(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）０．０１〜１０％の共役リノール酸と、
（ｂ）０．０００１〜５０％のレチノイン酸と、
（ｃ）皮膚科学的に許容されるビヒクルと、
から成る、皮膚の皺または皮膚のたるみを治療または予防するための局所用組成物であって、
共役リノール酸が、シス９，トランス１１異性体であることを特徴とする、局所用組成物。
【請求項２】
組成物が塗り置き型組成物であることを特徴とする、請求項１に記載の局所用組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】    （発明の分野）
本発明は、ヒトの皮膚に塗布する局所用組成物、及び、皮膚の状態及び外観を改善するための該組成物の使用に関する。
【０００２】    （発明の背景）
皮膚は、皮膚科学的異常、苛酷な環境（風、空調及び中央暖房）、または、正常な老化過程（加齢老化）などによって劣化し、また、日光照射（光老化）はこのような皮膚の劣化を加速する。近年は、皮膚の外観及び状態を改善する化粧組成物及び化粧方法に対する要望が非常に大きくなっている。
【０００３】  小じわ、皺、たるみ、色素沈着及び老人斑のような皮膚の加齢老化及び光老化の目に見える徴候を治療するかまたはその進行を妨げる老化防止化粧品に対する消費者の要望は増大の一途を辿っている。
【０００４】  また、消費者が老化防止以外の有益な効果を化粧品に期待することも少なくはない。敏感肌という概念は、敏感肌、乾燥肌及び／または鱗肌などの皮膚の外観及び状態を改善し、赤焼け肌及び／または刺激肌を鎮静する化粧品に対する消費者の要望を喚び起した。消費者はまた、油／皮脂の調節効果をもつ化粧品を要望している。多くの人々が皮膚の色素沈着の程度に関心を抱いている。例えば、老人斑または雀斑のある人々は、色素が沈着したこのような斑点を目立ち難くすることを望んでいる。また別の人々は、日光に曝されることによって生じた皮膚の黒ずみを軽減したり、または、生まれつきの皮膚の色を薄くすることを望んでいる。これらの要望に応えるために、メラノサイト中の色素産生を低減させる製品開発の試みが数多くなされた。しかしながら、これまでに同定された物質は、例えば皮膚刺激のような望ましくない副作用を生じ易い。
【０００５】  従ってこのような物質は化粧品用途に適していなかったり、または、望ましい皮膚美白効果が得られない低濃度でしか塗布できなかったりする。副作用を減らすために異なる皮膚美白物質の組合せを使用することも考察されたが、このような組合せの使用は、競合作用によって皮膚美白効果がむしろ減少するという危険も孕んでいる。従って、皮膚美白用化粧品の効果を改善すること、特にこのような化粧品が皮膚を刺激しないようにすることが要望されている。
【０００６】  皮膚の状態及び外観を改善するためにポリ不飽和必須脂肪酸、遊離酸及びそれらのアルカリ塩またはアンモニウム塩の長鎖トリグリセリドエステルを含む皮膚保護用の化粧組成物及び皮膚科学的組成物は当業界で公知である。例えば、英国特許公開ＧＢ２１８１３４９Ａは、特にリノール酸のトリグリセリドから成る皮膚の滑らかさ及び弾力性を改善するための組成物を記載している。例えば、Ｄｒ．Ａｕｇｕｓｔ  Ｗｏｌｆｆ  Ｇｍｂｈから市販されている製品Ｌｉｎｏｌａ  Ｆｅｔｔ  ｎは、病的乾燥肌及び皮膚病の治療に有効であり、特に共役リノール酸の９，１１異性体の混合物を含有する製品である。
【０００７】  レチノール（ビタミンＡ）は、ヒト体内で自然に産生される内因性化合物であり、上皮細胞の正常な分化に必須である。天然及び合成のビタミンＡ誘導体（レチノイド）は多様な皮膚異常の治療に広く使用されており、皮膚の修復剤または回復剤として使用されてきた。例えばレチノイン酸は、ニキビ、しわ、乾癬、老人斑及びシミのような多様な皮膚状態の治療に使用されてきた。例えば、Ｖａｈｌｑｕｉｓｔ，Ａ．ら，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，Ｖｏｌ．９４，Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｄ．Ｂ．ａｎｄ  Ｃｕｎｌｉｆｆｅ，Ｗ．Ｊ．（１９９０），ｐｐ．４９６−４９８；Ｅｌｌｉｓ，Ｃ．Ｎ．ら，“Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｔｉｎｏｌｓ  ｉｎ  Ｓｋｉｎ”，Ｖａｓｅｌ，Ｋａｒｇｅｒ，Ｖｏｌ．３，（１９８９），ｐｐ．２４９−２５２；Ｌｏｗｅ，Ｎ．Ｊ．ら，“Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｔｉｎｏｌｓ  ｉｎ  Ｓｋｉｎｓ”，Ｖｏｌ．３，（１９８９），ｐｐ．２４０−２４８，国際特許出願ＰＣＴ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＷＯ９３／１９７４３参照。
【０００８】  国際特許ＷＯ９９／２６５８８は、共役リノール酸と任意にレチノイン酸エステルであるアスコルビン酸レチノイルとを含む皮膚老化防止用化粧クリームを記載している。
他の多くの特許出願は、リノール酸とレチノール及び／またはその誘導体とを含有する組成物を記載している。これらの特許出願としては、国際特許ＷＯ−Ａ−９８／１３０２０、米国特許ＵＳ−Ａ−５，７５９，５５６、ＵＳ−Ａ−５，７２３，１３９、欧州特許公開ＥＰ−Ａ−７４２，００５、及び、米国特許ＵＳ−Ａ−５，４５１，４０５がある。
【０００９】  しかしながら、小じわ、皺、たるみ、色素沈着及び老人斑のような皮膚の老化及び光損傷の目に見える徴候を治療／遅延をするために皮膚に局所用塗布する有効な代替的化粧組成物の必要性は存続している。
【００１０】  本発明の発明者らは、小じわ、皺、たるみ、色素沈着及び老人斑のような加齢老化または光老化を生じている正常な（しかし美容的には望ましくない）皮膚状態の有効な治療及び予防が、特定の脂肪酸即ち共役リノール酸及び／またはその誘導体と、レチノイン酸、レチノールまたはレチノールのエステル（レチニルエステル）及び／または酵素アシルＣｏＡレチノールトランスフェラーゼ（ＡＲＡＴ）もしくは酵素レシチンレチノールアシルトランスフェラーゼ（ＬＲＡＴ）のインヒビター（本文中では以後ＬＲＡＴ／ＡＲＡＴインヒビターと呼ぶ）との組合せから成る化粧組成物を皮膚に塗布することによって得られることを知見した。本発明の発明者らはまた、このような化粧組成物の使用が、老化防止効果に加えて、敏感肌及び／または刺激肌の鎮静、油／皮脂分泌の調節、皮膚の美白のような別の皮膚保護効果を有利に提供することを知見した。
【００１１】  上記に検討した技術は、相乗的に作用する共役リノール酸とレチノイン酸、レチノールまたはレチニルエステル及び／またはＬＲＡＴ／ＡＲＡＴインヒビターとの特定の組合せを開示していない。また、このような特定の組合せを、皺、敏感肌、乾燥肌の治療、油／皮脂分泌の調節または皮膚の美白の目的に使用することも開示していない。
【００１２】    （発明の概要）
本発明の第一の目的は、（ａ）共役リノール酸及び／またはその誘導体と、
