(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）配列番号４のアミノ酸配列を有するキメラ４Ｄ５免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含むポリペプチドと、
（Ｂ）配列番号９、配列番号１１及び配列番号１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するバリアント４Ｄ５免疫グロブリン重鎖を含むポリペプチドと
を含む免疫グロブリン。
【請求項２】
前記軽鎖可変ドメインを含むポリペプチドが配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の免疫グロブリン。
【請求項３】
前記重鎖を含むポリペプチドが配列番号９のアミノ酸配列を有する、請求項１又は２に記載の免疫グロブリン。
【請求項４】
前記重鎖を含むポリペプチドが配列番号１１のアミノ酸配列を有する、請求項１又は２に記載の免疫グロブリン。
【請求項５】
前記重鎖を含むポリペプチドが配列番号１３のアミノ酸配列を有する、請求項１又は２に記載の免疫グロブリン。
【請求項６】
前記重鎖が、野生型Ｆｃドメインと比較して、
（Ａ）強化された抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；
（Ｂ）ＦｃγＲＩＩＡ若しくはＦｃγＲＩＩＩＡへの結合の増加；
（Ｃ）ＦｃγＲＩＩＢへの結合の減少；又は
（Ｄ）ＦｃγＲＩＩＢへの結合の増加
を示すバリアントＦｃドメインを有する、請求項１〜５のいずれかに記載の免疫グロブリン。
【請求項７】
前記免疫グロブリンが抗体である、請求項１〜６のいずれかに記載の免疫グロブリン。
【請求項８】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項７に記載の免疫グロブリン。
【請求項９】
前記免疫グロブリンがダイアボディである、請求項７に記載の免疫グロブリン。
【請求項１０】
前記免疫グロブリンが抗体の免疫学的に活性なエピトープ結合性断片である、請求項１〜６のいずれかに記載の免疫グロブリン。
【請求項１１】
患者における癌の処置のための医薬の製造における、請求項１〜１０のいずれかに記載の免疫グロブリンの使用。
【請求項１２】
前記癌がＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する癌であり、前記免疫グロブリンがヒトＨＥＲ２／ｎｅｕに結合する、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記医薬が、抗脈管形成剤、抗腫瘍剤、化学療法剤及び細胞傷害剤からなる群から選択される治療剤をさらに含む、請求項１１又は１２に記載の使用。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれかに記載の免疫グロブリンと、薬学的に許容される担体又は添加剤を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用：
本出願は、２００８年４月２日に出願された米国特許出願第６１／０４１，６４９号（係属中）に対する優先権を主張する。米国特許出願第６１／０４１，６４９号は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
配列表への参照：
本出願は、米国特許施行規則１．８２１条以下に従って、１つまたはそれより多くの配列表を含み、それらは、紙およびコンピュータ読み取り可能な媒体の両方で開示され、その紙およびコンピュータ読み取り可能な開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
発明の背景：
発明の分野：
本発明は、公知の４Ｄ５抗体と比較してグリコシル化が減少し、エフェクター機能が変化している、ＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的に結合する新規４Ｄ５抗体、特に、ＨＥＲ２／ｎｅｕに対する新規キメラ４Ｄ５抗体に関する。本発明は、癌、自己免疫疾患、炎症性障害および感染症などの疾患の診断、予後判定および治療での抗体およびそれらを含む組成物の使用方法にも関する。
【背景技術】
【０００４】
関連技術の説明：
ＨＥＲ２／ｎｅｕおよびＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体
細胞の増殖および分化過程は、チロシンキナーゼなどの特異的受容体を通してそれらの作用を発揮する増殖因子を含む。チロシンキナーゼ受容体へのリガンドの結合は、最終的に細胞の増殖および分化をもたらす事象のカスケードを誘発する。（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら（１９７９年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ４８巻：１９３〜２１６頁（非特許文献１）、Ｓａｃｈｓら（１９８７年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４７巻：１９８１〜８１９６頁）。チロシンキナーゼ受容体は、配列類似性および異なる特徴に基づいていくつかの群に分類することができる。そのようなファミリーの１つはＥｒｂＢまたは上皮増殖因子受容体ファミリーであり、それは、ＨＥＲ−１（ｅｒｂＢ−１またはＥＧＦＲとしても公知）、ＨＥＲ−２またはＨＥＲ２／ｎｅｕ（ｅｒｂＢ−２、ｃ−ｎｅｕまたはｐ１８５としても公知）、ＨＥＲ−３（ｅｒｂＢ−３としても公知）およびＨＥＲ−４（ｅｒｂＢ−４としても公知）として公知の複数の受容体を含む。（例えば、上記Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら、Ｓｅｍｂａら（１９８５年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （Ｕ．Ｓ．Ａ．）  ８２巻：６４９７〜６５０１頁、Ｃｏｕｓｓｅｎｓら（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０巻：１１３０〜１１３９頁、Ｂａｒｇｍａｎｎら（１９８６年）Ｃｅｌｌ  ４５巻：６４９〜６５７頁、Ｋｒａｕｓら（１９８９年）ＰＮＡＳ  ８６巻：９１９３〜９１９７頁、Ｃａｒｒａｗａｙら（１９９４年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９巻：１４３０３〜１４３０６頁およびＰｌｏｗｍａｎら（１９９３年）Ｎａｔｕｒｅ  ３６６巻：４７３〜４７５頁、Ｔｚａｈａｒら（１９９４年）Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９巻：２５２２６〜２５２３３頁を参照）。
【０００５】
ＥｒｂＢ受容体は、正常な発達過程およびヒト腫瘍形成の両方において、細胞の増殖、分化、運動およびアポトーシスを調節するシグナルを伝えることに重要な役割を果たす。（Ｓｌａｍｏｎら（１９８９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４巻：７０７〜７１２頁）。例えば、ｅｒｂＢ受容体の活性化は、下流のＭＡＰＫ−Ｅｒｋ１／２およびホスホイノシチド−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／ＡＫＴの増殖経路および生存経路と結び付いており、それらを刺激する。癌におけるこれらの経路の脱調節は、疾患の進行および治療への不応性に関連付けられた。（Ｆｕｋａｚａｗａら（１９９６年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１巻：１４５５４〜１４５５９頁、Ｔｚａｈａｒら（１９９６年）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １６巻：５２７６〜５２８７頁、Ｌａｎｇｅら（１９９８年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３巻：３１３０８〜３１３１６頁、  Ｏｌａｙｉｏｙｅら（１９９８年）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １８巻：５０４２〜５０５１頁、Ｈａｃｋｅｌら（１９９９年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １１巻：１８４〜１８９頁）。ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴの活性化は、細胞の生存を促進し、腫瘍攻撃性を高め、ＡＫＴ２は、ＨＥＲ２／ｎｅｕを過剰発現する乳癌で活性化および過剰発現されると報告された。（Ｓｈａｋ（１９９９年）Ｓｅｍｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．補遺１２巻：７１〜７７頁、Ｈｕａｎｇら（２０００年）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ７巻：２１６６〜２１７４頁、Ｂａｃｕｓら（２００２年）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２１巻：３５３２〜３５４０頁）。
【０００６】
ＥｒｂＢファミリーの受容体によるシグナル伝達は、ホモまたはヘテロの受容体二量体化、細胞質テールの相互のチロシンリン酸化および細胞内シグナル伝達経路の活性化を誘発するリガンド結合によって開始される。（Ｃｉｔｒｉら（２００３年）Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２８４巻：５４頁）。ＥｒｂＢ受容体に結合して活性化するリガンドの有効性は、特定のタンパク質の細胞表面外部ドメイン脱落を触媒する、ＡＤＡＭ（ディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ）ファミリーの亜鉛依存性メタロプロテアーゼなどの、様々なメタロプロテアーゼによって媒介される。（ＣｈａｎｇおよびＷｅｒｂ（２００１年）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １１巻：５３７〜５４３頁、ＭｏｓｓおよびＬａｍｂｅｒｔ（２００２年）Ｅｓｓａｙｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８巻：１４１〜１５３頁、ＳｅａｌｓおよびＣｏｕｒｔｎｅｉｄｇｅ（２００３年）Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １７巻：７〜３０頁を参照）。具体的には、ＡＤＡＭファミリーは、ＥｒｂＢ受容体の活性化を担うリガンド（ＡＰＰおよびＮｏｔｃｈなど）を切断することが示されている。（Ｂｌｏｂｅｌ（２００５年）Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ６巻：３２〜４３頁）。
【０００７】
ＥｒｂＢファミリーの重要なメンバーであるＨＥＲ２／ｎｅｕは、化学処理ラットの神経芽細胞腫からの形質転換遺伝子の産物として当初同定された１８５ｋＤａ受容体タンパク質である。ＨＥＲ２／ｎｅｕは、いくつかのヒト癌腫および哺乳動物の発達におけるその役割のため、広く調査されてきた。（ＨｙｎｅｓおよびＳｔｅｒｎ（１９９４年）Ｂｉｏｃｈｉｍ．  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １１９８巻：１６５〜１８４頁およびＤｏｕｇａｌｌら（１９９４年）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ９巻：２１０９〜２１２３頁、Ｌｅｅら（１９９５年）Ｎａｔｕｒｅ  ３７８巻：３９４〜３９８頁）。ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子およびＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質はＳｅｍｂａら（１９８５年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （Ｕ．Ｓ．Ａ．）  ８２巻：６４９７〜６５０１頁およびＹａｍａｍｏｔｏら（１９８６年）Ｎａｔｕｒｅ  ３１９巻：２３０〜２３４頁に記載され、その配列はＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号Ｘ０３３６３として入手可能である。ＨＥＲ２／ｎｅｕは、４つのドメインを含む：リガンドが結合する細胞外ドメイン；親油性膜貫通ドメイン；保存された細胞内チロシンキナーゼドメイン；およびリン酸化されることができるいくつかのチロシン残基を保有するカルボキシル末端シグナル伝達ドメイン。（Ｐｌｏｗｍａｎら（１９９３年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （Ｕ．Ｓ．Ａ．）  ９０巻：１７４６〜１７５０頁）。ＨＥＲ２／ｎｅｕ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の配列は、Ｆｒａｎｋｌｉｎら（２００４年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．  ５巻（４号）：３１７〜３２８頁によって記載された。そしてタンパク質データバンク記録１Ｓ７８（２００４年）から入手可能である。
【０００８】
ＨＥＲ２／ｎｅｕは増殖因子受容体として機能し、乳癌、卵巣癌および肺癌などの腫瘍によってしばしば発現される。ＨＥＲ２／ｎｅｕはヒトの乳癌および卵巣癌のうちの２５〜３０％で過剰発現され、これらの患者における攻撃性臨床進行および不良な予後に関連する。（Ｓｌａｍｏｎら（１９８７年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５巻：１７７〜１８２頁、Ｓｌａｍｏｎら（１９８９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４巻：７０７〜７１２頁）。ＨＥＲ２／ｎｅｕの過剰発現は、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、甲状腺、膵臓および膀胱の癌腫を含む他の癌腫でも観察されている。（例えば、Ｋｉｎｇら（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９巻：９７４頁、ＭｃＣａｎｎら（１９９０年）Ｃａｎｃｅｒ  ６５巻：８８〜９２頁、Ｙｏｎｅｍｕｒａら（１９９１年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５１巻：１０３４頁を参照）。
【０００９】
ＨＥＲ２／ｎｅｕの活性化は、乳癌患者におけるホルモン治療に対する臨床応答の低下と関連付けられている。（Ｗｒｉｇｈｔら（１９８９年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４９巻：２０８７〜２０９０頁、Ｋｕｒｏｋａｗａ  ＆  Ａｒｔｅａｇａ（２００１年）Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ７巻：４４３６ｓ〜４２ｓ頁、４４１１ｓ〜４４１２ｓ頁）。実際、ＨＥＲ２／ｎｅｕの発現は、抗エストロゲン抵抗性を伝達するのに十分である。（Ｂｅｎｚら（１９９３年）Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  Ｔｒｅａｔ．  ２４巻：８５〜９５頁）。ＨＥＲ２／ｎｅｕならびにＨＥＲ−３は、前立腺癌患者におけるホルモン抵抗性の開始にも関与するようでもある。前立腺癌患者の約１／３は、精巣および副腎のアンドロゲンの作用を破壊することが目的のホルモン治療を受ける。乳癌と同様に、抵抗性は回避不能である。最近のデータは、ＨＥＲ２／ｎｅｕおよびＨＥＲ−３から発するシグナルが、「ホルモン治療不応性」状態を誘導することを示唆する。（Ｍｅｌｌｉｎｇｈｏｆｆら（２００４年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ６巻：５１７〜５２７頁）。
【００１０】
ＨＥＲ２／ｎｅｕのいくつかの切断型バージョンおよびスプライスバージョンが公知である。例えば、一部の胃癌腫細胞の核周囲細胞質に位置する切断型ＥＣＤは、イントロン内のポリアデニル化シグナルの使用によって生成される選択的転写産物によって生成される。（Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９８６年）Ｎａｔｕｒｅ  ３１９巻：２３０〜２３４頁およびＳｃｏｔｔら（１９９３年）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １３巻：２２４７〜２２５７頁）。いかなる特定の治療、診断または研究上の有用性も、この切断型ＥＣＤポリペプチドによって生じたものとはみなされていない。ＨＥＲ２／ｎｅｕのＥＣＤは、培養中の乳癌腫細胞からタンパク質分解的に脱落させることもでき、また一部の癌患者の血清で見出され、その場合、それは転移性乳癌および全体的な予後不良の血清マーカーであり得る。（Ｐｅｔｃｈら（１９９０年）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １０巻：２９７３〜２９８２頁、Ｌｅｉｔｚｅｌら（１９９２年）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  １０巻：１４３６〜１４４３頁、Ｓｃｏｔｔら（１９９３年）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １３巻：２２４７〜２２５７頁ならびにＬｅｅおよびＭａｉｈｌｅ（１９９８年）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １６巻：３２４３〜３２５２頁）。一部のＨＥＲ２／ｎｅｕ過剰発現腫瘍細胞では、周知のメタロプロテアーゼ活性化剤である４−アミノフェニル第二水銀アセテート（ＡＰＭＡ）が、ＡＤＡＭ１０およびＡＤＡＭ１５などのメタロプロテアーゼを活性化して、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体を２つの部分（ｐ９５として公知の切断型膜結合型受容体およびｐ１０５またはＥＣＤ１０５として公知の可溶性ＥＣＤ）へと切断する。（例えば、Ｍｏｌｉｎａら（２００１年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６１巻：４７４４〜４７４９頁、米国特許出願公開第２００４／０２４７６０２号を参照）。ＥＣＤの喪失は、ｐ９５受容体を構成的に活性なチロシンキナーゼにし、それは、癌細胞に増殖および生存のシグナルを送達することができる。（例えば、米国特許第６，５４１，２１４号を参照）。
【００１１】
ＨＥＲ２／ｎｅｕを過剰発現する乳癌細胞では、化学療法剤（例えば、シスプラチン、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｕｂｉｃｉｎ）、タキソール）と組み合わせたＨＥＲ２／ｎｅｕ特異抗体を用いた処置が、化学療法単独による処置よりも高い細胞傷害応答を引き出すことを研究は示している。（Ｈａｎｃｏｃｋら（１９９１年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５１巻：４５７５〜４５８０頁、Ａｒｔｅａｇａら（１９９４年）Ｃａｎｃｅｒ  ５４巻：３７５８〜３７６５頁、Ｐｉｅｔｒａｓら（１９９４年）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ９巻：１８２９〜１８３８頁）。ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体が化学療法剤に対する応答を高める可能性がある１つの可能な機構は、ＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質発現の調節を通すもの、またはＤＮＡ修復を妨害することによるものである。（Ｓｔａｎｃｏｖｓｋｉら（１９９１年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （Ｕ．Ｓ．Ａ．）  ８８巻：８６９１〜８６９５頁、Ｂａｃｕｓら（１９９２年）Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ＆  Ｄｉｆｆ．  ３巻：４０１〜４１１頁、Ｂａｃｕｓら（１９９３年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５３巻：５２５１〜５２６１頁、Ｋｌａｐｐｅｒら（１９９７年）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １４巻：２０９９〜２１０９頁、Ｋｌａｐｐｅｒら（２０００年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６０巻：３３８４〜３３８８頁、Ａｒｔｅａｇａら（２００１年）Ｊ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １９巻（１８ｓ号）：３２ｓ〜４０ｓ頁）。
【００１２】
ＨＥＲ−１またはＨＥＲ２／ｎｅｕをターゲティングする多くのモノクローナル抗体および低分子チロシンキナーゼ阻害剤が開発されている。例えば、４Ｄ５として公知のマウスモノクローナル抗体は、膜貫通領域の非常に近くに存在する、ＨＥＲ２／ｎｅｕのシステインリッチＩＩドメイン中の細胞外エピトープ（アミノ酸５２９〜６２７）を認識する。４Ｄ５を用いた乳癌細胞の処置は、受容体リン酸化アッセイで測定したところ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ＨＥＲ−３複合体のＮＤＦ／ヒレグリン活性化を部分的にブロックする。（Ｃａｒｔｅｒら（１９９２年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （Ｕ．Ｓ．Ａ．）  ８９巻：４２８５〜４２８９頁、Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉら（１９９９年）Ｓｅｍ．  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．  ２６巻：６０〜７０頁、Ｙｅら（１９９９年）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８巻：７３１〜７３８頁、Ｖｏｇｅｌら（２００１年）Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ６１巻（補遺２巻）：３７〜４２頁、Ｖｏｇｅｌら（２００２年）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２０巻（３号）：７１９〜７２６頁、Ｆｕｊｉｍｏｔｏ−Ｏｕｃｈｉら（２００２年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ４９巻：２１１〜２１６頁）。しかし、ヒトへの４Ｄ５の投与は、患者が速やかにＨＡＭＡ応答を起こしたため臨床上失敗であったので、ヒト化された形態を開発した。ヒト化抗体４Ｄ５の配列および結晶構造は、米国特許第６，０５４，２９７号、上記Ｃａｒｔｅｒら、およびＥｉｇｅｎｂｒｏｔら（１９９３年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２９巻：９６９〜９５頁に記載されている。
【００１３】
トラスツズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によりＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）として販売されている）として公知の４Ｄ５のヒト化形態は、乳癌を含むＨＥＲ２／ｎｅｕの過剰発現または遺伝子増幅に関係する癌を処置するために、開発および承認された。（Ｃｏｂｌｅｉｇｈら（１９９９年）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  １７巻：２６３９〜２６４８頁）。トラスツズマブは、ＥＣＤ部分およびｐ９５部分へのＨＥＲ２／ｎｅｕのＡＰＭＡ媒介切断をインビトロで阻害し、ＨＥＲ２／ｎｅｕ脱落の可能な阻害を含む異なる機構を通してインビトロで作用すると考えられている。（Ｐｅｇｒａｍら（１９９８年）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １６巻（８号）：２６５９〜２６７１頁、Ｂａｓｅｌｇａら（２００１年）Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２８巻（５号）（補遺１６巻）：４〜１１頁、Ｂａｓｅｌｇａら（２００１年）Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １２巻（補遺１巻）：Ｓ３５〜Ｓ４１頁。しかし、トラスツズマブ治療は、一部の患者での心臓毒性およびＨＡＨＡ応答の発生など、様々な欠点を有する。
【００１４】
したがって、癌治療で使用するためのＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体の新しい形態または改善された形態、例えばより高い親和性または特異性、ＨＡＭＡ応答またはＨＡＨＡ応答のより低い可能性、変化したエフェクター機能などを有する４Ｄ５抗体の必要性がまだある。
【００１５】
Ｆｃ受容体
免疫系の細胞との抗体抗原複合体の相互作用は、抗体依存性細胞傷害、肥満細胞脱顆粒および食作用などのエフェクター機能から、リンパ球増殖および抗体分泌の調節などの免疫調節シグナルまでに及ぶ広範囲の応答をもたらす。すべてのこれらの相互作用は、造血細胞上の専門化した細胞表面受容体であるＦｃ受容体に対する、抗体または免疫複合体のＦｃドメインの結合を通して開始される。抗体および免疫複合体によって誘発される細胞応答の多様性は、Ｆｃ受容体の構造不均一性から生じる。Ｆｃ受容体は、おそらく細胞内シグナル伝達を媒介する、構造的に関連したリガンド結合ドメインを共有する。
【００１６】
免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのタンパク質のメンバーであるＦｃ受容体は、免疫グロブリン分子のＦｃ部分に結合することができる表面糖タンパク質である。ファミリーの各メンバーは、Ｆｃ受容体のα鎖上の認識ドメインを通して、１つまたはそれより多くのアイソタイプの免疫グロブリンを認識する。Ｆｃ受容体は、免疫グロブリンサブタイプへのそれらの特異性によって定義される。ＩｇＧについてのＦｃ受容体は「ＦｃγＲ」と称され、ＩｇＥについてのＦｃ受容体は「ＦεＲ」と称され、ＩｇＡについてのＦｃ受容体は「ＦｃαＲ」と称される。異なる補助細胞は異なるアイソタイプの抗体のＦｃ受容体を保有し、抗体のアイソタイプはどの補助細胞が所与の応答に関与するかを決定する（Ｂｉｌｌａｄｅａｕら（２００２年）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔ．  ２巻（１０９号）：１６１〜８１頁、Ｇｅｒｂｅｒら（２００１年）Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ３巻：１３１〜１３９頁、Ｒａｖｅｔｃｈら（２００１年）Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９巻：２７５〜９０頁、Ｒａｖｅｔｃｈら（２０００年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０巻：８４〜８９頁、Ｒａｖｅｔｃｈ（１９９４年）Ｃｅｌｌ  ７８巻（４号）：５５３〜５６０頁、Ｒａｖｅｔｃｈら（１９９１年）Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ９巻：４５７〜４９２頁、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ（第４版、１９９９年）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ／Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋも参照）。様々な受容体の概要を、表１に示す。
【００１７】
【表１】
0005555223.tif 000002
【００１８】
各Ｆｃγ受容体（「ＦｃγＲ」）は、Ｃ２セットの免疫グロブリン関連のドメインに関係がある細胞外ドメイン、一回膜貫通ドメインおよび可変長の細胞質内ドメインを有する、内在性膜糖タンパク質である。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）およびＦｃγＲＩＶと命名された、４つの公知のＦｃγＲがある。これらの受容体は、別個の遺伝子によってコードされている。しかし、ファミリーメンバー間の多大な相同性は、それらがおそらく遺伝子重複によって共通の祖先から発生したことを示唆する。
【００１９】
活性化シグナルおよび阻害シグナルはいずれも、連結後にＦｃγＲを通して伝達される。これらの正反対の機能は、異なる受容体アイソフォーム間の構造的な差から生じる。免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）または免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）と呼ばれる、この受容体の細胞質シグナル伝達ドメイン中の２つの別個のドメインは、異なる応答の原因となる。これらの構造への異なる細胞質酵素の補充は、ＦｃγＲ媒介細胞応答の結果を決定する。ＩＴＡＭ含有ＦｃγＲ複合体には、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＶが含まれるが、ＩＴＩＭ含有複合体にはＦｃγＲＩＩＢだけが含まれる。
【００２０】
ＦｃγＲＩは、抗体定常領域に対する高い親和性、および限定的アイソタイプ特異性を示す（ＨｕｌｅｔｔおよびＨｏｇａｒｔｈ（１９９４年）Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５７巻：１〜１２７頁）。ＦｃγＲＩＩタンパク質は、単量体Ｉｇに対する低い親和性（１０６Ｍ−１）のために、複合体化したＩｇＧだけに結合する４０ＫＤａの内在性膜糖タンパク質である。この受容体は、単球、マクロファージ、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、好中球、肥満細胞および血小板を含むすべての造血細胞に存在する、最も広く発現されるＦｃγＲである。ＦｃγＲＩＩは、その免疫グロブリン結合鎖に２つの免疫グロブリン様領域だけを有し、したがって、ＩｇＧに対してＦｃγＲＩよりもずっと低い親和性を有する。３つの公知のヒトＦｃγＲＩＩ遺伝子（ＦｃγＲＩＩ−Ａ、ＦｃγＲＩＩ−Ｂ、ＦｃγＲＩＩ−Ｃ）があり、そのすべては凝集体または免疫複合体中のＩｇＧに結合する。ヒト好中球は、ＦｃγＲＩＩＡ遺伝子を発現する。ＦｃγＲＩＩＢ遺伝子は、Ｂリンパ球で発現される。その細胞外ドメインは、ＦｃγＲＩＩＡと９６％同一であり、区別できない様式でＩｇＧ複合体に結合する。
【００２１】
