(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＣＤ４０治療剤での治療に対して応答性である炎症性疾患または自己免疫疾患を有する被験者を同定するのを補助するための方法であって、該方法が、以下：
ａ）テスト用生物学的サンプルと有効量の該抗ＣＤ４０治療剤とを接触させる工程；
ｂ）該テスト用生物学的サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを検出する工程であって、ここで、該バイオマーカーは、
（ｉ）細胞アポトーシスのバイオマーカーであって、該アポトーシスのバイオマーカーが、切断されたカスパーゼタンパク質、切断されたポリＡＤＰ−リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）の細胞表面発現、ゲノムＤＮＡフラグメント化およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、細胞アポトーシスのバイオマーカー；
（ｉｉ）ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達経路のバイオマーカーであって、該ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達経路が、ＡＫＴシグナル伝達経路、ＮＦ−κＢシグナル伝達経路、およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達経路からなる群から選択され、そして、該ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達経路のバイオマーカーが、ホスホ−ＰＩ３Ｋ、ホスホ−ＰＤＫ１、ホスホ−ＡＫＴ、ホスホ−ＭＥＫ、ホスホ−ＥＲＫ、ホスホ−ｐ３８、ホスホ−ＩＫＫα／β、ホスホ−ＩκＢタンパク質、および活性化ＮＦ−κＢからなる群から選択される、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達経路のバイオマーカー；および
（ｉｉｉ）細胞生存のバイオマーカーであって、該細胞生存のバイオマーカーが、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーである抗アポトーシスタンパク質、ＩＡＰアポトーシス阻害剤タンパク質、およびＴＮＦ受容体関連因子−１（ＴＲＡＦ−１）からなる群から選択される、細胞生存のバイオマーカー
からなる群から選択される、工程；ならびに
ｃ）該テスト用生物学的サンプル中の該少なくとも１つのバイオマーカーのレベルと、コントロール用生物学的サンプル中で検出される該少なくとも１つのバイオマーカーのレベルとを比較する工程であって、ここで、該コントロール用生物学的サンプルは、該抗ＣＤ４０治療剤と接触されていない、工程
を含み、ここで、該テスト用生物学的サンプルおよび該コントロール用生物学的サンプルは該被験者由来であり、ここで、該テスト用生物学的サンプルおよび該コントロール用生物学的サンプルは、ＣＤ４０リガンドで刺激されたＣＤ４０発現細胞を含み、ここで、該コントロール用生物学的サンプルと比較した、該テスト用生物学的サンプル中の
（ｉ）該アポトーシスのバイオマーカーのうちの少なくとも１つのレベルの上昇；および／または
（ｉｉ）該ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達経路のうちの少なくとも１つのバイオマーカーのうちの少なくとも１つのレベルの低下；および／または
（ｉｉｉ）該細胞生存のバイオマーカーのうちの少なくとも１つのレベルの低下
が、該抗ＣＤ４０治療剤での治療から恩恵を受ける被験者を示す、方法。
【請求項２】
前記ＣＤ４０発現細胞が、前記接触させる工程よりも前に、ＣＤ４０のリガンドを用いてエクスビボで刺激される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＣＤ４０の前記リガンドが、可溶性ＣＤ４０Ｌおよび膜結合ＣＤ４０Ｌからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＣＤ４０発現細胞に関連する炎症性疾患または自己免疫疾患についての被験者の治療における抗ＣＤ４０治療剤の効果をモニタリングするのを補助するための方法であって、該方法が、以下：
ａ）ベースライン生物学的サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを検出する工程であって、ここで、該ベースライン生物学的サンプルは、１用量の該抗ＣＤ４０治療剤を投与する前である該被験者由来であり、ここで、該ベースライン生物学的サンプルはＣＤ４０発現細胞を含み、ここで、該バイオマーカーは、
（ｉ）細胞アポトーシスのバイオマーカーであって、該アポトーシスのバイオマーカーが、切断されたカスパーゼタンパク質、切断されたポリＡＤＰ−リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）の細胞表面発現、ゲノムＤＮＡフラグメント化およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、細胞アポトーシスのバイオマーカー；
（ｉｉ）ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達経路のバイオマーカーであって、該ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達経路が、ＡＫＴシグナル伝達経路、ＮＦ−κＢシグナル伝達経路、およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達経路からなる群から選択され、そして、該ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達経路のバイオマーカーが、ホスホ−ＰＩ３Ｋ、ホスホ−ＰＤＫ１、ホスホ−ＡＫＴ、ホスホ−ＭＥＫ、ホスホ−ＥＲＫ、ホスホ−ｐ３８、ホスホ−ＩＫＫα／β、ホスホ−ＩκＢタンパク質、および活性化ＮＦ−κＢからなる群から選択される、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達経路のバイオマーカー；および
（ｉｉｉ）細胞生存のバイオマーカーであって、該細胞生存のバイオマーカーが、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーである抗アポトーシスタンパク質、ＩＡＰアポトーシス阻害剤タンパク質、およびＴＮＦ受容体関連因子−１（ＴＲＡＦ−１）からなる群から選択される、細胞生存のバイオマーカー
からなる群から選択される、工程；
ｂ）少なくとも１つの引き続いての生物学的サンプル中の該少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを検出する工程であって、ここで、該少なくとも１つの引き続いての生物学的サンプルは、該抗ＣＤ４０治療剤の投与後の該被験者由来である、工程；ならびに
ｃ）該少なくとも１つの引き続いてのサンプル中の該少なくとも１つのバイオマーカーのレベルと、該ベースライン生物学的サンプル中の該少なくとも１つのバイオマーカーのレベルとを比較し、そして該少なくとも１つのバイオマーカーのレベルの変化と治療効果とを関連付ける工程、
を含み、ここで、該ベースライン生物学的サンプルと比較した、該引き続いての生物学的サンプル中の
（ｉ）該アポトーシスのバイオマーカーのうちの少なくとも１つのレベルの上昇；および／または
