(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体のリンパ脈管形成を阻害するための薬剤であって、配列番号：２のアミノ酸残基２２−３５２、配列番号：４の残基２２−３４９、配列番号：６の残基２２−３４７、配列番号：８の残基２２−３５０、又は配列番号：１０の残基２２−３５０を含むＡＬＫ−１イムノアドヘシンの有効量を含有し、それによってリンパ脈管形成が阻害される薬剤。
【請求項２】
被検体が、腫瘍、癌、細胞増殖性疾患、黄斑変性、炎症媒介疾患、関節リウマチ、糖尿病性網膜症又は乾癬を患っている、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
被検体のリンパ脈管形成と関連する病的状態を治療するための医薬であって、配列番号：２のアミノ酸残基２２−３５２、配列番号：４の残基２２−３４９、配列番号：６の残基２２−３４７、配列番号：８の残基２２−３５０、又は配列番号：１０の残基２２−３５０を含むＡＬＫ−１イムノアドヘシンの有効量を含有してなり、それによってリンパ脈管形成と関連する病的状態が治療される医薬であって、該リンパ脈管形成と関連する病的状態が腫瘍、癌、細胞増殖性疾患、黄斑変性、炎症媒介疾患、関節リウマチ、糖尿病性網膜症又は乾癬である医薬。
【請求項４】
腫瘍、癌又は細胞増殖性疾患が、カルチノーマ、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫又は白血病である、請求項２又は３に記載の薬剤又は医薬。  
【請求項５】
被検体の腫瘍性リンパ脈管形成を阻害するための薬剤であって、配列番号：２のアミノ酸残基２２−３５２、配列番号：４の残基２２−３４９、配列番号：６の残基２２−３４７、配列番号：８の残基２２−３５０、又は配列番号：１０の残基２２−３５０を含むＡＬＫ−１イムノアドヘシンの有効量を含有してなり、それによって腫瘍性リンパ脈管形成が阻害される薬剤。
【請求項６】
被検体の腫瘍転移を阻害又は予防するための医薬であって、配列番号：２のアミノ酸残基２２−３５２、配列番号：４の残基２２−３４９、配列番号：６の残基２２−３４７、配列番号：８の残基２２−３５０、又は配列番号：１０の残基２２−３５０を含むＡＬＫ−１イムノアドヘシンの有効量を含有してなり、それによって腫瘍転移が阻害又は予防される医薬。 
【請求項７】
被検体が腫瘍転移を生じているか又は生じるリスクにある、請求項５又は６に記載の薬剤又は医薬。
【請求項８】
前記腫瘍転移がリンパ系にある、請求項７に記載の薬剤又は医薬。
【請求項９】
前記腫瘍転移が遠隔臓器にある、請求項７に記載の薬剤又は医薬。
【請求項１０】
被検体の周皮細胞組織を破壊するための薬剤であって、配列番号：２のアミノ酸残基２２−３５２、配列番号：４の残基２２−３４９、配列番号：６の残基２２−３４７、配列番号：８の残基２２−３５０、又は配列番号：１０の残基２２−３５０を含むＡＬＫ−１イムノアドヘシンの有効量を含有してなり、それによって周皮細胞組織が破壊される薬剤。
【請求項１１】
被検体が腫瘍、癌、細胞増殖性疾患、黄斑変性、炎症媒介疾患、関節リウマチ、糖尿病性網膜症又は乾癬を患っている、請求項１０に記載の薬剤。
【請求項１２】
被検体の腫瘍増殖を阻害するための薬剤であって、配列番号：２のアミノ酸残基２２−３５２、配列番号：４の残基２２−３４９、配列番号：６の残基２２−３４７、配列番号：８の残基２２−３５０、又は配列番号：１０の残基２２−３５０を含むＡＬＫ−１イムノアドヘシンの有効量を含有してなり、それによって腫瘍増殖が阻害される薬剤。
【請求項１３】
被検体の腫瘍、癌又は細胞増殖性疾患を治療するための医薬であって、配列番号：２のアミノ酸残基２２−３５２、配列番号：４の残基２２−３４９、配列番号：６の残基２２−３４７、配列番号：８の残基２２−３５０、又は配列番号：１０の残基２２−３５０を含むＡＬＫ−１イムノアドヘシンの有効量を含有してなり、それによって腫瘍、癌又は細胞増殖性疾患が治療される医薬。
【請求項１４】
腫瘍、癌又は細胞増殖性疾患が、カルチノーマ、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫又は白血病である、請求項１２又は１３に記載の薬剤又は医薬。
【請求項１５】
さらに、抗血管形成剤と併用される、請求項１２又は１３に記載の薬剤又は医薬。
【請求項１６】
抗血管形成剤が血管内皮性増殖因子(ＶＥＧＦ)のアンタゴニストである、請求項１５に記載の薬剤又は医薬。
【請求項１７】
ＶＥＧＦのアンタゴニストが抗ＶＥＧＦ抗体である、請求項１６に記載の薬剤又は医薬。
【請求項１８】
抗ＶＥＧＦ抗体がベバシズマブである、請求項１７に記載の薬剤又は医薬。
【請求項１９】
血管形成と関係する病的状態を有する被検体において抗血管形成剤の有効性を上げるための、配列番号：２のアミノ酸残基２２−３５２、配列番号：４の残基２２−３４９、配列番号：６の残基２２−３４７、配列番号：８の残基２２−３５０、又は配列番号：１０の残基２２−３５０を含むＡＬＫ−１イムノアドヘシンの有効量を含有してなる薬剤であって、該薬剤は抗血管形成剤と組み合わされ、これにより該抗血管形成剤の阻害活性が高まる薬剤であって、血管形成と関係する病的状態が腫瘍、癌又は細胞増殖性疾患である薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００７年１１月９日に出願の米国特許仮出願６０／９８６８７６と２００８年９月１９日出願の米国特許仮出願６１／０９８５５７の優先権を主張する。これらの内容の全体は出典明記によって本明細書中に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、血管形成および／またはリンパ脈管形成と関係する疾患の治療のためのアクチビンレセプター様キナーゼ-１(ＡＬＫ-１)のアンタゴニストの使用に関する方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
脈管供給の発達は、多くの生理学的及び病理学的なプロセスに基本的に必要である。胚及び腫瘍のような活発に発達する組織は十分な血液供給を必要とする。これは、血管新生と一般に呼ばれるプロセスにより新規な脈管形成を促すプロ血管新生因子を生産することによってこの必要性が満たされる。脈管形成は、以下の工程のすべて又は多数を伴う複雑であるが、規則正しい生物学的現象である：a) 内皮細胞(ＥＣ)が既存のＥＣから増殖するか又は始原細胞から分化する；b) ＥＣが移動して合体し、索状構造を形成する；c) 次いで脈管性索が管形成をして中央に内腔を有する脈管を形成する、d) 既存の索又は脈管から出芽して二次脈管を形成する；e) 原始脈管叢がさらに再造形及び再構築する；そして、f) 周囲に内皮細胞が集まり、内皮管を覆い、脈管に維持及び調節的な機能を与える；このような細胞には、小毛細管のための周細胞、より大きな脈管のための平滑筋細胞及び心臓の心筋細胞が含まれる。Hanahan, D. Science 277:48-50 (1997)；Hogan, B. L. & Kolodziej, P. A. Nature Reviews Genetics. 3:513-23 (2002)；Lubarsky, B. & Krasnow, M. A. Cell. 112:19-28 (2003)。
【０００４】
血管新生が様々な疾患の病因に関係することは、現在証明されている。これらには、固形腫瘍及び転移、アテローム性動脈硬化、水晶体後線維増殖、血管腫、慢性炎症、増殖性網膜症などの眼内新生血管性疾患、例えば糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性(ＡＭＤ)、新血管性緑内障、移植した角膜組織及び他の組織の免疫拒絶反応、関節リウマチ及び乾癬が含まれる。Folkman等, J. Biol. Chem., 267:10931-10934 (1992)；Klagsbrun等, Annu. Rev. Physiol. 53:217-239 (1991)；及びGarner A., "Vascular diseases", In: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds., 2nd Edition (Marcel Dekker, NY, 1994), pp 1625-1710。
【０００５】
腫瘍増殖の場合、血管新生は、過形成から腫瘍形成への変化に、そして、腫瘍の増殖及び転移のために栄養を提供するために重要であると思われる。Folkman等, Nature 339:58 (1989)。血管新生によって、腫瘍細胞は正常細胞よりも増殖優位性と増殖自立性を獲得しうる。通常、腫瘍は利用できる毛細管床から離れているため、数立方ミリメートルのサイズまでしか増殖できない単一の異常細胞として始まり、更なる増殖及び転移をせずに長期間「休止中の」ままで存在しうる。次いで、腫瘍細胞の中には血管新生の表現型に切り替わるものがあり、内皮細胞を活性化し、その内皮細胞が増殖して、新規な毛細血管の血管に成熟する。これらの新しく形成された血管は原発性腫瘍の連続した増殖を促すだけでなく、転移性腫瘍細胞の転移及び再コロニー形成化を促す。したがって、腫瘍切片の微小血管の密度と乳癌並びに多様な他の腫瘍における患者生存との間に相関性が観察されている。Weidner等, N. Engl. J. Med 324:1-6 (1991)；Horak等, Lancet 340:1120-1124 (1992)；Macchiarini等, Lancet 340:145-146 (1992)。血管新生の切り替わりを制御する正確なメカニズムは十分にわかっていないが、腫瘍質量の血管新生は多数の血管新生刺激因子及びインヒビターの最終的なバランスから生じる(Folkman, 1995, Nat Med 1(1): 27-31)。
【０００６】
転移が大多数、およそ９０％の固形腫瘍による死の原因となることは現在認められている(Gupta and Massague, Cell 127, 679-695 (2006))。転移の複雑な過程は、原発性腫瘍からの腫瘍細胞の剥離、リンパ管又は血管への腫瘍細胞の血管内異物侵入、および二次部位における腫瘍細胞の管外遊出および増殖を含む異なる一連の工程を伴う。多くの腫瘍タイプの領域リンパ節の分析により、リンパ脈管構造がヒトの癌播種の重要な手段であることが示唆されている。さらに、ほとんどすべてのカルチノーマにおいて、リンパ節の腫瘍細胞の存在は、最も重要な予後不良因子である。以前はこのような転移だけが腫瘍の近くの既存のリンパ管に沿って悪性細胞の移動を引き起こすと考えられていたが、最近の実験的研究と臨床病理学的な報告(Achen et al., Br J Cancer 94 (2006), 1355-1360およびNathanson, Cancer 98,413-423 (2003)に概説される)から、リンパ脈管形成が固形腫瘍によって誘導され、腫瘍拡散を促しうることが示唆されている。これらのそして他の最近の研究から、リンパ管およびリンパ脈管形成のターゲティングが癌転移の発達を制限するための有用な治療的方策であり得ることが示唆され、これは多くの患者に有意な利点となるであろう。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、ＡＬＫ−１経路を調整する薬剤が血管形成およびリンパ脈管形成を損なうことが可能であるという発見に、ある程度基づく。ＡＬＫ−１アンタゴニストによる治療により、内皮細胞出芽が増加し、周皮細胞が脱組織化され、腫瘍およびリンパ脈管構造を含む脈管が不適切に発達した。ＡＬＫ−１アンタゴニストで治療された腫瘍モデルは、数種類の癌において腫瘍増殖が阻害された。したがって、本発明は、周皮細胞組織化を破壊するため、血管形成及び／又はリンパ脈管形成を阻害するため、及び血管形成および／またはリンパ脈管形成と関係する病的状態をターゲティングするための、方法、組成物、キットおよび製造品を提供する。
一態様では、本発明は、リンパ脈管新生の阻害方法であって、リンパ脈管新生の阻害を必要とする被検体に有効量のＡＬＫ−１アンタゴニストを投与することを含み、それによってリンパ脈管新生が阻害される方法を提供する。ある実施態様では、被検体は、例えば、腫瘍、癌、細胞増殖性疾患、黄斑変性、炎症性媒介性疾患、関節リウマチ、糖尿病性網膜症又は乾癬を患っている。ある実施態様では、腫瘍、癌又は細胞増殖性疾患は、カルチノーマ、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫又は白血病である。
【０００８】
他の態様では、本発明は、被検体のリンパ脈管新生と関連する病的状態の治療方法であって、被検体に有効量のＡＬＫ−１アンタゴニストを投与することを含み、それによってリンパ脈管新生と関連する病的状態が治療される方法を提供する。リンパ脈管形成と関係する病的状態は、例えば、腫瘍、癌、細胞増殖性疾患、黄斑変性、炎症性媒介性疾患、関節リウマチ、糖尿病性網膜症又は乾癬であってもよい。ある実施態様では、腫瘍、癌又は細胞増殖性疾患は、カルチノーマ、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫又は白血病である。
また、本発明は、疾患、例えば血管形成又はリンパ脈管形成と関係する病的状態の治療上および／または予防上の処置のための医薬の調製における、ＡＬＫ−１アンタゴニストの使用を提供する。このような状態には、例えば、腫瘍、癌、細胞増殖性疾患、黄斑変性、炎症性媒介性疾患、関節リウマチ、糖尿病性網膜症又は乾癬が含まれる。また、腫瘍転移の治療上および／または予防上の処置のための医薬の調製におけるＡＬＫ−１アンタゴニストの使用が提供される。
【０００９】
更なる態様では、本発明は、被検体の腫瘍性リンパ脈管新生の阻害方法であって、被検体に有効量のＡＬＫ−１アンタゴニストを投与することを含み、それによって腫瘍性リンパ脈管新生が阻害される方法を提供する。また、被検体の腫瘍転移の阻害又は予防の方法であって、被検体に有効量のＡＬＫ−１アンタゴニストを投与することを含み、それによって腫瘍転移が阻害又は予防される方法が提供される。ある実施態様では、被検体は、腫瘍転移を生じているか又は生じるリスクにある。腫瘍転移は、例えば、リンパ系に、または、遠隔臓器にあってもよい。
他の態様では、本発明は、被検体の周皮細胞組織の破壊方法であって、被検体に有効量のＡＬＫ−１アンタゴニストを投与することを含み、それによって周皮細胞組織が破壊される方法を提供する。ある実施態様では、被検体は、例えば、腫瘍、癌、細胞増殖性疾患、黄斑変性、炎症性媒介性疾患、関節リウマチ、糖尿病性網膜症又は乾癬を患っている。ある実施態様では、腫瘍、癌又は細胞増殖性疾患は、カルチノーマ、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫又は白血病である。
【００１０】
さらに他の態様では、本発明は、被検体の腫瘍増殖の阻害方法であって、被検体に有効量のＡＬＫ−１アンタゴニストを投与することを含み、それによって腫瘍増殖が阻害される方法を提供する。また、本発明は、被検体の腫瘍、癌又は細胞増殖性疾患の治療方法であって、被検体に有効量のＡＬＫ−１アンタゴニストを投与することを含み、それによって腫瘍、癌又は細胞増殖性疾患が治療される方法を提供する。ある実施態様では、腫瘍、癌又は細胞増殖性疾患は、例えば、カルチノーマ、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫又は白血病である。
ある実施態様では、本発明の方法はさらに、被検体に有効量の抗血管形成剤を投与することを含む。ある実施態様では、抗血管形成剤は、血管内皮性増殖因子(ＶＥＧＦ)のアンタゴニスト、例えば抗ＶＥＧＦ抗体である。ある実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体はベバシズマブである。ある実施態様では、本発明の方法はさらに、一又は複数の化学療法剤を投与することを含む。
【００１１】
また、本発明は、血管形成と関係する病的状態を有する被検体において抗血管形成剤の有効性を上げる方法であって、抗血管形成剤と組み合わせて有効量のＡＬＫ−１アンタゴニストを被検体に投与することを含み、これにより該抗血管形成剤の阻害活性が高まる方法を提供する。ある実施態様では、血管形成と関係する病的状態は、腫瘍、癌又は細胞増殖性疾患である。
ある実施態様では、ＡＬＫ−１アンタゴニストは、ＡＬＫ−１イムノアドヘシンである。ある実施態様では、ＡＬＫ−１イムノアドヘシンは、配列番号：２のアミノ酸残基２２−３５２、配列番号：４の残基２２−３４９、配列番号：６の残基２２−３４７、配列番号：８の残基２２−３５０、又は配列番号：１０の残基２２−３５０を含む。他の実施態様では、ＡＬＫ−１アンタゴニストは、抗ＡＬＫ−１抗体又はその抗原結合断片である。
【００１２】
また、腫瘍転移の予防、阻害ないしは治療、又は腫瘍、癌又は細胞増殖性疾患の治療に使用するためのＡＬＫ-１アンタゴニストが提供される。ＡＬＫ−１アンタゴニストは、例えば、ＡＬＫ−１イムノアドヘシン又は抗ＡＬＫ−１抗体又はその抗原結合断片であってもよい。ある実施態様では、ＡＬＫ−１イムノアドヘシンは、配列番号：２のアミノ酸残基２２−３５２、配列番号：４の残基２２−３４９、配列番号：６の残基２２−３４７、配列番号：８の残基２２−３５０、又は配列番号：１０の残基２２−３５０を含む。また、本発明は、有効量のＡＬＫ−１アンタゴニストと薬学的に許容可能な担体とを含む、腫瘍、癌又は細胞増殖性疾患を治療するための組成物を提供する。ある実施態様では、ＡＬＫ−１アンタゴニストは、ＡＬＫ−１イムノアドヘシンである。ある実施態様では、ＡＬＫ−１イムノアドヘシンは、配列番号：２のアミノ酸残基２２−３５２、配列番号：４の残基２２−３４９、配列番号：６の残基２２−３４７、配列番号：８の残基２２−３５０、又は配列番号：１０の残基２２−３５０を含む。ある実施態様では、ＡＬＫ−１アンタゴニストは、抗ＡＬＫ−１抗体である。
一態様では、本発明は、容器と容器内に包含される組成物とを具備する製造品であって、該組成物がＡＬＫ−１アンタゴニストを含むものである製造品を提供する。他の態様では、本発明は、ＡＬＫ−１アンタゴニストと、ＡＬＫ−１アンタゴニストを使用するための指示書を具備するキットを提供する。また、治療上有効な量のＡＬＫ−１アンタゴニストを薬学的に許容可能な担体と混ぜることを含む、組成物の調製方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＡＬＫ１.Ｆｃ(５μｇ／ｍｌ)の非存在下(図１Ａ)及び存在下(図１Ｂ)で、三次元フィブリンゲルでのＨＵＶＥＣ出芽アッセイの９日目に撮影した相収縮電子顕微鏡画像である。
【図２】Ｐ１１に採取し、抗ＣＤ３１およびレクチン-ＦＩＴＣにて染色したラット網膜の共焦点画像である。出生後４日目(Ｐ４)、Ｐ６およびＰ９の新生仔ラットに、１０ｍｇ／ｋｇのＡＬＫ１.Ｆｃ又はＰＢＳを腹腔内投与した。
【図３】Ｐ１１に採取して、Ｃｙ３コンジュゲート抗α平滑筋アクチン(ＡＳＭＡ)およびレクチン-ＦＩＴＣにて染色したラット網膜の共焦点画像である。Ｐ４、Ｐ６およびＰ９の新生仔ラットに、１０ｍｇ／ｋｇのＡＬＫ１.Ｆｃ又はＰＢＳを腹腔内投与した。
【図４】Ｐ１１に採取して、Ｃｙ３コンジュゲート抗α平滑筋アクチン(ＡＳＭＡ)およびレクチン-ＦＩＴＣにて染色したラット網膜の共焦点画像である。Ｐ４、Ｐ６およびＰ９の新生仔ラットに、１０ｍｇ／ｋｇのＡＬＫ１.Ｆｃ又はＰＢＳを腹腔内投与した。
【図５】ＡＬＫ１.Ｆｃ(１０ｍｇ／ｋｇ)がＨＭ７(図５Ａ)およびＭＶ５２２(図５Ｂ)異種移植片の腫瘍増殖を阻害することを示すグラフである。ＳＥとともに平均腫瘍体積を表す。
【図６】ＡＬＫ１.Ｆｃ(１０ｍｇ／ｋｇ)がＣ６(図６Ａ)およびＣａｌｕ６(図６Ｂ)異種移植片の腫瘍増殖を阻害することを示すグラフである。ＳＥとともに平均腫瘍体積を表す。
【図７】ＨＭ７異種移植片においてＡＬＫ１.Ｆｃが抗ＶＥＧＦと併用されるときに、相加的抗腫瘍活性を有することを示すグラフである。
【図８】ＬＬ２異種移植片においてＡＬＫ１.Ｆｃが抗ＶＥＧＦと併用されるときに、相加的抗腫瘍活性を有することを示すグラフである。
【図９】ＰＢＳ(図９Ａ)、ＡＬＫ１.Ｆｃ(図９Ｂ)、抗ＶＥＧＦ抗体(Ｂ２０-４．１、５ｍｇ／ｋｇ)(図９Ｃ)又は抗ＶＥＧＦ抗体とＡＬＫ１.Ｆｃ(図９Ｄ)にて処置したＬＬ２腫瘍モデルマウスにおける腫瘍血管密度を示す共焦点画像である。
【図１０】ＰＢＳ(図１０Ａ)又はＡＬＫ１.Ｆｃ(図１０Ｂ)にて処置された新生仔マウスからの腸絨毛の共焦点画像である。組織は、毛細血管を示すために抗ＣＤ３１にて、そしてリンパ毛細管を示すために抗ＬＹＶＥ−１にて染色した。
【図１１】ＰＢＳ(図１１Ａ)又はＡＬＫ１.Ｆｃ(図１１Ｂ)にて処置された新生仔マウスからの単一の腸絨毛の共焦点画像である。組織は、毛細血管を示すために抗ＣＤ３１にて、そしてリンパ毛細管を示すために抗ＬＹＶＥ−１にて染色した。
【図１２】ＰＢＳ(図１２Ａ−Ｃ)又はＡＬＫ１.Ｆｃ(図１２Ｄ−Ｆ)にて処置された新生仔マウスからのマウス尾部皮膚の共焦点画像である。組織は、毛細血管を示すために抗ＣＤ３１にて、そしてリンパ毛細管を示すために抗ＬＹＶＥ−１にて染色した。
【図１３】ＰＢＳ(図１３Ａ)又はＡＬＫ１.Ｆｃ(図１３Ｂ)にて処置されたＴＩＢ６８腫瘍モデルマウスの周皮細胞組織を示す共焦点画像である。
【図１４】Ｐ８に採取し、抗ＣＤ３１にて染色したマウス網膜の共焦点画像を示す。Ｐ４およびＰ６のマウスに、ＰＢＳ、ＡＬＫ１.Ｆｃ、ＡＬＫ１.Ｆｃ.２、ＡＬＫ１.Ｆｃ.４又はＡＬＫ１.Ｆｃ.５を腹腔内投与した。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（本発明の詳細な説明）
【００１５】
本発明の実行は、特に明記しない限り、当業者の技術の範囲内である、分子生物学(組み換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術を使用するであろう。このような技術は、文献、例えば"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989)；"Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984)；"Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987)；"Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.)；"Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates)；"PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994)に十分に説明されている。
特に定義しない限り、本明細書中で用いた技術及び科学的な用語は、本発明が属する分野の通常の技術者によって共通して理解される意味と同じである。Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994)およびMarch, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)は、本出願において使用する多くの用語に対して一般的な指針を当業者に示す。
特許出願及び刊行物を含む本明細書において引用されるすべての文献は、出典明記によってその全体が援用される。
【００１６】
定義
本明細書において用いられる「ＡＬＫ-１」(「アクチビンレセプター様キナーゼ-１とも交換可能に称される)なる用語は、具体的又は文脈上別途示されない限り、任意の天然の又は変異体(天然又は合成いずれかの)ＡＬＫ−１ポリペプチドを指す。「天然配列」なる用語は、特に天然に生じる切断型又は分泌型(例えば細胞外ドメイン配列)、天然に生じる変異体型(例えば、選択的スプライシング型)および天然に生じる対立遺伝子変異体を包含する。「野生型ＡＬＫ−１」なる用語は、概して、天然に生じるＡＬＫ−１タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す「野生型ＡＬＫ−１配列」なる用語は、概して、天然に生じるＡＬＫ−１に見られるアミノ酸配列を指す。
「キメラＡＬＫ−１」分子は、異種し性ポリペプチドに融合又は結合した、完全長ＡＬＫ−１又はその一ないし複数のドメインを含むポリペプチドである。キメラＡＬＫ−１分子は、概して、天然に生じるＡＬＫ−１と同様に少なくとも一つの生物学的性質を共有する。キメラＡＬＫ−１分子の例は、精製のためにエピトープタグ付加させたものである。他のキメラＡＬＫ−１分子はＡＬＫ−１イムノアドヘシンである。
【００１７】
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能を持つ異種タンパク質(「アドヘシン」)の結合特異性を付与した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは抗体の抗原認識及び結合部位以外の所望の結合特異性を持つアミノ酸配列(即ち「異種」)と免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む近接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３、又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ(ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む)、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得てもよい。
【００１８】
「ＡＬＫ-１イムノアドヘシン」なる用語は、「ＡＬＫ-１-免疫グロブリンキメラ」なる用語と交換可能に用いられ、免疫グロブリン配列とＡＬＫ−１分子(天然の又は変異体)の少なくとも一部を組み合わせるキメラ分子を指す。場合によって、ＡＬＫ−１イムノアドヘシンは、ＡＬＫ−１の細胞外ドメイン(ＥＣＤ)又は、ＡＬＫ−１リガンドと結合するために十分なその一部を含む。ある実施態様では、ＡＬＫ−１イムノアドヘシンのＡＬＫ−１部分のＮ末端は、配列番号：２のＡｓｐ２２からＳｅｒ２７(含む)までの任意のアミノ酸残基で始まり、ＡＬＫ−１イムノアドヘシンのＡＬＫ−１部分のＣ末端は、配列番号：２のＳｅｒ１１０からＧｌｕ１１８(含む)までの任意のアミノ酸残基で終わってもよい。ある実施態様では、ＡＬＫ−１イムノアドヘシンは、配列番号：２のアミノ酸残基１−１１８を含む。ある実施態様では、ＡＬＫ−１イムノアドヘシンは、配列番号：２のアミノ酸残基２２−１１８、配列番号：２の残基２３−１１８、配列番号：２の残基２４−１１８、配列番号：２の残基２５−１１８、配列番号：２の残基２６−１１８、又は配列番号：２の残基２７−１１８を含む。ある実施態様では、プロセシングされていないＡＬＫ−１イムノアドヘシンは、ＡＬＫ１.Ｆｃ(配列番号：２)、ＡＬＫ１.Ｆｃ.２(配列番号：４)、ＡＬＫ１.Ｆｃ.３(配列番号：６)、ＡＬＫ１.Ｆｃ.４(配列番号：８)又はＡＬＫ１.Ｆｃ.５(配列番号：１０)である。ある実施態様では、ＡＬＫ−１イムノアドヘシンは、配列番号：２のアミノ酸残基２２−３５２、配列番号：４の残基２２−３４９、配列番号：６の残基２２−３４７、配列番号：８の残基２２−３５０、又は配列番号：１０の残基２２−３５０を含む。免疫グロブリン配列は、好ましくは、必ずではないが、免疫グロブリン定常ドメイン(Ｆｃ領域)である。イムノアドヘシンは、ヒト抗体の重要な化学的及び生物学的な性質の多くを有しうる。イムノアドヘシンは適切なヒト免疫グロブリンヒンジおよび定常ドメイン(Ｆｃ)配列に結合される所望の特異性を有するヒトタンパク質配列から構築されうるので、所望の結合特異性は全体のヒトの構成成分を用いて達成されてもよい。このようなイムノアドヘシンは、患者への免疫原性が最小であり、慢性的な使用又は反復使用に安全である。ある実施態様では、Ｆｃ領域は天然の配列Ｆｃ領域である。ある実施態様では、Ｆｃ領域は変異体Ｆｃ領域である。ある実施態様では、Ｆｃ領域は機能的Ｆｃ領域である。ＡＬＫ−１イムノアドヘシンのＡＬＫ−１部分および免疫グロブリン配列部分は、ごく小さなリンカーによって連結されてもよい。
【００１９】
治療用途として記載されているホモ多量体イムノアドヘシンの例には、ＨＩＶの細胞表面ＣＤ４への結合を阻止するＣＤ４-ＩｇＧイムノアドヘシンが含まれる。ＣＤ４-ＩｇＧを妊娠中の女性に分娩直前に投与した第Ｉ相の臨床治験から得られたデータは、このイムノアドヘシンがＨＩＶの母子移行の防止において有用であることを示唆している（Ashkenazi等, Intern. Rev. Immunol. 10: 219-227 (1993)）。また、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に結合するイムノアドへシンも開発されている。ＴＮＦは、敗血性ショックの主要なメディエータであることが分かっている炎症誘発性サイトカインである。敗血性ショックのマウスモデルに基づいて、ＴＮＦレセプターイムノアドヘシンは、敗血性ショックの治療において臨床的に用いるための候補として有望であることが示されている（Ashkenazi, A.等 (1991) PNAS USA 88:10535-10539）。ＩｇＧ Ｆｃ領域に融合したＴＮＦレセプター配列を含んでなるイムノアドヘシンであるＥＮＢＲＥＬ(登録商標)(エタネルセプト)は、慢性関節リウマチの治療に対して１９９８年１１月２日に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された。慢性関節リウマチの治療におけるＥＮＢＲＥＬ(登録商標)の新しく拡大した用途が２０００年６月６日にＦＤＡによって承認された。ＥＮＢＲＥＬ(登録商標)を含む、ＴＮＦ阻害薬に関する最近の情報については、Lovell等, N. Engl. J. Med. 342: 763-169 (2000)、及び８１０−８１１頁の添付の論説；及びWeinblatt等, N. Engl. J. Med. 340: 253-259 (1999)；Maini及びTaylor, Annu. Rev. Med. 51: 207-229 (2000)の概説を参照のこと。
イムノアドヘシン構造の二つの腕が異なる特異性を持つ場合、このイムノアドヘシンは二重特異的抗体に倣って「二重特異的イムノアドヘシン」と呼ばれる。Dietsch等, J. Immunol. Methods 162:123 (1993)は、アドヘシン分子の細胞外ドメイン、Ｅ-セレクチン及びＰ-セレクチンを組み合わせた、このような二重特異的イムノアドヘシンを記載しており、そのセレクチンの各々は天然では異なる細胞型中で発現される。結合実験により、そのように形成された二重特異的免疫グロブリン融合タンパク質が、それ由来の単一特異的イムノアドヘシンと比較して骨髄細胞株に結合する向上した能力を有していることが示された。
【００２０】
「ヘテロアドヘシン」なる用語は「キメラヘテロ多量体アドヘシン」なる表現と交換可能に使用され、各キメラ分子がヘテロ多量体レセプターモノマーの各々の細胞外ドメインのような生物学的に活性な部分を多量体化ドメインと組み合わせているキメラ分子（アミノ酸配列）の複合体を意味する。「多量体化ドメイン」はヘテロ多量体複合体内のキメラ分子の安定な相互作用を促進する。多量体化ドメインは、免疫グロブリン配列、ロイシンジッパー、疎水性領域、親水性領域、又はキメラヘテロ多量体のキメラ分子間に細胞間ジスルフィド結合を形成する遊離チオールを介して作用しうる。多量体化ドメインは免疫グロブリン定常領域を含みうる。加えて、多量体化領域は、立体的相互作用が安定な相互作用を促進するばかりでなく、モノマー混合物からホモ二量体よりもヘテロ二量体の生成を更に促進するように、操作されうる。「隆起(protuberances)」は、第一のポリペプチドの接合点からの小アミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）と置き換えることにより構築される。隆起に対する同一又は類似のサイズの代償的「空洞(cavities)」は、場合によっては、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えばアラニン又はスレオニン）と置き換えることにより第二のポリペプチドの接合点上につくり出される。免疫グロブリン部分は、必ずではないが好ましくは、免疫グロブリン定常ドメインである。本発明のキメラの免疫グロブリン部分はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭから得ることができるが、好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ３から得ることができる。
【００２１】
本明細書中の「Ｆｃ領域」なる用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異形Ｆｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化するかも知れないが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６の位置又はＰｒｏ２３０からの位置のアミノ酸残基からＦｃ領域のカルボキシル末端まで伸長すると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン(ＥＵ番号付けシステムによれば残基４４７)は、例えば、抗体の産生又は精製中に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組み換え遺伝子操作することによって取り除かれてもよい。したがって、インタクト抗体の組成物は、すべてのＫ４４７残基が除去された抗体群、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体群、及びＫ４４７残基を有する抗体と有さない抗体の混合を含む抗体群を含みうる。
特に明記しない限り、本明細書中の免疫グロブリン重鎖の残基の番号付けは、出典明記によって本明細書中に特別に援用されるKabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)のＥＵインデックスのものである。「KabatのＥＵインデックス」はヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号を指す。
【００２２】
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を有する。例示的「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞障害作用(ＣＤＣ)、Ｆｃレセプター結合、抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用(ＡＤＣＣ)、食作用、細胞表面レセプター(例えばＢ細胞レセプター； ＢＣＲ)の下方制御などが含まれる。そのようなエフェクター機能は、通常、Ｆｃ領域が結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と組み合わさることを必要とし、例えば本明細書中に開示される様々なアッセイを使用して評価される。
「天然配列のＦｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を包含する。天然配列のヒトＦｃ領域は、天然配列のヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域(非Ａ-及びＡ-アロタイプ)；天然配列のヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域；天然配列のヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域；及び天然配列のヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域；並びに、これらの自然に生じる変異体が含まれる。
「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾、好ましくは一又は複数のアミノ酸置換により、天然配列のＦｃ領域とは異なるアミノ酸配列を包含するものである。好ましくは、変異体Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域もしくは親ポリペプチドのＦｃ領域と比較した場合、少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、天然配列のＦｃ領域又は親のポリペプチドのＦＣ領域におよそ１からおよそ１０のアミノ酸置換、好ましくはおよそ１からおよそ５のアミノ酸置換を有する。本明細書中の変異体Ｆｃ領域は、好ましくは、天然配列のＦｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と、少なくともおよそ８０％の同一性を有する、最も好ましくは少なくともおよそ９０％の同一性を、より好ましくは少なくともおよそ９５％の同一性を有するものであろう。
【００２３】
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療的な使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、タンパク質は、(１)ローリー法で測定した場合９５％を越える抗体、最も好ましくは９９重量％を超えるまで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分なほど、あるいは、(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ(ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動)により均一になるまで充分なほど精製される。抗体の自然環境の少なくとも一の成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツでの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一の精製工程により調製される。
【００２４】
「抗体」及び「イムノグロブリン」なる用語は互換性をもって広義な意味で使われ、モノクローナル抗体(例えば完全長又は無傷のモノクローナル抗体)、ポリクローナル抗体、単価抗体、多価抗体、多特異性抗体(例えば所望の生物学的活性を示す限りの二重特異性抗体)及び本明細書で記載される抗体断片が含まれる。抗体はヒト、ヒト化及び／又は親和性成熟したものであり得る。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の相補性決定領域(ＣＤＲ)又は高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つのＣＤＲにより連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲによって近接して結合され、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabat等, Sequence of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, BEthesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞性細胞毒性への抗体の関与を示す。
【００２５】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ')２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。二本鎖のＦｖ種において、この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖の可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ種において、一つの重鎖及び一つの軽鎖の可変ドメインはフレキシブルなペプチドリンカーによって共有結合されて、軽鎖及び重鎖が「二量体」構造類似体内で二本鎖Ｆｖ種内のものに結合しうる。この配置において、各可変ドメインの３つのＣＤＲは相互に作用してＶＨ-ＶＬ二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６つのＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(ＣＨ１)を有する。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が一つの遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。また、抗体断片の他の化学結合も知られている。
