(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
4週齢以下の非成体NOD/SCID/IL2rgnullマウスにヒト急性骨髄性白血病患者由来の白血病幹細胞含有物を移植し、該マウスを生育させることを含む、ヒト白血病細胞が選択的に増幅し、骨髄の骨芽細胞が豊富に存在する領域に隣接する骨内膜表面にヒト白血病幹細胞が存在するマウスの製造方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法により得られるマウス由来の白血病幹細胞含有物を、別の4週齢以下の非成体NOD/SCID/IL2rgnullマウスに移植し、該マウスを生育させる工程を１回以上含む、ヒト白血病細胞が選択的に増幅し、骨髄の骨芽細胞が豊富に存在する領域に隣接する骨内膜表面にヒト白血病幹細胞が存在するマウスの製造方法。
【請求項３】
白血病幹細胞含有物移植後の生育期間が4週以上である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
ヒト白血病細胞の増幅がマウス末梢血中で生じていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
白血病幹細胞含有物の由来する個々の患者における白血病の病態を再現することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法により得られる、ヒト白血病細胞が選択的に増幅したマウス。
【請求項７】
a)請求項６記載のマウスに被験物質を投与する工程、および
b)該マウスにおける白血病の改善を評価する工程、
を含む、ヒト急性骨髄性白血病治療剤のスクリーニング方法。
【請求項８】
c)該マウスにおける被験物質の副作用をモニターする工程、
をさらに含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
a)ヒト急性骨髄性白血病患者もしくは請求項６記載のマウスから単離したhCD34＋hCD38＋細胞およびhCD34＋hCD38-細胞、ならびに正常なヒト臍帯血もしくは骨髄またはヒト化マウスより単離したhCD34＋hCD38＋細胞およびhCD34＋hCD38-細胞における遺伝子発現を網羅的に検出する工程、ならびに
b)正常および白血病におけるhCD34＋hCD38＋細胞とhCD34＋hCD38-細胞との間で示差的に発現される遺伝子を同定する工程、
を含む、ヒト白血病幹細胞マーカー遺伝子の同定方法。
【請求項１０】
該マーカー遺伝子が静止期ヒト白血病幹細胞のマーカー遺伝子である、請求項９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト急性骨髄性白血病(AML)患者由来の白血病幹細胞（LSC）が生着し、骨髄、脾臓、末梢血中でヒトAML細胞が選択的に増幅されたマウス、およびその製造方法に関する。また、本発明は、該マウスを用いた、LSCを根絶し得る薬剤のスクリーニング、個々の患者に適した治療法の検討方法などに関する。さらに、本発明は、静止期にあるヒトLSCに特異的なマーカー分子の同定方法、および該マーカー分子を標的としたLSC選択的AML治療剤開発に関する。
【背景技術】
【０００２】
急性骨髄性白血病(AML)は、最も一般的な／頻度（発症率）の高い成人白血病であり、稀な白血病幹細胞(LSC)から始まる未熟な骨髄芽球のクローン性の増殖によって特徴付けられる（非特許文献１〜３）。ヒトLSCの機能的特徴および分子的特徴は、大部分が不明である。【０００３】
マウス白血病モデルは白血病誘発に対する貴重な知見を提供してきたが、ヒトの白血病誘発に独自の病原機構を理解するためには、原発性ヒト白血病の直接的なin vivo研究が必要である（非特許文献４）。しかし、既存の免疫不全系統(例えば、CB17/SCID（非特許文献５）、NOD/SCID（非特許文献６〜８）およびNOD/SCID/β2mnull（非特許文献９）)は、寿命が短く、加齢に依存して体液性免疫応答を生じるので、原発性ヒトAMLの高率な生着率を得ることは難しく、さらに長期評価はきわめて困難であった。【０００４】
Shultzらは最近、獲得免疫および自然免疫の両方の欠如を導くscidバックグラウンド上に、サイトカイン受容体共通γ鎖の完全ヌル変異を有する新規免疫不全マウス系統を開発した。また、本発明者らは、共通γ鎖の完全ヌル変異（非特許文献１０）を有する、長期異種間生着が改善された新規免疫不全系統NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/J(NOD/SCID/IL2rgnull)マウスを作製した（非特許文献１１）。この系統は、90週を超える平均余命を有し、NOD/SCID（非特許文献１２）、NOD/SCID/β2mnull（非特許文献１３）、NOD-Rag1null（非特許文献１４）、NOD-Rag1nullPrf1null（非特許文献１５）等の系統よりも丈夫であり、ヒト長期再増殖性造血幹細胞(LT-HSC)の再構成およびリンパ系/骨髄系分化能の評価を可能にしている（非特許文献４、１６）。
【０００５】
従来の化学療法剤はAMLを一時的に寛解し得るものの、後になって再発することが患者を救うことができない困難な問題となっており、有効な治療剤・治療方法の開発のためには、これまでに知られていない白血病の性質を明らかにすることによる再発メカニズムの解明が強く望まれている。そのためには、マウスでなくヒトのAML、特に細胞株でない個々の患者のAMLの特徴を再現することができ、長期間評価にたえ得る動物モデルの開発が不可欠である。
【非特許文献１】Passegue, E., Jamieson, C.H., Ailles, L.E. & Weissman, I.L. Normal and leukemic hematopoiesis: are leukemias a stem cell disorder or a reacquisition of stem cell characteristics? Proc Natl Acad Sci U S A 100 Suppl 1, 11842-11849 (2003).
【非特許文献２】Hope, K.J., Jin, L. & Dick, J.E. Acute myeloid leukemia originates from a hierarchy of leukemic stem cell classes that differ in self-renewal capacity. Nat Immunol 5, 738-743 (2004).
【非特許文献３】Jordan, C.T. & Guzman, M.L. Mechanisms controlling pathogenesis and survival of leukemic stem cells. Oncogene 23, 7178-7187 (2004).
【非特許文献４】Huntly, B.J. et al. MOZ-TIF2, but not BCR-ABL, confers properties of leukemic stem cells to committed murine hematopoietic progenitors. Cancer Cell 6, 587-596 (2004).
【非特許文献５】Lapidot, T. et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature 367, 645-648 (1994).
【非特許文献６】Bonnet, D. & Dick, J.E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat Med 3, 730-737 (1997).
【非特許文献７】Ailles, L.E., Gerhard, B. & Hogge, D.E. Detection and characterization of primitive malignant and normal progenitors in patients with acute myelogenous leukemia using long-term coculture with supportive feeder layers and cytokines. Blood 90, 2555-2564 (1997).
【非特許文献８】Lumkul, R. et al. Human AML cells in NOD/SCID mice: engraftment potential and gene expression. Leukemia 16, 1818-1826 (2002).
【非特許文献９】Feuring-Buske, M. et al. Improved engraftment of human acute myeloid leukemia progenitor cells in beta 2-microglobulin-deficient NOD/SCID mice and in NOD/SCID mice transgenic for human growth factors. Leukemia 17, 760-763(2003).
【非特許文献１０】Cao, X. et al. Defective lymphoid development in mice lacking expression of the common cytokine receptor gamma chain. Immunity 2, 223-238 (1995).
【非特許文献１１】Ishikawa, F. et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood 106, 1565-1573 (2005).
【非特許文献１２】Shultz, L.D. et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J Immunol 154, 180-191 (1995).
【非特許文献１３】Christianson, S.W. et al. Enhanced human CD4+ T cell engraftment in beta2-microglobulin-deficient NOD-scid mice. J Immunol 158, 3578-3586 (1997).
【非特許文献１４】Shultz, L.D. et al. NOD/LtSz-Rag1null mice: an immunodeficient and radioresistant model for engraftment of human hematolymphoid cells, HIV infection, and adoptive transfer of NOD mouse diabetogenic T cells. Journal of Immunology 164, 2496-2507 (2000).
【非特許文献１５】Shultz, L.D. et al. NOD/LtSz-Rag1nullPfpnull mice: a new model system with increased levels of human peripheral leukocyte and hematopoietic stem-cell engraftment. Transplantation 76, 1036-1042 (2003).
