(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビフィズス菌の表層に目的のタンパク質またはペプチドを発現するためのビフィズス菌表層発現遺伝子であって、ビフィズス菌由来のＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質をコードする遺伝子と、該目的のタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子とが、５’末端側からこの順で連結されている、ビフィズス菌表層発現遺伝子。
【請求項２】
前記目的のタンパク質またはペプチドが、抗原タンパク質または抗原ペプチドである、請求項１に記載のビフィズス菌表層発現遺伝子。
【請求項３】
前記抗原タンパク質またはペプチドがサルモネラ由来のフラジェリンである、請求項２に記載のビフィズス菌表層発現遺伝子。
【請求項４】
前記抗原タンパク質またはペプチドがインフルエンザウイルスのＭ２タンパク質である、請求項２に記載のビフィズス菌表層発現遺伝子。
【請求項５】
前記ＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質をコードする遺伝子と前記目的のタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子との間に、アジュバンド機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項２から４のいずれかの項に記載のビフィズス菌表層発現遺伝子。
【請求項６】
前記アジュバンド機能を有するタンパク質がフラジェリンである、請求項５に記載のビフィズス菌表層発現遺伝子。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかの項に記載のビフィズス菌表層発現遺伝子を発現可能な様式で含む、遺伝子発現用プラスミド。
【請求項８】
請求項７に記載のプラスミドを保持し、目的のタンパク質またはペプチドを細胞表層に提示する、形質転換ビフィズス菌。
【請求項９】
ゲノム中に、請求項１から６のいずれかの項に記載のビフィズス菌表層発現遺伝子を発現可能な様式で含み、前記目的のタンパク質またはペプチドを細胞表層に提示する、形質転換ビフィズス菌。
【請求項１０】
前記目的のタンパク質またはペプチドがサルモネラ由来のフラジェリンである、請求項８または９に記載の形質転換ビフィズス菌。
【請求項１１】
請求項１０に記載の形質転換ビフィズス菌を含む、経口用サルモネラ感染症ワクチン。
【請求項１２】
前記目的のタンパク質またはペプチドがインフルエンザウイルスのＭ２タンパク質である、請求項８または９に記載の形質転換ビフィズス菌。
【請求項１３】
アジュバンド機能を有するタンパク質をさらに表層に提示する、請求項１２に記載の形質転換ビフィズス菌。
【請求項１４】
前記アジュバンド機能を有するタンパク質がフラジェリンである、請求項１３に記載の形質転換ビフィズス菌。
【請求項１５】
請求項１２から１４のいずれかの項に記載の形質転換ビフィズス菌を含む、経口用インフルエンザワクチン。
【請求項１６】
請求項８または９に記載の形質転換ビフィズス菌であって、前記目的のタンパク質またはペプチドが、抗原タンパク質または抗原ペプチドおよびアジュバンド機能を有するタンパク質である、形質転換ビフィズス菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビフィズス菌の表層にタンパク質またはペプチドを発現させ提示させる技術に関し、この技術を使用したビフィズス菌による新規ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の細胞膜は、細胞の内外を隔てる生体膜であり、細胞膜表面には細胞の情報を提供する機能や細胞内外の物質を輸送する機能を有する膜タンパク質が多数存在している。近年、膜タンパク質が免疫に重要な役割を果たしており、抗原抗体反応において細胞表層の膜タンパクがターゲットにされていることが判明している。そのため、特定の抗原を膜タンパクと融合させて微生物の細胞表層に提示して、抗原抗体反応を人為的に誘導するための経口ワクチンとして使用するという概念が提唱されている。しかし、現在のところ実用例はなく、論文などに記載されている応用例も少ない。例えば、ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素などの酵素タンパクの膜結合部をコードする遺伝子を有するベクターを利用して、宿主微生物の細胞表層に提示する例がある（特許文献１）。しかし、宿主としては、乳酸菌、酵母、および大腸菌が報告されるのみである。【０００３】
ビフィドバクテリウム属に属する微生物（これらを総称して「ビフィズス菌」という）は、人間や他の動物の小腸の下流または大腸で見られる常在菌である。ビフィズス菌は、偏性嫌気性のグラム陽性菌であるため、培養における選択性が高く（好気性の菌が増殖しない）、生体親和性も高く（乳幼児の腸内での最優勢菌であり、成人にも多く存在する）、そしてグラム陰性菌にあるエンドトキシンが存在しない（安全性が高い）。したがって、ビフィズス菌はＧＲＡＳ（一般的に安全と認められる）として認知されている。また、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）について、腸管を覆っているムチンからなる粘液との結合性を有しているとの報告もあるため、ビフィズス菌は腸において他の菌より腸壁への付着性が高いと考えられている。【０００４】
このようにビフィズス菌が非常に注目を集めているにもかかわらず、ビフィズス菌においてタンパク質を細胞表層に提示するための発現系は開発されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００５−５００５４号公報
【特許文献２】特許第３６４２７５５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Suzuki R.ら，J. Biol. Chem.，2008年，283巻，p.13165
【非特許文献２】McClelland M.ら，Nature，2001年，413巻，p.852
【非特許文献３】Heiderbergら，Nature，2000年，406巻，p.477
【非特許文献４】Tominaga A.ら，Genes Genet. Syst.，2001年，76巻，p.111
【非特許文献５】Wada J.ら，Acta Crystallographica Section F.，2007年，F63巻，p.751
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ビフィズス菌の細胞表層にタンパク質またはペプチドを発現・提示するための手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一般に、膜タンパク質は細胞膜上でのみ立体構造を構成するため、タンパク質単体での立体構造解析が困難であり、このような膜タンパク質を含む融合タンパクを意図的に表層に提示させることも困難であった。しかし、近年、ビフィズス菌の細胞膜に存在するＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質（以下、ＧＬ−ＢＰという）について立体構造解析が行われた（非特許文献１）。本発明者らは、このＧＬ−ＢＰに注目し、目的のタンパク質の表層提示への利用について研究を進めた結果、ビフィズス菌の細胞膜にタンパク質を発現・提示するための手段を提供することに成功した。【０００９】
本発明は、ビフィズス菌の表層に目的のタンパク質またはペプチドを発現するためのビフィズス菌表層発現遺伝子を提供し、該遺伝子は、ビフィズス菌由来のＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質をコードする遺伝子と、該目的のタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子とが、５’末端側からこの順で連結されている。【００１０】
１つの実施態様では、上記目的のタンパク質またはペプチドは、抗原タンパク質または抗原ペプチドである。【００１１】
さらなる実施態様では、上記抗原タンパク質またはペプチドはサルモネラ由来のフラジェリンであり、そして別の実施態様では、上記抗原タンパク質またはペプチドはインフルエンザウイルスのＭ２タンパク質である。【００１２】
１つの実施態様では、上記ビフィズス菌表層発現遺伝子は、上記ＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質をコードする遺伝子と上記目的のタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子との間に、アジュバンド機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む。【００１３】
ある実施態様では、上記アジュバンド機能を有するタンパク質はフラジェリンである。【００１４】
本発明はまた、上記のいずれかのビフィズス菌表層発現遺伝子を発現可能な様式で含む、遺伝子発現用プラスミドを提供する。【００１５】
本発明はさらに、上記のプラスミドを保持し、目的のタンパク質またはペプチドを細胞表層に提示する、形質転換ビフィズス菌を提供する。【００１６】
本発明はさらに、ゲノム中に、上記のいずれかのビフィズス菌表層発現遺伝子を発現可能な様式で含み、上記目的のタンパク質またはペプチドを細胞表層に提示する、形質転換ビフィズス菌を提供する。【００１７】
１つの実施態様では、上記目的のタンパク質またはペプチドはサルモネラ由来のフラジェリンである。【００１８】
１つの実施態様では、上記目的のタンパク質またはペプチドはインフルエンザウイルスのＭ２タンパク質である。【００１９】
１つの実施態様では、上記の形質転換ビフィズス菌は、アジュバンド機能を有するタンパク質をさらに表層に提示する。【００２０】
さらなる実施態様では、上記アジュバンド機能を有するタンパク質はフラジェリンである。【００２１】
１つの実施態様では、上記目的のタンパク質またはペプチドは、抗原タンパク質または抗原ペプチドおよびアジュバンド機能を有するタンパク質である。【００２２】
本発明はまた、サルモネラ由来のフラジェリンを表層に提示する形質転換ビフィズス菌を含む、経口用サルモネラ感染症ワクチンを提供する。【００２３】
本発明はまた、インフルエンザウイルスのＭ２タンパク質を表層に提示する形質転換ビフィズス菌を含む、経口用インフルエンザワクチンを提供する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、ビフィズス菌の細胞表層に目的のタンパク質またはペプチドを発現・提示することができる。例えば、ビフィズス菌の表層に、微生物、ウイルス、原虫、ガンなどの抗原タンパク質または抗原ペプチドを提示させることにより、小腸粘膜や鼻粘膜にキャリアとして抗原タンパク質を運び、粘膜において提示された抗原に対する抗体反応を誘起する、経口および経鼻ワクチンとして利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＧＬ−ＢＰ遺伝子の下流にフラジェリン（ＦｌｉＣ）遺伝子を連結した融合遺伝子の模式図である。
【図２】（ａ）は、実施例１で得た形質転換ビフィズス菌（ＧＬ−ＢＰ−ＦｌｉＣ表層提示）の蛍光顕微鏡写真であり、（ｂ）は、未処理のビフィズス菌（ＧＬ−ＢＰ−ＦｌｉＣ表層提示なし）の蛍光顕微鏡写真である。
【図３】実施例１で得た形質転換ビフィズス菌（ＧＬ−ＢＰ−ＦｌｉＣ表層提示）のタンパク質溶解液のウエスタンブロッティングの写真である。
