(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(I)
【化１】
0005543209.tif 000049
［式中、
【化２】
0005543209.tif 000050
は、一重結合または二重結合のいずれか適切な方であり、
【化３】
0005543209.tif 000051
は、結合がないかまたは一重結合のいずれか適切な方であり、
【化４】
0005543209.tif 000052
は、
【化５】
0005543209.tif 000053
の中から選択され、
【化６】
0005543209.tif 000054
および
【化７】
0005543209.tif 000055
は、TおよびXによって共に縮合しており、
U、VおよびWは、同じであるか異なっており、かつC、N、OおよびSから選択されてよく、
TおよびXは、CまたはNであり、
YはN-OR1、NR'1またはCR2R'2であり、
R1は、H、アルキル、アルケニル、アルコキシアルキル、アリールオキシアルキル、アリールアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、またはカルボキシアルキルであり、
R'1は、H、アルキル、アリール、またはアラルキルであり、
R2およびR'2は、それぞれ同じであるか異なっており、H、アルキル、アリール、またはアラリキルから独立に選択され、
Ru、RvおよびRwは、同じであるか異なっており、かつ、
【化８】
0005543209.tif 000056
が結合がない場合は不在であり、または、
【化９】
0005543209.tif 000057
が一重結合である場合はH、CN、=O、Hal、Alk、OAlk、OH、NRCN、C(CN)=C(OH)(OAlk)、SR、NRR'、C(O)NRR'、ヘテロ環、アリール、ヘテロアリールおよびシクロアルキルからなる群から選択されてよく、Alk、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ環およびシクロアルキルはHal、NRR'、CN、OH、CF3、アリール、ヘテロアリールまたはOAlkによって置換されていてもよく、
R3、R4、R5およびR6は、それぞれ同じであるか異なっており、かつH、OAlk、Alk、Hal、NRR'、CN、OH、OCF3、CF3、アリールおよびヘテロアリールからなる群から独立に選択され、
RおよびR'は、それぞれ同じであるか異なっており、かつHおよびAlkからなる群から独立に選択され、AlkはHal、NRR'、CN、OH、CF3、アリールまたはヘテロアリールによって置換されていてもよい］
の化合物、あるいはそれらの薬剤として許容される塩、水和物、または水和された塩、あるいはこれらの化合物の多形結晶構造またはそれらの光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマーまたはエナンチオマー、あるいは幾何異性体(EおよびZ)あるいはそれらの混合物。
【請求項２】
U、V、Wが、独立にCまたはNである、請求項1に記載の式(I)の化合物。
【請求項３】
Ru、Rv、Rwの少なくとも1つが、H、アリール、Alk、NRR'、Hal、-Alkアリール、-AlkOH、-AlkOAlk、シクロアルキルから選択される、請求項1または2に記載の式(I)の化合物。
【請求項４】
R3、R4、R5およびR6が、それぞれ同じであるか異なっており、かつH、Hal、Alk、OAlk、OCF3からなる群から独立に選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
RvおよびRwが、独立にHまたは不在である、請求項1から4のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
式(Ia)
【化１０】
0005543209.tif 000058
［式中、R3、R4、R5、R6、Y、T、U、V、W、XおよびRuは、請求項1から5のいずれか一項で規定した通りである］
の化合物である、請求項1から5のいずれか一項に記載の式(I)の化合物。
【請求項７】
- 3-メチル-1,2,3a,4,10-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-メチルオキシム
- 3-メチル-1,2,3a,4,10-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-アリルオキシム
- 1-メチル-2,3,4,10,10a-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-アリルオキシム
- 3-ブチル-1,2,3a,4,10-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-アリルオキシム
- 1-ブチル-2,3,4,10,10a-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-アリルオキシム
- 1,2,3,3a,4,10-ヘキサアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-アリルオキシム
- 1,2,3,3a,4,10-ヘキサアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンオキシム
- 1,2,3,3a,4,10-ヘキサアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-デシルオキシム
- 1,2,3,3a,4,10-ヘキサアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-(2-メトキシエチル)オキシム
- 1,2,3,3a,4,10-ヘキサアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-(3-フェノキシプロピル)オキシム
- 1-エチル-2,3,4,10,10a-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-メチルオキシム
- 3-エチル-1,2,3a,4,10-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-メチルオキシム
- 1-エチル-2,3,4,10,10a-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-エチルオキシム
- 3-エチル-1,2,3a,4,10-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-エチルオキシム
- 1-エチル-2,3,4,10,10a-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-アリルオキシム
- 3-エチル-1,2,3a,4,10-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-アリルオキシム
- 1-エチル-2,3,4,10,10a-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-ベンジルオキシム
- 3-エチル-1,2,3a,4,10-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-ベンジルオキシム
- [1-エチル-2,3,4,10,10a-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-イリデン]フェニルアミン
- (1,2,3,3a,4,10-ヘキサアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-イリデンアミノオキシ)酢酸エチルエステル
- (1,2,3,3a,4,10-ヘキサアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-イリデンアミノオキシ)酢酸リチウム塩
あるいはそれらの薬剤として許容される塩、水和物、または水和された塩、あるいはこれらの化合物の多形結晶構造またはそれらの光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマーまたはエナンチオマー、あるいは幾何異性体(EおよびZ)あるいはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項1から6のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
対応する式(I')
【化１１】
0005543209.tif 000059
［式中、R3、R4、R5、R6、Het1、T、U、V、W、X、Ru、Rv、Rwは、請求項1から6のいずれか一項の通りに規定され、Ru'、Rv'、Rw'はそれぞれ、Ru、Rv、Rwに類似しているか、あるいは1つまたは複数の工程により前駆体基を所望のRu、RvまたはRw基に転換することを可能にするRu、Rv、Rwに相当する前駆体基である］
の化合物を反応させる工程、および任意選択で、式(I)の化合物を単離する工程を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の式(I)の化合物の調製方法。
【請求項９】
式(II)および(III)
【化１２】
0005543209.tif 000060
［式中、R3、R4、R5、R6、T、U、V、W、X、Ru、Rv、Rwは、請求項1から6のいずれか一項で規定された通りである］
の対応する化合物を反応させる工程を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の化合物の調製方法。
【請求項１０】
式(I)
【化１３】
0005543209.tif 000061
［式中、R3、R4、R5、R6、T、U、V、W、X、Het1、Ru、RvおよびRwは、請求項1から7のいずれか一項で規定された通りである］
の化合物を含む、薬剤組成物。
【請求項１１】
1つまたは複数のシステインプロテアーゼを阻害するための、請求項10に記載の薬剤組成物。
【請求項１２】
前記システインプロテアーゼが、脱ユビキチン化酵素、カスパーゼ、カテプシン、カルパインおよびウイルス、細菌、真菌または寄生虫のシステインプロテアーゼの1つまたは複数の群に属する、請求項11に記載の薬剤組成物。
【請求項１３】
癌および転移、神経変性疾患、炎症性障害、心臓血管疾患ならびに/またはウイルスの感染および/もしくは潜伏、
炎症性障害、神経変性障害、急性または慢性の感染性、虚血性または化学的肝傷害がもたらす肝損傷または肝不全、急性または慢性の感染性、虚血性または化学的腎傷害がもたらす腎損傷および腎不全、急性または慢性の感染性、虚血性または化学的心傷害がもたらす心損傷および心不全、膵島のインスリンベータ細胞に対する急性または慢性の自己免疫、化学的、酸化的または代謝的損傷がもたらす糖尿病、
癌および転移、心臓血管疾患、免疫疾患、骨および関節疾患、骨粗鬆症および関節炎、
老化障害、後期発症糖尿病および白内障、
A型肝炎、C型肝炎、SARSコロナウイルスの感染および疾患、ライノウイルスの感染および疾患、アデノウイルスの感染および疾患、ポリオを含むウイルスの感染およびウイルス性疾患、
連鎖球菌の感染および疾患、クロストリジウム属細菌が原因の感染および疾患、ブドウ球菌の感染および疾患、歯肉炎および歯周病を含む細菌の感染および細菌性疾患、
真菌の感染および真菌性疾患、寄生原虫の感染および寄生原虫感染症、寄生平虫の感染および寄生平虫感染症、寄生回虫の感染および寄生回虫感染症
の治療および/または予防用の、請求項10に記載の薬剤組成物。
【請求項１４】
−前記神経変性疾患が、アルツハイマー病およびパーキンソン病の中から選択され、
−前記ウイルスの感染および/もしくは潜伏が、単純ヘルペスウイルス-1、エプスタインバーウイルスもしくはSARSコロナウイルスの中から選択され、
−前記神経変性障害が、脳卒中に起因する神経細胞の損傷の中から選択される、請求項13に記載の薬剤組成物。
【請求項１５】
抗癌治療、神経学的治療、血栓溶解治療、酸化防止治療、抗感染薬、血圧降下治療、利尿治療、血栓溶解治療、免疫抑制治療、心臓血管治療、免疫調整治療、抗炎症治療、抗ウイルス治療、抗菌治療、抗真菌治療、抗原虫治療、駆虫治療から選択される1つまたは複数の治療と組合せて使用するための、請求項10に記載の薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新しいシステインプロテアーゼ阻害剤、それらの調製方法および治療のためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテアーゼはそれらの基質特異性または触媒作用の機序に基づいて分類することができる。ペプチド加水分解の機序に基づいて、5つの主要なプロテアーゼの種類、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼおよび金属プロテアーゼが知られている。システインプロテアーゼは、とりわけ脱ユビキチン化酵素である、カスパーゼ、カテプシン、カルパインおよびウイルス、細菌または寄生虫のシステインプロテアーゼを含む。
【０００３】
脱ユビキチン化酵素には、ユビキチン特異プロテアーゼ(USP)およびユビキチンカルボキシヒドロラーゼ(UCH)が含まれる。大まかに言えば、ユビキチン経路はタンパク質の分解を調節し、より詳しくは癌に、アルツハイマー病、パーキンソン病などの神経変性疾患に、炎症に、ウイルスの感染性および潜伏(特に単純ヘルペスウイルス-1、エプスタインバー(EP)ウイルス、SARSコロナウイルス)に、または心臓血管疾患に関与する(Chem.Rev.、1997、97、133〜171頁;Chem.Rev.、2002、102、4459〜4488頁;J.Biochem.、2003、134、9〜18頁;J.Virology、2005、79(7)、4550〜4551頁;Cardiovasc.Res.、2004、61、11〜21頁)。
【０００４】
カスパーゼはアポトーシスに関与することが示されており、したがって、肝炎、肝不全、炎症、心虚血および心不全、腎不全、神経変性、難聴、糖尿病、または脳卒中における標的である(J.Pharmacol Exp.Ther.、2004、308(3)、1191〜1196頁;J.Cell.Physiol.、2004、200(2)、177〜200頁;Kidney Int、2004、66(2)、500〜506頁;Am.J.Pathol.、2004、165(2)、353〜355頁;.Mini Rev.Chem.、2004、4(2)、153〜165頁;Otol.Neurotol.、2004、25(4)、627〜632頁;参照文献7、21、22、23、24、25)。
【０００５】
