(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
【化１】
0005395811.tif 000017
（式中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルコキシ基又はアルキル基を示し、Ｒ3は水素原子又はカルボキシル基を示し、ｎは０〜３の数を示す）
で表されるインドリルアルキルアミン類又はその塩を含有する培地中で、インドリルアルキルコハク酸アミド合成能を有するバチルス属に属する微生物を培養することを特徴とする、一般式（２）
【化２】
0005395811.tif 000018
（式中、Ｒ1、Ｒ2及びｎは前記と同じ）
で表されるインドリルアルキルコハク酸アミド化合物又はその塩の製造法。
【請求項２】
Ｒ1及びＲ2がそれぞれ独立して水素原子又は水酸基であり、ｎが１である請求項１記載の製造法。
【請求項３】
培地中にマンガンイオン（Ｍｎ2+）を１〜２０００ppm含有せしめることを特徴とする請求項１又は２記載の製造法。
【請求項４】
培地中に有機酸又はその塩を含有せしめることを特徴とする請求項１〜３いずれかに記載の製造法。
【請求項５】
請求項１記載の一般式（１）で表されるインドリルアルキルアミン類又はその塩を生合成する植物体、種子、該植物体栽培用水又は土壌に、インドリルアルキルコハク酸アミド合成能を有するバチルス属に属する微生物を施用し、インドリルアルキルコハク酸アミドを合成させることを特徴とする植物成長調整方法。
【請求項６】
バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）Ｂ−１８（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−８５８）株、バチルス・チューリンゲンシスＢ−２４（ＮＩＴＥ Ｐ−８５７）株、又はバチルス・セレウス（Bacillus cereus）Ｂ−１６（ＮＩＴＥ Ｐ−８５６）株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物成長調整剤として有用なインドリルアルキルコハク酸アミド化合物の微生物を利用した製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発根促進活性が高く、植物の成長を促進する成分は、農業及び林業分野において強く望まれており、数多くの研究がなされている。そのような状況下、下記一般式（ａ）【０００３】
【化１】
0005395811.tif 000002
【０００４】
（式中、Ａｒは置換基を有していてもよいフェニル、ナフチル又はインドリル基を示し、ｎは０〜３の数を示す）
で表されるコハク酸アミド化合物又はその塩が優れた発根促進作用を有し、植物成長調整剤として有用であることが知られている（特許文献１及び２）。【０００５】
このコハク酸アミド化合物は特許文献１及び２記載のように化学合成によって得ることもできるが、このうちフェネチルコハク酸アミドはバチルス属に属する微生物によっても生産されることが知られている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平１−２５５６０７号公報
【特許文献２】特開２００１−１３９４０５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】副島ら１９９９．新規発根促進物質Ｎ−（フェネチル）コハク酸アミドの精製と単離．植物化学調節学会第３４回大会講演要旨集，７５−７６ページ．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現在、市場に流通している植物成長調整剤のほとんどは化学合成によって製造されているが、消費者の間には物質自体の安全性に疑念をもつ風潮も未だに強い。このことは、有機農産物や減農薬栽培農産物がもてはやされていることからも裏付けられる。この点を鑑みると、植物成長調整剤を含む農薬としては、天然由来のものが好ましく、化学合成により得られるものでなく、微生物によって生産されるものが望まれている。
しかしながら、インドリルアルキルコハク酸アミドについての微生物による生産法についての報告はない。
従って、本発明の課題は、植物成長促進剤として有用なインドリルアルキルコハク酸アミド化合物の微生物による新たな製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
そこで本発明者は、インドリルアルキルコハク酸アミドの生産能を有する新たな微生物を探索したところ、バチルス属に属する微生物がトリプタミン、トリプトファン及びセロトニン塩酸塩からインドリルアルキルコハク酸アミド化合物を効率良く生産することを見出し、本発明を完成した。【００１０】
すなわち、本発明は、一般式（１）【００１１】
【化２】
0005395811.tif 000003
【００１２】
（式中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルコキシ基又はアルキル基を示し、Ｒ3は水素原子又はカルボキシル基を示し、ｎは０〜３の数を示す）
で表されるインドリルアルキルアミン類又はその塩を含有する培地中で、インドリルアルキルコハク酸アミド合成能を有するバチルス属に属する微生物を培養することを特徴とする、一般式（２）【００１３】
【化３】
0005395811.tif 000004
【００１４】
（式中、Ｒ1、Ｒ2及びｎは前記と同じ）
で表されるインドリルアルキルコハク酸アミド化合物又はその塩の製造法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明方法によれば、バチルス属に属する微生物の培養により、植物成長調整剤として有用なインドリルアルキルコハク酸アミド化合物又はその塩が効率良く得られる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書において、質量％とは(wt／vol)％を意味し、容量％とは(vol／vol)％を意味する。
【００１７】
本発明のインドリルアルキルコハク酸アミド化合物の製造法に用いられる微生物は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・アシディセラー（Bacillus acidiceler）、バチルス・アシディコーラ（Bacillus acidicola）、バチルス・アエオリウス（Bacillus aeolius）、バチルス・アエリウス（Bacillus aerius）、バチルス・アエロフィルス（Bacillus aerophilus）、バチルス・アガラドヘレンス（Bacillus agaradhaerens）、バチルス・アキバイ（Bacillus akibai）、バチルス・アルカリフィルス（Bacillus alcalophilus）、バチルス・アルギコーラ（Bacillus algicola）、バチルス・アルカリジアゾトロフィカス（Bacillus alkalidiazotrophicus）、バチルス・アルカリテルリス（Bacillus alkalitelluris）、バチルス・アルティチュジニス（Bacillus altitudinis）、バチルス・アルベアユエンシス（Bacillus alveayuensis）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・アンスラシス（Bacillus anthracis）、バチルス・アクイマリス（Bacillus aquimaris）、バチルス・アレノシイ（Bacillus arenosi）、バチルス・アルセニシセレナティス（Bacillus arseniciselenatis）、バチルス・アルセニカス（Bacillus arsenicus）、バチルス・アーヴァイ（Bacillus arvi）、バチルス・アサヒイ（Bacillus asahii）、バチルス・アトロファエウス（Bacillus atrophaeus）、バチルス・アウランティアカス（Bacillus aurantiacus）、バチルス・アキサクィエンシス（Bacillus axarquiensis）、バチルス・アゾトフォーマンス（Bacillus azotoformans）、
