(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取されたＤＮＡ含有試料において、ＫＣＮＱ１遺伝子に存在する１以上の多型を検出することを含み、
前記多型が、ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ１５１２９０、ｒｓ１６３１８４、ｒｓ２２３７８９５およびｒｓ２２３７８９２で示される多型である、上記被験者の２型糖尿病に対する遺伝的感受性の検査方法。
【請求項２】
被験者から採取されたＤＮＡ含有試料において、ＫＣＮＱ１遺伝子に存在する多型であって、一方のアリール頻度が、任意の２型糖尿病非罹患者集団におけるよりも任意の２型糖尿病患者集団において高い多型からなる群より選ばれる１以上の多型を検出することを含み、
前記多型が、ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ１５１２９０、ｒｓ１６３１８４、ｒｓ２２３７８９５およびｒｓ２２３７８９２で示される多型である、上記被験者の２型糖尿病に対する遺伝的感受性の検査方法。
【請求項３】
ｒｓ１５１２９０の遺伝子型がＣ、ｒｓ１６３１８４の遺伝子型がＧ、ｒｓ２２３７８９５の遺伝子型がＣ、および／またはｒｓ２２３７８９２の遺伝子型がＣである場合に、２型糖尿病に対する遺伝的感受性が高いと判定する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ２３０７０２７、ｒｓ３７４１８７２、ｒｓ５７４６２８、ｒｓ２２３３６４７、ｒｓ３７８５２３３およびｒｓ２０７５９３１で示される多型であって、一方のアリール頻度が、任意の２型糖尿病非罹患者集団におけるよりも任意の２型糖尿病患者集団において高い多型からなる群より選ばれる１以上の多型を検出することをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ｒｓ２３０７０２７の遺伝子型がＣ、ｒｓ３７４１８７２の遺伝子型がＣ、ｒｓ５７４６２８の遺伝子型がＧ、ｒｓ２２３３６４７の遺伝子型がＧ、ｒｓ３７８５２３３の遺伝子型がＣ、および／またはｒｓ２０７５９３１の遺伝子型がＧである場合に、２型糖尿病に対する遺伝的感受性が高いと判定する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ１５１２９０、ｒｓ１６３１８４、ｒｓ２２３７８９５、およびｒｓ２２３７８９２で示される多型からなる群より選ばれる１以上の多型を検出し得る１以上の核酸プローブおよび／またはプライマーを含む、２型糖尿病に対する遺伝的感受性の検査用キット。
【請求項７】
前記核酸プローブおよび／またはプライマーが、遺伝子型がＣ／Ａのｒｓ１５１２９０、遺伝子型がＧ／Ｔのｒｓ１６３１８４、遺伝子型がＣ／Ａのｒｓ２２３７８９５、および遺伝子型がＣ／Ｔのｒｓ２２３７８９２を検出し得る核酸プローブおよび／またはプライマーである、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ２３０７０２７、ｒｓ３７４１８７２、ｒｓ５７４６２８、ｒｓ２２３３６４７、ｒｓ３７８５２３３およびｒｓ２０７５９３１で示される多型からなる群より選ばれる１以上の多型を検出し得る１以上の核酸プローブおよび／またはプライマーをさらに含む、請求項６または７に記載のキット。
【請求項９】
前記核酸プローブおよび／またはプライマーが、遺伝子型がＣ／Ｔのｒｓ２３０７０２７、遺伝子型がＣ／Ｔのｒｓ３７４１８７２、遺伝子型がＧ／Ａのｒｓ５７４６２８、遺伝子型がＧ／Ａのｒｓ２２３３６４７、遺伝子型がＣ／Ａのｒｓ３７８５２３３、および／または遺伝子型がＡ／Ｇのｒｓ２０７５９３１を検出し得る核酸プローブおよび／またはプライマーである、請求項８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験者の２型糖尿病に対する遺伝的感受性の検査方法に関する。さらに詳しくは、被験者から採取されたＤＮＡ含有試料において、主としてＫＣＮＱ１遺伝子および／またはＥＩＦ２ＡＫ４遺伝子に存在する１以上の多型を検出することを含む、上記被験者の２型糖尿病に対する遺伝的感受性の検査方法に関する。さらに本発明は、ＫＣＮＱ１遺伝子の発現または上記遺伝子の発現産物であるＫＣＮＱ１タンパク質の構造もしくは機能に相互作用する物質を選択する工程を含む、２型糖尿病の予防剤または治療剤のスクリーニング方法に関する。さらに本発明は、ＥＩＦ２ＡＫ４遺伝子の発現または上記遺伝子の発現産物であるＥＩＦ２ＡＫ４タンパク質の構造もしくは機能に相互作用する物質を選択する工程を含む、２型糖尿病の予防剤または治療剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は世界中でもっともありふれた疾病の一種であり、中でも２型糖尿病は、アジア人やアフリカ人において特に急増している疾病である。２型糖尿病は、インスリン分泌不全および／またはインスリン抵抗性による、インスリンの相対的不足を特徴とする疾病である。インスリン分泌不全およびインスリン抵抗性のいずれも、遺伝的な因子が関与していると考えられており、特に日本人などアジア人では、インスリン分泌不全については、遺伝的な因子が主として関与しているといわれている。
【０００３】
糖尿病患者では、多飲、多尿、夜尿等が症状として現れるとされている。しかし、これらの症状は、血糖値の異常高値が長期に続いてはじめて生じるものであり、また年齢が増すと自然にみられるものでもあることから、早期の段階で自身が糖尿病に罹患していることを自覚する患者は少ない。このため、糖尿病に罹患した患者の多くは、合併症に伴う症状が現れることではじめて糖尿病に罹患したことを自覚することとなる。このような合併症を伴った糖尿病患者の治療は、極めて困難となる場合が多い。したがって、糖尿病の治療には、早期の発見および治療が非常に有効である。特に、２型糖尿病については、遺伝的な因子の関与が大きいために、２型糖尿病の発症に関連する遺伝的な因子を見つけ出し、これらの因子を基に２型糖尿病の遺伝的感受性を検査することで、２型糖尿病の早期の発見および治療だけでなく、予防までもが可能になると考えられていた。
【０００４】
これまでに、２型糖尿病の発症に関係する遺伝的な因子を探索するために、罹患血縁者を対象としたマイクロサテライトを用いた連鎖解析が日本国内外の多くの母集団で適用されている（非特許文献１〜４を参照）。それらの結果において、染色体番号２のＣＡＰＮ１０および染色体番号２０のＨＮＦ４Ａなどが２型糖尿病の感受性遺伝子としてこれまでに同定されている。
【非特許文献１】Horikawa, Y. et al., (2000), Nat. Genet. 26, 163？175
【非特許文献２】Weedon, M.N. et al., (2004), Diabetes 53, 3002？3006.
【非特許文献３】Mori, Y. et al, (2002), Diabetes 51, 1247？1255.
