(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジグリコール酸エステルリンカーを介して、疎水性分子にカップル化されたタキサンのコンジュゲートが、脂質及び／又は両親媒性安定剤と非共有的に会合する（associating）ことにより形成されるナノ粒子又はミセルを含む医薬組成物。
【請求項２】
前記コンジュゲートが、脂質及び両親媒性安定剤と会合されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記タキサンが、パクリタキセルであることを特徴とする請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記疎水性分子が、長鎖アルコール、トコフェロール、又はステロイドであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記脂質が、リン脂質又はトコフェロールであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記両親媒性安定剤が、コポリマーであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記コポリマーが、ポリエチレングリコール及びポリスチレンのコポリマーであることを特徴とする請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
タキサン組成物の薬物動態を模倣するように製剤化される追加的な抗悪性腫瘍剤を更に含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
被検体（subject）にタキサンを投与する際に使用するための請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の組成物を調製する方法であって、
コントロールされた流速を使用して、限局的な空間（confined space）において、水と、ジグリコール酸エステルリンカーを介して、疎水性分子にカップル化されたタキサンのコンジュゲート、脂質及び／又は両親媒性安定剤を含む混和性溶媒とを急速に混合するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本願は、２００７年１１月２８日に出願された米国出願番号６０／９９０，９０７（引用によって全体が本願に組み込まれる）の利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、薬剤送達の分野内に属し、特にコントロールされた薬物動態（pharmacokinetics）を有するタキサンの成功裏の送達の領域（area）内に属す。
【背景技術】
【０００３】
パクリタキセルは、種々の癌を処置するために広範囲に使用される化学治療剤である。該臨床物質（clinical material）は、Cremophor（登録商標）ＥＬ／エタノールに製剤化（ないしは処方：formulated）され、そして投与の前にバッファーで希釈される。ミセル、リポソーム又はエマルジョンを使用してパクリタキセルの製剤（ないし製剤化：formulation）を改良する試みを記載する文献において、多数の報告がある（引用文献１、１５、１６、１７）。しかしながら、ほとんど全てのケースでは、これらの担体（carriers）はパクリタキセルを製剤化するが、該薬剤が数分のオーダー（order）の半減期（half lives）を有する担体の外に急速に分離するので、インビボにおいて真の（true）送達ビヒクルとして働かないことは、報告された薬物動態のデータから明白である。１つの例外がＮＫ１０５として知られる製剤であると思われる（引用文献２）。ＮＫ１０５は、カルボキシル基が４−フェニルブタノールでキャップされた（capped）ポリ（エチレングリコール）−ポリ（アスパラギン酸）から成るミセルに製剤化されたパクリタキセルである。
【０００４】
多くの試みが機能的な親油性パクリタキセルのプロドラッグを生産するために行われ、パクリタキセルの性能を改良するか、又は、該薬剤と関連（ないし会合）する製剤の問題が取り組まれた。これらは、リン脂質（引用文献３、４）、コレステロール（引用文献５）、α―ブロモ脂肪酸（引用文献６、７）、オレイン酸（引用文献８、９）、フラーレン（引用文献１０）、及びドコサヘキサエン酸（docosahexanoic acid）（引用文献１１）とのコンジュゲート（ないし抱合体：conjugates）を含む。これらプロドラッグは、リポソーム（引用文献３、７、１０）、油エマルジョン（oil emulsions）（引用文献８、９）又はミセル（引用文献５、６、１１）などの脂質ビヒクルに製剤化された。更に、ＷＯ２００６／０１４６２６は、微粒子型で存在することができるパクリタキセル及び他の薬剤と疎水性（半）部分（hydrophobic moieties）とのコンジュゲートを開示する。これらの報告のほとんどは、インビボモデルにおいて、パクリタキセルを上回る改良された有効性を主張するが、しかしながら、ほとんどのケースにおいて、それらは、血漿薬剤排出（plasma drug elimination）に関する情報を提供しないか、又は、初期の（early）分布段階（フェーズ）というよりも末期の（terminal）薬剤排出段階に着目するデータを提供するかのいずれかである。ミセル及びナノ粒子を含む微粒子担体で観察される透過性及び保持性の増強（EPR:enhanced permeability and retention）の現象のため、投与後の最初の２４時間の間の薬剤排出の情報が、腫瘍送達の観点からのもっとも重要な（ないし有意な）目的の期間の情報である。
【０００５】
本発明は、一連の親油性パクリタキセルのプロドラッグ、そして、会合した（associated）ミセル／ナノ粒子（micellar/nanoparticle）製剤によって例示される。脂質アンカー（lipid anchor）の疎水性の度合い及びプロドラッグのクロス‐リンカーの不安定性の度合いを操作することによって薬剤の放出が調節され、延長した循環半減期（circulation half lives）を有する微粒子送達ビヒクルが記載される。インビボでのプロドラッグの有効性は、リンケージ（linkage）の性質及び脂質アンカーの相対的な分離速度（ないしは割合：rate）に依存することが示される。
【０００６】
多くの化学治療的な処置処方（chemotherapeutic treatment regimes）は、複数（multiple）の薬剤を含む。細胞ベースの研究において、多数の薬剤の組み合わせは、適切な比率では相乗的に作用するが、他の比率では拮抗的に作用する。これらの知見がインビボの研究に適用される場合には、従来の水性ベースのカクテル（aqueous based cocktail）の状態で投与される時の個々の薬剤の異なる薬物動態的な挙動が、投与された比率を変える。ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０２８６９６に記載されるように、薬剤の送達及び放出をコーディネートする（ないしは調和させる：coordinate）ように設計（ないしはデザイン）した微粒子送達ビヒクルを使用することによって、この問題は解決された。タキサン組成物の薬物動態を模倣するように１つ以上の追加的な抗悪性腫瘍剤（antineoplastic agents）を製剤化することができるので、本発明は、パクリタキセル及びそのアナログを含む組成物のコントロールを容易にする改良を提供する。
【発明の概要】
【０００７】
［発明の開示］
本発明は、タキサンのプロドラッグと、ミセルもしくはナノ粒子の送達ビヒクルとを採用して、薬物動態のコントロールを容易にする。タキサンをより疎水性にして、結果的に脂質ベースの送達システムとより適合性（compatible）にすることによって、タキサン組成物の薬物動態をコントロールすることができる。インビボでの効果的な放出速度（release rates）がタキサンの放出速度に合致するように追加的な抗悪性腫瘍剤を含む製剤の特徴を調節することも可能である。ミセル又は親油性のナノ粒子の担体は、これらのプロドラッグ及び他の薬剤を水性の環境に懸濁することに使用できる。
【０００８】
以下に示すように、長期循環ジグリコール酸エステルプロドラッグ（long circulating diglycolate prodrug）のナノ粒子は、最大許容量で、市販の製剤化されたパクリタキセルを上回る顕著に増強された治療活性を提供し、それゆえに、これらのタイプの製剤はそれ自体が有利である。
【０００９】
従って、１つの視点において、本発明は、タキサンのプロドラッグから形成されるナノ粒子又はミセルを含む医薬組成物であって、当該プロドラッグは、グリコール酸エステルリンカー（glycolate linker）を介して、疎水性（半）部分（moiety）にカップル化された前記タキサンのコンジュゲートであり、前記プロドラッグが、脂質及び／又は両親媒性安定剤と会合される（associated）ことを特徴とする組成物に向けられる。
【００１０】
他の視点において、本発明は、本発明の組成物を使用してタキサンを投与する方法、本発明の組成物と追加的な抗悪性腫瘍剤の製剤とを組み合わせて投与する方法、そしてこれら組成物及び製剤を調製する方法に向けられる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１Ａ及び１Ｂは、ＨＰＬＣによって測定した場合のテストプロドラッグ１及び２の排出か（図１Ａ）、又は相対的な薬剤保持を示すグラフ（図１Ｂ）である。
【００１２】
【図２】図２は、ＰＯＰＣ/２ｋＰＳ３ｋにて製剤化されたプロドラッグ１−９の排出を示す。
【００１３】
【図３】図３は、プロドラッグ１−７の類似の製剤における相対的な有効性を示す。
【００１４】
【図４】図４は、タキソール（Taxol）（登録商標）との比較における、様々な濃度でのプロドラッグ７の有効性を示す。
【００１５】
