(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞へのヒト多能性幹細胞の導かれた分化を促進するための方法であって：
（ａ）分化細胞を生成するためにニコチンアミド（ＮＡ）が補充された基礎培地中でヒト多能性幹細胞を培養すること；および続いて
（ｂ）前記分化細胞を、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）スーパーファミリーの１つまたは複数のメンバーが補充された基礎培地中で培養し、それにより、前記ヒト多能性幹細胞がＲＰＥ細胞に分化するために誘導されること
を含む方法。
【請求項２】
前記ＮＡが補充された基礎培地中での培養は、少なくとも２日間実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＴＧＦβスーパーファミリーの１つまたは複数のメンバーが補充された培地は、ＮＡをさらに含む、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３またはアクチビンＡである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞へのヒト多能性幹細胞の導かれた分化を促進するための方法であって：
（ａ）分化細胞を生成するためにニコチンアミド（ＮＡ）が補充された基礎培地中でヒト多能性幹細胞を培養すること；および続いて
（ｂ）前記分化細胞を、アクチビンＡが補充された基礎培地中で培養し、それにより、前記ヒト多能性幹細胞がＲＰＥ細胞に分化するために誘導されること
を含む方法。
【請求項６】
前記ＮＡが補充された基礎培地中での培養は、２週間実施される、請求項１または５に記載の方法。
【請求項７】
前記ニコチンアミドの濃度は約１０ｍＭである、請求項１または５に記載の方法。
【請求項８】
前記アクチビンＡの濃度は２０〜１８０ｎｇ／ｍｌである、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記アクチビンＡが補充された基礎培地はさらに、ニコチンアミドを補充される、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
（ｂ）の工程後に前記分化細胞から色素沈着細胞を単離することをさらに含む、請求項１または５に記載の方法。
【請求項１１】
前記単離された色素沈着細胞を拡大することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヒト多能性幹細胞はヒト胚性幹細胞である、請求項１または５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、分化した網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を生成するための方法およびシステム、およびそれらによって得られたＲＰＥ細胞の治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来技術の一覧
以下は、本発明の分野における最新技術を記載するために適切であると考えられる参考文献の一覧である。
（１）  Ｓｔｒａｕｓｓ  Ｏ．，Ｔｈｅ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｐｉｇｍｅｎｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｉｎ  ｖｉｓｕａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ；Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．８５：８４５−８８１，２００５．
（２）  Ｌｕｎｄ  ＲＤ．ら、Ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ；Ｐｒｏｇ  Ｒｅｔｉｎ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ  ２０：４１５−４４９，２００１．
（３）  Ｈａｒｕｔａ  Ｍ．，Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｓｏｕｒｃｅ  ｆｏｒ  ｏｃｕｌａｒ  ｒｅｐａｉｒ；Ｓｅｍｉｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２０（１）：１７−２３，２００５．
（４）  Ｈａｒｕｔａ  Ｍ．ら、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｉｇｍｅｎｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ；Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ４５：１０２０−１０２４，２００４．
（５）  Ａｏｋｉ  Ｈ．ら、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈａｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  ｉｎｔｏ  ＲＰＥ  ｃｅｌｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｄｅｖｅｌｏｐ  ｉｎｔｏ  ＲＰＥ  ｃｅｌｌ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ；Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．８２（２）：２６５−２７４，２００６．
（６）  Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  Ｉ．ら、Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｐｉｇｍｅｎｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ；Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ６（３）：２１７−２４５，２００４．
（７）  Ｌｕｎｄ  ＲＤ．ら、Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｓｃｕｅ  ｖｉｓｕａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ  ＲＣＳ  ｒａｔｓ；Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ８（３）：１８９−１９９，２００６．
（８）  ＰＣＴ出願公開ＷＯ０６／０７０３７０
【０００３】
発明の背景
網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の機能異常、傷害および喪失は、いくつかの眼疾患および眼障害（例えば、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、ベスト病（卵黄様黄斑ジストロフィーの早期発症形態）を含む遺伝性黄斑変性、および、様々なサブタイプの色素性網膜炎（ＲＰ）など）の顕著な特徴である。そのような疾患のための可能性のある処置の１つが、ＲＰＥ（および光受容体）を、そのような疾患に冒された人の網膜に移植することである。ＲＰＥ細胞がその移植によって補充されることにより、変性を遅らせ、停止させ、または、逆戻りさせることができ、また、網膜機能を改善することができ、また、そのような状態に起因する失明を防止することができると考えられる。
【０００４】
黄斑、すなわち、網膜の中央部は、細かい視覚細部および色知覚に関わっており、我々の毎日の視覚作業の多く（例えば、顔認識および読書）のために非常に重要である。黄斑は多くの場合、広範囲に及ぶ様々な網膜変性（例えば、色素性網膜炎（ＲＰ））において、同様にまた、黄斑領域がより特異的に攻撃目標となる種々の疾患（例えば、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）およびベスト病）において疾患プロセスの一部として冒される。これらの疾患の多くでは、最初の機能異常および機能不全が、光受容体の下に位置する網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞において生じる。
【０００５】
高度に特殊化したＲＰＥ細胞は、光受容体の機能を支えることにおいて大きな役割を果たす：ＲＰＥ細胞は栄養を脈絡膜血管から積極的に輸送し、光受容体における発色団のために必要であるビタミンＡの再利用に関与し、また、脱落した光受容体外側セグメントをこれらの細胞の正常な更新プロセスの一部として取り込み、再利用する１。
【０００６】
ＲＰの様々なサブタイプ、ベスト病およびＡＭＤでは、ＲＰＥの機能不全が最終的には視覚喪失および失明につながる。これらの細胞を置き換えることが、考えられる治療的介入の１つであり２、しかし、そのような細胞をヒトのドナーまたは胚から得ることは困難である。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、機能的なＲＰＥ細胞へのその分化を導くための手段が解明され得るならば、ＲＰＥ細胞のための可能性のある無限のドナー源として役立つかもしれない３。神経前駆体細胞（ＮＰ）について非常に富化された培養物へのｈＥＳＣの分化を導くための様々な方法が以前に記載されている（Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  ＢＥ．他、Ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ；Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９：１１３４〜１１４０、２００１；Ｉｔｓｙｋｓｏｎ  Ｐ．他、Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｎｏｇｇｉｎ；Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３０（１）：２４〜３６、２００５）。加えて、網膜細胞を、インビトロ、および、齧歯類における網膜下腔への移植の後でのインビボの両方で生じさせることができるｈＥＳＣの潜在的能力が示されている（Ｂａｎｉｎ  Ｅ．他、Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ；Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２４（２）：２４６〜２５７、２００６）。
【０００７】
マウスおよび非ヒト霊長類のＥＳＣがＲＰＥ細胞に分化し、かつ、移植後に生存し、網膜の変性を弱めることができる潜在的能力が明らかにされている４、５。しかしながら、ＲＰＥ細胞へのｈＥＳＣの自発的分化が示されたが、その分化プロセスの効率は低く、相当の分化時間が要求され、ほんの低い（１％未満の）割合のＲＰＥ細胞含有クラスターが４週間〜８週間の分化の後で得られただけであった。さらに、改善された網膜機能がこれらのＲＰＥ細胞の網膜下移植の後でＲＣＳラットにおいて観測された一方で、正真正銘の成熟ＲＰＥ細胞としての移植された細胞の機能は明らかにされず、この作用は可能性として、ＲＰＥ非特異的な栄養作用に関連づけられ得る６、７、９、１０。
【０００８】
近年では、ｈＥＳＣを、ＲＰＥ細胞に再現性良く分化するように導くことができることもまた示された（この場合、ＲＰＥの究極的運命に向かうｈＥＳＣの自発的分化ではなく、むしろ、導かれた分化がニコチンアミド（ＮＡ）の存在下で生じた）８。
【発明の概要】
【０００９】
第１の態様によれば、本発明は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞へのヒト幹細胞（ｈＳＣ）の導かれ、かつ、増強された分化を促進するための培養システムを調製するための、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦβ）スーパーファミリーのメンバーの使用を提供する。
【００１０】
第２の態様によれば、本発明は、ＲＰＥの究極的運命へのｈＳＣの導かれた分化を促進するための方法が提供され、この方法は：
（ａ）ｈＳＣを含む細胞培養物を提供すること；および
（ｂ）前記細胞培養物における細胞を、ＴＧＦβスーパーファミリーの１つまたは複数のメンバーが補充された基礎培地を含む培養システムにおいて培養し、それにより、前記ｈＳＣがＲＰＥの究極的運命への導かれた分化に向かって促進されること
を含む。
【００１１】
第３の態様によれば、ＴＧＦβスーパーファミリーの１つまたは複数のメンバーの存在下でのｈＳＣの導かれた分化によって得られるＲＰＥ細胞を含む細胞培養物が提供される。好ましくは、そのようなＲＰＥ細胞は、本明細書に開示される方法によって得られる最終分化した（成熟している）ＲＰＥ細胞である。本明細書で使用されるように、そのようなＲＰＥ細胞は、ｈＳＣがＲＰＥ細胞に自発的に分化するときに得られる形質とは異なるいくつかの特徴的な形質を示す。好ましくは、そのようなＲＰＥ細胞は、その分化の期間中においてＴＧＦβのシグナル伝達に対して応答することができる。
【００１２】
第４の態様によれば、ｈＳＣ由来のＲＰＥ細胞を対象の眼に移植する方法が提供され、前記ＲＰＥ細胞は前記ｈＳＣの導かれた分化によって得られ、この方法は、
（ａ）ｈＳＣを含む細胞培養物を提供すること；
（ｂ）前記細胞培養物を、ＴＧＦβスーパーファミリーの１つまたは複数のメンバーが補充された基礎培地を含む培養システムにおいて培養し、それにより、前記ｈＳＣが、ＲＰＥ細胞に分化するために誘導されること；
（ｃ）前記細胞培養物からＲＰＥ細胞を集めること；および
（ｄ）前記ＲＰＥ細胞を前記対象の眼に移植すること
を含む。
【００１３】
第５の態様によれば、前記ｈＳＣの導かれた分化によって得られる移植可能なｈＳＣ由来ＲＰＥ細胞を含む細胞培養システムが提供される。移植されたＲＰＥ細胞は、前記移植された細胞が前記対象の眼の中で機能的であることを示す１つまたは複数のパラメーターを示した。移植されたＲＰＥ細胞の機能性は、移植されたＲＰＥ細胞が、網膜機能を改善することと並行して、光受容体の脱落した外側セグメントを取り込むことができることによって示される。
【００１４】
本明細書に開示される方法の培養システムにおけるｈＳＣは、分化し続けるｈＳＣであり、すなわち、本質的には未分化状態にあるｈＳＣの集団であるか、または、前記細胞の少なくとも一部が、導かれた分化の初期段階を受けるために誘導されており、また、時には、前記細胞の大部分が、導かれた分化の初期段階を受けるために誘導されているｈＳＣの集団である。１つの実施形態によれば、分化の初期段階が、細胞をＮＡに事前にさらすことによって達成され、だが、分化の初期段階は、未分化細胞が、ＮＡと、ＴＧＦβスーパーファミリーの１つまたは複数のメンバーとに同時にさらされるときにもまた生じる。理論にとらわれることはないが、ＮＡに事前にさらすこと（これは、ＴＧＦβスーパーファミリーの１つまたは複数のメンバーとのインキュベーションに先立つ）により、細胞が、下記でさらに議論されるように、特定のＲＰＥ形態学を有するＲＰＥ細胞への（自発的分化とは対照的に）導かれた分化に向かうように刺激されることが推測される。
【００１５】
１つの好ましい実施形態によれば、ｈＳＣはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）である。
【００１６】
１つの実施形態によれば、ＴＧＦβスーパーファミリーの１つまたは複数のメンバーを含む培地で細胞を培養することは、ｈＳＣが分化（導かれた分化、好ましくは、ＮＡによって導かれる分化）を開始した後少なくとも２日である。
【００１７】
第６の態様によれば、対象において、網膜色素上皮の機能異常、傷害および／または喪失を含む網膜疾患または網膜障害を処置または防止する方法が提供され、この方法は、前記対象に、ｈＳＣを導かれた分化に向かって誘導することによって得られるｈＳＣ由来ＲＰＥ細胞を眼内移植することを含む。移植可能なＲＰＥ細胞は、好ましくは、本明細書に開示される方法によって得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
本発明を理解するために、そして本発明がどのように実際に実施されうるかを示すために、好ましい実施形態を単に非限定的に例示し、添付の図面を参照して説明する。
【図１Ａ−Ｃ】ＮＡの存在下でのＲＰＥマーカーの発現を分析するリアルタイムＰＣＲ。ｈＥＳＣの分化を、ｈＥＳＣを浮遊性クラスターとして培養することによって誘導した。６週間の分化において、ＲＰＥマーカーのＭｉＴＦ−Ａ（図１Ａ）およびＲＰＥ６５（図１Ｂ）の発現レベルがＮＡの存在下では著しく高まった。その後の時点でのリアルタイムＰＣＲ分析では、ＮＡの存在下における時間に沿ったＭｉＴＦ−Ａ（図１Ｃ）およびＲＰＥ６５（図１Ｄ）の発現レベルにおける進行性の増大が明らかにされた。ベストロフィン、ＣＲＡＬＢＰおよびＭｅｒｔｋを含むＲＰＥマーカーのさらなる転写物の発現が、置床された色素沈着クラスターのＲＴ−ＰＣＲ分析によって明らかにされた（図１Ｅ）。＋／−は逆転写酵素の存在または非存在をそれぞれ示す。
【図１Ｄ−Ｅ】ＮＡの存在下でのＲＰＥマーカーの発現を分析するリアルタイムＰＣＲ。ｈＥＳＣの分化を、ｈＥＳＣを浮遊性クラスターとして培養することによって誘導した。６週間の分化において、ＲＰＥマーカーのＭｉＴＦ−Ａ（図１Ａ）およびＲＰＥ６５（図１Ｂ）の発現レベルがＮＡの存在下では著しく高まった。その後の時点でのリアルタイムＰＣＲ分析では、ＮＡの存在下における時間に沿ったＭｉＴＦ−Ａ（図１Ｃ）およびＲＰＥ６５（図１Ｄ）の発現レベルにおける進行性の増大が明らかにされた。ベストロフィン、ＣＲＡＬＢＰおよびＭｅｒｔｋを含むＲＰＥマーカーのさらなる転写物の発現が、置床された色素沈着クラスターのＲＴ−ＰＣＲ分析によって明らかにされた（図１Ｅ）。＋／−は逆転写酵素の存在または非存在をそれぞれ示す。
【図２Ａ−Ｄ】ＮＡのＲＰＥ分化誘導作用は特定の培地組成に依存しない。ＫＯ培地（図２Ａ）において、または、Ｂ２７が補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２により１週間後に置き換えられる、Ｎ２が補充されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（ＮＮ培地）（図２Ｃ）において１２週間分化するｈＥＳＣクラスターの暗視野顕微鏡写真。両方の培地において、ＮＡは、色素沈着細胞に向かう分化を増強したが（図２Ｂ、図２Ｄ）、分化したｈＥＳＣクラスターのサイズおよびその総数は、ＮＮ培地に関してはより小さかった（白矢印により、分化し続けるクラスターの内部における色素沈着領域が示される）。ＲＮＡレベルでは、両方の培地において、ＮＡ補充がＭｉＴＦ−ＡおよびＲＰＥ６５の発現レベルを高めた（それぞれ、図２Ｅおよび図２Ｆ）。
【図２Ｅ−Ｆ】ＮＡのＲＰＥ分化誘導作用は特定の培地組成に依存しない。ＫＯ培地（図２Ａ）において、または、Ｂ２７が補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２により１週間後に置き換えられる、Ｎ２が補充されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（ＮＮ培地）（図２Ｃ）において１２週間分化するｈＥＳＣクラスターの暗視野顕微鏡写真。両方の培地において、ＮＡは、色素沈着細胞に向かう分化を増強したが（図２Ｂ、図２Ｄ）、分化したｈＥＳＣクラスターのサイズおよびその総数は、ＮＮ培地に関してはより小さかった（白矢印により、分化し続けるクラスターの内部における色素沈着領域が示される）。ＲＮＡレベルでは、両方の培地において、ＮＡ補充がＭｉＴＦ−ＡおよびＲＰＥ６５の発現レベルを高めた（それぞれ、図２Ｅおよび図２Ｆ）。
【図３Ａ−Ｆ】ｈＥＳＣの浮遊性クラスターの内部におけるメラニン発現細胞は、推定されるＲＰＥ細胞である。色素沈着細胞について非常に富化された明確な領域を伴う分化し続けるｈＥＳＣの浮遊性クラスターの暗視野顕微鏡写真（図３Ａ）。抗Ｏｔｘ２および抗ＭｉＴＦとの免疫反応性を有する、解離および置床の後での色素沈着細胞の蛍光像（図３Ｂ）および位相差像（図３Ｃ）。限定された色素沈着領域を例示する、置床後の分化し続けるクラスターの暗視野顕微鏡写真が示される（図３Ｄ）。ＲＰＥ細胞に典型的である形態学的特徴を有する色素沈着領域内の細胞の位相差像（図３Ｅ）。これらの細胞がＲＰＥ細胞のマーカーを発現することを示す間接的免疫蛍光染色：ＭｉＴＦ（図３Ｆ）、ＺＯ−１（図３Ｇ）、ベストロフィン（図３Ｈ）、ＲＰＥ６５（図３Ｉ）およびＣＲＡＬＢＰ（図３Ｊ）。解離、低密度での置床および培養の後、色素沈着細胞は色素沈着を失い、類線維様の形態学を獲得する（位相差像）（図３Ｋ）。さらに長期間の培養、および、高密度クラスターへの増殖の後、細胞はＲＰＥ細胞に特徴的な形態学および色素沈着を再獲得する（図３Ｌ）。
