(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アワユキセンダングサ（Bidens pilosa L. var. radiata Scherff.）の抽出物を有効成分として含むマツノマダラカミキリ（Monochamus alternatus Hope）の防除剤。
【請求項２】
前記の抽出物が、煮沸抽出法、浸漬抽出法、振とう抽出法、ソックスレー抽出法および水蒸気蒸留法からなる群より選択される１以上の抽出方法によって得られるものである、請求項１に記載のマツノマダラカミキリの防除剤。
【請求項３】
前記の抽出物が、アビエチン酸エチル、イソバニリン、α-カリオフィレン、β-カリオフィレン、クマラン、桂皮酸、デヒドロアビエチン酸メチルエステル、シリンガアルデヒド、ステアリン酸、バニリン酸、パルミチン酸、4-ヒドロキシ安息香酸、4H-ピラン-4-オン,2,3-ジヒドロ-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル、ブチルヒドロキシトルエン、2(4H)-ベンゾフラノン,5,6,7,7a-テトラヒドロ-4,4,7a-トリメチルおよびミリスチン酸からなる群より選択される１種以上の化合物を含むものである、請求項１または２に記載のマツノマダラカミキリの防除剤。
【請求項４】
アルカロイド、タンニン、サポニン、フラボノイド、カルコン系物質、カフェオイル誘導体、リノール系化合物、ジテルペン、精油、フェニルプロパノイド配糖体、フェノール類、フラボノイド類、フラボン配糖体およびポリアセチレン類、フェルラ酸、ケルセチン、カフェ酸、ピロカテチン、サリチル酸、p-ビニルグワヤコール、ジメソキシフェノール、オイゲノール、4-エチル-1,2-ベンゼネジオール、イソバニリン、2-ハイドロ-6-メチルベンザルデハイド、バニリン、バニリン酸、p-ハイドロキシベンゼン酸、プロトカテチュイック酸およびクマリン酸からなる群より選択される１種以上の物質をさらに含む、請求項３に記載のマツノマダラカミキリの防除剤。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか一項に記載のマツノマダラカミキリの防除剤を、マツ属植物に施用するマツノマダラカミキリの防除方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物病害防除の技術分野に属し、マツノザイセンチュウおよびマツノマダラカミキリの防除剤および防除方法、ならびにこれら生物によって引き起こされるマツ材線虫病の防除剤および防除方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マツ材線虫病の原因であるマツノザイセンチュウ（線形動物門、幻器綱、アフェレンコイデス目、アフェレンコイデス科、Bursaphelenchus xylophilus（Steiner & Buhrer）Nickle）、および、その媒介虫であるマツノマダラカミキリ（節足動物門、昆虫綱、コウチュウ目、カミキリムシ科、Monochamus alternatus Hope）は、１９０５年に造船材料として北米から輸入された木材によって長崎に侵入し、その後、北海道、青森を除く全地域に拡大し、平成２２年度のマツ材線虫病に羅病したマツの積量は約５８万立方メートルに及ぶ。
日本に分布するアカマツやクロマツ、南西諸島の固有種であるヤクタネゴヨウ（絶滅危惧種）、リュウキュウマツが甚大な被害を受けており、日本各地に存在するマツが本病の脅威にさらされている。
本病による被害は日本のみならず、中国、台湾、韓国、ヨーロッパ地域においても発生しており、上記の種に加えてタイワンアカマツ、チョウセンゴヨウ、ヨーロッパアカマツ、フランスカイガンショウなどを含むマツ属（Pinus）植物も本病に対する感受性が高い。
ヨーロッパ諸国ではマツ材線虫病の感染拡大を防止するためマツ材の輸入に関して検疫を行っている。
【０００３】
マツ材線虫病は、５〜７月に枯れたマツの幹から羽化し、脱出したマツノマダラカミキリ（一般的には８千〜数万頭のマツノザイセンチュウを体内に保持）が性成熟のためにマツの若枝に飛来し、表皮を摂食する。
表皮が剥がれた部位から、マツノザイセンチュウを誘引するβミルセンやエタノールなどの化学物質が揮発することで、マツノザイセンチュウに対して正の走化性を示すと考えられているが、このようにしてマツノザイセンチュウはマツ組織内に寄生する（６〜９月）。
寄生後、早ければ２〜３週間程度で松枯れ症状を呈する。
そして、７〜８月になると、枯死したマツにマツノマダラカミキリ雌成虫が飛来し、マツの樹皮下に産卵する。
孵化したマツノマダラカミキリの幼虫は、マツの樹皮下組織を摂食しながら成長し、１１〜翌５月に蛹室を形成して蛹となり、５〜６月に羽化に至る。
【０００４】
本病の防除手段は、一般的に、マツノザイセンチュウに対する予防剤の散布、媒介虫であるマツノマダラカミキリに対する殺虫剤の散布のほか、枯死木の伐倒や薫蒸処理などによって行われているが、これらの方法は有効である一方で、野生生物や環境への影響、農薬のドリフト（飛散）被害、労働および経費負担が問題視されている。
