(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣＲ法によるアレルギー物質の検出方法であって、
遺伝子配列中のＣＯ１（cytochrome oxidase subunit 1）領域の塩基配列からなり、あわび、いか、さば、又はいくら／さけを検出するプライマーと、遺伝子配列中のＲｕｂｉｓＣＯ（ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase）領域の塩基配列からなり、くるみを検出するプライマーのいずれかを用い、
前記プライマーとして、
あわびを検出するためのプライマーであって、配列表の配列番号１及び２の塩基配列からなるプライマーセット、
いかを検出するためのプライマーであって、配列表の配列番号３及び４の塩基配列からなるプライマーセット、
さばを検出するためのプライマーであって、配列表の配列番号５及び６の塩基配列からなるプライマーセット、
いくら／さけを検出するためのプライマーであって、配列表の配列番号７及び８の塩基配列からなるプライマーセット、
くるみを検出するためのプライマーであって、配列表の配列番号１３及び１４の塩基配列からなるプライマーセット、
を含むことを特徴とするアレルギー物質の検出方法。
【請求項２】
ＰＣＲ法によるアレルギー物質の検出に用いるプライマーであって、
遺伝子配列中のＣＯ１（cytochrome oxidase subunit 1）領域の塩基配列からなり、あわび、いか、さば、又はいくら／さけを検出するプライマーと、遺伝子配列中のＲｕｂｉｓＣＯ（ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase）領域の塩基配列からなり、くるみを検出するプライマーのいずれかからなり、
前記プライマーは、
あわびを検出するためのプライマーであって、配列表の配列番号１及び２の塩基配列からなるプライマーセット、
いかを検出するためのプライマーであって、配列表の配列番号３及び４の塩基配列からなるプライマーセット、
さばを検出するためのプライマーであって、配列表の配列番号５及び６の塩基配列からなるプライマーセット、
いくら／さけを検出するためのプライマーであって、配列表の配列番号７及び８の塩基配列からなるプライマーセット、
くるみを検出するためのプライマーであって、配列表の配列番号１３及び１４の塩基配列からなるプライマーセット、
を含むことを特徴とするアレルギー物質の検出に用いるプライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギー物質の検出方法及びアレルギー物質の検出に用いるプライマーに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来より、特定の物質によってアレルギー体質の人がアレルギーを起こすおそれがあることが知られており、そのような物質はアレルギー物質として広く知られている。
【０００３】
このアレルギー物質について、日本では、小麦、そば、卵、乳、及び落花生の５品目を「特定原材料」として定め、これらを含む食品についてはその旨を商品に表示することが義務付けられており、また、特定原材料以外のあわび、いか、えび、かに、さけ、さば、鶏肉、豚肉、いくら、牛肉、ゼラチン、オレンジ、キウイフルーツ、くるみ、大豆、まつたけ、もも、やまいも、りんご及び、バナナの２０品目を「特定原材料」に準ずるもの（以下、「準特定原材料」という。）として、これらを含む食品についてはその旨を可能な限り商品に表示することが推奨されている。
【０００４】
このように「特定原材料」や「準特定原材料」などのアレルギー物質については、生産・流通・加工などの各段階において不意に微量の混入が起こることも考えられるために、提供する食品原料や製品にアレルギー物質が含有されていないか否かの品質管理が重要となり、そのための検出方法の確立が望まれている。
【０００５】
アレルギー物質のうちの「特定原材料」については、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロッド法、ＰＣＲ法などを用いた検出方法が確立されている。
【０００６】
また、アレルギー物質のうちの「準特定原材料」については、たとえば、特許文献１に鶏肉、豚肉、牛肉の検出方法が開示されており、特許文献２、３にそば、落花生、小麦、大豆の検出方法が開示されており、特許文献４、５にキウイフルーツ、くるみ、りんご、やまいも、バナナの検出方法が開示されており、さらには、特許文献６、７にさば、さけ、あわび、いか、かに、えびの検出方法が開示されている。