【非特許文献４】Nawata, H. et al, (2004), J. Hum. Genet. 49, 629？634.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、これまでに多くの候補遺伝子が検討されてきたが、未だ決定的な遺伝因子は得られていない。さらに、一般的に、上記した罹患血縁者を対象としたマイクロサテライトを用いた連鎖解析により特定の疾病の発症に関係する遺伝子を見つけることは非常に困難である。上記ＣＡＰＮ１０およびＨＮＦ４Ａについても、２型糖尿病に対する遺伝的感受性を判定する決定的なマーカー遺伝子としては有効ではなかった。そこで、２型糖尿病の早期の発見および治療ならびに２型糖尿病の予防のために、被験者の２型糖尿病に対する遺伝的感受性を正確、簡便かつ迅速に検査する方法が望まれている。
【０００６】
したがって、本発明は、２型糖尿病の遺伝的感受性を判定する決定的な遺伝的な因子を対象とした、正確、簡便かつ迅速に被験者の２型糖尿病に対する遺伝的感受性を検査する方法を提供することを解決すべき課題とした。
【０００７】
さらに、本発明は、上記因子または上記因子によりもたらされる産物に相互作用する物質を選択する工程を含む、２型糖尿病の予防剤または治療剤のスクリーニング方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために、２型糖尿病患者１６１２人および非罹患者１４２４人を対象として、標準日本人多型（ＪＳＮＰ）に由来する１０５種のＳＮＰｓを用いた全ゲノム規模の多段階相関解析を実施した。その結果、２型糖尿病の発症に関連する遺伝的な因子としてこれまでに報告されていない、新規な１１種のＳＮＰｓを検出することに成功した。驚くべきことに、ＫＣＮＱ１遺伝子における４種およびＥＩＦ２ＡＫ４における1種のＳＮＰｓは、他のＳＮＰｓと比して顕著に２型糖尿病の発症と相関していた。ＫＣＮＱ１遺伝子は、カリウムイオンチャネルタンパク質をコードする遺伝子の一種であり、上記遺伝子の異常は、心不整脈、てんかん、聴力喪失、および筋肉機能障害などのイオンチャネル疾患を引き起こすことがこれまでに報告されている（例えば、Vincent, (1998), Ann. Med. Feb; 30(1):58-65）。他方、ＥＩＦ２ＡＫ４遺伝子は、真核生物性翻訳開始因子２α（ＥＩＦ２α）をリン酸化するキナーゼファミリータンパク質をコードする遺伝子であり、その発現産物はＧＣＮ２キナーゼとも呼ばれ、ＥＩＦ２αタンパクをリン酸化し、多数のカスケードを経由して、タンパク合成の抑制や、最近では脂質合成にも関与すると考えられている（例えば、Howard C. Towle1、（２００７）、Cell Metabolism 5, February 2007）。これらの報告に、ＫＣＮＱ１遺伝子およびＥＩＦ２ＡＫ４遺伝子ならびにこれらの遺伝子産物が２型糖尿病の発症に関与するという情報は含まれておらず、本発明者らによってはじめて見出されたものである。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。
【０００９】
すなわち、本発明によれば、被験者から採取されたＤＮＡ含有試料において、ＫＣＮＱ１遺伝子に存在する１以上の多型を検出することを含む、上記被験者の２型糖尿病に対する遺伝的感受性の検査方法が提供される。
【００１０】
さらに本発明の別の側面によれば、被験者から採取されたＤＮＡ含有試料において、ＫＣＮＱ１遺伝子に存在する多型であって、一方のアリール頻度が、任意の２型糖尿病非罹患者集団におけるよりも任意の２型糖尿病患者集団において高い多型からなる群より選ばれる１以上の多型を検出することを含む、上記被験者の２型糖尿病に対する遺伝的感受性の検査方法が提供される。
【００１１】
本発明の被験者の２型糖尿病に対する遺伝的感受性の検査方法は、前記多型がＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ１５１２９０、ｒｓ１６３１８４、ｒｓ２２３７８９５およびｒｓ２２３７８９２で示される多型である。
【００１２】
好ましくは、本発明の被験者の２型糖尿病に対する遺伝的感受性の検査方法は、ｒｓ１５１２９０の遺伝子型がＣ、ｒｓ１６３１８４の遺伝子型がＧ、ｒｓ２２３７８９５の遺伝子型がＣ、および／またはｒｓ２２３７８９２の遺伝子型がＣである場合に、２型糖尿病に対する遺伝的感受性が高いと判定する。
【００１７】
好ましくは、本発明の被験者の２型糖尿病に対する遺伝的感受性の検査方法は、ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ２３０７０２７、ｒｓ３７４１８７２、ｒｓ５７４６２８、ｒｓ２２３３６４７、ｒｓ３７８５２３３およびｒｓ２０７５９３１で示される多型であって、一方のアリール頻度が、任意の２型糖尿病非罹患者集団におけるよりも任意の２型糖尿病患者集団において高い多型からなる群より選ばれる１以上の多型を検出することをさらに含む。
【００１８】
好ましくは、本発明の被験者の２型糖尿病に対する遺伝的感受性の検査方法は、ｒｓ２３０７０２７の遺伝子型がＣ、ｒｓ３７４１８７２の遺伝子型がＣ、ｒｓ５７４６２８の遺伝子型がＧ、ｒｓ２２３３６４７の遺伝子型がＧ、ｒｓ３７８５２３３の遺伝子型がＣ、および／またはｒｓ２０７５９３１の遺伝子型がＧである場合に、２型糖尿病に対する遺伝的感受性が高いと判定する。
【００２０】
さらに本発明の別の側面によれば、ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ１５１２９０、ｒｓ１６３１８４、ｒｓ２２３７８９５、およびｒｓ２２３７８９２で示される多型からなる群より選ばれる１以上の多型を検出し得る１以上の核酸プローブおよび／またはプライマーを含む、２型糖尿病に対する遺伝的感受性の検査用キットが提供される。
【００２１】
好ましくは、本発明の２型糖尿病に対する遺伝的感受性の検査用キットは、前記核酸プローブおよび／またはプライマーが、遺伝子型がＣ／Ａのｒｓ１５１２９０、遺伝子型がＧ／Ｔのｒｓ１６３１８４、遺伝子型がＣ／Ａのｒｓ２２３７８９５、および遺伝子型がＣ／Ｔのｒｓ２２３７８９２を検出し得る核酸プローブおよび／またはプライマーである。
【００２２】
好ましくは、本発明の２型糖尿病に対する遺伝的感受性の検査用キットは、ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ２３０７０２７、ｒｓ３７４１８７２、ｒｓ５７４６２８、ｒｓ２２３３６４７、ｒｓ３７８５２３３およびｒｓ２０７５９３１で示される多型からなる群より選ばれる１以上の多型を検出し得る１以上の核酸プローブおよび／またはプライマーをさらに含む。
【００２３】
好ましくは、本発明の２型糖尿病に対する遺伝的感受性の検査用キットは、前記核酸プローブおよび／またはプライマーが、遺伝子型がＣ／Ｔのｒｓ２３０７０２７、遺伝子型がＣ／Ｔのｒｓ３７４１８７２、遺伝子型がＧ／Ａのｒｓ５７４６２８、遺伝子型がＧ／Ａのｒｓ２２３３６４７、遺伝子型がＣ／Ａのｒｓ３７８５２３３、および／または遺伝子型がＡ／Ｇのｒｓ２０７５９３１を検出し得る核酸プローブおよび／またはプライマーである。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、ＫＣＮＱ１遺伝子の疾患感受性多型を検査（遺伝子検査、血液検査等）することによって、２型糖尿病の疾患感受性の正確、簡便かつ迅速な検査が可能になる。すなわち、本発明によれば、２型糖尿病の発症前検査、リスク検査、早期検査が可能になる。さらに本発明によれば、ＫＣＮＱ１遺伝子の発現・生理活性を調節することによる２型糖尿病の予防および治療、ならびに２型糖尿病の原因治療が可能になる。以上の検査、予防および治療は、ＫＣＮＱ１遺伝子の疾患感受性多型に加えて、他の疾患感受性多型を対象とすることで、２型糖尿病の遺伝的感受性の検査精度が増すことになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明による２型糖尿病に対する遺伝的感受性の検査方法は、被験者から採取されたＤＮＡ含有試料において、ＫＣＮＱ１遺伝子に存在する１以上の多型を検出することを含むことを特徴とする方法である。
【００３０】
さらに本発明の別の側面によれば、本発明による２型糖尿病に対する遺伝的感受性の検査方法は、被験者から採取されたＤＮＡ含有試料において、ＫＣＮＱ１遺伝子に存在する多型であって、一方のアリール頻度が、任意の２型糖尿病非罹患者集団におけるよりも任意の２型糖尿病患者集団において高い多型からなる群より選ばれる１以上の多型を検出することを含むことを特徴とする方法である。
【００３１】
さらに本発明の別の側面によれば、本発明による２型糖尿病に対する遺伝的感受性の検査方法は、被験者から採取されたＤＮＡ含有試料において、ＥＩＦ２ＡＫ４遺伝子に存在する１以上の多型を検出することを含むことを特徴とする方法である。
【００３２】
さらに本発明の別の側面によれば、本発明による２型糖尿病に対する遺伝的感受性の検査方法は、被験者から採取されたＤＮＡ含有試料において、ＥＩＦ２ＡＫ４遺伝子に存在する多型であって、一方のアリール頻度が、任意の２型糖尿病非罹患者集団におけるよりも任意の２型糖尿病患者集団において高い多型からなる群より選ばれる１以上の多型を検出することを含むことを特徴とする方法である。
【００３３】
本明細書において「被験者」とは、特に制限される者ではなく、２型糖尿病患者や２型糖尿病に対する遺伝的感受性の高い者に限らず、健常者を含めたあらゆる者をいう。
【００３４】
本明細書において「ＤＮＡ含有試料」とは、特に制限されるものではないが、ＤＮＡの種類や含有量に係らず、ＤＮＡが含まれている試料をいう。
【００３５】
本明細書において「２型糖尿病に対する遺伝的感受性」とは、遺伝的に２型糖尿病の発症を誘発され得る性質をいう。
【００３６】
本明細書において「（遺伝子）多型」とは、ゲノムＤＮＡ上の１または複数の塩基の変化（置換、欠失、挿入、転位、逆位等）であって、その変化が集団内に１％以上の頻度で存在するものをいい、例えば、１個の塩基が他の塩基に置換されたもの（ＳＮＰ）、１〜数十塩基が欠失もしくは挿入されたもの（ＤＩＰ）、２〜数十塩基を１単位とする配列が繰り返し存在する部位においてその繰り返し回数が異なるもの（繰り返し単位が２〜４塩基のものをマイクロサテライト多型、数〜数十塩基のものをｖａｒｉａｂｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔ（ＶＮＴＲ）という）等が挙げられる。本発明の検査方法に利用することができる多型は、下記の条件を満たす限りいずれのタイプのものであってもよいが、好ましくはＳＮＰである。