【非特許文献１６】Shultz, L.D. et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J Immunol 174, 6477-6489 (2005).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ヒトAMLの優れたモデルマウスを提供し、このマウスを用いて、AMLの再発メカニズムを解明し、AMLに適した治療剤・治療方法を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題に鑑み鋭意検討を行った結果、まずNOD/SCID/IL2rgKOマウスが従来の免疫不全マウスでもっとも優れていると評されたNOD/SCID/b2mKOマウスより白血病の生着率を高率に支持することをあきらかとした。さらに新生仔期に移植することが、多くの研究者が技術的な簡便性から用いている成熟期に移植するより有意に高い生着率を支持することを示した。また、本発明者らは、新生仔NOD/SCID/IL2rgnullマウスにヒト急性骨髄性白血病(AML)患者由来のLSC含有物を移植することによって得られたマウスが、個々のヒト患者のAMLの病態を十分再現しており、AMLのモデルマウスとして適切であること、マウスからマウスへの連続移植によってもヒトAML細胞（LSCとnon-LSC）の増幅が可能であることを見出した。さらに、該マウスの解析から、LSCは骨髄(BM)の骨芽細胞リッチな領域にホーミングしてその中に生着し、そこでLSCは細胞周期が静止期で停止し、そのため細胞周期依存的な化学療法剤により誘導されるアポトーシスから保護されることが判明した。そこで、本発明者らは、ヒトLSCにおける網羅的な遺伝子発現解析を実施することにより、細胞周期が静止期で停止したLSCにおいて発現が変動する遺伝子を抽出、該LSCマーカー遺伝子として同定した。
本発明者らは、これらの知見にもとづいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。【０００８】
即ち、本発明は以下を提供する：
（１）  非成体NOD/SCID/IL2rgnullマウスにヒト急性骨髄性白血病患者由来の白血病幹細胞含有物を移植し、該マウスを生育させることを含む、ヒト白血病細胞が選択的に増幅したマウスの製造方法；
（２）  上記（１）記載の方法により得られるマウス由来の白血病幹細胞含有物を、別の非成体NOD/SCID/IL2rgnullマウスに移植し、該マウスを生育させる工程を１回以上含む、ヒト白血病細胞が選択的に増幅したマウスの製造方法；
（３）  白血病幹細胞含有物移植後の生育期間が4週以上である、上記（１）または（２）記載の方法；
（４）  ヒト白血病細胞の増幅がマウス末梢血中で生じていることを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法；
（５）  白血病幹細胞含有物の由来する個々の患者における白血病の病態を再現することを特徴とする、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法；
（６）  上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法により得られる、ヒト白血病細胞が選択的に増幅したマウス；
（７）  a)上記（６）記載のマウスに被験物質を投与する工程、およびb)該マウスにおける白血病の改善を評価する工程、を含む、ヒト急性骨髄性白血病治療剤のスクリーニング方法；
（８）  c)該マウスにおける被験物質の副作用をモニターする工程、をさらに含む、上記（７）記載の方法；
（９）  a)上記（６）記載のマウスにヒト急性骨髄性白血病の治療を施す工程、およびb)該マウスにおける白血病の改善および/または治療の副作用を評価する工程、を含む、該マウス末梢血中の白血病細胞が由来する個々の患者のための治療方法を選択または最適化する方法；
（１０）  工程b)および/またはc)において、マウスから採取した末梢血を検査することを特徴とする、上記（７）〜（９）のいずれかに記載の方法；
（１１）  a)ヒト急性骨髄性白血病患者もしくは上記（６）記載のマウスから単離したhCD34＋hCD38＋細胞およびhCD34＋hCD38-細胞、ならびに正常なヒト臍帯血もしくは骨髄またはヒト化マウスより単離したhCD34＋hCD38＋細胞およびhCD34＋hCD38-細胞における遺伝子発現を網羅的に検出する工程、ならびにb)正常および白血病におけるhCD34＋hCD38＋細胞とhCD34＋hCD38-細胞との間で示差的に発現される遺伝子を同定する工程、を含む、ヒト白血病幹細胞マーカー遺伝子の同定方法；
（１２）  該マーカー遺伝子が静止期ヒト白血病幹細胞のマーカー遺伝子である、上記（１１）記載の方法；
（１３）  静止期ヒト白血病幹細胞マーカー分子に対する抗体を含有してなる、該細胞を標的化した急性骨髄性白血病治療剤；
（１４）  静止期ヒト白血病幹細胞マーカー分子に対する抗体を患者に投与することを含む、急性骨髄性白血病の治療方法；
（１５）  急性骨髄性白血病を治療するための、静止期ヒト白血病幹細胞マーカー分子に対する抗体。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により得られるマウスは、ヒトAML細胞のみが選択的に増幅され、正常の造血幹細胞等は増幅されないので、ヒトAMLモデルとして特に優れている。また、骨髄や脾臓だけでなく末梢血中でもヒトAML細胞が顕著に増幅されるので、マウスを殺すことなく、生きたまま経過観察が可能である。さらに、該マウスは移植したLSC含有物の由来する個々のAML患者の特徴（細胞の表出するタンパク、細胞が発現する遺伝子プロファイルなど）をよく再現することができるので、治療薬・治療法の有効性をモニターしAMLの再発を早期に予測できる点で有効である。一方、本発明の（静止期）ヒトLSCマーカー分子は従来の化学療法剤に抵抗性のLSCに対する有効な分子標的となり得るので、新規抗LSC治療戦略の開発を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１−１】ヒト初代LSCの表現型および機能的特徴は、NOD/SCID/IL2rgnullマウスにおいてin vivoで長期間維持される。(a)(左)9人のAML患者由来の4×106のTCD BMMNCを注射したNOD/SCID/IL2rgnull新生仔、NOD/SCID/β2mnull新生仔またはNOD/SCID/IL2rgnull成体の原発性ヒトAML生着。レシピエントBMにおけるヒトAMLの割合(%hCD45+hCD33+細胞)を、注射の3ヵ月後に決定した。各円の中の数字は、症例番号を示す(症例1および2:AML M1;症例3および4:AML M2;症例5および6:AML M3;症例7および8:AML M4;症例9:AML M7)。*ノンパラメトリックFriedman検定によりp=0.0011、各群につきn=9。(右)正常ヒトBMのhCD45+hCD33+細胞と比較した、移植の12週間後のヒト初代AMLレシピエントNOD/SCID/IL2rgnullマウス由来のBM細胞の表面表現型および形態。hCD45およびhCD33/hCD13の両方を発現する全てのレシピエントBM細胞は、各々の元のAML型と一致する骨髄芽球性の形態を示した。スケールバー、5μm。(b)一次、二次および三次移植の16〜24週間後の間の、ソートしたhCD34+hCD38-、hCD34+hCD38+およびhCD34-BM細胞のレシピエントの末梢血における％AML生着。各移植サイクルにおいて、ソートしたBM hCD34+hCD38-細胞の全てのレシピエントは生着したが、hCD34+hCD38+細胞およびhCD34-細胞のレシピエントは生着を示さなかった(*および**p<0.0001、Kruskal-Wallis検定)。
【図１−２】(c-j)AML患者のBMならびに対応する一次、二次および三次レシピエントのPBおよびBMの代表的なフローサイトメトリー分析(c,e,gおよびi:AML M2ならびにd,f,hおよびj:AML M4)。(c,d)原発性AML BMにおけるhCD34およびhCD38発現を分析した（左パネル）。示された長方形のゲートから、103、104および105のhCD34+hCD38-BM細胞を、一次移植のためにソートした。患者のBM細胞の大部分は、骨髄マーカーのhCD13またはhCD33を発現した（中央および右のパネル）。(e,f)一次レシピエントのPB生着を、注射の4、8、12および16週間後に測定したところ、用量依存性が示された（左パネル）。一次レシピエントのBM生着ならびにhCD34およびhCD38の発現を、注射の16週間後に試験し、一次レシピエントの104のソートしたBM hCD34+hCD38-細胞を二次レシピエントに注射した(中央および右のパネル)。(g,h)二次レシピエントのPB生着を、4週間と18週間との間、2〜3週間毎に測定した（左パネル）。二次レシピエントのBM生着ならびにhCD34およびhCD38の発現を、移植の18週間後に試験し、三次移植のために示された各長方形ゲートから細胞をソートした(中央および右パネル)。(i,j)ソートした二次レシピエントのBM hCD34+hCD38-(8×103、n=2)、hCD34+hCD38+(5×104、n=2)およびhCD34-(2×106、n=2)(AML M2)、ならびにBM hCD34+hCD38-(103、n=1)、hCD34+hCD38+(6×103、n=1)およびhCD34-(105、n=1)(AML M4)を、三次レシピエントに注射した。PB生着を、移植の4週間後と20週間後との間に、2週間毎に測定した。三次レシピエントのBM生着ならびにhCD34およびhCD38の発現を、移植の20週間後に試験した。
