(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビフィズス菌属の細菌の成長を促進し、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の放出を促進し、Ｔヘルパー細胞タイプＩ（Ｔｈ１細胞）の分化を促進し、及び／又はＴヘルパー細胞タイプＩＩ（Ｔｈ２細胞）の分化を抑制するためのキバナシュスラン種（Anoectochilus spp.）・多糖類抽出物であって、キバナシュスラン種のタイプＩＩアラビノガラクタンを含み、４０〜７０キロダルトンの平均分子量を有し、該抽出物は、
ａ）キバナシュスラン種から水を使って水溶性のキバナシュスラン種抽出物を抽出するステップと、
ｂ）該キバナシュスラン種抽出物を脱脂し、次に水様の抽出物を収集するステップと、
ｃ）該水様抽出物に、該水様抽出物との総体積に対して６５体積％〜８５体積％のエタノールを加え、次に沈澱物を収集するステップと、
によって調製されるキバナシュスラン種・多糖類抽出物。
【請求項２】
前記ビフィズス菌属はビフィズス菌ブレーベである請求項１に記載の抽出物。
【請求項３】
該抽出物は５０〜６０キロダルトンの範囲の平均分子量を有し、前記タイプＩＩアラビノガラクタンは１５〜４５キロダルトンの範囲の平均分子量を有する請求項１に記載の抽出物。
【請求項４】
前記タイプＩＩアラビノガラクタンは２５〜３５キロダルトンの範囲の平均分子量を有する請求項１に記載の抽出物。
【請求項５】
水溶液の形態である請求項１に記載の抽出物。
【請求項６】
前記キバナシュスラン種はキバナシュスラン（Anoectochilus formosanus Hayata）である請求項１に記載の抽出物。
【請求項７】
前記タイプＩＩアラビノガラクタンは、該抽出物の乾燥重量に対して２０重量％〜５０重量％の濃度である請求項１に記載の抽出物。
【請求項８】
前記タイプＩＩアラビノガラクタンは、該抽出物の乾燥重量に対して３０重量％〜４０重量％の濃度である請求項１に記載の抽出物。
【請求項９】
腸内の脂肪酸の量の増加、カルシウム吸収の促進、抗骨粗しょう症、抗炎症、白血球減少の抑制、抗アレルギー、喘息の緩和、結腸癌の抑制、及び／又は免疫機能の調節のために有用な請求項１に記載の抽出物。
【請求項１０】
前記ステップｂ）において、脱脂ステップは前記キバナシュスラン種抽出物の体積に対して１５体積％〜３５体積％の酢酸エチルを該キバナシュスラン種抽出物に加えることで実行される請求項１に記載の抽出物。
【請求項１１】
前記ステップｂ）において、脱脂ステップは前記キバナシュスラン種抽出物の体積に対して２０体積％〜３０体積％の酢酸エチルを該キバナシュスラン種抽出物に加えることで実行される請求項１に記載の抽出物。
【請求項１２】
前記エタノールの濃度は、前記水様抽出物と該エタノールとの総体積に対して７０体積％〜８０体積％である請求項１に記載の抽出物。
【請求項１３】
前記ステップｃ）において収集した前記沈澱物を水に溶かすことを更に含む請求項１に記載の抽出物。
【請求項１４】
ビフィズス菌属の細菌の成長を促進し、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の放出を促進し、Ｔヘルパー細胞タイプＩ（Ｔｈ１細胞）の分化を促進し、及び／又はＴヘルパー細胞タイプＩＩ（Ｔｈ２細胞）の分化を抑制するための医薬組成物であって、
効果的な量の請求項１に記載の抽出物を含む医薬組成物。
【請求項１５】
ビフィズス菌属の細菌の成長を促進することによる、腸内の脂肪酸の量の増加、カルシウム吸収の促進、及び／又は抗骨粗しょう症のための請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の放出を促進することによる、抗炎症、及び／又は白血球減少の抑制のための請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
Ｔヘルパー細胞タイプＩ（Ｔｈ１細胞）を調節し、及び／又はＴヘルパー細胞タイプＩＩ（Ｔｈ２細胞）を調節することによる、抗アレルギー、喘息の緩和、結腸癌の抑制、及び／又は免疫機能の調節のための請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
該医薬組成物の量は、前記タイプＩＩアラビノガラクタンとして計算して、１日当り２ｍｇ／ｋｇ体重〜２５ｍｇ／ｋｇ体重である請求項１５〜１７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１９】
該医薬組成物の量は、前記タイプＩＩアラビノガラクタンとして計算して、１日当り３ｍｇ／ｋｇ体重〜２０ｍｇ／ｋｇ体重である請求項１５〜１７のいずれかに記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有用な細菌の成長を促進し、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の放出を促進し、Ｔヘルパー細胞タイプＩ（Ｔｈ１細胞）を調節し、及び／又はＴヘルパー細胞タイプＩＩ（Ｔｈ２細胞）を調節するためのキバナシュスラン種・多糖類抽出物の使用と、その調製方法とに関する。
《関連する出願への相互参照》
本出願は、２００９年１０月５日付で出願した台湾特許出願第０９８１３３７１４号に基づく優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
キバナシュスラン種（Anoectochilus spp.）はラン科に属し、キバナシュスラン（Anoectochilus formosanus Hayata）は血圧を減少させる効果、血糖値を下げる効果、肝臓を保護する効果、抗炎症効果、制癌効果、免疫システムを調節する効果等の広い効果を有していると考えられている。従って、キバナシュスラン（Anoectochilus formosanus Hayata）は、中国医学において「薬の王」又は「薬の虎」とも呼ばれている（特許文献１、非特許文献１、非特許文献２を参照。これらの文献を本明細書に援用する）。
【０００３】
しかし、キバナシュスラン（Anoectochilus formosanus Hayata）の活性成分は現在、不明なままであり、キバナシュスラン（Anoectochilus formosanus Hayata）についての研究は、原抽出物に限定され、従って、薬効率の最適化及び薬理学的研究も限定されている。また、キバナシュスラン種の生理学的作用は完全には分かっていないので、キバナシュスラン種の他の病気への適用を研究する必要がある。
【０００４】
本発明の発明者は、キバナシュスラン種・多糖類抽出物は、有用な細菌の成長を促進する効果、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の放出を促進する効果、Ｔヘルパー細胞タイプＩ（Ｔｈ１細胞）を調節する効果、及び／又はＴヘルパー細胞タイプＩＩ（Ｔｈ２細胞）を調節する効果を有することを生体内実験と生体外実験とにより発見し、この抽出物の主活性成分はキバナシュスラン種のタイプＩＩアラビノガラクタンであることを確認した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００４／０００９２３９号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Shih et al. 2001, “Ameliorative effects of Anoectochilus formosanus extract on osteopenia in overiectomized rats”, J Ethnopharmacol 77, 233-238
【非特許文献２】Masuda et al. 2008, “Suppressive effects of Anoectochilus formosanus extract on osteoclast formation in vitro and bone resorption in vivo”, J Bone Miner Metab 26, 123-129
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の主な目的は、有用な細菌の成長を促進し、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の放出を促進し、Ｔヘルパー細胞タイプＩ（Ｔｈ１細胞）を調節し、及び／又はＴヘルパー細胞タイプＩＩ（Ｔｈ２細胞）を調節するためのキバナシュスラン種・多糖類抽出物を提供することである。この抽出物はキバナシュスラン種のタイプＩＩアラビノガラクタンを含み、約４０〜約７０キロダルトンの平均分子量を有する。
【０００８】
本発明の別の目的は、前記抽出物の調製方法を提供することである。
【０００９】
本発明の更に別の目的は、有用な細菌の成長を促進し、Ｇ−ＣＳＦの放出を促進し、Ｔｈ１細胞を調節し、及び／又はＴｈ２細胞を調節するための医薬組成物であって、効果的な量の前記抽出物を含む医薬組成物を提供することである。
【００１０】
また、本発明は、有用な細菌の成長を促進し、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の放出を促進し、Ｔヘルパー細胞タイプＩ（Ｔｈ１細胞）を調節し、及び／又はＴヘルパー細胞タイプＩＩ（Ｔｈ２細胞）を調節するための薬剤の製造のための前記抽出物の使用を提供する。
【００１１】
本発明の詳細な技術及び好適な実施形態を、当業者が本発明の特徴をよく理解できるように添付の図面を参照しながら下記に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明のキバナシュスラン種・多糖類抽出物及びキバナシュスラン種のタイプＩＩアラビノガラクタンの調製のフローチャートである。
【図２】本発明のキバナシュスラン種・多糖類抽出物のβグルコシル・ヤリブ抗原親和性試験の発色グラフである。