カテプシンは、一般的には癌および転移、炎症、免疫/免疫調整(Eur.Respir.J.、2004、23(4)、620〜628頁)およびアテローム性動脈硬化(Ageing Res.Rev.、2003、2(4)、p.407〜418頁)に関与することが示されている。より詳しくは、カテプシンは癌および転移、ならびに関節炎に関与すると見なされているカテプシンBおよびB様(Cancer Metastasis Rev.、2003、22(2〜3)、271〜286頁;Biol.Chem.、2003、384(6)、845〜854頁およびBiochem.Soc.Symp.、2003、70、263〜276頁)、特に癌および転移に関与するカテプシンD(Clin.Exp.Metastasis、2004、21(2)、91〜106頁)、骨粗鬆症および関節炎に作用するカテプシンK(Int.J.Pharm.、2004、277(1〜2)、73〜79頁)、免疫における抗原提示においてある役割を果たすことが示されているカテプシンS(Drug News Perspective、2004、17(6)、357〜363頁)が含まれる。
【０００６】
カルパインは、一般的な老化(Ageing Res.Rev.、2003、2(4)、407〜418頁)だけでなく、より具体的には、糖尿病(Mol.Cell.Biochem.、2004、261(1)、161〜167頁)および白内障(Trends Mol.Med.、2004、10(2)、78〜84頁)において、役割を果たす。
【０００７】
ウイルスのシステインプロテアーゼは、ライノウイルス、ポリオウイルス、A型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、アデノウイルス、またはSARSコロナウイルスにおいて同定されている(Chem.Rev.1997、97、133〜171頁;Chem.Rev.2002、102、4450〜4488頁;J.Virology、2005、79(7)、4450〜4551頁およびActa Microbiol.Immunol.Hung.、2003、50(1)、95〜101頁)。
【０００８】
細菌のシステインプロテアーゼには、ストレプトパイン、ブドウ球菌のシステインプロテアーゼ、クロストリパインまたはギンギパインが含まれ、アスペルギルスフラバス(Aspergillus flavas)などの酵母も、病原性(毒性)因子を構成しうるシステインプロテアーゼを発現することが示されている(Chem.Rev.1997、97、133〜171頁)。
【０００９】
寄生虫のシステインプロテアーゼは、例えばMolecular & Biochemical Parasitology(2002、120、1〜21頁)およびChem.Rev.(2002、102、4459〜4488頁)で概説されている。大部分の主要な寄生虫疾患の原因となる寄生虫は、それらの感染、栄養または再生サイクルのどこかでそれら自身のシステインプロテアーゼを使用しているということは注目に値する。かかる疾患にはマラリア、シャーガス病、アフリカトリパノーマ症、リーシュマニア症、ランブル鞭毛虫症、トリコモナス症、アメーバ症、クリプトスポリディウム症、トキソプラズマ症(toxoplamiasis)、住血球虫症、吸虫症(fasciolasis)、オンコセルカ症、および他の平虫または回虫の一部による他の感染症が含まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第6514972号
【特許文献２】国際公開第01/79209号
【特許文献３】国際公開第02/02562号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Chem.Rev.、1997、97、133〜171頁
【非特許文献２】Chem.Rev.、2002、102、4459〜4488頁
【非特許文献３】J.Biochem.、2003、134、9〜18頁
【非特許文献４】J.Virology、2005、79(7)、4550〜4551頁
【非特許文献５】Cardiovasc.Res.、2004、61、11〜21頁
【非特許文献６】J.Pharmacol Exp.Ther.、2004、308(3)、1191〜1196頁
【非特許文献７】J.Cell.Physiol.、2004、200(2)、177〜200頁
【非特許文献８】Kidney Int、2004、66(2)、500〜506頁
【非特許文献９】Am.J.Pathol.、2004、165(2)、353〜355頁
【非特許文献１０】Mini Rev.Chem.、2004、4(2)、153〜165頁
【非特許文献１１】Otol.Neurotol.、2004、25(4)、627〜632頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、新規な種類のシステインプロテアーゼ阻害剤を見付けることは、幅広い範囲の疾患および病的状態においてとても重要である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
米国特許第6514972号;国際公開第01/79209号および国際公開第02/02562号は4つの縮合環を含む化合物を開示している。しかし、これらのシステインプロテアーゼ阻害剤としての使用は示唆されていない。
【００１４】
第1の目的によれば、本発明は式(I)
【化１】
0005543209.tif 000002
［式中、
【化２】
0005543209.tif 000003
は、一重結合または二重結合のいずれか適切な方であり、
【化３】
0005543209.tif 000004
は、結合がないかまたは一重結合のいずれか適切な方であり、
【化４】
0005543209.tif 000005
は、1〜5個のヘテロ原子を含み、H、CN、=O、Hal、Alk、OAlk、OH、NRCN、C(CN)=C(OH)(OAlk)、SR、NRR'、C(O)NRR'、ヘテロ環、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される1つまたは複数の置換基によって置換されていてもよい、5から7員のへテロ環、好ましくはヘテロアリールであり、Alk、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ環はHal、NRR'、CN、OH、CF3、アリール、ヘテロアリール、OAlkによって置換されていてもよく、
【化５】
0005543209.tif 000006
および
【化６】
0005543209.tif 000007
は、TおよびXによって共に縮合しており、
YはN-OR1、NR'1またはCR2R'2であり、
R1は、H、アルキル、アルケニル、アルコキシアルキル、アリールオキシアルキル、アリールアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、またはカルボキシアルキルであり、
R'1は、H、アルキル、アリール、またはアラルキルであり、
R2およびR'2は、それぞれ同じであるか異なっており、H、アルキル、アリール、またはアラリキルから独立に選択され、
T、U、V、WおよびXは、同じであるか異なっており、かつC、N、OおよびSから選択されてよく、
Ru、RvおよびRwは、同じであるか異なっており、かつH、CN、=O、Hal、Alk、OAlk、OH、NRCN、C(CN)=C(OH)(OAlk)、SR、NRR'、C(O)NRR'、ヘテロ環、アリール、ヘテロアリールおよびシクロアルキルからなる群から選択されてよく、Alk、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ環およびシクロアルキルはHal、NRR'、CN、OH、CF3、アリール、ヘテロアリールまたはOAlkによって置換されていてもよく、
R3、R4、R5およびR6は、それぞれ同じであるか異なっており、かつH、OAlk、Alk、Hal、NRR'、CN、OH、OCF3、CF3、アリールおよびヘテロアリールからなる群から独立に選択され、
RおよびR'は、それぞれ同じであるか異なっており、かつHおよびAlkからなる群から独立に選択され、AlkはHal、NRR'、CN、OH、CF3、アリールまたはヘテロアリールによって置換されていてもよい］
の化合物、あるいはそれらの薬剤として許容される塩、水和物、または水和された塩、あるいはこれらの化合物の多形結晶構造またはそれらの光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマーまたはエナンチオマー、あるいはそれらの位置異性体、幾何異性体(EおよびZ)あるいはそれらの混合物に関する。
【００１５】
好ましくは、X、T、U、V、Wは、CまたはNである。
【００１６】
好ましくは、YはN-OR1またはNR'1であり、より好ましくはN-OR1であり、特にN-OH、N-アルキル、N-Oアルケニル、N-Oアルキル-O-アルキル、N-O-アルキル-CO-Oアルキル、N-O-アルキル-COOHである。
【００１７】
YがCR2R'2であるとき、R2および/またはR'2は式(I)の構造の残りと融合環を形成することができないことが理解されるであろう。
【００１８】
好ましくは、
【化７】
0005543209.tif 000008
は2または3個のヘテロ原子、より好ましくは2または3個のNを含む。
【００１９】
最も好ましくは、
【化８】
0005543209.tif 000009
は
【化９】
0005543209.tif 000010
【化１０】
0005543209.tif 000011
または
【化１１】
0005543209.tif 000012
である。
【００２０】
好ましくは、
【化１２】
0005543209.tif 000013
は置換されていない。
【００２１】
好ましくは、Ru、RvおよびRwは、H、アリール、Alk、NRR'、Hal、Alkアリール、AlkOH、AlkOAlkおよびシクロアルキルから選択される。
【００２２】
好ましくは、
【化１３】
0005543209.tif 000014
は
【化１４】
0005543209.tif 000015
または
【化１５】
0005543209.tif 000016
または
【化１６】
0005543209.tif 000017
であり、RwはHである。
【００２３】
好ましくは、R3、R4、R5およびR6は、それぞれ同じであるか異なっており、かつH、Hal、Alk、OAlkおよびOCF3からなる群から独立に選択される。
【００２４】
好ましくは、RおよびR'は、それぞれ同じであるか異なっており、かつHおよびAlkからなる群から独立に選択される。
【００２５】
式(I)の好ましい化合物は、式(Ia)：
【化１７】
0005543209.tif 000018
の化合物である。
【００２６】
最も好ましい化合物は、特に式(I1)から(I4)：
【化１８】
0005543209.tif 000019
の化合物である。
【００２７】
本発明の好ましい化合物は、
- 3-メチル-1,2,3a,4,10-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-メチルオキシム
- 3-メチル-1,2,3a,4,10-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-アリルオキシム
- 1-メチル-2,3,4,10,10a-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-アリルオキシム
- 3-ブチル-1,2,3a,4,10-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-アリルオキシム
- 1-ブチル-2,3,4,10,10a-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-アリルオキシム 
- 1,2,3,3a,4,10-ヘキサアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-アリルオキシム
- 1,2,3,3a,4,10-ヘキサアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンオキシム
- 1,2,3,3a,4,10-ヘキサアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-デシルオキシム
- 1,2,3,3a,4,10-ヘキサアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-(2-メトキシエチル)オキシム
- 1,2,3,3a,4,10-ヘキサアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-(3-フェノキシプロピル)オキシム 
- 1-エチル-2,3,4,10,10a-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-メチルオキシム
- 3-エチル-1,2,3a,4,10-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-メチルオキシム
- 1-エチル-2,3,4,10,10a-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-エチルオキシム
- 3-エチル-1,2,3a,4,10-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-エチルオキシム
- 1-エチル-2,3,4,10,10a-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-アリルオキシム 
- 3-エチル-1,2,3a,4,10-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-アリルオキシム
- 1-エチル-2,3,4,10,10a-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-ベンジルオキシム
- 3-エチル-1,2,3a,4,10-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-ベンジルオキシム
- [1-エチル-2,3,4,10,10a-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-イリデン]フェニルアミン
- (1,2,3,3a,4,10-ヘキサアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-イリデンアミノオキシ)酢酸エチルエステル
- (1,2,3,3a,4,10-ヘキサアザシクロペンタルブルフルオレン-9-イリデンアミノオキシ)アセタートリチウム塩
あるいはそれらの薬剤として許容される塩、水和物、または水和された塩、あるいはこれらの化合物の多形結晶構造またはそれらの光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマーまたはエナンチオマー、あるいはそれらの位置異性体、幾何異性体(EおよびZ)あるいはそれらの混合物からなる群から選択される。
【００２８】
上記または下記での使用においては：
Alkは、アルキル、アルケンまたはアルキンを表す。
【００２９】
「アルキル」は、鎖中に1〜20個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖であってよい脂肪族炭化水素基を意味する。好ましいアルキル基は鎖中に1〜20個の炭素原子を有する。「分岐鎖」は、直鎖アルキル鎖に結合した1つまたは複数のメチル、エチルまたはプロピルなどの低級アルキル基を意味する。例となるアルキル基にはメチル、エチル、n-プロピル、i-プロピル、n-ブチル、t-ブチル、n-ペンチル、3-ペンチル、オクチル、ノニル、デシルが含まれる。
