(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む一本鎖ＲＮＡ核酸分子であって、
領域（Ｘ）、リンカー領域（Ｌｘ）および領域（Ｘｃ）を含み、
前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）との間に、前記リンカー領域（Ｌｘ）が連結され、
前記領域（Ｘｃ）が、前記領域（Ｘ）と相補的であり、
前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）の少なくとも一方が、前記発現抑制配列を含み、
前記発現抑制配列が、１９塩基〜３０塩基であり、
前記領域（Ｘ）が、１９塩基〜３０塩基であり、
前記領域（Ｘｃ）が、１９塩基〜３０塩基であり、
前記リンカー領域（Ｌｘ）が、ピロリジン骨格およびピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有することを特徴とする標的遺伝子の発現を抑制する一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【請求項２】
前記リンカー領域（Ｌｘ）が、下記式（Ｉ）で表わされる構造、または下記式（Ｉ）が２つ以上連結された構造である、請求項１記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【化１】
0005555346.tif 000039
前記式中、
Ｃ＝Ｘ１およびＣ＝Ｘ２は、それぞれ独立して、ＣＨ２、ＣＯ、ＣＳまたはＣＮＨであり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｒ３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５またはＣ−６に結合する水素原子または置換基であり；
Ｌ１は、ｎ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｌは、１または２であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
環Ａは、前記環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素または硫黄で置換されてもよく、
前記環Ａ内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよく、
前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｘ）に結合し、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基である。
【請求項３】
前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）および前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）が、下記式（３）または式（５）の条件を満たす、請求項１または２記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
Ｘ＞Ｘｃ  ・・・（３）
Ｘ＝Ｘｃ  ・・・（５）
【請求項４】
前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）および前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）が、下記式（１１）の条件を満たす、請求項３記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
Ｘ−Ｘｃ＝１〜１０  ・・・（１１）
【請求項５】
前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）および前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）が、下記式（１１）の条件を満たす、請求項３または４記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
Ｘ−Ｘｃ＝１、２または３  ・・・（１１）
【請求項６】
前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）と、前記リンカー領域（Ｌｘ）の前記式（Ｉ）の構造との結合が、下記（１）または（３）の条件を満たす、請求項１から５のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
条件（１）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（３）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
【請求項７】
前記式（Ｉ）において、Ｌ１は、前記ポリエーテル鎖であり、前記ポリエーテル鎖が、ポリエチレングリコールである、請求項２から６のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【請求項８】
前記式（Ｉ）において、Ｌ１の原子個数（ｎ）とＬ２の原子個数（ｍ）との合計（ｍ＋ｎ）が、０〜３０の範囲である、請求項２から７のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【請求項９】
前記式（Ｉ）の構造が、下記式（Ｉ−１）〜式（Ｉ−９）のいずれか一つであり、下記式において、ｎは、０〜３０の整数、ｍは、０〜３０の整数、ｑは、０〜１０の整数である、請求項２から８のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【化３】
0005555346.tif 000040
【請求項１０】
前記式（Ｉ−１）において、ｎ＝８、前記（Ｉ−２）において、ｎ＝３、前記式（Ｉ−３）において、ｎ＝４または８、前記（Ｉ−４）において、ｎ＝７または８、前記式（Ｉ−５）において、ｎ＝３およびｍ＝４、前記（Ｉ−６）において、ｎ＝８およびｍ＝４、前記式（Ｉ−７）において、ｎ＝８およびｍ＝４、前記（Ｉ−８）において、ｎ＝５およびｍ＝４、前記式（Ｉ−９）において、ｑ＝１およびｍ＝４である、請求項９記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【請求項１１】
前記式（Ｉ−４）が、下記式（Ｉ−４ａ）であり、前記式（Ｉ−８）が、下記式（Ｉ−８ａ）である、請求項１０記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【化４】
0005555346.tif 000041
【請求項１２】
少なくとも１つの修飾された残基を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【請求項１３】
標識物質を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【請求項１４】
安定同位体を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【請求項１５】
前記一本鎖ＲＮＡ核酸分子において、塩基数の合計が、３８塩基以上である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【請求項１６】
前記遺伝子の発現抑制が、ＲＮＡ干渉による発現抑制である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【請求項１７】
標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、
請求項１から１６のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子を含むことを特徴とする、発現抑制用組成物。
【請求項１８】
請求項１から１６のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子を含むことを特徴とする、薬学的組成物。
【請求項１９】
炎症治療用である、請求項１８記載の薬学組成物。
【請求項２０】
非ヒト動物において、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、
請求項１から１６のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子を使用することを特徴とする発現抑制方法。
【請求項２１】
前記一本鎖ＲＮＡ核酸分子を、細胞、組織または器官に投与する工程を含む、請求項２０記載の発現抑制方法。
【請求項２２】
前記一本鎖ＲＮＡ核酸分子を、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで投与する、請求項２１記載の発現抑制方法。
【請求項２３】
前記遺伝子の発現抑制が、ＲＮＡ干渉による発現抑制である、請求項２０から２２のいずれか一項に記載の発現抑制方法。
【請求項２４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、
請求項１から１６のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子を使用することを特徴とする発現抑制方法。
【請求項２５】
非ヒト動物において、標的遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ干渉を誘導する方法であって、
請求項１から１６のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子を使用することを特徴とする誘導方法。
【請求項２６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、標的遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ干渉を誘導する方法であって、
請求項１から１６のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子を使用することを特徴とする誘導方法。
【請求項２７】
非ヒト動物の疾患の治療方法であって、
請求項１から１６のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子を、患者に投与する工程を含み、
前記一本鎖ＲＮＡ核酸分子が、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を有することを特徴とする治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現を抑制する一本鎖核酸分子に関し、より詳細には、含窒素脂環式骨格を有する一本鎖核酸分子、それを含む組成物およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の発現を抑制する技術として、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が知られている（非特許文献１）。ＲＮＡ干渉による遺伝子の発現抑制は、例えば、短い二本鎖のＲＮＡ分子を細胞等に投与することによって、実施されるのが一般的である。前記二本鎖のＲＮＡ分子は、通常、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）と呼ばれる。この他に、環状のＲＮＡ分子であって、分子内アニールにより、部分的に二重鎖を形成したＲＮＡ分子によっても、遺伝子の発現が抑制できることが報告されている（特許文献１）。しかしながら、これらの手法では、遺伝子の発現抑制を誘導するＲＮＡ分子は、以下のような問題がある。
【０００３】
まず、前記ｓｉＲＮＡを製造する場合、センス鎖およびアンチセンス鎖を別々に合成した上で、最後にこれらの鎖をハイブリダイズする工程が必要である。このため、製造効率が悪いという問題がある。また、前記ｓｉＲＮＡを細胞に投与する際、一本鎖ＲＮＡへの解離を抑制した状態で、細胞に投与する必要があるため、その取り扱い条件の設定にも労力を要する。つぎに、環状のＲＮＡ分子の場合、その合成が困難という問題がある。
【０００４】
また、これらのＲＮＡ分子は、基本的にヌクレオチド残基から構成されている。そして、前記ＲＮＡ分子に、なんらかの機能や標識を付与する場合、例えば、ヌクレオチド残基の構成要素である、塩基、糖残基またはリン酸基に修飾を施すしかないのが現状である。このため、ＲＮＡ干渉を利用した医薬品等の開発において、遺伝子発現の抑制機能を維持した状態で、さらなる機能や標識を付与するための改変が、極めて困難である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｆｉｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８  Ｆｅｂ  １９；３９１（６６６９）：８０６−１１
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国公開公報２００４−０５８８８６
【発明の概要】
【０００７】
そこで、本発明は、容易且つ効率よく製造方法が可能であり、遺伝子の発現を抑制可能な新たな核酸分子の提供を目的とする。
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明の核酸分子は、標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む一本鎖核酸分子であって、領域（Ｘ）、リンカー領域（Ｌｘ）および領域（Ｘｃ）を含み、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）との間に、前記リンカー領域（Ｌｘ）が連結され、前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）の少なくとも一方が、前記発現抑制配列を含み、前記リンカー領域（Ｌｘ）が、ピロリジン骨格およびピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有することを特徴とする。
【０００９】
本発明の組成物は、標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、前記本発明の一本鎖核酸分子を含むことを特徴とする。
【００１０】
本発明の組成物は、薬学的組成物であって、前記本発明の一本鎖核酸分子を含むことを特徴とする。
【００１１】
本発明の発現抑制方法は、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、前記本発明の一本鎖核酸分子を使用することを特徴とする。
【００１２】
本発明の疾患の治療方法は、前記本発明の一本鎖核酸分子を、患者に投与する工程を含み、前記一本鎖核酸分子が、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を有することを特徴とする。
【００１３】
本発明の一本鎖核酸分子は、遺伝子の発現抑制が可能であり、かつ、環状ではないため、その合成が容易であり、また、一本鎖であるため、二本鎖のアニール工程が無く、効率良く製造可能である。また、前記リンカー領域が前記非ヌクレオチド残基を含むため、例えば、従来のようなヌクレオチド残基の改変に限られず、例えば、前記リンカー領域における修飾等の改変も可能となる。
【００１４】
なお、本発明の一本鎖核酸分子の構造が、遺伝子の発現を抑制可能であることを見出したのは、本発明者が初めてである。本発明の一本鎖核酸分子の遺伝子の発現抑制効果は、ＲＮＡ干渉と同様の現象によるものと推測されるが、本発明における遺伝子発現抑制は、ＲＮＡ干渉に制限および限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の一本鎖核酸分子の一例を示す模式図である。
【図２】本発明の一本鎖核酸分子のその他の例を示す模式図である。
【図３】本発明の一本鎖核酸分子のその他の例を示す模式図である。
【図４】図４は、本発明の実施例におけるＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の実施例における安定性を示す電気泳動写真である。
【図６】図６は、本発明の実施例におけるＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明の実施例におけるｓｓＲＮＡに対するダイサータンパク質の反応性を示す電気泳動の結果である。
【図８】図８は、本発明の実施例におけるＡ５４９細胞のＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図９】図９は、本発明の実施例における２９３細胞のＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図１０】図１０は、本発明の実施例におけるＨＣＴ１１６細胞のＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図１１】図１１は、本発明の実施例におけるＨＣＴ１１６細胞のＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図１２】図１２は、本発明の実施例におけるＴＧＦ−β１遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図１３】図１３は、本発明の実施例における各投与群における単位重量の肺あたりのＴＧＦ−β１遺伝子発現量を示すグラフである。
【図１４】図１４（Ａ）は、本発明の実施例における各投与群のＢＡＬＦサンプル中のＴＮＦ−α量を示すグラフであり、図１４（Ｂ）は、本発明の実施例における各投与群のＢＡＬＦサンプル中のＩＦＮ−β量を示すグラフである。
【図１５】図１５は、本発明の実施例におけるリボヌクレアーゼ耐性を示す電気泳動写真である。
【図１６】図１６は、本発明の実施例におけるＳ７ヌクレアーゼ耐性を示す電気泳動写真である。
【図１７】図１７は、参考例で使用したｓｓＲＮＡを示す図である。
【図１８】図１８は、参考例におけるＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図１９】図１９は、参考例におけるＴＧＦ−β１遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図２０】図２０は、参考例におけるＬＡＭＡ１遺伝子の発現量の相対値を示すグラフである。
【図２１】図２１は、参考例におけるＬＭＮＡ遺伝子の発現量の相対値を示すグラフである。
【図２２】図２２は、参考例で使用したｓｓＲＮＡを示す図である。
【図２３】図２３は、参考例におけるＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書で使用する用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で用いることができる。
【００１７】
１．ｓｓＰＮ分子
本発明の一本鎖核酸分子は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む一本鎖核酸分子であって、領域（Ｘ）、リンカー領域（Ｌｘ）および領域（Ｘｃ）を含み、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）との間に、前記リンカー領域（Ｌｘ）が連結され、前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）の少なくとも一方が、前記発現抑制配列を含み、前記リンカー領域（Ｌｘ）が、ピロリジン骨格およびピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有することを特徴とする。
【００１８】
本発明において、「標的遺伝子の発現抑制」は、例えば、前記標的遺伝子の発現を阻害することを意味する。前記抑制のメカニズムは、特に制限されず、例えば、ダウンレギュレーションまたはサイレンシングでもよい。前記標的遺伝子の発現抑制は、例えば、前記標的遺伝子からの転写産物の生成量の減少、前記転写産物の活性の減少、前記標的遺伝子からの翻訳産物の生成量の減少、または前記翻訳産物の活性の減少等によって確認できる。前記タンパク質は、例えば、成熟タンパク質、または、プロセシングもしくは翻訳後修飾を受ける前の前駆体タンパク質等があげられる。
【００１９】
本発明の一本鎖核酸分子は、以下、本発明の「ｓｓＰＮ分子」ともいう。本発明のｓｓＰＮ分子は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、標的遺伝子の発現抑制に使用できることから、「標的遺伝子の発現抑制用ｓｓＰＮ分子」または「標的遺伝子の発現抑制剤」ともいう。また、本発明のｓｓＰＮ分子は、例えば、ＲＮＡ干渉により、前記標的遺伝子の発現を抑制できることから、「ＲＮＡ干渉用ｓｓＮＰ分子」、「ＲＮＡ干渉誘導用ｓｓＰＮ分子」または「ＲＮＡ干渉剤もしくはＲＮＡ干渉誘導剤」ともいう。また、本発明は、例えば、インターフェロン誘導等の副作用を抑制できる。
【００２０】
本発明のｓｓＰＮ分子は、その５’末端と３’末端とが未連結であり、線状一本鎖核酸分子ということもできる。
【００２１】
本発明のｓｓＰＮ分子において、前記発現抑制配列は、例えば、本発明のｓｓＰＮ分子が、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞内に導入された場合に、前記標的遺伝子の発現を抑制する活性を示す配列である。前記発現抑制配列は、特に制限されず、目的の標的遺伝子の種類に応じて、適宜設定できる。前記発現抑制配列は、例えば、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉に関与する配列を適宜適用できる。ＲＮＡ干渉は、一般に、長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、細胞内において、Ｄｉｃｅｒにより、３’末端が突出した１９〜２１塩基対程度の二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）に切断され、その一方の一本鎖ＲＮＡが標的ｍＲＮＡに結合して、前記ｍＲＮＡ分解することにより、前記ｍＲＮＡの翻訳を抑制する現象である。前記標的ｍＲＮＡに結合する前記ｓｉＲＮＡにおける一本鎖ＲＮＡの配列は、例えば、標的遺伝子の種類に応じて様々な種類が報告されている。本発明は、例えば、前記ｓｉＲＮＡの一本鎖ＲＮＡの配列を、前記発現抑制配列として使用できる。
【００２２】
なお、本発明は、前記標的遺伝子に対する前記発現抑制配列の配列情報がポイントではなく、前記発現抑制配列による前記標的遺伝子の発現抑制活性を、例えば、細胞内で機能させるための核酸分子の構造に関する。したがって、本発明においては、例えば、出願時において公知となっている前記ｓｉＲＮＡの一本鎖ＲＮＡ配列の他、将来的に明らかとなる配列に関しても、前記発現抑制配列として利用できる。
【００２３】
前記発現抑制配列は、例えば、前記標的遺伝子の所定領域に対して、９０％以上の相補性を有していることが好ましく、より好ましくは９５％であり、さらに好ましくは９８％であり、特に好ましくは１００％である。このような相補性を満たすことにより、例えば、オフターゲットを十分に軽減できる。
【００２４】
具体例として、標的遺伝子がＧＡＰＤＨ遺伝子の場合、前記発現抑制配列は、例えば、配列番号４に示す１９塩基長の配列が使用でき、標的遺伝子がＴＧＦ−β１の場合、前記発現抑制配列は、例えば、配列番号１８に示す２１塩基長の配列が使用でき、標的遺伝子がＬＡＭＡ１遺伝子の場合、前記発現抑制配列は、例えば、配列番号６に示す１９塩基長の配列が使用でき、標的遺伝子がＬＭＮＡ遺伝子の場合、例えば、配列番号３０に示す１９塩基長の配列が使用できる。
５’−GUUGUCAUACUUCUCAUGG−３’  （配列番号４）
５’−AAAGUCAAUGUACAGCUGCUU−３’  （配列番号１８）
５’−AUUGUAACGAGACAAACAC−３’  （配列番号６）
５’−UUGCGCUUUUUGGUGACGC−３’  （配列番号３０）
【００２５】
本発明のｓｓＰＮ分子による前記標的遺伝子の発現の抑制は、例えば、ＲＮＡ干渉が生じることによると推測される。なお、本発明は、このメカニズムにより限定されない。本発明のｓｓＰＮ分子は、例えば、いわゆるｓｉＲＮＡのように、二本の一本鎖ＲＮＡからなるｄｓＲＮＡとして、細胞等へ導入するものではなく、また、細胞内において、前記発現抑制配列の切り出しは、必ずしも必須ではない。このため、本発明のｓｓＰＮ分子は、例えば、ＲＮＡ干渉様の機能を有するということもできる。
【００２６】
本発明のｓｓＰＮ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記ピロリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造を有してもよいし、前記ピペリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造を有してもよいし、前記ピロリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造と、前記ピペリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造との両方を有してもよい。本発明のｓｓＰＮ分子は、例えば、生体内におけるインターフェロン誘導等の副作用を抑制でき、ヌクレアーゼ耐性に優れる。
【００２７】
本発明のｓｓＰＮ分子において、前記ピロリジン骨格は、例えば、ピロリジンの５員環を構成する炭素が、１個以上、置換されたピロリジン誘導体の骨格でもよく、置換される場合、例えば、Ｃ−２の炭素以外の炭素原子であることが好ましい。前記炭素は、例えば、窒素、酸素または硫黄で置換されてもよい。前記ピロリジン骨格は、例えば、ピロリジンの５員環内に、例えば、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよい。前記ピロリジン骨格において、ピロリジンの５員環を構成する炭素および窒素は、例えば、水素が結合してもよいし、後述するような置換基が結合してもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記ピロリジン骨格のいずれの基を介して、前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）と結合してもよく、好ましくは、前記５員環のいずれか１個の炭素原子と窒素であり、好ましくは、前記５員環の２位の炭素（Ｃ−２）と窒素である。前記ピロリジン骨格としては、例えば、プロリン骨格、プロリノール骨格等があげられる。前記プロリン骨格およびプロリノール骨格等は、例えば、生体内物質およびその還元体であるため、安全性にも優れる。
【００２８】
本発明のｓｓＰＮ分子において、前記ピペリジン骨格は、例えば、ピペリジンの６員環を構成する炭素が、１個以上、置換されたピペリジン誘導体の骨格でもよく、置換される場合、例えば、Ｃ−２の炭素以外の炭素原子であることが好ましい。前記炭素は、例えば、窒素、酸素または硫黄で置換されてもよい。前記ピペリジン骨格は、例えば、ピペリジンの６員環内に、例えば、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよい。前記ピペリジン骨格において、ピペリジンの６員環を構成する炭素および窒素は、例えば、水素基が結合してもよいし、後述するような置換基が結合してもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記ピペリジン骨格のいずれの基を介して、前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）と結合してもよく、好ましくは、前記６員環のいずれか１個の炭素原子と窒素であり、好ましくは、前記６員環の２位の炭素（Ｃ−２）と窒素である。
【００２９】
前記リンカー領域は、例えば、前記非ヌクレオチド構造からなる非ヌクレオチド残基のみを含んでもよいし、前記非ヌクレオチド構造からなる非ヌクレオチド残基と、ヌクレオチド残基とを含んでもよい。
【００３０】
本発明のｓｓＰＮ分子において、前記リンカー領域は、例えば、下記式（Ｉ）で表わされる。
【化１】
0005555346.tif 000002
【００３１】
前記式（Ｉ）中、例えば、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｒ３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５またはＣ−６に結合する水素原子または置換基であり、
Ｌ１は、ｎ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換れていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｌは、１または２であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
環Ａは、前記環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素、硫黄で置換されてもよく、
前記環Ａ内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよく、
前記領域（Ｙｃ）および前記領域（Ｙ）は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｙ）に結合し、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ)である。
【００３２】
前記式（Ｉ）中、Ｘ１およびＸ２は、例えば、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨである。前記式（Ｉ）中において、Ｘ１がＨ２であるとは、Ｘ１が、Ｘ１の結合する炭素原子とともに、ＣＨ２（メチレン基）を形成することを意味する。Ｘ２についても同様である。
【００３３】
前記式（Ｉ）中、Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳである。
【００３４】
前記式（Ｉ）中、環Ａにおいて、ｌは、１または２である。ｌ＝１の場合、環Ａは、５員環であり、例えば、前記ピロリジン骨格である。前記ピロリジン骨格は、例えば、プロリン骨格、プロリノール骨格等があげられ、これらの二価の構造が例示できる。ｌ＝２の場合、環Ａは、６員環であり、例えば、前記ピペリジン骨格である。環Ａは、環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素または硫黄で置換されてもよい。また、環Ａは、環Ａ内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよい。環Ａは、例えば、Ｌ型およびＤ型のいずれでもよい。
【００３５】
前記式（Ｉ）中、Ｒ３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５またはＣ−６に結合する水素原子または置換基である。Ｒ３が前記置換基の場合、置換基Ｒ３は、１でも複数でも、存在しなくてもよく、複数の場合、同一でも異なってもよい。
【００３６】
置換基Ｒ３は、例えば、ハロゲン、ＯＨ、ＯＲ４、ＮＨ２、ＮＨＲ４、ＮＲ４Ｒ５、ＳＨ、ＳＲ４またはオキソ基（＝Ｏ）等である。
【００３７】
Ｒ４およびＲ５は、例えば、それぞれ独立して、置換基または保護基であり、同一でも異なってもよい。前記置換基は、例えば、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキル、シリル、シリルオキシアルキル等があげられる。以下、同様である。置換基Ｒ３は、これらの列挙する置換基であってもよい。
【００３８】
前記保護基は、例えば、反応性の高い官能基を不活性に変換する官能基であり、公知の保護基等があげられる。前記保護基は、例えば、文献（J.  F.W.  McOmie,  「Protecting  Groups  in  Organic  Chemistry」PrenumPress,  London  and  New  York,  1973）の記載を援用できる。前記保護基は、特に制限されず、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ）、ビス（２−アセトキシエチルオキシ）メチル基（ＡＣＥ）、トリイソプロピルシリルオキシメチル基（ＴＯＭ）、１−（２−シアノエトキシ）エチル基（ＣＥＥ）、２−シアノエトキシメチル基（ＣＥＭ）およびトリルスルフォニルエトキシメチル基（ＴＥＭ）、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）等があげられる。Ｒ３がＯＲ４の場合、前記保護基は、特に制限されず、例えば、ＴＢＤＭＳ基、ＡＣＥ基、ＴＯＭ基、ＣＥＥ基、ＣＥＭ基およびＴＥＭ基等があげられる。この他にも、後述する［化５］のシリル含有基もあげられる。以下、同様である。
【００３９】
前記式（Ｉ）中、Ｌ１は、ｎ個の原子からなるアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、Ｌ１は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。前記ポリエーテル鎖は、例えば、ポリエチレングリコールである。なお、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ１がＯの場合、その酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接せず、ＯＲ１の酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接しない。
【００４０】
前記式（Ｉ）中、Ｌ２は、ｍ個の原子からなるアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、Ｌ２は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。なお、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ２がＯの場合、その酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接せず、ＯＲ２の酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接しない。
【００４１】
Ｌ１のｎおよびＬ２のｍは、特に制限されず、それぞれ、下限は、例えば、０であり、上限も、特に制限されない。ｎおよびｍは、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）の所望の長さに応じて、適宜設定できる。ｎおよびｍは、例えば、製造コストおよび収率等の点から、それぞれ、０〜３０が好ましく、より好ましくは０〜２０であり、さらに好ましくは０〜１５である。ｎとｍは、同じでもよいし（ｎ＝ｍ）、異なってもよい。ｎ＋ｍは、例えば、０〜３０であり、好ましくは０〜２０であり、より好ましくは０〜１５である。
【００４２】
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、例えば、それぞれ独立して、置換基または保護基である。前記置換基および前記保護基は、例えば、前述と同様である。
【００４３】
前記式（Ｉ）において、水素原子は、例えば、それぞれ独立して、Ｃｌ、Ｂｒ、ＦおよびＩ等のハロゲンに置換されてもよい。
【００４４】
前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）は、例えば、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｘ）に結合する。ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよい。Ｒ１およびＲ２が存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記式（Ｉ)の構造である。Ｒ１および／またはＲ２が前記ヌクレオチド残基の場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、ヌクレオチド残基Ｒ１および／またはＲ２を除く前記式（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基と、前記ヌクレオチド残基とから形成される。Ｒ１および／またはＲ２が前記式（Ｉ）の構造の場合、前記リンカー領域（Ｘｃ）は、例えば、前記式（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基が、２つ以上連結された構造となる。前記式（Ｉ）の構造は、例えば、１個、２個、３個または４個含んでもよい。このように、前記構造を複数含む場合、前記（Ｉ）の構造は、例えば、直接連結されてもよいし、前記ヌクレオチド残基を介して結合してもよい。他方、Ｒ１およびＲ２が存在しない場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記式（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基のみから形成される。
【００４５】
前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）と、−ＯＲ１−および−ＯＲ２−との結合の組合せは、特に制限されず、例えば、以下のいずれかの条件があげられる。
条件（１）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（２）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
【００４６】
前記式（Ｉ）の構造は、例えば、下記式（Ｉ−１）〜式（Ｉ−９）が例示でき、下記式において、ｎおよびｍは、前記式（Ｉ）と同じである。下記式において、ｑは、０〜１０の整数である。
【化２】
0005555346.tif 000003
【００４７】
前記式（Ｉ−１）〜（Ｉ−９）において、ｎ、ｍおよびｑは、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、前記式（Ｉ−１）において、ｎ＝８、前記（Ｉ−２）において、ｎ＝３、前記式（Ｉ−３）において、ｎ＝４または８、前記（Ｉ−４）において、ｎ＝７または８、前記式（Ｉ−５）において、ｎ＝３およびｍ＝４、前記（Ｉ−６）において、ｎ＝８およびｍ＝４、前記式（Ｉ−７）において、ｎ＝８およびｍ＝４、前記（Ｉ−８）において、ｎ＝５およびｍ＝４、前記式（Ｉ−９）において、ｑ＝１およびｍ＝４があげられる。前記式（Ｉ−４）の一例（ｎ＝８）を、下記式（Ｉ−４ａ）に、前記式（Ｉ−８）の一例（ｎ＝５、ｍ＝４）を、下記式（Ｉ−８ａ）に示す。
【化３】
0005555346.tif 000004
【００４８】
本発明のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）と相補的である。このため、本発明のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘｃ）が前記領域（Ｘ）に向かって折り返し、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが、自己アニーリングによって、二重鎖を形成可能である。本発明のｓｓＰＮ分子は、このように、分子内で二重鎖を形成可能であり、例えば、従来のＲＮＡ干渉に使用するｓｉＲＮＡのように、分離した２本の一本鎖ＲＮＡがアニーリングによって二本鎖ＲＮＡを形成するものとは、明らかに異なる構造である。
【００４９】
本発明のｓｓＰＮ分子は、例えば、前記領域（Ｘｃ）のみが折り返して前記領域（Ｘ）と二重鎖を形成してもよいし、さらに、他の領域において新たな二重鎖を形成してもよい。以下、前者のｓｓＰＮ分子、すなわち、二重鎖形成が１カ所である分子を「第１のｓｓＰＮ分子」といい、後者のｓｓＰＮ分子、すなわち、二重鎖形成が２カ所である分子を「第２のｓｓＰＮ分子」という。以下に、前記第１のｓｓＰＮ分子および前記第２のｓｓＰＮ分子について、例示するが、本発明は、これには制限されない。
【００５０】