（ｉｉ）該ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達経路のうちの少なくとも１つのバイオマーカーのうちの少なくとも１つのレベルの低下；および／または
（ｉｉｉ）該細胞生存のバイオマーカーのうちの少なくとも１つのレベルの低下
が、該抗ＣＤ４０治療剤での治療の効果を示す、方法。
【請求項５】
前記被験者は、１用量の前記抗ＣＤ４０治療剤が投与されている、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記被験者は、複数用量の前記抗ＣＤ４０治療剤が投与されている、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記抗ＣＤ４０治療剤が、ヒトＢ細胞の表面上で発現されたヒトＣＤ４０抗原へ特異的に結合し得るアンタゴニスト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体であり、該モノクローナル抗体は、該Ｂ細胞の表面上に発現された該ＣＤ４０抗原へ結合される際に顕著なアゴニスト活性を有さない、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗ＣＤ４０治療剤が、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用またはＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達を阻害するＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）アンタゴニストである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＣＤ４０Ｌアンタゴニストが、ＣＤ４０Ｌへ特異的に結合する抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体、ＣＤ４０の可溶性形態、ＣＤ４０を含む融合タンパク質の可溶性形態、および医薬品からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記切断されたカスパーゼタンパク質が、切断されたカスパーゼ３、切断されたカスパーゼ７、および切断されたカスパーゼ９からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
細胞表面ＰＳがアネキシンＶ染色によって検出され、そしてゲノムＤＮＡフラグメント化がＴＵＮＥＬ染色によって検出される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＭＡＰＫシグナル伝達経路が、ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路およびＭＥＫ／ｐ３８シグナル伝達経路からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーがＢｃｌ−ｘｌおよびＭｃｌ−１からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＩＡＰアポトーシス阻害剤タンパク質が、サバイビン、ＸＩＡＰ、およびｃＩＡＰ１からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記テスト用生物学的サンプルおよび前記コントロール用生物学的サンプル中において、ＣＤ４０シグナル伝達の少なくとも１つのサイトカインマーカーのレベルを検出する工程をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法、または前記引き続いての生物学的サンプルおよび前記ベースライン生物学的サンプル中において、ＣＤ４０シグナル伝達のうちの少なくとも１つのサイトカインマーカーのレベルを検出する工程をさらに含む、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記サイトカインマーカーが、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン（ＩＬ）−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、およびマクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記コントロール用生物学的サンプルと比較した前記テスト用生物学的サンプル中の前記サイトカインマーカーの少なくとも１つのレベルの低下が、前記抗ＣＤ４０治療剤での治療から恩恵を受ける被験者を示すか、または前記ベースライン生物学的サンプルと比較した前記引き続いての生物学的サンプル中の前記サイトカインマーカーのうちの少なくとも１つのレベルの低下が、前記抗ＣＤ４０治療剤での治療の効果を示す、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗ＣＤ４０治療剤が、ＣＤ４０発現細胞の表面上に発現されたヒトＣＤ４０抗原へ特異的に結合し、その結果、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）活性を調節する抗ＣＤ４０モノクローナル抗体であり、そして前記バイオマーカーがアポトーシスのバイオマーカーである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記コントロール用生物学的サンプルと比較した前記テスト用生物学的サンプル中の前記アポトーシスのバイオマーカーの少なくとも１つのレベルの上昇が、前記抗ＣＤ４０抗体での治療から恩恵を受ける被験者を示すか、または前記ベースライン生物学的サンプルと比較した前記引き続いての生物学的サンプル中の前記アポトーシスのバイオマーカーのうちの少なくとも１つのレベルの上昇が、該抗ＣＤ４０抗体での治療の効果を示す、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記引き続いての生物学的サンプルおよび前記ベースライン生物学的サンプル中において、該引き続いての生物学的サンプルおよび該ベースライン生物学的サンプル中のＣＤ４０発現細胞における、細胞表面ＣＤ４０、細胞表面ＣＤ４０Ｌ、ならびに細胞表面ＣＤ４０および細胞表面ＣＤ４０Ｌの両方からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤ４０関連因子の発現のレベルを検出する工程をさらに含み、ここで、該ベースライン生物学的サンプルと比較した該引き続いての生物学的サンプル中の該ＣＤ４０関連因子のうちの少なくとも１つの発現レベルの低下が、該抗ＣＤ４０治療剤での治療の効果を示す、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
血液または血液成分のベースラインサンプルおよび血液または該血液成分の引き続いてのサンプルを前記被験者から回収する工程、ならびに該ベースラインサンプルおよび該引き続いてのサンプル中の循環可溶性ＣＤ４０または循環可溶性ＣＤ４０Ｌのレベルを検出する工程をさらに含み、ここで、該ベースラインサンプルと比較した該引き続いてのサンプル中の該循環可溶性ＣＤ４０または循環可溶性ＣＤ４０Ｌのうちの少なくとも１つの発現のレベルの低下が、該抗ＣＤ４０治療剤での治療の効果を示す、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記被験者の生物学的サンプル中において、該生物学的サンプル中のＣＤ４０発現細胞における、細胞表面ＣＤ４０の発現レベル、細胞表面ＣＤ４０Ｌの発現レベル、または両方を検出する工程をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