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−２３０３８３号公報
【特許文献２】特開２００３−１９９５９９号公報
【特許文献３】特開２００１−３０９７８６号公報
【特許文献４】特開２００６−３３３７２９号公報
【特許文献５】特開２００７−２８２６２６号公報
【特許文献６】特開２００６−２８０２８１号公報
【特許文献７】特開２００８−０００１２８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
様々な加工処理工程を経た食品原料や製品中から検出対象生物を検出する場合、「特定原材料」の検出方法で確立されているように、検出対象生物に特徴的な蛋白質を検出する方法（ＥＬＩＳＡ法やウェスタンブロッド法）や検出対象生物に特徴的なＤＮＡ塩基配列を検出する方法（ＰＣＲ法）が有望な手法となる。
【０００９】
しかしながら、一般に、蛋白質は、ＤＮＡと比べて、食品製造工程における様々な加工処理に対する安定性が低いため、蛋白質を検出する方法は、高度に加工された被験食品に対しては適用できない可能性が高い。
【００１０】
そのため、蛋白質よりも加工処理に比較的強いとされるＤＮＡの塩基配列を標的とした検出方法は、様々な加工処理工程を経た食品原料や製品中から検出対象生物の混入の有無を調べる手法として、有望な方法と考えられる。また、動植物のＤＮＡ塩基配列には、ｒＲＮＡ遺伝子クラスターのようにコピー数の多い塩基配列が存在し、このような多コピー数の塩基配列を標的配列に使用できれば、検出方法の感度を高めることも可能となる。さらに、細胞中に複数存在するクロロプラスト由来ＤＮＡあるいはミトコンドリア由来ＤＮＡの塩基配列を標的配列とする場合も、同様に検出方法の感度の向上化に寄与する。
【００１１】
また、アレルギー物質を含む食品の検出方法は、多くの場合に加工食品を対象に用いられるために、交差反応性（類似物質、代謝物、マトリクス中に存在する可能性のある成分への反応性）について、十分な検証を行わなければならない。
【００１２】
そこで、本発明では、アレルギー物質のうちの「準特定原材料」に含まれるあわび、いか、さば、いくら／さけ、りんご、バナナ、くるみ、ももを食品原料や製品中から特異的に検出できるＰＣＲ法を用いた検出方法、及びこの検出方法に用いるプライマーやプライマーセット、さらには、検出キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するために、請求項１に係る本発明では、ＰＣＲ法によるアレルギー物質の検出方法において、遺伝子配列中のＣＯ１（cytochrome oxidase subunit 1）領域の塩基配列からなり、あわび、いか、さば、又はいくら／さけを検出するプライマーと、遺伝子配列中のＲｕｂｉｓＣＯ（ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase）領域の塩基配列からなり、くるみを検出するプライマーのいずれかを用いることにした。
【００１４】
また、請求項１に係る本発明では、前記プライマーとして、あわびを検出するためのプライマーであって、配列表の配列番号１及び２の塩基配列からなるプライマーセット、いかを検出するためのプライマーであって、配列表の配列番号３及び４の塩基配列からなるプライマーセット、さばを検出するためのプライマーであって、配列表の配列番号５及び６の塩基配列からなるプライマーセット、いくら／さけを検出するためのプライマーであって、配列表の配列番号７及び８の塩基配列からなるプライマーセット、くるみを検出するためのプライマーであって、配列表の配列番号１３及び１４の塩基配列からなるプライマーセットを含むことにした。
【００１５】
また、請求項２に係る本発明では、ＰＣＲ法によるアレルギー物質の検出に用いるプライマーにおいて、遺伝子配列中のＣＯ１（cytochrome oxidase subunit 1）領域の塩基配列からなり、あわび、いか、さば、又はいくら／さけを検出するプライマーと、遺伝子配列中のＲｕｂｉｓＣＯ（ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase）領域の塩基配列からなり、くるみを検出するプライマーのいずれかからなることにした。
【００１６】
