(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺腺癌患者において肺癌の外科切除後の肺腺癌の再発を予測するための方法であって、配列番号１〜８２の各ヌクレオチド配列を含む遺伝子からなる群から選択される１０〜８２の遺伝子の遺伝子セットの発現を該患者由来の生物学的サンプルにおいて測定することを含み、ここで、配列番号１〜５、８〜９、１２、１４〜１５、１７、１９〜２１、２３〜２８、３０〜３３、３５〜５９、６１〜６８、７０〜８２のいずれかのヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現が術後無再発症例と比べて相対的に高い場合、或いは、配列番号６〜７、１０〜１１、１３、１６、１８、２２、２９、３４、６０、６９のいずれかのヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現が術後無再発症例と比べて相対的に低い場合、肺腺癌の再発が高いと予測することを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
前記遺伝子セットの遺伝子数が３０〜８２である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子セットの発現の測定を、前記遺伝子に対応する核酸又はタンパク質の存在もしくは量を測定することによって行う、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子セットの発現の測定を、ハイブリダイゼーション法又は定量ＰＣＲ法によって行う、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ハイブリダイゼーション法が、マイクロアレイ法又はブロット法である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ハイブリダイゼーション法を、前記遺伝子由来のＲＮＡ転写産物、ｃＲＮＡ、ａＲＮＡ又はｃＤＮＡとハイブリダイズする核酸を用いて行う、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子セットの発現の測定を、免疫学的方法によって行う、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記免疫学的方法を、前記遺伝子によってコードされるタンパク質又はその断片に対する抗体を用いて行う、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
肺腺癌患者において肺癌の外科切除後の肺腺癌の再発を予測するための組成物であって、該組成物が、配列番号１〜８２のいずれかのヌクレオチド配列を含む１０以上の異なる遺伝子の発現を測定することを可能にする複数の核酸を含み、該核酸が、
（１）配列番号１〜８２に示されるヌクレオチド配列、それに相補的なヌクレオチド配列、或いはそれらのヌクレオチド配列中の連続する１５塩基から全塩基数未満の部分配列を有する核酸、及び
（２）配列番号１〜８２に示されるヌクレオチド配列又はそれに相補的なヌクレオチド配列を含む核酸とハイブリダイズする核酸、或いは該ハイブリダイズする核酸の連続する１５塩基から全塩基数未満の部分配列を有する核酸、
からなる群から選択されることを特徴とする、前記組成物。
【請求項１０】
前記組成物がキット、マイクロアレイ又はプライマーセットの形態である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記核酸が３０種類以上から８２種類以下の遺伝子の発現の測定を可能にする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法で使用するためのものである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
肺腺癌患者において肺癌の外科切除後の肺腺癌の再発を予測するための組成物であって、該組成物が、配列番号１〜８２のいずれかのヌクレオチド配列を含む１０以上の異なる遺伝子の発現産物を測定することを可能にする複数の抗体を含み、該抗体が、配列番号１〜８２に示されるいずれかのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質又は該タンパク質のアミノ酸配列の連続する少なくとも８アミノ酸残基からなるポリペプチドと免疫学的に反応する抗体、及び該抗体の断片、からなる群から選択されることを特徴とする、前記組成物。
【請求項１４】
前記組成物がキットの形態である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記抗体が３０種類以上から８２種類以下の遺伝子の発現産物の測定を可能にする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法で使用するためのものである、請求項１３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺腺癌患者の術後再発を予測するための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺癌は、先進諸国において癌関連死亡原因のトップである。肺癌は、小細胞癌と非小細胞癌に大別され、さらに非小細胞癌は主として腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌に分類される。肺非小細胞癌の中で肺腺癌は非小細胞癌の約半数を占め、我国では最も発生頻度が高いことが知られている。また、非小細胞癌患者の１０年生存率は約１０％と非常に低く、その患者の約２５〜３０％はステージＩの患者で外科切除を受けただけであり、そのような患者のうち約３５〜５０％が５年以内に再発している。
近年、マイクロアレイや質量分析などの技術の進歩により、これらを利用したバイオインフォマティクス、プロテオミクスなどの新しい技術領域が開発されている。癌研究においても、癌の診断や治療を目的として、このような技術を利用した遺伝子発現の網羅的解析が盛んに行われている。
肺癌についても、肺癌患者における肺癌の分類、転移の予測及び再発の予測と、遺伝子発現パターンや臨床パラメーターとの相関性を追求する研究が行われている（非特許文献１）。
本発明者らもこれまでに、肺癌を中心に、遺伝子発現パターンの網羅的解析を行い、転移や予後の予測に関連する発現パターンを解析してきた（非特許文献２）。また、本発明者らは、最近、肺腺癌をＴＲＵ−ａ型、ＴＲＵ−ｂ型及び非ＴＲＵ型に分類し、この分類に基づいて肺腺癌患者の術後予後を予測するための方法及び組成物を開示している（特許文献１）。
肺腺癌に関して、さらに別のグループが、肺腺癌を判別するための遺伝子セット、肺腺癌の胸膜浸潤を判別するための遺伝子セット、及び肺腺癌の再発を予測するための遺伝子セットを開示している（特許文献２〜４）。このうち、特許文献４には、肺腺癌の術後再発を予測するための方法及び４５個の遺伝子のセットが記載されており、この遺伝子セットによる肺腺癌の判別率が５０％以上であると記載している。また、非特許文献３には、５４個の遺伝子セットによる肺腺癌の再発の予測を開示しており、ここにはまた、肺腺癌患者の予後を判定する従来の方法による再発の正確な予測の難しさが記載されている。
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００７／０４３４１８
【特許文献２】特開２００７−６７９１
【特許文献３】特開２００７−６７９２
【特許文献４】特開２００７−１３５４６６
【非特許文献１】Ｄ．Ｇ．Ｂｅｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００２，８（８）：８１６−８２４
【非特許文献２】冨田秀太及び高橋隆，「発現プロファイル解析に基づく肺癌の診断・治療の新展開」実験医学２００４，２２（１４）：４５−５０，羊土社（日本）
【非特許文献３】Ｊ．Ｅ．Ｌａｒｓｅｎら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００７，１３：２９４６−２９５４
【発明の開示】
【０００３】
癌患者のなかには、腫瘍の外科切除後に転移、再発などによって予後が著しく悪く５年以内に死亡する患者もいれば、逆に、転移や再発のない、すなわち予後が良好である患者もいる。本発明者らは、我国の肺癌患者に比較的多い肺腺癌患者において、肺癌の予後予測において特に再発の予測を高い確度で可能とする方法がないことに注目してきた。肺癌の外科手術後の再発予測は様々な要因が関連するため、その予測が非常に困難である。もし肺腺癌患者の再発を極めて高い確度で予測可能であれば、現在手術後に後治療なしで経過観察の対象となっている患者群のなかに治療を必要とする一群を同定することが可能となり、その予後を改善できる可能性があると考えられる。
従来の肺腺癌の再発予測法では、ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ  ｃｒｏｓｓ−ｖａｌｉｄａｔｉｏｎを利用して再発リスクを予測することができる遺伝子セットを同定している。このとき、もし判定不能という判定基準を用いるときには、判定不能症例がどの程度の割合で含まれるかによって見かけの判別率と真の判別率が極端に異なる場合がある。また、ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ  ｃｒｏｓｓ−ｖａｌｉｄａｔｉｏｎでは、解析対象となるデータが極めて少ない場合において、繰り返し計算も少なく、予測モデルの精度を評価する有効な手法ではあるが、望むらくは、解析対象データを増やし、かつ、１０−ｆｏｌｄクロスバリデーション法とランダム分割を取り入れた繰り返し計算を行い、より精確なモデルの評価を行うことが好ましい。
さらにまた、マイクロアレイを利用した癌細胞の網羅的遺伝子発現プロファイリングと臨床アウトカムを関連付ける際には、サンプリングの仕方、プラットフォームの違い、統計解析の違いなどによって、再現性や信頼性に疑義が生じることがあると指摘されている（例えば、松井茂之，実験医学２００７，２５（１７）：７２−７８（増刊）羊土社（日本））。