【００１８】
バチルス・バディウス（Bacillus badius）、バチルス・バーバリカス（Bacillus barbaricus）、バチルス・バタビエンシス（Bacillus bataviensis）、バチルス・ベンゾボランス（Bacillus benzoevorans）、バチルス・ボゴリエンシス（Bacillus bogoriensis）、バチルス・ボロニフィルス（Bacillus boroniphilus）、バチルス・ブタノリボランス（Bacillus butanolivorans）、バチルス・カーボニフィルス（Bacillus carboniphilus）、バチルス・セセンベンシス（Bacillus cecembensis）、バチルス・セルロシリティカス（Bacillus cellulosilyticus）、バチルス・チャガノレンシス（Bacillus chagannorensis）、バチルス・シービー（Bacillus cibi）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・クラーキー（Bacillus clarkii）、バチルス・クラウシー（Bacillus clausii）、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・コアウイレンシス（Bacillus coahuilensis）、バチルス・コーニー（Bacillus cohnii）、バチルス・デシシフロンディス（Bacillus decisifrondis）、バチルス・デコロラチオニス（Bacillus decolorationis）、バチルス・ドレンテンシス（Bacillus drentensis）、バチルス・エダフィカス（Bacillus edaphicus）、バチルス・エンドフィティカス（Bacillus endophyticus）、バチルス・ファラギニス（Bacillus farraginis）、バチルス・フォスティディオサス（Bacillus fastidiosus）、バチルス・ファルマス（Bacillus firmus）、バチルス・フレクサス（Bacillus flexus）、バチルス・ホラミニス（Bacillus foraminis）、バチルス・フォルディ（Bacillus fordii）、バチルス・フォルティス（Bacillus fortis）、バチルス・フマリオリィ（Bacillus fumarioli）、バチルス・フニクラス（Bacillus funiculus）、バチルス・ガラクトシディリティカス（Bacillus galactosidilyticus）、バチルス・ゲラティニ（Bacillus gelatini）、バチルス・ギブソニー（Bacillus gibsonii）、バチルス・ハルマパラス（Bacillus halmapalus）、バチルス・ハロデュランス（Bacillus halodurans）、バチルス・ハロフィルス（Bacillus halophilus）、バチルス・ヘミセルロシリティカス（Bacillus hemicellulosilyticus）、バチルス・ハーバーステイネンシス（Bacillus herbersteinensis）、
【００１９】
バチルス・ホリコシー（Bacillus horikoshii）、バチルス・ホルティ（Bacillus horti）、バチルス・フミ（Bacillus humi）、バチルス・ファジンポエンシス（Bacillus hwajinpoensis）、バチルス・イドリエンシス（Bacillus idriensis）、バチルス・インディカス（Bacillus indicus）、バチルス・インファンティス（Bacillus infantis）、バチルス・インファーナス（Bacillus infernus）、バチルス・インソリタス（Bacillus insolitus）、バチルス・イサベリエ（Bacillus isabeliae）、バチルス・チョッカリ（Bacillus jeotgali）、バチルス・コリエンシス（Bacillus koreensis）、バチルス・クルーウィッチアエ（Bacillus krulwichiae）、バチルス・レヘンシス（Bacillus lehensis）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・リトラリス（Bacillus litoralis）、バチルス・ルシフェレンシス（Bacillus luciferensis）、バチルス・マカウエンシス（Bacillus macauensis）、バチルス・マキアエ（Bacillus macyae）、バチルス・マラシテンシス（Bacillus malacitensis）、バチルス・マンナニリティカス（Bacillus mannanilyticus）、バチルス・マリナス（Bacillus marinus）、バチルス・マリスフラビィ（Bacillus marisflavi）、バチルス・マシリエンシス（Bacillus massiliensis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・メタノリカス（Bacillus methanolicus）、バチルス・モジャベンシス（Bacillus mojavensis）、バチルス・ムシラギノサス（Bacillus mucilaginosus）、バチルス・ムラリス（Bacillus muralis）、バチルス・ムリマルティニ（Bacillus murimartini）、バチルス・ミコイデス（Bacillus mycoides）、バチルス・ネールソニー（Bacillus nealsonii）、バチルス・ニアベンシス（Bacillus niabensis）、バチルス・ニアシニ（Bacillus niacini）、バチルス・ノバリス（Bacillus novalis）、バチルス・オデッセイ（Bacillus odysseyi）、バチルス・オクヘンシス（Bacillus okhensis）、バチルス・オクヒデンシス（Bacillus okuhidensis）、バチルス・オレロニウス（Bacillus oleronius）、バチルス・オシメンシス（Bacillus oshimensis）、バチルス・パリダス（Bacillus pallidus）、バチルス・パナシテラエ（Bacillus panaciterrae）、バチルス・パタゴニエンシス（Bacillus patagoniensis）、バチルス・プラコルチディス（Bacillus plakortidis）、バチルス・ポチェオネンシス（Bacillus pocheonensis）、バチルス・ポリゴニ（Bacillus polygoni）、
【００２０】
バチルス・シュードアルカリフィルス（Bacillus pseudalcaliphilus）、バチルス・シュードファーマス（Bacillus pseudofirmus）、バチルス・シュードミコイデス（Bacillus pseudomycoides）、バチルス・シクロデュランス（Bacillus psychrodurans）、バチルス・フィクロサッカロリティカス（Bacillus psychrosaccharolyticus）、バチルス・フィクロトレランス（Bacillus psychrotolerans）、バチルス・プミラス（Bacillus pumilus）、バチルス・ピクナス（Bacillus pycnus）、バチルス・キングダオネンシス（Bacillus qingdaonensis）、バチルス・ルリス（Bacillus ruris）、バチルス・サフェンシス（Bacillus safensis）、バチルス・サラリウス（Bacillus salarius）、バチルス・サリフィルス（Bacillus saliphilus）、バチルス・シュリジェリー（Bacillus schlegelii）、バチルス・セレナターセナティス（Bacillus selenatarsenatis）、バチルス・セレニティレドセンス（Bacillus