(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
心筋細胞および／または心臓前駆細胞を製造するための方法であって、下記の工程：
（ｉ）人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞または胚性幹（ＥＳ）細胞をシクロスポリン−Ａの非存在下で培養して、中胚葉細胞を誘導する工程、および
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた中胚葉細胞をシクロスポリン−Ａの存在下で培養する工程
を含み、該中胚葉細胞がＦｌｋ１陽性（Ｆｌｋ１＋）細胞であることを特徴とする、方法。
【請求項２】
心臓前駆細胞が心筋に分化する能力を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
心臓前駆細胞がＦｌｋ１＋／ＣＸＣＲ４＋／血管内皮カドヘリン−細胞集団である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
心筋細胞または心臓前駆細胞が心筋組織を組み立てる能力を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞が哺乳類に由来する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ｉＰＳ細胞が、少なくともＯｃｔおよびＳｏｘファミリーメンバーの転写因子をコードする遺伝子による形質導入により、哺乳類の体細胞から生成される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
転写因子がＫｌｆファミリーメンバーをさらに含むか、またはＫｌｆファミリーメンバーとＭｙｃファミリーメンバーの組合せをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
哺乳類がヒトまたはマウスである、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
体細胞が組織または器官からのものである、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
心筋細胞および／または心臓前駆細胞を誘導し得る薬剤のための候補薬剤をスクリーニングするための方法であって、ｉＰＳ細胞から分化された中胚葉細胞を候補薬剤の存在下で培養すること、および該薬剤を拍動コロニーおよび／またはＦｌｋ１＋／ＣＸＣＲ４＋／血管内皮カドヘリン−細胞の形成に基づいて選択することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願の優先権
本願は、２００８年３月２６日出願の米国仮出願第６１／０６４，７７７号の優先権を主張する。この優先権主張出願の全開示内容は本願の一部とみなし、明らかに、参照によりそのまま本明細書に組み入れるものとする。
技術分野
本発明は、心筋細胞および／または心臓前駆細胞を生産するための方法に関する。より具体的には、該方法は、中胚葉細胞に分化された人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞または胚性幹（ＥＳ）細胞をシクロスポリン−Ａの存在下で培養することを含む。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
最近、胚性幹（ＥＳ）細胞とは異なるがＥＳ細胞様である新規な多能性幹細胞、すなわち、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞が、特定された転写因子をコードする遺伝子による形質導入により、成体体細胞から生成された(Takahashi, K.およびYamanaka, S., Cell 126, 663-676 (2006); Okita, K., Ichisaka, T.およびYamanaka, S., Nature 448, 313-317 (2007); Takahashi, K.ら, Cell 131, 861-872 (2007); Yu, J.ら, Science 318, 1917-1920 (2007))。成体ヒト組織からのｉＰＳ細胞の樹立が、細胞移植による再生医療、ならびに患者特異的細胞モデルおよび創薬系の生成を通じて、ｉＰＳ細胞の臨床応用を促進しつつある(Yamanaka, S., Cell Stem Cell 1, 39-49 (2007); Laflamme, M.A.およびMurry, C.E., Nat. Biotechnol. 23, 845-856 (2005); Kovacic, J.C.,ら, Cell Stem Cell 1, 628-633 (2007))。
【０００３】
ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞は、増殖、多能性および分化に関してほぼ同様の全体的な特徴を示すので(Takahashi, K.およびYamanaka, S., Cell 126, 663-676 (2006); Okita, K.ら, Nature 448, 313-317 (2007); Takahashi, K.ら, Cell 131, 861-872 (2007); Yu, J.ら, Science 318, 1917-1920 (2007); Narazaki, G,ら, Circulation 118, 498-506 (2008))、ＥＳ細胞に関する研究は、ｉＰＳ細胞の研究における科学的および技術的基礎として利用することができる。これまでに、本発明者らは、in vitroにおいて心血管発生の初期過程を再現することができる新規なＥＳ細胞分化系を確立した(Yamashita, J.ら, Nature 408, 92-96 (2000); Yamashita, J.K.ら, FASEB J. 19, 1534-1536 (2005); Yanagi, K.ら, Stem Cells 25, 2712-2719 (2007); Yurugi-Kobayashi, T.ら, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 26, 1977-1984 (2006); Kono. T.ら, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 26, 2070-2076 (2006); Hiraoka-Kanie, M.ら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 351, 669-674 (2006))。内皮細胞（ＥＣ）、壁細胞（ＭＣ；周皮細胞および血管平滑筋細胞）(Yamashita, J.ら, Nature 408, 92-96 (2000))および心筋細胞(Yamashita, J.K.ら, FASEB J. 19, 1534-1536 (2005))は、共通の中胚葉前駆細胞、すなわち、Ｆｌｋ１（血管内皮増殖因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ２）とも呼ばれる）発現細胞から体系的に誘導される。本発明者らはまた、Ｆｌｋ１＋中胚葉細胞の後代のうち心臓前駆細胞集団、ＦＣＶ細胞（Ｆｌｋ１＋／ＣＸＣＲ４＋／血管内皮カドヘリン−細胞集団）を同定することにも成功した(Yamashita, J.K.ら, FASEB J. 19, 1534-1536 (2005))。Ｆｌｋ１＋細胞の後代における小さいサブセットに過ぎないＦＣＶ細胞は、極めて心臓特異的な前駆細胞である活性を示したが、ＦＣＶ細胞の効率的な増殖方法はまだ知られていない。最近になり、本発明者らは、ｉＰＳ細胞からＦＣＶ前駆細胞への誘導を検討することができる、類似した心血管細胞用のマウスｉＰＳ分化系の確立に成功した(Yamashita, J.K.ら, FASEB J. 19, 1534-1536 (2005))。
【０００４】
しかしながら、心筋細胞については、心筋細胞を誘導するための効率的な方法、心臓前駆細胞の同定および増殖、ならびに心臓分化のモデル系の確立などのｉＰＳ細胞技術がまだ確立されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Takahashi, K.およびYamanaka, S., Cell 126, 663-676 (2006)
【非特許文献２】Okita, K., Ichisaka, T.およびYamanaka, S., Nature 448, 313-317 (2007)
【非特許文献３】Takahashi, K.ら, Cell 131, 861-872 (2007)
【非特許文献４】Yu, J.ら, Science 318, 1917-1920 (2007)
【非特許文献５】Yamanaka, S., Cell Stem Cell 1, 39-49 (2007)
【非特許文献６】Laflamme, M.A.およびMurry, C.E., Nat. Biotechnol. 23, 845-856 (2005)
【非特許文献７】Kovacic, J.C.,ら, Cell Stem Cell 1, 628-633 (2007)
【非特許文献８】Narazaki, G,ら, Circulation 118, 498-506 (2008)
【非特許文献９】Yamashita, J.ら, Nature 408, 92-96 (2000)
【非特許文献１０】Yamashita, J.K.ら, FASEB J. 19, 1534-1536 (2005)
【非特許文献１１】Yanagi, K.ら, Stem Cells 25, 2712-2719 (2007)
【非特許文献１２】Yurugi-Kobayashi, T.ら, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 26, 1977-1984 (2006)
【非特許文献１３】Kono. T.ら, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 26, 2070-2076 (2006)
【非特許文献１４】Hiraoka-Kanie, M.ら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 351, 669-674 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞から心臓前駆細胞および／または心筋細胞を効果的に誘導するための方法を提供することである。
【０００７】
本発明の他の目的は、前記方法により生産された心臓前駆細胞または心筋細胞を提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、前記の心臓前駆細胞または心筋細胞を使用することにより心疾患を有する被験体を治療するための方法を提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、心疾患の治療のための医薬または移植片またはインプラントの製造における前記心臓前駆細胞または心筋細胞の使用を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、心筋細胞および／または心臓前駆細胞を誘導し得る薬剤をスクリーニングするための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、今回、Ｆｌｋ１＋中胚葉細胞への免疫抑制剤シクロスポリン−Ａ（ＣＳＡ）の添加が、ＦＣＶ心臓前駆細胞集団の特異的増殖を介して心筋細胞を強く誘導することを見出した。さらに今回、本発明者らは、ＥＳ細胞系におけるこの単純な方法が、ｉＰＳ細胞における使用に完全に適応されること、詳細には、心臓前駆細胞および心筋細胞がヒトまたはマウスｉＰＳ細胞に由来するＦｌｋ１＋中胚葉細胞から効率よく誘導できることを見出した。この新規な分化技術は、細胞の供給源、移植の方法および創薬を提供することにより心臓再生に幅広く寄与するであろう。
【００１２】
発明の概要
従って、本発明は、次のように要約される。
【００１３】
第１の態様において、本発明は、中胚葉細胞に分化されたｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞をシクロスポリン−Ａの存在下で培養することを含む、心筋細胞および／または心臓前駆細胞を製造するための方法を提供する。
【００１４】
一実施形態において、中胚葉細胞はＦｌｋ１陽性（Ｆｌｋ１＋）である。
【００１５】
他の実施形態において、心臓前駆細胞は心筋に分化する能力を有し、より詳細には、心臓前駆細胞はＦｌｋ１＋／ＣＸＣＲ４＋／血管内皮カドヘリン−細胞集団である。
【００１６】
さらに他の実施形態において、心筋細胞または心臓前駆細胞は心筋組織を組み立てる能力を有する。
【００１７】