本発明の目的は、肺腺癌患者において肺癌の外科切除後の肺腺癌の再発を予測する際に、肺腺癌の再発を極めて高い確度で予測するための方法及び組成物を提供することである。
本発明者らは、判定不能の判定手法と異なる、全ての症例に高再発リスクか低再発リスクのいずれかの判定を提示する手法であること、また、従来の再発予測遺伝子セットと異なる、８２種類の遺伝子からなる新規の遺伝子セットを該判定のために使用することによって、評価モデルにおいて７０％超の確度で再発の有無を予測することを可能にし、本発明を完成した。
本発明は、要約すると、以下の特徴を包含する。
本発明は、第１の態様において、肺腺癌患者において肺癌の外科切除後の肺腺癌の再発を予測するための方法であって、配列番号１〜８２の各ヌクレオチド配列を含む遺伝子からなる群から選択される２〜８２個の遺伝子の遺伝子セットの発現を該患者由来の生物学的サンプルにおいて測定することを含み、ここで、配列番号１〜５、８〜９、１２、１４〜１５、１７、１９〜２１、２３〜２８、３０〜３３、３５〜５９、６１〜６８、７０〜８２のいずれかのヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現が術後無再発症例と比べて相対的に高い場合、或いは、配列番号６〜７、１０〜１１、１３、１６、１８、２２、２９、３４、６０、６９のいずれかのヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現が術後無再発症例と比べて相対的に低い場合、肺腺癌の再発が高いと予測することを特徴とする、上記方法を提供する。
本発明の実施形態によれば、上記遺伝子セットの遺伝子数は５以上８２以下である。
本発明の別の実施形態によれば、上記遺伝子セットの発現の測定は、上記遺伝子に対応する核酸又はタンパク質の存在もしくは量を測定することによって行なわれる。
本発明の別の実施形態によれば、上記遺伝子セットの発現の測定は、ハイブリダイゼーション法又は定量ＰＣＲ法によって行なわれる。
本発明の実施形態によれば、上記ハイブリダイゼーション法は、マイクロアレイ法又はブロット法である。
本発明の実施形態によれば、上記ハイブリダイゼーション法は、上記遺伝子由来のＲＮＡ転写産物、ｃＲＮＡ、ａＲＮＡ又はｃＤＮＡとハイブリダイズする核酸を用いて行なわれる。
本発明の別の実施形態によれば、上記遺伝子セットの発現の測定は、免疫学的方法によって行なわれる。
本発明の実施形態によれば、上記免疫学的方法は、上記遺伝子によってコードされるタンパク質又はその断片に対する抗体を用いて行なわれる。
本発明は、第２の態様において、肺腺癌患者において肺癌の外科切除後の肺腺癌の再発を予測するための組成物であって、該組成物が、配列番号１〜８２のいずれかのヌクレオチド配列を含む２以上の異なる遺伝子の発現を測定することを可能にする複数の核酸を含み、該核酸が、
（１）配列番号１〜８２に示されるヌクレオチド配列、それに相補的なヌクレオチド配列、或いはそれらのヌクレオチド配列中の連続する１５塩基から全塩基数未満の部分配列を有する核酸、及び
（２）配列番号１〜８２に示されるヌクレオチド配列又はそれに相補的なヌクレオチド配列を含む核酸とハイブリダイズする核酸、或いは該ハイブリダイズする核酸の連続する１５塩基から全塩基数未満の部分配列を有する核酸、
からなる群から選択されることを特徴とする、上記組成物を提供する。
本発明の実施形態において、上記組成物は、キット、マイクロアレイ又はプライマーセットの形態である。
本発明の別の実施形態において、上記核酸は、５種類以上から８２種類以下の遺伝子の発現の測定を可能にする。
本発明の別の実施形態において、上記組成物は、本発明の上記方法で使用するためのものである。
本発明は、第３の態様において、肺腺癌患者において肺癌の外科切除後の肺腺癌の再発を予測するための組成物であって、該組成物が、配列番号１〜８２のいずれかのヌクレオチド配列を含む２以上の異なる遺伝子の発現産物を測定することを可能にする複数の抗体を含み、該抗体が、配列番号１〜８２に示されるいずれかのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質又は該タンパク質のアミノ酸配列の連続する少なくとも８アミノ酸残基からなるポリペプチドと免疫学的に反応する抗体、及び該抗体の断片、からなる群から選択されることを特徴とする、上記組成物を提供する。
本発明の実施形態において、上記組成物は、キットの形態である。
本発明の別の実施形態において、上記抗体プローブは、５種類以上から８２種類以下の遺伝子の発現産物の測定を可能にする。
本発明の別の実施形態において、上記組成物は、本発明の上記方法で使用するためのものである。
本明細書中、「術後再発」は、肺腺癌の外科切除後に患者が肺腺癌を再発することを意味する。再発すると予測された患者は、高再発リスクであると判定され、低い生存率を有する。これに対して、無再発と予測された患者は、低再発リスクであると判定され、高い生存率を有する。
本明細書中、「患者」は、ヒトを含む哺乳動物を指し、好ましい哺乳動物はヒトである。
本明細書中、「核酸」は、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかであり、例えば各遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）、ｃＲＮＡ、ａＲＮＡ、ｃＤＮＡなどが含まれる。
本明細書中、「遺伝子」は、特定のタンパク質をコードし、エクソン、イントロン、５’−及び３’−非翻訳領域などによって構成され、その転写によって前駆体ｍＲＮＡの形成を可能にし、さらにスプライシング事象を経てｍＲＮＡとなり、タンパク質へと翻訳される。
本明細書中、「タンパク質」は、特定の遺伝子によってコードされるタンパク質、その変異体又はその断片を包含する。このような変異体は、スプライシング、多型性などの天然事象に基づく変異体を含む。また、このような断片は、生体内でプロテアーゼ、ペプチダーゼなどの酵素作用によって自然発生的に生じたタンパク質断片である。
本明細書中、「ハイブリダイゼーション」は、核酸と核酸との塩基対合による二本鎖の形成反応である。ハイブリダイゼーションには、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション、及びＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションが含まれる。ハイブリダイゼーションは、通常、固体支持体上に固定された核酸プローブを用いて行われる。固体支持体は、プラスチック又はポリマー、ガラスなどの材質で、テストプレート、試験管、試験片、チップなどの形状としうる。ハイブリダイゼーションでは、温度、イオン強度、界面活性剤の濃度、ホルムアミドの有無、核酸のＧＣ含量などが、ハイブリッドの安定性やハイブリダイゼーション速度に影響を与える。一般に、温度が高い、又はイオン強度が高いほど、すなわち厳しい（ストリンジェントな）条件ほど、ハイブリッドの安定性は低下し、逆にハイブリダイゼーションの特異性が増大する。ハイブリダイゼーションについては、Ａｕｓｂｅｌ  ＦＭら，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（３版）Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５年，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（米国）に記載されている。
本明細書中、「免疫学的」とは、抗原と抗体との複合体を形成することを意味する。このような複合体を形成する反応を、免疫学的反応と称し、この反応を利用して抗原又は抗体を検出又は定量する方法を、免疫学的方法と称する。免疫学的方法は、固相又は液相、均一又は不均一などの条件下で行うことができ、このとき抗原−抗体複合体の検出は、標識（例えば色素、蛍光性物質、放射性同位元素、酵素など）を利用する方法、凝集を利用する方法（例えばラテックス法など）、濁度を利用する方法、免疫沈降を利用する方法、二次抗体を利用する方法（例えばサンドイッチ法）などによって行うことができる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００７−３３９２１４号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、訓練セットをランダムに１０分割する１０−ｆｏｌｄ  ｃｒｏｓｓ−ｖａｌｉｄａｔｉｏｎを１００回繰り返すことを使用して再発関連シグネチャを同定するための訓練−有効性戦略の概略図を示す。
図２は、再発関連シグネチャを同定するための訓練手順の結果を示す。図２Ａは、再発関連シグネチャを規定するための最適プローブ数の探索結果を示す。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線を用いて訓練群における生存率を評価した。全ステージ（図２Ｂ）及びステージＩ（図２Ｃ）における患者の再発関連曲線も示す。
図３は、訓練データセットにおけるＥＧＦＲ変異（図３Ａ）、Ｋ−ｒａｓ変異（図３Ｂ）及びｐ５３変異（図３Ｃ）の存在又は非存在におけるＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す。
図４は、評価セットＩおよび評価セットＩＩを用いたＲＲＳ−８２シグネチャの有効性を示す。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線を、ＲＲＳ−８２に基いて予測したリスクに従って示した。図４Ａは全ステージの無再発生存曲線を示し、図４Ｂは全ステージの全生存曲線、図４ＣはステージＩの無再発生存曲線、また、４ＤステージＩの全生存曲線を示す。また、ステージＩのみのサンプルからなる評価セットＩＩを用いた無再発生存曲線を図４Ｅに、全生存曲線を図４Ｆに示した。さたに、評価セットＩ＋ＩＩにおける無再発生存曲線を図４Ｇ、全生存曲線を図４Ｈに示す。