【００２６】
任意の脊椎動物種からの抗体(イムノグロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
イムノグロブリンの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、イムノグロブリンは異なるクラスが割り当てられる。イムノグロブリンには５つの主なクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、更にそれらは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２等のサブクラス(アイソタイプ)に分かれる。イムノグロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。イムノグロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られている。
「抗体断片」は完全な抗体の一部のみを含んでなるものであり、その一部は、完全な(インタクトな)抗体に存在する場合のその一部に通常関連する機能の少なくとも一、好ましくはその機能のほとんどないしはすべてを保持することが好ましい。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２及びＦｖ断片；ダイアボディ；線形抗体；単鎖抗体分子；及び、抗体断片から形成される多特異性抗体が含まれる。一実施態様では、抗体断片は完全な抗体の抗原結合部位を含んでなるために、抗原結合能を有する。他の実施態様では、抗体断片は、例えばＦｃ領域を含んでなるものは、完全な抗体に存在する場合のＦｃ領域に通常関連する生物学的な機能、例えばＦｃＲｎ結合、抗体半減期の調節、ＡＤＣＣ機能及び補体結合の少なくとも一を保持する。一実施態様では、抗体断片は、完全な抗体と実質的に類似したインビボ半減期を有する一価性抗体である。例えば、このような抗体断片は、インビボ安定性を断片に与えることができるＦｃ配列に結合した抗原結合アームを含んでもよい。
【００２７】
本願明細書において、用いられる「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」なる用語は、配列中の高頻度に可変している及び／又は構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。通常、抗体は、ＶＨ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３)の３つと、ＶＬ(Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)の３つの計６つの高頻度可変領域を含んでなる。多くの高頻度可変領域が描写されており、本願明細書において、包含される。Kabat相補性決定領域(ＣＤＲ)は、配列多様性に基づいており、最も一般的に用いられるものである(Kabat 等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Chothiaは、代わりに構造的ループの位置を指す(Chothia 及びLesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。ＡｂＭ高頻度可変領域は、KabatＣＤＲとChothia構造ループとが組み合わさったものであり、Oxford Molecular's AbM抗体モデリングソフトウェアにより使用されている。「接触」高頻度可変領域は、利用できる複雑な結晶構造の分析に基づくものである。これら高頻度可変領域の残基を以下に示す。
【００２８】
カバットループ    ＡｂＭ       Chothia       接触
L1   L24-L34      L24-L34      L26-L32      L30-L36
L2   L50-L56      L50-L56      L50-L52      L46-L55
L3   L89-L97      L89-L97      L91-L96      L89-L96
H1   H31-H35B     H26-H35B     H26-H32      H30-H35B
(カバット番号付け)
H1   H31-H35      H26-H35      H26-H32      H30-H35 
(Chothia番号付け)
H2   H50-H65      H50-H58      H53-H55      H47-H58
H3   H95-H102     H95-H102     H96-H101     H93-H101
【００２９】
高頻度可変領域は、次のような「拡大高頻度可変領域」を含むことができる、即ち、ＶＬの２４−３６又は２４−３４(Ｌ１)、４６−５６又は５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７(Ｌ３)と、ＶＨの２６−３５(Ｈ１)、５０−６５又は４９−６５(Ｈ２)及び９３−１０２、９４−１０２、又は９５−１０２(Ｈ３)である。可変ドメイン残基には、これら各々を規定するために、上掲のKabat等に従って番号を付した。
本願明細書において、定められるように、「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は高頻度可変領域残基以外のその可変ドメイン残基である。
【００３０】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、一般に少量で存在する突然変異等の、モノクローナル抗体の産生の間に生じる可能性のある突然変異を除いて、同一である及び／又は同じエピトープ(一又は複数)に結合する。このようなモノクローナル抗体は、一般に、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を包含しており、この場合の標的に結合するポリペプチドは、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含むプロセスによって得られたものである。例えば、このような選択プロセスは、複数のクローン、例えばハイブリドーマクローン、ファージクローン又は組換えＤＮＡクローンのプールからの、独特のクローンの選択であり得る。選択された標的結合配列を更に変化させることにより、例えば標的に対する親和性を向上させる、標的結合配列をヒト化する、細胞培養液中でのその産生を向上させる、インビボでのその免疫原性を低減する、多特異性抗体を作製する等が可能であること、並びに、変化させた標的結合配列を含む抗体も本発明のモノクローナル抗体であることを理解されたい。一般に異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と比べて、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、１の抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、通常他の免疫グロブリンによって汚染されない点で有利である。「モノクローナル」との修飾詞は、ほぼ均一な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で生成しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は様々な技術によって作ることができ、それらの技術には例えばハイブリドーマ法（例えば、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)；Hongo等, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow等, Antibodies: A loboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第２版 1988)；Hammerling等: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)）、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第4,816,567号参照）、ファージディスプレイ法（例えば、Clarkson等, Nature, 352:624-628 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)；Sidhu等, J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004)；Lee等, J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；及びLee等, J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004)参照）、及びヒト免疫グロブリン座位又はヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部又は全部を有する動物においてヒト又はヒト様抗体を産生する技術（例えば、国際公開1998/24893；国際公開1996/34096；国際公開1996/33735；国際公開1991/10741；Jackobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature, 362:255-258 (1993)；Bruggemann等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,591,669号(すべてGenPharm)；同第5,545,807号；国際公開1997/17852；米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；及び同第5,661,016号；Marks等, Bio/Technology, 10:779-783 (1992)；Longerg等, Nature, 368:856-859 (1994)；Morrison, Nature, 368:812-813 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnology, 14:845-851 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology, 14:826 (1996)；及びLongerg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995)）が含まれる。
【００３１】
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、非ヒト免疫グロブリンから得られた最小配列を含むキメラ抗体である。多くの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、全て又はほとんど全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又はほとんど全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、状況に応じて免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細は、Jones等, Nature 321, 522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332, 323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照のこと。また、以下の概説文献及びここに挙げる引用文献も参照のこと：Vaswani及びHamilton, Ann. Allergy, Asthma &amp; Immunol. 1:105-115 (1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)；Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)。
【００３２】
「キメラ」抗体(免疫グロブリン)は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種由来の抗体あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同であり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体あるいは他の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である「キメラ」抗体、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りそれら抗体の断片を有する(アメリカ特許番号4,816,567、及び、Morrison 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。本明細書中で用いられるヒト化抗体は、キメラ抗体のサブセットである。
【００３３】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般的に、ｓｃＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
「抗原」は、抗体が選択的に結合しうる予め決められた抗原である。標的抗原は、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン又は他の天然に生じる化合物ないしは合成化合物であってもよい。標的抗原はポリペプチドであることが望ましい。
【００３４】
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を指し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ−ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合してなる。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成が可能であるリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディーは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；国際公開９３／１１１６１；及びHollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。
「ヒト抗体」は、ヒトにより生成される抗体のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を有するもの、及び／又は本明細書中に開示したヒト抗体をつくるためのいずれかの技術を使用して、つくられたものである。この定義におけるヒト抗体は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特別に除く。
【００３５】
「親和性成熟」抗体は、その1つ以上のCDRに1つ以上の変更を有する抗体であって、そのような変更を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性を向上させる。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の、さらにはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当技術分野において既知の方法により生産できる。Marks他は、Bio/Technology, 10:779-783(1992年)において、ＶＨドメインとＶＬドメインのシャフリングによる親和成熟を開示している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、Barbas他、Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994)；Schier他、Gene, 169:147-155 (1995)；Yelton他、J. Immunol., 155:1994-2004 (1995)；Jackson他, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995)；及びHawkins他, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に開示されている。
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域(天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域)に帰する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイプにより変わる。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)；貪食作用；細胞表面レセプター(例えば、Ｂ細胞レセプター)のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。
【００３６】
「抗体依存性細胞媒介性細胞障害」又は「ＡＤＣＣ」とは、ある種の細胞障害細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球及びマクロファージ)上に存在するＦｃレセプター(ＦｃＲｓ)と結合した分泌Ｉｇにより、これらの細胞障害エフェクター細胞が抗原-担持標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒により標的細胞を死滅させることを可能にする細胞障害性の形態を意味する。抗体は細胞障害細胞を「備えて」おり、これはこのような死滅には絶対に必要なものである。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) の４６４頁の表３に要約されている。対象の分子のＡＤＣＣ活性をアッセイするために、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。このようなアッセイにおいて有用なエフェクター細胞には、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー細胞(ＮＫ細胞)が含まれる。代わりとして、もしくは付加的に、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes等, (USA) 95:652-656 (1998)において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価することが可能である。
【００３７】
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。その細胞が少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行することが望ましい。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球が含まれるが、ＰＢＭＣとＮＫ細胞が好適である。エフェクター細胞は天然源、例えば血液から単離してもよい。
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載するものである。好適なＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。さらに好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(ガンマレセプター)と結合するもので、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含み、これらのレセプターの対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされた形態のものも含まれる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ(「活性型レセプター」)及びＦｃγＲＩＩＢ(「阻害型レセプター」)が含まれ、主としてその細胞質ドメインは異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型レセプターＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター活性化モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motif ;ＩＴＡＭ)を含んでいる。阻害型レセプターＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター阻害性モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif ;ＩＴＩＭ)を含んでいる(Daeron, Annu. Rev. immunol. 15:203-234 (1997)を参照)。ＦｃＲsに関しては、 Ravetch and Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994); 及びde Haas等, J.Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に概説されている。将来的に同定されるものも含む他のＦｃＲsはここでの「ＦｃＲ」という言葉によって包含される。また、該用語には、母性ＩｇＧの胎児への移送を担い(Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976) Kim等, J. Immunol.24:249 (1994))、免疫グロブリンのホメオスタシスを調節する新生児性レセプターＦｃＲｎも含まれる。
国際公開公報００／４２０７２(Presta) にＦｃＲへの結合を向上又は減弱させた抗体変異型が述べられている。この特許公開の内容はここに出典明記により具体的に組み込まれる。Shields等, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)も参照のこと。
ＦｃＲｎへの結合の測定方法は公知である(例としてGhetie 1997, Hinton 2004を参照)。インビボでのヒトＦｃＲｎへの結合とヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えばヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス又は形質転換されたヒト細胞株、又はＦｃ変異形ポリペプチドを投与された霊長類動物においてアッセイすることができる。
【００３８】
「補体依存性細胞障害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。典型的な補体経路の活性化は補体系(Ｃｌｑ)の第１補体が、同族抗原と結合した(適切なサブクラスの)抗体に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。
Ｆｃ領域アミノ酸配列を変更してＣ１ｑ結合能力が増大又は減少したポリペプチド変異体は、米特許第６１９４５５１号Ｂ１及び国際公開公報９９／５１６４２に記述される。それらの特許文献の内容は、出典明記によって、特別に本願明細書に組み込まれるものとする。またIdusogie 等 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)を参照のこと。
【００３９】
「Ｆｃ領域含有ポリペプチド」なる用語は、Ｆｃ領域を含む抗体もしくはイムノアドヘンシンのようなポリペプチドを指す。Ｆｃ領域のＣ末端リジン(ＥＵ番号付けシステムに従うと残基４４７)は、例えば、ポリペプチドの精製中又はポリペプチドをコードする核酸を組み換え操作することによって除去してもよい。したがって、本発明のＦｃ領域を有するポリペプチドを含んでなる組成物は、Ｋ４４７を有するポリペプチド集団、すべてのＫ４４７が除去されたポリペプチド集団、又はＫ４４７残基を有するポリペプチドとＫ４４７残基を有さないポリペプチドの混合集団を包含しうる。
【００４０】
「遮断(ブロッキング)」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害するか又は低減するものである。好適な遮断抗体又はアンタゴニスト抗体は、実質的又は完全に、抗原の生物学的活性を阻害する。
「慢性」投与とは、初期の治療効果（活性）を長期間にわたって維持するようにするために、急性態様とは異なり連続的な態様での薬剤の投与を意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ周期的になされる処置である。
【００４１】
「疾病」又は「疾患」は、本発明の物質／分子又は方法を用いた治療によって利益を得る任意の症状である。これには、問題とする疾患に哺乳動物がかかりやすくなる病理学的症状を含む慢性及び急性の疾病又は疾患を含む。限定的なものではなく、ここで治療する疾患の例には、悪性及び良性の腫瘍；癌腫、芽腫及び肉腫が含まれる。異常な又は過度なリンパ脈管形成と関係する症状には、限定するものではないが、腫瘍、癌、細胞増殖性疾患、黄斑変性、炎症媒介性疾患、関節リウマチ、糖尿病性網膜症及び乾癬が含まれる。
「細胞増殖性疾患(障害)」及び「増殖性疾患(障害)」なる用語は、異常な細胞増殖にある程度関連している疾患を意味する。一実施態様では、細胞増殖性疾患は癌である。
本明細書中の「腫瘍」とは、悪性か良性かにかかわらず、すべての腫瘍性細胞成長及び増殖と、すべての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。「癌」」「癌性」「細胞増殖性疾患」、「増殖性疾患」及び「腫瘍」なる用語は、本明細書に参照されるように相互に限定的なものでない。
【００４２】
「癌」及び「癌性」なる用語は、一般的に調節不可能な細胞成長／増殖に特徴がある哺乳動物の生理学的状態を指すか又は表す。癌の例には、上皮癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病が含まれるが、これに限定されるものではない。このような癌のより具体的な例には、扁平細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞性癌、胃腸癌、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮上皮癌、唾液腺上皮癌、腎臓癌、肝癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌、胃癌、メラノーマ、及び様々なタイプの頭頸部癌が含まれる。血管新生の調節不全により、本発明の組成物及び方法により治療されうる多くの疾患が引き起こされうる。これらの疾患には、非腫瘍性及び腫瘍性の両方の状態が含まれる。腫瘍性疾患のものには上記のものが含まれるが、これに限定されるものではない。
非腫瘍性疾患には、限定するものではないが、例えば、望ましくない又は異常な肥大、関節炎、関節リウマチ(ＲＡ)、乾癬、乾癬のプラーク、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化、アテローム硬化性プラーク、未熟児の網膜症を含む糖尿病性及び他の増殖的な網膜症、水晶体後繊維増殖、血管新生緑内障、年齢関連性黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植片血管新生、角膜移植片拒絶、網膜／脈絡叢血管新生、角度(ルベオーシス)の血管新生、眼性新生血管疾患、血管再狭窄、動静脈奇形(ＡＶＭ)、髄膜腫、血管腫、血管線維腫、甲状腺の過形成(甲状腺機能亢進症を含む)、角膜及び他の組織移植、慢性の炎症、肺炎症、急性の肺損傷／ＡＲＤＳ、敗血症、原発性肺高血圧症、悪性の肺滲出、大脳浮腫(例えば、急性の脳卒中／非開放性頭部損傷／外傷と関係するもの)、滑液炎症、ＲＡのパンヌス形成、筋炎骨化(myositis)、肥大性骨形成、骨関節炎(ＯＡ)、抵抗性腹水、多嚢胞性卵巣疾患、子宮内膜症、サードスペース体液疾患(膵炎、コンパートメント症候群、熱傷、腸疾患)、子宮類線維腫、早産、ＩＢＤなどの慢性炎症(クローン病及び潰瘍性大腸炎)、腎臓同種異系移植片拒絶反応、炎症性腸疾患、ネフローゼ症候群、望ましくない又は異常な組織塊成長(非癌)、出血性関節、肥大性瘢痕、体毛成長の阻害、オスラー-ウェーバー症候群、化膿肉芽腫水晶体後繊維増殖、強皮症、トラコーマ、血管癒着、関節滑膜炎、皮膚炎、子癇前症、腹水、心嚢貯留液(心外膜炎と関係するものなど)及び胸水が含まれる。
【００４３】
ここで使用されるところの「治療」は、治療されている個体又は細胞の天然の過程を改変するための臨床的介入を意味し、予防のため又は臨床的病理の過程中に実施することができる。治療の望ましい効果には、疾病の発生又は再発の防止、症状の寛解、疾病の任意の直接的又は間接的病理的結果の低減、転移の防止、疾病の進行速度の低減、疾病状態の回復又は緩和、及び寛解又は改善された予後が含まれる。ある実施態様では、抗体は疾患又は疾病の進行を遅らせるために用いられる。
「被検体」は脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物には、限定するものではないが、家畜動物(ウシ及びヒツジなど)、スポーツ用動物、愛玩動物(ネコ、イヌ及びウマなど)、霊長類、マウス及びラットが含まれる。
治療の対象のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００４４】
「有効量」とは所望の治療又は予防結果を達成するために必要な用量及び時間での効果的な量を意味する。
物質／分子の「治療的有効量」は、例えば個体の疾病ステージ、年齢、性別、及び体重、並びに個体に所望の応答を誘発する物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの能力などの因子に従って変わりうる。また、治療的有効量は物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの任意の毒性又は有害な効果よりも治療的に恩恵のある効果が上回るものである。「予防的有効量」とは所望の予防結果を達成するために必要な用量及び時間での効果的な量を意味する。典型的には必ずではないが、予防的用量は疾患の初期ステージ又はその前の被検体に用いるので、予防的有効量は治療的有効量よりも少ないであろう。
【００４５】
ここで用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体(例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体)、化学治療薬、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド(ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド)、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロランブシル、ダウノルビシン又はその他インターカレート剤、酵素及びその断片、例えば核溶解性酵素、抗生物質、及び毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、そして下記に開示する種々の抗腫瘍又は抗癌剤を含むように意図されている。他の細胞障害性薬が下記に記載されている。殺腫瘍性剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
【００４６】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びCYTOXAN(登録商標)シクロホスファミドのようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(特にブラタシン及びブラタシノン)；デルタ-９-テトラヒドロカナビノール(ドロナビノール、MARINOL(登録商標)；βラパチョーネ；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトセシン(合成アナログトポテカン(HYCAMTIN(登録商標)、CPT-11(イリノテカン、CAMPTOSAR(登録商標))、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン(scopolectin)及び９-アミノカンプトテシンを含む)；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む)；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；テニポシド；クリプトフィシン(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８)；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン(合成アナログ、ＫＷ-２１８９及びＣＢ１-ＴＭ１を含む)；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１(例えばAgnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186(1994)参照)；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン類(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ADRIAMYCIN(登録商標)ドキソルビシン(モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン、及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイ���ン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)；葉酸アナログ、例えばデノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリンアナログ、例えばフルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；アンドロゲン類、例えばカルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えばフロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エポシロン；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシノイド(maytansinoid)類、例えばメイタンシン(maytansine)及びアンサミトシン(ansamitocine)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類(特にＴ-２毒素、ベラクリン(verracurin)Ａ、ロリジン(roridine)Ａ及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン(ELDISINE(登録商標)、FILDESIN(登録商標))；ダカーバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ａｒａ-Ｃ」)；チオテパ；タキソイド類、例えばTAXOL(登録商標)パクリタキセル(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)、ABRAXANETMパクリタキセルのクレモフォー無添加アルブミン操作ナノ粒子製剤(American  Pharmaceutical  Partners, Schaumberg, Illinois)、及びTAXOTERE(登録商標)ドキセタキセル(Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)；クロランブシル；ゲムシタビン(GEMZAR(登録商標))；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナアナログ、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン(VELBAN(登録商標))；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；マイトキサントロン；ビンクリスチン(ONCOVIN(登録商標))；オキサリプラチン；ロイコボビン(leucovovin)；ビノレルビン(NAVELBINE(登録商標))；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノ���イシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸のようなレチノイド；カペシタビン(XELODA(登録商標))；上述したもののいずれかの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体：並びに上記のうち２以上の組み合わせ、例えば、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニソロン併用療法の略称であるＣＨＯＰ、及び5-FU及びロイコボビン(leucovovin)とオキサリプラチン(ELOXATINTM)を組み合わせた治療法の略称であるFOLFOXが含まれる。
【００４７】
またこの定義に含まれるものには、癌の成長を助けるホルモンの作用を調節、低減、遮断又は阻害するように働き、多くの場合全身処置の形態で使用される抗ホルモン剤がある。それらはそれ自体がホルモンであってもよい。それらは例えば抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体モジュレータ(ＳＥＲＭ)を含み、例えば、タモキシフェン(NOLVADEX(登録商標)タモキシフェンを含む)、ラロキシフェン(raloxifene)(EVISTA(登録商標))、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びトレミフェン(FARESTON(登録商標))；抗プロゲステロン；エストロゲンレセプター下方調節剤(ERD)；卵巣を抑止又は停止させる機能がある作用剤、黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)アゴニスト、例えば酢酸リュープロリド(LUPRON(登録商標)及びELIGARD(登録商標))、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリン及びトリプテレリン(tripterelin)；その他抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド；並びに副腎のエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４(５)-イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール(MEGASE(登録商標))、エキセメスタン(AROMASIN(登録商標))、フォルメスタニー(formestanie)、ファドロゾール、ボロゾール(RIVISOR(登録商標))、レトロゾール(FEMARA(登録商標))、及びアナストロゾール(ARIMIDEX(登録商標))である。加えて、このような化学療法剤の定義には、クロドロネート(例えばBONEFOS(登録商標)又はOSTAC(登録商標))、エチドロン酸(DIDROCAL(登録商標))、NE-58095、ゾレドロン酸／ゾレドロネート(ZOMETA(登録商標))、アレンドロネート(FOSAMAX(登録商標))、パミドロン酸(AREDIA(登録商標))、チルドロン酸(SKELID(登録商標))、又はリセドロン酸(ACTONEL(登録商標))、並びにトロキサシタビン(troxacitabine)(１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に接着細胞の増殖に結びつくシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ-α、Ｒａｆ、及びＨ-Ｒａｓ、及び上皮成長因子レセプター(EGF-R)；THERATOPE(登録商標)ワクチン及び遺伝子治療ワクチン等のワクチン、例えばALLOVECTIN(登録商標)ワクチン、LEUVECTIN(登録商標)ワクチン、及びVAXID(登録商標)ワクチン；トポイソメラーゼ１阻害剤(LURTOTECAN(登録商標))；ｒｍＲＨ(ABARELIX(登録商標))；ラパチニブ(lapatinib ditosylate)(GW572016としても知られるErbB-2及びEGFR二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤)；及び上記のもののいずれかの製薬的に許容される塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【００４８】