ＦｃγＲＩＩ−ＡおよびＦｃγＲＩＩ−Ｂの細胞質ドメイン中の明確な差は、受容体連結に対する２つの機能的に異質な応答を生成する。ＦｃγＲＩＩ−Ａアイソフォームは、食作用および呼吸バーストなどの細胞活性化につながる細胞内シグナル伝達を開始するが、ＦｃγＲＩＩ−Ｂアイソフォームは、阻害シグナル、例えばＢ細胞活性化の阻害を開始する。免疫複合体または特異抗体架橋によるＦｃγＲＩＩＡクラスタリングは、ＩＴＡＭリン酸化を促進する受容体関連キナーゼとともにＩＴＡＭを凝集する役目を果たす。ＩＴＡＭリン酸化はＳｙｋキナーゼのドッキング部位の役目を果たし、その活性化は下流の基質（例えば、ＰＩ３Ｋ）の活性化をもたらす。細胞の活性化は、炎症促進性媒介物質（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍｅｄｉａｔｏｒ）の放出につながる。ＦｃγＲＩＩＡまたはＦｃεＲＩなど、ＩＴＡＭを有する活性化ＦｃγＲとともに共連結（ｃｏ−ｌｉｇａｔｅ）または共凝集（ｃｏ−ａｇｇｒｅｇａｔｅ）されると、ＦｃγＲＩＩＢ中のＩＴＩＭはリン酸化され、ｓｒｃホモロジー２含有イノシトールホスファターゼ（ＳＨＩＰ）のＳＨ２ドメインを補充し、それは次にリン酸化されてＳｈｃと結合する（Ｏｔｔ（２００２年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６２巻（９号）：４４３０〜４４３９頁、Ｙａｍａｎｓｈｉら（１９９７年）Ｃｅｌｌ  ８８巻：２０５頁、Ｃａｒｐｉｎｏら（１９９７年）Ｃｅｌｌ  ８８巻：１９７頁）。ＳＨＩＰは、ＩＴＡＭ含有ＦｃγＲ媒介チロシンキナーゼ活性化の結果として放出されるホスホイノシトールメッセンジャーを加水分解し、その結果として細胞内Ｃａ＋＋の流入を防止し、ＦｃγＲ連結に対する細胞応答を低下させる。したがって、Ｂ細胞活性化、Ｂ細胞増殖および抗体分泌が阻止され、ＦｃγＲ媒介食作用が下方制御される（Ｔｒｉｄａｎｄａｐａｎｉら（２００２年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７巻（７号）：５０８２〜８９頁）。
【００２２】
具体的には、ＦｃγＲＩＩＢとのＦｃγＲＩＩＡとの共凝集は、細胞の調節に関与しアポトーシスを抑制する役目を果たすセリンスレオニンキナーゼであるＡｋｔのリン酸化の下方制御をもたらし、肥満細胞の高親和性ＩｇＥ受容体ＦｃεＲＩとのＦｃγＲＩＩＢの共凝集は、抗原誘導脱顆粒、カルシウム動員およびサイトカイン生成の阻害をもたらす（Ｌｏｎｇ（１９９９年）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７巻：８７５頁、Ｍｅｔｃａｌｆｅら（１９９７年）Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  ７７巻：１０３３頁）。ＦｃγＲＩＩＢおよびＢ細胞受容体（ＢＣＲ）の共凝集は、ＢＣＲ媒介シグナル伝達の阻害、ならびに細胞周期進行および細胞生存の阻害をもたらす。ＢＣＲシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ媒介阻害の多数のエフェクター機能はＳＨＩＰを通して媒介されるが、ＳＨＩＰ欠失マウスからのリポポリサッカリド（ＬＰＳ）活性化Ｂ細胞が、カルシウム動員、Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ３生成、ならびにＥｒｋおよびＡｋｔのリン酸化の顕著なＦｃγＲＩＩＢ媒介阻害を示すことが最近証明された（Ｂｒａｕｗｅｉｌｅｒら（２００１年）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６７巻（１号）：２０４〜２１１頁）。
【００２３】
このクラス内の不均一性のために、マウスおよびヒトにおけるＦｃγＲＩＩＩのサイズは４０〜８０ｋＤａの範囲である。２つのヒト遺伝子は、２つの転写産物（内在性膜糖タンパク質であるＦｃγＲＩＩＩＡ、およびグリコシルホスファチジル−イノシトール（ＧＰＩ）連結バージョンであるＦｃγＲＩＩＩＢ）をコードする。１つのマウス遺伝子は、膜貫通ヒトＦｃγＲＩＩＩＡに相同的なＦｃγＲＩＩＩをコードする。ＦｃγＲＩＩＩは、他の２つのＦｃγＲの各々と構造上の特徴を共有する。ＦｃγＲＩＩと同様に、ＦｃγＲＩＩＩはＩｇＧに低い親和性で結合し、対応する２つの細胞外Ｉｇ様ドメインを含む。ＦｃγＲＩＩＩＡは、マクロファージ、肥満細胞で発現され、ＮＫ細胞で唯一のＦｃγＲである。ＧＰＩ連結ＦｃγＲＩＩＩＢは、ヒト好中球だけで発現されることが現在公知である。
【００２４】
ＦｃγＲＩＶ（ｍＦｃＲＩＶとしても公知）は、骨髄細胞での最適な発現および機能のためにＦｃＲγ鎖の結合を必要とする。そのシグナル伝達能力は、アダプター分子Ｃｒｋ−Ｌおよびホスファチジルイノシトール−３−ＯＨキナーゼを補充する細胞質「ＹＥＥＰ」モチーフによっても高められる。ＦｃγＲＩＶは、ｂアロタイプの免疫グロブリンＥ抗体（ＩｇＥｂ）、ならびにＩｇＧ２ａ抗体およびＩｇＧ２ｂ抗体に優先的に結合する。抗原−ＩｇＥｂ免疫複合体によるＦｃγＲＩＶの連結は、マクロファージ媒介食作用、Ｔ細胞への抗原提示、炎症促進性サイトカインの生成および皮膚アレルギー反応の後期相を促進する（Ｈｉｒａｎｏら（２００７年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８巻：７６２〜７７１頁）。ＦｃγＲＩＶは、すべての哺乳動物種で保存されている、中間の親和性および限定的サブクラス特異性を有する最近同定された受容体である（Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎら（２００５年）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２３巻：４１〜５１頁、Ｍｅｃｈｅｔｉｎａら（２００２年）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５４巻：４６３〜４６８頁、Ｄａｖｉｓら（２００２年）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  １９０巻：２３〜３６頁）。ＦｃＲＩＩＩおよびＦｃＲＩＶは、細胞傷害性抗体または病原性免疫複合体によって誘発される炎症性疾患を媒介するための、生理的に重要な活性化ＦｃＲである。ＦｃＲＩＶは、樹状細胞、マクロファージ、単球および好中球上に見出される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２５】
【非特許文献１】Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら（１９７９年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ４８巻：１９３〜２１６頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
すべてのそのような進歩にもかかわらず、自己免疫、癌、炎症性疾患の処置および／または移植で治療的有用性を有し、Ｆｃ受容体からのエフェクター機能を媒介する向上した能力を示す、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体の必要性がまだある。本発明は、この必要性および他の必要性に関する。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
発明の概要
本発明の実施形態は、様々なポリペプチド、例えば配列番号４のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含むポリペプチド、配列番号２のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖を含むポリペプチド、およびＮ６５Ｓ置換を含むキメラ４Ｄ５免疫グロブリン軽鎖を含むポリペプチドを提供する。他の実施形態は、配列番号７のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖を含むポリペプチド、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖を含むポリペプチド、ならびに様々な置換を含む４Ｄ５免疫グロブリン重鎖を含むポリペプチドを提供する。
【００２８】
上記ポリペプチドは抗体であってもよく、ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的に結合してもよい。上記ポリペプチドおよび抗体は、変更されたエフェクター機能、ＦｃγＲへの結合の増加または減少などを含めた表現型変化を上記ポリペプチドまたは抗体に付与し得る１つまたはそれより多くの改変を含む、バリアントＦｃドメインを含み得る。本発明の実施形態は、上記ポリペプチドおよび抗体をコードするポリヌクレオチド、上記ポリヌクレオチドを含むベクターならびに上記ベクターを含む宿主細胞も提供する。上記ポリペプチドおよび抗体の生成方法、ならびに様々な疾患および障害の処置方法も提供される。
【００２９】
詳細には、本発明は、Ｎ６５Ｓ置換を含むキメラ４Ｄ５免疫グロブリン軽鎖を含むポリペプチド、特に、上記ポリペプチドが配列番号４または配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含むようなポリペプチドの実施形態を提供する。
【００３０】
本発明は、特に、上記ポリペプチドが抗体、より詳しくは、Ｆｃドメインで少なくとも１つの改変を有するバリアントＦｃドメインを含む抗体であるようなポリペプチドの実施形態に関する。本発明は、上記改変が、Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５ＩおよびＰ３９６Ｌからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含む実施形態に特に関する。
【００３１】
本発明は、上記Ｆｃドメイン中の改変が、
（Ａ）Ｆ２４３Ｌ、Ｄ２７０Ｅ、Ｒ２９２Ｐ、Ｓ２９８Ｎ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、Ａ３３０ＶおよびＰ３９６Ｌからなる群から選択される少なくとも１つの置換；
（Ｂ）Ｆ２４３ＬおよびＰ３９６Ｌ；Ｆ２４３ＬおよびＲ２９２Ｐ；ならびにＲ２９２ＰおよびＶ３０５Ｉからなる群から選択される少なくとも２つの置換；
（Ｃ）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２ＰおよびＹ３００Ｌ；Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２ＰおよびＶ３０５Ｉ；Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２ＰおよびＰ３９６Ｌ；ならびにＲ２９２Ｐ、Ｖ３０５ＩおよびＰ３９６Ｌからなる群から選択される少なくとも３つの置換；または
（Ｄ）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００ＬおよびＰ３９６Ｌ；ならびにＦ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｖ３０５ＩおよびＰ３９６Ｌからなる群から選択される少なくとも４つの置換
を含むような抗体の実施形態にさらに関し、
より詳細には、上記Ｆｃドメイン中の改変が
（１）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２ＰおよびＹ３００Ｌ；
（２）Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００ＬおよびＰ３９６Ｌ；または
（３）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５ＩおよびＰ３９６Ｌ
を含む抗体に関する。
【００３２】
本発明は、野生型Ｆｃドメインと比較して、上記バリアントＦｃドメインが、
（Ａ）強化された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；
（Ｂ）ＦｃγＲＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＩＡへの結合の増加；
（Ｃ）ＦｃγＲＩＩＢへの結合の減少；または
（Ｄ）ＦｃγＲＩＩＢへの結合の増加
を示すような抗体の実施形態にさらに関する。
【００３３】
本発明は、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する可変ドメインを含む免疫グロブリン重鎖を含むポリペプチドにさらに関する。
【００３４】
本発明は、
（Ａ）Ｆ２４３Ｌ、Ｄ２７０Ｅ、Ｒ２９２Ｐ、Ｓ２９８Ｎ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、Ａ３３０ＶおよびＰ３９６Ｌからなる群から選択される少なくとも１つの置換；
（Ｂ）
（１）Ｆ２４３ＬおよびＰ３９６Ｌ；
（２）Ｆ２４３ＬおよびＲ２９２Ｐ；ならびに
（３）Ｒ２９２ＰおよびＶ３０５Ｉ
からなる群から選択される少なくとも２つの置換；
（Ｃ）
（１）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２ＰおよびＹ３００Ｌ；
（２）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２ＰおよびＶ３０５Ｉ；
（３）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２ＰおよびＰ３９６Ｌ；ならびに
（４）Ｒ２９２Ｐ、Ｖ３０５ＩおよびＰ３９６Ｌ
からなる群から選択される少なくとも３つの置換；
（Ｄ）
（１）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００ＬおよびＰ３９６Ｌ；ならびに
（２）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｖ３０５ＩおよびＰ３９６Ｌ
からなる群から選択される少なくとも４つの置換；
または
（Ｅ）少なくともＦ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５ＩおよびＰ３９６の置換
を含む４Ｄ５免疫グロブリン重鎖を含むポリペプチドにさらに関する。
【００３５】
本発明は、上記ポリペプチドが抗体であるようなポリペプチドの実施形態にさらに関する。
【００３６】
本発明は、上記抗体が配列番号７、配列番号９、配列番号１１または配列番号１３のアミノ酸配列を有する可変ドメインを含む免疫グロブリン重鎖をさらに含む、上述の抗体の実施形態にさらに関する。
【００３７】
本発明は、上記抗体が
（Ａ）Ｆ２４３Ｌ、Ｄ２７０Ｅ、Ｒ２９２Ｐ、Ｓ２９８Ｎ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、Ａ３３０ＶおよびＰ３９６Ｌからなる群から選択される少なくとも１つの置換；
（Ｂ）
（１）Ｆ２４３ＬおよびＰ３９６Ｌ；
（２）Ｆ２４３ＬおよびＲ２９２Ｐ；ならびに
（３）Ｒ２９２ＰおよびＶ３０５Ｉ
からなる群から選択される少なくとも２つの置換；
（Ｃ）
（１）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２ＰおよびＹ３００Ｌ；
（２）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２ＰおよびＶ３０５Ｉ；
（３）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２ＰおよびＰ３９６Ｌ；ならびに
（４）Ｒ２９２Ｐ、Ｖ３０５ＩおよびＰ３９６Ｌ
からなる群から選択される少なくとも３つの置換；
（Ｄ）
（１）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００ＬおよびＰ３９６Ｌ；ならびに
（２）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｖ３０５ＩおよびＰ３９６Ｌ
からなる群から選択される少なくとも４つの置換；
または
（Ｅ）少なくともＦ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５ＩおよびＰ３９６置換
を含む上述の抗体の実施形態にさらに関する。
【００３８】
本発明は、上記免疫グロブリン軽鎖が配列番号４のアミノ酸配列を有する可変ドメインを含み、上記免疫グロブリン重鎖が配列番号９、配列番号１１または配列番号１３のアミノ酸配列を含む、上述の抗体の実施形態にさらに関する。
【００３９】
本発明は、上記抗体がＦ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ）断片、単鎖抗体、モノクローナル抗体またはダイアボディである、上述の抗体の実施形態にさらに関する。
【００４０】
本発明は、患者での癌の処置のための医薬の製造における、上述の抗体の使用であって、特に、上記癌がＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する癌であり、上記抗体がヒトＨＥＲ２／ｎｅｕに結合する使用にさらに関する。
【００４１】
本発明は、上述の抗体の有効量を癌の処置を必要とする患者に提供することを含む癌の処置方法であって、特に、上記癌がＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する癌であり、上記抗体がヒトＨＥＲ２／ｎｅｕに結合する方法にさらに関する。
【００４２】
本発明は、そのような抗体の使用であって、上記処置が、上記抗体と同時にまたは逐次的に第２の治療剤を投与する工程をさらに含み、上記第２の治療剤は、抗脈管形成剤、抗腫瘍剤、化学療法剤および細胞傷害剤からなる群から選択される使用にさらに関する。
【００４３】
本発明の追加の利点および特徴は、本発明の好ましい実施形態を例示する以下の詳細な説明、図面および実施例から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、好ましい実施形態のキメラ４Ｄ５抗体（配列番号４）とマウス４Ｄ５抗体（配列番号３）およびヒト化４Ｄ５抗体（配列番号５）とで軽鎖可変領域の配列を比較する配列アラインメントを示す。
【図２】図２は、ｃｈ４Ｄ５−野生型Ｆｃ（「ＷＴ」）（配列番号７）、ｃｈ４Ｄ５−ＦｃＭＴ１（「ＭＴ１」）（配列番号９）、ｃｈ４Ｄ５−ＦｃＭＴ２（「ＭＴ２」）（配列番号１１）、およびｃｈ４Ｄ５−ＦｃＭＴ３（「ＭＴ３」）（配列番号１３）の重鎖の配列間の比較を示す。ＣＤＲは、関連する残基の下に示される黒いバーで示されている。
【図３】図３は、ｃｈ４Ｄ５−野生型Ｆｃ（パネルＡ）、ｃｈ４Ｄ５（パネルＢ）およびトラスツズマブ（パネルＣ）の結合のＢＩＡＣｏｒｅ解析を示す。
【図４】図４は、インビトロにおけるＳＫＢＲ３細胞の増殖に対するｃｈ４Ｄ５の効果を示す。
【図５】図５は、非トランスジェニックマウスにおける本実施形態の様々な抗体の強化された抗腫瘍活性を示す。
【図６】図６は、ｈＣＤ１６Ａトランスジェニックマウスにおける本実施形態の様々な抗体の強化された抗腫瘍活性を示す。
【図７】図７は、非トランスジェニックマウスおよびトランスジェニックマウスにおける本実施形態の様々な抗体による腫瘍増殖阻害でのｍＦｃＲＩＶおよびｈＣＤ１６Ａの役割を示す。
【図８】図８は、ｈＣＤ１６Ａトランスジェニックマウスにおける本実施形態の様々な抗体の強化された抗腫瘍活性を示す。
【図９】図９は、ＨＥＲ２／ｎｅｕに対する様々な癌細胞系由来の細胞の代表的な免疫組織化学的染色を図示している。様々なパネルは、異なる細胞系、すなわち、パネルＡ：ＭＤＡ−ＭＢ−４３５；パネルＢ：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１；パネルＣ：Ａ５４９；パネルＤ：ＯＶＣＡＲ−８；パネルＥ：ＭＣＦ−７；パネルＦ：ＢＴ−２０；パネルＧ：ＨＴ−２９；パネルＨ：ＺＲ７５−１；パネルＩ：ＪＩＭＴ−１；パネルＪ：ＭＤＡ−ＭＢ−４５３；パネルＫ：ＢＴ−４７４；パネルＬ：ＳＫＢＲ−３；パネルＭ：ｍＳＫＯＶ−３を表している。
【図１０】図１０は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現レベルが非常に低いまたは全くない（ＤＡＫＯスコアが０の）癌細胞系（パネルＡのＭＤＡ−ＭＢ−４３５；パネルＢのＭＤＡ−ＭＢ−２３１）における本実施形態の様々なｃｈ４Ｄ５抗体のＡＤＣＣ媒介能力を試験するために実施されたＡＤＣＣアッセイの結果を示す。
【図１１】図１１は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現レベルが低い（ＤＡＫＯスコアが１＋の）癌細胞系（パネルＡのＡ５４９；パネルＢのＯＶＣＡＲ−８；パネルＣのＭＣＦ−７；パネルＤのＢＴ−２０；パネルＥのＨＴ−２９）における本実施形態の様々なｃｈ４Ｄ５抗体のＡＤＣＣ媒介能力を試験するために実施されたＡＤＣＣアッセイの結果を示す。
【図１２】図１２は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現レベルが中程度（ＤＡＫＯスコアが２＋の）の癌細胞系（パネルＡのＺＲ７５−１；パネルＢのＪＩＭＴ−１）における本実施形態の様々なｃｈ４Ｄ５抗体のＡＤＣＣ媒介能力を試験するために実施されたＡＤＣＣアッセイの結果を示す。
【図１３】図１３は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現レベルが高い（ＤＡＫＯスコアが３＋の）癌細胞系（パネルＡのＭＤＡ−ＭＢ−４５３；パネルＢのＢＴ−４７４；パネルＣのＳＫＢＲ−３；パネルＤのｍＳＫＯＶ−３）における本実施形態の様々なｃｈ４Ｄ５抗体のＡＤＣＣ媒介能力を試験するために実施されたＡＤＣＣアッセイの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
発明の詳細な説明
本発明は、ＨＥＲ２／ｎｅｕに対する抗体を用いる、特定の癌の処置、診断および予後判定のための新規抗体および方法を提供する。特に、本発明は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ過剰発現細胞に対する選択的細胞傷害剤として特に有用である抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体、例えばＨＥＲ２／ｎｅｕに対するキメラ４Ｄ５抗体を提供し、それは、既知の４Ｄ５抗体と比較してグリコシル化を減少させ、エフェクター機能を変化させた。本発明は、癌、自己免疫疾患、炎症性障害および感染症などの疾患の診断、予後判定および治療で、抗体およびそれらを含む組成物を使用する方法も提供する。
【００４６】
次に、図面および以下の実施例と一緒に本発明の原理を説明する役目を果たす、本発明の現在好ましい実施形態に詳細に言及する。当業者が本発明を実施することを可能にするためにこれらの実施形態を十分詳細に記載するが、他の実施形態を利用することができること、および本発明の精神と範囲から逸脱することなく、構造的、生物学的および化学的変更を加えることができることを理解するべきである。他に定義されていない場合は、本明細書で用いるすべての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。当業者は、そのような定義または本明細書に記載の技術の詳細な説明について、一般の参考テキストを参照することができる。これらのテキストには、例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、および２００８年３月にかけての補遺）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、第３版、２００１年）、Ｓｉｎｇｌｅ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓｅｌｖｉｎ  ＆  Ｈａ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、２００８年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｂｅａｕｃａｇｅら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、２０００年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．および２００８年３月にかけての補遺）、Ｍａｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｈｏｗａｒｄ  ＆  Ｋａｓｅｒ編、ＣＲＣ、２００６年）、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９年）、Ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ（Ｇｏｏｄｒｉｃｈ  ＆  Ｋｕｇｅｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、２００７年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（Ｅｎｎａら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．および２００８年３月にかけての補遺）、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ、第１１版、２００６年）、ならびにＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、第２１版、２００５年）が含まれる。
【００４７】
Ａ．定義
本明細書で用いられる場合、用語「ＡＤＣＣ」は、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびマクロファージなどの単球細胞）が標的細胞上の結合した抗体を認識し、その後その標的細胞の溶解を引き起こすインビトロの細胞媒介性反応である、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を指す。
【００４８】
本明細書で用いられる場合、用語「抗体」は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ポリクローナル抗体、ラクダ化抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、免疫学的活性抗体断片（例えば、エピトープに結合することができる抗体断片、例えばＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ＶＬドメインもしくはＶＨドメインまたは抗原に免疫特異的に結合する相補性決定領域（ＣＤＲ）のいずれかを含む断片など）、二機能性または複数機能性の抗体、ジスルフィド連結二重特異性Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、イントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）およびダイアボディ、ならびに上記のいずれかのエピトープ結合性断片を指す。特に、抗体という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫活性断片、すなわち抗原結合部位を含む分子を包含することを意味する。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラス（例えば、米国特許出願公開第２００４０１８５０４５号、第２００５００３７０００号、第２００５００６４５１４号、第２００５０２１５７６７号、第２００７０００４９０９号、第２００７００３６７９９号、第２００７００７７２４６号および第２００７０２４４３０３号を参照）であってもよい。
【００４９】
「Ｂ細胞抗原受容体」または「ＢＣＲ」への言及は、膜免疫グロブリン（ｍｌｇ）抗原結合コンポーネントを包含する、Ｂ細胞抗原受容体、またはその生物活性部分（すなわち、リガンドに結合することができる部分および／またはトランスデューサーコンポーネントに会合することができる部分）、ならびにトランスデューサーＣＤ７９ａおよびＣＤ７９ｂコンポーネント、またはその生物活性部分（すなわち、細胞内シグナルを伝達することができる部分および／または細胞外リガンド結合部分に会合することができる部分）に言及することを意図する。
【００５０】
本明細書で用いる場合、用語「癌」は、細胞の異常な無制御の増殖から生じる新生物または腫瘍を指す。本明細書で用いる場合、癌には白血病およびリンパ腫が明らかに包含される。一部の実施形態では、癌は、良性腫瘍を指し、これは、限局されたままである。他の実施形態では、癌は、悪性腫瘍を指し、これは、隣接した体構造に侵入および破壊し、遠い部位に広がっている。一部の実施形態では、癌は特定の癌抗原に関連する。
【００５１】
用語「細胞増殖性障害」および「増殖性障害」は、ある程度の異常な細胞増殖に関連する障害を指す。一実施形態では、細胞増殖性障害は癌である。
【００５２】
抗体に言及する場合、用語「キメラ」は、それらが所望の生物活性を示す限り、重鎖および／または軽鎖の一部が１種（例えば、マウス）からの抗体または抗体のクラスもしくはサブクラスと同一または相同であり、残りの部分は別の種（例えば、ヒト）の抗体または抗体のクラスもしくはサブクラスと同一または相同である抗体を指す。本明細書では目的のあるキメラ抗体には、ヒト以外の霊長類（例えば、旧世界サル、類人猿など）に由来する可変ドメイン抗原結合性配列およびヒト定常領域配列を含む「霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）」抗体が含まれる。
【００５３】
本明細書で用いる場合、用語「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、抗原結合に必要である、抗体可変ドメインのアミノ酸残基を指す。一般的に、各可変ドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と識別される３つのＣＤＲ領域を有する。
【００５４】
本明細書で用いる場合、用語「ダイアボディ分子」は、それぞれ少なくとも１つのＶＬおよび１つのＶＨドメインまたはその断片を含む、２つまたはそれより多くのポリペプチド鎖またはタンパク質の複合体を指し、両ドメインは単一のポリペプチド鎖に含まれる。特定の実施形態では、「ダイアボディ分子」は、ＦｃまたはヒンジＦｃドメインを含む分子を包含する。複合体中の前記ポリペプチド鎖は同じであっても異なってもよく、すなわち、ダイアボディ分子はホモ多量体またはヘテロ多量体であってもよい。特定の態様では、「ダイアボディ分子」は、二量体もしくは四量体またはＶＬおよびＶＨドメインの両方を含む前記ポリペプチド鎖を包含する。多量体タンパク質を含む個々のポリペプチド鎖は、鎖間ジスルフィド結合によって多量体の少なくとも１つの他のペプチドに共有結合することができる。
【００５５】
本明細書で用いる場合、用語「障害」および「疾患」は互換可能に用いられて、被験体の状態を指す。特に、用語「自己免疫疾患」は用語「自己免疫障害」と互換可能に用いられて、被験体自身の細胞、組織および／または器官に対する被験体の免疫反応によって引き起こされる細胞、組織および／または器官の損傷を特徴とする被験体の状態を指す。用語「炎症性疾患」は用語「炎症性障害」と互換可能に用いられて、炎症、好ましくは慢性炎症を特徴とする被験体の状態を指す。自己免疫障害は、炎症に関連してもよく、または関連しなくともよい。さらに、炎症は、自己免疫障害によって引き起こされてもよく、またはそうでなくてもよい。したがって、ある障害は、自己免疫性および炎症性の両方の障害として特徴付けることができる。
【００５６】
本明細書で用いる場合、用語「エフェクター細胞」は、１つまたはそれより多くのＦｃ受容体を発現して、１つまたはそれより多くのエフェクター機能を媒介する免疫系の細胞を指す。エフェクター細胞は、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、肥満細胞、血小板、Ｂ細胞、大顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を包含するがそれらに限定されず、ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサルが挙げられるがそれらに限定されない任意の生物体からのものであってもよい。
【００５７】
