(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝毒性および／または前駆型遺伝毒性の活性を有する化合物をスクリーニングする方法であって、該方法が以下の段階：
（a）少なくともGLS2、IER5、TMEM194、PROCR、ITGA2B、FADS3、STMN3、PIB5PA、ROBO3、EDA2RおよびKIF1Aの遺伝子を発現することが可能な細胞系またはその試料を提供すること、ここで該系が、単細胞、細胞培養物、組織、器官および哺乳動物（ヒトを除く）の群から選択されるか、またはそれらの試料である、
（b）スクリーニングされる化合物を有する前記系の少なくとも一部をインキュベートすること、ならびに
（c）遺伝子発現分析により、遺伝毒性および／または前駆型遺伝毒性の活性を検出すること、ここで前記系における前記遺伝子の発現を、対照の細胞系における遺伝子発現と比較する、
を含む、前記方法。
【請求項２】
段階（a）において、系が、少なくともIER5、 TNFSF9、 MAGI3、 BCL2L13、 LGALS7、 PROCR、 MR1、 IL27RA、 KIF1A、 STMN3、 ROBO3、 EDA2R、 PLAU、 NPAS1、 EMP1、 FLNC、 CAPZA3、 RASIP1、 GLS2、 FADS3、 DNASE1L1、 POMT1、 GLS、 UBE2R2、 ITGA2B、 PIB5PA、 AXL、 GPR137B、 TMEM194、 STYXL1、 MLLT11およびANKRD10を発現することが可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階（a）において、系が、さらに、（１）SFN、 BAX、 GADD45A、 MAPK12、 ANXA1、 EMP3、 EMP1、 ARHGDIB、 LRDD、 HIST1H2BD、 CRABP2、 HIST2H4、 HDAC4、 MEIS1、 SRY、 CTDSP2、 CTDSP1、 ZNF395、 PIR、 ZHX2、 GPX1、 MVP、 TAP1、 PROCR、 MICB、 IFIH1、 FXYD2、 HBA1、 SLC26A3、 MAP1LC3B、 ITGA2B、 TIMP1、 PLAU、 COL7A1、 MICAL1、 TUBA1、 SNTB1、 CGNL1、 SORBS2、 ST3GAL1、 AXL、 CKM、 AK1、 GPR3、 S100P、 XYLB、 HK2、 NEDD4L、 CEL、 FADS3、 RASD1、 DNAJB2、 DPYSL4、 NDP、 FJX1、 FZD4、 MGC59937、 FLJ45909、 SPATA18、 IER5、 ATHL1、 LRG1、 FLJ43339、 LOC196463、 PLTPRおよびANKS4Bからなる群から選択される少なくとも３種の追加遺伝子および／または（２）C12orf5、 CASP4、 CDKN1A、 G1P3、 PHLDA1、 TGM2、 P53INP1、 CD247、 CD68、 GAGE12I、 GAGE4、 HCP5、 IFITM2、 IL1R2、 MR1、 NMI、 PRAME、 PROCR、 ABCA4、 CLCNKA、 CLDN16、 OSTalpha、 SLC22A17、 SLC30A1、 STX19、 CCDN1、 CD44、 CRABP2、 DLL1、 EMP1、 FOXJ1、 FSD1、 G0S2、 HAPLN4、 HBA1、 HPCAL4、 IFITM1、 IGFBP3、 KRT17、 LOX、 MMP7、 NOV、PLAU、 PTGS1、 RAPGEF3、 S100A4、 SH2D2A、 VCX、 VCX2、 VCX-C、 AMRH2、 CLDN23、 CYP2J2、 FLNC、 FLRT3、 GNA15、 GPR110、 HERC6、 INPP4B、 RGS16、 SDPR、 TBC1D2、 TUBB3、 FBXO27、 FDXR、 TMOD1、 F12、 NT5E、 ABHD7、 C15orf52、 C2orf32、 CAMKV、 CAPN9、 CHGA、 CT45-4、 FAM43A、 FNDC5、 GBGT1、 GLS、 MYEOV、 PCNXL2、 PI3、 PTRF、 RBM3、 S100A16およびSPG3Aからなる群から選択される少なくとも１種の追加遺伝子を発現することが可能であり、ここで前記の追加遺伝子(単数または複数)はIER5、 TNFSF9、 MAGI3、 BCL2L13、 LGALS7、 PROCR、 MR1、 IL27RA、 KIF1A、 STMN3、 ROBO3、 EDA2R、 PLAU、 NPAS1、 EMP1、 FLNC、 CAPZA3、 RASIP1、 GLS2、 FADS3、 DNASE1L1、 POMT1、 GLS、 UBE2R2、 ITGA2B、 PIB5PA、 AXL、 GPR137B、 TMEM194、 STYXL1、 MLLT11、 ANKRD10、 ERCC8、 NTHL1、 CDKN1A、 TNFRSF14、 ISG15、 NDFIP2、 TAP1、 SLC4A8、 MFI2、 SLC2A6、 CNNM1、 CCS、 SLC41A1、 KCNQ2、 PLK2、 NETO2、 SPATA18、 NRG1、 ARHGDIB、 LAMC2、 CRABP2、 PDS5B、 HOMER3、 EMP3、 BRMS1L、 TUBA4A、 DPYSL4、 LAMP3、 TDRD3、 ADPRHL1、 RPL34、 HNF4A、 SPR、 RNF167、 RETSAT、 B3GALNT2、 SRD5A2L、 GALE、 CEL、 MAT2B、 NAT9、 ADORA2A、 DLGAP1、 ARSK、 RRAS、 BCKDK、 GPR30、 BSDC1、 SORBS2、 CCDC24、 DSCR6、 STOM、 C1orf91、 ABHD3、 FAM20A、 S100PBP、 LOC144501、 SP4およびANKRD41と異なるものである、ならびに段階（c）において、前記の追加遺伝子(単数または複数)の発現を、対照系における遺伝子発現と比較する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
段階（a）において、系が、（１）IER5、 TNFSF9、 MAGI3、 BCL2L13、 LGALS7、 PROCR、 MR1、 IL27RA、 KIF1A、 STMN3、 ROBO3、 EDA2R、 PLAU、 NPAS1、 EMP1、 FLNC、 CAPZA3、 RASIP1、 GLS2、 FADS3、 DNASE1L1、 POMT1、 GLS、 UBE2R2、 ITGA2B、 PIB5PA、 AXL、 GPR137B、 TMEM194、 STYXL1、 MLLT11、 ANKRD10、 ERCC8、 NTHL1、 CDKN1A、 TNFRSF14、 ISG15、 NDFIP2、 TAP1、 SLC4A8、 MFI2、 SLC2A6、 CNNM1、 CCS、 SLC41A1、 KCNQ2、 PLK2、 NETO2、 SPATA18、 NRG1、 ARHGDIB、 LAMC2、 CRABP2、 PDS5B、 HOMER3、 EMP3、 BRMS1L、 TUBA4A、 DPYSL4、 LAMP3、 TDRD3、 ADPRHL1、 RPL34、 HNF4A、 SPR、 RNF167、 RETSAT、 B3GALNT2、 SRD5A2L、 GALE、 CEL、 MAT2B、 NAT9、 ADORA2A、 DLGAP1、 ARSK、 RRAS、 BCKDK、 GPR30、 BSDC1、 SORBS2、 CCDC24、 DSCR6、 STOM、 C1orf91、 ABHD3、 FAM20A、 S100PBP、 LOC144501、 SP4およびANKRD41、（２） SFN、 BAX、 GADD45A、 MAPK12、 ANXA1、 EMP3、 EMP1、 ARHGDIB、 LRDD、 HIST1H2BD、 CRABP2、 HIST2H4、 HDAC4、 MEIS1、 SRY、 CTDSP2、 CTDSP1、 ZNF395、 PIR、 ZHX2、 GPX1、 MVP、 TAP1、 PROCR、 MICB、 IFIH1、 FXYD2、 HBA1、 SLC26A3、 MAP1LC3B、 ITGA2B、 TIMP1、 PLAU、 COL7A1、 MICAL1、 TUBA1、 SNTB1、 CGNL1、 SORBS2、 ST3GAL1、 AXL、 CKM、 AK1、 GPR3、 S100P、 XYLB、 HK2、 NEDD4L、 CEL、 FADS3、 RASD1、 DNAJB2、 DPYSL4、 NDP、 FJX1、 FZD4、 MGC59937、 FLJ45909、 SPATA18、 IER5、 ATHL1、 LRG1、 FLJ43339、 LOC196463、 PLTPRおよびANKS4B、および／または（３）C12orf5、 CASP4、 CDKN1A、 G1P3、 PHLDA1、 TGM2、 P53INP1、 CD247、 CD68、 GAGE12I、 GAGE4、 HCP5、 IFITM2、 IL1R2、 MR1、 NMI、 PRAME、 PROCR、 ABCA4、 CLCNKA、 CLDN16、 OSTalpha、 SLC22A17、 SLC30A1、 STX19、 CCDN1、 CD44、 CRABP2、 DLL1、 EMP1、 FOXJ1、 FSD1、 G0S2、 HAPLN4、 HBA1、 HPCAL4、 IFITM1、 IGFBP3、 KRT17、 LOX、 MMP7、 NOV、PLAU、 PTGS1、 RAPGEF3、 S100A4、 SH2D2A、 VCX、 VCX2、 VCX-C、 AMRH2、 CLDN23、 CYP2J2、 FLNC、 FLRT3、 GNA15、 GPR110、 HERC6、 INPP4B、 RGS16、 SDPR、 TBC1D2、 TUBB3、 FBXO27、 FDXR、 TMOD1、 F12、 NT5E、 ABHD7、 C15orf52、 C2orf32、 CAMKV、 CAPN9、 CHGA、 CT45-4、 FAM43A、 FNDC5、 GBGT1、 GLS、 MYEOV、 PCNXL2、 PI3、 PTRF、 RBM3、 S100A16およびSPG3Aの遺伝子を発現することが可能である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
段階（c）において、系におけるGADD45A、MAPK12およびNTHL1の遺伝子の遺伝子発現を、対照系における遺伝子発現と比較することを除く、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
段階（c）において、遺伝子発現が、シグナル量またはシグナルの変化量と相関する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
段階（c）において、系における遺伝子の発現が、負もしくは正の対照系と比較して、上方調節または下方調節される場合、あるいは、前記系と正の対照系とにおける遺伝子の発現が、実質的に同一である場合に、存在する活性を検出する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
段階（c）において、負の対照系を用いる差次的遺伝子発現分析によって、存在する活性を検出する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
段階（a）において、哺乳動物（ヒトを除く）を提供し、段階（b）において、スクリーニングされる化合物を前記哺乳動物に投与し、ならびに段階（c）において、前記哺乳動物から回収した生物試料における遺伝毒性および／または前駆型遺伝毒性の活性のレベルを、遺伝毒性効果を示さない哺乳動物（ヒトを除く）と比較して検出する、ここでレベルの差異は、遺伝毒性によりもたらされた病理学的な状態に対して前記化合物が治療効果を有する可能性の増大を示す、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
増殖、分化および／または損傷修復の調節解除によって引き起こされ、もたらされ、および／または、伝播される、生理学的および／または病理学的な状態を監視する方法であって、該方法では、少なくとも１つの遺伝毒性もしくは前駆型遺伝毒性の化合物または生理学的に許容し得るそれらの塩の有効量が投与されたかかる処置を必要とする哺乳動物から回収した生物試料において、少なくともGLS2、IER5、TMEM194、PROCR、ITGA2B、FADS3、STMN3、PIB5PA、ROBO3、EDA2RおよびKIF1Aの遺伝子の発現を決定する、前記方法。
【請求項１１】
状態が、がん、腫瘍、転移がんおよび血管新生の障害の群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
遺伝毒性および／または前駆型遺伝毒性の活性を有する化合物をスクリーニングするためのマーカー遺伝子としてのGLS2、IER5、TMEM194、PROCR、ITGA2B、FADS3、STMN3、PIB5PA、ROBO3、EDA2RおよびKIF1Aの遺伝子の使用。
【請求項１３】
ストリンジェントな条件下でGLS2、IER5、TMEM194、PROCR、ITGA2B、FADS3、STMN3、PIB5PA、ROBO3、EDA2RおよびKIF1Aの遺伝子、あるいは、前記遺伝子によりコードされた遺伝子産物もしくはそれらの各部分と特異的にハイブリダイズする核酸プローブの、遺伝毒性および／または前駆型遺伝毒性の活性を検出するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、規定した少なくとも１１種の遺伝子の一団を発現することが可能な細胞系を提供すること、スクリーニングされる化合物を有する前記系の少なくとも一部をインキュベートすること、および、前記系における遺伝子の発現を、対照の細胞系における遺伝子発現と比較すること、それによって（前駆型）遺伝毒性((pro-)genotoxic)活性を検出ことにより、（前駆型）遺伝毒性活性を有する化合物をスクリーニングする方法に関する。本発明の他の目的は、少なくとも単一の（前駆型）遺伝毒性化合物の有効量を、かかる治療を必要とする哺乳動物に投与すること、および、該哺乳動物から回収した生物試料において、規定した１１種の遺伝子の発現を決定することによって、増殖、分化および／または損傷修復の調節解除により、引き起こされ、もたらされ、および／または、伝播される、生理学的および／または病理学的な状態を監視する方法に関与する。本発明はまた、ストリンジェントな条件下で、表１、図１a＋bおよび／または図２a＋bのマーカー遺伝子と特異的にハイブリダイズする核酸プローブを含む、（前駆型）遺伝毒性活性を有する化合物をスクリーニングするためのアレイにも関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝毒性試験は、医薬開発と、化学物質のリスク評価とにおいて、標準的な試験戦略の一部として重要である。遺伝毒性の異なる様々な作用機構が反映されるためには、標準的な試験に、細菌における変異原性と、インビトロおよび／またはインビボでの哺乳動物細胞に対する染色体損傷特性とのバッテリーアセスメント(battery assessment)が含まれる。
【０００３】
近年の機構の調査では、それらの化学的特徴付けにおいて、特に遺伝毒性物質および発がん性物質の最新リスクアセスメントとEU REACH規制計画(regulation program)との中で、関心が著しく高まってきている。統合生物学の「オミクス」技術は、所定の系における全化合物の記録を介する細胞機構の包括的見解を創出することによる単一のエンドポイント測定という古典的な還元主義的アプローチと正反対に位置する。
【０００４】
