(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、その微生物の発酵原料を前記の発酵培養液に追加する連続発酵によりＬ−アミノ酸を製造する方法であって、前記の分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜を用い、その膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲にして濾過処理することを特徴とする連続発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項２】
多孔性膜の純水透過係数が、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下である請求項１記載の連続発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項３】
多孔性膜の平均細孔径が０.０１μｍ以上０.２μｍ未満であり、かつ、該平均細孔径の標準偏差が０.１μｍ以下である請求項１または２記載の連続発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項４】
多孔性膜の膜表面粗さが０.１μｍ以下である請求項１から３のいずれかに記載の連続発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項５】
多孔性膜が多孔質樹脂層を含む多孔性膜である請求項１から４のいずれかに記載の連続発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項６】
多孔性膜の素材がポリフッ化ビニリデン系樹脂である請求項１から４のいずれかに記載の連続発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項７】
Ｌ−アミノ酸がＬ−スレオニンである請求項１から６のいずれかに記載の連続発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項８】
Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物が、エシェリシア属（Ｇｅｎｕｓ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、プロビデンシア属（Ｇｅｎｕｓ  Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、コリネバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ  Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはセラチア属（Ｇｅｎｕｓ  Ｓｅｒｒａｔｉａ）のいずれかに属する細菌である請求項７記載の連続発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項９】
Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物が、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、プロビデンシア・レトゲリ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）またはセラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）のいずれかである請求項７または８記載の連続発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項１０】
Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンである請求項１から６のいずれかに記載の連続発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項１１】
Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物が、エシェリシア属（Ｇｅｎｕｓ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、コリネバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはブレビバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ  Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のいずれかに属する細菌である請求項１０記載の連続発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項１２】
Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物が、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）またはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）のいずれかである請求項１０または１１記載の連続発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−アミノ酸を生産する能力のある微生物の発酵培養液から、目詰まりが生じにくい多孔性分離膜を通してＬ−アミノ酸を含む液を効率よく濾過・回収すること、および未濾過液を発酵培養液に戻すことにより発酵に関与する微生物濃度を向上させ、高い生産性を得ることができる連続発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微生物や培養細胞の培養を伴う物質生産方法である発酵法は、大きく（１）バッチ発酵法（Ｂａｔｃｈ発酵法）および流加発酵法（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃh発酵法）と、（２）連続発酵法とに分類することができる。
【０００３】
上記（１）のバッチ発酵法および流加発酵法は、設備的には簡素であり短時間で培養が終了し、雑菌汚染による被害が少ないという利点がある。しかしながら、時間経過とともに発酵培養液中の生産物濃度が高くなり、浸透圧あるいは生産物阻害等の影響により生産性および収率が低下してくる。そのため、長時間にわたり安定して高収率かつ高生産性を維持することが困難である。一方、上記（２）の連続発酵法は、発酵槽内で目的物質が高濃度に蓄積されることを回避することによって、長時間にわたって高収率でかつ高生産性を維持することができるという利点がある。
【０００４】
次に、飼料添加物等として有用なＬ−スレオニン等を含むアミノ酸の製造方法に関する背景技術について説明する。近年アミノ酸は、医薬品、医薬中間体、飼料添加物または食料添加物などとして需要が増大している重要な物質であり、従来から大腸菌やコリネバクテリウム等の細菌を用いたバッチ培養での発酵生産が行われている（特許文献１、特許文献２、非特許文献１および非特許文献２参照。）。一方、更に生産効率を向上させる目的で、Ｌ−グルタミン酸（特許文献３参照。）やＬ−リジン（非特許文献３参照。）の発酵について連続培養法が開示されている。しかしながら、これらの例では、発酵培養液へ原料の連続的な供給を行うとともに、微生物を含んだ発酵培養液を抜き出すために、発酵培養液中の微生物が希釈されることから、生産効率の向上は限定されたものであった。このことから、これらアミノ酸を効率的に製造することができれば製造コストの低下が期待でき、上記多種用途へのアミノ酸供給が更に容易になることが期待できる。
【０００５】
一方、セラミックス製フィルターを用いて細菌をろ過しながら培養する連続的な発酵に関する検討が行われている。例えば、小林らは、セラミックス製フィルターを用いた乳酸菌による連続的な乳酸発酵の検討を行っているが、菌体の濾過において、十分な透過性能を確保するためには、濾過圧力として、約９０ｋＰａの高い膜間差圧と逆洗浄が必要であることを報告している。また、膜表面の循環速度を早くすることにより透過性は向上するが、同時に膜表面での剪断力によって、微生物の活性低下や破裂などの不具合が生じることを開示している（非特許文献４参照。）。
【０００６】
同様に、セラミックス製フィルターを用いた連続的な発酵を行うための装置が開示されているが、この装置では、セラミックス製フィルターの逆洗浄のために、空気や窒素などの気体や、水や濾過膜透過水などの液体を発酵培養液の中に加えることになるため、細菌の物質生産能力が変化し培養の状態を最適に維持することが難しいことに加えて、菌体分離のための濾過膜装置が複雑になるという課題があった（特許文献４参照。）。更に、濾過膜を用いた細菌の培養法の技術も開示されているが、上記の装置と同様に逆洗浄操作に伴う不具合があり、また濾過時にポンプによる吸引が必要で、濾過膜装置の複雑化が課題であった（特許文献５参照。）。
【０００７】
すなわち、アミノ酸生産菌に代表される細菌を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収すると同時に濾過された細菌を培養液に還流させ、培養液中の細菌濃度を向上させ、かつ、高く維持させることにより高い物質生産性を得ることは依然として困難であり、技術の革新が望まれていた。
【特許文献１】特開平１−１４８１９４号公報
【特許文献２】特開平２−２１９５８２号公報
【特許文献３】特開平１０−１５０９９６号公報
【特許文献４】特開昭６２−１３８１８４号公報
【特許文献５】特開平２−１７４６７４号公報
【非特許文献１】イシダ、ナカモリ（Ｉｓｈｉｄａ，Ｎａｋａｍｏｒｉ）ら、「バイオサイエンス  バイオテクロノジー  アンド  バイオケミカル（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）」，５７（１０），１７５５−６（１９９３）
【非特許文献２】オカモト，イケダ（Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｉｋｅｄａ），「ジャーナル  オブ  バイオサイエンス  アンド  バイオエンジニアリング（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ），８９（１），８７−９（２０００）
【非特許文献３】トシヒコ・ヒラノ（Ｔｏｓｈｉｈｉｋｏ  Ｈｉｒａｎｏ）ら、「アプライド  マイクロバイアル  アンド  バイオテクノロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」，３２，２６９−２７３（１９８９）
【非特許文献４】小林猛ら，ケミカル・エンジニア，１２，４９（１９８８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで本発明の目的は、簡便な操作方法で、長時間にわたり安定して高生産性を維持することができる連続発酵法によるＬ−アミノ酸の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究の結果、微生物の分離膜内への侵入が少なく、微生物を膜間差圧が低い条件で発酵培養液を濾過した場合に、分離膜の目詰まりが著しく抑制されることを見出し、課題であった高濃度の微生物の濾過が長期間安定に維持できることを可能とし、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明のＬ−アミノ酸の製造方法は、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、その微生物の発酵原料を前記の培養液に追加する連続発酵によりアミノ酸を製造する方法であって、前記の分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜を用い、その膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲にして濾過処理することを特徴とする連続発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法である。
【００１１】
具体的に本発明は、発酵培養液を分離膜によって濾液と未濾過液に分離し、その濾液から所望の発酵生産物であるＬ−アミノ酸を回収するとともに、その未濾過液を発酵培養液に保持または還流させる連続発酵方法によるＬ−アミノ酸の製造方法において、高い透過性と高い細胞阻止率を持ち閉塞しにくい上記の特定の多孔性分離膜を利用すると共に上記の特定の低い膜間差圧で濾過処理することにより、安定に低コストで、発酵生産効率を著しく向上させるＬ−アミノ酸の製造方法である。
【００１２】
本発明の連続発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜の純水透過係数は、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下である。
【００１３】
本発明の連続発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜の平均細孔径は０.０１μｍ以上０.２μｍ未満であり、その平均細孔径の標準偏差は０.１μｍ以下であり、そしてその膜表面粗さは０.１μｍ以下である。
【００１４】
本発明の連続発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜は多孔質樹脂層を含む多孔性膜である。
【００１５】