ここで用いられる際の「増殖阻害剤」は、細胞の成長をインビトロ又はインビボの何れかで阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、成長阻害剤は、Ｓ期で細胞(例えばＡＬＫ−１を発現する細胞)の割合を有意に減少させるものである。成長阻害剤の例は、細胞周期の進行を(Ｓ期以外の位置で)阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキサン類、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びアラ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。タキサン類(パクリタキセル及びドセタキセル)は、共にイチイに由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル(TAXOTERE(登録商標)、ローン・プーラン ローラー)は、パクリタキセル(TAXOL(登録商標)、ブリストル-マイヤー スクウィブ)の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体から微小管の集合を促進し、細胞の有糸分裂を阻害する結果となる脱重合を防ぐことによって微小管を安定化にする。
【００４９】
疾患の「病理状態」には、患者の健康を損なうあらゆる現象が含まれる。癌の場合には、これに限定されるものではないが、異常又は制御不能な細胞成長、転移、隣接細胞の正常機能の阻害、サイトカイン又は他の分泌産物の異常なレベルでの放出、炎症又は免疫反応の抑制又は悪化等々が含まれる。
一又は複数の更なる治療薬「と組み合わせて(と併用して)」の投与は、同時（一時）及び任意の順序での連続投与を含む。
【００５０】
ここで用いられる「担体」には、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤が含まれ、用いられる用量及び濃度でそれらに曝露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例には、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭが含まれる。
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小胞体であり、哺乳動物への薬物（Ｂｖ８ポリペプチド又はその抗体など）の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質構造に類似する二層形成体として配される。
【００５１】
本明細書中で用いる「ＶＥＧＦ」又は「ＶＥＧＦ-Ａ」なる用語は、Leung等 Science, 246:1306 (1989)、Houck等 Mol. Endocrin., 5:1806 (1991)、及びRobinson & Stringer, Journal of Cell Science, 144(5): 853-865 (2001)によって記載されているように、１６５アミノ酸の血管内皮細胞増殖因子と、関連した１２１-、１４５-、１８３-、１８９-、及び２０６-アミノ酸の血管内皮細胞増殖因子、並びにそれらの天然に生じる対立遺伝子型及びプロセシング型を意味する。
「ＶＥＧＦアンタゴニスト」は、一又は複数のＶＥＧＦレセプターへの結合を含む、ＶＥＧＦを中和、遮断、阻害、抑止、低減又は干渉することができる分子を指す。ＶＥＧＦアンタゴニストには、抗ＶＥＧＦ抗体及びその抗原結合性断片、ＶＥＧＦに特異的に結合することによって一又は複数のレセプターへの結合を隔離するレセプター分子及び誘導体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの小分子インヒビターなどの抗ＶＥＧＦレセプター抗体及びＶＥＧＦレセプターアンタゴニスト、及び融合タンパク質、例として、ＶＥＧＦ-Ｔｒａｐ(Regeneron)、ＶＥＧＦ１２１-ゲロニン(Peregrine)が含まれる。また、ＶＥＧＦアンタゴニストには、ＶＥＧＦのアンタゴニスト変異体、ＶＥＧＦに対するアンチセンス分子、ＲＮＡアプタマー、及びＶＥＧＦないしはＶＥＧＦレセプターに対するリボザイムが含まれる。
【００５２】
「抗ＶＥＧＦ抗体」は、十分な親和性と特異性を有してＶＥＧＦに結合することができる抗体を指す。抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ活性が関与する疾患及び症状を標的とし、干渉する際の治療上の薬剤として有用でありうる。例として米国特許第６５８２９５９号、同第６７０３０２０号；国際公開第９８／４５３３２号；国際公開第９６／３００４６号；国際公開第９４／１０２０２号、国際公開第２００５／０４４８５３号；;欧州特許第０６６６８６８号Ｂ１；米国特許公開第２００３０２０６８９９号、同第２００３０１９０３１７号、同第２００３０２０３４０９号、同第２００５０１１２１２６号、同第２００５０１８６２０８号及び同第２００５０１１２１２６号；Popkov等, Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)；及び国際公開第２００５０１２３５９号を参照のこと。抗ＶＥＧＦ抗体は通常、ＶＥＧＦ-Ｂ又はＶＥＧＦ-Ｃなどの他のＶＥＧＦホモログにも、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦ又はｂＦＧＦなどの他の増殖因子にも結合しないだろう。抗ＶＥＧＦ抗体である、「ｒｈｕＭＡｂ ＶＥＧＦ」又は「アバスチン(登録商標)」としても知られる「ベバシズマブ(ＢＶ)」は、Presta et al. Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)に従って生成される組み換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体である。ベバシズマブは、ヒトＶＥＧＦのそのレセプターへの結合をブロックするマウスの抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａ.４.６.１から、変異したヒトのＩｇＧ１フレームワーク領域と抗原結合性相補性決定領域を含む。フレームワーク領域のほとんどを含め、ベバシズマブのアミノ酸配列のおよそ９３％は、ヒトのＩｇＧ１に由来し、配列のおよそ７％はマウスの抗体Ａ４.６.１に由来する。ベバシズマブは、およそ１４９０００のダルトンの分子量を有し、グリコシル化されている。抗ＶＥＧＦ抗体断片である、「ルセンティス(登録商標)」としても知られる「ラニビズマブ」を含む、ベバシズマブ及び他のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体は、２００５年２月２６日に発行の米国特許第６８８４８７９号にさらに記載されている。
【００５３】
ＡＬＫ−１ポリペプチドに関して「生物活性」及び「生物学的に活性な」なる用語は、ＡＬＫ−１と関係している物理的な／化学的な性質および生物学的機能を指す。いくつかの実施態様では、ＡＬＫ−１「生物活性」には、ＡＬＫ−１リガンド、例えばＢＭＰ９および／またはＢＭＰ１０への結合、又は活性化ＡＬＫ-１下流分子のシグナル伝達、例えばＳｍａｄ１、Ｓｍａｄ５および／またはＳｍａｄ８のリン酸化、の一又は複数が含まれる。
「ＡＬＫ−１アンタゴニスト」は、例えばＡＬＫ−１レセプター活性化の低減又はブロック、ＡＬＫ-１下流分子のシグナル伝達、例えばＳｍａｄ１、Ｓｍａｄ５および／またはＳｍａｄ８のリン酸化の低減又はブロック、ＡＬＫ−１に対するＡＬＫ−１リガンド(例えばＢＭＰ９又はＢＭＰ１０)結合の破壊又はブロックを含む、ＡＬＫ−１の活性を中和、ブロック、阻害、無効、低減又は干渉することができる分子を指す。ＡＬＫ-１アンタゴニストには、抗体およびその抗原結合断片、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖、核酸、生物有機分子、ペプチド模倣体、薬物およびそれらの代謝産物、転写および翻訳調節配列等が含まれる。また、アンタゴニストには、タンパク質の小分子インヒビター、及び融合タンパク質(イムノアドヘシンを含む)、タンパク質に特異的に結合することによってその標的への結合を隔離するレセプター分子及び誘導体、タンパク質のアンタゴニスト変異体、タンパク質に対するｓｉＲＮＡ分子、タンパク質に対するアンチセンス分子、ＲＮＡアプタマー、及びタンパク質に対するリボザイムが含まれる。ある実施態様では、ＡＬＫ−１アンタゴニストはＡＬＫ−１に結合し、ＡＬＫ−１の生物学的活性を中和、ブロック、阻害、無効、低減又は干渉する分子である。
【００５４】
「抗腫瘍性組成物」なる用語は、少なくとも一の活性な治療的作用剤、例えば「抗癌剤」を含む、癌を治療する際に有用な組成物を指す。治療的作用剤(抗癌剤、本明細書中で「抗腫瘍剤」とも称する)の例には、限定するものではないが、例えば、化学療法剤、増殖阻害性剤、細胞障害性剤、放射線療法に用いられる作用剤、抗血管新生剤、アポトーシス作用剤、抗チュービュリン剤、毒素、及び癌を治療するための他の作用剤、例えば、抗ＶＥＧＦ中和抗体、ＶＥＧＦアンタゴニスト、抗ＨＥＲ-２抗体、抗ＣＤ２０抗体、上皮性増殖因子レセプター(ＥＧＦＲ)アンタゴニスト(例えばチロシンキナーゼインヒビター)、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲインヒビター、エルロチニブ、ＣＯＸ-２インヒビター(例えばセレコキシブ)、インターフェロン、サイトカイン、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、又はＶＥＧＦレセプター(一又は複数)の一又は複数に結合するアンタゴニスト(例えば中和抗体)、血小板由来増殖因子(ＰＤＧＦ)及び／又は幹細胞因子(ＳＣＦ)のレセプターチロシンキナーゼのインヒビター(例えば、メシル酸イマチニブ(Ｇｌｅｅｖｅｃ(登録商標) Novartis)、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２、及び他の生理活性的で有機化学的作用剤などが含まれる。
【００５５】
この出願で用いられる用語「プロドラッグ」は、親薬剤に比較して腫瘍細胞に対する細胞障害性が低く、酵素的に活性化又はより活性な親形態に変換される製薬的活性物質の前駆体又は誘導体形態を意味する。例えば、Wilman, 「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」, Biochemical Society Transactions, 14, :375-382, 615th Meeting, Belfast (1986)、及びStella 等, 「Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」、Directed Drug Delivery, Borchardt等(編), 247-267項, Humana Press (1985)参照。本発明のプロドラッグは、限定するものではないが、ホスファート含有プロドラッグ、チオホスファート含有プロドラッグ、スルファート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ-アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β-ラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒のない薬剤に転換可能な５-フルオロシトシン及び他の５-フルオロウリジンプロドラッグを含む。限定はしないが、本発明で使用されるプロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞障害性剤の例には、前記の化学療法剤が含まれる。
【００５６】
「血管形成因子又は薬剤」は、血管の発達を刺激する、例えば脈管形成、血管内皮細胞増殖、血管の安定性および／または脈管形成などを促進する増殖因子である。例えば、血管形成因子には、例えば、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦファミリのメンバー、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦファミリ、線維芽細胞増殖因子ファミリ(ＦＧＦ)、ＴＩＥリガンド(アンギオポイエチン)、エフリン、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＬＫ−１などが含まれるが、これらに限定されるものではない。また、成長ホルモン、インスリン様増殖因子-Ｉ(ＩＧＦ−Ｉ)、ＶＩＧＦ、上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)、ＣＴＧＦ及びそのファミリのメンバー、およびＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βなどの、創傷治癒を促進する因子を含むであろう。例として、Klagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991)；Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003)；Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999)；Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003)(例えば、血管形成因子の一覧を示している表１)；及びSato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)を参照。
【００５７】
「抗血管新生剤」又は「血管新生(血管形成)インヒビター」は、直接的又は間接的に、血管新生、脈管形成又は望ましくない血管透過を阻害する、小分子量の物質、ポリヌクレオチド(例えば阻害ＲＮＡ(ＲＮＡｉ又はｓｉＲＮＡ)を含む)、ポリペプチド、単離したタンパク質、組換えタンパク質、抗体、又はそれらのコンジュゲート又は融合タンパク質を意味する。例えば、抗血管新生剤は、上記に定義したように血管新生剤に対する抗体又は他のアンタゴニスト、例えば、ＶＥＧＦに対する抗体、ＶＥＧＦレセプターに対する抗体、ＶＥＧＦレセプターシグナル伝達を遮断する小分子(例えば、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２８４、ＳＵ６６６８、ＳＵＴＥＮＴ／ＳＵ１１２４８(sunitinib malate)、ＡＭＧ７０６、又は例えば国際公開２００４／１１３３０４に記載されるもの)である。また、抗血管新生剤には、天然の血管新生インヒビター、例えばアンジオスタチン、エンドスタチンなどが含まれる。例えばKlagsbrun及びD'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991)；Streit及びDetmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003)(例えば、悪性黒色腫の抗血管新生治療を列挙している表３)；Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999)；Tonini等, Oncogene, 22:6549-6556 (2003)(例えば、抗血管新生因子を列挙している表２)；及び、Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)(例えば、臨床試験で用いられる抗血管新生剤を列挙している表１)を参照のこと。
【００５８】
本発明の方法および組成物
本発明は、ＡＬＫ−１経路を調整する薬剤(例えばＡＬＫ-１イムノアドヘシン又は抗ＡＬＫ-１抗体)が血管形成とリンパ脈管形成の両方に作用することが可能であるという発見に、ある程度基づく。一態様では、本発明は、内皮細胞をＡＬＫ−１アンタゴニストと接触させることを含む、分化のより成熟したステージへの内皮細胞の分化の予防方法を提供する。内皮細胞は、任意のタイプの内皮細胞、例えば血液又はリンパの内皮細胞であってもよい。他の態様では、本発明は、周皮細胞をＡＬＫ−１アンタゴニストと接触させることを含む、周皮細胞組織の破壊方法を提供する。さらに、このような薬剤は、単一の薬剤として、そして、ＶＥＧＦアンタゴニストと併用して腫瘍増殖を阻害することが可能であることが明らかとなった。したがって、ＡＬＫ-１アンタゴニストは、血管形成とリンパ脈管形成とに関係している病的状態および疾患に有用である。
ＡＬＫ−１アンタゴニストが様々な病的状態又は疾患を治療するかまたは予防するために用いられうることが考慮される。本発明は、ＡＬＫ−１レセプター経路の活性化を阻害するために、限定するものではないが、ＡＬＫ−１イムノアドヘシン又は抗ＡＬＫ−１抗体などのＡＬＫ−１アンタゴニストの有効量を使用する、リンパ脈管形成の阻害方法を包含する。他の態様では、本発明は、必要とする被検体にＡＬＫ−１アンタゴニストの有効量を投与することを含む、リンパ脈管形成の阻害方法を提供する。
【００５９】
異常なリンパ脈管形成と関係している病的状態又は疾患の例としては、腫瘍、癌、腫瘍又は癌の転移、細胞増殖性疾患、黄斑変性、炎症性媒介性疾患、関節リウマチ、糖尿病性網膜症および乾癬が含まれるが、これらに限定されるものではない。一態様では、本発明は、被検体に有効量のＡＬＫ−１アンタゴニストを投与することを含む、被検体の腫瘍リンパ脈管形成の阻害又は予防方法を提供する。また、被検体に有効量のＡＬＫ−１アンタゴニストを投与することを含む、被検体の腫瘍転移の阻害又は予防方法が提供される。ある実施態様では、被検体は、腫瘍転移を生じているか、又は生じるリスクにあってもよい。このような転移は、リンパ系又は遠隔臓器にあってもよい。
【００６０】
本発明は、被検体にＡＬＫ−１アンタゴニストの有効量を投与することを含む、被検体の周皮細胞組織の分裂方法を提供する。ある実施態様では、被検体は、腫瘍、癌、腫瘍又は癌転移、細胞増殖性疾患、黄斑変性、炎症性媒介性疾患、関節リウマチ、糖尿病性網膜症および乾癬を患っている。ある実施態様では、周皮細胞組織の破壊は、腫瘍又は癌等の腫瘍性疾患に罹患した被検体の腫瘍血管に起こる。
本発明は、被検体にＡＬＫ−１アンタゴニストの有効量を投与することを含む、被検体の腫瘍、癌、細胞増殖性疾患および／または腫瘍性疾患の治療方法を意図する。一態様では、本発明は、ＡＬＫ−１アンタゴニストの有効量を投与することを含む、被検体の腫瘍増殖の阻害方法を提供する。ＡＬＫ−１アンタゴニストで治療される腫瘍性疾患の例には、「癌」及び「癌性」なる用語の下で本明細書に記述されるものが含まれるが、これらに限定されるものではない。
本発明で有用なＡＬＫ−１アンタゴニストによる治療に反応する非腫瘍性状態には、例えば、望ましくない又は異常な肥大、関節炎、関節リウマチ(ＲＡ)、乾癬、乾癬のプラーク、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化、アテローム硬化性プラーク、心筋梗塞からの浮腫、糖尿病および他の増殖性網膜症、例えば未熟児の網膜症、水晶体後線維増殖症、血管新生緑内障、年齢関連性黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植片血管新生、角膜移植片拒絶、網膜／脈絡叢血管新生、アングルの血管新生(ルベオーシス)、眼性新生血管疾患、血管性再狭窄、動静脈奇形(ＡＶＭ)、髄膜腫、血管腫、血管線維腫、甲状腺の過形成(グレイブス疾患を含む)、角膜及び他の組織移植、慢性炎症、肺炎症、急性の肺損傷／ＡＲＤＳ、敗血症、原発性肺高血圧症、悪性の肺滲出、大脳浮腫(例えば急性の脳卒中／非開放性頭部損傷／外傷と関係する)、滑液炎症、ＲＡのパンヌス形成、骨化性筋炎、肥大性骨形成、骨関節炎(ＯＡ)、抵抗性腹水、多嚢胞性卵巣疾患、子宮内膜症、サードスペースの体液疾患(膵炎、区画症候群、熱傷、腸疾患)、子宮類線維腫、早産、ＩＢＤのような慢性炎症(クローン病および潰瘍性大腸炎)、腎臓同種異系移植片拒絶反応、炎症性腸疾患、ネフローゼ症候群、望ましくない又は異常な組織塊増殖(非癌性)、肥満、脂肪組織質量増殖、血友病関節、肥大した瘢痕、体毛成長の阻害、オスラーウェバー症候群、化膿肉芽腫水晶体後線維増殖症、強皮症、トラコーマ、血管性接着、関節滑膜炎、皮膚炎、子癇前症、腹水、心嚢貯留液(心外膜炎と関係するものなど)および胸水が含まれるがこれらに限定されるものではない。さらに、疾患の例には上皮又は心臓疾患が含まれる。
【００６１】
併用療法
上記のように、本発明は、ＡＬＫ−１アンタゴニスト(ＡＬＫ−１イムノアドヘシン又は抗ＡＬＫ−１抗体など)が他の療法によって投与される併用療法を提供する。例えば、ＡＬＫ−１アンタゴニストは、様々な腫瘍性又は非腫瘍性の症状を治療するために抗癌療法又は抗脈管新生療法と組み合わせて用いられる。 他の例では、ＡＬＫ−１アンタゴニストは、抗リンパ脈管形成剤(例えば抗ＶＥＧＦＣ抗体のようなＶＥＧＦＣアンタゴニスト)と組み合わせて使われる。一実施態様では、腫瘍性又は非腫瘍性の症状は異常ないしは望ましくない血管新生又はリンパ脈管形成に関連する病的状態に特徴がある。ＡＬＫ−１アンタゴニストは、同じ組成物中で又は別々の組成物として、これらの目的のために有効である他の薬剤と組み合わせて、又は連続的に投与されうる。あるいは又はさらに、ＡＬＫ−１の複数のインヒビターが投与されてもよい。 
【００６２】
ＡＬＫ−１アンタゴニストおよび他の治療薬(例えば抗癌剤、抗脈管形成剤)の投与は、例えば単一の組成物として、又は、２以上の異なる組成物として、同じないしは異なる投与経路を使用して、同時になされうる。あるいは又はさらに、前記投与はいずれかの順序で経時的になされうる。あるいは又はさらに、複数の工程はいずれかの順序で経時的及び同時に併用としてなされうる。
ある実施態様では、２以上の組成物の投与の間には数分から数日、数週から数か月の範囲の間隔がありうる。例えば、抗癌剤がまず投与され、その後ＡＬＫ−１アンタゴニストが投与されてもよい。しかしながら、ＡＬＫ−１アンタゴニストの同時投与又は第一投与も考慮される。したがって、一態様では、本発明は、ＡＬＫ−１アンタゴニスト( ＡＬＫ−１イムノアドヘシン又は抗ＡＬＫ−１抗体など)の投与の後に抗脈管形成剤(ＶＥＧＦアンタゴニスト、例えば抗ＶＥＧＦ抗など体)を投与することを含む方法を提供する。一実施態様では、抗脈管形成剤は、抗ＶＥＧＦ中和抗体ないしは断片(例えばヒト化Ａ４.６.１、ＡＶＡＳＴＩＮ(登録商標)(Genentech, South San Francisco, CA)、Ｙ０３１７、Ｍ４、Ｇ６、Ｂ２０、２Ｃ３など)である。例として米国特許第６５８２９５９号、同第６８８４８７９号、同第６７０３０２０号；国際公開９８／４５３３２；国際公開９６／３００４６；国際公開９４／１０２０２；欧州特許第０６６６８６８号Ｂ１；米国特許公開２００３０２０６８９９、２００３０１９０３１７、２００３０２０３４０９および２００５０１１２１２６；Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)；及び国際公開２００５０１２３５９を参照のこと。
【００６３】
ＡＬＫ−１アンタゴニストと組み合わせて投与される治療薬の有効量は医師又は獣医の裁量である。治療される症状を最大限管理するために用量投与及び調整がなされる。用量は、さらに、使用される治療薬の種類及び治療される特定の個体などの因子に依存するであろう。抗癌剤の好適な用量は現在用いられているものであり、抗癌剤及びＡＬＫ−１アンタゴニストの組合せ作用(相乗作用)のために低くてもよい。ある実施態様では、インヒビターの組合せは単一のインヒビターの有効性を増強する。「増強」なる用語は、その一般的又は認可された用量での治療薬の有効性の改善を指す。また、本明細書中の薬学的組成物と題した項目を参照のこと。
一般的に、ＡＬＫ−１アンタゴニストと抗癌剤は、腫瘍、癌又は細胞増殖性疾患などの病理学的疾患をブロック又は低減するために、同じないしは類似の疾患に好適である。一実施態様では、抗癌剤は抗血管新生剤である。
【００６４】
癌との関係における抗血管新生療法は、腫瘍増殖を支える栄養分の供給に必要な腫瘍血管の発達を阻害することを目的とした癌治療方略である。血管新生が原発性腫瘍増殖と転移の療法に伴うので、本発明によって提供される抗血管新生療法は、原発部位での腫瘍の新生物性増殖の阻害と二次部位での腫瘍の転移の予防が可能であり、ゆえに他の療法によって腫瘍の攻撃がなされる。
多くの抗血管新生剤が同定されており、当分野で公知であり、本明細書中に挙げるもの、例えば定義の項目に挙げるもの、例えばCarmeliet and Jain, Nature 407:249-257 (2000)；Ferrara等, Nature Reviews:Drug Discovery, 3:391-400 (2004)；及びSato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)に挙げるものなどがある。また、米国特許出願ＵＳ２００３００５５００６も参照のこと。ある実施態様では、ＡＬＫ−１アンタゴニストは、抗ＶＥＧＦ中和抗体(又は断片)及び／又は他のＶＥＧＦアンタゴニストないしはＶＥＧＦレセプターアンタゴニスト、例として、限定するものではないが、例えば、可溶性ＶＥＧＦレセプター(例えば、ＶＥＧＦＲ-１、ＶＥＧＦＲ-２、ＶＥＧＦＲ-３、ニューロピリン(例えば、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２))断片、ＶＥＧＦないしはＶＥＧＦＲを遮断することができるアプタマー、中和抗ＶＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ(ＲＴＫ)の低分子量インヒビター、ＶＥＧＦのアンチセンス方略、ＶＥＧＦないしはＶＥＧＦレセプターに対するリボザイム、ＶＥＧＦのアンタゴニスト変異体、及びこれらのいずれかの組み合わせと組み合わせて用いられる。あるいは又はさらに、２つ以上の血管新生インヒビターは、場合によってＶＥＧＦアンタゴニスト及び他の薬剤に加えて個体に同時に投与されてもよい。ある実施態様では、一又は複数の更なる治療薬、例えば抗癌剤は、ＡＬＫ−１アンタゴニスト、ＶＥＧＦアンタゴニスト及び抗血管新生剤と組み合わせて投与されてもよい。
【００６５】
本発明のある態様では、ＡＬＫ−１アンタゴニストによる併用腫瘍療法に有用な他の治療剤には、他の癌療法(例えば、外科的治療、放射線処置(例えば、放射活性物質の照射又は投与を伴う)、化学療法、本明細書中に挙げる抗癌剤及び当分野で公知の抗癌剤、又はこれらの組み合わせ)が含まれる。あるいは又はさらに、本明細書中に開示した同じ又は２以上の異なる抗原を結合する２以上の抗体が個体に同時に投与されてもよい。また、患者に一又は複数のサイトカインを投与することが有益であることもある。
【００６６】
化学療法剤
ある態様では、本発明は、有効量のＡＬＫ−１アンタゴニスト(及び／又は血管新生インヒビター)と一又は複数の化学療法剤を投与することによる、疾患(腫瘍、癌又は細胞増殖性疾患など)の治療方法を提供する。様々な化学療法剤が本発明の併用治療方法で用いられてもよい。考慮する化学療法剤の例示的及び非限定的リストを本明細書中の「定義」の項目に示す。ＡＬＫ−１アンタゴニストと化学療法剤の投与は、例えば単一の組成物として、又は、２以上の異なる組成物として、同じないしは異なる投与経路を使用して、同時になされうる。あるいは又はさらに、前記投与はいずれかの順序で経時的になされうる。あるいは又はさらに、複数の工程はいずれかの順序で経時的及び同時に併用としてなされうる。ある実施態様では、２以上の組成物の投与の間には数分から数日、数週から数か月の範囲の間隔がありうる。例えば、化学療法剤がまず投与され、その後ＡＬＫ−１アンタゴニストが投与されてもよい。しかしながら、ＡＬＫ−１アンタゴニストの同時投与又は化学療法剤の投与の前の投与も考慮される。したがって、一態様では、本発明は、ＡＬＫ−１アンタゴニスト( ＡＬＫ−１イムノアドヘシン又は抗ＡＬＫ−１抗体など)の投与の後に化学療法剤を投与することを含む方法を提供する。
当業者によって理解されるように、化学療法剤の適切な用量は、一般的に、化学療法剤が単独ないしは他の化学療法剤と組み合わせて投与される臨床治療に既に用いられる用量の程度であろう。用量の変更はおそらく治療する症状に応じて行うであろう。治療を行う医師は、個々の被検体ごとに適当な用量を決定することが可能であろう。
【００６７】
ＡＬＫ-１
ＡＬＫ-１は、ＴＧＦレセプターファミリの内皮特異的なタイプＩレセプターである。ＡＬＫ−１遺伝子は、５０３のアミノ酸ポリペプチドをコードし、親水性システイン-豊富なリガンド-結合ドメイン、単一の疎水性膜貫通領域、および主にセリン／トレオニンキナーゼドメインからなるＣ末端細胞内部分を含む。ヒトＡＬＫ−１の受託番号はＣＡＡ８０２５５であり、マウスＡＬＫ−１の受託番号はＣＡＡ８３４８４である。
ＡＬＫ-１の突然変異は、遺伝性出血性毛細管拡張症２型と関係していた。長年、ＡＬＫ-１はオーファンレセプターであった。ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３はＡＬＫ−１リガンドであると既に推測されていたが、最近、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０はＡＬＫ−１の生理学的リガンドと同定された(David, L. et al., Blood 109:1953-1961 (2007))。ＡＬＫ−１の活性化は、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５およびＳｍａｄ８のリン酸化を誘導することが示されている。
【００６８】
ＡＬＫ-１アンタゴニスト
考慮するＡＬＫ−１アンタゴニスト(例えば抗ＡＬＫ−１抗体およびＡＬＫ−１イムノアドヘシンなど)の例示的及び非限定的な一覧は本明細書において「定義」の項目の下に示される。
本発明で有用なＡＬＫ−１アンタゴニストは、当分野で公知の様々なアッセイによって、それらの物理的／化学的な性質および生物学的機能について特徴付けされうる。いくつかの実施態様では、ＡＬＫ−１アンタゴニストは、ＡＬＫ−１への結合、一又は複数のＡＬＫ−１リガンド、例えばＢＭＰ９又はＢＭＰ１０への結合、ＡＬＫ−１レセプター活性化の低減又はブロック、ＡＬＫ−１下流分子のシグナル伝達(例えばＳｍａｄ１、Ｓｍａｄ５および／またはＳｍａｄ８のリン酸化)の低減又はブロック、ＡＬＫ−１へのＢＭＰ９又はＢＭＰ１０の結合の破壊又はブロック、血管形成の阻害、リンパ脈管形成の阻害、腫瘍、細胞増殖性疾患又は癌の治療及び／又は阻害、ＡＬＫ−１発現と関係している疾患の治療又は予防、いずれか一又は複数について特徴を示す。ＡＬＫ−１アンタゴニストの特徴を表す方法は当分野で公知であり、いくらかは本明細書中に記載され、例示される。
【００６９】
ＡＬＫ-１イムノアドヘシン
構造や調整を含み、イムノアドヘシンは、例えば国際公開９１／０８２９８、及び米国特許第５４２８１３０号および同第５１１６９６４号に記載されており、これらの開示内容は本明細書中に出典明記によって援用される。
イムノアドヘシン又はキメラヘテロ多量体アドヘシンの製造
以下の説明は、主として、イムノアドヘシン核酸を含むベクターにて形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりイムノアドヘシンを産生させる方法に関する。勿論、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてイムノアドヘシンを調製することができると考えられている。例えば、イムノアドヘシン配列又はその一部分を、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生成してもよい(例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., サン フランシスコ, カリフォルニア(1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照)。手動技術又は自動を使用することによってインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機(Foster City, CA)を用いて、製造者の指示によって実施してもよい。イムノアドヘシンの種々の部分を別々に化学的に合成し、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて完全長のイムノアドヘシンを製造してもよい。
天然配列ＡＬＫ−１レセプターをコードする核酸は、例えば、ＡＬＫ−１レセプターを発現させるために知られている細胞から単離してもよい。ヒトＡＬＫ−１ ｃＤＮＡの受託番号はＺ２２５３３であり、マウスＡＬＫ−１ ｃＤＮＡの番号はＺ３１６６４.１である。
【００７０】
免疫グロブリン軽鎖又は重鎖の定常領域をコードするＤＮＡは、公知であるか、又はｃＤＮＡライブラリからすぐに入手可能であるか、又は合成される。例としてAdams et al., Biochemistry 19:2711-2719 (1980)；Gough et al., Biochemistry 19:2702-2710 (1980)；Dolby et al; P.N.A.S. USA, 77:6027-6031 (1980)；Rice et al P.N.A.S USA 79:7862-7865 (1982)；Falkner et al; Nature 298:286-288 (1982)；及びMorrison et al; Ann. Rev. Immunol. 2:239-256 (1984)を参照。
本発明のイムノアドヘシン又はキメラヘテロアドヘシンは、好ましくは、宿主細胞での発現によって産生され、そこから単離される。一般に、宿主細胞は本発明の核酸にて形質転換される。好ましくは、核酸は発現ベクターに組み込まれる。本明細書中のベクターをクローニングし発現させるために適切な宿主細胞には、原核生物の宿主細胞(例として、大腸菌、バシラス属株、シュードモナス属株および他の細菌株)、酵母および他の真核微生物、及び高次の真核細胞(例として、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞および他の哺乳動物細胞)が含まれる。また、細胞は、生きている動物に(例えば、ウシ、ヤギ又はヒツジに)存在してもよい。昆虫細胞も用いられてもよい。クローニングおよび発現方法論は公知技術である。
ＡＬＫ１.Ｆｃ分子などのイムノアドヘシンの発現を得るために(実施例１に詳述する)、形質転換又は形質移入によって宿主細胞に一又は複数の発現ベクターを導入し、生じた組み換え宿主細胞を、プロモータを誘導し、組み換え細胞を選択し、又はＡＬＫ１.Ｆｃ ＤＮＡを増幅するために適切に変更した従来の栄養培地中で培養する。通常、インビトロ哺乳動物細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコールおよび実務上の技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991)にみられる。
【００７１】
イムノアドヘシンをコードする核酸の構築
本発明のイムノアドヘシンを調製する場合、好ましくは、天然のレセプターの細胞外ドメインをコードする核酸は、免疫グロブリン定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸にＣ末端融合しているが、Ｎ末端融合もまた可能である。一般的に、このような融合では、コード化されたキメラポリペプチドは、少なくとも機能的に活性な、免疫グロブリン重鎖の定常領域のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを保持する。また、定常ドメインのＦｃ部分のＣ末端、又は重鎖のＣＨ１に対して直近のＮ末端ないしは軽鎖の対応する領域に融合される。結果として生じるＤＮＡ融合コンストラクトは、適切な宿主細胞において発現される。
天然配列の細胞外ドメイン(例えばＡＬＫ−１の細胞外ドメイン)のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子および／または所望のイムノアドヘシンを調製するために使用される抗体配列は、当分野で公知の様々な方法によって調製される。これらの方法には、限定するものではないが、天然の供給源からの単離、又は天然配列のＡＬＫ−１の非変異体バージョンないしは早期に調製された変異体のオリゴヌクレオチドが媒介する(または、部位特異的)突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発およびカセット突然変異誘発による調製が含まれる。
【００７２】
キメラのヘテロアドヘシンに含まれる天然配列の細胞外ドメインのアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチド変化を天然の細胞外ドメインＤＮＡ配列に導入することによって、または、所望のキメラヘテロアドヘシン単量体ポリペプチドのインビトロ合成によって調製される。このような変異体には、例えば、イムノアドヘシン又はキメラヘテロアドヘシンのアミノ酸配列における残基の欠失、又は挿入又は置換が含まれる。
上記の天然配列における変化は、保存的及び非保存的突然変異のための技術及びガイドラインのいずれかを用いて施されうる。
【００７３】
一実施態様では、核酸は、ＡＬＫ-１レセプター細胞外ドメイン配列が免疫グロブリン、例えばＩｇＧ１のエフェクター機能を含有する抗体(特にＦｃドメイン)のＣ末端部分のＮ末端に融合しているキメラ分子をコードする。ＡＬＫ-１レセプター細胞外ドメイン配列に全ての重鎖定常領域を融合させることは可能である。しかしながら、より好ましくは、パパイン切断部位のすぐ上流のヒンジ領域で始まる配列(化学的にＩｇＧ Ｆｃを決定する、残基２１６、重鎖定常領域の初めの残基を１１４とする(Kobet et al., supra)、又は他の免疫グロブリンの類似する部位)が融合に用いられる。一実施態様では、ＡＬＫ-１レセプター細胞外ドメイン配列は、ヒンジ領域およびＣＨ２およびＣＨ３、又はＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ３重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに融合される。融合がなされる正確な部位は重要ではなく、最適部位は常法の試験により測定されてよい。