他の実施形態において、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞は、有蹄類（例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタなど）および齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスターなど）、霊長類（ヒト、サル、チンパンジーなど）などを含む哺乳類由来である。好ましくは、哺乳類はヒトおよびマウスである。
【００１８】
他の実施形態において、ｉＰＳ細胞は哺乳類の体細胞から生成される。体細胞は、器官、組織などを構成する細胞などで生殖系細胞以外の任意の細胞である。体細胞の例は、肝臓細胞、胃細胞または皮膚細胞である。
【００１９】
他の実施形態において、ｉＰＳ細胞は、少なくともＯｃｔおよびＳｏｘファミリーメンバーの転写因子をコードする遺伝子による形質導入により、哺乳類の体細胞から生成することができる。転写因子はさらに、Ｋｌｆファミリーメンバーの転写因子、またはＫｌｆファミリーメンバーおよびＭｙｃファミリーメンバーの転写因子を含み得る。好ましくは、ＯｃｔファミリーメンバーはＯｃｔ３／４を含むことができる；Ｓｏｘ２ファミリーメンバーはＳｏｘ２を含むことができる；ＫｌｆファミリーメンバーはＫｌｆ４を含むことができる；Ｍｙｃファミリーメンバーはｃ−Ｍｙｃを含むことができる。
【００２０】
第２の態様において、本発明はまた、心筋細胞および／または心臓前駆細胞を誘導し得る薬剤のための候補薬剤をスクリーニングするための方法であって、中胚葉細胞に分化されたｉＰＳ細胞を候補薬剤の存在下で培養すること、および該薬剤を拍動コロニーおよび／またはＦｌｋ１＋／ＣＸＣＲ４＋／血管内皮カドヘリン−細胞の形成に基づいて選択することを含む方法を提供する。
【００２１】
第３の態様において、本発明はさらに、上記で定義された方法により製造された心筋細胞、心臓前駆細胞またはその混合物を提供する。
【００２２】
第４の態様において、本発明はさらに、上記で定義された心筋細胞、心臓前駆細胞またはその混合物を被験体の心臓に移植することを含む、心疾患を有する被験体を治療するための方法を提供する。被験体は上記で定義された哺乳類、好ましくはヒトを含む。心疾患は、限定されるものではないが、心筋梗塞および心筋症を包む心不全を含む。
【００２３】
第５の態様において、本発明はさらに、心疾患を有する被験体を治療するための医薬または移植片またはインプラントの製造における、上記で定義された心筋細胞、心臓前駆細胞またはその混合物の使用を提供する。被験体および心疾患は上記で定義された通りである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１−１】ＣＳＡ処理によるＥＳ細胞からの心筋細胞および心臓前駆細胞の誘導。図１ａ−ｉ：ＣＳＡによるＦｌｋ１＋中胚葉からの心筋細胞の誘導（実験１）。ａ、ｂ：ＣＳＡによる心筋細胞誘導の肉眼的所見。左のパネル：対照。右のパネル：ＣＳＡ処理。スケールバー＝４００μｍ。図１ａ：拍動コロニーの所見。矢印は、拍動コロニーを示す。矢頭は、広域の拍動領域を囲む。図１ｂ：ｃＴｎＴ（褐色）で染色された心筋細胞。図１ｃ：ｃＴｎＴ染色の蛍光強度による心筋細胞誘導の定量的評価。相対蛍光強度で示す（ｎ＝９、†ｐ＜０．００１ｖｓ対照）。図１ｄ、ｅ：単離された心筋細胞の所見。ｄ：ｃＴｎＴ（赤）およびＤＡＰＩ（青）染色。スケールバー＝５０μｍ。ｅ：アクチニン（赤）染色。右のパネルは、四角で囲んだ領域を高倍率で示す。明らかな筋節構造が見られる。スケールバー＝２５μｍ。
【図１−２】図１ｆ、ｇ：誘導心筋細胞の活動電位。図１ｆ：ペースメーカー電位および自発的拍動を有する細胞。図１ｇ：静止心室型細胞。図１ｈ：ＣＳＡによるＧＦＰ＋心筋細胞誘導のＦＡＣＳ分析。左のパネル：対照。右のパネル：ＣＳＡ処理。Ｘ軸：αＭＨＣプロモーターにより駆動されるＧＦＰ。Ｙ軸：側方散乱。全てのＦｌｋ１＋細胞由来集団を分析した。ＧＦＰ＋心筋細胞のパーセンテージを示す。図１ｉ：純化された心筋細胞の収量。１０４個のＦｌｋ１＋細胞から得られたＧＦＰ＋心筋細胞の細胞数（ｎ＝１２、†ｐ＜０．００１ｖｓ対照）。図１ｊ、ｋ：Ｆｌｋ１＋中胚葉からのＦＣＶ前駆細胞の誘導（実験３）。図１ｊ：ＣＳＡによる心臓前駆細胞誘導のＦＡＣＳ分析。Ｘ軸：Ｆｌｋ１。Ｙ軸：ＣＸＣＲ４。ＦＣＶ細胞（二重陽性集団）のパーセンテージを示す。図１ｋ：純化された心臓前駆細胞の収量。１０４個のＦｌｋ１＋細胞から得られたＦＣＶ前駆細胞の細胞数（ｎ＝１２、†ｐ＜０．００１ｖｓ対照）。
【図１−３】図１ｌ、ｍ：ラット心筋梗塞モデルへのＦＣＶ細胞移植（４×１０５細胞）の代表的データ。ＧＦＰおよびｃＴｎＴに関する二重免疫染色。上のパネル：ＧＦＰ（ドナー細胞由来心筋細胞、緑）およびＤＡＰＩ（青）。下のパネル：ｃＴｎＴ（全心筋細胞、赤）およびＤＡＰＩ。図１ｌ：梗塞領域の修復に寄与する移植細胞の肉眼的所見。スケールバー＝４００μｍ。図１ｍ：四角で囲んだ領域の高倍率像。矢頭は、ｃＴｎＴ＋／ＧＦＰ−である内在性心筋細胞を示す。スケールバー＝５０μｍ。図１ｎ：ＣＳＡ処理によるＥＣおよび心筋細胞の相反所見（実験１）。ＣＤ３１（全ＥＣ；緑）およびｃＴｎＴ（赤）に関する二重免疫染色。上のパネル：対照。下のパネル：ＣＳＡ処理。スケールバー＝４００μｍ。
【図２−１】ＣＳＡ処理によるｉＰＳ細胞からの心筋細胞および心臓前駆細胞の誘導。図２ａ、ｂ：ＣＳＡによるマウスｉＰＳ細胞由来Ｆｌｋ１＋中胚葉からの心筋細胞の誘導（実験１）。図２ａ：ＣＳＡによる心筋細胞誘導の肉眼的所見。ｃＴｎＴ染色（赤）。左のパネル：対照。右のパネル：ＣＳＡ処理。スケールバー＝４００μｍ。図２ｂ：ｃＴｎＴ染色の蛍光強度による心筋細胞誘導の定量的評価。相対蛍光強度を示す（ｎ＝４、†ｐ＜０．００１ｖｓ対照）。図２ｃ：ＣＳＡによるマウスｉＰＳ細胞からの心臓前駆細胞誘導のＦＡＣＳ分析（実験３）。Ｘ軸：Ｆｌｋ１。Ｙ軸：ＣＸＣＲ４。ＦＣＶ細胞（二重陽性集団）のパーセンテージを示す。
【図２−２】図２ｄ−ｆ：ヒトｉＰＳ細胞からの心筋細胞誘導。ヒトｉＰＳ細胞をＥＮＤ−２細胞と同時培養して心筋細胞を誘導した。図２ｄ：ヒトｉＰＳからの細胞拍動コロニーの肉眼的所見。拍動コロニーを矢頭によって示す。スケールバー(scare bar)＝４００μｍ。図２ｅ：ＥＮＤ２細胞上の拍動コロニーのｃＴｎＴ染色。左のパネル：位相差画像。右のパネル：ヒトｃＴｎＴ染色（緑）。スケールバー＝１００μｍ。図２ｆ：分離した拍動コロニーのアクチニン染色。アクチニン（赤）およびＤＡＰＩ（青）。右のパネルは、四角で囲んだ領域を高倍率で示す。明らかな筋節構造が見られる。スケールバー＝２５μｍ。
【図２−３】図２ｇ−ｉ：ヒトｉＰＳ細胞からの心筋細胞誘導。ヒトｉＰＳ細胞をＥＮＤ−２細胞と同時培養して心筋細胞を誘導した。図２ｇ：分離した拍動コロニーにおけるＣａ＋＋トランジェント。細胞質Ｃａ＋＋の変化はｆｌｕｏ−８でモニタリングした。左のパネル：ｆｌｕｏ−８添加ｉＰＳコロニーの透過画像。中央および左のパネル：蛍光変化の終了時（Ａ）およびピーク時（Ｂ）のＦｌｕｏ−８画像。スケールバー＝５０μｍ。下のパネル：ｆｌｕｏ−８強度変化の経時的推移。強度は周辺部（１）、コロニー全体（２）および中央部（３）で測定した（ＲＯＩを中央のパネルに示す）。記録開始時の強度（Ｆ０）に対する強度の比（Ｆ１／Ｆ０）を示す。Ｃａトランジェントがコロニー内でよく同調していることに着目されたい。図２ｈ、ｉ．  ＣＳＡによるヒトｉＰＳ細胞からの心筋細胞の誘導。図２ｈ：１２ウェルディッシュにおけるヒトｉＰＳ細胞由来拍動コロニーの代表的な肉眼的所見。左のパネル：対照。右のパネル：分化８日目からのＣＳＡ処理。赤い矢印：拍動コロニー。図２ｉ：分化１２日目のＥＮＤ−２細胞上に現れた全ヒトｉＰＳ細胞由来コロニーにおける拍動コロニーのパーセンテージ（ｎ＝８、†ｐ＜０．００１）。
【図３】in vivoにおける心筋細胞再生に対する心臓前駆細胞の効果的な寄与。図３Ａ、Ｂ：細胞移植の代表的データ。移植細胞の心筋細胞としての寄与をＧＦＰの免疫染色（褐色）により評価した。スケールバー＝４００μｍ。挿入は四角で囲んだ領域を高倍率で示す。スケールバー＝１００μｍ。図３Ａ．  ＧＦＰ＋細胞の投与（４×１０５個）。図３Ｂ：ＦＣＶ前駆細胞の投与（４×１０５個）。図３Ｃ：Ｃｘ４３（緑）およびｃＴｎＴ（赤）に関する二重免疫染色。Ｃｘ４３は隣接するｃＴｎＴ＋心筋細胞の間に見られた（矢頭）。スケールバー＝１００μｍ。図３Ｄ：再生心筋細胞の推定面積（ｎ＝３、＊＊ｐ＜０．０１ｖｓＧＦＰ＋細胞の投与）。図３Ｅ：再生心筋細胞の推定体積（ｎ＝３、†ｐ＜０．００１ｖｓＧＦＰ＋細胞の投与）。
【図４】心筋細胞分化の手順および経時的推移。本実験系では、４つの異なる分化段階を表す細胞、すなわち、未分化ＥＳ細胞、Ｆｌｋ１＋中胚葉細胞、ＦＣＶ心臓前駆細胞および心筋細胞が段階的に誘導される。未分化ＥＳ細胞は、Ｆｌｋ１＋細胞への分化を誘導するために、分化培地中、ＯＰ９細胞またはＩＶ型コラーゲン（Ｃｏｌ．ＩＶ）コーティングディッシュ上で（ＥＳ−０日目(ES-d0)）、９６〜１０８時間培養した（方法を参照）。ＦＡＣＳにより得られたＦｌｋ１＋／Ｅ−カドヘリン−中胚葉細胞は、心筋細胞へのさらに分化誘導するために、ＯＰ９間質細胞上にプレーティングした（Ｆｌｋ−０日目(Flk-d0)と表す）。ＦＣＶ細胞は、Ｆｌｋ−２日目(Flk-d2)にＦｌｋ１＋／ＣＸＣＲ４＋／血管内皮カドヘリン−集団として出現した。拍動コロニーはＦｌｋ−４日目(Flk-d4)に見られ始めた。α−ＭＨＣプロモーターにより駆動されるＧＦＰ＋心筋細胞の出現を評価し、Ｆｌｋ−６日目(Flk-d6)に採取した。実験１：中胚葉から心筋細胞への分化。Ｆｌｋ−０日目に純化されたＦｌｋ１＋中胚葉細胞にＣＳＡを加え、Ｆｌｋ−６日目に心筋細胞の出現を評価した。実験２：未分化ＥＳ細胞から中胚葉への分化。ＥＳ−０日目に未分化ＥＳ細胞にＣＳＡを加え、ＥＳ−４日目(ES-d4)に中胚葉の誘導をＦＡＣＳによりＦｌｋ１＋細胞の出現として評価した。実験３：中胚葉から心臓前駆細胞への分化。Ｆｌｋ−０日目にＦｌｋ１＋細胞にＣＳＡを加え、Ｆｌｋ−２日目にＦＣＶ心臓前駆細胞の出現をＦＡＣＳにより評価した。実験４：心臓前駆細胞から心筋細胞への分化。Ｆｌｋ−２日目に純化されたＦＣＶ前駆細胞にＣＳＡを加え、Ｆｌｋ−６日目に心筋細胞の出現を評価した。実験５：心筋細胞の分化に対するＣＳＡの中胚葉特異的効果。ＣＳＡ（または他の試薬）をＦｌｋ−０日目〜２日目にのみ加え、Ｆｌｋ−６日目に心筋細胞の出現を評価した。Ｆｌｋ−２日目の純化されたＦＣＶ細胞を慢性病期ラット心筋梗塞モデルに移植した。
【図５】心筋細胞分化におけるマウスＥＳ細胞の心臓マーカーのＲＴ−ＰＣＲ分析。純化されたＦＣＶ前駆細胞またはＧＦＰ＋心筋細胞におけるｍＲＮＡ発現はＣＳＡの非存在下（ＣＳＡ−）または存在下（ＣＳＡ＋）で誘導する。
【図６】本発明の系におけるＥＳ細胞からの心臓細胞の誘導効率。１×１０５の未分化ＥＳ細胞から分化を始めると、中胚葉分化の最初の４日間で全細胞数はおよそ１００〜１５０倍（１〜１．５×１０７細胞）に増える。全細胞のおよそ３０〜４０％がＦｌｋ１＋中胚葉細胞となる（およそ４×１０６細胞）。ＯＰ９細胞上で純化されたＦｌｋ１＋細胞を６日間培養した後（Ｆｌｋ−６日目(Flk-d6)）、本発明者らの常法により、４×１０６個のＦｌｋ１＋細胞からおよそ１．２×１０６個の心筋細胞が得られる（図１ｉ）。ＣＳＡ処理は心筋細胞の誘導をおよそ１７倍増強し、その結果、４×１０６個のＦｌｋ１＋細胞から２×１０７個の心筋細胞が得られる（図１ｉ）。ＣＳＡ増強後、１個のＥＳ細胞からおよそ２００個の心筋細胞が誘導できる。他方、本発明者らの常法でＦｌｋ−２日目(Flk-d2)の４×１０６個のＦｌｋ１＋細胞からは８×１０４個のＦＣＶ前駆細胞が誘導できるに過ぎない。ＣＳＡ処理はＦＣＶ前駆細胞誘導をおよそ２２倍増強し、その結果、４×１０６個のＦｌｋ１＋細胞から１．７×１０６個のＦＣＶ細胞が得られる（図１ｋ）。
【図７】初期のＥＳ細胞分化に対するＣＳＡの効果。未分化ＥＳ細胞からの初期分化に対するＣＳＡの効果（実験２）。図７ａ：ＣＳＡの不在下（ＣＳＡ−）または存在下（ＣＳＡ＋）でのＥＳ−４日目におけるＦｌｋ１のＦＡＣＳ分析。図７ｂ：ＥＳ−４日目(ES-d4)における中内胚葉マーカーｂｒａｃｈｙｕｒｙ、外胚葉マーカーＮｅｓｔｉｎおよびＰａｘ６、ならびに内胚葉マーカーＡＦＰおよびＦｏｘａ２のｍＲＮＡ発現。
【図８】ＯＰ９上での単一のＦＣＶ細胞培養からのコロニー。Ｆｌｋ−６日目(Flk-d6)における単一ＦＣＶ細胞由来のコロニーに対する、ＤＡＰＩ（グレー）とＣＤ３１（全ＥＣ、緑）、ｃＴｎＴ（全心筋細胞（ＣＭ）、赤）およびカルポニン（心筋細胞と壁細胞（ＭＣ）、青）の三重染色。図８ａ：ＥＣ／ＣＭコロニー。図８ｂ：ＣＭ／ＭＣコロニー。矢頭はカルポニン＋／ｃＴｎＴ−のＭＣを示す。図８ｃ：三重陽性コロニー。矢頭はカルポニン＋／ｃＴｎＴ−のＭＣを示す。スケールバー＝１００μｍ。
【図９】ＦＣＶ細胞の増殖またはアポトーシスに対するＣＳＡの影響。図９ａ、ｂ：ＥｄＵの取り込み。ＥｄＵで処理したＦＣＶ細胞をＦＡＣＳにより純化し、細胞遠心分離によりスライドガラス上にプレーティングした。図９ａ：ＥｄＵ（緑）およびＤＡＰＩ（青）に関する二重染色。左のパネル：対照（ＣＳＡ−）。右のパネル：ＣＳＡ処理（ＣＳＡ＋）。ＥｄＵ＋核を矢頭で示す。スケールバー＝１００μｍ。図９ｂ：ＥｄＵ＋ ＦＣＶ細胞の定量的評価。全細胞中のＥｄＵ＋細胞のパーセンテージを示す（各２００核、ｎ＝３）。図９ｃ：アネキシンＶ発現のＦＡＣＳ分析。ゲーティングされたＦＣＶ細胞集団を示す。アポトーシス細胞（アネキシンＶ＋、赤い四角）のパーセンテージを示す。
