(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル内のグルコースを検出するためのバイオセンサ先端デバイスであって、
近位端および遠位端を各々が有する複数の先端本体であって、前記複数の先端本体の少なくとも１つは、近位端および遠位端を有する光ファイバを含む、複数の先端本体と、
前記複数の先端本体の前記少なくとも１つの先端本体の遠位端に光学的に近接していて、少なくとも１つのグルコース・ガラクトース結合蛋白質（ＧＧＢＰ）を含む検出素子と
を備え、前記ＧＧＢＰは、グルコースと、前記ＧＧＢＰに結合された少なくとも１つのリポータ基とを結合するように適合されており、前記リポータ基は、前記ＧＧＢＰを前記グルコースに結合したときに発光変化を受けるように適合されており、
前記検出素子は、ポリマーマトリックス内に閉じ込められているか、またはポリマーマトリックスに取り付けられており、前記ポリマーマトリックスは、アミン基と反応して前記アミン基と結合する第１のセットの反応基を含み、前記ポリマーマトリックスは、前記光ファイバの前記表面上にある前記アミン基を通して、前記光ファイバの前記遠位端に取り付けられていること
を特徴とするバイオセンサ先端デバイス。
【請求項２】
少なくとも１つの先端本体はニードルを備えていることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記ポリマーマトリックスは、前記光ファイバの遠位端に直接取り付けられていることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
取り付け可能光コンポーネントを受け入れることができる構成および寸法になっている光結合部をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
【請求項５】
前記ＧＧＢＰと関連付けられた少なくとも１つの参照基をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
【請求項６】
前記検出素子は患者の皮膚内にまたは貫通して挿入されるようにさらに適合されていることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
【請求項７】
前記サンプルの温度を検出する温度検出素子をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
【請求項８】
前記先端本体および検出素子は無菌であることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
【請求項９】
少なくとも１つの先端本体は、前記近位端と遠位端との間に配置された１以上のポートをさらに備えることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記１以上のポートは、前記グルコースを前記検出素子に近づけることを可能にしていることを特徴とする請求項９に記載のデバイス。
【請求項１１】
前記１以上のポートは、治療剤を投与するために構成されていることを特徴とする請求項１０に記載のデバイス。
【請求項１２】
少なくとも１つの先端本体の少なくとも一部は患者の皮膚を貫通して延びていることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記光ファイバおよび検出素子を含む前記先端本体は、ニードルであることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
【請求項１４】
前記ニードルは、前記近位端と遠位端との間に配置された１以上のポートをさらに備えることを特徴とする請求項１３に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記ニードルは、前記検出素子から遠位に突出しかつ前記検出素子に近接している屈曲先端部分を備えることを特徴とする請求項１３に記載のデバイス。
【請求項１６】
前記デバイスは、２つの先端本体を有することを特徴とする請求項１３に記載のデバイス。
【請求項１７】
前記２つの先端本体の第１の先端本体が前記検出素子を含み、前記２つの先端本体の第２の先端本体が前記患者へ前記治療薬を投与するための投与手段を含むことを特徴とする請求項１６に記載のデバイス。
【請求項１８】
前記検出素子は、前記ポリマーマトリックスを経由して、前記第１の先端本体の前記内面にさらに取り付けられていることを特徴とする請求項１７に記載のデバイス。
【請求項１９】
マウントをさらに備えたことを特徴とする請求項１８に記載のデバイス。
【請求項２０】
前記ポリマー上の前記反応基は、前記ファイバ上の前記表面にあるアミン基に結合することを特徴とする請求項１３に記載のデバイス。
【請求項２１】
マウントをさらに備えたことを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理学的に関係のある化合物の濃度をモニタするために使用できるデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、係属中の米国特許出願第１０／７２１７９７号の一部継続出願であり、その全内容は引用により本明細書の組み込まれている。
【０００３】
種々の病気や疾患の診断や治療を改善するために生理学的に関係のある化合物の生体内濃度をモニタすることが望ましい目標となっており、多くの個人の生活を向上する可能性がある。この分野における進歩は、糖尿病患者の適切な代謝調節を促進する分野で特に有望性を示している。現在、大部分の糖尿病患者は、血液中のグルコースレベルをモニタするために「フィンガースティック（ｆｉｎｇｅｒ  ｓｔｉｃｋ）」法を使用しており、患者の薬剤服用順守（ｐａｔｉｅｎｔ  ｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ）は、たびたびのフィンガースティックによって引き起こされる苦痛のために問題となっている。その結果、血液または他の生体液中のグルコースの頻発的および／または継続的モニタリングのために、非侵襲性（ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ）または最小限に侵襲性の生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）法、およびより効果的な生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）法を開発する努力が行なわれている。
【０００４】
頻発的および／または継続的生体内モニタリングに対するアプローチを大きく分けると、「非侵襲性」と「最小限侵襲性」の２種類がある。非侵襲性モニタリングでは、皮膚および組織内のスペクトル変化を直接追跡することによりアナライト(ａｎａｌｙｔｅ)レベルを判定する。この技術の例として、赤外線放射と電波インピーダンス分光法（ｒａｄｉｏ  ｗａｖｅ  ｉｍｐｅｄａｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ)がある。これらのアプローチの進歩は、頻繁な較正の必要性、再現可能なサンプル照射、および個体間での分光バックグランドの差異に起因して遅いものだった。「最小限侵襲性」アプローチでは、人体から直接採血することを避け、中間（ｉｎｔｅｒｍｅｄｅｄｉａｔｅ）検出素子を使用して生体液中の信号変化をモニタリングすることに依拠している。このタイプのバイオセンサは、変換（検出）素子と結合された生物認識素子（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を使用して、特定の定量的または半定量的分析情報を提供する能力を備えたデバイスである。
【０００５】
頻発的または継続的アナライトモニタリングのための従来システムの多くは、グルコースをグルクロン酸および過酸化水素に酸化して、電気化学信号を生成するグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）などの酵素を使用する電力測定バイオセンサを伴う。これらのセンサは、酸素欠乏や酸化副産物の堆積に起因して不正確な測定の影響を受けやすくなっている。グルコース濃度を正確に測定するためには余剰酸素が必要であるが、これは人体血液または間質液中には存在しないのが普通である。また、電気化学反応自体も、酵素とその保護層の両方を阻害し、劣化させるおそれのある酸化副産物の堆積を引き起こす。
【０００６】
電気化学信号ではなく光信号に基づくバイオセンサも開発されており、安定性と較正の面で顕著な改善をもたらしている。例えば、アナライト依存光信号を第２のアナライト非依存信号と対照すると、センサのノイズおよび不安定性の原因を補正することができる。しかしながら、生体内アナライト検出のための光検出の潜在能力はまだ実現されていない。その１つの理由は、現在の光検出法の多くが、グルコースオキシダーゼなどの酵素化学（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）に頼っているからである。ある一般的な方法では、ＧＯｘ酵素反応による酸素の消費をモニタリングするために酸素感受性蛍光染料（ｏｘｙｇｅｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｄｙｅ）が使用されている。これは、蛍光信号レベルが酸素レベルの変化と共に変化する光バイオセンサであるが、このようなセンサは、同じ化学的性質、すなわち、酸素欠乏および酵素劣化に基づく電流測定センサと同じ問題の影響を受けている。
【０００７】
酵素検出（例えば、ＧＯｘ）に関連する難題を解決するために、それが電気化学的であるか、光学的であるかに関係なく、非酵素蛋白質ベースの光検出または蛍光検出が研究されている。競合ＦＲＥＴアッセイを作り出すために標識（ｌａｂｅｌｅｄ）コンカナバリンＡとデキストランが使用されている。しかし、このシステムでは、両方のコンポーネントを閉じ込める必要があり、またアッセイのダイナミックレンジが制限されている。非特許文献１および２を参照されたい。
【０００８】
別の蛋白質ベースの検出化学では、グルコース結合に応答して蛍光信号を生成するために、Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ペリプラズムリセプタ、グルコース・ガラクトース結合蛋白質（ＧＧＢＰ）を使用している。例えば、非特許文献３〜６を参照されたい。ＧＧＢＰは、リガンドが結合すると著しい構造変化を起こし、２つの球状ドメイン間にリガンドをトラップする。例えば、非特許文献７を参照されたい。環境感受性フルオロフォア（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｌｙ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）によりサイトを特定して蛋白質を標識付けすることにより、この属性を蛍光信号の生成に利用することができる。例えば、非特許文献５を参照されたい。ＧＧＢＰはグルコースを消費することも、反応生産物を生成することもしないので、これは無試薬（ｒｅａｇｅｎｔｌｅｓｓ）センサとして使用することができる。このセンサによると、電流測定バイオセンサよりも正確さと信頼性を向上することができる。
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願第２００３／０１５３０２６号明細書
【特許文献２】米国特許出願第２００３／０１３４３４６号明細書
【特許文献３】米国特許出願第２００３／０１３０１６７号明細書
【特許文献４】米国特許出願第１０／７２１０９１号明細書
【特許文献５】米国特許第６２７７６２７号明細書
【特許文献６】米国特許第６１９７５３４号明細書
【特許文献７】国際公開第０３／０６０４６４号パンフレット
【特許文献８】米国特許出願第１０／４２８２９５号明細書
【特許文献９】国際特許出願第ＵＳ０３／００２０３号明細書
【特許文献１０】米国特許出願第２００３０１３４３４６号明細書