【００３７】
本発明の方法において利用することができる多型は、
ＫＣＮＱ１遺伝子および／またはＥＩＦ２ＡＫ４遺伝子に存在する１以上の多型、
または、
（１）ＫＣＮＱ１遺伝子内および／またはＥＩＦ２ＡＫ４遺伝子内に存在する多型であって、
（２）その一方のアリール頻度が、任意の２型糖尿病非罹患者集団におけるよりも任意の２型糖尿病患者集団において有意に高いもの
のいずれかであれば特に制限されない。
【００３８】
本明細書にいう「一方のアリール頻度」とは、ある特定のアリール（allele；対立遺伝子）が繰り返して起こる度合いをいう。
【００３９】
本明細書にいう「任意の２型糖尿病非罹患者集団」とは、任意の基準で２型糖尿病を発症していないと判定された者の集団をいい、さらに「任意の２型糖尿病患者集団」とは、任意の基準で２型糖尿病を発症していると判定された者の集団をいう。２型糖尿病患者集団および２型糖尿病非罹患者集団は、上記を満足し、かつそれぞれ統計学上信頼し得る結果を与えるに十分な数からなる集団であれば、その大きさ（サンプル数）、各サンプルの背景（例えば、出身地、年齢、性別、疾患等）などに特に制限はない。また、倫理上、試料提供者のインフォームド・コンセントを必要とすることから、２型糖尿病非罹患者集団としては、通常、ある医療機関における２型糖尿病以外の患者群、あるいはある地域における集団検診において２型糖尿病に罹患していないと診断された被験者群などが好ましく用いられる。
【００４０】
したがって、本明細書にいう「一方のアリール頻度が、任意の２型糖尿病非罹患者集団におけるよりも任意の２型糖尿病患者集団において高い」とは、例えば、ある特定のアリールが、任意の基準で２型糖尿病を発症していないと判定された者の集団よりも、任意の基準で２型糖尿病を発症していると判定された者の集団において、繰り返して起こる度合いが高いことをいう。
【００４１】
ＫＣＮＱ１遺伝子内およびＥＩＦ２ＡＫ４遺伝子内に存在する多型としては、例えば、ＮＣＢＩ  ＳＮＰ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／）、ＪＳＮＰ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｓｎｐ．ｉｍｓ．ｕ−ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ／）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｉｎｄｅｘ．ｃｆｍ）等に登録された公知の多型が挙げられる。ＮＣＢＩ  ＳＮＰ  Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ１５１２９０、ｒｓ１６３１８４、ｒｓ２２３７８９５、ｒｓ２２３７８９２およびｒｓ２２５０４０２で示される多型、ならびに該多型と連鎖不平衡係数Ｄ'が０．９以上の連鎖不平衡状態にある多型からなる群より選択される多型を挙げることができる。
【００４２】
本発明の検査方法において利用することができる多型としては、好ましくは、ＮＣＢＩ  ＳＮＰ  Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ１５１２９０、ｒｓ１６３１８４、ｒｓ２２３７８９５、ｒｓ２２３７８９２およびｒｓ２２５０４０２で示される多型、ならびに上記多型と連鎖不均衡係数Ｄ'が０．９以上の連鎖不均衡状態にある多型である。
【００４３】
ここで「連鎖不平衡係数Ｄ'」は、２つのＳＮＰについて第一のＳＮＰの各アリールを（Ａ，ａ）、第二のＳＮＰの各アリールを（Ｂ，ｂ）とし、４つのハプロタイプ（ＡＢ，Ａｂ，ａＢ，ａｂ）の各頻度をＰＡＢ，ＰＡｂ，ＰａＢ，Ｐａｂとすると、下記式により得られる。
Ｄ'＝（ＰＡＢＰａｂ−ＰＡｂＰａＢ）／Ｍｉｎ［（ＰＡＢ＋ＰａＢ）（ＰａＢ＋Ｐａｂ），（ＰＡＢ＋ＰＡｂ）（ＰＡｂ＋Ｐａｂ）］
［式中、Ｍｉｎ［（ＰＡＢ＋ＰａＢ）（ＰａＢ＋Ｐａｂ），（ＰＡＢ＋ＰＡｂ）（ＰＡｂ＋Ｐａｂ）］は、（ＰＡＢ＋ＰａＢ）（ＰａＢ＋Ｐａｂ）と（ＰＡＢ＋ＰＡｂ）（ＰＡｂ＋Ｐａｂ）とのうち、値の小さい方をとることを意味する。］
好ましくは、Ｄ'が０．９５以上、より好ましくは０．９９以上、最も好ましくは１である多型が挙げられる。
【００４４】
上記多型のうち、一方のアリール頻度が任意の２型糖尿病非罹患者集団におけるよりも任意の２型糖尿病患者集団において有意に高いものが、本発明の検査方法に利用することができる。本明細書においては、以下、かかる多型を２型糖尿病マーカー多型という場合もある。
【００４５】
本発明においては、ＮＣＢＩ  ＳＮＰ  Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ１５１２９０、ｒｓ１６３１８４、ｒｓ２２３７８９５、ｒｓ２２３７８９２およびｒｓ２２５０４０２で示される多型、ならびに上記多型と連鎖不均衡係数Ｄ'が０．９以上の連鎖不均衡状態にある多型を検査に用いることができる。本発明の検査方法において検出される多型は、上記した多型のうちのいずれか１つであってもよいし、２つ以上であってもよい。
【００４６】
本発明の検査方法において、多型の検出は公知のＳＮＰ検出方法のいずれも使用することができる。古典的な検出方法としては、例えば、被験者の細胞等から抽出したゲノムＤＮＡを試料とし、ＮＣＢＩ  ＳＮＰ  Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ１５１２９０、ｒｓ１６３１８４、ｒｓ２２３７８９５、ｒｓ２２３７８９２またはｒｓ２２５０４０２で示される多型部位の塩基を含む約１５〜約５００塩基の違続した塩基配列を含有してなる核酸をプローブとして用い、例えばＷａｌｌａｃｅら（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ１．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，８０，２７８−２８２（１９８３））の方法に従って、ストリンジェンシーを正確にコントロールしながらハイブリダイゼーションを行い、プローブと完全相補的な配列のみを検出する方法や、上記核酸と上記核酸において多型部位の塩基が他の塩基に置換された核酸のいずれか一方を標識し、他方を未標識としたミックスプローブを用い、変性温度から徐々に反応温度を低下させながらハイブリダイゼーションを行い、一方のプローブと完全相補的な配列を先にハイブリダイズさせ、ミスマッチを有するプローブとの交差反応を防ぐ方法などが挙げられる。ここで標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。
【００４７】
好ましくは、多型の検出は、例えば、ＷＯ  ０３／０２３０６３に記載された種々の方法、例えば、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＡＳＯハイブリダイゼーション、ダイレクトシークエンス法、ＡＲＭＳ法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法、ＲＮａｓｅＡ切断法、化学切断法、ＤＯＬ法、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法、インベーダー法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、ＴＤＩ法、モレキュラー・ビーコン法、ダイナミック・アリールスペシフィック・ハイブリダイゼーション法、パドロック・プローブ法、ＵＣＡＮ法、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸ハイブリダイゼーション法、およびＥＣＡ法などにより実施することができる（ＷＯ  ０３／０２３０６３，第１７頁第５行〜第２８頁第２０行を参照）。以下、代表的な方法として、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法とインベーダー法について、より詳細に説明する。
【００４８】
（ａ）ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法
ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法は、蛍光標識したアリール特異的オリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎプローブ）とＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲとを利用した方法である。ＴａｑＭａｎプローブとしては、例えば、ＮＣＢＩ  ＳＮＰ  Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ１５１２９０、ｒｓ１６３１８４、ｒｓ２２３７８９５、ｒｓ２２３７８９２またはｒｓ２２５０４０２で示される多型部位の塩基を含む約１５〜約３０塩基の連続した塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが用いられる。該プローブは、その５'末端がＦＡＭやＶＩＣなどの蛍光色素で、３'末端がＴＡＭＲＡなどのクエンチャー（消光物質）でそれぞれ標識されており、そのままの状態ではクエンチャーが蛍光エネルギーを吸収するため蛍光は検出されない。プローブは双方のアリールについて調製し、一括検出のために互いに蛍光波長の異なる蛍光色素（例えば、一方のアリールをＦＡＭ、他方をＶＩＣ）で標識することが好ましい。また、ＴａｑＭａｎプローブからのＰＣＲ伸長反応が起こらないように３'末端はリン酸化されている。ＴａｑＭａｎプローブとハイブリダイズする領域を含むゲノムＤＮＡの部分配列を増幅するように設計されたプライマーおよびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとともにＰＣＲを行うと、ＴａｑＭａｎプローブが鋳型ＤＮＡとハイブリダイズし、同時にＰＣＲプライマーからの伸長反応が起こるが、伸長反応が進むとＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５'ヌクレアーゼ活性によりハイブリダイズしたＴａｑＭａｎプローブが切断され、蛍光色素が遊離してクエンチャーの影響を受けなくなり、蛍光が検出される。鋳型の増幅により蛍光強度は指数関数的に増大する。