用語「エフェクター細胞」は、Ｆｃ受容体またはリガンドとの抗体Ｆｃ領域の相互作用に起因する生物活性を指す。抗体は、１つまたはそれより多くのエフェクター機能を有することができる。抗体エフェクター機能の非限定的な例は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御、オプソニン作用、オプソニン食作用、細胞結合およびロゼット形成を包含する。エフェクター機能は、抗原の結合の後に作動するもの、および抗原結合とは無関係に作動するものの両方を包含する。
【００５８】
本明細書で用いる場合、用語「エピトープ」は、ポリペプチドまたはタンパク質または非タンパク質分子のうちの、免疫特異的に抗体が結合する部分を指す。エピトープは、それが動物で抗体産生応答を引き出すように、免疫原性活性を有することができる。エピトープが免疫特異的に抗体に結合する能力は、例えば免疫アッセイで決定することができる。エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。
【００５９】
本明細書で用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載するために用いられる。例示的なＦｃＲは、天然配列のヒトＦｃＲである。ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合するもの（γ受容体）であってもよく、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃγＲＩＶのサブクラスの受容体を包含し、例えばこれらの受容体の対立遺伝子バリアントおよび選択的スプライス形態を包含し、例えば少なくとも２つの公知のＦｃγＲＩＩ受容体（ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢ）がある。用語ＦｃＲは、胎児への母体ＩｇＧの移動を担う新生児受容体ＦｃＲｎを包含する。
【００６０】
本明細書で用いるように、用語「Ｆｃ領域」は、ＩｇＧ重鎖のＣ末端領域を定義するために用いられる。境界はごくわずかに変動してもよいが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６からカルボキシ末端までに及ぶと定義される。ＩｇＧのＦｃ領域は、２つの定常ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）を含む。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＣＨ２ドメイン（「Ｃγ２」ドメインとも呼ばれる）は、通常アミノ酸２３１からアミノ酸３３８までにわたり、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインは、通常アミノ酸３４２〜４４７にわたる。
【００６１】
用語「グリコシル化部位」は、哺乳動物細胞によって糖残基の結合場所として認識されるアミノ酸残基を指す。オリゴ糖などの炭水化物が結合するアミノ酸残基は、通常アスパラギン（Ｎ結合）残基、セリン（Ｏ結合）残基およびスレオニン（Ｏ結合）残基である。特異的結合部位は、「グリコシル化部位配列」と呼ばれる特徴的なアミノ酸配列を通常有する。Ｎ結合グリコシル化のためのグリコシル化部位配列は、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒであり、ここでＸはプロリン以外の従来のアミノ酸のいずれであってもよい。ヒトＩｇＧのＦｃ領域は２つのＮ結合型グリコシル化部位を有し、各ＣＨ２ドメインの２９７位のアスパラギン（Ａｓｎ  ２９７）に１つ存在する。
【００６２】
本明細書で用いる場合、用語「ＨＡＭＡ応答」は、ヒト免疫系がマウスの抗体を異物として認識してそれを攻撃するときに起こる有害な免疫原性応答である、ヒト抗マウス抗体応答を指す。ＨＡＭＡ応答は、毒性ショックまたは死を引き起こすことができる。キメラのおよびヒト化された抗体は、投与される抗体の非ヒト部分を減少させることによってＨＡＭＡ応答の可能性を低下させるが、そのような抗体に対するヒト抗ヒト抗体応答（「ＨＡＨＡ応答」）免疫応答の可能性がまだある。
【００６３】
用語「重鎖」、「軽鎖」（「ＣＬ」）、「軽鎖可変領域」（「ＶＬ」）、「重鎖可変領域」（「ＶＨ」）、「フレームワーク領域」（「ＦＲ」）、「重鎖定常ドメイン」（「ＣＨ」）、「軽鎖定常ドメイン」（「ＣＬ」）は、天然に存在する免疫グロブリン中のドメイン、および合成（例えば、組換え体）結合タンパク質（例えば、ヒト化抗体）の対応するドメインを指す。天然に存在する免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）の基本構造単位は、２つの軽鎖および２つの重鎖を有する四量体である。通常、天然に存在する免疫グロブリンは約１５０ＫＤａの糖タンパク質として発現されるが、ＩｇＧは非グリコシル化形態で生成されてもよい。各鎖のアミノ末端（「Ｎ」）部分は、抗原認識を主に担う約１００〜１１０またはそれより多くのアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端（「Ｃ」）部分は定常領域を定義し、軽鎖は単一の定常ドメインを有し、重鎖は通常３つの定常ドメインおよびヒンジ領域を有する。したがって、天然に存在するＩｇＧ分子の軽鎖の構造はＮ−ＶＬ−ＣＬ−Ｃであり、ＩｇＧ重鎖の構造はＮ−ＶＨ−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−Ｃ（ここでＨはヒンジ領域である）である。ＩｇＧ分子の可変領域は、抗原と接触する残基を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）、および構造を維持してＣＤＲループの配置を決めるフレームワークセグメントと呼ばれる非ＣＤＲセグメントからなる。したがって、ＶＬドメインおよびＶＨドメインは、構造Ｎ−ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４−Ｃを有する。
【００６４】
本明細書で用いる場合、用語「異種の」核酸は、宿主細胞に導入されるＤＮＡ、ＲＮＡなどを表す。核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡおよびこれらの融合体または組合せを含む様々な供給源のいずれに由来してもよい。核酸は、宿主またはレシピエント細胞と同じ細胞または細胞型からのポリヌクレオチド、あるいは異なる細胞型、例えば哺乳動物または植物からのポリヌクレオチドを含むことができ、任意選択で、マーカーまたは選択遺伝子、例えば抗生物質耐性遺伝子、温度抵抗性（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）遺伝子などを含むことができる。
【００６５】
用語「ヒンジ領域」は、一般にヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０に及ぶと定義される。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間Ｓ−Ｓ結合を形成する最初および最後のシステイン残基を同じ位置に置くことによって、ＩｇＧ１配列と整列させることができる。
【００６６】
本明細書で用いる場合、用語「ヒト化」は、当該技術分野でのその通常の意味を有する。一般的な用語として、非ヒト抗体のヒト化は、非ヒト免疫グロブリンＶＬ領域およびＶＨ領域由来のＣＤＲ配列をヒトフレームワーク領域に置換することを含む。さらに、本明細書で用いる場合、「ヒト化」抗体は、親和性を増加させるためにまたは他の目的のために導入される、ＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域の追加の置換および変異を含むことができる。例えば、ヒト配列中における非ヒトフレームワーク残基の置換は、親和性を増加させることができる。生じた可変ドメインは、非ヒトＣＤＲ配列、およびヒト抗体フレームワーク配列由来のフレームワーク配列、またはヒトコンセンサス配列を有する。様々な異なるヒトフレームワーク領域は、ヒト化抗体の基礎として、単独でまたは組み合わせて用いることができる。
【００６７】
本明細書で用いる場合、用語「免疫調節剤」およびその変形形態は、宿主の免疫系を調節する剤を指す。特定の実施形態では、免疫調節剤は免疫抑制剤である。他の特定の実施形態では、免疫調節剤は免疫刺激剤である。免疫調節剤は、低分子、ペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質、抗体、無機分子、模倣剤および有機分子を包含するが、これらに限定されない。
【００６８】
本明細書で用いる場合、用語「免疫特異的に結合する」は、抗体とそれが認識するエピトープとの間で示される特異的結合を指す。そのような結合は、少なくとも約０．１ｍＭ、より普通には少なくとも約１μＭ、好ましくは少なくとも約０．１μＭ以下、最も好ましくは０．０１μＭ以下のＫＤを一般に示す。好ましくは、本発明の抗体は、高い親和性（例えば、低いＫＤ）で、タンパク質に免疫特異的に結合する。
【００６９】
抗原に免疫特異的に結合する抗体は、例えば免疫アッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅまたは当該技術分野で公知である他のアッセイによって測定した場合に、より低い親和性で他のペプチドまたはポリペプチドに結合することができる。好ましくは、抗原に特異的に結合する分子は、他のタンパク質と交差反応をしない。抗原に特異的に結合する分子は、例えば免疫アッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅ、または当業者に公知である他の技術によって同定することができる。
【００７０】
本明細書で用いる場合、用語「抗体工学技術（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｒｔ）」は、２００７年１２月１９日に出願の米国特許仮出願第６０／７８１，５６４号、第６０／９４５，５２３号、第６１／０１５，１０６号、および２００８年１月４日に出願の第６１／０１９，０５１号；米国特許出願公開第２００４０１８５０４５号、米国特許出願公開第２００４０１９７３４７号、米国特許出願公開第２００４０１９７８６６号、米国特許出願公開第２００５００３７０００号、米国特許出願公開第２００５００６４５１４号、米国特許出願公開第２００５０２１５７６７号、米国特許出願公開第２００６０１３４７０９号、米国特許出願公開第２００６０１７７４３９号、米国特許出願公開第２００７０００４９０９号、米国特許出願公開第２００７００３６７９９号、米国特許出願公開第２００７００３７２１６号、米国特許出願公開第２００７００７７２４６号、米国特許出願公開第２００７０２４４３０３号、米国特許出願公開第２００８００４４４２９号、米国特許出願公開第２００８００５０３７１号、第１１／８６９，４１０号、第１１／９５２，５６８号；米国特許第７，１１２，４３９号；国際公開第０４／０６３３５１号、国際公開第０６／０８８４９４号、国際公開第０７／０２４２４９号、国際公開第０６／１１３６６５号、国際公開第０７／０２１８４１号、国際公開第０７／１０６７０７号；またはＰＣＴ／ＵＳ０７／８６７９３に開示される技術を指す。
【００７１】
本明細書で用いる場合、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量存在し得る可能な天然に存在する変異を除いて同一であり、そして本明細書で用いる場合、用語「ポリクローナル抗体」は、不均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一のエピトープに対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらを他の抗体による汚染なしに合成することができるという点で有利である。用語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるという抗体の特性を示し、任意の特定の方法による抗体の生成を要求するものと解釈されてはならない。
【００７２】
本明細書で用いる場合、用語「核酸」および「ヌクレオチド配列」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ分子とＲＮＡ分子との組合せ、またはハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ分子、ならびにＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子の類似体を包含する。そのような類似体は、例えば、イノシンまたはトリチル化塩基が挙げられるがそれらに限定されないヌクレオチド類似体を用いて生成することができる。そのような類似体は、分子に、例えばヌクレアーゼ耐性または細胞膜を通過する能力の向上などの、有益な属性を与える修飾骨格を含むＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を含むこともできる。核酸またはヌクレオチド配列は、一本鎖、二本鎖であってもよく、一本鎖および二本鎖の部分を含むことができ、三本鎖部分を含むことができるが、好ましくは二本鎖のＤＮＡである。
【００７３】
本明細書で用いる場合、「実質的な配列同一性」は、最大対応について比較および整列した場合、少なくとも約８０％のアミノ酸残基同一性、好ましくは少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の同一性を有する２つまたはそれより多くの配列または部分配列（例えば、ドメイン）を指す。２つの類似した配列（例えば、抗体可変領域）間の配列同一性は、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ、１９８１年、Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２巻：４８２頁［ローカルホモロジーアルゴリズム］、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ、１９７０年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８巻：４４３頁［ホモロジーアラインメントアルゴリズム］、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ、１９８８年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （Ｕ．Ｓ．Ａ．）  ８５巻：２４４４頁［類似検索法］、またはＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５巻：４０３〜１０頁［ＢＬＡＳＴアルゴリズム］のアルゴリズムなどのアルゴリズムによって測定することができる。前記のアルゴリズムのいずれかを用いる場合、デフォルトパラメータ（ウインドウ長、ギャップペナルティなどについて）が用いられる。アミノ酸配列は、配列同一性の程度が少なくとも約７０％同一、好ましくは少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、またはさらに少なくとも約９５％同一である場合、第２の配列に「実質的に類似する」と言われる。核酸配列は、（１）配列同一性の程度が少なくとも約７０％同一、好ましくは少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、またはさらに少なくとも約９５％同一であるか、あるいは、核酸配列が、第２の配列によってコードされるポリペプチドに少なくとも約７０％同一、好ましくは少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、またはさらに少なくとも約９５％同一であるポリペプチドをコードする場合、第２の配列に「実質的に類似する」と言われる。実質的に同一である配列は、実質的に類似もしている。
【００７４】
抗体に言及する場合、各ドメインへのアミノ酸の割当ては、明示的に本明細書に参照として援用されるＫａｂａｔ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、１９８７年および１９９１年）に従う。本明細書全体で、ＩｇＧ重鎖の残基の番号付けは、Ｋａｂａｔの場合の通りのＥＵインデックスの番号付けであり、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の番号付けを指す。
【００７５】
Ｂ．抗体
本発明は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、好ましくはヒトＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的に結合するキメラ抗体およびポリペプチドを特に包含する。軽鎖可変領域のグリコシル化部位の除去に起因して、マウスの４Ｄ５およびトラスツズマブなどの公知の４Ｄ５抗体と比較して、抗体は低減したグリコシル化を有する。特に、抗体は、天然マウスの４Ｄ５では６５位、６６位および６７位のＮ−Ｒ−Ｓ配列を含む、軽鎖可変領域のグリコシル化部位を欠く。好ましくは、天然の４Ｄ５抗体と比較して、抗体はＨＥＲ２／ｎｅｕに対する強化された結合親和性を有し、より好ましくは、抗体は強化されたエフェクター機能を有する。
【００７６】
抗体は、軽鎖可変領域の６５位、６６位および６７位のＮ結合型グリコシル化部位を欠くキメラ４Ｄ５免疫グロブリン軽鎖を含む。特定の実施形態では、抗体は軽鎖可変領域（ＶＬ）の６５位に、改変、好ましくは置換を含む。好ましい実施形態では、抗体は、配列番号１の核酸配列によってコードされる軽鎖を含むか、または配列番号２のアミノ酸配列を含む。本発明の好ましい軽鎖の核酸配列およびアミノ酸配列を、以下に示す：
【００７７】
【化１】
0005555223.tif 000003
【００７８】
Ｎ６５Ｓ改変を有するキメラ４Ｄ５抗体（配列番号４）と、天然マウス４Ｄ５抗体（配列番号３）およびヒト化４Ｄ５抗体（配列番号５）とでのＶＬ領域アミノ酸配列の間の例示的な比較を表す図１からわかるように、ＶＬ領域の６５位に改変を有するこれらの抗体は、天然のマウス４Ｄ５抗体で見出されるＮ結合型グリコシル化部位を欠く。別の好ましい実施形態では、抗体はＶＬ領域にＮ６５Ｓ改変を含み、好ましくは配列番号４のＶＬ領域アミノ酸配列を有する。これらの配列を、以下に示す：
【００７９】
【化２】
0005555223.tif 000004
【００８０】
【化３】
0005555223.tif 000005
【００８１】
一実施形態では、重鎖は、（好ましくは配列番号６の核酸配列によってコードされるか、または配列番号７のアミノ酸配列を有する）マウスの４Ｄ５野生型Ｆｃ領域を有する。これらの配列を以下に示す：
【００８２】
【化４】
0005555223.tif 000006
【００８３】
他の実施形態では、重鎖は、好ましくはバリアントＦｃ領域を含み、より好ましくはＦｃＭＴ１、ＦｃＭＴ２またはＦｃＭＴ３などのバリアントＦｃ領域を含む、マウスの４Ｄ５抗体重鎖のバリアントである。これらの配列を以下に示す：
【００８４】
【化５】
0005555223.tif 000007
【００８５】
【化６】
0005555223.tif 000008
【００８６】
一実施形態では、バリアント４Ｄ５重鎖はＦｃ領域に改変を有し、配列番号８の核酸配列によってコードされるかもしくは配列番号９のアミノ酸配列を含み、または配列番号１０の核酸配列によってコードされるかもしくは配列番号１１のアミノ酸配列を含み、または配列番号１２の核酸配列によってコードされるかもしくは配列番号１３のアミノ酸配列を含む。好ましくは、抗体は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２からなる群から選択される核酸配列によってコードされる重鎖を含むか、または配列番号７、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００８７】
一実施形態では、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体は、ＶＬ領域にＮ６５Ｓ改変を有する免疫グロブリン軽鎖、および改変されたＦｃ領域を有する免疫グロブリン重鎖を含む。好ましくは、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖、ならびに配列番号７、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖を含む。一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、（一部の実施形態では少なくとも配列番号４を含む）軽鎖可変ドメインに融合された軽鎖定常ドメインをさらに含む。他の実施形態では、抗体は改変されるか、断片であるか、または改変された断片である。
【００８８】
キメラ４Ｄ５抗体は、活性化低親和性Ｆｃ受容体への結合を高めるために、および低親和性阻害剤受容体ＣＤ３２Ｂ（ＦｃγＲＩＩ−Ｂ）への結合を変化させないかまたは最小限にしか増加させないために、本発明の様々な実施形態に従って構築された。抗体は、以下の野生型およびＦｃ最適化抗体を包含する：
・  配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖、および配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖を有するｃｈ４Ｄ５−野生型Ｆｃ。ｃｈ４Ｄ５−野生型Ｆｃは、脱グリコシル化軽鎖をもたらすＮ６５Ｓ置換を軽鎖に有する。
【００８９】
・  配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖、および配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖を有するｃｈ４Ｄ５−ＦｃＭＴ１。ｃｈ４Ｄ５−ＦｃＭＴ１は、脱グリコシル化軽鎖をもたらすＮ６５Ｓ置換を軽鎖に、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５ＩおよびＰ３９６Ｌ置換を重鎖に有する（すべてＫａｂａｔにしたがって番号付けした）。ｃｈ４Ｄ５−ＦｃＭＴ１はヒトＣＤ１６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩ−Ａ）への結合の１０倍の増加を示し、ＣＤ１６−１５８Ｐｈｅへの結合はＣＤ１６−１５８Ｖａｌへの結合よりも比例して強く強化される。
【００９０】
・  配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖、および配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖を有するｃｈ４Ｄ５−ＦｃＭＴ２。ｃｈ４Ｄ５−ＦｃＭＴ２は、脱グリコシル化軽鎖をもたらすＮ６５Ｓ置換を軽鎖に、Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００ＬおよびＰ３９６Ｌ置換を重鎖に有する（すべてＫａｂａｔにしたがって番号付けした）。この抗体はｃｈ４Ｄ５−ＦｃＭＴ１抗体のさらなる改良型であり、類似したＣＤ１６Ａ結合特性を有するが、ＣＤ３２Ｂ（ＦｃγＲＩＩ−Ｂ）への結合のより好ましい減少も有する。
【００９１】
・  配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖、および配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖を有するｃｈ４Ｄ５−ＦｃＭＴ３。ｃｈ４Ｄ５−ＦｃＭＴ３は、脱グリコシル化軽鎖をもたらすＮ６５Ｓ置換を軽鎖に、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２ＰおよびＹ３００Ｌ置換を重鎖に有する（すべてＫａｂａｔにしたがって番号付けした）。この抗体はｃｈ４Ｄ５−ＦｃＭＴ１抗体のさらなる改良型であり、類似したＣＤ１６Ａ結合特性を有するが、ＣＤ３２Ｂ（ＦｃγＲＩＩ−Ｂ）への結合のより好ましい減少も有する。
【００９２】
・  ｃｈ４Ｄ５−Ａｇ
・  配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖、およびＮ２９７Ｑ置換を有する重鎖を有するｃｈ４Ｄ５−Ｎ２９７Ｑ（Ｋａｂａｔにしたがって番号付けした）。
【００９３】
ｃｈ４Ｄ５−野生型ＦｃとＦｃ最適化バリアントｃｈ４Ｄ５−ＦｃＭＴ１、ｃｈ４Ｄ５−ＦｃＭＴ２およびｃｈ４Ｄ５−ＦｃＭＴ３との重鎖配列の比較を、図２に示す。ＣＤＲは、関係する残基の下に示す黒いバーで示す。
【００９４】
本発明によって企図されるポリペプチド（特に抗体）は、本発明の任意のアミノ酸配列のすべてまたは一部分を含むことができる。例えば、一実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ６５Ｓ置換を有するマウスの４Ｄ５免疫グロブリン軽鎖を含み、別の実施形態では、ポリペプチドはマウスの４Ｄ５免疫グロブリン重鎖バリアントを含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン、または配列番号２のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、バリアントＦｃドメイン、または配列番号７、配列番号９、配列番号１１もしくは配列番号１３のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖、またはＦ２４３Ｌ、Ｒ２９２ＰおよびＹ３００Ｌ置換を含む４Ｄ５免疫グロブリン重鎖を含む。
【００９５】
本発明によって企図されるポリペプチド（特に抗体）は、お互いとの複合体、または他の非免疫グロブリンポリペプチド（例えば、酵素、ホルモン、構造タンパク質など）との複合体であることができる。例えば、実施形態は、２つのポリペプチドを含むポリペプチド複合体を提供することができ、ここで、前記ポリペプチドの１つは重鎖を含み、他のポリペプチドはバリアント軽鎖を含むか、両ポリペプチドが同じ配列を含む。複合体化は、本明細書で記載されるものなどの二量体化／多量体化ドメインでの二量体化／多量体化、または共有結合相互作用（例えばジスルフィド結合を通して）（一部の場面では、それは二量体化ドメインの一部であり、例えば二量体化ドメインはロイシンジッパー配列およびシステインを含むことができる）を含む、任意の適する技術によって媒介することができる。別の実施形態では、組成物は本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを含むことができ、例えば、組成物は本明細書に記載のポリペプチドのいずれか複数を含むことができる。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む組成物は、キットまたは製造品（任意選択で指示書、緩衝液などを同梱した）の形態であることができる。
【００９６】
ポリペプチドバリアント（特に抗体バリアント）を調製することができることも考えられる。ポリペプチドバリアントは、天然のアミノ酸配列と比較して、それらのアミノ酸配列中の所望の位置に配列改変（例えば、置換、欠失および／または付加）を有することができる。当業者は、アミノ酸変化が抗体またはポリペプチドの翻訳後プロセスを変化させ得ること、例えばグリコシル化部位の数もしくは位置を変更するか、または膜アンカリング特性を変化させることができることを理解するであろう。好ましい実施形態では、抗体およびポリペプチドバリアントは、Ｆｃ領域バリアントである。
【００９７】
バリアントは、天然の抗体またはポリペプチドと比較して、同じであるかまたは変化させた活性を有することができる。例えば、バリアントは同じ活性を有するが、それがより安定であるかまたはインビボでより長い半減期を有するような様式で、例えば抗体を、例えば米国特許第５，７３９，２７７号に記載されるようにアルブミンまたはサルベージ受容体結合エピトープと結合することによって改変することが望ましい可能性がある。または、例えば、抗体が、増加した抗原結合親和性を有するが、天然の抗体と同じエフェクター機能を有することが望ましい可能性があり、または、抗体が同じ抗原結合親和性を有するが、低下したエフェクター機能を有することが望ましい可能性がある。活性は、例えばＥＬＩＳＡアッセイ、表面プラズモン共鳴アッセイ、放射標識タンパク質結合アッセイ（ＲＩＡ）または免疫沈降アッセイなどのインビトロのアッセイを用いることによって試験することができる。
【００９８】
機能または免疫学的同一性の実質的な改変は、（ａ）（例えばシートもしくは螺旋立体配座としての）改変領域のポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位の分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさを維持することに対するそれらの影響がかなり異なる改変を選択することによって達成することができる。例えばＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ（１９８９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４巻：１０８１〜１０８５頁によって記載されるように、連続配列に沿って１つまたはそれより多くのアミノ酸を同定するために、走査アミノ酸分析を使用することもできる。好ましい走査アミノ酸には、比較的小さい中性アミノ酸、例えばアラニン、グリシン、セリンおよびシステインが含まれる。アラニンは、最も一般的なアミノ酸であり、埋没した位置および露出した位置の両方でしばしば見出され、β炭素を越える側鎖を除去し、バリアントの主鎖立体配座を変化させる可能性が低いので、一般的にこの群の中で好ましい走査アミノ酸である。アラニン置換が適切な量のバリアントを与えない場合、等配電子のアミノ酸（ｉｓｏｔｅｒｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）を用いることができる。さらに、分子の酸化安定度を改善して、異常な架橋を防止するために、抗体またはポリペプチドの適切な立体配座の維持に関与しない任意のシステイン残基を、一般にセリンで置換することができる。しかし、特定の状況、特に抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合、その安定性を改善するためにシステイン結合を抗体またはポリペプチドに加えることができる。
【００９９】
Ｂ１．Ｆｃドメインバリアント
本発明のポリペプチドは、バリアントＦｃドメインを有することができる。Ｆｃドメインの改変は、変化した表現型、例えば変化した血清半減期、変化した安定性、細胞酵素への変化した感受性または変化したエフェクター機能を通常もたらす。例えば癌の処置における抗体の有効性を高めるために、本発明の抗体を、エフェクター機能に関して改変することが望ましい可能性がある。エフェクター機能の低下または消去は、例えばその作用機構がブロッキングまたは拮抗作用を含むが、標的抗原を保有する細胞の殺傷を含まない抗体の場合など、特定の場合に望ましい。高められたエフェクター機能は、ＦｃγＲが低レベルで発現される、腫瘍および外来細胞などの望ましくない細胞、例えば低レベルのＦｃγＲＩＩＢを有する腫瘍特異Ｂ細胞（例えば、非ホジキンリンパ腫、ＣＬＬおよびバーキットリンパ腫）に関する場合に一般に望ましい。前記実施形態では、付与されたかまたは変化したエフェクター機能活性を有する本発明の分子は、エフェクター機能活性の高められた効力が望まれる疾患、障害または感染症の処置および／または予防のために有用である。
【０１００】
特定の実施形態では、本発明の分子は、１つまたはそれより多くのＦｃγＲ受容体に対するＦｃ領域の、したがって本発明の分子の親和性およびアビディティを低減させる、Ｆｃドメインのアミノ酸への１つまたはそれより多くの改変を含む。他の実施形態では、本発明の分子は、１つまたはそれより多くのＦｃγＲ受容体に対するＦｃ領域の、したがって本発明の分子の、親和性およびアビディティを高める、Ｆｃ領域のアミノ酸への１つまたはそれより多くの改変を含む。他の実施形態では、分子はバリアントＦｃドメインを含み、そこで前記バリアントは、Ｆｃドメインを含まないかまたは野生型Ｆｃドメインを含む分子と比較して、高められたＡＤＣＣ活性および／またはＦｃγＲＩＩＡへの結合の増加を付与または媒介する。代わりの実施形態では、分子はバリアントＦｃドメインを含み、そこで前記バリアントは、Ｆｃドメインを含まないかまたは野生型Ｆｃドメインを含む分子と比較して、低下したＡＤＣＣ活性（または他のエフェクター機能）および／またはＦｃγＲＩＩＢへの結合の増加を付与または媒介する。
