(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３またはそれらのＣ末端がアミド化された形態に示されるアミノ酸配列から成る単離されたペプチド。
【請求項２】
請求項１の単離されたペプチドおよび薬学上許容可能なキャリア又は希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項３】
疼痛を治療する医薬であって、有効な鎮痛量である請求項１の単離されたペプチドのような治療を必要とする対象に投与する、医薬。
【請求項４】
前記疼痛が、神経原性疼痛及び／又は神経因性疼痛である、請求項３の医薬。
【請求項５】
前記疼痛が、癌の疼痛、手術後の疼痛、口腔又は歯の疼痛、参照される三叉神経痛に由来する疼痛、ヘルペス後神経痛に由来する疼痛、又は反射性交感神経性ジストロフィによる疼痛である、請求項３の医薬。
【請求項６】
前記疼痛が、炎症状態に関連する、請求項３の医薬。
【請求項７】
前記疼痛が、急性疼痛、偏頭痛、頭痛、偏頭痛の頭痛、外傷性神経傷害、神経圧迫、神経絞扼、ヘルペス後神経痛、三叉神経痛、糖尿病性神経障害、慢性腰痛、幻肢痛、慢性骨盤痛、神経腫疼痛、複合性局所疼痛症候群、慢性関節痛、癌、化学療法、ＨＩＶ及びＨＩＶの治療が誘導する神経障害、過敏性腸症候群及び関連する疾患及びクローン病に関連する疼痛から成る群から選択される１以上の状態に関連する、請求項３の医薬。
【請求項８】
それを必要とする対象に治療上有効な量の請求項２の医薬組成物を投与することを含む、対象において疼痛を治療する医薬。
【請求項９】
前記ペプチドがクモ毒から単離される請求項１の単離されたペプチド。
【請求項１０】
前記ペプチドが単離された合成ペプチドである請求項１の単離されたペプチド。
【請求項１１】
前記クモがタランチュラの種である請求項９の単離されたペプチド。
【請求項１２】
クモ毒の粗精製のペプチドを回収して回収したペプチドを作製することと、前記回収したペプチドを可溶化して可溶化したペプチドを作製することと、前記可溶化したペプチドを還元して還元したペプチドを作製することと、還元された及び／又は酸化されたシステイン又はグルタチオンを含む酸化還元混合物にて前記還元ペプチドを折り畳んで折り畳んだペプチドを作製することと、前記折り畳んだペプチドを精製して再折り畳みしたペプチドを作製することを含む、請求項１のペプチドを再折り畳みする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願記載の主題は、強力で選択的なイオンチャンネルブロッカーとして使用される単離されたクモ毒ペプチド、及び神経因性疼痛の治療のための組成物と方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
電位依存性ナトリウム（Ｎａｖ１）チャンネル及び場合によっては低電位活性化型カルシウム（Ｃａｖ３）チャンネルは、ニューロンを含む興奮細胞すべてにおいて活動電位の生成と伝搬の基礎となる膜タンパク質である。Ｎａｖ１チャンネルの阻害は、活動電位を興奮させることができないので情報をコードし、伝達することができないニューロンを生じる。
【０００３】
神経因性疼痛は、末梢の過興奮性及び中枢性感作の双方を含む複合神経過程である。末梢の過興奮性の原因は、中枢神経系（ＣＮＳ）に伝達され、疼痛として感知される損傷された後根神経節（ＤＲＧ）の異所性の自然に生じる興奮なのかも知れない。末梢における損傷された感覚性侵害受容ニューロンにてＮａｖ１（又はＣａｖ３）チャンネルを特異的に阻害することによってこの現象に対処することは、神経因性疼痛を軽減する又は取り除くことにおいて有効であり得る。非特異的Ｎａｖブロッカー（たとえば、局所麻酔）の局所適用、又はＤＲＧニューロン膜におけるＮａｖ１チャンネルを特異的に認識するＮａｖ１ブロッカーの全身性適用のいずれかによってこれを達成し得る。この特異性を高める一般的アプローチの１つは、ＣＮＳを回避することによる（ほとんどのＮａｖ１アイソフォームがニューロンの活動に決定的に重要である）。他のアプローチは、発現が過興奮性ＤＲＧニューロンに限定されているＮａｖ１アイソフォームに対する選択的ブロッカーを見つけることである（Ｄｅｖｏｒ，  ２００６；  Ｃｕｍｍｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．    ２００７）。Ｎａｖ１ブロッカーの特異性に関する主な課題の１つは、心臓遮断活性の回避である。
【０００４】
テトロドトキシン（ＴＴＸ）感受性のＮａｖ１．３チャンネルは通常、胚形成期の間にＣＮＳ及び末梢神経系（ＰＮＳ）で発現され、成熟と共にその発現は激しく下方調節される。しかしながら、チャンネル発現の上方調節は以下の神経損傷で報告されている。これらの所見は、Ｎａｖ１．３アイソフォームを特異的に標的にすることが損傷した過興奮性ＤＲＧニューロンを専ら遮断し得ることを示唆している（Ｄｅｖｏｒ，  ２００６；  Ｃｕｍｍｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．    ２００７）。
【０００５】
ＴＴＸ耐性のＮａｖ１．８チャンネルはほぼ専らＰＮＳで発現され、ＤＲＧニューロンの活動電位の十分に立証されたＴＴＸ耐性成分のほとんどに介在することが示されている。最近、疼痛制御における標的としてＮａｖ１．８チャンネルの重要性を強調する論文が公表されている（Ｊａｒｖｉｓ，  Ｍ．    Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．    ２００７；  Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．    ２００７）。
【０００６】
末梢で特異的に発現されるタンパク質を標的とすることによって疼痛を治療することの重要性は、脊髄で発現されるＡＳＩＣＩチャンネルの場合によって強調され、その阻害は神経因性疼痛のラットモデルで鎮痛を誘導する。しかしながら、ペプチド修飾物質の投与は、全身性投与ではペプチドが脳血管関門を交差して標的タンパク質に到達しないので、直接的であるべきである（Ｍａｚｚｕｃａ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００７，  Ｎａｔ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  １０，  ９４３）。
【０００７】
本明細書の全体を通して種々の科学出版物及び特許又は公開された特許出願が参照される。本発明が関するところの最先端をさらに完全に説明するために、これら出版物すべての開示はその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。本明細書のこの節又はそのほかの部分における参照の引用又は特定は、そのような参照が本発明に対する従来技術として利用可能であるという承認として解釈されるべきではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
提供されるのはクモ毒から単離されたペプチドである。単離された合成クモ毒ペプチドも提供される。好適なクモには、タランチュラ種を挙げることができる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一実施形態では、本願記載の主題に係る精製した又は単離したペプチドは、２〜５０の連続したアミノ酸、１０〜５０の連続したアミノ酸、２０〜５０の連続したアミノ酸、２５〜４５の連続したアミノ酸、２９〜４０の連続したアミノ酸、２９〜３５の連続したアミノ酸、少なくとも２９且つ多くとも３５の連続したアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む又はそれから成る。
【００１０】
さらなる実施形態では、本願記載の主題に係る精製した又は単離したペプチドは、３０００〜５０００ダルトン、３２５０〜４７５０ダルトン、３５００〜４５００ダルトン、３５５０〜４３００ダルトン、又は３６００〜４２５０ダルトンの範囲で分子量を有する。
【００１１】
一実施形態では、本願記載のペプチドは、イオンチャンネル阻害活性を示すことができる。イオンチャンネルは、ナトリウムイオンチャンネル又はカルシウムイオンチャンネルであることができる。
【００１２】
その上さらなる実施形態では、本願記載の主題は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５若しくは配列番号６のいずれか１つの配列、又は（ｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５若しくは配列番号６のいずれか１つの１以上のアミノ酸残基を異なったアミノ酸残基で置き換えることによって、（ｉｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５若しくは配列番号６のいずれか１つの１以上のアミノ酸残基の欠失によって、及び／又は（ｉｉｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５若しくは配列番号６のいずれか１つの１以上のアミノ酸残基の付加によって得られる配列、又は該ペプチドの塩若しくは化学誘導体を含む、それから成る、又はその範囲内で見い出される配列を含む精製した又は単離したペプチドを提供する。欠失、置換又は付加に関する１以上は、１〜１０、１〜８、１〜６、１〜４、１〜２又は１を指すことができる。一実施形態では、イオンチャンネル遮断活性が維持される。
【００１３】
本願記載の主題に係る精製した又は単離したペプチドは、たとえば、ＤＤＣＬＧＭＦＳＳＣＤＰＤＮＤＫＣＣＥＧＲＫＣＮＫＤＫＷＣＫＹＶＬ（配列番号１）、ＹＣＱＥＦＬＷＴＣＤＥＥＲＫＣＣＧＤＭＶＣＲＬＷＣＫＫＲＬ（配列番号２）、ＡＣＬＧＦＧＥＫＣＮＰＳＮＤＫＣＣＫＳＳＳＬＶＣＳＱＫＨＫＷＣＫＹＧＷ（配列番号３）、ＡＣＫＧＬＦＶＴＣＴＰＧＫＤＥＣＣＰＮＨＶＣＳＳＫＨＫＷＣＫＹＫＩ（配列番号４）、ＤＣＬＧＦＭＲＫＣＩＰＤＮＤＫＣＣＲＰＮＬＶＣＳＲＴＨＫＷＣＫＹＶＦ（配列番号５）及びＤＣＬＧＷＦＫＧＣＤＰＤＮＤＫＣＣＥＧＹＫＣＮＲＲＤＫＷＣＫＹＫＬＷ（配列番号６）を含む１以上のアミノ酸配列を含むことができ、又はそれから成ることができる。或いは、ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６によって表されるアミノ酸配列のＣ末端がアミド化された形態を含むことができ、又はそれから成ることができる。特に、ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号４又は配列番号５によって表されるアミノ酸配列のＣ末端がアミド化された形態を含むことができ、又はそれから成ることができる。ペプチドが配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含む又はそれから成る場合、クモ毒は、Ｒｅｄ  Ｍｏｒｐｈ  Ｇｒａｍｍｏｓｔｏｌａ（ＲＭＧ）の毒であり得るが、Ｂｒｏｗｎ  Ｍｏｒｐｈ  Ｇｒａｍｍｏｓｔｏｌａ（ＢＭＧ）ではない。
【００１４】
別の実施形態では、本願記載の主題は、配列ＤＣＬＧＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＣＸ５ＰＤＮＤＫＣＣ（配列番号７）を含む２０〜４０の連続したアミノ酸を有する精製した又は単離したペプチドを提供し、式中、Ｘ１はＭ又はＦであり、Ｘ２はＭ又はＦであり、Ｘ３はＲ又はＳであり、Ｘ４はＫ又はＳであり、Ｘ５はＤ又はＩであり、ペプチドはイオンチャンネル阻害活性を示す。イオンチャンネルはナトリウムイオンチャンネル又はカルシウムイオンチャンネルであり得る。ペプチドはクモ毒から精製することができ、又は単離した合成クモ毒ペプチドであることができる。
【００１５】
一実施形態では、本願記載の主題は、配列ＡＣＸ６ＧＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＣＸ１１ＰＸ１２Ｘ１３ＤＸ１４ＣＣ（配列番号８）を含む２０〜４０の連続したアミノ酸を有する精製した又は単離したペプチドを提供し、式中、Ｘ６はＫ又はＬであり、Ｘ７はＬ又はＦであり、Ｘ８はＧ又はＦであり、Ｘ９はＥ又はＶであり、Ｘ１０はＫ又はＴであり、Ｘ１１はＮ又はＴであり、Ｘ１２はＳ又はＧであり、Ｘ１３はＮ又はＫであり、Ｘ１４はＫ又はＥであり、ペプチドはイオンチャンネル阻害活性を示す。イオンチャンネルはナトリウムイオンチャンネル又はカルシウムイオンチャンネルであり得る。ペプチドはクモ毒から精製することができ、又は単離した合成クモ毒ペプチドであることができる。
【００１６】
さらなる実施形態では、本願記載の主題は、配列Ｘ１５ＶＣＳＸ１６Ｘ１７ＨＫＷＣＫＹ（配列番号９）を含む２０〜４０の連続したアミノ酸を有する精製した又は単離したペプチドを提供し、式中、Ｘ１５はＬ又はＨであり、Ｘ１６はＱ、Ｓ又はＲであり、Ｘ１７はＫ又はＴであり、ペプチドはイオンチャンネル阻害活性を示す。イオンチャンネルはナトリウムイオンチャンネル又はカルシウムイオンチャンネルであり得る。ペプチドはクモ毒から精製することができ、又は単離した合成クモ毒ペプチドであることができる。
【００１７】
その上さらなる実施形態では、本願記載の主題によれば、本願記載のペプチド又はその塩を１以上含むことができる又はそれから成ることができるイオンチャンネル阻害剤が提供される。イオンチャンネルはナトリウムイオンチャンネル又はカルシウムイオンチャンネルであり得る。
【００１８】
本願記載の主題によれば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び／又は配列番号９のいずれかによって表される１以上のアミノ酸配列を含む、それから成る、又はその範囲内で見い出されるペプチドと、薬学上許容可能なキャリア又は希釈剤とを含むことができる又はそれから成ることができる医薬組成物が提供される。一実施形態では、キャリアは水性キャリアである。一実施形態では、ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び／又は配列番号９のいずれかによって表されるアミノ酸配列のＣ末端がアミド化された形態によって表される１以上のアミノ酸配列を含むことができ、又はそれから成ることができる。一実施形態では、ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号４又は配列番号５によって表されるアミノ酸配列のＣ末端がアミド化された形態によって表される１以上のアミノ酸配列を含むことができ、又はそれから成ることができる。ペプチドが配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含む又はそれから成る場合、クモ毒は、Ｒｅｄ  Ｍｏｒｐｈ  Ｇｒａｍｍｏｓｔｏｌａ（ＲＭＧ）の毒であり得るが、Ｂｒｏｗｎ  Ｍｏｒｐｈ  Ｇｒａｍｍｏｓｔｏｌａ（ＢＭＧ）ではない。
【００１９】
一実施形態では、本願記載の主題によれば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び／又は配列番号９のいずれかによって表される１以上のアミノ酸配列を含む、それから成る、又はその範囲内で見い出されるペプチド及び／又は薬学上許容可能なその塩の治療上有効な量をそれが必要な対象に投与することを含むことができ、又はそれから成ることができる、対象において疼痛を治療する方法が提供される。一実施形態では、ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び／又は配列番号９のいずれかによって表されるアミノ酸配列のＣ末端がアミド化された形態によって表される１以上のアミノ酸配列を含むことができ、又はそれから成ることができる。別の実施形態では、ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号４又は配列番号５によって表されるアミノ酸配列のＣ末端がアミド化された形態によって表される１以上のアミノ酸配列を含むことができ、又はそれから成ることができる。さらなる実施形態では、治療上有効な量は鎮痛又は抗炎症に有効な量を含むことができる。ペプチドが配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含む又はそれから成る場合、クモ毒は、Ｒｅｄ  Ｍｏｒｐｈ  Ｇｒａｍｍｏｓｔｏｌａ（ＲＭＧ）の毒であり得るが、Ｂｒｏｗｎ  Ｍｏｒｐｈ  Ｇｒａｍｍｏｓｔｏｌａ（ＢＭＧ）ではない。
【００２０】
別の実施形態では、本願記載の主題によれば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９のいずれかによって表されるアミノ酸配列を含む、それから成る、又はその範囲内で見い出されるペプチド及び／又は薬学上許容可能なその塩と薬学上許容可能なキャリア又は希釈剤を含む又はそれから成る医薬組成物の治療上有効な量をそれが必要な対象に投与することを含むことができ、又はそれから成ることができる、対象において疼痛を治療する方法が提供される。一実施形態では、ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び／又は配列番号９のいずれかによって表されるアミノ酸配列のＣ末端がアミド化された形態によって表される１以上のアミノ酸配列を含むことができ、又はそれから成ることができる。別の実施形態では、ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号４又は配列番号５によって表されるアミノ酸配列のＣ末端がアミド化された形態によって表される１以上のアミノ酸配列を含むことができ、又はそれから成ることができる。さらなる実施形態では、治療上有効な量は鎮痛又は抗炎症に有効な量を含むことができる。ペプチドが配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含む又はそれから成る場合、クモ毒は、Ｒｅｄ  Ｍｏｒｐｈ  Ｇｒａｍｍｏｓｔｏｌａ（ＲＭＧ）の毒であり得るが、Ｂｒｏｗｎ  Ｍｏｒｐｈ  Ｇｒａｍｍｏｓｔｏｌａ（ＢＭＧ）ではない。
【００２１】
さらなる実施形態では、本願記載の主題は、有効量の本願記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象にてイオンチャンネル活性を阻害する方法を提供し、その際、イオンチャンネル活性は心臓機能を損傷することなく阻害ざれる。
【００２２】
対象にてＮａｖチャンネルを遮断する方法も提供される。該方法は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９のいずれかによって表されるアミノ酸配列を含む、それから成る、又はその範囲内で見い出されるペプチド及び／又は薬学上許容可能なその塩と薬学上許容可能なキャリア又は希釈剤を含む又はそれから成る医薬組成物の治療上有効な量をそれが必要な対象に投与することを含むことができ、又はそれから成ることができる。一実施形態では、ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び／又は配列番号９のいずれかによって表されるアミノ酸配列のＣ末端がアミド化された形態によって表される１以上のアミノ酸配列を含むことができ、又はそれから成ることができる。別の実施形態では、ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号４又は配列番号５によって表されるアミノ酸配列のＣ末端がアミド化された形態によって表される１以上のアミノ酸配列を含むことができ、又はそれから成ることができる。さらなる実施形態では、治療上有効な量は鎮痛又は抗炎症に有効な量を含むことができる。ペプチドが配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含む又はそれから成る場合、クモ毒は、Ｒｅｄ  Ｍｏｒｐｈ  Ｇｒａｍｍｏｓｔｏｌａ（ＲＭＧ）の毒であり得るが、Ｂｒｏｗｎ  Ｍｏｒｐｈ  Ｇｒａｍｍｏｓｔｏｌａ（ＢＭＧ）ではない。
【００２３】
本願記載の主題によれば、提供されるのは、対象への局所、注射、直腸、鼻内、肺、経口、非経口又は腸内の投与のための医薬組成物である。医薬組成物は吸入又は注入によって投与することができる。医薬組成物は、注射製剤、水溶液、脂質、エマルション、ジェル、ローション、クリーム、軟膏、錠剤、カプセル剤、ゲル／カプセル剤、及び座薬を含むが、これらに限定されない剤形を含むことができる。