（１）第１のｓｓＰＮ分子
前記第１のｓｓＰＮ分子は、例えば、前記領域（Ｘ）、前記領域（Ｘｃ）および前記リンカー領域（Ｌｘ）からなる分子である。
【００５１】
前記第１のｓｓＰＮ分子は、例えば、５’側から３’側にかけて、前記領域（Ｘｃ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記領域（Ｘ）を、前記順序で有してもよいし、３’側から５’側にかけて、前記領域（Ｘｃ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記領域（Ｘ）を、前記順序で有してもよい。
【００５２】
前記第１のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）に相補的である。ここで、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の全領域またはその部分領域に対して相補的な配列を有していればよく、好ましくは、前記領域（Ｘ）の全領域またはその部分領域に相補的な配列を含む、または、前記相補的な配列からなる。前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の相補的な前記全領域または相補的な前記部分領域に対して、例えば、完全に相補的でもよいし、１もしくは数塩基が非相補的であってもよいが、完全に相補的であることが好ましい。前記１塩基若しくは数塩基は、例えば、１〜３塩基、好ましくは１塩基または２塩基である。
【００５３】
前記第１のｓｓＰＮ分子において、前記発現抑制配列は、前述のように、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）の少なくとも一方に含まれる。前記第１のｓｓＰＮ分子は、前記発現抑制配列を、例えば、１つ有してもよいし、２つ以上有してもよい。
【００５４】
後者の場合、前記１のｓｓＰＮ分子は、例えば、同じ標的遺伝子に対する同じ発現抑制配列を２つ以上有してもよいし、同じ標的に対する異なる発現抑制配列を２つ以上有してもよいし、異なる標的遺伝子に対する異なる発現抑制配列を２つ以上有してもよい。前記第１のｓｓＰＮ分子が、２つ以上の前記発現抑制配列を有する場合、各発現抑制配列の配置箇所は、特に制限されず、前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）のいずれか一領域でもよいし、異なる領域であってもよい。前記第１のｓｓＰＮ分子が、異なる標的遺伝子に対する前記発現抑制配列を２つ以上有する場合、例えば、前記第１のｓｓＰＮ分子によって、２種類以上の異なる標的遺伝子の発現を抑制可能である。
【００５５】
前記第１のｓｓＰＮ分子の一例を、図１の模式図に示す。図１（Ａ）は、一例として、前記ｓｓＰＮ分子について、各領域の順序の概略を示す模式図であり、図１（Ｂ）は、前記ｓｓＰＮ分子が、前記分子内において二重鎖を形成している状態を示す模式図である。図１（Ｂ）に示すように、前記ｓｓＰＮ分子は、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）との間で、二重鎖が形成され、前記Ｌｘ領域が、その長さに応じてループ構造をとる。図１は、あくまでも、前記領域の連結順序および二重鎖を形成する各領域の位置関係を示すものであり、例えば、各領域の長さ、前記リンカー領域（Ｌｘ）の形状等は、これに制限されない。
【００５６】
前記第１のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）の塩基数は、特に制限されない。以下に各領域の長さを例示するが、本発明は、これには制限されない。本発明において、「塩基数」は、例えば、「長さ」を意味し、「塩基長」ということもできる。本発明において、塩基数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものであり、具体例として、「１〜４塩基」との記載は、「１、２、３、４塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
【００５７】
前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の全領域に完全に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の５’末端から３’末端の全領域に相補的な塩基配列からなることを意味し、すなわち、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが、同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の全ての塩基と相補的であることを意味する。
【００５８】
また、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の部分領域に完全に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の部分領域に相補的な塩基配列からなることを意味し、すなわち、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）よりも、１塩基以上短い塩基長の塩基配列からなり、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の前記部分領域の全ての塩基と相補的であることを意味する。前記領域（Ｘ）の前記部分領域は、例えば、前記領域（Ｘ）における、前記領域（Ｘｃ）側の末端の塩基（１番目の塩基）から連続する塩基配列からなる領域であることが好ましい。
【００５９】
前記第１のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）との関係は、例えば、下記（３）または（５）の条件を満たし、前者の場合、具体的には、例えば、下記（１１）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ  ・・・（３）
Ｘ−Ｘｃ＝１〜１０、好ましくは１、２または３、
より好ましくは１または２  ・・・（１１）
Ｘ＝Ｘｃ  ・・・（５）
【００６０】
前記領域（Ｘ）および／または前記領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記領域は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の塩基数は、例えば、１９〜３０塩基であり、好ましくは、１９、２０または２１塩基である。前記発現抑制配列を含む領域は、例えば、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜３１塩基であり、好ましくは、１〜２１塩基であり、より好ましくは、１〜１１塩基である。
【００６１】
前記領域（Ｘ）の塩基数は、特に制限されない。前記領域（Ｘ）が、前記発現抑制配列を含む場合、その下限は、例えば、１９塩基である。その上限は、例えば、５０塩基であり、好ましくは３０塩基であり、より好ましくは２５塩基である。前記領域（Ｘ）の塩基数の具体例は、例えば、１９塩基〜５０塩基であり、好ましくは、１９塩基〜３０塩基、より好ましくは１９塩基〜２５塩基である。
【００６２】
前記領域（Ｘｃ）の塩基数は、特に制限されない。その下限は、例えば、１９塩基であり、好ましくは２０塩基であり、より好ましくは２１塩基である。その上限は、例えば、５０塩基であり、より好ましくは４０塩基であり、さらに好ましくは３０塩基である。
【００６３】
前記ｓｓＰＮ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）の長さは、特に制限されない。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）とが二重鎖を形成可能な長さであることが好ましい。前記リンカー領域（Ｌｘ）が、前記非ヌクレオチド残基の他に、前記ヌクレオチド残基を含む場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）の塩基数は、その下限が、例えば、１塩基であり、好ましくは２塩基であり、より好ましくは３塩基であり、その上限が、例えば、１００塩基であり、好ましくは８０塩基であり、より好ましくは５０塩基である。
【００６４】
前記第１のｓｓＰＮ分子の全長は、特に制限されない。前記第１のｓｓＰＮ分子において、前記塩基数の合計（全長の塩基数）は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、その上限は、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。前記第１のｓｓＰＮ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）を除く塩基数の合計は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１  塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、上限が、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。
【００６５】
（２）第２のｓｓＰＮ分子
前記第２のｓｓＰＮ分子は、例えば、前記領域（Ｘ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記領域（Ｘｃ）の他に、さらに、領域（Ｙ）および前記領域（Ｙ）に相補的な領域（Ｙｃ）を有する分子である。前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とが連結して、内部領域（Ｚ）を形成している。なお、特に示さない限り、前記第２のｓｓＰＮ分子は、前記第１のｓｓＰＮ分子の記載を援用できる。
【００６６】
前記第２のｓｓＰＮ分子は、例えば、５’側から３’側にかけて、前記領域（Ｘｃ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）、前記領域（Ｘ）、前記領域（Ｙ）および前記領域（Ｙｃ）を、前記順序で有してもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）を、５’側領域（Ｘｃ）、前記内部領域（Ｚ）中の前記領域（Ｘ）を、内部５’側領域（Ｘ）、前記内部領域（Ｚ）中の前記領域（Ｙ）を、内部３’領域（Ｙ）、前記領域（Ｙｃ）を、３’側領域（Ｙｃ）ともいう。また、前記第２のｓｓＰＮ分子は、例えば、３’側から５’側にかけて、前記領域（Ｘｃ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）、前記領域（Ｘ）、前記領域（Ｙ）および前記領域（Ｙｃ）を、前記順序で有してもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）を、３’側領域（Ｘｃ）、前記内部領域（Ｚ）中の前記領域（Ｘ）を、内部３’側領域（Ｘ）、前記内部領域（Ｚ）中の前記領域（Ｙ）を、内部５’領域（Ｙ）、前記領域（Ｙｃ）を、５’側領域（Ｙｃ）ともいう。
【００６７】
前記内部領域（Ｚ）は、前述のように、例えば、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とが連結されている。前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）は、例えば、直接的に連結され、その間に介在配列を有していない。前記内部領域（Ｚ）は、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｙｃ）との配列関係を示すために、「前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）が連結して構成される」と定義するものであって、前記内部領域（Ｚ）において、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とが、前記ｓｓＰＮ分子の使用において、別個の独立した領域であることを限定するものではない。すなわち、例えば、前記内部領域（Ｚ）が、前記発現抑制配列を有する場合、前記内部領域（Ｚ）において、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とにわたって、前記発現抑制配列が配置されてもよい。
【００６８】
前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）に相補的である。ここで、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の全領域またはその部分領域に対して相補的な配列を有していればよく、好ましくは、前記領域（Ｘ）の全領域またはその部分領域に相補的な配列を含む、または、前記相補的な配列からなる。前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の相補的な前記全領域または相補的な前記部分領域に対して、例えば、完全に相補的でもよいし、１もしくは数塩基が非相補的であってもよいが、完全に相補的であることが好ましい。前記１塩基若しくは数塩基は、例えば、１〜３塩基、好ましくは１塩基または２塩基である。
【００６９】
前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｙｃ）は、前記領域（Ｙ）に相補的である。ここで、前記領域（Ｙｃ）は、前記領域（Ｙ）の全領域またはその部分領域に相補的な配列を有していればよく、好ましくは、前記領域（Ｙ）の全領域またはその部分領域に対して相補的な配列を含む、または、前記相補的な配列からなる。前記領域（Ｙｃ）は、前記領域（Ｙ）の相補的な前記全領域または相補的な前記部分領域に対して、例えば、完全に相補的でもよいし、１もしくは数塩基が非相補的であってもよいが、完全に相補的であることが好ましい。前記１塩基若しくは数塩基は、例えば、１〜３塩基、好ましくは１塩基または２塩基である。
【００７０】
前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記発現抑制配列は、例えば、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とから形成される前記内部領域（Ｚ）および前記領域（Ｘｃ）の少なくとも一つに含まれ、さらに、前記領域（Ｙｃ）に含まれてもよい。前記内部領域（Ｚ）が前記発現抑制配列を有する場合、例えば、前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｙ）のいずれに前記発現抑制配列を有してもよく、また、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とにわたって、前記発現抑制配列を有してもよい。前記第２のｓｓＰＮ分子は、前記発現抑制配列を、例えば、１つ有してもよいし、２つ以上有してもよい。
【００７１】
前記第２のｓｓＰＮ分子が、２つ以上の前記発現抑制配列を有する場合、各発現抑制配列の配置箇所は、特に制限されず、前記内部領域（Ｚ）および前記領域（Ｘｃ）のいずれか一方でもよいし、前記内部領域（Ｚ）および前記領域（Ｘｃ）のいずれか一方と、さらに他の異なる領域であってもよい。
【００７２】
前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）とは、例えば、直接連結してもよいし、間接的に連結してもよい。前者の場合、直接的な連結は、例えば、ホスホジエステル結合による連結等があげられる。後者の場合、例えば、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）との間に、リンカー領域（Ｌｙ）を有し、前記リンカー領域（Ｌｙ）を介して、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）とが連結している形態等があげられる。
【００７３】
前記第２のｓｓＰＮ分子が前記リンカー領域（Ｌｙ）を有する場合、前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、前記ヌクレオチド残基からなるリンカーでもよいし、前述した、ピロリジン骨格およびピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有するリンカーでもよい。後者の場合、前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、前記式（Ｉ）で表わすことができ、前記リンカー領域（Ｌｘ）における前記式（Ｉ）の説明を全て援用できる。
【００７４】
前記領域（Ｙｃ）および前記領域（Ｙ）は、例えば、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｙ）に結合する。ここで、Ｒ１およびＲ２は、前述のリンカー領域（Ｌｘ）と同様に、存在しても存在しなくてもよい。
【００７５】
前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）、ならびに、前記領域（Ｙｃ）および前記（Ｙ）と、前記−ＯＲ１−および−ＯＲ２−との結合の組合せは、特に制限されず、例えば、以下のいずれかの条件があげられる。
条件（１）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（２）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（３）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（４）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
【００７６】
前記第２のｓｓＰＮ分子について、前記リンカー領域（Ｌｙ）を有するｓｓＰＮ分子の一例を、図２の模式図に示す。図２（Ａ）は、一例として、前記ｓｓＰＮ分子について、５’側から３’側に向かって、各領域の順序の概略を示す模式図であり、図２（Ｂ）は、前記ｓｓＰＮ分子が、前記分子内において二重鎖を形成している状態を示す模式図である。図２（Ｂ）に示すように、前記ｓｓＰＮ分子は、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）との間、前記領域（Ｙ）と前記領域（Ｙｃ）との間で、二重鎖が形成され、前記Ｌｘ領域および前記Ｌｙ領域が、その長さに応じてループ構造をとる。図２は、あくまでも、各領域の連結順番および二重鎖を形成する各領域の位置関係を示すものであり、例えば、各領域の長さ、リンカー領域の形状等は、これに制限されない。また、図２は、前記領域（Ｘｃ）を５’側に示したが、これには制限されず、前記領域（Ｘｃ）が、３’側に位置してもよい。
【００７７】
前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘｃ）、前記領域（Ｘ）、前記領域（Ｙ）および前記領域（Ｙｃ）の塩基数は、特に制限されない。各領域の長さを以下に例示するが、本発明は、これには制限されない。
【００７８】
前記領域（Ｘｃ）は、前述のように、例えば、前記領域（Ｘ）の全領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）と同じ塩基長であり、前記領域（Ｘ）の全領域に相補的な塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｘｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｘ）と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補的である。なお、これには制限されず、例えば、前述のように、１もしくは数塩基が非相補的であってもよい。
【００７９】
また、前記領域（Ｘｃ）は、前述のように、例えば、前記領域（Ｘ）の部分領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の部分領域と同じ塩基長であり、すなわち、前記領域（Ｘ）よりも、１塩基以上短い塩基長の塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｘｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｘ）の前記部分領域と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の前記部分領域の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補的である。前記領域（Ｘ）の前記部分領域は、例えば、前記領域（Ｘ）における、前記領域（Ｘｃ）側の末端の塩基（１番目の塩基）から連続する塩基配列からなる領域であることが好ましい。
【００８０】
前記領域（Ｙｃ）は、前述のように、例えば、前記領域（Ｙ）の全領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｙｃ）は、例えば、前記領域（Ｙ）と同じ塩基長であり、前記領域（Ｙ）の全領域に相補的な塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｙｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｙ）と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｙｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｙ）の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補である。なお、これには制限されず、例えば、前述のように、１もしくは数塩基が非相補的であってもよい。
【００８１】
また、前記領域（Ｙｃ）は、前述のように、例えば、前記領域（Ｙ）の部分領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｙｃ）は、例えば、前記領域（Ｙ）の部分領域と同じ塩基長であり、すなわち、前記領域（Ｙ）よりも、１塩基以上短い塩基長の塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｙｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｙ）の前記部分領域と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｙｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｙ）の前記部分領域の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補である。前記領域（Ｙ）の前記部分領域は、例えば、前記領域（Ｙ）における、前記領域（Ｙｃ）側の末端の塩基（１番目の塩基）から連続する塩基配列からなる領域であることが好ましい。
【００８２】
前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記内部領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）と、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）および前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）との関係、前記内部領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）と、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）との関係は、例えば、下記式（１）および（２）の条件を満たす。
Ｚ＝Ｘ＋Ｙ  ・・・（１）
Ｚ≧Ｘｃ＋Ｙｃ  ・・・（２）
【００８３】
前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）の関係は、特に制限されず、例えば、下記式のいずれの条件を満たす。
Ｘ＝Ｙ  ・・・（１９）
Ｘ＜Ｙ  ・・・（２０）
Ｘ＞Ｙ  ・・・（２１）
【００８４】
第２のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）、前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）、前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）および前記領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）の関係は、例えば、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの条件を満たす。
（ａ）下記式（３）および（４）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ  ・・・（３）
Ｙ＝Ｙｃ  ・・・（４）
（ｂ）下記式（５）および（６）の条件を満たす。
Ｘ＝Ｘｃ  ・・・（５）
Ｙ＞Ｙｃ  ・・・（６）
（ｃ）下記式（７）および（８）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ  ・・・（７）
Ｙ＞Ｙｃ  ・・・（８）
（ｄ）下記式（９）および（１０）の条件を満たす。
Ｘ＝Ｘｃ  ・・・（９）
Ｙ＝Ｙｃ  ・・・（１０）
【００８５】
前記（ａ）〜（ｄ）において、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）の差、前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）と前記領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）の差は、例えば、下記条件を満たすことが好ましい。
（ａ）下記式（１１）および（１２）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝１〜１０、好ましくは１、２、３または４、
より好ましくは１、２または３  ・・・（１１）
Ｙ−Ｙｃ＝０  ・・・（１２）
（ｂ）下記式（１３）および（１４）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝０  ・・・（１３）
Ｙ−Ｙｃ＝１〜１０、好ましくは１、２、３または４、
より好ましくは１、２または３  ・・・（１４）
（ｃ）下記式（１５）および（１６）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝１〜１０、好ましくは、１、２または３、
より好ましくは１または２  ・・・（１５）
Ｙ−Ｙｃ＝１〜１０、好ましくは、１、２または３、
より好ましくは１または２  ・・・（１６）
（ｄ）下記式（１７）および（１８）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝０  ・・・（１７）
Ｙ−Ｙｃ＝０  ・・・（１８）
【００８６】
前記（ａ）〜（ｄ）の第２のｓｓＰＮ分子について、それぞれの構造の一例を、図３の模式図に示す。図３は、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）を含むｓｓＰＮであり、（Ａ）は、前記（ａ）のｓｓＰＮ分子、（Ｂ）は、前記（ｂ）のｓｓＰＮ分子、（Ｃ）は、前記（ｃ）のｓｓＰＮ分子、（Ｄ）は、前記（ｄ）のｓｓＰＮ分子の例である。図３において、点線は、自己アニーリングにより二重鎖を形成している状態を示す。図３のｓｓＰＮ分子は、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）を、前記式（２０）の「Ｘ＜Ｙ」と表わしたが、これには制限されず、前述のように、前記式（１９）の「Ｘ＝Ｙ」でも、前記式（２１）の「Ｘ＞Ｙ」でもよい。また、図３は、あくまでも前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）との関係、前記領域（Ｙ）と前記領域（Ｙｃ）との関係を示す模式図であり、例えば、各領域の長さ、形状、リンカー領域（Ｌｙ）の有無等は、これには制限されない。
【００８７】
前記（ａ）〜（ｃ）のｓｓＰＮ分子は、例えば、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）、および、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）が、それぞれ二重鎖を形成することによって、前記内部領域（Ｚ）において、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｙｃ）のいずれともアライメントしない塩基を有する構造であり、二重鎖を形成しない塩基を有する構造ともいえる。前記内部領域（Ｚ）において、前記アライメントしない塩基（二重鎖を形成しない塩基ともいう）を、以下、「フリー塩基」という。図３において、前記フリー塩基の領域を、「Ｆ」で示す。前記領域（Ｆ）の塩基数は、特に制限されない。前記領域（Ｆ）の塩基数（Ｆ）は、例えば、前記（ａ）のｓｓＰＮ分子の場合、「Ｘ−Ｘｃ」の塩基数であり、前記（ｂ）のｓｓＰＮ分子の場合、「Ｙ−Ｙｃ」の塩基数であり、前記（ｃ）のｓｓＰＮ分子の場合、「Ｘ−Ｘｃ」の塩基数と「Ｙ−Ｙｃ」の塩基数との合計数である。
【００８８】
他方、前記(ｄ)のｓｓＰＮ分子は、例えば、前記内部領域（Ｚ）の全領域が、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｙｃ）とアライメントする構造であり、前記内部領域（Ｚ）の全領域が二重鎖を形成する構造ともいえる。なお、前記（ｄ）のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘｃ）の５’末端と前記領域（Ｙｃ）の３’末端は、未連結である。
【００８９】
前記領域（Ｘｃ）、前記領域（Ｙｃ）、および前記内部領域（Ｚ）における前記フリー塩基（Ｆ）の塩基数の合計は、前記内部領域（Ｚ）の塩基数となる。このため、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｙｃ）の長さは、例えば、前記内部領域（Ｚ）の長さ、前記フリー塩基の数およびその位置に応じて、適宜決定できる。
【００９０】
前記内部領域（Ｚ）の塩基数は、例えば、１９塩基以上である。前記塩基数の下限は、例えば、１９塩基であり、好ましくは２０塩基であり、より好ましくは２１塩基である。前記塩基数の上限は、例えば、５０塩基であり、好ましくは４０塩基であり、より好ましくは３０塩基である。前記内部領域（Ｚ）の塩基数の具体例は、例えば、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、または、３０塩基である。前記内部領域（Ｚ）が、前記発現抑制配列を有する場合、例えば、この条件が好ましい。
【００９１】
前記内部領域（Ｚ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記内部領域（Ｚ）は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の塩基数は、例えば、１９〜３０塩基であり、好ましくは、１９、２０または２１塩基である。前記内部領域（Ｚ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜３１塩基であり、好ましくは、１〜２１塩基であり、より好ましくは、１〜１１塩基であり、さらに好ましくは、１〜７塩基である。
【００９２】
前記領域（Ｘｃ）の塩基数は、例えば、１〜２９塩基であり、好ましくは１〜１１塩基であり、好ましくは１〜７塩基であり、より好ましくは１〜４塩基であり、さらに好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。前記内部領域（Ｚ）または前記領域（Ｙｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、例えば、このような塩基数が好ましい。具体例として、前記内部領域（Ｚ）の塩基数が、１９〜３０塩基（例えば、１９塩基）の場合、前記領域（Ｘｃ）の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは１〜７塩基であり、より好ましくは１〜４塩基であり、さらに好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。
【００９３】
前記領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の長さは、例えば、前述の通りである。前記領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは、１〜７塩基である。
【００９４】
前記領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、１〜２９塩基であり、好ましくは１〜１１塩基であり、好ましくは１〜７塩基であり、より好ましくは１〜４塩基であり、さらに好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。前記内部領域（Ｚ）または前記領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、例えば、このような塩基数が好ましい。具体例として、前記内部領域（Ｚ）の塩基数が、１９〜３０塩基（例えば、１９塩基）の場合、前記領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは１〜７塩基であり、より好ましくは１塩基、２塩基、３塩基または４塩基であり、さらに好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。
【００９５】
前記領域（Ｙｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記領域（Ｙｃ）は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の長さは、例えば、前述の通りである。前記領域（Ｙｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは、１〜７塩基である。
【００９６】
前述のように、前記内部領域（Ｚ）、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、前記式（２）の「Ｚ≧Ｘｃ＋Ｙｃ」で表わすことができる。具体例として、「Ｘｃ＋Ｙｃ」の塩基数は、例えば、前記内部領域（Ｚ）と同じ、または、前記内部領域（Ｚ）より小さい。後者の場合、「Ｚ−（Ｘｃ＋Ｙｃ）」は、例えば、１〜１０、好ましくは１〜４、より好ましくは１、２または３である。前記「Ｚ−（Ｘｃ＋Ｙｃ）」は、例えば、前記内部領域（Ｚ）におけるフリーの領域（Ｆ）の塩基数（Ｆ）に相当する。
【００９７】
前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）の長さは、特に制限されない。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、前述の通りである。前記リンカー領域（Ｌｙ）の構成単位が塩基を含む場合、前記リンカー領域（Ｌｙ）の塩基数は、その下限が、例えば、１塩基であり、好ましくは２塩基であり、より好ましくは３塩基であり、その上限が、例えば、１００塩基であり、好ましくは８０塩基であり、より好ましくは５０塩基である。前記各リンカー領域の塩基数は、具体例として、例えば、１〜５０塩基、１〜３０塩基、１〜２０塩基、１〜１０塩基、１〜７塩基、１〜４塩基等が例示できるが、これには制限されない。
【００９８】
前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）と同じでもよいし、異なってもよい。
【００９９】
前記第２のｓｓＰＮ分子の全長は、特に制限されない。前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記塩基数の合計（全長の塩基数）は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、その上限は、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）およびリンカー領域（Ｌｙ）を除く塩基数の合計は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、上限が、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。
【０１００】
本発明のｓｓＰＮ分子は、前述のように、前記リンカー領域（Ｌｘ）が、前記非ヌクレオチド構造を有していればよく、その他の構成単位は、特に制限されない。前記構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基等があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基等があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、修飾されていない非修飾ヌクレオチド残基および修飾された修飾ヌクレオチド残基等があげられる。本発明のｓｓＰＮ分子は、例えば、前記修飾ヌクレオチド残基を含むことによって、ヌクレアーゼ耐性を向上し、安定性を向上可能である。また、本発明のｓｓＰＮ分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基の他に、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。
【０１０１】
前記領域（Ｘｃ）、前記領域（Ｘ）、前記領域（Ｙ）および前記領域（Ｙｃ）の構成単位は、それぞれ、前記ヌクレオチド残基が好ましい。前記各領域は、例えば、下記（１）〜（３）の残基で構成される。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
【０１０２】
前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記非ヌクレオチド残基のみから構成されてもよいし、前記非ヌクレオチドと前記ヌクレオチド残基から構成されてもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、下記（４）〜（７）の残基で構成される。
（４）非ヌクレオチド残基
（５）非ヌクレオチド残基および非修飾ヌクレオチド残基
（６）非ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
（７）非ヌクレオチド残基、非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
【０１０３】
前記リンカー領域（Ｌｙ）の構成単位は、特に制限されず、例えば、前述のように、前記ヌクレオチド残基および前記非ヌクレオチド残基等があげられる。前記リンカー領域は、例えば、前記ヌクレオチド残基のみから構成されてもよいし、前記非ヌクレオチド残基のみから構成されてもよいし、前記ヌクレオチド残基と前記非ヌクレオチド残基から構成されてもよい。前記リンカー領域は、例えば、下記（１）〜（７）の残基で構成される。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
（４）非ヌクレオチド残基
（５）非ヌクレオチド残基および非修飾ヌクレオチド残基
（６）非ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
（７）非ヌクレオチド残基、非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
【０１０４】