【非特許文献１】Ballerstadt, R., Schultz, J.S; “Competitive-binding assay method based on fluorescence quenching of ligands held in close proximity by a multivalent receptor,”Anal. Chem. Acta 345 (1-3): 203-212(1997)
【非特許文献２】Rusell, R.J., Pishko M.V., Gefrides C.C., McShane, M.J., Cote, G.L.; “A fluorescence-based glucose biosensor using concanavalin A and dextran encapsulated in a poly(ethylene glycol) hydrogel,” Anal. Chem. 71(15): 3126-3132 (1999)
【非特許文献３】Tolosa, L., I. Gryczynski, L. R. Eichhorn, J. D. Dattelbaum, F. N. Castellano, G. Rao, and J. R. Lakowicz;“Glucose sensor for low-cost lifetime-based sensing using a genetically engineered protein,” Anal. Biochem. 267: 114-120(1999)
【非特許文献４】Hellinga, H. W., and S. Marvin; “Protein engineering and the development of generic biosensor,” Trends Biotechnol. 16: 183-189(1998)
【非特許文献５】Salins, L. L., R. A. Ware, C. M. Ensor, and S. Daunert,“A novel reagentless sensing system for measuring glucose based on the galactose/glucose-binding protein,” Anal Biochem 294: 19-26 (2001)
【非特許文献６】De Lorimier, R. M.,J.J. Smith, M. A. Dwyer, L. L. Looger, K. M. Sali, C. D. Paavola, S. S. Rizk, S. Sadigov, D. W. Conrad, L. Loew, and H. W. Hellinga,“Construction of a fluorescent biosensor family,” Protein Sci. 11:2655-2675 (2002)
【非特許文献７】Shilton, B. H., M. M. Flocco, M. Nilson, and S. L. Mowbray;“Conformational changes of three periplasmic receptors for bacterial chemotaxis and transport: the maltose-, glucose/galactose- and ribosebinding protein,” J. Mol. Biol. 264: 350-363(1996)
【非特許文献８】Cass et al., Anal. Chenz. 1994, 66, 3840-3847
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
いくつかのグループが生理学的範囲内でグルコースに反応できるＧＧＢＰ突然変異体を開発しているが、生体内または生体外のアナライトモニタリングに適している、結合蛋白質技術に基づく機能的バイオセンサデバイスの報告はまだない。機能する頻発的および／または継続的バイオセンサでは、センサの完全性および機能性ならびに患者の快適性を維持する一方でしつつ、検出素子を光検出素子に結合する必要がある。例えば、生物認識素子および付随の変換素子は、検出素子を免疫システムから遮蔽し、アナライトが出入りする拡散を可能にし、検出素子が患者の血液または他の生体液（例えば、間質液）中に浸出するのを防止する生体適合性材料内に組み込まれていることが好ましい。結合蛋白質は、効果的使用を可能にするために方向性制御と構造自由度（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｆｒｅｅｄｏｍ）を必要とするので、文献に教示されているような、多くの物理的吸着およびランダムまたはバルク共有結合面付着（ｒａｎｄｏｍ  ｏｒ  ｂｕｌｋ  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）または固定化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）という方法は、一般的に準最適であるか、不成功のどちらかである。さらに、再現可能な方法および／または制御された方法により光でサンプルを調査する手段の開発が要望されている。
【００１１】
一般的に知られている１つのアプローチは、検出素子を光ファイバの一方の端に結合し、励振源（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｓｏｕｒｃｅ）や検出器等の光素子を他方の端に結合することである。しかしながら、結合蛋白質を光ファイバの一方の端に結合することは、蛋白質の構造可動性（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ)および／または方向可動性(ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ)を保持するという上記難題の影響を受ける。さらに、光ファイバケーブリングは、患者がセンサを定期的に取り外したり、取り替えたりする必要がありうるので、患者の使用の観点から実用的でないことがしばしばである。光ファイバ全体を交換することはコストがかかり、また不便である。最後に、例えば、励振源、検出器およびその他の光素子を備える光システムは、例えば、患者の動きや光学式読取装置（ｏｐｔｉｃａｌ  ｒｅａｄｅｒ）内の電子機器のドリフトに起因する光アライメントの変化を許容または補正するように十分にロバストでなければならない。また、光システムは、システムを持ち運び不能にし、従って着用不能にするような大電力消費および／または大型素子に依拠することなく、リポータ染料（ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｄｙｅ）からの信号を検出するのに十分な感度を有していなければならない。
【００１２】
したがって、光検出素子に結合された構造可動性（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ)および／または方向可動性(ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ)を有する結合蛋白質がその検出素子内に組み込まれたバイオセンサであって、直用可能でロバストなデバイスを提供するものが望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、サンプル内のターゲットアナライト（ｔａｒｇｅｔ  ａｎａｌｙｔｅ）の濃度を検出するデバイスに関する。サンプルとしては、血液、唾液、涙、汗、尿、脳脊髄液（ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ）、リンパ液、間質液、プラズマ、血清、動物組織および媒質（ｍｅｄｉａ）がある。デバイスは、一般的に、(i) 近位端（ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｅｎｄ）および遠位端（ｄｉｓｔａｌ  ｅｎｄ）を有する光導管(ｏｐｔｉｃａｌ  ｃｏｎｄｕｉｔ)と、(ii) 光導管の遠位端に光学的に近接していて、少なくとも１つのターゲットアナライトと結合するように適合された少なくとも１つの結合蛋白質を備える検出素子とを備え、この検出素子は、少なくとも１つリポータ基（ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｒｏｕｐ）も備えている。
【００１４】
光導管は、長さが約０．１ｃｍから１ｍの範囲にわたっているが、光が光システムに入出力されるように、および検出素子に入出力されるように結合されている。例えば、光導管は、レンズ、反射チャネル、ニードルまたは光ファイバとすることができる。光ファイバは、シングルストランドの光ファイバ（シングルモードまたはマルチモード）にすることも、２つ以上のファイバの束にすることもできる。ある実施形態では、ファイバの束は二分岐になっている。ファイバは非テーパ形にすることも、患者の皮膚内に入り込むようにテーパ形にすることもできる。
【００１５】
光システムは、光導管の近位端に取り付けることができる。光システムは、１または２以上の励振源と１または２以上の検出器の組み合わせを備える。また、光システムは、フィルタ、二色性（ｄｉｃｈｒｏｉｃ）素子、電源、ならびに信号検出用および変調用電子機器を備えることもできる。光システムは、任意選択として、マイクロプロセッサを備えることも可能である。
【００１６】
光システムは、１または２以上の調査波長（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ）の光を光導管内に結合することによって、連続的にまたは断続的にサンプルを調査する。ついで、１または２以上の調査波長は光導管を通過し、検出素子を照射する。アナライト濃度が変化すると、検出素子の一部であるリポータ基の発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）の波長、強度、寿命、エネルギー伝達効率、および／または偏光が変化する。結果として得られる変化した発光信号は、光導管を通って光システムに戻され、そこでこの信号が検出され、解釈され、格納され、および／または表示される。いくつかの実施形態では、光システムは複数の励振源を備える。これらの励振源の１または２以上を、検出信号の動的信号処理を可能にし、もって信号対雑音および検出感度を向上するように変調することができる。変調はまた、デバイスによる電力消費を低減するためや、色退色（ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）などの望ましくない現象を最小限にすることによって寿命を延長するために使用することができる。光システムはまた、リポータ基および任意選択の参照基からの発光信号を検出するためや、内部参照および／または較正のために使用できる１または２以上の電磁エネルギー検出器を備えることができる。光システムの総電力消費は、デバイスがバッテリ電源で動作できるように少量に保たれる。
【００１７】
検出素子は、少なくとも１つのターゲットアナライトと結合するのに適した１または２以上の結合蛋白質と少なくとも１つのリポータ基を備える。適した結合蛋白質としては、バイオセンサとして使用するのに適していればいずれであってもよい。例えば、適した結合蛋白質としては、特許文献１〜４に記載されているもののいずれにすることもできる。特許文献１〜４の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。また、適した結合蛋白質としては、特許文献５〜７に記載されているもののいずれにすることも可能である。特許文献５〜７の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
【００１８】
