(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコール化ヒト成長ホルモンを製造する方法であって、
（ａ）ｐＨが９．０以上の溶液中、Ｕ型またはＹ型分岐の二本鎖ポリエチレングリコールをヒト成長ホルモンと、接触させる工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られた、二本鎖ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された産物を、適当な濃度のＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出する工程であって、前記産物は二つのバンドを示す工程と、
（ｃ）前記二つのバンド中の見かけ分子量の小さい、二本鎖ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された産物を単離し収集する工程と、を含み、
収集された前記産物を精製する工程を含んでもよい、ポリエチレングリコール化ヒト成長ホルモンを製造する方法。
【請求項２】
工程（ａ）の前記ｐＨが９．５以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）の前記ｐＨが１０．０以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ａ）の前記ｐＨが１０．５である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒト成長ホルモンの二本鎖ポリエチレングリコールに対するモル比が１：２である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｂ）におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥが１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
収集された前記産物の精製は、ゲルクロマトグラフィーによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ゲルクロマトグラフィーは、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦクロマトグラフィー、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦクロマトグラフィー又はＭａｃｒｏＣａｐ  ＳＰクロマトグラフィーを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記二本鎖ポリエチレングリコールは以下の構造式（Ｉ）を有するＹ型分岐ポリエチレングリコールである請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【化１】
0005458416.tif 000026
（ここで、ＰａおよびＰｂは同一または異なるポリエチレングリコールである。ｊは１〜１２の整数である。ＲｉはＨ、置換あるいは無置換のＣ１〜１２のアルキル基、置換アリール基、アラルキル基、またはヘテロアルキル基である。Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立して連結基であり、Ｘ１は（ＣＨ２）ｎであり、Ｘ２は（ＣＨ２）ｎ、（ＣＨ２）ｎＯＣＯ、（ＣＨ２）ｎＮＨＣＯ、（ＣＨ２）ｎＣＯからなる群から選ばれる基であり、ｎは１〜１０の整数である。Ｆは、ヒドロキシル基、カルボキシル基、エステル基、アシルクロライド、ヒドラジド、マレイミド、ピリジンジスルフィドからなる群から選ばれる末端基であり、治療剤あるいは基質にあるアミノ基、ヒドロキシル基またはメルカプト基と反応して共有結合を形成することができる。）
【請求項１０】
前記Ｙ型分岐ポリエチレングリコールは、以下の構造式（ＩＩ）を有する請求項９に記載の方法。
【化２】
0005458416.tif 000027
（ここで、ＲおよびＲ’はそれぞれ独立して低分子量のアルキル基である。ｍおよびｍ’は重合度を表し、任意の整数である。ｍ＋ｍ’は６００〜１５００である。）
【請求項１１】
ＲおよびＲ’はそれぞれ独立してＣ１〜Ｃ４のアルキル基である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＲおよびＲ’はメチル基である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ｍ＋ｍ’は９１０である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｙ型分岐ポリエチレングリコールは、以下の構造式（ＩＩＩ）を有する請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【化３】
0005458416.tif 000028
（ここで、前記Ｙ型分岐ポリエチレングリコールの総平均分子量は２６ｋＤ〜６０ｋＤである。）
【請求項１５】
前記Ｙ型分岐ポリエチレングリコールの総平均分子量は４０ｋＤである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｙ型分岐ポリエチレングリコールは、均等アーム型である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記二本鎖ポリエチレングリコールは以下の構造式（ＩＶ）を有するＵ型分岐ポリエチレングリコールである請求項１に記載の方法。
【化４】
0005458416.tif 000029
（ここで、ＲおよびＲ’はそれぞれ独立して低分子量のアルキル基である。ｎおよびｎ’は重合度を表し、任意の整数である。ｎ＋ｎ’は６００〜１５００である。前記Ｕ型分岐ポリエチレングリコールの平均分子量は２６ｋＤ〜６６ｋＤである。）
【請求項１８】
ＲおよびＲ’はそれぞれ独立してＣ１〜Ｃ４のアルキル基である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ｎ＋ｎ’は９１０である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｕ型分岐ポリエチレングリコールの総平均分子量は４０ｋＤである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｕ型分岐ポリエチレングリコールは、均等アーム型である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
ポリエチレングリコール化ヒト成長ホルモンを製造する方法であって、
（ａ）ｐＨが９．０または１０．５の溶液中、下式（ＩＩＩ）に示す二本鎖ポリエチレングリコールをヒト成長ホルモンと、１：２のモル比率で、接触させる工程と、
【化５】
0005458416.tif 000030
（ここで、ＲおよびＲ’はそれぞれ独立して低分子量のアルキル基である。ｊは１〜１２の整数である。ｍおよびｍ’は重合度を表し、任意の整数である。ｍ＋ｍ’は９１０であり、二本鎖ポリエチレングリコールの総平均分子量は４０ｋＤである。）
（ｂ）工程（ａ）で得られた二本鎖ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された産物を１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出する工程であって、前記産物は二つのバントを示し、前記産物は前記二つのバンド中の見かけ分子量の小さいバンドを主とする工程と、
（ｃ）Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦクロマトグラフィー、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦクロマトグラフィー及びＭａｃｒｏＣａｐ  ＳＰクロマトグラフィーからなる群から選ばれるゲルクロマトグラフィーにより、前記二つのバンド中の見かけ分子量の小さい、前記二本鎖ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された産物を単離し、収集する工程と、を含むポリエチレングリコール化ヒト成長ホルモンを製造する方法。
【請求項２３】
ポリエチレングリコール化ヒト成長ホルモン調製物を製造する方法であって、
（ａ）ｐＨが９．０以上又は９．５以上の溶液中、Ｕ型またはＹ型分岐の二本鎖ポリエチレングリコールをヒト成長ホルモンと、接触させる工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られた、二本鎖ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された産物を、適当な濃度のＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出する工程であって、前記産物は二つのバンドを示す工程と、
（ｃ）前記二本鎖ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された産物を単離、収集する工程であって、
前記収集した産物は、前記二つのバンド中の見かけ分子量の小さい、二本鎖ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された産物を主とする混合物であり、前記二つのバンド中の見かけ分子量の小さい、二本鎖ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された産物の含有量は、７０％以上である工程と、を含み、
前記収集した産物を精製する工程を含んでもよい、ポリエチレングリコール化ヒト成長ホルモン調製物を製造する方法。
【請求項２４】
工程（ａ）の前記ｐＨが１０．０以上である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
工程（ａ）の前記ｐＨが１０．５である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記ヒト成長ホルモンの二本鎖ポリエチレングリコールに対するモル比が１：２である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
工程（ｂ）におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥが１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記二つのバンド中の見かけ分子量の小さい、二本鎖ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された産物の含有量は、８０％以上である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記二つのバンド中の見かけ分子量の小さい、二本鎖ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された産物の含有量は、９０％以上である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記精製は、ゲルクロマトグラフィーによって行われる、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
前記ゲルクロマトグラフィーは、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦクロマトグラフィー、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦクロマトグラフィー又はＭａｃｒｏＣａｐ  ＳＰクロマトグラフィーを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記二本鎖ポリエチレングリコールは以下の構造式（Ｉ）を有するＹ型分岐ポリエチレングリコールである請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【化６】
0005458416.tif 000031
（ここで、ＰａおよびＰｂは同一または異なるポリエチレングリコールである。ｊは１〜１２の整数である。ＲｉはＨ、置換あるいは無置換のＣ１〜１２のアルキル基、置換アリール基、アラルキル基またはヘテロアルキル基である。Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立して連結基であり、Ｘ１は（ＣＨ２）ｎであり、Ｘ２は（ＣＨ２）ｎ、（ＣＨ２）ｎＯＣＯ、（ＣＨ２）ｎＮＨＣＯ、（ＣＨ２）ｎＣＯからなる群から選ばれる基であり、ｎは１〜１０の整数である。Ｆは、ヒドロキシル基、カルボキシル基、エステル基、アシルクロライド、ヒドラジド、マレイミド、ピリジンジスルフィドからなる群から選ばれる末端基であり、治療剤あるいは基質にあるアミノ基、ヒドロキシル基またはメルカプト基と反応して共有結合を形成することができる。）
【請求項３３】
前記Ｙ型分岐ポリエチレングリコールは、以下の構造式（ＩＩ）を有する請求項３２に記載の方法。
【化７】
0005458416.tif 000032
（ここで、ＲおよびＲ’はそれぞれ独立して低分子量のアルキル基である。ｍおよびｍ’は重合度を表し、任意の整数である。ｍ＋ｍ’は６００〜１５００である。）
【請求項３４】
ＲおよびＲ’はそれぞれ独立してＣ１〜Ｃ４のアルキル基である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＲおよびＲ’はメチル基である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
ｍ＋ｍ’は９１０である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記Ｙ型分岐ポリエチレングリコールは、以下の構造式（ＩＩＩ）を有する請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【化８】
0005458416.tif 000033
（ここで、Ｙ型分岐ポリエチレングリコールの総平均分子量は２６ｋＤ〜６０ｋＤである。）
【請求項３８】
前記Ｙ型分岐ポリエチレングリコールの総平均分子量は４０ｋＤである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記Ｙ型分岐ポリエチレングリコールは、均等アーム型である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記二本鎖ポリエチレングリコールは以下の構造式（ＩＶ）を有するＵ型分岐ポリエチレングリコールである請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【化９】
0005458416.tif 000034
（ここで、ＲおよびＲ’はそれぞれ独立して低分子量のアルキル基である。ｎおよびｎ’は重合度を表し、任意の整数である。ｎ＋ｎ’は６００〜１５００である。前記Ｕ型分岐ポリエチレングリコールの平均分子量は２６ｋＤ〜６６ｋＤである。）
【請求項４１】
ＲおよびＲ’はそれぞれ独立してＣ１〜Ｃ４のアルキル基である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ｎ＋ｎ’は９１０である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記Ｕ型分岐ポリエチレングリコールの総平均分子量は４０ｋＤである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記Ｕ型分岐ポリエチレングリコールは、均等アーム型である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
ポリエチレングリコール化ヒト成長ホルモン調製物を調製する方法であって、
（ａ）ｐＨが９．０または１０．５の溶液中、下式（ＩＩＩ）に示す二本鎖ポリエチレングリコールをヒト成長ホルモンと１：２のモル比率（前記ヒト成長ホルモン：二本鎖ポリエチレングリコール）で接触させる工程と、
【化１０】
0005458416.tif 000035
（ここで、ＲおよびＲ’はそれぞれ独立して低分子量のアルキル基である。ｊは１〜１２の整数である。ｍおよびｍ’は重合度を表し、任意の整数である。ｍ＋ｍ’は９１０であり、二本鎖ポリエチレングリコールの総平均分子量は４０ｋＤである。）
（ｂ）工程（ａ）で得られた二本鎖ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された産物を、１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出する工程であって、前記産物は二つのバントを示す工程と、
（ｃ）Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦクロマトグラフィー、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦクロマトグラフィー及びＭａｃｒｏＣａｐ  ＳＰクロマトグラフィーからなる群から選ばれるゲルクロマトグラフィーにより、二本鎖ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された産物を単離し、収集する工程と、を含み、
前記収集した産物中の、前記二つのバンド中の見かけ分子量の小さい、二本鎖ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された産物の含有量は７０％以上である、ポリエチレングリコール化ヒト成長ホルモン調製物を調製する方法。
【請求項４６】