（ｂ）レチノイン酸、レチノール、レチニルエステル及び／またはＬＲＡＴ／ＡＲＡＴインヒビターと、
（ｃ）皮膚科学的に許容されるビヒクルと、
から成る局所用組成物を提供することである。
【００１３】  本発明の第二の目的は、皺、たるみ、乾燥肌、老化肌及び／または光損傷肌の治療／予防；皮膚のコラーゲン沈積の増進、皮膚のデコリン産生の増進、組織修復の増強；刺激肌、赤焼け肌及び／または敏感肌の鎮静；皮膚の肌理、滑らかさ及び／または引き締めの改善；皮膚の美白；油／皮脂分泌の調節；から選択された少なくとも１つの皮膚保護効果を与える化粧方法であって、上述の局所用組成物を皮膚に塗布することから成る方法を提供することである。
【００１４】  本発明はまた、皺、たるみ、老化肌及び／または光損傷肌の治療／予防；皮膚のコラーゲン沈積の増進、皮膚のデコリン産生の増進、組織修復の増強；刺激肌、赤焼け肌及び／または敏感肌の鎮静；皮膚の肌理、滑らかさ及び／または引き締めの改善；皮膚の美白；油／皮脂分泌の調節；から選択された少なくとも１つの皮膚保護効果を与えるための本発明の組成物の使用を包含する。
【００１５】  本発明の更に別の目的は、皺、たるみ、老化肌及び／または光損傷肌の治療／予防；皮膚のコラーゲン沈積の増進、皮膚のデコリン産生の増進、組織修復の増強；刺激肌、赤焼け肌及び／または敏感肌の鎮静；皮膚の肌理、滑らかさ及び／または引き締めの改善；皮膚の美白；油／皮脂分泌の調節；から選択された少なくとも１つの美容的皮膚保護効果を与えるための局所用化粧組成物における共役リノール酸及び／またはその誘導体とレチノイン酸、レチノール、レチニルエステル及び／またはＬＲＡＴ／ＡＲＡＴインヒビターとの組合せ使用を提案することである。
【００１６】  従って、本発明の組成物、方法及び使用は老化防止効果を提供し、その結果として、滑らかで撓やかな皮膚の発生が促され、同時に、皮膚の弾力性が改善され皺及び老化肌の出現が減少または遅延され、また、肌の色が改善される。外観、肌理及び状態が、特に輝き及び透明性について全般的に改善され、皮膚が全体的に若々しい外観を得る。本発明の組成物、方法及び使用はまた、敏感肌及び／または刺激肌の鎮静及び緩和、皮膚の美白、油／皮脂分泌の調節にも有効である。従って本発明は、多様な皮膚保護効果を与えるという利点を有している。
【００１７】  本文中に使用された治療するという用語は、皺肌、老化肌及び／または光損傷肌及び／または刺激肌のような上述の典型的な皮膚状態を軽減したり、その進行を妨げたり及び／または予防すること、並びに、刺激及び皺を予防または減少させ、皮膚の撓やかさ、引き締め、滑らかさ、柔軟性及び弾力性を増加させることによって皮膚の質を全般的に高め外観及び肌理を改善すること、をその範囲内に包含する。本発明の組成物、方法及び使用は、皺がある状態、老化した状態、光損傷された状態、刺激された状態に既に陥っている皮膚を治療するためにも、または、正常な老化／光老化過程に起因する上述の望ましくない変化を予防または抑制する目的で若い皮膚を治療するためにも有効であろう。
【００１８】    （詳細な説明）
共役リノール酸（本文中では以後ＣＬＡで表す）はジ不飽和長鎖（Ｃ１８）脂肪酸である。ＣＬＡは、（６，８）、（７，９）、（８，１０）、（９，１１）、（１０，１２）または（１１，１３）位置で種々のシス及びトランス二重結合のコンフィギュレーションが可能なリノール酸の位置異性体及び幾何異性体のグループから成る。従ってＣＬＡには異なる２４個の異性体が存在する。
【００１９】  本発明はまた、このような共役リノール酸部分を含む遊離酸の誘導体を包含する。好ましい誘導体は、酸のカルボキシル基の置換から誘導された誘導体、例えばエステル（例えば、トリグリセリドエステル、モノグリセリドエステル、ジグリセリドエステル、ホスホエステル）、アミド（例えば、セラミド誘導体）、塩（例えば、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩）；及び／または、Ｃ１８炭素鎖の置換から誘導された誘導体、例えばアルファヒドロキシ誘導体及び／またはベータヒドロキシ誘導体である。
【００２０】  トリグリセリドエステル誘導体の場合、グリセロール主鎖のＣＬＡ置換基の全ての位置異性体が包含される。トリグリセリドは少なくとも１個のＣＬＡ部分を含有しなければならない。例えば、グリセロール主鎖の３個のエステル化可能な位置のうちで、１位及び２位はＣＬＡによってエステル化され３位は別の脂質によってエステル化されているか、あるいは、グリセロール主鎖の１位及び３位がＣＬＡでエステル化され、２位が別の脂質でエステル化されている。
【００２１】  本発明に使用され得るＣＬＡの最も好ましい異性体は、シス９トランス１１（ｃ９  ｔ１１）またはトランス１０シス１２（ｔ１０  ｃ１２）異性体である。好ましくは、組成物中に存在する全ＣＬＡ及び／またはＣＬＡ部分の重量の少なくとも１重量％がｃ９，ｔ１１及び／またはｔ１０，ｃ１２異性体の形態である。より好ましくは、組成物中に存在する全ＣＬＡ及び／またはＣＬＡ部分の重量の少なくとも２０重量％、最も好ましくは少なくとも４０重量％がｃ９，ｔ１１及び／またはｔ１０，ｃ１２異性体の形態である。
【００２２】  特に好ましい実施態様では、共役リノール酸のｃ９，ｔ１１またはｔ１０，ｃ１２異性体が富化されている。“富化された”なる用語は、組成物中に存在する全ＣＬＡ（及び／またはＣＬＡ）部分の重量の少なくとも５０重量％がシス９，トランス１１及び／またはトランス１０，シス１２異性体の形態であることを意味する。好ましくは組成物中に存在する全ＣＬＡ及び／またはＣＬＡ部分の重量の少なくとも７０重量％、より好ましくは少なくとも８０重量％、最も好ましくは少なくとも９０重量％がｃ９，ｔ１１及び／またはｔ１０，ｃ１２異性体の形態である。
【００２３】  本発明によるＣＬＡ及び／またはＣＬＡ部分含有誘導体は、桐油または脱水ヒマシ油（Ｕｎｉｃｈｅｍａ）のような共役リノール酸トリグリセリドに富む油として市販されている。ミックス異性体製品はＳｉｇｍａから入手でき、ｃ９，ｔ１１異性体に富むＣＬＡはＭａｔｒｅｙａ  ｉｎｃ．から入手できる。あるいは、本発明の好ましい実施態様によれば、ＣＬＡを国際特許ＷＯ９７／１８３２０に開示された方法で製造してもよい。該特許の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする。好ましい製造方法は実施例１で後述する。
【００２４】  本明細書中で“共役リノール酸”または“ＣＬＡ”なる用語が使用されているとき、これらの用語が常に、ＣＬＡ部分を含有するそれらの誘導体をも包含することを理解されたい。“ＣＬＡ部分”なる用語は、ＣＬＡ誘導体の（１個または複数の）ＣＬＡ脂肪酸アシル部分を意味する。
【００２５】  本発明に従って使用されるＣＬＡは局所用組成物中に有効量で存在する。通常は、有効成分の総量が組成物の０．０００１−５０重量％の範囲になる量で存在する。最小コストで最大効果を得るために、より好ましくはこの量は、０．０１−１０重量％であり、最も好ましくは０．１−５重量％である。
【００２６】  本発明の組成物はまた、特にレチノイン酸、レチノール、レチニルエステル及び／またはＬＲＡＴ／ＡＲＴＡインヒビターを含む。