本発明のｓｓＰＮ分子は、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）を除き、前記ヌクレオチド残基のみから構成される分子、前記ヌクレオチド残基の他に前記非ヌクレオチド残基を含む分子等があげられる。本発明のｓｓＰＮ分子において、前記ヌクレオチド残基は、前述のように、例えば、前記非修飾ヌクレオチド残基のみでもよいし、前記修飾ヌクレオチド残基のみでもよいし、前記非修飾ヌクレオチド残基および前記修飾ヌクレオチド残基の両方であってもよい。前記ｓｓＰＮ分子が、前記非修飾ヌクレオチド残基と前記修飾ヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾ヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。本発明のｓｓＰＮ分子が、前記非ヌクレオチド残基を含む場合、前記非ヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１または２個である。
【０１０５】
本発明のｓｓＰＮ分子において、前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基が好ましい。この場合、本発明のｓｓＰＮ分子は、例えば、「ｓｓＲＮＡ分子」、または「Ｐ−ｓｓＲＮＡ分子」ともいう。前記ｓｓＲＮＡ分子は、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）を除き、前記リボヌクレオチド残基のみから構成される分子、前記リボヌクレオチド残基の他に前記非ヌクレオチド残基を含む分子等があげられる。前記ｓｓＲＮＡ分子において、前記リボヌクレオチド残基は、前述のように、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基のみでもよいし、前記修飾リボヌクレオチド残基のみでもよいし、前記非修飾リボヌクレオチド残基および前記修飾リボヌクレオチド残基の両方を含んでもよい。
【０１０６】
前記ｓｓＲＮＡ分子が、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記修飾リボヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾リボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。前記非修飾リボヌクレオチド残基に対する前記修飾リボヌクレオチド残基は、例えば、リボース残基がデオキシリボース残基に置換された前記デオキシリボヌクレオチド残基等があげられる。前記ｓｓＲＮＡ分子が、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記デオキシリボヌクレオチド残基を含む場合、前記デオキシリボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。
【０１０７】
本発明のｓｓＰＮ分子は、例えば、標識物質を含み、前記標識物質で標識化されてもよい。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体等があげられる。前記標識物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ４８８等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。前記同位体は、例えば、安定同位体および放射性同位体があげられ、好ましくは安定同位体である。前記安定同位体は、例えば、被ばくの危険性が少なく、専用の施設も不要であることから取り扱い性に優れ、また、コストも低減できる。また、前記安定同位体は、例えば、標識した化合物の物性変化がなく、トレーサーとしての性質にも優れる。前記安定同位体は、特に制限されず、例えば、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｓ、３４Ｓおよび３６Ｓ等があげられる。
【０１０８】
本発明のｓｓＰＮ分子は、前述のように、例えば、前記非ヌクレオチド構造に前記標識物質を導入することが好ましく、前記リンカー領域（Ｌｘ）の前記非ヌクレオチド残基に前記標識物質を導入することが好ましい。前記非ヌクレオチド残基への標識物質の導入は、例えば、簡便かつ安価に行うことができる。
【０１０９】
本発明のｓｓＰＮ分子は、前述のように、前記標的遺伝子の発現を抑制ができる。このため、本発明のｓｓＰＮ分子は、例えば、遺伝子が原因となる疾患の治療剤として使用できる。前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を含む前記ｓｓＰＮ分子であれば、例えば、前記標的遺伝子の発現抑制により、前記疾患を治療できる。本発明において、「治療」は、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。
【０１１０】
本発明のｓｓＰＮ分子の使用方法は、特に制限されず、例えば、前記標的遺伝子を有する投与対象に、前記ｓｓＰＮ分子を投与すればよい。
【０１１１】
前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官等があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物等があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｔｒｏでもよい。前記細胞は、特に制限されず、例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等の各種培養細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等の幹細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等があげられる。
【０１１２】
本発明において、発現抑制の対象となる前記標的遺伝子は、特に制限されず、所望の遺伝子を設定でき、前記遺伝子に応じて、前記発現抑制配列を適宜設計すればよい。
【０１１３】
本発明のｓｓＰＮ分子の具体例を以下に示すが、本発明はこれには何ら制限されない。前記ｓｓＰＮ分子の塩基配列は、例えば、配列番号３、１１、１４〜１７および２３の塩基配列が例示でき、また、前記塩基配列において、例えば、１もしくは数個の欠失、置換および／または付加された塩基配列でもよい。前記標的遺伝子がＧＡＰＤＨ遺伝子の場合、例えば、配列番号３および１１の塩基配列があげられ、標的遺伝子がＴＧＦ−β１の場合、例えば、配列番号１４〜１７および２３の塩基配列があげられる。
【０１１４】
本発明のｓｓＰＮ分子の使用に関しては、後述する本発明の組成物、発現抑制方法および治療方法等の記載を援用できる。
【０１１５】
本発明のｓｓＰＮ分子は、前述のように標的遺伝子の発現を抑制可能であることから、例えば、医薬品、診断薬および農薬、ならびに、農薬、医学、生命科学等の研究ツールとして有用である。
【０１１６】
本発明において、「アルキル」は、例えば、直鎖状または分枝状のアルキル基を含む。前記アルキルの炭素数は、特に制限されず、例えば、１〜３０であり、好ましくは、１〜６または１〜４である。前記アルキル基は、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ぺンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル等があげられる。好ましくは、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ぺンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル等があげられる。
【０１１７】
本発明において、「アルケニル」は、例えば、直鎖状または分枝状のアルケニルを含む。前記アルケニルは、前記アルキルにおいて、１個または複数の二重結合を有するもの等があげられる。前記アルケニルの炭素数は、特に制限されず、例えば、前記アルキルと同様であり、好ましくは２〜８である。前記アルケニルは、例えば、ビニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１，３−ブタジエニル、３−メチル−２−ブテニル等があげられる。
【０１１８】
本発明において、「アルキニル」は、例えば、直鎖状または分枝状のアルキニルを含む。前記アルキニルは、前記アルキルにおいて、１個または複数の三重結合を有するもの等があげられる。前記アルキニルの炭素数は、特に制限されず、例えば、前記アルキルと同様であり、好ましくは２〜８である。前記アルキニルは、例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル等があげられる。前記アルキニルは、例えば、さらに、１個または複数の二重結合を有してもよい。
【０１１９】
本発明において、「アリール」は、例えば、単環芳香族炭化水素基および多環芳香族炭化水素基を含む。前記単環芳香族炭化水素基は、例えば、フェニル等があげられる。前記多環芳香族炭化水素基は、例えば、１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントリル、２−アントリル、９−アントリル、１−フェナントリル、２−フェナントリル、３−フェナントリル、４−フェナントリル、９−フェナントリル等があげられる。好ましくは、例えば、フェニル、１−ナフチルおよび２−ナフチル等のナフチル等があげられる。
【０１２０】
本発明において、「ヘテロアリール」は、例えば、単環芳香族複素環式基および縮合芳香族複素環式基を含む。前記ヘテロアリールは、例えば、フリル（例：２−フリル、３−フリル）、チエニル（例：２−チエニル、３−チエニル）、ピロリル（例：１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル）、イミダゾリル（例：１−イミダゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル）、ピラゾリル（例：１−ピラゾリル、３−ピラゾリル、４−ピラゾリル）、トリアゾリル（例：１，２，４−トリアゾール−１−イル、１，２，４−トリアゾール−３−イル、１，２，４−トリアゾール−４−イル）、テトラゾリル（例：１−テトラゾリル、２−テトラゾリル、５−テトラゾリル）、オキサゾリル（例：２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、５−オキサゾリル）、イソキサゾリル（例：３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル）、チアゾリル（例：２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル）、チアジアゾリル、イソチアゾリル（例：３−イソチアゾリル、４−イソチアゾリル、５−イソチアゾリル）、ピリジル（例：２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル）、ピリダジニル（例：３−ピリダジニル、４−ピリダジニル）、ピリミジニル（例：２−ピリミジニル、４−ピリミジニル、５−ピリミジニル）、フラザニル（例：３−フラザニル）、ピラジニル（例：２−ピラジニル）、オキサジアゾリル（例：１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）、ベンゾフリル（例：２−ベンゾ［ｂ］フリル、−ベンゾ［ｂ］フリル、４−ベンゾ［ｂ］フリル、５−ベンゾ［ｂ］フリル、６−ベンゾ［ｂ］フリル、７−ベンゾ［ｂ］フリル）、ベンゾチエニル（例：２−ベンゾ［ｂ］チエニル、３−ベンゾ［ｂ］チエニル、４−ベンゾ［ｂ］チエニル、５−ベンゾ［ｂ］チエニル、６−ベンゾ［ｂ］チエニル、７−ベンゾ［ｂ］チエニル）、ベンズイミダゾリル（例：１−ベンゾイミダゾリル、２−ベンゾイミダゾリル、４−ベンゾイミダゾリル、５−ベンゾイミダゾリル）、ジベンゾフリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、キノキサリル（例：２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、６−キノキサリニル）、シンノリニル（例：３−シンノリニル、４−シンノリニル、５−シンノリニル、６−シンノリニル、７−シンノリニル、８−シンノリニル）、キナゾリル（例：２−キナゾリニル、４−キナゾリニル、５−キナゾリニル、６−キナゾリニル、７−キナゾリニル、８−キナゾリニル）、キノリル（例：２−キノリル、３−キノリル、４−キノリル、５−キノリル、６−キノリル、７−キノリル、８−キノリル）、フタラジニル（例：１−フタラジニル、５−フタラジニル、６−フタラジニル）、イソキノリル（例：１−イソキノリル、３−イソキノリル、４−イソキノリル、５−イソキノリル、６−イソキノリル、７−イソキノリル、８−イソキノリル）、プリル、プテリジニル（例：２−プテリジニル、４−プテリジニル、６−プテリジニル、７−プテリジニル）、カルバゾリル、フェナントリジニル、アクリジニル（例：１−アクリジニル、２−アクリジニル、３−アクリジニル、４−アクリジニル、９−アクリジニル）、インドリル（例：１−インドリル、２−インドリル、３−インドリル、４−インドリル、５−インドリル、６−インドリル、７−インドリル）、イソインドリル、フェナジニル（例：１−フェナジニル、２−フェナジニル）またはフェノチアジニル（例：１−フェノチアジニル、２−フェノチアジニル、３−フェノチアジニル、４−フェノチアジニル）等があげられる。
【０１２１】
本発明において、「シクロアルキル」は、例えば、環状飽和炭化水素基であり、炭素数は、例えば、３〜１５である。前記シクロアルキルは、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、橋かけ環式炭化水素基、スピロ炭化水素基等があげられ、好ましくは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、橋かけ環式炭化水素基等があげられる。
【０１２２】
本発明において、「橋かけ環式炭化水素基」は、例えば、ビシクロ［２．１．０］ペンチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［２．２．２］オクチルおよびビシクロ［３．２．１］オクチル、トリシクロ［２．２．１．０］ヘプチル、ビシクロ［３．３．１］ノナン、１−アダマンチル、２−アダマンチル等があげられる。
【０１２３】
本発明において、「スピロ炭化水素基」は、例えば、スピロ［３．４］オクチル等があげられる。
【０１２４】
本発明において、「シクロアルケニル」は、例えば、環状の不飽和脂肪族炭化水素基を包み、炭素数は、例えば、３〜７個である。前記基は、例えば、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル等があげられ、好ましくは、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル等である。前記シクロアルケニルは、例えば、環中に不飽和結合を有する橋かけ環式炭化水素基およびスピロ炭化水素基も含む。
【０１２５】
本発明において、「アリールアルキル」は、例えば、ベンジル、２−フェネチル、およびナフタレニルメチル等があげられ、「シクロアルキルアルキル」または「シクリルアルキル」は、例えば、シクロヘキシルメチル、アダマンチルメチル等があげられ、「ヒドロキシアルキル」は、例えば、例えば、ヒドロキシメチルおよび２−ヒドロキシエチル等があげられる。
【０１２６】
本発明において、「アルコキシ」は、例えば、前記アルキル−Ｏ−基を含み、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、およびｎ−ブトキシ等があげられ、「アルコキシアルキル」は、例えば、メトキシメチル等があげられ、「アミノアルキル」は、例えば、２−アミノエチル等があげられる。
【０１２７】
本発明において、「ヘテロシクリル」は、例えば、１−ピロリニル、２−ピロリニル、３−ピロリニル、１−ピロリジニル、２−ピロリジニル、３−ピロリジニル、ピロリジノン、１−イミダゾリニル、２−イミダゾリニル、４−イミダゾリニル、１−イミダゾリジニル、２−イミダゾリジニル、４−イミダゾリジニル、イミダゾリジノン、１−ピラゾリニル、３−ピラゾリニル、４−ピラゾリニル、１−ピラゾリジニル、３−ピラゾリジニル、４−ピラゾリジニル、ピペリジノン、ピペリジノ、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−ピペリジニル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニル、ピペラジノン、２−モルホリニル、３−モルホリニル、モルホリノ、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル等があげられる。
【０１２８】
本発明において、「ヘテロシクリルアルキル」は、例えば、ピペリジニルメチル、ピペラジニルメチル等があげられ、「ヘテロシクリルアルケニル」は、例えば、２−ピペリジニルエテニル等があげられ、「ヘテロアリールアルキル」は、例えば、ピリジルメチルおよびキノリン−３−イルメチル等があげられる。
【０１２９】
本発明において、「シリル」は、式Ｒ３Ｓｉ−で表される基を含み、Ｒは、独立して、前記アルキル、アリールおよびシクロアルキルから選択でき、例えば、トリメチルシリル基、tert-ブチルジメチルシリル基等があげられ、「シリルオキシ」は、例えば、トリメチルシリルオキシ基等があげられ、「シリルオキシアルキル」は、例えば、トリメチルシリルオキシメチル等があげられる。
【０１３０】
本発明において、「アルキレン」は、例えば、メチレン、エチレン、およびプロピレン等があげられる。
【０１３１】
本発明において、前述した各種基は、置換されてもよい。前記置換基は、例えば、ヒドロキシ、カルボキシ、ハロゲン、ハロゲン化アルキル（例：ＣＦ３、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＨ２ＣＣｌ３）、ニトロ、ニトロソ、シアノ、アルキル（例：メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル）、アルケニル（例：ビニル）、アルキニル（例：エチニル）、シクロアルキル（例：シクロプロピル、アダマンチル）、シクロアルキルアルキル（例：シクロヘキシルメチル、アダマンチルメチル）、シクロアルケニル（例：シクロプロペニル）、アリール（例：フェニル、ナフチル）、アリールアルキル（例：ベンジル、フェネチル）、ヘテロアリール（例：ピリジル、フリル）、ヘテロアリールアルキル（例：ピリジルメチル）、ヘテロシクリル（例：ピペリジル）、ヘテロシクリルアルキル（例：モルホリルメチル）、アルコキシ（例：メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ）、ハロゲン化アルコキシ（例：ＯＣＦ３）、アルケニルオキシ（例：ビニルオキシ、アリルオキシ）、アリールオキシ（例：フェニルオキシ）、アルキルオキシカルボニル（例：メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）、アリールアルキルオキシ（例：ベンジルオキシ）、アミノ［アルキルアミノ（例：メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ）、アシルアミノ（例：アセチルアミノ、ベンゾイルアミノ）、アリールアルキルアミノ（例：ベンジルアミノ、トリチルアミノ）、ヒドロキシアミノ］、アルキルアミノアルキル（例：ジエチルアミノメチル）、スルファモイル、オキソ等があげられる。
【０１３２】
２．ヌクレオチド残基
前記ヌクレオチド残基は、例えば、構成要素として、糖、塩基およびリン酸を含む。前記ヌクレオチド残基は、前述のように、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基等があげられる。前記リボヌクレオチド残基は、例えば、糖としてリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびＵ（ウラシル）を有し、前記デオキシリボース残基は、例えば、糖としてデオキシリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）を有る。
【０１３３】
前記ヌクレオチド残基は、未修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基等があげられる。前記未修飾ヌクレオチド残基は、前記各構成要素が、例えば、天然に存在するものと同一または実質的に同一であり、好ましくは、人体において天然に存在するものと同一または実質的に同一である。
【０１３４】
前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記未修飾ヌクレオチド残基を修飾したヌクレオチド残基である。前記修飾ヌクレオチドは、例えば、前記未修飾ヌクレオチド残基の構成要素のいずれが修飾されてもよい。本発明において、「修飾」は、例えば、前記構成要素の置換、付加および／または欠失、前記構成要素における原子および／または官能基の置換、付加および／または欠失であり、「改変」ということができる。前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、天然に存在するヌクレオチド残基、人工的に修飾したヌクレオチド残基等があげられる。前記天然由来の修飾ヌクレオチド残基は、例えば、リンバックら（Ｌｉｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４、Ｓｕｍｍａｒｙ：ｔｈｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｏｆ  ＲＮＡ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２１８３〜２１９６）を参照できる。また、前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記ヌクレオチドの代替物の残基であってもよい
【０１３５】
前記ヌクレオチド残基の修飾は、例えば、リボース−リン酸骨格（以下、リボリン酸骨格）の修飾等があげられる。
【０１３６】
前記リボリン酸骨格において、例えば、リボース残基を修飾できる。前記リボース残基は、例えば、２’位炭素を修飾でき、具体的には、例えば、２’位炭素に結合する水酸基を、水素またはフルオロ等に置換できる。前記２’位炭素の水酸基を水素に置換することで、リボース残基をデオキシリボースに置換できる。前記リボース残基は、例えば、立体異性体に置換でき、例えば、アラビノース残基に置換してもよい。
【０１３７】
前記リボリン酸骨格は、例えば、非リボース残基および／または非リン酸を有する非リボリン酸骨格に置換してもよい。前記非リボリン酸骨格は、例えば、前記リボリン酸骨格の非荷電体等があげられる。前記非リボリン酸骨格に置換された、前記ヌクレオチドの代替物は、例えば、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン等があげられる。前記代替物は、この他に、例えば、人工核酸モノマー残基等があげられる。具体例として、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）等があげられ、好ましくはＰＮＡである。
【０１３８】
前記リボリン酸骨格において、例えば、リン酸基を修飾できる。前記リボリン酸骨格において、糖残基に最も近いリン酸基は、αリン酸基と呼ばれる。前記αリン酸基は、負に荷電し、その電荷は、糖残基に非結合の２つの酸素原子にわたって、均一に分布している。前記αリン酸基における４つの酸素原子のうち、ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と非結合である２つの酸素原子は、以下、「非結合（ｎｏｎ−ｌｉｎｋｉｎｇ）酸素」ともいう。他方、前記ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と結合している２つの酸素原子は、以下、「結合（ｌｉｎｋｉｎｇ）酸素」という。前記αリン酸基は、例えば、非荷電となる修飾、または、前記非結合原子における電荷分布が非対称型となる修飾を行うことが好ましい。
【０１３９】
前記リン酸基は、例えば、前記非結合酸素を置換してもよい。前記酸素は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｓｅ（セレン）、Ｂ（ホウ素）、Ｃ（炭素）、Ｈ（水素）、Ｎ（窒素）およびＯＲ（Ｒは、例えば、アルキル基またはアリール基）のいずれかの原子で置換でき、好ましくは、Ｓで置換される。前記非結合酸素は、例えば、両方が置換されていることが好ましく、より好ましくは、両方がＳで置換される。前記修飾リン酸基は、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、ホスホネート水素、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、およびホスホトリエステル等があげられ、中でも、前記２つの非結合酸素が両方ともＳで置換されているホスホロジチオエートが好ましい。
【０１４０】
前記リン酸基は、例えば、前記結合酸素を置換してもよい。前記酸素は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｃ（炭素）およびＮ（窒素）のいずれかの原子で置換でき。前記修飾リン酸基は、例えば、Ｎで置換した架橋ホスホロアミデート、Ｓで置換した架橋ホスホロチオエート、およびＣで置換した架橋メチレンホスホネート等があげられる。前記結合酸素の置換は、例えば、本発明のｓｓＰＮ分子の５’末端ヌクレオチド残基および３’末端ヌクレオチド残基の少なくとも一方において行うことが好ましく、５’側の場合、Ｃによる置換が好ましく、３’側の場合、Ｎによる置換が好ましい。
【０１４１】
前記リン酸基は、例えば、前記リン非含有のリンカーに置換してもよい。前記リンカーは、例えば、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキサイドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノ等を含み、好ましくは、メチレンカルボニルアミノ基およびメチレンメチルイミノ基を含む。
【０１４２】
本発明のｓｓＰＮ分子は、例えば、３’末端および５’末端の少なくとも一方のヌクレオチド残基が修飾されてもよい。前記修飾は、例えば、３’末端および５’末端のいずれか一方でもよいし、両方でもよい。前記修飾は、例えば、前述の通りであり、好ましくは、末端のリン酸基に行うことが好ましい。前記リン酸基は、例えば、全体を修飾してもよいし、前記リン酸基における１つ以上の原子を修飾してもよい。前者の場合、例えば、リン酸基全体の置換でもよいし、欠失でもよい。
【０１４３】
前記末端のヌクレオチド残基の修飾は、例えば、他の分子の付加等があげられる。前記他の分子は、例えば、前述のような標識物質、保護基等の機能性分子等があげられる。前記保護基は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｓｉ（ケイ素）、Ｂ（ホウ素）、エステル含有基等があげられる。前記標識物質等の機能性分子は、例えば、本発明のｓｓＰＮ分子の検出等に利用できる。
【０１４４】
前記他の分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基のリン酸基に付加してもよいし、スペーサーを介して、前記リン酸基または前記糖残基に付加してもよい。前記スペーサーの末端原子は、例えば、前記リン酸基の前記結合酸素、または、糖残基のＯ、Ｎ、ＳもしくはＣに、付加または置換できる。前記糖残基の結合部位は、例えば、３’位のＣもしくは５’位のＣ、またはこれらに結合する原子が好ましい。前記スペーサーは、例えば、前記ＰＮＡ等のヌクレオチド代替物の末端原子に、付加または置換することもできる。
【０１４５】
前記スペーサーは、特に制限されず、例えば、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮ−、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、無塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、およびモルホリノ等、ならびに、ビオチン試薬およびフルオレセイン試薬等を含んでもよい。前記式において、ｎは、正の整数であり、ｎ＝３または６が好ましい。
【０１４６】
前記末端に付加する分子は、これらの他に、例えば、色素、インターカレート剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サッフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性担体（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コール酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射線標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋複合体）等があげられる。
【０１４７】
本発明のｓｓＰＮ分子は、前記５’末端が、例えば、リン酸基またはリン酸基アナログで修飾されてもよい。前記リン酸基は、例えば、５’一リン酸（(HO)2(O)P-O-5’）、５’二リン酸（(HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’三リン酸（(HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化、7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’一チオリン酸（ホスホロチオエート：(HO)2(S)P-O-5’）、５’一ジチオリン酸（ホスホロジチオエート：(HO)(HS)(S)P-O-5’）、５’−ホスホロチオール酸（(HO)2(O)P-S-5’）、硫黄置換の一リン酸、二リン酸および三リン酸（例えば、５’−α−チオ三リン酸、５’−γ−チオ三リン酸等）、５’−ホスホルアミデート（(HO)2(O)P-NH-5’、(HO)(NH2)(O)P-O-5’）、５’−アルキルホスホン酸（例えば、RP(OH)(O)-O-5’、(OH)2(O)P-5’-CH2、Ｒはアルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル等））、５’−アルキルエーテルホスホン酸（例えば、RP(OH)(O)-O-5’、Ｒはアルキルエーテル（例えば、メトキシメチル、エトキシメチル等））等があげられる。
【０１４８】
前記ヌクレオチド残基において、前記塩基は、特に制限されない。前記塩基は、例えば、天然の塩基でもよいし、非天然の塩基でもよい。前記塩基は、例えば、天然由来でもよいし、合成品でもよい。前記塩基は、例えば、一般的な塩基、その修飾アナログ等が使用できる。
【０１４９】
前記塩基は、例えば、アデニンおよびグアニン等のプリン塩基、シトシン、ウラシルおよびチミン等のピリミジン塩基等があげられる。前記塩基は、この他に、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン（ｎｕｂｕｌａｒｉｎｅ）、イソグアニシン（ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎｅ）等があげられる。前記塩基は、例えば、２−アミノアデニン、６−メチル化プリン等のアルキル誘導体；２−プロピル化プリン等のアルキル誘導体；５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン；５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン；６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン；５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル；８−ハロ化、アミノ化、チオール化、チオアルキル化、ヒドロキシル化および他の８−置換プリン；５−トリフルオロメチル化および他の５−置換ピリミジン；７−メチルグアニン；５−置換ピリミジン；６−アザピリミジン；Ｎ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニンを含む）；５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン；ジヒドロウラシル；３−デアザ−５−アザシトシン；２−アミノプリン；５−アルキルウラシル；７−アルキルグアニン；５−アルキルシトシン；７−デアザアデニン；Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン；２，６−ジアミノプリン；５−アミノ−アリル−ウラシル；Ｎ３−メチルウラシル；置換１，２，４−トリアゾール；２−ピリジノン；５−ニトロインドール；３−ニトロピロール；５−メトキシウラシル；ウラシル−５−オキシ酢酸；５−メトキシカルボニルメチルウラシル；５−メチル−２−チオウラシル；５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル；５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル；３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル；３−メチルシトシン；５−メチルシトシン；Ｎ４−アセチルシトシン；２−チオシトシン；Ｎ６−メチルアデニン；Ｎ６−イソペンチルアデニン；２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン；Ｎ−メチルグアニン；Ｏ−アルキル化塩基等があげられる。また、プリンおよびピリミジンは、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、「Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、８５８〜８５９頁、クロシュビッツジェーアイ（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ  Ｊ．Ｉ．）編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９０、およびイングリッシュら（Ｅｎｇｌｉｓｃｈら）、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０巻、ｐ．６１３に開示されるものが含まれる。
【０１５０】
前記修飾ヌクレオチド残基は、これらの他に、例えば、塩基を欠失する残基、すなわち、無塩基のリボリン酸骨格を含んでもよい。また、前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、米国仮出願第６０／４６５，６６５号（出願日：２００３年４月２５日）、および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０号（出願日：２００４年３月８日）に記載される残基が使用でき、本発明は、これらの文献を援用できる。
【０１５１】
３．本発明のｓｓＰＮ分子の合成方法
本発明のｓｓＰＮ分子の合成方法は、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。前記合成方法は、例えば、遺伝子工学的手法による合成法、化学合成法等があげられる。遺伝子工学的手法は、例えば、インビトロ転写合成法、ベクターを用いる方法、ＰＣＲカセットによる方法等があげられる。前記ベクターは、特に制限されず、プラスミド等の非ウイルスベクター、ウイルスベクター等があげられる。これに限定されない。前記化学合成法は、特に制限されず、例えば、ホスホロアミダイト法およびＨ−ホスホネート法等があげられる。前記化学合成法は、例えば、市販の自動核酸合成機を使用可能である。前記化学合成法は、一般に、アミダイトが使用される。前記アミダイトは、特に制限されず、市販のアミダイトとして、例えば、ＲＮＡＰｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ（２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳｉ、商品名、三千里製薬）、ＡＣＥアミダイト、ＴＯＭアミダイト、ＣＥＥアミダイト、ＣＥＭアミダイト、ＴＥＭアミダイト等があげられる。本発明のｓｓＰＮ分子については、例えば、前記式（Ｉ）で表わされるリンカー領域の合成の際、後述する本発明のモノマーを使用することが好ましい。
【０１５２】
４．組成物
本発明の発現抑制用組成物は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であり、前記本発明のｓｓＰＮ分子を含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明のｓｓＰＮ分子を含むことが特徴であり、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の発現抑制用組成物は、例えば、発現抑制用試薬ということもできる。
【０１５３】
本発明によれば、例えば、前記標的遺伝子が存在する対象に投与することで、前記標的遺伝子の発現抑制を行うことができる。
【０１５４】
また、本発明の薬学的組成物は、前述のように、前記本発明のｓｓＰＮ分子を含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明のｓｓＰＮ分子を含むことが特徴であり、その他の構成は何ら制限されない。本発明の薬学的組成物は、例えば、医薬品ということもできる。本発明の薬学的組成物は、例えば、医薬品ということもできる。
【０１５５】
本発明によれば、例えば、遺伝子が原因となる疾患の患者に投与することで、前記遺伝子の発現を抑制し、前記疾患を治療することができる。本発明において、「治療」は、前述のように、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。
【０１５６】
本発明において、治療の対象となる疾患は、特に制限されず、例えば、遺伝子の発現が原因となる疾患等があげられる。前記疾患の種類に応じて、その疾患の原因となる遺伝子を前記標的遺伝子に設定し、さらに、前記標的遺伝子に応じて、前記発現抑制配列を適宜設定すればよい。
【０１５７】
具体例として、前記標的遺伝子を前記ＴＧＦ−β１遺伝子に設定し、前記遺伝子に対する発現抑制配列を前記ｓｓＰＮ分子に配置すれば、例えば、炎症性疾患、具体的には、急性肺傷害等の治療に使用できる。
【０１５８】
本発明の発現抑制用組成物および薬学的組成物（以下、組成物という）の使用方法は、特に制限されず、例えば、前記標的遺伝子を有する投与対象に、前記ｓｓＰＮ分子を投与すればよい。
【０１５９】
前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官等があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物等があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｔｒｏでもよい。前記細胞は、特に制限されず、例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等の各種培養細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等の幹細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等があげられる。
【０１６０】
前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象に応じて適宜決定できる。前記投与対象が培養細胞の場合、例えば、トランスフェクション試薬を使用する方法、エレクトロポレーション法等があげられる。前記投与がｉｎ  ｖｉｖｏの場合、例えば、経口投与でもよいし、非経口投与でもよい。前記非経口投与は、例えば、注射、皮下投与、局所投与等があげられる。
【０１６１】
