(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＣＰを有効成分とする心筋梗塞後の左室リモデリングの予防及び／又は治療剤。
【請求項２】
ＥＣＰの治療的有効量含む請求項１に記載の剤。
【請求項３】
ＥＣＰがヒト由来である請求項１又は２に記載の剤。
【請求項４】
カテーテルで心臓の患部に投与するための請求項１〜３のいずれか１項に記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＣＰを有効成分として含有する左室リモデリング、心筋壊死に起因する不整脈、心筋壊死、心室中隔壁の肥大化及び心臓内腔の拡大の予防及び／又は治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
好酸球カチオン性タンパク質（ＥＣＰ）は、好酸球の活性化に伴って発現が上昇する塩基性顆粒中に存在するタンパク質であり、寄生虫殺傷、神経毒、リンパ球増殖抑制、殺菌、ヒスタミン遊離、リボヌクレアーゼ、凝固時間短縮等に関する活性を有することが従来報告されていた（非特許文献１）。特許文献１では、ＥＣＰを培養心筋細胞に添加することと関連した心筋細胞の肥大化及び心拍数の増加が示されている。しかし、ＥＣＰが具体的に如何なる心疾患の治療に対して有効であるかについての十分な検討は成されておらず、心臓の左室リモデリング、心筋の壊死に起因した不整脈、心筋壊死、心臓内腔の拡大等の予防ないし治療におけるＥＣＰの有効性については実質的になんら示されていなかった。
【特許文献１】特願２００４−１２３６７９号公報
【非特許文献１】日本臨床  １９９２、５１（３）：６０（６０６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は左室リモデリング、心筋壊死に起因する不整脈、心筋壊死、心室中隔壁の肥大化及び心臓内腔の拡大を予防及び／又は治療するためのＥＣＰを有効成分として含有する新たな医薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本願発明者らは、上記の実情に鑑みて鋭意研究を重ね、ＥＣＰが左室リモデリング、心筋壊死に起因する不整脈、心筋壊死、心室中隔壁の肥大化及び心室内腔の拡大の予防及び／又は治療に特に有効であることを見出した。本発明は、かかる知見に基づき、更に研究を重ねた結果完成したものである。即ち、本発明は以下の態様の発明を提供する。
項１．ＥＣＰを有効成分とする左室リモデリングの予防及び／又は治療剤。
項２．ＥＣＰを有効成分とする心筋壊死に起因する不整脈の予防及び／又は治療剤。
項３．ＥＣＰを有効成分とする心筋壊死の予防及び／又は治療剤。
項４．ＥＣＰを有効成分とする心室中隔壁の肥大化の予防及び／又は治療剤。
項５．ＥＣＰを有効成分とする心臓内腔の拡大の予防及び／又は治療剤。
項６．ＥＣＰの治療的有効量含む項１〜５のいずれか１項に記載の剤。
項７．ＥＣＰがヒト由来である項１〜６のいずれか１項に記載の剤。
項８．カテーテルで心臓の患部に投与するための項１〜７のいずれか１項に記載の剤。
【発明の効果】
【０００５】
本発明のＥＣＰを有効成分とする剤は、左室リモデリング、心筋壊死に起因する不整脈、心筋壊死、心室中隔壁の肥大化及び心臓内腔の拡大の予防及び／又は治療に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
一実施形態において、本発明はＥＣＰを有効成分とする左室リモデリングの予防及び／又は治療剤である。左室リモデリングとは、冠動脈の閉塞等によって心臓に対して負荷がかかった結果、心筋細胞が傷害を受けて壊死し、傷害部分において心筋の細胞脱落、菲薄化、伸展、並びにこれらに引続く健常部心筋の肥大と伸展、内腔の拡大、及び間質の繊維化等といった形態の変化が心臓の左室に生じる現象をいう。左室リモデリングに付随して不整脈が生じることもある。
【０００７】
一実施形態において、本発明はＥＣＰを有効成分とする心筋壊死に起因する不整脈の予防及び／又は治療剤である。心筋壊死に起因する不整脈とは、心臓の血管が閉塞し、その先に存在する心筋細胞に酸素や養分が行き届かなくなり、心筋細胞が壊死した結果生じる不整脈のことである。
【０００８】
一実施形態において、本発明はＥＣＰを有効成分とする心筋壊死の予防及び／又は治療剤である。心筋壊死とは、冠動脈の閉塞や種々の原因によって心筋細胞が壊死することをいう。