【図１０】心筋細胞の増殖またはアポトーシスに対するＣＳＡの影響。図１０ａ、ｂ：Ｆｌｋ−３日目(Flk-d3)の心筋細胞におけるＥｄＵの取り込み。図１０ａ：ｃＴｎＴ（赤）、ＥｄＵ（緑）およびＤＡＰＩ（青）に関する三重染色。左のパネル：対照（ＣＳＡ−）。右のパネル：ＣＳＡ処理（ＣＳＡ＋）。ＥｄＵ＋／ｃＴｎＴ＋心筋細胞を矢頭で示す。スケールバー＝１００μｍ。図１０ｂ：ＥｄＵ＋心筋細胞の定量的評価。全心筋細胞中のＥｄＵ＋心筋細胞のパーセンテージを示す（各２００核、ｎ＝３）。図１０ｃ：Ｆｌｋ−６日目(Flk-d6)のアネキシンＶ発現のＦＡＣＳ分析。ゲーティングされたＧＦＰ＋心筋細胞集団を示す。アポトーシス細胞（アネキシンＶ＋、赤い四角）のパーセンテージを示す。
【図１１】ＦＣＶ細胞の心筋細胞への分化に対するＣＳＡの効果。図１１ａ、ｂ：ＣＳＡによる純化されたＦＣＶ細胞からの心筋細胞の誘導（実験４）。図１１ａ：ｃＴｎＴ（褐色）で染色された心筋細胞の肉眼的所見。左のパネル：対照。右のパネル：ＣＳＡ処理。スケールバー＝４００μｍ。図１１ｂ：ｃＴｎＴ染色の蛍光強度による心筋細胞誘導の定量的評価。相対蛍光強度を示す（ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５ｖｓ対照）。
【図１２】ＣＳＡ処理による心筋細胞を含む血液細胞またはＥＣの相反所見。Ｆｌｋ−６日目におけるＦＡＣＳ分析（実験１）。左のパネル：対照。右のパネル：ＣＳＡ処理。Ｘ軸：αＭＨＣプロモーターにより駆動されるＧＦＰ（心筋細胞）。Ｙ軸：ＣＤ３１（全ＥＣ）（ａ）、ＣＤ４５（全白血球）（ｂ）。全てのＦｌｋ１＋細胞由来集団を分析した。
【図１３】ＥＣおよび心筋細胞分化に対するＣＳＡの中胚葉特異的効果。ＣＳＡの中胚葉特異的処理によるＦｌｋ１＋細胞からの心筋細胞およびＥＣの誘導（実験５）。Ｆｌｋ−６日目(Flk-d6)におけるＣＤ３１（緑）およびｃＴｎＴ（赤）に関する二重免疫染色。左のパネル：対照。右のパネル：ＣＳＡ処理。スケールバー＝１００μｍ。ＣＳＡの中胚葉処理により、ｃＴｎＴ＋心筋細胞の増加とそれに相反するＣＤ３１＋ＥＣの減少が誘導に着目されたい。
【図１４】心筋細胞分化に対するＦＫ５０６およびＮＦ−ＡＴ阻害剤の効果。ＣＳＡによるＦｌｋ１＋細胞からの心筋細胞の誘導（実験１）。写真：基剤（対照）、ＦＫ５０６またはＮＦ−ＡＴ阻害剤１１Ｒ−ＶＩＶＩＴで処理されたｃＴｎＴ染色（褐色）心筋細胞の肉眼的所見。スケールバー＝４００μｍ。棒グラフ：ｃＴｎＴ染色の蛍光強度による心筋細胞誘導の定量的評価。相対蛍光強度を示す（ｎ＝３）。
【図１５】心筋細胞分化に対するＴＧＦ−β、ｗｎｔ３ａおよびＤｋｋ１の中胚葉特異的効果。提示した因子の中胚葉特異的処理によるＦｌｋ１＋細胞からの心筋細胞の誘導（図４の実験５）。ａ：ｃＴｎＴ（赤）で染色された心筋細胞の肉眼的所見。スケールバー＝４００μｍ。ｂ：ｃＴｎＴ染色の蛍光強度による心筋細胞誘導の定量的評価。相対蛍光強度を示す（ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１ｖｓ対照）。
【図１６】ヒトｉＰＳ細胞の心筋細胞分化中の分化マーカーのＲＴ−ＰＣＲ分析。ＥＮＤ２細胞上でのヒトｉＰＳ細胞培養中（分化０日目〜１２日目）の種々の遺伝子のｍＲＮＡ発現。遺伝子発現パターンはヒトｉＰＳ細胞の心筋細胞への分化を十分反映した。未分化細胞マーカーＯｃｔ３／４は分化後には減少し、中胚葉／心臓前駆細胞マーカーｉｓｌｅｔ１が６日目から見られた。いくつかのｍＲＮＡの発現はタンパク質または細胞表現型の出現に数日先行していた。すなわち、ＶＥＧＦＲ２＋中胚葉細胞は分化のおよそ８日後にヒトＥＳ細胞から出現したが(Sone, M.ら, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 27, 2127-2134 (2007))、中内胚葉マーカーｂｒａｃｈｙｕｒｙ−Ｔおよび中胚葉マーカーＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ２）は分化４日目から出現した。ｃＴｎＴは８日目から明らかになったが、最初の拍動コロニーは１０日目以降に出現した。
【図１７】ＦＣＶ前駆細胞におけるＩｓｌｅｔ１およびＮｋｘ２．５の発現。純化されたＦＣＶ細胞におけるｉｓｌｅｔ１および／またはＮｋｘ２．５発現細胞の定量的評価。ＦＣＶ細胞をＦＡＣＳにより純化し、細胞遠心分離によりスライドガラス上にプレーティングし、抗ｉｓｌｅｔ１およびＮｋｘ２．５抗体で二重染色した。棒グラフは、全ＦＣＶ細胞中のｉｓｌｅｔ１および／またはＮｋｘ２．５陽性細胞のパーセンテージを示す（各１０００細胞、ｎ＝３）。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
定義
本明細書で用いる用語は全て、特に断りのない限り、当業者にとって通例の意味を有する。以下の用語は次のような意味を有する。
【００２６】
本明細書において「心筋細胞」とは、心臓壁を構成し、自己拍動の特性を有する心筋の細胞を意味する。
【００２７】
本明細書において「心臓前駆細胞」とは、前記心筋細胞の前駆細胞を意味する。この細胞は心臓の拍動筋肉と電気伝導組織を形成する心筋細胞および血管平滑筋細胞を生じる能力を有する。
【００２８】
本明細書において「胚性幹細胞」または「ＥＳ細胞」とは、動物の初期段階の胚である胚盤胞内に存在する内部細胞塊に由来する多能性細胞を意味する。ＥＳ細胞は動物の身体のいずれの組織にも分化する能力を有する(Evans, M.J.およびKaufman, M.H., Nature 292, 154-156 (1981))。形質転換ＥＳ細胞を胚盤胞に戻し、続いて代理母の子宮に移植すれば、キメラトランスジェニック動物を作出できる。
【００２９】
本明細書において「人工多能性細胞」または「ｉＰＳ細胞」とは、卵母細胞、胚またはＥＳ細胞ではない分化細胞の核初期化により人工的に誘導した多能性を有する細胞を意味する。このｉＰＳ細胞は、Takahashi, K.およびYamanaka, S. (Cell 126, 663-676 (2006))、Takahashi, K.ら(Cell 131, 861-872 (2007))またはYu, J.ら(Science 318, 1917-1920 (2007))に記載された、３つまたは４つの転写因子をコードする遺伝子を用いて形質導入することにより哺乳類の体細胞から誘導することができる。
【００３０】
本明細書において「Ｆｌｋ１」とは、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）を指す。
【００３１】
本明細書において「Ｆｌｋ１＋／ＣＸＣＲ４＋」とは、前駆心臓中胚葉の指標であるＭｅｓｐ−１、ＧＡＴＡ−４およびＴｂｘ５が有意に豊富なＥＳ細胞後代を同定するためのバイオマーカー対を意味する。このバイオマーカー対は、多能性幹細胞プール内に心臓形成の特性が現れたことを推定するために使用でき、心臓形成性細胞系列の標的選択を可能とする(Nelsonら, Stem Cells 26, 1464 -1473 (2008))。
【００３２】
本明細書において「形質導入」とは、ウイルスベクターまたはプラスミドベクターなどのベクターを用いて細胞に外来ＤＮＡを導入する手法を意味し、これにより、その細胞はその外来ＤＮＡを含む。
【００３３】
本明細書において「移植」とは、動物の心臓の梗塞または傷害部位に、心筋細胞、心臓前駆細胞またはその混合物を含む細胞インプラントまたは移植片を移植することを意味する。
【００３４】
本明細書におい「シクロスポリン−Ａ」または「ＣＳＡ」とは、この化合物がＴ細胞の活性を阻害する能力を有することから、臓器または骨髄の移植後に患者の拒絶反応を防ぐために通常用いられる免疫抑制剤を指す。ＣＳＡはNovartis (Basel, Switzerland)から入手可能である。
【００３５】
本明細書において「動物」、「被験体」または「患者」とは、霊長類、齧歯類および有蹄類を含む哺乳類、好ましくはヒトを意味する。
【００３６】
発明の説明
１．ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞からの心筋細胞および／または心臓前駆細胞の生成
本発明は、中胚葉細胞に分化されたｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞をシクロスポリン−Ａ（「ＣＳＡ」と呼ぶ）の存在下で培養することを含む、心筋細胞および／または心臓前駆細胞を生産するための方法を提供する。
【００３７】
「中胚葉細胞に分化されたｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞」とは、これらの細胞が中胚葉細胞（すなわち、中胚葉〜初期心臓分化系列）、好ましくはＦｌｋ１＋（キナーゼインサートドメインタンパク質受容体、Ｋｄｒとしても知られる）細胞に分化された段階であることを意味する。本発明によれば、中胚葉細胞段階でｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞の培養物にＣＳＡを加えると、それらは常法に比べてより効率的に心筋細胞および／または心臓前駆細胞に分化される。
【００３８】
これまでに、アクチビンＡおよび骨形成因子４（ＢＭＰ４）を含む誘導物質を用いると、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞から心筋細胞、心血管細胞または心血管前駆細胞が誘導されることが知られている(Takahasi, K.ら, Cell 131, 861-872 (2007); Laflamme, M.A.ら, Nat. Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007); Yang, L.ら, Nature 453, 524-528 (2008))。しかしながら、ＣＳＡによるＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞からの心筋細胞および／または心臓前駆細胞の誘導は、本発明者らにより今回初めて見出された。
【００３９】
本発明者らは、以下、出発細胞としてのＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞からの心筋細胞および／または心臓前駆細胞の生成を詳細に説明する。
【００４０】
１．１  ＥＳ細胞の調製
本発明では、心筋細胞および／または心臓前駆細胞を誘導するための出発細胞としてすべてのＥＳ細胞を使用することができる。本明細書において「心筋細胞および／または心臓前駆細胞」とは、心筋細胞、心臓前駆細胞またはその混合物もしくは集団を含むものとする。
【００４１】
使用可能なＥＳ細胞としては、霊長類、齧歯類、有蹄類などのＥＳ細胞のような哺乳類ＥＳ細胞を含み、霊長類としては、ヒト、サル、チンパンジーなどを含み、齧歯類としては、マウス、ラット、ハムスターなどを含み、有蹄類としては、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどを含む。
【００４２】
マウスＥＳ細胞は、Evans, M.J.およびKaufman, M.H. 1981 (Nature 292, 154-156 (1981))により、マウス受精卵の初期段階の胚である胚盤胞に存在する内部細胞塊から初めて樹立された。その後、1998年にThomson, J.A.ら(Science 282, 1145-1147 (1998))により、ヒト胚盤胞の内部細胞塊からヒトＥＳ細胞も樹立された。同様に、ウシ胚盤胞の内部細胞塊からウシＥＳ様細胞も樹立された（特開２００２−１５３２８１）。
【００４３】
ＥＳ細胞は多能性幹細胞であるので、あらゆる細胞、組織または器官に分化する能力および半永久的に増殖する能力の双方を有する。
【００４４】