【図３Ｇ−Ｌ】ｈＥＳＣの浮遊性クラスターの内部におけるメラニン発現細胞は、推定されるＲＰＥ細胞である。色素沈着細胞について非常に富化された明確な領域を伴う分化し続けるｈＥＳＣの浮遊性クラスターの暗視野顕微鏡写真（図３Ａ）。抗Ｏｔｘ２および抗ＭｉＴＦとの免疫反応性を有する、解離および置床の後での色素沈着細胞の蛍光像（図３Ｂ）および位相差像（図３Ｃ）。限定された色素沈着領域を例示する、置床後の分化し続けるクラスターの暗視野顕微鏡写真が示される（図３Ｄ）。ＲＰＥ細胞に典型的である形態学的特徴を有する色素沈着領域内の細胞の位相差像（図３Ｅ）。これらの細胞がＲＰＥ細胞のマーカーを発現することを示す間接的免疫蛍光染色：ＭｉＴＦ（図３Ｆ）、ＺＯ−１（図３Ｇ）、ベストロフィン（図３Ｈ）、ＲＰＥ６５（図３Ｉ）およびＣＲＡＬＢＰ（図３Ｊ）。解離、低密度での置床および培養の後、色素沈着細胞は色素沈着を失い、類線維様の形態学を獲得する（位相差像）（図３Ｋ）。さらに長期間の培養、および、高密度クラスターへの増殖の後、細胞はＲＰＥ細胞に特徴的な形態学および色素沈着を再獲得する（図３Ｌ）。
【図４Ａ−Ｂ】アクチビンＡはＲＰＥ分化を誘導する。ヒトＥＳＣを、最初の１週間の分化の後で補充されたアクチビンＡの非存在下または存在下で６週間、浮遊性クラスターとして分化させた。クラスターの暗視野顕微鏡写真は、アクチビンＡが、色素沈着細胞を含むクラスターの割合を著しく増大させたことを示す（図４Ａ、図４Ｂ）（白矢印により、分化し続けるクラスターの内部における色素沈着領域が示され、また、クラスターのいくつかの内部における色素沈着領域の境界が点線によって示される）。アクチビンＡの存在下では、色素沈着領域の境界がクラスター内の周りの色素非沈着領域からよりはっきり区別される。さらに、色素沈着細胞がアクチンビンＡの存在下ではより濃い（図４Ｂ）。
【図４Ｃ−Ｅ】アクチビンＡはＲＰＥ分化を誘導する。ＲＮＡレベルにおいて、リアルタイムＰＣＲ分析により、ＲＰＥ６５の発現（図４Ｄ）およびベストロフィンの発現（図４Ｅ）がアクチンビンＡの存在下で著しく高まることが示される。ＭｉＴＦ−Ａの発現はアクチビンＡ処理によって変化しなかった（図４Ｃ）。
【図５Ａ−Ｄ】ＢＭＰおよびＴＧＦβ３はＲＰＥ分化において役割を有する。ヒトＥＳＣを、６週間、浮遊性クラスターとして分化させるために誘導した。色素沈着細胞への自発的分化が希に認められたが（図５Ａ）、培地がＮＡにより補充されたときには著しく高まった（図５Ｂ、最も左側および左側の暗視野像；白矢印により、分化し続けるクラスターの内部における色素沈着領域が示される）。ｎｏｇｇｉｎによる培地の補充は、色素沈着細胞への分化をＮＡの非存在下（図５Ｄ）および存在下（図５Ｃ）の両方で阻止した。
【図５Ｅ−Ｇ】ＢＭＰおよびＴＧＦβ３はＲＰＥ分化において役割を有する。ＲＮＡレベルにおいて、リアルタイムＰＣＲ分析により、ｎｏｇｇｉｎがＭｉＴＦ−Ａの発現レベルをＮＡの存在下および非存在下の両方で低下させたことが示された（図５Ｅ）。ＴＧＦβ３がＮＡの存在下でのｈＥＳＣクラスターの分化の期間中に培養培地に加えられたとき、ＴＧＦβ３はＭｉＴＦ−Ａの発現レベルを著しく増強したが（図５Ｆ）、ＲＰＥ６５の発現レベルを増強しなかった（図５Ｇ）。
【図６Ａ−Ｇ】ラットの眼における移植されたｈＥＳＣ由来ＲＰＥ細胞の生存および一体化。ｈＥＳＣ由来ＲＰＥ細胞を眼内移植した後、色素沈着細胞をシロネズミの眼においてインビボで容易に特定することができた（図６Ａ、図６Ｂ）。眼球摘出（図６Ｂ）、ならびに、角膜および水晶体の除去の後、中心となる移植片、同様にまた、さらなる分散した色素沈着斑を認めることができた（図６Ｃ）。組織学的切片において、ＧＦＰもまた共発現する濃い色素沈着細胞を含んだ移植片を特定することができた（図６Ｄ〜図６Ｇ）。このことは、これらの細胞がｈＥＳＣ由来であったという事実を証明する。
【図６Ｈ−Ｊ】ラットの眼における移植されたｈＥＳＣ由来ＲＰＥ細胞の生存および一体化。移植された細胞を硝子体内領域において見出すことができ、また、網膜と水晶体との間において見出すことができ（図６Ｈ）、また、（時には、注入路に沿って硝子体の中に突き出るが）網膜において見出すことができ（図６Ｉ）、また、網膜下腔においても見出すことができた（図６Ｉ、図６Ｏ、図６Ｐ）。移植されたｈＥＳＣ由来ＲＰＥ細胞（矢印により示される色素沈着細胞）がシロネズミのＲＰＥ層の中に一体化した（図６Ｊ）。色素沈着細胞がコントロールの移植されていない眼のＲＰＥ層では認められなかった。
【図６Ｋ−Ｐ】ラットの眼における移植されたｈＥＳＣ由来ＲＰＥ細胞の生存および一体化。移植された細胞を硝子体内領域において見出すことができ、また、網膜と水晶体との間において見出すことができ（図６Ｈ）、また、（時には、注入路に沿って硝子体の中に突き出るが）網膜において見出すことができ（図６Ｉ）、また、網膜下腔においても見出すことができた（図６Ｉ、図６Ｏ、図６Ｐ）。移植されたｈＥＳＣ由来ＲＰＥ細胞（矢印により示される色素沈着細胞）がシロネズミのＲＰＥ層の中に一体化した（図６Ｊ）。色素沈着細胞がコントロールの移植されていない眼のＲＰＥ層では認められなかった。移植片の内部において、ＺＯ−１による免疫染色（図６Ｋ〜図６Ｎ）により、接着結合が、移植されたＧＦＰ＋ｈＥＳＣ由来細胞の間に存在したことが示された。そのような結合はＲＰＥ細胞に特徴的である。ＲＰＥ機能異常および網膜変性を有するＲＣＳラットの網膜下腔への移植の後、光受容体層が比較的保存されることを、（矢印によって示される）移植片から離れた領域と比較されたとき、移植片の近くで認めることができた（図６Ｏ；四角内の領域が星印によって示され、図６Ｐに拡大される）。多角形形状および丸石様外観を有する大きい移植されたｈＥＳＣ由来ＥＰＲ細胞に留意すること（図６Ｐ）（星印）。ここに示されるすべての場合において、ＲＰＥ細胞は、アクチンＡの存在を伴わないｈＥＳＣに由来した。
【図７】網膜電図記録法による記録は、ｈＥＳＣ由来ＲＰＥ細胞の移植により、網膜機能の救済がジストロフィー性ＲＣＳラットの眼においてもたらされることを示す。全範囲ＥＲＧ応答が、移植されていないコントロールの他眼と比較して、ｈＥＳＣに由来するＲＰＥ細胞を移植した後のＲＣＳラットの眼ではより大きい（ｎ＝１１匹のラット）。これらの実験で使用されたＲＰＥ細胞は、培養培地へのアクチビンＡの添加を行うことなく誘導された。強度が増大する４つの刺激に対する暗順応した混合型の錐体−杆体応答のｂ波振幅が示される。
【図８Ａ−Ｆ】ｈＥＳＣからの色素沈着細胞の発達を誘導することにおけるＮＡの影響を示す、形態学およびマーカー発現の分析。色素沈着細胞の進行性出現を、ＮＡの存在下（図８Ａ、図８Ｃおよび図８Ｅ）または非存在下（図８Ｂ、図８Ｄまたは図８Ｆ）での４週間（図８Ａ、図８Ｂ）、６週間（図８Ｃ、図８Ｄ）および８週間（図８Ｅ、図８Ｆ）にわたるｈＥＳＣ由来クラスターの培養の期間中において示す暗視野顕微鏡写真（白矢印により、分化し続けるクラスターの内部における色素沈着領域が示される）。
【図８Ｇ−Ｉ】ｈＥＳＣからの色素沈着細胞の発達を誘導することにおけるＮＡの影響を示す、形態学およびマーカー発現の分析。ＮＡが補充された培地における培養（太線の棒）の期間中およびコントロール培養物（細線の棒）における種々の時点での、色素沈着領域を含有するクラスターの割合のヒストグラム表示（図８Ｇ）。ＮＡ補充による８週間の培養の期間中における、色素沈着領域の割合のヒストグラム表示（図８Ｈ）、および、抗ＭｉＴＦ（初期のＲＰＥマーカー）との免疫反応性を有する細胞の割合のヒストグラム表示（図８Ｉ）。スケールバー：（Ａ）２００μｍ；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１。
【図９Ａ−Ｄ】ＲＰＥ発達の進行を、ｈＥＳＣが分化し続けるクラスターにおいて時間に沿って示すリアルタイムＰＣＲ分析、免疫染色分析およびフローサイトメトリー分析（図９Ａ〜図９Ｌ）。ＲＰＥ発達における重要な遺伝子の発現の時期を、ＮＡの存在下（太線の棒）または非存在下（細線の棒）で培養されたクラスターにおいて分析するリアルタイムＰＣＲ。下記マーカーの進行性発現をｈＥＳＣ由来クラスターの８週間の分化の期間中において連続した時点で分析した：ｈＥＳＣ特異的マーカー、Ｏｃｔ４（図９Ａ）；初期神経マーカー、Ｏｔｘ２（図９Ｂ）、Ｍｕｓａｓｈｉ（図９Ｃ）およびＰａｘ６（図９Ｄ）；網膜始原体マーカー、Ｓｉｘ３（図９Ｅ）、Ｒｘ１（図９Ｆ）およびＣｈｘ１０（図９Ｇ）；ＲＰＥマーカー、ＭｉＴＦ−Ａ（図９Ｈ）、ＲＰＥ６５（図９Ｉ）およびベストロフィン（図９Ｊ）；光受容体始原体マーカー、Ｃｒｘ（図９Ｋ）；メラノサイト発達マーカー、Ｓｏｘ１０（水平縞の棒、図９Ｌ）（Ｍ５１メラノサイト細胞株がコントロールとして使用される）。ｈＥＳＣ特異的マーカーのＴＲＡ−１−６０（図９Ｍ）および神経始原体マーカーのＰＳＡ−ＮＣＡＭ（図９Ｏ）の進行性発現を、ＮＡの存在下（太線の棒）または非存在下（細線の棒）で８週間にわたって分化するクラスターにおいて明らかにするＦＡＣＳ分析。ＮＡの存在下で２週間および４週間にわたって分化するクラスターの中における、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ（太線の棒）、ネスチン（水平縞の棒）、Ｍｕｓａｓｈｉ（細線の棒）、Ｐａｘ６（垂直縞の棒）の初期神経マーカーを発現する細胞の割合の間接的免疫蛍光分析（図９Ｎ）。これらのマーカーを発現する細胞を明らかにする免疫蛍光像：ＰＳＡ−ＮＣＡＭ（図９Ｐ）、ネスチン（図９Ｑ）、ｍｕｓａｓｈｉ（図９Ｒ）、Ｐａｘ６（図９Ｓ）。
【図９Ｅ−Ｈ】ＲＰＥ発達の進行を、ｈＥＳＣが分化し続けるクラスターにおいて時間に沿って示すリアルタイムＰＣＲ分析、免疫染色分析およびフローサイトメトリー分析（図９Ａ〜図９Ｌ）。ＲＰＥ発達における重要な遺伝子の発現の時期を、ＮＡの存在下（太線の棒）または非存在下（細線の棒）で培養されたクラスターにおいて分析するリアルタイムＰＣＲ。下記マーカーの進行性発現をｈＥＳＣ由来クラスターの８週間の分化の期間中において連続した時点で分析した：ｈＥＳＣ特異的マーカー、Ｏｃｔ４（図９Ａ）；初期神経マーカー、Ｏｔｘ２（図９Ｂ）、Ｍｕｓａｓｈｉ（図９Ｃ）およびＰａｘ６（図９Ｄ）；網膜始原体マーカー、Ｓｉｘ３（図９Ｅ）、Ｒｘ１（図９Ｆ）およびＣｈｘ１０（図９Ｇ）；ＲＰＥマーカー、ＭｉＴＦ−Ａ（図９Ｈ）、ＲＰＥ６５（図９Ｉ）およびベストロフィン（図９Ｊ）；光受容体始原体マーカー、Ｃｒｘ（図９Ｋ）；メラノサイト発達マーカー、Ｓｏｘ１０（水平縞の棒、図９Ｌ）（Ｍ５１メラノサイト細胞株がコントロールとして使用される）。ｈＥＳＣ特異的マーカーのＴＲＡ−１−６０（図９Ｍ）および神経始原体マーカーのＰＳＡ−ＮＣＡＭ（図９Ｏ）の進行性発現を、ＮＡの存在下（太線の棒）または非存在下（細線の棒）で８週間にわたって分化するクラスターにおいて明らかにするＦＡＣＳ分析。ＮＡの存在下で２週間および４週間にわたって分化するクラスターの中における、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ（太線の棒）、ネスチン（水平縞の棒）、Ｍｕｓａｓｈｉ（細線の棒）、Ｐａｘ６（垂直縞の棒）の初期神経マーカーを発現する細胞の割合の間接的免疫蛍光分析（図９Ｎ）。これらのマーカーを発現する細胞を明らかにする免疫蛍光像：ＰＳＡ−ＮＣＡＭ（図９Ｐ）、ネスチン（図９Ｑ）、ｍｕｓａｓｈｉ（図９Ｒ）、Ｐａｘ６（図９Ｓ）。
【図９Ｉ−Ｌ】ＲＰＥ発達の進行を、ｈＥＳＣが分化し続けるクラスターにおいて時間に沿って示すリアルタイムＰＣＲ分析、免疫染色分析およびフローサイトメトリー分析（図９Ａ〜図９Ｌ）。ＲＰＥ発達における重要な遺伝子の発現の時期を、ＮＡの存在下（太線の棒）または非存在下（細線の棒）で培養されたクラスターにおいて分析するリアルタイムＰＣＲ。下記マーカーの進行性発現をｈＥＳＣ由来クラスターの８週間の分化の期間中において連続した時点で分析した：ｈＥＳＣ特異的マーカー、Ｏｃｔ４（図９Ａ）；初期神経マーカー、Ｏｔｘ２（図９Ｂ）、Ｍｕｓａｓｈｉ（図９Ｃ）およびＰａｘ６（図９Ｄ）；網膜始原体マーカー、Ｓｉｘ３（図９Ｅ）、Ｒｘ１（図９Ｆ）およびＣｈｘ１０（図９Ｇ）；ＲＰＥマーカー、ＭｉＴＦ−Ａ（図９Ｈ）、ＲＰＥ６５（図９Ｉ）およびベストロフィン（図９Ｊ）；光受容体始原体マーカー、Ｃｒｘ（図９Ｋ）；メラノサイト発達マーカー、Ｓｏｘ１０（水平縞の棒、図９Ｌ）（Ｍ５１メラノサイト細胞株がコントロールとして使用される）。ｈＥＳＣ特異的マーカーのＴＲＡ−１−６０（図９Ｍ）および神経始原体マーカーのＰＳＡ−ＮＣＡＭ（図９Ｏ）の進行性発現を、ＮＡの存在下（太線の棒）または非存在下（細線の棒）で８週間にわたって分化するクラスターにおいて明らかにするＦＡＣＳ分析。ＮＡの存在下で２週間および４週間にわたって分化するクラスターの中における、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ（太線の棒）、ネスチン（水平縞の棒）、Ｍｕｓａｓｈｉ（細線の棒）、Ｐａｘ６（垂直縞の棒）の初期神経マーカーを発現する細胞の割合の間接的免疫蛍光分析（図９Ｎ）。これらのマーカーを発現する細胞を明らかにする免疫蛍光像：ＰＳＡ−ＮＣＡＭ（図９Ｐ）、ネスチン（図９Ｑ）、ｍｕｓａｓｈｉ（図９Ｒ）、Ｐａｘ６（図９Ｓ）。
【図９Ｍ−Ｏ】ＲＰＥ発達の進行を、ｈＥＳＣが分化し続けるクラスターにおいて時間に沿って示すリアルタイムＰＣＲ分析、免疫染色分析およびフローサイトメトリー分析（図９Ａ〜図９Ｌ）。ＲＰＥ発達における重要な遺伝子の発現の時期を、ＮＡの存在下（太線の棒）または非存在下（細線の棒）で培養されたクラスターにおいて分析するリアルタイムＰＣＲ。下記マーカーの進行性発現をｈＥＳＣ由来クラスターの８週間の分化の期間中において連続した時点で分析した：ｈＥＳＣ特異的マーカー、Ｏｃｔ４（図９Ａ）；初期神経マーカー、Ｏｔｘ２（図９Ｂ）、Ｍｕｓａｓｈｉ（図９Ｃ）およびＰａｘ６（図９Ｄ）；網膜始原体マーカー、Ｓｉｘ３（図９Ｅ）、Ｒｘ１（図９Ｆ）およびＣｈｘ１０（図９Ｇ）；ＲＰＥマーカー、ＭｉＴＦ−Ａ（図９Ｈ）、ＲＰＥ６５（図９Ｉ）およびベストロフィン（図９Ｊ）；光受容体始原体マーカー、Ｃｒｘ（図９Ｋ）；メラノサイト発達マーカー、Ｓｏｘ１０（水平縞の棒、図９Ｌ）（Ｍ５１メラノサイト細胞株がコントロールとして使用される）。ｈＥＳＣ特異的マーカーのＴＲＡ−１−６０（図９Ｍ）および神経始原体マーカーのＰＳＡ−ＮＣＡＭ（図９Ｏ）の進行性発現を、ＮＡの存在下（太線の棒）または非存在下（細線の棒）で８週間にわたって分化するクラスターにおいて明らかにするＦＡＣＳ分析。ＮＡの存在下で２週間および４週間にわたって分化するクラスターの中における、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ（太線の棒）、ネスチン（水平縞の棒）、Ｍｕｓａｓｈｉ（細線の棒）、Ｐａｘ６（垂直縞の棒）の初期神経マーカーを発現する細胞の割合の間接的免疫蛍光分析（図９Ｎ）。これらのマーカーを発現する細胞を明らかにする免疫蛍光像：ＰＳＡ−ＮＣＡＭ（図９Ｐ）、ネスチン（図９Ｑ）、ｍｕｓａｓｈｉ（図９Ｒ）、Ｐａｘ６（図９Ｓ）。
【図９Ｐ−Ｓ】ＲＰＥ発達の進行を、ｈＥＳＣが分化し続けるクラスターにおいて時間に沿って示すリアルタイムＰＣＲ分析、免疫染色分析およびフローサイトメトリー分析（図９Ａ〜図９Ｌ）。ＲＰＥ発達における重要な遺伝子の発現の時期を、ＮＡの存在下（太線の棒）または非存在下（細線の棒）で培養されたクラスターにおいて分析するリアルタイムＰＣＲ。下記マーカーの進行性発現をｈＥＳＣ由来クラスターの８週間の分化の期間中において連続した時点で分析した：ｈＥＳＣ特異的マーカー、Ｏｃｔ４（図９Ａ）；初期神経マーカー、Ｏｔｘ２（図９Ｂ）、Ｍｕｓａｓｈｉ（図９Ｃ）およびＰａｘ６（図９Ｄ）；網膜始原体マーカー、Ｓｉｘ３（図９Ｅ）、Ｒｘ１（図９Ｆ）およびＣｈｘ１０（図９Ｇ）；ＲＰＥマーカー、ＭｉＴＦ−Ａ（図９Ｈ）、ＲＰＥ６５（図９Ｉ）およびベストロフィン（図９Ｊ）；光受容体始原体マーカー、Ｃｒｘ（図９Ｋ）；メラノサイト発達マーカー、Ｓｏｘ１０（水平縞の棒、図９Ｌ）（Ｍ５１メラノサイト細胞株がコントロールとして使用される）。ｈＥＳＣ特異的マーカーのＴＲＡ−１−６０（図９Ｍ）および神経始原体マーカーのＰＳＡ−ＮＣＡＭ（図９Ｏ）の進行性発現を、ＮＡの存在下（太線の棒）または非存在下（細線の棒）で８週間にわたって分化するクラスターにおいて明らかにするＦＡＣＳ分析。ＮＡの存在下で２週間および４週間にわたって分化するクラスターの中における、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ（太線の棒）、ネスチン（水平縞の棒）、Ｍｕｓａｓｈｉ（細線の棒）、Ｐａｘ６（垂直縞の棒）の初期神経マーカーを発現する細胞の割合の間接的免疫蛍光分析（図９Ｎ）。これらのマーカーを発現する細胞を明らかにする免疫蛍光像：ＰＳＡ−ＮＣＡＭ（図９Ｐ）、ネスチン（図９Ｑ）、ｍｕｓａｓｈｉ（図９Ｒ）、Ｐａｘ６（図９Ｓ）。
【図１０Ａ−Ｃ】ｈＥＳＣの浮遊性クラスターの内部における色素発現細胞は、推定されるＲＰＥ細胞であることを示す、形態学、マーカー発現および機能の分析。Ｆ−アクチンの分布を、ＲＰＥに特徴的であるｈＥＳＣ由来の色素沈着した子孫の内部において示すファロイジン染色（図１０Ａ）；解離、低密度での置床および培養の後、色素沈着細胞は色素沈着を失い、類線維様の形態学を獲得する（位相差像、１週間の培養）（図１０Ｂ）。さらに長期間の培養、および、高密度クラスターへの増殖の後、細胞はＲＰＥ細胞に特徴的な形態学および色素沈着を再獲得する（１．５ヶ月の培養）（図１０Ｃ）。
【図１０Ｄ−Ｆ】ｈＥＳＣの浮遊性クラスターの内部における色素発現細胞は、推定されるＲＰＥ細胞であることを示す、形態学、マーカー発現および機能の分析。ＲＰＥに特徴的な特徴を示すｈＥＳＣ由来ＲＰＥ細胞の電子顕微鏡分析：微絨毛（図１０Ｄ）、基底膜（図１０Ｅ）、メラニン顆粒（図１０Ｄ）、密着結合（図１０Ｆ）。
【図１０Ｇ−Ｊ】ｈＥＳＣの浮遊性クラスターの内部における色素発現細胞は、推定されるＲＰＥ細胞であることを示す、形態学、マーカー発現および機能の分析。ｈＥＳＣ由来の色素沈着細胞による緑色蛍光ラテックスビーズ（白矢じり）の食作用を示す位相差像（図１０Ｇ）および蛍光像（図１０Ｈ〜図１０Ｊ）；細胞膜を赤色蛍光色素ＰＫＨにより染色した（灰色）。３つの共焦点蛍光像により、連続するｚ軸切片が明らかにされた（図１０Ｈ〜図１０Ｊ）。
【図１１Ａ−Ｆ】ＴＧＦβファミリー由来の因子は、ＲＰＥの究極的運命に向かう分化を促進することを示す、形態学および遺伝子発現の分析。４週間分化するｈＥＳＣ由来クラスターの暗視野顕微鏡写真では、アクチビンの存在下におけるこの初期段階での色素沈着細胞の出現（図１１Ａ）、ならびに、ＮＡのみ（図１１Ｂ）とは対照的に、アクチビンＡおよびＮＡの存在下で分化する色素沈着クラスターの数における増大（図１１Ｃ）が示された。アクチビンＡと同様に、ＴＧＦβ１による補充もまた、色素沈着クラスターの出現を増大させる（図１１Ｄ）。対照的に、アクチビンのシグナル伝達経路の阻害剤（ＳＢ４３１５４２）をアクチビンＡおよびＮＡと一緒に適用することにより、色素沈着クラスターの出現に対するアクチビンＡの影響が低下した（図１１Ｅ）。色素沈着クラスターの発達もまた、細胞をＮＡと一緒にＦＧＦβの存在下で培養することによってなくなった（図１１Ｆ）。
【図１１Ｇ−Ｉ】ＴＧＦβファミリー由来の因子は、ＲＰＥの究極的運命に向かう分化を促進することを示す、形態学および遺伝子発現の分析。アクチビン受容体およびアクチビンＡの転写物の発現が、ＮＡの存在下または非存在下で培養された２週齢のクラスター、および、コントロールとしての未分化ｈＥＳＣのＲＴ−ＰＣＲ分析によって明らかにされた（図１１Ｇ）。ＮＡ、ＮＡ＋ＡｃｔＡ、ＮＡ＋ＳＢ４３１５４２、ＮＡ＋ＡｃｔＡ＋ＳＢ４３１５４２、ＮＡ＋ＴＧＦβ１の存在下で培養した後の４週間での色素沈着領域含有クラスターの割合のヒストグラム分析（図１１Ｈ）。ＮＡの補充（太線の棒）、または、アクチビンＡおよびＮＡの補充（対角縞の棒）を伴う４週間の培養の後における色素沈着細胞の割合のヒストグラム分析（図１１Ｉ）。＊＊ｐ＜０．００５（白矢印により、分化し続けるクラスターの内部における色素沈着領域が示される）。
【図１１Ｊ−Ｌ】ＴＧＦβファミリー由来の因子は、ＲＰＥの究極的運命に向かう分化を促進することを示す、形態学および遺伝子発現の分析。１４０ｎｇ／ｍｌがＲＰＥ誘導のために最適であるアクチビンＡの種々の濃度における色素沈着細胞の割合のヒストグラム分析（図１１Ｊ）、ならびに、ＲＰＥマーカーの転写物の発現レベルのヒストグラム分析：ベストロフィン（図１１Ｋ）およびＲＰＥ６５（図１１Ｌ）。
【図１１Ｍ−Ｐ】ＴＧＦβファミリー由来の因子は、ＲＰＥの究極的運命に向かう分化を促進することを示す、形態学および遺伝子発現の分析。アクチビンＡの補充（対角縞の棒）または非補充（太線の棒）を伴ってＮＡの存在下で分化するｈＥＳＣにおける網膜遺伝子およびＲＰＥ遺伝子の発現レベルに対するアクチビンＡの影響のリアルタイムＰＣＲ経時変化分析：ベストロフィン（図１１Ｍ）、総ＭｉＴＦ（図１１Ｎ）、Ｒｘ１（図１１Ｏ）およびＣｈｘ１０（図１１Ｐ）。
