(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ１４を発現し、かつ、ＣＸＣＲ４を高発現する末梢血単球をフィブロネクチン上でインビトロ培養することにより単球由来多能性細胞（ＭＯＭＣ）を作製する方法であって、前記のインビトロ培養をストローマ由来因子（ＳＤＦ−１）存在下で行うことを特徴とするＭＯＭＣの作製方法。
【請求項２】
ＣＤ１４を発現する末梢血単球を被検物質存在下で培養して得られた単球のＣＸＣＲ４の発現レベルを測定する工程；と、測定して得られたＣＸＣＲ４の発現レベルを評価する工程；とを有することを特徴とする、単球由来多能性細胞（ＭＯＭＣ）への分化誘導を促進する物質をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単球由来多能性細胞（ＭＯＭＣ）の作製方法や、ＭＯＭＣへの分化誘導剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在の医学に残された大きな課題は疾患、外傷などによる臓器の欠失や機能障害の克服といわれている。このような状態に対する治療として現時点で施行しうる唯一の方法は臓器移植であるが、脳死判定やドナー供給の問題のため現実的な治療法として普及するには多くの障害がある。一方、最近の幹細胞および発生生物学の進歩に伴って臓器再生を目指した再生医学が注目され、２１世紀に進むべき医療の方向性として期待されている。動物実験レベルでは胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の移植により臓器の機能回復が報告されているが、ヒトへの応用を考えた場合には拒絶反応やＥＳ細胞使用による倫理的な問題で行き詰まっているのが現状である。また、成人の各種組織幹細胞（間葉系、血管、肝など）も生体内にきわめて少数しか存在せず、その単離は技術的に難しく、移植に十分な細胞数を得ることは現時点で困難とされている。したがって、ＥＳ細胞や組織幹細胞を用いた再生医療が実地医療に応用されるためには解決しなければならない多くの問題が山積しており、特に、細胞移植による再生医療が現実のものとなるためには、分化能を有する細胞の安定供給が必要不可欠である。
【０００３】
本願発明者らは、ヒト末梢血単球由来細胞が特定の培養条件下で骨，軟骨，骨格筋，脂肪，心筋，血管内皮，神経へと分化する能力を持つことを世界に先駆けて見い出し（非特許文献１〜４、特許文献１）、この新規細胞を単球由来多能性細胞（monocyte-derived multipotent cell; ＭＯＭＣ）と名付けた。単球は末梢血から大きな侵襲なく簡単に採取することができるため、入手が比較的簡便であり、また、末梢血単核球の約２０％を占めているため、必要十分量の細胞を安定供給することができる。また、ＭＯＭＣは、投与対象に由来する単球から作製できることから、ドナー確保や拒絶反応の問題がなく、倫理的な問題も少ない。すなわち、ＭＯＭＣは、現実的な臓器再生のための細胞移植に非常に適した多能性細胞であるといえる。本発明者らの出願に係る特許文献１には、ＣＤ１４−細胞を用いて、末梢血単球からＭＯＭＣへと分化誘導することによって、ＭＯＭＣを作製する方法が記載されている。本方法を用いると、特殊な装置を用いることなく、単球からＭＯＭＣへの分化誘導を簡単、迅速、安価に行うことができる。また、本願発明者らは、末梢血単球からのＭＯＭＣの誘導には、リンパ球でなく血小板との共培養が必要であることをこれまで見い出している（非特許文献５）。
【０００４】
一方、特許文献２には、活性化単核細胞の蛋白質キナーゼＣのｂIIにより、単核細胞をＰ幹細胞に変換することを特徴とするＰ幹細胞の形成方法が教示されており、蛋白質キナーゼＣ条件剤として、ＧＭ−ＣＳＦやＳＤＦ或いはその組み合わせを用い得ることが記載されている。特許文献２にはさらに、Ｐ幹細胞が軟骨細胞や神経細胞や骨細胞に分化しうると記載されている。また、Ｐ幹細胞は、コラーゲン上、フィブロネクチン上のいずれで培養しても得られる細胞である（特許文献２の「実施例１の具体例３」参照）。
【０００５】
また、ＳＤＦ−１（Stromal Derived Factor 1；ストローマ由来因子）は、細胞の増殖、分化、機能発現を行うサイトカインの１種である（非特許文献６）。サイトカインには、極めて多様なタンパク質が含まれており、インターロイキン（ＩＬ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、変換成長因子（ＴＧＦ）、骨形成誘導タンパク質（ＢＭＰ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、角質細胞増殖因子（ＫＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＦＧ）、マクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ）、単球遊走タンパク質（ＭＣＰ）、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）などがよく知られており、中でも、特定の白血球サブセットの遊走作用・活性化を支配する一連のサイトカインとして発見されたものは、ケモカイン(chemokine)と特に呼ばれている。ケモカインは分子内に保存されたシステイン残基（Ｃｙｓ）をもち、この分子構造上の位置よりＣＸＣ，ＣＣ，Ｃ，ＣＸ３Ｃの４つのサブファミリーに分類されている。ＳＤＦ−１はＣＸＣタイプのケモカインであり、ＳＤＦ−１の受容体は、ＣＸＣケモカインレセプターの１つであるＣＸＣＲ４であることが知られている。