【図５】図５は、タキソール（登録商標）と同等（parity）に達するために必要なプロドラッグ７のパクリタキセル当量数（number of paclitaxel equivalents of 7）の算出を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、グリコール酸エステル（ないしはグリコール酸：glycolate）を介して疎水性（半）部分（moiety）にカップル化される（coupled）プロドラッグとして製剤化（formulated）されたタキサンに関する改良された送達特徴を示す組成物を提供する。製剤の薬物動態は、疎水性（半）部分の性質を操作すること、並びにミセル及びナノ粒子の成分（ないしは構成：components）を操作することによってコントロールできるので、所望の薬剤送達の特徴を達成することができる。これら薬物動態は他の抗悪性腫瘍剤（antineoplastic agents）を含む製剤（formulations）の薬物動態に適合させることができ、薬剤送達をコーディネートし（ないしは調和させ）、それによって、腫瘍に送達される抗悪性腫瘍剤及びタキサン薬剤の比率が実質的に投与された比率のままの改良されたシステムに関する機会を提供する。それゆえに、１つ以上の追加的な抗悪性腫瘍剤の適合性製剤（compatible formulation）と組み合わせて改良されたタキサン製剤を使用するときに、インビトロで決定される相乗的な比率を１．５又は２などの小さな因数（factor）の範囲内で維持することができる。もちろん、これらの製剤は、癌及び他の過剰増殖性（hyperproliferative）の兆候の処置に有用である。経時的に（over time）血液又は血漿中の薬剤のレベルを決定（ないし測定）することによって、この比率の維持を容易に測定することができる。コーディネートされた組成物は、少なくとも１時間又は４時間にわたって、あるいは２４時間でさえ、血液又は血漿において測定される場合の投与された比率を前述の限度内に維持する。
【００１７】
上述のように、タキサンプロドラッグを担持（ないしは輸送：carry）する本発明の組成物におけるナノ粒子又はミセルの成分は、脂質及び／又は両親媒性安定剤（amphiphilic stabilizer）から構成される。
【００１８】
本願で使用される場合に、「タキサン」とは、パクリタキセル及びそのアナログから成る薬剤のクラス（class）を意味する。パクリタキセルは、当初、イチイ（木）（Yew tree）から導出されたものであり、そして、そのアナログは、ドセタキセル（docetaxel）及び類似の構造の他の化合物を含む。タキソール（Taxol）（登録商標）は、Cremophor（登録商標）と一緒に製剤化されたパクリタキセルの商業的に入手可能な形態である。
【００１９】
プロドラッグの一部（a part）を形成する「疎水性（半）部分」（moiety）は、一般的には、高分子量のアルコールであり、それゆえに、グリコール酸（エステル）リンケージ（glycolate linkage）を介してタキサンにカップル化することができる。該アルコールは、６個以上の炭素（一般的には６−３０個の炭素、あるいは、いくつかの実施形態では６−２０個の炭素）の直鎖状（straight）の鎖、分枝状の鎖、又は、環状アルコール（cyclic alcohol）であり得る。コレステロールのようなステロイド、又はビタミンＥ及び関連する（半）部分（moieties）のようなトコフェロールでもあり得る。
【００２０】
本発明のナノ粒子組成物のプロドラッグと会合される（associated）脂質は、典型的には、ジステアロイルホスファチジルコリン（distearoyl phosphatidylcholine）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（dipalmitoyl phosphatidylcholine）、ジミリストイルホスホコリン（dimyristoyl phosphocholine）そして対応するホスファチジルエタノール（phosphatidyl ethanols）、ホスファチジルイノシトール（phosphatidyl inositols）、ホスファチジルグリセロール（phosphatidyl glycerols）及び同様のものなどのリン脂質である。脂肪酸の鎖は、不飽和であってもよく、そして、例えば、オレイン酸及びリノール酸を含むことができる。これらの脂肪酸は同一である必要がない。更に、脂質部分は、スフィンゴミエリン（sphingomyelin）などのスフィンゴシン（sphingosine）であることができ、もしくは、それ自体がビタミンＥコハク酸（エステル）（vitamin E succinate）又は、それ自体がビタミンＥアジピン酸塩（vitamin E adipate）のようなトコフェロールエステルであってもよい。
【００２１】
両親媒性安定剤は、親水性部位（portion）及び疎水性部位を含むポリマー状の化合物である。典型的な疎水性ポリマーは、ポリスチレン及びポリメタクリレートの疎水性誘導体、並びにポリビニル誘導体を含む。典型的な親水性の構成要素は、ポリエチレングリコール及び疎水性ポリマの親水性誘導体、並びに、デキストラン（dextran）及びデキストラン誘導体、そしてポリアミノ酸を含む。該リストは、例示的であるものとし、網羅的ではない。一般的には、両親媒性安定剤は、およそ５００を上回る分子量を有するが、１０００−５００００ｇ／ｍｏｌのより高い分子量を有することもできる。
【００２２】
以下の実施例において、親油性ナノ粒子の製剤のためにデザインされた一連のパクリタキセルプロドラッグが記載される。コハク酸（エステル）又はジグリコール酸（エステル）クロスリンカーを使用して、疎水性が増加する一連の脂質アンカーを薬剤にコンジュゲートすることによって、パクリタキセルの疎水性を増加させた。パクリタキセル自体は水にほぼ不溶性であるが、脂質ベースの送達システムの外へ急速に分離され得るという十分な水への溶解性（典型的には、数分のオーダー（order）の半減期）を有する。本発明は、有効性を最大化しつつ、製剤化された薬剤の薬物動態をインビボにおいてコントロールする。プロドラッグを、良く（well）定義されたブロックコポリマー安定化ナノ粒子（block copolymer stabilized nanoparticles）に製剤化した。これらのナノ粒子は、インビボにおいて、およそ２４時間の排出半減期を有することが示された。プロドラッグがナノ粒子から放出される速度は、脂質アンカーの疎水性を調節することによってコントロールすることができ、結果として放出速度が１から２４時間までの範囲にわたった。
【００２３】
ナノ粒子製剤は、４℃で、数ヶ（several）月間安定的に保存することができた。
【００２４】
様々なパクリタキセルのプロドラッグの治療上の活性を評価するために、ナノ粒子製剤を、ＨＴ２９ヒト結腸異種移植腫瘍（HT29 human colon xenograph tumors）を保有するマウスに静脈内に投与した。血漿半減期及びプロドラッグの曲線下面積（area under the curve）が増加した場合に、ＨＴ２９腫瘍に対する活性もまた増加した。両方の処置がタキソール（登録商標）の最適処置処方を使用して最大許容投与量（ＭＴＤ）で投与されたときに、パクリタキセルプロドラッグナノ粒子は、ＨＴ２９腫瘍が４００ｍｇに到達するまでの時間を、タキソール（登録商標）に比べて２倍以上にした。
【００２５】
インビボにおいて単一ポリマ鎖が経時的に粒子の外に分離することの結果として、該タイプのナノ粒子製剤は、おそらく、ほとんどクリアされるであろう。安定剤の構成要素の段階的な消失（Gradual loss）は、粒子を不安定化し、そして、まだ外に分離していないペイロード（payload）を排出するという結果になるだろう。比較的に少量のポリマの消失が、粒子のコアを潜在的なタンパク質相互作用に曝すため、高い薬剤／安定剤の比率を有する粒子は、急速にクリアされる。低い薬剤／安定剤の比率を有する粒子は、ポリマーの消失に対してより強力な耐性（tolerance）を有し、そして、インビボにおける他のメカニズムを介してクリアされるのに十分な程度に長く残存する。従って、理想的な送達システムは、比較的に低い（low）薬剤／ポリマーの比率で、好ましくは、低い（low）分離速度を有する安定剤で、ミセルのサイズを適合（approach）させるべきである。
【００２６】
異なる疎水性の脂質アンカを有するプロドラッグは、同一の粒子組成物からの異なる分離速度を示す。これらのナノ粒子において、薬剤の物理化学的な特徴は、担体自体の分解よりも、むしろ、担体からの薬剤の放出を主に規定する（dictate）。この挙動は、例えば、タキソール（登録商標）とナノ粒子におけるパクリタキセルプロドラッグとの間の顕著な差に導く。パクリタキセルは、注射の際に、Cremophorのミセルの外に急速に分離し、そして、それが血液区画（blood compartment）において遭遇する親油性のシンク（部分）（sinks）に広範囲に分布する。薬剤は排出される前に、経時的に血液分画に再分布する（redistributes back）。プロドラッグナノ粒子は、この初期の分布フェーズを示さず、むしろ経時的に薬剤を継続的に放出し、その速度は、プロドラッグの構成要素の分離速度に依存する。プロドラッグ分離速度が有効性と直接的に相関することが以下に示され、そしてこの速度は、プロドラッグの脂質アンカ（そして、それ故に、疎水性）を変更することによって容易に調整可能であった。
【００２７】
分離速度への有効性の依存性は、腫瘍におけるナノ粒子の蓄積の後に、プロドラッグが徐々に放出されるという点で合理的に説明することができる。ペイロードを急速に放出するか、或いは循環系から急速にクリアされるナノ粒子は、腫瘍サイトに薬剤をわずかしか（less）送達しないだろうし、結果的には減少した有効性を示すことが予測できる。
【００２８】