本発明の連続発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜の膜素材にポリフッ化ビニリデン系樹脂を用いることである。
【００１８】
本発明の連続発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記のＬ−アミノ酸は、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−チロシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−バリンまたはＬ−ロイシンであり、より好ましくはＬ−スレオニン、Ｌ−リジンおよびＬ−グルタミン酸である。
【００１９】
本発明の連続発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記のＬ−アミノ酸を生産する能力のある微生物は、エシェリシア属（Ｇｅｎｕｓ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、プロビデンシア属（Ｇｅｎｕｓ  Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、コリネバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ  Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはセラチア属（Ｇｅｎｕｓ  Ｓｅｒｒａｔｉａ）のいずれかに属する細菌であり、特に好ましい細菌は、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、プロビデンシア・レトゲリ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）またはセラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）である。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、簡便な操作条件で、長時間にわたり安定して所望の発酵生産物の高生産性を維持する連続発酵が可能となり、発酵生産物であるＬ−アミノ酸を低コストで安定に生産することが可能となる。本発明の連続発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法により得られたＬ−アミノ酸は、例えば、飼料添加物、医薬品、医薬中間体または食料添加物等として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、Ｌ−アミノ酸を生産する能力のある微生物の発酵培養液を、分離膜で濾過し濾液から生産物を回収すると共に未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、その微生物の発酵原料を前記の発酵培養液に追加する連続発酵であって、前記の分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜を用い、その膜間差圧を０.１以上２０ｋＰａ未満にして濾過処理することを特徴とする連続発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法である。
【００２２】
本発明において分離膜として用いられる多孔性膜は、発酵に使用される微生物による目詰まりが起こりにくく、かつ、濾過性能が長期間安定に継続する性能を有するものであることが望ましい。そのため、本発明で使用される多孔性膜は、その平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満であることが重要である。
【００２３】
本発明で分離膜として用いられる多孔性膜の構成について説明する。本発明における多孔性膜は、被処理水の水質や用途に応じた分離性能と透水性能を有するものであり、阻止性能および透水性能や耐汚れ性という分離性能の点からは、多孔質樹脂層を含む多孔性膜であることが好ましい。このような多孔性膜は、多孔質基材の表面に、分離機能層として作用とする多孔質樹脂層を有している。多孔質基材は、多孔質樹脂層を支持して分離膜に強度を与えるものである。
【００２４】
多孔質基材の材質は、有機材料および無機材料等を用いることができるが、有機繊維が望ましく用いられる。好ましい多孔質基材は、セルロース繊維、セルローストリアセテート繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維およびポリエチレン繊維などの有機繊維を用いてなる織布や不織布であり、中でも、密度の制御が比較的容易であり製造も容易で安価な不織布が好ましく用いられる。
【００２５】
また、多孔質樹脂層は、上述したように分離機能層として作用するものであり、有機高分子膜を好適に使用することができる。有機高分子膜の材質としては、例えば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、セルロース系樹脂およびセルローストリアセテート系樹脂などが挙げられる。有機高分子膜は、これらの樹脂を主成分とする樹脂の混合物であってもよい。ここで主成分とは、その成分が５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上含有することをいう。中でも、多孔質樹脂層を構成する素材としては、溶液による製膜が容易で物理的耐久性や耐薬品性にも優れているポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂およびポリアクリロニトリル系樹脂が好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはそれを主成分とする樹脂が最も好ましく用いられる。
【００２６】
ここで、ポリフッ化ビニリデン系樹脂としては、フッ化ビニリデンの単独重合体が好ましく用いられるが、その他、フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体との共重合体も好ましく用いられる。フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体としては、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレンおよび三塩化フッ化エチレンなどが例示される。
【００２７】
本発明で用いられる多孔性膜は、平膜であっても中空糸膜であっても良い。多孔性膜が平膜の場合、その平均厚みは用途に応じて選択されるが、好ましくは２０μｍ以上５０００μｍ以下であり、より好ましくは５０μｍ以上２０００μｍ以下の範囲で選択される。
【００２８】
上述のように、本発明で用いられる分離膜は、多孔質基材と多孔質樹脂層とから形成されている多孔性膜であることが望ましい。その際、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していても、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していなくてもどちらでも良く、用途に応じて選択される。多孔質基材の平均厚みは、好ましくは５０μｍ以上３０００μｍ以下の範囲で選択される。
【００２９】
また、多孔性膜が中空糸膜の場合、中空糸の内径は好ましくは２００μｍ以上５０００μｍ以下の範囲で選択され、膜厚は好ましくは２０μｍ以上２０００μｍ以下の範囲で選択される。また、有機繊維または無機繊維を筒状にした織物や編物を中空糸の内部に含んでいても良い。
【００３０】
まず、多孔性膜のうち平膜の作製法の概要について説明する。
【００３１】
多孔質基材の表面に、前記の樹脂と溶媒とを含む原液の被膜を形成すると共に、その原液を多孔質基材に含浸させる。その後、被膜を有する多孔質基材の被膜側表面のみを、非溶媒を含む凝固浴と接触させて樹脂を凝固させると共に多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を形成する。原液は、樹脂を溶媒に溶解させて調整する。原液に、さらに非溶媒を含ませることもできる。原液の温度は、製膜性の観点から、通常、１５〜１２０℃の範囲内で選定することが好ましい。
【００３２】
ここで、原液には、開孔剤を添加することもできる。開孔剤は、凝固浴に浸漬された際に抽出されて、樹脂層を多孔質にする作用を持つものである。開孔剤を添加することにより、平均細孔径の大きさの制御することができる。開孔剤は、凝固浴に浸漬された際に抽出されて、樹脂層を多孔質にする作用を持つものである。開孔剤は、凝固浴への溶解性の高いものであることが好ましい。開孔剤としては、例えば、塩化カルシウムや炭酸カルシウムなどの無機塩を用いることができる。また、開孔剤として、ポリエチレングリコールやポリプロピレングリコールなどのポリオキシアルキレン類や、ポリビニルアルコール、ポリビニルブチラールおよびポリアクリル酸などの水溶性高分子化合物や、グリセリンを用いることができる。
【００３３】
また、溶媒は、樹脂を溶解するものである。溶媒は、樹脂および開孔剤に作用してそれらが多孔質樹脂層を形成するのを促す。このような溶媒としては、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ − メチル− ２ − ピロリドン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、テトラメチル尿素、リン酸トリメチル、シクロヘキサノン、イソホロン、γ − ブチロラクトン、メチルイソアミルケトン、フタル酸ジメチル、プロピレングリコールメチルエーテール、プロピレンカーボネート、ジアセトンアルコール、グリセロールトリアセテート、アセトンおよびメチルエチルケトンなどを用いることができる。中でも、樹脂の溶解性の高いＮＭＰ、ＤＭＡｃ、ＤＭＦおよびＤＭＳＯを好ましく用いられる。これらの溶媒は、単独で用いても良いし２種類以上を混合して用いても良い。原液は、先述の樹脂を好ましくは５重量％以上６０重量％以下の濃度で、上述の溶媒に溶解させることにより調整することができる。
【００３４】
また、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびグリセリンなどの溶媒以外の成分を溶媒に添加しても良い。非溶媒は、樹脂を溶解しない液体である。非溶媒は、樹脂の凝固の速度を制御して細孔の大きさを制御するように作用する。非溶媒としては、水やメタノールおよびエタノールなどのアルコール類を用いることができる。中でも、価格の点から水やメタノールが好ましい。非溶媒は、これらの混合物であってもよい。
【００３５】
次に、多孔性膜のうち、中空糸膜の作製法の概要について説明する。
【００３６】
中空糸膜は、樹脂と溶媒からなる原液を二重管式口金の外側の管から吐出すると共に、中空部形成用流体を二重管式口金の内側の管から吐出して、冷却浴中で冷却固化して作製することができる。
【００３７】
原液は、上述の平膜の作成法で述べた樹脂を好ましくは２０重量％以上６０重量％以下の濃度で、上述の平膜の生成法で述べた溶媒に溶解させることにより調整することができる。また、中空部形成用流体には、通常気体もしくは液体を用いることができる。また、得られた中空糸膜の外表面に、新たな多孔性樹脂層をコーティング（積層）することもできる。積層は中空糸膜の性質、例えば、親水性・疎水性あるいは細孔径等を所望の性質に変化させるために行うことができる。積層される新たな多孔性樹脂層は、樹脂を溶媒に溶解させた原液を、非溶媒を含む凝固浴と接触させて樹脂を凝固させることによって作製することができる。その樹脂の材質は、例えば、上述有機高分子膜の材質と同様のものが好ましく用いられる。また、積層方法としては、原液に中空糸膜を浸漬してもよいし、中空糸膜の表面に原液を塗布してもよく、積層後、付着した原液の一部を掻き取ったり、エアナイフを用いて吹き飛ばしすることにより積層量を調整することもできる。
【００３８】
本発明で用いられる多孔性膜は、支持体と組み合わせることによって分離膜エレメントとすることができる。支持体として支持板を用い、その支持板の少なくとも片面に、本発明で用いられる多孔性膜を配した分離膜エレメントは、本発明で用いられる多孔性膜を有する分離膜エレメントの好適な形態の一つである。この形態で、膜面積を大きくすることが困難な場合には、透水量を大きくするために、支持板の両面に多孔性膜を配することが好ましい。
【００３９】
分離膜としての多孔性膜の平均細孔径が上記のように０．０１μｍ以上１μｍ未満の範囲内にあると、菌体や汚泥などがリークすることのない高い排除率と、高い透水性を両立させることができ、さらに目詰まりをしにくく、透水性を長時間保持することが、より高い精度と再現性を持って実施することができる。細菌類を用いた場合、多孔性膜の平均細孔径は好ましくは０.４μｍ以下であり、平均細孔径は０.２μｍ未満であればなお好適に実施することが可能である。平均細孔径は、小さすぎると透水量が低下することがあるので、本発明では、平均細孔径は０.０１μｍ以上であり、好ましくは０．０２μｍ以上であり、さらに好ましくは０．０４μｍ以上である。
【００４０】
ここで、平均細孔径は、倍率１０，０００倍の走査型電子顕微鏡観察における、９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔すべての直径を測定し、平均することにより求めることができる。
【００４１】
上記の平均細孔径の標準偏差σは、０．１μｍ以下であることが好ましい。更に、平均細孔径の標準偏差が小さい、すなわち細孔径の大きさが揃っている方が均一な透過液を得ることができる。発酵運転管理が容易になることから、平均細孔径の標準偏差は小さければ小さい方が望ましい。