前記収集した産物中の、前記二つのバンド中の見かけ分子量の小さい、二本鎖ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された産物の含有量は、８０％以上である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記収集した産物中の、前記二つのバンド中の見かけ分子量の低い、二本鎖ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された産物の含有量は、９０％以上である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
請求項２３〜４７のいずれか一項に記載の方法で製造されたポリエチレングリコール化ヒト成長ホルモン調製物であって、前記ヒト成長ホルモンは天然物から抽出され、または組み換えバイオテクノロジーによって得られたものである、ポリエチレングリコール化ヒト成長ホルモン調製物。
【請求項４９】
前記ヒト成長ホルモンは、配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示す配列を有する、請求項４８に記載のポリエチレングリコール化ヒト成長ホルモン調製物。
【請求項５０】
前記二本鎖ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された調製物は、以下の構造式（ＶＩＩ）で示される請求項４８又は４９に記載のポリエチレングリコール化ヒト成長ホルモン調製物。
【化１１】
0005458416.tif 000036
（ここで、ＲおよびＲ’はそれぞれ独立して低分子量のアルキル基である。ｍおよびｍ’は重合度を表し、任意の整数である。ｍ＋ｍ’は９１０である。ｊは１〜１２の整数である。前記ポリエチレングリコール化ヒト成長ホルモン調製物中の、前記二つのバンド中の見かけ分子量の小さい二本鎖ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された産物の含有量は、７０％以上である。）
【請求項５１】
ＲおよびＲ’はそれぞれ独立してＣ１〜Ｃ４のアルキル基である、請求項５０に記載のポリエチレングリコール化ヒト成長ホルモン調製物。
【請求項５２】
ＲおよびＲ’はメチル基である、請求項５０に記載のポリエチレングリコール化ヒト成長ホルモン調製物。
【請求項５３】
前記ポリエチレングリコール化ヒト成長ホルモン調製物中の、前記二つのバンド中の見かけ分子量の低い二本鎖ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された産物の含有量は、８０％以上である、請求項５０に記載のポリエチレングリコール化ヒト成長ホルモン調製物。
【請求項５４】
前記ポリエチレングリコール化ヒト成長ホルモン調製物中の、前記二つのバンド中の見かけ分子量の低い二本鎖ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された産物の含有量は、９０％以上である、請求項５０に記載のポリエチレングリコール化ヒト成長ホルモン調製物。
【請求項５５】
前記組み換えヒト成長ホルモンは、人工的に合成されたものであるか、または、原核生物発現系、真核酵母発現系、昆虫細胞系、及び哺乳類細胞系からなる群から選ばれる一つの発現系で発現されたものである、請求項４８〜５４のいずれか一項に記載のポリエチレングリコール化ヒト成長ホルモン調製物。
【請求項５６】
組成物であって、薬学的に有効な量の請求項４８〜５５のいずれか一項に記載のポリエチレングリコール化ヒト成長ホルモン調製物と、薬学的に許容できるキャリアまたは賦形剤とを含有する組成物。
【請求項５７】
マンニトール、アミノ酸、塩化ナトリウム、酢酸および酢酸ナトリウムを含む、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
前記アミノ酸は、アスパラギン酸、アスパラギン、リシンおよびグリシンからなる群から選択される、請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
成長ホルモンでの治療が必要な疾患の治療または老化防止における使用のための、請求項４８〜５５のいずれか一項に記載のポリエチレングリコール化ヒト成長ホルモン調製物。
【請求項６０】
成長ホルモンでの治療が必要な疾患の治療または老化防止における使用のための、請求項５６〜５８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６１】
前記成長ホルモンでの治療が必要な疾患は、低身長症、火傷、創傷、骨折、出血性潰瘍、腎不全、ＡＩＤＳ、内因性成長ホルモン分泌不全性低身長症、Ｔｕｒｎｅｒ症候群、合成代謝障害および成人成長ホルモン分泌不全からなる群から選ばれる、請求項５９に記載のポリエチレングリコール化ヒト成長ホルモン調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物製剤の技術分野に属する。具体的に、生物活性の高い二本鎖ポリエチレングリコール化成長ホルモンおよびにその製造方法、ならびに得られたポリエチレングリコール化成長ホルモンの医薬品分野への使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト成長ホルモン（ＨｕＧＨ）はヒト脳下垂体前葉から分泌されるタンパク質ホルモンである。その先駆体は２１７個のアミノ酸残基からなり、第１〜２６個目のアミノ酸残基がシグナルペプチドを構成し、そのほかの１９１個のアミノ酸残基が成熟分子となる。２組の分子内ジスルフィド結合（Ｃｙｓ７９とＣｙｓ１９１，Ｃｙｓ２０８とＣｙｓ２１５）を有し、糖化されてなく、分子量が２２ｋＤであり、その配列を配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示す（ＮＣＢＩ  ：Ｐ０１２４１，ＡＡＡ７２２６０；Ｄｅｎｏｔｏ  Ｆ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｕｍａｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｍＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ：  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ９：  ３７１９−３７３０，  １９８１；  Ｒｏｓｋａｍ  Ｗ，  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｇｅｎｅ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ７：  ３０５−３２０，  １９７９；  Ｍａｒｔｉａｌ  Ｊ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｕｍａｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ：  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２０５：  ６０２−６０７，  １９７９；  Ｃｈｅｎ  Ｅ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｌｏｃｕｓ：  ｎｕｃｌｅｉｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ，  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ４：  ４７９−４９７，  １９８９）。ヒト成長ホルモンは主に細胞、器官および骨格の成長を促進する作用を有し、生体の合成代謝に深く関わっている（Ｉｇｌｅｓｉａｓ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｍａｌｎｏｕｒｉｓｈｅｄ  ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ：  ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｓｔｕｄｙ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ．，３２（３）：  ４５４−４６３，１９９８；Ｎｅｅｌｙ  Ｅ  Ｋ，Ｕｓｅ  ａｎｄ  ａｂｕｓｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ．  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．，４５：４０７−４１０，  １９９４）。ＤＮＡ組み換え技術を利用して製造した組み換えヒト成長ホルモン（ｒＨｕＧＨ）は、二十年程度の臨床的応用を経て、もう臨床的な有効性と安全性が証明されている。
【０００３】
多くの研究結果から、ｒＨｕＧＨは低身長症、火傷、創傷、骨折、出血性潰瘍、腎不全、ＡＩＤＳ、合成代謝障害、内因性成長ホルモン分泌不全性低身長症、Ｔｕｒｎｅｒ症候群および成人成長ホルモン分泌不全などに治療作用を有し、老化防止の治療にも著しい効果を示すことが明らかとなった。現在、ｒＨｕＧＨは低身長症を治療するための唯一、有効的な薬物である。２００１年３月までに、米国ＦＤＡに承認されたｒＨｕＧＨの臨床研究に進められる適応症は、重篤火傷の窒素保持集中治療、短小腸症候群（単独投与あるいはグルタミンとの併用）、ＡＩＤＳ関連の成長抑制などである。現在までにｒＨｕＧＨの販売｛はんばいしょうにん｝承認された適応症は、主に未成年者の内因性成長ホルモン分泌不全性低身長症、Ｔｕｒｎｅｒ症候群、未成年者の自発性あるいは器官型成長ホルモン分泌不全性低身長症、Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ症候群、若年性成長障害（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、ＡＩＤＳ関連の分解代謝障害、慢性腎不全関連の成長抑制および成人成長ホルモン分泌不全などである。
【０００４】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は不活性で、非毒性で、生分解性有機ポリマーであり、バイオテクノロジーおよび医薬品分野に広く使われている。ＰＥＧ修飾技術とは、共有結合によりＰＥＧを活性タンパク質に結合することである。タンパク質薬物は、ＰＥＧ化されて、その性質が大幅に改善される。具体的には、薬物代謝半減期が延長され、免疫原性が低下され、安全性が向上され、治療効果が著しくなり、投与頻度が少なくなり、薬物の溶解性と水溶性が改善され、タンパク酵素分解耐性が強くなり、薬の放出制御が容易になるなどである（Ｉｎａｄａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏａｃｔ．  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，  ５，  ３４３，  １９９０；Ｄｅｌｇａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  ９，  ２４９，  １９９２；Ｋａｔｅｒ．  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｒｍｓ，  １０，  ９１，  １９９３、および米国特許ＵＰ４１７９３３７に参照）。米国特許第４１７９３３７号には、ＰＥＧが酵素またはインシュリンと連結すると、該タンパク質の免疫原性が低下されるとともに、該タンパク質の細胞学活性も顕著に低下されるが、元のタンパク質の活性も一定の割合｛いってい すう｝保持されることが記載されている。このような効果はＧ−ＣＳＦ（Ｓａｔａｋｅ−Ｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，  １７，  １５７−１６０，  １９９２）、ＩＬ−２（Ｋａｔｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８４，  １４８７，  １９８７）、ＴＮＦ−α（Ｔｓｕｔｓｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｐｎ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ８５，  ９，  １９９４）、ＩＬ−６（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｌａｂ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｅｄ．，  １２４，  ５２９，  １９９４）およびＣＤ４−ＩｇＧ（Ｃｈａｍｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊ．  Ｃｈｅｍ．，  ５，  １３３，  １９９４）においても見出される。
【０００５】
米国特許第５８２４７８４号には、末端にホルミル基の付いたＰＥＧ修飾剤を採用して固定サイト（タンパク質Ｎ−末端アミノ基）にシングル修飾したＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦを得たことが記載されている。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化法によって合成したＰＥＧ−ＮＨＳ修飾剤はＧ−ＣＳＦにおけるリシンのε‐アミノ基とアミド結合を形成することができる。ＰＥＧ−ＮＨＳの化学活性は高いが、選択性は低いので、固定サイトにおけるシングルＰＥＧ修飾産物を得がたい。シングルＰＥＧ修飾産物はマルチＰＥＧ修飾産物より均一であり、単離、精製に便利であり、且つ量産する際の品質制御やバッチ間の安定性制御が保証される。
【０００６】
今まで多種のＰＥＧ化治療用タンパク質薬物が臨床に使用されてきた。例えばＰＥＧ化アデノシンデアミナーゼ（Ａｄａｇｅｎ．ＲＴＭ，Ｅｎｚｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＰＥＧ化Ｌ−アスパラギナーゼ（Ｏｎｃａｐｓｐａｒ．ＲＴＭ，Ｅｎｚｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＰＥＧ化インターフェロンα２ｂ（ＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ．ＲＴＭ，Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）およびＰＥＧ化インターフェロンα２ａ（Ｐｅｇａｓｙｓ，Ｒｏｃｈｅ）、ＰＥＧ化顆粒球コロニー刺激因子（Ｎｅｕｌａｓｔａ．ＲＴＭ，Ａｍｇｅｎ）が挙げられる。薬物中のＰＥＧ部分（あるいはＰＥＧ自体）の体内においての代謝はすでにかなり明瞭に理解されており、安全で、副作用のない優れた薬物修飾子と認められた。
【０００７】
通常、ＰＥＧは誘導体化され、ＰＥＧ両端の一方又は両方の末端基が化学活性化され、適当な官能基を形成し、タンパク質薬物と結合できるものとなる。この官能基は、結合する薬物における少なくとも一つの官能基に対する活性を有し、互いに安定な共用結合を形成できる。例えば、ＰＥＧ分子は、タンパク質ペプチド鎖におけるリジンのε‐アミノ基に連結でき、あるいはタンパク質ペプチド鎖のＮ末端のα‐アミノ基に連結できる。タンパク質の修飾に用いられるＰＥＧは通常三つの形式を含んでいる。即ち、直鎖分子型（ＥＰ  ０５９３８６８；Ｙｕ−Ｓｅｎ  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，５４：５４７−５７０，２００２；  Ｙｕ−Ｓｅｎ  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９，１０６３４−１０６４０，２０００．）、Ｕ型分岐の分子型（ＥＰ  ０８０９９９６）およびＹ型分岐の分子型（ＣＮ１２４３７７９、ＥＰ１４９６０７６）である。欧州特許ＥＰ０８０９９９６にはＩＦＮ−αのＰＥＧ化方法が報告された。
【０００８】
通常、本分野において、ＰＥＧで修飾された後、多くのタンパク質の性質は、１．免疫原性および抗原性が低下されること、２．循環半減期が延長されること、３．水溶性が改善されること、４．タンパク質分解耐性が強くなること、５．生物学的利用率が高まること、６．毒性が弱くなること、７．熱安定性と機械的安定性が改善されること、８．等電点、電気泳動、動力学的性質などが変わるとの変化が起きると認められる。さらに、最も重要なのは、ＰＥＧで修飾されたタンパク質の細胞学的活性が降下されることにある。それは、最終産物に導入された官能基、ＰＥＧ及びＰＥＧと修飾タンパク質との結合の原因であり、カップリング条件および副生物などにも関わる。Ｄｏｒｉｓ  Ｂｒｕｇｇｅｒら（ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ，Ｐｕｂ．Ｎｏ．：ＵＳ  ２００４／０２２３９５０  Ａ１）は、二本鎖ＵＰＥＧで、インターフェロンα２ａの異なる修飾サイトのうちのシングルサイトに修飾された産物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの抗ウイルス活性に顕著な差があると報告した。その内、ＵＰＥＧで、Ｌｙｓ１２１サイトに単一修飾された産物の比活性が一番低いのに対し、ＵＰＥＧで、Ｌｙｓ３１サイトに単一修飾された産物の比活性が一番高く、両者の比活性には５倍ほどの差があった。
【０００９】
李偉華ら（中国特許公開号：ＣＮ  １４７７１２６Ａ）はポリエチレングリコール化成長ホルモンの製造方法を報告した。その方法によると、ｐＨ  ６．５〜７．０で分岐型ＰＥＧ（ｍＰＥＧｎ−ＮＨＳ）によって成長ホルモンの修飾反応をすることが好ましく、分岐型ＰＥＧによってシングルサイトに単一修飾された精製成長ホルモンは、除脳下垂体ラット法によりその生物活性が測定された。その結果から明らかなように、ポリエチレングリコール化成長ホルモン（ＰＥＧは二本鎖ＰＥＧ−ＮＨＳ、分子量が４０ｋＤ）は、毎日等量の成長ホルモンを注射することに匹敵する体重増加効果がある。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は二本鎖ポリエチレングリコール化成長ホルモンを製造する方法を提供し、具体的には、以下のａ）〜ｃ）工程を含む方法を提供する。