【図３Ａ】本発明のキバナシュスラン種・多糖類抽出物の単糖組成の分析グラフである。
【図３Ｂ】キバナシュスラン種のタイプＩＩアラビノガラクタンの単糖組成の分析グラフである。
【図４】本発明のキバナシュスラン種・多糖類抽出物及びキバナシュスラン種のタイプＩＩアラビノガラクタンの分子量の分析グラフである。
【図５】ビフィズス菌ブレーベの成長のカーブグラフである。
【図６】マウスの大腿骨のマイクロＣＴ（コンピュータ断層撮影）グラフである。
【図７Ａ】マウスの腸内の様々な短鎖脂肪酸の濃度を示す棒グラフである。
【図７Ｂ】マウスの腸内の様々な短鎖脂肪酸の濃度を示す棒グラフである。
【図７Ｃ】マウスの腸内の様々な短鎖脂肪酸の濃度を示す棒グラフである。
【図７Ｄ】マウスの腸内の様々な短鎖脂肪酸の濃度を示す棒グラフである。
【図８Ａ】マウスの腸内のＣａＢＰ−Ｄ９ｋ（カルシウム結合タンパク質）のｍＲＮＡの電気泳動グラフである。
【図８Ｂ】マウスの腸内のＣａＢＰ−Ｄ９ｋのｍＲＮＡの発現を示す棒グラフである。
【図９Ａ】マクロファージＲＡＷ２６４．７の亜硝酸塩濃度を示す棒グラフである。
【図９Ｂ】マクロファージＲＡＷ２６４．７のＧ−ＣＳＦ濃度を示す棒グラフである。
【図９Ｃ】マクロファージＲＡＷ２６４．７のＧ−ＣＳＦと一酸化窒素との比を示す棒グラフである。
【図１０Ａ】リポ多糖類（ＬＰＳ）で刺激されたＩＣＲマウスにキバナシュスラン種のタイプＩＩアラビノガラクタンを投与して１時間後のマウス血液中のＴＮＦ−α濃度を示す棒グラフである。
【図１０Ｂ】リポ多糖類（ＬＰＳ）で刺激されたＩＣＲマウスにキバナシュスラン種のタイプＩＩアラビノガラクタンを投与して１６時間後のマウス血液中のＴＮＦ−α濃度を示す棒グラフである。
【図１１】ＥＬ４細胞内のＴ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ−３、ＧＡＰＤＨタンパク質のウェスタンブロッティングの転写結果を示すグラフである。
【図１２】ＢＡＬＢ／ｃマウスの肺スライスのＨＥ染色グラフである。
【図１３】ＢＡＬＢ／ｃマウスの腸のメチレンブルー染色グラフである。
【図１４】ビフィズス菌ブレーベの培養液の濁度を示す棒グラフである。
【図１５】マクロファージＲＡＷ２６４．７の一酸化窒素シンセターゼ、Ｇ−ＣＳＦ、及びＴＮＦ−αのｍＲＮＡの電気泳動グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
アラビノガラクタンはタイプＩとタイプＩＩのアラビノガラクタンに分類することができる。タイプＩアラビノガラクタンのガラクタンの主鎖は、β（１→４）結合で結合され、一方、タイプＩＩアラビノガラクタンのガラクタンの主鎖は、β（１→３）（１→６）結合で結合されている。異なる由来のタイプＩＩアラビノガラクタン同士は異なる性質（例えば、分子量、主鎖又は分枝鎖の構造、成分など）を有しているので、それらの作用も異なる（Paulsen et al., “Bioactive peptic polysaccharides”, Adv Polym Sci., 2005, 186: 69-101を参照。この文献を本明細書に援用する）。この文献では、タイプＩＩアラビノガラクタンはキバナシュスラン種のタイプＩＩアラビノガラクタンとして定義されている。
【００１４】
上述したように、キバナシュスラン種の活性成分は、まだ不明であり、キバナシュスラン種は、まだ多くの未知の効果を有している。本発明の発明者は多くの生体外細胞実験と生体内動物実験とにより、キバナシュスラン種・多糖類抽出物は、有用な細菌の成長を促進する効果、顆粒球コロニー刺激因子（以下、Ｇ−ＣＳＦと呼ぶ）の放出を促進する効果、Ｔヘルパー細胞タイプＩ（以下、Ｔｈ１細胞と呼ぶ）を調節する効果、及び／又はＴヘルパー細胞タイプＩＩ（以下、Ｔｈ２細胞と呼ぶ）を調節する効果を有することを発見し、この抽出物の主活性成分はキバナシュスラン種のタイプＩＩアラビノガラクタンであることを確認した。
【００１５】
従って、本発明は有用な細菌の成長を促進し、Ｇ−ＣＳＦの放出を促進し、Ｔｈ１細胞を調節し、及び／又はＴｈ２細胞を調節するためのキバナシュスラン種・多糖類抽出物を提供する。この抽出物は、キバナシュスラン種のタイプＩＩアラビノガラクタンを含む。
【００１６】
本発明のキバナシュスラン種・多糖類抽出物は水溶性の抽出物で、キバナシュスラン種は、好ましくはキバナシュスラン（Anoectochilus formosanus Hayata）である。具体的には、本発明のキバナシュスラン種・多糖類抽出物は、主に多糖類と、幾つかのタンパク質とを含み、脂溶性の成分をほとんど含まない。これらのタンパク質は、自由または共役タンパク質（糖タンパク質またはプロテオグリカン）の形態で存在する。特性分析後、多糖類成分は、主にキバナシュスラン種のタイプＩＩアラビノガラクタンと、澱粉とからなり、この澱粉は高度に分枝したα（１→４）（１→６）結合の構造を有することが確認された。キバナシュスラン種・多糖類抽出物の単糖類成分とキバナシュスラン種のタイプＩＩアラビノガラクタンとの分析後、両者はアラビノース、ガラクトース、グルコース、マンノース、及びフルクトースを含むことが発見された。キバナシュスラン種・多糖類抽出物は、主にグルコースからなり、タイプＩＩアラビノガラクタンは、主にガラクトースからなる。
【００１７】
本発明のキバナシュスラン種・多糖類抽出物は、約４０〜約７０キロダルトンの平均分子量を持ち、（本抽出物の乾燥重量に対して）約２０重量％〜約５０重量％のタイプＩＩアラビノガラクタンを含む。タイプＩＩアラビノガラクタンは、約１５〜約４５キロダルトンの平均分子量を持ち、自由または共役タンパク質（糖タンパク質またはプロテオグリカン）の形態で存在する幾つかのタンパク質を含む。本発明の好適な実施形態では、キバナシュスラン種・多糖類抽出物は、約５０〜約６０キロダルトンの平均分子量を持ち、（本抽出物の乾燥重量に対して）約３０重量％〜約４０重量％のタイプＩＩアラビノガラクタンを含み、タイプＩＩアラビノガラクタンは、約２５〜約３５キロダルトンの平均分子量を有する。
【００１８】
本発明のキバナシュスラン種・多糖類抽出物は、「プレバイオティクス」効果を有し、腸内の有用な細菌（即ち、プロバイオティクス）の成長を促進する可能性がある。本明細書において、「有用な細菌」は健康に有益な生理学的作用を行う可能性があるか、又は動物体の病気を治すことができる細菌を指す。本発明の１つの実施形態では、ビフィズス菌ブレーベ（Bifidobacterium breve；ビフィズス菌属）をキバナシュスラン種・多糖類抽出物またはキバナシュスラン種のタイプＩＩアラビノガラクタンで培養し、この細菌の成長を促進した。本発明の別の実施形態では、キバナシュスラン種・多糖類抽出物が、マウスの腸内のビフィズス菌類の量を増加させる可能性があることを発見した。
【００１９】
ビフィズス菌類は腸内で発酵を行い、腸内の脂肪酸、特に短鎖脂肪酸（例えば、酢酸、乳酸、プロピオン酸、及び酪酸）の量を増加させる可能性がある。短鎖脂肪酸は腸内のｐＨ値を下げてカルシウム吸収を促進するだけでなく、骨芽細胞を活性化して骨形成を促進して、例えば骨粗しょう症を予防するか、緩和するか、治すか等の抗骨粗しょう症効果を達成する（Katono et al., “Sodium butyrate stimulates mineralized nodule formation and osteoprotegerin expression by human osteoblasts”, Arch oral Biol. 208; 53:903-909を参照。この文献を本明細書に援用する）。従って、腸内のビフィズス菌類の成長を促進することが出来れば、カルシウム吸収と骨形成とを効率的に促進して抗骨粗しょう症効果を達成できる可能性がある。本発明のキバナシュスラン種・多糖類抽出物は、ビフィズス菌類の成長を促進できるので、上記の抗骨粗しょう症効果を提供できる。また、本発明のキバナシュスラン種・多糖類抽出物は、体内の有用な細菌の成長を促進することが出来、従って、外来細菌を使用して骨粗しょう症を緩和する場合に発生する可能性がある問題、例えば、有用な外来細菌は長時間腸内にほとんど留まらないこと、腸の粘膜の吸収が少ないこと等を避けることが出来る。
【００２０】
本発明のキバナシュスラン種・多糖類抽出物は、Ｇ−ＣＳＦを放出するよう体内のマクロファージを刺激する作用も有している。免疫システムでは、白血球が重要な役割を果す。病原体又は異物が体内に侵入した時、白血球がそれらを分解し、一連の生理学的防御反応を誘導する。患者が癌に対する化学療法を受けている場合、抗癌剤は患者の体の白血球を作る能力を損ない、これにより体内の白血球量を著しく減らして、患者の免疫力を不足させ、患者が病原菌又はウイルスに対して防御出来なくする。Ｇ−ＣＳＦは白血球にとっての成長ホルモンであり、白血球量を効率的に増加させる可能性がある。本発明のキバナシュスラン種・多糖類抽出物は、Ｇ−ＣＳＦを放出するよう体内のマクロファージを刺激するので、白血球量を間接的に増加させることが出来る。従って、癌患者の化学療法中、患者に本発明のキバナシュスラン種・多糖類抽出物を投与することで、白血球の減少という副作用を緩和することができる。
【００２１】
また、Ｇ−ＣＳＦは、炎症を予防するか、緩和するか、治すか等の抗炎症効果を有し、リポ多糖類（ＬＰＳ）によって促進されるＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子−α）の放出を抑制することが知られている（Boneberg et al., “Molecular aspects of anti-inflammatory action of G-CSF”, Inflamm. Res. 2002. 51: 119-128を参照。この文献を本明細書に援用する）。従って、本発明のキバナシュスラン種・多糖類抽出物は、Ｇ−ＣＳＦの放出の促進による抗炎症効果も提供する可能性がある。
【００２２】