selenitireducens）、バチルス・セオハエアネンシス（Bacillus seohaeanensis）、バチルス・サックレトニー（Bacillus shackletonii）、バチルス・シルベストリス（Bacillus silvestris）、バチルス・シンプレックス（Bacillus simplex）、バチルス・シラリス（Bacillus siralis）、バチルス・スミシー（Bacillus smithii）、バチルス・ソリ（Bacillus soli）、バチルス・ソノレンシス（Bacillus sonorensis）、バチルス・スフェリカス（Bacillus sphaericus）、バチルス・スポロサーモデュランス（Bacillus sporothermodurans）、バチルス・ストラトスフェリカス（Bacillus stratosphericus）、バチルス・サブテラネウス（Bacillus subterraneus）、バチルス・タエアネンシス（Bacillus taeanensis）、バチルス・テクィレンシス（Bacillus tequilensis）、バチルス・サーマンタルクティカス（Bacillus thermantarcticus）、バチルス・サーモアミロボランス（Bacillus thermoamylovorans）、バチルス・サーモクローカー（Bacillus thermocloacae）、バチルス・チオパランス（Bacillus thioparans）、バチルス・ツスシー（Bacillus tusciae）、バチルス・バリスモーチス（Bacillus vallismortis）、バチルス・ベデリ（Bacillus vedderi）、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）、バチルス・ビエトナメンシス（Bacillus vietnamensis）、バチルス・ビレティ（Bacillus vireti）、バチルス・ワコエンシス（Bacillus wakoensis）、バチルス・ヴェイヘンステファネンシス（Bacillus weihenstephanensis）に属し、インドリルアルキルコハク酸アミド合成能を有するものであれば特に制限されないが、インドリルアルキルコハク酸アミド化合物合成能の点で、バチルス・チューリンゲンシス、バチルス・セレウス、バチルス・ズブチリス、バチルス・メガテリウムに属するものが特に好ましい。
【００２１】
上記のうち好適な具体例としては、バチルス・チューリンゲンシスＪＣＭ２０３８６株、同Ｂ−２株、同Ｂ−３（郵便番号292-0818 日本国 千葉県 木更津市 かずさ鎌足2-5-8（独）製品評価技術基板機構特許微生物寄託センター 受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６８９）株、同Ｂ−９株、同Ｂ−１０株、同Ｂ−１８（ＮＩＴＥ ＡＢＰ−８５８）株、同Ｂ−２１株、同Ｂ−２２株、同Ｂ−２４株（ＮＩＴＥ ＡＰ−８５７）、同Ｂ−２６株、同Ｂ−３３株、同Ｂ−３６株、同Ｂ−５９株；バチルス・セレウスＢ−５株、同Ｂ−６（ＮＩＴＥ ＡＰ−６９０）株、同Ｂ−７株、同Ｂ−８株、同Ｂ−１１株、同Ｂ−１２株、同Ｂ−１４株、同Ｂ−１５株、同Ｂ−１６株（ＮＩＴＥ ＡＰ−８５６）；バチルス・メガテリウムＢ−３２（ＮＩＴＥ ＡＢＰ−８５９）株；バチルス・ズブチリスＪＣＭ１４６５株等が挙げられ、インドリルアルキルコハク酸アミド化合物合成能の点で、バチルス・チューリンゲンシスＪＣＭ２０３８６株、同Ｂ−３株、同Ｂ−１８株、同Ｂ−２４株；バチルス・セレウスＢ−６株、同Ｂ−１５株、同Ｂ−１６株；バチルス・ズブチリスＪＣＭ１４６５株が特に好ましい。
なお、寄託日は受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−６８９株・ＮＩＴＥ ＡＰ−６９０株は平成２０年（２００８）年１２月５日であり、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−８５６・ＡＰ−８５７・ＡＢＰ−８５８・ＡＢＰ−８５９は平成２１（２００９）年１２月２５日である。
上記のうち、バチルス・チューリンゲンシスＪＣＭ２０３８６株及びバチルス・ズブチリスＪＣＭ１４６５株は、独立行政法人  理化学研究所から購入できる菌株である。またその他の菌株は、土壌から分離されたものである。
【００２２】
これらの微生物を用いて一般式（２）のインドリルアルキルコハク酸アミド化合物又はその塩を製造するには、培地中に一般式（１）で表されるインドリルアルキルアミン類又はその塩を含有せしめる。
【００２３】
Ｒ1及びＲ2としては、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基が挙げられる。ここでＣ1-6アルキル基としては、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ｔ−ブチル基等が挙げられる。Ｃ1-6アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、イソプロピルオキシ基等が挙げられる。またハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。
【００２４】
一般式（１）及び（２）中、ｎは０〜３の数を示すが、０〜２、特に１が好ましい。
【００２５】
一般式（１）及び（２）中、Ｒ1及びＲ2としては水素原子、水酸基が特に好ましく、ｎは１が特に好ましい。
【００２６】
インドリルアルキルアミン類（１）としては、インドリルアルキルアミン類（Ｒ3＝Ｈ）でもよいし、インドリルアルキルカルボキシアミン類（Ｒ3＝ＣＯＯＨ）でもよいが、トリプタミン（Ｒ1＝Ｈ、Ｒ2＝Ｈ、ｎ＝１、Ｒ3＝Ｈ）、トリプトファン（Ｒ1＝Ｈ、Ｒ2＝Ｈ、ｎ＝１、Ｒ3＝ＣＯＯＨ）、セロトニン（Ｒ1＝ＯＨ、Ｒ2＝Ｈ、ｎ＝１、Ｒ3＝ＣＯＯＨ，若しくはＲ1＝Ｈ、Ｒ2＝ＯＨ、ｎ＝１、Ｒ3＝Ｈ）、あるいはこれらの塩が収率向上の点で特に好ましく、これらの化合物は２種以上を併用してもよい。
なお、インドリルアルキルアミン類（１）の塩としては、塩酸塩、硝酸塩、硫酸塩等が挙げられるが、塩酸塩が好ましい。
【００２７】
培地中のインドリルアルキルアミン類（１）又はその塩の濃度は、インドリルアルキルコハク酸アミド化合物の生産性の点から０．００１〜１０質量％、さらに０．００１〜５質量％、特に０．０１〜５質量％が好ましい。また、当該インドリルアルキルアミン類（１）は、反応系に一括又は連続的に加えることができる。
【００２８】
培地中にはマンガンイオン（Ｍｎ2+）を含有させることによりインドリルアルキルコハク酸アミド化合物をさらに効率よく生産させることができる。マンガンイオンを添加する場合は硫酸マンガン、塩酸マンガン、炭酸マンガン、ＥＤＴＡマンガン等いずれでも可能であり、これらを１種又は２種以上用いることができるが、硫酸マンガンが特に好ましい。
培地中の含有量はマンガンイオン（Ｍｎ2+）として１〜２０００ｐｐｍ、特に２〜１０００ｐｐｍが好ましい。なお、マンガンイオン（Ｍｎ2+）は、反応系に一括又は連続的に加えることができる。
【００２９】
また、培地中には有機酸又はその塩を含有させることによりインドリルアルキルコハク酸アミド化合物をさらに効率よく生産させることができる。有機酸としてはリンゴ酸、フマル酸、コハク酸、クエン酸、イソクエン酸、α−ケトグルタル酸、オキサロ酢酸等が挙げられ、これらを１種又は２種以上用いることができる。このうち、インドリルアルキルコハク酸アミド化合物産生効率の点で、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸が好ましく、Ｌ−リンゴ酸、Ｄ−リンゴ酸、フマル酸がより好ましい。
これらの有機酸の培地中の濃度は０．１〜１０質量％が好ましく、０．２〜１質量％がより好ましい。なお、有機酸又はその塩は、反応系に一括又は連続的に加えることができる。
【００３０】
本発明の製造法において、前記微生物の培養は、インドリルアルキルアミン類（１）又はその塩、必要に応じてその他上記の化合物を培地に添加する以外は、通常のバチルス属微生物が増殖する条件で行えばよい。