【図２−１】正常なマウス造血は、BMの骨芽細胞リッチな領域におけるヒトLSCのホーミングおよび生着の後に抑制される。(a)ヒトおよびマウスの赤血球および血小板マーカーに対する抗体を用いた、hCD34+hCD38-LSCレシピエントの代表的なPBフローサイトメトリー分析(移植の12週間後のAML M4二次レシピエントのPB)。全ての成熟赤血球および血小板はマウス起源である。(b)PBのヘモグロビン濃度および血小板計数は共に、104のソートしたhCD34+hCD38-BM細胞の二次レシピエント(AML M2、n=3;AML M4、n=2)および103のソートしたhCD34+hCD38-BM細胞の三次レシピエント(AML M2、黒四角、n=2;AML M4、白丸、n=1)において、PBのヒトAML負荷の増加と共に減少した。(c)移植していないコントロールマウスと比較して、移植の18週間後のソートしたhCD34+hCD38-AML M2 BM細胞の三次移植レシピエントの大腿骨および脾臓は、赤血球形成の抑制を示す。
【図２−２】(d)高線量(6〜8Gy)を照射した後に、ソートしたhCD34+hCD38-AML M2およびM4の初代BM細胞を注射した新生仔マウスの大腿骨切片の、注射の3日後の抗hCD34抗体を使用した免疫組織化学分析。BM腔中の内因性マウス白血球の大多数は、照射によって根絶される。hCD34+細胞の顕著なホーミング/生着は、BM腔の中心では見られない。対照的に、hCD34+AML細胞は、骨幹端の骨内膜領域に優先的に存在する(矢頭)。(e)移植の16週間後の、抗hCD34抗体および抗hCD38抗体を使用した免疫組織化学分析。中心領域と比較して、骨内膜においてhCD34+細胞の優先的な局在が存在し（矢頭）、一方でhCD38+細胞は中心領域と比較して骨内膜中では希薄である。
【図２−３】(f)(上パネル)4つの独立したサンプルにおいて、hCD34+細胞を、BMの骨内膜領域および中心領域内で計数したところ、ほぼ全てのホーミングしたhCD34+細胞は、骨内膜中に局在することが示された(*p<0.0001、両側t検定)。(中央および下のパネル)3つの独立したサンプルにおいて、hCD34またはhCD38陽性細胞を、BMの骨内膜領域および中心領域内で計数したところ、hCD34+細胞の大多数が骨内膜領域内に存在し、ほぼ全てのhCD38+細胞が中心領域に局在することが示された(*、**p<0.0001、両側t検定)。(g)抗hCD34抗体(赤)および抗マウスオステオポンチン抗体(緑)ならびにDAPI(青)を使用した免疫蛍光染色により、移植の16週間後にAML生着大腿骨内で、hCD34+AML細胞がマウス骨芽細胞に隣接する骨内膜表面にて見出され得ることが示され、これは、LSCと骨芽細胞との間の潜在的な相互作用を示している。
【図３−１】骨内膜領域内の初代hCD34+hCD38-LSCは、in vivo治療試験モデルにおいてAra-C誘導性のアポトーシスに対して比較的抵抗性である。(a)(左パネル)150mg/kgのAra-Cの単回用量を、ソートしたhCD34+hCD38-BM細胞のレシピエントに、一次移植の12〜16週間後にi.p.投与した(AML M2、白四角、n=2;AML M4、白丸、n=2;AML M4、黒丸、n=2)。0日目のAra-C注射後、PB 1ml当たりのhCD45+hCD33+細胞計数を4日毎にモニタリングしたところ、生着したマウスにおけるAML負荷の迅速な低下が示され、8〜12日目にAML計数の再下点に達し、その後28〜32日目までにAML計数は回復した。(+)は、マウスが死んだことを示す。(右パネル)Ara-Cの副作用をin vivoで試験した。Ara-Cの典型的な血液学的副作用が、i.p.注射の8日後に、Ara-C処置したAML生着マウスにおいて見られた。1匹のマウスは、注射の8日後に、肝アミノトランスフェラーゼASTの軽度の上昇をも示した。(b)(左)Ara-C注射の3日後、AML生着マウス由来のBM hCD45+細胞画分を、アポトーシスの程度について試験した(n=3)。2セットのドットプロットが示される。(右)hCD34+hCD38-細胞は、hCD34+hCD38-集団およびhCD34-集団と比較して、Ara-Cに対して比較的抵抗性である(p<0.05、両側t検定)。白丸、黒丸および白四角は、個々のサンプルを示す。(c)大腿骨切片を、未処置のAML生着マウスおよびAML M2生着マウスにおいて、Ara-C注射の3日後に得た。未処置の大腿骨において、BM腔には、均一な外観のAML芽球が充満している(上パネル)。Ara-C処置の3日後に、骨の骨内膜表面以外のBM腔中で、細胞の減少が見られた（中央パネル）。TUNEL染色により、BM腔の中央における細胞の優先的な殺傷が確認され、一方で骨内膜表面の細胞は比較的生き延びていた(下パネル)。
【図３−２】(d)抗hCD34抗体および抗hCD38抗体を使用した大腿骨切片の免疫組織化学分析は、化学療法後に骨内膜領域にhCD34+hCD38-細胞が残存することを示す。(e)抗hCD34抗体(赤)および抗マウスオステオポンチン抗体(緑)ならびにDAPI(青)を使用した大腿骨切片の免疫蛍光染色により、Ara-C注射の3日後に、hCD34+ AML細胞が、マウス骨芽細胞に隣接する骨内膜表面に残存することが示される。同様の知見が、抗hCD34抗体(ピンク)および抗マウスオステオポンチン抗体(茶色)による免疫組織化学染色によって観察される。(f)AML生着レシピエントにおけるLSCおよび非幹細胞画分の細胞周期状態を、BrdU取り込みおよびHoechst/Pyronin Y染色によって分析した。(左)プロットの代表的セットを示す。(右)hCD34+hCD38- LSCの大多数はG0期にある(*p=0.004および**p=0.001、両側t検定)。
【図４】原発性ヒトAMLおよびレシピエントマウスのBMの包括的遺伝子発現プロファイリングにより、LSC特異的転写物が同定された。(a)患者(Pt)由来のhCD34+hCD38-細胞と対応するレシピエントマウスAML BM(Ms)由来のhCD34+hCD38-細胞との間の、包括的遺伝子発現プロフィールの比較。このパネルは、相関距離および平均の関連性を使用し、多重スケールブーツストラップリサンプリングによるクラスタリングにおいて不確定度を評価する、教師なし階層的クラスタリングを示す。系統樹のそれぞれの枝の数字は、2つのタイプのp値を示す：近似的に不偏なp値(AU、赤)およびブーツストラップ確率値(BP、緑)。(b)hCD34+hCD38-細胞中で濃縮された上位6つの遺伝子セットが示される。各遺伝子セットのfalse discovery rate(FDR)および公称(nominal)p値を、正規化した遺伝子セット濃縮スコアに基づき、サンプル上の表現型標識のパーミュテーションによって計算した。(c)CD34+CD38-細胞とCD34+CD38+細胞との間で、統計的に有意に示差的に発現されたタンパク質コード遺伝子。14(MOV10からC18orf1まで)および15(WNT5BからTTNまで)の遺伝子がそれぞれ、CD34+CD38-細胞において有意に(p<0.01)上方制御および下方制御された。カラースケールは、CD34+CD38-細胞において示差的に発現された遺伝子の正規化したハイブリダイゼーションシグナル強度の、CD34+CD38+細胞において示差的に発現された遺伝子の正規化したハイブリダイゼーションシグナル強度に対するLog2比を示す。このパネルにおいて、赤および青はそれぞれ、図の下にある参照カラーコードに示されるように、CD34+CD38-細胞における上方制御および下方制御を示す。各々の同定された示差的に発現された遺伝子についてのHUGO Gene Nomenclature Committeeに承認された遺伝子記号は、各行の右側に示される。CD34+CD38+細胞およびCD34+CD38-細胞の起源[即ち、症例番号および患者(Pt)に直接由来するかまたは異種移植モデルマウス(Ms)由来か]は、各列の上部に示される。
【図５】(a)AML生着マウスの骨切片を、モノクローナルマウス抗ヒトCD45抗体(赤)で標識した。核をDAPI(青)で標識した。En:骨内膜細胞、Os:骨細胞。(b-f)AML生着マウスの骨切片を、モノクローナルマウス抗ヒトCD34抗体(緑)およびポリクローナルヤギ抗ヒトCD45抗体(赤)で標識した。核をDAPI(青)で標識した。
【図６】マウスレシピエントにおける長期生着および連続移植後の、患者LSCのmRNAプロフィールシグネチャの統計的に有意な保存を独立して示す対応分析。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の末梢血中でヒトAML細胞が選択的に増幅したマウス（「本発明のマウス」ともいう）は、非成体NOD/SCID/IL2rgnullマウスにヒトAML患者由来のLSC含有物を移植し、該マウスを一定期間以上生育させることにより製造される。該製造方法(「本発明の方法」ともいう)で用いるNOD/SCID/IL2rgnullマウス(レシピエント)は、上記非特許文献１１に記載される方法に準じて作製することができる。具体的な方法の概略は、後記実施例の「材料および方法」に記載されたとおりである。本明細書中で使用する場合、「非成体」マウスとは、4週齢以下、好ましくは1週齢以下、より好ましくは生後3日以内のマウス（「新生仔」マウスともいう）を意味する。レシピエントマウスは、細胞移植の前に放射線等を照射することにより、自身の骨髄細胞を殺傷しておくことが好ましい。レシピエントマウスは、SPFグレード以上の条件下で飼育管理されているものを用いることが望ましい。【００１２】
本明細書において、上記レシピエントマウスに移植する「LSC含有物」とは、ヒトAML患者の骨髄から採取した少なくともLSCを含む細胞混合物およびそれから分離されるLSC含有画分を意味する。AML患者の性別、年齢、病気のステージ、AMLの種類等は特に制限されず、例えば、French-American-British（FAB）分類システムの任意のサブタイプに属するAMLであってよい。LSC含有物は、例えばT細胞枯渇骨髄単核細胞（TCD-BMMNC）や骨髄由来のhCD34+細胞画分であってよく、hCD34+hCD38-細胞画分などが特に好ましい。これらのLSC含有物は、その調製方法に起因して、LSC以外に正常な細胞(造血幹細胞(HSC)など)を含んでいてもよい。粗LSC含有物は常法によりAML患者の骨髄より採取することができ、LSCを含む各種細胞画分は、既知の細胞表面マーカー分子を用いたフローサイトメトリーなどにより得ることができる。尚、LSCとHSCの分離は困難である。【００１３】