図５は、ＲＲＳ−８２に基づくリスク群とＴＮＭステージとの関係を示す。図５Ａは、低リスクＲＲＳ−８２シグネチャをもつ患者の無再発生存曲線、図５Ｂは、高リスクＲＲＳ−８２シグネチャをもつ患者の無再発生存曲線をそれぞれ示す。
図６は、独立したデータセットの解析により、ＲＲＳ−８２シグネチャの有効性を示す。図６Ａは、３９個の肺腺癌からなるＤｕｋｅ大学のデータセットに、ＲＲＳ−８２シグネチャの構成成分を用いて行った教師無し階層的クラスタリング解析結果を示し、図６ＢはクラスターＩ及びＩＩのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す。また、図６ＣはＭｉｃｈｉｇａｎ大学のデータセットを用いて、予測モデルを構築する概念図を示す。図６Ｄは図６Ｃにより構築されたモデルを用いて、Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇがんセンターの遺伝子発現データ１０４サンプルを解析したＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す。
図７は、訓練データセットでのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存の評価を示す。図７Ａは、全ステージの複数の患者でのＲＲＳ−８２シグネチャによる全生存曲線を示し、また、図７Ｂは、ステージＩの複数の患者でのＲＲＳ−８２シグネチャによる全生存曲線を示す。
図８は、評価セットＩ中ステージＩＩ〜ＩＩＩ症例での、ＲＲＳ−８２シグネチャによるＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存の評価を示す。ステージＩＩ〜ＩＩＩ患者のうち、無再発（図８Ａ）及び全生存（図８Ｂ）は、高リスクシグネチャを有する患者と比べて低リスクＲＲＳ−８２シグネチャを有する患者の場合に良好となる傾向があったが統計的に有意ではなかった。
図９は、評価セットＩにおいて、ＲＲＳ−８２シグネチャとステージの関連性を、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線を用いて評価した。図９Ａに示す低リスク群では、ステージＩ症例とステージＩＩ−ＩＩＩ症例の比較において、統計的に有意ではないが、ステージＩ症例の全生存曲線が良好となる傾向がある。図９Ｂに示す高リスク群では、ステージＩ症例とステージＩＩ−ＩＩＩ症例の比較において、全生存曲線はほぼ同一曲線となっている。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明は、上記のとおり、肺腺癌患者において肺癌の外科切除後の肺腺癌の再発を高い確度で予測するための方法を提供する。このような高い確度での予測を可能にしたのは、一部には、肺腺癌患者のうち術後再発症例及び術後無再発症例を専門医の見識と経験に基いて厳密に選択し、信頼性の高い統計学的手法を使用するなどの条件下で、肺腺癌患者での術後再発／無再発に関連して従来未公表の８２個の遺伝子セットを見出したことに基づいている。
＜遺伝子セットの決定＞
本発明では、肺腺癌患者において肺癌の外科切除後の肺腺癌の再発を予測するための８２個の異なる遺伝子からなるセットを見出したが、この遺伝子セットを決定した手順について以下に説明する。
背景技術に記載したように、肺腺癌の術後再発を予測するための遺伝子セットがいくつかのグループによって報告されているが、数万の遺伝子群から予測可能であると記載される遺伝子セットの各々は、互いに重複がないか、さもなくば重複が極めて低い。本発明者らが見出した８２遺伝子セットについても、例えば特開２００７−１３５４６６に記載された４５遺伝子セットと重複する遺伝子はないし、また、Ｊ．Ｅ．Ｌａｒｓｅｎら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００７，１３：２９４６−２９５４に記載された５４遺伝子セットと重複する遺伝子はわずかに１個のみである。しかし、図２Ａで証明されるように、単一の遺伝子を用いて再発予測を実施するときの正答率（すなわち、［正答数／（正答数＋誤答数）］×１００（％））は、著しく低下する。正答率を高めるためには、複数の、好ましくは５以上の、より好ましくは１０以上の、さらに好ましくは３０以上の、最も好ましくは８２の遺伝子からなるセットを使用することが望ましい。たとえ８２超の遺伝子を使用したとしても正答率はよくなるどころか逆に悪化する傾向を、図２Ａは示している。
後述の実施例に記載するように、本発明者らは、切除手術を受けた肺腺癌患者から８７の肺腺癌サンプルを用意し、このうち６０をランダムに訓練セットに割り当て、残りの２７を評価セットとして用いた。訓練セットのサンプルについて、バックグラウンドの発現量を超えるプローブを選択し、このフィルタリング基準を満たしたプローブシグナルを用いて、教師付きクラス分類技術（重み付き投票アルゴリズム；Ｙａｎａｇｉｓａｗａら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９９：８５８−６７，２００７）によって、再発の高リスク又は低リスクを平均７５％以上の高い確度で予測可能にする８２遺伝子を再発関連シグネチャ（すなわち、再発するか又は再発するリスクが高い、あるいは、再発しないか又は再発するリスクが低い）として同定した。このとき、無再発シグネチャを同定するプローブシグナルの選択するために、１０−ｆｏｌｄクロスバリデーション法を用いた。この方法の概略は図１に示されている。
１０−ｆｏｌｄクロスバリデーション法は、例えば１００サンプルを１０サンプルずつに１０分割し、この１０分割から１分割を除いた残り９分割について特性（再発関連シグネチャ）の選択を行い、選択されたトップ１位から最大２００位までの予測プローブからなる分類器を構築し、除いた１分割の分類を行う。次に、除いた１分割を元に戻した１０分割の中から別の１分割を除いた残り９分割について同様にシグネチャの選択を行い、選択されたトップ１位から最大２００位までの予測されたプローブからなる分類器を構築し、除いた別の１分割の分類を行う。同様の操作を合計１０回行う。ここで、例えば１００サンプルを１０分割する割り当て方は無数に存在する事を考慮し、割り当て方による偏りを低減するために、無作為（ランダム）に１００通りの方法で１００サンプルを１０分割した。このようにして、１００通りの無作為分割毎に１０−ｆｏｌｄクロスバリデーション法を施行した計１０００個の独立したセットに対して、最大２００個の予測プローブからなる分類器を構築した。その結果、学習エラーが最小となる予測プローブ数８２を見出し（図２Ａ）、独立した１，０００個のセット間で最も高頻度に共有されている８２個のプローブを再発関連シグネチャとして同定し、このようにして最終分類器を構築する。
上記のように構築された分類器を使用して、テストサンプルの分類を行う。テストサンプルとして、ランダムに選択された肺腺癌患者から切除された肺腺癌の２７評価サンプルが使用された。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線とＣｏｘ比例ハザードモデル分析を用いて、評価サンプルから得られた再発関連シグネチャと、全生存（ｏｖｅｒａｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）及び無再発生存（ｒｅｌａｐｓｅ−ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）との関係を分析する。その結果、本発明の８２遺伝子セット（「ＲＲＳ−８２」という）は、再発・死亡の高リスク患者と、無再発・高生存の低リスク患者とを７５％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の高い確度で判別することができる。
ＲＲＳ−８２は、配列番号１〜８２の各ヌクレオチド配列を含む８２種の遺伝子からなるセットである、この遺伝子セットを表１に示す、
【表１】
0005407018.tif 000002
0005407018.tif 000003
0005407018.tif 000004
上記表中のＮｏ．１からＮｏ．８２はそれぞれ、配列番号１から配列番号８２に対応している。８２種の遺伝子を、術後無再発症例との相対的発現差を基に、再発関連シグネチャ、すなわち再発（死亡）シグネチャ又は高再発リスクシグネチャ及び無再発シグネチャ又は低再発リスクシグネチャ、について分類すると、次の２つの群に分けることができた。
（１）配列番号１〜５、８〜９、１２、１４〜１５、１７、１９〜２１、２３〜２８、３０〜３３、３５〜５９、６１〜６８、７０〜８２の各ヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現が術後無再発症例と比べて相対的に高い場合、肺腺癌の再発が高いと予測できる群（あるいは、相対的発現が低い場合、肺腺癌の再発が低いと予測できる群）、及び
（２）配列番号６〜７、１０〜１１、１３、１６、１８、２２、２９、３４、６０、６９の各ヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現が術後無再発症例と比べて相対的に低い場合、肺腺癌の再発が高いと予測できる群（あるいは、相対的発現が高い場合、肺腺癌の再発が低いと予測される）。
すなわち、上記（１）群の遺伝子の場合、肺腺癌患者を、相対的発現が高いか低いかによって再発（死亡）患者又は高リスク患者、あるいは、無再発患者又は低再発リスク患者として予測・分類することができる。また、上記（２）群の遺伝子の場合、逆に、肺腺癌患者を、相対的発現が低いか高いかによって無再発患者又は低リスク患者、あるいは、再発（死亡）患者又は高リスク患者として予測・分類することができる。
本発明方法によって再発又は高リスクと判定されたならば、肺腺癌患者の術後再発を抑制するための治療計画を早期に立案することが可能になるし、一方、無再発又は低リスクと判定されたならば、無用の化学療法や放射線治療を避けるための判断材料ともなりうる。
