(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子を検出する検出器であって、
前記分子を受け取る外面及び前記外面の反対側に位置する内面を有し、厚さが５ナノメートル〜５０ミクロンである半導体膜と、
前記半導体膜の前記内面に配置された金属、ドープされた半導体及びドープされたダイヤモンド材料からなるグループから選択された材料を含み、厚さが５ナノメートル〜１０ミクロンであり、前記半導体膜が前記分子を受け取ったときに電子を放出する電子放出層と、
放出された前記電子のうちの少なくとも一部の電子を検出するように配置された電子検出器と
を備える検出器。
【請求項２】
−３０００Ｖ〜３０００Ｖの電圧を前記放出層に印加することによって、前記放出層が電気的にバイアスされる、請求項１に記載の検出器。
【請求項３】
前記放出層の厚さが５ナノメートル〜２５ナノメートルである、請求項１に記載の検出器。
【請求項４】
前記放出層が、前記半導体膜の前記内面の少なくとも一部を覆う金属層である、請求項１に記載の検出器。
【請求項５】
前記半導体膜が、２Ｋ〜６００Ｋの温度で使用される、請求項１に記載の検出器。
【請求項６】
前記半導体膜が、Ｓｉ、Ｇｅ、ＳｉＮ、ダイヤモンド−オン−インシュレータ半導体及びこれらの組合せからなるグループから選択された１種又は数種の半導体材料を含む、請求項１に記載の検出器。
【請求項７】
−２０００Ｖ〜２０００Ｖの電圧を前記半導体膜に印加することによって、前記半導体膜の前記外面が電気的にバイアスされる、請求項１に記載の検出器。
【請求項８】
前記半導体膜が、１種又は数種の半導体材料の複数の層を備え、前記複数の層の厚さがそれぞれ１ナノメートル〜１０００ナノメートルである、請求項１に記載の検出器。
【請求項９】
１つ又は複数の活性検出器領域を有する基板をさらに備え、活性検出器領域がそれぞれ前記半導体膜及び前記放出層を備え、それぞれの活性検出器領域の前記半導体膜の表面積が０．１ｍｍ２〜２０２ｃｍ２である、請求項１に記載の検出器。
【請求項１０】
前記半導体膜の厚さが５０ナノメートル〜３００ナノメートルである、請求項１に記載の検出器。
【請求項１１】
前記放出層及び前記半導体膜の前記内面が実質的に平坦であり、前記放出層と前記半導体膜とを合わせた厚さが５％を超えて変化しない、請求項１に記載の検出器。
【請求項１２】
前記膜の前記内面と前記電子検出器の間に配置された電極をさらに備える、請求項１に記載の検出器。
【請求項１３】
前記電極が、−２０００Ｖ〜２０００Ｖの電圧を前記電極に印加することによって電気的にバイアスされる格子電極である、請求項１２に記載の検出器。
【請求項１４】
前記半導体膜が、前記外面に配置された保護層をさらに備え、前記保護層の厚さが５ナノメートル〜２５ナノメートルである、請求項１に記載の検出器。
【請求項１５】
前記電子検出器が、前記放出層によって放出された電子の経路に配置された１つ又は複数のマイクロチャンネルプレート又はダイノードを備える、請求項１に記載の検出器。
【請求項１６】
前記電子検出器が、光ルミネセンススクリーン及び光検出器をさらに備え、前記光ルミネセンススクリーンが、共振器から前記電子を受け取り、電磁放射を発生させ、前記光検出器が前記電磁放射を検出する、請求項１５に記載の検出器。
【請求項１７】
４重極質量分析器、扇形磁場質量分析器、飛行時間質量分析器及びイオントラップ質量分析器からなるグループから選択された質量分析器をさらに備える、請求項１に記載の検出器。
【請求項１８】
分子を検出する方法であって、
前記分子を受け取る外面及び前記外面の反対側に位置する内面を有し、厚さが５ナノメートル〜５０ミクロンである半導体膜、並びに
前記半導体膜の前記内面に配置された金属、ドープされた半導体及びドープされたダイヤモンドからなるグループから選択された材料を含み、厚さが５ナノメートル〜１０ミクロンであり、前記半導体膜が前記分子を受け取ったときに電子を放出する電子放出層
を備える検出器を用意するステップと、
前記分子を前記膜の前記外面と接触させ、それにより、前記放出層によって放出された電子を発生させるステップと、
放出された前記電子を検出するステップと
を含む方法。
【請求項１９】
前記放出層若しくは前記半導体層又はその両方を電気的にバイアスして前記放出層からの電界放出若しくは２次電子放出又はその両方を生じさせるステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記放出層の位置において−２０００Ｖ〜２０００Ｖの範囲から選択された電位を確立するのに十分な、前記放出層から近い距離のところに配置された少なくとも部分的に透過性の格子電極を使用して、前記放出層が電気的にバイアスされる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記分子がイオンであり、前記方法が、１０ｋｅＶ〜５０ｋｅＶに等しい運動エネルギーで前記外面に衝突するように前記イオンを加速させるステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記分子の質量が少なくとも１００ｋＤａである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
２Ｋ〜６００Ｋの温度で実施される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
放出された電子を検出する前記ステップが、放出された前記電子のうちの少なくとも一部の電子の経路に電子検出器を配置するステップを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記電子検出器がマイクロチャンネルプレート又はダイノードを備える、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
放出された電子を検出する前記ステップが、前記放出層からの前記電子を、マイクロチャンネルプレート又はダイノードを使用して増幅するステップを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
分子を検出する方法であって、
ａ）活性検出器領域を有する検出器を用意するステップであり、活性検出器領域がそれぞれ、
前記分子を受け取る外面及び前記外面の反対側に位置する内面を有し、厚さが５ナノメートル〜５０ミクロンである半導体膜、並びに
前記半導体膜の前記内面に配置された金属、ドープされた半導体及びドープされたダイヤモンドからなるグループから選択された材料を含み、厚さが５ナノメートル〜１０ミクロンであり、前記半導体膜が前記分子を受け取ったときに電子を放出する電子放出層
を備える、ステップと、
ｂ）前記分子を前記半導体膜の前記外面と接触させるステップと、
ｃ）前記外面と接触した前記分子の運動エネルギーを半導体膜の格子振動に変換して、フォノンを発生させるステップと、
ｄ）前記フォノンを前記放出層へ移動させ、それにより、フォノンの前記移動に応じて電子を前記放出層から発生させるステップと、
ｅ）前記放出層によって放出された前記電子を検出するステップと
を備える方法。
【請求項２８】
前記検出器は、前記半導体膜に付着させたナノピラーを含まない、請求項１に記載の検出器。
【請求項２９】
前記半導体膜および放出層は組み合わされ、前記検出器の活性領域全体にわたって２０％を超えて変化しない均一の組み合わされた厚さを形成する、請求項１に記載の検出器。
【請求項３０】
前記検出器は、前記半導体膜に付着させたナノピラーを含まない、請求項１８に記載の方法。
【請求項３１】
前記半導体膜および放出層は組み合わされ、前記検出器の活性領域全体にわたって２０％を超えて変化しない均一の組み合わされた厚さを形成する、請求項１８に記載の方法。
【請求項３２】
前記検出器は、前記半導体膜に付着させたナノピラーを含まない、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記半導体膜および放出層は組み合わされ、前記検出器の活性領域全体にわたって２０％を超えて変化しない均一の組み合わされた厚さを形成する、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【米連邦政府の支援を受けた研究又は開発に関する声明】
【０００１】
[0001]本発明は、以下の機関によって与えられた米国政府の援助を受けてなされたものである：ＵＳＡＦ／ＡＦＯＳＲ  ＦＡ９５５０−０８−１−０３３７。米国政府は、本発明に関して一定の権利を有する。
【関連出願の相互参照】
【０００２】
[0002]本出願は、２００９年６月２２日に出願した米国特許出願第１２／４８９，０３７号の恩典を主張するものであり、この出願は、本開示と矛盾しない程度に、参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