特にマツノマダラカミキリに使用される有機リン系殺虫剤は、人や他の生物にも影響することが懸念され、さらに農薬の連用は、薬剤耐性昆虫の出現を誘発することが知られている。
また抵抗性マツを利用する方法もあるが、抵抗性系統が少なく、挿木による繁殖が困難であること、外国産の系統は日本の風土に適さないなどの欠点がある。
【０００５】
現在は、マツ材線虫病に対して、環境負荷が大きい防除手段が多く採られていることから、特に生物多様性保護の観点から、可能な限り農薬に依存した防除方法からの脱却が望まれている。
【０００６】
マツノザイセンチュウまたはマツノマダラカミキリの防除方法には、網、化学物質、酵素、電流、微生物等を用いた方法があり、植物由来抽出物または成分を利用したものとしては、マツ由来の有機溶媒抽出物（特許文献１）、ヒガンバナ科球根圧搾液（特許文献２）、アフリカンマリーゴールド油、スイートバジル油およびパルマローザ油（特許文献３）などを利用する方法があるが、キク科センダングサ属植物を利用する方法は知られていない。
特許文献１〜３において利用される植物は、木材、燃料、食材、精油原料、観賞用植物、土壌改良用作物等として既に広く利用されているものであり、病害虫防除剤の原料として大量に調達すること等が容易でない場合もある。
また、これら植物を病害虫防除に用いることにより、例えば食料として有用な資源を消費してしまうことにも繋がりかねないという問題も有している。
【０００７】
特許文献４には、キク科植物の抽出物を有効成分とするネコブセンチュウ防除剤が記載されている。また、特許文献５には、アワユキセンダングサの抽出物を有効成分とするネグサレセンチュウ又はシストセンチュウの防除剤が記載されている。
【０００８】
しかし、特許文献４および５に記載された防除剤は土壌有害線虫を対象とするものであり、マツノザイセンチュウおよびマツノマダラカミキリについては記載が無い。特許文献４および５に記載のネコブセンチュウ類、ネグサレセンチュウ類およびシストセンチュウ類は、いずれもティレンクス目に属し（それぞれメロイドギネ科、プラティレンクス科、ヘテロデラ科）、本発明で対象となるマツノザイセンチュウ（アフェレンコイデス目アフェレンコイデス科）とは属する目が異なることから、両者は分類学上はもちろんのこと遺伝的観点からも全く別の生物である。
【０００９】
また、特許文献４および５に記載された防除剤が対象とする線虫類は、土壌線虫類に含まれ、野菜類の根を犯すものである。つまり、土壌線虫類は、単独で、土壌中の野菜類の根に侵入する。
これに対し、本発明で対象となるマツノザイセンチュウは、マツノマダラカミキリという寄生宿主の存在があって初めてマツ属植物の地上部に到達し、マツ属植物の組織内に侵入して増殖することができる。
そして、この寄生宿主は、マツノマダラカミキリのみである。
このように、マツノザイセンチュウと土壌線虫類とは、生態的特徴からしても全く異なる。
【００１０】
特許文献６には、キク科センダングサ属植物の抽出物を主成分とする害虫防除剤が記載されている。
しかし、特許文献６に記載の害虫防除剤が対象とする害虫は、ヨトウムシ類（チョウ目、ヤガ科）、アブラムシ類（カメムシ目、アブラムシ科）、シロチョウ類（チョウ目、シロチョウ科）、ハダニ類（ダニ目、ハダニ科）およびコナジラミ類（カメムシ目、コナジラミ科）であり、マツノマダラカミキリ（コウチュウ目、カミキリムシ科）とは異なる分類群に属するものである。
また、これらの害虫類はいずれも、野菜類または草本植物を食害し、それ単体で病害虫として認められるのに対し、マツノマダラカミキリは、単体では単にマツ属植物の若枝と樹皮下組織を摂食するのみで病害虫として認められるほどの甚大な被害を発生させないという点で違いがある。
さらに、マツノマダラカミキリは、マツノザイセンチュウを体内に宿し、マツノザイセンチュウをマツ属植物に伝搬する役割を果たすことで、マツ材線虫病を媒介する。
つまり、マツ材線虫病の発症原因という点からみると、マツノマダラカミキリのみが、マツ材線虫病の原因であるマツノザイセンチュウを体内に宿してマツ属植物へ伝搬する役割を果たすのであり、特許文献６の防除剤が対象とする害虫類がマツ材線虫病の発症原因に関与することはなく、マツ材線虫病を媒介しないという点で、両者は全く異なる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開平５−２７９２２３号公報
【特許文献２】特開２００９−２６８４５３号公報
【特許文献３】特表２００９−５３６９３７号公報
【特許文献４】特許第４５２８９８２号公報
【特許文献５】特開２０１１−６８６１２号公報
【特許文献６】特開２０１０−２０８９９４号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Deba, F., Xuan, T. D., Yasuda, M. and Tawata, S. (2008) Chemical composition and antioxidant, antibacterial and antifungal activities of the essential oil from Bidens pilosa Linn. var. Radiata. Food Control 19, 346-352.