【００４２】
平均細孔径の標準偏差σは、上述の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔数をＮとして、測定した各々の直径をＸｋとし、細孔直径の平均をＸ（ａｖｅ）とした下記の（式１）により算出される。
【００４３】
【数１】
0005458481.tif 000002
【００４４】
本発明で用いられる多孔性膜においては、発酵培養液の透過性が重要点の一つであり、透過性の指標として、使用前の多孔性膜の純水透過係数を用いることができる。本発明において、多孔性膜の純水透過係数は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上であることが好ましい。純水透過係数が２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下であれば、実用的に十分な透過水量が得られる。より好ましい純水透過係数は、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上１×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下である。
【００４５】
本発明で用いられる多孔性膜の膜表面粗さは、分離膜の目詰まりに影響を与える因子である。膜表面粗さが好ましくは０.１μｍ以下のときに、分離膜の剥離係数や膜抵抗を好適に低下させることができ、より低い膜間差圧で連続発酵が実施可能である。従って、目詰まりを抑えることにより、安定した連続発酵が可能になることから、表面粗さは小さければ小さいほど好ましい。
【００４６】
また、多孔性膜の膜表面粗さを低くすることにより、微生物の濾過において、膜表面で発生する剪断力を低下させることが期待でき、微生物の破壊が抑制され、多孔性膜の目詰まりも抑制されることにより、長期間安定な濾過が可能になると考えられる。
【００４７】
ここで、膜表面粗さは、下記の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）を使用して、下記の装置と条件で測定することができる。
・装置：原子間力顕微鏡装置(Digital Instruments（株）製Nanoscope IIIa)
・条件：探針        ＳｉＮカンチレバー(Digital Instruments（株）製)
：走査モード  コンタクトモード（気中測定）
水中タッピングモード（水中測定）
：走査範囲    １０μm、２５μm 四方（気中測定）
５μm、１０μm 四方（水中測定）
：走査解像度  ５１２×５１２
・試料調製：測定に際し膜サンプルは、常温でエタノールに１５分浸漬後、ＲＯ水中に２４時間浸漬し洗浄した後、風乾し用いた。ＲＯ水とは、濾過膜の一種である逆浸透膜（ＲＯ膜）を用いて濾過し、イオンや塩類などの不純物を排除した水を指す。ＲＯ膜の孔の大きさは、概ね２ｎｍ以下である。
【００４８】
膜表面粗さｄｒｏｕｇｈは、上記のＡＦＭにより各ポイントのＺ軸方向の高さから、下記の（式２）により算出する。
【００４９】
【数２】
0005458481.tif 000003
【００５０】
本発明において、微生物を分離膜で濾過処理する際の膜間差圧は、微生物および培地成分が容易に目詰まりしない条件であればよいが、膜間差圧を０.１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲にして濾過処理することが重要である。膜間差圧は、好ましくは０.１ｋＰａ以上１０ｋＰａ以下の範囲であり、さらに好ましくは０.１ｋＰａ以上５ｋＰａの範囲である。上記の膜間差圧の範囲を外れた場合、微生物および培地成分の目詰まりが急速に発生し、透過水量の低下を招き、連続発酵運転に不具合を生じることがある。
【００５１】
濾過の駆動力としては、発酵培養液と多孔性膜処理水の液位差（水頭差）を利用したサイホンにより多孔性膜に膜間差圧を発生させることが可能である。また、濾過の駆動力として多孔性膜処理水側に吸引ポンプを設置してもよいし、多孔性膜の発酵培養液側に加圧ポンプを設置することも可能である。膜間差圧は、発酵培養液と多孔性膜処理水の液位差を変化させることにより制御することができる、また、膜間差圧を発生させるためにポンプを使用する場合には、吸引圧力により膜間差圧を制御することができ、更に発酵培養液側の圧力を導入する気体または液体の圧力によっても膜間差圧を制御することができる。これら圧力制御を行う場合には、発酵培養液側の圧力と多孔性膜処理水側の圧力差をもって膜間差圧とし、膜間差圧の制御に用いることができる。
【００５２】
また、本発明において使用される多孔性膜は、濾過処理する膜間差圧として、０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲で濾過処理することができる性能を有するものであることが好ましい。また、本発明で使用される多孔性膜は、上述のように、使用前の純水透過係数が、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上の範囲であることが好ましく、さらに２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下の範囲にあることが好ましい。
【００５３】
本発明で使用される微生物の発酵原料としては、発酵培養する微生物の生育を促し、目的とする発酵生産物であるＬ−アミノ酸を良好に生産させ得るものであれば良い。発酵原料としては、例えば、炭素源、窒素源、無機塩類、および必要に応じてアミノ酸、およびビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する液体培地等が好ましく用いられる。
【００５４】
上記の炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラクトース、ラクトース等の糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、サトウキビ搾汁、更には酢酸、フマル酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類およびグリセリン等が使用される。ここで糖類とは、多価アルコールの最初の酸化生成物であり、アルデヒド基またはケトン基をひとつ持ち、アルデヒド基を持つ糖をアルドース、ケトン基を持つ糖をケトースと分類される炭水化物のことを指す。
【００５５】
また、上記の窒素源としては、例えば、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば、油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。
【００５６】
また、上記の無機塩類としては、例えば、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、およびマンガン塩等を適宜添加使用することができる。
【００５７】
本発明で使用される微生物が生育のために特定の栄養素を必要とする場合には、その栄養物を標品もしくはそれを含有する天然物として添加することができる。また、消泡剤も必要に応じて添加使用することができる。
【００５８】
本発明において、発酵培養液とは、発酵原料に微生物が増殖した結果得られる液のことを言い、追加する発酵原料の組成は、培養開始時の発酵原料組成から適宜変更しても良い。発酵原料組成から追加する発酵原料の組成に変更する場合、目的とするＬ−アミノ酸の生産性が高くなるような変更が好ましい。例えば、上記の炭素源に対する窒素源、無機塩類、アミノ酸およびビタミンなどの有機微量栄養素の重量比率を低下させることにより、Ｌ−アミノ酸の生産コストの低減、すなわち広義でＬ−アミノ酸の生産性の向上が実現できる場合もある。一方、上記炭素源に対する窒素源、無機塩類、アミノ酸およびビタミンなどの有機微量栄養素の重量比率を増加させることにより、Ｌ−アミノ酸の生産性を向上させることができる場合もある。
【００５９】
本発明では、発酵培養液中の糖類など発酵原料の濃度は、５ｇ／ｌ以下に保持されるようにすることが好ましい。その理由は、発酵培養液の引き抜きによる発酵原料の流失を最小限にするためである。そのため発酵原料の濃度は、可能な限り小さいことが望ましい。
【００６０】
微生物の発酵培養は、通常、ｐＨが４〜８で温度が２０〜４０℃の範囲で行われることが多い。発酵培養液のｐＨは、無機の酸または有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウムおよびアンモニアガスなどによって、上記範囲内のあらかじめ定められた値に調節される。
【００６１】
微生物の発酵培養において、酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を２１％以上に保つ、発酵培養液を加圧する、攪拌速度を上げる、あるいは通気量を上げるなどの手段を用いることができる。逆に、酸素の供給速度を下げる必要がある場合は、炭酸ガス、窒素およびアルゴンなど酸素を含まないガスを空気に混合して供給することも可能である。
【００６２】
本発明においては、培養初期にＢａｔｃｈ培養またはＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養を行って微生物濃度を高くした後に連続培養（引き抜き）を開始しても良いし、高濃度の菌体をシードし、培養開始とともに連続培養を行っても良い。適当な時期から、発酵原料液の供給および培養物の引き抜きを行うことが可能である。発酵原料液供給と培養物の引き抜きの開始時期は、必ずしも同じである必要はない。また、発酵原料液の供給と培養物の引き抜きは連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。発酵原料液には、上記に示したような菌体増殖に必要な栄養素を添加し、菌体増殖が連続的に行われるようにすればよい。
【００６３】
発酵培養液中の微生物の濃度は、効率よい生産性を得る上で、発酵培養液の環境が微生物の増殖にとって不適切となって死滅する比率が高くならない範囲で、高い状態で維持することが好ましい。一例として、濃度を乾燥重量として５ｇ／Ｌ以上に維持することにより、より良好な生産効率が得られる。また、連続発酵装置の運転上の不具合や生産効率の低下を招かなければ、微生物の濃度の上限値は特に限定されない。
【００６４】
発酵生産能力のあるフレッシュな菌体を増殖させつつ行う連続培養操作は、培養管理上、通常、単一の発酵反応槽で行うことが好ましい。しかしながら、菌体を増殖しつつ生産物を生成する連続培養法であれば、発酵反応槽の数は問わない。発酵反応槽の容量が小さい等の理由から、複数の発酵反応槽を用いることもあり得る。この場合、複数の発酵反応槽を配管で並列または直列に接続して連続培養を行っても、発酵生産物の高生産性は得られる。
【００６５】
本発明においては、微生物を発酵反応槽に維持したままで、発酵反応槽からの発酵培養液の連続的かつ効率的な抜き出しが可能となることから、微生物を連続的に培養し、十分な増殖を確保した後に発酵原料液組成を変更し、目的とする化学品を効率よく製造することも可能である。
【００６６】
本発明で好適に発酵生産されるアミノ酸としては、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−チロシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−バリンおよびＬ−ロイシン等が挙げられ、特に、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジンおよびＬ−グルタミン酸が好適である。
【００６７】
本発明で使用される微生物は、本発明の本質が発酵培養の効率化にあることから、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を持つもので、例えば、従来Ｌ−アミノ酸を効率よく生産することが可能な微生物を好適に利用することができる。このような微生物としては、例えば、発酵工業においてよく使用される大腸菌やコリネ型細菌などの細菌が挙げられる。
【００６８】
Ｌ−アミノ酸生産菌は、対応するＬ−アミノ酸を生産する能力のある細菌である。
【００６９】
Ｌ−スレオニン生産菌としては、エシェリシア属（Ｇｅｎｕｓ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、プロビデンシア属（Ｇｅｎｕｓ  Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、コリネバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ  Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはセラチア属（Ｇｅｎｕｓ  Ｓｅｒｒａｔｉａ）に属する細菌等が挙げられる。そして特に好ましい細菌は、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、プロビデンシア・レトゲリ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）およびセラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）である。
【００７０】
また、Ｌ−リジン生産菌としては、エシェリシア属、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する細菌等が挙げられる。そして特に好ましい細菌は、エシェリシア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・フラバムおよびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムである。