【図４】ビフィズス菌を経口投与したマウスの糞溶解物中の抗フラジェリンＩｇＡレベルの経時変化を示すグラフである。
【図５】ビフィズス菌を経口投与したマウスの血清中の（ａ）抗フラジェリンＩｇＡレベル、（ｂ）抗フラジェリンＩｇＧレベル、および（ｃ）抗フラジェリンＩｇＭレベルの経時変化を示すグラフである。
【図６】致死量のネズミチフス菌を経口投与した後のマウスの生存率の経時変化を示すグラフである。
【図７】三層構造のシームレスカプセル製剤の模式断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
（ビフィズス菌）
本発明において、「ビフィズス菌」とは、ビフィドバクテリウム属に属する微生物をいう。ビフィズス菌としては、例えば、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・アングラタム（B. angulatum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシス・アニマリス（B. animalis subsp. animalis）、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシス・ラクティス（B. animalis subsp. lactis）、ビフィドバクテリウム・アステロイデス（B. asteroides）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（B. bifidum）、ビフィドバクテリウム・ボウム（B. boum）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（B. breve）、ビフィドバクテリウム・カテヌラタム（B. catenulatum）、ビフィドバクテリウム・ケリナム（B. choerinum）、ビフィドバクテリウム・コリネフォーム（B. coryneforme）、ビフィドバクテリウム・クニクリ（B. cuniculi）、ビフィドバクテリウム・デンティコレンス（B. denticolens）、ビフィドバクテリウム・デンティウム（B. dentium）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（B. gallicum）、ビフィドバクテリウム・ガリナラム（B. gallinarum）、ビフィドバクテリウム・グロボサム（B. globosum）、ビフィドバクテリウム・インディカム（B. indicum）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（B. infantis）、ビフィドバクテリウム・イノピナタム（B. inopinatum）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（B. lactis）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B. longum）、ビフィドバクテリウム・マグナム（B. magnum）、ビフィドバクテリウム・メリシカム（B. merycicum）、ビフィドバクテリウム・ミニマム（B. minimum）、ビフィドバクテリウム・パーブロラム（B. parvulorum）、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラタム（B. pseudocatenulatum）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシス・グロボスム（B. pseudolongum subsp. globosum）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシス・シュードロンガム（B. pseudolongum subsp. pseudolongum）、ビフィドバクテリウム・プロルム（B. pullorum）、ビフィドバクテリウム・ルミナル（B. ruminale）、ビフィドバクテリウム・ルミナンティアム（B. ruminantium）、ビフィドバクテリウム・セクラル（B. saeculare）、ビフィドバクテリウム・スカードビ（B. scardovii）、ビフィドバクテリウム・ズブチル（B. subtile）、ビフィドバクテリウム・スイス（B. suis）、ビフィドバクテリウム・サームアシドフィルム（B. thermacidophilum）、およびビフィドバクテリウム・サームフィルム（B. thermophilum）が挙げられる。
【００２７】
この中でも、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシス・アニマリス（B. animalis subsp. animalis）、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシス・ラクティス（B. animalis subsp. lactis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（B. bifidum）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（B. breve）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（B. lactis）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B. longum）、およびビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシス・シュードロンガム（B. pseudolongum subsp. pseudolongum）が好ましく用いられる。
【００２８】
また、これらの耐性株または変異株を用いてもよい。これらの菌株は、いずれも市販されているか、または寄託機関から容易に入手できる。例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B．longum）JCM1217（ATCC15707）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（B．bifidum）ATCC11863などが挙げられる。
【００２９】
（ＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質）
ＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質（ＧＬ−ＢＰ）は、ビフィズス菌が有するラクト−Ｎ−ビオース（すなわち、Ｎ−アセチル−３−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−Ｄ−グルコサミン）およびガラクト−Ｎ−ビオース（すなわち、Ｎ−アセチル−３−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−Ｄ−ガラクトサミン）を輸送するＡＢＣタンパク質（ATP Binding Cassette protein）ファミリーに属する膜タンパク質である。ＡＢＣタンパク質とは、ＡＴＰ（アデノシン３リン酸）というエネルギーを使用し、すべての生物の細胞膜上で特異的な物質の輸送を能動的に行う重要な膜タンパク質であり、細胞膜上に多種のＡＢＣタンパク質が存在している。そのため、ＡＢＣタンパク質であるＧＬ−ＢＰは、ＧＬ−ＢＰ表層発現のための細胞機能が備わっているビフィドバクテリウム属細菌（ビフィズス菌）において、適切なプロモーターを利用すれば、ビフィズス菌では普遍的に発現する。例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムJCM1217（ATCC15707）株由来のＧＬ−ＢＰは、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する。
【００３０】
ＧＬ−ＢＰの構造は天然に存在するＧＬ−ＢＰに限定されず、ビフィズス菌の細胞表層に発現する能力を有していれば、該ＧＬ−ＢＰを構成するアミノ酸に１以上の置換、挿入、または欠失を有していてもよい。
【００３１】
（目的のタンパク質またはペプチド）
ビフィズス菌の表層に提示すべき目的のタンパク質またはペプチドは、特に限定されない。目的のタンパク質またはペプチドは、本来細胞表層に局在しないタンパク質またはペプチドであって、細胞表層に提示することを目的として配置されるタンパク質またはペプチドが好ましい。例えば、抗原タンパク質またはペプチド、酵素などが挙げられる。なお、目的の機能を果たし得る限り、その構造は天然に存在するタンパク質またはペプチドに限定されず、該タンパク質またはペプチドを構成するアミノ酸に１以上の置換、欠失、または付加が有ってもよい。
【００３２】
抗原タンパク質またはペプチドとしては、細菌、ウイルス、原虫などに由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドが挙げられる。細菌としては、サルモネラ菌、ネズミチフス菌、赤痢菌、肺炎双球菌、結核菌などの細菌感染症を引き起こし得る細菌が挙げられる。ウイルスとしては、種々の型のインフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ＡＩＤＳウイルス、各種肝炎ウイルスなどが挙げられる。原虫としては、マラリア、トリコモナス、トキソプラズマなどが挙げられる。より具体的な抗原タンパク質またはペプチドとしては、サルモネラ菌やネズミチフス菌のフラジェリンタンパク質、インフルエンザウイルスのＭ２タンパク質、マラリア原虫のＳＥＲＡ（Serine Repeat Antigen）タンパク質、新生児Ｂ群レンサ球菌感染症の原因であるＢ群連鎖球菌のＧＢＳ８０タンパク質、歯周病の原因菌であるポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）のｐｇ４０エンベロープタンパク質、ＨＩＶウイルスのｇｐ１２０またはｇｐ１６０エンベロープタンパク質、子宮頸ガン原因ウイルスであるヒトパピローマウイルスのＥ６、Ｅ７、またはＬ２タンパク質、Ｃ型肝炎ウイルスＨＣＶのＥ２・ＮＳ１エンベロープ糖タンパク質、日本脳炎の原因であるフラビウイルス属のＮＳ１非構造タンパク質またはＤＩ・ＩＩ・ＩＩＩタンパク質、アルツハイマーの原因であるアミロイドベータ（Ａβ）タンパク質、牛ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）の原因であるペスチウイルス属のｇｐ５３タンパク質、豚コレラウイルスのｇｐ５５エンベロープタンパク質、犬パルポウイルスおよび猫汎白血球減少症の原因となるパルポウイルスのＶＰ２カプシドタンパク質、エビが感染して死に至らしめるホワイトスポット症候群ウイルスのＶＰ２８エンベロープタンパク質などが挙げられる。
【００３３】
酵素としては、例えば、グルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソセロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、カルボキシメチルセルラーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミンシンセターゼ、リパーゼ、リジン脱炭酸酵素、アラビノフラノシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼなどが挙げられる。
【００３４】