【００２７】  “レチノール”なる用語は、レチノールの以下の異性体を包含する：全−トランス−レチノール、１３−シス−レチノール、１１−シス−レチノール、９−シス−レチノール、３，４−ジデヒドロ−レチノール。好ましい異性体は、全−トランス−レチノール、１３−シス−レチノール、３，４−ジデヒドロ−レチノール、９−シス−レチノールである。市場で入手し易いという理由で全−トランス−レチノールが最も好ましい。
【００２８】  レチニルエステルはレチノールのエステルである。“レチノール”なる用語は上記に定義した。本発明に使用され得る適当なレチニルエステルはレチノールのＣ１−Ｃ３０エステル、好ましくはＣ２−Ｃ２０エステル、最も好ましくはＣ２−Ｃ３エステルであり、より入手し易いという理由でＣ１６エステルが好ましい。本発明に使用され得る好ましいエステルは、市場で最も入手し易く従って最も廉価であるという理由でパルミチン酸レチニル、酢酸レチニル、プロピオン酸レチニル及びリノール酸レチニルから選択される。レチニルエステルはまた有効性の点からも好ましい。
【００２９】 ＬＲＡＴ／ＡＲＡＴインヒビター
レチノールはヒトの体内で天然に産生される内因性化合物であり、上皮細胞の正常な分化に必須である。レチノールのエステルはｉｎ−ｖｉｖｏで加水分解されてレチノールを生じる。レチニルエステル及びレチノールは以下のメカニズム：
【００３０】
【化１】
0005416875.tif 000002
に従って皮膚中で代謝されてレチノイン酸に変換されると考えられている。
【００３１】  しかしながら内在的に産生されたレチノールの殆どは迅速に不活性脂肪酸エステルに変換されて上皮細胞（ケラチノサイト）に蓄積される。
【００３２】  レチノールから不活性レチニルエステルへのエステル化は、細胞中で、酵素アシルＣｏＡレチノールトランスフェラーゼ（ＡＲＡＴ）によって触媒されてアシルＣｏＡから脂肪酸アシル基が転移するか、または、酵素レシチンレチノールアシルトランスフェラーゼ（ＬＲＡＴ）によって触媒されてホスファチジルコリンからアシル基が転移することによって達成される。これらのエステル化反応はケラチノサイト中で極めて効率的であり、細胞性レチノイドの大部分（９５％）はレチニル脂肪酸エステルの形態である。
【００３３】  従って、本出願中の“ＬＲＡＴ／ＡＲＡＴインヒビター”なる用語は、これらのエステル化反応を阻害し、その結果としてレチノイン酸への変換に利用できるレチノールの量を増加させることによってレチノールの作用を増強する因子を意味する。
【００３４】  本発明の範囲内のＬＲＡＴ／ＡＲＡＴインヒビターとして認定される化合物は、実施例３で後述するｉｎ  ｖｉｔｒｏミクロソームアッセイ（Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  Ａｓｓａｙ）によって測定したときに１００μＭの濃度でＬＲＡＴまたはＡＲＡＴによって触媒されるレチノールのエステル化を少なくとも２０％阻害する化合物である。本発明の好ましい実施態様では、ＬＲＡＴ／ＡＲＡＴインヒビターは、１００μＭの濃度でＬＲＡＴまたはＡＲＡＴによって触媒されるレチノールのエステル化を少なくとも４０％、最も好ましくは少なくとも５０％阻害する化合物である。化合物がこのようなＬＲＡＴ／ＡＲＡＴインヒビターであるか否かを判定するために使用されるｉｎ  ｖｉｔｒｏミクロソームアッセイは実施例３に後述する。
【００３５】  従って、ある化合物がこのｉｎ  ｖｉｔｒｏミクロソームアッセイに合格したとき、即ち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏミクロソームアッセイによって測定したときに化合物がＬＲＡＴまたはＡＲＡＴに触媒されるレチノールのエステル化を十分に阻害するとき、該化合物はたとえ本文中に特定されていなくても本発明に包含される。
【００３６】  このようなＬＲＡＴ／ＡＲＡＴインヒビターの例は、脂肪酸アミド、ヒドロキシ脂肪酸アミド、セラミド、メリナミド、イミダゾリジノン及び脂環式不飽和炭化水素、テルペン及び脂肪酸ヒドロキシエチルイミダゾリン界面活性剤である。
【００３７】 脂環式不飽和化合物
適当な脂環式不飽和化合物は上述のｉｎ−ｖｉｔｒｏミクロソームアッセイテストによって選択される。
【００３８】  好ましい脂環式不飽和化合物は、脂環式不飽和アルデヒド、ケトン、アルコール及びエステル、例えば、アルファダマスコン、ベータダマスコン、デルタダマスコン、イソダマスコン、ダマセノン、アルファイオノン、ベータイオノン、アリルアルファイオノン、イソブチルイオノン、アルファメチルイオノン、ガンマメチルイオノン、ブラーマノール、サンダノール、アルファテルピネオール、リラール、エチルサフラネート、及び、それらの混合物から選択される。好ましくは、最低コストで最高性能を得るために、脂環式不飽和化合物をダマスコン及びイオノンから成るグループから選択する。
【００３９】  最も好ましくは、脂環式不飽和化合物はα−ダマスコン及び／またはα−イオノンである。
【００４０】 ジテルペン
適当なジテルペンは上述のｉｎ−ｖｉｔｒｏミクロソームアッセイテストによって選択される。好ましいジテルペン化合物はゲラニルゲラニオールであり、これはレチノールのエステル化の強力なインヒビターである。
【００４１】 脂肪酸ヒドロキシエチルイミダゾリン界面活性剤
本発明に包含される脂肪酸ヒドロキシエチルイミダゾリン界面活性剤は上述のｉｎ−ｖｉｔｒｏミクロソームアッセイテストに合格するものである。好ましい脂肪酸ヒドロキシエチルイミダゾリンは以下の一般構造：
【００４２】
【化２】
0005416875.tif 000003
〔式中、Ｒは８−２０個の炭素原子を含有する飽和または不飽和の直鎖状または分枝状の脂肪族炭化水素鎖である〕を有している。
【００４３】  好ましくは、脂肪酸ヒドロキシエチルイミダゾリン中のＲは８−１８個の炭素原子、より好ましくは１１−１８個の炭素原子を含有している。市場での入手容易性及び有効性の面からより好ましい脂肪酸ヒドロキシエチルイミダゾリンはオレイルヒドロキシエチルイミダゾリンである。
【００４４】 脂肪酸アミド
好ましくは、脂肪酸アミドが少なくとも６個の炭素原子を含有している。適当な脂肪酸は飽和及び不飽和の直鎖状または分枝状の脂肪酸を包含する。より長鎖の脂肪酸アミドのほうが皮膚のコンディショニングに有益であるので、適当な脂肪酸は好ましくは８−２４個の炭素原子、より好ましくは１２−２０個の炭素原子を含有し、最も好ましくは１２−１８個の炭素原子を含有する。必須脂肪酸が皮膚に栄養を与えるので、本発明の最も好ましい実施態様では必須脂肪酸のアミドが使用される。必須脂肪酸の非限定例としては、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、ガンマ−リノレン酸、ホモ−ガンマ−リノレン酸、及び、それらの混合物がある。リノール酸はまたセラミドの前駆物質であるので最も好ましい。
【００４５】  本発明に包含される好ましいアミドは、モノ−及びジ−アルカノールアミド、特に必須脂肪酸のアルカノールアミドである。アルキルアミドよりもアルカノールアミドのほうが入手し易い。
