ９）が目立っている。したがって、Ａ型ウイルスのサブタイプは、ウイルスエンベロープに存在するＨＡサブタイプおよびＮＡサブタイプによって定義される。野鳥は、全てのインフルエンザＡサブタイプの保有宿主を構成する。インフルエンザウイルスＡ型の特定のサブタイプは、風土性または流行性（毎年の伝染病）に、家禽（Ｈ５Ｎ１およびＨ９Ｎ２を含む種々のサブタイプ）、ウマ（主に、Ｈ３Ｎ８）、ブタ（主に、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２およびＨ１Ｎ２）、ならびにヒト（主に、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）に感染する。イヌ、ネコおよび他の野生種もまた、時折特定のサブタイプ（イヌにおいて、Ｈ３Ｎ８およびＨ５Ｎ１；ネコにおいて、Ｈ５Ｎ１）に感染し得る。
【０００３】
獣医学分野において、養鶏場、特に、ヒヨコ、ニワトリ、雌鶏および雄鶏は、数に関して、インフルエンザウイルスによって影響を及ぼされがちな最大の集団を示す。サブタイプＨ５およびＨ７のトリインフルエンザ株は、２つの病原型であり得る：ローパス（low path、またはＬＰ）病原型およびハイパス（high path、またはＨＰ）病原型。ＨＰ株は、トリインフルエンザの原因であって、特に、赤血球凝集素切断部位での変異／挿入後のＬＰ株Ｈ５およびＨ７（多数の酸性アミノ酸の存在）に由来する。現在、トリインフルエンザ、特に、Ｈ５およびＨ７サブタイプの感染を予防するために、厳しい衛生対策および定期的なコントロールが農場では強く勧められている。
【０００４】
ヒトにおいて、伝染病（長年にわたりより実質的または実質的でない）の原因である季節性の循環ウイルス株に対する免疫化が推奨されている。現在のワクチンの大部分は、雌鶏の胚形成卵を使用して製造され、これらの卵は、３つの異なるインフルエンザウイルス株（Ｈ３Ｎ２およびＨ１Ｎ１サブタイプを有するＡ型インフルエンザウイルスの２つの株、ならびにＢ型ウイルスの１つの株）に感染している。ウイルスの複製にとって有害であり得る干渉の任意の現象を防ぐために、インフルエンザに対して免疫されていない雌鶏由来の胚形成卵が使用されている。実際、卵中で時間を過ごした後のヒヨコに母系性の抗体が移行し、生後数日の間微生物の感染から該ヒヨコを防御していることが知られているが、引き換えに、微生物病原体に対する防御性の母系性抗体がまだ存在する一方でヒヨコが早い時期に微生物病原体に対して免疫された場合、それらは免疫欠損の原因となる。H. Stoneら（非特許文献１）は、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）に対して免疫した雌鶏由来の卵の卵黄を接種することによって、生まれたばかりのヒヨコがニューカッスル病に対して受動的に免疫され得ることを示している。しかしながら、卵黄の投与後にヒヨコをＮＤＶウイルスで免疫した場合、ワクチンへの免疫応答の減少が観察される。Hamalら（非特許文献２）の調査によれば、防御性の母系性抗体の生まれたばかりのヒヨコへの移行、特に、ＮＤＶウイルスまたは伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）に対する抗体の移行の割合は、３０％〜４０％の間（生後３日目のヒヨコの血中を循環する雌鶏の血漿中の抗体量のパーセンテージ）であって、これは、多くの量の母系性抗体が卵中に隔離されたことを示している。このことは、J.R. Beckら（非特許文献３）の調査によって確認されており、J.R. Beckらは、不活化したインフルエンザウイルス株で雌鶏を免疫した約３週間後に、全ての卵が抗ＨＡ抗体を含んでいることを示している。また、Fontaineら（非特許文献４）によれば、胚形成卵を抗インフルエンザ血漿に接種した場合、該卵がインフルエンザウイルスによる感染から防御されることが知られている。これらの全ての理由から、当業者であれば、インフルエンザに対して免疫された雌鶏由来の卵を使用した場合、インフルエンザに対する母系性抗体の卵への移行が原因で、該卵は、インフルエンザウイルスを産生できなくなると考えていた。
【０００５】
２０００年代初めから、養鶏場におけるトリインフルエンザの経済的影響が、養鶏場全体を破壊するか、それより規模の小さな場合では、感染した雌鶏の産卵を停止させる、高伝染性で病原性のトリウイルス株の出現と一緒に増加している。高病原性のウイルス株のＨＡの分類は、それらのほぼ全てがＨ５またはＨ７サブタイプを有することを示している。現在、Ｈ５またはＨ７サブタイプを有するウイルス株がヒトに適応することがおそれられており、これらのサブタイプを含む、明らかに単離されたヒトインフルエンザの重篤なケースが既に報告されている。
【０００６】
インフルエンザワクチンの製造のための卵の供給がもはや常に保証されないかもしれないという危険に直面して、インフルエンザに対するワクチンの新しい製造方法は、現在、細胞培養系の使用に向かっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Avian Dis. 36: 1048-1051, 1992
【非特許文献２】Poultry Science 65: 1364-1372, 2006
【非特許文献３】Avian Dis. 47:1196-1199, 2003
【非特許文献４】Pathobiologie, 11/9: 611-613, 1963
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
インフルエンザワクチンの新しい製造方法にもかかわらず、いかなる環境下でも短期間で非常に大量にインフルエンザワクチンの製造のためのインフルエンザウイルスを製造できることが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、全ての期待に反して、インフルエンザに対して事前に免疫した雌鶏由来の卵の使用に基づくインフルエンザウイルスの製造方法を記載することによって、この必要性を満たすものである。
【００１０】
すなわち、本発明は以下に関する：
インフルエンザウイルスの製造方法であって、
ａ．インフルエンザワクチンを雌鶏に投与する工程、
ｂ．免疫した雌鶏から卵を採取する工程、
ｃ．胚形成プロセスを引き起こす工程、
ｄ．インフルエンザウイルスを尿膜腔に接種することによって、胚形成卵を感染させる工程、
ｅ．感染した胚形成卵を、ウイルスの複製を可能にする温度および湿度条件下でインキュベートする工程、および
ｆ．ウイルスを含む尿膜液を回収する工程を含む方法。
好ましくは、ワクチンは、トリインフルエンザから雌鶏を防御する。
【００１１】
典型的に、インフルエンザワクチンは、その組成物において、タンパク質および／または該タンパク質をコードする遺伝子の形態でインフルエンザウイルスの赤血球凝集素を含む。
１つの態様によれば、インフルエンザワクチン組成物は、不活化されたインフルエンザウイルス全体を含む。
別の態様によれば、インフルエンザワクチン組成物は、インフルエンザウイルス全体由来の産物を含む。
さらに別の態様によれば、ワクチン組成物はアジュバントも含む。
【００１２】
別の態様において、インフルエンザワクチン組成物は、弱毒化インフルエンザウイルスを含む。
別の態様によれば、インフルエンザワクチンは、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素をコードする遺伝子を含むベクターを含む。
好ましくは、ベクターはポックスウイルスである。
特定の態様において、ベクターは、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼをコードする遺伝子も含む。
別の態様によれば、ワクチン組成物はアジュバントも含む。
【００１３】
本発明の１つの実施態様によれば、雌鶏に投与するワクチン組成物に含まれる、タンパク質および／または該タンパク質をコードする遺伝子の形態のインフルエンザウイルスの赤血球凝集素、ならびに免疫した雌鶏由来の胚形成卵の尿膜腔に感染させるために使用するインフルエンザウイルスの赤血球凝集素は、異なるサブタイプを有する。
【００１４】
別の実施態様によれば、雌鶏に投与するワクチン組成物に含まれる、タンパク質および／または該タンパク質をコードする遺伝子の形態のインフルエンザウイルスの赤血球凝集素、ならびに免疫した雌鶏由来の胚形成卵の尿膜腔に感染させるために使用するインフルエンザウイルスの赤血球凝集素は、同じサブタイプを有する。
【００１５】
さらに別の実施態様によれば、雌鶏に投与するワクチン組成物に含まれる、タンパク質および／または該タンパク質をコードする遺伝子の形態のインフルエンザウイルスの赤血球凝集素、ならびに免疫した雌鶏由来の胚形成卵の尿膜腔に感染させるために使用するインフルエンザウイルスの赤血球凝集素は、同一である。
【００１６】
さらに別の実施態様によれば、雌鶏に投与するワクチン組成物に含まれるインフルエンザウイルスは、免疫した雌鶏由来の胚形成卵の尿膜腔に感染させるために使用するインフルエンザウイルスと同一である。
【００１７】
特に好ましい実施態様において、雌鶏に投与するワクチン組成物に含まれる、タンパク質および／または該タンパク質をコードする遺伝子の形態のインフルエンザウイルスの赤血球凝集素、ならびに免疫した雌鶏由来の胚形成卵の尿膜腔に感染させるために使用するインフルエンザウイルスの赤血球凝集素は、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７またはＨ９サブタイプを有する。
【００１８】
別の特に好ましい実施態様において、雌鶏に投与するワクチン組成物に含まれる、タンパク質および／または該タンパク質をコードする遺伝子の形態のインフルエンザウイルスの赤血球凝集素、ならびに免疫した雌鶏由来の胚形成卵の尿膜腔に感染させるために使用するインフルエンザウイルスの赤血球凝集素は、Ｈ５またはＨ７サブタイプを有する。
【００１９】
特定の態様において、本発明の方法は、ウイルスを精製するさらなる工程を含む。
別の特定の態様において、本発明の方法は、ウイルスを不活化するさらなる工程を含む。
【００２０】
本発明はまた、本発明の方法を使用して得られるインフルエンザワクチンに関する。
本発明はまた、インフルエンザの予防における使用のためのワクチンの製造のための、本発明の方法の使用に関する。
特定の態様において、本発明の方法の使用は、汎発性ヒトインフルエンザの予防における使用のためのワクチンの製造に役立つ。
【００２１】
別の特定の態様において、本発明の方法の使用は、流行性ヒトインフルエンザの予防における使用のためのワクチンの製造に役立つ。
本発明はまた、インフルエンザウイルスの流行性株またはインフルエンザウイルスの汎発性株によるヒトにおける感染を予防する方法であって、本発明の方法を使用して得られるインフルエンザワクチンの有効量をヒトに投与する工程を含む方法に関する。
さらに別の態様において、本発明の方法の使用は、ウマ科のメンバー、ブタ科のメンバー、イヌ科のメンバー、ネコ科のメンバー、イタチ科およびトリ種でのインフルエンザの予防における使用のためのワクチンの製造に役立つ。
【００２２】
本発明はまた、ウマ科のメンバー、ブタ科のメンバー、イヌ科のメンバー、ネコ科のメンバー、イタチ科およびトリ種の群から選択される動物において、インフルエンザを予防する方法であって、本発明の方法を使用して得られるインフルエンザワクチンの有効量を該動物に投与する工程を含む方法に関する。
【００２３】