また、請求項２に係る本発明では、前記プライマーは、あわびを検出するためのプライマーであって、配列表の配列番号１及び２の塩基配列からなるプライマーセット、いかを検出するためのプライマーであって、配列表の配列番号３及び４の塩基配列からなるプライマーセット、さばを検出するためのプライマーであって、配列表の配列番号５及び６の塩基配列からなるプライマーセット、いくら／さけを検出するためのプライマーであって、配列表の配列番号７及び８の塩基配列からなるプライマーセット、くるみを検出するためのプライマーであって、配列表の配列番号１３及び１４の塩基配列からなるプライマーセットを含むことにした。
【発明の効果】
【００１９】
そして、本発明では、ＰＣＲ法を用いてアレルギー物質のうちの「準特定原材料」に含まれるあわび、いか、さば、いくら／さけ、りんご、バナナ、くるみ、ももを食品原料や製品中から特異的に検出することができる。
【００２０】
特に、配列表の配列番号１又は２の塩基配列からなるプライマー、又は、配列表の配列番号１及び２の塩基配列からなるプライマーセットを用いた場合には、あわびを特異的に検出することができる。
【００２１】
また、配列表の配列番号３又は４の塩基配列からなるプライマー、又は、配列表の配列番号３及び４の塩基配列からなるプライマーセットを用いた場合には、いかを特異的に検出することができる。
【００２２】
また、配列表の配列番号５又は６の塩基配列からなるプライマー、又は、配列表の配列番号５及び６の塩基配列からなるプライマーセットを用いた場合には、さばを特異的に検出することができる。
【００２３】
また、配列表の配列番号７又は８の塩基配列からなるプライマー、又は、配列表の配列番号７及び８の塩基配列からなるプライマーセットを用いた場合には、いくら／さけを特異的に検出することができる。
【００２４】
また、配列表の配列番号９又は１０の塩基配列からなるプライマー、又は、配列表の配列番号９及び１０の塩基配列からなるプライマーセットを用いた場合には、りんごを特異的に検出することができる。
【００２５】
また、配列表の配列番号１１又は１２の塩基配列からなるプライマー、又は、配列表の配列番号１１及び１２の塩基配列からなるプライマーセットを用いた場合には、バナナを特異的に検出することができる。
【００２６】
また、配列表の配列番号１３又は１４の塩基配列からなるプライマー、又は、配列表の配列番号１３及び１４の塩基配列からなるプライマーセットを用いた場合には、くるみを特異的に検出することができる。
【００２７】
また、配列表の配列番号１５又は１６の塩基配列からなるプライマー、又は、配列表の配列番号１５及び１６の塩基配列からなるプライマーセットを用いた場合には、ももを特異的に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下に、本発明に係るアレルギー物質の検出方法、アレルギー物質の検出に用いるプライマー、及びアレルギー物質の検出に用いる検出キットの具体的な内容について説明する。
【００２９】
本発明者らは、分子生物学的観点から、検出対象とする植物及びその他の生物の遺伝子配列における共通性と特異性に着目し、２０品目の準特定原材料の中から、あわび、いか、さば、いくら／さけ、りんご、バナナ、くるみ、あるいはももを高感度に検出することができる方法を鋭意研究した。
【００３０】
本発明では、前述のとおり高感度な検出方法を開発するために、細胞中に複数存在するクロロプラスト由来ＤＮＡあるいはミトコンドリア由来ＤＮＡの塩基配列を標的とした。さらに、その中でも数多くの塩基配列が既に報告されている領域、具体的には魚介類におけるＣＯ１（cytochrome  oxidase  subunit  1）領域及び、植物のＲｕｂｉｓＣＯ（ribulose-1,5-bisphosphate  carboxylase/oxygenase）領域に着目した。
【００３１】
一般に、ＰＣＲ法のためのプライマー開発においては、理論上、首尾よく設計したとしても、必要な性能を示すプライマーを得るためには一定の試行錯誤を要することが知られている。したがって、より確実に高性能なプライマーを設計する必要があり、そのための工夫として、混合プライマーによる検出方法を検討した。混合プライマーによる検出方法は、特に検出対象が広範囲の生物属である場合、つまり上記課題の場合に特に有効であることが期待される。混合プライマーによる検出方法を採用した結果、過度な試行錯誤を要することなく、あわび、いか、さば、いくら／さけ、りんご、バナナ、くるみ、あるいはももについて十分な性能をもつ検出マーカーが作出できることを知見した。
【００３２】
［プライマー及びプライマーセット］