また、本発明の発明者は、本発明のキバナシュスラン種・多糖類抽出物は、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞とを調節できることも発見した。Ｔ細胞は免疫システムにおいて重要な役割を果し、分泌されるサイトカインの種類に依る２種類に分化する。Ｔｈ１細胞はインターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）とインターロイキン−２（ＩＬ−２）とを産生し、一方、Ｔｈ２細胞はインターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、及びインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）を産生する。Ｔｈ１細胞はキラー細胞を助け、ＩＮＦ−γを分泌してマクロファージを活性化して細胞媒介性免疫を促進することができる。Ｔｈ２細胞はアトピー抗体ＩｇＥの産生においてＢ細胞を助け、ＩＬ−４及びＩＬ−５を分泌することで肥満細胞又は好酸球を活性化して、ヒスタミン、ロイコトリエン、ポスタグランジン(postaglandine)などを含む炎症メディエータを分泌させることができる。Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞とは互いに拮抗し、Ｔｈ１細胞によって放出されるＩＮＦ−γはＴｈ２細胞を抑制し、Ｔｈ２細胞によって放出されるＩＬ−４とＩＬ−１０とはＴｈ１細胞によるＩＮＦ−γの産生を抑制する可能性がある。
【００２３】
従って、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞との間の相互作用は、生理学的免疫反応に影響する場合があり、多くの病気に大きく関係する。例えば、Ｔｈ２細胞の過剰な活動がアレルギーを引き起こし、アトピー咳又は喘息を引き起こす気道アレルギーを発症する場合があることが知られている。また、Ｔｈ２細胞の免疫反応の高まりは、発癌物質により誘導された結腸癌の形成を促進する可能性があることが、文献において証明された（Osawa et al., “Predominant T helper type 2-inflammatory responses promote murine colon cancers”, Int J Cancer. 2006. 118(9): 2232-6を参照。この文献を本明細書に援用する）。一方、過剰に活性なＴｈ１細胞は自己免疫機能の異常を引き起こす場合がある。従って、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞との間の免疫バランスを、それらの活動を正常状態に維持するよう調節することが出来れば、自己免疫疾患を治し、アレルギー（アトピー咳及び喘息を含む）を緩和し、結腸癌を抑制することが出来る。
【００２４】
本発明のキバナシュスラン種・多糖類抽出物は、Ｔｈ１細胞の分化とそれによって媒介される免疫反応とを促進し、同時にＴｈ２細胞の分化と免疫反応とを抑制する可能性がある。従って、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞との拮抗関係において、Ｔｈ２細胞が過剰に活性で、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞との間に不均衡がある場合、本発明のキバナシュスラン種・多糖類抽出物は、Ｔｈ１細胞経路へ免疫反応を振り向けて、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞とのバランスを調節し、抗アレルギー効果、喘息の緩和、結腸癌の抑制、及び免疫機能の調節を達成する可能性がある。
【００２５】
本発明のキバナシュスラン種・多糖類抽出物を、下記のステップを含む方法によって提供することが出来る。
ａ）キバナシュスラン種から水を使って水溶性のキバナシュスラン種抽出物を抽出する、
ｂ）キバナシュスラン種抽出物を脱脂し、次に水様の抽出物を収集する、
ｃ）この水様抽出物にエタノールを加え、次に沈澱物を収集する。ここで、エタノールの濃度は水様抽出物とエタノールとの総体積に対して約６５体積％〜約８５体積％である。
【００２６】
ステップａ）、抽出ステップを実行する手法を下記に説明する。先ず、水とキバナシュスラン種とを混合し、かき混ぜジュースを作り、次に不溶性成分を濾過して取除き、水溶性のキバナシュスラン種抽出物を得る。
【００２７】
脱脂ステップｂ）は任意の既知の適切な脱脂手法で実行してよい。例えば、酢酸エチル（又はヘキサン）を水溶性キバナシュスラン種抽出物に加え、所望される作用を持たない脂溶性の成分を取除き、次に水様の抽出物を収集する。ここで、酢酸エチルの量に制限はなく、ステップａ）の水溶性キバナシュスラン種抽出物の体積に対して、酢酸エチルの濃度は通常、約１５体積％〜約３５体積％、好ましくは、約２０体積％〜約３０体積％である（Wu et al., “The hepatoprotective activity of kinsenoside from Anoectochilus formosanus”, Phtother res. 2007; 21: 58-61を参照。この文献を本明細書に援用する）。
【００２８】
ステップｃ）では、エタノールを水様抽出物に加え、生成沈澱物を収集する。この沈澱物の成分は、主に糖類と、少量のタンパク質と、核酸とである。エタノールの濃度は水様抽出物とエタノールとの総体積に対して約６５体積％〜約８５体積％、好ましくは、約７０体積％〜約８０体積％である。
【００２９】
選択肢として、ステップａ）又はステップｂ）は、抽出効率を増加させるために適切な抽出手段（例えば、超音波振動など）を使用してもよい。また、選択肢として、ステップａ）及び／又はステップｂ）は、キバナシュスラン種の無効な成分から有効な成分をできるだけ多く分離し、所望の有効な成分をできるだけ多く抽出して、資源の無駄を減らし経済的利益を増加させるために繰り返し実行してもよい。
【００３０】
キバナシュスラン種・多糖類抽出物の適用形態に依って、乾燥ステップｄ）をステップｃ）で得た沈澱物を乾燥するために実行してもよい。例えば、本発明のキバナシュスラン種・多糖類抽出物を経口投与で適用する場合、抽出物中の有機溶媒を体に害を及ぼさないよう取除くために乾燥ステップ（例えば、減圧下及び／又は通風状態での濃縮）を使用することができる。或いは、ステップｃ）又はステップｄ）で得た沈澱物を水に溶かして本発明の抽出物を水様溶液として提供してもよい。
【００３１】
本発明の実施形態では、キバナシュスラン種・多糖類抽出物を次のようにして得ることが出来る。先ず、水とキバナシュスラン（Anoectochilus formosanus Hayata）とを混合し、かき混ぜジュースを作り、不溶性成分を濾過して取除き、水溶性のキバナシュスラン種抽出物を得る。次に、約２５体積％酢酸エチルをキバナシュスラン種抽出物に加え、脱脂を行い、水相を集めて水様抽出物を得る。その後、最終濃度約７５体積％のエタノールをこの水様抽出物に加えて、沈澱物を生成させ、次に、この沈澱物を集めてキバナシュスランの所望の多糖類抽出物を得る。
【００３２】
また、本発明は、有用な細菌の成長を促進し、Ｇ−ＣＳＦの放出を促進し、Ｔｈ１細胞を調節し、及び／又はＴｈ２細胞を調節するための医薬組成物であって、キバナシュスラン種の効果的な量の上記多糖類抽出物を含む医薬組成物を提供する。具体的には、本発明の医薬組成物は、腸内の脂肪酸（例えば、短鎖脂肪酸）の量の増加、カルシウム吸収の促進、抗骨粗しょう症、抗炎症、白血球減少の抑制、抗アレルギー、喘息の緩和、結腸癌の抑制、及び／又は免疫機能の調節などのために使用されてよい。
【００３３】
本発明の医薬組成物は、適切な様々な形態で薬剤として投与できる。例えば、この薬剤は、これらに限定されないが、経口投与、皮下投与、又は静脈投与等により適用することが出来る。本発明の抽出物に加えて、この薬剤は１つ以上の補助薬を含んでもよく、獣医療と人間医療の両方で実際に使用できる。
【００３４】
経口投与に適した薬剤を製造する場合、本発明の医薬組成物を経口投与に適し本発明の抽出物の作用に悪影響を与えない補助薬と混合してもよい。例えば、補助薬は、溶媒、油溶媒、希釈剤、安定剤、吸収遅延剤、崩壊剤、乳化剤、結合剤、潤滑剤、溶解剤等であってよい。例えば、溶媒は水又は蔗糖溶液であってよく、希釈剤はラクトース、澱粉、又は微晶質セルロース、吸収遅延剤はキトサン又はグリコサミノグリカン、潤滑剤は炭酸マグネシウム、油溶媒は、オリーブ油、ヘリオトロープ油、魚肝油等の植物油又は動物油であってよい。本発明の医薬組成物と他の適切な補助薬とを、従来の方法で適切な経口投与形態、例えば錠剤、カプセル、顆粒、粉末、流体抽出物、溶液、シロップ、懸濁液、乳濁液、チンキ剤等にしてもよい。
【００３５】
皮下投与又は静脈投与に適した薬剤を製造する場合、本発明の医薬組成物と省略可能な補助薬とをこれらの形態の場合に通常使用される１つ以上の成分（例えば、屈水剤、乳化剤、又は他の補助薬）と混合して、静脈注射液、乳濁静脈注射液、注射液、粉末注入剤、懸濁注入液、粉末懸濁注入剤等を調製してもよい。例えば、溶媒は水、生理食塩水、アルコール（例えば、エタノール、プロパノール、グリセリン等）、糖溶液（例えば、グルコース又はマンニトール溶液）、又はこれらの組合せであってよい。
【００３６】
選択肢として、上記の有益な補助薬に加えて、他の添加剤、例えば香味剤、トナー、着色剤等も薬剤製造時に加え、投与時の口快適感と視感とを向上させてもよい。また、適切な投与量の防腐剤、保存料、殺菌剤、抗真菌剤等を加え、得られる薬剤の保存性を向上させてもよい。
【００３７】
また、該薬剤は、その効果を向上させるか、又は適用及び調合の柔軟性を増加させるために１つ以上の他の活性成分を含んでもよい。例えば、該薬剤に含まれてもよい他の活性成分は、骨粗しょう症を治療するための物質（例えば、アレンドロナート、パラソリン（parathorine）、エストロゲン、カルシウム化合物、又はビタミンＤ等）、抗関節炎物質（例えば、コンドロイチン又はグルコサミン）、他の活性成分など本発明の抽出物に悪影響を与えない活性成分を含む。