本発明はまた、インフルエンザウイルスの製造のための、インフルエンザに対して免疫した雌鶏由来の卵の使用である。
好ましい態様によれば、インフルエンザに対して免疫した雌鶏由来の卵の使用は、インフルエンザワクチンの製造のためのものである。
【００２４】
また、最後の態様によれば、インフルエンザに対して免疫した雌鶏由来の卵の使用は、インフルエンザウイルスの製造またはインフルエンザワクチンの製造のためのものであり、ここで、該卵はインフルエンザウイルスの赤血球凝集素に対する抗体を含み、特に、該卵は、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７またはＨ９サブタイプを有するインフルエンザウイルスの赤血球凝集素に対する抗体を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、ドナープラスミドｐＪＹ１３９４．１の完全ヌクレオチド配列を示す。
【図２】図２は、挿入部位Ｆ８に隣接するアーム、および切断部位で修飾したＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／７／０３株のＨＡをコードする合成遺伝子が続くＨ６ワクシニアプロモーターを含む、ドナープラスミドｐＪＹ１３９４．１中のインサートのヌクレオチド配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
語句「インフルエンザウイルス」は、野生株由来のインフルエンザ、および１つまたは複数の野生株のゲノムセグメントの、卵中での強力な増殖ポテンシャルについて選択された「マスター」株との再集合からもたらされたリアソータントな株由来のインフルエンザウイルスの両方を示す。リアソータントな株は、「マスター」株の特性を獲得するが、野生株のＨＡおよびＮＡの特性を少なくとも保持しており、これは、リアソータントな株のＨＡおよびＮＡのタンパク質の配列と、野生株のＨＡおよびＮＡのタンパク質の配列との間の同一性（全アライメントプログラムによって決定される）が、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、さらにより好ましくは１００％であることを意味する。リアソータントな株は、感受性細胞の野生株および「マスター」株の同時感染、その後の望ましいリアソータントな株を選択する適切な手段によって得ることができる。前記株は、WO 01/83794およびWO 03/091401ならびにProc. Nat. Acad. Sci. USA 96:9345-9350 (1999)にて記載されるように、野生株および「マスター」株の核酸の逆遺伝子学、ならびにマルチプラスミド発現系によっても得ることができる。Ｈ５およびＨ７株などのハイパス株の場合、複数の酸性アミノ酸を含む切断部位の修飾は、リアソータントな株にローパスを与えるように実施され得る。
【００２７】
用語を簡略化するために、用語「ワクチン株」または「ワクチンウイルス」は、インフルエンザワクチンの製造のために使用されるインフルエンザウイルスを示すために区別せずに使用され；同様に、用語「感染株」または「感染ウイルス」は、生物学的材料（卵、動物）を感染させるために使用されるインフルエンザウイルスを示すために使用される。
【００２８】
さらに、用語「免疫した雌鶏由来の卵」は、事前に免疫され、雄鶏と接触させた雌鶏から得られた、雌鶏の受精卵を示すために使用される。
【００２９】
一般に、雌鶏の免疫化のために使用されるインフルエンザワクチンは、インフルエンザウイルスのいずれの株から製造してもよい。ワクチン株は、Ａ型ウイルスであってもよいが、ＢまたはＣ型ウイルスであってもよい。Ａ型ウイルスの株である場合、ウイルスはＨＡのいずれのサブタイプおよび／またはＮＡのいずれのサブタイプであり得る。例えば、ウイルスは、流行性ヒトＡ型インフルエンザの現在原因であるＨ１Ｎ１またはＨ３Ｎ２サブタイプを有するウイルス株であり得る。
【００３０】
免疫化がトリインフルエンザからの防御を与えるという条件で、雌鶏をインフルエンザウイルスで免疫することには大きな利点がある。
【００３１】
トリインフルエンザは看過され得るか、または兆候のセット、しばしば、呼吸器官および／または腸管の性質、より高いまたは低い強度（それらは、雌鶏の全身状態をより多くまたは少なく損ない、ウイルス株が高病原性である場合、動物の死亡をもたらし得る）によって特徴付けられ得る。トリインフルエンザは、一般に、産卵能力を減少させるか消失させ得る。Ｈ６Ｎ２またはＨ９Ｎ２、あるいはＨ５またはＨ７サブタイプに属するローパスのウイルス株は、一般に、穏やかな形態のトリインフルエンザの原因であり、一般に、卵の産生を低下させるか消失させるが、死亡率は高くない。一方で、Ｈ５およびＨ７サブタイプに属するハイパスのウイルス株（特に、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ９、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ４またはＨ７Ｎ７）は高病原性であり、雌鶏の農場において非常に高い死亡率をもたらす。
【００３２】
ＨＡは、インフルエンザに対する防御免疫の発達において不可欠な抗原である。本発明の方法において使用するワクチンは、その組成物において、タンパク質および／または該タンパク質をコードする遺伝子の形態で、インフルエンザウイルスのＨＡを少なくとも含む。
【００３３】
用語「遺伝子」は、オープンリーディングフレームに対応し、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を意味することが意図される。発現のための調節配列（プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、転写終止など）の制御下の遺伝子がベクターの核酸、特に、プラスミドまたはウイルスに挿入され、これらの調節配列は、翻訳領域（内在性の配列）と通常関連するものであるか、あるいは、異なる起源（外来性の配列）に由来するものであってもよい。
【００３４】
それは、インフルエンザウイルスのヒト株のＨＡを含むが、雌鶏に対して病原性ではない。好ましくは、それは、目的のＨＡ、すなわち、トリインフルエンザの原因であり、それについて雌鶏を免疫し防御しようとするウイルス株のＨＡと同じサブタイプを有するＨＡを含む。好ましくは、ワクチン中に存在するＨＡのタンパク質の配列と雌鶏を防御することが望まれる株のタンパク質配列との間の同一性の程度は、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％（全アライメントプログラム（Ｂｌａｓｔプログラムなど）の手段によって決定される）である。
【００３５】
通常、ＨＡを含むワクチンは、不活化されたインフルエンザウイルス全体、または不活化されたインフルエンザウイルス全体由来の産物を含む組成物の形態である。
【００３６】
表現「不活化されたインフルエンザウイルス全体由来の産物」は、ウイルス株から調製され、該ウイルス株のＨＡを少なくとも含む不活化された（すなわち、非感染性である）ワクチン組成物を意味することが意図される。ウイルス全体の株由来の産物は、断片化された（または、分割された）ウイルスであってもよく、この場合、「分割された」ワクチンに言及する。ウイルス全体の株由来の別の産物は、この株のＨＡ自体または抽出および精製方法を使用して得られたＮＡと関連したＨＡであり、この場合、「サブユニット」ワクチンに言及する。ＨＡはまた、ビロソームに二次的に組み込まれ得る。不活化されたインフルエンザウイルス全体または不活化されたウイルス全体由来の産物を含むワクチン組成物はまた、１つまたは複数のアジュバントまたはアジュバント処方物を含み得る。アジュバント処方物の非限定的な例として、油中水または水中油乳濁液、例えば、ＭＦ５９（登録商標）乳濁液（Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach Edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995 page 183）、リポソームベースの処方物、ならびにＭＰＬ（Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach Edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995 pages 1186-187）、アブリジン（Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach Edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995 page 148）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach Edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995 page 157）、コリネバクテリウムパルバム、サポニン、リゾレシチン、プルロニック誘導体（Hunter H. et al. 1991, vaccine, 9: 250-256）（Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach Edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995 page 200 and pages 297-311）、アルミニウム塩またはその組合せ（Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach Edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995 pages 249-276）に基づく処方物が挙げられる。好ましくは、油中水乳濁液は、流動パラフィンから、ポリソルベート８０またはポリソルベート８５などの親水性界面活性剤から、およびソルビタンオレアートまたはソルビタントリオレアートなどの親油性界面活性剤からなる。雌鶏にて使用する乳濁液の例が、Stone et al. (1983, Avian Dis., 27: 688-697; 1993; Avian Dis., 37: 399-405; 1991, Avian Dis., 35: 8-16)；M. Brugh et al. (1983, Am. J; Vet. Res., 44: 72-75)；Woodward L. et al. (1985, Vaccine, 3: 137-144)；(Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach Edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995 page 219)に記載されている。ワクチン株は、一般に、雌鶏、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウまたは他のトリ種にて単離された野生株から得られ、この株は、雌鶏にとって最も一般にローパスである。