(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｓｉＲＮＡと、一般式(Ｉ) ：
Ａ−Ｙ−Ｌ         (Ｉ) 
で示されるトランスフェクション用化合物またはその塩、異性体もしくはそれらの混合物、とを含む組成物。
上記式中、
・Ａは４, ５−二置換２−デオキシストレプタミン環の種類のアミノグリコシドを意味し、
・Ｙはスペーサーを意味し、そして
・Ｌは下記のいずれかの基を意味する：
−(Ｒ１) Ｒ２基（式中、Ｒ１およびＲ２は互いに独立して、水素原子もしくは脂肪性脂肪族鎖を意味するか、またはＲ１もしくはＲ２の一方は存在せず、ただしＲ１とＲ２の少なくとも一方は脂肪性脂肪族鎖を意味する）、または
−Ｎ−Ｒ３もしくは−Ｏ−Ｒ３基（式中、Ｒ３はステロイド誘導体を意味する）。
【請求項２】
前記４, ５−二置換２−デオキシストレプタミン環の種類のアミノグリコシドＡが、パラモマイシン、ネオマイシン、およびリボスタマイシンから選ばれる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
スペーサーＹが、炭素数１〜６のアルキル官能基、ケトン官能基、エステル官能基、エーテル官能基、アミノ官能基、アミド官能基、アミジン官能基、カルバメート官能基、チオカルバメート官能基、グリセロール、尿素、チオ尿素、および芳香環から選ばれた少なくとも１種の化学官能基から構成される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
スペーサーＹが次式で示される基から選ばれる、請求項３に記載の組成物：
−Ｃ(Ｏ)−；
−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ2−ＣＨ2−；
−Ｗ−(ＣＨ2 −) k−Ｗ'−；および
−(ＣＨ2−) i −Ｗ−(ＣＨ2−) j −。
上記式中、ｉ，ｊおよびｋは１〜６（両端を含む）から選ばれた整数であり、ＷおよびＷ' は互いに同一でも異なっていてもよく、それぞれケトン官能基、エステル官能基、エーテル官能基、アミノ官能基、アミド官能基、アミジン官能基、カルバメート官能基、チオカルバメート官能基、グリセロール、尿素、チオ尿素、および芳香環から選ばれた基である。
【請求項５】
Ｌが−(Ｒ１) Ｒ２基を意味し、少なくとも１種の脂肪性脂肪族鎖が炭素数１０〜２２の飽和または不飽和アルキル基から選ばれる、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
Ｌがジミリストイル、ジオレイルおよびジステアリルから選ばれる、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記トランスフェクション用化合物が下記から選ばれる、請求項１に記載の組成物：
【化２−１】
0005407862.tif 000005
【化２−２】
0005407862.tif 000006
【化２−３】
0005407862.tif 000007
【請求項８】
少なくとも１種のアジュバントをさらに含有する、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
前記少なくとも１種のアジュバントが、脂質、ペプチド、タンパク質およびポリマーの少なくとも１種である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記少なくとも１種のアジュバントが中性脂質から選ばれる請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記中性脂質が、両性イオン性または生理条件下でイオン性電荷を失う天然および合成脂質から選ばれる、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記中性脂質がジオレイルホスファチジルエタノールアミン、オレイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイル−、ジパルミトイル−およびジミリストイル−ホスファチジルエタノールアミン類、ならびに１〜３回Ｎ−メチル化されたそれらの誘導体、さらにはホスファチジルグリセロール類、ジアシルグリセロール類、グリコシルジアシルグリセロール類、セレブロシド類、スフィンゴ脂質類、アシアロガングリオシド類、ジオレイルホスファチジルコリン、ならびにコレステロールから選ばれる、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
細胞外または細胞内標的化エレメントをさらに含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
前記標的化エレメントが、糖、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、脂質、神経メディエータ、ホルモン、ビタミン、およびそれらの誘導体から選ばれる、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記標的化エレメントが、請求項１に記載のトランスフェクション用化合物またはｓｉＲＮＡのいずれかに共有結合している、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
注射用処方組成物に対して薬学的に許容される賦形剤をさらに含有する請求項１〜１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
皮膚および／または粘膜への投与に対して薬学的に許容される賦形剤をさらに含有する請求項１〜１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
被験者における標的遺伝子発現の阻害用の医薬品の製造のための、請求項１〜１７のいずれかに記載の組成物の使用であり、ここで、該組成物中に含まれるｓｉＲＮＡは該標的遺伝子に特異的に向けられる、前記使用。
【請求項１９】
下記工程を含む、ｓｉＲＮＡをin vitroで細胞内に移入する方法：
(１) 請求項１〜１７のいずれかに記載の組成物を用意し、そして
(２) 該細胞を前記組成物と接触させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｓｉＲＮＡとトランスフェクション用化合物（transfecting compound）とを含む組成物に関する。このトランスフェクション用化合物は、４,５−二置換２−デオキシストレプタミン環の種類のアミノグリコシド（アミノ配糖体）が、スペーサー分子を介して、一般式：−(Ｒ１)Ｒ２（式中、Ｒ１およびＲ２は互いに独立して、水素原子もしくは脂肪性脂肪族鎖を意味するか、またはＲ１もしくはＲ２の一方は存在せず、ただしＲ１とＲ２の少なくとも一方は脂肪性脂肪族鎖を意味する）または一般式：−ＯＲ３もしくは−ＮＲ３（式中、Ｒ３はステロイド誘導体を意味する）で示される脂質部分に結合されてなる。本発明はまた、これらの組成物のin vitroおよびin vivo用途にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ、RNA interference）は、転写後遺伝子サイレンシングプロセスとその後の細胞内での遺伝子機能の表現型分析による標的遺伝子発現のノックダウンのための強力で汎用されるツールとなってきた。ＲＮＡ干渉の機序を包含する治療手法も活発に研究されている。効率的な標的遺伝子ノックダウンを達成するには、特定の２１−２５二本鎖小分子干渉性ＲＮＡ（small interfering RNA）（ｓｉＲＮＡ）を細胞の細胞質区画（cytoplasmic compartment）内に導入しなければならない。
【０００３】
ｓｉＲＮＡの細胞内への導入にはいろいろな方法が使われてきた。その中でも、最も広く使用されているのは、９０年代にＤＮＡトランスフェクション用に既に開発されていた普通のカチオン性（陽イオン性）脂質の使用に基づく方法である。このカチオン性脂質は、ジオクタデシルジアンモニウムブロミド（ＤＯＤＡＢ）、もしくはジオレイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）のような第四級アンモニウム、またはジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）のようなポリカチオン、またはビス（グアニジニウム）−トレン−コレステロール（ＢＧＴＣ，トレン＝トリス(２−アミノエチル)アミン）のようなグアニジニウム残基を包含するカチオン性先端基（headgroup）に疎水性部分が連結した構造を有する。
【０００４】
他の種類のカチオン性脂質もＤＮＡトランスフェクション用に合成された。特に、一般式：Ａ−Ｙ−Ｌ（式中、Ａはアミノグリコシド、Ｙはスペーサー分子、そしてＬは脂質部分を意味する）で示される化合物がＵＳ２００３−００５４５５６Ａ１（ここに参考として援用、特許文献１）として公開された米国特許出願第１０／２２８９５９号に記載されている。これらのＤＮＡトランスフェクション用化合物の利点は、Sainlos et al, 2005 (非特許文献１)、Sainlos et al, 2004 (非特許文献２)、およびBelmont et al, 2002 (非特許文献３)においてもさらに確認されている。
【０００５】
通常はカチオン性脂質にジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）のようなコリピド（co-lipid）を会合させてリポソームを形成する。プラスミドＤＮＡとカチオン性先端基との間の静電的相互作用により粒子の生成を生ずるが、その粒子の構造は使用したコリピドおよびカチオン性リポソーム中のその割合に依存して、ラメラまたは六角形（ヘキサゴナル）になることが示された。
【０００６】
それにもかかわらず、ｓｉＲＮＡにより形成された複合体の構造上の特徴はなお未知であり、プラスミドＤＮＡにより観察された構造の妥当性は、ｓｉＲＮＡについては未だ解明されていない。また、ＤＮＡトランスフェクション用に開発されたカチオン性ベクターのすべてがｓｉＲＮＡ分子のような低分子量で特異的な化学構造の核酸の供給については必ずしも最適化されていない。