【００４６】  最も好ましい脂肪酸アミドは、リノール酸、パルミチン酸及びココヤシ油のモノ−及びジエタノールアミド及びホスファチジルエタノールアミン、ジエチルコカミド、リノレアミジルジメチルアミン、ジメチルリノレアミド、ジエチルリノレアミド、ジメチルパルミチド、ミリストイルサルコシンから選択される。
【００４７】 ヒドロキシ脂肪酸アミド
ヒドロキシ脂肪酸アミドの構造は以下の式：
【００４８】
【化３】
0005416875.tif 000004
で示される。式中のＲ１、Ｒ２及びＲ４の各々は独立に、水素、及び、１−２０個の炭素原子を含有しヒドロキシル化されてもよい直鎖状または分枝状の飽和または不飽和の脂肪族炭化水素から選択され、
Ｒ３は−（ＣＨ２）ｎ−を表し、ここでｎは０−１８の整数である。
【００４９】  好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４の各々が独立に、２−２０個の炭素原子、より好ましくは２−１５個の炭素原子、最も好ましくは３−１３個の炭素原子を含有している。
【００５０】  好ましくは、ヒドロキシ酸アミドがα−またはβ−ヒドロキシ酸のアミドである。即ち、ｎが０または１である。
【００５１】  本発明の組成物に含有させる最も好ましいヒドロキシ脂肪酸アミドは、ラクトアミド−モノエタノールアミド、Ｃ１３−β−ヒドロキシ酸アミド（２−ヒドロキシ−Ｃ１３−アミド）、Ｎ−ヒドロキシエチル−２−ヒドロキシ−Ｃ１６アミド、１２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）オクタデカンアミド、及び、ヒマシ油のモノエタノールアミドである。
【００５２】多環式トリテルペンカルボン酸（ＰＴＣＡ）
適当なＬＲＡＴ／ＡＲＡＴインヒビターの別の例は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏミクロソームアッセイに合格するＰＴＣＡである。
【００５３】  好ましくはＰＴＣＡは五環性のトリテルペンモノカルボン酸である。
【００５４】  最も好ましくはＰＴＣＡは、ウルソール酸、オレアノール酸、グリシルレチン酸及びグリシルリジン酸（ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｃ  ａｃｉｄ）から成るグループから選択される。
【００５５】  ＰＴＣＡはＡｌｄｒｉｃｈ及びＳｉｇｍａから市販されている。ＰＴＣＡを含有する植物抽出物、例えば、Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ（ローズマリー）、Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ種（カキ）、Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ  ｓｕｓｐｅｎｓａ（レンギヨウ）、Ｌａｖａｎｄｕｌａ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ（ラベンダー）、Ｐｒｕｎｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ（シソ）、Ｐａｅｏｎｉａ  ｌａｃｔｉｆｏｌｉａ、Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ  ｇｌａｂｒａ（カンゾウ）のエキスは本発明に好適に使用され得る。
【００５６】  組成物のｐＨ次第では、ＰＴＣＡが組成物中に塩の形態、例えばアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩の形態で存在し得ることを理解されたい。
【００５７】 セラミド
セラミドは例えば、天然産生セラミド、植物セラミド、短鎖セラミド、擬似セラミドまたはネオセラミドでよい。これらの分子の一般構造は欧州特許公開ＥＰ  Ａ  ７１１５５８に記載されている。該特許の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする。有効性の点で最も好ましいセラミド誘導体はアセチルスフィンゴシンである。
【００５８】  レチノイン酸、レチノール、レチニルエステル及び／またはＬＲＡＴ／ＡＲＡＴインヒビターは本発明組成物中に、組成物の０．０００１重量％−５０重量％の範囲、好ましくは０．０１重量％−１０重量％の範囲、最も好ましくは０．１重量％−５重量％の範囲の量で使用される。
【００５９】 皮膚科学的に許容されるビヒクル
本発明に従って使用される組成物はまた、有効成分の希釈剤、分散剤または担体として作用する皮膚科学的／美容的に許容されるビヒクルから成る。ビヒクルは、水、液体状または固体状の皮膚緩和薬、シリコーン油、乳化剤、溶媒、保湿剤、増結剤、粉末、液体発泡剤などのような皮膚保護製品に常用の材料から成り得る。
【００６０】  ビヒクルは一般的に組成物の５−９９．９重量％、好ましくは２５−８０重量％を形成し、別の化粧品添加物が存在しないときは、組成物のバランスを形成し得る。
【００６１】 任意の皮膚有効物質及び化粧品添加物
有効成分以外に、日光遮断剤、別の皮膚美白剤、日焼け剤のようなその他の特定の皮膚有効物質を含有させてもよい。また、ビヒクルが更に、香料、乳白剤、保存剤、着色剤及び緩衝剤のような添加剤を含有してもよい。
【００６２】 製品の調製、形態、使用及び包装
本発明方法に使用される局所用組成物を調製するために、皮膚保護製品の通常の調製方法を使用し得る。一般には皮膚科学的／美容的に許容される担体に有効成分を慣用の方法で混和させる。適当な方法としては、組成物に含有させるべき水または別の溶媒もしくは液体の一部に有効成分を先ず溶解または分散させる。好ましい組成物は水中油型または油中水型または水中油中水型エマルジョンである。
【００６３】  組成物は、クリーム、ジェルまたはローション、カプセル、などのような慣用の皮膚保護製品の形態でよい。組成物はまた、所謂“濯ぎ落とし（ｗａｓｈ−ｏｆｆ）型”製品、例えば、浴用またはシャワー用ジェルでもよい。これらの組成物は場合によっては、濯ぎ中に有効成分が皮膚に付着することを促進するデリバリーシステムを含んでいる。最も好ましくは製品が“塗り置き（ｌｅａｖｅ−ｏｎ）型”製品、即ち、皮膚に塗布され、塗布直後に入念な濯ぎ段階が不要な製品である。組成物は、慣用の例えばジャー、ボトル、チューブ、ロール−ボールなどに任意の適当な方法で包装され得る。また、本発明組成物を同時にまたは順次に皮膚に塗布される２つの独立組成物のキットとして包装するように設計してもよい。第一の組成物は共役リノール酸を含有し、第二の組成物はレチノイン酸、レチノール、レチニルエステル／ＬＲＡＴ／ＡＲＡＴインヒビター化合物を含有している。
【００６４】  本発明組成物はまた、錠剤、カプセルなどのような経口摂取に適した形態に製品化してもよい。