ａ）ｐＨが６．０以上、好ましくは７．０以上、好ましくは８．０以上、好ましくは９．０以上、好ましくは９．５以上、最も好ましくは１０．５の溶液中、Ｕ型またはＹ型分岐の二本鎖ポリエチレングリコールを成長ホルモン、好ましくはヒト成長ホルモンと、好ましくは約１：２のモル比（前記成長ホルモン：二本鎖ポリエチレングリコール）で接触させる工程、
ｂ）工程ａ）で得られた、ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された産物を、適当な濃度のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、好ましくは１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで、検出する工程であって、前記修飾産物は、二つのバンドであるか、または、見かけ分子量が小さい方のバンドを主とするものである工程、及び、
ｃ）ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された、前記二つのバンドにおける見かけ分子量の小さい方の産物を単離し、収集する工程。
【００１１】
該製造方法は任意に精製工程をさらに含んでもよい。好ましくは、ゲルクロマトグラフィーを利用する。ゲルクロマトグラフィーとしては、例えばＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦクロマトグラフィー、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦクロマトグラフィー又はＭａｃｒｏＣａｐ  ＳＰクロマトグラフィーが挙げられる。
【００１２】
好ましい態様において、本発明は、二本鎖ポリエチレングリコールが、以下に示す構造式（Ｉ）を有するＹ型ポリエチレングリコールである、二本鎖ポリエチレングリコール化成長ホルモンを製造する方法を提供する。
【化１】
0005458416.tif 000002
ここで、ＰａおよびＰｂは同一または異なるポリエチレングリコールである。ｊは１〜１２の整数である。ＲｉはＨ、置換若しくは無置換のＣ１〜１２のアルキル基、置換アリール基、アラルキル基またはヘテロアルキル基である。Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立して連結基であり、Ｘ１は（ＣＨ２）ｎであり、Ｘ２は（ＣＨ２）ｎ、（ＣＨ２）ｎＯＣＯ、（ＣＨ２）ｎＮＨＣＯ、（ＣＨ２）ｎＣＯからなる群から選ばれる基であり、ｎは１〜１０の整数である。Ｆは、ヒドロキシル基、カルボキシル基、エステル基、アシルクロライド、ヒドラジド、マレイミド、ピリジンジスルフィドからなる群から選ばれる末端基であり、治療剤あるいは基質にあるアミノ基、ヒドロキシル基またはメルカプト基と反応して共有結合を形成することができる。
【００１３】
好ましい態様において、本発明は、前記Ｙ型ポリエチレングリコールが下式（ＩＩ）に示す構造式を有する、二本鎖ポリエチレングリコール化成長ホルモンを製造する方法を提供する。
【化２】
0005458416.tif 000003
ここで、ＲおよびＲ’はそれぞれ独立して低分子量のアルキル基、好ましくはＣ１〜Ｃ４のアルキル基、最も好ましくはメチル基である。ｍおよびｍ’は重合度を表し、任意の整数である。ｍ＋ｍ’は好ましくは６００〜１５００である。ｊは１〜１２の整数である。ＲｉはＨ、置換若しくは無置換のＣ１〜１２のアルキル基、置換アリール基、アラルキル基またはヘテロアルキル基である。Ｆは、ヒドロキシル基、カルボキシル基、エステル基、アシルクロライド、ヒドラジド、マレイミド、ピリジンジスルフィドからなる群から選ばれる末端基であり、治療剤あるいは基質にあるアミノ基、ヒドロキシル基またはメルカプト基と反応して共有結合を形成することができる。
【００１４】
好ましい態様において、本発明は、前記Ｙ型ポリエチレングリコールが下式（ＩＩＩ）に示す構造式を有する、二本鎖ポリエチレングリコール化成長ホルモンを製造する方法を提供する。
【化３】
0005458416.tif 000004
ここで、ＲおよびＲ’はそれぞれ独立して低分子量のアルキル基、好ましくはＣ１〜Ｃ４のアルキル基、最も好ましくはメチル基である。ｍおよびｍ’は重合度を表し、任意の整数である。ｍ＋ｍ’は好ましくは６００〜１５００であり、最も好ましくは９１０である。ポリエチレングリコールの総平均分子量は約２６ｋＤ〜６０ｋＤであり、好ましくは４０ｋＤである。ｊは１〜１２の整数である。
【００１５】
好ましい態様において、本発明は、前記二本鎖ポリエチレングリコールが、下式（ＩＶ）に示す構造式を有するＵ型ポリエチレングリコールである、二本鎖ポリエチレングリコール化成長ホルモンを製造する方法を提供する。
【化４】
0005458416.tif 000005
ここで、ＲおよびＲ’はそれぞれ独立して低分子量のアルキル基、好ましくはＣ１〜Ｃ４のアルキル基である。ｎおよびｎ’は重合度を表し、任意の整数であり、ｎ＋ｎ’は６００〜１５００であり、最も好ましくは９１０である。前記Ｕ型ポリエチレングリコールの平均分子量は約２６ＫＤ〜６６ＫＤであり、最も好ましくは４０ｋＤである。
【００１６】
好ましい態様において、本発明は、二本鎖ポリエチレングリコール化成長ホルモンを製造する方法を提供し、具体的には以下のａ）〜ｃ）工程を含む方法を提供する。
ａ）ｐＨが９．０又は１０．５の溶液中、下式（ＩＩＩ）に示すポリエチレングリコールをヒト成長ホルモンと約１：２のモル比（前記ヒト成長ホルモン：二本鎖ポリエチレングリコール）で接触させる工程、
【化５】
0005458416.tif 000006
（ここで、ＲおよびＲ’はそれぞれ独立して低分子量のアルキル基、好ましくはＣ１〜Ｃ４のアルキル基、最も好ましくはメチル基である。ｍ＋ｍ’は９１０であり、ｊは１〜１２の整数であり、ポリエチレングリコールの総平均分子量は約４０ｋＤである。）
ｂ）  ａ）で得られた、ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された産物を、１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出する工程であって、前記産物は二つのバンドを示す工程、及び、
ｃ）ゲルクロマトグラフィーにより、シングルサイトに修飾された、見かけ分子量の小さい方の前記産物を精製し、単離し、収集する工程であって、前記ゲルクロマトグラフィーは、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦクロマトグラフィー、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦクロマトグラフィー又はＭａｃｒｏＣａｐ  ＳＰクロマトグラフィーからなる群から選ばれる工程。
【００１７】
本発明は、上記の方法により製造されたポリエチレングリコール化成長ホルモンを提供し、前記成長ホルモンは、天然物から抽出され、または組み換えバイオテクノロジーによって得られたものであり、好ましくは配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示す配列を有する。
【００１８】
好ましい態様において、本発明は、前記ポリエチレングリコール化成長ホルモンは、分子量が６２ｋＤであり、その構造式が下式（ＶＩＩ）に示される上記の方法により製造されたポリエチレングリコール化成長ホルモンを提供する。
【化６】
0005458416.tif 000007
ここで、ＲおよびＲ’はそれぞれ独立して低分子量のアルキル基、好ましくはＣ１〜Ｃ４のアルキル基、最も好ましくはメチル基である。ｍ＋ｍ’は９１０である。ｊは１〜１２の整数である。
【００１９】
本発明は、ポリエチレングリコール化成長ホルモン調製物を製造する方法を提供し、具体的には以下のａ）〜ｃ）工程を含む方法を提供する。
ａ）ｐＨが８．０以上、好ましくは９．０以上、好ましくは９．５以上、好ましくは１０．０以上、最も好ましくは１０．５の溶液中、Ｕ型またはＹ型分岐の二本鎖ポリエチレングリコールを、成長ホルモン、好ましくはヒト成長ホルモンと、好ましくは約１：２のモル比（前記成長ホルモン：二本鎖ポリエチレングリコール）で接触させる工程、
ｂ）  ａ）で得られた、ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された産物を、適当な濃度のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、好ましくは１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで、検出する工程であって、前記産物は二つのバンドを示す工程、及び、
ｃ）前記ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された前記産物を、単離し、収集する工程。
【００２０】
前記収集した産物は、ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された、見かけ分子量の低い産物を主として含む混合物であり、その内、ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された、見かけ分子量の低い産物の含有量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出され、７０％以上、好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上である。
【００２１】
前記方法は、精製工程を任意に含んでもよい。ゲルクロマトグラフィー、例えばＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦクロマトグラフィー、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦクロマトグラフィー又はＭａｃｒｏＣａｐ  ＳＰクロマトグラフィーを好ましくは利用する。
【００２２】
好ましい態様において、本発明は、前記二本鎖ポリエチレングリコールが以下に示す構造式（Ｉ）を有するＹ型ポリエチレングリコールである、ポリエチレングリコール化成長ホルモン調製物を製造する方法を提供する。
【化７】
0005458416.tif 000008
ここで、ＰａおよびＰｂは同一または異なるポリエチレングリコールである。ｊは１〜１２の整数である。ＲｉはＨ、置換若しくは無置換のＣ１〜１２のアルキル基、置換アリール基、アラルキル基またはヘテロアルキル基である。Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立して連結基であり、Ｘ１は（ＣＨ２）ｎであり、Ｘ２は（ＣＨ２）ｎ、（ＣＨ２）ｎＯＣＯ、（ＣＨ２）ｎＮＨＣＯ、（ＣＨ２）ｎＣＯからなる群から選ばれる基であり、ｎは１〜１０の整数である。Ｆは、ヒドロキシル基、カルボキシル基、エステル基、アシルクロライド、ヒドラジド、マレイミド、ピリジンジスルフィドからなる群から選ばれる末端基であり、治療剤あるいは基質にあるアミノ基、ヒドロキシル基またはメルカプト基と反応して共有結合を形成することができる。
【００２３】
好ましい態様において、本発明は、前記Ｙ型ポリエチレングリコールが下式（ＩＩ）に示す構造式を有する、ポリエチレングリコール化成長ホルモン調製物を製造する方法を提供する。
【化８】
0005458416.tif 000009
ここで、ＲおよびＲ’はそれぞれ独立して低分子量のアルキル基、好ましくはＣ１〜Ｃ４のアルキル基、最も好ましくはメチル基である。ｍおよびｍ’は重合度を表し、任意の整数であり、ｍ＋ｍ’は好ましくは６００〜１５００であり、最も好ましくは９１０である。ｊは１〜１２の整数である。ＲｉはＨ、置換あるいは無置換のＣ１〜１２のアルキル基、置換アリール基、アラルキル基またはヘテロアルキル基である。Ｆは、ヒドロキシル基、カルボキシル基、エステル基、アシルクロライド、ヒドラジド、マレイミド、ピリジンジスルフィドからなる群から選ばれる末端基であり、治療剤あるいは基質にあるアミノ基、ヒドロキシル基またはメルカプト基と反応して共有結合を形成することができる。
【００２４】
好ましい態様において、本発明は、前記Ｙ型ポリエチレングリコールが下式（ＩＩＩ）に示す構造式を有する、ポリエチレングリコール化成長ホルモン調製物を製造する方法を提供する。
【化９】
0005458416.tif 000010
ここで、ＲおよびＲ’はそれぞれ独立して低分子量のアルキル基、好ましくはＣ１〜Ｃ４のアルキル基、最も好ましくはメチル基である。ｍおよびｍ’は重合度を表し、任意の整数であり、ｍ＋ｍ’は好ましくは６００〜１５００であり、最も好ましくは９１０である。ｊは１〜１２の整数である。ポリエチレングリコールの総平均分子量は好ましくは約２６ｋＤ〜６０ｋＤであり、より好ましくは４０ｋＤである。
【００２５】
好ましい態様において、本発明は、前記二本鎖ポリエチレングリコールが以下に示す構造式（ＩＶ）を有するＵ型ポリエチレングリコールである、ポリエチレングリコール化成長ホルモン調製物を製造する方法を提供する。
【化１０】
0005458416.tif 000011
ここで、ＲおよびＲ’はそれぞれ独立して低分子量のアルキル基、好ましくはＣ１〜Ｃ４のアルキル基である。ｎおよびｎ’は重合度を表し、任意の整数であり、ｎ＋ｎ’は６００〜１５００であり、最も好ましくは９１０である。前記Ｕ型ポリエチレングリコールの平均分子量は約２６ｋＤ〜６６ｋＤであり、最も好ましくは約４０ｋＤである。
【００２６】
好ましい態様において、本発明はポリエチレングリコール化成長ホルモン調製物を製造する方法を提供し、具体的には以下のａ）〜ｃ）の工程を含む方法を提供する。
ａ）ｐＨが９．０又は１０．５の溶液中、下式（ＩＩＩ）に示すポリエチレングリコールをヒト成長ホルモンと約１：２のモル比（前記ヒト成長ホルモン：二本鎖ポリエチレングリコール）で接触させる工程、
【化１１】
0005458416.tif 000012
（ここで、ＲおよびＲ’はそれぞれ独立して低分子量のアルキル基、好ましくはＣ１〜Ｃ４のアルキル基である。ｍ＋ｍ’は９１０であり、ｊは１〜１２の整数である。ポリエチレングリコールの総平均分子量は約４０ｋＤである。）
ｂ）１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで、ａ）で得られたポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された産物を検出する工程、及び、
ｃ）ゲルクロマトグラフィーにより、ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された産物を単離し、収集する工程であって、前記ゲルクロマトグラフィーは、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦクロマトグラフィー、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦクロマトグラフィー又はＭａｃｒｏＣａｐ  ＳＰクロマトグラフィーからなる群から選ばれ、そして、ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された、前記見かけ分子量のより低い産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ含有量は７０％以上、好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上である工程。
【００２７】
また、本発明は、前記成長ホルモンが、天然物から抽出され、または組み換えバイオテクノロジーによって得られたものであり、好ましくは配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示す配列を有するホルモンである、上記の方法により製造されたポリエチレングリコール化成長ホルモン調製物を提供する。前記ポリエチレングリコール化成長ホルモン調製物において、ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された産物は、好ましくは、下式（ＶＩＩ）に示される。
【化１２】
0005458416.tif 000013
ここで、ＲおよびＲ’はそれぞれ独立して低分子量のアルキル基、好ましくはＣ１〜Ｃ４のアルキル基、最も好ましくはメチル基である。ｍ＋ｍ’は９１０である。ｊは１〜１２の整数である。前記ポリエチレングリコール化成長ホルモン調製物における、ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された、見かけ分子量の低い産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ含有量は７０％以上、好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上である。
【００２８】
本発明の好ましい態様において、前記組み換えヒト成長ホルモンは人工的に合成されたもの、又は以下の発現系の一つで発現されたものである：原核生物発現系（例えば大腸菌）、真核酵母発現系（例えばピキア）、昆虫細胞系、及び哺乳類細胞系（例えばＣＨＯ細胞）。
【００２９】
本発明は薬学的に有効な量の前記ポリエチレングリコール化成長ホルモン又はポリエチレングリコール化成長ホルモン調製物と、薬学的に許容できるキャリアまたは賦形剤とを含む組成物を提供し、前記キャリアまたは賦形剤はマンニトール、アミノ酸、塩化ナトリウム、酢酸または酢酸ナトリウムを含み、前記アミノ酸は好ましくはアスパラギン酸、アスパラギン、リシンおよびグリシンからなる群から好ましくは選ばれる。
【００３０】