【０１０１】
一部の実施形態では、本発明は、バリアントＦｃ領域を含む分子を包含し、そのバリアントＦｃ領域は、野生型Ｆｃ領域を含む匹敵する分子と比較して、いかなるＦｃγＲへも検出可能な結合を示さない。他の実施形態では、本発明は、バリアントＦｃ領域を含む分子を包含し、そのバリアントＦｃ領域は単一のＦｃγＲ、好ましくはＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢまたはＦｃγＲＩＩＩＡの１つだけに結合する。
【０１０２】
本発明のポリペプチドは、活性化および／または阻害性のＦｃγ受容体への変化した親和性を含むことができる。一実施形態では、抗体またはポリペプチドは、野生型Ｆｃ領域を有する匹敵する分子と比較して、ＦｃγＲＩＩＢへの高められた親和性ならびにＦｃγＲＩＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＡへの低減した親和性を有するバリアントＦｃ領域を含む。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、野生型Ｆｃ領域を有する匹敵する分子と比較して、ＦｃγＲＩＩＢへの低減した親和性ならびにＦｃγＲＩＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＡへの高められた親和性を有するバリアントＦｃ領域を含む。さらに別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、野生型Ｆｃ領域を有する匹敵する分子と比較して、ＦｃγＲＩＩＢへの低減した親和性およびＦｃγＲＩＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＡへの低減した親和性を有するバリアントＦｃ領域を含む。さらに別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、野生型Ｆｃ領域を有する匹敵する分子と比較して、ＦｃγＲＩＩＢへの変化していない親和性ならびにＦｃγＲＩＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＡへの低減した（または高められた）親和性を有するバリアントＦｃ領域を含む。
【０１０３】
特定の実施形態では、免疫グロブリンが高められたエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を有するように、本発明は、ＦｃγＲＩＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＡへの変化した親和性を有するバリアントＦｃ領域を含む免疫グロブリンを包含する。エフェクター細胞機能の非限定的な例は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性食作用、食作用、オプソニン作用、オプソニン食作用、細胞結合、ロゼット形成、Ｃ１ｑ結合、および補体依存性細胞媒介性細胞傷害を包含する。
【０１０４】
好ましい一実施形態では、親和性またはエフェクター機能の変化は、野生型Ｆｃ領域を含む匹敵する分子と比較して、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍または少なくとも１００倍である。本発明の他の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、野生型Ｆｃ領域を含む分子と比較して、１つまたはそれより多くのＦｃＲに、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２２５％または２５０％高い親和性で免疫特異的に結合する。そのような測定はインビボまたはインビトロのアッセイであってもよく、好ましい実施形態では、ＥＬＩＳＡまたは表面プラズモン共鳴アッセイなどのインビトロアッセイである。
【０１０５】
異なる実施形態では、分子はバリアントＦｃドメインを含み、前記バリアントはＦｃγＲ受容体の少なくとも１つの活性をアゴナイズするか、またはＦｃγＲ受容体の少なくとも１つの活性をアンタゴナイズする。好ましい実施形態では、分子は、ＦｃγＲＩＩＢの１つまたはそれより多くの活性、例えば、Ｂ細胞受容体媒介シグナル伝達、Ｂ細胞の活性化、Ｂ細胞の増殖、抗体産生、Ｂ細胞の細胞内カルシウム流入、細胞周期進行、ＦｃεＲＩシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ媒介阻害、ＦｃγＲＩＩＢのリン酸化、ＳＨＩＰ補充、ＳＨＩＰリン酸化およびＳｈｃとの結合、またはＦｃγＲＩＩＢシグナル伝達経路の１つまたはそれより多くの下流分子（例えば、ＭＡＰキナーゼ、ＪＮＫ、ｐ３８またはＡｋｔ）の活性をアゴナイズする（あるいは、それらをアンタゴナイズする）バリアントを含む。別の実施形態では、分子は、ＦｃεＲＩの１つまたはそれより多くの活性、例えば、肥満細胞活性化、カルシウム動員、脱顆粒、サイトカイン生成またはセロトニン放出をアゴナイズする（あるいは、それらをアンタゴナイズする）バリアントを含む。
【０１０６】
特定の実施形態では、分子は、２つ以上のＩｇＧアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）からのドメインまたは領域を含むＦｃドメインを含む。様々なＩｇＧアイソタイプは、それらのヒンジおよび／またはＦｃドメインのアミノ酸配列の差に起因して、例えばＦｌｅｓｃｈおよびＮｅｐｐｅｒｔ（１９９９年）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｌａｂ．  Ａｎａｌ．  １４巻：１４１〜１５６頁、Ｃｈａｐｐｅｌら（１９９３年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ３３巻：２５１２４〜２５１３１頁、Ｃｈａｐｐｅｌら（１９９１年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （Ｕ．Ｓ．Ａ．）  ８８巻：９０３６〜９０４０頁、Ｂｒｕｅｇｇｅｍａｎｎら（１９８７年）Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ  １６６巻：１３５１〜１３６１頁に記載のように、血清半減期、補体結合、ＦｃγＲ結合親和性およびエフェクター機能活性（例えばＡＤＣＣ、ＣＤＣなど）を含む異なる物理的および機能的な特性を示す。Ｆｃ媒介エフェクター機能および／または結合活性に影響を及ぼすために、この種のバリアントＦｃドメインを単独で、またはアミノ酸改変と組み合わせて用いることができる。組合せでは、アミノ酸改変およびＩｇＧヒンジ／Ｆｃ領域は類似した機能性（例えば、ＦｃγＲＩＩＡへの親和性の増加）を示すことができ、相加的に、またはより好ましくは相乗的に作用して、野生型Ｆｃ領域を含む本発明の分子と比較して本発明の分子のエフェクター機能を改変することができる。他の実施形態では、アミノ酸改変およびＩｇＧ  Ｆｃ領域は反対の機能（例えば、それぞれ、ＦｃγＲＩＩＡへの親和性の増加および減少）を示すことができ、Ｆｃ領域を含まないかまたは同じアイソタイプの野生型Ｆｃ領域を含む本発明の分子と比較して、本発明の分子の特定の機能を選択的に緩和または低減する作用をすることができる。
【０１０７】
好ましい特定の実施形態では、分子はバリアントＦｃ領域を含み、前記バリアントＦｃ領域は野生型Ｆｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、その結果前記分子は変化したＦｃＲ親和性を有するが、ただし、前記バリアントＦｃ領域は、Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎら（２０００年）Ｎａｔｕｒｅ  ４０６巻：２６７〜２７３頁によって開示されるものなどのＦｃ−ＦｃＲ相互作用の結晶学的および構造的な分析に基づき、ＦｃγＲと直接接触する位置に置換を有しない。ＦｃγＲと直接接触するＦｃ領域中の位置の例は、アミノ酸残基２３４〜２３９（ヒンジ領域）、アミノ酸残基２６５〜２６９（Ｂ／Ｃループ）、アミノ酸残基２９７〜２９９（Ｃ’／Ｅループ）およびアミノ酸残基３２７〜３３２（Ｆ／Ｇループ）である。一部の実施形態では、本発明の分子は、構造的および結晶学的分析に基づきＦｃγＲと直接接触をせず、例えばＦｃ−ＦｃγＲ結合部位の中にない、少なくとも１つの残基の改変を含むバリアントＦｃ領域を含む。
【０１０８】
バリアントＦｃドメインは当該技術分野で周知であって、（例えばＮＫ依存性またはマクロファージ依存性アッセイで）機能的にアッセイして、Ｆｃドメイン（またはその一部）を含む本発明の分子によって示されるエフェクター機能を付与または改変するために、任意の公知のＦｃバリアントを本発明で用いることができる。例えば、エフェクター機能の変化が確認されたＦｃドメインバリアントが抗体工学技術に開示され、その中に開示される任意の適するバリアントを本分子で用いることができる。
【０１０９】
特定の実施形態では、分子は、１つまたはそれより多くの領域に１つまたはそれより多くのアミノ酸改変を有するバリアントＦｃ領域を含み、前記改変は、阻害性ＦｃγＲ（例えばＦｃγＲＩＩＢ）と比較して、活性化ＦｃγＲ（例えばＦｃγＲＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＩＡ）に対するバリアントＦｃ領域の親和性比を変化させる（野生型Ｆｃ領域と比較して）。
【０１１０】
【数１】
0005555223.tif 000009
【０１１１】
Ｆｃバリアントが１より高い親和性比を有する場合、ＦｃγＲによって媒介されるエフェクター細胞機能（例えば、ＡＤＣＣ）の効力増強が望ましい場合、例えば癌または感染性疾患の場合、本発明の方法は、疾患、障害もしくは感染症の治療的もしくは予防的な処置、またはそれらの症状の改善を提供することにおいて特に有用である。Ｆｃバリアントが１未満の親和性比を有する場合、ＦｃγＲによって媒介されるエフェクター細胞機能の効力低下が望ましい場合、例えば自己免疫または炎症性の障害の場合、本発明の方法は、疾患もしくは障害の治療的もしくは予防的な処置、またはそれらの症状の改善を提供することにおいて特に有用である。表２は、それらの親和性比が１より高いかまたは１未満であるかにより、例示的な単変異、二重変異、三重変異、四重変異および五重変異を列挙する。様々な変異の特異的結合データを表３に記載し、これらの変異に関するさらなる情報は、抗体工学技術で見出すことができる。
【０１１２】
【表２−１】
0005555223.tif 000010
【０１１３】
【表２−２】
0005555223.tif 000011
【０１１４】
【表３−１】
0005555223.tif 000012
【０１１５】
【表３−２】
0005555223.tif 000013
【０１１６】
【表３−３】
0005555223.tif 000014
【０１１７】
他の実施形態では、分子は１つまたはそれより多くのアミノ酸置換を有するバリアントＦｃ領域を含み、前記置換はバリアントＦｃ領域の結合を（野生型Ｆｃ領域と比較して）変化させ、例えば活性化ＦｃγＲ（例えばＦｃγＲＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＩＡ）への結合を高め、および／または阻害性ＦｃγＲ（例えばＦｃγＲＩＩＢ）への結合を減少させる。表４に示すように、１つまたはそれより多くのアミノ酸変化を有する様々なＦｃ変異を操作し、そしてｋｏｆｆについて表面プラズモン共鳴によって分析した。様々なＦｃγＲの結合についての解離速度定数をＢＩＡｃｏｒｅ分析によって決定し、野生型Ｆｃのものと直接比較し、試験した各ＦｃγＲに関して比（ｘ＝ＷＴ  ｋｏｆｆ／変異体ｋｏｆｆ）を表４の右側のカラムに示した。
【０１１８】
【表４−１】
0005555223.tif 000015
【０１１９】
【表４−２】
0005555223.tif 000016
【０１２０】
抗体工学技術には、望ましい改変に関して厖大な指針もある。特定の状況で望ましい可能性がある例示的な改変を、以下に記載する：
特定の実施形態では、バリアントＦｃ領域において、２３５位、２４０位、２４１位、２４３位、２４４位、２４７位、２６２位、２６３位、２６９位、２９８位、３２８位または３３０位のいずれかにおける任意のアミノ酸改変（例えば、置換）、好ましくは以下の残基：Ａ２４０、Ｉ２４０、Ｌ２４１、Ｌ２４３、Ｈ２４４、Ｎ２９８、Ｉ３２８またはＶ３３０のうちの１つまたはそれより多く。異なる特定の実施形態では、バリアントＦｃ領域において、２６８位、２６９位、２７０位、２７２位、２７６位、２７８位、２８３位、２８５位、２８６位、２８９位、２９２位、２９３位、３０１位、３０３位、３０５位、３０７位、３０９位、３３１位、３３３位、３３４位、３３５位、３３７位、３３８位、３４０位、３６０位、３７３位、３７６位、４１６位、４１９位、４３０位、４３４位、４３５位、４３７位、４３８位または４３９位のいずれかにおける任意のアミノ酸改変（例えば、置換）、好ましくは以下の残基：Ｈ２８０、Ｑ２８０、Ｙ２８０、Ｇ２９０、Ｓ２９０、Ｔ２９０、Ｙ２９０、Ｎ２９４、Ｋ２９５、Ｐ２９６、Ｄ２９８、Ｎ２９８、Ｐ２９８、Ｖ２９８、Ｉ３００またはＬ３００のうちの１つまたはそれより多く。
【０１２１】
好ましい実施形態では、変化した親和性でＦｃγＲに結合するバリアントＦｃ領域において、２５５位、２５６位、２５８位、２６７位、２６８位、２６９位、２７０位、２７２位、２７６位、２７８位、２８０位、２８３位、２８５位、２８６位、２８９位、２９０位、２９２位、２９３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９８位、３００位、３０１位、３０３位、３０５位、３０７位、３０９位、３１２位、３２０位、３２２位、３２６位、３２９位、３３０位、３３２位、３３１位、３３３位、３３４位、３３５位、３３７位、３３８位、３３９位、３４０位、３５９位、３６０位、３７３位、３７６位、４１６位、４１９位、４３０位、４３４位、４３５位、４３７位、４３８位または４３９位のいずれかにおける任意のアミノ酸改変（例えば、置換）。好ましくは、バリアントＦｃ領域は、以下の残基：Ａ２５６、Ｎ２６８、Ｑ２７２、Ｄ２８６、Ｑ２８６、Ｓ２８６、Ａ２９０、Ｓ２９０、Ａ２９８、Ｍ３０１、Ａ３１２、Ｅ３２０、Ｍ３２０、Ｑ３２０、Ｒ３２０、Ｅ３２２、Ａ３２６、Ｄ３２６、Ｅ３２６、Ｎ３２６、Ｓ３２６、Ｋ３３０、Ｔ３３９、Ａ３３３、Ａ３３４、Ｅ３３４、Ｈ３３４、Ｌ３３４、Ｍ３３４、Ｑ３３４、Ｖ３３４、Ｋ３３５、Ｑ３３５、Ａ３５９、Ａ３６０またはＡ４３０のいずれかを有する。
【０１２２】
異なる実施形態では、ＦｃγＲに（そのＦｃ領域を通して）減少した親和性で結合するバリアントＦｃ領域において、２５２位、２５４位、２６５位、２６８位、２６９位、２７０位、２７８位、２８９位、２９２位、２９３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９８位、３００位、３０１位、３０３位、３２２位、３２４位、３２７位、３２９位、３３３位、３３５位、３３８位、３４０位、３７３位、３７６位、３８２位、３８８位、３８９位、４１４位、４１６位、４１９位、４３４位、４３５位、４３７位、４３８位または４３９位のいずれかにおける任意のアミノ酸改変（例えば、置換）。
【０１２３】
異なる実施形態では、ＦｃγＲに（そのＦｃ領域を通して）高められた親和性で結合するバリアントＦｃ領域において、２８０位、２８３位、２８５位、２８６位、２９０位、２９４位、２９５位、２９８位、３００位、３０１位、３０５位、３０７位、３０９位、３１２位、３１５位、３３１位、３３３位、３３４位、３３７位、３４０位、３６０位、３７８位、３９８位または４３０位のいずれかにおける任意のアミノ酸改変（例えば、置換）。異なる実施形態では、ＦｃγＲＩＩＡに高められた親和性で結合するバリアントＦｃ領域において、以下の残基、Ａ２５５、Ａ２５６、Ａ２５８、Ａ２６７、Ａ２６８、Ｎ２６８、Ａ２７２、Ｑ２７２、Ａ２７６、Ａ２８０、Ａ２８３、Ａ２８５、Ａ２８６、Ｄ２８６、Ｑ２８６、Ｓ２８６、Ａ２９０、Ｓ２９０、Ｍ３０１、Ｅ３２０、Ｍ３２０、Ｑ３２０、Ｒ３２０、Ｅ３２２、Ａ３２６、Ｄ３２６、Ｅ３２６、Ｓ３２６、Ｋ３３０、Ａ３３１、Ｑ３３５、Ａ３３７またはＡ４３０のいずれか。
【０１２４】
他の実施形態では、本発明は当該技術分野で公知である任意のＦｃバリアント、例えば、Ｊｅｆｆｅｒｉｓら（２００２年）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ８２巻：５７〜６５頁、Ｐｒｅｓｔａら（２００２年）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ  ３０巻：４８７〜９０頁、Ｉｄｕｓｏｇｉｅら（２００１年）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６６巻：２５７１〜７５頁、Ｓｈｉｅｌｄｓら（２００１年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６巻：６５９１〜６６０４頁、Ｉｄｕｓｏｇｉｅら（２０００年）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４巻：４１７８〜８４頁、Ｒｅｄｄｙら（２０００年）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４巻：１９２５〜３３頁、Ｘｕら（２０００年）Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００巻：１６〜２６頁、Ａｒｍｏｕｒら（１９９９年）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２９巻：２６１３〜２４頁、Ｊｅｆｆｅｒｉｓら（１９９６年）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ５４巻：１０１〜０４頁、Ｌｕｎｄら（１９９６年）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５７巻：４９６３〜６９頁、Ｈｕｔｃｈｉｎｓら（１９９５年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （Ｕ．Ｓ．Ａ．）  ９２巻：１１９８０〜８４頁、Ｊｅｆｆｅｒｉｓら（１９９５年）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．  ４４巻：１１１〜１７頁、Ｌｕｎｄら（１９９５年）ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ９巻：１１５〜１９頁、Ａｌｅｇｒｅら（１９９４年）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５７巻：１５３７〜４３頁、Ｌｕｎｄら（１９９２年）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２９巻：５３〜５９頁、Ｌｕｎｄら（１９９１年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４７巻：２６５７〜６２頁、Ｄｕｎｃａｎら（１９８８年）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２巻：５６３〜６４頁、米国特許第５，６２４，８２１号、第５，８８５，５７３号、第６，１９４，５５１号、第７，２７６，５８６号および第７，３１７，０９１号；国際公開第００／４２０７２号および国際公開第９９／５８５７２号に開示のものの使用を包含する。
【０１２５】
好ましいバリアントは、２２８位、２３０位、２３１位、２３２位、２３３位、２３４位、２３５位、２３９位、２４０位、２４１位、２４３位、２４４位、２４５位、２４７位、２６２位、２６３位、２６４位、２６５位、２６６位、２７１位、２７３位、２７５位、２８１位、２８４位、２９１位、２９６位、２９７位、２９８位、２９９位、３０２位、３０４位、３０５位、３１３位、３２３位、３２５位、３２６位、３２８位、３３０位または３３２位のいずれかにおいて１つまたはそれより多くの改変を含む。
【０１２６】
特に好ましいバリアントは、群Ａ〜ＡＩから選択される１つまたはそれより多くの改変を含む：
【０１２７】
【数２】
0005555223.tif 000017
【０１２８】
【数３】
0005555223.tif 000018
【０１２９】
さらにより特に好ましいバリアントは、群１〜１０５から選択される１つまたはそれより多くの改変を含む。
【０１３０】
【数４】
0005555223.tif 000019
【０１３１】
エフェクター機能は、抗体工学技術に記載のものなどの技術、または他の手段によって改変することができる。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それによってこの領域での鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にし、改善された内在化能力および／または増加した補体媒介細胞殺傷およびＡＤＣＣを有することができるホモ二量体抗体の生成をもたらすことができる。Ｃａｒｏｎら（１９９２年）Ｊ．  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  １７６巻：１１９１〜１１９５頁およびＢ．  Ｓｈｏｐｅｓ（１９９２年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８巻：２９１８〜２９２２頁を参照。高められた抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体は、Ｗｏｌｆｆら（１９９３年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３巻：２５６０〜２５６５頁に記載のヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製することもできる。あるいは、二重のＦｃ領域を有し、それによって高められた補体溶解およびＡＤＣＣ能力を有することができる抗体を操作することができる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら（１９８９年）Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３巻：２１９〜２３０頁。
【０１３２】
Ｂ２．配列改変
一般に、配列改変は、天然の配列と比較してアミノ酸配列に変化をもたらす、抗体またはポリペプチド中の１つまたはそれより多くの残基の置換、欠失または付加であることができる。所望の活性に悪影響を与えることなく、どのアミノ酸残基を挿入、置換または欠失することができるかの決定の指針は、抗体またはポリペプチドの配列を公知の相同タンパク質分子の配列と比較し、高相同性領域で作製されるアミノ酸配列変化の数を最小にすることによって見出すことができる。許容されるバリエーションは、配列にアミノ酸の挿入、欠失または置換を系統的に作製し、生じたバリアントを完全長または成熟した天然の配列によって示される活性について試験することによって決定することができる。
【０１３３】
アミノ酸置換は、１つまたはそれより多くの残基の保存的または非保存的な置換を含むことができる。そのような置換は当該技術分野で周知の技術であり、例えば、保存的置換は、類似した構造的特性および／または化学的特性を有する別のアミノ酸でアミノ酸を置換すること、例えばセリンによるロイシンの置換を伴う。非保存的置換は、一般に、異なる構造的特性および／または化学的特性を有する別のアミノ酸でアミノ酸を置換することを伴い、例えば、酸性アミノ酸（例えば、ＧｌｕまたはＡｓｐ）は塩基性アミノ酸（例えば、ＬｙｓまたはＡｓｎ）で置換することができる。
【０１３４】
特に好ましい種類の置換型バリアントは、親抗体と比較して改善された生物特性を有するバリアント抗体を得るために、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つまたはそれより多くの超可変領域残基を置換することを含む。そのような置換型バリアントを生成するための便利な方法は、ファージディスプレイを用いる親和性成熟を含む。簡潔には、いくつかの超可変領域部位を変異させて、各部位で可能なすべてのアミノ置換を生成し、このように生成される抗体バリアントをファージの上でディスプレイし、次に、ファージによってディスプレイされるバリアントをそれらの生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。改変のための候補超可変領域部位を確認するために、アラニン走査変異誘発を実施して、抗原結合に顕著に寄与する超可変領域残基を確認することができる。あるいは、またはさらに、抗体とその抗原との間の接触点を確認するために、抗原抗体複合体の結晶構造を分析することが有益なこともある。そのような接触残基および隣接残基は、本明細書で詳述する技術による置換のための候補である。そのようなバリアントが一旦生成されると、一群のバリアントを本明細書に記載のスクリーニングにかけ、１つまたはそれより多くの関連アッセイで優れた特性を有する抗体をさらなる開発のために選択することができる。
【０１３５】
改変は、例えば、Ｗａｎｇら（２００２年）Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍ．  １巻：１〜１１頁、Ｗａｎｇら（２００１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２巻：４９８〜５００頁およびｖａｎ  Ｈｅｓｔら（２００１年）Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍ．  １９巻：１８９７〜１９０４頁に記載のものなどの方法による、（例えば、置換または付加による）非天然アミノ酸の組込みを含むこともできる。代替の戦略は、例えば、Ｔａｎｇら（２００１年）Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  １２３巻（４４号）：１１０８９〜１１０９０頁およびＫｉｉｃｋら（２００１年）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ５０５巻（３号）：４６５頁に記載のように、アミノアシル−ｔＲＮＡの生合成を担う酵素に焦点をあてる。
【０１３６】
好ましい実施形態では、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個のアミノ酸残基が改変されている。さらに、またはあるいは、そのような改変は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個以下の改変されたアミノ酸残基を有することを特徴としてもよい。特に好ましい実施形態では、少なくとも１つ、しかし１０以下の残基が改変されている。さらに、またはあるいは、そのような改変は、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３または２個以下の改変されたアミノ酸残基を有することを特徴とすることができる。改変は、すべて置換、すべて欠失、すべて付加、または置換、欠失もしくは付加の任意の組合せであることができる。
【０１３７】
アミノ酸配列バリアントをコードする核酸分子は、当該技術分野で公知である様々な方法によって調製することができる。これらの方法には、天然源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列バリアントの場合）、または抗体のより早期に調製されたバリアントもしくは非バリアントバージョンの、オリゴヌクレオチド媒介性（または部位特異的）変異誘発、制限選択変異誘発、ＰＣＲ変異誘発およびカセット式変異誘発による調製が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３８】
Ｂ３．他の改変
本発明のポリペプチドバリアント（特に抗体バリアント）には、共有結合が抗体によるエピトープ結合免疫特異性の保持を可能にする限り、例えば、任意の種類の分子の共有結合によって改変される類似体および誘導体が含まれる。例えば、限定するものではないが、抗体の誘導体および類似体には、例えばグリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞抗体単位または他のタンパク質への結合などによってさらに改変されたものが含まれる。多数の化学的改変のいずれかを、特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシン存在下での代謝合成などを含むがそれらに限定されない公知の技術によって実施することができる。さらに、類似体または誘導体は、１つまたはそれより多くの非天然アミノ酸を含むことができる。
【０１３９】
抗体およびポリペプチドは、（好ましくは抗体の所望の機能、例えば結合活性を変化させることなく）１つまたはそれより多くのグリコシル化部位を抗体に導入するか、１つまたはそれより多くのグリコシル化部位を抗体から欠失させるか、または、抗体上の既存のグリコシル化部位を移動させることによって改変することができる。グリコシル化部位は、当該技術分野で公知である方法によって、抗体の可変領域および／または定常領域に導入するか、またはそこから欠失させることができる。例えば、所望の配列（例えば、Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）が得られるように、抗体のアミノ酸配列を改変または変異させることによって本発明の抗体にグリコシル化部位を導入することができ、２９７位ではなく２９６位がグリコシル化されるように、Ｆｃ領域の２９６位を改変することによってグリコシル化部位を移動させことができる。例えば米国特許第６，４７２，５１１号および第６，２１８，１４９号；米国特許出願公開第２００３０１１５６１４号および第２００２００２８４８６号；ＥＰ０３５９０９６Ｂ１；ならびに国際公開第０３／０３５８３５号に記載のように、タンパク質の炭水化物含量（グリコシル化）を改変する方法は、当該技術分野で周知である。
【０１４０】
一部の実施形態では、本発明の分子は、変化したグリコシル化パターンまたは変化したグリコフォームを含むように操作される。操作されたグリコフォームは、エフェクター機能を高めることを含むがそれに限定されない、様々な目的のために役立つことができる。操作されたグリコフォームは、当業者に公知である任意の方法によって、例えば操作されたかまたはバリアントの発現株を用いることによって、１つまたはそれより多くの酵素、例えばＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ−ＩＩＩ）との共発現（ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）によって、様々な生物体においてまたは様々な生物体からの細胞系で本発明の抗体を発現させることによって、あるいは抗体を発現させ、精製した後に炭水化物を改変することによって生成することができる。操作されたグリコフォームを生成する方法は当該技術分野で公知であり、例えばＯｋａｚａｋｉら（２００４年）ＪＭＢ  ３３６巻：１２３９〜１２４９頁、Ｓｈｉｎｋａｗａら（２００３年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８巻：３４６６〜３４７３頁、Ｓｈｉｅｌｄｓら（２００２年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７巻：２６７３３〜２６７４０頁、Ｄａｖｉｅｓら（２００１年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ７４巻：２８８〜２９４頁、Ｕｍａｎａら（１９９９年）Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７巻：１７６〜１８０頁；米国特許第６，６０２，６８４号；米国特許出願公開第２００３０１５７１０８号、第２００３０１１５６１４号および第２００３０００３０９７号；国際公開第０２／３１１１４０号、国際公開第０２／３０９５４号、国際公開第０１／２９２２４６号、国際公開第００／６１７３９号；Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）から入手可能なＰｏｔｉｌｌｅｇｅｎｔＴＭ技術；ならびに、ＧＬＹＣＡＲＴ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＧ（Ｚｕｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手可能なＧｌｙｃｏＭＡｂＴＭグリコシル化操作技術に記載のものが含まれるがそれらに限定されない。