本発明の組成物は、追加的な抗悪性腫瘍剤を更に含むことができる。本発明の組成物において、タキサンプロドラッグの薬物動態が容易にコントロールされるので、類似の組成物又は他の（alternative）製剤のいずれかの追加的な抗悪性腫瘍剤に、類似の薬物動態を提供することができ、そして、本発明の組成物と混合すること、あるいは被検体に同時に投与することができる。従って、追加的な抗悪性腫瘍剤は、リポソーム、ミセル、他の（alternative）ナノ粒子又はタキサンの薬物動態を模倣するようにデザインされた他の（other）組成物に製剤化することができる。適切な抗悪性腫瘍剤は多種多様であり、かつ本発明の分野においてよく知られており、例えば、ダウノルビシン（daunorubicin）及びドキソルビシン（doxorubicin）などのアントラサイクリン（anthracyclines）、カルボプラチン（carboplatin）及びシスプラチン（cisplatin）などのプラチナ含有薬剤、イリノテカン（irinotecan）及びそのアナログを含むファミリー（family）、フルオロピリミジン（fluoropyrimidines）、及びメトトレキサート（methotrexate）のなどの種々の他の一般的に採用される薬剤を含む。タキサン製剤の薬物動態を模倣するようにデザインされた、追加的な抗悪性腫瘍剤（１つ以上）の製剤は、上記のようなタキサン製剤と混合することか、又は個別の組成物として実質的に同時に投与することができる。
【００２９】
一つの実施形態において、タキサンプロドラッグは、ドキソルビシンなどの水溶性の薬剤の疎水性プロドラッグアナログと共製剤化（co-formulated）することができ、そして、２重薬剤ナノ粒子（dual-drug nanoparticles）は、注射後の延長された期間、血漿中で、注射された［時の］薬剤：薬剤の比率で２つの薬剤を維持する。ナノ粒子に疎水性プロドラッグを製剤化することは、広範囲に異なる物理化学的な特徴を有する抗癌剤の組み合わせを共送達（co-deliver）すること、及びインビボで適切な薬剤：薬剤比率を維持することへの新たなアプローチを提供する。また、本願発明の更に好ましい形態は、以下のとおりである。
（形態１）ジグリコール酸エステルリンカーを介して、疎水性分子にカップル化されたタキサンのコンジュゲートが、脂質及び／又は両親媒性安定剤と非共有的に会合する（associating）ことにより形成されるナノ粒子又はミセルを含む医薬組成物。
（形態２）前記コンジュゲートが、脂質及び両親媒性安定剤と会合されることを特徴とする形態１に記載の組成物。
（形態３）前記タキサンが、パクリタキセルであることを特徴とする形態１又は２に記載の組成物。
（形態４）前記疎水性分子が、長鎖アルコール、トコフェロール、又はステロイドであることを特徴とする形態１〜３のいずれか１に記載の組成物。
（形態５）前記脂質が、リン脂質又はトコフェロールであることを特徴とする形態１〜４のいずれか１に記載の組成物。
（形態６）前記両親媒性安定剤が、コポリマーであることを特徴とする形態１〜５のいずれか１に記載の組成物。
（形態７）前記コポリマーが、ポリエチレングリコール及びポリスチレンのコポリマーであることを特徴とする形態６に記載の組成物。
（形態８）タキサン組成物の薬物動態を模倣するように製剤化される追加的な抗悪性腫瘍剤を更に含むことを特徴とする形態１〜７のいずれか１に記載の組成物。
（形態９）被検体（subject）にタキサンを投与する際に使用するための形態１〜７のいずれか１に記載の組成物。
（形態１０）形態１に記載の組成物を調製する方法であって、
コントロールされた流速を使用して、限局的な空間（confined space）において、水と、前記コンジュゲート、脂質及び／又は両親媒性安定剤を含む混和性溶媒とを急速に混合するステップを含む方法。
（形態１１）形態１に記載の組成物を調製する方法であって、
コントロールされた流速を使用して、限局的な空間（confined space）において、水と、ジグリコール酸エステルリンカーを介して、疎水性分子にカップル化されたタキサンのコンジュゲート、脂質及び／又は両親媒性安定剤を含む混和性溶媒とを急速に混合するステップを含む方法。
【００３０】
本発明の組成物は、任意の適切なルートによって投与することができ、非経口的な投与が好ましい。処置されるべき被検体は、ヒト、他の高等動物、及びネズミ及びラットなどの研究モデルを含む。
【００３１】
以下の実施例は、本発明を説明するものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００３２】
略称
ＶＥＳ、ビタミンＥコハク酸（ないしビタミンＥコハク酸エステル）（Vitamin E succinate）；
ＰＯＰＣ、１‐パルミトイル‐２‐オレオイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３−ホスフォコリン（1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine）；
ＣＶＩＪ、限局的な体積衝突噴流（confined volume impinging jets）；
２ｋＰＳ３ｋ、ポリ（エチレングリコール）２０００‐ｂ‐ポリスチレン３０００（poly(ethylene glycol)2000-b-polystyrene3000）；
２．５ｋＰＳ３ｋ、ポリ（エチレングリコール）２５００‐ｂ‐ポリスチレン３０００（poly(ethylene glycol)2500-b-polystyrene3000）；
３Ｈ‐ＣＨＥ、トリチウム化コレステロールヘキサデシルエーテル（tritiated cholesterol hexadecyl ether）；
ＴＬＣ、薄層クロマトグラフィー（thin layer chromatography）；
ＤＩＰＣ、ジイソプロピルカルボジイミド（diisopropylcarbodiimide）；
ＤＭＡＰ、Ｎ，Ｎ‐４‐ジメチルアミノピリジン（N,N‐4‐dimethylaminopyridine）
【００３３】
材料
全ての試薬は、別途特定されない限り、Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, ONから購入した。溶媒は、VWR International, Mississauga, ONから得た。パクリタキセルは、Indena S.p.A., Milan, Italyから購入した。３Ｈ‐ＣＨＥは、Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Inc., Waltham,MAから得た。ＰＯＰＣは、Northern Lipids, Burnaby, BCから得た。１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（spectra）は、Bruker Advance 400で、ＣＤＣｌ３で記録した。ＨＴ-２９ヒト結腸直腸腺癌細胞（HT-29 Human colorectal adenocarcinoma cells）は、ATCC, Manassas, VAから得た。Ｆｏｘｎ１ｎｕマウスは、Harlan, Indianapolis, INから得た。限局的な体積衝突噴流ミキサーは、Princeton Universityにおいてカスタム構築（custom built）した。全ての動物実験は、University of British Columbia's Animal Care Committeeによって認証されたプロトコルに従い、そして、Canadian Council of Animal Careによって確立された最新のガイドラインに従って実行した。
［実施例１］
プロドラッグの合成
【００３４】
一般的に入手可能な範囲の脂質アルコールをアンカーの構成要素（スキーム１）として使用した。該脂質アルコールは、α‐トコフェロール（α-tocopherol）（プロドラッグ１及び３）、オレイルアルコール（oleyl alcohol）（プロドラッグ２及び４)、オクタデカノール（octadecanol）（プロドラッグ５）、コサノール（cosanol）（プロドラッグ６）、ドコサノール（docosanol）（プロドラッグ７）、コレステロール（cholesterol）（プロドラッグ８）、及び１，２‐ジミリストイルｓｎ‐グリセロール（1,2-dimyristoyl-sn-glycerol）（プロドラッグ９）を含む。対応する環状無水物を用いる処理によって脂質をクロス‐リンカーとコンジュゲートさせ、次に、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）を使用して、アンカー‐リンカーの生成物とパクリタキセルとをＮ，Ｎ‐４‐ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の存在下で縮合した。コハク酸（Succinic acid）（プロドラッグ１‐２）、及びジグリコール酸（diglycolic acid）（プロドラッグ３‐９）を、クロス‐リンカーとして使用した。後者の３‐オキサ部分は、コハク酸（ないしコハク酸エステル：succinate）アナログに関連する加水分解に対するクロス‐リンカーの２´‐アシル基の感受性を増加させるものであった。
0005537753.tif 000002
0005537753.tif 000003
【００３５】
２´‐アシルパクリタキセル誘導体を、パクリタキセルの２´‐ヒドロキシル基及び７´‐ヒドロキシル基の間の反応速度（reaction rates）の差を利用することによって、選択的に調製した。ここで使用された反応条件下では、ＴＬＣによってモニターした場合に、顕著なレベルの２´，７‐ジアシル生成物が生産される前に、パクリタキセルの大部分は消費された。未精製の（crude）反応混合物における反応しなかったパクリタキセル、２´，７‐ジアシル生成物及びその他の不純物を除去するために、カラムクロマトグラフィーを使用した。最終生成物の純度及び同一性（identity）を、ＨＰＬＣ及びＮＭＲ解析によってそれぞれ確認した。
【００３６】
脂質アンカーの合成については、脂質アルコールのピリジン溶液を、３当量のコハク酸無水物（succinic anhydride）又はジグリコール酸無水物（diglycolic anhydride）で、室温で、オーバーナイトで処理した。溶媒をロト‐バップ（roto-vap）で除去し、残渣を希釈塩酸から塩化メチレンで抽出した。有機分画を無水硫酸マグネシウムで乾燥してろ過し、溶媒を除去した。適切な酸への転換をＴＬＣによってモニターしたところ、ほとんどのケースにおいて１００％であった。結果として得られた生成物を、真空下で乾燥させるか、又はベンゼンから凍結乾燥させた。該リピッドアシッド（lipid acids）を更なる精製なしで次のステップにおいて使用した。