培地には、バチルス属微生物の増殖に必要な炭素源、窒素源、ビタミン源、ミネラル源等を添加するのが好ましい。炭素源としては、グルコース、水飴、可溶性デンプンなどが用いられる。窒素源としては、トリプトン、ソイトン、酵母エキス、ペプトン、カゼイン、カゼイン消化物、肉エキス、コーンスチープリカー、アミノ酸液、大豆粕、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等を用いることができるが、トリプトファン含量の高いカゼイン、カゼイン消化物、酵母エキス、コーンスチープリカー等が好ましいことは言うまでもない。
ミネラル源としては、マグネシウム塩、カリウム塩、リン酸塩、鉄塩などを用いることができる。また、これらを総合的に含有する培地としては、牛乳；チーズホエイ、大豆ホエイ等のホエイ等を用いることができる。培養方法としては、液体培地を用いて、振盪培養、撹拌培養を行えばよい。
【００３１】
培養条件としては好気的条件で、８〜４５℃、ｐＨ３．２〜９．５が好ましい。培養時間は、２４〜７２０時間でよい。
【００３２】
前記培養により、培養液中にインドリルアルキルコハク酸アミド化合物（２）又はその塩が蓄積するので、常法によりインドリルアルキルコハク酸アミド化合物（２）又はその塩を採取すればよい。この培養液は、そのまま植物成長調整剤や肥料として用いることもできる。また、イオン交換樹脂、多孔性合成吸着剤、溶媒抽出等によってインドリルアルキルコハク酸アミド化合物（２）又はその塩を部分精製又は精製単離して利用することもできる。
【００３３】
例えば、イオン交換樹脂による部分精製物は、上記培養液のｐＨを中性領域（ｐＨ５〜８）に調整後、強塩基性イオン交換樹脂又は弱塩基性イオン交換樹脂に吸着させた後、酸含有アルコール水溶液で溶出して得ることができる。このとき、吸着前のイオン交換樹脂を蟻酸型又は酢酸型等に置換することが好ましい。
当該溶液の酸濃度としては、０．０１〜４Ｎが好ましく、１〜３Ｎがより好ましい。当該酸としては、蟻酸、酢酸、塩酸、硫酸等が挙げられる。
当該溶液のアルコール濃度としては、０〜８０容量％が好ましく、０〜３０容量％がより好ましい。当該アルコールとしては、メタノール、エタノール、ブタノール、イソプロパノール等が挙げられる。
【００３４】
また、例えば、多孔性合成吸着剤による部分精製物は、上記培養液のｐＨを酸性〜中性領域（ｐＨ１〜８）に調整後、ポリスチレン系合成吸着剤、スチレン−ジビニルベンゼン系吸着剤又はメタクリル系合成吸着剤に吸着させた後、アルコール水溶液又はケトン水溶液で溶出して得ることができる。
当該溶液のアルコール又はケトン濃度としては、５〜９９容量％が好ましく、１０〜３０容量％がより好ましい。当該アルコールとしては、メタノール、エタノール、ブタノール、イソプロパノール等が挙げられる。当該ケトンとしてはアセトン等が挙げられる。
【００３５】
さらに高度な精製を行うには、濃縮、沈殿化、有機溶媒による抽出、各種クロマトグラフィー等を採用することができる。
【００３６】
なお、この培養液には植物成長調整作用をもつフェニル酢酸やインドール酢酸が含まれる場合がある（Kimら２００４.Current Microbiology誌４８巻３１２−３１７ページ及びWillkinsonら１９９４.Plant and Soil誌159巻２９１−２９５ページ）。その場合は、目的に応じて混合物のまま使用してもよいし、それぞれを分取して使用しても良い。
また、培地条件によってはＮ−（フェネチル）コハク酸アミドが含まれる場合があるが、この場合も目的に応じて混合物のまま使用してもよいし、それぞれを分取して使用しても良い。
【００３７】
また、植物は一般にトリプトファンを生合成でき、多くの植物でトリプタミンも生合成できることが証明されている（Facchiniら２０００.Phytochemistry誌５４巻１２１−１３８ページ）。そしてそれらの一部は植物体表面、特に根面から分泌されていることが知られている（Kamilovaら２００.Molecular Plant-Microbe Interaction誌１９巻２５０−２５６ページ）。このため、これらの植物体、その種子、該植物体栽培用水又は土壌に、当該微生物株を施用又は接種すれば、植物体内乃至植物体表面でインドリルアルキルコハク酸アミドを生合成するので、植物の成長調節が可能になる。
具体的には、接種源としては、当該菌株を通常のバチルス属微生物が増殖する条件で培養することによって得られた菌体及び／又は芽胞を含む培養液そのものや、遠心分離・膜分離などによって菌体及び／又は芽胞を濃縮したもの、あるいはさらに菌体及び／又は芽胞を水又は通常用いられる緩衝液で洗浄したものを用いることができる。これらの接種源はそのまま使用することもできるし、その乾燥物、凍結乾燥物を使用することもできる。また、ベントナイト、ゼオライト、クレーなどの無機物質担体、ピートモス、活性炭などの有機物担体に保持させて使用することもできる。
接種する対象としては植物体全般、水、土壌に使用することができるが、当該化合物の発根促進活性が高いことを利用する場合は、種子、根、挿し木の切り口断面などが好ましい。接種濃度としては接種源１ｇあたり菌数が１×１０4〜１×１０11個となるようにした上で接種すればよい。
【００３８】
また、本発明者は、後記実施例に示すように、一般式（３）
【００３９】
【化４】
0005395811.tif 000005
【００４０】
（式中、Ｒ４は水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルコキシ基又はアルキル基を示し、ｍは０〜３の数を示す）
で表されるヒドロキシインドリルアルキルコハク酸アミド化合物又はその塩が発根促進作用を有することを見出している。
【００４１】
従って、上記一般式（３）で表される化合物又はその塩は、発根促進剤や植物成長調整剤として使用することができ、また、発根促進剤や植物成長調整剤を製造するために使用することができる。なお、「発根促進」とは、アズキ、トマト等の植物の発根を促進することをいい、「植物成長調整」は、当該植物の成長を調整することをいう。
【００４２】
上記Ｒ４、ｍの好適な具体例としては、発根促進作用の点で、それぞれＲ１、ｎと同様である。また、一般式（３）で表される化合物又はその塩としては、発根促進作用の点で、ブホブタン酸が特に好ましい。
【実施例】
【００４３】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。【００４４】
実施例１
５００mL容バッフル付き三角フラスコに０質量％、０．０１質量％、０．０３質量％、０．１質量％又は０．３質量％のトリプタミンを添加したＴｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ（ベクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製、以下ＴＳＢ）を各３００mL×２本準備し、オートクレーブ滅菌後、あらかじめＴＳＢで前培養したＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ＪＣＭ２０３８６株を接種した。温度２７℃、回転数８０rpmで１０日間振とう培養した。培養温度は２７℃とし、回転数８０rpmで１０日間振とう培養した。【００４５】
得られた培養液は以下の通り粗精製した。培養液を６，５００rpm、３０分で遠心分離し、上澄みを塩酸でpH３．０に調整した。別途、スチレン−ジビニルベンゼン系合成吸着樹脂ダイヤイオンＨＰ−２０をメタノールで洗浄した後、カラム（内径２０mm×長さ３００mm）に充填し、pH３．０酢酸水を通液して調整した。本カラムに上記上澄み液を流すことによって、Ｎ− ［２−（３−インドリル）エチル］コハク酸アミド（以下ＩＥＳＡ）を吸着した。カラムは１０容量％イソプロパノール５００mLで洗浄した後、３０容量％イソプロパノール５００mLでＩＥＳＡを溶出した。溶出液はエバポレータで約１００mLに濃縮し、水酸化ナトリウム水溶液を用いてpH８．０に調整して、酢酸エチルで３回抽出を行い、酢酸エチル層は棄却した。残った水相は塩酸を用いてpH２．５とし、酢酸エチル抽出を３回行った。得られた酢酸エチル層は無水硫酸マグネシウムを用いて脱水した後、溶媒を減圧下で除去した。残渣は少量の１Ｎ酢酸水で溶解し、別途メタノールで洗浄後、１Ｎ酢酸水を通液して調整したSepPak  Ｃ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ社製）に通過させることにより、ＩＥＳＡを吸着した。カートリッジは６０容量％メタノール２０mLで溶出し、溶出液は減圧下、乾固した。【００４６】