【０００７】
実際、ｓｉＲＮＡ分子は、ＤＮＡトランスフェクションに一般に使用されているＤＮＡとは非常に異なる非常に特異的な構造を示す。ｓｉＲＮＡは、両末端とも数個（通常は２個）のヌクレオチドの３'オーバーハング(張出し)を持つ短い（通常は２１〜２５ヌクレオチド）の二本鎖のＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。各鎖（ストランド）は５'リン酸基および３'ヒドロキシル（−ＯＨ）基を有する。天然ｓｉＲＮＡのこの非常に特異的な構造は、長いｄｓＲＮＡまたはヘアピンＲＮＡをｓｉＲＮＡに変換する酵素であるダイサーによる処理を受ける結果である。この特定の構造は、合成ｓｉＲＮＡについては保存されてきた。これに対して、トランスフェクションされたＤＮＡ分子は通常は特定の遺伝子を発現させるために使用される。これは、トランスフェクションされたＤＮＡ分子が、該遺伝子をコードする配列の他に、トランスフェクションされた細胞内への該遺伝子の発現を指令するための調節配列も含んでいることを意味する。トランスフェクションされたＤＮＡ分子は従って、２１〜２５ヌクレオチドの非常に短いｓｉＲＮＡとは異なり、一般に長い鎖長のＤＮＡ分子である。この非常に著しい構造上の差異によって、ある特定のトランスフェクション用化合物について、上記一方または他方の核酸カテゴリーとのトランスフェクション効率には著しい変化を生ずることがある。
【０００８】
また、ＤＮＡ発現ベクターとｓｉＲＮＡの活性は、標的細胞内にトランスフェクションされてしまうと、互いに完全に異なり、それぞれ別個の機序により媒介される。ＤＮＡ発現ベクターは遺伝子発現を生ずるように転写されなければならないのに対して、ｓｉＲＮＡは、本プロセスにおいて巻き戻しを行う、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれるエンドリボヌクレアーゼ含有複合体中に組み込まれ、その後、ｓｉＲＮＡ鎖がガイドとなってＲＩＳＣを相補的ＲＮＡ分子に導き、そこでｓｉＲＮＡは該同族ＲＮＡ（cognate RNA）を開裂して破壊し（エフェクター工程）、こうして特定の遺伝子発現を阻害する。同族ＲＮＡの開裂はｓｉＲＮＡ鎖が結合した領域の中央付近で起こる。ｓｉＲＮＡの作用機序は従って極めて複雑であり、ｓｉＲＮＡのための効率的なトランスフェクション用化合物は従って標的細胞へのｓｉＲＮＡの導入と効率的な干渉を可能にするための細胞内での機能性ｓｉＲＮＡの放出の両方を可能にすべきである。
【０００９】
構造および作用機序に関するｓｉＲＮＡの特殊性のため、ＤＮＡトランスフェクション用に最適化されたカチオン性脂質は、それらの一部はｓｉＲＮＡのトランスフェクションにいくらかの効率性を有するかもしれないが、すべてがｓｉＲＮＡトランスフェクションに適応させることはできないかもしれない。やはり、現在知られているトランスフェクション用化合物の大部分はＤＮＡトランスフェクション用に最適化されたものであり、ｓｉＲＮＡトランスフェクション用の最適化トランスフェクション用化合物を意図した研究は今なお多くはない。従って、高効率でｓｉＲＮＡをトランスフェクションするのに特化されたトランスフェクション用化合物が求められている。
【発明の概要】
【００１０】
本発明者らは、脂質性アミノグリコシド誘導体が示す哺乳動物細胞におけるｓｉＲＮＡ分子の導入と遺伝子発現のノックダウンの効力を調査した。我々は、スクシニル・スペーサーを介してジオレイル鎖に結合させたカチオン性先端基としてのアミノグリコシドの使用に基づいた新規なカチオン性脂質の合成に成功した。アミノグリコシド（アミノ配糖体）は６個までのアミノ基と多くのヒドロキシル基とにより修飾されたオリゴ糖からなり、従って多方面のポリカチオン性の基本作用を達成する。アミノグリコシドのグリコシド結合が持つ固有の融通性のために、ＲＮＡ分子と相互作用するように自身を再構築することができる。この群の化合物は、カナマイシン、トブラマイシン、ネオマイシンまたはパロモマイシンのように、二本鎖ＲＮＡの主溝、より一般的にはＡ型核酸と相互作用することが知られている種々のアミノグリコシドを用いてそのカチオン性先端基を修飾することができるという有利な可能性を提供する。
【００１１】
本発明者らは、脂質性アミノグリコシド誘導体とのｓｉＲＮＡ分子の複合体化は、プラスミドＤＮＡについて既に提案されているコロイド安定性の３段階モデルを支持するが、ｓｉＲＮＡの複合体は、グアニジニウム−コレステロール試薬と複合体化させたｓｉＲＮＡでみられたものより平均径がより小さく、かつより低い脂質性アミノグリコシド誘導体／ｓｉＲＮＡ電荷比に対する全ｓｉＲＮＡ捕捉を示すことを見出した。
【００１２】
我々はまた、脂質性アミノグリコシド誘導体／ｓｉＲＮＡ複合体が、極性先端基として使用したアミノグリコシドに応じて各種のモフォロジーを持った、自己集合型ＲＮＡ集中（self-assembled RNA-concentrated）粒子からなる特異的な構造を形成することも見出した。実際、４,６−二置換２−デオキシストレプタミン環の種類の脂質性アミノグリコシド誘導体は、脂質二重層とｓｉＲＮＡ分子との規則的な重ね合わせからなる通常の「タマネギ様」の構造を形成したが、４,５−二置換２−デオキシストレプタミン環の種類の脂質性アミノグリコシド誘導体は、予想外にも、小さな集中構造のブドウ様の異なる構造を形成した。
【００１３】
また、ＤＮＡトランスフェクション用に計画された脂質性アミノグリコシド誘導体およびカチオン性脂質によるin vitro遺伝子発現阻害の比較分析は、４,５−二置換２−デオキシストレプタミン環の種類の脂質性アミノグリコシド誘導体が標的細胞内への干渉機序を誘導するのに最も高い効率を有することを示した。実際、すべての脂質性アミノグリコシド誘導体およびＤＮＡトランスフェクション試薬ＢＧＴＣがいずれも高いｓｉＲＮＡ内部移行（内在化、internalization）を可能にしたが、標的遺伝子の高いｓｉＲＮＡ媒介ＲＮＡｉノックダウンが可能であったのは、予想外にも４,５−二置換２−デオキシストレプタミン環の種類のアミノグリコシド誘導体だけであった。この現象の理由はまだ解明されていないが、この種の脂質性アミノグリコシド誘導体／ｓｉＲＮＡ複合体の独特の構造がこれらの特定の化合物の著しく高い効率に関与しているのではないかと考えられる。
【００１４】
最後に、脂質性アミノグリコシド誘導体と市販のｓｉＲＮＡ導入用試薬によるin vitro遺伝子発現阻害の比較分析はまた、４,５−二置換２−デオキシストレプタミン環の種類の脂質性アミノグリコシド誘導体がｓｉＲＮＡ導入用に現在市販されている試薬に比べてｓｉＲＮＡ媒介ＲＮＡｉノックダウンについてより高い効率を示すことを実証した。
【００１５】
よって、効率的なＤＮＡトランスフェクションを媒介することが知られている脂質性アミノグリコシド誘導体の広い種類の中でも、本発明者らは、哺乳動物細胞内への効率的かつ機能的なｓｉＲＮＡの導入に特によく適している４,５−二置換２−デオキシストレプタミン環型の脂質性アミノグリコシド誘導体という新規な下位種類のものを同定した。
【００１６】
かくして、本発明は、ｓｉＲＮＡと、一般式(Ｉ)：
Ａ−Ｙ−Ｌ        (Ｉ)
で示されるトランスフェクション用化合物またはその塩、異性体もしくは混合物、とを含む組成物に関する。一般式(Ｉ)において、
・Ａは４,５−二置換２−デオキシストレプタミン環の種類のアミノグリコシドを意味し、
・Ｙはスペーサーを意味し、そして
・Ｌは下記のいずれかの基を意味する：
−(Ｒ１)Ｒ２基（式中、Ｒ１およびＲ２は互いに独立して、水素原子もしくは脂肪性脂肪族鎖を意味するか、またはＲ１もしくはＲ２の一方は存在せず、ただしＲ１とＲ２の少なくとも一方は脂肪性脂肪族鎖を意味する）、または
−Ｎ−Ｒ３もしくは−Ｏ−Ｒ３基（式中、Ｒ３はステロイド誘導体を意味する）。
【００１７】
本発明の目的にとって、用語「アミノグリコシド」（または「アミノシド」）とは、アミノシクリトール基のゲニンを一般には複数個の糖分子（その少なくとも１つはアミノ糖(オサミン)である）と化合させることにより形成される天然のヘテロシド(heteroside)を意味するものである。アミノグリコシド類はストレプタミンまたは２−デオキシストレプタミンをとりうる分子核と、この核に結合しているアミノヘキソースの両方において異なる構造をとりうる。現在使用されている大部分のアミノグリコシドは分子核として２−デオキシストレプタミンをとり、他方の環が結合する２−デオキシストレプタミン環ＩＩの位置に応じて、さらに次の２種類の下位種類に分けることができる：
・２−デオキシストレプタミン核が４位と５位において置換されている、４,５−二置換２−デオキシストレプタミン型アミノグリコシド、および
・２−デオキシストレプタミン核が４位と６位において置換されている、４,６−二置換２−デオキシストレプタミン型アミノグリコシド。
【００１８】
４,５−二置換型のものとしてはネオマイシン、パラモマイシン、およびリボスタマイシンが挙げられ、一方、４,６−二置換型のものとしてはトブラマイシン、カナマイシン、アミカシンおよびゲンタマイシンが挙げられる。
【００１９】
本発明に係る組成物のトランスフェクション用化合物は、上に定義したような４,５−二置換２−デオキシストレプタミン型アミノグリコシドである。それは、有利にはパラモマイシン、ネオマイシンおよびリボスタマイシンから選ばれ、好ましくはパラモマイシンおよびネオマイシンから選ばれる。或いは、代わりに任意の合成または半合成の上に定義されたような４,５−二置換２−デオキシストレプタミン型アミノグリコシドを使用してもよい。
【００２０】
本発明によると、用語「スペーサー」とは、アミノグリコシドもしくはそのポリグアニジル化誘導体と分子の脂質成分との間で結合を形成することができると共に、これら２成分の間の望ましくない相互作用を低減させるためにそれらを離間させることができる任意の化学基を意味する。従って、スペーサーは２官能性の化学基であり、それは、例えば、炭素数１〜６のアルキル、ケトン、エステル、エーテル、アミン、アミド、アミジン、カルバメートもしくはチオカルバメートの各官能基、グリセロール、尿素、チオ尿素または芳香環から選ばれた１または２以上の化学官能基から構成されうる。
【００２１】