[0003]質量分析は、この数十年の間に、広範な種類の分子を検出し、その分子の特性を評価する目的に最も広く適用可能な分析ツールの１つとして出現した。質量分析は、気相中でイオンを形成する能力を有するほとんど全ての化学種に適用可能であり、したがって、おそらくは、最も普遍的に適用可能な定量分析法を提供する。ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド及びこれらの錯体などの生体分子の複雑な混合物を分析する質量分析法を開発することに重点が置かれている。質量分析分野の進歩によって特に、タンパク質配列の分析が推進された（Ｄｏｍｏｎ他、Ｒｅｖｉｅｗ−Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００６、３１２（５７７１）：２１２〜２１７、Ａｓｈｃｒｏｆｔ，Ａ．Ｅ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、２００３、２０（２）：２０２〜２１５、Ｍａｎｎ他、Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｍｅｓ  ｂｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００１、７０：４３７〜４７３、及びＣｏｏｎ他、Ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２００５、３８（４）：５１９、５２１、５２３）。
【０００４】
[0004]現在、タンパク質の分析は、さまざまな電気泳動技法によって、又は質量分析によって実行することができる。質量分析は内因的に、分子量を決定するより迅速で、より正確な分析法である。条件に大きく依存する外因性の分子の特性である電気泳動度とは対照的に、質量分析において利用される質量電荷比（ｍ／ｚ）は、条件に依存しない内因性のイオンの特性である。このことは、分子の分析に使用するのに、質量分析計で決定されたｍ／ｚ比は、内因的に、電気泳動度よりも正確で、信頼できるパラメータであることを意味する。第２に、質量分析の速度は真に驚異的であり、１分析あたり数ミリ秒の潜在性を有する。このことは、プロテオミクス向けの質量分析法を、適当にロバストで高性能な形で開発することができた場合、その方法は、大規模な配列決定の労力の本質を根底から転換する潜在性を有することを意味する。
【０００５】
[0005]質量分析の基本的な障害は、マトリックス支援レーザ脱離イオン化（Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ−Ｌａｓｅｒ−Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ−ａｎｄ−Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＭＡＬＤＩ）又はエレクトロスプレーイオン化（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ−Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＥＳＩ）を使用した核酸及びタンパク質の分析に対して利用可能な質量範囲に限界があることである。この限界は、質量の増大に伴って信号強度が劇的に低下することによって現れる。この現象は、配列決定用混合物の分析を、１００ｋＤａ未満、より一般的には５０ｋＤａの断片質量に限定している。大きなタンパク質の混合物に対する信号強度の低下は、単に機器に関連した影響だけが原因であり、イオン化の効率、溶液断片化又は気相断片化などの化学的な問題に起因するわけではないことが示されている。機器の問題を定量的に詳細に分析した結果、最も重大な機器の問題は明らかにイオンの検出にあった。イオン質量の増大に伴うマイクロチャンネル検出器又は電子増倍管検出器による２次電子収率のよく知られた低下と、混合物分析において検出器が飽和するよく知られた影響とが相まって、高分子量種の複雑な混合物の質量分析では、劇的な信号強度の低下が観察される。
【０００６】
[0006]現在、１００ｍＫ未満などの超低温で動作する超伝導接合でできた極低温熱量計は、最も感度の高い検出器の中に含まれる（米国特許第５，９９４，６９４号及びＴｗｅｒｅｎｂｏｌｄ他、「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｏ  Ａ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、６８（１９９６）３５０３）。超電導接合は一般的に、その急峻なＩＶ特性の転移端に電圧バイアスされ、一方、結晶は、超電導転移温度Ｔｃよりも十分に低い温度に維持される。加速されたタンパク質は、熱フォノンのシャワーを生じさせ、この熱フォノンのシャワーが結晶全体を加熱する。超電導相転移は温度に強く依存するため、この温度上昇を、ＩＶ特性の変化として監視する。フォノンによって与えられる熱量は、衝突した粒子のエネルギーに正比例する。したがって、これらの超電導検出器は極めて高い分解能を有し、非常に重いタンパク質（数ＭＤａ）であっても分解することができる。しかしながら、この種の検出器の主な欠点は、動作温度が１Ｋよりもはるかに低いこと、及び検出器の画素数が限られていること（最大１６）である。これらの限界にはさらに、回復時間が長いこと、複雑さのため、すなわちそれぞれの画素への電線の数のために、検出器の個々の要素の配列が容易ではないこと、及び分子イオンによってボロメータに加えられた熱を放散させる必要があることなどが含まれる。しかしながら、現在も進歩し続けているとはいえ、このような検出器が室温又は室温に近い温度で動作するようになるかどうかは疑わしい。このような検出器には超電導素子が必要なためである。極低温冷却の必要性は、実験の費用及び困難を増大させ、おそらくはすぐには採用されないであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
[0007]求められているものは、分子を検出することができる検出器であって、（１）できるだけ感度が高く、単一の検出効率（「単一の陽子分解能」）を有し、（２）大きな分子に対して感度が低下せず、（３）動作するのに極低温を必要としない検出器である。分解能が最重要であることは変わらないため、検出器の分解能によってプロセスが制限されないように、検出器が高速であることも重要である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
[0008]本発明は、フォノンを介した電界放出（ｆｉｅｌｄ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ）（ＦＥ）及び／又は２次電子放出（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ）（ＳＥＥ）による電子の発生に基づいて、タンパク質及びオリゴヌクレオチドを含む分子を検出する活性検出器及び方法を提供する。この検出器は、１つ又は複数の分子が接触する外面と、薄い電子放出層を有する内面とを有する半導体膜を備える。半導体膜と接触した分子の運動エネルギーは、膜の外面から内面の電子放出層へ伝わる振動量子（すなわちフォノン）の発生によって、半導体膜を貫いて移動し、放出層から電子を放出させる。放出された電子を検出するために電子検出器が配置され、この電子検出器は電子増幅手段を含むことができ、又は含まなくてもよい。
【０００９】
[0009]任意選択で、この検出器は、質量分析計又は微分移動度分析器の一部である。例えば、一実施形態では、この検出器が、従来の質量分析用のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦシステム内に取り付けられ、マルチチャンネルプレート（ｍｕｌｔｉ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｐｌａｔｅ）（ＭＣＰ）を利用して信号を増幅する。分子は、ＭＡＬＤＩ法に従って脱離、イオン化され、ビームライン中で加速され（ＴＯＦ構成）、続いて膜の外面にぶつかる。分子の運動エネルギーは半導体膜へ移動し、薄い電子放出層から電子を放出させる。放出された電子は、ＭＣＰを使用して検出又は増幅され、ＭＣＰは、質量／電荷分析用及びその後の試料同定用の信号を生成する。
【００１０】
[0010]一実施形態では、分子検出器が、分子を受け取る外面と、外面の反対側に位置する内面とを有し、厚さが５ナノメートル〜５０ミクロンである半導体膜を備える。半導体膜の厚さは、１０ナノメートル〜５０ミクロン、１０ナノメートル〜１ミクロン又は１０ナノメートル〜５００ナノメートルであることが好ましく、５０ナノメートル〜３００ナノメートルであるとより好ましい。一実施形態では、半導体膜の厚さが５ナノメートルよりも厚く、好ましくは１０ナノメートルよりも厚い。他の実施形態では、半導体膜の厚さが５０ミクロンよりも薄く、好ましくは５００ナノメートルよりも薄い。