【００７１】
Ｌ−グルタミン酸生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・フラバムおよびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムが好ましい。
【００７２】
Ｌ−トリプトファン生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）およびエシェリシア・コリ等が挙げられる。
【００７３】
Ｌ−イソロイシン生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムおよびセラチア・マルセセンス等が挙げられる。
【００７４】
Ｌ−グルタミン生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムおよびフラボバクテリウム・リゲンス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｉｇｅｎｓｅ）等が挙げられる。
【００７５】
Ｌ−アルギニン生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・フラバム、セラチア・マルセセンス、エシェリシア・コリおよびバチルス・サブチリス等が挙げられる。
【００７６】
Ｌ−アラニン生産菌としては、ブレビバクテリウム・フラバムおよびアルスロバクター・オキシダンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）等が挙げられる。
【００７７】
Ｌ−ヒスチジン生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・アモニアジェネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、セラチア・マルセセンス、エシェリシア・コリ、バチルス・サブチリスおよびストレプトマイセス・コエリコラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）等が挙げられる。
【００７８】
Ｌ−プロリン生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、カルチア・カテナフォルマ（Ｋｕｒｔｈｉａ  ｃａｔｅｎａｆｏｒｍａ）、セラチア・マルセセンスおよびエシェリシア・コリ等が挙げられる。
【００７９】
Ｌ−フェニルアラニン生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムまたはエシェリシア・コリ等が挙げられる。
【００８０】
Ｌ−アスパラギン酸生産菌としては、ブレビバクテリウム・フラバム、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｈｅｒｉｕｍ）、エシェリシア・コリおよびシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）等が挙げられる。
【００８１】
Ｌ−チロシン生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムおよびエシェリシア・コリ等が挙げられる。
【００８２】
Ｌ−メチオニン生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカムが好ましい。
【００８３】
セリン生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムおよびアルスロバクター・オキシダンス等が挙げられる。
【００８４】
Ｌ−セリン生産菌としては、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）およびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等が挙げられる。
【００８５】
Ｌ−バリン生産菌としては、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム、セラチア・マルセセンスおよびクレブシェラ・ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）等が挙げられる。
【００８６】
Ｌ−ロイシン生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムおよびセラチア・マルセセンス等が挙げられる。
【００８７】
上記のＬ−スレオニン等のＬ−アミノ酸の生産能力を持つ微生物は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。一例として、特開平２−２１９５８２号公報に記載されているＬ−スレオニン生産性の向上したプロビデンシア・レトゲリや、特表平３−５００４８６号パンフレットに記載されているＬ−アラニン生産性の向上したコリネバクテリウム・グルタミカム等が挙げられる。
【００８８】
本発明の連続発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法により製造された濾過・分離発酵液に含まれるＬ−アミノ酸の分離・精製は、従来知られている濃縮、蒸留および晶析などの方法を組み合わせて行うことができる。
【００８９】
本発明の連続発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法で用いられる連続発酵装置の１つの例は、主に、Ｌ−アミノ酸生産菌を保持しＬ−アミノ酸を製造するための発酵反応槽、およびＬ−アミノ酸生産菌と培養液を濾過分離するための多孔性膜を含む分離膜エレメントから構成される。分離膜エレメントは、発酵反応槽の内部または外部のいずれに設置されてもよい。
【００９０】
本発明の連続発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法は、分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の多孔性膜を使用し、濾過圧力である膜間差圧が０.１から２０ｋＰａの範囲で濾過処理することを特徴としている。そのため、特別に発酵反応槽内を加圧状態に保つ必要がないことから、濾過分離装置と発酵反応槽間で発酵培養液を循環させる動力手段が不要となり、分離膜エレメントを発酵反応槽内部に設置して発酵培養装置をコンパクト化することもできる。
【００９１】
本発明の連続発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法で用いられる連続発酵装置のうち、分離膜エレメントが発酵反応槽の内部に設置された代表的な一例を図１に示す。図１は、本発明で用いられる膜分離型の連続発酵装置の一つの実施の形態を説明するための概略側面図である。図１において、膜分離型の連続発酵装置は、微生物を発酵培養させる発酵反応槽１と、その発酵反応槽１の中の発酵培養液の量を制御するための水頭差制御装置３で基本的に構成されている。発酵反応槽１内には分離膜エレメント２が配設されており、その分離膜エレメント２には多孔性膜が組み込まれている。この多孔性膜としては、例えば、国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および分離膜エレメントを使用することができる。分離膜エレメントに関しては、追って詳述する。
【００９２】
次に、図１の膜分離型の連続発酵装置による連続発酵の形態について説明する。培地供給ポンプ７によって、培地を発酵反応槽１に連続的もしくは断続的に投入する。培地については、発酵反応槽１内に投入する前に、必要に応じて加熱殺菌、加熱滅菌あるいはフィルターを用いた滅菌処理を行うことができる。発酵生産時には、必要に応じて、発酵反応槽１内の攪拌機５で発酵反応槽１内の発酵液を攪拌することができる。また必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を発酵反応槽１内に供給することができる。このとき、供給した気体を回収リサイクルして再び気体供給装置４に供給することができる。また必要に応じて、ｐＨセンサ・制御装置９およびｐＨ調整溶液供給ポンプ８によって発酵反応槽１内の発酵液のｐＨを調整することができる。また必要に応じて、温度調節器１０によって発酵反応槽１内の発酵培養液の温度を調節することにより生産性の高い発酵生産を行うことができる。
【００９３】
ここでは、計装・制御装置による発酵培養液の物理化学的条件の調節に、ｐＨおよび温度の調節を例示したが、必要に応じて、溶存酸素やＯＲＰの制御を行うことができ、更にはオンラインケミカルセンサーなどの分析装置により発酵培養液中のＬ−アミノ酸の濃度を測定し、それを指標とした物理化学的条件の制御を行うことができる。また、培地の連続的もしくは断続的投入の形態に関しては、特に限定されるものではないが、上記の計装装置による発酵培養液の物理化学的環境の測定値を指標として、培地投入量および速度を適宜調節することができる。
【００９４】
発酵培養液は、発酵反応槽１内に設置された分離膜エレメント２によって、微生物と発酵生産物に濾過・分離され装置系から取り出される。また、濾過・分離された微生物は装置系内に留まることにより装置系内の微生物濃度を高く維持することができ、生産性の高い発酵生産を可能としている。ここで、分離膜エレメント２による濾過・分離は発酵反応槽１の水面との水頭差圧によって行い、特別な動力を必要としない。また、必要に応じて、レベルセンサ６および水頭差圧制御装置３によって、分離膜エレメント２の濾過・分離速度およびよび発酵反応槽１内の発酵液量を適当に調節することができる。上記の分離膜エレメント２による濾過・分離は水頭差圧によって行うことを例示したが、必要に応じて、ポンプや、液体や気体等による吸引濾過あるいは装置系内を加圧することにより、濾過・分離することもできる。
【００９５】
次に、本発明の連続発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法で用いられる連続発酵装置のうち、分離膜エレメントが、発酵反応槽の外部に設置された代表的な一例を図２の概要図に示す。図２は、本発明で用いられる他の膜分離型の連続発酵装置の一つの実施の形態を説明するための概略側面図である。
【００９６】
図２において、膜分離型の連続発酵装置は、微生物を培養発酵させるための発酵反応槽１と、その発酵反応槽１に発酵培養液循環ポンプ１１を介して接続され内部に分離膜エレメント２を備えた膜分離槽１２と、発酵反応槽１内の発酵培養液の量を制御するための水頭差制御装置３で基本的に構成されている。ここで、分離膜エレメント２には、多孔性膜が組み込まれている。この多孔性膜としては、例えば、国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜、および分離膜エレメントを使用することが好適である。
【００９７】
図２において、培地供給ポンプ７によって培地を発酵反応槽１に投入し、必要に応じて、攪拌機５で発酵反応槽１内の発酵培養液を攪拌することができる。また必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を供給することができる。このとき、供給した気体を回収リサイクルして再び気体供給装置４で供給することができる。また、必要に応じて、ｐＨセンサ・制御装置９およびよびｐＨ調整溶液供給ポンプ８によって発酵培養液のｐＨを調整することができる。また必要に応じて、温度調節器１０によって発酵培養液の温度を調節することにより、生産性の高い発酵生産を行うことができる。さらに、装置内の発酵培養液は、発酵培養液循環ポンプ１１によって発酵反応槽１と膜分離槽１２の間を循環する。発酵生産物を含む発酵培養液は、分離膜エレメント２によって微生物と発酵生産物に濾過・分離され、発酵生産物を装置系から取り出すことができる。
【００９８】
また、濾過・分離された微生物は、装置系内に留まることにより装置系内の微生物濃度を高く維持することができ、生産性の高い発酵生産を可能としている。ここで、分離膜エレメント２による濾過・分離は膜分離槽１２の水面との水頭差圧によって行うことができ、特別な動力を必要としない。また、必要に応じて、レベルセンサ６および水頭差圧制御装置３によって、分離膜エレメント２の濾過・分離速度および装置系内の発酵培養液量を適当に調節することができる。また、必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を膜分離槽１２内に供給することができる。
【００９９】
上記のように、分離膜エレメント２による濾過・分離は水頭差圧によって行うことができるが、必要に応じて、ポンプや、液体や気体等による吸引濾過あるいは装置系内を加圧することにより濾過・分離することもできる。このような手段により、膜間差圧を調整制御することができる。
【０１００】
次に、本発明で用いられる分離膜エレメントの好適な形態の例である国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および分離膜エレメントを、以下に図面を用いてその概略を説明する。図３は、本発明で用いられる分離膜エレメントの一つの実施の形態を説明するための概略斜視図である。
【０１０１】