例えば、スペーサーは次式で示される基から選ぶことができる：
−Ｃ(Ｏ)−；
−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ2−ＣＨ2−；
−Ｗ−(ＣＨ2−)k−Ｗ'−；および
−(ＣＨ2−)i−Ｗ−(ＣＨ2−)j−。
【００２２】
上記式中、ｉ，ｊおよびｋは１〜６（両端を含む）から選ばれた整数であり、ＷおよびＷ'は互いに同一でも異なっていてもよく、それぞれケトン官能基、エステル官能基、エーテル官能基、アミノ官能基、アミド官能基、アミジン官能基、カルバメート官能基、チオカルバメート官能基、グリセロール、尿素、チオ尿素ならびに芳香環から選ばれた基である。
【００２３】
本発明の目的にとって、用語「脂肪性脂肪族鎖」とは、１０〜２２の炭素原子を含有し、場合により該脂肪性脂肪族鎖が脂質特性を有している限り１または２以上のヘテロ原子を含有していてもよい飽和または不飽和のアルキル基を意味するものである。好ましくは、これは１、２または３個の不飽和結合を有する炭素数１０〜２２の直鎖または分岐鎖アルキル基である。好ましくは、このアルキル基は炭素数が１０、１２、１４、１６、１８、２０または２２、より好ましくは１８、２０または２２のものである。より具体的には、−(ＣＨ2)11ＣＨ3、−(ＣＨ2)13ＣＨ3、−(ＣＨ2)15ＣＨ3、−(ＣＨ2)17ＣＨ3、ミリストイル、オレイルおよびステアリルから選ばれた脂肪族基を挙げることができる。
【００２４】
好ましい態様において、Ｌが−（Ｒ１）Ｒ２を表す場合、Ｌはジミリストイル、ジオレイルおよびジステアリルから選択される。
本発明の目的にとって、用語「ステロイド誘導体」とは、コレスタン型の多環式化合物を意味するものである。これらの化合物は天然でもそうでなくてもよく、好ましくはコレステロール、コレスタノール、３−α−シクロ−５−α−コレスタン−６−β−オール、コール酸、ギ酸コレステリル、ギ酸コレスタニル、３−α−５−シクロ−５−α−コレスタン−６−β−イル・フォルミエート（ギ酸エステル）、コレステリルアミン、６−(１,５−ジメチルヘキシル)−３ａ,５ａ−ジメチルヘキサデカヒドロシクロペンタ[ａ]シクロプロパ[２,３]シクロペンタ[１,２−ｆ]ナフタレン−１０−イルアミン、およびコレスタニルアミンから選ばれる。
【００２５】
本発明に係る組成物において使用される好ましいトランスフェクション用化合物を次に示す。
【００２６】
【化１−１】
0005407862.tif 000002
【００２７】
【化１−２】
0005407862.tif 000003
【００２８】
【化１−３】
0005407862.tif 000004
【００２９】
本発明は、異性体が存在すれば、一般式(Ｉ)で示されるトランスフェクション用化合物の異性体、ならびにそれらの混合物、あるいはそれらの塩を含む組成物にも関することは理解されよう。
【００３０】
具体的には、本発明の化合物は無毒で薬学的に許容される塩の形態であってもよい。これらの無毒な塩は、無機酸（例えば、塩酸、硫酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香酸、フマル酸、メタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、またはシュウ酸）との塩を包含する。
【００３１】
本発明に係る一般式(Ｉ)で示される化合物は、ＵＳ２００３−００５４５５６Ａ１、ならびにSainlos et al, 2005 (非特許文献１)、Sainlos et al, 2004 (非特許文献２)、およびBelmont et al, 2002 (非特許文献３)に既に記載されているようにして調製される。
【００３２】
本発明に係る組成物はまた、トランスフェクション用化合物／ｓｉＲＮＡ複合体と組み合わせることができ、そのトランスフェクション力を向上させることができる１種または２種以上のアジュバントをさらに含んでいてもよい。従って、別の態様では、本発明は、ｓｉＲＮＡ、上述したようなトランスフェクション用化合物、ならびにトランスフェクション用化合物／ｓｉＲＮＡ複合体と組み合わせて、そのトランスフェクション力を向上させることができる少なくとも１種のアジュバントを含む組成物に関する。
【００３３】
本発明に係る化合物のトランスフェクション力を強めることができるこれらのアジュバントは、有利には脂質（例えば、中性脂質、特にリン脂質）、ペプチド（例えば、ＷＯ９６／２５５０８に記載されているもののような、ヒストン、ヌクレオリンもしくはプロタミン誘導体）、タンパク質（例えば、ＷＯ９７／１２０５１に記載されているもののようなＨＮＧ型のタンパク質）、ならびに／またはポリマー（例えば、トランスフェクション用化合物／ｓｉＲＮＡ処方組成物を「ステルス」型処方組成物にすることができるポリマー、例示として、トランスフェクション用化合物／ｓｉＲＮＡ処方組成物をコロイド的に安定化させるために単独で、もしくは脂質に結合させた形態で処方組成物に導入されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば、ＰＥＧ−コレステロール）から選ばれる。
【００３４】
この観点から、本発明の組成物は、アジュバントとして、特に脂質集合体を形成する特性を有する１種または２種以上の中性脂質を含有していてもよい。用語「脂質集合体」とは、あらゆる種類のリポソーム（単層膜と多重膜の両方）ならびにミセルもしくはより不定形の集合体をも包含する包括的用語（総称）である。
【００３５】
より好ましくは、本発明に関して使用される中性脂質は、２つの脂肪鎖を含む脂質である。特に有利には、生理条件下でイオン性電荷を失うか、または両性イオン性である天然または合成脂質が使用される。より具体的には、それらはジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、オレイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジステアロイル−、ジパルミトイル−およびジミリストイルホスファチジルエタノールアミン類、ならびに１〜３回Ｎ−メチル化されたそれらの誘導体、さらにはホスファチジルグリセロール類、ジアシルグリセロール類、グリコシルジアシルグリセロール類、セレブロシド類（特に、ガラクトセレブロシド類など）、スフィンゴ脂質類（特にスフィンゴミエリンなど）、またはアシアロガングリオシド類（特に、アシアロＧＭ１およびアシアロＧＭ２など）から選択しうる。特に好ましい変更例によると、本発明に関して使用される脂質アジュバントは、ＤＯＰＥ、ＤＯＰＯ、コレステロール、またはＰＥＧ−コレステロールのような非イオン性界面活性剤の脂質誘導体から選択される。
【００３６】
これらの多様な脂質は、当業者に周知の慣用技術を用いて、合成により、又は臓器（例えば、脳）もしくは卵からの抽出により得ることができる。具体的には、天然脂質の抽出は有機溶媒を用いて実施することができる。
【００３７】
好ましくは、本発明の組成物は、０.０１〜２０、好ましくは０.５〜５の範囲内からなる電荷比（正電荷のモル数／負電荷のモル数）に対応して、ｍｏｌ／ｍｏｌでｓｉＲＮＡ１当量あたり０.０１〜２０当量、より好ましくは０.５〜５当量のアジュバントを含む。
【００３８】
別の態様によると、上述したアジュバントは、本発明に係る組成物のトランスフェクション力を向上させることができる；具体的には、ペプチド類、タンパク質類、またはポリエチレングリコールのようなある種のポリマー類は、本発明に係るトランスフェクション化合物と、単に混合されるのではなく、複合化（コンジュゲート）されうる。特に、ＰＥＧは、本発明に係るアミノグリコシドの脂質誘導体に、アミノグリコシドの残留アミンまたはアミノグリコシドのヒドロキシル基の部位のいずれかで共有結合することができる。
【００３９】
特に有利な１態様によると、本発明に係る組成物は、ｓｉＲＮＡの移動を指令することができる標的化エレメントをさらに含む。この標的化エレメントは、ある種の望ましい細胞型または組織（腫瘍細胞、肝細胞、造血細胞など）に向かうｓｉＲＮＡの移動を指令することができる細胞外標的エレメントでよい。それはまた、ある種の好ましい細胞区画（ミトコンドリア、核など）に向かうｓｉＲＮＡの移動を指令することができる細胞内標的化エレメントであってもよい。標的化エレメントは、本発明に係るトランスフェクション用化合物およびｓｉＲＮＡと混合してもよく、この場合は、標的化エレメントは好適には、脂肪性脂肪族鎖（少なくとも炭素数１０）またはポリエチレングリコールに共有結合される。別の変更例によると、標的エレメントは本発明に係るトランスフェクション用化合物に共有結合されるが、その結合は、スペーサーＹを構成する化学官能基の１つで、または脂質成分の末端で（例えば、Ｒの末端で、および／もしくはそれらが脂肪性脂肪族鎖を意味する場合にはＲで）で、または直接アミノグリコシド上の残留アミンのいずれかもしくはヒドロキシル基の位置で起こる。最後に、標的化エレメントは既に明記したようにｓｉＲＮＡに結合させてもよい。
【００４０】
本発明に関して使用されうる標的化エレメントとしては、糖、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、脂質、神経メディエータ（neuromediators）、ホルモン、ビタミン、またはそれらの誘導体を挙げることができる。好適には、、それらは糖、ペプチド、ビタミンまたはタンパク質、例えば、抗体もしくはその断片、細胞受容体リガンドもしくはその断片、受容体もしくは受容体断片など、である。
【００４１】
例えば、それらは、成長因子受容体、サイトカイン受容体、細胞レクチン型の受容体もしくは葉酸受容体に対するリガンド、またはインテグリンのような接着タンパク質受容体に対して親和性を持つＲＧＤ配列を含んだリガンドでよい。トランスフェリン受容体、ＨＤＬ受容体およびＬＤＬ受容体、または葉酸輸送体もまた挙げることができる。標的化エレメントはまた、アシアロ糖タンパク質もしくはシアリルルイス酸Ｘのようなシアリル化（sialidized）種に対する、またはＦａｂ抗体断片もしくは単鎖抗体（ＳｃＦｖ）に対する受容体のようなレクチン類を標的にすることができる糖であってもよい。
【００４２】