【００２４】
さらに別の実施形態では、医薬組成物は、経口、非経口または腸内の投与のための液体製剤を含むことができる。液体製剤は水性製剤を含むことができる。
【００２５】
本明細書で記載される方法によって治療される疼痛は、末梢の疼痛を含む任意の既知の型の疼痛であり得る。たとえば、治療される疼痛は、神経性の疼痛、神経因性の疼痛、癌の疼痛、手術後の疼痛、口腔又は歯の疼痛、参照される三叉神経痛に由来する疼痛、ヘルペス後神経痛に由来する疼痛、反射性交感神経性ジストロフィによる疼痛及び／又は炎症性状態に関連する疼痛として記載される１以上の疼痛であり得る。
【００２６】
疼痛は、たとえば、侵害受容性疼痛、非侵害受容性疼痛、体性痛、内臓痛、神経痛として特徴付けることができる。疼痛は、損傷された細胞から放出される化学刺激と同様に熱、寒冷、振動、伸張に応答する受容体の刺激の結果であり得る。さらに疼痛は、神経細胞機能不全によって生成される疼痛の結果であり得る。本願記載の主題によれば、疼痛は、たとえば、皮膚、筋肉、関節、骨及び靭帯のような組織に関連する−筋骨格系疼痛として知られることが多い疼痛であり得る。疼痛はまた主たる体腔の内臓に関連した疼痛であり得る。この点で、疼痛は、胸部（心臓及び肺）、腹部（肝臓、腎臓、脾臓及び大腸）、及び／又は骨盤（膀胱、子宮及び卵巣）と関連し得る。さらに、本主題に係る疼痛は、神経系自体に関連する疼痛、たとえば、圧迫神経又は神経絞扼に関連する疼痛であり得る。疼痛は、末梢神経系、すなわち、組織と脊髄の間の神経、又は中枢神経系、すなわち、脊髄と脳の間の神経を起源とし得る。疼痛は、たとえば、多発性硬化症、卒中、脳出血、及び／又は酸素飢餓、神経圧迫、神経絞扼、神経炎症、椎間板損傷／椎間板ヘルニア及び／又は帯状疱疹若しくはウイルス感染のような神経感染による神経変性と関連し得る。
【００２７】
本願記載の主題によれば、炎症性状態は、急性疼痛、偏頭痛、頭痛、偏頭痛の頭痛、外傷性神経傷害、神経圧迫、神経絞扼、ヘルペス後神経痛、三叉神経痛、糖尿病性神経障害、慢性腰痛、幻肢痛、慢性骨盤痛、神経腫疼痛、複合性局所疼痛症候群、慢性関節痛、癌、化学療法、ＨＩＶ及びＨＩＶの治療が誘導する神経障害、過敏性腸症候群及び関連する疾患及びクローン病から成る群から選択される１以上の状態に関連し得る。
【００２８】
さらに、提供されるのは、凍結乾燥した粗精製のクモ毒を遠心して遠心した毒を得ることと、遠心した毒を濾過して濾過した毒を得ることと、濾過した毒をゲル濾過カラムに負荷することと、カラムを溶出して単離されたペプチドを含有する分画を得ることを含むことができる、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び／又は配列番号９のいずれかによって表される１以上のアミノ酸配列を含む、それから成るペプチドをクモ毒から単離する方法であり、単離されたペプチドは陽イオン交換クロマトグラフィ及び／又はＨＰＬＣクロマトグラフィを用いてさらに精製することができる。ペプチドが配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含む又はそれから成る場合、クモ毒は、Ｒｅｄ  Ｍｏｒｐｈ  Ｇｒａｍｍｏｓｔｏｌａ（ＲＭＧ）の毒であり得るが、Ｂｒｏｗｎ  Ｍｏｒｐｈ  Ｇｒａｍｍｏｓｔｏｌａ（ＢＭＧ）ではない。
【００２９】
さらに、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び／又は配列番号９のいずれかによって表される１以上のアミノ酸配列を含む、それから成るペプチドをクモ毒から単離する方法が提供される。ペプチドが配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含む又はそれから成る場合、クモ毒は、Ｒｅｄ  Ｍｏｒｐｈ  Ｇｒａｍｍｏｓｔｏｌａ（ＲＭＧ）の毒であり得るが、Ｂｒｏｗｎ  Ｍｏｒｐｈ  Ｇｒａｍｍｏｓｔｏｌａ（ＢＭＧ）ではない。凍結乾燥した粗精製のクモ毒を遠心して遠心した毒を得ることと、遠心した毒を濾過して濾過した毒を得ることと、濾過した毒をゲル濾過カラムに負荷することと、カラムを溶出して単離されたペプチドを含有する分画を得ることを含むことができ、単離されたペプチドが陽イオン交換クロマトグラフィ及び／又はＨＰＬＣクロマトグラフィを用いてさらに精製される方法。
【００３０】
さらに別の実施形態では、ペプチドを再び折り畳む方法が提供され、該方法は、１．１ｍＭ〜２４ｍＭの濃度で粗精製のペプチドを回収することと、たとえば、０．１Ｍのトリス緩衝液又は２ＭのＮＨ４ＯＡＣ緩衝液に粗精製のペプチドを溶解することと、たとえば、２０ｍＭのＤＴＴでペプチドを還元することと、たとえば、７〜９．５の範囲でのｐＨにて１０〜２４．８μＭの最終ペプチド濃度で緩衝化した水溶液における還元された及び／又は酸化されたシステイン又はグルタチオンの系を含有する酸化還元混合物においてペプチドを折り畳むことと、たとえば、折り畳まれたペプチドを半分取Ｃ１８カラムにて精製することを含む、又はそれらから成る。好適な緩衝液には、たとえば、酢酸アンモニウム緩衝液、重炭酸アンモニウム緩衝液、及び０．１ＭトリスＨＣｌ緩衝液が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１Ａ】Ｐｔｅｒｉｎｏｃｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．  Ｕｓａｍｂａｒａの毒（Ｐｓｐ）に由来するペプチドＡのクロマトグラフィ精製を示すグラフである。
【図１Ｂ】Ｐｔｅｒｉｎｏｃｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．  Ｕｓａｍｂａｒａの毒（Ｐｓｐ）に由来するペプチドＡのクロマトグラフィ精製を示す追加のグラフである。
【図２Ａ】Ｐｓｐ毒由来のペプチドＢのクロマトグラフィ精製を示すグラフである。
【図２Ｂ】Ｐｓｐ毒由来のペプチドＢのクロマトグラフィ精製を示す追加のグラフである。
【図２Ｃ】Ｐｓｐ毒由来のペプチドＢのクロマトグラフィ精製を示す別のグラフである。
【図３Ａ】Ｈａｐｌｏｐｅｌｍａ  ｌｉｖｉｄｕｍの毒（Ｈｖ）に由来するペプチドＣのクロマトグラフィ精製を示すグラフである。
【図３Ｂ】Ｈａｐｌｏｐｅｌｍａ  ｌｉｖｉｄｕｍの毒（Ｈｖ）に由来するペプチドＣのクロマトグラフィ精製を示す追加のグラフである。
【図３Ｃ】Ｈａｐｌｏｐｅｌｍａ  ｌｉｖｉｄｕｍの毒（Ｈｖ）に由来するペプチドＣのクロマトグラフィ精製を示す別のグラフである。
【図４Ａ】Ｈｖ由来のペプチドＤのクロマトグラフィ精製を示すグラフである。
【図４Ｂ】Ｈｖ由来のペプチドＤのクロマトグラフィ精製を示す追加のグラフである。
【図４Ｃ】Ｈｖ由来のペプチドＤのクロマトグラフィ精製を示す別のグラフである。
【図５Ａ】Ｒｅｄ  Ｍｏｒｐｈ  Ｇｒａｍｍｏｓｔｏｌａ（ＲＭＧ）の毒に由来するペプチドＥのクロマトグラフィ精製を示すグラフである。
【図５Ｂ】Ｒｅｄ  Ｍｏｒｐｈ  Ｇｒａｍｍｏｓｔｏｌａ（ＲＭＧ）の毒に由来するペプチドＥのクロマトグラフィ精製を示す追加のグラフである。
【図５Ｃ】Ｒｅｄ  Ｍｏｒｐｈ  Ｇｒａｍｍｏｓｔｏｌａ（ＲＭＧ）の毒に由来するペプチドＥのクロマトグラフィ精製を示す別のグラフである。
【図５Ｄ】Ｒｅｄ  Ｍｏｒｐｈ  Ｇｒａｍｍｏｓｔｏｌａ（ＲＭＧ）の毒に由来するペプチドＥのクロマトグラフィ精製を示すさらなるグラフである。
【図６Ａ】ＲＭＧの毒に由来するペプチドＦのクロマトグラフィ精製を示すグラフである。
【図６Ｂ】ＲＭＧの毒に由来するペプチドＦのクロマトグラフィ精製を示す追加のグラフである。
【図６Ｃ】ＲＭＧの毒に由来するペプチドＦのクロマトグラフィ精製を示す別のグラフである。
【図７Ａ】２μＭの純粋なペプチドＡの浴潅流の前とその最中における電圧ランプ刺激に対するｒＮａｖ１．３チャンネルの応答を示す図である。
【図７Ｂ】３．４μＭの純粋なペプチドＡの浴潅流の前とその最中における電圧ランプ刺激に対するｈＮａｖ１．３チャンネルの応答を示す図である。
【図７Ｃ】２μＭの純粋なペプチドＡの浴潅流の前とその最中における電圧ランプ刺激に対するｒＮａｖ１．８チャンネルの応答を示す図である。
【図７Ｄ】５．２５μＭの純粋なペプチドＡの浴潅流の前とその最中における及び実証されたｈＥＲＧブロッカーの浴潅流の最中における電圧ステップ刺激に対するｈＫｖ１１．１（ｈＥＲＧ）チャンネルの応答を示す図である。
【図７Ｅ】図７Ａ〜図７Ｄに示された各チャンネルの少なくとも３回の実験を要約する用量反応曲線を示す図である。
【図７Ｆ】急性的に分離したラットのＤＲＧニューロンにおける電流刺激に対する電圧の応答を示す図である。
【図７Ｇ】図７Ｆで記載した条件で実施した幾つかの実験を要約する棒グラフである。
【図７Ｈ】マウス胚性幹細胞に由来する心筋細胞（ｍＥＳ−ＣＭ）で記録された膜電圧の連続的な痕跡を示す図である。活動電位は自然に且つ定期的に興奮させられ、その周波数及び振幅を以下のチャートにプロットする。
【図７Ｉ】３．７５μＭのペプチドＡと３μＭのＴＴＸの効果がＡＰ周波数に影響を及ぼした幾つかの実験を要約する棒グラフである。
【図８Ａ】０．５μＭの純粋なペプチドＢの浴潅流の前とその最中における電圧ランプ刺激に対するｒＮａｖ１．３チャンネルの応答を示す図である。
【図８Ｂ】０．５μＭの純粋なペプチドＢの浴潅流の前とその最中における電圧ランプ刺激に対するｈＮａｖ１．３チャンネルの応答を示す図である。
【図８Ｃ】０．７μＭの純粋なペプチドＢの浴潅流の前とその最中における電圧ランプ刺激に対するｒＮａｖ１．８チャンネルの応答を示す図である。
【図８Ｄ】１．５μＭの純粋なペプチドＢの浴潅流の前とその最中における及び実証されたｈＥＲＧブロッカーの浴潅流の最中における電圧ステップ刺激に対するｈＫｖ１１．１（ｈＥＲＧ）チャンネルの応答を示す図である。
【図８Ｅ】図８Ａ〜図８Ｄに示された各チャンネルの少なくとも３回の実験を要約する用量反応曲線を示す図である。
【図８Ｆ】急性的に分離したラットのＤＲＧニューロンにおける電流刺激に対する電圧の応答を示す図である。
【図８Ｇ】図８Ｆで記載した条件で実施した幾つかの実験を要約する棒グラフである。
【図８Ｈ】マウス胚性幹細胞に由来する心筋細胞（ｍＥＳ−ＣＭ）で記録された膜電圧の連続的な痕跡を示す図である。
【図８Ｉ】９μＭのペプチドＢと３μＭのＴＴＸの効果がＡＰ周波数に影響を及ぼした幾つかの実験を要約する棒グラフである。
【図９Ａ】１．２５μＭ（Ｈｖ３９２０）の純粋なペプチドＣの浴潅流の前とその最中における電圧ランプ刺激に対するｒＮａｖ１．３チャンネルの応答を示す図である。
【図９Ｂ】２．４μＭ（Ｈｖ３９２０）の純粋なペプチドＣの浴潅流の前とその最中における電圧ランプ刺激に対するｈＮａｖ１．３チャンネルの応答を示す図である。
【図９Ｃ】３．６μＭ（Ｈｖ３９２０）の純粋なペプチドＣの浴潅流の前とその最中における電圧ランプ刺激に対するｒＮａｖ１．８チャンネルの応答を示す図である。
【図９Ｄ】４Ｍの純粋なペプチドＣの浴潅流の前とその最中における及び実証されたｈＥＲＧブロッカーの浴潅流の最中における電圧ステップ刺激に対するｈＫｖ１１．１（ｈＥＲＧ）チャンネルの応答を示す図である。
【図９Ｅ】図９Ａ〜図９Ｄに示された各チャンネルの少なくとも３回の実験を要約する用量反応曲線を示す図である。見かけのＩＣ５０は表３に示す。
【図９Ｆ】急性的に分離したラットのＤＲＧニューロンにおける電流刺激に対する電圧の応答の重ね合わせた痕跡を示す図である。
【図９Ｇ】図９Ｆで記載した条件で実施した幾つかの実験を要約する棒グラフである。
【図９Ｈ】マウス胚性幹細胞に由来する心筋細胞（ｍＥＳ−ＣＭ）で記録された膜電圧の連続的な痕跡を示す図である。
【図９Ｉ】５μＭのペプチドＣと３μＭのＴＴＸの効果がＡＰ周波数に影響を及ぼした幾つかの実験を要約する棒グラフである。
【図１０Ａ】０．１５μＭの純粋なペプチドＤの浴潅流の前とその最中における電圧ランプ刺激に対するｒＮａｖ１．３チャンネルの応答を示す図である。
【図１０Ｂ】０．５μＭの純粋なペプチドＤの浴潅流の前とその最中における電圧ランプ刺激に対するｈＮａｖ１．３チャンネルの応答を示す図である。
【図１０Ｃ】０．４８μＭの純粋なペプチドＤの浴潅流の前とその最中における電圧ランプ刺激に対するｒＮａｖ１．８チャンネルの応答を示す図である。
【図１０Ｄ】１μＭの純粋なペプチドＤの浴潅流の前とその最中における及び実証されたｈＥＲＧブロッカーの浴潅流の最中における電圧ステップ刺激に対するｈＫｖ１１．１（ｈＥＲＧ）チャンネルの応答を示す図である。
【図１０Ｅ】図１０Ａ〜図１０Ｄに示された各チャンネルの少なくとも３回の実験を要約する用量反応曲線を示す図である。
【図１０Ｆ】急性的に分離したラットのＤＲＧニューロンにおける電流刺激に対する電圧の応答の重ね合わせた痕跡を示す図である。
【図１０Ｇ】図１０Ｆで記載した条件で実施した幾つかの実験を要約する棒グラフである。
【図１０Ｈ】マウス胚性幹細胞に由来する心筋細胞（ｍＥＳ−ＣＭ）で記録された膜電圧の連続的な痕跡を示す図である。
【図１０Ｉ】０．７５μＭのペプチドＤと３μＭのＴＴＸの効果がＡＰ周波数に影響を及ぼした幾つかの実験を要約する棒グラフである。
【図１１Ａ】０．３μＭの純粋なペプチドＥの浴潅流の前とその最中における電圧ランプ刺激に対するｒＮａｖ１．３チャンネルの応答を示す図である。
【図１１Ｂ】０．９３μＭの純粋なペプチドＥの浴潅流の前とその最中における電圧ランプ刺激に対するｈＮａｖ１．３チャンネルの応答を示す図である。
【図１１Ｃ】０．９３μＭの純粋なペプチドＥの浴潅流の前とその最中における電圧ランプ刺激に対するｒＮａｖ１．８チャンネルの応答を示す図である。
【図１１Ｄ】０．９３μＭの純粋なペプチドＥの浴潅流の前とその最中における及び実証されたｈＥＲＧブロッカーの浴潅流の最中における電圧ステップ刺激に対するｈＫｖ１１．１（ｈＥＲＧ）チャンネルの応答を示す図である。
【図１１Ｅ】図１１Ａ〜図１１Ｄに示された各チャンネルの少なくとも３回の実験を要約する用量反応曲線を示す図である。
【図１１Ｆ】急性的に分離したラットのＤＲＧニューロンにおける電流刺激に対する電圧の応答の重ね合わせた痕跡を示す図である。
【図１１Ｇ】図１１Ｆで記載した条件で実施した幾つかの実験を要約する棒グラフである。
【図１１Ｈ】マウス胚性幹細胞に由来する心筋細胞（ｍＥＳ−ＣＭ）で記録された膜電圧の連続的な痕跡を示す図である。
【図１１Ｉ】０．８３μＭのペプチドＥと３μＭのＴＴＸの効果がＡＰ周波数に影響を及ぼした幾つかの実験を要約する棒グラフである。
【図１２Ａ】０．１μＭの純粋なペプチドＦの浴潅流の前とその最中における電圧ランプ刺激に対するｒＮａｖ１．３チャンネルの応答を示す図である。
【図１２Ｂ】０．５２μＭの純粋なペプチドＦの浴潅流の前とその最中における電圧ランプ刺激に対するｈＮａｖ１．３チャンネルの応答を示す図である。
【図１２Ｃ】０．５μＭの純粋なペプチドＦの浴潅流の前とその最中における電圧ランプ刺激に対するｒＮａｖ１．８チャンネルの応答を示す図である。
【図１２Ｄ】０．９２μＭの純粋なペプチドＦの浴潅流の前とその最中における及び実証されたｈＥＲＧブロッカーの浴潅流の最中における電圧ステップ刺激に対するｈＫｖ１１．１（ｈＥＲＧ）チャンネルの応答を示す図である。
【図１２Ｅ】図１２Ａ〜図１２Ｄに示された各チャンネルの少なくとも３回の実験を要約する用量反応曲線を示す図である。
【図１２Ｆ】急性的に分離したラットのＤＲＧニューロンにおける電流刺激に対する電圧の応答の重ね合わせた痕跡を示す図である。
【図１２Ｇ】図１２Ｆで記載した条件で実施した幾つかの実験を要約する棒グラフである。
【図１２Ｈ】マウス胚性幹細胞に由来する心筋細胞（ｍＥＳ−ＣＭ）で記録された膜電圧の連続的な痕跡を示す図である。
【図１２Ｉ】１μＭのペプチドＥと３μＭのＴＴＸの効果がＡＰ周波数に影響を及ぼした幾つかの実験を要約する棒グラフである。
【図１３】天然のペプチドＡ（三角）、２０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）で１時間還元した合成ペプチドＡ（四角）及び折り畳んだ合成ペプチドＡ（丸）の分析用逆相ＨＰＬＣクロマト図を示す。
【図１４】天然のペプチドＢ（三角）、２０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）で１．５時間還元した合成ペプチドＢ（四角）及び折り畳んだ合成ペプチドＢ（丸）の分析用逆相ＨＰＬＣクロマト図を示す。
【図１５】天然のペプチドＣ（三角）、２０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）で１時間還元した合成ペプチドＣ（四角）及び折り畳んだ合成ペプチドＣ（丸）の分析用逆相ＨＰＬＣクロマト図を示す。
【図１６】天然のペプチドＤ（三角）、２０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）で１時間還元した合成ペプチドＤ（四角）及び折り畳んだ合成ペプチドＤ（丸）の分析用逆相ＨＰＬＣクロマト図を示す。
【図１７】天然のペプチドＥ（三角）、２０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）で１時間還元した合成ペプチドＥ（四角）及び折り畳んだ合成ペプチドＥ（丸）の分析用逆相ＨＰＬＣクロマト図を示す。
【図１８】天然のペプチドＦ（三角）、２０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）で１時間還元した合成ペプチドＦ（四角）及び折り畳んだ合成ペプチドＦ（丸）の分析用逆相ＨＰＬＣクロマト図を示す。
【図１９】ペプチドＡ〜Ｆについてペプチド濃度に対するｒＮａｖ１．３チャンネルの電流の％阻害として表される天然と合成のペプチドの遮断活性の比較を示す図である。
【図２０】同側及び反対側の後肢の結紮前及び結紮後の足引っ込め閾値を示す図である。
【図２１】試験化合物の急性投与及び慢性投与の後、１時間及び３時間の時点での同側の足引っ込め閾値を示す図である。
【図２２】試験化合物の急性投与及び慢性投与の後、１時間及び３時間の時点での反対側の足引っ込め閾値を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
１．定義
以下の定義は、そのような用語を付与される範囲を含む本明細書及び特許請求の範囲の明瞭で一貫した理解を提供する役目を果たす。
【００３３】
本明細書で使用されるとき、用語「投与すること」、「投与」などは、健全な医療行為において治療効果を提供するような方式で対象に組成物を送達する方法を指す。本主題の一態様は、それを必要とする患者への治療上有効な量の本主題の組成物の経口投与を提供する。
【００３４】
本願記載のクモ毒のペプチドは、疼痛の治療又は鎮痛の誘導に有用である。本明細書で使用されるとき、用語「治療すること」にはまた、そのような疼痛が発生する傾向を有する患者又は対象における疼痛の予防、及びいったん定まっている発生した疼痛の改善若しくは排除、又はそのような疼痛の特徴的な症状の緩和も含まれる。
【００３５】
本明細書で使用されるとき、「疼痛」はあらゆる種類の疼痛を指す。特に、該用語は、神経因性疼痛及び手術後疼痛のような慢性疼痛、慢性腰痛、群発性頭痛、ヘルペス神経痛、幻肢痛、中枢性疼痛、歯痛、オピオイド耐性痛、内臓痛、手術痛、骨損傷痛、分娩中の疼痛、日焼けを含む火傷による疼痛、分娩後の疼痛、偏頭痛、狭心症の疼痛、及び膀胱炎を含む生殖泌尿器関連の疼痛を指す。加えて、神経因性疼痛は、多数の別々の病因から生じ得る。神経因性疼痛は、眼科手術、歯の修復（歯根管）、火傷、反射性交感神経ジストロフィ、ヘルペス後神経痛、糖尿病性の神経障害、関節炎などの結果、生じ得る。該用語はまた、反射性交感神経ジストロフィ及び侵害受容疼痛又は痛覚による疼痛も指す。加えて、用語「疼痛」は、関節炎；たとえば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）又は狼瘡を含む自己免疫疾患；慢性前立腺症；慢性炎症；過敏症；炎症性腸疾患；再潅流損傷；血管炎；移植の拒絶；骨盤炎症性疾患；糸球体腎炎；喘息、炎症性筋疾患；全身性硬化症；皮膚筋炎；多発性筋炎；封入体筋炎；チェディアック・ヒガシ症候群；及び慢性肉芽腫性疾患に関連する疼痛を含むが、これらに限定されない炎症状態と関連する疼痛を指す。