被験者から回収された生物学的サンプル中の循環可溶性ＣＤ４０または循環可溶性ＣＤ４０Ｌのレベルを検出する工程をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記バイオマーカーのレベルを検出する工程が、バイオマーカータンパク質発現を検出するために抗体を使用することを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記バイオマーカーのレベルを検出する工程が、核酸ハイブリダイゼーションを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記バイオマーカーのレベルを検出する工程が、定量ＲＴ−ＰＣＲを行うことを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗ＣＤ４０治療剤が、以下：
ａ）配列番号１０または配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８７を含むエピトープへ結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント；
ｂ）配列番号１０または配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８９を含むエピトープへ結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント；ならびに
ｃ）競合的結合アッセイにおいて、特許寄託番号ＰＴＡ−５５４２としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９または特許寄託番号ＰＴＡ−５５４３としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２と競合するモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント；
からなる群から選択されるアンタゴニスト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントである、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗ＣＤ４０治療剤が、以下：
ａ）配列番号２の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む軽鎖可変ドメインと、配列番号４の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む重鎖可変ドメインとを含むモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント；または
ｂ）配列番号６の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む軽鎖可変ドメインと、配列番号７の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む重鎖可変ドメインとを含むモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント
である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗体またはその抗原結合性フラグメントが、以下：
ａ）配列番号２；
ｂ）配列番号４；
ｃ）配列番号５；
ｄ）配列番号２および配列番号４；
ｅ）配列番号２および配列番号５；
ｆ）配列番号６；
ｇ）配列番号７；
ｈ）配列番号８；
ｉ）配列番号６および配列番号７；ならびに
ｊ）配列番号６および配列番号８
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗体またはその抗原結合性フラグメントが、以下：
ａ）配列番号２に示される可変領域および定常領域の配列を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント；
ｂ）配列番号４に示される可変領域および定常領域の配列を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント；
ｃ）配列番号５に示される可変領域および定常領域の配列を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント；
ｄ）配列番号２に示される可変領域および定常領域の配列と配列番号４に示される可変領域および定常領域の配列を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント；
ｅ）配列番号２に示される可変領域および定常領域の配列と配列番号５に示される可変領域および定常領域の配列を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント；
ｆ）配列番号６に示される可変領域および定常領域の配列を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント；
ｇ）配列番号７に示される可変領域および定常領域の配列を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント；
ｈ）配列番号８に示される可変領域および定常領域の配列を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント；
ｉ）配列番号６に示される可変領域および定常領域の配列と配列番号７に示される可変領域および定常領域の配列を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント；ならびに
ｊ）配列番号６に示される可変領域および定常領域の配列と配列番号８に示される可変領域および定常領域の配列を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント；
から選択される、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗ＣＤ４０治療剤が、特許寄託番号ＰＴＡ−５５４２としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９もしくはその抗原結合性フラグメント、または、特許寄託番号ＰＴＡ−５５４３としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２もしくはその抗原結合性フラグメントである、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、および単鎖Ｆｖフラグメントからなる群から選択される、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記炎症性疾患または自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、円盤状ループス、ループス腎炎、サルコイドーシス、若年性関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、ライター症候群、強直性脊椎炎、痛風性関節炎、臓器または組織移植片の拒絶、対宿主性移植片病、多発性硬化症、高ＩｇＥ症候群、結節性多発性動脈炎、原発性胆汁性肝硬変、炎症性腸疾患、クローン病、セリアック病（グルテン過敏性腸症）、自己免疫性肝