(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞が培養される面に格子状に形成された第１の凸部と、
前記第１の凸部上に島状に配置された複数の第２の凸部と、
前記第１及び第２の凸部によって構成される複数のマイクロ空間構造と、
前記マイクロ空間構造の底面に、サンドブラスト法により形成された複数の微細な突起からなる突起群と、を備え、
前記微細な突起の幅または直径が２０ｎｍ〜３μｍであり、
前記微細な突起のアスペクト比が０．２〜１．０である細胞培養容器。
【請求項２】
前記微細な突起の幅または直径が２０ｎｍ〜４００ｎｍであり、透明性を有することを特徴とする請求項１に記載の細胞培養容器。
【請求項３】
細胞培養容器の全体または一部に、有機膜または無機膜が被覆されていることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞培養容器。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養容器の製造方法であって、
基板上にパターンを形成するステップと、
前記基板上に形成されたパターンまたはその転写パターンにしたがって金属を付着させ、金属構造体を形成するステップと、
前記金属構造体のパターンを転写して前記複数のマイクロ空間構造を形成するステップと、
前記マイクロ空間構造の底面に複数の微細な突起からなる突起群を形成するステップとを備えた細胞培養容器の製造方法。
【請求項５】
前記基板上にパターンを形成するステップにおいて、レジストパターンを形成するステップが、レジスト層が所望の高さまたは深さを有する構造体に形成されるまで、複数回レジスト層の形成、露光を繰り返すステップを含むことを特徴とする請求項４に記載の細胞培養容器の製造方法。
【請求項６】
前記複数回レジスト層の形成、露光を繰り返すステップにおいて、パターンの位置を合わせるためにマスク位置を合わせるステップを備えることを特徴とする請求項５に記載の細胞培養容器の製造方法。
【請求項７】
前記複数回レジスト層の形成、露光を繰り返すステップにおいて、異なるパターンのマスクを用いることを特徴とする請求項５または６に記載の細胞培養容器の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養容器およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞死は、アポトーシス（apoptosis）と、ネクローシス（necrosis）に大別される。アポトーシスとは、多細胞生物の体を構成する細胞の死に方の一種で、個体をより良い状態に保つために積極的に引き起こされる、管理・調節された細胞の自殺のことをいう。他方、ネクローシスとは、血行不良、外傷などによる細胞内外の環境の悪化によって起こる細胞死、すなわち壊死（えし）をいう。【０００３】
壊死は、生物の組織の一部分が死ぬことである。壊死は通常の死とは違い、体の一部分を構成する細胞だけが死滅する。感染、物理的破壊、化学的損傷、血流の減少などが原因となる。血流減少によるものを特に梗塞と呼ぶ。細胞の死ではあっても、血球、皮膚、消化管の粘膜上皮のように正常な細胞、組織が次々に補充され機能的な障害、組織学的な異常を残さないものは壊死と呼ばない。壊死した組織は、生体の免疫系によって最終的には取り除かれ、欠損部分は元の組織が再生したり線維化したりすることで補われる。【０００４】
このような細胞についての試験・研究には、組織から単離した細胞を培養する必要がある。近年、この細胞培養は、創薬開発、薬剤の産生、再生医療での基礎試験、薬物の効果判定等、多様な目的で実施され、バイオテクノロジー関連分野において欠かせない方法となっている。細胞培養器で培養される細胞の接着能は、細胞の分化・増殖能にとって極めて重要な因子であるため、研究開発のスピードを左右する。また、培養試験に用いられる細胞培養株は極めて高額であるため、試験コストにも直接影響する。【０００５】
プラスチック製シャーレ、ガラス製シャーレ、容器内に固定されたガラスプレート、ウェルプレート等の細胞培養容器で細胞を培養する場合、培養細胞から排出される炭酸ガスなどによるｐＨ変化は、培養細胞の活性に大きく影響することが知られている。このため、従来の長期間培養においては、研究者が定期的に培養液を交換することで、培養細胞の活性を保っている。【０００６】
また、特許文献１には、細胞培養容器の表面に、相当直径が１０ｎｍ〜１ｍｍである突起群が形成されていることを特徴とする細胞培養容器が提案されている。これは、突起群の形成により、培養液を細胞の下部に行き渡らせ、細胞の必要とする栄養物の供給と細胞の放出する老廃物の排出を促進するとともに、細胞と容器の接触を点接触にすることにより細胞の剥離時に生じる細胞の損傷を防ぐものである。
【特許文献１】特開２００５−１６８４９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、神経細胞や心筋、骨格筋のように再生しない組織の壊死や、神経細胞や心筋、肝臓細胞といった培養が難しいとされる組織の細胞死を抑制するためには、新鮮な培養液の交換だけでは、細胞死の抑制が実現できていないのが現状である。特に、培養が難しいとされる培養種では、新鮮な培養液の交換を行っても、最初に配置した細胞数に対する生存率は２０〜４０％程度である。【０００８】