数年前に、遺伝毒性と発がん性とを評価するトキシコゲノミクス（TXG）を適用した最初の研究が公開され、非遺伝毒性の肝発がん物質とは異なる遺伝子発現特性を示したラットにおいて、遺伝毒性の異なる肝発がん物質と遺伝子発現特性が重複したことを実証した。そして、未知の物質を、十分に記載されている肝発がん物質のデータから築かれた分類モデルを用いて、７５〜８８％の確度をもって正確に分類することができた（Ellinger-Ziegelbauer et al., 2008, Mutat. Res. 637, 23-39）。2006年に、齧歯動物の発がん性に係るインビトロでの寿命バイオアッセイの代替手段を開発するために、carcinoGENOMICSプロジェクトが始まった。
【０００５】
哺乳動物細胞アッセイは、感受性が高いにもかかわらず、結果の解釈を次々に複雑化させる偽陽性を高率で生じさせるという特異性の低さによって制限されている。偽陽性の結果により、ヒトのハザード外挿法(hazard extrapolation)が複雑化し（Kirkland et al., 2005, Mutat. Res. 584, 1-256；Kirkland et al., 2006, Mutat. Res. 608, 29-42）、インビトロおよび／またはインビボでの骨の折れる追跡試験に着手するはめになり、インビトロでの新規ツールの開発が促される。偽陽性率を低減させるための努力は、新規ICH S2（R1）指針の開発と、標準的な試験における最も有効なアッセイの組み合わせに関する検討とに反映されている。
【発明の概要】
【０００６】
したがって、本発明の土台を形成している技術的課題は、化合物をスクリーニングする方法を提供することであり、該方法は、それらの遺伝毒性および／または前駆型遺伝毒性の特性を効率的に同定および特徴付けすることができる。本発明の他の課題としては、遺伝毒性および／または前駆型遺伝毒性の活性を検出するためのアレイを提供することであり、該アレイは、遺伝毒性に依存する疾患のシンプルかつ迅速な監視を可能にすることができる。
【０００７】
本発明は、遺伝毒性および／または前駆型遺伝毒性の活性を有する化合物をスクリーニングする方法を提供することにより前記課題を解決するものであって、該方法には以下の段階：
（a）少なくともGLS2、IER5、TMEM194、PROCR、ITGA2B、FADS3、STMN3、PIB5PA、ROBO3、EDA2RおよびKIF1Aの遺伝子を発現することが可能な細胞系またはその試料を提供すること、ここで該系が、単細胞、細胞培養物、組織、器官および哺乳動物の群から選択されるか、またはそれらの試料である、
（b）スクリーニングされる化合物を有する前記系の少なくとも一部をインキュベートすること、ならびに
（c）遺伝子発現分析により、遺伝毒性および／または前駆型遺伝毒性の活性を検出すること、ここで前記系における該遺伝子の発現を対照の細胞系における遺伝子発現と比較する、
が含まれる。
【０００８】
驚くべきことに、本発明者らは、少なくとも１１種の遺伝子の前記群が遺伝毒性と相関することを立証した。その結果、前記複数のマーカー遺伝子は、新規の遺伝毒性標的遺伝子に相当し、該標的遺伝子自体およびそれら遺伝子産物それぞれは、遺伝毒性のステージを区別するための標的として十分に好適なものである。原因となる遺伝子は、差次的発現分析の結果として選択される。同定された遺伝子は、現在知られているそれら実体の機能または場所に不可避的に関連しないが、かかる関係がその群の単一メンバー間またはより多くのメンバー間に見られることは除外されない。その代わり、処置されていない細胞に対し、上方調節または抑制のいずれかにより示される明白な差異によって、全遺伝子が特徴付けられる。前記遺伝子は、配列および他の特質に関し、技術分野の最先端において既に記載のあるものであるが、遺伝毒性単独または本発明で規定された組み合わせにおける遺伝毒性のいずれにも繋がりがない。前記１１種のマーカー遺伝子または表１に従うマーカー遺伝子を加えて、最大限の試験信頼性のために、使用することができる。前記遺伝子には別の名称があってもよいが、受入番号により容易に指定される。該受入番号は、GenBankやSwissProt等の多数のデータベースにおいて、一般に認められており不変である。
【０００９】
本発明者らは、（前駆型）遺伝毒性試験化合物、とりわけ遺伝毒性化合物により誘導されるDNA損傷に関連する、特徴的な遺伝子調節過程を、予想外にも同定した。DNA損傷応答ネットワークの包括的な概観を示す（図７）。STAT1、SP1およびP53は、それら自身の遺伝子発現レベルでは調節されなかったが、標的遺伝子の調節は、遺伝毒物の処置に応答するこれらの転写モジュレータの活性化を示した。これらの転写因子の活性は、一般的な細胞ストレス、DNA損傷またはインターフェロンを含む、複数のシグナルにより誘導され得るタンパク質リン酸化によって、決定的に調節される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１ａ】図１a＋bは、遺伝毒性化合物で処置したHepG2細胞において、推定マーカー遺伝子の遺伝子−機能−色分け地図を示す。遺伝子調節、ならびに、アクチノマイシンＤ（ACT）、メチルメタンスルホネート（MMS）およびエトポシド（ETO）による４８ｈの処置に応答して、１．５倍を超える上方（赤）または下方（緑）に有意に調節解除された（ANOVAによるｐ値／BH−ｑ値＜０．０１）該遺伝子の機能。処置濃度は、ETOが５００ｎＭ、MMSが５００μＭ（nd＝低用量）および２ｍＭ（hd＝高用量）、ならびにACTが２５０ｎＭであった。１００μＭの用量のテオフィリン（THEO）は、負の対照とした。細胞に６ｈ、２４ｈおよび４８ｈの時間で連日処置した後、Illuminaマイクロアレイを使用して遺伝子発現分析を行った［Genedata’s Expressionist（登録商標）Analyst（Basel／Switzerland）に従い図を改変した］。
【図１ｂ】図１a＋bは、遺伝毒性化合物で処置したHepG2細胞において、推定マーカー遺伝子の遺伝子−機能−色分け地図を示す。遺伝子調節、ならびに、アクチノマイシンＤ（ACT）、メチルメタンスルホネート（MMS）およびエトポシド（ETO）による４８ｈの処置に応答して、１．５倍を超える上方（赤）または下方（緑）に有意に調節解除された（ANOVAによるｐ値／BH−ｑ値＜０．０１）該遺伝子の機能。処置濃度は、ETOが５００ｎＭ、MMSが５００μＭ（nd＝低用量）および２ｍＭ（hd＝高用量）、ならびにACTが２５０ｎＭであった。１００μＭの用量のテオフィリン（THEO）は、負の対照とした。細胞に６ｈ、２４ｈおよび４８ｈの時間で連日処置した後、Illuminaマイクロアレイを使用して遺伝子発現分析を行った［Genedata’s Expressionist（登録商標）Analyst（Basel／Switzerland）に従い図を改変した］。
【００１１】
【図２ａ】図２a＋bは、前駆型遺伝毒性化合物の特徴的な遺伝子調節およびこれら遺伝子の機能的なカテゴリー化を示す。代謝活性化系（β−ナフトフラボン／フェノバルビタールにより誘導されたS9）の有無において、HepG2細胞を、7,12-ジメチルベンズ[a]アントラセン（DMBA）、ジエチルニトロソアミン（DEN）、シクロホスファミド（CPA）およびアフラトキシンＢ１（AFB1）、ならびに対照としてテオフィリン（THEO）およびメトホルミン（MET）で、連日にわたり合計４８ｈ処置した。異なる継代細胞を用いて実験を３回繰り返し、続いてIllumina Human Ref-8 BeadChipアレイを使用して遺伝子発現定量を行った。（A）対照媒体を参照した８８種の遺伝子の相対発現値を示す色分け地図。遺伝毒性応答が正であることを示した試料の少なくとも４０％において、１．５倍で切り捨てた調節解除を適用するフィルタリング手法と組み合わせたANOVA（ｐ値＜０．０１／BH−ｑ値＜０．３）により、遺伝子を同定した。上方調節された遺伝子（≧１．５倍）を赤で示し、下方調節された遺伝子を緑で示す（≦−１．５倍）。調節バーは対数の目盛が付いている。（B）MetaCore（商標）（GeneGo、St. Joseph／USA）およびToxWiz（Cambridge Cell Networks、Cambridge／UK）のデータベースを使用する遺伝子の機能的なカテゴリー化。（C）P53に直接関連する調節解除された遺伝子を、ネットワーク物として示す。以下の表は、全P53シグナル伝達カスケードに含まれる遺伝子を集約したものである。調節バーは、異なる処置による遺伝子発現値を、アナログ式に順序付けて、色分け地図（A）のヘッダーに示す［Genedata’s Expressionist（登録商標）Analyst（A）およびToxWiz（C）に従い図を改変した］。
【図２ｂ】図２a＋bは、前駆型遺伝毒性化合物の特徴的な遺伝子調節およびこれら遺伝子の機能的なカテゴリー化を示す。代謝活性化系（β−ナフトフラボン／フェノバルビタールにより誘導されたS9）の有無において、HepG2細胞を、7,12-ジメチルベンズ[a]アントラセン（DMBA）、ジエチルニトロソアミン（DEN）、シクロホスファミド（CPA）およびアフラトキシンＢ１（AFB1）、ならびに対照としてテオフィリン（THEO）およびメトホルミン（MET）で、連日にわたり合計４８ｈ処置した。異なる継代細胞を用いて実験を３回繰り返し、続いてIllumina Human Ref-8 BeadChipアレイを使用して遺伝子発現定量を行った。（A）対照媒体を参照した８８種の遺伝子の相対発現値を示す色分け地図。遺伝毒性応答が正であることを示した試料の少なくとも４０％において、１．５倍で切り捨てた調節解除を適用するフィルタリング手法と組み合わせたANOVA（ｐ値＜０．０１／BH−ｑ値＜０．３）により、遺伝子を同定した。上方調節された遺伝子（≧１．５倍）を赤で示し、下方調節された遺伝子を緑で示す（≦−１．５倍）。調節バーは対数の目盛が付いている。（B）MetaCore（商標）（GeneGo、St. Joseph／USA）およびToxWiz（Cambridge Cell Networks、Cambridge／UK）のデータベースを使用する遺伝子の機能的なカテゴリー化。（C）P53に直接関連する調節解除された遺伝子を、ネットワーク物として示す。以下の表は、全P53シグナル伝達カスケードに含まれる遺伝子を集約したものである。調節バーは、異なる処置による遺伝子発現値を、アナログ式に順序付けて、色分け地図（A）のヘッダーに示す［Genedata’s Expressionist（登録商標）Analyst（A）およびToxWiz（C）に従い図を改変した］。
【００１２】
【図３】図３は、簡易的な分類アルゴリズムを評価し、化合物分類に最適な遺伝子を同定するための訓練データ集合による遺伝子ランキングを示す。このモデルを構築するために、訓練データ集合を（前駆型）遺伝毒性の群から構築した：２４ｈおよび４８ｈの処置におけるアクチノマイシンＤ、メチルメタンスルホネートおよびエトポシドのを、直接作用する遺伝毒物の代表として選択した。前駆型遺伝毒素のその４８ｈ処置とは対照的に、7,12-ジメチルベンズ[a]アントラセン（DMBA）、ジエチルニトロソアミン（DEN）、シクロホスファミド（CPA）およびアフラトキシンＢ１（AFB1）のみを使用した。しかしながら、AFB1  ０．５μＭ−S9とDMBA  １０μＭ−S9と同様、CPA−S9も、遺伝子発現応答がないかまたは極端に弱いため、非遺伝毒性としてカテゴリー化した。テオフィリン（THEO）、メトホルミン（MET）および対照S9も非遺伝毒素とともにグループ化した。３つの異なる分類アルゴリズム：サポートベクターマシン（SVM）を青で示し、Ｋ最近傍（KNN）を緑グラフで表し、疎線形判別分析を赤線で示す、と組み合わせて、ANOVAを遺伝子ランキング方法として適用した。線形カーネルおよびペナルティ係数の１０を、SVM方法のパラメータとして使用した。距離測度として正相関を有するKNNを実行させ、ｋを４に設定した。ｋ倍の交差検証により予測性を評価した（ｋ＝１０、５０回繰り返し）。分類指標計算に使用した遺伝子数の依存において、SVMにより、誤分類率が最も低いことがわかった。最高得点を出した９１種の遺伝子で、最小の誤分類率である４．７％に到達した。遺伝子ランキングは、Genedata（Basel／Switzerland）のExpressionist（登録商標）Analystソフトウェアパッケージを使用して、実行した。
【００１３】
【図４】図４（A）は、前駆型遺伝毒性および非遺伝毒性の試験化合物の全ゲノム発現データの主成分分析（PCA）を示す。Illumina発現データを、PCAに供する前に、シグナル強度の中央値で標準化した。クラスタ分離に対する最重要エフェクタは、使用した処置時間（丸形：２４ｈ、ひし形：４８ｈ）および代謝活性化系（MAS／ラット肝S9：黒い記号；MASなし：白い記号）であった。図（B）は、S9曝露に応答したHepG2細胞における差次的に調節された遺伝子（ANOVAのｐ／BH−ｑ値＜０．０５ならびに２４および／または４８ｈ処置後の≧１．５／≦−１．５の変化比(fold-change)）および対応する遺伝子機能の例を示す。
【００１４】
【図５】図５（A／IおよびB／I）は、（前駆型）遺伝毒性（黒い記号）および非遺伝毒性（白い記号）の訓練試料の全ゲノム発現データのPCAを示す（群の割り当てについての詳細な情報は表３に規定されている）。示されたデータは、適切な対照媒体／媒体−S9に対して算出された相対値である。PCAのA／Iには遺伝毒性および前駆型遺伝毒性の全試験試料が含まれているが、B／Iは、３つの分離された化合物の座標原点付近のクラスタを拡大したものを表す。点線は、（前駆型）遺伝毒性と非遺伝毒性との試料の間の仮想的な分離を示す。A／IおよびB／Iの分析（２４ｈおよび４８ｈの遺伝毒性データを含むが、４８ｈのデータには前駆型遺伝毒性試験化合物しか含まれない）を比較して、A／IIおよびB／IIは、（前駆型）遺伝毒物および非遺伝毒物による２４ｈの処置後に対応するデータを示す。PCAのB／IIの試料のランダムな集合は、この早い時点での対照／非遺伝毒物の間で重複し、ほとんど同じのプロフィールを明示している。
【００１５】
【図６ａ】図６a〜dは、様々な（前駆型）遺伝毒性（黄色いバー）および非遺伝毒性（青いバー）の化合物により２４および／または４８ｈ処置した後の、HepG2細胞における差次的に調節された遺伝子の遺伝子機能プロフィールディスプレイを示す。試験化合物に対する応答を、Illuminaアレイを使用して分析した。色分け地図に示す９１種の遺伝子を、群の分離のためのANOVAに続き分類指標計算のためのサポートベクターマシンを用いた遺伝子ランキングにより、最も予測がつくように同定した。この遺伝子集合を使用する、ｋ倍の交差検証により評価（ｋ＝１０、５０回繰り返し）した誤分類率は、たったの０．２５％にしか相当しない。９１種の遺伝子の遺伝子発現調節はDENでも提供されているが、DENは訓練セットの一部ではなかった。カラースケールは、遺伝子発現の変化比に対応する：上方調節遺伝子は赤で、下方調節遺伝子は緑で、調節されない遺伝子は黒で示す。
【図６ｂ】図６a〜dは、様々な（前駆型）遺伝毒性（黄色いバー）および非遺伝毒性（青いバー）の化合物により２４および／または４８ｈ処置した後の、HepG2細胞における差次的に調節された遺伝子の遺伝子機能プロフィールディスプレイを示す。試験化合物に対する応答を、Illuminaアレイを使用して分析した。色分け地図に示す９１種の遺伝子を、群の分離のためのANOVAに続き分類指標計算のためのサポートベクターマシンを用いた遺伝子ランキングにより、最も予測がつくように同定した。この遺伝子集合を使用する、ｋ倍の交差検証により評価（ｋ＝１０、５０回繰り返し）した誤分類率は、たったの０．２５％にしか相当しない。９１種の遺伝子の遺伝子発現調節はDENでも提供されているが、DENは訓練セットの一部ではなかった。カラースケールは、遺伝子発現の変化比に対応する：上方調節遺伝子は赤で、下方調節遺伝子は緑で、調節されない遺伝子は黒で示す。