その他の目的のタンパク質またはペプチドとしては、例えば、蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＳＩＲＩＵＳ、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ＤｓＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＫＯ、ｍＣｅｒｕｌｅａｎなど）、生物発光タンパク質（ホタルルシフェラーゼ、イクオリン（オワンクラゲ）、ウミシイタケルシフェラーゼ、ウミホタルルシフェラーゼなど）、毒性物質の検出に用いられるアリルハイドロカーボンレセプター、Ｈｉｓタグ、プロテインＡ、ガンや特定の疾患（例えば、アルツハイマー病）などに特異的に発現しているタンパク質に対する抗体が挙げられる。
【００３５】
（アジュバンド機能を有するタンパク質）
アジュバンド機能を有するタンパク質として、微生物の鞭毛を構成するフラジェリンタンパク質が、高レベルの抗体を誘導することが知られている。
【００３６】
鞭毛は細胞表面から突き出た長い構造体であり、運動性および宿主細胞への侵入において重要な役割を果たす。この鞭毛はフラジェリン（以下、ＦｌｉＣという場合がある）と称されるタンパク質からなる。例えば、サルモネラ属ネズミチフス菌（サルモネラ・エンテリカ・サブスピーシス・エンテリカ・セロバー・ティフィムリウム（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium））の抗原性タンパク質フラジェリンは、非特許文献２に記載されている。コレラ菌（ビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae））の抗原性タンパク質フラジェリンは、非特許文献３に記載されている。また、赤痢菌（シゲラ・ディセンテリエ（（Shigella dysenteriae））の抗原性タンパク質フラジェリンは、非特許文献４に記載されている。例えば、ネズミチフス菌由来のフラジェリンは、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する。フラジェリンタンパク質は、アジュバント機能を有する限り、その構成アミノ酸に１以上の置換、欠失、または付加が有ってもよい。
【００３７】
（ビフィズス菌表層提示融合タンパク質）
本発明において、ビフィズス菌の表層に発現・提示されるタンパク質またはペプチドは、ＧＬ−ＢＰとの融合タンパク質として発現される。この融合タンパク質は、Ｎ末端からＧＬ−ＢＰおよび目的のタンパク質またはペプチドの順に連結されている。必要に応じて、ＧＬ−ＢＰと目的のタンパク質またはペプチドとの間に、アジュバンド機能を有するタンパク質を含んでいてもよい。
【００３８】
（形質転換ビフィズス菌の調製）
以下、目的のタンパク質またはペプチドをビフィズス菌表層に融合タンパク質として発現・提示させる形質転換ビフィズス菌の調製手順について、操作の順に説明する。
【００３９】
１．各タンパク質をコードする遺伝子の取得
ＧＬ−ＢＰをコードする遺伝子、目的のタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子、およびＦｌｉＣをコードする遺伝子は、それぞれ公知の遺伝子配列またはアミノ酸配列情報に基づいて、入手可能である。例えば、任意のビフィズス菌から調製したゲノムＤＮＡあるいはｃＤＮＡを鋳型とし、該ビフィズス菌のＧＬ−ＢＰの構造遺伝子の配列情報に基づいて作製したプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅して取得し得る。一般に１つのアミノ酸に対して複数種の遺伝暗号が存在するため、公知塩基配列または公知アミノ酸配列に基づく塩基配列とは異なる塩基配列を有する遺伝子であってもよい。
【００４０】
例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B. longum）のＧＬ−ＢＰをコードする遺伝子は、非特許文献５に記載されたビフィドバクテリウム・ロンガムのＧＬ−ＢＰの構造遺伝子配列から入手可能である。例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムの染色体ＤＮＡあるいはｃＤＮＡを鋳型とし、配列情報に基づいて作製したプライマー対を用いてＰＣＲで増幅し、入手できる。
【００４１】
目的のタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子は、公知の遺伝子配列情報またはアミノ酸配列情報に基づいて、入手可能である。例えば、リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）由来のグルコアミラーゼをコードする遺伝子は、リゾプス・オリゼから調製したゲノムＤＮＡあるいはｃＤＮＡを鋳型とし、このリゾプス・オリゼのグルコアミラーゼの構造遺伝子の配列情報に基づいて作製したプライマー対を用いてＰＣＲで増幅し、取得し得る。
【００４２】
ＦｌｉＣをコードする遺伝子は、公知の遺伝子配列情報またはアミノ酸配列情報に基づいて、入手可能である。ＦｌｉＣをコードする遺伝子は、例えば、感染症病原細菌（例えば、サルモネラ、コレラ菌、または赤痢菌）から調製したゲノムＤＮＡあるいはｃＤＮＡを鋳型とし、該細菌のＦｌｉＣの構造遺伝子の配列情報に基づいて作製したプライマー対を用いてＰＣＲで増幅し、取得し得る。
【００４３】
より具体的には、上記の各タンパク質をコードする遺伝子は、例えば、公知の塩基配列情報から、公知の化学合成によって得ることができる。化学合成法としては、例えば、フォスフォアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機により化学合成する方法が挙げられる。また、取得すべき塩基配列の５’末端および３’末端の塩基配列に基づいてプライマーを調製し、種々の由来生物の組織または細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーから選択したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法を用いてＤＮＡの増幅を行うことにより、上記の遺伝子を取得することもできる。またさらに、公知塩基配列情報に基づき、その全長または一部を化学合成したＤＮＡまたはポリヌクレオチドをプローブとして、種々の由来生物の組織または細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーに対してコロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、上記の遺伝子を取得することもできる。
【００４４】
また、上記の各タンパク質をコードする遺伝子は、公知のアミノ配列情報からも容易に得ることができる。公知のアミノ配列情報から上記の各タンパク質をコードする遺伝子を得る方法としては、例えば、公知のアミノ配列をコードする遺伝子の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて、ＰＣＲ法によって上記ｃＤＮＡライブラリーなどから目的とする遺伝子を増幅する方法、または適切なベクターに組込んだ遺伝子と、上記各タンパク質をコードする遺伝子の一部あるいは全域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを標識したもの（プローブ）とのハイブリダイゼーションによって選別する方法などが挙げられる。
【００４５】
上記の各タンパク質をコードする遺伝子は、上記のようにして取得した遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとは、上記ＤＮＡをプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などにより得られるＤＮＡを意味する。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、約０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下、約６５℃にてハイブリダイゼーションを行った後、約０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、約６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡが挙げられる。上記ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして、具体的には、上記公知塩基配列情報またはアミノ酸配列情報に基づいて得られる各タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列と、少なくとも約８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは約９０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００４６】
２．ビフィズス菌形質転換用ベクターの調製
上記１．のように調製された各タンパク質をコードする遺伝子を有する組換え体ＤＮＡを調製する。本発明において、組換え体ＤＮＡは、発現ベクターまたは染色体組込み型ベクター（例えば、相同組換え型ベクター）であり得る。このようなベクターの調製に用いられるプラスミドとしては、ビフィズス菌で発現可能なプラスミドであれば特に制限はない。ビフィズス菌に由来するプラスミドとしては、ｐＴＢ６、ｐＢＬ６７、ｐＢＬ７８、ｐＮＡＬ８Ｈ、ｐＮＡＬ８Ｍ、ｐＮＡＣ１、ｐＢＣ１、ｐＭＢ１、ｐＧＢＬ８ｂなどが用いられる。これらのプラスミドと大腸菌のプラスミドとの複合プラスミドもまた用いられ得、例えば、ｐＢＬＥＳ１００、ｐＫＫＴ４２７、ｐＲＭ２などが挙げられる。
【００４７】
発現の安定性および形質転換株の調製のためのＤＮＡの調製の容易さという観点から、上記プラスミドの中でも、ビフィドバクテリウム・ロンガムのプラスミドと大腸菌のプラスミドとから合成された複合プラスミドが好ましい。
【００４８】
発現ベクターは、形質転換株を選択する観点から、抗生物質耐性、アミノ酸要求性などの選択マーカーを有することが好ましい。
【００４９】
発現ベクターは、ＧＬ−ＢＰと目的のタンパク質またはペプチドとの融合タンパク質の発現のために、または発現に有利となるように、調節配列を付加したものが好ましい。調節配列としては、例えば、プロモーター配列、リーダー配列、プロペプチド配列、エンハンサー配列、シグナル配列、ターミネーター配列などが挙げられる。これらの調節配列は、ビフィズス菌で発現するものであれば、その由来は特に制限はない。
【００５０】
プロモーター配列としては、ビフィズス菌で発現するものであれば特に制限はない。発現効率の観点からは、ビフィドバクテリウム・ロンガムのヒストン様タンパク（ＨＵ）のプロモーター配列、ＬＤＨプロモーターなどが好ましく用いられる。
【００５１】
また、発現効率を高める観点からは、ターミネーター配列を有することが好ましい。ターミネーター配列としては、上記ＨＵ遺伝子のターミネーター配列が好ましく用いられる。
【００５２】
その他、必要に応じて、リーダー配列、プロペプチド配列、エンハンサー配列、シグナル配列などを配置することができる。また、ＧＬ−ＢＰをコードする遺伝子と目的のタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子との間に適切な長さのリンカーをコードする遺伝子を配置してもよい。
【００５３】