また、本発明は、成長ホルモンでの治療が必要な疾患の治療のための又は老化防止のための、治療剤の製造における前記ポリエチレングリコール化成長ホルモン又はポリエチレングリコール化成長ホルモン調製物若しくは組成物の使用を提供する。好ましくは、前記成長ホルモンでの治療が必要な疾患は低身長症、火傷、創傷、骨折、出血性潰瘍、腎不全、ＡＩＤＳ、内因性成長ホルモン分泌不全性低身長症、Ｔｕｒｎｅｒ症候群および成人成長ホルモン分泌不全、合成代謝障害からなる群から選ばれる。
【００３１】
また、本発明は、患者に、治療に有効な量のポリエチレングリコール化成長ホルモン又はポリエチレングリコール化成長ホルモン調製物若しくは組成物を投与することを含む、成長ホルモンでの治療を必要とする疾患の患者を治療する方法または老化防止のための方法を提供する。好ましくは、前記成長ホルモンでの治療が必要な疾患は低身長症、火傷、創傷、骨折、出血性潰瘍、腎不全、ＡＩＤＳ、内因性成長ホルモン分泌不全性低身長症、Ｔｕｒｎｅｒ症候群、合成代謝障害および成人成長ホルモン分泌不全からなる群から選ばれる。
【００３２】
［発明の詳細な説明］
本発明は、生物活性の高い二本鎖ポリエチレングリコール化成長ホルモンならびその製造方法を提供する。本発明の著しい特徴は、反応条件および単離方法を改善することにより、成長ホルモンの、ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された産物における細胞学的活性の低い成分の含有量を顕著に減少することにある。二本鎖ポリエチレングリコールの分子量が４０ｋＤである実施例において、細胞学的活性の低いシングルサイト修飾産物の特徴は、１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ単離ゲルにおいて、この産物と細胞学的活性の高いシングルサイト修飾産物とは、二つのバンドに完全に分離｛ぶんり｝することにある。細胞学的活性の低いシングルサイト修飾産物は、細胞学的活性の高いシングルサイト修飾産物より見かけ分子量が高い。除脳下垂体ラットを動物モデルとし、組み換えヒト成長ホルモンを陽性対照とし、『中華人民共和国薬局方』２００５年版改正付録ＸＩＩ  Ｐ「成長ホルモン生物測定法」に準じて最終的に製造された細胞学的活性の高いシングルサイト修飾産物の体内生物活性を測定した。細胞学的活性の高いシングルサイト修飾産物は、普通の成長ホルモンより生物活性が有意に高く、普通の成長ホルモンの１．５倍以上である。カニクイザルの薬物動態学の研究から明らかなように、平均血清薬物代謝半減期は普通の成長ホルモンより２０倍以上延長され、長期作用を有する。
【００３３】
本発明の好ましい態様においては、ｐＨ８．０の条件で、成長ホルモンの二本鎖ＰＥＧ−ＮＨＳ修飾反応をさせ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により反応調製物を検出し、銀染色法を利用する。驚いたことに、成長ホルモンの、ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された産物は、二つのバンドを呈し、以前の報告（Ｒｏｓｓ  Ｃｌａｒｋ，Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｏｌｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．  Ｌｏｎｇ−ａｃｔｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：  ２１９６９−２１９７７，  １９９６．李偉華、董建ら，長期効果成長ホルモンならび薬物組成物．中国特許公開号：ＣＮ  １４７７１２６Ａ）と相違する。さらなる実験において、ｐＨ６．０〜１０．５範囲内で、成長ホルモンの二本鎖ＰＥＧ−ＮＨＳでの修飾の状況を調べた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出するとき、シングルサイト修飾産物はいずれも二つの主バンドを呈し、反応におけるｐＨの上昇にしたがって、見かけ分子量の小さいバンドの含有量が高まり、ｐＨ≧１０．０では、シングルサイト修飾産物はほとんど見かけ分子量の小さいバンドに変わる。
【００３４】
本発明の好ましい態様においては、適当なゲルクロマトグラフィー精製技術によって、ｐＨ１０．５およびｐＨ６．０の条件でポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された組み換えヒト成長ホルモンの精製物が、それぞれ製造される。分離ゲルの濃度が１２％であるＳＤＳ−ＰＡＧＥを採用して検出し、銀染色法を利用する。ｐＨ６．０の条件で、ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された組み換えヒト成長ホルモンの精製物は、二つのバンドをはっきりと呈し、ｐＨ１０．５の条件で、ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された組み換えヒト成長ホルモンの精製物は、見かけ分子量の小さいバンドを主とし、そのＳＤＳ−ＰＡＧＥ含有量が８０％以上であった。いずれの条件でも微量の基質タンパクだけが検出された（０．５％を超えない）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳでの検出から確認されたように、この二つのｐＨ条件での調製物はいずれも成長ホルモンのポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された産物であった。細胞学的活性の検出から、ｐＨ１０．５の条件でのシングルサイト修飾産物は、ｐＨ６．０の条件でのシングルサイト修飾産物より生物学的活性が有意に高く、前者の細胞学比活性が後者の約２倍に当たった。
【００３５】
本発明の好ましい態様においては、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦクロマトグラフィーおよびＭａｃｒｏＣａｐ  ＳＰクロマトグラフィーなどの精製工程によって、ｐＨ６．０の条件でポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾され、見かけ分子量の大きい、組み換えヒト成長ホルモンの修飾産物の精製物が製造される。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ検出から、この組み換えヒト成長ホルモンのポリエチレングリコールで修飾された産物は、ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された産物であることが確認される。細胞学的活性の検出から、その細胞学的比活性について、ｐＨ１０．５の条件でポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された組み換えヒト成長ホルモンの産物（見かけ分子量が小さい）の精製物より有意に低かった。後者の細胞学比活性が前者の３倍にまでなる。
【００３６】
本発明の好ましい態様においては、『中華人民共和国薬局方』２００５年版改正付録ＸＩＩ  Ｐ「成長ホルモン生物測定法」に準じて、組み換えヒト成長ホルモンを陽性対照とし、除脳下垂体ラット法により、ｐＨ１０．５の条件で４０ｋＤのＰＥＧ−ＮＨＳによってシングルサイトに修飾された組み換えヒト成長ホルモンの修飾産物のｉｎ  ｖｉｖｏ  生物学活性を検出した。一日一回組み換えヒト成長ホルモンを全部で６回投与する。ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された組み換えヒト成長ホルモンの産物を、組み換えヒト成長ホルモンの６回の総投与量と同じ量で単回投与する。ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された組み換えヒト成長ホルモンの産物は、組み換えヒト成長ホルモンより生物学的活性が有意に高く、後者の生物学比活性の１．５倍以上であり、薬理学的に長期間の効果を有する。カニクイザルの薬物動態学の研究によると、ポリエチレングリコールでシングルサイトに修飾された組み換えヒト成長ホルモンの薬物代謝半減期は、普通の組み換えヒト成長ホルモンより２０倍以上延長されていた。
【００３７】
本発明は分岐型（Ｕ型分岐またはＹ型分岐）ＰＥＧ誘導体を採用して成長ホルモンを修飾する。本発明において使われるＹ型分岐ＰＥＧ誘導体は新規の分岐ＰＥＧ誘導体であって、その構造は直鎖のＰＥＧ及びＵ型分岐のＰＥＧと異なっている。前記ＰＥＧ誘導体とＵ型分岐のＰＥＧの最大の差異は、本発明で用いるＹ型ＰＥＧ誘導体は２本のＰＥＧ分岐鎖がＮ原子により連結したものであるのに対し、Ｕ型ＰＥＧ誘導体は２本のＰＥＧ分岐鎖がＣ原子により連結したものであることである。本発明におけるＹ型若しくはＵ型ＰＥＧでの修飾は主に、タンパク質若しくはペプチドＮ末端の遊離α‐アミノ基、又は、リジン残基の側鎖のε‐アミノ基において起こる。Ｙ型ＰＥＧ誘導体の分子構造を下式（Ｉ）に示す。
【化１３】
0005458416.tif 000014
ここで、ＰａおよびＰｂは同一または異なるポリエチレングリコールである。ｊは１〜１２の整数である。ＲｉはＨ、置換あるいは無置換のＣ１〜１２のアルキル基、置換アリール基、アラルキル基またはヘテロアルキル基である。Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立して連結基であり、Ｘ１は（ＣＨ２）ｎであり、Ｘ２は（ＣＨ２）ｎ、（ＣＨ２）ｎＯＣＯ、（ＣＨ２）ｎＮＨＣＯ、（ＣＨ２）ｎＣＯからなる群から選ばれる基であり、ｎは１〜１０の整数である。Ｆは、ヒドロキシル基、カルボキシル基、エステル基、アシルクロライド、ヒドラジド、マレイミド、ピリジンジスルフィドからなる群から選ばれる末端基であり、治療剤あるいは基質にあるアミノ基、ヒドロキシル基またはメルカプト基と反応して共有結合を形成することができる。
【００３８】
本発明の好ましい態様において、前記Ｙ型ＰＥＧ誘導体の構造式におけるＰａおよびＰｂは同一または異なるポリエチレングリコールであって、下式（ＩＩ）に示される。
【化１４】
0005458416.tif 000015
ここで、ＲおよびＲ’はそれぞれ独立して低分子量のアルキル基、好ましくはＣ１〜Ｃ４のアルキル基、最も好ましくはメチル基である。ｍおよびｍ’は重合度を表し、任意の整数であり、ｍ＋ｍ’は好ましくは６００〜１５００であり、最も好ましくは９１０である。ＲｉはＨ、置換あるいは無置換のＣ１〜１２のアルキル基、置換アリール基、アラルキル基またはヘテロアルキル基である。ｊは１〜１２の整数である。Ｆは、ヒドロキシル基、カルボキシル基、エステル基、アシルクロライド、ヒドラジド、マレイミド、ピリジンジスルフィドからなる群から選ばれる末端基であり、治療剤あるいは基質にあるアミノ基、ヒドロキシル基またはメルカプト基と反応して共有結合を形成することができる。好ましくは、ポリエチレングリコールの総平均分子量は約２６ｋＤ〜６０ｋＤであり、最も好ましくは約４０ｋＤである。
【００３９】
好ましい態様において、本発明は以下に示す構造式（ＶＩ）を有するポリエチレングリコール化成長ホルモンを提供する。
【化１５】
0005458416.tif 000016
ここで、ＲおよびＲ’はそれぞれ独立して低分子量のアルキル基、好ましくはＣ１〜Ｃ４のアルキル基、最も好ましくはメチル基である。ｊは１〜１２の整数である。ｍおよびｍ’は重合度を表し、任意の整数であり、ｍ＋ｍ’は好ましくは６００〜１５００である。ＲｉはＨ、置換あるいは無置換のＣ１〜１２アルキル基、置換アリール基、アラルキル基またはヘテロアルキル基である。Ｆは、ヒドロキシル基、カルボキシル基、エステル基、アシルクロライド、ヒドラジド、マレイミド、ピリジンジスルフィドからなる群から選ばれる末端基であり、治療剤あるいは基質にあるアミノ基、ヒドロキシル基またはメルカプト基と反応して共有結合を形成することができる。本発明の好ましい態様において、一種のＹ型ＰＥＧ誘導体分子（ＹＰＥＧ−ＮＨＳ）の構造式は下式（ＩＩＩ）に示される。
【化１６】
0005458416.tif 000017
ここで、ＲおよびＲ’はそれぞれ独立して低分子量のアルキル基、好ましくはＣ１〜Ｃ４のアルキル基、最も好ましくはメチル基である。ｊは１〜１２の整数である。ｍおよびｍ’は重合度を表し、任意の整数であり、ｍ＋ｍ’は好ましくは６００〜１５００であり、最も好ましくは約９１０である。
【００４０】
本発明の好ましい態様において、一種のＵ型ＰＥＧ誘導体分子（ＵＰＥＧ−ＮＨＳ）の構造式は下式（ＩＶ）に示される。
【化１７】
0005458416.tif 000018
ここで、ＲおよびＲ’はそれぞれ独立して低分子量のアルキル基、好ましくはＣ１〜Ｃ４のアルキル基である。ｎおよびｎ’は重合度を表し、任意の整数であり、ｎ＋ｎ’は好ましくは６００〜１５００であり、最も好ましくは９１０である。ポリエチレングリコールの総平均分子量は約２６ｋＤ−６６ｋＤ、最も好ましくは約４０ｋＤである。
【００４１】
ＹＰＥＧあるいはＵＰＥＧで修飾されたＧＨを得るために、本発明の好ましい態様において、まずＹＰＥＧおよびＵＰＥＧの活性化された誘導体、例えばポリエチレングリコールスクシンイミジルエステル（ＰＥＧ−ＮＨＳ）を、求核置換反応によって、ＰＥＧ部分を共有結合でタンパク質のアミノ基（−ＮＨ２）と連結する。ここで、前記アミノ基は、タンパク質Ｎ末端のα‐アミノ基およびリジン残基のε‐アミノ基を含む。ＧＨとＹＰＥＧ−ＮＨＳとを反応させ、ＹＰＥＧ−ＧＨを生成する反応方程式を以下に示す。
【化１８】
0005458416.tif 000019
ＧＨとＵＰＥＧ−ＮＨＳとを反応させ、ＵＰＥＧ−ＧＨを生成する反応方程式を以下に示す。
【化１９】
0005458416.tif 000020
【００４２】
好ましくは、ポリエチレングリコールの総平均分子量は約２６ｋＤ−６０ｋＤ、最も好ましくは４０ｋＤである。
【００４３】
さらに好ましい態様において、本発明のポリエチレングリコール化成長ホルモンの構造式を下式（ＶＩＩ）に示す。
【化２０】
0005458416.tif 000021
ここで、ＲおよびＲ’はそれぞれ独立して低分子量のアルキル基、好ましくはＣ１〜Ｃ４のアルキル基、最も好ましくはメチル基である。ｊは１〜１２の整数である。ｍおよびｍ’は重合度を表し、任意の整数であり、ｍ＋ｍ’は好ましくは６００〜１５００である。この構造の中で、Ｙ分岐ＰＥＧがシングルサイトで成長ホルモン（ＧＨ）分子に結合する。ｍおよびｍ’は同じあるいは異なる整数である。上式の中で、ＹＰＥＧ−ＧＨの分子量は主に重合度のｍおよびｍ’によって決まる。ｍ＋ｍ’は好ましくは６００〜１５００であり、対応するＹＰＥＧの平均分子量が約２６ｋＤ〜６６ｋＤである。ｍ＋ｍ’は好ましくは７９５〜１０３０であり、対応するＹＰＥＧの平均分子量が約３５ｋＤ〜４５ｋＤである。ｍ＋ｍ’は好ましくは８８５〜１０３０であり、対応するＹＰＥＧの平均分子量が約３９ｋＤ〜４５ｋＤである。ｍ＋ｍ’は最も好ましくは９１０であり、対応するＹＰＥＧの平均分子量が約４０ｋＤである。ｍおよびｍ’の比例範囲は０．５〜１．５であり、好ましくは０．８〜１．２である。
【００４４】
本発明における成長ホルモンは天然物から抽出され、または組み換えバイオテクノロジーによって得られたものである。好ましくは、前記成長ホルモンは天然物から抽出され、または組み換えバイオテクノロジーによって得られ、配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示す配列を有するヒト成長ホルモンである。さらに好ましくは、前記成長ホルモンは組み換えヒト成長ホルモンである。成長ホルモンは人工的に合成されたものであってよく、原核生物発現系、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現されたものであってもよく、真核酵母発現系、例えばピキア（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）で発現されたものであってもよく、ほかの昆虫細胞系あるいは哺乳類細胞系、例えばＣＨＯで発現されたものであってもよい。天然あるいは組み換え成長ホルモンを製造する方法および成長ホルモンとそのＰＥＧ修飾産物の活性検出方法は当該技術分野において既存の技術である。
【００４５】
本発明に記載されたＹＰＥＧ−ＧＨおよびＵＰＥＧ−ＧＨはＧＨと臨床応用が同じであり、いずれも低身長症、火傷、創傷、骨折、出血性潰瘍、腎不全、ＡＩＤＳ、合成代謝障害、成人成長ホルモン分泌不全などの疾患の治療及び老化防止に使用される。本発明のＹＰＥＧ−ＧＨおよびＵＰＥＧ−ＧＨは組成物として患者に投与してもよい。前記組成物の中には薬学的に有効な量のＹＰＥＧ−ＧＨ又はＵＰＥＧ−ＧＨと薬学的に許容できるキャリアまたは賦形剤を含む。したがって、別の局面において、本発明は、組成物を提供する。該組成物は、薬学的に有効な量の本発明のＹＰＥＧ−ＧＨ又はＵＰＥＧ−ＧＨと、薬学的に許容できるキャリアまたは賦形剤を含む。本発明に使用される薬学的に許容できるキャリアは、使用される量および濃度で、接触する細胞又は哺乳動物に対して非毒性である、薬用に許容できるキャリア、賦形剤または安定剤を含む。通常、生理学的に許容できるキャリアは水を含むｐＨ緩衝溶液である。生理学的に許容できるキャリアの例としては、例えばリン酸塩、クエン酸塩若しくはほかの有機酸を含む緩衝溶液、アスコルビン酸を含む抗酸化剤、低分子量（１０個の残基を超えない）のペプチド、血清アルブミン、ゼラチン若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン若しくはリシンなどのアミノ酸、ブドウ糖、マンノースなど単糖、二糖若しくはデキストリンなどの他の糖類、ＥＤＴＡなどのキレート剤、マンニトール若しくはソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどのカウンターイオンを形成する塩、及び／又は、ＴＷＥＥＮ、ポリエチレングリコール、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳなどの非イオン型界面活性剤が挙げられる。賦形剤は好ましくは無菌で、一般的に有害物質を含まない。これらの組成物は常用の滅菌技術で滅菌される。本発明の好ましい態様において、前記組成物はさらにマンニトール、グリシン、塩化ナトリウム、酢酸または酢酸ナトリウムを含み、前記アミノ酸はリシン、アスパラギン酸、アスパラギンまたはグリシンからなる群から選ばれる。