【図１２Ａ−Ｃ】ＮＡおよびアクチビンＡによって処理されたｈＥＳＣに由来するＲＰＥ細胞はジストロフィー性ＲＣＳラットの眼における網膜下移植の後で生存する。色素沈着細胞のクラスターを、眼底画像化システムを使用してＲＣＳラットの眼においてインビボで容易に特定することができた（図１２Ａ〜図１２Ｃ）；移植片の網膜下の存在位置を示した眼底写真（図１２Ａ）および赤色除外写真（図１２Ｂ）（網膜血管が色素沈着領域全体に走ることに留意すること）。ｈＥＳＣ由来のＧＦＰ発現細胞は、フルオレセインの励起フィルターおよび放射フィルターが使用されたとき、蛍光を放射することを認めることができる（図１２Ｃ）。
【図１２Ｄ−Ｅ】ＮＡおよびアクチビンＡによって処理されたｈＥＳＣに由来するＲＰＥ細胞はジストロフィー性ＲＣＳラットの眼における網膜下移植の後で生存する。蛍光顕微鏡においてエクスビボで画像化されたアイカップ調製物（図１２Ｄ〜図１２Ｅ）では、網膜下のＧＦＰ陽性細胞の大きいクラスターを認めることができ（図１２Ｄ）、同様にまた、多数の分散したより小さいクラスターを認めることができる（図１２Ｅ）。
【図１３Ａ−Ｂ】ＲＣＳラットの眼における、網膜下のｈＥＳＣ由来のアクチビンＡ処理ＲＰＥ細胞移植片の組織学的外観。ヘマトキシリンおよびエオシンによって染色された組織学的切片（図１３Ａおよび図１３Ｂ）では、移植されたｈＥＳＣ由来の色素沈着細胞（これらはクラスターで現れたか、または、孤立した細胞として現れた）の網膜下および時には網膜内での存在位置が示された（矢印）。
【図１３Ｃ−Ｄ】ＲＣＳラットの眼における、網膜下のｈＥＳＣ由来のアクチビンＡ処理ＲＰＥ細胞移植片の組織学的外観。ＧＦＰによる免疫染色（図１３Ｃ〜図１３Ｄ）により、これらの細胞が実際にｈＥＳＣ由来であることが確認された。移植片は多くの場合、かなり大きく、また、散らばり（図１３Ｃ）、また、ＧＦＰを共発現する色素沈着細胞を明瞭に認めることができる（図１３Ｄ）。ＧＦＰ陽性の色素沈着細胞が宿主のＲＰＥ層の内部に一体化していることに留意すること（図１３Ｄ、矢印）。
【図１３Ｅ−Ｆ】ＲＣＳラットの眼における、網膜下のｈＥＳＣ由来のアクチビンＡ処理ＲＰＥ細胞移植片の組織学的外観。ＧＦＰによる免疫染色（図１３Ｅ〜図１３Ｆ）により、これらの細胞が実際にｈＥＳＣ由来であることが確認された。移植片は多くの場合、かなり大きく、また、散らばり（図１３Ｅ）、また、ＧＦＰを共発現する色素沈着細胞を明瞭に認めることができる（図１３Ｆ）。
【図１４Ａ−Ｅ】移植されたｈＥＳＣ由来の色素沈着細胞は成熟ＲＰＥのマーカーを発現する。免疫染色により、移植片の内部における多数の移植された細胞が、ＲＰＥ特異的なマーカーのＲＰＥ６５（図１４Ａ〜図１４Ｅ）およびベストロフィン（図１４Ｆ〜図１４Ｊ）、ならびに、密着結合マーカーのＺＯ−１（図１４Ｋ〜図１４Ｏ）を含めて、成熟ＲＰＥ細胞に特徴的である様々なタンパク質を発現することが明らかにされた。図１４Ａ、図１４Ｆおよび図１４Ｋは、ＧＦＰおよび関連マーカーを共発現する移植片の低倍率蛍光像を示す。それぞれの横列における高倍率の共焦点像では、色素（Ｎｏｍａｒｓｋｉ光学系による）、ならびに、ＧＦＰおよび種々のマーカーの共発現が細胞１個のレベルで示される。これらの系列により、細胞が実際にｈＥＳＣ由来であること、および、細胞が成熟ＲＰＥの様々なマーカーをインビボで発現することが確認される。図１４Ｍにおいて、ＧＦＰの共発現（図１４Ｎ、図１４Ｏ）が実際に生じるＺＯ−１陽性のｈＥＳＣ由来細胞（図１４Ｍにおける完全な矢印）とは対照的に、宿主ＲＰＥがＺＯ−１について染まり（点線の矢印）、一方で、宿主ＲＰＥは、図１４Ｎ、図１４ＯではＧＦＰ陰性である（対応する領域が暗い）ことに留意すること。
【図１４Ｆ−Ｊ】移植されたｈＥＳＣ由来の色素沈着細胞は成熟ＲＰＥのマーカーを発現する。免疫染色により、移植片の内部における多数の移植された細胞が、ＲＰＥ特異的なマーカーのＲＰＥ６５（図１４Ａ〜図１４Ｅ）およびベストロフィン（図１４Ｆ〜図１４Ｊ）、ならびに、密着結合マーカーのＺＯ−１（図１４Ｋ〜図１４Ｏ）を含めて、成熟ＲＰＥ細胞に特徴的である様々なタンパク質を発現することが明らかにされた。図１４Ａ、図１４Ｆおよび図１４Ｋは、ＧＦＰおよび関連マーカーを共発現する移植片の低倍率蛍光像を示す。それぞれの横列における高倍率の共焦点像では、色素（Ｎｏｍａｒｓｋｉ光学系による）、ならびに、ＧＦＰおよび種々のマーカーの共発現が細胞１個のレベルで示される。これらの系列により、細胞が実際にｈＥＳＣ由来であること、および、細胞が成熟ＲＰＥの様々なマーカーをインビボで発現することが確認される。図１４Ｍにおいて、ＧＦＰの共発現（図１４Ｎ、図１４Ｏ）が実際に生じるＺＯ−１陽性のｈＥＳＣ由来細胞（図１４Ｍにおける完全な矢印）とは対照的に、宿主ＲＰＥがＺＯ−１について染まり（点線の矢印）、一方で、宿主ＲＰＥは、図１４Ｎ、図１４ＯではＧＦＰ陰性である（対応する領域が暗い）ことに留意すること。
【図１４Ｋ−Ｏ】移植されたｈＥＳＣ由来の色素沈着細胞は成熟ＲＰＥのマーカーを発現する。免疫染色により、移植片の内部における多数の移植された細胞が、ＲＰＥ特異的なマーカーのＲＰＥ６５（図１４Ａ〜図１４Ｅ）およびベストロフィン（図１４Ｆ〜図１４Ｊ）、ならびに、密着結合マーカーのＺＯ−１（図１４Ｋ〜図１４Ｏ）を含めて、成熟ＲＰＥ細胞に特徴的である様々なタンパク質を発現することが明らかにされた。図１４Ａ、図１４Ｆおよび図１４Ｋは、ＧＦＰおよび関連マーカーを共発現する移植片の低倍率蛍光像を示す。それぞれの横列における高倍率の共焦点像では、色素（Ｎｏｍａｒｓｋｉ光学系による）、ならびに、ＧＦＰおよび種々のマーカーの共発現が細胞１個のレベルで示される。これらの系列により、細胞が実際にｈＥＳＣ由来であること、および、細胞が成熟ＲＰＥの様々なマーカーをインビボで発現することが確認される。図１４Ｍにおいて、ＧＦＰの共発現（図１４Ｎ、図１４Ｏ）が実際に生じるＺＯ−１陽性のｈＥＳＣ由来細胞（図１４Ｍにおける完全な矢印）とは対照的に、宿主ＲＰＥがＺＯ−１について染まり（点線の矢印）、一方で、宿主ＲＰＥは、図１４Ｎ、図１４ＯではＧＦＰ陰性である（対応する領域が暗い）ことに留意すること。
【図１５】移植されたｈＥＳＣ由来のアクチビンＡ処理ＲＰＥ細胞により、機能的救済がＲＣＳラット網膜変性モデルにおいてもたらされる。第８週で記録された全範囲ＥＲＧ応答は、処置されていないコントロールの他眼と比較されたとき、同様にまた、培地だけの網膜下注入が行われた眼と比較されたとき、ｈＥＳＣに由来するアクチビン処理されたＲＰＥ細胞を移植した後のＲＣＳラットの眼の方が高かった。暗順応した状態における、強度が増大する一連の白色閃光に対する代表的なＥＲＧ応答が、移植を受けた眼（図１５Ａ）において、そのコントロールの他眼（図１５Ｂ）に対して示される。図１５Ｃは、移植を受けた眼と、コントロール眼の様々な異なる群（黒ひし形、注入を受けた眼（ｎ＝１３）；黒四角、注入を受けなかった眼（ｎ＝１３）；黒丸、培地注入を受けなかった眼（ｎ＝５）、黒三角、培地注入を受けた眼（ｎ＝５））との間において、平均振幅における際立った違いを示す。示されるように、網膜機能のより良好な保存に向かう傾向が、アクチビンＡの非存在下で誘導されるＲＰＥ細胞（図７）を移植した後で達成される救済効果と比較されたとき、アクチビンＡにより処理されたＲＰＥ細胞（ここに示される）を移植した後では認められる。
【図１６Ａ−Ｂ】移植されたｈＥＳＣ由来のアクチビンＡ処理ＲＰＥ細胞により、構造的救済がＲＣＳラット網膜変性モデルにおいてもたらされる。変性しつつある宿主網膜に対する、移植されたｈＥＳＣ由来のアクチビンＡ処理ＲＰＥ細胞の影響を、ヘマトキシリンおよびエオシンにより染色された切片の高分解能顕微鏡像を使用して調べ、定量した。外顆粒層（光受容体層）（ＯＮＬ）、ならびに、内側および外側の光受容体セグメント（ＩＳ＋ＯＳ）が比較的保存されることが、移植片から離れた領域と比較されたとき、網膜下のＲＰＥ移植片の近くで認められた（２つの例が、図１６Ａ、図１６Ｂに示される）。図１６Ａにおける挿入図により、この違いが明らかにされる（移植片の近くにおいて右側の挿入図に示される比較的厚いＯＮＬを有する救済された網膜；ＯＮＬがひどく薄くなっていることが、移植片から離れた左側の挿入図において見られる）。
【図１６Ｃ−Ｄ】移植されたｈＥＳＣ由来のアクチビンＡ処理ＲＰＥ細胞により、構造的救済がＲＣＳラット網膜変性モデルにおいてもたらされる。網膜全体の厚さ（図１６Ｃ）、同様にまた、ＯＮＬおよびＩＳ＋ＯＳの厚さ（図１６Ｄ）が、移植片から離れた領域（灰色棒）に対して比較されたとき、ｈＥＳＣ由来のＲＰＥ移植片の近傍では著しく増大した（黒色棒、平均±ＳＥＭ、ｎ＝７）。このタイプの構造的救済が網膜下移植片および深部網膜内移植片の近くでのみ観測されただけであり、移植片がもっぱら硝子体内であったときには観測されなかった（示されず）。定量化技術の詳細については、方法を参照されたい。
【図１７Ａ−Ｃ】移植されたｈＥＳＣ由来のアクチビンＡ処理ＲＰＥ細胞により、ロドプシンがインビボで取り込まれる。網膜下の移植されたＲＰＥ細胞の共焦点像では、同じ１個の細胞の内部における、色素、ＧＦＰ、ＲＰＥ６５およびロドプシンの共局在化が示される。ＲＣＳラットの生来的なＲＰＥ細胞はＲＰＥ６５を発現したが（図１７Ｃ、矢印）、ＧＦＰを発現せず（図１７Ｄ、矢印）、最少量のロドプシンを含有する（図１７Ｂ、図１７Ｅ）。
【図１７Ｄ−Ｅ】移植されたｈＥＳＣ由来のアクチビンＡ処理ＲＰＥ細胞により、ロドプシンがインビボで取り込まれる。網膜下の移植されたＲＰＥ細胞の共焦点像では、同じ１個の細胞の内部における、色素、ＧＦＰ、ＲＰＥ６５およびロドプシンの共局在化が示される。ＲＣＳラットの生来的なＲＰＥ細胞はＲＰＥ６５を発現したが（図１７Ｃ、矢印）、ＧＦＰを発現せず（図１７Ｄ、矢印）、最少量のロドプシンを含有する（図１７Ｂ、図１７Ｅ）。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本開示は、ヒト幹細胞（ｈＳＣ）、好ましくは、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞への分化を促進するための培養システムを調製するための、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦβ）スーパーファミリーの１つまたは複数のメンバーの使用を提供する。本明細書で詳しく議論される具体的に示されている使用に加えて、本開示において同様に包含されるものが、ＴＧＦβスーパーファミリーの１つまたは複数のメンバーの存在下におけるｈＳＣの導かれた分化によって得られるＲＰＥ細胞、同様にまた、ＲＰＥの究極的運命へのｈＳＣの導かれた分化を促進するための方法、同様にまた、そのようなｈＳＣ由来ＲＰＥ細胞を成長および維持するための方法、ならびに、そのようなｈＳＣ由来ＲＰＥ細胞を使用する方法であることに留意しなければならない。いくつかの好ましい実施形態によれば、本明細書中の教示に従って得られるＲＰＥ細胞は、下記でさらに議論および説明されるように、成熟している（別の言い方をすれば、最終分化した）機能的なＲＰＥ細胞である。
【００２０】
本開示は大まかには、ＲＰＥ細胞、好ましくは、成熟しているＲＰＥ細胞へのｈＳＣの導かれた分化を促進／誘導／増強することにおける増殖因子のＴＧＦβスーパーファミリーの１つまたは複数のメンバーの使用に関する。
【００２１】
下記の記載および請求項では、使用が、時には、様々な用語とともに行われ、本教示に従って解釈されなければならないような用語の意味は下記の通りである。
【００２２】
用語集
「トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦβ）スーパーファミリー増殖因子」は、本明細書で使用される場合、増殖因子のＴＧＦβスーパーファミリーのいずれかのメンバーを意味し、例えば、トランスフォーミング増殖因子−βタンパク質（これには、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３のサブタイプが含まれる）、同様にまた、相同的なリガンド（これには、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢおよびアクチビンＡＢ）、ノーダル（ｎｏｄａｌ）、抗ミューラーホルモン（ＡＭＨ）、いくつかの骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６およびＢＭＰ７）および成長分化因子（ＧＤＦ）が含まれる）などを意味する。
【００２３】
「ヒト幹細胞」または「ｈＳＣ」は、本明細書で使用される場合、下記で詳述されるように、好適な条件下では、特定の特殊化された機能を有する他の細胞タイプに分化することができ、その一方で、他の好適な条件下では、未分化の多能性状態で自己再生することができ、また、未分化の多能性状態に留まることができるヒト起源の細胞を示す。
【００２４】
本明細書で使用される「細胞」は、１個の細胞、同様にまた、細胞の集団（すなわち、２個以上の細胞）を示す。集団は、１つの細胞タイプを含む純集団である場合がある。代替では、集団は、２つ以上の細胞タイプを含む場合がある。ｈＳＣ細胞は好ましくは、任意の年齢の個体の骨髄組織から、または、新生児個体の臍帯血もしくは組織から得られる造血系幹細胞または間葉系幹細胞、あるいは、胎児、出生後の任意の時期、または、死体脳から得られる神経幹細胞、あるいは、受精後に形成される胚組織（例えば、卵割球、胚盤胞）から得られる胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、あるいは、妊娠期間中の任意の時期（好ましくは、妊娠１０週前）の胎児の生殖組織から得られる胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）である。細胞の用語は、１個の細胞または細胞のクラスターを意味する場合がある。
【００２５】
「胚性幹細胞」および「多能性の胚性幹細胞」は、本明細書で使用される場合、生殖細胞（精子および卵）を含めて、胚または成体におけるいずれかの分化した細胞タイプを生じさせることができる細胞を示す。
【００２６】
「細胞培養物」または「培養（された）細胞」は、本明細書で使用される場合、人工的なインビトロ環境で培養されるか、または育てられるか、または成長する細胞または組織を示す。
【００２７】
「未分化の多能性ｈＳＣ」、「多能性ｈＳＣ」は、本明細書で使用される場合、いずれかの成体細胞を形成する能力を有する、ヒト供給源の前駆体細胞を示す。そのような細胞は、その細胞が、（ｉ）未分化の状態におけるインビトロでの大規模な増殖が可能であり、また、（ｉｉ）長期間にわたる培養の後でさえ、３つすべての胚の胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）の派生体への分化が可能であるという点で、真の細胞株である。ｈＥＳＣが、（卵割段階または胚盤胞段階での）１週齢未満である受精胚から得られるか、または、同等な特徴を有する人為的手段によって（例えば、核移入によって）作製される。他の多能性ｈＳＣには、多分化能の成体始原体細胞（ＭＡＰ）、誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、および、羊水幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００２８】
「未分化（の）」は、本明細書で使用される場合、集団における細胞およびその派生体の実質的な割合（少なくとも２０％、場合により、５０％または８０％を超えて）が未分化細胞の特徴的なマーカーおよび形態学的特徴を呈示し、これらにより、未分化細胞が胚起源または成体起源の分化した細胞から識別されるときの培養された細胞を示す。細胞は、細胞が少なくとも３週間の培養期間中に少なくとも１回の集団倍加を経て、一方で、未分化細胞の特徴的マーカーまたは形態学的特徴を有する細胞の少なくとも約５０％または同じ割合を前記培養期間の後で保持するとき、未分化の状態で増殖すると認識される。
【００２９】
「細胞懸濁物」または「浮遊性細胞」は、本明細書で使用される場合、細胞の大部分が、培地において、典型的には、培養培地（システム）において自由に浮遊する細胞の培養物を示し、この場合、細胞は、１個１個がばらばらの細胞として、細胞クラスターとして、および／または、細胞凝集物として浮遊する。言い換えれば、細胞は、基体に付着することなく、培地において生存および拡大培養する。
【００３０】
「培養システム」は、本明細書で使用される場合、ＳＣの拡大培養のために好適である培養システムを示す。この用語は、基礎培地（塩、糖およびアミノ酸を含む、定義された基本溶液を通常は含む細胞培養培地）と、増殖因子のトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦβ）スーパーファミリーの１つまたは複数のメンバーとを少なくとも含む様々な構成要素の組合せを意味する。本発明による培養システムはさらに、他の構成要素を含むことができ、例えば、血清または血清代用物、培養（栄養）培地、および、外部から添加された他の因子（これらは一緒になって、ＳＣの成長を支える好適な条件を提供する）、同様にまた、細胞培養システムにおいて典型的に使用される他の成分など（これらに限定されない）を含むことができる。上記の構成要素はまとめて、可溶性の構成要素として分類することができる。しかしながら、本発明の関連においては、構成要素はまた、キャリア、すなわち、不溶性の構成要素に連携することができる。そのような連携は化学的または物理的な付着／結合によることができる。例えば、構成要素をマトリックス（例えば、細胞外マトリックス）の表面に固定化することができ、または、システムに加えられる細胞によって提供することができ、または、生分解性物質に結合させることができる。さらに、構成要素をキャリアから放出させることができ、キャリアは、構成要素を包むか、または埋め込む細胞または小胞である場合がある。従って、下記では、培養システムを形成するために基礎培地を補う構成要素は、可溶性の構成要素および不溶性の構成要素の両方を含む。
【００３１】
「分化」は、本明細書で使用される場合、細胞の状態をある１つの細胞タイプから別の細胞タイプに切り換えるプロセスを示し、より具体的には、本開示の関連においては、そのようなＲＰＥ細胞が成熟している（最終分化した）細胞であることを示す少なくとも１つの特徴的な特徴を有する網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の細胞タイプを獲得するヒト幹細胞のプロセスを示している。本明細書で使用される用語「細胞タイプ」は、細胞の異なった形態学的形態または機能的形態を示す。
【００３２】
「分化し続けるｈＳＣ」は、本明細書で使用される場合、好適な条件下では、事前に決定されている究極的運命に、増強され、かつ、導かれた様式で分化することができる未分化のｈＳＣを示す；この用語はまた、その少なくとも一部が、少なくとも最初の分化（すなわち、導かれた分化）またはそれらの組合せを受けるために既に誘導されている、ｈＳＣの集団を示す。
【００３３】
「刺激する」、「増強する」、「促進する」または「導く」は、文脈が他のことを示さない限り本明細書では交換可能に使用されるが、ＲＰＥ細胞への幹細胞の非自発的分化を開始することを示す。
【００３４】
「分化誘導剤」または「分化促進剤」、「分化刺激剤」または「分化促進因子」は、本明細書では交換可能に使用されるが、体細胞（好ましくは、ＲＰＥ細胞）への多能性ＳＣの分化を刺激するか、増強するか、促進するか、または導くことができる任意の薬剤を意味する。
【００３５】
「網膜色素上皮細胞」、「ＲＰＥ細胞」、「ＲＰＥ」は、文脈が許すように交換可能に使用され得るが、網膜の色素沈着細胞層を形成する生来的なＲＰＥ細胞の細胞タイプに機能的に類似する細胞タイプの細胞を意味する（例えば、眼の中に移植されたとき、そのような細胞は、生来的なＲＰＥ細胞の機能的活性に類似する機能的活性を示す）。従って、用語「網膜色素上皮細胞」、「ＲＰＥ細胞」または「ＲＰＥ」は、網膜の色素沈着層の生来的なＲＰＥ細胞と、本開示に従ってｈＳＣから直接に分化されるＲＰＥ細胞との両方を示すために使用することができる。
【００３６】
用語「ｈＳＣ由来（の）ＲＰＥ細胞」は、ｈＳＣからの導かれた分化によって得られるＲＰＥ細胞を意味するために本明細書では使用される。１つの好ましい実施形態によれば、ｈＳＣ由来ＲＰＥ細胞は、本明細書下記において定義されるパラメーターによって示されるような成熟している（最終分化した）機能的なＲＰＥ細胞である。用語「導かれた分化」は用語「ＲＰＥ誘導（された）分化」と交換可能に使用され、ＲＰＥ細胞タイプへの分化を誘導／促進するだけである培養条件下でｈＳＣを操作するプロセスを意味するとして理解されなければならない。
【００３７】