【００１１】
[0011]半導体膜の内面に電子放出層が配置され、放出層の厚さは５ナノメートル〜１０ミクロンであり、この電子放出層は、半導体膜が分子を受け取ったときに電子を放出する。電子放出層の厚さは、５ナノメートル〜１ミクロン、５ナノメートル〜１００ナノメートル又は１０ナノメートル〜２５ナノメートルであることが好ましく、１０ナノメートル〜２０ナノメートルであるとより好ましい。一実施形態では、電子放出層の厚さが５ナノメートルよりも厚く、好ましくは１０ナノメートルよりも厚い。他の実施形態では、電子放出層の厚さが１０ミクロンよりも薄く、好ましくは１００ナノメートルよりも薄い。分子検出器は、放出層によって放出された電子のうちの少なくとも一部の電子を検出するように配置された電子検出器をさらに備える。
【００１２】
[0012]電子放出層は、電界放出（ＦＥ）及び／又は２次電子放出（ＳＥＥ）によって電子を放出することができる任意の材料を含むことができる。一実施形態では、電子放出層が、金属、濃くドープされた半導体及びドープされたダイヤモンド材料からなるグループから選択された材料を含む。濃くドープされたダイヤモンド材料は、当技術分野で知られているダイヤモンド−オン−インシュレータ（ＤＯＩ）材料から製作することができる。電子放出層が薄い金属層である場合には、金などの酸化しない金属を使用することが好ましい。放出層は、前記半導体膜の内面の少なくとも一部、好ましくは半導体膜の内面の５０％〜１００％の間、よりいっそう好ましくは半導体膜の内面の７５％〜１００％の間を共形に覆う。
【００１３】
[0013]電界放出若しくは２次電子放出又はその両方を生じさせるために、任意選択で、電子放出層が電気的にバイアスされる。放出層は、−３０００Ｖ〜３０００Ｖの電圧を放出層に印加することによって電気的にバイアスされることが好ましい。一実施形態では、放出層が、−１０００Ｖ〜１０００Ｖの電圧を印加することによって電気的にバイアスされる。任意選択で、−２０００Ｖ〜２０００Ｖの電圧を印加することによって、半導体膜の外面も電気的にバイアスされる。一実施形態では、この外面が、−１０００Ｖ〜１０００Ｖの電圧を印加することによって電気的にバイアスされる。或いは、実質的に大地電位にある半導体膜が使用される。検出器は、半導体膜と電子検出器の間に配置された電極をさらに備えることができる。この電極は、電子放出層からの電界放出若しくは２次電子放出又はその両方、或いは半導体膜自体からの深部放出（ｄｅｅｐ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ）を生じさせるため、電気的にバイアスされる。一実施形態では、この電極が、電子放出層からの入射電子を少なくとも部分的に透過させる格子電極である。例えば、この格子電極は、入射電子の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％を透過させることができる。この電極は、−２０００Ｖ〜２０００Ｖの電圧を印加することによって電気的にバイアスされることが好ましい。一実施形態では、この電極が、−１０００Ｖ〜１０００Ｖの電圧を印加することによって電気的にバイアスされる。
【００１４】
[0014]半導体膜は、弾道フォノン、並びに膜の外面に分子が衝突したときに横偏極若しくは縦偏極又はその両方が生じる非弾道性の光学フォノン及び音響フォノンを伝達する能力を有する１つ又は複数の半導体材料層を備える。半導体膜は、半導体膜と接触した分子からフォノンへの運動エネルギーの高い変換効率、及び電子放出層へのフォノンの高い伝達効率を達成することができることが好ましい。変換効率及び伝達効率は、半導体材料の硬度及び／又はデバイ温度（θＤ）を増大させることによって向上させることができる。本発明において使用するのに適した半導体材料には、限定はされないが、シリコン（Ｓｉ）、ゲルマニウム（Ｇｅ）、窒化シリコン（ＳｉＮ）、ダイヤモンド−オン−インシュレータ半導体及びこれらの組合せが含まれる。一実施形態では、半導体膜が、１種又は数種の半導体材料の複数の層を備え、これらの層の厚さがそれぞれ１ナノメートル〜１０００ナノメートルである。それぞれの層の厚さは５ナノメートル〜１００ナノメートルであることが好ましい。さらに、半導体膜は、同じ半導体材料又は異なる半導体材料を含む複数の層の交互配列を備えることができ、この配列は２つ以上の層を含む。一実施形態では、半導体膜のそれぞれの層が単結晶材料を含む。任意選択で、半導体膜は、外面に配置された保護層をさらに備える。この保護層は、ＳｉＮなどの低伝導率半導体材料の帯電効果を防ぐ、厚さ５ナノメートル〜２５ナノメートル、より好ましくは厚さ１０ナノメートル〜２０ナノメートルの薄い金属層であることが好ましい。
【００１５】
[0015]一実施形態では、放出層及び半導体膜の内面が実質的に平坦であり、１００ナノメートル以上の縦寸法を有する起伏特徴物などの突出部が一切ない。しかしながら、スパッタリング技法を使用して半導体膜に金属層などの放出層を追加すると、その結果として、放出層上に、非常に滑らかな表面と比較される小さなスパイク又は表面粗さの領域が形成される。これらのスパイク及び表面粗さは、幾何学的な低下要因によって電圧しきい値を低下させることがあり、放出確率を高めることがある。一実施形態では、放出層の厚さが均一であり、活性領域全体にわたって２０％を超えて変化せず、好ましくは１０％だけしか、よりいっそう好ましくは５％だけしか変化しない。他の実施形態では、半導体膜と放出層とを合わせた厚さが均一であり、活性領域全体にわたって２０％を超えて変化せず、好ましくは１０％だけしか、よりいっそう好ましくは５％だけしか変化しない。
【００１６】
[0016]米国特許第７，４０８，１４７号は、ＭＡＬＤＩ、ＥＳＩ及びＴＯＦシステム内において、分子が衝突する膜の内面に付着させた長さが約１００ナノメートル〜３ミクロンの間のナノピラー（ｎａｎｏｐｉｌｌａｒ）を利用して、分子を検出する装置及び方法を開示している。本発明がナノピラーの使用を受け入れることができることもあるが、フォノンの発生若しくは伝播又は電子の放出を成功させるのに、本発明はナノピラーを必要としない。本発明のある種の実施形態では、検出器が、半導体膜に付着させたナノピラー又は他の同様の構造体を一切含まない。ナノピラーはこれらの実施形態から排除されることが意図されていることが理解される。
【００１７】
[0017]フォノンの発生及び伝播は、極低温でより効率的である。１００ケルビン未満のような低温は、背景電気雑音の量を低減させ、熱エネルギーに変換されることにより失われるエネルギーの量を低減させるが、電子を引き出し、放出させるために大きな電圧を印加すると半導体膜が熱せられることがあることに留意すべきである。しかしながら、このような低温の維持には費用がかかり、多大な労力を必要とする。本発明の検出器は極低温において機能するが、この半導体膜は、室温及び室温よりも高い温度でフォノンエネルギーをＦＥ及び／又はＳＥＥに変換する能力を有する。一実施形態では、下動作温度が１０ｍＫよりも高く、上動作温度が、半導体材料の崩壊温度（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）（Ｓｉでは約１７００Ｋ）に依存する。検出器は、１０ｍＫ〜１５００Ｋの間、より好ましくは２Ｋ〜６００Ｋの間、より好ましくは１００Ｋ〜５００Ｋの間、よりいっそう好ましくは２５０Ｋ〜４００Ｋの間の温度で使用されることが好ましい。
【００１８】
[0018]電子検出器は、放出層から放出された電子を受け取り、検出することができる、当技術分野で知られている任意の装置とすることができる。電子検出器は、任意選択で、放出層から放出された電子を増幅する手段を備えることができ、この増幅手段には、限定はされないが、オシロスコープが含まれる。一実施形態では、電子検出器が、放出層によって放出された電子の経路に配置された１つ又は複数のマイクロチャンネルプレート（ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌ  ｐｌａｔｅ）（ＭＣＰ）又はダイノードを備える。他の実施形態では、電子検出器が、光ルミネセンススクリーン及び光検出器をさらに備え、光ルミネセンススクリーンは、放出層によって放出された電子を受け取り、電磁放射を発生させ、光検出器はこの電磁放射を検出する。電子検出器は、電子放出層から５０ナノメートル〜１０センチメートルのところに配置されることが好ましい。一実施形態では、電子検出器が、電子放出層から１００ナノメートル〜８センチメートルのところに配置される。或いは、ＭＣＰと膜とが結合され、これによって背景ドリフト及び背景雑音が低減し、検出可能な質量範囲が広がる。膜は、運動エネルギーの大部分を最初に膜内の格子振動に変換し、次いで電子の放出に変換するので、これは、膜のエネルギー変換機構に基づく。放出された電子は次いで、ＭＣＰによって倍加される。