本発明はまた、核酸をin vitro、in vivoまたはex vivoで細胞内に移入するための本発明に係る組成物の使用にも関する。
より正確には、本発明の１目的は、疾患、特に遺伝子産物の過剰発現から生ずる疾患の治療を意図した医薬品の製造のために本発明に係る組成物を使用することである。この医薬品中に含まれているｓｉＲＮＡは該遺伝子産物のｍＲＮＡを特異的に標的とし、それにより該疾患をin vivoまたはex vivoで治療する。
【００４３】
本発明はまた、被験者に請求項１に係る組成物を投与することを含む、該被験者における標的遺伝子発現を阻害する方法にも関する。ここで、該組成物中に含まれるｓｉＲＮＡは該標的遺伝子に特異的に向けられる。
【００４４】
例えば、治療において、または遺伝子調節の研究もしくは病的状態の動物モデルの創出のためにin vivoで使用するには、本発明に係る組成物を、局所、皮膚、経口、直腸、膣、腸管外、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、経皮、気管内、腹腔内などの投与の観点で処方することができる。
【００４５】
好ましくは、本発明の組成物は、特に所望器官への直接注射のための注射用処方組成物、または局所投与（皮膚および／もしくは粘膜への）に対して薬剤に許容される賦形剤を含有する。
【００４６】
それらは、具体的には、滅菌等張溶液、あるいは乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物であってもよく、乾燥組成物は適宜滅菌水または生理食塩水を添加することにより注射用溶液を作製することができる。注射に用いるｓｉＲＮＡの用量および投与回数は、さまざまなパラメータに応じて、特に使用する投与方法、患者の病理学的状態、発現させる遺伝子、または所望の治療持続期間に応じて調整されうる。投与方法のより詳細に関して、組織、例えば、腫瘍への直接注射でも、または循環系への注射のいずれでもよく、あるいは培養中の細胞を処置した後、それらを注射または移植によりin vivo再移植することを含む方法でもよい。本発明に関係する関連の組織は、例えば、筋肉、皮膚、脳、肺、気管、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、膀胱、胃、腸、精巣、卵巣、直腸、神経系、眼、腺、結合組織などである。
【００４７】
In vitro応用に関しては、本発明はさらに、下記工程を含む、ｓｉＲＮＡを細胞内に移入する方法に関する：
(１)請求項１に係る組成物を用意し、そして
(２)該細胞を該組成物と接触させる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】ＲＮＡ干渉によるｄ２−ＧＦＰ細胞のin vitroＧＦＰ阻害。ＧＦＰを標的とするｓｉＲＮＡを、０〜８の範囲内の各種の＋／−電荷比でＢＧＴＣ−ＤＯＰＥ（●）、ＤＣＣｈｏｌ−ＤＯＰＥ（▼）およびＰＥＩ（〇）と複合体化させてトランスフェクションを行った。In vitroトランスフェクションは、無血清培地５００μl中でウェルあたり０.３９μgのｓｉＲＮＡを用いて２時間実施した。その後、２０％ＦＣＳ含有培地５００μlを各ウェルに加えた。トランスフェクションから２４時間後にＧＦＰ蛍光測定を行った。各ポイントは、６個の別個の値の平均値およびＳＥＭ（標準誤差）を示す。
【図２】脂質性アミノグリコシド誘導体の構造。(Ａ) ジオレイルアミン−Ａ−スクシニル−トブラマイシン（ＤＯＳＴ）、(Ｂ) ジオレイルアミン−Ａ−スクシニル−カナマイシン（ＤＯＳＫ）、(Ｃ) ジオレイルアミン−Ａ−スクシニル−パロモマイシン（ＤＯＳＰ）、および(Ｄ) ジオレイルアミン−Ａ−スクシニル−ネオマイシン（ＤＯＳＮ）。
【図３Ａ】各種カチオン性脂質とプラスミドＤＮＡまたはｓｉＲＮＡの会合から生じた複合体の物理化学的特性。カチオン性リポソームを異なる濃度でプラスミドＤＮＡ（〇）またはｓｉＲＮＡ（▲）と混合することにより、核酸をＢＧＴＣ−ＤＯＰＥと複合体化させた。複合体のコロイド安定性および核酸複合体化を評価するため、それぞれ複合体化から１時間後に動的光散乱（実線）およびＢＥＴ蛍光（点線）の測定を行った。コロイド安定性ではなかった複合体には７００ｎｍの任意数値を付与した。
【図３Ｂ】核酸をＤＯＳＴ−ＤＯＰＥと複合体化させた場合の図３Ａと同様の図。
【図３Ｃ】核酸をＤＯＳＫ−ＤＯＰＥと複合体化させた場合の図３Ａと同様の図。
【図３Ｄ】核酸をＤＯＳＰ−ＤＯＰＥと複合体化させた場合の図３Ａと同様の図。
【図３Ｅ】核酸をＤＯＳＮ−ＤＯＰＥと複合体化させた場合の図３Ａと同様の図。
【図４】低温電子顕微鏡により観察されたカチオン性脂質／ｓｉＲＮＡ複合体のギャラリー。(Ａ)単層膜（一枚膜）ＢＧＴＣ−ＤＯＰＥリポソーム。(Ｂ)ＢＧＴＣ−ＤＯＰＥ／ｓｉＲＮＡ複合体の視野。(Ｃ)高倍率でのＢＧＴＣ−ＤＯＰＥ／ｓｉＲＮＡ複合体の構造。(Ｄ)ＤＯＳＴ−ＤＯＰＥ／ｓｉＲＮＡ複合体の視野。(Ｅ)高倍率でのＤＯＳＴ−ＤＯＰＥ／ｓｉＲＮＡ複合体の構造。縁部にみられる通常の構成のＲＮＡ分子に留意。(Ｆ)ＤＯＳＫ−ＤＯＰＥ／ｓｉＲＮＡ複合体の視野。(Ｇ)高倍率での２つのＤＯＳＫ−ＤＯＰＥ／ｓｉＲＮＡ複合体の構造。(Ｈ)ＤＯＳＰ−ＤＯＰＥ／ｓｉＲＮＡ複合体の視野。(Ｉ)高倍率での２つのＤＯＳＰ−ＤＯＰＥ／ｓｉＲＮＡ複合体の構造。(Ｊ)ＤＯＳＮ−ＤＯＰＥ／ｓｉＲＮＡ複合体の視野。(Ｋ)高倍率での２つのＤＯＳＮ−ＤＯＰＥ／ｓｉＲＮＡ複合体の構造。スケールバー：高倍率の画像では５０ｎｍ、低倍率の画像では１μｍ。
【図５Ａ】図５Ａおよび５Ｂは、ｄ２ＧＦＰ細胞中のｓｉＲＮＡ導入によるＧＦＰ発現阻害。カチオン性リポソーム／ｓｉＲＮＡ複合体のin vitroトランスフェクション効率と、電荷比(Ａ)およびｓｉＲＮＡ量(Ｂ)との関係。In vitroＧＦＰ測定は、下記各種カチオン性リポソームによりトランスフェクションされた細胞内で実施した：ＢＧＴＣ−ＤＯＰＥ（●）、ＤＯＳＫ−ＤＯＰＥ（▼）、ＤＯＳＴ−ＤＯＰＥ（〇）、ＤＯＳＰ−ＤＯＰＥ（■）およびＤＯＳＮ−ＤＯＰＥ（▽）。トランスフェクションされた細胞と非活性ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞との間のＧＦＰ蛍光の比率として表された残留ＧＦＰ発現を、カチオン性脂質／ｓｉＲＮＡ電荷比（＋／−）との関係として示す。細胞は１ウェルあたり４００ｎｇのｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。
【図５Ｂ】各種ベクターについて残留ＧＦＰ発現をｓｉＲＮＡ量との関係として示す、図５Ａと同様の図。カチオン性脂質は、ＢＧＴＣ−ＤＯＰＥ（●）、ＤＯＳＫ−ＤＯＰＥ（▼）、ＤＯＳＴ−ＤＯＰＥ（〇）、ＤＯＳＰ−ＤＯＰＥ（■）およびＤＯＳＮ−ＤＯＰＥ（▽）についてそれぞれ４、１２、４、１０および１０の電荷比で使用した。
【図５Ｃ】ＧＦＰ阻害およびｓｉＲＮＡ内部移行の視覚化画像。細胞は対照ｓｉＲＮＡ（Ａ〜Ｄ）または３'−ローダミン標識抗ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ（Ｅ〜Ｌ）によりトランスフェクションされた。ｓｉＲＮＡ（５００ｎｇ／ウェル）はカチオン性脂質：ＢＧＴＣ−ＤＯＰＥ、ＤＯＳＰ−ＤＯＰＥまたはＤＯＳＫ−ＤＯＰＥの不存在下（Naked siRNA）または存在下で処方された。細胞は、ＧＦＰ蛍光を見るためにＦＩＴＣフィルター下で（Ａ〜Ｈ）またはｓｉＲＮＡ内部移行を見るためにローダミンフィルター下で観察された。
【図５Ｄ】各種ヒト細胞系（ＨＥＫ，ＨｅＬａおよびｄ２ＧＦＰ細胞）のＤＯＳＰ／ｓｉＲＮＡリポプレックス（lipoplex）によるトランスフェクション後のヒト・ラミンＡ／Ｃ ｍＲＮＡのリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析結果（ＨＰＲＴ１に対して正規化）。値は対照ｓｉＲＮＡを用いて同じ実験条件下でトランスフェクションした細胞に対する相対値である。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｃは中性脂質アジュバントを使用しない場合のアミノグリコシド誘導体ＤＯＳＰのトランスフェクション効率を示す。ＧＦＰサイレンシングおよびｓｉＲＮＡ内部移行の蛍光顕微鏡視覚化画像。ＧＦＰ発現性ヒト肺がん細胞Ｈ１２９９を対照ｓｉＲＮＡ（SiRNA control, パネルＡ、Ｂ）または３'−ローダミン標識抗ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ（パネルＣ〜Ｆ）でトランスフェクションした。ｓｉＲＮＡ分子はＤＯＳＰの不存在下で（パネルＡ、Ｃ、ＥのNaked siRNA）または存在下で（パネルＢ，Ｄ，Ｆ）処方された。トランスフェクションされたＨ１２９９細胞は、ＧＦＰ蛍光を見るためにＦＩＴＣフィルター下で（パネルＡ，Ｂ、白／薄灰色部分を参照）またはｓｉＲＮＡ内部移行を見るためにローダミンフィルター下（パネルＥ，Ｆ、白／薄灰色部分を参照）で観察された。
【図６Ｂ】ＤＯＳＰ試薬を用いたラミンＡ／Ｃサイレンシング効率とｓｉＲＮＡ量との関係。３.７５〜２００ｎｇ／ウェルの範囲内の抗ラミンＡ／Ｃ ｓｉＲＮＡ量をＤＯＳＰと共に処方した。ＨｅＬａ細胞トランスフェクション後のヒト・ラミンＡ／Ｃ ｍＲＮＡのリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果は、ＤＯＳＰ試薬が非常に少ない量のｓｉＲＮＡで効率的であることを示した（ＨＰＲＴ１に対して正規化）。値は対照ｓｉＲＮＡを用いて同じ実験条件下でトランスフェクションした細胞に対する相対値である。
【図６Ｃ】ＤＯＳＰ試薬または競合試薬を用いたラミンＡ／Ｃサイレンシング効率。１８.７５および３７.５ｎｇ／ウェルで抗ラミンＡ／Ｃ ｓｉＲＮＡをＤＯＳＰまたは市販試薬のHiPerFectと共に処方した。ＨｅＬａ細胞トランスフェクション後のヒト・ラミンＡ／Ｃ ｍＲＮＡのリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果は、ＤＯＳＰ試薬がHiPerFectより効率性が高いことを示した（ＨＰＲＴ１に対して正規化）。値は対照ｓｉＲＮＡを用いて同じ実験条件下でトランスフェクションした細胞に対する相対値である。