上記遺伝子の相対的発現レベルを比較する際の対照は、術後無再発症例であり、上記の予測を可能にするならば、術後一定期間（例えば３年、好ましくは５年、より好ましくは１０年）無再発と判定された患者由来のサンプル（肺腺癌組織又は細胞）である。
本発明におけるＲＲＳ−８２と、ＥＧＦＲ、Ｋ−ｒａｓ又はｐ５３遺伝子変異との間に統計的に有意な関連は見出されていない（図３）。
本発明におけるＲＲＳ−８２の判別能力を、評価セット（２７肺腺癌サンプル）を用いて検証したときには、ＲＲＳ−８２の高リスクシグネチャを示した全ての患者が５年以内に肺腺癌を再発し、一方、低リスクシグネチャを示した患者の約７０％が５年後に再発の兆候を示さなかった（図４）。この意味では、本発明の方法は、肺腺癌患者における術後再発の高リスク群を予測するうえで極めて有効であるといえる。
本発明の方法による再発・無再発予測は、腫瘍のステージに関わらず実施可能であり、興味深いことに早期のステージであっても実施可能である。
＜肺腺癌の術後再発の予測法＞
本発明は、その一の態様において、肺腺癌患者において肺癌の外科切除後の肺腺癌の再発を予測するための方法であって、配列番号１〜８２の各ヌクレオチド配列を含む遺伝子からなる群から選択される２〜８２個の遺伝子の遺伝子セットの発現を該患者由来の生物学的サンプルにおいて測定することを含み、ここで、配列番号１〜５、８〜９、１２、１４〜１５、１７、１９〜２１、２３〜２８、３０〜３３、３５〜５９、６１〜６８、７０〜８２のいずれかのヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現が術後無再発症例と比べて相対的に高い場合、或いは、配列番号６〜７、１０〜１１、１３、１６、１８、２２、２９、３４、６０、６９のいずれかのヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現が術後無再発症例と比べて相対的に低い場合、肺腺癌の再発が高いと予測することを特徴とする上記方法を提供する。
上記８２種の遺伝子は、上記のとおり、配列番号１〜８２によって示されるヌクレオチド配列を含むヒト遺伝子である。生物由来の遺伝子であるがゆえに、多型変異、スプライス変異、突然変異などの変異が生じることもあると考えられる。したがって、本発明の対象遺伝子は、配列番号１〜８２によって示されるヌクレオチド配列だけでなく、これらの配列中に１もしくは数個のヌクレオチドの欠失、置換又は付加を含むことができるし、あるいは、これらの配列に対し少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有しうる。
本明細書で使用する「同一性（％）」という用語は、ギャップを導入した或いはギャップを導入しない公知のＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いて決定することができる（Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０：５８７３−５８７７；Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７：２２６４−２２６８；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２）。一般に、全塩基数に対する一致した塩基数の百分率として同一性（％）を算出できる。
本明細書で使用する「数個」という用語は、２から１０までの整数を指し、すなわち２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のいずれかであり、好ましくは２から５までの整数、より好ましくは２又は３である。
本発明では、遺伝子セットにおける遺伝子数が２〜全数（８２）であり、この範囲の遺伝子数であれば、術後再発を予測することができる。しかしながら、予測確度（又は精度）をより高めるためには、遺伝子数を５〜８２とすることが好ましく、さらに好ましい範囲は１０〜８２、もっと好ましい範囲は３０〜８２、例えば４０〜８２、５０〜８２、６０〜８２，７０〜８２であり、最も好ましい遺伝子数は８２である。
遺伝子の発現は、核酸か又はタンパク質の量又は存在について測定することができる。核酸の測定においては、各遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡ及びその誘導体核酸、例えばｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ及びａＲＮＡ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ＲＮＡ）を測定対象とすることができる。一方、タンパク質の測定においては、各遺伝子によってコードされるタンパク質（発現産物又は遺伝子産物ともいう）、その断片又はその翻訳後修飾産物（例えば糖などによる修飾）を測定対象としうる。
以下に、上記の８２遺伝子の発現を、核酸及びタンパク質レベルで測定するための手法について説明する。
テストサンプルは、肺腺癌患者の肺腺癌組織又細胞であり、これは手術によって切除された癌組織、あるいは、生検によって得られた組織又は細胞などである。
核酸による遺伝子発現の測定
本発明方法において、８２種の遺伝子の発現を検出するために、以下の核酸をプローブ又はプライマーとして使用することができる。
（１）配列番号１〜８２に示されるヌクレオチド配列、それに相補的なヌクレオチド配列、或いはそれらのヌクレオチド配列中の連続する１５塩基から全塩基数未満の部分配列を有する核酸、及び
（２）配列番号１〜８２に示されるヌクレオチド配列又はそれに相補的なヌクレオチド配列を含む核酸とハイブリダイズする核酸、或いは該ハイブリダイズする核酸の連続する１５塩基から全塩基数未満の部分配列を有する核酸。
上記の部分配列からなる核酸断片のサイズは、１５塩基から全塩基数未満であり、例えば１７塩基以上、２０塩基以上、３０塩基以上、５０塩基以上、７０塩基以上、１００塩基以上、１５０塩基以上、２００塩基以上、３００塩基以上、４００塩基以上又は５００塩基以上から全塩基数未満の範囲である。
上記核酸は、約１００塩基以下のＤＮＡ分子であれば、ホスホアミダイト法などを利用する市販のＤＮＡ自動合成装置を用いて合成するか、或いは、約１００塩基超のＤＮＡ分子であれば、ｃＤＮＡクローニングやポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって作製することができる。また、ｃＲＮＡやａＲＮＡは、市販キット等を用いてｃＤＮＡから作製しうる。
ｃＤＮＡクローニング及びＰＣＲ法では、肺腺癌組織から全ＲＮＡを取得し、オリゴｄＴセルロースカラム処理によってポリＡ（＋）ＲＮＡを得たのち、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法によってｃＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーから、配列番号１〜８２に示されたヌクレオチド配列に基づいて作製した１５塩基以上の長さのプローブ又はプライマーを用いて目的の遺伝子に対応するｃＤＮＡを選抜／クローニング又はＰＣＲ増幅することができる。プローブは、ｃＤＮＡ配列に相補的な配列を有し、その長さは、好ましくは２０塩基以上、より好ましくは３０塩基以上、さらに好ましくは５０塩基以上である。また、プライマーは、センスプライマー及びアンチセンスプライマーからなり、その長さは、好ましくは１５〜５０塩基、より好ましくは１７〜３０塩基、さらに好ましくは２０〜２５塩基である。
上記のようにして得られたＤＮＡは、市販又は文献記載のベクターに挿入したのち、原核又は真核生物の宿主細胞に導入し、増幅することができるし、或いは、目的ＤＮＡが挿入されたベクターを鋳型にしてＰＣＲ増幅することができる。
ベクターは、プラスミド、ファージ、プラスミド、ウイルスなどのベクターであり、例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系、ｐＵＣ系、ｐＢＲ系などのプラスミドである。ベクターは、目的ＤＮＡの他に、プロモーター、複製開始点、リボソーム結合配列（又はシャイン−ダルガルノ配列）、ターミネーター、選択マーカー配列（例えば薬剤耐性遺伝子）、マルチクローニングサイトなどを含むことができる。宿主細胞に適したベクターが市販されているのでそれを使用するのが望ましい。
原核宿主細胞は、細菌細胞であり、一般に大腸菌、枯草菌、シュードモナス属細菌などを含む。また、真核宿主細胞は、酵母、真菌、担子菌、動物細胞（昆虫細胞、哺乳動物細胞など）、植物細胞などを含む。
ベクターを宿主細胞に導入する方法もまた公知であり、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム法、スフェロプラスト融合法、プロトプラスト融合法、マイクロインジェクション、遺伝子銃法、アグロバクテリウム法などが含まれる。
上記の技術の詳細は、例えばＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９８９年，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（米国）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（３版）Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５年，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（米国）などに記載されている。
本発明方法で使用可能な核酸には、上記（２）のとおり、配列番号１〜８２に示されるヌクレオチド配列又はそれに相補的なヌクレオチド配列を含む核酸とハイブリダイズする核酸、或いは該ハイブリダイズする核酸の連続する１５塩基から全塩基数未満の部分配列を有する核酸である。ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションが好ましく、この条件では、上記ヌクレオチド配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する配列の核酸とハイブリダイゼーションを起こすことができる。