【００３８】
被験者の必要に応じて、該薬剤を、１日に１回、１日に数回、又は数日に１回等の異なる投与頻度で適用することが出来る。例えば、該薬剤が哺乳動物において抗炎症のために使用される場合、哺乳動物に投与される医薬組成物の量は、タイプＩＩアラビノガラクタンとして計算して、１日当り約２ｍｇ／ｋｇ体重〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重である。単位ｍｇ／ｋｇ体重は、体重１キログラム当りに必要な投与量を意味する。好ましくは、哺乳動物に投与される該医薬組成物の量は、タイプＩＩアラビノガラクタンとして計算して、１日当り約３ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重である。しかし、深刻な状況（例えば、急性関節炎又は深刻な骨粗しょう症）では、投与量を実際の必要に応じて数倍又は数十倍に増加させることが出来る。
【００３９】
また、本発明は、有用な細菌の成長を促進し、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の放出を促進し、Ｔヘルパー細胞タイプＩ（Ｔｈ１細胞）を調節し、及び／又はＴヘルパー細胞タイプＩＩ（Ｔｈ２細胞）を調節するための適切な形態の薬剤を製造するための上記抽出物の使用を提供する。
【００４０】
下記に具体的な実施例を用いて本発明を更に詳細に説明する。下記の実施例を参照することで、当業者は本発明の基本思想と他の目的と、本発明の技術方法と実施形態とを容易に理解できるであろう。しかし、下記の実施例は本発明を例示するためだけに提供され、本発明の範囲はこれらによって限定されない。
【実施例】
【００４１】
＜実施例１＞キバナシュスランの水溶性多糖類抽出物の調製
下記に例示するように、図１に示すフローチャートに従って、キバナシュスラン（Anoectochilus formosanus Hayata）の水溶性多糖類抽出物（以下、「ＷＰＡＦ抽出物」と呼ぶ）と、キバナシュスラン（Anoectochilus formosanus Hayata）のタイプＩＩアラビノガラクタン（以下、「ＩＩ−ＡＧＡＦ」と呼ぶ）とを調製した。
【００４２】
先ず、水と、Yu-Jung farm（台湾）から購入したキバナシュスラン（この植物のサンプルはthe Pharmacy College, China Medical University（台湾）に寄託番号CMU AF 0609で寄託され、このカレッジによって特定されている）とを混合し、ジュースを作り、不溶性成分を濾過して取除き、水溶性のキバナシュスラン抽出物を得た。次に、最終濃度約２５体積％の酢酸エチルをキバナシュスラン抽出物に加え、水様抽出物を収集して脂溶性成分を取除いた。次に、最終濃度約７５体積％のエタノールをこの水様抽出物に加えて、沈澱物を生成させ、この沈澱物を集めて水に溶かしキバナシュスランの水溶性多糖類抽出物（ＷＰＡＦ抽出物）を得た。収量はキバナシュスラン１ｋｇ当り約２．４ｍｇであった。
【００４３】
水溶性ＷＰＡＦ抽出物を２つに分け、一方にはアミラーゼ、アミルグルコシダーゼ、及びプロテアーゼ（アイルランドMegazyme International社から購入）を加え、分解させ、最終濃度約７５体積％のエタノールを加え、沈澱物を生成させた。最後に、この沈澱物を水に溶かして、多糖であり完全には精製されていないタイプＩＩアラビノガラクタン（ＩＩ−ＡＧＡＦ）を得た。
【００４４】
＜実施例２＞ＷＰＡＦ抽出物とＩＩ−ＡＧＡＦとの特性解析
Ｉ．ヨウ化物を使用する発色試験
ヨウ化物を使用する発色の原理は、多糖（例えば、澱粉又はグリコーゲン（両方ともグルカンである））はヨウ化物と複合体を形成し、発色する場合があることである。この複合体においてヨウ化物は多糖の螺旋分子鎖の真中に位置し、生成される色は直鎖（α（１→４）結合）の長さに依存する。例えば、アミロースは紫を発色し、澱粉を部分加水分解した生成物であるデキストリンは、鎖の長さに依存して赤褐色〜透明色を発色し、分枝鎖を持つグリコーゲンは赤褐色を発色する。
【００４５】
実施例１のＷＰＡＦ抽出物（１２ｍｇ）を９０％ジメチルスルホキシド（６ｍｌ）に加え、１００℃で３０分間加熱した。次に、得られたサンプルのうち１００μｌを９００μｌの水と混合し、５０μｌの０．０１Ｎヨウ化物（ヨウ化カリウム）を加え、この混合物を振動させて混合した。
【００４６】
ヨウ化物を使用する発色試験の結果は、ＷＰＡＦ抽出物が赤〜紫を発色する可能性があることを示した。これは、ＷＰＡＦ抽出物中のα右旋性グルカンが高度に分枝したα（１→４）（１→６）結合の構造を有することを示す。
【００４７】
ＩＩ．βグルコシル・ヤリブ抗原親和性試験
ヤリブ試験をvan Holstの方法及びvan Hengelの方法に従って実行した（van Holst et al., “Quantification of arabinogalactan protein by single radical gel diffusion”, Anal Biochem. 148:446-450, 1985及びvan Hengel et al., “Fucosylated arabinogalactan-proteins are required for full root cell elongation in Arabidopsis”, Plant J. 32:106-113, 2002を参照。これらの文献を本明細書に援用する）。アラビアゴムを陽性対照として使用した。脱イオン水中で、ゲル切片を加熱し、１重量％アガロースＩ（登録商標）、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０２ｗ／ｖ％アジ化ナトリウム、及び１０μｇ／ｍｌβグルコシル・ヤリブ抗原を溶かし、ゲル成形カセット（Protean II, 米国BioRad社）に徐々に注入し、厚さ３ｍｍのゲル切片を作った。次に、直径１．２ｍｍのサンプル装填穴をパスツールピペット（米国Kimble社）で作った。実施例１のＷＰＡＦ抽出物を０．１５Ｍ塩化ナトリウム及び０．０２ｗ／ｖ％アジ化ナトリウム溶液で溶かした後、０．８μｌの抽出物を該サンプル装填穴に装填した。該ゲル切片を湿気のある閉じた容器内に室温で２日間静置した。拡散円が観察された。結果を図２に示す。
【００４８】
アラビノガラクタンはタイプＩとタイプＩＩに分類することができ、タイプＩアラビノガラクタンのガラクタンの主鎖はβ（１→４）結合で結合され、一方、タイプＩＩアラビノガラクタンのガラクタンの主鎖は、β（１→３）（１→６）結合で結合されている。合成フェニルグリコサイド（phenylglycoside）であるヤリブ試薬は、タイプＩＩアラビノガラクタンと反応し発色するので、アラビノガラクタンの結合形態を決定するために使用できる。
【００４９】
図２はヤリブ反応が発生し、ＷＰＡＦ抽出物がアラビアゴムと反応し発色したことを示す。これはＷＰＡＦ抽出物がタイプＩＩアラビノガラクタンを含んでいることを示す。
【００５０】
上記の結果は、ＷＰＡＦ抽出物は主に澱粉とＩＩ−ＡＧＡＦとを含むことを示す。従って、ＷＰＡＦ抽出物をアミラーゼ及びアミルグルコシダーゼで処置すると、澱粉は分解して主残留物としてＩＩ−ＡＧＡＦが残る。また、多糖成分はタンパク質（例えば、糖タンパク質）を通常含むので、プロテアーゼで処置し、更にタンパク質を取除いてもよい。
【００５１】
ＩＩＩ．タンパク質、糖類、及びウロン酸の含有量の決定
タンパク質の総含有量をFolin-Lowry法及びCoomassie Blue法で測定し、ウシ血清アルブミンを基準として使用した（Lowry et al., “Protein measurement with the Folin phenol reagent”, J. Biol. Chem. 1951. 93: 265-275を参照。この文献を本明細書に援用する）。結果を表１に示す。
【００５２】
糖類の総含有量をフェノール硫酸法で測定し、ＷＰＡＦ抽出物に関して、グルコースを基準として使用し、ＩＩ−ＡＧＡＦに関して、ガラクトースを基準として使用した（Dubois et al., “Colorimetric method for determination of sugars and related substances”, Anal. Chem. 1956. 28: 350-356を参照。この文献を本明細書に援用する）。結果を表１に示す。
【００５３】
ウロン酸の含有量はｍ−ヒドロキシジフェニルを使用して測定した。この測定において、基準カーブを１０〜９０μｇ／ｍｌのガラクツロン酸を使用して作り、０．５重量％水酸化ナトリウム溶液を、ｍ−ヒドロキシジフェニル溶液を置き換え天然糖類の褐色発色反応を補正するために使用した。
【００５４】
先ず、０．０１２５Ｍの四ホウ酸ナトリウムを含む硫酸溶液（１．２ｍｌ）に２００μｇのＷＰＡＦ抽出物を加え、完全に混合し、沸騰水に５分間浸漬した。このサンプルを冷却した後、ｍ−ヒドロキシジフェニル溶液（２０μｌ）又は０．５重量％水酸化ナトリウム溶液を加え、１５分間静置して発色させた。波長５２０ｎｍを使って吸光度値を測定した。結果を表１に示す。上記方法はBlumenkrantz et al., “New method for quantitative determination of uronic acid”, Analytical Biochemistry. 1973. 54: 484-489に記載されている。この文献を本明細書に援用する。
【００５５】
【表１】
0005395733.tif 000002
a ＷＰＡＦ抽出物の固形分を基準として使用した。
b BSAを基準とするFolin-Lowry（FL）法による値。
c BSAを基準とするCoomassie Blue（CB）法（Bio-Radタンパク質検定試薬）による値。
d ＷＰＡＦ抽出物の場合、グルコースを、ＩＩ−ＡＧＡＦの場合、ガラクトースを基準とするフェノール硫酸法による値。
e ガラクツロン酸を基準として使用した。
【００５６】