【００３７】
パクリタキセルコンジュゲートの合成については、パクリタキセル（１当量）、リピッドアシッド（２当量）、及びＮ，Ｎ-４-ジメチルアミノピリジン（３当量）をアルコールフリーのクロロホルムに溶解した。次に、ジイソプロピルカルボジイミド（１．３当量）を加え、そして、溶液を室温で撹拌した。ほとんどのパクリタキセルが消費されるまで（典型的には２‐４時間）、ＴＬＣによって反応をモニターした。次に、反応混合物を希釈塩酸で洗浄し、そして無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒の除去の後、未精製の生成物を、メタノール／塩化メチレン勾配を使用してシリカゲルカラムに通した。精製したプロドラッグを、ベンゼンから凍結乾燥し、そして、室温で保存した。
【００３８】
調製した化合物は、以下のプロドラック１−９である。
【００３９】
２’−Ｏ−（４’’−Ｏ−トコフェロールサッキノイル）−パクリタキセル（2'-O-(4''-O-tocopherylsuccinoyl)-paclitaxel）（プロドラック１）
パクリタキセル及びトコフェロールコハク酸から合成した。
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 3.83 (1H, d, J = 7.25 Hz); 4.22 (1H, d, J = 8.60 Hz); 4.33 (1H, d, J = 8.60 Hz); 4.46 (1H, dd, J = 10.88 Hz, J' = 6.58 Hz); 4.99 (1H, d, J = 9.54 Hz); 5.52 (1H, d; J = 3.22 Hz); 5.70 (1H, d, J = 6.98 Hz); 5.98 (1H, dd, J = 9.13 Hz, J' = 3.22 Hz); 6.27 (1H, t, J = 8.6 Hz); 6.97 (1H, d, J = 8.87 Hz)。
【００４０】
２'−Ｏ−（４''−Ｏ−オレイルサッキノイル)−パクリタキセル（2'-O-(4''-O-oleylsuccinoyl)-paclitaxel）（プロドラック２）
パクリタキセル及びオレイルコハク酸から合成した。
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 3.82 (1H, d, J = 7.0 Hz); 3.96 (2H, t, J = 6.81 Hz); 4.21 (1H, d, J = 8.38 Hz); 4.33 (1H, d, J = 8.38 Hz); 4.46 (1H, br. s); 4.98 (1H, d, J = 8.45 Hz); 5.36 (2H, m); 5.50 (1H, d, J = 2.89 Hz); 5.69 (1H, d, J = 7.00 Hz); 6.00 (1H, dd, J = 9.04 Hz, J' = 2.74 Hz); 6.26 (1H, t, J = 8.91 Hz); 7.08 (1H, d, J = 9.06 Hz)。
【００４１】
２'−Ｏ−（５''‐Ｏ‐トコフェロールジグリコロイル)−パクリタキセル（2'-O-(5''-O-tocopheryldiglycoloyl)-paclitaxel）（プロドラック３）
パクリタキセル及びトコフェロールジグリコール酸から合成した。
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ3.84 (1H, d, J = 6.98 Hz); 4.22 (1H, d, J = 8.3 Hz); 4.34 (1H, d, J = 8.6 Hz); 4.99 (1H, d, J = 7.79 Hz); 5.64 (1H, d, J = 2.96 Hz); 5.70 (1H, d, J = 6.98 Hz); 6.06 (1H, dd, J = 9.27 Hz, J’ = 2.82 Hz); 6.30 (1H, t); 6.97 (1H, d, J = 9.13 Hz)。
【００４２】
２'−Ｏ−（５''−Ｏ−オレイルジグリコロイル)−パクリタキセル（2'-O-(5''-O-oleyldiglycoloyl)-paclitaxel）（プロドラック４）
パクリタキセル及びオレイルジグリコール酸から合成した。
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ3.83 (1H, d, J = 7.0 Hz); 4.46 (1H, t, J = 7.96 Hz); 4.99 (1H, d, J = 8.45 Hz); 5.35 (2H, m); 5.60 (1H, d, J = 2.74 Hz); 5.70 (1H, d, J = 7.08 Hz); 6.05 (1H, dd, J = 9.25 Hz, J' = 2.55 Hz); 6.28 (1H, t, J = 8.9 Hz); 7.04 (1H, d, J = 9.29 Hz)。
【００４３】
２'−Ｏ−（５''−Ｏ−オクタデシルジグリコロイル）−パクリタキセル（2'-O-(5''-O-octadecyldiglycoloyl)-paclitaxel）（プロドラック５）
パクリタキセル及びオクタデシルジグリコール酸から合成した。
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ3.83 (1H, d, J = 7.0 Hz); 4.46 (1H, dd, J = 10.74 Hz, J’ = 6.70 Hz); 4.99 (1H, d, J = 8.45 Hz); 5.60 (1H, d, J = 2.82 Hz); 5.70 (1H, d, J = 7.00 Hz); 6.05 (1H, dd, J = 9.25 Hz, J' = 2.55 Hz); 6.28 (1H, t, J = 8.9 Hz); 7.05 (1H, d, J = 9.29 Hz).
【００４４】
２'−Ｏ−（５''−Ｏ−コサニルジグリコロイル）−パクリタキセル（2'-O-(5''-O-cosanyldiglycoloyl)-paclitaxel）（プロドラック６）
パクリタキセル及びコサニルジグリコール酸から合成した。
1H NMR (400MHz, CDCl3)δ3.83 (1H, d, J = 6.98 Hz); 4.0-4.4 (5H, m); 4.46 (1H, dd, J = 10.75 Hz, J’ = 6.72); 4.99 (1H, d, J = 9.40 Hz); 5.60 (1H, d, J = 2.96 Hz); 5.70 (1H, d, J = 7.25 Hz); 6.05 (1H, dd, J = 9.27 Hz, J' = 2.82); 6.29 (1H, t, J = 8.3 Hz); 7.05 (1H, d, J = 9.13 Hz).
【００４５】
２'−Ｏ−（５''−Ｏ−ドコサニルジグリコロイル）−パクリタキセル（2'-O-(5''-O-docosanyldiglycoloyl)-paclitaxel）（プロドラック７）
パクリタキセル及びドコサニルジグリコール酸から合成した。
1H NMR (400MHz, CDCl3)δ3.83 (1H, d, J = 6.98 Hz); 4.0-4.4 (5H, m); 4.46 (1H, dd, J = 10.75 Hz, J’ = 6.72 Hz); 4.99 (1H, dd, J = 9.40 Hz, J’ = 1.61 Hz); 5.60 (1H, d, J = 2.96 Hz); 5.70 (1H, d, J = 6.98 Hz); 6.05 (1H, dd, J = 9.40 Hz, J' = 2.95 Hz); 6.28 (1H, t, J = 8.3 Hz); 7.05 (1H, d, J = 9.40 Hz).
【００４６】
２'−Ｏ−（５''−Ｏ−コレステリルジグリコロイル）−パクリタキセル（2'-O-(5''-O-cholesteryldiglycoloyl)-paclitaxel）（プロドラック８）
パクリタキセル及びコレステリルジグリコール酸から合成した。
1H NMR (400MHz, CDCl3)δ3.83 (1H, d, J = x Hz); 4.0-4.4 (5H, m); 4.47 (1H, dd, J = 10.6 Hz, J’ = 6.8 Hz); 4.63 (1H, m); 4.99 (1H, d, J = 7.79 Hz); 5.38 (1H, d, J = 3.76 Hz); 5.61 (1H, d, J = 2.69 Hz); 5.70 (1H, d, J = 7.25 Hz); 6.06 (1H, dd, J = 9.13 Hz, J' = 2.69 Hz); 6.28 (1H, t, J = 8.3 Hz); 7.09 (1H, d, J = 9.40 Hz).
【００４７】
２'−Ｏ−（５''−Ｏ−（1'''，2'''ジミリストイル‐ｓｎ‐グリセロ）ジグリコロイル）−パクリタキセル（2'-O-(5''-O-(l'',2'''-dimyristoyl-sn-glycerol)diglycoloyl)-paclitaxel）（プロドラック９）
パクリタキセル及び３−（１，２ジミリストイル‐ｓｎ‐グリセロール）ジグリコール酸から合成した。
1H NMR (400MHz, CDCl3)δ3.84 (1H, d, J = 6.98 Hz); 4.47 (1H, dd, J = 10.6 Hz, J’ = 6.8 Hz); 4.99 (1H, dd, J = 9.54 Hz, J’ = 1.75 Hz); 5.20 (1H, m); 5.61 (1H, d, J = 2.96 Hz); 5.71 (1H, d, J = 7.25 Hz); 6.07 (1H, d, J = 9.27 Hz, J’ = 2.82 Hz); 6.31 (1H, t); 7.11 (1H, d, J = 9.40 Hz).