【図７】ｄ２ＧＦＰ細胞中でのｓｉＲＮＡ媒介ＧＦＰ遺伝子ノックダウン効率に対するｓｉＲＮＡ導入用の市販試薬とＤＯＳＰ−ＤＯＰＥ誘導体との比較。２００ｎｇの抗ＧＦＰ ｓｉＲＮＡを適当な試薬と製造業者の記載通りに処方し、１ウェルあたり６５０００細胞の細胞数で２４ウェル培養プレート上においてトランスフェクションした。＊印は、市販試薬でトランスフェクションされた細胞とＤＯＳＰ−ＤＯＰＥでの細胞との間の有意差（ｐ＜）を意味する。
【図８】ｄ２−ＧＦＰ中でのin vitro抗ＧＦＰ ｓｉＲＮＡ導入後のＧＦＰ発現の経時変化。抗ＧＦＰ ｓｉＲＮＡは次の異なるベクターと共に処方した：ＤＯＳＫ−ＤＯＰＥ（▼）、ＤＯＳＴ−ＤＯＰＥ（〇）、ＤＯＳＰ−ＤＯＰＥ（■）およびＤＯＳＮ−ＤＯＰＥ（▽）。これらのベクターはそれぞれ４、１２、４、１０および１０の＋／−電荷比で使用した。トランスフェクションは、無血清培地５００μl中でウェルあたり０.３９μgのｓｉＲＮＡを用いて２時間実施した。その後、２０％ＦＣＳ含有培地５００μlを各ウェルに加えた。種々の時点でＧＦＰ蛍光測定を行った。各ポイントは、６個の別個の値の平均値およびＳＥＭ（標準誤差）を示す。
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｄはアミノグリコシド誘導体によるin vitroプラスミド導入に関する。In vitroトランスフェクションは、無血清培地５００μl中で２時間行い、その後に１０％ＦＣＳを含有する培地１ｍｌで置換した。トランスフェクションから２４時間後にタンパク質およびｍＲＮＡ測定を行った。各ポイントは、６個の別個の値の平均値およびＳＥＭ（標準誤差）を示す。本図はｄ２−ＧＦＰ細胞中でのルシフェラーゼ発現と＋／−電荷比との関係を示す。トランスフェクションは下記のカチオン性脂質と複合体化したルシフェラーゼプラスミド１μｇで実施した：ＢＧＴＣ−ＤＯＰＥ（●）、ＤＯＳＫ−ＤＯＰＥ（▼）、ＤＯＳＴ−ＤＯＰＥ（〇）、ＤＯＳＰ−ＤＯＰＥ（■）およびＤＯＳＮ−ＤＯＰＥ（▽）。
【図９Ｂ】ｐＴＥＲプラスミドによりコードされるｓｉＲＮＡヘアピンの発現を示す。トランスフェクションは、下記の各種の＋／−電荷比でカチオン性脂質と複合体化されたｐＴＥＲプラスミド１μｇにより実施した：０（白い棒）、２（灰色棒）、４（横線）、６（斜線）、８（交差斜線）、１０（黒い棒）。
【図９Ｃ】図９Ｃおよび９Ｄは、ＣＯＳ−７細胞におけるＫＣＮＥ１プラスミドとＫＣＮＥ１標的ｓｉＲＮＡとの共導入に関する。ＫＣＮＥ１プラスミド０.８μｇと０.８μｇ(Ｃ)または所望量(Ｄ)のＫＣＮＥ１標的ｓｉＲＮＡとを混合し、次いで適当なアミノグリコシド誘導体(Ｃ)またはＤＯＳＰ−ＤＯＰＥカチオン性脂質のみ(Ｄ)と複合体化させた。結果は、各種条件下で得られたＫＣＮＥ１ ｍＲＮＡ量とｓｉＲＮＡスクランブル（競争）により得られたＫＣＮＥ１ ｍＲＮＡ量の％として表した。
【図９Ｄ】図９Ｃに関して説明した通りである。
【実施例】
【００４９】
実施例１：カチオン性部分を持つカチオン性脂質のｓｉＲＮＡトランスフェクションのための使用
１.１：材料および方法
１.１.１：核酸、カチオン性脂質および複合体の調製
３'−ローダミン標識抗ＧＦＰ ｓｉＲＮＡおよび５'−ローダミン標識対照ｓｉＲＮＡはQiagen社（米国カリフォルニア州チャツワース）により供給された。ストック。非標識の抗ＧＦＰ ｓｉＲＮＡはEurogentec社（ベルギー、スラン）により供給された。抗ＧＦＰ ｓｉＲＮＡはセンス鎖について下記配列を有していた：ＧＣＡＡＧＣＵＧＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＡＵ（配列番号１）。ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡを標的とするサイレンサーTMＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡ（ヒト、マウス、ラット）はAmbion社（英国、ケンブリッジ州）により供給された。ヒト抗ラミンＡ／Ｃ ｓｉＲＮＡは、Santa Cruz Biotechnology社（米国カリフォルニア州サンタクルーズ）により供給された。抗ＧＦＰ ｓｉＲＮＡヘアピンをコードするプラスミドｐＴＥＲは、ｐＣＤＮＡ４ＴＯ（Invtrogen Life Technologies、米国カリフォルニア州カールスバッド）のＢｇｌＩＩとＨｉｎｄＩＩとの間に修飾Ｈｌプロモーターを挿入することにより得たものであり、A. Polesskaya氏（フランス、ビルジュイフ）の好意により供給された。プラスミド類は、EndoFreeプラスミド精製カラム（Qiagen、米国カリフォルニア州チャツワース）を用いて組換え大腸菌（Escherichia coli）から精製した。脂質アミノグリコシド誘導体およびＢＧＴＣは既に述べたようにして（非特許文献１〜３）合成した。
【００５０】
３−β−(Ｎ−(Ｎ',Ｎ'−ジメチルエタン)カルバモイル)コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）およびジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）はAventi Polar Lipids, Inc. (米国アラバマ州アラバスター)から入手した。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）２５ｋＤＡはシグマ社（米国ミズーリ州セントルイス）から入手した。RNAiFect、X-treme-GENEおよびLipofectamine 2000は、それぞれQiagen社、Roche Diasnostics社およびInvitrogen社から入手した。脂質性アミノグリコシド誘導体／ＤＯＰＥおよびＢＧＴＣ／ＤＯＰＥのカチオン性リポソームは先行技術文献に記載のようにして調製した。分散液を１０分間超音波処理し、４℃で保存するという小さな変化を加えた。脂質性アミノグリコシド誘導体／核酸複合体およびＢＧＴＣ／核酸リポプレックスは、各種濃度のカチオン性リポソームを３００ｍＭ ＮａＣｌ中の所望濃度のプラスミドＤＮＡまたはｓｉＲＮＡと同量ずつ混合することにより調製した。
【００５１】
１.１.２：in vitroトランスフェクション
ｄ２ＧＦＰ（ヒト肺がん）細胞を、フラスコ内で１％ストレプトマイシン／ペニシリン、ゲネチシン０.８ｍｇ／ｍｌ（GIBCO、Invitrogen Life Technologies社、米国カリフォルニア州カールスバッド）および１０％ウシ胎仔血清（Eurobio、フランス、クールブフ）を加えた、グルコース、ｌ−グルタミンおよびピルビン酸（ピルベート）を含有するＤ−ＭＥＭ中で、５％ＣＯ2／加湿雰囲気において３７℃で培養した。トランスフェクションの１日前に、細胞を６５０００の細胞数で２４ウェルの培養プレートに移した。それにより２４時間後に約７０〜８０％コンフルエンス（集密）の状態になった。各ウェルにおいて、５００μlの血清およびゲネシチン不含有Ｄ−ＭＥＭ中の複合体５０５０μlを添加することによりトランスフェクションを行った。２時間後、トランスフェクション培地を、１０％ウシ胎仔血清および１％ストレプトマイシン／ペニシリンを含有する１ｍｌのＤ−ＭＥＭで置換した。トランスフェクション実験を３回実施し、残留ＧＦＰ発現をトランスフェクションの２４時間後に定量した。経時的実験のために、トランスフェクションを下記の変更点を除いて上記と同様に実施した。トランスフェクションした細胞を３日目ごとに、ＧＦＰ定量測定の日のコンフルエンスが９０％となるように適当な細胞数で新たな２４ウェル培養プレートに移した。トランスフェクション実験は３回実施し、残留ＧＦＰ発現をトランスフェクションから１、２、３、５、６および９日後に測定した。
【００５２】
ＲＮＡ分離のために、細胞を１ウェルあたり２５００００細胞の細胞数で６ウェル皿に入れた。各ウェル内で、無血清かつ無ゲネチシンのＤ−ＭＥＭ １ｍｌ中の複合体処方組成物１００μl を加えることによりトランスフェクションを行った。３７℃で２時間後、トランスフェクション培地を、１０％ウシ胎仔血清および１％ストレプトマイシン／ペニシリンを含有する１ｍｌのＤ−ＭＥＭで置換した。２４時間後、ＲＮＡを単離した。
【００５３】
１.１.３：遺伝子発現および阻害
２４時間後、トランスフェクションした細胞を５００μlのＰＢＳで２回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche Diagnostics、ドイツ、マンハイム）を加えたレポーター溶解緩衝液（Promega、ウイスコンシン州マディソン）で溶解させた。１回の凍結−解凍（−８０℃／２０℃）により完全な溶解を確保した。その後、サンプルを１００００ｇで５分間遠心した。ＧＦＰ蛍光測定を、１８０μl量の上清でのアッセイにより、それぞれ４８５ｎｍおよび５３５ｎｍの励起波長および発光波長のVictor2（Perkin Elmer、フランス、レジュリ）を用いて実施した。蛍光は、ＢＣＡアッセイキット（Pierce、米国イリノイ州ロックフォード）を用いて得られた、サンプルの全タンパク質濃度に対して正規化された。残留ＧＦＰ発光は、対照サンプルの蛍光の％として表された。
【００５４】
ラミンＡ／Ｃ免疫染色は、ＰＢＳで洗浄し、ＰＡＦ２％溶液で５分間固定し、次いでＰＢＳ−Triton０.２％溶液中で５分間インキュベーションした細胞について実施した。まず、細胞を、ヒト由来のラミンＡの内部領域内での２３１−３４０マッピングに対するラビット・ポリクローナル抗体である抗ラミン一次抗体（1／50）(ラミンＡ／Ｃ(Ｈ−110))（Santa Cruz Biotechnology、米国カリフォルニア州）とともに１時間インキュベーションした。次に、細胞を、ビオチン化ラビットＩｇＧ（Sigma、米国ミズーリ州セントルイス）（1／800）と共に１時間、そしてStreptavidine-Rhod（1／200）(Molecular Probes)と共に３０分間インキュベーションした。細胞を、Dako蛍光マウンティング・メディウム（Dako Cytomacion、デンマーク）を用いてローダミン励起で観察した。
【００５５】
１.１.４：蛍光顕微鏡