このように、上記のプラスミドに、必要に応じて、プロモーター配列、ターミネーター配列などの調節配列、および選択マーカー遺伝子を導入して、クローニングベクターが調製される。選択マーカーとしては、スペクチノマイシン（ＳＰｒ）、アンピシリン（Ａｍｐｒ）、テトラサイクリン（ＴＥＴｒ）、カナマイシン（ＫＭｒ）、ストレプトマイシン（ＳＴｒ）、ネオマイシン（ＮＥＯｒ）などの抗生物質耐性マーカー；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＥＰ）などの蛍光マーカー；ＬａｃＺなどの酵素などが挙げられる。
【００５４】
クローニングベクターのプロモーターの下流には、マルチクローニングサイトを有するリンカーなどを備えていることが好ましい。このようなリンカーを用いることにより、上記融合タンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）がプロモーターの下流に、かつ、インフレームで融合タンパク質を発現することができるように、組み込まれる。クローニングベクター用のプラスミドとしては、代表的には、ｐＢＬＥＳ１００、ｐＢＬＥＭ１００などが挙げられる（特許文献２参照）。
【００５５】
このプラスミドｐＢＬＥＳ１００に上記取得したＨＵプロモーター配列、ＧＬ−ＢＰをコードする遺伝子、および目的のタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子をインフレームで組み込むことにより、融合タンパク質をビフィズス菌の表層に発現するベクターが得られる。このような方法で得られる発現ベクターは、ビフィズス菌の形質転換に用いられる。
【００５６】
３．融合タンパク質を発現する形質転換ビフィズス菌の調製
組換え体ＤＮＡ、例えば、発現ベクターを、宿主であるビフィズス菌に導入する。形質転換方法は、公知の方法であればいずれも用いることができる。具体的には、例えば、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、カルシウムイオン法、プロトプラスト法、マイクロインジェクション法、パーティクル・ガン法などが挙げられる。本発明においては、エレクトロポレーション法を用いるのが好ましい。エレクトロポレーション法による場合、０．５〜２０ｋＶ／ｃｍ、０．５μｓｅｃ〜１０ｍｓｅｃの条件で行うことが可能である。より好ましくは、２〜１０ｋＶ／ｃｍ、５０μｓｅｃ〜５ｍｓｅｃで行うことが望ましい。
【００５７】
形質転換株は、融合タンパク質発現ベクターが有する選択マーカーで選択される。形質転換株を培養する培地としては、宿主微生物それぞれに適した培地、例えば、ブドウ糖血液肝臓（ＢＬ）寒天培地、デ・マン−ロゴサ−シャープ（ＭＲＳ）寒天培地、岐阜大学嫌気性（ＧＡＭ）寒天培地、改良ＧＡＭ（ＴＧＡＭ）寒天培地、ブリッグス（Ｂｒｉｇｇｓ）寒天培地、および酵母エキスブドウ糖ペプトン（ＹＧＰ）寒天培地が挙げられる。これらの培地に選択マーカーに応じて抗生物質を添加し、あるいはアミノ酸を欠失または添加し、選択圧とする。
【００５８】
なお、培養条件は、ビフィズス菌が培養可能な嫌気培養で行うことが好ましい。嫌気性条件下で培養することにより、好気性菌の増殖を防ぐことができる。嫌気性条件下とは、ビフィズス菌が増殖可能な程度の嫌気度を保てる密閉容器中であり、例えば、嫌気チャンバーまたは嫌気ボックスなどにおいて可能な条件が挙げられる。培養温度は、ビフィズス菌を培養可能な温度であればよく、通常、４℃〜４５℃、好ましくは１５℃〜４０℃、より好ましくは２４℃〜３７℃である。
【００５９】
なお、ＧＬ−ＢＰと目的のタンパク質またはペプチドとの融合タンパク質を表層提示させるためのベクターだけでなく、ＧＬ−ＢＰとアジュバント機能を有するタンパク質との融合タンパク質を表層提示させるためのベクターも同時に導入した形質転換ビフィズス菌を調製してもよい。
【００６０】
融合タンパク質をコードする遺伝子の導入を、形質転換ビフィズス菌からプラスミドを抽出して、制限酵素処理後に電気泳動で確認してもよく、制限酵素処理断片の配列を直接シーケンスしてもよい。
【００６１】
得られた形質転換ビフィズス菌の融合タンパク質の発現の確認は、例えば、ウエスタンブロッティング法で行うことができる。まず、形質転換ビフィズス菌を、例えば、非イオン性界面活性剤を用いて、溶菌する。非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、４０、６０、６５、８０、８５）、ソルビタンエステル（Ｓｐａｎ（登録商標）２０、４０、６０、６５、８０、８５）などが挙げられる。次いで、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）−塩酸緩衝液などを用いて希釈し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、トリス−グリシン−ポリアクリルアミドゲルなどを用いて電気泳動を行う。次いで、ニトロセルロース、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＦ）膜などに転写し、目的のタンパク質またはペプチドに対する抗体（免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ））と反応させ、さらに蛍光標識を有する２次抗体で反応させることにより、融合タンパク質の発現を確認できる。
【００６２】
特に、目的のタンパク質またはペプチドがビフィズス菌表層に提示されていることは、形質転換ビフィズス菌に対して、目的のタンパク質またはペプチドに対する抗体とＦＩＴＣ標識抗ＩｇＧ抗体とを用いる免疫抗体法によって容易に確認し得る。なお、ＧＬ−ＢＰとアジュバント機能を有するタンパク質と目的のタンパク質またはペプチドとの融合タンパク質を発現する場合、アジュバント機能を有するタンパク質と目的のタンパク質またはペプチドとがビフィズス菌の表層に提示されているため、確認に用いる抗体は、いずれのタンパク質（またはペプチド）に対する抗体であってもよい。
【００６３】
目的のタンパク質またはペプチドの表層提示が確認された形質転換ビフィズス菌は、当業者が通常用いる方法により培養し、回収して、そのまま製剤の製造に用いてもよい。あるいは、乾燥して用いてもよい。乾燥は、凍結乾燥、低温乾燥などの低温処理を行い、腸内環境あるいは培地などの生育条件下に曝したときに生育可能となるような処理方法により行われる。
【００６４】
形質転換ビフィズス菌は、公知の方法で後処理を行ってもよい。例えば、遠心分離などにより粗精製を行ってもよい。また、所望により粗精製を行った後、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または乳酸配合リンゲル液などの当該分野で従来から使用されている溶媒に溶解または懸濁させてもよい。また、所望により凍結乾燥または噴霧乾燥を行い、粉状物または粒状物にしてもよい。
【００６５】
（形質転換ビフィズス菌含有製剤）
本発明の形質転換ビフィズス菌は、表層に提示している目的のタンパク質またはペプチドが疾患の治療または予防目的で投与することが好ましい場合、任意の製剤の形態で投与される。投与経路は特に限定されず、経口投与または非経口投与が挙げられる。目的のタンパク質またはペプチドが抗原タンパク質またはペプチドである場合は、経口投与または経鼻投与が好ましい。
【００６６】
経口投与に適する製剤の例としては、例えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、シロップ剤、溶液剤、カプセル剤または懸濁剤などが挙げられる。非経口投与に適する製剤の例としては、例えば、注射剤、点滴剤、吸入剤、噴霧剤、坐剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤などが挙げられる。
【００６７】
経口投与用の液体製剤の製造には、例えば、水、ショ糖、ソルビット、果糖などの糖類；ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類；ゴマ油、オリーブ油、大豆油などの油類；ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤などの製剤用添加物を用いることができる。また、カプセル剤、錠剤、散剤、または顆粒剤などの固形製剤の製造には、例えば、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニットなどの賦形剤；澱粉、アルギン酸ソーダなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤；ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤；脂肪酸エステルなどの界面活性剤；グリセリンなどの可塑剤を用いることができる。
【００６８】
非経口投与用の製剤のうち注射剤や点滴剤などの血管内投与用製剤は、好ましくはヒト血液と等張の水性媒体を用いて調製することができる。例えば、注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、または塩溶液とブドウ糖溶液の混合物から選ばれる水性媒体を用い、常法に従って適当な助剤とともに溶液、懸濁液または分散液として調製することができる。腸内投与のための坐剤は、例えば、カカオ脂、水添油脂または水添脂肪酸などの担体を用いて調製することができる。
【００６９】
非経口投与用の製剤のうち噴霧剤は、ヒトの口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ有効成分である形質転換ビフィズス菌を微細な粒子として分散させて吸収を促進することのできる担体を用いて調製することができる。このような担体として、例えば、乳糖またはグリセリンなどを用いることができる。形質転換ビフィズス菌および用いる担体の性質により、エアロゾルやドライパウダーなどの形態の製剤として調製することができる。非経口投与用の製剤の製造には、例えば、希釈剤、香料、防腐剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される１または２以上の製剤用添加物を用いることができる。
【００７０】
（経口ワクチン）
本発明において、目的のタンパク質またはペプチドが、抗原タンパク質である場合、形質転換ビフィズス菌は、経口ワクチンとして好適である。例えば、抗原タンパク質がフラジェリンである場合、フラジェリンは腸管壁で抗原として認識されて、抗体が産生される。したがって、フラジェリンを有する微生物の感染に対して有効な経口ワクチンとなる。
【００７１】
例えば、以下に記載の耐酸性カプセル製剤（シームレスカプセル製剤、軟カプセル製剤、および硬カプセル製剤）は、経口投与されると、ｐＨ１〜３の胃内で溶解せずに通過して、腸に到達し、腸で溶解する。カプセルの溶解により製剤から放出された形質転換ビフィズス菌は、腸内環境で生育し、その表層に目的のタンパク質またはペプチドを提示する。
【００７２】
（形質転換ビフィズス菌を含有する耐酸性カプセル製剤の製造）
本発明の経口ワクチンは、カプセル製剤の形態であることが好ましい。本明細書中では、内容物をその中に含むカプセルを「カプセル製剤」という。本発明におけるカプセル製剤は、カプセル皮膜と目的のタンパク質またはペプチドを表層に発現する形質転換ビフィズス菌とで構成され、このカプセル皮膜は耐酸性である。耐酸性であるカプセル皮膜と目的のタンパク質またはペプチドを表層に発現する形質転換ビフィズス菌とで構成されるカプセル製剤とは、耐酸性のカプセル皮膜を有し、そして目的のタンパク質またはペプチドを表層に発現する形質転換ビフィズス菌をカプセル内容物として含有する限り、任意の構成および形状をとり、当該カプセル製剤が、さらなる構成要素を含んでいることを除外しない。したがって、目的のタンパク質またはペプチドを表層に発現する形質転換ビフィズス菌が、耐酸性のカプセル皮膜によって包含されている、または封じ込められている（すなわち、耐酸性の皮膜によって形成されるカプセルの内部領域に含有されている）。本明細書中では、このカプセル製剤を「耐酸性カプセル製剤」ともいう。