【００３０】
「アルケン」は、鎖中に2〜15個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖であればよい炭素-炭素二重結合を有する脂肪族炭化水素基を意味する。好ましいアルケニル基は鎖中に2〜12個の炭素原子、より好ましくは鎖中に約2〜4個の炭素原子を有する。例となるアルケニル基にはエテニル、プロペニル、n-ブテニル、i-ブテニル、3-メチルブト-2-エニル、n-ペンテニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニルが含まれる。
【００３１】
「アルコキシアルキル」は、アルキル基が本明細書中に独立に定義されるアルキル-O-アルキルを意味する。アルコキシアルキルの例は、メトキシエチルである。
【００３２】
「アルコキシカルボニルアルキル」は、アルキル基が本明細書中に独立に定義されるアルキル-O-CO-アルキル基を意味する。例となるアルコキシカルボニルアルキルは、メトキシおよびエトキシカルボニルメチルおよびカルボニルエチル基である。
【００３３】
「ハロゲン原子」は、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素の原子のことを言うものであり、好ましくはフッ素原子および塩素原子である。
【００３４】
「アリール」は、6〜14個の炭素原子、好ましくは6〜10個の炭素原子からなる芳香族単環式または多環式炭化水素環系を意味する。例となるアリール基にはフェニルまたはナフチルが含まれる。
【００３５】
「アリールアルキル」は、アリールおよびアルキル基が本明細書中に独立に定義されるアリール-アルキル基を意味する。アリールアルキル基の例は、ベンジルである。
【００３６】
「アリールオキシアルキル」は、アリールおよびアルキル基が本明細書中に独立に定義されるアリール-O-アルキル基を意味する。例となるアリールアルキル基は、フェノキシプロピルである。
【００３７】
本明細書で使用する「ヘテロ環」または「ヘテロ環状」という用語は、飽和、部分的に不飽和または不飽和の非芳香族で安定な3〜14、好ましくは5〜10員の単環、二環または多環であって環原子の少なくとも1員がヘテロ原子であるもののことを言うものである。通常、ヘテロ原子には、これらだけには限定されないが、酸素、窒素、イオウ、セレン、およびリン原子が含まれる。好ましいヘテロ原子は酸素、窒素およびイオウである。
【００３８】
適当なヘテロ環は、The Handbook of Chemistry and Physics、76th Edition、CRC Press,Inc.、1995〜1996、2-26〜2-26頁にも開示されており、その開示を参照により本明細書に組み入れる。
【００３９】
好ましい非芳香族へテロ環には、これらだけには限定されないが、ピロリジニル、ピラゾリジニル、イミダゾリジニル、オキシラニル、テトラヒドロフラニル、ジオキソラニル、テトラヒドロピラニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ピペリジル、ピペラジニル、モルホリニル、ピラニル、イミダゾリニル、ピロリニル、ピラゾリニル、チアゾリジニル、テトラヒドロチオピラニル、ジチアニル、チオモルホリニル、ジヒドロ-ピラニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロピリジル、ジヒドロピリジル、テトラヒドロピリニジニル、ジヒドロチオピラニル、アゼパニルだけでなく、フェニル基との縮合から生じる縮合系も含まれる。
【００４０】
本明細書で使用する「ヘテロアリール」または芳香族へテロ環という用語は、5〜14個、好ましくは5〜10員の芳香族へテロ単環式、二環式または多環式の環のことを言うものである。例にはピロリル、ピリジル、ピラゾリル、チエニル、ピリミジニル、ピラジニル、テトラゾリル、インドリル、キノリニル、プリニル、イミダゾリル、チエニル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、フラニル、ベンゾフラニル、1,2,4-チアジアゾリル、イソチアゾリル、トリアゾイル、テトラゾリル、イソキノリル、ベンゾチエニル、イソベンゾフリル、ピラゾリル、カルバゾリル、ベンゾイミダゾリル、イソオキサゾリル、ピリジル-N-オキシドだけでなく、フェニル基との縮合から生じる縮合系も含まれる。
【００４１】
「カルボキシアルキル」は、アルキル基が本明細書中に独立に定義されるHOOC-アルキル基を意味する。好ましい基は、カルボキシメチルおよびカルボキシエチルである。
【００４２】
「アルキル」、「シクロアルキル」、「アルケニル」、「アルキニル」、「アリール」、「ヘテロアリール」、「ヘテロ環」などは、対応する「アルキレン」、「シクロアルキレン」、「アルケニレン」、「アルキニレン」、「アリーレン」、「ヘテロアリーレン」、「ヘテロシクレン」および2つの水素原子を取り除くことによって形成される類似のもののことをも言うものである。
【００４３】
本明細書で使用する「患者」という用語は、繁殖、愛玩または保存の目的で価値のある動物などの動物、または好ましくはヒトもしくは子供であって1つまたは複数の疾患および本明細書に記載する状態に悩まされているもしくは悩まされる恐れがある者のことを言うものである。
【００４４】
本明細書で使用する「治療上有効な量」は、本明細書で記載する疾患および状態の症状を予防、軽減、除去、治療または抑制するのに有効な本発明の化合物の量のことを言うものである。「抑制すること」という用語は、本明細書で記載する疾患および状態の進行を遅くする、中断させる、阻止する、または停止させるすべての方法のことを言うものとするが、必ずしもすべての疾患および状態の症状を完全に排除することを示すものではなく、かつ予防的な処置を含むものとする。
【００４５】
本明細書で使用する「薬剤として許容される」という用語は、健全な医学的判断の範囲内でヒトの組織と接触させるのに適当であり、合理的な利益/リスク比との釣り合いを超える毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題のある合併症がない、これらの化合物、材料、賦形剤、組成物または投与形態(剤形)のことを言うものである。
【００４６】
本明細書で使用する「薬剤として許容される塩」は、親化合物がその酸塩または塩基塩を作ることによって改変されている開示された化合物の誘導体のことを言うものである。薬剤として許容される塩には、例えば無毒性の無機または有機の酸から形成された、親化合物の従来の無毒性塩または第四級アンモニウム塩が含まれる。例えば、かかる従来の無毒性塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機酸から得られたもの、および酢酸、プロピオン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、トルエンスルホン酸、シュウ酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸などの有機酸から調製された塩が含まれる。さらなる付加塩には、トロメタミン、メグルミン、エポラミンなどのアンモニウム塩、ナトリウム、カリウム、カルシウム、亜鉛またはマグネシウムなどの金属塩が含まれる。
【００４７】
本発明の薬剤として許容される塩は、塩基性または酸性部分を含有する親化合物から従来の化学的方法によって合成することができる。一般的には、かかる塩はこれらの化合物の遊離酸または遊離塩基形態を、適切な塩基または酸の化学量論量と、水中または有機溶媒中またはこれら2者の混合物中で反応させることによって調製することができる。一般的には、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水媒体が好ましい。適当な塩のリストはRemington's Pharmaceutical Sciences、17th ed.、Mack Publishing Company、Easton、PA、1985、1418頁に見出され、この開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【００４８】
幾何異性体、位置異性体および立体異性体を有する一般式(I)の化合物も本発明の一部分である。
【００４９】
他の1つの目的によれば、本発明は式(I)の化合物の調製方法にも関する。
【００５０】
本発明の化合物および方法は、当業者に周知のいくつかの方法で調製することができる。これらの化合物は、熟練者には理解されている通り、例えば下記の方法の適用もしくは適合、またはそれらの変形によって合成することができる。適切な改変および置き換えは当業者には簡単に明白かつ周知であるかまたは科学文献から直ぐに手に入れることができるはずである。
【００５１】
特に、かかる方法はR.C.Larock、Comprehensive Organic Transformations、Wiley-VCH Publishers、1999で見出すことができる。
【００５２】
本発明の化合物は、1つまたは複数の非対称に置換された炭素原子を含有することがあり、かつ光学活性体またはラセミ体で単離しうることは理解されるであろう。したがって、特定の立体化学または異性体が具体的に表示されていない限りは、すべてのキラル、ジアステレオマー、ラセミ体、異性体の構造が特に意図されている。かかる光学活性体を調製および単離する方法は、当業において周知である。例えば、立体異性体の混合物は、これらだけには限定されないが、ラセミ体の分割、順相、逆相、およびキラルクロマトグラフィー、優先的塩形成、再結晶化などによって分離することができる。立体異性体は、キラルな出発原料からまたは意図的な標的キラル中心の合成によってのいずれかのキラル合成によって合成することもできる。
【００５３】
加えて、本発明の方法は、すべて本発明によって包含されるいくつかの位置異性体に導くこともある。位置異性体は、一般的にクロマトグラフィーによって単離される。
【００５４】
本発明の化合物は様々な合成経路によって調製することができる。試薬および出発原料は市販されているか、または当業者なら周知の技法によって容易に合成することができる。すべての置換基は、別途に表示のない限り、前記で規定した通りである。
【００５５】
以後に記載する反応において、反応性官能基、例えばヒドロキシ、アミノ、イミノ、チオまたはカルボキシ基は、これらが最終生成物中に所望である場合には、これらが反応に不要の関与をしないように保護する必要がありうる。従来の保護基を標準的な実施方法によって使用することができ、例えばT.W.Greene and P.G.M.Wuts、Protective Groups in Organic Chemistry、3rd ed.、John Wiley and Sons、1999;J.F.W.McOmie、Prptective Groups in Organic Chemistry、Plenum Press、1973を参照されたい。
【００５６】
一部の反応は塩基の存在下で行うことができる。この反応で使用する塩基の性質に関しては特別な制限はなく、この種の反応において従来使用されているどの塩基でも、この分子の他の部分に対して有害な効果を有していなければ、ここで等しく使用することができる。適当な塩基の例には、水酸化ナトリウム、炭酸カリウム、トリエチルアミン、水素化ナトリウム、水素化カリウムなどのアルカリ金属水素化物、メチルリチウムおよびブチルリチウムなどのアルキルリチウム化合物、およびナトリウムメトキシドおよびナトリウムエトキシドなどのアルカリ金属アルコキシドが含まれる。
【００５７】
通常、反応は適当な溶媒中で行われる。関与する反応剤に対して有害な効果を有していなければ、様々な溶媒を使用することができる。適当な溶媒の例には、芳香族、脂肪族または脂環族炭化水素であればよい炭化水素、例えばヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエンおよびキシレンなど、ジメチルホルムアミドなどのアミド、エタノールおよびメタノールなどのアルコール、ジエチルエーテルおよびテトラヒドロフランなどのエーテルが含まれる。
【００５８】
反応は幅広い範囲の温度にわたって起こりうる。一般的には、0°C〜150°C(より好ましくはほぼ室温〜100°C)の温度で反応を行うことが好都合であることが分かっている。反応に必要な時間も多くの因子特に反応温度および反応剤の性質に依存して幅広く変わりうる。しかし、上記で概略を示した好ましい条件下で反応を行えば、通常3時間〜20時間で足りるはずである。
【００５９】
こうして調製された化合物は、従来の手段によって反応混合物から取り出すことができる。例えば、化合物は反応混合物からの溶媒の留去、あるいは、必要とあれば、溶媒を反応混合物から留去した後で、残留物を水中に注ぎ入れ、続いて水と混和しない有機溶媒による抽出および抽出液から溶媒を留去することによって取り出すことができる。加えて、生成物は、所望とあれば、さらに再結晶化、再沈殿化または様々なクロマトグラフィー技法、特にカラムクロマトグラフィーまたは実験用薄層クロマトグラフィーなどの様々な周知の技法によってさらに精製することができる。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
本発明の式(I)の化合物の調製方法は、本発明のもう1つの目的である。
【００６１】
第1の態様によれば、式(I)の本発明の化合物は、対応する式(II)および(III)
【化１９】
0005543209.tif 000020
［式中、R3、R4、R5、R6、T、U、V、W、X、Ru、Rv、Rwは、式(I)で規定された通りである］
の化合物を反応させることから得ることができる。
【００６２】
一般的に、この反応は、アルコール(好ましくはエタノール)などの有機プロトン性溶媒中において、酢酸などの酸の存在下で行う。
【００６３】
代わりにおよび/または重ねて、式(I)の化合物を、対応する式(I')
【化２０】
0005543209.tif 000021
［式中、R3、R4、R5、R6、Het1、T、U、V、W、X、Ru、Rv、Rwは、式(I)で規定された通りであり、
Ru'、Rv'、Rw'はそれぞれ、Ru、Rv、Rwに類似しているか、あるいは1つまたは複数の工程により前駆体基を所望のRu、RvまたはRw基に転換することを可能にするRu、Rv、Rwに相当する前駆体基である］
の対応する化合物より取得してよい。
【００６４】
本発明によれば、ある官能基の「前駆体基」という表現は、1つまたは複数の適当な試薬による1つまたは複数の反応によって所望の官能基となることができる任意の基のことを言うものである。これらの反応には、脱保護だけでなく、通常の付加、置換または官能化反応も含まれる。
【００６５】
式(I')の化合物は、対応する上記で開示された式(II)および(III)の化合物より取得してよい。
【００６６】
式(I)の化合物は特に、EP 05292612.8で開示された式(I')の化合物より取得してよい。
【００６７】
上記の反応は、熟練者によって、以後の実施例で例示される方法を適用または適合させることによって、行われることができる。
【００６８】
さらに、本発明の方法は、式(I)の化合物を単離する追加の段階をも含むことができる。これは熟練者によって、上記の取り出し方法などの任意の従来の方法によって、行われることができる。
【００６９】
出発物質(II)および(III)は、市販されているかまたは既知の方法もしくは実施例に記載されている方法を適用するかまたは適合させることによって得ることができる。