【０００９】
一実施形態において、本発明はＥＣＰを有効成分とする心室中隔壁の肥大化の予防及び／又は治療剤である。心室中隔壁の肥大化とは、左室リモデリングの結果、健常側である心筋に過剰な負荷がかかり結果として心筋細胞の肥大化を招くことであり、心肥大すること自体が心臓に負担を与えるものである。
【００１０】
一実施形態において、本発明はＥＣＰを有効成分とする心臓内腔の拡大の予防及び／又は治療剤である。心臓内腔の拡大とは、左室リモデリングの最終形であり、肥大した心筋によっても心臓のポンプ機能をカバーできず、結果として心臓に大きな負荷がかかる結果、心臓の容量が増大して内腔が拡大（左室拡張末期容量の増大）することである。心臓内腔が拡大すると心臓のポンプ機能は著しく損なわれるために、心不全の状態となり患者の生活の質が低下するばかりでなく心不全により入院を余儀なくされることとなり、医療経済的にも損失が大きく患者や家族の負担も大きくなる。
【００１１】
また左室リモデリングに特徴的なひとつの病理学的変化は線維化である。心筋梗塞により死滅した心筋細胞が貪食細胞により処理された後の空間に線維化が起きるので、線維化面積が大きければ大きいほど心筋のダメージが大きく、そのあとの左室リモデリングが進行することが予測される。
【００１２】
本発明においてＥＣＰとは、上記のような左室リモデリング、心筋壊死、心室中隔壁の肥大化及び心室内腔の拡大および、心筋壊死に起因する不整脈の治療ないし予防効果があるものであれば特に限定されない。ＥＣＰは、ヒトを含む各種哺乳動物の細胞（白血球や造血幹細胞）から公知の方法に従って単離することができる。また、ＥＣＰのアミノ酸配列及びそれをコードした遺伝子配列が明らかとなっているため（例えば、ヒト：ＧｅｎＢａｎｋ／Ｘ１５１６１、チンパンジー：ＧｅｎＢａｎｋ／ＡＦ２９４０２８、ゴリラ：ＧｅｎＢａｎｋ／Ｕ２４０９７）、公知のペプチド合成方法を用いた合成や、遺伝子組み換え技術を用いた宿主細胞での製造も可能である。さらに、本発明の予防ないし治療剤としての効果を奏する限りにおいて、本発明のＥＣＰは公知のアミノ酸配列に１個以上のアミノ酸の置換・付加・欠失操作を行った改変体であってもよい。
【００１３】
例えば組換えＥＣＰをｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写翻訳で作製する場合には、ＥＣＰをコードするＤＮＡを、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するベクターに挿入して発現ベクターを作製し、このベクターをプロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加することによってＥＣＰを製造することも出来る。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６などが例示できる。これらのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７１８、ｐＴ７／３  １９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩなどが例示できる。
【００１４】
組換えＥＣＰを大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに前記のＤＮＡ断片を組換えた発現ベクターを作成し、それを大腸菌に導入し、培養して得られた培養物から融合ペプチドを単離する。発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。
【００１５】
また組換えＥＣＰを真核細胞で発現させる場合には、ＥＣＰをコードしたＤＮＡ断片を、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作成し、真核細胞内に導入すれば、融合ペプチドを形質転換真核細胞で発現させることができる。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＳＧ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。真核細胞としては、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、目的とするタンパク質を発現できるものであれば、いかなる真核細胞でもよい。