【図６ｃ】図６a〜dは、様々な（前駆型）遺伝毒性（黄色いバー）および非遺伝毒性（青いバー）の化合物により２４および／または４８ｈ処置した後の、HepG2細胞における差次的に調節された遺伝子の遺伝子機能プロフィールディスプレイを示す。試験化合物に対する応答を、Illuminaアレイを使用して分析した。色分け地図に示す９１種の遺伝子を、群の分離のためのANOVAに続き分類指標計算のためのサポートベクターマシンを用いた遺伝子ランキングにより、最も予測がつくように同定した。この遺伝子集合を使用する、ｋ倍の交差検証により評価（ｋ＝１０、５０回繰り返し）した誤分類率は、たったの０．２５％にしか相当しない。９１種の遺伝子の遺伝子発現調節はDENでも提供されているが、DENは訓練セットの一部ではなかった。カラースケールは、遺伝子発現の変化比に対応する：上方調節遺伝子は赤で、下方調節遺伝子は緑で、調節されない遺伝子は黒で示す。
【図６ｄ】図６a〜dは、様々な（前駆型）遺伝毒性（黄色いバー）および非遺伝毒性（青いバー）の化合物により２４および／または４８ｈ処置した後の、HepG2細胞における差次的に調節された遺伝子の遺伝子機能プロフィールディスプレイを示す。試験化合物に対する応答を、Illuminaアレイを使用して分析した。色分け地図に示す９１種の遺伝子を、群の分離のためのANOVAに続き分類指標計算のためのサポートベクターマシンを用いた遺伝子ランキングにより、最も予測がつくように同定した。この遺伝子集合を使用する、ｋ倍の交差検証により評価（ｋ＝１０、５０回繰り返し）した誤分類率は、たったの０．２５％にしか相当しない。９１種の遺伝子の遺伝子発現調節はDENでも提供されているが、DENは訓練セットの一部ではなかった。カラースケールは、遺伝子発現の変化比に対応する：上方調節遺伝子は赤で、下方調節遺伝子は緑で、調節されない遺伝子は黒で示す。
【００１６】
【図７】図７は、ＤＮＡ損傷応答での遺伝子の、推定される調節および相互作用を示す。矢印は、一般的な調節の傾向、それぞれ上方（↑）および下方（↓）の調節を示す。（前駆型）遺伝毒性試験化合物において、丸括弧なしで表示された遺伝子が、９１種の特徴的な遺伝子から見出され得る一方、丸括弧で閉じられた遺伝子は、いくつかの試験化合物のみにより１．５倍以上で調節されていた。下線の遺伝子は、主要な転写メディエータであるSTAT1、P53またはSP1により制御されていることが知られており、それらメディエータは、Illumina遺伝子発現プロファイリング実験において、標的遺伝子調節により同定されたものである。
【００１７】
【図８】図８は、遺伝毒性試験化合物によるP53の誘導とシグナリングとの潜在的機構を示す。メチルメタンスルホネート（MMS）により誘導されたDNA損傷に続くP53の蓄積は、塩基除去修復（BER）の化合物、および、DNA損傷後に活性化されるATMとチェックポイントキナーゼとを介する、P53インヒビタであるAPAKの阻害によりもたらされることが示唆されている。後者の機構は、エトポシド（ETO）により誘導されるP53の誘導に加えてトポイソメラーゼII（TOPO2）の阻害特徴に関与することが想定されている。対して、RNAポリメラーゼIIの阻害は、主にアクチノマイシンＤ（ACT）によるP53の蓄積に関与しているように見える。さらに、非機能的mdm2変異体（Mdm2＊）の発現と同様に、TOPO2の阻害もまた、ACTによるP53の活性化においてその役割を果たしている可能性がある。矢印は、Illuminaマイクロアレイにおける遺伝子の調節の傾向を示す（↑／↓＝≧１．５倍の誘導比(fold-induction)による上方／下方の調節）。
【００１８】
【図９ａ】図９a＋bは、Ｎ−ニトロソジエチルアミン（DEN）の遺伝子発現パターンを示す。（A）SVMアルゴリズムと組み合わせた遺伝子ランキングにより、訓練データ集合から算出した９１種の遺伝子分類指標を使用する、S9を有する遺伝毒性としての、および外部代謝活性化系なしの非遺伝毒性としての、DENの分類。（B）DENにより誘導されたDNA毒性の応答に機能的に関与する、有意に調節解除された遺伝子（ANOVAのｐ値／BH−ｑ値＜０．０１および４８ｈのDEN試料の少なくとも４０％において、１．５倍以上の変化比）。
【図９ｂ】図９a＋bは、Ｎ−ニトロソジエチルアミン（DEN）の遺伝子発現パターンを示す。（A）SVMアルゴリズムと組み合わせた遺伝子ランキングにより、訓練データ集合から算出した９１種の遺伝子分類指標を使用する、S9を有する遺伝毒性としての、および外部代謝活性化系なしの非遺伝毒性としての、DENの分類。（B）DENにより誘導されたDNA毒性の応答に機能的に関与する、有意に調節解除された遺伝子（ANOVAのｐ値／BH−ｑ値＜０．０１および４８ｈのDEN試料の少なくとも４０％において、１．５倍以上の変化比）。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
P53は、遺伝毒性および前駆型遺伝毒性の試験化合物に応答して、有意に増加する。遺伝毒性の試験化合物であるETO、MMS、およびACTの機構によって、p53の活性化とp53シグナリング応答の仲介とがもたらされる（図８）。p53の阻害を誘導するACTの用量は、mRNA合成の阻害に必要な用量と相関する。さらに、比較的まれなACT高用量でのDNA鎖切断率は、トポイソメラーゼの阻害が、p53蓄積において２番目に重要なことであることを示した。p53活性化の機構を、ACTに阻止されたRNAポリメラーゼII（POLR2）またはこのポリメラーゼに関連する転写因子を有する該ポリメラーゼの感覚機能として見ることができる。トポイソメラーゼII（TOPO2）およびRNAポリメラーゼIIの下方調節は、ACTにより観察された（図８）。加えて、近年発見されたp53のレギュレータ−APAK（ATMとP53とに関連するKZNFタンパク質）の活性化と同様に、mdm2機能の欠如は、ACT、MMSにもたらされ、おそらくETOにももたらされるp53の誘導の役割を示唆する。mdm2に関連するp53蓄積の新規機構は、トランケート(truncate)されたmdm2のスプライス変異体であるmdm2＋１０８（p53の重大な調節ドメインを欠いている）の誘導を介してACTによりもたらされる。よって、p53−mdm2フィードバック調節は、p53の大幅な増加の原因に寄与しているだろう。APAKには、遺伝毒性試験化合物に応答した遺伝子発現レベルで調節されることが見出せなかった。P53活性化の機構に加えて、P53応答にもたらされる様々な遺伝子は、上方調節されることが見出された。ミトコンドリアの透過を促進するタンパク質をコードし、アポトーシス誘導に関与するBAXは、直接作用する遺伝毒性の全試験化合物により強力に上方調節されることが見出された（図７および８）。
【００２０】
さらに、APエンドヌクレアーゼ２（APEX2）がMMS処置２４ｈおよび４８ｈ後に見出され、β−ポリメラーゼ（POLB）がMMS曝露４８ｈ後に見出された。両タンパク質は、MMS等の薬剤による曝露に起因する、アルキル化されたDNA塩基の塩基除去修復の範囲内で、p53の機能を仲介することが示唆されている。GADD45αもまた、遺伝毒性の全試験化合物により著しく上方調節された（図７および８）。GADD45αは、CDK1／Cyclin Bの阻害により細胞周期の停止を引き起こし、修飾されたDNA領域の認識によりDNA修復を仲介し、DNA−ヒストン相互作用の不安定化により損傷された位置への接近を容易にする。P53により調節される他の２つの遺伝子の発現は、（前駆型）遺伝毒性の試験化合物：14-3-3-σ（Stratifin、SFN）およびCDKN1A（p21）による処置に応答して、上昇する。両タンパク質産物は、DNA損傷に応答して細胞周期の停止を誘発する。14-3-3-σは、cdk1の活性脱リン酸化に必要なプロテインホスファターゼであるcdc25の核内への輸送を阻むことによって、非阻害条件下で細胞周期が進行する。G２チェックポイントでの調節機能に加えて、P21と同様、14-3-3-σも、G１期の間、細胞周期の停止を誘発する。
【００２１】
P53とは別に、STAT1（signal transducer and activator of transcription 1）は、遺伝毒性ストレス後の細胞周期停止とアポトーシスとの促進に関する腫瘍抑制の特徴と誘導機能とを有することにも起因すると考えられている。想定される機構は、DNA損傷後のDNA合成の有効な阻害をもたらすATM-NBS1-SMC1およびATM-Chk2-Cdc25のシグナリングカスケードを通して進行する。さらに、STAT1とP53との間の直接的な相互作用は、共調節というやり方(co-regulatory manner)で、P53に依存した転写効果とアポトーシスとを調整すると考えられる。加えて、STAT1は、p53のインヒビタであるmdm2の負のレギュレータとして説明されている。STAT1の直接の標的は、アポトーシスと、Fas、FasリガンドならびにCdkインヒビタであるp21およびp27などの細胞周期調節遺伝子とである。発見した９１種の遺伝子のうち、（前駆型）遺伝毒物：IL27RA（Interleukin 27 receptor, alpha；TCCR／WSX1とも呼ばれる）、ISG15（interferon-stimulated gene 15kDa）およびTAP1（transporter 1, ATP-binding cassette, sub-family B）による曝露に応答して上方調節されるものとして、３種のSTAT1標的遺伝子が同定された（図７）。IL27RのリガンドであるIL27は、免疫応答抑制、ヘルパーＴタイプ１分化、ならびに、抗血管新生および抗増殖（抗腫瘍）の特性における機能性を有する。TAP1は、TAP／MDRファミリーの輸送体であり、抗原提示のためのMHCクラスI分子のローディング(loading)に関与する。腫瘍細胞におけるTAP1の下方調節は、変性細胞に対する免疫反応を阻むことによる悪性形質転換に関連する。ISG15の調節異常は腫瘍促進にも繋がりがある。
【００２２】
今までに見出された９１種の遺伝子の生物学的分析を行っている間に、他の転写レギュレータである、SP1を含む亜鉛−システイン−ヒスチジンモチーフを強調した（図７）。SP1は、様々な過程、例えば細胞周期の調節、ホルモンの活性化、アポトーシスおよび血管新生に関与していることが報告されており、CDK4、Rad51、E2-DP1、p21またはStat3を含む多くの異なる細胞周期レギュレータにより活性化される。さらに、DNA損傷後に、損傷を感知するキナーゼであるDNA-PKとATMとによるリン酸化を介してSP1が活性化され得ることが実証されている。さらに、SP1に誘導されるアポトーシス細胞死がP53の存在下でしか引き起こされないことが先の刊行物に示されているように、SP1の機能性は、細胞のP53の状態に強く依存しているように見える。しかしながら、SP1は、プロアポトーシスの特徴とは別に、成長刺激特性を有することも提唱されている。SP1の１つの標的はc-Mycであり、細胞周期の進行を刺激し、したがって発がんにおいて重要な役割を演じている。MYCは、ACT、ETOおよびMMSにより下方調節されることが見出された。また、SP1調節ネットワークのさらなる転写因子であるEGR1（early growth response 1）も調節解除されるが、MMS、DEN、AFB1およびCPAに対しては上方調節されることが観察された。したがって、MYCおよびEGR1は、９１種の推定マーカー遺伝子には割り当てなかった。
【００２３】
ERG1の誘導は、DNA損傷化合物の影響に関連し、ERG1は、腫瘍サプレッサであるPTENを上方調節することによって、PI3K／Aktシグナリング経路を阻害するのと同様、P53の活性化を容易にする。CEBPB（CCAAT/enhancer binding protein, beta）を介するEGR1とHOMER3（homer homolog 3）との間接的な相互作用を前提とする。HOMER3は、マイクロアレイの研究において（前駆型）遺伝毒性の試験物質により上方調節されたものとして見出された。加えて、RhoGDI2（Rho GDP dissociation inhibitor (GDI) beta、ARHGDIB）、受容体型チロシンキナーゼAXLおよびNeuregulin 1（NRG1）は、この研究において上方調節されたものとして見出された。GDI（GDP解離インヒビタ）は、カスパーゼの標的であるから、プログラム細胞死に関与するが、AXLおよびNRG1は一般に、Akt（protein kinase B、v-akt murine thymoma viral oncogene）を介してもたらされる成長刺激機能を発揮する。対して、成長阻害作用機序は、細胞状態にもよるが、NRG1についても説明されている。AKT1のmRNA自体は差次的に調節されていなかった。これは、NRG1およびAXLが（前駆型）遺伝毒物に応答する他の機構を示唆している。
【００２４】
最高得点を出した９１種の遺伝子のうち、IER5（immediate early response 5）、EMP 3（epithelial membrane protein 3）、EMP1（epithelial membrane protein 1）、CRABP2（cellular retinoic acid binding protein 2）、PROCR（protein C receptor、endothelial／EPCR）およびPLAU（plasminogen activator、urokinase）は、遺伝毒性として注釈を付した試料の中で、常に上方調節されていた（表３／図７）。近年、電離放射に応答するIER5およびPROCRの誘導が発見された。さらに、Hela細胞においてsiRNAによりもたらされるIER5の抑制が、放射に誘導されるG２／Mの停止を促進した。EMP1もまた、G１期と短縮されたS期との延長による細胞周期調節特性を明らかにし、異なる腫瘍で過剰発現していることが見出された。NIH3T3細胞において、EMP1の一過性発現が細胞増殖の特異的な阻害をもたらし、EMP1の過剰発現の後、アポトーシス様な表現型が観察された。22kDaの末梢性ミエリンタンパク質のファミリー（PMP22またはTMP遺伝子ファミリー）の他のメンバーであるEMP3は、細胞情報伝達および増殖における役割を演じている可能性がある。不完全な腫瘍細胞にEMP3を再導入することによって、腫瘍成長およびコロニー形成が阻害された。これは、EMP3が腫瘍抑制の役割を有することを示唆している。
【００２５】
さらに、EMP3の細胞保護特性を、HepG2細胞で実証することができた。CRABP2は、レチノイン酸（RA）が結合するためのリポカインドメインを含む１５ｋＤａの小さなタンパク質をコードしている。したがって、CRABP2は、レチノイン酸受容体（RAR）に結合後の発生、胚形成、分化およびアポトーシスに関与する遺伝子の転写を調節するRAの核転座に重要である。CRABP2は、RARシグナリング経路の抗増殖効果をもたらすものと仮定されている。前記遺伝子と比較して、PROCRおよびPLAUは、好ましくは細胞生存を刺激する。MHC IファミリーのメンバーであるPROCRは典型的には、抗炎症および抗凝固の特性を発揮する。PLAUの細胞成長促進活性はおそらく、PLAUのuPARへの結合後のMAPK（p38）シグナリング活性化により認識されている。PLAUは、RAS-ERKとPI3K-Aktとのシグナリング活性化による抗アポトーシス機能を有すると考えられている。さらに、Bcl2ファミリーのメンバーと、PLAUによりもたらされるアポトーシス抑制におけるFas（TNF／死受容体）シグナリングとの間に機能的な繋がりがあるものとして対処されている。
【００２６】
最高得点を出した９１種の遺伝子と、関連する前述の分子の分析とによって、HepG2細胞の（前駆型）遺伝毒物への曝露に応答した、細胞の死および生存の複雑な調節が実証される。主に影響される過程には、細胞周期調節、細胞増殖およびアポトーシスが含まれる。差次的に調節されることが見出された遺伝子は、その大部分が、プロアポトーシスおよび抗増殖の機能に割り当てることができる。このデータは、試験化合物に誘導されるDNA損傷に応答した、細胞周期の停止とプログラム細胞死との誘導を示す。
【００２７】