【非特許文献２】増澤幹男・増澤真実子・前田亜希子・宮田聡子・勝岡憲生（2005）．Livedo reticularis with summer ulcerationの夏季潰瘍に対するかんぽう茶（登録商標）の予防効果．日皮会報115（1），7-13．
【非特許文献３】宇佐美英治・草野源次郎・片寄貴則・輪千浩史・瀬山義幸（2004）．天然物中の水溶性抗酸化因子及び脂溶性抗酸化因子による抗酸化作用の評価．YAKUGAKU ZASSHI 123（11），847-850．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、環境に対して低負荷であり、野生生物に対する安全性に優れた、マツノザイセンチュウおよびマツノマダラカミキリの防除剤及び防除方法、ならびにこれら生物によって引き起こされるマツ材線虫病の防除剤および防除方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、キク科センダングサ属植物の抽出物を有効成分として含む、マツ材線虫病の防除剤および防除方法を提供する。
【００１５】
また、本発明は、キク科センダングサ属植物の抽出物を有効成分として含む、マツノザイセンチュウの防除剤及び防除方法を提供する。
【００１６】
さらに、本発明は、キク科センダングサ属植物の抽出物を有効成分として含む、マツノマダラカミキリの防除剤及び防除方法を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のマツ材線虫病防除剤は、キク科センダングサ属植物の抽出物に含まれる成分がマツノザイセンチュウ及びマツノマダラカミキリに対して不動化、忌避及び殺虫効果を発揮することにより、マツノザイセンチュウによって生じるマツ材線虫病を予防、軽減、駆除することができるものである。
【００１８】
本発明のマツ材線虫病防除剤、マツノザイセンチュウ防除剤及びマツノマダラカミキリ防除剤の有効成分の原料となるキク科センダングサ属植物、特にアワユキセンダングサは、日本及び熱帯・亜熱帯地域に広く分布しており、かつ、生育が旺盛で資源量が豊富であるため、入手が容易である。
したがって、本発明のマツ材線虫病防除剤、マツノザイセンチュウ防除剤及びマツノマダラカミキリ防除剤は、従来の植物由来成分等を利用した病害虫防除剤と比較して、安価に製造することが可能である。
加えて、かかる植物はこれまで雑草・害草として扱われ、ほとんど利用されていないのが現状であるため、本発明は未利用生物資源の有効活用にもつながるものと期待される。
【００１９】
また、アワユキセンダングサ等のキク科センダングサ属植物は、一部地域においては漢方茶等として利用されており、高い安全性を有している。
さらに、最近ではキク科センダングサ属植物の成分が皮膚炎や成人病に有効とする報告もあるほか、主要な農作物や土壌微生物に対しても悪影響がないことが知られている。
したがって、本発明のマツ材線虫病防除剤、マツノザイセンチュウ防除剤及びマツノマダラカミキリ防除剤は、ヒトを含む生物や環境への影響が小さく、生物多様性を損なうことがないものである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】アワユキセンダングサ抽出液を施用したことで死亡したマツノザイセンチュウを撮影した顕微鏡写真（撮影倍率は100倍）。
【図２】マツノザイセンチュウにアワユキセンダングサ抽出液を施用した実験の結果を示すグラフ。
【図３】マツ材線虫病に罹病したマツ組織内に寄生するマツノザイセンチュウにアワユキセンダングサ抽出液を施用した実験の結果を示すグラフ。
【図４】マツノマダラカミキリ（成虫）を撮影した写真（写真左：アワユキセンダングサ抽出液を噴霧して死亡したマツノマダラカミキリ、写真右：滅菌水を噴霧して生存しているマツノマダラカミキリ）。
【図５】マツの若枝に残ったマツノマダラカミキリ（成虫）の食痕を撮影した写真（写真左：アワユキセンダングサ抽出液を噴霧したマツの若枝、写真右：水を噴霧したマツの若枝）。
【図６】マツノマダラカミキリ（幼虫）を撮影した写真（写真左：アワユキセンダングサ抽出液（10倍希釈液）を滴下して死亡したマツノマダラカミキリ、写真中央：アワユキセンダングサ抽出液（原液）を滴下して死亡したマツノマダラカミキリ、写真右：滅菌水を滴下して生存しているマツノマダラカミキリ）。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明のマツ材線虫病防除剤、マツノザイセンチュウ防除剤及びマツノマダラカミキリ防除剤の有効成分は、キク科センダングサ属植物から得られる抽出物である。
キク科センダングサ属植物は、アワユキセンダングサ（B. pilosa L. var. radiata Scherff.）、タチアワユキセンダングサ（Bidens pilosa L. var. radiata Sch. Bip）、ハイアワユキセンダングサ（Bidens pilosa L. var. radiata Sch. f. decumbens Scherff.）などが挙げられる。これらの植物の中でも、アワユキセンダングサを抽出物の原料として用いることが好ましい。
【００２２】
キク科センダングサ属植物は、開花期のものであっても栄養生長期のものであってもよく、生の状態であっても乾燥させたものであってもよいが、乾燥させた植物体を用いることが好ましい。
乾燥の目安としては、限定されるものではないが、例えば水分含量が０％〜１５％未満であることが好ましく、アワユキセンダングサであれば、通常、４０〜８０℃の温風下で２４時間または１００℃で２時間程度の条件で乾燥させれば十分である。また、抽出効率の点から、植物体を適宜細断ないし粉砕等したもの、例えば粉末状のものを抽出原料として用いることが好ましい。