【００１６】
発現ベクターを宿主細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。
【００１７】
培養物からのＥＣＰの単離精製は、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどを適宜組み合せることが例示できる。
【００１８】
なお、ＥＣＰは分泌性タンパク質であり、例えばヒトＥＣＰの場合にはそのＮ末端側の２３アミノ酸配列が分泌シグナルである。従って、原核細胞や真核細胞で組換えＥＣＰを発現させる場合には、その培養物からの組換えＥＣＰの回収効率を考慮して、分泌シグナル配列よりＣ端側（例えば第２８位Ａｒｇ以降）の活性領域を発現させることが好ましい。
【００１９】
本発明のＥＣＰの生体への投与形態は、経口的又は非経口的に行うことができるが、経口投与又は注射による投与が好ましい。また本発明の一実施形態においては、ＥＣＰを点滴などにより全身投与することが好ましい。
【００２０】
本発明のＥＣＰは単独でも使用可能であるが、症状や投与形態に応じて適宜製剤化して用いることが望ましく、公知の製剤技術に従って薬理学的に許容される担体や添加剤等を付加することができる。投与剤形としては、通常の経口型製剤及び非経口型製剤、例えば、液剤（注射剤、点鼻剤、シロップ剤、ドライシロップ剤など）、錠剤、トローチ剤、カプセル剤（硬、軟、マイクロカプセル等）、散剤、細粒剤、顆粒剤、軟膏剤、坐剤等などや、ドラッグデリバリーシステム（例えば、徐放剤等）などを利用することも可能である。中でも、経口投与剤又は注射剤であることが望ましく、特に注射剤として用いることが望ましい。
【００２１】
上記各種の剤形に製剤化する際に用いられる担体としては、公知の各種担体を適宜選択することができる。例えば、経口投与剤形とする場合は、水、シュークロース、ソルビトール、フラクトース等の糖類、ポリエチレングリコール等のグリコール類、ゴマ油、大豆油等の油類、アルキルパラヒドロキシベンゾエート等の防腐剤、ストロベリー・フレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を使用することができる。
【００２２】
注射剤の場合は、塩溶液、グルコース溶液、または塩水とグルコース溶液の混合物や各種の緩衝液等からなる担体を用いて製剤化することができる。また粉末状態で製剤化し、使用時に前記液体担体と混合して注射液を調製するようにしてもよい。注射剤として用いる場合、注射部位は特に限定されるものではなく、動脈、静脈、筋肉（骨格筋、平滑筋、心筋など）、皮膚、皮下等に行えばよい。必要時応じて局所注入、腹腔内投与、選択的静脈内注入、静脈注射、皮下注射、臓器灌流液注入等を採用することができる。
【００２３】
例えば、カテーテルを用いて虚血状態の心臓部位近傍に本発明の剤を直接注入することが望ましい。本発明に用いることができるカテーテルとしては心臓血管造影（ＣＡＧ）用のカテーテルおよび、治療用のカテーテル（パーフュージョンカテーテル）およびマイクロカテーテルや血栓吸引用カテーテルなど、内腔を通じてＥＣＰを投与できるものであれば何でもよく、またバルーンの中から徐々に外部に浸透するタイプのバルーンカテーテルも使用可能である。また、心臓内腔から梗塞心筋を特定し、同部位に直接内腔側から刺入できるシステム（ＮＯＧＡシステム）を用いることも一つの方法として挙げられる。また、梗塞心筋に特異的に薬剤を到達させるドラッグデリバリーシステムがあれば、これを用いて末梢から投与することにより、目的部位へ投与することも可能である。
【００２４】
更に本発明の予防ないし治療剤は、抗血小板剤、血管拡張剤、微小循環改善剤、抗凝固剤、高脂血症治療剤等と併用することも可能である。
【００２５】
本発明の剤におけるＥＣＰの治療有効量、患者の年齢や体重、症状、投与経路等によって異なり、所望の効果が奏される限り特に限定されるものではないが、血中ＥＣＰ濃度が１０ｎｍｏｌ〜０．１ｍｍｏｌ、好ましくは５ｎｍｏｌ〜０．５ｍｍｏｌ程度となる量を投与することが望ましい。
【００２６】