遺伝毒性と明らかに異なる遺伝子との繋がりは、増殖、分化または損傷修復におけるシグナリングに干渉することができる変異原および前駆型変異原のインビトロでの検出に利用される。表１に従う複数の遺伝子に基づく、化合物特異的な遺伝子発現プロフィールの構築は、遺伝毒性の作用機構を確立するのに予想外の利益があるため、古典的なスクリーニング方法を補う新規化合物の潜在的危険性または利益の評価に裏付けられる。本方法の根底にある独創的な原理を意味するものには、核酸レベルまたはタンパク質レベルのいずれか（ここで核酸レベルが好ましく、より好ましくはmRNAである）で検出することができる規定された遺伝子またはそれらの遺伝子産物を探査することが含まれる。遺伝子産物は、ある細胞タイプにおける特異性と同様に、その絶対量および相対量の両方の点で、選択する。
【００２８】
一般的に「遺伝子」は、調節機能、触媒機能を有するか、および／または、タンパク質をコードするRNAに転写されることができるゲノム上の領域である。遺伝子は典型的にはイントロンとエキソンとを有し、成熟タンパク質の別バージョンをコードする異なるRNAスプライス変異体を産生するために編成されている場合がある。「遺伝子」には、機能ドメインに相当してもしなくてもよい遺伝子の断片も熟慮される。
【００２９】
本明細書で使用される「複数の遺伝子」は、その発現のレベルが異なる組織、細胞において、または異なる条件もしくは生物学的状態の下で変動する、同定されたかあるいは単離された遺伝子の群を指す。異なる条件は、ホルモン、受容体リガンド、化学化合物などを含むある薬剤（外因性であろうと内因性であろうと）に曝露することによって引き起こされ得る。複数の遺伝子の発現により、あるパターンが実証される。すなわち、複数の遺伝子のそれぞれは、異なる条件において、または、内因性または外因性のある薬剤への曝露の有無により、差次的に発現する。各遺伝子の差次的発現の程度またはレベルは、その複数の中で変動していてもよく、本発明に従い質的におよび／または量的に決定してもよい。本明細書で使用する遺伝子発現プロフィールは、異なるレベルで差次的に発現する複数の遺伝子を指し、これが「パターン」または「プロフィール」を構成する。本明細書で使用される「発現プロフィール」、「プロフィール」、「発現パターン」、「パターン」、「遺伝子発現プロフィール」および「遺伝子発現パターン」という用語を交換可能に使用する。
【００３０】
「遺伝子産物」という用語は、DNA合成、転写、スプライシング、翻訳、断片化もしくはメチル化などの生化学的、化学的または物理的な反応によって、該遺伝子の基質から形成される分子を意味する。本発明の好ましい遺伝子産物は、RNA、とりわけmRNAおよびcRNA、cDNAならびにタンパク質である。
【００３１】
本明細書で使用される「遺伝毒性活性を有する化合物」は、「変異原」とも称されるが、生命体の遺伝物質、通常DNAを変化させ、よって天然のバックグラウンドレベルを超えて突然変異の頻度を上昇させる物理的または化学的な薬剤である。例えば、変異原の生物学的効果の１つが、がんの発生を促進することであることを、当業者は知っているだろう。変異原の他の生物学的効果については、文書に十分に記載され、考察されている。変異原による核酸配列の変化には、DNA配列におけるヌクレオチド塩基対の置換ならびに１つまたは２つ以上のヌクレオチドの挿入および欠失が含まれる。
【００３２】
最初の段階（a）において、細胞系を提供する。細胞系は、対象が細胞を含んでいるという条件で、任意の対象と定義される。故に、細胞系は、単細胞、細胞培養物、組織、器官および哺乳動物の群から選択することができる。細胞系の範囲には、かかる生物学的な実体の一部、すなわち、組織、器官および哺乳動物の試料も包含される。前記の順の細胞系それぞれは、以下の系のそれぞれの試料に相当し得ることは理解されるべきである。
【００３３】
とりわけ、細胞系は、試験される哺乳動物から、インビボまたはインシチュで採取される。細胞系の回収は、良好な医療行為に従う。生物学的試料は、任意の生物学的種の種類から採取してもよいが、該試料は特にヒト、ラットまたはマウス、より好ましくはヒトから採取する。
【００３４】
本発明において、細胞系には、生物流体も含まれてよく、ここで体液の試料は、好ましくは血液、血清、血漿、唾液または尿からなる。生検によって、特に病気の位置の近くから採取された組織試料を収集することも好ましい。生物学的試料は、子宮、下垂体、肝臓、脳、結腸、乳房、脂肪組織などを含む任意の組織に由来し得る。好ましい態様において、生物学的試料は、腎臓、下垂体および子宮に由来する。該試料は、水素結合を形成するインヒビタなどの障害物質を除去するために精製してもよい。
【００３５】
細胞試料は、単離された状態、培養下、または細胞株として、いずれにおける任意のタイプの初代細胞または遺伝子操作された細胞を指す。ただし、それらは、少なくともGLS2、IER5、TMEM194、PROCR、ITGA2B、FADS3、STMN3、PIB5PA、ROBO3、EDA2RおよびKIF1Aの遺伝子を発現することができる。同じ機能を有する変異体、突然変異体、一部または相同な遺伝子配列が、保護ならびに定義の範囲内に含まれることは理解されるべきである。元の配列とその誘導体との間の変更度合いは、変異原により変更された遺伝子発現の要件により不可避的に制限される。好ましくは、その相同性は少なくとも８５％に達する。可能な変更には、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入、置換、修飾および付加、または他の核酸との融合が含まれる。操作された細胞は、これらの遺伝子またはそれらの一部を有する適切なベクターを用いる形質移入により、それらを発現することができる。好ましくは、組み換え細胞は、真核生物由来である。
【００３６】
本発明のより好ましい態様において、スクリーニング方法の段階（a）で、HepG2細胞を提供する。使用するS9の用量は、細胞毒性評価が負であっても、実験結果に影響を及ぼす。この用量は、規制されている標準的な遺伝毒性試験で使用される用量と同等であることに注意すべきである。S9で有意に調節された遺伝子は、（前駆型）遺伝毒性薬剤により誘導されたそれらと異なるものであり、S9の効果は、適正な対照との比較により、調整することができる。いずれの場合においても、固有の十分な代謝活性を有する細胞系は確かに適切なものではあるが、遺伝毒性を評価するための代謝的能力のあるそのような細胞系は現在、存在しない。初代肝細胞は、目下、薬物代謝およびインビトロでのCYP誘導／阻害研究において最高水準である。成体の分化した肝細胞は、該肝細胞を遺伝毒性調査にとって好適なモデルにさせない増殖能を欠いており、かつ、該肝細胞が、培養中のタンパク質と遺伝子発現、ヒト肝細胞の制限された可用性およびかかる系の標準化を複雑にする、しばしば著しいドナー／バッチの可変性と同様に、形態における有意な変化も示すとしても、HepG2細胞の主要な利点は、前記肝細胞のヒト分子の特徴を有することである。例えば、トポイソメラーゼおよび真核生物の修復酵素などの特異的な標的が発現され、遺伝毒性の過剰促進を阻むことによって、偽陽性の低減に寄与する。
【００３７】
細胞試料は、凍結などして保管し、ある時間培養するか、またはすぐに段階（b）に供する。それを、スクリーニングする化合物とともにインキュベートする前に、細胞試料を多数の部分に分ける。少なくとも２つの部分を提供する；一方をスクリーニングに使用するのに対し、他方を対照として役立たせる。好ましくは、スクリーニング用の部分の数は、対照の部分の数を超えている。通常、多数の部分は、ハイスループット・スクリーニングに供する。
【００３８】
前記化合物は、標的分子と相互作用することが可能な生物学的および／または化学的な構造物からなる。本明細書において、ゲノミクスのシグナリングにおける任意の成分を、「標的分子」として見なすべきであり、選択した遺伝子自体、または調節タンパク質もしくはその遺伝子産物、あるいは該遺伝子またはその遺伝子産物を含むシグナル伝達経路の成分に限定されるものではない。それ故、化合物の特異的相互作用は、単なる標的化、または細胞機能における変更の誘導のいずれかを含んでもよいし、それは両効果さえも同時に含んでもよい。
【００３９】
本発明の方法においてスクリーニングされる化合物は、とにかく制限されるものではない。特に、該化合物は、核酸、ペプチド、炭水化物、ポリマー、５０と１０００Ｄａとの間の分子量を有する小分子およびタンパク質の群から選択される。これらの化合物はしばしば、ライブラリで利用することができる。細胞試料の異なる部分の中で単一の化合物をインキュベートすることが好ましい。しかしながら、１つの部分の中で少なくとも２つの化合物をインキュベートすることによって、化合物の協同効果を調査することも可能である。細胞のさらなる部分を、化合物の非存在下で、同時にインキュベートする。
【００４０】
「インキュベーション」という用語は、化合物および／または標的の種類に応じて、特定の時間、前記化合物を細胞と接触させることを意味する。インキュベーションの過程はまた、他の様々なパラメータ、例えば細胞のタイプおよび検出の感受性にも依存するものであり、該パラメータの最適化は当業者に知られている所定の手順に従う。インキュベーションの手順は、変異原の化学的変換なしで実現され得るか、または前駆型変異原の代謝的変換を含んでもよい。化学溶液の添加および／または物理的手順の適用（例えば熱の影響）によって、試料中の標的構造物への接近性が向上し得る。特異的なインキュベーション産物は、インキュベーションの結果として形成される。
【００４１】
段階（c）において、本発明の意図における有効な化合物の同定は、前記系を発現することが可能な、表１に規定された少なくとも１１種の遺伝子の発現パターンを決定することによって、間接的に実施する。この決定は、特定の瞬間に実施し、実験の開始時点のシグナル強度と正／負の対照とが相関する。対照系を化合物（負の対照）とともにインキュベートしないか、または、対照系を、下記のマイクロアレイの例で記載した、遺伝毒性活性を有さない標準化合物（負の対照）もしくは（前駆型）遺伝毒性活性を有する標準化合物（正の対照）とともにインキュベートするか、のいずれかである。活性は発現の変化によって明らかになる。好ましくは、変異原曝露により細胞で発現または抑制された遺伝子を、変異原に曝露されなかった細胞で発現または抑制された遺伝子と比較する。それぞれの処置の間で、ペアワイズ(pairwise)比較を行う。ペアワイズ比較は、処置の所定条件下での所定遺伝子の発現データを、もう１つの処置条件下でのこの遺伝子の発現データと比較したものである。この比較は、既知かつ市販のプログラムの助けを借りて、好適な統計的技術を使用して実施する。
【００４２】
負もしくは正の対照系と比較して、系における遺伝子の発現が上方調節または下方調節されている場合、あるいは、系と正の対照系とにおいて遺伝子の発現が実質的に同一である場合に、存在する活性が段階（c）で検出されることは、本発明のより好ましい側面である。負の対照系を用いる差次的遺伝子発現分析により段階（c）において存在する活性が検出されることは、本発明の好ましい側面である。遺伝子発現を監視するのに好適な試験、ヌクレオチド配列の決定および変異体分析は、当業者に知られているものか、またはありふれた事項として容易に設計することができるものである。本発明に従うアッセイは、遺伝子発現を検出および／または定量化するのに好適な任意のアッセイであってもよい。選択マーカーは、よりハイスループットなスクリーニングツール、例えばHigh Content Imaging（HCI）または遺伝子発現パネル（例えば、リアルタイムPCRをベースとしたTaqMan（商標）低密度アレイまたはLuminexでのbDNAアッセイ）を確立するために、使用することができる。両技術は、生物学的複雑性および分子間相互作用をある程度保存する、いくつかの選択したエンドポイントの組み合わせを可能とする。特に、HCIは、古典的な遺伝毒性エンドポイント（例えば小核誘導）と、細胞生存性／細胞毒性の同時取得による細胞マーカーの分析とを組み合わせる可能性を提供する。標準的アッセイにおける偽陽性がとりわけ細胞毒性を介して生じ得るため、細胞生存性は、遺伝毒性試験について熟考するのに重要なパラメータである。同じことがP53などの分子マーカーの測定に対しても正しい。p53はDNA損傷に対して極端に敏感に反応するが、栄養枯渇および低酸素もまた、その活性化を誘導することができる。同様にSTAT1も、高浸透圧ストレス、上昇したグルコースレベル、低酸素または活性酸素種により活性化することが知られている。複数のエンドポイント測定とともに用量選択について、細胞毒性を熟考することによって、偽陽性が抑えられるか、または低減し得る。別個の（前駆体）遺伝毒性遺伝子調節は、非遺伝毒性化合物であるMETおよびTHEOにより成し遂げられる。
【００４３】
多くの異なるタイプのアッセイが知られており、その例は以下に記載するが、ヌクレオチドアレイおよびヌクレオチドフィルタによる分析が挙げられる。当該分野においても周知な手順に従い、ハイブリダイズの条件（温度、時間、および濃度）を調整する。チップハイブリダイゼーションおよび／またはPCRを、遺伝子発現の決定に適用することは好ましい。他の好ましい態様において、本発明のアッセイには、高密度オリゴヌクレオチドアレイの使用が含まれる。他のさらに好ましい態様において、多重qPCR、より好ましくは低密度TaqManアレイまたは分岐DNAアッセイにより、分析を実施する。他の固体支持体およびマイクロアレイも、当業者に知られており、市販されている。
【００４４】
それ故に、この発明は、評価される細胞から核酸試料を調製すること、該核酸試料をマイクロアレイと接触させること、マイクロアレイとハイブリダイズした核酸を検出すること、および、段階（c）で検出した結果を、対照細胞から調製した核酸試料を使用して検出した結果と比較することによって、遺伝毒性活性を有する化合物の細胞効果を予測する方法に関する。
【００４５】
本発明の好ましい態様において、遺伝子産物として、RNA、cRNA、cDNAおよび／またはタンパク質、より好ましくはmRNA、cRNAおよび／またはcDNAを検出する。例えば、かかる細胞の全RNAを、Trizol（Invitrogen）に続き、例えばRneasyカラム（Qiagen）を介する再精製など、当業者に知られている方法によって、調製する。
【００４６】
方法に従い、当該分野において周知の検出可能な標識を使用して、標識した標的を生成するために、全RNAを使用する。例えば、アッセイに使用するためのcRNA標的を形成するビオチンを用いて該RNAを標識してもよい。次に、鋳型としてのmRNAを抽出し、逆転写酵素（例えば、SuperScript Reverse Transcriptase；GibcoBRL）ならびに標識したdNTP（例えば、Cy3-dUTPおよびCy5-dUTP；Amersham Pharmacia Biotech）を使用してcDNAを産生する。評価される細胞の中で発現された遺伝子量が反映されているcDNA試料を調製する。これによって、標識cDNAがcDNA試料に含まれることになる。ここで、蛍光標識または放射性標識のいずれかを標識として使用してもよい。このやり方で調製されたcDNA試料を、一本鎖に変性した形態で、後述するマイクロアレイに適用し、cDNA試料に含まれるcDNAを、基板に固定化された遺伝子とハイブリダイズする。
【００４７】
「インシチュ・ハイブリダイゼーション」は、試料中の遺伝子の存在またはそのコピー数を決定するための方法論であり、例えば蛍光インシチュ・ハイブリダイゼーション（FISH）である。一般的に、インシチュ・ハイブリダイゼーションには、以下の主要な段階が含まれる：（1）分析される組織または生物学的構造物の固定；（2）標的核酸との接近性を上昇させ、かつ非特異的な結合を低減するための、生物学的構造物のハイブリダイゼーション前処理；（3）生物学的構造物または組織の中の核酸と、核酸混合物とのハイブリダイゼーション；（4）ハイブリダイゼーション中に結合しなかった核酸断片を除去するためのハイブリダイゼーション後の洗浄；および（5）ハイブリダイズした核酸断片の検出。このようなアプリケーションで使用するプローブは典型的には、例えば放射性同位元素または蛍光レポーターにより標識されている。ストリンジェントな条件下で標的核酸との特異的なハイブリダイゼーションを可能にするために、好ましいプローブは十分に長く、例えば、約５０、１００または２００ヌクレオチド（nt）〜約１０００かそれ以上のヌクレオチドである。ここで、好ましくは５０〜８０℃で１０〜２０時間、より好ましくは約６５℃で１０〜２０時間のインキュベートによって、cDNAとのハイブリダイゼーションを達成することができる。
