(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト対象から得られた試験試料を分類するコンピュータ実行型の方法であって、
（ａ）前記試験試料と関連するデータセットを取得する工程であって、前記取得データセットが、アポリポタンパク質Ｈ、ＣＤ４０、ハプトグロビン、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、および腫瘍壊死因子受容体ＩＩ（ＴＮＦ−ＲＩＩ）から選択される少なくとも３つのタンパク質マーカーについての定量的データを含み、かつ
所望により、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、α−１アンチトリプシン、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フィブリノゲン、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、組織因子、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ（ＴＮＦＲＩＩ）、および可溶性血管細胞接着分子１（ｓＶＣＡＭ−１）からなる群から選択される多分析物パネルから選択される少なくとも３つのタンパク質マーカーについての定量的データを含む、工程と、
（ｂ）１つまたは複数の参照データセットに対して前記取得データセットを比較するコンピュータ上の分析プロセスに前記取得データセットを入力する工程と、
（ｃ）前記分析プロセスの出力に従って前記試験試料を分類する工程であって、前記分類が、急速慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）分類、緩徐低下ＣＯＰＤ分類および健康分類からなる群から選択される、工程と、を含む方法。
【請求項２】
前記試験試料を分類した後に、治験で薬物の効力を評価するか、前記対象におけるＣＯＰＤを診断するか、前記対象におけるＣＯＰＤの進行度を評価するか、もしくは前記対象のためのＣＯＰＤ治療計画を開発するために、前記分類情報を変換する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試験試料が、血液、血漿、および血清からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記分析プロセスが、前記１つまたは複数の参照データセットを含む予測モデルの使用を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）において、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、α−１アンチトリプシン、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フィブリノゲン、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、組織因子、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ（ＴＮＦＲＩＩ）、および可溶性血管細胞接着分子１（ｓＶＣＡＭ−１）から選択される少なくとも３つのタンパク質マーカーについての定量的データを取得する工程さらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記１つまたは複数の参照データセットが、健常対象、急速低下ＣＯＰＤと診断された対象、および緩徐低下ＣＯＰＤと診断された対象からなる群から選択される１人または複数人のヒト対象から得られた定量的データを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記取得データセットが、アポリポタンパク質Ｈ、ＭＣＰ−１、およびＴＮＦ−ＲＩＩからの定量的データを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記取得データセットが、アポリポタンパク質Ｈ、ＣＤ４０、ハプトグロビン、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、およびＴＮＦ−ＲＩＩからの定量的データを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記取得データセットが、ＩｇＡ、ＭＩＰ−１α、および組織因子からの定量的データを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記取得データセットが、ＭＤＣ、組織因子、およびｓＶＣＡＭ−１からの定量的データを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記取得データセットが、α−１アンチトリプシン、ＣＲＰ、フィブリノゲン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＭＤＣ、組織因子、ＴＮＦ−ＲＩＩ、およびｓＶＣＡＭ−１からの定量的データを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記分析プロセスが、線形判別分析（ＬＤＡ）モデル、サポートベクターマシン分類アルゴリズム、再帰的特徴削除モデル、マイクロアレイの予測分析モデル、ロジスティック回帰モデル、ＣＡＲＴアルゴリズム、ＦｌｅｘＴｒｅｅアルゴリズム、ＬＡＲＴアルゴリズム、ランダムフォレストアルゴリズム、ＭＡＲＴアルゴリズム、または機械学習アルゴリズムのいずれかの使用を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
前記分析プロセスが、７５％を超える品質メトリックを提供するように選択された項を含むＬＤＡモデルの使用を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記品質メトリックが精度である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＬＤＡモデルを、少なくとも７０％の感度または特異度のうちの少なくとも１つを提供するように調整する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記予測モデルが、分類のための少なくとも７５％の品質メトリックを有する、請求項４に記載の方法。
【請求項１７】
前記予測モデルが、分類のための少なくとも９０％の品質メトリックを有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記品質メトリックが精度である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記予測モデルの限度を、少なくとも７０％の感度または特異度のうちの少なくとも１つを提供するように調整する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ヒト対象から得られた試験試料を分類するためのキットであって、
（ａ）アポリポタンパク質Ｈ、ＣＤ４０、ハプトグロビン、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、および腫瘍壊死因子受容体ＩＩ（ＴＮＦ−ＲＩＩ）からなる群から選択される多分析物パネルから選択される少なくとも３つのタンパク質マーカーを検出するための試薬と、
所望により（ｂ）アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、α−１アンチトリプシン、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フィブリノゲン、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、組織因子、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ（ＴＮＦＲＩＩ）、および可溶性血管細胞接着分子１（ｓＶＣＡＭ−Ｉ）からなる群から選択される多分析物パネルから選択される少なくとも３つのタンパク質マーカーを検出するための試薬と、を含み、
前記分類が、急速慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）分類、緩徐低下ＣＯＰＤ分類および健康分類からなる群から選択される、キット。
【請求項２１】
前記試薬が抗体である、請求項２０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００８年３月１０日に出願された米国特許仮出願第６１／０６８，７７２号の恩典を主張し、これは参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、一般に、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の迅速な検出および正確な診断のための方法に関する。より具体的には、本発明は、ＣＯＰＤであることを示すバイオマーカーシグネチャーと、これらのバイオマーカーシグネチャー内の１つまたは複数のタンパク質の示差発現を検出して試験試料を分類することとに関する。
【背景技術】
【０００３】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、タバコの煙のような粒子の吸入に対する異常な炎症反応によって引き起こされる進行性の気流制限によって特徴付けられる（概説として、Ｆａｂｂｒｉら，２００６，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１７３：１０５６−１０６５を参照されたい）。ＣＯＰＤは米国における主な死因である（Ｈｅｆｆｎｅｒ，２００２，Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃａｒｅ  ４７：５８６−６０７）。医師は、患者の症状を観察し、喫煙や職業などのライフスタイルの選択を評価し、健康診断を行ない、肺活量測定試験を行なって患者の気流を測定することによってＣＯＰＤを診断する。ＣＯＰＤの最も信頼できる診断パラメータは肺活量測定によって測定されるＦＥＶ１（１秒間努力呼気容量）の低下である（Ｒｅｎｎａｒｄ，１９９８，Ｃｈｅｓｔ  １１３：２３５Ｓ−２４１Ｓ）。健常な非喫煙者および喫煙者では、緩徐ではあるが進行性のＦＥＶ１低下が観察される（≦２０ｍｌ／年）。喫煙者の約１５％では、肺機能が正常よりも急速に低下し、加速的な身体能力制限（低運動耐容能）と呼吸困難とをもたらす（Ｒｅｎｎａｒｄ，１９９８，前掲）。ＣＯＰＤ患者間での低下速度は非常に大いに変動し得る。
【０００４】
米国特許出願公開第２００６／０２１１０２６号（Ｐ．Ｂｅｌｌｏｎｉらの名で２００６年９月に公開）には、生体試料中のバイオマーカーの相対的なレベルが予想されるレベルよりも高いのかまたは低いのかを決定することによって肺気腫およびＣＯＰＤを診断し、治療薬の候補の有効性を評価するための方法であって、このバイオマーカーが、特異的ＳｐＢ、デスモシン、ＶＥＧＦ、ＩＧＦＢＰ２、ＭＭＰ１２、ＴＩＭＰ１、ＭＭＰ９、Ｃｒａｂｐ２、Ｒｂｐ１、Ｃｙｐ２６ａ１、Ｔｇｍ２、Ｔｉｍｐ３、Ａｄａｍ１７、セルピンａ１、Ｓｌｐｉ、Ｃｏｌ１ａｌ１、Ｅｌｎ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ−ＲＩＩ、Ｓｆｔｐａ１、Ｓｆｔｐｂ、Ｃｓｆ２、Ｃｘｃｌ１、Ｃｘｃｌ２、Ｃｘｃｌ５、ＩＬ−８Ｒβ、ＩＬ−８Ｒα、ＩＬ−６、ＴＮＦ、ＥＧＦ−Ｒ、Ａｒｅｇ、ＰＤＧＦα、ＨｐＧＦ、ＦＧＦ７、Ｋｄｒ、ｆｌｔ１、Ａｎｇｐｔ１、Ｔｅｋ、ＨＩＦ１α、Ｈｙｏｕ１、ＰＧＦ、およびトロポエラスチンからなる群から選択される、方法が開示されている。
【０００５】
ＰＣＴ出願公開ＷＯ２００４／０７００５８号（Ｂａｙｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＡＧの名で２００４年８月１９日に公開）には、ＣＯＰＤ患者における、ヒト膜貫通、４−ドメイン、サブファミリーＳ、メンバー８Ｂ（「ＭＳ４Ａ８Ｂ」）の過剰発現およびＣＯＰＤの診断／予後マーカーとしてのその使用が開示されている。
【０００６】
ＰＣＴ出願公開ＷＯ２００６／１１８５２２号（Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ  ＡＢの名で２００６年１１月９日に公開）には、亜鉛−α２−糖タンパク質、α１−アンチトリプシン、コラーゲンタイプＩＩＩ、プロスタグランジン−Ｈ２  Ｄイソメラーゼ、コラーゲンタイプＩ、α１−ミクログロブリン、ＦＧＦ、オステオポンチン、α１−酸性糖タンパク質２およびフィブリノゲンα−Ｅ鎖に由来するペプチドのＣＯＰＤバイオマーカーとしての同定および使用が開示されている。
【０００７】
ＰＣＴ出願公開ＷＯ２００７／０８４４８５号（Ｂａｔｅｌｌｅ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの名で２００７年７月２６日に公開）では、ＣＯＰＤ関連疾患を評価するために、喫煙者で示差発現した種々の遺伝子マーカーと、該マーカーの使用とが同定されている。
【０００８】
ＰＣＴ出願公開ＷＯ２００８／００３０６６号（Ｒｅｓｐｉｒｉｓ，Ｉｎｃ．の名で２００８年１月３日に公開）には、情報コンテンツのリポジトリからＣＯＰＤマーカーを同定する方法と、疾患の進行を急速低下状態と緩徐低下状態の間で評価することを含むＣＯＰＤの診断に該マーカーを使用することとが開示されている。
【発明の概要】
【０００９】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の迅速な検出および／または正確な診断のための方法を提供する。本方法は、試験試料（例えば、血液または血液派生物、例えば、血漿もしくは血清）中の、開示された３つの多分析物パネルのうちの１つに含まれるタンパク質バイオマーカーの少なくともサブセットを定量化することによって実施することができる。対照対象に見出されるレベルと統計的に異なる選択されたバイオマーカーの変化レベルは、ＣＯＰＤの陽性診断を裏付ける。したがって、ＣＯＰＤと診断された患者の血漿試料中に見出される、本明細書で「バイオマーカーシグネチャー」と記載されるタンパク質バイオマーカーの多分析物パネルは、ＣＯＰＤの陽性診断または陰性診断の裏付け、ならびに陽性ＣＯＰＤ診断の重症度（例えば、急速低下ＣＯＰＤおよび緩徐低下ＣＯＰＤ）の分類に役立つ。特定の実施形態では、正確な診断および／または分類を行なうに当たって９０％を超える精度を本開示の方法により提供する。
【００１０】