【０００６】
前述のように、ＭＯＭＣの作製方法は特許文献１により知られていたが、ＭＯＭＣへの分化効率のより高い、より実用的なＭＯＭＣ作製方法が求められていた。しかし、ＳＤＦ−１が、末梢血単球からＭＯＭＣへの分化誘導効率に影響するかどうかは全く知られていなかった。
【０００７】
【特許文献１】特許第３７６２９７５号公報
【特許文献２】特開２００６−３３３８６６号公報
【非特許文献１】J Leukoc Biol, 2003, 74, 833-45
【非特許文献２】Stem Cell Dev, 2005, 14, 676-86
【非特許文献３】Immunol Cell Biol, 2006, 84, 209-17
【非特許文献４】Stem Cells, 2006, 24, 2733-43
【非特許文献５】第２８回  日本炎症・再生医学会  抄録集「Ｗ−７−４  ヒト単球由来多能性細胞の誘導過程の検討」、２００７年７月発行
【非特許文献６】Science, 1993, 261, 600-603
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、臓器再生のための細胞移植に非常に適した多能性細胞であるＭＯＭＣを効率よく、大量に作製しうる実用的な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは、末梢血単球からのＭＯＭＣの誘導には、リンパ球でなく血小板との共培養が必要であるとの知見をこれまでに得ていた（非特許文献５）。そのため、血小板が産生することが知られる多数のサイトカイン等の中から、ＭＯＭＣへの分化誘導活性を有する物質の検索を行ったが、目的の活性を有する物質は見い出されなかった。そこで、血小板が産生しなくても血小板の活性化に伴って放出されるサイトカイン等まで検索の対象を拡大し、鋭意検討を重ねた結果、ＳＤＦ−１を用いることによって、末梢血単球からより効率的にＭＯＭＣを作製し得ることをようやく見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、（１）ＣＤ１４を発現し、かつ、ＣＸＣＲ４を高発現する末梢血単球をフィブロネクチン上でインビトロ培養することにより単球由来多能性細胞（ＭＯＭＣ）を作製する方法であって、前記のインビトロ培養をストローマ由来因子（ＳＤＦ−１）存在下で行うことを特徴とするＭＯＭＣの作製方法に関する。
【００１２】
さらに本発明は、（２）ＣＤ１４を発現する末梢血単球を被検物質存在下で培養して得られた単球のＣＸＣＲ４の発現レベルを測定する工程；と、測定して得られたＣＸＣＲ４の発現レベルを評価する工程；とを有することを特徴とする、単球由来多能性細胞（ＭＯＭＣ）への分化誘導を促進する物質をスクリーニングする方法に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法を用いると、末梢血単球からＭＯＭＣをより効率的に作製することができ、ＭＯＭＣをより低コストで作製しうる。作製したＭＯＭＣから所望の細胞へと分化誘導することによって、移植用の細胞を安定的に確保することが可能となり、再生医療の進歩に大きく貢献しうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の単球由来多能性細胞（ＭＯＭＣ）の作製方法（以下、単に「本発明の作製方法」ともいう。）は、ＣＤ１４を発現する末梢血単球をフィブロネクチン上でインビトロ培養することによりＭＯＭＣを作製する方法であって、前記のインビトロ培養をＳＤＦ−１存在下で行うことを特徴とする。ここで、ＳＤＦ−１存在下とは、インビトロ培養の際に用いる培地に、ＳＤＦ−１を添加することや、ＳＤＦ−１含有組成物を添加することを意味する。ＳＤＦ−１の濃度を必要に応じて特異的に向上させることができることから、培地に添加するのは、ＳＤＦ−１であることが好ましい。前記培地中のＳＤＦ−１の濃度は特に制限されないが、好ましくは１０〜２００ｎｇ／ｍｌであり、より好ましくは５０〜２００ｎｇ／ｍｌとすることができる。
【００１５】