本発明の予防ないし治療剤を投与するタイミングについては、心筋梗塞後、なるべく速やかに投与することが望ましいと考えられるが、左室リモデリングが完成するまでの時期であればいつでも投与可能と考えられる。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を実施例に基づいて更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
冠動脈を閉塞したマウスの心臓に対するＥＣＰの効果
【００２８】
ラット実験的心筋梗塞モデルにおいて梗塞作成直後に梗塞部位および梗塞辺縁部約１５箇所に１０μｇ／ｍｌのＥＣＰを１５０μｌ直接心筋内投与した。またコントロールとして、ラット心筋梗塞モデルに、１０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａを、ＥＣＰ投与の場合と同様に、１５０μｌ直接心筋内投与した。使用したＥＣＰは、ヒトＥＣＰ遺伝子を用いて大腸菌で産生させたものである。投与後閉胸し７日間後に心臓エコー検査にて心機能を測定するとともに、左室リモデリング等に対する影響を検討し、さらに心臓を摘出して、ホルマリン固定後、切片を作成し、組織学的検討を行い、線維化面積の比較を行った。ＥＣＰを投与したモデルとしていないモデルの心臓切片をＨＥ染色及びＡｚａｎ染色した結果を図１に示す。
【００２９】
線維化面積の比較検討においても非投与群では線維化は23.2±6.03%であり、ＥＣＰ投与群では線維化面積は16.1±3.65%と少なかった（各５例ずつの比較）。このことからECP投与によって線維化が抑制されていると考えられる。健常な心臓を図２に示す。心臓エコー検査において、ＥＣＰを投与した心臓のポンプ機能は、拍出率（ＥＦ）＝６３．８％であり、ＲＮａｓｅ  Ａを投与した心臓では、ＥＦ＝５１．５％であった。よって、心機能はコントロールと比較して、ＥＦが１０％以上著明に改善していることが分かった。左室内腔についても、ＥＣＰを投与した心臓では、ＬＶＤｄ＝８．７７ｍｍであり、ＲＮａｓｅ  Ａを投与した心臓ではＬＶＤｄ＝９．７０ｍｍであった。よって、左心内腔の大きさに関しても同様に改善が見られ、左室リモデリング抑制効果がみられた。さらに図１の結果より、ＥＣＰを投与した心臓では組織学的には心筋壊死が大幅に減少しており、梗塞に陥った心筋を広範囲に生存あるいは再生させたものと考えられる。  
【００３０】
実施例２
ラット実験的心筋梗塞モデルを使用して梗塞作成直後に、実施例１と同様に梗塞部位に生理食塩水を直接刺入投与したもの、ＥＣＰ（１０μｇ／ｍｌ）を直接刺入投与したものおよび、アルゼット社製浸透圧ポンプ(２ML-1)を背部に埋め込みECP（1.25μｇ／ｍｌ）を全身投与開始したものを作成し、閉胸した７日後に心臓エコー検査（短軸法および長軸法での観察）にて心機能を測定し、左室リモデリング等に対する影響を検討した。その結果を図３及び４に示す。図３及び４に示すように、ＥＣＰの投与の有無によって各群間でラットの体重及び心拍(ＨＲ)に差はなかったが、心臓のポンプ機能を示すEF(駆出率)およびFS(fractional shortening)に関しては、コントロールに比べてＥＣＰを直接投与した場合及びポンプ投与した場合の両方で有意に高い値となった。つまり良好な心機能を保っていた。心重量比もコントロールに比べて有意に良好であり、左室リモデリングが抑制された結果、心肥大が抑制された（心体重比が低かった）と考えられた。また、浸透ポンプによる全身投与でも上記の効果が得られたことから、ＥＣＰには全身投与しても心臓に作用させることが可能であると考えられ、かつ全身投与による大きな副作用は現在までのところ確認されていない。
【００３１】
実施例３
マウス胚性癌腫細胞株Ｐ１９の分化誘導の実験
１）細胞の培養と回収
直径６０mmの細胞培養用ディッシュにＰ１９ＣＬ６細胞５ｘ１０５個を播種し5ｍＬの分化誘導培地（α−ＭＥＭ培地／１０％ＦＢＳ／５０μｇ／ｍＬ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ／５０ｕｎｉｔ／ｍＬ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／０．９％ＤＭＳＯ）と、その培地に１μｇ／ｍＬの濃度でＥＣＰを加えた２種類の培地を用いて培養した。一定の時間経過ごとに細胞を回収し、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。
【００３２】