トリインフルエンザサブタイプＨ５またはＨ７から雌鶏を防御するためのワクチンの調製のために使用される単離物（野生株）の例として、Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６８またはＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｔａｌｙ／２２Ａ／９８単離物（Ｈ５Ｎ９サブタイプを有するウイルス株である）、Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｅｎｇｌａｎｄ／Ｎ−２８／７３、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｍｅｘｉｃｏ／２３８／９４／ＣＰＡ、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｍｅｘｉｃｏ／２３２／９４／ＣＰＡまたはＡ／ｄｕｃｋ／Ｐｏｔｓｄａｍ／１４０２／８６単離物（Ｈ５Ｎ２サブタイプを有するウイルス株である���、Ａ／ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｄｏｎｇ／１／１９９６単離物（Ｈ５Ｎ１サブタイプを有するＨＰウイルス株である）、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｔａｌｙ／ＡＧ−４７３／１９９９またはＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｔａｌｙ／１０６７／１９９９単離物（Ｈ７Ｎ１サブタイプを有するウイルス株である）、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｐａｋｉｓｔａｎ／９５単離物（Ｈ７Ｎ３サブタイプを有するＨＰウイルス株である）、ならびにＡ／ｄｕｃｋ／Ｐｏｔｓｄａｍ／１５／８０単離物（Ｈ７Ｎ７サブタイプを有するウイルス株である）が挙げられる。トリインフルエンザサブタイプＨ９から家禽を防御するために使用されるＨ９Ｎ２ウイルス株の例として、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｒａｎ／ＡＶ１２２２１／９８およびＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／ＵＡＥ／４１５／９９単離物が挙げられる。トリインフルエンザサブタイプＨ６から家禽を防御するために使用されるＨ６Ｎ２ウイルス株の例として、Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｉｔａｌｙ／９０単離物が挙げられる。ワクチンの製造のために使用されるワクチン株はまた、特に、逆遺伝学によって得られる野生株のリアソータントな株でもよい。特に、Ｈ５Ｎ１野生株Ａ／ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｄｏｎｇ／１／９６の「マスター」株Ａ／ＰＲ／８／３４との逆組換え（reverse recombination）によって得られたリアソータントな株であるＲｅ−１ワクチン株が挙げられ、該株は、卵中で非常によく増殖する（Tian et al., 2005, Virology, 341: 153-162）。逆遺伝学によって得られるリアソータントな株の別の例として、遺伝学的再集合によって得られ、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｖｉｅｔｎａｍ／Ｃ５８／０４  Ｈ５Ｎ１株のＨ５赤血球凝集素、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｇｅｒｍａｎｙ／１２１５／７３  Ｈ２Ｎ３株のノイラミニダーゼ、およびＡ／ＰＲ／８／３４「マスター」株の内部遺伝子を含むＨ５Ｎ３株である（Webster et al., 2006, Virology, 351: 301-311）。
【００３７】
トリインフルエンザに対するワクチンは、通常、不活化された単一のインフルエンザウイルス株のウイルスを含む（一価ワクチン）が、特定の場合において、不活化されたいくつかのインフルエンザウイルス株を含む多価ワクチンを使用することが有利であり得る。このことは、特に、不活化されたワクチン株Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｔａｌｙ／２２Ａ／９８（Ｈ５Ｎ９）およびＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｔａｌｙ／１０６７／１９９９（Ｈ７Ｎ１）を含む油中水乳濁液である、Ｈ７Ｎ１およびＨ５Ｎ９株に基づくワクチンである。不活化されたワクチンはまた、異なるバレンス（valence）、例えば、Ｈ９Ｎ２トリインフルエンザおよびニューカッスル病に対する二価ワクチンを含み得る。不活化されたワクチンは、一般に、非経口（筋肉内または皮下）で投与される。Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｃｉｏｎ  ＡｐｌｉｃａｄａによるＡｅｒｏｖａｃ  ＡＩワクチン固体（不活化されたワクチン株Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｍｅｘｉｃｏ／２３２／９４／ＣＰＡ（Ｈ５Ｎ２）を含む）の場合、スプレーの形態で投与され得る。免疫化のスキームは、通常、２〜４週間にそれぞれ１または２回の投与を含む。投与されるワクチンの用量は動物の年齢によって変動するが、通常、不活化する前に１０８〜１０１０ＥＩＤ５０／ｍｌの力価を有する尿膜腔液１０〜２００μｌの等価物を含む。ワクチンの用量は通常、０．０５〜１ｍｌの範囲の容積で投与される。不活化されたトリインフルエンザワクチンの調製物が、H. Stone (1987, Avian Dis. 31: 483-490)に記載されている。ワクチン株のＨＡサブタイプが病原性のトリインフルエンザの原因である株のＨＡと同じものである限り、８０％〜９０％のオーダーの２つのＨＡのタンパク質配列の間の同一性の程度（全アライメントプログラムの手段によって決定される）に基づいて、トリインフルエンザの臨床症状に対して得られる防御の割合（罹患率および死亡率）は、一般的に８０％より高いか、好ましくは、９０％より高い。このことは、ワクチン株ＨＡのタンパク質配列と、病原性感染株ＨＡのタンパク質配列との間の８０％〜９０％のオーダーの同一性の程度が、この防御の割合を得ることに十分であることを示すM. Bublot et al., 2007, Avian Dis. 51: 332-337の調査によって確認されている。さらに、この防御の割合を得るために、ワクチン株のＮＡサブタイプが病原性の感染株のＮＡのものと同じである必要はない。さらに、トリインフルエンザワクチンは、感染性のウイルスに曝露された免疫された動物においてウイルスの排出を大きく減少させることが、経口および総排出腔サンプルにて観察されたウイルスの負荷の明確な減少から決定された(M. Bublot et al., 2007, Avian Dis. 51: 332-337)。トリインフルエンザワクチンの別の有益な効果は、雌鶏の農場におけるウイルスの拡散を減少させるものである。
【００３８】
本発明の方法の別の実施態様によれば、雌鶏を免疫するために使用されるワクチンは、弱毒化インフルエンザワクチン株を含む組成物の形態である。ワクチン株は、一般に、目的のＨＡおよび二次的に目的のＮＡを発現する野生株と、低温に適応しているか、および／または温度感受性である「マスター」株との間の遺伝学的再集合後に選択されたリアソータントの形態である。リアソータントな株は、その表面にて目的のＨＡ、二次的に目的のＮＡを発現するウイルス株であって、同時に、トリの内部温度の狭い温度内でのみ複製する能力に関する「マスター」株の病原性特性を保持している。結果として、ウイルス株は、雌鶏に投与された後で、限られた様式で局所的に複製する。これらのリアソータントな株を得る方法は、当業者に周知であり、特に、WO 03/091401およびWO 2006/063053ならびにWareing M.D. et al., 2002, Vaccine 20: 2082-2090に記載されている。ワクチンの投与は、一般に、噴霧によって実施される。弱毒株を製造する別の手段は、ＮＳ１タンパク質をコードする遺伝子を切断することである（Richt J.A. et al., Vaccination of pigs against swine influenza viruses by using an NS1-truncated modified live-virus vaccine, 2006, J. Virol., 80: 11009-18；Quinlivan M. et al., Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein, 2005, J. Virol., 79: 8431-9）。
【００３９】
ワクチン株は、ベロ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはニワトリ胚細胞（ＣＥＫ、ＰＣＪ）などの細胞での培養技術を使用する、および／または胚形成卵での従来の製造方法を使用する任意の手段によって製造され得る。ウイルスを回収、精製、および適切には不活化する方法もまた、当業者に周知である。
【００４０】
本発明の方法の別の実施態様によれば、ワクチンは、インビトロでの発現系において製造されるタンパク質の形態である。例えば、ＨＡは、昆虫細胞での組換えバキュロウイルスを使用する発現系にて使用され得る(Crawford J. et al., Baculovirus-derived hemagglutinin vaccines protect against lethal influenza infections by avian H5 and H7 subtypes, 1999, Vaccine, 17: 2265-74)。赤血球凝集素はまた、「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）の形態（Prel A. et al., Assessment of the protection afforded by triple baculovirus recombinant coexpressing H5, N3, M1 proteins against a homologous H5N3 low-pathogenicity avian influenza virus challenge in Muscovy ducks, 2007, Avian Dis., 51: 484-9；Pushko P. et al., Influenza virus-like particles comprised of the HA, NA, and M1 proteins of H9N2 influenza virus induce protective immune responses in BALB/c mice, 2005, Vaccine, 23: 5751-9）、またはレトロウイルスベースの偽型の形態（Szecsi J. et al., 2006, Virol. J., 3: 70）でインビトロにて発現され得る。インビトロで製造されたタンパク質または製造されたウイルス粒子は、多かれ少なかれ精製され、次いで、不活化されたワクチンにて使用される種々のアジュバントと組み合わされる。
【００４１】
本発明の方法の別の実施態様によれば、インフルエンザワクチンは、インフルエンザワクチンのＨＡをコードする核酸フラグメントを含むベクターを含む。