【００７０】
これらの合成は、多成分反応としてワンポットで行うこともできる。
【００７１】
他の1つの目的によれば、本発明は以下に規定される式(I)
【化２１】
0005543209.tif 000022
［式中、
【化２２】
0005543209.tif 000023
は、一重結合または二重結合のいずれか適切な方であり、
【化２３】
0005543209.tif 000024
は、結合がないかまたは一重結合のいずれか適切な方であり、
【化２４】
0005543209.tif 000025
は、1〜5個のヘテロ原子を含み、H、CN、=O、Hal、Alk、OAlk、OH、NRCN、C(CN)=C(OH)(OAlk)、SR、NRR'、C(O)NRR'、ヘテロ環、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される1つまたは複数の置換基によって置換されていてもよい、5から7員のへテロ環、好ましくはヘテロアリールであり、Alk、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ環はHal、NRR'、CN、OH、CF3、アリール、ヘテロアリール、OAlkによって置換されていてもよく、
【化２５】
0005543209.tif 000026
および
【化２６】
0005543209.tif 000027
は、TおよびXによって共に縮合しており、
YはN-OR1、NR'1またはCR2R'2であり、
R1は、H、アルキル、アルケニル、アルコキシアルキル、アリールオキシアルキル、アリールアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、またはカルボキシアルキルであり、
R'1は、H、アルキル、アリール、またはアラルキルであり、
R2およびR'2は、それぞれ同じであるか異なっており、H、アルキル、アリール、またはアラリキルから独立に選択され、
T、U、V、WおよびXは、同じであるか異なっており、かつC、N、OおよびSから選択されてよく、
Ru、RvおよびRwは、同じであるか異なっており、かつH、CN、=O、Hal、Alk、OAlk、OH、NRCN、C(CN)=C(OH)(OAlk)、SR、NRR'、C(O)NRR'、ヘテロ環、アリール、ヘテロアリールおよびシクロアルキルからなる群から選択されてよく、Alk、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ環およびシクロアルキルはHal、NRR'、CN、OH、CF3、アリール、ヘテロアリールまたはOAlkによって置換されていてもよく、
R3、R4、R5およびR6は、それぞれ同じであるか異なっており、かつH、OAlk、Alk、Hal、NRR'、CN、OH、OCF3、CF3、アリールおよびヘテロアリールからなる群から独立に選択され、
RおよびR'は、それぞれ同じであるか異なっており、かつHおよびAlkからなる群から独立に選択され、AlkはHal、NRR'、CN、OH、CF3、アリールまたはヘテロアリールによって置換されていてもよい］
の化合物、あるいはそれらの薬剤として許容される塩、水和物、または水和された塩、あるいはこれらの化合物の多形結晶構造またはそれらの光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマーまたはエナンチオマー、あるいはそれらの幾何異性体(EおよびZ)あるいはそれらの混合物にも関する。
【００７２】
好ましくは、X、T、U、V、Wは、CまたはNである。
【００７３】
本発明による治療上の使用のための好ましい化合物は、
- 3-メチル-1,2,3a,4,10-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-メチルオキシム
- 3-メチル-1,2,3a,4,10-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-アリルオキシム
- 1-メチル-2,3,4,10,10a-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-アリルオキシム
- 3-ブチル-1,2,3a,4,10-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-アリルオキシム
- 1-ブチル-2,3,4,10,10a-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-アリルオキシム
- 1,2,3,3a,4,10-ヘキサアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-アリルオキシム
- 1,2,3,3a,4,10-ヘキサアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンオキシム
- 1,2,3,3a,4,10-ヘキサアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-デシルオキシム 
- 1,2,3,3a,4,10-ヘキサアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-(2-メトキシエチル)オキシム
- 1,2,3,3a,4,10-ヘキサアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-(3-フェノキシプロピル)オキシム
- 1-エチル-2,3,4,10,10a-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-メチルオキシム
- 3-エチル-1,2,3a,4,10-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-メチルオキシム
- 1-エチル-2,3,4,10,10a-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-エチルオキシム 
- 3-エチル-1,2,3a,4,10-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-エチルオキシム
- 1-エチル-2,3,4,10,10a-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-アリルオキシム
- 3-エチル-1,2,3a,4,10-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-アリルオキシム
- 1-エチル-2,3,4,10,10a-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-ベンジルオキシム
- 3-エチル-1,2,3a,4,10-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-ベンジルオキシム
- [1-エチル-1,2,3a,4,10,10a-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-イリデン]フェニルアミン
- (1,2,3,3a,4,10-ヘキサアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-イリデンアミノオキシ)酢酸エチルエステル
- (1,2,3,3a,4,10-ヘキサアザシクロペンタトブルフルオレン-9-イリデンアミノオキシ)酢酸リチウム塩
あるいはそれらの薬剤として許容される塩、水和物、または水和された塩、あるいはこれらの化合物の多形結晶構造またはそれらの光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマーまたはエナンチオマー、あるいはそれらの位置異性体、幾何異性体(EおよびZ)あるいはそれらの混合物からなる群から選択される。
【００７４】
本発明による治療上の使用のための最も好ましい化合物は、
- 3-メチル-1,2,3a,4,10-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-メチルオキシム
- 3-メチル-1,2,3a,4,10-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-アリルオキシム
- 3-ブチル-1,2,3a,4,10-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-アリルオキシム
- 1,2,3,3a,4,10-ヘキサアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-アリルオキシム
- 1,2,3,3a,4,10-ヘキサアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンオキシム
- 1,2,3,3a,4,10-ヘキサアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-デシルオキシム
- 1,2,3,3a,4,10-ヘキサアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-(2-メトキシエチル)オキシム
- 1,2,3,3a,4,10-ヘキサアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-(3-フェノキシプロピル)オキシム
- 3-エチル-1,2,3a,4,10-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-メチルオキシム
- 3-エチル-1,2,3a,4,10-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-エチルオキシム
- 3-エチル-1,2,3a,4,10-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-アリルオキシム
- (1,2,3,3a,4,10-ヘキサアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-イリデンアミノオキシ)酢酸エチルエステル
- (1,2,3,3a,4,10-ヘキサアザシクロペンタトブルフルオレン-9-イリデンアミノオキシ)酢酸リチウム塩
あるいはそれらの薬剤として許容される塩、水和物、または水和された塩、あるいはこれらの化合物の多形結晶構造またはそれらの光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマーまたはエナンチオマー、あるいはそれらの位置異性体、幾何異性体(EおよびZ)あるいはそれらの混合物からなる群から選択される。
【００７５】
さらに他の1つの目的によれば、本発明は、上記で薬剤組成物に関して規定された式(I)の化合物の、システインプロテアーゼを阻害する薬剤の調製のための使用に関する。
【００７６】
本発明の化合物は、システインプロテアーゼ、特に脱ユビキチン化酵素(USPおよびUCHなど)、カスパーゼ、カテプシン(特にカテプシンB、D、K、Sなど)、カルパインだけでなく、ウイルス、細菌、または寄生虫のシステインプロテアーゼをも、それを必要としている患者において阻害するのに有用である。
【００７７】
本発明の化合物は、癌および転移、より詳しくは前立腺癌および/または結腸癌、アルツハイマー病およびパーキンソン病などの神経変性疾患、難聴、老化に付随する障害、炎症性障害、関節炎、骨粗鬆症、肝炎、肝不全、心虚血および心不全、脳卒中、アテローム性動脈硬化、腎不全、糖尿病、白内障;単純ヘルペスウイルス1、エプスタインバーウイルス、SARSコロナウイルス、ライノウイルス、ポリオウイルス、A型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、アデノウイルスなどによる急性または潜伏性ウイルス感染症;連鎖球菌属(Streptococcus sp.)、ブドウ球菌属(Staphylococcus sp.)、クロストリジウム属(Clostidium sp.)、アスペルギルス属(Aspergillus sp.)などに属する病原体による細菌感染症または真菌感染症;トリパノゾーマ属(Trypanosoma sp.)、プラスモジウム属(Plasmodium sp.)、リーシュマニア属(Leishmania sp.)、トリコモナス属(Trichomonas sp.)、エントアメーバ属(Entamoeba sp.)、ジアルジア属(Giardia sp.)、トキソプラズマ属(Toxoplasma sp.)、クリプトスポリジウム属(Cryptosporidium sp.)などに属する種による原虫感染症、ファッシオラ属(Fasciola sp.)、住血球虫属(Schistosoma sp.)、オンコセルカ属(Onchocerca sp.)、回虫属(Ascaris sp.)、条虫属(Taenia sp.)、線虫属(Caenorhabitis sp.)、トキソカラ属(Toxocara sp.)、捻転胃虫属(Haemonchus sp.)、鉤虫属(Ancylostoma sp.)、鞭虫属(Trichuris sp.)、旋毛虫属(Trichinella sp.)、ストロンギロイデス属(Strongyloides sp.)、ブルギア属(Brugia sp.)などに属する種による平中または回虫感染症;ならびに免疫障害、免疫調節障害または抗原提示障害を治療および/または予防するために特に有用である。
【００７８】
本発明はまた、本発明の化合物を、薬剤として許容される担体または賦形剤と一緒に、これを必要としている患者に投与することを含む、対応する治療の方法にも関する。
【００７９】
本明細書に記載する疾患および症状の治療を必要としている対象者の識別は、十分に当業の熟練者の能力および知識の範囲内である。当業に熟練した獣医師または医師は、臨床試験、理学的検査、病歴/家族暦または生物学的試験および診断試験によって、かかる治療を必要としている対象者を容易に特定することができる。
【００８０】
治療上有効な量は、当業の熟練者として立会いの診断医によって従来の技法を使用し、かつ類似の状況下で得られた結果を参照して容易に決定することができる。治療上有効な量の決定においては、これらだけには限定されないが、対象者の種、大きさ、年齢、一般的な健康状態;関与する具体的な疾患;疾患の関与の程度または重篤性;個々の対象者の応答;投与される具体的な化合物;投与の方式;投与される製剤の生体利用率;選択された投与計画;併用薬剤の使用;他の関連状況を含むいくつかの因子が立会いの診断医によって考慮される。
【００８１】
所望の生物学的効果を達成するために必要とされる式(I)の化合物の量は、使用する化合物の化学的特徴(例えば疎水性)、化合物の効力、疾患の種類、患者が属する種、患者の病的状態、投与の経路、選択された経路による化合物の生体利用効率、所要投与量を決定するすべての因子、送達および投与計画を含む、多くの因子に応じて変化する。
【００８２】
「薬剤として」または「薬剤として許容される」は、動物またはヒトに対して適切に投与された場合に、有害な、アレルギー性のまたは他の望ましくない反応を起こさない分子および組成物のことを言うものである。
【００８３】