ＣＯＰＤ患者で示差発現する循環タンパク質が本明細書で同定され、記載されている。循環血漿マーカーとしては、アポリポタンパク質Ｈ、ＣＤ４０、ハプトグロビン、インターロイキン−８（「ＩＬ−８」）、単球走化性タンパク質−１（「ＭＣＰ−１」）、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ（「ＴＮＦ−ＲＩＩ」）、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、免疫グロブリンＡ（「ＩｇＡ」）、マクロファージ炎症性タンパク質１−α（「ＭＩＰ−１α」）、組織因子、腫瘍壊死因子−α（「ＴＮＦ−α」）、α−１アンチトリプシン、Ｃ−反応性タンパク質（「ＣＲＰ」）、フィブリノゲン、インターロイキン−４（「ＩＬ−４」）、マクロファージ由来ケモカイン（「ＭＤＣ」）、および可溶性血管細胞接着分子１（「ｓＶＣＡＭ−１」）が挙げられる。上記の血漿マーカーのサブセットを含む３つのバイオマーカーシグネチャーであって、（ａ）急速低下ＣＯＰＤ患者と対照（シグネチャー１）、（ｂ）緩徐低下ＣＯＰＤ患者と対照（シグネチャー２）、および（ｃ）急速低下ＣＯＰＤ患者と緩徐低下ＣＯＰＤ患者（シグネチャー３）の区別を可能にするバイオマーカーシグネチャーを開示する。
【００１１】
したがって、本発明は、試験試料中のＣＯＰＤであることを示す示差タンパク質発現を検出する方法を提供し、その場合、該試験試料は、血液または血液派生物（例えば、血漿）を含むが、これらに限定されない。本明細書で同定されたタンパク質の循環レベルを検出することにより、患者を「ＣＯＰＤを有する」と分類すること（診断）、およびＣＯＰＤと診断された患者を疾患の重症度に従って分類すること（疾患の監視）ができる。このような分類を治療に対する応答の予測で用いて、ＣＯＰＤ治療のための奏効する治療法の開発を助け、治験での（すなわち、患者の治療計画後の）薬効の事前評価を助けることができる。例えば、ある単一の時点または時間経過において、開示されたバイオマーカーの発現測定は、患者が治療を受けた後に行なうことができ、この治療には、例えば、薬物療法、併用薬物療法、および非薬理学的な介入が含まれ得る。本明細書に開示されるバイオマーカーシグネチャー、またはそのバイオマーカーサブセットを評価することにより、個々のマーカーでは見出せないある程度の識別が提供される。一実施形態では、発現プロファイルは、タンパク質の濃度または量を測定することによって決定される。
【００１２】
一実施形態では、本発明は、哺乳類対象から得られた試験試料を分類するコンピュータ実行型の方法であって、（ａ）該試験試料と関連するデータセットを取得する工程であって、該取得データセット（すなわち、試験データセット）が、（ｉ）アポリポタンパク質Ｈ、ＣＤ４０、ハプトグロビン、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、および腫瘍壊死因子受容体ＩＩ（ＴＮＦ−ＲＩＩ）と、（ｉｉ）アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、ＣＤ４０、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ハプトグロビン、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）、組織因子、および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）と、（ｉｉｉ）α−１アンチトリプシン、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フィブリノゲン、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、組織因子、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ（ＴＮＦＲＩＩ）、および可溶性血管細胞接着分子１（ｓＶＣＡＭ−１）と、からなる群から選択される多分析物パネルから選択される少なくとも３つのタンパク質マーカーについての定量的データを含む、工程と、（ｂ）該取得データセットを１つまたは複数の参照データセットと比較するコンピュータ上の分析プロセスに該取得データセットを入力する工程と、（ｃ）該分析プロセスの出力に従って該試験試料を分類する工程であって、該分類が慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）分類および健康分類からなる群から選択される、工程と、を含む方法を提供する。好ましい哺乳類対象はヒト対象である。
【００１３】
さらなる実施形態では、本発明は、ヒト対象から得られた試験試料を分類する方法であって、（ａ）該試験試料と関連するデータセットを取得する工程であって、該取得データセットが、（ｉ）アポリポタンパク質Ｈ、ＣＤ４０、ハプトグロビン、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、および腫瘍壊死因子受容体ＩＩ（ＴＮＦ−ＲＩＩ）と、（ｉｉ）アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、ＣＤ４０、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ハプトグロビン、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）、組織因子、および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）と、（ｉｉｉ）α−１アンチトリプシン、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フィブリノゲン、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、組織因子、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ（ＴＮＦＲＩＩ）、および可溶性血管細胞接着分子１（ｓＶＣＡＭ−１）と、からなる群から選択される多分析物パネルから選択される少なくとも３つのタンパク質マーカーについての定量的データを含む、工程と、（ｂ）該取得データセットを１つまたは複数の参照データセットと比較する分析プロセスを用いて該試験試料を分類するために該取得データセットを変換する工程と、（ｃ）該分析プロセスの出力に従って該試験試料を分類する工程であって、該分類が慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）分類および健康分類からなる群から選択される、工程と、を含む方法に関する。
【００１４】
本明細書に開示される分析方法は、限定するものではないが、１つまたは複数の参照データセットを利用して、予測モデルを作成する工程を含む。試料を分類するために試験試料データを予測モデルと比較するが、その場合、分類はＣＯＰＤ分類および健康分類からなる群から選択される。ＣＯＰＤ分類は、急速低下ＣＯＰＤ分類または緩徐低下ＣＯＰＤ分類であり得る。
【００１５】
本発明の予測モデルは、参照集団から得られた本明細書に記載の１つまたは複数のマーカーセットの定量的データを利用する。一実施形態では、定量的データは、開示されたバイオマーカーシグネチャー、またはそのタンパク質バイオマーカーサブセット内のタンパク質バイオマーカーの（例えば、好適な検出方法で測定される）血液または血液派生物（例えば、血漿）中のタンパク質濃度または相対量を表す。予測モデルは分類の際にある程度の精度を提供することができるが、その場合、このモデルは、所望の品質閾値を満たす。対象となる品質閾値は、所与の閾値の精度を提供することができ、本明細書で品質メトリックと呼ぶことがある。予測モデルは、例えば、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、またはそれを上回る品質メトリック、例えば、分類精度、を提供し得る。そのようなモデルにおいて、感度と選択性の所望のバランスを提供するようにパラメータを適切に選択し得る。
【００１６】
本発明の一実施形態では、そのような予測モデルは、哺乳類対象から得られた試験試料を、健常人またはＣＯＰＤの人、特に、急速低下ＣＯＰＤの人に由来するものであると分類するための方法で使用することができる。該方法の第１の工程は、血液または血液派生物（例えば、血漿）試料と関連するデータセットを得ることであり、その場合、このデータセットは、アポリポタンパク質Ｈ、ＣＤ４０、ハプトグロビン、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）および腫瘍壊死因子受容体ＩＩ（ＴＮＦ−ＲＩＩ）からなる群から選択される少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、または６つ全てのタンパク質マーカーについての定量的データを含む。次いで、試験試料データセットを、予測モデルの作成に使用される１つまたは複数の参照試料から得られる同一のタンパク質マーカー群からの定量的データを含む参照データセットと比較する。一実施形態では、試験データセットと予測モデルの作成に使用される参照データセット（単数または複数）はともに、アポリポタンパク質Ｈ、ＭＣＰ−１、およびＴＮＦ−ＲＩＩという、少なくとも３つの血漿マーカーについての定量的データを含む。別の実施形態では、定量的データは、タンパク質濃度の測定値である。
【００１７】
別の実施形態では、予測モデルは、血液または血液派生物（例えば、血漿）試料と関連するデータセットを得ることにより、哺乳類対象から得られた試験試料を分類する際に使用されるが、その場合、このデータセットは、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、ＣＤ４０、ハプトグロビン、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）、組織因子、および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）からなる群から選択される少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、または少なくとも６つ、または少なくとも７つ、または８つ全てのタンパク質マーカーについての定量的データを含む。上記の実施形態に記載されているように、試験試料データセットを、予測モデルの作成に使用される１つまたは複数の参照試料から得られる同一のデータセット（すなわち、同一のタンパク質バイオマーカー群に由来する定量的データから構成された参照データセット）と比較する。この方法により、試料が、健常人またはＣＯＰＤの人、特に、緩徐低下ＣＯＰＤの人に由来するものであると分類される。さらなる実施形態では、試験データセットと予測モデルの作成に使用される参照データセット（単数または複数）はともに、ＩｇＡ、ＭＩＰ−１α、および組織因子という、少なくとも３つの血漿マーカーについての定量的データを含む。別の実施形態では、定量的データは、タンパク質濃度の測定値である。
【００１８】
さらなる実施形態では、予測モデルは、哺乳類対象から得られた試験試料を、特定の重症度のＣＯＰＤ、特に、急速低下ＣＯＰＤまたは緩徐低下ＣＯＰＤの人に由来するものであると分類する際に使用される。該方法の第１の工程は、血液または血液派生物（例えば、血漿）試料と関連するデータセットを得ることであり、その場合、このデータセットは、α−１アンチトリプシン、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フィブリノゲン、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、組織因子、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ（ＴＮＦ−ＲＩＩ）、および可溶性血管細胞接着分子１（ｓＶＣＡＭ−１）からなる群から選択される少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、または少なくとも６つ、または少なくとも７つ、または少なくとも８つ、または９つ全てのタンパク質マーカーについての定量的データを含む。試験試料データセットは、予測モデルの作成に使用される１つまたは複数の参照試料から得られる同一のデータセット（すなわち、同一のタンパク質バイオマーカー群に由来する定量的データから構成された参照データセット）と比較される。さらなる実施形態では、データセットは、ＭＤＣ、組織因子、およびｓＶＣＡＭ−１という、少なくとも３つの血漿マーカーについての定量的データを含む。別の実施形態では、定量的データは、タンパク質濃度の測定値である。
【００１９】
本明細書で使用するとき、急速低下ＣＯＰＤの人は、肺活量測定で測定したとき、平均で年間４０ｍｌ以上のＦＥＶ１（１秒間努力呼気容量）を失う。緩徐低下ＣＯＰＤの人は、平均で年間４０ｍｌ未満のＦＥＶ１を失う。
【００２０】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」のようなオープンエンド形式（ｏｐｅｎ−ｅｎｄｅｄ）の用語への言及により、追加の要素または工程が認められる。追加の要素または工程の可能性を強調するために、「１つまたは複数」のような語句が、オープンエンド型の用語とともにまたはオープンエンド型の用語なしで使用されることもある。
【００２１】
明示しない限り、「１つ（ａ）」または「１つ（ａｎ）」のような用語への言及は、１つ（ｏｎｅ）に限定されない。例えば、「１つの細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」は、「複数の細胞（ｃｅｌｌｓ）」を除外しない。複数存在する可能性を強調するために、１つまたは複数のような語句が使用されることもある。
【００２２】
本発明の他の特徴および利点は、様々な実施例を含む、本明細書に提供されるさらなる説明から明白である。提供される実施例には、本発明を実施するのに有用な様々な要素および方法が説明されている。本実施例は、請求された発明を限定するものではない。本開示に基づいて、当業者は、本発明を実施するのに有用な他の要素および方法を同定および利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】単変量分析で測定したときに、ＣＯＰＤ急速低下群（「＋」）およびＣＯＰＤ緩徐低下群（「◇」）および／または健常対象（「●」）の間で有意に異なるレベルで存在する４例の血漿マーカー（Ａ）エオタキシン、（Ｂ）ＩＬ−４、（Ｃ）ＭＣＰ−１、および（Ｄ）ｓＶＣＡＭ−１を示す。