【００４６】
別の局面において、本発明は、本発明のポリエチレングリコール化成長ホルモン又は本発明のポリエチレングリコール化成長ホルモンを含む組成物の、成長ホルモンでの治療が必要な疾患の治療のための薬剤及び老化防止治療のための薬剤の製造における使用を提供する。好ましくは、前記成長ホルモンでの治療が必要な疾患は低身長症、火傷、創傷、骨折、出血性潰瘍、腎不全、ＡＩＤＳ、内因性成長ホルモン分泌不全性低身長症、Ｔｕｒｎｅｒ症候群、合成代謝障害および成人成長ホルモン分泌不全からなる群から選ばれる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、ｐＨ８．０の条件での、ＹＰＥＧ−ＮＨＳ  ４０ｋＤ又はＵＰＥＧ−ＮＨＳ  ４０ｋＤにより修飾反応されたｒＨｕＧＨのサンプルの非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果である。分離ゲル濃度が１２％、銀染色法が利用される。レーン１：マーカー，ＬＭＷ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；レーン２：ｒＨｕＧＨのＹＰＥＧ−ＮＨＳ修飾反応サンプルで、反応ｐＨ８．０、サンプル量が２μｇである。；レーン３：ｒＨｕＧＨのＹＰＥＧ−ＮＨＳ修飾反応サンプルで、反応ｐＨ８．０、サンプル量が５μｇである。；レーン４：ｒＨｕＧＨのＵＰＥＧ−ＮＨＳ修飾反応サンプルで、反応ｐＨ８．０、サンプル量が５μｇである。
【００４８】
【図２】図２は、異なるｐＨ条件での、ＹＰＥＧ−ＮＨＳ  ４０ｋＤにより修飾反応されたｒＨｕＧＨのサンプルの非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果である。分離ゲル濃度が１２％、銀染色法が利用される。レーン１：ｒＨｕＧＨのＹＰＥＧ−ＮＨＳ修飾反応サンプルで、反応ｐＨ６．０である。；レーン２：ｒＨｕＧＨのＹＰＥＧ−ＮＨＳ修飾反応サンプルで、反応ｐＨ７．０である。；レーン３：ｒＨｕＧＨのＹＰＥＧ−ＮＨＳ修飾反応サンプルで、反応ｐＨ８．０である。；レーン４：ｒＨｕＧＨのＹＰＥＧ−ＮＨＳ修飾反応サンプルで、反応ｐＨ９．０である。；レーン５：ｒＨｕＧＨのＹＰＥＧ−ＮＨＳ修飾反応サンプルで、反応ｐＨ９．５である。；レーン６：ｒＨｕＧＨのＹＰＥＧ−ＮＨＳ修飾反応サンプルで、反応ｐＨ１０．０である。；レーン７：ｒＨｕＧＨのＹＰＥＧ−ＮＨＳ修飾反応サンプルで、反応ｐＨ１０．５である。；レーン８：マーカー，ＬＭＷ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ。各サンプルの量はすべて５μｇである。
【００４９】
【図３】図３は、異なるｐＨ条件での、ＵＰＥＧ−ＮＨＳにより修飾反応されたｒＨｕＧＨのサンプルの非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果である。分離ゲル濃度が１２％、銀染色法が利用される。レーン１：ｒＨｕＧＨのＵＰＥＧ−ＮＨＳ修飾反応サンプルで、反応ｐＨ６．０である。；レーン２：ｒＨｕＧＨのＵＰＥＧ−ＮＨＳ修飾反応サンプルで、反応ｐＨ７．０である。；レーン３：ｒＨｕＧＨのＵＰＥＧ−ＮＨＳ修飾反応サンプルで、反応ｐＨ８．０である。；レーン４：ｒＨｕＧＨのＵＰＥＧ−ＮＨＳ修飾反応サンプルで、反応ｐＨ９．０である。；レーン５：ｒＨｕＧＨのＵＰＥＧ−ＮＨＳ修飾反応サンプルで、反応ｐＨ９．５である。；レーン６：ｒＨｕＧＨのＵＰＥＧ−ＮＨＳ修飾反応サンプルで、反応ｐＨ１０．０である。；レーン７：ｒＨｕＧＨのＵＰＥＧ−ＮＨＳ修飾反応サンプルで、反応ｐＨ１０．５である。；レーン８：マーカー，ＬＭＷ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ。各サンプルの量はすべて５μｇである。
【００５０】
【図４】図４は、ｐＨ６．０またはｐＨ１０．５の条件でＹＰＥＧ−ＮＨＳ  ４０ｋＤあるいはＵＰＥＧ−ＮＨＳ  ４０ｋＤによってシングルサイトに修飾されたｒＨｕＧＨ修飾産物の精製物の非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果である。分離ゲル濃度が１２％、銀染色法が利用される。レーン１：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ  Ｕ１０．５，サンプル量１０μｇ；レーン２：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ  Ｕ１０．５，サンプル量２μｇ；レーン３：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ  Ｕ６．０，サンプル量１０μｇ；レーン４：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ  Ｕ６．０，サンプル量２μｇ；レーン５：マーカー，ＬＭＷ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒ；レーン６：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ  Ｙ１０．５，サンプル量１０μｇ；レーン７：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ  Ｙ１０．５，サンプル量２μｇ；レーン８：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ  Ｙ６．０，サンプル量１０μｇ；レーン９：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ  Ｙ６．０，サンプル量２μｇ；レーン１０：ｒＨｕＧＨ，サンプル量１００ｎｇ；レーン１１：ｒＨｕＧＨ，サンプル量５０ｎｇ。
【００５１】
【図５】図５は、ｐＨ６．０またはｐＨ１０．５の条件で、ＵＰＥＧ−ＮＨＳ  ４０ｋＤでシングルサイトに修飾されたｒＨｕＧＨの修飾産物の精製物の細胞学的活性の検出結果、２連プレートである。
【００５２】
【図６】図６は、ｐＨ６．０またはｐＨ１０．５の条件で、ＹＰＥＧ−ＮＨＳ  ４０ｋＤでシングルサイトに修飾されたｒＨｕＧＨの修飾産物の精製物の細胞学的活性を検出した結果、２連プレートである。
【００５３】
【図７ａ】図７ａは、ｐＨ６．０、ｐＨ９．０またはｐＨ１０．５の条件で、ｒＨｕＧＨのＹＰＥＧ−ＮＨＳ  ４０ｋＤシングルサイト修飾産物の精製物およびＵＰＥＧ−ＮＨＳ  ４０ｋＤシングルサイト修飾産物の精製物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分子量を検出した結果である。ａ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ６；ｂ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ９；ｃ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ１０．５；ｄ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ６−１；ｅ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ６；ｆ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ９；ｇ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ１０．５；ｈ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ６−１；ｉ：ＹＰＥＧ−ＮＨＳ，４０ｋＤ；ｊ：ＵＰＥＧ−ＮＨＳ，４０ｋＤ；ｋ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＩＩ，ＢＲＵＫＥＲ；ｌ：ｒＨｕＧＨ；ｍ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｉ，ＢＲＵＫＥＲ。
【図７ｂ】図７ｂは、ｐＨ６．０、ｐＨ９．０またはｐＨ１０．５の条件で、ｒＨｕＧＨのＹＰＥＧ−ＮＨＳ  ４０ｋＤシングルサイト修飾産物の精製物およびＵＰＥＧ−ＮＨＳ  ４０ｋＤシングルサイト修飾産物の精製物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分子量を検出した結果である。ａ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ６；ｂ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ９；ｃ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ１０．５；ｄ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ６−１；ｅ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ６；ｆ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ９；ｇ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ１０．５；ｈ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ６−１；ｉ：ＹＰＥＧ−ＮＨＳ，４０ｋＤ；ｊ：ＵＰＥＧ−ＮＨＳ，４０ｋＤ；ｋ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＩＩ，ＢＲＵＫＥＲ；ｌ：ｒＨｕＧＨ；ｍ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｉ，ＢＲＵＫＥＲ。
【図７ｃ】図７ｃは、ｐＨ６．０、ｐＨ９．０またはｐＨ１０．５の条件で、ｒＨｕＧＨのＹＰＥＧ−ＮＨＳ  ４０ｋＤシングルサイト修飾産物の精製物およびＵＰＥＧ−ＮＨＳ  ４０ｋＤシングルサイト修飾産物の精製物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分子量を検出した結果である。ａ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ６；ｂ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ９；ｃ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ１０．５；ｄ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ６−１；ｅ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ６；ｆ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ９；ｇ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ１０．５；ｈ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ６−１；ｉ：ＹＰＥＧ−ＮＨＳ，４０ｋＤ；ｊ：ＵＰＥＧ−ＮＨＳ，４０ｋＤ；ｋ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＩＩ，ＢＲＵＫＥＲ；ｌ：ｒＨｕＧＨ；ｍ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｉ，ＢＲＵＫＥＲ。
【図７ｄ】図７ｄは、ｐＨ６．０、ｐＨ９．０またはｐＨ１０．５の条件で、ｒＨｕＧＨのＹＰＥＧ−ＮＨＳ  ４０ｋＤシングルサイト修飾産物の精製物およびＵＰＥＧ−ＮＨＳ  ４０ｋＤシングルサイト修飾産物の精製物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分子量を検出した結果である。ａ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ６；ｂ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ９；ｃ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ１０．５；ｄ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ６−１；ｅ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ６；ｆ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ９；ｇ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ１０．５；ｈ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ６−１；ｉ：ＹＰＥＧ−ＮＨＳ，４０ｋＤ；ｊ：ＵＰＥＧ−ＮＨＳ，４０ｋＤ；ｋ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＩＩ，ＢＲＵＫＥＲ；ｌ：ｒＨｕＧＨ；ｍ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｉ，ＢＲＵＫＥＲ。
【図７ｅ】図７ｅは、ｐＨ６．０、ｐＨ９．０またはｐＨ１０．５の条件で、ｒＨｕＧＨのＹＰＥＧ−ＮＨＳ  ４０ｋＤシングルサイト修飾産物の精製物およびＵＰＥＧ−ＮＨＳ  ４０ｋＤシングルサイト修飾産物の精製物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分子量を検出した結果である。ａ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ６；ｂ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ９；ｃ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ１０．５；ｄ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ６−１；ｅ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ６；ｆ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ９；ｇ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ１０．５；ｈ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ６−１；ｉ：ＹＰＥＧ−ＮＨＳ，４０ｋＤ；ｊ：ＵＰＥＧ−ＮＨＳ，４０ｋＤ；ｋ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＩＩ，ＢＲＵＫＥＲ；ｌ：ｒＨｕＧＨ；ｍ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｉ，ＢＲＵＫＥＲ。
【図７ｆ】図７ｆは、ｐＨ６．０、ｐＨ９．０またはｐＨ１０．５の条件で、ｒＨｕＧＨのＹＰＥＧ−ＮＨＳ  ４０ｋＤシングルサイト修飾産物の精製物およびＵＰＥＧ−ＮＨＳ  ４０ｋＤシングルサイト修飾産物の精製物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分子量を検出した結果である。ａ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ６；ｂ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ９；ｃ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ１０．５；ｄ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ６−１；ｅ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ６；ｆ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ９；ｇ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ１０．５；ｈ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ６−１；ｉ：ＹＰＥＧ−ＮＨＳ，４０ｋＤ；ｊ：ＵＰＥＧ−ＮＨＳ，４０ｋＤ；ｋ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＩＩ，ＢＲＵＫＥＲ；ｌ：ｒＨｕＧＨ；ｍ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｉ，ＢＲＵＫＥＲ。
【図７ｇ】図７ｇは、ｐＨ６．０、ｐＨ９．０またはｐＨ１０．５の条件で、ｒＨｕＧＨのＹＰＥＧ−ＮＨＳ  ４０ｋＤシングルサイト修飾産物の精製物およびＵＰＥＧ−ＮＨＳ  ４０ｋＤシングルサイト修飾産物の精製物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分子量を検出した結果である。ａ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ６；ｂ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ９；ｃ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ１０．５；ｄ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ６−１；ｅ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ６；ｆ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ９；ｇ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ１０．５；ｈ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ６−１；ｉ：ＹＰＥＧ−ＮＨＳ，４０ｋＤ；ｊ：ＵＰＥＧ−ＮＨＳ，４０ｋＤ；ｋ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＩＩ，ＢＲＵＫＥＲ；ｌ：ｒＨｕＧＨ；ｍ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｉ，ＢＲＵＫＥＲ。