このサンプルはＨＰＬＣ（カラム、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｐｈｅ  内径１０mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；移動相、１容量％酢酸含有５０容量％メタノール；流速、３．０mL／分）を用いて精製し、ＩＥＳＡ保持時間相当画分（保持時間８．５〜１１．５分）を分取した。分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、ＯＤＳ-Ａ  内径１０mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；移動相、１容量％酢酸含有５０容量％メタノール；流速、３．０mL／分）を用いて精製し、ＩＥＳＡ保持時間相当画分（保持時間１１〜１３分）を分取した。さらに分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、Ｐｏｌａｒ ＲＰ  内径１０mm×長さ２５０mm（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）；移動相、１容量％酢酸含有３０容量％アセトニトリル；流速、３．０mL／分）で分析した。ピークは１４．３分に認められ、これは化学合成したＩＥＳＡとほぼ一致した。このピークの紫外部吸光スペクトルを測定したところ、２８１nmに吸光極大が認められ、化学合成したＩＥＳＡとほぼ一致した。２８０nmで測定したピーク面積を化学合成したＩＥＳＡによって作成した検量線と比較し、培養液中から得られたＩＥＳＡ濃度を算出した。結果は表１に示した。
この結果から、本菌株はＴＳＢのみで培養しても培養液中にＩＥＳＡを生産していたことが証明された。これはＴＳＢ中に培地原料として添加されているカゼイン由来のトリプトファンが約１質量％含まれるものに由来すると考えられる。さらに、トリプタミンの添加区ではＩＥＳＡ生産量が飛躍的に向上することも同時に証明された。【００４７】
また、上記分析時にＩＥＳＡ保持時間相当画分（保持時間１３．５−１５．５分）を分取し、５検体分を１サンプルにまとめて濃縮し、さらにＨＰＬＣ（カラム、ＸＴｅｒｒａＲＰ  内径１０mm×長さ２５０mm（Ｗａｔｅｒｓ社製）；移動相、１容量％酢酸含有２５容量％アセトニトリル；流速、３．０mL／分）で精製し、ＩＥＳＡ保持時間相当画分（保持時間１５〜１９分）を単一ピークとして分取した。得られた画分は減圧下で濃縮後、五酸化二リン存在下、デシケータ内で減圧乾燥した結果、ＩＥＳＡの結晶５．８ｍｇを得た。この結晶についてグリセロールを用いた質量分析（ＭＳ−ＦＡＢ）によって分析したところ、（Ｍ＋Ｈ）+が２６１として検出され、さらにＮａＣｌを添加して分析したところ（Ｍ＋Ｎａ）+が２８３として検出され、化学合成品と一致した。さらに、1Ｈ−ＮＭＲでの帰属も化学合成品と一致した（表２）。
これらの結果から、表１のＩＥＳＡは物理化学的な構造解析によってもＩＥＳＡであることが証明された。【００４８】
【表１】
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【００４９】
【表２】
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【００５０】
実施例２
５００mL容バッフル付き三角フラスコにトリプトファンを１質量％添加したＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ（ベクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製、以下ＮＢ）を各３００mL×２本準備し、オートクレーブ滅菌後、あらかじめＮＢで前培養したＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓＢ−３株（北海道別海町土壌由来、（独）製品評価技術基板機構特許微生物寄託センター受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−６８９）及びＢ． ｃｅｒｅｕｓＢ−６株（北海道別海町由来、同受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−６９０）のうちいずれかを接種し、実施例１と同様に培養を行った。【００５１】
なお、Ｂ−６株については、以下の手順で１６ｓ  ｒＤＮＡ配列による遺伝子同定を行った。ＮＢにて３７℃・２日間、好気培養したＢ６株培養液から遠心分離で菌体を回収し、ＰｒｅｐＭａｎ  Ｕｌｔｒａ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にてＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ溶液５μＬ、１６ｓ  ｒＤＮＡ内部配列より作成したプライマー８Ｆ（ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣ：配列番号１）及び１４９２Ｒ（ＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ：配列番号２）の１０pmol／μＬ溶液を各１μＬ、滅菌水５μＬ、Ｐｒｅｍｉｘ  Ｔａｑ（ＴａＫａｒａ）１２．５μＬを０．２mLマイクロチューブにて混和し、ＧｅｎｅＡｍｐTM ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲは９４℃・４分反応後、９４℃・３０秒、５０℃・３０秒、７２℃・１分を３５サイクル行い、最後に７２℃・５分反応した。ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）にて増幅物を精製し、増幅断片の部分シーケンス解析をＳＩＧＭＡ  Ｇｅｎｏｓｙｓに依頼した。解析された約７００ｂｐについて、ＤＤＢＪ（ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）ホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｔｏｐ−ｊ．ｈｔｍｌ）にてＦＡＳＴＡ検索を行い、相同性が最も高かった菌種と同定した。【００５２】
培養液は実施例１と同様に粗精製を行った。粗精製したサンプルはＨＰＬＣ（カラム、ＹＭＣ Ｐａｃｋ Ｃ８内径２０mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；移動相、１容量％酢酸含有５０容量％メタノール；流速、６．０mL／分）を用いて精製し、ＩＥＳＡ保持時間相当画分（保持時間２１〜２８分）を分取した。さらに分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、ＹＭＣ Ｐａｃｋ Ｃ８内径２０mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；移動相、１容量％酢酸含有３０容量％アセトニトリル；流速、６．０mL／分）を用いて精製し、ＩＥＳＡ保持時間相当画分（保持時間２８〜３４分）を分取した。さらに分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｐｈｅ  内径１０mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；移動相、１容量％酢酸含有５０容量％メタノール；流速、３．