炎、悪性貧血、自己免疫性溶血性貧血、乾癬、強皮症、重症筋無力症、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性甲状腺炎、グレーヴズ病、橋本甲状腺炎、免疫複合体病、慢性疲労免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、多発性筋炎および皮膚筋炎、クリオグロブリン血症、血栓溶解、心筋症、尋常性天疱瘡、間質性肺線維症、サルコイドーシス、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病、１、２、３および４型遅延型過敏症、アレルギーまたはアレルギー性障害、ぜん息、チャーグ−ストラウス症候群（アレルギー性肉芽腫症）、アトピー性皮膚炎、アレルギー性および刺激性接触皮膚炎、じんま疹、ＩｇＥ媒介性アレルギー、アテローム性動脈硬化症、脈管炎、特発性炎症性ミオパシー、溶血性疾患、アルツハイマー病、ならびに慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシーからなる群から選択される、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、診断および予測医学の分野、より詳細には、異常なＣＤ４０シグナル伝達に関連する自己免疫および／または炎症性成分を有する疾患の治療における治療剤の効果を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーのリガンドの多くのメンバーおよびそれらの対応する受容体が、アポプトーシスを誘導するかまたは細胞生存および増殖を増強することによって正常細胞の増殖を調節する。正常な細胞恒常性を維持するのは、アポトーシスシグナルと生存および増殖シグナルとの間のこのバランスである。少なくとも２６のＴＮＦファミリー受容体および１８のＴＮＦファミリーリガンドが、現在まで同定された。前記受容体およびリガンドの両方の生物学的に活性な形態は、自己組織化タンパク質三量体である。前記受容体およびリガンドの両方の膜貫通性および可溶性の形態が、同定された。前記受容体の細胞内ドメインは配列相同性を共有しないが、それらの細胞外ドメインは４０のアミノ酸システインリッチな繰り返しを含む。それらの細胞質尾部は、細胞内タンパク質の２つの主要なグループ、ＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）およびデスドメイン（ＤＤ）含有タンパク質と相互作用することによって、シグナル伝達する。これらの受容体のいくつかの細胞質尾部における少なくとも６つのヒトＴＲＡＦおよびＴＲＡＦ結合部位の間の相互作用は、ＡＫＴ（プロテインキナーゼＢまたはＰＫＢと呼ばれるセリン／トレオニンキナーゼ）、核因子−κＢ（ＮＦ−κＢ）、およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）を含む、いくつかのシグナル伝達経路を開始させる。例えば、非特許文献１による概説を参照のこと。
【０００３】
ＴＮＦファミリー受容体メンバーＣＤ４０は、正常および新生物性の両方のヒトＢ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、ＣＤ８＋Ｔ細胞、内皮細胞、ならびに単球性および上皮細胞の表面上に存在する５０−５５ｋＤａ細胞表面抗原である。ＣＤ４０抗原はまた、活性化Ｔ細胞、活性化血小板、炎症を起こした血管平滑筋細胞、好酸球、関節リウマチ中の滑膜、皮膚線維芽細胞および他の非リンパ球様細胞タイプ上において発現される。
【０００４】
細胞発現ＣＤ４０のタイプに依存して、連結反応は、細胞間接着、分化、活性化および増殖を誘導し得る。例えば、その同族リガンド（ｃｏｇｎａｔｅ  ｌｉｇａｎｄ）であるＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４とも呼ばれる）へのＣＤ４０の結合は、Ｂ細胞増殖および形質細胞への分化、抗体産生、アイソタイプスイッチング、およびＢ細胞記憶産生（Ｂ−  ｃｅｌｌ  ｍｅｍｏｒｙ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）を刺激する。Ｂ細胞分化の間、ＣＤ４０は、プレＢ細胞上に発現されるが、形質細胞への分化の際に失われる。
【０００５】
ＣＤ１５４としても公知であるＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）は、２つの類似の生物学的に活性な可溶性形態（それぞれ、１８ｋＤａおよび３１ｋＤａ）でも存在する３２−３３ｋＤａ膜貫通タンパク質である（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。ＣＤ４０Ｌは、休止しているものではなく活性化されたＣＤ４＋Ｔ−ヘルパー細胞上において発現される（非特許文献５；非特許文献６；および非特許文献７）。ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌの両方がクローン化およびキャラクタライズされた（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；および非特許文献１１）。ヒトＣＤ４０Ｌを記載する特許文献１も参照のこと。ＣＤ４０Ｌ遺伝子がトランスフェクトされそしてそれらの表面上にＣＤ４０Ｌタンパク質を発現する細胞は、Ｂ細胞増殖を誘導し得、そして他の刺激性シグナルと一緒に、抗体産生を誘導し得る（非特許文献９（上述）；および特許文献１）。自己免疫疾患を有する患者は、健常者には見られない高い血清レベルの可溶性ＣＤ４０Ｌ（ｓＣＤ４０Ｌ）を有する。ＣＤ４０Ｌの過剰発現は、げっ歯類モデルにおいて全身性エリテマトーデスに類似する自己免疫疾患を引き起こす（非特許文献１２）。対照的に、活性化Ｔ細胞上に官能性ＣＤ４０Ｌが存在しないことは、Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群を引き起こす（非特許文献１３；および非特許文献１４）。さらに、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用を遮断することは、非ヒト霊長類モデルにおいて移植片拒絶を予防し得る。例えば、非特許文献１５を参照のこと。
【０００６】
ＡＰＣにおけるＣＤ４０発現は、これらの細胞の活性化において重要な共刺激役割を果たす。例えば、アゴニスト性抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）が、Ｂ細胞活性化におけるＴヘルパー細胞（Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｃｅｌｌｓ）の効果を模倣すると示された。ＦｃγＲＩＩを発現する接着細胞に提示されると、これらの抗体はＢ細胞増殖を誘導する（非特許文献１６）。さらに、アゴニスト性抗ＣＤ４０  ｍＡｂは、ＩＬ−４の存在下でのＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＥの分泌についてＴヘルパーシグナルに取って代わり得る（非特許文献１７）。さらに、アゴニスト性抗ＣＤ４０  ｍＡｂは、リンパ節から単離されたＢ細胞のプログラム細胞死（アポトーシス）を防止し得る。
【０００７】
これらおよび他の観察が、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌの相互作用が液性免疫応答および細胞性免疫応答の両方を調節することにおいて極めて重要な役割を果たすという現在の説を支持している。より最近の研究は、多様な生理学的および病理学的プロセスにおけるＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用の遥かにより広い役割を明らかにした。