【図２】（Ａ）ＣＯＰＤ急速低下群と健常対照、（Ｂ）ＣＯＰＤ緩徐低下群と健常対照、および（Ｃ）ＣＯＰＤ急速低下群とＣＯＰＤ緩徐低下群という、異なるシグネチャーを用いた線形判別分析（ＬＤＡ）からのグラフ出力を示す（「●」、対照（ＣＴＬ）；「＋」、ＣＯＰＤまたはＣＯＰＤ急速型；「◇」、ＣＯＰＤ緩徐型）。ＬＤＡ分析では、データセットの各点から各群の多変量平均値までの距離を測定し、その点を最も近い群へと分類する。使用した距離量は、変数間の分散と共分散を考慮に入れるマハラノビス距離である。各多変量平均値は表示付きの丸である。丸の大きさは、平均値の９５％信頼限界に相当する。有意に異なる群は、交差しない丸を有する傾向にある。これらのグラフは、ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｒｙ，ＮＣ）のＪＭＰソフトウェアｖ５．０．１を用いて作成された。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
ＣＯＰＤ患者を陽性同定するおよび／またはＣＯＰＤの結果として急速な肺の低下もしくは緩徐な肺の低下を経験する可能性のある罹患患者を区別するための分子的因子と最も信頼のおける試験の両方の開示を本明細書で提供する。ＣＯＰＤは、肺機能の顕著な制限が疾患の後期にしか現れない、何十年もかけてゆっくりと進行する疾患であるので、１）ＣＯＰＤの診断を助けること、２）肺機能低下速度を予測すること、および３）治験で時宜に適った形で薬効を監視することが可能なバイオマーカーを早期に検出することは非常に有用である。
【００２５】
Ｉ．血漿バイオマーカー
そのレベルが健常対照と比較してＣＯＰＤ患者において統計的に異なる血漿タンパク質の同定を開示する（実施例３参照）。本明細書に記載の単変量分析によって評価され、分析された８９個の血漿マーカーのうち、２５個がＣＯＰＤ急速低下群と健常対照群の間で統計的に異なり（ｐ＜０．０５；以下の表３参照）、４個のマーカーがＣＯＰＤ緩徐低下群と健常対照群の間で統計的に異なり（ｐ＜０．０５；以下の表４参照）、１０個のマーカーがＣＯＰＤ急速低下群とＣＯＰＤ緩徐低下群の間で統計的に異なる（ｐ＜０．０５；以下の表５参照）。これらの血漿マーカーはどれも、それらだけではＣＯＰＤ患者と対照を明確に区別することはできないので、線形判別分析（ＬＤＡ）法を用いるデータの多変量分析を行なった。この方法により、ＣＯＰＤ急速低下群と健常対照（シグネチャー１）、ＣＯＰＤ緩徐低下群と健常対照（シグネチャー２）、およびＣＯＰＤ急速低下群とＣＯＰＤ緩徐低下群（シグネチャー３）を正確に区別することができる３つの血漿バイオマーカー群が同定された。
【００２６】
血液は、気管支肺胞洗浄液または誘発喀痰に含まれる肺分泌物よりも簡単に入手できかつ信頼できるので、血漿中で検出できるＣＯＰＤバイオマーカーが好ましい。興味深いことに、局所性炎症と全身性炎症の両方がＣＯＰＤで起こるという証拠が増えている（Ｗｏｕｔｅｒｓ，２００５，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｏｃ．２：２６−３３に概説されている）。しかしながら、ＣＯＰＤが、煙で刺激された肺に現れる一般的な炎症調節の欠陥に起因するのか、または肺で特異的に起こって全身に広がる制御不能の炎症プロセスが起因するのかは依然として明らかではない。いずれにせよ、末梢血は、ＣＯＰＤの進行に関する好都合でかつ豊富な情報源である。
【００２７】
シグネチャー１は、以下の６つのタンパク質マーカー、すなわち、アポリポタンパク質Ｈ、ＣＤ４０、ハプトグロビン、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、および腫瘍壊死因子受容体ＩＩ（ＴＮＦ−ＲＩＩ）から構成される多分析物パネルである。シグネチャー１は、ＣＯＰＤ急速低下群由来の血漿試料を９３％の症例（感度）で、および健常者由来の血漿試料を８６％の症例（特異度）で正確に同定し、この２つの群を９０％の全体精度で区別することができる（以下の実施例３の表６参照）。
【００２８】
シグネチャー２は、以下の８つのタンパク質マーカー、すなわち、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、ＣＤ４０、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ハプトグロビン、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）、組織因子、および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）から構成される多分析物パネルである（以下の実施例３の表６参照）。シグネチャー２は、（健常対象ではなく）ＣＯＰＤ緩徐低下群からの血漿試料を、感度９１％、特異度９６％、全体精度９４％で正確に同定することができる。
【００２９】
シグネチャー３は、以下の９つのタンパク質マーカー、すなわち、α−１アンチトリプシン、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フィブリノゲン、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、組織因子、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ（ＴＮＦ−ＲＩＩ）、および血管細胞接着分子１（ｓＶＣＡＭ−１）から構成される多分析物パネルである。シグネチャー３は、血漿試料がＣＯＰＤ急速低下群に由来するものであることを９５％の症例（感度）で、および血漿試料がＣＯＰＤ緩徐低下群に由来するものであることを８６％の症例（特異度）で正確に同定し、この２つの群を９２％の全体精度で区別することができる（以下の実施例３の表６参照）。
【００３０】
表１に、本明細書に開示されるシグネチャー１〜３に同定されるタンパク質についてのさらなる情報を提供する。記載された受託番号は、米国国立衛生研究所によって維持されている全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）データベース内に登録されているものに対応する。
【００３１】
【表１】
0005574990.tif 000002
【００３２】
タンパク質は、複数の異なる形態で試料中に存在することが多い。これらの形態は、翻訳前修飾および翻訳後修飾のいずれかまたは両方から生じ得る。翻訳前の修飾形態としては、対立遺伝子変異体、スプライス変異体、およびＲＮＡ編集形態が挙げられる。翻訳後の修飾形態としては、タンパク質分解による切断（例えば、親タンパク質のシグナル配列または断片の切断）、グリコシル化、リン酸化、脂質化、酸化、メチル化、システイン化、スルホン化、およびアセチル化から生じる形態が挙げられる。
【００３３】
したがって、本出願において名前または受託番号によって同定される特異的なバイオマーカー配列に加えて、本発明は、表１に記載の例示されたバイオマーカー配列（ヌクレオチド配列またはタンパク質配列のいずれか）と少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一な天然に存在する変異体を試験試料中で検出することも企図する。該バイオマーカー変異体は、本発明の方法に対する有用性を有するものとし、かつ表１の列１に記載の新規バイオマーカーの検出に使用される、本明細書に開示される方法（例えば、表１に記載のタンパク質バイオマーカーに特異的な抗体との交差反応性）によって検出されるものとする。これらの変異体としては、多型、スプライス変異体、および突然変異が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列との関連で、「同一性」パーセントという用語は、配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮもしくは当業者に利用可能な他のアルゴリズム）を用いてまたは目視検査によって測定される、最大一致を求めて比較し、整列させたときに、規定のパーセンテージの同一ヌクレオチドまたは同一アミノ酸残基を有する２つ以上の配列またはサブ配列を指す。適用次第で、同一性パーセントは、比較されている配列のある領域に対して（例えば、機能ドメインに対して）存在することもあるし、あるいは、比較される２つの配列の全長にわたって存在することもある。配列比較のために、典型的には、１つの配列が参照配列の役目を果たし、試験配列がそれに対して比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列と参照配列をコンピュータに入力し、必要な場合、サブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、参照配列に対する試験配列（単数または複数）の配列同一性パーセントを計算する。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、スミスとウォーターマンの局所相同性アルゴリズム（１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２）によって、ニードルマンとワンチの相同性アライメントアルゴリズム（１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３）によって、ピアソンとリップマンの類似性検索の方法（１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４）によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩの中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視検査によって実行することができる（一般的には、Ａｕｓｕｂｅｌ，ＦＭら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｏｏｋｌｙｎ，Ｎ．Ｙ．，Ａ．１Ｅ．１−Ａ．１Ｆ．１１，１９９６−２００４を参照されたい）。配列同一性および配列相同性のパーセントを決定するのに好適なアルゴリズムの１つの例はＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から公に利用可能である。
【００３５】
ＩＩ．バイオマーカー検出
タンパク質バイオマーカーは、分子量および／またはその既知のタンパク質アイデンティティにより特徴付けられる。タンパク質バイオマーカーは、種々の分画技術、例えば、質量分析を伴うクロマトグラフ分離、固定化した抗体を用いるタンパク質捕捉、および従来のイムノアッセイを用いて、試料中の他のタンパク質から分別することができる。この目的を達成するために利用し得る検出パラダイムとしては、光学的方法、電気化学的方法（ボルタメトリー技術およびアンペロメトリー技術）、原子間力顕微鏡法、および高周波法、例えば、多極共鳴分光法が挙げられる。共焦点と非共焦点の両方の顕微鏡法に加えて、蛍光、発光、化学発光、吸光度、反射率、透過率、ならびに複屈折または屈折率の検出が、光学的方法の実例となる（例えば、表面プラズモン共鳴、偏光解析法、共振ミラー法、グレーティングカプラー導波管法、および干渉法）。
【００３６】
試料（例えば、本明細書に記載の試験試料）中のタンパク質を検出または測定する場合、異なるタンパク質と同じタンパク質の異なる形態の両方を区別する能力は、タンパク質間の違いの性質と使用される検出方法によって決まる。例えば、モノクローナル抗体を用いるイムノアッセイは、エピトープを含むあらゆるタンパク質形態を検出し、それらを区別しない。しかしながら、タンパク質上の異なるエピトープに対する２つの抗体を使用するサンドイッチイムノアッセイは、両方のエピトープを含むあらゆるタンパク質形態を検出し、これらのエピトープのうちの１つしか含まない形態を検出しない。タンパク質の特定の形態（または特定の形態のサブセット）が、特定の方法によって一緒に検出される異なる形態の群よりも良好なバイオマーカーである場合、アッセイの能力が劣っていてもよい。したがって、タンパク質の形態を区別し、かつ１つまたは複数の所望のタンパク質形態を特異的に検出および測定するアッセイ法を利用することが有用であり得る。タンパク質分析物の異なる形態を区別すること、またはタンパク質分析物の特定の形態を特異的に検出することを、分析物の「分別」と言う。
【００３７】
本発明の一実施形態では、血液試料、または血液由来の試料（例えば、血漿、血清）を、本明細書に記載の多分析物バイオマーカーシグネチャーのメンバーとして開示される１つまたは複数のタンパク質マーカーの存在についてアッセイする。典型的には、血液試料を採取し、血漿または血清などの派生産物を試験する。このようなタンパク質バイオマーカーは、特異的結合メンバーを使用することによって検出し得る。例えば、この目的のために抗体を使用することは、特に興味深い。以下のものを含む様々なフォーマットが、このようなアッセイに使用される：抗体アレイ；酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）フォーマット；懸濁液／溶液中での標識抗体の結合ならびにフローサイトメトリーおよび質量分析を含むが、これらに限定されない方法による検出を含む。検出には、１種の抗体または抗体パネル、好ましくは、アレイフォーマットの抗体パネルを利用してもよい。
【００３８】
本発明のバイオマーカーは、気相イオンを検出するために質量分析計を利用する方法である質量分析によって検出することもできる。質量分析計の例は、飛行時間型、磁場型、四重極フィルター型、イオントラップ型、イオンサイクロトロン共鳴型、静電場型の分析装置およびこれらのハイブリッドである。質量分析計は、レーザー脱離／イオン化（ＬＤＩ）質量分析計であり得る。レーザー脱離／イオン化質量分析では、タンパク質分析物を、質量分析計のプローブインターフェースに係合し、イオン化と質量分析計への導入のために分析物をイオン化エネルギーに提示するように構成された装置である、質量分析プローブの表面に置く。レーザー脱離質量分析計は、分析物を表面から脱離させるために、それらを揮発させてイオン化し、質量分析計のイオン光学がそれらを利用できるようにするために、通常は紫外線レーザーからのレーザーエネルギーを利用するが、赤外線レーザーからのレーザーエネルギーも利用する。ＬＤＩによるタンパク質分析は、ＭＡＬＤＩまたはＳＥＬＤＩという形をとることができる（Ｚｈａｎｇらの名で出願された米国特許公開第２００７０１７２９０２号参照）。
【００３９】
質量分析は、異なる形態のタンパク質を分別するのに特に強力な方法でもあるが、それは、これらの異なる形態が、通常、この手法により分別可能な異なる質量を有するからである。したがって、タンパク質の１つの形態が、このバイオマーカーのもう１つの形態よりも、開示された方法による検出に優れたバイオマーカーであるならば、従来のイムノアッセイによって、これらの形態を区別することと有用なバイオマーカーを特異的に検出することの両方ができない場合に、質量分析によって、有用な形態を特異的に検出し、測定することができる場合がある。
【００４０】