【００３６】
本発明の化合物又は薬学上許容可能なその塩若しくは溶媒和物を有効成分として含有する医薬組成物は、従来の薬剤配合法に従って調製することができる。たとえば、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（１９９０，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．）を参照のこと。
【００３７】
本明細書で使用されるとき、用語「賦形剤」又は「補助剤」は、薬剤物質ではない医薬組成物の任意の成分を指す。
【００３８】
本明細書で使用されるとき、語句「薬剤製品」「医薬剤形」「最終剤形」などは、治療を必要とする患者に投与される、１以上の薬剤物質と１以上の賦形剤の組み合わせ（すなわち、医薬組成物）を指し、溶液、水溶液、エマルション、懸濁液、錠剤、カプセル剤、座薬、クリーム、ジェル、ローションなどの形態であり得る。
【００３９】
本明細書で使用されるとき、用語「対象」又は「個体」又は「動物」又は「患者」又は「哺乳類」は、診断、予後又は治療が望まれる任意の対象、特に哺乳類対象、たとえば、ヒトを指す。
【００４０】
本明細書で使用されるとき、疾患、障害又は状態の、用語「治療」又は「治療すること」は、その少なくとも１つの症状の緩和、その重症度の軽減又はその進行の遅延、妨害若しくは阻害を包含する。治療は、疾患、障害又は状態が完全に治癒されることを意味しなくてもよい。有効な治療であるには、本明細書で有用な組成物は、疾患、障害又は状態の重症度を軽減し、それに関連する症状の重症度を軽減し、患者又は対象の生活の質の向上を提供し、又は疾患、障害若しくは状態の発症を遅らす、防ぐ若しくは抑制することだけを必要とする。
【００４１】
本明細書で使用されるとき、用語「薬学上許容可能な」キャリアは、非毒性で不活性の固体、半固体、液体の任意の種類の充填剤、希釈剤、被包材、製剤化補助剤、又は単に生理食塩水のような無菌の水性媒体を指す。薬学上許容可能なキャリアとして役立ち得る物質の一部の例は、ラクトース、グルコース及びスクロースのような糖類、コーンスターチ及びポテトスターチのようなデンプン、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース及びセルロースアセテートのようなセルロース及びその誘導体；粉末化トラガカント；麦芽、ゼラチン、タルク；ココアバター及び座薬ワックスのような賦形剤；ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及び大豆油のような油；プロピレングリコールのようなグリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールのようなポリオール；オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルのようなエステル類、寒天；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムのような緩衝剤；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張生理食塩水、リンガー溶液；エチルアルコール及びリン酸緩衝液、並びに医薬製剤で使用されるそのほかの非毒性で相溶性の物質である。
【００４２】
活性剤は好ましくは、治療上有効な量で投与される。本明細書で使用されるとき、用語「安全で有効な量」は、本願記載の方法で使用した場合、理に適った利益／リスクの比と釣り合った、過度の有害な副作用（たとえば、毒性、刺激又はアレルギー反応）なしで望ましい治療応答を得るのに十分である成分の量を指す。語句「治療上有効な量」は本明細書で使用されるとき、望ましい治療応答を得るのに十分な、本願記載の活性剤の量を指す。たとえば、「治療上有効な量」は、任意の薬物療法に適用可能な理に適った利益／リスクの比で疼痛を治療する若しくは緩和する又は鎮痛を誘導するための活性剤の十分な量であり得る。投与される実際の量、及び投与の度合いと時間的経過は、治療される状態の性質と重症度に左右される。治療の処方、たとえば、投与量やタイミングなどの決定は一般開業医や専門家の責任の範囲内であり、通常、治療される障害、個々の患者の状態、送達の部位、投与の方法、及び開業医に既知のそのほかの因子を考慮に入れる。技法及びプロトコールの例はＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに見つけることができる。
【００４３】
本明細書で使用されるとき、用語「ペプチド」は、アミノ酸１つのアミノ基と隣のアミノ酸のカルボキシル基からＨ２Ｏの分子を取り除くことによって形成される共有結合により連結される２以上のアミノ酸から構成される化合物を意味する。
【００４４】
本発明の目的での用語「単離された」は、元々の環境（天然に存在する環境）から取り出されている生体材料（核酸又はタンパク質）を指す。たとえば、植物又は動物に天然の状態で存在するペプチドは単離されないが、天然に存在する隣接するアミノ酸から分離された同じペプチドは「単離された」とみなされる。
【００４５】
用語「精製された」は、ほかの化合物の存在を排除して絶対的な純度を示す形態で存在する物質を要求しない。むしろ、それは相対的な定義である。ペプチドは、少なくとも１桁、好ましくは２又は３桁、好ましくは４又は５桁、出発物質又は天然物質を精製した後の「精製された」状態にある。
【００４６】
本明細書で使用されるとき、用語「実質的に純粋な」は、天然の混入物質から分離されているペプチド又はそのほかの物質を説明する。通常、単量体ペプチドは試料の少なくとも６０〜７５％が単一のペプチド主鎖を示す場合、実質的に純粋である。軽微な変異体又は化学修飾体は通常、同一ペプチド配列を共有する。普通、実質的に純粋なペプチドは、約８５〜９０％を超える、特に９５％を超えて純粋な、９７％を超えて純粋な、又は９９％を超えて純粋なペプチド試料を含む。通常、純度はポリアクリルアミドゲル上で測定され、均質性は染色によって判定される。或いは、特定の目的では、高い解像度が必要とされ、精製のためにＨＰＬＣ又は類似の手段が使用される。ほとんどの目的では、単純なクロマトグラフィカラム又はポリアクリルアミドゲルを用いて純度を決定する。
【００４７】
用語「天然に会合する宿主成分を実質的に含まない」は、天然の宿主状態でそれに伴う天然の混入物質から分離されるペプチド又はそのほかの物質を説明する。従って、化学的に合成された又は天然に由来する宿主細胞とは異なる細胞系で合成されたペプチドは天然に会合する宿主細胞成分を実質的に含まない。
【００４８】
用語「相同性」は、２つのポリヌクレオチド間又は２つのペプチド部分間における同一性の比率を指す。１つの部分から別の部分までの配列間の対応は当該技術で既知の技法によって決定することができる。たとえば、配列情報を並べ、容易に利用できるコンピュータプログラムを用いて２つのペプチド分子間の配列情報を直接比較することにより相同性を決定することができる。
【００４９】
本明細書で使用されるとき、その文法上の形態及びスペルの変異すべてにおける用語「相同の」は、スーパーファミリーのタンパク質（たとえば、免疫グロブリンスーパーファミリー）及び異なった種に由来する相同タンパク質（たとえば、ミオシン軽鎖など）を含む「共通する進化的な起源」を持つタンパク質間の関係を指す（Ｒｅｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７，  Ｃｅｌｌ  ５０：  ６６７）。そのようなタンパク質（及びそれらをコードする遺伝子）は高い程度の配列類似性によって反映されるように配列相同性を有する。しかしながら、通常の用途及び本適用において、用語「相同の」は、たとえば、「高い」のような副詞で修飾された場合、配列類似性を指すことができ、共通する進化的起源を指すのではない。
【００５０】
従って、その文法的形態のすべてにおける用語「配列類似性」は、共通する進化的起源を共有してもよく又はしなくてもよい核酸配列又はアミノ酸配列の間の同一性又は対応の程度を指す（Ｒｅｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７，  Ｃｅｌｌ  ５０：  ６６７を参照）。
【００５１】
特定の実施形態では、アミノ酸の少なくとも約５０％（好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０％又は９５％）が配列の規定された長さにわたって一致する場合、２つのアミノ酸配列は「実質的に相同」であり、又は「実質的に類似」する。実質的に相同である配列は既知の技法を用いて配列を比較することによって特定することができる。
【００５２】
用語「対応すること」は、類似性又は相同性が測定される分子と正確な位置が同一であろうと、異なっていようと、類似の配列又は相同の配列を指すように本明細書で使用される。核酸又はアミノ酸の配列配置にはスペースが含まれてもよい。従って、用語「対応すること」は、配列類似性を指し、アミノ酸残基又はヌクレオチド塩基の番号付けを指すのではない。
【００５３】
用語「クモ」はＴｈｅｒａｐｈｏｓｉｄａｅ科のタランチュラを指す。Ｔｈｅｒａｐｈｏｓｉｄａｅ科は、１００を超える属とその中の約９００の種を含有する幾つかの亜科に分けられる。Ｔｈｅｒａｐｈｏｓｉｄａｅ科の亜科には以下が含まれる。
Ａｃａｎｔｈｏｐｅｌｍｉｎａｅ：小型、陸生の新世界タランチュラの亜科。この亜科はたった１つの属Ａｃａｎｔｈｏｐｅｌｍａ及び２つの種、Ａ．ｂｅｃｃａｒｒｉとＡ．Ｒｕｆｅｓｃｅｎｓを有する。
Ａｖｉｃｕｌａｒｉｉｎａｅ：熱帯性で木に住む新世界タランチュラの亜科。属には、Ａｖｉｃｕｌａｒｉａ、Ｅｐｈｅｂｏｐｕｓ、Ｉｒｉｄｏｐｅｌｍａ、Ｐａｃｈｉｓｔｏｐｅｌｍａ及びＴａｐｉｎａｕｃｈｅｎｉｕｓが挙げられる。
Ｅｕｍｅｎｏｐｈｏｒｉｎａｅ：旧世界タランチュラの亜科。属にはＡｎｏｐｌｏｓｃｅｌｕｓ、Ｂａｔｅｓｉｅｌｌａ、Ｃｉｔｈａｒｉｓｃｈｉｕｓ、Ｅｎｃｙｏｃｒａｔｅｓ、Ｅｕｍｅｎｏｐｈｏｒｕｓ、Ｈｙｓｔｅｒｏｃｒａｔｅｓ、Ｌｏｘｏｍｐｈａｌｉａ、Ｌｏｘｏｐｔｙｇｕｓ、Ｍａｓｃａｒａｎｅｕｓ、Ｍｏｎｏｃｅｎｔｏｐｕｓ、Ｍｙｏｓｔｏｌａ及びＰｈｏｎｅｙｕｓａが挙げられる。Ｐｒｏｓｈａｐａｌｏｐｕｓはこの亜科に入れられることがある。
Ｈａｒｐａｃｔｉｒｉｎａｅ：アフリカの旧世界タランチュラの亜科。属にはＡｕｇａｃｅｐｈａｌｕｓ、Ｂｒａｃｈｉｏｎｏｐｕｓ、Ｃｅｒａｔｏｇｙｒｕｓ、Ｅｕｃｒａｔｏｓｃｅｌｕｓ、Ｈａｒｐａｃｔｉｒａ、Ｉｄｉｏｔｈｅｌｅ、Ｐｔｅｒｉｎｏｃｈｉｌｕｓ及びＴｒｉｃｈｏｇｎａｔｈｅｌｌａが挙げられる。
Ｉｓｃｈｎｏｃｏｌｉｎａｅ亜科は世界中のクモを含む。属には、Ｃａｔｕｍｉｒｉ、Ｃｈａｅｔｏｐｅｌｍａ、Ｃｒａｔｏｒｒｈａｇｕｓ、Ｇｕｙｒｕｉｔａ、Ｈｅｍｉｅｒｃｕｓ、Ｈｅｔｅｒｏｔｈｅｌｅ、Ｈｏｌｏｔｈｅｌｅ、Ｉｓｃｈｎｏｃｏｌｕｓ、Ｎｅｓｉｅｒｇｕｓ、Ｏｌｉｇｏｘｙｓｔｒｅ、Ｐｌｅｓｉｏｐｈｒｉｃｔｕｓ及びＳｉｃｋｉｕｓが挙げられる。
旧世界タランチュラの群からの亜科Ｏｒｎｉｔｈｏｃｔｏｎｉｎａｅのアースタイガー。属にはＣｉｔｈａｒｏｇｎａｔｈｕｓ、Ｃｙｒｉｏｐａｇｏｐｕｓ、Ｈａｐｌｏｐｅｌｍａ、Ｌａｍｐｒｏｐｅｌｍａ、Ｏｒｎｉｔｈｏｃｔｏｎｕｓ及びＰｈｏｒｍｉｎｇｏｃｈｉｌｕｓが挙げられる。
Ｐｏｅｃｉｌｏｔｈｅｒｉｉｎａｅはインド及びスリランカの木にいるクモである。この亜科はたった１つの属Ｐｏｅｃｉｌｏｔｈｅｒｉａを含む。
Ｓｅｌｅｎｏｃｏｓｍｉｉｎａｅは主として東アジアとオーストラリアのタランチュラから成る亜科である。属にはＢａｃｃａｌｌｂｒａｐｏ、Ｃｈｉｌｏｂｒａｃｈｙｓ、Ｃｈｉｌｏｃｏｓｍｉａ、Ｃｏｒｅｍｉｏｃｎｅｍｉｓ、Ｈａｐｌｏｃｏｓｍｉａ、Ｌｙｒｏｇｎａｔｈｕｓ、Ｏｒｐｈｎａｅｃｕｓ、Ｐｈｌｏｇｉｅｌｌｕｓ、Ｐｈｌｏｇｉｕｓ、Ｐｓａｌｍｏｐｏｅｕｓ、Ｓｅｌｅｎｏｂｒａｃｈｙｓ、Ｓｅｌｅｎｏｃｏｓｍｉａ、Ｓｅｌｅｎｏｐｅｌｍａ、Ｓｅｌｅｎｏｔｈｏｌｕｓ、Ｓｅｌｅｎｏｔｙｐｕｓ、Ｔａｐｉｎａｕｃｈｅｎｉｕｓ及びＹａｍｉａが挙げられる。
Ｓｅｌｅｎｏｇｙｒｉｎａｅは、インド及びアフリカのタランチュラの亜科である。属にはＡｎｎａｎｄａｌｉｅｌｌａ、Ｅｕｐｈｒｉｃｔｕｓ及びＳｅｌｅｎｏｇｙｒｕｓが挙げられる。
Ｓｔｒｏｍａｔｏｐｅｌｍｉｎａｅは木に住む西アフリカのタランチュラである。属にはＥｎｃｙｏｃｒａｔｅｌｌａ、Ｈｅｔｅｒｏｓｃｏｄｒａ及びＳｔｒｏｍａｔｏｐｅｌｍａが挙げられる。
Ｔｈｅｒａｐｈｏｓｉｎａｅは新世界の陸生タランチュラである。属には、Ａｃａｎｔｈｏｓｃｕｒｒｉａ、Ａｅｎｉｇｍａｒａｃｈｎｅ、Ａｍｉ、Ａｐｈｏｎｏｐｅｌｍａ、ｂｏｎｎｅｔｉｎａ、ｂｒａｃｈｙｐｅｌｍａ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｐｅｌｍａ、Ｃｉｔｈａｒａｃａｎｔｈｕｓ、Ｃｌａｖｏｐｅｌｍａ、Ｃｒａｓｓｉｃｒｕｓ、Ｃｕｂａｎａｎａ、Ｃｙｃｌｏｓｔｅｒｎｕｍ、Ｃｙｒｉｏｃｏｓｍｕｓ、Ｃｙｒｔｏｐｈｏｌｉｓ、Ｅｕａｔｈｌｕｓ、Ｅｕｐａｌａｅｓｔｒｕｓ、Ｇｒａｍｍｏｓｔｏｌａ、Ｈａｐａｌｏｐｕｓ、Ｈａｐａｌｏｔｒｅｍｕｓ、Ｈｅｍｉｒｒｈａｇｕｓ、Ｈｏｍｏｅｏｍｍａ、Ｋｏｃｈｉａｎａ、Ｌａｓｉｏｄｏｒａ、Ｌａｓｉｏｄｏｒｉｄｅｓ、Ｍａｇｕｌｌａ、Ｍａｒａｃａ、Ｍｅｇａｐｈｏｂｅｍａ、Ｍｅｌｌｏｌｅｉｔａｏｉｎａ、Ｍｅｔｒｉｏｐｅｌｍａ、Ｎｅｏｓｔｅｎｏｔａｒｓｕｓ、Ｎｅｓｉｐｅｌｍａ、Ｎｈａｎｄｕ、Ｏｚｏｐａｃｔｕｓ、Ｐａｍｐｈｏｂｅｔｅｕｓ、Ｐａｒａｐｈｙｓａ、Ｐｈｏｒｍｉｃｔｏｐｕｓ、Ｐｌｅｓｉｏｐｅｌｍａ、Ｐｒｏｓｈａｐａｌｏｐｕｓ、Ｐｓｅｕｄｈａｐａｌｏｐｕｓ、Ｒｅｖｅｒｓｏｐｅｌｍａ、Ｓｃｈｉｓｍａｔｏｔｈｅｌｅ、Ｓｃｈｉｚｏｐｅｌｍａ、Ｓｅｒｉｃｏｐｅｌｍａ、Ｓｐｈａｅｒｏｂｏｔｈｒｉａ、Ｓｔｉｃｈｏｐｌａｓｔｏｒｉｓ、Ｔｈｅｒａｐｈｏｓａ、Ｔｈｒｉｘｏｐｅｌｍａ、Ｔｍｅｓｉｐｈａｎｔｅｓ、Ｖｉｔａｌｉｕｓ及びＸｅｎｅｓｔｈｉｓが挙げられる。
Ｔｈｒｉｇｍｏｐｏｅｉｎａｅはインドのタランチュラである。属にはＨａｐｌｏｃｌａｓｔｕｓ及びＴｈｒｉｇｍｏｐｏｅｕｓが挙げられる。
【００５４】
好適な種には、Ｐｔｅｒｉｎｏｃｈｉｌｕｓ  ａｌｌｕａｕｄｉ、Ｐｔｅｒｉｎｏｃｈｉｌｕｓ  ｃｈｏｒｄａｔｅｓ、Ｐｔｅｒｉｎｏｃｈｉｌｕｓ  ｌｅｅｔｚｉ、Ｐｔｅｒｉｎｏｃｈｉｌｕｓ  ｌｕｇａｒｄｉ、Ｐｔｅｒｉｎｏｃｈｉｌｕｓ  ｍｕｒｉｎｕｓ（すなわち、Ｐｔｅｒｉｎｏｃｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．Ｕｓａｍｂａｒａ（Ｐｓｐ））、Ｐｔｅｒｉｎｏｃｈｉｌｕｓ  ｓｉｍｏｎｉ及びＰｔｅｒｉｎｏｃｈｉｌｕｓ  ｖｏｒａｘを含むＨａｒｐａｃｔｉｒｉｎａｅ亜科Ｐｔｅｒｉｎｏｃｈｉｌｕｓ属のタランチュラが挙げられるが、これらに限定されない。さらにそのほかの好適な種には、Ｈａｐｌｏｐｅｌｍａ  ａｌｂｏｓｔｒｉａｔｕｍ、Ｈａｐｌｏｐｅｌｍａ  ｄｏｒｉａｅ、Ｈａｐｌｏｐｅｌｍａ  ｈａｉｎａｎｕｍ、Ｈａｐｌｏｐｅｌｍａ  ｌｉｖｉｄｕｍ、Ｈａｐｌｏｐｅｌｍａ  ｌｏｎｇｉｐｅｓ、Ｈａｐｌｏｐｅｌｍａ  ｍｉｎａｘ、Ｈａｐｌｏｐｅｌｍａ  ｒｏｂｕｓｔｕｍ、Ｈａｐｌｏｐｅｌｍａ  ｓａｌａｎｇｅｎｓｅ、Ｈａｐｌｏｐｅｌｍａ  ｓｃｈｍｉｄｔｉ及びＨａｐｌｏｐｅｌｍａ  ｖｏｎｗｉｒｔｈｉを含むＯｒｎｉｔｈｏｃｔｏｎｉｎａｅ亜科Ｈａｐｌｏｐｅｌｍａ属のタランチュラが挙げられるが、これらに限定されない。さらにそのほかの好適な種には、Ｇｒａｍｍａｓｔｏｌａ  ａｃｔａｅｏｎ、Ｇｒａｍｍａｓｔｏｌａ  ａｌｔｉｃｅｐｓ、Ｇｒａｍｍａｓｔｏｌａ  ａｎｄｒｅｌｅｅｔｚｉ、Ｇｒａｍｍａｓｔｏｌａ  ｐｕｌｃｈｒｉｐｅｓ、Ｇｒａｍｍａｓｔｏｌａ  ｂｕｒｚａｑｕｅｎｓｉｓ、Ｇｒａｍｍａｓｔｏｌａ  ｃｈａｌｃｏｔｈｒｉｘ、Ｇｒａｍｍａｓｔｏｌａ  ｄｏｅｒｉｎｇｉ、Ｇｒａｍｍａｓｔｏｌａ  ｆｏｓｓｏｒ、Ｇｒａｍｍａｓｔｏｌａ  ｇｏｓｓｅｉ、Ｇｒａｍｍａｓｔｏｌａ  ｇｒｏｓｓａ、Ｇｒａｍｍａｓｔｏｌａ  ｉｈｅｒｉｎｇｉ、Ｇｒａｍｍａｓｔｏｌａ  ｉｎｅｒｍｉｓ、Ｇｒａｍｍａｓｔｏｌａ  ｍｅｎｄｏｚａｅ、Ｇｒａｍｍａｓｔｏｌａ  ｍｏｌｌｉｃｏｍａ、Ｇｒａｍｍａｓｔｏｌａ  ｍｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｇｒａｍｍａｓｔｏｌａ  ｐｏｒｔｅｒｉ  Ｇｒａｍｍａｓｔｏｌａ  ｐｕｌｃｈｒａ、Ｇｒａｍｍａｓｔｏｌａ  ｒｏｓｅａ、Ｇｒａｍｍａｓｔｏｌａ  ｓｃｈｕｌｚｅｉ、Ｇｒａｍｍａｓｔｏｌａ  ｓｐａｔｕｌａｔａ、及びＧｒａｍｍａｓｔｏｌａ  ｖａｃｈｏｎｉを含むＴｈｅｒａｐｈｏｓｉｎａｅ亜科ｇｒａｍｍｏｓｔｏｌａ属のタランチュラが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
Ｇｒａｍｍｏｓｔｏｌａ  ｒｏｓｅａの分類に関してＧｒａｍｍｏｓｔｏｌａ  ｒｏｓｅａはたとえば、茶色又は赤色として分類されてもよいことが理解されるべきである。赤色のＧｒａｍｍｏｓｔｏｌａ  ｒｏｓｅａはＰｈｒｉｘｏｔｒｉｃｈｕｓ  ａｕｒａｔｕｓ及びＰａｒａｐｈｙｓａ  ｓｃｒｏｆａとしても知られ、赤色Ｇｒａｍｍｏｓｔｏｌａ（ＲＭＧ）と呼ばれてもよい。茶色のＧｒａｍｍｏｓｔｏｌａ  ｒｏｓｅａはＧｒａｍｍｏｓｔｏｌａ  ｐｏｔｅｒｉ及びＧｒａｍｍｏｓｔｏｌａ  ｓｐａｔｕｌａｔａとしても知られ、茶色Ｇｒａｍｍｏｓｔｏｌａ（ＲＭＧ）と呼ばれてもよい。また、少なくとも２つの追加の種又は色のＧｒａｍｍｏｓｔｏｌａ  ｒｏｓｅａは、一方がコンセピオンからのものであり、他方はチリ北部からのものである。
【００５６】
特に好適なタランチュラの種には、Ｐｔｅｒｉｎｏｃｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ、Ｕｓａｍｂａｒａ（Ｐｓｐ）、Ｈａｐｌｏｐｅｌｍａ  Ｌｉｖｉｄｕｍ（Ｈｖ）及びＲｅｄ  Ｍｏｒｐｈ  Ｇｒａｍｍｏｓｔｏｌａ（ＲＭＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
本明細書で言及される濃度範囲、比率範囲又は比範囲は、特に指示されない限り、その範囲及び分画の範囲内の整数の濃度、比率又は比、たとえば、整数の１／３及び１／１００を含むように理解されるべきである。
【００５８】
たとえば、ポリマーのサブユニット、サイズ又は厚さのような物理的特徴に関する、本明細書で言及される数範囲は、特に指示されない限り、言及された範囲内の整数を含むように理解されるべきである。
【００５９】
用語「ａ」及び「ａｎ」は本明細書の上記及びどこかで使用されるとき、「１以上の」数えられる成分を指すことが理解されるべきである。特に言及されない限り、単数の使用が複数を含むことは当業者に明らかであろう。従って、用語「ａ」、「ａｎ」及び「少なくとも１」は、本出願では相互交換可能に使用される。
【００６０】
出願の全体を通して、種々の実施形態の記載は、言語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」を使用するが、特別な場合によっては、言語「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ」又は「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ」を用いて代わりに実施形態を説明することができることが当業者によって理解されるであろう。
【００６１】
本教示のより良い理解の目的で及び本教示の範囲を全く限定しない目的で、特に指示されない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される量、比率又は割合、及びそのほかの数的な値を表す数はすべて、あらゆる場合、用語「約」によって修飾されると理解されるべきである。従って、反対に指示されない限り、以下の明細書及び添付の特許請求の範囲で言及される数的パラメータは、得られるように求められる所望の特性によって変化してもよい近似である。最低限、各数的パラメータは、報告された有意な数字の数の観点で、通常の四捨五入法を適用して少なくとも解釈されるべきである。
【００６２】
他の用語は本明細書で使用されるとき、当該技術で周知の意味によって定義されることとする。
ＩＩ．クモ毒ペプチドを単離する方法
【００６３】