２）ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出と評価
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出は、ＱＩＡ  ｓｈｕｌｅｄｄｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ）とＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行った。まず、ディッシュ上の細胞にβ−ＭＥを加えたＲＬＴ溶液（同ｋｉｔに含まれている細胞溶解液）を７００μＬ加え、細胞を溶解した。溶解液をＱＩＡ  ｓｈｕｌｅｄｄｅｒのカラムに移し、遠心（１００００ｒｐｍ，  ２分間，  室温）して細胞を破砕した。破砕液をＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔのカラムに添加し、遠心（１００００ｒｐｍ，１５秒，室温）を行った。同ｋｉｔに含まれているＲＷ液（洗浄液）７００μＬをカラムに添加し、再度遠心（１００００ｒｐｍ，１５秒，室温）を行った。次に、同ｋｉｔのＲＰＥ液（洗浄液）７００μＬをカラムに添加し、遠心（１００００ｒｐｍ，１５秒，室温）を行った。最後に、５０μＬのＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ水をカラムに添加して、遠心（１００００ｒｐｍ，  １５秒，  室温）を行った。回収したＲＮＡ溶液の濃度を分光光度計で測定した。また、ＥＸＰＥＲＩＯＮ（ＢｉｏＲａｄ）により、ＲＮＡの解析を行った。
【００３３】
３）ｃＤＮＡの合成
回収したｔｏｔａｌ  ＲＮＡ５μｇと１００ｍＭ ｏｌｉｇｏ-ｄＴ１８−２１、１０ｍＭ  dNTPs （１０ｍＭｄAＴＰ、１０ｍＭ  ｄCＴＰ、１０ｍＭ  ｄGＴＰ、１０ｍＭ  ｄTＴＰ）をよく混合し、５分間６５℃で加熱し、氷上で急冷した。その後、反応液にＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の５ｘ  ｂｕｆｆｅｒと０．１Ｍ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を混ぜて、２分間４２℃で加温し、さらに、逆転写酵素Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩを加えて、４２℃で５０分間反応させてｃＤＮＡを合成した。反応終了後、１５分間７０℃で加熱し逆転写酵素を失活させた。
４）Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）
得られたｃＤＮＡを鋳型に用いて、各遺伝子に特異的なプライマーでＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件は、以下の通りである。
【００３４】
（各遺伝子に特異的なプライマー）
ＧＡＴＡ４；
ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＡＣＴＣＴＧＧＡＧＧＣＧＡＧＡＴＧＧＧ−３’（配列番号１）
ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＣＴＣＧＧＣＡＴＴＡＣＧＡＣＧＣＣＡＣＡＧ−３’（配列番号２）
Ｗｎｔ３ａ；  
ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＡＡＧＣＡＧＧＣＴＣＴＧＧＧＣＡＧＣＴＡ−３’（配列番号３）
ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＧＡＣＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＣＡ−３’（配列番号４）
Ｗｎｔ５ａ；
ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＴＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＣＧＣＣＣＡＧＧＴＴＧＴ−３’（配列番号５）
ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＧＧＣＴＣＡＴＧＧＣＧＴＴＣＡＣＣＡＣ−３’（配列番号６）
Ｗｎｔ８ａ；
ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＴＣＣＣＡＡＧＧＣＣＴＡＴＣＴＧＡＣＣＴＡＣ−３’（配列番号７）
ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＣＣＧＧＣＣＣＴＧＴＴＧＴＴＧＴＧＡ−３’（配列番号８）
α−Ａｃｔｉｎ；
ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＣＣＣＴＧＴＡＣＧＣＣＴＣＴＧＧＣＣＧＴＡ−３’（配列番号９）
ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＡＣＴＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＡ−３’（配列番号１０）
Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  （  ＧＡＰＤＨ  ）；
ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＣＣＣＴＴＣＡＴＴＧＡＣＣＴＣＡＡＣＴＡＣ−３’（配列番号１１）
ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＧＡＴＧＴＣＡＴＣＡＴ−３’（配列番号１２）
ＰＣＲ  反応液の組成：
ｃＤＮＡ溶液                      １．０  μＬ
１０  ｘ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ    ２．０  μＬ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ              ０．５  μＬ
Ｐｒｉｍｅｒ  forward  （１０μＭ）    １．０  μＬ
Ｐｒｉｍｅｒ  reverse  （１０μＭ）    １．０  μＬ
Ｔａｑ  polymerase（Ｎew Ｅngland Ｂiolabs）          ０．２  μＬ
超純水（ＵＰＷ）                          １４．３  μＬ
ＰＣＲの反応条件：９５℃で５ｍｉｎ処理した後、９５℃  で１ｍｉｎ、５５℃で１ｍｉｎ、７５℃で１ｍｉｎの条件をこの順番で３０回反応を繰り返して反応を終了した後に、次の解析を行うまで反応液を４℃で維持した。
【００３５】
PCR反応の後、アガロースゲル電気泳動により、ＰＣＲ産物を確認した。その結果を図５及び６に示す。確認した遺伝子は心筋の発生段階で発現の変化が顕著に認められることが知られているＧＡＴＡ４，Ｗｎｔ３ａ，Ｗｎｔ５ａ，Ｗｎｔ８ａである。ＧＡＴＡ４，Ｗｎｔ３ａ，Ｗｎｔ５ａ，Ｗｎｔ８ａの各遺伝子はＥＣＰ存在下で発現が早く誘導された。このうち、Ｗｎｔ３ａ，Ｗｎｔ５ａ，Ｗｎｔ８ａは時間経過後発現が減衰するが、ＥＣＰ存在下では減衰が早く起こることが観察された。これらの現象は心筋の分化誘導促進するＥＣＰの活性と相関する。
【００３６】
さらに、細胞が拍動するには０．９％ＤＭＳＯ存在下で通常１２〜１４日が必要であるが、０．９％ ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）  とＥＣＰ存在下では７〜８日に短縮された。また、ＤＭＳＯのみでは拍動細胞は塊状になって不連続に存在してそれぞれの塊が独立に拍動するが、ＥＣＰが存在すると、拍動細胞はシート状で拍動し、シート内の細胞は協調的に拍動を伝播するのが観察された。これはＥＣＰによる不整脈の予防ないし治療効果を示唆するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、ＥＰＣを投与した心臓切片と投与していない心臓切片をＨＥ染色及びＡｚａｎ染色した結果を示す。
【図２】図２は、健常なマウス心臓の断面をＡｚａｎ染色したものを示す。
【図３】図３は、図３は、ＥＣＰの投与による効果を示す。
【図４】図４は、図４は、ＥＣＰの投与による効果を示す。
【図５】図５は、ＥＰＣ添加による遺伝子発現への影響を示す。
【図６】図６は、ＥＰＣ添加による遺伝子発現への影響を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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