ヒトのイムノアドヘシンでは、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３免疫グロブリン配列の使用が好ましい。ＩｇＧ１を使用する主要な利点は、ＩｇＧ１イムノアドヘシンが固定されたプロテインＡにて効率良く精製されうることである。それに対して、ＩｇＧ３の精製は、非常に用途が狭い培地であるプロテインＧを必要とする。しかしながら、特定のイムノアドヘシンを構築するためにＩｇ融合パートナーを選択する場合、免疫グロブリンの他の構造的および機能的性質を考慮しなければならない。例えば、ＩｇＧ３ヒンジはより長くてよりフレキシブルであるので、長い「アドヘシン」ドメインとなり、ＩｇＧ１に融合させる場合に、適切に折り畳まれ機能しないかもしれない。他の考慮すべきことは結合価であるかもしれない。ＩｇＧイムノアドヘシンは二価のホモダイマーであるのに対して、ＩｇＡおよびＩｇＭのようなＩｇサブタイプは、それぞれ基本のＩｇホモダイマーユニットの二量体又は五量体の構造を生じさせうる。
【００７４】
インビボ用途のために設計されるＡＬＫ−１イムノアドヘシンでは、Ｆｃ領域によって特定されるエフェクター機能及び薬物動態学的性質がまた重要である。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４は全て２１日のインビボ半減期を持っているが、補体系を活性化させるその相対能力は異なっている。ＩｇＧ４は補体を活性化させず、ＩｇＧ２はＩｇＧ１よりも補体活性化が有意に弱い。さらに、ＩｇＧ１とは異なり、ＩｇＧ２は単核細胞又は好中球上のＦｃレセプターに結合しない。ＩｇＧ３は補体活性化には最適であるが、そのインビボ半減期は他のＩｇＧアイソタイプのおよそ１／３である。
ヒトの治療薬として使用されるために設計されるイムノアドヘシンについての他の重要な考慮事項は、特定のアイソタイプのアロタイプ変異体の数である。一般に、血清学的に定義されるアロタイプが少ないＩｇＧアイソタイプが好ましい。例えば、ＩｇＧ１は４つのみの血清学的に定義されるアロタイプ部位を有し、そのうちの２つ（Ｇ１ｍ及び２）はＦｃ領域に位置し、これらの部位の一つであるＧ１ｍ１は非免疫原性である。これに対して、ＩｇＧ３には１２の血清学的に定義されるアロタイプがあり、その全てがＦｃ領域にあり、これらの部位の３つのみ（Ｇ３ｍ５、１１及び２１）が非免疫原性である一つのアロタイプを有している。よって、ＩｇＧ３イムノアドヘシンの潜在的な免疫原性はＩｇＧ１イムノアドヘシンのものよりも大きい。
【００７５】
ＡＬＫ−１レセプター配列(例えば細胞外ドメイン配列)をコードするｃＤＮＡとイムノアドヘシンのＩｇ部分を、選択された宿主細胞において効率良く発現させるプラスミドベクターにタンデムで挿入する。哺乳動物細胞での発現には、例として、ｐＲＫ５ベースのベクター(Schall et al., Cell 61, 361-370 (1990))及びＣＤＭ８ベースのベクター(Seed, Nature 329, 840 (1989))を使用することができる。正確な接合は、オリゴヌクレオチドに誘導された欠失の突然変異誘発を用いて、設計された接合コドン間の余分な配列を取り除くことによって作製されてもよい(Zoller and Smith, Nucleic Acids Res. 10, 6487 (1982)；Capon et al., Nature 337, 525-531 (1989))。それぞれ半分が所望の接合部の各側の配列に相補的である合成オリゴヌクレオチドを使用することができ、これらは理想的には３６から４８ｍｅｒである。あるいは、ＰＣＲ法を使用して、適切なベクターにインフレームになるように分子の２つの部分を接合することができる。
一実施態様では、キメラヘテロアドヘシンポリペプチドは、抗タグ抗体が選択的に結合するエピトープを提供するタグポリペプチドとのキメラヘテロアドヘシンの単量体の融合体を含む。キメラヘテロアドヘシンのこのようなエピトープタグ付加形態は、その存在を、タグポリペプチドに対する標識抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグを供給すると、キメラヘテロアドヘシンを抗タグ抗体を用いたアフィニティー精製によって直ぐに精製することができる。タグポリペプチドとその各抗体は当分野で周知である。例として、Ｆｌｕ ＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５(Field et al., Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165 (1988))；ｃ-ｍｙｃタグとそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体(Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5(12): 3610-3616 (1985))；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパクＤ(ｇＤ)タグとその抗体(Paborsky et al., Protein Engineering 3(6): 547-553 (1990))が含まれる。
【００７６】
キメラヘテロ多量体の共有結合的修飾の他の種類は、ヘテロ多量体の単量体ポリペプチドを様々な非タンパク質ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーのいずれかに連結させることを含む。また、キメラヘテロ多量体は、例えばコアセルベーション法によって又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル(例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセル)内に、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルション内に捕捉されてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980)において開示される。
【００７７】
宿主細胞の選別および形質転換
宿主細胞を、ここに記載したイムノアドヘシン製造のための発現又はクローニングベクターにて形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変更された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及び上掲のSambrook等に見出すことができる。
形質転換又は形質移入の後、本発明の核酸は宿主細胞のゲノムに統合されても、染色体外エレメントとして存在してもよい。真核生物細胞形質移入及び原核生物細胞形質転換の方法は、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションなど、当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw et al., Gene, 23:315 (1983)及び１９８９年６月２９日公開の国際公開８９／０５８５９に記載されているように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が用いられる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第４３９９２１６号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van Solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、インタクトな細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【００７８】
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。  適切な原核生物には、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性微生物、例えば大腸菌のような腸内細菌科が含まれる。種々の大腸菌株が公に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)；大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１５３７)；大腸菌株Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７３２５)及びＫ５７７２(ＡＴＣＣ５３６３５)である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌属、例えば大腸菌(E. coli)、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えばネズミチフス菌(Salmonella Typhimurium)、セラチア、例えばセラチア・マルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバチルス・スブチルス(B. subtilis)及びバチルス・リチェニフォルミス(B. licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日発行のＤＤ２６６７１０に記載されたバチルス・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス、例えば緑膿菌及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定するものではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生成物発酵のための共通の宿主株である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０を、宿主にとって内因性のタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子変異をもたらすように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５(ａｒｇＦ−ｌａｃ)１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｋａｎｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７(ＡＴＣＣ５５２４４)；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５(ａｒｇＦ-ｌａｃ)１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｒｂｓ７  ｉｌｖＧ  ｋａｎｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び１９９０年８月７日発行の米国特許第４９４６７８３号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ方法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応も適切である。
【００７９】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、イムノアドヘシンコードベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)(Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; １９８５年５月２日公開の欧州特許第１３９３８３号)；クリュイベロミセス宿主(Kluyveromyces hosts)(米国特許第４９４３５２９号; Fleer等, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991))、例えばクリュイベロミセスラクチス(K. lactis)(MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt等, J. Bacteriol., 154(2): 737-742 [1983])、クリュイベロミセス・フラギリス(K. fragilis)(ＡＴＣＣ１２４２４)、クリュイベロミセス・ブルガリクス(K. bulgaricus)(ＡＴＣＣ１６０４５)、クリュイベロミセス・ウィケラミイ(K. wickeramii)(ＡＴＣＣ２４１７８)、クリュイベロミセス・ワルチイ(K. waltii)(ＡＴＣＣ５６５００)、クリュイベロミセス・ドロソフィラルム(K. drosophilarum)(ＡＴＣＣ３６９０６； Van den Berg等, Bio/Technology, 8: 135 (1990))、クリュイベロミセス・テモトレランス(K. thermotolerans)及びクリュイベロミセス・マルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)(欧州特許第４０２２２６号)；ピシア・パストリス(Pichia pastoris)(欧州特許第１８３０７０号； Sreekrishna等, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988])；カンジダ；トリコデルマ・レーシア(Trichoderma reesia)(欧州特許第２４４２３４号)；アカパンカビ(Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979])；シュワニオマイセス(Schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)(１９９０年１０月３１日公開の欧州特許第３９４５３８号)；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)(１９９１年１月１０日公開の国際公開９１／００３５７)；及びアスペルギルス宿主、例えばアスペルギルス・ニダランス(Ballance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn等, Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984])及びアスペルギルス・ニガー(Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985])が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(Methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピシア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されるメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
【００８０】
グリコシル化イムノアドヘシンの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物由来のものである。非脊椎動物細胞の例には、植物細胞だけでなく、ショウジョウバエＳ２及びヨトウ(spodoptera)Ｓｆ９等の昆虫細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主細胞株の例には、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)及びＣＯＳ細胞が含まれる。より具体的な例には、ＳＶ４０(ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１)で形質転換させたサル腎ＣＶ１細胞株；ヒト胚芽腎細胞株(２９３又は懸濁培養で成長するようにサブクローン化された２９３細胞、Graham等,J.Gen Virol.,36:59 (1977))；チヤイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ、Urlaub等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216 (1980));マウスセルトリ細胞(ＴＭ４、Mather,Biol.Reprod.,23：243-251 (1980))；ヒトの肺細胞(Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５)；ヒトの肝細胞(Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５)；及びマウス乳房腫瘍(ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)。適切な宿主細胞の選別は、従来技術の範囲内であると考えられる。
【００８１】
通常、ＡＬＫ−１イムノアドヘシンの発現のための哺乳動物宿主細胞株の選択は主に発現ベクターに依存する。他の考慮事項は必要とされるタンパク質の量である。ミリグラム量はしばしば一過性形質移入によって生産できる。例えば、アデノウイルスＥＩＡ形質転換２９３ヒト胎児由来腎臓細胞株に、リン酸カルシウム法の変形法によってｐＲＫ５ベースのベクターを用いて一過性に形質移入し、効率的なイムノアドヘシンの発現を可能にする。ＣＤＭ８ベースのベクターを用いて、ＤＥＡＥ-デキストラン法によってＣＯＳ細胞に形質移入することができる(Aruffo et al., Cell 61, 1303-1313 (1990)；Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. (US) 9, 347-353 (1990))。多量のタンパク質が所望される場合には、宿主細胞株の安定な形質移入後にイムノアドヘシンを発現させることができる。例えば、ｐＲＫ５ベースのベクターは、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）をコードしＧ４１８耐性を付与する更なるプラスミドの存在下でチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中に導入することができる。Ｇ４１８に耐性のあるクローンを培養中に選択することができる。これらのクローンはＤＨＦＲインヒビターのメトトレキセートのレベルを増加させた状態で成長させ、ＤＨＦＲ及びイムノアドヘシン配列をコードする遺伝子コピーの数が同時に増幅されているクローンが選択される。イムノアドヘシンがそのＮ末端に疎水性リーダー配列を含んでいる場合には、それは形質移入細胞によってプロセッシングされ分泌される可能性が高い。より複雑な構造を持つイムノアドヘシンの発現には独特に適合された宿主細胞が必要となりうる。例えば、軽鎖又はＪ鎖のような成分がある種のミエローマ又はハイブリドーマ細胞宿主によって提供されうる(上掲のGascoigne et al., 1987；Martin et al., J. Virol. 67, 3561-3568 (1993))。
【００８２】
複製可能なベクターの選択と使用
イムノアドヘシンをコードする核酸は、クローニング(ＤＮＡの複製)又は発現のために複製可能なベクターに挿入してもよい。多くのベクターが利用可能である。例えば、ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子又はファージの形であってもよい。適切な核酸配列は、様々な手順によってベクターに挿入されてよい。通常、ＤＮＡは、当分野で公知の技術を使用して適切な制限エンドヌクレアーゼ部位(一又は複数)に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの構築には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
イムノアドヘシンは直接的に組換え手法によって生成されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとして生成されてよい。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるイムノアドヘシンコードＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクリュイベロミセス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第５０１０１８２号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、カンジダ・アルビカンス(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(１９９０年４月４日発行の欧州特許第３６２１７９号)、又は１９９０年１１月１５日に公開された国際公開９０／１３６４６に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【００８３】
発現及びクローニングベクターは共に、一又は複数の選択された宿主細胞内でベクターを複製させる核酸配列を含む。このような配列は、様々な細菌、酵母及びウイルスについて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は、大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
典型的に、発現及びクローニングベクターは、選択マーカーとも称される選択遺伝子を含むであろう。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与えるか、(b)栄養要求性欠陥を補うか、又は(c)複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質、例えば桿菌のためのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子、をコードする。
哺乳動物細胞に適切な選択マーカーの例は、イムノアドヘシンコード核酸を捕捉するために細胞成分を同定することを可能にするもの、例えばＤＨＦＲ又はチミジンキナーゼである。野生型ＤＨＦＲが使用される適切な宿主細胞は、Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されるように、調製され、増殖される、ＤＨＦＲ活性を欠損しているＣＨＯ細胞株である。  酵母に用いられる適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である[Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)；Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979)；Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中での生育能を欠く酵母の変異株、例えばＡＴＣＣ番号４４０７６又はＰＥＰ４-１のための選択マーカーを提供する[Jones, Genetics, 85:12 (1977)]。
【００８４】
通常、発現及びクローニングベクターは、ｍＲＮＡ合成を促すためにイムノアドヘシンコード核酸配列に作用可能に連結されるプロモーターを含む。様々な宿主となりうる細胞によって認識されるプロモーターは周知である。原核生物の宿主による使用に適切なプロモーターには、β-ラクタマーゼ、及びラクトースプロモーターシステム[Chang et al., Nature, 275:615 (1978)；Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)]、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーターシステム[Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980)；欧州特許第３６７７６号]、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター[deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]が含まれる。また、細菌システムでの使用のためのプロモーターは、イムノアドヘシンをコードするＤＮＡに操作可能に連結されたシャイン−ダルガーノ(Ｓ.Ｄ.)配列を含むであろう。
酵母宿主との使用に適したプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1978)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、増殖条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸フォスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモーターは欧州特許第７３６５７号に更に記載されている。
【００８５】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのイムノアドヘシンの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、伝染性上皮腫ウイルス(１９８９年７月５日に公開のＵＫ２２１１５０４)、アデノウイルス(例えばアデノウイルス２)、ウシ乳頭腫ウイルス、レトロウイルス(トリ肉腫ウイルス)、サイトメガロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びサルウイルス４０(ＳＶ４０)のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーターによって、異種性哺乳動物プロモーターからのもの、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーターによって、又は熱ショックプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
高等真核生物によるイムノアドヘシンをコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強されうる。エンハンサーは、その転写を亢進するようにプロモーターに働く通常およそ１０から３００ｂｐの、ＤＮＡのシス作用因子である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、イムノアドヘシンコード配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされうるが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
【００８６】
また、真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト又は他の多細胞生物の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含みうる。このような配列は、真核生物又はウイルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの３'の非翻訳領域から一般に入手できる。これらの領域は、イムノアドヘシンをコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組み換え脊椎動物細胞培養物中でのイムノアドヘシンの合成への適応に適する他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981)；Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979)；欧州特許第１１７０６０号；及び欧州特許第１１７０５８号に記載される。
【００８７】
イムノアドヘシンの精製および特徴づけ
イムノアドヘシン又はキメラヘテロアドヘシンは分泌されたポリペプチドとして好ましくは培養培地から回収されるが、宿主細胞溶解物から回収されてもよい。第一工程として、宿主細胞又は溶解した断片いずれかの微粒子のデブリは、例えば、遠心分離法又は限外濾過によって取り除かれる。場合によって、タンパク質は、市販のタンパク質濃度フィルターによって、その後、イムノアフィニティカラムによる分画；イオン交換カラムによる分画；硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカによるクロマトグラフィ；ヘパリンセファロースによるクロマトグラフィ；陽イオン交換樹脂によるクロマトグラフィ；等電点電気泳動；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；及びゲル濾過から選択される一又は複数の精製手順によって他の不純物からキメラヘテロアドヘシンを分離することによって濃縮されてよい。
イムノアドヘシンを精製する特に有益な方法は、アフィニティクロマトグラフィである。アフィニティーリガンドの選択は、キメラに用いられる免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４重鎖に基づくイムノアドヘシンの精製に用いることができる(Lindmark等, J. Immunol. Meth. 62: 1-13 [1983])。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトＩｇＧ３に推奨されている(Guss等, EMBO J. 5: 15671575 [1986])。アフィニティリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。プロテインＡ又はＧアフィニティーカラムへイムノアドヘシンを結合させるための条件はＦｃドメインの特性によって完全に支配される。つまり、その種及びアイソタイプである。一般に、適切なリガンドが選択されると、効率的な結合が無条件培地流体から直接生じる。イムノアドヘシンの一つの顕著な特徴は、ヒトＩｇＧ１分子の場合、プロテインＡに対する結合能が同じＦｃタイプの抗体に対して若干消失していることである。結合したイムノアドヘシンは酸性ｐＨ（３．０かそれ以上）又は穏やかなカオトロピック塩を含む中性ｐＨバッファーの何れかで効率的に溶出させることができる。このアフィニティークロマトグラフィー工程により＞９５％の純度のイムノアドヘシンの調製物を得ることができる。
【００８８】
従来から知られている他の方法も、イムノアドヘシンの精製のために、プロテインＡ又はＧのアフィニティークロマトグラフィーの代わりに又はそれに加えて使用することができる。イムノアドヘシンは、チオフィリックゲルクロマトグラフィー(Hutchens and Porath, Anal. Biochem. 159, 217-226 (1986))及び固定化金属キレートクロマトグラフィー(Al-Mashikhi and Makai, J. Dairy Sci. 71, 1756-1763 (1988))では抗体と同様に挙動する。しかし、抗体とは異なり、イオン交換カラムにおけるその挙動はその等電点によってだけでなく、そのキメラの性質による分子中に存在しうる電荷双極子によっても支配される。 
エピトープタグ付加イムノアドヘシンの調製は、融合ポリペプチドを吸着するためにエピトープに対する抗体を含有するイムノアフィニティカラムを使用した精製を容易にする。
【００８９】
ある実施態様では、ＡＬＫ−１イムノアドヘシンは、基本的に国際公開９１／０８２９８にて図示されるように、単量体又はヘテロないしはホモ多量体、二量体又は四量体としてアセンブルされる。一般に、これらのアセンブルされた免疫グロブリンは公知のユニット構造であろう。基本の４つの鎖構造ユニットは、ＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＥが存在する形態である。４ユニット構造は、分子量が高い免疫グロブリンにおいて繰り返される。一般に、ＩｇＭは、ジスルフィド結合によって一つにされた基本の４つのユニットの五量体として存在する。また、ＩｇＡグロブリン、稀にＩｇＧグロブリンは、血清中では多量体の形態で存在してもよい。多量体の場合、各４ユニットは同じでも異なっていてもよい。
一般に、本発明のＡＬＫ−１イムノアドヘシンは、例えばＡＬＫ−１レセプター活性化の低減又はブロック、ＡＬＫ-１下流分子のシグナル伝達、例えばＳｍａｄ１、Ｓｍａｄ５および／またはＳｍａｄ８のリン酸化の低減又はブロック、ＡＬＫ−１に対するＡＬＫ−１リガンド(例えばＢＭＰ９又はＢＭＰ１０)結合の破壊又はブロックを含む、ＡＬＫ−１の活性を中和、ブロック、阻害、無効、低減又は干渉することができるという性質のいずれか一又は複数を有するであろう。
【００９０】
抗体
一実施態様では、抗ＡＬＫ−１抗体はモノクローナルである。また、本明細書中で提供される抗ＡＬＫ−１抗体のＦａｂ、Ｆａｂ'、Ｆａｂ'-ＳＨ及びＦ(ａｂ')２断片も本発明の範囲内に包含される。これらの抗体断片は、従来の方法、例えば酵素消化により作製されるか、組換え体技術により生成されてもよい。このような抗体断片は、キメラでもよいし、ヒト化のものでもよい。これらの断片は、後述する診断目的及び治療目的のために有用である。
モノクローナル抗体は実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、わずかながら存在しうる天然に生じる突然変異体を除いて同一のものである。よって、「モノクローナル」との修飾詞は、別個の抗体の混合物ではなく、抗体の特性を示すものである。
抗ＡＬＫ−１モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４８１６５６７号)によって作製することができる。
【００９１】
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを免疫化し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を誘導する。一般的に、ＡＬＫ−１への抗体は、ＡＬＫ−１とアジュバントを複数回皮下(ｓｃ)又は腹腔内(ｉｐ)に注射することにより動物内に生じる。ＡＬＫ−１は当分野で公知の方法を用いて調製されうる。その方法のいくつかは本明細書中でさらに記載される。例えば、ＡＬＫ−１の組み換え産生は以下に記載される。一実施態様では、動物を、免疫グロブリン重鎖のＦｃ部位に融合したＡＬＫ−１の細胞外ドメイン(ＥＣＤ)を含むＡＬＫ−１の誘導体で免疫化する。他の実施態様では、動物を、ＡＬＫ−１−ＩｇＧ１融合タンパク質で免疫化する。通常、動物は、一リン酸化リピドＡ(ＭＰＬ)／トレハロースジクリノミコレート(trehalose dicrynomycolate)(ＴＤＭ) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT)によりＡＬＫ−１の免疫原性コンジュゲート又は誘導体に対して免疫化され、該溶液は複数の部位の皮下に注射される。２週後に、動物を追加免役する。７〜１４日後、動物から採血して、血清を抗ＡＬＫ−１力価について検定する。力価がプラトーになるまで動物を追加免役する。
別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,59-103頁(Academic Press, 1986))。
【００９２】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの生産を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫系、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、San Diego, California USAから入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及びアメリカ培養細胞系統保存機関、Rockville, Maryland USAから入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されたものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
【００９３】
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、ＡＬＫ−１に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunsonほか, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のスキャッチャード分析法によって測定することができる。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地には、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地が包含される。加えて、該ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインA-SEPHAROSE、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような常套的な免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
【００９４】
抗ＡＬＫ−１抗体は、所望される活性を有する合成抗体クローンをスクリーニングするために、コンビナトリアルライブラリを用いて同定することができる。原則として、合成抗体クローンを、ファージコートタンパク質と融合した抗体可変領域(Fv)の種々の断片を表示するファージを有するファージライブラリをスクリーニングすることによって選択される。このようなファージライブラリは、所望される抗原に対するアフィニティークロマトグラフィーによって選別される。所望される抗原と結合することができるFv断片を発現するクローンは抗原へ吸収され、それによって、ライブラリの非結合クローンから分離される。次いで、この結合クローンは、抗原から溶出させることが可能であり、抗原吸収／溶出の付加的サイクルによってさらに濃縮することができる。任意の抗ＡＬＫ−１抗体は、興味の対象であるファージクローンを選択するために適切な抗原スクリーニング手法を設計し、続いて、興味の対象であるファージクローンからのＦｖ配列、及びKabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3に記載の適切な定常領域(Fc)配列を用いての全長抗ＡＬＫ−１抗体クローンの構築によって得ることができる。
抗体の抗原結合ドメインは、約１１０アミノ酸の２つの可変(Ｖ)領域である軽(ＶＬ)及び重(ＶＨ)鎖で形成され、その双方には、３つの超可変ループ又は相補鎖決定領域(ＣＤＲ)が存在する。可変ドメインは、Winter等，Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455(1994)に記載のように、ＶＨ及びＶＬが短くて柔軟なペプチドを介して共有結合している一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)断片として、又は定常ドメインと融合して非共有的に相互作用しているＦａｂ断片のいずれかとしてファージ上に機能的に表示することができる。ここで用いられているように、ｓｃＦｖコード化ファージクローン、及びＦａｂコード化ファージクローンは、総称して「Ｆｖファージクローン」又は「Ｆｖクローン」と呼ぶ。
【００９５】
ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)によって分離してクローンし、ファージライブラリにおいてランダムに組み換えられることが可能であり、それは、Winter等，Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455(1994)に記載のように抗原結合クローンについて探索することが可能である。免疫化したソースからのライブラリは、ハイブリドーマを構成する必要がなく、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、天然レパートリーをクローニングして、Griffiths等，EMBO J, 12: 725-734(1993)に記載のようにどんな免疫化もせずに、幅広い非自己及びまた自己抗原に対するヒト抗体の単一のソースを提供することが可能である。最終的には、天然ライブラリは、また、Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol. 227: 381-388(1992)に記載のように、幹細胞からの再配列されていないV遺伝子セグメントをクローニングし、及びランダム配列を有するＰＣＲプライマーを利用して高度可変ＣＤＲ３領域をコードし、インビトロでの再配列を完成させることによって合成的に作製することができる。