本願記載の単離されたクモ毒ペプチドは粗精製のクモ毒から単離することができる。特に、粗精製の毒を精製して本願記載の単離されたペプチドを入手する方法は、粗精製のクモ毒を遠心して遠心した毒を得ることと、遠心したクモ毒を濾過して濾過したクモ毒を得ることと、濾過したクモ毒をゲル濾過カラムに負荷することと、カラムを溶出して単離されたペプチドを含有する分画を得ることを含むことができ、又はそれらから成ることができ、単離されたペプチドは陽イオン交換クロマトグラフィ及び／又はＨＰＬＣクロマトグラフィを用いてさらに精製することができる。
粗精製の毒は、１以上の新鮮な毒、凍結保存した毒又は凍結乾燥した粗精製の毒であってもよい。粗精製の毒、たとえば、凍結乾燥した毒は、たとえば、約１０，０００〜約１６，０００ｒｐｍ又は約１３，０００ｒｐｍにて、たとえば、約２〜約１５分間、又は約７分間で、緩衝液、たとえば、ｐＨ約６．０の１００ｍＭのＡｍＡｃ（緩衝液Ａ）に溶解することができる。たとえば、膜フィルター、たとえば、０．２２μｍのフィルターを介して上清を任意でさらに濾過することができる。その後、予備洗浄したゲル濾過カラム、たとえば、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−３０に上清又は濾液を負荷することができる。カラム容量（ｃｖ）の約２倍の緩衝液Ａにてカラムを予備洗浄することができ、次いで試料を注入する。実行パラメータには、たとえば、０．８ｍｌ／分、７ｍｌ／分画で２ｃｖの緩衝液Ａによって試料を流すことが含まれる。次いで分画を引き出し、膜フィルター、たとえば、０．２２μｍのフィルターを介して任意で再び濾過することができる。その後、逆相ＨＰＬＣを用いて、たとえば、溶媒、０．１％ＴＦＡ中５％ＡＣＮ（Ａ）と移動相、たとえば、０．１％ＴＦＡ中６０％ＡＣＮ（Ｂ）を含む段階勾配によって溶出して、得られた試料をさらに任意で精製することができる。段階は、３ｃｖについて０〜３０％のＢ、１０ｃｖについて３０〜５５％のＢ、０．５ｍｌ／分画及び２ｃｖについて５５〜１００％のＢであり得る。本願記載のペプチドは２番目の段階で溶出される。実行パラメータは、緩衝液０．１％ＴＦＡ中５％〜６０％のＣＡＮであり得る。３区分勾配：０％−３０％−５５％−１００％、０．５ｍｌ／分画、１ｍｌ／分。
ＩＩＩ．クモ毒ペプチドを合成する方法
【００６４】
本願記載のペプチドは化学合成によって調製することができ、又は組換えＤＮＡ技術を用いて製造してもよい。化学合成によって本発明のペプチドを調製するには、公知の方法を使用してもよく、たとえば、本発明のペプチドは、アジド、酸塩化物、酸無水物、化合物酸無水物、ＤＣＣ、活性化エステル、Ｗｏｏｄｗａｒｄの試薬Ｋ、カルボニルイミダゾール、脱酸化、ＤＣＣ／ＨＯＮＢ、ＢＯＰ試薬を用いる方法によって得ることができる（たとえば、Ｂｏｚａｎｓｚｋｙ，  Ｍ  ａｎｄ  Ｍ．  Ａ．  Ｏｎｄｅｔｔｉ，  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９６６）；  Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ａｎｄ  Ｌｕｅｂｋｅ，  Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９６５）；  Ｆ．  Ｍ．  Ｆｉｎｎ  ａｎｄ  Ｋ．  Ｈｏｆｉｎａｎｎ，  Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｖｏｌ．  ２，  Ｈ．  Ｎｅｎｒａｔｈ，  Ｒ．  Ｌ．  Ｈｉｌｌ  ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９７６）；  Ｎｏｂｕｏ  Ｉｚｕｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｇｏｓｅｉ  ｎｏ  Ｋｉｓｏ  ｔｏ  Ｊｉｋｋｅｎ  （Ｂａｓｉｃｓ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），  Ｍａｒｕｚｅｎ  Ｃｏ．  （１９８５）；  Ｈａｒｕａｋｉ  Ｙａｊｉｍａ  ａｎｄ  Ｓｈｕｎｐｅｉ  Ｓａｋａｋｉｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｉｋａｇａｋｕ  Ｊｉｋｋｅｎ  Ｋｏｚａ  （Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）  １，  Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｅｄ．，  Ｔｏｋｙｏ  Ｋａｇａｋｕ  Ｄｏｊｉｎ  Ｃｏ．  （１９７７）；  Ｔｏｓｈｉｙａ  Ｋｉｍｕｒａ，  Ｚｏｋｕ  Ｓｅｉｋａｇａｋｕ  Ｊｉｋｋｅｎ  Ｋｏｚａ  （Ｓｅｑｕｅｌ  ｔｏ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）  ２，  Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｅｄ．，  Ｔｏｋｙｏ  Ｋａｇａｋｕ  Ｄｏｊｉｎ  Ｃｏ．  （１９８７）を参照）。さらに、本願記載のペプチドは、自動ペプチド合成機（たとえば、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｏ．）を用いる化学合成によって調製することができる。本願記載のペプチドの合成及び再折り畳み手順についてＢｕｌａｊ，Ｇら（２００６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５，７４０４に記載されたもののような方法も使用することができる。
【００６５】
さらに、反応の完了に続いて、本願記載のペプチドを公知の精製法によって精製し、分離することができる。たとえば、本発明のペプチドは、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィ、液体クロマトグラフィ、再結晶化などの組み合わせによって精製し、分離することができる。本願記載の、上記方法によって得られるペプチドが遊離の形態である場合、公知の方法を用いてそれを塩の形態に変換することができ、それに対して、ペプチドが塩の形態で得られる場合、公知の方法を用いてそれを遊離の形態に変換することができる。
【００６６】
加えて、大腸菌における組換え発現系を用いて、特異的な酵素、たとえば、エンテロキナーゼやＴＥＶの切断部位を持つ融合タンパク質（ＴＲＸ又はＧＳＴ）として本願記載のペプチドを発現させてもよい。次に、細菌を破壊し、遠心し、得られた液が融合タンパク質を含有する。次いで特異的なアフィニティカラム、たとえば、溶出されるＮｉ２＋カラム又はグルタチオンカラムに融合タンパク質を負荷することができる。溶出の後、精製した融合タンパク質を特異的な酵素切断反応に供する。次いで、ＨＰＬＣ又はイオン交換クロマトグラフィによってペプチドを精製する。
ＩＶ．ほかの生物学的な方法
【００６７】
従来の及び分析的な化学的技法、分子生物学的技法及び細胞生物学的技法を含む方法を本明細書で記載する。そのような技法は一般に当該技術で既知であり、たとえば、Ｃｌａｓｓｉｃｓ  ｉｎ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔａｒｇｅｔｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｋ．Ｃ．Ｎｉｃｏｌａｏｕ及びＥ．Ｊ．Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＶＣＨ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６；Ｔｈｅ  Ｌｏｇｉｃ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｅ．Ｊ．Ｃｏｎｅｙ及びＸｕｅ−Ｍｉｎ  Ｃｈｅｎｇ，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，１９８９；並びにＮＭＲ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｕｔｈｒｉｃｈ，Ｋ．，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８６のような方法論の論文で詳細に記載されている。分子生物学的な方法及び細胞生物学的な方法は、  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版、１〜３巻、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１；及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２（定期的に更新される）のような論文に記載されている。
Ｖ．クモ毒ペプチドを含む医薬組成物
製剤
【００６８】
本願記載の医薬組成物は、非経口、局所又は直腸で投与することができる。それらは当然、各投与経路に好適な形態で提供される。たとえば、それらは、注射、吸入、軟膏、座薬など、注射、点滴又は吸入による投与、ローション又は軟膏による局所投与、及び座薬による直腸投与によって投与される。
【００６９】
語句「非経口投与」及び「非経口で投与される」は、本明細書で使用されるとき、腸内投与及び局所投与以外の普通、注射による投与の方式を意味し、それには限定しないで、静脈内、筋肉内、動脈内、クモ膜下、関節包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、関節包下、クモ膜下、髄腔内、及び胸骨内の注射及び注入が挙げられる。
【００７０】
語句「全身性投与」「全身性に投与される」、「末梢性投与」及び「末梢性に投与される」は、本明細書で使用されるとき、化合物、薬剤又はそのほかの物質の中枢神経系への直接投与ではなく、それが患者の系に入るので代謝等の過程に供されるように投与すること、たとえば、皮下投与を意味する。
【００７１】
追加の賦形剤に関する一般的な製剤化の手順及び情報の詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版に見つけられ得る。
【００７２】
治療を必要とする対象に、有効量の本明細書に記載されるペプチドを含有する組成物を投与することができる。組成物は、非経口で、静脈内に、局所で、経口で、頬内に、鼻内に、直腸内に、皮下に、筋肉内に、又は腹腔内に投与することができる。一実施では、たとえば、脳脊髄液に組成物を注射することができる。
【００７３】
治療の組成物は投与経路に適合するように製剤化されてもよい。組成物は、錠剤、カプセル剤、溶液、粉剤、吸入剤、ローション、チンキ剤、トローチ、座薬、又は経皮貼付剤として製剤化することができる。たとえば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（１９６３），  ５２：９１８以下参照を参照のこと。
【００７４】
非経口、経皮又は皮下の投与のための溶液は、たとえば、水、生理食塩水、グリセリン、不揮発性油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール又はそのほかの合成溶媒のような無菌の希釈剤；たとえば、ベンジルアルコール及びメチルパラベンのような抗菌剤；たとえば、アスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤；キレート剤；たとえば、酢酸塩又はリン酸塩のような緩衝剤を含んでもよい。溶液は、アンプル、使い捨てシリンジ、又はプラスチック若しくはガラスのバイアルに保存することができる。
【００７５】
注射又は静脈内投与のための製剤は、溶媒又は分散媒であるキャリアを含むことができる。好適なキャリアには、水、生理的生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、エタノール、ポリオール類（たとえば、グリセロール、グリコール、プロピレングリコールなど）及びこれらの混合物が挙げられる。これらの組成物は、無菌であり、注射できる流体でなければならない。レシチン又は界面活性剤のようなコーティングによって流動性を維持することができる。たとえば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸及びチメロサールのような抗菌剤及び抗真菌剤を含めることによって微生物の混入を防ぐことができる。糖類及びマンニトールやソルビトールのような多価アルコール、塩化ナトリウムを用いて組成物における等張性を維持することができる。
溶液のフィルター無菌化によって無菌性を保証することができる。或いは、個々にフィルター無菌化した成分から溶液を製造することができる。フィルター無菌化した成分を真空乾燥し、又は凍結乾燥して無菌粉末を製造することができる。注射に先立って、無菌のキャリア溶液によってそのような粉末を再水和することができる。
【００７６】
経口組成物には、たとえば、錠剤、カプセル剤、トローチ、懸濁剤及び溶液が含まれる。不活性希釈剤又は食用キャリアと共に組成物を作出してもよい。カプセル剤は、適当な希釈剤をペプチド又はその製剤と混ぜ合わせ、カプセルに混合物を充填することによって製剤化することができる。一般的な希釈剤は、たとえば、粉末化セルロースのようなデンプン又はスクロース、フルクトース若しくはマンニトールのような糖類である。錠剤は、湿式若しくは乾式の造粒によって、圧縮によって又はそのほかの既知の方法によって作製してもよい。所望のペプチド／化合物に加えて、錠剤用の組成物は、たとえば、微細結晶セルロースのような結合剤、又はゼラチン；たとえば、デンプンのような賦形剤；糖（たとえば、ラクトース、フルクトース、グルコース、メチルセルロース、エチルセルロース）；ゴム（たとえば、ゴムトラガカント、アカシアゴム）；崩壊剤（たとえば、アルギン酸、プリモゲル、若しくはコーンスターチ）；潤滑剤（たとえば、ステアリン酸マグネシウム、若しくはステロート）；流動促進剤（たとえば、コロイド状二酸化珪素）；甘味剤（たとえば、スクロース若しくはサッカリン）；香味剤（たとえば、ペパーミント、サリチル酸メチル、若しくはオレンジ風味）；又は類似の性質の任意の化合物を含むことができる。たとえば、ポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド又はポリグリコリドのような生分解性ポリマーをマトリクスとして用いて組成物の放出を遅らせることができる（たとえば、米国特許第５，４１７，９８６号、同第４，６７５，３８１号及び同第４，４５０，１５０号を参照）。
【００７７】
吸入による投与については、たとえば、好適な高圧ガス、たとえば、気体を含有する加圧容器の分配器からのエアゾール噴霧の形態で、又はそのほかの既知の方法によって化合物を送達してもよい。たとえば、投与は、たとえば、鼻内スプレー若しくは座薬によって経粘膜であることができ、又はたとえば、軟膏、軟膏、ジェル若しくはクリームのような経皮手段によることもできる。そのような投与方式は、たとえば、胆汁塩及びフシジン酸誘導体を含む製剤を使用することができる。
投与方式
【００７８】
本明細書に記載されるペプチドは、たとえば、ボーラス注射によって、たとえば、硬膜外領域との接触を長引かせるように持続点滴によって、又はほかの既知の方法によって投与することができる。任意の時間、ペプチドを注入することができる。特定の対象の必要性に従って、たとえば、疼痛を治療するための標準的な臨床プロトコールの枠組みの範囲内で投与の投与量及びタイミングを修正することができる。クモ膜下経路によって及び血流の中にペプチドを送達することもできる。加えて、埋め込み可能な又は生体搭載可能なポンプを用いて本明細書に記載されるペプチドを制御された速度で送達することができる。或いは、長期間投与は、技術で既知のデポー製剤又は徐放性製剤によって達成することができる。
投与量
【００７９】
治療に適切な投与量を決定しなければならない。阻害剤の有効量は、対象における脊髄性筋萎縮症状を改善するのに必要とされる量又は用量である。個々の対象を治療するのに必要とされる量又は用量の決定は当業者、たとえば、内科医、薬剤師又は研究者にとって日常的なことである。
【００８０】
ペプチド及び／又はペプチド製剤の毒性及び治療有効性も決定されてもよい。非ヒト動物にてＬＤ５０（集団の５０％までの致死用量）及びＥＤ５０（集団の５０％における治療上有効な量）を決定するために日常的なプロトコールを利用することができる。ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として治療指数を測定する。好適な比には、たとえば、約２、５、１０、５０又は１００を超える比が挙げられる。そのような治療は高い有効性を提供する投与量では毒性をほとんど有さないので、高い治療指数の化合物、製剤及び投与法を決定することができる。冒されていない組織、たとえば、内皮組織への損傷をできるだけ抑える一方で、冒された組織に化合物を送達する手段が利用可能であれば、毒性効果又は望ましくない副作用を伴った化合物を使用することができる。
【００８１】
ヒトでの使用について投与量範囲を定式化することにおいて、ペプチド調製物の有効用量は、以下に記載するように実験動物による試験から推定することができる。たとえば、細胞培養アッセイにおける治療上有効な投与量には、たとえば、約０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ又は１０μＭのペプチド及びその間の範囲のペプチドが含まれる。この範囲に入る阻害剤の循環血漿濃度を達成するために動物にて用量を定式化することができる。例となる用量は、細胞培養アッセイで測定するとき、ＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量の抑制を達成する試験化合物の濃度）を超える血漿濃度を生じる。たとえば、血液試料を得ることと、抗体に基づく特異的なＥＬＩＳＡアッセイを用いて又は高速液体クロマトグラフィ若しくは質量分光分析法によって試料を解析することによって循環血漿濃度を決定することができる。
【００８２】
或いは、以下に記載するような動物モデルでの試験から用量を推定することができる。少なくとも１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ以上の用量でラットがペプチド又は医薬組成物を受け取った場合、症状の緩和が認められる。たとえば、用量は、１０μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、８０μｇ／ｋｇ、１２０μｇ／ｋｇ、１８０μｇ／ｋｇ、２４０μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、３６０μｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇであってもよい。動物とヒトについての投与量（体表面の平方メートル当たりのミリグラムに基づく）の相互関係は、たとえば、Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐ．１９６６，５０，２１９によって記載されている。体表面積は、患者の身長と体重から近似的に決定され得る。たとえば、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｔａｂｌｅｓ，Ｇｅｉｇｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ａｒｄｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７０，５３７を参照のこと。治療しているヒト患者の有効量は、ほぼ少なくとも３μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、１２０μｇ／ｋｇ、１８０μｇ／ｋｇ，２４０μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、又は５００μｇ／ｋｇであると推定される。対象における疼痛を軽減するのに有効な局所濃度を維持するためにペプチドをある頻度で又は連続的に投与することができる。
【００８３】