【図７ｈ】図７ｈは、ｐＨ６．０、ｐＨ９．０またはｐＨ１０．５の条件で、ｒＨｕＧＨのＹＰＥＧ−ＮＨＳ  ４０ｋＤシングルサイト修飾産物の精製物およびＵＰＥＧ−ＮＨＳ  ４０ｋＤシングルサイト修飾産物の精製物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分子量を検出した結果である。ａ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ６；ｂ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ９；ｃ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ１０．５；ｄ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ６−１；ｅ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ６；ｆ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ９；ｇ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ１０．５；ｈ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ６−１；ｉ：ＹＰＥＧ−ＮＨＳ，４０ｋＤ；ｊ：ＵＰＥＧ−ＮＨＳ，４０ｋＤ；ｋ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＩＩ，ＢＲＵＫＥＲ；ｌ：ｒＨｕＧＨ；ｍ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｉ，ＢＲＵＫＥＲ。
【図７ｉ】図７ｉは、ｐＨ６．０、ｐＨ９．０またはｐＨ１０．５の条件で、ｒＨｕＧＨのＹＰＥＧ−ＮＨＳ  ４０ｋＤシングルサイト修飾産物の精製物およびＵＰＥＧ−ＮＨＳ  ４０ｋＤシングルサイト修飾産物の精製物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分子量を検出した結果である。ａ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ６；ｂ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ９；ｃ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ１０．５；ｄ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ６−１；ｅ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ６；ｆ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ９；ｇ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ１０．５；ｈ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ６−１；ｉ：ＹＰＥＧ−ＮＨＳ，４０ｋＤ；ｊ：ＵＰＥＧ−ＮＨＳ，４０ｋＤ；ｋ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＩＩ，ＢＲＵＫＥＲ；ｌ：ｒＨｕＧＨ；ｍ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｉ，ＢＲＵＫＥＲ。
【図７ｊ】図７ｊは、ｐＨ６．０、ｐＨ９．０またはｐＨ１０．５の条件で、ｒＨｕＧＨのＹＰＥＧ−ＮＨＳ  ４０ｋＤシングルサイト修飾産物の精製物およびＵＰＥＧ−ＮＨＳ  ４０ｋＤシングルサイト修飾産物の精製物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分子量を検出した結果である。ａ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ６；ｂ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ９；ｃ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ１０．５；ｄ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ６−１；ｅ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ６；ｆ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ９；ｇ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ１０．５；ｈ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ６−１；ｉ：ＹＰＥＧ−ＮＨＳ，４０ｋＤ；ｊ：ＵＰＥＧ−ＮＨＳ，４０ｋＤ；ｋ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＩＩ，ＢＲＵＫＥＲ；ｌ：ｒＨｕＧＨ；ｍ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｉ，ＢＲＵＫＥＲ。
【図７ｋ】図７ｋは、ｐＨ６．０、ｐＨ９．０またはｐＨ１０．５の条件で、ｒＨｕＧＨのＹＰＥＧ−ＮＨＳ  ４０ｋＤシングルサイト修飾産物の精製物およびＵＰＥＧ−ＮＨＳ  ４０ｋＤシングルサイト修飾産物の精製物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分子量を検出した結果である。ａ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ６；ｂ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ９；ｃ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ１０．５；ｄ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ６−１；ｅ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ６；ｆ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ９；ｇ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ１０．５；ｈ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ６−１；ｉ：ＹＰＥＧ−ＮＨＳ，４０ｋＤ；ｊ：ＵＰＥＧ−ＮＨＳ，４０ｋＤ；ｋ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＩＩ，ＢＲＵＫＥＲ；ｌ：ｒＨｕＧＨ；ｍ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｉ，ＢＲＵＫＥＲ。
【図７ｌ】図７ｌは、ｐＨ６．０、ｐＨ９．０またはｐＨ１０．５の条件で、ｒＨｕＧＨのＹＰＥＧ−ＮＨＳ  ４０ｋＤシングルサイト修飾産物の精製物およびＵＰＥＧ−ＮＨＳ  ４０ｋＤシングルサイト修飾産物の精製物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分子量を検出した結果である。ａ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ６；ｂ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ９；ｃ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ１０．５；ｄ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ６−１；ｅ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ６；ｆ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ９；ｇ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ１０．５；ｈ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ６−１；ｉ：ＹＰＥＧ−ＮＨＳ，４０ｋＤ；ｊ：ＵＰＥＧ−ＮＨＳ，４０ｋＤ；ｋ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＩＩ，ＢＲＵＫＥＲ；ｌ：ｒＨｕＧＨ；ｍ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｉ，ＢＲＵＫＥＲ。
【図７ｍ】図７ｍは、ｐＨ６．０、ｐＨ９．０またはｐＨ１０．５の条件で、ｒＨｕＧＨのＹＰＥＧ−ＮＨＳ  ４０ｋＤシングルサイト修飾産物の精製物およびＵＰＥＧ−ＮＨＳ  ４０ｋＤシングルサイト修飾産物の精製物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分子量を検出した結果である。ａ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ６；ｂ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ９；ｃ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ１０．５；ｄ：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｙ６−１；ｅ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ６；ｆ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ９；ｇ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ１０．５；ｈ：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ，Ｕ６−１；ｉ：ＹＰＥＧ−ＮＨＳ，４０ｋＤ；ｊ：ＵＰＥＧ−ＮＨＳ，４０ｋＤ；ｋ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＩＩ，ＢＲＵＫＥＲ；ｌ：ｒＨｕＧＨ；ｍ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｉ，ＢＲＵＫＥＲ。
【００５４】
【図８】図８は、ｐＨ６．０の条件でＰＥＧ−ＮＨＳ  ４０ｋＤでシングルサイトに修飾された見かけ分子量の大きいｒＨｕＧＨ修飾産物の精製物と、ｐＨ１０．５の条件でＰＥＧ−ＮＨＳ  ４０ｋＤでシングルサイトに修飾されたｒＨｕＧＨ修飾産物の精製物との非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果である。単離ゲル濃度が１２％、銀染色法が利用される。レーン１：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ  Ｙ１０．５，サンプル量２μｇ；レーン２：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ  Ｙ６．０−１，サンプル量２μｇ；レーン３：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ  Ｕ１０．５，サンプル量２μｇ；レーン４：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ  Ｕ６．０−１，サンプル量２μｇ；レーン５：  ｒＨｕＧＨ，サンプル量５０ｎｇ；レーン６：  ｒＨｕＧＨ，サンプル量１００ｎｇ；レーン７：マーカー，ＬＭＷ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；レーン８：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ  Ｙ１０．５，サンプル量１０μｇ；レーン９：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ  Ｙ６．０−１，サンプル量１０μｇ；レーン１０：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ  Ｕ１０．５，サンプル量１０μｇ；レーン１１：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ  Ｕ６．０−１，サンプル量１０μｇ。
【００５５】
【図９】図９は、ｐＨ６．０の条件でＰＥＧ−ＮＨＳ  ４０ｋＤでシングルサイトに修飾された見かけ分子量の大きいｒＨｕＧＨ修飾産物の精製物（Ｙ６−１、Ｕ６−１）と、ｐＨ１０．５の条件でＰＥＧ−ＮＨＳ  ４０ｋＤでシングルサイトに修飾されたｒＨｕＧＨ修飾産物の精製物（Ｙ１０．５、Ｕ１０．５）との、還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出した見かけ分子量である。レーン１：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ  Ｙ６−１＋ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ  Ｙ１０．５，それぞれ２５ｎｇ；レーン２：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ  Ｙ６−１，５０ｎｇ；レーン３：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ  Ｙ１０．５，５０ｎｇ；レーン４，６：ブランク；レーン５：ｍａｒｋｅｒ，ＨＭＷ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；レーン７：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ  Ｕ６−１＋ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ  Ｕ１０．５，それぞれ２５ｎｇ；レーン８：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ  Ｕ６−１，５０ｎｇ；レーン９：ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ  Ｕ１０．５，５０ｎｇ。
【００５６】
【図１０】図１０は、カニクイザルに３００μｇ・ｋｇ−１ｒＨｕＧＨおよびＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ（Ｙ１０．５）をそれぞれ単剤皮下注射した際の、平均血清薬物濃度−時間曲線である。
【００５７】
［発明を実施するための形態］
本発明を下記実施例によりさらに説明するが、任意の実施例又はそれらの組合せは、本発明の範囲あるいは態様を限定するものではない。本発明の範囲は添付の請求の範囲に限定され、本明細書および当該技術分野の一般的な常識を組み合わせて、当業者は、請求の範囲により限定される範囲を明確に理解することができる。
【００５８】
［実施例１］
組み換えヒト成長ホルモンのＵ型およびＹ型分岐ＰＥＧによる修飾
２００ｍｇのＵＰＥＧ−ＮＨＳまたはＹＰＥＧ−ＮＨＳ（平均分子量４０ＫＤ、均等アーム型、ロットナンバーそれぞれＺＺ００４Ｐ１８２、ＺＺ００４Ｐ１６７）（  Ｂｅｉｊｉｎｇ  ＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．）をそれぞれ取り、別々に２ｍｌ  ２ｍＭ  ＨＣｌ（広東光華化学株式会社）、別々に５０ｍｇのｒＨｕＧＨ（厦門特宝生物工程株式会社）および５０ｍＭホウ酸−ホウ砂緩衝溶液（ｐＨ８．０）（中国医薬集団上海化学試薬公司）を加え、反応系の全体積を１０ｍｌにした。この反応系において、ｒＨｕＧＨ反応最終濃度は５ｍｇ／ｍｌであり、ｒＨｕＧＨとＰＥＧ−ＮＨＳとの反応モル比は１：２であった。振動しながら＜１０℃の湯浴に２ｈ放置し、氷酢酸（汕頭市西隆化工場）を加え、ｐＨ＜４．０まで調節し反応を終止した。サンプリングして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行ない、銀染色法を利用する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果が図１に示す。図１の電気泳動結果によると、ｐＨ８．０の条件で修飾産物は主に二つのバンドを呈し、ＵＰＥＧ−ＮＨＳおよびＹＰＥＧ−ＮＨＳ修飾反応サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動行為は同じである。
【００５９】
［実施例２］
異なるｐＨ条件で組み換えヒト成長ホルモンのＵ型およびＹ型分岐ＰＥＧでの修飾