結合蛋白質と関連付けられているリポータ基は、結合蛋白質がターゲットアナライトに結合すると発光が変化するように適合されている。本明細書で用いるとき、「と関連付けられている（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ）」という用語は、リポータ基が共有結合的または非共有結合的に結合蛋白質と関連付けられており、ターゲットアナライトが結合蛋白質に結合すると、波長、強度、寿命、エネルギー伝達効率、および／または偏光などのリポータ基の発光特性が変化することを意味している。リポータ基の例としては、これらに限定されないが、有機染料、有機染料の対、蛍光性または生物発光性（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）融合蛋白質、蛍光性または生物発光性融合蛋白質の対、または上記を任意に組み合わせたものがある。リポータ基は、蛍光共鳴エネルギー移動が生じるドナー及びアクセプタで構成することができる。その他の発光性標識部分（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）としては、ユウロピウム(Ｅｕ３＋)やテルビウム(Ｔｂ３＋)などのランタニドのほかに、一般的にフェナントロリンなどのジイミンリガンドとの錯体（ｃｏｍｐｌｅｘ）である金属リガンド錯体などがあり、この中には、ルテニウム[Ｒｕ（ＩＩ）]、レニウム［Ｒｅ（Ｉ）］、またはオスミウム[Ｏｓ（ＩＩ）]の錯体が含まれる。
【００１９】
検出素子は、光導管に光学的に近接している。ここで「光学的に近接（ｏｐｔｉｃａｌ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ）」とは、デバイスのコンポーネントが相互に十分に近接し、光信号を相互の間で送受信できることを意味する。検出素子を光導管に光学的に近接して配置するには、いくつかの方法が可能である。例えば、光導管に直接的に取り付けること、光導管に取り付けられたコネクタに取り付けること、光導管に取り付けられたポリマー鎖またはポリマーマトリックスに取り付けること、または、光導管に取り付けられたコネクタに取り付けられたポリマー鎖またはポリマーマトリックスに取り付けることが可能である。検出素子は、光導管に永続的に固定することも、検出素子を利便性良く、かつ経済的に置換できるように交換可能に取り付けることも可能である。
【００２０】
別の実施形態では、検出素子は、さらに、１または２以上の参照基を備えることが可能である。リポータ基とは異なり、参照基では、ターゲットアナライトが結合蛋白質に結合したときに発光信号が実質的に変化しない。ここで「実質的に変化しない」とは、参照基の発光変化が、リポータ基に生じる発光変化よりも大幅に小さいことを意味している。参照基は、発光性染料および／または蛋白質で構成でき、内部参照（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｉｎｇ）および較正のために使用される。参照基は、デバイスの任意の数のコンポーネントに取り付けることができ、これらには、検出素子、リポータ基を含有していない結合蛋白質、ポリマーマトリックス、ポリマー鎖、結合蛋白質でない生体分子、光導管または先端（ｔｉｐ）が含まれている。
【００２１】
検出素子（この用語は一般的に、関連付けられたリポータ基および任意選択の参照基を有する結合蛋白質を指す。）は、例えば、共有結合性、イオン性またはファンデルワールス相互作用、ディップコーティング（ｄｉｐ  ｃｏａｔｉｎｇ）、スピンコーティング、プラズマコーティング、または真空蒸着を使用して、光導管の遠位端に直接的に取り付けることができる。検出素子は、コネクタに取り付けることも可能であり、このようにすると、検出素子を容易に取り外し可能にできるので交換可能にできる。
【００２２】
別の実施形態では、検出素子は、ポリマーマトリックスに取り付けられているか、あるいは固定されている。本明細書で使用されるとき「マトリックス」という用語は、アナライトに対して透過性である任意の２次元または３次元構造とすることができる。マトリックスは、任意的に、他の生体分子からの干渉を実質的に防止でき、また実質的に生体適合性のあるものにすることができる。ある実施形態では、マトリックスは、結合蛋白質にある程度の構造および／または方向可動性を保持させることができる。マトリックスは、内層が結合蛋白質を保持する働きをし、１または２以上の外層が透過性を制御し、かつ／または生体適合性を実現する働きをする複数の層で構成することができる。例えば、ポリマーマトリックスは、特許文献８に記載されているもののいずれにすることもできる。特許文献８の全内容は引用により本明細書の一部になっている。固定化は、共有結合で検出素子をポリマーマトリックスにリンクすることによっても、物理的に検出素子をマトリックス内に閉じ込めることによっても実現できる。ポリマーマトリックスが物理的に検出素子を閉じ込める場合には、マトリックス孔（ｍａｔｒｉｘ  ｐｏｒｅ）が検出素子を保持するサイズになっている。検出素子がポリマーマトリックスに取り付けられる実施形態では、検出素子は、例えば、共有結合性またはイオン性リンケージによりマトリックスに付着される。ポリマーマトリックスは、接着剤、ディップまたはスピンコーティング、プラズマコーティング、共有結合性、イオン性またはファンデルワールス相互作用、機械的コネクタまたはこれらの組み合わせにより光導管の遠位端に取り付けることができる。
【００２３】
別の実施形態では、検出素子はポリマー鎖に取り付けられている。検出素子をポリマー鎖に取り付ける方法として、共有結合性、イオン性およびファンデルワールス相互作用ならびにこれらの組み合わせがあるが、これらに限定されない。ポリマー鎖は、例えば、ディップまたはスピンコーティング、プラズマコーティング、真空蒸着、共有結合性、イオン性もしくはファンデルワールス相互作用またはこれらの組み合わせを用いて光導管の遠位端に取り付けられている。
【００２４】
別の実施形態では、このデバイスは、さらに、皮膚を貫通して検出素子が皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）または皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）空間内の体液に接触するように設計された（テーパ状または非テーパ状）先端（ｔｉｐ）を備える。好ましくは、先端は使い捨てである。先端は、プラスチック、スチール、ガラス、ポリマー、又はこれら若しくは同様の材料を任意に組み合わせたもので作ることができる。先端は、接着剤または機械的取付け部品（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｆｉｔｔｉｎｇ）を使用して光導管（ファイバ）に直接接続することができる。先端は、検出素子を収めている光導管を収容して、光導管および検出素子を格納するために使用することもできる。ある実施形態では、検出素子は先端内に収めておくことができる。
【００２５】
このデバイスは、さらに、デバイスのコンポーネントを相互に取り付けるために使用できるコネクタを備えることも可能である。このコネクタは、例えば、標準光ファイバコネクタ、ルアーロック（ｌｕｅｒ  ｌｏｃｋ）、プラスチック、メタル若しくはガラススリーブ、又はバネ調整ハウジング（ｓｐｒｉｎｇ−ｌｏａｄｅｄ  ｈｏｕｓｉｎｇ）などの任意の機械的デバイスにすることができる。例えば、コネクタは、検出素子を光導管に取り付けるためにも、光導管を光システムに取り付けるためにも使用できる。コネクタの主目的は、他のコンポーネントを取り外し可能にして、コンポーネントが交換可能になるようにするコンポーネントを提供ことである。
【００２６】
本発明は、添付図面に示された実施形態を参照して、より容易に理解されるだろう。
【００２７】
図全体を通して、当然に理解されるように、類似の符号は類似の特徴と構造を示している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、添付図面を参照して本発明の好ましい実施形態について説明する。本発明の以下の詳細な説明は実施形態すべてを説明することを目的とするものではない。本発明の好ましい実施形態の説明において、特定の用語が明確性のために用いられているが、本発明はそこで選択された特定用語に限定されるものではない。当然に理解されるように、各々の特定要素は、類似の目的を達成するために同じように動作する技術的等価物を含んでいる。
【００２９】
本発明は、所望の臨床または分析的範囲内で関心のあるアナライトを結合するように設計された結合蛋白質に関わるものである。加えて、１または２以上の発光性リポータ基が結合蛋白質と関係付けられている。これらの発光性リポータ基の例としては、蛋白質内のシステイン残留物に共有結合的に結合された有機芳香族染料分子、または設計された結合蛋白質に融合した（ｆｕｓｅｄ）蛋白質などの発光性生体分子があるが、これらに限定されない。システインまたは他のアミノ酸基を結合蛋白質に加工して、発光性リポータ分子の取り付け位置を設けることができる。アナライトが結合蛋白質に結合すると、１または２以上のリポータ基の発光特性が変化する。影響を受ける発光特性としては、吸収または放出波長、吸収または放出強度、放出寿命、放出偏光、および／またはエネルギー伝達効率がある。アナライトの結合は可逆にすることもでき、結合が解かれると、この場合も、リポータ基の発光特性が変化する。
【００３０】
１または２以上の結合蛋白質は、その関連付けられたリポータ基と共に検出素子を構成する。任意選択として、検出素子は１または２以上の参照基を備えることもできる。リポータ基と異なり、参照基では、ターゲットアナライトが結合蛋白質に結合したとき発光信号が実質的に変化しない。参照基からの発光信号は、例えば、光システム（ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｙｓｔｅｍ）内の電子ドリフトやサンプルまたは光導管の動きに起因する光学的影響を補正するために使用できる内部光基準（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｔａｎｄａｒｄ）を提供する。参照基は較正のためにも使用できる。参照基は、デバイスの任意の数のコンポーネントに取り付けることができ、この中には、検出素子、リポータ基を含有しない結合蛋白質、ポリマーマトリックス、ポリマー連鎖、結合蛋白質でない生体分子、光導管、または先端（ｔｉｐ）が含まれる。ある実施形態では、参照基は、生理学的に関係のある濃度でアナライトに顕著な反応を示さないように設計された結合蛋白質に取り付けられている。
【００３１】
１または２以上の結合蛋白質、１または２以上のリポータ基、および任意選択の参照基を備える検出素子は、光導管の端部で固定することも、光導管とのインタフェースとなる使い捨て先端（ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ  ｔｉｐ）内部で固定することもできる。検出素子を光導管に又は使い捨て先端内部に固定することは、検出素子の薄層を、例えば、ディップまたはスピンコーティング、共有結合による取り付け、プラズマ処理などによって光導管または先端上に直接的に堆積することによって行なうことができる。あるいは、検出素子を最初にポリマーマトリックス内に固定し、次に、接着剤、射出成形、ディップまたはスピンコーティング、プラズマコーティング、真空蒸着、インクジェット技術、共有結合性、イオン性またはファンデルワールス相互作用、機械的取り付けまたはこれらを組み合わせたものによって、マトリックスを光導管または先端に取り付けることも可能である。代替実施形態では、検出化学作用を有する薄層を光導管に取り付けてから、半透膜で被覆することもできる。
【００３２】
光システムは、光を電磁励振源から光導管を下って検出素子が包含されている遠位端に通すことによって、リポータ基と参照基の発光応答について調査する能力を備えている。光システムはまた、リポータ基と参照基の発光応答によって生成された戻り信号（ｒｅｔｕｒｎ  ｓｉｇｎａｌ）をモニタし、解釈する。リポータ基の発光特性は、波長、強度、寿命、エネルギー伝達効率または偏光のいずれも、アナライトが結合蛋白質に結合するか、あるいはその結合が解かれると、それに応答して変化する。
【００３３】