上記の核酸を用いて８２遺伝子セットの発現の測定を行う。好ましい測定法は、ハイブリダイゼーション法又は定量ＰＣＲ法（例えばリアルタイムＰＣＲ法など）を含む。
ハイブリダイゼーションは、固体支持体の表面上に付着又は結合した核酸プローブに対し、それに部分的又は完全に相補的な核酸を、塩基対合を介して結合させて二本鎖を形成する手法をいう。固体支持体は、例えばテストプレート、試験管、試験片、アレイなどを含み、その材質は、通常、ポリマー（又はプラスチック、樹脂）、ガラスなどである。本発明方法で使用されるハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション又はＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションのいずれであってもよく、その方法には、非限定的に、例えばマイクロアレイ法、ブロット法、例えばノザンブロット、サザンブロット、ノザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが含まれる。
マイクロアレイ法では、配列番号１〜８２のヌクレオチド配列を含む遺伝子又はそれに対応する核酸（ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ又はａＲＮＡ）とハイブリダイズする１５塩基以上の核酸プローブを支持体に結合したマイクロアレイ（又はＤＮＡチップ）を作製し使用する。マイクロアレイの表面には、核酸プローブを共有結合するための反応性基を含むスペーサーやクロスリンカーを導入することができる。アレイ表面と核酸プローブとの結合は、例えば光や熱による化学反応を介して行うことができる。
上記のハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行うときには、核酸プローブとテスト用核酸との間でより特異的な結合が可能になる。ストリンジェントな条件は、上に定義した条件を含むが、ハイブリダイゼーション法の種類に応じて適宜最適な条件を決定することが望ましい。一般に、ストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）は、温度、溶液のイオン強度、ホルムアミドの存在、核酸の相対ＧＣ含量、インキュベーション時間などによって大きく左右される。温度は、オリゴヌクレオチドの５０％がその相補鎖と解離するときの温度（Ｔｍ）の前後の温度範囲から最適温度を決めることができる。ストリンジェントな条件での温度は、通常、４２〜６８℃の範囲内の温度である。高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、例えば６×ＳＳＣ、０．０１Ｍ  ＥＤＴＡ、１×デンハルト液、０．５％ＳＤＳ中、６８℃でのハイブリダイゼーション；１Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％サルコシル、３０％ホルムアミド中、６０℃でのハイブリダイゼーション；０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５５℃での洗浄などである。ここで、１×ＳＳＣは１５０ｍＭ塩化ナトリウムと１５ｍＭクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．２）である。
核酸プローブの固相化は、特に制限はないが、一般的な方法、例えばスポッター又はアレイヤーと呼ばれる高密度分注機を用いてＤＮＡをスポットする方法、ノズルから液滴を噴射するインクジェット方式などの方法を用いて実施することができる。
肺腺癌患者から外科切除された肺腺癌組織テストサンプル由来のｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ、ａＲＮＡなどの核酸を、Ｃｙ染料（例えばＣｒ３、Ｃｙ５）などの蛍光物質で標識し、マイクロアレイ上のプローブとハイブリダイズさせる。レーザースキャンによる読み取り装置を用いて蛍光強度を読み取り、コンピュータでデータ解析する。
ブロット法では、本発明の上記核酸プローブを放射性同位元素（例えば、３２Ｐ及び３５Ｓ）や蛍光物質（フルオレサミン、ローダミン、それらの誘導体、Ｃｙ染料など）などで標識したのち、ポリマーメンブレンに転写したテストサンプル中のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ、ａＲＮＡなどの核酸との間でハイブリダイゼーションを行う。シグナルを、放射線検出器又は蛍光検出器を用いて検出し、その強度を測定する。
定量リアルタイムＰＣＲ法では、肺腺癌組織テストサンプル中のｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡを鋳型として標的の各遺伝子の領域が増幅できるように、プライマーをｃＤＮＡとアニーリングさせてＰＣＲを行い、リアルタイムで増幅産物二本鎖ＤＮＡを検出する。増幅産物は１サイクル毎に指数関数的に増幅し、やがてプラトーに達する。段階希釈した標準サンプルを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、サイクル数を横軸に、ＰＣＲ増幅量を縦軸にとり、サイクル数毎の増幅曲線を作成する。閾値を設定し、閾値と増幅曲線が交わる点Ｃｔ値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｃｙｃｌｅ）を算出する。Ｃｔ値は、ＰＣＲ産物が一定量に達したときのサイクル数である。Ｃｔ値と初期鋳型ＤＮＡ量の間に直線関係があるので、検量線を作成する。
増幅産物の検出は、インターカレーター法、蛍光標識プローブ法などの方法を用いて行うことができる。インターカレーター法は、例えばハイブリダイゼーションによって形成されたＤＮＡの二本鎖の間に蛍光物質が結合する性質を利用して増幅産物量をモニターする方法である。蛍光標識プローブ法では、プローブを蛍光物質で標識し、増幅産物量を蛍光シグナルによってモニターする。この方法のなかには、５’末端に蛍光物質及び３’末端にクエンチャーを結合したプローブを使用する方法も知られている。
リアルタイムＰＣＲ装置が市販されているので、これを用いてリアルタイムＰＣＲ法を実施することができる。
ＰＣＲを実施する際の条件として、増幅サイズは８０〜１５０ｂｐの範囲とすること、プライマーサイズは１７〜２５塩基の範囲とすること、プライマー全体のＧＣ含量は４０〜６０％の範囲とすること、プライマーの３’末端はＧ又はＣ、プライマー内部やプライマー間に３塩基以上相補する配列がないこと、上流プライマーと下流プライマーのＴｍ値を２℃以内にそろえること、鋳型特異的プライマーを設計すること、などが知られている。
ＰＣＲ条件は、例えば変性：９２〜９４℃で３０〜６０秒；アニーリング：５０〜５５℃で３０〜６０秒；伸長：６８〜７２℃で３０〜６０秒を１サイクルとして３０〜４０サイクルの反応を含む。逆転写酵素は、市販の酵素、例えばＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｍ−ＭＬＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ）などを使用することができる。
本発明において、再発と無再発との相対的発現レベル差は、１．１倍以上、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２．０倍以上である。
タンパク質による遺伝子発現の測定
本発明方法では、配列番号１〜８２によって示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子によってコードされるタンパク質又はその断片の量を測定することによって、遺伝子発現を測定することができる。この発現レベルの代替的測定法は、免疫学的方法である。
抗体を作製するためのタンパク質は、ｃＤＮＡクローニング及び遺伝子組み換え技術を利用して作製することができる。
簡単に説明すると、例えば肺腺癌組織からｃＤＮＡライブラリーを作製し、配列番号１〜８２の各ヌクレオチド配列に基いて合成したプライマーを用いるＰＣＲ法によってｃＤＮＡクローンを作製し、得られたｃＤＮＡクローンを発現ベクターに組み込み、該ベクターによって形質転換又はトランスフェクションされた原核又は真核宿主細胞を培養することによって該細胞又は培養上清から得ることができる。このとき、発現ベクターは市販又は文献記載のものを使用することができ、例えばプラスミド、コスミド、ファージなどである。ベクターは、目的タンパク質をコードするＤＮＡ、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、リボソーム結合配列、複製開始点、ターミネーター、選択マーカーなどを含むことができる。ポリペプチドの分離・精製を容易にするために、標識（ポリ）ペプチド（例えばβ−ガラクトシダーゼ遺伝子など）、（Ｈｉｓ）６−１０タグ、ＦＬＡＧタグ（アミノ酸配列：ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１５０））、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）などのタンパク質又はオリゴペプチドと、目的タンパク質との融合タンパク質が形成されるように、それらに対応するＤＮＡ配列を含有させることもできる。
宿主細胞は、細菌などの原核細胞（例えば大腸菌、枯草菌、シュウドモナス属細菌など）、酵母（例えばサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、ピチア属など）、昆虫細胞（例えばＳｆ細胞）、哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３、ＮＩＨ３Ｔ３など）などを含む。