投与の方法に応じて、適切な用量は、たとえば、約１μｇ／ｋｇ／日から約１０ｍｇ／ｋｇ／日まで変化し得る。患者にとっての用量は、患者が内科医、薬剤師又は研究者のケアのもとにいる間に最適化される。たとえば、相対的に低い用量の記載されるペプチドが当初投与され得る。以下に記載されるように疼痛の症状と感覚について患者をモニターすることができる。適切な応答が得られるまで用量を高めることができる。加えて、特定の対象についての具体的な用量レベルは、対象の年齢、体重、全身状態、性別及び食生活、投与の時間、投与経路、排泄率、及び併用で提供されるそのほかの薬剤によって変化し得る。
実施例
方法
【００８４】
粗精製毒のゲル濾過
Ｐｔｅｒｉｎｏｃｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．Ｕｓａｍｂａｒａ、Ｈａｐｌｏｐｅｌｍａ  Ｌｉｖｉｄｕｍ及びＲｅｄ  Ｍｏｒｐｈ  Ｇｒａｍｍｏｓｔｏｌａのクモ毒は米国アリゾナ州のＳｐｉｄｅｒｐｈａｒｍから購入した。Ｓｐｉｄｅｒｐｈａｒｍから購入した凍結乾燥した粗精製毒（Ｎａｎｏｄｒｏｐによってタンパク質含量について各バッチも測定した）１００ｍｇを２．５ｍｌの緩衝液Ａ（１００ｍＭのＡｍＡｃ、ｐＨ６．０）に溶解し、１３，０００ｒｐｍで７分間遠心し、０．２２μｍのセルロースアセテート膜フィルターを介して濾過し、次いでＡＫＴＡプライムシステム（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてＸＫカラム２６／７０（コード番号：５６８７６９００：ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）に詰めたＳｕｐｅｒｄｅｘ−３０分取用ゲル濾過媒体（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）に負荷した。カラム容量（ｃｖ）の２倍の緩衝液Ａでカラムを予備洗浄し、試料ループを用いて試料を注入した。
実行パラメータ：緩衝液Ａ＝１００ｍＭのＡｍＡｃ、ｐＨ６．０、０．８ｍｌ／分にて２ｃｖ、７ｍ／分画で試料を流した。
【００８５】
そのほかのクロマトグラフィ手順
陽イオン交換法及びＨＰＬＣの手順は図１〜６の説明に詳細に記載する。
【００８６】
質量分光分析
シナピン酸マトリクスを用いて製造元のプロトコールによって調製されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  Ｍ．Ｓ．（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｖｏｙａｇｅｒ  Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ−ＤＥ，Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）。
【００８７】
ペプチドの配列決定
精製したペプチドを次いで配列決定に供したが、それには以下が含まれた
・ドイツのＰｒｏｔｅｏｍｅ  Ｆａｃｔｏｒｙ及び／又はスイスのＡｔｈｅｒｉｓによって実行された天然ペプチドのＥｄｍａｎ配列決定。
・ドイツのＰｒｏｔｅｏｍｅ  Ｆａｃｔｏｒｙ及び／又はスイスのＡｔｈｅｒｉｓによって実行された天然ペプチドのＭＳ−ＭＳ解析。
・天然ペプチドの酵素的切断と断片のＨＰＬＣによる分離。
・ドイツのＰｒｏｔｅｏｍｅ  Ｆａｃｔｏｒｙ及び／又はスイスのＡｔｈｅｒｉｓによって実行された断片のＥｄｍａｎ配列決定。
・米国カリフォルニア州、カリフォルニア大学デービス校で実行された天然ペプチドのアミノ酸解析。
・ドイツのＰｒｏｔｅｏｍｅ  Ｆａｃｔｏｒｙ及び／又はスイスのＡｔｈｅｒｉｓによって実行されたモノアイソトピックＬＣ−ＭＳ解析。
【００８８】
細胞培養
ラットのＤＲＧニューロン：３週齢のチャールズリバーラットから、後根神経節（ＤＲＧ）に由来するニューロンの一次培養物を回収した。コラゲナーゼ／ディスパーゼでの酵素消化によってＤＲＧを調製し、トリプシンにて分離し、磨いたパスツールピペットを介して粉々にして単一細胞浮遊液にした。パーコール勾配を用いて細胞を精製し、ニューロンの培養物を濃縮した。次いで、マトリゲル（登録商標）で被覆したカバースリップ上で２４穴組織培養プレートにそれらを入れ、５０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦと１０ｍＭのＡｒａＣの存在下でＦ−１２培地と１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）にて３７℃で培養した。次いで、培養したＤＲＧを調製後２４時間から４日間、電気生理学的検討に用いることができる。
【００８９】
マウスＥＳ細胞由来の心筋細胞：一次神経型細胞を代表し、一次心筋細胞の典型的な特性と特徴を示す遺伝子操作したマウス胚性幹細胞に由来するＣｏｒ．Ａｔ（登録商標）使用準備済みの心筋細胞を製造元の指示書に従って使用した。手短には、細胞を融解し、ピューロマイシンを含有するＣｏｒ．Ａｔ（登録商標）培地中で０．１％ゼラチン又は０．１％ゼラチン／フィブロネクチンを被覆したカバースリップに別々に４８時間付着させ、次いで培地をＣｏｒ．Ａｔ（登録商標）培地に交換した。４日後１週間以内に細胞を電気生理学的検討に用いた。
【００９０】
ｒＮａｖ１．３チャンネルは記載された（Ｃｕｍｍｉｎｓ，  Ｔ．    Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．    ２００１）ようにＨＥＫ−２９３細胞で発現された。
【００９１】
チャンネルにおけるｒＮａｖ１．８は、記載された（Ｚｈｏｕ，  Ｘ．，  ｅｔ  ａｌ．    ２００３；  Ｊｏｈｎ，  Ｖ．    Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．    ２００４；  Ｊａｒｖｉｓ，  Ｍ．    Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．    ２００７；  Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．    ２００７）ように従来の一過性の又は安定的な形質転換を用いてＮＤ７−２３細胞にて発現された。
【００９２】
Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞におけるｈＮａｖ１．３。ＲＮＡを合成し、Ｘｅｎｏｐｕｓの卵母細胞に注入し（卵母細胞当たり約１０ｎｇ）、３日後、二電極電圧クランプ法（Ｄａｓｃａｌ  １９８７）を用いて内向き電流を記録した。
【００９３】
ｈＫｖ１１．１（ｈＥＲＧ）は記載された（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．    １９９８）ようにＨＥＫ−２９３細胞で発現された。
【００９４】
電気生理学プロトコール
パッチクランプ法（Ｈａｍｉｌ  ｅｔ  ａｌ．    １９８１）を用いて、２、３の細胞種についてイオン電流又は膜電圧を追跡し、記録した。これらには、天然の細胞又はモデル細胞と同様に組換えチャンネルを過剰発現する非相同の発現系が含まれた。活性を追跡するのに使用した溶液及び電圧プロトコールを表１に示す。パッチクランプの記録ではすべて、サンプリングレートは１０〜５０ｋＨｚ（２０〜１００μｓ間隔）だった。設定したパッチクランプには、増幅器及びデジタイザー（Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ，ＤＩＧＤＡＴＡ１３２２Ａ−  Ａｘｏｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  ＥＣＬＩＰＳＥ１００）及び極微操作装置（ＭＰ−２２５−ＳＵＴＴＥＲ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴ  Ｃｏ）が含まれた。ホウケイ酸ガラスチューブ（ＳＵＴＴＥＲ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴ  Ｃｏ）からピペットを引いた。細胞は常に対照の細胞外液と共に精査され、試薬を含有する溶液への変更は、ＶａｌｖｅＬｉｎｋ１６（Ａｕｔｏｍａｔｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）とペリスタポンプ（Ｉｉｓｍａｔｅｃ）潅流システムを用いて実施した。Ａｌｏｍｏｎｅ（Ｉｓｒａｅｌ）から購入したＴＴＸ、ｒＢｅＫＭ−１は別にして、試薬はすべてＳｉｇｍａから購入した。
【００９５】
Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞における電流は、浴ＮＤ９６溶液、Ｇｅｎｅｌａｍｐ及びＤｉｇｉｄａｔａ１３２０（Ａｘｏｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）及び手動（重力に基づく）潅流システムを用いて記録した。
【００９６】
【表１】
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実施例１
粗精製毒からのペプチドの精製及び化学的性状分析
【００９７】
２，３の異なったクロマトグラフィ工程を用いてペプチドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦをＰｔｅｒｉｎｏｃｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ、Ｕｓａｍｂａｒａ（Ｐｓｐ）、Ｈａｐｌｏｐｅｌｍａ  Ｌｉｖｉｄｕｍ（Ｈｖ）及びＲｅｄ  Ｍｏｒｐｈ  Ｇｒａｍｍｏｓｔｏｌａ（ＲＭＧ）のクモ毒から単離した（図１〜６を参照）。
Ｐｓｐ毒からのペプチドＡのクロマトグラフィ精製
【００９８】
方法の節で記載された手順に従って、１００ｍｇの凍結乾燥した粗精製毒（Ｎａｎｏｄｒｏｐによる１１０ｍｇ）をゲル濾過カラムに負荷した。
【００９９】
分画（Ｎｏ．３２〜３６）をプールし、０．２２μｍのセルロースアセテートフィルターを介して濾過し、次いで、ＨＰＬＣシステム（ＡＫＴＡ  ｐｕｒｉｆｉｅｒ，ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いた、溶液Ａ（０．１％ＴＦＡ中５％ＡＣＮ）で予め平衡化したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ逆相ＨＰＬＣカラム（５ｕ，Ｃ１８，３００Ａ，２５０ｘ４．６ｍｍ，００Ｇ−４０５３−ＥＯ，Ｓ／Ｎｏ３９７２７４−１０）に試料の１／４を負荷した。溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡ中５％ＡＣＮ）と移動相としての０．１％ＴＦＡ中６０％ＡＣＮ（溶媒Ｂ）を用いた一工程勾配及び１ｍｌ／分の一定流速での実行によってタンパク質を溶出した。工程は、３ｃｖ（１ｃｖは約４．１２５ｍｌ）について０〜３０％のＢ、１０ｃｖについて３０〜５５％のＢ、０．５ｍｌ／分画及び２ｃｖについて５５〜１００％のＢである。関連するペプチドは第２工程で溶出する。同じ手順を試料の残りについて実施した（＝４逐次実行）。実行パラメータ：緩衝液０．１％ＴＦＡ中の５〜６０％のＡＣＮ、３区分勾配：０％〜３０％〜５５％〜１００％、０．５ｍｌ／分画、１ｍｌ／分。
Ｐｓｐ毒からのペプチドＢのクロマトグラフィ精製
【０１００】
方法で記載されたような手順に従って、１００ｍｇの凍結乾燥した粗精製毒（Ｎａｎｏｄｒｏｐによる１１０ｍｇ）をゲル濾過カラムに負荷した。
【０１０１】
分画Ｎｏ．３７〜４０をプールし、Ｎｏ．４１〜４３をプールし、さらにプールした分画それぞれを０．２２μｍのフィルターで濾過し、ＡＫＴＡプライムシステム（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いたＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ５ｍｌ陽イオン交換カラム（ＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ；Ｌｏｔ：１０００５３８３−３）に負荷した。カラムは緩衝液Ｂ（２５ｍＭの酢酸アンモニウムと１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）で予め活性化し、緩衝液Ａ（２５ｍＭの酢酸アンモニウムｐＨ６．０と１０ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄した。１ｍｌ／分の流速、３ｍｌ／分画の一工程勾配によって分離を実施した。工程は、３０ｃｖについて０％のＡと５０％のＢ（Ａ＝２５ｍＭの酢酸アンモニウムと１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０、Ｂ＝２５ｍＭの酢酸アンモニウムと１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０、１ｃｖ＝５ｍｌ）、１０ｃｖについて５０−５０％Ｂ、４ｃｖについて５０−１００％Ｂである。関連するペプチドは第１工程に溶出する。実行パラメータ：２５ｍＭのＡｍＡｃ、ｐＨ６．０及び１０ｍＭ〜１ＭのＮａＣｌ、３０ｃｖについて０〜５０％Ｂの勾配、１ｍｌ／分、３ｍｌ／分画。
【０１０２】
ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムからの関連するピークを０．２２μｍのフィルターで濾過し、溶液Ａ（０．１％ＴＦＡ中５％ＡＣＮ）で予め平衡化したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ逆相ＨＰＬＣカラム（５ｕ，Ｃ１８，３００Ａ，２５０ｘ４．６ｍｍ，００Ｇ−４０５３−ＥＯ，Ｓ／Ｎｏ３９７２７４−１０）を用いた各２回の逐次実行（ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ上で、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）でのＨＰＬＣによるさらなる精製に供した。溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡ中５％ＡＣＮ）と移動相としての０．１％ＴＦＡ中６０％ＡＣＮ（溶媒Ｂ）を用いた一工程勾配及び１ｍｌ／分の一定流速での実行によってペプチドを溶出した。工程は、３ｃｖ（１ｃｖは約４．１２５ｍｌ）について０〜３０％のＢ、１０ｃｖについて３０〜５５％のＢ、０．５ｍｌ／分画及び２ｃｖについて５５〜１００％のＢである。関連するペプチドは第２工程で溶出する。実行パラメータ：緩衝液：０．１％ＴＦＡ中の５〜６０％のＡＣＮ、３区分勾配：０％〜３０％〜５５％〜１００％、０．５ｍｌ／分画、１ｍｌ／分。
Ｈｖ毒からのペプチドＣのクロマトグラフィ精製
【０１０３】
方法で記載されたような手順（上記参照）に従って、１００ｍｇの凍結乾燥した粗精製毒（Ｎａｎｏｄｒｏｐによる５５ｍｇ）をゲル濾過カラムに負荷した。
【０１０４】
ゲル濾過の後の凍結乾燥したピークを二重蒸留水（ＤＤＷ）に溶解し、０．２２μｍのフィルターで濾過し、ＡＫＴＡプライムシステム（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いたＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ５ｍｌ陽イオン交換カラム（ＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ；Ｌｏｔ：１０００５３８３−３）に負荷した。カラムは緩衝液Ｂ（２５ｍＭの酢酸アンモニウムと１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）で予め活性化し、緩衝液Ａ（２５ｍＭの酢酸アンモニウムｐＨ６．０と１０ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄した。１ｍｌ／分の流速、３ｍｌ／分画での一工程勾配によって分離を実施した。工程は、３０ｃｖについて０％のＡと５０％のＢ（Ａ＝２５ｍＭの酢酸アンモニウムと１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０、Ｂ＝２５ｍＭの酢酸アンモニウムと１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０、１ｃｖ＝５ｍｌ）、１０ｃｖについて５０−５０％Ｂ、４ｃｖについて５０−１００％Ｂである。実行パラメータ：２５ｍＭのＡｍＡｃ、ｐＨ６．０及び１０ｍＭ〜１ＭのＮａＣｌ、３０ｃｖについて０〜５０％Ｂの勾配、１ｍｌ／分、３ｍｌ／分画。
【０１０５】
ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムからの活性ピークを、溶液Ａ（０．１％ＴＦＡ中５％ＡＣＮ）で予め平衡化したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ逆相ＨＰＬＣカラム（５ｕ，Ｃ１８，３００Ａ，２５０ｘ４．６ｍｍ，００Ｇ−４０５３−ＥＯ，Ｓ／Ｎｏ３９７２７４−１０）を用いたＨＰＬＣ（ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ上で、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）によるさらなる精製に供した。溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡ中５％ＡＣＮ）と移動相としての０．１％ＴＦＡ中６０％ＡＣＮ（溶媒Ｂ）を用いた一工程勾配及び１ｍｌ／分の一定流速での実行によってペプチドを溶出した。工程は、２ｃｖ（１ｃｖ約２０ｍｌ）について０〜２８％のＢ、８ｃｖについて２８〜４７％のＢ、０．５ｍｌ／分画、及び２ｃｖについて４７〜１００％のＢである。関連するペプチドは第２工程で溶出する。実行パラメータ：緩衝液：０．１％ＴＦＡ中の５〜６０％のＡＣＮ、３区分勾配：０％〜２８％〜４７％〜１００％、０．５ｍｌ／分画、１ｍｌ／分。
Ｈｖ毒からのペプチドＤのクロマトグラフィ精製
【０１０６】
１００ｍｇの凍結乾燥した粗精製毒（Ｎａｎｏｄｒｏｐによる５５ｍｇ）をゲル濾過カラムに負荷し、方法で記載されたような手順に従って処理した。
【０１０７】
ゲル濾過後の凍結乾燥したピークをＤＤＷに溶解し、０．２２μｍのフィルターで濾過し、ＡＫＴＡプライムシステム（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いたＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ５ｍｌ陽イオン交換カラム（ＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ；Ｌｏｔ：１０００５３８３−３）に負荷した。カラムは緩衝液Ｂ（２５ｍＭの酢酸アンモニウムと１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）で予め活性化し、緩衝液Ａ（２５ｍＭの酢酸アンモニウムｐＨ６．０と１０ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄した。１ｍｌ／分の流速、３ｍｌ／分画での一工程勾配によって分離を実施した。工程は、３０ｃｖについて０％のＡと５０％のＢ（Ａ＝２５ｍＭの酢酸アンモニウムと１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０、Ｂ＝２５ｍＭの酢酸アンモニウムと１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０、１ｃｖ＝５ｍｌ）、１０ｃｖについて５０−５０％Ｂ、４ｃｖについて５０−１００％Ｂである。実行パラメータ：２５ｍＭのＡｍＡｃ、ｐＨ６．０及び１０ｍＭ〜１ＭのＮａＣｌ、３０ｃｖについて０〜５０％Ｂの勾配、１ｍｌ／分、３ｍｌ／分画。
【０１０８】
ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムからの活性ピークを、溶液Ａ（０．１％ＴＦＡ中５％ＡＣＮ）で予め平衡化したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ逆相ＨＰＬＣカラム（５ｕ，Ｃ１８，３００Ａ，２５０ｘ４．６ｍｍ，００Ｇ−４０５３−ＥＯ，Ｓ／Ｎｏ３９７２７４−１０）を用いたＨＰＬＣ（ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ上で、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）によるさらなる精製に供した。溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡ中５％ＡＣＮ）と移動相としての０．１％ＴＦＡ中６０％ＡＣＮ（Ｂ）を用いた一工程勾配及び１ｍｌ／分の一定流速での実行によってペプチドを溶出した。工程は、２ｃｖ（１ｃｖ約２０ｍｌ）について０〜２８％のＢ、８ｃｖについて２８〜４７％のＢ、０．５ｍｌ／分画、及び２ｃｖについて４７〜１００％のＢである。関連するペプチドは第２工程で溶出する。実行パラメータ：緩衝液：０．１％ＴＦＡ中の５〜６０％のＡＣＮ、３区分勾配：０％〜２８％〜４７％〜１００％、０．５ｍｌ／分画、１ｍｌ／分。
ＲＭＧ毒からのペプチドＥのクロマトグラフィ精製
【０１０９】
１００ｍｇの凍結乾燥した粗精製毒（Ｎａｎｏｄｒｏｐによる１５０ｍｇ）をゲル濾過カラムに負荷し、方法で記載されたような手順に従って処理した。
【０１１０】
ＨＰＬＣシステム（ＡＫＴＡ  ｐｕｒｉｆｉｅｒ，ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いた、溶液Ａ（０．１％ＴＦＡ中５％ＡＣＮ）で予め平衡化したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ逆相ＨＰＬＣカラム（Ｃ１８、１０ｕ、３００Ａ，２５０ｘ１０ｍｍ，００Ｇ−４０５５−ＮＯ，Ｓ／Ｎｏ．３７８１５９−１）に分画Ｎｏ．３７〜３８を負荷した。溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡ中５％ＡＣＮ）と移動相としての０．１％ＴＦＡ中６０％ＡＣＮ（緩衝液Ｂ）を用いた一工程勾配及び２．５ｍｌ／分の一定流速での実行によってタンパク質を溶出した。工程は、３ｃｖ（１ｃｖ約２０ｍｌ）について０〜３５％のＢ、６ｃｖについて３５〜３８％のＢ、及び２ｃｖについて３８〜１００％のＢである。関連するペプチドは第２工程で溶出する。最終的に、分画Ｎｏ．３７〜３８からの関連するピークをプールし、さらなる分離のために凍結乾燥した。実行パラメータ：緩衝液：０．１％ＴＦＡ中の５〜６０％のＡＣＮ、３区分勾配：０％〜３５％〜３８％〜１００％、２ｍｌ／分画、２．５ｍｌ／分。
【０１１１】
凍結乾燥したピークをＤＤＷに溶解し、０．２２μｍのフィルターで濾過し、ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｕｅｒシステム（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いたＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ５ｍｌ陽イオン交換カラム（ＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ；Ｌｏｔ：１０００５３８３−３）に負荷した。カラムは緩衝液Ｂ（２５ｍＭの酢酸アンモニウムと１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）で予め活性化し、緩衝液Ａ（２５ｍＭの酢酸アンモニウムｐＨ６．０と１０ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄した。１ｍｌ／分の流速、０．５ｍｌ／分画での一工程勾配によって分離を実施した。工程は、３０ｃｖについて０％のＡと５０％のＢ（Ａ＝２５ｍＭの酢酸アンモニウムと１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０、Ｂ＝２５ｍＭの酢酸アンモニウムと１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０、１ｃｖ＝１ｍｌ）、１０ｃｖについて５０−５０％Ｂ、４ｃｖについて５０−１００％Ｂである。関連するペプチドは第１工程で溶出する。実行パラメータ：２５ｍＭのＡｍＡｃ、ｐＨ６．０及び１０ｍＭ〜１ＭのＮａＣｌ、３０ｃｖについて０〜５０％Ｂの勾配、１ｍｌ／分、３ｍｌ／分画。
【０１１２】
ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムからの活性ピークを、溶液Ａ（０．１％ＴＦＡ中５％ＡＣＮ）で予め平衡化したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ逆相ＨＰＬＣカラム（Ｃ１８、１０ｕ、３００Ａ，２５０ｘ１０ｍｍ，００Ｇ−４０５５−ＮＯ，Ｓ／Ｎｏ．３７８１５９−１）を用いたＨＰＬＣ（ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ上で、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）によるさらなる精製に供した。溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡ中５％ＡＣＮ）と移動相としての０．１％ＴＦＡ中６０％ＡＣＮを用いた一工程勾配及び１ｍｌ／分の一定流速での実行によってペプチドを溶出した。工程は、３ｃｖ（１ｃｖ約２０ｍｌ）について０〜３０％のＢ、６ｃｖについて３０〜５５％のＢ、０．５ｍｌ／分画、及び２ｃｖについて５５〜１００％のＢである。関連するペプチドは第２工程で溶出する。実行パラメータ：緩衝液：０．１％ＴＦＡ中の５〜６０％のＡＣＮ、３区分勾配：０％〜３０％〜５５％〜１００％、０．５ｍｌ／分画、１ｍｌ／分。
ＲＭＧ毒からのペプチドＦのクロマトグラフィ精製
【０１１３】
１００ｍｇの凍結乾燥した粗精製毒（Ｎａｎｏｄｒｏｐによる１５０ｍｇ）をゲル濾過カラムに負荷し、方法で記載されたような手順に従って処理した。
【０１１４】
凍結乾燥したピークをＤＤＷに溶解し、０．２２μｍのフィルターで濾過し、ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｕｅｒシステム（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いたＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ５ｍｌ陽イオン交換カラム（ＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ；Ｌｏｔ：１０００５３８３−３）に負荷した。カラムは緩衝液Ｂ（２５ｍＭの酢酸アンモニウムと１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）で予め活性化し、緩衝液Ａ（２５ｍＭの酢酸アンモニウムｐＨ６．０と１０ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄した。１ｍｌ／分の流速、０．５ｍｌ／分画での一工程勾配によって分離を実施した。工程は、３０ｃｖについて０％のＡと５０％のＢ（Ａ＝２５ｍＭの酢酸アンモニウムと１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０、Ｂ＝２５ｍＭの酢酸アンモニウムと１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０、１ｃｖ＝１ｍｌ）、１０ｃｖについて５０−５０％Ｂ、４ｃｖについて５０−１００％Ｂである。関連するペプチドは第１工程で溶出する。実行パラメータ：２５ｍＭのＡｍＡｃ、ｐＨ６．０及び１０ｍＭ〜１ＭのＮａＣｌ、３０ｃｖについて０〜５０％Ｂの勾配、１ｍｌ／分、３ｍｌ／分画。
【０１１５】
ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムからの活性ピークを、溶液Ａ（０．１％ＴＦＡ中５％ＡＣＮ）で予め平衡化したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ逆相ＨＰＬＣカラム（Ｃ１８、１０ｕ、３００Ａ，２５０ｘ１０ｍｍ，００Ｇ−４０５５−ＮＯ，Ｓ／Ｎｏ．３７８１５９−１）を用いたＨＰＬＣ（ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ上で、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）によるさらなる精製に供した。溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡ中５％ＡＣＮ）と移動相としての０．１％ＴＦＡ中６０％ＡＣＮ（緩衝液Ｂ）を用いた一工程勾配及び２．５ｍｌ／分の一定流速での実行によってペプチドを溶出した。工程は、３ｃｖ（１ｃｖ約２０ｍｌ）について０〜３５％のＢ、１５ｃｖについて３５〜５５％のＢ、１．５ｍｌ／分画、及び２ｃｖについて５５〜１００％のＢである。関連するペプチドは第２工程で溶出する。実行パラメータ：緩衝液：０．１％ＴＦＡ中の５〜６０％のＡＣＮ、３区分勾配：０％〜３５％〜５５％〜１００％、１．５ｍｌ／分画、２．５ｍｌ／分。
【０１１６】
得られたペプチドの質量及び配列を表２に要約する
【表２】
0005555891.tif 000003
【０１１７】
６種のペプチドはすべてＮ末端側からの外見の順に従って気付く、その配列にて６つのシステインを含有する。ペプチドすべてについての天然の試料及び還元試料のＭＳ解析によってシステイン対間の３つのジスルフィド結合の存在が確認された。対のシステイン結合の順は、ほかの多数のタランチュラ毒素に対する類似性から推定され、おそらく以下の順：Ｃ１−Ｃ４、Ｃ２−Ｃ５及びＣ３−Ｃ６である（概説については、Ｅｓｃｏｕｂａｓ，  Ｆ．  ａｎｄ  Ｒａｓｈ，  Ｌ．，  ２００４を参照）。加えて、ペプチドＡ、Ｂ、Ｄ及びＥはそのＣ末端でアミド化されている。
実施例２
合成ペプチドの再折り畳み
【０１１８】
Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，Ｍら（１９９２）  Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＢＯＣ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｔ．Ｊ．  Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４０，１８０−１９３及びＡｔｈｅｒｔｏｎ，Ｅら、（１９８９）Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．）に従って、ＢＯＣ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）又はＦｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）の固相ペプチド合成を用いた化学合成による固相合成法によってペプチドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦを合成で製造し、７０〜９５％の純度で凍結乾燥粉末として提供した。次いで各ペプチドを以下に記載するような様々な再折り畳み法に供し、正しい折り畳みと、毒から精製された天然ペプチドと同一の生物活性を達成した。
ペプチドＡの再折り畳み
【０１１９】
粗精製した合成ペプチドをタンパク質濃度５ｍＭにて０．１Ｍのトリス緩衝液ｐＨ８．５に溶解し、次いで室温（ＲＴ）にて１時間、２０ｍＭのＤＴＴによって還元した。０．１Ｍのトリス緩衝液ｐＨ８．５及び０．５ｍＭシステインと０．５ｍＭシスチンの混合物を含有する折り畳み溶液に最終濃度２５μＭで還元ペプチドを加えた。システイン／シスチン緩衝液系を用いて４℃にて８日間、再折り畳みと正しいジスルフィド結合パターンの形成を達成した。
【０１２０】
０．１％ＴＦＡでの６０％のＣＨ３ＣＮの２６％〜５３％の３１．５分間の勾配を用いて（５ｍｌ／分）、半分取Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ、２５０ｘ１０ｍｍ、１０ミクロン、３００Ａ）における逆相ＨＰＬＣによって再折り畳み合成毒素を精製した。ペプチドＡの再折り畳みは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光分析及びバイオアッセイによって確認した。
【０１２１】
合成ペプチドＡと元々の天然ペプチド試料のクロマトグラフィでの比較については、折り畳み還元したペプチドを分析用Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｋｉｎｅｔｅｘ、５０ｘ４．６ｍｍ、２．６ミクロン、１００Ａ）を用いた逆相ＨＰＬＣ（島津システム）によって精製した。逆相ＨＰＬＣ解析は、５％〜６０％のＣＨ３ＣＮの１０分間の線形勾配（２．５ｍｌ／分）によって達成した（図１３を参照）。
ペプチドＢの再折り畳み
【０１２２】
粗精製の合成ペプチドをタンパク質濃度１．１ｍＭで６ＭのＧｎＨＣｌ（塩酸グアニジン）と０．１Ｍのトリス緩衝液ｐＨ９．５に溶解し、次いでＲＴにて１．５時間２０ｍＭのＤＴＴで還元した。０．１Ｍのトリス緩衝液ｐＨ９．５と０．１５ｍＭのシステイン及び１．５ｍＭのシスチンの混合物を含有する折り畳み溶液に還元したペプチドを２７．５μＭの最終濃度で加えた。４℃にて１日間、システイン／シスチン緩衝液系を用いて再折り畳みと正しいジスルフィド結合パターンの形成を達成した。
【０１２３】
０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中６０％ＣＨ３ＣＮの３０％〜５５％の２６．１８分間の勾配を用いて（６ｍｌ／分）、半分取Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ、２５０ｘ１０ｍｍ、１０ミクロン、３００Ａ）における逆相ＨＰＬＣによって再折り畳み合成毒素を精製した。ペプチドＢの再折り畳みは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光分析及びバイオアッセイによって確認した。
【０１２４】
合成ペプチドＢと元々の天然ペプチド試料のクロマトグラフィでの比較については、折り畳み還元したペプチドを分析用Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｋｉｎｅｔｅｘ、５０ｘ４．６ｍｍ、２．６ミクロン、１００Ａ）を用いた逆相ＨＰＬＣ（島津システム）によって精製した。逆相ＨＰＬＣ解析は、５％〜６０％のＣＨ３ＣＮの１０分間の線形勾配（２．５ｍｌ／分）によって達成した（図１４を参照）。
ペプチドＣの再折り畳み
【０１２５】
粗精製の合成ペプチドをタンパク質濃度１０．６ｍＭで６ＭのＧｎＨＣｌ（塩酸グアニジン）と０．１Ｍのトリス緩衝液ｐＨ９．５に溶解し、次いでＲＴにて１時間２０ｍＭのＤＴＴで還元した。０．１Ｍのトリス緩衝液ｐＨ７．５と０．１５ｍＭのシステイン及び１．５ｍＭのシスチンの混合物を含有する折り畳み溶液に還元したペプチドを２５．５μＭの最終濃度で加えた。４℃にて５日間、システイン／シスチン緩衝液系を用いて再折り畳みと正しいジスルフィド結合パターンの形成を達成した。
【０１２６】
０．１％のＴＦＡ中６０％ＣＨ３ＣＮの２２％〜４５％の２６．１８分間の勾配を用いて（６ｍｌ／分）、半分取Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ、２５０ｘ１０ｍｍ、１０ミクロン、３００Ａ）における逆相ＨＰＬＣによって再折り畳み合成毒素を精製した。ペプチドＣの再折り畳みは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光分析及びバイオアッセイによって確認した。
【０１２７】
合成ペプチドＣと元々の天然ペプチド試料のクロマトグラフィでの比較については、折り畳み還元したペプチドを分析用Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｋｉｎｅｔｅｘ、５０ｘ４．６ｍｍ、２．６ミクロン、１００Ａ）を用いた逆相ＨＰＬＣ（島津システム）によって精製した。逆相ＨＰＬＣ解析は、５％〜６０％のＣＨ３ＣＮの１０分間の線形勾配（２．５ｍｌ／分）によって達成した（図１５を参照）。
ペプチドＤの再折り畳み
【０１２８】
粗精製の合成ペプチドをタンパク質濃度２４ｍＭで０．１Ｍのトリス緩衝液ｐＨ７．５に溶解し、次いでＲＴにて１時間２０ｍＭのＤＴＴで還元した。０．１Ｍのトリス緩衝液ｐＨ７．５と１．５ｍＭのシステイン及び０．１５ｍＭのシスチンの混合物を含有する折り畳み溶液に還元したペプチドを１３．５μＭの最終濃度で加えた。４℃にて４日間、システイン／シスチン緩衝液系を用いて再折り畳みと正しいジスルフィド結合パターンの形成を達成した。
【０１２９】
０．１％のＴＦＡ中６０％ＣＨ３ＣＮの２５％〜５５％の３５分間の勾配を用いて（４．５ｍｌ／分）、半分取Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ、２５０ｘ１０ｍｍ、１０ミクロン、３００Ａ）における逆相ＨＰＬＣによって再折り畳み合成毒素を精製した。ペプチドＤの再折り畳みは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光分析及びバイオアッセイによって確認した。
【０１３０】
合成ペプチドＤと元々の天然ペプチド試料のクロマトグラフィでの比較については、折り畳み還元したペプチドを分析用Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｋｉｎｅｔｅｘ、５０ｘ４．６ｍｍ、２．６ミクロン、１００Ａ）を用いた逆相ＨＰＬＣ（島津システム）によって精製した。逆相ＨＰＬＣ解析は、５％〜６０％のＣＨ３ＣＮの１０分間の線形勾配（２．５ｍｌ／分）によって達成した（図１６を参照）。
ペプチドＥの再折り畳み
【０１３１】
粗精製の合成ペプチドをタンパク質濃度６ｍＭで０．１Ｍのトリス緩衝液ｐＨ７．５に溶解し、次いでＲＴにて１時間２０ｍＭのＤＴＴで還元した。０．１Ｍのトリス緩衝液ｐＨ７．５と０．１５ｍＭのシステイン及び１．５ｍＭのシスチンの混合物を含有する折り畳み溶液に還元したペプチドを２４．５μＭの最終濃度で加えた。４℃にて２日間、システイン／シスチン緩衝液系を用いて再折り畳みと正しいジスルフィド結合パターンの形成を達成した。
【０１３２】
０．１％のＴＦＡ中６０％ＣＨ３ＣＮの２３％〜４５％の３５分間の勾配を用いて（６ｍｌ／分）、半分取用Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ、２５０ｘ１０ｍｍ、１０ミクロン、３００Ａ）における逆相ＨＰＬＣによって再折り畳み合成毒素を精製した。ペプチドＥの再折り畳みは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光分析及びバイオアッセイによって確認した。
【０１３３】
合成ＢＳ−０７と元々の天然ペプチド試料のクロマトグラフィでの比較については、折り畳み還元したペプチドを分析用Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｋｉｎｅｔｅｘ、５０ｘ４．６ｍｍ、２．６ミクロン、１００Ａ）を用いた逆相ＨＰＬＣ（島津システム）によって精製した。逆相ＨＰＬＣ解析は、５％〜６０％のＣＨ３ＣＮの１０分間の線形勾配（２．５ｍｌ／分）によって達成した（図１７を参照）。
ペプチドＦの再折り畳み
【０１３４】
粗精製のペプチドを秤量し、水に溶解し、２８０ｎｍで測定した。
【０１３５】
２０ｍＭの最終濃度で加え、ＲＴで１時間インキュベートするＤＴＴによってペプチドの還元を行った。
【０１３６】
１ｍＭのグルタチオン（ＧＳＨ）と０．１ｍＭの酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）と１ｍＭのＥＤＴＡを含有する２ＭのＮＨ４ＯＡｃ緩衝液（ｐＨ＝７．０）における酸化的折り畳み反応に還元ペプチドＦを供した。最終濃度１０μＭになるように６回に分けて一滴ずつ還元ペプチドを溶液に加えた。溶液を２４℃にて１２０時間撹拌した。
【０１３７】