「機能的なＲＰＥ細胞」は、ＴＧＦβスーパーファミリーの１つまたは複数のメンバーの存在下でのｈＳＣの導かれた分化によって得られる細胞を意味するために本明細書では使用され、そのようなＲＰＥ細胞は以下の特徴の少なくとも１つを示す：
−  分化期間中において、培養細胞はＴＧＦβのシグナル伝達に対して応答する；
−  ＲＰＥ細胞は、そのうえ最終分化を示す様々なマーカー（例えば、ベストロフィンまたはＲＰＥ６５）の発現によって、または、代替では、インビボで増殖する潜在能力を失っていることによって示されるように、成熟している最終分化した細胞である；
−  移植後（すなわち、インサイチュにおいて）、ＲＰＥ細胞は、ＲＰＥ細胞に隣接する光受容体を支える栄養作用を示す；
−  さらに、インサイチュにおいて、ＲＰＥ細胞は、これらの光受容体の正常な更新プロセスの一部としての脱落した光受容体外側セグメントの食作用を伴って機能することができる。
【００３８】
従って、本発明によるＲＰＥ細胞は宿主ＲＰＥの再生のために特に好適であり、それにより、改善された視覚を対象の眼へのＲＰＥ細胞による移植の後でもたらす。
【００３９】
「類似する」は、分化したＲＰＥ細胞に関連して使用されるとき、分化したＲＰＥ細胞が１つまたは複数の異なった形態学的特徴または機能的特徴を生来的なＲＰＥ細胞と共有することを意味する。例えば、十分な類似性が、例えば、分化した細胞が、天然に存在するＲＰＥ細胞の１つまたは複数のマーカー（例えば、ＭｉＴＦ、ＺＯ−１、ベストロフィン、ＲＰＥ６５、Ｏｔｘ２、ＭｅｒｔｋおよびＣＲＡＬＢＰ）を発現すること、あるいは、細胞がＲＰＥ細胞の１つまたは複数の物理的な形態学的特徴（例えば、電子顕微鏡観察によって明らかにされるような、細胞内での典型的なＦ−アクチン分布、色素沈着顆粒による色素沈着、多角形（例えば、六角形）の形状、ＲＰＥの丸石様外観および超構造的特徴）を表すことを明らかにすることによって示されるかもしれない。加えて、上記で列挙された機能のいずれか１つ、例えば、ＲＰＥ細胞に隣接する光受容体を支える栄養作用、ロドプシンに場所を提供する脱落した光受容体外側セグメントの食作用を伴う機能性、または、インビボで増殖する潜在能力がないことが含まれる場合がある。
【００４０】
「大規模」は、細胞の培養および拡大に関して本明細書で使用される場合、細胞培養における細胞の倍加を４週間後に少なくとも可能する条件下でのＲＰＥ細胞の産生を示し、４週間後の細胞集団はＲＰＥ細胞から本質的になる。
【００４１】
「細胞マーカー」は、本明細書で使用される場合、細胞を特徴づけるために、または、細胞を他の細胞タイプから識別するために使用することができる細胞の表現型特徴のいずれかを示す。マーカーは、タンパク質（これには、分泌タンパク質、細胞表面タンパク質または内在性タンパク質が含まれる；これらは、細胞によって合成されるか、または、取り込まれるかのどちらかである）、核酸（例えば、ｍＲＮＡまたは酵素活性な核酸分子）、または、多糖であり得る。目的とする細胞タイプのマーカーについて特異的である、抗体、レクチン、プローブまたは核酸増幅反応によって検出可能である何らかのそのような細胞成分の決定基が含まれる。マーカーはまた、遺伝子産物の機能に依存する生化学的アッセイまたは酵素アッセイあるいは生物学的応答によって特定することができる。それぞれのマーカーに関連するものが、転写物をコードする遺伝子であり、また、マーカーの発現を引き起こす事象である。マーカーが、受け入れられ得るコントロール（例えば、アクチンまたはグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ））よりも、（抗体アッセイまたはＰＣＲアッセイで測定される遺伝子産物全体に関しては）少なくとも５０％高いレベルで発現されるならば、または、（集団における陽性細胞に関しては）少なくとも３０％高頻度であるレベルで発現されるならば、マーカーは、未分化の細胞集団または分化した細胞集団において優先的に発現されると言われる。２倍以上、１０倍以上、１００倍以上または１００００倍以上の高頻度で発現されるマーカーが、ますますより好ましい。
【００４２】
本開示により、懸濁されているｈＳＣに適用される独特な培養システムの存在下でのｈＳＣの誘導的かつ導かれた分化に起因する、ＲＰＥが由来するｈＳＣの使用が行われる。
【００４３】
ｈＳＣの限定されない例には、胎児から、または、出生後の任意の時期で、または、死体から得られる神経幹細胞、任意の年齢のヒト個体の骨髄組織から、または、新生児個体の臍帯血から得られる造血幹細胞、間葉系幹細胞、羊水幹細胞、受精後に形成される胚組織から（例えば、１個の卵割球から、または、胚盤胞から）得られる胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、妊娠期間中の任意の時期（好ましくは、妊娠１０週前）の胎児の生殖組織から得られる胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、誘導された多能性幹細胞、あるいは、任意の年齢のヒト個体の生殖腺から得られる幹細胞がある。本発明による好ましいヒト幹細胞がヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）である。
【００４４】
ｈＳＣを、広く知られている細胞培養方法を使用して得ることができる。例えば、ｈＥＳＣを、卵割期または桑実期のヒト胚の１個１個ばらばらの卵割球から、すなわち、卵割段階および桑実胚のヒト胚ならびにヒト胚盤胞から単離することができる。ヒト胚を、インビボ着床前の胚から、または、より典型的には、体外受精（ＩＶＦ）胚から得ることができる。代替では、受精していないヒト卵母細胞を、卵割し、発達して胚盤胞段階に至るように単為生殖的に活性化することができる。加えて、単一細胞のヒト胚を胚盤胞段階に拡大することができる。ｈＥＳＣを胚盤胞から単離するために、透明帯が除かれ、内部細胞塊（ＩＣＭ）が免疫手術によって単離される。この場合、栄養外胚葉細胞が穏やかなピペッティングによって無傷のＩＣＭから溶解され、除かれる。その後、ＩＣＭは、その成長を可能にする適切な培地を含有する組織培養フラスコに置床される。９日後〜１５日後において、ＩＣＭ由来の成長物が機械的解離または酵素消化のどちらかによって凝集塊に解離され、その後、細胞が新鮮な組織培養培地に再置床される。未分化の形態学を明らかにするコロニーがマイクロピペットによって個々に選択され、機械的に凝集塊に解離され、再置床される。得られるＥＳＣが、その後、１週間毎〜２週間毎に定法に従って分割される。ｈＥＳＣの調製方法に関するさらなる詳細については、Ｔｈｏｍｓｏｎ他［米国特許第５８４３７８０号；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５、１９９８；Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３、１９９８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：７８４４、１９９５］、Ｂｏｎｇｓｏ他［Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  ４：７０６、１９８６］を参照のこと。
【００４５】
市販されているｈＳＣもまた、本発明に従って使用することができる。様々なｈＳＣをＮＩＨヒト胚性幹細胞登録機関から購入することができる。市販されている胚性幹細胞株の限定されない例には、ＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＢＧ０４、ＣＹ１２、ＣＹ３０、ＣＹ９２、ＣＹ１０、ＴＥ０３およびＴＥ３２がある。
【００４６】
ｈＥＳＣおよびｈＥＳＣ由来細胞の可能性のある様々な適用は広範囲にわたり、そのような範囲には、薬物発見および薬物試験、移植において使用される細胞、組織および器官の作製、生体分子の産生、化合物の毒性および／または催奇性を試験すること、分子をその毒性作用、再生作用、保護作用または何らかの他の作用についてハイ・スループット・スクリーニングすること、ならびに、発達プロセスおよび他の生物学的プロセスの研究を容易にすることが含まれる。例えば、ｈＥＳＣまたはｈＥＳＣ由来細胞の治療的移植によって処置可能であることが現在期待される疾患には、パーキンソン病、心筋梗塞、若年発症糖尿病および白血病が含まれる［Ｇｅａｒｈａｒｔ  Ｊ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１０６１〜１０６２、１９９８；ＲｏｓｓａｎｔおよびＮａｇｙ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：２３〜２４、１９９９］。
【００４７】
しかしながら、ｈＥＳＣの実用的な利用には様々な著しい困難がある。２つのそのような困難には、ｈＥＳＣを、自発的分化を伴うことなく、未分化の多能性状態で維持すること、および、体細胞の特定タイプへのｈＥＳＣの分化を導くことが含まれる。いくつかの培養システムが、幹細胞（具体的には、ｈＥＳＣ）を未分化の状態で維持および拡大培養するために記載されている８。
【００４８】
数え切れないほどの治療的適用における、幹細胞に由来する分化した細胞の潜在的可能性のために、培養での幹細胞の分化を体細胞の特定の究極的運命に向かって導くか、または促進することは、非常に注目される。
【００４９】
ある種の眼疾患および眼障害において、例えば、網膜および黄斑の眼疾患および眼障害において、ＲＰＥ細胞の機能不全は究極的には視覚喪失を引き起こし、また、失明さえも引き起こす。機能不全の宿主ＲＰＥに取って代わり、また、機能不全の宿主ＲＰＥを支えるためにＲＰＥ細胞を移植することが、考えられる治療的介入として示唆されているが、そのような細胞をヒトドナーまたはヒト胚から得ることは困難である。従って、ｈＳＣは、機能的なＲＰＥ細胞へのその分化を導くための手段が解明され得るならば、ＲＰＥ細胞のための潜在的な無限のドナー源として役立ち得る。
【００５０】
今回、驚くべきことに、ｈＳＣを増殖因子のＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーと接触させることにより、ＲＰＥの究極的運命に向かうｈＳＣの分化が強く促進されることが見出されている。別の言い方をすれば、これらの増殖因子は、ｈＳＣに対する誘導作用を有する。従って、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦβ）スーパーファミリーのメンバー（１つまたは複数）を、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞へのヒト幹細胞（ｈＳＣ）の分化を誘導するための培養システムの調製のために使用することがそのように想定されている。
【００５１】
増殖因子のＴＧＦβスーパーファミリーの多くのメンバーが知られている（いくつかの限定されない例が上記で列挙される）一方で、１つの好ましい実施形態によれば、ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーは、好ましくは、ＴＧＦβ１増殖因子、ＴＧＦβ３増殖因子またはアクチビンＡ、あるいは、これらの組合せである。
【００５２】
細胞培養におけるニコチンアミド（ＮＡ）が、幹細胞の胚体外細胞への分化に対する阻害作用を有すること、また、さらに、ＮＡが、神経の究極的運命に向かう体細胞分化、および、さらにはＲＰＥ細胞様の究極的運命に向かう体細胞分化を促進することが以前に見出された８。ＮＡは、「ナイアシンアミド」としてもまた知られており、ベータ細胞の機能を保存および改善すると考えられる、ビタミンＢ３（ナイアシン）のアミド誘導体形態である。ＮＡはＣ６Ｈ６Ｎ２Ｏの化学式を有する。ＮＡは、成長および食物のエネルギーへの変換のために不可欠である。また、ＮＡは、関節炎の処置、ならびに、糖尿病の処置および防止において使用されている。
0005395058.tif 000002
【００５３】
本開示の関連において、ＮＡの用語はまた、ＮＡの誘導体を意味する。
【００５４】
用語「ニコチンアミド（ＮＡ）の誘導体」は、本明細書で使用される場合、天然ＮＡの化学的修飾された誘導体である化合物を意味する。化学的修飾には、例えば、基本ＮＡ構造のピリジン環における置換（環構成炭素または環構成窒素を介する置換）、アミド成分の窒素原子または酸素原子を介する置換、ならびに、基の欠失または置換、例えば、ＮＡのチオベンゾアミドアナログを形成するための基の欠失または置換が含まれ得る（これらのすべては、有機化学に精通した当業者によって理解される通りである）。本発明の関連における誘導体にはまた、ＮＡのヌクレオシド誘導体（例えば、ニコチンアミドアデニン）が含まれる。ＮＡの様々な誘導体が記載され、いくつかはまた、ＰＤＥ４酵素の阻害活性との関連においてであり（ＷＯ０３／０６８２３３；ＷＯ０２／０６０８７５；ＧＢ２３２７６７５Ａ）、または、ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤としてである（ＷＯ０１／５５１１４）。例えば、４−アリールニコチンアミド誘導体を調製するプロセス（ＷＯ０５／０１４５４９）。
【００５５】
上記に関連して、今回、驚くべきことに、ｈＳＣがＮＡの存在下で分化し続けているとき、ｈＳＣの性質が変化し、それに従って、ｈＳＣが、ＲＰＥの究極的運命（好ましくは、成熟している機能的なＲＰＥ細胞）に向かうその分化を導く、ＴＧＦβスーパーファミリーの１つまたは複数のメンバーの誘導作用に対して応答する能力を獲得することが見出されている。従って、細胞を培養状態においてＮＡに事前にさらすこととの組合せで、ｈＳＣを増殖因子のＴＧＦβスーパーファミリーの１つまたは複数のメンバーにその後でさらすとき、ＮＡのＲＰＥ分化誘導作用が著しく高まり得る。
【００５６】
従って、１つの実施形態によれば、細胞を増殖因子のＴＧＦβスーパーファミリーの１つまたは複数のメンバーにより処理することを含む方法が、ＮＡに事前にさらすこととの組合せで使用される。組合せを、ＴＧＦβおよびＮＡの両方を含む培養システムを調製するために、同様にまた、ＮＡに既にさらされているｈＳＣの分化および／またはさらなる分化を誘導／促進するために使用されるための、ＴＧＦβスーパーファミリーの１つまたは複数のメンバーのみを含む培養システムを調製するために行うことができる。理論にとらわれることはないが、ＮＡが分化誘導剤／促進剤として作用すると考えられ、また、同様に、ＴＧＦβスーパーファミリーの１つまたは複数のメンバーがＲＰＥ分化促進因子として作用すると考えられる。加えて、理論によってとらわれることはないが、ｈＳＣをＮＡに事前にさらすことにより、細胞に、ＴＧＦβスーパーファミリーの１つまたは複数のメンバーのＲＰＥ分化促進作用に対するその応答を可能にする性質がもたらされると考えられる。
【００５７】
従って、本発明の１つの実施形態によれば、ｈＳＣは最初に、ＮＡが補充された基礎培地を含む培養システムにおいて、ＴＧＦβスーパーファミリーの１つまたは複数のメンバーが補充された基礎培地（同じまたは異なる培地）でのその細胞培養で細胞を培養する前の少なくとも数時間、好ましくは少なくとも１日間、より好ましくは少なくとも２日間、培養される。
【００５８】
別の実施形態によれば、未分化のｈＳＣが、ＮＡと、ＴＧＦβスーパーファミリーの１つまたは複数のメンバーとが補充された基礎培地を含む培養システムにおいて培養される。
【００５９】
様々な基礎培地が、細胞培養における使用のために、好ましくは、ＳＣ培養における使用のためにこの技術分野において知られていることは特筆される。本開示に従って使用することができる基礎培地の限定されない列挙には、以下の培地が含まれる：Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）（カタログ番号２１１０３−０４９，Ｇｉｂｃｏ  １９９８／１９９９）、ＫＯ−ＤＭＥＭ（カタログ番号１０８２９−０１８，Ｇｉｂｃｏ  １９９８／１９９９）、ＤＭＥＭ（カタログ番号４１９６５−０３９，Ｇｉｂｃｏ  ２００４）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（カタログ番号２１３３１−０２０，Ｇｉｂｃｏ  ２００４）、Ｃｅｌｌｇｒｏ（商標）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（カタログ番号２００１，ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ  ２００５）、またはＸ−Ｖｉｖｏ（商標）（カタログ番号０４−３８０Ｑ，ＬＯＮＺＡ  ２００７）。
【００６０】
本開示はまた、ＲＰＥの究極的運命へのｈＳＣの導かれた分化を誘導するための方法を提供し、この方法は：
（ａ）ｈＳＣを含む細胞培養物を提供すること；および
（ｂ）前記細胞培養物における細胞を、ＴＧＦβスーパーファミリーの１つまたは複数のメンバーが補充された基礎培地を含む培養システムにおいて培養し、それにより、ＲＰＥの究極的運命へのｈＳＣの導かれた分化が促進されること
を含む。
【００６１】
分化は、ｈＳＣの浮遊性クラスターの内部、または、接着性培養物の内部において生じ得る。接着性培養物の内部における体細胞分化が記載されていた［米国特許第７１１２４３７号］。従って、そのような接着性培養物は、増殖因子のＴＧＦβスーパーファミリーの１つまたは複数のメンバーが補充された培養システムによってＲＰＥ分化を誘導するための基礎として役立ち得る。
【００６２】
細胞培養における細胞は未分化ｈＳＣの集団であり得るか、または、ｈＳＣの少なくとも一部が分化を開始している細胞の集団であり得る。最初の分化が、導かれた分化である。従って、本開示の関連において、本方法で提供される細胞は、時には、分化し続ける細胞として示される。
【００６３】
上記で既に示されたように、基礎培地は、培地への可溶性の構成要素の導入によって、同様にまた、不溶性の構成要素によって補充することができる。増殖因子のＴＧＦβスーパーファミリーの１つまたは複数のメンバーによる補充に関連して、メンバーを可溶性形態で提供することができ、または、培養システムに添加されるマトリックスもしくは細胞に付着もしくは結合させることができ、あるいは、構成要素を他の物質に結合することができ、または複合体化することができる。メンバーはまた、後者に存在する細胞から培養システムに分泌させることができる。
【００６４】
ｈＳＣを未分化の状態で提供することができ、同様にまた、分化促進因子（分化刺激剤）（例えば、ＮＡなど）にさらされた後で提供することができる。未分化のｈＳＣを、ｈＳＣが未分化の多能性状態で維持され得る様々な培養システムから得ることができる。例えば、細胞を、フィーダーを含まない接着性システムまたは懸濁システムにおいて培養することができ（ＷＯ０６／０７０３７０）、あるいは、フィーダー細胞上で培養することができる。一般に使用されるフィーダー細胞には、初代マウス胚線維芽細胞（ＰＭＥＦ）、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、マウス胎児線維芽細胞（ＭＦＦ）、ヒト胚線維芽細胞（ＨＥＦ）、ヒト胚性幹細胞の分化から得られるヒト線維芽細胞、ヒト胎児筋細胞（ＨＦＭ）、ヒト胎児皮膚細胞（ＨＦＳ）、ヒト成体皮膚細胞、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）、臍帯血または胎盤から得られるヒト細胞、ヒト成体ファローピウス管上皮細胞（ＨＡＦＴ）、および、ヒト骨髄間質細胞（ｈＭＳＣ）が含まれる。ｈＳＣのクラスターを、細胞をフィーダー層または細胞外マトリックスから解離して、細胞の懸濁物を形成することによって接着性細胞培養物から得ることができる。細胞の懸濁物は、浮遊性クラスター、または、細胞のクラスターが成長して、細胞クラスターを形成する本質的には１個１個ばらばらの細胞の懸濁物を含むことができる。
【００６５】
１つの好ましい実施形態によれば、細胞培養物は、細胞懸濁物、好ましくは、懸濁培養物での浮遊性クラスター、すなわち、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）に由来する細胞の凝集物を含む。浮遊性幹細胞の様々な供給源が以前にＷＯ０６／０７０３７０に記載された（これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００６６】
本開示による培養工程は、細胞を１つまたは複数の異なる培養システムによる細胞培養において培養することを含むことができ、そのような培養システムの少なくとも１つがＴＧＦβスーパーファミリーの１つまたは複数のメンバーを含む。
【００６７】
本開示の１つの実施形態によれば、培養における細胞は、増殖因子のＴＧＦβスーパーファミリーの前記１つまたは複数のメンバーに加えて、ＮＡが補充された基礎培地を含む培養システムにおいて培養される。
【００６８】