【００１９】
[0019]任意選択で、本発明の検出器は、分子を受け取ることができる１つ又は複数の活性検出器領域を有する基板を備え、活性検出器領域がそれぞれ半導体膜及び放出層を備える。それぞれの活性領域の半導体膜は、特定の分子質量に感応するように選択し、又は操作することができる。検出器のこれらの活性領域を、互いに同じ分子質量に感応するようにし、又は互いに異なる分子質量に感応するようにすることができる。それぞれの活性領域の表面積は、０．１ｍｍ２〜２０２ｃｍ２の間であることが好ましい。或いは、それぞれの活性領域が０．１ｍｍ２よりも小さい表面積を有し、数平方インチよりも大きな総面積を形成することもできる。
【００２０】
[0020]本発明の他の実施形態は、ａ）分子を受け取る外面及び外面の反対側に位置する内面を有し、厚さが５ナノメートル〜５０ミクロン、好ましくは１０ナノメートル〜５００ナノメートルである半導体膜、並びにｂ）半導体膜の内面に配置された金属、ドープされた半導体及びドープされたダイヤモンド材料からなるグループから選択された材料を含み、厚さが５ナノメートル〜１０ミクロン、好ましくは５ナノメートル〜１００ナノメートルであり、半導体膜が分子を受け取ったときに電子を放出する電子放出層を備える検出器を用意するステップによって分子を検出する方法を提供する。この方法は、分子を膜の外面と接触させ、それにより、放出層によって放出された電子を発生させるステップと、放出層によって放出された電子を検出するステップとをさらに含む。他の実施形態では、放出された電子を検出するステップが、放出された電子のうちの少なくとも一部の電子の経路に電子検出器を配置するサブステップと、放出された電子を、ＭＣＰ又はダイノードを使用して増幅する任意選択のサブステップとを含む。任意選択で、放出層若しくは半導体層又はその両方が電気的にバイアスされる。放出層は、放出層の両面間に−３，０００Ｖ〜３，０００Ｖ、好ましくは−１，０００Ｖ〜１，０００Ｖの電位を確立するように、電気的にバイアスされる。
【００２１】
[0021]他の実施形態は、分子を検出する方法であって、
ａ）活性検出器領域を有する検出器を用意するステップであり、活性検出器領域がそれぞれ、分子を受け取る外面及び外面の反対側に位置する内面を有し、厚さが１０ナノメートル〜５０ミクロン、好ましくは１０ナノメートル〜５００ナノメートルである半導体膜、並びに半導体膜の内面に配置された金属、ドープされた半導体及びドープされたダイヤモンド材料からなるグループから選択された材料を含み、厚さが５ナノメートル〜１０ミクロン、好ましくは５ナノメートル〜１００ナノメートルであり、半導体膜が分子を受け取ったときに電子を放出する電子放出層を備える、ステップと、
ｂ）分子を前記半導体膜の外面と接触させるステップと、
ｃ）外面と接触した分子の運動エネルギーを半導体膜の格子振動に変換して、フォノンを発生させるステップと、
ｄ）フォノンを放出層へ移動させ、それにより、フォノンの移動に応じて電子を放出層から発生させるステップと、
ｅ）放出層によって放出された電子を検出するステップと
を含む方法を提供する。
【００２２】
[0022]本発明の検出器及び方法を使用して検出することができる分子には、タンパク質、オリゴヌクレオチドなどの大きな分子（少なくとも５０ｋＤａ、少なくとも１００ｋＤａ又は少なくとも１，０００ｋＤａ）が含まれる。この検出器は、半導体膜と接触した分子の運動エネルギーを利用してフォノンを発生させるため、本発明は、帯電していない中性分子又は伝統的なＭＡＬＤＩ技法ではイオン化することが難しい中性分子を検出することができ、それにより、プロテオミクス（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）向けの非常に感度の高い広範囲の分子検出方式を可能にする。分子及び膜の熱的操作及び／又は電気的操作を使用して、中性分子の検出をさらに改善することができる。この検出器は既存の技術と両立し、既存の技術では効果的に実行することができない中性分子及び大きなタンパク質の検出を可能にする。
【００２３】
[0023]一実施形態では、本発明の検出器がエネルギー検出機能をさらに有する。例えば、本発明の検出器を使用して、検出器の外面に衝突した分子の運動エネルギーを測定することができる。分子が衝突したときに生み出されるフォノンのエネルギー及び数は、その分子の運動エネルギーに正比例する。したがって、膜から放出される電子の数もこのエネルギーに比例する。次いで、このピーク領域を積分すると、入来粒子のこの全運動エネルギーが得られる。
【００２４】
[0024]本発明の検出器は、限定はされないが、４重極質量分析器、扇形磁場質量分析器、飛行時間質量分析器及びイオントラップ質量分析器を含む、ある範囲の質量分析器に対する汎用検出プラットホームを提供する。
【００２５】
[0025]一実施形態では、本発明の検出器によって検出される分子が、１０ｋｅＶ〜５０ｋｅＶの運動エネルギーで膜の外面に衝突したイオンである。これらのイオンの運動エネルギーは、少なくとも部分的に、半導体膜の格子振動に変換される。他の実施形態では、この検出器が、半導体膜の外面と流体連通した飛行時間分析器を備える。飛行時間分析器によって分離されたイオンは半導体膜の外面に衝突し、分子を検出するとともに、飛行時間データを集めることを可能にする。他の実施形態では、検出器が、半導体膜の外面と流体連通したイオン加速器を備え、イオンは、このイオン加速器によって加速され、半導体膜の外面に衝突する。
【００２６】
[0026]本発明の他の実施形態は、半導体膜の外面と接触している分子を解放する手段を備える。外面から分子を解放する手段には、限定はされないが、半導体膜の外面において熱エネルギーパルス、電磁放射パルス、電流パルス又は衝撃波を発生させる手段が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】標準機器を使用して得たオリゴヌクレオチド標準試料の等モル混合物の代表的な質量スペクトルを示す図である。このスペクトルは、検出される分子の質量が増大するにつれて信号強度が低下することを示している。
【図２】本発明の検出器を示す図である。放出層を備える半導体膜が、フライトチューブ（ｆｌｉｇｈｔ  ｔｕｂｅ）からの分子が半導体膜の外面と接触するように配置されている。放出層から放出された電子は、格子電極を通り抜けて、ＭＣＰを含む電子検出器に到達する。
【図３】半導体膜と電子検出器の間に金属格子電極が配置された本発明の同種の検出器を示す図である。金属放出層から放出された電子の経路も示されている。
【図４】電子を増幅する目的に使用されるＭＣＰと、それらの電子を集め、電圧を発生させる目的に使用されるアノードと、その電圧を測定する目的に使用されるオシロスコープとを備える電子検出器の回路を示す図である。
【図５】基板上の本発明の半導体膜を示す図である。それぞれの窓は活性検出器領域であり、パターン形成された銀層が膜を機械的に支持している。
【図６】本発明の検出器を含む飛行時間／ＭＡＬＤＩシステムを示す図である。
【図７】本発明の検出器を使用して得たアンギオテンシン（１，２８９Ｄａ）の質量スペクトルを示す図である。
【図８】本発明の検出器を使用して得たウシインスリンの質量スペクトルを示す図である。
【図９】本発明の検出器を使用して得たウシインスリンの質量スペクトルを示す図である。
【図１０】本発明の検出器を使用して得たシトクロムＣ（１２，３６２Ｄａ）の質量スペクトルを示す図である。
【図１１】本発明の検出器を使用して得たインスリンからの飛行時間スペクトルを示す図である。
【図１２】従来のＭＣＰと本発明の膜−ＭＣＰ組合せ検出器との比較を示す図である。
【図１３】１価の荷電ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ１＋）及び２価の荷電ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ２＋）が衝突した後の本発明の検出器膜の振動振幅及び振動数の比較を示す図である。
【図１４】ＢＳＡ１＋とＢＳＡ２＋の振動緩和時間の比較を示す図である。
【図１５】異なる質量（スペクトルのピーク）について、本発明の検出器膜の振動振幅及び振動数の比較を示す図である。
【図１６】本発明の検出器を使用したスペクトルのさまざまなピークの緩和時間を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
定義