LSC含有物のレシピエントへの移植方法は特に制限されないが、注射、注入、点滴などが好ましく、静脈内注射がもっとも好ましい。肝臓内注射、骨髄内注射などによっても、生着が得られる。【００１４】
LSC含有物を移植した後、該マウスを通常の飼育条件下（好ましくはSPF以上の条件下）で飼育管理すると、約４週後には骨髄で、約８週後には末梢血中においても、LSCの生着およびヒトAML細胞の増幅が認められる。移植後の生育期間に特に上限は無く、該マウスが死亡するまで生育させ得るが、該マウスを各種試験に供することを考慮すれば、１６週齢以下、好ましくは１２週齢以下のものを使用することが望ましい。【００１５】
本発明のマウスにおいては、骨髄(BM)中だけでなく、末梢血(PB)中でも顕著なLSCの生着およびAML細胞の増幅が認められる。従来公知の免疫不全マウスでは、末梢血中にAML細胞がほとんど検出されなかったので、本発明のマウスは簡便かつ安定なAMLモデル系を提供した最初の例である。また、本発明のマウスでは、末梢血中に正常なヒト由来細胞の存在は確認されない。これは、レシピエントマウスにおいてヒトの正常な造血が生じていないことを示唆する。この意味で、AML細胞はマウス末梢血中で「選択的に」増幅される。【００１６】
本発明では、ヒトAML患者由来のLSC含有物を直接移植したマウス(一次レシピエント)の骨髄からLSC含有物を採取し、別の非成体NOD/SCID/IL2rgnullマウス(二次レシピエント)に移植することによっても、ヒト患者由来のAML細胞が同様に増幅される。この操作を三次レシピエント、四次レシピエントなどで繰り返し実施しても、同様の効果(即ち、AML細胞の選択的増幅)が得られる(一次レシピエントから二次レシピエントへの移植も含め、連続移植という)。レシピエントマウスからLSC含有物を採取するタイミングは、少なくとも該マウスの骨髄に十分量のLSCが生着するようになる時期以降が好ましく、例えば、移植の約10週後以降、好ましくは約12〜約24週後などが挙げられるがこれに限定されない。【００１７】
本明細書中で使用する場合、「AML細胞（白血病細胞ともいう）」はhCD45+hCD33+細胞として定義され、hCD34+hCD38-細胞（即ち、AML発症の能力を選択的に有する、細胞周期が静止期で停止した化学療法剤抵抗性LSC）、hCD34+hCD38+細胞（細胞周期が停止していないLSC）、hCD34-細胞（AML非幹細胞）などが含まれる。【００１８】
白血病幹細胞を移植したレシピエントマウスにおいては、正常な造血の抑制(ヘモグロビン濃度、血小板計数などを測定することにより示される)、赤血球形成の抑制といったヒトAMLの特徴が良好に再現される。さらに、増幅されたAML細胞では、French-American-British(FAB)分類システムのサブタイプM0〜M7などの、個々の患者の元のAMLの特徴（白血病細胞の表面表現型、形態、遺伝子発現パターンなど）も再現される。従って、このレシピエントマウスをモデル動物として用いて、個々の患者に適したAML治療剤/治療方法を選択することができる。NOD/SCID/IL2rgnullマウスは従来のAMLモデルで使用されてきたマウス系統と比較して寿命が長く、また本発明の系では連続移植もできるので、長期間の試験が可能である。【００１９】
「本発明のマウス」は、有効なAML治療剤をスクリーニングし、個々の患者に適した治療方法を選択/最適化し、hCD34＋hCD38＋細胞とhCD34＋hCD38-細胞との間で示差的に発現される遺伝子（即ち、静止期LSCマーカー遺伝子）を同定するためなどに使用することができる。【００２０】
AML治療剤をスクリーニングするために、被験物質を当該マウスに投与し、その有効性（白血病の改善）および必要に応じて副作用を評価する。有効性および副作用の評価は、該マウスの生存、骨髄や末梢血中でのAML細胞数、全身状態（毛並み、活動性など）等を指標として行うことができるが、本発明のマウスは、骨髄だけでなく末梢血中にも十分量のAML細胞が存在するため、骨髄採取のためにマウスを殺傷することなく、1匹のマウスでの採血により、被験物質の治療効果や副作用を継続的にモニタリングできることが従来のモデルと比較したあきらかな優位性である。また、上記のように、本発明のマウスは寿命が比較的長いので、被験物質の有効性および副作用をより長期にわたって評価することができる。【００２１】
被験物質の投与方法は特に限定されず、経口投与または非経口投与(静脈内、腹腔内、皮下などが挙げられるが、これらに限定されない)から適宜選択される。投与のための剤形も、投与経路や被験物質の性質などに依存して適宜決定される。【００２２】
スクリーニングに供される被験物質は、いかなる化合物又は組成物であってもよく、例えば、核酸（例、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）、糖質（例、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖）、脂質（例、飽和又は不飽和の直鎖、分岐鎖及び／又は環を含む脂肪酸）、アミノ酸、タンパク質（例、オリゴペプチド、ポリペプチド）、抗体、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリ、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリ、天然成分（例、微生物、動植物、海洋生物等由来の成分）等が挙げられる。被験物質は、公知の化合物であってもよい。
好ましい被験物質の一例として、既知もしくは新規に見出されたAML治療ターゲット分子に対する抗体、あるいは治療ターゲット遺伝子に対するsiRNA、アンチセンス核酸（DNA、RNA）などが挙げられる。【００２３】
被験物質の有効性を末梢血を用いて評価する方法としては、例えば、末梢血中のhCD45+hCD33+細胞計数(AML細胞計数)、ヘモグロビン濃度、血小板計数などの経時的なモニタリングが挙げられるが、これらに限定されない。モニタリングは、例えば移植後約12〜32週にわたって実施することができる。このようなモニタリングにより、被験物質の有効性だけでなく副作用を評価してもよい。【００２４】
本発明により明らかにされたように、AML LSCは骨髄のニッチ(骨芽細胞が豊富に存在する領域に隣接する骨内膜表面)に存在し、細胞周期の静止期(G0期)にあるために、標準的な化学療法剤(例えば、寛解導入において必須であるAra-Cなど)では根絶することができず、これがAMLの再発の原因と考えられる。従って、本発明のスクリーニング方法により、その作用機構が細胞周期に依存しない治療剤が得られることが予測され、AMLの完治をもたらし得る治療剤の開発が期待される。【００２５】
現在実施されているAML治療の方法には、化学療法、放射線療法、幹細胞移植、その他の薬物療法、生物学的療法、またはそれらの組み合わせなどが挙げられる。本発明のマウスには、患者の元のAML特徴を保持するLSCが生着しているので、本発明のマウスをこれらのAML治療(1つまたは複数の療法)に供し、その有効性（白血病の改善）および/または副作用を評価することによって、個々の患者のための治療方法を選択/最適化することが可能である。治療方法の「選択/最適化」とは、各個人の疾患型に適した療法の選択、組み合わせ、あるいは条件変更などを行なうことをいう。AML治療の有効性および/または副作用の評価方法には、上記と同様の方法が挙げられる。【００２６】
本発明はまた、正常およびAMLにおけるhCD34＋hCD38＋細胞およびhCD34＋hCD38-細胞における遺伝子発現を網羅的に検出し、これらを比較することによる、ヒト白血病幹細胞マーカー遺伝子の同定方法を提供する。正常hCD34＋hCD38＋細胞およびhCD34＋hCD38-細胞は、正常人の臍帯血や骨髄から、あるいはヒト化マウス（造血系のヒト細胞を移植した免疫不全マウスであれば特に制限はないが、例えばWO 2004/110139に記載されるマウス等が挙げられる）から、血液を採取してソーティングすることにより取得することができる。また、AMLのhCD34＋hCD38＋細胞およびhCD34＋hCD38-細胞は、AML患者や本発明のマウスから同様にして取得することができる。ヒトからのサンプリングには制限が伴うので、本発明のマウスを用いることは大いに有用である。【００２７】
例えば、正常のhCD34＋hCD38±細胞(正常ヒトHSC)とAMLのhCD34＋hCD38±細胞(LSC)との間で示差的に発現される遺伝子を同定することにより、AML細胞マーカー遺伝子を抽出することができる。ここで「示差的に発現される」とは、両細胞間で有意に発現量が異なる（AML細胞において発現が上昇するか低下するかを問わない）ことを意味する。このような遺伝子の同定方法としては、マイクロアレイを適切な統計的解析法と組み合わせた方法(例えば、本明細書の後記実施例に記載される方法)などが挙げられるが、これらに限定されない。【００２８】
好ましい一実施態様においては、１）AMLにおけるhCD34＋hCD38＋細胞（活性型LSC）とhCD34＋hCD38-細胞（静止期LSC）との間で示差的に発現される遺伝子を同定し、２）正常なhCD34＋hCD38＋細胞（活性型HSC）とhCD34＋hCD38-細胞（静止期HSC）との間で示差的に発現される遺伝子を同定する。１)および２）で同定された遺伝子群を比較して、両者で共通して示差的に発現される遺伝子群を除外したものを、静止期ヒトLSC特異的なマーカー遺伝子として抽出することができる。【００２９】
本発明はまた、上記方法により同定された静止期LSCマーカー遺伝子にコードされる蛋白質を分子標的とする、静止期LSC選択的なヒトAML治療剤を提供する。該蛋白質を標的化し得る物質の好ましい例として、該蛋白質に対する抗体が挙げられる。後記実施例に示されるとおり、活性型LSCと比較して静止期LSCにおいて有意に発現が上昇する遺伝子が同定された(図4b、参照)。これらの遺伝子の塩基配列はいずれも公知であり、当業者は、常法に従って容易に該遺伝子のcDNAをクローニングし、組換え蛋白質を取得することができる。得られた組換え蛋白質をもしくはそのフラグメントを抗原として周知の抗体作製技術を用いて該蛋白質に対する抗体を作製することができる。また、該遺伝子の発現を直接転写・翻訳レベルで抑制するための、shRNA、siRNA、アンチセンスDNA、アンチセンスRNAに基づく医薬も創薬の候補のひとつとなりうる。【００３０】