別の実施形態によれば、細胞が未分化のｈＳＣである場合、細胞は最初に、基礎培地およびＮＡを含む培養システムにおいて培養され、そして、好ましくは、ｈＳＣの分化が誘導された後（すなわち、所定の期間の後、または、細胞の分化をこの技術分野において利用可能な技術によって確認した後）、細胞培養における細胞は、増殖因子のＴＧＦβスーパーファミリーの１つまたは複数のメンバーを含む培養システムにおいて培養される。第２の培養システムもまた、ＮＡを含むことができ、すなわち、最初の培養システムと同じにすることができ、この場合、最初の培養システムに、ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーが加えられる。結果として、ＲＰＥ細胞への導かれた分化が誘導される。
【００６９】
この実施形態によれば、最初の細胞培養におけるｈＳＣは、少なくとも、ｈＳＣの分化が開始するために要求される期間、ＮＡを含む培養システムにおいて培養される。１つの具体的な実施形態によれば、細胞培養システムは、数日間、好ましくは少なくとも２日間にわたって、また、好ましくは少なくとも１週間、より好ましくは少なくとも２週間にわたって、ＮＡを含む培養システムにおいて培養される。
【００７０】
理論によってとらわれることはないが、ＮＡが、自発的分化（すなわち、ＮＡ暴露の非存在下、または、ＴＧＦβのメンバーとの組合せでのＮＡへの暴露の非存在下で生じる自発的分化）と比較されたとき、その進行においてもまた加速される導かれた分化プロセスを誘導することが、本発明者らによって明記される。導かれた分化において、未分化の幹細胞が培養システムからより迅速に除かれることが本明細書において示されている。従って、ＮＡが、導かれた分化プロセスを促進および加速させるための手段として、また、未分化の幹細胞を完全に除き、それにより、潜在的な合併症（例えば、未分化の細胞が移植後に存在することから生じるテラトーマ腫瘍形成）を防止するための手段として、分化し続けるｈＳＣの培養システムにおいて使用される。
【００７１】
ｈＳＣをＮＡにさらし、その後、ＴＧＦβスーパーファミリーの１つまたは複数のメンバーにさらすことにより、自発的に分化し続ける細胞（すなわち、これらの因子の非存在下における自発的に分化し続ける細胞）と比較されたとき、異なる表現型を有する細胞への分化が誘導されることが本明細書において示されている。
【００７２】
さらには、理論によってとらわれることはないが、ＮＡが、ＴＧＦβスーパーファミリーの１つまたは複数のメンバーに対する受容体（これらの受容体は、自発的に分化し続ける幹細胞によって発現されない）を発現する細胞への分化を誘導し、それによって、成熟している機能的なＲＰＥ細胞への導かれた分化を可能にすることが本発明者らによって仮定される。そのような受容体発現は、ＲＰＥの究極的運命に向かう、すなわち、成熟している機能的なＲＰＥ細胞に向かう、培養での分化し続ける細胞の導かれた分化に対するＴＧＦβスーパーファミリーメンバーの誘導作用を可能にする。
【００７３】
上記で示されたように、増殖因子のＴＧＦβスーパーファミリーの様々なメンバーが存在する。例えば、本発明による増殖因子は下記増殖因子の１つまたは複数であり得る：ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、ｎｏｄａｌ、抗ミューラーホルモン（ＡＭＨ）、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７または成長分化因子（ＧＤＦ）。しかしながら、好ましくは、ＴＧＦβスーパーファミリーの増殖因子はＴＧＦβ３またはＴＧＦβ１またはアクチビンＡまたはこれらの組合せである。
【００７４】
本発明による基礎培地は、細胞の成長をインビトロで支えるためにこの技術分野において知られているいずれかの知られている細胞培養培地であり、典型的には、培養での細胞を生存可能な状態で維持するために要求される塩、糖、アミノ酸および何らかの他の栄養分を含む定義された基本溶液を含む培地である。本発明に従って利用することができる市販されている基礎培地の限定されない例には、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）、ＫＯ−ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｃｅｌｌｇｒｏ（商標）幹細胞成長培地またはＸ−Ｖｉｖｏ（商標）が含まれる。基礎培地には、細胞培養を取り扱う技術分野において知られているような様々な作用因を補充することができる。以下は、本開示に従って使用されるために培養システムに含めることができる様々な補充物に対する限定されない言及である：
−  血清または血清代替物含有培地、例えば、ノックアウト血清代替物（ＫＯＳＲ）、Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ−ＣＳ、ＴＣＨ（商標）、Ｎ２、Ｎ２派生物またはＢ２７、あるいは、組合せ（これらに限定されない）；
−  細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分、例えば、フィブロネクチン、ラミニンおよびゼラチン（これらに限定されない）。ＥＣＭは、増殖因子のＴＧＦβスーパーファミリーの１つまたは複数のメンバーを運ぶために使用することができる；
−  抗菌剤、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシン（これらに限定されない）；
−  非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、
−  培養でのＳＣの生存を促進することにおいて役割を果たすことが知られているニューロトロフィン、例えば、ＢＤＮＦ、ＮＴ３、ＮＴ４など（これらに限定されない）。
【００７５】
細胞がＲＰＥの究極的運命に促進されると、ＲＰＥ細胞は、様々な適用における使用のために、様々な知られている方法によって培養から回収し／集めることができる。
【００７６】
本開示はまた、ＴＧＦβスーパーファミリーの１つまたは複数のメンバーの存在下におけるｈＳＣの導かれた誘導によって得られるＲＰＥ細胞を提供する。１つの実施形態によれば、そのようなＲＰＥ細胞が本発明の方法によって得られる。
【００７７】
上記に加えて、本開示による導かれた分化によって産生されるＲＰＥ細胞は、自発的分化の期間中に発達するＲＰＥ細胞との比較において、様々な特異的性質を有する。
−  分化し続ける細胞は、その発達および分化においてＴＧＦβシグナル伝達に対して応答する潜在的能力を有する；
−  得られるＲＰＥ細胞は成熟細胞である（最終分化している）；
−  成熟ＲＰＥ細胞は、自発的分化の期間中に形成されるＲＰＥ細胞との比較において、より濃い色素沈着を呈示する。
−  成熟ＲＰＥ細胞は、自発的分化によって産生されるＲＰＥ細胞におけるそれらの発現と比較して、成熟ＲＰＥ細胞の様々なマーカー（例えば、ベストロフィンおよびＴＰＥ６５）の転写物の著しくより高いレベルを発現する。この関連において、例えば、図９Ｊ、図１１Ｍおよび図１１Ｋが参照され、これらは、ＮＡの存在下での分化と比較して、自発的分化（ＮＡ非存在）におけるベストロフィンの発現を示し（図９Ｊ）、また、導かれた分化に対するアクチビンＡの増強作用を示す（図１１Ｋ、図１１Ｍおよび図４Ｅ）。さらに、図１Ｂおよび図９Ｉが参照され、これらは、ＮＡの存在下での分化と比較して、さらには図４ＤにおけるアクチビンＡの増強作用と比較して、自発的分化（ＮＡ非存在）におけるＲＰＥ６５の発現を示す。
−  電子顕微鏡（ＥＭ）分析において、ＲＰＥ細胞は、自発的に分化し続けるｈＳＣに由来したＲＰＥ様細胞の内部において明らかにされない、成熟している正真正銘のＲＰＥ細胞の様々な形態学的特徴（例えば、先端絨毛、密着結合および基底膜）を呈示する。
【００７８】
本開示の方法によって産生されるＲＰＥ細胞は、そのような細胞の大規模および／または長期間の培養のために使用することができる。この目的のために、本発明の方法は、細胞の大規模産生のために好適であり、かつ、未分化のｈＳＣが本発明に従って培養されなければならないバイオリアクターにおいて行われなければならない。細胞をバイオリアクターにおいて培養するための様々な一般的要件が、この技術分野に精通した当業者には広く知られている。
【００７９】
代替として、本開示の方法によって産生されるＲＰＥ細胞はその誘導の後で拡大することができる。拡大のために、本開示の方法によって産生されるＲＰＥ細胞は解離され、細胞外マトリックス（好ましくは、ポリ−Ｄ−リシンおよびラミニン）上に低密度で置床され、ＮＡを伴う血清非含有ＫＯＭにおいて培養される。これらの培養条件下で、色素沈着細胞は色素沈着を失い、類線維様の形態学を獲得する。さらに長期にわたる培養、および、高密度培養物への増殖の後、細胞はＲＰＥ細胞の特徴的な多角形形状の形態学および色素沈着を再獲得する。
【００８０】
ＲＰＥ細胞は、懸濁状態で、または、単層物で拡大することができる。単層培養物でのＲＰＥ細胞の拡大は、この技術分野に精通した当業者には広く知られている方法によってバイオリアクターでの大規模な拡大に変更することができる。
【００８１】
ＲＰＥ細胞をｈＳＣから得ることが非常に有益であることが、この技術分野に精通した当業者によって理解される。ＲＰＥ細胞を、その生存、再生および機能を促進するための新しい薬物を開発するためのインビトロモデルとして使用することができる。ｈＳＣ由来ＲＰＥ細胞は、ＲＰＥ細胞に対して毒性作用または再生作用を有する化合物についてのハイ・スループット・スクリーニングのために役立ち得る。ＲＰＥ細胞は、光受容体細胞の発達、分化、維持、生存および機能のために重要である機構、新しい遺伝子、可溶性または膜結合型の因子を発見するために使用することができる。
【００８２】
ＲＰＥ細胞はまた、様々な網膜変性における正常に機能しないまたは変性したＲＰＥ細胞の移植、補充および支援のためのＲＰＥ細胞の無限の供給源として役立ち得る。さらに、遺伝子改変されたＲＰＥ細胞が、遺伝子を運び、その遺伝子を移植後の眼および網膜において発現させるためのベクターとして役立ち得る。
【００８３】
従って、本開示のさらなる態様によれば、ＲＰＥ細胞を対象の眼に移植する方法が提供され、この方法は、
（ａ）ｈＳＣを含む細胞培養物を提供すること；
（ｂ）細胞を、ＴＧＦβスーパーファミリーの１つまたは複数のメンバーが補充された基礎培地を含む培養システムにおいて培養し、それにより、ｈＳＣが、ＲＰＥ細胞への分化を促進されること；
（ｃ）前記細胞培養物からＲＰＥ細胞を集めること；および
（ｄ）前記分化したＲＰＥ細胞を前記対象の眼に移植すること
を含む。
【００８４】
細胞を集めることを、この技術分野において知られている様々な方法によって行うことができる。限定されない例には、機械的解体、および、パパインによる解離が含まれる。この技術分野において知られている他の方法もまた適用可能である。
【００８５】
ｈＳＣ由来ＲＰＥ細胞を対象の眼の内部において様々な標的部位に移植することができる。１つの実施形態によれば、ＲＰＥ細胞の移植は、ＲＰＥの正常な解剖学的存在位置（光受容体外側セグメントと脈絡膜との間）である眼の網膜下腔に対してである。加えて、細胞の遊走能および／または正のパラクリン作用に依存して、眼のさらなる区画への移植を検討することができ、そのような区画には、硝子体腔、内側網膜または外側網膜、網膜周辺部および脈絡膜内が含まれる。
【００８６】
さらに、移植を、この技術分野において知られている様々な技術によって行うことができる。ＲＰＥ移植を行うための様々な方法が、例えば、米国特許第５９６２０２７号、同第６０４５７９１号および同第５９４１２５０号において、また、Ｅｙｅ  Ｇｒａｅｆｅｓ  Ａｒｃｈ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、１９９７（３月）、２３５（３）：１４９〜５８；Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ、２０００（２月２４日）、２６８（３）：８４２〜６；Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｓｕｒｇ、１９９１（２月）、２２（２）：１０２〜８において記載される。角膜移植を行うための様々な方法が、例えば、米国特許第５７５５７８５号において、また、Ｅｙｅ、１９９５、９（Ｐｔ  ６  Ｓｕ）：６〜１２；Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  １９９２（８月）、３（４）：４７３〜８１；Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｓｕｒｇ  Ｌａｓｅｒｓ  １９９８（４月）、２９（４）：３０５〜８；Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ２０００（４月）、１０７（４）：７１９〜２４；および、Ｊｐｎ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  １９９９（１１月〜１２月）、４３（６）：５０２〜８において記載される。主としてパラクリン作用が利用されることになるならば、細胞はまた、宿主免疫系に対する細胞の暴露もまた低下させる半透過性容器の中にカプセル化されて送達され、眼に維持される場合がある（Ｎｅｕｒｏｔｅｃｈ  ＵＳＡ  ＣＮＴＦ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ；ＰＮＡＳ  ２００６（３月７日）、第１０３（１０）巻、３８９６〜３９０１）。
【００８７】
１つの実施形態によれば、移植が、毛様体輪（ｐａｒｓ  ｐａｎａ）硝子体切除手術、その後での、小さい網膜開口部を介する網膜下腔への細胞の送達によって、または、直接的な注入によって行われる。代替として、細胞を経強膜的かつ経脈絡膜的な方法によって網膜下腔に送達することができる。加えて、硝子体腔内への直接的な経強膜注入、または、毛様体の近くにおける前部網膜周辺部への送達を行うことができる。
【００８８】
ＲＰＥ細胞を様々な形態で移植することができる。例えば、ＲＰＥ細胞を細胞懸濁物の形態で標的部位に導入することができ、あるいは、マトリックス、細胞外マトリックスもしくは基体（例えば、生分解性ポリマー）、または、組合せに付着させることができる。ＲＰＥ細胞はまた、他の網膜細胞と一緒に、例えば光受容体と一緒に移植することができる（共移植）。
【００８９】
従って、本発明はまた、本発明の方法によって得られるｈＳＣ由来ＲＰＥ細胞を含む組成物に関連する。組成物は好ましくは、眼への移植のために好適なそのような組成物である。
【００９０】
様々な眼の状態を、本発明の方法によって得られるＲＰＥ細胞を対象の眼に導入することによって処置または防止することができる。そのような眼の状態には、網膜の機能異常、網膜の傷害および／または網膜色素上皮の喪失を一般に伴う網膜の疾患または障害が含まれ得る。本発明に従って処置することができる状態の限定されない列挙には、色素性網膜炎、レーバー先天性黒内障、遺伝性または後天性の黄斑変性、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、ベスト病、網膜剥離、脳回転状萎縮症、コロイデレミア、ＲＰＥのパターンジストロフィー、同様にまた、ＲＰＥの他のジストロフィー、シュタルガルト病、光傷害、レーザー傷害、炎症性傷害、感染性傷害、放射線傷害、血管新生傷害または外傷性傷害のいずれか１つによって引き起こされる損傷に起因するＲＰＥ損傷および網膜損傷が含まれる。
【００９１】
理論によってとらわれることはないが、移植されたＲＰＥ細胞は、多数の機構を介してその治療的作用を発揮することができる。１つの機構が、網膜内の変性しつつある光受容体または他の細胞の生存を促進する栄養支援作用である。本開示の方法によって、かつ、ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーの存在下でｈＳＣに由来するＲＰＥ細胞は、ＲＰＥ細胞に隣接する光受容体を潜在的には栄養作用によって保つことができる。
【００９２】
移植されたＲＰＥ細胞はまた、正常に機能しない宿主ＲＰＥ細胞および／または変性しつつある宿主ＲＰＥ細胞を補充する再生機構を介してその作用を発揮することができる。本開示の方法によって、かつ、ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーの存在下でｈＳＣに由来するＲＰＥ細胞は、正常に機能しない宿主ＲＰＥ細胞を補充することができる。移植されたＲＰＥ細胞は成熟しており、ロドプシンを含む光受容体の脱落した外側セグメントの食作用の機能的能力を有する。
【００９３】
上記で述べられたように、本開示の方法によって、かつ、ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーの存在下でｈＳＣに由来するＲＰＥ細胞は成熟しており、そのようなものとして、移植後、インビボで増殖しない。従って、本開示の方法によってｈＳＣに由来するＲＰＥ細胞は移植治療のためにより安全であり、テラトーマ腫瘍、または、増殖する前駆体細胞の腫瘍に発達することについての低下した危険性を有する。
【００９４】
本明細書で使用される場合、用語「処置する（治療する）」または「処置（治療）」は、対象の眼の状態に対する本発明のｈＳＣ由来ＲＰＥ細胞の治療的作用ならびに予防的作用を示し、そのような作用には、一般に、状態に関連する症状の改善、重篤度を軽減すること、または、状態を治癒させることを含むことができ、より具体的には、そのような作用には、処置された患者の網膜およびＲＰＥに対して引き起こされる損傷の逆戻り、対象の網膜の改善された機能、宿主の失われつつある網膜細胞およびＲＰＥ細胞の置換および／または支援によるか、あるいは、直接的またはパラクリン作用による対象の網膜およびＲＰＥの再建、同様にまた、状態の結果として対象の網膜に対して引き起こされる損傷における弱化、阻害または中断によって示され得る予防的作用が含まれ得る。
【００９５】
本明細書および請求項において使用される場合、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」の形態は、文脈が明確にそうでないことを示さない限り、単数の参照物、同様にまた、複数の参照物を包含する。例えば、用語「増殖因子（ａ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）」は１つまたは複数の増殖因子を包含し、用語「増殖因子（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ）」は、２つ以上の増殖因子だけでなく、１つの増殖因子を包含する。
【００９６】
本明細書で使用される場合、用語「または（あるいは、もしくは）」は、列挙された選択肢の１つまたは２つ以上の組合せを意味する。さらに、用語「および（ならびに）」によって分けられる選択肢の列挙が続く表現「・・・から選択される」の使用は、列挙された選択肢の１つまたは２つ以上の組合せを包含する。
【００９７】
さらに、本明細書で使用される場合、用語「含む」は、方法または組成物が、列挙された構成要素を含み、しかし、他の構成要素を排除しないことを意味することが意図される。同様に、「から本質的になる」は、列挙された構成要素を含むが、本発明の培養システムの機能性に対する本質的な重要性を有し得る他の構成要素を除外する方法およびシステムを規定するために使用される。例えば、基礎培地、培地補充物およびフィーダー細胞から本質的になる培養システムは、細胞に対する影響を培養において有する他の物質の微々たる量（細胞の拡大培養および分化に対する微々たる影響を培養システムにおいて有する量）を含まないか、または、細胞に対する影響を培養において有する他の物質のほんの微々たる量（細胞の拡大培養および分化に対する微々たる影響を培養システムにおいて有する量）を含むだけである。また、本明細書で定義されるような構成要素から本質的になる組成物は、単離方法および精製方法に由来する微量の混入物を除外しない。「からなる」は、微量を超える量の他の構成要素を除外することを意味するものとする。これらの変遷用語のそれぞれによって規定される様々な実施形態が本発明の範囲内である。
【００９８】
さらに、すべての数値（例えば、濃度または用量、あるいは、それらの範囲）は、述べられた値から２０％に至るまで、時には１０％に至るまで（＋）または（−）で変化する概略値である。必ずしも常に明示的に述べられないとしても、すべての数値的指示には用語「約」が先行することを理解しなければならない。必ずしも常に明示的に述べられないが、本明細書に記載される試薬は単に例示であること、および、そのような試薬の同等物がこの技術分野では知られていることを理解しなければならない。
【００９９】
いくつかの例示的な実施形態
材料および方法
ｈＥＳ細胞培養