［実施例２］
【００４８】
ナノ粒子製剤
プロドラッグ、共脂質（co-lipid）及び安定剤ポリマー（stabilizer polymers）（典型的には、１：１：２ｗ／ｗに基づく）を、エタノール／ＴＨＦ（４：１）に、４０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。１２／１２／５３／５３ｍｌ／分（溶媒／水／水／水）に設定した流量（flow rates）で４ポートＣＶＩＪミキサー（引用文献１３、１４）を使用して、溶媒を急速に水で希釈した。流量は、ハーバードアパラタスＰＨＤ２０００シリンジポンプ（Harvard Apparatus PHD2000 syringe pumps）を使用してコントロールした。次に、結果として得られた溶液を水に対して透析して、残りの溶媒を除去した。最終的な薬剤濃度は、典型的には、およそ０．７ｍｇ／ｍｌであった。より高い濃度のものが必要なときには、透析した溶液を等量の６００ｍＭのショ糖で希釈し、そして次に、１００ｋＤ、内径（lumen）０．５ｍｍ、経路長６０ｃｍのミッドギーフープカートリッジ（MidGee hoop cartridge）（GE Healthcare Life Sciences、Piscataway、NJ）を使用して蠕動ポンプで濃縮した。粒子径は、マルバーンゼータサイザーナノ‐ＺＳパーティクルサイザー（Malvern Zetasizer Nano-ZS particle sizer）を用いて決定し、容積重量データとして報告した。
【００４９】
製剤は、溶媒１ｍＬ当り４０ｍｇの濃度で、それぞれ１：１：２の重量比のプロドラッグ、共脂質及び両親媒性安定剤からなった。より高い初期濃度のもの（＞４０ｍｇ／ｍＬ）の使用は、しばしば、下流の調製の操作を邪魔する大型の（large）粒子の生産に導いた。共脂質は、α−トコフェロール‐コハク酸（エステル）（ＶＥＳ）又はプロセッシングを容易にするＰＯＰＣのどちらかであった。ＶＥＳは、４℃での長期保存の際に沈殿したため、後半の製剤化では、ＶＥＳをＰＯＰＣによって置き換えた。ポリ（エチレングリコール）‐ｂ‐ポリスチレン（２ｋＰＳ３ｋ又は２．５ｋＰＳ３ｋ）を両親媒性安定剤として用いた。他の安定剤も使用することができる。瞬間（フラッシュ）沈殿法を使用して、平均的な粒子径を、プロドラッグ／ＶＥＳ／２ｋＰＳ３ｋナノ粒子については１０から２０ｎｍの範囲にし、そして、プロドラッグ／ＰＯＰＣ／２ｋＰＳ３ｋナノ粒子については２０から３０ｎｍの範囲にした。
【００５０】
４℃での長期保存の後に、ナノ粒子製剤の安定性を、ＨＰＬＣによってモニターした。
【００５１】
ナノ粒子を含有するサンプル（５０μＬ）を、１５０μＬの希釈剤（メタノール:アセトニトリル、２：１  ｖ／ｖ）と、激しいボルテックス処理（vigorous vortexing）によって混合し、次に１００００ｘｇで１０分間遠心分離した。２２７ｎｍでのＵＶ検出によってモニターしたフェノメネクスSynergi Fusion逆相解析カラム（Phenomenex Synergi Fusion reverse phase analytical column）を用いた定量のために、上清（２０μＬ）をウォーターズＨＰＬＣ（Waters HPLC）の中に注入した。メタノールと１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．６）との移動相が、それぞれ、最初の溶媒混合液の７０：３０から１００:０までの、１ｍＬ／分の勾配溶出で、クロマトグラフィーを実行した。カラムの温度を３０℃に設定した。サンプルは、ＨＰＬＣ解析の前に、オートサンプラーの区画中で４℃で維持した。
【００５２】
ＰＯＰＣ/２ｋＰＳ３ｋで製剤化されたプロドラック４、５、及び６（プロドラック：ＰＯＰＣ：２ｋＰＳ３ｋ＝１：１：２）の緩衝化していない３００ｍＭショ糖溶液の解析は、１１週間の保存後に、５％未満のフリーのパクリタキセルの存在を示した。このレベルのフリーの薬剤は、コントロールの有効性実験において、抗腫瘍活性を有さないことを示した（データは示さない）。従って、安定性は、これらの研究において実施されたインビボ実験に十分であると考えられた。
【００５３】
１−２週間の保存の後にいくつかの製剤組成物で沈殿物を形成したプロドラック８を除いて、ショ糖溶液又は水のいずれかの中で４℃で保存されたナノ粒子製剤は、３ヶ月間、物理的に安定であることが視覚的な検査によってわかった。また、ＶＥＳを共脂質として使用する製剤は、コロイド状又は結晶状の沈殿物の緩やかな（slow）形成も導いた（ＶＥＳが水相に分離し、その後続いてナノ粒子の外へ沈殿することに起因すると思われる）。従って、ＶＥＳ製剤は、短時間の実験のみに適し、有効性の評価などの長期間の実験には適していなかった。
【００５４】
水、１５０ｍＭ生理食塩水又は３００ｍＭのショ糖の中において、プロドラッグ／共脂質／２．５ｋＰＳ３ｋ（１:１:２）のナノ粒子をボルテックス処理した後の粒子サイズの変化を検査することによって、製剤の物理的な安定性を研究した（表１）。これら製剤は、２０と３０ｎｍとの間の直径を有するナノ粒子を主に含んだ。力学的なストレスに対して感受性の粒子は、これらの条件に供したときには、凝集又は相分離を起こし、結果としてサンプル中において、より大型の（larger）粒子が形成された。動的光散乱（dynamic light scattering）を使用して、粒子サイズの増加をモニターし、激しいボルテックス処理の前及び後のサンプルのＺ平均値（粒度分布の強度加重平均サイズ（intensity weighted mean size））を測定した。力学的な不安定性に起因する凝集物又は沈殿物の形成については、Ｚ平均値の変化を代用の読取り値（surrogate readout）として用いた、ここで、ΔＺ平均値についてのより高い値は、より高いレベルの凝集又は沈殿を示した（表１）。ＰＯＰＣを共脂質として用いたナノ粒子は、塩存在下では、ＶＥＳを用いて調製されたナノ粒子、又は共脂質の不在下で調製されたナノ粒子よりも顕著に安定的であることがわかった（プロドラック５の製剤に関するそれぞれのΔＺ平均＝２４、３７２、７７４ｎｍ）。ほとんどのケースにおいて、力学的な安定性は、水と比較して、３００ｍＭのショ糖存在下において顕著に改善された。ΔＺ平均が０−４０ｎｍの範囲内であるショ糖サンプルは、ミクロンサイズの物質をほんの少ししか有さないか、又は、全く有さなかった（＜サンプルの２％）。これらの条件下（ΔＺ平均＝１００‐２００ｎｍ）で、水および生理食塩水の中において高いレベルの凝集物を生産したいくつかのプロドラッグ製剤（プロドラック３及び９）は、ショ糖中では安定であった（ΔＺ平均＝０‐４０ｎｍ）。この研究の結論は、もっとも良い（best）安定性がＰＯＰＣ共脂質を使用して、３００ｍＭのショ糖溶液に製剤化されたナノ粒子の状態で得られたということであった。
［表１］
プロドラッグ製剤の物理的安定性。全ての製剤を、プロドラッグ／共脂質／２．５ｋＰＳ３ｋ（１:１:２）ナノ粒子の水溶液として調製した。粒子の直径は、マルバーンナノ-ＺＳパーティクルサイザー（Malvern Nano-ZS particle sizer）を用いて決定した容量重量平均（volume weighted average）である。３０秒間ボルテックス処理の後、等容量の水、３００ｍＭの生理食塩水又は６００ｍＭのショ糖で希釈したサンプルのＺ平均（ΔＺ平均）の変化を測定することによって安定性を評価した。
0005537753.tif 000004
【００５５】
大型の（large）サンプル調製に必要な通常のプロセッシングステップにサンプルを供した時に、類似の結果が得られた。力学的なストレスに曝されたときに、水に製剤化されたナノ粒子、あるいはＶＥＳで製剤化されたナノ粒子、又は共脂質なしで製剤化されたナノ粒子は安定ではなく、膜分離法（diafiltration）を使用する濃縮ステップの間に著しい沈殿物の形成を示した。濃縮の前に終濃度が３００ｍＭのショ糖でナノ粒子溶液を希釈することによって、製剤の濃縮する間の安定性を改善することができた。共脂質としてのＰＯＰＣの使用は、保存及び形成後プロセッシング（post-formation processing）の間の物理的安定性の更なる改善を提供し、上述の安定性の研究の結果と符合する。その後、この実験で使用した全ての濃縮サンプルは、共脂質としてのＰＯＰＣを基にし、３００ｍＭのショ糖に調製した。これらの条件下において、沈殿物の形成は、８ｍｇ／ｍＬの薬剤の濃度までは無視することができた。
【００５６】