本発明に係るプライマー及びプライマーセットには、あわびに対して特徴的な塩基配列を有するもの、いかに対して特徴的な塩基配列を有するもの、さばに対して特徴的な塩基配列を有するもの、いくら／さけに対して特徴的な塩基配列を有するもの、りんごに対して特徴的な塩基配列を有するもの、バナナに対して特徴的な塩基配列を有するもの、くるみに対して特徴的な塩基配列を有するもの、及びももに対して特徴的な塩基配列を有するものがある。
【００３３】
各プライマー及びプライマーセットは、以下のようにして設計した。即ち、あわび、いか、さば及びいくら／さけのＣＯ１（cytochrome  oxidase  subunit  1）領域、りんご、バナナ及びもものＲｕｂｉｓＣＯ（ribulose-1,5-bisphosphate  carboxylase/oxygenase）領域それぞれについて、既知のＤＮＡデータベース（GenBank  nucleotide  sequence  database）から取得した。それぞれ近縁種について厖大な塩基配列の多重並列配列図を作成後、それらの塩基配列の類似性や特異性等の性状を詳細に比較検討することによって、あわび、いか、さば、いくら／さけ、りんご、バナナ、くるみ、及びももの各々に特異的な当該遺伝子配列領域を選出し、それらの領域からプライマー及びプライマーセットを新規に設計した。設計の際には、検出目的とする複数の生物種の当該遺伝子配列領域とそれぞれ完全に一致するものを含む混合プライマーであり、検出目的としない生物種とはストリンジェントな条件下でハイブリダイズしないように創意工夫して設計した。
【００３４】
本発明に係るプライマー又はプライマーセットを用いたＰＣＲ法による分析では、対象となる試料が加工品である場合も想定される。加工品を分析する場合、ＤＮＡが分解または、断片化している可能性があるので、100〜500bp程度の短めのＰＣＲ増幅産物を形成するようなＰＣＲプライマーが、高感度分析のために好ましい。それ故に、ＰＣＲプライマーの設計の際には、ＰＣＲ増幅産物の長さが500bp以下となるように工夫して設計した。
【００３５】
従って、本発明に係るプライマー又はプライマーセットを用いたＰＣＲ法、及びそれによる増幅産物を確認する核酸分析の手法は、各種食品中に含まれるあわび、いか、さば、いくら／さけ、りんご、バナナ、くるみ及びもも由来ＤＮＡを高感度かつ特異的に検出することができる。
【００３６】
ここで、核酸分析とは、生物分類における、個々の種、属、あるいは、グループによって特徴的な塩基配列が存在することを利用して、その特徴的な塩基配列の有無を分析することによって、その生物の種、属、あるいは、グループを把握するために有効な手段であって、特定の微生物の検出や生物種の同定などに有用に用いられる方法である。
【００３７】
本発明に係るプライマーの塩基配列は以下のいずれかである（詳細は、配列表による。）。Ｓはセンスプライマーを表し、ＡＳはアンチセンスプライマーを表す。
配列番号１（あわび用Ｓ）：AAYTGRYTRGTMCCYYTAATAYTRGGWGCA
配列番号２（あわび用ＡＳ）：TGGYATTCGYTCTARRGGYTGTG
配列番号３（いか用Ｓ）：ACMACYATYHTWAATATACGVTGAGAAGGYY
配列番号４（いか用ＡＳ）：TGDGADACAATRTGWGAAATAATACCAAANG
配列番号５（さば用Ｓ）：TMGTHCCCTTCYTMCACNCATNYAAACAA
配列番号６（さば用ＡＳ）：GGACTAGGAAYARNGAGNAGTNGAGKACA
配列番号７（いくら／さけ用Ｓ）：GCYCTYCTRGGRRATGAYCARATYTAYAAC
配列番号８（いくら／さけ用ＡＳ）：GGNGGAGRAGTCARAARCTTATG
配列番号９（りんご用Ｓ）：TTGATCGGTTAATTCAATAAGAAATAGGCC
配列番号１０（りんご用ＡＳ）：CACTTGATGTTTTGAAAATGGGTTTTSG
配列番号１１（バナナ用Ｓ）：AAATTGACTTATTATACTCCTGACTACCG
配列番号１２（バナナ用ＡＳ）：ATCAAGACTGGTAAGTCCATCG
配列番号１３（くるみ用Ｓ）：GATAGACAGAAGAATCATRGTRAAC
配列番号１４（くるみ用ＡＳ）：GGTGCCCTAAAGTYSGTCCA
配列番号１５（もも用Ｓ）：ACCGTTTCTTATTTTGTGCCGAAGCAA
配列番号１６（もも用ＡＳ）：TCTCTGGCAAATACAGCTCTTTTCATCATA
【００３８】