前述のＣＤ１４を発現する末梢血単球（以下、「ＣＤ１４陽性末梢血単球」ともいう。）の起源としてはマウス、ラット、イヌ、ブタ、サル、ヒトなど特に限定されないが、ヒトを好適に例示することができ、ヒト単球の場合、ドナー由来であってもよいが自己由来であることが特に好ましい。これら末梢血単球は、起源となる動物の静脈血から常法により単離することができる。また、末梢血単球から前述のＣＤ１４陽性末梢血単球を分離する方法としては特に制限されないが、例えば抗ＣＤ１４抗体結合磁気ビーズを用いるなどして、末梢血単球からＣＤ１４陽性末梢血単球を容易に分離することができる。
【００１６】
本発明に用いるＣＤ１４陽性末梢血単球として、ＣＸＣＲ４を高発現するＣＤ１４陽性末梢血単球を用いることがより好ましい。具体的には、採取したＣＤ１４陽性末梢血単球のうち、ＣＸＣＲ４の発現数の多い上位７０％の単球を用いることが好ましく、上位５０％の単球を用いることがより好ましい。ＣＸＣＲ４の発現数は、標識化抗ＣＸＣＲ４抗体及びフローサイトメトリーを用いるなどして、容易に測定することができ、さらに、ＣＸＣＲ４の発現数の高い単球を選別することができる。
【００１７】
また、前述のインビトロ培養の方法としては、ＣＤ１４陽性末梢血単球を、ＳＤＦ−１存在下、フィブロネクチン上でインビトロ培養する方法であれば特に制限されないが、フィブロネクチンでコートしたプラスチックプレート上で、ＳＤＦ−１存在下、ＣＤ１４陽性末梢血単球を、３７℃、５％ＣＯ２、湿気下にて密度１０４〜１０７／ｍｌ、例えば２×１０６／ｍｌで培養し、２〜４日毎に、特に好ましくは３日毎に非接着細胞を除去するとともに、新鮮培地を補充しつつ、好ましくは５〜１４日間、特に好ましくは７〜１０日間培養してＭＯＭＣを採取する方法を好適に例示することができる。このようにして得られる本発明のＭＯＭＣは、その元来のフェノタイプを５世代継代するまで維持しつつ、培養によって増殖させることが可能である。
【００１８】
また、前述のインビトロ培養する際の培地としては、ＳＤＦ−１を含む細胞培養用培地であれば特に制限されないが、ＳＤＦ−１を含む血小板培養上清（１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）添加低グルコース Dulbecco's modified Eagle's medium（ＤＭＥＭ）培地）を好適に例示することができる。本発明に用いるＳＤＦ−１は、特に制限されず、市販のものを用いることができる。また、ＳＤＦ−１の由来としては、培養するＣＤ１４陽性末梢血単球の由来に応じて、その由来と同種のＳＤＦ−１、例えばヒト由来のＣＤ１４陽性末梢血単球を用いるときはヒト由来のＳＤＦ−１を用いることが好ましい。
【００１９】
また、前記培地中には、ＭＯＭＣへの分化誘導を行い得る限り、ＳＤＦ−１以外のサイトカイン等の他の任意成分を含んでいてもよい。上記ＳＤＦ−１以外のサイトカインとして、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ｂＦＧＦなどのＭＯＭＣへの誘導を阻害する活性を有するサイトカインを含む培地を用いてもよいが、培地中のこれらのサイトカインのいずれか１種又は２種以上の濃度が１ｎｇ／ｍｌ以下であることが好ましく、１００ｐｇ／ｍｌ以下であることがより好ましく、１０ｐｇ／ｍｌ以下であることがさらに好ましく、１ｐｇ／ｍｌ以下であることがさらにより好ましい。
【００２０】
本発明の作製方法により得られた細胞がＭＯＭＣであることは、以下に示すＭＯＭＣの性質を確認することにより容易に特定することができる。
ＭＯＭＣは、ＣＤ１４を発現する単球に由来し、ＣＤ１４とＣＤ３４とＣＤ４５とＩ型コラーゲンとを発現する紡錘形の細胞又は細胞群である。上記ＣＤ１４とＣＤ４５とは単球及び単球由来細胞のマーカーとして、ＣＤ３４は幹細胞のマーカーとして、Ｉ型コラーゲンは間葉系細胞のマーカーとして知られている。本発明のＭＯＭＣとしては、幹細胞マーカーとしてのＣＤ１０５、Ｓｃａ−１や、間葉系細胞のマーカーとしてのIII型コラーゲン、フィブロネクチンや、血管内皮マーカーとしてのＶＥカドヘリン、Ｆｌｔ−１を発現するものが好ましい。かかるＭＯＭＣは、上記タンパク質の発現パターンから、単球、マクロファージ、樹状細胞とは異なる細胞であり、間葉系細胞、血管内皮細胞、幹細胞の特徴をあわせ持つ細胞群といえる。
【００２１】
本発明の分化誘導促進剤は、ＳＤＦ−１を有効成分として含有することを特徴とする。ＣＤ１４陽性末梢血単球をフィブロネクチン上でインビトロ培養する際の培地に本発明の分化誘導促進剤を添加すると、ＭＯＭＣへの誘導効率が向上し、より低コストでＭＯＭＣを作製することができる。
【００２２】
本発明の分化誘導剤に含まれるＳＤＦ−１の濃度は、上記培地に添加することによってＭＯＭＣへの誘導効率を向上させ得る限り特に制限されない。また、本発明の分化誘導剤は、ＳＤＦ−１のみを含有していてもよいが、ＭＯＭＣ誘導を阻害しない限り、ＳＤＦ−１以外の任意成分を含有していてもよい。かかる任意成分としては、水等の溶媒や、炭素源、窒素源等の単球の培養成分や、ＳＤＦ−１以外のＭＯＭＣ分化誘導物質を例示することができる。
【００２３】