【０００８】
ＣＤ４０シグナル変換経路は、多くの細胞内因子の協調的調節に依存する。ＴＮＦ受容体フェミリーの他のメンバーと同様に、ＣＤ４０は、ＴＲＡＦ−１、ＴＲＡＦ−２、−３、−５および−６を含むＴＲＡＦを活性化し、これらは、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）、ｃ−ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）、ｐ３８  ＭＡＰＫおよびＮＦ−κＢを含むＣＤ４０Ｌ（膜結合ＣＤ４０Ｌまたは可溶性ＣＤ４０Ｌのいずれか）とＣＤ４０との結合に続いて多様なシグナル伝達経路をアップレギュレートする（例えば、非特許文献１８；非特許文献１９を参照のこと）。
【０００９】
ＣＤ４０を介してのシグナル伝達は、アポトーシスから細胞死を防止することが示された（非特許文献２０）。アポトーシスシグナルは、協調してプログラム細胞死を誘導するために必要である。細胞死シグナルは、小胞体ストレス等の細胞内からの内因性刺激、あるいはＦａｓＬまたはＴＮＦαの受容体結合等の外因性刺激を含み得る。シグナル伝達経路は、複雑であり、カスパーゼ３およびカスパーゼ９等のカスパーゼならびにポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の活性化を含む。前記カスケードの間、抗アポトーシスシグナル伝達タンパク質（例えば、Ｍｃｌ−１およびＢｃｌ−ｘ）ならびにＩＡＰファミリーのタンパク質のメンバー（例えば、Ｘ連鎖アポトーシス阻害剤（Ｘ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）（ＸＩＡＰ））が、ダウンレギュレートされる（非特許文献２１）。例えば、樹上細胞において、ＣＤ４０細胞シグナル伝達は、ＦａｓＬによって変換されたアポトーシスシグナルを遮断し得る（非特許文献２２）。
【００１０】
したがって、ＣＤ４０ＬによるＣＤ４０結合および引き続いてのＣＤ４０シグナル伝達活性化は、正常な免疫応答に必要な工程である；しかし、ＣＤ４０シグナル伝達の調節異常は、疾患へ導き得る。ＣＤ４０シグナル伝達経路は、自己免疫疾患に関与することが示された（非特許文献２３および非特許文献２４）。さらに、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用は、炎症性プロセスにおいて重要な役割を果たす。例えば、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌの両方が、ヒトおよび実験的アテローム性動脈硬化症病巣において過剰発現される。ＣＤ４０刺激は、内皮細胞、平滑筋細胞およびマクロファージ等のアテローム関連細胞タイプにおいてマトリクス分解酵素の発現および組織因子発現を誘導する。さらに、ＣＤ４０刺激は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＩＬ−Ｉ、ＩＬ−６およびＩＬ−８等の炎症性サイトカインならびにＩＣＡＭ−Ｉ、Ｅ−セレクチンおよびＶＣＡＭ等の接着分子の産生を誘導する。ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用の阻害は、動物モデルにおいてアテローム発生を防止する。移植片モデルにおいて、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用を遮断することは、炎症を防止する。ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ結合は、アルツハイマーアミロイドベータペプチドと相乗的に作用し、ミクログリア活性化を促進し、それによって神経毒性に至ることが示された。
【００１１】
関節リウマチ（ＲＡ）を有する患者において、ＣＤ４０発現が関節軟骨細胞において増加され、したがって、ＣＤ４０シグナル伝達は、有害なサイトカインおよびマトリックスメタロプロテアーゼの産生に恐らく寄与する。非特許文献２５を参照のこと。さらに、滑膜の炎症反応の増幅が、ＲＡ患者由来のＣＤ１４＋滑膜細胞上でのＣＤ４０の連結反応によるＭＡＰＫおよびＮＦ−κＢの活性化によって生じることが示された（非特許文献２６）。ＲＡの実験モデルにおいて、抗ＣＤ４０Ｌ抗体治療は、疾患誘導、関節の炎症および抗コラーゲン抗体産生を防止した（非特許文献２７）。最後に、臨床試験において、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）（一般的には細胞リンパ腫の治療に適応される）を投与することによりＲＡ患者からＣＤ２０＋陽性Ｂ細胞を激減させることが、症状を改善することが示された（非特許文献２８）。
【００１２】
Ｔ細胞への抗原の提示の間にＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用を遮断することはまた、Ｔ細胞耐性を誘導すると示された。したがって、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用を遮断することは、初期Ｔ細胞活性化を防止し、かつ、該抗原への再暴露に対する長期耐性を誘導する。
【００１３】
正常な免疫の維持におけるＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達の重要な役割を考慮すると、ＣＤ４０シグナル伝達を標的にする治療レジメンに応答性である自己免疫および／または炎症性疾患を有する個人を同定するための方法が必要とされる。
【特許文献１】米国特許第５，９４５，５１３号明細書
【非特許文献１】ＹｏｕｎｅｓおよびＫａｄｉｎ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００３年、１８：３５２６−３５３４
【非特許文献２】Ｇｒａｆら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５年、２５：１７４９−１７５４
【非特許文献３】Ｍａｚｚｅｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５年、２７０：７０２５−７０２８
【非特許文献４】Ｐｉｅｔｒａｖａｌｌｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６年、２７１：５９６５−５９６７
【非特許文献５】Ｌａｎｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２年、２２：２５７３−２５７８
【非特許文献６】Ｓｐｒｉｇｇｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９２年、１７６：１５４３−１５５０
【非特許文献７】Ｒｏｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３年、１５１：１−１４
【非特許文献８】Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１９８９年、８：１４０３−１４１０
【非特許文献９】Ａｒｍｉｔａｇｅら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９２年、３５７：８０−８２
【非特許文献１０】Ｌｅｄｅｒｍａｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９２年、１７５：１０９１−１１０１