表１に示すように、ＷＰＡＦ抽出物は約３３．４重量％のＩＩ−ＡＧＡＦを含み、ＩＩ−ＡＧＡＦは幾らかのタンパク質を含む。
【００５７】
ＩＶ．単糖比率の分析
ＷＰＡＦ抽出物の多糖類を酸で加水分解して単糖類にした後、ＨＰＡＥＣ（高性能陰イオン交換クロマトグラフ）を使用して、ＷＰＡＦ抽出物の単糖比率を分析し、実施例１のＷＰＡＦ抽出物及びＩＩ−ＡＧＡＦの単糖組成を決定した。加水分解は２Ｍトリフルオロ酢酸を主に使用して行った。
【００５８】
先ず、ＷＰＡＦ抽出物（１ｍｇ）又はＩＩ−ＡＧＡＦ（１ｍｇ）を２Ｍトリフルオロ酢酸溶液（１ｍｌ）に溶かし、真空加水分解管内に静置し酸加水分解を行った。反応条件は１００℃、３時間であった。反応終了後、トリフルオロ酢酸を減圧下で濃縮することで取除き、脱イオン水をサンプルに加え、サンプルを再び減圧下で濃縮することで乾燥させた。上記手順はトリフルオロ酢酸を取除くために数回繰り返すことが出来る。
【００５９】
次に、ＨＰＡＥＣ分析を行った。上記の加水分解質を１ｍｌの脱イオン水で溶かし、孔サイズ０．４５μｍのＰＶＤＦ薄膜（米国Millipore社）で濾過し、ＨＰＡＥＣシステムに注入し分析を行った。ＨＰＡＥＣシステムの構成要素と分析条件は、817 Bi Bioscan（スイスMetrohm社）、812 valve unit（スイスMetrohm社）、Series III pump（米国LabAlliance社）、検出器：パルス式電流測定検出器（スイスMetrohm社）、電位及びパルス時間：Ｅ１：０．０５ボルト／０．４ｓ，Ｅ２：０．７５ボルト／０．２ｓ，Ｅ３：−０．１５ボルト／０．４ｓ、サンプルループ：容量：２０μｌ、分離カラム：CarboPac PA1 guard column（４×５０ｍｍ）−CarboPac PA1（４×２５０ｍｍ）（米国Dionex社)、流量：１．０ｍｌ／分、溶離システム：１０ｍＭ水酸化ナトリウム及び１ｍM酢酸バリウム（孔サイズ０．２μｍのナイロン薄膜（米国ChromTech社）で濾過した）、データ処理システム：Metrodata IC Net 2.1（スイスMetrohm社）であった。アラビノース、ガラクトース、グルコース、マンノース、及びフルクトースを基準として使用し、保持時間を比較することで分析を行った。結果を表２、図３Ａ、及び図３Ｂに示す。
【００６０】
【表２】
0005395733.tif 000003
【００６１】
図３Ａに示すように、ＨＰＡＥＣ分析によると、ＷＰＡＦ抽出物は、グルコース、ガラクトース、アラビノース、マンノース、及びフルクトース等の単糖単位を含む。それらの比率を表２に示す。グルコースの比率が最も高い。
【００６２】
図３Ｂに示すように、アミラーゼ及びアミルグルコシダーゼでＷＰＡＦ抽出物を分解した後に得られたＩＩ−ＡＧＡＦは、グルコース、ガラクトース、アラビノース、マンノース、及びフルクトース等の単糖単位をまだ含む。それらの比率を表２に示す。ガラクトースの比率が最も高い。
【００６３】
これらの結果は、本発明のＷＰＡＦ抽出物は、澱粉と、ガラクタンをバックボーンとするアラビノガラクタンとを主に含むことを示す。アラビノガラクタンの側鎖はグルコース単位とマンノース単位を含む。
【００６４】
Ｖ．分子量の決定
実施例１のＷＰＡＦ抽出物とＩＩ−ＡＧＡＦとの分子量をＨＰＳＥＣ（高性能サイズ排除クロマトグラフ）で分析した。ＷＰＡＦ抽出物又はＩＩ−ＡＧＡＦの適当な量を脱イオン水で溶かし、孔サイズ０．４５μｍのＰＶＤＦ薄膜（米国Millipore社）で濾過し、容量５００μｌのサンプルループに注入し、ＨＰＳＥＣ機で分析した。分子量分析の基準はSTANDARD P-82（プルラン：P-800（７８．８×１０4ダルトン）、400（４０．４×１０4ダルトン）、200（２１．２×１０4ダルトン）、100（１１．２×１０4ダルトン）、50（４．７３×１０4ダルトン）、20（２．２８×１０4ダルトン）、10（１．１８×１０4ダルトン）、及び5（０．５９×１０4ダルトン）、日本Shodex社）である。
【００６５】
ＨＰＳＥＣ分析の条件は、洗浄溶液供給ポンプ：709 IC pump（スイスMetrohm社)、注入器：Rheodyne sample injector（米国Cotati社）、サンプル注入量：５００μＬ、カラム用の定温キャビネット：７０℃に維持されたSuper CO-150（台湾Enshine社）、検出器：直列接続された多角度レーザ光散乱光度計（DAWN EOS、米国Wyatt Technology社）と干渉型屈折率計（OPTILAB DSP、米国Wyatt Technology社）（屈折率計の温度は３５℃に維持）、カラム：Tskgel guard column PWH （７５×７．５ｍｍ内側寸法、日本Tosho社）＋TSKgel G4000 PWXL（３００×７．８ｍｍ内側寸法、日本Tosho社）＋ViscoGel G2500 PWXL（３００×７．８ｍｍ内側寸法、米国Viscotek社）、流相：０．３Ｎ亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ3）＋０．０２％アジ化ナトリウム（ＮａＮ3）、流量：０．８ｍｌ／分である。
【００６６】
分析結果を図４に示す。図４において、実線はＷＰＡＦ抽出物を、点線はＩＩ−ＡＧＡＦを表す。計算後、ＷＰＡＦ抽出物の平均分子量（ＭW）は５５キロダルトン、ＩＩ−ＡＧＡＦの平均分子量は２９キロダルトンである。
【００６７】
＜実施例３＞ＷＰＡＦ抽出物のプレバイオティクス効果
Ｉ．管試験
ビフィズス菌ブレーベ（Bifidobacterium breve）を食品工業発展研究所（台湾）から購入し、ＭＲＳ培地（１重量％プロテオースＮｏ．３、１重量％牛肉エキス、０．５重量％酵母菌エキス、２重量％デキストロース、０．１重量％Tween 80、０．２重量％クエン酸アンモニウム、０．５重量％酢酸ナトリウム、０．０１重量％硫酸マグネシウム、０．００５重量％マンガン、０．２重量％リン酸カリウム、及び１．５重量％寒天（米国Difco社）を含む）で培養した。この細菌を培養器内で嫌気的条件下で１〜２日間培養した後、培養液を集め、波長６００ｎｍを使って濁度を測定した。次に、培養液を適切に希釈し、プレート内のＭＲＳ培地の表面上に均一に塗布し、培養器内で嫌気的条件下で３７℃で培養した。２日後、培地の濁度を測定し、コロニー数を計数した。
【００６８】
濁度は、ＭＲＳ培地に培養液を塗布し培養した後のコロニー数に直線的に比例する。これらの関係を表す式とｒ値を下記に示す。
Ｙ＝（１３６１Ｘ−１１．７４）×１０7、ｒ2＝０．９８７１
Ｙ＝コロニー形成ユニット（ＣＦＵ）／ｍｌ、Ｘ＝ＯＤ６００
【００６９】
上記の式は、濁度はコロニー数を反映し、従って、下記の実験においてコロニー数は濁度で表わされることを示す。
【００７０】
図５に示すように、ビフィズス菌ブレーベの培養時間対濁度のカーブグラフにおいて、最大の傾き０．０５は培養１８時間後に存在する。実施例１の様々な濃度のＷＰＡＦ抽出物をビフィズス菌ブレーベを含む培地に加えた場合、ビフィズス菌ブレーベの成長カーブの最大の傾きは１８時間から１６時間に移動した。様々な濃度０．５、１、２ｍｇ／ｍｌのＷＰＡＦ抽出物の１６時間における傾きはそれぞれ０．０８、０．１０、０．１０であり、対照グループの１８時間における傾きは０．０６である。この結果は本発明のＷＰＡＦ抽出物はビフィズス菌ブレーベの成長を促進する可能性があることを示す。対照グループと実験グループに関して、１８時間培養後のビフィズス菌ブレーベの濁度を表３に示す。
【００７１】
【表３】
0005395733.tif 000004
全ての値は平均±ＳＤ（ｎ＝６）。**P<0.01,
***P<0.001（対照グループと比較）
【００７２】
ＩＩ．マウス腸試験
ＩＣＲマウス（台湾BioLASCO社から購入）を下記の実験において使用した。先ず、水又は実施例１のＷＰＡＦ抽出物（１５又は４０ｍｇ／ｋｇ体重）をマウスに投与した。３日後と７日後にマウスの糞を密封容器で収集した。これらの糞を適切な比率の無菌嫌気希釈液で希釈し、管振動器で均一に混合して均質な液体を作った。嫌気的条件下で、この液体を適切な濃度に希釈し、ビフィズス菌類を含むBeerens培地（１L培地は３７ｇブレインハートインフュージョン、５ｇ酵母菌エキス、０．５ｇシステイン、及び１５ｇ寒天を含む）の表面上に塗布し、次に、培養器内において嫌気的条件下で３７℃で２〜４日間培養し、コロニー数を計数した。
【００７３】
結果を表４に示す。３日目に投与量４５ｍｇ／ｋｇ体重のＷＰＡＦ抽出物は、マウスの糞のビフィズス菌類のコロニー数を明らかに増加させた。７日目に投与量１５及び４５ｍｇ／ｋｇ体重のＷＰＡＦ抽出物の両方が、糞のビフィズス菌類のコロニー数を明らかに増加させた。
【００７４】
【表４】
0005395733.tif 000005
全ての値は平均±ＳＤ（ｎ＝７）。*** P<0.001（Ｈ2Ｏグループと比較）
【００７５】
＜実施例４＞ＷＰＡＦ抽出物の抗骨粗しょう症効果
Ｉ．卵巣切除マウス試験
ＩＣＲマウス（台湾BioLASCO社から購入）を下記の実験において使用した。エストロゲンの不十分な分泌は骨粗しょう症を引き起こす場合があることが知られている。従って、この実験では、ＩＣＲマウスの卵巣を取除き、エストロゲンを分泌できなくして骨粗しょう症を発症させた。対照グループ（即ち、偽のグループ）では、ＩＣＲマウスの背の両側の卵巣位置の皮膚と筋肉を切開し、次に卵巣を取除くことなく縫合した。
【００７６】
３日後、実施例１のＷＰＡＦ抽出物を様々な投与量（１５又は４５ｍｇ／ｋｇ体重）でＩＣＲマウスに投与した。投与から３週間後、マウスを屠殺した。以下、卵巣を取除いたマウスを「ＯＶＸ」又は「ＯＶＸマウス」と呼ぶ。
【００７７】
マウスの血清内のＩ型コラーゲン架橋Ｃ末端テロペプチド（ＣＴｘ）の量をＥＬＩＳＡ（酵素免疫吸着法）により決定した。実験薬剤はデンマークIDS Nordic社から購入した。ＣＴｘは骨のコラーゲンの分解生成物であり、血液中のＣＴｘの濃度が上がると、骨吸収が増加すること意味し、骨粗しょう症を引き起こす可能性がある（Swaminathan. 2001, “Biochemical markers of bone turnover”, Clinica Chimica Acta. 313: 95-105を参照。この文献を本明細書に援用する）。結果を表５に示す。
