(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
直接配列の少なくとも２つの繰り返しグルタミン酸残基（Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）、および少なくとも１つのシュードプロリン部分の残基を含む非樹脂結合ペプチドを含む、ペプチド誘導体であって、ここで該ペプチド誘導体が部分保護または完全保護ペプチドであり、そしてここで該少なくとも１つのシュードプロリン部分が少なくとも１つのセリンまたはトレオニンに導入され、そしてここで該少なくとも１つのシュードプロリン部分がグルタミン酸残基の繰り返し配列とペプチドのＮ末端との間にある、ペプチド誘導体。
【請求項２】
少なくとも１５アミノ酸を含む、請求項１記載のペプチド誘導体。
【請求項３】
少なくとも１７アミノ酸を含む、請求項１記載のペプチド誘導体。
【請求項４】
配列番号３４：
【表４０】
0005473925.tif 000061
［配列中、Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（４−５）、Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（６−７）、Ｔｈｒ−Ｓｅｒ（７−８）およびＬｅｕ−Ｓｅｒ（１０−１１）より選択される少なくとも一つの位置は、シュードプロリンにより置き換えられている］
のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか記載のペプチド誘導体。
【請求項５】
直接配列の少なくとも２つの繰り返しグルタミン酸残基（Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）、および少なくとも１つのシュードプロリン部分の残基を含むペプチドを含む、ペプチド誘導体であって、ここで該ペプチド誘導体が部分保護または完全保護ペプチドであり、ここで少なくとも最初のシュードプロリン部分がグルタミン酸残基の繰り返し配列とペプチドのＮ末端との間にあり、ここで該ペプチドが、
【表４１】
0005473925.tif 000062
0005473925.tif 000063
0005473925.tif 000064
0005473925.tif 000065
［配列番号２〜３１における配列中、４および５位のＸ４−Ｘ５；６および７位のＸ６−Ｘ７；７および８位のＸ７−Ｘ８；そして１０および１１位のＸ１０−Ｘ１１は、シュードプロリンを含む］
から成る群より選択される、ペプチド誘導体。
【請求項６】
配列：
【表４２】
0005473925.tif 000066
［配列中、６および７位のＸ６−Ｘ７、そして１０および１１位のＸ１０−Ｘ１１は、シュードプロリンを含む］
を有する、請求項１〜５のいずれか一項記載のペプチド誘導体。
【請求項７】
下記工程：
ａ）直接配列の少なくとも２つの繰り返しグルタミン酸（Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）を含み、少なくとも１つのシュードプロリン部分をさらに含むアミノ酸配列を含む、第一の保護ペプチドフラグメントを調製すること、ここで該少なくとも１つのシュードプロリン部分が少なくとも１つのセリンまたはトレオニンに導入され、そしてここで該少なくとも１つのシュードプロリン部分がグルタミン酸残基の繰り返し配列とペプチドのＮ末端との間にある；および
ｂ）該第一の保護ペプチドフラグメントと少なくとも第二の保護ペプチドフラグメントを溶液相中で組み立ててカップリングし、インスリン分泌性ペプチドの保護誘導体を生成すること
を含む、該インスリン分泌性ペプチドの保護誘導体を作製する方法。
【請求項８】
第一の保護ペプチドフラグメントが、配列番号３４：
【表４３】
0005473925.tif 000067
［配列中、Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（４−５）、Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（６−７）、Ｔｈｒ−Ｓｅｒ（７−８）およびＬｅｕ−Ｓｅｒ（１０−１１）より選択される少なくとも一つの位置は、シュードプロリンにより置き換えられている］
のアミノ酸配列を含むフラグメントである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
第一の保護ペプチドフラグメントが、
【表４４】
0005473925.tif 000068
0005473925.tif 000069
0005473925.tif 000070
［配列番号２〜３１における配列中、４および５位のＸ４−Ｘ５；６および７位のＸ６−Ｘ７；７および８位のＸ７−Ｘ８；そして１０および１１位のＸ１０−Ｘ１１は、シュードプロリンを含む］
から成る群より選択される、請求項７または８記載の方法。
【請求項１０】
第一の保護ペプチドフラグメントが、配列：
【表４５】
0005473925.tif 000071
［配列中、６および７位のＸ６−Ｘ７、そして１０および１１位のＸ１０−Ｘ１１は、シュードプロリンである］
を有する、請求項７記載の方法。
【請求項１１】
第二の保護ペプチドフラグメントが、
【表４６】
0005473925.tif 000072
から成る群より選択される、請求項７記載の方法。
【請求項１２】
配列番号２〜３１、５０〜５９のいずれかに示される少なくとも一つのアミノ酸配列を含む、請求項１記載のペプチド誘導体。
【請求項１３】
下記工程：
ａ）第一、第二、および第三の保護ペプチドを提供する工程であって、該第一の保護ペプチドが、少なくとも二つの繰り返しＧｌｕ残基の配列（Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）および少なくとも１シュードプロリン残基を含み、該少なくとも１つのシュードプロリン残基は少なくとも１つのセリンまたはトレオニンに導入され、該少なくとも１つのシュードプロリン残基はグルタミン酸残基の繰り返し配列とペプチドのＮ末端との間に置かれ、そして該第一、第二、および第三の保護ペプチドのいずれもが少なくとも１つの保護基を含む工程；
ｂ）保護されたセリン残基と第三の保護ペプチドをカップリングして、第四の保護ペプチドを得る工程；
ｃ）該第四の保護ペプチドと該第二の保護ペプチドをカップリングして、第五の保護ペプチドを得る工程；ならびに
ｄ）該第五の保護ペプチドと該第一の保護ペプチドをカップリングして、脱保護された場合にインスリン分泌活性を有する保護ペプチド誘導体を生成する工程
を含む、脱保護された場合にインスリン分泌活性を有する保護ペプチド誘導体を作製する方法。
【請求項１４】
下記工程：
ｅ）保護ペプチド誘導体を脱保護し、そしてインスリン分泌活性を有する脱保護ペプチド誘導体をクロマトグラフィー精製する工程；および
ｆ）該精製されたインスリン分泌性ペプチドを溶液から沈殿させる工程
をさらに含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
第一の保護ペプチドが、配列番号３４：
【表４７】
0005473925.tif 000073
［配列中、Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（４−５）、Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（６−７）、Ｔｈｒ−Ｓｅｒ（７−８）およびＬｅｕ−Ｓｅｒ（１０−１１）より選択される少なくとも一つの位置は、シュードプロリンにより置き換えられている］
のアミノ酸配列を含む、請求項１３または１４記載の方法。
【請求項１６】
第一の保護ペプチドが、配列番号２〜３１のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を有する、請求項１３または１４記載の方法。
【請求項１７】
第一の保護ペプチドが、配列番号２〜３１のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を有し、第二の保護ペプチドが、配列番号３５〜３９のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を有し、そして第三の保護ペプチドが、配列番号４０〜４２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１３または１４記載の方法。
【請求項１８】
第一、第二、および第三の保護ペプチドを、固相合成技法を使用して合成することをさらに含む、請求項１３または１４記載の方法。
【請求項１９】
工程ｂ）、ｃ）およびｄ）を溶液相中で行うことをさらに含む、請求項１３または１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固相および溶液相プロセスを使用して、インスリン分泌性ペプチド、特にエキセナチドおよびその対応物を調製するための方法に関する。さらに本発明は、これらの方法に使用することのできる中間体ペプチドフラグメントに関する。
【０００２】
ペプチド合成のための多数の方法が文献に記載されている（例えば、米国特許第６，０１５，８８１号; Mergler et al. (1988) Tetrahedron Letters 29:4005-4008; Mergler et al. (1988) Tetrahedron Letters 29:4009-4012; Kamber et al. (eds), Peptides, Chemistry and Biology, ESCOM, Leiden (1992) 525-526; Riniker et al. (1993) Tetrahedron Letters 49:9307-9320; Lloyd-Williams et al. (1993) Tetrahedron Letters 49:11065-11133; およびAndersson et al. (2000) Biopolymers 55:227-250を参照されたい。様々な合成方法は、合成が行われる相、すなわち液相または固相の物理的状態により区別される。
【０００３】
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）では、アミノ酸またはペプチド基を固体支持体樹脂に結合させる。次に、関心が持たれるペプチド物質が形成するまで、支持体に結合したペプチドにアミノ酸またはペプチド基を連続的に結びつける。次に、支持体に結合したペプチドを、典型的には支持体から切断し、さらなる加工および／または精製に供する。一部の例では、固相合成は成熟ペプチド産物をもたらし、他の例では、支持体から切断されたペプチド（すなわち「ペプチド中間体フラグメント」）をさらに大型の成熟ペプチド産物の調製に使用する。
【０００４】
固相プロセスから生成したペプチド中間体フラグメントは、固相合成プロセスまたは液相合成プロセス（本明細書において「溶液相合成」と呼ぶ）で一緒にカップリングすることができる。固相による有用成熟ペプチドの合成が不可能であり、実際的でもない場合に、溶液相合成が特に有用でありうる。例えば固相合成では、より長いペプチドは、まだ固体支持体に結びついている間についには不規則なコンフォメーションを採り、成長中の鎖に追加のアミノ酸またはペプチド物質を付加することが困難になるおそれがある。ペプチド鎖が支持体樹脂上で長くなるほど、カップリングおよび脱保護などのプロセス工程の効率が下がるおそれがある。次にはこのことが、活性化可能なアミノ酸、共試薬、および溶媒などの出発物質の損失増加に加えて、これらの問題を埋め合わせるための長い加工時間を招くおそれがある。ペプチドの長さが大きくなるほど、これらの問題が増えるおそれがある。
【０００５】
したがって、固相手順のみを使用して単一フラグメントに合成された、３０アミノ酸長を超える成熟ペプチドが見出されることは比較的まれである。代わりに、個別のフラグメントを別々に固相上で合成し、次に固相および／または溶液相中でカップリングし、所望のペプチド産物を構築することができる。このアプローチは、フラグメント候補を注意深く選択する必要がある。いくつかの一般原理がフラグメントの選択の指針となることがあるが、フラグメント候補の実証試験が、かなり頻繁に必要となる。ある状況で役立つフラグメント戦略が、他の状況では役立たないおそれがある。妥当なフラグメント候補が明らかになった場合でさえも、合成戦略が商業的に妥当な条件で機能するためには、プロセス改革がなお必要なことがある。したがって、ハイブリッド型スキームを使用したペプチド合成は、大変なことが多く、多くの場合で、実際の合成を行うまでどのような問題が合成スキームに内在するのか予測することは困難である。
【０００６】
溶液相カップリングでは、二つのペプチド中間体フラグメント、または一つのペプチド中間体フラグメント（すなわち「フラグメント」）および一つの反応性アミノ酸を、適切な溶媒中でカップリングするが、これを通常はカップリング反応の効率および質を高める追加の試薬の存在下で行う。ペプチド中間体フラグメント（すなわち「フラグメント」）は、一つのフラグメントのＮ末端がもう一つのフラグメントのＣ末端に、またはその逆にカップリングするように反応的に配置される。加えて、固相合成時に存在する側鎖保護基は、通常は溶液相カップリング時にもフラグメントに保持され、フラグメント末端の特異的反応性を確実にする。これらの側鎖保護基は、典型的には成熟ペプチドが形成するまで除去されない。
【０００７】
合成スキーム全体における一つまたは複数の工程のささやかな改善が、成熟ペプチドの調製における重大な改善になりうる。そのような改善は、時間および試薬全体の大規模な節約を導くことができ、最終産物の純度および収率を大きく改善することもできる。完全保護フラグメントの溶解度不良のせいで、および溶液相カップリングでの易エピマー化のせいで重大な落とし穴があることから、このハイブリッド型アプローチにとって化学的戦略を妥当に選択することが必要である。
【０００８】
ハイブリッド型合成における改良の重要性の考察は、これらの手順を使用して産生した任意の種類のペプチドにあてはめることができるが、治療的に有用なペプチドおよび産業的医学用途のための規模で製造されるペプチドの状況で特に重要である。より大型の生体分子薬、例えば治療用ペプチドなどの合成は、非常に費用のかかることがある。他の要因に加えて、試薬のコスト、合成時間、多数の合成工程のせいで、これらのより大型の生体分子薬の合成プロセスのごくわずかな改善が、そのような薬を製造することが経済的に実現可能であるかにまでも重大な影響を及ぼしうる。そのような改善が必要であるのは、より大型の生体分子薬に関するこれらの高い生産コストが原因であり、このことは、多くの場合で、この種のより大型の生体分子薬の適切な治療代替物が、たとえあったとしても少数であるという事実に裏打ちされている。
【０００９】
このことは、エキセナチドペプチドなどのインスリン分泌性ペプチドおよびその機能的対応物の場合に明らかに分かる。そのようなペプチドは、２型インスリン非依存性糖尿病および肥満の処置のための治療剤になる可能性がある。それらのペプチドは、内因性インスリンの初期の迅速放出を改善し、膵臓のグルカゴン放出を抑制し、胃排出をレギュレーションし、食欲を減退させる。それらの全ては、血糖を低下するように機能する。エキセナチドは、血糖レベルが上昇したときにそれを低下させる点で自己レギュレーション性であり、レベルが正常に戻った場合には血糖を低下させ続けない。
【００１０】
ネイティブなエキセナチドは、アメリカドクトカゲから単離され、３９アミノ酸残基長である。エキセナチドは、分子量４１８６．６ダルトンである。合成的に創出された場合にエクセンジン−４と呼ばれるネイティブなエキセナチドは、商品名BYETTA（商標）で市販されており、表記エキセナチド（１−３９）で表すことができる。この表記は、そのペプチドが１（Ｎ末端）から３９（Ｃ末端）まで全てのアミノ酸を有することを示す。エキセナチドは、配列番号１：
【００１１】
【表１】
0005473925.tif 000002
のアミノ酸配列を有する。
【００１２】
エキセナチドの固相および溶液相合成における主な課題は、１５、１６および１７位の３グルタミン酸残基の配列に関係する。実際、このような配列に少なくとも２つのグルタミン酸残基を有する任意のペプチドは、この難問を共有する傾向にあるものである。具体的には、そのようなグルタミン酸残基をはるかに越えてペプチドフラグメントを化学合成することは困難である。理論に縛られることを望むわけではないが、繰り返しＧｌｕ配列は、固相中でねじれるフラグメント部分をもたらす傾向にある。このことは、このＧｌｕ鎖を経由してフラグメントのサイズを効果的に積み上げ続けることを比較的困難にする。従来の常法では、二つ以上の繰り返しＧｌｕ残基の配列を有するフラグメントは、実際問題として上流（Ｃ末端方向）および／または下流（Ｎ末端方向）に１〜３アミノ酸だけを有することができるであろう。この問題は、繰り返しＧｌｕ鎖から下流の方が厳格な傾向にある。これは、多くの場合に、繰り返しＧｌｕ残基の配列を有する、固相において成長したペプチドフラグメントが比較的短い傾向にあることを意味しうる。