【００４８】
本明細書で使用する「マイクロアレイ」という用語は、生体分子を検出するために、例えば遺伝子発現を測定するために使用することができるヌクレオチドアレイを指す。この開示において「アレイ」、「スライド」および「（DNA）チップ」を交換可能に使用する。マイクロアレイには通常、例えばスライドガラス、シリコーンなどから作製された基板と、この基板上にアレイとして固定化されたDNA断片とが含まれる。このマイクロアレイを用いて、基板上に固定化されたDNA断片と試料に含まれるDNAとをハイブリダイズすることによって、それらを検出することができる。試料中のDNAを放射性標識または蛍光標識するので、放射性画像スキャナ、蛍光画像スキャナなどによる検出が可能となる。世界中の研究および製造施設において様々な種類のアレイが製造されており、そのいくつかは市販されている。例えば、核酸材料のアレイ基板上に配置されるやり方が異なるヌクレオチドアレイには、スポットされたアレイ(spotted array)とインシチュ合成されたアレイとの主に２種類がある。もっとも広く使用されるオリゴヌクレオチドアレイの１つは、Affymetrix, Inc.により製造されたGeneChipである。オリゴヌクレオチドプローブは、１０〜５０ヌクレオチド（nt）、好ましくは１５〜３０nt、より好ましくは２０〜２５ntの長さを有する。それらは、アレイ基板上にインシリコで合成される。これらのアレイは、例えばcm２あたり遺伝子４０，０００以上という高密度を達成し易い。他方、スポットされたアレイは、より低い密度を有する傾向にあるが、プローブ、典型的には部分的なcDNA分子は、通常、２５ヌクレオチドよりはるかに長い。スポットされたcDNAアレイの代表的なタイプは、Incyte Genomicsにより製造されたLifeArrayである。合成前かつ増幅前のcDNA配列を、これらの種類のアレイの基盤に付着させる。
【００４９】
一態様において、アレイはマトリックスであって、該マトリックスでは、各位置が、遺伝子にコードされた産物（例えばタンパク質またはRNA）に対する個別の結合部位に相当し、該結合部位は、GLS2、IER5、TMEM194、PROCR、ITGA2B、FADS3、STMN3、PIB5PA、ROBO3、EDA2RおよびKIF1Aの全遺伝子、あるいは表１および任意に図１a＋bおよび／または図２a＋bに従う多くのまたはほとんどすべての遺伝子の産物に存在する。一態様において、「結合部位」（以下「部位」）は、関連する特定のcDNAが特異的にハイブリダイズする核酸または核酸類似物である。結合部位の核酸または類似物は、例えば、合成オリゴマー、完全長cDNA、完全長未満のcDNAまたは遺伝子断片であり得る。好ましくは、マイクロアレイは、関心のある遺伝子発現調整剤の作用に関連する遺伝子、または、関心のある生物学的経路の遺伝子の結合部位を有する。ストリンジェントな条件下で、１１種の遺伝子、加えて表１ならびに任意に図１a＋bおよび／または図２a＋bに従う遺伝子の規定された群から選択される遺伝子またはその一部とハイブリダイズすることが可能な１種以上のDNA断片が基板上に固定化されていることが好ましい。基板上に固定化されるDNA断片には、前記遺伝子の全部または一部が含まれていてもよい。本明細書で使用する「遺伝子の一部」という用語は、前記遺伝子および少なくとも１０nt、好ましくは少なくとも２５nt、より好ましくは５０nt、最も好ましくは３００nt、極めて好ましくは５００ntと均等のヌクレオチド配列の一部を意味する。
【００５０】
変異原活性を有する化学物質の有無にかかわらず構成的に発現する遺伝子（以下、負の対照遺伝子などともいう）をマイクロアレイの基盤上に固定化することが、さらに好ましい。本発明に従う遺伝子の発現レベルは、基板上に負の対照遺伝子を固定化すること、および負の対照遺伝子の発現レベルを一定値に修正することによって、修正することができる。よって、表１および任意に図１a＋bおよび／または図２a＋bに従う遺伝子の発現レベルの変化は、確実に検出することができる。いくつかの負の対照遺伝子、および／または、異なる発現レベルを有するそのような遺伝子を選択することによって、正確性をさらに高めることができる。
【００５１】
固体支持体または基板（本明細書ではこれらの用語を交換可能に使用し、ガラス、プラスチック（例えばポリプロピレンまたはナイロン）、ポリアクリルアミン、ニトロセルロースまたは他の材料から製造されてもよい）に核酸または類似物を付着させる。DNA断片および負の対照遺伝子が基板上に固定化されている場合、従来知られている技術を使用することができる。例えば、基板の表面は、基板表面上にそれらの電荷を介してDNA断片を静電的に結合させるために、ポリリジンなどのポリカチオンにより処置することができる。さらに、DNA断片の５’末端を基板と共有結合させる技術を使用してもよい。代わりに、その表面上にリンカーを有する基板を産生し、リンカーと共有結合を形成することができる官能基を、DNA断片の末端に導入する。リンカーと官能基との間に共有結合を形成することによって、DNA断片を固定化する。表面に核酸を付着させる好ましい方法は、ガラス板上にプリントすることによる。
【００５２】
最後に、マイクロアレイ上のDNA断片とハイブリダイズするcDNAを検出する。ハイブリダイズしたcDNAが蛍光標識されている場合、蛍光は、例えば蛍光レーザー顕微鏡およびCCDカメラにより検出し、蛍光強度はコンピュータにより分析する。同様に、ハイブリダイズしたcDNAが放射性標識されている場合、検出は、RI画像スキャナなどを使用して実行することができ、放射線の強度はコンピュータにより分析することができる。
【００５３】
スクリーニング方法の他の態様において、段階（c）では、変異原および／または前駆型変異原の活性の検出をさらに改良することができる。このために、遺伝子発現は、GLS2、IER5、TMEM194、PROCR、ITGA2B、FADS3、STMN3、PIB5PA、ROBO3、EDA2RおよびKIF1Aの遺伝子、または表１の全遺伝子によりコードされる各遺伝子産物により決定され、シグナル量またはシグナル変化量を、系の遺伝子発現に相関させる。本発明の細胞系を、同定された内分泌活性の化合物と様々な濃度でインキュベートする。変異原化合物の存在下で観察された放射シグナル量またはシグナル変化量は、該化合物により経験された遺伝子発現の変化を示す。よって、その変化は、試料中の変異原の濃度に関連し得る、すなわち、較正曲線によって、一致する濃度の検針が可能となる。好ましくは、UV／VIS着色または発光を使用する場合、較正曲線は、ランベルト・ベールの方程式に基づく。
【００５４】
化合物の遺伝毒性は、試料中の遺伝子産物の濃度を、変異原で処置した、および／または処置しない細胞の知られている遺伝子産物濃度レベルと比較することによって、診断する。既知濃度を統計的に証明することによって、あるレベルまたは範囲のそれぞれを表すことは、理解されるべきである。以下に記載したとおり、ある因子による明らかな上方調節または下方調節のいずれかが認識されるように（このことは、バイオマーカー選択の土台を形成する）、遺伝子発現の方向および強度はまた、本発明の標的遺伝子の差次的発現分析によっても解明される。刺激されなかった細胞の濃度レベルと同等な遺伝子産物濃度では、化合物を変異原として分類することができないが、刺激されなかった細胞の遺伝子産物濃度レベルとは異なる、測定された任意の濃度は、試験された細胞試料の異常を示す。遺伝毒性を検出するためには、刺激されなかった細胞の遺伝産物濃度レベルより高い濃度で測定されることが好ましい。本発明者らは、この方法を使用して、マイクロモーラー以下で、またはナノモーラー濃度でさえも、その感受性を実証した。較正プロットによって、前記方法が、２倍を超える大きさにわたるダイナミックレンジに適用され得ることがわかる。
【００５５】
本発明の好ましい態様に従う「ポリメラーゼ連鎖反応」または「PCR」は、遺伝子のコピー数を測定するために使用される、増幅をベースとしたアッセイである。かかるアッセイにおいて、対応する核酸配列は、増幅反応において鋳型として作用する。定量的増幅において、増幅産物の量は、元の試料における鋳型の量に比例するだろう。前述の原理に従う、使用した特異的プロープに対応する遺伝子コピー数の測定が、適切な対照との比較により提供される。
【００５６】
リアルタイム定量的PCRの詳細なプロトコルを、例えばRNAについて提供する。生物学的試料における「mRNAのレベル」は、細胞または生物学的試料に存在する所定の遺伝子から転写されたmRNAの量を指す。本発明において有効に測定された生物学的試料（例えば細胞または細胞培養物）の生物学的状態の一側面は、その転写状態である。生物学的試料の転写状態には、ある条件下の細胞における、構成的RNA種（特にmRNA）の固有性および豊富さが含まれる。好ましくは、生物学的試料における全構成的RNA種のかなりの割合を測定するが、少なくとも、関心のある化合物の作用を特徴付けるのに十分な割合を測定する。
【００５７】
増幅される部位の側面に位置する領域のヌクレオチド配列情報に基づいて、プライマーを設計する。プライマーは、１００〜２００塩基対の長さの領域が増幅されるように、設計してもよい。核酸増幅方法としては、PCR、好ましくはリアルタイムPCRが挙げられるが、特に限定されない。mRNAのレベルはまた、本明細書に記載の他の方法により定量化してもよい。
【００５８】
分析される生物学的試料と前記プライマーとを使用して核酸の増幅反応を実施した後、核酸が増幅したか否かをチェックする。増幅された核酸の検出を容易にするために、予めプライマーを標識してもよい。適用可能な蛍光標識の例としては、Applied Biosystems製のFAM（商標）、TET（商標）、HEX（商標）、TAMRA（商標）およびROX（商標）が挙げられる。これらの場合において、プライマーの５’末端または３’末端のいずれか、好ましくは５’末端を標識してもよい。代わりに、標識されたヌクレオチドを使用するPCRの最中、またはPCRが完了した後でさえも、核酸を標識することができる。汎用の発光決定装置により発光を測定する。
【００５９】
TaqManプローブを使用する「リアルタイム定量的PCR」の方法も当該分野において周知である。故に、ポリヌクレオチドを定量化するために、TaqManをベースとしたアッセイを適用することができる。TaqManをベースとしたアッセイでは、５’に蛍光染料を、３’に消光剤を含む蛍光発生オリゴヌクレオチドプローブを使用する。該プローブはPCR産物とハイブリダイズするが、３’末端のブロッキング剤により、それ自体は伸長することができない。PCR産物がその後のサイクルで増幅される場合、ポリメラーゼ（例えばAmpliTaq）の５’ヌクレアーゼ活性はTaqManプローブの切断をもたらす。この切断により、５’の蛍光染料と３’の消光剤とが分離し、それによって、増幅に応じて蛍光が増加するという結果になる。
【００６０】
キャピラリ電気泳動により実施してもよい一本鎖構造多型（SSCP）分析などの電気泳動に反応溶液を供することによっても、増幅した核酸断片の有無をチェックすることができる。しかしながら、他の電気泳動の方法（例えばゲル電気泳動）もまた適用可能であり、当業者に周知である。
【００６１】
したがって、本発明は、前記アッセイによる遺伝子発現調整のアセスメントまたは測定に関する。かかる調整は、遺伝子発現の誘導または阻害に関する。典型的には、遺伝子発現の調整は、内因性または外因性の因子または薬剤により引き起こされてもよい。所定の化合物の効果は、当業者に知られている任意の手段で測定することができる。例えば、PCR、ノーザン・ブロッティング、プライマー伸長、ディファレンシャル・ディスプレイ技術などにより、発現レベルを測定してもよい。発現の誘導（すなわち上方調節）は、特定の遺伝子の発現レベルにおいて、定性的にまたは定量的に、観測可能または測定可能な任意の増加を指す。それに反して、発現の阻害（すなわち下方調節）は、特定の遺伝子の発現レベルにおいて、定性的にまたは定量的に、観測可能または測定可能な任意の減少を指す。生物学的試料中のRNA転写物を測定することが可能な任意の技術を使用して、発現レベルの測定を実行してもよい。これらの技術の例としては、前述したように、数ある中でも、PCR、TaqMan、プライマー伸長、ディファレンシャル・ディスプレイおよびヌクレオチドアレイが挙げられる。調整の場合、遺伝子産物の濃度がそれぞれ、対照系の遺伝子産物濃度の少なくとも２倍、好ましくは少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも２５倍、最も好ましくは少なくとも４０倍を上回るかまたは下回ることは、本発明の他の態様である。
【００６２】
本発明のバイオマーカーのパネルは、スクリーニング方法の範囲内において、たった１１種のマーカー遺伝子の使用を可能とする感度を示すが、遺伝毒性の検出には、これらマーカー遺伝子より多くの遺伝子を適用することが好ましい。図３に準じるランキングは、１１種または３２種の遺伝子を使用することによって、誤分類率の低いものが得られることを示す。該率は、１０％を下回る（それぞれ１１遺伝子では７．１％、３２遺伝子では７．１２％である）。遺伝子ランキングを表１に示す。したがって、所定のランキングにおける遺伝子順位を検討しながら、任意の複数の遺伝子に適用することができる。言い換えれば、GLS2、IER5、TMEM194、PROCR、ITGA2B、FADS3、STMN3、PIB5PA、ROBO3、EDA2RおよびKIF1Aの１１種の遺伝子（ランキング１〜１１を割り当てられている）から始めて、遺伝子パネルは、好ましくはランキング１２の他の遺伝子によって、より好ましくは次にランキング１３の他の遺伝子などによって、最高９１遺伝子まで延長することができる。本発明の最も好ましい態様において、段階（a）で提供される細胞系は、したがって、少なくとも表１のランキング１〜３２の遺伝子、極めて好ましくはパネル全体の９１遺伝子を発現することができる。したがって、表１の少なくとも３２遺伝子の発現は、最も好ましくは段階（c）における対照系での遺伝子発現、極めて好ましくはパネル全体の９１遺伝子と比較する。本発明者らは、低−多数の遺伝子レポーターアッセイより広い範囲の遺伝毒性応答を対象にすることによって、多数の変異原応答遺伝子の分析において、スクリーニングの安定性が増し、エラー率が低下することを、説明している。
【００６３】
表１に従う群から選択される遺伝子の発現に加え、細胞系またはその試料は、好ましくは、図１a＋bの少なくとも３遺伝子および／または図２a＋bの少なくとも単一の遺伝子を発現することができる。ここで、本発明のスクリーニング方法の段階（a）において、追加された遺伝子は、表１のこれらの遺伝子とは異なる。表２の少なくとも単一の異なる遺伝子がより好ましい。さらに、段階（c）において、追加の遺伝子の発現を、対照系の遺伝子発現と比較する。
【００６４】
本発明に従う段階（a）の最も好ましい他の態様において、提供される系は、表１、図１a＋bおよび／または図２a＋bの全遺伝子、極めて好ましくは表１の全９１遺伝子、大変極めて好ましくはさらに図１a＋bおよび図２a＋bの異なる全遺伝子を発現することができる。
【００６５】
本発明の他の態様において、系における遺伝子GADD45A、MAPK12およびNTHL1の遺伝子発現を、対照系における遺伝子発現と比較することは、段階（c）から除外する。
【００６６】
段階（a）において、細胞系またはその試料は、表１の多数の遺伝子を発現することができ、および／または、加えて図１a＋bおよび／または図２a＋bの多数の遺伝子を発現することができ、ならびにさらに段階（c）において、表１、図１a＋bおよび／または図２a＋bの多数の遺伝子の発現パターンを対照系の発現パターンと比較する場合、遺伝毒性は化合物特異的に特徴付けることができる。とりわけ、発現パターンは、多数の遺伝子および／または変更された調節の大きさの相関により、決定される。この発明のスクリーニング方法は、評価される細胞に対する、遺伝毒性活性を有する化学物質の効果を評価するのみならず、この効果の詳細を示すこともできる。カテゴリー化された遺伝子の発現レベルを個々に評価することによって、どのような化学物質が、評価される細胞に影響を及ぼす遺伝毒性活性を有するかを区別することが可能となる。