繊維状ファージは、マイナーコートタンパク質ｐＩＩＩへの融合によって、抗体断片を表示するのに用いられる。この抗体断片は、一本鎖Ｆｖ断片として表示することが可能であり、そのＶＨ及びＶＬドメインは、例えば、Marks等，J. Mol. Biol. 222: 581-597(1991)に記載のような、又は、例えば、Hoogenboom等，Nucl. Acids. Res., 19: 4133-4137(1991)に記載のような、１つの鎖はｐＩＩＩと融合し、もう一方の鎖は、幾つかの野生型コートタンパク質を置換することによってファージ表面上に表示されるようになるＦａｂコートタンパク質構造のアセンブリがある細菌宿主細胞のペリプラズムへ分泌されるＦａｂ断片のように、柔軟なポリペプチドスペーサーによって同じポリペプチド鎖上に連結されている。
【００９６】
一般的に、抗体遺伝子断片をコードする核酸は、ヒト又は動物から収集した免疫細胞から得られる。抗ＡＬＫ−１クローンに有利になるように偏ったライブラリが望ましい場合には、被検体をＡＬＫ−１で免疫化して抗体応答を生成させ、そして、脾臓細胞及び／又は他の末梢血リンパ球(ＰＢＬ)である循環Ｂ細胞を、ライブラリ構築のために回収する。好ましい実施態様では、ＡＬＫ−１免疫化により、ＡＬＫ−１に対するヒト抗体を産生するＢ細胞が生じるように、抗ＡＬＫ−１クローンに好ましいヒト抗体遺伝子断片ライブラリは、機能的ヒト免疫グロブリン遺伝子アレイを有する(及び、機能的な内因性抗体産生系を欠く)トランスジェニックマウスにおける抗ＡＬＫ−１抗体応答を生成することによって得られる。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスの作製は以下に記載する。
抗ＡＬＫ−１反応細胞集団のさらなる濃縮は、適切なスクリーニング手法を利用してＡＬＫ−１特異的膜結合抗体を発現するＢ細胞を単離すること、例えば、ＡＬＫ−１アフィニティクロマトグラフィーによる細胞分離、又は蛍光色素標識ＡＬＫ−１への細胞の吸着とその後の蛍光標示式細胞分取器(ＦＡＣＳ)によって得ることができる。
あるいは、非免疫化供与体からの脾臓細胞及び／又はＢ細胞又は他のＰＢＬの利用によって可能性のある抗体レパートリーのより良い表示が提供され、また、ＡＬＫ−１が免疫原ではない任意の動物(ヒト又は非ヒト)種を利用した抗体ライブラリの構築が可能となる。インビトロの抗体遺伝子コンストラクトを取り込むライブラリに関しては、幹細胞を被検体から収集して非再配列の抗体遺伝子セグメントをコードする核酸を提供する。対象の免疫細胞は、種々の動物種、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ目、オオカミ、犬科、ネコ科、ブタ、ウシ、ウマ、及びトリ種等から得ることができる。
【００９７】
抗体可変遺伝子セグメント(ＶＨ及びＶＬセグメントを含む)をコードする核酸を、興味の対象の細胞から回収して増幅した。再配列したＶＨ及びＶＬ遺伝子ライブラリの場合では、その所望するＤＮＡは、Orlandiら，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989)に記載されているように、リンパ球からのゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを単離し、再配列したＶＨ及びＶＬ遺伝子の５'及び３'末端と一致するプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を行うことによって得ることが可能であり、よって発現のための多様なＶ遺伝子レパートリーを作製することができる。このＶ遺伝子は、Orlandi等, (1989)及びWardら，Nature, 341: 544-546(1989)に記載のように、成熟Ｖドメインをコードするエクソンの５'末端のバックプライマーとＪセグメントに基づいた前方向プライマーにより、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡから増幅することが可能である。しかしながら、ｃＤＮＡからの増幅のためには、バックプライマーは、また、Jonesら，Biotechnol., 9:88-89(1991)に記載のようにリーダーエクソンに、前方向プライマーは、Sastryら，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86:5728-5732(1989)に記載のように定常領域内に基づくことが可能である。相補性を最大にするために、Orlandiら(1989)又はSastryら(1989)に記載のように、縮重をプライマーへ取り込むことが可能である。好ましくは、例えば、Marksら，J. Mol. Biol., 222: 581-597(1991)の方法に記載のように、又はOrumら，Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498(1993)の方法に記載のように、免疫細胞の核酸試料に存在するすべての入手可能なＶＨ及びＶＬ配列を増幅するために、各Ｖ遺伝子ファミリーを標的にしたＰＣＲプライマーを用いて、そのライブラリの多様性を最大にする。発現ベクターへの増幅ＤＮＡのクローニングに関しては、希な制限部位を、Orlandiら(1989)に記載のように、又はClacksonら，Nature, 352: 624-628(1991)に記載のようにタグ付加したプライマーによるさらなるＰＣＲ増幅によって、ＰＣＲプライマー内の１つの末端へタグとして導入することができる。
【００９８】
合成的に再配列したＶ遺伝子のレパートリーは、Ｖ遺伝子セグメントからインビボで誘導することができる。殆どのヒトＶＨ遺伝子セグメントはクローニング及び配列決定(Tomlinson等, J. Mol. Biol. 227: 776-798(1992)に報告されている)、そしてマッピングがされている(Matsudaら，Nature Genet., 3: 88-94(1993))；これらクローニングされたセグメント(Ｈ１及びＨ２ループのすべての主要なコンホメーションを含む)は、Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol. 227: 381-388(1992)に記載のように、多様な配列と長さのＨ３ループをコードするＰＣＲプライマーによる多様なＶＨ遺伝子レパートリーを作製するのに用いられる。ＶＨレパートリーは、また、Barbas等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461(1992)に記載されているように、単一の長さの長いＨ３ループに焦点を合わせたすべての配列多様性をともなって作製することができる。ヒトＶκ及びＶλセグメントはクローニング及び配列決定がなされ(Williams及びWinter， Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461(1993))、合成軽鎖レパートリーを作製するのに利用することができる。ＶＨ及びＶＬフォールドの範囲及びＬ３及びＨ３の長さに基づく合成的Ｖ遺伝子レパートリーは、相当に構造的多様性を有する抗体をコードする。ＤＮＡをコードするＶ遺伝子の増幅に続いて、生殖系のＶ遺伝子セグメントは、Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol. 227: 381-388(1992)の方法に従ってインビトロで再配列することができる。
【００９９】
抗体断片のレパートリーは、幾つかの方法でＶＨ及びＶＬ遺伝子レパートリーを共に組み合わせることによって構築することができる。各レパートリーを異なるベクターで作製し、そのベクターを、例えばHogrefe等, Gene, 128: 119-126(1993)に記載のようにインビトロで、又はコンビナトリアル・インフェクション、例えばWaterhouse等, Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266(1993)に記載のloxP系によってインビボで作製することが可能である。このインビボの組み換え手法では、大腸菌の形質転換効率によって強いられるライブラリの大きさの限界を克服するために、二本鎖種のＦａｂフラグメントが利用される。ナイーブのＶＨ及びＶＬレパートリーは、１つはファージミドへ、そして他はファージベクターへと個別にクローニングされる。この２つのライブラリは、その後、各細胞が異なる組み合わせを有し、そのライブラリの大きさが、存在する細胞の数(約１０１２クローン)によってのみ限定されるように、ファージミド含有細菌のファージ感染によって組み合わせられる。双方のベクターは、ＶＨ及びＶＬ遺伝子が単一のレプリコンへ組み換えられ、ファージビリオンへ共にパッケージされるように、インビボの組み換えシグナルを有する。これら巨大なライブラリは、良好な親和性(約１０−８ＭのＫｄ−１)の多くの多様な抗体を提供する。
別法として、このレパートリーは、例えばBarbas等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982(1991)に記載のように同じベクターへ連続してクローニング、又は、Clakson等, Nature, 352: 624-628(1991)に記載のようにＰＣＲ後に、クローニングすることでアセンブリすることができる。ＰＣＲアセンブリは、また、柔軟なペプチドスペーサーをコードしているＤＮＡとＶＨ及びＶＬ ＤＮＡを連結させて、単鎖のＦｖ(ｓｃＦｖ)レパートリーを形成することに利用することができる。さらに他の技術では、「細胞内でのＰＣＲアセンブリ」は、Embleton等, Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837(1992)に記載のように、ＰＣＲによってリンパ球内のＶＨ及びＶＬ遺伝子を組み合わせて、その後、連結した遺伝子のレパートリーをクローニングするのに利用される。
【０１００】
ナイーブのライブラリ(天然又は合成のいずれか)によって産生された抗体は中度の親和性(約１０６〜１０７Ｍ−１のＫｄ−１)である可能性があるが、Winterら(1994), 上掲に記載のように第二番目のライブラリから構築して遊離することによって、親和性成熟をもインビトロで模倣することが可能である。例えば、Hawkins等, J. Mol. Biol. 226: 889-896(1992)の方法、又はGram等, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580(1992)の方法においてエラー・プローンポリメラーゼ(Leung等, Technique, 1:11-15(1989)で報告されている)を利用することによって、突然変異をインビトロでランダムに導入することができる。さらには、１つ又はそれより多いＣＤＲをランダムに変異させることによって、例えば、選択した個々のＦｖクローンにおいて、対象のＣＤＲまで及ぶランダム配列を有するプライマーによるＰＣＲを利用して、そしてより高い親和性クローンをスクリーニングすることで親和性成熟をおこなうことが可能である。国際公開第９６０７７５４号(１９９６年３月１４日に公開)は、免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域へ突然変異生成を誘導して軽鎖遺伝子のライブラリを作製する方法を記載している。その他の有効な手法は、Marks等, Biotechnol. 10: 779-783(1992)に記載のように、非免疫化供与体から得られた天然で発生するＶドメイン変異体のレパートリーによるファージディスプレイによって選択されたＶＨ又はＶＬドメインを組み換えること、及び数回のチェーン・シャッフリングにおいてより高い親和性についてスクリーニングすることである。この技術は、１０−９Ｍの範囲の親和性の抗体及び抗体断片の産生を可能にする。
【０１０１】
ＡＬＫ−１核酸及びアミノ酸配列は当分野で公知であり、さらに本明細書中において検討される。ＡＬＫ−１をコードするＤＮＡは、当分野で公知の様々な方法によって調製できる。これらの方法には、Engels 等, Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 28: 716-734 (1989)に記載の何れかの方法、例えばトリエステル、亜リン酸エステル、ホスホラミダイト及びＨ-ホスホン酸塩方法による化学的な合成法が含まれるがこれに限定されるものではない。一実施態様では、発現宿主細胞に好ましいコドンが、ＡＬＫ−１コード化ＤＮＡの設定に用いられる。これに対して、ＡＬＫ−１をコードするＤＮＡは、ゲノムないしｃＤＮＡのライブラリから単離できる。
ＡＬＫ−１をコードするＤＮＡ分子の構築に続いて、そのＤＮＡ分子は、プラスミド等の発現ベクターの発現コントロール配列と作用可能に連結し、このコントロール配列は、そのベクターで形質転換した宿主細胞によって認識される。一般的に、プラスミドベクターは、その宿主細胞と適合する種から誘導された複製及びコントロール配列を有する。このベクターは、通常は、形質転換細胞で表現型の選択を提供することが可能なタンパク質をコードする配列だけでなく複製部位を有する。原核宿主細胞及び真核宿主細胞での発現に好適なベクターは当分野で公知であり、さらにそのいくつかを本明細書に記載する。酵母菌などの原核生物、又は哺乳動物などの多細胞生物由来の細胞が用いられうる。
【０１０２】
場合によっては、ＡＬＫ−１をコードしているＤＮＡは宿主細胞によって培地中への発現産物の分泌を生じさせる分泌リーダー配列に作用可能に結合される。分泌リーダー配列の例には、stII、エコチン(ecotin)、lamB、ヘルペスGD、lpp、アルカリホスファターゼ、インベルターゼ、及びアルファ因子が含まれる。ここでの使用にまた適しているのはプロテインＡの３６アミノ酸リーダー配列である(Abrahmsen等, EMBO J., 4:3901(1985) )。
宿主細胞はこの発明の上述の発現又はクローニングベクターでトランスフェクトされ、好ましくは形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように変性された一般的な培養液中で培養される。
【０１０３】
トランスフェクションとは、実際に任意のコード化配列が発現するかどうか分からない宿主細胞による発現ベクターの取り込みを意味する。トランスフェクションの多くの方法は、通常の技能を有する技術者に知られており、例えば、ＣａＰＯ４沈降法及び電気穿孔法がある。一般に成功したトランスフェクションは、宿主細胞内で該ベクターの働きの兆候が現れた時に認識される。
形質転換とは、ＤＮＡが染色体外成分として又は染色体組み込みによってのいずれかで複製可能となるように、生物にＤＮＡを導入することを意味する。用いる宿主細胞によって、その細胞に適した基本的な技術を用いて形質転換は行われる。形質転換法は当分野で公知であり、そのいくつかをさらに本明細書中に記載する。
【０１０４】
ＡＬＫ−１を産生するために用いる原核生物宿主細胞は、一般的に、Sambrook等, 上掲に記載のように培養することが可能である。
ＡＬＫ−１を産生するために使用される哺乳動物宿主細胞は、様々な培地で培養することができる。その培地は当分野で周知であり、そのいくつかを本明細書中に記載する。
この開示で言及している宿主細胞には、宿主動物内の細胞だけでなくインビトロ培養物の細胞が含まれる。
【０１０５】
ＡＬＫ−１の精製は、当分野で認識される方法を用いて実施される。そのいくつかを本明細書中に記載する。
ファージディスプレイクローンのアフィニティークロマトグラフィー分離での利用のために、例えば、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、ガラスビーズ、セルロース、種々のアクリルコポリマー、ヒドロキシルメタクリルゲル、ポリアクリル及びポリメタクリルコポリマー、ナイロン、中性及びイオン性担体等の適切な基質へ精製したＡＬＫ−１を付着させることが可能である。基質へのＡＬＫ−１タンパク質の付着は、Methods in Enzymology, ４４巻(1976)に記載されている方法によって完遂することができる。アガロース、デキストラン又はセルロース等の多糖類基質へタンパク質リガンドを付着させるために広く用いられている技術には、ハロゲン化シアンによる担体の活性化、それに続く、活性化基質へのペプチドリガンドの第１級脂肪族又は芳香族アミンのカップリングが含まれる。
あるいは、ＡＬＫ−１は、吸収プレートのウェルをコーティングするために利用すること、吸収プレートへ付着させた宿主細胞上で発現させるか又はセルソーティングで利用すること、又はストレプトアビジンでコーティングしたビーズによる捕獲のためにビオチンとコンジュゲートすること、又はファージディスプレイライブラリをパニングするためのあらゆる他の当該分野の方法において利用することが可能である。
【０１０６】
吸着剤との少なくともファージ粒子の一部分の結合に適した条件下で、ファージライブラリの試料を固定化ＡＬＫ−１と接触させる。通常は、ｐＨ、イオン強度、温度等を含む条件を選択して、生理学的条件を模倣する。固相と結合したファージを洗浄し、その後、例えばBarbas等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982(1991)に記載されているように酸で、又は例えばMarks等, J. Mol. Biol. 222: 581-597(1991)に記載にされているようにアルカリで、又は例えばClackson等, Nature, 352: 624-628(1991)の抗原競合法に類似の手法であるＡＬＫ−１抗原競合によって溶出する。ファージは、１回目の選択で２０〜１，０００倍に濃縮することが可能である。さらには、この濃縮したファージを細菌培養液で生育させ、さらなる回の選択に供することが可能である。
【０１０７】
選択の効率は多くの要因に依存し、それには、洗浄の間の解離の動力学、そして単一のファージ上の複数の抗体断片が同時に抗原と関われるかどうかということが含まれる。一次解離定数(及び弱い結合親和性)を有する抗体は、短い洗浄、多価ファージディスプレイ及び固相の抗原の高いコーティング密度の利用によって保持することが可能である。高い密度は、多価相互作用を介してファージを安定化するだけでなく、解離したファージの再結合に有利に作用する。遅い解離動力学(及び良好な結合親和性)を有する抗体の選択は、Bass等, Proteins, 8: 309-314(1990)及び国際公開第92/09690号に記載されているような長い洗浄と単価ファージディスプレイの利用、そしてMarks等, Biotechnol., 10: 779-783(1992)に記載されているような抗原の低度のコーティング密度によって促進することが可能である。
【０１０８】
親和性に僅かな違いがあったとしても、ＡＬＫ−１に対する異なる親和性のファージ抗体の中で選択することは可能である。しかしながら、選択した抗体のランダム変異(例えば、上記の幾つかの親和性成熟の技術で行われているような)は、多くの変異を生じやすく、その殆どが抗原と結合し、僅かがより高い親和性である。ＡＬＫ−１を限定すると、希な高い親和性のファージが競合して除かれることが可能である。すべてのより高い親和性の変異を保持するために、ファージは、過度のビオチン化ＡＬＫ−１とインキュベートすることが可能であるが、ＡＬＫ−１に対する標的モル濃度親和定数よりも低いモル濃度のビオチン化ＡＬＫ−１とインキュベートできる。次いで、高親和性結合ファージをストレプトアビジンでコーティングした常磁性体ビーズによって捕獲することが可能である。そのような「平衡捕獲」は、結合の親和性に従い、親和性の低い過度のファージから、僅かに２倍高い親和性の変異体クローンの単離を可能にする感度で抗体を選択することを可能にする。固相と結合したファージを洗浄するのに用いる条件を操作して、解離定数を基礎として識別することも可能である。
抗ＡＬＫ−１クローンは活性選択されうる。一実施態様では、本発明は、ＡＬＫ−１レセプター活性化を低減又はブロック、ＡＬＫ-１下流分子のシグナル伝達、例えばＳｍａｄ１、Ｓｍａｄ５および／またはＳｍａｄ８のリン酸化を低減又はブロック、ＡＬＫ−１に対するＡＬＫ−１リガンド(例えばＢＭＰ９又はＢＭＰ１０)結合を破壊又はブロックする抗ＡＬＫ−１抗体を提供する。
【０１０９】
ハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡ又はファージディスプレイＦｖクローンは、常法を用いて(例えば、ハイブリドーマの対象の領域をコードする重鎖及び軽鎖又はファージＤＮＡ鋳型を特異的に増幅するように設定したオリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより)即座に分離されて、配列決定される。ひとたび分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外では抗体タンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌での組み換え発現に関する概説論文には、Skerra等, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)及びPluckthun, Immunol. Revs. 130: 151-188(1992)が含まれる。
ＦｖクローンをコードするＤＮＡは、重鎖及び／又は軽鎖定常領域をコードする公知のＤＮＡ配列(例えば好適なＤＮＡ配列は上掲のカバット等から得ることができる)と組み合わせて、完全長ないし一部の重鎖及び／又は軽鎖をコードするクローンを形成できる。このために、何れかのアイソタイプの定常領域、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ定常領域を用いることができることが理解されるであろう。このような定常領域は任意のヒト又は動物種から得ることができる。ある動物(例えばヒト)種の可変ドメインＤＮＡから得て、次いで「ハイブリッド」である完全長重鎖及び／又は軽鎖のコード配列を形成するために他の動物種の定常領域ＤＮＡに融合したＦｖクローンは、本明細書で用いられる「キメラ」及び「ハイブリッド」抗体の定義に含まれる。好適な実施態様では、ヒト可変ＤＮＡから得たＦｖクローンをヒト定常領域ＤＮＡに融合して、すべてのヒト、完全長ないし一部の重鎖及び／又は軽鎖のコード配列を形成する。
【０１１０】
また、ハイブリドーマ由来の抗ＡＬＫ−１抗体をコードするＤＮＡは、例えば、ハイブリドーマクローン由来の相同的マウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列を置換すること(例えばMorrison等, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:6851(1984)の方法)によって修飾することができる。ハイブリドーマ又はＦｖクローン由来の抗体ないし抗体断片をコードするＤＮＡは、免疫グロブリンコード化配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード化配列の全て又は一部を共有結合させることによってさらに修飾することができる。そのように、「キメラ」又は「ハイブリッド」抗体は、Ｆｖクローン又はハイブリドーマクローン由来の抗体の結合特異性を有するように調製される。
【０１１１】
抗体断片
本発明は抗体断片を包含する。特定の場合では、全抗体よりも抗体断片の利用に利点がある。より小さいサイズの断片によりクリアランスが速くなり、固形腫瘍へのアクセスが改善されうる。
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、完全な抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗体断片はすべて、大腸菌で発現され、分泌されるため、この断片の大規模産生が容易となる。抗体断片は上述において検討した抗体ファージライブラリーから分離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。サルベージレセプター結合エピトープ残基を含有する、インビボ半減期が増加したＦａｂ及びＦ(ａｂ')２断片は米国特許第５８６９０４６号に記載される。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦＶ)である。国際公開９３/１６１８５；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。Ｆｖ及びｓＦｖは、定常領域が欠けている完全な結合部を有する唯一の種である；したがって、それらは、インビボでの使用の間の非特異的結合を減らすために適する。ｓＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノ末端又はカルボキシ末端の何れかで、エフェクタータンパク質の融合物を得るために構築されうる。上掲のAntibody Engineering, ed. Borrebaeckを参照。また、抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。このような直線状の断片は単特異的又は二重特異的であってもよい。
【０１１２】
ヒト化抗体
本発明はヒト化抗体を包含する。非ヒト抗体をヒト化する様々な方法は従来からよく知られている。例えば、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にはヒト抗体の該当する高頻度可変領域配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jonesほか, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmannほか, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyenほか, Science, 239:1534-1536(1988))を使用して実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４８１６５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくつかの高頻度可変領域残基及び場合によってはいくらかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク領域として受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J. Immunol., 151:2623(1993))。
【０１１３】
更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、ある方法によって、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接的かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【０１１４】
ヒト抗体
ヒト抗ＡＬＫ−１抗体は、上記のように、ヒト由来のファージディスプレイライブラリから選択したＦｖクローン可変ドメイン配列を公知のヒト定常ドメイン配列と結合することによって構築することができる。あるいは、ヒトモノクローナル抗ＡＬＫ−１抗体は、ハイブリドーマ法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の生産のためのヒトミエローマ及びマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞株は，例えば，Kozbor, J. Immunol. 133, 3001(1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及びBoerner 等, J. Immunol., 147: 86 (1991)によって記載されている。
免疫化することで、内因性免疫グロブリンの生産なしに、ヒト抗体の完全なレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物(例えばマウス)を生産することが現在は可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系変異体マウスでの抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子のホモ接合体欠失は、内因性抗体の生産の完全な阻害をもたらすことが記載されている。そのような生殖細胞系変異体マウスでのヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子配列の転移は、抗原の挑戦によってヒト抗体の生産を引き起こす。例えば、Jakobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551-255(1993)；Jakobovits等, Nature 362, 255-258(1993)を参照のこと。
【０１１５】
また、遺伝子シャフリングは、ヒト抗体が開始非ヒト、例えば齧歯類の抗体と類似した親和性及び特性を有している場合、非ヒト、例えば齧歯類の抗体からヒト抗体を得るために使用することもできる。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれるこの方法により、上記のファージディスプレイ技術により得られた非ヒト抗体断片の重鎖可変領域遺伝子又は軽鎖可変領域遺伝子の何れかをヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置換し、非ヒト鎖／ヒト鎖ｓｃＦｖないしＦａｂキメラの集団を作成する。抗原を選択することにより、ヒト鎖が初めのファージディスプレイクローンにおいて一致した非ヒト鎖の除去により破壊された抗原結合部位を回復する、非ヒト鎖／ヒト鎖キメラｓｃＦｖないしＦａｂが単離される、つまり、エピトープがヒト鎖のパートナーの選択をつかさどる(インプリントする)。残りの非ヒト鎖を置換するためにこの工程を繰り返すと、ヒト抗体が得られる(１９９３年４月１日公開のＰＣＴ特許出願ＷＯ９３／０６２１３を参照)。伝統的なＣＤＲ移植による非ヒト抗体のヒト化と異なり、この技術により、非ヒト起源のＦＲ又はＣＤＲ残基を全く持たない完全なヒト抗体が得られる。
【０１１６】
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒト抗体ないしヒト化抗体である。この場合、結合特異性の一つはＡＬＫ−１に対するものであり、他方は任意の他の抗原に対するものである。例示的な二重特異性抗体は、ＡＬＫ−１の２つの異なるエピトープに結合しうる。また、二重特異性抗体はＡＬＫ−１を発現する細胞に細胞障害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はＡＬＫ−１結合アーム及び細胞障害剤(例えば、サポリン(saporin)、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)と結合するアームを有する。二重特異性抗体は完全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。
二重特異性抗体を作製する方法は当該分野において既知である。二重特異性抗体の伝統的な組み換え産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの重鎖は異なる特異性を持っている(Millstein等, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が１９９３年５月１３日に公開の国際公報９３／０８８２９及びTraunecker等、EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
【０１１７】
異なったより好適なアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原−抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、コンストラクトに使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が特に重要性を持たないときは、２又は３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
このアプローチ法の好適な実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公報９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
【０１１８】
他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
二特異性抗体とは架橋抗体や「ヘテロコンジュゲート抗体」を含む。例えば、ヘテロ抱合体の一方の抗体がアビジンと結合し、他方はビオチンと結合していても良い。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせること(米国特許第４６７６９８０号)及びＨＩＶ感染の治療(国際公報９１/００３６０、国際公報９２/００３７３及び欧州特許第０３０８９号)等の用途が提案されている。ヘテロ抱合抗体は適当な架橋方法によって生成できる。当技術分野においては、適切な架橋剤は周知であり、それらは複数の架橋法と共に米国特許第４６７６９８０号などに記されている。
【０１１９】
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は完全な抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルヒド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
最近の進歩により大腸菌からＦａｂ'-ＳＨ断片を直接回収することが容易となっており、これにより化学的にカップリングされて二重特異性抗体にを形成する。Shalaby 等, J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)は、完全なヒト化二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の産生について記述している。各々のＦａｂ'断片は大腸菌から別々に分泌されて、インビトロで化学的にカップリングされて、二重特異性抗体を形成する。したがって、形成された二重特異性抗体は、ＨＥＲ２を過剰発現する細胞及び正常ヒトT細胞に結合するだけでなく、ヒト胸部腫瘍の標的に対するヒト細胞毒性リンパ球の溶解活性を引き起こすことができた。
【０１２０】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産された。Kostelny等, J.Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させられた。抗体ホモダイマーはヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、ついで再酸化させて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーを使用する他の二重特異性抗体断片製造方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol., 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等, J.Immunol. 147:60(1991)。
【０１２１】
多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション(及び／又は異化)されうる。本発明の抗体は、３又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(ＩｇＭクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと３又はそれ以上の抗原結合部位を有する。好ましい二量化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオにおいて、抗体はＦｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端に３又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ここで、好ましい多価抗体は３ないし８、好ましくは４の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。多価抗体は少なくとも１つのポリペプチド鎖(好ましくは２つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖(類)は２又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖(類)はＶＤ１-(Ｘ１)ｎ-ＶＤ２-(Ｘ２)ｎ-Ｆｃを有し、ここでＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域のポリペプチド鎖の一つであり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖(類)は：ＶＨ-ＣＨ１-柔軟なリンカー-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖を有し得る。ここで多価抗体は、好ましくは少なくとも２つ(好ましくは４つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有する。ここで多価抗体は、例えば約２〜約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有する。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、場合によってはＣＬドメインを更に有する。
【０１２２】
抗体変異体
いくつかの実施態様では、ここに開示する抗体のアミノ酸配列の修飾を考える。例えば、抗体の結合親和性及び／又は生物学的特性を向上することができれば望ましい。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体の核酸に適切なヌクレオチド変化を導入して、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、抗体のアミノ酸配列内の残基の、例えば、欠失型、又は挿入或いは置換を含む。最終構成物が所望する特徴を有していれば、欠失、挿入又は置換をどのように組合せてもよい。アミノ酸変化は、配列ができるときに被検体の抗体アミノ酸配列に導入されうる。
突然変異誘発に好ましい位置である抗体の特定の残基又は領域の同定に有益な方法は、Cunningham及びWellsによりScience, 244:1081-1085 (1989年)に開示されているように、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的となる残基又は残基の組が同定され(例えば、arg、asp、his、lys、及びgluなどの荷電した残基)、中性の、又は負に荷電したアミノ酸(最も好ましくはアラニン又はポリアラニン)で置換され、アミノ酸の抗原との相互作用に影響を与える。次いで、置換に対する機能的感受性を示しているそれらアミノ酸位置を、置換の部位において、又は置換の部位のために、さらなる、又は他の変異体を導入することにより精製する。このように、アミノ酸配列変異体を導入する部位は予め決定されるが、突然変異自体の性質は予め決定する必要は無い。例えば、任意の部位における突然変異の機能を分析するために、標的コドン又は領域においてａｌａスキャンニング又はランダム突然変異誘発を実行し、発現した免疫グロブリンを所望の活性についてスクリーニングする。