【００１３】
エキセナチドの場合、このことが固相フラグメント戦略に影響を及ぼした。ある場合では、一つのフラグメントが一つのＧｌｕ残基だけを含むように、Ｇｌｕ配列の中にフラグメントの切断点を配置することができよう。しかし、エキセナチドペプチドの状況でこの戦略は、もう一方のフラグメントに依然として２Ｇｌｕ残基を並んで残すことから、固相における４フラグメント合成戦略の後で溶液相においてフラグメントをカップリングすることを決定しうる。または、３Ｇｌｕ残基全てが一つのフラグメントに含まれてもよい。しかし、従来の戦略を使用すると、このことは、構築中のフラグメントに第三のＧｌｕ残基が付加された後で、そのフラグメントにＭｅｔ、ＭｅｔおよびＧｌｎ、または可能性があることにはＭｅｔ、ＧｌｎおよびＬｙｓ残基を付加することだけが実用的で、組み立てるべき残基は残りの別のペプチドフラグメントに残る。再度このことは、固相における４フラグメント合成戦略の後で溶液相においてフラグメントをカップリングすることを決定しうる。４フラグメント合成アプローチが、ときに望ましいことがあるが、繰り返しＧｌｕ配列の従来の取り扱いにより、これらの戦略でさえ、望しいというよりも問題となる。
【００１４】
要するに、繰り返しＧｌｕ配列に関連する実際問題のせいで、繰り返しＧｌｕ残基を組み入れているフラグメントは、追加のフラグメントに頼る合成戦略により確実に相対的に短くなるおそれがある。二つ以上のＧｌｕ残基を並んで含む、より長いフラグメントを合成するためには、固相合成を使用できると大いに望ましいであろう。
【００１５】
これらの問題に加えて、ペプチドの大規模生産についての産物の回収および産物の純度、ならびに試薬の取り扱い、保存および廃棄に関する問題は、ペプチド合成スキームの実現可能性に大きく影響を及ぼすおそれがある。したがって、大バッチ量で収率を改善して、商業的に関心が持たれるペプチド物質を効率的に生産することのできるペプチド合成プロセスの必要性が引き続きある。
【００１６】
本発明は、固相および溶液相（「ハイブリッド」）アプローチを使用して合成された、ペプチドのアミノ酸配列に二つ以上の隣接Ｇｌｕ残基を含むペプチドの調製に関する。これらの繰り返しＧｌｕ配列を組み入れている長鎖ペプチドフラグメントが、二つの対応するアミノ酸残基の代替として一つまたは複数のシュードプロリン残基もまた組み入れる場合に、そのフラグメントを容易に合成できることが見出された。理論に縛られることを望むわけではないが、一つまたは複数のシュードプロリンは、成長中のフラグメントを強固にすることを助け、一つまたは複数のシュードプロリンの不在下で実際に達成できるよりも有意に多くのアミノ酸を成長中の鎖にずっと容易に付加し続けると考えられる。模式的に、シュードプロリンは、成長中のペプチド鎖に追加のアミノ酸残基を組み入れることがより容易な構造コンフォメーションに成長中のペプチドフラグメントを保つことを助けるｉｎ  ｓｉｔｕ骨格と見なすことができる。脱保護時にシュードプロリンは容易に改変され、所望のアミノ酸残基対をもたらすが、そのシュードプロリンは、そのアミノ酸残基対に代わり第一に置換されたものである。シュードプロリンを上流（Ｃ末端方向）で置換して、より上流のアミノ酸残基が反復Ｇｌｕ配列の前に来られるようにしてもよいし、下流（Ｎ末端方向）で置換して、より下流のアミノ酸残基をＧｌｕ残基の後のペプチドフラグメントに付加できるようにしてもよい。利点がより顕著なことから、下流の方が好ましい。
【００１７】
一般に、８個を超えない、好ましくは５個を超えない介在アミノ酸残基が、シュードプロリン残基と繰り返しＧｌｕ鎖および／または別のシュードプロリン鎖との間にあるように、シュードプロリン残基をペプチドまたはペプチドフラグメントに組み入れることが望ましい。シュードプロリン残基の利点は、数個の追加のアミノ酸残基にわたり続きうることから、１個を超えるシュードプロリンをペプチドまたはペプチドフラグメントに組み入れる態様では、少なくとも２個以上のアミノ酸残基をシュードプロリン残基の間に配置することが望ましい。
【００１８】
本発明の原理は、１５、１６、および１７位の３Ｇｌｕ残基の繰り返し配列を含むエキセナチドペプチドなどのインスリン分泌性ペプチド、ならびにそれらの天然および非天然対応物ならびにこれらの中間体ペプチドフラグメントに適用することができる。例えば少なくとも一つのシュードプロリンを使用することによって、エキセナチドペプチドおよびその対応物は、固相化学反応を使用してわずか三つの異なるペプチド中間体フラグメントに容易に合成される。次に、溶液相化学反応を使用して、フラグメントの一つに追加のアミノ酸物質を付加する。次に、これらのフラグメントを溶液相の中で一緒にカップリングする。
【００１９】
エキセナチドフラグメントの一つにシュードプロリンを使用すると、たとえこのフラグメントがＧｌｕ残基の繰り返し配列を含みうるとしても、そのフラグメントを極めて長くすることが可能になり、そのフラグメントの固相合成が容易になり、それに続くこのフラグメントと他のフラグメントとの溶液相カップリングもまた容易になる。少なくとも一つのシュードプロリンを使用しなければ、ハイブリッド型合成を効果的に適用するためには少なくとも４個のペプチドフラグメントが必要であろう。例えば、エキセナチド（１−１７）、エキセナチド（１−１９）、およびエキセナチド（１−２０）（これらの全てがＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ配列を含む）などのフラグメントは、シュードプロリン置換を使用すると、高い収率および純度で非常に容易に合成されるが、シュードプロリン置換を使用しないと、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ配列を含むずっと短いフラグメントのみを、匹敵する収率および純度で合成することができる。
【００２０】
一局面では、本発明は、直接配列の少なくとも２つのグルタミン酸残基（Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）から成るアミノ酸配列を含み、少なくとも一つのシュードプロリン部分の残基をさらに含むインスリン分泌性ペプチドフラグメントに関し、該フラグメントは、場合により側鎖保護を有する。
【００２１】
好ましくは、少なくとも第一のシュードプロリン残基は、そのフラグメントのグルタミン酸残基の繰り返し配列とＮ末端との間にある。
【００２２】
さらに、シュードプロリン残基と、グルタミン酸残基の繰り返し配列の最も近いＧｌｕ残基との間に少なくとも２アミノ酸残基がある、上記と同義のインスリン分泌性ペプチドフラグメントが好ましい。
【００２３】
好ましい局面では、インスリン分泌性ペプチドフラグメントは、さらに、第一のシュードプロリン残基下流（すなわちＮ末端のより近く）に第二のシュードプロリン残基を含む。
【００２４】
好ましくは、上記と同義のフラグメントは、少なくとも１５アミノ酸残基を含み、ここで、フラグメントに組み入れられる各シュードプロリン残基は、２アミノ酸残基として数えられる。さらに好ましくは、インスリン分泌性ペプチドフラグメントは、少なくとも１７アミノ酸残基を含む。
【００２５】
グルタミン酸残基の繰り返し配列がフラグメントのＣ末端に隣接する、上記と同義のインスリン分泌性ペプチドフラグメントが好ましい。
【００２６】
二つを超えないアミノ酸残基がグルタミン酸残基の繰り返し配列とフラグメントのＣ末端との間にある、上記と同義のインスリン分泌性ペプチドフラグメントもまた好ましい。さらに好ましくは、上記と同義のフラグメントは、直接配列の少なくとも３グルタミン酸残基（Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）から成る。
【００２７】
本発明の好ましい局面では、上記と同義のインスリン分泌性ペプチドフラグメントは、配列番号３４：
【００２８】
【表２】
0005473925.tif 000003
［配列中、Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（４−５）、Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（６−７）、Ｔｈｒ−Ｓｅｒ（７−８）およびＬｅｕ−Ｓｅｒ（１０−１１）より選択される少なくとも一つの位置がシュードプロリンによって置き換えられている］のアミノ酸配列を含み、該フラグメントは、場合により側鎖保護を有する。
【００２９】
以下から成る群より選択されるインスリン分泌性ペプチドフラグメントが好ましい：
【００３０】
【表３】
0005473925.tif 000004
0005473925.tif 000005
0005473925.tif 000006
0005473925.tif 000007
［配列番号２〜３１の式中、４および５位のシュードプロリンＸ４−Ｘ５は、Ｇｌｙ−Ｔｈｒまたはその対応物に対応し；６および７位のシュードプロリンＸ６−Ｘ７は、Ｐｈｅ−Ｔｈｒｅまたはその対応物に対応し；７および８位のシュードプロリンＸ７−Ｘ８は、Ｔｈｒ−Ｓｅｒまたはその対応物に対応し；１０および１１位のシュードプロリンＸ１０−Ｘ１１は、Ｌｅｕ−Ｓｅｒまたはその対応物に対応する］。
【００３１】
特に好ましいのは、式：
【００３２】
【表４】
0005473925.tif 000008
［式中、６および７位のシュードプロリンＸ６−Ｘ７は、Ｐｈｅ−Ｔｈｒまたはその対応物に対応し、１０および１１位のシュードプロリンＸ１０−Ｘ１１は、Ｌｅｕ−Ｓｅｒまたはその対応物に対応する］のインスリン分泌性ペプチドフラグメントである。
【００３３】
さらに好ましいインスリン分泌性ペプチドフラグメントは、式：
【００３４】
【表５】
0005473925.tif 000009
［式中、６および７位のシュードプロリンＸ６−Ｘ７は、Ｐｈｅ−Ｔｈｒまたはその対応物に対応し、１０および１１位のシュードプロリンＸ１０−Ｘ１１は、Ｌｅｕ−Ｓｅｒまたはその対応物に対応する］のフラグメントである。
【００３５】
式：
【００３６】
【表６】
0005473925.tif 000010
［式中、６および７位のシュードプロリンＸ６−Ｘ７は、Ｐｈｅ−Ｔｈｒまたはその対応物に対応し、１０および１１位のシュードプロリンＸ１０−Ｘ１１は、Ｌｅｕ−Ｓｅｒまたはその対応物に対応する］のインスリン分泌性ペプチドフラグメントもまた好ましい。
【００３７】
さらに、式：
【００３８】
【表７】
0005473925.tif 000011
［式中、６および７位のシュードプロリンＸ６−Ｘ７は、Ｐｈｅ−Ｔｈｒまたはその対応物に対応し、１０および１１位のシュードプロリンＸ１０−Ｘ１１は、Ｌｅｕ−Ｓｅｒまたはその対応物に対応する］のインスリン分泌性ペプチドフラグメントも好ましい。
【００３９】
別の好ましいインスリン分泌性ペプチドフラグメントは、式：
【００４０】
【表８】
0005473925.tif 000012
［式中、６および７位のシュードプロリンＸ６−Ｘ７は、Ｐｈｅ−Ｔｈｒまたはその対応物に対応し、１０および１１位のシュードプロリンＸ１０−Ｘ１１は、Ｌｅｕ−Ｓｅｒまたはその対応物に対応する］を有する。
【００４１】
式：
【００４２】
【表９】
0005473925.tif 000013
【００４３】
のインスリン分泌性ペプチドフラグメントもまた好ましい。
【００４４】
別の局面では、本発明は、以下の工程を含む、インスリン分泌性ペプチドを作製する方法に関する：
ａ）直接配列の少なくとも２つのグルタミン酸（Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）を含み、シュードプロリンをさらに含むアミノ酸配列を含む第一のペプチドフラグメントまたはその対応物を調製すること；および
ｂ）インスリン分泌性ペプチドにそのペプチドフラグメントを組み入れること。
【００４５】
「インスリン分泌性ペプチドにそのペプチドフラグメントを組み入れる」は、そのペプチドフラグメントと第二のペプチドフラグメントをカップリングしてインスリン分泌性ペプチドを得ることを意味する。
【００４６】
好ましくは、この方法は、少なくとも第一のシュードプロリン残基が、グルタミン酸残基の繰り返し配列と、フラグメントのＮ末端との間にある、上記と同義の第一のペプチドフラグメントを用いて実施される。
【００４７】
本発明の好ましい局面では、その方法は、
【００４８】
【表１０】
0005473925.tif 000014
0005473925.tif 000015
0005473925.tif 000016
0005473925.tif 000017
［配列番号２〜３１の式中、４および５位のシュードプロリンＸ４−Ｘ５は、Ｇｌｙ−Ｔｈｒまたはその対応物に対応し；６および７位のシュードプロリンＸ６−Ｘ７は、Ｐｈｅ−Ｔｈｒｅまたはその対応物に対応し；７および８位のシュードプロリンＸ７−Ｘ８は、Ｔｈｒ−Ｓｅｒまたはその対応物に対応し；１０および１１位のシュードプロリンＸ１０−Ｘ１１は、Ｌｅｕ−Ｓｅｒまたはその対応物に対応する］から成る群より選択されるフラグメントを用いて実施される。
【００４９】
さらに好ましくは、その方法は、式：
【００５０】
【表１１】
0005473925.tif 000018
［式中、６および７位のシュードプロリンＸ６−Ｘ７は、Ｐｈｅ−Ｔｈｒまたはその対応物に対応し、１０および１１位のシュードプロリンＸ１０−Ｘ１１は、Ｌｅｕ−Ｓｅｒまたはその対応物に対応する］の第一のペプチドフラグメントを用いて実施される。
【００５１】
別の好ましい局面では、その方法は：
【００５２】
【表１２】
0005473925.tif 000019
［式中、６および７位のシュードプロリンＸ６−Ｘ７は、Ｐｈｅ−Ｔｈｒまたはその対応物に対応し、１０および１１位のシュードプロリンＸ１０−Ｘ１１は、Ｌｅｕ−Ｓｅｒまたはその対応物に対応する］から成る群より選択される第一のペプチドフラグメントを用いて実施される。
【００５３】
式：
【００５４】
【表１３】
0005473925.tif 000020
［式中、６および７位のシュードプロリンＸ６−Ｘ７は、Ｐｈｅ−Ｔｈｒまたはその対応物に対応し、１０および１１位のシュードプロリンＸ１０−Ｘ１１は、Ｌｅｕ−Ｓｅｒまたはその対応物に対応する］の第一のペプチドフラグメントが使用される方法もまた好ましい。
【００５５】
さらに：
【００５６】
【表１４】
0005473925.tif 000021
［式中、６および７位のシュードプロリンＸ６−Ｘ７は、Ｐｈｅ−Ｔｈｒまたはその対応物に対応し、１０および１１位のシュードプロリンＸ１０−Ｘ１１は、Ｌｅｕ−Ｓｅｒまたはその対応物に対応する］から成る群より選択される第一のペプチドフラグメントが使用される、上記と同義の方法が好ましい。
【００５７】
さらに好ましい局面では、その方法は、式：
【００５８】
【表１５】
0005473925.tif 000022
［式中、６および７位のシュードプロリンＸ６−Ｘ７は、Ｐｈｅ−Ｔｈｒまたはその対応物に対応し、１０および１１位のシュードプロリンＸ１０−Ｘ１１は、Ｌｅｕ−Ｓｅｒまたはその対応物に対応する］の第一のペプチドフラグメントを用いて実施される。
【００５９】
【表１６】
0005473925.tif 000023
［式中、６および７位のシュードプロリンＸ６−Ｘ７は、Ｐｈｅ−Ｔｈｒまたはその対応物に対応し、１０および１１位のシュードプロリンＸ１０−Ｘ１１は、Ｌｅｕ−Ｓｅｒまたはその対応物に対応する］から成る群より選択される第一のペプチドフラグメントを用いて実施される方法もまた好ましい。
【００６０】
別の局面では、本発明は、以下を含むインスリン分泌性ペプチドに関する：
少なくとも１残基のシュードプロリン；直接配列の少なくとも２つのグルタミン酸残基（Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）；および場合により少なくとも一つの保護基。
【００６１】
好ましくは、インスリン分泌性ペプチドは、エキセナチド（１−３９）の対応物である。さらに好ましくは、そのペプチドは、そのペプチドに該少なくとも１残基のシュードプロリンを組み入れる改変がエキセナチド（１−３９）と異なる。
【００６２】
さらなる局面では、本発明は、少なくとも１残基のシュードプロリン、直接配列の少なくとも２つのグルタミン酸残基（Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）；および場合により少なくとも一つの保護基を含むインスリン分泌性ペプチドまたはその対応物に関し、ここで、そのペプチドは、配列番号１〜７９のいずれかに示される少なくとも一つのアミノ酸配列を含む。
【００６３】
さらに好ましくは、本発明は、少なくとも１残基のシュードプロリン、直接配列の少なくとも２つのグルタミン酸残基（Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）；および場合により少なくとも一つの保護基を含むインスリン分泌性ペプチドまたはその対応物に関し、ここで、そのペプチドは、配列番号２〜３１のいずれかに示される少なくとも一つのアミノ酸配列を含む。