【非特許文献１１】Ｈｏｌｌｅｎｂａｕｇｈら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９２年、１１：４３１３−４３２１
【非特許文献１２】Ｈｉｇｕｃｈｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２年、１６８：９−１２
【非特許文献１３】Ａｌｌｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９３年、２５９：９９０
【非特許文献１４】Ｋｏｒｔｈａｕｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９３年、３６１：５３９
【非特許文献１５】Ｗｅｅら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、１９９２年、５３：５０１−５０７
【非特許文献１６】Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８９年、２５１：７０
【非特許文献１７】Ｇａｓｃａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１年、１４７：８
【非特許文献１８】ＹｏｕｎｅｓおよびＣａｒｂｏｎｅ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｒｋｅｒｓ、１９９９年、１４：１３５−１４３
【非特許文献１９】ｖａｎ  ＫｏｏｔｅｎおよびＢａｎｃｈｅｒｅａｕ、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．２０００年、６７：２−１７
【非特許文献２０】Ｍａｋｕｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２年、１４：９７３−９８２
【非特許文献２１】Ｂｕｄｉｈａｒｄｊｏら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９９９年、１５：２６９−２９０
【非特許文献２２】Ｂｊｏｒｃｋら、Ｉｎｔｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７年、９：３６５−３７２
【非特許文献２３】Ｉｃｈｉｋａｗａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２年、１６９：２７８１−２７８７
【非特許文献２４】Ｍｏｏｒｅら、Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．２００２年、１９：１３９−１４５
【非特許文献２５】Ｇｏｔｏｈら、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２００４年、３１：１５０６−１５１２
【非特許文献２６】Ｈａｒｉｇａｉら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｒｈｅｕｍ．２００４年、５０：２１６７−２１７７
【非特許文献２７】Ｄｕｒｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９３年、２６１：１３２８−１３３０
【非特許文献２８】Ｓｈａｗら、Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．２００３年、６２（Ｓｕｐｐｌ．２）：ｉｉ５５−ｉｉ５９
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
ＣＤ４０Ｌ媒介性シグナル伝達を調節するおよび／または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を調節するものを含む、抗ＣＤ４０治療剤から恩恵を受ける炎症性疾患および／または自己免疫疾患を有する被験者を同定するための方法が提供される。このような抗ＣＤ４０治療剤としては、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用、特にＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達を遮断するかまたはこれに干渉するアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、アンタゴニスト抗ＣＤ４０Ｌ抗体、および医薬、ならびに、さらに、または代わりに、作用機序としてＡＤＣＣ活性を有するアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、該方法は、目的の１またはそれ以上の抗ＣＤ４０治療剤に対するエクスビボ細胞性応答をモニターするための、細胞アポトーシス、細胞増殖および生存のバイオマーカーの使用を含む。これらのエクスビボ予測アッセイは、以下を含む：候補被験者由来のテスト用生物学的サンプルおよびコントロール用生物学的サンプルを提供すること、ここで、これらの生物学的サンプルは、インビボまたはエクスビボで、ＣＤ４０リガンドで刺激されたＣＤ４０発現細胞を含む；該テスト用生物学的サンプルと目的の抗ＣＤ４０治療剤とを接触させること；該テスト用生物学的サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーの発現レベルを検出すること；ならびに、該バイオマーカーの発現レベルと、目的の抗ＣＤ４０治療剤と接触されていない該コントロール用生物学的サンプル中において検出された対応の発現レベルとを比較すること。これらのエクスビボ予測アッセイにおける使用のためのバイオマーカーとしては、抗ＣＤ４０治療剤の作用機序に依存して、細胞アポトーシスのバイオマーカー、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達経路のバイオマーカーおよび細胞増殖または生存のバイオマーカーを含む、その発現レベルが治療介入に対する反応性の予測指標であるタンパク質および／または遺伝子が挙げられる。抗ＣＤ４０治療剤がＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達の崩壊によるその作用機序を有する場合、細胞アポトーシス、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達経路および細胞増殖または生存のバイオマーカーが、これらのエクスビボ予測アッセイにおいて使用され得る。ある実施形態において、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達の追加のマーカーがアッセイされ得、これらとしては、ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０相互作用によってアップレギュレートされるサイトカイン、例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン（ＩＬ）−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、およびマクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）が挙げられるが、これらに限定されない。抗ＣＤ４０治療剤がＡＤＣＣによるその作用機序を有する場合、抗ＣＤ４０抗体、細胞アポトーシスのバイオマーカーが、これらのエクスビボ予測アッセイにおいて使用され得る。
【００１５】