また、本発明に係るプライマーセットは、配列番号１の塩基配列からなるプライマー（あわび用Ｓ）と配列番号２の塩基配列からなるプライマー（あわび用ＡＳ）とのセット（あわび用プライマーセット）；配列番号３の塩基配列からなるプライマー（いか用Ｓ）と配列番号４の塩基配列からなるプライマー（いか用ＡＳ）とのセット（いか用プライマーセット）；配列番号５の塩基配列からなるプライマー（さば用Ｓ）と配列番号６の塩基配列からなるプライマー（さば用ＡＳ）とのセット（さば用プライマーセット）；配列番号７の塩基配列からなるプライマー（いくら／さけ用Ｓ）と配列番号８の塩基配列からなるプライマー（いくら／さけ用ＡＳ）とのセット（いくら／さけ用プライマーセット）；配列番号９の塩基配列からなるプライマー（りんご用Ｓ）と配列番号１０の塩基配列からなるプライマー（りんご用ＡＳ）とのセット（りんご用プライマーセット）；配列番号１１の塩基配列からなるプライマー（バナナ用Ｓ）と配列番号１２の塩基配列からなるプライマー（バナナ用ＡＳ）とのセット（バナナ用プライマーセット）；配列番号１３の塩基配列からなるプライマー（くるみ用Ｓ）と配列番号１４の塩基配列からなるプライマー（くるみ用ＡＳ）とのセット（くるみ用プライマーセット）；配列番号１５の塩基配列からなるプライマー（もも用Ｓ）と配列番号１６の塩基配列からなるプライマー（もも用ＡＳ）とのセット（もも用プライマーセット）である。
【００３９】
［検出方法］
本発明に係る検出方法は、試料からＤＮＡを抽出する工程と、このＤＮＡを鋳型として、上記説明した本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程と、増幅されたＤＮＡを検出することにより試料中にあわび、あわび、いか、さば、いくら／さけ、りんご、バナナ、くるみ及びももが存在しているか否かを検出する工程とを含む方法である。
【００４０】
即ち、上記本発明に係るプライマー又はプライマーセットを用いて、試料中のＤＮＡをＰＣＲ等で核酸分析することにより、試料中の特定植物を特異的に検出することが可能となる。このとき、あわびを検出する場合には、あわび用センスプライマー、あわび用アンチセンスプライマー、又はあわび用プライマーセットを使用する。いかを検出する場合には、いか用センスプライマー、いか用アンチセンスプライマー、又はいか用プライマーセットを使用する。さばを検出する場合には、さば用センスプライマー、さば用アンチセンスプライマー、又はさば用プライマーセットを使用する。いくら／さけを検出する場合には、いくら／さけ用センスプライマー、いくら／さけ用アンチセンスプライマー、又はいくら／さけ用プライマーセットを使用する。りんごを検出する場合には、りんご用センスプライマー、りんご用アンチセンスプライマー、又はりんご用プライマーセットを使用する。バナナを検出する場合には、バナナ用センスプライマー、バナナ用アンチセンスプライマー、又はバナナ用プライマーセットを使用する。くるみを検出する場合には、くるみ用センスプライマー、くるみ用アンチセンスプライマー、又はくるみ用プライマーセットを使用する。ももを検出する場合には、もも用センスプライマー、もも用アンチセンスプライマー、又はもも用プライマーセットを使用する。
【００４１】
検出方法（核酸分析）の種類は、特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、ＰＣＲ増幅産物をアガロース電気泳動で検出する方法、ＰＣＲ増幅産物を蛍光検出する方法、ＰＣＲ増幅産物をプローブで検出する方法等を例示することができる。
【００４２】
ＰＣＲ増幅産物をアガロース電気泳動で検出する方法とは、検出目的に応じて選択した上記本発明の特定植物検出用プライマーセットを用いて、試料中のＤＮＡにおける標的塩基配列を選択的に増幅させ、ＰＣＲ増幅産物の有無をアガロース電気泳動によって検出する方法である。ＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドやサイバーグリーンIなどの核酸染色によって行うことができる。
【００４３】
ＰＣＲ増幅産物を蛍光検出する方法とは、リアルタイムＰＣＲ装置を用いてＰＣＲを行い、その装置の検出システムにより自動的にＰＣＲ増幅産物の有無を確認する方法である。例えば、ＰＣＲ反応液中にサイバーグリーンIを添加した場合、サイバーグリーンIが二本鎖ＤＮＡに結合したときに発する蛍光量に依存したＰＣＲ増幅産物量をサイクル毎にモニターすることができる。
【００４４】