【００７３】
目的のタンパク質またはペプチドを表層に発現する形質転換ビフィズス菌が経口ワクチンとして機能するためには、この形質転換ビフィズス菌が胃を通過し、腸に到達し、そこで生育できるようにしなければならない。ところで、胃のｐＨは１〜３であり、この著しく低いｐＨのため、経口摂取されたビフィズス菌は、その大部分が死滅する。増殖能を有したまま腸まで達するビフィズス菌は、一般に、投与量の１００００分の１以下となると言われている。したがって、本発明で用いる形質転換ビフィズス菌がヒトの腸内に生存したまま到達し、かつ、腸内で増殖して目的のタンパク質またはペプチドを発現するためには、形質転換ビフィズス菌が胃酸による影響を極力受けないようにすることが好ましい。
【００７４】
そのため、本発明においては、好適には、耐酸性のカプセル皮膜によって形質転換ビフィズス菌が包含されまたは封じ込められている、すなわち、耐酸性の皮膜のカプセルの内側に形質転換ビフィズス菌が含有されている、カプセル製剤とする。カプセル製剤の構成、形状などは、皮膜が胃酸に対して耐性を有する限り、特に制限がない。すなわち、胃酸がカプセル内に浸入し、形質転換ビフィズス菌と接触しないように構成することが望ましい。カプセル皮膜は、ｐＨ４以下、好ましくはｐＨ１〜３で溶解しない皮膜であり得る。カプセル化法も特に制限はない。
【００７５】
（シームレスカプセル製剤）
胃酸に対して耐性を付与するためのカプセルの形状としては、好ましくは、「シームレスカプセル」が挙げられる。シームレスカプセルとは、軟カプセルの一種であり、継ぎ目のない皮膜で内容物を封入する形態のカプセルをいう。シームレスカプセルは、二層以上の多層構造が可能であり、三層またはそれ以上の多層構造を有することが好ましい。通常、最内層に内容物（本発明の場合は、形質転換ビフィズス菌）を含み得、そして外層（または最外層）が皮膜となり得る。言い換えれば、形質転換ビフィズス菌が皮膜によって包含された形態である。
【００７６】
以下に、三層構造のシームレスカプセル製剤の調製について説明する。図７は三層構造のシームレスカプセル製剤の模式断面図である。この三層構造は、最内層、この最内層を覆う内皮層、およびこの内皮層を覆う外層からなる。
【００７７】
最内層は、上記形質転換ビフィズス菌、およびこの形質転換ビフィズス菌を懸濁／混合するための非水性溶媒または固体成分（以下、この成分を最内層用物質という）からなる。最内層用物質には特に制限がない。例えば、各種油脂類、脂肪酸類、糖の脂肪酸エステル、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、鎖状エーテル、高級脂肪酸エステル、高級アルコール、テルペン類が挙げられる。具体的には、大豆油、胡麻油、パーム油、パーム核油、コーン油、綿実油、椰子油、ナタネ油、カカオ脂、牛脂、豚脂、馬油、鯨油、融点が４０℃以下である上記天然油脂の水添油脂、マーガリン、ショートニング、グリセリン脂肪酸エステル、蔗糖脂肪酸エステル、樟脳油、薄荷油、α−ピネン、Ｄ−リモネンなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらの最内層用物質は、単独でまたは２種以上を混合して用いることができる。
【００７８】
内皮層の材料としては、上記最内層用物質のうち、融点が２０℃〜５０℃であり、かつ最内層と異なる物質が用いられる。より好ましくは、常温で固体の物質が用いられる。以下の実施例において、最内層用物質として融点が３４℃の水添パーム核油、および内皮層の材料として融点が４３℃の水添パーム核油を用いたように、最内層用物質および内皮層の材料としてそれぞれ融点が異なるように水添処理された同種の油脂を用いることもできる。この内皮層は、水分および酸素の透過を抑制し、胃酸との接触を防ぐように働き得る。どのような物質を選択するかは、カプセルの保存期間などを考慮して決定することができる。
【００７９】
外層（三層構造以上の場合は最外層）の材料としては、タンパク質と水溶性多価アルコールとの混合物、タンパク質と水溶性多価アルコールと多糖類との混合物、多糖類と水溶性多価アルコールとの混合物などが挙げられる。タンパク質としては、例えば、ゼラチンおよびコラーゲンが挙げられる。水溶性多価アルコールとしては、例えば、ソルビトール、マンニトール、グリセリン、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールが挙げられる。多糖類としては、寒天、ゲランガム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、ペクチン、アルギン酸塩、カラギナン、アラビアガム、デキストリン、変性デキストリン、デンプン、化工デンプン、プルラン、ペクチン、およびカルボキシメチルセルロース塩が挙げられる。ペクチン、アルギン酸塩、ゲランガム、もしくはカラギナンを使用する場合は、適宜アルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩を添加してもよい。
【００８０】
上記の三層構造のシームレスカプセル製剤の調製は、当業者に周知の技術、例えば、特許第１３９８８３６号明細書に記載されている三重ノズルを用いる滴下法で行われる。この滴下法では、同心三重ノズルの最内側ノズルから形質転換ビフィズス菌（例えば、凍結乾燥菌体）と合わせた最内層用物質（好ましくは、２０〜５０℃で非流動性である疎水性溶媒物質中への形質転換ビフィズス菌（好ましくは、凍結乾燥菌体）の懸濁液）を、中間ノズルから内皮層を構成する物質（例えば、常温では固体である物質の融解液）を、そして、最外側ノズルから外層（皮膜）となる物質の溶液を同時に吐出し、冷却下で流動しているキャリア液（例えば、コーン油、ナタネ油など）中に滴下させることにより、最内層に形質転換ビフィズス菌が含まれる三層構造の「シームレス」カプセルが形成される。したがって、形質転換ビフィズス菌が、継ぎ目のない外層皮膜によって包含または封じ込められている。
【００８１】
上記のようにして形成されたカプセルは、次いで乾燥される。乾燥方法としては、例えば、常温通風乾燥を施す。乾燥は、例えば５℃〜３０℃の空気により乾燥させる方法が一般的である。乾燥時間は２〜１２時間が好適である。特開平０７−０６９８６７号公報に記載される、上記のように通常の乾燥を施したカプセルに対し、さらに真空乾燥または真空凍結乾燥を施す方法が好適に用いられ得る。真空度は０.５〜０．０２torrに保ち、真空凍結乾燥では−２０℃以下で凍結させ乾燥させる方法である。真空乾燥または真空凍結乾燥に要する時間は特に限定的ではないが、一般に５〜６０時間、好ましくは２４〜４８時間である。５時間以下であると、乾燥が不十分であり、カプセル内に存在する水分が内容物質に悪影響を与え得る。
【００８２】
特開平０７−０６９８６７号公報に記載の方法により得られるカプセルはそのカプセル内の水分が真空凍結乾燥により十分除去されており、Ａｗ値は０．２０以下で熱伝導率０．１６ｋｃａｌ／ｍｈ℃以下になり得る。真空乾燥または真空凍結乾燥によりもちろん水分が低下するのと同時に、カプセルが十分乾燥し、多孔質になるため、熱伝導率も単に通常乾燥で得られたものよりも大きく低下することになる。
【００８３】
Ａｗ値とは試料中に存在する水分の絶対量ではなく、水分の存在状態によって決定される値、すなわち試料中における水の自由度を表したものであって、化学反応や微生物の生育に直接関与することができる水分を表す指標で、電気抵抗式水分活性測定法（例えば、ＡｗメーターＷＡ−３６０、株式会社芝浦電子製作所）で測定される。熱伝導率はフィッチ（Ｆｉｔｃｈ）法などで測定される。Ａｗ値は好ましくは０．２０以下であり、熱伝導率は好ましくは０．０２〜０．０８ｋｃａｌ／ｍｈ℃である。
【００８４】
シームレスカプセル製剤のカプセル皮膜に耐酸性を付与するには、耐酸性の外層を形成させるか、または形成されたシームレスカプセルの皮膜（最外層）を耐酸性となるように処理する。
【００８５】
耐酸性外層を形成させる方法としては、ゲル化能を有するゼラチン、寒天、カラギナンなどに対して、ペクチン、アルギン酸塩、アラビアゴムなどを０．０１〜２０質量％、好ましくは０．１〜１０質量％となるように添加する方法が挙げられる。
【００８６】
形成されたシームレスカプセルの皮膜（最外層）に耐酸性を付与する方法としては、例えば、シームレスカプセルの外層（最外層）の架橋処理およびシームレスカプセルの表面のコーティング処理が挙げられる。これらの処理を単独でまたは組み合わせて行うことが好ましい。
【００８７】
タンパク質を含む外層を架橋処理する場合、まず、シームレスカプセルを調製した後、十分に水洗する。水洗したシームレスカプセルを、架橋剤を含む水溶液に加え、外層の表面を架橋させる。架橋剤としては、従来公知の架橋剤を使用することができる。架橋剤としては、例えば、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、グリオキサール、グルタルアルデヒド、シンナムアルデヒド、バニリルアルデヒド、アセトン、エチルメチルケトン、エチレンオキシド、プロピレンオキシド、カリミョウバン、およびアンモニウムミョウバンが挙げられる。一般には、シームレスカプセル１質量部を、０．１〜２％(w/v)、好ましくは０．５〜２％(w/v)の架橋剤を含む水溶液５０〜１００質量部に加え、１０〜３００秒間撹拌することにより、外層の処理を行う。なお、架橋剤の使用量、作用させる時間は、架橋剤によって異なる。外皮膜の表面を架橋処理した後、十分に水洗することにより、架橋剤を含む水溶液を除去し、外層中に含まれる水分を乾燥させる。
【００８８】
また、上記のタンパク質を含む外層の架橋処理として、トランスグルタミナーゼを用いる酵素処理による架橋を行ってもよい。この場合、生成したシームレスカプセル１質量部を、０．１〜１０％(w/v)、好ましくは０．５〜２％(w/v)の酵素を含む水溶液５０〜１００質量部に加え、１〜３００分間撹拌することにより、外層を処理し、上記と同様に水洗、乾燥させる。
【００８９】
コーティング処理を行う場合は、生成した湿シームレスカプセルを乾燥させた後、セラック、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、セルロースＴＣ−５、ビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体、ゼイン、エチレンワックスなどを基材とし、ヒマシ油、ナタネ油、ジブチルフタレート、ポリエチレングリコール、グリセリン、ステアリン酸、脂肪酸エステル、ソルビタンパルミテート、ポリオキシエチレンステアレート、アセチル化モノグリセリドなどを可塑剤として用いて、常法に従ってシームレスカプセルをコーティングする。
【００９０】
さらに、カプセル皮膜に腸溶性を付与することにより、胃内の酸性溶液（例えば、胃酸）などからカプセルを保護しそして腸内で崩壊させることにより、カプセル内部の形質転換ビフィズス菌を腸内で放出させ、腸内で抗原産生を十分行わせることが可能となる。腸溶性の付与は、当業者が通常腸溶性カプセルを製造する方法で行われる。また、シームレスカプセルの外層材料としてゼラチンおよびペクチンを含む混合物を用いることにより、腸溶化皮膜とできる。ゲル化能を有するゼラチン、寒天、カラギナンなどに対して、ペクチン、アルギン酸塩、アラビアゴムなどを０．０１〜２０質量％、好ましくは０．１〜１０質量％となるように添加し、調製した耐酸性外層は、腸溶性もまた有する。
【００９１】