【００６５】  本発明方法は、治療を要する皮膚に対して１日１回またはそれ以上の回数で行うとよい。皮膚の状態、本発明方法に使用した有効成分の濃度、組成物の使用量及び組成物の塗布頻度などに依存して通常は３−６カ月後に皮膚外観の改善が明らかになる。一般的に、例えば０．１−５ｍｌという少量の組成物を適当な容器またはアプリケーターから皮膚に塗布し、手または指または適当なデバイスを使用して皮膚に塗り延ばすか及び／または擦り込む。組成物が“塗り置き型”製品または“濯ぎ落とし型”製品のいずれの形態で製品化されているかに応じて任意に後続の濯ぎ段階を行う。
【００６６】  本発明がより容易に理解できるように、以下の実施例を単なる代表例として示す。
【００６７】 実施例
実施例１
この実施例はｃ９  ｔ１１異性体及びｔ１０  ｃ１２異性体を含む共役リノール酸の合成を示す。
【００６８】 ＣＬＡの混合異性体の製造
“Ａｎａｌａｒ  Ｒｅａｇｅｎｔ”（ＡＲ）水酸化ナトリウム（０．６ｋｇ）を６ｋｇの医薬グレードのプロピレングリコールに混合し８０−８５℃に加熱することによって溶解した。サンプルを冷却し、２ｋｇのベニバナ油を添加した。標準パイロット規模装置を使用し、混合物を速やかに撹拌しながら１７０℃で３時間還流させた。反応混合物を約９５℃に冷却し、撹拌機を中速に減速し、温度を約９０℃に維持しながら脱イオン水（８リットル）に溶解した３５．５％の塩酸を１．２８０リットル使用して混合物を中和した。反応混合物を沈降させ、水相を流出させた。油相を２×１リットルの５％ＡＲ塩溶液及び９０℃の２×１リットルの脱イオン水で洗浄し、セッケン性物質を完全に除去した。ＣＬＡを富化した油を真空下に１００℃で乾燥した後、約５０℃で抜き出し、Ｗｈａｔｍａｎフィルターとセライト−ハイフロ−濾過助剤の薄層とを含むＢｕｃｈｎｅｒシステムで濾過した。ＣＬＡの混合異性体を含む油を必要になるまで窒素下、−２５℃で保存した。この方法で得られた油の組成を以下の表１に示す：
【００６９】
【表１】
0005416875.tif 000005
【００７０】  ２．ｃ９  ｔ１１異性体を富化したＣＬＡの製造
（Ｉ）ラウリルエステルの調製：
ベニバナから調製したＣＬＡ（２．０ｋｇ）を２×モル当量のラウリルアルコール（１−ドデカノール；９８％、Ａｌｄｒｉｃｈ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）に５．９６ｋｇの脱イオン水と共に添加した。温度を２５℃に調整し、少量の水を予め混合した１％（ｗ／ｗ）のＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  Ｃａｎｄｉｄｕｍ（Ａｍａｎｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｊａｐａｎ）を添加し、激しく撹拌した。４４時間で反応を停止した。容器を８０−９０℃に加熱し、水相を排出し、油を脱イオン水で洗浄し、真空下に１００℃で３０分間乾燥した。油を５０℃に冷却し、Ｗｈａｔｍａｎフィルターとセライト−ハイフロ−濾過助剤の薄層とを含むＢｕｃｈｅｒシステムで濾過した。
【００７１】  （ＩＩ）ｃ９，ｔ１１を富化したＣＬＡエステルの分離：
１３０℃で２５−３５ｍｌ／分で分子蒸留させることによって残留ラウリルアルコールを除去した。残渣を１５８℃で２５−３５ｍｌ／分の流速で蒸発させることによってラウリルエステル（ｃ９，ｔ１１を富化したＣＬＡ）と遊離酸（ｔ１０，ｃ１２を富化したＣＬＡ）とに粗分離した。ラウリルエステル残渣中に残留する遊離酸は、１７１℃で３０−４０ｍｌ／分の流速で更に蒸留することによって減少させた。２７９０ｇのラウリルエステル残渣を９０℃で４ＭのＡＲ水酸化ナトリウム３３０ｍｌを使用して中和し、次いで水相から油を分離し、高温の脱イオン水で油を３回洗浄し、更に０．１Ｍのアルカリで洗浄し、湯で２回洗浄した。富化したラウリルエステル油サンプルを上記同様に乾燥した。
【００７２】  （ＩＩＩ）ｃ９，ｔ１１を富化したＣＬＡラウリルエステルのケン化
ｃ９，ｔ１１を富化したＣＬＡのラウリルエステルをＡＲ水酸化ナトリウム／９６％食品グレードエタノールを使用してケン化し、ＡＲ濃塩酸を使用して再び酸性化した。富化ＣＬＡ遊離脂肪酸を含有する反応混合物を１００℃で乾燥し、上記同様に約５０℃で濾過した。ラウリルアルコールを１３２℃で２５−３０ｍｌ／分で蒸発させた。残留ラウリルアルコールを完全に除去するために、ＳＰ３９２  Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉリパーゼ（５％，Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ製のｂａｔｃｈ  ｌｕｘ  ０１１０）を使用して遊離アルコールを反応混合物中に存在する脂肪酸とエステル化した。真空下、１５５℃、１５−２０ｍｌ／分で分子蒸留を使用してｃ９，ｔ１１富化ＣＬＡを含有する脂肪酸をラウリルエステルから分離した。上記方法で製造したｃ９，ｔ１１富化ＣＬＡの組成を以下の表２に示す：
【００７３】
【表２】
0005416875.tif 000006
【００７４】  （ＩＩ）ｔ１０，ｃ１２を富化したＣＬＡの分離：
１３０℃で２５−３５ｍｌ／分で分子蒸留させることによって残留ラウリルアルコールを除去した。残渣を１５８℃で２５−３５ｍｌ／分の流速で蒸発させることによってラウリルエステル（ｃ９，ｔ１１を富化したＣＬＡ）と遊離酸（ｔ１０，ｃ１２を富化したＣＬＡ）に粗分離した。
【００７５】 ｔ１０，ｃ１２富化ＣＬＡの単離
エステル含量を減少させるために前段階（ＩＩ）で得られたＣＬＡ遊離酸を１６０−１６５℃で２０−３０ｍｌ／分で再度蒸留した。１３１℃で２５−３０ｍｌ／分の流速で蒸留することによって残留ラウリルアルコールを更に減少させた。残留ラウリルアルコールを完全に除去するために、ＳＰ３９２  Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉリパーゼ（５％，Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ製のｂａｔｃｈ  ｌｕｘ  ０１１０）を使用して遊離アルコールを反応混合物中に存在する脂肪酸とエステル化した。真空下、１５５℃、１５−２０ｍｌ／分で分子蒸留を使用してｔ１０，ｃ１２富化ＣＬＡを含有する脂肪酸をラウリルエステルから分離した。この方法で製造したｔ１０，ｃ１２富化ＣＬＡの組成を以下の表３に示す：
【００７６】
【表３】
0005416875.tif 000007
【００７７】 実施例２−ｔ１０，ｃ１２  ＣＬＡトリグリセリドの製造
実施例１に従って調製したｔ１０，ｃ１２富化ＣＬＡ（１０ｇ）を１．０１ｇ（１０．１％）のグリセロール（Ｅｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｅｖｅｒａｒｄｓ製のＰｒｉｃｅｒｉｎｅ  ９０８３グリセリンＣＰ）と混合し、０．５ｇ（約５％）のＳＰ３９２  Ｍｕｃｏｒ  Ｍｉｅｈｅｉ非特異的リパーゼ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ｂａｔｃｈ  Ｌｕｘ  ０１１０製のＭｕｃｏｒ  Ｍｅｉｈｅｉ）を添加した。混合材料をロータリーエバポレーターで真空下、６０℃、少量の窒素ブリードを伴って撹拌した。