０mL／分）を用いて精製し、ＩＥＳＡ保持時間相当画分（保持時間９〜１１分）を分取した。さらに分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、ＯＤＳ−Ａ  内径１０mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；移動相、１容量％酢酸含有５０容量％メタノール；流速、３．０mL／分）を用いて精製し、ＩＥＳＡ保持時間相当画分（保持時間１１〜１３分）を分取した。さらに分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、Ｐｏｌａｒ ＲＰ  内径１０mm×長さ２５０mm（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）；移動相、１容量％酢酸含有３０容量％アセトニトリル；流速、３．０mL／分）で精製し、ＩＥＳＡ保持時間相当画分（保持時間１３〜１５分）を分取した。さらに分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、Ｐｕｒｅｓｉｌ Ｃ１８  内径４．６mm×長さ２５０mm（Ｗａｔｅｒｓ社製）；カラム温度、４０℃；移動相、１容量％酢酸含有２５容量％アセトニトリル；流速、０．８mL／分）で分析した。ピークは１２．４分に認められ、これは化学合成したＩＥＳＡとほぼ一致した。このピークの紫外部吸光スペクトルを測定したところ、２８１nmに吸光極大が認められ、化学合成したＩＥＳＡと一致した。２８０nmで測定したピーク面積に基づいて実施例１と同様にＩＥＳＡを定量した結果、Ｂ−３株由来の培養液中で０．０３９mg／Ｌ、Ｂ-６株由来の培養液中で０．０３８mg／Ｌであることが判明した。本結果から、これらの菌株はＩＥＳＡを生産することが証明された。【００５３】
実施例３
培地をコーンスチープリカー（和光純薬社製）を３容量％添加したＴＳＢとし、菌株をＢ−３株とした以外は実施例２と同様に培養、粗精製、分析を行った。
その結果、０．１０２mg／ＬのＩＥＳＡが検出された。【００５４】
実施例４
培地を、ＮＢ、ＮＢにトリプタミンを１０mM添加したもの、ＮＢにトリプタミンを１０mM添加とフェネチルアミンを３mM添加したもの、ＮＢにトリプタミンを１０mM添加とフェネチルアミンを１０mM添加したものとし、それ以外は実施例１と同様にそれぞれ培養、粗精製を行った。【００５５】
粗精製後のサンプルはＨＰＬＣ（カラム、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｐｈｅ  内径１０mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；移動相、１容量％酢酸含有５０容量％メタノール；流速、３．０mL／分）を用いて精製し、ＩＥＳＡ及びＮ−（フェネチル）コハク酸アミド（以下、ＰＥＳＡ）保持時間相当画分（保持時間８．５〜１１分）を分取した。分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、ＯＤＳ-Ａ  内径１０mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；移動相、１容量％酢酸含有５０容量％メタノール；流速、３．０mL／分）を用いて精製し、ＩＥＳＡ及びＰＥＳＡ保持時間相当画分（保持時間１０．５〜１４．０分）を分取した。さらに分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、Ｐｏｌａｒ ＲＰ  内径１０mm×長さ２５０mm（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）；移動相、１容量％酢酸含有３０容量％アセトニトリル；流速、３．０mL／分）で分析した。ＩＥＳＡのピークは１４．０分に認められ、これは化学合成したＩＥＳＡとほぼ一致した。このピークの紫外部吸光スペクトルを測定したところ、２８２nmに吸光極大が認められ、化学合成したＩＥＳＡとほぼ一致した。２８０nmで測定したピーク面積を化学合成したＩＥＳＡによって作成した検量線と比較し、培養液中から得られたＩＥＳＡ濃度を算出した。また、ＰＥＳＡのピークは１１．９分に認められ、これは化学合成したＰＥＳＡとほぼ一致した。このピークの紫外部吸光スペクトルを測定したところ、２５９nmに吸光極大が認められ、化学合成したＰＥＳＡとほぼ一致した。２６０nmで測定したピーク面積を化学合成したＰＥＳＡによって作成した検量線と比較し、培養液中から得られたＰＥＳＡ濃度を算出した。結果は表４に示した。
この結果から、本発明の方法によればＩＥＳＡとＰＥＳＡを同時に生産させることも可能であることが証明された。また、ＩＥＳＡを優先的に生産させたい場合はフェネチルアミン添加量を少なくした方が有利であることが判明した。また、双方の基質濃度と生産物との関係は競合阻害と考えられるため、ＩＥＳＡ生合成酵素とＰＥＳＡ生合成酵素は同一である可能性が推察される。【００５６】
【表３】
0005395811.tif 000008
【００５７】
実施例５
５００mL容バッフル付き三角フラスコにトリプタミンを０．１質量％添加したＮＢを３００mL×２本準備し、オートクレーブ滅菌後、あらかじめＮＢで前培養したＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓＪＣＭ１４６５株を接種し、実施例１と同様に培養、粗精製を行った。粗精製後のサンプルは実施例４と同様にＨＰＬＣによる精製、分析を行った。その結果、０．０３２mg／ＬのＩＥＳＡが検出された。
このことから、適当な濃度のトリプタミンを培地に添加すればＢ． ｓｕｂｔｉｌｉｓを用いてもＩＥＳＡを生産できることが明らかとなった。【００５８】
実施例６
培地を、ＮＢにトリプトファンを１質量％添加したもの、ＮＢにトリプトファンを１質量％、硫酸マンガン５水和物（ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ）を０．３質量％（マンガンイオン濃度として684ppm）添加し、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．８に調整したものとし、菌株をＢ−３株とした以外は実施例５と同様にそれぞれ培養、粗精製、分析を行った。その結果、硫酸マンガン無添加区で０．６４３mg／Ｌ、硫酸マンガン添加区で３．７０４mg／ＬのＩＥＳＡが検出された。
このことから、マンガンイオンの添加によりＩＥＳＡ生産量は５倍以上高まったことが確認された。【００５９】
実施例７
基本培地を食塩（ＮａＣｌ）０．５質量％、リン酸水素二カリウム（Ｋ2ＨＰＯ4）０．２５質量％、ブドウ糖（ｇｌｕｃｏｓｅ）０．２５質量％、硫酸マンガン五水和物（０．３質量％，マンガンイオン濃度として684ppm）水溶液とした。これに（１）酵母エキス（Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔｓ、ベクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製）３容量％、（２）トリプトン（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、ベクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製）３質量％、（３）ソイトン（Ｓｏｙｔｏｎｅ、ベクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製）３質量％、（４）ソイトン３質量％およびグルタミン酸１質量％をそれぞれ加え、ｐＨ７．２に調整したものを培地とし、菌株をＢ−３株とした以外は実施例５と同様に培養、粗精製、分析を行った。結果は表４に示した。
本結果から、培地にマンガンイオンを添加しておくことで、酵母エキス、トリプトン、ソイトンなど広範な窒素源からＩＥＳＡを生産できることが確認された。【００６０】
【表４】
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【００６１】