トランスフェクションされた細胞の蛍光顕微鏡検査は、倒立型蛍光顕微鏡Axiovert 200M (CarlZeiss、ドイツ、ゲッティンゲン)を用いて実施した。
【００５６】
１.１.５：臭化エチジウム蛍光測定
臭化エチジウム蛍光測定を励起波長および発光波長がそれぞれ２６０ｎｍおよび５９０ｎｍのKontron SFM25蛍光分光光度計で行った。蛍光は１０μｇ／ｍｌの核酸（ｓｉＲＮＡまたはＤＮＡ）で調製されたサンプルに臭化エチジウム（最終濃度５μＭ）を添加した直後から監視した。
【００５７】
１.１.６：動的光散乱
動的光散乱測定は、Zetasizer 300HSA（英国、ウースター州モルバン）を用いて２０℃で行った。さまざまな量のカチオン性脂質を含有する核酸１０μｇ／ｍｌで調製されたサンプルについて測定値を監視した。
【００５８】
１.１.７：低温ＴＥＭ（cryo-TEM）顕微鏡
１０μｇのｓｉＲＮＡ／ｍｌと適当量のカチオン性脂質とを用いてｓｉＲＮＡ／カチオン性脂質複合体を調製した。５μl量のサンプルを、多孔質炭素被覆銅グリッド上に付着させ、過剰分を濾紙で吸い取った後、グリッドを液体窒素で冷却された液体エタン浴（Leica EM CPC）中に投入した。この標本をクライオホルダー（Gatan）を用いて−１７０℃の温度に保持し、２００ｋＶおよび低線量条件下では５００００Ｘの標準倍率で動作するFEI Tecnai F20電子顕微鏡で観察した。画像は２Ｋ×２Ｋ Gatant低速スキャンＣＣＤカメラで記録した。
【００５９】
１.１.８：ＲＮＡレベルでの遺伝子発現阻害
TRIzol試薬（Invitrogen、フランス、セルジ・ポントワ）とRnesyTMミニキット (Qiagen、米国カリフォルニア州チャツワース)とを用いて全ＲＮＡを抽出した。ｍＲＮＡの精製を、OligotexTM  mRNAミディキット (Qiagen、米国カリフォルニア州チャツワース) を用いて行った。SuperScriptTM III (Invitrogen Life Technologies社、米国カリフォルニア州カールスバッド) を用いて、逆転写を供給業者の記載通りに実施した。ABI PrismTM7900HT配列検出システム (Applied Biosystems) を用いてリアルタイム定量ＰＣＲを実施し、得られたデータを、Applied Biosystems SDS 2.1ソフトウェアによる機器スペクトル補償後に取得した。ＧＦＰリバースプライマーの配列は、ＣＧＧＧＣＡＴＧＧＣＧＧＡＣＴＴ（配列番号２）、ＦＡＭプローブの配列はＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣ（配列番号３）、そしてＧＦＰフォワードプライマーの配列はＧＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＡＴＧＡＡＧ（配列番号４）であった。各実験に対して対照の無ＤＮＡサンプルについても実施した。サイクリング条件は、９５℃で１０分間の高温開始後に、９５℃で１５秒と６０℃で１分の４０サイクルを含んでいた。ゲル電気泳動を用いて、適当なサイズの単一アンプリコンを検出した。データの正規化のためにＨＰＲＴ遺伝子を用いた。値は、対照ｓｉＲＮＡで得られた量に対する、抗ＧＦＰもしくはＧＡＰＤＨもしくはラミンＡ／Ｃ ｍＲＮＡがトランスフェクションされた細胞内で得られた正規化されたＧＦＰもしくはＧＡＰＤＨもしくはラミンＡ／Ｃ ｍＲＮＡ量の％に対応していた。
【００６０】
１.２：結果
１.２.１：カチオン性ベクター／ｓｉＲＮＡ複合体の遺伝子発現阻害活性
まず、我々は、細胞質ＧＦＰを発現する形質転換細胞株（ｄ２ＧＦＰ）内での抗ＧＦＰ ｓｉＲＮＡ分子の導入を通してＧＦＰ発現を阻害するために、プラスミドＤＮＡトランスフェクションに現在使用されているカチオン性ベクターの能力を評価した。抗ＧＦＰ ｓｉＲＮＡ分子は、ＢＧＴＣ／ＤＯＰＥまたはＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥまたはＰＥＩとの複合体であった。トランスフェクションから１日後に、ＧＦＰ発現の阻害を蛍光ＧＦＰ測定により監視した。図１は、正電荷モル数／負電荷モル数として表されるカチオン性ベクター／ｓｉＲＮＡ電荷比が増大するにつれて、残留ＧＦＰ発現が低下したことを示している。ＢＧＴＣ、ＤＣ−ＣｈｏｌおよびＰＥＩのカチオン性リポソームと複合体化されたｓｉＲＮＡで得られた残留ＧＦＰ発現は、それぞれ約３２％、５２％および５５％であった。これらの結果は、ｓｉＲＮＡにより媒介される遺伝子発現の阻害効率が向上した新規ベクター開発の必要性を浮かび上がらせるものであった。その後の実験における遺伝子発現阻害の比較のための標準的カチオン性ベクターとしてＢＧＴＣ−ＤＯＰＥリポソームを選択した。
【００６１】
１.２.２：脂質性アミノグリコシド誘導体の化学構造
脂質性アミノグリコシド誘導体は、アミノグリコシド先端基に自己凝集性の炭化水素系後端部（テイル部）が結合してなる両親媒性物質である。図２は、本試験で使用された種々の脂質性アミノグリコシド誘導体を示す。それらは、カチオン性先端基としてのトブラマイシン、カナマイシン、パロモマイシンまたはネオマイシンが、スクシニル・スペーサーを介して、ジオレイル鎖に結合したものからなる。トブラマイシンおよびカナマイシンは４,６−二置換２−デオキシストレプタミン環の種類に属し、パロモマイシンおよびネオマイシンは４,５−二置換２−デオキシストレプタミン環の種類に属する。
【００６２】
１.２.３：カチオン性リポソーム／核酸複合体のコロイド安定性
我々は、ＤＮＡまたはｓｉＲＮＡとＢＧＴＣのカチオンリポソームまたは脂質性アミノグリコシド誘導体との会合から生ずる複合体の物理化学的性質を、カチオン性脂質／核酸電荷比との関係として検討した（図３）。電荷比を算出するために、１μｇのｓｉＲＮＡは３ナノモルの荷電リン酸分であり、ＢＧＴＣ、ＤＯＳＴ、ＤＯＳＫ、ＤＯＳＰおよびＤＯＳＮはそれぞれ２、４、３、４および６個の正電荷をもつと仮定した。
【００６３】
ｓｉＲＮＡと複合体化させたカチオン性リポソームの動的光散乱分析は、ＤＮＡで得られ、リポポリアミンについて既に報告されているのと同様に（非特許文献４）、コロイド安定性の３ゾーン・モデルの存在を明らかに示した。Ａ、ＢおよびＣと命名されたこれらの３つの異なるゾーンは、カチオン性脂質／核酸電荷比により決まる。カチオン性脂質／核酸電荷比が低いゾーンＡでは、核酸が部分的に集中した負電荷のコロイドとして安定な複合体が生ずる。ゾーンＢは、中性電荷の大きくてコロイドとして不安定な粒子を含有する。ゾーンＣは、正電荷の小さくてコロイドとして安定な複合体を意味する。
【００６４】
最も重要な点は、ＢＧＴＣ−ＤＯＰＥ／ｓｉＲＮＡ複合体（図３Ａ）は、ＢＧＴＣ／ｓｉＲＮＡ電荷比が２〜８の範囲に及ぶ大きなゾーンＢを示し、そこでは複合体は凝集するため、７００ｎｍに達するような平均径（直径）を有していた。これに対して、脂質性アミノグリコシド誘導体のカチオン性リポソームをｓｉＲＮＡと複合体化させたものは（図３Ｂ〜３Ｅ）は、ＢＧＴＣで得られたものより短いゾーンＢを示し、複合体の平均径は約４００ｎｍであった。
【００６５】
ゾーンＣでは、ＢＧＴＣ−ＤＯＰＥ／ｓｉＲＮＡ複合体は平均径が２２５ｎｍであったのに対し、ジオレイルアミン−Ａ−スクシニル−トブラマイシン−ＤＯＰＥ（ＤＯＳＴ−ＤＯＰＥ）、ジオレイルアミン−Ａ−スクシニル−カナマイシン−ＤＯＰＥ（ＤＯＳＫ−ＤＯＰＥ）、ジオレイルアミン−Ａ−スクシニル−パロモマイシン−ＤＯＰＥ（ＤＯＳＰ−ＤＯＰＥ）、およびジオレイルアミン−Ａ−スクシニル−ネオマイシン−ＤＯＰＥ（ＤＯＳＮ−ＤＯＰＥ）リポソームと複合体化させたｓｉＲＮＡでは、平均径がそれぞれ８１、１０５、５８および５７ｎｍであった。従って、脂質性アミノグリコシド誘導体のカチオン性リポソームは、ｓｉＲＮＡ分子と複合体化した場合に小さい粒子を形成することができた。留意すべきは、プラスミドＤＮＡと共に処方した場合には、ＢＧＴＣのカチオン性リポソームと脂質性アミノグリコシド誘導体のそれとの間に粒子サイズの著しい差がなかったことである（図３）。
【００６６】
次に、我々は、同じサンプルについて、臭化エチジウム蛍光測定によりｓｉＲＮＡおよびＤＮＡ複合体形成を調査した。全般的傾向として、カチオン性脂質／核酸電荷比が増大するにつれて蛍光強度は低下した。蛍光強度は、ゾーンＡでは１００％から０に近い値まで低下し、ゾーンＢおよびＣではこの最小値にとどまった。ＤＮＡをＢＧＴＣまたは各種脂質性アミノグリコシド誘導体のいずれかのリポソームと複合体化した場合には、蛍光強度は同様の低下を生じたが、ｓｉＲＮＡ分子を複合体化した場合には差異が認められた。脂質性アミノグリコシド誘導体の間でも著しく変動した、蛍光強度の電荷比に対する減少曲線の勾配は、ＤＯＳＫおよびＤＯＳＴで認められたものに比べて、ＤＯＳＮおよびＤＯＳＰではより急勾配であった。対比すると、ＢＧＴＣとのｓｉＲＮＡ複合体では蛍光強度が低下するまでの遅延が観察された。ＤＮＡおよびｓｉＲＮＡと混合したカチオン性脂質のアガロースゲル電気泳動は、蛍光実験で得られた結果を確認した（データを示さず）。
【００６７】
１.２.４：カチオン性リポソーム／ｓｉＲＮＡ複合体の低温透過電子顕微鏡写真
ＢＧＴＣ／ＤＯＰＥ小胞標本を、３０〜７０ｎｍの範囲内からなる直径の単層膜ラメラリポソームから作製した（図４Ａ）。ＢＧＴＣ−ＤＯＰＥリポソームをｓｉＲＮＡ溶液と混合すると、サイズが２００〜５００ｎｍの範囲内の小さな密集した丸みを帯びた構造物の生成を生じた（図４Ｂ）。これらの構造物は恐らくｓｉＲＮＡ分子に対応する電子密度の高い電子緻密層により離間された数層の脂質層のスタック（積み重ね）からなるものであった。７.０ｎｍの測定距離は、脂質二重層（二分子層）の厚さおよび二本鎖ｓｉＲＮＡ分子の直径に対応していた。よく配向した集中構造では、間隔が３.０ｎｍの微細なスジ模様が見えた。これは恐らく２層の脂質膜間の規則的配置を示していよう（図４Ｃ）。
【００６８】
ＤＯＳＴ−ＤＯＰＥおよびＤＯＳＫ−ＤＯＰＥリポソームでは、サイズ１００〜３００ｎｍの範囲内の小さな複合体が、ｓｉＲＮＡ分子の存在下で誘導された（図４Ｄ〜４Ｇ）。それらは、脂質二重層とｓｉＲＮＡ分子との規則的な重なりからなるタマネギ様の構造を形成していて、ＢＧＴＣ−ＤＯＰＥリポソームで形成されたものにとても似ていた。典型的なリポプレックス（図４Ｄおよび詳細図は図４Ｅ）は、繰り返し２層間の間隔が６.７ｎｍであり、電子緻密層はｓｉＲＮＡ分子の層に対応していた。ＢＧＴＣ−ＤＯＰＥ複合体について測定されたのと同じ間隔のリポプレックスの縁部（上右）に示されるように、ｓｉＲＮＡ分子は脂質膜上でよく配向していることは留意に値する。