【００６７】
本発明はまた、スクリーニング方法の態様も教示しており、段階（a）において、哺乳動物、好ましくは実験哺乳動物を提供し、段階（b）において、スクリーニングされる化合物を該哺乳動物に投与し、ならびに段階（c）において、該哺乳動物から回収した生物学的試料中の遺伝毒性および／または前駆型遺伝毒性の活性のレベルを、遺伝毒性効果を示さない哺乳動物と比較して検出し、ここでレベルの差異は、該化合物が、遺伝毒性によりもたらされた病理学的状態に対する治療効果を有する可能性の増大を示す。治療効果による質的レベルを、段階（c）に取り込む。「治療効果」は、１つもしくは２つ以上の疾患の症状をある程度まで軽減するか、あるいは、部分的にまたは完全に、疾患もしくは病理学的状態に関連するかまたは原因となる１つまたは２つ以上の生理学的または生化学的なパラメータを正常に戻す。さらに、「治療上の有効量」という表現は、この量を与えられていない対応する対象と比較して、以下の因果関係：疾患、症状、状態、病状、障害もしくは副作用の改善された処置、治癒、予防または除去すること、あるいは疾患、病状もしくは障害の前に軽減することも有する量を意味する。「治療上の有効量」という表現はまた、正常な生理学的機能を増進するのに有効な量も包含する。いくつかの化合物を試験することによって、哺乳動物の対象を処置するのに最も好適なその化合物の選択が可能となる。選択した化合物のインビボでの用量率は、有利には、特定の細胞に対し、それらのインビボでのデータにより予め調整する。したがって、治療有効性は著しく増進する。
【００６８】
本発明はまた、生理学的および／または病理学的な状態を監視する方法にも関し、該方法は、少なくとも１種の遺伝毒性もしくは前駆型遺伝毒性の化合物、または生理学的に許容し得るその塩の有効量を、かかる処置を必要とする哺乳動物に投与すること、および、該哺乳動物から回収した生物試料において、少なくともGLS2、IER5、TMEM194、PROCR、ITGA2B、FADS3、STMN3、PIB5PA、ROBO3、EDA2RおよびKIF1Aの遺伝子の発現を決定することによって、増殖、分化および／または損傷修復の調節解除により、引き起こされ、もたらされ、および／または、伝播される。化合物は、好ましくは、前記の本発明のスクリーニング方法により得られる。よって、スクリーニング方法に関する本明細書の従前の教示は、監視する方法に限定されずに、目的に適うならば、有効であり応用可能である。
【００６９】
前述の複数の遺伝子を同定することにより、状態、疾患または処置の進行のアセスメントにとって強力なツールが提供される。具体的には、外科手術、治療レジームの開始または治療レジームの完了などの出来事の前の患者においてベースラインの結果を提供するために、複数の遺伝子を同定することができる。次に、このベースラインを、かかる出来事の最中または後のいずれかに同一の方法を使用して得られた結果と比較することができる。この情報は、診断および予後の目的の両方にとって、使用することができる。
【００７０】
ヒトおよび獣医学において、本発明の監視する方法を採用することができる。哺乳動物は好ましくは実験動物および／または非ヒト生命体である。本明細書において、治療の役割を果たすために、疾患の発病前または後に、一度または何度か、化合物を投与することができる。「有効量」または「有効用量」または「用量」という用語は、本明細書において交換可能に使用し、疾患または病理学的状態に対して予防的または治療的に関連する効果を有する（すなわち、組織、系、動物またはヒトにおいて、例えば研究者または医師に探し求められるか、望まれる生物学的または医学的な応答を引き起こす）医薬化合物の量を意味する。
【００７１】
本発明の使用の前述した医薬品は、とりわけ治療的処置に使用される。監視することは、処置の一種として見なされ、ここで、例えば前記応答をブースター(booster)し、遺伝毒性によりもたらされる疾患の病原体および／または症状を完全に除去するために、前記化合物は好ましくは異なる間隔で投与される。同一の化合物または異なる化合物のいずれかを適用することができる。医薬は、疾患が発症する可能性を低減させるのにも、遺伝毒性の影響のため、または、発症し継続している症状を処置するため、増殖、分化および／または損傷修復に関連するそれらの疾患の発症を予め防ぐのにさえも、使用することができる。本発明の意図において、対象が、家族性傾向、遺伝的欠損、または以前患った疾患などの前述した生理学的または病理学的な状態に関する任意の前提条件を保有している場合、予防的処置が望ましい。本発明に関する疾患は、好ましくは、がん、腫瘍、転移がん、および／または血管新生の障害である。
【００７２】
本発明に従う前記化合物は、最終的にそれらの非塩形態で使用することができる。他方、本発明はまた、それらの薬学的に許容し得る塩の形態でこれらの化合物の使用も包含し、該形態は、当該分野において知られている手順により様々な有機および無機の酸および塩基に由来し得る。「薬学的に許容し得る塩」および「生理学的に許容し得る塩」という本文脈における表現は、本明細書において交換可能に使用するが、特にこの塩形態が、活性成分の遊離形態、または前に使用した活性成分の任意の他の塩形態と比較して、改善した薬物速度論的特性を活性成分に分け与える場合、その塩の１つの形態で本発明に従う化合物を含む活性成分を意味するために用いられる。活性成分の薬学的に許容し得る塩形態はまた、前には有さなかった所望の薬物速度論的特性を初めて有したこの活性成分も提供することができ、本体におけるその治療有効性に関するこの活性成分の薬動力学に対して肯定的な影響さえも有することができる。
【００７３】
本発明の目的はまた、遺伝毒性および／または前駆型遺伝毒性の活性を有する化合物をスクリーニングするために、マーカー遺伝子としてGLS2、IER5、TMEM194、PROCR、ITGA2B、FADS3、STMN3、PIB5PA、ROBO3、EDA2RおよびKIF1Aの遺伝子を使用することでもある。スクリーニング方法に関する本明細書の従前の教示は、該使用に限定されずに、目的に適うならば、有効であり応用可能である。
【００７４】
遺伝毒性または前駆型遺伝毒性の活性を検出するために、表１の遺伝子にコードされた少なくとも１種の遺伝子産物と特異的に相互作用する物質を使用することは、本発明のさらなる他の目的である。本明細書で使用する「特異的な物質」という用語には、信頼性の高い結合を確保するために、選択した遺伝子にコードされた少なくとも1種の遺伝子産物と高い親和性を有する分子が含まれる。該物質は、好ましくは該遺伝子産物の一部に特異的である。かかる一部は、特異的な機能の発現に十分なそれらの領域に限定したもの、すなわち認識するための構造的決定要因を定めたものに相当する。すべてのトランケーションは、特有な認識を保存しているという要件により不可避的に限定されている。しかしながら、遺伝子産物の一部は、極めて小さいものであってもよい。好ましくは、選択した単一の標的に対して排他的かつ直接的な相互作用を保証するために、該物質は単一特異性である。
【００７５】
本発明に従う遺伝子産物またはその一部の認識は、遺伝子配列を有するヌクレオチド配列または該遺伝子により発現されたアミノ酸配列の一次、二次および／または三次構造レベルで、物質との特異的な相互作用により実現され得る。遺伝情報のコード機能については一次構造認識が好まれるが、それに対して、タンパク質認識については主に三次元構造を考慮するべきである。本発明に照らして、「認識」という用語は、以下に限定されないが、特異的な物質と標的との間の任意のタイプの相互作用、とりわけ、共有結合、疎水的／親水的な相互作用、ファン・デル・ワールス力、イオン対、水素結合、リガンド−受容体の相互作用、エピトープと抗体結合部位との間の相互作用、ヌクレオチド塩基対などの、共有結合もしくは共有結合性の結び付きまたは非共有結合または非共有結合性の結び付きに関連する。かかる結び付きはまた、ペプチド、タンパク質または他のヌクレオチド配列などの他の分子の存在も包含してもよい。
【００７６】
特異的な物質は、認識、結合および相互作用を可能にするようなやり方で、標的分子と相互作用することが可能な生物学的および／または化学的な構造物からなる。特に、該物質は、核酸、ペプチド、炭水化物、ポリマー、５０と１０００Ｄａとの間の分子量を有する小分子およびタンパク質の群から選択され、好ましくは核酸である。特異的な物質は、信頼性の高い結合を確保するために、十分な感受性と特異性とを発現している。
【００７７】
タンパク質またはペプチドは好ましくは、抗体、サイトカイン、リポカイン、受容体、レクチン、アビジン、リポタンパク質、糖タンパク質、オリゴペプチド、ペプチドリガンドおよびペプチドホルモンからなる群から選択される。より好ましくは、特異的な物質として抗体を使用する。
【００７８】
「核酸」という用語は、一本鎖もしくは二本鎖のDNAまたはRNAの天然あるいは合成のポリマーを指し、代わりに、DNAまたはRNAのポリマーに組み込まれ得る、合成、非天然または修飾ヌクレオチドを含む。各ヌクレオチドは、糖部分、リン酸部分、および、プリンまたはピリミジンのいずれかの残基からなる。核酸は、好ましくは、一本鎖もしくは二本鎖のDNAまたはRNA、プライマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、DNA酵素、アプタマーおよび／またはsiRNA、あるいはそれらの一部である。核酸は、ホスホロチオエートDNA、ロックド核酸（LNA）、ペプチド核酸（PNA）またはスピーゲルマー(spiegelmer)として任意に修飾され得る。
【００７９】
遺伝毒性および／または前駆型遺伝毒性の活性を検出するために、ストリンジェントな条件下で、GLS2、IER5、TMEM194、PROCR、ITGA2B、FADS3、STMN3、PIB5PA、ROBO3、EDA2RおよびKIF1Aの遺伝子、または好ましくは該遺伝子にコードされた遺伝子産物、またはそれらの各部分と特異的にハイブリダイズする核酸プローブを使用することは、本発明の好ましい目的である。「核酸プローブ」は、化学結合の１つまたは２つ以上のタイプ、通常水素結合の形成による相補的塩基対を介して、標的核酸または相補配列と結合することができる核酸である。本明細書で使用するプローブには、天然（すなわちA、G、C、もしくはT）または修飾塩基（すなわち7-デアザグアノシン、イノシンなど）が含まれてもよい。さらに、プローブ中の塩基は、ハイブリダイゼーションを干渉しない限り、ホスホジエステル結合以外の繋がりで連結していてもよい。プローブが、プローブ配列との完全な相補性を欠いている標的配列と、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに応じて結合してもよいことは、当業者に理解されるだろう。プローブは好ましくは、同位体、例えば発色団、発光団もしくは色原体により直接標識されているか、またはストレプトアビジン複合体と後に結合し得るビオチンにより間接的に標識されている。プローブの有無をアッセイすることによって、関心のある標的遺伝子の有無を検出することができる。遺伝毒性に特異的な物質として使用する、とりわけ好ましい核酸プローブは、オリゴヌクレオチドプローブである。
【００８０】
特異的な物質を標識することができるが、その際、標識がそれらの固有素性と適用される検出方法とに依存するようにする。特異的なインキュベーション産物を検出するために、適用する方法は、監視される特異的なインキュベーション産物に依存し、当業者に周知である。本発明に従う好適な検出方法の例は、蛍光、発光、VIS着色、放射線放射、電気化学過程、磁気または質量分析である。
【００８１】
標識が容易に検出されるものである限り、標識方法は特に限定されるものではない。「標識された核酸またはオリゴヌクレオチドのプローブ」は、核酸またはプローブに結合した標識の存在を検出することによって、核酸またはプローブの存在を検出し得るような標識に対して、リンカー結合もしくは化学結合を介して共有的、またはイオン性、ファン・デル・ワールス、静電的、疎水的相互作用もしくは水素結合を介して非共有的のいずれかで、結合されるものである。本発明の好ましい態様において、核酸は、ジゴキシゲニン、ビオチン、化学発光物質、蛍光染料、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、電子密度の高い試薬、酵素；これらのすべては当該分野において周知であり、または放射性同位体により標識される。本発明の範囲において核酸を標識するのに好ましい同位体は、３H、１４C、３２P、３３P、３５S、または１２５I、より好ましくは３２P、３３P、または１２５Iである。
【００８２】
本発明のさらなる他の目的は、本明細書中の任意の表または図に従う複数の遺伝子の規定された組み合わせを含むジーンチップに関する。特に、本発明は、ストリンジェントな条件下で、GLS2、IER5、TMEM194、PROCR、ITGA2B、FADS3、STMN3、PIB5PA、ROBO3、EDA2RおよびKIF1Aの遺伝子と特異的にハイブリダイズすることができる核酸プローブ、もしくは好ましくは該遺伝子によりコードされている遺伝子産物、またはそれらの各部分を含むアレイとして実施してもよい。本発明はまた、ストリンジェントな条件下で、図１a＋bおよび／または図２a＋bの遺伝子、もしくは好ましくは該遺伝子によりコードされている遺伝子産物、またはそれらの各部分と特異的にハイブリダイズすることができる核酸プローブを含むアレイとしても実施してもよい。両アレイは特に、遺伝毒性および／または前駆型遺伝毒性の活性を有する化合物をスクリーニングするための本発明の方法を実施するために設計されている。本発明のアレイには、本発明の方法を実行する方法について、書面での指示が含まれるか、または書面での指示にユーザーを向かわせる物品が含まれていてもよい。スクリーニング方法に関する本明細書の従前の教示は、キットに限定されずに、目的に適うならば、有効であり応用可能である。
【００８３】
本発明の範囲において、遺伝毒性活性を有する化合物をスクリーニングする方法には、表１の遺伝子を含む群から選択された少なくとも１１種の遺伝子に特有な遺伝子発現パターンを適用するが、該方法は初めて提供されるものである。本発明は、遺伝毒性に関連するマーカー遺伝子の一部の特徴的な発現フィンガープリントを教示する。統計的データ分析でさえも、（前駆型）遺伝毒性応答に最も代表的な９１遺伝子を明らかにした。細胞分化、ストレスの複合相互調節、ならびに転写モジュレータであるSTAT1、SP1およびP53を介するDNA損傷応答などのいくつかの過程は差次的に調節されている。評価された遺伝子セットは、その代謝活性化の後、N-ニトロソジエチルアミン（DEN）の遺伝毒性特徴を予測するために、有利に使用した。DENは、そのゲノムシグネチャにより、S9なしでは非遺伝毒性として、MAS存在下では遺伝毒性として、正確に分類することができた。遺伝毒性を予測するために、インビトロでの機構のプロファイリングが、単一のエンドポイント検出と比較して、強力なツールであることを、このデータは支持している。
【００８４】