【００４２】
用語「ベクター」は、生物、細胞または細胞成分中に伝播され得るおよび／または移行され得る核酸構造をいう。ベクターは、特に、自動的に複製することができるか、または宿主細胞の染色体に組み込まれ得る、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミドおよび人工染色体を含む。
【００４３】
表現「インフルエンザウイルスのＨＡをコードする遺伝子を含むベクター」は、目的のＨＡおよび／またはＮＡをコードする核酸を含み、トリ細胞に導入した後で、該細胞にてＨＡおよび／またはＮＡを発現するベクターを意味することが意図される。目的のＨＡを発現するプラスミドであってもよいが、一般に、そのゲノムに目的のＨＡをコードする核酸を含み、感染した細胞にて目的のＨＡを発現するウイルスベクターである。ＨＡをコードする核酸のウイルスベクターのゲノムへの組込みは、一般に、分子生物学技術、特に、遺伝学的組換え、クローニング、逆遺伝学などによって実施される。ＨＡは、ウイルスベクターの表面で発現してもしなくてもよい。好ましくは、ウイルスベクターは、インビトロでの複数回の継代、または特定の遺伝子の欠失によって従来的に弱毒化されて、トリ細胞におけるベクターウイルスの複製が十分に制限され、雌鶏の全身の状態に対して影響がないので、非病原性であると考えられる。ウイルスベクターの例として、トリパラミクソウイルス(Ge J., et al., Newcastle disease virus-based live attenuated vaccine completely protects chickens and mice from lethal challenge of homologous and heterologous H5N1 avian influenza viruses, 2007, J Virol., 81: 150-8)；シチメンチョウヘルペスウイルス（ＨＶＴ）またはマレック病ヘルペスウイルス(Sondermeijer et al., 1993, Vaccine, 11, 349-358)；感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）(Veits J., et al., Deletion of the non-essential UL0 gene of infectious laryngotracheitis (ILT) virus leads to attenuation in chickens, and UL0 mutants expressing influenza virus hemagglutinin (H7) protect against ILT and fowl plague, 2003, J Gen. Virol., 84: 3343-52；Luschow D. et al., Protection of chickens from lethal avian influenza A virus infection by live-virus vaccination with infectious laryngotracheitis virus recombinants expressing the hemagglutinin (H5) gene, 2001, Vaccine, 19: 4249-59)；アデノウイルス(Francois A. et al., Avian adenovirus CELO recombinants expressing VP2 of infectious bursal disease virus induce protection against bursal disease in chickens, 2004, Vaccine, 22: 2351-60；Gao W. et al., Protection of mice and poultry from lethal H5N1 avian influenza virus through adenovirus-based immunization, 2006, J Virol., 80: 1959-64；Toro H. et al., Protective avian influenza in ovo vaccination with non-replicating human adenovirus vector, 2007, Vaccine, 25: 2886-91)；コロナウイルス(Cavanagh, 2007, Vet Res. 38: 281-97; Eriksson, 2006, Clin. Dev. Immunol. 13: 353-60)が挙げられるが、雌鶏の免疫のために、ポックスウイルス、特に、ワクシニアウイルスＮＹＶＡＣ（欠失ワクシニアウイルス）、ワクシニアウイルスＭＶＡ株、特に、トリポックスウイルス、特に、カナリアポックスウイルス、ＡＬＶＡＣ（弱毒化されたカナリアポックスウイルス）、ハトポックス、ウズラポックス、シチメンチョウポックス、スズメポックスおよび最も特に家禽ポックス、ＴＲＯＶＡＣ（弱毒化家禽ポックス)が使用される（特に、AU 701599BおよびAU 701781BならびにUS 5,756,103に記載される）。必要に応じて、弱毒化ウイルスベクターは、目的のＨＡのみを発現し；含まれるワクチンは、特に、Ｈ５Ｎ８インフルエンザウイルス株のＨＡを発現するＴＲＯＶＡＣ家禽ポックスベクター（Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｉｒｅｌａｎｄ／１３７８／８３）を含むワクチンである。他の場合において、弱毒化ウイルスベクターは、目的のＨＡと一緒に目的のＮＡの両方を発現し、例えば、Avian Pathology, 32: 25-32, 2003に記載の組換えポックスウイルスは、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルス株由来のＨＡおよびＮＡの両方を発現する。目的のＮＡは、雌鶏を免疫し、防御しようとするウイルス株のＮＡと同じサブタイプを通常有するＮＡである。さらに他の場合、弱毒化ベクターは、MingXiao M. et al., 2006, Vaccine, 24: 4304-4311に記載の組換えポックスウイルス（Ｈ５およびＨ７サブタイプの両方を発現する）などの場合、異なるサブタイプに属する目的のいくつかのＨＡを発現する。これらのベクターの免疫原性の能力は、免疫賦活能力を示すサイトカインおよび／またはケモカイン（ＩＬ−１、ＩＦＮ、ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８またはＴＮＦ  ５）をコードする遺伝子を組込むことによってさらに強化され得る（Vaccine, (2006), 24: 4304-4311）。インフルエンザウイルスのＨＡをコードするベクターに基づくワクチンはまた、その免疫原性を増加させるために、アジュバンドと組み合わせられ得る。
【００４４】
ウイルスベクターを含むワクチン組成物は、特にベクターに応じて、種々の経路によって投与してもよく；例えば、アラーメンブレン（alar membrane）の貫通（ポックスウイルスベクター）、針を用いるかまたは用いない筋肉内、皮下または経皮経路を介して（任意のベクター）、卵内経路を介して（１７〜１９日齡の胚形成卵；例えば、ＨＶＴ／Ｍａｒｅｋおよびアデノウイルスにて）、眼または口腔鼻経路を介して、スプレーによるか、飲料水（パラミクソウイルス、コロナウイルス、アデノウイルスベクター）にて、または別々に少なくとも１５日に１または２回の注射で。投与するワクチンの用量は、１〜７ｌｏｇ１０５０％感染単位のオーダー（好ましくは、家禽ベクターについて２〜４ｌｏｇ１０の用量）である。不活化または弱毒化インフルエンザウイルス全体を使用する従来の免疫化と比べて、ウイルスベクターに基づく免疫化の利点は、免疫した動物は感染した動物と区別され得るという事実にある。さらに、ウイルスベクターを用いた免疫化は、動物の防御を強化し得る細胞性免疫の発達を促進する。Avian Dis., (2007), 51: 325-331 and Avian Dis., (2007), 51: 498-500にて示されるように、雌鶏にて獲得される防御の程度および養鶏場でのウイルスの拡散の減少は、不活化インフルエンザウイルスを含む従来のワクチンを用いて観察されたものと同じである。
【００４５】
雌鶏の免疫化がいくつかの注射を含む場合、第１の投与にて使用されるワクチンは、第２の注射または続く注射にて使用されるものと異なり得る。２つの異なる弱毒化ウイルスベクターが、例えば、第１の免疫化にて目的のＨＡを発現する組換えＡＬＶＡＣベクターを、および続く免疫化にて目的の同じＨＡを発現する組換えＴＲＯＶＡＣまたはＮＹＶＡＣベクターを使用して、ＡＬＶＡＣベクターに対する抗体応答が組換えＴＲＯＶＡＣまたはＮＹＶＡＣベクターによる雌鶏細胞の感染、続く感染細胞でのＨＡの発現を妨げないように使用され得る。また、「プライムブースト」法を使用してもよく、この方法は、第１の注射にてＨＡを発現する弱毒化ウイルスベクターを使用し、ブースト注射にて、例えば、第１の免疫化にて使用したＨＡと同じサブタイプに属する１つまたは複数の不活化ワクチン株を含むワクチンを使用するか、または、逆の順番でプロセスを実施する。また、目的のＨＡを発現するプラスミドを使用して、第１の注射にてＤＮＡの免疫化を実施し、続いて、第１の免疫化にて使用したＨＡと同じＨＡを発現するサブタイプに属するか第１の免疫化にて使用したＨＡと同じＨＡ不活化ウイルス株および／または弱毒化ウイルスベクターを含むワクチンを使用してブースト注射を行ってもよい。
【００４６】
投与するワクチンの型または採用する免疫化スキームが何であっても、雌鶏のトリウイルスからの防御は、迅速に、一般に、ワクチン用量の投与後７〜１８日の間で提供される。しかしながら、約１年間続くその産卵活動を通じて雌鶏のトリウイルスからの防御を確かにするために、最初のワクチンの投与後３〜１６週間で、１回または２回のブースト免疫化を実施することが推奨される。不活化ワクチンを用いるいくつかの免疫化スキームが産卵中の雌鶏にて使用され得；例えば、２回の注射（３〜６週齢での第１の注射、および産卵開始の直前の１６〜１９週齢での第２の注射）、または３回の注射（約２〜４週齢での第１の注射、３〜４週間後の第２の注射、および産卵開始の直前の１６〜１９週齢での第３の注射）。また、産卵の間、ブースターを投与してもよい。２つの異なるワクチンを使用する「プライムブースト」スキームにおいて、生後１日目のヒヨコを鶏痘ベクターベースのワクチンで免疫してもよく；続いて、ヒヨコは、不活化インフルエンザウイルスでの１回（産卵開始前の３〜６週齢にて）または２回（３〜６週齢および産卵開始前の１６〜１９週齢にて）の免疫化を受ける。
【００４７】
本発明の方法の実施において、一旦雌鶏のトリインフルエンザからの防御が確かにされた場合（通常、ワクチンの投与後７〜１８日間で生じる）、好ましくは、卵は該雌鶏から採取される（Bublot M. et al. (2006, Annals of the New York Academy of Sciences 1081: 193-201); Van der Goot et al. (2005, Proc. Natl. Acad. Sc., 102: 18141-6); Ellis et al. (Avian Pathol. 2004, 33, 405-412)）。
【００４８】