本発明の他の実施形態において、抗ＣＤ４０治療剤での介入から恩恵を受ける個人または個人の部分母集団を予測する１またはそれ以上のＣＤ４０関連因子の発現レベルについて、候補被験者をスクリーニングする。したがって、１実施形態において、候補被験者、例えば、自己免疫および／または炎症性成分を含む疾患を有する被験者から回収された生物学的サンプルが、生物学的サンプルの細胞上における細胞表面ＣＤ４０抗原の発現レベル、生物学的サンプルの細胞上における細胞表面ＣＤ４０Ｌの発現レベル、可溶性ＣＤ４０（ｓＣＤ４０）の循環レベル、および可溶性ＣＤ４０Ｌ（ｓＣＤ４０Ｌ）の循環レベルからなる群から選択される１またはそれ以上のＣＤ４０関連因子について、スクリーニングされる。これらのＣＤ４０関連因子は、前記疾患の予測指標であり得、そして、抗ＣＤ４０治療剤の作用機序に関わらず、抗ＣＤ４０治療剤での治療介入に応答するかまたは応答しない被験者を同定するためにさらに使用され得る。コントロールまたは参照標準と比較した場合、生物学的サンプル中の１またはそれ以上のこれらのＣＤ４０関連因子の増加された発現レベルは、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達を調節するか、ＡＤＣＣを調節するか、または両方を調節する抗ＣＤ４０治療剤での治療介入から恩恵を受ける個人を示す。このスクリーニング法で同定された候補被験者は、目的の抗ＣＤ４０治療剤で治療され得るか、または、本明細書中に記載されるエクスビボ予測アッセイを使用して抗ＣＤ４０治療剤に対する応答性についてさらにスクリーニングされ得る。
【００１６】
なお他の実施形態において、他のクラスの治療剤では結果の悪い予後を有するが抗ＣＤ４０治療剤での介入から恩恵を受ける候補被験者の部分母集団を規定するために、１またはそれ以上の臨床的に有用な予測マーカーの有無について、候補被験者がスクリーニングされる。この様式において、候補被験者から回収された生物学的サンプルが、その作用機序がＣＤ４０標的化またはＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達によるものではない、現在の治療剤では結果の悪い予後を示すことが公知である１またはそれ以上の臨床的に有用な予測マーカーについてスクリーニングされる。所定の自己免疫または炎症性疾患についての任意の臨床的に有用な予測マーカーが、該スクリーニング法において含まれ得る。このスクリーニング法で同定された部分母集団中の候補被験者は、本明細書中で記載されるエクスビボ予測アッセイを使用して、抗ＣＤ４０治療剤に対する応答性についてさらにスクリーニングされ得る。
【００１７】
本発明はまた、炎症性疾患または自己免疫疾患を有する被験者の治療における抗ＣＤ４０治療剤の効果をモニタリングするための方法を提供する。この様式において、本明細書中に開示されるエクスビボ予測アッセイを使用して前もってスクリーニングされていてもまたはされていなくてもよい、抗ＣＤ４０治療剤での治療を受ける被験者は、細胞アポトーシス、細胞増殖および生存の少なくとも１つのバイオマーカーの発現のインビボ変化、ならびに／あるいは該抗ＣＤ４０治療剤での治療に続いての１またはそれ以上のＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達経路についてモニタリングされる。アッセイされる特定のバイオマーカーは、上述の治療剤の作用機序に基づいて選択され得る。あるいは、またはさらに、該被験者は、該抗ＣＤ４０治療剤での治療に続いての、細胞上における細胞表面ＣＤ４０抗原、細胞上における細胞表面ＣＤ４０Ｌ、ｓＣＤ４０の循環レベル、およびｓＣＤ４０Ｌの循環レベルからなる群から選択される１またはそれ以上のＣＤ４０関連因子の発現レベルのインビボ変化について、モニタリングされ得る。この様式において、第１の生物学的サンプルが被験者から得られ、そしてアッセイされる各因子についてのベースライン発現レベルを得るためにこれらのバイオマーカーおよび／またはＣＤ４０関連因子の１またはそれ以上の発現レベルについてアッセイされ、そして次いで１またはそれ以上の引き続いての（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ）生物学的サンプルが該被験者から得られ、そして同一のバイオマーカーおよび／またはＣＤ４０関連因子についてアッセイされ、ここで該引き続いての生物学的サンプルは、目的の抗ＣＤ４０治療剤の少なくとも１回の投薬量の投与に続いて得られる。モニタリングは、抗ＣＤ４０治療剤が被験者に投与される任意の所定の治療プロトコルの効果を確かめるために、期間中の１点でまたは期間中の複数点で行われ得る。アッセイされるバイオマーカーに依存して、任意の２つの時点の間のバイオマーカーの発現レベルの低下または増加は、炎症性疾患または自己免疫疾患の治療における抗ＣＤ４０治療剤の効果を示し得る。モニタリングによって１またはそれ以上のＣＤ４０関連因子の発現レベルの低下が明らかとなった場合、このような結果は、炎症性疾患または自己免疫疾患の治療における抗ＣＤ４０治療剤の効果を示し得る。
【００１８】
生物学的サンプル中におけるこれらの種々のバイオマーカーおよびＣＤ４０関連因子ならびに任意の臨床的に有用な予測マーカーの発現レベルは、例えば、免疫組織化学技術または核酸ベースの技術（例えば、インサイチュハイブリダイゼーションおよびＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、タンパク質レベルまたは核酸レベルで検出され得る。ある実施形態において、少なくとも１つのバイオマーカーの発現の上昇されたレベルまたは増加は、抗ＣＤ４０治療剤での治療に対してポジティブな治療応答を示す。他の実施形態において、少なくとも１つのバイオマーカーの発現の低下されたレベルまたは減少は、抗ＣＤ４０治療剤での治療に対してポジティブな治療応答を示す。
【００１９】
本発明の方法は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、円盤状ループス（ｄｉｓｃｏｉｄ  ｌｕｐｕｓ）、ループス腎炎、サルコイドーシス、若年性関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、ライター症候群、強直性脊椎炎、痛風性関節炎、臓器または組織移植片の拒絶、対宿主性移植片病、多発性硬化症、高ＩｇＥ症候群、結節性多発性動脈炎、原発性胆汁性肝硬変、炎症性腸疾患、クローン病、セリアック病（グルテン過敏性腸症）、自己免疫性肝炎、悪性貧血、自己免疫性溶血性貧血、乾癬、強皮症、重症筋無力症、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性甲状腺炎、グレーヴズ病、橋本甲状腺炎、免疫複合体病、慢性疲労免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、多発性筋炎および皮膚筋炎、クリオグロブリン血症、血栓溶解、心筋症、尋常性天疱瘡、間質性肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、サルコイドーシス、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病、１、２、３および４型遅延型過敏症、アレルギーまたはアレルギー性障害（ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）、ぜん息、チャーグ−ストラウス症候群（アレルギー性肉芽腫症）、アトピー性皮膚炎、アレルギー性および刺激性接触皮膚炎、じんま疹（ｕｒｔｅｃａｒｉａ）、ＩｇＥ媒介性アレルギー（ＩｇＥ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｌｌｅｒｇｙ）、アテローム性動脈硬化症、脈管炎、特発性炎症性ミオパシー（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍｙｏｐａｔｈｉｅｓ）、溶血性疾患、アルツハイマー病、ならびに慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー等が挙げられるが、これらに限定されない、自己免疫および／または炎症性成分を含む疾患を予防、改善または治療することにおいて抗ＣＤ４０治療介入が有益である被験者を同定するために使用され得る。