本発明の分化誘導剤の剤型は、特に制限されず、粉末状等の固形剤であってもよいし、液体状の液剤であってもよい。
【００２４】
本発明のＭＯＭＣへの分化誘導を促進する物質をスクリーニングする方法（以下、「本発明のスクリーニング方法」ともいう。）は、工程（Ａ）：ＣＤ１４を発現する末梢血単球を被検物質存在下で培養して得られた単球のＣＸＣＲ４の発現レベルを測定する工程；と、工程（Ｂ）：測定して得られたＣＸＣＲ４の発現レベルを評価する工程；とを有することを特徴とする。ＣＸＣＲ４の発現レベルが高いＣＤ１４陽性末梢血単球は、ＣＸＣＲ４の発現レベルが低いものに比べてＭＯＭＣへの誘導効率が高いため、ＣＸＣＲ４の発現レベルを向上させる物質は、ＭＯＭＣへの分化誘導も促進すると考えられる。
【００２５】
上記工程（Ａ）としては、ＣＤ１４を発現する末梢血単球（ＣＤ１４陽性末梢血単球）を被検物質存在下で培養して得られた単球のＣＸＣＲ４の発現レベルを測定する工程である限り特に制限されない。上記工程における、単球のＣＸＣＲ４の発現レベルを測定する方法としては特に制限されず、例えば、標識化抗ＣＸＣＲ４抗体及びフローサイトメトリーを用いるなどして容易に測定することができる。
【００２６】
上記工程（Ｂ）としては、測定して得られたＣＸＣＲ４の発現レベルを評価する工程である限り特に制限されないが、例えば、ＣＤ１４陽性末梢血単球を被検物質非存在下で培養して得られた単球のＣＸＣＲ４の発現レベルを基準として、被検物質存在下における発現レベルがより高い場合は、その被検物質を、ＭＯＭＣへの分化誘導を促進する物質と評価することができる。
【００２７】
前述の本発明の作製方法によって作製されるＭＯＭＣは多能性を有している。ＭＯＭＣの有する多能性としては、中胚葉系細胞に間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を分化させることが知られている誘導条件下で中胚葉系細胞に分化する多能性を例示することができ、より具体的には、間葉系組織へと分化誘導する条件下での培養により骨芽細胞、骨格筋芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等の間葉系細胞に分化しうる多能性や、培養心筋細胞との共培養等の心筋へと分化誘導する条件下での培養により心筋細胞に分化しうる多能性や、血管内皮細胞を維持する条件下での培養等の血管内皮へと分化誘導する条件下での培養により血管内皮細胞に分化しうる多能性の他、培養神経細胞との共培養等の神経へと分化誘導する条件下での培養により、外胚葉系細胞である神経細胞に分化しうる多能性などを好適に例示することができる。
【００２８】
本発明におけるＭＯＭＣ、並びに／又は、前記ＭＯＭＣから分化・誘導された、前記中胚葉系前駆細胞、中胚葉系細胞及び／若しくは中胚葉系組織や、前記神経前駆細胞、神経細胞及び／若しくは神経組織等を投与、例えば障害、欠損部位およびその近傍へ直接注入、又は末梢血へ投与することにより、前記組織の先天性疾患、変性疾患や外傷を治療しうる。ＭＯＭＣ又は分化誘導処理したＭＯＭＣのいずれが治療剤として適しているかは、細胞の種類や疾病の種類や投与方法を考慮して適宜決定することが好ましい。また、ＭＯＭＣは遺伝子導入が比較的簡単な細胞であることから、ヒトへの細胞移植の前に特定の遺伝子を導入した後に組織再生治療等に用いることもできる。例えば、ある種の先天性疾患で骨の形成に障害がある場合に、その遺伝子を是正した上で移植することや、あるいは、特定の蛋白（サイトカイン、成長因子、ホルモンなど）を産生するように調製した上で移植することもできる。
【００２９】
前述のように、本発明におけるＭＯＭＣは、前記組織の組織再生治療における細胞供給源としてきわめて有用である。具体的に本発明におけるＭＯＭＣを用いた治療剤や治療方法の対象となる疾患又は病態としては、骨形成不全、骨折、関節リウマチなど変性疾患による骨破壊や、軟骨が破壊される関節リウマチ、変形性関節症や、ジストロフィーなどの先天性疾患や筋炎などの後天性疾患による筋萎縮や、心筋梗塞や心筋症による心筋障害や、脳梗塞、パーキンソン病などの脳障害、脊髄損傷などの外傷や、動脈硬化や膠原病による血管障害を挙げることができ、便宜上、豊胸をはじめとした美容形成等も本発明における治療剤や治療方法に含まれる。このようなＭＯＭＣ又は分化誘導処理したＭＯＭＣを使用する細胞治療には、現在提案されている組織特異的幹細胞及びＥＳ細胞を用いる再生治療等にはない大きな利点がある。すなわち、血液採取という低侵襲的に患者本人から大量の単球を採取できることから、循環単球は比較的容易に入手可能な自己細胞供給源ということができ、さらに、単球からＭＯＭＣを作製することは技術的に簡便で迅速に実施でき、また、ＥＳ細胞を使用する際の倫理上のジレンマも回避することができる。
【００３０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