アミノ酸配列挿入には、１残基から１００以上の残基を有するポリペプチドまでの長さに亘るアミノ−末端融合及び／又はカルボキシ−末端融合、ならびに、単一又は多重アミノ酸残基の配列内挿入を含む。端末挿入の例には、Ｎ−末端メチオニル残基を持つ抗体、又は細胞障害性ポリペプチドに融合した抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体の血清半減期を増加させるポリペプチド又は(例えばＡＤＥＰＴのための)酵素の抗体のＮ−末端又はＣ−末端への融合が含まれる。
【０１２３】
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン(ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸)のトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作出される。Ｏ結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、糖類Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つが結合することを意味するが、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた用いられる。
抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、それが一又は複数の上述したトリペプチド配列(Ｎ結合グリコシル化部位のもの)を含むように変化させることによって簡便に達成される。該変化は、元の抗体の配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる(Ｏ-結合グリコシル化部位の場合)。
【０１２４】
抗体がＦｃ領域を含有する場合、それに接着する炭水化物を変更してもよい。例えば、抗体のＦｃ領域に接着するフコースを欠損する成熟炭水化物構造の抗体は、米国公開特許第２００３／０１５７１０８号(Presta, L.)に記載される。米国公開特許第２００４／００９３６２１号(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.)も参照のこと。抗体のＦｃ領域に接着した炭水化物内のＮ-アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)を二分する抗体は、国際公報第０３／０１１８７８号、Jean-Mairet 等、及び米国特許第６６０２６８４号、Umana 等に参照されている。抗体のＦｃ領域に接着するオリゴサッカライド内の少なくとも一のガラクトース残基を有する抗体は、国際公報第９７／３００８７号、Patel 等に報告される。また、抗体のＦｃ領域に接着する変更された炭水化物を有する抗体については、国際公報第９８／５８９６４号(Raju, S.)及び国際公報第９９／２２７６４号(Raju, S.)も参照のこと。また、修飾されたグリコシル化を有する抗原結合分子については、米国公開特許第２００５／０１２３５４６号(Umana 等)を参照。
【０１２５】
本明細書中の好適なグリコシル化変異形はＦｃ領域を含有し、Ｆｃ領域に接着される炭水化物構造はフコースを欠いている。このような変異形は改善されたＡＤＣＣ機能を有する。場合によって、Ｆｃ領域は、更にＡＤＣＣを改善する一つ以上のアミノ酸置換、例えばＦｃ領域の位置２９８、３３３及び／又は３３４の置換(Ｅｕ残基番号付け)を更に含む。「脱フコース化」又は「フコース欠失」抗体に関する文献の例には以下のものを含む：米国公開番号２００３／０１５７１０８；国際公報２０００／６１７３９；国際公報２００１／２９２４６；米国公開番号２００３／０１１５６１４；米国公開番号２００２／０１６４３２８；米国公開番号２００４／００９３６２１；米国公開番号２００４／０１３２１４０；米国公開番号２００４／０１１０７０４；米国公開番号２００４／０１１０２８２；米国公開番号２００４／０１０９８６５；国際公報２００３／０８５１１９；国際公報２００３／０８４５７０；国際公報２００５／０３５５８６；国際公報２００５／０３５７７８；；国際公報２００５／０５３７４２；Okazaki 等 J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)；及びYamane-Ohnuki 等 Biotech. Bioeng.87: 614 (2004)。脱フコース化抗体を産生する細胞株の例として、タンパク質フコース化欠失Ｌｅｃ１３ ＣＨＯ細胞 (Ripka 等 Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国公開番号２００３／０１５７１０８, Presta, L；及び国際公報２００４／０５６３１２, Adams 等, 特に実施例１１)、及びノックアウト細胞株、例としてα-１,６-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８,-ノックアウトＣＨＯ細胞 (Yamane-Ohnuki 等 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004))などがある。
【０１２６】
他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗体分子において少なくとも一つのアミノ酸残基に異なる残基が挿入されている。置換突然変異について最も関心ある部位は高度可変領域を含むが、ＦＲ交互変化も考慮される。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表２に示す。これらの置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表２に「例示的置換」と名前を付けた又はアミノ酸の分類を参照して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入して、生成物をスクリーニングしてよい。
【０１２７】
表２
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【０１２８】
抗体の生物学的性質における実質的な修飾は、(ａ)置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、(ｂ)標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は(ｃ)側鎖の嵩を維持するそれらの効果において実質的に異なる置換を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいて群に分けることができる：
(１)疎水性：ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile；
(２)中性の親水性：cys、ser、thr、asn、gln；
(３)酸性：asp、glu；
(４)塩基性：his、lys、arg；
(５)鎖配向に影響する残基：gly、pro； 及び
(６)芳香族：trp、tyr、phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
【０１２９】
ある型の置換変異体は、親抗体(例えば、ヒト化又はヒト抗体)の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的に、さらなる発展のために選択され、得られた変異体は、それらが作製された親抗体と比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を作製する簡便な方法は、ファージディスプレイを使用する親和性突然変異を含む。簡潔に言えば、幾つかの高頻度可変領域部位(例えば６−７部位)を突然変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された多価抗体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物としてディスプレイされる。ファージディスプレイ変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。修飾のための候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。別法として、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体と抗原の接点を特定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここに述べた技術に従う置換の候補である。そのような変異体が生成されると、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択する。
【０１３０】
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、この分野で知られた種々の方法によって調製される。これらの方法は、限定するものではないが、天然源からの単離(天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合)又は初期に調製された抗体の変異体又は非変異体のオリゴヌクレオチド媒介(又は部位特異的)突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による調製を含む。
免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域内に一以上のアミノ酸修飾を導入してＦｃ領域変異型を生成することが望ましい。Ｆｃ領域変異体は、ヒンジシステイン修飾を含む、一以上のアミノ酸位置でのアミノ酸修飾(例えば、置換)を有するヒトＦｃ領域配列(例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域)を含みうる。
【０１３１】
当分野での記載や教示に従って、ある実施態様では、方法を用いた抗体が野生型の対応抗体と比較して例えばＦｃ領域内に一以上の変異を有することを考慮する。にもかかわらず、この抗体はその野生型対応物と比較して治療的有用性を示す実質的に同じ特徴を維持している。例えば、国際公開９９／５１６４２などに記載のようにＣ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞障害(ＣＤＣ)を変更する(すなわち改良又は減少する)結果となるＦｃ領域内に特定の変異を生じさせることが考えられる。また、Ｆｃ領域変異型の他の例に関するDuncan & Winter Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第５６４８２６０号；米国特許第5,624,821号；及び国際公開公報94/29351を参照。国際公開公報００／４２０７２(Presta)及び国際公開公報２００４／０５６３１２(Lowman)は、ＦｃＲへの結合が改善したか、減退した抗体変異体を開示している。これらの特許文献の内容は出典明記によって、本明細書に特別に組み込まれる。また、Shields 等 J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照のこと。半減期が増加して、胎児への母性ＩｇＧの移送を担う(Guyer 等, J. Immunol. 117:587 (1976)及びKim 等, J. Immunol. 24:249 (1994))新生児Ｆｃレセプター(ＦｃＲｎ)への結合が改善している抗体は、米国特許公開２００５／００１４９３４Ａ１ (Hinton 等)に開示されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を向上させる一又は複数の置換を有するＦｃ領域を含んでなる。Ｆｃ領域アミノ酸配列が変更されてＣ１ｑ結合能力が増加したか減少したポリペプチド変異体は、米国特許第６１９４５５１号Ｂ１、国際公開公報９９／５１６４２に開示される。これらの特許文献の内容は出典明記によって、本明細書に特別に組み込まれる。また、Idusogie 等 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)を参照のこと。
【０１３２】
抗体誘導体
抗体は当該分野において知られ直ぐに利用できる更なる非タンパク質性部分を含むように更に修飾することができる。好ましくは、抗体の誘導体化に適した部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例には、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-１,３-ジオキソラン、ポリ-１,３,６-トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマーかランダムコポリマー)、及びデキストラン又はポリ(ｎ-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは水中におけるその安定性のために製造の際に有利であろう。ポリマーは任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、一を超えるポリマーが結合する場合、それらは同じでも異なった分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、限定されるものではないが、その抗体誘導体が定まった条件下での治療に使用されるかどうか、改善される抗体の特定の性質又は機能を含む考慮事項に基づいて決定することができる。
【０１３３】
所望の特性を有する抗体のスクリーニング
抗体は当該分野で知られている様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び生物学的機能について特徴付けることができる。いくつかの実施態様では、抗体は、ＡＬＫ−１への結合、ＡＬＫ−１活性化の低減又はブロック、ＡＬＫ−１下流分子のシグナル伝達(例えばＳｍａｄ１、Ｓｍａｄ５および／またはＳｍａｄ８のリン酸化)の低減又はブロック、ＡＬＫ−１に対するＡＬＫ−１リガンド(例えばＢＭＰ９又はＢＭＰ１０)結合の破壊又はブロック、血管形成の阻害、リンパ脈管形成の阻害、腫瘍、細胞増殖性疾患又は癌の治療及び／又は予防、ＡＬＫ−１の発現及び／又は活性と関連する疾患の治療又は予防の何れか一又は複数に特徴がある。
精製された抗体は、限定されるものではないが、Ｎ末端シークエンシング、アミノ酸解析、非変性サイズ排除高圧液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)、質量分析、イオン交換クロマトグラフィー及びパパイン消化を含む一連のアッセイによって更に特徴付けることができる。
【０１３４】
本発明の特定の実施態様では、ここで生産された抗体はその生物学的活性について分析される。ある実施態様では、本発明の抗体はその抗原結合活性について試験される。当該分野で知られ、ここで使用することができる抗原結合アッセイには、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ(酵素結合免疫吸着検定法)、「サンドウィッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、及びプロテインＡイムノアッセイのような技術を用いた任意の直接的又は競合的結合アッセイが制限なく含まれる。
一実施態様では、抗体は、すべてではなくいくつかのエフェクター機能を有する変更した抗体であり、このことによって抗体のインビボ半減期が重要なある種のエフェクター機能(補体及びＡＤＣＣなど)が不要で有害である多くの手法の所望する候補となる。特定の実施態様では、生成した免疫グロブリンのＦｃ活性を測定して、所望の特性が維持されていることを確認する。インビボ及び／又はインビトロ細胞障害アッセイを行って、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃレセプター(ＦｃＲ)結合アッセイを行って、抗体がＦｃγＲ結合を欠損している(すなわちＡＤＣＣ活性をほとんど欠損している)が、ＦｃＲｎ結合能は維持していることを確認することができる。ＡＤＣＣに関与している第一細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲIIIのみを発現しており、その一方で単核細胞はＦｃγＲI、ＦｃγＲII及びＦｃγＲIIIを発現している。造血系細胞でのＦｃＲ発現については、Ravetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)の464頁の表3に要約されている。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの例は、米国特許第5,500,362号又は同第5,821,337号に記載されている。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー(ＮＫ)細胞が含まれる。あるいは、又は加えて、対象とする分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes 等. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示されているような動物モデル内でインビボに評価することができる。また、Ｃ１ｑ結合アッセイを行って、抗体がＣ１ｑに結合できない、つまりＣＤＣ活性を欠損していることを確認してもよい。補体活性化を評価するために、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載のように、ＣＤＣアッセイを行ってもよい。また、ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期測定を、当分野で公知の方法を用いて行うことができる。その例を実施例の項目に記載する。
【０１３５】
ベクター、宿主細胞及び組換え方法
抗体の組み換え生成のために、コードする核酸を単離して、更なるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製ベクターに挿入する。抗体をコードするＤＮＡは従来の手順で簡単に単離し、配列決定される(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて)。多くのベクターが利用可能である。用いる宿主細胞にある程度依存してベクターを選択する。一般的に、好適な宿主細胞は原核生物又は真核生物(一般的に哺乳動物)由来の細胞である。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ定常領域を含め、任意のアイソタイプの定常領域がこの目的のために使われてもよく、このような定常領域はヒト又は動物種の何れかから得られうることは理解されるであろう。
【０１３６】
原核生物の宿主細胞を用いた抗体生成
ベクターの構築
抗体のポリペプチド成分をコードしているポリヌクレオチド配列は標準的な組換え技術を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列はハイブリドーマ細胞のような抗体産生細胞から単離し配列決定することができる。あるいは、ポリヌクレオチドはヌクレオチド合成機又はＰＣＲ法を使用して合成することができる。ひとたび得られると、ポリペプチドをコードしている配列は原核生物宿主中で異種ポリヌクレオチドを複製し、発現することが可能な組換えベクター中に挿入される。当該分野において入手でき知られている多くのベクターを本発明の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、主として、ベクターに挿入される核酸のサイズとベクターで形質転換される特定の宿主に依存する。各ベクターは、機能(異種性ポリヌクレオチドの増幅又は発現ないしその両方)及び属する特定の宿主細胞への適合性に応じて、様々な成分を含む。一般的に、限定するものではないが、ベクター成分には複製起源、選択マーカー遺伝子、プロモータ、リボゾーム結合部位(ＲＢＳ)、シグナル配列、異種性核酸挿入及び転写終末配列が含まれる。
一般には、レプリコン及び宿主細胞と適合性のある種に由来するコントロール配列を含んでいるプラスミドベクターが、宿主細胞と関連して使用される。そのベクターは、通常、複製開始点並びに形質転換細胞において表現型の選択を提供可能なマーキング配列を有する。例えば、一般的に大腸菌は、大腸菌種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換する。ｐＢＲ３２２はアンピシリン(Ａｍｐ)及びテトラサイクリン(Ｔｅｔ)耐性のコード遺伝子を含んでいるため、形質転換細胞を容易に同定することができる。ｐＢＲ３２２、その誘導体又は他の微生物プラスミド又はバクテリオファージも外来性タンパク質を発現する微生物によって使用可能なプロモータを含むか、含むように変更される。特定の抗体の発現に使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例はCarter等の米国特許第５６４８２３７号に詳細に記載されている。
【０１３７】
また、レプリコン及び宿主微生物と適合性のあるコントロール配列を含んでいるファージベクターを、これらの宿主との関連でトランスフォーミングベクターとして使用することができる。例えば、λＧＥＭ.ＴＭ.-１１のようなバクテリオファージを、大腸菌ＬＥ３９２のような感受性の宿主細胞を形質転換するために使用できる組換えベクターを作製する際に利用することができる。
発現ベクターは各ポリペプチド成分をコードする２又はそれ以上のプロモータ−シストロン(翻訳単位)対を含みうる。プロモーターはその発現を調節するシストロンの上流(５')に位置している非翻訳配列である。原核生物のプロモーターは典型的には誘導性と構成的との二つのクラスのものがある。誘導性プロモーターは、例えば栄養分の有無又は温度の変化のような、培養条件の変化に応答してその調節下でシストロンの転写レベルを増大させるように誘導するプロモーターである。
【０１３８】
様々な潜在的宿主細胞によって認識されるプロモータが非常にたくさん公知となっている。選択したプロモーターを、制限酵素消化によって供給源ＤＮＡからプロモータを除去し、ベクター内に単離したプロモータを挿入することによって軽鎖又は重鎖をコードするシストロンＤＮＡに作用可能に連結することができる。天然プロモーター配列と多くの異種プロモーターの双方を、標的遺伝子の増幅及び／又は発現を生じさせるために使用することができる。ある実施態様では、天然の標的ポリペプチドプロモーターと比較して、一般的に発現する標的遺伝子をより多く転写させ、効率をよくするので、異種プロモーターが有用である。
原核生物宿主での使用に好適なプロモーターには、ＰｈｏＡプロモーター、βガラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃ又はｔｒｃプロモーターが含まれる。しかし、細菌中で機能性である他のプロモーター(例えば他の既知の細菌又はファージプロモーター)も好適である。そのヌクレオチド配列は発表されており、よって当業者は、任意の必要とされる制限部位を供給するリンカー又はアダプターを使用して標的軽鎖及び重鎖をコードするシストロンにそれらを作用可能に結合させることができる(Siebenlist等 (1980) Cell 20:269)。
【０１３９】
本発明の一態様では、組換えベクター内の各シストロンは、膜を貫通して発現されるポリペプチドの転写を誘導する分泌シグナル配列成分を含む。一般に、シグナル配列はベクターの成分でありうるか、ベクター中に挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部でありうる。この発明の目的のために選択されるシグナル配列は宿主細胞によって認識されプロセシングされる(つまりシグナルペプチダーゼにより切断される)ものでなければならない。異種ポリペプチドに天然のシグナル配列を認識せずプロセシングする原核生物宿主細胞に対しては、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンＩＩ(ＳＴＩＩ)リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ及びＭＢＰからなる群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。一実施態様では、発現系の双方のシストロンに使用されるシグナル配列はＳＴＩＩシグナル配列又はその変異体である。
他の態様では、本発明による免疫グロブリンは宿主細胞の細胞質内で産生されるので、各シストロン内に分泌シグナル配列の存在は必要でない。この点において、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖は発現され、折り畳まれ、集合して細胞質内に機能的免疫グロブリンを形成する。ジスルフィド結合形成に好適な細胞質条件を示し、発現したタンパク質サブユニットを好適に折り畳み、集合することができる宿主系が存在する(例として大腸菌ｔｒｘＢ−系)。Proba及びPluckthun Gene, 159:203 (1995)。
【０１４０】
抗体を発現するのに適した原核生物宿主細胞には、古細菌及び真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物が含まれる。有用な細菌の例には、エシェリキア属(例えば大腸菌)、バシラス属(例えば枯草菌)、エンテロバクター属、シュードモナス種(例えば緑膿菌)、ネズミチフス菌、霊菌(Serratia marcescans)、クレブシエラ属、プロテウス属、赤痢菌、根粒菌、ビトレオシラ(Vitreoscilla)又はパラコッカス(Paracoccus)が含まれる。一実施態様では、グラム陰性菌が使用される。一実施態様では、大腸菌細胞が本発明の宿主として使用される。大腸菌株の例として、遺伝子型W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kanR を有する３３Ｄ３株(米国特許第5,639,635号)を含むW3110株 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), 1190-1219頁；ATCC寄託番号27,325)及びその誘導体が含まれる。また、大腸菌294 (ATCC 31,446), 大腸菌B, 大腸菌λ 1776 (ATCC 31,537)及び大腸菌RV308(ATCC 31,608) など、他の株及びその誘導体も好適である。この例は限定的なものでなく例示的なものである。定義した遺伝子型を有する上記の何れかの細菌の誘導体の構築方法は当業者に公知であり、例として, Bass等, Proteins, 8:309-314 (1990)に記載されている。一般的に、細菌細胞中でのレプリコンの複製能を考慮して適した細菌を選択することが必要である。ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、又はｐＫＮ４１０のようなよく知られたプラスミドを使用してレプリコンを供給する場合、例えば、大腸菌、セラシア属、又はサルモネラ種を宿主として好適に用いることができる。典型的に、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌しなければならず、望ましくは更なるプロテアーゼインヒビターを細胞培養中に導入することができる。
【０１４１】
抗体産生
上述した発現ベクターで宿主細胞を形質転換又は形質移入し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように修飾された通常の栄養培地中で培養する。
形質転換とは、ＤＮＡを原核生物宿主中に導入し、そのＤＮＡを染色体外要素として、又は染色体組込みによって複製可能にすることを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換はそのような細胞に適した標準的技術を使用してなされる。塩化カルシウムを用いるカルシウム処理は実質的な細胞壁障害を含む細菌細胞のために一般に使用される。形質転換のための他の方法はポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。さらに別の方法はエレクトロポレーションである。
【０１４２】
ポリペプチドを生産するために使用される原核生物細胞は当該分野で知られ、選択された宿主細胞の培養に適した培地中で増殖させられる。好適な培地の例には、ルリア培地(ＬＢ)プラス必須栄養分サプリメントが含まれる。ある実施態様では、培地は発現ベクターを含む原核生物細胞の増殖を選択的に可能にするために、発現ベクターの構成に基づいて選択される選択剤をまた含む。例えば、アンピシリンがアンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖用培地に加えられる。
炭素、窒素及び無機リン酸源の他に任意の必要なサプリメントを、単独で、又は複合窒素源のような他のサプリメント又は培地との混合物として導入される適切な濃度で含有させられうる。場合によっては、培養培地はグルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリトリトール及びジチオトレイトールからなる群から選択される一又は複数の還元剤を含みうる。
原核生物宿主細胞は適切な温度で培養される。例えば、大腸菌の増殖に対しては、好適な温度は約２０℃から約３９℃、より好ましくは約２５℃から約３７℃の範囲、更により好ましくは約３０℃である。培地のｐＨは、主として宿主生物に応じて、約５から約９の範囲の任意のｐＨでありうる。大腸菌に対しては、ｐＨは好ましくは約６．８から約７．４、より好ましくは約７．０である。
【０１４３】
発現ベクターに誘導性プロモータが用いられる場合、プロモータの活性に適する条件下でタンパク質発現を誘導する。本発明の一態様では、ポリペプチドの転写制御のためにＰｈｏＡプロモータが用いられる。したがって、形質転換した宿主細胞を誘導のためにリン酸限定培地で培養する。好ましくは、リン酸限定培地はＣ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である(例として、Simmons等, J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147を参照)。様々な他の誘導因子は用いるベクターコンストラクトに応じて当業者に知りうるように用いてよい。
一実施態様では、発現された本発明のポリペプチドは宿主細胞の細胞膜周辺中に分泌され、そこから回収される。タンパク質の回収は、一般的には浸透圧ショック、超音波処理又は溶解のような手段によって典型的には微生物を破壊することを含む。ひとたび細胞が破壊されると、細胞片又は全細胞を遠心分離又は濾過によって除去することができる。タンパク質は、例えばアフィニティー樹脂クロマトグラフィーによって更に精製することができる。あるいは、タンパク質は培養培地に輸送しそこで分離することができる。細胞を培養物から除去することができ、培養上清は濾過され、生成したタンパク質の更なる精製のために濃縮される。発現されたポリペプチドを更に単離し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(ＰＡＧＥ)及びウェスタンブロットアッセイ法のような一般的に知られている方法を使用して同定することができる。
【０１４４】
本発明の一態様では、抗体産生は発酵法によって多量に受け継がれる。組換えタンパク質の生産には様々な大規模流加発酵法を利用することができる。大規模発酵は少なくとも１０００リットルの容量、好ましくは約１０００から１０００００リットルの容量である。これらの発酵槽は、酸素と栄養分、特にグルコース(好ましい炭素／エネルギー源)を分散させる撹拌翼を使用する。小規模発酵とは一般におよそ１００リットル以下の容積で、約１リットルから約１００リットルの範囲でありうる発酵槽での発酵を意味する。
発酵法では、タンパク質の発現の誘導は、典型的には、細胞が適切な条件下にて、初期定常期に細胞があるステージで、所望の密度、例えば約１８０−２２０のＯＤ５５０まで増殖したところで開始される。当該分野で知られ上述されているように、用いられるベクターコンストラクトに応じて、様々なインデューサーを用いることができる。細胞を誘導前の短い時間の間、増殖させてもよい。細胞は通常約１２−５０時間の間、誘導されるが、更に長い又は短い誘導時間としてもよい。
【０１４５】
ポリペプチドの生産収量と品質を改善するために、様々な発酵条件を変更することができる。例えば、分泌される抗体ポリペプチドの正しい組み立てとフォールディングを改善するために、例えばＤｓｂタンパク質(ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ及び／又はＤｓｂＧ)又はＦｋｐＡ(シャペロン活性を持つペプチジルプロピルシス、トランス-イソメラーゼ)のようなシャペロンタンパク質を過剰発現する更なるベクターを用いて宿主原核細胞を同時形質転換させることができる。シャペロンタンパク質は細菌宿主細胞中で生産される異種性タンパク質の適切な折り畳みと溶解性を容易にすることが実証されている。Chen等 (1999) J Bio Chem 274:19601-19605；Georgiou等, 米国特許第６０８３７１５号；Georgiou等, 米国特許第６０２７８８８号；Bothmann及びPluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105；Ramm及びPluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113；Arie等 (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210。
発現された異種タンパク質(特にタンパク分解を受けやすいもの)のタンパク質分解を最小にするために、タンパク質分解酵素を欠くある種の宿主株を本発明に用いることができる。例えば、原核生物宿主細胞株を改変して、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ及びその組合せのような既知の細菌プロテアーゼをコードしている遺伝子に遺伝子突然変異を生じさせることができる。幾つかの大腸菌プロテアーゼ欠損株が利用でき、例えば、上掲のJoly等 (1998)；Georgiou等, 米国特許第５２６４３６５号；Georgiou等, 米国特許第５５０８１９２号；Hara等 (1996) Microbial Drug Resistance 2:63-72に記載されている。
ある実施態様では、タンパク質溶解性酵素を欠損した、一以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換した大腸菌株を発現系の宿主細胞として用いる。
【０１４６】
抗体精製
当分野で公知の標準的なタンパク質精製方法を用いることができる。以下の方法は好適な精製手順の例である：免疫親和性又はイオン交換カラムによる分画化、エタノール沈降法、逆相ＨＰＬＣ、シリカ又はＤＥＡＥなどの陽性交換樹脂によるクロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈降法及び、例えばSephadex G-75を用いたゲル濾過法。
一態様では、固形層に固定したプロテインＡを完全長抗体産物の免疫親和性精製法に用いる。プロテインＡは抗体のＦｃ領域に高い親和性で結合する黄色ブドウ球菌から単離した４１ｋＤの細胞壁タンパク質である。Lindmark等 (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13。プロテインＡを固定した固形層は、ガラス又はシリカ表面、より好ましくは孔を調節したガラスカラム又はケイ酸カラムを含むカラムが好ましい。ある方法では、カラムは非特異的な混入物の接着を防ぐためにグリセロールなどの試薬でコートされている。
精製の初めの工程では、上記に記載のように細胞培養物からの調製物をプロテインＡ固定固形層に適応し、プロテインＡに対象とする抗体を特異的に結合させる。ついで、固形層を洗浄して、固形層に非特異的に結合した混入物を除去する。最後に、対象とする抗体を溶出により固形層から除去する。
【０１４７】
真核生物の宿主細胞を用いた抗体の生成
一般的に、ベクターは、限定するものではないが、以下の一以上を含む：シグナル配列、複製起点、一以上のマーカ遺伝子、エンハンサー因子、プロモータ及び転写終末因子。
【０１４８】
シグナル配列成分
真核生物の宿主細胞に用いるベクターは、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいは対象とするポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドを含んでいてもよい。好ましく選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用できる。
このような前駆体領域のＤＮＡは、多価抗体をコードするＤＮＡに読み取り枠を一致させて結合される。
【０１４９】
複製開始点
一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である。例えば、ＳＶ４０開始点は典型的にはただ初期プロモーターを有しているために用いられる。
【０１５０】
選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(ａ)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(ｂ)必要があれば栄養要求性欠陥を補い、又は(ｃ)複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択方法の一例では、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択工程を生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの他の例は、抗体核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することを可能にするもの、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等々である。
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Ｍｔｘ)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞である(例として、ATCC CRL-9096)。
あるいは、抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ(ＡＰＨ)のような他の選択可能マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第４９６５１９９号を参照のこと。
【０１５１】
プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは通常は宿主生物体によって認識され抗体ポリペプチド核酸に作用可能に結合しているプロモーターを含む。真核生物のプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に見出されるＡＴリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗体ポリペプチドの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、伝染性上皮腫ウイルス、アデノウイルス(例えばアデノウイルス２)、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びサルウイルス４０(ＳＶ４０)のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点を更に含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウイルスを用いて哺乳動物宿主中でＤＮＡを発現させる系が、米国特許第4419446号に開示されている。この系の変形例は米国特許第4601978号に開示されている。あるいは、ラウス肉腫ウイルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