また、特許文献１に示す方法によれば、突起群の形成により、培養液を細胞の下部に行き渡らせ、細胞の必要とする栄養物の供給と細胞の放出する老廃物の排出を促進することはできる。しかしながら、細胞と容器の接触が点接触になるため、細胞の接着斑となる擬似足場が基板表面に形成できなくなり、細胞が十分な分化・増殖を行うことができないという問題があった。【０００９】
本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであり、培養する細胞の生存率を高めることができる細胞培養容器およびその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明にかかる細胞培養容器は、細胞が培養される面に複数の微細な突起からなる突起群を備える細胞培養容器であって、前記微細な突起の幅または直径が２０ｎｍ〜３μｍであり、前記微細な突起のアスペクト比が０．２〜３．０であるものである。【００１１】
本発明にかかる細胞培養容器の製造方法は、基板上にパターンを形成するステップと、前記基板上に形成されたパターンまたはその転写パターンにしたがって金属を付着させ、金属構造体を形成するステップと、前記金属構造体のパターンを転写して細胞培養容器を形成するステップと、前記細胞容器の細胞が培養される面に複数の微細な突起からなる突起群を形成するステップとを備えたものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、培養する細胞の生存率を高めることができる細胞培養容器およびその製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】本発明の実施の形態１にかかる細胞培養容器の構成を模式的に示す図である。
【図１Ｂ】本発明の実施の形態１にかかる細胞培養容器の構成を模式的に示す図である。
【図２Ａ】本発明の実施の形態２にかかる細胞培養容器の構成を模式的に示す図である。
【図２Ｂ】本発明の実施の形態２にかかる細胞培養容器の構成を模式的に示す図である。
【図２Ｃ】本発明の実施の形態２にかかる細胞培養容器の構成を模式的に示す図である。
【図３Ａ】本発明の実施の形態２にかかる細胞培養容器の製造方法を模式的に示す図である。
【図３Ｂ】本発明の実施の形態２にかかる細胞培養容器の製造方法を模式的に示す図である。
【図３Ｃ】本発明の実施の形態２にかかる細胞培養容器の製造方法を模式的に示す図である。
【図３Ｄ】本発明の実施の形態２にかかる細胞培養容器の製造方法を模式的に示す図である。
【図３Ｅ】本発明の実施の形態２にかかる細胞培養容器の製造方法を模式的に示す図である。
【図３Ｆ】本発明の実施の形態２にかかる細胞培養容器の製造方法を模式的に示す図である。
【図３Ｇ】本発明の実施の形態２にかかる細胞培養容器の製造方法を模式的に示す図である。
【図３Ｈ】本発明の実施の形態２にかかる細胞培養容器の製造方法を模式的に示す図である。
【図４】本発明の実施例５にかかる細胞培養容器を模式的に示す平面図である。
【符号の説明】
【００１４】
１  微細な突起
２  凹部
３  第１の凸部
４  第２の凸部
５  ２段の凸部
６  第１の凸部の側壁
７  第２の凸部の側壁
１１  基板
１２  第１レジスト層
１３  マスクＡ
１４  第２レジスト層
１５  マスクＢ
１６  レジストパターン
１７  導電性膜
１８  金属構造体
１９  樹脂製成型品
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明者らは、鋭意研究した結果、プレート、シャーレ等の細胞培養容器において細胞が培養される面に形成される微細な突起の寸法およびアスペクト比を所望の範囲とすることで、培養細胞が接着、分化・増殖するのに最適な細胞培養容器を提供できることを見出した。以下に、本発明の実施の形態について図を用いて説明する。【００１６】
発明の実施の形態１
図１Ａは、実施の形態１にかかる細胞培養容器の構成を示した平面図であり、図１Ｂは図１ＡのＩＢ−ＩＢ'断面図である。実施の形態１にかかる細胞培養容器は、細胞を培養する面に微細な突起１を備えている。なお、図１Ａおよび図１Ｂに示す微細な突起１は四角柱状であるが、円柱状または多角柱状であってもよい。【００１７】
細胞が培養される面の微細な突起１の幅または直径は２０ｎｍ〜３μｍが好ましく、１００ｎｍ〜１．５μｍがより好ましい。微細な突起１の幅または直径が２０ｎｍよりも小さいと、約３μｍ〜２０μｍの直径を有する細胞が微細な突起１を認識することが困難となる。そのため、擬似足場となる接着斑を形成することが困難となり、細胞の分化・増殖速度は低下する。逆に微細な突起１の幅または直径が３μｍよりも大きいと、細胞の直径に近くなるため、擬似足場を形成することが困難となり、細胞の接着能は低下する。微細な突起１のアスペクト比は、細胞の擬似足場となる接着斑が到達し、かつ再現しやすい工業技術の観点から、０．２〜３．０が好ましく、０．５〜２．０がより好ましい。【００１８】
アスペクト比とは、細胞が培養される面の微細な突起１の幅または直径と高さとの比を示す。例えば、微細な突起１の直径が３μｍ、高さが９μｍの場合、アスペクト比は３．０となる。【００１９】
微細な突起１の形成法について述べる。以下にあげる方法は代表的な例であり、これに限定されるものではない。真空装置を用いたアルゴンプラズマ等によるエッチングは、幅または直径が３０ｎｍ前後の微細な突起１を形成することができる。真空蒸着法では、真空度、原材料と基板距離を調整することで、幅または直径が３０ｎｍ〜４００ｎｍ付近の微細な突起１を有する無機材料を形成することができる。幅または直径が４００ｎｍ〜３μｍの微細な突起１を形成する方法には、サンドブラスト法、ドライアイス洗浄、レーザーアブレーション、有機・無機粒子コーティング、電機メッキ、無電解メッキ、カニゼンメッキによる無機材料堆積等がある。【００２０】