【００６４】
少なくとも１残基のシュードプロリン、直接配列の少なくとも２つのグルタミン酸残基（Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）；および場合により少なくとも一つの保護基を含むインスリン分泌性ペプチドまたはその対応物が特に好ましく、ここで、そのペプチドは、配列番号２、３、４、１２、１３、１４、２２、２３、および２４のいずれかに示される少なくとも一つのアミノ酸配列を含む。
【００６５】
別の局面では、本発明は、配列番号３５〜３９のいずれか一つに示されるフラグメントまたはその対応物から成る群より選択されるペプチドフラグメントに関する。
【００６６】
別の局面では、本発明は、配列番号４０〜４２のいずれか一つに示されるフラグメントまたはその対応物から成る群より選択されるペプチドフラグメントに関する。
【００６７】
別の局面では、本発明は、配列番号４３〜４５のいずれか一つに示されるフラグメントまたはその対応物から成る群より選択されるペプチドフラグメントに関する。
【００６８】
別の局面では、本発明は、配列番号４６〜４９のいずれか一つに示されるフラグメントまたはその対応物から成る群より選択されるペプチドフラグメントに関する。
【００６９】
別の局面では、本発明は、以下の工程を含む、インスリン分泌性ペプチドを作製する方法に関する：
ａ）第一、第二、および第三のペプチドフラグメントを提供すること（該第一のフラグメントは、少なくとも二つの繰り返しＧｌｕ残基を含み、少なくとも１残基のシュードプロリンを含み、該フラグメントのいずれかは、場合により少なくとも一つの保護基を含む）；
ｂ）セリン残基と第三のペプチドフラグメントをカップリングして、第四のペプチドフラグメントを得ること、
ｃ）第四のフラグメントと第二のフラグメントをカップリングして、第五のフラグメントを得ること；
ｄ）第五のペプチドフラグメントと第一のペプチドフラグメントをカップリングして、インスリン分泌性ペプチドを得ること。
【００７０】
好ましい局面では、その方法は、ペプチドを単離する工程、すなわち以下の工程をさらに含む：
ｅ）ペプチドをクロマトグラフィー精製すること；および
ｆ）精製されたペプチドを沈殿させること。
【００７１】
好ましくは、上記と同義の工程ａ）は、配列番号３４：
【００７２】
【表１７】
0005473925.tif 000024
［式中、Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（４−５）、Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（６−７）、Ｔｈｒ−Ｓｅｒ（７−８）およびＬｅｕ−Ｓｅｒ（１０−１１）より選択される少なくとも一つの位置は、シュードプロリンにより置き換えられている］のアミノ酸配列を含む第一のペプチドフラグメントを提供することを含み、該フラグメントは、場合により側鎖保護を含む。
【００７３】
さらに好ましくは、工程ａ）は、配列番号２〜３１のいずれか一つに示されるフラグメントから成る群より選択される第一のペプチドフラグメントを提供することを含む。
【００７４】
好ましい局面では、本発明は、以下の工程を含む上記と同義のインスリン分泌性ペプチドを作製する方法に関する：
ａ）配列番号２〜３１のいずれか一つに示されるフラグメントから成る群より選択される第一のペプチドフラグメントまたはその対応物、配列番号３５、３７〜３９のいずれか一つに示されるフラグメントまたはその対応物から成る群より選択される第二のペプチドフラグメント、および配列番号４１または４２に示されるフラグメントまたはその対応物から成る群より選択される第三のペプチドフラグメントを提供すること；
ｂ）セリン残基と第三のペプチドフラグメントをカップリングして第四のペプチドフラグメントを得ること、
ｃ）第四のフラグメントと第二のフラグメントをカップリングして第五のフラグメントを得ること；
ｄ）第五のペプチドフラグメントと第一のペプチドフラグメントをカップリングしてインスリン分泌性ペプチドを得ること。
【００７５】
好ましくは、第一、第二、および第三のフラグメントを、固相合成技法を使用して合成し、第四および第五のフラグメントならびにインスリン分泌性ペプチドを溶液相中で形成する。
【００７６】
工程（ｂ）が、沈殿を引き起こすために少なくともエタノールを使用することを含む方法もまた好ましい。
【００７７】
さらに、配列番号２、３、４、１２、１３、１４、２２、２３および２４のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する第一のペプチドフラグメントまたはその対応物が使用される、上記と同義の方法が好ましい。
【００７８】
配列番号３５〜３９のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する第二のペプチドフラグメントまたはその対応物が使用される、上記と同義の方法もまた好ましい。
【００７９】
加えて、配列番号４０〜４２のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する第三のペプチドフラグメントまたはその対応物が使用される、上記と同義の方法が好ましい。
【００８０】
図１は、本発明による合成スキーム（１０）の概略図である。第一のペプチドフラグメント（１２）、第二のペプチドフラグメント（１４）および第三のペプチドフラグメント（１６）を固相上に調製する（工程ａ）。第四のフラグメント（２０）とセリンをカップリングすることにより第三のフラグメント（１６）から調製する（工程ｂ）。次に、第四のフラグメント（２０）と第二のフラグメント（１４）をカップリングして第五のフラグメント（２２）を提供する（工程ｃ）。最後に、第五のフラグメント（２２）と第一のフラグメント（１２）をカップリングしてインスリン分泌性ペプチド（１１）を得る（工程ｄ）。
【００８１】
下に記載された本発明の態様は、網羅的であることを意図せず、本発明を以下の詳細な説明に開示された厳密な形態に限定することも意図しない。それどころか、それらの態様は、他の当業者が本発明の原理および実施を認識および理解できるように選択および説明されている。
【００８２】
本発明は、ペプチドのアミノ酸配列に二つ以上の隣接Ｇｌｕ残基、好ましくは三つ以上の隣接Ｇｌｕ残基を含むペプチドおよびペプチドフラグメントを作製するための合成法に向けられる。本発明のペプチド分子は、保護、非保護、または部分保護されていてもよい。保護には、Ｎ末端保護、側鎖保護、および／またはＣ末端保護が含まれうる。好ましい態様では、本発明は、一般にそのような繰り返しＧｌｕ残基を有するインスリン分泌性ペプチドおよびそれらの対応物、フラグメントおよびそれらの対応物、ならびにこれらの縮合産物およびそれらの対応物の合成に向けられる。最も好ましくは、本発明は、エキセナチド、エキセナチドの対応物、およびそれらのフラグメントなどのエキセンディン類を合成するために使用される。
【００８３】
本明細書に使用するような「対応物」は、ペプチドの天然および非天然アナログ、誘導体、縮合化合物（fusion compounds）、塩などを表す。本明細書に使用するようなペプチドアナログは、一般に別のペプチドまたはペプチド対応物に比べて一つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、逆位、および／または付加などによる改変アミノ酸配列を有するペプチドを表す。置換は、一つまたは複数の天然または非天然アミノ酸を伴ってもよい。置換は、好ましくは保存的または高度に保存的であってもよい。保存的置換は、一般に同じ実効電荷ならびに一般的に同じ大きさおよび形状を有する別のアミノ酸によるアミノ酸の置換を表す。例えば、脂肪族または置換された脂肪族アミノ酸側鎖を有するアミノ酸は、それらの側鎖における炭素およびヘテロ原子の合計数の違いが約４を超えない場合に、およそ同じ大きさを有する。それらは、それらの側鎖における分枝の数の違いが約１または２を超えない場合に、およそ同じ形状を有する。それらの側鎖にフェニルまたは置換フェニル基を有するアミノ酸は、およそ同じ大きさおよび形状を有すると見なされる。５群のアミノ酸を下に挙げる。化合物中のアミノ酸を同じ群からの別のアミノ酸に置き換える結果として、一般に保存的置換が生じる。
【００８４】
第Ｉ群：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、およびＣ１−Ｃ４脂肪族またはＣ１−Ｃ４ヒドロキシル置換脂肪族側鎖（直鎖または一分枝）を有する非天然アミノ酸。
第ＩＩ群：グルタミン酸、アスパラギン酸、およびカルボン酸置換Ｃ１−Ｃ４脂肪族側鎖（非分枝または一分枝点）を有する非天然アミノ酸。
第ＩＩＩ群：リシン、オルニチン、アルギニン、およびアミンまたはグアニジノ置換Ｃ１−Ｃ４脂肪族側鎖（非分枝または一分枝点）を有する非天然アミノ酸。
第ＩＶ群：グルタミン、アスパラギン、およびアミド置換Ｃ１−Ｃ４脂肪族側鎖（非分枝または一分枝点）を有する非天然アミノ酸。
第Ｖ群：フェニルアラニン、フェニルグリシン、チロシンおよびトリプトファン。
【００８５】
本明細書に使用するような「対応物」という用語は、さらに好ましくは、ペプチドの塩、またはＣ末端でアミド化されたそれらの誘導体を表す。
【００８６】
「高度に保存された置換」は、側鎖における同じ官能基ならびにほぼ同じ大きさおよび形状を有する別のアミノ酸によるアミノ酸の置き換えである。脂肪族または置換脂肪族アミノ酸側鎖を有するアミノ酸は、それらの側鎖における炭素原子とヘテロ原子の合計数の違いが２を超えない場合に、ほぼ同じ大きさを有する。それらは、それらの側鎖に同じ数の分枝を有する場合に、ほぼ同じ形状を有する。高度に保存された置換の例には、ロイシンに対するバリン、セリンに対するトレオニン、グルタミン酸に対するアスパラギン酸、およびフェニルアラニンに対するフェニルグリシンが挙げられる。
【００８７】
「ペプチド誘導体」は、一般に一つまたは複数のその側鎖、α炭素原子、末端アミノ基、および／または末端カルボン酸基の化学的改変を有するペプチド、ペプチドアナログ、または他のペプチド対応物を表す。例として、非限定的に化学的改変には、化学的部分の付加、新しい結合の創出、および／または化学的部分の除去が挙げられる。非限定的に、アミノ酸側基での改変には、リシンのｅ−アミノ基のアシル化、アルギニン、ヒスチジン、またはリシンのＮ−アルキル化、グルタミン酸またはアスパラギン酸のカルボン酸基のアルキル化、およびグルタミンまたはアスパラギンの脱アミドが挙げられる。非限定的に、末端アミノ基の改変には、デス−アミノ、Ｎ−低級アルキル、Ｎ−ジ−低級アルキル、およびＮ−アシル（例えば、−ＣＯ−低級アルキル）改変が挙げられる。非限定的に末端カルボキシ基の改変には、アミド、低級アルキルアミド、ジアルキルアミド、および低級アルキルエステル改変が挙げられる。したがって、部分保護または完全保護ペプチドがペプチド誘導体を構成する。
【００８８】
本発明の実施において、化合物がインスリンホルモンの合成または発現を刺激する、または合成もしくは発現の刺激を引き起こすもしくは引き起こすのを助けることができるならば、その化合物は「インスリン分泌」活性を有する。好ましい実施形態では、インスリン分泌活性は、米国特許第６，８８７，８４９号および第６，７０３，３６５号に記載されたアッセイにより実証することができる。
【００８９】
例示の目的で、次式（配列番号１）を有するエキセナチドペプチド（１１）の合成に関連して、図１を参照して本発明の原理をこれから説明する：
【００９０】
【表１８】
0005473925.tif 000025
【００９１】
図１のスキーム１０は、エキセンディンペプチドおよびそれらの対応物の規模拡大された合成に特に適すると考えられる。規模拡大手順は、典型的には商業的流通に有用な量のペプチドを提供するために行われる。例えば、規模拡大された手順におけるペプチドの量は、１バッチあたり５００ｇまたは１kg、より典型的には１バッチあたり数十kg〜数百kg以上でありうる。好ましい態様では、本発明の方法は、加工（合成）時間の短縮、産物の収率の改善、産物の純度の改善、ならびに／または必要な試薬および／もしくは出発物質の量の削減などの改善を提供することができる。図１に示される合成スキーム１０は、ペプチド産物（１１）を調製するために固相および溶液相技法の組み合わせを使用する。
【００９２】
図１を参照すると、スキーム１０は、固相上にペプチド中間体フラグメント（１２）、（１４）および（１６）を合成することを含む。溶液相中で追加のアミノ酸とフラグメント（１６）をカップリングし、フラグメント（２０）を作製する。次に、結果として生じた三つのフラグメントを溶液相中で組み立てて、完全サイズのペプチド（１１）を作製する。
【００９３】
フラグメント（１２）は、一般に少なくとも８アミノ酸残基を含み、より望ましくはＨｉｓ１から１５、１６、および１７位のＧｌｕ残基の少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個、さらに好ましくは少なくとも３個全てにわたる。好都合には、この比較的大型のペプチドフラグメントの合成を容易にするために、フラグメント（１２）に一つまたは複数のシュードプロリンを組み入れる。この方式で使用されるシュードプロリン残基は、脱保護工程が実施されるまで、そのフラグメントに、または場合によりそのフラグメントを組み入れているより大きなフラグメントに組み込まれているであろう。
【００９４】
本発明の実施に使用するような「シュードプロリン」という用語は、ＳｅｒまたはＴｈｒなどのヒドロキシル官能アミノ酸の残基を含むジペプチドを表し、そのアミノ酸のヒドロキシル官能側鎖は、α−アミノと側鎖ヒドロキシルとの間のＴＦＡに不安定なプロリン様オキサゾリジン環として保護されている。オキサゾリジン環の結果として、そのペプチドは可逆的なプロリン模倣体として機能する。シュードプロリンは、一般に構築中のターゲットフラグメントの二つの隣接アミノ酸残基の代わりとなってペプチドフラグメントに置換される。シュードプロリンのＣ末端部分は、通常、オキサゾリジン環で保護されたＳｅｒまたはＴｈｒのいずれかに対応するが、隣接部分は、任意の他のアミノ酸に対応しうる。したがって、ペプチドに組み入れるような典型的なシュードプロリンの残基または部分は、一般式
【００９５】
【化１】
0005473925.tif 000026
［式中、Ｎ末端近位のΦは任意のアミノ酸残基を表し、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して適切な二価連結部分である。多くの場合に、Ｒ１は式
【００９６】
【化２】
0005473925.tif 000027
の二価部分であり、ここで、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立してＨまたはメチルなどの低級アルキルのような一価部分である。Ｒ３およびＲ４は、環構造の共構成員であってもよい。望ましくは、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立してメチルまたはＨである。さらに好ましくは、Ｒ３およびＲ４はメチルである。オキサゾリジン環で保護されたＳｅｒの場合、Ｒ２は二価部分ＣＨ２であるが、Ｔｈｒの場合、Ｒ２は二価部分−（ＣＨ３）ＣＨ−である］により表すことができる。
【００９７】
脱保護時に、Ｒ１部分は切断されて次式：
【００９８】
【化３】
0005473925.tif 000028
［式中、Ｒ２は上記と同義である］に示されるジペプチド残基を提供する。
【００９９】
図１に示されるエキセナチド（１−３９）ペプチド（１１）のフラグメント（１２）に適用されるように、比較的長いフラグメントの合成を容易にするために、フラグメントの１５、１６、および１７位のＧｌｕ残基から下流に一つまたは複数のそのようなシュードプロリンを置換して入れてもよい。配列番号１から分かるように、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ残基から下流の５、７、８、および１１位にＳｅｒまたはＴｈｒｅｅ残基がある。これは、一つまたは複数のシュードプロリンをＧｌｙ−Ｔｈｒ（４−５）、Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（６−７）、Ｔｈｒ−Ｓｅｒ（７−８）、および／またはＬｅｕ−Ｓｅｒ（１０−１１）位でフラグメント１２に置換して入れられることを示している。好ましくは、シュードプロリンは、Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（６−７）および／またはＬｅｕ−Ｓｅｒ（１０−１１）位の少なくとも一つに使用される。さらに好ましくは、対応するシュードプロリンは、Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（６−７）およびＬｅｕ−Ｓｅｒ（１０−１１）位のそれぞれに使用される。所望により第三または第四のシュードプロリンを使用することができるであろうが、これら二つの好ましい位置に一つまたは二つのシュードプロリンを使用することにより、追加的なシュードプロリンの寄与の必要なしに、フラグメント１２を比較的容易に構築するために十分な性能が提供される。