ＥＳ細胞は、既知の方法により、哺乳類胚盤胞の内部塊から調製することができる。例えば、この方法は、in vivoまたはin vitro受精後に哺乳類の卵から胚盤胞を得るステップ；その胚盤胞からマイクロマニピュレーションにより内部細胞塊を取り出すステップ；取り出した内部細胞塊を、ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、α−ＥＭＥ培地、ハムＦ−１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地またはその混合物などの動物細胞培養培地中、マウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー上またはフィーダー不含条件で約１〜２週間培養するステップ；培養ディッシュからＥＳ細胞を回収するステップ；および回収したＥＳ細胞をフィーダー細胞の存在または非存在下で培養することにより複数回継代するステップを含む。フィーダー不含条件での内部細胞塊の培養は、ＭＥＦで馴化された培地中、マトリゲルまたはラミニン上で行うことができる(Xu, C.ら, Nat. Biothechnol. 19, 971-974 (2001))。これらのＭＥＦ細胞は、マイトマイシンＣ、ストレプトマイシン、ペニシリンなどの抗生物質で予め処理されていてもよい。ディッシュからのＥＳ細胞の脱着は、ＥＤＴＡまたはコラゲナーゼＩＶと一緒ににインキュベートすることにより行うことができる(Laflamme, M.A.ら, Nat. Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007))。培養培地には、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）、非必須アミノ酸、グルタミン酸、ピルビン酸ナトリウムおよび抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシンなど）などから選択する物質を含むことができ、培養は一般に約３７〜３８．５℃、２〜５％ＣＯ２および９８〜９５％空気の雰囲気中で行うことができる。継代培養は３〜４日間隔で、ＭＥＦフィーダー上またはコラゲナーゼＩでコーティングしたプレート上で行うことができる。
【００４５】
調製されたＥＳ細胞は一般にそれらのマーカー遺伝子を用いて同定することができる。ヒトＥＳ細胞マーカー遺伝子の例としては、Ｏｃｔ３／４（同じタンパク質であるが、Ｏｃｔ３またはＯｃｔ４とも呼ばれる）、アルカリ性ホスファターゼ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、増殖分化因子３（ＧＤＦ３）、reduced expression 1（ＲＥＸ１）、繊維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ４）、胚性細胞特異的遺伝子１（ＥＳＧ１）、developmental pluripotency-associated ２（ＤＰＰＡ２）、ＤＰＰＡ４、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ１）、未分化ヒトＥＳ細胞特異的表面抗原（ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ１−６０、Ｔｒａ１−８１）などがある(Takahashi, K.ら, Cell 131, 861-872 (2007); Kroon, E.ら, Nat. Biotechnol. 26, 443-452 (2008); Xu, C.ら, Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001))。これらのマーカー遺伝子は、以下の１．２節に記載されるヒトｉＰＳ細胞でも発現する。少なくとも、Ｏｃｔ３／４、アルカリ性ホスファターゼ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｇｄｆ３およびＦｇｆ４マーカー遺伝子はマウスＥＳ細胞でも同様に発現される(Takahashi, K.およびYamanaka, S., Cell 126, 663-676 (2006))。マーカー遺伝子または遺伝子産物の存在はＲＴ−ＰＣＲまたはウエスタンブロッティングのいずれかによって検出することができる。
【００４６】
１．２  ｉＰＳ細胞の調製
上記のように、Takahashi, K.およびYamanaka, S. (Cell 126, 663-676 (2006);国際公開ＷＯ２００７／０６９６６６)によってマウスｉＰＳ細胞が最初に樹立され、その後、Takahashi, K.ら(Cell 131, 861-872 (2007))および、Yu, J.ら(Science 318, 1917-1920 (2007))によりそれぞれヒトｉＰＳ細胞が樹立された。
【００４７】
ｉＰＳ細胞は、核初期化因子としてＯｃｔおよびＳｏｘファミリーメンバーを含む少なくとも３つまたは４つまたは６つの転写因子をコードする遺伝子により体細胞に形質導入を行うことにより、体細胞から誘導することができる。他の転写因子は、Ｋｌｆファミリーメンバーと任意のＭｙｃファミリーメンバーの組合せおよび／またはＮａｎｏｇとＬｉｎファミリーメンバーの組合せであり得る。
【００４８】
Ｏｃｔファミリーメンバーの例としては、限定されるものではないが、Ｏｃｔ３／４、Ｏｃｔ１ＡおよびＯｃｔ６などがあり、好ましくは、Ｏｃｔ３／４が挙げられる。Ｏｃｔ３／４はＰＯＵ（Ｐｉｔ、Ｏｃｔ、Ｕｎｃ）ファミリーに属する転写因子であり、胚細胞、生殖細胞またはＥＳ細胞のような未分化細胞のマーカーとして報告されている(Niwa, H. Cell Struc. Func. 26, 137-148 (2001); Pesce, M.およびScholer, H.R., Stem Cells 19, 271-278 (2001))。
【００４９】
Ｓｏｘ（ＳＲＹ関連ＨＭＧボックス）ファミリーメンバーの例としては、限定されるものではないが、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ７、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７およびＳｏｘ１８などがあり、好ましくはＳｏｘ２が挙げられる。Ｓｏｘ２は、多能性細胞においてＯｃｔ３／４と協同しながらＦｇｆ４の発現を活性化する因子である(Yuan, H.ら, Genes. Dev. 9, 2635-2645; Avilion, A.A.ら, Genes Dev. 17, 126-140 (2003))。
【００５０】
Ｋｌｆ（Ｋｒｕｐｐｅｌ様因子）ファミリーメンバーの例としては、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４およびＫｌｆ５などがあり、好ましくはＫｌｆ４が挙げられ、腫瘍抑制因子として報告されている(Ghalebら, Cell Res. 15, 92-96 (2005))。
【００５１】
Ｍｙｃファミリーメンバーの例としては、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−ＭｙｃおよびＬ−Ｍｙｃなどがあり、好ましくはｃ−Ｍｙｃが挙げられ、細胞の分化および増殖に関与する転写制御因子である(AdhikaryおよびEilers, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 635-645 (2005))。
【００５２】
Ｎａｎｏｇは、胚盤胞の内部細胞塊で最も高く発現し、分化細胞では発現しないホメオボックスタンパク質である(Chambers, L.ら, Cell 113, 643-655 (2003); Zaehres, H.ら, Stem. Cells 23, 299-305 (2005))。
【００５３】
Ｌｉｎファミリーメンバーの例としては、未分化ヒトＥＳ細胞のマーカーとして知られるＬｉｎ２８が挙げられる(Richards, M,ら, Stem Cells 22, 51-64 (2004))。
【００５４】
より具体的には、転写因子の組合せとしては、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃ(Takahashi, K.およびYamanaka, S., Cell 126, 663-676 (2006); Takahashi, K.ら, Cell 131, 861-872 (2007))；Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４(Nakagawa, M.ら, Nat. Biotechnol. 26, 101-106 (2008))；ならびにＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８(Yu, J.ら Science 318, 1917-1920 (2007))がある。さらに、次の６つの転写因子の組合せ：Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４が使用可能であり、この組合せはヒト体細胞からｉＰＳ細胞を生成する効率を高めることができる(Liao, J.ら, Cell Res. 18, 600-603 (2008))。Nakagawa, M.ら (2008)によれば、３つの転写因子Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４をコードする遺伝子によるヒトまたはマウス体細胞への形質導入は奇形腫の形成または腫瘍形成を劇的に抑制することができる。
【００５５】
核初期化因子をコードする遺伝子は、通常のクローニングおよび／またはＲＴ−ＰＣＲ法により、各遺伝子が存在する細胞または組織のｍＲＮＡから予め合成されたｃＤＮＡライブラリーから個々に分離することができる。それらによりコードされている遺伝子およびタンパク質の配列はＮＣＢＩ（ＵＳＡ）にアクセスすることによりＧｅｎＢａｎｋから入手することができる。
【００５６】
体細胞としては、一次細胞、二次細胞およびその細胞系統を含め成体および胎児体細胞が用いられる。体細胞の例としては、限定されるものではないが、皮膚細胞、ケラチノサイト、肝臓細胞、胃細胞、腸細胞、脾臓細胞、腎臓細胞、食道細胞、骨細胞、脳細胞、神経細胞、グリア細胞、上皮細胞、表皮細胞、筋肉細胞、膵臓細胞および繊維芽細胞を含む、哺乳類（好ましくは、ヒト）の組織および器官からのあらゆる細胞を含む。
【００５７】
ｉＰＳ細胞の生成のための形質導入は、限定されるものではないが、ウイルスおよびプラスミド、リポフェクション、エレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションなどのベクターの使用を含む。複製欠陥型であるウイルスベクターの例としては、限定されるものではないが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターなどが挙げられる。好ましくは、市販のベクターがベクターとして使用可能であり、ウイルスベクターの例としては、ｇａｇに欠陥があるｐＭＸ、ｐＭＹおよびｐＭＺ(Cosmo Bio, Japan)；レトロＸＱベクター(Clontech, the Netherlands)およびｐＬｅｎｔｉ６／Ｕｂｃベクター(Invitrogen, USA)などが挙げられる。
【００５８】
ベクターを用いた形質導入の場合、核初期化因子をコードする遺伝子は個々にベクターＤＮＡに挿入してもよいし、あるいは組み合わせて単一のベクターＤＮＡに挿入してもよい。これらの遺伝子は、それらが発現し得るように、プロモーターおよびエンハンサーなどの調節配列と機能し得る形で連結されてもよい。プロモーターの例としては、ＣＭＶプロモーター、ＭＳＶプロモーター、ＲＳＶプロモーターおよびＳＶ４０プロモーターなどがある。これらのベクターはさらに、薬剤耐性遺伝子（例えば、ピューロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子またはハイグロマイシン耐性遺伝子など）などの陽性選択マーカー、陰性選択マーカー（例えば、ジフテリア毒素Ａフラグメント遺伝子またはチミジンキナーゼ遺伝子など）、インターナルリボソームエントリーサイト（ＩＲＥＳ）、ターミネーター、複製起点などを含み得る。
【００５９】
体細胞（例えば、５×１０４〜１×１０７細胞／１００ｍｍディッシュ）を、約３７℃にて、ＭＥＦフィーダー上で、またはフィーダー不含条件（例えば、マトリゲルコーティングプレート上）で、上記の３つ、４つまたは６つの核初期化因子を含むベクターのカクテルで形質導入またはトランスフェクションし(Takahashi, K.ら, Cell 131, 861-872 (2007))、その結果形質導入の約１〜４週間後にｉＰＳ細胞またはそのコロニーが誘導される。用いる培養培地はＤＭＥＭ、α−ＭＥＭ、ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地またはその混合物であってよく、この培地はＦＢＳ、抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシンなど）、非必須アミノ酸、グルタミン酸、ピルビン酸ナトリウム、β−ＭＥなどを含み得る。その後、生成されたｉＰＳ細胞を、ｂＦＧＦを添加したマウスまたは霊長類ＥＳ培地で維持すればよい。継代では、ｉＰＳ細胞を約３７℃にてコラゲナーゼＩＶ（例えば１ｍｇ／ｍｌ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２とともにインキュベートし、それらがほぼ集密状態にまで増殖したところで、細胞を掻き取り、新しい培養ディッシュのＳＮＬフィーダー細胞上へ移す。ヒトｉＰＳ細胞のフィーダー不含培養では、細胞をマトリゲルコーティングプレート上、ＭＥＦ馴化または非馴化霊長類ＥＳ細胞培地（双方ともｂＦＧＦ（例えば４ｎｇ／ｍｌ）を含有）中に播種し、培地を毎日新鮮培地に交換すればよい。