微細な突起１はナノオーダーのパターンすなわちナノパターンにより形成することもできる。このナノパターンの形成法では、まず、電子線描画、Ｘ線露光、縮小露光等により、感光性樹脂またはシリコン基板上にナノパターンを形成する。次に、電気メッキにより金属製原盤を作製し、ナノインプリント成形法によりナノパターンプレートを作製する。これらの製造法では、微細な突起１のアスペクト比が３．０を超える場合、精密寸法を有する金属製原盤が必要となる。しかし、設備およびナノパターンを形成するための露光用マスクが高額となるため、作製するナノパターンプレートが高コストとなる問題を有していた。本発明者らは、鋭意研究した結果、細胞の接着、分化・増殖に適した微細な突起１のアスペクト比が０．２〜３．０であることを見出した。このため、低コスト化を実現することができる。【００２１】
培養細胞の観察では、倒立顕微鏡を用いた透過光観察が主流である。このため、細胞が培養される面に形成される微細な突起１の寸法およびアスペクト比には、波長４５０ｎｍ〜６００ｎｍの可視光を散乱させないこと、すなわち透明性が要求される。細胞の接着能、分化・増殖性能と透明性の両立する範囲として、微細な突起１の幅または直径が２０ｎｍ〜４００ｎｍ、アスペクト比が０．２〜１．０が好ましく、微細な突起１の幅または直径が１００ｎｍ〜３００ｎｍ、アスペクト比が０．５〜１．０がより好ましい。【００２２】
透過光観察を可能にするため、樹脂プレートをガラスプレートと同等の光透過率とするには、紫外線領域を含む波長３００ｎｍ〜８００ｎｍの光透過率を８０％以上、ヘイズ値を１０％以内とすることが好ましい。上記要求を満たすため、細胞培養容器には、紫外線吸収剤が含まれないアクリル樹脂を用いるか、ＰＣ（ポリカーボネイト）、ポリスチレン等の化学構造に環構造を有さない材料を選択する必要がある。また、酸化防止剤、粘度向上剤、耐熱安定剤、膠着防止剤等の添加物には、紫外線吸収剤が含まれていない必要がある。【００２３】
蛍光観察法では、蛍光色素を光らせるための光（励起光）は、細胞培養容器を透過しなければ、それにより発生した蛍光（蛍光放射光）を識別できない。したがって、細胞培養容器には高い光透過性が要求される。蛍光（蛍光放射光）を識別するために必要な透明性は、可視光の全光線透過率８０％以上、ヘイズ値１０％以内とする必要がある。上記要求を満たすため、細胞培養容器には、例えば、ポリメチルメタクリレート等の光学特性に優れる材料を用いることが好ましく、結晶性樹脂であるポリオレフィン系樹脂を用いる場合は、非結晶状態で用いることが好ましい。【００２４】
自家蛍光とは、ポリマー分子が紫外・可視光を吸収した後、光を放出して自ら蛍光を発することをいう。ガラスプレートは自家蛍光を発しないのに対し、樹脂プレートの多くは自家蛍光するため、サンプルから発生した蛍光（蛍光放射光）を識別できなくなり、蛍光分析の特徴である微量分析が困難となる。【００２５】
自家蛍光の影響を受けないためには、波長２３０ｎｍ〜８００ｎｍの光を照射することで自家蛍光しないことが要求される。そのため、細胞培養容器には、ＰＣ（ポリカーボネイト）、ポリスチレン等の化学構造に環構造を有しない樹脂材料を選択する必要がある。また、自家蛍光の可能性を極力排除するため、酸化防止剤、粘度向上剤、耐熱安定剤、膠着防止剤等の添加物は、できる限り少量とするか、添加しないことが好ましい。【００２６】
微分干渉観察法のコントラストを低下させずに、偏光顕微鏡や微分干渉顕微鏡により観察するために、光学ひずみの小さい材料が要求される。そのため、細胞培養容器には、ＰＣ（ポリカーボネイト）、ポリスチレン等の化学構造に環構造を有しない樹脂材料を選択する必要がある。【００２７】
細胞培養容器に有機膜または無機膜を被覆することで、親水化または疎水化することができる。これにより、微細な突起への気泡の付着防止や細胞の接着度合いを制御することができる。例えば、低温プラズマ処理、コロナ放電処理、紫外線照射等を用いる方法、細胞の接着を促すタンパク質であるコラーゲン等を塗布する方法がある。また、細胞培養容器の一部分をマスクすることにより、他の部分のみを有機膜または無機膜により被覆することもできる。これにより、培養試験条件の幅をさらに広くすることができる。【００２８】
発明の実施の形態２
上記の細胞が培養される面に、複数のマイクロ空間構造を有する樹脂製の細胞培養容器を用いることもできる。実施の形態２にかかる細胞培養容器の構成について図２Ａ、図２Ｂおよび図２Ｃを用いて説明する。図２Ａは、実施の形態２にかかる細胞培養容器の構成を示す平面図である。図２Ｂは、図２Ａに示された点線内の構成を拡大して示す平面図である。図２Ｃは、図２ＢのＩＩＣ−ＩＩＣ'断面図である。【００２９】
細胞培養容器には、図２Ａに示すように、複数のマイクロ空間構造を構成する凹凸パターンが形成されている。凹凸パターンは、図２Ｃに示すように、２段の階段状に形成されている。すなわち、細胞培養容器の細胞を培養する面に、格子状に形成された第１の凸部３と、その上に形成された直方体状の第２の凸部４からなる２段の凸部５が形成されている。この２段の凸部５により形成される空間が凹部２となる。すなわち、凹部２は、第１の凸部３により完全に囲まれた凹部と第２の凸部４により形成される凹部とからなる。第１の凸部３の側壁６および第２の凸部４の側壁７は底面に対して略垂直に形成されている。さらに凹部２の底面に微細な突起１が形成されている。なお、微細な突起１は、細胞を培養する面の全体に形成されていてもよく、また、一部に形成されていてもよい。【００３０】