本発明の組成物は、例えば、本発明のｓｓＰＮ分子のみを含んでもよいし、さらにその他の添加物を含んでもよい。前記添加物は、特に制限されず、例えば、薬学的に許容された添加物が好ましい。前記添加物の種類は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択できる。
【０１６２】
本発明の組成物において、前記ｓｓＰＮ分子は、例えば、前記添加物と複合体を形成してもよい。前記添加物は、例えば、複合化剤ということもできる。前記複合体により、例えば、前記ｓｓＰＮ分子を効率よくデリバリーできる。前記ｓｓＰＮ分子と前記複合化剤との結合は、特に制限されず、例えば、非共有結合等があげられる。前記複合体は、例えば、包接複合体等があげられる。
【０１６３】
前記複合化剤は、特に制限されず、ポリマー、シクロデキストリン、アダマンチン等があげられる。前記シクロデキストリンは、例えば、線状シクロデキストリンコポリマー、線状酸化シクロデキストリンコポリマー等があげられる。
【０１６４】
前記添加剤は、この他に、例えば、担体、標的細胞への結合物質、縮合剤、融合剤等があげられる。
【０１６５】
前記担体は、例えば、高分子が好ましく、より好ましくは、生体高分子である。前記担体は、例えば、生分解性が好ましい。前記担体は、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、グロブリン等のタンパク質；例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、ヒアルロン酸等の糖質；脂質等があげられる。前記担体は、例えば、合成ポリアミノ酸等の合成ポリマーも使用できる。前記ポリアミノ酸は、例えば、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−マレイン酸無水物コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、又はポリホスファジン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｉｎｅ)等があげられる。
【０１６６】
前記結合物質は、例えば、甲状腺刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントプロテインＡ、ムチン糖質、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンＢ１２、ビオチン、ネプロキシン（Ｎｅｐｒｏｘｉｎ)、ＲＧＤペプチド、ＲＤＧペプチド擬似体等があげられる。
【０１６７】
前記融合剤および縮合剤は、例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）等のポリアミノ鎖等があげられる。ＰＥＩは、例えば、直鎖状および分岐状のいずれでもよく、また、合成物および天然物のいずれでもよい。前記ＰＥＩは、例えば、アルキル置換されてもよいし、脂質置換されてもよい。また、前記融合剤は、この他に、例えば、ポリヒスチジン、ポリイミダゾール、ポリピリジン、ポリプロピレンイミン、メリチン、ポリアセタール物質（例えば、カチオン性ポリアセタール等）等が使用できる。前記融合剤は、例えば、αらせん構造を有してもよい。前記融合剤は、例えば、メリチン等の膜崩壊剤でもよい。
【０１６８】
本発明の組成物は、例えば、前記複合体の形成等について、米国特許第６，５０９，３２３号、米国特許公報第２００３／０００８８１８号、ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０号等を援用できる。
【０１６９】
前記添加剤は、この他に、例えば、両親媒性分子等があげられる。前記両親媒性分子は、例えば、疎水性領域および親水性領域を有する分子である。前記分子は、例えば、ポリマーが好ましい。前記ポリマーは、例えば、二次構造を有するポリマーであり、反復性の二次構造を有するポリマーが好ましい。具体例としては、例えば、ポリペプチドが好ましく、より好ましくは、αらせん状ポリペプチド等である。
【０１７０】
前記両親媒性ポリマーは、例えば、２つ以上の両親媒性サブユニットを有するポリマーでもよい。前記サブユニットは、例えば、少なくとも１つの親水性基および１つの疎水性基を有する環状構造を有するサブユニット等があげられる。前記サブユニットは、例えば、コール酸等のステロイド、芳香族構造等を有してもよい。前記ポリマーは、例えば、芳香族サブユニット等の環状構造サブユニットとアミノ酸の両方を有してもよい。
【０１７１】
５．発現抑制方法
本発明の発現抑制方法は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、前記本発明のｓｓＰＮ分子を使用することを特徴とする。本発明の発現抑制方法は、前記本発明のｓｓＰＮ分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
【０１７２】
本発明の発現抑制方法において、前記遺伝子の発現抑制のメカニズムは、特に制限されず、例えば、ＲＮＡ干渉による発現抑制等があげられる。ここで、本発明の発現抑制方法は、例えば、前記標的遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ干渉を誘導する方法であり、前記本発明のｓｓＰＮ分子を使用することを特徴とする発現誘導方法ともいえる。
【０１７３】
本発明の発現抑制方法は、例えば、前記標的遺伝子が存在する対象に、前記ｓｓＰＮ分子を投与する工程を含む。前記投与工程により、例えば、前記投与対象に前記ｓｓＰＮ分子を接触させる。前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官等があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物等があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｔｒｏでもよい。
【０１７４】
本発明の発現抑制方法は、例えば、前記ｓｓＰＮ分子を単独で投与してもよいし、前記ｓｓＰＮ分子を含む前記本発明の組成物を投与してもよい。前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類の種類に応じて適宜選択できる。
【０１７５】
６．治療方法
本発明の疾患の治療方法は、前述のように、前記本発明のｓｓＰＮ分子を、患者に投与する工程を含み、前記ｓｓＰＮ分子が、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を有することを特徴とする。本発明の治療方法は、前記本発明のｓｓＰＮ分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。本発明の治療方法は、例えば、前記本発明の発現抑制方法を援用できる。
【０１７６】
７．ｓｓＰＮ分子の使用
本発明の使用は、前記標的遺伝子の発現抑制のための、前記本発明のｓｓＰＮ分子の使用である。また、本発明の使用は、ＲＮＡ干渉の誘導のための、前記本発明のｓｓＰＮ分子の使用である。
【０１７７】
本発明の核酸分子は、疾患の治療に使用するための核酸分子であって、前記核酸分子は、前記本発明のｓｓＰＮ分子であり、前記ｓｓＰＮ分子が、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を有することを特徴とする。
【０１７８】
８．モノマー
本発明のモノマーは、核酸合成用のモノマーであって、下記式（ＩＩ）の構造を有することを特徴とする。本発明のモノマーは、特に示さない限り、前記本発明のｓｓＰＮ分子の説明を援用できる。
【化４】
0005555346.tif 000005
【０１７９】
本発明のモノマーは、例えば、前記本発明のｓｓＰＮ分子の合成において、前記式（Ｉ）で表わされるリンカー領域（Ｌｘ）およびリンカー領域（Ｌｙ）を容易に合成できる。本発明のモノマーは、例えば、自動核酸合成用のアミダイトとして使用でき、例えば、一般的な核酸自動合成装置に適用可能である。前記合成方法は、例えば、ホスホロアミダイト法、および、Ｈ−ホスホネート法等があげられる。
【０１８０】
前記式中、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、保護基またはリン酸保護基であり；
Ｒ３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５またはＣ−６に結合する水素原子または置換基であり；
Ｌ１は、ｎ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨもしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｌは、１または２であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
環Ａは、前記環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素または硫黄で置換されてもよく、
前記環Ａ内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよい。
【０１８１】
前記式（ＩＩ）において、前記式（Ｉ）と同一箇所は、前記式（Ｉ）の説明を援用できる。具体的に、前記式（ＩＩ）において、例えば、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１、Ｙ２、Ｒ３、Ｌ１、Ｌ２、ｌ、ｍ、ｎおよび環Ａは、前記式（Ｉ）の説明を全て援用できる。
【０１８２】
前記式（ＩＩ）において、Ｒ１およびＲ２は、前述のように、それぞれ独立して、Ｈ、保護基またはリン酸保護基である。
【０１８３】
前記保護基は、例えば、前記式（Ｉ）における説明と同様であり、具体例として、例えば、群Ｉから選択できる。前記群Ｉは、例えば、ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基、ＴＢＤＭＳ基、ＡＣＥ基、ＴＯＭ基、ＣＥＥ基、ＣＥＭ基、ＴＥＭ基、および、下記式に示すシリル含有基があげられ、中でも、ＤＭｔｒ基および前記シリル含有基のいずれかであることが好ましい。
【化５】
0005555346.tif 000006
【０１８４】
前記リン酸保護基は、例えば、下記式で表わすことができる。
−Ｐ（ＯＲ６）（ＮＲ７Ｒ８）
前記式において、Ｒ６は、水素原子または任意の置換基である。置換基Ｒ６は、例えば、炭化水素基が好ましく、前記炭化水素基は、電子吸引基で置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい。置換基Ｒ６は、例えば、ハロゲン、ハロアルキル、ヘテロアリール、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキル、および、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル等の炭化水素等があげられ、さらに、電子吸引基で置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい。置換基Ｒ６は、具体的には、例えば、β−シアノエチル基、ニトロフェニルエチル基、メチル基等があげられる。
【０１８５】
Ｒ７およびＲ８は、それぞれ、水素原子または任意の置換基であり、同一でも異なっていてもよい。置換基Ｒ７およびＲ８は、例えば、炭化水素基が好ましく、前記炭化水素基は、さらに任意の置換基で置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい。前記炭化水素基は、例えば、前述した前記Ｒ６での列挙と同様であり、好ましくは、メチル基、エチル基、イソプロピル基である。この場合、−ＮＲ７Ｒ８は、具体的には、例えば、ジイソプロピルアミノ基、ジエチルアミノ基、エチルメチルアミノ基等があげられる。または、置換基Ｒ７およびＲ８が一体となって、それらが結合する窒素原子とともに（すなわち、−ＮＲ７Ｒ８が一体となって）、窒素含有環（例えば、ピペリジル基、モルホリノ基等）を形成してもよい。
【０１８６】
前記リン酸保護基の具体例としては、例えば、下記群ＩＩから選択できる。群ＩＩは、例えば、−P(OCH2CH2CN)(N(i-Pr)2)、−P(OCH3)(N(i-Pr)2)等があげられる。前記式において、i-Prは、イソプロピルを示す。
【０１８７】
前記式（ＩＩ）において、例えば、Ｒ１およびＲ２は、いずれか一方が、Ｈまたは保護基であり、他方が、Ｈまたはリン酸保護基である。好ましくは、例えば、Ｒ１が、前記保護基の場合、Ｒ２は、Ｈまたは前記リン酸保護基が好ましく、具体的には、Ｒ１が、前記群Ｉから選択される場合、Ｒ２は、Ｈまたは前記群ＩＩから選択されることが好ましい。また、好ましくは、例えば、Ｒ１が、前記リン酸保護基の場合、Ｒ２は、Ｈまたは前記保護基が好ましく、具体的には、Ｒ１が、前記群ＩＩから選択される場合、Ｒ２は、Ｈまたは前記群Ｉから選択されることが好ましい。
【０１８８】
前記式（ＩＩ）の構造は、例えば、下記式（ＩＩ−１）〜式（ＩＩ−９）が例示でき、下記式において、ｎおよびｍは、前記式（ＩＩ）と同じである。下記式において、ｑは、０〜１０の整数である。
【化６】
0005555346.tif 000007
【０１８９】
前記式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−９）において、ｎ、ｍおよびｑは、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、前記式（ＩＩ−１）において、ｎ＝８、前記（ＩＩ−２）において、ｎ＝３、前記式（ＩＩ−３）において、ｎ＝４または８、前記（ＩＩ−４）において、ｎ＝７または８、前記式（ＩＩ−５）において、ｎ＝３およびｍ＝４、前記（ＩＩ−６）において、ｎ＝８およびｍ＝４、前記式（ＩＩ−７）において、ｎ＝８およびｍ＝４、前記（ＩＩ−８）において、ｎ＝５およびｍ＝４、前記式（ＩＩ−９）において、ｑ＝１およびｍ＝４があげられる。前記式（ＩＩ−４）の一例（ｎ＝８）を、下記式（ＩＩ−４ａ）に、前記式（ＩＩ−８）の一例（ｎ＝５、ｍ＝４）を、下記式（ＩＩ−８ａ）に示す。
【化７】
0005555346.tif 000008
【０１９０】
本発明のモノマーは、例えば、前記標識物質を含むことが好ましく、中でも、前記安定同位体を含むことが好ましい。前記標識物質は、前述の通りである。
【０１９１】
本発明のモノマーが、前記安定同位体等の同位体を含む場合、例えば、簡便に、前記本発明のｓｓＰＮ分子に前記同位体を導入できる。同位体を有する前記モノマーは、例えば、前記同位体を導入したピロリジン骨格の原料およびピペリジン骨格の原料から、合成可能である。前記ピロリジン骨格の原料は、例えば、プロリンおよびプロリノール等があげられる。
【０１９２】
以下に、安定同位体が導入されたプロリンおよびプロリノールを原料として、安定同位体が導入された本発明のモノマーを同性するスキームを例示する。以下のスキームは例示であって、本発明は、これに制限されない。
【０１９３】
【化８】
0005555346.tif 000009
【０１９４】
安定同位体が導入されたプロリノールとして、例えば、重水素（Ｄ）が導入されたプロリノールは、例えば、下記式に示すように、のように、プロリンをＬｉＡｌＤ４で処理することで調製できる。
【化９】
0005555346.tif 000010
【０１９５】
安定同位体が導入されたプロリンとして、例えば、重酸素（１８Ｏ）が導入されたプロリンは、例えば、下記式に示すように、塩基性条件下で、プロリンメチルエステルをＨ２１８Ｏと反応させることにより調製できる。
【化１０】
0005555346.tif 000011
【０１９６】
重窒素（１５Ｎ）導入プロリン（プロリン−１５Ｎ）および重窒素（１５Ｎ）導入プロリノール（プロリノール−１５Ｎ）は、例えば、以下のスキームにより合成できる。すなわち、まず、フランまたはテトラヒドロフランと１５ＮＨ３とを反応させ、重窒素（１５Ｎ）導入ピロールを調製し、これをホルミル化して、重窒素（１５Ｎ）導入２−ホルミルピロールを得る。これをカルボン酸に酸化し、ピロール部位を還元することにより、プロリン−１５Ｎが合成できる。また、前記重窒素（１５Ｎ）導入２−ホルミルピロールを還元することで、プロリノール−１５Ｎを合成できる。
【化１１】
0005555346.tif 000012
【０１９７】
前記重炭素（１３Ｃ）導入プロリン（プロリン−１３Ｃ）および前記重炭素（１３Ｃ）導入プロリノール（プロリノール−１３Ｃ）は、例えば、以下のスキームにより合成できる。すなわち、まず、ピロールを、前記重炭素（１３Ｃ）導入ＤＭＦ（ＤＭＦ−１３Ｃ）によりホルミル化し、重炭素（１３Ｃ）導入２−ホルミルピロールを得る。これをカルボン酸に酸化し、ピロール部位を還元することにより、プロリン−１３Ｃを合成できる。また、前記重炭素（１３Ｃ）導入２−ホルミルピロールを還元することで、プロリノール−１３Ｃを合成できる。
【化１２】
0005555346.tif 000013
【０１９８】
このようにして、安定同位体が導入されたモノマーが合成可能であり、また、前記モノマーを合成用アミダイトとして使用することによって、安定同位体が前記リンカー領域に導入された核酸分子を合成可能である。
【０１９９】
以下に実施例等により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【０２００】
（実施例Ａ１）
１．プロリノールの合成
下記式に示すスキーム１に従い、ジメトキシトリチル基で保護されたプロリノールを合成した。
【０２０１】
【化１３】
0005555346.tif 000014
【０２０２】
（１）Ｆｍｏｃ−Ｌ−プロリノール（化合物２）
Ｌ−プロリノール（化合物１）（０．６１ｇ、６．０ｍｍｏｌ）を、純水７０ｍＬに溶解し、Ｌ−プロリノール水溶液を調製した。Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニロキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（２．０ｇ、６．０ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ１０ｍＬに溶解した。このＴＨＦ溶液を、前記Ｌ−プロリノール水溶液に加え、１時間撹拌して、両者を反応させた。この反応液を、液体画分と沈殿画分とに分離し、それぞれの画分を酢酸エチルで抽出し、それぞれ有機層を回収した。そして、それぞれの有機層を合わせた後、無水硫酸ナトリウムを添加して、水分を吸収させた（以下、乾燥という）。前記有機層をろ過して、ろ液を回収し、前記ろ液を減圧濃縮した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）により精製し、化合物２を得た（１．４ｇ、収率７４％）。以下に、化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）:  δ７．７７(２Ｈ，ｄ，Ｊ=７．７Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ)，７．６０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ），７．４０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ），７．３１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ），４．４０−４．５０（２Ｈ，ｍ，ＣＯＯＣＨ２），４．２２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，Ａｒ−ＣＨ），３．２０−３．８０（５Ｈ，ｍ，Ｈ−５，Ｈ−６），１．７５（３Ｈ，ｍ，Ｈ−３，Ｈ−４），１．４０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３）．
【０２０３】
（２）Ｆｍｏｃ−ＤＭＴｒ−Ｌ−プロリノール（化合物３）
前記Ｆｍｏｃ−Ｌ−プロリノール（化合物２）（１．４ｇ、４．３ｍｍｏｌ）を、ピリジン２０ｍＬに溶解して、３回共沸した。得られた残留物を、ピリジン２０ｍＬに溶解した。この溶液を、アルゴン下、氷浴中で、撹拌しながら、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴｒ−Ｃｌ）（１．８ｇ、５．３ｍｍｏｌ）を添加した。この反応液について、クロロホルム／メタノールのＴＬＣにより反応を追跡し、Ｆｍｏｃ−Ｌ−プロリノールのスポットが消えるまで、４時間反応させた。そして、過剰のＤＭＴｒ−Ｃｌをクエンチするために、前記反応液に、メタノール３ｍＬを加えて１０分撹拌した。前記反応液に、さらに、クロロホルムを加えた後、有機層を回収した。回収した前記有機層に、飽和食塩水による洗浄、５％炭酸水素ナトリウム水溶液による洗浄を行い、もう一度、飽和食塩水による洗浄を行った。洗浄後の有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過して、得られたろ液を減圧濃縮した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒クロロホルム、１％ピリジン）により精製し、化合物３を得た（２．０ｇ、収率７４％）。以下に、化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．７７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ），７．６０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ），７．４０−７．１８（１３Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），６．８９（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ），４．２０−４．４０（２Ｈ，ｍ，ＣＯＯＣＨ２），４．０２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，Ａｒ−ＣＨ），３．８０−３．１０（５Ｈ，ｍ，Ｈ−５，Ｈ−６），３．７３（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３），１．８４（３Ｈ，ｍ，Ｈ−３，Ｈ−４），１．５８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３）．
【０２０４】
（３）ＤＭＴｒ−Ｌ−プロリノール（化合物４）
前記Ｆｍｏｃ−ＤＭＴｒ−Ｌ−プロリノール（化合物３）（２．０ｇ、３．２ｍｍｏｌ）を、２０％ピペリジンを含むＤＭＦ溶液２５ｍＬに溶解し、１２時間撹拌した。この溶液を減圧濃縮し、得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８５：１５、１％ピリジン含有）で精製し、化合物４を得た（１．０ｇ、収率７８％）。以下に、化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４０−７．１４（９Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），６．８２（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ），３．７８（６Ｈ，ｓ，ＯＣＨ３），３．３１（１Ｈ，ｍ，Ｈ−６），３．０７（２Ｈ，ｍ，Ｈ−２，Ｈ−６），２．９０（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５），１．８４（３Ｈ，ｍ，Ｈ−３，Ｈ−４），１．４０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３）．
【０２０５】
２．アミダイト誘導体の合成
つぎに、下記式に示すスキーム２に従い、プロリノールを有するアミダイト誘導体を合成した。以下、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を、「ＥＤＣ」、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（４−ジメチルアミノピリジン）を「ＤＭＡＰ」という。
【０２０６】
【化１４】
0005555346.tif 000015
【０２０７】
（１）ＤＭＴｒ−アミド−Ｌ−プロリノール（化合物５）
前記ＤＭＴｒ−Ｌ−プロリノール（化合物４）（０．８０ｇ、２．０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（０．４６ｇ、２．４ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．２９ｇ、２．４ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン２０ｍＬに溶解して撹拌した。この溶液に、１０−ヒドロキシデカン酸（０．４５ｇ、２．４ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌した。この反応液について、酢酸エチルのＴＬＣにより反応を追跡し、ＤＭＴｒ−Ｌ−プロリノールのスポットが消えるまで、２０時間反応させた。そして、前記反応液に、ジクロロメタンを加えた後、有機層を回収した。回収した前記有機層を、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過して、得られたろ液を減圧濃縮し、その残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル、１％ピリジン含有）により精製し、化合物５を得た（０．７１ｇ，収率６２％）。以下に、化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４０−７．１４（９Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），  ６．８２（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ），３．７８（６Ｈ，ｓ，ＯＣＨ３），３．６８−２．９３（７Ｈ，ｍ，Ｈ−２，Ｈ−５，Ｈ−６），２．２７−１．７２（６Ｈ，ｍ，アルキル，Ｈ−３，Ｈ−４），１．５８（４Ｈ，ｓ，アルキル），１．３０（１０Ｈ，ｓ，アルキル）．
【０２０８】
（２）ＤＭＴｒ−アルキル−Ｌ−プロリノール（化合物６）
前記ＤＭＴｒ−Ｌ−プロリノール（化合物４）（０．８０ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を、メタノール１５ｍＬに溶解し、５−ヒドロキシペンタナール（０．３１ｇ、３．０ｍｍｏｌ）を加えて撹拌した。この溶液に、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（０．２５ｇ、４．０ｍｍｏｌ）を加え、さらに撹拌した。この反応液について、酢酸エチル／ヘキサンのＴＬＣにより反応を追跡し、ＤＭＴｒ−Ｌ−プロリノールのスポットが消えるまで、２４時間反応させた。そして、前記反応液に、酢酸エチルを加え、有機層を回収した。回収した前記有機層を、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過して、得られたろ液を減圧濃縮し、その残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１、１％ピリジン含有）により精製し、化合物６を得た（０．６２ｇ、収率６３％）。以下に、化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４０−７．１４（９Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），６．８２（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ），３．７８（６Ｈ，ｓ，ＯＣＨ３），３．７０−２．８６（４Ｈ，ｍ，ＣＨ２ＯＨ，Ｈ−６），２．０６−１．７９（５Ｈ，ｍ，アルキル，Ｈ−２，Ｈ−５），１．７４−１．４９（６Ｈ，ｍ，アルキル，Ｈ−３，Ｈ−４），１．４５−１．２７（４Ｈ，ｍ，アルキル）．
【０２０９】
（３）ＤＭＴｒ−ウレタン−Ｌ−プロリノール（化合物７）
１，４−ブタンジオール（０．９０ｇ、１０ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン３０ｍＬに溶解し、さらに、カルボニルジイミダゾール（１．４ｇ、８．６ｍｍｏｌ）を加え、３時間撹拌した。この反応液の有機層を、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過して、得られたろ液を減圧濃縮し、その残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９：１）により精製した。これによって、１，４−ブタンジオールの一方の末端がカルボニルジイミダゾールで活性化された化合物を得た（０．２５ｇ，１．５ｍｍｏｌ）。この化合物をジクロロメタン１５ｍＬに溶解し、前記ＤＭＴｒ−Ｌ−プロリノール（化合物４）（０．６ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を添加し、２４時間撹拌した。この混合液に、さらに、酢酸エチルを加え、有機層を回収した。回収した前記有機層を、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過して、得られたろ液を減圧濃縮し、その残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１、１％ピリジン含有）により精製し、化合物７を得た（０．６１ｇ、収率７７％）。以下に、化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４０−７．１４（９Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），６．８２（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ），４．２４−３．９４（２Ｈ，ｍ，ＣＯＯＣＨ２），３．７８（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３），３．７２−２．９６（７Ｈ，ｍ，アルキル，Ｈ−２，Ｈ−５，Ｈ−６），２．１０−１．３０（８Ｈ，ｍ，アルキル，Ｈ−３，Ｈ−４）．
【０２１０】
（４）ＤＭＴｒ−ウレイド−L−プロリノール（化合物８）
前記ＤＭＴｒ−Ｌ−プロリノール（化合物４）（０．５０ｇ、１．２ｍｍｏｌ）およびトリホスゲン（０．１２ｇ、０．４０ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン８ｍＬに溶解し、アルゴン下、氷浴中で、撹拌した。そして、前記溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．３１ｇ、２．４ｍｍｏｌ）を添加し、１時間撹拌した。さらに、前記溶液に、８−アミノ−１−オクタノール（０．１７ｇ、１．２ｍｍｏｌ）を添加し、同様にして氷浴中で３０分撹拌した後、室温で２０時間撹拌した。前記溶液に、ジクロロメタンを加え、有機層を回収した。回収した前記有機層を、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過して、得られたろ液を減圧濃縮し、その残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１、１％トリエチルアミン含有）により精製し、化合物８を得た（０．４４ｇ、収率６２％）。以下に、化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４０−７．１４（９Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），６．８２（４Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），３．７８（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３），３．６８−３．２５（９Ｈ，ｍ，ＣＨ２ＮＨ，ＣＨ２ＯＨ，Ｈ−２，Ｈ−５，Ｈ−６），１．７４−１．１８（１６Ｈ，ｍ，アルキル，Ｈ−３，Ｈ−４）．
【０２１１】
（５）プロリノールを有するアミダイト誘導体（化合物９〜１２）
前記修飾プロリノール（化合物５〜８）を、それぞれ原料として、以下に示す方法により、化合物９〜１２を合成した。前記修飾プロリノールおよび５−ベンジルチオ−１Ｈ−テトラゾールを、アセトニトリル３ｍＬに溶解した。前記修飾プロリノールの使用量は、化合物５の場合、０．６９ｇ（１．２ｍｍｏｌ）、化合物６の場合、０．６０ｇ（１．２ｍｍｏｌ）、化合物７の場合、０．６０ｇ（１．２ｍｍｏｌ）、化合物８の場合、０．２５ｇ（０．４３ｍｍｏｌ）とした。また、５−ベンジルチオ−１Ｈ−テトラゾールの使用量は、化合物５〜７に対しては、０．１５ｇ（０．７８ｍｍｏｌ）、化合物８に対しては、５４ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ）とした。前記溶液に、アルゴン下、２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトを添加し、２時間撹拌した。前記２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトの添加量は、前記化合物５〜７を使用した系では、０．５４ｇ（１．８ｍｍｏｌ）とし、前記化合物８を使用した系では、０．１９ｇ（０．６４ｍｍｏｌ）とした。そして、前記溶液に、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を添加し、さらに、ジクロロメタンで抽出し、有機層を回収した。回収した前記有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過して、得られたろ液を減圧濃縮し、その残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１、１％トリエチルアミン含有）により精製し、化合物９〜１２を得た。以下に、各化合物のＮＭＲの結果を示す。
【０２１２】
ＤＭＴｒ−アミド−Ｌ−プロリノールアミダイト（化合物９、０．６０ｇ、収率５５％）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ７．４０−７．１４（９Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），６．８２（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ），３．７８（６Ｈ，ｓ，ＯＣＨ３），３．６８−２．９３（１１Ｈ，ｍ，ＣＨ２Ｏ，ＰＯＣＨ２，ＣＨＣＨ３，Ｈ−２，Ｈ−５，Ｈ−６），２．５８（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２ＣＮ），２．２７−１．７２（６Ｈ，ｍ，アルキル，Ｈ−３，Ｈ−４），１．５８（４Ｈ，ｓ，アルキル），１．３０（２２Ｈ，ｓ，アルキル，ＣＨＣＨ３）．
【０２１３】
ＤＭＴｒ−アルキル−Ｌ−プロリノールアミダイト（化合物１０、０．７１ｇ、収率６０％）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４０−７．１４（９Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），６．８２（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ），３．７８（６Ｈ，ｓ，ＯＣＨ３），３．７０−２．８６（８Ｈ，ｍ，ＣＨ２Ｏ，ＰＯＣＨ２，ＣＨＣＨ３，Ｈ−６），２．５８（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２ＣＮ），２．０６−１．７９（５Ｈ，ｍ，アルキル，Ｈ−２，Ｈ−５），１．７４−１．４９（６Ｈ，ｍ，アルキル，Ｈ−３，Ｈ−４），１．３７−１．１０（１６Ｈ，ｍ，アルキル，ＣＨＣＨ３）．
【０２１４】
ＤＭＴｒ−ウレタン−Ｌ−プロリノールアミダイト（化合物１１、０．６７ｇ、収率５２％）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４０−７．１４（９Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），６．８２（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ），４．２４−３．９４（２Ｈ，ｍ，ＣＯＯＣＨ２），３．７８（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３），３．７２−２．９６（１１Ｈ，ｍ，ＣＨ２Ｏ，ＰＯＣＨ２，ＣＨＣＨ３，Ｈ−２，Ｈ−５，Ｈ−６），２．５８（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２ＣＮ），２．１０−１．４６（８Ｈ，ｍ，アルキル，Ｈ−３，Ｈ−４），１．３４−１．１０（１２Ｈ，ｍ，ＣＨＣＨ３）．
【０２１５】
ＤＭＴｒ−ウレイド−Ｌ−プロリノールアミダイト（化合物１２、０．２０ｇ、収率６１％）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４０−７．１４（９Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），６．８２（４Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），３．７８（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３），３．６５−３．２５（１３Ｈ，ｍ，ＣＨ２Ｏ，ＰＯＣＨ２，ＣＨＣＨ３，Ｈ−２，ＣＨ２ＮＨ，ＣＨ２ＯＨ，Ｈ−２，Ｈ−５，Ｈ−６），２．７３（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２ＣＮ），２．１０−１．４８（１６Ｈ，ｍ，アルキル，Ｈ−３，Ｈ−４），１．３５−１．１０（１２Ｈ，ｍ，ＣＨＣＨ３）．
【０２１６】
（実施例Ａ２）
つぎに、下記式に示すスキーム３に従い、Ｌ−プロリンを有するアミダイト誘導体を合成した。
【０２１７】
【化１５】
0005555346.tif 000016
【０２１８】
（１）ＤＭＴｒ−ヒドロキシアミドアミノ−Ｌ−プロリン（化合物１１）
ＤＭＴｒ−アミド−Ｌ−プロリン（化合物６）（１．００ｇ、２．０５ｍｍｏｌ）および５−ヒドロキシペンタナール（０．３３ｇ、３．０７ｍｍｏｌ）を含むエタノール溶液（７ｍＬ）に、氷冷下、酢酸緩衝液（７ｍＬ）を加えた。この混合液を、氷冷下、２０分撹拌した後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（０．７７ｇ、１２．２８ｍｍｏｌ）を加え、さらに、室温下、７時間撹拌した。前記混合液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した後、さらに飽和食塩水で洗浄した。そして、前記有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過し、ろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ＝９８：２、０．０５％ピリジン含有）に供した。ついで、得られた生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ＝９８：２、０．０５％ピリジン含有）に供し、さらに、得られた生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ジクロロメタン：アセトン＝７：３、０．０５％ピリジン含有）に供した。これによって、無色シロップ状の化合物１１を得た（０．４９ｇ、収率４１％）。
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ５７５（Ｍ＋）、３０３（ＤＭＴｒ＋）
【０２１９】
（２）ＤＭＴｒ−アミドアミノ−Ｌ−プロリンアミダイト（化合物１２）