植物体の部位に関しては、花、葉、茎、根などを含む全草を抽出原料として用いることが可能であるが、根を除いた地上部を用いることが好ましい。
【００２３】
キク科センダングサ属植物の抽出物は、一般的な植物成分抽出方法を用いて得ることができる。かかる抽出方法としては、例えば、煮沸抽出法、浸漬抽出法、振とう抽出法、ソックスレー抽出法、水蒸気蒸留法などが挙げられ、これらの中でも煮沸抽出法が好ましい。
【００２４】
また、抽出に用い得る溶媒としては、水だけでなく低級アルコール類（例えばメタノール、エタノール等）、ケトン類（例えばアセトン、メチルエチルケトン等）、親水性有機溶媒（例えばアセトニトリル、酢酸エチル等）、エーテル類（例えばエチルエーテル、イソプロピルエーテル等）、芳香族炭化水素類（例えばトルエン、キシレン等）、ハロゲン化炭化水素類（例えば塩化メチレン、クロロホルム等）などの疎水性有機溶媒が挙げられ、これらの混合溶媒も利用できる。一つの好ましいキク科センダングサ属植物の抽出物は、溶媒として水を用い、煮沸抽出法によって得られる抽出物（水煮沸抽出物）である。また、水煮沸抽出以外の方法を用いる場合であっても、適宜、溶媒や抽出時間等の条件を設定してキク科センダングサ属植物の抽出物を得ることが可能である。
【００２５】
また、得られた抽出物を、必要によりカラム分画法や溶媒分画法などにより精製することも可能である。
【００２６】
本発明における「抽出物」とは、溶媒を用いる各種抽出方法によって得られる抽出液のほかに、抽出液を濃縮した濃縮液、抽出液を適当な溶媒で希釈した希釈液、抽出液またはその濃縮液もしくは希釈液から加熱乾燥や凍結乾燥などの種々の方法によって溶媒を除くことにより得られる固形の抽出物（粉末状や粒状のもの等）、ならびに固形化剤やゲル化剤の添加等によって得られる固形もしくは半固形の抽出物も含まれるものとする。
【００２７】
本発明の防除剤におけるキク科センダングサ属植物の抽出物は、例えば、キク科センダングサ属植物の乾燥植物体１重量部に対して５〜１０００重量部、好ましくは５〜１００重量部の水を加えて加熱し、３０〜６０分間、好ましくは３０分間沸騰させることによって得ることができる。かかる方法によって得られる抽出物（抽出液）は、上述の通り、必要に応じて希釈もしくは濃縮することができ、溶媒を除去して固形の抽出物とすることもできる。
【００２８】
本発明の防除剤におけるキク科センダングサ属植物の抽出物は、好ましくは、アビエチン酸エチル、イソバニリン、α-カリオフィレン、β-カリオフィレン、クマラン、桂皮酸、デヒドロアビエチン酸メチルエステル、シリンガアルデヒド、ステアリン酸、バニリン酸、パルミチン酸、4-ヒドロキシ安息香酸、4H-ピラン-4-オン,2,3-ジヒドロ-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル、ブチルヒドロキシトルエン、2(4H)-ベンゾフラノン,5,6,7,7a-テトラヒドロ-4,4,7a-トリメチル及びミリスチン酸からなる群より選択される１種以上の化合物を含むものである。
【００２９】
また、キク科センダングサ属植物の抽出物は、上記の化合物以外にも、アワユキセンダングサは、アルカロイド、タンニン、サポニン、フラボノイド、カルコン系物質、カフェオイル誘導体、リノール系化合物、ジテルペン、精油、フェニルプロパノイド配糖体、フェノール類、フラボノイド類、フラボン配糖体及びポリアセチレン類、フェルラ酸、ケルセチン、カフェ酸、ピロカテチン、サリチル酸、p-ビニルグワヤコール、ジメソキシフェノール、オイゲノール、4-エチル-1,2-ベンゼネジオール、イソバニリン、2-ハイドロ-6-メチルベンザルデハイド、バニリン、バニリン酸、p-ハイドロキシベンゼン酸、プロトカテチュイック酸及びクマリン（クマリック）酸を含有することが報告されている（非特許文献１〜３）。したがって、本発明の防除剤におけるキク科センダングサ属植物の抽出物は、これらの物質のうち１種以上を含むものであってもよい。また、本発明の防除剤は、これらの物質のうち１種以上とキク科センダングサ属植物の抽出物とを組み合わせて含むものであってもよく、さらに各種展着剤及び浸透移行剤等と組み合わせることもできる。
【００３０】
本発明の防除剤が有効な植物はマツ属(Pinus)植物であり、より具体的には、マツ材線虫病に対して感受性が高い植物、例えば、アカマツ（Pinus densiflora Sieb. ＆ Zucc.）、クロマツ（Pinus thunbergii Parl.）、ヤクタネゴヨウ（Pinus amamiana Koidz.）、リュウキュウマツ（Pinus luchuensis Mayr）、タイワンアカマツ（Pinus massoniana Lambert, 1803）、チョウセンゴヨウ（Pinus koraiensis Siebold et Zucc.）、ヨーロッパアカマツ（Pinus sylvestris L.）、フランスカイガンショウ（Pinus pinaster Aiton）等が挙げられる。
【００３１】
以下、アワユキセンダングサの乾燥植物体１重量部に対して５重量部の水を加えて加熱し、３０分間沸騰させることによって得られる抽出液（以下、「抽出原液」と称する）を有効成分として含む本発明の防除剤における抽出原液の好適濃度について記載する。
【００３２】
マツノザイセンチュウに対して、１００％不動化させる効果を得るためには、抽出原液もしくはその１０倍程度までの希釈液を用いることが好ましく、１００％ではないが高い確率で不動化させる効果を得るためには、抽出原液の２０〜１００倍程度までの希釈液を用いることが好ましい。