シームレスカプセル製剤は、その製法に起因して、形状は球状であり得る。シームレスカプセルの平均粒径は、０．３〜１０ｍｍ、好ましくは、１．５〜８．０ｍｍである。
【００９２】
このようにして得られたシームレスカプセル製剤は、室温で形質転換ビフィズス菌の活性を保持したまま６ヶ月以上保存することが可能であり、１０℃以下で保存する場合は、１年以上の長期保存が可能である。
【００９３】
（軟カプセル製剤）
軟カプセル製剤は、シームレスカプセル製剤の場合と同様、非水性溶媒中への形質転換ビフィズス菌の懸濁液を内容物とし、皮膜シートで包含したものである。皮膜シートの材料は、シームレスカプセルの外層の材料と同様である。
【００９４】
軟カプセル製剤は、公知の技術、例えば、特許第２９９９５３５号明細書に記載されている方法で調製することができる。例えば、ロータリーダイを用いて、内容物を注入および充填しながら、皮膜シートを型を通して加熱することによって封入し、カプセル化し得る。腸において形質転換ビフィズス菌を放出する機能を持たせるために、得られた軟カプセルから、離型剤である油を極性溶媒（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール）で洗浄することによって除去する。その後、シームレスカプセルの場合と同様に、架橋処理およびコーティング処理を組み合わせて行うか、あるいはいずれか一方の処理を行い、耐酸性とし得る。
【００９５】
耐酸性皮膜シートを、ゲル化能を有するゼラチン、寒天、カラギナンなどに対して、ペクチン、アルギン酸塩、アラビアゴムなどを０．０１〜２０質量％、好ましくは０．１〜１０質量％となるように添加し、公知の方法に基づいて調製することもできる。あるいは、皮膜シートを架橋処理およびコーティング処理を組み合わせて行うか、あるいはいずれか一方の処理を行い、耐酸性とし得る。このようにして得られた耐酸性皮膜シートを用いて、例えば、公知の技術によりカプセルの成形およびカプセル内への内容物の導入をし、次いでカプセルの継ぎ目を溶着することによって内容物を封入し、耐酸性皮膜によって形質転換ビフィズス菌が包含された軟カプセル製剤を製造し得る。
【００９６】
軟カプセル製剤は、球状、楕円状、または矩形状の構造であり得る。軟カプセルは、長径が３〜１６ｍｍおよび短径が２〜１０ｍｍのものが好ましく、長径が５〜７ｍｍおよび短径が２〜３ｍｍのものがより好ましい。
【００９７】
このようにして得られた軟カプセル製剤は、室温で形質転換ビフィズス菌の活性を保持したまま６ヶ月以上保存することが可能であり、１０℃以下で保存する場合は、１年以上の長期保存が可能である。
【００９８】
（硬カプセル製剤）
硬カプセル製剤は、カプセル皮膜を予めボディとキャップとに成型し、内容物をカプセルボディに充填し、次いでカプセルキャップを組み合わせることにより、製造され得る。
【００９９】
硬カプセル製剤の皮膜材料としては、ゼラチン、セルロース、プルラン、カラギナン、ならびに、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース誘導体が挙げられる。硬カプセルの成型は、当業者が通常用いる方法で行われ得る。成型カプセルは、市販のカプセルであってもよい。内容物を皮膜で包み込み、封入することもできる。
【０１００】
内容物は、形質転換ビフィズス菌を賦形剤（例えば、無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、乳糖、コーンスターチ、結晶セルロース）とよく混合させたもの、あるいは、形質転換ビフィズス菌の乾燥菌末を含有する粉体であり得る。
【０１０１】
内容物をカプセル内に入れた後、カプセル皮膜をコーティングしてもよい。このコーティングには、シームレスカプセルの外層で説明した材料および方法が適用され、それにより耐酸性および好ましくは腸における崩壊性（腸溶性）が付与される。このコーティングは、カプセル皮膜を封入して内容物を包含させる役割も有し得る。
【０１０２】
耐酸性皮膜シートを、ゲル化能を有するゼラチン、寒天、カラギナンなどに対して、ペクチン、アルギン酸塩、アラビアゴムなどを０．０１〜２０質量％、好ましくは０．１〜１０質量％となるように添加し、公知の方法に基づいて調製することもできる。あるいは、皮膜シートを架橋処理およびコーティング処理を組み合わせて行うか、あるいはいずれか一方の処理を行い、耐酸性とし得る。このようにして得られた耐酸性皮膜シートを用いて、例えば、公知の技術で硬カプセルを成型し得、そしてこの成型した硬カプセル内部に内容物を入れて、カプセルの継ぎ目を溶着することによって内容物を封入し、耐酸性皮膜によって形質転換ビフィズス菌が包含された硬カプセル製剤を製造し得る。
【０１０３】
このようにして得られた硬カプセル製剤では、室温で形質転換ビフィズス菌の活性を保持したまま６ヶ月以上保存することが可能であり、１０℃以下で保存する場合は、１年以上の長期保存が可能である。
【実施例】
【０１０４】
以下に実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。【０１０５】
（実施例１：ＧＬ−ＢＰ−ＦｌｉＣ表層提示ビフィズス菌の作成）
Ａ．ＧＬ−ＢＰ遺伝子の単離
ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）JCM1217（ATCC15707）ゲノム（Accession：EU193949）より、プライマーglt-f：5'-ggggtgctgatatattggtttg-3'（配列番号５）および終止コドンがXhoIに置換されるようにしたglt-r：5'-gctcgagctcggaaacagacaggccgaagtt-3'（配列番号６）とKOD -Plus-（TOYOBO社製）とを用いてＰＣＲ反応を行ってＧＬ−ＢＰ遺伝子を増幅させた。増幅させたＧＬ−ＢＰ遺伝子を含むＰＣＲ産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、１９８９ｂｐのＰＣＲ産物を切り出し、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega社製）を用いてＧＬ−ＢＰ増幅断片のみを単離精製した。【０１０６】
Ｂ．単離したＧＬ−ＢＰ遺伝子を有するｐＭＷ１１８プラスミドの構築
単離精製したＧＬ−ＢＰ遺伝子増幅断片を、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）を有するｐＭＷ１１８（株式会社ニッポンジーン製）のSmaIサイトに導入し、プラスミドの構築を行った。なお、ライゲーションには、DNA Ligation kit Ver. 2（タカラバイオ株式会社製）を用いた。構築したプラスミドを、ヒートショック法（４２℃、３０秒）にて大腸菌ＤＨ５α（タカラバイオ株式会社製）に導入し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地（Difco社製）に塗布し、３７℃にて一晩培養し、ＧＬ−ＢＰ遺伝子を有するプラスミドを保持した形質転換大腸菌を得た。形質転換大腸菌からQuantum Prep Plasmid Miniprep Kit（Bio-Rad社製）を使用してプラスミドを抽出精製し、シーケンスによる配列確認を行い、ＧＬ−ＢＰ遺伝子の導入された組換えプラスミドを得た。得られた組換えプラスミドをｐＪＴ１０１と命名した。【０１０７】
Ｃ．ＦｌｉＣ遺伝子の単離
サルモネラ属ネズミチフス菌（サルモネラ・エンテリカ・サブスピーシス・エンテリカ・セロバー・ティフィムリウム（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium）ATCC13312（住商ファーマより購入））のゲノムより、XhoI配列を付加したプライマーfliC-f：5'-cctcgagatggcacaagtcattaatacaaacag-3'（配列番号７）およびfliC-r：5'-cctcgagttaacgcagtaaagagaggacg-3'（配列番号８）を用いてＰＣＲ反応を行ってＦｌｉＣ遺伝子を増幅させた。増幅させたＦｌｉＣ遺伝子を含むＰＣＲ産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、１５０２ｂｐのＰＣＲ産物を切り出し、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いてＦｌｉＣ増幅断片のみを単離精製した。【０１０８】
Ｄ．ＧＬ−ＢＰ遺伝子の下流にＦｌｉＣ遺伝子を有するプラスミドの構築
上記Ｃ．にて単離精製したＦｌｉＣ遺伝子の増幅断片を、制限酵素XhoIで処理した。このXhoI処理したＦｌｉＣ遺伝子増幅断片を、DNA Ligation kit Ver. 2を用いて、同じく制限酵素XhoIで処理した上記ｐＪＴ１０１プラスミドへ導入し、プラスミドの構築を行った。構築したプラスミドを、ヒートショック法にて大腸菌ＤＨ５αに導入し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃にて一晩培養し、ＧＬ−ＢＰ遺伝子とＦｌｉＣ遺伝子との融合遺伝子（図１）を有するプラスミドを保持した形質転換大腸菌を得た。得られた形質転換大腸菌から、Quantum Prep Plasmid Miniprep Kitを使用してプラスミドを抽出精製し、シーケンスによる配列確認を行い、ＧＬ−ＢＰ遺伝子の下流にＦｌｉＣ遺伝子を連結した組換えプラスミドを得た。得られた組換えプラスミドをｐＪＴ１０２と命名した。【０１０９】
Ｅ．大腸菌−ビフィズス菌シャトルベクターの構築
大腸菌−ビフィズス菌シャトルベクターであるｐＢＬＥＳ１００ベクターのビフィズス菌複製開始点を残したまま短縮するため、ｐＢＬＥＳ１００（Matsumura H.ら，Biosci. Biotech. Biochem.，1997年，61巻，pp.1211-1212）をテンプレートにして、プライマー（pBLES-f：5'-agggacttgatctgctcatccag-3'（配列番号９）およびpBLES-r：5'-ttcccattaaataataaaacaaaaaaat-3'（配列番号１０））を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅産物を用いてアガロースゲル電気泳動を行い、ＰＣＲ産物を切り出しWizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いてＰＣＲ増幅断片のみを単離精製した。精製後、DNA Ligation Kit Ver2.1（タカラバイオ株式会社製）を用いて、セルフライゲーションを行った。セルフライゲーションで得られたプラスミドをｐＴＫ１７５１と命名した。ｐＴＫ１７５１をテンプレートとして、プライマーpBLES-f3581：5'-tagtttgcgcaacgttgttgcc-3'（配列番号１１）およびpBLES-r93：5'-gatttcatacacggtgcctgac-3'（配列番号１２）を用いてＰＣＲを行い、スペクチノマイシン耐性遺伝子（ＳＰｒ）およびビフィズス菌の複製開始点ori領域を含むＰＣＲ産物を得、エタノール沈殿法にて精製した。また、これとは別に、ｐＭＷ１１８をテンプレートとして、プライマーpMW118-f：5'-atcacgaggccctttcgtcttc-3'（配列番号１３）およびpMW118-r：5'-cctgttctattaggtgttacatgc-3'（配列番号１４）を用いて、大腸菌複製開始点ori領域を含むＰＣＲ産物を得、エタノール沈殿法にて精製した。２つのＰＣＲ産物を用いて、DNA Ligation Kit Ver2.1を用いて、ライゲーションを行った。得られたプラスミドをヒートショック法にて大腸菌ＤＨ５αに導入し、スペクチノマイシン７０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃にて一晩培養し、大腸菌複製開始点ori領域とスペクチノマイシン耐性遺伝子（ＳＰｒ）とビフィズス菌の複製開始点ori領域とを有するプラスミドを保持した形質転換大腸菌を得た。得られた形質転換大腸菌から、Quantum Prep Plasmid Miniprep Kitを使用してプラスミドを抽出精製し、大腸菌複製開始点ori領域とスペクチノマイシン耐性遺伝子（ＳＰｒ）とビフィズス菌の複製開始点ori領域とを有する組換えプラスミドを得た。得られた組換えプラスミドをシャトルベクターｐＪＷ２４１と命名した。【０１１０】