上記のｃＤＮＡクローニング及び遺伝子組換え技術については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）、Ａｕｓｂｅｌら（上記）などに記載されている。
このようにして得られた目的タンパク質は、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、等電点電気泳動、電気泳動、限外ろ過、塩析、透析などを単独で又は組み合わせて精製することができる。
本発明の遺伝子によってコードされるタンパク質は、配列番号８３〜１４９に示されるアミノ酸配列を含む（この配列はそれぞれ、配列番号１５〜２１、２３〜８２のヌクレオチド配列によってコードされる。）。また、アミノ酸配列を記載していないタンパク質の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（米国）、ＥＭＢＬ（欧州）などのデータベースにアクセスすることによって入手可能であるか、あるいは、それらに対応するヌクレオチド配列を利用するｃＤＮＡクローニング及びシークエンシングによって目的タンパク質のアミノ酸配列を決定することができる。
免疫学的方法では、上記の手法で得られたタンパク質又はその断片を抗原として用いてウサギ、マウス、ラット、ウマなどの哺乳動物を免疫し、それらの抗原に対する抗体を産生し、精製する。
抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗ペプチド抗体、それらの抗体断片などを含む。
ポリクローナル抗体は、前記動物を適量（通常、μｇオーダー）の抗原で皮下に免疫し、さらに約２〜３週間後に追加免疫し、初回免疫から約３週間〜２か月後に採血し、抗血清から目的のポリクローナル抗体を含むＩｇＧ成分を硫安分画、イオン交換クロマトグラフィーを使用して分離することによって作製することができる。このとき抗原に対する抗体の特異性を高めるために、得られたＩｇＧを、目的タンパク質をセルロース又はアガロースなどの担体に結合して作製されたカラムに結合させたのち、高塩濃度のバッファーで溶出し、透析や限外ろ過などの方法で脱塩して、特異的ポリクローナル抗体を得ることができる。抗体価は、通常の免疫測定法、例えば酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光抗体法などによって測定することができる。
モノクローナル抗体は、例えば以下の一般的方法によって作製することができる（例えば長宗秀明と寺田弘，単クローン抗体−調製とキャラクタリゼーション，１９９０，広川書店；佐渡義一（２００１）「ラットモノクローナル抗体作製の省力化」生化学７３：１１６３−１１６７など）。
標的タンパク質又はその断片を、ポリクローナル抗体の作製と同様にマウス又はラット（例えばＢａｌｂ／ｃマウス）の皮下に投与し、１〜４週間間隔で、約２〜４回追加免疫を行う。抗体価がプラトーに達したとき、抗原を静脈内または腹腔内に注射し、最終免疫とする。２〜５日後、抗体産生細胞（例えば脾臓細胞又はリンパ節細胞）を採取する。次いで、抗体産生細胞を骨髄腫細胞株（好ましくは、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損細胞株）に融合させてハイブリドーマ細胞を生成し、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を行う。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞と骨髄腫細胞株とを適当な割合で混合し、ポリエチレングリコールなどの細胞融合促進剤の存在下で実施する。目的の抗体かどうかの確認は、上記の免疫測定法によって行うことができる。さらに、ハイブリドーマの増殖のために、マウスの腹腔内にハイブリドーマを投与し、ハイブリドーマを増殖させたのち、１〜２週間後に腹水を採取する。抗体の精製は、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて行うことができる。
抗ペプチド抗体は、タンパク質の表面上のリニアーなペプチドに対する抗体であり、免疫学的特異性を高めることができる。そのようなペプチドは、例えばＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅらの親水性−疎水性領域の推定法、Ｅｍｉｎｉらによるタンパク質分子上の特定ペプチド部位の表面に位置する確率、ポリペプチド鎖の折れ曲がり程度、例えばＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎらなどのαヘリックス、βシート、ターンを表示するタンパク質の二次構造予測、等を単独で又は組み合わせて使用して推定しうる。次いで、推定されたペプチドは、ペプチド合成機を用いて合成することができる。
上記の抗体類を、肺腺癌組織テストサンプル中の標的タンパク質又はその断片の検出のために使用することができる。多数の抗体をマイクロアレイ支持体上に結合した抗体マイクロアレイを作製することによって、或いは、多数の抗体をＰＶＤＦ膜などのポリマー膜（フィルター）上にドットスポットするか、又はマルチウエルプレートなどの固相の表面に抗体を吸着させることによって、一度に多数の標的タンパク質を検出又は定量することが可能になる。また、慣用の免疫学的測定法、例えば酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光抗体法、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法、免疫比濁法、ラテックス凝集反応、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応、粒子凝集反応またはウェスタンブロット法などによって、テストサンプル中の標的タンパク質又はその断片を検出又は定量することができる。
固相上で反応を行うときには、固相支持体として、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンなどのポリマーの膜、マルチウエルプレート、試験管、試験片（テストストリップ）、ラテックス、磁性体粒子などが含まれる。固定化は、物理的吸着か或いは化学的に行うことができる。化学的結合のためには、例えばマレイル化試薬、臭化シアンなどの試薬で固相を処理し、タンパク質のアミノ基などと反応する官能基を固相に導入することができる。
標識の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどの酵素、フルオレセイン、ローダミン、それらの誘導体などの蛍光物質、ルシフェラーゼ系、ルミノール系などの発光物質、３２Ｐ、１２５Ｉなどの放射性同位元素などが含まれる。標識化は、例えばグルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、クロラミンＴ法、ボルトンハンター法などを含む。
＜術後再発予測用組成物＞
本発明はまた、肺腺癌患者において肺癌の外科切除後の肺腺癌の再発を予測するための組成物であって、該組成物が、配列番号１〜８２のいずれかのヌクレオチド配列を含む２以上から８２種、好ましくは５以上から８２種の異なる遺伝子の発現を測定することを可能にする複数の核酸を含み、該核酸が、
（１）配列番号１〜８２に示されるヌクレオチド配列、それに相補的なヌクレオチド配列、或いはそれらのヌクレオチド配列中の連続する１５塩基から全塩基数未満の部分配列を有する核酸、及び
（２）配列番号１〜８２に示されるヌクレオチド配列又はそれに相補的なヌクレオチド配列を含む核酸とハイブリダイズする核酸、或いは該ハイブリダイズする核酸の連続する１５塩基から全塩基数未満の部分配列を有する核酸、
からなる群から選択されることを特徴とする上記組成物を提供する。
本発明の組成物を構成する複数の核酸は、該組成物が、配列番号１〜８２のいずれかのヌクレオチド配列を含む２以上から８２種、好ましくは５以上から８２種、より好ましくは１０以上から８２種、さらに好ましくは３０以上から８２種、さらにより好ましくは４０以上から８２種の異なる遺伝子の発現を測定することを可能にする限り、上記（１）及び（２）に記載した核酸のいずれの組み合わせであってもよい。
上記（１）の核酸は、
（ａ）配列番号１〜８２に示されるヌクレオチド配列、
（ｂ）上記（ａ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、及び
（ｃ）上記（ａ）のヌクレオチド配列又は上記（ｂ）のヌクレオチド配列において連続する１５塩基から全塩基数未満、好ましくは１７塩基以上、２０塩基以上、３０塩基以上、５０塩基以上、７０塩基以上、１００塩基以上、１５０塩基以上、２００塩基以上、３００塩基以上、４００塩基以上又は５００塩基以上から全塩基数未満の部分配列、
を有する核酸である。
上記（２）の核酸は、上記（１）の（ａ）又は（ｂ）のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸であるか、あるいは、その核酸のヌクレオチド配列において連続する１５塩基から全塩基数未満、好ましくは１７塩基以上、２０塩基以上、３０塩基以上、５０塩基以上、７０塩基以上、１００塩基以上、１５０塩基以上、２００塩基以上、３００塩基以上、４００塩基以上又は５００塩基以上から全塩基数未満の部分配列、を有する核酸である。好ましくは、このような核酸は、上記（１）の（ａ）又は（ｂ）のヌクレオチド配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する配列の核酸、又はその１５塩基から全塩基数未満の断片である。
好ましい核酸は、上記（１）の核酸、特に上記（１）（ｃ）の核酸である。
本発明の組成物は、核酸構成成分を単に混合した形態の混合物だけでなく、キット、マイクロアレイ又はプライマーセットの形態であってもよい。むしろ、このような後者の形態が好ましい。ここで、キットの場合、上記核酸を個々に包装するかあるいは複数の核酸の混合形態で包装することができ、キットにはさらに、ハイブリダイゼーションのためのバッファ、検出用試薬（酵素類など）、使用説明書などを含ませることができる。マイクロアレイやプライマーセットについては、上記の説明のとおりである。