逆相ＨＰＬＣとさらなるイオン交換クロマトグラフィを含む３工程精製法によって再折り畳みした物質を精製した。
【０１３８】
溶離液として６０％ＣＨ３ＣＮを含有する０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液を用いた４０分間の線形勾配による（２９〜３８％）ＪｕｐｉｔｅｒＣ１８カラムを用いて逆相ＨＰＬＣ精製を行った。ピーク分画をプールし、凍結乾燥した。２５％のＣＨ３ＣＮを含有するリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ＝２．５）における７００ｍＭ塩化カリウムの２５分間の線形勾配（５０〜７０％）によるＬｕｎａＳＣＸカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィによって過剰な混入物を除いた。６０％ＣＨ３ＣＮの３０〜５０％の２０分間線形勾配を用いた脱塩用のＪｕｐｉｔｅｒＣ１８カラムにピーク分画をもう一度負荷した。ピーク分画を凍結乾燥し、ＭＳ、分析用ＨＰＬＣ及びバイオアッセイによる分析によって性状分析した（図１８を参照）。
実施例３
単離した純粋なペプチドの試験管内での生物活性
【０１３９】
ＴＴＸ感受性Ｎａｖ１．３チャンネルとＴＴＸ耐性Ｎａｖ１．８チャンネルに対する遮断活性を調べた。これらのそれぞれを哺乳類細胞株で安定的に発現させ、好適な電圧刺激によってチャンネル電流を誘発した。毒素の浴潅流の前、最中（高い用量であることが多い）及び後でのこれらの電流を測定することによって毒素の活性を調べた。各毒素の用量にて阻害された電流の分画を少なくとも３回の別々の細胞で測定し、平均値±ＳＤをプロットする。
【０１４０】
ペプチドＡは、それぞれ１．７５μＭと２．５μＭの見かけのＩＣ５０でＮａｖ１．３とＮａｖ１．８の双方のチャンネルを阻害した。
ペプチドＢは、２３０ｎＭの見かけのＩＣ５０でＮａｖ１．３チャンネルを阻害した。
ペプチドＣは、１．２μＭの見かけのＩＣ５０でＮａｖ１．３チャンネルを阻害した。
ペプチドＤは、１６０ｎＭの見かけのＩＣ５０でＮａｖ１．３チャンネルを阻害した。
ペプチドＥは、３１０ｎＭの見かけのＩＣ５０でＮａｖ１．３チャンネルを阻害した。
ペプチドＦは、それぞれ１３０ｎＭと１７０ｎＭの見かけのＩＣ５０でＮａｖ１．３とＮａｖ１．８の双方のチャンネルを阻害した。
【０１４１】
活動電位（ＤＲＧニューロン膜におけるＮａｖチャンネルの開放によって生成される）の形態でそれを脊髄に伝達する後根神経節（ＤＧＲ）ニューロンによって末梢の疼痛刺激は感知される。末梢の神経障害では、疼痛シグナルは、多分、その膜上に発現されるＮａｖチャンネルの異なったレパートリーが原因で、損傷されたＤＲＧニューロンの固有の活動電位の興奮によって生成される。ＤＲＧニューロンにおいてＮａｖを遮断することは活動電位の生成及び疼痛シグナルの伝達を阻害することが想定されている。従って、我々はラットのＤＲＧニューロンにおける活動電位を記録し、毒素が一工程のさらなる標的確認としてそれを阻害するかどうかを調べた。ペプチドＡ（５μＭ）、Ｂ（０．７μＭ）、Ｃ（５μＭ）、Ｄ（０．７５μＭ）、Ｅ（０．８３μＭ）及びＦ（１μＭ）は、Ｎａｖ１．３チャンネルについて見られるＩＣ５０よりも高い用量でＤＲＧの活動電位を阻害した（図７〜１２）。調べた細胞すべてにおいてペプチドの効果を６００ｎＭのＴＴＸの効果と比較した（図７〜１２パネルＦ、Ｇを参照）。
【０１４２】
２つの追加の試験管内の系を用いて試験管内の安全性試験の測定と同様に毒性活性の特異性を調べた。
【０１４３】
第１は、ヒト心臓Ｋｖ１１．１（ｈＥＲＧ）チャンネルを非相同に発現している細胞におけるＫ＋電流の測定である。Ｎａｖ１．３で測定されたＩＣ５０と、このＩＣ５０の３倍と１０倍である各ペプチドの３つの用量を用いた。調べた最高の用量でもペプチドＡ、Ｃ、Ｅ及びＦは効果を示さなかった。ペプチドＢとＤは双方とも、２５％の阻害効果を示したが、それは調べた最高の用量のみで見られた。
【０１４４】
第２の系は、マウスの胚性幹（ＥＳ）細胞に由来する心筋細胞における活動電位の自然に発生する興奮であった。これらの活動電位は多数のイオンチャンネルのアンサンブル活性によって自然発生的に生成される。そのような系における毒素の効果は、少なくとも心臓の副作用に関して推定上の生体内の安全性と同様に特異性（心臓の活動電位の生成が心臓のＮａｖ１．５イオンチャンネルのアイソフォームに依存しているとき）の双方を示す。陽性対照として、調べた細胞すべてにおいてＴＴＸを低濃度（３００〜６００ｎＭ）と高濃度（３μＭ）で潅流した。一般に、高い用量だけがこれらの細胞における活動電位の生成を阻害した（たとえば、図９Ｈ及び１１Ｈを参照）。ペプチドＡ（３．８μＭ）、Ｂ（９μＭ）、Ｃ（５μＭ）、Ｄ（０．７５μＭ）、Ｅ（０．８３μＭ）及びＦ（１μＭ）は、これらの細胞における活動電位の周波数及び振幅に対して効果を有さなかった（又はペプチドＢ及びＦについては約２０％阻害の非常に軽微な効果を有した）（図７〜１２、パネルＨ、Ｉ）。
【０１４５】
各ペプチドについて試験すべての結果を表３と図７〜１２に要約する。
【０１４６】
図１Ａ及び図１Ｂに示すように、ペプチドＡはＰｔｅｒｉｎｏｃｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．Ｕｓａｍｂａｒａ  ｖｅｎｏｍ（Ｐｓｐ）からクロマトグラフィ精製によって得ることができる。
【０１４７】
図２Ａ，２Ｂ及び２Ｃに示す、ペプチドＢはＰｓｐ毒からクロマトグラフィ精製によって得ることができる。
【０１４８】
図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃに示すように、ペプチドＣは、Ｈａｐｌｏｐｅｌｍａ  ｌｉｖｉｄｕｍの毒（Ｈｖ）からクロマトグラフィ精製によって得ることができる。
【０１４９】
図４Ａ，４Ｂ、及び４Ｃに示す、ペプチドＤはＨｖからクロマトグラフィ精製によって得ることができる。
【０１５０】
図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ及び５Ｄに示すように、ペプチドＥは、Ｒｅｄ  Ｍｏｒｐｈ  Ｇｒａｍｍｏｓｔｏｌａ（ＲＭＧ）の毒からクロマトグラフィ精製によって得ることができる。
【０１５１】
図６Ａ，６Ｂ及び６Ｃに示す、ペプチドＦはＲＭＧの毒からクロマトグラフィ精製によって得ることができる。
【０１５２】
図７Ａ〜ＩはペプチドＡの試験管内の活性を示す。
【０１５３】
図７Ａは、２μＭの純粋なペプチドＡの浴潅流の前及び最中の電圧ランプの刺激（方法を参照）に対するｒＮａｖ１．３チャンネルの応答の重ね合わせた痕跡の例を示す。図７Ａ〜７Ｄのそれぞれに示すように、対照の濃度は黒線で表し、浴潅流の前に測定する。それに対して灰色の線は浴潅流の間に測定した電圧を表す。
【０１５４】
図７Ｂは、３．４μＭの純粋なペプチドＡの浴潅流の前及び最中の電圧ランプの刺激（方法を参照）に対するｈＮａｖ１．３チャンネル（Ｘｅｎｏｐｕｓの卵母細胞で発現される）の応答の重ね合わせた痕跡の例を示す。
【０１５５】
図７Ｃは、２μＭの純粋なペプチドＡの浴潅流の前及び最中の電圧ランプの刺激（方法を参照）に対するｒＮａｖ１．８チャンネルの応答の重ね合わせた痕跡の例を示す。
【０１５６】
図７Ｄは、５．２５μＭの純粋なペプチドＡの浴潅流の前及び最中の電圧ステップの刺激（方法を参照）に対するｈＫｖ１１．１（ｈＥＲＧ）チャンネルの応答の重ね合わせた痕跡の例を示す。図７Ｄはまた、確立したｈＥＲＧブロッカー（２００ｎＭのＢｅＫＭ−１）の浴潅流に対する応答も示す。応答は細い黒線で示される。
【０１５７】
図７Ｅは、各チャンネル（挿入における記号）についての少なくとも３回の実験を要約した用量反応曲線を示す。見かけのＩＣ５０を表３に提供する。
【０１５８】
図７Ｆは、急性的に分離したラットのＤＲＧニューロンにおける電流刺激に対する電圧応答の重ね合わせた痕跡の例を示す。６００ｎＭのＴＴＸの浴潅流の間、及び５μＭのペプチドＡの浴潅流の間、痕跡は対照の条件下にある。図７Ｆに示すように、太い黒線は対照条件下での応答を表し、細い黒線は６００ｎＭのＴＴＸの浴潅流の間の応答を表し、灰色の線は５μＭのペプチドＡの浴潅流の間の応答を表す。
【０１５９】
図７Ｇは、図７Ｆに記載した条件などでの幾つかの実験を要約する棒グラフを示す。
【０１６０】
図７Ｈは、マウス胚性幹細胞に由来する心筋細胞（ｍＥＳ−ＣＭ）において記録された膜電圧の連続痕跡の例を示す。活動電位は自然発生的に及び規則的に興奮させられ、その周波数及び振幅を以下のグラフにプロットする。棒は示した濃度での化合物の浴潅流の期間を表す。
【０１６１】
図７Ｉは、３．７５μＭのペプチドＡ及び３μＭのＴＴＸの効果がＡＰ周波数に影響を及ぼした幾つかの実験を要約する棒グラフを示す。
【０１６２】
図８Ａ〜ＩはペプチドＢの試験管内の活性を示す。
【０１６３】
図８Ａは、０．５μＭの純粋なペプチドＢの浴潅流の前と最中での電圧ランプの刺激（方法を参照）に対するｒＮａｖ１．３チャンネルの応答の重ね合わせた痕跡の例を示す。図８Ａ〜８Ｄのそれぞれに示すように対照濃度は黒線で表し、浴潅流の前に測定する。それに対して灰色の線は浴潅流の間に測定した電圧を表す。
【０１６４】
図８Ｂは、０．５μＭの純粋なペプチドＢの浴潅流の前及び最中の電圧ランプの刺激（方法を参照）に対するｈＮａｖ１．３チャンネル（Ｘｅｎｏｐｕｓの卵母細胞で発現される）の応答の重ね合わせた痕跡の例を示す。
【０１６５】
図８Ｃは、０．７μＭの純粋なペプチドＢの浴潅流の前及び最中の電圧ランプの刺激（方法を参照）に対するｒＮａｖ１．８チャンネルの応答の重ね合わせた痕跡の例を示す。
【０１６６】
図８Ｄは、１．５μＭの純粋なペプチドＢの浴潅流の前及び最中の電圧ステップの刺激（方法を参照）に対するｈＫｖ１１．１（ｈＥＲＧ）チャンネルの応答の重ね合わせた痕跡の例を示す。図８Ｄはまた、細い黒線で示されるように、確立したｈＥＲＧブロッカー（２００ｎＭのＢｅＫＭ−１）の浴潅流の間の応答も示す。
【０１６７】
図８Ｅは、各チャンネル（挿入における記号）についての少なくとも３回の実験を要約した用量反応曲線を示す。見かけのＩＣ５０を表３に提供する。
【０１６８】
図８Ｆは、急性的に分離したラットのＤＲＧニューロンにおける電流刺激に対する電圧応答の重ね合わせた痕跡の例を示す。６００ｎＭのＴＴＸの浴潅流の間、及び０．７μＭのペプチドＢの浴潅流の間、痕跡は対照の条件下にある。図８Ｆに示すように、太い黒線は対照条件下での応答を表し、細い黒線は６００ｎＭのＴＴＸの浴潅流の間の応答を表し、灰色の線は０．７μＭのペプチドＢの浴潅流の間の応答を表す。
【０１６９】
図８Ｇは、図８Ｆに記載した条件などでの幾つかの実験を要約している棒グラフを示す。
【０１７０】
図８Ｈは、マウス胚性幹細胞に由来する心筋細胞（ｍＥＳ−ＣＭ）において記録された膜電圧の連続痕跡の例を示す。活動電位は自然発生的に及び規則的に興奮させられ、その周波数及び振幅を以下のグラフにプロットする。棒は示した濃度での化合物の浴潅流の期間を表す。
【０１７１】
図８Ｉは、９μＭのペプチドＢ及び３μＭのＴＴＸの効果がＡＰ周波数に影響を及ぼした幾つかの実験を要約する棒グラフを示す。
【０１７２】
図９Ａ〜ＩはペプチドＣの試験管内の活性を示す。
【０１７３】
図９Ａは、１．２５μＭの純粋なペプチドＣの浴潅流の前と最中での電圧ランプの刺激（方法を参照）に対するｒＮａｖ１．３チャンネルの応答の重ね合わせた痕跡の例を示す。図９Ａ〜９Ｄのそれぞれに示すように対照濃度は黒線で表し、浴潅流の前に測定する。それに対して灰色の線は浴潅流の間に測定した電圧を表す。
【０１７４】
図９Ｂは、２．４μＭの純粋なペプチドＣの浴潅流の前及び最中の電圧ランプの刺激（方法を参照）に対するｈＮａｖ１．３チャンネル（Ｘｅｎｏｐｕｓの卵母細胞で発現される）の応答の重ね合わせた痕跡の例を示す。
【０１７５】
図９Ｃは、３．６μＭの純粋なペプチドＣの浴潅流の前及び最中の電圧ランプの刺激（方法を参照）に対するｒＮａｖ１．８チャンネルの応答の重ね合わせた痕跡の例を示す。
【０１７６】
図９Ｄは、４μＭの純粋なペプチドＣの浴潅流の前及び最中の電圧ステップの刺激（方法を参照）に対するｈＫｖ１１．１（ｈＥＲＧ）チャンネルの応答の重ね合わせた痕跡の例を示す。図９Ｄはまた、細い黒線で示されるように、確立したｈＥＲＧブロッカー（２００ｎＭのＢｅＫＭ−１）の浴潅流の間の応答も示す。
【０１７７】
図９Ｅは、各チャンネル（挿入における記号）についての少なくとも３回の実験を要約した用量反応曲線を示す。見かけのＩＣ５０を表３に提供する。
【０１７８】
図９Ｆは、急性的に分離したラットのＤＲＧニューロンにおける電流刺激に対する電圧応答の重ね合わせた痕跡の例を示す。３００ｎＭのＴＴＸの浴潅流の間、及び５μＭのペプチドＣの浴潅流の間、痕跡は対照の条件下にある。図９Ｆに示すように、太い黒線は対照条件下での応答を表し、細い黒線は３００ｎＭのＴＴＸの浴潅流の間の応答を表し、灰色の線は５μＭのペプチドＣの浴潅流の間の応答を表す。
【０１７９】
図９Ｇは、図９Ｆに記載した条件などでの幾つかの実験を要約している棒グラフを示す。
【０１８０】
図９Ｈは、マウス胚性幹細胞に由来する心筋細胞（ｍＥＳ−ＣＭ）において記録された膜電圧の連続痕跡の例を示す。活動電位は自然発生的に及び規則的に興奮させられ、その周波数及び振幅を以下のグラフにプロットする。棒は示した濃度での化合物の浴潅流の期間を表す。示されるように、低い濃度、すなわち３００ｎＭ及び高い濃度、すなわち３μＭ双方のＴＴＸの効果はこの調製では完全に明らかである。
【０１８１】
図９Ｉは、５μＭのペプチドＣ及び３μＭのＴＴＸの効果がＡＰ周波数に影響を及ぼした幾つかの実験を要約する棒グラフを示す。
【０１８２】
図１０Ａ〜ＩはペプチドＤの試験管内の活性を示す。
【０１８３】
図１０Ａは、０．１５μＭの純粋なペプチドＤの浴潅流の前と最中での電圧ランプの刺激（方法を参照）に対するｒＮａｖ１．３チャンネルの応答の重ね合わせた痕跡の例を示す。図１０Ａ〜１０Ｄのそれぞれに示すように対照濃度は黒線で表し、浴潅流の前に測定する。それに対して灰色の線は浴潅流の間に測定した電圧を表す。
【０１８４】
図１０Ｂは、０．５μＭの純粋なペプチドＤの浴潅流の前（黒色、対照）及び最中の電圧ランプの刺激（方法を参照）に対するｈＮａｖ１．３チャンネル（Ｘｅｎｏｐｕｓの卵母細胞で発現される）の応答の重ね合わせた痕跡の例を示す。
【０１８５】
図１０Ｃは、０．４８μＭの純粋なペプチドＤの浴潅流の前及び最中の電圧ランプの刺激（方法を参照）に対するｒＮａｖ１．８チャンネルの応答の重ね合わせた痕跡の例を示す。
【０１８６】
図１０Ｄは、１μＭの純粋なペプチドＤの浴潅流の前及び最中の電圧ステップの刺激（方法を参照）に対するｈＫｖ１１．１（ｈＥＲＧ）チャンネルの応答の重ね合わせた痕跡の例を示す。図１０Ｄはまた、細い黒線で示される、確立したｈＥＲＧブロッカー（２００ｎＭのＢｅＫＭ−１）の浴潅流の間の応答も示す。
【０１８７】
図１０Ｅは、各チャンネル（挿入における記号）についての少なくとも３回の実験を要約した用量反応曲線を示す。見かけのＩＣ５０を表３に提供する。
【０１８８】
図１０Ｆは、急性的に分離したラットのＤＲＧニューロンにおける電流刺激に対する電圧応答の重ね合わせた痕跡の例を示す。６００ｎＭのＴＴＸの浴潅流の間、及び０．７５μＭのペプチドＤの浴潅流の間、痕跡は対照の条件下にある。図１０Ｆに示すように、太い黒線は対照条件下での応答を表し、細い黒線は６００ｎＭのＴＴＸの浴潅流の間の応答を表し、灰色の線は０．７５μＭのペプチドＤの浴潅流の間の応答を表す。
【０１８９】
図１０Ｇは、図１０Ｆに記載した条件などでの幾つかの実験を要約している棒グラフを示す。
【０１９０】
図１０Ｈは、マウス胚性幹細胞に由来する心筋細胞（ｍＥＳ−ＣＭ）において記録された膜電圧の連続痕跡の例を示す。活動電位は自然発生的に及び規則的に興奮させられ、その周波数及び振幅を以下のグラフにプロットする。棒は示した濃度での化合物の浴潅流の期間を表す。
【０１９１】
図１０Ｉは、０．７５μＭのペプチドＤ及び３μＭのＴＴＸの効果がＡＰ周波数に影響を及ぼした幾つかの実験を要約する棒グラフを示す。
【０１９２】
図１１Ａ〜ＩはペプチドＥの試験管内の活性を示す。
【０１９３】
図１１Ａは、０．３μＭの純粋なペプチドＥの浴潅流の前と最中での電圧ランプの刺激（方法を参照）に対するｒＮａｖ１．３チャンネルの応答の重ね合わせた痕跡の例を示す。図１１Ａ〜１１Ｄのそれぞれに示すように対照濃度は黒線で表し、浴潅流の前に測定する。それに対して灰色の線は浴潅流の間に測定した電圧を表す。
【０１９４】
図１１Ｂは、０．９３μＭの純粋なペプチドＥの浴潅流の前及び最中の電圧ランプの刺激（方法を参照）に対するｈＮａｖ１．３チャンネル（Ｘｅｎｏｐｕｓの卵母細胞で発現される）の応答の重ね合わせた痕跡の例を示す。
【０１９５】
図１１Ｃは、０．９３μＭの純粋なペプチドＥの浴潅流の前及び最中の電圧ランプの刺激（方法を参照）に対するｒＮａｖ１．８チャンネルの応答の重ね合わせた痕跡の例を示す。
【０１９６】
図１１Ｄは、０．９３μＭの純粋なペプチドＥの浴潅流の前及び最中の電圧ステップの刺激（方法を参照）に対するｈＫｖ１１．１（ｈＥＲＧ）チャンネルの応答の重ね合わせた痕跡の例を示す。図１１Ｄはまた、細い黒線で示される、確立したｈＥＲＧブロッカー（２００ｎＭのＢｅＫＭ−１）の浴潅流の間の応答も示す。
【０１９７】
図１１Ｅは、各チャンネル（挿入における記号）についての少なくとも３回の実験を要約した用量反応曲線を示す。見かけのＩＣ５０を表３に提供する。
【０１９８】
図１１Ｆは、急性的に分離したラットのＤＲＧニューロンにおける電流刺激に対する電圧応答の重ね合わせた痕跡の例を示す。６００ｎＭのＴＴＸの浴潅流の間、及び０．８３μＭのペプチドＥの浴潅流の間（灰色、示した濃度）、痕跡は対照の条件下にある。図１１Ｆに示すように、太い黒線は対照条件下での応答を表し、細い黒線は６００ｎＭのＴＴＸの浴潅流の間の応答を表し、灰色の線は０．８３μＭのペプチドＥの浴潅流の間の応答を表す。
【０１９９】
図１１Ｇは、図１１Ｆに記載した条件などでの幾つかの実験を要約している棒グラフを示す。
【０２００】
図１１Ｈは、マウス胚性幹細胞に由来する心筋細胞（ｍＥＳ−ＣＭ）において記録された膜電圧の連続痕跡の例を示す。活動電位は自然発生的に及び規則的に興奮させられ、その周波数及び振幅を以下のグラフにプロットする。棒は示した濃度での化合物の浴潅流の期間を表す。
【０２０１】
図１１Ｉは、０．８３μＭのペプチドＥ及び３μＭのＴＴＸの効果がＡＰ周波数に影響を及ぼした幾つかの実験を要約する棒グラフを示す。
【０２０２】
図１２Ａ〜ＩはペプチドＦの試験管内の活性を示す。
【０２０３】
図１２Ａは、０．１μＭの純粋なペプチドＦの浴潅流の前と最中での電圧ランプの刺激（方法を参照）に対するｒＮａｖ１．３チャンネルの応答の重ね合わせた痕跡の例を示す。図１２Ａ〜１２Ｄのそれぞれに示すように対照濃度は黒線で表し、浴潅流の前に測定する。それに対して灰色の線は浴潅流の間に測定した電圧を表す。
【０２０４】
図１２Ｂは、０．５２μＭの純粋なペプチドＦの浴潅流の前及び最中の電圧ランプの刺激（方法を参照）に対するｈＮａｖ１．３チャンネル（Ｘｅｎｏｐｕｓの卵母細胞で発現される）の応答の重ね合わせた痕跡の例を示す。
【０２０５】
図１２Ｃは、０．５μＭの純粋なペプチドＦの浴潅流の前及び最中の電圧ランプの刺激（方法を参照）に対するｒＮａｖ１．８チャンネルの応答の重ね合わせた痕跡の例を示す。
【０２０６】
図１２Ｄは、０．９２μＭの純粋なペプチドＦの浴潅流の前及び最中の電圧ステップの刺激（方法を参照）に対するｈＫｖ１１．１（ｈＥＲＧ）チャンネルの応答の重ね合わせた痕跡の例を示す。図１２Ｄはまた、細い黒線で示される、確立したｈＥＲＧブロッカー（２００ｎＭのＢｅＫＭ−１）の浴潅流の間の応答も示す。
【０２０７】
図１２Ｅは、各チャンネル（挿入における記号）についての少なくとも３回の実験を要約した用量反応曲線を示す。見かけのＩＣ５０を表３に提供する。
【０２０８】
図１２Ｆは、急性的に分離したラットのＤＲＧニューロンにおける電流刺激に対する電圧応答の重ね合わせた痕跡の例を示す。６００ｎＭのＴＴＸの浴潅流の間、及び１μＭのペプチドＦの浴潅流の間、痕跡は対照の条件下にある。図１２Ｆに示すように、太い黒線は対照条件下での応答を表し、細い黒線は６００ｎＭのＴＴＸの浴潅流の間の応答を表し、灰色の線は１μＭのペプチドＦの浴潅流の間の応答を表す。
【０２０９】
図１２Ｇは、図１２Ｆに記載した条件などでの幾つかの実験を要約している棒グラフを示す。