該抗体はADCC活性もしくはCDC活性を用いて、静止期LSCを選択的に殺傷するものであってもよいし、あるいは、該抗体に抗癌物質を常法により結合したイムノコンジュゲートであってもよい。このような抗癌物質には、放射性核種、毒素、他の各種薬物などが挙げられる。LSCは静止期にあり、細胞周期依存的な化学療法剤に対して抵抗性であるので、他の作用機序によりLSCを殺傷するものが望ましい。使用する抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくはIgG、IgMまたはIgA、特に好ましくはIgGが挙げられる。また、該抗体は、標的抗原を特異的に認識し結合するための相補性決定領域（CDR）を少なくとも有するものであれば特に制限はなく、完全抗体分子の他、例えばFab、Fab'、F(ab’)2等のフラグメント、scFv、scFv-Fc、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール（PEG）等の蛋白質安定化作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体などであってもよい。また、該抗体はヒトを投与対象とする医薬品として使用されることから、ヒトに投与した場合に抗原性を示す危険性が低減された抗体、具体的には、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス−ヒトキメラ抗体などであり、特に好ましくは完全ヒト抗体である。ヒト化抗体およびキメラ抗体は、常法に従って遺伝子工学的に作製することができる。また、完全ヒト抗体は、ヒト−ヒト（もしくはマウス）ハイブリドーマより製造することも可能ではあるが、大量の抗体を安定に且つ低コストで提供するためには、ヒト抗体産生マウスやファージディスプレイ法を用いて製造することが望ましい。本発明者らがすでに特許出願した免疫系ヒト化マウスもその一例である（WO 2004/110139を参照のこと）。ここで「ヒト化マウス」とは、造血系のヒト細胞を移植した免疫不全マウスを意味する。【００３１】
上記抗体またはイムノコンジュゲートはそのまま、あるいは薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とともに、常法に従って製剤化することができ、経口または非経口投与（例、静脈注射）に適する剤形として提供される。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記活性成分を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene(50mol)adduct of hydrogenated castor oil）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記物質を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。【００３２】
上記医薬組成物の投与量は、患者の年齢、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば注射剤の形で投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該抗体を、約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。
【実施例】
【００３３】
本発明を以下の実施例においてより詳細に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものと解釈すべきではない。【００３４】
（材料および方法）
マウス
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtmlWjl/Sz(NOD/SCID/IL2rgnull)マウスは、Il2rg遺伝子座の完全ヌル変異(Shultz, L.D. et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J Immunol 154, 180-191 (1995))をNOD.Cg-Prkdcscid(NOD/SCID)系統と戻し交雑することによって、The Jackson Laboratoryで開発された。NOD.Cg-Prkdcscidb2mtm1Unc(NOD/SCID/β2mnull)マウスは、The Jackson Laboratoryで維持された研究用コロニーから得た。マウスを、理研およびThe Jackson Laboratoryの動物施設で、各施設でInstitutional Animal Committeesによって確立されたガイドラインに従って、照射した食物および酸性化した水を用いて飼育し、規定された細菌叢のもとで維持した。
【００３５】
患者サンプル
理研RCAIのInstitutional Review Board for Human Researchからの以前の承認により、全ての実験を実施した。AML患者由来の白血病細胞は、書面によるインフォームドコンセントにより収集した。サンプルは、French-American-British(FAB)分類システムのサブタイプM1(前骨髄球性を超える成熟を伴わない;症例1、2および11)、M2(骨髄芽球性、成熟を伴う;症例3、4、10)、M3(前骨髄球性;症例5、6)、M4(骨髄単球性;症例7、8および12)およびM7(巨核芽球性;症例9)を有するAML患者に由来した。BMMNC（骨髄単核球細胞）は、密度勾配遠心分離を使用して単離した。【００３６】
初代AML BMMNCの一次および連続異種移植
T細胞枯渇(TCD)BMMNC移植のために、全BMMNCを、マウス抗hCD3、抗hCD4および抗hCD8モノクローナル抗体(BD Immunocytometry, San Jose, CA)と共にインキュベートし、その後抗マウスIgG抗体コンジュゲート化免疫磁気ビーズ(Dynal, Norway)を用いてT細胞を除去した。ソートしたhCD34+hCD38-AML細胞の移植のために、AML患者のBMMNCを、蛍光色素コンジュゲート化マウス抗hCD34モノクローナル抗体および抗hCD38モノクローナル抗体(BD Immunocytometry, San Jose, CA)で標識し、その後FACSAria(Becton Dickinson, San Jose, CA)を使用して蛍光標識細胞分取(FACS)を行なった。混入を回避するために、FSC/SSC高さおよびFSC/SSC幅の分析によって、ダブレットを排除した。hCD34+hCD38-細胞の純度は、ソート後には98％よりも高かった。新生仔(誕生後2日以内)および成体(10〜12週齢)のマウスに、137Cs源照射器を使用して、100cGy/分で、それぞれ100cGyおよび300cGyの全身照射を与え、その後2時間以内にAML細胞の静脈内注射を行なった。【００３７】
一次移植のために、9人のAML患者(症例1〜9)由来の4×106のTCD-BMMNC、ならびに6人のAML患者(症例1、4、7、10、11および12)由来の103、1〜2×104または1〜2×105の精製hCD34+hCD38-BM AML細胞を、照射した新生仔レシピエントに注射した(レシピエントの総数＝27)。TCD-BMMNC注射した一次レシピエントを、移植の3ヵ月後にBM AML生着について評価した(注射した各マウス系統についてn=9)。精製hCD34+hCD38-細胞のレシピエントを、移植の16〜24週間後まで、4週間毎にPB AML生着について評価した。移植の16週間後、症例1、4、7、10および11由来の104の精製hCD34+hCD38-AML細胞の一次レシピエントを屠殺し、二次移植のためのBMを得た。各場合において、一次レシピエントのBM由来の104〜5×105のhCD34+hCD38-細胞を、細胞分取によって精製し、照射した二次レシピエントに注射した(AML症例数=5、レシピエントの総数=24)。二次レシピエントのPBを、AML生着、ヘモグロビン濃度および血小板計数について、2〜3週間の間隔でモニタリングした。移植の16〜24週間後、AML症例4、7および10の二次レシピエントを屠殺して、三次移植のためのBMを得た。症例4(AML M2)の二次レシピエントから、ソートしたBM hCD34+hCD38-細胞(8×103)、hCD34+hCD38+細胞(5×104)およびhCD34-細胞(2×106)を、照射した三次レシピエント(各々n=2)に注射した。症例7(AML M4)の二次レシピエントから、ソートしたBM hCD34+hCD38-細胞(103)、hCD34+hCD38+細胞(6×103)およびhCD34-細胞(105)を、照射した三次レシピエント(各々n=1)に注射した。症例10(AML M2)の二次レシピエントから、ソートしたBM hCD34+hCD38-細胞(104)を、照射した三次レシピエント(n=3)に注射した。三次レシピエントのPBを、AML生着、ヘモグロビン濃度および血小板計数について、16〜24週目まで2〜4週間の間隔でモニタリングした。詳細な移植結果もまた表１中に示す。【００３８】
レシピエントマウスのPBおよびBM分析
BMは大腿骨および脛骨から収集し、PBは移植レシピエントの眼窩静脈叢から収集した。BM細胞およびPB細胞の表面表現型を、マウス抗hCD33、hCD13、hCD34、hCD38、hCD45、hGPA、hCD41aおよびラット抗mTer119、ならびにmCD41aモノクローナル抗体(BD Immunocytometry)を使用するフローサイトメトリーによって分析した。生着したhCD45+hCD33+細胞をソートし、May-Grunwald Giemsa染色によって形態学的に試験した。ソートしたhCD45+hCD33+レシピエントBMMNCは全てMay-Grunwald-Giemsa染色によって確認されるとおり白血病芽球であったので、ヒトAML生着をレシピエントBMにおける%hCD45+hCD33+として定義した。【００３９】