第１の凸部３は、図２Ａに示すように矩形状の凹部２の四辺を囲むよう格子状に配置されている。第２の凸部４は、隣接する凹部２の間の第１の凸部３の上に島状に配置されている。第２の凸部４は、矩形状の凹部２の四辺のそれぞれに設けられている。そのため、凹部２は完全には仕切られておらず、矩形状の凹部２の４つの頂点部分において、隣接する凹部２と連通している。なお、凹凸パターンを２段以上の階段状に形成することが好ましいが、１段でもよい。【００３１】
上記の複数のマイクロ空間構造を有する樹脂製の細胞培養容器に、所望の幅または直径およびアスペクト比を満足する微細な突起１を形成することで、細胞の接着能、分化・増殖機能に加え、細胞の伸展方向や形態の制御試験等、幅広い用途に提供することができる。また、この細胞培養容器は、従来のパターン付きガラス製プレートと対比しても充分に高い精度を発揮することができる。さらに、細胞培養容器を安価に形成することができるため、その利点を発揮できるような産業上大量に使用される用途に、特に適している。【００３２】
上記の細胞が培養される面に、複数のマイクロ空間構造を有する樹脂製の細胞培養容器の製造方法について説明する。この製造方法は、基板上にマイクロ空間構造を形成するステップと、基板上に形成されたマイクロ空間構造パターンまたはその転写パターンにしたがって金属を付着させ、前記樹脂プレートの構造パターンの反対パターンを有する金属構造体を形成するステップと、前記金属構造体のパターンを転写して樹脂プレートを形成するステップとを備える。【００３３】
詳細には以下の通りである。
（i）基板上への第１レジスト層の形成
（ii）基板とマスクＡとの位置合わせ
（iii）マスクＡを用いた第１レジスト層の露光
（iv）第１レジスト層の熱処理
（v）第１レジスト層上への第２レジスト層の形成
（vi）基板とマスクＢとの位置合わせ
（vii）マスクＢを用いた第２レジスト層の露光
（viii）第２レジスト層の熱処理
（ix）レジスト層の現像
を行い、所望のレジストパターンを形成する。
（x）さらに、形成されたレジストパターンを導電化処理した後、形成されたレジストパターンにしたがって、基板上に金属構造体をメッキにより堆積させる。
（xi）この金属構造体を型として、樹脂成形品を形成する
ことによって、細胞培養容器が製造される。
（v）〜（viii）の工程は任意であり、省略できる。一方、（v）〜（viii）の工程を複数回繰り返すこともできる。【００３４】
レジストパターン形成処理についてさらに詳細に説明する。
基板上に、例えば、深さ３０μｍと深さ１００μｍの構造体を得ようとした場合、第１レジスト層（厚さ７０μｍ）、第２レジスト層（厚さ３０μｍ）順に形成し、各層に露光、または露光、熱処理を行う。現像工程では、最初に第２レジスト層である深さ３０μｍのパターンが得られ、次に第１レジスト層と第２レジスト層を合わせた深さ１００μｍのパターンが得られる。深さ１００μｍのパターンが得られた時点で、第２レジスト層である深さ３０μｍのパターンを現像液に溶解、または変形させないためには、各層の現像液への溶解性を制御させることが要求される。【００３５】
光分解型のポジ型レジストを用いて、耐アルカリ性を発現させる方法の一つとして、ベーク時間（溶剤の乾燥時間）を長くし、レジストを硬化させることがあげられる。通常、レジストは膜厚、シンナー等の溶剤濃度および感度に応じてベーク時間を設定している。この時間を長くすることによって耐アルカリ性を持たせることができる。また、第１レジスト層のベークが進行しすぎると、レジストが極度に硬化し、後の現像において光が照射された部分を溶解させパターンを形成することが困難になることから、ベーク時間を短くする等、適宜選択することが好ましい。ベークに用いる装置は、溶剤を乾燥できれば特に限定されるものではなく、オーブン、ホットプレート、熱風乾燥機等があげられる。光分解型のポジ型レジストは光架橋型のネガ型レジストと比較して、耐アルカリ性の発現幅は制限されるため、設定するレジスト厚さは、各層を合わせて５〜２００μｍの範囲内が好ましく、１０〜１００μｍの範囲内であることがより好ましい。【００３６】
光架橋型のネガ型レジストを用いて耐アルカリ性を発現させる方法として、ベーク時間の最適化の他に、架橋密度の最適化があげられる。通常、ネガ型レジストの架橋密度は、露光量によって設定することができる。化学増幅系ネガ型レジストの場合、露光量および熱処理時間によって架橋密度を設定することができる。この露光量、または熱処理時間を長くすることによって、耐アルカリ性を発現させることができる。光架橋型のネガ型レジストの場合、設定するレジスト厚さは、各層を合わせて５〜５００μｍの範囲内が好ましく、１０〜３００μｍの範囲内であることがより好ましい。【００３７】
（i）基板１１上への第１レジスト層１２の形成について説明する。
図３Ａに基板１１上に第１レジスト層１２が形成された状態を示す。成形品形成ステップで得られる樹脂製細胞容器の平面度は、基板１１上へ第１レジスト層１２を形成する工程で決定づけられる。すなわち、基板１１上に第１レジスト層１２を形成した時点の平面度が金属構造体、ひいては細胞培養容器の平面度に反映される。【００３８】