【００６０】
ｉＰＳ細胞の生成は、特異的マーカー遺伝子の発現により確認することができる。これらのマーカー遺伝子は、マウスｉＰＳ細胞についてはTakahashi, K.およびYamanaka, S. Cell 126, 663-676 (2006)に、また、ヒトｉＰＳ細胞についてはTakahashi, K.ら, Cell 131, 861-872 (2007)に記載されている。ヒトまたはマウスｉＰＳ細胞において発現されるこれらのマーカー遺伝子は、それぞれ上記の１．１節に記載のようなヒトまたはマウスＥＳ細胞におけるマーカー遺伝子とほとんど同じである。アルカリホスファターゼ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２およびＮａｎｏｇのマーカー遺伝子の発現は、生成されたｉＰＳ細胞が未分化で、ＥＳ様の多能性細胞であることを示す。マーカー遺伝子または遺伝子産物の存在はＲＴ−ＰＣＲまたはウエスタンブロッティングのいずれかにより検出することができる。
【００６１】
他の哺乳類ｉＰＳ細胞でも、上記と同様の方法でそれらを生成し、同定することができる。
【００６２】
１．３  ＥＳまたはｉＰＳ細胞からの中胚葉細胞の誘導および分化
本発明によれば、中胚葉細胞に分化しているＥＳまたはｉＰＳ細胞をＣＳＡの存在下で培養すると、それらのＥＳまたはｉＰＳ細胞が心筋細胞および／または心臓前駆細胞に分化する。
【００６３】
本発明において、中胚葉細胞はＦｌｋ１陽性（すなわちＦｌｋ１＋）であることによって特徴付けられ、このＦｌｋ１＋細胞は、Yamashita, J.ら (Nature 408, 92-96 (2000) 、Yamashita, J.K.ら(FASEB J. 19, 1534-1536 (2005))またはNarazaki, G.ら, Circulation 118, 498-506 (2008)により記載されている方法によって、ＥＳまたはｉＰＳ細胞をコラーゲンＩＶコーティングディッシュ（ＬＩＦ（−）およびフィーダー（−））上で４〜５日間培養することにより誘導することができる。
【００６４】
簡潔には、ＥＳ細胞を、分化培地としての１０％ＦＣＳを含有するα−ＭＥＭ中で、コラーゲンＩＶコーティングディッシュまたはマイトマイシンＣ処理コンフルエントＯＰ９細胞シート（ＭＭＣ−ＯＰ９）上に、１〜１０×１０３細胞／ｃｍ２の細胞密度で４．５日間培養する。ｉＰＳ細胞については、細胞をまずゼラチンコーティングディッシュに、１〜１０×１０３〜１０４細胞／ｃｍ２の細胞密度でプレーティングし、３０分間培養して接着したフィーダー細胞を排除し、次に、接着していない細胞を、分化のために回収する。細胞を回収し、Ｆｌｋ１＋細胞を純化するために蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を行う。
【００６５】
その後、純化されたＦｌｋ１＋細胞をＭＭＣ−ＯＰ９上に１〜１０×１０３〜１０４細胞／ｃｍ２の細胞密度でプレーティングし、ＣＳＡを含有する分化培地（１０％ＦＣＳを添加したα−ＭＥＭ）中、約３７℃で２〜６日間培養して心臓分化を誘導する。培地は２日ごとに交換する。ＦＣＶ（Ｆｌｋ１＋／ＣＸＣＲ４＋／血管内皮カドヘリン−）細胞の誘導およびＦＣＶ細胞の選別を記載のように行う(Yamashita, J.K.ら FASEB J. 19, 1534-1536 (2005))。純化されたＣＳＡ誘導ＦＣＶ細胞は高い心臓前駆細胞活性を有し、これらの細胞はＦｌｋ１、ＣＸＣＲ４、ＧＡＴＡ４、Ｔｂｘ３、Ｎｋｘ２．５およびｉｓｌｅｔ１などの心臓前駆細胞マーカーを発現する（図５）。Ｆｌｋ１＋中胚葉細胞培養物にＣＳＡを加えると、ＣＳＡ無しの場合より、約１７倍高い心筋細胞を生成し、約２２倍高いＦＣＶ前駆細胞を生成する（図６）。
【００６６】
培養培地におけるＣＳＡの濃度は、例えば、およそ０．１〜１０μｇ／ｍＬ、好ましくはおよそ１〜３μｇ／ｍＬである。培養４〜６日後、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞由来中胚葉細胞は、心筋細胞を生じる能力を有する自己拍動心筋細胞および／または心臓前駆細胞に分化する。
【００６７】
心筋細胞の生成は次の点：
（１）拍動細胞であること（図１ａ）；
（２）心臓トロポニン−Ｔ（ｃＴｎＴ）に関して陽性であること（図１ｂ、ｃ）；
（３）筋節形成を示すこと（図１ｅ）；
（４）純化された心筋細胞の活動電位がペースメーカー電位を有する細胞の存在を示すこと（図１ｆ）；および
（５）心室型細胞はペースメーカー電位および自己拍動が無いこと（図１ｇ）；
（６）純化されたＣＳＡ誘導心筋細胞がα−ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）２ｖおよび２ａ、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４およびＴ−ｂｏｘタンパク質３（Ｔｂｘ３）などの心臓マーカーｍＲＮＡ発現を示すこと（図５）
により確認することができる。
【００６８】
心臓前駆細胞の生成は、Ｆｌｋ１、ＣＸＣＲ４、ＧＡＴＡ４、Ｎｋｘ２．５、ｉｓｌｅｔ１などの心臓前駆細胞マーカーのｍＲＮＡの発現により確認することができるが、逆に、心臓前駆細胞は、成熟心筋細胞マーカーＭＨＣ、ＭＬＣ−２ｖおよびＭＬＣ−２ａを発現しない（図５）。
【００６９】
本発明によれば、ＥＳ細胞の場合、約６０％のＦｌｋ１＋細胞由来細胞が心筋細胞に変化し（図１ｈ）、ＣＳＡ処理は、同数のＦｌｋ１＋細胞から出発してＦＡＣＳ純化心筋細胞の収量に約１７倍の増加をもたらす（図１ｉ）。その結果、１個のＥＳ細胞からおよそ２００個の心筋細胞を得ることができた（図６）。
【００７０】
同様に、ｉＰＳ細胞の場合、純化されたｉＰＳ細胞由来Ｆｌｋ１＋細胞に対するＣＳＡ処理は、ＣＳＡで処理しなかった場合よりも心筋細胞の出現をおよそ１２倍顕著に増加させ（図２ａ、ｂ）、ＣＳＡ処理はまたＦＣＶ心臓前駆細胞集団も劇的に増加させる。ｉＰＳ細胞由来Ｆｌｋ１＋細胞からのＦＣＶ細胞はＣＳＡにより２８％まで増加する（図２ｃ）。
【００７１】
ヒトｉＰＳ細胞をＥＮＤ−２臓側内胚葉様間質細胞上で培養すると(Mummery, C.ら Circulation 107, 2733-2740 (2003))、培養のおよそ１０〜１２日後に自己拍動コロニーが見られる（図２ｄ）。これらの拍動細胞はｃＴｎＴ陽性であり（図２ｅ）、アクチニン染色を伴う明らかな筋節形成を示す（図２ｆ）。拍動細胞では、細胞内Ｃａ２＋レベルは収縮と同期して増える（図２ｇ）。これらの結果は、本発明の方法によりヒトｉＰＳ細胞から機能的心筋細胞が首尾よく誘導できることを示す。
【００７２】
よって、本発明は、ＣＳＡの新たに発見された中胚葉特異的効果によって、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞から心臓前駆細胞および心筋細胞を有効に生成するための新規な方法を提供する。
【００７３】
ＣＳＡにより増殖されたＦＣＶ細胞の心筋細胞へのin vivo分化能をラット慢性心筋梗塞モデルへの移植のより調べると(Tambara, K.ら Circulation 108 suppl II, 259-263 (2003))、移植されたＦＣＶ細胞は心筋細胞に首尾よく分化し、梗塞心臓に組み込まれ、傷病組織においてＧＦＰ＋／ｃＴｎＴ＋ドナー細胞由来心筋細胞層をより効率よく形成する（図１ｌ、ｍ；図３Ｂ）。また、移植された前駆細胞は組織化された心筋に首尾よく分化する（図３Ｃ）。ＦＣＶ細胞の移植によって、活性のある再生心筋細胞の最大面積が、ＧＦＰ＋心筋細胞の場合より８倍高く増加するという結果がもたらされる（図３Ｄ）。
【００７４】
ＥＳまたはｉＰＳ細胞から誘導されたＦｌＫ１＋中胚葉細胞とＣＳＡとの組合せの使用を含む本発明の方法により生成された、心筋細胞、心臓前駆細胞またはその混合物もまた、本発明の範囲に包含される。ＣＳＡにより誘導された心筋細胞は心筋組織を組み立てる能力を有し、ＣＳＡにより誘導された心臓前駆細胞は、心筋細胞を生じるＦｌｋ１＋／ＣＸＣＲ４＋／血管内皮カドヘリン−細胞集団である。さらに、ＣＳＡにより誘導された心筋細胞は、α−ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）２ｖおよび２ａ、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４、Ｔ−ｂｏｘタンパク質３（Ｔｂｘ３）などのマーカーｍＲＮＡの発現を示し、ＣＳＡにより誘導された心臓前駆細胞は、Ｆｌｋ１、ＣＸＣＲ４、ＧＡＴＡ４、Ｎｋｘ２．５、ｉｓｌｅｔ１などのマーカーｍＲＮＡの発現を示すが、成熟心筋細胞マーカーであるＭＨＣ、ＭＬＣ−２ｖおよびＭＬＣ−２ａは示さない（図５）。
【００７５】
２．  心筋細胞および／または心臓前駆細胞を誘導し得る薬剤のスクリーニング
本発明はさらに、心筋細胞および／または心臓前駆細胞を誘導し得る薬剤について候補薬剤をスクリーニングするための方法であって、中胚葉細胞に分化されたｉＰＳ細胞を候補薬剤の存在下で培養すること、および該薬剤を拍動コロニーおよび／またはＦｌｋ１＋／ＣＸＣＲ４＋／血管内皮カドヘリン−細胞の形成に基づいて選択することを含む方法を提供する。
【００７６】
スクリーニング系の培養条件は、ＣＳＡの代わりに候補薬剤を用いること以外は上記の１．３節に記載されているものと同じである。すなわち、ｉＰＳ細胞から誘導された純化されたＦｌｋ１＋中胚葉細胞をＭＭＣ−ＯＰ９上に１〜１０×１０３〜１０４細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングし、候補薬剤を含有する分化培地（１０％ＦＣＳを添加したα−ＭＥＭ）中、約３７℃で培養し、その後、心臓分化が誘導されるかどうかを、上記の１．３節に記載されているように心臓前駆細胞マーカーおよび／または心筋細胞マーカーの遺伝子の発現を測定することによるか、またはＦＣＶ心臓前駆細胞または拍動コロニーの形成を検出することにより判定する。ＦＣＶ心臓前駆細胞はＦｌｋ１陽性、ＣＸＣＲ４陽性、血管内皮カドヘリン陰性であり(Yamashita, J.K.ら, FASEB J. 19, 1534-1536 (2005))、これらのマーカーの有無は、プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによるか、または各マーカーに対する抗体を用いるＦＡＣＳもしくはウエスタンブロッティングにより判定される。
【００７７】
候補薬剤としては、限定されるものではないが、小分子、ペプチド、ポリペプチド、（糖）タンパク質、ヌクレオシド、核酸、オリゴ糖、炭水化物、（糖）脂質、天然産物、合成化合物および無機物などが挙げられる。これまでのところ、アクチビンＡとＢＭＰの組合せが分化誘導物質として知られている(Takahashi, K.ら, Cell 131, 861-872 (2007))。
【００７８】
このスクリーニング法は、スクリーニング系にｉＰＳ細胞由来Ｆｌｋ１＋中胚葉細胞を用いること、および指標としてＦＣＶ心臓前駆細胞または拍動コロニー（心筋細胞、ｃＴｎＴ陽性）の形成を判定することを特徴とする。この方法により選択された薬剤は心筋細胞および／または心臓前駆細胞を誘導することができ、よって、再生療法において新規な心臓再生薬として使用可能である。
【００７９】
３．  心筋細胞および／または心臓前駆細胞の治療への使用
本発明はさらに、上記の１．３節に記載されている手順によって調製された心筋細胞、心臓前駆細胞またはその混合物を被験体の心臓に移植することを含む、心疾患を有する被験体を治療するための方法を提供する。
【００８０】
本発明はさらに、心疾患を有する被験体を治療するための医薬または移植片またはインプラントの製造における、上記の§１．３に記載されている手順によって調製された心筋細胞、心臓前駆細胞またはその混合物の使用も提供する。
【００８１】
上記の発明において、心臓前駆細胞を使用するのが好ましい。
【００８２】
これらの発明は、心臓修復または心臓再生のための幹細胞に基づく方法を提供する。特に、Dr. Yamanaka, S (Cell 131, 861-872 (2007); Nat. Biotechnol. 26, 101-106 (2008))のグループによって発見された体細胞からヒトｉＰＳ細胞を誘導する技術を本発明と融合させると、雌性だけでなく雄性においても、心臓修復または再生のための幹細胞に基づく方法をもたらすことが可能となる。
【００８３】
被験体としては、上記で定義されたような哺乳類、好ましくはヒトを含む。
【００８４】
心疾患としては、限定されるものではないが、心筋梗塞および心筋症を含む心不全が含まれる。
【００８５】
最近、Laflamme, M.A.らは、アクチビンＡおよびＢＭＰ４を用いてヒトＥＳ細胞から誘導された心筋細胞が梗塞ラット心臓の機能を高めたことを報告した(Nat. Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007))。本発明者らもまた、今回、ラット心筋梗塞モデルへの心臓前駆細胞の移植が梗塞領域における移植細胞の肉眼的所見および心筋組織への組み込み、すなわち壁の肥厚をもたらすことを見出した（図１ｌ、１ｍ、３Ｂ、３Ｄ、３Ｅ）。ラットの心筋梗塞は６０分の虚血とその後の再潅流により誘発させることができる(Laflamme, M.A.ら,前掲)。