得られた前記ＤＭＴｒ−ヒドロキシアミドアミノ−Ｌ−プロリン（化合物１１）（０．５０ｇ、０．８７ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリルと混合し、室温で共沸乾燥した。得られた残留物に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（１７８ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）を加え、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に対し、無水アセトニトリル（１ｍＬ）を加え、さらに、２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（３１３ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（１ｍＬ）を加えた。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で４時間撹拌した。そして、前記混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水および飽和食塩水で、順次洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られた前記ろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣を、充填剤としてアミノシリカを用いたカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ヘキサン：アセトン＝７：３、０．０５％ピリジン含有）に供し、無色シロップ状の化合物１２（０．５７ｇ、純度９３％、収率７９％）を得た。前記純度は、ＨＰＬＣにより測定した（以下、同様）。以下に、化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４１−７．４３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２８−７．３２（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２５−７．２７（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．１８−７．２１（ｍ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、６．８０−６．８４（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、３．７３−３．８４（ｍ，１Ｈ）、３．７９（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３）、３．４７−３．６４（ｍ，３Ｈ）、３．１２−３．２６（ｍ，２Ｈ）、３．０５（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．９８−２．０２（ｍ，２Ｈ）、２．６１（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．５５−２．６３（ｍ，２Ｈ）、２．２７−２．４２（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、２．３１（ｔ，７．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．０３−２．１９（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．４０−１．９０（ｍ，８Ｈ）、１．２３−１．３３（ｍ，５Ｈ）、１．１４−１．２０（ｍ，１２Ｈ，ＣＨ３）；
Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ１４６．９１；
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ７７４（Ｍ＋）、３０３（ＤＭＴｒ＋），２０１（Ｃ８Ｈ１９Ｎ２ＯＰ＋）．
【０２２０】
（３）ＤＭＴｒ−ヒドロキシアミドカルバモイル−Ｌ−プロリン（化合物１３）
ＤＭＴｒ−アミド−Ｌ−プロリン（化合物６）（１．００ｇ、２．０５ｍｍｏｌ）を溶解した無水アセトニトリル溶液（１０ｍＬ）に、１−イミダゾリルカルボニルオキシ−８−ヒドロキシオクタン（１．１２ｇ，４．９２ｍｍｏｌ）を溶解した無水アセトニトリル溶液（２０ｍＬ）を、アルゴン雰囲気下、室温で加えた。この混合液を、４０〜５０℃で２日間加熱した後、５日間室温で放置した。前記混合液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ジクロロメタン：アセトン＝４：１、０．０５％ピリジン含有）に供した。これによって、無色シロップ状の化合物１３を得た（０．６８ｇ、収率５０％）。以下に、化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δ７．４０−７．４２（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２７−７．３１  （ｍ，６Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．１７−７．２１（ｍ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、６．７９−６．８２（ｍ，４Ｈ，  Ａｒ−Ｈ）、４．２３−４．３０（ｍ，１Ｈ）、４．０５−４．１０（ｍ，２Ｈ）、３．７９（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３）、３．６０−３．６５（ｍ，２Ｈ）、３．３２−３．５５（ｍ，２Ｈ）、３．１６−３．２９（ｍ，２Ｈ），３．０１−３．０７（ｍ，２Ｈ）、２．３８−２．４０（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．８３−１．９０（ｍ，２Ｈ）、１．５７−１．６９（ｍ，８Ｈ）、１．２６−１．３６（ｍ，２Ｈ）；
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ６０２（Ｍ＋）、３０３（ＤＭＴｒ＋）．
【０２２１】
（４）ＤＭＴｒ−アミドカルバモイル−Ｌ−プロリンアミダイト（化合物１４）
得られた前記ＤＭＴｒ−ヒドロキシアミドカルバモイル−Ｌ−プロリン（化合物１３）（０．６３ｇ、１．００ｍｍｏｌ）を無水ピリジンと混合し、室温で共沸乾燥した。得られた残留物に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（２０６ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ）を加え、減圧下に脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に対し、無水アセトニトリル（１ｍＬ）を加え、さらに、２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（２８２ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（１ｍＬ）を加えた。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で４時間撹拌した。そして、前記混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水および飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣を、充填剤としてアミノシリカを用いたカラムクロマト（展開溶媒ヘキサン：アセトン＝７：３、０．５％ピリジン含有）に供し、無色シロップ状の化合物１４（０．７４ｇ、純度１００％、収率８７％）を得た。以下に、化合物のＮＭＲの結果を示す。
Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ１４７．１９；
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ８６０  （Ｍ＋）、３０３（ＤＭＴｒ＋），２０１（Ｃ８Ｈ１９Ｎ２ＯＰ＋）．
【０２２２】
（５）ＤＭＴｒ−ｔ−ブチルジメチルシロキシアミドウレイド−Ｌ−プロリン（化合物１５）
トリホスゲン（１．２２ｇ、４．１０ｍｍｏｌ）に、アルゴン雰囲気および氷冷下、無水テトラヒドロフラン溶液（１０ｍＬ）を加えた。この混合液に、アルゴン雰囲気および氷冷下、ＤＭＴｒ−アミド−Ｌ−プロリン（化合物６）（１．００ｇ、２．０５ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（９．８０ｇ、７５．８ｍｍｏｌ）を溶解した無水テトラヒドロフラン溶液（１０ｍＬ）を、３０分間で滴下し、その後、室温で１時間撹拌した。前記混合液に、アルゴン雰囲気および氷冷下、１０−アミノ−１−ｔ−ブチルジメチルシロキシデカン（２．６６ｇ、１０．２５ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（３．２０ｇ、２４．７６ｍｍｏｌ）を溶解した無水テトラヒドロフラン溶液（２０ｍＬ）を、４５分間で滴下した。そして、前記混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で一晩撹拌した。この混合液を酢酸エチル（２００ｍＬ）で希釈し、有機層を回収した。前記有機層を、飽和重曹水で洗浄した後、さらに、飽和食塩水で洗浄した。そして、有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過し、ろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ジクロロメタン：アセトン＝４：１、０．０５％ピリジン含有）に供した。これによって、無色シロップ状の化合物１５を得た（０．８７ｇ、収率５５％）。
【０２２３】
（６）ＤＭＴｒ−ヒドロキシアミドウレイド−Ｌ−プロリン化合物（１６）
得られた前記ＤＭＴｒ−ｔ−ブチルジメチルシロキシアミドウレイド−Ｌ−プロリン（１５）（０．８７ｇ、１．１２ｍｍｏｌ）に、アルゴン雰囲気下、無水テトラヒドロフランジクロロメタン溶液（１０ｍＬ）を室温で加えた。前記混合液に、アルゴン雰囲気下、１ｍｏｌ／Ｌテトラブチルアンモニウムフルオリド含有テトラヒドロフラン溶液(４．６９ｍＬ、東京化成）を加え、室温で３日間撹拌した。前記混合液をジクロロメタン（１５０ｍＬ）で希釈し、水で洗浄した後、さらに飽和食塩水で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ジクロロメタン：アセトン＝１：１、０．０５％ピリジン含有）に供し、無色シロップ状の化合物１６を得た（０．６８ｇ、収率９２％）。以下に、化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δ７．４１−７．４３  （ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２７−７．３１（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．１９−７．２６（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．１９−７．２１（ｍ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、６．８０−６．８３（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、４．３４（ｔ，２Ｈ，ＣＨ２）、３．７９（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３）、３．６３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．４  Ｈｚ，ＣＨ２）、３．６１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，ＣＨ２）、３．３４−３．３７（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、３．１６−３．２７（ｍ，５Ｈ），３．０４（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．３８−２．４５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．８３−２．０５（ｍ，３Ｈ）、１．４５−１．６４（ｍ，８Ｈ）、１．２５−１．３８（ｍ，７Ｈ）．
【０２２４】
（７）ＤＭＴｒ−アミドウレイド−Ｌ−プロリンアミダイト（化合物１７）
得られた前記ＤＭＴｒ−ヒドロキシアミドウレイド−Ｌ−プロリン（化合物１６）（０．６２ｇ、０．９４ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリルと混合し、室温で共沸乾燥した。得られた残留物に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（１９２ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）を加え、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合液に対し、無水アセトニトリル（１ｍＬ）を加え、さらに、２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（２８２ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（１ｍＬ）を加えた。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で４時間撹拌した。そして、前記混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水および飽和食塩水で、順次洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られた前記ろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣を、充填剤としてアミノシリカを用いたカラムクロマト（展開溶媒ヘキサン：アセトン＝１：１、０．０５％ピリジン含有）に供し、無色シロップ状の化合物１７を得た（０．７７ｇ、純度８８％、収率８４％）。以下に、化合物のＮＭＲの結果を示す。
Ｐ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δ１４７．２７；
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ８６０（Ｍ＋＋１）、３０３（ＤＭＴｒ＋），２０１（Ｃ８Ｈ１９Ｎ２ＯＰ＋）．
【０２２５】
（実施例Ａ３）プロリンジアミドアミダイトの合成
プロリン骨格を有するリンカーを含む本発明の核酸分子を生成するため、前記スキーム３により、Ｌ−プロリンジアミドアミダイトおよびＤ−プロリンジアミドアミダイトを合成した。
【０２２６】
（Ｂ３−１）Ｌ−プロリンジアミドアミダイト
（１）Ｆｍｏｃ−ヒドロキシアミド−Ｌ−プロリン（化合物４）
前記スキーム３の化合物２（Ｆｍｏｃ−Ｌ−プロリン）を開始原料とした。前記化合物２（１０．００ｇ、２９．６４ｍｍｏｌ）、４−アミノ−１−ブタノール（３．１８ｇ、３５.５６ｍｍｏｌ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１０．９０ｇ、７０．７２ｍｍｏｌ）を混合し、前記混合物に対し、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に、無水アセトニトリル（１４０ｍＬ）を室温で加え、さらに、ジシクロヘキシルカルボジイミド（７．３４ｇ、３５.５６ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（７０ｍＬ）を添加した後、アルゴン雰囲気下、室温で１５時間撹拌した。反応終了後、生成した沈殿をろ別し、回収したろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣にジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水（２００ｍＬ）で洗浄した。そして、有機層を回収し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去し、その残渣にジエチルエーテル（２００ｍＬ）を加え、粉末化した。生じた粉末を濾取することにより、無色粉末状の化合物４（１０．３４ｇ、収率８４％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．７６−７．８３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．５０−７．６３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．３８−７．４３  （ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２８−７．３３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ），４．４０−４．４６（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），４．１５−４．３１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），３．６７−３．７３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、３．３５−３．５２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、３．１８−３．３０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．２０−２．５０（ｍ，４Ｈ）、１．８１−２．０３（ｍ，３Ｈ）、１．４７−１．５４（ｍ，２Ｈ）；
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ４０９（Ｍ＋Ｈ＋）．
【０２２７】
（２）ＤＭＴｒ−アミド−Ｌ−プロリン（化合物６）
Ｆｍｏｃ−ヒドロキシアミド−Ｌ−プロリン（化合物４）（７．８０ｇ、１９．０９ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（５ｍＬ）と混合し、室温で２回共沸乾燥した。得られた残留物に、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（８．２０ｇ、２４．２０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（２３ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）および無水ピリジン（３９ｍＬ）を加えた。この混合物を、室温で１時間撹拌した後、メタノール（７．８ｍＬ）を加え、室温で３０分撹拌した。この混合物を、ジクロロメタン（１００ｍＬ）で希釈し、飽和重曹水（１５０ｍＬ）で洗浄後、有機層を分離した。前記有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた未精製の残渣に、無水ジメチルホルムアミド（３９ｍＬ）およびピペリジン（１８．７ｍＬ、１８９ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応終了後、前記混合液について、減圧下、室温で、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（商品名Ｗａｋｏｇｅｌ  Ｃ−３００、展開溶媒ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ＝９：１、０．０５％ピリジン含有に供し、淡黄色油状の化合物６（９．１１ｇ、収率９８％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δ７．３９−７．４３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．３０（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７，２１（ｔｔ，１Ｈ，４．９，１．３Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ）、６．８１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、３．７８（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３）、３．７１（ｄｄ，Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，５．４Ｈｚ，ＣＨ）、３．２１（２Ｈ，１２．９，６．３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、３．０５（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．８５−２．９１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．０８−２．１７（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．８５−２．００（ｍ，３Ｈ）、１．５５−１．６５（ｍ，５Ｈ）；
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）；  ｍ／ｚ  ４８９（Ｍ＋Ｈ＋）、３０３（ＤＭＴｒ＋）．
【０２２８】
（３）ＤＭＴｒ−ヒドロキシジアミド−Ｌ−プロリン（化合物８）
得られた前記ＤＭＴｒ−アミド−Ｌ−プロリン（化合物６）（６．０１ｇ、１２．２８ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２．８３ｇ、１４．７４ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（３．９８ｇ、２９．４７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（４．４７ｇ、４４．２１ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（１２０ｍＬ）を混合した。この混合液に、さらに、アルゴン雰囲気下、室温で、６−ヒドロキシヘキサン酸（１．９５ｇ、１４．４７ｍｍｏｌ）を加え、その後、アルゴン雰囲気下、室温で、１時間撹拌した。前記混合液をジクロロメタン（６００ｍＬ）で希釈し、飽和食塩水（８００ｍＬ）で３回洗浄した。有機層を回収し、前記有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。これにより、淡黄色泡状の前記化合物８（６．２９ｇ、収率８５％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δ７．４１−７．４３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２７−７．３１（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．１９−７．２６（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．１７−７．２１（ｍ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、６．７９−６．８２（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、４．５１−４．５３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、３．７９（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３）、３．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，ＣＨ２）、３．５０−３．５５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、３．３６−３．４３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），３．１５−３．２４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），３．０４（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．３８−２．４５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、２．３１（ｔ，６．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．０５−２．２０（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．９２−２．００（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．７５−１．８３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．４８−１．７１（ｍ，８Ｈ）、１．３５−１．４４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）；
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ６０２（Ｍ＋）、３０３（ＤＭＴｒ＋）．
【０２２９】
（４）ＤＭＴｒ−ジアミド−Ｌ−プロリンアミダイト（化合物１０）
得られた前記ＤＭＴｒ−ヒドロキシジアミド−Ｌ−プロリン（化合物８）（８．５５ｇ、１４．１８ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリルと混合し、室温で３回共沸乾燥した。得られた残留物に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（２．９１ｇ、１７．０２ｍｍｏｌ）を加え、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に対し、無水アセトニトリル（１０ｍＬ）を加え、さらに、２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（５.１３ｇ、１７．０２ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（７ｍＬ）を加えた。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で２時間撹拌した。そして、前記混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水（２００ｍＬ）で３回洗浄した後、飽和食塩水（２００ｍＬ）で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られた前記ろ液について、減圧下に溶媒を留去した。得られた残渣を、充填剤としてアミノシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ヘキサン：酢酸エチル＝１：３、０．０５％ピリジン含有）に供し、無色シロップ状の化合物１０（１０.２５ｇ、純度９２％、収率８３％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４０−７．４２（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２９−７．３１（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２５−７．２７（ｍ，２Ｈ，  Ａｒ−Ｈ）、７．１７−７．２１（ｍ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、６．８０−６．８２（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、４．５１−４．５３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、３．７５−３．９３（ｍ，４Ｈ）、３．７９（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３）、３．４５−３．６０（ｍ，４Ｈ）、３．３５−３．４５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、３．２０−３．２９（ｍ，１Ｈ）、３．０４（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．６２（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．４０−２．４４（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、２．３１（ｔ，７．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．０３−２．１９（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．９２−２．０２（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．７０−１．８３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．５１−１．７１（ｍ，８Ｈ）、１．３５−１．４４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、１．１８（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ，ＣＨ３）、１．１６（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ，ＣＨ３）；
Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  Ｍｓδ１４７．１７；
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ８０２（Ｍ＋）、３０３（ＤＭＴｒ＋），２０１（Ｃ８Ｈ１９Ｎ２ＯＰ＋）．
【０２３０】
（Ｂ３−２）Ｄ−プロリンジアミドアミダイト
（１）Ｆｍｏｃ−ヒドロキシアミド−Ｄ−プロリン（化合物３）
前記スキーム３の化合物１（Ｆｍｏｃ−Ｄ−プロリン）を開始原料とした。前記化合物１（１．５ｇ、４．４５ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．１ｇ、５．３４ｍｍｏｌ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１．５ｇ、１０．６９ｍｍｏｌ）の混合物に対し、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に、無水アセトニトリル（２４ｍＬ）を室温で加え、さらに、４−アミノ−１−ブタノール（０．４８ｇ、５．３４ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（６ｍＬ）添加した後、アルゴン雰囲気下、室温で１５時間撹拌した。反応終了後、生成した沈殿をろ別し、回収したろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣にジクロロメタンを加え、酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で３回、飽和重曹水で３回洗浄した。そして、有機層を回収し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒留去し、その残渣にジエチルエーテル（５０ｍＬ）を加え、粉末化した。生じた粉末を濾取することにより、白色粉末状の化合物３を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：  δ７．７７（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ）；７．５８（ｂｒ，２Ｈ）；７．４１（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ）；７．３２（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ）；４．２５−４．４３（ｍ，４Ｈ）；３．２５−３．６１（ｍ，６Ｈ）；１．５７−１．９２（ｍ，８Ｈ）．
ＭＳ（ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ４０９（Ｍ＋Ｈ＋）．
【０２３１】
（２）ＤＭＴｒ−アミド−Ｄ−プロリン（化合物５）
Ｆｍｏｃ−ヒドロキシアミド−Ｄ−プロリン（化合物３）（１．０ｇ、２．４５ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（５ｍＬ）と混合し、室温で２回共沸乾燥した。得られた残留物に、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（１．０５ｇ、３．１０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（３ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）および無水ピリジン（５ｍＬ）を加えた。この混合物を、室温で１時間撹拌した後、メタノール（１ｍＬ）を加え、室温で３０分撹拌した。この混合物を、ジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水で洗浄後、有機層を分離した。前記有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた未精製の残渣に、無水ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）およびピペリジン（２．４ｍＬ、２４ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応終了後、前記混合液について、減圧下、室温で、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（商品名Ｗａｋｏｇｅｌ  Ｃ−３００、展開溶媒ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ＝９：１、０．０５％ピリジン含有）に供し、淡黄色油状の化合物５（１．２６ｇ、収率９６％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ７．６２（ｂｒ，１Ｈ）；７．４１−７．４４（ｍ，２Ｈ）；７．２６−７．３３（ｍ，６Ｈ）；７．１７−７．２２（ｍ，１Ｈ）；６．８０−６．８４（ｍ，４Ｈ）；３．７８（ｓ，６Ｈ）；３．７１（ｄｄ，Ｊ＝８．８，５．４Ｈｚ，１Ｈ）；  ３．２２（ｑ，６．５Ｈｚ，２Ｈ）；３．０７（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ）；２．９７−３．０３（ｍ，１Ｈ）；２．８５−２．９１（ｍ，１Ｈ）；１．８５−２．１５（ｍ，３Ｈ）；１．５５−１．７３（ｍ，６Ｈ）；
ＭＳ  （ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ４８９（Ｍ＋Ｈ＋），３０３（ＤＭＴｒ＋）．
【０２３２】
（３）ＤＭＴｒ−ヒドロキシジアミド−Ｄ−プロリン（化合物７）
得られた前記ＤＭＴｒ−アミド−Ｄ−プロリン（化合物５）（１．２ｇ、２．４５ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（５６６ｍｇ、２．９５ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（７９６ｍｇ、５．８９ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（１．２ｍＬ、８．８４ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（２４ｍＬ）を混合した。この混合液に、さらに、アルゴン雰囲気下、室温で、６−ヒドロキシヘキサン酸（３９０ｍｇ、２．９５ｍｍｏｌ）を加え、その後、アルゴン雰囲気下、室温で１時間撹拌した。前記混合液をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水で３回洗浄した。有機層を回収し、前記有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。これにより、淡黄色油状の化合物７（１．４ｇ、収率９５％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：  δ７．４０−７．４３（ｍ，２Ｈ）；７．２５−７．３２  （ｍ，６Ｈ）；７．１７−７．２２（ｍ，１Ｈ）；６．７９−６．８３（ｍ，４Ｈ）；３．７９（ｓ，６Ｈ）；３．５８−３．６３（ｍ，２Ｈ）；３．４９−３．５５（ｍ，１Ｈ）；３．１５−３．２６（ｍ，２Ｈ）；３．０２−３．０７（ｍ，２Ｈ）；２．３０−２．３３（ｍ，２Ｈ）；２．１１−２．２０（ｍ，１Ｈ）；１．５０−１．９９（ｍ，１３Ｈ）；１．３６−１．４３（ｍ，２Ｈ）；
ＭＳ  （ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ６０２（Ｍ＋），３０３（ＤＭＴｒ＋）．
【０２３３】
（４）ＤＭＴｒ−ジアミド−Ｄ−プロリンアミダイト（化合物９）
得られた前記ＤＭＴｒ−ヒドロキシジアミド−Ｄ−プロリン（化合物７）（１．２ｇ、１．９９ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリルと混合し、室温で３回共沸乾燥した。得られた残留物に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（４１０ｍｇ、２．４０ｍｍｏｌ）を加え、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に対し、無水アセトニトリル（２．４ｍＬ）を加え、さらに、２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（７２２ｍｇ、２．４０ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で２時間撹拌した。そして、前記混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水で３回洗浄後、飽和食塩水で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣を、充填剤としてアミノシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ヘキサン：酢酸エチル＝１：３）に供し、無色油状の化合物９（１．４ｇ、純度９５％、収率８３％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：  δ７．４０−７．４３（ｍ，２Ｈ）；７．２５−７．３２（ｍ，６Ｈ）；７．１４−７．２１（ｍ，１Ｈ）；６．８０−６．８３（ｍ，４Ｈ）；３．８０−３．８５（ｍ，２Ｈ）；３．７９（ｓ，６Ｈ）；３．４９−３．６５（ｍ，５Ｈ）；３．０２−３．０６（ｍ，２Ｈ）；２．６０−２．６３（ｍ，２Ｈ）；２．２９−２．３３（ｍ，  ２Ｈ）；１．７７−１．８２（ｍ，２Ｈ）；１．５６−１．６８（ｍ，８Ｈ）；１．３８−１．４３（ｍ，２Ｈ）；１．１５−１．２９（ｍ，１８Ｈ）；
３１Ｐ−ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：  δ１４６．９４；
ＭＳ（ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ８０２（Ｍ＋），  ３０３（ＤＭＴｒ＋），２０１（Ｃ８Ｈ１９Ｎ２ＯＰ＋）.