基板１１上に第１レジスト層１２を形成する方法は何ら限定されないが、一般的にスピンコート方式、ディッピング方式、ロール方式、ドライフィルムレジストの貼り合わせ等を挙げることができる。なかでも、スピンコート方式は、回転しているガラス基板上にレジストを塗布する方法で、直径３００ｍｍを超えるガラス基板にレジストを高い平面度で塗布する利点がある。従って、高い平面度を実現できる観点から、スピンコート方式が好ましい。【００３９】
第１レジスト層１２として用いられるレジストは、ポジ型レジスト、ネガ型レジストのいずれもでもよい。いずれの場合も、レジストの感度、露光条件により、レジストの焦点深度が変わる。そのため、例えば、ＵＶ露光装置を用いた場合、露光時間、ＵＶ出力値をレジスト厚さ、感度に応じて種類を選択するのが好ましい。【００４０】
第１レジスト層１２として用いるレジストがウェットレジストの場合、例えば、スピンコート方式で所定のレジスト厚さを得る方法としては、スピンコート回転数の変更や粘度調整による方法がある。スピンコート回転数の変更による方法は、スピンコーターの回転数を適宜設定することによって所望のレジスト厚さを得るものである。粘度調整による方法は、レジスト厚さが厚い場合や塗布面積が大きい場合に、平面度が低下することが懸念されるため、実際使用上で要求される平面度に応じて粘度を調整するものである。【００４１】
例えばスピンコート方式の場合、１回で塗布するレジスト層の厚さは、高い平面度を保持することを考慮し、好ましくは１０〜５０μｍ、さらに好ましくは、２０〜５０μｍの範囲内であることが好ましい。高い平面度を保持したうえで、所望のレジスト層の厚さを得るためには、レジスト層を複数回に分けて形成することができる。【００４２】
第１レジスト層１２にポジ型レジストを用いた場合、ベーク時間（溶剤の乾燥）が過度に進行しすぎると、レジストが極度に硬化し、後の現像においてパターンを形成することが困難になることから、設定するレジスト厚さが１００μｍ以上でない場合、ベーク時間を短くする等、適宜選択することが好ましい。【００４３】
（ii）基板１１とマスクＡ１３との位置合わせについて説明する。
第１レジスト層１２のパターンと、第２レジスト層１４のパターンにおける位置関係を所望の設計通りにするためには、マスクＡ１３を用いた露光時に、正確な位置合わせを行うことが必要となる。位置合わせには、基板１１とマスクＡ１３の同位置に切削加工を施しピン固定する方法、レーザー干渉計を用い位置だしする方法、基板１１とマスクＡ１３の同位置に位置マークを作製、光学顕微鏡で位置合わせをする方法等があげられる。光学顕微鏡で位置合わせをする方法は、例えば、フォトリソグラフ法にて基板１１に位置マークを作製し、マスクＡ１３にはレーザー描画装置で位置マークを描画する。光学顕微鏡を用いた手動操作においても、５μｍ以内の精度が簡単に得られる点で有効である。【００４４】
（iii）マスクＡ１３を用いた第１レジスト層１２の露光について説明する。
図３Ｂに示される工程で使用するマスクＡ１３は何ら限定されないが、エマルジョンマスク、クロムマスク等を挙げることが出来る。レジストパターン形成ステップでは、使用するマスクＡ１３によって寸法、および精度が左右される。そして、その寸法、および精度は、樹脂製細胞培養容器にも反映される。したがって、樹脂製細胞培養容器の各寸法、および精度を所定のものとするためには、マスクＡ１３の寸法、および精度を規定する必要がある。マスクＡ１３の精度を高める方法は何ら限定されないが、例えば、マスクＡ１３のパターン形成に使用するレーザー光源をより波長の短いものに変えることを挙げることができるが、設備費用が高額であり、マスクＡ１３製作費が高額となるため、樹脂製細胞培養容器が実用的に要求される精度に応じて適宜規定するのが好ましい。【００４５】
マスクＡ１３の材質は温度膨張係数、ＵＶ透過吸収性能の面から石英ガラスが好ましいが比較的高価であるため、樹脂成形品が実用的に要求される精度に応じて適宜規定するのが好ましい。設計通りの所望の深さまたは高さが異なる構造体、あるいは、第１レジストパターンと第２レジストパターンが異なる構造体を得るには、第１レジスト層１２および第２レジスト層１４の露光に用いるマスクのパターン設計（透過／遮光部）が確実であることが必要であり、ＣＡＥ解析ソフトを用いたシミュレーションもその解決策の一つである。【００４６】
露光に用いられる光源は設備費用が安価である紫外線またはレーザー光であることが好ましい。シンクロトロン放射光は、設備費用が高額であり、実質的に樹脂プレートの価格が高額となるものの、露光深度が深いものを得たい場合などに用いることができる。【００４７】
露光時間や露光強度等の露光条件は第1レジスト層１２の材質、厚み等により変化するため、得られるパターンに応じて適宜調節することが好ましい。特に空間構造パターンの寸法、および精度に影響を与えるため、露光条件の調節は重要である。また、レジストの種類により焦点深度が変わるため、例えばＵＶ露光装置を用いた場合、露光時間、ＵＶ出力値をレジストの厚さ、感度に応じて選択するのが好ましい。【００４８】
（iv）第１レジスト層１２の熱処理について説明する。
露光後の熱処理は、レジストパターンの形状を補正するためにアニールといわれる熱処理が知られている。ここでは、化学架橋を目的とし、化学増幅系ネガ型レジストを用いた場合のみに熱処理を行う。化学増幅系ネガ型レジストとは、主に、２成分系または３成分系からなり、露光時の光によって、例えば、化学構造の末端のエポキシ基が開環し、熱処理によって架橋反応させるものである。熱処理時間は、例えば膜厚１００μｍの場合、設定温度１００℃の条件下においては数分で架橋反応は進行する。【００４９】