NOD/SCID/IL2rgnullレシピエント骨切片の組織学的分析
パラホルムアルデヒドで固定し、脱灰し、パラフィン包埋した切片を、ソートしたhCD34+hCD38-AML BM細胞を移植したレシピエントの大腿骨から調製した。各切片をヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色に供した。TUNEL染色を、Biopathology Institute(Oita, Japan)によるApopTagペルオキシダーゼin situアポトーシス検出キット(Intergene, Purchase, NY)を使用して、標準的な手順に従って実施した。CD34+細胞集団の局在を決定するために、切片をマウス抗hCD34抗体(Immunotech, France)で免疫染色し、ラット抗マウスオステオポンチン抗体(Immuno-Biological Laboratories, Tokyo, Japan)を使用した。LSCの定量的局在について、骨内膜領域および中心領域を、以前に記載されたように(Nilsson, S.K., Johnston, H.M. & Coverdale, J.A. Spatial localization of transplanted hemopoietic stem cells: inferences for the localization of stem cell niches. Blood 97, 2293-2299 (2001))、それぞれ骨内膜から12細胞内側または外側の領域として定義した。各領域内の細胞計数を、Zeiss Axiovert 200(Carl Zeiss, Germany)を用いて光学顕微鏡下で実施した。ホーミング分析のために、症例4、7および10由来の4×103〜4×104のBM hCD34+hCD38-細胞を、6〜8Gyを照射した後に新生仔レシピエントに注射した。3日目にレシピエントを屠殺し、大腿骨および脛骨を組織学的分析のために得た。合計10,065の細胞が、大腿骨および脛骨の切片から計数された。生着後局在分析について、合計24,973の細胞が、症例4、10および11由来のBM hCD34+hCD38-細胞のレシピエントから調製した大腿骨および脛骨の切片を使用して計数された。免疫蛍光標識を、モノクローナル抗ヒトCD45抗体(Dako, Denmark)およびモノクローナル抗ヒトCD34抗体(Immunotech)を使用して実施した。白血病細胞の表面上のhCD34およびhCD45の同時局在を決定するために、ポリクローナルヤギ抗ヒトCD45抗体(Santa Cruz Biotechnology, CA)を使用した。Alexa 488コンジュゲート化ロバ抗マウスIgGおよびAlexa 568コンジュゲート化ロバ抗ヤギIgG(Invitrogen, CA)を二次抗体として使用した。共焦点レーザー走査画像化を、Zeiss LSM 510(Carl Zeiss, Germany)を使用して実施した。
【００４０】
シトシンアラビノシド(Ara-C)処置および分析
150mg/kg のAra-C(Biogenesis, Poole, UK)の腹腔内(i.p.)注射を、移植の12〜16週間後に、症例4(n=2)および7(n=4)由来の104の精製BM hCD34+hCD38-細胞を移植したNOD/SCID/IL2rgnullレシピエントにおいて実施した。PBを、注射の時点(0日目)およびその後4日毎に得、MNCをマウス抗hCD45および抗hCD33モノクローナル抗体で標識し、フローサイトメトリーを用いてhCD45+hCD33+細胞の割合を決定した。PB  1ml当たりのAML細胞数を、各レシピエントにおいて、PB hCD45+hCD33+細胞の割合と総PB白血球計数/mlとを乗算することによって決定した。ヘモグロビン濃度、血小板計数および血漿アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)レベルを、Ara-C投与の前および投与の8日後に分析した。
【００４１】
化学療法後のアポトーシス分析
移植の12〜20週間後に、症例4、7および11由来のソートしたBM hCD34+hCD38-細胞104〜105を移植したNOD/SCID/IL2rgnullレシピエントに、150mg/kgのAra-Cをi.p.注射した。注射の3日後、BMを、hCD45+ゲート内のhCD34+hCD38-画分、hCD34+hCD38+画分およびhCD34-画分を最初に分割し、Annexin Vおよび7-アミノ-アクチノマイシンD(7AAD)染色(BD Immunocytometry, San Jose, CA)によって各画分中の生存集団を定量することによって、アポトーシス細胞の存在について分析した。Annexin V-7AAD-hCD45+hCD34+hCD38-細胞をソートし、103の細胞を、照射した新生仔NOD/SCID/IL2rgnullレシピエントに静脈内注射した。
【００４２】
細胞周期分析
in vivoのBrdU取り込みについて、ヒトAML生着レシピエントを、2mgのBrdUでパルスし(i.p.)、BMを、FITC BrdU Flow Kit(BD Biosciences, San Diego, CA)ならびに上記のhCD34抗体およびhCD38抗体を使用して、注射の24時間後に分析した。細胞周期のG0期にある細胞の定量のために、ヒトAML生着レシピエントのBM細胞を、5μg/mlのHoechst 33342および30μg/mlのPyronin Yで標識し、その後抗hCD34抗体および抗hCD38抗体を使用する表面染色を実施した。【００４３】
マイクロアレイ分析
マイクロアレイ分析のために、AML患者および対応する三次レシピエントのBMから、2〜5×104のhCD34+hCD38-細胞およびhCD34+hCD38+細胞を、FACSAriaを用いて精製した。総RNAを、ISOGEN-LS試薬(Nippon Gene, Toyama, Japan)を使用して抽出し、RNAの完全性をBioanalyzer(Agilent, Santa Clara, CA, USA)を用いて評価した。cDNA合成、aRNA増幅、ビオチン化および断片化を、One-Cycle Target Labeling Kit(Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)を用いて実施した。15μgの標識サンプルをハイブリダイゼーションカクテルに添加し、製造者の指示書に記載されたとおりに、45℃で16時間、Human Genome U133 Plus 2.0 GeneChips(Affymetrix)とハイブリダイズさせた。洗浄およびストレプトアビジン-フィコエリトリン染色を、GeneChip Fluidics Station(Affymetrix)を使用して実施した。続いて、チップを、GeneChip Scanner 3000(Affymetrix)を使用してスキャンした。各プローブセットについて正規化したハイブリダイゼーション強度を、GeneSpringソフトウェアパッケージ(Agilent)のGC-RMA法(Subramanian, A. et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 15545-15550 (2005))をデフォルトの設定で用いて計算した。Rで実行されるpvclust(Suzuki, R. & Shimodaira, H. Pvclust: an R package for assessing the uncertainty in hierarchical clustering. Bioinformatics (Oxford, England) 22, 1540-1542 (2006))(http://www.r-project.org/)および2007年2月に構築された「Curated」遺伝子セットコレクションを使用するGene Set Enrichment Analysis(Subramanian, A. et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 15545-15550 (2005))を、パラメータをデフォルトに設定して使用する階層的クラスタリング分析に、このマイクロアレイデータを供した。同じmRNAプロフィールを使用する対応する分析もまた実施した(Culhane, A.C., Thioulouse, J., Perriere, G. & Higgins, D.G. MADE4: an R package for multivariate analysis of gene expression data. Bioinformatics (Oxford, England) 21, 2789-2790 (2005))。CD34+CD38-細胞とCD34+CD38+細胞との間で有意に示差的な発現を示す遺伝子を規定するために、マイクロアレイデータを、p値<0.01で統計的t検定によって分析した。特に、RefSeqコレクション(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/)中のヒトタンパク質コード遺伝子をこの分析において考慮した。全てのマイクロアレイデータを、アクセッションID CBX21でCIBEX(日本の公開の遺伝子発現データベース(http://cibex.nig.ac.jp/))に登録した。【００４４】
統計的分析
平均％生着における差異を、BMDP Statistical Software(SPSS, Chicago, IL)を使用して、ノンパラメトリックFriedman二元配置分散分析によって分析した。ソートした集団における一次および二次生着の平均％の差異を、Kruskal-Wallis検定(GraphPad Prism, GraphPad, San Diego, CA)によって分析した。両側t検定を、ホーミングおよび生着局在、アポトーシスならびに細胞周期分析のために使用した(GraphPad Prism, GraphPad, San Diego, CA)。【００４５】
実施例１