本発明の組成物は、上記記載のとおり、肺腺癌患者において肺癌の外科切除後の肺腺癌の再発を予測するための方法に使用できる。本発明の方法については、上記の説明のとおりである。
本発明はさらに、肺腺癌患者において肺癌の外科切除後の肺腺癌の再発を予測するための組成物であって、該組成物が、配列番号１〜８２のいずれかのヌクレオチド配列を含む２以上から８２種、好ましくは５以上から８２以下、より好ましくは１０以上、さらに好ましくは３０以上、さらにより好ましくは４０以上から８２以下の異なる遺伝子の発現を測定することを可能にする複数の抗体を含み、該抗体が、配列番号１〜８２に示されるヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質又は該タンパク質のアミノ酸配列の連続する少なくとも８アミノ酸残基からなるポリペプチドと免疫学的に反応する抗体、及び該抗体の断片、からなる群から選択されることを特徴とする、上記組成物と提供する。
抗体の作製については、上記の説明のとおりである。
抗体は、上記の方法で作製されるようなポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗ペプチド抗体などであるが、それらに限定されないものとする。抗体の種類は、いずれのタイプ、クラス、サブクラスでもよく、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡなどを含む。また、抗体の断片は、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどを含む。
本発明の組成物は、抗体構成成分を単に混合した形態の混合物だけでなく、キット、抗体結合支持体又は抗体マイクロアレイの形態であってもよい。固相支持体として、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンなどのポリマーの膜、マルチウエルプレート、試験管、試験片（テストストリップ）、ラテックス、磁性体粒子などが含まれる。アレイの材質として、ポリマー、ガラスなどが含まれる。
本発明の抗体含有組成物は、上記記載のとおり、肺腺癌患者において肺癌の外科切除後の肺腺癌の再発を予測するための方法に使用できる。本発明の方法については、免疫学的方法であり、上記の説明のとおりである。
本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明はそれらの実施例によって制限されないものとする。
【実施例】
【０００６】
材料及び方法
患者
１９９５年１２月〜１９９９年８月の間に治癒の可能性のある切除手術を受けた患者の８７肺腺癌事例を、愛知県がんセンター及び名古屋大学の倫理委員会の承認と患者の同意書を得て愛知県がんセンター（名古屋市）にて取得した。どの事例も補助化学療法は受けなかった。最終フォローアップの時点で生存していた患者のフォローアップ期間の中央値は９０ヶ月であった（範囲：６４〜１０８ヶ月）。腫瘍検体はすべてＯＣＴ化合物（サクラ精機株式会社、日本国、東京）に埋め込み、−８０℃で保存した。患者人数の３分の２（ｎ＝６０）をランダムに訓練セットに割り当て、残りの３分の１（ｎ＝２７）を評価セットＩとした。また、同様に２００２年２月から２００４年１２月の間で切除手術を受けた患者の肺腺癌サンプルのうちステージＩと診断された３０サンプルを評価セットＩＩとして用いた（表２）。
【表２】
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ＲＮＡの単離
腫瘍検体の凍結組織を病理学者（Ｙ．Ｙ．）の指導の下で、ギムザ染色した１０枚毎の切片を用いてグロス顕微解剖に供した。トータルＲＮＡをＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を用いて抽出し、ＤＮａｓｅＩで処理した。ＲＮＡ量はＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｒ）ＮＤ−１０００ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、デラウェア州ウィルミントン）を用いて測定し、ＲＮＡの性質はＡｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザーを用いて観察しＲＮＡ完全数値（ＲＩＮ）として示した（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州パロアルト）。全ての主要な肺癌の組織型を示す２０の肺細胞株を用いて、共通標準ＲＮＡを大量に用意した。
ＥＧＦＲ、ｐ５３及びＫ−ｒａｓの発現プロファイル及び突然変異状態の取得
５００ｎｇのトータルＲＮＡから、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州パロアルト）及びＴ７プロモーターを含むポリｄＴプライマーを用いて、二本鎖ｃＤＮＡを合成した。Ｌｏｗ  ＲＮＡ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｌｉｎｅａｒ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてｃＲＮＡを生成し、Ｃｙ３又はＣｙ５により標識した。Ｃｙ５−サンプルｃＲＮＡとＣｙ３−共通標準ｃＲＮＡを４１，０００個の異なるプローブを有するＷｈｏｌｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  ｏｌｉｇｏ  ＤＮＡマイクロアレイキット（Ｇ４１１２Ｆ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション及び洗浄の後、ＡｇｉｌｅｎｔＤＮＡマイクロアレイスキャナー（Ｇ２５０５Ｂ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてスライドをスキャンした。発現データは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェア９．５．１（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて取得した。ＥＧＦＲ、ｐ５３及びＫ−ｒａｓの突然変異状態は同じ患者のセットに関して既に報告されている（Ｔａｋｅｕｃｈｉら、ＪＣＯ、２００６）。Ｄｕｋｅデータセットは、受託番号ＧＳＥ３５９３でＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／）よりダウンロードし、生存期間（月）、状況、細胞型などの臨床情報に関してはＤｕｋｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｐｏｌｉｃｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｄｕｋｅ．ｅｄｕ／）からダウンロードした。４５の腺癌サンプルのうち、臨床情報に関する注釈付きの３９腺癌サンプルを本分析に用いた。
統計的方法
まず、少なくとも９０％のサンプルでバックグラウンドを超える発現量のプローブを選択した。このフィルタリング基準を通過したシグナルを用いて再発関連シグネチャを同定するために、教師付きクラス分類の確立された技術である、重み付き投票アルゴリズム（各加重値はＳＮ比として計算され、既に詳細に説明した方法（Ｙａｎａｇｉｓａｗａら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９９：８５８−６７，２００７）を用いた。簡単に言うと、訓練データセットに特異的な過学習をすることなく、一般的に使用可能な分類器を取得するために、本発明者らは、無再発シグネチャを同定するためのプローブシグナルを選択する際に、１００のランダム相互作用を行う１０−ｆｏｌｄクロスバリデーション方法を用いた（ＡＭ  Ｍｏｌｉｎａｒｏら，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２１：３３０１−７，２００５）。そこで、分類器構築の全工程を、一定数の予測される遺伝子を有する分類器ごとに１０００回繰り返す。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線及びＣｏｘ比例ハザードモデル分析（Ｓｔａｔａバージョン７．０）を用いて、２７名の患者の評価用セット中の得られた再発関連シグネチャと全生存及び無再発生存との関係を分析した。死亡と再発のハザード比をそれぞれ示す。多変数Ｃｏｘモデルに提示されたＰ値は同様の比試験で取得した。全ての統計的検定を両側検定とした。Ｃｌｕｓｔｅｒプログラム（ＭＢ  Ｅｉｓｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１４８６３−８，１９９８）を用いて、遺伝子と症例との間の平均連関階層的クラスタリングを行った。このとき、表示は、Ｔｒｅｅｖｉｅｗプログラムを使用した（ＭＢ  Ｅｉｓｅｎら，上記）。
結果
再発関連シグネチャの同定
本発明者らは、訓練セット／評価セットＩ間の情報漏洩なく外科的治療を受けた肺腺癌患者の再発と死亡に関する遺伝子発現シグネチャを構築し検証した（図１）。まず、８７事例の発現プロファイルデータを６０の訓練セットと２７の評価セットＩに分類した。次に、６０の訓練セットのうち、再発により、外科的切除後５年以内に死亡した２１人の患者が腫瘍中に一般的な高リスクシグネチャを有しているのに対し、全フォローアップ期間中再発の兆候を示すことなく５年以上生存した２８人の患者は前述のシグネチャを腫瘍中に有さなかったと仮定した。訓練セット中残る１１名の患者は、腫瘍の悪性度が不明確なことから、再発関連シグネチャを同定する工程から除外された。除外された患者のうち、５名はフォローアップ期間中なんらかの再発の兆候を示しつつ５年以上生存し、５名は５年以上生存した後に癌により死亡し、１名は再発の証拠はないが死亡した。
全ゲノムマイクロアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製；Ｗｈｏｌｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ（４×４４Ｋ）Ｏｌｉｇｏ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｋｉｔ；型番Ｇ４１１２Ｆ）上の４１，０００個のプローブのうち、２３，８２８個のプローブが情報伝達的プローブを選択する最初のフィルタリング基準を通過しＳＮ計測基準に基づいて分類され、再発により死亡した患者と手術により治癒した患者を識別する最良の再発関連シグネチャを同定するのに用いられた。増加する数の予測プローブを適用した各モデルに関する学習エラーは、１０−ｆｏｌｄクロスバリデーションにより計算し、計算は新しくランダムに分けられたデータセットを用いて１００回繰り返した。最大２００個の予測プローブからなる１，０００個の独立したセットは、再発関連シグネチャを用いた分類器を構築するために選択された。その結果、８２個の予測プローブの使用により最小学習エラーが発生することがわかり（図２Ａ）、各８２個の予測プローブからなる独立した１，０００個のセット間で最も高頻度に共有されている８２個のプローブが再発関連シグネチャとして同定された（以下「ＲＲＳ−８２」と称する。上記表１参照）。ＲＲＳ−８２シグネチャは、全ステージ又はステージＩを考慮した際に極めて予後が不良な患者群を識別することができるように思われる（無再発生存に関しては図２Ｂ及び２Ｃ、全生存に関しては図７を参照）。
ＲＲＳ−８２と様々な遺伝的変化の関係と比較
肺癌は、遺伝的変化を有する患者の臨床的性質に影響を与えるかもしれない様々な遺伝的変化を隠匿することが知られている。そこで、本発明者らはＲＲＳ−８２とＥＧＦＲ、Ｋ−ｒａｓ又はｐ５３遺伝子変異の存在との関連を分析した。しかしながら、それらの間に統計的に有意な関連は発見されなかった。更に、その遺伝的変化の予後的有意性も同じ患者のサンプルセットを用いて分析し、それによりＲＲＳ−８２を用いる予後予測分類器を構築した、ＥＧＦＲ変異の存在と術後予後間の関連は観察されなかった（図３Ａ）。Ｋ−ｒａｓ変異（図３Ｂ）又はｐ５３変異（図３Ｃ）を有する患者と有さない患者間に、全生存に関する統計的有意差はなかった。
評価セットを用いたＲＲＳ−８２の検証
ＲＲＳ−８２のロバスト性を評価するために、肺腺癌２７サンプルの独立した評価セットＩを用いてＲＲＳ−８２の識別能力を分析した。評価セットＩを用いて得られた結果は、ＲＲＳ−８２が再発及び死亡の高リスク患者と低リスク患者を識別できることを示した。無再発生存は２群間で有意に異なり、高リスク群の８名の患者の無再発生存期間中央値が２９２日間なのに対し、低リスク群の１８名の患者では１０８ヶ月間であった（Ｐ＜０．０００３、図４Ａ）。高リスク群及び低リスク群中の無再発患者の割合は２年の時点でそれぞれ３８％、７８％だった。注目すべきは、ＲＲＳ−８２の高リスクシグネチャを示す８名の患者全てが５年以内のフォローアップ期間中に再発を経験したのに対して、ＲＲＳ−８２の低リスクシグネチャを示す患者の６７％が術後５年後に再発の兆候を示していなかった。高リスク群の患者のうち、外科的切除後の全生存率は、低リスク群患者の生存率に比して有意に低かった（Ｐ＝０．０２６、図４Ｂ）。多変量Ｃｏｘ比例ハザードモデルにおいて、ＲＲＳ−８２は無再発生存（Ｐ＝０．０３）及び全体的生存（Ｐ＝０．０３）の両方を予測する独立した有意な予後的因子であることが判った。また、評価セットＩとＩＩを加えたときの多変量Ｃｏｘ比例ハザードモデルにおいても、ＲＲＳ−８２は無再発生存（Ｐ＜０．００１）及び全体的生存（Ｐ＝０．００５）の両方を予測する独立した有意な予後的因子であることが判った（表３）。
【表３】
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ステージＩ患者におけるＲＲＳ−８２の有用性
本発明者らは、早期またはより進行した疾病を持つ腺癌事例のサブグループのＲＲＳ−８２の識別力を、評価セットＩ中ステージＩの１６サンプルを用いて更に評価した。ＲＲＳ−８２に基づいて高リスクと予測されたステージＩ患者は全員５年以内に再発を経験し、フォローアップ期間中に死亡した（無再発生存については図４Ｃ（Ｐ＝０．０００８）、全生存については図４Ｄ（Ｐ＝０．０４３）に示す。両件とも対数順位検定による）。また、すべてステージＩからなる評価セットＩＩの３０サンプルを用いても、統計的有意であることが確認された（図４Ｅ、４Ｆ）。さらに、評価セットＩのステージＩの１６サンプルと評価セットＩＩの３０サンプルを合わせた４６サンプルの解析においても、ＲＲＳ−８２の識別力は統計的有意であることが確認された（図４Ｇ、４Ｈ）。
ステージＩＩ〜ＩＩＩ患者のうち、無再発及び全生存は、高リスクシグネチャを有する患者と比べて低リスクＲＲＳ−８２シグネチャを有する患者の場合に良好となる傾向があったが統計的に有意ではなかった（図８Ａ及び８Ｂ）。
本発明者らは、別の側面からもＲＲＳ−８２とＴＮＭ診断（Ｔ：原発腫瘍の拡がり；Ｎ：所属リンパ節転移の有無と拡がり；Ｍ：遠隔転移の有無）（例えば肺癌・食道癌・乳癌・取扱い規約（抜粋）金原出版）の関係を調査した。低リスク群の患者のうち、無再発生存のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線（図５Ａ）及び全生存のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線（図９Ａ）が共に、病理学的な疾病のステージと適度な関係を示す傾向があった（無再発生存に関してはＰ＝０．１５、全生存に関してはＰ＝０．１８）。一方、高リスク群の患者では、無再発生存（図５Ｂ）及び全生存曲線（図９Ｂ）が共に、病理学的な疾病のステージとは無関係であった（無再発生存に関してはＰ＝０．７１、全生存に関してはＰ＝０．８７）。
本発明の上記テストの結果、訓練セットと評価セットＩそれぞれにおける高リスクＲＲＳ−８２シグネチャと判定した症例の８６％、１００％に再発が認められた。これは、Ｄｕｋｅら（ＤＧ  Ｂｅｅｒ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：８１６−２４，２００２）が報告したＡＣＯＳＯＧ及びＣＡＬＧＢ有効性評価データセットのそれぞれの６９％、７９％で再発を高リスクｍｅｔａｇｅｎｅシグネチャが予測した結果に比べると、格段に判定の確度（又は精度）が向上していることが分かる。
独立したデータセットを用いたＲＲＳ−８２の一般適用性の確認
肺腺癌の生存可能性を予測する際のＲＲＳ−８２のロバスト性は、３９サンプルの肺腺癌に関する他の完全に異なるデータセットとＤｕｋｅ大学の遺伝子発現データセットを用いて更に検証した。Ａｇｉｌｅｎｔプラットフォーム上のＲＲＳ−８２中４６個の遺伝子のみが比較的新しいバージョンのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプラットフォームのＤｕｋｅ大学データセットプローブに対応するので（表４）、ＲＲＳ−８２を用いた分類器を直接適用することは不可能であった。そこで、教師無しの階層クラスタリングにより４６個の対応する遺伝子の発現プロファイルに基づき分析した。２９サンプルの腺癌が、有意に異なる術後生存可能性を示す（Ｐ＝０．０２８、図６Ｂ）明らかに２つの違うサブセットにクラスター分類された（図６Ａ）。また、Ｍｉｃｈｉｇａｎ大学の遺伝子発現データセットを用いてＲＲＳ−８２と重複する３１遺伝子を抽出し、予測モデルの構築を行った（図６Ｃ）。そのモデルを用いて、Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇがんセンターの遺伝子発現データ１０４サンプルを解析したところ、このモデルにより判別された高リスク群と低リスク群には、無再発生存に関して統計学的に有意な違いを認めた。（Ｐ＝０．０００３）（図６Ｄ）。これらの結果により、ＲＲＳ−８２に含まれる遺伝子は、再発リスク評価に関連する汎用性（一般適用性）を有する事が示された。
【表４】
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【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明の方法により、肺腺癌患者の術後再発の可能性を極めて高い確度で予測することができる。この方法は、ステージＩの患者の場合であっても高い確度の予測を可能にする。これによって、再発のリスクが高い患者に対して生存率を改善するための治療計画を、術後早い段階で、立てることができるようになる。
本発明により、肺腺癌患者において腺癌の術後再発を予測することが可能となるため、術後の患者に適した治療計画を立てることができる。このように、本発明は、肺腺癌の治療のために医療産業に寄与することが可能である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
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【図１】
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【図３】
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【図４Ａ−Ｄ】
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【図４Ｅ−Ｈ】
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【図５】
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【図６Ｃ−Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図２】
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【図６Ａ−Ｂ】
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