【００７８】  ９６時間後、混合物をＢｕｃｈｅｒフィルターのセライトスーパーセル濾過助剤の薄層で濾過することによって反応を停止させ、ＣＬＡトリグリセリド油相を収集した。油相の組成を以下の表４に示す：
【００７９】
【表４】
0005416875.tif 000008
【００８０】 実施例３
この実施例は、レチノールのエステル化を検定するｉｎ  ｖｉｔｒｏミクロソームアッセイを使用して本発明の範囲内のＬＲＡＴ／ＡＲＡＴインヒビターを同定する方法を示す。
【００８１】 レチノールのｉｎ  ｖｉｔｒｏミクロソームエステル化方法
ミクロソームは、Ｊ．Ｃ．Ｓａａｒｉ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌ．Ｂｒｅｄｂｅｒｇ，“ＣｏＡ  ａｎｄ  Ｎｏｎ−ＣｏＡ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｒｅｔｉｎｏｌ  Ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３，８０８４−９０（１９８８）に記載の手順で得られる。
【００８２】  ０．１Ｍのリン酸ナトリウムバッファｐＨ７と、５ｍＭのジチオトレイトールと、２ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンと、４０マイクロモーラーのパルミトイルＣｏＡと、４０マイクロモーラーのジラウロイルホスファチジルコリンと、１０マイクロモーラーのレチノールと被検化合物または溶媒ブランクとを含有する溶液を、ウシのレチナール色の上皮細胞から単離したミクロソーム画分と共に３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、等容量のエタノールを加えて反応を停止させ、形成されたレチニルエステル（ＡＲＡＴ触媒反応からはパルミチン酸レチニル、ＬＲＡＴ触媒反応からはラウリン酸レチニル）をヘキサンで抽出した。ヘキサン層を取り出し、窒素下で蒸発させ、残渣を３．９×３００ｍｍのＣ１８逆相カラムでテトラヒドロフラン移動相中の８０％メタノールを使用してＨＰＬＣによって分析し、蛍光を検出（３２５ｎｍで励起、４８０ｎｍで発光）して、レチニルエステルを定量した。溶媒ブランクの存在下で形成されたエステルの量を１００％とし、これを使用して被検化合物によるエステル形成阻害のパーセントを計算した。対照としてはミクロソームのアリコートを５分間煮沸することによって失活させたものを用いた。この結果によれば、エステル形成が少なくとも９５％阻害されていた。
【００８３】  得られた結果を表５にまとめる。
【００８４】
【表５】
0005416875.tif 000009
【００８５】  アセチルスフィンゴシン、ＬＯＤＥＡ、ＬＯＭＥＡ及びヒドロキシエチルイミダゾリン界面活性剤が強力なレチノールエステル化インヒビターであり、その他の界面活性剤及びその他の複素環化合物は本質的に不活性であることが認められる。カプリルヒドロキシエチルイミダゾリン（Ｒ＝ＣＨ３（ＣＨ２）６）はＬＲＡＴを十分に阻害しなかった。
【００８６】  このｉｎ  ｖｉｔｒｏミクロソームアッセイテストを表６Ａ及び表６Ｂに挙げた化合物に対して行った。
【００８７】  表６Ａの化合物は１００μＭの濃度で試験された。表６Ｂの化合物は１０μＭの濃度で試験された。
【００８８】
【表６】
0005416875.tif 000010
【００８９】
【表７】
0005416875.tif 000011
【００９０】  表６Ａ及び表６Ｂの結果から、ある種の脂環式不飽和化合物、特にイオノン及びダマスコンは、ＬＲＡＴ及びＡＲＡＴに触媒されるレチノールエステル化の強力なインヒビターであると認められる。これらは、レチノール中に存在するトリメチルシクロヘキセン環系を含有している。
【００９１】  追加の脂環式不飽和化合物に対してｉｎ−ｖｉｔｒｏミクロソームアッセイテストを行った。得られた結果を表７にまとめる。
【００９２】  表７の化合物は１００μＭの濃度で試験した。
【００９３】
【表８】
0005416875.tif 000012
【００９４】  表７の結果から、脂環式不飽和化合物の必ずしも全部がＬＲＡＴ及びＡＲＡＴに触媒されるレチノールエステル化を阻害しないかまたは十分に阻害しないことが明らかである。
【００９５】  ジテルペン化合物、ゲラニルゲラニオールまたはファルネソールに対してｉｎ−ｖｉｔｒｏミクロソームアッセイテストを行った。
【００９６】  得られた結果を表８にまとめる。
【００９７】
【表９】
0005416875.tif 000013
１  ＴＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，Ｏｒｅｇｏｎ）から入手。また、Ｓｉｇｍａ、及び、ＣＴＣ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ａｔｌａｎｔａ，Ｇｅｏｒｇｉａ）からも入手可能。
２  Ｇｉｖａｕｄａｎ  Ｃｏ．、Ｂｅｄｏｕｋｉａｎ  Ｃｏ．、または、Ｄｒａｇｏｃｏ  Ｃｏ．から入手可能。
【００９８】  表８の結果から、ゲラニルゲラニオール及びファルネソールの双方がレチノールのエステル化を阻害することが明らかである。ゲラニルゲラニオールはファルネソールよりも実質的に強力なエステル化インヒビターである。
【００９９】 実施例４
比較目的のレチノイン酸による局所処理後のｉｎ  ｖｉｖｏ皮膚のプロコラーゲン−Ｉ及びデコリンの上方調節の同定
主要なマトリックス皮膚タンパク質であるコラーゲンは、皮膚に引張り強度（張り）を与えることが知られている。デコリンは、コラーゲンが皮膚の細胞外マトリックス中に調節的に適正に沈積するために重要であることが知られたプロテオグリカンである。また、老化肌及び／または光損傷肌では皮膚中のコラーゲン及びデコリンのレベルが著しく低下していることも公知である。多くの研究は、皮膚のＩ型コラーゲンのレベルが加齢及び／または光損傷の増加に伴って低下することを証明した（例えば、Ｌａｖｋｅｒ，Ｒ．Ｊ．Ｉｎｖ．Ｄｅｒｍ．，（１９７９），７３，７９−６６；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．ｍｅｄ．（１９９３）３２９，５３０−５３５）。デコリンの場合、ｍＲＮＡ発現及びプロテオグリカンの発現はｉｎ  ｖｉｔｒｏの光損傷皮膚中で大幅に減少することが証明された（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９５）７２，６６２−６６９）。従ってこれらの皮膚タンパク質のレベル低下は、皺及び弛みの原因となる皮膚の引張り強度の低下に関連している。