次に、図１を参照して、本発明の特定の実施形態について説明する。光システム２は、これらに限定されないが電磁エネルギーエミッタ、電磁エネルギー検出器、各種のミラー、フィルタ、電子機器、ホログラフィック光学系、二色性素子、および、調査放射（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ）を電磁エネルギーエミッタから光導管を下って検出素子に送信したあと、戻り発光信号を解析し解釈するために必要な光学基準（ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｔａｎｄａｒｄ）を含む素子の組み合わせを備える。リポータ基からの戻り発光信号は、検出されるアナライトの濃度の変化に応答して変化する。光システム２は、信号処理、１または２以上の信号の数学的操作、ならびにデータの格納および取り扱いを処理するコンピュータまたはマイクロプロセッサ３を装備することもできる。コンピュータまたはマイクロプロセッサ３は、光システムの他のコンポーネントと物理的に接触させることができるが、好ましい実施形態では、光システムの他のコンポーネントから最大で数メートルまで物理的に分離させることもできる。この実施形態では、光システム内の電磁エネルギー検出器および電子処理素子からの情報はワイヤレス（無線）でコンピュータまたはマイクロプロセッサ３に伝達される。コンピュータまたはマイクロプロセッサ３は、検出素子に固有の較正情報を格納することもできる。光システム２で発生した１または２以上の波長の光は、光導管４を下って検出素子６に伝達される。光導管４は光ファイバにすることも、光を最小損失で伝達する短光導波路（ｓｈｏｒｔ  ｌｉｇｈｔｇｕｉｄｅ）にすることもできる。検出素子６は、１または２以上の結合蛋白質からなり、１または２以上の関連発光性リポータ基が、ポリマーマトリックスに固定されているか、ポリマー連鎖に取り付けられているか、使い捨て先端に組み込まれているか、光導管の遠位端に直接的に取り付けられているか、あるいはコネクタに取り付けられている。検出素子６は、任意選択として、参照または較正信号を得る目的で、生体分子、ポリマーまたは有機分子に取り付けられた追加の発光性参照基を含むこともできる。検出素子６は、光導管４の遠位端に直接にまたはポリマーマトリックスを介して取り付けることができるが、好ましい実施形態では、光導管４の遠位端に取り付けられた使い捨て先端５に取り付けられる。このケースでは、使い捨て先端５は、接着剤を介して機械的に、または当業者に知られている任意の他の適当な手段によって、光導管４に対して配置されている。
【００３４】
図２は、２つの代表的実施形態における光システム２を示す拡大図である。図２Ａにおいて、ダイクロイックミラーまたはビームスプリッタ１１を使用して、光が電磁エネルギーソース７から光導管４に向けられる。励起ソースは、例えば、アークランプ、レーザダイオードまたはＬＥＤで構成できるが、これらに限定されない。この実施形態では、光導管４は光ファイバケーブルであり、励起光を電磁エネルギーソース７から検出素子６に伝達するためにも、リポータ基または参照基からの発光信号を光システム２に戻すように伝達するためにも、同じケーブルが使用されている。ダイクロイック素子１１は、好ましくは、戻り信号を励起光から分離し、信号を電磁エネルギー検出器８に向ける。検出器は、例えば、フォトダイオード、ＣＣＤチップまたは光電子倍増管を含むことができるが、これらに限定されない。複数の発光信号が検出素子から戻される場合には、戻り信号の一部を複数の検出器に向けるために追加のダイクロイック素子を使用することができる。好ましくは、アナライトに反応しない発光性参照基をアナライト依存性リポータ分子と一緒に含めておくと、参照信号が得られる。この参照信号は、例えば、光または電子ドリフトを補正するために使用することができる。
【００３５】
図２Ｂは、検出素子との間で光を送受伝達するために２分岐光ファイバ束（ｂｉｆｕｒｃａｔｅｄ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｂｕｎｄｌｅ）または溶融型光ファイバ構成（ｆｕｓｅｄ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｆｉｂｅｒ  ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）が使用されている第２の実施形態を示す図である。ここでは、励起ソース７からの光は、２分岐光ファイバ束の一方のアームを下って伝達される。検出素子からの戻り発光信号は２分岐光ファイバの他方のアームを使用して検出されるので、このケースでは、光ファイバ束は励起を戻り発光から分離する働きをする。ダイクロイック光学系、ビームスプリッタまたは偏光器（ｐｏｌａｒｉｚｅｒ）を付加的に使用して、例えば波長または偏光に基づいて戻り発光をさらに分割することができる。任意選択として、検出される発光波長を選択するためにバンドパスフィルタ１２を使用することができる。電源９は光システム２に電力を供給する。
【００３６】
図３は、例えば、光導管が光ファイバで構成されているとき、検出素子６を光導管４の端部に取り付ける種々の代表的方法または手段を示している。当業者ならば理解されるように、図３に図示の代表的取り付け方法のいずれにおいても、検出素子６と光ファイバ４との間を十分に接触または密接させたり、動作時に検出素子６が光ファイバから剥離するのを防止して、光が効率的に検出素子６との間で送受されることを保証するといった設計上の考慮事項に注意が払われるべきである。さらに、動作時間中に検出素子の保全性を維持することは、信頼の高い信号応答が得られることを保証するために重要である。例えば、生体内で使用されるとき、検出素子６は、収縮、膨張、劣化の原因となったり、信号強度、発光、応答時間などを含む他の望ましい機能特性にマイナスの影響を及ぼしたりする種々の環境の影響を受けるおそれがある。従って、最適な取り付け方法または手段は、特定の検出素子または特定の応用分野の特性、構成、および寸法に応じて変化することがある。図３に図示の実施形態のすべては、一般的に光ファイバ４の遠位端１０を光ファイバ４の軸に直角の平面として示しているが、代替実施形態では、遠位端１０を複合/合成/湾曲した面にすることも、テーパ状または軸に対して角度を付けることもできる。図３に図示の取り付け方法は好ましい実施形態であり、個別でも組み合わせでも使用することができる。
【００３７】
ある特定の実施形態では、検出素子６は、例えば、共有結合性、イオン性またはファンデルワールス相互作用、ディップコーティング、スピンコーティング、プラズマコーティング、真空蒸着、インクジェット技術またはこれらの組み合わせを使用して、光ファイバ４の遠位端１０に直接取り付けることができる。図３Ａを参照すると、結合蛋白質、関連リポータ基および任意選択の参照基を備える検出素子は代替的に、例えば単層または長鎖ポリマーなどのポリマ１３に取り付けることができ、ポリマー１３は、例えばディップまたはスピンコーティング、プラズマコーティング、真空蒸着、共有結合性、イオン性またはファンデルワールス相互作用、インクジェット技術、またはこれらの組み合わせを使用して光ファイバ１４の遠位端１０に直接取り付けることができる。
【００３８】
図３Ｂに示す別の実施形態では、検出素子６はポリマーマトリックス１４に固定することができ、ポリマーマトリックス１４は、例えば、接着剤、ディップまたはスピンコーティング、プラズマコーティング、射出成形、インクジェット技術、共有結合性、イオン性またはファンデルワールス相互作用、機械的コネクタあるいはこれらの組み合わせを使用して光ファイバ４の遠位端１０に取り付け可能になっている。好ましい実施形態では、ポリマーマトリックス１４と蛋白質の反応基が、例えば、アミン基をガラスまたはシリカファイバの遠位端の先端または表面１０に導入することによって、検出素子６を光ファイバ４に直接共有結合するために使用されている。マトリックス１４は、好ましくは、信号伝達または信号の大きさと応答時間との関係を最適化する構成および寸法になっている。この点に関して、好ましい実施形態では、マトリックス１４が光ファイバ４の遠位端の表面１０から突出する高さまたは距離１５は、約５ミクロンまたはそれ以下から約１ｍｍまでの間になっている。例えば、ある動作例では、応答時間はマトリックス高さ１５が約５０ミクロンであるとき約３秒であった。一般的に、マトリックスの高さ１５が小さくなると、応答時間の短縮化が達成されるが、信号応答時間は、例えば、正確な寸法、水和状態または特定の用途などの、他の条件に応じて変化することがある。ある代替実施形態では、光反射面が光ファイバ４に面している反射または光散乱材料層をマトリックス１４の最遠位端表面１６に設けて、発光を向上し、および/または戻り信号を増幅することを可能にしている。ある変形実施形態では、反射材料層に、プラズマまたはスパッタコーティングまたはマトリックス１４に取り付けられた薄膜光散乱面を設けることができる。さらに別の実施形態では、光反射粒子状物質をマトリックス全体に分散させて、光散乱効果を向上することを可能にしている。
【００３９】
図３Ｃに示す別の実施形態では、プラスチックまたはポリマースリーブ１７を光ファイバ４の遠位端上に設けて、検出素子（図示せず）を格納および／または保護することができる。検出素子は図３Ｂに示すように、ポリマーマトリックス内に閉じ込めるか、あるいはポリマーマトリックスに接続することができる。このポリマーマトリックスは、検出素子を収容している場合と収容していない場合があるが、射出、注入（ｐｏｕｒｉｎｇ）またはディッピングによってスリーブ内に挿入することができ、そのあと、スリーブ１７内で架橋結合（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋ）させるか、重合化させることができる。ポリマーマトリックスが検出素子なしでスリーブ内に導入される場合は、検出素子は続いてポリマーマトリックス内に導入または分散され、検出素子をマトリックスに閉じ込めるか、結合するか、あるいは共有結合的に取り付けることができる。別の方法として、検出素子６は、光ファイバ４の挿入の前にスリーブ１７内で重合化させることができる。動作時には、検出素子６と光ファイバ４を備えるスリーブ１７は、継続的または一時的使用のために生体内に埋め込むことができる。検出素子６がスリーブ１７内に位置している代替実施形態では、スリーブ１７は取り外し可能に光ファイバ４に結合可能にし、光ファイバ４はスリーブ１７から出し入れするように取り外し可能に挿入可能にして、スリーブ１７の一部または全体を生体内に残したままにし、光ファイバ４を一時的使用のために必要に応じて挿入し、取り外しできるようにすることができる。代替実施形態では、スリーブ１７の代わりに異種のハウジングを使用することができる。
【００４０】