【０２３４】
（実施例Ａ４）
プロリン骨格を有するリンカーを含む本発明の核酸分子を生成するため、下記スキーム４により、Ｌ−プロリンジアミドアミダイトタイプＢを合成した。
【０２３５】
【化１６】
0005555346.tif 000017
【０２３６】
（１）Ｆｍｏｃ−ｔ−ブチル−ジメチルシロキシアミド−Ｌ−プロリン（化合物１８）
Ｆｍｏｃ−ヒドロキシアミド−Ｌ−プロリン（化合物４）（２．００ｇ、３０ｍｍｏｌ）、ｔ−ブチル−ジメチルシリルクロリド（１．１１ｇ、３５ｍｍｏｌ）およびイミダゾール（１０．９０ｇ、７１ｍｍｏｌ）を混合した。前記混合物に対し、減圧下に脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に、無水アセトニトリル（２０ｍＬ）を室温で加え、アルゴン雰囲気下、室温で終夜撹拌した。反応終了後、前記混合物にジクロロメタン（１５０ｍＬ）を加え、水で３回洗浄し、飽和食塩水で洗浄した。有機層を回収し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去し、その残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ＝９５：５）に供し、無色シロップ状の化合物１８（２．３５ｇ、収率９２％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．７６−７．７８（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．５０−７．６３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．３８−７．４２（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２９−７．３４（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ），４．１０−４．４６（ｍ，４Ｈ，ＣＨ２），３．４７−３．５９（ｍ，４Ｈ，ＣＨ２）、３．２０−３．２６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ）、１．８５−１．９５（ｍ，２Ｈ）、１．４２−１．５５（ｍ，６Ｈ）、０．９６（ｓ，９Ｈ，ｔ−Ｂｕ）、０．０２（ｓ，６Ｈ，ＳｉＣＨ３）；
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ５２３（Ｍ＋Ｈ＋）．
【０２３７】
（２）ｔ−ブチル−ジメチルシロキシアミド−Ｌ−プロリン（化合物１９）
得られた前記Ｆｍｏｃ−ｔ−ブチル−ジメチルシロキシアミド−Ｌ−プロリン（化合物１８）（１．１８ｇ、２．５ｍｍｏｌ）に対し、無水アセトニトリル（５ｍＬ）およびピペリジン（２．４ｍＬ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応終了後、前記混合物にアセトニトリル（５０ｍＬ）を加え、不溶物をろ別した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ＝９：１）に供し、無色シロップ状の化合物１９（０．６１ｇ、収率９０％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ３．７１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，５．２Ｈｚ，ＣＨ）、３．６１−３．６４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、３．２２−３．２８（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．９８−３．０４（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、２．８６−２．９１（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、２．０８−２．１７（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．８６−１．９３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．６６−１．７５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、１．５２−１．５７（ｍ，４Ｈ）、０．８９（ｓ，９Ｈ，ｔ−Ｂｕ）、０．０５（ｓ，６Ｈ，ＳｉＣＨ３）；
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）；  ｍ／ｚ  ３０１（Ｍ＋Ｈ＋）．
【０２３８】
（３）ｔ−ブチル−ジメチルシロキシアミドヒドロキシアミド−Ｌ−プロリン（化合物２０）
得られた前記ｔ−ブチル−ジメチルシロキシアミド−Ｌ−プロリン（化合物１９）（５５０ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）、６−ヒドロキシヘキサン酸（３００ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（４３４ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）、および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（６９５ｍｇ、４．５ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（２０ｍＬ）を混合した。前記混合物に、アルゴン雰囲気下、室温で、トリエチルアミン（６８９ｍｇ、６．８ｍｍｏｌ）を加え、その後、アルゴン雰囲気下、室温で、終夜撹拌した。前記混合液を飽和食塩水で洗浄した。有機層を回収し、前記を硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ＝９：１）に供し、無色シロップ状の化合物２０（６９６ｍｇ、収率９２％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ４．５４（ｄ，１Ｈ，ＣＨ）、３．５８−３．６７（ｍ，５Ｈ）、３．５２−３．５６（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），３．３２−３．３９（ｍ，１Ｈ），３．２０−３．２５（ｍ，２Ｈ）、２．４０−２．４３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、２．３３（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．０５−２．２５（ｍ，２Ｈ）、１．９３−２．０３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．７５−１．８５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．５０−１．７３（ｍ，８Ｈ）、１．３７−１．４６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、０．８７（ｓ，９Ｈ，ｔ−Ｂｕ）、０．０４（ｓ，６Ｈ，ＳｉＣＨ３）；
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ４１５（Ｍ＋＋１）．
【０２３９】
（４）ＤＭＴｒ−ヒドロキシジアミド−Ｌ−プロリンタイプＢ（化合物２１）
得られた前記ｔ−ブチル−ジメチルシロキシアミドヒドロキシアミド−Ｌ−プロリン（化合物２０）（６４０ｍｇ、１．５４ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（１ｍＬ）と混合し、室温で共沸乾燥した。得られた残留物に、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（６５７ｍｇ、１．８５ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（２ｍｇ）および無水ピリジン（５ｍＬ）を加え、室温で４時間撹拌した後、メタノール（１ｍＬ）を加え、３０分室温で撹拌した。前記混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣に、無水アセトニトリル（５ｍＬ）および１ｍｏｌ／Ｌテトラブチルアンモニウムフルオリド含有テトラヒドロフラン溶液（１．４２ｍＬ、テトラブチルアンモニウムフルオリド１．４２ｍｍｏｌ）を加え、室温で終夜撹拌した。反応終了後、前記混合物に酢酸エチル（１００ｍＬ）を加え、水で洗浄した後、飽和食塩水で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下に溶媒を留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ＝９５：５、０．０５％ピリジン含有）に供し、無色シロップ状の化合物２１（６８０ｍｇ、収率７３％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４１−７．４４（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２６−７．３３（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．１８−７．２１（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．１７−７．２１（ｍ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、６．８０−６．８４（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、４．５１−４．５３（ｄ，６．８Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ）、３．７９（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３）、３．６１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ，５．４Ｈｚ，ＣＨ２）、３．５０−３．５４（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、３．３６−３．４３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），３．２０−３．２６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），３．０５（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．３８−２．４５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、２．３０（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．０５−２．２５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．９２−２．００（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．７５−１．８３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．５２−１．６７（ｍ，８Ｈ）、１．３５−１．４５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）；
Ｍｓ  （ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ６０２（Ｍ＋）、３０３（ＤＭＴｒ＋）．
【０２４０】
（５）ＤＭＴｒ−ジアミド−Ｌ−プロリンアミダイトタイプＢ（化合物２２）
得られた前記ＤＭＴｒ−ヒドロキシジアミド−Ｌ−プロリンタイプＢ（化合物２１）（６３７ｍｇ、１．０６ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリルと混合し、室温で共沸乾燥した。得られた残留物に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（２０１ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）を加え、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に対し、無水アセトニトリル（１ｍＬ）を加え、さらに、２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（３５０ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（１ｍＬ）を加えた。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で４時間撹拌した。前記混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水および飽和食塩水で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣を、充填剤としてアミノシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ヘキサン：アセトン＝７：３）に供し、無色シロップ状の化合物２２（６８０ｍｇ、純度９５％、収率７６％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４１−７．４３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２５−７．３２（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．１７−７．２２（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、６．８０−６．８３（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、４．５３（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ）、３．７５−３．９３（ｍ，３Ｈ）、３．７９（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３）、３．４６−３．６８（ｍ，５Ｈ）、３．３４−３．４１（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、３．１０−３．３１（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、３．０５（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．６２（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．３９−２．４６（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、２．２９（ｔ，７．３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．０３−２．１９（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．９０−２．００（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．７０−１．８３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．５１−１．７１（ｍ，８Ｈ）、１．３５−１．４５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、１．１８（ｄ，Ｊ＝６．４  Ｈｚ，６Ｈ，  ＣＨ３）、１．１６（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ，ＣＨ３）；
Ｐ−ＮＭＲ  （ＣＨ３ＣＮ）  δ１４６．９０；
Ｍｓ  （ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ８０３（Ｍ＋＋１）、３０３（ＤＭＴｒ＋）．
【０２４１】
（実施例Ａ５）
プロリン骨格を有するリンカーを含む本発明の核酸分子を生成するため、下記スキーム５により、ＤＭＴｒ−アミドエチレンオキシエチルアミノ−Ｌ−プロリンアミダイト（以下、ＰＥＧスペーサータイプという）を合成した。
【０２４２】
【化１７】
0005555346.tif 000018
【０２４３】
（１）ＤＭＴｒ−アミドヒドロキシエトキシエチルアミノ−Ｌ−プロリン（化合物２３）
ＤＭＴｒ−アミド−Ｌ−プロリン（化合物６）（１．００ｇ、２．０５ｍｍｏｌ）、４−トルエンスルホン酸２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルエステル（３．１０ｇ、１２．３０ｍｍｏｌ）、および炭酸カリウム（０．８５ｇ、６．１５ｍｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド溶液（１０ｍＬ）を混合し、アルゴン雰囲気下、室温で４日間撹拌した。前記混合物について、減圧化、室温で溶媒を留去した後、ジクロロメタン（２０ｍＬ）を加え、ろ過した。ろ液を濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供した。前記シリカゲルカラムクロマトグラフィーの展開溶媒は、まず、０．０５％ピリジンを含む酢酸エチルを使用した後、０．０５％ピリジンを含むＣＨ２Ｃｌ２とＣＨ３ＯＨの混合液（ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ＝９：１）を使用した。その結果、無色シロップ状の化合物２３（１．１５ｇ、収率９７％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４１−７．４５（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２７−７．３１（ｍ，６Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．１７−７．２１（ｍ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、６．７９−６．８２（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、３．７９（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３）、３．６０−３．７０（ｍ，２Ｈ）、３．３９−３．５７（ｍ，４Ｈ），３．１３−３．２７（ｍ，３Ｈ），３．０７−３．０８（ｍ，２Ｈ）、２．７１−２．８４（ｍ，１Ｈ）、２．３８−２．４６（ｍ，１Ｈ）、２．１４−２．１９（ｍ，１Ｈ）、１．８４−１．８７（ｍ，１Ｈ）、１．５７−１．７６（ｍ，８Ｈ）．
【０２４４】
（２）ＤＭＴｒ−アミドエチレンオキシエチルアミノ−Ｌ−プロリンアミダイト（化合物２４）
得られた前記ＤＭＴｒ−アミドヒドロキシエトキシエチルアミノ−Ｌ−プロリン（化合物２３）（０．６３ｇ、１．００ｍｍｏｌ）を無水ピリジンと混合し、室温で共沸乾燥した。得られた残留物に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（２０６ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ）を加え、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に対し、無水アセトニトリル（１ｍＬ）を加え、さらに、２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（２８２ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（１ｍＬ）を加えた。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で４時間撹拌した。そして、前記混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水および飽和食塩水で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られた前記ろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣を、充填剤としてアミノシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ヘキサン：アセトン＝７：３、０．０５％ピリジン含有）に供し、無色シロップ状の化合物２４（０．７４ｇ、純度１００％、収率８７％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ）：  δ７．４１−７．４３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２８−７．３１（ｍ，６Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．１８−７．２２（ｍ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、６．８４−６．８６（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、３．７３−３．８４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、３．７９（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３）、３．４７−３．６４（ｍ，７Ｈ）、３．１５−３．２３（ｍ，１Ｈ）、３．１１（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、３．０１（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．９５−２．９９（ｍ，１Ｈ）、２．５８−２．６３（ｍ，２Ｈ）、２．３１−２．３５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、２．０３−２．１９（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．４８−１．７８（ｍ，１０Ｈ）、１．１２−１．５７（ｍ，１２Ｈ，ＣＨ３）；
Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ）：  δ１４８．００；
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ７７６（Ｍ＋）、３０３（ＤＭＴｒ＋）  ２０１（Ｃ８Ｈ１９Ｎ２ＯＰ＋）．
【０２４５】
（実施例Ａ６）
１．保護プロリノールの合成
以下に示すスキーム６に従い、ジメトキシトリチル基で保護されたプロリノール（化合物３）を合成した。
【０２４６】
【化１８】
0005555346.tif 000019
【０２４７】
（１）トリフルオロアセチル−Ｌ−プロリノール(化合物１)
Ｌ−プロリノール(２．０ｇ、２０ｍｍｏｌ)をＴＨＦ２０ｍＬに溶解した。他方、トリフルオロ酢酸エチル(３．０ｇ、２１ｍｍｏｌ)をＴＨＦ２０ｍＬに溶解した。そして、後者のＴＨＦ溶液を、前者のＬ−プロリノール含有ＴＨＦ溶液に滴下し、１２時間撹拌した。この反応液を減圧濃縮し、化合物１を得た(３．７ｇ、収率９７％)。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ４．２８−４，２３（１．０Ｈ，ｍ，ＯＨ），３．９０−３．４１（５Ｈ，Ｈ−２，Ｈ−５，Ｈ−６，ｍ），２．２７−１．７７（４Ｈ，Ｈ−３，Ｈ−４，ｍ）．
【０２４８】
（２）トリフルオロアセチル−ＤＭＴｒ−Ｌ−プロリノール（化合物２）
得られた前記トリフルオロアセチル−Ｌ−プロリノール（化合物１）（３．７ｇ、１９ｍｍｏｌ）をピリジンに溶解して、３回、室温で共沸乾燥した。得られた残留物をピリジン１５ｍＬに溶かし、アルゴン下、氷浴中で撹拌しながら、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴｒ−Ｃｌ）（８．１ｇ、２４ｍｍｏｌ）を加え、さらに、室温で４時間反応させた。そして、過剰のＤＭＴｒ−Ｃｌをクエンチするために、前記反応液に、さらに、メタノール１０ｍＬを加え１０分撹拌した。その後、前記反応液に、ジクロロメタンを加え飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄した。洗浄後の回収した有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過して、得られたろ液を減圧濃縮し、その残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ＝９５：５、０．１％ピリジン含有）に供し、精製した化合物２を得た（８．５ｇ、収率８９％）。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．３９−７．１８（９Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），６．８２（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ），３．７８（６Ｈ，ｓ，ＯＣＨ３），３．７０−３．４１（５Ｈ，Ｈ−２，Ｈ−５，Ｈ−６，ｍ），２．１９−１．８５（４Ｈ，Ｈ−３，Ｈ−４，ｍ）．
【０２４９】
（３）ＤＭＴｒ−Ｌ−プロリノール（化合物３）
得られた前記トリフルオロアセチル−ＤＭＴｒ−Ｌ−プロリノール（化合物２）（５ｇ、１０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ１００ｍＬに溶解した。このＴＨＦ溶液に５％水酸化ナトリウム水溶液１００ｍＬを加え、撹拌した。この溶液に、１Ｍ  フッ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）溶液５ｍＬ加え、室温で１２時間撹拌した。この反応液を、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄した。洗浄後の回収した有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過して、得られたろ液を減圧濃縮し、化合物３を得た（３．６ｇ、収率９０％）。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４０−７．１４（９Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），６．８２（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ），３．７８（６Ｈ，ｓ，ＯＣＨ３），３．３１（１Ｈ，ｍ，Ｈ−６），３．０７（２Ｈ，ｍ，Ｈ−２，Ｈ−６），２．９０（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５），１．８４（３Ｈ，ｍ，Ｈ−３，Ｈ−４），１．４０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３）．
【０２５０】
２．アミダイト誘導体の合成
前記「１．」で合成した保護プロリノール（化合物３）を用いて、下記スキーム７により、結合形式が異なる、プロリノールを有するアミダイト誘導体を合成した。
【０２５１】
【化１９】
0005555346.tif 000020
【０２５２】
（１）ＤＭＴｒ−ウレタン−Ｌ−プロリノール（化合物４）
１，８−オクタンジオール（９．０ｇ、６２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ９０ｍＬに溶解し、アルゴン下に置いた。他方、カルボニルジイミダゾール（２．０ｇ、１２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ１０ｍＬに溶解した。後者のＴＨＦ溶液を、前者のＴＨＦ溶液に加え、室温で１時間撹拌した。この反応液を、１，８−オクタンジオールのＴＬＣスポットが消えるまで、水で洗浄した。さらに、洗浄後に回収した有機層を、飽和食塩水で洗浄し、回収した有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過し、得られたろ液を減圧濃縮した。その残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ＝９５：５）に供し、精製した化合物を得た。この化合物は、１，８−オクタンジオールの片末端がカルボニルジイミダゾールで活性化された化合物であった（２．３ｇ、収率７７％）。
【０２５３】
前記化合物０．９ｇをアセトニトリル１０ｍＬで溶解し、アルゴン下においた。他方、ＤＭＴｒ−Ｌ−プロリノール（化合物３）（１．９ｇ、４．８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル２０ｍＬに溶解した。後者のアセトニトリル溶液を、前記前者のアセトニトリル溶液に加え、室温で２４時間撹拌した。そして、この反応液を、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄し、回収した有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過し、得られたろ液を減圧濃縮した。その残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ジクロロメタン：アセトン＝９：１、０．１％ピリジン含有）に供し、精製した化合物４（プロリノールウレタンアミダイト）を得た（１．５ｇ、収率６５％）。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４０−７．１４（９Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），６．８２（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ），４．２４−３．９４（２Ｈ，ｍ，ＣＯＯＣＨ２），３．７８（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３），３．７２−２．９６（７Ｈ，ｍ，ａｌｋｙｌ，Ｈ−２，Ｈ−５，Ｈ−６），２．１０−１．３０（１６Ｈ，ｍ，ａｌｋｙｌ，Ｈ−３，Ｈ−４）；