本明細書で使用する「薬剤として許容される賦形剤」には、いかなる担体、希釈剤、補助剤、または媒体、保存料もしくは酸化防止剤、充填剤、崩壊剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤、殺カビ剤、等圧剤および吸収遅延剤なども含まれる。かかる媒体および剤の薬剤有効物質に対する使用は、当業において周知である。何らかの従来の媒体または剤が有効成分と共存し得ない場合を除き、治療用組成物におけるその使用は想定される。補助的な有効成分も、適当な治療用の組合せとして組成物中に組み込むことができる。
【００８４】
本発明の場合は、「処置(治療)すること」または「処置(治療)」という用語は、かかる用語が当てはまる障害もしくは状態、またはかかる障害もしくは状態の1つまたは複数の症状を、反転させること、緩和させること、進行を阻止すること、または予防することを意味する。
【００８５】
「治療上有効な量」は、発病に関与する活性なシステインプロテアーゼの阻害を必要とする病的状態を予防または治療するのに有効な、本発明による化合物/薬剤の量を意味する。
【００８６】
本発明によれば、「患者」または「それを必要とする患者」は、発病において活性なシステインプロテアーゼが関与する病的状態に影響されているまたは影響されそうな動物またはヒトが意図されている。好ましくは、患者はヒトである。
【００８７】
一般的に言えば、本発明の化合物は、非経口投与用には0.1%w/v〜10%w/vの化合物を含有する生理緩衝水溶液中で提供することができる。通常の投与範囲は1日当り1μg/kg体重〜0.1g/kg体重であり、好ましい投与範囲は1日当り0.01mg/kg体重〜10mg/kg体重またはヒトの子供においても等価な投与量である。投与される薬剤の好ましい投与量は、疾患または障害の種類および進行の程度、特定の患者の全身的な健康状態、選択された化合物の相対的な生物学的効率、化合物の製剤法、投与の経路(静脈内、筋肉内など)、選択された送達経路による化合物の薬物速度論的特性、および投与の速度(ボーラス注入または連続注入)およびスケジュール(所与の期間の繰り返し回数)などの変数に依存すると考えられる。
【００８８】
本発明の化合物は、単位投与形態で投与することができ、ここで「単位投与」という用語は患者に投与することができる単一の投与を意味し、これは楽に取り扱うことができて包装されており、上記の有効成分をそれ自体または薬剤として許容される組成物としてのいずれかで含む物理的および化学的に安定な単位投与量として持続する。そういう形態で、通常の1日の全投与量の範囲は、0.01mg/kg〜100mg/kg体重である。一般的な指針としては、ヒトに対する投与量は、1日当り1mg〜3000mgの範囲である。好ましくは、単位投与量の範囲は1mg〜500mgであり、1日1回〜6回投与するが、より好ましくは10mg〜500mgを1日1回である。本明細書で提供される化合物は、1つまたは複数の薬剤として許容される賦形剤と混合することによって薬剤組成物として製剤することができる。かかる単位投与組成物は、経口投与による、特に錠剤、単純カプセルまたはソフトゲルカプセルの形態での;または鼻腔内での、特に粉末、点鼻剤、またはエアロゾルの形態での使用;皮膚への、例えば、局所的に軟膏、クリーム、ローション、ゲルもしくはスプレーでの使用、または経皮パッチによる使用のために調製することができる。
【００８９】
組成物は、好都合には単位投与形態で投与することができ、製薬技術分野で周知の任意の方法によって調製することができ、例えばRemington:The Science and Practice of Pharmacy、20th ed.;Gennaro,A.R.、Ed.;Lippincott Williams & Wilkins;Philadelphia、PA、2000に記載されている通りである。
【００９０】
好ましい製剤は、本発明の化合物が経口または非経口投与のために製剤されている薬剤組成物である。
【００９１】
経口投与のためには、錠剤、丸薬、粉末、カプセル、トローチなどは、以下の成分、または類似の性質の化合物のいずれかの1つまたは複数を含有することができる:微結晶セルロース、もしくはトラガカントガムなどの結合剤;デンプンもしくは乳糖などの希釈剤;デンプンおよびセルロース誘導体などの崩壊剤;ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤;コロイド状二酸化ケイ素などの流動化剤;ショ糖もしくはサッカリンなどの甘味料;またはペパーミント、もしくはサリチル酸メチルなどの香味料。カプセルは、一般的に任意選択で可塑剤とブレンドされたゼラチンブレンドから作られるハードカプセルまたはソフトカプセルおよびデンプンカプセルの形態でよい。加えて、単位投与形態は投与単位の物理的形態を改変する様々な他の材料、例えば、糖類のコーティング、シェラック、または腸溶性剤を含有することができる。他の経口投与形態シロップまたはエリキシルは、甘味料、保存料、色素、着色料、および香味料を含有することができる。加えて、活性化合物は、急速溶解、改良放出、または持続放出調製物および製剤中に組み入れることができ、かかる持続放出製剤は好ましくは2つの放出モードを有する。好ましい錠剤は、乳糖、コーンスターチ、ケイ酸マグネシウム、クロスカメロースナトリウム、ポビドン、ステアリン酸マグネシウム、またはタルクを任意の組合せで含有している。
【００９２】
非経口投与用の液体調製物は、無菌の水性または非水性溶液、懸濁液、およびエマルジョンを含む。液体組成物は、結合剤、緩衝剤、保存料、キレート化剤、甘味料、香味料および着色料などを含むことができる。非水溶媒には、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、およびオレイン酸エチルなどの有機エステルが含まれる。水性担体には、アルコールと水の混合物、緩衝媒体、および生理食塩水が含まれる。特に、生体適合性、生物分解性のラクチドポリマー、ラクチド/グリコリドコポリマー、またはポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンコポリマーが、活性化合物の放出を制御するのに有用な賦形剤でありうる。静脈内ビヒクルには、流体および栄養素補給液、電解質補給液、例えばリンゲルデキストロースに基づくものなどが含まれうる。これらの活性化合物のための他の有用でありうる非経口送達システムには、エチレン-酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、インプラント可能な注入システム、およびリポソームが含まれる。
【００９３】
代わりの投与モードは、乾燥粉末、エアロゾル、または点滴剤などの手段を含む、吸入用の製剤を含む。これらは、例えばポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル、グリココレートおよびデオキシコレートを含有する水溶液、または点鼻剤の形態で投与するための油性溶液、または鼻腔内に塗布するゲルでよい。口腔投与用の製剤は、例えばキャンデーまたはトローチを含み、かつショ糖またはアカシアなどの香味付きの基剤およびグリココレートなどの他の賦形剤も含むことができる。直腸内投与用の製剤は、好ましくは単位投与量の座薬として提供され、ココアバターなどの固形担体を有し、かつサリシレートを含んでもよい。皮膚への局所的塗布用製剤は、好ましくは軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル、またはオイルの形態をとる。使用することができる担体には、石油ゼリー、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、またはこれらの組合せが含まれる。経皮投与用に適当な製剤は、個別のパッチとして提供することができ、かつポリマーまたは接着剤中に溶解および/または分散された親油性エマルジョンまたは緩衝された水溶液であればよい。
【実施例】
【００９４】
本発明は、以下の実施例の記載によってさらに例示されるが、限定はされない。
【００９５】
代表的な本発明の化合物を下の表にまとめてある。
【表１−１】
0005543209.tif 000028
【表１−２】
0005543209.tif 000029
【表１−３】
0005543209.tif 000030
【表１−４】
0005543209.tif 000031
【００９６】
（実験）
代表的な本発明の化合物は、以下の手順によって合成することができる。
【００９７】
（一般的手順A:ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オン）
【化２７】
0005543209.tif 000032
R1置換(1,2,4)-トリアゾール-3,4-ジアミン(8.8mmol)およびニンヒドリン(1.57g、8.8mmol)のEtOH(10ml)およびAcOH(1.5ml)中混合物を2〜16時間還流させた。減圧下で溶媒を除去し、残留物をEtOAc中に溶解させて飽和K2CO3および食塩水で洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥し、ろ過して溶媒を減圧下で蒸発させて除去した。粗製物を次の通りに精製した:位置異性体混合物の精製のためのシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー(トルエン/MeOH 95:5〜8:2またはCH2Cl2/EtOAc 9:1〜1:1)、次いで位置異性体の分離のための中性アルミナ(等級II)フラッシュクロマトグラフィー(CH2Cl2/EtOAc 7:3〜CH2Cl2/MeOH 1:1+5%HCOOHまたはAcOH)。
【００９８】
＜1-メチル-2,3,4,10,10a-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オン(1b/A)＞
一般的手順Aによって黄色固体として収率13%で調製した。
1H NMR(300MHz,DMSO d6):δ8.23(d,1H)、8.02(m,2H)、7.89(ddd,1H)、2.72(s,3H)。ESI+MS:C12H7N5Oの計算値:237.22;実測値:238.2(MH+)。
【００９９】
（一般的手順B:ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンの合成）
【化２８】
0005543209.tif 000033
ジアミノトリアゾールの調製はEur.J.Med.Chem.-Chim.Ther.、1986、21、235頁で報告されている手順に従う。
【０１００】
ジアミノグアニジンヒドロクロリド(1g、8mmol)の過剰量(10g)の適切なカルボン酸中混合物を攪拌し、120〜130°Cで12〜24時間加熱した。溶液を室温まで冷却し、37%HCl(10ml)を加えた。混合物を2〜3時間還流させ、次いで乾燥するまで真空下で濃縮した。得られた粗製物をEt2Oで洗浄し(3回)、それ以上の精製はせずに使用した。
【０１０１】
粗製ジアミノトリアゾールおよびニンヒドリンの間の縮合については一般的手順Aを参照されたい。
【０１０２】
＜1-ブチル-2,3,4,10,10a-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オン(1f/A)＞
一般的手順Bによって黄色の固体として収率6%で調製した。
1H NMR (300 MHz, DMSO d6): δ 8.23 (d, 1 H), 8.02 (m, 2H), 7.89 (ddd, 1 H), 3.10 (dd, 2H), 1.81 (m, 2H), 1.42 (m, 2H), 0.94 (t, 3H). ESI+MS: C15H13N5Oの計算値: 279.30; 実測値: 280.2 (MH+)。
【０１０３】
＜3-ブチル-1,2,3a,4,10-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オン(1f/B)＞
一般的手順Bによって黄色の固体として収率10%で調製した。1H NMR (300 MHz, DMSO d6): δ 8.16 (d, 1 H), 7.99 (m, 2H), 7.85 (dd, 1 H), 3.16 (dd, 2H), 1.87 (m, 2H), 1.44 (m, 2H), 0.96 (t, 3H). ESI+MS: C15H13N5Oの計算値: 279.30; 実測値: 280.3 (MH+)。
【０１０４】
＜1-エチル-2,3,4,10,10a-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オン(1g/A)＞
一般的手順Bによって黄色の固体として収率48%で調製した。1H NMR(300MHz,CDCl3): δ8.21(d,1H)、8.00(d,1H)、7.90(ddd,1H)、7.77(ddd,1H)、3.21(q,2H)、1.49(t,3H)。ESI+MS:C13H9N5Oの計算値:251.25;実測値:252.1(MH+)。
【０１０５】
＜3-エチル-1,2,3a,4,10-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オン(1g/B)＞
一般的手順Bによって黄色の固体として収率32%で調製した。1H NMR(300MHz,CDCl3): δ8.12(d,1H)、8.02(d,1H)、7.88(ddd,1H)、7.75(ddd,1H)、3.25(q,2H)、1.53(t,3H)。ESI+MS:C13H9N5Oの計算値:251.25;実測値:252.1(MH+)。
【０１０６】
（一般的手順E:ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンのO-アルキルオキシム誘導体の合成）
【化２９】
0005543209.tif 000034
ピリジン中(10 ml)の1(1 mmol)、O-アルキルヒドロキシルアミン塩酸塩(3 mmol)および分子ふるいの懸濁液を、2〜12時間の間60°Cに加熱した。不溶性残渣を濾過し、溶媒を気化し、粗製物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー(CH2Cl2/アセトン 85:15またはトルエン/MeOH 9:1または石油スピリット/EtOAc 1:1)により精製した。
【０１０７】
＜3-メチル-1,2,3a,4,10-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-メチルオキシム (5a)＞
1b/Bから一般的手順Eによって黄色の固体として収率55%で2:1 E/Z混合物として調製した。1H NMR (300 MHz, DMSO d6) (異性体の混合物): δ 8.43 (m, 1H), 8.16 (m, 1H), 7.81 (m, 2H), 4.34 (s, 3H), 2.75 (s, 3H). 8.05 (m, 1H), 7.92 (m, 1 H), 7.72 (m, 2H), 4.30 (s, 3H), 2.75 (s, 3H). ESI+MS: C13H10N6Oの計算値: 266.26; 実測値: 267.1 (MH+)
【０１０８】
＜3-メチル-1,2,3a,4,10-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-アリルオキシム (5b)＞