ｅＧＦＰを構成的に発現するようにレンチウイルスベクターによって操作されたヒトＥＳＣ（ＨＥＳ１細胞株）およびｈＥＳＣ［Ｇｒｏｐｐ  Ｍ、Ｉｔｓｙｋｓｏｎ  Ｐ、Ｓｉｎｇｅｒ  Ｏ、Ｂｅｎ−Ｈｕｒ  Ｔ、Ｒｅｉｎｈａｒｔｚ  Ｅ、Ｇａｌｕｎ  ＥおよびＲｅｕｂｉｎｏｆｆ  ＢＥ、Ｓｔａｂｌｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：２８１〜７（２００３）］を、８６％のＫＯ−ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、１４％のＫＯＳＲ（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのグルタミン、１％の非必須アミノ酸、５０ユニット／ｍｌのペニシリン（Ｇｉｂｃｏ）、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）および４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）からなるＫＯ培地（ＫＯＭ）においてヒト包皮線維芽細胞フィーダー層の上で培養した。ｈＥＳ細胞をＩＶ型コラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ；Ｇｉｂｃｏ）とともに毎週継代培養し、新鮮なフィーダー層に置床した。分化を誘導する１週間前に、細胞を、０．０５％のＥＤＴＡ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）が補充されたＣａ／Ｍｇ＋＋非含有ＰＢＳによるほぼ１個１個ばらばらの細胞の懸濁物への解離によって継代し、フィーダーに再置床した。
【０１００】
懸濁培養でのＥＢ形成
上記のように１個１個ばらばらの細胞に解離されたｈＥＳ細胞を置床した後６日〜８日で、細胞をＩＶ型コラゲナーゼによる処理によってフィーダーから除いた。凝集塊を、８６％のＫＯ−ＤＭＥＭ、１４％のＫＯＳＲ、１ｍＭのグルタミン、１％の非必須アミノ酸、５０ユニット／ｍｌのペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンからなるＫＯ培地（ＫＯＭ）において、０．１％の低融解温度アガロースにより事前に被覆された細菌学用ディッシュの内部における懸濁状態で１２週間までの様々な期間、１０ｍＭのニコチンアミド（ＮＡ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）の存在下または非存在下で培養した。いくつかの実験では、使用された培地は、Ｎ２補充物（１：１００）（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地（Ｇｉｂｃｏ）であり（ＮＮ培地）、この培地は、１週間後、Ｂ２７（１：５０）（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）で置き換えられた。
【０１０１】
ＴＧＦ−β増殖因子または阻害剤の存在下におけるｈＥＳＣのＲＰＥ細胞への分化
ヒトＥＳＣを、ニコチンアミド（ＮＡ）１０ｍＭの存在下、６週間までの期間、上記のようなＫＯＭにおいて浮遊性クラスターとして分化させた。分化の最初の１週間または２週間の後、培養物には、アクチビンＡ（２０ｎｇ／ｍｌ〜１８０ｎｇ／ｍｌ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  Ｉｎｃ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）、ＴＧＦβ３（１ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、ＴＧＦβ１（１ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ）またはＳＢ４３１５４２（５μＭ〜５０μＭ、Ｓｉｇｍａ）を補充した。コントロール培養物には、ＮＡだけを補充した。
【０１０２】
ＫＯＭにおける懸濁状態にあるヒトＥＳＣにはまた、１週間後、ＮＡの存在下または非存在下で、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）アンタゴニストのｎｏｇｇｉｎ（７００ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を補充したか、あるいは、第３週および第４週の期間中に、ＮＡの存在下で、ＦＧＦβ（２０ｎｇ／ｍｌ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  Ｉｎｃ）を補充し、ＫＯＭにおける懸濁状態にあるヒトＥＳＣを懸濁状態において浮遊性クラスターとして第６週まで分化させた。
【０１０３】
ＲＰＥ細胞の拡大の説明
ＲＰＥ細胞を拡大するために、色素沈着クラスターを小さい凝集塊に穏やかに機械的に解離し、ポリ−Ｄ−リシン（３０ｋＤａ〜７０ｋＤａ、１０μｇ／ｍｌ）およびラミニン（４μｇ／ｍｌ）上に低密度で置床し、ＮＡを伴うＫＯＭにおいて培養した。これらの培養条件下で、色素沈着細胞は色素沈着を失い、類線維様の形態学を獲得した。１．５ヶ月間のさらなる培養、および、高密度培養物への増殖の後、細胞はＲＰＥ細胞の特徴的な多角形形状の形態学および色素沈着を再獲得した。
【０１０４】
免疫染色およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを、下記で記載されるように、すべての培養物に対して行った。
【０１０５】
クラスター内の分化した細胞の間接的免疫蛍光染色
凝集物内の細胞の免疫表現型を特徴づけるために、２週間、４週間、６週間または８週間にわたって培養されたクラスターを、０．０４％トリプシン／０．０４％ＥＤＴＡによるか、または、パパイン解離システム（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ）によるかのどちらかで穏やかに解離し、得られた小さい凝集塊および１個１個ばらばらの細胞を、ポリ−Ｄ−リシン（３０ｋＤａ〜７０ｋＤａ、１０μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌ）だけの上でＮＡが補充されたＫＯＭ培地、あるいは、ラミニン（４μｇ／ｍｌ）またはフィブロネクチン（１０μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌ）のどちらかが補充されたＫＯ培地において置床した（すべてをＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）から得た）。細胞を２時間後に４％パラホルムアルデヒドにより固定処理し、ネスチン（１：２００）、ポリシアル酸ＮＣＡＭ（ＰＳＡ−ＮＣＡＭ）（１：１００）、Ｍｕｓａｓｈｉ（１：２００）（すべてをＣｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）から得た）、Ｐａｘ６（ＤＳＨＢ、１：１００、または、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、１：２５０）、Ｏｔｘ２（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、１：２００）、ＭｉＴＦ（Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）；マウスＩｇＧ１、１：５０）の発現について調べた。
【０１０６】
色素沈着細胞の富化調製物の免疫染色のために、分化を８週間〜１０週間行わせた浮遊性凝集塊の内部における細胞の色素沈着（褐色）クラスターを機械的に解体し、ガラス性マイクロピペットまたは手術用メスの刃（Ｎｏ．１５、Ｓｗａｎｎ−Ｍｏｒｔｏｎ  Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ、英国）によって単離した。
【０１０７】
色素沈着細胞について富化された単離クラスターをさらに、トリプシン（０．０２５％、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＰＢＳ中）消化またはパパイン解離（パパイン解離システム；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）の助けを用いて／用いることなく、磨砕によって機械的に解離して、より小さい凝集塊にした。細胞の小さいクラスターを、ポリ−Ｄ−リシン（３０ｋＤａ〜７０ｋＤａ、１０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）が被覆され、かつ、ラミニン（４μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）が被覆されたガラス製カバースリップに置床し、ｈＥＳＣクラスターの懸濁培養のために使用される培養培地においてさらに３週間〜５週間培養した。成長物内の分化した細胞を、室温で３０分間、４％パラホルムアルデヒドにより固定処理した。抗細胞内マーカー抗体による免疫染色のために、細胞膜を、３０分間、正常ヤギ血清（５％、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）がブロッキング処理のために補充されたＰＢＳにおける０．２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）により透過処理した。細胞を下記の一次抗体とインキュベーションした：抗ＭｉＴＦ（Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ；マウスＩｇＧ１、１：５０）、抗ＲＰＥ６５（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ；マウスＩｇＧ１、１：３００）、抗ベストロフィン（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ；マウスＩｇＧ１、１：１５０）、抗ＺＯ−１（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ；ウサギポリクローナル、１：１０）、抗Ｋｉ６７（Ｄａｋｏ  Ｄｅｎｅｍａｒｋ  Ａ／Ｓ；１：５０）および抗ＣＲＡＬＢＰ（Ｊｏｈｎ  Ｃ．Ｓａａｒｉ（ワシントン大学（Ｓｅａｔｔｌｅ）からの譲渡物；ウサギポリクローナル、１：１００）。細胞はまた、ファロイジン（１：２００、Ｓｉｇｍａ）とインキュベーションした。
【０１０８】
一次抗体の所在確認を、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）コンジュゲート化ヤギ抗マウス免疫グロブリン（Ｄａｋｏ  Ｄｅｎｍａｒｋ  Ａ／Ｓ；１：２０〜１：５０）、Ｃｙ（商標）３にコンジュゲート化されたヤギ抗マウスＩｇＧ（１：５００）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）、Ｃｙ２にコンジュゲート化されたウサギ抗ヤギＩｇＧ（１：２００；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ）、および、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）にコンジュゲート化されたブタ抗ウサギＩｇ（Ｄａｋｏ；１：５０）を使用することによって行った。
【０１０９】
ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲによるｈＥＳＣクラスターの分析
総ＲＮＡを、血清非含有条件下で成長させたｈＥＳＣから抽出し（継代後１週間）、また、ｈＥＳＣ由来クラスターを、１０ｍＭのニコンチンアミドの存在下または非存在下、および、ＴＧＦβスーパーファミリー増殖因子またはアンタゴニストによる補充を伴って、または、そのような補充を伴うことなく培養している期間中に８週までの連続する時点で抽出した。ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）またはＴＲＩ−Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ）を使用して単離した。ｃＤＮＡ合成を、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴ）およびランダムプライマーを製造者の説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ）に従って使用して行った。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いた標準的なプロトコルを使用して行った。増幅条件は下記の通りであった：９４℃での１５秒間の変性、５５℃での３０秒間のアニーリングおよび７２℃での４５秒間の伸長。サイクル数は、具体的なｍＲＮＡ存在量に依存して、１８回〜４０回の間で変化した。ヒト遺伝子転写物を特定するためのプライマーヒト配列（フォワードおよびリバース、５’−３’）および増幅生成物の長さは下記の通りであった（配列番号１〜配列番号１２）：
ＭｉＴＦ−Ａ（ＧＡＧＣＣＡＴＧＣＡＧＴＣＣＧＡＡＴ，ＧＡＣＡＴＧＧＣＡＡＧＣＴＣＡＧＧＡＣＴ；４８６ｂｐ）；
ＲＰＥ６５（ＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＧＧＡＴＴＴＧＡＧ，ＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＣＣＡＧＡＴＡＧＴＣ；２３１ｂｐ）；
ベストロフィン（ＧＡＡＴＴＴＧＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＴ，ＡＴＣＣＴＣＣＴＣＧＴＣＣＴＣＣＴＧＡＴ；２１４ｂｐ）；
ＣＲＡＬＢＰ（ＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＴＧＡＧＧＡＡ，ＣＡＡＧＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＣＣＡＣＡＴ；２１８ｂｐ）；
ＭＥＲＴＫ（ＡＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＧＣＡＴＴＴＧ，ＴＣＴＡＡＧＧＧＡＴＣＧＧＴＴＣＴＣＣＡ，１８９ｂｐ）；
ＡＣＴＲＩＡ（ＡＡＴＧＴＴＧＣＣＧＴＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣ，ＣＴＧＡＧＡＡＣＣＡＴＣＴＧＴＴＧＧＧＴＡ；６９９ｂｐ）；
ＡＣＴＲＩＢ（ＣＡＣＧＴＧＴＧＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＧ，ＧＧＣＧＧＴＴＧＴＧＡＴＡＧＡＣＡＣＧ；３４６ｂｐ）；
ＡＣＴＲＩＩＡ（ＡＡＣＣＡＴＧＧＣＴＡＧＡＧＧＡＴＴＧＧＣ，ＣＴＴＴＣＡＣＣＴＡＣＡＣＡＴＣＣＡＧＣＴＧ；５５１ｂｐ）；
ＡＣＴＲＩＩＢ（ＣＡＣＣＡＴＣＧＡＧＣＴＣＧＴＧＡＡＧ，ＧＡＧＣＣＣＴＴＧＴＣＡＴＧＧＡＡＧＧ；６１１ｂｐ）；
アクチビンＡ（ＣＴＴＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＣＣＣＧＡＴ；ＣＴＴＣＴＧＣＡＣＧＣＴＣＣＡＣＣＡＣ；２６２ｂｐ）；
β−アクチン（ＴＴＣＡＣＣＡＣＣＡＣＧＧＣＣＧＡＧＣ，ＴＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＡＴＣＣＴＧＴＣＧ；３５１ｂｐ）；
ＧＡＰＤＨ（ＡＧＣＣＡＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣＣ；ＧＴＡＣＴＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＡＴＣＧ；３０１ｂｐ）。
【０１１０】
リアルタイムＰＣＲのために、転写物のレベルを、市販されているＴａｑＭａｎ（登録商標）Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）に由来するＴａｑＭａｎプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブを使用してモニターした：Ｏｃｔ４、ＩＤ  Ｈｓ０１８９５０６１；Ｍｕｓａｓｈｉ、ＩＤ  Ｈｓ０１０４５８９４；Ｐａｘ６、ＩＤ  Ｈｓ００２４０８７１；Ｓｉｘ３、ＩＤ  Ｈｓ００１９３６６７；Ｒｘ１、ＩＤ  Ｈｓ００４２９４５９；Ｃｈｘ１０、ＩＤ  Ｈｓ０１５８４０４８；ＭｉＴＦ−Ａ、ＩＤ  Ｈｓ０１１１５５５３；総ＭｉＴＦ、ＩＤ  Ｈｓ０１１１５５５７；ベストロフィン、ＩＤ  Ｈｓ００１８８２４９；ＲＰＥ６５、ＩＤ  Ｈｓ００１６５６４２；Ｓｏｘ１０、ＩＤ  Ｈｓ００３６６９１８；Ｃｒｘ、ＩＤ  Ｈｓ００２３０８９９。定量的ＰＣＲ分析を、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７０００ＨＴ配列検出システムおよびＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７９００ＨＴ配列検出システムならびにＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造者のプロトコルに従って使用して行った。ハウスキーピング遺伝子のβ−グルクロニダーゼ（ＧｕｓＢ、アッセイＩＤ  Ｈｓ９９９９９９０８）をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ定量分析における正規化のための内部基準として選択した。それぞれの遺伝子の相対的な発現レベルが、０日目（または非処理細胞）の発現レベルが１で設定されたときの相対値として示される。増幅反応を製造者のプロトコル（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って二連または三連で行った。
【０１１１】
透過電子顕微鏡観察およびラテックスビーズの食作用
ヒトＥＳＣ由来クラスターをＫＯＭにおける懸濁状態で培養した。その後、色素沈着領域を機械的に分離し、透過電子顕微鏡観察のために処理した。細胞を０．１Ｍカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．４）における２％グルタルアルデヒドおよび４％ホルムアルデヒドにより固定処理した。０．１Ｍカコジル酸緩衝液で３回洗浄した後、組織を１％四酸化オスミウムおよび１．５％フェリシアン酸カリウムにより後固定処理し、増大する濃度のエタノールにより脱水し、Ａｇａｒ１００樹脂に包埋した。ＬＫＢウルトロトーム３によって切断された極薄切片を酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛により染色した。顕微鏡写真を、ＭｅｇａｖｉｅｗＩＩ  ＣＣＤカメラおよびＡｎａｌｙｓｉｓ（バージョン３．０）ソフトウエア（Ｓｏｆｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｏｆｔ−ｉｍａｇｉｎｇ．ｃｏｍ）を備えるＴｅｃｎａｉ１２電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ、Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ、オランダ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｈｉｌｉｐｓ．ｃｏｍ）を用いて撮影した。
【０１１２】
食作用能を調べるために、色素沈着クラスターを、１ｍＬあたり１．０×１０９個のビーズの濃度において１μｍのラテックスビーズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）と３７℃で１８時間インキュベーションした。その後、色素沈着クラスターをＰＢＳ＋により洗浄し、パパイン解離システムを使用して１個１個ばらばらの細胞または小さい凝集塊に解離し、ポリ−Ｄ−リシンの上に置床した。固定処理の後、細胞の膜を赤色蛍光色素ＰＫＨ（Ｓｉｇｍａ）により染色した。食作用を、共焦点顕微鏡（Ｐｌｙｍｐｕｓ  Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  ＦＶ１０００）を使用して分析した。
【０１１３】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリー分析を、ニコチンアミド補充の存在下または非存在下で分化するｈＥＳＣ由来クラスターの内部における様々な時点でのＰＳＡ−ＮＣＡＭ陽性細胞およびＴＲＡ−１−６０陽性細胞の数を求めるために行った。クラスターを０．０４％トリプシン／０．０４％ＥＤＴＡにより解離した。その後、１個１個ばらばらの細胞を抗ＰＳＡ−ＮＣＡＭ抗体または抗Ｔｒａ−１−６０抗体（ともにＣｈｅｍｉｃｏｎから得られる；１：１００）により染色し、ＦＩＴＣにコンジュゲート化されたヤギ抗マウス免疫グロブリン（Ｄａｋｏ；１：１００）により検出し、細胞生死判別用色素のヨウ化プロピジウム（０．００５ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）により対比染色した。コントロール細胞は二次抗体とのみインキュベーションしただけであった。細胞に関連する免疫反応性を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエアを使用して、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により分析した。