【０１００】
具体的で例示的な実施形態では、１０および１１位のＬｅｕ−Ｓｅｒの代わりに使用するために適したＦＭＯＣ保護シュードプロリンは、式１
【０１０１】
【化４】
0005473925.tif 000029
［式中、末端ＯＨは、Ｃ末端でのカップリングに利用可能な酸官能基を示す］を有する。このシュードプロリンは、表記Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ΨＭｅ，Ｍｅｐｒｏ）−ＯＨにより表すことができる。同様に、６および７位のＰｈｅ−Ｔｈｒの代わりに使用するために適したＦｍｏｃ保護シュードプロリンは、式
【０１０２】
【化５】
0005473925.tif 000030
［式中、末端ＯＨは、Ｃ末端でのカップリングに利用可能な酸官能基を示す］を有する。このシュードプロリンは、表記Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ΨＭｅ，Ｍｅｐｒｏ）−ＯＨにより表すことができる。
【０１０３】
第一フラグメント（１２）は、望ましくは式Ｘｊ，ｋエキセナチド（１−ｍ）フラグメント［式中、ｊおよびｋは、４および５、６および７、７および８、ならびに／または１０および１１位の残基と定義されるが、但し、シュードプロリンはこれらの少なくとも一つの位置に存在し；Ｘは、それぞれ独立してシュードプロリン部分であり；ｍは１５〜２０、好ましくは１７〜１９、さらに好ましくは１７または１９である］を有する。このように、好ましい態様が、固相合成に関してねじれ効果が最も問題になりうるＣ末端近位にＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕの配列を組み入れているにせよ、第一のフラグメントが例外的に長いことを認識することができる。
【０１０４】
一つまたは複数のアミノ酸残基は、常法による側鎖保護基を含んでもよい。いくつかの態様では、ペプチドフラグメント（１２）は、Ｃ末端を介して樹脂に結合してもよい。このフラグメントは、場合によりＮ末端および／またはＣ末端保護基を担持してもよい。Ｆｍｏｃ、Ａｌｌｏｃ、およびＺ部分は、それぞれペプチドフラグメントの固相合成に関して特に有用なＮ末端保護基であろう。
【０１０５】
Ｆｍｏｃは、フルオレニル−メトキシ−カルボニル部分を表す。Ａｌｌｏｃは、アリルオキシカルボニル保護基を表す。Ｚは、ベンジルオキシ−カルボニル保護基を表す。
【０１０６】
代表的な態様では、フラグメント（１２）は、以下のような一つまたは複数のペプチドフラグメントを含んでもよい：
【０１０７】
【表１９】
0005473925.tif 000031
0005473925.tif 000032
0005473925.tif 000033
0005473925.tif 000034
［配列番号２〜３１の式中、４および５位のシュードプロリンは、Ｇｌｙ−Ｔｈｒまたはその対応物に対応し；６および７位のシュードプロリンは、Ｐｈｅ−Ｔｈｒｅまたはその対応物に対応し；７および８位のシュードプロリンは、Ｔｈｒ−Ｓｅｒまたはその対応物に対応し；１０および１１位のシュードプロリンは、Ｌｅｕ−Ｓｅｒまたはその対応物に対応する。
【０１０８】
脱保護形態では、配列番号２〜１１に示されるシュードプロリン含有フラグメントは、配列番号３２：
【０１０９】
【表２０】
0005473925.tif 000035
【０１１０】
に示されるエキセナチド（１−１９）のアミノ酸配列を有する。
【０１１１】
脱保護された形態では、配列番号１２〜２１に示されるシュードプロリン含有フラグメントは、配列番号３３：
【０１１２】
【表２１】
0005473925.tif 000036
【０１１３】
に示されるエキセナチド（１−１８）のアミノ酸配列を有する。
【０１１４】
脱保護された形態では、配列番号２２〜３１に示されるシュードプロリン含有フラグメントは、配列番号３４：
【０１１５】
【表２２】
0005473925.tif 000037
【０１１６】
に示されるエキセナチド（１−１７）のアミノ酸配列を有する。
【０１１７】
固相合成は、一般にフラグメント（１２）のＣ末端からＮ末端方向で実施される。したがって、フラグメント（１２）が１７アミノ酸残基から成るならば、フラグメントのＣ末端部分に存在する１７位のアミノ酸（Ｇｌｕ−）が、固相樹脂支持体にカップリングする第一のアミノ酸残基である。次に、固相合成は、所望の配列に対応する方法でアミノ酸残基を連続的に付加することにより進行する。ペプチド中間体フラグメントの合成は、Ｎ末端残基（例えば、Ｎ末端ヒスチジン残基（Ｈｉｓ）が新生ペプチド鎖に付加された後に完了する。
【０１１８】
フラグメント（１４）は、一般に、表記エキセナチド（ｎ−ｑ）により確認することができる第二のペプチドフラグメントであり、ここで、ｎはｍ＋１（ｍは、第一のフラグメントに関して１５〜２０であると上記に定義されている）であり、ｑは２５〜３０である。したがって、フラグメント（１４）のＮ末端は、１６〜２０位のいずれかのアミノ酸残基であってもよく、Ｃ末端は、エキセナチドまたはその対応物の２５〜３０位のいずれかでありうる。好ましい態様では、ｎは１８〜２０であり、ｑは２６〜３０である。フラグメント（１４）の一つまたは複数のアミノ酸残基は、常法による側鎖保護基を含んでもよい。いくつかの態様では、ペプチドフラグメント（１４）は、Ｃ末端を介して樹脂に結合してもよい。このフラグメントは、場合によりＮ末端および／またはＣ末端保護基を担持してもよい。Ｆｍｏｃ、Ａｌｌｏｃ、およびＺ部分は、それぞれペプチドフラグメントの固相合成に関して特に有用なＮ末端保護基であろう。代表的な態様では、フラグメント（１４）は以下のようなアミノ酸配列を有しうる：
【０１１９】
【表２３】
0005473925.tif 000038
【０１２０】
上に述べたように、固相合成は、一般にフラグメント（１４）のＣ末端からＮ末端方向に実施される。したがって、フラグメント（１４）が２６位で終止するならば、そのフラグメントのＣ末端部分に存在するロイシン（Ｌｅｕ）アミノ酸は、固相樹脂支持体にカップリングする第一のアミノ酸残基である。次に、固相合成は、所望の配列に対応する方法でアミノ酸残基を連続的に付加することにより進行する。ペプチド中間体フラグメントの合成は、Ｎ末端残基（例えば、１８位のＮ末端アラニン残基（Ａｌａ）で終止するフラグメント（１４）の場合）が新生ペプチド鎖に付加された後に完了する。
【０１２１】
フラグメント（１６）は、表記エキセナチド（ｑ＋１−３８）により一般に確認できる第三のペプチドフラグメントであり、ここで、ｑは、第二のフラグメントに関して上記に定義されている。多くの場合にフラグメント（１６）は、ネイティブなエキセナチドのＣ末端の３９位残基にセリン（Ｓｅｒ）残基をまだ含まないことに留意されたい。続いて多くの場合に、溶液相中で好ましくは側鎖保護を有するセリンを使用して、フラグメント（１６）のＣ末端にセリンをカップリングする。
【０１２２】
フラグメント（１６）の一つまたは複数のアミノ酸残基は、常法による側鎖保護基を含んでもよい。いくつかの態様では、ペプチドフラグメント１６は、Ｃ末端を介して樹脂に結合していてもよい。このフラグメントは、場合によりＮ末端および／またはＣ末端保護基を担持してもよい。Ｆｍｏｃ、Ａｌｌｏｃ、およびＺ部分は、それぞれペプチドフラグメントの固相合成に関して特に有用なＮ末端保護基であろう。代表的な態様では、フラグメント（１６）は、以下のようなアミノ酸配列を有しうる：
【０１２３】
【表２４】
0005473925.tif 000039
【０１２４】
固相合成は、一般にフラグメント（１６）のＣ末端からＮ末端方向に実施される。したがって、フラグメントのＣ末端部分に存在するＰｒｏ３８アミノ酸は、固相樹脂支持体にカップリングする第一のアミノ酸残基である。次に、固相合成は、所望の配列に対応する方法でアミノ酸残基を連続的に付加することにより進行する。ペプチド中間体フラグメントの合成は、Ｎ末端残基の後に完了する（例えば、フラグメント（１６）がエキセナチド（２７−３８）を含む態様では、Ｎ末端リシン残基（Ｌｙｓ２７）が新生ペプチド鎖に付加された。フラグメント（１６）の合成に使用される任意のアミノ酸は、常法による側鎖保護を含んでもよい。
【０１２５】
図１の参照を続けると、フラグメント（１２）、（１４）および（１６）は、望ましくは溶液相カップリング技法を使用して所望のペプチド（１１）を完成させるために、セリンと一緒に組み立てられる。フラグメントが側鎖保護基を担持し、シュードプロリン残基を組み入れている限り、溶液相カップリングの間にこれらの保護は所定の位置に保たれる。同様に反応物のＮ末端およびＣ末端は、適切に保護される。これらのカップリングを達成するために、溶液相中でセリンをフラグメント（１６）に付加し、中間体フラグメント（２０）を産生する。例として、フラグメント（１６）の様々な態様にＳｅｒ３９を付加することにより、以下のような一つまたは複数のフラグメント（２０）を産生することができる：
【０１２６】
【表２５】
0005473925.tif 000040
【０１２７】
次に、ペプチドフラグメント（１４）および（２０）を溶液相中でカップリングし、中間体保護フラグメント（２２）をもたらす。例として、以下が、好ましいフラグメント（２２）の好ましい態様である：
【０１２８】
【表２６】
0005473925.tif 000041
【０１２９】
次に、ペプチドフラグメント（１２）および（２２）を溶液相中でカップリングしてシュードプロリン含有ペプチド（１１）をもたらす。他のアミノ残基が側鎖保護を担持する限り、この保護は、望ましくはこの工程にわたり維持される。例として、結果として生じる好ましいペプチド（１１）の好ましい態様は以下の通りである：
【０１３０】
【表２７】
0005473925.tif 000042
0005473925.tif 000043
0005473925.tif 000044
0005473925.tif 000045
0005473925.tif 000046
0005473925.tif 000047
【０１３１】
配列番号５０〜７９において、Ｘ４−Ｘ５、Ｘ６−Ｘ７、Ｘ７−Ｘ８、およびＸ１０−Ｘ１１の対は、それぞれ上記と同義のシュードプロリン残基を構成する。
【０１３２】
図１の反応スキームを実施するにあたり、固相および溶液相合成を産業界で公知の標準法により実施することができる。代表的な実施形態では、アミノ酸をＣ末端からＮ末端に付加する化学反応を使用して、ペプチドを固相中で合成する。したがって、特定のフラグメントのＣ末端近位のアミノ酸またはペプチド基を、最初に樹脂に付加する。これは、アミノ酸またはペプチド基のＣ末端官能基と樹脂支持体上の相補的官能基を反応させることにより起こる。アミノ酸またはペプチド基のＮ末端側は、望まれない副反応を防止するためにマスクする。アミノ酸またはペプチド基は、また、望ましくは側鎖保護も同様に含む。次に、関心が持たれるペプチドが形成するまで、支持体に結合したペプチド物質にアミノ酸またはペプチド基を連続的に結びつける。これらの大部分もまた、常法による側鎖保護を含む。連続的にカップリングするたびに、樹脂に結合したペプチド物質のＮ末端のマスキング基を除去する。次に、これと、Ｎ末端がマスクされた次のアミノ酸のＣ末端を反応させる。したがって、固相合成の産物は樹脂支持体に結合したペプチドである。
【０１３３】
固相ペプチド合成の実施に適した任意の種類の支持体を使用することができる。好ましい態様では、支持体は、ポリアミド、ポリスルファミド、置換ポリエチレン、ポリエチレングリコール、フェノール樹脂、多糖、またはポリスチレンなどの一つまたは複数のポリマー、コポリマーまたはポリマーの組み合わせから作ることのできる樹脂を含む。ポリマー支持体は、また、ペプチド合成に使用される溶媒に十分に不溶性で不活性な任意の固体でありうる。固体支持体は、典型的には成長中のペプチドが合成時にカップリングしている連結部分であって、支持体からペプチドを放出させるための所望の条件で切断することのできる連結部分を含む。適切な固体支持体は、光切断可能な、ＴＦＡ切断可能な、ＨＦ切断可能な、フッ化物イオンで切断可能な、還元的に切断可能な；Ｐｄ（Ｏ）切断可能な；求核的に切断可能な；またはラジカル切断可能なリンカーを有しうる。好ましい連結部分は、切断されたペプチドの側鎖基がまだ実質的に包括的に保護されるような条件で切断可能である。
【０１３４】
好ましい一合成方法では、ペプチド中間体フラグメントは、トリチル基を含む酸感受性固体支持体上で、さらに好ましくはペンダント塩素族を有するトリチル基を含む樹脂、例えば２−クロロトリチルクロリド（２−ＣＴＣ）樹脂上で合成する（Barlos et al. (1989) Tetrahedron Letters 30(30):3943-3946）。例には、また、トリチルクロリド樹脂、４−メチルトリチルクロリド樹脂、４−メトキシトリチルクロリド樹脂、４−アミノブタン−１−オール２−クロロトリチル樹脂、４−アミノメチルベンゾイル２−クロロトリチル樹脂、３−アミノプロパン−１−オール２−クロロトリチル樹脂、ブロモ酢酸２−クロロトリチル樹脂、シアノ酢酸２−クロロトリチル樹脂、４−シアノ安息香酸２−クロロトリチル樹脂、グリシノール（glicinol）２−クロロトリチル樹脂、プロピオン酸２−クロロトリチル樹脂、エチレングリコール２−クロロトリチル樹脂、Ｎ−Ｆｍｏｃヒドロキシルアミン２−クロロトリチル樹脂、ヒドラジン２−クロロトリチル樹脂も挙げられる。いくつかの好ましい固体支持体には、ジビニルベンゼンとコポリマー化することができ、反応性基がアンカーされる支持体物質を形成するポリスチレンが挙げられる。
【０１３５】
固相合成に使用される他の樹脂には、４−ヒドロキシメチルフェニルオキシメチルアンカー基を有するスチレンとジビニルベンゼンとのコポリマーを含む「ワング」樹脂（Wang, S. S. 1973, J. Am. Chem. Soc）、および４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸樹脂（Richter et al. (1994), Tetrahedron Letters 35(27):4705-4706）が挙げられる。ワング、２−クロロトリチルクロリド、および４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸樹脂は、例えば、Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, Californiaから購入することができる。
【０１３６】
固相合成用の樹脂を調製するために、その樹脂を適切な溶媒中で予備洗浄することができる。例えば、２−ＣＴＣ樹脂などの固相樹脂をペプチドチャンバーに添加し、適切な溶媒で予備洗浄する。予備洗浄溶媒は、カップリング反応に使用される溶媒（または溶媒の混合物）の種類に基づいて選択してもよいし、またはその逆でもよい。洗浄に、そしてその後のカップリング反応にも適した溶媒には、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、ジクロロエタン（ＤＣＥ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）など、およびこれらの試薬の混合物が挙げられる。他の有用な溶媒には、ＤＭＳＯ、ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、Ｎ−メチルピロリジン、およびそれらの混合物が挙げられる。いくつかの場合では、カップリングは、ＤＭＦとＤＣＭの９：１〜１：９、さらに通例には４：１〜１：４の容量比の混合物などの二成分溶媒系で行うことができる。
【０１３７】
特に注記しない限り、本発明の合成は、好ましくは適切な保護基の存在下で実施される。保護基の性質および使用は、当技術分野で周知である。一般に、適切な保護基は、それが結びつけられる原子または部分、例えば酸素または窒素が加工および合成時に望まれない反応に関与することを防止することを助けることのできる任意の種類の基である。保護基には、側鎖保護基およびアミノ保護基またはＮ末端保護基が含まれる。保護基は、また、カルボン酸、チオールなどの反応または結合も防止することができる。
【０１３８】
「側鎖保護基」は、側鎖の部分がペプチドの合成、加工などの工程に使用される化学物質と反応することを防止することを助ける、アミノ酸の側鎖（すなわちアミノ酸一般式Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｒ）（Ｈ）−ＣＯＯＨにおけるＲ基）とカップリングした化学部分を表す。側鎖保護基の選択は、様々な要因、例えば行われる合成の種類、ペプチドが供されるであろう加工、および所望の中間体産物または最終産物に依存しうる。側鎖保護基の性質は、アミノ酸自体の性質にも依存する。一般に、固相合成時にα−アミノ基の脱保護の間に除去されない側鎖保護基が選択される。したがって、α−アミノ保護基および側鎖保護基は、典型的には同じでない。