1b/Bから一般的手順Eによって黄色の固体として収率65%で1:1 E/Z混合物として調製した。1H NMR (300 MHz, CDCl3) (異性体の混合物): δ 8.02 (d, 1 H), 7.95 (d, 1 H), 7.75-7.56 (m, 2H), 6.26-6.08 (m, 1 H), 5.50 (dd, 1 H), 5.35 (d, 1 H), 5.05 (d, 2H), 2.86 (s, 3H). 8.49 (m, 1 H), 8.13 (m, 1 H), 7.77-7.56 (m, 2H), 6.26-6.08 (m, 1 H), 5.50 (dd, 1 H)1 5.39 (d, 1 H), 5.12 (d, 2H), 2.86 (s, 3H). ESI+MS: C15H12N6Oの計算値: 292.30; 実測値: 293.1 (MH+)
【０１０９】
＜1-メチル-2, 3, 4,10,10a-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-アリルオキシム (5c)＞
1b/Bから一般的手順Eによって黄色の固体として収率76%で7:3 E/Z混合物として調製した。1H NMR (300 MHz, CDCl3) (異性体の混合物): δ 8.16 (m, 1 H), 7.95 (m, 1 H), 7.77-7.60 (m, 2H), 6.26-6.08 (m, 1 H), 5.54 (ddt, 1 H), 5.37 (ddt, 1 H), 5.04 (ddd, 2H), 2.84 (s, 3H). 8.49 (m, 1 H), 8.26 (m, 1 H), 7.77-7.60 (m, 2H), 6.26-6.08 (m, 1 H), 5.49 (ddt, 1 H), 5.40 (ddt, 1 H), 5.09 (ddd, 2H), 2.88 (s, 3H). ESI+MS: C15H12N6Oの計算値: 292.30; 実測値: 293.1 (MH+)
【０１１０】
＜3-ブチル-1,2,3a,4,10-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-アリルオキシム (5d)＞
1b/Bから一般的手順Eによって黄色の固体として収率93%で6:4 E/Z混合物として調製した。1H NMR (300 MHz, CDCl3) (異性体の混合物): δ 8.42 (m, 1 H), 8.06 (m, 1 H), 7.64 (m, 2H), 6.19-6.00 (m, 1 H), 5.41 (m, 1 H), 5.31 (m, 1 H), 5.03 (ddd, 2H), 3.17 (dd, 2H), 1.88 (m, 2H), 1.43 (m, 2H), 0.93 (t, 3H). 7.96 (m, 1 H), 7.87 (m, 1 H), 7.55 (m, 2H), 6.19-6.00 (m, 1 H), 5.41 (m, 1 H), 5.26 (m, 1 H), 4.97 (ddd, 2H), 3.17 (dd, 2H), 1.88 (m, 2H), 1.43 (m, 2H), 0.93 (t, 3H). ESI+MS: C18H18N6Oの計算値: 334.38; 実測値: 335.1 (MH+)
【０１１１】
＜1-ブチル-2,3,4,10,10a-ペンタアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-アリルオキシム (5e)＞
1b/Bから一般的手順Eによって黄色の固体として収率95%で1:1 E/Z混合物として調製した。1H NMR (300 MHz, CDCl3) (異性体の混合物): δ 8.45 (m, 1 H), 8.22 (m, 1 H), 7.69 (m, 2H), 6.22-6.02 (m, 1 H), 5.45 (m, 1 H), 5.35 (m, 1 H), 5.05 (ddd, 2H), 3.21 (dd, 2H), 1.91 (m, 2H), 1.45 (m, 2H), 0.95 (t, 3H). 8.12 (m, 1 H), 7.91 (m, 1 H)1 7.62 (m, 2H), 6.22-6.02 (m, 1 H)1 5.49 (m, 1 H), 5.32 (m, 1 H)1 4.99 (ddd, 2H)1 3.18 (dd, 2H), 1.91 (m, 2H)1 1.45 (m, 2H), 0.95 (t, 3H). ESI+MS: C18H18N6Oの計算値: 334.38; 実測値: 335.2 (MH+)
【０１１２】
（1,2,3,3a,4,10-ヘキサアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンO-アリルオキシムおよび/またはそれに相当する位置異性テトラゾール(6)の合成）
【化３０】
0005543209.tif 000035
化合物を、（ニンヒドリンおよびテトラゾール-1,5-ジアミンから調製された）1,2,3,3a,4,10-ヘキサアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンの6:4位置異性混合物から一般的手順EによってE/Zおよび位置異性混合物の黄色の固体として収率89%で調製した。1H NMR (300 MHz, CDCl3) (異性体の混合物): δ 8.47 (m, 1 H), 8.22 (m, 1 H), 7.84-7.58 (m, 2H), 6.23-6.03 (m, 1H), 5.46 (m, 1 H), 5.37 (m, 1 H), 5.13 (ddd, 2H). 8.19 (m, 1 H), 7,98 (m, 1 H), 7.84-7.58 (m, 2H), 6.23- 10 6.03 (m, 1 H), 5.46 (m, 1 H), 5.34 (m, 1 H), 5.06 (m, 2H). ESI+MS: C10H9N7Oの計算値: 279.26; 実測値: 280.2 (MH+)
【０１１３】
（1,2,3,3a,4,10-ヘキサアザシクロペンタルブルフルオレン-9-オンオキシムおよび/またはそれに相当する位置異性テトラゾール(7)の合成）
【化３１】
0005543209.tif 000036
化合物を、（ニンヒドリンおよびテトラゾール-1,5-ジアミンから調製された）1,2,3,3a,4,10-ヘキサアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンの6:4位置異性混合物から一般的手順EによってE/Zおよび位置異性混合物の黄色の固体として収率44%で調製した。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) (異性体の混合物): 20 δ 13.87 (bs, 1 H), 8.59 (m, 1 H), 8.14 (m, 1 H), 7.78-7.52 (m, 2H). 13.69 (bs, 1 H), 8.05 (d, 1 H), 7.91 (d, 1H), 7.78-7.52 (m, 2H). ESI+MS: C10H5N7Oの計算値: 239.20; 実測値: 240.1 (MH+)
【０１１４】
（一般的手順F:ヘキサアザシクロペンタ[b]フルオレン-9-オンのO-アルキルオキシムの合成）
【化３２】
0005543209.tif 000037
DMF (2 ml)中の7 (48 mg, 0.20 mmol)、臭化アルキル(0.6 mmol)およびK2CO3 (55 mg, 0.4 mmol)の混合物を室温で16時間撹拌し、その後減圧下で溶媒を気化した。粗生成物をのシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー(MeOHまたは石油エーテルとの変動する混合物中のCH2Cl2)により精製した。
【０１１５】
（1,2,3,3a,4,10-ヘキサアザ-シクロペンタ[b]フルオレン-9-オン O-デシル-オキシムおよび/またはそれに相当する位置異性テトラゾール(8a)の合成）
一般的手順Fによって黄緑色の固体として収率53%でE/Zおよび位置異性体混合物として調製した。1H NMR (300 MHz, CDCl3) (異性体の混合物): δ 8.39 (m, 1 H), 8.24 and 8.15 (m, 1H), 7.78-7.63 (m, 2H), 4.61-4.47 (m, 2H), 1.82 (m, 2H), 1.47-1.06 (m, 14H), 0.75 (m, 3H). ESI+MS: C20H25N7Oの計算値: 379.47; 実測値: 380.2 (MH+).
【０１１６】
（1,2,3, 3a, 4,10-ヘキサアザ-シクロペンタ[b]フルオレン-9-オン O-(2-メトキシ-エチル)-オキシムおよび/またはそれに相当する位置異性テトラゾール(8b)の合成）
一般的手順Fによって薄茶色の固体として収率29%でE/Zおよび位置異性体混合物として調製した。1H NMR (300 MHz, DMSO d6) (異性体の混合物): δ 8.49 (m, 1 H), 8.27 (m, 1 H), 7.83-7.66 (m, 2H), 4.73 (m, 2H), 3.82 (m, 2H), 3.40 (s, 3H). 8.49 (m, 1 H), 8.19 (m, 1 H), 7.83-7.66 (m, 2H), 4.73 (m, 2H), 3.82 (m, 2H), 3.41 (s, 3H). ESI+MS: C13H11N7O2の計算値: 297.28; 実測値: 298.0 (MH+).
【０１１７】
（1,2,3,3a,4,10-ヘキサアザ-シクロペンタ[b]フルオレン-9-オン O-(3-フェノキシ-プロピル)-オキシムおよび/またはそれに相当する位置異性テトラゾール(8c)の合成）
一般的手順Fによって黄緑色の固体として収率42%でE/Zおよび位置異性体混合物として調製した。1H NMR (300 MHz, CDCl3) (異性体の混合物): δ 8.41 (m, 1 H), 8.15 (m, 1 H), 7.76-7.58 (m, 2H), 7.18 (m, 2H), 6.83 (m, 3H), 4.87-4.70 (m, 2H), 4.18-4.07 (m, 2H), 2.42-2.27 (m, 2H). 8.26 (m, 1 H), 7.89 (d, I H), 7.76-7.58 (m, 2H), 7.18 (m, 2H), 6.83 (m, 3H), 4.87-4.70 (m, 2H), 4.18-4.07 (m, 2H), 2.42- 2.27 (m, 2H). ESI+MS: C19H15N7O2の計算値: 373.38; 実測値: 374.1 (MH+).
【０１１８】
（一般的手順K:エチル ペンタアザ- シクロペンタ[b]フルオレン-9-オンのO-アルキルオキシムの合成）
【化３３】
0005543209.tif 000038
ピリジン中(10 ml)の1g/Aまたは1g/B (1 mmol)、O-アルキルヒドロキシルアミン塩酸塩(2 mmol)および分子ふるいの懸濁液を、2〜3時間の間60°Cに加熱した。不溶性残渣を濾過し、溶媒を気化し、粗製物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。
【０１１９】
＜1-エチル-2,3,4,10,10a-ペンタアザ-シクロペンタ[b]フルオレン-9-オン O-メチル-オキシム (10a)＞
1-Ethyl-2,3,4,10,10a-pentaaza-cyclopenta[b]fluoren-9-one O-methyl-oxime (10a) 
1g/Aから一般的手順K(溶離剤: CH2Cl2/EtOAc/MeOH 80:17:3)によって黄色の固体として一定量の収率で7:3 E/Z混合物として調製した。1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.47 (m, 1 H), 8.27 (m, 1 H), 7.73 (m, 1 H), 7.66 (m, 1 H), 4.41 (s, 3H), 3.28 (q, 2H), 1.55 (t, 3H) and 8.17 (m, 1 H), 7,96 (m, 1 H), 7.73 (m, 1 H), 7.63 (m, 1 H), 4.37 (s, 3H), 3.25 (q, 2H), 1.55 (t, 3H). ESI+MS: C14H12N6Oの計算値: 280.29; 実測値: 281.1 (MH+).
【０１２０】
＜3-エチル-1,2,3a,4,10-ペンタアザ-シクロペンタ[b]フルオレン-9-オン O-メチル-オキシム (10b)＞
1g/Bから一般的手順K(溶離剤: CH2Cl2/EtOAc/MeOH 80:17:3)によって黄色の固体として一定量の収率で7:3 E/Z混合物として調製した。1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.50 (m, 1 H), 8.17 (m, 1 H), 7.63 (m, 2H), 4.45 (s, 3H), 3.30 (q, 2H), 1.57 (t, 3H) and 8.07 (d, 1 H), 7.98 (d, 1 H), 7.68 (ddd, 1 H), 7.64 (ddd, 1 H), 4.41 (s, 3H)1 3.29 (q, 2H), 1.59 (t, 3H). ESI+MS: C14H12N6Oの計算値: 280.29; 実測値: 281.1 (MH+).
【０１２１】
＜1-エチル-2,3,4,10,10a-ペンタアザ-シクロペンタ[b]フルオレン-9-オン O-エチル-オキシム (10c)＞
1g/Aから一般的手順K(溶離剤: CH2Cl2/EtOAc/MeOH 70:25:5)によって黄色の固体として一定量の収率で6:4 E/Z混合物として調製した。1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.17 (m, 1 H), 7.96 (m, 1 H), 7.73 (m, 1 H), 7.65 (ddd, 1 H), 4.60 (q, 2H), 3.26 (q, 2H), 1.55 (t, 3H), 1.55 (t, 3H) and 8.47 (m, 1 H), 8.27 (m, 1 H); 7.72 (m, 1 H), 7.63 (ddd, 1H), 4.66 (q, 2H), 3.30 (q, 2H), 1.54 (t, 3H), 1.51 (t, 3H). ESI+MS: C15H14N6Oの計算値: 294.32; 実測値: 295.1 (MH+).
【０１２２】
＜3-エチル- 1,2, 3a, 4,10-ペンタアザ-シクロペンタ[b]フルオレン-9-オン O-エチル-オキシム (10d)＞
1g/Bから一般的手順K(溶離剤: CH2Cl2/EtOAc/MeOH 70:25:5)によって黄色の固体として一定量の収率で1:1 E/Z混合物として調製した。1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.49 (m, 1 H), 8.13 (m, 1 H), 7.70 (m, 1 H), 7.62 (m, 1 H), 4.69 (q, 2H), 3.27 (q, 2H), 1.58-1.48 (m, 6H), and 8.03 (m, 1 H), 7,96 (m, 1 H), 7.70 (m, 1 H), 7.62 (m, 1 H), 4.62 (q, 2H), 3.27 (q, 2H), 1.58-1.48 (m, 6H). ESI+MS: C15H14N6Oの計算値: 294.32; 実測値: 295.1 (MH+).