[0042]「分子」は、化学的に結合した原子の集合体を指し、特性組成を有する。本明細書で使用されるとき、分子は、中性分子又は荷電分子（すなわちイオン）を指す。分子は、１価の荷電分子及び多価の荷電分子を指すことがある。用語「分子」は生体分子を含み、生体分子は、生物によって生み出される分子又は生きている生物にとって重要な分子であり、生体分子には、限定はされないが、タンパク質、ペプチド、脂質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、オリゴヌクレオチド、炭水化物、多糖、糖タンパク質、リポタンパク質、糖、並びにこれらの誘導体、変異体及び錯体が含まれる。
【００２９】
[0043]「イオン」は一般に、正又は負の電荷を有する１価又は多価の荷電原子、分子及び巨大分子、並びに正又は負の電荷を有する原子、分子及び巨大分子の錯体、凝集体及びクラスターを指す。イオンには正イオン及び負イオンが含まれる。
【００３０】
[0044]「膜」は、主として扁平な薄い構造要素などの装置構成要素を指す。本発明の膜は、膜の受取り側に分子が接触したときに電子を放出することができる半導体膜を含む。本発明において有用な膜は、誘電材料、セラミック、ポリマー材料、ガラス及び金属を含む広範囲にわたる追加の材料を含むことがある。
【００３１】
[0045]「電界放出」（ＦＥ）又は「電界電子放出」（ｆｉｅｌｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ）（ＦＥＥ）は、強い電界にさらされた（金属、半導体などの）凝縮した材料の表面から、真空中又は別の材料中への電子の放出である。
【００３２】
[0046]「２次放出」又は「２次電子放出」（ＳＥＥ）は、十分なエネルギーを有する１次入射粒子が、表面にぶつかったとき又はある材料中を通過したときに、電子などの２次粒子の放出を誘発する現象である。
【００３３】
[0047]「活性領域」は、本発明の検出器の領域であって、分子を受け取り、表面に衝突した分子の運動エネルギーを変換してフォノンを生成する能力を有する領域を指す。
【００３４】
[0048]「フォノン」は、結晶格子内の原子の振動に起因する振動エネルギーの単位を指す。
【００３５】
[0049]「半導体」は、非常に低い温度では絶縁体だが、約３００ケルビンの温度ではかなりの導電性を有する材料を指す。本説明では、用語「半導体」の使用法が、マイクロエレクトロニクス及び電気デバイスの分野におけるこの用語の使用法と矛盾しないことが意図されている。本発明において有用な半導体は、シリコン、ゲルマニウム、ドープされたダイヤモンドなどの元素半導体、及び化合物半導体を含むことができ、化合物半導体には、ＩＶ族化合物半導体、例えばＳｉＣ及びＳｉＧｅ、ＩＩＩ−Ｖ族半導体、例えばＡｌＳｂ、ＡｌＡｓ、Ａｌｎ、ＡｌＰ、ＢＮ、ＧａＳｂ、ＧａＡｓ、ＧａＮ、ＧａＰ、ＩｎＳｂ、ＩｎＡｓ、ＩｎＮ及びＩｎＰ、ＩＩＩ−Ｖ族３元半導体合金、例えばＡｌｘＧａ１−ｘＡｓ、ＩＩ−ＶＩ族半導体、例えばＣｓＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＯ、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ及びＺｎＴｅ、Ｉ−ＶＩＩ族半導体であるＣｕＣｌ、ＩＶ−ＶＩ族半導体、例えばＰｂＳ、ＰｂＴｅ及びＳｎＳ、層半導体（ｌａｙｅｒ  ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）、例えばＰｂＩ２、ＭｏＳ２及びＧａＳｅ、酸化物半導体、例えばＣｕＯ、Ｃｕ２Ｏなどがある。用語「半導体」は、真性半導体、及び所与の用途又はデバイスに対して有用な有益な電気特性を与えるために、選択された１種又は数種の材料でドープされた外因性半導体を含み、外因性半導体は、ｐ型ドーピング材料を有する半導体及びｎ型ドーピング材料を有する半導体を含む。用語「半導体」は、半導体及び／又はドーパントの混合物を含む複合材料を含む。
【００３６】
[0050]本発明の正確な性質を十分に説明するため、以下の説明では、本発明の装置、装置構成要素及び方法の多数の特定の詳細を示す。しかしながら、これらの特定の詳細が与えられなくとも本発明を実施することができることは、当業者には明白である。
【００３７】
[0051]図１は、オリゴヌクレオチド標準試料の等モル混合物を使用して従来の装置によって得た代表的な質量スペクトルを示す。このスペクトルは、分子の質量が増大するにつれて信号強度が低下することを示している。従来の装置は、１００個未満のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドまでに限定され、より一般的な限界は５０ヌクレオチドである。他の分子の質量を増大させたときの結果も、この結果と同様である。本発明は、大きな分子及び小さな分子の検出を可能にする、分子が検出器の表面に衝突したときの分子の運動エネルギーを利用する。図７〜１０に示すように、本発明の検出器を使用して、ウシインスリン（約５，７３３Ｄａ）、アンギオテンシン（約１，２９６Ｄａ）、シトクロムＣ（約１２，３６２Ｄａ）などの大きなペプチドを含む広範囲のタンパク質／ペプチドを分析した。
【００３８】
[0052]本発明の検出器１の基本設計及び動作原理を図２及び３に示す。ある半導体構造物から、薄い半導体膜２（厚さが１０ナノメートル〜３００ナノメートルであることが好ましい）を機械加工によって得る。膜２の外面４は、イオン加速器、フライトチューブなどの分子源１６から分子を受け取るように配置される。半導体膜２の内面７は、膜２の外面４に分子が衝突したときに電子８（図３に示されている）を放出する電子放出層３を備える。薄い保護層１０、一般に薄い金属層が外面４を覆ってもよい（図３に示されている）。半導体膜は例えば、３０ナノメートルの金の保護層が外面に配置され、電子放出層の働きをする１５ナノメートルの金層が内面に配置された１００ナノメートルのＳｉＮｘ層を備えることができる。電子の放出は、図３に示された３０ナノメートル層、すなわち上記表記によれば外面から始まる。半導体膜２は、上検出器ホルダ１７及び下検出器ホルダ１８によって支持される。半導体膜２は、テフロンなどの不活性スペーサ１９を利用して、放出層３のすぐ近くに電極９を配置することができる。
【００３９】
[0053]放出層３からの電子８の放出は、分子の衝突の強さ、すなわち分子の移動した運動量、したがって分子のエネルギーに比例する。放出された電子８は、ゲーティング電極９によって加速され、電子検出器５によって集められる。電子検出器５は任意選択で、標準マルチチャンネルプレート（ＭＣＰ）１１及び電子８を検出するアノード１４を含む。電子８はＭＣＰの入力層１２と接触し、それにより、電子８を増幅するＭＣＰの出力層１３によって追加の電子が放出される。
【００４０】
[0054]アノード１４は、図４に示されているように、オシロスコープ１５の部分とし、又は電子の存在を検出し、表示することができる他の装置の部分とすることができる。加速された荷電分子は半導体膜２に衝突し、それらの分子の運動量が、フォノン支援トンネリングによる放出層３からの電子の放出を誘発する。ここで、この検出器は、フォノンを直接に検出することによって分子の質量（ｍ）を分解する能力を有するが、イオン化された分子の荷電状態又は原子価（ｚ）をサンプリングすることもできることを強調しておく。
【００４１】
[0055]タンパク質などの分子は半導体膜２の外面４に衝突し、弾道フォノン及び非弾道フォノンを励起する。分子が膜２にぶつかると、その分子が獲得したエネルギーの一部は分子内の構造変化に消費され、そのエネルギーの約半分は、膜内においてフォノンを励起する。その分子が荷電分子である場合には、検出器１によってその電荷を検出することを予想することもできる。図５に示すように、検出器１は、半導体膜２及び放出層３をそれぞれが有する複数の活性領域２１を有する基板２０を備えることもできる。
【００４２】
[0056]検出器１は、図６に示したシステムのような質量分析システムに組み込まれていることが好ましい。質量分析計の真空中に大きな分子を導入することができる主な方法は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）とマトリックス支援レーザ脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）の２つである。ＭＡＬＤＩの利点は、分析物の主に１価の分子イオンを生成し、したがって混合物の分析に比較的によく適している点である（１成分あたりのピークが１つであり、それにより容易に解釈可能な単純な質量スペクトルが得られる）。ＥＳＩは、ＭＡＬＤＩよりも穏やかで、一般にＭＡＬＤＩよりも正確な質量を与えるイオン生成プロセスだが、さまざまな荷電状態にあるイオンの複雑な分布を与える特性を有し、したがって、多くの成分を含む混合物の分析には適さないことが広く知られている（１成分あたり多数のピークが生じ、それにより「スペクトルの密集（ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｃｏｎｇｅｓｔｉｏｎ）」が起こる）。