【００３３】
つまり、マツノザイセンチュウに対する不動化、忌避、殺虫効果を目的とする場合は、抽出原液もしくはその１００倍程度までの希釈液を用いることが好ましい。
また、マツ属植物の表皮にできたマツノマダラカミキリによる摂食痕から、マツノザイセンチュウがマツ属植物の皮下組織内へ侵入することを阻止するには、抽出原液またはその２００倍程度までの希釈液を用いることが好ましい。
【００３４】
一方、マツノマダラカミキリの成虫に対して、忌避、不動化、殺虫効果を発揮するためには、抽出原液を用いることが好ましい。
【００３５】
また、マツノマダラカミキリの幼虫に対して、不動化、殺虫効果を発揮するためには、抽出原液もしくはその２０倍程度までの希釈液を用いることが好ましい。
【００３６】
本発明の防除剤の有効成分であるキク科センダングサ属植物の抽出物は、マツノザイセンチュウならびにマツノマダラカミキリ（幼虫及び成虫）に対して、忌避、不動化または殺虫効果を有する。したがって、本発明の防除剤を、マツ属植物、マツノザイセンチュウまたはマツノマダラカミキリのいずれか１種以上に施用することにより、マツ材線虫病を防除することが可能である。
【００３７】
例えば、マツ材線虫病に罹病したマツ属植物に本発明の防除剤を適用すれば、(1)マツ属植物の組織内に存在するマツノザイセンチュウおよびマツノマダラカミキリ幼虫を殺虫すること、(2)マツノザイセンチュウの媒介虫であるマツノマダラカミキリ体内への移行を阻止すること、および(3)該媒介虫の羽化を阻止することが可能であり、その結果、マツ材線虫病の予防および防除が可能となる。
また、キク科センダングサ属植物の抽出物はマツノザイセンチュウおよびマツノマダラカミキリに対して忌避性を示すため、健全なマツ属植物に本発明の防除剤を適用することにより、マツノマダラカミキリの後食（成熟のための行動：若枝の樹皮を摂食する）およびマツノザイセンチュウのマツ属植物組織内への侵入を阻止または軽減することができる。
【００３８】
本発明における防除剤の「施用」とは、防除剤を施用対象物（例えば、マツ属植物、マツノザイセンチュウまたはマツノマダラカミキリ）に接触させることを意味する。摂食させる手段は、噴霧、塗布、浸漬、樹幹内注入、土壌灌注（根からの吸収）等が挙げられるが、いかなる手段を用いることもできる。
【００３９】
本発明の防除剤は、所望の施用方法に応じ、農薬等において採用され得る各種の剤形に製剤化することが可能である。剤形の例としては、これらに限定されないが、粉剤（一般粉剤、DL粉剤、フローダスト(FD)剤を含む）、粒剤、ペースト剤、水和剤、水溶剤、液剤、乳剤、フロアブル剤、マイクロエマルション剤、マイクロカプセル剤等が挙げられる。また、防除剤の製剤化のために、当該技術分野において通常用いられる賦形剤、媒体、担体、添加剤等を適宜選択して用いることが可能である。例えば、増量剤、有効成分を溶解または分散させるための媒体（溶媒や分散媒等）、分散剤、乳化剤、固形化もしくは半固形化のための固形化剤やゲル化剤、徐放性付与のためのマトリックス等を用いることができる。
【００４０】
マツ属植物への施用に関しては、マツ属植物の生木または枯死木内に液状の防除剤を注入することができ、また、マツ属植物の生木または枯死木の表面に液状または固形（例えば粉状）の防除剤を施用することもできる。この場合の施用は、キク科センダングサ属植物の抽出物をマツ属植物の表面に定着させるかあるいはマツ属植物の組織内に浸透移行させることを目的としている。したがって、キク科センダングサ属植物の抽出物を単独で施用することもできるが、マツ属植物の表面への定着性やマツ属植物の組織内への浸透性を良くするために、各種の展着剤や浸透移行剤を併用することもできる。展着剤や浸透移行剤とは、一般に界面活性剤を主成分とする液体であり、例えば一般展着剤（スプレッダー）、機能性展着剤（アジュバント）、固着性展着剤（スチッカー）などを併用することができる。
【００４１】
例えば、非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアリキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヘキシタン脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレン脂肪酸エステル、Ｎ―オクチルピロリドン、アセチレン系界面活性剤などがある。アニオン系界面活性剤としては、アルキルベンゼンスルホネート、ジアルキルスルホサクシネート、リグニンスルホネート、ナフタレンスルホネートのホルマリン縮合物などがある。固着性を良くするものには、アニオン性界面活性剤として、リグニンスルホンジェート、ナフタレンスルホネートの縮合物、パラフィン、ワックス、モタンワックス、ポリオキシエチレン樹脂酸エステル、ポリビニルアルコール、メチルビニルエーテル／無水マレイン酸共重合体などがある。浸透性を付与するものにはポリオキシエチレンヘキシタン脂肪酸エステルやポリオキシエチレンドデシルエーテルなどがある。
【００４２】
本発明における「防除」とは、本剤を施用することでマツノザイセンチュウ、マツノマダラカミキリを忌避、不動化、殺虫すること、または、これによってマツ材線虫病を予防、症状の軽減、駆除することを意味し、「防除剤」とは、本剤を施用することでマツノザイセンチュウ、マツノマダラカミキリを忌避、不動化、殺虫する効果を有する薬剤、または、これによってマツ材線虫病を予防、症状の軽減、駆除する効果を有する薬剤を意味する。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例によって本発明をより詳細に説明する。