エステルリンケージの相対的な不安定性に基づいて予測することができるように、ジグリコール酸（エステル）リンケージは、コハク酸（エステル）リンケージよりも加水分解に対してより感受性になることわかった。ジグリコール酸（エステル）リンケージの増加した活性は、生物学的製剤サンプルのプロドラッグの正確な解析についての更なる問題（difficulty）を提起した。１：４（ｖ：ｖ）のメタノール：アセトニトリルは、ほぼ完全な血漿タンパク質の沈殿及びナノ粒子からのプロドラッグの遊離に有効であった。しかしながら、血漿サンプルをプロセッシングした後に、時の経過と共にフリーのパクリタキセルの定常的な（steady）増加が観察され、このことは基質の精密解析（matrix workup）及びＨＰＬＣ解析の間における加水分解（の進行）を意味した。ジグリコール酸（エステル）プロドラッグ６は、９時間後に完全に加水分解されたが、一方では、コハク酸（エステル）プロドラッグ２は、６８時間後におよそ２５％まで減少した。酢酸塩でｐＨ４にサンプルを緩衝化した時には、加水分解は観察されなかった。血漿不在下のプロドラッグ６／ＰＯＰＣ／２ｋＰＳ３ｋの緩衝化していないサンプルは、この加水分解を示さず、これら製剤におけるプロドラッグの時間依存的な加水分解は沈殿しない血漿構成要素の存在に起因する可能性が最も高いことを意味した。この結果は、プロドラッグは、粒子内にある時は安定であり、そして、生体培地における加水分解はプロドラッグの放出後に行われることを示唆する。
［実施例３］
インビトロ活性
【００５７】
ＭＣＦ‐７ヒト腫瘍細胞系列（cell line）は、American Type culture Collection （Manassas, VA）から購入した。Ａ２７８０ヒト腫瘍細胞系列は、European Collection of Cell culture （UK）から購入した。
【００５８】
細胞を１６段階の濃度で、７２時間、段階希釈したプロドラッグ／ＰＯＰＣ／２．５ｋＰＳ３ｋ（１：１：２）ナノ粒子製剤に３回曝した。ＤＭＳＯ添加の後、５７０ｎｍで、標準の３‐（４，５‐ジメチルチアゾール‐２‐イル）‐２，５‐ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）検出法を使用して、生存可能な細胞を定量した。処理後の生存率は、未処理コントロールウェルに対する平均（mean）パーセントとして表現される。
【００５９】
蒸留水に調製したプロドラッグ／ＰＯＰＣ／２．５ｋＰＳ３ｋ（１：１：２）で処理したＡ２７８０及びＭＣＦ‐７ヒト腫瘍細胞を使用して、プロドラッグの細胞毒性の評価を実行した（表２）。プロドラッグを含まないコントロール製剤は、他のナノ粒子構成要素が細胞の成長阻害に寄与しないことが確認された。 更に、いくつかの異なるナノ粒子製剤（プロドラッグ１／ＶＥＳ／２ｋＰＳ３ｋ；プロドラッグ１／２ｋＰＳ３ｋ、及びプロドラッグ１／Cremophor）を使用してプロドラッグ１を評価し、観察された活性が、使用される製剤のタイプと独立的であったことを示した。
［表２］
プロドラッグ／ＰＯＰＣ／２ｋＰＳ３ｋ（１:１:２） 製剤を用いたヒト腫瘍細胞系列の阻害
0005537753.tif 000005
【００６０】
Ａ２７８０及びＭＣＦ‐７細胞に対して、コハク酸（エステル）とリンクした（succinate-linked）プロドラッグ（１及び２）は、フリーのパクリタキセルよりも〜１‐２桁（オーダー）の大きさで弱い（less potent）ことがわかった。この傾向は、テストしたほとんどの細胞系列で観察された。観察された活性の減少は、コハク酸（エステル）基の加水分解に対する抵抗性の結果である可能性があった。それらに続くプロドラッグ（３から９）は、３‐オキサ基の存在に起因して加水分解に対してより感受性になることが予測されたジグリコール酸（エステル）リンカー部分で調製した。ジグリコール酸（エステル）プロドラッグは、全て、成長阻害アッセイ（〜２０ｎＭ）において類似の効力（potency）を示し、そしてパクリタキセルのポジティブコントロールよりも、１桁の大きさだけ弱かった。コハク酸（エステル）アナログは、対応するジグリコール酸（エステル）プロドラッグよりも常に弱かった。例えば、Ａ２７８０細胞系列において、パクリタキセルの２．４ｎＭ（ＩＣ５０値）に比べて、コハク酸（エステル）プロドラッグ１及びジグリコール酸（エステル）プロドラッグ３のＩＣ５０値は、それぞれ１９２ｎＭ及び２５．３ｎＭであった。同様に、コハク酸（エステル）プロドラッグ２及びジグリコール酸（エステル）プロドラッグ４は、それぞれ、７５．１、及び２８．４のＩＣ５０値を有した。これら結果は、パクリタキセル、２'‐Ｏ‐ヘキサデカノイルパクリタキセル（2'‐O‐hexadecanoylpaclitaxel）、及び２'-（２''-ブロモヘキサデカノイル）パクリタキセル（2'‐(2''‐bromohexadecanoyl) paclitaxel）に関するＭＣＦ‐７乳癌細胞系列（MCF-7 breast carcinoma cell line）のＩＣ５０値が、それぞれ、＜１、８６００、及び７０ｎＭとして報告された、関連化合物の文献報告と一貫する（引用文献７）。
［実施例４］
インビボにおけるナノ粒子の血漿排出
【００６１】
胸腺欠損ヌードマウス（athymic nude mice）（ｎ＝３／時点）に、テストサンプル（１０μｌ／ｇ体重、最大量２５０μｌまで）を静脈注射した。指定した時点において、心臓への穿刺（cardiac puncture）によって血液を採取し、そしてＥＤＴＡでコートされたマイクロチューブ（BD Biosciences）に移した。チューブを２８００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。血漿を回収し、そして５０μｌアリコット（aliquots）を試薬含有（量）に関してＨＰＬＣによって解析した。３Ｈ‐ＣＨＥ含有サンプル（５０μｌ）をピコフルオロ４０（登録商標）シンチレーション液（PicoFluor40TM scintillation fluid）（Packard）で希釈し、そしてベックマン-コールターＬＳ６５００マルチパーパスシンチレーションカウンター（Beckman Coulter LS 6500 Multipurpose scintillation counter）でカウントした。体重グラム当りに０．０４１２５ｍｌの容量の血漿があると仮定して、血液区画におけるマウス当りの試薬の総量（カウント）を算出した。
【００６２】
脂質ベースの粒子製剤からの親油性薬剤の分離速度は、一般的に、大量の（bulk）水性相（phase）に対する薬剤担体システムの透析によって決定される。これら環境下における薬剤の低い（low）水性の溶解度は、透析膜を通して溶出するよりはむしろ、薬剤が担体システムに戻る可能性が高いという結果となり、結果として不自然に低い（low）見かけ上の分離速度になる。このような実験は、インビボにおける疎水性薬剤に関して観察される挙動を正確に反映せず、インビボでは、フリーな薬剤は、送達ビヒクルに戻るよりはむしろ、存在する巨大な疎水性のリザーバー（large hydrophobic reservoir）（例えば、細胞膜又は親油性タンパク質）に急速に分離することができる。従って、透析実験は、これらの製剤の真の（true）送達能力を誤って示す。インビボにおける真の分離速度を決定するもっとも正確な手段は、交換不可能なマーカーを使用して薬剤及び粒子の両方を追跡することである。従って、そのようなマーカーを確認（ないし同定）すること、及びそれが粒子の薬物動態を反映することを確認することが必要不可欠であった。
【００６３】
プロドラッグ及び粒子の両方を追跡する排出実験を実行して、インビボにおけるプロドラッグの分離する挙動のより正確な記載を得た（図１）。プロドラッグの排出は、ＨＰＬＣによってフォローしたが、粒子排出速度は、ナノ粒子をトリチウム化コレステリルヘキサデシルエーテル（tritiated cholesterylhexadecyl ether）（３Ｈ-ＣＨＥ）でラベルすることによって決定した。このラベルは、これらシステムにおいて交換不可能であり、代謝不可能な脂質マーカーとみなされるので、インビボにおいて、リポソームを追跡することに広範囲に使用される。この粒子の完全性（integrity）が維持される場合には、この分子の疎水性及び低いレベルの水和が、この実験で用いたナノ粒子からの低い分離速度に結果としてなるので、粒子の運命の評価を提供することが予測される。
【００６４】