質量分析は、イムノアッセイと組み合わせることもできる。最初に、生体特異的捕捉試薬（例えば、バイオマーカーおよびその諸形態を認識する抗体）を用いて、対象となるバイオマーカーを捕捉する。好ましくは、生体特異的捕捉試薬は、ビーズ、プレート、膜、またはアレイのような固相に結合されている。結合しなかった材料を洗い流した後、捕捉された分析物を質量分析によって検出および／または測定する。従来のＭＡＬＤＩまたはＳＥＬＤＩ、およびエレクトロスプレーイオン化のような、レーザー脱離手法を含む、様々な種類の質量分析は、上記のような、タンパク質形態の検出に有用である。
【００４１】
試験試料は、バイオチップによって分析することもできる。バイオチップは、通常、固体基板を含み、大抵は平らな表面を有しており、そこに（吸着剤または親和性試薬とも呼ばれる）捕捉試薬が付着している。多くの場合、バイオチップの表面は複数のアドレス可能な場所を含み、各場所はそこに結合した捕獲試薬を有する。タンパク質バイオチップは、ポリペプチドを捕捉するように構成されたバイオチップである。多くのタンパク質バイオチップが当技術分野で記載されている。これらには、例えば、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）、Ｚｙｏｍｙｘ（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、およびＰｒｏｃｏｇｎｉａ（Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ，ＵＫ）によって製造されるタンパク質バイオチップが含まれる。このようなタンパク質バイオチップの例は、以下の特許または公開特許出願に記載されている：米国特許第６，２２５，０４７号（Ｈｕｔｃｈｅｎｓ  ＆  Ｙｉｐ）；米国特許第６，５３７，７４９号（ＫｕｉｍｅｌｉｓおよびＷａｇｎｅｒ）；米国特許第６，３２９，２０９号（Ｗａｇｎｅｒら）；ＰＣＴ国際公開ＷＯ００／５６９３４号（Ｅｎｇｌｅｒｔら）；ＰＣＴ国際公開ＷＯ０３／０４８７６８号（Ｂｏｕｔｅｌｌら）；および米国特許第５，２４２，８２８号（Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍら）。
【００４２】
ＩＩＩ．試料の分類
本発明は、対象における慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を迅速に検出および／または正確に診断し、ＣＯＰＤと診断された対象に由来する試料をこの疾患の重症度に従って分類および／または同定し、対象におけるＣＯＰＤの進行度を同定および評価する（疾患の監視／病期診断）ために使用される方法を開示する。試験試料を、健常対照、急速低下ＣＯＰＤ患者、または緩徐低下ＣＯＰＤ患者に由来するものであると分類および／または同定することを用いて、治療計画への応答を予測および／または監視することもでき、これには、治験期間中の薬効の監視が含まれるが、これに限定されない。したがって、本発明は、治療剤および治療計画の有効性を評価する方法；疾患の病期診断および分類の方法などを含む。早期検出を用いて、発症しつつあるＣＯＰＤの存在を明らかにすることができ、それによって、適切な予防手段または防御手段による治療介入が可能になる。
【００４３】
試験試料をＣＯＰＤ対象（緩徐低下ＣＯＰＤまたは急速低下ＣＯＰＤのいずれか）から得られたものであると分類および／もしくは同定するか、患者をＣＯＰＤと診断するか、または患者におけるＣＯＰＤの重症度を分類する方法では、本明細書で提供される１つまたは複数のタンパク質マーカーの、血液、血清、および血漿を含むが、これらに限定されない、試験試料中での発現パターンを入手し、対照値と比較して、診断／分類を決定する。例えば、血液由来の試料（試験試料）を、特異的結合剤（例えば、抗体）、または特異的結合剤のパネルに適用して、対象となるマーカーの存在を決定する、および／または試料中のマーカーを定量化することができる。分析は、一般に、本明細書に記載のマーカー、例えば、アポリポタンパク質Ｈ、ＣＤ４０、ハプトグロビン、インターロイキン−８（「ＩＬ−８」）、単球走化性タンパク質−１（「ＭＣＰ−１」）、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ（「ＴＮＦ−ＲＩＩ」）、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、免疫グロブリンＡ（「ＩｇＡ」）、マクロファージ炎症性タンパク質１α（「ＭＩＰ−１α」）、組織因子、腫瘍壊死因子−α（「ＴＮＦ−α」）、α−１アンチトリプシン、Ｃ−反応性タンパク質（「ＣＲＰ」）、フィブリノゲン、インターロイキン−４（「ＩＬ−４」）、マクロファージ由来ケモカイン（「ＭＤＣ」）、および可溶性血管細胞接着分子１（「ｓＶＣＡＭ−１」）のうちの少なくとも１つ；通常、これらのマーカーのうちの少なくとも２つ、より通常は、これらのマーカーのうちの少なくとも３つを検出および／または定量化する工程を含み、所望される特定の分類によっては、これらのマーカーのうちの４つ、５つ、６つ、７つ、または全てを検出および／または定量化する工程を含むこともある。
【００４４】
試験試料をＣＯＰＤ対象に由来するものであると分類するおよび／または対象をＣＯＰＤと診断する、特に、急速低下ＣＯＰＤと健常対照を分類する場合、好ましいマーカーセットは、以下の多分析物パネル、すなわち、アポリポタンパク質Ｈ、ＣＤ４０、ハプトグロビン、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、およびＴＮＦ−ＲＩＩのうちの少なくとも３つを含むが、それらのうちの４つ、５つ、または６つ全てを含むこともある。この多分析物パネルは、本明細書に記載のシグネチャー１に相当する。この方法にとって好ましい定量化するための少なくとも３つのマーカーは、健常対象ではなくＣＯＰＤ急速低下群に由来する血漿試料を約８９％の全体精度で正確に同定する、アポリポタンパク質Ｈ、ＭＣＰ−１、およびＴＮＦ−ＲＩＩである（以下の表６参照）。精度は、シグネチャー１中の記載された６つ全てのバイオマーカーについての定量的データを評価することによって、約９０％まで上昇する（以下の表６参照）。
【００４５】
試験試料を、ＣＯＰＤ対象に由来するものであると分類するおよび／または対象をＣＯＰＤと診断する、特に、緩徐低下ＣＯＰＤと健常対照を分類する場合、好ましいマーカーセットは、以下の多分析物パネル、すなわち、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、ＣＤ４０、ハプトグロビン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩｇＡ、ＭＩＰ−１α、組織因子、およびＴＮＦ−αのうちの少なくとも３つを含むが、それらのうちの４つ、５つ、６つ、７つ、または８つ全てを含むこともある。この多分析物パネルは、本明細書に記載のシグネチャー２に相当する。この方法にとって好ましい定量化するための少なくとも３つのマーカーは、健常対象ではなくＣＯＰＤ緩徐低下群に由来する血漿試料を約７６％の全体精度で正確に同定する、ＩｇＡ、ＭＩＰ−１α、および組織因子である（以下の表６参照）。精度は、ＧＭ−ＣＳＦ（合計４つのバイオマーカー）をさらに定量化することによって約７８％まで上昇し、ＧＭ−ＣＳＦとアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（合計５つのバイオマーカー）をさらに定量化することによって約８３％まで上昇する。精度は、記載された８つ全てのバイオマーカーについての定量化データを評価することによって約９４％まで上昇する（以下の表６参照）。
【００４６】
試験試料を、ＣＯＰＤ対象に由来するものであると分類するおよび／または対象をＣＯＰＤと診断する、特に、急速低下ＣＯＰＤと緩徐低下ＣＯＰＤを分類する場合、好ましいマーカーセットは、以下の多分析物パネル、すなわち、α−１アンチトリプシン、ＣＲＰ、フィブリノゲン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＭＤＣ、組織因子、ＴＮＦ−ＲＩＩ、およびｓＶＣＡＭ−１のうちの少なくとも３つを含むが、それらのうちの４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つ全てを含むこともある。この多分析物パネルは、本明細書に記載のシグネチャー３に相当する。この方法にとって好ましい定量化するための少なくとも３つのマーカーは、ＣＯＰＤ緩徐低下群に由来する血漿試料ではなくＣＯＰＤ急速低下群に由来する血漿試料を約８０％の全体精度で正確に同定する、ＭＤＣ、組織因子、およびｓＶＣＡＭ−１である（以下の表６参照）。精度は、ＩＬ−４（合計４つのバイオマーカー）をさらに定量化することによって約８５％まで上昇し、また、精度は、記載された９つ全てのバイオマーカーについての定量化データを評価することによって約９２％まで上昇する。ＣＯＰＤ（すなわち、急速低下群と緩徐低下群）の重症度の段階を決める場合、個々の試験データセットを、既知の病期の疾患試料から得られた１つまたは複数の参照データセットと比較し、病期を予測するモデルを構築し、そのモデルにデータセットを入力して、予測された病期診断を得る。
【００４７】
したがって、本明細書に開示される情報を用いて、本発明は、哺乳類対象から得られた試験試料を分類するコンピュータ実行型の方法であって、（ａ）該試料と関連するデータセットを取得する工程であって、該取得データセット（すなわち、試験データセット）が、（ｉ）アポリポタンパク質Ｈ、ＣＤ４０、ハプトグロビン、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、および腫瘍壊死因子受容体ＩＩ（ＴＮＦ−ＲＩＩ）と、（ｉｉ）アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、ＣＤ４０、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、ハプトグロビン、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）、組織因子、および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）と、（ｉｉｉ）α−１アンチトリプシン、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フィブリノゲン、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、組織因子、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ（ＴＮＦ−ＲＩＩ）、および可溶性血管細胞接着分子１（ｓＶＣＡＭ−１）と、からなる群から選択される多分析物パネルから選択される少なくとも３つのタンパク質マーカーについての定量的データを含む、工程と、（ｂ）該取得データセットを１つまたは複数の参照データセットと比較するコンピュータ上の分析プロセスに、該取得データセットを入力する工程と、（ｃ）該分析プロセスの出力に従って該試料を分類する工程であって、該分類がＣＯＰＤ分類および健康分類からなる群から選択される、工程と、を含む方法を提供する。さらなる実施形態では、ＣＯＰＤ分類は、急速低下ＣＯＰＤ分類および／または緩徐低下ＣＯＰＤ分類のいずれかに相当する。
【００４８】
本発明はさらに、ヒト対象から得られた試験試料を分類するための方法であって、（ａ）該試験試料と関連するデータセットを取得する工程であって、該取得データセットが、（ｉ）アポリポタンパク質Ｈ、ＣＤ４０、ハプトグロビン、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、および腫瘍壊死因子受容体ＩＩ（ＴＮＦ−ＲＩＩ）と、（ｉｉ）アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、ＣＤ４０、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ハプトグロビン、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）、組織因子、および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）と、（ｉｉｉ）α−１アンチトリプシン、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フィブリノゲン、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、組織因子、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ（ＴＮＦ−ＲＩＩ）、および可溶性血管細胞接着分子１（ｓＶＣＡＭ−１）からなる群から選択される多分析物パネルから選択される少なくとも３つのタンパク質マーカーについての定量的データを含む、工程と、（ｂ）該取得データセットを１つまたは複数の参照データセットと比較する分析プロセスを用いて該試験試料を分類するために該取得データセットを変換する工程と、（ｃ）該分析プロセスの出力に従って該試料を分類する工程であって、該分類が慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）分類および健康分類からなる群から選択される、工程とを含む方法を提供する。
【００４９】
対象（例えば、ヒト患者）に最も適した治療方針を正確に開発するために、本明細書に記載の分類方法を用いて、診断または疾患の病期診断の目的でこのような対象を同定することができる。これらの分類方法を用いて、治験期間中にＣＯＰＤ治療薬の有効性を計算および評価するのを助けることもできる。したがって、ひとたび対象が分類されれば、この情報を変換して、例えば、該対象においてＣＯＰＤがさらに進行するのを制限するより効果的な治療計画を作成する、またはＣＯＰＤ治療で使用される薬剤候補の有効性を決定することができる。
【００５０】
本明細書に開示される方法は、本明細書に記載の３つのバイオマーカーシグネチャーの少なくともサブセットの、試験血漿試料中濃度の決定とともに実施することができる。特定の実施形態では、開示される方法は、正確な診断をするに当たって９０％を超える精度を提供する。
【００５１】
本明細書に記載の方法は、これらの方法を実施することができる任意の装置を用いて実施し得る。使用し得る装置の例としては、あらゆる種類のコンピュータを含む、電子計算装置が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載の方法がコンピュータ上で実施される場合、コンピュータがこれらの方法の工程を実行するように設定するために使用し得るコンピュータプログラムは、コンピュータプログラムを含むことができる任意のコンピュータ可読媒体に含まれ得る。使用し得るコンピュータ可読媒体の例としては、ディスケット、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ならびに他のメモリおよびコンピュータ記憶装置が挙げられるが、これらに限定されない。コンピュータがこれらの方法の工程を実行するように設定するために使用し得るコンピュータプログラムは、電子ネットワーク上で、例えば、インターネット、ワールドワイドウェブ、イントラネット、または他のネットワーク上でも提供し得る。