図３Ｄに示す別の実施形態では、光ファイバ４がニードル（ｎｅｅｄｌｅ）１８の内側内に保持されている。ここで使用されている「ニードル」という用語には、マイクロニードルが含まれるが、これに限定されない。ニードル１８は、貫通深さ（ｐｉｅｒｃｉｎｇ  ｄｅｐｔｈ）を制御するためのベベル２０のような変形された遠位端１９及び／又はアナライトがニードル１８に収められた検出素子６に接近することを可能にする１または２以上のサイドポートを有することができる。検出素子６は、図３Ａ、図３Ｂまたは図３Ｃの説明の中で記述されている方法のいずれかを使用して光ファイバ４に直接接続されるように、ニードル１８の内側に位置している。これとは別に、検出素子６は光ファイバ４と機械的に接触させるだけにすることも可能である。代替実施形態では、ニードル１８の遠位端は、検出素子６をニードル１８に機械的に固定するために圧着する（ｃｒｉｍｐ）ことができる。好ましい実施形態では、光ファイバ４の外径２３は約５０−４００ミクロンの範囲にあり、好ましくは約５０−２００ミクロンの範囲にあり、ニードル１８の内径２７は光ファイバ４をニードル１８内に挿入することを可能にするために外径２３よりも若干大きな寸法になっている。ある変形実施形態では、ニードル１８は、例えば、摩擦ばめ（ｆｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｉｔ）またはニードル１８を光ファイバ上に圧着することによって、光ファイバ４に機械的に固定することができる。代替実施形態では、光ファイバ４は、接着剤または当業者に既知の他の適当な手段によって化学的にニードル１８内に固定することができる。この点に関して、集積された光ファイバと検出素子を有するニードルを備えるバイオセンサ先端アセンブリは、一時的使用の場合は使い捨てとして製造し、継続的使用の場合は生体内に残しておくことができる。別の実施形態では、光ファイバ４は取り外し可能にニードル１８から出し入れできるようにして、ニードル１８は生体内に残し、光ファイバ４は一時的使用のため必要に応じて挿入と取り外しができるようにしている。ある好ましい実施形態では、ニードル１８の近位端は、取り付け可能な光コンポーネントを受け入れる構成および寸法になった光結合部を備え、例えば、図２Ａまたは２Ｂに示すような光システムに接続され、あるいは光システムとのインタフェースとなっている。好ましい実施形態では、ニードル１８は直線ニードルになっているが、代替実施形態では、ニードル１８はその長さ方向の任意の個所に１または２以上のベンド（ｂｅｎｄ）または屈曲部を備えることが可能になっている。さらに、図３Ｅに図示の別の代替実施形態では、ニードル１８の遠位端は、マトリックス１４から遠位端方向に突出し、かつマトリックス１４に隣接している屈曲先端部２９を遠位端に備えると共に、反射または光拡散面または層３０を備え、光反射面は光ファイバ４に面して、発光を向上しかつ／または戻り信号を増幅することを可能にしている。図３Ｆに示すニードルアセンブリの別の実施形態では、ニードル１８の遠位端１９は、そこからアナライトが流れ、または移動する１または２以上のポートまたは穴３１を備え、アナライトがニードル１８に収められた検出素子６に接近するこ��を可能にしている。
【００４１】
図４は、着用可能光バイオセンサの例示的実施形態を示す図である。この実施形態では、先端本体（ｔｉｐ  ｂｏｄｙ）２１は、長さがほぼ１〜１０ｍｍのスチールニードルを備え、光ファイバ２２上に固定された検出素子６がそこに収められている。光ファイバ４、検出素子６およびニードル２１は、マウント２４内に位置している。光ファイバ４と検出素子６を収めている先端本体またはニードル２１は患者の皮膚内に垂直に挿入され、検出素子６が皮内と皮下のいずれかに置かれる。例示的実施形態では、ニードル２１はマウント２４上に固定装着され、制御された挿入深さが得られるようにしている。この点に関して、ニードル２１は、好ましくは、約０．１ｍｍから約１０ｍｍまでの距離、最も好ましくは、約1ｍｍから約２ｍｍまでの距離だけ患者の皮膚内に入り込む。そのあと、接着リング２５がマウントとニードルのアセンブリを定位置に保持する。次に、光システムはマウントとニードルのアセンブリ上をクランプし、コネクタ２６は光ファイバ２２と光システム２とのインタフェースとなっている。光リーダは、例えば、約０．０２〜１メートルだけプラットフォームから分離され、光ファイバでシステムの他の部分に接続可能になっている。光システムは、例えば、図２Ａまたは図２Ｂに示すどちらかの光実施形態に従って設計することができる。励振源は、例えば、アークランプ、レーザダイオードまたはＬＥＤで構成できるが、これらに限定されない。検出器は、フォトダイオード、ＣＣＤチップ、または光電子倍増管で構成できるが、これらに限定されない。代替実施形態では、複数の先端本体またはニードルアセンブリ２１が単一のマウント２４に取り付け可能になっている。この点に関して、先端本体またはニードルアセンブリは複数のアナライトを検査（ｔｅｓｔ）し、各ニードルアセンブリは１つのアナライトを検査する構成にすることができる。別の実施形態では、先端本体またはニードルアセンブリは、薬剤が少なくとも１つの先端本体またはニードルアセンブリから投与できるようにマウント２４に取り付け可能になっている。従って、ドラッグデリバリーシステムは、正しい投薬量がアナライトのテストに基づいて計算され、同一のバイオセンサマウント２４に取り付けられた先端本体またはニードルアセンブリから投与されるように設計することができる。この実施形態で、投薬のために使用される先端本体またはニードルアセンブリは、そこから薬剤を投与するための１または２以上のポートを備えることができる。さらに別の実施形態では、温度プローブを、少なくとも１つの先端本体またはニードルアセンブリ内に収容させることも、そこに隣接させることも、あるいはそこに取り付けることも可能になっている。この温度プローブの例としては、熱電対、または、例えば温度感受性フルオロフォアを使用した光学温度モニタがある。別の変形形態では、バイオセンサ先端は着用可能パッチデバイスに組み込むことが可能であり、そこでは先端本体の近位端がパッチに取り付けられ、パッチは患者の外側の皮膚（ｅｘｔｅｒｉｏｒ  ｓｋｉｎ）に着用される構造と寸法になっている。別の実施形態では、バイオセンサ先端は時計に組み込むことが可能であり、そこでは先端本体の���位端が時計に取り付けられ、時計は患者の外側手首部分に着用される構造および寸法になっている。
【００４２】
上述した実施形態のすべてにおいて、アセンブルされた光ファイバおよび検出素子、または製造された先端デバイスは無菌になっている。この点に関して、「無菌(sterile)」とは、微生物またはバクテリアが本質的に存在しないことを意味する。ある製造方法では、アセンブルされたコンポーネントは製造ステップごとに定期的に殺菌処理されている。例えば、図３Ｃに示す実施形態では、スリーブは製造ステップごとに殺菌処理され、最終的に無菌にパッケージされたデバイスが得られている。別の方法として、アセンブルされた光ファイバおよび検出素子または製造された先端デバイスは最終ステップで殺菌処理することができる。
【００４３】
以下の例は、本発明のいくつかの好ましい実施形態を示したもので、単に例示的実施形態を示すことを目的としている。ここでは、非特許文献８または他の文献に記載されている手順に従って、フルオロフォアリポータプローブを有する標識突然変異結合蛋白質（ｌａｂｅｌｅｄ  ｍｕｔａｔｅｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が使用されている。
【００４４】
例１
本発明の一実施形態によれば、グルコース・ガラクトース結合蛋白質（ＧＧＢＰ）は、グルタミン酸を位置１４９で置換したシステインと、アラミンを位置２１３で置換したアルギニンと、ロイシンを位置２３８で置換したセリンとを含むトリプル突然変異（ｔｒｉｐｌｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）（Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｒ／Ｌ２３８Ｓ）と共に使用された。この蛋白質は位置１４９で、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−Ｎ−(ヨードアセチル)−Ｎ’−（７−ニトロベンジン−２−オキサ−１，３−ジアゾール）−４−イル）エチレンジアミン（ＩＡＮＢＤアミド）オキシ（Ｎ，Ｎ’−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−Ｎ−(ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ)−Ｎ’−（７−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚ−２−ｏｘａ−１，３−ｄｉａｚｏｌ−４−ｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＩＡＮＢＤ  ａｍｉｄｅ）ｏｘｙ）で標識付けられた。この突然変異ＧＧＢＰ（Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｒ／Ｌ２３８Ｓ）はグルコースに固有であり、リポータ基はグルコース結合に応答して蛍光強度変化を生じる。  
【００４５】
マルチコーティングまたはマルチレイヤのマトリックスは次のように作製された。コアマトリックスは、発光性または染料標識付結合蛋白質（特許文献９に記載されているように作製されたＰＢＳバッファにおける１５μＭ，ｐＨ７．４）１に対して２から４の３重量％アルギン酸塩（ｖ／ｖ）をシンチレーションバイアル内で混合し、低速でボルテックスして形成された。結果として得られた蛋白質−アルギン酸塩混合液３ｍＬをシリンジに入れ、ミキサで１０ｍＬ／ｈｒのレートで２００ｍｌの１Ｍ  ＣａＣｌ2に注入することにより、０．４〜１．５ｍｍ径のビーズ（ｂｅａｄ）を形成した。これらのビーズは、ＣａＣｌ2溶液中にミキサで１５〜６０分間混合された。次に、ポリ−Ｌ−リシン０．０１％ｗ／ｖ水溶液約１０ｍＬ中に上方からビーズを１時間入れることによって閉じ込め層（ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ  ｌａｙｅｒ）が形成され、そのあと、ポリリシンコーティングビーズを１５〜３０分間吸収タオル上で乾燥した。この時点で、センサは使用の準備が整った。
【００４６】
この実施形態で使用されたファイバは二分岐光ファイバであった。この光ファイバは、中心の４００μｍファイバの周囲に６本の４００μｍファイバが配置されている。６本のファイバは励起導管として使用され、中心のファイバは検出導管として使用された。ファイバの総直径は1．４  ｍｍであった。ファイバが研磨されたあと、検出素子を光ファイバの遠位端に粘着するためにＬｏｃｔｉｔｅ  ４０１メディカルグレード接着剤が使用された。ファイバの近位端は二分岐され、一方のアームは励振源に通じ、他方のアームは検出器に通じていた。４７０ｎｍＬＥＤが励振源として使用され、商用蛍光スペクトロメータが電磁エネルギー検出器として使用された。５４０ｎｍでの放出強度が測定された。
【００４７】
試験において、上記のように形成されたバイオセンサの遠位端と検出素子が、１３ゲージニードルを通して麻酔状態の豚の皮下１〜２ｍｍの脇腹に挿入された。1０％のデキストロースを含む乳酸加リンガー溶液と含まない乳酸加リンガー溶液を交互に豚の耳静脈に注入して、豚のグルコースレベルを制御下で増減した。間隔を置いて、食道カテーテルを通して豚の大静脈から血液サンプルが採血され、血糖値がハンドヘルド血液グルコースメータでテストされた。図５に示すように、麻酔状態の豚のグルコースレベルの変化を追跡するためにバイオセンサの蛍光強度が観察された。
【００４８】
例２ 
別の実施形態では、結合蛋白質は、グルタミン酸を位置１４９で置換したシステインと、アラニンを位置２１３で置換したアルギニンと、ロイシンを位置２３８で置換したセリンとを有するグルコース−ガラクトース結合蛋白質（ＧＧＢＰ）であった（Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｒ／Ｌ２３８Ｓ）。この蛋白質は位置１４９でＮ，Ｎ’−ジメチル−Ｎ−（ヨードアセチル)−Ｎ’−（７−ニトロベンジン−２−オキサ−，３−ジアゾール−４−イル）エチレンジアミン（ＩＡＮＢＤアミド）（Ｎ，Ｎ’−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−Ｎ−(ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ)−Ｎ’−（７−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚ−２−ｏｘａ−，３−ｄｉａｚｏｌ−４−ｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＩＡＮＢＤ  ａｍｉｄｅ））で標識付けられた。バイオセンサは、４００ミクロンコア径ファイバの先端をカテーテルチューブの短片内に挿入し、カテーテルチューブを０．１〜１ｍｍだけファイバ先端上に突出させることによって作製された。ファイバはシリカコア、シリカクラッディング、およびポリアミドバッファを備えていた。ファイバ径は４００／４４０／４７０ミクロンであったが、ここでスラッシュは、コア、クラッディング、バッファの外側から測定した径を示している。