免疫した雌鶏由来の卵にてインフルエンザ抗体、特に、ＨＡに対する抗体、詳細には、インフルエンザウイルスの感受性の高い卵への侵入をブロックする赤血球凝集（ＩＨＡ）を抑制する抗体が存在するにも関わらず、インフルエンザに対して免疫した雌鶏から生じた胚形成卵からインフルエンザウイルスを製造するために使用される方法は従来からあるものである。好ましくは、コントロールされた環境で飼育された免疫した雌鶏から得られた９〜１４日の胚形成卵が使用される。胚形成のプロセスは、以下のやり方でコントロールされる：１０〜２０℃、好ましくは、１６〜１８℃の温度で、一般に、産卵から１週間を超えない期間保存された卵を使用する。胚形成のプロセスは、３７．５℃±１℃の温度で、７０±１０％の相対湿度を有する加湿チャンバーにて、９〜１４日間卵をインキュベートすることによって引き起こされる。胚形成卵を検卵によって選択し、尿膜腔を通常少ない体積中の２〜７ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０のウイルスの用量で感染させる。ウイルスをウイルス株の病原性に応じて一般に１〜４日間の範囲で増殖させ、ウイルス株の表現型および低温または高温適応の程度に応じて変動し得る温度で増殖させる。インフルエンザウイルスの増殖のための温度は、一般に、２８〜３９℃の範囲であり、通常、３３〜３９℃の範囲である。次いで、感染した尿膜液を回収し、意図する使用に応じて処理する。
【００４９】
この方法を使用して、ＨＡのサブタイプが雌鶏を免疫するために使用したワクチンに含まれるＨＡのサブタイプと異なるインフルエンザウイルスを製造し得る。これは、例えば、雌鶏をＨ５トリインフルエンザから防御するために雌鶏を不活化したＨ５Ｎ９ウイルスで免疫する一方で、これらの雌鶏由来の卵をＨ１Ｎ１またはＨ３Ｎ２インフルエンザウイルス、または最新のヒトインフルエンザの流行性の形態に対するワクチンを調製するためにＢ型インフルエンザウイルスで感染させる場合である。本発明の方法のバリアントによれば、免疫した雌鶏由来の胚形成卵を使用して製造されるインフルエンザウイルスのＨＡサブタイプは、雌鶏を免疫するために使用したＨＡとは異なるサブタイプを有するが、一方で、製造されたインフルエンザウイルスのＮＡは、ワクチンにて使用されるウイルスのＮＡと同じサブタイプを有する。これは、例えば、雌鶏をトリインフルエンザから防御するために、Ｈ５およびＮ１を発現する不活化Ｈ５Ｎ１ウイルス株または組換えポックスウイルスで雌鶏を免疫する一方、免疫した雌鶏由来の胚形成卵をＨ１Ｎ１ウイルス株に感染させる場合である。
【００５０】
本発明の方法の別の態様によれば、免疫した雌鶏由来の胚形成卵にて得られたインフルエンザウイルスのＨＡは、雌鶏を免疫するために使用したワクチンに含まれるＨＡと同じサブタイプを有する。これは、例えば、雌鶏をＨ５を発現する不活化したＨ５Ｎ１ウイルスまたは組換えポックスウイルスで免疫する一方で、免疫した雌鶏由来の卵をＨ５Ｎ１またはＨ５Ｎ９インフルエンザウイルスに感染させる場合である。卵中に「サブタイプ」特異的な交差反応性の抗ＨＡ抗体が存在している（これは、ワクチン組成物中に含まれるＨＡが免疫した雌鶏由来の胚形成卵に感染したインフルエンザウイルス株のＨＡと同じサブタイプを有する場合である）にも関わらず、これはウイルスの複製に対してネガティブな効果を有さない。
【００５１】
また、さらに驚くべきことに、この複製は、免疫した雌鶏由来の胚形成卵を感染させるために使用したインフルエンザウイルスとこれらの雌鶏を免疫するために使用されたインフルエンザウイルスとの間に完全な同一性が存在する場合においても影響を及ぼされない。この場合、サブタイプ特異的な交差反応性抗ＨＡ抗体および特定の株について高度に特異的である抗ＨＡ抗体（株特異的な抗体とも呼ばれる）の両方が見出されるので、これは、卵においては、さらにブロードな抗ＨＡ抗体のパネルの存在によって反映される（実施例３を参照のこと）。広範に確立された見解に反して、卵中のインフルエンザ抗体の存在、詳細には、抗ＨＡ抗体の存在は、インフルエンザウイルスの複製に影響を及ぼさない。インフルエンザに対して免疫した雌鶏由来の卵から得られた感染した尿膜液にて回収されたウイルスおよび／または血球凝集性抗原の量は、免疫していない雌鶏由来の卵から得られた感染した尿膜液にて回収されたものと同じオーダーである（実施例１および２を参照のこと）。
【００５２】
本発明の方法はまた、リアソータントなウイルス株の製造に利点を有し得る。この場合、第１の工程において、免疫した雌鶏由来の胚形成卵は、野生型のウイルス株および胚形成卵にてよく複製するマスターウイルス株（例えば、Ａ／ＰＲ／８／３４株）に同時感染している。第２の工程において、複製できない野生株が一般に非常に少量であるが、リアソータントおよびマスター株の混合物を実質的に含む感染した尿膜液を収集する。Ａ／ＰＲ／８／３４株の表現型の特性（すなわち、胚形成卵における良好な複製能）ならびに野生株のＨＡおよびＮＡを同時に発現するリアソータントな株を、次いで、各クローニング工程にて、当業者に周知の方法に従って、回収した感染性尿膜液をＡ／ＰＲ／８／３４に特異的な抗ＨＡおよび抗ＮＡ抗体と混合することによる連続的なクローニングを用いて選択する。また、弱毒ウイルス生ワクチンを目的として、低温適応性および熱感受性リアソータントな株を製造することもできる。この場合、第１の工程において、免疫した雌鶏由来の胚形成卵は、体温適応性から熱感受性の表現型特性を有する野性型ウイルス株およびマスター株に同時感染している。この場合、感染した卵のインキュベーションのための温度は、通常より低い温度である（温度は、一般に３５℃または３０℃未満である）。第２の工程において、低温感受性の野生株は複製していないので、リアソータントおよびマスター株の混合物を実質的に含む感染した尿膜液を収集する。マスター株の表現型の特性（詳細には、低温適応および／または温度感受性）ならびに野生株のＨＡおよびＮＡを発現するリアソータントを、次いで、各クローニング工程にて、当業者に周知の方法に従って、回収した感染性尿膜液をマスター株に特異的な抗ＨＡおよび抗ＮＡ抗体と混合することによる連続的なクローニングを用いて選択する。
【００５３】
トリインフルエンザから雌鶏の繁殖コロニー、より一般的には家禽（アヒル、シチメンチョウ、ガチョウなど）の繁殖コロニーを防御するためのワクチンを調製するための第１の系統として、本発明の方法を実施する。トリインフルエンザの無症候性または穏やかな形態に関与するウイルス株はいずれのサブタイプであってもよく、詳細には、Ｈ９Ｎ２、Ｈ６Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３またはＨ７Ｎ１サブタイプであってよい。これらのウイルス株は、繁殖コロニーにおいて実質的な死亡率を引き起こさないが、卵の産生において一時的な減少の原因になり得る。繁殖コロニーにおいて実質的な死亡率をもたらすトリインフルエンザの深刻な形態に関与するハイパスなウイルス株は、一般に、Ｈ５およびＨ７サブタイプ、詳細には、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ４またはＨ７Ｎ７に属する。
【００５４】
一般に、本発明の方法の工程ａ）にてトリインフルエンザに対して雌鶏を免疫するために使用するワクチン組成物に含まれるインフルエンザウイルスの赤血球凝集素および該方法の工程ｃ）にて胚形成卵を感染させるために使用するウイルスの赤血球凝集素は同じサブタイプを有し、詳細には、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７およびＨ９サブタイプはトリインフルエンザの原因であるウイルス株にて原則的に見出されるので、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７およびＨ９サブタイプから選択される。
【００５５】
特定の態様において、本発明の方法の工程ａ）にてトリインフルエンザに対して雌鶏を免疫するために使用するワクチン組成物に含まれるインフルエンザウイルスの赤血球凝集素および該方法の工程ｃ）にて胚形成卵を感染させるために使用するウイルスの赤血球凝集素は同じサブタイプを有し、詳細には、Ｈ５およびＨ７サブタイプはトリインフルエンザおよびヒトインフルエンザの深刻な形態の原因であるウイルス株にて見出されるので、Ｈ５およびＨ７サブタイプから選択される。特徴付けられているトリインフルエンザおよび／またはヒトインフルエンザの深刻な形態の原因であるウイルス株は、一般にＨ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ３またはＨ７Ｎ７サブタイプに属する。
【００５６】
したがって、詳細には、本発明は以下である：
インフルエンザウイルスの製造方法であって、
ａ．インフルエンザワクチンを雌鶏に投与する工程、
ｂ．免疫した雌鶏から卵を採取する工程、
ｃ．胚形成プロセスを引き起こす工程、
ｄ．インフルエンザウイルスを尿膜腔に接種することによって、胚形成卵を感染させる工程、
ｅ．感染した胚形成卵を、ウイルスの複製を可能にする温度および湿度条件下でインキュベートする工程、および
ｆ．ウイルスを含む尿膜液を回収する工程を含む方法。
雌鶏の免疫化スキームが２回の注射を予定する場合、第１の注射は不活化されたインフルエンザウイルス全体の代わりに、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素Ｈ５またはＨ７サブタイプをコードする遺伝子を含むベクター、一般にポックスウイルスを含むワクチン組成物を用いて実施され得る。
【００５７】
感染した尿膜液がインフルエンザワクチンの製造のために意図される場合、本発明の方法は、一般に、ウイルス株を精製するさらなる工程を含み、所望により、FR 2201079またはFR 1538322に記載されるような当業者に周知の方法を使用するウイルスの不活化工程が前または後に行われる。
【００５８】
精製は短時間であってもよく、一般に、感染した尿膜液を澄ました後で、遠心分離によってウイルスを濃縮する工程に限定してもよい。精製は、例えば、ショ糖密度勾配の手段（EP 0 7760362）によって実施されるゾーン遠心分離工程を用いて補われ得る。ウイルスを精製するために、クロマトグラフィー法を実施してもよい。不活化された全体ワクチンまたは弱毒化ワクチンの組成物を構成する精製ウイルス全体の懸濁物が得られる。
【００５９】
ウイルス懸濁物の不活化が、β-プロピオラクトン(E. Budowsky et al. 1991, Vaccine, 9: 319-325; 1991, Vaccine, 9: 398-402; 1993, Vaccine, 11: 343-348)、エチレンイミンまたは誘導体(D. King 1991, Avian Dis. 35: 505-514)またはホルモル(EP 0 776 0362)を使用する従来の手段によって実施される。
【００６０】
不活化されたウイルス全体に基づくワクチン組成物が、１つまたは複数のアジュバントを用いて処方され得る。これらのワクチンは従来、アルミニウム塩を用いるか、または油中水もしくは水中油乳濁物にて処方され得る（トリインフルエンザワクチンの場合）が、パラフィン、ポリソルベート８０、ポリソルベート８３またはポリソルベート８５などの親水性界面活性剤、およびソルビタンオレアート、ソルビタンセスキオレアートまたはソルビタントリオレアートなどの疎水性界面活性剤からなる油中水乳濁物が通常使用される。インフルエンザに対する体液性および／または細胞性応答を増加させ得る任意のアジュバントが使用され得る。非限定的なアジュバント処方物の例として、ＭＦ５９（登録商標）乳濁物、リポソームベースの処方物、およびＭＰＬ、コリネバクテリウムパルバム、サポニン、リゾレシチン、プルロニック誘導体またはその組合せに基づく処方物が言及される。