【００４９】
（ｂ）インベーダー法
インベーダー法では、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法と異なり、アリール特異的オリゴヌクレオチド（アリールプローブ）自体は標識されず、多型部位の塩基の５'側に鋳型ＤＮＡと相補性のない配列（フラップ）を有し、３'側には鋳型に特異的な相補配列を有する。インベーダー法では、さらに鋳型の多型部位の３'側に特異的な相補配列を有するオリゴヌクレオチド（インベーダープローブ；該プローブの５'末端である多型部位に相当する塩基は任意である）と、５'側がヘアピン構造をとり得る配列を有し、ヘアピン構造を形成した際に５'末端の塩基と対をなす塩基から３'側に連続する配列がアリールプローブのフラップと相補的な配列であることを特徴とするＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）プローブとが用いられる。ＦＲＥＴプローブの５'末端は蛍光標識（例えば、ＦＡＭやＶＩＣなど）され、その近傍にはクエンチャー（例えば、ＴＡＭＲＡなど）が結合しており、そのままの状態（ヘアピン構造）では蛍光は検出されない。
【００５０】
鋳型であるゲノムＤＮＡにアリールプローブおよびインベーダープローブを反応させると、三者が相補結合した際に多型部位にインベーダープローブの３'末端が侵入する。この多型部位の構造を認識する酵素（ｃｌｅａｖａｓｅ）を用いてアリールプローブの一本鎖部分（即ち、多型部位の塩基から５'側のフラップ部分）を切り出すと、フラップはＦＲＥＴプローブと相補的に結合し、フラップの多型部位がＦＲＥＴプローブのヘアピン構造に侵入する。この構造をｃｌｅａｖａｓｅが認識して切断することにより、ＦＲＥＴプローブの末端標識された蛍光色素が遊離してクエンチャーの影響を受けなくなって蛍光が検出される。多型部位の塩基が鋳型とマッチしないアリールプローブはｃｌｅａｖａｓｅによって切断されないが、切断されないアリールプローブもＦＲＥＴプローブとハイブリダイズすることができるので、同様に蛍光が検出される。但し、反応効率が異なるため、多型部位の塩基がマッチするアリールプローブでは、マッチしないアリールプローブに比べて蛍光強度が顕著に強い。
【００５１】
通常、３種のプローブおよびｃｌｅａｖａｓｅと反応させる前に、鋳型ＤＮＡはアリールプローブおよびインベーダープローブがハイブリダイズする部分を含む領域を増幅し得るプライマーを用いてＰＣＲにより増幅しておくことが好ましい。
【００５２】
上記のようにして多型を調べた結果、任意の２型糖尿病非罹患者集団におけるよりも任意の２型糖尿病患者集団において有意に高いアリールを保有していると判定された場合、特に該アリールについてホモ接合体であると判定された場合には、被験者は当該２型糖尿病に対する遺伝的感受性が高いと判定することができる。例えば、ＮＣＢＩ  ＳＮＰ  Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ１５１２９０の遺伝子型がＣ、ｒｓ１６３１８４の遺伝子型がＧ、ｒｓ２２３７８９５の遺伝子型がＣ、ｒｓ２２３７８９２の遺伝子型がＣおよび／またはｒｓ２２５０４０２の遺伝子型がＣである場合に、２型糖尿病に対する遺伝的感受性が高いと判定することができる。
【００５３】
さらに本発明の別の側面によれば、本発明による２型糖尿病に対する遺伝的感受性の検査方法は、被験者から採取されたＤＮＡ含有試料において、上記したＫＣＮＱ１遺伝子および／またはＥＩＦ２ＡＫ４遺伝子に存在する１以上の多型に加えて、ＮＣＢＩ  ＳＮＰ  Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ２３０７０２７、ｒｓ３７４１８７２、ｒｓ５７４６２８、ｒｓ２２３３６４７、ｒｓ３７８５２３３およびｒｓ２０７５９３１で示される多型、ならびに上記多型と連鎖不均衡係数Ｄ'が０．９以上の連鎖不均衡状態にある多型であって、一方のアリール頻度が、任意の２型糖尿病非罹患者集団におけるよりも任意の２型糖尿病患者集団において高い多型からなる群より選ばれる１以上の多型を検出することをさらに含むことを特徴とする方法である。例えば、ｒｓ２３０７０２７の遺伝子型がＣ、ｒｓ３７４１８７２の遺伝子型がＣ、ｒｓ５７４６２８の遺伝子型がＧ、ｒｓ２２３３６４７の遺伝子型がＧ、ｒｓ３７８５２３３の遺伝子型がＣ、および／またはｒｓ２０７５９３１の遺伝子型がＡである場合に、２型糖尿病に対する遺伝的感受性が高いと判定することができる。
【００５４】
本発明のキットは、ＫＣＮＱ１遺伝子および／またはＥＩＦ２ＡＫ４遺伝子に存在する１以上の多型を検出し得る１以上の核酸プローブおよび／またはプライマーを含むことを特徴とする、２型糖尿病に対する遺伝的感受性の検査用キットである。すなわち、本発明のキットは、例えば、ＫＣＮＱ１遺伝子内および／またはＥＩＦ２ＡＫ４遺伝子内に存在する多型であって、一方のアリール頻度が、任意の２型糖尿病非罹患者集団におけるよりも任意の２型糖尿病患者集団において高い多型からなる群より選択される１以上の多型の各々を検出し得る１以上の核酸プローブおよび／またはプライマーを含むことを特徴とする。
【００５５】
具体的には、本発明のキットに用いられる核酸プローブは、上記本発明の検査方法において検出すべき多型部位の塩基を含む領域でゲノムＤＮＡとハイブリダイズする核酸であり、標的部位に対して特異的であり、かつ多型性を容易に検出し得る限りその長さ（ゲノムＤＮＡとハイブリダイズする部分の塩基長）に特に制限はなく、例えば約１５塩基以上、好ましくは約１５〜約５００塩基、より好ましくは約１５〜約２００塩基、いっそう好ましくは約１５〜約５０塩基である。
【００５６】
該プローブは、多型性の検出に適した付加的配列（ゲノムＤＮＡと相補的でない配列）を含んでいてもよい。例えば、上記インベーダー法に用いられるアリールプローブは、多型部位の塩基の５'末端にフラップと呼ばれる付加的配列を有する。
【００５７】
また、該プローブは、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素（例：１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ等）、酵素（例：β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等）、蛍光物質（例：フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート等）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等）などで標識されていてもよい。あるいは、蛍光物質（例：ＦＡＭ、ＶＩＣ等）の近傍に該蛍光物質の発する蛍光エネルギーを吸収するクエンチャー（消光物質）がさらに結合されていてもよい。かかる実施態様においては、検出反応の際に蛍光物質とクエンチャーとが分離して蛍光が検出される。
【００５８】
好ましくは、本発明のキットに用いられる核酸プローブは、ＮＣＢＩ  ＳＮＰ  Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ１５１２９０、ｒｓ１６３１８４、ｒｓ２２３７８９５、ｒｓ２２３７８９２およびｒｓ２２５０４０２で示される多型、ならびに上記多型と連鎖不均衡係数Ｄ'が０．９以上の連鎖不均衡状態にある多型からなる群から選ばれる多型部位の塩基を含む、約１５〜約５００塩基、好ましくは約１５〜約２００塩基、より好ましくは約１５〜約５０塩基の連続した塩基配列を含有してなる核酸である。さらに好ましくは、上記核酸プローブとともに、ＮＣＢＩ  ＳＮＰ  Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ２３０７０２７、ｒｓ３７４１８７２、ｒｓ５７４６２８、ｒｓ２２３３６４７、ｒｓ３７８５２３３およびｒｓ２０７５９３１で示される多型、ならびに上記多型と連鎖不均衡係数Ｄ'が０．９以上の連鎖不均衡状態にある多型からなる群から選ばれる多型部位の塩基を含む、約１５〜約５００塩基、好ましくは約１５〜約２００塩基、より好ましくは約１５〜約５０塩基の連続した塩基配列を含有してなる核酸である核酸プローブも用いられ得る。
【００５９】
本発明のキットに用いられる核酸プライマーは、上記本発明の検査方法において検出すべき多型部位の塩基を含むゲノムＤＮＡの領域を特異的に増幅し得るように設計されたものであればいかなるものであってもよい。該プライマーは、多型性の検出に適した付加的配列（ゲノムＤＮＡと相補的でない配列）、例えばリンカー配列を含んでいてもよい。
【００６０】
また、該プライマーは、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素（例：１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ等）、酵素（例：β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等）、蛍光物質（例：フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート等）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等）などで標識されていてもよい。
【００６１】
本発明のキットに用いられる核酸プローブまたはプライマーは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、また、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。二本鎖の場合は二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのいずれであってもよい。従って、本明細書においてある塩基配列を有する核酸について記載する場合、特に断らない限り、該塩基配列を有する一本鎖核酸、該塩基配列と相補的な配列を有する一本鎖核酸、それらのハイブリッドである二本鎖核酸をすべて包含する意味で用いられていると理解されるべきである。