【０１００】  レチノイン酸が老化防止の強力な有効成分であり、光損傷した皮膚の真皮修復を誘発することは公知である。レチノイン酸で皮膚を局所処理した後の皺の消滅及び真皮の修復は、皮膚における新しいコラーゲンの沈積及び合成によって生じることが教示された（例えば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．ｍｅｄ．（１９９３）３２９，５３０−５３５）。レチノイン酸を使用して皮膚のコラーゲンレベルを向上させることによって真皮マトリックスを強化すると老化防止／真皮修復という有益な効果が得られることは広く認められている。プロコラーゲン−Ｉはコラーゲンの前駆物質である。被検化合物の塗布に応答したプロコラーゲン−Ｉの産生増加は、コラーゲンレベル上昇のマーカーである。
【０１０１】  両腕の前腕外側が同程度またはほぼ同程度の軽度から中等度の光損傷を生じた女性の２つのグループを募集した。彼女らに、湿潤剤ベース中の０．０５％のレチノイン酸（ＲｅｔｉｎｏｖａＲＴＭ）を提供し、また、プラセーボ対照として同様の官能特性を有するが有効成分非含有の調和した色の湿潤クリーム（ＤｅｒｍａｃａｒｅＲＴＭローション）を提供した。２つのグループの参加者の各人が一方の腕の前腕外側にＲｅｔｉｎｏｖａＲＴＭを塗布し、他方の腕の前腕外側にプラセーボ（ＤｅｒｍａｃａｒｅＲＴＭ）を塗布した。グループ１では前腕外側に対する１日１回の製品塗布を１４週間継続し、グループ２では前腕外側に対する製品塗布を２８週間継続した。試験の終了時点で、各前腕の処理領域から全厚み４ｍｍの２つのパンチ生検組織を採取した。皮膚の細胞外マトリックス成分、デコリン及びプロコラーゲン−Ｉ、の発現に対するレチノイン酸処理の効果をプラセーボ処理した前腕に比較して同定するために、参加者から採取した生検組織の免疫組織化学分析を行った。以下の手順に従った。
【０１０２】 材料
ロウ引き切片用の抗体希釈バッファは、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．０５％トリトンＸ−１００及び０．０５％ナトリウムアジドから構成した。プロコラーゲン−Ｉ（アミノ末端）に対する第一抗体はＣｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．（ｃａｔ＃  ＭＡＢ  １９１２、ラットＩｇＧ１）から入手し、トリプシンで前処理（０．５ｍｇ／ｍｌ、２５分間、３７℃）した後の切片に１：８００の希釈度で４℃で一夜使用した。デコリンに対する第一抗体はＢｉｏｇｅｎｅｓｉｓ（ウサギポリクローナル）から入手し、ロウ引き切片に１：８００の希釈度で４℃で一夜使用した。ＤＡＫＯから入手した抗ラットビオチニル化第二抗体（ｃａｔ＃  Ｅ０４６８、ウサギポリクローナル）は、１：４００の希釈度でロウ引き切片に使用した。Ａｍｅｒｓｈａｍから得られた抗ウサギビオチニル化第二抗体（ｃａｔ＃  ＲＰＮ  １００４、ロバポリクローナル）は１：４００の希釈度でロウ引き切片に使用した。Ｚｙｍｅｄから得られたストレプトアビジンコンジュゲートアルカリホスファターゼ（ｃａｔ＃  ４３−４３２２）は１：２５００の濃度で使用した。ファーストレッド色素原はＤＡＫＯ（ｃａｔ＃  Ｋ５９７）から得られた。Ｓｉｇｍａから得られた核対比染料ギル＃３ヘマトキシリン（ｃａｔ＃  ＧＨＳ−３）を濾過し、希釈しないで使用した。トリプシンはＳｉｇｍａ（ｃａｔ＃  Ｔ−７１８６）から入手し、スライドはＤＡＤＯのＧｌｙｃｅｒｇｅｌ（ｃａｔ＃  Ｃ５６３）で作製した。
【０１０３】 方法
生検組織のロウ引き切片をシラン被覆スライドに作製し、５５℃で１８時間ベーキングした。キシレン及びアルコールによってスライドを脱ロウし、水に入れ、次いでＴＢＳに移した。ＤＡＫＯＲＴＭペンを使用して切片に円を描いた。必要ならばトリプシンを各抗体に関する指定通りに使用して切片を抗原回収用に加工した。抗原回収が必要な場合、スライドを０．５ｍｇ／ｍｌのトリプシン（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ＃  Ｔ−７１８６）と共に３５℃で２５分間インキュベートした。次いで、プロテアーゼをＴＢＳで濯ぎ落とした（２×２分間）。抗原回収が必要なときは抗原検索の後、そうでないときは切片に円を描いた後直接に、ＴＢＳ／０．５％ＢＳＡ／０．１％ナトリウムアジド中の第二抗体宿主血清の５％溶液をブロッキング溶液として使用し、非特異的抗体結合を湿潤室中で室温で少なくとも２０分間ブロックした。余剰のブロッキング溶液を排出させたが、切片が乾燥しないようにした。次に切片を（上記の指定通りに適宜希釈した）第一抗体と共に湿潤室中で４℃で一夜インキュベートした。次いで、切片が乾燥しないようにして抗体を切片から排除した。次に、未結合の第一抗体を除去するためにスライドをＴＢＳで洗浄し−順次に、１分間の濯ぎ及び５分間の洗浄を３回行う−、次いで適当な（上記の指定通りに適宜希釈した）第二抗体と共に湿潤室中で室温で１時間インキュベートした。
【０１０４】  続いて、切片が乾燥しないようにして抗体溶液をスライドから排除した。未結合の第二抗体を除去するために、ＴＢＳ中でスライドを洗浄し、１分間濯ぎ、次いで４×５分間洗浄した。ビオチニル化第二抗体の場合、続いて切片をストレプトアビジンコンジュゲートと共に３７℃で４５分間インキュベートし、次いでＴＢＳ中で洗浄して未結合のストレプトアビジンコンジュゲートを除去した。色素原を添加し、過染を避けるために観察しながら発色させた。次に切片を対比染色してスライドに作製した。
【０１０５】  レチノイン酸（ＲｅｔｉｎｏｖａＲＴＭ）処理部位とプラセーボ（ＤｅｒｍａｃａｒｅＲＴＭ）処理部位との間のプロコラーゲン−Ｉ及びデコリンの発現の差は、光学顕微鏡を用いた免疫組織化学染色切片の目視評価によって判定した。
【０１０６】  この分析から、以下の表９に示すように、レチノイン酸（ＲｅｔｉｎｏｖａRTM）を局所塗布した後の光損傷皮膚中のプロコラーゲン−Ｉ及びデコリンの顕著な上方調節が確認された。
【０１０７】
【表１０】
0005416875.tif 000014
【０１０８】  従って細胞外マトリックス成分であるプロコラーゲン−Ｉとデコリンとはレチノイン酸に誘発される真皮修復の明らかに同定できるマーカーである。
【０１０９】 実施例５
ヒト真皮繊維芽細胞中のプロコラーゲン−Ｉ及びデコリン合成の測定手順
真皮繊維芽細胞ならし培地の調製
原発性ヒト包皮の継代２（Ｐ２）の繊維芽細胞を１２−ウェルのプレートに１００００細胞／ｃｍ２で播種し、１０％ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ改質イーグル培地（ＤＭＥＭ）に入れて５％二酸化炭素及び４％酸素雰囲気中で２４時間維持した。この時間の経過後、細胞を無血清ＤＭＥＭで洗浄し、次いで新しい無血清ＤＭＥＭ培地中で更に６０時間インキュベートした。次に繊維芽細胞単層を無血清ＤＭＥＭで再度洗浄した。三重複試験の形態で、最終容量０．４ｍｌ／ウェルの新しい無血清ＤＭＥＭ中で被検試薬とビヒクル対照とを細胞に添加し、更に２４時間インキュベートした。この繊維芽細胞ならし培地を直ちに分析するかまたは後で分析するために液体窒素中で急冷凍して−７０℃で保存した。次に細胞をカウントし、次いでドット−ブロット分析から得られたデータを細胞数に標準化した。
【０１１０】 実施例６
真皮繊維芽細胞ならし培地中のプロコラーゲン−Ｉ及びデコリンタンパク質のドット−ブロットアッセイ