分離膜エレメントは、図３に示すように、剛性を有する支持板１３の両面に、流路材１４と前記の分離膜１５をこの順序で配し構成されている。支持板１３は、両面に凹部１６を有している。分離膜１５は、発酵培養液を濾過する。流路材１４は、分離膜１５で濾過された濾液を効率よく支持板１３に流すためのものである。支持板１３に流れた濾液は、支持板１３の凹部１６を通り、集水パイプ１７を介して連続発酵装置外部に取り出される。濾液を取り出すための動力として、水頭差圧、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を用いることができる。
【０１０２】
図４は、本発明で用いられる別の分離膜エレメントの他の実施の形態を説明するための概略斜視図である。分離膜エレメントは、図４に示すように、中空糸膜（多孔性膜）で構成された分離膜束１８と上部樹脂封止層１９と下部樹脂封止層２０によって主に構成されている。分離膜束１８は、上部樹脂封止層１９および下部樹脂封止層２０よって束状に接着・固定化されている。下部樹脂封止層２０による接着・固定化は、分離膜束１８の中空糸膜（多孔性膜）の中空部を封止しており、培養液の漏出を防ぐ構造になっている。一方、上部樹脂封止層１９は、分離膜束１８の中空糸膜（多孔性膜）の内孔を封止しておらず、集水パイプ２２に濾液が流れる構造となっている。この分離膜エレメントは、支持フレーム２１を介して連続発酵装置内に設置することが可能である。分離膜束１８によって濾過された発酵生産物を含む濾液は、中空糸膜の中空部を通り、集水パイプ２２を介して連続発酵装置外部に取り出される。濾液を取り出すための動力として、水頭差圧、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を用いることができる。
【０１０３】
本発明のＬ−アミノ酸の製造方法で用いられる連続発酵装置の分離膜エレメントを構成する部材は、高圧蒸気滅菌操作に耐性の部材であることが好ましい。連続発酵装置内が滅菌可能であれば、連続発酵時に好ましくない微生物による汚染の危険を回避することができ、より安定した連続発酵が可能となる。分離膜エレメントを構成する部材は、高圧蒸気滅菌操作の条件である、１２１℃で１５分間に耐性であることが好ましい。分離膜エレメント部材には、例えば、ステンレスやアルミニウムなどの金属、ポリアミド系樹脂、フッ素系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリアセタール系樹脂、ポリブチレンテレフタレート系樹脂、ＰＶＤＦ、変性ポリフェニレンエーテル系樹脂およびポリサルホン系樹脂等の樹脂を好ましく選定することができる。
【０１０４】
本発明のＬ−アミノ酸の製造方法で用いられる連続発酵装置では、分離膜エレメントは、図１のように発酵反応槽内に設置しても良いし、図２のように発酵反応槽外に設置しても良い。分離膜エレメントを発酵反応槽外に設置する場合には、別途、膜分離槽を設けてその内部に分離膜エレメントを設置することができ、発酵反応槽と膜分離槽の間を培養液を循環させながら、分離膜エレメントにより培養液を連続的に濾過することができる。
【０１０５】
本発明のＬ−アミノ酸の製造方法で用いられる連続発酵装置では、膜分離槽は、高圧蒸気滅菌可能であることが望ましい。膜分離槽が高圧蒸気滅菌可能であると、雑菌による汚染回避が容易である。
【０１０６】
本発明の連続発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法に従って連続発酵を行った場合、従来のバッチ式の発酵と比較して、高い体積生産速度が得られ、極めて効率のよい発酵生産が可能となる。ここで、連続培養における発酵生産速度は、次の（式３）で計算される。
・発酵生産速度（ｇ／Ｌ／ｈｒ）＝抜き取り液中の生産物濃度（ｇ／Ｌ）×発酵培養液抜き取り速度（Ｌ／ｈｒ）÷装置の運転液量（Ｌ）        ・・・・（式３）
また、バッチ式培養による発酵生産速度は、原料炭素源をすべて消費した時点の生産物量（ｇ）を、炭素源の消費に要した時間（ｈ）とその時点の発酵培養液量（Ｌ）で除して求められる。
【０１０７】
本発明の連続発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法で得られるＬ−アミノ酸は、主に、飼料添加物、医薬品、医薬中間体および食料添加物等としての用途があり、本発明によって、より安価にＬ−アミノ酸を提供することが可能となる。
【実施例】
【０１０８】
以下、本発明の連続発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法をさらに詳細に説明するために、図１および図２の概略図に示す連続発酵装置を用いることによる、連続的なＬ−スレオニンおよびＬ−リジンの発酵生産について、実施例を挙げて説明する。本発明はこれらの実施例に限定されない。
【０１０９】
下記のＬ−スレオニンの製造方法に関する実施例においては、Ｌ−スレオニンを生産させる微生物として、プロビデンシア・レトゲリのうちプロビデンシア・レトゲリ  ＳＧＲ５８８−７７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０５２８）を用い、Ｌ−リジンの製造方法に関する実施例においては、Ｌ−リジンを生産させる微生物として、コリネバクテリウム・グルタミカムのうちコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２を遺伝子改変した株を用いた。
【０１１０】
また、発酵原料のうち炭素源にはグルコースを用い、窒素源と無機塩類には、下記の実施例で説明する原料を用いた。
【０１１１】
（参考例１）Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジンおよびグルコースの定量法
培養液中に含まれるＬ−スレオニン量の測定は、次の方法で行った。測定するＬ−スレオニンを含む発酵培養液を２５μＬ取り、そこに１５０μｌのＮａＨＣＯ３（７５ｍＭ）および内標として２５μｌのＬ−メチオニン（２ｇ／Ｌ）を加える。上記の溶液に、さらに９００μｌのエタノールおよび１５０μｌの０．２Ｍジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）を加え混合する。上記の溶液を３７℃の温度で１時間静置後、下記条件でＨＰＬＣ分析を行った。
・カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  Ｃ１８  ＴＹＰＥ  ＳＧ１２０（資生堂）
・移動相：０．１％（ｗ／ｖ）Ｈ３ＰＯ４：アセトニトリル＝７：３（流速１．２ｍＬ／ｍｉｎ）
・検出方法：ＵＶ（３６０ｎｍ）
・温度：２３℃
検量線は、濃度既知のＬ−スレオニンを標品として分析を行い、横軸にＬ−スレオニン濃度、縦軸にＬ−スレオニン面積／Ｌ−メチオニン（内標）面積の面積比をプロットして作製した。
【０１１２】
培養液中に含まれるＬ−リジン量の測定は、次の方法で行った。測定するＬ−リジンを含む発酵培養液を２５μＬ取り、そこに４００μＬのＮａＨＣＯ３（７５ｍＭ）および内標として２５μＬの１，４−ブタンジオール（２ｇ／Ｌ）を加える。上記の溶液に、１５０μｌの０．２ＭＤＮＦＢを添加後、３７℃で１時間反応させた。
その溶液５０μｌをアセトニトリル１ｍＬに溶解し、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心した上清１０μｌを以下の条件でＨＰＬＣにより分析した。
・カラム      ：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  Ｃ１８  ＴＹＰＥ  ＳＧ１２０（資生堂）
・移動相      ：０．１％（ｗ／ｗ）リン酸水溶液：アセトニトリル＝４５：５５（流速１ｍＬ／ｍｉｎ）
・検出方法：ＵＶ（３６０ｎｍ）
・温度：２３℃
検量線は、濃度既知のＬ−リジンを標品として分析を行い、横軸にＬ−リジン濃度、縦軸にＬ−リジン面積／１，４−ブタンジオール（内標）面積の面積比をプロットして作製した。
【０１１３】
また、グルコース濃度の測定には、“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。
【０１１４】
（参考例２）多孔性膜の作製（その１）
樹脂としてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）樹脂を、また溶媒としてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）をそれぞれ用い、これらを９０℃の温度下に十分に攪拌し、次の組成を有する原液を得た。
・ＰＶＤＦ：１３．０重量％
・ＤＭＡｃ：８７．０重量％
次に、上記の原液を２５℃の温度に冷却した後、あらかじめガラス板上に貼り付けて置いた、密度が０．４８ｇ／ｃｍ3で、厚みが２２０μｍのポリエステル繊維製不織布（多孔質基材）に塗布し、直ちに次の組成を有する２５℃の温度の凝固浴中に５分間浸漬して、多孔質基材に多孔質樹脂層が形成された多孔性膜を得た。
・水 ：３０．０重量％
・ＤＭＡｃ：７０．０重量％
この多孔性膜をガラス板から剥がした後、８０℃の温度の熱水に３回浸漬してＤＭＡｃを洗い出し、分離膜を得た。この分離膜の凝固浴と接触した側における、多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は２．０μｍであった。また、反対側における、多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は０．１μｍであった。次に、上記の分離膜について純水透水量を評価したところ、５０×１０-9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差 は０．０３５μｍで、膜表面粗さは１８μｍであった。
【０１１５】
（参考例３）  多孔性膜の作製（その２）
樹脂としてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）樹脂を、また開孔剤として分子量が約２０，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を、溶媒としてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）を、そして非溶媒として純水をそれぞれ用い、これらを９０℃の温度下に十分に攪拌し、次の組成を有する原液を得た。
・ＰＶＤＦ：１３．０重量％
・ＰＥＧ ： ５．５重量％
・ＤＭＡｃ：７８．０重量％
・純水 ： ３．５重量％
次に、上記の原液を２５℃の温度に冷却した後、密度が０．４８ｇ／ｃｍ3 、厚みが２２０μｍのポリエステル繊維製不織布（多孔質基材）に塗布し、塗布後、直ちに２５℃の温度の純水中に５分間浸漬し、さらに８０℃の温度の熱水に３回浸漬してＤＭＡｃおよびＰＥＧを洗い出し、多孔質樹脂層を有する多孔性膜（分離膜）を得た。この分離膜の原液を塗布した側における、多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は０．０２μｍであった。この分離膜について純水透水量を評価したところ、２×１０-9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。平均細孔径の標準偏差 は０．００５５μｍで、膜表面粗さは０．１μｍであった。
【０１１６】
（参考例４）  多孔性膜の作製（その３）
下記組成の原液を用いた他は参考例２と同様にして、多孔質樹脂層を有する多孔性膜（分離膜）を得た。
・ＰＶＤＦ：１３．０重量％
・ＰＥＧ ： ５．５重量％
・ＤＭＡｃ：８１．５重量％
この分離膜の原液を塗布した側における、多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は０．２μｍであり、この分離膜について純水透水量を評価したところ、１００×１０-9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差 は０．０６０μｍで、膜表面粗さは０．０８μｍであった。
【０１１７】
（参考例５）  多孔性膜の作製（その４）
重量平均分子量４１．７万のフッ化ビニリデンホモポリマーとγ-ブチロラクトンとを、それぞれ３８重量％と６２重量％の割合で１７０℃の温度で溶解し、原液を作製した。この原液を、γ-ブチロラクトンを中空部形成液体として随拌させながら口金から吐出し、温度２０℃のγ-ブチロラクトン８０重量％水溶液からなる冷却浴中で固化して中空糸膜を作製した。
【０１１８】
次いで、重量平均分子量２８．４万のフッ化ビニリデンホモポリマーを１４重量％、セルロースアセテートプロピオネート（イーストマンケミカル社、ＣＡＰ４８２−０．５）を１重量％、Ｎ-メチル-２-ピロリドンを７７重量％、ポリオキシエチレンヤシ油脂肪酸ソルビタン（三洋化成株式会社製、商品名“イオネットＴ−２０Ｃ”（登録商標））を５重量％、および水を３重量％の割合で９５℃の温度で混合溶解して、原液を調整した。この原液を、上記で得られた中空糸膜の表面に均一に塗布し、すぐに水浴中で凝固させて本発明で用いる中空糸膜（多孔性膜）を製作した。得られた中空糸膜（分離膜）の被処理水側表面の平均細孔径は、０．０５μｍであった。次に、上記の分離膜である中空糸膜について純水透水量を評価したところ、５．５×１０-9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差 は０．００６μｍであった。
【０１１９】
（実施例１）  連続発酵によるＬ−スレオニンの製造（その１）