ＦＡＢ−ＭＳ：  ５７６［Ｍ＋Ｈ］＋．
【０２５４】
（２）ＤＭＴｒ−ウレイド−Ｌ−プロリノール（化合物５）
アルゴン下、トリホスゲン（２．０ｇ、６．７ｍｍｏｌ）をＴＨＦ１０ｍＬに溶解し、０℃で撹拌した。他方、ＤＭＴｒ−Ｌ−プロリノール（化合物３）（１．３ｇ、３．２ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１６ｇ、１２４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ１０ｍＬに溶解し、前記トリホスゲンのＴＨＦ溶液に滴下した。この反応液を、０℃で１時間、続いて、室温で２時間撹拌した。そして、８−アミノ−１−オクタノール（２．３ｇ、１６ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５．０ｇ、３８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ３０ｍＬに溶解した。このＴＨＦ溶液に、前記撹拌後の反応液を滴下し、０℃で１時間、続いて、室温で４８時間撹拌した。この反応液を減圧濃縮し、その残渣をジクロロメタンに溶解した。この溶液を、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄し、回収した有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過して、得られたろ液を減圧濃縮し、その残渣を、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供して、精製した。この際、展開溶媒は、０．１％ピリジンを含有するアセトンと水との混合溶媒を使用し、前記アセトンと水との混合割合は、ステップワイズとし、具体的には、アセトン：水のモル比を、２：８、３：７、４：６および５：５の順に変化させた。目的の化合物５を含むフラクションを、ジクロロメタンで抽出し、この有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過し、得られたろ液を減圧濃縮し、化合物５（プロリノールウレイドアミダイト）を得た（０．９ｇ、収率４９％）。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４０−７．１４（９Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），６．８２（４Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），３．７８（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３），３．６８−３．２５（９Ｈ，ｍ，ＣＨ２ＮＨ，ＣＨ２ＯＨ，Ｈ−２，Ｈ−５，Ｈ−６），１．７４−１．１８（１６Ｈ，ｍ，ａｌｋｙｌ，Ｈ−３，Ｈ−４）；
ＦＡＢ−ＭＳ  ：５７５［Ｍ＋Ｈ］＋．
【０２５５】
（３）プロリノールを有するアミダイト誘導体（化合物６および７）
修飾プロリノールとして、得られた前記化合物４（０．８０ｇ、１．４ｍｍｏｌ）をアセトニトリルに溶解し、室温で３回共沸乾燥した。得られた残留物をアセトニトリル１ｍＬに溶解し、アルゴン下においた。このアセトニトリル溶液に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（０．２４ｇ，１．４ｍｍｏｌ）を添加し、反応液とした。他方、２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（０．５０ｇ、１．７ｍｍｏｌ）をアセトニトリル１ｍＬに溶解した。これを、前記反応液に添加し、室温で４時間撹拌した。前記反応液に、ジクロロメタンを加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄した。洗浄後の回収した有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、前記有機層をろ過して、得られたろ液を減圧濃縮した。その残渣を、アミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ヘキサン：アセトン＝１０：１、０．１％ピリジン含有）に供し、精製した化合物６（ＤＭＴｒ−ウレタン−Ｌ−プロリノールアミダイト）（０．９０ｇ、収率８３％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４０−７．１４（９Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），６．８２（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ），４．２４−３．９４（２Ｈ，ｍ，ＣＯＯＣＨ２），３．７８（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３），３．７２−２．９６（１１Ｈ，ｍ，ＣＨ２Ｏ，ＰＯＣＨ２，ＣＨＣＨ３，Ｈ−２，Ｈ−５，Ｈ−６），２．５８（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２ＣＮ），２．１０−１．４６（１６Ｈ，ｍ，ａｌｋｙｌ，Ｈ−３，Ｈ−４），１．３４−１．１０（１２Ｈ，ｍ，ＣＨＣＨ３）；
３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ）：  δ１４６．８２；
ＦＡＢ−ＭＳ：  ７７６［Ｍ＋Ｈ］＋．
【０２５６】
前記修飾プロリノールとして、前記化合物４に代えて、前記化合物５を使用した以外は、同様に処理を行い、精製した化合物７（ＤＭＴｒ−ウレイド−Ｌ−プロリノールアミダイト）（０．８０ｇ、収率７４％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４０−７．１４（９Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），６．８２（４Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），３．７８（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３），３．６５−３．２５（１３Ｈ，ｍ，ＣＨ２Ｏ，ＰＯＣＨ２，ＣＨＣＨ３，Ｈ−２，ＣＨ２ＮＨ，ＣＨ２ＯＨ，Ｈ−２，Ｈ−５，Ｈ−６），２．７３（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２ＣＮ），２．１０−１．４８（１６Ｈ，ｍ，ａｌｋｙｌ，Ｈ−３，Ｈ−４），１．３５−１．１０（１２Ｈ，ｍ，ＣＨＣＨ３）；
３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ）：  δ  １４６．８３；
ＦＡＢ−ＭＳ：７７５  ［Ｍ＋Ｈ］＋．
【０２５７】
（実施例Ｂ１）ＲＮＡの固相合成
本発明のリンカーを有するＲＮＡを合成した。ＲＮＡは、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（商品名ＡＢＩ  Ｅｘｐｅｄｉｔｅ（登録商標）  ８９０９  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステムズ）により、３’側から５’側に向かって合成した。前記合成には、ＲＮＡアミダイトとして、ＲＮＡ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ（２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳｉ、商品名、三千里製薬）を用いた（以下、同様）。前記アミダイトの脱保護は、定法に従い、合成したＲＮＡは、ＨＰＬＣにより精製した。以下の実施例において、ＲＮＡの合成は、特に示さない限り、同様に行った。
【０２５８】
具体的には、本実施例のＲＮＡ（Ｅｘ）として、前記スキーム２の前記化合物１２をリンカーとして有するｓｓＲＮＡ（ＰＨ−０００１）を合成した。まず、下記配列番号１に示す配列のＲＮＡを合成した。そして、前記ＲＮＡの５’末端に、前記化合物１２を連結した。さらに、前記配列番号１に示すＲＮＡの５’側に、前記化合物１２を介して、下記配列番号２に示す配列のＲＮＡを合成した。
5’-GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU-3’（配列番号１）
5’-CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC-3’（配列番号２）
【０２５９】
このようにして合成したｓｓＲＮＡを、実施例のｓｓＲＮＡ（ＰＨ−０００１）という。前記ＰＨ−０００１は、下記配列番号３に示すように、５’側に、前記配列番号２のＲＮＡ配列を有し、３’側に、前記配列番号１のＲＮＡ配列を有し、前記ＲＮＡ配列が、リンカーＬｘ（すなわち前記化合物１２）を介して連結されている構造とした。また、下記配列に示すように、前記配列番号２のＲＮＡ配列と、前記配列番号１のＲＮＡ配列は、相補的な配列を有している。このため、前記ＰＨ−０００１は、下記式に示すように、自己アニーリングしてステム構造をとっている。なお、下記配列において、下線部GUUGUCAUACUUCUCAUGG（配列番号４）が、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制に関与する領域である。
Ｅｘ：ＰＨ−０００１（配列番号３）
5’-CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC-Lx-GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU-3’
【化２０】
0005555346.tif 000021
【０２６０】
他方、本発明のリンカーを有さない比較例のＲＮＡとして、ＲＮＡｉポジティブコントロール（Ｐｃ）の下記ｓｈＲＮＡ（ＮＨ−０００１）を合成した。以下に示すように、前記ＮＨ−０００１は、５’領域の大文字で示す配列が、前記ＰＨ−０００１と同じ配列番号２のＲＮＡ配列であり、３’領域の大文字で示す配列が、前記ＰＨ−０００１と同じ配列番号１のＲＮＡ配列である。そして、前記ＮＨ−０００１は、配列番号２のＲＮＡ配列と配列番号１のＲＮＡ配列との間に、リンカーとして、前記化合物１２に代えて、小文字で示すＲＮＡ配列を有する。前記ＮＨ−０００１は、前記ＰＨ−０００１と同様に、下記式に示すように、自己アニーリングしてステムを形成し、ｓｈＲＮＡの構造をとっている。なお、下記配列において、下線部GUUGUCAUACUUCUCAUGG（配列番号４）が、発現抑制に関与する領域である。
Ｐｃ：ＮＨ−０００１（配列番号５）
5’-CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCCccacaccGGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU-3’
【化２１】
0005555346.tif 000022
【０２６１】
（実施例Ｂ２）ＨＣＴ１１６細胞におけるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制効果
本発明のＲＮＡを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制を確認した。
【０２６２】
（１）材料および方法
実施例のＲＮＡ（Ｅｘ）として、前記実施例Ｂ１のｓｓＲＮＡ（ＰＨ−０００１）を使用した。前記ＲＮＡを、所望の濃度（１μｍｏｌ／Ｌ、５μｍｏｌ／Ｌ、２５μｍｏｌ／Ｌ）となるように、注射用蒸留水（大塚製薬、以下同様）に溶解し、ＲＮＡ溶液を調製した。
【０２６３】
細胞は、ＨＣＴ１１６細胞（ＤＳファーマバイオメディカル）を使用し、培地は、１０  ％ＦＢＳを含むＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地を使用し、培養条件は、３７℃、５％  ＣＯ２下とした。
【０２６４】
まず、ＨＣＴ１１６細胞を、前記培地中で培養し、その培養液を、２４穴プレートに、４００μｌずつ、２×１０４細胞／ウェルとなるように分注した。さらに、前記ウェル中の細胞を２４時間培養した後、前記ＲＮＡを、トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、前記トランスフェクション試薬の添付プロトコールに従って、トランスフェクションした。具体的には、前記ウェルあたりの組成を以下のように設定し、トランスフェクションを行った。なお、前記ウェルにおいて、前記ＲＮＡの最終濃度は、１ｎｍｏｌ／Ｌ、５ｎｍｏｌ／Ｌ、２５ｎｍｏｌ／Ｌとした。
【表１】
0005555346.tif 000023
【０２６５】
トランスフェクション後、前記ウェル中の細胞を２４時間培養した後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、オランダ）を用い、添付のプロトコールに従って、ＲＮＡを回収した。次に、逆転写酵素（商品名ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  III、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、添付のプロトコールに従って、前記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。そして、以下に示すように、合成した前記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量および内部標準であるβ−アクチン遺伝子の発現量を測定した。前記ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量は、前記β−アクチン遺伝子の発現量により補正した。
【０２６６】
前記ＰＣＲは、試薬としてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＦａｓｔＳｔａｒｔＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（商品名、Ｒｏｃｈｅ）、機器としてＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＤＸ４００（商品名、Ｒｏｃｈｅ）を用いた（以下、同様）。前記ＧＡＰＤＨ遺伝子およびβ−アクチン遺伝子の増幅には、それぞれ、以下のプライマーセットを使用した。
ＧＡＰＤＨ遺伝子用ＰＣＲプライマーセット
5’-GGAGAAGGCTGGGGCTCATTTGC-3’（配列番号７）
5’-TGGCCAGGGGTGCTAAGCAGTTG-3’（配列番号８）
β−アクチン遺伝子用プライマーセット
5’-GCCACGGCTGCTTCCAGCTCCTC-3’（配列番号９）
5’-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGTCAC-3’（配列番号１０）
【０２６７】
なお、コントロール１として、前記（Ｂ）液１００μLのみを添加した細胞についても、遺伝子発現量を測定した（−）。また、コントロール２として、トランスフェクションにおいて、前記ＲＮＡ溶液を未添加とし、前記（Ａ）１．５μｌと前記（Ｂ）とを合計１００μｌ添加した以外は、同様にして処理した細胞についても、遺伝子発現量を測定した（ｍｏｃｋ）。
【０２６８】
補正後のＧＡＰＤＨ遺伝子発現量について、コントロール（−）の細胞の発現量を１として、各ＲＮＡを導入した細胞の発現量の相対値を求めた。
【０２６９】
（２）結果
これらの結果を、図４に示す。図４は、ＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフであり、縦軸は、相対遺伝子発現量である。図４に示すように、前記実施例Ｂ１のＰＨ−０００１は、発現阻害活性を損なうことがなかった。また、前記ＰＨ−０００１は、本発明のリンカーである前記化合物１２によって安定化されていると考えられる。
【０２７０】
（実施例Ｂ３）ヒト血清中での安定性
本発明のＲＮＡについて、ヒト血清中での安定性を確認した。
【０２７１】
（１）材料および方法
実施例のＲＮＡ（Ｅｘ）として、前記実施例Ｂ１のｓｓＲＮＡ（ＰＨ−０００１）を使用した。比較例のＲＮＡとして、前記実施例Ｂ１に示す、ＲＮＡｉポジティブコントロール（Ｐｃ）の前記ｓｈＲＮＡ（ＮＨ−０００１）を使用した。
【０２７２】
まず、１×ＰＢＳに、前記ＲＮＡおよび正常ヒト血清（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を混合した混合液３０μｌを、３７℃でインキュベートした。前記混合液３０μｌにおいて、前記ＲＮＡの添加量は、６０ｐｍｏｌとし、前記正常ヒト血清の添加量は、終濃度１０％とした。そして、インキュベート開始から、０時間後、０．５時間後、１時間後および２時間後に、フェノール・クロロフォルム抽出によって反応を停止した。得られた抽出液を１５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（商品名、Ｌｏｎｚａ）で染色し、Ｅ−ＢＯＸ−ＶＸ２（エムエス機器、東京）を用いて分析した。
【０２７３】
（２）結果
この結果を図５に示す。図５は、安定性を示す電気泳動写真である。図５において、レーン「Ｍ」は、分子量マーカーであり、（ｈ）は、インキュベート時間を示す。
【０２７４】
図５に示すように、天然のヌクレオチドからなる比較例のＮＨ−０００１は、インキュベート０．５時間後において、速やかな分解反応がすでに開始しており、その結果、０．５〜２時間の全ての結果において、０時間の結果よりも、ＲＮＡサイズが小さくなったことが確認された。これに対して、本発明のリンカーを含む実施例のＰＨ−０００１は、インキュベート時間の経過にともなう泳動度の変化、すなわち、分解による分子量の減少が、ほとんど確認されなかった。この結果から、本発明のリンカーを有するＲＮＡを用いることによって、ヒト血清中での安定性が向上することが実証された。
【０２７５】
（実施例Ｂ４）ＨＣＴ１１６細胞におけるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制効果
プロリンを含む下記式のリンカーを有するｓｓＲＮＡを合成し、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制効果を確認した。
【化２２】
0005555346.tif 000024
【０２７６】
（１）材料および方法
（１．１）ｓｓＲＮＡの固相合成
前記ＲＮＡは、前記実施例Ｂ１と同様にして、ホスホロアミダイト法に基づき合成した。
【０２７７】
実施例のＲＮＡ（Ｅｘ）として、以下に示すｓｓＲＮＡ（ＰＫ−０００４）を使用した。下記配列において、「Ｌｘ」および「Ｌｙ」は、それぞれ、プロリンを含む前記式（化２２）のリンカーである。前記ｓｓＲＮＡの合成の際、配列番号１１にしたがって、前記ＲＮＡアミダイト（商品名ＲＮＡＰｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ、三千里製薬）を用いて、３’側からＲＮＡを合成し、「Ｌｘ」および「Ｌｙ」の部位は、前記実施例Ａ３−１で合成したＤＭＴｒ−ジアミド−Ｌ−プロリンアミダイト（スキーム３の化合物１０）を連結した。なお、前記配列において、GUUGUCAUACUUCUCAUGG（配列番号４）の配列が、発現抑制に関与する領域である。
【化２３】
0005555346.tif 000025
【０２７８】
比較例のＲＮＡは、ＲＮＡｉネガティブコントロール（Ｎｃ）のｓｓＲＮＡ（ＰＫ−０００３）を使用した。下記配列において、「Ｌｘ」および「Ｌｙ」は、それぞれ、プロリンを含む前記式（化２２）のリンカーである。前記ｓｓＲＮＡの合成の際、配列番号１２にしたがって、前記ＲＮＡアミダイト（商品名ＲＮＡ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ、三千里製薬）を用いて、３’側からＲＮＡを合成し、「Ｌｘ」および「Ｌｙ」の部位は、前記実施例Ａ３で合成したＤＭＴｒ−ジアミド−Ｌ−プロリンアミダイト（スキーム３の化合物１０）を連結した。また、前記発現抑制に関与する配列に代えて、スクランブル配列とした。
【化２４】
0005555346.tif 000026
【０２７９】
（１．２）遺伝子の発現抑制
凍結保存した前記ＲＮＡを、２０μｍｏｌ／Ｌとなるように、注射用蒸留水（大塚製薬）に溶解し、ＲＮＡ溶液を調製した。
【０２８０】
前記ＲＮＡ溶液を使用し、前記実施例Ｂ２と同様にして、ＨＣＴ１１６細胞におけるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を確認した。なお、トランスフェクションにおいて、ウェルあたりの組成は、以下のように設定した。下記組成において、（Ｂ）は、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、（Ｃ）は、２０μｍｏｌ／Ｌ  前記ＲＮＡ溶液であり、両者をあわせて９８．５μｌ添加した。前記ウェルにおいて、前記ＲＮＡの最終濃度は、１ｎｍｏｌ／Ｌ、３ｎｍｏｌ／Ｌ、１０ｎｍｏｌ／Ｌとした。
【表２】
0005555346.tif 000027
【０２８１】
（２）結果
これらの結果を、図６に示す。図６は、ＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。図６に示すように、本発明のリンカーを有する実施例のＰＫ−０００４は、強い遺伝子発現抑制活性を示し、その活性は投与量依存的であった。他方、ネガティブコントロールのＰＫ−０００３は、抑制効果が観察されなかった。
【０２８２】
（実施例Ｂ５）ダイサータンパク質の反応性
プロリンを有するリンカーで置換したｓｓＲＮＡに対する、組換えヒトダイサータンパク質の反応性を確認した。
【０２８３】
（１）材料および方法
実施例のＲＮＡ（Ｅｘ）として、前記実施例Ｂ４のｓｓＲＮＡ（ＰＫ−０００４）を使用した。比較例のＲＮＡとして、前記実施例Ｂ４に示す、ＲＮＡｉネガティブコントロール（Ｎｃ）のｓｓＲＮＡ（ＰＫ−０００３）、以下に示すＲＮＡｉポジティブコントロール（Ｐｃ）のｓｓＲＮＡ（ＮＫ−００１６）を使用した。前記ＮＫ−００１６は、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記内部５’側領域（Ｘ）、前記３’側領域（Ｙｃ）および前記内部３’側領域（Ｙ）が、前記ＰＫ−０００４と同じ配列であり、前記ＸｃとＸとの間、ＹｃとＹとの間に、前記ＰＫ−０００４の前記式（化２２）のリンカー（Ｌｘ、Ｌｙ）に代えて、ポリヌクレオチドをリンカーとして有する構造とした。
【０２８４】
【化２５】
0005555346.tif 000028
【０２８５】
試薬としてＣｏｌｄｓｈｏｃｋ−ＤＩＣＥＲ（商品名、タカラバイオ）を用い、添付プロトコールに従って、前記ダイサータンパク質と前記ＲＮＡを含む反応液を調製し、これを３７℃でインキュベートした。インキュベート時間は、０、３、６、９時間とした。所定時間インキュベート後の前記反応液に、前記試薬の反応停止液を加え、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。その後、前記ポリアクリルアミドゲルを、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（商品名、Ｌｏｎｚａ）で染色し、Ｅ−ＢＯＸ−ＶＸ２（商品名、エムエス機器）を使用して分析した。
【０２８６】
（２）結果と考察
これらの結果を図７に示す。図７は、ｓｓＲＮＡに対するダイサータンパク質の反応性を示す電気泳動の結果である。図７において、レーン「Ｍ」は、分子量マーカー（２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐおよび５０ｂｐ）であり、（ｈ）は、前記インキュベートの時間を示す。
【０２８７】
天然のヌクレオチドからなる比較例のＮＫ−００１６は、前記ダイサータンパク質と速やかに反応し、９時間後までには消失した。これに対して、プロリンを含むリンカーを有するＲＮＡ、すなわち、実施例のＰＫ−０００４とネガティブコントロールのＰＫ−０００３は、前記ダイサーに徐々に反応したため、９時間後においても完全に消失しなかった。この結果から、プロリンを含むリンカーを有することによって、細胞内での安定性が向上することがわかった。すなわち、遺伝子発現抑制効果の結果と併せて考慮すると、プロリンを含むリンカーを有する本発明のＲＮＡは、細胞内でのＲＮＡ干渉効果の持続性を向上させる効果があると考えられる。
【０２８８】
（実施例Ｂ６）Ａ５４９細胞および２９３細胞におけるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制効果
プロリンを有するリンカーで置換したｓｓＲＮＡを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制を確認した。
【０２８９】
（１）材料および方法
実施例のＲＮＡ（Ｅｘ）として、前記実施例Ｂ４のｓｓＲＮＡ（ＰＫ−０００４）を使用した。比較例のＲＮＡとして、前記実施例Ｂ４に示す、ＲＮＡｉネガティブコントロール（Ｎｃ）のｓｓＲＮＡ（ＰＫ−０００３）を使用した。前記ＲＮＡを、２０μｍｏｌ／Ｌとなるように、注射用蒸留水（大塚製薬）に溶解し、ＲＮＡ溶液を調製した。
【０２９０】
細胞は、Ａ５４９細胞および２９３細胞（ＤＳファーマバイオメディカル）を使用した。前者の培地は、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、後者の培地は、１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地を使用した。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２下とした。
【０２９１】
まず、細胞を、前記培地中で培養し、その培養液を、２４穴プレートに、４００μｌずつ、５×１０４細胞／ウェルとなるように分注した。さらに、前記ウェル中の細胞を２４時間培養した後、前記ＲＮＡをトランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、前記トランスフェクション試薬の添付プロトコールに従って、トランスフェクションした。具体的には、Ａ５４９細胞および２９３細胞に対して、それぞれ、前記ウェルあたりの組成を以下のように設定し、トランスフェクションを行った。下記組成において、（Ｂ）は、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、（Ｃ）は、２０μｍｏｌ／Ｌ  前記ＲＮＡ溶液であり、両者をあわせて９８．５μｌまたは９９μｌ添加した。なお、前記ウェルにおいて、前記ＲＮＡの最終濃度は、１ｎｍｏｌ／Ｌ、３ｎｍｏｌ／Ｌ、１０ｎｍｏｌ／Ｌとした。
【表３】
0005555346.tif 000029
【０２９２】
トランスフェクション後、前記実施例Ｂ４と同様にして、前記細胞の培養、ＲＮＡ回収、ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨ遺伝子の相対的発現量を測定した。
【０２９３】
（２）結果
これらの結果を、図８および図９に示す。図８は、Ａ５４９細胞の結果であり、図９は、２９３細胞の結果である。図８および図９は、ＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。図８および図９に示すように、実施例のＰＫ−０００４は、強い遺伝子発現抑制活性を示し、濃度依存的に効果を示すことがわかった。他方、ネガティブコントロールのＰＫ−０００３は、抑制効果が観察されなかった。
【０２９４】
（実施例Ｂ７）ＨＣＴ１１６細胞におけるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制効果
プロリンまたはプロリノールを有するリンカーで置換したｓｓＲＮＡを用いて、ＨＣＴ１１６細胞でのＧＡＰＤＨ発現抑制効果を確認した。
【０２９５】
（１）材料および方法
（１．１）ｓｓＲＮＡの固相合成
実施例のＲＮＡ（Ｅｘ  ｓｓＲＮＡ）として、前記実施例Ｂ４と同じＥｘ  ｓｓＲＮＡを合成した。前記ＲＮＡの合成は、特に示さない限り、前記実施例Ｂ４に準じた。
【化２６】
0005555346.tif 000030
【０２９６】
リンカー用アミダイトは、前記実施例Ａ３−１で合成したＬ−プロリンジアミドアミダイト（スキーム３の化合物１０）、前記実施例Ａ６で合成したプロリノールウレタンアミダイト（スキーム７の化合物６）、プロリノールウレイドアミダイト（スキーム７の化合物７）、プロリンアミドアミンアミダイト（スキーム３の化合物１２）、およびプロリンアミドウレイドアミダイト（スキーム３の化合物１７）を用いた。合成した各ＲＮＡについて、リンカー部の合成に使用したアミダイトを下記表に示す。
【０２９７】
【表４】
0005555346.tif 000031
【０２９８】
（１．２）遺伝子の発現抑制
前記ＲＮＡを使用した以外は、前記実施例Ｂ４と同様にして、ＨＣＴ１１６細胞へのトランスフェクション、培養、ＲＮＡ回収、ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨ遺伝子の相対的発現量を測定した。
【０２９９】
（２）結果
これらの結果を、図１０に示す。図１０は、ＨＣＴ１１６細胞のＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。図１０に示すように、プロリンまたはプロリノールを含むｓｓＲＮＡ（ＰＫ−０００４、ＰＫ−０００６、ＰＫ−００１０、ＰＫ−００１２、ＰＫ−００１６）は、強い遺伝子発現抑制活性を示し、濃度依存的に効果を示すことがわかった。
【０３００】
（実施例Ｂ８）ＨＣＴ１１６細胞におけるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制効果
プロリンを有するリンカーで置換したｓｓＲＮＡを用いて、ＨＣＴ１１６細胞でのＧＡＰＤＨ発現抑制効果を確認した。
【０３０１】
（１）材料および方法
（１．１）ｓｓＲＮＡの固相合成
実施例のＲＮＡ（Ｅｘ  ｓｓＲＮＡ）として、前記実施例Ｂ４と同じＥｘ  ｓｓＲＮＡを合成した。前記ＲＮＡの合成は、特に示さない限り、前記実施例Ｂ４に準じた。
【化２７】
0005555346.tif 000032
【０３０２】
リンカー用アミダイトとして、前記実施例Ａ３−１で合成したＤ−プロリンジアミドアミダイト（スキーム３の化合物９）および前記実施例Ａ４で合成したプロリンジアミドアミダイトタイプＢ（スキーム４の化合物２２）を用いた。合成した各ＲＮＡについて、リンカー部の合成に使用したアミダイトを下記表に示す。
【０３０３】