具体的には、配列番号１のプライマーと配列番号２のプライマーを用いたＰＣＲ増幅産物のサイズは約308bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にあわびが存在していたことを示唆する。
【００４５】
また、配列番号３のプライマーと配列番号４のプライマーを用いたＰＣＲ増幅産物のサイズは約280bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にいかが存在していたことを示唆する。
【００４６】
また、配列番号５のプライマーと配列番号６のプライマーを用いたＰＣＲ増幅産物のサイズは約186bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にさばが存在していたことを示唆する。
【００４７】
また、配列番号７のプライマーと配列番号８のプライマーを用いたＰＣＲ増幅産物のサイズは約190bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にいくら／さけが存在していたことを示唆する。
【００４８】
また、配列番号９のプライマーと配列番号１０のプライマーを用いたＰＣＲ増幅産物のサイズは約143bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にりんごが存在していたことを示唆する。
【００４９】
また、配列番号１１のプライマーと配列番号１２のプライマーを用いたＰＣＲ増幅産物のサイズは約174bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にが存在していたことを示唆する。
【００５０】
また、配列番号１３のプライマーと配列番号１４のプライマーを用いたＰＣＲ増幅産物のサイズは約324bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にが存在していたことを示唆する。
【００５１】
また、配列番号１５のプライマーと配列番号１６のプライマーを用いたＰＣＲ増幅産物のサイズは約130bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にが存在していたことを示唆する。
【００５２】
ＰＣＲ増幅産物をプローブで検出する方法としては、Taq Man法に代表されるように、ＰＣＲ増幅産物の内部塩基配列とハイブリダイズするような蛍光物質標識プローブを反応液に添加し、該プローブがＰＣＲ増幅産物にハイブリダイズ後、該プローブが分解されるときに生じる蛍光量をリアルタイムＰＣＲ装置で自動的に検出することによって、ＰＣＲ増幅産物の有無を確認する方法が挙げられる。この他にも、ＰＣＲ増幅産物をプローブで検出する方法として、Molecular  Beacon法、CycleaveＰＣＲ法、ハイブリプローブを利用する方法等が挙げられる。これらの方法で使用するＰＣＲプライマーは、本発明に係るプライマー又はプライマーセットのいずれかを使用すればよく、各々のプライマー又はプライマーセットで増幅されるＰＣＲ増幅産物の内部塩基配列から標的とする生物種に共通な塩基配列領域を別途選択し、その領域に基づいたプローブを使用すればよい。
【００５３】
なお、本発明に係る検出方法において、対象となる被験試料の種類は、特に限定されない。例えば、被験試料としては、食品原料や加工食品等が挙げられる。食品原料としては、特定植物を取り扱う食品原料生産工場において、別途生産される特定植物を意図的に含まない食品原料が挙げられる。加工食品としては、菓子類、麺類、粉末スープ、液体スープ、熱風乾燥又は凍結乾燥した具材、あるいは、これらの加工食品を含有する各種調理食品等が挙げられる。また、特定植物を取り扱う食品製造工場において、別途生産される特定植物を意図的に含まない加工食品が挙げられる。また、特定植物を含む加工食品を製造後、特定植物を含まない加工食品を製造する際には、特定植物残渣の除去を念頭においた食品製造設備の入念な清掃作業が必須となる。この清掃作業方法の有効性、並びに、食品製造設備の特定植物残渣の有無を確認する観点から、当該製造設備の拭き取り試料も被験試料として挙げられる。
【００５４】
また、試料の形態も特に限定されず、一般的な既知のＤＮＡ抽出法や市販の各種ＤＮＡ抽出キット［例えば、Nucleon PhytoPure, plant and fungal ＤＮＡ
extraction kits（Amersham Biosciences Corp., USA）、ＤＮＡ Extraction IsoplantII kit（Nippon Gene Co.