【００４９】
固定化マトリックスは、架橋結合されたアルギン酸塩ベースのハイドロゲル（ａｌｇｉｎａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ）であり、これはＰｒｏｎｏｖａ（商標）ＵＰ  ＬＶＧアルギン酸塩を、カーボキシルを通してカルボジイミド化学作用によってアジピン酸ジヒドラジドと共有結合的に架橋結合することによって作製された。Ｐｒｏｎｏｖａ（商標）がこの実施形態で選択されたのは、その粘性が低く、またグルロニック対マヌロニック（ｇｕｌｕｒｏｎｉｃ  ｔｏ  ｍａｎｎｕｒｏｎｉｃ）比が高いためである。アルギン酸塩１グラムを５０ｍＬ  ０．１Ｍ  ＭＥＳバッファ（ｐＨ  ６．５）内で溶解したあと、ＡＡＤ  １１０ｍｇおよびヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）７９ｍｇを添加することによって２％アルギン酸塩溶液が作製された。この溶液は使用されるまで４℃で保管された。アルギン酸塩溶液に、溶液１０ｍＬ当たり１４５ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）が、デュアルシリンジ混合法（ｄｕａｌ−ｓｙｒｉｎｇｅ  ｍｉｘｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を用いて添加された。アルギン酸塩、ＡＡＤ、ＨＯＢｔ、ＥＤＣ混合液は１ｍＬシリンジに吸入され、先端の尖っていない３０ゲージニードルがシリンジに取り付けられた。ニードルが準備状態に置かれたあと、先端が光ファイバ上のカテーテルチュービングモールドに挿入された。ファイバ上のカテーテルチュービングは充満され、光ファイバの先端とアルギン酸塩マトリックスとの間に良好な接触が確保された。マトリックスは１５分間架橋結合するように放置され、そのあとファイバ先端とマトリックスアセンブリは０．１Ｍ、６．５ｐＨ  ＭＥＳ溶液に移され、そこで、これらは２時間保管された。２時間経過後、検出先端は余剰燐酸塩バッファ溶液（ＰＢＳ、０．００２７Ｍ  塩化カリウム、０．１３７塩化ナトリウム、ｐＨ７．４)の中に置かれ、そこで、これらは反応を抑えるために少なくとも３０分間保管された。
【００５０】
結合蛋白質を取り付けるために、先端は約８時間、標識付きＧＧＢＰのＰＢＳバッファ 中での溶液［ＮＢＤ−Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｒ／Ｌ２３８Ｓ  ＧＧＢＰ］（５３μＭ、５０μＬ）の中で培養された。センサはこの培養期間周囲光から保護された。８〜２４時間の培養後、５０μＬのＥＤＣ／ＮＨＳ（２００ｍＭ／５０／０ｍＭ）が培養管に添加された。４０分後、センサ先端は取り出され、反応を抑えるために１Ｍ、ｐＨ８．５エタノールアミン５０μＬに入れられた。エタノールアミン溶液に入れられた２０分後、センサ先端はＰＢＳ溶液に移され、そこで、これらは少なくとも２４時間、未反応の蛋白質が放散する間放置された。そのあと、センサは未使用のＰＢＳに移され、使用準備状態になるまで暗室に保管された。
【００５１】
この例におけるファイバはシングル４００μｍコアマルチモードファイバ（シリカコア、シリカクラッディング、ポリアミドバッファ）であった。この実施例では、同じファイバが励起信号と発光信号の両方を伝達しているので、図２Ａに示すように、発光を励起から分離するために二色性光学系が使用された。励起は４７０ｎｍＬＥＤで行なわれた。４７０ｎｍ励起をファイバの入力端側に反射し、中心が５５０ｎｍである蛍光を検出器に伝達するために商用二色性フィルタが使用された。ガラス非球面レンズは、ビームコリメーションと光をファイバ内と検出器上に集束させるために使用された。散乱された励起は、さらに５５０ｎｍバンドパスフィルタを使用して検出器から除去された。ＳＭＡコネクタは、光ファイバセンサとの接続と切り離しを迅速化した。この実施形態の電磁エネルギー検出器は、単一光子計数光電子倍増管であった。データ収集は、ＲＳ−２３２コネクタを通して検出器と通信するラップトップコンピュータで行なわれた。
【００５２】
図６：試験において、上記のように形成されたバイオセンサの遠位端と検出素子は、グルコース濃度が異なっている豚血清（ｐｏｒｃｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）溶液に挿入された。すべての豚血清溶液は２００ミクロンフィルタに通してフィルタ処理され、溶液中のグルコースレベルが臨床分析機器で測定された。図６はセンサの生体外性能を示す図である。血清中の初期グルコースレベルは５６ｍｇ／ｄＬと測定された。１５０および３００ｍｇ／ｄＬの血清サンプルがＰＢＳ内の濃度１Ｍのグルコースを血清のアリコートに打ち込むことによって作製された。
【００５３】
例３ 
本発明の別の実施形態では、バイオセンサは薄膜を光ファイバの表面に共有結合で取り付けることによって形成された。結合蛋白質は、グルタミン酸を位置１４９で置換したシステインと、アラニンを位置２１３で置換したアルギニンと、ロイシンを位置２３８で置換したセリンとを有するグルコース−ガラクトース結合蛋白質（ＧＧＢＰ）であった（Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｒ／Ｌ２３８Ｓ）。蛋白質は位置１４９でＮ，Ｎ’−ジメチル−Ｎ−（ヨードアセチル)−Ｎ’−（７−ニトロベンジン−２−オキサ−１，３−ジアゾール−３−イル）エチレンジアミン（ＩＡＮＢＤアミド）（Ｎ，Ｎ’−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−Ｎ−(ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ)−Ｎ’−（７−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚ−２−ｏｘａ−１，３−ｄｉａｚｏｌ−３−ｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＩＡＮＢＤ  ａｍｉｄｅ））で標識付けられた。
【００５４】
バイオセンサは、アルギン酸塩マトリックスをシリカファイバのアミン官能性（ａｍｉｎｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）表面に共有結合で接続することによって作製された。ファイバはシリカコア、シリカクラッディング、およびポリアミドバッファを備えていた。ファイバ径は４００／４４０／４７０ミクロンであり、ここでスラッシュはコア／クラッディング／バッファの外側から測定された径を示している。
【００５５】
ポリアミドバッファは、ファイバの最後の数ミリメータを約１〜２秒間トーチ（ｔｏｒｃｈ）にさらすことによって光ファイバの先端から除かれた。ついで、残留ポリアミドが払拭された。次に、バッファが除かれた先端は１時間１Ｍ硫酸中に置かれた。そのあと、先端は蒸留水で洗浄され、１５分間エタノール中に置かれたあと、１５分間無水トルエン（ａｎｈｙｄｒｏｕｓ  ｔｏｌｕｅｎｅ）中に沈められた。洗浄された先端は、３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（ＡＰＴＥＳ）１％を含有する温かい（６０℃）無水トルエン中に置かれ、５分間反応させたままにした。次に、先端はＡＰＴＥＳ溶液から取り出され、１５分間エタノールで洗浄された。このプロセスの終了時に、ファイバの表面上にアミン基が存在することが光電子分光法によって確認された。
【００５６】
ついで、アルギン酸塩マトリックスは、次のようにアミン官能性ファイバ表面に塗布された。固定化マトリックスは、架橋結合されたアルギン酸塩ベースのハイドロゲルであり、これは、その低粘度と高グルロニック対マヌロニック比のために選択されたＰｒｏｎｏｖａ（商標）ＵＰ  ＬＶＧアルギン酸塩を、カーボキシルを通してカルボジイミド化学作用によってアジピン酸ジヒドラジド（ＡＡＤ）と共有結合で架橋結合することによって作製された。２％アルギン酸塩溶液は、５０ｍＬ  ０．１Ｍ  ＭＥＳバッファ（ｐＨ  ６．５）中に１グラムのアルギン酸塩を溶解し、そのあとＡＡＤ１１０ｍｇとヒドロキシベンゾトリアゾル（ＨＯＢｔ）７９ｍｇを添加することにより作製された。この溶液の０．５ｍＬアリコートはついで、デュアルシリンジ混合法を用いてＭＥＳバッファ５０μＬ中でＥＤＣ１ｍｇと混合された。この溶液の総体積は約０．５５ｍＬであった。アルギン酸塩、ＡＡＤ、ＨＯＢｔ、ＥＤＣ混合液はついで、微小遠心バイアルに移され、ＡＰＴＥＳ官能性ファイバ先端は３−４分間またはマトリックスが硬化を始めるまでアルギン酸塩溶液に沈められていた。そのあと、先端はアルギン酸塩溶液から取り出され、約１〜１０分間空気中で反応を続けるように放置され、そのあと０．１Ｍ、６．５ｐＨ  ＭＥＳバッファに移された。先端は２時間ＭＥＳバッファ中に置かれたあと、余剰燐酸塩バッファ（ＰＢＳ、０．００２７Ｍ塩化カリウム、０．１３７塩化ナトリウム、ｐＨ７．７）中で最低３０分間クエンチされた。
【００５７】
結合蛋白質を取り付けるために、先端はＰＢＳバッファ［ＮＢＤ−Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｒ／Ｌ２３８Ｓ  ＧＧＢＰ］（２０〜６０μＭ、５０μＬ）において標識付きＧＧＢＰ溶液中で７時間培養された。センサは培養期間中周囲光から保護された。約２〜８時間の培養後、５０μＬのＥＤＣ／ＮＨＳ（２００ｍＭ／５０ｍＭ）が培養管に添加された。５〜４０分後、センサ先端は取り出され、反応を抑える（ｑｕｅｎｃｈ）ために１Ｍ、ｐＨ８．５エタノールアミン５０μＬ中に置かれた。エタノールアミン溶液中に２０分間置かれたあと、センサ先端はＰＢＳ溶液に移され、そこで先端は少なくとも８時間、、未反応の蛋白質が放散する間放置された。センサは、そのあと新鮮なＰＢＳに移され、使用準備状態に置かれるまで暗室に保管された。
【００５８】
上述した実施形態の試験において、光リーダは、４７０ｎｍ励起がソレノイド駆動シャッタを使用して変調されたことを除き、前例で説明したものと同じであった。シャッタおよび検出器とのインタフェースとなって、これらを制御するほかに、蛍光測定値の定期的収集（ｔｉｍｅｄ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）、結果のグラフィカル表示、データ分析および較正アルゴリズムはソフトウェアで行なわれた。
【００５９】
以上のように形成されたバイオセンサの遠位端と検出素子は、次に、麻酔状態の豚の脇腹に挿入された。この挿入は、１８〜２４ゲージニードルで形成された皮膚の穴を通して皮内または皮下にファイバを挿入することで行なわれた。１０％デクストロースを含む乳酸加リンガ溶液と含まない乳酸加リンガ溶液を交互に豚の耳静脈に注入して、豚のグルコースレベルを制御下で増減した。間隔を置いて、食道カテーテルを通して豚の大静脈から血液サンプルが採血され、血糖の測定値がハンドヘルド血液グルコースメータでテストされた。図７に示すように麻酔状態の豚の血液のグルコースレベルの変化を追跡するためにバイオセンサの蛍光強度が観察された。
【００６０】
例４