ＭＯＭＣは、ＣＤ１４陽性末梢血単球（末梢血中のＣＤ１４＋単球）をインビトロ培養することにより誘導される多分化能を有する細胞であり、そのフェノタイプはＣＤ１４＋ＣＤ４５＋ＣＤ３４＋Ｉ型コラーゲン＋である。従来のＭＯＭＣ作製法（日本特許第３７６２９７５号公報）では、末梢血中ＣＤ１４＋単球からＭＯＭＣへの分化誘導過程で、ＣＤ１４＋単球が固相化したフィブロネクチンに接着すること、及びＣＤ１４−単球細胞由来の液性因子が培養液中に存在することが必須であった。さらに、日本特許第３７６２９７５号公報の明細書中の実施例１９では、末梢血ＣＤ１４＋単球細胞がすべてＭＯＭＣに分化するのではなく、その一部の細胞しか分化能を有していないことが明らかにされている。また、本願発明者らは、末梢血単球からのＭＯＭＣの誘導には、リンパ球でなく血小板との共培養が必要であることをこれまで見い出している（非特許文献５）。本願発明者らは、より効率的なＭＯＭＣ作製法を確立するため、ＭＯＭＣ分化誘導に必須の「接着因子」及び「液性因子」を特定するとともに、ＭＯＭＣ作製に適した単球細胞の特性を検討した。
【実施例２】
【００３２】
［ＭＯＭＣ分化誘導に関与する接着因子の同定］
まず、フィブロネクチンとＩ型コラーゲンについて、それらのＭＯＭＣ分化誘導能を比較した。成人健常ドナーから得た静脈血について密度勾配遠心分離を行い、末梢血単球（ＰＢＭＣ）を単離し、更に抗ＣＤ１４抗体結合磁気ビーズを用いてＰＢＭＣからＣＤ１４＋単球を分離した。得られたＣＤ１４＋単球を、ＳＤＦ−１を含む血小板培養上清（１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）添加低グルコース Dulbecco's modified Eagle's medium（ＤＭＥＭ）培地）に懸濁し、フィブロネクチン又はＩ型コラーゲンでコートしたプレート上で７−１０日間培養した。その結果、Ｉ型コラーゲン上の培養で得られた細胞は、フィブロネクチンと比べて付着細胞数の著しい増加が見られたが（図１Ａ）、フローサイトメトリーで解析した結果、ＭＯＭＣに特徴的なフェノタイプのひとつであるＣＤ３４の発現は見られなかった（図１Ｂ）。また、フィブロネクチン上で培養した細胞（ＭＯＭＣ）は、少なくとも６回目の継代までは細胞数が増加していくのに対して、Ｉ型コラーゲンで作製した細胞は継代の度に細胞数が減少した（図２Ａ）。また、様々なマーカー遺伝子の発現を、ＲＴ−ＰＣＲ法により解析した結果、Ｉ型コラーゲン上で培養した細胞は、ＭＯＭＣとは異なりＣＤ３４を発現せず、また、ＭＯＭＣに比べてＩ型コラーゲンとIII型コラーゲンの発現が高いことが明らかなった（図２Ｂ）。さらに、ＭＯＭＣを他の細胞に分化誘導する既知の培養法を用いて、Ｉ型コラーゲン上で培養した細胞の分化能を検討した結果、Ｉ型コラーゲンで作製した細胞はいずれの細胞にも分化しなかったことから（図２Ｃ）、この細胞はＭＯＭＣと異なる性質を持つ細胞であることが明らかとなった。これらの結果から、Ｉ型コラーゲンはＭＯＭＣ分化誘導能を有しておらず、ＣＤ１４＋単球からＭＯＭＣへの分化には、細胞の培養プレートへの接着だけでなく、フィブロネクチンに特異的なドメインによる刺激が必要であることが示された。
なお、背景技術に記載された特許文献２に教示されているＰ幹細胞が、コラーゲン上、フィブロネクチン上のいずれで培養しても得られる細胞である（特許文献２の「実施例１の具体例３」参照）ことを考慮すると、コラーゲン上で培養したときは全く得ることのできないＭＯＭＣは、Ｐ幹細胞とは明らかに異なる細胞だといえる。
【実施例３】
【００３３】
次に、ＭＯＭＣの誘導に関与する単球上の接着分子の同定を試みた。
フィブロネクチンと結合する細胞接着分子は、インテグリンファミリーの中の、ＶＬＡ−３、ＶＬＡ−４、ＶＬＡ−５であることが知られている。このうち、末梢血単球にはＶＬＡ−４とＶＬＡ−５が発現しており、ＶＬＡ−３は発現していない（図３）。インテグリンはα鎖とβ鎖の２つのサブユニットからなるヘテロ二量体であり、ＶＬＡ−４はβ鎖（β１）とα鎖（ＣＤ４９ｄ）からなり、ＶＬＡ−５はβ鎖（β１）とα鎖（ＣＤ４９ｅ）からなっている。そこで、ＶＬＡ−４とＶＬＡ−５をそれぞれ構成するα鎖であるＣＤ４９ｄとＣＤ４９ｅに対する抗体を用いてブロッキングを行い、ＭＯＭＣの誘導に関与する単球上の接着分子の同定を行った。コントロールとして単球に発現が見られないＶＬＡ−３のα鎖であるＣＤ４９ｃに対する抗体を用いた。
【００３４】