第１レジスト層１２の熱処理が進行しすぎると、後の現像において未架橋部分を溶解させパターンを形成することが困難になることから、設定するレジスト厚さが１００μｍ以上でない場合、熱処理時間を短くする、または後の第２レジスト層１４の熱処理のみとする等、適宜選択することが好ましい。【００５０】
（v）第１レジスト層１２上への第２レジスト層１４の形成について説明する。
図３Ｃに第２レジスト層１４が形成された状態を示す。この第２レジスト層１４の形成は、上記（i）において説明した第１レジスト層１２の形成と同様の方法による。また、スピンコート方式にて、ポジ型レジストを使用してレジスト層を形成する場合、ベーク時間を通常の１．５〜２．０倍程度とすることで、耐アルカリ性を発現させることができる。これにより、第１レジスト層１２と第２レジスト層１４の現像終了時、第２レジスト層１４のレジストパターンの溶解、または変形を防止することができる。【００５１】
（vi）基板１１とマスクＢ１５との位置合わせについて説明する。
基板１１とマスクＢ１５との位置合わせは、上記（ii）について説明した、基板１１とマスクＡ１３との位置合わせと同様の方法による。【００５２】
（vii）マスクＢ１５を用いた第２レジスト層１４の露光について説明する。
マスクＢ１５を用いた第２レジスト層１４の露光は、上記（iii）において説明したマスクＡ１３を用いた第１レジスト層１２の露光と同様の方法による。図３Ｄに第２レジスト層１４の露光の様子を示す。【００５３】
（viii）第２レジスト層１４の熱処理について説明する。
第２レジスト層１４の熱処理は、上記（iv）において説明した第１レジスト層１２の熱処理と同様の方法による。また、第２レジスト層１４の熱処理は、後の現像において第１レジスト層１２のパターンが得られた時点で、第２レジスト層１４のパターンが溶解、または変形させないために行う。熱処理によって化学架橋が進行し、架橋密度を高めることで耐アルカリ性が発現する。耐アルカリ性を発現させるための熱処理時間は、通常の１．１〜２．０倍の範囲からレジストの厚さに応じて適宜選択することが好ましい。【００５４】
（ix）レジスト層１２および１４の現像について説明する。
図３Ｅに示す現像工程では、用いたレジストに対応する所定の現像液を用いることが好ましい。現像時間、現像温度、現像液濃度等の現像条件はレジスト厚みやパターン形状に応じて適宜調節することが好ましい。例えば、必要な深さを得るために現像時間を長くしすぎると、所定の寸法よりも大きくなってしまうため、適宜条件を設定することが好ましい。この現像工程により、レジストパターン１６が形成される。【００５５】
細胞培養容器の上面、または微細パターン底部の平面精度を高める方法としては、例えば、レジスト塗布で使用するレジスト種類（ネガ型、ポジ型）を変更する方法、金属構造体の表面を研磨する方法などがあげられる。【００５６】
なお、所望の造型深さを得るために複数のレジスト層を形成する場合、それら複数のレジスト層を同時に露光・現像処理する、あるいは、一つのレジスト層を形成および露光処理した後、さらにレジスト層の形成および露光処理を行い、２つのレジスト層を同時に現像処理することができる。【００５７】
（x）金属構造体形成ステップについてさらに詳細に説明する。
金属構造体形成ステップとはレジストパターン形成ステップで得られたレジストパターン１６に沿って金属を堆積させ、金属構造体１８のマイクロ空間構造面をレジストパターン１６に沿って形成することにより、金属構造体１８を得る工程である。【００５８】
図３Ｆに示すように、この工程では予めレジストパターン１６に沿って導電性膜１７を形成する。導電性膜１７の形成方法は、特には限定されないが、好ましくは、真空蒸着法、スパッタリング法等による。導電性膜１７に用いられる導電性材料としては金、銀、白金、銅、アルミニウムなどを挙げることができる。【００５９】
図３Ｇに示すように、導電性膜１７を形成した後、レジストパターン１６に沿って金属をメッキにより堆積させ、金属構造体１８を形成する。メッキ方法は特に限定されないが、例えば電解メッキ、無電解メッキ等を挙げることができる。用いられる金属は特に限定されないが、ニッケル、ニッケル−コバルト合金、銅、金を挙げることができ、経済性・耐久性の観点からニッケルが好ましく用いられる。【００６０】
金属構造体１８はその表面状態に応じて研磨しても構わない。ただし、汚れが造形物に付着することが懸念されるため、研磨後、超音波洗浄を実施することが好ましい。また、金属構造体１８はその表面状態を改善するために、離型剤等で表面処理しても構わない。なお、金属構造体１８の深さ方向の傾斜角度は、樹脂成形品の形状から５０°〜９０°であることが望ましく、より望ましくは６０°〜８７°である。メッキにより堆積した金属構造体１８はレジストパターン１６から分離される。【００６１】
（xi）成形品形成ステップについて詳細に説明する。
成形品形成ステップは、図３Ｈに示すように、前記金属構造体１８を型として、樹脂成形品１９を形成する工程である。樹脂成形品１９の形成方法は特に限定されないが、例えば射出成形、プレス成形、モノマーキャスト成形、溶剤キャスト成形、押出成形によるロール転写法等を挙げることができ、生産性、型転写性の観点から射出成形が好ましく用いられる。所定の寸法を選択した金属構造体１８を型として射出成形で樹脂成形品１９を形成する場合、金属構造体１８の形状を高い転写率で樹脂成形品１９に再現することができる。転写率を確認する方法としては、光学顕微鏡、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）等を用いる方法がある。【００６２】