【００４４】
１．供試線虫
本明細書に記載される実験に供試したマツノザイセンチュウは、以下の手順に従って得られたものである。
（１）手動の直径１５mm木工用ドリルを用いて、琉球大学校構内のマツ材線虫病に罹病したリュウキュウマツから木くずを採取した。
（２）得られた木くずの組織内から、ベルマン法（線虫学実験法、２００４、ｐ８７〜８８、編集者：線虫学実験法編集委員会、発行者：真宮靖治、発行所：日本線虫学会）によりマツノザイセンチュウを滅菌済み遠沈管に１０ml分離し、遠心機で３，０００rpm（１分間）遠心した。
（３）遠心後の上澄みの９mlをパスツールピペットで取り除いて、沈殿したマツノザイセンチュウに新たに滅菌水を加えて再度遠心分離を行う工程を計５回繰り返した後、上澄みの９mlを取り除いて残った沈殿したマツノザイセンチュウに、１０％に希釈した乳酸をパスツールピペットで９ml加えて遠心分離を行い、さらに上澄みの９mlを取り除いた後に、再度滅菌水を９ml加えて遠心し、上澄みの９mlを取り除くことで、マツノザイセンチュウの洗浄を行った。
（４）得られた表面殺菌済みのマツノザイセンチュウを、あらかじめＰＤＡ培地（ジャガイモ：２００〜３００g、ブドウ糖：１０〜２０g、寒天：１０〜２０g、水：１，０００ml）上で学内保存菌Botrytis cinerea Persoonを前培養した培地上で７日間増殖させた後、パスツールピペットを用いて滅菌水を約１０ml滴下し、良く懸濁して回収したものを以下の実験に供試した。
【００４５】
２．供試昆虫
（１）マツノマダラカミキリ成虫
マツ材線虫病に罹病したリュウキュウマツから羽化、脱出し、１〜２週間経過したマツノマダラカミキリ成虫を、沖縄県森林資源研究センターから譲り受け、以下の実験に供試した。
【００４６】
（２）マツノマダラカミキリ幼虫
沖縄県森林資源研究センターから譲り受けたマツ材線虫病に罹病したリュウキュウマツの丸太内の蛹室から、薪割り機及びピンセットを用いてマツノマダラカミキリの幼虫を採取した。その後、２５℃暗黒条件下に１日静置し状態の良いものを選抜して以下の実験に供試した。
【００４７】
３．マツノザイセンチュウの同定
マツノザイセンチュウの同定は、ベルマン法により分離された線虫を実体顕微鏡で口腔、食道及び陰門部などの形態的特徴を観察し同定を行った。属の同定は、検索表（Williamら、１９９６）を用いて行った。次に、形態的にBursaphelenchus属と同定した個体１頭を用いてＰＣＲ−ＲＦＬＰ法（Iwahoriら、１９９８）により種の同定を行い、さらに線虫の１８Ｓ及び２６ＳｒＲＮＡ遺伝子間スペーサー領域の配列を解読し（ＰＣＲ増幅及び配列決定のために使用したプライマーは、１８Ｓプライマー（配列番号１：5'-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3'）及び２６Ｓプライマー（配列番号２：5'-GGAATCATTGCCGCTCACTTT-3'））、得られた配列についてＤＤＢＪ（DNA Data Bank of Japan）のＷｅｂサイトでＢＬＡＳＴ検索を行なって種を特定した。その結果、上記いずれの手法においても、以下の実験に供試したセンチュウは、マツノザイセンチュウ（Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & Buhrer) Nickle）であると同定された。
【００４８】
[試験例１]
アワユキセンダングサ抽出液の作製
琉球大学農学部フィールドセンター内に自生する開花期のアワユキセンダングサの地上部を刈り取り、乾熱滅菌機で、１００℃、２時間乾燥させたアワユキセンダングサを切断し、ミキサーでさらに細かく粉砕したものをビーカーに１０g入れ、５０mlの水を加えた。これにアルミ箔で蓋をして、３０分間煮沸し、濾紙で濾過することにより抽出液を得た（以下、「試験例１の抽出液」とも称する）。
【００４９】
[試験例２]
アワユキセンダングサ含有成分の分析
（１）試験例１の抽出液２５mlを、回転石を入れた１００mlビーカーに移し、水酸化ナトリウム（４Ｎ）を１：１の割合で加え、ウォーターバスを用いて５０℃、４時間撹拌した。撹拌後、塩酸（１２Ｎ）を加え、溶液をpH１に調整した。濃度の測定はリトマス紙を用いた。
（２）pHの調整後、得られた溶液の半分量（２５ml）と酢酸エチル１００mlを分液漏斗に入れて撹拌し、しばらく静置したのち、酢酸エチル層と水層とが分離したら、水層を５０mlの容量ビーカーに回収し、残った酢酸エチル分画を１,０００ml容量の三角フラスコに回収した。
（３）回収した（２）の水層に対しても、さらに（２）と同じ工程で酢酸エチルと抽出液の二層分配を計２回行い、酢酸エチル分画を回収した。
（４）pHの調整後の、（２）の残りの溶液（２５ml）についても、（２）と同じ工程で酢酸エチルと抽出液の二層分配を複数回行い、計６００mlの酢酸エチル分画を得た。また、回収した酢酸エチル分画中に微量に混入している水を除去するため、硫酸ナトリウムを０．５ｇ程度加え、十分に撹拌し、冷室（２℃）に保存した。
（５）（４）の酢酸エチル分画を濾過して得られたうちの１００mlをフラスコに入れて、ロータリーエバポレーターを用いて酢酸エチルを揮発させ、固形の物質を得た。得られた物質をアセトンで溶解して１０,０００ppmに調製し、濾過した後に２ml容量のバイアルに約１．５ml入れたものをサンプルとした。
（６）サンプルについて、GC-MS（GCMS-QP2010、カラム：DB-SMS、カラム長：３０m、内径φ０．２５mm）を用いて成分分析を行った。
【００５０】