【０１４１】
Ｂ４．ポリペプチドコンジュゲート
融合タンパク質を生成するために、本発明のポリペプチドを異種のポリペプチドまたはその部分に組換えで融合させるかまたは化学的にコンジュゲート（共有結合および非共有結合のコンジュゲーションを含む）させることができる。好ましくは、所望の融合タンパク質を生成するために、本発明のポリペプチド（特に抗体）は、異種のポリペプチドの少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０または少なくとも１００個のアミノ酸に融合される。融合は必ずしも直接である必要はなく、リンカー配列を通して起こることができる。本発明のポリペプチドは固体支持体または半固体のマトリックスに結合させることもでき、それらは標的抗原の免疫アッセイまたは精製のために特に有用である。そのような支持体およびマトリックスには、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが含まれるが、これらに限定されない。結合は、例えばＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、４４巻（１９７６年）に記載の方法で達成することができる。
【０１４２】
所与の生物応答を改変するために、治療剤の血清半減期に影響を及ぼす（例えば、増加させる）ために、または細胞の特定のサブセットに治療剤をターゲティングするために、抗体およびポリペプチドを治療剤にコンジュゲートさせることができる。精製を促進するために、それらをマーカー配列（例えば、ヘキサヒスチジンペプチドまたは「フラグ」標識）に融合させることもできる。そのような治療的部分を抗体にコンジュゲートさせる技術は、周知である。例えば、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ中のＨｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」（第２版、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、１９８７年、６２３〜５３頁、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．）を参照。
【０１４３】
さらなる融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフリングおよび／またはコドンシャッフリング（「ＤＮＡシャッフリング」と総称される）の技術を通して生成することができる。ＤＮＡシャッフリングは、本発明の分子の活性を変化させるために使用することができる（例えば、より高い親和性およびより低い解離速度を有する抗体）。本発明の抗体およびポリペプチド、またはそれらのコード核酸は、組換えの前にエラープローン（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、ランダムなヌクレオチド挿入または他の方法によるランダム変異誘発にかけることによって、さらに変化させることができる。本発明の分子をコードするポリヌクレオチドの１つまたはそれより多くの部分を、１つまたはそれより多くの異種分子の１つまたはそれより多くのコンポーネント、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片などで組み換えることができる。
【０１４４】
Ｂ５．断片
本発明は、抗体および他のポリペプチド断片をさらに提供する。例えば完全長天然の抗体またはタンパク質と比較した場合、そのような断片は、例えばＮ末端もしくはＣ末端で切断（ｔｒｕｎｃａｔｅ）されていてもよく、または内部の残基を欠いてもよい。特定の断片は、所望の生物活性のために必須でないアミノ酸残基を欠いてもよい。これらの断片は、多くの従来の技術のいずれかで調製することができる。所望のペプチド断片は、化学的に合成することができる。代替アプローチは、酵素消化によって、例えば、特定のアミノ酸残基によって規定される部位でタンパク質を切断することが公知である酵素でタンパク質を処理することによって、または適する制限酵素でＤＮＡを消化し、所望の断片を単離することによって抗体またはポリペプチド断片を生成することを含む。さらに別の適する技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、所望の抗体またはポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離および増幅することを含む。ＤＮＡ断片の所望の末端を定義するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲにおいて５’および３’のプライマーで使用される。好ましくは、抗体およびポリペプチド断片は、本明細書で開示される天然の抗体またはポリペプチドと、少なくとも１つの生物学的および／または免疫学的活性を共有する。
【０１４５】
一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、二量体化配列を含むことができる二量体化ドメイン、および／または１つまたはそれより多くのシステイン残基を含む配列をさらに含む。一部の実施形態では、二量体化ドメインは抗体の重鎖または軽鎖の可変ドメインとウイルスのコートタンパク質の少なくとも一部との間に位置し、二価ディスプレイを提供するために１つまたはそれより多くのジスルフィド結合および／または単一の二量体化配列が二量体化ドメインに存在してもよい。一部の実施形態では、Ｆ（ａｂ）２の重鎖は、ヒンジ領域を含まない二量体化ドメインで二量体化する。二量体化ドメインは、ロイシンジッパー配列を含むことができる。
【０１４６】
別の実施形態では、本発明のポリペプチド断片は、別のポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも３０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも４０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも５０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも６０個の連続したアミノ残基、少なくとも７０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも８０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも９０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１００個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１５０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１７５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２００個の連続したアミノ酸残基、または少なくとも２５０個の連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、ポリペプチドの断片は、ポリペプチドの少なくとも１つの機能を保持する。
【０１４７】
Ｂ６．ダイアボディおよびＤＡＲＴ
ダイアボディおよび二重親和性再ターゲティング試薬（「ＤＡＲＴ」）も、本発明によって提供される。ダイアボディおよびＤＡＲＴは、本発明の抗体およびポリペプチドに一般に由来する抗原結合ドメインを含む。ダイアボディおよびＤＡＲＴの設計および構築は、例えば、２００８年１月４日に出願の米国特許仮出願第６１／０１９，０５１号および２００７年６月２１日に出願の第６０／９４５，５２３号；２００６年４月１７日に出願の米国特許出願第１１／４０９，３３９号；Ｍａｒｖｉｎら（２００５年）Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｓｉｎ．  ２６巻：６４９〜６５８頁、Ｏｌａｆｓｅｎら（２００４年）Ｐｒｏｔ．  Ｅｎｇｒ．  Ｄｅｓ．  Ｓｅｌ．  １７巻：２１〜２７頁、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （Ｕ．Ｓ．Ａ．）  ９０巻：６４４４〜６４４８頁に記載されている。ダイアボディ分子の各ポリペプチド鎖は、同じ抗体または異なる抗体からのＶＬドメインおよびＶＨドメインを含み、それらのドメインは、自己アセンブリを抑制するように共有結合される。ポリペプチド鎖のうちの２つの相互作用は、２つのＶＬ−ＶＨ対合を生成し、２つのエピトープ結合部位、すなわち二価分子を形成する。ＶＨドメインおよびＶＬドメインはいずれもポリペプチド鎖の中のいかなる位置にも拘束されず、それらのドメインはお互いとのそれらの相対位置で制限されてもいない。唯一の制限は、相補的ポリペプチド鎖が機能的ダイアボディを形成するために利用可能であるということである。ドメインはペプチドリンカーによって分離されてもよく、ポリペプチド鎖は各鎖で少なくとも１つのシステイン残基を含むように操作することができるので、鎖間ジスルフィド結合を形成してダイアボディを安定させることができる。
【０１４８】
ＶＬドメインおよびＶＨドメインが同じ抗体に由来する場合、２つの相補的ポリペプチド鎖は同一であって、二価の単一特異性抗体を生じることができるか、または異なって、二価の二重特異性抗体（例えば、同じ抗原上の２つの異なるエピトープに結合するもの）が生じることができる。ＶＬドメインおよびＶＨドメインが異なる抗原に特異的な抗体に由来する場合、機能的二重特異性ダイアボディの形成は、２つの異なるポリペプチド鎖の相互作用、すなわちヘテロダイマーの形成を必要とする。特定の実施形態では、ダイアボディの少なくとも１つのエピトープ結合部位は、特定の細胞、例えばＢ細胞もしくはＴ細胞、貪食性細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または樹状細胞の上の抗原に特異的である。
【０１４９】
様々な実施形態では、ダイアボディのポリペプチド鎖の１つまたはそれより多くは、Ｆｃドメインを含む。ダイアボディ分子のポリペプチド鎖のＦｃドメインは優先的に二量体化し、免疫グロブリン様特性、例えばＦｃ−ＦｃγＲ相互作用を示すダイアボディ分子の形成が起こる。Ｆｃを含むダイアボディは二量体であってもよく、例えば、各々ＶＨドメイン、ＶＬドメインおよびＦｃドメインを含む２つのポリペプチド鎖を含むことができる。様々な実施形態では、ダイアボディのポリペプチド鎖の１つまたはそれより多くはヒンジドメインを含み、それは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥおよびＩｇＭを含む任意の免疫グロブリンアイソタイプまたはアロタイプに由来することができる。好ましい実施形態では、ヒンジドメインはＩｇＧに由来し、そこにおいて、ＩｇＧアイソタイプはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４またはそれらのアロタイプである。ヒンジドメインは鎖の他のドメインまたは部分と比較して任意の位置でポリペプチド鎖において操作することができ、特定の状況では、ダイアボディ分子がヒンジ−Ｆｃドメインを含むようにＦｃドメインと一緒に操作することができる。
【０１５０】
他の実施形態では、Ｆｃドメインを含むダイアボディ分子は四量体であることができ、それは２つの「より重い」ポリペプチド鎖（すなわち、ＶＬドメイン、ＶＨドメインおよびＦｃドメインを含むポリペプチド鎖）および２つの「より軽い」ポリペプチド鎖（すなわち、ＶＬおよびＶＨを含むポリペプチド鎖）を含むことができる。そのようなより軽い鎖およびより重い鎖は相互作用してモノマーを形成することができ、またそれらの不対Ｆｃドメインを通して相互作用することによってＩｇ様分子を形成することができ、その分子はＤＡＲＴ分子であってもよい。そのようなＩｇ様ダイアボディは四価であり、単一特異性、二重特異性または四重特異性であることができる。Ｉｇ様ＤＡＲＴ種は、そのドメインが同じエピトープに（４つの同一の抗原分子に結合することができる四価の、モノエピトープ特異的Ｉｇ様ＤＡＲＴを形成するように）、または異なるエピトープもしくは抗原に結合するように設計することができるので、独特の特性を有する。例えば、そのドメインは、同じ抗原の２つのエピトープに結合するように（四価の一抗原特異的二エピトープ特異的Ｉｇ様ＤＡＲＴを形成するように）、または異なる抗原分子のエピトープに結合するように（第１の抗原に特異的な１対の結合部位および第２の抗原に特異的な第２の対の結合部位を有する四価のＩｇ様ＤＡＲＴを形成するように）設計することができる。そのような属性の組合せを有するハイブリッド分子は、容易に生成することができる。
【０１５１】
特定の作用機構によって束縛されることを意図するわけではないが、本発明のダイアボディ分子は、一部、例えばダイアボディ−エピトープ相互作用の向上したアビディティによってダイアボディが標的細胞の上により長く留まる能力に起因して、特定の抗原（例えば、ＦｃγＲ）を低下したレベルで発現する標的細胞に免疫特異的に結合するダイアボディの能力に起因して、当該技術分野で公知である治療的抗体と比較してより高い治療効力を示す。したがって、本発明のダイアボディは、標的抗原が標的細胞集団で低いレベルで発現される亜集団での、癌などの疾患または障害の処置、予防または管理で特に有用性を有する。
【０１５２】
それらのより高い価数、低い解離速度および循環からの速やかなクリアランス（約５０ｋＤａ以下の、小さいダイアボディについて）に起因して、当該技術分野で公知であるダイアボディ分子は、腫瘍画像化の分野でも特に有用性を示した。（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄら（１９９７年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  １０巻：１２２１頁）。異なる細胞の架橋、例えば腫瘍細胞への細胞傷害性Ｔ細胞の架橋が、特に重要である。（Ｓｔａｅｒｚら（１９８５年）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４巻：６２８〜６３１頁、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９６年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ９巻：２９９〜３０５頁）。ダイアボディエピトープ結合ドメインは、任意の免疫エフェクター細胞の表面決定因子（例えばＴリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または他の単核細胞の上で発現されるＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ３２またはＣＤ６４）に対するものとすることもできる。多くの研究では、エフェクター細胞決定因子（例えばＦｃγ受容体（ＦｃγＲ））に結合するダイアボディも、エフェクター細胞を活性化することが見出された。（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９６年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ９巻：２９９〜３０５頁、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９９年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５９巻：２９０９〜２９１６頁）。通常、エフェクター細胞活性化は、Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用を介した、エフェクター細胞への抗原結合抗体の結合によって誘発される。したがって、この点に関しては、本発明のダイアボディ分子は、それらがＦｃドメインを含むかどうかとは無関係に、Ｉｇ様機能を示すことができる。腫瘍およびエフェクター細胞の架橋によって、ダイアボディはエフェクター細胞を腫瘍細胞に近づけるだけでなく、有効な腫瘍殺傷ももたらす。ＣａｏおよびＬａｍ（２００３年）Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ．  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．  ５５巻：１７１〜９７頁。
【０１５３】
本発明のダイアボディ分子は、新規のタンパク質合成および結合タンパク質をコードする核酸の組換え発現を含む、様々な方法を用いて生成することができる。所望の核酸配列は、組換え方法（例えば、所望のポリヌクレオチドの事前に調製されたバリアントのＰＣＲ変異誘発）によって、または固相ＤＮＡ合成によって生成することができる。好ましくは組換え発現方法が用いられる。一態様では、本発明はＣＤ１６Ａ  ＶＨおよび／またはＶＬをコードする配列を含むポリヌクレオチドを提供する。別の態様では、本発明はＣＤ３２Ｂ  ＶＨおよび／またはＶＬをコードする配列を含むポリヌクレオチドを提供する。遺伝コードの縮重のため、様々な核酸配列が各免疫グロブリンアミノ酸配列をコードし、本発明は、本明細書に記載される結合タンパク質をコードするすべての核酸を包含する。
【０１５４】
Ｂ７．抗体生成
本発明の好ましい実施形態の抗体は、様々な方法のいずれかで生成することまたは得ることができる。例えば、そのような抗体は、血漿から、合成的に、組換えもしくはトランスジェニックに、細胞（例えば、ハイブリドーマ培養）経由などによって得ることができる。合成タンパク質の生成は、例えば、Ｄａｗｓｏｎら（２０００年）Ａｎｎ．  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６９巻：９２３〜９６０頁、Ｗｉｌｋｅｎら（１９９８年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ９巻（４号）：４１２〜４２６頁およびＫｏｃｈｅｎｄｏｅｒｆｅｒら（１９９９年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ３巻（６号）：６６５〜６７１頁に記載されている。
【０１５５】
組換えおよびトランスジェニックな抗体の生成は、例えば、Ｗａｎｇら（２００７年）ＩＤｒｕｇｓ  １０巻（８号）：５６２〜５６５頁、Ｈａｇｅｍｅｙｅｒら（２００７年）Ｓｅｍｉｎ．  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈｅｍｏｓｔ．  ３３巻（２号）：１８５〜１９５頁、Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら（２００７年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  ２９巻（６号）：８４５〜８５２頁、Ｇａｓｓｅｒら（２００７年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  ２９巻（２号）：２０１〜２１２頁、Ａｕｂｒｅｙら（２００６年）Ｊ．  Ｓｏｃ．  Ｂｉｏｌ．  ２００巻（４号）：３４５〜３５４頁、Ｌａｆｆｌｙら（２００６年）Ｊ．  Ｓｏｃ．  Ｂｉｏｌ．  ２００巻（４号）：３２５〜３４３頁、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ（２００５年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．  ２１巻（１号）：１１〜１６頁、Ｓｍｉｔｈら（２００４年）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ５７巻（９号）：９１２〜９１７頁、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら（２００４年）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２６巻（１号）：３９〜６０頁、Ｆｉｓｃｈｅｒら（２００３年）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１巻（７〜８号）：８２０〜８２５頁、Ｍａｙｎａｒｄら（２０００年）Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．  ２巻：３３９〜３７６頁、Ｙｏｕｎｇら（１９９８年）Ｒｅｓ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４９巻（６号）：６０９〜６１０頁およびＨｕｄｓｏｎ（１９９８年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ９巻（４号）：３９５〜４０２頁に記載されている。
【０１５６】
細胞（例えば、ハイブリドーマ）培養を通した抗体生成は、例えば、上記Ｌａｆｆｌｙら（２００６年）、Ａｌｄｉｎｇｔｏｎら（２００７年）Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ｂ  Ａｎａｌｙｔ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ８４８巻（１号）：６４〜７８頁、Ｓ．Ｓ．  Ｆａｒｉｄ（２００６年）Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ｂ  Ａｎａｌｙｔ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ８４８巻（１号）：８〜１８頁、Ｂｉｒｃｈら（２００６年）Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．  ５８巻（５〜６号）：６７１〜６８５頁、Ｅｖｅｎら（２００６年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２４巻（３号）：１０５〜１０８頁、Ｇｒａｕｍａｎｎら（２００６年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｊ．  １巻（２号）：１６４〜８６頁；米国特許第７，１１２，４３９号；ならびに米国特許出願公開第２００７００３７２１６号および第２００４０１９７８６６号に記載されている。
【０１５７】
抗体は、ファージディスプレイ法、例えば、Ｂｒｉｎｋｍａｎら（１９９５年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２巻：４１〜５０頁、Ａｍｅｓら（１９９５年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４巻：１７７〜８６頁、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら（１９９４年）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４巻：９５２〜５８頁、Ｐｅｒｓｉｃら（１９９７年）Ｇｅｎｅ  １８７巻：９〜１８頁、Ｂｕｒｔｏｎら（１９９４年）Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７巻：１９１〜２８０頁；国際公開第９０／０２８０９号、国際公開第９１／１０７３７号、国際公開第９２／０１０４７号、国際公開第９２／１８６１９号、国際公開第９３／１１２３６号、国際公開第９５／１５９８２号、国際公開第９５／２０４０１号；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号、第５，２２３，４０９号、第５，４０３，４８４号、第５，５８０，７１７号、第５，４２７，９０８号、第５，７５０，７５３号、第５，８２１，０４７号、第５，５７１，６９８号、第５，４２７，９０８号、第５，５１６，６３７号、第５，７８０，２２５号、第５，６５８，７２７号、第５，７３３，７４３号および第５，９６９，１０８号に開示されているものなどを通して生成することができる。ファージディスプレイ技術は、その抗原への抗体の親和性を高めるために用いることもできる。親和性成熟と呼ばれるこの技術は、変異誘発またはＣＤＲウォーキング、および最初のまたは親の抗体と比較してより高い親和性で抗原に結合する抗体を特定するための、コグネイト抗原を用いる再選抜を採用する。例えば、Ｇｌａｓｅｒら（１９９２年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４９巻：３９０３頁、Ｗｕら（１９９８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （Ｕ．Ｓ．Ａ．）  ９５巻：６０３７頁、Ｙｅｌｔｏｎら（１９９５年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５５巻：１９９４頁、Ｓｃｈｉｅｒら（１９９６年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ．  ２６３巻：５５１頁を参照。
【０１５８】
モノクローナル抗体は、当業者に公知である様々な方法、例えば、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５年）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６巻：４９５頁、Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３年）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４巻：７２頁またはＣｏｌｅら（１９８５年）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．、７７〜９６頁に記載のハイブリドーマ法、または、例えば米国特許第４，８１６，５６７号に記載の組換えＤＮＡ法によって作製することができ、あるいは、抗体は、例えばＣｌａｃｋｓｏｎら（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２巻：６２４〜６２８頁およびＭａｒｋｓら（１９９１年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２巻：５８１〜５９７頁に記載の技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することができる。目的の抗原に対するポリクローナル抗体の生成のために、当該技術分野で周知である様々な手順を用いることができる。例えば、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、マウス、ラットおよびモルモットを含むがそれらに限定されない様々な宿主動物を、目的の抗原またはその誘導体の注入によって免疫することができ、免疫応答を起こさせた後に、免疫した動物の血清から抗体を特定することができる。
【０１５９】
二重特異性抗体は、例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎら（１９８３年）Ｎａｔｕｒｅ  ３０５巻：５３７〜３９頁、国際公開第９３／０８８２９号、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら（１９９１年）ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０巻：３６５５〜５９頁に記載のように、２つの鎖が異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現とそれに続くアフィニティークロマトグラフィーを用いる所望分子の精製によって作製することもできる。別のアプローチでは、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）が、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリンの定常ドメイン配列、例えば重鎖定常ドメインに融合される。これらの融合物をコードする核酸は、同じであるかまたは異なる発現ベクターに挿入することができ、適する宿主生物体で発現される。
【０１６０】
完全ヒト抗体（完全にヒトの抗体とも呼ばれる）は、内因性免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の遺伝子を発現することができないが、ヒトの重鎖および軽鎖の遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて生成することができる。選択された抗原、例えば本発明のポリペプチドの全体または一部で、トランスジェニックマウスを通常の方法で免疫する。トランスジェニックマウスが保持するヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化の間再編成され、その後クラススイッチおよび体細胞性変異を受ける。したがって、そのような技術を用いて、治療的に有用なＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体およびＩｇＥ抗体を生成することが可能である。ヒト抗体を生成することについてのこの技術の概要は、例えば、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ（１９９５年）Ｉｎｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３巻：６５〜９３頁および米国特許第５，６３３，４２５号に記載されている。完全ヒト抗体は、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ（１９９１年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２７巻：３８１頁およびＭａｒｋｓら（１９９１年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２巻：５８１頁によって記載されるとおりの、ファージディスプレイライブラリーを含む、当該技術分野で公知である他の技術を用いて生成することもできる。完全ヒト抗体は、例えばＡｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆ．）およびＧｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆ．）から市販品を得ることもできる。選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導選択」と呼ばれる技術を用いて生成することができる。このアプローチでは、例えば、Ｊｅｓｐｅｒｓら（１９９４年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２巻：８９９〜９０３頁に記載のとおりに、同じエピトープを認識する完全にヒトの抗体の選択を誘導するために、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体を用いる。