【００４３】
[0057]飛行時間（ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ）（ＴＯＦ）分離は、確立された質量選択技法であり、タンパク質を分離する目的に使用することができる。およそＶ＝２０〜３０ｋＶのＤＣ電圧中で、帯電したタンパク質を、Ｅｅｌ＝ｑＶ＝ｚｅＶのエネルギーまで加速させ、開口を通してＴＯＦ室内へ入れる（ｅは電気素量である）。この室内で、運動エネルギーＥｅｌ＝Ｅｋｉｎ＝ｍｖ２／２に基づいて質量分離が起こり、この分離が、質量に依存した飛行時間ｔ＝ｄ／ｖ＝ｄ（ｍ／２ｑＶ）１／２＝ｄ／（２ｅＶ）１／２（ｍ／ｚ）１／２＝ｋ（ｍ／ｚ）１／２を与える。ｄは移動距離、ｋ＝ｄ／（２ｅＶ）１／２は換算係数（ｓｃａｌｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）である。この方法によって分離が起こり、最も小さな粒子が最初に通過し、最も大きな分子が最も遅く通過する。加速電圧及びＴＯＦ室の長さを変更することによって分解能を向上させることができる。大きなタンパク質の質量分析には、長さがおよそｄ＝１〜２ｍのＴＯＦ室で十分である。分子の質量は、ｔを測定することによって得ることができる。質量分析では、分解能がｍ／Δｍと定義される。上記の式から、下式のようになることが分かる。
ｍ／Δｍ＝ｔ／（２Δｔ）  
【００４４】
[0058]この単純な式は、特定のイオンの到着時間の均質性を高めれば高めるほど、及びタイミング測定を正確にすればするほど、他のイオンからそのイオンの質量を分解する能力が大きくなることを示している。したがって、測定される量は、時刻ｔの後に到着した特定の分子の電荷である。取り扱わなければならない時間は一般に、数マイクロ秒〜数百マイクロ秒程度である。
【００４５】
[0059]この電子検出器は、当技術分野で知られている任意の装置とすることができ、任意選択で、半導体膜によって放出された電子を、マイクロチャンネルプレート（ＭＣＰ）を使用するなどによって増幅する。マイクロチャンネルプレートは、小型のチャンネル型電子倍増管の平行アレイからなる。チャンネルの直径は一般に１０〜１００ミクロンの範囲にあり、チャンネルの長さは約１ｍｍである。チャンネルはそれぞれ連続ダイノード構造として動作し、このことは、それぞれのチャンネルが、そのチャンネル自体のダイノード抵抗器鎖の働きをすることを意味する。それぞれのチャンネルの両端間に１〜２ｋＶの電位を与える。高エネルギーの分子がチャンネルの低電位端に入り、チャンネルの壁をたたくと、壁は２次電子を生成し、生成された２次電子は電界によってチャンネルに沿って加速される。次いで、これらの電子が壁をたたき、より多くの電子を発生させる。チャンネルの高電位端から２次電子が現れるまで、このプロセスが何度も繰り返される。大まかに言うと、１つの分子がカスケードを開始するごとに１０４個の電子がチャンネルから出現し、これによりかなりの利得、したがって単一の分子を検出できる能力が得られる。
【００４６】
[0060]離散ダイノード検出器及び連続ダイノード検出器はともに、２次電子放出（ＳＥＥ）に依存して動作する。２次電子放出は、１０〜数１０００電子ボルトの範囲のエネルギーを有する分子又は電子によって、表面が、真空中で衝撃を受けたときに起こる。大部分の材料について、それぞれの１次電子によって生成される２次電子の数は０．２〜３個の間にある。生み出される電子の平均数に対応するこの数は、２次放出係数（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）として知られている。一般的な離散ダイノード検出器は、最高１６個の段（ダイノード）を使用する。このシステムによる全利得は１０８に達しうる。それぞれのダイノードの電位は抵抗分圧器によって確立される。或いは、高い繰返し率で使用されているときに迅速に電子を補給するため、それぞれのダイノードを、対応するそれぞれの外部回路に接続してもよい。一方、連続ダイノード検出器は、検出器全体の両端にこの電位を与えることができるような態様で、高抵抗性の材料に依存する。
【００４７】
[0061]単一の分子を検出する能力を有するように、所与の種類の分子に対して、ＭＣＰの感度を非常に高くすることができる。ＭＣＰの面積を大きくすることができ、このことは、前述のような多数のイオンの分析に対して理想的である。最後に、それらのイオンは、数ナノ秒程度の非常に速やかな立上り時間を示す。
【実施例】
【００４８】
[0062]放出層として機能する薄い金層を有するＳｉ及びＳｉＮの半導体膜を使用して、タンパク質及び他の大きな分子用の活性検出器を形成した。それらの検出器を、従来の質量分析用のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦシステム内に取り付けた。それらの検出器はＭＣＰ（マルチチャンネルプレート）を含む。分子は脱離、イオン化され（ＭＡＬＤＩ法）、ビームライン中で加速され（ＴＯＦ構成）、膜の外面と接触する。分子の運動エネルギーＥｋｉｎ＝１／２ｍｖ２は、裏面から前面へ伝わる移動する振動量子（フォノン）の発生によって、膜へ移動する。前面で、振動エネルギーは再び移動するが、そのときには、表面の薄い放出層からの電子の放出をサポートする。放出層の金属は、従来の電界放出の開始電圧よりもわずかに低い電圧に電圧バイアスされる。イオンの検出を示す後述の実験は、特に明示しない限り、室温で実行した。
【００４９】
実施例１
[0063]図１２に、本発明の検出器の測定値の概要を、標準ＭＣＰ検出器との比較で示す。２つのデータトレースが示されている。１つは、従来のＭＣＰ検出器のデータトレース（ＭＣＰとして示されている）、もう１つは、ＭＣＰを備えた本発明の膜−検出器を使用したデータトレース（検出器＋ＭＣＰとして示されている）である。示されているとおり、これらの検出器はともに、２３マイクロ秒付近に最も顕著なピークを有する同じピーク構造を示す。このピークは、この特定のケースにおいて試験試料として使用した分子（アンギオテンシン）に由来するピークである。この分子は負に帯電しており、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦユニット内で加速され、次いで２３マイクロ秒間移動した後、検出器に衝突する。より短い時間尺度において出現するより小さなピークは、いわゆるマトリックス、すなわちアンギオテンシンを調製する際に使用した溶液中で使用された分子である。
【００５０】
[0064]より詳細に検討すると、膜検出器自体の概念を示すものの他に、注目に値する点がいくつか見つかる。第１に、半導体膜検出器−ＭＣＰシステムの背景ドリフトは、従来のＭＣＰのドリフトよりもはるかに低い。第２に、膜検出器−ＭＣＰシステムの雑音は従来のＭＣＰ検出器の雑音よりも低く、さらに改善することができる（バイアス条件の最適化及び電界放出の調整）。最後に、これが最も重要な点だが、ＭＣＰ検出器とは違い、膜検出器−ＭＣＰシステムの質量範囲には制限がない。これは、半導体膜のエネルギー変換機構に起因する。半導体膜は最初に、運動エネルギーの大部分を主として膜内の格子振動に変換し、次いで電界放出障壁を横切って電子を「蹴り出す」。放出された電子は次いで、膜に挟み込まれたＭＣＰによって倍加される。最後に、熱によって励起された分子、すなわちＤＣ電界を使用せずに励起された分子を使用して伝播を生み出すことによって、膜検出器−ＭＣＰシステムは、いわゆる中性分子、すなわち帯電していない分子又はＭＡＬＤＩではイオン化することが困難な分子を調べることもできることを指摘しておかなければならない。この膜検出器−ＭＣＰシステムが、タンパク質の質量分析の分野、したがってプロテオミクスの分野に可能な大きなインパクトを与える非常に感度の高い広範囲の分子検出方式を利用可能にすることは明らかである。
【００５１】
実施例２
[0065]この検出機構は、全体を３つの異なる事象に分けることができ、それらはすなわち（ａ）（荷電タンパク質などの）分子の衝突、（ｂ）半導体膜内における弾道フォノン又は非弾道フォノン（例えば音響フォノン）の発生、最後に（ｃ）フォノン支援トンネリングを介した放出層からの電子の放出、である。バイアス条件並びに検出器の詳細な機械的及び電子的構造によっては、単一の電子を発生させることができるだけでなく、多数の電子を発生させることも可能である。すなわち、この装置は大きな利得で動作することができる。続いて、発生させた電子を、従来のＭＣＰ電子検出器又は蛍光スクリーンによって検出した。励起されたフォノンのエネルギーは、質量、したがって分子が移動させた運動量に比例する。このことは、衝突のエネルギー、したがって励起されたフォノンのエネルギーに比例する加速された質量が測定されたことを保証する。