図１に示す連続発酵装置を稼働させることにより、Ｌ−スレオニンが連続発酵で得られるかどうかを調べるため、同装置を用いた連続発酵試験を行った。培地には表１に示す培地を用いた。この培地は、１２１℃の温度で１５分間、高圧（２気圧）蒸気滅菌処理して用いた。分離膜エレメント部材として、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。分離膜には、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする前述の参考例２で作製した多孔性膜を用いた。この多孔質膜の特性を調べたところ、平均細孔径が０.１μｍであり、純水透過係数が５０×１０-9ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａであった。この実施例１における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３７（℃）
・発酵反応槽通気量：１．５（Ｌ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・滅菌：分離膜エレメントを含む発酵反応槽、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧（２気圧）蒸気滅菌。
・ｐＨ調整：２８％アンモニア水溶液によりｐＨ７に調整
・膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（連続発酵開始後〜１００時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
１００時間〜２００時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御）
微生物として、プロビデンシア・レトゲリ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ）ＳＧＲ５８８−７７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０５２８）を用い、培地として表１に示す組成のＬ−スレオニン発酵培地を用いた。発酵培養液に含まれるＬ−スレオニンおよびグルコースの濃度測定は、参考例１に示した方法で行った。
【０１２０】
【表１】
0005458481.tif 000004
【０１２１】
まず、１００ｍｌのグルコースブイヨン培地（１％グルコース、３％ブイヨン（ニッスイ社製））を投入した５００ｍｌ容の三角フラスコに、寒天培地から掻き取ったプロビデンシア・レトゲリ  ＳＧＲ５８８−７７株を植菌した。これを温度３７℃、回転数１４０ｒｐｍで撹拌しながら培養を行った（前々培養）。得られた前々培養液を、１ＬのＬ−スレオニン前培養培地（表２）を投入した図１に示す連続発酵装置に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって８００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整と３７℃の温度に温度調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後、直ちに、表１のＬ−スレオニン発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵培養液量が１．５Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＬ−スレオニンの製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により、連続発酵開始後〜１００時間は０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御し、１００時間〜２００時間は０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御した。適宜、膜透過濾液中の生産されたＬ−スレオニン濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、Ｌ−スレオニンと投入グルコースから算出されたＬ−スレオニン生産速度を表４に示した。２００時間の発酵試験を行った結果、図１に示した連続発酵装置を用いることにより、安定したＬ−スレオニンの連続発酵による製造が可能であることが確認することができた。連続発酵の期間中の膜間差圧は、０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で推移した。
【０１２２】
【表２】
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【０１２３】
（実施例２）連続発酵によるＬ−スレオニンの製造（その２）
分離膜として参考例３で作製した多孔性膜を用い、実施例１と同様のＬ−スレオニン連続発酵試験を行った。その結果を表４に示す。その結果、安定したＬ−スレオニンの連続発酵による製造が可能であることが確認できた。また、連続発酵の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１２４】
（実施例３）連続発酵によるＬ−スレオニンの製造（その３）
分離膜として参考例４で作製した多孔性膜を用い、実施例１と同様のＬ−スレオニン連続発酵試験を行った。その結果を表４に示す。その結果、安定したＬ−スレオニンの連続発酵による製造が可能であることが確認できた。また、連続発酵の期間中の膜間差圧は、０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で推移した。
【０１２５】
（実施例４）連続発酵によるＬ−スレオニンの製造（その４）分離型・平膜３
図２に示す連続発酵装置を稼働させることにより、Ｌ−スレオニンが得られるかどうかを調べるため、同装置を用いた連続発酵試験を行った。培地には表１に示す培地を用い、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌処理して用いた。分離膜エレメント部材として、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。分離膜には、参考例４で作成したポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする多孔性膜を用いた。該多孔質膜の平均細孔径は０.１μｍであり、純水透過係数は５０×１０-9ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａである。この実施例４における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３７（℃）
・発酵反応槽通気量：１．５（Ｌ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎの
オートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
・ｐＨ調整：２８％アンモニア水溶液によりｐＨ７に調整
・  膜透過水量制御：膜分離槽水頭差により流量を制御（水頭差は２ｍ以内で制御した。）。
【０１２６】
微生物として、プロビデンシア・レトゲリ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ）ＳＧＲ５８８−７７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０５２８）を用い、培地として表１に示す組成のＬ−スレオニン発酵培地を用いた。発酵培養液に含まれるＬ−スレオニンおよびグルコースの濃度測定は、参考例１に示した方法で行った。
【０１２７】
まず、１００ｍｌのグルコースブイヨン培地（１％グルコース、３％ブイヨン（ニッスイ社製））を投入した５００ｍｌ容の三角フラスコに、寒天培地から掻き取ったプロビデンシア・レトゲリ  ＳＧＲ５８８−７７株を植菌した。これを温度３７℃、回転数１４０ｒｐｍで撹拌しながら培養を行った（前々培養）。得られた前々培養液を、１ＬのＬ−スレオニン前培養培地（表２）を投入した図２に示す連続発酵装置に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって８００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整と３７℃の温度に温度調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後、直ちに、表１のＬ−スレオニン発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵培養液量が１．５Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＬ−スレオニンの製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、発酵反応槽水頭を最大２ｍ以内、すなわち膜間差圧が２０ｋＰａ以内となるように適宜水頭差を変化させることにより行った。適宜、膜透過濾液中の生産されたＬ−スレオニン濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、Ｌ−スレオニンと投入グルコースから算出されたＬ−スレオニン生産速度を表４に示した。２００時間の発酵試験を行った結果、図２に示した連続発酵装置を用いることにより、安定したＬ−スレオニンの連続発酵による製造が可能であることが確認することができた。
【０１２８】
（実施例５）連続発酵によるＬ−スレオニンの製造（その５）
図１に示す連続発酵装置を稼働させることにより、Ｌ−アミノ酸が連続発酵で得られるかどうかを調べるため、同装置を用いた連続発酵試験を行った。培地には表１に示す培地を用い、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌処理して用いた。分離膜エレメント部材として、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。分離膜には、参考例５で作成したポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする多孔性膜を用いた。この実施例５における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３７（℃）
・発酵反応槽通気量：１．５（Ｌ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎの
オートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
・ｐＨ調整：２８％アンモニア水溶液によりｐＨ７に調整
・膜透過水量制御：膜分離槽水頭差により流量を制御（水頭差は２ｍ以内で制御した。）。
【０１２９】
微生物として、プロビデンシア・レトゲリ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ）ＳＧＲ５８８−７７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０５２８）を用い、培地として表１に示す組成のＬ−スレオニン発酵培地を用いた。発酵培養液に含まれるＬ−スレオニンおよびグルコースの濃度測定は、参考例１に示した方法で行った。
【０１３０】
まず、１００ｍｌのグルコースブイヨン培地（１％グルコース、３％ブイヨン（ニッスイ社製））を投入した５００ｍｌ容の三角フラスコに、寒天培地から掻き取ったプロビデンシア・レトゲリ  ＳＧＲ５８８−７７株を植菌した。これを温度３７℃、回転数１４０ｒｐｍで撹拌しながら培養を行った（前々培養）。得られた前々培養液を、１ＬのＬ−スレオニン前培養培地（表２）を投入した図１に示す膜分離型の連続発酵装置に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって８００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整と３７℃の温度に温度調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後、直ちに、表１のＬ−スレオニン発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵培養液量が１．５Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＬ−スレオニンの製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、発酵反応槽水頭を最大２ｍ以内、すなわち膜間差圧が２０ｋＰａ以内となるように適宜水頭差を変化させることにより行った。適宜、膜透過濾液中の生産されたＬ−スレオニン濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、Ｌ−スレオニンと投入グルコースから算出されたＬ−スレオニン生産速度を表４に示した。２００時間の発酵試験を行った結果、図１に示した連続発酵装置を用いることにより、安定したＬ−スレオニンの連続発酵による製造が可能であることが確認することができた。
【０１３１】
（比較例１）  バッチ発酵によるＬ−スレオニンの製造
微生物を用いた発酵形態として最も典型的なバッチ発酵を２Ｌ容のジャーファーメンターを用いて行い、そのＬ−スレオニン生産性を評価した。バッチ培養開始時の培地には表２に示す培地を用いた。この培地は、１２１℃の温度で１５分間、高圧（２気圧）蒸気滅菌処理して用いた。この比較例１では、微生物として実施例１と同様なプロビデンシア・レトゲリ  ＳＧＲ５８８−７７株を用い、発酵液に含まれるＬ−スレオニンおよびグルコースの濃度測定は、参考例１に示した方法で行った。比較例１の運転条件は、下記のとおりである。