【００８６】
本発明によれば、ｉＰＳまたはＥＳ細胞から誘導された心筋細胞、心臓前駆細胞またはその混合物、好ましくは心臓前駆細胞は、ヒトを含む哺乳類の心臓の梗塞領域（例えば、梗塞病巣）にインプラント、移植片またはグラフトの形で、直接注入する手法により外科的に移植される。移植細胞の細胞総数は例えば１×１０７〜１×１０９細胞である。
【００８７】
療法において移植される細胞調製物は、純化し、in vivo使用におけるそれらの安全性を確認しなければならない。これらの細胞の純化は例えばパーコール勾配およびＦＡＣＳの使用により行うことができる。安全性については、腫瘍形成または発癌のあらゆるリスクを回避しなければならない。特に、ｉＰＳ細胞の誘導の場合、ｃ−Ｍｙｃおよびレトロウイルスベクターの使用を避けることが望ましいかもしれない。純化された細胞は好ましくは無血清培地で保存し、１〜２日以内に使用されなければならない。
【００８８】
以下の実施例は本発明を説明するために示し、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００８９】
実施例１：  ＥＳ細胞に対するＣＳＡの心臓形成効果
本発明者らの心筋細胞分化系では、一連の４つの分化段階の細胞集団、すなわち、未分化ＥＳ細胞、Ｆｌｋ１＋中胚葉細胞、ＦＣＶ心臓前駆細胞および心筋細胞を同定および純化ことができる（図４）(Yamashita, J.ら Nature 408, 92-96 (2000); Yamashita, J.K. ら FASEB J. 19, 1534-1536 (2005))。純化されたＦｌｋ１＋細胞をＯＰ９間質細胞上で培養すると、培養４日（Ｆｌｋ−４日目(Flk-d4)）で自己拍動心筋細胞が出現する。細胞移植試験に用いる前に、心筋細胞分化に対するin vitroでの効果を確認するためにＦｌｋ１＋細胞にＣＳＡを加えたところ、ＣＳＡ（１〜３μｇ／ｍＬ）は、Ｆｌｋ−６日目(Flk-d6)において拍動細胞を増加させる顕著な効果を示した（図４の実験１）（図１ａ）。ＣＳＡの添加は対照よりも、心臓トロポニン−Ｔ（ｃＴｎＴ）陽性心筋細胞の出現におよそ１３倍の増加を誘導した（図１ｂ、ｃ）。ＣＳＡにより誘導された心筋細胞は明瞭なｃＴｎＴ発現（図１ｄ）と筋節形成（図１ｅ）を示した。純化された心筋細胞の活動電位はペースメーカー電位を有する細胞の存在（図１ｆ）、ならびにペースメーカー電位および自己拍動を欠いた心室型細胞（図１ｇ）の存在を示した。純化されたＣＳＡ誘導心筋細胞は、α−ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）２ｖおよび２ａ、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４、Ｔ−ｂｏｘタンパク質３（Ｔｂｘ３）などの種々の心臓マーカーｍＲＮＡ発現を示した（図５）。これらの結果は、ＣＳＡ処理により機能的心筋細胞が首尾よく誘導され、増殖されたことを示す。至適条件において、およそ６０％のＦｌｋ１＋細胞由来細胞がＭＨＣプロモーターにより駆動されるＧＦＰに陽性（ＧＦＰ＋）の心筋細胞となった(Yamashita, J.K.ら FASEB J. 19, 1534-1536 (2005))（図１ｈ）。ＣＳＡ処理は、同じ数のＦｌｋ１＋細胞から出発してＦＡＣＳ純化心筋細胞の収量におよそ１７倍の増加をもたらした（図１ｉ）。結果として、１個のＥＳ細胞からおよそ２００個の心筋細胞を得ることができた（図６）。
【００９０】
本発明者らはさらに、ＣＳＡの分化段階特異的効果を評価した。ＣＳＡは未分化のＥＳ細胞からのＦｌｋ１＋中胚葉細胞の出現または初期の分化過程での内胚葉および外胚葉マーカー発現には影響を及ぼさなかった（図４の実験２）（図７）。驚くべきことに、Ｆｌｋ１＋細胞へのＣＳＡの添加は特異的にＦＣＶ（Ｆｌｋ１＋／ＣＸＣＲ４＋／血管内皮カドヘリン−）心臓前駆細胞集団(Yamashita, J.K.ら FASEB J. 19, 1534-1536 (2005))を対照のおよそ１０〜２０倍に増加させた（図４の実験３）。全Ｆｌｋ１＋細胞由来細胞内のＦＣＶ細胞の最大パーセンテージはＣＳＡにより４０％まで高まった（図１ｊ）。純化されたＦＣＶ前駆細胞の収量はＣＳＡ処理によりおよそ２２倍増加した（図１ｋ）。純化されたＣＳＡ誘導ＦＣＶ細胞は、Ｆｌｋ１、ＣＸＣＲ４、ＧＡＴＡ４、Ｎｋｘ２．５、ｉｓｌｅｔ１などの種々の心臓前駆細胞マーカーｍＲＮＡ発現を示したが、成熟心筋細胞マーカーであるＭＨＣ、ＭＬＣ−２ｖおよびＭＬＣ−２ａは示さなかった（図５）。ＯＰ９細胞上のＥＣおよびＭＣと同様に単一のＦＣＶ細胞から心筋細胞を生成することができた（図８）。同数の対照ＦＣＶ細胞およびＣＳＡにより増殖されたＦＣＶ細胞から、ＯＰ９細胞上において、同程度の数の心筋細胞が誘導された。ＣＳＡにより増殖されたＦＣＶ細胞の心筋細胞へのin vivo分化能を、ラット慢性心筋梗塞モデルへの移植により調べた(Yamashita, J.K.ら FASEB J. 19, 1534-1536 (2005))。ＧＦＰ＋心筋細胞が移植された場合（図３Ａ）に比べて、移植されたＦＣＶ細胞は首尾よく心筋細胞に分化し梗塞心臓中に組み込まれて、傷病組織において、より効果的にＧＦＰ＋／ｃＴｎＴ＋ドナー細胞由来心筋細胞層を形成した（図１ｌ、ｍ；図３Ｂ）。隣接するｃＴｎＴ＋細胞間にコネキシン４３が見られたが、これは移植された前駆細胞が組織化された心筋に首尾よく分化したことを示唆している（図３Ｃ）。ＦＣＶ細胞移植は、活性のある再生心筋細胞の最大面積について、ＧＦＰ＋心筋細胞移植により誘導した場合より８倍高い増加を示した（図３Ｄ）。再生心筋の推定体積はＦＣＶ細胞の注入により、ＧＦＰ＋細胞の場合よりもおよそ２３倍増加した（図３Ｅ）。これらの結果は、ＣＳＡにより増殖されたＦＣＶ細胞はin vitroおよびin vivoの双方で高い心臓形成能を有することを示した。ＦＣＶ細胞および心筋細胞におけるＥｄＵの組み込みおよびアネキシンＶの発現はＣＳＡ処理により影響を受けなかった（図９、１０）が、このことはＣＳＡによるＦＣＶ細胞および心筋細胞の増加が、ＦＣＶ細胞および心筋細胞の増殖および／または延命によるものではなかったことを示唆する。純化されたＦＣＶ細胞にＣＳＡを加えた場合（図４の実験４）には、心筋細胞に若干の増加（およそ２．６倍）が見られた（図１１）。
【００９１】
本発明者らはさらに、ＣＳＡの細胞および分子機構を調べた。Ｆｌｋ１＋細胞に対するＣＳＡ処理（Ｆｌｋ−０〜６日目(Flk-d0〜Flk-d6)：図４の実験１）は、Ｆｌｋ１＋細胞からのＥＣまたは血液細胞の相反する低下を伴った劇的な心筋細胞の増加を誘導した（図１ｎ、図１２）。ＣＳＡを中胚葉段階にのみ加えた場合でも（Ｆｌｋ−０〜２日目(Flk-d0〜Flk-d2)：実験５）同様の効果が見られたが（図１３）、これは、ＣＳＡはＦｌｋ１＋細胞に作用し、ＥＣまたは血液細胞から心筋細胞へ細胞運命をシフトさせ得ることを示唆する。カルシニュリン阻害剤であるＣＳＡおよびＦＫ５０６は、活性化Ｔ細胞（ＮＦ−ＡＴ）シグナルの核内転写因子の阻害を介してそれらの免疫抑制効果を発揮する(Martinez, S.およびRedondo, J.M. Curr Med Chem. 11, 997-1007 (2004))。それにもかかわらず、ＦＫ５０６およびＮＦ−ＡＴ阻害剤１１Ｒ−ＶＩＶＩＴは、本発明者らの系において心筋細胞誘導に有意な効果を示さなかった（図１４）ことから、ＣＳＡの主要な心臓形成効果はＮＦ−ＡＴに依存しないことを示している。Ｆｌｋ１＋細胞へのｗｎｔ３ａおよびＴＧＦ−βの中胚葉特異的添加（Ｆｌｋ−０〜２日目：図４の実験５）は、Ｆｌｋ−６日目において心筋細胞の有意な減少を示した（図１５）。これに対して、Ｄｋｋ１の中胚葉特異的添加はＦｌｋ−６日目において心筋細胞に有意な増加を示した（図１５）。しかしながら、このＤｋｋ１の効果はＣＳＡの場合よりも弱かった。これらの結果は、ＣＳＡの強力な心筋細胞誘導活性が、中胚葉特異的でかつＮＦ−ＡＴ非依存的な様式で心臓前駆細胞の特異的かつ効率的な増殖を誘導する新規な機構によって誘発されることを示す。
【００９２】
実施例２：  ｉＰＳ細胞に対するＣＳＡの心臓形成効果
本発明者らはさらに、ｉＰＳ細胞に対するＣＳＡの心臓形成効果を調べた。最近、本発明者らは、マウスＥＳ細胞と同じ分化方法を用い、マウスｉＰＳ細胞(Okita, K.ら, Nature448, 313-317 (2007))が心筋細胞を生じ得ることを証明した(Yamashita, J.K.ら FASEB J. 19, 1534-1536 (2005); Narazaki, Gら Circulation 118, 498-506 (2008))。純化されたｉＰＳ細胞由来Ｆｌｋ１＋細胞に対するＣＳＡ処理は、対照よりおよそ１２倍心筋細胞の出現を著しく増加させた（図２ａ、ｂ）。ＣＳＡ処理はまた、ｉＰＳ細胞においてＦＣＶ心臓前駆細胞集団を劇的に増加させた。ｉＰＳ細胞由来Ｆｌｋ１＋細胞からのＦＣＶ細胞の最大パーセンテージはＣＳＡにより２８％まで増加した（図２ｃ）。
【００９３】
次に、本発明者らは、ヒトｉＰＳ細胞からの心筋細胞の分化を調べた(Nakagawa, M.ら Nat. Biotechnol. 26, 101-106 (2008))。ヒトｉＰＳ細胞をＥＮＤ−２臓側内胚葉様間質細胞で培養したところ(Mummery, C. ら Circulation 107, 2733-2740 (2003))、培養のおよそ１０〜１２日後に自己拍動コロニーが見られた（図２ｄ）。拍動細胞はｃＴｎＴ陽性であり（図２ｅ）、アクチニン染色を伴う明らかな筋節形成を示した（図２ｆ）。Ｆｌｕｏ−８画像は、収縮と同期した細胞内Ｃａ２＋レベルの上昇を明らかにした（図２ｇ）。これらの結果は、この方法によりヒトｉＰＳ細胞から機能的心筋細胞が首尾よく誘導されたことを示す。
【００９４】
最後に、本発明者らは、ヒトｉＰＳ細胞からの心筋細胞の誘導に対するＣＳＡの中胚葉効果を調べた。最近、本発明者らは、ヒトＥＳ細胞から分化のおよそ８日後にＶＥＧＦＲ２＋中胚葉細胞が出現したことを証明した(Sone, M.ら Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 27, 2127-2134 (2007))。また、ＥＮＤ２細胞上でヒトｉＰＳ細胞の培養中のｍＲＮＡ発現パターンから、ヒトｉＰＳ細胞の心筋細胞への分化動態が明らかになり（図１６）、ヒトｉＰＳ細胞における中胚葉誘導が分化６〜８日前後で起こることを示唆した。中胚葉段階（すなわち、分化８日目）で分化中のヒトｉＰＳ細胞に対するＣＳＡの添加は拍動コロニーの出現を劇的に増加させたが、未分化段階では（分化０日目）増加させなかった（図２ｈ）。出現した全コロニー数に違いはなかったが、出現した全コロニーのうちの拍動コロニーのパーセンテージは、ＣＳＡ処理によりおよそ４．２倍増加し（図２ｉ）、これは、ＣＳＡが中胚葉段階において分化中のヒトｉＰＳ細胞の運命を心筋細胞へシフトさせるであろうことを示唆する。ヒトｉＰＳ細胞において心臓前駆細胞はまだ同定されていないが、このＣＳＡの中胚葉段階特異的効果は、ヒトｉＰＳ細胞におけるＣＳＡによる心臓前駆細胞増殖を強く示唆する。よって、ＣＳＡ処理は同様に、中胚葉特異的にｉＰＳ細胞からの心筋細胞の誘導を高めた。
【００９５】
したがって、本発明は、新たに発見されたＣＳＡの中胚葉特異的効果によって、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞からの高心臓形成性前駆細胞ならびに心筋細胞の特異的かつ効率的な増殖のための新規な技術を提供する。最近、胚様体中の心筋細胞に対するＣＳＡの弱い誘導効果が報告された(Sachinidis, A.らCell. Physiol. Biochem. 18, 303-314 (2006))。本発明者らの新規な段階的な心筋細胞分化系は、胚様体の細胞混合物に埋没していたＣＳＡの有力な中胚葉特異的効果を選択的に浮き立たせることに成功したはずである。この新規な培養系は、化学生物学的方法を用いて、低分子からの新規な心臓再生薬のスクリーニングおよび発見に役立つであろう。
【００９６】
マウスＥＳ細胞の分化の６〜６．５日後、心筋細胞出現の１〜２日前に検出されるＦＣＶ細胞は、本発明者らの知る限りでは、初めて同定された明瞭な心臓前駆細胞集団であり(Yamashita, J.K.らFASEB J. 19, 1534-1536 (2005))、これまでで心筋細胞に最も近い上流の心臓前駆細胞である。最近、数種の多能性心臓前駆細胞集団が報告された(Kattman, S.J.ら, Dev. Cell 11, 723-32 (2006); Wu, S.M.ら Cell 127, 1137-1150 (2006); Moretti, A.ら Cell 127, 1151-1165 (2006))。Kattmanらにより報告された心臓前駆細胞は、ＦＣＶ細胞よりも早い分化段階で（すなわち、分化４．２５日後）同定された。他のＮｋｘ２．５＋またはｉｓｌｅｔ１＋心臓前駆細胞は、ＥＳ細胞分化の４〜６日目に報告されている(Wu, S.M.ら Cell 127, 1137-1150 (2006); Moretti, A.ら Cell 127, 1151-1165 (2006))。本発明者らのＦＣＶ集団では、およそ４２％の細胞がＩｓｌｅｔ１＋、２４％がＮｋｘ２．５＋、そして１４％がＩｓｌｅｔ１およびＮｋｘ２．５に関し二重陽性であった（図１７）。さらに、ＦＣＶ細胞はまた、Ｉｓｌｅｔ１＋／Ｎｋｘ２．５＋前駆細胞と同様に、ＥＣおよびＭＣへの分化能を併せ持っている（図８）。よって、ＦＣＶ細胞は、Ｎｋｘ２．５＋および／またはＩｓｌｅｔ１＋心臓前駆細胞と重複のある集団であるはずである。