成人健常ドナーから得た静脈血について密度勾配遠心分離を行い、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離した。そして、抗ＣＤ６１抗体結合ビーズを用いて、混入している血小板を完全に除去し、さらに抗ＣＤ１４抗体結合ビーズを用いてＣＤ１４＋細胞を単離した。得られたＣＤ１４＋単球を、ＭＯＭＣ分化誘導因子を含む血小板培養上清に懸濁し、フィブロネクチンをコートしたプレート上に１ｘ１０６／ｍｌの細胞密度で播種した。培養液に、抗ＣＤ４９ｄ抗体（Beckman Coulter社製）、抗ＣＤ４９ｅ抗体（Beckman Coulter社製）、又は抗ＣＤ４９ｃ抗体（Beckman Coulter社製）をそれぞれ２０μｇ／ｍｌとなるように添加し、７−１０日間培養した。培養終了時の各プレートにおける付着細胞数をカウントして比較することで、各種抗体がＭＯＭＣ分化誘導に及ぼす影響を検討した。その結果、抗ＣＤ４９ｅ抗体によりＶＬＡ−５をブロックした場合、ＭＯＭＣの誘導が著しく阻害されたことから、フィブロネクチンによるＭＯＭＣ分化誘導に関与する細胞接着分子はＶＬＡ−５であることが明らかとなった（図４）。一方、抗ＣＤ４９ｄ抗体によりＶＬＡ−４をブロックした培養細胞は、ネガティブコントロールである抗ＣＤ４９ｃ抗体を添加した区と比較して差が認められなかったことから、ＶＬＡ−４はＭＯＭＣ誘導には関与しないことが示された（図４）。
【実施例４】
【００３５】
次に、ＭＯＭＣの誘導に関与するフィブロネクチンのドメインの同定を行った。図５に示すように、フィブロネクチンのドメインのうち、ＶＬＡ−５と結合する可能性が考えられるのはＲＧＤとＣＳ−１の２つのドメインである。そこで、これらのＲＧＤドメインとＣＳ−１ドメインに対する競合ペプチドを、ＭＯＭＣを誘導する培養液に添加して、ＭＯＭＣの誘導に対する影響を検討した。ネガティブコントロールとして、それぞれの競合ペプチドの１アミノ酸を他のアミノ酸に置換したペプチドを用いた（配列番号１〜４に示す）。
【００３６】
成人健常ドナーから得た静脈血について密度勾配遠心分離を行い、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離した。混入している血小板を抗ＣＤ６１抗体結合ビーズを用いて前述のＰＢＭＣから完全に除去し、さらに抗ＣＤ１４抗体結合ビーズを用いてＣＤ１４＋単球を単離した。得られたＣＤ１４＋単球を、ＭＯＭＣ分化誘導因子を含む血小板培養上清に懸濁し、フィブロネクチンをコートしたプレート上に１´１０６／ｍｌの細胞密度で播種した。培養液にＲＧＤペプチド（ＧＲＧＤＳＰ；配列番号１）、ＣＳ−１ペプチド（ＥＩＬＤＶ；配列番号２）、ＲＧＤペプチドに対するコントロールペプチド（ＧＲＧＥＳＰ；配列番号３）、又はＣＳ−１ペプチドに対するコントロールペプチド（ＥＩＬＡＶ；配列番号４）を５００μｇ／ｍｌとなるように添加し、７−１０日間培養した。培養終了時に付着細胞数をカウントして競合ペプチドを添加した付着細胞数と、コントロールペプチドを添加した付着細胞数とを比較することで、各競合ペプチドがＭＯＭＣ分化誘導に及ぼす影響を検討した。その結果、ＣＳ−１ドメインと競合するペプチドを添加してもほとんど影響はなかったが、ＲＧＤドメインと競合するペプチドを加えるとコントロールペプチドと比べてＭＯＭＣの誘導が著しく阻害された（図６）。これらのことから、ＭＯＭＣの誘導にはフィブロネクチンのＲＧＤドメインが関与していることが明らかとなった。より詳細にいえば、ＶＬＡ−５とフィブロネクチンとの結合にはフィブロネクチンのＲＧＤドメインが深く関与していること、及び、ＲＧＤドメインの競合ペプチド存在下では、ＶＬＡ−５とフィブロネクチンとの結合が阻害され、その結果ＭＯＭＣの誘導が阻害されることが示唆された。
【実施例５】
【００３７】
［ＭＯＭＣ分化誘導に関与する液性因子の同定］
本願発明者らは、末梢血単球からのＭＯＭＣ分化誘導には、リンパ球でなく血小板との共培養が必要であることをこれまで見い出している（非特許文献５）。本発明者らは、１５種類の調節因子（ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＩＬ−７、ＴＧＦ−β、ＥＮＡ７８、ＧＲＯ−α、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１α、ＮＡＰ−２、ＰＦ−４、ＭＣＰ−３、ＴＡＲＣ、ＳＤＦ−１）に関して分化誘導活性を検討した。この１５種類の調節因子のうち、ＳＤＦ−１以外の調節因子は、血小板が産生する調節因子として知られている。
【００３８】
成人健常ドナーから得た静脈血について密度勾配遠心分離を行い、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離した。更に抗ＣＤ１４抗体結合磁気ビーズを用いて前述のＰＢＭＣからＣＤ１４＋単球を分離した。得られたＣＤ１４＋単球を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）添加低グルコースDulbecco's modified Eagle's medium（ＤＭＥＭ）培地に懸濁し、フィブロネクチンをコートしたプレートに２ｘ１０５／ｍｌの細胞密度で播種した。各被検物質を０−１００ｎｇ／ｍｌの濃度となるよう培養液に添加し、７−１０日間培養した。その結果、図７に示すように、１００ｎｇ／ｍｌのＳＤＦ−１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加した場合、高頻度でＭＯＭＣ様の紡錘形細胞が出現し（図７Ａ）、またそのＭＯＭＣ様細胞への誘導活性は濃度依存的（５，１０，５０，１００，２００ｎｇ／ｍｌ）であることが明らかとなった（図７Ｂ）。一方、ＳＤＦ−１以外の１４種の調節因子は、いずれもＭＯＭＣ様細胞への分化誘導活性を示さず、ＴＧＦ−βやＰＤＧＦ−ＡＡやＰＤＧＦ−ＡＢやｂＦＧＦは、むしろＭＯＭＣへの誘導を阻害する活性を示した（図８〜１１）。