【０１１４】
ｈＥＳＣ由来の分化したＲＰＥ細胞の硝子体内移植および網膜下移植
眼内移植のために、ｅＧＦＰを発現するように操作されたｈＥＳＣ［これは、Ｇｒｏｐｐ他、Ｓｔａｂｌｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２００３、７：２８１〜７において既に記載された通りである］を使用して、ＲＰＥ細胞を上記で記載されるように培養において作製した。簡単に記載すると、色素沈着細胞に関して富化されたクラスターを、ＮＡだけの存在下、または、アクチビンＡが補充されたＮＡの存在下での６週間〜８週間の分化の後で切り分けることによって機械的に単離した。小さい内径のガラスキャピラリーによる注入を可能にするために、凝集塊をさらに、３７℃での３０分間のパパインによる消化（パパイン解離システム；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）、それに続く磨砕によって細胞のより小さいクラスターに解離した。
【０１１５】
１５匹の成体シロネズミ（体重、２３０ｇ〜２５０ｇ）および１００匹を超える１週齢〜３週齢の異系交配されたジストロフィー性ＲＣＳラットを眼内移植のために使用した。ＲＣＳラットでは、Ｍｅｒｔｋ遺伝子における変異により、出生後数ヶ月の間に網膜変性につながるＲＰＥ機能異常が引き起こされる。すべての動物実験が、ＡＲＶＯ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｉｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  ａｎｄ  Ｖｉｓｉｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈに従って行われ、Ｈｅｂｒｅｗ大学Ｈａｄａｓｓａｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌの動物研究のための施設内委員会によって承認された。
【０１１６】
移植のために（同様にまた、網膜電図記録法による記録のために）、動物を、弛緩剤のキシラジン（２．０ｍｇ／ｋｇ）との組合せで腹腔内注射されたケタミンＨＣｌ（Ｋｅｔａｌａｒ、Ｐａｒｋｅ  Ｄａｖｉｓ、英国；１００ｍｇ／ｋｇ）により麻酔した。局所麻酔点滴（ベノキシナートＨＣｌ、０．４％；Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、イスラエル）を投与した。瞳孔をトロピカミド（０．５％）（Ｍｙｄｒａｍｉｄｅ、Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、イスラエル）およびフェニレフリンＨＣｌ（２．５％）（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、イスラエル）により散大させた。解剖顕微鏡（Ｓｔｅｍｉ  ＳＶ１１、Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）で見ながら、４μＬの培地におけるおよそ１０００００個の細胞を硝子体腔の中に注入し、または、空気圧式Ｐｉｃｏ−ｉｎｊｅｃｔｏｒ（ＰＬＩ−１００；Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃｏｒｐ．、Ｇｒｅｅｎｖａｌｅ、ＮＹ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｄｉｃａｌｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ）に接続されたガラスキャピラリーによる経強膜的かつ経脈絡膜的な方法によって網膜下腔の中に注入した。注入されていない他眼は１つのタイプのコントロールとして役立った。さらなるコントロールとして、眼には、生理的食塩水（注射用塩化ナトリウムＢＰ、０．９％、Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ  ＡＧ、Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ、ドイツ）が注入された。
【０１１７】
注入期間中および注入後において、脈絡膜の出血が全く認められなかった。動物を、加熱用ランプを使用して、手技の間中およびその後、暖かく保った。移植後、すべての動物が免疫抑制剤のシクロスポリンＡ（Ｓａｎｄｉｍｍｕｎｅ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ  ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、スイス）を２１０ｍｇ／ｌの濃度でそれらの飲み水において受けた。
【０１１８】
移植された細胞のインビボおよびエクスビボ画像化
移植された細胞のインビボでの生存および存在位置をモニターするために、麻酔した動物を、カラー眼底カメラ（Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）を使用して画像化し、また、ＧＦＰ発現細胞の蛍光を、フルオレセインフィルターを走査型レーザー検眼鏡（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  ＨＲＡ、ドイツ）で使用して検出した。いくつかの眼では、ＧＦＰ陽性移植片の存在位置がまた、蛍光顕微鏡（Ｃａｎｏｎ、日本）を使用してアイカップ調製物においてエクスビボで求められた。
【０１１９】
ｈＥＳＣ由来ＲＰＥ細胞を眼内移植した後での宿主網膜機能の評価
移植後４週間〜６週間で、網膜機能を、網膜電図記録法（ＥＲＧ）によって、移植を受けたＲＣＡラット眼およびコントロールのＲＣＳラット眼において評価した。全範囲ＥＲＧを一晩の暗順応の後で記録した。動物を薄暗い赤色光においてケタミンおよびキシラジンにより麻酔し、瞳孔をトロピカミドおよびフェニレフリンにより散大させた。単極のラットＥＲＧレンズ電極（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、オランダ）をさらなる局所麻酔の後でそれぞれの眼に設置し、参照電極および接地電極を舌および尾にそれぞれ設置した。市販のコンピューター化ＥＲＧシステム（ＬＫＣ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＴＡＳ３０００）を使用して、Ｇａｎｚｆｅｌｄボウルに取り付けられたキセノンのフォトストロボ閃光（Ｇｒａｓｓ、ＰＳ−２２）を使用して発生させられた全範囲刺激に対する網膜の応答を記録した。暗順応条件下での薄暗い青色閃光を、主として杆体駆動による応答を誘発するために使用した。青色のより強い刺激強度において、また、暗順応した状態での白色閃光を用いて、混合型の錐体−杆体の応答を記録した。明順応した条件（明順応条件）下では、杆体を抑制する３４ｃｄ／ｍ２の白色バックグラウンドにおける白色閃光により、１Ｈｚおよび１６Ｈｚの錐体応答が生じた。シグナルを０．３Ｈｚ〜５００Ｈｚの間でフィルター処理し、シグナル平均化を使用した。
【０１２０】
移植を受けた眼の組織学的および免疫組織化学的評価
動物を移植後４週間〜８週間で屠殺し、眼を組織学的検査および免疫組織化学的検査のために摘出した。Ｄａｖｉｄｓｏｎ溶液における固定処理の後、眼をパラフィンに包埋し、４μｍの連続切片で切片化した。それぞれの５番目のスライドを組織形態学的な評価および定量のためにヘマトキシリンおよびエオシンにより染色した。間接的免疫蛍光研究については、移植された細胞の分化の状態を特徴づけるために、標本をキシレンにおいて脱パラフィン化し、段階的なアルコールにおいて脱水し、リン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）により洗浄し、１０ｍＭクエン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）と１１０℃で４分間インキュベーションした。ＰＢＳにより洗浄した後、標本を、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および３％の正常ヤギ血清または正常ロバ血清を含有するＰＢＳ溶液により室温で１時間ブロッキング処理した。続いて、切片を下記の一次抗体の適切な組合せと加湿チャンバーで１時間インキュベーションした：フルオレセイン（ＦＩＴＣ）またはローダミン（ＴＲＩＴＣ）とコンジュゲート化された抗緑色蛍光タンパク質（抗ＧＦＰ）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ；マウスモノクローナル、１：１００）；抗ＲＰＥ６５（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ；マウスＩｇＧ１、１：１００）；抗ベストロフィン（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ；マウスＩｇＧ１、１：１００）；抗ＺＯ−１（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ；ウサギポリクローナル、１：１００）；および抗ロドプシン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ；ウサギポリクローナル、１：１００）。一次抗体の所在確認を、ＰＢＳで洗浄した後、Ｃｙ（商標）２コンジュゲート化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：２００）、Ｃｙ（商標）２コンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：２００）、Ｃｙ（商標）３コンジュゲート化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：２００）、Ｃｙ（商標）２コンジュゲート化ロバ抗マウスＩｇＧ（１：２００）、Ｃｙ（商標）５コンジュゲート化ロバ抗ウサギＩｇＧ（１：２００；すべてが、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡから得られる）を使用することによって行った。核を、４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を含有する固定用培地（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）により、または、ヨウ化プロピジウム（１μｇ／ｍｌ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）により対比染色した。抗原−抗体反応の特異性を明らかにするために、関連性のないイソ型と一致させた抗体による対応する陰性コントロールを行った。ＤＰ７０デジタルカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ、日本）を備えるＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ４１顕微鏡を、蛍光顕微鏡画像化および光学顕微鏡画像化のために使用した。共焦点像を、ＩＸ７０倒立型顕微鏡の周りに組み立てられたＯｌｙｍｐｕｓ  Ｆｌｕｏｖｉｅｗ３００（ＦＶ３００）共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、日本）で集めた。４８８ｎｍのＡｒレーザー、５４３のＨｅＮｅ緑色レーザーおよび６３３のＨｅＮｅ赤色レーザーをＮｏｍａｒｓｋｉ光学系との組合せで使用した。
【０１２１】
ＲＰＥ移植片の近傍における光受容体層救済の定量
変性しつつある宿主網膜に対するｈＥＳＣ由来ＲＰＥの移植の影響を定量化するために、ヘマトキシリンおよびエオシンにより染色された切片の高分解能顕微鏡像を得て、網膜の全長の合成写真を、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウエア（Ａｄｏｂｅ、米国）を使用して構築した。網膜全体の厚さ、外顆粒層（光受容体層）の厚さ、ならびに、内側セグメント層および外側セグメント層の厚さを、Ｊ−ｉｍａｇｅプログラム（ＮＩＨ）を使用してｈＥＳＣ由来ＲＰＥ細胞の網膜下移植片の近くで測定した。これらを、移植片から離れた網膜の対応する反対側で得られた測定値と比較した。ＲＣＳラットにおける変性プロセスは場所に依存するので、厚さを、毛様体から等しい距離にある領域において測定した。それぞれの領域において、少なくとも３つの等間隔での測定値を平均化した。
【０１２２】
結果
分化したＲＰＥの特徴づけ
ｈＥＳＣの分化を、ｈＥＳＣを、ＮＡが補充されたＫＯ培地において浮遊性クラスターとして培養することによって誘導した。これらの培養条件下で、色素沈着細胞について非常に富化される定義された領域が、図３Ａに示されるように、分化し続けるクラスターの内部において発達した。これらの色素沈着領域が４週間の分化の後で現れ、８週間後、クラスターの７２．９±２．５％が色素沈着領域を有した。色素沈着領域がＮＡ補充の非存在下では４週間の分化の後で認められず、これらの条件では、わずかに１３．１±４．８％が８週間後に色素沈着領域を発達させただけであった（図８Ａおよび図８Ｂ）。従って、ＮＡ処理は、自発的に分化し続けるｈＥＳＣクラスターと比較されたとき、色素沈着細胞へのｈＥＳＣクラスター内での分化を増強／促進した。
【０１２３】
分化をＮＩＣの存在下で８週間行わせたクラスターの内部において、細胞の５．７±１．０％が色素沈着し、５．４±１．１％が初期ＲＰＥマーカーのＭｉＴＦを発現し、ほとんどの場合において、ＭｉＴＦの発現が色素沈着と相関した（図８Ｃ）。部分的に解離され、置床された、分化したｈＥＳＣのクラスターは、暗視野顕微鏡写真（図３Ｄ）および位相差像（図３Ｅ）によって示されるように、分化した細胞の数あるタイプの中でも、色素沈着細胞の単層物から構成されるコロニーに発達した。これらのコロニーの内部における細胞は多角形形状を取っており、密着結合が細胞間に存在する細胞の「丸石」様シートを形成した（図３Ｅ）。これは、生来的なＲＰＥ細胞に非常に特徴的である特徴である。細胞内におけるＦ−アクチン分布が、ファロイジンによる染色によって明らかにされるように、正真正銘のＲＰＥ細胞と同様に、その膜に隣接していた（図１０Ａ）。色素沈着したＲＰＥ細胞はＲＰＥマーカーを共発現した：Ｏｔｘ２（図３Ｂ）およびＭｉＴＦ−Ａ（図３Ｂおよび図３Ｆ）、同様にまた、ＺＯ−１（図３Ｇ）、ベストロフィン（図３Ｈ）、ＲＰＥ６５（図３Ｉ）およびＣＲＡＬＢＰ（図３Ｊ）。
【０１２４】
解離、低密度での置床および培養の後、色素沈着細胞は、位相差画像化によって示されるように、色素沈着を失い、類線維様の形態学を獲得した（図３Ｋおよび図１０Ｂ）。さらに長期間の培養、および、高密度培養物への増殖の後、細胞はＲＰＥ細胞の多角形形状の形態学および色素沈着を再獲得した（図３Ｌおよび図１０Ｃ）。
【０１２５】
電子顕微鏡観察（ＥＭ）分析では、ｈＥＳＣ由来の色素沈着細胞が、その先端側での微絨毛（図１０Ｄ）、および、その底部側での基底膜（図１０Ｅ）を含めて、生来的なＲＰＥ細胞の形態学的特徴を有したことが明らかにされた。これらの細胞はメラニン顆粒を含有し（図１０Ｄ）、密着結合によって結合した（図１０Ｆ）。
【０１２６】
ＲＰＥ細胞の非常に重要な特徴の１つが、光受容体から脱落した外側セグメントの食作用である。ｈＥＳＣ由来の色素沈着細胞が食作用能を有したかどうかを調べるために、ｈＥＳＣ由来の色素沈着細胞を１μｍの蛍光性ラテックスビーズとインキュベーションした。３つの共焦点蛍光像により、連続したｚ軸切片が表される（図１０Ｈ〜図１０Ｊ）。共焦点顕微鏡分析では、推定されるＲＰＥ細胞は蛍光性ビーズの食作用が可能であったことが示された（図１０Ｇ〜図１０Ｊ）。
【０１２７】
ニコチンアミドの分化誘導作用
ＲＰＥの究極的運命に向かうｈＥＳＣの分化を、（自発的分化し続けるクラスターをコントロールとして提供することなく）、ｈＥＳＣをＮＡ添加ＫＯＭまたはＮＡ非添加ＫＯＭにおいて浮遊性クラスターとして培養することによって調べた。６週間の分化の後、ＲＰＥ細胞のマーカー（ＭｉＴＦ−ＡおよびＲＰＥ６５）の発現レベルが、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって求められるように、ＮＡの存在下では著しく高まった（それぞれ、図１Ａおよび図１Ｂ）。ＭｉＴＦ−Ａの発現がＮＡの存在下ではほぼ２倍増大し、一方で、ＲＰＥ６５の発現はほぼ３０倍増大した。ほとんどの色素沈着細胞がＭｉＴＦ−Ａを共発現したので（図８Ｃ）、ＮＡの存在下では、色素沈着細胞あたりのＲＰＥ６５の発現レベルにおける増大は著しく、かつ、突出していたようであった。従って、ＲＰＥの究極的運命に向かうその誘導作用に加えて、ＮＡはまた、ＲＰＥ細胞の成熟化を促進し、細胞の表現型に対する影響を有した。２週間〜６週間の間における連続した時点でのＱ−ＰＣＲ分析では、ＮＡの存在下において、ＭｉＴＦ−ＡおよびＲＰＥ６５の発現レベルにおける増大が示された（それぞれ、図１Ｃおよび図１Ｄ）。これらのマーカーの発現が４週間の分化の後ではアップレギュレーションされ、発現レベルが、その後の４週間の期間中、増大し続けた（最後の２週間は示されず）。ＲＰＥマーカーのベストロフィン、ＣＲＡＬＢＰおよびＭｅｒｔｋの類似する増大した発現が、置床された色素沈着クラスターにおける細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析によって示された（図１Ｅ）。
【０１２８】
ＲＰＥ細胞のインビトロでの発達がインビボでのＲＰＥの重要な発達段階を繰り返すかどうかを見出すために、経時変化実験を、ＲＰＥ発達の期間中における重要なマーカーのｈＥＳＣクラスター内での発現の分析を含めて行った。ＮＡの存在下または非存在下で分化するクラスターを、未分化のｈＥＳＣのマーカーの発現、初期の神経分化、網膜およびＲＰＥの発達についてリアルタイムＰＣＲによって分析した（図９Ａ〜図９Ｌ）。最初に、Ｏｃｔ４（未分化ｈＥＳＣのマーカー）の発現（図９Ａ）が、ＮＡの存在下での分化の期間中においてより迅速に低下したことが明らかにされた。一致して、ＦＡＣＳ分析では、ＴＲＡ−１−６０（未分化細胞の表面膜マーカー）の発現もまた、ＮＡ処理サンプルではより迅速に低下したことが明らかにされた（図９Ｍ）。従って、ＮＡの存在下での分化を、未分化の細胞をクラスターから除くために使用することができ、また、ＮＡの存在下での分化は、移植後のテラトーマ腫瘍形成を回避する助けとなり得る。
【０１２９】
加えて、ＮＡ処理は初期の神経分化のプロセスを高めた。ＮＡの存在下では、初期神経マーカーの転写物の発現（Ｏｔｘ２（図９Ｂ）、Ｐａｘ６（図９Ｄ）およびＭｕｓａｓｈｉ（図９Ｃ））が、２週間、２週間〜６週間、および、４週間〜６週間の分化の後でそれぞれ著しく増大した。類似する結果がＰＳＡ−ＮＣＡＭ（神経前駆体のマーカー）の発現のＦＡＣＳ分析によってタンパク質レベルで明らかにされた（図９Ｏ）。ＮＡを伴った４週間の分化の後において、細胞の８１．４±６．３％が、コントロールのクラスターにおける１４．４±５．９と比較されるが、ＰＳＡ−ＮＣＡＭを発現した。間接的免疫蛍光染色により、４週間で、ＮＡ処理クラスター内の細胞の大部分が神経表現型を獲得し、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ（７４．２±４．１％）、ネスチン（５５．９±１０．１％）およびＭｕｓａｓｈｉ（７１．４％）を発現したことが確認された（図９Ｎ）。
【０１３０】
Ｒｘ１およびＳｉｘ３（これらは網膜の特異化および形態形成の重要な調節遺伝子である）の転写物の発現（それぞれ、図９Ｆおよび図９Ｅ）が２週間の分化の後で明らかにされた。ＮＡ処理はこれらの遺伝子の発現を増大させた。
【０１３１】
ＮＡの存在下では、初期ＲＰＥマーカーのＭｉＴＦ−Ａの転写物の発現が４週間の分化の後で誘導された（図９Ｈ）。より成熟したＲＰＥのマーカー（ベストロフィンおよびＲＰＥ６５）の発現が主に、４週間後および８週間後でそれぞれアップレギュレーションされた（それぞれ、図９Ｊおよび図９Ｉ）。これらの転写物の発現もまた、コントロールとしての自発的に分化し続けるｈＥＳＣクラスターと比較されたとき、ＮＡ処理クラスターの方が高かった（図９Ｉおよび図９Ｊ）。ＲＰＥ６５の発現が１００倍以上増強された。このことから、誘導作用に加えて、ＮＡはまた、細胞の表現型に対する作用を有したことがさらに確認された。得られた色素沈着細胞が神経冠由来のメラノサイトでないことを除外するために、Ｓｏｘ１０（これはこれらの細胞の発達マーカーである）の発現が明らかにされ、Ｍ５１メラノーマ細胞株のコントロール細胞と比較して低く、ＮＡ補充に依存していなかった。従って、培養物はメラノサイトから構成されなかった。従って、ＮＡは、ＲＰＥの究極的運命に向かう分化の誘導を促進するという結論が下された。