Ｆ．大腸菌−ビフィズス菌シャトルベクターｐＪＷ２４１へのＧＬ−ＢＰ遺伝子とＦｌｉＣ遺伝子とが連結された遺伝子の組込み
ＧＬ−ＢＰ遺伝子とＦｌｉＣ遺伝子とが連結された遺伝子を有するベクターｐＪＴ１０２をテンプレートとして、プライマーGL-BP-NdeI-f：5'-ccatatgaagtacgttgctttgtaaggggag-3'（配列番号１５）およびFliC-NdeI-r：5'-ccatatgttaacgcagtaaagagaggacg-3'（配列番号１６）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅産物をエタノール沈殿法にて精製後、制限酵素NdeIで制限酵素処理した。また、これとは別に、上記Ｅ．で得た大腸菌−ビフィズス菌シャトルベクターを制限酵素NdeIで処理した。NdeI処理したＰＣＲ遺伝子断片とｐＪＷ２４１とを、DNA Ligation Kit Ver2.1を用いてライゲートし、得られたプラスミドをヒートショック法にて大腸菌ＤＨ５αに導入し、スペクチノマイシン７０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃にて一晩培養して、大腸菌複製開始点ori領域、スペクチノマイシン耐性遺伝子（ＳＰｒ）、ビフィズス菌の複製開始点ori領域、およびＧＬ−ＢＰ遺伝子とＦｌｉＣ遺伝子との融合遺伝子を有するプラスミドを保持した形質転換大腸菌を得た。形質転換大腸菌からQuantum Prep Plasmid Miniprep Kitを使用してプラスミドを抽出精製し、ＧＬ−ＢＰ遺伝子とＦｌｉＣ遺伝子とが連結された遺伝子の配列の存在を確認した。得られた組換えプラスミドをｐＪＷ２４５と命名した。【０１１１】
Ｇ．宿主ビフィズス菌液の調製
ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）105-A（Matsumura H.ら，Biosci. Biotech. Biochem.，1997年，61巻，pp.1211-1212：東京大学名誉教授  光岡知足氏より供与）をＧＡＭ培地（日水製薬株式会社製）５０ｍｌに植菌し、アネロパックケンキ（三菱ガス化学株式会社製）を用いて３７℃にて培養した。培養中、波長６００ｎｍでの吸光度を測定し、吸光度が０．４〜０．８に達した時点で培養を止めた。培養終了後、高速遠心分離機で遠心分離（６０００×ｇ、１０分間）し、菌体を集めた。集めた菌体に１０％(v/v)グリセロール溶液１０ｍｌを加えて懸濁し、高速遠心分離機で遠心分離して、菌体を２〜３回洗浄した。【０１１２】
Ｈ．組換えプラスミドｐＪＷ２４５のビフィズス菌への形質転換によるＧＬ−ＢＰ−ＦｌｉＣ表層提示ビフィズス菌の作成
上記Ｇ．で得た宿主ビフィズス菌液に、１０％(v/v)グリセロール溶液５００μｌを加えて懸濁した。別のチューブに、この懸濁液２００μｌをとり、上記Ｆ．で得た組換えプラスミドｐＪＷ２４５を含む溶液５μｌを加えて混合し、氷上に５分間放置した。次いで、エレクトロポレーション・キュベット０．２ｃｍ（Bio-Rad社製）に混合液を入れ、Gene Pulser Xcellエレクトロポレーションシステム（Bio-Rad社製）を用いて２ｋＶ、２．５μＦ、２００Ωの条件でエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後直ちに、予め３７℃にしておいたＧＡＭ培地０．８ｍｌを加え、アネロパックケンキを用いて３７℃にて３時間培養した。次いで、スペクチノマイシン７０μｇ／ｍｌを含むＧＡＭ寒天培地（日水製薬株式会社製）に塗布し、アネロパックケンキを用いて３７℃にて培養し、形質転換ビフィズス菌を得た。得られた形質転換ビフィズス菌をスペクチノマイシン７０μｇ／ｍｌを含むＧＡＭ培地に植菌し、アネロパックケンキを用いて３７℃で培養した。培養終了後、１．５ｍｌチューブに培養液を分注し、等量の５０％(v/v)グリセロール溶液を加えて懸濁した。得られた懸濁液を−８０℃で保存してフリーズストックを作成し、これを、ＧＬ−ＢＰ−ＦｌｉＣ表層提示ビフィズス菌（形質転換ビフィズス菌という場合がある）のマスターセルとした。【０１１３】
（実施例２：形質転換ビフィズス菌のＧＬ−ＢＰ−ＦｌｉＣ表層提示の確認−１）
上記実施例１で得たフリーズストックした形質転換ビフィズス菌を解凍し、スペクチノマイシン７０μｇ／ｍｌを含むＧＡＭ培地中で培養した。培養した形質転換ビフィズス菌を高速遠心分離機で遠心分離し、菌体を集めた。集めた菌体に緩衝液であるＰＢＳ（株式会社ニッポンジーン製）を加えて懸濁し、高速遠心分離機での遠心分離により菌体洗浄を３回行った。次いで、１％(w/v)ＢＳＡを含むＰＢＳに一次抗体Anti FliC mouse antibody（BioLegend社製）を加え、これをビフィズス菌液に加えて懸濁し、３７℃にて３０分間放置した。３０分間放置した菌液を高速遠心分離機で遠心分離し、菌体を集めた。集めた菌体にＰＢＳを加えて懸濁し、高速遠心分離機での遠心分離による菌体洗浄を２回行った。次いで、１％(w/v)ＢＳＡを含むＰＢＳに二次抗体Alexa FluorTM 488 Rabbit Anti-Mouse IgG antibody（Molecular Probes社製）を加え、これをビフィズス菌液に加えて懸濁し、３７℃にて３０分間放置した。３０分間放置した菌液を、高速遠心分離機で遠心分離して菌体を集めた。集めた菌体にＰＢＳを加えて懸濁し、高速遠心分離機での遠心分離による菌体洗浄を２回行った後、蛍光顕微鏡（KEYENCE社製）で観察した。結果を図２に示す。【０１１４】
図２（ａ）は、上記実施例１で得た形質転換ビフィズス菌（ＧＬ−ＢＰ−ＦｌｉＣ表層提示）の蛍光顕微鏡写真であり、図２（ｂ）は、宿主ビフィズス菌（ＧＬ−ＢＰ−ＦｌｉＣ表層提示なし）の蛍光顕微鏡写真である。この蛍光顕微鏡写真から、形質転換ビフィズス菌の細胞表面にＦｌｉＣが存在することを確認した。【０１１５】
（実施例３：形質転換ビフィズス菌のＧＬ−ＢＰ−ＦｌｉＣ表層提示の確認−２）
上記実施例１で得たフリーズストックした形質転換ビフィズス菌を解凍し、スペクチノマイシン７０μｇ／ｍｌを含むＧＡＭ培地で培養した。培養した形質転換ビフィズス菌を高速遠心機で遠心し、菌体を集めた。集めた菌体にＰＢＳを加えて懸濁し、高速遠心分離機での遠心分離による菌体洗浄を３回行った。菌体に、ＰＢＳ、１ＭのTris-HCl（pH8.0）（株式会社ニッポンジーン製）、およびTriton X-100（和光純薬工業株式会社製）を含む溶液を加え、３０分間氷上に放置した。この溶液に、等量の２×ＳＤＳゲル泳動緩衝液を加え、９５℃で５分間放置して電気泳動用サンプルを得た。次いで、８％(w/v)アクリルアミドゲルを泳動装置（アトー株式会社製）にセットし、得られたサンプルをアプライし、分子量マーカーと共に２０ｍＡの電流にて１．５時間電気泳動を行った。電気泳動後のゲルをニトロセルロースメンブレン（アトー株式会社製）に重ね、ブロッティング装置（Bio-Rad社製）に２０ｍＡの電流をかけてブロッティングを行った。ブロッティング後、ニトロセルロースメンブレンを４％(w/v)スキムミルク（ＢＤ社製）を含む緩衝液であるＴＢＳ（株式会社ニッポンジーン製）に１時間浸漬してブロッキングを行った。ブロッキング後、ニトロセルロースメンブレンをＴＢＳで２回洗浄した。洗浄後、ニトロセルロースメンブレンを、０．５％(w/v)の一次抗体（Anti FliC mouse antibody：BioLegend社製）を添加したＴＢＳに１．５時間浸漬し、ＴＢＳで３回洗浄した。次いで、ニトロセルロースメンブレンを、０．５％(w/v)の二次抗体（goat anti mouse IgG conjugated with alkaline phosphatase：BioLegend社製）を添加したＴＢＳに３時間浸漬した。次いで、ニトロセルロースメンブレンをＴＢＳで３回洗浄し、1-Steptm NBT/BCIP plus Suppressorキット（PIERCE社製）を用いて遮光下で３０分間発色させ、純水ですすいだ後、発色によりＦｌｉＣとＧＬ−ＢＰとの融合タンパク質（ＧＬ−ＢＰ−ＦｌｉＣ）の表層発現を確認した。ウエスタンブロッティングの結果を図３に示す。【０１１６】
図３から明らかなように、サンプルにはＦｌｉＣとＧＬ−ＢＰの分子量の合計に相当する９８ｋＤａに明確なバンドが見られた。陽性コントロールであるＦｌｉＣでは、約５０ｋＤにバンドを観察した。したがって、形質転換ビフィズス菌が、ＧＬ−ＢＰ−ＦｌｉＣを発現していることを確認した。【０１１７】
（実施例４：マウス投与用の形質転換ビフィズス菌の調製）
上記実施例１で得たフリーズストックした形質転換ビフィズス菌を解凍し、スペクチノマイシン７０μｇ／ｍｌを含むＧＡＭ培地に植菌し、アネロパックケンキを用いて3７℃で一晩培養した。培養した菌液を高速遠心分離機で遠心分離し、菌体を集めた。集めた菌体にＰＢＳを加えて懸濁し、高速遠心分離機での遠心分離により菌体洗浄を２回行った。次いで、菌体を２．５×１０７ＣＦＵ／１００μｌになるようＰＢＳに懸濁し、マウス投与用の形質転換ビフィズス菌を得た。【０１１８】
（実施例５：形質転換ビフィズス菌投与によるマウスの抗体産生の確認）
８〜１２週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールス・リバー株式会社）に、上記実施例４で調製したマウス投与用の形質転換ビフィズス菌を、週に３回の頻度で４週間にわたって５０μＬずつ経口投与した（試験群）。比較コントロール（比較コントロール群）として空ベクター（ｐＪＷ２４１ベクター）を導入したビフィズス菌、ならびにネガティブコントロール（ネガティブコントロール群）として５０μｌのＰＢＳを、試験群と同様に投与した。各群のマウスはそれぞれ７匹、６匹、および５匹であった。【０１１９】
投与開始後０日目、１４日目、および２８日目に、各群のマウスの尾静脈から採血した。採取した血液を、４℃にて３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して血清を得て、−８０℃で保存した。また、投与開始後０、４、７、１１、１４、１８、２１、２５、および２８日目に糞を採集し、凍結乾燥した。５％(w/v)スキムミルク（ＢＤ社製）、０．１ｍｇ／ｍｌの大豆トリプシンインヒビター（ロシュ・アプライドサイエンス社製）、および２ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（Sigma社製）をＰＢＳに加えて、糞用溶解液を調製した。乾燥便１ｍｇに対して、糞用溶解液２０μｌを加えた。ボルテックスにかけて糞を溶解させた後、４℃にて１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上清を得、−８０℃で保存した。【０１２０】