【０１３９】
いくつかの例では、そして固相合成および他のペプチド加工に使用される試薬の種類に応じて、アミノ酸は、側鎖保護基の存在を必要としないことがある。そのようなアミノ酸は、典型的には側鎖に反応性酸素、窒素、または他の反応性部分を含まない。
【０１４０】
側鎖保護基の例には、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ｔｅｒｔ−ブチル（ｔＢｕ）、トリフェニルメチル（トリチル）、テトラヒドロピラニル、ベンジルエーテル（Ｂｚｌ）および２，６−ジクロロベンジル（ＤＣＢ）、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、４−ニトロベンゼンスルホニル（Ｎｓ）、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）、ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（ｐｂｆ）、アダマンチルオキシカルボニル、キサンチル（Ｘａｎ）、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル、メチルエステル、エチルエステルおよびｔ−ブチルエステル（ＯｔＢｕ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−Ｃｌ−Ｚ）、ｔ−アミルオキシカルボニル（Ａｏｃ）、および芳香族または脂肪族ウレタン型保護基、ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）などの光に不安定な基；ならびにトリメチルシリルオキシカルボニル（ＴＥＯＣ）などのフッ化物に不安定な基が挙げられる。好ましい側鎖基は、ｔｅｒｔ−ブチル（ｔＢｕ）、トリフェニルメチル（トリチル）、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）、ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（ｐｂｆ）、ｔ−ブチルエステル（ＯｔＢｕ）およびベンジルオキシカルボニル（Ｚ）である。
【０１４１】
本発明の実施にあたりエキセナチドペプチドを合成するために通常使用されるアミノ酸のための好ましい側鎖保護基を、次の表Ａに示す：
【０１４２】
【表２８】
0005473925.tif 000048
＊ｐｂｆは、ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル基を表す。保護アミノ酸は、Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−ＮＧ−２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル−Ｌ−アルギニンであり、次式を有する：
【０１４３】
【化６】
0005473925.tif 000049
【０１４４】
「アミノ末端保護基」は、アミノ酸のαアミノ基にカップリングした化学部分を含む。典型的には、アミノ末端保護基は、成長中のペプチド鎖に付加されるべき次のアミノ酸の付加前に脱保護反応で除去されるが、ペプチドが支持体から切断されるときには維持することができる。アミノ末端保護基の選択は、様々な要因、例えば行われる合成の種類および所望の中間体産物または最終産物に依存しうる。
【０１４５】
アミノ末端保護基の例には、（１）ホルミル、アクリリル（Ａｃｒ）、ベンゾイル（Ｂｚ）およびアセチル（Ａｃ）などのアシル型保護基；（２）ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）および置換Ｚなどの芳香族ウレタン型保護基、例えばｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル；（３）脂肪族保護基、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、アリルオキシカルボニルなど；（４）シクロアルキルウレタン型保護基、９−フルオレニル−メチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、およびシクロヘキシルオキシカルボニルなど；（５）チオウレタン型保護基、フェニルチオカルボニルなどが挙げられる。好ましい保護基には、９−フルオレニル−メチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、２−（４−ビフェニリル）−プロピル（２）オキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、２−フェニルプロピル（２）−オキシカルボニル（Ｐｏｃ）およびｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）が挙げられる。
【０１４６】
結果として生じたペプチドを保護された状態で切断することが弱酸性切断剤を使用して比較的簡単に実施される限り、ＦｍｏｃまたはＦｍｏｃ様化学反応は固相ペプチド合成に大いに好ましい。この種類の切断反応は、結果として生じる副産物、不純物などに関して比較的清浄であり、膨潤洗浄および収縮洗浄の両方からペプチドを大規模に回収することを技術的および経済的に実行可能にして収率を上げる。本明細書に使用するようなペプチド合成に関する「大規模」は、一般に１バッチあたり少なくとも５００ｇ、さらに好ましくは少なくとも２kgの範囲のペプチドの合成を含む。大規模合成は、典型的には樹脂、溶媒、アミノ酸、カップリング用化学物質などの試薬の量および脱保護反応に適応することができる鋼製反応容器などの大型反応容器で行われ、その容器は、キログラム〜メートルトン範囲のペプチドの生産を可能にする大きさである。
【０１４７】
追加的に、Ｆｍｏｃを切断した場合に側鎖保護が所定の位置に残るように、側鎖保護基に対してＦｍｏｃ保護基をペプチドから選択的に切断することができる。この種の選択性は、アミノ酸カップリング時に側鎖の反応を最小限にするために重要である。また、Ｆｍｏｃに対して側鎖保護基を除去するために、側鎖保護基を選択的に切断し、Ｆｍｏｃを所定の位置に残すことができる。この後者の選択性は、さらに下に記載する精製スキームの際に好都合に頼られる。
【０１４８】
固相カップリング反応は、カップリング反応を増強または改善する一つまたは複数の化合物の存在下で行うことができる。反応速度を増大させ、副反応の速度を減少することができる化合物には、第三級塩基、例えば、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）およびトリエチルアミン（ＴＥＡ）の存在下で保護アミノ酸を活性化種（例えば、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰＯ、ＨＢＴＵ、およびＴＢＴＵは全てＨＯＢｔエステルを生成する）に変換することのできるホスホニウム塩およびウラニウム塩が含まれる。他の試薬は、保護試薬を提供することによりラセミ化の防止を助ける。これらの試薬には、カルボジイミド（例えばＤＣＣまたはＷＳＣＤＩ）に補助求核剤（例えば、１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、またはＨＯＳｕ）を添加したものが挙げられる。クロロギ酸イソブチルに補助求核剤を添加したもの、または添加していないものを使用した混合無水物法もまた、それに関連する低いラセミ化が原因で、アジド法と同様に利用することができる。これらの種類の化合物は、また、カルボジイミド介在性カップリングの速度を増大させることができ、ＡｓｎおよびＧｌｎ残基の脱水を防止することができる。
【０１４９】
カップリングが完了したと判定した後で、カップリング反応混合物を溶媒で洗浄し、ペプチド物質のそれに続くアミノ酸残基のそれぞれについてカップリングサイクルを繰り返す。次のアミノ酸をカップリングするために、樹脂と結合した物質からのＮ末端保護基（例えばＦｍｏｃ基）の除去は、典型的にはＮ−メチルピロリジン（ＮＭＰ）またはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などの溶媒に２０〜５０％（重量に基づく）ピペリジンを含む試薬を用いた処理により達成される。Ｆｍｏｃ保護基の除去後に、典型的には数回の洗浄を行い、残留ピペリジンおよびＦｍｏｃ副産物（ジベンゾフルベンおよびそのピペリジン付加物など）を除去する。
【０１５０】
続くアミノ酸は、樹脂支持体上のペプチド物質のローディング係数に対して化学量論的に過剰のアミノ酸で利用することができる。一般に、カップリング工程に使用されるアミノ酸の量は、樹脂上の第一のアミノ酸のローディング係数と少なくとも等しい（１当量以上）。好ましくは、カップリング工程に使用されるアミノ酸の量は、少なくとも１．３当量（０．３過剰）以上、最も好ましくは約１．５当量（０．５過剰）以上である。一部の場合では、例えばカップリング工程は、１〜３の範囲のアミノ酸当量を利用する。
【０１５１】
最終カップリングサイクルの後で、樹脂をＮＭＰなどの溶媒で洗浄し、次にＤＣＭなどの第二の不活性溶媒で洗浄する。合成されたペプチド物質を樹脂から取りはずすために、切断されたペプチド物質がまだ十分な側鎖保護基および末端保護基を担持するような方法で切断処理を実施する。所定の位置に保護基を残すことは、樹脂の切断の間またはその後にペプチドフラグメントの望まれないカップリングまたは他の望まれない反応を防止することを助ける。Ｆｍｏｃまたは類似の化学反応をペプチドの合成に使用する場合に、保護された切断を任意の所望の方法で、例えばＤＣＭなどの溶媒中に酢酸または希ＴＦＡなどの比較的弱酸の試薬を使用することにより、達成することができる。０．５〜１０重量％の、好ましくは１〜３重量％のＴＦＡ濃度のＤＣＭ溶液を使用することが典型的である。例えば米国特許第６，２８１，３３５号を参照されたい。
【０１５２】
固相樹脂からペプチド中間体フラグメントを切断する工程は、以下のような例示的なプロセスに沿って進行することができる。しかしながら、樹脂からペプチド中間体フラグメントを効果的に切断する任意の適切なプロセスを使用することができる。例えば、樹脂に結合したペプチド物質が入った容器に約５〜２０容、好ましくは約１０容の酸性切断試薬含有溶媒を加える。その結果、典型的にはビーズの形の樹脂が試薬に浸される。液体内容物を適温で適切な時間かき混ぜると、切断反応が起こる。かき混ぜは、ビーズの凝集防止に役立つ。適切な時間および温度条件は、使用される酸試薬、ペプチドの性質、樹脂の性質などの要因に依存するものである。一般的な指針として、約−１５℃〜約５℃、好ましくは約−１０℃〜約０℃で約５分〜２時間、好ましくは約２５分〜約４５分の撹拌が適切であろう。切断時間は、約１０分から約２時間の範囲、または１日の長きにわたることもありうる。切断は、望ましくは、反応の間に典型的に起こりうる反応性発熱と適合するようにそのような冷却温度範囲で実施される。加えて、より低温の切断反応は、ｔｒｔ基などの酸感受性側鎖保護基がこの工程で除去されることを防止する。
【０１５３】
切断処理の最後に、反応をクエンチする。これは、例えば切断試薬をピリジンなどの適切な塩基と混合すること、および追加的に５分〜２時間、好ましくは約２０分から約４０分などの追加的な時間かき混ぜ、撹拌し続けることによって達成することができる。塩基の添加およびかき混ぜの継続は、容器内容物の温度の増大を引き起こす。かき混ぜの終わりに、容器内容物は、約０℃〜約１５℃、好ましくは約５℃〜約１０℃の範囲にありうる。
【０１５４】
ペプチドの回収の局面を改善するために、樹脂を膨潤および収縮させるなどの要因を、場合により合成プロセス全体に組み入れてもよい。これらの技法は、例えば、米国特許公報第２００５／０１６４９１２Ａ１号に記載されている。
【０１５５】
いくつかの局面では、他のペプチドフラグメントおよび／またはアミノ酸との溶液相カップリングのために、切断されたペプチドフラグメントを調製することができる。溶液相におけるペプチドカップリング反応は、例えば、New Trends in Peptide Coupling Reagents; Albericio, Fernando; Chinchilla, Rafeal; Dodsworth, David J.; and Najera, Armen; Organic Preparations and Procedures International (2003), 33(3), 203-303に総説されている。
【０１５６】
ペプチドフラグメントは、好ましくは溶液相カップリングを行う前に単離する。例えば、フラグメント（１２）に適用可能な例示的な一単離戦略によると、フラグメント（１２）を水で１回または複数回抽出する。乳濁物が生じたならば、本発明により塩水を採用する。例示的な塩水は、望ましくは濾過して固体を除去したＮａＣｌ飽和溶液である。塩水は、乳濁物の崩壊を助け、ＤＣＭ相と水相の間によりよい分離層を与える。より高い収率の達成を助けるために逆抽出を利用してもよい。蒸留を利用して、樹脂からの切断に使用されたジクロロメタンを減少させ、続いて少なくとも数回の洗浄を行い、それに続いて単離に供する産物を固体として沈殿させるためにヘプタンを添加する。蒸留により任意の残りのジクロロメタンを２５容量％未満までさらに減少させる。沈殿したフラグメント（１２）をヘプタンで洗浄し、次に最大３５℃の温度で真空下で乾燥させ、単離を完了する。
【０１５７】
対照的に、フラグメント（１４）は、さらに容易に乳化するおそれがある。したがって、水抽出は、フラグメント（１４）の単離のための初期工程としてはあまり望ましくない。その代わりに、例示的な単離戦略は、最初に蒸留によりジクロロメタン（ＤＣＭ）を減少させ、次に水への２５％のＩＰＡ（イソプロパノール）を添加し、残りのジクロロメタンは、蒸留により２５容量％未満までさらに減少させる。沈殿したフラグメント（１４）を単離し、２５％ＩＰＡ／水で洗浄し、次に最大３５℃の温度で真空下で乾燥させる。
【０１５８】
水中で抽出した場合にフラグメント（１６）の乳濁物が一般に形成しない点において、フラグメント（１６）の単離は、フラグメント（１２）の単離と類似している。したがって、上に特定されたフラグメント（１２）についての単離プロトコールを、フラグメント（１６）について追随してもよい。
【０１５９】
溶液相におけるペプチド中間体フラグメントと他のフラグメントまたはアミノ酸とのカップリングは、in situカップリング試薬、例えば、ＢＯＰ、６−クロロ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（６−Ｃｌ−ＨＯＢＴ）、ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、ＨＡＴＵ、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣＤＩ）、またはｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）を使用して実施することができる。他のカップリング技法は、ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）およびｐ−ニトロフェノール（ＨＯＮｐ）エステルなどの予備形成した活性エステル；予備形成した対称無水物；Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）などの非対称無水物；またはフッ化アシルおよび塩化アシルなどの酸ハライドを使用する。
【０１６０】
溶液相カップリング反応に、適切なカップリング溶媒を使用することができる。使用されるカップリング溶媒は、形成するペプチド結合のラセミ化度；ペプチドおよび／またはペプチドフラグメントの溶解度；ならびにカップリングの反応速度に影響を及ぼしうることが了解されている。いくつかの態様では、カップリング溶媒は、一つまたは複数の水混和性試薬を含む。水混和性溶媒の例には、例えば、ＤＭＳＯ、ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、Ｎ−メチルピロリジン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジオキサン、またはそれらの混合物が挙げられる。
【０１６１】
他の態様では、カップリング反応は、一つまたは複数の水非混和性試薬を含むことがある。水非混和性溶媒の例はメチレンクロリドである。これらの態様では、水非混和性溶媒は、好ましくは脱保護反応と適合性であり；例えば、水非混和性溶媒が好ましく使用されるならば、その溶媒は脱保護反応に有害な影響を及ぼさない。
【０１６２】
ペプチド（１１）が形成した後で、所望により産物を脱保護、クロマトグラフィー精製、凍結乾燥および／または沈殿、さらなる加工（例えば別のペプチドと反応させて融合タンパク質を形成させる）；これらの組み合わせなどに供することができる。
【０１６３】