【００６９】
ＤＯＳＰ−ＤＯＰＥおよびＤＯＳＮ−ＤＯＰＥリポソームでは、サイズ５０〜３００ｎｍの範囲内の複合体が、ｓｉＲＮＡ分子の添加後に形成された（図４Ｈ〜４Ｋ）。また、ＤＯＳＮ−ＤＯＰＥリポソームで形成された複合体は、ブドウ状の小さな密集した構造を形成する傾向を示した。先の３種類のカチオン性脂質で形成された複合体とは異なり、ＤＯＳＰ−ＤＯＰＥおよびＤＯＳＮ−ＤＯＰＥリポソームで作製された複合体は、より不規則な構造を有していた。それらは脂質二重層とｓｉＲＮＡ分子の重なりから構成されていたが、この配置は長い距離にわたっては広がっていなかった。この差の１つの説明は、リポソームのサイズ（直径範囲３０〜５０ｎｍ）に帰することができよう。それらは他の３種類のカチオン性脂質で作製されたもの（データは示さず）よりサイズが小さく、タマネギ様の構造の形成を誘導することができなかった。
【００７０】
上記５種類の異なる脂質組成物で作製されたリポソームを３００ｍＭ ＮａＣｌに曝すと、小さなリポソームは単層膜小胞のまま残るが、大きなものは浸透作用によって二倍の脂質二重層リポソームになったことを述べるのは重要である（データ示さず）。
【００７１】
１.２.５：脂質性アミノグリコシド誘導体／ｓｉＲＮＡ複合体の遺伝子発現阻害活性
図５Ａは、ＢＧＴＣ／ｓｉＲＮＡ電荷比が増大するにつれて、ＢＧＴＣ−ＤＯＰＥ／ｓｉＲＮＡ複合体によるｄ２−ＧＦＰトランスフェクション細胞のＧＦＰ蛍光レベルが次第に低下したことを示している。これに対し、ＤＯＳＴ−ＤＯＰＥ／ｓｉＲＮＡ複合体は、ＤＯＳＴ／ｓｉＲＮＡ電荷比が４の場合でＧＦＰ蛍光の１１％への急激な低下を生じ、より高い電荷比でもこの最小値にとどまった。意外にも、ＤＯＳＫ−ＤＯＰＥ／ｓｉＲＮＡ複合体ではＧＦＰ蛍光は漸減を示し、ＤＯＳＫ／ｓｉＲＮＡ電荷比１２で４１％の最小蛍光レベルに到達した。４,５−二置換型のＤＯＳＰ−ＤＯＰＥおよびＤＯＳＮ−ＤＯＰＥから得られたアミノグリコシド誘導体は両方とも、カチオン性脂質／ｓｉＲＮＡ電荷比の増加に伴ってＧＦＰ発現の漸減を示し、カチオン性脂質／ｓｉＲＮＡ電荷比８で１０％の最小残留蛍光レベルに到達した。各種カチオン性脂質による同じ条件での対照ｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、非トランスフェクション細胞（データを示さず）に比べて、ＧＦＰ発現に影響しなかった。その後の実験に関して、カチオン性脂質／ｓｉＲＮＡ電荷比を、ＢＧＴＣおよびＤＯＳＴにより複合体化したｓｉＲＮＡでは４、ＤＯＳＰによるものでは１０、そしてＤＯＳＮおよびＤＯＳＫによるものでは１２に設定した。
【００７２】
図５Ｂは、トランスフェクションされたｓｉＲＮＡの量との関係としてＧＦＰ発現に対するカチオン性脂質の影響を示す。ＢＧＴＣ−ＤＯＰＥおよびＤＯＳＫ−ＤＯＰＥリポソームについては、ＧＦＰ発現は次第に低下し、５００ｎｇのｓｉＲＮＡ量で５０％の最小ＧＦＰ発現が得られた。これに対し、ＤＯＳＮ−ＤＯＰＥ、ＤＯＳＴ−ＤＯＰＥおよびＤＯＳＰ−ＤＯＰＥのカチオン性リポソームは、１ウェルあたり３００ｎｇのｓｉＲＮＡ量で２０％の最小ＧＦＰ発現に至った。
【００７３】
図５Ｃは、同じ実験について、高いｓｉＲＮＡ内部移行分子に恐らく関係してＧＦＰ蛍光レベルの強い低下を生じたＤＯＳＰ−ＤＯＰＥカチオン性リポソームによるＧＦＰ発現阻害のローダミン蛍光により視覚化された視覚化画像を示す（図５Ｃ）。ただし、ＤＯＳＫ−ＤＯＰＥカチオン性リポソームもｓｉＲＮＡ細胞内部移行を生じたが、ＧＦＰ蛍光はｓｉＲＮＡ対照で得られたものに比べて若干低下しただけであった（図５Ｃ）。対照として、裸のｓｉＲＮＡ（naked siRNA）をＧＦＰ阻害について評価したが、ＧＦＰ蛍光レベルを低下させることはできなかった（図５Ｃ）。ＢＧＴＣ−ＤＯＰＥカチオン性リポソームはＤＯＳＫで得られたものとＤＯＳＰで得られたものとの間の中間のＧＦＰ発現阻害を生じた。
【００７４】
次に、内因性ラミンＡ／Ｃ発現を標的とするｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉ実験を行った。この場合、ＲＴ−ＰＣＲ結果は、ＤＯＳＰ／ｓｉＲＮＡ複合体でトランスフェクションされたｄ２−ＧＦＰ細胞は、対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞に比べて、残留ラミンＡ／Ｃ ｍＲＮＡが非常にわずかであったことを示した（図５Ｄ）。ＤＯＳＰ／ｓｉＲＮＡ複合体がｄ２ＧＦＰ細胞内で内因性遺伝子の発現の効率的なノックダウンを可能することもできることを実証する知見である。我々の結論を拡張するため、ＤＯＳＰ／抗ラミンＡ／Ｃ ｓｉＲＮＡ複合体がＨＥＫ２９３細胞（ヒト胚腎細胞）およびＨｅＬａ細胞（ヒト類上皮子宮頸がん由来）のような他のヒト細胞株中でのラミンＡ／Ｃ発現のサイレンシングにも非常に効果的であって、非常に低レベルの残留ラミンＡ／Ｃ ｍＲＮＡがやはり観察されたことを見出した（図５Ｄ）。
【００７５】
ＤＯＰＥのような中性脂質アジュバントを使用せずに、ｓｉＲＮＡのトランスフェクションのために本発明にかかるアミノグリコシド誘導体を使用した実験も行った。
ＧＦＰ発現性ヒト肺がんＨ１２９９細胞を対照ｓｉＲＮＡまたは３'−ローダミン標識抗ＧＦＰ ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。ｓｉＲＮＡ分子はＤＯＳＰの不存在下（「裸(naked)」ｓｉＲＮＡ）または存在下で処方したが、いずれの場合もＤＯＰＥは使用しなかった。トランスフェクションしたＨ１２９９細胞を、ＧＦＰ蛍光を視覚化するためにＦＩＴＣフィルターを用いて、またはｓｉＲＮＡ内部移行（内在化）を視覚化するためにローダミンフィルターを用いて観察した。
【００７６】
図６Ａに示した結果は、ＤＯＰＥのような中性脂質アジュバントを使用しない、ＤＯＳＰ／ｓｉＲＮＡ複合体によるＨ１２９９細胞中への抗ＧＦＰ ｓｉＲＮＡ分子の導入は、ＧＦＰ陽性細胞（白／薄灰色領域により表される）の数の強力な減少を生じたことを示している（パネルＤ）。このことは、ｓｉＲＮＡ分子の高い細胞取込み（パネルＦにおいて、ローダミン標識抗ＧＦＰ ｓｉＲＮＡに起因する蛍光により視覚化されているように、灰色領域を参照）と相関していた。裸の「未反応」のｓｉＲＮＡを、ｓｉＲＮＡ導入に対するＩＣＡＦｅｃｔｉｎ ＤＯＳＰの効率の対照として使用した。パネルＡ、ＣおよびＥは、裸の(naked)「未反応」ｓｉＲＮＡを用いた場合にはＧＦＰ発現の抑制とｓｉＲＮＡ取込みのいずれもなかったことを示している。ｓｉＲＮＡ導入に対するＤＯＳＰ試薬の役割を確認する知見である。
【００７７】
また、中性脂質アジュバントを使用せずに抗ラミンＡ／Ｃ ｓｉＲＮＡと複合体化させたＤＯＳＰ試薬を用いたラミンＡ／Ｃサイレンシング効率は、ＲＴ−ＰＣＲによっても試験した。３.７５〜２００ｎｇ／ウェルの範囲内の抗ラミンＡ／Ｃ ｓｉＲＮＡ料をＤＯＳＰと共に処方した。
【００７８】
図６Ｂに示したＨｅＬａ細胞のトランスフェクション後のヒト・ラミンＡ／Ｃ ｍＲＮＡのリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果は、ＤＯＳＰ試薬が非常に少量のｓｉＲＮＡ（ＨＰＲＴ１に対して正規化）で効率的であることを示している。
【００７９】
最後に、ＤＯＳＰ試薬の効率を、抗ラミンＡ／Ｃ ｓｉＲＮＡのトランスフェクションについて、市販試薬のHiPerFectのそれと比較した。１８.７５および３７.５ｎｇ／ウェルで抗ラミンＡ／Ｃ ｓｉＲＮＡをＤＯＳＰまたは市販試薬HiPerFectと共に処方した。
【００８０】
図６Ｃに示したＨｅＬａ細胞のトランスフェクション後のヒト・ラミンＡ／Ｃ ｍＲＮＡのリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果は、ＤＯＳＰ試薬がHiPerFectより効率的（ＨＰＲＴ１に対して正規化）で効率的であったことを示している。
【００８１】
１.２.６：市販試薬と比較した脂質性パラモマイシン誘導体／ｓｉＲＮＡ複合体の遺伝子発現阻害活性
図７は、ＤＯＳＰ−ＤＯＰＥが、X-tremeGeneおよびリポフェクタミン(Lipofectamine)TM2000で観察されたものに比べて、ｄ２ＧＦＰでトランスフェクションされた細胞中のＧＦＰ蛍光レベルのより大きな減少を生じたことを示している。結果は、ＤＯＳＰ−ＤＯＰＥ／ｓｉＲＮＡ複合体で得られた残留ＧＦＰ発現により正規化された。ＤＯＳＰ−ＤＯＰＥとRNAiFectTM試薬との間には有意差は認められなかった。
【００８２】
１.２.７：ＧＦＰ発現阻害の動態特性
次に、カチオン性リポソーム／ｓｉＲＮＡ複合体のＧＦＰ発現に及ぼす影響を時間との関係として検討した（図８）。ＤＯＳＮ−ＤＯＰＥまたはＤＯＳＰ−ＤＯＰＥと複合体化されたｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞については、残留ＧＦＰ発現は５日間は約１０％であり、次いで次第に増大して９日目に１００％に戻った。ＤＯＳＴ−ＤＯＰＥ／ｓｉＲＮＡ複合体でトランスフェクションされた細胞は同様のＧＦＰ発現の経時変化を示したが、残留ＧＦＰ発現は約２０％であった。図８はまた、ＤＯＳＫ−ＤＯＰＥリポソームは２日目でＧＦＰ蛍光減少の最大値に至ったことを示している。
【００８３】
１.２.８：アミノグリコシド誘導体およびＢＧＴＣ−ＤＯＰＥリポソームによるプラスミドのin vitroトランスフェクション
我々は、アミノグリコシド誘導体が、ｄ２ＧＦＰ細胞中に、ｓｉＲＮＡだけでなく、ＧＦＰに抗して小ヘアピンＲＮＡをコードするプラスミドＤＮＡもまた導入する可能性についても評価した（図９）。結果は、カチオン性脂質／ＤＮＡ電荷比が増大するにつれてＧＦＰ発現が減少し、カチオン性脂質に依存した最小蛍光値に到達することを示した。例外はＤＯＳＮ−ＤＯＰＥ／ＤＮＡ複合体で、カチオン性脂質／ＤＮＡ電荷比の増大によるＧＦＰ発現の増大を生じた。これらの結果は、ルシフェラーゼをコードするプラスミドのトランスフェクションで得られたものとよく一致しており、ＧＦＰ発現阻害がトランスフェクション効率と相関していることを示した。