【００７８】
【表５】
0005395733.tif 000006
全ての値は平均±ＳＤ（ｎ＝８）。##P<0.01（Ｈ2Ｏグループと比較）
*P<0.05（ＯＶＸ＋Ｈ2Ｏグループと比較）
【００７９】
表５に示すように、卵巣を取除くことはマウスの血清中のＣＴｘ濃度を増加させる可能性があり、本発明のＷＰＡＦ抽出物はＣＴｘ濃度を下げる可能性がある。これはＷＰＡＦ抽出物は骨吸収を抑制し骨基質の喪失を低減できることを示す。
【００８０】
その後、マウスの大腿骨を取出し、マイクロＣＴ（コンピュータ断層撮影）スキャナー（SkyScan 1076）で撮影した。梁数と骨量（ＢＶ）と組織量（ＴＶ）との比を分析ソフトウェアで分析した。結果を図６及び表６に示す。
【００８１】
【表６】
0005395733.tif 000007
全ての値は平均±ＳＤ（ｎ＝８）。##P<0.01（対照グループと比較）
* P<0.05（ＯＶＸ＋Ｈ2Ｏグループと比較）
【００８２】
図６及び表６から分かるように、本発明のＷＰＡＦ抽出物は、ＯＶＸマウスの骨量比の減少と梁数の減少を抑制する可能性がある。
【００８３】
その後、マウスの脊柱を取出し、付いている肉を完全に取除き、エタノールに浸漬して脂肪を取除き、１００℃で一晩乾燥し、その重量を測定した。次に、脊柱を１０００℃で１０時間焼き、灰の重量を測定した。その灰を６Ｎ塩酸に溶かした。その灰のカルシウムの量をｏ−クレゾールフタレインコンプレクソンを用いて測定した。脊柱１ｇ当りのカルシウムの重量を求めた。検定薬剤は英国Randox Lab.社から購入した。結果を表７に示す。
【００８４】
【表７】
0005395733.tif 000008
全ての値は平均±ＳＤ（ｎ＝８）。###P<0.001（対照グループと比較）
** P<0.01（ＯＶＸ＋Ｈ2Ｏグループと比較）
【００８５】
表７に示すように、本発明のＷＰＡＦ抽出物は、ＯＶＸマウスの脊柱のカルシウム喪失を抑制する可能性がある。図６、表５〜表７から、上記実験は、本発明のＷＰＡＦ抽出物は、卵巣を取除いたことによって発症したマウスの骨粗しょう症を緩和できることを示す。
【００８６】
ＩＩ．カルシウム吸収試験
上記屠殺したＩＣＲマウスの盲嚢内の物質を取出し、遠心分離機にかけ上澄みを集めた。上澄みを適切に希釈した後、カルシウム濃度をｏ−クレゾールフタレインコンプレクソンを用いて測定した。結果を表８に示す。
【００８７】
【表８】
0005395733.tif 000009
全ての値は平均±ＳＤ（ｎ＝８）。*P<0.05（ＯＶＸ＋Ｈ2Ｏグループと比較）
【００８８】
表８に示すように、本発明のＷＰＡＦ抽出物は、マウスの盲嚢内の遊離カルシウムの量を増加させる可能性がある。酸性環境はカルシウムの溶解度を上昇させるので、腸によるカルシウムの吸収を容易にする。従って、下記の実験は、マウスの盲嚢内の物質中の短鎖脂肪酸の量を更に測定する。
【００８９】
上記上澄みをＨＰＬＣ機で分析した。ＨＰＬＣ機の構成要素は、ポンプ供給システム：SDS 9414溶剤供給システム（ドイツSchambeck SFD社）、サンプル注入容量：２０μＬ、検出器：115 UV検出器（波長２１０ｎｍ）（米国Gilson社）及び屈折率計：Shodex RI-71（日本SHOWA DENKO社）、カラム：Transgenomic ICSep ION-300 column（米国Transgenomic社）及びガードカラム：Transgenomic ICSep ION-300 Guard kit（米国Transgenomic社）、カラムのオーブンの温度：６５℃、溶離剤：０．００８５ＮのＨ2ＳＯ4、データ処理システム：SISC Hsun-Huaクロマトグラフィー統合データ処理システム（台湾Hsun-Hua社）である。
【００９０】
上記上澄みをこのシステムに注入し、吸光度を波長２１０ｎｍで紫外線検出器を使って測定した。有機酸の最大吸光度の波長は２１０ｎｍであるので、この波長を短鎖脂肪酸の量を検出するために使用でき、その濃度は屈折率計で測定できる。この実験では、様々な濃度の短鎖脂肪酸基準（酢酸、乳酸、プロピオン酸、及び酪酸を含む）を調製し、基準カーブを解析図中のピークの積分面積と濃度とに従って作成し、上澄み中の短鎖脂肪酸の濃度を求めた。単位「μｍｏｌ／ｇ盲嚢内物質」は酢酸、プロピオン酸、及び酪酸の量を表すために使用される。結果を図７Ａ〜図７Ｄに示す。
【００９１】
図７Ａ〜図７Ｄから分かるように、本発明のＷＰＡＦ抽出物は、マウスの盲嚢内の短鎖脂肪酸の量を増加させ、従って、盲嚢内のｐＨ値を減少させ、カルシウム吸収を促進する可能性がある。
【００９２】
腸粘膜細胞のＣａＢＰ−Ｄ９ｋ（カルシウム結合タンパク質）はカルシウム吸収に密接に関係している。ＣａＢＰ−Ｄ９ｋの発現量が増加すると、カルシウム吸収も増加する（Bouillon et al., 2003, “Intestinal calcium absorption: molecular vitamin D mediated mechanisms”, J. Cell. Biochem., 88: 332-339を参照。この文献を本明細書に援用する）。
従って、下記の実験はＣａＢＰ−Ｄ９ｋのｍＲＮＡ量を、その発現量を観察するために更に分析した。
【００９３】
先ず、ＩＣＲマウスの盲嚢粘膜を引っかき集め、ｍＲＮＡを抽出した。盲嚢及び結腸粘膜のＣａＢＰ−Ｄ９ｋのｍＲＮＡ発現量をＲＴ−ＰＣＲで分析した。ＣａＢＰ−Ｄ９ｋの分析のためのプライマー配列は次のとおりである。
センス：AAGAGCATTTTTCAAAAATA (SEQ ID NO: 1)
アンチセンス：GTCTCAGAATTTGCTTTATT (SEQ ID NO: 2)
【００９４】
図８Ａ及び図８Ｂから分かるように、ＷＰＡＦ抽出物は盲嚢のＣａＢＰ−Ｄ９ｋのｍＲＮＡ発現を促進する。これはＷＰＡＦ抽出物がカルシウム吸収を促進できることを示す。
【００９５】
実施例３及び実施例４は、本発明のＷＰＡＦ抽出物は、腸内の有用な細菌の成長を促進することで有用な細菌の量を増加させ、腸内の発酵を促進し、短鎖脂肪酸を産生してｐＨ値を下げ、カルシウム吸収を促進する可能性がある。従って、本発明のＷＰＡＦ抽出物は、骨粗しょう症を緩和することが出来る。
【００９６】
＜実施例５＞ＷＰＡＦ抽出物は、Ｇ−ＣＳＦを放出するようマクロファージを刺激する
Ｉ．マウスのマクロファージ試験
先ず、５重量％チオグリコレート（米国Becton Dickinson社）をＩＣＲマウスに腹膜腔注射により投与した。３日後、ＩＣＲマウスに腹膜腔のマクロファージをハンクス液（米国Amresco社）で洗い出し、培地（ダルベッコＭＥＭ培地（Dulbecco’s modified eagle’s medium）、１０％加熱不活性化したウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含む）で培養した。次に、実施例１のＷＰＡＦ抽出物（５０、１００、又は２００μｇ／ｍｌ）をマクロファージを含む培地に加え、培養を続けた。１６時間後、培養液を遠心分離機にかけ、上澄みを集め、マウス血清のＧ−ＣＳＦの濃度をＥＬＩＳＡで測定した。結果を表９に示す。
【００９７】
【表９】
0005395733.tif 000010
全ての値は平均±ＳＤ（ｎ＝３）。*P<0.05, **P<0.01（対照グループと比較）
【００９８】
表９から分かるように、本発明のＷＰＡＦ抽出物は、マウスの腹膜腔のマクロファージを明らかに活性化し、Ｇ−ＣＳＦを放出させる。
【００９９】
ＩＩ．白血球試験
シクロホスファミドは化学療法のための薬剤であり、免疫抑制効果があり、白血球の量を減らす。先ず、実施例１のＷＰＡＦ抽出物（１５又は４５ｍｇ／ｋｇ体重）をＩＣＲマウスに３日間連続して腹膜腔注射により投与した。３日目に、投与から３０分後、１００ｍｇ／ｋｇ体重のシクロホスファミドをマウスの腹膜腔に注射した。シクロホスファミドの投与後２日目に、マウスの血液を眼窩から採取し、その中の小核を測定した。マウス小核用のプロトタイプMicroFlow解析キット（FITC-anti CD71及びヨウ化プロピジウムを含む）を使用して測定した。フローサイトメトリー（Becton Dickinson FASCScan）を使用して６００〜９５０個の多染赤血球（網状赤血球）、小核数、及び多染赤血球と全赤血球との比とを計数した。上記実験の手順は、Hayashi et al., 1990, “The micronucleus assay with mouse peripheral blood reticulocytes using acridine orange-coated slides”, Mutat. Res. 245: 245-249に記載されている。この文献を本明細書に援用する。
【０１００】
実験中、実施例１のＷＰＡＦ抽出物をＩＣＲマウスに毎日投与し、シクロホスファミド投与後７日目にＩＣＲマウスを屠殺した。マウスの脾臓を取出し、その重量を測定し、白血球の変化を血球分析装置で分析し、血清中のＧ−ＣＳＦ濃度も分析した。結果を表１０及び表１１に示す。
【０１０１】
【表１０】
0005395733.tif 000011
全ての値は平均±ＳＤ（ｎ＝８）。  #P<0.05, ###P<0.01（対照グループと比較）。ＣＰ：シクロホスファミド、ＭＮ：小核、ＮＣＥ：正染色性赤血球、ＰＣＥ：多染赤血球
【０１０２】
表１０から分かるように、シクロホスファミド投与の４８時間後、シクロホスファミドはマウスの血液の多染赤血球数を減少させ、小核数を増加させる。実施例１のＷＰＡＦ抽出物はこの現象に影響を与えない。このことは本発明のＷＰＡＦ抽出物はシクロホスファミドの抗癌効果に影響を与えないことを示す。
【０１０３】
【表１１】
0005395733.tif 000012
全ての値は平均±ＳＤ（ｎ＝８）。##P<0.01（対照グループと比較）、*P<0.05, **P<0.01（ＣＰ＋Ｈ2Ｏグループと比較）。ＣＰ：シクロホスファミド