・発酵反応槽容量（Ｌ−スレオニン発酵培地量）：１（Ｌ）
・温度調整：３７（℃）
・発酵反応槽通気量：１（Ｌ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：２８％アンモニア水溶液によりｐＨ７に調整
まず、９０ｍｌのグルコースブイヨン培地（１％グルコース、３％ブイヨン（ニッスイ社製））を投入した５００ｍｌ容の三角フラスコに、寒天培地から掻き取ったプロビデンシア・レトゲリ  ＳＧＲ５８８−７７株を植菌した。これを温度３７℃、回転数１４０ｒｐｍで撹拌しながら培養を行った（前培養）。得られた前培養液を８１０ｍｌの表２に示す培地を投入したミニジャーファーメンターに植菌し、バッチ発酵を行った。培養途中で追加した培地の組成を表３に示した。培地の追加は、培養開始後２４時間、３２時間、４０時間、４８時間に５０ｍＬずつ行った。バッチ発酵の結果を、上記実施例１〜５の連続発酵試験で得られたＬ−スレオニン発酵生産性と比較して表４に示す。
【０１３２】
表４の結果から、本発明で用いられる図１および図２に示した連続発酵装置を用いることにより、Ｌ−スレオニンの生産速度が大幅に向上することを確認することができた。
【０１３３】
【表３】
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【０１３４】
【表４】
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【０１３５】
（実施例６）  連続発酵によるＬ−リジンの製造（遺伝子組換え株の作製）
Ｌ−リジン生産能力をもつ微生物として、コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２（以下ＡＴＣＣ１３０３２株と略す。）のホモセリンデヒドロゲナーゼ（ＨＯＭ）遺伝子破壊株の作製を行った。
【０１３６】
（１）レバンスクラーゼ（ＳａｃＢ）遺伝子のクローニング
バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＳａｃＢ遺伝子のクローニングを行った。
【０１３７】
データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されているＳａｃＢ遺伝子（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｘ０２７３０）の塩基配列を参考に、オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１，２）を合成した。バチルス・サブチリス  ＩＦＯ１３７１９株から常法に従い調整したゲノムＤＮＡの溶液を増幅鋳型として０．２ｍｌのミクロ遠心チューブに０．２μｌづつ取り、各プライマーを２０ｐｍｏｌ、トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０（２０ｍＭ）、塩化カリウム（２．５ｍＭ）、ゼラチン（１００μｇ／ｍｌ）、各ｄＮＴＰ（５０μＭ）、ＬＡＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（２単位）（宝酒造製）となるように各試薬を加え、全量を５０μｌとした。ＤＮＡの変性条件を９４℃、３０秒、プライマーのアニーリング条件を５５℃、３０秒、ＤＮＡプライマーの伸長反応条件を７２℃、３分の各条件でＢｉｏＲａｄ社のサーマルサイクラーを用い、３０サイクルポリメラーゼ連鎖反応を行わせた（以下ＰＣＲ法と略す）。この実施例６におけるＰＣＲ法は特に断らない限り、本条件にて行った。このＰＣＲ法により得られた産物を１％アガロースにて電気泳動し、ＳａｃＢ遺伝子を含む約１．４ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから切り出しジーン・クリーン・キット（ＢＩＯ１０１社製）により精製した。この断片を、制限酵素のＳａｃＩで消化し、得られた１．４ｋｂのＳａｃＩ断片を、予めＳａｃＩで消化しておいたｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ間隙にライゲーションキットｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて挿入し、得られたプラスミドをｐＴＭ３８と命名した。
【０１３８】
（２）ホモセリンデヒドロゲナーゼ（ＨＯＭ）遺伝子のクローニング
ＨＯＭ活性を欠損させるために、Ｎ末端から３００アミノ酸領域に該当する遺伝子のクローニングを行った。
【０１３９】
データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されているＨＯＭ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＡ００００３６）の塩基配列を参考に、オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号３，４）を合成した。ＡＴＣＣ１３０３２株から常法に従い調整したゲノムＤＮＡの溶液を増幅鋳型として、配列番号３，４のオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲを行い、このＰＣＲにより得られた産物を１％アガロースにて電気泳動し、ＨＯＭ遺伝子を含む約０．９ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから切り出しジーン・クリーン・キット（ＢＩＯ１０１社製）により精製した。この断片を、制限酵素のＳｐｈＩおよびＢａｍＨＩで消化し、得られた０．９ｋｂのＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ断片を、予めＳｐｈＩおよびＢａｍＨＩで消化しておいたｐＴＭ３８のＳｐｈＩ／ＢａｍＨＩ間隙にライゲーションキットｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて挿入し、得られたプラスミドをｐＴＭ４４と命名した。
【０１４０】
（３）クロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃｍ遺伝子）のクローニング
データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されているｐＨＳＧ３９９（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｍ１９０８７）の塩基配列を参考に、オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号５，６）を合成した。
【０１４１】
ｐＨＳＧ３９９を増幅鋳型として、配列番号５，６のオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲを行い、このＰＣＲにより得られた産物を１％アガロースにて電気泳動し、Ｃｍ伝子を含む約１．０ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから切り出しジーン・クリーン・キット（ＢＩＯ１０１社製）により精製した。この断片を、制限酵素のＡｏｒ５１ＨＩで消化し、得られた１ｋｂのＡｏｒ５１ＨＩ断片を、予めＡｏｒ５１ＨＩで消化しておいたｐＴＭ４４のＡｏｒ５１ＨＩ間隙にライゲーションキットｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて挿入し、得られたプラスミドをｐＴＭ６２と命名した。
【０１４２】
（４）ホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊
ＡＴＣＣ１３０３２株にプラスミドｐＴＭ６２を、電気穿孔法［ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，６５，ｐ．２９９（１９８９）］により導入し、カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）が添加されているＬＢ（トリプトン（１０ｇ／ｌ）（Ｂａｃｔｏ社製）、酵母エキス（５ｇ／ｌ）（Ｂａｃｔｏ社製）、塩化ナトリウム（１０ｇ／ｌ））寒天培地上で選択した。
【０１４３】
このようにして選択された形質転換体から常法に従いゲノムＤＮＡ溶液を調整した。このゲノムＤＮＡを鋳型として、オリゴヌクレオチド（配列番号：３，４）をプライマーセットとして用いたＰＣＲ法を行い、得られた産物を１．０％アガロースゲルにて電気泳動したところ、約２．４ｋｂのバンドが観察された。このことから、選択された形質転換体が、ＨＯＭ遺伝子座にＣｍ遺伝子が挿入され、破壊されていることを確認することができた。この形質転換体を、コリネバクテリウム・グルタミカム  ｄｅｌｔａ−ＨＯＭ株（以下、ｄｅｌｔａ−ＨＯＭ株と略す。）と命名した。
【０１４４】
（実施例７）連続発酵によるＬ−リジンの製造（その１）
図１に示す連続発酵装置を稼働させることにより、Ｌ−リジンが連続発酵で得られるかどうかを調べるため、同装置を用いた連続発酵試験を行った。培地には表５に示す培地を用いた。この培地は、１２１℃の温度で１５分間、高圧（２気圧）蒸気滅菌処理して用いた。分離膜エレメント部材として、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。分離膜には、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする前述の参考例４で作製した多孔性膜を用いた。この多孔質膜の平均細孔径は上述のとおり０.１μｍであり、純水透過係数は５０×１０-9ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａである。この実施例７における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：２（Ｌ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：６５０（ｒｐｍ）
・滅菌：分離膜エレメントを含む発酵反応槽、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧（２気圧）蒸気滅菌。
・ｐＨ調整：４Ｎ  ＮＨ4ＯＨによりｐＨ７．３に調整
・膜透過水量制御：膜分離槽水頭差により流量を制御（水頭差は２ｍ以内で制御した。）。
【０１４５】
微生物として、実施例６で作製したｄｅｌｔａ−ＨＯＭ株を用い、培地として表５に示す組成のＬ−リジン発酵培地を用いた。発酵培養液に含まれるＬ−リジンおよびグルコースの濃度測定は、参考例１に示した方法で行った。
【０１４６】
【表５】
0005458481.tif 000008
【０１４７】
まず、５ｍｌのＢＹ培地（０．５％イーストエキストラクト、０．７％ミートエキストラクト、１％ペプトン、０．３％塩化ナトリウム）を投入した試験管に、寒天培地から掻き取ったｄｅｌｔａ−ＨＯＭ株を植菌し、これを温度３０℃で２４時間振とう培養を行った（前々々培養）。得られた前々々培養液を、表５に示した培地を５０ｍＬ投入した５００ｍＬの三角フラスコに全量植菌し、３０℃で２４時間振とう培養した（前々培養）。得られた前々培養液を、表５に示した培地を１Ｌ投入した図１に示す連続発酵装置に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって６５０ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整と３０℃の温度に温度調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後、直ちに、表５に示す培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵培養液量が１．５Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＬ−リジンの製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、発酵反応槽水頭を最大２ｍ以内、すなわち膜間差圧が２０ｋＰａ以内となるように適宜水頭差を変化させることにより行った。適宜、膜透過濾液中の生産されたＬ−リジン濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、Ｌ−リジンと投入グルコースから算出されたＬ−リジン生産速度を表６に示した。２００時間の発酵試験を行った結果、図１に示した連続発酵装置を用いることにより、安定したＬ−リジンの連続発酵による製造が可能であることが確認することができた。
【０１４８】
（実施例８）連続発酵によるＬ−リジンの製造（その２）
図１に示す連続発酵装置を稼働させることにより、Ｌ−リジンが連続発酵で得られるかどうかを調べるため、同装置を用いた連続発酵試験を行った。培地には表５に示す培地を用いた。この培地は、１２１℃の温度で１５分間、高圧（２気圧）蒸気滅菌処理して用いた。分離膜エレメント部材として、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。分離膜には、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする前述の参考例５で作製した多孔性膜を用いた。この多孔質膜の平均細孔径は上述のとおり０.１μｍであり、純水透過係数が５０×１０-9ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａである。この実施例９における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：２（Ｌ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：６５０（ｒｐｍ）