【００６２】
上記核酸プローブまたはプライマーは、例えば、ＮＣＢＩ  ＳＮＰ  Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号登録番号ｒｓ１５１２９０、ｒｓ１６３１８４、ｒｓ２２３７８９５、ｒｓ２２３７８９２、ｒｓ２２５０４０２、ｒｓ２３０７０２７、ｒｓ３７４１８７２、ｒｓ５７４６２８、ｒｓ２２３３６４７、ｒｓ３７８５２３３、またはｒｓ２０７５９３１で示される塩基配列の情報に基づいて、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を用いて常法に従って合成することができる。
【００６３】
好ましくは、本発明のキットに用いられる１以上の核酸プローブおよび／またはプライマーは、遺伝子型がＣ／Ａのｒｓ１５１２９０、遺伝子型がＧ／Ｔのｒｓ１６３１８４、遺伝子型がＣ／Ａのｒｓ２２３７８９５、遺伝子型がＣ／Ｔのｒｓ２２３７８９２および／または遺伝子型がＣ／Ａのｒｓ２２５０４０２を検出し得る核酸プローブおよび／またはプライマーと、遺伝子型がＣ／Ｔのｒｓ２３０７０２７、遺伝子型がＣ／Ｔのｒｓ３７４１８７２、遺伝子型がＧ／Ａのｒｓ５７４６２８、遺伝子型がＧ／Ａのｒｓ２２３３６４７、遺伝子型がＣ／Ａのｒｓ３７８５２３３、および／または遺伝子型がＡ／Ｇのｒｓ２０７５９３１を検出し得る核酸プローブおよび／またはプライマーを含む。
【００６４】
上記核酸プローブおよび／またはプライマーは、各々別個に（あるいは可能であれば混合した状態で）水もしくは適当な緩衝液（例：ＴＥバッファーなど）中に適当な濃度（例：２×〜２０×濃度で１〜５０μＭなど）となるように溶解し、約−２０℃で保存することができる。
【００６５】
本発明のキットは、多型検出法に応じて、当該方法の実施に必要な他の成分を構成としてさらに含んでいてもよい。例えば、該キットがＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法による多型検出用である場合には、該キットは、１０×ＰＣＲ反応緩衝液、１０×ＭｇＣｌ２水溶液、１０×ｄＮＴＰｓ水溶液、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ）等をさらに含むことができる。
【００６６】
本発明はまた、ＫＣＮＱ１遺伝子および／またはＥＩＦ２ＡＫ４遺伝子の発現および／または活性を調節（例えば、抑制）することによる、２型糖尿病の予防および／または治療に関する。
【００６７】
ＫＣＮＱ１遺伝子の発現またはＫＣＮＱ１タンパク質の構造もしくは機能に相互作用（例えば、促進、抑制または安定化）する物質は、２型糖尿病の予防または治療に有効である。したがって、本発明のスクリーニング方法は、ＫＣＮＱ１遺伝子を発現する細胞（例えば、ＩＮＳ−１細胞やＲＩＮ細胞などの膵β細胞、心筋細胞など）に被験物質を作用させる工程、ＫＣＮＱ１遺伝子の発現変化またはＫＣＮＱ１タンパク質の機能変化を検出する工程、および上記変化に対応してＫＣＮＱ１遺伝子またはＫＣＮＱ１タンパク質に相互作用する物質を選択する工程を含むことを特徴とする、上記相互作用する物質のスクリーニング方法である。スクリーニングして得られた上記相互作用する物質は、２型糖尿病の予防剤または治療剤として、２型糖尿病の予防または治療するために使用される。これはＥＩＦ２ＡＫ４遺伝子の発現またはＥＩＦ２ＡＫ４タンパク質の構造もしくは機能に相互作用する物質についても同様のことがいえる。
【００６８】
被験物質としては、例えば核酸、タンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これらの物質は新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。
【００６９】
ＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）の発現量は、ＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）をコードする核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸（即ち、前記したＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）をコードする塩基配列またはその一部を含有する核酸（以下、「センスＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）」ともいう）またはＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）をコードする塩基配列に相補的な塩基配列またはその一部（アンチセンスＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）））を用いてそのｍＲＮＡを検出することにより、転写レベルで測定することもできる。あるいは、該発現量は、通常知られる方法で作製された抗ＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）抗体を用いてタンパク質（ペプチド）を検出することにより、翻訳レベルで測定することもできる。
【００７０】
従って、より具体的には、本発明は、
（１）ＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）遺伝子を発現する細胞を被験物質の存在下および非存在下に培養し、両条件下におけるＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）をコードするｍＲＮＡの量を、センスもしくはアンチセンスＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）を用いて測定、比較することを特徴とする、ＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）遺伝子またはＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）タンパク質に相互作用する物質のスクリーニング方法、
（２）ＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）遺伝子を発現する細胞を被験物質の存在下および非存在下に培養し、両条件下におけるＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）タンパク質（ペプチド）の量を、抗ＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）抗体を用いて測定、比較することを特徴とする、ＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）遺伝子またはＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）タンパク質に相互作用する物質のスクリーニング方法、および
（３）ＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）遺伝子を発現する細胞を被験物質の存在下および非存在下に培養し、両条件下におけるＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）タンパク質の機能を、バッククランプ法によるチャネル活性の変化を測定、比較することを特徴とする、ＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）遺伝子またはＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）タンパク質に相互作用する物質のスクリーニング方法を提供する。
【００７１】
例えば、ＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）のｍＲＮＡ量またはタンパク質（ペプチド）量の測定は、具体的には以下のようにして行うことができる。
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、トリなど）に対して、薬剤あるいは物理的刺激などを与える一定時間前（３０分前〜２４時間前、好ましくは３０分前〜１２時間前、より好ましくは１時間前〜６時間前）もしくは一定時間後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、または薬剤あるいは物理的刺激と同時に被験物質を投与し、投与から一定時間が経過した後、心筋、膵組織などを採取する。得られた生体試料に含まれるＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）遺伝子を発現する細胞において発現したＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）のｍＲＮＡは、例えば、通常の方法により細胞等からｍＲＮＡを抽出し、例えば、ＴａｑＭａｎアッセイやＲＴ−ＰＣＲなどの手法を用いることにより定量することができ、あるいは自体公知のノーザンブロット解析により定量することもできる。一方、ＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）タンパク質量は、ウェスタンブロット解析や以下に詳細する各種イムノアッセイ法を用いて定量することができる。
（ｉｉ）ＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）またはその部分ペプチドをコードする核酸を導入した形質転換体を常法に従って作製し、該形質転換体を常法に従って培養する際に被験物質を培地中に添加し、一定時間培養後、該形質転換体に含まれるＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）のｍＲＮＡ量またはタンパク質（ペプチド）量を定量、解析することにより行うことができる。
【００７２】