例えば本発明によると、側鎖保護基およびいくつかの末端保護基は、典型的には固相合成の間ずっと、そして溶液相カップリング反応に入るときおよびその間にもずっとペプチド中間体フラグメント上に保持される。一般に、溶液相カップリング工程が完了後に、一つまたは複数の脱保護工程を行い、ペプチドから一つまたは複数の保護基を除去することができる。
【０１６４】
包括的脱保護による保護基の除去は、典型的には側鎖保護基を切断するための酸性溶解剤を含む脱保護溶液を利用する。包括的脱保護のために通常使用される酸分解試薬には、ニートなトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ＨＣｌ、ＢＦ３Ｅｔ２ＯまたはＭｅ３ＳｉＢｒなどのルイス酸、液体フッ化水素酸（ＨＦ）、臭化水素（ＨＢｒ）、トリフルオロメタンスルホン酸、およびそれらの組み合わせが挙げられる。脱保護溶液は、一つまたは複数の適切なカチオンスカベンジャー、例えば、ジチオスレイトール、アニソール、ｐ−クレゾール、エタンジチオール、またはジメチルスルフィドもまた含む。脱保護溶液は、水もまた含みうる。本明細書に使用するような脱保護組成物に存在する試薬の量は、典型的には比で表現されるが、ここで、個別の構成要素の量は、分子が「重量部」または「容量部」などの「部」単位で、分母が組成物中の合計部である。例えば、ＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：ＤＴＴを９０：５：５（重量／重量／重量）の比で含有する脱保護溶液は、９０／１００重量部のＴＦＡ、５／１００重量部のＨ２Ｏ、および５／１００重量部のＤＴＴを有する。
【０１６５】
いくつかの態様では、脱保護組成物中の酸分解薬剤、好ましくはＴＦＡの量が９０／１００重量部を超える脱保護反応を行うことができる。他の好ましい脱保護組成物は、９３／１００重量部以上の量、または９３／１００重量部〜９５／１００重量部の範囲の量で酸分解薬剤の量を含む。
【０１６６】
粗固体沈殿は、様々な方法で精製することができる。例示的な戦略によると、粗ペプチドを緩衝液に溶解し、逆相クロマトグラフィーにより精製する。クロマトグラフィーフラグメントを水で希釈し、次に逆相クロマトグラフィー媒体で濃縮する。クロマトグラフィーの後に一つまたは複数の戦略を使用してペプチドを単離してもよい。一戦略によると、通常の凍結乾燥戦略を使用することができる。または、沈殿形成戦略を使用してペプチドを単離してもよい。沈殿形成が特に好都合である。最初に、沈殿形成は凍結乾燥よりもずっと経済的で、工業規模で適用することが、より容易である。また、ペプチドの純度をさらに向上させる機会がもしあれば凍結乾燥はほとんど提供しないものの、塩および他の可溶性純物質が溶液中に留まることから、沈殿形成はペプチドの純度を向上させる。特に塩は容易に洗浄除去される。沈殿形成は非常に低い残留塩含量を有する精製ペプチドを提供する。
【０１６７】
典型的なクロマトグラフィー精製は、水およびアセトニトリルなどの液体媒質中のペプチドを主構成要素として提供する。また、ＴＦＡ対イオンが存在しがちである。沈殿形成を達成するためには、製剤化用の酢酸、クエン酸、コハク酸、有機カルボン酸などの対イオンに転換することが望ましい。この転換は、逆相媒体またはイオン交換媒体のカラムを使用して容易に達成される。そのようなカラムは、またペプチドを濃縮する傾向にあり、溶媒系をペプチドの単離に適切なもう一つの溶媒系に交換する。結果として生じる典型的な溶媒は、約４〜約８重量部：１重量部のエタノール／水である。この転換の後に、クロマトグラフィーから溶出した画分をエタノール単独で、または他のアルコールもしくは酢酸エチルなどの有機溶媒と組み合わせて沈殿させる。沈殿を濾過し、次にエタノールで洗浄し、乾燥させ、パッケージに入れ、保存し、さらに加工し、かつ／またはその他の取り扱いを行う。
【０１６８】
無水（anhydrous）エタノール（無水(absolute）または変性）を約１０〜約５０分などの時間をかけて添加する。より良い濾過特性を有するペプチドをもたらすことが見出されたことから、−１０℃〜２０℃の範囲などのコントロールされた温度で混合／かき混ぜながらこの添加を行う。
【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１】図１は、本発明による合成スキームの概略図である。
【０１７０】
本発明の原理を、これから以下の実際の実施例に関してさらに説明する。特に明確に述べない限り、以下において全てのパーセンテージおよび比は容量あたりである。
【０１７１】
実施例１  −  Ｎ末端にＦｍｏｃ保護を有するフラグメント（１２）、エキセナチド（１−１７）ＯＨの固相合成
Ａ．  Ｆｍｏｃ−Ｈ−Ｇｌｕ−をロードした２ＣＴＣ樹脂の調製
Ｆｍｏｃ−Ｈ−Ｇｌｕをロードされた２ＣＴＣ樹脂を膨潤させるためにこの樹脂をジクロロメタンと混合し、Ｎ，Ｎジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で洗う（すなわち６０mlのＤＭＦ中に１０ｇの樹脂）。
【０１７２】
Ｂ．  Ｎ末端にＦｍｏｃ保護を有するフラグメント（１２）の固相ペプチド合成（ＡＡ１−１７ＯＨ）
１．  アミノ酸のカップリング
Ｈ−Ｇｌｕ樹脂にロードされた次のアミノ酸はＦｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）ＯＨである。過剰の保護アミノ酸（例えば１．７〜２．０当量）、過剰のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ、例えば１．７〜２．０当量）および過剰のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、例えば１．９〜２．２当量）をＤＭＦ中で混合し、≦５℃に冷却する。結果として生じた溶液を過剰の２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ、例えば１．７〜２．０当量）のＤＭＦ溶液と混合する。この活性化アミノ酸溶液を樹脂と混合し、続いてジクロロメタンですすぐ。ニンヒドリン試験（下記に提供）陰性結果が得られるまで（典型的には３時間）その懸濁液を２５℃で撹拌する。
【０１７３】
ニンヒドリン試験
【０１７４】
【表２９】
0005473925.tif 000050
【０１７５】
２．  樹脂からのＦｍｏｃおよび側鎖保護フラグメントの切断
ピペリジン（典型的には５〜２０％）のＤＭＦ溶液を用いた処理によりＦｍｏｃ保護基を除去する。溶液を排出し、樹脂をＤＭＦで洗浄して残留ピペリジンを減少させる。フラグメントにおける残りのアミノ酸についてアミノ酸カップリングおよびＦｍｏｃ除去のサイクルを繰り返す。全てのシュードプロリンカップリングではＨＯＢＴを排除した。以下の保護アミノ酸が、表示順にこのフラグメントについてカップリングされるアミノ酸である：
【０１７６】
【表３０】
0005473925.tif 000051
【０１７７】
最終カップリングの後で、樹脂をＤＭＦで洗浄することで、樹脂に結合したＦｍｏｃ保護エキセナチド（１−１７）フラグメントを得るが、このフラグメントは、上記アミノ酸リストに示したようなシュードプロリン置換を有する表記ＦｍｏｃＡＡ１−１７−樹脂で表すことができる。
【０１７８】
ジクロロメタンへの希（例えば１％）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を≦１１０分間使用して、樹脂に結合したＦＡＡ１−１７ＯＨを樹脂から切断する。次に、ピリジンを添加してＴＦＡを中和させる。液体を除去し、樹脂をジクロロメタンで洗浄する。トリフルオロ酢酸のジクロロメタン溶液を用いた追加の処理に続くピリジンにより樹脂の切断を繰り返し、結果として生じた溶液を最初の切断溶液と混合してもよい。
【０１７９】
３．  ＦｍｏｃＡＡ１−７０Ｈの沈殿
ＦｍｏｃＡＡ１−１７ＯＨを水で３回抽出する。時に乳濁液が観察される。そのような場合、もしも乳濁液が生じたならば、水（straight water）抽出の代わりに塩水（すなわちＮａＣｌ飽和水溶液）を使用する。逆抽出（水性抽出物を集めたものにＤＣＭを加える）を利用して良好な収率を確実にすることを助ける。蒸留によりジクロロメタンを減少させる。次に、アンチ溶媒としてヘプタンを加え、ペプチド産物を沈殿させる。または、沈殿を引き起こすために産物のＤＣＭ溶液をヘプタンに加えてもよい。沈殿の性質、すなわち濾過性を評定することにより、所望の添加順序を経験的に決定する。＜２５vol％まで蒸留することにより、残りのジクロロメタンをさらに減少させる。沈殿したＦＡＡ１−１７ＯＨを単離し、ヘプタンで洗浄し、次に真空下で乾燥させる（最大３５℃）。
【０１８０】
実施例２  −  Ｎ末端にＦｍｏｃ保護を有するフラグメント（１４）、エキセナチド（１８−２６）ＯＨの固相合成
Ａ．  Ｆｍｏｃ−Ｈ−Ｌｅｕをロードされた２ＣＴＣ樹脂の調製
Ｆｍｏｃ−Ｈ−Ｌｅｕをロードされた２ＣＴＣ樹脂を膨潤させるために、その樹脂をジクロロメタンと混合し、Ｎ，Ｎジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で洗浄する（すなわち６０mlのＤＭＦ中に１０ｇの樹脂）。
【０１８１】
Ｂ．  固相ペプチド合成
１．  アミノ酸カップリング
樹脂にロードされる次のアミノ酸はＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）ＯＨである。過剰の保護アミノ酸（例えば１．５当量）、過剰のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ、例えば１．５当量）および過剰のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、例えば１．７当量）をＤＭＦ中で混合し、≦５℃に冷却する。結果として生じた溶液を過剰の２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ、例えば１．５当量）のＤＭＦ溶液と混合する。活性化アミノ酸溶液を樹脂と混合し、続いてジクロロメタンですすぐ。ニンヒドリン試験（上記のとおり）陰性結果が得られるまで（典型的には３時間）その懸濁液を≦２５℃で撹拌する。
【０１８２】
２．  Ｆｍｏｃの除去
ピペリジン（典型的には５〜２０％）のＤＭＦ溶液を用いた処理によりＦｍｏｃ保護基を除去する。溶液を排出し、樹脂をＤＭＦで洗浄して残留ピペリジンを減少させる。
【０１８３】
フラグメントにおける残りのアミノ酸についてアミノ酸カップリングおよびＦｍｏｃ除去のサイクルを繰り返す。以下の保護アミノ酸が、表示順にこのフラグメントについてカップリングされるアミノ酸である：
【０１８４】
【表３１】
0005473925.tif 000052
【０１８５】
最終カップリングの後で、樹脂をＤＭＦで洗浄することで、Ｆｍｏｃ保護された樹脂結合エキセナチド（１８−２６）フラグメントを得るが、このフラグメントは、表記ＦｍｏｃＡＡ１８−２６−樹脂で特定することができる。
【０１８６】
３．  樹脂からの切断
希（例えば２％）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）のジクロロメタン溶液を使用して、樹脂に結合したＦｍｏｃＡＡ１８−２６ＯＨを≦１１０分間樹脂から切断する。ピリジンを添加してＴＦＡを中和する。溶液を除去し、樹脂をジクロロメタンで洗浄する。トリフルオロ酢酸のジクロロメタン溶液を用いた追加の処理に続くピリジンにより樹脂の切断を繰り返してもよい。
【０１８７】
４．  ＦｍｏｃＡＡ１８−２６ＯＨの沈殿
ＦｍｏｃＡＡ１８−２６ＯＨは容易に乳濁するおそれがある。したがって、水抽出は勧められない。その代わりに、ジクロロメタンを蒸留により本来の容量の＜５０％に減少させ、水への２５％  ＩＰＡ（イソプロパノール）を添加し、残りのジクロロメタンを＜１０vol％に蒸留することによりさらに減少させる。沈殿したＦＡＡ１８−２６ＯＨを単離し、２５％  ＩＰＡ／水で洗浄し、次に真空下で乾燥させる（最大３５℃）。
【０１８８】
実施例３  −  Ｎ末端にＦｍｏｃ保護を有するフラグメント（１６）の固相合成：エキセナチド（２７−３８）ＯＨ
Ａ．  Ｆｍｏｃ−Ｈ−Ｌ−Ｐｒｏをロードした２ＣＴＣ樹脂の調製
Ｈ−Ｌ−Ｐｒｏ樹脂（２−Ｃｌ−トリチル）を膨潤させるために、その樹脂をジクロロメタンと混合し、Ｎ，Ｎジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で洗浄する（すなわち６０mlのＤＭＦ中に１０ｇの樹脂）。
【０１８９】
Ｂ．  固相ペプチド合成
１．  アミノ酸のカップリング
配列における次のアミノ酸Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ、過剰の保護アミノ酸（例えば１．５当量）、過剰のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ、例えば１．５当量）および過剰のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、例えば１．７当量）をＤＭＦ中で混合し、≦５℃に冷却する。結果として生じた溶液を過剰の２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ、例えば１．５当量）のＤＭＦ溶液と混合する。活性化したアミノ酸溶液を樹脂と混合し、続いてジクロロメタンですすぐ。ニンヒドリン試験（上記実施例１に提供）陰性結果が得られるまで（典型的には３時間）その懸濁液を≦２５℃で撹拌する。
【０１９０】
２．  Ｆｍｏｃの除去
ピペリジン（典型的には５〜２０％）のＤＭＦ溶液を用いた処理によりＦｍｏｃ保護基を除去する。好ましい手順は、第二級アミンの添加である（特に２番目および３番目のＦｍｏｃ除去工程の後のピペラジン＋ＨＯＢＴ（すなわち１００mlのＤＭＦ中に５ｇのピペラジン＋１．５ｇ  ＨＯＢＴ）。溶液を排出し、樹脂をＤＭＦで洗浄して残留ピペリジンを減少させる。
【０１９１】
フラグメントにおける残りのアミノ酸についてアミノ酸カップリングおよびＦｍｏｃ除去のサイクルを繰り返す。フラグメントにおける残りのアミノ酸についてこのサイクルを繰り返す。以下の保護アミノ酸が、表示順にこのフラグメントについてカップリングされるアミノ酸である：
【０１９２】
【表３２】
0005473925.tif 000053
【０１９３】
最終カップリングの後で、樹脂をＤＭＦで洗浄することで、Ｆｍｏｃ保護された樹脂結合エキセナチド（２７−３８）フラグメントを得るが、このフラグメントは、表記ＦｍｏｃＡＡ２７−３８−樹脂により特定することができる。
【０１９４】
３．  樹脂からの切断
希（例えば２％）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）のジクロロメタン溶液を使用して、樹脂結合ＦｍｏｃＡＡ２７−３８ＯＨを樹脂から≦１１０分切断する。ピリジンを添加してＴＦＡを中和する。溶液を除去し、樹脂をジクロロメタンで洗浄する。トリフルオロ酢酸のジクロロメタン溶液を用いた追加の処理に続くピリジンにより樹脂の切断を繰り返してもよい。
【０１９５】
４．  ＦｍｏｃＡＡ２７−３８ＯＨの沈殿
ＦｍｏｃＡＡ２７−３８ＯＨを３回水抽出する。乳濁が観察されたならば、前述のように塩水が勧められる。良好な収率を確実にするためにＤＣＭを用いた逆抽出を採用する。ジクロロメタンを蒸留により減少させ、ヘプタンを加え、＜２５vol％まで蒸留することにより残りのジクロロメタンをさらに減少させる。沈殿したＦＡＡ２７−３８を単離し、ヘプタンで洗浄し、次に真空下で乾燥させる（最大３５℃）。
【０１９６】
実施例４  −  溶液相ペプチド合成：セリンをフラグメント（１６）に付加
上記実施例３で調製されたフラグメント１６（１．２当量）に、過剰の６−クロロ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（６−Ｃｌ−ＨＯＢＴ；例えば、１．２〜１．４当量）、Ｌ−セリン（ｔＢｕ）アミド（例えば、１−１．２当量）およびＤＭＦを添加することにより、セリンアミドを結びつけることができる。溶液を≦５℃に冷却し、過剰のＤＩＥＡ（例えば２．０当量）およびＨＢＴＵ（例えば１．２５当量）と混合する。反応が完了する（すなわち、例えばＨＰＬＣにより≦１％のＦｍｏｃＡＡ２７−３８ＯＨ）まで、結果として生じた溶液を≦０℃に保つ。次に、Ｆｍｏｃ保護基を除去する。一つのアプローチでは、ピペリジンまたはピペラジンが結合した樹脂を反応混合物に添加し、完了するまで（すなわち、例えばＨＰＬＣにより≦１％のＦｍｏｃＡＡ２７−３９ＮＨ２）その溶液を≦０℃で撹拌する。別のアプローチでは、アミン塩基（例えば、モノエタノールアミン、ジメチルアミン、ジプロピルアミン、トリエチルアミン）を反応混合物に添加し、完了するまで（すなわち、例えばＨＰＬＣにより≦１％のＦｍｏｃＡＡ２７−３９ＮＨ２）その溶液を≦０℃で撹拌する。ジクロロメタン溶液をリン酸緩衝液（典型的にはｐＨ８〜９）で洗浄する。蒸留によりジクロロメタンを減少させる。切断溶液を水抽出し、次に、ＭＴＢＥを用いて丸底フラスコの中に沈殿させる。または、ペプチドのＤＣＭ溶液をＭＴＢＥに添加してペプチドを沈殿させる。所望の順序は、各アプローチを使用して形成した沈殿の特性を評定することにより経験的に決定することができる。残りのジクロロメタンは、＜２５vol％（例えばＧＣによる）まで蒸留することによりさらに減少させる。沈殿したＨＡＡ２７−３９ＮＨ２を単離し、ＭＴＢＥで洗浄し、次に真空下で乾燥させる（最大３５℃）。（Ｎ末端のＨは、そこのアミン官能基を表す。Ｃ末端のＮＨ２は、そこのアミド官能基を表す）。