初代ヒトAML細胞は、新生仔NOD/SCID/IL2rgnullモデルにおいて高い効率で生着する。80〜90％のAML芽球を含む9人の患者のBMから、4×106のT細胞枯渇BM単核細胞(BMMNC)を、致死未満で照射したレシピエントに静脈内注射した。ヒトAMLの生着は、成体NOD/SCID/IL2rgnull(11.9%)レシピエントおよび新生仔NOD/SCID/β2mnull(12.9%)レシピエントと比較して、新生仔NOD/SCID/IL2rgnullレシピエント(37.8%)において有意に効率が高かった(図1a)。さらに、全てのAML患者のBMMNCは、新生仔NOD/SCID/IL2rgnullレシピエントにおいて生着したが、3/9(2人のM3および1人のM7)のBMMNCは、成体NOD/SCID/IL2rgnullレシピエントおよび新生仔NOD/SCID/β2mnullレシピエントにおいて生着できなかった。
【００４６】
実施例２
CB17/SCIDマウスおよびNOD/SCIDマウスにおいて、BM中のヒトAML hCD34+hCD38-の生着は以前に実証されているが、末梢血(PB)生着の検出は限定的であった(Lapidot, T. et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature367, 645-648 (1994)およびLumkul, R. et al. Human AML cells in NOD/SCID mice: engraftment potential and gene expression. Leukemia16, 1818-1826 (2002))。新生仔NOD/SCID/IL2rgnullレシピエントにおいて、外因性サイトカインも他の操作もなしに、ソートした初代AML hCD34+hCD38-細胞を103の少量静脈内注射した後に、用量依存的なPB AMLの生着が検出されたが、5×104〜106のhCD34+hCD38+細胞または106のhCD34-細胞の注射は、検出可能な生着を生じなかった(図1b-f, 表１)。移植されたhCD34+hCD38- LSCは、hCD45+hCD34+hCD38-細胞ならびにhCD45+hCD34+hCD38+およびhCD45+hCD34-のAML非幹細胞を生じ、初代LSCのin vivoでの自己複製能および分化能の両方が実証されている。原発性AML疾患をin vivoでよりよく再現することに加えて、循環PB AML細胞の存在は、単一のレシピエントにおける複数の時点にわたる個々の患者のAMLの試験を可能にし、AMLの発症、増殖、増悪、治療の効果、再発のすべてをマウスに再現することができるため、これは、新生仔NOD/SCID/IL2rgnullモデルの顕著な利点である。
【００４７】
実施例３
連続移植により、AML BM hCD34+hCD38-細胞の機能的自己複製能および分化能(LSCの決定的な特性)が実証された。二次および三次のレシピエントにおいて、104および103の少量の精製AML BM hCD34+hCD38-細胞の注射はそれぞれ、充分高率な長期生着を生じ、hCD34+hCD38- LSCおよびhCD34+hCD38+/hCD34-芽球を生じた(図1b, g-j, 表１)。一次レシピエント同様、ソートされたhCD34+hCD38-細胞の二次および三次のレシピエントは全て、AMLの生着を示した(図1b, 表１)。対照的に、5×104〜106のhCD34+hCD38+の精製BM細胞も105〜2×106のhCD34-の精製BM細胞も、二次レシピエントおよび三次レシピエントのPBおよびMBにおいて検出可能な白血病を開始させなかった(図1b, i, j)。これらの知見は、LSCがhCD34+hCD38-のままであり、その間異種BM微小環境が、連続移植過程の間のヒトLSCの自己複製および分化を支持することを実証している。ヒトAMLは、患者から三次レシピエントへと１年を超えてin vivoで累積的に維持され、このことは、LSCの長期生着能および自己複製能を実証している。【００４８】
【表１−１】
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【００４９】
【表１−２】
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【００５０】
【表１−３】
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【００５１】
実施例４
正常なヒト造血は、連続移植過程において観察されず、レシピエントPBの赤血球および血小板は全てマウス起源であった(図2a)。わずか数十個の正常造血幹細胞からヒト血小板が産生されることを考慮に入れると、これは、選択的に白血病幹細胞が生着し、マウス体内において白血病を形成していることの証拠である。さらに、レシピエントPBのヘモグロビン濃度および血小板計数は、白血病負荷（leukemic burden）に反比例し、これは、AML疾患の進行に特徴的な正常な造血の抑制に類似している(図2b)。レシピエントの大腿骨および脾臓の巨視的外観により、AML疾患と一致する赤血球形成の抑制が確認され(図2c)、これは、ソートされたhCD34+hCD38+およびhCD34-AML細胞または正常BM hCD34+hCD38-細胞が移植された際には観察されなかった知見である。レシピエントの脾臓サイズは症例間で変動したが、腫大した脾臓は、ヒトAML細胞を一貫して含んだ(データ示さず)。これらの知見は、NOD/SCID/IL2rgnullマウスにおけるLSC生着およびAML増殖(expansion)が、ヒト白血病誘発を再現するという、さらなる機能的証拠を提供する。
【００５２】
実施例５
ヒト初代（ここで初代とは、患者より直接得られた細胞であることを意味するため、培養などにより患者細胞の性質が人為的影響を受けていない）LSCのための微小環境ニッチはin vivoで規定されていないが、ヒトLSCの自己複製および分化した白血病性子孫の増殖によって特徴付けられる首尾よい長期生着は、NOD/SCID/IL2rgnullマウスのBMがヒトLSCの生存および増殖のための支持的微小環境を提供する能力を実証している。すなわち、環境はヒトでなくマウスであるものの、ヒト白血病幹細胞の機能的、細胞学的特徴を維持することができる環境を、本移植システムは有している。LSCのための微小環境ニッチを直接位置決めするために、レシピエントの大腿骨切片を、静脈内LSC注射の３日後に試験した。hCD34+AML細胞は、正常な「マウス」造血幹細胞の微小環境ニッチの部位(Zhang, J. et al. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature 425, 836-841 (2003); Calvi, L.M. et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature 425, 841-846 (2003);およびArai, F. et al. Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. Cell 118, 149-161 (2004))である骨内膜表面を裏打ちしていることが見出され、一方でBM腔の中心領域は、照射に起因してほぼ細胞が消失した空洞に近い状況であった(図2d)。骨内膜領域の細胞は、形態学的に均一ではなく、典型的に丸い細胞のみならず紡錘型の細胞および他の異型形状の細胞もCD45を発現し、丸形の細胞だけでなく紡錘形の細胞もヒト白血病細胞であって骨内膜細胞や血管内皮細胞ではないことを実証している(図５a-b)。CD45とCD34との同時局在は、共焦点顕微鏡画像によっても確認された(図５c-f)。hCD34+AML細胞は、移植の４ヶ月後(このとき、BMにはAML細胞が充満している)に、マウス骨芽細胞に隣接する骨内膜表面に優先的に残留する(図2e, g)。定量的分析により、LSCがBMの骨内膜領域にホーミングしてそこに存在し続けることが実証された(図2f)。これらの細胞はAML患者から得られたので、ソートされたhCD34+hCD38-細胞は、LSC同様正常HSCも含んでいる可能性がある。しかし、ソートされたhCD34+hCD38-細胞のレシピエントにおいて正常なヒト造血の生着が存在しないことは、これらの細胞の大多数（数的にも機能的にも）が悪性腫瘍起源であることを示している。これらの知見は、AML進行の間の正常な造血の抑制が、共用のBM微小環境ニッチについての競合の結果であり得ることを示唆している。
【００５３】
実施例６
治療剤のin vivo試験は、AMLに対する新規治療の開発を大いに促進し、個々の患者のための治療戦略の最適化を導き得る、いわゆる個人医療（テーラーメード医療）の実現に繋がると期待される。本発明者らは、シトシンアラビノシド(Ara-C)のin vivo抗白血病細胞毒性を、AMLが生着したNOD/SCID/IL2rgnullレシピエントにおいて試験した(図3a,左)。シトシンアラビノシドは、AMLの治療のための標準的な化学療法剤である。Ara-C処置したマウスにおいて、PB AML負荷は、8日目までに顕著に減少した。細胞毒性効果には、全ての処置マウスにおいて貧血および血小板減少症が伴い、１匹の動物では軽症の肝毒性が生じ、これは、Ara-Cの既知の毒性プロフィールと一致する(図3a,右)。AMLを有する患者の場合と同様、１回のAra-C処置の効果は一過性であり、その後、PB AML細胞計数の回復によって実証されるとおり、16〜28日目までにAMLが再発した。
【００５４】
実施例７