【００９７】
本発明者らの知る限り、これはｉＰＳ細胞からの心臓前駆細胞および心筋細胞の特異的増殖の最初の報告である。ｉＰＳ細胞から心筋細胞を誘導する本発明者らの有効な方法は、心筋細胞の患者特異的細胞モデルを作出するための重要な技術的基礎となる(Yamanaka, S. Cell Stem Cell 1, 39-49 (2007))。最近、ヒトＥＳ細胞を用い、心臓中胚葉／前駆細胞集団が確認された(Yang, L.ら Nature 453, 524-528 (2008))。ヒトｉＰＳ細胞からの心臓前駆細胞の同定、有効な誘導および純化は、細胞に基づく心臓再生に間違いなく重要である。よって、この新規な心臓分化技術は、細胞供給源の多様な選択肢、移植の方法および創薬を提供することにより心臓再生医療の開発に幅広く寄与するであろう。
【００９８】
実施例１および２の実験手順
抗体
マウスＥ−カドヘリン（ＥＣＣＤ２）、マウスＦｌｋ１（ＡＶＡＳ１２）に対するモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）を本発明者らの研究室でこれまでに記載されているように作製し、標識した(Yamashita, J.ら Nature 408, 92-96 (2000); Yamashita, J.K.らFASEB J. 19, 1534-1536 (2005))。心臓トロポニン−Ｔ（ｃＴｎＴ）に対するＭｏＡｂ（１：２０００）はNeoMarkers (Fremont, CA)から購入した。ヒトｉＰＳ細胞を染色するため、ｃＴｎＴに対するＭｏＡｂ（１：１００）をSanta Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)から購入した。マウスα−アクチニンに対するＭｏＡｂ（１：８００）はSigma (St Louis, Mo)から購入した。ＰＥコンジュゲートＡＶＡＳ１２のＭｏＡｂはeBioscience (San Diego, CA)から購入した。マウスＣＤ３１に対するＭｏＡｂ（免疫染色用、１：２００）およびビオチン化ＣＸＣＲ４はBD Pharmingen (San Diego, CA)から購入した。ＧＦＰに対するポリクローナルウサギ抗体（１：５００）はMBL (Nagoya, Japan)から購入した。
【００９９】
試薬
シクロスポリン−Ａ（Novartis Pharmaから恵与された。）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）(Nacalai Tesque, Kyoto Japan)に３０ｍｇ／ｍＬで溶かした。使用時に分化培地で１〜３μｇ／ｍＬの希釈溶液を作製した。ＦＫ５０６（Astellas Pharma Incから譲渡）をＤＭＳＯに１０ｍｇ／ｍＬで溶かし、分化培地で１０ｎｇ〜１μｇ／ｍＬの希釈溶液を作製した。１１Ｒ−ＶＩＶＩＴはCalbiochem(Darmstadt, Germany)から入手した。Ｗｎｔ３ａ、Ｄｋｋ−１およびＴＧＦ−βはR&D Systems (Minneapolis, MN)から入手した。アネキシンＶ−ＦＩＴＣまたはＰＥはBD pharmingen (San Diego, CA)から購入した。Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ（商標）ＥｄＵ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８イメージングキットはInvitrogen(Carlsbad, California)から入手した。ＰＫＨ６７蛍光色素はSigma (St. Louis, MO)から購入した。
【０１００】
マウスＥＳおよびｉＰＳ細胞の培養
マウスα−ミオシン重鎖（ＭＨＣ）プロモーターにより駆動されるＥＧＦＰ遺伝子を有するＥＭＧ７マウスＥＳ細胞を本研究に用いた(Yamashita, J.K.ら FASEB J. 19, 1534-1536 (2005))。Ｎａｎｏｇプロモーターにより駆動されるＧＦＰ／ＩＲＥＳ／ピューロマイシン耐性遺伝子を有する生殖系コンピテントマウスｉＰＳ細胞系統２０Ｄ−１７、３８Ｃ−２および３８Ｄ−２（Ｎａｎｏｇ−ｉＰＳ細胞）をこれまでに記載されているように維持した。簡潔には、ｉＰＳ細胞を、１５％ＦＣＳ、非必須アミノ酸、１ｍｍｏｌ／Ｌピルビン酸ナトリウム、５．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ２−メルカプトエタノール、５０ユニット／ｍＬペニシリンおよび５０ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、ピューロマイシン耐性遺伝子が安定的に組み込まれているマイトマイシン−Ｃ−処理マウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）のフィーダー層上で維持した。ＯＰ９間質細胞は記載のように維持した(Nishikawa, S.I.ら Development 125, 1747-1757 (1998))。
【０１０１】
ヒトＥＳおよびｉＰＳ細胞の培養
ＥＮＤ−２細胞（Dr. Mummeryから恵与された。）は、これまでに記載されているように培養した(Mummery, C.ら Circulation 107, 2733-2740 (2003))。Ｍｙｃ陰性ヒトｉＰＳ細胞系統２５３Ｇ１および２５３Ｇ４もこれまでに記載されているように維持した(Nakagawa, M.ら Nat. Biotechnol. 26, 101-106(2008))。ヒトｉＰＳ細胞からの心筋細胞分化の誘導は、これまでに記載されている方法(Mummery, C.ら Circulation 107, 2733-2740 (2003); Passier, R.ら Stem Cells 23, 772-780 (2005))に基づき、未分化ヒトｉＰＳ細胞の凝集塊をＥＮＤ−２細胞上で共培養することにより行った。心筋細胞分化に対するＣＳＡの効果を検討するため、２μｇ／ｍＬのＣＳＡを０日目または共培養開始の８日後に培養培地に加えた。１２日目の拍動コロニー数を顕微鏡観察によりスコアリングした。細胞内Ｃａ＋＋測定およびアクチニンの免疫染色のため、拍動コロニーを機械的に切り取り、トリプシン−ＥＤＴＡ処理で穏やかに分離し、ゼラチンコーティングディッシュ上に再度プレーティングした。
【０１０２】
一例として、ヒトｉＰＳ細胞は成人ヒト皮膚繊維芽細胞（ＨＤＦ）から次のようにして生成することができる。
【０１０３】
本発明者らは、ヒトＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４（および±ｃ−Ｍｙｃ）をコードするｐＭＸ（レトロウイルスベクター）をＨＤＦ−Ｓｌｃ７ａｌ（８×１０５細胞／１００ｍｍディッシュ）に導入した。ヒトＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびＭｙｃを、以下のセンス（「Ｓ」）およびアンチセンス（「ＡＳ」）プライマー：
ｈＯＣＴ３／４−Ｓ、CACCATGGCGGGACACCTGGCTTCAG（配列番号１）；
ｈＯＣＴ３／４−ＡＳ、ACCTCAGTTTGAATGCATGGGAGAGC（配列番号２）；
ｈＳＯＸ２−Ｓ、CACCATGTACAACATGATGGAGACGGAGCTG（配列番号３）；
ｈＳＯＸ２−ＡＳ、TCACATGTGTGAGAGGGGCAGTGTGC（配列番号４）；
ｈＫＬＦ４−Ｓ、CACCATGGCTGTCAGTGACGCGCTGCTCCC（配列番号５）；
ｈＫＬＦ４−ＡＳ、TTAAAAATGTCTCTTCATGTGTAAGGCGAG（配列番号６）；
ｈＭＹＣ−Ｓ、CACCATGCCCCTCAACGTTAGCTTCACCAA（配列番号７）；
ｈＭＹＣ−ＡＳ、TCACGCACAAGAGTTCCGTAGCTGTTCAAG（配列番号８）
を用いるＲＴ−ＰＣＲにより、ヒト組織ライブラリーから個々にクローニングした。
【０１０４】
形質導入６日後、細胞をトリプシン処理により採取し、マイトマイシンＣ処理ＳＮＬフィーダー細胞(McMahonおよびBradley, Cell 62, 1073-1085 (1990))上に５×１０４または５×１０５細胞／１００ｍｍディッシュでプレーティングした。翌日、培地（１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ）を、４ｎｇ／ｍｌの塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を添加した霊長類ＥＳ細胞培養用培地に置き換えた。およそ２週間後、顆粒状コロニーがいくつか出現し、これらのコロニーはｈＥＳ細胞と形態上類似していなかった。２５日目前後に、本発明者らは、平坦でｈＥＳ細胞コロニーに似た明らかに異なるタイプのコロニーを認めた。５×１０４の繊維芽細胞から、本発明者らは約１０のｈＥＳ細胞様コロニーと約１００の顆粒状コロニーを見出した。３０日目、本発明者らはｈＥＳ細胞様コロニーを採取し、酵素消化を行わずにそれらを機械的に小塊に解離させた。５×１０５個の繊維芽細胞を用いて培養を開始したところ、ディッシュは３００を超える顆粒状コロニーでほぼ覆われた。本発明者らは、これらの顆粒状細胞中にいくつかのｈＥＳ細胞様コロニーを時折観察した。
【０１０５】
ｈＥＳ様細胞をヒトＥＳ細胞培養条件下、ＳＮＬフィーダー細胞上で増殖させた。それらは稠密で平坦なコロニーを形成した。各細胞は、大きな核と乏しい細胞質を特徴とするヒトＥＳ細胞に類似した形態を示した。ｈＥＳ細胞を用いた場合では、本発明者らは、コロニーの中央部で時折自発的分化を観察した。
【０１０６】
これらの細胞は、フィーダー依存性においてもｈＥＳ細胞と類似性を示した。それらはゼラチンコーティング組織培養プレートには接着しなかった。対照的に、それらは、ＥＳ培地でなくＭＥＦ馴化培地（ＭＥＦ−ＣＭ）中、マトリゲルコーティングプレート上で未分化状態が維持された。
【０１０７】
ＨＤＦの形質導入後に選択された細胞はヒトｉＰＳ細胞であり、その特性は形態を含め、Nakagawaら(Nat. Biotechnol. 26, 101-106 (2008))により記載されている。
【０１０８】
心筋細胞分化の誘導
Ｆｌｋ１＋細胞の誘導およびＦｌｋ１＋細胞の選別は、これまでに記載されているように行った(Yamashita, J.ら Nature 408, 92-96 (2000); Yamashita, J.K.ら FASEB J. 19, 1534-1536 (2005))。簡潔には、マウスＥＳ細胞（またはｉＰＳ細胞）を、分化培地（１０％ウシ胎児血清を添加したα最小必須培地(GIBCO, Grand Island, NY)）中、ＩＶ型コラーゲンコーティングディッシュ(Biocoat, BecktonDickinson)またはマイトマイシンＣ処理コンフルエントＯＰ９細胞シート（ＭＭＣ−ＯＰ９）上、１〜２．５×１０３細胞／ｃｍ２の細胞密度で９６〜１０８時間培養した。（ｉＰＳ細胞については、細胞をまずゼラチンコーティングディッシュにプレーティングし、３０分間培養して接着したフィーダー細胞を排除し、次に、非接着細胞を回収し、分化させた）。細胞を回収し、Ｆｌｋ１＋細胞を純化するためにＦＡＣＳを行った。その後、純化されたＦｌｋ１＋細胞をＭＭＣ−ＯＰ９上に１〜１０×１０３細胞／ｃｍ２の細胞密度でプレーティングし、心臓分化を誘導するための分化培地で培養した。培地は２日ごとに交換した。ＦＣＶ細胞の誘導およびＦＣＶ細胞の選別は記載されているように行った(Yamashita, J.K.ら FASEB J. 19, 1534-1536 (2005))。純化されたＦＣＶ前駆細胞を再びＭＭＣ−ＯＰ９細胞上にプレーティングした。プレーティング前にＭＭＣ−ＯＰ９細胞を予めＰＫＨ６７蛍光色素(Sigma)で染色した。ＣＳＡ（１〜３μｇ／ｍＬ）をＯＰ９細胞上の未分化ＥＳ細胞、Ｆｌｋ１＋細胞またはＦＣＶ細胞に加えた。ＣＳＡは２日ごとに培地の交換とともに繰り返し加えた。同じ希釈率のＤＭＳＯ単独も対照として用いた。
【０１０９】
フローサイトメトリーおよび細胞選別