２００ｍｇのＵＰＥＧ−ＮＨＳまたはＹＰＥＧ−ＮＨＳ（平均分子量４０ＫＤ、均等アーム型、ロットナンバーそれぞれＺＺ００４Ｐ１８２、ＺＺ００４Ｐ１６７）（Ｂｅｉｊｉｎｇ  ＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．）をそれぞれ量り、それぞれ２ｍＭ  ＨＣｌ（広東光華化学株式会社）２ｍｌに溶解した。５０ｍｇのｒＨｕＧＨ（厦門特宝生物工程株式会社）および対応する緩衝溶液をそれぞれ加え、反応系の全体積を１０ｍｌにした。対応するｐＨの１０ｍＭ  ＰＢＮａ緩衝溶液（中国医薬集団上海化学試薬公司）を用いて反応ｐＨを６．０、７．０または８．０にし、対応するｐＨの５０ｍＭホウ砂緩衝溶液（中国医薬集団上海化学試薬公司）を用いて反応ｐＨを９．０、９．５、１０．０または１０．５にした。この反応系において、ｒＨｕＧＨ反応最終濃度は５ｍｇ／ｍｌであり、ｒＨｕＧＨとＰＥＧ−ＮＨＳとの反応モル比は１：２であった。振とうしながら＜１０℃の水浴に２ｈ放置し、氷酢酸（汕頭市西隆化工場）を加え、ｐＨ＜４．０に調節し反応を終止した。サンプリングして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行ない、銀染色法を利用した。ゲルドキュメンテーションシステム（タイプ：ＦＲ−２００、上海複日科技株式会社）によって電気泳動の結果を分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果を図２、図３に示す。ゲルドキュメンテーションシステムの分析結果を表１に示す。電気泳動の結果によると、ｐＨ６．０−９．５の条件における修飾産物の主バンドはすべてはっきりと二つのバンドを呈し、反応ｐＨの上昇に従って、見かけ分子量の小さい主バンドの含有量が相応的に増加する。ｐＨ１０．０及び１０．５の条件において修飾産物はだいたい見かけ分子量の小さい主バンドを主とする。ＵＰＥＧ−ＮＨＳおよびＹＰＥＧ−ＮＨＳ修飾反応サンプルは同じＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の特徴を示す。
【表１】
0005458416.tif 000022
【００６０】
［実施例３］
ｐＨ６．０、ｐＨ９．０または１０．５のｐＨ条件でＵ型およびＹ型分岐ＰＥＧでシングルサイトに修飾された組み換えヒト成長ホルモンの製造、並びに、細胞学的活性及び分子量の測定
１、修飾反応
１２００ｍｇのＵＰＥＧ−ＮＨＳまたはＹＰＥＧ−ＮＨＳ（平均分子量４０ＫＤ、均等アーム型、ロットナンバーそれぞれＺＺ００４Ｐ１８２、ＺＺ００４Ｐ１６７）（Ｂｅｉｊｉｎｇ  ＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．）を３組取り、それぞれ２ｍＭ  ＨＣｌ（広東光華化学株式会社）１２ｍｌに溶解した。それぞれ３００ｍｇのｒＨｕＧＨ（厦門特宝生物工程株式会社）と５０ｍＭホウ砂緩衝溶液（ｐＨ１０．５）若しくは５０ｍＭホウ酸／ホウ砂緩衝溶液（ｐＨ９．０）若しくは１０ｍＭ  ＰＢＮａ（ｐＨ６．０）（中国医薬集団上海化学試薬公司）を加え、反応系の全体積を６０ｍｌにした。この反応系において、ｒＨｕＧＨの反応最終濃度は５ｍｇ／ｍｌであり、ｒＨｕＧＨとＰＥＧ−ＮＨＳとの反応モル比は約１：２であり、反応ｐＨはそれぞれ１０．５、９．０または６．０である。振とうしながら＜１０℃の湯浴に２ｈ放置し、氷酢酸（汕頭市西隆化工場）を加えｐＨ＜４．０に調節し、反応を終止した。サンプリングして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行ない、銀染色法を利用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果が図１に示す。図１の電気泳動結果によると、ｐＨ８．０の条件で修飾産物は主に二つのバンドを呈し、ＵＰＥＧ−ＮＨＳおよびＹＰＥＧ−ＮＨＳ修飾反応サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動行為は同じである。
【００６１】
２、精製
２．１  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦクロマトグラフィー精製
ｒＨｕＧＨのＰＥＧ修飾反応サンプルを超純水で３倍希釈し、希釈サンプルのｐＨをＮａＯＨあるいはＨＣｌで９．０に調節した。
【００６２】
２．１．１  ｒＨｕＧＨのＰＥＧ修飾反応サンプル（ｐＨ６．０）のＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦクロマトグラフィー精製
カラム（上海錦華クロマトグラフィー設備工場）の規格がФ１８ｍｍ×４００ｍｍ、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ充填物（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の充填規格がФ１８ｍｍ×２４０ｍｍ、カラム体積（ＣＶ）が６１ｍｌである。Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦクロマトグラフィーカラムを０．５Ｍ  ＮａＯＨ  ５ｍｌ／ｍｉｎ×３０ｍｉｎで定置洗浄し、３ＣＶのｄｄＨ２Ｏ  ５ｍｌ／ｍｉｎで溶離し、３ＣＶの１Ｍ  ＮａＣｌ  ５ｍｌ／ｍｉｎで再生し、５ＣＶの２０ｍＭホウ砂／ホウ酸−１７ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ９．０、Ａ液）５ｍｌ／ｍｉｎで溶離した。ＰＥＧ修飾ｒＨｕＧＨの超純水希釈サンプルを３ｍｌ／ｍｉｎの流速でロードし、溶出液の検出波長を２８０ｎｍ（ＡＫＴＡ  Ｂａｓｉｃ１００，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に設定した。Ａ液の５ｍｌ／ｍｉｎで一番目のピークが完全に検出されるまで溶出し、２０ｍＭホウ砂／ホウ酸−１００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ９．０、Ｂ液）に変えて５ｍｌ／ｍｉｎで二番目のピークが完全に出るまで溶出し、２０ｍＭホウ砂／ホウ酸−２００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ９．０、Ｃ液）に変えて５ｍｌ／ｍｉｎで三番目のピークが完全に出るまで溶出した。集めた二番目のピークが目的サンプルである。目的サンプルの緩衝系を５Ｋ限界ろ過フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ポリエーテルスルフォン材料）で２０ｍＭホウ砂／ホウ酸（ｐＨ  ９．０）に変えた。
【００６３】
２．１．２  ｒＨｕＧＨのＰＥＧ修飾反応サンプル（ｐＨ９．０または１０．５）のＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦクロマトグラフィー精製
カラム（上海錦華クロマトグラフィー設備工場）の規格がФ１８ｍｍ×４００ｍｍ、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ充填物（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の充填規格がФ１８ｍｍ×２４０ｍｍ，カラム体積（ＣＶ）が６１ｍｌである。Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦクロマトグラフィーカラムを０．５Ｍ  ＮａＯＨ  ５ｍｌ／ｍｉｎ×３０ｍｉｎで定置洗浄し、３ＣＶのｄｄＨ２Ｏ  ５ｍｌ／ｍｉｎで溶離し、３ＣＶの１Ｍ  ＮａＣｌ  ５ｍｌ／ｍｉｎで再生し、５ＣＶの２０ｍＭホウ砂／ホウ酸−１７ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ９．０、Ａ液）５ｍｌ／ｍｉｎで溶離した。ＰＥＧ修飾ｒＨｕＧＨの超純水希釈サンプルを３ｍｌ／ｍｉｎの流速でロードし、溶出液の検出波長を２８０ｎｍ（ＡＫＴＡ  Ｂａｓｉｃ１００，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に設定した。Ａ液を５ｍｌ／ｍｉｎで一番目のピークが完全に検出されるまで溶出し、２０ｍＭホウ砂／ホウ酸−４０ｍＭ  ＮａＣｌ  （ｐＨ９．０、Ｂ液）に変えて５ｍｌ／ｍｉｎで二番目のピークが完全に出るまで溶出し、２０ｍＭホウ砂／ホウ酸−１００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ９．０、Ｃ液）に変えて５ｍｌ／ｍｉｎで三番目のピークが完全に出るまで溶出し、２０ｍＭホウ砂／ホウ酸−２００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ９．０、Ｄ液）に変えて５ｍｌ／ｍｉｎで四番目のピークが完全に出るまで溶出した。集めた三番目のピークが目的サンプルである。目的サンプルの緩衝系を５Ｋ限界ろ過フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ポリエーテルスルフォン材料）で２０ｍＭホウ砂／ホウ酸（ｐＨ  ９．０）に変えた。
【００６４】
２．２  ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦクロマトグラフィー精製
カラム（上海錦華クロマトグラフィー設備工場）の規格がФ１８ｍｍ×４００ｍｍ、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ充填物（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の充填規格がФ１８ｍｍ×２３５ｍｍ、１ＣＶ＝６０ｍｌ。
【００６５】
ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦクロマトグラフィーカラムを０．５Ｍ  ＮａＯＨ  ５ｍｌ／ｍｉｎ×３０ｍｉｎで定置洗浄し、３ＣＶのｄｄＨ２Ｏ  ５ｍｌ／ｍｉｎで溶離し、３ＣＶの１Ｍ  ＮａＣｌ  ５ｍｌ／ｍｉｎで再生し、３ＣＶの２０ｍＭホウ砂／ホウ酸−１７ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ９．０、Ａ液）５ｍｌ／ｍｉｎで溶離した。Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ精製ＰＥＧ−ｒＨｕＧＨサンプルを３ｍｌ／ｍｉｎの流速でロードし、３ＣＶのＡ液５ｍｌ／ｍｉｎで溶出し、６ＣＶの２０ｍＭホウ砂／ホウ酸−３０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ９．０、Ｂ液）５ｍｌ／ｍｉｎで溶出し、２０ｍＭホウ砂／ホウ酸−１００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ９．０、Ｃ液）に変え、一番目、二番目のピークが完全に出るまで５ｍｌ／ｍｉｎで溶出した。溶出液の検出波長を２８０ｎｍ（ＡＫＴＡ  Ｂａｓｉｃ１００，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に設定した。集めた二番目のピークが目的サンプルである。目的タンパクサンプルの緩衝系を５ｍＭ  ＰＢＮａ（ｐＨ  ８．５）に変え、５Ｋ限界ろ過フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ポリエーテルスルフォン材料）で適宜濃縮した。
【００６６】
２．３  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦクロマトグラフィー精製
カラム（上海錦華クロマトグラフィー設備工場）の規格がФ２５ｍｍ×４００ｍｍ、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ充填物（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の充填規格がФ２５ｍｍ×２００ｍｍ，１ＣＶ＝９８ｍｌ。
【００６７】
Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦクロマトグラフィーカラムを０．５Ｍ  ＮａＯＨ  １０ｍｌ／ｍｉｎ×３０ｍｉｎで定置洗浄し、３ＣＶのｄｄＨ２Ｏ  １０ｍｌ／ｍｉｎで溶離し、３ＣＶの１Ｍ  ＮａＣｌ  １０ｍｌ／ｍｉｎで再生し、３ＣＶの５ｍＭＰＢＮａ（ｐＨ  ８．５，Ａ液）１０ｍｌ／ｍｉｎで溶離した。ＰＥＧ−ｒＨｕＧＨのＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ精製サンプルを６ｍｌ／ｍｉｎの流速でロードし、３ＣＶのＡ液１０ｍｌ／ｍｉｎで溶出し、５ｍＭ  ＰＢＮａ−９０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ８．５，Ｂ液）に変えて１０ｍｌ／ｍｉｎで一番目のピークが完全に出るまで溶出した。５ｍＭ  ＰＢＮａ−３００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ８．５，Ｃ液）に変えて１０ｍｌ／ｍｉｎで二番目のピークが完全に出るまで溶出した。溶出液の検出波長を２８０ｎｍ（ＡＫＴＡ  Ｂａｓｉｃ１００，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に設定した。集めた一番目のピークが目的サンプルである。目的サンプルの緩衝系を５Ｋ限界ろ過フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ポリエーテルスルフォン材料）で３ｍＭ  ＮａＡｃ／ＨＡｃ−７ｍＭ  ＮａＣｌ−５ｍＭ  Ｌｙｓ（ｐＨ  ５．０）に変え、最終濃度が４５ｍｇ／ｍｌになるまでマンニトールを追加した。０．２μｍろ過で除菌し、サンプリングして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行ない、銀染色法を利用した。残ったサンプルを−７０℃において保存した。ｐＨ６．０修飾反応産物をＹ６あるいはＵ６と命名し、見かけ分子量の大きいバンドはＹ６−１あるいはＵ６−１と命名し、見かけ分子量の小さいバンドはＹ６−２あるいはＵ６−２と命名した。ｐＨ９．０修飾反応産物をＹ９あるいはＵ９と命名し、ｐＨ１０．５修飾反応産物をＹ１０．５あるいはＵ１０．５と命名した。
【００６８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果を図４に示す。電気泳動の結果によると、ｐＨ６．０修飾産物ははっきりと二つのバンドを呈し、ｐＨ１０．５修飾産物は主に見かけ分子量の小さいバンドであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ含有量が８０％以上である。
【００６９】
３．細胞学的活性検出
ＧＨ国家標準品を対照とし、ＨｕＧＨ依存性ラットリンパ腫細胞株Ｎｂ２−１１を採用し、ＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ各サンプルの細胞学的活性を分析した。
【００７０】
最終濃度が５×１０４ｃｅｌｌ／ｍｌになるまでＮｂ２−１１細胞を希釈した。ＧＨ国家標準品（ロットナンバー：３５−２０００２、１ｍｇ／ｍｌ／本、３ＩＵ／本、中国薬品生物制品検定所）を１００ｎｇ／ｍｌ（０．０００３ＩＵ／ｍｌ）に予備希釈し、ＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ各検出用サンプルを予備実験の結果によって０．０００３ＩＵ／ｍｌに予備希釈した。予備希釈に基づいて、各サンプルを１．５倍に希釈してから検出した。サンプル活性の計算式を下式に示す。
【数１】
0005458416.tif 000023
ここで、Ｃ１が検出用サンプルの、標準品の半数有効量に相当する希釈倍数
Ｃ２が標準品の半数有効量の希釈倍数
Ｄ１が検出用サンプルの予備希釈倍数
Ｄ２が標準品の予備希釈倍数
検出方法：
（１）対数増殖期の細胞を採用し、繰り返しピペッティングし、遠心洗浄をし、希釈液に細胞を再懸濁し、細胞濃度を５×１０４ｃｅｌｌ／ｍｌに調節した。
（２）検出用サンプルの予備希釈物をそれぞれセルプレート（９６ウェルプレート、Ｃｏｒｎｉｎｇ）で、二倍希釈を行い、全部で１０個の希釈液を作製した。各希釈液をダブルウェル、５０μｌ／ウェルずつ作製した。陽性対照も同じ方法で８個の希釈液をした。希釈液を陰性対照として使った。
（３）細胞を１００μｌ／ウェルの濃度で加え、二酸化炭素ガスインキュベーターに置き３７℃で７０時間培養した。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅＴＭ溶液（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）を３０μｌ／ウェル加え、１分間振り混ぜ、二酸化炭素ガスインキュベーターに置き３７℃で５時間培養した。室温で５分間振り混ぜ、プレートを読んだ（励起波長５３０ｎｍ、発光波長５９０ｎｍ）。
（４）４パラメーター回帰法で標準品の曲線または検出用サンプルの曲線を描いた。標準品の曲線または検出用サンプルの曲線の方程式で各検出用サンプルの力価を測定した。
【００７１】
細胞学的活性の検出結果を表２または図５、図６に示す。各サンプルについて２つのサンプルを検出した。ｒＨｕＧＨのＹＰＥＧ−ＮＨＳ  ｐＨ６．０修飾産物（Ｙ６）の細胞学的比活性は１．０８×１０−１ＩＵ／ｍｇで、ｐＨ９．０修飾産物（Ｙ９）の細胞学的比活性は１．６６×１０−１ＩＵ／ｍｇで、ｐＨ１０．５修飾産物（Ｙ１０．５）の細胞学的比活性は２．０９×１０−１ＩＵ／ｍｇで、Ｙ１０．５の細胞学的比活性はＹ６の約２倍に当たった。ｒＨｕＧＨのＵＰＥＧ−ＮＨＳ  ｐＨ６．０修飾産物（Ｕ６）の細胞学的比活性は８．８５×１０−２ＩＵ／ｍｇで、ｐＨ９．０修飾産物（Ｕ９）の細胞学的比活性は１．４２×１０−１ＩＵ／ｍｇであった。ｐＨ１０．５修飾産物（Ｕ１０．５）細胞学的比活性は１．８２×１０−１ＩＵ／ｍｇで、Ｕ１０．５の細胞学的比活性はＵ６の約２倍に当たった。修飾反応ｐＨの上昇にしたがって、ＰＥＧでシングルサイトに修飾された産物（二つの主バンド）の細胞学比活性は相応的に強くなる。