この薬物試験モデルを使用して、本発明者らは、ヒトAML幹細胞画分および非幹細胞画分の化学受容性を試験した。Ara-C処置の３日後のBMのフローサイトメトリー分析により、hCD34+hCD38-LSCでは、AML非幹細胞画分と比較して、統計的に有意にAra-Cに対する抵抗性が高いことが明らかになった(図3b)。化学療法抵抗性の白血病細胞の局在を同定するために、本発明者らは、Ara-C処置の３日後の大腿骨切片を使用して、ヘマトキシリン−エオシン(HE)およびTUNEL染色を実施した。組織学的研究により、骨内膜表面を裏打ちするTUNEL陰性生存細胞から、骨髄腔の中心のアポトーシス細胞が顕著に分離されていることが実証された(図3c)。免疫染色により、骨内膜に隣接する細胞はその表面上にhCD34を発現するがhCD38は発現せず、オステオポンチン+骨芽細胞に隣接することが確認された(図3d,e)。Ara-C処置マウス由来の103のAnnexinV-7AAD-hCD34+hCD38-細胞の注射は、二次レシピエントにおいてヒトAMLを発症させたが、hCD34+hCD38+細胞もhCD34-細胞もヒトAMLを発症させず、このことは、稀なLSCの化学療法抵抗性がAML再発の原因であることを示している。BrdU取り込みおよびHoechst/Pyronin Y染色によって実証されるように、hCD34+hCD38- AML細胞は、hCD34+hCD38+細胞およびhCD34-細胞と比較して、比較的細胞周期静止である(図3f)。Ara-Cを含む多数の化学療法剤は、細胞周期依存的な細胞毒性を発揮するので、LSCの細胞周期静止は、LSCの化学療法剤抵抗性の基礎をなす機構の１つである可能性がある。【００５５】
実施例８
LSCはin vivoでAMLを排他的に開始し得、従来の化学療法薬物に対して抵抗性であるので、化学療法抵抗性のLSCを特異的に標的化する新規治療戦略が、ヒトAMLにおける疾患再発を予防するために必要とされる(Guzman, M.L. et al. Preferential induction of apoptosis for primary human leukemic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 16220-16225 (2002);Guzman, M.L. et al. The sesquiterpene lactone parthenolide induces apoptosis of human acute myelogenous leukemia stem and progenitor cells. Blood 105, 4163-4169 (2005);およびTaussig, D.C. et al. Hematopoietic stem cells express multiple myeloid markers: implications for the origin and targeted therapy of acute myeloid leukemia. Blood 106, 4086-4092 (2005))。最近、細胞表面マーカーCD44は、マウスおよびヒトのLSCのホーミングおよび生着の両方において重要であると報告された(Jin, L., Hope, K.J., Zhai, Q., Smadja-Joffe, F. & Dick, J.E. Targeting of CD44 eradicates human acute myeloid leukemic stem cells. Nat Med 12, 1167-1174 (2006)およびKrause, D.S., Lazarides, K., von Andrian, U.H. & Van Etten, R.A. Requirement for CD44 in homing and engraftment of BCR-ABL-expressing leukemic stem cells. Nat Med 12, 1175-1180 (2006))。LSCのホーミングの妨害によるAMLの開始の予防に加えて、既に生着していてAML非幹細胞を生じることができるLSCを根絶し得る治療を開発することが、緊急の課題である。原発性AML患者における非幹細胞画分と比較した、LSCの網羅的なトランスクリプトーム分析は、個々の患者のレベルで、LSCにおいて特異的に発現される分子標的を同定するための強力なツールである。LSCの機能的特性を保持するAMLモデルマウスの開発は、LSCおよび非LSCを提供することにより、包括的な遺伝子プロファイリングを促進し得る。4人の原発性AML患者および対応する4匹のレシピエントマウスのBMからの、機能的に規定された初代ヒトLSCの予期される単離の後、本発明者らは、hCD34+hCD38-細胞とhCD34+hCD38+細胞とを比較するために、包括的遺伝子発現プロファイリングを実施した。患者BM由来のhCD34+hCD38-細胞とレシピエントマウスBM由来のhCD34+hCD38-細胞との間の遺伝子発現プロフィールの高い相関は、LSCにおける遺伝子発現シグネチャが、連続移植の間マウスBM微小環境において比較的安定のままであったことを示している(図4a, 図6)。この結果は、レシピエントマウスBM由来のhCD34+hCD38-細胞の分析が、患者BM由来のhCD34+hCD38-細胞の分析を補完する情報を提供できることを示している。従って、本発明者らは、各々の元の原発性AML BMおよび対応するレシピエントマウスBM由来のhCD34+hCD38+細胞と比較して、hCD34+hCD38-細胞において一貫して濃縮された遺伝子を明確にするために、遺伝子セット濃縮分析を実施した(図4b)。LSC画分において最も顕著に濃縮された遺伝子セットは、MAPK(mitogen-activated protein kinase)、SRC(v-src sarcoma viral oncogene homolog)、FYN(FYN oncogene related to SRC, FGR, YES)およびPXN(パキシリン)などの遺伝子を含むインテグリン経路であった(Cursi, S. et al. Src kinase phosphorylates Caspase-8 on Tyr380: a novel mechanism of apoptosis suppression. Embo J 25, 1895-1905 (2006)およびJanes, S.M. & Watt, F.M. New roles for integrins in squamous-cell carcinoma. Nat Rev Cancer 6, 175-183 (2006))。これらのインテグリン関連遺伝子を介したシグナル伝達は抗アポトーシス性であり、腫瘍細胞における細胞周期停止をもたらすか、あるいは白血球付着を調節する。さらに、本発明者らは、教師なし階層的クラスタリングによって、LSCにおいて統計的信頼度で示差的に発現される遺伝子を同���した(図4c)。その遺伝子は、LSC特異的治療の潜在的な標的である、転写因子、アポトーシスのネガティブレギュレータおよび膜貫通分子をコードする(図4c)。LSCにおける、細胞周期をG0からG1に推進するサイクリンA(CCNA1)の相対的下方調節は、細胞周期分析によって明らかなように、LSCにおける％G0頻度の増加と適合するように思われる(図3f)。対照的に、BAALC(brain and acute leukemia, cytoplasmic)(Tanner, S.M. et al. BAALC, the human member of a novel mammalian neuroectoderm gene lineage, is implicated in hematopoiesis and acute leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 13901-13906 (2001))（その発現は、AML患者の予後の悪さと相関する）は、LSCにおいて高度に発現される。さらに、BMI-1との相互作用を介してポリコーム複合体を形成し、転写リプレッサーとして作用するリングフィンガータンパク質1（RING1）もまた、LSCにおいて過剰発現される。NOD/SCID/IL2rgnullマウスにおいて機能的に規定された集団を比較する、より多数のAML患者を試験する包括的トランスクリプトーム分析が、将来LSC特異的分子標的の検出に必要とされる。
【００５６】
NOD/SCID/IL2rgnull原発性ヒトAML生着モデル系を使用して、本発明者らは以下を実証した：
1)長期生着性で自己複製性のLSCは、AML患者およびレシピエントマウスのBMにおいて排他的に存在すること；
2)LSCが骨芽細胞リッチな骨内膜領域にホーミングしてそこに定着し、増殖すること；
3)骨芽細胞リッチな領域内の大多数のLSCがG0期にあり、Ara-C処置に対して抵抗性であってこれがAML再発に寄与すること；および
4)マウスBM中に生着したLSCが、表現型、機能および遺伝子発現パターンにおいて患者のAML LSCの特徴を保持し、これにより個々のAML患者における新規LSC特異的治療標的の同定が可能となること。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明のNOD/SCID/IL2rgnull原発性ヒトAML生着モデルは、各患者からin vivo研究用の白血病細胞の豊富な供給源を作製することによって、患者特異的な様式でのAML治療の効力および最適な治療ウインドウのin vivo決定のために使用され得る。in vivoの系を使用した初代AML LSCの化学受容性の予測および治療の副作用の評価は、個別のLSC標的化白血病治療の開発の助けとなろう。機能的に規定されたヒトLSCを提供するヒト原発性AML生着モデルの開発により、レシピエントマウスから、適切な数の稀なLSCを非LSC集団と共に単離することが可能となる。in vivoで初代LSCをこのように増殖させる能力は、LSCトランスクリプトームの大規模な分子分析を可能にし、治療標的の発見、および患者特異的なLSC標的化AML治療の開発のためのLSCに特異的な薬物抵抗性の分析を促進する。
【００５８】
本出願は、日本で出願された特願２００７−２７１８７０を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含される。また、本明細書で引用した特許文献および非特許文献は、引用したことによってその内容の全てが開示されたと同程度に本明細書中に組み込まれるものである。
【図４】
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【図６】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図５】
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