【０１９７】
実施例５  −  溶液相ペプチド合成：エキセナチド（１８−３９）ＮＨ２（フラグメント２２）の調製（Ｃ末端のＮＨ２はアミド官能基を表す）
Ｈ−ＡＡ（２７−３９）ＮＨ２（１．２５当量）、Ｆｍｏｃ−ＡＡ（１８−２６）ＯＨ（１当量）および過剰の６−Ｃ１−ＨＯＢＴ（例えば、１．２〜１．４当量）をＤＣＭおよびＤＭＦ（１９：１）に溶解させ、結果として生じた溶液を≦２５℃に冷却する。その混合物を過剰のＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）（４当量）のＤＭＦ溶液と混ぜる。反応が完了する（すなわち、例えばＨＰＬＣにより≦１％の総Ｆｍｏｃ−ＡＡ（１８−２６）ＯＨ）まで、結果として生じた溶液を≦２５℃に保つ。必要であれば、原料および／または試薬の追加のチャージを加えてもよい。Ｆｍｏｃ基を除去するために、ピペリジンまたはピペラジンと結合した樹脂をその混合物と混合する（すなわち、例えばＨＰＬＣにより≦１％のＦｍｏｃ−ＡＡ（１８−３９）ＮＨ２）。完了した場合は、その混合物を≦２５℃で水と混合する。前述のような塩水をＤＣＭ溶液に加え、続いて４回水抽出する。この溶液を乾燥するまでストリッピングし、ＤＣＭを再度加える。蒸留によりジクロロメタンを減少させる。次に、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）を加えるか、またはそのＭＴＢＥにＤＣＭを加えるかのいずれかとし、ペプチドを沈殿させ、＜２５vol％まで（例えばＧＣによる）蒸留することにより残りのジクロロメタンをさらに減少させる。沈殿したＨＡＡ１８−３９ＮＨ２を単離し、ＭＴＢＥで洗浄し、次に真空下で乾燥させる（最大３５℃）。
【０１９８】
実施例６  −  エキセナチド（１−３９）ＮＨ２（フラグメント１１）（完全保護）の溶液相ペプチド合成
ＤＣＭ中のフラグメント２２（エキセナチド（１８−３９）ＮＨ２）（１当量）、フラグメント１２（上記で調製したエキセナチド（１−１７））（１当量）、過剰の６−Ｃｌ−ＨＯＢＴ（例えば１．４〜２当量）を≦０℃で過剰のＥＤＡＣ（例えば３〜４当量）と混合した。反応が完了するまで（すなわち、例えばＨＰＬＣにより≦１．０％のＡＡ１−１７０Ｈおよび≦１．５％のＨＡＡ１８−３９ＮＨ２）、反応混合物を撹拌する。ＡＡＦ１−３９ＮＨ２からｆｍｏｃを除去するために、ピペリジンまたはピペラジンと結合した樹脂を≦２５℃で２時間加える。反応物を１５℃に冷却する。水で反応をクエンチし、ＤＣＭに溶解させる。次に、これを４回水抽出し、乾燥するまでストリッピングする。水抽出およびＦＭＯＣ除去工程は場合により逆にすることができる。ＡＡＨ１−３９ＮＨ２をＤＣＭに溶解させる。
【０１９９】
実施例７  −  ＡＡ１−３９ＮＨ２からエキセナチドへの包括的脱保護
前例からのジクロロメタン溶液をトリフルオロ酢酸、水およびジチオトレイトールと混合する（例えば、１／０．０８／０．０１２重量％）。その混合物を≦２４℃で最大３時間撹拌し、続いて≦０℃に冷却する。その混合物を窒素下で保存する。冷ＭＴＢＥを滴下して反応混合物からペプチドを沈殿させる。産物のスラリーを０℃で１時間撹拌する。固体を濾過により単離し、ＭＴＢＥで洗浄し、≦３５℃の真空下で乾燥させる。
【０２００】
実施例８  −  脱カルボキシル化
ＩＰＡ、モノエタノールアミンまたはＤＩＥＡ、および酢酸（例えば２８：１：１v/v/v）を予備混合し、脱保護ペプチドと共に３５℃で３時間撹拌した。反応物を０℃で冷却する。ＨＡＡ１−３９ＮＨ２を濾過し、ＩＰＡですすぎ、≦３５℃の真空下で乾燥させる。
【０２０１】
実施例９  −  精製
実施例９は、包括的脱保護された粗エキセナチドを逆相クロマトグラフィーにより高ｐＨで勾配＃１を使用して精製することを説明する。
【０２０２】
下記手順に記載するように、実施例９に以下の装置を使用する：
クォータナリポンプ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム、ＵＶ検出器、およびフラクションコレクターシステム。
【０２０３】
下記手順に記載するように、実施例９に以下の試薬を使用する：
ＨＰＬＣ等級アセトニトリル（ＡＣＮ）、蒸留Ｈ２Ｏ、酢酸アンモニウムＮＨ４ＯＡｃ（ＡＣＳ等級）、および水酸化アンモニウムＮＨ４ＯＨ（ＡＣＳ等級）。
【０２０４】
実施例９の手順を以下のように説明する：
工程１．  移動相ＡおよびＢを以下のように作製した：
移動相Ａは、４ｇのＮＨ４ＯＡｃおよび２mLのＮＨ４ＯＨを１７００mLのＨ２Ｏに入れて混合することにより作製した。固体が溶解するまで混合を行った。混合後に、３００mLのＡＣＮを加えた。
【０２０５】
移動相Ｂは、４ｇのＮＨ４ＯＡｃおよび２mLのＮＨ４ＯＨを５００mLのＨ２Ｏに入れて混合することにより作製した。固体が溶解するまで混合を行った。混合後に、１５００mLのＡＣＮを加えた。
【０２０６】
工程２．  カラムを取り付け、以下の運転パラメータを設定した：
クロマトグラフィー条件：
カラム：  Kromasil C4 １０μm ２cm×２５０mm
オーブン:  外界温度
流速:  １５．５mL/min
検出器の波長:  ＶＷＤ：２８０nm
インジェクション容量：８００mgのエキセナチド含量／５０％試料／５０％  Ｈ２Ｏ。
この明細書に使用するような「粗製品」という用語は、試料全体を表す。「含量」という用語は、試料全体中のエキセナチドの量である。例えば、粗製品が純度５０％であったならば、実際のエキセナチドは、重量１ｇ毎に０．５ｇあるであろう。
運転時間：６２分＋試料のロード時間
【０２０７】
工程３  −  ５μm疎水性ＰＴＦＥフィルターを通過させて試料を濾過してから、カラムに試料をロードする
【０２０８】
工程４  −  カラムに試料をロードする
試料をロードする前に、安定なベースラインが得られるまでカラムを初期条件に条件付けする
【０２０９】
【表３３】
0005473925.tif 000054
【０２１０】
工程５．  １０．０分から１７．５分にかけて３０〜６０秒間隔で画分を収集する。
【０２１１】
工程６．  画分のプール基準：＞９７．０％の面積百分率（area normalization）の画分を収集し、単離および沈殿のためにプールする。＜９７．０％の面積百分率の収集物質を以下のように収集する：９７．０％画分の前に収集された画分を前端として混合し、９７．０％画分の後に収集された画分を後端として混合する。次に、必要に応じて前端および後端を再クロマトグラフィーにかける。
【０２１２】
実施例１０  −  精製
実施例１０は、包括的脱保護された粗エキセナチドを逆相クロマトグラフィーにより勾配＃２を使用して低ｐＨで精製することを説明する。
【０２１３】
下記手順に説明するように、以下の装置を実施例１０で使用する：
クォータナリポンプＨＰＬＣシステム、ＵＶ検出器、およびフラクションコレクターシステム。
【０２１４】
下記手順に説明するように、以下の試薬を実施例１０で使用する：
ＨＰＬＣ等級アセトニトリル（ＡＣＮ）、蒸留Ｈ２Ｏ、およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）。
【０２１５】
実施例１０の手順を以下のように説明する：
【０２１６】
工程１．  移動相ＡおよびＢは以下のように作製した：
移動相Ａは、２リットルの移動相Ａあたり１８０２．３ｇのＨ２Ｏ、１５２．０ｇのＡＣＮ、および３．０ｇのＴＦＡを混合することによって作製した（すなわち１８００mL  Ｈ２Ｏ、２００mL  ＡＣＮ、２mL  ＴＦＡ）。
移動相Ｂは、２リットルの移動相Ｂあたり１００５．２ｇのＨ２Ｏ、７７３．７ｇのＡＣＮ、および３．０ｇのＴＦＡを混合することによって作製した（すなわち１０００mL  Ｈ２Ｏ、１０００mL  ＡＣＮおよび２mL  ＴＦＡ）。
【０２１７】
工程２．  カラムを取り付け、以下の運転パラメータを設定する：
クロマトグラフィー条件：
カラム：Phenomenex Luna C18(2)  ２cm×２５０mm
オーブン:外界温度
流速:５．０mL/min
検出器の波長:ＶＷＤ：２１８nm
インジェクション容量: １ｇの実際の粗エキセナチド／２０mL  Ｈ２Ｏ（３６０mgのエキセナチド含量）
運転時間：６０分＋試料のロード時間
試料は、５μm疎水性ＰＴＦＥフィルターを通して濾過してからカラムに試料をロードする。
【０２１８】
工程３．  カラムに試料をロードする
試料をロードする前に、安定なベースラインが得られるまでカラムを初期条件に条件付けする。
【０２１９】
【表３４】
0005473925.tif 000055
【０２２０】
工程４．  １８．５分から４３．５分にかけて画分を収集する。ピークの頂点にわたり１５秒間隔で採取し、頂点の前側および後ろ側では３０〜６０秒間隔で採取した。
【０２２１】
工程５．  以下のように画分をプールする：≦８５％の面積百分率の画分を前端および後端とし、高ｐＨカラムで精製するために≧８５％の画分をプールする。
【０２２２】
実施例１１  −  精製
実施例１１は、包括的脱保護された原料エキセナチドを、低ｐＨで勾配＃３を使用した逆相クロマトグラフィーにより精製することを説明する。
【０２２３】
下記手順に記載するように、実施例１１に以下の装置を使用する：
クォータナリポンプＨＰＬＣシステム、ＵＶ検出器、およびフラクションコレクターシステム。
【０２２４】
下記手順に記載するように、実施例１１に以下の試薬を使用する：
ＨＰＬＣ等級アセトニトリル（ＡＣＮ）、蒸留Ｈ２Ｏ、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、氷酢酸（ＨＰＬＣ、Ｕ．Ｓ．Ｐ．またはＡＣＳ等級）、酢酸ナトリウム三水和物（ＨＰＬＣ、Ｕ．Ｓ．Ｐ．またはＡＣＳ等級）およびＬ−メチオニン９８％＋または等価物。
【０２２５】
実施例１１についての手順を以下のように説明する：
【０２２６】
工程１．  移動相ＡおよびＢを以下のように作製した：
移動相Ａは、２リットルの移動相Ａあたり１８０２．３ｇのＨ２Ｏ、１５２．０ｇのＡＣＮ、および３．０ｇのＴＦＡを混合することにより作製した（すなわち１８００mLのＨ２Ｏ、２００mLのＡＣＮ、２mLのＴＦＡ）。
【０２２７】
移動相Ｂは、２リットルの移動相Ｂあたり１００５．２ｇのＨ２Ｏ、５３１．４ｇのＡＣＮ、２６１．５ｇのＴＨＦ、および３．０ｇのＴＦＡを混合することにより作製した（すなわち１０００mLのＨ２Ｏ、７００mLのＡＣＮ、３００mLのＴＨＦ、および２mLのＴＦＡ）。
注：ＴＨＦは過酸化物を含まなかった。
【０２２８】
過酸化物スカベンジャー溶液の調製：
１．６３ｇの酢酸ナトリウム三水和物、１．４９ｇのＬ−メチオニン、および１．０８ｇの酢酸を１０００mLのＨ２Ｏに加える。
【０２２９】
工程２．  カラムを取り付け、以下の運転パラメータを設定する：
クロマトグラフィー条件：
カラム：Kromasil 100-10-C18  １cm×２５０mm
オーブン：外界温度
流速：３．６mL/min
検出器の波長：ＶＷＤ：２８０nm
インジェクション容量：  １００mgのエキセナチド含量／２０mLの移動相Ａ
運転時間:５０分+試料のロード時間
【０２３０】
工程３．  ５μm疎水性ＰＴＦＥフィルターを通して試料を濾過してから、カラムに試料をロードする。
【０２３１】
工程４.  カラムに試料をロードする。
試料をロードする前に、安定なベースラインが得られるまでカラムを初期条件に条件付けする。
【０２３２】
【表３５】
0005473925.tif 000056
【０２３３】
工程５．  １６．０分から２２．０分にかけて画分を１５〜３０秒間隔で収集する。
【０２３４】
工程６．  収集した各画分に等容量のスカベンジャー溶液を加え、Ｎ２下および０−６℃で保存する。
【０２３５】
工程７．  以下のように画分をプールする：≦８５．０％の面積百分率の画分を前端および後端とし、高ｐＨカラムで精製するために≧８５．０％の画分をプールする。
【０２３６】
実施例１２  −  精製
実施例１２は、包括的脱保護された原料エキセナチドを、勾配＃４を使用する低ｐＨの逆相クロマトグラフィーにより精製することを説明する。
【０２３７】
下記手順に記載するように、実施例１２に以下の装置を使用する：
クォータナリポンプＨＰＬＣシステム、ＵＶ検出器、およびフラクションコレクターシステム。
【０２３８】
下記手順に記載するように、実施例１２に以下の試薬を使用する：
ＨＰＬＣ等級アセトニトリル（ＡＣＮ）、蒸留Ｈ２Ｏ、およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）。
【０２３９】
実施例１２の手順を以下のように説明する：
【０２４０】
工程１．  移動相ＡおよびＢを以下のように作製した：
移動相Ａは、２リットルの移動相Ａあたり１８０２．３ｇのＨ２Ｏ、１５２．０ｇのＡＣＮ、および３．０ｇのＴＦＡを混合することにより作製した（すなわち１８００mLのＨ２Ｏ、２００mLのＡＣＮ、２mLのＴＦＡ）。
【０２４１】
移動相Ｂは、２リットルの移動相Ｂあたり１００５．２ｇのＨ２Ｏ、７７３．７ｇのＡＣＮ、および３．０ｇのＴＦＡを混合することにより作製した（すなわち１０００mLのＨ２Ｏ、１０００mLのＡＣＮ、および２mLのＴＦＡ）。
【０２４２】
工程２．  カラムを取り付け、以下の運転パラメータを設定する：
クロマトグラフィー条件：
カラム：Kromasil 100-10-C18 １cm×２５０mm
オーブン：外界温度
流速：３．６mL/min
検出器の波長：ＶＷＤ：２８０nm
インジェクション容量:  １００mgのエキセナチド含量／２０mLの移動相Ａ
運転時間:５０分＋試料のロード時間
【０２４３】
工程３．  ５μm疎水性ＰＴＦＥフィルターを通して試料を濾過してから、カラムに試料をロードする。
【０２４４】
工程４．  カラムに試料をロードする。
試料をロードする前に、安定なベースラインが得られるまでカラムを初期条件に条件付けする。
【０２４５】
【表３６】
0005473925.tif 000057
【０２４６】
工程５．  １４．０分から２４．０分にかけて画分を１５〜３０秒間隔で収集する。
【０２４７】
工程６．  以下のように画分をプールする：≦８５．０％の面積百分率の画分を前端および後端とし、高ｐＨカラムで精製するために≧８５．０％の画分をプールする。
【０２４８】
実施例１３  −  エキセナチド（１−１９）の固相ペプチド合成
Ａ．  Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｖａｌをロードされた樹脂の精製
Ｆｍｏｃ  Ｌバリン樹脂（２−Ｃｌ−トリチル）（１当量）を膨潤させるためにこの樹脂をジクロロメタンと混合し、Ｎ，Ｎジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で洗浄する。（すなわち６０mlのＤＭＦ中に１０ｇの樹脂）。
【０２４９】
Ｂ．  固相合成
１．  Ｆｍｏｃ（１−１９）についてのアミノ酸カップリング
Ｈ−Ｖａｌ−樹脂にロードされる次のアミノ酸はＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ  ＯＨである。過剰の保護アミノ酸（例えば、１．７〜２．０当量）、過剰のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ、例えば、１．７〜２．０当量）および過剰のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、例えば１．９〜２．２当量）をＤＭＦ中で混合し、≦５℃に冷却する。結果として生じた溶液を過剰の２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ、例えば、１．７〜２．０当量）のＤＭＦ溶液と混合する。この活性化アミノ酸溶液を樹脂と混合し、続いてジクロロメタンですすぐ。ニンヒドリン試験（上記）陰性結果が得られるまで（典型的には３時間）その懸濁液を≦２５℃で撹拌する。
【０２５０】
２．  Ｆｍｏｃの除去
ピペリジン（典型的には５〜２０％）のＤＭＦ溶液で処理することによりＦｍｏｃ保護基を除去する。溶液を排液し、樹脂をＤＭＦで洗浄して残留ピペリジンを減少させる。
【０２５１】
フラグメントにおける残りのアミノ酸についてアミノ酸カップリングおよびＦｍｏｃ除去のサイクルを繰り返す。全てのシュードプロリンカップリングではＨＯＢＴを排除する。
【０２５２】
以下の保護アミノ酸が、表示順にこのフラグメントについてカップリングされるアミノ酸である：
【０２５３】
【表３７】
0005473925.tif 000058
【０２５４】
最終カップリングの後に、樹脂をＤＭＦで洗浄し、Ｆｍｏｃ保護された、樹脂結合エキセナチド（１−１９）フラグメントを得るが、そのフラグメントは、表記ＦｍｏｃＡＡ１−１９−樹脂により特定することができ、上記アミノ酸リストに表示したようなシュードプロリン置換を有する。