【実施例６】
【００３９】
［ＳＤＦ−１により誘導された紡錘形細胞の性質の特定］
実施例５でＳＤＦ−１により分化誘導された紡錘形細胞がＭＯＭＣであるかどうかを検討した。まず、紡錘形細胞のフェノタイプを、フローサイトメトリーで解析したところＣＤ１４＋ＣＤ４５＋ＣＤ３４＋であり、これら分子の発現強度は、従来の方法で誘導されたＭＯＭＣと同等であることが判明した（図１２）。さらに、本培養法（誘導物質としてＳＤＦ−１を用いる）で得られた紡錘形細胞が、多分化能を有するＭＯＭＣであるかどうかを確認するために、以下に示す細胞への分化誘導を試みた。
【００４０】
間葉系幹細胞を骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞へとそれぞれ分化誘導する既知の培養法と血管内皮細胞を維持する既知の培養法に従い（Arthritis Rheum 2001, 44, 1928-42； Circulation 2003, 108, 2511-16）、ＳＤＦ−１で作製した紡錘形細胞を培養した。１週間培養した後、培養細胞の形態を検討するとともに、免疫染色法によりＣＤ４５と各細胞に特異的なマーカー遺伝子の発現を調べた。その結果を図１３に示す。なお、各細胞への分化の評価に用いたマーカー遺伝子としては、骨芽細胞用としてＰＥＢＰ２αＡを、軟骨細胞用としてＳＯＸ９を、脂肪細胞用としてＰＰＡＲγを、血管内皮細胞用としてｅＮＯＳ及びＴｉｅ−２を用いた。
【００４１】
（１）骨芽細胞への誘導条件では、細胞は類円形の形態を示し、培養１週間後には骨芽細胞に特異的な転写因子であるＰＥＢＰ２αＡ遺伝子の発現を認めた（図１３Ａ）。
（２）軟骨細胞への誘導条件では、細胞は細胞質に富むやや大型の類円形の形態を示し、培養１週間後には軟骨細胞に特異的な転写因子であるＳｏｘ９遺伝子の発現を認めた（図１３Ｂ）。
（３）脂肪細胞への誘導条件では、脂肪滴が出現し、培養１週間後には脂肪細胞に特異的な転写因子であるＰＰＡＲγ２遺伝子の発現を認めた（図１３Ｃ）。
（４）血管内皮細胞を維持する既知の条件でＭＯＭＣ様の紡錘形細胞を培養したところ、小突起を有する多型性の形態となり、血管内皮に特異的なｅＮＯＳ遺伝子及びＴｉｅ−２遺伝子の発現が確認された（図１３Ｄ及びＥ）。
上記（１）〜（４）の結果から、ＳＤＦ−１により誘導された紡錘形細胞は、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞及び血管内皮細胞への分化能を有することが明らかとなった。
【００４２】
実施例５及び６記載の実験結果より、ＳＤＦ−１によりＣＤ１４＋単球から誘導された細胞は、（１）紡錘形の形態を示すこと、（２）ＣＤ１４＋ＣＤ４５＋ＣＤ３４＋であること、さらに（３）多分化能を有することが明らかとなった。これらの性質はＭＯＭＣの特徴と一致していることから、ＳＤＦ−１がＭＯＭＣ分化誘導能を有する液性因子であることが明らかとなった。
【実施例７】
【００４３】
［末梢血単球のＣＸＣＲ４発現レベルがＭＯＭＣ分化能に及ぼす影響］
ＳＤＦ−１の受容体は、膜貫通型ケモカインレセプターＣＸＣＲ４であることが知られている。そこで、発明者らは、ＣＸＣＲ４を含む４種類のケモカインレセプター及び１種類のサイトカインレセプター（ＬＮＧＦＲ）の単球細胞膜上における発現レベルが、ＭＯＭＣ分化誘導効率に影響を及ぼすかどうかを検討した。検討したケモカインレセプターを以下に示す；
ＣＸＣＲ４（ＳＤＦ−１のレセプター）
ＣＣＲ１（ＭＩＰ１α、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ３、ＭＣＰ４のレセプター）
ＣＣＲ５（ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ２のレセプター）
ＣＸ３ＣＲ１（Ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅのレセプター）
ＬＮＧＦＲ（ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒの低親和性レセプター）
【００４４】
成人健常ドナーから得た静脈血について密度勾配遠心分離を行い、ＰＢＭＣを単離した。更に抗ＣＤ１４抗体結合磁気ビーズを用いて前述のＰＢＭＣからＣＤ１４＋単球を分離した。得られた末梢血単球上のＣＤ１４と前述の各ケモカインレセプターの発現レベルをフローサイトメトリーにより評価した。代表的な結果として、ＣＸＣＲ４の発現をフローサイトメトリーで評価した結果を図１４に示す。
【００４５】