【表５】
0005555346.tif 000033
【０３０４】
（１．２）遺伝子の発現抑制
前記ＲＮＡを使用した以外は、前記実施例Ｂ４と同様にして、ＨＣＴ１１６細胞へのトランスフェクション、培養、ＲＮＡ回収、ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨ遺伝子の相対的発現量を測定した。
【０３０５】
（２）結果
これらの結果を、図１１に示す。図１１は、ＨＣＴ１１６細胞のＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。図１１に示すように、プロリンを含むｓｓＲＮＡ（ＰＫ−０００４、ＰＫ−００３４、ＰＫ−００３６）は、強い遺伝子発現抑制活性を示し、濃度依存的に効果を示すことがわかった。
【０３０６】
（実施例Ｂ９）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴＧＦ−β１遺伝子の発現抑制効果
プロリンを有するリンカーで置換したｓｓＲＮＡを用いて、Ｈｅｐａ１−６細胞でのＴＧＦ発現抑制効果を確認した。
【０３０７】
（１）材料および方法
（１．１）ｓｓＲＮＡの固相合成
実施例のＲＮＡとして、以下に示すＰＫ−０００７、ＰＫ−００２６、ＰＫ−００２７、ＰＫ−００２８を合成した。前記ＲＮＡの合成は、特に示さない限り、前記実施例Ｂ４に準じた。リンカー用アミダイトとして、前記実施例Ａ３−１で合成したＬ−プロリンジアミドアミダイト（スキーム３の化合物１０）を用いた。各ＲＮＡは、ＴＧＦ−β１遺伝子の発現を抑制する２１塩基長の下記配列を有している。この配列は、Ｃｈｅｎｇらが用いたｓｉＲＮＡ（Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．，２００９，６，７７２−７７９）に基づいて、設計した。下記配列において、「＊」は、フリー塩基を示す。
ＴＧＦ−β１遺伝子発現抑制配列（配列番号１８）
５’−ＡＡＡＧＵＣＡＡＵＧＵＡＣＡＧＣＵＧＣＵＵ−３’
【化２８】
0005555346.tif 000034
【０３０８】
（１．２）遺伝子の発現抑制
凍結保存した前記ＲＮＡを、２０μｍｏｌ／Ｌとなるように、注射用蒸留水（大塚製薬）に溶解し、ＲＮＡ溶液を調製した。
【０３０９】
細胞は、Ｈｅｐａ１−６細胞（理化学研究所バイオリソースセンター）を使用した。培地は、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地を使用した。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２下とした。
【０３１０】
Ｈｅｐａｌ−６細胞を前記培地中で培養し、その培養液を、２４穴プレートに、４００μｌずつ、３×１０４細胞／ウェルとなるように分注した。そして、前記ＲＮＡ溶液を使用した以外は、前記実施例Ｂ４と同様にして、Ｈｅｐａｌ−６細胞への前記ｓｓＲＮＡのトランスフェクション、ＲＮＡ回収およびｃＤＮＡ合成を行った。なお、前記トランスフェクションについて、前記ウェルにおける前記ＲＮＡの終濃度は、１ｎｍｏｌ／Ｌとした。そして、プライマーとして、下記ＴＧＦ−β１遺伝子用ＰＣＲプライマーセットおよびβ−アクチン遺伝子用プライマーセットを使用した以外は、前記実施例Ｂ４と同様にして、ＰＣＲを行い、ＴＧＦ−β１遺伝子の発現量および内部標準であるβ−アクチン遺伝子の発現量を測定した。前記ＴＧＦ−β１遺伝子の発現量は、内部標準であるβ−アクチン遺伝子の発現量により補正した。
ＴＧＦ−β１遺伝子用ＰＣＲプライマーセット
5’-CCATTGCTGTCCCGTGCAGAGCTG-3’（配列番号１９）
5’-ATGGTAGCCCTTGGGCTCGTGGATC-3’（配列番号２０）
β−アクチン遺伝子用プライマーセット
5’-GTCGTACCACAGGCATTGTGATGG-3’（配列番号２１）
5’-GCAATGCCTGGGTACATGGTGG-3’（配列番号２２）
【０３１１】
また、前記実施例Ｂ４と同様にして、コントロール（−）およびコントロール（ｍｏｃｋ）について、遺伝子発現量を測定した。そして、補正後のＴＧＦ−β１遺伝子発現量について、コントロール（−）の細胞の発現量を１として、各ＲＮＡを導入した細胞の発現量の相対値を求めた。
【０３１２】
（２）結果
これらの結果を、図１２に示す。図１２は、ＴＧＦ−β１遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。図１２に示すように、プロリンを含むｓｓＲＮＡは、全て、強い遺伝子発現抑制活性を示した。
【０３１３】
中でも、フリー塩基の位置を、前記内部領域（Ｚ）における３’末端から２番目および３番目としたＰＫ−００２７およびＰＫ−００２８は、フリー塩基の位置を、前記内部領域（Ｚ）における３’末端から４番目および５番目としたＰＫ−０００７およびＰＫ−００２６よりも、高い発現抑制活性を示した。この結果から、前記内部領域（Ｚ）におけるフリー塩基の位置を、前記内部領域の中央よりも、３’側に配置するほど、前記発現抑制活性を向上できることがわかった。なお、前記フリー塩基の位置は、例えば、前記内部領域の中央よりも、５’側に配置するほど、前記発現抑制活性を向上できることも確認済みである。このようなフリー塩基の位置と発現抑制活性との関係は、後述する参考例の結果と同様の挙動を示した。
【０３１４】
（実施例Ｂ１０）ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴＧＦ−β１遺伝子発現抑制効果および急性肺傷害抑制効果
プロリンを有するリンカーで置換したｓｓＲＮＡを用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子発現抑制および急性肺傷害抑制の効果を確認した。前記効果の確認は、Ｔａｋａｇｉら（Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ  ２００９；７：２０５３−２０６３）に記載の方法に従って行った。
【０３１５】
（Ｂ１０−１）ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴＧＦ−β１遺伝子の発現抑制効果
プロリンを有するリンカーで置換したｓｓＲＮＡを用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴＧＦ−β１遺伝子の発現抑制効果を確認した。
【０３１６】
（１）材料および方法
（１．１）急性肺傷害マウスへのＲＮＡの投与
実施例のＲＮＡ（Ｅｘ）は、前記実施例Ｂ９におけるｓｓＲＮＡ（ＰＫ−０００７）を使用した。比較例のＲＮＡは、以下に示す、ネガティブコントロール（Ｎｃ）のｓｓＲＮＡ（ＰＫ−０００８）、ポジティブコントロール（Ｐｃ）のｓｓＲＮＡ（ＮＫ−００３３）およびそのネガティブコントロール（Ｎｃ）のｓｓＲＮＡ（ＮＫ−００３５）、ポジティブコントロール（Ｐｃ）のｄｓＲＮＡ（ＮＩ−００３０）およびそのネガティブコントロール（Ｎｃ）のｄｓＲＮＡ（ＮＩ−００３１）を使用した。
【０３１７】
【化２９】
0005555346.tif 000035
【０３１８】
前記ＲＮＡ  １００μｇを滅菌生理食塩水７５μｌに溶解して、ＲＮＡ溶液を調製した。他方、１００μｇのリポ多糖（ＬＰＳ）を、滅菌生理食塩水５０μｌに溶解して、ＬＰＳ溶液を調製した。
【０３１９】
まず、前記ＲＮＡ溶液８０μｌを、マウスの気管内に滴下した。滴下から１時間後に、前記マウスの気管内に、前記ＬＰＳ溶液５０μｌを滴下して、肺傷害を誘発した。
【０３２０】
前記ＬＰＳに対するネガティブコントロールとして、前記ＬＰＳ溶液に代えて、ＬＰＳ未添加の滅菌生理食塩水５０μｌを用いた。また、前記ＲＮＡ溶液に対するネガティブコントロールとして、滅菌生理食塩水８０μｌを用いた。
【０３２１】
以下に、各投与群を示す。各投与群において、４〜６匹のマウスを使用した。
・投与群１
滅菌生理食塩水７５μｌの投与から５分後、滅菌生理食塩水５０μｌを投与
・投与群２
滅菌生理食塩水７５μｌの投与から５分後、前記ＬＰＳ溶液５０μｌを投与
・投与群３
ＲＮＡ溶液（ＰＫ−０００７）７５μｌの投与から５分後、前記ＬＰＳ溶液５０μｌを投与
・投与群４
ＲＮＡ溶液（ＰＫ−０００８）７５μｌの投与から５分後、前記ＬＰＳ溶液５０μｌを投与
・投与群５
ＲＮＡ溶液（ＮＫ−００３３）７５μＬの投与から５分後、前記ＬＰＳ溶液５０μｌを投与
・投与群６
ＲＮＡ溶液（ＮＫ−００３５）７５μｌの投与から５分後、前記ＬＰＳ溶液５０μｌを投与
・投与群７
ＲＮＡ溶液（ＮＩ−００３０）７５μｌの投与から５分後、前記ＬＰＳ溶液５０μｌを投与
・投与群８
ＲＮＡ溶液（ＮＩ−００３１）５０μｌの投与から５分後に、前記ＬＰＳ溶液５０μｌを投与
【０３２２】
（１．２）気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）のサンプリング
前記ＬＰＳ溶液または滅菌生理食塩水（ＬＰＳに対するネガティブコントロール）を滴下してから２４時間後、前記マウスの腹腔に、過剰量のペントバルビタールを投与して安楽死させた。そして、肺を採取し、サンプルとした。
【０３２３】
前記マウスの肺サンプルについて、ＴＧＦ−β１  ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＣｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ（商品名、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、単位重量の肺あたりのＴＧＦ−β１発現量を測定した。
【０３２４】
（２）結果
その結果を、図１３に示す。図１３は、各投与群における単位重量の肺あたりのＴＧＦ−β１遺伝子発現量を示すグラフであり、横軸は、ＴＧＦ−β１タンパク質の発現量を示す。ＬＰＳ（＋）／ＰＫ−０００７（＋）の投与群３は、ＬＰＳ（＋）／ｓｓＲＮＡ（−）の投与群２と比較して、ＴＧＦ−β１タンパク質の発現量が著しく抑制された。この抑制効果は、ＬＰＳ（＋）／ポジティブコントロールＮＫ−００３３（＋）の投与群５およびＬＰＳ（＋）／ポジティブコントロールＮＩ−００３０の投与群７よりも、強いことが明らかとなった。なお、ネガティブコントロールＰＫ−０００８（＋）の投与群４、ネガティブコントロールＮＫ−００３５（＋）の投与群６、ネガティブコントロールＮＩ−００３１（＋）の投与群８では、抑制効果は確認されなかった。
【０３２５】
（Ｂ１０−２）ｉｎ  ｖｉｖｏでのオフターゲット効果
プロリンを有するリンカーで置換したｓｓＲＮＡを用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏでのオフターゲット効果を確認し、副作用を評価した。
【０３２６】
実施例のＲＮＡは、前記実施例Ｂ９のｓｓＲＮＡ（ＰＫ−０００７）を使用した。比較例のＲＮＡは、前記実施例Ｂ１０−１に示す、ＲＮＡｉネガティブコントロール（Ｎｃ）の前記ｓｓＲＮＡ（ＰＫ−０００８）を使用した。前記ＲＮＡ  １００μｇを滅菌生理食塩水７５μｌに溶解して、それぞれのＲＮＡ溶液を調製した。
【０３２７】
以下に、各投与群を示す。各投与群において、２〜４匹のマウスを使用した。
・投与群１
滅菌生理食塩水７５μｌを投与
・投与群２
ｓｓＲＮＡ溶液（ＰＫ−０００７）７５μｌを投与
・投与群３
ｓｓＲＮＡ溶液（ＰＫ−０００８）７５μｌを投与
【０３２８】
そして、投与から２４時間後、前記実施例Ｂ１０−１と同様にして、マウスを安楽死させた。前記マウスの心臓に穿刺して、血液サンプルを回収し、３．８％  クエン酸ナトリウム水溶液を含む試験管に添加した。前記クエン酸ナトリウム水溶液の量（体積）は、前記血液サンプルの１／１０とした。この混合液から、Ｙａｓｕｉら（Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ２００１：１６３：１６６０−８）の記載にしたがって、ＢＡＬＦ（気管支肺胞洗浄液）サンプルを回収した。そして、前記ＢＡＬＦサンプルの上清について、ＴＮＦ−α量およびＩＦＮ−β量を測定した。
【０３２９】
前記ＴＮＦ−α量は、商品名Ｍｏｕｓｅ  ＴＮＦ  ｓｅｔ  II（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて、その使用説明書に従って定量した。また、前記ＩＦＮ−β量は、商品名Ｒａｂｂｉｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎβ（ＰＢＬ  ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＳｏｕｒｃｅ）および商品名Ｂｉｏｔｉｎ  ＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ−ＮＨ２（同仁化学研究所）を用いて作製したＥＬＩＳＡプレートを用いて、それらの使用説明書にしたがって定量した。
【０３３０】
その結果を、図１４に示す。図１４（Ａ）は、各投与群のＢＡＬＦサンプル中のＴＮＦ−α量を示すグラフであり、図１４（Ｂ）は、各投与群のＢＡＬＦサンプル中のＩＦＮ−β量を示すグラフである。図１４において、横軸は、それぞれの量を示す。前記ＰＫ−０００７（＋）の実施例投与群２は、ｓｓＲＮＡ（−）の投与群１と比較して、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−βの発現が惹起されなかった。
【０３３１】
（実施例Ｂ１１）リボヌクレアーゼ耐性
本発明のｓｓＲＮＡについて、リボヌクレアーゼ耐性を確認した。
【０３３２】
（１）材料および方法
実施例のＲＮＡ（Ｅｘ）として、前記実施例Ｂ９のｓｓＲＮＡ（ＰＫ−０００７）を使用した。比較例のＲＮＡとして、前記実施例Ｂ１０−１に示す、ポジティブコントロール（Ｐｃ）のｄｓＲＮＡ（ＮＩ−００３０）を使用した。
【０３３３】
まず、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）に、６０ｐｍｏｌの前記ＲＮＡ、５×１０−５ユニットのＲＮａｓｅ  Ａ（Ｒｏｃｈｅ）および５×１０−５ユニットのＲＮａｓｅ  Ｔ１（商品名、Ｒｏｃｈｅ）を混合し、３７℃にてインキュベートした。インキュベート開始から１０分、２０分、３０分後に、定法に従ってＲＮａｓeの反応を停止させた。そして、前記反応液を１５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（商品名、Ｌｏｎｚａ）で染色し、Ｅ−ＢＯＸ−ＶＸ２（商品名、エムエス機器、東京）を用いて分析した。
【０３３４】
（２）結果
この結果を図１５に示す。図１５は、リボヌクレアーゼ耐性を示す電気泳動写真である。図１５において、レーン「Ｍ」は、分子量マーカーであり、（ｍｉｎ）は、インキュベート時間を示す。
【０３３５】
図１５に示すように、天然のヌクレオチドからなる比較例のＮＩ−００３０は、インキュベート１０分後において、ほぼ全てが分解された。これに対して、実施例のＰＫ−０００７は、インキュベート１０分後においても、残存していた。この結果から、本発明のｓｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡよりもリボヌクレアーゼ耐性に優れることがわかった。
【０３３６】
（実施例Ｂ１２）ヌクレアーゼ耐性
本発明のｓｓＲＮＡについて、ヌクレアーゼ耐性を確認した。
【０３３７】
（１）材料および方法
実施例のＲＮＡ（Ｅｘ）として、前記実施例Ｂ９のｓｓＲＮＡ（ＰＫ−０００７）を使用した。比較例のＲＮＡとして、前記実施例Ｂ１０−１に示す、ＲＮＡｉポジティブコントロール（Ｐｃ）のｄｓＲＮＡ（ＮＩ−００３０）を使用した。
【０３３８】
まず、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）に、６０ｐｍｏｌの前記ｓｓＲＮＡ、０．５ユニットのＳ７ヌクレアーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を混合し、３７℃にてインキュベートした。インキュベート開始（０ｈ）から０．５時間後に、定法に従ってＳ７ヌクレアーゼの反応を停止させた。そして、前記反応液を定法に従い、７Ｍ尿素−１５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（商品名、Ｌｏｎｚａ）で染色し、Ｅ−ＢＯＸ−ＶＸ２（商品名、エムエス機器）を用いて分析した。
【０３３９】
（２）結果
この結果を図１６に示す。図１６は、Ｓ７ヌクレアーゼ耐性を示す電気泳動写真である。図１６において、レーン「Ｍ」は、分子量マーカーであり、（ｈ）は、インキュベート時間を示す。
【０３４０】
図１６に示すように、天然のヌクレオチドからなる比較例のＮＩ−００３０は、インキュベート０．５時間後において、ほぼ全てが分解された。これに対して、実施例のＰＫ−０００７は、インキュベート０．５時間後においても、残存していた。この結果から、本発明のｓｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡよりもＳ７ヌクレアーゼ耐性に優れることがわかった。
【０３４１】
前記実施例Ｂの各結果から、本発明のｓｓＰＮは、例えば、標的遺伝子の種類に依存することなく、構築可能であることがわかった。このことから、本発明のｓｓＰＮ分子は、遺伝子の発現抑制において、標的遺伝子の種類に依存することなく使用できる、汎用性の高い新たなツールであるといえる。
【０３４２】
（参考例１）
フリー塩基の位置が異なるｓｓＲＮＡを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制を確認した。
【０３４３】
（１）材料および方法
ＲＮＡとして、図１７に示すｓｓＲＮＡを使用した。図１７において、右端の番号は、配列番号を示す。図１７において、５’側から、小文字下線の領域は、前記領域（Ｘｃ）、大文字下線の領域は、前記内部領域（Ｚ）、小文字下線の領域は、前記領域（Ｙｃ）を示す。前記Ｘｃと前記Ｚとの間が、リンカー領域（Ｌｘ）であり、前記Ｚと前記Ｙｃとの間が、リンカー領域（Ｌｙ）である。また、「Ｘｃ／Ｙｃ」は、前記領域（Ｘｃ）の塩基長（Ｘｃ）と、前記領域（Ｙｃ）の塩基長（Ｙｃ）との比を示す。図１７において、「＊」は、フリー塩基を示す。
【０３４４】
各ｓｓＲＮＡは、いずれも、内部領域（Ｚ）の塩基長を２６塩基、リンカー領域（Ｌｘ）の塩基長を７塩基、リンカー領域（Ｌｙ）の塩基長を４塩基とした。また、ＮＫ−００３６およびＮＫ−００４０は、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｙｃ）との合計塩基数（Ｘｃ＋Ｙｃ）を２６塩基とし、それ以外は、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｙｃ）との合計塩基数（Ｘｃ＋Ｙｃ）を２５塩基とした。そして、この条件の下、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｙｃ）の塩基長を変化させた。これによって、ＮＫ−００３６およびＮＫ−００４０は、フリー塩基を有さない分子とした。また、これら以外の各ｓｓＲＮＡは、前記内部領域（Ｚ）における、二重鎖を形成しないフリー塩基を全て１塩基とし、且つ、前記内部領域（Ｚ）における前記フリー塩基の位置を３’側から５’側に変動させた。
【０３４５】
前記ＲＮＡを使用した以外は、前記実施例Ｂ２と同様にして、ＨＣＴ１１６細胞へのトランスフェクション、培養、ＲＮＡ回収、ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨ遺伝子の相対的発現量を測定した。トランスフェクション時のＲＮＡ濃度は、１０ｎｍｏｌ／Ｌとした。
【０３４６】
（２）結果および考察
これらの結果を、図１８に示す。図１８は、終濃度１０ｎｍｏｌ／ＬのＲＮＡを使用した場合におけるＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。図１８に示すように、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の長さを変化させたいずれのｓｓＲＮＡについても、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制が確認できた。
【０３４７】
特に、前記領域（Ｘｃ）の塩基長と前記領域（Ｙｃ）の塩基長の差が大きくなるに従って、相対的に遺伝子の発現量が低下し、発現抑制活性が増加したことが確認された。すなわち、前記内部領域（Ｚ）におけるフリー塩基の位置を、前記内部領域の中央よりも、５’側または３’側に配置するほど、前記発現抑制活性を向上できることがわかった。
【０３４８】
（参考例２）
フリー塩基の位置が異なるｓｓＲＮＡを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＴＧＦ−β１遺伝子の発現抑制効果を確認した。
【０３４９】
（１）材料および方法
ＲＮＡとして、以下に示すｓｓＲＮＡを使用した。下記配列において、「＊」は、フリー塩基を示す。
【化３０】
0005555346.tif 000036
【０３５０】
（１．２）遺伝子の発現抑制
凍結保存した前記ＲＮＡを、２０μｍｏｌ／Ｌとなるように、注射用蒸留水に溶解し、ＲＮＡ溶液を調製した。そして、前記ＲＮＡ溶液を使用した以外は、前記実施例Ｂ９と同様にして、Ｈｅｐａｌ−６細胞への前記ｓｓＲＮＡのトランスフェクション、ＲＮＡ回収、ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲを行い。ＴＧＦ−β１遺伝子の相対的発現量を測定した。トランスフェクション時のＲＮＡ濃度は、１ｎｍｏｌ／Ｌとした。
【０３５１】
（２）結果
これらの結果を、図１９に示す。図１９は、ＴＧＦ−β１遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。図１９に示すように、いずれのｓｓＲＮＡも、遺伝子発現抑制活性を示した。また、フリー塩基の位置を、前記内部領域（Ｚ）における３’末端から２番目および３番目としたＮＫ−００５５およびＮＫ−００６２は、フリー塩基の位置を、前記内部領域（Ｚ）における３’末端から４番目および５番目としたＮＫ−００３３およびＮＫ−００６１よりも、高い発現抑制活性を示した。この結果は、異なる遺伝子をターゲットとする前記参考例１と同様の挙動であった。
【０３５２】
（参考例３）
フリー塩基の位置が異なるｓｓＲＮＡを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＬＡＭＡ１遺伝子の発現抑制を確認した。
【０３５３】
（１）材料および方法
ＲＮＡとして、以下に示すｓｓＲＮＡを使用した。下記配列において、「＊」は、フリー塩基を示す。
【化３１】
0005555346.tif 000037
【０３５４】
前記ＲＮＡを使用した以外は、前記実施例Ｂ６と同様にして、２９３細胞へのトランスフェクションを行い、前記細胞を４８時間培養した。トランスフェクション時のＲＮＡ濃度は、１０ｎｍｏｌ／Ｌとした。そして、プライマーとして、以下のＬＡＭＡ１遺伝子用プライマーセットを使用した以外は、前記実施例Ｂ２と同様にして、ＲＮＡ回収、ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲを行い、ＬＡＭＡ１遺伝子の発現量および内部標準であるβ−アクチン遺伝子の発現量を測定した。前記ＬＡＭＡ１遺伝子の発現量は、内部標準であるβ−アクチン遺伝子の発現量により補正した。
ＬＡＭＡ１遺伝子用プライマーセット
5’-AAAGCTGCCAATGCCCCTCGACC-3’（配列番号５５）
5’-TAGGTGGGTGGCCCTCGTCTTG-3’（配列番号５６）
【０３５５】
また、前記実施例Ｂ２と同様にして、コントロール１（−）およびコントロール２（ｍｏｃｋ）に関しても、発現量を測定した。そして、補正後のＬＡＭＡ１遺伝子発現量について、コントロール（−）の細胞の発現量を１として、各ＲＮＡを導入した細胞の発現量の相対値を求めた。
【０３５６】
（２）結果
これらの結果を、図２０に示す。図２０は、２９３細胞におけるＬＡＭＡ１遺伝子の発現量の相対値を示すグラフである。図２０に示すように、いずれのｓｓＲＮＡも、遺伝子発現抑制活性を示した。また、フリー塩基の位置を、前記内部領域（Ｚ）における３’末端から２番目としたＮＫ−００６４は、フリー塩基の位置を、前記内部領域（Ｚ）における３’末端から４番目としたＮＫ−００４３よりも、高い発現抑制活性を示した。この結果は、異なる遺伝子をターゲットとする前記参考例１および参考例２と同様の挙動であった。
【０３５７】
（参考例４）
フリー塩基の位置が異なるｓｓＲＮＡを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＬＭＮＡ遺伝子の発現抑制を確認した。
【０３５８】
（１）材料および方法
ＲＮＡとして、以下に示すｓｓＲＮＡを使用した。下記配列において、「＊」は、フリー塩基を示す。
【化３２】
0005555346.tif 000038
【０３５９】
前記ＲＮＡを使用した以外は、前記実施例Ｂ６と同様にして、Ａ５４９細胞へのトランスフェクションを行い、前記細胞を４８時間培養した。トランスフェクション時のＲＮＡ濃度は、３ｎｍｏｌ／Ｌとした。そして、プライマーとして、以下のＬＭＮＡ遺伝子用プライマーセットを使用した以外は、前記実施例Ｂ２と同様にして、ＲＮＡ回収、ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲを行い、ＬＭＮＡ遺伝子の発現量および内部標準であるβ−アクチン遺伝子の発現量を測定した。前記ＬＭＮＡ遺伝子の発現量は、内部標準であるβ−アクチン遺伝子の発現量により補正した。
ＬＭＮＡ遺伝子用プライマーセット
5’-CTGGACATCAAGCTGGCCCTGGAC-3’（配列番号５９）
5’-CACCAGCTTGCGCATGGCCACTTC-3’（配列番号６０）
【０３６０】
また、前記実施例Ｂ２と同様にして、コントロール１（−）およびコントロール２（ｍｏｃｋ）に関しても、発現量を測定した。そして、補正後のＬＭＮＡ遺伝子発現量について、コントロール（−）の細胞の発現量を１として、各ＲＮＡを導入した細胞の発現量の相対値を求めた。
【０３６１】
（２）結果
これらの結果を、図２１に示す。図２１は、Ａ５４９細胞におけるＬＭＮＡ遺伝子の発現量の相対値を示すグラフである。図２１に示すように、いずれのｓｓＲＮＡも、遺伝子発現抑制活性を示した。また、フリー塩基の位置を、前記内部領域（Ｚ）における３’末端から２番目としたＮＫ−００６６は、フリー塩基の位置を、前記内部領域（Ｚ）における３’末端から４番目としたＮＫ−００６３よりも、高い発現抑制活性を示した。この結果は、異なる遺伝子をターゲットとする前記参考例１〜参考例３と同様の挙動であった。
【０３６２】
参考例１〜参考例４の結果から、例えば、フリー塩基の位置に関しては、標的遺伝子の種類ならびにそれに対する発現抑制配列にかかわらず、同様の挙動を示すことは明らかである。そして、前記実施例Ｂ９においては、これらの参考例と同様の挙動を示していることは、前述の通りである。
【０３６３】
（参考例５）
前記内部５’側領域（Ｘ）、前記５’側領域（Ｘｃ）、前記内部３’側領域（Ｙ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の各長さを変化させたｓｓＲＮＡを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制を確認した。
【０３６４】
（１）材料および方法
ＲＮＡとして、図２２に示すｓｓＲＮＡを使用した。図２２において、右端の番号は、配列番号を示す。図２２において、５’側から、小文字下線の領域は、前記領域（Ｘｃ）、大文字下線の領域は、前記内部領域（Ｚ）、小文字下線の領域は、前記領域（Ｙｃ）を示す。また、「Ｘｃ＋Ｙｃ／Ｘ＋Ｙ」は、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｙｃ）の塩基長の合計と、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）の塩基長の合計との比を示す。図２２において、「＊」は、フリー塩基を示す。
【０３６５】
各ｓｓＲＮＡは、いずれも、リンカー領域（Ｌｘ）の塩基長を７塩基、リンカー領域（Ｌｙ）の塩基長を４塩基、前記領域（Ｙｃ）の塩基長を１塩基とし、前記内部領域（Ｚ）の３’側から２番目の塩基を、フリー塩基とした。そして、前記内部領域（Ｚ）の塩基長と前記領域（Ｘｃ）の塩基長を変動させた。
【０３６６】
特に示さない限りは、前記実施例Ｂ２と同様にして、前記ＲＮＡについて、ＨＣＴ１１６細胞へのトランスフェクション、培養、ＲＮＡ回収、ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量の相対値を算出した。前記トランスフェクションの条件は、前記ウェルあたりの組成を前記実施例Ｂ４の表２と同様とした。
【０３６７】
（２）結果および考察
これらの結果を、図２３に示す。図２３は、終濃度１ｎｍｏｌ／ＬのＲＮＡを使用した場合におけるＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。図２３に示すように、前記領域（Ｘ）、前記領域（Ｘｃ）、前記領域（Ｙ）および前記領域（Ｙｃ）の長さを変化させたいずれのｓｓＲＮＡについても、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制が確認できた。
【０３６８】
以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
【０３６９】
この出願は、２０１０年８月３日に出願された日本出願特願２０１０−１７４９１５、２０１０年１０月１３日に出願された日本出願特願２０１０−２３０８０６、２０１０年１２月２日に出願された日本出願特願２０１０−２６９８２３、および２０１１年７月８日に出願された日本出願特願２０１１−１５２３８１を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
【産業上の利用可能性】
【０３７０】
本発明のｓｓＰＮ分子によれば、遺伝子の発現抑制が可能であり、かつ、環状ではないため、その合成が容易であり、また、一本鎖であるため、二本鎖のアニール工程が無く、効率良く製造可能である。また、前記リンカー領域が前記非ヌクレオチド残基を含むため、例えば、従来のようなヌクレオチド残基の改変に限られず、例えば、前記リンカー領域における修飾等の改変も可能となる。このように、本発明のｓｓＰＮ分子は、前述のように標的遺伝子の発現を抑制可能であることから、例えば、医薬品、診断薬および農薬、ならびに、農薬、医学、生命科学等の研究ツールとして有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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