【０１５２】
エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物によるこの発明の抗体ポリペプチドをコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、抗体ポリペプチドコード配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされうるが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
【０１５３】
転写終末成分
また、真核生物宿主細胞に用いられる発現ベクターは、典型的には、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウイルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'、時には３'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、抗体をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号とそこに開示された発現ベクターを参照のこと。
【０１５４】
宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載のベクター中のＤＮＡをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、脊椎動物の宿主細胞を含む本明細書中に記載の高等真核生物細胞を含む。培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１);ヒト胚腎臓株(２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977))；ハムスター乳児腎細胞(ＢＨＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))；マウスのセルトリ細胞(ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))；サルの腎細胞 (ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０); アフリカミドリザルの腎細胞(ＶＥＲＯ-７６, ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト子宮頸癌細胞 (ＨＥＬＡ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞 (ＭＤＣＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞 (ＢＲＬ３Ａ, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞 (Ｗ１３８, ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２, ＨＢ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞 (ＭＭＴ０６０５６２, ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞;ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株(ＨｅｐＧ２)である。
宿主細胞は、抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
【０１５５】
宿主細胞の培養
本発明の抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((ＭＥＭ),(シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、GENTAMYCINTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【０１５６】
抗体の精製
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内で生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第１の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＰｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過装置を用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる(Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983))。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている(Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986))。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Bakerbond ABXＴＭ樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィー(ポリアスパラギン酸カラム)、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される多価抗体に応じて利用可能である。
予備的精製工程に続いて、目的の抗体及び混入物を含む混合液をｐＨ約２．５−４．５、好ましくは低塩濃度(例として、約０−０．２５Ｍ塩)の溶出緩衝液を用いて低ｐＨ疎水性作用クロマトグラフィを行う。
【０１５７】
イムノコンジュゲート
また、本発明は、化学療法剤、薬剤、成長阻害剤、毒素(例えば、細菌、糸状菌、植物又は動物由来の酵素活性性毒素、又はその断片)、又は放射性同位体(すなわち放射性コンジュゲート)などの細胞毒性剤にコンジュゲートした抗ＡＬＫ−１抗体を含む、イムノコンジュゲート(「抗体−薬剤コンジュゲート」又は「ＡＤＣ」と交換可能に称される)を考慮する。
細胞障害性又は細胞分裂停止性の薬剤、すなわち癌治療における腫瘍細胞を殺す又は阻害するための薬剤の局部運搬に抗体−薬剤コンジュゲートを用いると(Syrigos及びEpenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172；米国特許第4,975,278号)、腫瘍への薬剤成分の標的とする運搬とそこでの細胞内集積が可能となるものであり、この非コンジュゲート薬物作用剤の全身性投与により正常細胞並びに除去しようとする腫瘍細胞への毒性が容認できないレベルとなりうる(Baldwin等, (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,」 in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pincheraら. (ed.s), pp. 475-506)。これによって、最小限の毒性で最大限の効果を求める。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体はこの方策に有用であるとして報告されている(Rowland等, (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87)。この方法に用いる薬物には、ダウノマイシン、ドキソルビジン、メトトレキサート及びビンデジンが含まれる(Rowland等, (1986)、上掲)。抗体−毒素コンジュゲートに用いる毒素には、ジフテリア毒素などの細菌性毒素、ゲルダナマイシン(Mandlerら(2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581；Mandlerら(2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028；Mandlerら(2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791)、メイタンシノイド(EP 1391213；Liu等, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)、及びカリケアマイシン(Lode等, (1998) Cancer Res. 58:2928；Hinman等, (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)などのリシン、小分子毒素などの植物毒が含まれる。該毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合又はトポイソメラーゼ阻害を含む機能によりその細胞障害性及び細胞分裂停止性の効果に影響しうる。ある種の細胞障害性剤は、大きな抗体又はタンパク質レセプターリガンドにコンジュゲートした場合に、不活性又は活性が低減する傾向がある。
【０１５８】
ゼバリン(ZEVALIN)(登録商標)(イブリツモマブチウキセタン(ibritumomab tiuxetan), Biogen/Idec)は正常及び悪性のＢリンパ球の細胞表面上にみられるＣＤ２０抗原に対するマウスＩｇＧ１κモノクローナル抗体と111In又は90Y放射性同位体とがチオウレアリンカーキレート剤にて結合した抗体−放射性同位体コンジュゲートである(Wiseman等, (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77；Wiseman等, (2002) Blood 99(12):4336-42；Witzig等, (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63；Witzig等, (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69)。ゼバリンはＢ細胞非ホジキン性リンパ球(ＮＨＬ)に対して活性を有するが、投与によってほとんどの患者に重症で長期の血球減少を引き起こす。カリケアマイシンに連結したｈｕＣＤ３３抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるマイロターグ(MYLOTARG)(登録商標)(ゲムツズマブオゾガミシン(gemtuzumab ozogamicin), Wyeth Pharmaceuticals)は、急性骨髄性白血病の治療用注射剤として2000年に認可された(Drugs of the Future (2000) 25(7):686；米国特許第4970198号；同第5079233号；同第5585089号；同第5606040号；同第5693762号；同第5739116号；同第5767285号；同第5773001号)。ジスルフィドリンカーＳＰＰを介してメイタンシノイド薬剤分子ＤＭ１と連結しているｈｕＣ２４２抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるカンツズマブメルタンシン(Cantuzumab mertansine)(Immunogen, Inc.)は、ＣａｎＡｇを発現する癌、例として大腸、膵臓、胃などの治療用に第ＩＩ相試験へと進んでいる。メイタンシノイド薬剤分子ＤＭ１と連結している抗前立腺特異的膜抗原(ＰＳＭＡ)モノクローナル抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるＭＬＮ−２７０４(Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.)は、前立腺癌の潜在的治療の開発段階にある。アウリスタチン(auristatin)ペプチド、アウリスタチンＥ(ＡＥ)及びモノメチルアウリスタチン(ＭＭＡＥ)、ドラスタチン(dolastatin)の合成類似体は、キメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６(癌細胞上のルイスＹに特異的)及びｃＡＣ１０(血液系悪性腫瘍上のＣＤ３０に特異的)(Doronina等, (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784)にコンジュゲートしており、治療的開発段階にある。
【０１５９】
免疫複合体(イムノコンジュゲート)の生成に有用な化学治療薬を本明細書中(例えば、上記を参照)に記載した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、(緑膿菌からの)外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPII、及びPAP-S)、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。例として1993年10月28日に公開の国際公開公報93/21232を参照のこと。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅが含まれる。抗体及び細胞障害性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの二官能性誘導体(ジメチルアジピミデートＨＣＬ等)、活性エステル(ジスクシンイミジルスベレート等)、アルデヒド(グルタルアルデヒド等)、ビス-アジド化合物(ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等)、ビス-ジアゾニウム誘導体(ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等)、ジイソシアネート(トリエン２，６-ジイソシアネート等)、及びビス-活性フッ素化合物(１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等)を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されているように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。国際公開94/11026参照。
抗体のコンジュゲートと一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウロスタチン、トリコセン(trichothene)及びＣＣ１０６５、及び毒性活性を有するこれらの毒素の誘導体が、ここで考察される。
【０１６０】
メイタンシン及びメイタンシノイド
いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲートは一又は複数のメイタンシノイド分子とコンジュゲートしている抗体(完全長又は断片)を含んでなる。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第３８９６１１１号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第４１５１０４２号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第4,137,230号；同4,248,870号；同4,256,746号；同4,260,608号；同4,265,814号；同4,294,757号；同4,307,016号；同4,308,268号；同4,308,269号；同4,309,428号；同4,313,946号；同4,315,929号；同4,317,821号；同4,322,348号；同4,331,598号；同4,361,650号；同4,364,866号；同4,424,219号；同4,450,254号；同4,362,663号；及び同4,371,533号に開示されている。
メイタンシノイド薬剤成分は、(i) 発酵又は化学修飾、発酵産物の誘導体化によって調製するために相対的に利用可能である(ii) 抗体に対する非ジスルフィドリンカーによる共役に好適な官能基による誘導体化に従う、(iii) 血漿中で安定、そして(iv) 様々な腫瘍細胞株に対して有効であるため、抗体薬剤コンジュゲートの魅力的な薬剤成分である。
【０１６１】
メイタンシノイドを含有するイムノコンジュゲート、その作製方法及びそれらの治療用途は、例えば米国特許第5,208,020号、同5,416,064号、欧州特許第0425235 B1号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。Liu等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：8618-8623(1996)には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合するＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含有するイムノコンジュゲートが記載されている。前記コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞障害性を有することが見出されており、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示す。Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)には、メイタンシノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸癌株化細胞の抗原に結合するマウス抗体Ａ７、又はＨＥＲ-２／ｎｅｕオンコジーンに結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ.１に結合しているイムノコンジュゲートが記載されている。ＴＡ.１-メイタンシノイドコンジュゲートの細胞障害性はヒト乳癌株化細胞ＳＫ-ＢＲ-３におけるインビトロで試験され、細胞当たり３×１０５ＨＥＲ-２表面抗原が発現した。薬剤コンジュゲートにより、遊離のメイタンシノイド剤に類似した細胞障害度が達成され、該細胞障害度は、抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることにより増加する。Ａ７-メイタンシノイドコンジュゲートはマウスにおいては低い全身性細胞障害性を示した。
【０１６２】
抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子に抗体を化学的に結合させることにより調製される。例えば、米国特許第5,208,020号(この開示内容は出典明記により特別に組み込まれる)を参照。１分子の毒素／抗体は、裸抗体の使用において細胞障害性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均３−４のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞障害性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第5,208,020号、及び他の特許、及び上述した特許ではない刊行物に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。
例えば、米国特許第5,208,020号又は欧州特許第0425235 B1号、Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)、及び2004年10月8日に出願の米国特許出願番号10/960,602(これらの開示内容は出典明記により特別に組み込まれる)に開示されているもの等を含め、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。リンカー成分ＳＭＣＣを含んでなる抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、2004年10月8日に出願の米国特許出願番号10/960,602に開示されるように調製されうる。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。更なる結合基を本願明細書中に記載し、例示する。
【０１６３】
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート(ＳＭＣＣ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、ジスルフィド結合により提供されるＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート(ＳＰＰ)及びＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)(Carlsson等, Biochem. J. 173：723-737[1978])が含まれる。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ-３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ-２０位で生じる。好ましい実施形態において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のＣ-３位で形成される。
【０１６４】
アウリスタチン類及びドラスタチン類
いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲートは、ドラスタチン又はドロスタチンペプチジル類似体及び誘導体、アウリスタチン(auristatin) (米国特許第5635483号；同第5780588号)にコンジュゲートした抗体を含んでなる。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解及び核と細胞の分割を妨げ(Woyke 等 (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584)、抗癌活性(米国特許第5663149号)及び抗真菌性活性(Pettit 等 (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)を有することが示されている。ドラスタチン又はアウリスタチン薬剤成分は、ペプチジル薬剤分子のＮ(アミノ)末端又はＣ(カルボキシル)末端により抗体に接着しうる(国際公開公報02/088172)。
例示的なアウリスタチンの実施態様は、Ｎ末端連結モノメチルアウリスタチン薬剤成分ＤＥ及びＤＦを含み、"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", US Ser. No. 10/983,340, filed Nov. 5, 2004に開示される。この開示内容は出典明記によってその全体が特別に組み込まれる。
【０１６５】
一般的に、ペプチドベースの薬剤成分は、２以上のアミノ酸及び／又はペプチド断片間でペプチド結合を形成することによって調製されうる。このようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野において周知の液相合成方法に従って調製することができる(E. Schroder and K. Lubke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Pressを参照)。アウリスタチン／ドラスタチン薬剤成分は、米国特許第5635483号；同第5780588号；Pettit 等 (1989) J. Am. Chem. Soc. 111: 5463-5465；Pettit 等 (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277；Pettit, G.R., 等 Synthesis, 1996, 719-725；及びPettit 等 (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863の方法に従って調製されうる。また、Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7): 778-784; "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"、2004年11月5日に出願のUS Ser. No. 10/983,340も参照のこと。これらは出典明記によってその全体が本願明細書中に組み込まれる(例えば、リンカー及びモノメチルバリン化合物、例えばＭＭＡＥ及びリンカーにコンジュゲートしたＭＭＡＦの調整方法を開示している)。
【０１６６】
カリケアマイシン
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した抗体を含んでなる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第5712374号、同5714586号、同5739116号、同5767285号、同5770701号、同5770710号、同5773001号、同5877296号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１(Hinman等, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58：2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
【０１６７】
他の細胞障害剤
本発明の抗体と結合可能な他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び５-フルオロウラシル、米国特許第5053394号、同5770710号に記載されており、集合的にＬＬ-Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第5877296号)が含まれる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(PAPI、PAPII及びPAP-S)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、1993年10月28日公開の国際公開第93/21232号を参照のこと。
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮアーゼ)との間に形成されるイムノコンジュゲートをさらに考察する。
【０１６８】
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗体を生成するために、種々の放射性同位体が利用される。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。コンジュゲートが検出に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)映像(磁気共鳴映像、mriとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57)は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
【０１６９】
抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート(ＳＭＣＣ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第94/11026号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞障害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第5208020号)。
化合物は、限定するものではないが、架橋剤：市販されている(例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aより)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、及びスルホ-SMPB、及びSVSB (succinimidyl-(4-ビニルスルホン)安息香酸塩)にて調製したＡＤＣが特に考えられる。2003-2004 Applications Handbook and Catalogの467-498頁を参照。
【０１７０】
抗体薬剤コンジュゲートの調製
抗体薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)において、抗体(Ａｂ)を、リンカー(Ｌ)を介して、一つ以上の薬剤部分(Ｄ)、例えば抗体につき約１〜約２０の薬剤部分にコンジュゲートする。式ＩのＡＤＣはいくつかの手段、当業者に公知の有機化学反応、状態及び試薬を用いて調製されうる：(1) 共有結合の後に薬剤部分Ｄと反応してＡｂ-Ｌを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた抗体の求核基の反応；及び(2) 共有結合の後に抗体の求核基と反応してＤ-Ｌを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた薬剤部分の求核基の反応、が含まれる。ＡＤＣを調製するための更なる方法は本願明細書中に記載される。
Ａｂ−(Ｌ−Ｄ)ｐ            Ｉ
リンカーは、一つ以上のリンカー成分から成ってもよい。例示的なリンカー成分は、６-マレイミドカプロイル(「ＭＣ」)、マレイミドプロパノイル(「ＭＰ」)、バリン-シトルリン(「val-cit」)、アラニン-フェニルアラニン(「ala-phe」)、ｐ-アミノベンジルオキシカルボンイル(「ＰＡＢ」)、Ｎ-スクシンイミジル４(２-ピリジルチオ)ペンタノエート(「ＳＰＰ」)、Ｎ-スクシンイミジル４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１カルボキシレート(「ＳＭＣＣ」)、及びＮ-スクシンイミジル(４-イオド-アセチル)アミノ安息香酸エステル(「ＳＩＡＢ」)を含む。更なるリンカー成分は当分野で公知であり、そのいくつかは本願明細書において、記述される。また、"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"、2004年11月5日に出願した米出願番号10/983,340を参照。その内容は出典明記により本願明細書に組み込まれる。
【０１７１】
いくつかの実施態様では、リンカーはアミノ酸残基を含みうる。例示的なアミノ酸リンカー成分には、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド又はペンタペプチドなどがある。例示的なジペプチドは、バリン-シトルリン(vc又はval-cit)、アラニン-フェニルアラニン(af又はala-phe)を含む。例示的なトリペプチドは、グリシン-バリン-シトルリン(gly-val-cit)及びグリシン-グリシン-グリシン(gly-gly-gly)を含む。アミノ酸リンカー成分を含んでなるアミノ酸残基は、天然に生じるもの、並びに微量のアミノ酸及び非天然に生じるアミノ酸類似体、例えばシトルリンを含む。アミノ酸リンカー成分は設定され、特に酵素、例えば腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ及びＤ又はプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断の選択性に最適化できる。
【０１７２】
抗体上の求核基には、限定するものでなく、以下のものを含む：(i) Ｎ末端アミン基、(ii) 側鎖アミン基、例えばリシン、(iii) 側鎖チオール基、例えばシステイン、及び(iv) 抗体がグリコシル化される糖水酸基又はアミノ基。アミン、チオール及び水酸基は、求核であり、反応して、リンカー部分上の求電子性の群及びリンカー試薬により共有結合を形成することができる：(i) 活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸及び酸ハロゲン化物；(ii) アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；(iii) アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド群、が含まれる。特定の抗体は、還元しうる鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、還元剤、例えばＤＴＴ(ジチオトレイトール)による処置によって、リンカー試薬を用いたコンジュゲート反応を行ってもよい。ゆえに、各々のシステイン架橋は、理論的には、２の反応性のチオール求核基を形成する。チオールにアミンを転換させる２-イミノチオラン(トラウトの試薬)を用いてリシンを反応させることによって抗体に付加的な求核基を導入することができる。反応性のチオール基は、１、２、３、４又はそれ以上のシステイン残基を導入する(例えば、一又は複数の非天然のシステインアミノ酸残基を含んでなる変異体抗体を調製する)ことによって抗体(又は、その断片)に導入されてもよい。
【０１７３】
また、抗体薬剤コンジュゲートは、抗体を修飾して求電子性の部分を導入する(リンカー試薬又は薬剤上の求核置換基と反応させることができる)ことによって生成してもよい。グリコシル化された抗体の糖質を、例えば過ヨウ素酸塩酸化剤を用いて酸化して、リンカー試薬又は薬剤部分のアミン基と反応するアルデヒド又はケトン基を形成させてもよい。生じたイミンシッフ塩基群が安定結合を形成するか、又は例えば安定アミン結合を形成させるホウ化水素試薬によって、還元してもよい。一実施態様では、ガラクトースオキシダーゼ又はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩の何れかによるグリコシル化抗体の炭水化物部分の反応により、薬剤(Hermanson, Bioconjugate Techniques)上の適当な基と反応することができるタンパク質のカルボニル(アルデヒド及びケトン)基が生じうる。他の実施態様では、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基を含んでいるタンパク質はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩と反応して、第一のアミノ酸の代わりにアルデヒドを生成する(Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146；米国特許第5362852号)。このようなアルデヒドは、薬剤部分又はリンカー求核基と反応することができる。
同様に、薬剤部分上の求核基には、限定するものではないが、以下のものを含む：反応して、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子性の基と共有結合することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸エステル及びアリールヒドラジド基：(i) 活性エステル(例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸及び酸ハロゲン化物)；(ii) アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；(iii) アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド基、が含まれる。
【０１７４】
別法として、抗体及び細胞障害剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。
他の実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から非結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
【０１７５】
ＡＬＫ−１ポリペプチドに対する共有的修飾
本発明のポリペプチドアンタゴニスト(例えばポリペプチドアンタゴニスト断片、ＡＬＫ−１融合分子、例えばＡＬＫ−１イムノアドヘシン又は抗ＡＬＫ−１抗体)の共有結合による修飾は本発明の範囲内に包含される。それらは、適当であれば、化学合成により、又は抗体の酵素的又はポリペプチドの化学的切断によりなされうる。他の種類のポリペプチドの共有的修飾は、選択される側鎖又はＮ末端ないしはＣ末端残基と反応可能な有機誘導体化剤とポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を反応させることによって、又は、修飾アミノ酸ないしは非天然のアミノ酸を発達するポリペプチド鎖に組み込むことによって、分子内に導入される。例えばEllman等 Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)；Noren等 Science 244:182 (1989)；及び、米国公開特許第２００３０１０８８８５号及び同第２００３００８２５７５号。
【０１７６】
最も一般的には、システイニル残基は、α-ハロアセタート(及び対応するアミン)、例えば、クロロ酢酸又はクロロアセトアミドと反応し、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。システイン残基もまたブロモトリフルオロアセトン；α-ブロモ-β-(５-イミドゾイル)プロピオン酸；クロロアセチルホスフェート；Ｎ-アルキルマレイミド類；３-ニトロ-２-ピリジルジスルフィド；メチル-２-ピリジルジスルフィド；ｐ-クロロ水銀安息香酸；２-クロロ水銀-４-ニトロフェノール；又はクロロ-７-ニトロベンゾ-２-オキサ-１,３-ジアゾールとの反応によって誘導体化される。
ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５−７．０でジエチルピロカルボナートとの反応によって誘導体化されるが、この薬剤はヒスチジル側鎖に対して比較的特異的である。パラ-ブロモフェナシルブロミドもまた有用である；この反応は、典型的にはｐＨ６．０で０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム中で行われる。
リジニル及びアミノ末端残基はコハク酸又は他のカルボン酸無水物と反応させられる。これらの試薬を用いた誘導体形成は、リシニル残基の電荷を逆転させる効果を有する。α-アミノ含有残基を誘導体化する他の適当な試薬には、イミドエステル、例えば、メチルピコリンイミデート、リン酸ピリドキサル、ピリドキサル、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ-メチルイソ尿素、２,４-ペンタンジオン、及びグリオキシレートを用いたトランスアミナーゼにより触媒される反応である。
【０１７７】
アルギニル残基は一あるいは幾つかの従来の試薬との反応によって修飾され、とりわけ、フェニルグリオキサール、２,３-ブタンジオン、１,２-シクロヘキサンジオン及びニンヒドリンがある。アルジニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫａのために反応がアルカリ性条件下で行われることを必要とする。更に、これらの試薬はリジンの基並びにアルギニンε-アミノ基と反応しうる。
チロシル残基の特異的修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応によるチロシル残基内へのスペクトル標識の導入に特に興味をもって、なされる。最も一般的には、Ｎ-アセチルイミジゾールとテトラニトロメタンを使用して、それぞれがＯ-アセチルチロシル種と３-ニトロ誘導体を形成する。チロシル残基はラジオイムノアッセイでの使用のための標識化タンパク質を調製するために１２５Ｉ又は１３１Ｉを用いてヨウ素化される。
【０１７８】
カルボキシル側基(アスパルチル又はグルタミル)がカルボジイミド(Ｒ-Ｎ=Ｃ=Ｎ-Ｒ')(ここで、ＲとＲ'は異なったアルキル基である)、例えば、１-シクロヘキシル-３-(２-モルホリニル-４-エチル)カルボジイミド又は１-エチル-３-(４-アゾニア-４,４-ジメチルペンチル)カルボジイミドとの反応によって選択的に修飾される。更に、アスパルチル及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル及びグルタミニル残基へ変換される。