Ltd., Japan）、DNeasy Plant Mini Kit（Qiagen GmbH, Hilden, Germany）等］によって、ＤＮＡの回収が可能な試料であれば、上記の検出方法に適用することができる。上記のＤＮＡ抽出法によって、ゲノムＤＮＡ及び細胞小器官由来ＤＮＡ（ミトコンドリアＤＮＡやクロロプラストＤＮＡ）を、通常、試料から抽出することができる。
【００５５】
［検出キット］
本発明に係る検出キットは、上記説明した本発明に係るプライマー又はプライマーセットのいずれかを含んで成るものであれば、その構成は特に限定されない。
【００５６】
具体的には、配列番号１の塩基配列からなるプライマー（あわび用Ｓ）；配列番号２の塩基配列からなるプライマー（あわび用ＡＳ）；配列番号１の塩基配列からなるプライマー（あわび用Ｓ）と配列番号２の塩基配列からなるプライマー（あわび用ＡＳ）とのセット（あわび用プライマーセット）；配列番号３の塩基配列からなるプライマー（いか用Ｓ）；配列番号４の塩基配列からなるプライマー（いか用ＡＳ）；配列番号３の塩基配列からなるプライマー（いか用Ｓ）と配列番号４の塩基配列からなるプライマー（いか用ＡＳ）とのセット（いか用プライマーセット）；配列番号５の塩基配列からなるプライマー（さば用Ｓ）；配列番号６の塩基配列からなるプライマー（さば用ＡＳ）；配列番号５の塩基配列からなるプライマー（さば用Ｓ）と配列番号６の塩基配列からなるプライマー（さば用ＡＳ）とのセット（さば用プライマーセット）；配列番号７の塩基配列からなるプライマー（いくら／さけ用Ｓ）；配列番号８の塩基配列からなるプライマー（いくら／さけ用ＡＳ）；配列番号７の塩基配列からなるプライマー（いくら／さけ用Ｓ）と配列番号８の塩基配列からなるプライマー（いくら／さけ用ＡＳ）とのセット（いくら／さけ用プライマーセット）；配列番号９の塩基配列からなるプライマー（りんご用Ｓ）；配列番号１０の塩基配列からなるプライマー（りんご用ＡＳ）；配列番号９の塩基配列からなるプライマー（りんご用Ｓ）と配列番号１０の塩基配列からなるプライマー（りんご用ＡＳ）とのセット（りんご用プライマーセット）；配列番号１１の塩基配列からなるプライマー（バナナ用Ｓ）；配列番号１２の塩基配列からなるプライマー（バナナ用ＡＳ）；配列番号１１の塩基配列からなるプライマー（バナナ用Ｓ）と配列番号１２の塩基配列からなるプライマー（バナナ用ＡＳ）とのセット（バナナ用プライマーセット）；配列番号１３の塩基配列からなるプライマー（くるみ用Ｓ）；配列番号１４の塩基配列からなるプライマー（くるみ用ＡＳ）；配列番号１３の塩基配列からなるプライマー（くるみ用Ｓ）と配列番号１４の塩基配列からなるプライマー（くるみ用ＡＳ）とのセット（くるみ用プライマーセット）；配列番号１５の塩基配列からなるプライマー（もも用Ｓ）；配列番号１６の塩基配列からなるプライマー（もも用ＡＳ）；配列番号１５の塩基配列からなるプライマー（もも用Ｓ）と配列番号１６の塩基配列からなるプライマー（もも用ＡＳ）とのセット（もも用プライマーセット）のいずれかを含む検出キットが挙げられる。
【００５７】
この検出キットには、上記の各々のプライマー又はプライマーセット、及び当該の各々のプライマー又はプライマーセットで増幅されるＰＣＲ増幅産物を検出するためのプローブ等が含まれていてもよい。さらに、この検出キットには、使用目的等に応じて、適当な試薬や各種容器等を含めることができる。具体的には、ＰＣＲプライマー伸長生成物を合成するための重合用試薬、例えば、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド、マグネシウム及び、ＰＣＲ反応用緩衝液、並びに、それらの品質を適切に保持可能な保存容器等を含めることができる。
【００５８】
［各プライマーセットの偽陽性、偽陰性の確認］
本発明に係るプライマーセットを使用したＰＣＲ分析法の有効性を確認するために、各種生物由来ＤＮＡに対するＰＣＲの偽陽性と偽陰性を調べる実験を、下記のように実施した。
【００５９】
準特定原材料の代表的な３種類及びその他一般的な生物種について市販品を入手し、各種生物由来の精製ＤＮＡは、各々の試料からQIAGEN DNeasy Plant Mini KitまたはQIAGEN
Genomic-Tip 20/Gを用いて調製したものを使用した。抽出方法は、食品衛生検査指針のアレルギー物質ＤＮＡ抽出精製法に従った。なお、いずれの精製ＤＮＡもＲＮＡ分解酵素によるＲＮＡの除去操作を実施してある。
【００６０】
配列番号１〜１６の各々のプライマーは、北海道システム・サイエンス社（Hokkaido System Science,Japan）で合成されたものを、以下のＰＣＲ法で使用した。
【００６１】