【００６１】
精製したウイルス懸濁物はまた、次の処理を受け得る。インフルエンザウイルス由来の生成物が得られる。例えば、断片化されているかまたは分割されたウイルスに基づくワクチン、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素を含むビロソーム、またはサブユニットワクチンを製造するために、当業者に周知の方法に従って洗剤または脂質溶媒を使用して、断片化され得る。精製したウイルスから得られる断片化されているかまたは分割されたウイルスに基づくワクチン、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素を含むビロソーム、またはインフルエンザウイルスの赤血球凝集素を含むサブユニットワクチンは、インフルエンザウイルス由来の生成物であると考えられる。これらに由来する生成物を含むワクチンが、同様に、１つまたは複数のアジュバントと一緒に処方され得る。
【００６２】
本発明の方法の手段によって得られるワクチンは、ヒトおよび動物をインフルエンザから防御することにおける使用のためのものである。
【００６３】
獣医学分野において、ワクチンはトリインフルエンザの予防分野において主に使用されるが、ウマ科のメンバー、詳細にはウマ、イヌ科のメンバー、詳細にはイヌ、ネコ科のメンバー、詳細にはネコ、ブタ科のメンバー、詳細にはブタ、イタチ科、詳細にはミンクおよびフェレット、ならびにトリ種、詳細には雌鶏、アヒル、シチメンチョウ、ウズラ、ホロホロチョウ、ガチョウおよびダチョウにてインフルエンザの症状および／またはウイルスの分泌を阻止または低減させるためにも使用され得る。ワクチン組成物が不活化されたウイルス株全体または由来する生成物を含む場合、該組成物は、一般に、皮下または筋肉内に、あるいは所望により家禽の繁殖コロニーにて霧状にした材料の形態で投与される。ワクチンが弱毒化生ウイルスの形態である場合、該ワクチンは、一般に、スプレー、飲料水または目薬で口鼻を介して投与される。免疫化スキームは、一般に、注射またはブースターの前の注射を提供する。投与されるワクチンの用量は、動物の大きさおよび年齢に依存する。前記用量は、通常、不活化する前に１０８〜１０１０ＥＩＤ５０／ｍｌの力価を有する尿膜液２０〜２００μｌを含み、０．０５〜１ｍｌの体積で注射される。
【００６４】
ヒトにおいて、ワクチンは、流行性のインフルエンザおよび汎発性インフルエンザの予防分野にて使用される。流行性のインフルエンザが、流行性のインフルエンザの原因であるウイルス株のＨＡと抗原的関連性が存在し、特定の免疫（例え、部分的に有効であるとしても）が存在する１つ（または複数）のインフルエンザウイルス株に接触（肝線維よって）または免疫化によって既に感作されているヒトの集団に影響を及ぼす一方で、汎発性インフルエンザの新たなウイルス株は従来循環しているウイルス株と抗原的関連性を有していないかほとんど有していないので、汎発性インフルエンザはこのウイルス株に感作されていないヒトの集団に影響を及ぼす。
【００６５】
流行性インフルエンザワクチンは、既に循環したことがある従来のウイルス株と抗原的関連性を有する循環している季節性のインフルエンザウイルス株によって引き起こされる季節性インフルエンザの形態からヒトの集団を防御することが意図される。これまでに、流行性インフルエンザの原因であるインフルエンザウイルス株（流行性インフルエンザウイルス株）は、Ａ型（Ｈ１Ｎ１もしくはＨ３Ｎ２サブタイプに属する）またＢ型である。
【００６６】
汎発性インフルエンザのワクチンは、ＨＡに関して、従来循環しているウイルス株と抗原的関連性を有していない新たなインフルエンザウイルス株である汎発性インフルエンザウイルス株による感染からヒト集団を防御することが意図される。
【００６７】
流行性または汎発性インフルエンザのワクチンは、弱毒化生ワクチンまたは不活化ワクチンの形態であってもよいが、汎発性インフルエンザの予防にとって、不活化ワクチンが好ましい。ワクチンは、一価ワクチン（１つのインフルエンザウイルス株から調製されたワクチン）または多価ワクチン（いくつかのインフルエンザウイルス株から調製されたワクチン）の形態であってよい。流行性インフルエンザワクチンの組成物は、これまでのところ、Ｈ３Ｎ２およびＨ１Ｎ１株ならびにＢ型ウイルス株から調製した三価ワクチンの形態である。不活化ワクチンは、一般に、ウイルス全体、断片化ウイルス（分割されたワクチン）もしくはベロソームの形態であるか、またはＨＡを含むサブユニット形態であり、所望により、上記のような１つまたは複数のアジュバントを含む。粘膜免疫の発達を促進するために、弱毒化生ワクチンは通常経口または経鼻で投与される一方で、不活化ワクチンは、非経口（筋肉内または皮下）、皮内、またはさらに経粘膜（鼻腔内）に、あるいは、WO 01/22992にて記載されるように２つの異なる投与経路を組み合わせることによって投与してもよい。免疫化スキームは、一般に、注射またはブースター後の注射を提供する。投与されるワクチンの用量は、個体の年齢およびアジュバントの有無に依存する。通常、ワクチンの用量は、ワクチンに含まれる各ワクチン株のＨＡ１５μｇの等価物を含む。ワクチンをアジュバントと組み合わせる場合、この用量は、ＨＡ約１〜２μｇまで減少させてもよく、または、高齢の個体または免疫不全を患う個体では、ＨＡ３０μｇまで増加させてもよい。
【００６８】
また、本発明は、インフルエンザウイルスの製造またはインフルエンザワクチンの製造のための、インフルエンザに対して免疫した雌鶏由来の卵の使用である。広く確立された見解に対して、免疫した雌鶏由来の卵中のインフルエンザウイルスの赤血球凝集素に対する抗体の存在は、その尿膜腔に感染させた後で産生されるインフルエンザウイルスの量に影響を及ぼさない。
【００６９】
以下の実施例は、非限定的に、本発明の種々の実施態様を示す。
これらの配列の種々の起源は、以下のとおりである：
・１〜５３：Ｍ１３Ｆプライマーの配列を含む、クローニングプラスミドの部分配列（下線部）。
・５４〜１４８３：ＴＲＯＶＡＣ鶏痘ベクターのゲノムに位置するＦ８インサートに隣接する「左腕」の配列。
・１４８４〜１５６８：左腕とＨ６プロモーターとの間のリンカー配列。
・１５６９〜１６９２：ワクシニアウイルスＨ６プロモーターの配列
・１６９３〜３３８７：Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／７／０３株の修飾した合成ＨＡ遺伝子であって；アミノ酸配列を上に示し、アミノ酸ごとのヌクレオチド配列を１文字表記で示す。
・３３８８〜３４１４：ＨＡ遺伝子と鶏痘の初期遺伝子のＴＴＴＴＴＡＴ転写終止配列を含む右腕との間のリンカー配列。
・３４１５〜４７９０：ＴＲＯＶＡＣ鶏痘ベクターのゲノムに位置するＦ８インサートに隣接する「右腕」の配列。
・４７９１〜４８８５：Ｍ１３Ｒプライマーの配列を含む、クローニングプラスミドの部分配列（下線部）。
【実施例】
【００７０】
実施例１：トリインフルエンザウイルス株Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｔａｌｙ／２２Ａ／９８（Ｈ５Ｎ９）を含む不活化ワクチンの２回の注射、またはＨ５Ｎ１株のＨＡをコードする組換えトリポックスウイルスの注射、その後のトリインフルエンザウイルス株Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｔａｌｙ／２２Ａ／９８（Ｈ５Ｎ９）を含む不活化ワクチンの第２の注射のいずれかで免疫した雌鶏由来の胚形成卵を使用するヒト流行性インフルエンザに対するワクチンを調製するために使用される２つのワクチン株Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）およびＡ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／５５／０４（Ｈ３Ｎ２）を製造する方法
１．１）操作プロトコル
１．１．１）組換えベクターｖＦＰ２２１１の構築
ｖＦＰ２２１１は組換え鶏痘ウイルスであって、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／７／０３  Ｈ５Ｎ１株の赤血球凝集素（ＨＡ）をコードする合成遺伝子がそのゲノムに挿入されている。ＨＡ遺伝子を合成して、切断部位を除き、ＧｅｎＢａｎｋヌクレオチド配列データベースにてＥＦ４７３０８０として（GenPeptタンパク質配列データベースにてＡＢＯ３０３４６として）記載されるＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／７／０３のネイティブな配列と同一のアミノ酸配列をコードする翻訳領域を得た。３３９位と３４７位の間に位置するＲＥＲＲＲＫＫＲＧアミノ酸配列（ハイパス株の切断部位に対応する）をＲＥ−−−−ＴＲＧ配列で置換した。このように修飾した切断部位は、サブタイプＨ５のローパス株の切断部位に対応する。
【００７１】
第１の工程において、H6ワクシニアプロモーターの制御下で修飾した合成ＨＡ遺伝子を含み、Ｆ８インサート部位の隣接アームに接するドナープラスミド（Taylor J. et al., Vaccine, 1988, 6: 504-508; Guo P. et al., J. Virol., 1989, 63: 4189-4198; Perkus M. et al., J. Virol., 1989, 63: 3829-3836）を構築して、鶏痘ベクターゲノムのＦ８挿入部位へのＨＡ遺伝子の挿入が可能にした。Ｆ８挿入部位は、SrinivasanおよびTripathy(2005, Veterinary Microbiology 108: 215-223)に記載のフォトリアーゼをコードする鶏痘遺伝子に対応し；この遺伝子はまた、鶏痘ゲノムの完全な配列においてFPV158の名称で記載されている(GenBank、参照ＡＦ１９８１００）。ＨＡ遺伝子およびＨ６プロモーターのＦ８部位への挿入は、リコンビナントからのＦＰＶ１５８遺伝子の欠失をもたらす。プラスミドｐＪＹ１３９４．１の完全なヌクレオチド配列およびＨＡに隣接する一連のヌクレオチド配列（プラスミドの完全な配列にも見られる）を、それぞれ図１および２に記載する。
【００７２】
次いで、プラスミドｐＪＹ１３９４．１の隣接するアームと鶏痘ゲノムの間の二重組換えによって、組換えウイルスｖＦＰ２２１１を得た。これのために、初代ニワトリ胚細胞をＮｏｔＩを用いて線状化したプラスミドｐＪＹ１３９４．１でトランスフェクションさせ、親鶏痘株（ＴＲＯＶＡＣベクター）で感染させた（１０の感染多重度）。ＴＲＯＶＡＣベクターは、Ｍｅｒｉａｌ社によってニワトリにて鶏痘に対して製造されたＤｉｆｔｏｓｅｃワクチンのワクチン株に由来する。組換えウイルスは、挿入されたＨＡ遺伝子を検出するためのプローブを用いる溶解プラークに対する特異的なハイブリダイゼーションによって選択した。このようにして単離したｖＦＰ２２１１を、次いで、ニワトリ胚細胞上でローリングボトルにて製造した。
【００７３】
１．１．２）不活化Ｈ５Ｎ９ワクチンの調製