グルタミニル及びアスパラギニル残基は、それぞれ対応するグルタミル及びアスパルチル残基へしばしば脱アミド化される。これらの残基は中性又は塩基性条件下で脱アミド化される。これらの残基の脱アミド化形態は本発明の範囲内に入る。
その他の修飾には、プロリンとリジンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化(T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 79-86頁 (1983))、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
【０１７９】
他のタイプの共有的修飾は本発明のポリペプチドに対してグリコシドを化学的又は酵素的にカップリングさせることを含む。これらの手順は、それらがＮ-又はＯ-結合グリコシル化のためのグリコシル化能を有する宿主細胞中でのポリペプチドの生産を必要としない点で有利である。用いられるカップリング態様に応じて、糖(類)は、(a)アルギニンとヒスチジンに、(b)遊離のカルボキシル基に、(c)遊離のスルフヒドリル基、例えばシステインのものに、(d)セリン、スレオニン又はヒドロキシプロリンのもののような遊離のヒドロキシル基に、(e)フェニルアラニン、チロシン又はトリプトファンのような芳香族残基、又は(f)グルタミンのアミド基に結合させることができる。これらの方法は１９８７年９月１１日公開の国際公開第８７／０５３３０号並びにAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 259-306頁 (1981)に記載されている。
本発明のポリペプチドに存在するあらゆる炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的になすことができる。化学的脱グリコシル化には、ポリペプチドを化合物トリフルオロメタンスルホン酸、又は等価化合物に暴露することを必要とする。この処理により、ポリペプチドをインタクトなままにしながら、結合糖(Ｎ-アセチルグルコサミン又はＮ-アセチルガラクトサミン)を除く殆どの又は全ての糖の切断が生じる。化学的脱グリコシル化は、Hakimuddin等, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。例えば抗体上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura等, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成できる。
本発明のポリペプチドの共有結合的修飾の他のタイプは、ポリペプチドを、種々の非タンパク質様ポリマーの一つ、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンへ、米国特許第４６４０８３５号；第４４９６６８９号；第４３０１１４４号；第４６７０４１７号；第４７９１１９２号又は第４１７９３３７号に記載された方法で結合させることを含む。
【０１８０】
薬学的製剤
本発明の抗体又はイムノアドヘシンを含んでなる治療用製剤は、所望の純度を持つ抗体と、場合によっては生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤を混合することにより(Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000))、水溶液、凍結乾燥又は他の乾燥製剤の形態に調製されて保存される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量と濃度でレシピエントに非毒性であり、ホスフェート、シトレート、ヒスチジン及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(約１０残基未満)のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質複合体)；及び／又はTWEENTM、PLURONICSTM又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１８１】
ここでの製剤は、治療される特定の徴候のために必要ならば一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を与えない相補的活性を持つものも含んでよい。そのような分子は、好適には、意図する目的のために有効な量で組み合わされて存在する。
また活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリー系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ-粒子及びナノカプセル)に、あるいはマクロエマルションに捕捉させてもよい。このような技術は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000)に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
【０１８２】
徐放性調合物を調製してもよい。徐放性調合物の好ましい例は、免疫グロブリンを含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチルメタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3773919号)、Ｌ-グルタミン酸とγエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOTTM(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフィア)、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシブチル酸が含まれる。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸等のポリマーは、分子を１００日以上かけて放出することを可能にするが、ある種のヒドロゲルはタンパク質をより短い時間で放出する。カプセル化された抗体が体内に長時間残ると、３７℃の水分に暴露された結果として変性又は凝集し、生物活性を喪失させ免疫原性を変化させるおそれがある。合理的な戦略を、関与するメカニズムに応じて安定化のために案出することができる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換による分子間Ｓ-Ｓ結合の形成であることが見いだされた場合、安定化はスルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分含有量を制御し、適当な添加剤を使用し、また特定のポリマーマトリクス組成物を開発することによって達成されうる。
【０１８３】
さらに、本発明に有用な薬剤が遺伝子治療によって被検体に導入されうることを考慮する。遺伝子治療は、被検体への核酸の投与によって行われる治療を指す。遺伝子治療適用において、例えば欠損した遺伝子の置換のために、遺伝子を細胞に導入して、治療的に有効な遺伝子産物のインビボ合成を達成する。「遺伝子治療」には、永続的な効果が単一の治療によって達成される従来の遺伝子治療と遺伝子治療薬の投与の両方が含まれ、治療的に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの１回の投与又は繰り返し投与を伴う。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ又はｓｉＲＮＡはインビボのある遺伝子の発現を遮断するための治療剤として用いられる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞膜による取り込みに制限されて細胞内濃度が低くなるが、インヒビターとして働く細胞内に移入することができることが既に報告されている(Zamecnik等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4143-4146 (1986))。オリゴヌクレオチドは、例えば負に荷電するホスホジエステル基を非荷電基に置換することによって修飾して、それらの取り込みを上げることができる。遺伝子治療の方法の一般的な概念については、例として、Goldspiel等 Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993)；Wu and Wu Biotherapy 3:87-95 (1991)；Tolstoshev Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993)；Mulligan Science 260:926-932 (1993)；Morgan and Anderson Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993)；及び、May TIBTECH 11:155-215 (1993)を参照。用いられうる組換えＤＮＡ技術の当分野で公知の共通の方法は、Ausubel等 eds. (1993) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; and Kriegler (1990) Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NYに記述される。
【０１８４】
用量及び投与
分子は、ヒト患者に、周知の方法、例えば、ボーラスとして又は所定時間に渡る連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節間、滑膜内、鞘内、経口、局所、又は吸入経路、及び／又は皮下投与などにより投与される。
ある実施態様では、本発明の治療はＡＬＫ−１アンタゴニストと一又は複数の抗癌剤、例えば抗血管形成剤又は抗リンパ脈管形成剤との併用投与を伴う。一実施態様では、付加的な抗癌剤、例えば、一又は複数の異なる抗血管新生剤、一又は複数の化学療法剤などが存在する。また、本発明は、複数のインヒビター、例えば同じ抗原に対する複数の抗体又は異なる癌活性分子に対する複数の抗体の投与を考慮する。一実施態様では、異なる化学療法剤の混合物が、ＡＬＫ−１アンタゴニスト及び／又は一又は複数の抗血管形成剤と投与される。併用投与は、別々の製剤又は単一の製薬的製剤による同時投与、及び／又はいずれかの順序での連続投与が含まれる。例えば、ＡＬＫ−１アンタゴニストは、抗癌剤の投与の前、後、交互に行われるか、又はこれらと同時になされうる。一実施態様では、両方(又はすべて)の活性剤が同時にその生物学的活性を及ぼす一定時間がある。
疾患の予防又は治療のために、ＡＬＫ−１アンタゴニストの好適な用量は、上記に定義した治療する疾患のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体を予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前の治療法、患者の病歴及びインヒビターへの応答性、及び担当医師の判断に依存するであろう。インヒビターは一時的又は一連の治療にわたって好適に患者に投与される。併用療法投与計画では、本発明の組成物は治療的有効量又は治療的相乗作用量で投与される。本明細書中で用いられるように、治療的有効量は、本発明の組成物の投与及び／又はＡＬＫ−１アンタゴニスト及び一又は複数の他の治療剤の同時投与により標的とする疾患又は症状が減少又は阻害される量である。薬剤の組み合わせの投与効果は付加的であってもよい。一実施態様では、投与の結果は相乗効果である。治療的相乗作用量は、特定の疾患に関係する状態又は症状を相乗作用的に又は有意に減少ないし除去するために必要な、ＡＬＫ−１アンタゴニスト及び一又は複数の他の治療剤、例えば血管形成インヒビターの量である。
【０１８５】
疾患のタイプ及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ(例えば０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ)のＡＬＫ−１アンタゴニスト又は血管形成インヒビターが、例えば一以上の分割投与又は連続注入による患者投与の初期候補用量である。ある典型的な１日量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与は、所望の疾患症状の抑制が得られるまで持続する。しかしながら他の用量処方が有用であるかもしれない。典型的には、臨床医は、必要とされる生物学的な効果が生じる用量(一又は複数)が達成されるまで分子(一又は複数)を投与するであろう。本発明の治療の経過は従来の技術及びアッセイにより用意にモニターされる。
例えば、血管新生インヒビター、例えばアバスチン(登録商標)(Genentech)などの抗ＶＥＧＦ抗体の調製及び投与計画は製造者の指示に従って用いられても、当業者によって経験的に決定されてもよい。疾患の種類および重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ(例えば０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ)のＶＥＧＦ特異的アンタゴニストを、例えば一又は複数の分割投与又は連続注入によって患者投与の初期候補用量とすることができる。ある典型的な１日量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。ある実施態様では、特に望ましい用量は、例えば５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇなどである。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与では、治療は、上記又は当分野で公知の方法によって測定して、癌が治療されるまで持続する。しかしながら、他の投与計画が有用であるかもしれない。ある例では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストは抗体である場合、本発明の抗体は、週に１回、２週間に１回、又は３週間に１回、およそ５ｍｇ／ｋｇからおよそ１５ｍｇ／ｋｇの範囲で、限定するものではないが７．５ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇなどで投与される。本発明の療法の経過は、従来の技術およびアッセイによって容易にモニターされる。
【０１８６】
ある例では、ベバシズマブはＶＥＧＦ特異的アンタゴニストである。ベバシズマブは、４ｍｌ又は１６ｍｌのベバシズマブ(２５ｍｇ／ｍｌ)を送達するために、１００ｍｇおよび４００ｍｇの防腐剤を含まない、使い捨てのバイアルで治療的使用のために供給される。１００ｍｇの生成物は、２４０ｍｇのα,α-トレハロース無水和物、２３．２ｍｇのリン酸ナトリウム(一塩基性、一水和物)、４．８ｍｇのリン酸ナトリウム(二塩基性、無水)、１．６ｍｇのポリソルベート２０および注入用の水、ＵＳＰに製剤化される。４００ｍｇの生成物は、９６０ｍｇのα,α-トレハロース無水和物、９２．８ｍｇのリン酸ナトリウム(一塩基性、一水和物)、１９．２ｍｇのリン酸ナトリウム(二塩基性、無水)、６．４ｍｇのポリソルベート２０および注入用の水、ＵＳＰに製剤化される。
ある例では、前記の化学療法剤についての調製及び処方の計画は製造業者の指示に従って用いるか、又は実務者によって経験的に決定されてよい。また、化学療法のための調製および処方の計画は、Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)において記述される。
【０１８７】
治療の有効性
本発明の治療の有効性は、新生物ないし非新生物疾患を評価する際に共通に用いられる様々なエンドポイントによって決定することができる。例えば、癌治療は、限定するものではないが、腫瘍再発、腫瘍重量ないしサイズの収縮、進行時間、生存期間、進行がない生存、全体の応答速度、応答の継続期間、及び生活の質などで評価されてもよい。本明細書に記載の抗血管新生剤は腫瘍の血管をターゲットとするのであって、新生物細胞自体をターゲットとする必要はないので、抗癌剤の特定のクラスを示し、それゆえに薬剤に対する臨床応答の特定の測定と定義を必要としうる。例えば、二次元分析において５０％より大きい腫瘍の収縮は応答を示す標準のカットオフである。しかし、インヒビターは原発性腫瘍を収縮することなく転移の拡がりを阻害するか、又は単に腫瘍抑制(tumouristatic)効果を及ぼしうる。したがって、例えば血管新生の血漿又は尿路マーカーの測定及び放射線画像法による応答の測定などの、治療の有効性を決定する手法が用いられうる。
【０１８８】
以下の実施例は例示するためのものであって、本明細書中の教示を限定して解釈するべきものではない。
【実施例】
【０１８９】
実施例１：ＡＬＫ１.Ｆｃ分子の生成
標準的な分子生物学技術を使用して、ＡＬＫ１.Ｆｃ分子は、ポリペプチドリンカーを介してＡＬＫ−１の細胞外ドメイン(ヒトＡＬＫ−１のアミノ酸残基１−１１８)をヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に付着することによって生成した。簡単にいうと、ＡＬＫ−１の細胞外断片(アミノ酸１−１１８)を、ヒトＩｇＧ１のＣ末端Ｆｃを有する融合タンパク質の発現のために設計されたｐＲＫ５ベクターにサブクローニングした。ＡＬＫ１.Ｆｃは、発現プラスミドにて過渡的にトランスフェクションされたＣＨＯ細胞の無血清培養から回収される順化培地から、プロテイン−Ａアフィニティクロマトグラフィによって精製した。ＡＬＫ１.Ｆｃ分子は、以下のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列を有した。
【０１９０】
ＡＬＫ１.Ｆｃ ｃＤＮＡ配列：
ATGACCTTGGGCTCCCCCAGGAAAGGCCTTCTGATGCTGCTGATGGCCTTGGTGACCCAGGGAGACCCTGTGAAGCCGTCTCGGGGCCCGCTGGTGACCTGCACGTGTGAGAGCCCACATTGCAAGGGGCCTACCTGCCGGGGGGCCTGGTGCACAGTAGTGCTGGTGCGGGAGGAGGGGAGGCACCCCCAGGAACATCGGGGCTGCGGGAACTTGCACAGGGAGCTCTGCAGGGGGCGCCCCACCGAGTTCGTCAACCACTACTGCTGCGACAGCCACCTCTGCAACCACAACGTGTCCCTGGTGCTGGAGGCCACCCAACCTCCTTCGGAGCAGCCGGGAACAGATGGCCAGACCGGTGTCACCGACAAAGCTGCGCACTATACTCTGTGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGCCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (配列番号：１)
ＡＬＫ１.Ｆｃタンパク質配列：
MTLGSPRKGLLMLLMALVTQGDPVKPSRGPLVTCTCESPHCKGPTCRGAWCTVVLVREEGRHPQEHRGCGNLHRELCRGRPTEFVNHYCCDSHLCNHNVSLVLEATQPPSEQPGTDGQTGVTDKAAHYTLCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (配列番号：２)
【０１９１】
実施例２：インビトロでの内皮細胞出芽を亢進するＡＬＫ１.Ｆｃ処置
血管内皮細胞増殖に対するＡＬＫ−１シグナル伝達の阻害効果を、ＨＵＶＥＣフィブリンゲルビーズアッセイを使用して調べた。ＨＵＶＥＣフィブリンゲルビーズアッセイの詳細は既に述べられている(Nakatsu, MN, Microvascular Research 44:102-112 (2003))。簡潔にいうと、Ｃｙｔｏｄｅｘ３ビーズ(Amersham Pharmacia Biotech)を、２ｍｌのＥＧＭ-２培地(Clonetics)の１ビーズにつき３５０−４００のヒト臍静脈内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)にてコートした。およそ２００のＨＵＶＥＣコートビーズは、１２ウェルの組織培養プレートの１ウェル中のフィブリン凝塊に包埋した。８０×１０３のＤ５５１ヒト線維芽細胞を、凝塊の上にプレーティングし、培地は２日ごとに交換した。ＡＬＫ１.Ｆｃは、５ｕｇ／ｍｌで培養液に加えた。位相差顕微鏡法画像を９日目に撮影した。
同時培養したヒト線維芽細胞の存在下でフィブリンゲル中で生育するＨＵＶＥＣは、異なる内腔様構造を有する出芽を生成する(Nakatsu, M. N. et al. Microvasc Res 66, 102-12 (2003))。ＡＬＫ１.Ｆｃを加えると出芽の長さが大きく増加したことから(図１)、ＡＬＫ−１シグナル伝達を阻害すると内皮細胞はより多くの探索行動を適応させ得たことが示唆される。これらの結果から、ＡＬＫ１.Ｆｃは、ＡＬＫ−１リガンドを隔離して、内在性ＡＬＫ−１の活性化を予防することによって内皮細胞に作用しうることを示した。
【０１９２】
実施例３：インビボで網膜血管発達に作用するＡＬＫ１-Ｆｃ処置
同腹仔からの新生仔ＳＤラットを用いて、網膜血管発達に対するＡＬＫ１.Ｆｃの効果を調べた。ラットに、出生後４日目(Ｐ４)、Ｐ６およびＰ９に、ＡＬＫ１.Ｆｃ(１０ｍｇ／ｋｇ体重)を腹腔内注射した。Ｐ１１に、ラットはイソフルランにて麻酔をかけた。ＦＩＴＣ標識トマト(Lycopersicon Esculentum)レクチン(１５０μｌの０．９％ＮａＣｌ中１５０μｇ；Vector Laboratories)を心臓内注射し、３分間循環させた。眼を採取し、終夜４％ＰＦＡを含むＰＢＳにて固定し、その後ＰＢＳ洗浄を行った。切開した網膜を１０％ヤギ血清を含むＰＢＳＴ(ＰＢＳ、０．５％トリトンＸ-１００)にて３時間ブロックし、次いでビオチン標識イソレクチンＢ４(１:１００、Bandeiraea simplicifoli；Molecular Probe)又はＣｙ３コンジュゲート抗α平滑筋アクチン(ＡＳＭＡ、１:２００、Sigma-Aldrich)と１０％ヤギ血清を含むＰＢＳＴと共に終夜インキュベートした。ビオチン標識イソレクチンＢ４を視覚化するために、次いで膜をＰＢＳＴにて４回洗浄し、Ｃｙ３-ストレプトアビジン(１:２００、Sigma-Aldrich)と共に終夜インキュベートした。染色が完了した後、網膜をＰＢＳＴにて４回洗浄した。すべての終夜インキュベートは４℃で行った。平らにマウントした網膜の画像を、共焦点蛍光顕微鏡法によって撮影した。
【０１９３】
早期の出生後のラット網膜は、明確な連続事象においてステレオタイプな血管パターンを発達させる。表在性網膜脈管構造は、視神経乳頭から拡大する網状組織として発達し、末梢では出芽が活性であり、中心部では広範に再造形(リモデリング)している。脈管発達の異なる態様、例えば脈管出芽、再造形、成熟および動脈−静脈特異化が容易に続きうる。ＡＬＫ１.Ｆｃ処置網膜では、動脈及び静脈を放射状に変更する特徴的なパターンはほとんど影響を受けなかった。しかしながら、血管密度、特に静脈の近くの毛細血管が明らかに増加した(イソレクチン-Ｃｙ３；図２)。加えて、毛細血管および静脈の血液灌流が目覚ましく減少した(レクチン-ＦＩＴＣ；図３及び４)。興味深いことに、網膜動脈は外見上は拡大したことから、Ａｌｋ１欠陥の胚では血管の欠損が観察されることが示唆された。さらに、拡大した網膜動脈は、血管平滑筋細胞範囲を組織破壊していた(ＡＳＭＡ；図３及び４)。これらの結果から、ＡＬＫ１.Ｆｃ処置は、インビボでＡＬＫ−１シグナル伝達に干渉することによって新生仔ラット網膜の血管発達に作用しうることを示す。
【０１９４】
実施例４：インビボ腫瘍増殖を阻害するＡＬＫ１-Ｆｃ処置
ＡＬＫ−１シグナル伝達が腫瘍増殖に直接関与するか否かを調べるために、我々は、皮下にヒト腫瘍異種移植片を持つヌードマウスにおいて腫瘍脈管形成および腫瘍増殖に対するＡＬＫ１.Ｆｃの作用を試験した。実験動物のケア及び使用のためのガイドラインに従ってベージュヌードマウス(Charles River Laboratories, Hollister, CA)を維持した。各実験に６〜８週齢の雌マウスを用いた。皮下腫瘍を得るために、マウスの右後部脇側に５０％マトリゲル(BD Bioscience)を含有する０．１ｍｌの腫瘍細胞懸濁液を注射した。５×１０６のヒト大腸癌ＨＭ７細胞、１０×１０６のヒト肺カルチノーマＭＶ-５２２細胞、１×１０６のラット神経膠芽腫Ｃ６細胞又は１０×１０６のヒト肺カルチノーマＣａｌｕ６細胞を、各々のマウスに注入した。以下のように、ＡＬＫ１.Ｆｃ(１０ｍｇ／ｋｇ)を腹腔内注射した。ＨＭ７では、ＡＬＫ１.Ｆｃ処置(ｑ／２ｄ)を腫瘍接種の３日後に始め、ＭＶ-５２２では、ＡＬＫ１.Ｆｃ処置(ｑ／２ｄ)を腫瘍接種の１６日後に始め、Ｃ６では、ＡＬＫ１.Ｆｃ処置(２×／ｗ)を腫瘍接種の３日後に始め、Ｃａｌｕ６では、ＡＬＫ１.Ｆｃ処置(ｑ／２ｄ)を腫瘍接種の２２日後に始めた。腫瘍増殖はカリパス測定値によって数量化した。腫瘍体積(ｍｍ３)は、長さ(ｌ)および幅(ｗ)を測定して、体積(Ｖ＝ｌｗ２／２)を算出することによって決定した。各群に１０〜１５匹の動物が含まれた。
ＡＬＫ１.Ｆｃ処置は、ベヒクル処置と比較して有意に腫瘍増殖を阻害した(図５及び６)。腫瘍増殖に対する効果は、試験したすべての異種移植片腫瘍モデルにおいて観察されたことから、観察された抗腫瘍効果は腫瘍タイプ特異的なものではないことが示唆される。
【０１９５】
実施例５：ＡＬＫ１-Ｆｃと抗ＶＥＧＦとの組合せ
上記の実施例４のＨＭ７腫瘍試験では、ＡＬＫ１.Ｆｃ処置は腫瘍細胞が注入された３日後に開始した。処置(ｑ／３ｄに１０ｍｇ／ｋｇ)が腫瘍細胞接種の９日後に開始される場合、ＡＬＫ１.Ｆｃの腫瘍増殖阻害活性は低減された(図７)。このモデルでは、抗ＶＥＧＦ抗体(ｑ／３ｄにＢ２０−４.１、５ｍｇ／ｋｇ)による処置は処置が遅れた場合にさらに有効ではなかった。しかしながら、両方の薬剤が共に用いられる場合には有意な相加効果が観察された(図７)。また、抗ＶＥＧＦ抗体およびＡＬＫ１.Ｆｃの併用効果は、ＬＬ２異種移植片モデルにおいても調べた。５×１０６のマウスｌｅｗｉｓ肺カルチノーマＬＬ２細胞を各マウスに注射し、ＡＬＫ１.Ｆｃ(ｑ／２ｄに１０ｍｇ／ｋｇ)と抗ＶＥＧＦ抗体(ｑ／２ｄに５ｍｇ／ｋｇ)による処置を腫瘍接種の２日後に開始した。結果は、ＬＬ２腫瘍モデルでの併用療法は単一療法と比較して非常に大きな抗腫瘍効果を示した(図８)。
ＣＤ３１染色によって評価されるように、腫瘍血管密度に対する抗ＶＥＧＦ抗体とＡＬＫ１.Ｆｃの効果を、ＬＬ２腫瘍モデルにおいて調べた。腫瘍細胞接種の１８日後に腫瘍を取り出し、１％パラホルムアルデヒド(ＰＦＡ)を含むＰＢＳに２時間浸漬することによって固定し、その後凍結保護のために３０％スクロースに終夜インキュベートした。試料をＯＣＴに包埋し、４０μｍ厚の切片を調製し、抗マウスＣＤ３１(１：５０、BD Pharmingen)、その後ＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗ラットＩｇＧにより染色した。予想されるように、抗ＶＥＧＦ抗体単独による処置は処置した腫瘍の血管密度を有意に低減した。しかしながら、ＡＬＫ１.Ｆｃによる処置は腫瘍血管密度にわずかな効果を示すのみであった。著しいことに、両薬剤による処置は、腫瘍血管密度の更なる目覚ましい低減を起こし(図９)、これは相加的抗腫瘍効果と一致していた。まとめると、これらの結果は、特に抗ＶＥＧＦと併用した場合に、ＡＬＫ１.ＦｃによるＡｌｋ１シグナル伝達のブロックが広範な抗腫瘍有効性を有しうることを示した。
【０１９６】
実施例６：インビボでのリンパ系脈管構造発達に作用するＡＬＫ１-Ｆｃ処置
同腹仔の新生仔ＣＤ１マウスを用いて、リンパ脈管新生に対するＡＬＫ１.Ｆｃの効果を調べた。出生後１日目(Ｐ１)、Ｐ３およびＰ６のマウスにＡＬＫ１.Ｆｃ(１０ｍｇ／ｋｇ体重)を腹腔内投与し、Ｐ９に組織を採取した。まとめて小腸を取り除き、ＰＢＳにてすすいだ。尾部皮膚については、真皮を表皮から切り離し、ＰＢＳにて洗浄し、続く染色に用いた。組織は、４％ＰＦＡを含むＰＢＳにて２時間室温で固定した。ＰＨＴ１(５％ヤギ血清、０．２％ＢＳＡ、０．５％トリトンＸ-１００、ＮａＮ３を含むＰＢＳ)にて室温で２時間ブロックした後、組織を、ラット抗ＣＤ３１(１：５０、BD Pharmingen)及びウサギポリクローナル抗ＬＹＶＥ−１(１:５００、Upstate)を含むＰＨＴ１と共に終夜インキュベートした。二次ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８コンジュゲートヤギ抗ラット(１:４００、Molecular Probes)とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４コンジュゲートヤギ抗ウサギ(１:４００、Molecular Probes)を含むＰＨＴ２(２％ＢＳＡ、０．５％トリトンＸ-１００を含むＰＢＳ)を用いて抗原−抗体複合体を視覚化した。染色が完了した後、組織をＰＢＳＴ(ＰＢＳ、０．５％トリトンＸ-１００)にて４回洗浄し、４％ＰＦＡを含むＰＢＳにて室温で５〜１０分かけて固定し、その後ＰＢＳでさらに４回洗浄した。すべての終夜インキュベートは４℃で行った。平らにマウントした組織の画像は、共焦点蛍光顕微鏡法によって撮影した。
ＡＬＫ１.Ｆｃ処置新生仔マウスの小腸では、絨毛がコントロールより適度に短かったにもかかわらず、絨毛の毛細血管(ＣＤ３１染色)は正常であるようであった(図１０及び１１)。対照的に、毛細リンパ管(ＬＹＶＥ-１染色)は非常に影響を受けた。それらは、絨毛に十分に伸びず、主に絨毛の基部で失速した。 
また、新生仔マウス尾部皮膚内のリンパ系血管網状組織は、ＡＬＫ１.Ｆｃ処置の後に劇的に変化した(図１２)。特徴的な蜂の巣状様パターンはほとんど破壊され、断片化し混乱したリンパ系脈管のみとなった。これらの結果は、血管形成を制御する際の重要な役割に加えて、Ａｌｋ１シグナル伝達は、リンパ系の脈管構造の出生後の発達にも必須であることを示す。
【０１９７】
実施例７：周皮細胞組織に影響するＡＬＫ１-Ｆｃ処置
腫瘍血管の周皮細胞組織に対するＡＬＫ１.Ｆｃによる処置の効果を調べた。ベージュヌードマウスの右後部脇側に５０％マトリゲル(BD Bioscience)を含有する０．１ｍｌの腫瘍細胞懸濁液を注射した。５×１０６のマウス単球性白血病ＴＩＢ６８細胞(ＢＡＬＢ／ｃ由来、単球-骨髄球の分化の初期を表すと考えられる)を各マウスに注射し、皮下腫瘍を定着させた。Ａｌｋ１.Ｆｃ(１０ｍｇ／ｋｇ)又はコントロールベヒクル(ＰＢＳ)を３日ごとに腹腔内投与した。細胞接種の翌日に処置を開始し、初期投与の１６日後に終了した。腫瘍は、４％パラホルムアルデヒド(ＰＦＡ)中で室温(ＲＴ)で２時間固定し、ＰＢＳ中ですすぎ、３０％スクロースへ移して４℃で終夜置き、ＯＣＴに包埋した。腫瘍組織の８０μｍ切片をＰＢＳ中で洗浄し、ＰＨＴ１(ＰＢＳ／１０％ヤギ血清／０．５％トリトンＸ-１００)にて室温で２時間かけてブロックし、そして、ＰＨＴ２(ＰＢＳ／２％ヤギ血清／０．５％トリトンＸ-１００)にて希釈した一次抗体と共に４℃で終夜インキュベートした(ラット抗マウスＣＤ３１、１：５０、BD Pharmingen；ウサギ抗Ｄｅｓｍｉｎ、１:４００、GeneTex)。ＰＢＳ／０．２％トリトンＸ-１００にて４回洗浄した後、切片を二次抗体(ヤギ抗ラットＡｌｅｘａ４８８；ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ５９４、１:４００、Molecular Probes)と共に室温で２時間インキュベートした。切片は、ＰＢＳ／０．２％トリトンＸ−１００の後にＰＢＳにて洗浄し、４％ＰＦＡにて室温に５分間おいて固定し、最後にＰＢＳにて洗浄した。これらの結果は、ＡＬＫ１.Ｆｃ処置腫瘍血管が十分に構築されず、周皮細胞を分離したことを示す(図１３)。
【０１９８】
実施例８：更なるＡＬＫ１イムノアドヘシン分子の生成
標準的な分子生物学技術を用いて、以下の更なる分子を生成した。
ＡＬＫ１.Ｆｃ.２ ｃＤＮＡ配列：
ATGACCTTGGGCTCCCCCAGGAAAGGCCTTCTGATGCTGCTGATGGCCTTGGTGACCCAGGGAGACCCTGTGAAGCCGTCTCGGGGCCCGCTGGTGACCTGCACGTGTGAGAGCCCACATTGCAAGGGGCCTACCTGCCGGGGGGCCTGGTGCACAGTAGTGCTGGTGCGGGAGGAGGGGAGGCACCCCCAGGAACATCGGGGCTGCGGGAACTTGCACAGGGAGCTCTGCAGGGGGCGCCCCACCGAGTTCGTCAACCACTACTGCTGCGACAGCCACCTCTGCAACCACAACGTGTCCCTGGTGCTGGAGGCCACCCAACCTCCTTCGGAGCAGCCGGGAACAGATGGCCAGACCGGTGTCACCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAG (配列番号：３)
ＡＬＫ１.Ｆｃ.２タンパク質配列：
MTLGSPRKGLLMLLMALVTQGDPVKPSRGPLVTCTCESPHCKGPTCRGAWCTVVLVREEGRHPQEHRGCGNLHRELCRGRPTEFVNHYCCDSHLCNHNVSLVLEATQPPSEQPGTDGQTGVTDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (配列番号：４)
【０１９９】
ＡＬＫ１.Ｆｃ.３ ｃＤＮＡ配列：
ATGACCTTGGGCTCCCCCAGGAAAGGCCTTCTGATGCTGCTGATGGCCTTGGTGACCCAGGGAGACCCTGTGAAGCCGTCTCGGGGCCCGCTGGTGACCTGCACGTGTGAGAGCCCACATTGCAAGGGGCCTACCTGCCGGGGGGCCTGGTGCACAGTAGTGCTGGTGCGGGAGGAGGGGAGGCACCCCCAGGAACATCGGGGCTGCGGGAACTTGCACAGGGAGCTCTGCAGGGGGCGCCCCACCGAGTTCGTCAACCACTACTGCTGCGACAGCCACCTCTGCAACCACAACGTGTCCCTGGTGCTGGAGGCCACCCAACCTCCTTCGGAGCAGCCGGGAACAGATGGCCAGACCGGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGCCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (配列番号：５)
ＡＬＫ１.Ｆｃ.３タンパク質配列：
MTLGSPRKGLLMLLMALVTQGDPVKPSRGPLVTCTCESPHCKGPTCRGAWCTVVLVREEGRHPQEHRGCGNLHRELCRGRPTEFVNHYCCDSHLCNHNVSLVLEATQPPSEQPGTDGQTGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (配列番号：６)
【０２００】
ＡＬＫ１.Ｆｃ.４ ｃＤＮＡ配列：
ATGACCTTGGGCTCCCCCAGGAAAGGCCTTCTGATGCTGCTGATGGCCTTGGTGACCCAGGGAGACCCTGTGAAGCCGTCTCGGGGCCCGCTGGTGACCTGCACGTGTGAGAGCCCACATTGCAAGGGGCCTACCTGCCGGGGGGCCTGGTGCACAGTAGTGCTGGTGCGGGAGGAGGGGAGGCACCCCCAGGAACATCGGGGCTGCGGGAACTTGCACAGGGAGCTCTGCAGGGGGCGCCCCACCGAGTTCGTCAACCACTACTGCTGCGACAGCCACCTCTGCAACCACAACGTGTCCCTGGTGCTGGAGGCCACCCAACCTCCTTCGGAGCAGCCGGGAACAGATGGCCAGGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (配列番号：７)
ＡＬＫ１.Ｆｃ.４タンパク質配列：
MTLGSPRKGLLMLLMALVTQGDPVKPSRGPLVTCTCESPHCKGPTCRGAWCTVVLVREEGRHPQEHRGCGNLHRELCRGRPTEFVNHYCCDSHLCNHNVSLVLEATQPPSEQPGTDGQEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (配列番号：８)
【０２０１】
ＡＬＫ１.Ｆｃ.５ ｃＤＮＡ配列：
ATGACCTTGGGCTCCCCCAGGAAAGGCCTTCTGATGCTGCTGATGGCCTTGGTGACCCAGGGAGACCCTGTGAAGCCGTCTCGGGGCCCGCTGGTGACCTGCACGTGTGAGAGCCCACATTGCAAGGGGCCTACCTGCCGGGGGGCCTGGTGCACAGTAGTGCTGGTGCGGGAGGAGGGGAGGCACCCCCAGGAACATCGGGGCTGCGGGAACTTGCACAGGGAGCTCTGCAGGGGGCGCCCCACCGAGTTCGTCAACCACTACTGCTGCGACAGCCACCTCTGCAACCACAACGTGTCCCTGGTGCTGGAGGCCACCCAACCTCCTTCGGAGCAGCCGGGAACAGATGGCCAGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAG (配列番号：９)
ＡＬＫ１.Ｆｃ.５タンパク質配列：
MTLGSPRKGLLMLLMALVTQGDPVKPSRGPLVTCTCESPHCKGPTCRGAWCTVVLVREEGRHPQEHRGCGNLHRELCRGRPTEFVNHYCCDSHLCNHNVSLVLEATQPPSEQPGTDGQEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (配列番号：１０)
【０２０２】
実施例９：インビボで網膜血管発達に作用するＡＬＫ１処置
出生後４日目(Ｐ４)およびＰ６のマウスに、ＡＬＫ１.Ｆｃ、ＡＬＫ１.Ｆｃ.２、ＡＬＫ１.Ｆｃ.４又はＡＬＫ１.Ｆｃ.５(１０ｍｇ／ｋｇ体重)を腹腔内投与した。Ｐ８にマウスに麻酔をかけた。眼を採取し、４％ＰＦＡを含むＰＢＳにて終夜をかけて固定し、その後ＰＢＳにて洗浄した。切開した網膜を１０％ヤギ血清を含むＰＢＳＴ(ＰＢＳ、０．５％トリトンＸ-１００)にて３時間ブロックし、次いでラット抗ＣＤ３１(１：５０、BD Pharmingen)を含むＰＢＳＴと共に終夜インキュベートした。抗ＣＤ３１を視覚化するために、網膜は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８コンジュゲートヤギ抗ラット(１:４００、Molecular Probes)を含むＰＢＳＴと共にインキュベートした。染色が完了した後、網膜をＰＢＳＴにて４回洗浄した。すべての終夜インキュベートは４℃で行った。平らにマウントした網膜の画像を、共焦点蛍光顕微鏡法によって撮影した。
早期の出生後のマウス網膜は、明確な連続事象においてステレオタイプな血管パターンを発達させる。表在性網膜脈管構造は、視神経乳頭から拡大する網状組織として発達し、末梢では出芽が活性であり、中心部では広範に再造形している。脈管発達の異なる態様、例えば脈管出芽、再造形、成熟および動脈−静脈特異化が容易に続きうる。ＡＬＫ１イムノアドヘシン(ＡＬＫ１.Ｆｃ、ＡＬＫ１.Ｆｃ.２、ＡＬＫ１.Ｆｃ.４およびＡＬＫ１.Ｆｃ.５)処置網膜では、動脈及び静脈を放射状に変更する特徴的なパターンはほとんど影響を受けなかった。しかしながら、血管密度、特に静脈の近くの毛細血管が明らかに増加した(図１４)。これらの結果は、新生仔マウスの網膜における脈管発達に対する更なるＡＬＫ１イムノアドヘシン(ＡＬＫ１.Ｆｃ.２、ＡＬＫ１.Ｆｃ.４およびＡＬＫ１.Ｆｃ.５)による処置の効果は、ＡＬＫ１.Ｆｃによる処置と同程度であることを示す。
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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