その結果、サンプルからは、アビエチン酸エチル、イソバニリン、α-カリオフィレン、β-カリオフィレン、クマラン、桂皮酸、デヒドロアビエチン酸メチルエステル、シリンガアルデヒド、ステアリン酸、バニリン酸、パルミチン酸、4-ヒドロキシ安息香酸、4H-ピラン-4-オン,2,3-ジヒドロ-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル、ブチルヒドロキシトルエン、2(4H)-ベンゾフラノン,5,6,7,7a-テトラヒドロ-4,4,7a-トリメチル及びミリスチン酸が検出された。
【００５１】
[実施例１]
マツノザイセンチュウに対する殺虫及び不動化実験
（１）試験例１の抽出液の、原液、１０、２０、１００倍希釈液を、それぞれ滅菌済み小型試験管にメスピペット（１ml）を用いて１ml加えた後、マイクロピペット（２０〜２００μl）を用いて１００頭/０．１mlに調整したマツノザイセンチュウの線虫懸濁液を添加し、パラフィルムで蓋をしてインキュベーター（２５℃条件下）に静置し、1日後、４日後、７日後（計３回）に不動化したマツノザイセンチュウを、８日後に致死したマツノザイセンチュウを、それぞれ光学顕微鏡下で計数した。対照として滅菌水区を設け、実験は７反復行った。
（２）７日後の動いているマツノザイセンチュウと不動化しているマツノザイセンチュウをそれぞれ計数し、不動化率を求めた。
（３）８日後の生存しているマツノザイセンチュウと致死しているマツノザイセンチュウをそれぞれ計数し、致死率を求めた。攪拌機で十分な刺激を与えても運動性がみられないものは、致死と判断した。
【００５２】
実験の結果、全ての実験区において、８６．５％以上の高い不動化率を示し、原液〜２０倍希釈液の実験区において、７６．４％以上の致死率を示したことからも明らかなとおり（表１）、アワユキセンダングサ抽出液のマツノザイセンチュウに対する高い殺虫効果及び不動化作用が認められた（表１及び図１）。
【００５３】
【表１】
0005560499.tif 000002
【００５４】
[実施例２]
マツノザイセンチュウに対する忌避実験
（１）乾熱滅菌したシャーレ底面の中央部にあらかじめ黒マジックで直径２cmの円を描いた。
（２）そのシャーレに素寒天培地（寒天：１０g、蒸留水：１，０００ml）を１０ml分注し、凝固させた後、試験例１の抽出液の、原液、１０、２０、１００、２００倍希釈液を、それぞれマイクロピペット（２０〜２００μl）を用いて円内に３．５μl滴下し、クリーンベンチ内で１０分間風乾させた。
（３）次に各実験区の円内に、マイクロピペット（２０〜２００μl）を用いて１００頭/３．５μlに調整したマツノザイセンチュウの線虫懸濁液を添加し、２５℃条件下に静置した。その後、３０分から２４時間後まで、円内に残存したマツノザイセンチュウの頭数を光学顕微鏡下で計数した。対照として滅菌水区を設け、実験は７反復行った。
【００５５】
アワユキセンダングサ抽出液を滴下後、２４時間経過した時点で、円内に残存したマツノザイセンチュウは、対照区では３９．３頭であったのに対し、原液、１０、２０倍希釈液の各実験区では、それぞれ１０．１頭、７．１頭、１８．７頭と減少していることからも明らかなとおり（図２）、時間の経過と共に円内に残存するマツノザイセンチュウの頭数は減少傾向にあり、アワユキセンダングサ抽出液のマツノザイセンチュウに対する忌避効果が認められた。
【００５６】
[実施例３]
マツ材線虫病に罹病したマツ組織内のマツノザイセンチュウに対する殺虫及び不動化実験
（１）３mmメッシュの篩を乗せた漏斗に約１０cmのゴム管を付け、そこから２〜３cm下をピンチクランプで止めた。
（２）次に、琉球大学校内のマツ材線虫病に罹病したリュウキュウマツから手動の直径１５mm木工用ドリルで木くず２０gを採取し、これを２枚重ねにしたキムワイプで包み、篩の上に置いて、試験例１の抽出液の、原液、１０、２０、５０、１００、２００倍希釈液をそれぞれ注ぎ静置した。
（３）１日後、３日後、５日後のマツノザイセンチュウを、次の手順で計数した。
ピンチクランプをゆっくり開けてマツノザイセンチュウを含む１０mlの液体を滅菌済み小型試験管に取り、遠心機で３,０００rpm（1分間）遠心した後、上澄みの９mlをパスツールピペットで取り除き、残り１ml中のマツノザイセンチュウの頭数を計数した。
なお、対照として、滅菌水区を設けた。また、実験は７反復行った。
【００５７】
実験の結果、対照区では、平均４５８．８頭のマツノザイセンチュウを確認できたのに対し、原液、１０、２０、５０、１００及び２００倍希釈液の各実験区では、それぞれ平均、８頭、３２．８頭、１０３．４頭、２１３．６頭、２１４．４頭、２８５．８頭のマツノザイセンチュウしか確認できなかった。また、実験区間では、アワユキセンダングサ抽出液の濃度が高くなるにつれて、分離されたマツノザイセンチュウの頭数が減少する傾向が認められた（図３）。
これは、不動化、致死したマツノザイセンチュウは運動性が失われていることから、キムワイプの隙間を通り抜けることができないため分離できなかったことによるものであるが、アワユキセンダングサ抽出液がマツノザイセンチュウに対して殺虫及び不動化作用を有することを示すものである。
なお、図３のグラフの値は、平均±標準偏差によるものであり、図３中のアルファベットは有意差を示す（Tukeyの多重比較検定、p＜0.05）。
【００５８】
[実施例４]
（１）マツノマダラカミキリ成虫に対する殺虫及び不動化実験