得られた血清ならびに糞溶解物について、以下のようにしてＥＬＩＳＡを行った。まず、３枚のNunc Immunoplate Maxisorb F96 プレート（Nalge Nunc社製）に１．０μｇ／ｍｌのフラジェリン（InvivoGen社製）を５０μｌ／ウェル加え、４℃にて一晩放置した。プレートをＰＢＳで洗浄後、１％(w/v)ＢＳＡ（和光純薬工業株式会社製）を含むＰＢＳを２００μｌ／ウェル加えて、室温で２時間放置した。ＴＢＳで洗浄後、ＰＢＳで希釈系列を作成したマウスの血清を５０μｌ／ウェル加え、室温でさらに３時間放置した。ＴＢＳで洗浄後、３枚のプレートにそれぞれ、Anti IgG Mouse Goat Poly-HRP 1/1000希釈液（R&Dシステムズ社製）、Anti IgA Mouse Goat Poly-HRP 1/2000希釈液（Santa Cruz Biotechnology社製）、およびAnti IgM Mouse Goat Poly-HRP 1/2000希釈液（Santa Cruz Biotechnology社製）を５０μｌ／ウェル加えて、室温にて３時間反応させた。ＴＢＳで洗浄後、基質試薬 OptEIATM（ＢＤ社製）を１００μｌ／ウェル加えて、遮光下で室温にて２０分間反応させた。１００μｌ／ウェルの１Ｎ硫酸（和光純薬工業株式会社製）を加えて反応を停止し、吸光度計Ultrospec Visible Plate Reader II 96（Amersham Biosciences社製）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。【０１２１】
糞溶解物中の抗フラジェリンＩｇＡレベルの経時変化を図４に示す。４５０ｎｍの吸光度が高いほど、ＩｇＡレベルが高いことを表す。図４のグラフにおいて、各値は各群のマウスの平均値を示し、そしてバーは標準偏差を示す。形質転換ビフィズス菌投与群のみが、投与開始後１１日目〜１４日目に、糞中の抗フラジェリンＩｇＡ抗体量が著しく上昇した。【０１２２】
血清中の種々の抗フラジェリン抗体レベルの経時変化を図５に示す。図５（ａ）は抗フラジェリンＩｇＡレベル、図５（ｂ）は抗フラジェリンＩｇＧレベル、そして図５（ｃ）は抗フラジェリンＩｇＭレベルの経時変化を示す。ＩｇＡは、糞溶解物の場合と同様に、投与開始後１４日目に高くなっていた。また、ＩｇＧおよびＩｇＭはいずれも、投与開始後１４日目には免疫グロブリンレベルが上昇しており、そして２８日目においても高いレベルで持続していた。このように、フラジェリン表層提示ビフィズス菌を経口投与することにより、血清中で抗フラジェリン抗体を確認した。【０１２３】
（実施例６：形質転換ビフィズス菌に対する脾臓細胞の免疫応答性の確認）
８〜１２週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスを開腹し、１８Ｇ針付きシリンジで脾臓を穿刺して脾臓細胞を取り出し、シャーレに移した。セルストレーナーを用いて脾臓細胞を単一細胞に分離し、滅菌したＰＢＳで２回洗浄した。脾臓細胞を０．１Ｍ塩化アンモニウム溶液に懸濁し、この細胞懸濁液を暗所下２５℃にて１５分間インキュベートした。次いで、遠心分離し、脾臓細胞を集めた。集めた脾臓細胞に、１０％のウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μＭの２−メルカプトエタノールおよび２ｍＭのＬ−グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製）を加えて懸濁し、細胞数を数えた。【０１２４】
脾臓細胞を３×１０６個／ウェルになるよう９６ウェルプレート（Pierce Biotechnology社製）の各ウェルに入れ、上記実施例４で調製したマウス投与用の形質転換ビフィズス菌を５０μｇ／ウェルになるよう加えて、脾臓細胞を２５℃にて４８時間培養した。比較コントロールとして、脾臓細胞を３×１０６個／ウェルになるよう９６ウェルプレートの各ウェルに入れ、形質転換ビフィズス菌を加えないで、脾臓細胞を２５℃にて４８時間培養した。次いで、培養液を５０００ｇで１０分間遠心分離して上清を得、−８０℃で保存した。【０１２５】
上清中のサイトカイン濃度を、市販のＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２用ＥＬＩＳＡキット（Pierce Biotechnology社製）を用いて測定した。この結果、形質転換ビフィズス菌存在下で脾臓細胞を培養したすべてのウェルの上清で高いレベルのＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２が検出された。このように、フラジェリン表層提示ビフィズス菌をマウスに経口投与することにより、マウスの脾臓細胞におけるＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２の産生を誘導することを確認した。【０１２６】
（実施例７：形質転換ビフィズス菌によるマウスの感染試験−１）
８〜１２週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスに、上記実施例４で調製したマウス投与用の形質転換ビフィズス菌を、一日おきに２週間にわたって２．５×１０７ｃｆｕ／１００μｌずつ経口投与した（試験群）。比較コントロール（比較コントロール群）として空ベクター（ｐＪＷ２４１ベクター）を導入したビフィズス菌、ならびにネガティブコントロール（ネガティブコントロール群）として１００μｌのＰＢＳを、試験群と同様に投与した。各群のマウスはそれぞれ１４匹であった。【０１２７】
投与開始後１４日目に、致死量の１．０×１０７ｃｆｕのサルモネラ属ネズミチフス菌（サルモネラ・エンテリカ・サブスピーシス・エンテリカ・セロバー・ティフィムリウム（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium）ATCC14028（住商ファーマより購入））（以下、ネズミチフス菌という）を経口投与し、その後４０日間毎日観察した。各群のマウスの生存率の経時変化を図６に示す。この結果、比較コントロール群で１４匹中９匹が、ネガティブコントロール群で１４匹中１２匹が死亡した（それぞれの平均生存日数は１４日間および２５日間）が、試験群では１４匹中２匹が死亡したのみでほとんどの個体が生存した。【０１２８】
各群の生存したマウス個体について、脾臓細胞が産生するサイトカイン濃度を、市販のＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２用ＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。この結果、試験群の個体から分離した脾臓細胞は、他の群に比べて有意に高いレベルのＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２を産生することが示された。このように、フラジェリン表層提示ビフィズス菌をマウスに経口投与することにより、ネズミチフス菌の経口投与によるマウスに対する致死作用を効果的に抑制することができた。【０１２９】
（実施例８：形質転換ビフィズス菌によるマウスの感染試験−２）
上記実施例７でネズミチフス菌を経口投与してから１１日後、各群の生存したマウス個体から脾臓を取り出し、脾臓内のネズミチフス菌をリアルタイムＰＣＲ分析により検出した。まず、脾臓からDNeasy Blood & Tissueキット（QIAGEN社製）を用いてＤＮＡを分離精製し、サンプルＤＮＡ溶液を調製した。１０６〜１０１０ｃｆｕのネズミチフス菌から同様にしてゲノムＤＮＡを分離精製し、段階的に希釈して検量線作成用ＤＮＡ溶液とした。次いで、ＰＣＲ反応チューブに、プライマーST11：5'-gccaaccattgctaaattggcgca-3'（配列番号１７）およびST15：5'-ggtagaaattcccagcgggtactgg-3'（配列番号１８）（Soumet Cら，Lett. Appl. Microbiol.，1999年，28巻，pp.113-117）を各０．３μｍｏｌ／ｌ含むSYBR Green Master mix（Applied Biosystems社製）を１２．５μｌ、およびサンプルＤＮＡ溶液または検量線作成用ＤＮＡ溶液を１μｌ入れ、混合した。ＰＣＲ反応はSYBR Green Master mixに添付のプロトコールに従った（５０℃にて２分間保持の後、９５℃にて１０分間保持し、次いで９５℃にて１５秒間保持および６０℃にて１分間保持からなるサイクルを５０回繰り返した）。ＰＣＲ反応は各サンプルＤＮＡ溶液について３回ずつ行った。【０１３０】
この結果、試験群のマウスの脾臓からはネズミチフス菌のＤＮＡは検出されなかった。これに対して、比較コントロール群およびネガティブコントロール群のマウスの脾臓からは、脾臓のＤＮＡ１ｍｇ当たりネズミチフス菌のＤＮＡがそれぞれ２．３４±０．３６×１０１０および２．２３±０．２０×１０１０コピー検出された。このように、フラジェリン表層提示ビフィズス菌をマウスに経口投与することにより、ネズミチフス菌の経口投与によるマウスへの感染を効果的に抑制することができた。【０１３１】
（実施例９〜１４：ＧＬ−ＢＰ−ＦｌｉＣ表層提示ビフィズス菌の作成とＧＬ−ＢＰ−ＦｌｉＣ表層提示の確認）
実施例１において、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）105-Aに代えて、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（B. adolescentis）ATCC15703（実施例９）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（B. animalis）ATCC25527（実施例１０）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（B. bifidum）ATCC11863（実施例１１）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（B. breve）ATCC15700（実施例１２）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（B. infantis）ATCC25962（実施例１３）、またはビフィドバクテリウム・シュードカテヌラタム（B. pseudocatenulatum）ATCC27919（実施例１４）を用いたこと以外は実施例１と同様に操作を行って、組換えプラスミドｐＪＷ２４５による形質転換ビフィズス菌を得、次いで実施例２と同様に操作を行って、これらの形質転換ビフィズス菌の細胞表面にＧＬ−ＢＰ−ＦｌｉＣが存在することを確認した。
【産業上の利用可能性】
【０１３２】
本発明によれば、ビフィズス菌の細胞表層に目的のタンパク質またはペプチドを発現・提示することができる。例えば、ビフィズス菌の表層に、微生物、ウイルス、原虫、ガンなどの抗原タンパク質を提示させることにより、小腸粘膜や鼻粘膜にキャリアとして抗原タンパク質を運び、粘膜において提示された抗原に対する抗体反応を誘起する、経口および経鼻ワクチンとして利用できる。【０１３３】
経口ワクチンの場合、小児や高齢者でも摂取しやすく、また通常の注射によるワクチン接種に伴う痛みもない。特に、本発明の経口ワクチンは、食経験のあるビフィズス菌を使用するため、安全性が高い。また、免疫が、実際の感染経路と同じ経路である腸管を介して誘導され、しかも体液性免疫と細胞性免疫との両方の免疫が働く。【０１３４】
さらに、ビフィズス菌表面に酵素を提示させることにより、微生物生産物の増強、新規生産物の産生、微生物変換などが可能となり、酵素の提示による臨床や研究で使用するバイオマーカーや相互作用解析、スクリーニングなどにも応用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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