【００５２】
[0066]ある簡単な方法では、タンパク質の全エネルギーが、ＭＡＬＤＩユニットのＤＣ電界中でタンパク質が獲得するエネルギーによって決定される。これは、タンパク質の運動エネルギーＥ＝１／２ｍｖ２に帰着する。この場合も、ｍはタンパク質の質量、ｖはタンパク質の最終速度である。これは、検出器内で励起されているフォノンの最大エネルギー量を与える。ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ室内における通常の加速電圧は１０ｋＶ程度であり、これにより、フォノンの振動数は３０００ＰＨｚ程度になる。ＥＤＣ−ｆｉｅｌｄ＝１．２４ｅＶ程度のより穏やかな加速エネルギーに関しても、可能なフォノンエネルギーが依然として非常に高く、およそＥｐｈ＝ｈ×３００ＴＨｚである（通常通り、ｈはプランクの量子を表す）。電界によって供給されるエネルギーは、検出器の可能な励起の上限となる。荷電分子は、室温において弾道フォノンを励起させるのに十分な大きさの大きなエネルギーで膜の外面に衝突する（室温における熱エネルギーは、式Ｅｔｈｅｒｍａｌ＝ｋＢＴ＝ｋＢ（３００Ｋ）＝２６ｍｅＶ＝ｈ（６ＴＨｚ）によって簡単に与えられる。ｋＢはボルツマン定数を表す）。
【００５３】
[0067]標準ＭＣＰシステムなどの古典的な固体検出器とは対照的に、本発明の検出器は注目に値する薄さを有する（半導体膜の厚さは５０〜３００ナノメートルの間であることが好ましい）。このことは、加速されたタンパク質などの粒子の衝突によって発生した機械的な振動（フォノン）が、古典的な熱量測定検出器の場合のように低エネルギーのフォノンに完全に熱化されることなく、好ましくも、高エネルギーの弾道フォノンとして伝達されることを保証する（「弾道」は、フォノンが散乱することなく伝わることを意味する）。数ＴＨｚのエネルギーを有する励起されたフォノンは、膜を貫いて伝わり、続いて放出層に入り、そこで、真空中への電子の放出を誘発する。Ｓｉ及びＳｉＮ中でのフォノンの平均自由行程は室温において３００ナノメートル程度であるため、この弾道フォノン伝播の仮定は、十分に薄い膜に対して正当化される。数十ｅＶ（これは数１００ＴＨｚに相当する）の一般的な衝突エネルギーは、フォノン及びそれに続く放出層からの電子を励起する十分なエネルギーを与える。
【００５４】
実施例３
[0068]サンプルの製造は、光リソグラフィ、材料のドーピング、並びにウェット及びドライエッチングステップを含む標準半導体処理ステップに基づくが、他のプロセスを使用することもできる。処理は、シリコンオンインシュレータ（ＳＯＩ）ウェーハから始まる。Ｓｏｉｔｅｃ  Ｃｏｒｐ．及びＵＷ−Ｍａｄｉｓｏｎの共同研究者を通して、特別に成長させたウェーハを受け取った。このＳＯＩウェーハの上面のシリコン層にドーピングを施し、又は、高濃度のｎ型及び／又はｐ型ドーピングを実施するためにウェーハを外部機関に送った。光リソグラフィの最初のシーケンスにおいて、金属リード線を画定し、後続のエッチングステップ用にウェーハの両面を処理した。シリコン又は窒化シリコンから製作された自立膜を画定するため、ＫＯＨウェットエッチングステップを使用した。これは、ウェーハの裏面から窓を開け、薄膜〜超薄膜だけを残す。
【００５５】
[0069]このような非常に薄い膜（２００ｎｍ）の一例が図５に示されており、この例では、ウェーハ全体の処理が使用されている。示されているように、図５の膜（９つの正方形）は半光透過性である。現在、この膜材料は、シリコン、窒化シリコン又はシリコン−ゲルマニウムヘテロ構造（ＳｉＧｅ）から製作することができる。膜内のひずみは、ＳｉＧｅ構造の層厚及び組成を調整することによって処理した。最後に、光／電子ビームリソグラフィと反応性イオンエッチング装置（ＲＩＥ）内でのドライエッチングとの組合せによって、膜の上面にパターンを形成した。現在、電子ビームリソグラフィでは、２インチウェーハ上に、３０ナノメートルという小さなフィーチャを画定するができる。
【００５６】
[0070]シリコン及び他のＩＶ族元素を使用する他に、ドープされたダイヤモンド−オン−ＳＯＩ出発材料から膜を製造することもできる。ダイヤモンドの明白な利点は、電子の電界放出に必要なエネルギーが極めて低いこと、及びその機械強度である。このことは、より低い動作電圧を使用することを可能にし、膜サイズを増大させる。
【００５７】
実施例４
[0071]原型検出器を試験するため、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦシステムを図６に示すように構成した。このシステムは、当技術分野で知られている以下のような関連構成要素を含む：真空室、ポンプ、ＭＡＬＤＩ用のレーザ、測定コンピュータ、ＭＣＰ、蛍光スクリーン及び読出し用の高分解能ＣＣＤカメラ。検出するフォノンのエネルギーは数十ＴＨｚ程度であり、Ｅｔｈ＝ｈ×６ＴＨｚである対応する室温におけるエネルギーよりもはるかに大きいため、本発明の検出器の動作原理は低温を必要としない。それにもかかわらず、この構成に「コールドフィンガ（ｃｏｌｄ  ｆｉｎｇｅｒ）」を組み込んだ。このユニットは、温度を４Ｋまで低下させることを可能にする。したがって測定ユニットは極めて柔軟であり、幅広い温度範囲にわたって検出器性能に関する情報を供給することができる。さらに、この構成のＴＯＦユニットには光学窓が組み込まれている。この窓は、半導体膜への光学的アクセスを可能にし、レーザ照射による電子の発生をサポートする。別の光学ポートが膜の裏面へのアクセスを与え、レーザ熱パルスによる検出後に、削摩されたタンパク質を除去することを可能にする。
【００５８】
[0072]イオン化されたタンパク質を用いた測定を実施するため、伝統的なＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ検出を使用した。すなわち、分子をイオン化し、飛行時間によって判定される分子の衝突を検出した（分子の電荷の検出を観察するＴＯＦモード検出器）。その後、衝突した分子がフォノンを発生させ、発生したフォノンが電子を放出させる、フォノン検出用のＴＯＦモードを使用する。次いで、これらの２つの方法（電荷及び質量の検出）を結合し、等モル試験溶液（質量既知のより大きなペプチド）の助けを借りて較正する。最後に、放出される電子の数が、励起されたフォノンのエネルギー、したがって分子の質量に比例する、「エネルギー分解モード」を使用する。
【００５９】
[0073]図７は、本発明の検出器を使用して得たアンギオテンシンの質量スペクトルを示す。同様に、図８及び９は、本発明の検出器を使用して得たウシインスリンの質量スペクトルを示し、図１０は、本発明の検出器を使用して得たシトクロムＣの質量スペクトルを示す。図１１は、本発明の検出器を使用して得たインスリンからの飛行時間スペクトルを示す。図９は、他の図に示された信号よりも低い分解能（ｍ／Δｍ＝８２．７２２）を有する検出器信号を示しているが、より低い分解能であっても、この検出器は依然として、ウシインスリン分子を検出することができる。イオンが検出器に直接にぶつかるように、図９の膜は部分的に破断している。この図は、分解能を比較する役目を果たし、この低い質量範囲においてもこの検出器が依然として有効でありえることを強調している。図７、８及び１０は、一般的なＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＣＰ構成よりも桁違いに優れた分解能（ｍ／Δｍは２，５００、９，０００及び１０，０００よりも大きい）を有する本発明の真の可能性を示す。これらの図に示された２つのピークは、膜内における音響フォノンの２つの異なる縦偏極に起因する。音響フォノンの線形分散関係に関して予想されるとおり、相対的なピーク間距離は、質量が大きくなるにつれて増大する。
【００６０】
[0074]この検出器を用いたタンパク質の検出は、タンパク質が膜にぶつかることによって起こる弾道フォノンの励起に依存し、この励起は、フォノン支援トンネリング（ｐｈｏｎｏｎ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｔｕｎｎｅｌｉｎｇ）（ＰＡＴ）を引き起こし、その結果、放出層の電子が真空中へ放出される。これらの電子は、ＭＣＰ及び蛍光ディスプレイによって検出され、蛍光ディスプレイは、大規模な膜検出器領域からのリアルタイム検出を可能にする。シリコン膜及び窒化シリコン膜でできた半導体膜は受動膜を構成する。埋め込まれたｐｎ接合を形成し、又はヘテロ構造が埋め込まれた膜を使用したドープされたシリコンから膜を製作すると、活性利得が達成される。
【００６１】
実施例５