H. Stone(1987, Avian Dis. 31: 483-490)に記載のものと等しい方法に従って、胚形成卵にて製造され、ベータ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）を用いて不活化し、流動パラフィン、ソルビタンオレアートおよびポリソルベート８０からなる油中水のローパスのＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｔａｌｙ／２２Ａ／９８  Ｈ５Ｎ９株を含む不活化Ｈ５Ｎ９ワクチン（Ilaria Capua研究室（Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Laboratorio Virologia、パドア、イタリア）より提供）を調製した。乳濁物の界面活性剤の混合物であるＨＬＢ（親水性親油性バランス）は、５．３の値を有する。ワクチンの用量は、不活化前に１０８．９ＥＩＤ５０／ｍｌの力価を有する尿膜液６０μｌと等価である。
【００７４】
１．１．３）産卵雌鶏の免疫化
特定病原体除去（ＳＰＦ）状態を有する生後１日目（Ｄ０）のレッグホーン種のヒヨコの群（Ｇ１およびＧ２）を形成した。以下の免疫化スキームを群Ｇ１に適用した：３．０  ｌｏｇ１０  ＣＣＩＤ５０／０．２ｍｌの力価を有するｖＦＰ２２１１のウイルス懸濁物０．２ｍｌを生後１日目（Ｄ０）のヒヨコに、インスリンシリンジを使用して首の付け根の皮下に与えた。８週齢（Ｗ８）で、ニワトリを交尾させた。約２５羽の雌鶏と１６羽の雄鶏を保存し、一緒にした。１７週齢（Ｗ１７）で、一価の不活化Ｈ５Ｎ９ワクチン０．５ｍｌの体積で、ワクチン用量のブースター注射を与えた。
【００７５】
以下の免疫化スキームを群Ｇ２に適用した：３週齢でＳＰＦのヒヨコに、一価の不活化Ｈ５Ｎ９ワクチン０．３ｍｌの体積で、叉骨にて、インスリンシリンジを使用してワクチン用量をＩＭ注射で与えた。３．０  ｌｏｇ１０  ＣＣＩＤ５０／０．２ｍｌの力価を有するｖＦＰ２２１１のウイルス懸濁物０．２ｍｌを生後１日目（Ｄ０）のヒヨコに、インスリンシリンジを使用して首の付け根の皮下に与えた。８週齢（８Ｗ）で、ニワトリを交尾させた。約２５羽の雌鶏と１６羽の雄鶏を保存し、一緒にした。１７週齢（Ｗ１７）で、一価の不活化Ｈ５Ｎ９ワクチン０．５ｍｌの体積で、ワクチン用量のブースター注射を与えた。
【００７６】
１．１．４）Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９  ＩＶＲ−１１６（Ｈ１Ｎ１）またはＡ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／５５／０４  Ｘ−１５７（Ｈ３Ｎ２）を用いた、群Ｇ１およびＧ２の雌鶏および免液していない雌鶏から得られた卵の感染についてのプロトコル
リアソータントなワクチン株（Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９  ＩＶＲ  １１６（Ｈ１Ｎ１）と呼ばれるＡ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（ｘＰＲ８）およびＡ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／５５／０４  Ｘ−１５７（Ｈ３Ｎ２）と呼ばれるＡ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／５５／０４（ｘＰＲ８）の複製能力を、４０〜４１週齢（試験２）および４９〜５０週齢（試験３）で産まれた群Ｇ１の雌鶏由来の卵および２６〜２７週齢（試験１）、４０〜４１週齢（試験２）および４９〜５０週齢（試験３）で産まれた群Ｇ２の雌鶏由来の卵で評価した。同時に、ウイルス株Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（ｘＰＲ８）（Ｈ１Ｎ１）およびＡ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／５５／０４（ｘＰＲ８）（Ｈ３Ｎ２）の複製能力を、免疫していないＳＰＦの雌鶏（コントロール群）由来のコントロールの卵にて同じやり方で評価した。
【００７７】
上記期間に産まれた全ての卵を、温度制御チャンバー（１２〜１５℃）にて保存した。同じ試験および同じ群の動物から得られた卵を一緒の群に分け、次いで、卵を相対湿度が約７０〜８０％であるチャンバーにて、３７〜３８℃で１０日間インキュベートすることによって、胚形成プロセスを引き起こした。１０日間のインキュベーションの後で、検卵デバイスの手段によって、各卵での胚のバイタリティーを検証し、尿膜腔を×印で特定した。同じ試験および同じ群の動物から得られた卵を一緒の群に分け、８個の卵をプールした。同じプールの胚形成卵を、消毒し、卵の殻に穴を開けた後で、×印の高さで、２００μｌの体積の同じ感染量のインフルエンザウイルスで感染させた。Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（ｘＰＲ８）（Ｈ１Ｎ１）およびＡ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／５５／０４（ｘＰＲ８）（Ｈ３Ｎ２）ウイルスの１０２、１０３および１０４ＥＩＤ５０（卵感染量５０％）の感染量を試験した。卵１個あたり１０３および１０４ＥＩＤ５０の感染量を、試験１および２の卵にて試験した。卵１個あたり１０２および１０３ＥＩＤ５０の感染量を、試験３の卵にて試験した。次いで、感染した胚形成卵を３４℃で４８時間、相対湿度が８０％であるチャンバーにてインキュベートし、次いで、４℃で一晩静置した。感染した尿膜液を各卵から取り出した。感染力価を、ＨＡＵ（血球凝集単位）力価を測定することによって、取り出した各尿膜液について評価した。シチメンチョウの赤血球を使用して、Ａ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／５５／０４（ｘＰＲ８）（Ｈ３Ｎ２）株で感染させた尿膜液のＨＡＵ力価を測定した。雌鶏の赤血球を使用して、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（ｘＰＲ８）（Ｈ１Ｎ１）株で感染させた尿膜液のＨＡＵ力価を測定した。リン酸バッファー中０．５％の雌鶏またはシチメンチョウ赤血球の存在下目に見える血球凝集を示した感染した尿膜液の最後の希釈物の逆数で、ＨＡＵ力価を示す。
【００７８】
１．２）結果
免疫した雌鶏および免疫していない雌鶏の種々の群から得た卵にて入手したＨＡＵ力価の平均を、卵へと注射したウイルスの感染量の関数として、および卵をサンプリングした時間の関数として、表ＩおよびＩＩに示す。
【００７９】
【表１】
0005537429.tif 000002
【００８０】
【表２】
0005537429.tif 000003
【００８１】
表ＩおよびＩＩにて得られた結果は、免疫した雌鶏（Ｇ１およびＧ２）から得られた卵の尿膜液のＨＡＵ力価の平均が、免疫していない雌鶏から得られた卵の尿膜液のＨＡＵ力価の平均と等価であることを示す。
【００８２】
免疫化および用量因子を調査するために、統計学的分析を実施した。ＨＡＵのそれぞれの値をｌｏｇ２に変換し、分散モデルを使用して分析した。小型化された試験を使用し、モデルの留数を用いて実施し（ＳＡＳ  ｖ８．２ソフトウェア）、分散の不均一性を試験した。
【００８３】
ＨＡＵ力価のそれぞれの値について実施した統計学的分析は、免疫化の効果は存在しないことを示した。また、卵を感染させるために使用したウイルスの用量に関するいずれの効果も存在しない。ＨＡＵ力価は、調査した産卵期の間（２６（試験１）〜５０週間（試験３）の範囲）実質的に影響を及ぼさない。
【００８４】
実施例２：トリインフルエンザウイルス株Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｔａｌｙ／２２Ａ／９８  （Ｈ５Ｎ９）を含む不活化ワクチンの２回の注射、またはＨ５Ｎ１株のＨＡをコードするリコンビナントトリポックスウイルスの注射、続くトリインフルエンザウイルス株を含む不活化Ｈ５Ｎ９ワクチンの第２の注射のいずれかを用いる、免疫した雌鶏由来の胚形成卵を使用する、パンデミックワクチン株Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｔａｌｙ／２２Ａ／９８（Ｈ５Ｎ９）およびＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４  ＮＩＢＲＧ１４（Ｈ５Ｎ１）の製造方法
２．１．１）雌鶏の免疫化
雌鶏を免疫するためのプロトコルは、実施例１にて使用したものと同一である。
【００８５】
２．１．２）Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｔａｌｙ／２２Ａ／９８  （Ｈ５Ｎ９）およびＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４  ＮＩＢＲＧ１４（Ｈ５Ｎ１）ウイルス株を用いた、群Ｇ１およびＧ２の雌鶏および免疫していない雌鶏から得られる卵の感染のためのプロトコル
感染プロトコルは、以下の修飾を除いて、実施例１にて使用したものと同じである：
ｔｈｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ  Ｉｓｔｉｔｕｔｏ  Ｚｏｏｐｒｏｆｉｌａｔｔｉｃｏ  Ｓｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｅ  ｄｅｌｌｅ  Ｖｅｎｅｚｉｅ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｏ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉａ、パドア、イタリアから入手したローパスのＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｔａｌｙ／２２Ａ／９８（Ｈ５Ｎ９）トリ株、および弱毒化されたパンデミックでリアソータントなワクチン株Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４  ＮＩＢＲＧ１４（Ｈ５Ｎ１）を使用して、卵を感染させた。後者の株は、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＮＩＢＳＣ）ラボラトリ、サウスミムス、ポッターバー、ハーツＥＮ６  ３ＱＧ、ＵＫから提供され、C. Nicolson et al., Generation of influenza vaccine viruses on Vero cells by reverse genetics: an H5N1 candidate vaccine strain produced under a quality system, 2005, Vaccine, 23: 2943-2952に記載のように、逆遺伝学によって得られた。
【００８６】
１０２、１０３、１０４および１０５ＥＩＤ５０の感染量（卵の感染量５０％）をこれらの株について試験した。１個の卵あたり１０３、１０４および１０５ＥＩＤ５０の感染量を、試験１の卵にて試験した。１個の卵あたり１０４および１０５ＥＩＤ５０の感染量を、試験２の卵にて試験した。１個の卵あたり１０２および１０３ＥＩＤ５０の感染量を、試験３の卵にて試験した。
【００８７】