【表２】
0005458416.tif 000024
【００７２】
４、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで分子量の測定
ドイツＢＲＵＫＥＲ社のＡｕｔｏｆｌｅｘ  ＩＩＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦシステムでＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ法に準じてＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ各サンプルの分子量を測定した。シナピン酸（ＳＡ，Ｃ１１Ｈ１２Ｏ５，ＭＷ  ２２４．２２；  ロット２００６  ２３６８７０  ００２、ＢＲＵＫＥＲ）を基質として使用し、タンパク分子量標準物質はＢＲＵＫＥＲ社のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｉ（Ｐａｒｔ  Ｎｏ．  ２０６３５５）およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ＳｔａｎｄａｒｄＩＩ（Ｐａｒｔ  Ｎｏ．２０７２３４）を用い、分析ソフトはｆｌｅｘＡｎａｌｙｓｉｓ  Ｖｅｒ．３．０．５４．０であった。結果を図７に示す。
【００７３】
ｒＨｕＧＨのＹＰＥＧ−ＮＨＳ  ｐＨ６．０修飾産物（Ｙ６）、ｐＨ９．０修飾産物（Ｙ９）およびｐＨ１０．５修飾産物（Ｙ１０．５）のＭＳ分子量はすべて６２０１２ダルトン±１０％の範囲にあり、ＹＰＥＧシングルサイト修飾ｒＨｕＧＨの理論分子量と一致し（ＹＰＥＧ−ＮＨＳの分子量が４０ｋＤ±１０％）、Ｙ６、Ｙ９およびＹ１０．５がｒＨｕＧＨのＹＰＥＧシングルサイト修飾産物であることが示された。ｒＨｕＧＨのＵＰＥＧ−ＮＨＳ  ｐＨ６．０修飾産物（Ｕ６）、ｐＨ９．０修飾産物（Ｕ９）およびｐＨ１０．５修飾産物（Ｕ１０．５）のＭＳ分子量はすべて６２０１２ダルトン±１０％の範囲にあり、Ｕ  ＰＥＧシングルサイト修飾ｒＨｕＧＨの理論分子量と一致し（ＵＰＥＧ−ＮＨＳの分子量が４０ｋＤ±１０％）、Ｕ６、Ｕ９およびＵ１０．５はｒＨｕＧＨのＵＰＥＧシングルサイト修飾産物であることが示された。
【００７４】
［実施例４］
ｐＨ６．０条件でＵ型およびＹ型分岐ＰＥＧでシングルサイトに修飾された組み換えヒト成長ホルモンの見かけ分子量の大きい修飾産物（Ｙ６−１、Ｕ６−１）の製造ならび分子量および細胞学的活性の分析
１、修飾反応
１２００ｍｇのＵＰＥＧ−ＮＨＳまたはＹＰＥＧ−ＮＨＳ（平均分子量４０ＫＤ、均等アーム型、ロットナンバーそれぞれＺＺ００４Ｐ１８２、ＺＺ００４Ｐ１６７）（Ｂｅｉｊｉｎｇ  ＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．）を２組取り、それぞれ２ｍＭ  ＨＣｌ（広東光華化学株式会社）１２ｍｌに溶解した。それぞれ３００ｍｇのｒＨｕＧＨ（厦門特宝生物工程株式会社）および、５０ｍＭホウ砂緩衝溶液（ｐＨ１０．５）あるいは５０ｍＭホウ酸／ホウ砂緩衝溶液（ｐＨ９．０）あるいは１０ｍＭ  ＰＢＮａ（ｐＨ６．０）（中国医薬集団上海化学試薬公司）を加え、反応系の全体積を６０ｍｌにした。この反応系において、ｒＨｕＧＨ反応最終濃度は５ｍｇ／ｍｌであり、ｒＨｕＧＨとＰＥＧ−ＮＨＳとの反応モル比は約１：２であり、反応ｐＨが６．０である。振とうしながら＜１０℃の湯浴に２ｈ放置し、氷酢酸（汕頭市西隆化工場）を加え、ｐＨ＜４．０まで調節し反応を終止した。
【００７５】
２、見かけ分子量の大きいＰＥＧシングルサイト修飾産物（Ｙ６−１、Ｕ６−１）の精製
２．１  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦクロマトグラフィー精製
ｒＨｕＧＨのＰＥＧ修飾反応サンプル（反応ｐＨ６．０）を超純水で３倍希釈し、それぞれＮａＯＨでｐＨ９．０に調整した。
【００７６】
カラム（上海錦華クロマトグラフィー設備工場）の規格がФ２５ｍｍ×５００ｍｍ、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ充填物（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の充填規格がФ２５ｍｍ×３１０ｍｍ，１ＣＶ＝１５２ｍｌである。Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦクロマトグラフィーカラムを０．５Ｍ  ＮａＯＨ  １０ｍｌ／ｍｉｎ×３０ｍｉｎ  定置洗浄し、３ＣＶのｄｄＨ２Ｏ  １０ｍｌ／ｍｉｎで溶離し、３ＣＶの１Ｍ  ＮａＣｌ  １０ｍｌ／ｍｉｎで再生し、５ＣＶの２０ｍＭホウ砂／ホウ酸−１７ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ９．０、Ａ液）１０ｍｌ／ｍｉｎで溶離した。ＰＥＧ修飾ｒＨｕＧＨの超純水希釈サンプルを６ｍｌ／ｍｉｎの流速でロードし、Ａ液を１０ｍｌ／ｍｉｎで一番目のピークが完全に出るまで溶出し、２０ｍＭホウ砂／ホウ酸−１００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ９．０、Ｂ液）に変えて１０ｍｌ／ｍｉｎで二番目のピークが完全に出るまで溶出し、２０ｍＭホウ砂／ホウ酸−２００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ９．０、Ｃ液）に変えて１０ｍｌ／ｍｉｎで三番目のピークが完全に出るまで溶出した。溶出液の検出波長を２８０ｎｍ（ＡＫＴＡ  Ｂａｓｉｃ１００，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に設定した。集めた二番目のピークが目的サンプルである。５Ｋ限界ろ過フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ポリエーテルスルフォン材料）で目的サンプルの緩衝系を５ｍＭ  ＮａＡｃ／ＨＡｃ（ｐＨ  ４．５）に変えた。
【００７７】
２．２  ＭａｃｒｏＣａｐ  ＳＰクロマトグラフィー精製
カラム（上海錦華クロマトグラフィー設備工場）の規格がФ１２ｍｍ×３００ｍｍ、ＭａｃｒｏＣａｐ  ＳＰ充填物（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の充填規格がФ１２ｍｍ×１８０ｍｍ、１ＣＶ＝２０ｍｌである。ＭａｃｒｏＣａｐ  ＳＰクロマトグラフィーカラムを０．５Ｍ  ＮａＯＨ  １ｍｌ／ｍｉｎ×３０ｍｉｎで定置洗浄し、３ＣＶのｄｄＨ２Ｏ  １ｍｌ／ｍｉｎで溶離し、３ＣＶの１Ｍ  ＮａＣｌ  １ｍｌ／ｍｉｎで再生し、５ＣＶの５ｍＭ  ＮａＡｃ／ＨＡｃ（ｐＨ  ４．５、Ａ液）１ｍｌ／ｍｉｎで溶離した。Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ精製ＰＥＧ−ｒＨｕＧＨサンプルを１ｍｌ／ｍｉｎの流速でロードし、３ＣＶのＡ液１ｍｌ／ｍｉｎで溶離し、５ｍＭ  ＮａＡｃ／ＨＡｃ−１００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ４．５、Ｂ液）を用いて、５ＣＶのＢ液０％−３０％の勾配で１ｍｌ／ｍｉｎで溶離し、１０ＣＶのＢ液３０％−４５％の勾配で溶離し、５ｍＭ  ＮａＡｃ／ＨＡｃ−１Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ４．５、Ｃ液）に変えて１ｍｌ／ｍｉｎで、一番目と二番目のピークが完全に出るまで溶出した。溶出液の検出波長を２８０ｎｍ（ＡＫＴＡ  Ｂａｓｉｃ１００，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に設定した。３０％−４５％Ｂ勾配溶離の第５から第８のＣＶの溶出サンプルが目的サンプルである。５Ｋ限界ろ過フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ポリエーテルサルフォン基質）を用いた限外ろ過で目的サンプルの緩衝系を３ｍＭ  ＮａＡｃ／ＨＡｃ−７ｍＭ  ＮａＣｌ−５ｍＭ  Ｌｙｓ（ｐＨ５．０）に変え、最終濃度が４５ｍｇ／ｍｌになるまでマンニトールを追加した。０．２μｍろ過で除菌し、サンプリングして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行ない、銀染色法を利用した。残ったサンプルを−７０℃において保存した。サンプル番号：Ｕ６−１、Ｙ６−１。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動検出の結果を図８に示し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の見かけの分子量の検出結果を図９に示した。
【００７８】
各ＰＥＧ−ｒＨｕＧＨサンプルの１０μｇのローディングでは、検出されたマルチサイト修飾産物は全て少量で、各サンプルの基質タンパク質（ｒＨｕＧＨ）の含有量はすべて０．５％以下であって（図８）、主バンドの含有量はすべて８０％以上であった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により各ＰＥＧ−ｒＨｕＧＨサンプルの見かけ分子量を検出した結果はすべて一本のバンドを呈し、Ｙ６−１の見かけ分子量はＹ１０．５より顕著に大きく、Ｕ６−１の見かけ分子量はＵ１０．５より顕著に大きい（図９）。
【００７９】
３、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる分子量の測定
ドイツＢＲＵＫＥＲ社のａｕｔｏｆｌｅｘ  ＴＯＦ／ＴＯＦシステムを用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ法に準じてＰＥＧ−ｒＨｕＧＨＹ各サンプルの分子量を測定した。検出方法は実施例３と同じであった。結果を図７に示す。
【００８０】
Ｙ６−１及びＵ６−１のＭＳ分子量はどちらも６２０１２ダルトン±１０％の範囲にあり、ＰＥＧシングルサイト修飾ｒＨｕＧＨの理論分子量と一致し（ＹＰＥＧ−ＮＨＳまたはＵＰＥＧ−ＮＨＳの分子量が４０ｋＤ±１０％）、どちらもＰＥＧのシングルサイト修飾産物であることが示された。
【００８１】
４．細胞学的活性の分析
ＧＨ国家標準品を対照とし、ＨｕＧＨ依存性ラットリンパ腫細胞株Ｎｂ２−１１を採用し、ＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ各サンプルの細胞学的活性を分析し、Ｙ６−１とＹ１０．５、Ｕ６−１とＵ１０．５の細胞学的活性の差別を比べた。検出方法は実施例３と同じであった。検出結果を表３に示す。一つのサンプルにおいて三回測定した。
【００８２】
Ｙ１０．５の平均細胞学的比活性が２．０８×１０−１ＩＵ／ｍｇ、Ｙ６−１の平均細胞学的比活性が５．５０×１０−２ＩＵ／ｍｇ、Ｕ１０．５の平均細胞学的比活性が２．２８×１０−１ＩＵ／ｍｇ，Ｕ６−１の平均細胞学的比活性が５．００×１０−２ＩＵ／ｍｇである。Ｙ１０．５／Ｕ１０．５の平均細胞学的比活性はＹ６−１／Ｕ６−１より顕著に高く、後者の３倍となった。
【表３】
0005458416.tif 000025
【００８３】
実施例５
ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ（Ｙ１０．５）およびＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ（Ｕ１０．５）の体内生物学的活性の分析
【００８４】
除脳下垂体ラットを動物モデルとして、『中華人民共和国薬局方』２００５年改正付録ＸＩＩ  Ｐ成長ホルモン生物測定法に準じて、ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ（Ｙ１０．５）およびＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ（Ｕ１０．５）の体内における動物成長を促進する生物学的活性を検出した。すなわち単回投与した一週間後に除脳下垂体ラット（内因性成長ホルモンなし）の成長発育に対する影響を検討した。
【００８５】
Ｗｉｓｔａｒラット、ＳＰＦ化、雄、出生して２６−２８ｄ、体重６０−８０ｇで、中国薬品生物製品検定所実験動物センター提供、動物合格証ナンバー：ＳＣＸＫ（京）２００５−０００４号を用いた。実験の２−３週前に無菌条件で手術によって脳下垂体を除去し、二級実験室で回復するまで正常に飼った。合格した除脳下垂体ラットが選ばれ、体重によって１０匹ずつ１０群に分けた。具体的には、陰性対照（ブランク溶媒）群、陽性対照ｒＨｕＧＨ（ＧＨ国家標準品で、中国薬品生物製品検定所製、３ＩＵ／本）投与群、低（２．７ＩＵ・ｋｇ−１）投与群、中（５．３ＩＵ・ｋｇ−１）投与群、高（１０．７ＩＵ・ｋｇ−１）投与群であり、６回投与で、一日に一回、６日間連続投与した。サンプルＹ１０．５の低（２．７ＩＵ・ｋｇ−１）、中（５．３ＩＵ・ｋｇ−１）および高（１０．７ＩＵ・ｋｇ−１）投与群、サンプルＵ１０．５の低（２．７ＩＵ・ｋｇ−１）、中（５．３ＩＵ・ｋｇ−１）および高（１０．７ＩＵ・ｋｇ−１）投与群は、標準品投与の第一日に同時に単回投与した。Ｙ１０．５およびＵ１０．５は推定力価の３ＩＵ／ｍｇに調製された。動物頚部に皮下注射し、投与量は０．５ｍｌであった。陰性対照群には溶媒だけを投与し、一日に一回、６日間投与した。最後の投与から２４時間後陽性対照群のラットを殺し、体重および脛骨の骨端軟骨板の幅を測った。『中華人民共和国薬局方』２００５年改正付録ＸＩＩ  Ｐ成長ホルモン生物測定法およびに付録ＸＩＶ生物検定統計法に準じて、データを処理した。
【００８６】
ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ（Ｙ１０．５）の生物力価は５．０ＩＵ・ｍｇ−１で、ＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ（Ｕ１０．５）の生物力価は５．２ＩＵ・ｍｇ−１で、普通のｒＨｕＧＨの１．５倍以上であった。動物成長における生物活性または長期的な薬理作用に関してＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ（Ｙ１０．５）およびＵＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ（Ｕ１０．５）の単回投与は、ｒＨｕＧＨの毎日の注射投与より強い。
【００８７】
［実施例６］
カニクイザルにおけるＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ（Ｙ１０．５）の血清薬物代謝半減期の測定
カニクイザル６匹を選んだ。雌３匹、雄３匹、体重が３．２４−５．４８ｋｇ（広西北海市玉埼実験動物科学技術株式会社、合格証番号：ＳＣＸＫ（桂）２００５−０００５）。３匹ずつカニクイザルを２群に分けて実験を行った。１つの群にはＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ（Ｙ１０．５）を３００mｇ・ｋｇ−１で単回皮下注射し（♂２匹，♀１匹）、もう一つの群にはｒＨｕＧＨ（Ｓａｉｚｅｎ，思真；スイスセロノ薬品株式会社）を３００mｇ・ｋｇ−１で単回皮下注射した（♂１匹，♀２匹）。投与後、定時に投与部位の反対側の後肢静脈から採血し、血清を分離した。Ｒ＆Ｄ社のＨｕｍａｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  ＥＬＩＳＡキットを使用し、ＥＬＩＳＡ法に準じて薬物血中濃度を測定し、薬物血中濃度変化の曲線を描き、薬物代謝半減期を計算した。その結果を図１０に示した。
【００８８】
カニクイザルへの、３００μｇ・ｋｇ−１投与量でのＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ（Ｙ１０．５）の単回皮下注射後の、血清薬物濃度ピーク到達時間は８−２４ｈであった。薬物の消失が緩やかであった。平均血清薬物代謝半減期は４１．３３ｈであった。カニクイザルへの、３００μｇ・ｋｇ−１投与量でのｒＨｕＧＨ（思真）の皮下注射後の、血清薬物濃度ピーク到達時間は１−２ｈで、２４ｈ後、薬物濃度が投与前のレベルに下がった。消失はＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ（Ｙ１０．５）より顕著に速かった。平均血清薬物代謝半減期は１．８０ｈである。ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧＨ（Ｙ１０．５）の平均血清薬物代謝半減期はｒＨｕＧＨの２０倍以上であった。
【図７ａ】
0005458416.tif 000037
【図７ｂ】
0005458416.tif 000038
【図７ｃ】
0005458416.tif 000039
【図７ｄ】
0005458416.tif 000040
【図７ｅ】
0005458416.tif 000041
【図７ｆ】
0005458416.tif 000042
【図７ｇ】
0005458416.tif 000043
【図７ｈ】
0005458416.tif 000044
【図７ｉ】
0005458416.tif 000045
【図７ｊ】
0005458416.tif 000046
【図７ｋ】
0005458416.tif 000047
【図７ｌ】
0005458416.tif 000048
【図７ｍ】
0005458416.tif 000049
【図１】
0005458416.tif 000050
【図２】
0005458416.tif 000051
【図３】
0005458416.tif 000052
【図４】
0005458416.tif 000053
【図５】
0005458416.tif 000054
【図６】
0005458416.tif 000055
【図８】
0005458416.tif 000056
【図９】
0005458416.tif 000057
【図１０】
0005458416.tif 000058
【配列表】
0005458416000001.app