樹脂成形品１９の平面度の最小値は、工業的に再現し易い観点から１μｍ以上であることが好ましい。樹脂成形品１９の平面度の最大値は、例えば、該成形品に反り等が発生して光学系ユニットと接触しない等、支障とならない観点から２００μｍ以下であることが好ましい。樹脂成形品の造形部に対する寸法精度は、工業的に再現し易い観点から±０．５〜１０％の範囲内であることが好ましい。【００６３】
以下に、本発明にかかる実施例および比較例を示す。これらの実施例および比較例は、微細な突起の寸法およびアスペクト比を変量し、培養細胞の接着能および分化・増殖能を解析したものである。微細な突起の寸法およびアスペクト比は、株式会社アルバック製の表面形状測定器（ＤＥＫＴＡＫ３０３０）による触針法にて測定した。光学物性値である全光透過率およびヘイズ値は、株式会社スガ試験機製の可視光線透過率計（型式：ＨＡ−ＴＲ）を用いて測定した。具体的には、全光線透過率をＪＩＳ  Ｋ６７１４に準拠した方法で２回測定し、その平均値を求めた。また、細胞の接着能は、比色分析法であるCrystal Violet法で解析した。細胞の分化・増殖能は、比色分析法であるＭＴＴ法で解析し、比較例１を１００％とした。【００６４】
Crystal Violet法は、Crystal Violetが生細胞に取り込まれることを利用した比色分析法である。具体的には、５．０×１０５個のＨｅＬａ細胞をインキュベーター内で２時間かけて培養した後、生理食塩水で洗浄し、基板に接着している細胞と、浮遊（死んでいる）細胞とを区分した。次に、Crystal Violetで染色した後、ＳＤＳ（sodium dodecyl sulfate)溶液を用いて基板に付着している細胞を溶解し、波長５４０ｎｍの吸光度を測定し、比較例１と比較した。【００６５】
ＭＴＴ法は、ＭＴＴ（テトラゾリウム塩の一種）が細胞内の脱水素酵素による反応によって、ホルマザンに変化することを利用した染色法である。細胞が元気な場合は酵素活性が高く、ホルマザンへの還元が高く、ホルマザン濃度が高くなる。この濃度差を吸光度として細胞数計測に利用したものである。具体的には、５．０×１０５個のＨｅＬａ細胞をインキュベーター内で３時間かけて培養した後、生理食塩水で洗浄し、基板に接着している細胞と、浮遊（死んでいる）細胞とを区分した。インキュベーター内で４８時間かけて培養した後、ＭＴＴを含む培養液と交換しさらに３時間培養を続けた。そして、イソプロパノールを加えてホルマザンを溶解、波長５７０ｎｍの吸光度を測定し、比較例１と比較した。【００６６】
［比較例１］
市販の滅菌済みのポリスチレン製シャーレ（φ９０ｍｍ−深さ２０ｍｍ）を用いた。培養される面の突起形状は、幅１０ｎｍ、アスペクト比０．０５であった。光学物性値は、全光線透過率８７％、ヘイズ値２．０％であった。【００６７】
［比較例２］
株式会社クラレ製のアクリル樹脂（パラペットＧＨ−Ｓ）を使用し、射出成形法により、幅２４ｍｍ、長さ７４ｍｍ、厚さ１．０ｍｍの樹脂プレートを作製した後、滅菌を行った。樹脂プレートの表面にあたる金型鏡面は、光メディアにも対応可能な鏡面仕上げを施した。培養される面の突起形状は、幅７ｎｍ、アスペクト比０．１であった。光学物性値は、全光線透過率９１％、ヘイズ値２．１％であった。【００６８】
［比較例３］
株式会社クラレ製のアクリル樹脂（パラペットＧＨ−Ｓ）を使用し、射出成形法により、幅２４ｍｍ、長さ７４ｍｍ、厚さ１．０ｍｍの樹脂プレートを作製した後、滅菌を行った。樹脂プレートの表面にあたる金型鏡面は、汎用の樹脂用を用いた。培養される面の突起形状は、幅１５ｎｍ、アスペクト比０．１であった。光学物性値は、全光線透過率９０％、ヘイズ値２．８％であった。【００６９】
［比較例４］
株式会社クラレ製のアクリル樹脂（パラペットＧＨ−Ｓ）を使用し、射出成形法により、幅２４ｍｍ、長さ７４ｍｍ、厚さ１．０ｍｍの樹脂プレートを作製した後、滅菌を行った。樹脂プレートの表面にあたる金型には、幅５．５μｍ、アスペクト比５を有するスタンパーを固定して成形した。培養される面の突起形状は、幅５μｍ、アスペクト比４．５であった。光学物性値は、全光線透過率７２％、ヘイズ値２５．６％であった。【００７０】
［実施例１］
株式会社クラレ製のアクリル樹脂（パラペットＧＨ−Ｓ）を使用し、射出成形法により、幅２４ｍｍ、長さ７４ｍｍ、厚さ１．０ｍｍの樹脂プレートを作製した後、滅菌を行った。樹脂プレートの表面にあたる金型鏡面は、汎用の樹脂用を用いた。次に、樹脂プレート上にサンドブラスト処理を行い、培養される面に微細な突起を形成した。培養される面の突起形状は、幅２．５μｍ、アスペクト比２．０であった。光学物性値は、全光線透過率７６％、ヘイズ値１７．３％であった。【００７１】
［実施例２］
株式会社クラレ製のアクリル樹脂（パラペットＧＨ−Ｓ）を使用し、射出成形法により、幅２４ｍｍ、長さ７４ｍｍ、厚さ１．０ｍｍの樹脂プレートを作製した後、滅菌を行った。樹脂プレートの表面にあたる金型鏡面は、汎用の樹脂用を用いた。次に、樹脂プレート上にサンドブラスト処理を行い、培養される面に微細な突起を形成した。そして、株式会社アルバック（型式：ＵＥＰ）の蒸着装置を用い、真空蒸着法により微細な突起上に無機膜を堆積させた。蒸着に用いたターゲット材料は、ＳｉＯ２とし、膜厚は０．５μｍとした。培養される面の突起形状は、幅８００ｎｍ、アスペクト比１．０であった。光学物性値は、全光線透過率７８％、ヘイズ値１３．８％であった。【００７２】