本発明の別の実施形態では、内部光参照基によるデュアル波長検出が行なわれた。結合蛋白質は、グルタミン酸を位置１４９で置換したシステインと、アラニンを位置２１３で置換したアルギニンと、ロイシンを位置２３８で置換したセリンとを有するグルコース・ガラクトース結合蛋白質（ＧＧＢＰ）であった（Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｒ／Ｌ２３８Ｓ）。この蛋白質は位置１４９でＮ，Ｎ’−ジメチル−Ｎ−（ヨードアセチル)−Ｎ’−（７−ニトロベンジン−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）エチレンジアミン（ＩＡＮＢＤアミド）（Ｎ，Ｎ’−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−Ｎ−(ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ)−Ｎ’−（７−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚ−２−ｏｘａ−１，３−ｄｉａｚｏｌ−４−ｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＩＡＮＢＤ  ａｍｉｄｅ））で標識付けられた。参照基は、グルタミン酸が位置１４９でシステインに置換されたＧＧＤＰ（ＴＲ−Ｅ１４９Ｃ  ＧＧＢＰ）に取り付けられたＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）Ｃ２マレイミドであった。グルコース濃度の生理的範囲にわたって、ＴＲ−Ｅ１４９Ｃ  ＧＧＢＰからの発光は実質的に変化せず、したがってＴＲ−Ｅ１４９Ｃ  ＧＧＢＰはアナライト依存結合蛋白質とリポータ基（ＮＢＤ−Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｒ／Ｌ２３８Ｓ  ＧＧＢＰ）からの信号の内部参照に役立っている。
【００６１】
バイオセンサは、４００ミクロンコア径ファイバの先端をカテーテルチューブの短片内に挿入し、カテーテルチューブを０．１〜０．５ｍｍだけファイバ先端上に突出させることによって作製された。ファイバはシリカコア、シリカクラッディング、およびポリイミドバッファを備えていた。ファイバ径は４００/４４０/４７０ミクロンであったが、ここでスラッシュはコア、クラッディング、バッファの外側から測定した径を示している。
【００６２】
固定化マトリックスは架橋結合されたアルギン酸塩ベースのハイドロゲルであり、これは、その粘性が低く、グルロニック対マヌロニック比が高いために選択されたＰｒｏｎｏｖａ（商標）ＵＰ  ＬＶＧアルギン酸塩を、カーボキシルを通してカルボジイミド化学作用によってアジピン酸ジヒドラジド（ＡＡＤ）と共有結合的に架橋結合することによって作製された。２％アルギン酸塩溶液は、アルギン酸塩１グラムを５０ｍＬ  ０．１Ｍ  ＭＥＳバッファ（ｐＨ  ６．５）内で溶解したあと、ＡＡＤ１１０ｍｇおよびヒドロキシベンゾトリアゾル（ＨＯＢｔ）７９ｍｇを添加することによって作製された。この溶液は使用されるまで４℃で保管された。デュアルシリンジ混合法を用いて、次に、アルギン酸塩溶液の０．５ｍＬアリコートは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ-プロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）１０ｍｇと６０μＭ  ＴＲ−Ｅ１４９Ｃ  ＧＧＢＰ  ９０μＬを含有する５０μＬ  ＭＥＳ溶液と混合された。アルギン酸塩、ＡＡＤ、ＨＯＢｔ、ＥＤＣ、ＴＲ−Ｅ１４９Ｃ混合液は１ｍＬシリンジに吸入され、先端の尖っていない３０ゲージニードルがシリンジに取り付けられた。ニードルが準備状態にされたあと、先端は光ファイバ上のカテーテルチュービングモールドに挿入された。ファイバ上のカテーテルチュービングは充満され、光ファイバの先端とアルギン酸塩マトリックスとの間に良好な接触が確保された。マトリックスは１５分間架橋結合するように放置され、そのあとファイバ先端とマトリックスアセンブリは０．１Ｍ、６．５ｐＨ  ＭＥＳ溶液に移され、そこで、これらは２時間保管された。２時間経過後、検出先端は余剰燐酸塩バッファ溶液（ＰＢＳ、０．００２７塩化カリウム、０．１３７塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）中に置かれ、そこで、これらは反応を抑えるために少なくとも３０分間保管された。
【００６３】
結合蛋白質を取り付けるために、先端はＰＢＳバッファ内のＩＡＮＢＤ標識付きＧＧＢＰ［ＮＢＤ−Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｒ／２３８Ｓ  ＧＧＢＰ］を含有する溶液中で培養された。ＮＢＤ−Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｒ／２３８Ｓ  ＧＧＢＰとＴＲ−Ｅ１４９Ｃ  ＧＧＢＰの溶液は両種とも６０μＭ濃度であった。培養期間中、センサは周囲光から保護された。約２〜８時間の培養後、５０μＬのＥＤＣ／ＮＨＳ（２００ｍＭ／５０ｍＭ）が培養管に添加された。５〜４０分後、センサ先端は取り出され、反応を抑えるために１Ｍ、ｐＨ８．５エタノールアミン５０μＬ中に置かれた。エタノールアミン溶液中に置かれて２０分後、センサ先端はＰＢＳ溶液に移され、そこでセンサ先端は少なくとも８時間、未反応蛋白質が放散するように放置された。センサは、そのあと、新鮮なＰＢＳに移され、使用準備状態になるまで暗室に保管された。
【００６４】
上述した実施形態の試験において、蛍光信号が図２Ａに示す構成に従った光システムを使用して読み取られた。４７０ｎｍ  ＬＥＤ  （ＬＳ−４５０）が励起のために使用され、２つの単一電子計数光電子倍増管が電磁エネルギー検出器として使用された。電磁エネルギー放出器からの４７０ｎｍの光をファイバの方向に反射し、リポータ基と参照基からの発光信号を検出器の方向に伝達するために商用二色性ビームスプリッタが使用された。第２の二色性スプリッタは、リポータ基と参照基からの発光信号を分離し、ＮＢＤ−Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｒ／Ｌ２３８Ｓからの放出を一方の検出器方向に向け、ＴＲ−Ｅ１４９Ｃ  ＧＧＢＰからの放出を他方の検出器方向に向けるために使用された。一方の検出器の前の５５０ｎｍバンドパスフィルタおよび他方の検出器の前の６１０ｎｍバンドパスフィルタは、それぞれＮＢＤ−Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｒ／Ｌ２３８ＳおよびＴＲ−Ｅ１４９Ｃ  ＧＧＢＰのさらなるスペクトル分解能を達成するために使用された。
【００６５】
試験において、以上のように形成されたバイオセンサの遠位端と検出素子は、異なるレベルのグルコースを含有しているＰＢＳバッファの溶液中に挿入された。この溶液中のグルコースレベルは臨床分析機器で測定された。図８は、グルコースレベルの変化に対するセンサ応答を示す図である。ＩＡＮＢＤリポータ基からの５５０ｎｍ信号がグルコースレベルの変化を追跡する。Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）リポータ基からの６１０ｎｍ放出はグルコースレベルが変化したとき実質的に不変である。しかし、この実施形態では、リポータ基の放出の一部が６１０ｎｍでも発生している。光システムに置かれていて、６１０ｎｍ発光信号を追跡する検出器は、参照基の放出だけでなく、この波長領域内で発生するリポータ基（ＩＡＮＢＤ）放出の一部も検出する。リポータ基からの６１０ｎｍ信号の寄与は５５０ｎｍ信号の一定の割合であるので、この寄与を６１０ｎｍ信号から数学的に減算すると、参照基だけに起因する信号が得られる。この数学的操作が行なわれるとき、６１０ｎｍ信号は、図８に示すようにグルコース濃度と共に実質的に不変である。
【００６６】
例５ 
本発明の別の実施形態では、バイオセンサは、薄膜を光ファイバの表面に共有結合的に付着することにより形成された。光ファイバの一方の端は蛍光検出デバイスに結合され、他方の端は、光ファイバの表面に共有結合的に接着されたアルギン酸塩マトリックスで構成されたほぼ５０ミクロン膜を含んでいた。
【００６７】
アルギン酸塩マトリックスを光ファイバに結合することは、プラズマ処理プロセスによりファイバにＡＰＴＭＳを最初にコーティングすることによって行なわれた。光ファイバは１２インチ径×１８インチ高さの直立円筒真空チャンバの中央平面（ｍｉｄｐｌａｎｅ）に配置された。約５立方センチメートルのＡＰＴＭＳを収めている開いた１インチx２インチ高さのバイアルはチャンバ内の電極上に置かれた。システムは初期に、回転翼型粗引きポンプの支援を受けたターボ分子ポンプによって約８ミリトールの圧力まで真空にされた。次に、ポンビングラインのバルブが、気化モノマ（ｖａｐｏｒｉｚｉｎｇ  ｍｏｎｏｍｅｒ）の圧力を一定の８５ミリトールに上昇させるように再び閉じられた。そのあと、電極は整合回路網（ｍａｔｃｈｉｎｇ  ｎｅｔｗｏｒｋ）に直列の１３．５６ＭＨｚ無線周波数発電機によって励起され、２２ワットの電力を供給した。このようにして発生したプラズマは６０秒間操作されて、モノマ蒸気をファイバ表面上の膜へと重合化した。
【００６８】
次に、アルギン酸塩ベースのハイドロゲルマトリックスがＡＰＴＭＳコーティングに結合された。このアルギン酸塩ハイドロゲルマトリックスは、Ｐｒｏｎｏｖａ（商標）ＵＰ  ＬＶＧアルギン酸塩を、カルボキシルを通してカルボジイミド化学作用によってアジピン酸ジヒドラジド（ＡＡＤ）と共有結合で架橋結合することにより作製された。Ｐｒｏｎｏｖａ（商標）ＵＰ  ＬＶＧが選択されたのは、その粘度が低く、グルロニック対マヌロニック比が高いためである。２％アルギン酸塩溶液は、アルギン酸塩１グラムを５０ｍＬ  ０．１Ｍ  ＭＥＳバッファ（ｐＨ６．０）中で溶解したあと、ＡＡＤ１１０ｍｇおよびヒドロキシベンゾトリアゾル（ＨＯＢｔ）７９ｍｇを添加することによって作製された。この溶液は必要時まで４℃で保管することができる。アルギン酸塩には、溶液１０ｍＬ毎に１９６ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ-プロピル）カルボジイミド（１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ−ｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｉｉｍｉｄｅ）（ＥＤＣ）がデュアルシリンジ混合法を用いて添加された。次に、アルギン酸塩／ＡＡＤ／ＨＯＢｔ／ＥＤＣ混合液はシリンジに注入され、光ファイバセンサのＡＰＴＭＳ処理先端はアルギン酸塩溶液中に浸されて約５０ミクロン厚のコーティングが形成された。次に、アルギン酸塩マトリックスは、水和チャンバ内で約２時間架橋結合するように放置された。そのあと、検出先端は反応を抑えるために１５分間余剰ｐＨ８．５エタノールアミン中に置かれ、余剰.１Ｍ  ＭＥＳ  ｐＨ６．５中に保管された。
【００６９】
結合蛋白質を取り付けるために、先端は約２時間.１Ｍ  ＭＥＳ  ｐＨ６．５バッファ（１００μＭ，５０μＬ）内の標識付きグルコース−ガラクトース結合蛋白質（ＧＧＢＰ）の溶液中で培養された。このバイオセンサで使用されたＧＧＢＰは突然変異ＧＧＢＰであり、そこではグルタミン酸が位置１４９でシステインに置換され、アラミンが位置２１３でアルギニンに置換され、ロイシンが位置２３８でセリンに置換された（Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｒ／Ｌ２３８Ｓ）。この突然変異ＧＧＢＰ蛋白質は、特許文献１０に言及されているように、位置１４９でＮ−（（２−ヨードアセトクシ）エチル）−Ｎ−メチル）アミノ−７−ニトロベンゾクサジアゾル（Ｎ−（（２−ｉｏｄｏａｃｅｔｏｘｙ）ｅｔｈｙｌ）−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ−７−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ）（ＩＡＮＢＤ）で標識付けされた。なお、特許文献１０の全内容は引用により本明細書の一部になっている。しかしながら、他の標識付き蛋白質を使用することも可能であることに留意されたい。センサは培養期間中周囲光から遮蔽された。２時間の培養後、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド２０ｍＭ（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスルホサクシンイミド５ｍＭ／５０ｍＭ（スルホ−ＮＨＳ−シグマ/フルカ）（１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ２０ｍＭ（ＥＤＣ）／Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｎｉｍｉｄｅ  ５ｍＭ（ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｓｉｇｍａ／Ｆｌｕｋａ））溶液５０μＬが培養管に添加された。４時間後、センサ先端は取り出され、反応を抑えるために１Ｍ  ｐＨ８．５エタノールアミン５０μＬ中に置かれた。エタノールアミン溶液中に２０分置かれた後、センサ先端は余剰ＰＢＳ溶液に移され、そこでセンサ先端は少なくとも８時間、未反応蛋白質が放散する間放置された。そのあと、センサは新鮮なＰＢＳに移され、使用準備状態になるまで暗室で保管された。