マツノマダラカミキリ成虫１頭に対し、試験例１の抽出液の原液２mlを噴霧器を用いて直接噴霧した。その成虫を、琉球大学校内から採取した、アワユキセンダングサ抽出液を施用していないリュウキュウマツの若枝（長さ５cm、幅２cm）と共に、円柱型プラスチック容器（直径６cm、高９cm）に入れ、２５℃条件下に静置した。その後、１日後、２日後、３日後に、プラスチック容器内の不動化及び致死した成虫をそれぞれ計数した。対照として滅菌水区を設け、実験は６反復行った。
【００５９】
実験の結果、全ての実験区（原液）で、１日後には不動化あるいは致死、３日後には致死の状態に至っており（表２及び図４）、アワユキセンダングサ抽出液がマツノマダラカミキリ成虫に対して殺虫及び不動化作用を有することが認められた。
【００６０】
【表２】
0005560499.tif 000003
【００６１】
（２）マツノマダラカミキリ成虫の忌避性に及ぼす影響
試験例１の抽出液の原液２mlを噴霧器を用いて直接噴霧したリュウキュウマツの若枝（長さ５cm、幅１．５〜２cm）３本を、アワユキセンダングサ抽出液を施用していないマツノマダラカミキリ成虫１頭（体長約２〜３cm）と共にプラスチック容器に入れ、２５℃条件下に静置した。その後、１日後、２日後、３日後に、それぞれマツの若枝に残ったマツノマダラカミキリの摂食痕の大きさを測定した。
判定基準は、処理したマツの若枝に摂食痕が全くみられないものを「強い忌避性有り（＋＋）」、１本あたりの摂食痕の総面積が１cm2以下のものを「忌避性有り（＋）」、それ以上のものを「忌避性無し（−）」とした。対照として滅菌水区を設け、実験は６反復行った。
【００６２】
実験の結果、全ての実験区において、１日後に、アワユキセンダングサ抽出液のマツノマダラカミキリに対する強い忌避性が認められた（表３及び図５）。
【００６３】
【表３】
0005560499.tif 000004
【００６４】
（３）マツノマダラカミキリ幼虫に対する殺虫効果実験
滅菌済みシャーレに、マツノマダラカミキリ幼虫各１頭を入れたうえで、試験例１の抽出液の、原液、１０、２０、１００倍希釈液をそれぞれメスピペット（２ml）を用いて２ml滴下した後、２５℃暗黒条件下に静置した。その後、１日後、３日後、７日後にそれぞれ致死幼虫を計数した。対照として滅菌水区及び無処理区を設け、実験は５反復行った。
【００６５】
実験の結果、対照区（無処理、滅菌水）は致死した幼虫が０頭であったのに対し、実験区は全ての濃度で致死した幼虫が見られ、原液では１００％、１０倍希釈液では８０％、２０倍希釈液では６０％、１００倍希釈液では２０％の割合で致死した（表４及び図６）。
【００６６】
【表４】
0005560499.tif 000005
【００６７】
以上の結果から、キク科センダングサ属植物の抽出物を有効成分として含む防除剤は、その濃度を適切に設定することにより、マツノザイセンチュウ及びマツノマダラカミキリ（幼虫、成虫のいずれも）に対する高い防除効果（忌避、不動化、殺虫）を示すことが認められた。
【００６８】
マツノザイセンチュウに対しては、本発明の防除剤が該線虫に対して接触すれば、マツ属植物の組織内および媒介虫であるマツノマダラカミキリの体内において殺虫性を発揮する。
また、マツノマダラカミキリおよびマツノザイセンチュウが共にキク科センダングサ属植物の抽出物に対して忌避性を示したことから、本発明の防除剤をマツ属植物の表面に適用することにより、マツ属植物の組織内へのマツノザイセンチュウの侵入を防止できることが確認された。
さらに、キク科センダングサ属植物の抽出物がマツノマダラカミキリ成虫および幼虫に対して殺虫性を示したことから、成虫に対しては本発明の防除剤を直接接触させることにより、また、幼虫に対しては本発明の防除剤をマツ属植物の組織内に適用することにより、殺虫効果を発揮できることが確認された。
【００６９】
[参考文献]
William, F. M. and Peter, G. M. with Howard, H. L. and Kent L.（1996）Plant-parasitic nematodes a pictorial key to genera, 5 th edition, pp.1-277, Comstock publishing associates a division of cornel university press, Ithaca and London. 
Iwahori, H. Tsuda, K. Kanzaki, N. Izui, K.& Futai, K（1998）PCR-RFLP and sequencing analysis of ribosomal DNA of Bursaphelenchus nematodes related to pine wilt disease. Fundam. appl. Nematol.,21(6).655-666
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明のマツ材線虫病防除剤は、昨今注目されている環境及び生物多様性を保全するための環境配慮型防除を促進するものであり、また単一の防除剤でありながら、マツ材線虫病の病原であるマツノザイセンチュウとその媒介虫であるマツノマダラカミキリの双方に対して高い抗虫活性（殺虫及び忌避効果）を有することから、効率的なマツ材線虫病の防除剤及び防除方法として有効に利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
0005560499.tif 000009
【図５】
0005560499.tif 000010
【図６】
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【配列表】
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