いくつかの実験を実行して、上述の仮説の妥当性及びおよその粒子の血漿排出速度を決定した。プロドラッグ１／ＶＥＳ／２ｋＰＳ３ｋ（１:１:２）、及びプロドラッグ２／ＶＥＳ／２ｋＰＳ３ｋ（１:１:２）の製剤を微量の（trace）３Ｈ-ＣＨＥでラベルし、そして、Foxn1nuマウスにおいて、ラベル及びプロドラッグの両方の、血漿でのレベルをモニターした（図１、パネルＡ）。３Ｈ‐ＣＨＥラベルは、両方の群において、同様の速度でクリアされ（ないし除去され：cleared）、およそ２４時間の半減期を有した。このシステムにおいて、プロドラッグ１は、３Ｈ‐ＣＨＥとおよそ同一の速度でクリアされたが、これに対してプロドラッグ２は、顕著により早くクリアされた。プロドラッグ／３Ｈ‐ＣＨＥの比率の比較（図１、パネルＢ）は、プロドラッグ１の粒子ラベルに対する比率が実験の過程にわたって実質的に変化しなかったことを実証し、分離半減期が実験期間よりも顕著に長いことを示唆した。およそ４時間の分離半減期と符合する速度で、３Ｈ‐ＣＨＥと相対的に、プロドラッグ２は減少した。実験のデータは、４つのパラメーターの２重指数関数的な衰退に適合させることができ、おそらく、薬剤が個々の粒子の外へ分離した場合の局所的な環境の変化に対する応答において、分離速度が経時的にコンスタントに変化したことを暗示した。
【００６５】
インビボにおけるプロドラッグ１／２ｋＰＳ３ｋ、プロドラッグ１／ＰＯＰＣ／２ｋＰＳ３ｋ１及び、３Ｈ‐ＣＨＥでラベルされたプロドラッグ１／ＶＥＳ／２ｋＰＳ３ｋ（１：１：２）の製剤を用いてプロドラッグ１及び３Ｈ‐ＣＨＥの血漿排出を比較することによって、排出に対する製剤組成の影響を決定した（データは示さない）。３つの製剤全てについて、ラベルとプロドラッグの両方の排出速度は、図１においてプロドラッグ１に関して観察されたものと類似であることがわかり、これらの製剤において、プロドラッグ１の排出速度に対する共脂質の役割がほんの少ししかない（little）ことを示した。どちらもプロドラッグを含んでいない３Ｈ‐ＣＨＥでラベルされた２ｋＰＳ３ｋミセル、及びＰＯＰＣ／２ｋＰＳ３ｋ（１：２）のナノ粒子を使用して、更なる排出の実験を行った（データは示さない）。両方のケースにおいて、３Ｈ‐ＣＨＥラベルは、図１のプロドラッグ１について観察された速度と、およそ同一の速度でクリアされた。最後に、プロドラッグ１／ＶＥＳ／３ｋＰＳ３ｋ及びプロドラッグ１／ＶＥＳ／２．５ｋＰＳ１．６ｋの製剤を使用した実験は、安定剤であるポリ（エチレングリコール）／ポリスチレン（poly(ethylene glycol)/polystyrene）の比率の適度なバリエーションが、図１に見られる排出に対比してのプロドラッグ１の排出に関してほんの少しの影響しか有さないことを示した（データは示さない）。
【００６６】
これらの製剤におけるプロドラッグ１の排出は、共脂質及び安定剤の組成と独立的であることがわかり、そして、経時的な３Ｈ‐ＣＨＥマーカーの喪失（loss）に対応した。これらの結果は、３Ｈ‐ＣＨＥラベルが、薬物動態実験を通して粒子と一緒に残り、粒子の組成における変化とは独立的であることを示唆する。これらの粒子の循環半減期は、著しく長く（およそ２４時間）、これら濃度で他のポリマーを使用して調製されたミセルに関して報告されている［循環半減期］よりも１桁の大きさだけ（an order of magnitude）より長く、そして、長期間循環を有する（long-circulating）リポソームで観察される循環半減期に匹敵した。
【００６７】
血漿の薬剤排出に対するプロドラッグの分離の影響を決定した。プロドラッグのパネル（prodrug panel）は、Foxn1nuマウスにおいて、プロドラッグ／ＰＯＰＣ／２ｋＰＳ３ｋ（１：１：２）ナノ粒子を使用してスクリーンし（screened）、異なるプロドラッグのコンジュゲートの排出速度を決定した（図２）。プロドラッグの循環レベルは、主にプロドラッグの分離速度に依存的であると思われ、そして、粒子は実験の過程にわたって完全なまま（intact）残るためには十分に安定であるので、結果的には、この速度を間接的に反映した。コンジュゲートは、０．７ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化した。プロドラッグ１／ＶＥＳ／２．５ｋＰＳ１．６ｋ（１：１：２）の血漿排出は、３−２５ｍｇ／ｋｇの範囲にわたる投与量とはほとんど（largely）独立的であるため、濃度のバリエーションが粒子の排出速度に影響を与えるようには思えなかった（データは示さない）。
【００６８】
各プロドラッグの分離半減期の評価をするために、プロドラッグ１が上述の議論された結果に基づく粒子排出速度を追従する（track）ものと推定（assumed）した。次に、全ての他のプロドラッグの排出を、４つのパラメーターの二重指数関数的な減衰曲線(four parameter double exponential decay curves)に適合させ、そしてプロドラッグ１に対して規格化した。製剤におけるプロドラッグの存在又は不在は、粒子の排出挙動に顕著に影響を与えず、薬剤を排出した場合の組成の経時的な変化が、粒子排出速度に影響を及ぼさなかったことを暗示する。従って、プロドラッグ１に対して規格化されたプロドラッグの排出は、これらの製剤におけるプロドラッグの相対的な分離半減期の合理的な近似値（approximation）を生じた。
【００６９】
プロドラッグ１は、２４時間に亘って（over）、無視することが可能な程度の（negligible）分離速度を有したが、これに対して、この組成のプロドラッグ２は、およそ１．７時間の半減期で外に分離した。これらのプロドラッグの両方は、コハク酸（エステル）クロスリンカーを使用しており、インビトロにおいてパクリタキセルよりも活性が著しく少なかった（less）。これらの化合物のジグリコール酸（エステル）のバージョン（それぞれプロドラッグ３及び４）は、それらのコハク酸（エステル）母体（succinate parents）に対して加速された排出を示し、それぞれおよそ１３時間及び１時間の分離半減期を有した。このことは、ジグリコール酸（エステル）リンケージの３‐オキサ基の存在に起因する水性相への分離の際の増加した水和のレベルと符合する。
【００７０】
それぞれ、オレイル（ΔＣ１８）、ステアリル（Ｃ１８）、コサニル（Ｃ２０）及びドコサニル（Ｃ２２）部分（moiety）を有するシリーズであるプロドラッグ４、５、６及び、７を使用して、脂質アンカーのサイズの小さな変化の影響を決定した。図２の結果に基づいて、本願発明者らは、これらのプロドラッグの分離半減期がそれぞれ、およそ１時間、１．７時間、６．５時間、そして１０時間になることを評価した（estimated）。これらの結果は、ナノ粒子からのプロドラッグの放出を、使用されるアルキルアンカーの長さを調節することによって制御することができることを示す。
【００７１】
また、分離キネティクス（partitioning kinetics）に対する他の一般的な脂質のタイプの影響も調査した。コレステリルジグリコール酸（エステル）（cholesteryl diglycolate）コンジュゲート（プロドラッグ８）は、直鎖脂肪族種よりもかなり長く保持され、およそ２１時間の見積もられた分離半減期を有した。残念なことに、プロドラッグ８は、保存の際にナノ粒子からの相分離を受け易く、そして、この研究における後の有効性実験において、十分に（fully）評価されなかった。１、２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−コハク酸（エステル）誘導体（1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-succinate derivative）（プロドラッグ９）は、それが２つのＣ１４アンカーを有するので、プロドラッグ７よりも良く（better）保持されるであろうという予測（anticipation）の下に評価したが、しかしながら、それはより早く外に分離され、８．５時間の半減期を有した。より高い分離速度は、ナノ粒子の外への交換の間のグリセロールバックボーン（glycerol backbone）上の増加したレベルの水和に起因するように思われた。
［実施例５］
インビボ効果
【００７２】
メスの胸腺欠損ヌードマウス（７−８週齢）に、１００μｌのＨＴ２９ヒト結腸癌細胞（２×１０６細胞）を２６ゲージの針を使用して皮下に接種した。最初の処置の前に、８０及び１２０ｍｇの間の平均腫瘍サイズで、マウスを無作為にグループ分けした（ｎ＝６／グループ）（２００ｍｇを超えた腫瘍、及び３０ｍｇより小さい腫瘍［の個体］は除いた）。テストサンプルを、１０μｌ薬剤／ｇ体重の容量（最大２５０μｌまで）で注射した。その後の注射は、指定されたスケジュールに従って実行した。腫瘍の長さ（length）及び幅（width）の測定値、体重、そして、生存確認（life observations）は、週当たりに２−３回記録した。腫瘍の重さは、式（Ｌ×Ｗ２）／２に従って算出した。