【０１６１】
本発明は、ポリペプチドおよび抗体を含めた本発明の分子をコードするポリヌクレオチド、ならびにこのポリヌクレオチドを含むベクター、ならびにこのベクターを含む宿主細胞も包含する。本発明の分子をコードするポリヌクレオチドを得ることができ、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、当該技術分野で公知である任意の方法、例えば組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなどによって決定することができる。一実施形態では、当該技術分野で利用可能なヒトライブラリーまたは任意の他のライブラリーを当該技術分野で公知である標準技術でスクリーニングして、本発明の分子をコードする核酸をクローニングすることができる。
【０１６２】
Ｂ８．抗体の特徴付け
本発明の抗体は、様々な方法で特徴付けることができる。特に、本発明の抗体は、抗原、例えばＨＥＲ２／ｎｅｕに免疫特異的に結合する能力について、または、分子がＦｃドメイン（またはその一部）を含む場合は、Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用、すなわちＦｃγＲへのＦｃドメイン（またはその一部）の特異的結合を示す能力についてアッセイすることができる。そのようなアッセイは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３巻：４１２〜４２１頁）、ビーズで（Ｌａｍ（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４巻：８２〜８４頁）、チップで（Ｆｏｄｏｒ（１９９３年）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４巻：５５５〜５５６頁）、細菌で（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子で（米国特許第５，５７１，６９８号、第５，４０３，４８４号および第５，２２３，４０９号）、プラスミドで（Ｃｕｌｌら（１９９２年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （Ｕ．Ｓ．Ａ．）  ８９巻：１８６５〜１８６９頁）またはファージで（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９巻：３８６〜３９０頁、Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９巻：４０４〜４０６頁、Ｃｗｉｒｌａら（１９９０年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （Ｕ．Ｓ．Ａ．）  ８７巻：６３７８〜６３８２頁およびＦｅｌｉｃｉ（１９９１年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２巻：３０１〜３１０頁）実施することができる。抗原に免疫特異的に結合すると特定された分子は、抗原に対するそれらの特異性および親和性について次にアッセイすることができる。
【０１６３】
免疫特異的結合、交差反応性およびＦｃ−ＦｃγＲ相互作用を分析するために用いることができる免疫アッセイは、ウェスタンブロット、放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫クロマトグラフィーアッセイ、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光免疫アッセイおよびプロテインＡ免疫アッセイなどの技術を用いる、競合的アッセイ系および非競合的アッセイ系を包含するが、これらに限定されない（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、２００８年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙを参照）。
【０１６４】
標的抗原への結合親和性は、標準の抗体抗原アッセイ、例えばＢｉａｃｏｒｅ競合アッセイ、飽和アッセイ、またはＥＬＩＳＡもしくはＲＩＡなどの免疫アッセイによって代表的に測定または決定される。
【０１６５】
好ましくは、本発明の分子を特徴付けるために、当業者に公知である技術のいずれかを用いる蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）が、免疫または機能ベースのアッセイで用いられる。フローソータは、本発明の分子によって結合された、例えばオプソニン作用を受けた多数の個々の細胞を速やかに調べることができる（例えば、１時間に１０，０００，０００〜１００，０００，０００個の細胞）。さらに、抗体挙動の最適化のために用いられる特定のパラメータは、抗原濃度、反応速度競合時間（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ）またはＦＡＣＳストリンジェンシーを包含するがそれらに限定されず、その各々は、特異的結合特性を示す抗体分子を選択するために変更することができる。生物細胞を選別して調べるためのフローサイトメータは、当該技術分野で周知である。公知のフローサイトメータが、例えば、米国特許第４，３４７，９３５号、第５，４６４，５８１号、第５，４８３，４６９号、第５，６０２，０３９号、第５，６４３，７９６号および第６，２１１，４７７号に記載されている。他の公知のフローサイトメータは、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙから販売されているＦＡＣＳ  ＶａｎｔａｇｅＴＭシステム、およびＵｎｉｏｎ  Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃａから販売されているＣＯＰＡＳＴＭシステムである。
【０１６６】
抗原結合性ドメインまたはＦｃ−ＦｃγＲ結合の反応速度パラメータを特徴付けるために、表面プラズモン共鳴に基づくアッセイを用いることができる。当業者に公知である任意の方法、例えば、Ｄｏｎｇら（２００２年）Ｒｅｖｉｅｗ  ｉｎ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ８２巻：３０３〜３２３頁、Ｍｕｌｌｅｔら（２０００年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２巻：７７〜９１頁、Ｒｉｃｈら（２０００年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１巻：５４〜６１頁、Ｆｉｖａｓｈら（１９９８年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９巻：９７〜１０１頁；ならびに米国特許第６，３７３，５７７号、第６，２８９，２８６号、第５，３２２，７９８号、第５，３４１，２１５号および第６，２６８，１２５号に記載の技術を用いることができる。例えば、Ｍｙｓｚｋａ（１９９７年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８巻：５０〜５７頁、Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙら（１９９６年）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３６巻：２７５〜２８３頁、Ｍｏｒｔｏｎら（１９９５年）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２７巻：１７６〜１８５頁、Ｆｉｓｈｅｒら（１９９４年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５巻：３８９〜９５頁、Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ（１９９４年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５巻：６５〜７１頁およびＣｈａｉｋｅｎら（１９９２年）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１巻：１９７〜２１０頁に記載のように、データは、結合曲線をプロットし、速度定数、例えばＫｏｎ、Ｋｏｆｆ、およびみかけの平衡結合定数Ｋｄを決定するために用いられる。好ましい実施形態では、ＳＰＲ分析を用いて測定された反応速度パラメータは、分子が機能アッセイ、例えばＡＤＣＣにおいてどのように作用するかについての予測的尺度として用いることができる。
【０１６７】
Ｆｃドメイン（またはその一部）を含む、および／またはＦｃγＲに特異的なエピトープ結合ドメインを含む分子によるＦｃγＲへの結合の特徴付けは、抗体工学技術に記載の方法によって実施することができる。エフェクター細胞機能についてのアッセイは、例えばＡｂｄｕｌ−Ｍａｊｉｄら（２００２年）Ｓｃａｎｄ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ５５巻：７０〜８１頁、Ｐｅｒｕｓｓｉａら（２０００年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １２１巻：１７９〜１９２頁、Ｌｅｈｍａｎｎら（２０００年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４３巻（１〜２号）：２２９〜２４２頁、Ｄｉｎｇら（１９９８年）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ８巻：４０３〜４１１頁、Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉら（１９９８年）Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ  ４４巻（１０号）：８４１〜８４８頁、Ｂｒｏｗｎ（１９９４年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ４５巻：１４７〜１６４頁およびＭｕｎｎら（１９９０年）Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７２巻：２３１〜２３７頁に記載されているように、周知である。
【０１６８】
例えば、ＦｃγＲ媒介食作用についてのアッセイは、Ｔｒｉｄａｎｄａｐａｎｉら（２０００年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５巻：２０４８０〜２０４８７頁で前に記載されている方法によって、フルオレセイン化ＩｇＧオプソニン処理ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）を貪食するＴＨＰ−１細胞の能力を測定することによって、またはＢｅｄｚｙｋら（１９８９年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４巻（３号）：１５６５〜１５６９頁に記載のとおりの抗体依存性オプソニン食作用アッセイ（ＡＤＣＰ）を用いることによって、ヒト単球を用いて実施することができる。Ｆｃドメイン（またはその部分）を含む本発明の分子によるＣ１ｑの結合および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の媒介を特徴付けるために、当業者に公知である標準の方法を用いることができる。例えば、例えばＧａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら（１９９６年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２巻：１６３頁に記載のように、Ｃ１ｑ結合を測定するためにＣ１ｑ結合性ＥＬＩＳＡを実施することができ、補体活性化を評価するために補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイを実施することができる。
【０１６９】
別の実施形態では、当業者に公知であり、例えばＷｅｎｇら（２００３年）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２１巻：３９４０〜３９４７頁、Ｐｅｒｕｓｓｉａら（２０００年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １２１巻：１７９〜１９２頁、Ｄｉｎｇら（１９９８年）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ８巻：４０３〜４１１頁に記載されている標準方法のいずれかを用いて、エフェクター細胞、例えばナチュラルキラー細胞中でのＦｃγＲ媒介ＡＤＣＣ活性について本発明の分子をアッセイすることができる。具体的な好ましい実施形態では、蛍光標識標的細胞に対するＡＤＣＣ活性を測定するために、例えばＢｌｏｍｂｅｒｇら（１９９６年）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９３巻：１９９〜２０６頁に記載のように、時間分解蛍光アッセイが用いられる。本発明のＡＤＣＣアッセイで用いられる標的細胞は、乳癌細胞系、例えばＡＴＣＣアクセッション番号がＨＴＢ−３０のＳＫ−ＢＲ−３（Ｔｒｅｍｐら（１９７６年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ３３〜４１頁）；Ｂリンパ球；バーキットリンパ腫由来の細胞、例えば、ＡＴＣＣアクセッション番号がＣＣＬ−８６のＲａｊｉ細胞（Ｅｐｓｔｅｉｎら（１９６５年）Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ３４巻：２３１〜２４０頁）およびＡＴＣＣアクセッション番号がＣＣＬ−２１３のＤａｕｄｉ細胞（Ｋｌｅｉｎら（１９６８年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２８巻：１３００〜１３１０頁）を包含するがそれらに限定されない。標的細胞は、アッセイされる分子の抗原結合部位によって認識されなければならない。好ましくは、本発明のＡＤＣＣアッセイで用いられるエフェクター細胞は、当業者に公知である標準の方法を用いて、例えばＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心法を用いて、好ましくは正常なヒト血液から精製される末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。
【０１７０】
Ｃ．処置方法および医薬組成物
本発明の組成物（例えば、抗体およびポリペプチド）の投与は、「予防」または「治療」目的のためであってもよく、あるいは診断目的のために用いることができる。本発明の組成物は、投与される量が疾患の実際の徴候についての治療を提供するために生理的に有意である場合、「治療」目的のために投与されると言われる。治療的に提供される場合、化合物は、好ましくは実際の疾患の症状の同定時（またはその少し後）に提供される。化合物の治療的投与は、そのような疾患の重篤度を軽減するかまたはその進行を逆転させるのに役立つ。本発明の組成物は、投与される量が潜在的な疾患または状態についての治療を提供するために生理的に有意である場合、「予防」目的のために投与されると言われる。予防的に提供される場合、化合物は、好ましくはその任意の症状に先立って提供される。化合物の予防的投与は、疾患のその後の任意の進展または再発を予防または軽減するのに役立つ。
【０１７１】
治療を提供することまたは「処置すること」は、傷害、病状または状態の処置または改善における任意の成功の徴候を指し、症状の緩和、寛解、軽減、または傷害、病状もしくは状態を患者により許容できるものにすること、変性もしくは衰弱の速度を遅くすること、変性の最終点の消耗性を弱くすること、または患者の身体的もしくは精神的な幸福を向上させることなどの、任意の客観的または主観的なパラメータを包含する。症状の処置または改善は、身体検査、神経精神医学的検査および／または精神医学的な評価の結果を含む、客観的または主観的なパラメータに基づくことができる。
【０１７２】
処置についての好ましい被験体には、疾患および他の病的状態にある、動物、最も好ましくはヒトまたは他の霊長類などの哺乳動物種、およびイヌ、ネコなどの家庭用動物が含まれる。「患者」は、被験体、好ましくは哺乳動物（ヒトを含む）を指す。
【０１７３】
本発明の特定の実施形態は、１つまたはそれより多くの治療剤を含む医薬組成物、および１つまたはそれより多くの治療剤の治療的有効量を投与する方法に関し、それらは、障害の予防的および／または治療的な処置が可能である。用語「治療剤」は、予防的または治療的に障害を処置する治療効果を有する任意の作用物質（ａｇｅｎｔ）を指す。例示的な治療剤には、本発明の抗体およびポリペプチド、ならびに抗体またはポリペプチドと組み合わせて投与することまたはコンジュゲートさせることができる他の治療剤が含まれる。好ましい実施形態では、治療剤は本発明の抗体であり、好ましくは抗体断片、ダイアボディ、Ｉｇ様ＤＡＲＴまたは融合タンパク質である。
【０１７４】
本発明の分子は、ＦｃγＲによって媒介されるエフェクター細胞機能（例えば、ＡＤＣＣ）が望ましい疾患、障害または感染症（例えば、癌、感染性疾患）の処置および／または予防のために特に有用である。例えば、本発明の分子は、免疫エフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞）の上の細胞表面抗原およびＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ）に結合して、前記細胞に対するエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、食作用、オプソニン作用など）を刺激することができる。一部の実施形態では、本発明の抗体およびポリペプチドは、癌の処置に特に適する。標準のモノクローナル抗体治療の効力は、被験体のＦｃγＲ多型に依存する。Ｃａｒｔｏｎら（２００２年）Ｂｌｏｏｄ  ９９巻：７５４〜７５８頁、Ｗｅｎｇら（２００３年）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．  ２１巻（２１号）：３９４０〜３９４７頁。これらの受容体はエフェクター細胞の表面で発現されて、ＡＤＣＣを媒介する。高親和性対立遺伝子は、エフェクター細胞のＡＤＣＣ媒介能力を向上させる。本発明の抗体およびポリペプチドは、エフェクター細胞上の（野生型Ｆｃドメインと比較して）より高められたＦｃγＲ親和性を示すバリアントＦｃドメインを含むことができ、したがって、患者のＦｃγＲ多型に関係なくより良好な免疫治療試薬を患者に提供することができる。
【０１７５】
診断目的のためには、抗体またはポリペプチドは、それらを、例えば疾患、障害または感染症の発達または進行をモニタリングするために用いることができるように、検出可能な物質に結合することができる。検出可能な物質の例には、様々な酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなど）、補欠分子族（例えば、アビジン／ビオチン）、蛍光物質（例えば、ウンベリフェロン、フルオレセインまたはフィコエリトリン）、発光物質（例えば、ルミノール）、生物発光物質（例えば、ルシフェラーゼまたはエクオリン）、放射性物質（例えば、炭素−１４、マンガン−５４、ストロンチウム−８５または亜鉛−６５）、ポジトロン放射金属、および非放射性常磁性金属イオンが含まれる。検出可能な物質は、当該技術分野の公知技術を用いて、本発明の分子に直接的に、または中間体（例えば、リンカー）を通して間接的にのいずれかで結合またはコンジュゲートさせることができる。
【０１７６】
Ｃ１．処置可能な障害
本発明の様々な実施形態により処置され得る例示的な障害としては、増殖性障害、細胞増殖性障害、および癌、自己免疫疾患、炎症性障害、ならびに感染症が挙げられるが、これらに限定されるものではない。様々な実施形態では、本発明は、疾患抗原に結合する治療的有効量の１つまたはそれより多くの分子（抗体もしくはポリペプチド）を被験体に投与することを含む、被験体における疾患または障害の処置、予防または管理のための方法および組成物を包含する。例えば、本発明の分子は、原発腫瘍の増殖または退縮、癌細胞の転移、および感染症の予防、抑制、軽減に特に有用である。特定の作用機序に縛られるつもりはないが、本発明の分子はエフェクター機能を媒介して、腫瘍クリアランス、腫瘍減少、またはその組合せをもたらす。代わりの実施形態では、本発明のダイアボディは、細胞表面抗原および／または受容体の架橋結合、ならびに強化されたアポトーシスまたは負の増殖調節シグナル伝達により治療活性を媒介する。
【０１７７】
ＦｃγＲＩＩＢに対する親和性が減少し、かつＦｃγＲＩＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＡに対する親和性が増加した抗体は、ＦｃγＲが結合した際の活性化応答が強化される可能性があり、したがって、癌を処置しかつ／または予防するための治療的効力を有する可能性がある。本明細書の方法により処置可能な癌の非限定的例としては、急性骨髄性リンパ腫、副腎癌腫、腺癌、基底癌、膀胱癌、骨癌、骨および結合組織肉腫、脳の癌、乳癌、気管支癌、子宮頸癌、絨毛癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、ファローピウス管癌、胆嚢癌、胃腸癌、グリオーマ、毛様細胞白血病、ヘパトーマ、ホジキン病、肝内胆管癌、関節癌、カポジ肉腫、腎癌、喉頭癌、肝癌、白血病、肺癌、リンパ芽球性白血病、リンパ腫、悪性中皮腫、髄芽腫、メラノーマ、中皮腫、中耳癌、多発性骨髄腫、骨髄腫、粘液肉腫、鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、鼻の癌、口腔癌、卵巣癌、膵癌、陰茎癌（ｐｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、腹膜癌、咽頭癌、下垂体癌、前立腺癌、直腸癌、腎癌、唾液腺癌、皮膚癌、軽部組織肉腫、扁平上皮癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、泌尿器癌、子宮癌、膣癌、小胞癌（ｖｅｓｔｉｃｕｌａｒ  ｃａｎｃｅｒ）、外陰癌、ならびにウィルムス腫瘍が挙げられる。
【０１７８】
一部の実施形態では、癌は、リンパ腫、白血病、骨髄腫、リンパ系悪性疾患、脾臓の癌、およびリンパ節の癌などの造血性癌または血液関連癌である。好ましい実施形態では、癌は、例えば、高悪性度、中悪性度または低悪性度のリンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、粘膜関連リンパ組織Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、およびＴ細胞リンパ腫などのＢ細胞リンパ腫を包含する）、と白血病（Ｂ細胞白血病（ＣＤ５＋Ｂリンパ球）などの慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病などのリンパ性白血病、脊髄形成異常症、急性骨髄性白血病などの骨髄性白血病、および二次性白血病を包含する）などのＢ細胞関連癌、形質細胞性悪性疾患などの多発性骨髄腫、ならびに他の血液学的および／またはＢ細胞もしくはＴ細胞に関連する癌である。他の例となる癌は、好塩基球、好酸球、好中球および単球などの多形核白血球、樹状細胞、血小板、赤血球ならびにナチュラルキラー細胞を含むさらなる造血細胞の癌である。
【０１７９】
一部の実施形態では、処置されるべき癌は、乳癌、前立腺癌、子宮癌、卵巣癌、結腸癌、子宮内膜癌、副腎癌腫、または非小細胞肺癌である。一部の実施形態では、癌は乳癌または前立腺癌である。一部の実施形態では、癌は、ＨＥＲ２／ｎｅｕが過剰発現されている癌である。特定の実施形態では、本発明の抗体またはポリペプチドは、本発明の抗体またはポリペプチドがない癌細胞の増殖と比べて、癌細胞の増殖を少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％、または少なくとも１０％抑制するまたは減少させる。
【０１８０】
ＦｃγＲＩＩＢに対する親和性が増加し、かつＦｃγＲＩＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＡに対する親和性が減少した抗体は、ＦｃγＲ結合の際に活性化応答の減少をもたらす可能性があり、したがって、炎症および自己免疫疾患を処置および／または予防するための治療的効力を有する可能性がある。本明細書の方法により処置され得る自己免疫障害の例には、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎および精巣炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水泡性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発性ニューロパチー、チャーグストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡（ｃｉｃａｔｒｉｃａｌ  ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ）、クレスト症候群、寒冷凝集素症、クローン病、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症−線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ神経障害、若年性関節炎、扁平苔癬、エリテマトーデス、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発性筋痛症、多発筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドース、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、１型または免疫介在性糖尿病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、疱疹性皮膚炎脈管炎などの脈管炎、白斑症、ならびにウェゲナー肉芽腫症が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１８１】
本明細書の方法により処置可能な炎症性障害の非限定的例としては、免疫介在性炎症性障害（ＩＭＩＤ）が挙げられ、これは抗原特異的病理学的免疫応答により引き起こされかつ維持される炎症状態である。これらの障害の中には、喘息、枯草熱、および蕁麻疹などの様々な種類のアレルギー性疾患、変形性関節症および関節リウマチなどの関節炎、慢性炎症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、結合組織障害、線維症、移植片拒絶および移植片対宿主病、炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）、炎症性骨溶解症、インスリン依存性糖尿病、肺線維症、網膜炎、未分化関節症、未分化脊椎関節症、ならびにブドウ膜炎がある。ＦｃγＲＩＩＢに対して特異的な少なくとも１つのエピトープ結合ドメインおよび／またはＦｃγＲＩＩＢに対する親和性が強化され、かつＦｃγＲＩＩＩＡに対する親和性が減少しているバリアントＦｃドメインを含む本発明の分子は、移植片の拒絶を予防するためにも使用することができる。
【０１８２】
本発明の抗炎症性ポリペプチドは、好ましくは、そのようなポリペプチドを受けていない動物の炎症と比べて、動物の炎症を少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％、または少なくとも１０％軽減する。
【０１８３】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、感染因子にとって有毒であり、前記分子のない免疫応答と比べて、前記因子に対する免疫応答を強化するか、または前記因子に対するエフェクター機能を強化する。本発明の分子により処置または予防することができる感染症は、細菌、真菌、原生動物、およびウイルスを含むが、これらに限定されることはない感染因子により引き起こされる。非限定的な例示的細菌性疾患としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｒａｃｉｓ（炭疽）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ（ライム病）、Ｃａｎｄｉｄａ、クラミジア、コレラ、ジフテリア（ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉａｌｓ、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、レジオネラ、マイコバクテリウム、マイコプラスマ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、百日咳、ペスト、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、ブドウ球菌、連鎖球菌、および破傷風により引き起こされる細菌性疾患が挙げられる。非限定的原生動物疾患としては、コクジディオア（ｋｏｋｚｉｄｉｏａ）、リーシュマニア、マラリア、またはトリパノソーマにより引き起こされる原生動物疾患が挙げられる。
【０１８４】
ウイルス性疾患の非限定的例としては、アデノウイルス、アルボウイルス、コロナウイルス、コクサッキーウイルス、サイトメガロウイルス、エボラ、エキノウイルス（ｅｃｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、エコーウイルス、内毒素（ＬＰＳ）、エンテロウイルス、Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、マウス肝炎）、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ−Ｉ）、単純ヘルペスＩＩ型（ＨＳＶ−ＩＩ）、マウスγヘルペスウイルス）、ヒト免疫不全症ウイルスＩ型（ＨＩＶ−Ｉ）、ヒト免疫不全症ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ−ＩＩ）、ハンタウイルス（ｈｕｎｔａｖｉｒｕｓ）、インフルエンザ、白血病ウイルス（例えば、マウス白血病、ネコ白血病など）、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、ポリオウイルス、ＲＳウイルス、レトロウイルス、ライノウイルス、牛疫、ロタウイルス、風疹ウイルス、天然痘、Ｔ細胞リンホトロピックウイルス１、ワクシニア、水痘、およびウイルス性髄膜炎、脳炎、またはテング熱などのウイルス性疾患の因子により引き起こされるウイルス性疾患が挙げられる。
【０１８５】
Ｃ２．製剤
医薬組成物は、薬剤的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従って処方することができ、薬剤的に許容可能な担体および／または賦形剤を含んでいてもよい。組成物は、任意の適切な形態であってよく、例えば、ごくわずかの非限定的選択肢をあげれば、錠剤、丸剤、散剤、トローチ剤、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、液剤、シロップ剤、エアゾール剤（固体として、または液状媒体中で）、例えば、最大１０重量％の活性化合物を含有する軟膏剤、軟質ゼラチンカプセルおよび硬質ゼラチンカプセル、坐剤、無菌注射液剤、ならびに無菌包装粉末でも可能である。そのような組成物は、任意の公知の方法によって調製してよく、例えば、無条件下で活性成分を担体または賦形剤と混合することにより調製してもよい。