雌鶏の赤血球を使用して、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｔａｌｙ／２２Ａ／９８（Ｈ５Ｎ９）またはＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４  ＮＩＢＲＧ１４（Ｈ５Ｎ１）に感染した尿膜液のＨＡＵ力価を測定した。
【００８８】
２．２）結果
免疫したおよび免疫していない雌鶏の種々の群から得られた卵にて得られたＨＡＵ力価を、卵へと注射したウイルスの感染量の関数として、および卵を採取した時間の関数として、表ＩＩＩおよびＩＶに示す。
【００８９】
【表３】
0005537429.tif 000004
【００９０】
【表４】
0005537429.tif 000005
【００９１】
表ＩＩＩおよびＩＶにて提供する結果ならびに統計学的分析は、雌鶏をこれらの雌鶏から得られた胚形成卵を感染させるために使用した株と同一の株で雌鶏を免疫した場合（Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｔａｌｙ／２２Ａ／９８（Ｈ５Ｎ９）株で免疫した群Ｇ１およびＧ２の場合）でさえ、免疫した雌鶏（Ｇ１およびＧ２）由来の卵から得られた尿膜液のＨＡＵ力価が免疫していない雌鶏由来の卵の尿膜液のＨＡＵ力価と類似していることを示す。卵を感染させるために使用するウイルスの用量に関しても、効果は存在しない。ＨＡＵ力価は、調査した産卵期の間（２６週間（試験１）〜５０週間（試験３））、実質的に影響を及ぼさなかった。
【００９２】
実施例１において、統計学的分析を実施した。
【００９３】
実施例３：Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｔａｌｙ／２２Ａ／９８（Ｈ５Ｎ９）ワクチン株で免疫した雌鶏由来の卵での抗Ｈ５母系性抗体応答の分析
３．１）操作プロトコル
Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｔａｌｙ／２２Ａ／９８（Ｈ５Ｎ９）株で免疫した群Ｇ１およびＧ２の雌鶏由来の卵における抗Ｈ５抗体の存在を、パラグラフ１．１．１）に記載のプロトコルに従って測定した。同時に、抗Ｈ５応答もまた、免疫していない雌鶏由来の卵黄（コントロール群）にて分析した。試験１（Ｗ２６−２７）、２（Ｗ４０−４１）および３（Ｗ４９−５０）の時点で採取した卵黄（または黄身）にて、抗Ｈ５応答を分析した。試験１の卵黄における抗Ｈ５応答の分析を、胚形成（Ｄ０）前かつ胚形成（Ｄ１０）後に実施した。試験２および３の卵黄における抗Ｈ５応答の分析を、胚形成（Ｄ１０）後に実施した。同じ分析を、免疫していない雌鶏から得られた卵を用いて実施した（パラグラフ３．２．２）を参照のこと）。また、胚形成（Ｄ１０）後の試験２の卵の尿膜液において、抗Ｈ５応答を調査した。ディスポーサブルチップを有するピペットを使用した吸引によって、卵黄を除去した。事前に希釈せずに凍結させた試験１を除いて、凍結させる前に、試験２および３の卵黄および尿膜液をリン酸バッファーに５倍希釈した。希釈した卵黄および尿膜液を、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｔａｌｙ／２２Ａ／９８（Ｈ５Ｎ９）株の存在下で生じる雌鶏の赤血球の血球凝集の抑制（ＩＨＡ）によってアッセイする方法を使用して実施される抗Ｈ５抗体アッセイの時まで、凍結保存した。アッセイは、ウイルスのＨＡに対して特異的な中和抗体の、ウイルスの「血球凝集」を抑制する能力に基づくものであった。この試験において、ＮＩＳＢＣ提供の抗Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４ヒツジ血清を、ポジティブコントロールとして使用し、未処理マウス血清をネガティブコントロールとして使用した。サンプル（希釈した卵黄または尿膜液）の連続２倍希釈を、円錐形の底を有するマイクロプレートにて実施し、１つのウェルあたり各希釈物５０μｌを得た。４血球凝集単位（４ＨＡＵ）の力価を有し、Ｉｌａｒｉａ  Ｃａｐｕａ研究室（Ｉｓｔｉｔｕｔｏ  Ｚｏｏｐｒｏｆｉｌａｔｔｉｃｏ  Ｓｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｅ  ｄｅｌｌｅ  Ｖｅｎｅｚｉｅ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｏ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉａ、パドア、イタリア）より提供のＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｔａｌｙ／２２Ａ／９８（Ｈ５Ｎ９）株で感染させた澄んだ尿膜液から得られたウイルスの懸濁物５０μｌを各ウェルに添加した。研究室の温度で１時間インキュベートし、リン酸バッファー中０．５％雌鶏赤血球溶液５０μｌを添加した。１時間、＋４℃で静置し、試験物を読み込んだ。血球凝集の抑制の存在は、マイクロウェルの底部での赤いスポットの存在によって反映される一方で、血球凝集の存在は、マイクロウェル中のピンク色のハロ（halo）の存在によって反映された。ＩＨＡ抗体の力価を、マイクロウェルにて血球凝集が観察されなかった最後の希釈物の逆数によって示す。
【００９４】
３．２）結果
３．２．１）試験１の卵黄における抗Ｈ５応答の分析
Ｄ０にて、免疫していない群で分析した８個の卵黄のうち８個が、ＩＨＡ試験においてネガティブである一方で、群２より得られた８個の卵黄のうち６個がＩＨＡ試験においてポジティブであり、これは、抗Ｈ５抗体の存在を示した。
【００９５】
Ｄ１０にて、免疫していない群で分析した４個の卵黄のうち４個が、ＩＨＡ試験においてネガティブである一方で、群２より得られた４個の卵黄のうち４個がＩＨＡ試験においてポジティブであった。
【００９６】
３．２．２）試験２の卵黄および尿膜液における抗Ｈ５応答の分析
Ｄ１０にて、免疫していない群で分析した５個の卵黄のうち５個が、ＩＨＡ試験においてネガティブである一方で、群１より得られた５個の卵黄のうち４個、および群２より得られた５個の卵黄のうち４個がＩＨＡ試験においてポジティブであり、これは、これらの群における抗Ｈ５抗体の存在を示した。得られたＩＨＡ力価の各値を、表Ｖに示す。
【００９７】
【表５】
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一方で、群１および２から得られた全ての尿膜液はＩＨＡ試験においてネガティブであり、これは、該尿膜液にて検出可能であるＨ５Ｎ９インフルエンザウイルスの血球凝集を抑制する抗体が存在しなかったことを意味する。
【００９８】
３．２．３）試験３の卵黄における抗Ｈ５応答の分析
Ｄ１０にて、免疫していない群で分析した５個の卵黄のうち５個が、ＩＨＡ試験においてネガティブである一方で、群１より得られた５個の卵黄のうち５個がＩＨＡ試験においてポジティブであった。
得られたＩＨＡ力価の各値を、表ＶＩに示す。
【００９９】
【表６】
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結論として、実施例２および３の結果に基づき、母系性抗Ｈ５Ｎ９抗体の存在（卵黄にて明らかにされた）は、Ｈ５Ｎ１またはＨ５Ｎ９株に感染した尿膜液のウイルス産生性に対して効果を有していない。
【０１００】
実施例４：Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｔａｌｙ／２２Ａ／９８（Ｈ５Ｎ９）で免疫した雌鶏の血清応答およびこれらの免疫した雌鶏由来の卵に存在する母系性抗Ｈ５抗体の分析
２８および３６週齢で、群１および２の免疫した雌鶏から血液サンプルを採取した。これらの雌鶏が産んだ卵を２７および３７週目で回収し、母系性抗体の卵黄への移行の重要性を評価した。抗Ｈ５抗体応答を、不活化ワクチン株と同属のＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｔａｌｙ／２２Ａ／９８  Ｈ５Ｎ９株を抗原として使用する血球凝集抑制試験の手段によって評価した。結果を表ＶＩＩにてｌｏｇ１０として示す。
【０１０１】
【表７】
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【０１０２】
【表８】
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結果は、群１および２の免疫した雌鶏が産んだ卵の卵黄への母系性抗体の伝達を確認する。
卵黄中の類似の抗Ｈ５Ｎ９抗体の力価は、異種性の抗Ｈ５Ｎ９の力価より大きいものの（表ＶＩＩＩ）、この差異は有意なものではない。
【０１０３】
実施例５：不活化Ｈ５Ｎ９ワクチン（Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｔａｌｙ／２２Ａ／９８株）で免疫した群２の雌鶏が産んだ卵でのＡ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６８  Ｈ５Ｎ９株の産生
５．１）
３および１７週齢で、不活化Ｈ５Ｎ９ワクチン（Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｔａｌｙ／２２Ａ／９８株）で２回免疫した群２の雌鶏由来の卵（約２２０〜２３０個）を、２８〜２９週間目で採取した。制御した温度（１２〜１５℃の間）で保存した後のこれらの卵を、３７℃で１１日間インキュベートした。胚が良好なバイアビリティーを有することを検証するために検卵した後で、９．６８ｌｏｇ１０ＥＩＤ５０／ｍｌの力価を有するＡ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６８  Ｈ５Ｎ９株の貯蔵ウイルス溶液（接種材料）０．２ｍｌを用いて、卵に尿膜腔にて接種した。約３０個の卵の７つの群を形成した。４つの群（Ｇ１〜Ｇ４）を、以下の接種材料の希釈物に接種した：１０−５、１０−４、１０−３および１０−２。３つの他の群（Ｇ５〜Ｇ７）を、接種材料の１０−３希釈物に接種した。接種後、卵を３７℃±１．５℃、７０％±１０％の湿度でインキュベートした。２０時間のインキュベーションの後で、接種により死亡した卵を除くために卵を検卵し、次いで、同じ条件下で再度インキュベートした。接種から４２時間後、卵を冷却し、尿膜液を回収した。群１〜４の卵の尿膜液をプールした（１つの群あたり１つの液のプール）。４つの群の卵の尿膜液を−７０℃で保存し、血球凝集単位および卵感染量５０％（ＥＩＤ５０）について力価を測定した。
【０１０４】
５．２．結果
結果を表ＩＸに示す。
【０１０５】
【表９】
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これらの結果は群間で非常に似た力価を示し、接種材料の希釈による影響がないことを示している。さらに、得られた力価は非常に高く、母系性抗Ｈ５Ｎ９抗体を有さない卵で得られたもの（過去の研究室のデータ）に匹敵する。したがって、これらの結果は、試験した条件下、卵における母系性抗体の存在は、同じサブタイプのインフルエンザウイルスの産生に干渉しないことを確認する。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図２−７】
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【配列表】
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