[0075]一連の実験において、タンパク質の質量を決定するための検出器膜に対する測定が、以下に詳述するある特定の動作モードを指示した。厚さ４５ｎｍの半導体膜（窒化シリコン製）並びに前面及び裏面の薄い金属層（約２０〜４０ｎｍ）を電気的及び機械的にバイアスして、電界放出を、膜の振動を検出する手段として使用することができるようにする。電気的にバイアスするとは、膜と（検出器の裏面、すなわちタンパク質の衝撃にさらされる面ではないほうの面の）格子電極の間の電圧を１００〜２０００Ｖの範囲に設定することを指す。機械的にバイアスするとは、ホルダ内の検出器チップ全体を締めつけることを指し、機械的圧力の増大は膜の膨れ（ｂｕｌｇｉｎｇ）につながる。これらの２つのバイアス方式を用いて、挟み込まれたＭＣＰ電子増幅器内に低い電界放出電流が見られる動作点まで、検出器を持っていく。
【００６２】
[0076]ここで説明する検出機構の決定的に重要な点は、膜が、低変位の機械的振動を行っている点である。これらの振動の振動数は、膜の横方向のサイズ及び材料の弾性定数によって決定される。詳細には、締めつけられた長方形の膜の基本振動数を用いて、この振動数を以下のように推定することができる。
ｆ＝（１／２）Ｃ＿ｓ＼ｓｑｒｔ｛（ｎ／ａ）＾２＋（ｍ／ｂ）＾２｝
上式で、Ｃ＿ｓは音速、ａ及びｂは辺の長さであり、ｎ及びｍは特定のモード数を与える（ベースモードはｎ＝ｍ＝１）。この場合、４〜２０ＭＨｚの範囲の振動数が得られた。
【００６３】
[0077]タンパク質が検出器膜にぶつかると、そのタンパク質は、基本機械膜モードの大振幅の振動を引き起こす。これらの振動はＭＣＰ電流中に現れる。１価のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ１＋）及び２価のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ２＋）を使用した図１３に示されているように、実際の検出モードでは、小振幅の振動が急激に強化される。タンパク質の質量及び／又は数によって、これらの振動の緩和時間は変化する（図１４参照）。例えば、タンパク質ＢＳＡ１＋の質量とＢＳＡ２＋の質量は同じだが、２価のＢＳＡタンパク質の総数は、１価のＢＳＡのそれよりもはるかに少ない。これは、この構成で使用されるＭＡＬＤＩプロセスに起因する。バイアス点では、（調整することができる）「暗電流」が存在する。タンパク質が膜にぶつかると、この特定の電流は振動し始める。この振動の振動数は上記式に従う。図１５に示すように、異なる質量（スペクトルのピーク）に対して、上記の仮定を強調する同一の振動が観察された。変調振幅は粒子運動量ｐ＝ｍｖの関数である。この式で、ｍはタンパク質の質量、ｖはタンパク質の速度である。さらに、この信号は、膜にぶつかっているある質量のタンパク質の数Ｎに依存する。したがって、膜振動の全振幅はＮｐに比例する。このことが、さまざまなピークからの振動緩和時間を比較した図１６に示されている。
【００６４】
[0078]以上に、明瞭に理解できるように図解及び例によって、本発明を、ある程度詳細に説明したが、当業者には、本発明又は本発明の特定の実施形態の範囲に影響を及ぼさない広範囲にわたる等価の条件、組成及びその他のパラメータの範囲に含まれる改変又は変更を本発明に加えることによって、本発明を実施することができること、並びにそのような改変又は変更は、添付された特許請求の範囲に包含されることが意図されていることが明白である。
【００６５】
[0079]本発明を実施する際には、特に例示したもの以外の出発材料、試薬、精製法、材料、基板、装置要素、分析法、検定法、成分の混合物及び組合せを、過度の実験に頼ることなく使用することができることを当業者は理解するであろう。このような材料及び方法の当技術分野で知られている機能的等価物は全て、本発明に含まれることが意図されている。使用した用語及び表現は、説明のための用語として使用したものであり、限定のための用語として使用したものではなく、このような用語及び表現の使用が、示し、説明した特徴物の等価物又はそれらの特徴物の一部分の等価物を排除する意図はなく、請求した発明の範囲内においてさまざまな改変が可能であることが理解される。したがって、本発明は特に、好ましい実施形態及び任意選択の特徴物によって開示されているが、本明細書に開示された概念の修正及び変更を、当業者に委ねることができること、並びにこのような修正及び変更は、添付された特許請求の範囲によって定義された本発明の範囲に含まれるとみなされることを理解すべきである。
【００６６】
[0080]本明細書で使用されるとき、「〜を備える、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「〜を含む（ｃｏｎｔａｉｎｇｉｎｇ）」又は「〜を特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ）」と同義であり、包括形式又は開放形式であり、列挙されていない追加の要素又は方法ステップを排除しない。本明細書で使用されるとき、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、特許請求の範囲に指定されていない要素、ステップ又は原料成分を排除する。本明細書で使用されるとき、「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、特許請求の範囲の基本的特性及び新規の特性にあまり影響を及ぼさない材料又はステップを排除しない。本明細書中のそれぞれの場合に、用語「〜を備える、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」及び「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」はいずれも、残りの２つの用語のいずれとも置き換えることができる。
【００６７】
[0081]一群の材料、組成物、成分又は化合物が本明細書に開示されているときには、それらのグループの個々のメンバ及びそれらのグループのサブグループが全て、別個に開示されていることが理解される。本明細書でマーカッシュ（Ｍａｒｋｕｓｈ）グループ又は他のグループ化が使用されているとき、そのグループの個々のメンバ並びにそのグループの可能な組合せ及び副組合せ（ｓｕｂｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）は全て、本開示に個別に含まれることが意図されている。特に明記しない限り、本明細書に記載され、例示された成分のあらゆる組成又は組合せを使用して本発明を実施することができる。本明細書中に範囲、例えば温度範囲、時間範囲又は組成範囲が与えられているときには、全ての中間範囲及び部分範囲、並びに与えられた範囲に含まれる全ての個別値が、本開示に含まれることが意図されている。本開示及び特許請求の範囲では、「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」が、「さらに」、又は「或いは」を意味する。また、単数形での用語の使用は複数形をも包含する。
【００６８】
[0082]本明細書に引用された参照文献は全て、本明細書の開示と矛盾しない程度に、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書に引用された一部の参照文献は、出発材料、追加の出発材料、追加の試薬、追加の合成法、追加の分析法、追加の生体物質、追加のペプチド、化学的に修飾されたペプチド、追加の細胞及び本発明の追加の使用の出所に関する詳細を提供するために、参照によって組み込まれる。本明細書に使用された見出しは全て、単に便宜的に付けられたものである。本明細書において言及された全ての特許及び公表物は、本発明が属する技術分野の技術者の技能レベルを指示し、それらの特許及び公表物は、それぞれの個々の公表物、特許又は特許出願が、参照によって組み込まれると具体的または個別に指示されたとの同じ程度に、参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書に引用された参照文献は、その公表日又は出願日における技術水準を指示するために、その全体が参照によって本明細書に組み込まれており、必要ならば、この情報を本明細書で使用して、先行技術に含まれる特定の実施形態を排除することができることが意図されている。例えば、組成物が請求されているときには、本明細書に引用された参照文献中に実施可能な程度の開示がなされた化合物を含む、本出願人の発明よりも前に当技術分野において知られており、使用可能な化合物は、本明細書の組成物請求項に含まれることが意図されていないことを理解すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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