【０１８６】
当該技術分野で公知の手順を用いることにより、患者への投与後に活性成分の速放、徐放または遅延放出を提供するように、活性成分を処方することもできる。本発明の組成物の物理的特徴および化学的特徴は、投与方法および処置されるべき特定の疾患または障害に応じて、当分野の技術に従って改変してもよいし、または最適化してもよい。組成物は、単位投与量形態で、封鎖した容器で、またはキットの一部として提供してもよく、キットは使用説明書および／または複数の単位投与量形態を含んでいてもよい。
【０１８７】
特定の実施形態では、治療剤は、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルへの封入、抗体もしくは融合タンパク質を発現することができる組換え細胞、受容体依存性エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ（１９８７年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６２巻：４４２９〜４４３２頁参照）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築などにより、治療剤を組成物に取り込むことができる。別の特定の実施形態では、治療剤は、乾燥無菌化凍結乾燥粉末または気密封鎖した容器中の水を含まない濃縮物として供給され、例えば、水または生理食塩水で、被験体への投与に適した濃度まで再構成することができる。
【０１８８】
好ましくは、治療剤は、少なくとも５ｍｇ、さらに好ましくは、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも３５ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、または少なくとも７５ｍｇの単位投与量で、気密封鎖した容器中の乾燥無菌凍結乾燥粉末として供給される。凍結乾燥粉末は、最初の容器中で２から８℃の間で保存されるべきであり、分子は再構成された後１２時間以内に、好ましくは、６時間以内、５時間以内、３時間以内、または１時間以内に非経口的に投与されるべきである。代替の実施形態では、治療剤は、治療剤の量および濃度を表示する気密封鎖した容器中に液体形態で提供される。好ましくは、液体形態は、気密封鎖した容器中に少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、少なくとも２．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２００ｍｇ／ｍｌの分子で供給される。
【０１８９】
Ｃ３．キット
組成物はキット中に含まれてもよい。キットは、非限定的態様では、治療剤を含む医薬組成物、投与の説明書および／または他のコンポーネントを含むことができる。好ましい実施形態では、キットはいつでも投与できる組成物を含むことができる。キットの容器は、コンポーネントを入れてもよい瓶、ディスペンサー、パッケージ、コンパートメント、またはその他の種類の容器を含むことができる。容器は、その表面にしるしを含むことができる。しるしは、例えば、言葉、語句、略語、絵、または記号でもよい。容器は、所定量のコンポーネント（例えば、本発明の組成物）を分配することができる。組成物は、スプレーで、エアロゾルで、または液体形態もしくは半固体形態で分配することができる。容器は、スプレー、ポンプ、または圧搾機構を持つことができる。ある種の態様では、キットは、本発明の組成物を投与するための注射器を備えることができる。
【０１９０】
キット中に１つより多くのコンポーネントが存在する場合（これらは一緒に包装されてもよい）、キットは、一般に、追加のコンポーネントを別々に入れてもよい、第２の、第３のまたは他の追加の容器も備えることになる。本発明のキットは、商業販売のためにコンポーネントをぴっちりと閉じ込めて収納する容器も備えることができる。そのような容器は、所望の瓶、ディスペンサー、またはパッケージを保持する射出成形または吹込み成形のプラスチック容器を備えてもよい。キットは、キットコンポーネントを用いるための説明書、ならびにキットに含まれていない他の任意の組成物、化合物、薬剤、活性成分または物体の使用のための説明書も備えることができる。説明書は、実行することが可能な変化形も含んでいてよい。説明書は、例えば、製品または組成物の適用法、使用法、および維持法の説明を含むことができる。
【０１９１】
Ｃ４．投与および投与量
本発明の組成物は様々な投与経路を利用することができる。選択される特定の方法は、当然のことながら、投与が疾患の予防のためでも、診断のためでも、または処置のためでも、選択された特定の治療剤、処置されるべき医学的障害の重篤度および治療効力に必要な投与量に依存する。本発明の方法は、医学的に許容可能であり、臨床的に容認できない有害作用を引き起こさずに有効レベルの活性化合物を生じる投与方法ならどれでも使用して実行してよい。そのような投与方法には、経口、口腔、舌下、吸入、粘膜、直腸、鼻腔内、局所的、眼球、眼周辺、眼球内、経皮的、皮下、動脈内、静脈内、筋肉内、非経口的または注入の方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物を処置が必要な領域に局所的に投与することが所望される場合があり、これは、例えば、局所注入によって、注射によって、または移植片によって達成してもよいが、これに限定されることはなく、前記移植片は、シアラスティック膜などの膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、またはゼラチン状の物質である。
【０１９２】
本明細書で使用する場合、用語「治療的有効量」は、有意義な患者の利益、すなわち、慢性状態の治癒もしくは改善、症状の軽減、そのような状態の治癒速度の増加、または処置された組織もしくは周辺組織における物質レベルの検出可能な変化を示すのに十分である医薬組成物または方法の各活性成分の総量を意味する。単独で投与される個々の活性成分に適用される場合は、前記用語はその成分だけを言及する。組合せに適用される場合は、組み合わせて、連続的に、または同時に投与されようとも、前記用語は治療効果をもたらす活性成分の組合せ量をいう。
【０１９３】
治療的用途および予防的用途に有効な投与スケジュールおよび量、すなわち、「投与計画」（ｄｏｓｉｎｇ  ｒｅｇｉｍｅｎ）は、疾患または状態の段階、疾患または状態の重篤度、患者の健康の全身状態、患者の身体状態、齢および同類のものを含む様々な要因に依存する。組成物の治療効果および毒性は、細胞培養物または実験動物において標準的な薬学的、薬理学的および毒物学的の手順により決定してよい。例えば、ＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％の致死用量）を決定する多数の方法が存在する。治療効果と毒性効果との間の用量比は治療指数であり、比ＥＤ５０／ＬＤ５０として表すことができる。高い治療指数を示す組成物が好ましい。細胞培養アッセイまたは動物の研究から得られるデータは、ヒトでの使用のためのある範囲の投与量を処方する際に使用してもよい。投与量は、好ましくは、毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含むある範囲の濃度内であり、用いられる投薬形態、患者の感受性、および投与経路に応じてこの範囲内で変わってもよい。
【０１９４】
投与計画は、当該技術分野で周知の薬物動態学的パラメータ、すなわち、吸収速度、生物学的利用効率、代謝、クリアランスなども考慮に入れる（例えば、Ｈｉｄａｌｇｏ−Ａｒａｇｏｎｅｓ（１９９６年）Ｊ．  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５８巻：６１１〜６１７頁；  Ｇｒｏｎｉｎｇ（１９９６年）Ｐｈａｒｍａｚｉｅ  ５１巻：３３７〜３４１頁；  Ｆｏｔｈｅｒｂｙ（１９９６年）Ｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｏｎ  ５４巻：５９〜６９頁；  Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９９５年）Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ８４巻：１１４４〜１１４６頁；  Ｒｏｈａｔａｇｉ（１９９５年）Ｐｈａｒｍａｚｉｅ  ５０巻：６１０〜６１３頁；  Ｂｒｏｐｈｙ（１９８３年）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２４巻：１０３〜１０８頁；最新版の上記Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ参照）。技術水準により、臨床医は個々の患者、治療剤および処置される疾患または状態ごとに投与計画を決定することができる。患者により必要とされかつ許容される投与量および頻度に応じて、本発明の組成物の単回または複数回の投与を施すことができる。予防的および治療的な処置の継続期間は、処置されている特定の疾患または状態に応じて変わる。急性処置が役立つ疾患もあれば、長期治療を必要とする疾患もある。投与が毎日でなければ、例えば、注射が数日おきに、数週間おきに、または数カ月おきに与えられるならば、薬剤の毎日の放出が治療必要性を満たすのに十分であるように、より多くの治療剤が各投与に含まれていてもよい。
【０１９５】
好ましい実施形態では、本発明の治療剤は、長い休止期間のない連続注入または頻回投与のどちらかにより規則正しい投与計画のもとで投与される。そのような規則正しい投与は、休止期間なく一定の間隔をおいて投薬することを含むことができる。典型的には、治療剤、特に細胞傷害剤は、より低い用量で使用される。そのような投与計画は、長期間の比較的低用量の慢性的連日投与を包含し、これにより毒性副作用を最小限に抑え、休止期間を除くことができる。Ｋａｍａｔら、（２００７年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６７巻：２８１〜８８頁。特定の実施形態では、治療剤は、約２４時間から約２日間まで、約１週間まで、約２週間まで、約３週間まで、約１ヶ月まで、約２ヶ月まで、約３ヶ月まで、約４ヶ月まで、約５ヶ月まで、約６ヶ月までの範囲の慢性的低用量または連続注入により送達される。そのような投与計画のスケジューリングは、熟練した癌専門医により最適化されることができる。
【０１９６】
本発明によって包含される抗体については、患者に投与される投与量は、典型的には、０．０００１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ患者体重である。好ましくは、患者に投与される投与量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇまで、０．０００１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇまで、０．０００１ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇまで、０．０００１から２ｍｇ／ｋｇまで、０．０００１から１ｍｇ／ｋｇまで、０．０００１ｍｇ／ｋｇから０．７５ｍｇ／ｋｇまで、０．０００１ｍｇ／ｋｇから０．５ｍｇ／ｋｇまで、０．０００１ｍｇ／ｋｇから０．２５ｍｇ／ｋｇまで、０．０００１から０．１５ｍｇ／ｋｇまで、０．０００１から０．１０ｍｇ／ｋｇまで、０．００１から０．５ｍｇ／ｋｇまで、０．０１から０．２５ｍｇ／ｋｇまで、または０．０１から０．１０ｍｇ／ｋｇ患者体重までである。例えば、脂質化などの改変により抗体の取込みおよび組織透過性を強化することによって、投与量および投与頻度を減少してもよく、または変更してもよい。一実施形態では、患者に投与される抗体の投与量は、単剤治療として使用されるときは、０．０１ｍｇから１０００ｍｇ／日である。別の実施形態では、抗体は、他の治療組成物と組み合わせて使用され、患者に投与される投与量は、前記分子が単剤治療として使用されるときよりは少なくなる。好ましい例では、被験体は、約１から１０週間まで、好ましくは２から８週間まで、さらに好ましくは約３から７週間まで、さらに好ましくは、約４、５、または６週間の間、約０．１から３０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で週あたり１回、抗体で処置される。
【０１９７】
Ｃ５．組合せ治療
本発明は、現行の標準および実験化学療法、ホルモン治療、生物学的治療、免疫治療、放射線療法、または手術を含むが、これらに限定されることはない、癌、自己免疫疾患、炎症、もしくは感染症の処置または予防のための当業者に公知の他の治療と組み合わせて本発明の抗体またはポリペプチドを投与することをさらに包含する。一部の実施形態では、本発明の抗体またはポリペプチドは、癌、自己免疫疾患、感染症、もしくは中毒の処置および／または予防のために、当業者に公知の治療的または予防的有効量の１つまたはそれより多くの治療剤と組み合わせて投与してもよい。
【０１９８】
本明細書で使用する場合、用語「組合せ」とは、１つより多くの治療剤の使用をいう。用語「組合せ」の使用は、障害を持つ患者に治療剤を投与する順序を制限しないし、薬剤が正確に同時に投与されることを意味せず、むしろ、本発明の抗体またはポリペプチドが他の薬剤と一緒に作用して、これらを他の方法で投与した場合よりも増加した利益を提供することができるように、本発明の抗体またはポリペプチドおよび他の薬剤を次々におよびある時間間隔内に哺乳動物に投与することを意味する。例えば、各治療剤（例えば、化学療法、放射線療法、ホルモン治療または生物学的治療）は同時に投与してもよいし、または異なる時点で任意の順序で連続して投与してもよいが、同時に投与されない場合は、所望の治療効果または予防効果を提供するように、十分接近した時間内に投与するべきである。各治療剤は、別々に、任意の適切な形態で、および任意の適切な経路により、例えば、１つは経口経路により、１つは非経口的に投与することができる。
【０１９９】
様々な実施形態では、障害を有する被験体に、第２の（または後の）治療剤の投与に先立って（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、もしくは１２週間前に）、同時に、またはその後で（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、もしくは１２週間後に）最初の治療剤を投与することができる。好ましい実施形態では、２つまたはそれより多くの薬剤は、同一患者の訪問時に、もしくは１２時間以下あけて、２４時間以下あけて、または４８時間以下あけて投与される。
【０２００】
特定の実施形態では、治療剤は、被験体に周期的に投与される。周期治療は、ある期間にわたって第１の薬剤を投与し、続いてある期間にわたって第２の薬剤および／または第３の薬剤を投与し、そしてこの連続投与を繰り返すことを含む。周期治療は、治療のうちの１つまたはそれより多くに対する抵抗性の発達を減少させ、治療のうちの１つの副作用を回避するかもしくは弱め、かつ／または処置効力を改善することができる。例となる周期は、毎週約１回、１０日ごとに約１回、２週間ごとに約１回、および３週間ごとに約１回である。各周期は、少なくとも１週間の休息、少なくとも２週間の休息、少なくとも３週間の休息を含むことができる。投与される周期数は、約１から約１２周期、さらに典型的には、約２から約１０周期、さらに典型的には、約２から約８周期である。
【０２０１】
細胞増殖障害の処置のための実施形態では、本発明の抗体またはポリペプチドは、アルキル化剤（例えば、メクロレタミンもしくはシスプラチン）、新脈管形成阻害剤、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン／ダウノマイシンもしくはドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、もしくはアントラマイシン）、抗体（例えば、ベバシズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．よりＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）として販売）などの抗ＶＥＧＦ抗体、パニツムマブ（Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．よりＶＥＣＴＩＢＩＸＴＭとして販売）などの抗ＥＧＦＲ抗体、もしくはナタリズマブ（Ｂｉｏｇｅｎ  ＩｄｅｃおよびＥｌａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．によりＴＹＳＡＢＲＩ（登録商標）として販売）などの抗インテグリン抗体）、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサートもしくは５−フルオロウラシル）、有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチンもしくはパクリタキセル）、細胞毒（例えば、細胞増殖阻害剤もしくは細胞破壊剤）、ホルモン治療剤（例えば、選択的エストロゲン受容体調節因子（例えば、タモキシフェンもしくはラロキシフェン）、アロマターゼ阻害剤、黄体形成ホルモン放出ホルモン類似体、プロゲステロン性薬剤（ｐｒｏｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ  ａｇｅｎｔ）、副腎皮質ステロイド、エストロゲン、アンドロゲン、抗エストロゲン剤、アンドロゲン受容体遮断剤、５−アルファ還元酵素阻害剤、副腎産生阻害剤（ａｄｒｅｎａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）など）、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、放射性元素（例えば、α放射体、γ放射体、など）、または他の任意の化学治療剤などの、しかしこれらに限定されることはない、別の治療剤にコンジュゲートされるか、または組み合わせて投与される。
【０２０２】
適切な新脈管形成阻害剤の非限定的例としては、ＡＢＴ−６２７、アンジオスタチン（プラスミノーゲン断片）、アンジオザイム、抗脈管形成性アンチトロンビンＩＩＩ、ベイ１２−９５６６、ベネフィン、ベバシズマブ、ＢＭＳ−２７５２９１、ビスホスホネート、軟骨由来阻害剤（ＣＤＩ）、ＣＡＩ、ＣＤ５９補体断片、ＣＥＰ−７０５５、Ｃｏｌ３、コンブレタスタチンＡ−４、エンドスタチン（コラーゲンＸＶＩＩＩ断片）、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）、フィブロネクチン断片、グロ−ベータ、ハロフジノン、ヘパリナーゼ、ヘパリン六糖断片、ＨＭＶ８３３、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ＩＭ−８６２、インターフェロンアルファ／ベータ／ガンマ、インターフェロン誘導タンパク質（ＩＰ−１０）、インターロイキン−１２、クリングル５（プラスミノーゲン断片）、マリマスタット、メタロプロテイナーゼ阻害剤（ＴＩＭＰ）、２−メトキシエストラジオール、ＭＭＩ  ２７０（ＣＧＳ  ２７０２３Ａ）、ＭｏＡｂ  ＩＭＣ−１Ｃ１１、ネオバスタット、ＮＭ−３、パンゼム、ＰＩ−８８、胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、血小板因子−４（ＰＦ４）、プリノマスタット、プロラクチン１６ｋＤａ断片、プロリフェリン関連タンパク質（ＰＲＰ）、ＰＴＫ  ７８７／ＺＫ  ２２２５９４、レチノイド、ソリマスタット、スクアラミン、ＳＳ  ３３０４、ＳＵ  ５４１６、ＳＵ６６６８、ＳＵ１１２４８、テトラヒドロコルチゾール−Ｓ、テトラチオモリブデート、サリドマイド、トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）、ＴＮＰ−４７０、トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−ｂ）、バスキュロスタチン、バソスタチン（カルレティキュリン断片）、ＺＤ６１２６、およびＺＤ６４７４が挙げられる。
【０２０３】
細胞増殖障害の処置のための追加の抗体の非限定的例としては、１７−１Ａ、αｖβ３、ＡＦＰ、ＣＤ３、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＥＡ、ＣＴＬＡ−４、ＤＮＡ関連タンパク質、ＥＧＦ受容体、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＧＤ２−ガングリオシド、ｇｐ  ＩＩＩｂ／ＩＩＩａ、ｇｐ７２、ＨＥＲ２、ＨＬＡ−ＤＲ  １０ベータ、ＨＬＡ−ＤＲ抗原、ＩｇＥ、ガングリオシドＧＤ３、ＭＵＣ−１、ｎｕＣ２４２、ＰＥＭ抗原、ＳＫ−１抗原、腫瘍抗原ＣＡ１２５、腫瘍抗原ＭＵＣ１、ＶＥＧＦ、およびＶＥＧＦ受容体に対する抗体が挙げられる。
【０２０４】
異なる実施形態では、本発明の抗体またはポリペプチドは、抗体、抗コリン作用剤、ベータアゴニスト、メチルキサンチン、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（例えば、アスピリン、イブプロフェン、セレコキシブまたはジクロフェナク）、およびステロイド系抗炎症剤（例えば、グルココルチコイド、デキサメタゾン、コルチゾン、プレドニゾンまたはエイコサノイド）などの、しかしこれらに限定されることはない、炎症性障害を処置するための治療剤と組み合わせて投与してもよい。さらなる抗体は、アルファ４ベータ７、ベータ２−インテグリン、ＣＢＬ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１／１８、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ６４（ＦｃＲ）、ＣＤ８０、ＣＤ１４７、補体（Ｃ５）、Ｅ−セレクチン、第ＶＩＩ因子、ｇｐＩＩｂＩＩＩａ、ＩＣＡＭ−３、ＩｇＥ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＴＮＦアルファ、およびＶＬＡ−４に対する抗体などの、しかしこれらに限定されることはない、炎症性疾患の処置に適したどんな抗体でもよい。
【０２０５】
さらなる実施形態では、本発明の抗体またはポリペプチドは、抗体、ブレキナール、シクロホスファミド、シクロスポリンＡ、サイトカイン受容体調節因子、デオキシスパガリン（ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）、レフルノミド、マクロライド抗生物質、マロノニトリロアミンド（ｍａｌｏｎｏｎｉｔｒｉｌｏａｍｉｎｄｅ）（例えば、レフルナミド）、メトトレキサート、メチルプレドニゾロン、ミゾリビン、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン（シロリムス（ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ））、ステロイド、およびＴ細胞受容体調節因子などの、しかしこれらに限定されることはない、自己免疫障害を処置するための治療剤と組み合わせて投与してもよい。さらなる抗体は、自己免疫障害の処置に適したどんな抗体でもよく、非限定的例としては、ａ４ｂ７インテグリン受容体、ＣＢＬ抗原、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ２３、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＦｃＲＩ、ガンマインターフェロン、ＩＬ−８、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ、ＩＣＥインターロイキン−１ベータ、Ｐ３８ＭＡＰキナーゼ、およびＴＮＦに対する抗体が挙げられる。
【０２０６】
さらに別の実施形態では、本発明の抗体またはポリペプチドは、抗生物質、抗真菌剤、または抗ウイルス剤などの、しかしこれらに限定されることはない、感染症を処置するための治療剤と組み合わせて投与してもよい。本発明の分子と組み合わせて使用することができる抗生物質としては、２，４−ジアミノピリミジン（例えば、ブロジモプリム）、アミノグリコシド（例えば、アプラマイシン、ネオマイシン、またはスペクチノマイシン）、アンフェニコール（例えば、クロラムフェニコール）、アンホマイシン、アンサマイシン（例えば、リファミドおよびリファンピン）、バシトラシン、カルバセフェム（例えば、ロラカルベフ）、カルバペネム（例えば、ビアペネムおよびイミペネム）、セファロスポリン（例えば、セファレキシンまたはセファドロキシル）、セファマイシン（例えば、セフブペラゾン、セフメタゾールおよびセフミノクス）、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、リンコサミド（例えば、クリンダマイシンおよびリンコマイシン）、マクロライド（例えば、トブラマイシン）、モノバクタム（例えば、カルモナム）、ニトロフラン（例えば、フラルタドンおよびフラゾリウムクロリド）、オキサセフェム（例えば、フロモキセフおよびモキサラクタム）、ペニシリン、キノロン（例えば、オフロキサシンまたはシプロフロキサシン）、スルホンアミド（例えば、ベンジルスルファミドおよびスルファシチン）、スルフォン（例えば、ジアチモスルホン、グルコスルホンナトリウムおよびソラスルホン）、ならびにテトラサイクリン（例えば、アピサイクリンおよびクロルテトラサイクリン）が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０２０７】
本発明の分子と組み合わせて使用することができる抗真菌剤としては、アムホテリシンＢ、ブトコナゾール、シクロピロクス、クロトリマゾール、エコナゾール、フルコナゾール、フルシトシン、グリセオフルジン（ｇｒｉｓｅｏｆｕｌｄｉｎ）、ハロプログリン、イントラテカル、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、ナフチフィン、ニスタチン、テルビナフィン、テルコナゾール、チオコナゾール、およびウンデシリネートが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の分子と組み合わせて使用することができる有用な抗ウイルス剤としては、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、ヌクレオシド類似体、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、およびプロテアーゼ阻害剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。そのような薬剤の非限定的例は、アシクロビル、アデホビル、アルファインターフェロン、アマンタジン、アンプレナビル、クレバジン、エンテカビル、ホスカルネット、ガングシクロビル、イドクスウリジン、インジナビル、ロピナビル、プレコナリル、リバビリン、リマンタジン、リトナビル、サキナビル、トリフルリジン、ビダラビン、およびジドブジンである。
【０２０８】
Ｃ６．治療的有用性の実証
本発明の医薬組成物、予防剤または治療剤は、好ましくは、ヒトにおける使用に先立って所望の治療活性について、インビトロで、細胞培養系において、および齧歯類動物モデル系などの動物モデル生物において試験される。例えば、特定の医薬組成物の投与が望ましいかどうかを決定するために使用することができるアッセイとしては、患者の組織試料を培養下で増殖し、本発明の医薬組成物に曝露するかまたは他の方法で接触させ、前記組織試料に対するそのような組成物の効果を観察する細胞培養アッセイが挙げられる。組織試料は患者からのバイオプシーにより入手することができる。この試験により、個々の患者ごとの治療的に最も有効な予防的または治療的な分子を同定することが可能になる。様々な特定の実施形態では、インビトロアッセイは、自己免疫障害または炎症障害に関与する細胞型のうちの代表的細胞（例えば、Ｔ細胞）を使用して実施して、本発明の医薬組成物がそのような細胞型に対して所望の効果を有するかどうかを決定することができる。
【０２０９】
適切な動物モデル系としては、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ウサギなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。当該技術分野で周知のどんな動物系を使用してもよい。本発明の特定の実施形態では、予防剤および／または治療剤の組合せはマウスモデル系で試験される。本発明の方法で使用するための好ましい動物モデルは、例えば、マウスエフェクター細胞上でヒトＦｃγＲを発現しているトランスジェニックマウスであり、例えば、米国特許第５８７７３９６号に記載されているマウスモデルはどれでも本発明において使用することができる。
【０２１０】
当該技術分野で公知であり、Ｃｒｏｆｆｏｒｄ  Ｌ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｄｅｒ  Ｒ．Ｌ．、「Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  Ａｎｉｍａｌｓ」、ｉｎ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ａｌｌｉｅｄ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：  Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ、ＭｃＣａｒｔｙら（編）、Ｃｈａｐｔｅｒ  ３０（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｆｅｂｉｇｅｒ、１９９３年）に記載されている炎症性関節炎の様々な実験動物モデルおよび自然動物モデルを使用することにより、抗炎症活性を決定することができる。例えば、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌおよびブタにおけるカラゲナン誘発関節炎、ザイモサン誘発関節炎、またはコラーゲン誘発関節炎などのアジュバンド誘発関節炎モデルは抗炎症活性を研究するには有用であり、ラットにおけるカラゲナン誘発性足浮腫の阻害は、大半のＮＳＡＩＤの抗炎症活性についての主要インビボスクリーンであり、ヒトでの効力を予測すると考えられている。これらのモデルは、例えば、Ｗｉｎｔｅｒら（１９６２年）Ｐｒｏｃ．  Ｓｏｃ．  Ｅｘｐ．  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．  １１１巻：５４４〜４７頁；  およびＨａｎｓｒａら（２０００年）Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ２４巻（２号）：１４１〜５５頁に記載されている。炎症性腸疾患の動物モデル、例えば、Ｓｔｒｏｂｅｒ（１９８５年）Ｄｉｇ．  Ｄｉｓ．  Ｓｃｉ．  ３０  （１２  Ｓｕｐｐｌ）：３Ｓ〜１０Ｓ；  Ｋｉｍら（１９９２年）Ｓｃａｎｄ．  Ｊ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｒｏｌ．  ２７巻：５２９〜３７頁などに記載されているモデルは、本発明の治療の効力を評価するのにも使用することができる。これらのモデルでは、硫酸化多糖類、デキストラン硫酸または化学的刺激物質の経口投与により、動物に潰瘍性大腸炎およびクローン病を誘発することができる。
【０２１１】