【０１２３】
＜1-エチル-2,3,4,10,10a-ペンタアザ-シクロペンタ[b]フルオレン-9-オン O-アリル-オキシム (10e)＞
1g/Aから一般的手順K(溶離剤: CH2Cl2/EtOAc/MeOH 80:16:4)によって黄色の固体として一定量の収率で6:4 E/Z混合物として調製した。1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.17 (d, 1 H), 7.95 (d, 1 H), 7.65 (m, 2H), 6.26-6.07 (m, 1 H), 5.54 (m, 1 H), 5,37 (m, 1 H), 5.04 (ddd, 2H), 3.26 (m, 2H), 1.54 (m, 3H) and 8.49 (d, 1 H), 8,27 (d, 1 H), 7.73 (m, 2H), 6.26-6.07 (m, 1 H), 5.49 (m, 1 H), 5,40 (m, 1H), 5.09 (ddd, 2H)1 3.26 (m, 2H), 1.54 (m, 3H). ESI+MS: C16H14N6Oの計算値: 306.33; 実測値: 307.1 (MH+).
【０１２４】
＜3-エチル-1,2,3a,4,10-ペンタアザ-シクロペンタ[b]フルオレン-9-オン O-アリル-オキシム (10f)＞
1g/Bから一般的手順K(溶離剤: CH2Cl2/EtOAc/MeOH 80:17:3)によって黄色の固体として収率96%で65:35 E/Z混合物として調製した。1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.50 (m, 1 H), 8.14 (m, 1H), 7.71 (m, 1 H), 7.65 (m, 1 H), 6.26- 6.09 (m, 1 H), 5.53 (m, 1 H), 5.39 (m, 1 H), 5.12 (ddd, 2H), 3.27 (q, 2H), 1.55 (t, 3H) and 8.04 (m, 1 H), 7.95 (m, 1 H), 7.71 (m, 1 H), 7.61 (m, 1 H)1 6.26-6.09 (m, 1 H), 5.47 (m, 1 H), 5.36 (m, 1 H), 5.106 (ddd, 2H), 3.27 (q, 2H), 1.56 (t, 3H). ESI+MS: C16H14N6Oの計算値: 306.33; 実測値: 307.2 (MH+).
【０１２５】
＜1-エチル-2,3,4,10,10a-ペンタアザ-シクロペンタ[b]フルオレン-9-オン O-ベンジル-オキシム (10g)＞
1g/Aから一般的手順K(溶離剤: CH2Cl2/EtOAc/MeOH 80:17:3)によって黄色の固体として収率86%で65:35 E/Z混合物として調製した。1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.16 (m, 1 H), 7.96 (m, 1 H), 7.70 (m, 1 H), 7.65 (m, 1 H), 7.52 (m, 2H), 7.41 (m, 3H)1 5.58 (s, 2H), 3.21 (q, 2H), 1.49 (t, 3H) and 8.43 (m, 1 H), 8,26 (m, 1 H)1 7.70 (m, 1 H), 7.65 (m, 1 H), 7.52 (m, 2H), 7.41 (m, 3H), H), 5.62 (s, 2H), 3.29 (q, 2H), 1.56 (t, 3H). ESI+MS: C20H16N6Oの計算値: 356.39; 実測値: 357.1 (MH+).
【０１２６】
＜3-エチル-1,2,3a,4,10-ペンタアザ-シクロペンタ[b]フルオレン-9-オン O-ベンジル-オキシム (10h)＞
1g/Bから一般的手順K(溶離剤: CH2Cl2/EtOAc/MeOH 80:17:3)によって黄色の固体として収率99%で6:4 E/Z混合物として調製した。1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.44 (m, 1 H), 8,13 (m, 1H), 7.67 (m, 1 H), 7.61 (m, 1 H), 7.52 (m, 2H), 7.46-7.29 (m, 3H), 5.64 (s, 2H)1 3.62 (q, 2H), 1.55 (t, 3H) and 8.01 (m, 1H), 7,92 (m, 1 H), 7.70 (m, 1 H), 7.65 (m, 1 H)1 7.52 (m, 2H), 7.41 (m, 3H), 5,59 (s, 2H), 3.29 (q, 2H), 1.56 (t, 3H). ESI+MS: C20H16N6Oの計算値: 356.39; 実測値: 357.1 (MH+). 
【０１２７】
（[1-エチル-2, 3,4,10,10a-ペンタアザ-シクロペンタ[b]フルオレン-9-イリデン]- フェニル-アミンおよび/またはそれに相当する位置異性テトラゾール(11)の合成）
【化３４】
0005543209.tif 000039
トルエン(4 ml)中の1g/A (200 mg, 0.79 mmol)、および分子ふるいの懸濁液に、アニリン(72 μl, 0.79 mmol)を添加した。混合物を130°Cで4時間撹拌し、その後溶媒を気化し、粗生成物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー (CH2Cl2/EtOAc/MeOH 80:18:2)により精製し、ジアステレオ異性体比1 :1でオレンジ色の固体として11 (231 mg, 90%)を取得した。1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.28 (d, 1 H), 7.70 (ddd, 1 H), 7.56-7.26 (m, 6H)1 6.91 (d, 1 H), 3.34 (q, 2H), 1.58 (t, 3H) and 8.22 (m, 2H), 7.81 (m, 2H), 7.47 (m, 1 H), 7.07 (m, 4H), 2.80 (q, 2H), 1.21 (t, 3H). ESI+MS: C19H14N6の計算値: 326.36; 実測値: 327.2 (MH+).
【０１２８】
（1,2,3,3a,4,10-ヘキサアザ-シクロペンタ[b]フルオレン-9-イリデンアミノオキシ)-酢酸 エチル エステルおよび/またはそれに相当する位置異性テトラゾール(12)の合成）
【化３５】
0005543209.tif 000040
オキシム7 (560mg, 2.34 mmol)およびセシウムカーボネート(1.54 g, 4.68 mmol)の混合物をDMF(12 ml)中で5分撹拌した。エチルブロモアセテート(1.2 g, 7.02 mmol)を一滴ずつ添加し、添加の最後に深く着色した混合物を室温で3時間撹拌した。溶媒を気化し、粗生成物をジクロロメタン中に溶解した。シリカのパッドを通した濾過後、気化し、シクロヘキサン/酢酸エチルで再結晶化し、シクロヘキサンと粉末化した後、717mg (94%)の化合物12が緑色の粉末として取得された。1H-NMR (400MHz, d6-DMSO) (異性体の混合物): δ(ppm) = 1.28 (m, 3H); 4,21 (m, 2H); 5.28 (m, 2H); 7;70 - 8.60 (m, 4H). LC-MS (ES): m/z = 651 (2M+H+), 326 (M+H+).
【０１２９】
（1,2,3, 3a, 4,10-ヘキサアザ-シクロペンタ[b]フルオレン-9-イリデンアミノオキシ)-アセタート リチウム塩および/またはそれに相当する位置異性テトラゾール(13)の合成）
【化３６】
0005543209.tif 000041
12 mlメタノール中のエステル12 (700 mg; 2.15 mmol)およびLiOH (451 mg, 10.75 mmol)の溶液を室温で2時間撹拌した。深く着色した混合物を-120°Cに冷却し、1時間後、形成した沈殿を濾過し、冷却メタノールで洗浄し、380 mg (59%)の化合物13が緑色の粉末として残された。1H-NMR (400MHz, D2O) (異性体の混合物): δ(ppm) = 4.8 (s, 2H); 7.40 - 8.40 (m, 4H). LC-MS (ES): m/z = 296 (M-H+).
【０１３０】
（代表的なシステインプロテアーゼ）
（USP5の活性アッセイ）
USP5は、米国薬局法緩衝液(50mM Tris-HCl;0.5mM EDTA;5mM DTT;0.01% トリトンX-100;ウシ血清アルブミン0.05mg.ml-1、pH7.6)中に希釈した。化合物のストックは、-20℃においてDMSO中で(100mM)貯蔵した。化合物は次の最終濃度において試験した:100μM、33.3μM、11.1μM、3.7μM、1.23μM、412nM、137nM、45.7nM、15.2nM、5nM。
【０１３１】
反応は二重実験としてBlack LJL 96ウェルプレート(HEマイクロプレート、Molecular Devices、最終反応容積20μl)中で行った。USP5に対する基質濃度は、400nM Ub-AMC(Boston Biochem)であった。特異性アッセイにおける酵素(USP5)の濃度は300pMであった。この濃度は、一定の基質濃度で初期速度下での特異性アッセイを実施するために定められた。化合物は酵素と共に25℃で30分間プレインキュベートした。反応は、アッセイ緩衝液中に希釈された酵素を含有しているプレート(+/-化合物)への基質の添加によって開始された。反応を37℃で60分間インキュベートした。酢酸(最終100mM)を加えることによって反応を停止させた。読み取りはPherastar Fluorescent Reader(BMG)で行った。λ発光380nm;λ励起=460nm。データ(平均値+/-標準偏差)は、対照(化合物なし)に対する%として解析し、GraphPad(Prism)を使用してパーセンテージを化合物濃度の対数に対してプロットした。データは(様々な勾配の)S字モデルにフィットさせた。
【０１３２】
（USP7のクローン化および精製）
USP7をコードしているcDNAは、胎盤mRNAからのPCR増幅によって得た。USP7のcDNAを、PCRによって、バキュロウイルス発現ベクター(pFastBac-HT;Invitrogen)へとサブクローニングした。変異させたUSP7をコードしているcDNAは、変異PCRによって生成させた。対応するタンパク質は、残基223におけるシステインのアラニンへの置換をコードする。この配列は、オープンリーディングフレーム全体の配列決定によって解明された。USP7をコードしているバクミドは、DH10Bac転位に続いて生成された。対応するバクミドを昆虫細胞(Sf9)中に導入した。ウイルスを培養物の上澄みから取り出して、2回増幅した。昆虫細胞(Sf9またはHigh Five、Invitrogen)を72時間感染させた。全細胞溶解物を集めて溶解緩衝液(Tris-HCl 50mM pH7.6、0.75% NP40、500mM NaCl、10%グリセリン、1mM DTT、10mMイミダゾール、プロテアーゼ阻害剤カクテル、AEBSF 20μg.ml-1、アプロチニン10μg.ml-1)中に溶解させた。タンパク質を金属アフィニティ樹脂(Talon Metal affinity resin、BD Biosciences)でアフィニティ精製した。捕捉された物質を洗浄緩衝液(50mMリン酸ナトリウムpH7.0、300mM NaCl、10mM イミダゾール、0.5%トリトンX-100、10%グリセリン)中で隅々まで洗浄し、樹脂から250mMのイミダゾール含有洗浄緩衝液中に溶出させた。タンパク質を透析緩衝液(Tris-HCl pH7.6 20mM、NaCl 200mM、DTT 1mM、EDTA 1mM、10%グリセリン)中で透析した。タンパク質の精製は、4〜12% NuPAGE(Invitrogen)で解析した。
【０１３３】
（USP7の活性アッセイ）
USP7をUSP緩衝液(50mM Tris-HCl、0.5mM EDTA、5mM DTT、0.01%トリトンX-100、ウシ血清アルブミン0.05mg.ml-1 pH7.6)中に希釈した。化合物のストックは-20℃においてDMSO中で(100mM)貯蔵した。化合物は、次の最終濃度において試験した:100μM、33.3μM、11.1μM、3.7μM、1.23μM、412nM、137nM、45.7nM、15.2nM、5nM。
【０１３４】
反応は二重実験としてBlack LJL 96ウェルプレート(HEマイクロプレート、Molecular Devices、最終反応容積20μl)中で行った。USP7に対する基質濃度は、400nM Ub-AMC(Chem.Biol.、2003、10、837〜846頁)(Boston Biochem)であった。特異性アッセイにおける酵素(USP7)の濃度は152pMであった。この濃度は、一定の基質濃度で初期速度下での特異性アッセイを実施するために定められた。化合物は酵素と共に25℃で30分間プレインキュベートした。反応は、アッセイ緩衝液中に希釈された酵素を含有しているプレート(+/-化合物)への基質の添加によって開始された。反応を37℃で60分間インキュベートした。酢酸(最終100mM)を加えることによって反応を停止させた。読み取りはPherastar Fluorescent Reader(BMG)で行った。発光λ380nm;λ励起=460nm。データ(平均値+/-標準偏差)は、対照(化合物なし)に対する%として解析し、GraphPad(Prism)を使用してパーセンテージを化合物濃度の対数に対してプロットした。データは(様々な勾配の)S字モデルにフィットさせた。