上記のスクリーニング方法におけるＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）タンパク質の量の測定は、具体的には、例えば、（ｉ）抗ＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）抗体と、試料液および標識化されたＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）を検出することにより試料液中のＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）を定量する方法や、（ｉｉ）試料液と、担体上に不溶化した抗ＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）抗体および標識化された別の抗ＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）抗体とを、同時あるいは連続的に反応させた後、不溶化担体上の標識剤の量（活性）を測定することにより、試料液中のＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）タンパク質を定量する方法等が挙げられる。
【００７３】
上記（ｉｉ）の定量法においては、２種の抗体はＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）タンパク質の異なる部分を認識するものであることが望ましい。例えば、一方の抗体がＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）タンパク質のＮ端部を認識する抗体であれば、他方の抗体としてＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）タンパク質のＣ端部と反応するものを用いることができる。
【００７４】
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−（ストレプト）アビジン系を用いることもできる。
【００７５】
試料液としては、ＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）タンパク質が細胞内に局在する場合は、細胞を適当な緩衝液に懸濁した後、超音波処理または凍結融解などによって細胞を破壊して得られる細胞破砕液が、ＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）タンパク質が細胞外に分泌される場合には、細胞培養上清がそれぞれ用いられる。必要に応じて、破砕液や培養上清からＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）タンパク質を分離・精製した後に定量を行ってもよい。また、標識剤の検出が可能である限り、無傷細胞を試料として用いてもよい。
【００７６】
抗ＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）抗体を用いるＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）タンパク質の定量法は、特に制限されるべきものではなく、試料液中の抗原量に対応した、抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられる。感度、特異性の点で、例えば、後述するサンドイッチ法を用いるのが好ましい。
【００７７】
抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化・固定化するのに用いられる化学結合を用いてもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。
【００７８】
サンドイッチ法においては不溶化した抗ＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）抗体に試料液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の抗ＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）抗体を反応させた後（２次反応）、不溶化担体上の標識剤の量もしくは活性を測定することにより、試料液中のＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序で行っても、また、同時に行ってもよいし、時間をずらして行ってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相化抗体あるいは標識化抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
【００７９】
抗ＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）抗体は、サンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどにも用いることができる。
【００８０】
競合法では、試料液中のＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）タンパク質と標識したＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）タンパク質とを抗体に対して競合的に反応させた後、未反応の標識抗原（Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ、Ｆいずれかの標識量を測定することにより、試料液中のＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）タンパク質を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、ポリエチレングリコールや前記抗体（１次抗体）に対する２次抗体などを用いてＢ／Ｆ分離を行う液相法、および、１次抗体として固相化抗体を用いるか（直接法）、あるいは１次抗体は可溶性のものを用い、２次抗体として固相化抗体を用いる（間接法）固相化法とが用いられる。
【００８１】
イムノメトリック法では、試料液中のＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）タンパク質と固相化したＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）タンパク質とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後、固相と液相を分離するか、あるいは試料液中のＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）タンパク質と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化したＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）タンパク質を加えて未反応の標識化抗体を固相に結合させた後、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し試料液中の抗原量を定量する。
【００８２】
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。試料液中のＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）タンパク質の量がわずかであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
【００８３】
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）タンパク質の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
【００８４】
例えば、入江  寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江  寛編「統ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」Ｖｏｌ．  ７０（Ｉmmｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ａ））、同書Ｖｏｌ．  ７３（Ｉmmｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｂ））、同書Ｖｏｌ．  ７４（Ｉmmｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｃ））、同書Ｖｏｌ．  ８４（Ｉmmｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、同書Ｖｏｌ．  ９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ））、同書Ｖｏｌ．  １２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
以上のようにして、抗ＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）抗体を用いることによって、細胞におけるＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）タンパク質の生産量を感度よく定量することができる。
【００８５】
例えば、ＫＣＮＱ１タンパク質の機能変化の測定は、具体的には以下のようにして行うことができる。