自己免疫障害の処置効力は、１型糖尿病、甲状腺自己免疫、全身性エリテマトーデス（ｅｒｕｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）、および糸球体腎炎などの自己免疫障害の動物モデル、例えば、Ｆｌａｎｄｅｒｓら（１９９９年）Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２９巻：２３５〜４６頁；  Ｋｒｏｇｈら（１９９９年）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８１巻：５１１〜１５頁；  Ｆｏｓｔｅｒ（１９９９年）Ｓｅｍｉｎ．  Ｎｅｐｈｒｏｌ．  １９巻：１２〜２４頁などに記載されているモデルを使用して評価してもよい。
【０２１２】
治療剤の抗癌活性も、ヒト異種移植片を有する、ＳＣＩＤマウスモデル、トランスジェニックマウスまたはヌードマウスなどの癌研究のための様々な実験動物モデル、ならびに当該技術分野で公知の、およびＲｅｌｅｖａｎｃｅ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１９９９年、Ｆｉｅｂｉｇ  ａｎｄ  Ｂｕｒｇｅｒ編）；  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（１９９９年、Ｋａｒｇｅｒ）；  Ｔｈｅ  Ｎｕｄｅ  Ｍｏｕｓｅ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１年、Ｂｏｖｅｎ  ａｎｄ  Ｗｉｎｏｇｒａｄ編）；およびＡｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｇｕｉｄｅ（１９９７年、Ｔｅｉｃｈｅｒ編）に記載されている、ハムスター、ウサギなどの他の動物モデルを使用することにより決定することができる。好ましい動物モデルはマウス異種移植片モデルである。異種移植腫瘍の供給源として使用することができる腫瘍細胞系としては、乳腺癌の患者から誘導され得るＳＫＢＲ３細胞およびＭＣＦ７細胞が挙げられるが、これらに限定されることはない。これらの細胞は、ｅｒｂＢ２受容体およびプロラクチン受容体の両方を有する。ＳＫＢＲ３細胞は、ＡＤＣＣおよび異種移植腫瘍モデルとして当該技術分野で慣用的に使用されてきた。代わりに、ヒト卵巣腺癌由来のＯＶＣＡＲ３細胞は、異種移植腫瘍の供給源として使用することができる。
【０２１３】
本発明の治療剤は、好ましくは、ヒトにおける使用に先立って、所望の治療活性または予防活性についてインビトロで、次にインビボで試験される。治療剤および方法は、腫瘍細胞系または悪性疾患細胞系の細胞を使用してスクリーニングされてもよい。当該技術分野で標準の多くのアッセイを使用して、そのような生存および／または増殖を評価することができる。例えば、細胞増殖は、３Ｈ−チミジン取込みを測定することにより、直接細胞計数により、癌原遺伝子（例えば、ｆｏｓ、ｍｙｃ）または細胞周期マーカーなどの公知の遺伝子の転写活性の変化を検出することによりアッセイすることができる。細胞生存率は、トリパンブルー染色により評価することができ、分化は、形態の変化、軟寒天における減少した増殖および／もしくはコロニー形成、または三次元基底膜もしくは細胞外マトリックス調製物における管状網形成に基づいて視覚的に評価することができる。
【０２１４】
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られるデータは、ヒトにおいて使用するためのある範囲の投与量の治療剤を処方するのに使用することができる。そのような薬剤の投与量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性のないＥＤ５０を含むある範囲の循環濃度内にある。投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変わってもよい。本発明の方法において使用される任意の薬剤について、治療的有効用量を最初に細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、細胞培養において決定した場合にＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように動物モデルにおいて処方してもよい。そのような情報を使用すれば、ヒトにおける有用な用量をもっと正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定してもよい。
【０２１５】
Ｄ．他の方法
Ｄ１．遺伝子治療
特定の実施形態では、本発明の分子をコードする配列を含む核酸が、遺伝子治療によって、疾患、障害または感染に付随する１つまたはそれより多くの症状を処置する、予防する、または緩和するために投与される。遺伝子治療とは、被験体への発現されたまたは発現可能な核酸の投与により実施される治療をいう。本発明のこの実施形態では、核酸は治療効果または予防効果を媒介するそれにコードされた抗体または融合タンパク質を産生する。当該技術分野で利用することができる遺伝子治療のためのどんな方法でも、例えば、例えば、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら（１９９３年）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２巻：４８８〜５０５頁；  Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ（１９９１年）Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３巻：８７〜９５頁；  Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ（１９９３年）Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  ３２巻：５７３〜５９６頁；  Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９９３年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０巻：９２６〜９３２頁；およびＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９３年）Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６２巻：１９１〜２１７頁に記載される方法を使用してよい。
【０２１６】
好ましい態様では、本発明の組成物は、本発明の抗体、ダイアボディ、または融合タンパク質をコードする核酸を含み、前記核酸は適切な宿主内で抗体を発現する発現ベクターの一部である。特に、そのような核酸は、抗体コード領域に作動可能的に連結されたプロモーター、好ましくは、異種プロモーターを有しており、前記プロモーターは誘導性または構成的であり、必要に応じて、組織特異的である。別の特定の実施形態では、Ｋｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈｉｅｓ（１９８９年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （Ｕ．Ｓ．Ａ．）  ８６巻：８９３２〜３５頁；およびＺｉｊｌｓｔｒａら（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２巻：４３５〜３８頁に記載されているように、抗体コード配列および他の任意の所望の配列には、ゲノム中の所望の部位で相同組換えを促進する領域が隣接しており、したがって、抗体コード核酸の染色体内発現を提供する核酸分子が使用される。
【０２１７】
核酸の被験体への送達は、直接的（その場合は、被験体は核酸または核酸担持ベクターに直接曝露される）、または間接的（その場合は、先ず細胞がインビトロにおいて核酸で形質転換され、次に被験体に移植される）のいずれであってもよい。これらの２つのアプローチは、それぞれ、インビボ遺伝子治療またはエキソビボ遺伝子治療として公知である。
【０２１８】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、インビボで投与され、そこで前記ポリヌクレオチドが発現されてコードされているポリペプチドを産生する。レトロウイルスベクターまたは他のウイルスベクターを使用する感染により（例えば、米国特許第４９８０２８６号；  Ｍｉｌｌｅｒら（１９９３年）Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２１７巻：５８１〜５９９頁；  Ｓａｌｍｏｎｓ  ａｎｄ  Ｇｕｎｚｂｅｒｇ（１９９３年）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４巻：１２９〜１４１頁；  Ｇｒｏｓｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ（１９９３年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．  ３巻：１１０〜１１４頁；  Ｋｏｚａｒｓｋｙ  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ（１９９３年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐ．  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．  ３巻：４９９〜５０３頁；  Ｗａｌｓｈら（１９９３年）Ｐｒｏｃ．  Ｓｏｃ．  Ｅｘｐ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．  ２０４巻：２８９〜３００頁；  Ｂｏｕｔら（１９９４年）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５巻：３〜１０頁；  Ｂｏｅｓｅｎら（１９９４年）Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ６巻：２９１〜３０２頁；  Ｃｌｏｗｅｓら（１９９４年）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９３巻：６４４〜６５１頁；  Ｋｌｅｉｎら（１９９４年）Ｂｌｏｏｄ  ８３巻：１４６７〜１４７３頁；および米国特許第５４３６１４６号に記載されている通り）、あるいは裸のＤＮＡの直接注入により、あるいは微粒子銃（例えば、遺伝子銃）、または、脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクト剤を使用するコーティング、リポソーム、微粒子もしくはマイクロカプセルへの被包の使用により、あるいはそれらを核に入ることが公知であるペプチドに連結させて、または受容体介在性エンドサイトーシスを受ける抗原に連結させて投与することにより（例えば、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ（１９８７年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６２巻：４４２９〜４４３２頁；  Ｊｏｌｉｏｔら（１９９１年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （Ｕ．Ｓ．Ａ．）  ８８巻：１８６４〜１８６８頁；国際公開第９２／０６１８０号；国際公開第９２／２２６３５号；国際公開第９２／２０３１６号；国際公開第９３／１４１８８号；国際公開第９３／２０２２１号に記載されている通り）（これを使用して、前記受容体を特異的に発現している細胞型をターゲティングすることができる）などの多数の方法のいずれによってもこれは実現することができる。
【０２１９】
核酸は、例えば、国際公開第９４／０８５９８号；  Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ（１９８０年）Ｍｅｔｈ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．  ２１Ａ：２２９頁；  Ｐｉｔｔｅｌｋｏｗ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ（１９８６年）Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｐｒｏｃ．  ６１巻：７７１頁；  Ｓｔｅｍｐｌｅ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９２年）Ｃｅｌｌ  ７巻１号：９７３〜９８５頁に記載されているように、得られた組換え細胞のインビボ投与に先立って細胞に導入してもよい。得られた組換え細胞は、当該技術分野で公知の様々な方法によって被験体に送達することができる。組換え血液細胞（例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞）は、好ましくは、静脈内に投与される。使用のために予測される細胞の量は、所望の効果、患者の状態などに依存し、当業者であれば決定することができる。遺伝子治療の目的で核酸を導入することができる細胞は、任意の所望の入手できる細胞型を包含し、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などの血液細胞、様々な幹細胞または前駆細胞、特に、（例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓などから得られる）造血幹細胞または造血前駆細胞などが挙げられるが、これらに限定されることはない。好ましい実施形態では、遺伝子治療に使用される細胞は、被験体にとって自家性である。
【０２２０】
Ｄ２．ワクチン治療
一部の実施形態では、本発明の抗体を使用して、癌抗原および感染症抗原を含むがこれらに限定されることはない抗原性因子または免疫原性因子に対する免疫応答を誘導してもよい。本発明のワクチン組成物は、免疫応答が望ましい１つまたはそれより多くの抗原性因子または免疫原性因子を含み、前記１つまたはそれより多くの抗原性因子または免疫原性因子は本発明の抗体で被膜されている。本発明のワクチン組成物は、免疫応答、好ましくは、抗原性因子または免疫原性因子に対する保護的免疫応答を誘発するのに特に効果的であり、前記抗原性因子または免疫原性因子は、それに対する免疫応答が望ましいウイルスでもよいし、他のウイルス病原体または非ウイルス病原体由来の抗原でもよい。
【０２２１】
さらに他の実施形態では、本発明は、その表面で抗体を発現している病原性細胞またはウイルス、好ましくは、弱毒ウイルスを包含する。本発明は、本発明の組成物を投与することにより被験体にトレランスを誘導する方法をさらに包含する。好ましくは、被験体にトレランスを誘導するのに適した組成物は、本発明の抗体で被膜された抗原性因子または免疫原性因子を含む。
【０２２２】
Ｄ３．リポソームまたは他のマイクロキャリアおよびナノキャリアをターゲティングする
一部の実施形態では、本発明の抗体を使用して、所望の治療組成物（例えば、抗癌薬）の標的細胞（例えば、前立腺癌細胞または他のＨＥＲ２／ｎｅｕ発現細胞）への送達のための、ターゲティングされるリポソームを調製することができる。抗腫瘍剤のターゲティングされた送達のための免疫リポソームの調製および使用は、Ｍａｓｔｒｏｂａｔｔｉｓｔａら（１９９９年）Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ４０巻：１０３〜１２７頁に概説されている。リポソームは脂質二重層をベースとする小胞構造体である。リポソームは直径がわずか２０ｎｍほどの小ささであってもよく、１０μｍほどの大きさであってもよい。リポソームは単層（わずか１つの二重層が水性の核を取り囲んでいる）であってもよく、多重膜（２またはそれより多くの二重層が水性の核の回りに同心円状に配向している）であってもよい。様々なターゲティング剤（例えば、本発明の抗体）を使用するリポソームのターゲティングは当該技術分野では周知である。例えば、米国特許第４９５７７７３号および米国特許第４６０３０４４号参照。ターゲティング剤をリポソームに結合させるための標準的な方法を使用することができる。抗体にターゲティングされたリポソームは、例えば、プロテインＡを取り込むリポソームを使用して構築することができる。Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎら（１９９０年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５巻：１６３３７〜１６３４２頁；およびＬｅｏｎｅｔｔｉら（１９９０年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （Ｕ．Ｓ．Ａ．）  ８７巻：２４４８〜２４５１頁参照。
【０２２３】
好ましい実施形態では、リポソームは、標準的な小胞形成脂質から形成され、この脂質は一般に、中性のおよび負に帯電しているリン脂質ならびにコレステロールなどのステロールを包含する。脂質の選択は、一般に、例えば、リポソームサイズおよび血流中でのリポソームの安定性を考慮して導かれる。例えば、Ｓｚｏｋａら（１９８０年）Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ９巻：４６７頁；米国特許第４２３５８７１号；  米国特許第４５０１７２８号；  および米国特許第４８３７０２８号に記載されているように、リポソームを調製するためには様々な方法を利用することができる。１つの方法は、不均一なサイズの多重膜小胞を作製する。この方法では、小胞形成脂質は、適切な有機溶媒または溶媒系に溶解され、真空または不活性ガス下で乾燥されて、薄い脂質フィルムを形成する。所望であれば、前記フィルムは、ｔ−ブタノールなどの適切な溶媒に再溶解されて、次に凍結乾燥されて、より簡単に水和される粉末様形態である、より均一な脂質混合物を形成する。このフィルムは、ターゲティングされる薬およびターゲティングコンポーネント（抗体）の水溶液で覆われており、（典型的には１５〜６０分の期間かけて攪拌しながら）水和させる。得られる多重膜小胞のサイズ分布は、もっと激しい攪拌条件下で脂質を水和させることにより、またはデオキシコレートなどの可溶化洗剤を添加することにより、もっと小さいサイズの方に移すことができる。
【０２２４】
Ｄ４．免疫アッセイ
本発明の抗体を使用して、ＨＥＲ２／ｎｅｕまたはＨＥＲ２／ｎｅｕを発現している細胞を検出することができる。そのような検出を達成するためには、多くの方法のうちのいずれを使用してもよい。例えば、免疫学的結合アッセイを使用してもよい（例えば、米国特許第４３６６２４１号、米国特許第４３７６１１０号、米国特許第４５１７２８８号、および米国特許第４８３７１６８号参照）。一般的免疫アッセイの概説は、Ａｓａｉ（編、１９９３年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｓｔｉｔｅｓ  ＆  Ｔｅｒｒ（編、１９９１年）Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  第７版も参照されたい。
【０２２５】
したがって、本発明は、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する細胞を検出する方法を提供する。１つの方法では、被験体にバイオプシーが実施され、収集された組織はインビトロで試験される。次に、この組織または組織由来の細胞を本発明の抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体に接触させる。こうして得られるどんな免疫複合体も、バイオプシーを実施した試料中にＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質が存在することを示している。そのような検出を促進するために、抗体を放射標識するか、または、放射標識などの検出可能な標識であるエフェクター分子に結合させることができる。別の方法では、前記細胞を典型的な画像化システムを使用してインビボで検出することができる。次に、標識の局在は、標識を検出するための公知の方法のいずれかによって決定される。画像診断を視覚化するための従来の方法を使用することができる。例えば、常磁性同位元素をＭＲＩに使用することができる。抗体の内部移行は、循環クリアランスと結びついた細胞外酵素環境によるクリアランスを受ける細胞外結合により与えられる寿命を超えた生物内での寿命を延ばすのに重要である可能性がある。
【０２２６】
ＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質も、標準免疫アッセイ法および本発明の抗体を使用して検出することができる。標準法には、例えば、放射免疫アッセイ、免疫クロマトグラフィー法、サンドイッチ免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡを含む）、免疫蛍光アッセイ、ウェスタンブロット、アフィニティークロマトグラフィー（アフィニティーリガンドが固相に結合している）、および標識した抗体を使用するインサイチュ検出が挙げられる。
【０２２７】
これまで本発明を一般的に説明してきたが、本発明は以下の実施例を参照することによりさらに容易に理解される。以下の実施例は、説明のために提供されるものであり、明記されていなければ、本発明を限定することを意図してはいない。
【実施例】
【０２２８】
（実施例１）
ＢＩＡＣｏｒｅ親和性決定
溶出し精製された抗体の結合の反応速度パラメータを、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ（ＢＩＡｃｏｒｅ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  １０００、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）および関連するソフトウェアを使用して解析した。約１０００応答単位（ＲＵ）の受容体が表面に固定化されるように、アミンカップリング化学（ＮＨＳ／ＥＤＣの混合でのカルボキシメチル基の修飾による）によりセンサーチップ表面の４フローセル（フローセル２）のうちの１つにＨＥＲ−２を固定化した。これに続いて、未反応活性エステルを、１Ｍ  Ｅｔ−ＮＨ２の注入で「覆って取り除いた（ｃａｐｐｅｄ  ｏｆｆ）」。一旦適切な表面が調製されたら、ｃｈ４Ｄ５−ＦｃＷＴ（野生型Ｆｃ）、ｃｈ４Ｄ５、およびトラスツズマブ（対照）を、７０ｍＬ／分の流速で１８０秒間表面に６．２５〜２００ｎＭの濃度で注入した。
【０２２９】
一旦全データセットを収集したら、得られた結合曲線を全体的に適合させ、速度定数および見かけの平衡結合定数を、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．から入手可能なＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋに記載されているとおりに、製造元から供給されたコンピュータアルゴリズムを使用して計算した。図３は、ＳＰＲ解析のグラフ結果を示しており、計算された定数は表５に提供されている。
【０２３０】
【表５】
0005555223.tif 000020
【０２３１】
（実施例２）
アポトーシス
様々な細胞系をｃｈ４Ｄ５およびｃｈ４Ｄ５−ＦｃＭＴ１と一緒に一晩インキュベートした。アポトーシスを、ＦＡＣＳ解析によりアッセイした。結果を表６に示す。
【０２３２】
【表６】
0005555223.tif 000021
【０２３３】
（実施例３）
増殖
本実施形態の様々なキメラ４Ｄ５抗体の効果を比較するために、ＤＮＡへの［３Ｈ］チミジン（［３Ｈ］ＴｄＲ）取込みをＳＫＢＲ３細胞増殖の生化学指標として使用した。ＣＤ１６−１５８Ｆ＋およびＣＤ１６−１５８Ｖ＋細胞に対するｃｈ４Ｄ５−Ａｇ、ｃｈ４Ｄ５、およびＣｈ４Ｄ−ＦｃＭＴ１の影響を研究し、対照と比較した。結果を図４に示す。
【０２３４】
（実施例４）
マウス（乳癌モデル）における抗腫瘍活性
様々な抗体の抗腫瘍活性を、非トランスジェニックマウスおよびトランスジェニック（ｈＣＤ１６Ａ）マウスを使用して、乳癌モデルにおいて研究した。ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ繁殖コロニー由来の５０匹のＢａｌｂ／ｃ  ＲＡＧ２−／−非トランスジェニックマウスに、０日目にＪＭＴ−１乳癌細胞を皮下注射した。マウスをそれぞれ１０マウスの５グループに分け、８週間毎週、ｃｈ４Ｄ５  Ｎ２９７Ｑ、ｃｈ４Ｄ５野生型Ｆｃ、ｃｈ４Ｄ５−ＦｃＭＴ１、ｃｈ４Ｄ５−ＦｃＭＴ２、またはＰＢＳ（負の対照）を腹腔内（ＩＰ）に処置した。腫瘍発達は、週あたり２回、キャリパーを使用してモニターし、腫瘍重量は次の式：腫瘍重量＝（長さ×幅２）／２により推定する。結果を図５に示す。ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ繁殖コロニー由来の２３匹のＢａｌｂ／ｃ  ＲＡＧ２−／−  ｍＣＤ１６−／−  ｈＣＤ１６Ａ＋トランスジェニックマウスに、０日目にＪＩＭＴ−１乳癌細胞を皮下注射した。マウスは３グループに分け、８週間毎週、ｃｈ４Ｄ５野生型Ｆｃ（ｎ＝８）、ｃｈ４Ｄ５−ＦｃＭＴ１（ｎ＝８）、またはＰＢＳ（負の対照；ｎ＝７）を腹腔内（ＩＰ）に処置した。腫瘍発達は、週あたり２回、キャリパーを使用してモニターし、腫瘍重量は次の式：腫瘍重量＝（長さ×幅２）／２により推定する。結果は図６に示している。
【０２３５】
（実施例５）
マウス（卵巣癌モデル）における抗腫瘍活性
様々な抗体の抗腫瘍活性を、非トランスジェニックマウスおよびトランスジェニック（ｈＣＤ１６Ａ）マウスを使用して、卵巣癌モデルにおいて研究した。ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ繁殖コロニー由来の２２匹のＲ３−／−  Ｎ／Ｎ  非トランスジェニックマウスに、０日目に、ＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞を皮下注射した。マウスを４グループに分け、８週間毎週、ｃｈ４Ｄ５  Ｎ２９７Ｑ（ｎ＝５）、ｃｈ４Ｄ５野生型Ｆｃ（ｎ＝６）、ｃｈ４Ｄ５−ＦｃＭＴ１（ｎ＝６）、またはＰＢＳ（負の対照；ｎ＝５）を腹腔内（ＩＰ）に処置した。腫瘍発達は、週あたり２回、キャリパーを使用してモニターし、腫瘍重量を次の式：腫瘍重量＝（長さ×幅２）／２により推定する。結果を図７のパネルＡに示す。ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ繁殖コロニー由来の３２匹のＲ３−／−  Ｎ／Ｎ  ｈＣＤ１６Ａ＋トランスジェニックマウスに、０日目に、ＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞を皮下注射した。マウスを４グループに分け、８週間毎週、ｃｈ４Ｄ５  Ｎ２９７Ｑ（ｎ＝８）、ｃｈ４Ｄ５野生型Ｆｃ（ｎ＝８）、ｃｈ４Ｄ５−ＦｃＭＴ１（ｎ＝８）、またはＰＢＳ（負の対照；ｎ＝８）を腹腔内（ＩＰ）に処置した。腫瘍発達は、週あたり２回、キャリパーを使用してモニターし、腫瘍重量を次の式：腫瘍重量＝（長さ×幅２）／２により推定する。結果を図７のパネルＢに示す。ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ繁殖コロニー由来の９６匹のｍＣＤ１６−／−  ｈｕＣＤ１６Ａ  ＦｏｘＮ１−／−  （ｎｕ／ｎｕ）トランスジェニックマウスに、０日目に、ＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞を皮下注射した。マウスをそれぞれ１６マウスの６グループに分け、８週間毎週、ｃｈ４Ｄ５−ＦｃＭＴ３、ｃｈ４Ｄ５−ＦｃＭＴ１、ｃｈ４Ｄ５−ＦｃＭＴ４、ｃｈ４Ｄ５、ｃｈ４Ｄ５Ａｇ、またはＰＢＳ（負の対照）を腹腔内（ＩＰ）に処置した。腫瘍発達は、週あたり２回、キャリパーを使用してモニターし、腫瘍重量を次の式：腫瘍重量＝（長さ×幅２）／２により推定する。結果を図８に示す。
【０２３６】
（実施例６）
様々な癌細胞系におけるＡＤＣＣアッセイ
図９は、ＨＥＲ２／ｎｅｕに対する様々な癌細胞系の代表的免疫組織化学染色を図示している。細胞系を、ＤＡＫＯ  ＨｅｒｃｅｐｔＴｅｓｔＴＭ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）として販売されているＨＥＲ２／ｎｅｕ試験キットに明記されているとおりにそのＨＥＲ２／ｎｅｕ染色強度に従ってランク付けした。すなわち、ＨＥＲ２／ｎｅｕ染色なし（ＤＡＫＯスコア０）、弱いＨＥＲ２／ｎｅｕ染色（ＤＡＫＯスコア１＋）、中程度のＨＥＲ２／ｎｅｕ染色（ＤＡＫＯスコア２＋）、および強いＨＥＲ２／ｎｅｕ染色（ＤＡＫＯスコア３＋）である。表７に示されるように、様々なパネルは様々な細胞系を表している。
【０２３７】
【表７】
0005555223.tif 000022
【０２３８】
Ｆｃバリアントドメインを有するｃｈ４Ｄ５抗体を含むいくつかのｃｈ４Ｄ５抗体を、ｃｈ４Ｄ５−ＦｃＭＴ１、ｃｈ４Ｄ５−ＦｃＭＴ２、ｃｈ４Ｄ５−ＦｃＭＴ３、ｃｈ４Ｄ５−ＦｃＷＴ（野生型Ｆｃ）、ｃｈ４Ｄ５  Ｎ２９７Ｑおよびトラスツズマブ（対照として）を含む癌細胞系においてＡＤＣＣを媒介する能力について試験した。有効なアッセイ（ＳＲ≦２０％  ＭＲ、ＡＩＣＣ≦５０％  ＭＲ）からのデータを表８に報告する。ここで、ＥＣ５０推定値は、モデルが最大溶解＞２０％に適合した場合のみ有効だと判断した。平方和Ｆ検定により、Ｆｃ最適化抗体について得られた最良適合値が、Ｆｃ野生型ｃｈ４Ｄ５抗体について得られた最良適合値と統計学的に異なっているかどうかを問うことによって、ＥＣ５０および最大溶解パラメータの比較を実施した。データを、図１０〜１３に示されるように、Ｓ字形用量応答モデルにも適合させた。
【０２３９】
【表８−１】
0005555223.tif 000023
【０２４０】
【表８−２】
0005555223.tif 000024
【０２４１】
【表８−３】
0005555223.tif 000025
【０２４２】
本明細書において言及した刊行物および特許はすべて、あたかも個々の出版物または特許出願がそれぞれ、参照によりその全体を援用すると具体的に個別に示されているのと同程度に参照により本明細書に援用されている。本発明はその特定の実施形態に関連して説明されてはいるが、本発明は追加の改変が可能であり、本出願は、一般に、本発明の原理に従い、本発明が付属する技術分野内で公知のまたは習慣的な慣行内に収まり、上文に記載された本質的特徴に適用され得るような本開示からの逸脱を含む、本発明のいかなる変形、使用、または改作も包含することを意図していると理解されるであろう。
【図１】
0005555223.tif 000026
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
0005555223.tif 000030
【図６】
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【図７】
0005555223.tif 000032
【図８】
0005555223.tif 000033
【図９Ａ】
0005555223.tif 000034
【図９Ｂ】
0005555223.tif 000035
【図９Ｃ】
0005555223.tif 000036
【図９Ｄ】
0005555223.tif 000037
【図９Ｅ】
0005555223.tif 000038
【図９Ｆ】
0005555223.tif 000039
【図９Ｇ】
0005555223.tif 000040
【図９Ｈ】
0005555223.tif 000041
【図９Ｉ】
0005555223.tif 000042
【図９Ｊ】
0005555223.tif 000043
【図９Ｋ】
0005555223.tif 000044
【図９Ｌ】
0005555223.tif 000045
【図９Ｍ】
0005555223.tif 000046
【図１０】
0005555223.tif 000047
【図１１】
0005555223.tif 000048
【図１２】
0005555223.tif 000049
【図１３】
0005555223.tif 000050
【配列表】
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