・滅菌：分離膜エレメントを含む発酵反応槽、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧（２気圧）蒸気滅菌。
・ｐＨ調整：４Ｎ  ＮＨ4ＯＨによりｐＨ７．３に調整
・膜透過水量制御：膜分離槽水頭差により流量を制御（水頭差は２ｍ以内で制御した。）。
【０１４９】
微生物として、実施例６で作製したｄｅｌｔａ−ＨＯＭ株を用い、培地として表５に示す組成のＬ−リジン発酵培地を用いた。発酵培養液に含まれるＬ−リジンおよびグルコースの濃度測定は、参考例１に示した方法で行った。
【０１５０】
まず、５ｍｌのＢＹ培地（０．５％イーストエキストラクト、０．７％ミートエキストラクト、１％ペプトン、０．３％塩化ナトリウム）を投入した試験管に、寒天培地から掻き取ったｄｅｌｔａ−ＨＯＭ株を植菌し、これを温度３０℃で２４時間振とう培養を行った（前々々培養）。得られた前々々培養液を、表５に示した培地を５０ｍＬ投入した５００ｍＬの三角フラスコに全量植菌し、３０℃で２４時間振とう培養した（前々培養）。得られた前々培養液を、表５に示した培地を１Ｌ投入した図１に示す連続発酵装置に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって６５０ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整と３０℃の温度に温度調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後、直ちに、表５に示す培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵培養液量が１．５Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＬ−リジンの製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、発酵反応槽水頭を最大２ｍ以内、すなわち膜間差圧が２０ｋＰａ以内となるように適宜水頭差を変化させることにより行った。適宜、膜透過濾液中の生産されたＬ−リジン濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、Ｌ−リジンと投入グルコースから算出されたＬ−リジン生産速度を表６に示した。２００時間の発酵試験を行った結果、図１に示した連続発酵装置を用いることにより、安定したＬ−リジンの連続発酵による製造が可能であることが確認することができた。
【０１５１】
（実施例９）連続発酵によるＬ−リジンの製造（その３）
図２に示す連続発酵装置を稼働させることにより、Ｌ−リジンが連続発酵で得られるかどうかを調べるため、同装置を用いた連続発酵試験を行った。培地には表５に示す培地を用いた。この培地は、１２１℃の温度で１５分間、高圧（２気圧）蒸気滅菌処理して用いた。分離膜エレメント部材として、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。分離膜には、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする前述の参考例４で作製した多孔性膜を用いた。この多孔質膜の平均細孔径は上述のように０.１μｍであり、純水透過係数が５０×１０-9ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａである。この実施例９における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：２（Ｌ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：６５０（ｒｐｍ）
・滅菌：分離膜エレメントを含む発酵反応槽、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧（２気圧）蒸気滅菌。
・ｐＨ調整：４Ｎ  ＮＨ4ＯＨによりｐＨ７．３に調整
・膜透過水量制御：膜分離槽水頭差により流量を制御（水頭差は２ｍ以内で制御した。）。
【０１５２】
微生物として、実施例６で作製したｄｅｌｔａ−ＨＯＭ株を用い、培地として表５に示す組成のＬ−リジン発酵培地を用いた。発酵培養液に含まれるＬ−リジンおよびグルコースの濃度測定は、参考例１に示した方法で行った。
【０１５３】
まず、５ｍｌのＢＹ培地（０．５％イーストエキストラクト、０．７％ミートエキストラクト、１％ペプトン、０．３％塩化ナトリウム）を投入した試験管に、寒天培地から掻き取ったｄｅｌｔａ−ＨＯＭ株を植菌し、これを温度３０℃で２４時間振とう培養を行った（前々々培養）。得られた前々々培養液を、表５に示した培地を５０ｍＬ投入した５００ｍＬの三角フラスコに全量植菌し、３０℃で２４時間振とう培養した（前々培養）。得られた前々培養液を、表５に示した培地を１Ｌ投入した図２に示す連続発酵装置に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって６５０ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整と３０℃の温度に温度調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後、直ちに、表５に示す培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵培養液量が１．５Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＬ−リジンの製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、発酵反応槽水頭を最大２ｍ以内、すなわち膜間差圧が２０ｋＰａ以内となるように適宜水頭差を変化させることにより行った。適宜、膜透過濾液中の生産されたＬ−リジン濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、Ｌ−リジンと投入グルコースから算出されたＬ−リジン生産速度を表６に示した。２００時間の発酵試験を行った結果、図２に示した連続発酵装置を用いることにより、安定したＬ−リジンの連続発酵による製造が可能であることが確認することができた。
【０１５４】
（実施例１０）  連続発酵によるＬ−リジンの製造（その４）
図２に示す連続発酵装置を稼働させることにより、Ｌ−リジンが連続発酵で得られるかどうかを調べるため、同装置を用いた連続発酵試験を行った。培地には表５に示す培地を用いた。この培地は、１２１℃の温度で１５分間、高圧（２気圧）蒸気滅菌処理して用いた。分離膜エレメント部材として、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。分離膜には、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする前述の参考例５で作製した多孔性膜を用いた。この多孔質膜の平均細孔径は上述のとおり０.１μｍであり、純水透過係数が５０×１０-9ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａである。この実施例１０における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：２（Ｌ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：６５０（ｒｐｍ）
・滅菌：分離膜エレメントを含む発酵反応槽、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧（２気圧）蒸気滅菌。
・ｐＨ調整：４Ｎ  ＮＨ4ＯＨによりｐＨ７．３に調整
・膜透過水量制御：膜分離槽水頭差により流量を制御（水頭差は２ｍ以内で制御した。）。
【０１５５】
微生物として、実施例６で作製したｄｅｌｔａ−ＨＯＭ株を用い、培地として表５に示す組成のＬ−リジン発酵培地を用いた。発酵培養液に含まれるＬ−リジンおよびグルコースの濃度測定は、参考例１に示した方法で行った。
【０１５６】
まず、５ｍｌのＢＹ培地（０．５％イーストエキストラクト、０．７％ミートエキストラクト、１％ペプトン、０．３％塩化ナトリウム）を投入した試験管に、寒天培地から掻き取ったｄｅｌｔａ−ＨＯＭ株を植菌し、これを温度３０℃で２４時間振とう培養を行った（前々々培養）。得られた前々々培養液を、表５に示した培地を５０ｍＬ投入した５００ｍＬの三角フラスコに全量植菌し、３０℃で２４時間振とう培養した（前々培養）。得られた前々培養液を、表５に示した培地を１Ｌ投入した図２に示す連続発酵装置に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって６５０ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整と３０℃の温度に温度調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後、直ちに、表５に示す培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵培養液量が１．５Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＬ−リジンの製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、発酵反応槽水頭を最大２ｍ以内、すなわち膜間差圧が２０ｋＰａ以内となるように適宜水頭差を変化させることにより行った。適宜、膜透過濾液中の生産されたＬ−リジン濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、Ｌ−リジンと投入グルコースから算出されたＬ−リジン生産速度を表６に示した。２００時間の発酵試験を行った結果、図２に示した連続発酵装置を用いることにより、安定したＬ−リジンの連続発酵による製造が可能であることが確認することができた。
【０１５７】
（比較例２）バッチ発酵によるＬ−リジンの製造
微生物を用いた発酵形態として最も典型的なバッチ発酵を２Ｌ容のジャーファーメンターを用いて行い、そのＬ−リジン生産性を評価した。バッチ培養開始時の培地には表５に示す培地を用いた。この培地は、１２１℃の温度で１５分間、高圧（２気圧）蒸気滅菌処理して用いた。この比較例１では、微生物として、実施例６で作製したｄｅｌｔａ−ＨＯＭ株を用い、発酵培養液に含まれるＬ−リジンおよびグルコースの濃度測定は、参考例１に示した方法で行った。比較例１の運転条件は、下記のとおりである。
・発酵反応槽容量（Ｌ−リジン発酵培地量）：１．５（Ｌ）
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：２（Ｌ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：６５０（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：４Ｎ  ＮＨ4ＯＨによりｐＨ７．３に調整
まず、５ｍｌのＢＹ培地（０．５％イーストエキストラクト、０．７％ミートエキストラクト、１％ペプトン、０．３％塩化ナトリウム）を投入した試験管に、寒天培地から掻き取ったｄｅｌｔａ−ＨＯＭ株を植菌し、これを温度３０℃で２４時間振とう培養を行った（前々培養）。得られた前々培養液を、表５に示した培地を５０ｍＬ投入した５００ｍＬの三角フラスコに全量植菌し、３０℃で２４時間振とう培養した（前々培養）。得られた前々培養液を、表５に示した培地を１４５０ｍＬ投入したミニジャーファーメンターに植菌し、バッチ培養を行った。バッチ発酵の結果を、上記の実施例７〜１０の連続発酵試験で得られたＬ−リジン発酵生産性と比較して表６に示す。
【０１５８】
【表６】
0005458481.tif 000009
【０１５９】
表６の結果から、本発明で用いられる図１および図２に示した連続発酵装置を用いることにより、Ｌ−リジンの生産速度が大幅に向上することを確認することができた。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１】図１は、本発明で用いられる膜分離型の連続発酵装置の一つの実施の形態を説明するための概略側面図である。
【図２】図２は、本発明で用いられる他の膜分離の型連続発酵装置の一つの実施の形態を説明するための概略側面図である。
【図３】図３は、本発明で用いられる分離膜エレメントの一つの実施の形態を説明するための概略斜視図である。
【図４】図４は、本発明で用いられる他の分離膜エレメントの一つの実施の形態を説明するための概略斜視図である。
【符号の説明】
【０１６１】
１  発酵反応槽
２  分離膜エレメント
３  水頭差制御装置
４  気体供給装置
５  攪拌機
６  レベルセンサ
７  培地供給ポンプ
８  ｐＨ調整溶液供給ポンプ
９  ｐＨセンサ・制御装置
１０  温度調節器
１１  発酵培養液循環ポンプ
１２  膜分離槽
１３  支持板
１４  流路材
１５  分離膜
１６  凹部
１７  集水パイプ
１８  分離膜束
１９  上部樹脂封止層
２０  下部樹脂封止層
２１  支持フレーム
２２  集水パイプ
【図１】
0005458481.tif 000010
【図２】
0005458481.tif 000011
【図３】
0005458481.tif 000012
【図４】
0005458481.tif 000013
【配列表】
0005458481000001.app