本発明の結果は、（前駆型）変異原化合物がHepG2細胞の特徴的な遺伝子発現パターンを誘導することを、実証する。ゲノムをベースとした、このような取り組みは、今後、異なるインビトロでの試験からの疑わしい結果を対処するのに役立つ遺伝毒性のための当座の標準試験バッテリに加えて、適用することができる。機構のプロファイリングは、かかるデータを解釈する間で有効であり、機構の調査は、遺伝毒性化合物の分類を容易にする強力なツールである。さらに、機構のデータは、遺伝毒性化合物について、化学的な特徴付けとリスクアセスメントとを向上させるだろう。医薬開発の最中における迅速なスクリーニングにゲノムプロファイリングを適用することは、開発において早く、異なる分子をランキングし、遺伝毒性の特徴を有する化合物を強調することに役立ち、インビボの追跡試験を止めることにより費用と動物とが節約される。発見された９１種の推定マーカー遺伝子は、今後、未知化合物の潜在的な遺伝毒性の特徴付けにおいて使用することができる。差次的に発現された遺伝子の分析は、とりわけ、よりハイスループットな試験系に好適である。よって、化学薬品は、未知の作用機序でも同定することができ、それらが遺伝毒性効果を発揮する可能性を予測できる。本発明の監視する方法を生じさせるのと同様に、検出方法を、シンプルかつ迅速なやり方で実施することができる。さらに、適切なアレイを、費用面において効率的に製造する。
【００８５】
化合物をインビトロでスクリーニングし、生理学的または病理学的な状態を監視する場合に、表１、図１a＋bおよび図２a＋bの遺伝子は、遺伝毒性を検出し特徴付けるためのバイオマーカーとして適格である。該遺伝子にコードされた標的遺伝子産物は、遺伝毒性活性と、それによって推し進められた内科的疾患とに高度に特異的である。すべての物質プローブは、低い製造原価および簡便な操作性と同様、高度な親和性、特異性および安定性により特徴付けられる。これらの特質は、再現可能な作用の土台（交差反応性の欠如が含まれる）、および、それらのマッチする標的構造物との信頼性の高いかつ安全な相互作用の土台を形成する。
【００８６】
本明細書に引用されたすべての参考文献は、本発明の開示において、参照により組み込まれる。
この発明は、かかる事項が変動しても、本明細書に記載された特定の方法、具体的な物質、使用、およびアレイに限定されないことは、理解されるべきである。本明細書で使用されている専門用語は、特定の態様のみを記載するためだけであり、添付の特許請求の範囲にしか規定されていない本発明の範囲を限定する意図はないことも理解されるべきである。添付の特許請求の範囲を含む本明細書に使用する単数形の言葉、「a」、「an」、および「the」などには、文脈上明確に指示した場合を除き、それらの対応する指示対象の複数形が含まれる。よって、例えば、「物質」への言及には、単一のまたはいくつかの異なる物質が含まれ、「方法」への言及には、当業者に知られている段階および方法の均等物への言及が含まれるなどである。別段の規定がない限り、本明細書で使用するすべての技術および科学用語は、この発明が属する技術分野における当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００８７】
本発明に従う本質的な技術は、本明細書に詳細に記載されている。詳細に記載されていない他の技術は、当業者に周知の知られている標準的な方法に対応するか、またはその技術は引用した参考文献、特許出願または基準となる論文により詳細に記載されている。本明細書に記載されているものと類似または均等の方法および材料が本発明の実行または試験において使用することができるが、好適な例は以下に記載されている。以下の例は、説明するために提供されるものであって、限定されるものではない。例の中では、汚染活性のない標準的な試薬および緩衝液を（実際的な場合はいつでも）使用している。例は、明確に実証された特質の組み合わせに限定されないように、特に解釈されるべきであるが、本発明の技術的課題が解決する場合、例示された特質は非制限的に再び組み合わせられてもよい。
【００８８】
本明細書において以下の略語を使用する：
シクロホスファミド（CPA）；アフラトキシンＢ１（AFB1）；7,12-ジメチルベンズ[a]アントラセン（DMBA）；N-ニトロソジエチルアミン（DEN）；アクチノマイシンＤ（ACT）；エトポシド（ETO）；メチルメタンスルホネート（MMS）；テオフィリン（THEO）；メトホルミン（MET）；代謝活性化系（MAS）、シトクロムP450モノオキシゲナーゼ（CYP）；なし（w/o）。
【００８９】
この研究の目的は、インビトロでの変異原および前駆型変異原の特徴付けおよび同定のための、全体的な遺伝子発現プロファイリングの安定性を評価することである。非遺伝毒性の参照化合物と同様に、３種の周知変異原、３種の前駆型変異原を２４または４８時間処置した後、遺伝発現変化を定量化するために、Illumina BeadChipアレイを使用した。詳細には、変異原（エトポシド／ETO、アクチノマイシンＤ／ACTおよびメチルメタンスルホネート／MMS）、前駆型変異原（シクロホスファミド／CPA、7,12-ジメチルベンズ[a]アントラセン／DMBA、およびアフラトキシンＢ１／AFB1）および非遺伝毒性（メトホルミン／METおよびテオフィリン／THEO）の試験化合物の遺伝発現プロフィールを、Illumina HumanRef-8 BeadChipアレイを使用し、２４ｈおよび４８ｈ処置後のHepG2細胞において、作り出した。前駆型変異原試験において、その乏しい代謝能力を補充するために、代謝活性化系（MAS）として、β−ナフトフラボン／フェノバルビタールにより誘導されたラット肝のS9ホモジネート画分を組み合わせて、HepG2細胞に処置した。使用した細胞培養物／MAS系と、研究した化合物の周知の遺伝毒性特徴との包括的な概要は、既に公開されていた（Boehme et al., 2010, Toxicol. Lett. 198, 272-281に要約されている）。試験化合物の選択に関して、遺伝毒性の異なる機構を有する化合物を選択するのに特別な注意を払った。さらに、使用した前駆型変異原を、様々なシトクロム-P450モノオキシゲナーゼ（CYP）を介して代謝的に活性化した。前述した試験化合物の共通する遺伝子発現特性を同定した後、該特性を、次にN-ニトロソジエチルアミン（DEN）の遺伝毒性を予測するために使用した。
【００９０】
・化学薬品および細胞培養培地補充物
アクチノマイシンＤ（Streptomyces種から、純度≧９５％）、7,12-ジメチルベンズ[a]アントラセン（純度≧９５％）、エトポシド（純度≧９８％）、メチルメタンスルホネート（液状、９９％）、テオフィリン（純度≧９９％）、1,1-ジメチルビグアニドハイドロクロライド（メトホルミン、純度≧９７％）、N-ニトロソジエチルアミン（液状）、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド2’-ホスフェート還元四ナトリウム塩水和物（NADPH）およびペニシリン／ストレプトマイシン溶液をSigma-Aldrich（Taufkirchen、Germany）から購入した。シクロホスファミド（一水和物、純度≧９７％）はCalbiochem（Darmstadt、Germany）から、アフラトキシンＢ１はAcros Organics（Geel、Belgium）からであった。DMEM／F12、ゲンタマイシン、およびピルビン酸ナトリウムを、Invitrogen Corp.（Karlsruhe、Germany）から入手した。ウシ胎児血清（FBS）はHycloneに発注した（発注番号CH30160、ロット番号CRJ0454、Perbio Science、Bonn、Germany）。β−ナフトフラボン／フェノバルビタールにより誘導されたラット肝S9（発注番号R1081.S9、ロット番号0710507）を、Tebu-bio（Offenbach、Germany）から購入した。リン酸ナトリウムの一塩基一水和物、リン酸ナトリウムの二塩基七水和物、塩化マグネシウム、および塩化カリウムを、Merck KGaA（Darmstadt、Germany）から入手した。
【００９１】
・細胞培養物
HepG2細胞（発注番号HB-8065、ロット3129867、ATCC、Manassas、USA）を、L-グルタミンを有するDMEM／F12ならびに１０％（v/v）FBS、１％（v/v）ペニシリン（１０kU/ml）／ストレプトマイシン（１０mg/ml）溶液、０．１％（v/v）ゲンタマイシン（５０mg/ml）、および１ｍＭのピルビン酸ナトリウムで補充した１５ｍＭのHepes中、３７℃かつ５％CO２で、培養フラスコにおいて、ルーチン的に維持した。実験に応じて、適切な細胞数をプレート上に播種し、細胞を３７℃かつ５％CO２で、処置前２４ｈ培養した。細胞の継代を４〜２０回とするすべての実験を少なくとも３回実施した。
【００９２】
・細胞処置および用量選択
細胞を６ウェルプレートに播種し（１．５×１０６細胞／ウェル）、接着させるため２４ｈ放置した後、非遺伝毒性のテオフィリンおよびメトホルミンと同様に、直接作用するかまたは前駆型の遺伝毒性の異なる化合物を用いて処置した。代謝活性化系との干渉を避けるため、前駆型遺伝毒物用にDMSOをたった０．２％（v/v）しか使用しなかったが、直接作用する遺伝毒物を用いる実験には、対照媒体としてのDMSOを０．５％（v/v）供給した。細胞毒性とP53タンパク質活性化との先の研究（Boehme et al., 2010, Toxicol. Lett. 198, 272-281）に従って、試験化合物の用量を選択した。直接作用する遺伝毒物のための連日の処置スケジュールを継続した一方で、S9画分の細胞毒性を制限するために、S9肝ホモジネート混合物を加えた前駆型変異原を使用した場合に、細胞を６ｈしか処置しなかった。６ｈの処置時間の後、培養培地による洗浄段階と１８ｈの回復時間とが続いた。１８ｈの回復時間の後、前記に従い処置を繰り返した。前駆型変異原のための処置培地は、ウェルあたり、３００μｌのS9混合物と７００μｌの培養培地とからなる。S9混合物には、以下の成分と濃度で含まれる：処置培地中の最終濃度として、２．４ｍＭのMgCl２、９．８ｍＭのKCl、３．６ｍＭのNADPH、３７．２ｍＭのリン酸緩衝液、および７５０ｐｍｏｌ／ｍｌのCYPに対する、事前混合物中の内容物が、８ｍＭのMgCl２、３２．８ｍＭのKCl、１２ｍＭのNADPH、１２４ｍＭのリン酸緩衝液、および２５００ｐｍｏｌ／ｍｌのCYPである。
【００９３】
・RNA抽出
処置時間の後、細胞をPBS（Gibco Invitroge、Karlsruhe、Germany）ですすぎ、回収して、QIAshredderスピンカラム手順とカラム上でのRNaseのないDNase消化とを含むRNeasy Mini Kit（QIAGEN、Hilden、Germany）を使用して、製造業者による説明のとおりに、全RNAを抽出した。RNAを４０μｌのRNaseのない水で溶出した。RNAの品質管理および定量化を、NanoDrop（登録商標）分光光度計（Kisker、Steinfurt、Germany）と2100 Agilent Bio-Analyzer（Agilent Technologies、Waldbronn、Germany）とを使用して決定した。品質比A260／A280が１．９と２．１との間であり、分解のピーク（18s／28s）の証拠がないRNAのみを使用した。
【００９４】
・cRNA合成およびIllumina全ゲノムチップハイブリダイゼーション
〜２３，０００の転写物の分析を可能にするIllumina Sentrix（登録商標）HumanRef-8 V2 BeadChipアレイ（Illumina Inc.、San Diego、CA、USA）を使用して、遺伝子発現分析を実行した。この過程（Zidek et al., 2007, Toxicol Sci 99, 289-302）を最適化するためにIlluminaから要請のあったいくつかの修飾を有するTheonyx Liquid Performer（Aviso GmbH、Greiz、Germany）とMessageAmp（商標）II aRNA増幅キット（Ambion、Darmstadt、Germany）とを使用して、自動化手順で、ビオチン標識したcRNAの合成を実施した。cDNAとcRNAとを精製するため、カラム浄化の代わりに、ビーズをベースとしたAgencourt（登録商標）RNAclean（商標）系（Beckman Coulter、Krefeld、Germany）を適用した。cRNA量を分光光度計（NanoDrop（登録商標））で測定し、品質アセスメントのために前記2100 Agilent Bio-Analyzerを使用した。
【００９５】
５８℃で２０ｈ、加湿条件下で（Hybridizationオーブン、Illumina Inc.、San Diego、CA、USA）、７５０ナノグラムの増幅されたビオチン化cRNAを、Hybridization Cartridge中のIllumina Sentrix（登録商標）BeadChip上でハイブリダイズした。次に、該チップを洗浄し、１μｇ／ｍｌのストレプトアビジンが接合したCy3（Amersham Biosciences、Buckinghamshire、UK）を用いて１０分間染色し、最後に、提供されたプロトコルに従って遠心分離により乾燥させた。Illumina（登録商標）BeadArray Reader（Illumina, Inc.、San Diego、CA、USA）を有する共焦点レーザー走査により、５３２ｎｍかつ０．８μｍの分解能で、蛍光検出を実行した。
【００９６】
・統計的データ分析
生データを濃縮するため、さらに、先の研究（Boehme et al., 2009, Toxicol. Appl. Pharmacol. 236, 85-96）において記載された異なる対照ビーズのパラメータに基づくアレイ品質を確保するために、Illumina（登録商標）BeadStudio Softwareを使用した。したがって、データの標準化と統計的分析とのために、GenedataのExpressionist（登録商標）Analyst software（Genedata AG、Basel、Switzerland）に、データをアップロードした。試料とアレイとの間の非生物学的差異（系統的変動）を相殺するために、変異原実験ではLowess（Locally Weighted Linear Regression）を使用し、前駆型変異原研究ではシグナル強度の中央値である１００で、データを標準化した。標準化した後、S9あり、なしのそれぞれの対応する対照媒体系に対して、個々の化合物それぞれの処置において、調節比(fold-regulation)を算出した。異なる研究から得られたデータの比較を成し遂げるために、相対値への変換を欠かさなかった。
【００９７】
試験された化合物に共通する変異原的作用機序を表す特徴的な遺伝子を同定するため、（前駆型）遺伝毒性の群と非遺伝毒性化合物としてのテオフィリンおよびメトホルミンとを構成する訓練データ集合を使用した。「未知の」試験化合物としてDENを使用し、そのため、訓練セットから除外した。群の選択のためのANOVAによる遺伝子ランキングに続き、分類指標計算のためのサポートベクターマシン（SVM）アルゴリズムによって、最も予測がつく遺伝子を同定した。ｋ倍の交差検証（ｋ＝１０、５０回繰り返し）により予測性を評価し、次に、訓練集合から構築した分類指標をDENの毒性を予測するために使用した。
【００９８】
化合物に特異的な差次的に発現した遺伝子を調査するため（S9およびDENの効果）、対照媒体（S9効果を評価するため）および参照化合物（DEN効果を評価するため）のそれぞれに対して、スチューデントのＴ検定または分散分析（ANOVA）により、遺伝子発現プロファイルを個々に比較した。ｐ値（Benjamini and Hochberg, 1995, J.R. Statist. Soc. 57, 289-300）に加えて、有意性測定として、BH−ｑ値（Benjamini and Hochberg false discovery rate）を使用した。
【００９９】
統計的分析に続き、データベースおよび経路分析ツールを使用して、GeneGo（Metacore（商標））、Ingenuity（IPA（登録商標））、およびCambridge Cell Networks（ToxWiz）から、生物学的／機能的な文脈の中でデータを解釈した。全データは、詳細な実験的／データ分析記載を含むMIAME（Minimum Information About a Microarray Experiment）の推奨に応じて、記録し、補足情報として利用可能である。
【０１００】