【００７３】
プロドラッグ１、２、４、５、６及び７のナノ粒子製剤の相対的な有効性を、Ｑ４Ｄｘ６［４日ごとに６回］のスケジュールで、３６μｍｏｌ／ｋｇの投与量を使用して、ＨＴ２９モデルにおいて決定した（図３）。生理食塩水をネガティブコントロールとして用いた。サブ最大投与量（sub-maximal dose）で実行した初期の実験は、この投与量がポジティブ及びネガティブコントロール群の挙動をひとまとめにする（bracketing）応答の範囲に結果としてなること、そして、この仕方において、個々のプロドラッグ種の相対的な治療の効力（potencies）の識別が可能であることを示唆した。プロドラッグ８は、保存の際の製剤からの薬剤の沈殿のため、この実験に含まなかった。プロドラッグ３及び９は、それらの分離半減期がプロドラッグ６及び７に類似したので、同様に除いた。
【００７４】
コハク酸（エステル）が連結した２つのプロドラッグ（プロドラッグ１及び２）は、３４μｍｏｌ／ｋｇの投与量では、いずれの治療的活性の証明も示さなかった。その結果は、インビトロ細胞成長阻害アッセイにおいて、これらのプロドラッグがパクリタキセルよりも効き目が１−２桁の大きさで（1-2 order of magnitude）弱かった（less potent）という観察結果（observation）と相関した（表２）。プロドラッグ２及び１の分離半減期は大幅に異なり、プロドラッグ２が有する１．７時間から、プロドラッグ１が有する効率的には交換不可能（non-exchangeable）（実験的な時間枠内では）の範囲にわたった。これらの結果は、コハク酸（エステル）が連結した種２（species 2）が細胞に対して作用可能（available）にされても、より低い（lower）加水分解速度及び［該加水分解に］付随する（concomitant）パクリタキセルの放出が有意義な治療的応答を提供することには十分でないということを示す。
【００７５】
予備のインビボでの粒子分布の実験は、腫瘍の蓄積レベルが腫瘍組織のｇ当りの注射された投与量の〜３％でのプラトー（plateau）を示し、蓄積の大部分が最初の８時間以内に発生した。類似の結果は、文献において報告されている。分離半減期が、それぞれ、およそ１及び１．７時間であるプロドラッグ４及び５のようなプロドラッグのケースにおいて、腫瘍に送達される薬剤のレベルが著しくより低い（lower）ことが予測され、これらの種で観察される減少した有効性におそらく関連する。プロドラッグ６及び７は、より緩やかな（slower）速度で薬剤を放出し、それぞれおよそ６．５及び１０時間の分離半減期を有する。腫瘍における粒子の蓄積は、全てのケースで類似となることが予測されるので、これらのプロドラッグを有する製剤は、より多くの（more）薬剤を腫瘍に送達することができる。
【００７６】
ジグリコール酸（エステル）が結合した４つの種（プロドラッグ４、５、６及び７）は、全て、腫瘍成長の阻害の度合いが変わるという結果となった。これらのプロドラッグのインビトロでの成長阻害の実験は、ジグリコール酸（エステル）連結プロドラッグの細胞毒性が、それらのコハク酸（エステル）アナログよりも大きかったことを実証した（表２）。これらの製剤の排出データは、脂肪族の鎖の長さがプロドラッグの分離半減期と関連したことを示し、それぞれ、１時間、１．７時間、６．５時間、及び１０時間であった。このことは、観察された有効性の傾向と良く（well）相関し、最高の抗腫瘍応答は、もっとも長い分離半減期をもつプロドラッグ、すなわち、ドコサニルコンジュゲート７（プロドラッグ７）で観察される。平均の腫瘍サイズが５００ｍｍ３に到達することに遅延を誘導させる処理を用いて、相対的な有効性を決定し、それぞれ３、４、１５、及び１７日の値を得た。これらの結果に基づいて、使用するプロドラッグ７のナノ粒子製剤の投与量及びスケジュールを最適化する更なる研究を実行した。
［実施例６］
プロドラッグ７の有効性に対する投与量の影響
【００７７】
ＨＴ２９腫瘍モデルにおいて、パクリタキセルの０．２５から３モル当量までの範囲にわたる投与量の有効性を、比較することによって、パクリタキセルに対比してのＰＯＰＣ／２．５ｋＰＳ３ｋナノ粒子製剤のプロドラッグ７の活性を決定した（図４）。Ｑ２Ｄｘ５スケジュールで、２３μｍｏｌ／ｋｇで投与されたタキソール（登録商標）をポジティブコントロールとして用いた。プロドラッグ７に関する最大の（greatest）有効性がＱ２Ｄスケジュールにおいて観察され（タキソール（登録商標）にもまた最適であった）、かつ、このタキソール（登録商標）投与量での最大許容処置単位（maximum tolerated treatment course）は、５回の注射であったのでので、該投与処方を選択した。このスケジュールでのプロドラッグ７の最大許容投与量（maximum tolerate dose：MTD）は、およそ３［倍］パクリタキセル当量であった（６９μｍｏｌ／ｋｇ）。
【００７８】
２つの方法によって腫瘍成長データを解析し、どれほどのプロドラッグ７の投与量がタキソール（登録商標）ポジティブコントロールと同等であるかを決定した。第１の方法では、腫瘍退縮という結果になった処理群のみを考察した。腫瘍サイズが１２５ｍｇに到達することにおける遅延は、処置の開始から測定し、次に、タキソール（登録商標）群で観察された遅延に対して規格化した。相対的な遅延を、プロドラッグ７のパクリタキセル投与当量に対してプロットし、プロドラッグ７のＭＴＤまでの線形の（linear）投与量応答を示したデータセットを得た。適合曲線（fitted curve）は、プロドラッグ７が、パクリタキセルの１．７５投与当量の投与量において、タキソール（登録商標）と同等（parity）を達成することを示した。第２の方法では、腫瘍サイズが３００ｍｇに到達することにおける遅延を生理食塩水のネガティブコントロールと相対的に測定し、そして次に、タキソール（登録商標）群で観察された遅延に対して規格化した。プロドラッグ７のパクリタキセル投与当量に対する相対的な遅延をプロットすることは、再び線形の投与量応答を生じ、タキソール（登録商標）群との同等性（parity）がプロドラッグ７の１．６５パクリタキセル当量で達成されたことを示した。重要なこととして、プロドラッグ７のナノ粒子製剤（ＭＴＤは６９μｍｏｌ／ｋｇ）が、２モル［sic, 3 molar］パクリタキセル当量（６９μｍｏｌ／ｋｇ）で投与されたときには、抗腫瘍活性は、ＭＴＤで投与されたタキソールを用いて達成された活性よりも著しく高かった（greater）。特に、ＭＴＤのタキソール（登録商標）で処理した腫瘍が３００ｍｇ近くまで成長したことと対照的に、ＭＴＤのプロドラッグ７のナノ粒子製剤で処理された腫瘍は、６０日目において５０ｍｇ未満のままであった（図４）。
【００７９】
図５は、タキソール（登録商標）と同等に達するプロドラッグ７のパクリタキセル当量数の算出を示す。
【００８０】
プロドラッグ７のナノ粒子の有効性に対する投与量の影響は、タキソール（登録商標）と対比して評価した。最適な治療応答は、ＨＴ２９固形腫瘍モデルにおいて、Ｑ２Ｄの投与（ないしドージング：dosing）で観察された。プロドラッグ７の製剤化に使用したナノ粒子はおよそ２４−３６時間の排出半減期を有するが、その一方では、プロドラッグ７自体はおよそ１０時間の分離半減期を有する。これらの値は、投与後およそ２日の期間にわたる（over）腫瘍サイトにおける効果的なプロドラッグの放出と符号し、Ｑ２Ｄスケジュールと合致する。ＭＴＤでのタキソールと比較した、０．２５から３倍パクリタキセル当量までの薬剤投与量の変化（titration）は、プロドラッグ７が、およそ１．７パクリタキセル当量で、同等の有効性を達成したことを示した。プロドラッグ７の容量応答は、ＭＴＤまで線形上昇型（linear up）であるため、より高い（higher）投与量のプロドラッグ７を使用して、有効性を最大許容投与量のタキソール（登録商標）を上回って有意に改良することが可能である。ナノ粒子にプロドラッグ７よりもより良く（better）保持されるプロドラッグは、プロドラッグ７で観察された投与量よりも低い投与量ですら同等性を達成するだろう。
【００８１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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