【０１０４】
表１１から分かるように、本発明のＷＰＡＦ抽出物は脾臓重量の減少とシクロホスファミドによるマウス白血球数の減少とを緩和する可能性がある。また、本発明のＷＰＡＦ抽出物は、シクロホスファミドを助け、マウス血液中のＧ−ＣＳＦ濃度を増加させる。
【０１０５】
上記の結果は、本発明のＷＰＡＦ抽出物は、シクロホスファミドの抗癌機構又は作用に影響を与えないが、シクロホスファミドによるマウス白血球数の減少という副作用をＧ−ＣＳＦの放出を促進することで緩和できることを示す。
【０１０６】
＜実施例６＞ＩＩ−ＡＧＡＦの抗炎症効果
Ｉ．免疫細胞活性化試験
幾つかの多糖は免疫細胞を活性化する作用を持つことが知られている。従って、マクロファージＲＡＷ２６４．７を使用してＩＩ−ＡＧＡＦの活性化効果とリポ多糖類（ＬＰＳ）の活性化効果とを比較した。
【０１０７】
様々な濃度（５０又は１００μｇ／ｍｌ）のＩＩ−ＡＧＡＦ又はＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）をマクロファージＲＡＷ２６４．７を含む培地（ダルベッコＭＥＭ培地、１０％加熱不活性化したウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含む）に加えた。２４時間培養後、培養液を遠心分離機にかけ、上澄みを集めた。上澄み液中の一酸化窒素の量をグリース試薬を用いて測定し、Ｇ−ＣＳＦ濃度をＥＬＩＳＡで測定した。結果を図９Ａ〜図９Ｃに示す。
【０１０８】
図９Ａ〜図９Ｃから分かるように、ＩＩ−ＡＧＡＦとＬＰＳの両方は、一酸化窒素とＧ−ＣＳＦを放出するようマクロファージを刺激することが出来る。ＬＰＳのＧ−ＣＳＦ／一酸化窒素放出比率は約０．８、ＩＩ−ＡＧＡＦは約１．６であり、これはＩＩ−ＡＧＡＦはＧ−ＣＳＦの放出を促進するより高い選択性を有していることを示す。
【０１０９】
ＩＩ．マウス炎症試験
様々な濃度（５又は１５ｍｇ／ｋｇ体重）のＩＩ−ＡＧＡＦをＩＣＲマウスに腹膜腔注射により投与した。１５分後、ＬＰＳ（８０ｍｇ／ｋｇ体重）をＩＣＲマウスに腹膜腔注射により投与した。１時間後と１６時間後、ＩＣＲマウスの血液を眼窩から採取し、ＴＮＦ−α濃度を酵素免疫測定剤（米国eBioscience社）を用いて測定した。結果を図１０Ａ及び図１０Ｂに示す。
【０１１０】
図１０Ａ及び図１０Ｂから分かるように、ＬＰＳの投与から１時間後と１６時間後に、ＩＩ−ＡＧＡＦはマウス血液中のＴＮＦ−α濃度を明らかに減少させた。これはＩＩ−ＡＧＡＦが抗炎症効果を有することを示す。
【０１１１】
＜実施例７＞ＷＰＡＦ抽出物はＴリンパ球を調節する
ＥＬ４細胞株（台湾国家衛生研究所から頂いたＡＴＣＣ（American Tissue Culture Collection）で培養されたＴ細胞株）をＤＭＥＭ培地（４ｍＭのＬ−グルタミンを含み、１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム及び４．５ｇ／Ｌグルコース（９０％）含むよう調整されたダルベッコＭＥＭ培地及び１０％ウシ胎児血清を含む）で培養し、実施例１のＷＰＡＦ抽出物（０．８、４．０、又は２０．０μｇ／ｍｌ）をこの培地に加えた。
【０１１２】
４８時間培養した後、細胞のタンパク質とＲＮＡを抽出した。タンパク質をウエスタンブロット法で転写し、Ｔ−ｂｅｔ抗体、ＧＡＴＡ−３抗体、及びグリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）抗体（Cell Signaling Technology社から購入）を検出のために使用した。結果を図１１に示す。ＲＮＡの逆転写をＭＭＬＶ逆転写酵素１ｓｔストランドｃＤＮＡ合成キット（米国Epicentre Biotechnologies社）を用いて実行し、ｄＵＴＰ及びＲＯＸ（台湾Protech社）と混合した特定のプライマーとＰＣＲ機（Smart-Quant Green Real-Time PCR Master）とをリアルタイム定量ＰＣＲ分析を行うために使用した。デジタル分析結果を表１２に示す。
【０１１３】
【表１２】
0005395733.tif 000013
全てのデータはＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量で補正され、対照グループと比較されている。全てのデータは平均±ＳＤ（ｎ＝３）。*P<0.05, **P<0.01（対照グループと比較）
【０１１４】
表１２と図１１に示すように、ＷＰＡＦ抽出物（４．０及び２０．０μｇ／ｍｌ）の刺激のもと、ＥＬ４細胞の転写因子Ｔ−ｂｅｔのタンパク質発現が明らかに増加し、Ｔ−ｂｅｔのｍＲＮＡの発現も増加した。また、ＩＦＮ−γのｍＲＮＡ発現も著しく増加した。これは本発明のＷＰＡＦ抽出物がＩＦＮ−γの発現を誘導し、Ｔｈ１細胞の分化を促進できることを示す。別の態様では、ＷＰＡＦ抽出物（４．０及び２０．０μｇ／ｍｌ）の刺激のもと、転写因子ＧＡＴＡ−３のタンパク質発現が明らかに減少し、そのｍＲＮＡ発現も減少し、ＩＬ−４及びＩＬ−１３のｍＲＮＡ発現も著しく減少した。これは本発明のＷＰＡＦ抽出物はＩＬ−４及びＩＬ−１３の発現を低減し、従って、Ｔｈ２細胞の分化を抑制する効果があることを示す。
【０１１５】
＜実施例８＞ＷＰＡＦ抽出物は喘息を緩和する
８週齢のＢＡＬＢ−ｃ雄マウス（台湾国家実験動物センターから購入）を下記の実験に使用した。マウスを４つのグループに分け、１つは対照グループ、他の３つは喘息実験グループとした。
【０１１６】
先ず、マウスに実施例１のＷＰＡＦ抽出物を１週間経口投与し、次にアトピー性喘息を起こさせるために、０．２ｍｌアルブミン（Sigma社）を実験グループのマウスに腹膜腔注射により投与した。以下、アルブミンによって引き起こされたアトピー性喘息のマウスを「ＯＶＡ」又は「ＯＶＡマウス」と呼ぶ。
【０１１７】
アルブミンの調製において生理食塩水を溶媒として使用した。この溶液は１０μｇグレードＶアルブミン（４０μｇ水酸化アルミニウムゲルを吸収（Sigma社））を含む。アルブミン注射後１１〜１５日目に、１日１回アルブミンをマウスの鼻腔に滴下した。１週間後、アルブミンを再びマウスの鼻腔に滴下し、滴下から１時間後、６時間後、及び２４時間後に、マウスの気道の抵抗力（enhanced pause（Penh））を呼吸装置（Buxco MAX II 1320 Modular Unit & Bias Flow Regulator）を用いて測定した。抵抗力の測定は呼気及び吸入のピーク流量と呼吸時間（breathing time）との比を計算することで行った。結果を表１３に示す。
【０１１８】
実験が４８時間経過した後、マウスをエーテルで麻酔して屠殺し、マウスが死ぬ前に脇の下から血液を採取した。マウスの肺を１ｍｌハンクス液（米国Amresco社）で３回洗浄し、肺胞すすぎ液を集めた。次に、マウスの肺を取出し、生理スライス分析のために１０体積％中性ホルマリンに浸漬した。生理スライス分析はＨＥ染色法で行い、スライスの細胞を観察した。結果を図１２に示す。
【０１１９】
細胞表面上の抗体をマーカーとして使用し、フローサイトメトリーを使用して肺胞すすぎ液中の細胞数を計数し、細胞を分類した。使用した薬剤はＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ４５、及びＣＤ６９（米国e-Bioscience社）であった。肺胞すすぎ液中のサイトカインＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−２、及びＩＦＮ−γの量を酵素免疫測定法で測定した。使用した検定薬剤は米国e-Bioscience社から購入した。マウスの血液中の抗体ＩｇＥ、ＩｇＧ１、及びＩｇＧ２ａの量も酵素免疫測定法で測定した。使用した検定薬剤は米国Bethyl Laboratories社から購入した。結果を表１４〜表１６に示す。
【０１２０】
【表１３】
0005395733.tif 000014
全てのデータは平均±ＳＤ（ｎ＝１０）。###P<0.001（対照グループと比較）、*P<0.05, ***P<0.001（ＯＶＡ＋Ｈ2Ｏグループと比較）
【０１２１】
表１３に示すように、気道の抵抗力の分析において、ＯＶＡ＋Ｈ2Ｏグループのマウスの気道抵抗力は、１時間後と６時間後に明らかに増加し、２４時間後に若干減少した。本発明のＷＰＡＦ抽出物はマウスの気道抵抗力を明らかに減少させた。
【０１２２】
【表１４】
0005395733.tif 000015
全てのデータは平均±ＳＤ（ｎ＝１０）。 ###P<0.001（対照グループと比較）、 
*P<0.05, **P<0.01（ＯＶＡ＋Ｈ2Ｏグループと比較）
【０１２３】
図１２及び表１４に示すように、本発明のＷＰＡＦ抽出物はＯＶＡマウスの気道の全肺侵入性細胞（即ち、肺胞すすぎ液中の細胞）の数を効率的に抑制できる。様々な種類の侵入性細胞に関して、本発明のＷＰＡＦ抽出物はマクロファージ及びエオシノフィルの数を減少させるが、ニューロフィルの数には影響しない。また、本発明のＷＰＡＦ抽出物はリンパ球の数を増加させる。リンパ球はＴリンパ球とＢリンパ球とを含み、Ｔリンパ球は免疫調節作用を有している。
【０１２４】
【表１５】
0005395733.tif 000016
全てのデータは平均±ＳＤ（ｎ＝１０）。###P<0.001, ##P<0.01, #P<0.05（対照グループと比較）、*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001（ＯＶＡ＋Ｈ2Ｏグループと比較）
【０１２５】
表１５に示すように、肺侵入性細胞のサイトカインの発現を観察した。表１５は、本発明のＷＰＡＦ抽出物は上記肺胞すすぎ液中のＩＬ−４及びＩＬ−５の量を減少させ、一方、ＩＦＮ−γの量を増加させ、ＩＬ−２の量を若干増加させたことを示す。
【０１２６】
ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２はＴｈ１細胞から分泌されるサイトカインであり、ＩＬ−４及びＩＬ−５はＴｈ２細胞から分泌されるサイトカインである。上記結果は、本発明のＷＰＡＦ抽出物が免疫調節作用を有し、Ｔｈ１細胞が媒介する免疫反応を促進し、一方、Ｔｈ２細胞が媒介する免疫反応を抑制し、これによってＴｈ１細胞とＴｈ２細胞との免疫バランスを調節する。
【０１２７】
【表１６】
0005395733.tif 000017
全てのデータは平均±ＳＤ（ｎ＝１０）。###P<0.001, ##P<0.01（対照グループと比較）、  *P<0.05（ＯＶＡ＋Ｈ2Ｏグループと比較）
【０１２８】
表１６に示すように、高い投与量（４５ｍｇ／ｋｇ体重）のＷＰＡＦ抽出物は、マウス血清中の、Ｔｈ２細胞によって調節される特定のアトピー抗体（抗ＯＶＡ・ＩｇＥ）とＩｇＧ１抗体との数を減少させる可能性がある。マウスにＷＰＡＦ抽出物を投与すると、その免疫システムは調節され、Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞の免疫バランスの変化（Ｔｈ１細胞経路へ傾斜した）が起こり、Ｔｈ１細胞によって調節されるＩｇＧ２ａ抗体の量を著しく増加させた。
【０１２９】
上記の結果は、本発明のＷＰＡＦ抽出物は免疫調節作用を有し、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞との免疫バランスを調節し、Ｔｈ１細胞が媒介する免疫反応を促進してＩｇＧ２ａ抗体の量を増加させ、一方、Ｔｈ２細胞の免疫反応を抑制してアトピー抗体ＩｇＥ及びＩｇＧ１の量を著しく減少させる可能性があることを示す。
【０１３０】
図１２及び表１３〜表１６は、本発明のＷＰＡＦ抽出物は免疫調節により喘息を緩和する可能性があることを示す。
【０１３１】
＜実施例９＞ＷＰＡＦ抽出物は結腸癌を抑制する
８週齢のＢＡＬＢ−ｃ雌マウス（台湾国家実験動物センターから購入）を下記の実験に使用した。マウスを４つのグループに分け、１つは対照グループ、他の３つは結腸癌実験グループとした。実験グループを水を投与するグループと、実施例１のＷＰＡＦ抽出物（１５又は４５ｍｇ／ｋｇ体重）を投与するグループに更に分けた。
【０１３２】
先ず、マウスにＷＰＡＦ抽出物を２週間経口投与し、次に１０ｍｇ／ｋｇ体重の発癌物質アゾキシメタン（ＡＯＭ、Sigma社）をマウスの腹膜腔に注入し、ＷＰＡＦ抽出物をマウスに連続して経口投与した。４ヶ月後、マウスを屠殺し、腸を取出し、腸内の物質をＤ−ＰＢＳ緩衝液（ダルベッコ・リン酸緩衝生理食塩水）で洗い出した。次に、腸を切開し、１０体積％中性ホルマリン溶液に浸漬し、平らに固定した。１週間浸漬後、大腸をメチレンブルーで染色し、単位長さ当りの前腫瘍組織（異常腺窩巣、ＡＣＦ）の数を計数した。結果を図１３及び表１７に示す。
【０１３３】
次に、腸間膜リンパ節をマウスの大腸から取出し、単一細胞懸濁液にして、リンパ球サブファミリーの分化抗原を分析した。腸間膜リンパ節組織内の免疫調節細胞のサブファミリーＴｒｅｇ細胞（Ｔ制御性細胞ＣＤ４＋、及びＣＤ２５＋）、Ｔｈ１細胞（ＣＤ４＋及びＴｉｍ−３＋）、及びＴｈ２細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ２７８＋）をＦＩＴＣ（イソチオシアン酸フルオレセイン）とＰＥ（フィコエリトリン）で染色したモノクローナル抗体と、フローサイトメトリーとで分析した。結果を表１８に示す。
【０１３４】
腸間膜リンパ球を１．０×１０6／ｍｌの密度で２４ウェル培養プレート内で培養した。細胞はコンカナバリンＡで刺激された。１〜３日後、培養液を遠心分離機にかけ、上澄みを集めた。サイトカインＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、及びＩＬ−５の分泌量を酵素免疫測定法で測定した。結果を表１９に示す。
【０１３５】
【表１７】
0005395733.tif 000018
全てのデータは平均±ＳＤ（ｎ＝１０）。 ###P<0.001（対照グループと比較）  *P<0.05（ＡＯＭ＋Ｈ2Ｏグループと比較）
【０１３６】
図１３及び表１７に示すように、直腸腫瘍がアゾキシメタンの誘導により生成された時、異常腺窩巣が明らかに形成され、マウスに高投与量（４５ｍｇ／ｋｇ体重）のＷＰＡＦ抽出物を経口投与するにしたがって、異常腺窩巣の数が効率的に減少した。
【０１３７】
【表１８】
0005395733.tif 000019
全てのデータは平均±ＳＤ（ｎ＝１０）。単位は％。 #P<0.05（対照グループと比較）、  *P<0.05, **P <0.01（ＯＶＡ＋Ｈ2Ｏグループと比較）
【０１３８】
表１８に示すように、マウスの大腸腫瘍がアゾキシメタンの誘導により生成された時、Ｔｒｅｇ細胞の数が明らかに増加し、マウスに低投与量（１５ｍｇ／ｋｇ体重）のＷＰＡＦ抽出物を経口投与するにしたがって、Ｔｒｅｇ細胞の比が減少した。これはＷＰＡＦ抽出物は腫瘍細胞を抑制する作用を有することを示す。
【０１３９】
別の態様では、Ｔｈ１細胞及びＴｈ２細胞のサブファミリーの組成分析において、直腸腫瘍がアゾキシメタンの誘導により生成されるのにしたがって、Ｔｈ１細胞（ＣＤ４＋及びＴｉｍ−３＋）の比率は明らかに減少し、本発明のＷＰＡＦ抽出物をマウスに投与した後、その比率は著しく増加したことが分かった。また、直腸腫瘍がアゾキシメタンの誘導により生成されるのにしたがって、Ｔｈ２細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ２７８＋）の比率は著しく増加した。上述したように、Ｔｈ２細胞の免疫反応の高まりは、アゾキシメタンにより誘導された腫瘍形成を促進することが知られている。本発明のＷＰＡＦ抽出物をマウスに投与した後、Ｔｈ２細胞の比率は著しく減少した。これは、本発明のＷＰＡＦ抽出物はＴｈ２細胞の免疫反応を低下させることで腫瘍形成を抑制する可能性があることを示す。
【０１４０】
【表１９】
0005395733.tif 000020
全てのデータは平均±ＳＤ（ｎ＝１０）。#P<0.05（対照グループと比較）、*P<0.05（ＯＶＡ＋Ｈ2Ｏグループと比較）
【０１４１】
表１９に示すように、本発明のＷＰＡＦ抽出物は、アゾキシメタンにより誘導された腫瘍のあるマウスのＩＦＮ−γ分泌を増加させ、ＩＬ−４及びＩＬ−５分泌を抑制する可能性がある。
【０１４２】
上記の実験は、本発明のＷＰＡＦ抽出物はＴｈ１細胞とＴｈ２細胞との免疫バランスを調節してＴｈ１細胞が媒介する免疫反応を促進し、一方、Ｔｈ２細胞の免疫反応を抑制して免疫調節により結腸癌を抑制できることを示す。
【０１４３】
＜実施例１０＞ＷＰＡＦ抽出物の活性成分の決定
Ｉ．ＩＩ−ＡＧＡＦのプレバイオティクス効果
実施例１の表１から分かるように、実施例１のＷＰＡＦ抽出物は３３．４重量％のＩＩ−ＡＧＡＦを含む。実施例１のＷＰＡＦ抽出物とＩＩ−ＡＧＡＦをそれぞれ、プレバイオティクス検定を実行するために使用した。ビフィズス菌ブレーベを有用な細菌として使用した。検定に使用したＩＩ−ＡＧＡＦの量は、ＷＰＡＦ抽出物のＩＩ−ＡＧＡＦ含有量に一致する（例えば、ＷＰＡＦ抽出物の投与量が０．６ｇである時、比較グループのＩＩ−ＡＧＡＦの投与量は約０．２ｇである）。結果を図１４に示す。図１４に示すように、本発明のＷＰＡＦ抽出物と対応する量のＩＩ−ＡＧＡＦとが提供するプレバイオティクス効果は等しい。
【０１４４】
ＩＩ．ＩＩ−ＡＧＡＦの免疫細胞活性化効果
上記のプレバイオティクス検定と同様に、実施例１のＷＰＡＦ抽出物と対応する量のＩＩ−ＡＧＡＦとをそれぞれ、マクロファージＲＡＷ２６４．７を含む培地に加えた。２４時間培養後、ｍＲＮＡを抽出し、一酸化窒素シンセターゼ、Ｇ−ＣＳＦ、及びＴＮＦ−αの発現を分析するためにＲＴ−ＰＣＲを行った。図１５に示すように、本発明のＷＰＡＦ抽出物と対応する量のＩＩ−ＡＧＡＦとが提供する免疫細胞を活性化する効果は等しい。
【０１４５】
上記の結果から、本発明のＷＰＡＦ抽出物の主活性成分はＩＩ−ＡＧＡＦであることが推測できる。澱粉等のＷＰＡＦ抽出物の他の成分は、特定の生理作用を提供しない。理論によって制約されることなく、澱粉が消化管に入った後、澱粉はアミラーゼによってグルコースに分解されると考えられており、従って、特定の生理作用を提供することはない。
【０１４６】
上記の開示は本発明の詳細な技術的内容と独創的特徴とに関する。当業者は、本発明の上記開示と示唆とに基づいて様々な変更と置換えとを本発明の特徴から逸脱することなく想到する可能性がある。しかし、そのような変更と置換えとは上記記載において完全には開示されていないが、添付の請求項に実質的に記載されている。
【図１】
0005395733.tif 000021
【図３Ａ】
0005395733.tif 000022
【図３Ｂ】
0005395733.tif 000023
【図４】
0005395733.tif 000024
【図５】
0005395733.tif 000025
【図７Ａ】
0005395733.tif 000026
【図７Ｂ】
0005395733.tif 000027
【図７Ｃ】
0005395733.tif 000028
【図７Ｄ】
0005395733.tif 000029
【図８Ｂ】
0005395733.tif 000030
【図９Ａ】
0005395733.tif 000031
【図９Ｂ】
0005395733.tif 000032
【図９Ｃ】
0005395733.tif 000033
【図１０Ａ】
0005395733.tif 000034
【図１０Ｂ】
0005395733.tif 000035
【図１４】
0005395733.tif 000036
【図２】
0005395733.tif 000037
【図６】
0005395733.tif 000038
【図８Ａ】
0005395733.tif 000039
【図１１】
0005395733.tif 000040
【図１２】
0005395733.tif 000041
【図１３】
0005395733.tif 000042
【図１５】
0005395733.tif 000043
【配列表】
0005395733000001.app