実施例８
（１）成分無調整牛乳（日本ミルクコミュニティ（株）製）そのもの、（２）当該牛乳にＬ−リンゴ酸（Ｌ−ｍａｌｉｃ ａｃｉｄ）を０．３質量％添加したもの、（３）上記牛乳に硫酸マンガン五水和物を０．３質量％（マンガンイオン濃度として684ppm）添加したもの、（４）上記牛乳にＬ−リンゴ酸（Ｌ−ｍａｌｉｃ ａｃｉｄ）０．３質量％と硫酸マンガン五水和物０．３質量％添加したものをそれぞれ調製し、ｐＨ７．２に調整して培地とし、菌株をＢ−３株とした以外は実施例５と同様に培養、粗精製、分析を行った。結果は表５に示した。
本結果よりＢ-３株により牛乳そのものを培地としてもＩＥＳＡを生産することが可能であることが明らかとなった。また、その生産量はマンガンイオンやリンゴ酸を添加することによりさらに向上することが判明した。【００６２】
【表５】
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【００６３】
実施例９
（１）チーズホエイからＵＦ膜（Ultrafiltration Membrane）を用いてタンパク質を回収した際の透過液であるホエイＵＦ膜パーミエイト（雪印乳業（株）なかしべつ工場製）にＬ−リンゴ酸（Ｌ−ｍａｌｉｃ ａｃｉｄ）０．３質量％と硫酸マンガン五水和物を０．３質量％（マンガンイオン濃度として684ppm）添加したもの、（２）乳清パウダーＦＣ０６（雪印乳業（株）製）１２質量％水溶液、（３）当該乳清パウダー１２質量％水溶液にＬ−リンゴ酸０．３質量％と硫酸マンガン五水和物を０．３質量％添加したものをそれぞれ調製し、ｐＨ７．２に調整して培地とした。これにＢ−３株を接種し、実施例５と同様に培養、粗精製、分析を行った。結果は表６に示した。
本結果から、ホエイＵＦ膜パーミエイトそのものを培地とし、マンガンイオンとＬ−リンゴ酸を添加した場合に、ＩＥＳＡを生産することができることが判明した。また、乳清パウダーといったホエイを培地とした場合、Ｂ−３株によってＩＥＳＡを生産することができるが、マンガンイオンとＬ−リンゴ酸を添加すればその生産量を飛躍的に向上させることができることが明らかとなった。【００６４】
【表６】
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【００６５】
実施例１０
タンパク質濃縮ホエイパウダーＷＰＣ３４Ｃ（ホエイ中タンパク質を膜濃縮後、スプレードライ乾燥したもの；雪印乳業（株）製）３質量％、食塩（ＮａＣｌ）０．５質量％、リン酸水素二カリウム（Ｋ2ＨＰＯ4）０．２５質量％、ブドウ糖０．２５質量％を蒸留水に溶解したものをホエイタンパク質基礎培地とした。
（１）この基礎培地そのもの、（２）基礎培地にＬ−リンゴ酸０．３質量％を添加したもの、（３）基礎培地にＬ−リンゴ酸０．３質量％および硫酸マンガン五水和物０．３質量％（マンガンイオン濃度として684ppm）を添加したもの、（４）基礎培地にＤ−リンゴ酸０．３質量％および硫酸マンガン五水和物０．３％を添加したもの、（５）基礎培地にフマル酸０．３質量％および硫酸マンガン五水和物０．３質量％を添加したものを、それぞれ調製し、すべてｐＨ ７．２とした。これにＢ−３株を接種し、実施例５と同様に培養、粗精製、分析を行った。結果は表７に示した。
本結果から、Ｂ−３株を用いることによって、ホエイタンパク質そのものを培地としてもＩＥＳＡを生産することができることが確認された。また、その生産量はマンガンイオンと有機酸を添加することによりさらに向上し、有機酸としてはＬ−リンゴ酸以外にもＤ−リンゴ酸、フマル酸でも効果的であることが判明した。【００６６】
【表７】
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【００６７】
実施例１１
（１）セミ脱塩乳清パウダーＦＣ１０（雪印乳業（株）製）１２質量％水溶液、（２）当該セミ脱塩乳清パウダー１２質量％水溶液に硫酸マンガン五水和物を０．３質量％（マンガンイオン濃度として684ppm）添加したもの、（３）上記水溶液に硫酸マンガン五水和物０．３質量％とＤ−リンゴ酸０．３質量％を添加したもの、（４）上記水溶液に硫酸マンガン五水和物０．３質量％とＬ−リンゴ酸０．３質量％を添加したもの、（５）上記水溶液に硫酸マンガン五水和物０．３質量％とフマル酸０．３質量％を添加したものを、それぞれ調製し、ｐＨ７．２に調整して培地とした。これにＢ−３株を接種し、実施例５と同様に培養、粗精製、分析を行った。結果は表８に示した。
本結果から、Ｂ−３株を用いることによって、ホエイそのものを培地としてもＩＥＳＡを生産することができることが確認された。また、その生産量はマンガンイオンと有機酸を添加することによりさらに向上し、有機酸としてはＬ−リンゴ酸以外にもＤ−リンゴ酸、フマル酸でも効果的であることが判明した。【００６８】
【表８】
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【００６９】
実施例１２
セミ脱塩乳清パウダーＦＣ１０（雪印乳業（株）製）１２質量％水溶液に硫酸マンガン五水和物を０．３質量％（マンガン濃度として684ppm）添加し、ｐＨ７．２に調整した培地（実施例１１の（２）に相当）を３００mL調製し、５００mL用バッフル付き三角フラスコに入れ、オートクレーブ滅菌した。
上記の培地に、あらかじめＮＢで前培養したBacillus thuringiensis Ｂ−２株（北海道別海町土壌由来）、同Ｂ−９株（北海道長沼町土壌由来）、同Ｂ−１０株（北海道別海町土壌由来）、同Ｂ-１８株（北海道由仁町土壌由来、（独）製品評価技術基板機構特許微生物寄託センター受領番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−８５８）、同Ｂ-２１株（北海道由仁町土壌由来）、同Ｂ-２２株（北海道長沼町土壌由来）、同Ｂ-２４株（北海道別海町土壌由来、（独）製品評価技術基板機構特許微生物寄託センター受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−８５７）、同Ｂ-２６株（北海道標津町土壌由来）、同Ｂ-３３株（北海道長沼町土壌由来）、同Ｂ-３６株（北海道標津町土壌由来）、同Ｂ-５９株（北海道標津町土壌由来）；B. cereus Ｂ−７株（北海道長沼町土壌由来）、同Ｂ−１５株（北海道長沼町土壌由来）、同Ｂ-１６株（北海道長沼町土壌由来、（独）製品評価技術基板機構特許微生物寄託センター受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−８５６）；B. megaterium Ｂ−３２株（北海道由仁町土壌由来、（独）製品評価技術基板機構特許微生物寄託センター受領番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−８５９）をそれぞれ接種し、実施例１と同様に培養した。
なお、上記菌株は実施例２と同様の方法で遺伝子同定を行った。【００７０】
培養液は実施例１と同様に粗精製を行った。粗精製したサンプルはＨＰＬＣ（カラム、ＹＭＣ  ＯＤＳ−Ａ 内径１０mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；移動相、１容量％酢酸含有５０容量％メタノール；流速、３．０mL／分）を用いて精製し、ＩＥＳＡ保持時間相当画分（保持時間１１．５〜１４分）を分取した。さらに分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、Ｐｏｌａｒ ＲＰ  内径４．６mm×長さ２５０mm（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）；カラム温度、４０℃；移動相、１容量％酢酸含有２５容量％アセトニトリル；流速、０．８mL／分）で分析した。ピークは１４．４分に認められ、これは化学合成したＩＥＳＡとほぼ一致した。２８０nmで測定したピーク面積を用いて実施例１と同様にＩＥＳＡ濃度を算出した。結果は表９に示した。