上述したように準備した各種生物のＤＮＡ量を測定後、滅菌水を用いて、ＤＮＡの濃度を20 ng/μLに調製した。ＰＣＲ用反応試料管に反応液を以下のように調製する。反応液は、1xＰＣＲ緩衝液（ＰＣＲ  bufferII,Applied  Biosystems,USA）、0.20nmol/ldNTP,1.5mmol/l塩化マグネシウム、0.2μmol/l  5’および3’プライマー、および0.625units  Taq  ＤＮＡポリメラーセ（AmpliTaqGold  ＤＮＡ  polymerase,Applied  Biosystems,USA）を含む液に、20ng/μlに調製したＤＮＡ試料液2.5μl（ＤＮＡとして50ng）を加え、全量を25μlにした。次に、その反応試料管をＰＣＲ増幅装置（GeneAmp  ＰＣＲ  System  9600,Applied  Biosystems,USA）にセットした。反応条件は次のとおりである。95℃に10分間保ち反応を開始させたのち、95℃0.5分間、各プライマーセットに最適のアニーリング温度0.5分間、72℃0.5分間を1サイクルとして、40サイクルのＰＣＲ増幅を行った。各プライマーセットのアニーリング温度は次のとおりである。配列番号1と2：55℃、配列番号3と4：45℃、配列番号5と6：60℃、配列番号7と8：60℃、配列番号9と10：65℃、配列番号11と12：50℃、配列番号13と14：50℃、配列番号15と16：50℃。次に終了反応として72℃で7分間保ったのち、4℃で保存し、得られた反応液をＰＣＲ増幅反応液とした。さらに、2.5%（w/v）アガロースゲル電気泳動によってＰＣＲ増幅産物（反応液の7.5μL）を分離し、分離後のゲルをエチジウムブロマイドで染色後、UV照射下において増幅産物を視覚化することによって、増幅産物の有無を確認した。分子量マーカーとして100bp  ＤＮＡ  Ladder（TOYOBO,Japan）を使用した。
【００６２】
これらのＰＣＲの結果を表１に示す。表中の＋（プラス）は電気泳動により標的サイズの増幅産物が検出されたことを示し、−（マイナス）は当該増幅産物が検出されなかったことを示す。
【表１】
0005611510.tif 000002
【００６３】
［プライマーセットを用いた検出限界の確認］
本発明に係るプライマーセットを用いたＰＣＲ法の検出感度を調べるために、下記のような実験を実施した。
【００６４】
クロアワビ、スルメイカ、マサバ、シロザケ、リンゴ（フジ）、バナナ（ジャイアント・キャベンディッシュ）、オニグルミ及びもも（白鳳）の可食部約50gをフードカッターで均質化処理し、準特定原材料試料とした。これら準特定原材料試料について、上記抽出法で精製ＤＮＡ液を調製した。精製ＤＮＡ液のＤＮＡ濃度を20ng/μlに調製した後、滅菌水を用いて400pg/μl、40pg/μl、4pg/μl、0.4pg/μlのＤＮＡ溶液の希釈系列を作製した。これら被験ＤＮＡ液の2.5μlを、上記ＰＣＲ反応条件でＰＣＲ法に供した。
【００６５】
ＰＣＲ反応後、上記したように、増幅産物の有無をアガロースゲル電気泳動によって確認した。これらのＰＣＲ法の結果を表２及び図１に示す。表中の＋（プラス）は電気泳動により標的サイズの増幅産物が検出されたことを示し、−（マイナス）は当該増幅産物が検出されなかったことを示す。
【００６６】
【表２】
0005611510.tif 000003
【００６７】
表２に示すように、準特定原材料（あわび、さば、いくら／さけ、りんご、バナナ、クルミ及びもも）検出用ＰＣＲプライマーを使用した場合の検出限界は、あわび：100pg  DNA/分析、いか：100pg  DNA/分析、さば：100pg  DNA/分析、いくら／さけ：10pg  DNA/分析、リンゴ：1000pg  DNA/分析、バナナ：1000pg  DNA/分析、クルミ：100pg  DNA/分析および、もも：1000pg  DNA/分析であった。
【００６８】
以上に説明したように、本発明によれば、ＰＣＲ法を用いた核酸分析による精度及び検出感度の高いあわび、いか、さば、いくら／さけ、りんご、バナナ、くるみ、あるいはももの検知を可能とし、上記アレルギー物質を含む食品が混入しているか否か、又は、使用されているか否かといった品質管理検査の実施を可能にするという効果を奏する。また、食物アレルギーの未然防止、アレルギー症状が生じた際の原因物質の調査等にも寄与する。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】検出感度を示す説明図。
【図１】
0005611510.tif 000004
【配列表】
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