分化中のＥＳ細胞（またはｉＰＳ細胞）についてのＦＡＣＳはこれまでに記載されているように行った(Yamashita, J.ら Nature 408, 92-96 (2000); Yamashita, J.K.ら FASEB J. 19, 1534-1536 (2005))。ＥＳ細胞分化の９６〜１０８時間後、培養細胞を採取し、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合ＡＶＡＳ１２およびＦＩＴＣ結合ＥＣＣＤ２で染色した。ヨウ化プロピジウム(Sigma)を排除する、生存したＦｌｋ１＋／Ｅ−カドヘリン−細胞をＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ(Becton Dickinson)により選別した。ＦＣＶ前駆細胞のＦＡＣＳでは、ＰＫＨ６７染色ＯＰ９細胞（Ｆｌｋ−２日目）上で純化されたＦｌｋ１＋細胞の分化２日後に、培養細胞を採取し、ＰＥ結合ＡＶＡＳ１２とビオチン化ＣＸＣＲ４の組合せで染色し、その後、ストレプトアビジン結合ＡＰＣを加え、ＦＡＣＳ分析を行った。ＰＫＨ陰性集団を分析し、ＥＳ細胞由来細胞として選別した。Ｆｌｋ１＋／ＣＸＣＲ４＋集団（血管内皮カドヘリン陰性であった(Yamashita, J.K.ら FASEB J. 19, 1534-1536 (2005))）をＦＣＶ心臓前駆細胞として評価し、選別した。心筋細胞のＦＡＣＳについては、ＯＰ９細胞上でのＦｌｋ１＋細胞の培養６日後（Ｆｌｋ−６日目）に細胞を採取し、ＧＦＰ＋集団を分化心筋細胞として評価し、選別した。
【０１１０】
免疫組織化学
ＥＣおよび心筋細胞の免疫染色は記載のように行った(Yamashita, J.K.ら FASEB J. 19, 1534-1536 (2005))。簡潔には、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）固定細胞を２％スキムミルク(BD, bioscience)でブロッキングし、一次抗体とともにインキュベートした。免疫組織化学については、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）(Invitrogen)と結合させた抗マウスＩｇＧを二次抗体として用いた。免疫蛍光染色については、Ａｌｅｘａ  ４８８または５４６と結合させた抗マウス、ラットおよびウサギＩｇを二次抗体として用いた。核をＤＡＰＩ(Invitrogen)で可視化した。心臓に左心室の頂端から逆向きの灌流を行い、４％緩衝パラホルムアルデヒドで４℃にて２時間固定し、Ｏ．Ｃ．Ｔ化合物(Tissue-Tek; Miles, Inc.)に包埋し、厚さ６μｍの横断切片を得た。Ｚｅｎｏｎ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６標識キット(molecular Probes)で標識した一次抗体抗ｃＴｎＴと抗ＧＦＰの混合物でｃＴｎＴおよびＧＦＰの二重染色を行った後、二次抗体Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８結合抗ウサギＩｇ（１：５００）(Molecular Probes)を用いた。染色された細胞を、倒立蛍光顕微鏡Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００−Ｕ(Nikon, Tokyo, Japan)、デジタルカメラシステムＡｘｉｏＣａｍ  ＨＲｃ(Carl Zeiss, Germany)またはＢＩＯＲＥＶＯ  ＢＺ−９０００(Keyence Osaka, Japan)を用いて写真撮影した。
【０１１１】
心筋細胞分化の定量
心筋細胞の分化を、記載のように(Yamashita, J.K.ら, FASEB J. 19, 1534-1536 (2005))Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６を用いたｃＴｎＴ染色の蛍光強度により定量的に評価した。染色細胞の画像をデジタルＣＣＤカメラＣｏｏｌ  ＳＮＡＰ−ＨＱ(Roper, Atlanta, CA)に取り込み、画像インフォマティクスソフトウエアＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ(Media Cybernetics, Silver Spring, MD)を用いて計算した。２４ウェルプレートの各ウェルにおいて倍率４０倍の１９視野を、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ(Media Cybernetics)のＳｔａｇｅ−Ｐｒｏモジュールにより制御される倒立蛍光顕微鏡に取り付けた電動Ｘ−ＹステージＰｒｏＳｃａｎ  Ｓｔａｇｅｓ(Planetron, Tokyo, Japan)で自動的に選択した。１９視野から得られた全蛍光強度の合計を出現した心筋細胞の量として定義した。
【０１１２】
心不全モデル
実験手順は全て、日本の「実験動物の管理と使用に関する指針」に関する法律を遵守する京都大学動物実験指針に従って行った。本発明者らは、体重２３５〜２５５ｇのＦ３４４／ｎｒｕヌードラット(Kyoto University, Japan)を用いた。心筋梗塞は、これまでに記載されているように(Tambara, K.ら Circulation 108 suppl II, 259-263 (2003))、左開胸術による左冠動脈の基部近位の結紮により作出した。
【０１１３】
ＥＳ細胞の移植
結紮後４週間で、中程度のサイズの心筋梗塞（ＭＩ）（梗塞サイズ：２０〜４０％）を有する６匹のラットを細胞移植実験に用いた。左開胸から、漏出を防ぐために注入点において６．０ポリプロピレン糸でマットレス縫合(mattress sultures)した後に、４×１０５細胞を含む１００μＬ培養培地を、２７ゲージの針を用い、傷病部位の中心部の心外膜下に注入した。注入後、ＭＩ領域の隆起を確認した。麻酔または外科術については記載されている(Tambara, K.ら Circulation 108 suppl II, 259-263 (2003))。
【０１１４】
電気生理学的研究
ＦＡＣＳで純化されたＧＦＰ陽性心筋細胞集団をゼラチンコーティングカバーガラス上に播種した。これらの細胞を２〜４日間培養した後、カバーガラスをパッチクランプレコーディングチャンバーに移した。ＧＦＰ蛍光（励起４８０±２０ｎｍおよび発光５３５±２５ｎｍ）を示す細胞をパッチクランプ増幅器(Axopatch200B, Axon Instruments/Molecular Devices Corp., Union City, CA)による膜電位の測定に用いた。実験は全て３６〜３７℃で行った。
【０１１５】
溶液の組成：  浸漬溶液は（ｍｍｏｌ／Ｌ）、１４０  ＮａＣｌ、５．４  ＫＣｌ、０．３３  ＮａＨ２ＰＯ４、０．４５  ＭｇＣｌ２、１．８  ＣａＣｌ２および５  ＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨでｐＨ＝７．４）を含んだ。ピペット溶液は（ｍｍｏｌ／Ｌ）、１１０  Ｌ−アスパラギン酸、３０  ＫＣｌ、５  ＭｇＡＴＰ、０．１  ＮａＧＴＰ、５  Ｋ２クレアチンリン酸、２  ＥＧＴＡ、１０  ＨＥＰＥＳおよび１０  ＮａＯＨ（ＫＯＨでｐＨ＝７．２）を含んだ。
【０１１６】
細胞内Ｃａ２＋の測定
ヒトｉＰＳ細胞に１μＭ  Ｑｕｅｓｔ  Ｆｌｕｏ−８(ABD Bioquest, Inc. Sunnyvale, CA)を３０分間加えた。拍動コロニーのＦｌｕｏ−８蛍光（励起４９５±１０ｎｍおよび発光５３５±２０ｎｍ）を、背面照射型電子増倍管ＣＣＤカメラ(ImagEM Hamamatsu Photonics K.K. Hamamatsu, Japan)で、１６ミリ秒ごとに測定した。３枚の連続画像の平均をとった。ｉＰＳコロニーの蛍光強度（バックグラウンド蛍光を差し引いたもの）の変化を、記録開始時のもの（Ｆ０）との強度比（Ｆ１／Ｆ０）として表した。測定は室温で行った。
【０１１７】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
種々の細胞集団から全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ(QIAGEN, Valencia, CA)を用いて単離した。ｃＤＮＡをスーパースクリプトＩＩＩ第一鎖合成系(Invitrogen)を用いて合成した。ＰＣＲ反応はＫＯＤ  ｐｌｕｓ(Toyobo, Tokyo, Japan)を用いて行った。用いたプライマーは表Ｉおよび表ＩＩに示す。
【０１１８】
【表１】
0005611035.tif 000002
【０１１９】
【表２】
0005611035.tif 000003
【０１２０】
アネキシンＶアポトーシスアッセイ
ＦＣＶ前駆細胞については、ＰＫＨ６７標識を用いずに、ＯＰ９細胞上で純化されたＦｌｋ１＋細胞を２日分化させた後、細胞を採取し、ＰＥ結合ＡＶＡＳ１２およびビオチン化ＣＸＣＲ４に対する抗体で細胞を染色した。ＧＦＰ＋心筋細胞はＦｌｋ−６日目にＦＡＣＳにより純化した。次に、キットの染色プロトコールに従い、本発明者らはアネキシンＶ−ＦＩＴＣを加え、暗所、室温で１５分間インキュベートし、ＦＡＣＳ分析を行った。
【０１２１】
ＥｄＵ細胞増殖アッセイ
本発明者らは、ＦＡＣＳによるＦＣＶ細胞選別の２時間前に培養培地にＥｄＵ溶液(Invitrogen)（１０μＭ）を加え、選別されたＦＣＶ細胞をサイトスピン(Thermo Shandon)(Waltham, MA)を用いてスライド上にプレーティングし、４％ＰＦＡで固定し、製造者の指示に従ってＣｌｉｃｋ−ｉＴ（商標）反応カクテルとともにインキュベートすることによりＥｄＵを検出した。ＥｄＵ＋／ＤＡＰＩ＋  ＦＣＶ細胞の数を定量するため、無作為に選択した１０視野で細胞を計数した。ＧＦＰ＋心筋細胞については、本発明者らは、Ｆｌｋ−３日目において固定する２時間前に培養培地にＥｄＵ溶液を加えた。ｃＴｎＴ＋／ＥｄＵ＋／ＤＡＰＩ＋核を計数した。
【０１２２】
単一細胞の培養
単一に選別されたＦＣＶ細胞は、Ｃｌｏｎｃｙｔｅ(BecktonDickinson, Franklin Lakes, NJ)を用い、９６ウェルプレートの個々のウェルのＯＰ９上にプレーティングされた(Yamashita, J.K.ら FASEB J. 19, 1534-1536 (2005))。４日後、Ａｂｃａｍ(Cambridge, UK)のカルポニンに対する一次抗体（１：５００）、ｃＴｎＴ（１：２０００）およびＣＤ３１（１：２００）で三重染色を行った後、Ａｌｅｘａ４８８結合抗ラットＩｇ、Ａｌｅｘａ５４６結合抗マウスＩｇ、およびＡＰＣ結合抗ウサギＩｇを添加した。ＡＰＣおよびＤＡＰＩ染色ではそれぞれ青およびグレーの画像が得られた。
【０１２３】
ＦＣＶ細胞染色
選別されたＦＣＶ細胞を、サイトスピン(Thermo Shandon)を用いてスライド上にプレーティングし、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ(Santa Cruz, CA)から入手したＡＶＡＳ１２に対する抗体（１：２０００）およびＮｋｘ２．５に対する抗体（１：２５０）、ならびにアイオワ大学(IOWA city, IA)から入手したｉｓｌｅｔ１に対する抗体（１：５００）で染色した。Ａｌｅｘａ  ４８８または５４６と結合させたマウス、ラットおよびウサギＩｇを二次抗体に用いた。
【０１２４】
誘導された内皮および血液細胞の分析
Ｆｌｋ１＋細胞を６日間、ＯＰ９と共培養した。浮遊細胞および接着細胞を採取し、ビオチン結合抗ＣＤ４５(eBioscience, San Diego, CA)または抗ＣＤ３１抗体で染色した後、ストレプトアビジン−ＡＰＣを加えた。染色された細胞をＦＡＣＳ  ｖａｎｔａｇｅで分析した。
【０１２５】
統計分析
データは、ウィンドウズ用のＳｔａｔＶｉｅｗソフトウエア(version 5.0, SAS Institute Inc, Cary, NC)を用いて処理した。値は平均±ＳＤとして報告する。全群の値の比較はＡＮＯＶＡによって行った。少なくとも３回の独立した実験を行った。ｐ＜０．０５を有意とみなした。
【産業上の利用可能性】
【０１２６】
本発明により、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞から心筋細胞および／または心臓前駆細胞を効率的に誘導するための技術が提供され、この技術は、生成された心筋細胞および／または心臓前駆細胞を患者に移植することにより、心臓再生、特に心疾患の治療に有用である。
【０１２７】
本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲を限定されるものではなく、実施形態は本発明の個々の態様の単なる例示を意図し、機能的に等価なものはいずれも本発明の範囲内にある。実際に、本明細書に示され、記載されているものの他、本発明の種々の改変が上の記載から当業者には明らかになるであろう。このような改変も添付の特許請求の範囲内にあるものとする。引用されている刊行物、特許および特許出願は全て、本開示と一致し、本開示を裏付けするあらゆる様式で、参照により本明細書に組み入れられる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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