ビヒクル（対照として）または被検試薬で処理した真皮繊維芽細胞ならし培地のサンプルに、２０ｍＭのジチオトレイトール（２００ｍＭの予製液を１：１０に希釈）及び０．１％のドデシル硫酸ナトリウム（１０％の予製液を１：１００に希釈）を補充し、十分に混合し、次いで７５℃で２分間インキュベートした。アッセイ標準は、上述のように、１７５ｃｍ２のフラスコ中に１００００細胞／ｃｍ２で播種し無血清ＤＭＥＭ中に維持することによって繊維芽細胞から調製した正味の繊維芽細胞ならし培地の系列希釈によって作製した。
【０１１１】  次いで、Ｂｉｏ−Ｒａｄの９６−ウェルＢｉｏ−Ｄｏｔ装置を製造業者の説明書に記載された通りに使用し、三重複試験の形態で、予め湿らせたＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ転移膜シートにアッセイサンプルを塗布した。１ウェルあたり約２００μｌの培地を塗布した。培地を重力下で膜濾過（３０分間）した後、膜をＰＢＳ（２００μｌ）で２回洗浄した。これらのＰＢＳ洗浄液を重力下で膜濾過した（２×１５分）。次に、Ｂｉｏ−Ｄｏｔ装置を真空マニホルドに接続し、第三及び最終のＰＢＳ洗浄を吸引下で実施した。装置を分解し、膜を取り出し、必要に応じて速やかに裁断し、ブロッキングバッファに入れて４℃で一夜維持した。デコリン分析用に調製した膜は、ＰＢＳ中の３％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ／０．１％（ｖ／ｖ）のトゥイーン２０でブロックし、一方、プロコラーゲン−Ｉ分析用に調製した膜は、ＰＢＳ中の５％（ｗ／ｖ）粉末脱脂ドライミルク／０．０５％トゥイーン２０でブロックした。
【０１１２】  翌日、膜を１：１００００の希釈度のヒトのプロコラーゲン−Ｉに対する第一抗体（ＭＡＢ１９１２；ラットモノクローナル；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔ．Ｉｎｃ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）またはヒトのデコリンに対する第一抗体（ウサギポリクローナル；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）によって室温で２時間プローブした。次に膜をＴＢＳ／０．０５％トゥイーン２０で洗浄し（３×５分間）、次いで必要に応じて１：１０００の希釈度の１２５Ｉ−コンジュゲート抗−ラットまたは抗−ウサギＦ（ａｂ’）２フラグメント（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共に室温で１時間インキュベートした。この後に、ＩｍｍｏｂｉｌｏｎストリップをＴＢＳ／トゥイーン２０で再度洗浄した後（３×５分間）、室温で風乾した。乾燥した膜をセロファンに包み、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ストレージ蛍光スクリーンに１６−１８時間露光した。
【０１１３】  この時間の経過時点で、露光したスクリーンをＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＭソフトウェアを使用してリン光体イメージング装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ  ＳＦ）で走査した。ドットの強度をＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＭ中の定量ツールを使用しコンピューター支援イメージ解析によって評価し、細胞数に標準化し、デコリン及びプロコラーゲン−Ｉの合成に対する種々の被検試薬の効果をビヒクル処理対照の１００任意単位の値に比較して判定した。
【０１１４】 実施例７
試験
以下の表１０は、ヒト真皮繊維芽細胞中のデコリン合成に対する共役リノール酸とＬＲＡＴ／ＡＲＡＴインヒビターＣｅｒａｍｉｄｅ  ６との組合せの相乗効果、及び、有効成分の使用量を示す。結果を標準化するために、被検物質の効果を、ビヒクル処理対照の１００任意単位の値に比較して判定した。試験に使用した試薬の濃度は細胞生存率に全く影響を与えなかった。
【０１１５】
【表１１】
0005416875.tif 000015
【０１１６】  表１０の結果は、共役リノール酸とＬＲＡＴ／ＡＲＡＴインヒビターとの組合せが対照に比較してヒト真皮繊維芽細胞中のプロコラーゲン−Ｉ及び／またはデコリンの合成を顕著に上方調節することを示す。
【０１１７】  皮膚中のデコリンのレベルは皮膚の状態及び外観の改善に関連する。皮膚中のデコリンレベルの上昇は、皺の消滅及び光損傷皮膚の真皮修復のような多くの皮膚有益効果に関連する皮膚中のコラーゲンの調節された適正な沈積に重要である。
【０１１８】 ＣＬＡとレチノイン酸との相乗作用
以下の表１１は、共役リノール酸とレチノイン酸との組合せがヒト真皮繊維芽細胞中のプロコラーゲン−Ｉ合成に与える相乗効果、及び、有効成分の使用量を示す。結果を標準化するために、被検物質の効果をビヒクル処理対照の１００任意単位の値に比較して判定した。試験に使用した試薬の濃度は細胞生存率に全く影響を与えなかった。
【０１１９】
【表１２】
0005416875.tif 000016
【０１２０】  表１１の結果は、共役リノール酸とレチノイン酸との組合せが対照に比較してヒト真皮繊維芽細胞中のプロコラーゲン−Ｉの合成を顕著に上方調節することを示す。
【０１２１】  皮膚中のデコリンのレベルは皮膚の状態及び外観の改善に関連する。皮膚中のデコリンレベルの上昇は、皺の消滅及び光損傷皮膚の真皮修復のような多くの皮膚有益効果に関連する皮膚中のコラーゲンの調節された適正な沈積に重要である。
【０１２２】 実施例８
この実施例は本発明の水中油型クリームを示す。
【０１２３】
【表１３】
0005416875.tif 000017
＊Ｂｒｉｊ  ５６はセチルアルコールＰＯＥ（１０）である。
Ａｌｆｏｌ  １６ＲＤはセチルアルコールである。
【０１２４】 実施例９
この実施例は本発明のアルコール性ローションを示す。
【０１２５】
【表１４】
0005416875.tif 000018
【０１２６】 実施例１０
この実施例は本発明の組成物を含有させた日光防御クリームを示す。
【０１２７】
【表１５】
0005416875.tif 000019
【０１２８】 実施例１１
この実施例は本発明の組成物を含有させた高含量分散質の油中水型エマルジョンを示す。
【０１２９】
【表１６】
0005416875.tif 000020
＊Ｂｒｉｊ  ９２はポリオキシエチレン（２）オレイルエーテルである。
【０１３０】  実施例８−１１は本発明の局所用組成物を示す。組成物は慣用の方法で加工できる。これらは化粧品用途に適している。組成物は、老化または光老化によって劣化した正常な皮膚に塗布されると皺のある肌、老化した肌、光損傷された肌及び／または刺激肌の外観を改善するため、また、若い皮膚に塗布されるとこのような劣化性変化を予防または遅延させるために有効なトリートメント化粧品を提供する。組成物はまた、刺激肌の鎮静、乾燥肌の調湿、肌の色の美白、及び、油／皮脂分泌の抑制にも有効である。