【００７０】
図９は、豚血液中のグルコース濃度の変化に対するグルコースバイオセンサの応答を示す図である。ファイバの検出端は、蛋白質含有マトリックスの外側の余剰水分を取り除くために乾燥され、そのあと、乾燥された光ファイバセンサは３．６ｍｇ／ｄＬのグルコースを含有する豚血液の１マイクロリットルサンプル中に注入された。センサの蛍光は血液サンプル中のフルコースレベルに応答して増加し、ほぼ２．４秒でその全蛍光応答に到達した。
【００７１】
例６ 
図１０に図示の別の実施形態の例では、ステインレススチール管１００がバイオセンサ先端１０２を光導管１０４に結合するために使用された。バイオセンサ先端１０２はステインレススチールニードル１０６の内側に取り付けられた光ファイバの小断片（約３ｃｍ）で構成されていた。光ファイバの一方の端（「検出端」）は、グルコース検出化学的組成でコーティングされ、他方の端は良好な光伝達が得られるように研磨された。光ファイバの検出端はニードル内に完全に収容され、バイオセンサ先端１０２の遠位端でニードルベベルのヒールから約２００−４００ミクロンだけ突出していた。
【００７２】
この例で使用されたファイバはシリカコア、シリカクラッディング、およびポリイミドバッファを備えていた。ファイバ径は４００／４４０／４７０  ＋／−約３ミクロンであった。ここでスラッシュはコア／クラッディング／バッファの外側から測定した径を示している。ファイバの検出端は上記例５で説明したように、ＡＰＴＭＳのプラズマ堆積を使用してアミン官能化された。アルギン酸塩と結合蛋白質も例５で説明したように適用されたが、１つの例外は、小さい先端の尖っていないニードルが取り付けられた混合シリンジの１つを使用して、アルギン酸塩がニードルのベベルとの架橋結合期間に適用されたことである。このバイオセンサで使用された結合蛋白質は、突然変異グルコース−ガラクトース結合蛋白質（ＧＧＢＰ）であり、ここではグルタミン酸が位置１４９でシステインに置換され、アラミンが位置２１３でアルギニンに置換され、ロイシンが位置２３８でセリンに置換された（Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｒ／Ｌ２３８Ｓ）。突然変異ＧＧＢＰ蛋白質は位置１４９でＮ−（（２−ヨードアセトクシ）エチル）−Ｎ−メチル）アミノ−７−ニトロベンゾクサジアゾル（Ｎ−（（２−ｉｏｄｏａｃｅｔｏｘｙ）ｅｔｈｙｌ）−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ−７−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ）（ＩＡＮＢＤ）で標識付けされた。
【００７３】
バイオセンサ先端１０２の近位端は、ステインレススチールコネクタチューブ１００を使用して光学機器に通じる光導管１０４から再現可能に切り離され、再び光導管１０４に取り付けられた。図１０に示す例では、コネクタチューブ１００は、チューブの内径を光ファイバ/ニードルおよび光導管アセンブリの外径よりもほぼ２０〜２６マイクロメータだけ大きくしたサイズであった（好ましくはこれは小さくすること、すなわち、１〜１２マイクロメータのサイズ差にすることも可能である）。バイオセンサ先端１０２の近位端と光導管１０４の遠位端は平坦に研磨され、センサから光学機器への光伝達を容易にするためにステインレススチールコネクタチューブ１００の内側で圧力を受けて結合している。この場合、バイオセンサ先端１０２は、ステインレススチールコネクタと光導管１０４から取り外すことによって使い捨てにすることも可能である。
【００７４】
例７ 
本発明の別の実施形態では、バイオセンサは、２１ゲージニードルの内側に収められた光ファイバの表面にアルギン酸塩マトリックスを共有結合で接続することによって形成された。使用された光ファイバはシリカコア、シリカクラッディング、およびポリイミドバッファを備えていた。ファイバ径は４００／４４０／４７０ミクロンであり、ここでスラッシュはコア/クラッディング/バッファの外側から測定した径を示している。光ファイバの近位端は研磨され、光蛍光機器（ｏｐｔｉｃａｌ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）への取り付けのための標準ＳＭＡ光ファイバコネクタ内に装着された。そのあと、ファイバの遠位端は２１ゲージステインレススチールニードルに挿入され、ファイバの先端は、ニードルベベルのヒールから約２００−５００ミクロンだけ突出していた。
【００７５】
次に、光ファイバ、ニードルアセンブリはプラズマ処理のために真空チャンバ内に置かれた。光ファイバは、１２インチ径×１８インチ高さの直立円筒真空チャンバの中央平面に置かれた。約５立方センチメートルのＡＰＴＭＳを収めている開いた１インチ径×２インチ高さのバイアルがチャンバ内の電極上に置かれた。システムは初期に、回転翼型粗引きポンプの支援を受けたターボ分子ポンプによって約８ミリトールの圧力まで真空にされた。次に、ポンビングラインのバルブが、気化モノマ（ｖａｐｏｒｉｚｉｎｇ  ｍｏｎｏｍｅｒ）の圧力を一定の８５ミリトールに上昇させるように再び閉じられた。そのあと、電極は整合回路網（ｍａｔｃｈｉｎｇ  ｎｅｔｗｏｒｋ）に直列の１３．５６ＭＨｚ無線周波数発電機によって励起され、２２ワットの電力を供給した。このようにして発生したプラズマは６０秒間操作されて、モノマ蒸気をファイバ表面上の膜へと重合化した。
【００７６】
次に、アルギン酸塩ベースのハイドロゲルマトリックスがＡＰＴＭＳコーティングに結合された。このアルギン酸塩ハイドロゲルマトリックスは、Ｐｒｏｎｏｖａ（商標）ＵＰ  ＬＶＧアルギン酸塩を、カルボキシルを通してカルボジイミド化学作用によってアジピン酸ジヒドラジド（ＡＡＤ）と共有結合で架橋結合することにより作製された。Ｐｒｏｎｏｖａ（商標）ＵＰ  ＬＶＧが選択されたのは、その粘度が低く、グルロニック対マヌロニック比が高いためである。２％アルギン酸塩溶液は、アルギン酸塩１グラムを５０ｍＬ  ０．１Ｍ  ＭＥＳバッファ（ｐＨ６．０）中に溶解したあと、ＡＡＤ１１０ｍｇとヒドロキシベンゾトリアゾル（ＨＯＢｔ）７９ｍｇを添加することによって作製された。この溶液は必要時まで４℃で保管することができる。アルギン酸塩には、溶液１０ｍＬ毎に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ-プロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）がデュアルシリンジ混合法を用いて添加された。次に、アルギン酸塩、ＡＡＤ、ＨＯＢｔ、ＥＤＣ混合液は１ｍＬシリンジに注入され、先端の尖っていない３０ゲージニードルがシリンジに取り付けられた。ニードルが準備状態に置かれたあと、先端は光ファイバを収めているニードルのベベル内に挿入された。ニードルのベベルは満たされ、光ファイバの先端とアルギン酸塩マトリックスの間に良好な接触を確保した。マトリックスは１５分間架橋結合するように放置され、そのあと先端とマトリックスアセンブリは０．１Ｍ、６．５ｐＨ  ＭＥＳ溶液に移され、そこで２時間保管された。２時間経過後、検出先端は余剰燐酸塩バッファ溶液（ＰＢＳ、０．００２７Ｍ塩化カリウム、０．１３７塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）に移され、そこで反応を抑えるために少なくとも３０分間保管された。
【００７７】
結合蛋白質を取り付けるために、先端はＰＢＳバッファ内の標識付きＧＧＢＰ溶液［ＮＢＤ−Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｒ／Ｌ２３８Ｓ  ＧＧＢＰ］（５３μＭ、５０μＬ）中で約８時間培養された。センサは培養期間周囲光から保護された。８〜２４時間の培養後、５０μＬのＥＤＣ／ＮＨＳ（２００ｍＭ／５０／０ｍＭ）が培養管に添加された。４０分後、センサ先端は取り出され、反応を抑えるために１Ｍ、ｐＨ８．５エタノールアミン５０μＬ中に置かれた。エタノールアミン溶液中に２０分置かれた後、センサ先端はＰＢＳバッファに移され、そこで少なくとも２４時間未反応蛋白質が放散するように放置された。そのあと、センサは新鮮なＰＢＳに移され、使用準備状態になるまで暗室に保管された。
【００７８】
試験において、ニードル、ファイバおよび検出素子を備えるバイオセンサの先端は目覚めた糖尿病のユカタン（Ｙｕｋａｔａｎ）豚の脇腹に約１〜２ｍｍ深さまで挿入された。この豚は、ストレプトゾトシン薬の投与によって糖尿病にされていた。試験期間、豚はグルコースレベルを調整するためにインシュリンと食料が交互に与えられた。間隔を置いて、血液サンプルが食道カテーテルを通して採血され、血糖の測定値がハンドヘルド血液グルコースメータでテストされた。バイオセンサの蛍光強度は、図１１に示すよう、目覚めた豚のグルコースレベルの変化を追跡するために観察された。図１１において、実線のカーブはバイオセンサからの蛍光信号を示し、単位は左側のｙ軸に示されている。三角形はハンドヘルドメータで測定された血液グルコースレベルを示し、値は右側のｙ軸から読み取られている。
【００７９】
以上、本発明の特定の実施形態とその応用を示して本発明を説明してきたが、当業者によれば、請求項に記載された本発明の範囲を逸脱することなく、それらに種々の改良と変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】本発明の実施形態によるバイオセンサを示す概念図である。
【図２Ａ】本発明の実施形態によるセンサの光部分における光構成の実施形態を示す図である。
【図２Ｂ】本発明の実施形態によるセンサの光部分における光構成の実施形態を示す図である。
【図３Ａ】本発明の実施形態によるバイオセンサ先端の種々の実施形態を示す図である。
【図３Ｂ】本発明の実施形態によるバイオセンサ先端の種々の実施形態を示す図である。
【図３Ｃ】本発明の実施形態によるバイオセンサ先端の種々の実施形態を示す図である。
【図３Ｄ】本発明の実施形態によるバイオセンサ先端の種々の実施形態を示す図である。
【図３Ｅ】本発明の実施形態によるバイオセンサ先端の種々の実施形態を示す図である。
【図３Ｆ】本発明の実施形態によるバイオセンサ先端の種々の実施形態を示す図である。
【図４】着用可能な生体内光バイオセンサである本発明の実施形態を示す図である。
【図５】本発明の実施形態による光ファイババイオセンサであって、麻酔状態の豚におけるグルコースレベルの変化を追跡するバイオセンサの性能を示すグラフである。
【図６】本発明の実施形態による光ファイババイオセンサであって、シングル４００ミクロンコアの光ファイバセンサと図２Ａに図示の光構成を使用したバイオセンサの性能を示すグラフである。
【図７】本発明の実施形態による光ファイババイオセンサであって、シングル４００ミクロンコアの光ファイバセンサと図２Ａに図示の光構成を使用したバイオセンサの性能を示す図である。
【図８】複数の検出器と内部参照とを備える本発明の実施形態を示す図である。
【図９】例５に従って構成されたバイオセンサの実施形態の性能を示すグラフである。
【図１０】例６に従って構成されたバイオセンサの実施形態を示す分解図である。
【図１１】例７に従って構成されたバイオセンサの実施形態の性能を示すグラフである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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