［実施例３］
株式会社クラレ製のアクリル樹脂（パラペットＧＨ−Ｓ）を使用し、射出成形法により、幅２４ｍｍ、長さ７４ｍｍ、厚さ１．０ｍｍの樹脂プレートを作製した後、滅菌を行った。樹脂プレートの表面にあたる金型鏡面は、汎用の樹脂用を用いた。次に、株式会社アルバック製の蒸着装置（型式：ＵＥＰ）を用い、真空蒸着法により微細な突起を形成した。蒸着に用いたターゲット材料は、ＳｉＯ２とし、膜厚は０．２μｍとした。培養される面の突起形状は、幅２８０ｎｍ、アスペクト比１．０であった。光学物性値は、全光線透過率８８％、ヘイズ値３．０％であった。【００７３】
［実施例４］
株式会社クラレ製のアクリル樹脂（パラペットＧＨ−Ｓ）を使用し、射出成形法により、幅２４ｍｍ、長さ７４ｍｍ、厚さ１．０ｍｍの樹脂プレートを作製した後、滅菌を行った。樹脂プレートの表面にあたる金型鏡面は、汎用の樹脂用を用いた。次に、株式会社アルバック製の蒸着装置（型式：ＵＥＰ）を用い、真空蒸着法により微細な突起を形成した。蒸着に用いたターゲット材料は、ＳｉＯ２とし、膜厚は０．１μｍとした。培養される面の突起形状は、幅１５０ｎｍ、アスペクト比０．８であった。光学物性値は、全光線透過率９０％、ヘイズ値２．５％であった。【００７４】
［実施例５］
株式会社クラレ製のアクリル樹脂（パラペットＧＨ−Ｓ）を使用し、スタンパーを使用した射出成形法により、幅２４ｍｍ、長さ７４ｍｍ、厚さ１．０ｍｍの樹脂プレート上に、高さ２０μｍの複数の側壁によって形成されたマイクロ空間構造を有するプレートを作製した。図４は、実施例５にかかる細胞培養容器の構成を示す平面図である。これは、図２に示す第1の突起３が無く、第２の突起４のみを有する構成である。この第２の突起４の寸法が、幅１０μｍ、長さ６０μｍ、高さ２０μｍであり、配列ピッチは縦・横ともに１００μｍである。樹脂プレートの表面にあたる金型鏡面は、汎用の樹脂用を用いた。この樹脂プレートを、滅菌した後、株式会社アルバック製の蒸着装置（型式：ＵＥＰ）を用い、真空蒸着法により微細な突起を形成した。蒸着に用いたターゲット材料は、ＳｉＯ２とし、膜厚は０．３μｍとした。培養される面の突起形状は、幅１８０ｎｍ、アスペクト比０．６であった。光学物性値は、全光線透過率８９％、ヘイズ値６．６％であった。【００７５】
以上の比較例および実施例の結果を表１にまとめて示す。【００７６】
【表１】
0005421588.tif 000002
【００７７】
比較例１と比較し、細胞が培養される面の突起幅が２０ｎｍよりも小さいまたは３μｍよりも大きいと細胞接着能は低下するまたは向上効果は認められなくなる。アスペクト比が０．２よりも小さいまたは３．０よりも大きいと、同様に、細胞接着能は低下するまたは向上効果は認められなくなる。突起幅、アスペクト比が大きくなると、透明性も損なわれる。【００７８】
実施例では、突起幅を２０ｎｍ〜３μｍ、アスペクト比を０．２〜３．０の範囲とすることで、比較例１よりも飛躍的に高い接着能を示す。本試験で用いたＨｅＬａ細胞では、突起幅が８００ｎｍで最も高い接着能を示した。細胞に応じてそのサイズ、活性が異なるため、細胞種別の最適値は変動することが予測されるが、所望の範囲内を満足すれば、接着性能に優れることが期待される。【００７９】
実施例３〜５においては、突起幅を４００ｎｍ以下とすることにより、高い透明性と細胞接着性の両方の性能を満足しており、透過光で観察を行う細胞観察用途において、その適用性の高いことが示されている。【００８０】
比較例１と比較し、細胞が培養される面の突起幅が２０ｎｍよりも小さいまたは３μｍよりも大きいと細胞の分化・増殖能は低下するまたは向上効果は認められなくなる。アスペクト比が０．２よりも小さいまたは３．０よりも大きいと、同様に、細胞の分化・増殖能は低下するまたは向上効果は認められなくなる。突起幅、アスペクト比が大きくなると、透明性も損なわれる。【００８１】
実施例では、突起幅を２０ｎｍ〜３μｍ、アスペクト比を０．２〜３．０の範囲とすることで、比較例１よりも飛躍的に高い細胞の分化・増殖能を示す。本試験で用いたＨｅＬａ細胞では、突起幅が８００ｎｍで最も高い細胞の分化・増殖能を示した。細胞に応じてそのサイズ、活性が異なるため、細胞種別の最適値は変動することが予測されるが、所望の範囲内を満足すれば、細胞の分化・増殖能に優れることが期待される。【００８２】
実施例３〜５においては、突起幅を４００ｎｍ以下とすることにより、高い透明性と細胞の分化・増殖能の両方の性能を満足しており、透過光で観察を行う細胞観察用途において、その適用性の高いことが示されている。特に実施例５では、褐色細胞腫（ＰＣ１２）の培養試験の結果、培養細胞相互にネットワークの形成が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明は、例えば、組織から単離した細胞を培養し、試験、検査に用いるための細胞培養容器に利用される。
【図１Ａ】
0005421588.tif 000003
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
0005421588.tif 000009
【図３Ｃ】
0005421588.tif 000010
【図３Ｄ】
0005421588.tif 000011
【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図４】
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