また、フローサイトメトリーを用いて、前述のＣＤ１４＋単球を、前述の各ケモカインレセプターを高発現するＣＤ１４＋単球細胞群と、それらのケモカインレセプターを低発現するＣＤ１４＋単球細胞群とに分離した。また、コントロールとして、ＣＤ１４＋ＣＤ１１ｂ＋細胞群を、フローサイトメトリーを用いて前述のＣＤ１４＋単球から分離した。それぞれの細胞群（細胞集団）を１０％ＦＢＳ添加低グルコースＤＭＥＭ培地に懸濁したのち、フィブロネクチンをコートしたプレート上で血小板と共培養した。培養７〜１０日後にそれぞれの細胞群の紡錘形細胞数をカウントし、ＭＯＭＣへの分化能を比較した。ＣＸＣＲ４レセプターに関していうと、ＣＤ１４＋ＣＸＣＲ４ｌｏｗ細胞群では、０．１ｍｍ２あたりの紡錘形細細胞は、コントロール細胞群の場合（６．０±０．６個）とほぼ同等の５．７±０．４個であった（図１５）のに対し、ＣＤ１４＋ＣＸＣＲ４ｈｉｇｈ細胞群では１１．５±０．９個と顕著に高い値を示した（図１５）。一方、図１６〜１９に示すように、ＣＸＣＲ４以外のケモカインレセプターに関しては、それらのケモカインレセプターが高発現している細胞群においてＭＯＭＣ分化能が向上しているという関係は認められなかった。例えば、ＣＣＲ１及びＬＮＧＦＲでは、それらのケモカインレセプターを高発現する細胞と低発現する細胞とでは、ＭＯＭＣ分化能はほぼ同じであり、ＣＣＲ５及びＣＸ３ＣＲ１では、それらのケモカインレセプターを高発現する細胞の方がむしろやや低い（有意ではない；Ｐ＞０．０５）ＭＯＭＣ分化能を示した。
これらの結果は、単球細胞のＭＯＭＣ分化能がＣＸＣＲ４発現レベルに依存することを示すとともに、血小板由来の液性因子によるＭＯＭＣ誘導に、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４シグナルが重要な役割を果たしていることを裏付けるものである。
【００４６】
上記の結果から、末梢血単球からのＭＯＭＣ分化誘導には、１）接着因子としてフィブロネクチン中のＲＧＥドメインが、２）さらに液性因子としてＳＤＦ−１が必須であることが明らかとなった。また、３）ＣＸＣＲ４を高発現するＣＤ１４＋単球細胞は、ＭＯＭＣ分化能が高く、ＭＯＭＣ作製に適した細胞であることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】Ｉ型コラーゲンとフィブロネクチンのＭＯＭＣ分化能を比較検討した結果を示す図である。
【図２】Ｉ型コラーゲンとフィブロネクチンのＭＯＭＣ分化能を比較検討した結果を示す図である。
【図３】接着分子であるインテグリンファミリーの種類とその性質を示す図である。
【図４】単球のインテグリンを、抗ＣＤ４９ｄ抗体、抗ＣＤ４９ｅ抗体、又は抗ＣＤ４９ｃ抗体によりブロックした時の、ＭＯＭＣ分化能を比較検討した結果を示す図である。
【図５】フィブロネクチンの構造を示す図である。
【図６】フィブロネクチンのＲＧＤ又はＣＳ−１ドメインと競合するペプチドを添加した時の、ＭＯＭＣ分化効率の変化を示す図である。
【図７】ＳＤＦ−１を用いた培養により出現したＭＯＭＣ様紡錘形細胞と、その出現頻度が添加したＳＤＦ−１濃度依存的に増加することを示す図である。
【図８】ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ｂＦＧＦ、及びＥＧＦのＭＯＭＣ誘導活性を調べた結果を示す図である。
【図９】ＩＬ−７、ＴＧＦ−β、ＥＮＡ７８、及びＧＲＯ−αのＭＯＭＣ誘導活性を調べた結果を示す図である。
【図１０】ＩＬ−８、ＭＩＰ−１α、ＮＡＰ−２、及びＰＦ−４のＭＯＭＣ誘導活性を調べた結果を示す図である。
【図１１】ＭＣＰ−３及びＴＡＲＣのＭＯＭＣ誘導活性を調べた結果を示す図である。
【図１２】ＳＤＦ−１により作製したＭＯＭＣ様紡錘形細胞におけるＣＤ１４とＣＤ３４の発現を、従来の方法で作製したＭＯＭＣでの発現と比較した結果を示す図である。
【図１３】ＳＤＦ−１により作製したＭＯＭＣ様紡錘形細胞の多分化能を検討した結果を示す図である。
【図１４】ＣＤ１４＋単球細胞集団におけるＣＸＣＲ４の発現を調べた結果である。
【図１５】ＣＤ１４＋ＣＸＣＲ４ｌｏｗ細胞とＣＤ１４＋ＣＸＣＲ４ｈｉｇｈ細胞のＭＯＭＣへの分化効率を比較検討した結果を示す図である。
【図１６】ＣＤ１４＋ＣＣＲ１ｌｏｗ細胞とＣＤ１４＋ＣＣＲ１ｈｉｇｈ細胞のＭＯＭＣへの分化効率を比較検討した結果を示す図である。
【図１７】ＣＤ１４＋ＣＣＲ５ｌｏｗ細胞とＣＤ１４＋ＣＣＲ５ｈｉｇｈ細胞のＭＯＭＣへの分化効率を比較検討した結果を示す図である。
【図１８】ＣＤ１４＋ＣＸ３ＣＲ１ｌｏｗ細胞とＣＤ１４＋ＣＸ３ＣＲ１ｈｉｇｈ細胞のＭＯＭＣへの分化効率を比較検討した結果を示す図である。
【図１９】ＣＤ１４＋ＬＮＧＦＲｌｏｗ細胞とＣＤ１４＋ＬＮＧＦＲｈｉｇｈ細胞のＭＯＭＣへの分化効率を比較検討した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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