【００８４】
また、ＫＣＮＥ１をコードするプラスミドと、ＫＣＮＥ１ ｍＲＮＡに対して標的化されるｓｉＲＮＡとの共導入に対するアミノグリコシド類の可能性についても評価した。図９Ｂは、ＤＯＳＰ−ＤＯＰＥおよびＤＯＳＮ−ＤＯＰＥがＫＣＮＥ１ ｍＲＮＡの最小レベルを生じたことを示している。図９Ｄは、ｓｉＲＮＡによる共注入されたプラスミドの阻害がトランスフェクションされたｓｉＲＮＡ量に依存することを示している。
【００８５】
１.３：結論
脂質性アミノグリコシド誘導体／ｓｉＲＮＡ複合体のコロイド（としての）安定性は、電荷比に依存し、それぞれ負荷電、中性または正荷電の複合体に対応する、主要なゾーンＡ、ＢおよびＣを決定した。このコロイド安定性挙動は、ＤＮＡ分子とのリポポリアミンミセル（非特許文献４）、ビスグアニジニウムリポソーム（非特許文献６および本研究）またはＤＯＴＡＰリポソームの会合から得られた複合体で既に認められていたものであった。しかし、ゾーンＢは、ＤＮＡを新たに合成された脂質性アミノグリコシド誘導体と複合体化させたものと似ていたが、ｓｉＲＮＡとの複合体化では縮小していた。
【００８６】
また、これら３ゾーンでの脂質性アミノグリコシド誘導体／ｓｉＲＮＡ複合体の平均径は、脂質性アミノグリコシド／ＤＮＡ複合体で測定された径より小さかった。ゾーンＣでは、ＤＯＳＴ、ＤＯＳＫ、ＤＯＳＰおよびＤＯＳＮとのｓｉＲＮＡの会合から生成した複合体の平均径は、それぞれ約８１、１０５、５８および５７ｎｍであった。
【００８７】
脂質性アミノグリコシド誘導体の中でも、ｓｉＲＮＡを４,６−二置換２−デオキシストレプタミン環型アミノグリコシドまたはＢＧＴＣと複合体化した場合に比べて、４,５−二置換２−デオキシストレプタミン環型アミノグリコシドと複合体化した場合には、ゾーンＡとＢとの間の境界が低電荷比の方向にシフトした。
【００８８】
また、いずれの場合も約６.７ｎｍの規則的な（層間）間隔が観察されたが、２つの異なる種類のアミノグリコシドでは複合体のモフォロジー（形態）が異なっていた。４,６−二置換２−デオキシストレプタミン環型アミノグリコシドおよびＢＧＴＣとの複合体は、脂質二重層とｓｉＲＮＡの分子が規則的に重層化して作られた典型的な「タマネギ様」の構造を示したが、４,５−二置換２−デオキシストレプタミン環型アミノグリコシドとの複合体は、予想外にも、小さな密集構造からなるブドウ型の別の構造体を形成した。
【００８９】
この２種類のアミノグリコシドとの複合体のモフォロジーの違いは、現時点では完全には説明できない。しかし、２−デオキシストレプタミン４,６−二置換と２−デオキシストレプタミン４,５−二置換がそれぞれ円筒および円錐形状をとりうると仮定すると、脂質性誘導体の幾何学形状に関連している可能性がある。このことはカチオン性リポソームの生成およびサイズに影響を及ぼすかもしれない。長い距離にわたる同心の多重膜ラメラの構成は、崩壊してＤＮＡ分子をサンドイッチするように再集合することができる大きな初期リポソームでより容易に形成されたことが示されている。他方、小さなリポソームはミセルに似て層状のラメラ微小ドメインを生じる。
【００９０】
いずれにせよ、ゾーンＡとＢとの間の境界のシフトおよび４,６−二置換２−デオキシストレプタミン環型アミノグリコシドと４,５−二置換２−デオキシストレプタミン環型アミノグリコシドとの間の複合体構造の違いは、４,５−二置換２−デオキシストレプタミン環型アミノグリコシドとの複合体が示す、哺乳動物細胞における機能干渉のより高い誘導効率と関係していた。実際、遺伝子サイレンシング用の非常に効果的な複合体が、小直径（５７ｎｍ）および高いコロイド安定性を特徴とするパロモマイシン先端基ではゾーンＣにおいて得られた。
【００９１】
カチオン性脂質／核酸複合体は、正電荷の複合体と細胞膜との間の静電相互作用により媒介されるエンドサイトーシス過程を経て細胞内に内部移行することが知られている。エンドソーム・エスケープは、現在のカチオン性試薬の主要な制限的ステップの１つとして認められている。本発明の複合体の特に高い効率に対する確実な説明は利用できないが、脂質性４,５−二置換２−デオキシストレプタミン環型アミノグリコシド誘導体／ｓｉＲＮＡの複合体は、アミノグリコシド／ｓｉＲＮＡの小サイズでの自己集合ならびに小葉状の膜の負電荷密度と適合することができるアミノグリコシドの融通性に起因する構造上の特徴およびフリップフロップ機序の増大という特異的な物理化学的特性のために、細胞の細胞質内でのＲＮＡ放出を改善することができるということは考えられる。４,５−二置換２−デオキシストレプタミン環で得られた特定のモフォロジーは、４,６−二置換２−デオキシストレプタミン環で得られたものに比べてより不安定な超分子構造を生じて、この状態では、ＲＩＳＣ複合体（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）へのその取り込みとその後の遺伝子発現阻害にとって重要なステップであるｓｉＲＮＡのより促進された放出を付与するのであろう。
【００９２】
得られた結果はまた、４,５−二置換２−デオキシストレプタミン環型アミノグリコシドを有するトランスフェクション用化合物は、市販のトランスフェクション系よりさらに一層効率が高いことを示している。
【００９３】
総括すると、本発明者らは、かくしてｓｉＲＮＡトランスフェクションに特に適合したトランスフェクション用化合物を形成し、その特性を決定した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００９４】
【特許文献１】ＵＳ２００３−００５４５５６Ａ１
【非特許文献】
【００９５】
【非特許文献１】Sainlos M., Hauchecorne M., Oudrhiri N., Zertal-Zidani S., Aissaoui A., Vigeron JP., Lehn JM., Lehn P. 遺伝子トランスフェクション用ベクターとしてのカナマイシンＡ由来カチオン性脂質, Chembiochem. 2005年6月; 6(6):1023-33
【非特許文献２】Sainlos M., 生理活性物質による遺伝子導入, パリ第６大学博士論文、2004年7月6日
【非特許文献３】Belmont P., Aissaoui A., Hauchecorne M., Oudrhiri N., Petit L., Vigneron JP., Lehn JM., Lehn P., in vitroおよびin vivo遺伝子トランスフェクション用の効率的ベクターとしてのアミノグリコシド由来カチオン性脂質、 J. Gene Med. 2002 Sep-Oct; 4(5):517-26
【非特許文献４】Pitard, B., Aguerre, O., Airiau, M., Lachages, A.M., Boukhnikachivili, T., Byk, G., Dubertret, C., Herviou, C., Scherman, D., Mayaux, J.F., Crouzet, J., プラスミドＤＮＡとカチオン性ミセルとの間のウイルスサイズド自己集成ラメラ複合体は遺伝子導入を促進する, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94, 14412-14417
【非特許文献５】Pitard, B., Oudrhiri, N., Lambert, O., Vivien, E., Masson, C., Wetzer, B.,Hauchecorne, M., Scherman, D., Rigaud,nJ.L., Vigneron JP., Lehn JM., Lehn P., 立体安定化ＢＧＴＣ系リポプレックス:構造の特徴およびin vivoマウス気道内への遺伝子トランスフェクション, J. Gene Medicine (2001) 3, 478-487
【非特許文献６】Pitard, B., Oudrhiri, N., Vigneron JP., Hauchecorne, M., Aguerre, O., Toury,R., Airiau, M., Ramasawmy, R., Scherman, D., Crouzet, J., Lehn JM., Lehn P., 遺伝子トランスフェクション用グアニジニウム−コレステロール試薬により形成された超分子集合体の構造上の特性, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 92, 26211-2626
【図１】
0005407862.tif 000008
【図２Ａ】
0005407862.tif 000009
【図２Ｂ】
0005407862.tif 000010
【図２Ｃ】
0005407862.tif 000011
【図２Ｄ】
0005407862.tif 000012
【図３Ａ】
0005407862.tif 000013
【図３Ｂ】
0005407862.tif 000014
【図３Ｃ】
0005407862.tif 000015
【図３Ｄ】
0005407862.tif 000016
【図３Ｅ】
0005407862.tif 000017
【図４】
0005407862.tif 000018
【図５Ａ】
0005407862.tif 000019
【図５Ｂ】
0005407862.tif 000020
【図５Ｃ】
0005407862.tif 000021
【図５Ｄ】
0005407862.tif 000022
【図６Ａ】
0005407862.tif 000023
【図６Ｂ】
0005407862.tif 000024
【図６Ｃ】
0005407862.tif 000025
【図７】
0005407862.tif 000026
【図８】
0005407862.tif 000027
【図９Ａ】
0005407862.tif 000028
【図９Ｂ】
0005407862.tif 000029
【図９Ｃ】
0005407862.tif 000030
【図９Ｄ】
0005407862.tif 000031
【配列表】
0005407862000001.app