本結果から、マンガンを添加したホエイを培地として用いることによってB. thuringiensis、B. cereus、B. megateriumを用いてＩＥＳＡを生産することが出来ることが確認された。特にB. thuringiensisＢ−１８株（ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−８５８）の生産能力が極めて高いことが明らかとなった。【００７１】
【表９】
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【００７２】
実施例１３  Ｎ−［２-（５−水酸化インドール−３−イル）エチル］コハク酸アミド（Bufobutanoic acid）の生産
まず、標品となるＮ−［２-（５−水酸化インドール−３−イル）エチル］コハク酸アミド（Bufobutanoic acid、以下ＢＢＡ）を下記の通り化学合成した。
無水コハク酸１．５５ｇにアセトン３０mLを加え、室温にて撹拌しながら、５−水酸化トリプタミン塩酸塩（セロトニン塩酸塩、シグマアルドリッチジャパン（株）社製）３ｇとトリエチルアミン１．９７mLをアセトン５０mLに溶解したものをゆっくりと加え、さらに３０分撹拌を続けた。反応後、溶媒は減圧下で留去し、残滓を５％炭酸水素ナトリウム水溶液と酢酸エチルとで溶解し、分液ロート中で分液した。酢酸エチル相を棄却した後、水相は濃塩酸を用いてｐＨ２．５に調整し、酢酸エチルで抽出を行った。酢酸エチル相は無水硫酸マグネシウムを用いて脱水した後、溶媒を減圧下にて留去した。得られた合成物はＨＰＬＣ（カラム、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｃ８  内径２０mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；移動相、１容量％酢酸含有５０容量％メタノール；流速、６．０mL／分）を用いて精製し、保持時間１２〜１４分の溶出液を分取した。分取した画分は減圧乾固し、五酸化二燐共存下のデシケータ内で減圧乾燥し、１．１ｇのＢＢＡを得た。【００７３】
培養による製造は以下の通り行った。ＮＢに０．１質量％の５−水酸化トリプタミン塩酸塩を添加し、ｐＨ６．８に調整した上で、５００mL容バッフル付き三角フラスコ２本に３００mLずつ分注し、オートクレーブ滅菌後、あらかじめＮＢで前培養したBacillus thuringiensis Ｂ−３株、及びB. cereus Ｂ−６株（北海道別海町由来、（独）製品評価技術基板機構特許微生物寄託センター受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−６９０）をそれぞれ接種した。培養温度は３７℃とし、回転数８０rpmで１０日間振とう培養した。
得られた培養液は実施例１と同様に遠心分離後、ダイヤイオンＨＰ−２０カラムへの吸着を行った。このカラムは１０容量％イソプロパノール５００mLでＢＢＡを溶出し、溶出液は実施例１と同様に溶媒抽出を行った。得られたサンプルは少量の２０容量％メタノールに溶解し、別途メタノールで洗浄後、２０容量％メタノールを通液して調製したSepPak ｔC18カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ社製）を通過させ、さらに２０容量％メタノール２０mLで溶出することにより精製した。【００７４】
粗精製したサンプルはＨＰＬＣ（カラム、ＹＭＣ  Ｐｈｅ 内径１０mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；移動相、１容量％酢酸含有３０容量％メタノール；流速、３．０mL／分）を用いて精製し、ＢＢＡ保持時間相当画分（保持時間１１〜１４分）を分取した。さらに分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、ＹＭＣ  ＯＤＳ−Ａ 内径１０mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；移動相、１容量％酢酸含有３０容量％メタノール；流速、３．０mL／分）を用いて精製し、ＢＢＡ保持時間相当画分（保持時間９．５〜１２．５分）を分取した。さらに分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、ＯＤＳ−Ａ  内径１０mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；移動相、１容量％酢酸含有２０容量％アセトニトリル；流速、３．０mL／分）で分析した。ピークは９．５分に認められ、これは化学合成したＢＢＡとほぼ一致した。また、ピークの吸光極大は２７９nmと化学合成したＢＢＡと一致しており、２３５〜４００nmの吸光スペクトルも化学合成したＢＢＡとほぼ一致した。２８０nmで測定したピーク面積を用いて実施例１と同様にＢＢＡ濃度を算出した結果、Ｂ−３株は５．５１４mg／Ｌ、Ｂ−６株は４．６０９mg／ＬのＢＢＡを生産したことが明らかとなった。
このことから、基質のインドリル基に水酸基を有していても、当該微生物によって対応するコハク酸アミド体を生産させることができることが明らかとなった。【００７５】
なお、ＢＢＡについて発根促進活性があることを確認するため、化学合成したＢＢＡ水溶液を調製し、塩酸を用いてpH7とし、アズキ発根促進アッセイ（Itagaki et al. 2003. Biological activities and structure-activity relationship of substitution compounds of N-[2-(3-indolyl)ethyl]succinamic acid and N-[2-(1-naphthyl)ethyl]succinamic acid、 derived from a new category of root-promoting substance、 N-(phenethyl)succinamic acid analogs. Plant Soil 255:67-75.）に供した。アズキ切片は基部を72時間被検液に浸漬し、7日後に発生した不定根数を数えた。反復数は5本とした。その結果を表１０に示す。
ＢＢＡ処理区では濃度依存的に顕著な発根数の増加が認められた。このことから、上記のＢＢＡ培養液を発根促進剤や植物成長調整剤として利用することが可能であることが確認された。【００７６】
【表１０】
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【００７７】
実施例１４
Bacillus thuringiensis Ｂ−１８株（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−８５８）をＮＢ１０mL中、２７℃、３日間培養し、培養液を１５，０００rpm、１０分遠心分離した。上澄を棄却した後、１０mLの滅菌水を加え、よく懸濁し、再度遠心分離することにより菌体の洗浄を行った。この洗浄をさらに２回繰り返したものに、滅菌水１０mLを加え、十分懸濁し、接種源とした。
一方、トマト品種ハウス桃太郎（タキイ種苗）種子を８０容量％エタノールに1分浸漬し、ついで滅菌水で洗浄し、ついで１容量％次亜塩素酸ナトリウムに５分浸漬し、ついで滅菌水で２回洗浄することで種子消毒を行ったのち、あらかじめ滅菌したゲルライト（和光純薬社製）１質量％を含む培地表面に播種した。
２７℃で３日間培養した後、発芽が確認された種子３粒を接種源に１０秒間浸漬した後、あらかじめゲルライト１質量％培地１００mLを外径４０mm×高さ１３０mmの植物培養試験管（旭テクノグラス社製）に入れて滅菌、固化したものに置床した（２反復）。蛍光灯による連続光下（２２００ルックス、２０℃）で１４日間栽培したのち、総根長をルートスキャナー（Ｃｏｍａｉｒ社製）で測定した。結果は表１１に示した。Ｂ−１８株の処理によって総根長が明らかに増加しているほか、目視による観察でも側根数の増加が認められた。【００７８】
【表１１】
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【配列表】
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