【０１３２】
ＮＡ処理はまた、神経網膜の網膜始原体の増殖を調節するＣｈｘ１０の発現、および、Ｃｒｘ（光受容体始原体のマーカー）の発現を増大させた（図９Ｋ）。
【０１３３】
まとめると、ｈＥＳＣクラスターの内部におけるＲＰＥ分化プロセスは、インビボでの正真正銘のＲＰＥ発達に類似する段階を経て進み、ＮＡによって増強されたという結論が、本発明者らによって下された。さらに、ＮＡは、得られたＲＰＥ細胞の表現型に対する作用を有した。これらの細胞は、自発的分化の後で得られるＲＰＥ細胞とは異なったものであり、また、成熟したＲＰＥ細胞のマーカーを著しくより大きいレベルで発現した。
【０１３４】
ＮＡは、培養培地にかかわらず、誘導作用を示す
ＮＡ補充は、分化し続けるｈＥＳＣのクラスターの暗視野顕微鏡写真において示されるように、ＫＯ培地およびＮＮ／ＤＭＥＭ培地の両方で１２週間培養された分化した細胞における色素沈着を増大させた（図２Ａ〜図２Ｄ）。１週間後にＤＭＥＭ／Ｆ１２−Ｂ２７によってさらに置き換えられたＮＮ培地（ＮＮ／ＤＭＥＭ）では、ＫＯと比較されたとき、ＮＡの存在下では、クラスターの総数からの色素沈着したｈＥＳＣクラスターの割合がより高かったが、ＫＯ培地で培養されたクラスターと比較して、それらのサイズおよび総集団数はより小さかった。ＲＴ−ＰＣＲ分析により、ＮＡ補充がＭｉＴＦ−Ａの発現をＫＯＭではおよそ３倍高め、ＮＮ／ＤＭＥＭ培地ではおよそ２．５倍高めたことが示された（図２Ｅ）。ＲＰＥ６５の発現が、ＮＡ非含有に対してＮＡの補充により、ＫＯＭではおよそ２倍になり、ＮＮ／ＤＭＥＭ培地ではほぼ６倍増大した（図２Ｆ）。従って、ＮＡの分化誘導作用が、ｈＥＳＣが培養され、分化が生じる培地にかかわらず、分化したＲＰＥ細胞において示される。
【０１３５】
ＳＣの分化に対するＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーの影響
最初に分析されたのが、２週齢のクラスターにおけるアクチビンＡと同様に、アクチビン受容体の発現であった。初期眼領域マーカーの発現がこの時に現れており、従って、分化し続ける細胞はおそらくは、初期眼胞に対応する発達段階にあるので、分析をこの時点で行った。受容体のＡＣＴＲＩＢおよびＡＣＴＲＩＩＢの発現が、細胞がＮＡの非存在下で分化しているときには発現がないか、または、より少ないこととの比較で、ＮＡの存在下では高かったことが明らかにされた（図１１Ｇ）。従って、ＮＡは、その存在下で分化する細胞の表現型に対する作用を有した。
【０１３６】
アクチビンＡが、ＲＰＥの究極的運命に向かう分化を増強することが見出された。４週間にわたって分化するｈＥＳＣ由来クラスターの暗視野顕微鏡写真では、アクチビンＡの存在下におけるこの早い段階での色素沈着細胞の出現が示された（図１１Ａ）。ＮＡの存在下では、アクチビンＡが、ＲＰＥ細胞に向かうｈＥＳＣの分化を著しく増強したことがさらに示された（図４Ａ〜図４Ｂ、および、図１１Ｂ〜図１１Ｃ）。色素沈着細胞を含んだクラスターの割合（５０．７±６．５対１７．７±３．２）、ならびに、細胞総数からの色素沈着細胞の割合（９．９±１．４対２．４±１．２）が、アクチビンＡを伴うことなくＮＡが補充されたコントロール培養物と比較された場合、分化がアクチビンＡの存在下で誘導されたときには著しくより高かった（図１１Ｈおよび図１１Ｉ）。この結果は、アクチビンＡ処理が、成熟したＲＰＥ細胞に対して特異的であるマーカーの発現（ＲＰＥ６５（図４Ｄ）およびベストロフィン（図４Ｅ））を著しく（それぞれ、５倍超および４倍超）増大させたことが示されたＲＴ−ＰＣＲにより確認された。さらに、アクチビンＡの存在下で発達した色素沈着細胞のクラスターの形態学的特徴が異なっていた。それらの色素沈着はより濃く、それらは、周りの色素沈着していない細胞からの非常に明瞭な境界を呈示した（図４Ｂ）。ＭｉＴＦ−Ａ（ＲＰＥ発達期間中のより初期に現れるマーカー）の発現は、アクチビンＡによる補充によって影響されなかった。従って、アクチビンＡ（これは増殖因子のＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーである）はｈＥＳＣのＲＰＥ細胞への分化を増強する。アクチビン阻害剤ＳＢ４３１５４２の補充は色素沈着クラスターの出現をこれらの条件下で著しく低下させた（図１１Ｅおよび図１１Ｈ）。ＲＰＥ分化に対するアクチビンＡの影響を様々な濃度で調べた。その影響は、用量依存的であることが見出され、最適な増強作用が、色素沈着細胞の割合およびＲＰＥマーカーの発現（ベストロフィン（図１１Ｋ）およびＲＰＥ６５（図１１Ｌ））に関しては１４０ｎｇ／ｍｌにおいてであった。実験のほとんどにおいて、アクチビンＡは、クラスターが２週間既に分化した後の２週間（第３週〜第４週）にわたって補充された。これは、本発明者らが、この時点での適用が、ＲＰＥ分化を高めるために最適であったことを見出したからである。初期の眼発達のマーカーの発現もまた、２週間の分化の後で始まったという観測結果（図９Ａ〜図９Ｌ）を考慮すると、アクチビンは眼およびＲＰＥの発達のプロセスを増強したようであった。そのうえ、色素沈着細胞の割合がアクチビンＡの存在下では５倍〜６倍増大し、一方で、成熟したＲＰＥ細胞のマーカー（例えば、ベストロフィン）の発現が約１０倍増大したので、アクチビンＡは、その誘導作用に加えて、細胞の成熟度および表現型に対する作用を有したようである。このことが、アクチビンＡの存在下で得られた色素沈着細胞の形態学的外観によって裏付けられた。これは、そのような色素沈着細胞はより濃く、周りの細胞からの際立った境界を伴っていたからである。
【０１３７】
遺伝子発現に対する２週間のアクチビンＡ処理の影響のＱ−ＰＣＲ経時変化分析では、アクチビンＡが、網膜始原体マーカーのＲｘ１およびＣｈｘ１０の発現、ならびに、ＲＰＥマーカーのベストロフィンの発現を著しく増大させたことが示された。４週間の分化において、アクチビンＡ処理はまた、総ＭｉＴＦイソ型の発現レベルを増大させた（図１１Ｍ〜図１１Ｐ）。
【０１３８】
網膜およびＲＰＥの分化に対するアクチビンＡの誘導作用が、ＴＧＦβスーパーファミリーの他のメンバーに関してもまた認められた。ＴＧＦβ３による、分化し続けるクラスターの処理は、重要な役割をインビボでのＲＰＥ発達において果たすＭｉＴＦ−Ａの転写物の発現レベルを著しく増強させた（図５Ｆ）。さらに、ＴＧＦβ１（これはＴＧＦβスーパーファミリーの別のメンバーである）による処理もまた、色素沈着細胞を有するクラスターの出現を著しく高めた（図１１Ｄおよび図１１Ｈ）。対照的に、ＴＧＦβスーパーファミリーに由来する因子の代わりに、ＮＡおよび塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）の存在下における分化は色素沈着細胞の出現をなくした（図１１Ｆ）。
【０１３９】
加えて、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）（これはＴＧＦβスーパーファミリーの別のサブファミリーに属する）が、ｈＥＳＣのＲＰＥ分化において役割を果たすことが示された。暗視野顕微鏡写真において示されるように、ＢＭＰアンタゴニストのｎｏｇｇｉｎの存在下では、色素沈着ＲＰＥ細胞へのｈＥＳＣクラスーの分化が阻止された（図５Ｄ）。培地がまた、ＮＡにより補充されたときでさえ、色素沈着細胞への分化がｎｏｇｇｉｎの補充により阻止された（図５Ｃ）。ＲＮＡレベルにおいて、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより、ｎｏｇｇｉｎが培養培地におけるＮＡの存在および非存在の両方においてＭｉＴＦ−Ａの発現を著しく減少させたことが明らかにされた（図５Ｅ）。従って、ＢＭＰは、ｈＥＳＣのＲＰＥ細胞への分化を誘導することにおいて役割を果たす。
【０１４０】
ｈＥＳＣに由来する分化したＲＰＥ細胞は眼内移植のために使用することができる
ｅＧＦＰを発現するように操作されたｈＥＳＣ由来ＲＰＥ細胞の富化された集団を最初に、色素沈着細胞の所在確認を容易にするために、シロネズミの硝子体腔および網膜下腔に移植した。眼内移植の後、移植された色素沈着細胞をインビボで容易に特定することができた（図６Ａおよび図６Ｂ）。図６Ｂに示される眼の摘出、角膜および水晶体の除去、ならびに、網膜の単離の後、網膜は、中心となる移植片、同様にまた、さらなる分散した色素沈着細胞を示した（図６Ｃ）。組織学的切片において、ＧＦＰもまた発現した視認される移植された色素沈着細胞を含んだ移植片が存在した（図６Ｄ〜図６Ｇ）。移植された細胞を硝子体腔において見出すことができ、また、注入路に沿って網膜において見出すことができ、また、網膜下腔においてもまた見出すことができた（図６Ｈ、図６Ｉ、図６Ｏ、図６Ｐ）。移植されたＲＰＥ細胞はまた、網膜下腔から遊走し、宿主ラットのＲＰＥ層の内部に一体化した（図６Ｊ）。移植片において、移植されたｅＧＦＰ陽性細胞における密着結合マーカーＺＯ−１の発現によって示されるように、密着結合（これはＲＰＥ細胞の特徴である）が形成された（図６Ｋ〜図６Ｎ）。移植片内の細胞はまた、ＲＰＥ６５、ベストロフィンおよびＭｉＴＦ−Ａの発現を維持した。
【０１４１】
ＲＣＳラットの網膜下腔への移植の後、ｈＥＳＣ由来ＲＰＥ細胞は生存し、一体化し、分化したＲＰＥの特徴を維持する
移植実験の主要部分を、ｈＥＳＣ由来ＲＰＥ細胞の送達により、疾患の経過が調節され得るかどうかを調べようとする試みで、ｍｅｒｔｋ遺伝子における変異によって引き起こされるＲＰＥ変性および網膜変性を表すＲＣＳラットにおいて行った。
【０１４２】
移植された色素沈着細胞を、標準的な眼底画像化システムを使用してＲＣＳラットの眼においてインビボで容易に特定することができた（図１２Ａ〜図１２Ｃ）。ｈＥＳＣ由来のＧＦＰ発現細胞は、フルオレセインの励起フィルターおよび放射フィルターが使用されるとき、蛍光を放射することを認めることができる（図１２Ｃ）。蛍光顕微鏡においてエクスビボで画像化されたアイカップ調製物では（図１２Ｄ〜図１２Ｅ）、網膜下のＧＦＰ陽性細胞の大きいクラスターを認めることができ（図１２Ｄ）、同様にまた、多数の分散したより小さいクラスターを認めることができる（図１２Ｅ）。
【０１４３】
組織学的評価および免疫組織化学的評価により、インビボおよびエクスビボでの巨視的観察結果が確認された。移植された細胞は網膜下腔において生存し、一体化し、かつ、成熟したＲＰＥを特徴づけ、また、多くの場合、成熟したＲＰＥに対して特異的であるタンパク質の発現を維持した（図１３および図１４）。著しい炎症反応または免疫反応が存在しなかったこと、および、腫瘍またはテラトーマが、移植を受けた１００を超える眼において認められなかったことに留意することは重要である。ヘマトキシリンおよびエオシンによって染色された切片（図１３Ａおよび図１３Ｂ）では、移植されたｈＥＳＣ由来の色素沈着細胞（これらはクラスターで現れたか、または、孤立した細胞として現れた）の網膜下および時には網膜内での存在位置が示される（矢印）。ＧＦＰによる免疫染色（図１３Ｃ〜図１３Ｆ）により、これらの細胞が実際にｈＥＳＣ由来であることが確認された。移植片は多くの場合、かなり大きく、散らばり（図１３Ｃおよび図１３Ｅ）、また、ＧＦＰを共発現する色素沈着細胞が明瞭に認められた（図１３Ｄおよび図１３Ｆ）。
【０１４４】
免疫染色により、移植片の内部における多数の移植された細胞が、成熟している分化したＲＰＥ細胞を特徴づけるタンパク質を発現することが明らかにされた（図１４）。これには、ＲＰＥ特異的マーカーの発現が含まれた（ＲＰＥ６５（図１４Ａ〜図１４Ｅ）およびベストロフィン（図１４Ｆ〜図１４Ｊ））。細胞はまた、密着結合を形成することができた（図１４Ｋ〜図１４Ｏ）。密着結合はＲＰＥ細胞の重要な機能であり、血液−網膜関門を維持するために不可欠である。各列における最も左側のパネルは、ＧＦＰおよび関連マーカーを共発現する移植片の低倍率の蛍光像を示す。各列における高倍率の共焦点像では、色素（Ｎｏｍａｒｓｋｉ光学系による）、同様にまた、ＧＦＰおよび異なるマーカーの共発現が細胞１個のレベルで示される。
【０１４５】
ｈＥＳＣ由来ＲＰＥ細胞により、機能的および構造的な網膜救済がジストロフィー性ＲＣＳラットにおいてもたらされる
網膜変性のＲＣＳラットモデルにおいて、網膜機能が通常、２〜３ヶ月の月齢までにひどく損なわれる。構造的には、網膜の外顆粒層（ＯＮＬ）の対応する喪失および薄化が生じ、また、網膜の外顆粒層が多くの場合、この月齢において光受容体核の１〜２列よりも少なくなるまで減少する。ｈＥＳＣ由来ＲＰＥ細胞が移植された眼において、網膜電図記録法による記録により、コントロールの処置されていない眼または培地注入された眼と比較された場合、網膜機能が著しく比較的保存されたことが明らかにされた（図７および図１５）。
【０１４６】
暗順応（ＤＡ）した状態における、強度が増大する一連の白色閃光に対する代表的なＥＲＧ応答が、そのコントロールの他眼（図１５Ｂ）に対して、移植を受けた眼において示される（図１５Ａ）。図１５Ｃは、移植を受けた眼と、異なる群のコントロール眼との間において、平均振幅における顕著な違いを示す。最大強度において、ＲＰＥ移植を受けた眼における平均ＤＡ  ｂ波振幅が２８３．３±３７．５（平均±ＳＥＭ；ｎ＝１３）であり、これに対して、処置されていないコントロールの他眼では１５８．５±１８．１（ｎ＝１３、ｐ＜０．０１）であり、培地注入を受けた眼では８９．９±１４．４（ｎ＝５、ｐ＜０．０１）であった。アクチビンＡを伴うことなく得られるＲＰＥ細胞の移植の後で達成される救済作用（図７）と比較した場合、アクチビンＡ処理されたＲＰＥ細胞の移植の後では、網膜機能のより良い保存に向かう傾向があることに留意することは重要である（図１５）。
【０１４７】
網膜構造の質的評価ならびに量的評価により、機能的な知見が裏付けられる（図１６）。光受容体（ＯＮＬ）層、ならびに、内側および外側の光受容体セグメント（ＩＳ＋ＯＳ）が比較的保存されることが、移植片から離れた領域と比較されたとき、網膜下のＲＰＥ移植片の近くで認められた（２つの例が、図１６Ａ、図１６Ｂに示される）。網膜全体の厚さ（図１６Ｃ）、同様にまた、ＯＮＬおよびＩＳ＋ＯＳの厚さ（図１６Ｄ）が、移植片から離れた領域（灰色棒）と比較されたとき、ｈＥＳＣ由来のＲＰＥ移植片の近傍では著しく増大する（黒色棒、平均±ＳＥＭ、ｎ＝７）。このタイプの構造的救済が網膜下移植片および深部網膜内移植片の近くでのみ認められただけであり、移植片がもっぱら硝子体内であったときには認められなかった（示されず）。
【０１４８】
移植されたｈＥＳＣ由来のアクチビンＡ処理されたＲＰＥ細胞により、ロドプシンがインビボで取り込まれる
健全なＲＰＥの重要な機能の１つが、光受容体の更新プロセスの一部としての、脱落した光受容体外側セグメントの取り込みおよび再利用である。網膜下の移植されたＲＰＥ細胞の共焦点像では、同じ１個の細胞の内部における、色素、ＧＦＰ、ＲＰＥ６５およびロドプシンの共局在化が示される。このことから、移植された細胞は、成熟したＲＰＥの表現型を有すること、および、（ロドプシンを含有する）脱落した外側セグメントの取り込みを行うことができることが示唆された。ＲＣＳラットの生来的なＲＰＥ細胞はＲＰＥ６５を発現する（図１７Ｃ、矢印）が、ＧＦＰを発現せず（図１７Ｄ、矢印）、最少量のロドプシンを含有する（図１７Ｂ、図１７Ｅ）ことに留意すること。
【０１４９】
従って、上記の結果は、ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーを含む培養システムにおいて、また、好ましくは、ＮＡの存在下で培養することによって得られるｈＳＣ由来のＲＰＥ細胞が、本質的に完全に機能的なＲＰＥ細胞を眼において提供するための移植のためにインビボで利用され得るという証拠を提供する。
【図７】
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【図９Ａ−Ｄ】
0005395058.tif 000004
【図９Ｅ−Ｈ】
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【図９Ｉ−Ｌ】
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【図９Ｍ−Ｏ】
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【図１１Ｍ−Ｐ】
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【図１５】
0005395058.tif 000009
【図１Ａ−Ｃ】
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【図１Ｄ−Ｅ】
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【図２Ａ−Ｄ】
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【図２Ｅ−Ｆ】
0005395058.tif 000013
【図３Ａ−Ｆ】
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【図３Ｇ−Ｌ】
0005395058.tif 000015
【図４Ａ−Ｂ】
0005395058.tif 000016
【図４Ｃ−Ｅ】
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【図５Ａ−Ｄ】
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【図５Ｅ−Ｇ】
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【図６Ａ−Ｇ】
0005395058.tif 000020
【図６Ｈ−Ｊ】
0005395058.tif 000021
【図６Ｋ−Ｐ】
0005395058.tif 000022
【図８Ａ−Ｆ】
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【図８Ｇ−Ｉ】
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【図９Ｐ−Ｓ】
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【図１０Ａ−Ｃ】
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【図１０Ｄ−Ｆ】
0005395058.tif 000027
【図１０Ｇ−Ｊ】
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【図１１Ａ−Ｆ】
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【図１１Ｇ−Ｉ】
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【図１１Ｊ−Ｌ】
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【図１２Ａ−Ｃ】
0005395058.tif 000032
【図１２Ｄ−Ｅ】
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【図１３Ａ−Ｂ】
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【図１３Ｃ−Ｄ】
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【図１３Ｅ−Ｆ】
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【図１４Ａ−Ｅ】
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【図１４Ｆ−Ｊ】
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【図１４Ｋ−Ｏ】
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【図１６Ａ−Ｂ】
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【図１６Ｃ−Ｄ】
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【図１７Ａ−Ｃ】
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【図１７Ｄ−Ｅ】
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【配列表】
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