【０２１０】
図１２Ｈは、マウス胚性幹細胞に由来する心筋細胞（ｍＥＳ−ＣＭ）において記録された膜電圧の連続痕跡の例を示す。活動電位は自然発生的に及び規則的に興奮させられ、その周波数及び振幅を以下のグラフにプロットする。棒は示した濃度での化合物の浴潅流の期間を表す。
【０２１１】
図１２Ｉは、１μＭのペプチドＦ及び３μＭのＴＴＸの効果がＡＰ周波数に影響を及ぼした幾つかの実験を要約する棒グラフを示す。
【０２１２】
【表３】
0005555891.tif 000004
【０２１３】
上記で提示したような６種のタランチュラ毒ペプチドの試験管内の活性は、神経因性疼痛の治療に対するペプチドの有効性及びそれらの推定上の心臓安全性の双方を示す。
【０２１４】
この適応における標的は、ＤＲＧ感覚ニューロンの中での電気的活性の伝達（活動電位の形態での）の阻害である。ＤＲＧニューロン内での活動電位の生成及び伝搬は、ＴＴＸ−感受性（とりわけＮａｖ１．３）のチャンネル及びＴＴＸ−耐性（主としてＮａｖ１．８）のチャンネルの活性化の双方に依存する（Ｄｅｖｏｒ，  ２００６；  Ｃｕｍｍｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．    ２００７）。従って、有効性は、標的チャンネルＮａｖ１．３（図７Ａ、Ｂ、Ｅ〜１２Ａ、Ｂ、Ｅ）及びＮａｖ１．８（図７Ｃ〜１２Ｆを参照）の電流に向かう、及びＤＲＧニューロンにおける誘発活動電位（図７Ｆ〜１２Ｆを参照）に向かう阻害作用から生じる。
【０２１５】
ペプチドＡ及びＦはＮａｖ１．３チャンネル及びＮａｖ１．８チャンネル双方の阻害剤である（図７Ｅ及び１２Ｅ）。最良のＮａｖ１チャンネルの標的との正確な同一性が完全には解明されていないので、このことは生体内で有利であり得る（Ｄｅｖｏｒ，  ２００６；  Ｃｕｍｍｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．    ２００７）。加えて、標的チャンネルを阻害することにおける最も強力なペプチドはＦであり、ナノモル以下の範囲でＤ、Ｂ及びＥが続き、マイクロモルの範囲でＣ及びＡが続く（表３を参照）。６種のペプチドはすべてＤＲＧニューロンにおける活動電位の生成を阻害した。各毒素について標的チャンネルに対する見かけのＩＣ５０より約３倍高い濃度にて、各細胞におけるＴＴＸの作用に対してこれを測定した。しかしながら、ペプチドＡの阻害作用は６００ｎＭのＴＴＸの効果よりも有意に低かった（図７Ｆ、Ｇ〜１２Ｆ、Ｇを参照）。
【０２１６】
アプローチは、多分脳血管関門（ＢＢＢ）を交差してＣＮＳに入ることはないペプチドによって末梢におけるＮａｖ１チャンネルを標的にすることであった。従って、推定上の安全性に関する主な懸念は心臓の機能に対する調節効果の回避である。この考えと一致して、ヒトの心臓カリウムｈＥＲＧ（Ｋｖ１１．１）チャンネル電流に向かう（Ｒｅｄｆｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３）（図７Ｄ、Ｅ〜１２Ｄ、Ｅ）及び心筋細胞のモデルにおける自然発生的な活動電位パターンに向かう（図７Ｈ、Ｉ〜１２Ｈ、Ｉを参照）その調節作用によってこれらペプチドの推定上の安全性に関する指示が提供される。
【０２１７】
ｈＥＲＧアッセイにて、標的チャンネルに対するそのＩＣ５０の約１０倍の濃度にて、ＢｅＫＭ−１の作用に対して各毒素を測定した（図７Ｄ、Ｅ〜１２Ｄ、Ｅを参照）。ペプチドＢ及びＤだけがこれら高い濃度にてこのチャンネルに対する軽微な阻害作用を示した（図８Ｅ及び１０Ｅを参照）。心臓活性の一体化モデル（マウスのＥＳ−ＣＭ）では、ペプチドＢ及びＦが活動電位の周波数に影響を及ぼしたが、特に３μＭのＴＴＸの有意な作用に比べて、どのペプチドも活動電位の振幅と周波数に対する有意な阻害作用は示さなかった（図７Ｈ、Ｉ〜１２Ｈ、Ｉを参照）。従って、どのペプチドも標的チャンネルの活性を阻害するのに有効な濃度にて有意な様態で正常であると思われる心臓の活動を遮断するとは思われなかった。
実施例４
天然と合成のペプチドの活性の比較
【０２１８】
実施例３の手順及び方法の節に従って合成ペプチドと天然ペプチドの遮断活性の比較を調べた。
【０２１９】
ＨＥＫ細胞にて発現されたｒＮａｖ１．３を阻害することについて天然ペプチドと合成ペプチドで類似の用量反応曲線が得られたが、各データ点は３〜５の実験の平均である。
【０２２０】
ペプチドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦの用量反応曲線は完全に重なり合うので、活性は天然ペプチドと合成ペプチドで同一である。合成ペプチドＤ及びＥに対するチャンネルの応答は、天然ペプチドより大きいと思われるが、この差異は記録された応答の範囲内である。合成ペプチドと天然ペプチドが質量分光分析及びＨＰＬＣ解析で同一に見え、Ｎａｖ１．３チャンネルブロッカーとしてのそれらの活性が非常に似ているので、我々は、毒から精製したものと同一のペプチドを提供するということにおいて合成手段は成功であったと結論付けている。
実施例５
ラットモデルにおける鎮痛適応のための化合物Ｃの評価
【０２２１】
本試験は、ラットにおける神経因性疼痛のＣｈｕｎｇモデルを用いた化合物Ｃの鎮痛適応を評価することを目的とする。本試験は、ニューヨーク州タリタウン７６５  Ｏｌｄ  Ｓａｗ  Ｍｉｌｌ  Ｒｉｖｅｒ  Ｒｏａｄに本社のあるＰｓｙｃｈｏＧｅｎｉｃｓ社にて実施された。
材料及び方法
【０２２２】
動物
Ｈａｒｌａｎ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）のオスのスプラーグドーリーラット（１００〜１２５ｇ）を試験で使用した。受け取った際、独自の識別番号をラットに割り振り、微細アイソレーターフィルターの蓋が付いたポリカーボネート製のケージでケージ当たり３匹にて群飼いした。試験の開始前にすべてのラットを検査し、手で扱い、体重測定して適切な健康状態と好適性を確保した。試験の経過中、１２／１２の明暗サイクルを維持し、ＥＳＴの７：００ａｍにライトを点けた。５０％前後で維持した相対湿度と共に室温は２０〜２３℃の間で維持した。試験の期間中、餌と水は自由に提供された。
【０２２３】
薬剤
化合物はすべて、５ｍｌ／ｋｇの用量体積で１日１回、５日間（手術後１７〜２１日目）投与した。参照化合物：ガバペンチン（１００ｍｇ／ｋｇ、ＴＲＣ、ロット番号１−ＳＷＮ−１５４−１）は０．５％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）水溶液に溶解し、経口で投与した。試験化合物：化合物Ｃ（０．２５、０．６２５及び１．２５ｍｇ／ｋｇ；ロット：該当なし）は蒸留水に溶解し、ストック濃度（２０倍）にして単回使用アリコートに分け、凍結した。各試験日にアリコートを融解し、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で２０倍に希釈し、試験用量の調製でストックとして使用した。化合物Ｃは皮下に投与した。
方法
神経因性疼痛（脊髄神経結紮）のためのＣｈｕｎｇモデル
【０２２４】
イソフルランの持続吸入による全身麻酔のもとで、外科診療部にて無菌処置と共に手術を行った。ラットの下部腰椎と仙椎のレベルでの領域の皮膚の毛を剃り、ベタジンとアルコールで消毒した。無菌の眼科用軟膏を用いて眼を円滑に動かした。麻酔のレベル、尾又は足をつまむことに対する動物の反射反応についての試験、及び動物の呼吸を厳密にモニターすることに関して動物を連続的に観察した。動物が麻酔から回復する間、加熱パッドを用いて体温を３７℃で維持した。脊柱に隣接するレベルで左長手切開を行い、傍脊柱筋群を分離した。Ｌ６の横突起を取り除き、隣接する結合組織を取り除いてＬ５とＬ６の脊髄神経を暴露した。神経を単離し、明瞭に見えるようにした後、４−０の絹糸を用いて左Ｌ５を結紮した。筋肉を４−０の絹糸で縫合し、ステープルで傷を閉じた。手術の直前及び６時間後、ラットすべてに鎮痛剤（ブプレノルフィン、０．０５ｍｇ／ｋｇ、皮下）を与えた。覚醒し、回復室で自由に動き回るまで各ラットを監視した。次いで試験の期間中、動物を単独飼育した。試験に先立って手術後２週間ラットを回復させた。
触刺激に対する足底過敏反応の評価（Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ試験）
【０２２５】
後足（同側及び反対側）の足底面に高い曲げ力のｖｏｎ  Ｆｒｅｙ（ＶＦ）フィラメントを適用することによって機械的刺激からの引っ込めを測定した。陽性反応はｖｏｎ  Ｆｒｅｙフィラメントからの引っ込めとして定義した。引っ込め反応の上下でのフィラメントへの反応を評価することによって足引っ込め閾値（ＰＷＴ）の裏付けを調べた。
【０２２６】
ラットを実験室に持ち込み、試験に先立って１時間部屋に慣らせ、ＰＷＴ測定を行う前１５分間観察室に適応させた。
【０２２７】
手術前ベースライン試験：手術に先立って、ＶＦ試験を用いてラットすべてを調べた。１２ｇ未満の同側ＰＷＴを有するラットを試験から除外した（ラット１匹を除外）。
【０２２８】
手術後ベースライン試験：手術後１４日目に、手術したラットすべてからベースライン反応を取り、４．５ｇより大きい同側ＰＷＴを排除基準として用いた（１３匹のラットを排除）。その後、ラットを計量し、術後のＰＷＴ値に基づいて処理群（群当たりｎ＝１０）に割り振った。
【０２２９】
急性試験及び慢性試験：手術後１７日目に、ラットにビヒクル、ガバペンチン、又は試験化合物を注射し、投与後１時間と３時間に試験した。試験化合物を５日間投与し、５日目（術後２１日目）に再び調べた。
【０２３０】
統計的解析
反復測定又は一方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）とその後のＦｉｓｈｅｒＰＬＳＤ事後比較によってＶｏｎ  Ｆｒｅｙデータを解析した。ｐ＜０．０５であれば効果は有意であるとみなした。データは平均値±平均値の標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）として表す。
結果
【０２３１】
ベースラインｖｏｎ  Ｆｒｅｙ試験（ＶＦ）−結紮前と結紮後
有意な結紮Ｘ足相互作用効果（図２０を参照）によって示されるように、脊髄神経結紮は、病変に対して反対側ではなく同側での後足にて有意に低い足引っ込め閾値を生じた。
【０２３２】
急性及び慢性のＶＦ試験
表４は、薬剤投与前の同側及び反対側の足引っ込め閾値の値を示す。
【表４】
0005555891.tif 000005
【０２３３】
脊髄結紮ラットにおける触覚刺激応答に対するガバペンチン及び化合物Ｃの急性投与と慢性投与の効果を図２１に示す。鎮静及び毒性の兆候は予備処理及び試験の間に認められなかった。
【０２３４】
急性−同側
二方向反復測定ＡＮＯＶＡによって治療の有意な主効果と、１７日目における時間の主効果への有意ではない傾向（ｐ＝０．０９）が得られた。事後試験は、ガバペンチンと化合物Ｃ（０．６２５及び１．２５ｍｇ／ｋｇ）の急性投与が、双方の時点に対しては重要性を失ったデータについてビヒクルに比べて同側の足引っ込め閾値を有意に高めることを示した。
【０２３５】
慢性−同側
２１日目では、二方向反復測定ＡＮＯＶＡによって有意な処理Ｘ時間相互作用効果、及び処理と時間の有意な主効果が得られた。事後試験は、ガバペンチンと化合物Ｃ（０．６２５及び１．２５ｍｇ／ｋｇ）が、慢性処理計画に従ったあらゆる時点でビヒクルに比べて同側の足引っ込め閾値を有意に高めることを示した。ガバペンチンの効果は投与後３時間に比べて１時間で有意に高かった。
【０２３６】
反対側
反対側の足引っ込め閾値に対する処理すべての効果を図２２に示す。二方向反復測定ＡＮＯＶＡによって１７日目（急性）又は２１日目（慢性）における有意な処理Ｘ時間相互作用効果又は処理の有意な主効果は認められなかった。
【０２３７】
要約
ガバペンチン（１００ｍｇ／ｋｇ）及び化合物Ｃ（０．６２５及び１．２５ｍｇ／ｋｇ）の急性投与又は５日間投与は、双方の時点（投与後１時間と３時間）で同側足引っ込め閾値（ＰＷＴ）を有意に高めた。反対側の足引っ込め閾値の値に対する試験化合物の有意な化合物はなかった。
【０２３８】
実施例６
患者は神経因性疼痛に罹っている。本明細書に記載されるような医薬組成物を患者に全身性に投与する。患者はその状態を改善する又は回復することが期待される。
実施例７
【０２３９】
二重盲検多施設偽薬対照試験において神経因性疼痛での有効性及び安全性を評価するために本明細書に記載されるようなペプチドのいずれかを含む医薬組成物の投与を評価する予測的臨床試験
試験設計
慢性神経因性疼痛の患者における週２回の自由な用量（５０〜２００μｇの本明細書に記載されるペプチドのいずれか／週）又は固定用量（２００μｇの本明細書に記載されるペプチドのいずれか／週）の有効性及び安全性を評価する無作為、二重盲検、多施設、偽薬対照、並行群を用いた１２週間の試験。試験は、数カ国での多施設で実施する。
【０２４０】
試験は、ヘルシンキ宣言を起源とする倫理原則を順守する。
対象
【０２４１】
適格な患者は、有痛性の糖尿病性末梢神経障害（ＤＰＮ）（グリコシル化ヘモグロビン［ＨｂＡ１ｃ］１１％の１型及び２型糖尿病で６ヵ月以上有痛性、遠位性、全身性、感覚運動性の多発性神経障害）又はヘルペス後神経痛（ＰＨＮ）（帯状疱疹の皮疹の治癒後３ヵ月以上存在する疼痛）の一次診断を持つ１８歳以上の男性及び非妊娠、非授乳の女性である。患者はまた、ベースライン又は無作為化にて短文型マクギル疼痛問診票（ＳＦ−ＭＰＱ）の視覚アナログ尺度で４０ｍｍ以上（０ｍｍ＝「疼痛なし」及び１００ｍｍ＝「考えられる最悪の疼痛」）のスコアを有することも求められる。
【０２４２】
患者が、臨床上有意な又は不安定な医学的状態又は精神状態を有する場合、除外される。過去２年以内に悪性腫瘍に罹った又は試験期間中に手術の必要性が予想される患者は、異常な心電図（ＦＣＧ）、クレアチニンクリアランス１６０ｍｌ／分、又は異常な血液像を持つ患者と同様に除外される。過去２年以内に不法薬剤又はアルコールを乱用した患者は除外される。プレガバリンの過去の臨床試験に参加した又はスクリーニングの前３０日以内に治験薬若しくは治験剤を服用した者も除外する。試験中の使用が禁止され、ベースラインの外来に先立って少なくとも７日に洗い流しが要求される薬物には、以下：神経因性疼痛を治療するのに通常使用される薬剤（たとえば、ベンゾジアゼピン、骨格筋弛緩剤、カプサイシン、局所麻酔剤、オピオイド、メマチン）、抗癲癇剤（たとえば、カルバマゼピン、クロナゼパム、フェニトイン、バルプロン酸、ラモトリジン、トピラメート、ガバペンチン）、非ＳＳＲＩ抗鬱剤（たとえば、三環系薬、ベンラファキシン）、及び潜在的レチノトキシン（たとえば、ヒドロキシクロロキン、デフェロキサミン、チオリダジン、ビガバトリン）が挙げられる。
【０２４３】
ＤＰＮの患者はまた、少なくとも１日の洗い流しなしではＮＳＡＩＤＳ（ＣＯＸ−２阻害剤を含む）及びデキストロメタロファンの服用も禁止される。ガバペンチンに以前暴露されたことがある患者は用量及び治療期間に関わりなく試験に入るのを許可される。うつ病の治療のためのＳＳＲＩ、心筋梗塞及び卒中の予防のためのアスピリン、不眠症のための短時間作用型ベンゾジアゼピン、及び救急薬としてのパラセタモールなどは、試験期間中の許容可能な薬物である。患者が、Ｂ型肝炎又はＣ型肝炎又はＨＩＶの感染、神経障害、ＤＰＮ若しくはＰＨＮの一次診断と無関係な重度の疼痛、又は冒された皮節若しくは神経因性疼痛の評価を混乱させ得る神経障害が関与する領域における潜在的に感覚を変える皮膚の状態の既往がある場合も除外される。最終的に、ＤＰＮ患者で悪性貧血、未治療の甲状腺機能低下又は足指以外の切断の既往のある患者も、ＰＨＮ患者でその状態に対して神経破壊治療又は神経外科治療を受けた患者と同様に除外される。
治療
【０２４４】
試験は２つの相：ベースラインの疼痛スコアを確立する１週間の観察相と、患者の必要性に対応した盲検化適応が治療群の１つの適用される１２週間の二重盲検治療相を有する。１：２：２の比率で偽薬（ｎ＝６５）、自由用量組成（５０〜２００μｇの本明細書に記載されるペプチドのいずれか／週）（ｎ＝１３５）、又は固定用量組成（２００μｇの本明細書に記載されるペプチドのいずれか／週）（ｎ＝１４０）に患者を無作為化する。
【０２４５】
組成自由用量の群に無作為化された患者は、応答と認容性に基づいて１週間間隔で増量する上昇用量（５０、１００、１５０及び２００μｇの本明細書で記載されるペプチドのいずれか／週）を受け取る。１週間後、又は２、３若しくは４週目又は２、３若しくは４週後、単一の減量用量が認められる。これが生じる場合、患者は試験の残りの間、この投与量のままである。この新しい試験設計の利点は、それが、医師が個々の患者の応答に基づいて処方薬剤の投与量を誂える治療ルーチンにさらに密接に近似することである。２００μｇの本明細書に記載されるペプチドのいずれか／週を含有する組成の固定用量群に無作為化された患者は、１００μｇの本明細書に記載されるペプチドのいずれか／週を含む組成を１週間で出発し、次いで二重盲検治療の残りの１１週間、２００μｇの本明細書に記載されるペプチドのいずれか／週で続ける。患者はすべて活性のある薬物又は対応する偽薬のカプセルを受け取り、同一の週２回の皮下注射のスケジュールに従う（週ごとの投与量を２つの等用量に分割し、３〜４日間隔以内で投与する）。各試験外来での薬物在庫管理及び投与手順の点検によって順守を評価する。二重盲検試験中いつでも患者は自由に試験を中断することができ、非盲検の延長に入ることができる。
【０２４６】
評価及び評価項目
ベースライン相（積極的な治療なし）の間に、患者は、１１点の（０＝「疼痛なし」〜１０＝「考えられる最悪の疼痛」；０＝「疼痛は睡眠を妨げない」〜１０＝「疼痛が睡眠を完全に妨げる」）数値化スケール（ＮＲＳ）を用いて疼痛と疼痛関連の睡眠妨害について毎日の日記の内容を作成する。この相の終点であらゆる包含／排除の基準を満たし続ける患者を二重盲検試験投薬に無作為化し、６回の無作為化後の外来で評価する。一次有効性パラメータは、患者の毎日の日記の内容で記録されるような患者のＮＲＳに基づく終点の平均疼痛スコアである。毎朝覚醒時、患者はＮＲＳを用いて過去２４時間の神経因性疼痛の強度を日記に記録する。二次有効性パラメータには、毎日の睡眠妨害日記（疼痛日記に類似する）、及び医学予後試験（ＭＯＳ）−睡眠スケール（Ｈｅｙ  ａｎｄ  Ｓｔｅｗａｒｔ，  １９９２）、及び患者の満足度（ＰＧＩＣ）が挙げられた。ＭＯＳ睡眠スケールは、健康関連の生活の質に対する睡眠の影響を測定するのに使用される検証された１２項目の患者が完成する問診票である。
【０２４７】
安全性
安全性の評価には、有害事象（ＡＥｓ、発生率、性質、強度、試験薬との関係）の要約、臨床検査成績、及び生理学的、神経学的検査と１２誘導心電図の成績が含まれた。
【０２４８】
本明細書に記載されるペプチドのいずれかを含む組成物を受け取っている患者は、疼痛、炎症及び慢性の神経因性疼痛に関連する他の症状が軽減されることが期待される。
【０２４９】
その本質的な性質から逸脱することなく種々の改変を行うことができることは、本主題が関係する当業者によって十分に理解されるであろう。そのような改変をすべて添付の特許請求の範囲内に包含することが意図される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図８Ｉ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図９Ｉ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
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【図１０Ｉ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
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【図１１Ｉ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１２Ｈ】
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【図１２Ｉ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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