【００５２】
本明細書に記載の方法は、プロセッサーとコンピュータ可読媒体とを含むシステムであって、このシステムにこれらの方法の工程を実行させるためのプログラムコード手段を含むシステムの中で実施し得る。プロセッサーは、これらの方法の実施に必要とされる作業を実行できる任意のプロセッサーであり得る。プログラムコード手段は、システムの中で実施されたときに、このシステムに本明細書に記載の方法の工程を実行させることができる任意のコードであり得る。プログラムコード手段の例としては、Ｃ＋＋、Ｊａｖａ（登録商標）、もしくはＦｏｒｔｒａｎのような、高レベルのコンピュータ言語で書かれた、本出願に記載の方法を実行するための命令；アセンブリ言語のような低レベルのコンピュータ言語で書かれた、本出願に記載の方法を実行するための命令；またはコンパイルされ、連結されたマシン言語のような、コンピュータで実行可能な形式の、本明細書に記載の方法を実行するための命令が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
ＩＶ．データ分析
試料（例えば、試験試料または参照試料）中のマーカーの定量は、上記の、当技術分野で公知の方法によって測定される。試験試料から得られた定量的データ（本明細書で互換的に使用される、「取得データセット」または「試験データセット」）は、取得データセットを１つまたは複数の参照データセットと比較する分析的な分類プロセスを受ける。一実施形態では、試験されるバイオマーカーのタンパク質濃度データを含むが、これに限定されない、生データを定量化し、試験試料から得られるのと同じ定量的データを用いて１つまたは複数の参照集団を評価することによって作成される予測モデルと比較する。予測モデルは、参照集団からの学習データセットを用いて作成されるが、その場合、この学習データセットと試験（または取得）データセットはともに、同じ定量的情報から構成される。例えば、本発明の一実施形態では、試験試料を分類する方法または対象を急速低下ＣＯＰＤ患者と診断する方法を実施する場合に、アポリポタンパク質Ｈ、ＭＣＰ−１、およびＴＮＦ−ＲＩＩの循環血漿濃度データからなる試験試料と関連するデータセットを、健常人（参照試料１）と急速低下ＣＯＰＤの人（参照試料２）の両方から得られる同じ濃度データセット（すなわち、アポリポタンパク質Ｈ、ＭＣＰ−１、およびＴＮＦ−ＲＩＩの循環血漿濃度）を用いて作成された予測モデルと比較する。
【００５４】
したがって、好ましい実施形態では、本発明の方法は、ＣＯＰＤを診断または分類するための分類子を使用する。分類子は、多分析物プロファイルを含む入力を受け取って、試験試料がどの群に属するかを示すデータを含む出力を提供する、任意の適当なパターン認識方法に基づくことができる。分類子は、対象の１つまたは複数の参照集団（参照データセット）からの学習データを用いて学習させることができる。通常、学習データは、学習集団中の各々の対象について、患者から採取した好適な試料中のバイオマーカータンパク質の定量的測定結果を含む多分析物プロファイルを含む。
【００５５】
分析的な分類プロセスは、定量的データを操作して試験試料を分類するために、種々の統計的分析方法のいずれか１つを使用し得る。有用な方法の例としては、線形判別分析（ＬＤＡ）、再帰的特徴削除、マイクロアレイの予測分析、ロジスティック回帰、ＣＡＲＴアルゴリズム、ＦｌｅｘＴｒｅｅアルゴリズム、ＬＡＲＴアルゴリズム、ランダムフォレストアルゴリズム、ＭＡＲＴアルゴリズム、および機械学習アルゴリズムが挙げられる。好ましい分析方法は、ＬＤＡである。これらの方法のいずれか１つを使用しつつ、１つまたは複数の参照データセットを用いて予測モデルを作成する。このようなモデルの作成では、対照試料および／または罹患試料を含むデータセットを学習セットとして使用する。学習セットは、試験試料で定量されるのと同じマーカー群についてのデータを含むことになる。急速低下ＣＯＰＤ患者と健常対象、緩徐低下ＣＯＰＤ患者と健常対象、および急速低下ＣＯＰＤ患者と緩徐低下ＣＯＰＤ患者を区別するために使用される予測モデルの例を本明細書で提供する。例えば、実施例３を参照されたい。
【００５６】
本明細書に示される予測モデルは、本明細書に記載のシグネチャー１、２、もしくは３に含まれるバイオマーカー、または該シグネチャー内のバイオマーカーサブセットの、複数回のタンパク質レベル測定の結果を利用し、そして、所望の精度で、ある人が特定の状態（ここで、状態は、急速低下ＣＯＰＤ、緩徐低下ＣＯＰＤ、または健康（疾患状態なし）であり得る）に属すると分類する方法を提供する。したがって、対象となる分類には、試験試料を以下の状態、すなわち、ｉ）ＣＯＰＤ状態（急速低下ＣＯＰＤ状態または緩徐低下ＣＯＰＤ状態を含む）とｉｉ）健康状態（疾患状態なし）のうちの１つまたは複数に割り当てることが含まれるが、これに限定されるものではない。
【００５７】
取得データセットと参照データセットを比較することで統計的に有意な差が得られるかどうかを決定することによって分類することもできる。統計的に有意な差が得られる場合は、データセットが得られた試料を参照データセット群に属さないと分類する。逆に、このような比較が参照データセットと比べて統計的に有意でない場合は、データセットが得られた試料を参照データセット群に属すると分類する。
【００５８】
試料が所与の群に属する確率を決定するための閾値を設定する予測モデル化方法によって分類することができる。本発明の方法の確率は、少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％またはそれを上回るものである。モデルの予測能力は、特定の値または値の範囲の品質メトリック、例えば、精度、を提供するその能力によって評価し得る。一実施形態では、望ましい品質閾値は、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％もしくはそれを上回る精度で、試験試料を分類する能力を有する。「精度」という用語は、疾患状態（例えば、ＣＯＰＤ）と対照状態（例えば、健康）とを正確に識別する個々のマーカーまたはマーカー組合せのコンピュータ演算能力を指す。当技術分野で知られているように、予測モデルの相対的な感度と特異度は、選択性メトリックまたは感度メトリックのどちらかに有利になるように合わせることができるが、この場合、２つのメトリックは反対の関係にある。「感度」という用語が、疾患状態を正確に同定する個々のマーカーまたはマーカー組合せの能力を指すのに対し、「特異度」という用語は、正常な（例えば、罹患していない）状態を正確に同定するこの（これらの）マーカーの能力を指す。上記のモデルの限度を調整して、実施される試験の特定の要件に応じた、選択された感度レベルまたは特異度レベルを提供することができる。感度と特異度の一方または両方は、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％もしくはそれを上回るものであり得る。
【００５９】
各マーカーの値（例えば、濃度）を、通常３つ１組でまたは３つ１組で複数回、測定することによって、生データを初めに分析することができる。データは操作することができる。例えば、標準曲線を用いて生データを変換することができ、３つ１組の測定結果の平均値を用いて各患者の平均値および標準偏差を算出することができる。モデルで使用する前に、これらの値を変換する、例えば、対数変換、ボックス・コックス変換（ＢｏｘおよびＣｏｘ（１９６４）  Ｊ．Ｒｏｙａｌ  Ｓｔａｔ．Ｓｏｃ，Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ，２６：２１１−２４６参照）することができる。次に、データを予測モデルに入力すると、この予測モデルが、試料を状態によって分類する。得られた情報は、患者、医療従事者、または臨床研究の分析者に提供することができる。
【００６０】
ＣＯＰＤ状態についての予測モデルを作成するために、既知の対照試料および／または対象となる分類に対応する試料を含む、頑健なデータセットを学習セット（「参照データセット」）で使用する。試料サイズは、一般に認められている基準を用いて選択する。上で論じられているように、異なる統計的方法を用いて、精度の高い予測モデルを得ることができる。線形判別分析（ＬＤＡ）を用いたそのような分析の一例を実施例３に示す。
【００６１】
線形判別分析（ＬＤＡ）は、試験試料または試験対象を、特定の対象物特性に基づいて、２つのカテゴリーのうちの１つに分類しようとする。換言すれば、ＬＤＡは、実験で測定された対象物属性によって対象物のカテゴリー化が予測されるかどうかを検証する。ＬＤＡは、通常、連続独立変数と二値カテゴリー独立変数を必要とする。本発明において、学習集団サブセットの全てにわたる本明細書に開示の選択されたバイオマーカーセットの定量値（例えば、タンパク質濃度データ）は、必須の連続独立変数の役割を果たす。学習集団の各メンバーの臨床群分類は、二値カテゴリー独立変数の役割を果たす。
【００６２】
ＬＤＡは、グループ分け情報を用いて群間分散と群内分散の比を最大化する変数の線形結合を求める。暗黙のうちに、ＬＤＡによって使用される線形重みは、学習セット全体のバイオマーカーの定量値（例えば、タンパク質濃度）がどのように２つの群（例えば、ＣＯＰＤ対照群と健常対照群）に分かれるかによって決まる。いくつかの実施形態では、ＬＤＡを、学習試料中のメンバーＮ個×本明細書に記載のバイオマーカーと組み合わせたバイオマーカーＫ個のデータ行列に適用する。次に、学習集団の各メンバーの線形判別式をプロットする。第１の対照亜群（例えば、健常群）に相当する学習集団のメンバーがクラスターを形成して１つの範囲の線形判別値（例えば、負）をとり、第２の対照亜群（例えば、ＣＯＰＤ対象）に相当する学習集団のメンバーがクラスターを形成して第２の範囲の線形判別値（例えば、正）をとることが理想的である。判別値のクラスター間の分離がより大きい場合に、ＬＤＡはより成功していると考えられる。線形判別分析についてのさらなる情報については、Ｄｕｄａ，Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，第２版，２００１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ；およびＨａｓｔｉｅ，２００１，Ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｖｅｎａｂｌｅｓ  ＆  Ｒｉｐｌｅｙ，１９９７，Ｍｏｄｅｒｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｗｉｔｈ  ｓ−ｐｌｕｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。
【００６３】
二次判別分析（ＱＤＡ）は、ＬＤＡと同じ入力パラメータを受け取り、ＬＤＡと同じ結果を返す。ＱＤＡは、線形方程式ではなく、二次方程式を用いて、結果を出す。ＬＤＡとＱＤＡは互換的であり、どちらを用いるかは好みの問題および／または分析を支援するソフトウェアの可用性の問題である。ロジスティック回帰は、ＬＤＡおよびＱＤＡと同じ入力パラメータを受け取り、ＬＤＡおよびＱＤＡと同じ結果を返す。
【００６４】
一実施形態では、予測モデルの導出において階層的クラスタリングを行ない、その場合、ピアソン相関をクラスタリングメトリックとして利用する。１つの手法は、ＣＯＰＤデータセットを「教師あり学習」問題の「学習試料」とみなすことである。ＣＡＲＴは、医学への適用において標準となっているが（Ｓｉｎｇｅｒ（１９９９）  Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）、これは、任意の質的特徴を量的特徴に変換し、それらをホテリングのＴ２統計量のための標本再利用法で評価される達成有意性水準によって分類し、ｌａｓｓｏ法を好適に適用することによって改変し得る。予測の問題は、回帰の質を評価する際の分類にジニ基準を実際に好適に利用することにより、予測を見失わない回帰の問題へと変わる。
【００６５】
この手法は、ＦｌｅｘＴｒｅｅ（Ｈｕａｎｇら，２００４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１０５２９−１０５３４）と呼ばれるものにつながっている。ＦｌｅｘＴｒｅｅは、シミュレーションにおいて、また、ＳＮＰおよび他の種類のデータに適用したときに、非常によく機能する。ソフトウェア自動化ＦｌｅｘＴｒｅｅが開発されている。近年の努力により、ＬＡＲＴｒｅｅまたはｓｉｍｐｌｙ  ＬＡＲＴ（Ｔｕｒｎｂｕｌｌ（２００５）  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｒｅｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｕｂｓｅｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｌａｓｓｏ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）と呼ばれる手法が開発されている。この名前は、ＣＡＲＴおよびＦｌｅｘＴｒｅｅに見られるような二分木；上で言及したｌａｓｓｏ法；およびＥｆｒｏｎら（２００４）  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ３２：４０７−４５１によってＬＡＲＳと呼ばれているものによるｌａｓｓｏ法の実施を反映している。Ｈｕａｎｇら，２００４（前掲）も参照されたい。
【００６６】
使用し得る他の分析方法には、ロジスティック回帰が含まれる（例えば、Ｒｕｃｚｉｎｓｋｉら，２００３，Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ．Ｇｒａｐｈ．Ｓｔａｔ．１２：４７５−５１２参照）。ロジスティック回帰は、その分類子を二分木として示すことができるという点でＣＡＲＴに似ている。ロジスティック回帰は、各ノードが、ＣＡＲＴによって生成される単純な「ａｎｄ」文よりも一般的な特徴についてのブーリアン文を有するという点で異なる。
【００６７】