ヒトＫＣＮＱ１タンパク質をＣＨＯ細胞に恒常的に高発現させた細胞株（ｈＫｖＬＱＴ１／ｈｍｉｎＫ−ＣＨＯ  Ｋ１  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ：ミリポア社、カタログ番号ＣＹＬ３００７）を用い、パッチクランプ法により、電気的に電位変化を記録することにより、特定の物質の存在下および非存在下のチャネル活性を測定、比較することで上記細胞株内におけるＫＣＮＱ１タンパク質の機能変化を測定できる。さらに、市販の機器（ＦＬＩＰＲ，ＩｏｎＷｏｒｋｓ  ＨＴ，ＰａｔｃｈＥｘｐｒｅｓｓなど）を用いることによりスループットの高いスクリーニングも可能である。さらに、ＥＩＦ２ＡＫ４タンパク質の機能変化は、例えば、ＥＩＦ２ＡＫ４タンパク質であるＧＣＮ２キナーゼによりリン酸化される基質量を測定することにより知ることができる。そのような方法としては、例えば、ポリアクリルアミドゲル中でリン酸化したＥＩＦ２タンパク質アルファサブユニットを特異的に染色するＰｒｏ−ＱR  ダイアモンドリン酸化タンパク質ゲル染色（イビトロジェン）などの他、３２Ｐ放射性標識、抗リン酸化チロシン抗体を利用するＥＬＩＳＡ法、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ法、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法などの通常知られる技術を利用することができる。
【００８６】
ＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）遺伝子の発現変化あるいはＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）タンパク質の機能変化をもたらすことがわかったＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）遺伝子またはＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）タンパク質に相互作用する物質について、細胞機能の変化を下記の方法で測定することができる。
【００８７】
例えば、薬剤の存在によりＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）遺伝子の発現が低下した細胞について、常法でインスリン分泌アッセイを行う。具体的には、２４穴プレートで培養した細胞で薬剤を添加してＫＣＮＱ１（またはＥＩＦ２ＡＫ４）遺伝子の発現を低下させ、薬剤添加５０〜１００時間後、プレインキュベーションした後に、０．５〜２時間、高グルコース（例えば、２０〜５０ｍＭ）、低グルコース（例えば、１〜１０ｍＭ）で刺激した後、上清を回収し、細胞に残った分は塩酸エタノールで抽出し、上清および細胞のインスリン含量を常法（例えば、ＥＬＩＳＡ）で測定する。インスリン分泌は、総インスリン量に対する分泌量の割合で表現し、比較することができる。
【００８８】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００８９】
１  材料および方法
（１）試料：
３つの独立した患者集団を、多段階ゲノム規模スクリーニングのために用意した。集団１は２型糖尿病患者１８８人のみからなる。集団２は２型糖尿病患者７５２人と非罹患者７５２人からなり、集団３は２型糖尿病患者６７２人と非罹患者６７２人からなる。２型糖尿病患者の試験対象患者基準は次の通りである：（１）発症開始年齢：４０〜５５歳、（２）最大ＢＭＩ  ＜  ３０ｋｇ／ｍ２、（３）インシュリン治療は診断から３年前まで未開始、および（４）抗体ＧＡＤ（グルタミン酸デカルボキシラーゼ）抗体が陰性。
【００９０】
集団２と３の非罹患者の基準は次の通り：（１）年齢：６０歳以上、（２）過去に糖尿病としての診断履歴がない、および（３）ヘモグロビンＡｌｃ＜５．６％。３集団の２型糖尿病患者と集団２と３の非罹患者は、日本の様々な地域に配置された１１施設から適用された。ゲノムＤＮＡは、常法により末梢血液から抽出された。ＢＭＩ（体重インデックス）、血液生化学（血漿グルコースとインシュリンレベルを含む）および２型糖尿病の家族歴などの臨床情報もまた得られた。各集団の背景的な特徴は、表１に要約される。研究プロトコールは、各施設の倫理委員会により承認された。
【００９１】
【表１】
0005604616.tif 000002
【００９２】
（２）研究設計：日本人ＳＮＰデータベースを用いた多段階ゲノム規模連鎖解析（図１Ａおよび図１Ｂ）
「ＪＳＮＰゲノムスキャン（ＪＧＳ）」と呼ばれる、多段階スクリーニングを常法に従い計画した。まず、１ｓｔスクリーニングで、各疾病の１８８人の患者（糖尿病の集団１）が、ＩＭＳ−ＪＳＴ日本人ＳＮＰデータベースプロジェクトにより提供された１０５種のＳＮＰｓに対してジェノタイプされた。相関解析は次の２セットが実施された：１）上記データベースで登録されている一般的な日本人集団の参照データとのアリール頻度を比較すること、および２）データが上記プロジェクトで得られた罹患者と他の４つの疾病集団における糖尿病非罹患者７５２人の集団とのアリールおよび／または遺伝子型頻度を比較すること（図１Ｂ）。より小さいアリール頻度（ＭＡＦ）がデータベースとの比較で１０％を越え、かつジェノタイプがＯＲ＞１．５またはアリールがＯＲ＞１．３を示したＳＮＰｓが２ｎｄスクリーニングのために選ばれた。陽性相関を示す、同じ遺伝子における多くのＳＮＰｓが強い連鎖不均衡（ＬＤ）内にあったならば、冗長性を避けるために、一つのＳＮＰだけが次のスクリーニングに対して選ばれた。その後、各疾病（糖尿病に対して２８７３種）の２８８０種のＳＮＰｓがｐ値で選ばれた。
【００９３】
２ｎｄスクリーニングにおいて、独立した２型糖尿病患者／非罹患者集団（集団２）が解析され、データの品質チェックの後に、妥当な２８２７種のＳＮＰｓのデータを生成し、アリールデータにより糖尿病（Ｐ＜０．０５）と相関があることを示したＳＮＰｓを３ｒｄスクリーニングの対象として選択した。
【００９４】
３ｒｄスクリーニングにおいて、別の集団（集団３）がタイプされ、および３ｒｄスクリーニングでの陽性ＳＮＰｓ（Ｐ＜０．０５）に対して、２集団を組み合わせた結果（集団２と３：２型糖尿病患者１４２４人と非罹患者１４２４人）もまた解析された。
【００９５】
その後、ＫＣＮＱ１遺伝子のデンスＳＮＰマッピングを実施した。はじめに、約１０ｋｂのインターバルをもつように、ＮＣＢＩ  ＳＮＰ  ＤａｔａｂａｓｅからさらなるＳＮＰｓを取り出し、本ゲノムスキャンにもともと含まれていた陽性ＳＮＰｓとともに、集団２と３においてそれらをタイプした。また２４人の日本人対象者について、日本人において広範囲に遺伝子変異体を同定するためにすべてのエキソンおよび推測上のプロモーター領域（転写開始部位から４ｋｂｐ上流）を含む遺伝子の配列を再決定した。また、ＫＣＮＱ１遺伝子について、４７ｋｂｐ（イントロン１５）にわたる陽性ＳＮＰｓ周辺領域の配列を再決定し、これらで同定されたＳＮＰｓのいくつかはその後、集団２と３でジェノタイプされた。
【００９６】
（３）タイピング方法
１ｓｔスクリーニングおよび２ｎｄスクリーニングにおいて、ジェノタイピングを常法に従い、多重ＰＣＲ型インベーダーアッセイ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）−ｂａｓｅｄ  Ｉｎｖａｄｅｒ  ａｓｓａｙ；サード・ウェーブ・テクノロジー社、マジソン、ウィスコンシン、ＵＳＡ）により実施した。３ｒｄスクリーニングおよびデンス・マッピングにおいて、ゲノム規模で増幅したＤＯＰ−ＰＣＲテンプレートを蛍光相関分光器（ＦＣＳ）にしたがって配列特異的プライマー（ＳＳＰ）−ＰＣＲによりジェノタイプした。結果として、２ｎｄスクリーニングおよびデンス・マッピングの両方に含められたＳＮＰｓに対して、集団２がＳＳＰ−ＰＣＲ−ＦＣＳ方法で再ジェノタイプされた。いくつかのＳＮＰｓをＴａｑｍａｎ  ｐｒｏｂｅ（アプライド・バイオシステムズ社、フォスターシティー、ＣＡ）を使ったリアルタイムＰＣＲでジェノタイプした。
【００９７】
（４）リアル−タイムＰＣＲによる遺伝子の組織発現解析
１４時間断食した後の１２齢週の５匹のメスＣ５７ＢＬ６またはＫＫ−Ａｙマウスから膵島を単離し、かつ全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙキット（キアジェン社、ヒルデン、ドイツ）で抽出した。内部標準としてＴＡＴＡ結合タンパク質を用い、ＡＢＩ７９００ＨＴで、マウスＫｃｎｑｌ  ｍＲＮＡの発現レベルを、ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ（アプライド・バイオシステムズ）を用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法で解析した。結果を、非罹患マウスであるＢＬ６マウスに対する倍変化量であらわした。
【００９８】
（５）統計解析
１ｓｔスクリーニングにおいて、上記で記載した通りに、２型糖尿病患者−非罹患者評価の２セットを実施した。非罹患者として４グループを使って、比較のために２×２または２×３分割表でデータを統計解析し、およびジェノタイプ・データが利用できなかった一般的な母集団の度数との比較のために、２×２分割表でアリールデータのみを解析した。
【００９９】
２ｎｄスクリーニングおよび３ｒｄスクリーニング、ならびにデンス・マッピングにおいて２×２分割表のアリールデータをχ２試験で解析した。連鎖不均衡およびハプロタイプ解析（複数のアリールで、それぞれについてどちらの親から受け継いだ遺伝子かで分けたときに、片親由来の遺伝子の並びを解析）をＨａｐｌｏｖｉｅｗ３．３１で実施した。ハプロタイプ度数の評価をさらにＰＨＡＳＥで計算した。臨床特性統計解析をＳｔａｔＶｉｅｗ  バージョン５．１（ＳＡＳ社、キャリー、ＮＣ）を用いて実施した。データは、必要の都度、ログ変換した。年齢、性別およびＢＭＩに対して調整されたｐ値をＡＮＣＯＶＡで決定した。ｐ＜０．０５を統計的に有意とした。
【０１００】
２  結果
（１）糖尿病の多段階相関解析
１ｓｔスクリーニングの多重ＰＣＲ型インベーダーアッセイによるＪＧＳに対してジェノタイプされた１０５種のＳＮＰｓのうち、常染色体の８２，３４３種のＳＮＰｓのデータが２型糖尿病患者１８７人に対してタインピング品質チェックに合格と判定された。対象者一人はまったくジェノタイプコールを与えなかった。組み合わせられた２種の相関解析により、２，８７３種のＳＮＰｓを２ｎｄスクリーニングの対象として選択した。
【０１０１】
２ｎｄスクリーニングで、３８種のＳＮＰｓが集団２における全試験者になんら結果を与えず、ならびに５種および３種のＳＮＰｓが多重ＰＣＲ型インベーダーアッセイにより、２型糖尿病患者または非罹患者のいずれかにおいて失敗した。残りの２８２７種のＳＮＰｓのコール率は０．９９３であった。その後、２０１種の陽性ＳＮＰｓ（Ｐ＜０．０５）を、３ｒｄスクリーニングへ選択した。