【０２５５】
３．  樹脂からの切断
希（例えば１％）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）のジクロロメタン溶液を使用して、樹脂結合ＦＡＡ１−１９ＯＨを≦１１０分で樹脂から切断する。次に、ピリジンを加え、ＴＦＡを中和する。その液体を除去し、樹脂をジクロロメタンで洗浄する。トリフルオロ酢酸のジクロロメタン溶液を用いた追加の処理に続くピリジンにより樹脂の切断を繰り返してもよく、結果として生じた溶液を最初の切断溶液と混合する。
【０２５６】
４．  ＦｍｏｃＡＡ１−１９ＯＨの沈殿
ＦｍｏｃＡＡ１−１９ＯＨを３回水抽出する。乳濁が観察されるならば、塩水が勧められる。ＤＣＭを用いた逆抽出を利用して、良好な収率を確実にすること助ける。蒸留によりジクロロメタンを減少させ、ヘプタンを加えてペプチドを沈殿させ、＜２５vol％まで蒸留することにより残りのジクロロメタンをさらに減少させる。沈殿したＦＡＡ１−１９を単離し、ヘプタンで洗浄し、次に真空下で乾燥させる（最大３５℃）。
【０２５７】
実施例１４  −  Ｆｍｏｃ保護されたエキセナチド（２０−２９）の固相ペプチド合成
Ａ．  Ｆｍｏｃ−Ｈ−Ｇｌｙをロードされた樹脂の調製
Ｈ−Ｇｌｙ−樹脂（２−Ｃｌ−トリチル）（１当量）を膨潤させるために、その樹脂をジクロロメタンと混合し、Ｎ，Ｎジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で洗浄する。（すなわち６０mlのＤＭＦ中に１０ｇの樹脂）。
【０２５８】
Ｂ．  固相合成
１．  アミノ酸のカップリング
樹脂にロードされる次のアミノ酸はＦｍｏｃ−Ａｓｎ（ｔｒｔ）ＯＨである。過剰の保護アミノ酸（例えば１．５当量）、過剰の６Ｃｌ  Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（６Ｃｌ  ＨＯＢＴ、例えば１．５当量）および過剰のＮ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ、例えば１．７当量）をＤＭＦ：ＤＭＳＯジメチルスルホキシド（１：１）中で混合し、≦２５℃に冷却する。活性化アミノ酸溶液を樹脂と混合し、続いてジクロロメタンですすぐ。ニンヒドリン試験（上記）の陰性結果が得られるまで（典型的には３時間）その懸濁液を≦２５℃で撹拌する。
【０２５９】
２．  Ｆｍｏｃの除去
ピペリジン（典型的には５〜２０％）のＤＭＦ溶液で処理することによりＦｍｏｃ保護基を除去する。その溶液を排出し、残留ピペリジンを減少させるために樹脂をＤＭＦで洗浄する。
【０２６０】
フラグメントにおける残りのアミノ酸について、アミノ酸のカップリングおよびＦｍｏｃ除去のサイクルを繰り返す。以下の保護アミノ酸が、表示順にこのフラグメントについてカップリングされるアミノ酸である：
【０２６１】
【表３８】
0005473925.tif 000059
【０２６２】
最終カップリングの後で、樹脂をＤＭＦで洗浄し、Ｆｍｏｃ保護された樹脂結合エキセナチド（２０−２９）フラグメントを得るが、そのフラグメントは表記ＦｍｏｃＡＡ２０−２９−樹脂により特定することができる。
【０２６３】
３．  樹脂からの切断
希（例えば２％）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）のジクロロメタン溶液を≦１１０分間使用して、樹脂結合ＦｍｏｃＡＡ２０−２９ＯＨを樹脂から切断する。ピリジンを加えてＴＦＡを中和する。その溶液を除去し、樹脂をジクロロメタンで洗浄する。トリフルオロ酢酸のジクロロメタン溶液を用いた追加の処理に続くピリジンにより、樹脂の切断を繰り返してもよい。
【０２６４】
４．  ＦｍｏｃＡＡ２０−２９ＯＨの沈殿
ＦｍｏｃＡＡ２０−２９ＯＨは容易に乳化しうる。したがって、水抽出は勧められない。その代わりに、ジクロロメタンを蒸留により減少させ、水への２５％ＩＰＡ（イソプロパノール）を加え、＜２５vol％に蒸留することにより残りのジクロロメタンをさらに減少させる。沈殿したＦＡＡ２０−２９ＯＨを単離し、２５％ＩＰＡ／水で洗浄し、次に真空下で乾燥させる（最大３５℃）。
【０２６５】
実施例１５  −  エキセナチド（３０−３８）の固相ペプチド合成
Ａ．  Ｈ−Ｌ−Ｐｒｏをロードした樹脂の調製
Ｈ−Ｌ−Ｐｒｏ樹脂（２−Ｃｌ−トリチル）（１当量）を膨潤させるために、その樹脂をジクロロメタンと合わせ、Ｎ，Ｎジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で洗浄する（すなわち６０ｍｌのＤＭＦ中に１０ｇの樹脂）。
【０２６６】
Ｂ．  固相合成
１．  アミノ酸のカップリング
配列における次のアミノ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ、過剰の保護アミノ酸（例えば１．５当量）、過剰のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ、例えば１．５当量）および過剰のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、例えば１．７当量）をＤＭＦ中で混合し、≦５℃に冷却する。結果として生じた溶液をＤＭＦ溶液および過剰の２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ、例えば１．５当量）と混合する。活性化アミノ酸溶液を樹脂と混合し、続いてジクロロメタンですすぐ。上記のようなニンヒドリン試験陰性結果が得られるまで（典型的には３時間）その懸濁液を≦２５℃で撹拌する。
【０２６７】
２．  Ｆｍｏｃの除去
ピペリジン（典型的には５〜２０％）のＤＭＦ溶液で処理することによりＦｍｏｃ保護基を除去するが、第二および第三のＰｒｏの場合は例外的にピペラジンを使用する。その溶液を排出し、樹脂をＤＭＦで洗浄して残留塩基を除去する。フラグメント中の残りのアミノ酸についてアミノ酸のカップリングおよびＦｍｏｃ除去のサイクルを繰り返す。フラグメント中の残りのアミノ酸についてそのサイクルを繰り返す。以下の保護アミノ酸が、表示順にこのフラグメントについてカップリングされるアミノ酸である：
【０２６８】
【表３９】
0005473925.tif 000060
【０２６９】
最終カップリングに続き、その樹脂をＤＭＦで、次にジクロロメタンで洗浄し、Ｆｍｏｃ保護された、樹脂に基づくエキセナチド（３０−３８）フラグメントを得るが、そのフラグメントは表記ＦｍｏｃＡＡ３０−３８−樹脂により特定することができる。
【０２７０】
３．  樹脂からの切断
希（例えば２％）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）のジクロロメタン溶液を≦１１０分使用して、樹脂結合ＦｍｏｃＡＡ３０−３８ＯＨを樹脂から切断する。ピリジンを加えてＴＦＡを中和する。溶液を除去し、樹脂をジクロロメタンで洗浄する。トリフルオロ酢酸のジクロロメタン溶液を用いた追加の処理に続くピリジンにより、樹脂の切断を繰り返してもよい。
【０２７１】
４．  フラグメントの沈殿
エキセナチド（３０−３８）ＯＨを３回水抽出する。乳化が観察されるならば、塩水が勧められる。ＤＣＭを用いた逆抽出を利用して良好な収率を確実にする。ジクロロメタンを蒸留により減少させ、ヘプタンを加え、＜２５vol％まで蒸留することにより残りのジクロロメタンをさらに減少させる。沈殿したＦＡＡ３０−３８を単離し、ヘプタンで洗浄し、次に真空下で乾燥させる（最大３５℃）。
【０２７２】
実施例１６  −  エキセナチド（３０−３９）ＮＨ２の溶液相ペプチド合成
ＦｍｏｃＡＡ３０−３８ＯＨ（１．２当量）、過剰の６−クロロ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（６−Ｃｌ−ＨＯＢＴ；例えば１．２〜１．４当量）、Ｌ−セリン（ｔＢｕ）アミド（例えば、１〜１．２当量）およびＤＣＭを混合する。その溶液を≦５℃に冷却し、過剰のＤＩＥＡ（例えば２．０当量）およびＨＢＴＵ（例えば１．２当量）と混合する。結果として生じた溶液は、反応が完了する（すなわち、例えばＨＰＬＣにより≦１％のＦｍｏｃＡＡ２７−３８ＯＨ）まで≦０℃に保つ。反応混合物を２５℃で希酢酸水溶液（典型的には３％〜５％）と混合する。そのジクロロメタン溶液を希重炭酸ナトリウム水溶液（典型的には２〜３％）で洗浄し、水で２回洗浄し、次に油になるまでストリッピングする。ジクロロメタンを用いた逆抽出が勧められる。Ｆｍｏｃ保護基を除去するために、ピペリジンまたはピペラジンと結合した樹脂を反応混合物に加え、完了する（すなわち、例えばＨＰＬＣにより≦１％のＦｍｏｃＡＡ３０−３９ＮＨ２）までその溶液を≦０℃で撹拌する。蒸留によりジクロロメタンを減少させ、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）を加えてペプチドを沈殿させ、＜２５vol％（例えばＧＣによる）まで蒸留することにより残りのジクロロメタンをさらに減少させる。沈殿したＨＡＡ３０−３９ＮＨ２を単離し、ＭＴＢＥで洗浄し、次に真空下で乾燥させる（最大３５℃）。
【０２７３】
実施例１７  −  エキセナチド（２０−３９）ＮＨ２の溶液相ペプチド合成
Ｈ−ＡＡ（３０−３９）ＮＨ２（１．２５当量）、Ｆｍｏｃ−ＡＡ（２０−２９）ＯＨ（１当量）および過剰の６−Ｃｌ−ＨＯＢＴ（例えば、１．２〜１．４当量）をＤＣＭに溶解させる。その溶液を≦２５℃に冷却し、過剰のＤＩＥＡ（例えば２．７当量）およびＨＢＴＵ（例えば１．２当量）と混合する。反応が完了する（すなわち、例えばＨＰＬＣにより≦１％の総Ｆｍｏｃ−ＡＡ（２０−２９）ＯＨ）まで、結果として生じた溶液を≦２５℃に保つ。必要であれば原料および／または試薬の追加のチャージを加えてもよい。ピペリジンまたはピペラジンと結合した樹脂をその混合物と混合してＦｍｏｃ基を除去する（すなわち、例えばＨＰＬＣにより≦１％のＦｍｏｃ−ＡＡ（２０−３９）ＮＨ２）。完了した場合に、その混合物を食塩洗浄と組み合わせ、次に≦２５℃で４回水洗浄する。ジクロロメタンを用いた逆抽出を利用して収率を増大させる。ジクロロメタンを蒸留により減少させ、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）を加え、（例えばＧＣにより）＜２５vol％に蒸留することにより残りのジクロロメタンをさらに減少させる。沈殿したＨＡＡ２０−３９ＮＨ２を単離し、ＭＴＢＥで洗浄し、次に真空下で乾燥させる（最大３５℃）。
【０２７４】
実施例１８  −  エキセナチド（１−３９）ＮＨ２（完全保護）の溶液相ペプチド合成
ＤＣＭ中のＨＡＡ２０−３９ＮＨ２（１当量）、ＡＡＦ１−１９ＯＨ（１当量）、過剰の６−Ｃｌ−ＨＯＢＴ（例えば、１．５〜２当量）を、≦０℃で過剰のＨＢＴＵおよびＤＩＥＡと混合する。反応が完了する（すなわち、例えばＨＰＬＣにより≦１．０％のＡＡ１−１９ＯＨおよび≦１．５％のＨＡＡ２０−３９ＮＨ２）まで、反応混合物を撹拌する。反応器を１５℃に冷却し、ＤＣＭでクエンチし、２５℃に加温する。水で２回水抽出する。ＤＣＭ層を濃縮する。ＡＡＦ１−３９ＮＨ２を提供するためにピペリジンまたはピペラジンと結合した樹脂を加えて、Ｆｍｏｃを≦２５℃で２時間除去する。ＡＡＨ１−３９ＮＨ２をＤＣＭに溶解させる。代替経路は、反応を活性化するためにＨＢＴＵ／ＤＩＥＡの代わりにＤＩＣ（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド）のＤＭＦ溶液を１時間５分前に加え、反応物を０℃に冷却することである。活性化後に５分間待機する。次に、試料を室温（２５℃）に加温する。水抽出を行うこと、および次にＦｍｏｃ保護を除去することｆｒ、wt/wt値を増加させることができる。Ｆｍｏｃの除去の次に水抽出を行うことを試すこともできる。
【０２７５】
実施例１９  −  エキセナチド（１−３９）ＮＨ２の包括的脱保護
前工程からのジクロロメタン溶液をトリフルオロ酢酸、水およびジチオトレイトール（例えば、１／０．０８／０．０１２の比）と混合する。その混合物を≦２４℃で最大３時間撹拌し、続いて≦０℃に冷却する。常に窒素下に保つ。冷ＭＴＢＥを滴下して加え、反応混合物からペプチドを沈殿させる。一旦全てのペプチドがＭＴＢＥ中に入ったならば１時間撹拌する。その固体を濾過により単離し、ＭＴＢＥで洗浄し、≦３５℃の真空下で部分乾燥させる。
【０２７６】
実施例２０  −  脱カルボキシル化
上記実施例８に概略したプロトコールに従って、実施例１９の脱保護ペプチドを脱カルボキシル化した。
【０２７７】
実施例２１  −  精製
上記実施例９〜１２のいずれかに概略したプロトコールにそれぞれ従って、実施例２０の脱カルボキシル化ペプチドを精製する。
【０２７８】
実施例２２  −  クロマトグラフィー後に行った濃縮および単離
使用前に窒素を少なくとも１０分間散布することにより全ての溶液を脱酸素化すべきである。産物を有する全ての溶液を窒素下に保つ。注記した以外の全ての操作は、室温で行う。
【０２７９】
１．  カールフィッシャー滴定によりペプチド溶液を＜１０％アセトニトリル（ＡＣＮ）に調整する。全てのプール画分を２容の水で希釈する。これは、正確なＡＣＮ濃度を与える。真空蒸留を利用してアセトニトリルを除去してもよい。
２．  約２ml/minのAmberchromeカラム（下記カラムの準備参照）にロードする。
３．  ＨＰＬＣ緩衝液を除去するために１カラム容の０．５Ｍ（３８．５g/l）酢酸アンモニウムを用いて約４ml/minで洗浄する。
４．  カラム容の２〜５重量％酢酸溶液を用いて約４ml/minで洗浄する。
５．  １カラム容の水を用いて約４ml/minで洗浄する。
６．  ８０：２０（wt/wt）のＥｔＯＨ（２Ｂ）：水を用いて流速約２ml/minで溶出させる。
７．  画分を収集する。ペプチドは、ボイド容量の直後に溶出するはずである。溶出の間にエタノール濃度を増大させてもよいし、次の運転で再インジェクションするためにテールを別に収集してもよい。
８．  ４カラム容の水をフラッシュすることによりカラムを再生することができる。
９．  エタノール／水共沸混合物を蒸留除去することによりさらなる濃縮を行うことができる。
１０．  ペプチドを沈殿させるために、産物画分にエタノール（２Ｂ）をかき混ぜながら加える。沈殿のために約１０〜１５容のエタノールを使用する。
１１．  撹拌しながら＜０℃に冷却し、少なくとも２時間保つ。
１２．  トルエン、ＭＴＢＥまたは酢酸エチルなどの有機共溶媒を使用して沈殿の収率を高めてもよい。
１３．  窒素圧を使用して、公称１μmのフィルターメンブレンを通してフィルターを加圧する。最初の部分が濁っているならばリサイクルする。フィルターを冷たく保つ。
１４．  １０ml/gのＥｔＯＨ（２Ｂまたは無水エタノールを使用することができる）ですすぐ。乾燥するまで窒素を吹きつけ続ける。乾燥の間にフィルターを２５℃に加温してもよい。
１５．  所望の残留溶媒レベルが達成されるまで減圧下で乾燥を続ける。
１６．  フィルターを掘り出し、パッケージングする前に残留溶媒についての試料を採取する。
【０２８０】
Amberchromeカラムの調製:
1. Amberchromeをエタノールへの５０％スラリーとして入手する。ロードする前に少なくとも１回そのスラリーを規定する。
２．  ３０分間沈降させ、デカンテーションして微細物を除く。等容量の水に加える。
３．  スラリーをカラムに注入する。バルブを開放し、過剰の液体を排出する。
４．  ２カラム容の水を用いてカラムを洗浄する。
５．  ロードする前に、樹脂ベッドの上に液体があれば排出する。
【０２８１】
実施例２３
以下は、クロマトグラフィーの後に行われたエキセナチドの一例である。２．５×１７cmのAmberchrome CM樹脂を低圧ガラスカラムに充填し、脱イオン水で平衡化する。容量９５０ml中に４．７ｇの精製ペプチドを含有する精製ペプチド溶液を１分あたり最大４mlの速度でカラムにロードする。ペプチド溶液は９０％を超える水濃度に希釈すべきである。ロードすると、ペプチドと結合した樹脂を１２０mlの０．１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液で、続いて１２０mlの２％酢酸水溶液で洗浄する。次に、そのペプチドを５：１のエタノール／水で溶出させ、産物を含有する画分を収集する。次に、１分あたり約３０mlの速度で８００mlのエタノールを添加することにより、収集した濃溶液約１５０mlを沈殿させる。次に、スラリーを−２０℃に冷却し、２時間保つ。７０mlの酢酸エチルを添加し、追加的に３０分間保つことにより沈殿形成を完了する。溶融ガラス漏斗を通過させてスラリーを濾過し、２００mlのエタノールで洗浄する。湿ケークを窒素気流および減圧下で完全に乾燥するまで室温で乾燥させる。これにより、３．８ｇの乾燥精製ペプチドを回収した。
【図１】
0005473925.tif 000074
【配列表】
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