別の手法は、最短収縮重心（ｎｅａｒｅｓｔ  ｓｈｒｕｎｋｅｎ  ｃｅｎｔｒｏｉｄ）の手法である（Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉら，２００２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：６５６７−７２）。この技法はｋ−ｍｅａｎｓ法に似ているが、クラスター中心を収縮することにより、情報を提供する少数の特徴に焦点を絞るように（ｌａｓｓｏ法に見られるような）特徴を自動的に選択するという利点を有する。この手法は、ＰＡＭソフトウェアとして利用可能であり、広く使用されている。さらに２組のアルゴリズムは、ランダムフォレスト（Ｂｒｅｉｍａｎら，２００１，Ｍａｃｈ  Ｌｅａｒｎ．４５：５−３２）とＭＡＲＴ（Ｈａｓｔｉｅら，２００１，Ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）である。これら２つの方法は、既に「コミッティー法（ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｍｅｔｈｏｄ）」である。したがって、これらは、結果を「採決する」予測子を含む。
【００６８】
有意性を順序付けるために、偽発見率（ＦＤＲ）を決定することができる。まず、１組の非類似値の帰無分布を作成する。一実施形態では、観測されたプロファイル値を並べ変えて、偶然に得られる一連の相関係数の分布を創出し、それによって、適当な組の相関係数の帰無分布を創出する（参照により本明細書に組み入れられる、Ｔｕｓｈｅｒら，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８，５１１６−２１を参照されたい）。帰無分布の組は、全ての利用可能なプロファイルについての各プロファイルの値を並べ変え、全てのプロファイルの対相関係数を計算し、この順列の相関係数の確率密度関数を計算し、この手順をＮ回（ここで、Ｎは大数、通常約３００である）繰り返すことによって得られる。Ｎ個の分布を用いて、所与の有意水準の実験的に観測された類似値の分布から得られる（類似）値を超える相関係数値のカウントの適当な尺度（平均値、中央値など）を計算する。
【００６９】
ＦＤＲとは、実験データにおけるこの選択されたピアソン相関よりも大きい相関（有意な相関）の数に対する（ランダム化されたデータの組におけるこの選択されたピアソン相関よりも大きい相関から推定される）期待される偽有意な相関（ｆａｌｓｅｌｙ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）の数の比率のことである。このカットオフ相関値を、実験プロファイル間の相関に適用することができる。
【００７０】
上述の分布を用いて、有意性についての信頼度を選択する。これを用いて、偶然に得られたと考えられる結果を超える相関係数の最小値を決定する。この方法を用いて、正の相関、負の相関、または両方の閾値を得る。この閾値（単数または複数）を用いて、ユーザーは、対相関係数の観測値をフィルタリングし、閾値（単数または複数）を超えないものを削除することができる。さらに、所与の閾値について、偽陽性率の推定値を得ることができる。各々の個々の「ランダム相関」分布については、観測結果がいくつ閾値範囲から外れるかを見出すことができる。この手順によってカウントの数列が得られる。この数列の平均と標準偏差から、潜在的な偽陽性の平均数とその標準偏差が得られる。
【００７１】
代替の分析手法では、横断面分析で選択される変数を予測子として個別に利用する。具体的なＣＯＰＤ転帰と、各々の患者が観察されるランダムな時間長と、プロテオームの特徴および他の特徴の選択とが与えられれば、生存分析のためのパラメトリック手法が、広く適用されているセミパラメトリックなコックスモデルよりも優れている場合がある。ワイブルの生存に関するパラメトリックフィットは、ハザード率が単調増加するか、単調減少するか、または一定となること許すものであるが、これはまた、（コックスモデルが表示する）比例ハザードを表示し、加速故障時間も表示する。回帰係数の近似最尤度推定量とその関数を得るときに利用可能な標準的手段は全て、このモデルで利用可能である。
【００７２】
さらに、特に共変量の数を、ｌａｓｓｏを用いて扱いやすい大きさに減らすことによって、分析が大幅に単純化されることになり、生存に対する完全にノンパラメトリックな手法の可能性が認められるので、コックスモデルを使用することができる。これらの統計手段は、ありとあらゆるプロテオームデータに適用可能である。容易に測定可能であって、かつ臨床的意義のあるＣＯＰＤを有する人の検出に関して極めて情報量の多い、１組のバイオマーカーを提供する。
【００７３】
予測モデルの開発においては、１サブセットのマーカー、すなわち、少なくとも３組、少なくとも４組、少なくとも５組、少なくとも６組、または完全な組のマーカーを選択することが望ましい場合がある。通常、精度の高い予測モデルを維持しながら、定量的試料分析に必要なもの（例えば、試薬の可用性、定量の利便性など）を提供する１サブセットのマーカーを選択する。分類モデルを構築するためのいくつかの情報提供マーカーの選択は、性能メトリックに基づいた有用な予測能力を有するモデルを生成するために、性能メトリックの定義とユーザー定義の閾値とを必要とする。例えば、性能メトリックは、予測の感度および／または特異度、ならびに予測モデルの全体精度であってもよい。実施例３に記載されるように、ＣＯＰＤおよびこの疾患の特定の病期に関連するバイオマーカーを同定するために、ＬＤＡが学習モデルで使用された。１サブセットのマーカーの選択を、マーカーサブセットの前進選択または後退選択に使用してもよい。マーカー全てを用いることなくモデルの性能を最適化するいくつかのマーカーを選択してもよい（下記の実施例３の表６参照）。最適な項数を定義するための１つの方法は、所望の予測能力（例えば、８０％を超える精度、または同等量の感度／特異度）を有するモデルを生成する項数であって、所与の分析プロセスに使用される任意の項の組合せと項数とを用いてこのメトリックについて得られる最大値からわずかに１標準誤差である項数を選択することである。
【００７４】
Ｖ．試薬およびキット
１つまたは複数の上記方法を実施するための試薬およびそのキットも提供する。本試薬およびそのキットは、非常に様々なものであってもよい。対象となる試薬には、ＣＯＰＤと関連する循環タンパク質マーカーの上記発現プロファイルの作成で使用されるように特別に設計された試薬が含まれる。
【００７５】
したがって、本発明は、１つまたは複数の上記方法を実施するためのキットであって、本明細書に記載のＣＯＰＤバイオマーカーに特異的な少なくとも１つの試薬を含み、このＣＯＰＤバイオマーカーが、アポリポタンパク質Ｈ、ＣＤ４０、ハプトグロビン、インターロイキン−８（「ＩＬ−８」）、単球走化性タンパク質−１（「ＭＣＰ−１」）、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ（「ＴＮＦ−ＲＩＩ」）、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、免疫グロブリンＡ（「ＩｇＡ」）、マクロファージ炎症性タンパク質１−α（ＭＩＰ−１α）、組織因子、および腫瘍壊死因子−α（「ＴＮＦ−α」）、α−１アンチトリプシン、Ｃ−反応性タンパク質（「ＣＲＰ」）、フィブリノゲン、インターロイキン−４（「ＩＬ−４」）、マクロファージ由来ケモカイン（「ＭＤＣ」）、および可溶性血管細胞接着分子１（「ｓＶＣＡＭ−１」）からなる群から選択される、キットを提供する。１つまたは複数のバイオマーカーの発現は、１つまたは複数のバイオマーカーを検出する該試薬を用いて測定することができる。このキットを用いて、ＣＯＰＤ群または健常群のヒト対象から得られる試験試料を分類する。
【００７６】
一実施形態では、該キットは、本明細書に記載の１つまたは複数のバイオマーカーシグネチャーから選択される少なくとも３つのタンパク質マーカーを検出するための試薬を含む。したがって、該キットは、
（ａ）アポリポタンパク質Ｈ、ＣＤ４０、ハプトグロビン、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、および腫瘍壊死因子受容体ＩＩ（ＴＮＦ−ＲＩＩ）と、
（ｂ）アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、ＣＤ４０、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ハプトグロビン、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）、組織因子、および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）と、
（ｃ）α−１アンチトリプシン、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フィブリノゲン、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、組織因子、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ（ＴＮＦＲＩＩ）、および可溶性血管細胞接着分子１（ｓＶＣＡＭ−１）と、
からなる群から選択される多分析物パネルから選択される少なくとも３つのタンパク質マーカーを検出するための試薬を含み得る。
【００７７】
本発明のキットは、生体試料中の本明細書に開示されるＣＯＰＤバイオマーカーに対応するポリペプチドまたは本明細書に開示されるＣＯＰＤバイオマーカーに対応するポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出するのに有用な標識化合物または標識薬剤である試薬と、試料中のポリペプチドまたはｍＲＮＡの量を測定するための手段（例えば、ポリペプチドに結合する抗体またはポリペプチドをコードするＤＮＡもしくはｍＲＮＡに結合するオリゴヌクレオチドプローブ）とを含み得る。ＣＯＰＤバイオマーカーに対応するポリペプチドとの結合に好適なこのような試薬の１つの種類は、対象となるマーカーに結合する抗体またはその断片（抗体誘導体を含む）である。さらに、核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、スプライスされたｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ）との結合に好適な試薬には、相補的核酸が含まれる。プローブ構造、基質組成、および結合技術が多種多様に異なっている、種々様々なアレイフォーマットが当技術分野で知られている。さらなる実施形態では、試薬は、検出可能な物質で直接的または間接的に標識されている。
【００７８】
特定の実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカーの発現は、（ａ）１つまたは複数のバイオマーカーによって調節されるポリペプチドの発現を検出すること、（ｂ）バイオマーカーを調節するポリペプチドの発現を検出すること、または（ｃ）バイオマーカーの代謝物の発現を検出することによって検出される。
【００７９】
抗体ベースのキットについて、キットは、例えば（１）本発明のバイオマーカーに対応するポリペプチドに結合する（例えば、固体支持体に結合した）第１の抗体と、任意で（２）当該ポリペプチドまたは第１の抗体のいずれかに結合し、かつ検出可能な標識にコンジュゲートされている第２の異なる抗体とを含むことができる。
【００８０】
オリゴヌクレオチドベースのキットについて、キットは、例えば（１）本発明のバイオマーカーに対応するポリペプチドをコードする核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、例えば、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド、または（２）本発明のバイオマーカーに対応する核酸分子を増幅するのに有用な１対のプライマーを含むことができる。
【００８１】
キットは、緩衝剤、防腐剤、タンパク質安定化剤、および／または検出可能な標識の検出に必要な構成要素などの、他の構成要素を含むこともできる。キットは、様々な方法で利用される試薬、例えば、血液試料を採取および処理するための装置、２次抗体、ＥＬＩＳＡ試薬；チューブ、スピンカラムなどを含み得る。キットの各構成要素を個々の容器に封入することができ、また、これらの様々な容器を全て、単一のパッケージに納めることができる。
【００８２】
対象となる代表的なアレイ組成物またはキット組成物は、アポリポタンパク質Ｈ、ＣＤ４０、ハプトグロビン、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１およびＴＮＦ−ＲＩＩからなる群から選択される少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、もしくは６つ全てのマーカーを定量するための試薬を含むか、またはこれらの試薬からなる。このキットを用いて、試験試料を、健常患者ではなく、急速低下ＣＯＰＤと分類する、および／または対象を、健常患者ではなく、急速低下ＣＯＰＤと診断することができる。キットに含まれる試薬を用いて定量するのに好ましい少なくとも３つのマーカーは、アポリポタンパク質Ｈ、ＭＣＰ−１、およびＴＮＦ−ＲＩＩを含み得る、またはこれらからなり得る。
【００８３】
別の一実施形態では、代表的なアレイまたはキットは、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、ＣＤ４０、ハプトグロビン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩｇＡ、ＭＩＰ−１α、組織因子、およびＴＮＦ−αからなる群から選択される少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、もしくは８つ全てのマーカーを定量するための試薬を含むか、またはこれらの試薬からなる。このキットを用いて、試験試料を、健常患者ではなく、緩徐低下ＣＯＰＤと分類する、および／または対象を、健常患者ではなく、緩徐低下ＣＯＰＤと診断することができる。キットに含まれる試薬を用いて定量するのに好ましい少なくとも３つのマーカーは、ＩｇＡ、ＭＩＰ−１α、および組織因子を含み得る、またはこれらからなり得る。
【００８４】
またさらなる実施形態では、代表的なアレイまたはキットは、α−１アンチトリプシン、ＣＲＰ、フィブリノゲン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＭＤＣ、組織因子、ＴＮＦ−ＲＩＩ、およびｓＶＣＡＭ−１からなる群から選択される少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、もしくは９つ全てのマーカーを定量するための試薬を含むか、またはこれらの試薬からなる。このキットを用いて、試験試料を、緩徐低下ＣＯＰＤではなく、急速低下ＣＯＰＤと分類する、および／または対象を、緩徐低下ＣＯＰＤではなく、急速低下ＣＯＰＤと診断することができる。キットに含まれる試薬を用いて定量するのに好ましい少なくとも３つのマーカーは、ＭＤＣ、組織因子、およびｓＶＣＡＭ−１を含み得る、またはこれらからなり得る。