【０１０２】
３ｒｄスクリーニングで、１種のＳＮＰを集団３でまったくタイプできず、および他の２００種のＳＮＰｓのコール率は０．９９０であった。７遺伝子の１０種のＳＮＰｓはｐ値が０．０５より低かった（表３）。最も顕著な相関を、ｐ＝３．４×１０？６を示した、ＫＣＮＱ１遺伝子のイントロン１５における、ｒｓ２２３７８９５（ＩＭＳ−ＪＳＴ０１８６０２）で見出した。別の２つのＳＮＰｓ（ＩＭＳ−ＪＳ０１８５９０および０１８６０１；ｒｓ１５１２９０およびｒｓ１６１８４にそれぞれ対応）は、さらに同じイントロンに局在しており、それぞれ１．１×１０？４および０．００２１のｐ値を示した。これらの１０種のＳＮＰｓに対して、集団２をＦＣＳ−ＳＳＰ−ＰＣＲ法で再びジェノタイプし、インベーダー法（２ｎｄスクリーニングに帰着する）との一致率は０．９９２であった。組み合わせられた２集団の結果（集団２＋３）をさらにこれらの１０種のＳＮＰｓで解析し、ＫＣＮＱ１遺伝子の３種を含むすべてのＳＮＰｓはより低いｐ値を示した（表２Ａおよび２Ｂ）。なお、表２Ａおよび２Ｂにおいて、アスタリスク（＊）は危険アリール、Ｃｈｒは染色体番号、ＤＭは２型糖尿病患者、ＮＣは非罹患者をそれぞれ示す。例えば、ｒｓ１５１２９０のＤＭ１２とは、Ｒｓ１５１２９０の遺伝子型がＡ／Ｃのヘテロザイゴートである２型糖尿病患者のことを示す。上記した通り、ｐ値は、２型糖尿病患者群と非罹患者群との間でアリール頻度を比較し、χ２検定を行って算出した。ＯＲは、その危険アリールのオッズ比である。
【０１０３】
【表２Ａ】
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【０１０４】
【表２Ｂ】
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【０１０５】
（２）デンス・マッピングおよびＫＣＮＱ１の相関解析
ＫＣＮＱ１遺伝子は、［ａ］２型糖尿病患者に最も強い相関を示し、［ｂ］陽性結果が複数のＳＮＰｓにまたがる唯一の遺伝子であり、かつ［ｃ］染色体１１ｐ１５．５に局在しており、日本人の糖尿病罹患同胞解析の独立した２報告において提案された、糖尿病と連鎖を示す候補領域に含まれていた（非特許文献３および４）：上記２報告とも精密なマッピングを達成できていなかったが、この領域の最大ＬＯＤスコアはそれぞれ３．０８と２．８９であった。以上の通り、ＫＣＮＱ１遺伝子は２型糖尿病の発症に関連する遺伝子として重要かつ今回はじめて見出された遺伝子であった。そこで、３ｒｄスクリーニングの後、ＫＣＮＱ１遺伝子をさらに解析した。
【０１０６】
図２の下部で示されている通り、３ｒｄスクリーニングを通過した３種のＳＮＰｓ（ｒｓ１５１２９０、ｒｓ１６３１８４、およびｒｓ２２３７８９５）は互いに「適度な」ＬＤ内にあった。最も低いｐ値を示したｒｓ２２３７８９５は、ｒｓ１５１２９０とのＤ'およびｒ２値が０．５４４および０．１２４、ｒｓ１６３１８４とのＤ'およびｒ２値は０．８３および０．４５５をそれぞれ示した。ＮＣＢＩ  ＳＮＰ  Ｄａｔａｂａｓｅから４９種のＳＮＰｓをピックアップし、集団２と３において、もとのスキャンで陽性の上記３種のＳＮＰｓと共にタイプした（図２）。５２種のＳＮＰｓのうち、ｒｓ２２３７８９２は、イントロン１５に局在し、図２の上部で示されている通りに、２型糖尿病（ｐ＝６．７×１０？１３；集団２と３）と最も強い相関を示した。ＯＲは１．４９［９５％ＣＩ：１．３４−１．６６］であった。ｒｓ２２３７８９５とｒｓ２２３７８９２との間のＤ'とＲ２値は、それぞれ、０．９５２と０．２９７であった。
【０１０７】
２４人の日本人対象者で遺伝子領域の配列を再決定することにより、３種の同義置換と２種の非同義置換（Ｐ４４８ＲとＧ６４３Ｒ）を含む、２１２種の変異体を同定した。ｒｓ１５１２９０とｒｓ２２３７８９５の間の３５．６ｋｂｐ領域で、ＭＡＦ（マイナーアリール頻度）が１０％を超えた１０種のＳＮＰｓを選び、集団２と３においてそれらをジェノタイプした。総計で、平均２ｋｂｐのインターバルを持つ１８種のＳＮＰｓを、ｒｓ１５１２９０とｒｓ２２３７８９５の間でジェノタイプした。２つの非同義置換多型もまたジェノタイプした。これらのＳＮＰｓのいずれもが、ｒｓ２２３７８９２より糖尿病と強い相関を示さなかった（図２）。
【０１０８】
（３）グルコース・ホメオスタシスと関連する臨床パラメーターへのＫＣＮＱ１変異体の影響
すべてのジェノタイプされたＳＮＰｓの中の最大および２番目に顕著な相関を示したｒｓ２２３７８９２（Ｃ／Ｔ；  危険アリール＝Ｃ）およびｒｓ２２３７８９５（Ａ／Ｃ；  危険アリール＝Ｃ）からハプロタイプを構築した。集団２＋３のおける疾病と最も顕著な相関がＴ−Ａハプロタイプ（ｐ＝３．２×１０？１３）で見出された。上記ｐ値がｒｓ２２３７８９２単独（Ｐ＝６．７×１０？１３）に対してのｐ値より大きくないことを示したので、上記遺伝子中の原因となる変異体を逃している可能性は低く、およびｒｓ２２３７８９２だけを使った詳しい分析を行なった。次に臨床表現型へのｒｓ２２３７８９２の危険アリールの影響を調査した。集団２＋３における１，４２４人の糖尿病患者において、上記ＳＮＰならびにＢＭＩ、糖尿病発症の年齢およびインスリン抵抗性のレベル（データなし）などの臨床パラメーターに対して相関は見出されなかった。
【０１０９】
空腹時血糖値とインシュリンのレベルが利用可能であった集団２＋３における９４８人の非罹患者において、ｒｓ２２３７８９２（ＣＣ、ｎ＝３５３）の危険アリールの同型接合体（ホモザイゴート）は、他の遺伝子型（ＣＴおよびＴＴ、ｎ＝５９５）をもつそれらより、ホメオスタシス・モデル評価によるβ−細胞機能指数（ＨＯＭＡ−β）が、顕著により低い値を示した；ＨＯＭＡ−β値は、それぞれ８１．７±５７．９および９４．３±８４．３であった（Ｐ＝０．００２４；性別、年齢およびＢＭＩによる調整の後のＰ値は０．０２だった）。この結果は糖尿病患者においては確認されなかったが、おそらくＫＣＮＱ１の危険アリールがインシュリン分泌を阻害することにより、糖尿病発症率に寄与することを示唆した。
【実施例２】
【０１１０】
逆転写およびリアルタイムＰＣＲ分析によって２型糖尿病のマウス・モデルの膵島中でのＫｃｎｑ１の発現を検討した。高血糖と高インスリン血症の両方を明らかに示した１２齢週の糖尿病罹患ＫＫ−Ａｙマウスの膵島におけるＫｃｎｑ１  ｍＲＮＡの発現量は、Ｃ５７ＢＬ６コントロール・マウス（Ｐ＝０．０００４）と比較して、１．６倍に顕著に増加された。
【実施例３】
【０１１１】
ＫＣＮＱ１遺伝子の発現を変化させる物質のスクリーニング系について検討した。膵β細胞株ＩＮＳ−１細胞（ラット）をＲＰＭＩ培地（１０％ＦＣＳ加）で培養した。配列表の配列番号１〜３に示す、Ｋｃｎｑ１遺伝子（ラットのＫＣＮＱ１遺伝子）のｓｉＲＮＡをデザインし、トランスフェクション用試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００）を用いてトランスフェクションし、４８〜７２時間後にトータルＲＮＡを回収しＴａｑＭａｎアッセイでＫｃｎｑ１遺伝子の発現量を定量した。その結果、膵β細胞株ＩＮＳ−１細胞に投与した３種のｓｉＲＮＡのいずれも、ｓｉＲＮＡを投与していないネガティブコントロールに比してmRNAレベルで約７０％の発現の減少、すなわち発現レベルが約３０％に低下したことが確認された（図３）。
【実施例４】
【０１１２】
実施例１と同様にして、集団１〜３とは異なる新たな集団４（２型糖尿病患者１０００人と非罹患者１０００人）のＫＣＮＱ１遺伝子のＳＮＰｓを測定し、得られたデータを基に相関解析を実施した。実施例１の解析結果と同様に、ＫＣＮＱ１遺伝子内のＮＣＢＩ  ＳＮＰ  Ｄａｔａｂａｓｅ登録番号ｒｓ１５１２９０、ｒｓ２２３７８９５およびｒｓ２２３７８９２のいずれのＳＮＰｓも２型糖尿病患者に強い相関を示した（表３）。したがって、集団４の解析結果は、実施例１の解析結果と非常に高い再現性を示す結果といえる。
【０１１３】
【表３】
0005604616.tif 000005
【実施例５】
【０１１４】
実施例４と同様に、集団４（２型糖尿病患者１０００人と非罹患者１０００人）のＥＩＦ２ＡＫ４遺伝子のＮＣＢＩ  ＳＮＰ  Ｄａｔａｂａｓｅ登録番号ｒｓ２２５０４０２のＳＮＰを測定し、得られたデータと集団２および３の測定データを合わせて相関解析した。その結果、ｐ値は３．４×１０−５であり、上記ＳＮＰが２型糖尿病患者に強い相関を示した。
【実施例６】
【０１１５】
実施例３と同様に、ＥＩＦ２ＡＫ４遺伝子の発現を変化させる物質のスクリーニング系について検討した。Ｅｉｆ２ａｋ４遺伝子（ラットのＥＩＦ２ＡＫ４遺伝子）のｓｉＲＮＡをデザインし（配列表の配列番号４〜６）、トランスフェクション用試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００）を用いて２通りの継代数の膵β細胞株ＩＮＳ−１細胞にトランスフェクションし、４８〜７２時間後にトータルＲＮＡを回収しＴａｑＭａｎアッセイでＥＩＦ２ＡＫ４遺伝子の発現量を定量した。その結果、膵β細胞株ＩＮＳ−１細胞に投与した３種のｓｉＲＮＡのいずれも、ｓｉＲＮＡを投与していないネガティブコントロールに比してｍＲＮＡレベルで約７０−９０％の発現の減少が確認された（図４）。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１Ａ】図１Ａは、日本人ＳＮＰデータベースを用いた多段階ゲノム規模連鎖解析の概念図を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、１ｓｔスクリーニングにおける２セットの相関解析の概念図を示す。
【図２】図２は、ＫＣＮＱ１遺伝子のデンス・マッピングを示す。
【図３】図３は、ｓｉＲＮＡを投与した後のＫｃｎｑ１の発現量を示す。
【図４】図４は、ｓｉＲＮＡを投与した後のＥｉｆ２ａｋ４の発現量を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
0005604616.tif 000009
【図４】
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【配列表】
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