【０１３５】
（USP8のクローン化および精製）
USP8をコードしているcDNAは、胎盤mRNAからのPCR増幅によって得た。USP8のcDNAを、PCRによって、バキュロウイルス発現ベクター(pFastBac-HT;Invitrogen)へとサブクローニングした。変異させたUSP8をコードしているcDNAは、変異PCRによって生成させた。対応するタンパク質は、残基786におけるシステインのアラニンへの置換をコードする。この配列は、オープンリーディングフレーム全体の配列決定によって解明された。USP7をコードしているバクミドは、DH10Bac転位に続いて生成された。対応するバクミドを昆虫細胞(Sf9)中に導入した。ウイルスを培養物の上澄みから取り出して、2回増幅した。昆虫細胞(Sf9またはHigh Five、Invitrogen)を72時間感染させた。全細胞溶解物を集めて溶解緩衝液(Tris-HCl 50mM pH7.6、0.75% NP40、500mM NaCl、10%グリセリン、1mM DTT、10mMイミダゾール、プロテアーゼ阻害剤カクテル、AEBSF 20μg.ml-1、アプロチニン10μg.ml-1)中に溶解させた。タンパク質を金属アフィニティ樹脂(Talon Metal affinity resin、BD Biosciences)でアフィニティ精製した。捕捉された物質を洗浄緩衝液(50mMリン酸ナトリウムpH7.0、300mM NaCl、10mM イミダゾール、0.5%トリトンX-100、10%グリセリン)中で隅々まで洗浄し、樹脂から250mMのイミダゾール含有洗浄緩衝液中に溶出させた。タンパク質を透析緩衝液(Tris-HCl pH7.6 20mM、NaCl 200mM、DTT 1mM、EDTA 1mM、10%グリセリン)中で透析した。タンパク質の精製は、4〜12% NuPAGE(Invitrogen)で解析した。
【０１３６】
（USP8の活性アッセイ）
USP8をUSP緩衝液(50mM Tris-HCl、0.5mM EDTA、5mM DTT、0.01%トリトンX-100、ウシ血清アルブミン0.05mg.ml-1 pH8.8)中に希釈した。化合物のストック(100mM)は、-20℃においてDMSO中で貯蔵した。化合物は次の最終濃度において試験した:100μM、33.3μM、11.1μM、3.7μM、1.23μM、412nM、137nM、45.7nM、15.2nM、5nM。
【０１３７】
反応は二重実験としてBlack LJL 96ウェルプレート(HEマイクロプレート、Molecular Devices、最終反応容積20μl)中で行った。USP8に対する基質濃度は、400nM Ub-AMC(Boston Biochem)であった。特異性アッセイにおける酵素(USP8)の濃度は630pMであった。この濃度は、一定の基質濃度で初期速度下での特異性アッセイを実施するために定められた。化合物は酵素と共に25℃で30分間プレインキュベートした。反応は、アッセイ緩衝液中に希釈された酵素を含有しているプレート(+/-化合物)への基質の添加によって開始された。反応を37℃で60分間インキュベートした。酢酸(最終100mM)を加えることによって反応を停止させた。読み取りはPherastar Fluorescent Reader(BMG)で行った。λ発光380nm;λ励起=460nm。データ(平均値+/-標準偏差)は、対照(化合物なし)に対する%として解析し、GraphPad(Prism)を使用してパーセンテージを化合物濃度の対数に対してプロットした。データは(様々な勾配の)S字モデルにフィットさせた。
【０１３８】
（UCH-L3の活性アッセイ）
UCH-L3をUSP緩衝液(50mM Tris-HCl、0.5mM EDTA、5mM DTT、0.01%トリトンX-100、ウシ血清アルブミン0.05mg.ml-1 pH7.6)中に希釈した。化合物のストックは-20℃においてDMSO中で(100mM)貯蔵した。化合物は、次の最終濃度において試験した:100μM、33.3μM、11.1μM、3.7μM、1.23μM、412nM、137nM、45.7nM、15.2nM、5nM。
【０１３９】
反応は二重実験としてBlack LJL 96ウェルプレート(HEマイクロプレート、Molecular Devices、最終反応容積20μl)中で行った。Uch-L3に対する基質濃度は、400nM Ub-AMC(Boston Biochem)であった。特異性アッセイにおける酵素(Uch-L3)の濃度は13pMであった。この濃度は、一定の基質濃度で初期速度下での特異性アッセイを実施するために定められた。化合物は酵素と共に25℃で30分間プレインキュベートした。反応は、アッセイ緩衝液中に希釈された酵素を含有しているプレート(+/-化合物)への基質の添加によって開始された。反応を37℃で60分間インキュベートした。酢酸(最終的に100mM)を加えることによって反応を停止させた。読み取りはPherastar Fluorescent Reader(BMG)で行った。δ発光380nm;δ励起=460nm。データ(平均値+/-標準偏差)は、対照(化合物なし)に対する%として解析し、GraphPad(Prism)を使用してパーセンテージを化合物濃度の対数に対してプロットした。データは(様々な勾配の)S字モデルにフィットさせた。
【０１４０】
（カスパーゼ3の活性アッセイ）
カスパーゼ3を、カスパーゼ3緩衝液(100mM Hepes pH 7.5、10%スクロース、0.1%CHAPS)中に希釈した。化合物のストックは-20℃においてDMSO中で(100mM)貯蔵した。化合物は、次の最終濃度において試験した:100μM、33.3μM、11.1μM、3.7μM、1.23μM、412nM、137nM、45.7nM、15.2nM、5nM。
【０１４１】
（カスパーゼ3の活性アッセイ）
カスパーゼ3は、カスパーゼ3緩衝液(100mM Hepes pH7.5、10%ショ糖、0.1%CHAPS)中に希釈した。化合物のストックは-20℃においてDMSO中で(100mM)貯蔵した。化合物は、次の最終濃度において試験した:100μM、33.3μM、11.1μM、3.7μM、1.23μM、412nM、137nM、45.7nM、15.2nM、5nM。反応は二重実験としてBlack LJL 96ウェルプレート(HEマイクロプレート、Molecular Devices、最終反応容積20μl)中で行った。カスパーゼ3に対する基質濃度は、500nM(Ac-DEVD-AMC、Promega)であった。特異性アッセイにおける酵素(カスパーゼ3)の濃度は3.2nMであった。この濃度は、一定の基質濃度で初期速度下での特異性アッセイを実施するために定められた。化合物は酵素と共に25℃で30分間プレインキュベートした。反応は、アッセイ緩衝液中に希釈された酵素を含有しているプレート(+/-化合物)への基質の添加によって開始された。反応を37℃で60分間インキュベートした。酢酸(最終的に100mM)を加えることによって反応を停止させた。読み取りはPherastar Fluorescent Reader(BMG)で行った。δ発光380nm;δ励起=460nm。データ(平均値+/-標準偏差)は、対照(化合物なし)に対する%として解析し、GraphPad(Prism)を使用してパーセンテージを化合物濃度の対数に対してプロットした。データは(様々な勾配の)S字モデルにフィットさせた。
【０１４２】
（カテプシンBの活性アッセイ）
カテプシンBは、カテプシンB緩衝液(20mM Tris-HCl pH6.8、1mM EDTA、1mM DTT)中に希釈した。化合物のストックは-20℃においてDMSO中で(100mM)貯蔵した。化合物は、次の最終濃度において試験した:100μM、33.3μM、11.1μM、3.7μM、1.23μM、412nM、137nM、45.7nM、15.2nM、5nM。反応は二重実験としてBlack LJL 96ウェルプレート(HEマイクロプレート、Molecular Devices、最終反応容積20μl)中で行った。カテプシンB特異性アッセイに対する基質濃度は、36μM(z-RR-AMC、Calbiochem)であった。特異性アッセイにおける酵素(カスパーゼ3)の濃度は3.6nMであった。この濃度は、一定の基質濃度で初期速度下での特異性アッセイを実施するために定められた。化合物は酵素と共に25℃で30分間プレインキュベートした。反応は、アッセイ緩衝液中に希釈された酵素を含有しているプレート(+/-化合物)への基質の添加によって開始された。反応を37℃で60分間インキュベートした。酢酸(最終的に100mM)を加えることによって反応を停止させた。読み取りはPherastar Fluorescent Reader(BMG)で行った。δ発光380nm;δ励起=460nm。データ(平均値+/-標準偏差)は、対照(化合物なし)に対する%として解析し、GraphPad(Prism)を使用してパーセンテージを化合物濃度の対数に対してプロットした。データは(様々な勾配の)S字モデルに合わせた。
【０１４３】
（細胞の生存能力および増殖方法）
（HCT116細胞の生存能力および増殖アッセイ）
HCT116結腸癌細胞は、ATCC(American Type Culture Collection)から得て、10%FBS、3mMグルタミンおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含有しているMcCoy's 5A培地中に保持した。細胞を5%CO2含有加湿大気中37℃でインキュベートした。
【０１４４】
細胞の生存能力は、96ウェル培養プレート(CellTiter 96(登録商標)Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay、Promega)中でMTS技法を使用し、製造者の指示に従ってアッセイした。MTS(3-(4,5-ジメチル-チアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム)は、MTTから誘導されるテトラゾリウムであり、代謝的に活性な細胞中で可溶な細胞浸透性のホルマザンに還元される。492nmの吸収によって検出されるホルマザンの量は、生存しており、代謝的に活性な細胞の数に比例する。
【０１４５】
1ウェル当り103個のHCT116細胞を播種した。24時間後、培地を交換し、細胞をそれぞれの化合物の次の濃度において三重実験で処理した:10μM、3.33μM、1.11μM、370nM、123nM、41nM、14nMおよび5nM。化合物は100%DMSO中に希釈し、その細胞に対する最終濃度は0.5%に維持した。
【０１４６】
細胞を化合物と共に72時間インキュベートし、次いでその生存能力をMTSの添加によって2時間でアッセイした。492nmにおける吸収は、96ウェル培養プレートから直接測定した。それぞれの化合物についてのGI50(増殖抑制率50%)濃度を、S字曲線の可変スロープフィット(Prism 4.0、Graphpad Softwares)を使用して計算した。値は3つの独立した実験の平均を表す。
【０１４７】
（PC3細胞の生存能力および増殖アッセイ）
PC-3前立腺癌細胞は、ATCCから得て、7%FBSおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含有しているF-12K培地中に保持した。細胞を5%CO2含有加湿大気中37℃でインキュベートした。
【０１４８】
細胞の生存能力は、96ウェル培養プレート(CellTiter 96(登録商標)Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay、Promega)中でMTS技法を使用し、製造者の指示に従ってアッセイした。MTS(3-(4,5-ジメチル-チアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム)は、MTTから誘導されるテトラゾリウムであり、代謝的に活性な細胞中で可溶な細胞浸透性のホルマザンに還元される。492nmの吸収によって検出されるホルマザンの量は、生存しており、代謝的に活性な細胞の数に比例する。
【０１４９】
1ウェル当り2×103個のPC3細胞を播種した。24時間後、培地を交換し、細胞をそれぞれの化合物の次の濃度において三重実験で処理した:10μM、3.33μM、1.11μM、370nM、123nM、41nM、14nMおよび5nM。化合物は100%DMSO中に希釈し、その細胞に対する最終濃度は0.5%に維持した。
【０１５０】
細胞を化合物と共に72時間インキュベートし、次いでその生存能力をMTSの添加によって2時間でアッセイした。492nmにおける吸収は、96ウェル培養プレートから直接測定した。それぞれの化合物についてのGI50(増殖抑制率50%)濃度を、S字曲線の可変スロープフィット(Prism 4.0、Graphpad Softwares)を使用して計算した。値は3つの独立した実験の平均を表す。
【０１５１】
（結果）
1.システインプロテアーゼ活性の阻害
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【０１５２】
2.細胞の生存能力および増殖の抑制
【表７】
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【表８】
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