【００８５】
キットは、１つまたは複数の表現型を統計分析するためのソフトウェアパッケージをさらに含み得、予測モデル内での分類の確率を計算するための参照データベース（単数または複数）を含み得る。
【００８６】
上記の構成要素に加えて、本キットは、本方法を実施するための、および本キットを用いて実施されたアッセイの結果を解釈するための指示をさらに含み得る。これらの指示は、種々の形態で本キットに存在し得、１つまたは複数のこれらの形態が、本キットに存在し得る。これらの指示が存在し得る１つの形態は、好適な媒体または基板（例えば、情報が印刷された１枚または複数枚の紙）の上、キットの包装中、添付文書中などに印刷された情報としてのものである。さらに別の手段は、情報が記録されたコンピュータ可読媒体、例えば、ディスケット、ＣＤなどである。存在し得るさらに別の手段は、遠隔部位の情報にアクセスするためにインターネット経由で使用し得るウェブサイトアドレスである。任意の好都合な手段がキットに存在し得る。
【００８７】
本発明の様々な特徴をさらに説明する実施例を以下でさらに示す。これらの実施例は、本発明を実施するための有用な方法も説明する。これらの実施例は、請求された発明を限定するものではない。
【実施例】
【００８８】
実施例１
研究対象の採取
１５年間の縦断的肺機能研究の最後に、４０人のＣＯＰＤ患者と２０人の健常対照からクエン酸緩衝液中に血液を採取した。ＣＯＰＤ患者と健常対照は、現喫煙者または元喫煙者のいずれかであった。ＣＯＰＤ患者は、当初、ＮＩＨが資金援助した全米肺健康研究（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｕｎｇ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｔｕｄｙ）という、肺機能に関する５年間の縦断的研究の一環として１９８７〜８８年に募集された（Ｏｗｅｎｓ，１９９１，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．９１：３７Ｓ−４０Ｓ）。募集された患者は、ＦＥＶ１が５０％〜９０％の範囲で、ＦＥＶ１／努力肺活量（ＦＶＣ）が０．７未満で、かつＣＯＰＤの特徴的な呼吸器症状を示す、３５歳〜５９歳の現喫煙者であった。肺活量測定は、肺健康研究の期間中、毎年行なわれた。この研究で評価されたＣＯＰＤ患者については、ユタ大学で次の１０年間、様々な間隔でさらなる肺活量測定が行なわれた。１５年間の肺機能に関する縦断的情報に基づいて、ＣＯＰＤ患者は２つのはっきりと区別できる群に分類された。２６人の急速低下群のＣＯＰＤサブグループは、過去１５年間で年間平均４０ｍｌ以上のＦＥＶ１を失った人によって定義される。これは、健康な喫煙者と非喫煙者について報告されている２０ｍｌのＦＥＶ１という正常な低下の２倍以上である（Ｒｅｎｎａｒｄ，１９９８，前掲）。１４人の緩徐低下群のＣＯＰＤサブグループは、年間平均４０ｍｌ未満のＦＥＶ１を失った人によって定義される。血液採取の時点で、急速低下群は、それまでの１５年間で平均２０．２％のＦＥＶ１を失っているので、全体で、予想される正常ＦＥＶ１の６４％を有していた。緩徐低下群は、それまでの１５年間で平均２．４％のＦＥＶ１しか失っていないので、全体で、予想される正常ＦＥＶ１の７２％を有していた。ＣＯＰＤ患者は全員、他の主な病気にはかかっておらず、研究期間中はコルチコステロイドを使用しておらず、よく似た年齢および性別分布であった。健康な喫煙者／元喫煙者の対照は、研究期間中ずっと募集され、性別、年齢、および民族性によってマッチングされた。研究におけるＣＯＰＤ患者と対照の臨床的特徴を表２に報告する。
【表２】
0005574990.tif 000003
【００８９】
実施例２
血漿マーカーの分析
Ｒｕｌｅｓ−Ｂａｓｅｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ社（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）独自のヒト抗原ＭＡＰプラットフォームでマーカーを分析するために、この会社に凍結血漿試料を送付した。凍結血漿試料を室温で解凍し、ボルテックスし、清澄化するために１３，０００  ｘ  ｇで５分間回転させ、マーカー分析用に４０ｕＬを取って、マスターマイクロタイタープレートに入れた。自動ピペッティングを用いて、各試料のアリコートを、ヒト抗原ＭＡＰの捕捉ミクロスフェアマルチプレックスの１つに導入した。これらの試料と捕捉ミクロスフェアの混合物を完全に混合し、室温で１時間インキュベートした。次に、各マルチプレックスに対するビオチン化レポーター抗体のマルチプレックス化カクテルをロボット制御によって添加し、完全に混合した後、室温でさらに１時間インキュベートした。各マルチプレックス中に完全に混合し、室温で１時間インキュベートした過剰なストレプトアビジン−フィコエリスリン溶液を用いて、これらのマルチプレックスを発色させた。各マルチプレックス化反応液の容量を真空濾過で減少させ、分析用のマトリックス緩衝液中に希釈することによって容量を増大させた。Ｌｕｍｉｎｅｘ  １００装置で分析を行ない、得られたデータ流を、Ｒｕｌｅｓ−Ｂａｓｅｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅで開発された独自のデータ分析ソフトウェアを用いて解釈した。各マルチプレックスについて、各マイクロタイタープレート上に校正物質と対照を含めた。各プレートの最初と最後の列に８点の校正物質を入れ、３つのレベルの対照を２つ１組で含めた。適切なアッセイ性能を保証するために、各マルチプレックスの高レベルと中レベルと低レベルの対照について、まず検査結果を明らかにした。データ分析パッケージに含まれる４および５パラメータの、加重および非加重曲線当てはめアルゴリズムを用いて、特定のマルチプレックス中にある各々の分析物についての未知値を測定した。
【００９０】
実施例３
データ分析
個々のマーカーの単変量分析。ウィルコクソン順位和検定を用いて、ＣＯＰＤ急速低下群と健常対照、ＣＯＰＤ緩徐低下群と健常対照、およびＣＯＰＤ急速低下群とＣＯＰＤ緩徐低下群の間の各マーカーの有意性を評価した。正確なｐ−値は、シフトアルゴリズム（ＳｔｒｅｉｔｂｅｒｇおよびＲｏｈｍｅｌ（１９８６）  Ｅｘａｃｔ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｒａｎｋ  Ｔｅｓｔ：Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｓｏｍｅ  Ｒｅｃｅｎｔｌｙ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ．１２：１０−１７）を用いて決定した。加えて、より厳密な偽発見率を用いて、各マーカーの有意性の強さをさらに評価した。ｐ−値で評価される偽陽性率（ＦＰＲ）は、実際に変化しなかった全マーカーの中での偽陽性の比率のことである。ｑ−値で評価される偽発見率（ＦＤＲ）は、偽陽性である有意変化の比率である。各マーカーのｑ−値は、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ  ＆  Ｈｏｃｋｂｅｒｇ（ＢｅｎｊａｍｉｎｉおよびＨｏｃｋｂｅｒｇ，２０００，Ｊ．Ｂｅｈａｖ．Ｅｄｕｃ．Ｓｔａｔｉｓｔ．２５：６０−８３）によって提唱された方法を用いて導き出された。分析は全て、Ｒ、バージョン２．４（Ｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅａｍ（２００６）．Ｒ：Ａ  ｌａｎｇｕａｇｅ  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｒ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ．ＩＳＢＮ  ３−９０００５１−０７−０，ＵＲＬ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ．）を用いて実施された。
【００９１】
本発明者らは、まず、試験した８９個の血漿マーカーの１つ１つについて、ＣＯＰＤ急速低下群と対照の間の平均値（中央値）を比較した。多くの小さいけれども有意な（ｐ＜０．０５）差がこれら２つの群の間に認められた（表３）。ｐ−値で評価される偽陽性率（ＦＰＲ）は、実際に変化しなかった全マーカーの中での偽陽性の比率のことである。ｑ−値で評価される偽発見率（ＦＤＲ）は、偽陽性である有意変化の比率である。正の変化倍数値は、健常対照に対する増加を表し、負の値は減少を表す。激しい変化倍数という点で、最も大きな差は、インターロイキン−４（ＩＬ−４；急速低下群において４．２倍の増加）、エオタキシン（２．６倍の増加）、インターロイキン−７（ＩＬ−７；２．２倍の増加）、およびハプトグロビン（２．０倍の増加）の場合に見られた。統計的に最も有意な差は、ＩＬ−４、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ−１）、可溶性血管細胞接着分子−１（ｓＶＣＡＭ−１）、およびエオタキシンについて認められ、ｐ値（偽陽性率）は０．１％未満、ｑ値（偽発見率）は１％未満であった（図１）。対照的に、緩徐ＣＯＰＤ低下群と対照との単変量比較からは、より少なくかつより小さい有意差が明らかとなった（表４）。４つのマーカーのみが０．０５未満のｐ値を有し、かつ４例全てにおいて、偽発見率が非常に高かった（＞５０％）。最後に、緩徐ＣＯＰＤ低下群と急速ＣＯＰＤ低下群を比較したときに、いくつかの興味深い差が見られた（表５）。インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、および組織因子は、緩徐低下群と比較して急速低下群において有意により高いレベルで存在した（ｐ＜０．０５）。癌抗原１９．９、免疫グロブリンＡ型（ＩｇＡ）、インスリン、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）、および可溶性血管細胞接着分子１（ｓＶＣＡＭ−１）は、緩徐低下群と比較して急速低下群において有意により低いレベルで存在した。
【表３】
0005574990.tif 000004
【表４】
0005574990.tif 000005
【表５】
0005574990.tif 000006
【００９２】
シグネチャーを同定するための多変量分析。線形判別分析（Ｖｅｎａｂｌｅｓ，Ｗ．Ｎ．  ＆  Ｒｉｐｌｅｙ，Ｂ．Ｄ．，（２００２）．Ｍｏｄｅｒｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，第４版．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）による前進選択法を用いて、ＣＯＰＤ急速低下群と健常対照、ＣＯＰＤ緩徐低下群と健常対照、およびＣＯＰＤ急速低下群とＣＯＰＤ緩徐低下群を最適に類別する多分析物パネル（シグネチャー）を決定した。この分析では、データセットの各点から各群の多変量平均（セントロイドと呼ぶ）までの距離を測定し、その点を最も近い群へと分類した。使用した距離量は、変数間の分散と共分散を考慮に入れるマハラノビス距離であった。代表的な多分析物パネル（シグネチャー）を、その予測性能とともに表６に示す。これらのマーカーが提供データセットについてＣＯＰＤと対照を類別する予測性能を、５０回繰り返しの５倍クロス確認を用いて調べた。これによって、データがランダムに５つの亜群に分けられ、各グループが１回に１つ除外され、残りの４つの亜群に対するモデルが構築され、このフィッティングしたモデルを用いて第５の亜群における疾患分類が予測され、これが５つの群全てに対して繰り返された後、結果が平均化される。この分析を５０回繰り返して、全体精度の信頼できる推定値を、バイオマーカーシグネチャーの感度と特異度とともに生成する。これらの分析は、２０人の対照と１４人または２６人のＣＯＰＤ対象に基づいており、Ｒ、バージョン２．４（Ｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅａｍ（２００６）．Ｒ：Ａ  ｌａｎｇｕａｇｅ  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｒ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ．ＩＳＢＮ  ３−９０００５１−０７−０，ＵＲＬ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ．）を用いて行なわれた。
【表６】
0005574990.tif 000007
【００９３】
どの血漿マーカーもそれらだけではＣＯＰＤ患者と対照を明確に区別することができなかったので、本発明者らは、線形判別分析法（ＬＤＡ）を用いるデータの多変量分析を行なった。この方法によって、ＣＯＰＤ急速低下群と対照（健常喫煙者）を正確に区別することができる血漿マーカー群（シグネチャー１）が同定された（図２Ａ）。図２Ａは、ＣＯＰＤ急速低下群と健常対照を類別する６マーカーシグネチャーの主成分を用いた二次元表示の線形判別分析（ＬＤＡ）からの出力である。使用した距離量は、変数間の分散と共分散を考慮に入れるマハラノビス距離である。各多変量平均は、表示付きの丸である。丸の大きさは、平均の９５％信頼限界に相当する。有意に異なる群は、交差しない丸を有する傾向にある。シグネチャー１は、以下の６個のマーカーから構成されている：アポリポタンパク質Ｈ、ＣＤ４０、ハプトグロビン、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、および腫瘍壊死因子受容体ＩＩ（ＴＮＦ−ＲＩＩ）。これらのマーカーの単変量分析により、ＣＤ４０（１．１５倍、ｐ＜０．５）を除いて、有意差が示された（ｐ＜０．０５；表３）。シグネチャー１は、血漿試料がＣＯＰＤ急速低下群に由来するものであることを９３％の症例（感度）で、血漿試料が健常対象に由来するものであることを８６％の症例（特異度）で正確に同定することができ、２つのグループを約９０％の全体精度で区別することが５０回繰り返しの５倍クロス確認によって示された。
【００９４】
次に、本発明者らは、シグネチャー１の縦断的安定性を検証することを望んだ。最初の試料を用いてシグネチャー１を同定してから約１年後に、２６人中９人のＣＯＰＤ急速低下群と２０人中５人の健常対照から血液試料を採取した。このシグネチャーは、９人全てのＣＯＰＤ急速低下群と５人中４人の健常対照を正確に同定し、約９３％の全体精度を示した（表６）。
【００９５】