表１には、遺伝毒性および前駆型遺伝毒性の試験化合物のために同定された９１種の推定マーカー遺伝子の調節解除値およびランキング統計がリスト化されている（分類モデル）。HepG2細胞に、連日６ｈ、7,12-ジメチルベンズ[a]アントラセン（DMBA）、ジエチルニトロソアミン（DEN）、シクロホスファミド（CPA）およびアフラトキシンＢ１（AFB1）、ならびに対照としてのテオフィリン（THEO）およびメトホルミン（MET）を処置し、続いて、代謝活性化系（β−ナフトフラボン／フェノバルビタールにより誘導されたS9）の有無において合計４８ｈの時間後に１８ｈ回復させた。前駆型遺伝毒性の処置とは対照的に、２４ｈおよび４８ｈの時間後に、直接作用する遺伝毒物により細胞を連続的に曝露させた。試験化合物を含む細胞培養培地を吸引し、未使用の処置培地により毎日交換した。群の分離のためのANOVAによる遺伝子ランキングに続き、分類指標計算におけるサポートベクターマシン（SVM）アルゴリズムによって、最高得点を出した９１種の遺伝子を同定した。当座の表にリスト化されたデータは、３〜２５回に及ぶ細胞継代を行った３回の異なる実験から得られた、対応する対照の媒体／S9と比較した遺伝子調節の平均値を表す。前駆型遺伝毒性化合物の実験部分１、遺伝毒性化合物の実験部分２、ANOVAランキング統計のランク数３、（前駆型）遺伝毒性試料における一般的な調節の傾向４。
【０１０１】
表２には、（前駆型）遺伝毒性モデル化合物による処置に応答して一貫性のある調節を示す選択遺伝子の調節解除値がリスト化されている。該表には、Illuminaマイクロアレイのデータに基づく分類モデルの選択遺伝子の調節解除値が含まれる。（前駆型）遺伝毒性モデル化合物による４８ｈ処置後のHepG2細胞において、全８遺伝子が有意に誘導された（正の遺伝毒性の試料の群のうち、少なくとも８０％の応答試料においてFC≧１．５倍（オレンジで示した））。表中にリスト化されたデータは、３〜２５回に及ぶ細胞継代を行った３回の異なる実験から得られた、対応する対照の媒体／S9と比較した遺伝子調節の平均値を表す。凡例：アクチノマイシンＤ（ACT）、メチルメタンスルホネート（MMS）、エトポシド（ETO）、アフラトキシンＢ１（AFB1）、7,12-ジメチルベンズ[a]アントラセン（DMBA）、シクロホスファミド（CPA）、ジエチルニトロソアミン（DEN）。＊有意性をスチューデントのｔ検定、ｐ値＜０．０５により決定した。
【０１０２】
表３は、共通する遺伝毒性応答を評価するための試験試料のカテゴリー化をリストにしたものである。クラスの割り当ては、P53および単一化合物の遺伝子発現分析と同様に、化合物クラスに基づくものである。＃有意のP53活性化および対照媒体と比較した著しい遺伝子発現変化により、試料を遺伝毒性としてカテゴリー化した。MASなしの正の応答は、先に示したように（Boehme et al., 2010, Toxicol. Lett. 198, 272-281）、HepG2細胞の代謝能力により引き起こされる。
【実施例】
【０１０３】
例１：全体的な遺伝子発現に影響を及ぼすパラメータ
本発明では、周知の遺伝毒性、前駆型遺伝毒性および非遺伝毒性の化合物の遺伝子発現パターンを調査した。最初に、遺伝子発現に影響を及ぼすパラメータを、主成分分析（PCA）を用いて同定した。異なる生物学的な複製物（継代細胞）は全体的なデータ分散に対する影響を切り離せないが、PCAは、使用した試験化合物の遺伝子発現に対する時間の効果と代謝活性化系の著しい効果とを明らかにした（図４A）。S9により誘導された遺伝子発現の分析により、２４ｈおよび／または４８ｈ処置後に１．５倍以上に調節された１６４種の有意な遺伝子が明らかとなった（対照のDMSOに対する両時点のANOVAが、ｐ値／BH−ｑ値＜０．０５）。これら遺伝子の１５０種が下方調節され、１４種が上方調節されたことを見出した。下方調節された遺伝子の７７パーセントは、２４ｈおよび４８ｈ後に同様な調節を示した。S9曝露後に差次的に調節されることが見出された遺伝子は、ビタミン／CoA、葉酸、脂肪酸／脂質、およびヌクレオチド代謝、ならびにタンパク質分解、細胞接着、細胞／酸化ストレスに対する応答、および遺伝子を調節する発生／細胞増殖などの過程に関与する（図４B）。
【０１０４】
例２：（前駆型）遺伝毒性および非遺伝毒性の化合物の遺伝子発現パターン
任意の特異的な物質の効果が表に出ないことから、遺伝子発現特性に対するMASの実質的な影響が問題となっていた。したがって、データを実験から独立させ、S9によりもたらされる効果によって物質によりもたらされる効果を調整するために、同じ継代細胞におけるそれらの対照媒体／媒体−S9を参照することにより、データを相対値に変換した。図５は、このタイプの相関が物質効果を発揮し、遺伝毒性および非遺伝毒性の化合物がすぐに別々にクラスタ化することを示す。ACTおよびMMSによる処置後の遺伝子発現の著しい変化により、クラスタの分離は、完全に解決することが困難であった（図５A／I）。しかしながら、ACTおよびMMSがPCAから除外された場合（拡大）、非遺伝毒性の化合物クラスからの遺伝毒性の明確な分離が可視化された（図５B／I）。その一方で、２４ｈ処置後の前駆型遺伝毒性の化合物では、明確な分離が可視化できなかった（図５A／IIおよび５B／II）。単一化合物の統計的分析（適切な対照媒体に対する、対応のある両側(paired two-tailed)Ｔ検定）によって、２４ｈ後のこの負の応答が確認された。さらに、S9なしのCPA、S9なしの０．５μＭのAFB1およびS9なしの１０μＭのDMBAすべてが、それぞれ、極端に弱い遺伝子発現変化しか引き起こさないか、または統計的に有意な遺伝子発現変化を引き起こさなかった。したがって、これらの試料を、METおよびTHEOとともに非遺伝毒性としてカテゴリー化した。一般的に、さらなる分析のための化合物分類は、化合物クラス、P53（Boehme et al., 2010, Toxicol. Lett. 198, 272-281）および表３にリスト化された単一化合物分析の遺伝子発現アセスメントの組み合わせに基づいた。
【０１０５】
図１a＋bおよび図２a＋bにおいて、対応するクラスの化合物のデータ分析を別個に実施した、すなわち図１a＋bが直接的な作用機序を有する遺伝毒性化合物に関する一方、図２a＋bは代謝活性化後に有効な前駆型遺伝毒性化合物に関する。図６a〜dおよび表１において、図１a＋bおよび図２a＋bの両データ集合を用いて、分類モデルを確立した。両クラス（直接的または間接的に作用するか否か）が遺伝毒性であるから、それらを単一の群に割り当て、対照化合物と比較した。DENはP53の活性化に関しては負であり、したがって、データ集合から除外され、それ故、DENなしの訓練データ集合を、（前駆型）遺伝毒性化合物に対して最も予測がつく遺伝子を同定するための分子分類指標を構築するために使用した。SVMアルゴリズムをベースとした分類指標決定方法に続くANOVAをベースとした遺伝子ランキングは、最高得点を出した９１種の遺伝子を使用して最も良好な予測性を明らかにした。これら遺伝子の調節および機能的なカテゴリー化を、図６a〜dの機能−色分け地図表示に示す。この結果は、先の実験の遺伝毒性および非遺伝毒性の群配分を裏付ける。
【０１０６】
MASなしのCPAは９１遺伝子を差次的に調節しなかったが、S9ありでは、著しい上方調節および下方調節が観察された。さらに、S9なしのAFB1（０．５μＭ）の最低用量が対照と比較して９１遺伝子の遺伝子発現を変化させる一方、より高い用量またはより低い用量でのS9の添加が、選択した遺伝子の発現の中で変更された応答をもたらす。同様の遺伝子調節プロフィールがDMBAでも観察され、それによって、S9なしの７５μＭでの遺伝子発現変化は、他の試験化合物の遺伝毒性応答と比較して相対的に弱かった。さらに、ETOの応答もまた、２４ｈ後で弱かったが、４８ｈ処置後ではより強くなった。よって、S9なしのDMBA（７５μＭ）およびETO（２４ｈ後）は、予測性を制限する化合物であり、そして、非差次的に調節された遺伝子のバックグラウンドが調節された遺伝子と比較して極端に高いことから、最高得点を出した９１遺伝子を使用する場合（全遺伝子を使用しない場合を除いて）にしか正確に予測されない。この結果を、９１種のうち１１種の遺伝子と９１種のうち３２種の遺伝子との調節を決定することで確認した（図３）。
【０１０７】
例３：N-ニトロソジエチルアミンの、ゲノムをベースとした分類
（前駆型）遺伝毒性試験化合物を最も予測がつくものとして見出した９１種の遺伝子を用いて、DENの遺伝子発現応答を評価した。先のP53活性化実験とは対照的に、DENは、正の応答が再現可能に確立されなかった場合、遺伝子発現分析により、S9の存在下で遺伝毒性であると正確に予測された（図９A）。これによって、我々は、DENに特異的な遺伝子発現をさらに分析するよう駆り立てられた。統計的分析（非遺伝毒性の化合物であるMETおよびTHEOに対するANOVAがｐ値／BH−ｑ値＜０．０１）は、８８種の上方および５７種の下方に調節された遺伝子を明らかにし、該遺伝子は、４８ｈのDEN試料の４０％以上において、少なくとも１．５倍を超える調節解除で切り捨てた。他の試験化合物について言及したように、２４ｈ処置での応答が欠如しているか弱いため、切り捨ての基準を４８ｈ試料に一致させた。同定された一般的な毒物学的経路は、細胞のDENへの曝露後の細胞ストレス状況および遺伝毒性応答を明確に反映した（図９B）。特に後者において、数ある中でも、アポトーシス、細胞周期チェックポイント／停止、およびDNA修復ならびにP53シグナリングに直接関与する遺伝子によりもたらされる多くの経路を、存在する他の試験化合物と同様のものと同定した。
【０１０８】
さらに、９１種の推定マーカー遺伝子と同様に、単一分析からの１４５種の遺伝子を含むDENにより誘導された遺伝子の調節パターンを比較する場合、発現値がしばしばS9存在下でより高いが、同様の調節は、S9の添加なしで検出することができた。よって、このデータは、不十分な代謝活性化または解毒を示唆し、MASとともにより低用量でのDENの既に増大した遺伝毒性効果をもたらす。HepG2細胞が、DENを最終的な遺伝毒性代謝物に変換する主要な酵素に相当するCYP2A6およびCYP2E1（Boehme et al., 2010, Toxicol. Lett. 198, 272-281）を十分に発現していないことが先に実証されていたことから、HepG2細胞それ自身による代謝活性化は、むしろ起こりそうもない。一見したところ、外部MASの添加によりDENが部分的にしか活性化されないようだが、弱い変化が遺伝子発現分析により記録されたとはいえ、おそらく、活性化は、安定で検出可能なP53応答を惹起するのに十分に有効なものではないか、または明白に解毒されたのだろう。
【０１０９】
実際に、ニトロソアミンをスクリーニングすることの困難性は、文字通り何度か記載してきた。インビボでのDNAの反応性および発がん性は一般的にこの化合物クラス（ほとんどのニトロソアミンは、潜在性ヒト発がん物質として分類されたIARC群2Aおよび2Bである）に受け入れられているが、インビトロでの異なるアッセイは、しばしば、弱いか、または負ですらある結果しか明らかにしない。細胞株におけるニトロソアミンによるスクリーニングの困難性が、CYP2E1活性の欠如によりしばしば説明されてきたが、この研究は、主な理由として制限された第I相の代謝を好まない。DENの正の応答が、極めて高い濃度のみ（１０〜３２ｍＭ）で、CYPに適格な初代肝細胞を使用するアルカリ溶出／UDSアッセイにおいて、実証された。さらに、β−ナフトフラボン／フェノバルビタールにより誘導されたS9を試験したが、イソニアジド（CYP2E1）により誘導されたミクロソームも試験した。細胞毒性およびP53活性化の研究は、欠落した応答の他の原因を示唆する両MASの間で差異がないことを明らかにした。HepG2細胞は、実際には、第II相の代謝活性化を有する。ニトロソアミンの第II相の生体内変化が、グルタチオン、アミノ酸、硫酸またはグルクロニドとの接合により起こる。ニトロソアミンのグルクロニドへの典型的な接合反応は、UDPグルクロノシルトランスフェラーゼ（UGT）により触媒される。HepG2細胞ではベースの発現が弱かったが、選択したUGT1A酵素は、リファンピシンまたは3-メチルコラントレンにより誘導され得た。さらに、ATP輸送体であるMRP1およびMRP2は、部分的に誘導されることが示され、ニトロソアミンの排出におそらく関与する。第II相の代謝に加えて、ジアゾニウムイオンの揮発性特徴はまた、インビトロでの賛否両論の結果にも関与する可能性がある。
【０１１０】
【表１−１】
0005421501.tif 000002
【０１１１】
【表１−２】
0005421501.tif 000003
【０１１２】
【表１−３】
0005421501.tif 000004
【０１１３】
【表１−４】
0005421501.tif 000005
【０１１４】
【表１−５】
0005421501.tif 000006
【０１１５】
【表１−６】
0005421501.tif 000007
【０１１６】
【表１−７】
0005421501.tif 000008
【０１１７】
【表１−８】
0005421501.tif 000009
【０１１８】
【表１−９】
0005421501.tif 000010
【０１１９】
【表１−１０】
0005421501.tif 000011
【０１２０】
【表１−１１】
0005421501.tif 000012
【０１２１】
【表１−１２】
0005421501.tif 000013
【０１２２】
【表１−１３】
0005421501.tif 000014
【０１２３】
【表１−１４】
0005421501.tif 000015
【０１２４】
【表１−１５】
0005421501.tif 000016
【０１２５】
【表１−１６】
0005421501.tif 000017
【０１２６】
【表１−１７】
0005421501.tif 000018
【０１２７】
【表１−１８】
0005421501.tif 000019
【０１２８】
【表１−１９】
0005421501.tif 000020
【０１２９】
【表１−２０】
0005421501.tif 000021
【０１３０】
【表１−２１】
0005421501.tif 000022
【０１３１】
【表１−２２】
0005421501.tif 000023
【０１３２】
【表１−２３】
0005421501.tif 000024
【０１３３】
【表１−２４】
0005421501.tif 000025
【０１３４】
【表１−２５】
0005421501.tif 000026
【０１３５】
【表１−２６】
0005421501.tif 000027
【０１３６】
【表１−２７】
0005421501.tif 000028
【０１３７】
【表１−２８】
0005421501.tif 000029
【０１３８】
【表１−２９】
0005421501.tif 000030
【０１３９】
【表１−３０】
0005421501.tif 000031
【０１４０】
【表１−３１】
0005421501.tif 000032
【０１４１】
【表１−３２】
0005421501.tif 000033
【０１４２】
【表２】
0005421501.tif 000034
【０１４３】
【表３】
0005421501.tif 000035
【図１ａ】
0005421501.tif 000036
【図１ｂ】
0005421501.tif 000037
【図２ａ】
0005421501.tif 000038
【図２ｂ】
0005421501.tif 000039
【図３】
0005421501.tif 000040
【図４】
0005421501.tif 000041
【図５】
0005421501.tif 000042
【図６ａ】
0005421501.tif 000043
【図６ｂ】
0005421501.tif 000044
【図６ｃ】
0005421501.tif 000045
【図６ｄ】
0005421501.tif 000046
【図７】
0005421501.tif 000047
【図８】
0005421501.tif 000048
【図９ａ】
0005421501.tif 000049
【図９ｂ】
0005421501.tif 000050