ＬＤＡ法を用いて、本発明者らは、ＣＯＰＤ緩徐低下群と健常対照を正確に区別することができる２つ目の血漿マーカー群（シグネチャー２）も同定した（図２）。図２は、ＣＯＰＤ緩徐低下群と健常対照を類別する８マーカーシグネチャーの主成分を用いた二次元表示の線形判別分析（ＬＤＡ）からの出力である。シグネチャー２は、以下の８個のマーカーから構成されている：アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、ＣＤ４０、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ハプトグロビン、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）、組織因子、および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）。シグネチャー２は、９１％の感度と９６％の特異度を有し、緩徐低下群と対照を約９４％の全体精度で区別することが５０回繰り返しの５倍クロス確認によって示された（表６）。
【００９６】
最後に、本発明者らは、ＣＯＰＤ急速低下群と緩徐低下群を正確に区別することができる３つ目の血漿マーカー群（シグネチャー３）を同定した（図２Ｃ）。図２Ｃは、ＣＯＰＤ緩徐低下群と急速低下群を類別する９マーカーシグネチャーの主成分を用いた二次元表示の線形判別分析（ＬＤＡ）からの出力である。シグネチャー３は、以下の９個のマーカーから構成されている：α１−アンチトリプシン、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フィブリノゲン、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、組織因子、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ（ＴＮＦ−ＲＩＩ）、および可溶性血管細胞接着分子−１（ｓＶＣＡＭ−１）。シグネチャー３は、血漿試料がＣＯＰＤ急速低下群に由来するものであることを９５％の症例で、血漿試料がＣＯＰＤ緩徐低下群に由来するものであることを８６％の症例で正確に同定することができ、２つのグループを約９２％の全体精度で区別することが５０回繰り返しの５倍クロス確認によって示された（表６）。
【００９７】
表７に、ＬＤＡ分析から得られた、優れた感度と特異度を与える代表的なバイオマーカー組合せを記載する。Ｒ（Ｖｅｎａｂｌｅｓ，Ｗ．Ｎ．  ＆  Ｒｉｐｌｅｙ，Ｂ．Ｄ．，（２００２）．Ｍｏｄｅｒｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，第４版．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）の中のコントリビュートライブラリー（ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｄ  ｌｉｂｒａｒｙ）を用いて、様々なマーカー組合せの性能を評価するためのＬＤＡを行なった。Ｒの中のコントリビュートライブラリーを用いて、バイオマーカー組合せの性能メトリックの信頼できる推定値を得るための５倍クロス確認を行なった（Ａｎｄｒｅａ  ＰｅｔｅｒｓおよびＴｏｒｓｔｅｎ  Ｈｏｔｈｏｒｎ，２００４，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ，Ｒパッケージ  バージョン０．８〜３）。
【表７】
0005574990.tif 000008
【００９８】
考察。本研究において、本発明者らは、そのレベルが健常対照と比較してＣＯＰＤ患者で統計的に異なる血漿タンパク質を同定した。評価した８９個の血漿マーカーのうち、２５個が急速低下群と対照の間で統計的に異なっていた（ｐ＜０．０５）のに対し、４個のマーカーしか、緩徐低下群と対照の間で統計的に異なっていなかった（ｐ＜０．０５）。これらの単変量分析から、緩徐低下群と対照の間に存在する（わずか４個のマーカー、ｐ＜０．０５）統計的有意差よりも大きい統計的有意差が急速低下群と緩徐低下群の間に実際に存在する（１０個のマーカー、ｐ＜０．０５）ことが示された。本発明者らの知る限り、これは、この疾患の緩徐発現と急速発現をこのように大規模に血清学的に区別した最初の研究である。
【００９９】
α１−アンチトリプシン（Ａｌｄｏｎｙｔｅら，２００４，ＣＯＰＤ１：１５５−１６４）、エオタキシン（Ａｌｄｏｎｙｔｅら，２００４，前掲；Ｊａｎｈｚ−Ｒｏｚｙｋら，２０００，Ｐｏｌ．Ｍｅｒｋｕｒ．Ｌｅｋａｒｓｋｉ．９：６４９−６５２）、フィブリノゲン（Ｇａｎら，２００４，Ｔｈｏｒａｘ  ５９：５７４−５８０）、ＩＬ−４（Ｚｈａｎｇら，１９９９，Ｊ  Ｔｏｎｇｊｉ  Ｍｅｄ．Ｕｎｉｖ．１９：１５−１９）、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、およびＶＥＧＦ（Ｐｉｎｔｏ−Ｐｌａｔａら，２００７，Ｔｈｏｒａｘ  ６２：５９５−６０１）などの、急速低下群と対照の間で差を示すマーカーのうちのいくつかは、増悪していないＣＯＰＤ患者の血液中で調節されることが過去に報告されている。対照と比較して急速低下群で顕著に調節される２５個のマーカーのうち、可溶性のＴＮＦ−α受容体ＩＩ（ｓＴＮＦＲＩＩ）と可溶型の血管細胞接着分子−１（ｓＶＣＡＭ−１）の２個しか急速低下群で減少しない。興味深いことに、これらは両方とも、抗炎症タンパク質である。ｓＴＮＦＲＩＩが炎症促進性タンパク質ＴＮＦ−α（Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒら，２００４，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ，１１：２２０５−２２１２）を捕捉するのに対し、ｓＶＣＡＭ−１は、ＶＣＡＭ−１を担持する白血球がＶＣＡＭ−１リガンドであるα４β１インテグリンを発現する内皮細胞に接着するのを妨害する（Ｆｏｓｔｅｒ，１９９６，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９８：Ｓ２７０−Ｓ２７７）。
【０１００】
興味深いことに、対照よりも急速低下群で顕著に増大するマーカーのパネルの中には、好中球とマクロファージという、ＣＯＰＤに関与する２つの細胞型の活性を調節することが知られている、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−８、およびＭＣＰ−１などの走化性因子が存在している（Ｂａｒｎｅｓ，２００４，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ．５６：５１５−５４８）。より一層興味深いことに、そのリストの中には、Ｔｈ２／Ｔｃ２表現型と関連する、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、およびエオタキシンなどのいくつかのメディエーターが存在している。このことは、ＣＯＰＤ患者の肺に存在するＴリンパ球が、健常喫煙者由来のＴリンパ球よりも顕著に多いＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３を産生するという最近の研究報告と一致する（Ｂａｒｃｅｌｏら，２００６，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：４７４−４７９）。この観察は、より重篤な種類の疾患において喘息とＣＯＰＤの間に重複があることを示唆する仮説を支持する（Ｊｅｆｆｅｒｙ，Ｐｅｔｅｒ  Ｋ．“Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ．”  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｔｏ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，第２３４巻．  Ｄｅｒｅｋ  Ｃｈａｄｗｉｃｋ  ＆  Ｊａｍｉｅ  Ａ．Ｇｏｏｄｅ編．Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ：Ｗｉｌｅｙ，２００１．１４９−１６８）。
【０１０１】
ＣＯＰＤは、多くの他の慢性疾患と同様に、表現型の発現が遺伝的要因と環境要因によって影響される不均一性の高い疾患であると考えられている。このため、単変量分析を行なったときに、各血漿マーカーについて群内変動性が観測されることが予想される。ＣＯＰＤと対照から得られた血清中マーカーを単変量分析した後の類似の変動性が別のグループによって最近記載された（Ｐｉｎｔｏ−Ｐｌａｔａら，２００７，前掲）。このような状況において、各々の個々の血漿マーカーは、健常人由来の試料と緩徐型または急速型のいずれかのＣＯＰＤ患者を正確に区別する限られた能力しか持たない。多変量分析における複数のマーカーの組合せは、こうした群内不均一性を考慮に入れる。多変量分析により、急速低下群と健常対照を約９０％の精度で区別することができる６マーカーシグネチャーが同定された。重要なことは、約１年後に同じコホートから得られた試料を分析したとき、これらの同じ６個のマーカーを用いて類似の結果が得られたということであり、これによって、このシグネチャーが縦断的に安定であり、したがって、臨床的に有用である可能性があることが示唆される。このシグネチャーは、ＣＯＰＤの特徴となる炎症において役割を果たすことが推定される、ＩＬ−８やＭＣＰ−１などの、好中球と単球に対する走化性因子（Ｂａｒｎｅｓ，２００４，前掲）；慢性腎不全（Ｓｃｈｗａｂｅら，１９９９，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：１５３−１５８）、慢性肝疾患（Ｓｃｈｍｉｌｏｖｉｔｚ−Ｗｅｉｓｓら，２００４，Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ９：２０５−２１０）、アルツハイマー病（Ｍｏｃａｌｉら，２００４，Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．３９：１５５５−１５６１）、および全身性硬化症（Ｋｏｍｕｒａら，２００７，Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．３４：３５３−３５８）の患者で上昇することが過去に報告されているＣＤ４０と命名された表面糖タンパク質の血中可溶形態；抗酸化特性と抗炎症特性を有する急性期タンパク質であるハプトグロビン（ＺｖｉおよびＬｅｖｙ，２００６，Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．５２：２９−３５）；抗炎症性ｓＴＮＦＲＩＩ；ならびに血液凝固、止血、および抗リン脂質抗体の産生を含む、種々の生理的経路に関与する血漿糖タンパク質であるアポリポタンパク質Ｈ（ＭｃＮｅｉｌら，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：４１２０−４１２４）から構成される。
【０１０２】
ｓＣＤ４０とハプトグロビンは、緩徐低下群と対照を約９４％の精度で区別することができる８個の血漿マーカーからなる群の一部でもある。このシグネチャーには、３つの他のサイトカイン／ケモカイン、すなわち、安定なＣＯＰＤ患者と増悪したＣＯＰＤ患者から得られる気管支肺胞洗浄液中に高いレベルで見られる、好中球の生存と活性の調節因子であるＧＭ−ＣＳＦ（Ｂａｌｂｉら，１９９７，Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．１０：８４６−８５０）；好中球と単球に対する走化性因子であるＭＩＰ１−α（Ｂａｒｎｅｓ，２００４，前掲）、およびＣＯＰＤに関与し（Ｂａｒｎｅｓ，２００４，前掲）、安定なＣＯＰＤ患者の血中により高いレベルで見られる（Ｇａｎら，２９９４，前掲）サイトカインである、ＴＮＦ−αも含まれる。ＣＯＰＤ緩徐低下群のシグネチャーは、リポタンパク質代謝の調節因子であるアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（Ｓｈａｃｈｔｅｒ，２００１，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．１２：２９７−３０４）；過去に抗リン脂質抗体と関連付けられている血中免疫グロブリンのサブタイプであるＩｇＡ（Ｓｔａｕｂら，２００６，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．Ｒｅｖ．６：１０４−１０６）；および抗リン脂質抗体の存在と血栓閉塞性合併症を特徴とする抗リン脂質症候群の患者で上昇することが分かっている凝固因子である可溶性組織因子（ｓＴＦ）によって完成となる。
【０１０３】
急速ＣＯＰＤ低下群対緩徐ＣＯＰＤ低下群のシグネチャーは、９個の血漿マーカーから構成される。これらのマーカーのうちの３つ、α１−アンチトリプシン、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、およびフィブリノゲンは、ＣＯＰＤ患者において調節されることが広く報告されている（Ｇａｎら，２００４，前掲；ＲａｎｅｓおよびＳｔｏｌｌｅｒ，２００５，Ｓｅｍｉｎ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２６：１５４−１６６）。３つの他のマーカーは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、およびマクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）という、サイトカイン／ケモカインである。ＧＭ−ＣＳＦは、緩徐低下群のシグネチャーにも含まれており、上で考察されている。ＩＬ−４は、単変量分析において緩徐低下群や対照と比較して急速低下群で最も顕著に増大したマーカーである。ＭＤＣ（ＣＣＬ２２）は、ＩＬ−４によって上方調節されることが示されており、Ｔｈ２細胞の炎症部位への動員に重要な役割を果たしている（Ｇａｎら，２００４，前掲；ＹａｍａｓｈｉｔａおよびＫｕｒｏｄａ，２００２，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１０５−１１４）。このシグネチャーは、上記のｓＴＦ、ｓＴＮＦＲＩＩ、およびｓＶＣＡＭ−１をもって完成となる。
【０１０４】
対照と緩徐ＣＯＰＤ低下群と急速ＣＯＰＤ低下群を区別する単一のシグネチャーを同定するという試みからは、８２％を超える精度が得られなかった。急速ＣＯＰＤ低下群または緩徐ＣＯＰＤ低下群と対照を正確に区別する明確なシグネチャーの必要性と、急速ＣＯＰＤ低下群と緩徐ＣＯＰＤ低下群を正確に区別するシグネチャーを発見することができるという事実とによって、ＣＯＰＤにおける肺機能低下速度と関連がある基本的な生化学的違いが存在することが示唆される。本発明者らの知る限り、本研究は、緩徐低下型のＣＯＰＤと急速低下型のＣＯＰＤを区別する血漿マーカーを記載した最初の研究である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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