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＡＤＣＣを調節するか、ＣＤ４０シグナル伝達、特に、ＣＤ４０とＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）との相互作用によって媒介されるＣＤ４０シグナル伝達経路に干渉するか、または両方を行う、ＣＤ４０受容体を標的にする抗ＣＤ４０治療剤での治療から恩恵を受ける炎症性疾患または自己免疫疾患を有する被験者を同定するための方法に関する。１実施形態において、該方法は、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達に関連する３つのクラスのバイオマーカー、特に、細胞増殖または生存および細胞アポトーシス経路のバイオマーカー、ならびに重要なＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達経路のバイオマーカー（ＡＫＴ、ＮＦ−κＢ、およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達経路を含む）の発現レベルに対する、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達を遮断するかまたはこれに干渉するアンタゴニスト抗ＣＤ４０治療剤の効果をモニタリングするための、エクスビボ予測アッセイの使用を含む。ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達を遮断するかまたはこれに干渉するアンタゴニスト抗ＣＤ４０治療剤の効果をモニタニングするために役立ち得る追加のマーカーとしては、本明細書下記において記載されるような、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達によってアップレギュレートされるサイトカインが挙げられる。細胞アポトーシス経路についてのバイオマーカーも、ＡＤＣＣを調節する抗ＣＤ４０治療剤、例えば、作用機序としてＡＤＣＣを有する抗ＣＤ４０抗体の効果をモニタリングするために役立ち得る。「ＣＤ４０アンタゴニスト」と本明細書中で呼ばれる、ＣＤ４０シグナル伝達のアンタゴニストとして作用する治療剤は、ＣＤ４０受容体へのＣＤ４０Ｌの結合によって通常誘導される１またはそれ以上のシグナル伝達合図に干渉し得る。本発明のエクスビボ予測アッセイは、ＣＤ４０を標的にしかつＡＤＣＣを調節するＣＤ４０アンタゴニストおよび治療剤での介入から恩恵を受ける被験者と、これらのタイプの治療剤での介入が有益ではない被験者とを区別するために使用され得る。候補被験者は、さらに、または代わりに、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達および／またはＡＤＣＣを調節する抗ＣＤ４０治療剤での治療介入から恩恵を受ける候補被験者の個人または部分母集団を規定するために、１以上のＣＤ４０関連因子および／または１以上の臨床的に有用な予測マーカーの有無、あるいは上昇または低下されたレベルについて、スクリーニングされ得る。これらのスクリーニング方法において同定された被験者は、本明細書中で記載されるエクスビボ予測アッセイを使用して、さらにスクリーニングされ得る。本明細書中で記載されるバイオマーカーおよびＣＤ４０関連因子はまた、ＣＤ４０シグナル伝達および／またはＡＤＣＣを調節する抗ＣＤ４０治療剤での治療の効果をモニタリングすることにおいて、ならびに炎症性疾患または自己免疫疾患を有する患者の部分母集団または個人患者における薬物応答性について原因を解明することにおいて使用される。
【００２１】
「ＣＤ４０抗原」、「ＣＤ４０細胞表面抗原」、「ＣＤ４０受容体」、または「ＣＤ４０」によって、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーに属する膜貫通糖タンパク質が意図される（例えば、米国特許第５，６７４，４９２号および第４，７０８，８７１号；Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  ＥＭＢＯ  ８：１４０３；Ｃｌａｒｋ（１９９０）  Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ３６：３３；Ｂａｒｃｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｔｈｅ  Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ（２ｄ  ｅｄ．；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を参照のこと）。この遺伝子の選択的スプライシングされた転写物変異体によってコードされる、ヒトＣＤ４０の２つのアイソフォームが、同定された。第１のアイソフォーム（「ロングアイソフォーム」または「アイソフォーム１」としても公知）は、２７７アミノ酸前駆体ポリペプチド（配列番号１１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ６０５９２およびＮＭ＿００１２５０を参照のこと）によってコードされる、配列番号１２（初めはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ４３０４５と報告され、そしてアイソフォーム１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１２４１）と同定された）として発現され、これはまた、最初の１９残基によって示されるシグナル配列を有する。第２のアイソフォーム（「ショートアイソフォーム」または「アイソフォーム２」としても公知）は、２０３アミノ酸前駆体ポリペプチド（配列番号９（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１５２８５４）によってコードされる、配列番号１０（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿６９０５９３））として発現され、これはまた、最初の１９残基によって示されるシグナル配列を有する。ヒトＣＤ４０のこれら２つのアイソフォームの前駆体ポリペプチドは、それらの最初の１６５残基（即ち、配列番号１０および配列番号１２の残基１−１６５）を共通して共有する。ショートアイソフォームの前駆体ポリペプチド（配列番号１０に示される）は、コードセグメントを欠いている転写物変異体（配列番号９）によってコードされ、これは、翻訳フレームシフトへ導き；得られるＣＤ４０アイソフォームは、ＣＤ４０のロングアイソフォームに含まれるもの（配列番号１２の残基１６６−２７７に示されるＣ末端）と比べて短くかつ異なるＣ末端（配列番号１０の残基１６６−２０３）を含む。本発明の目的について、用語「ＣＤ４０抗原」、「ＣＤ４０細胞表面抗原」、「ＣＤ４０受容体」または「ＣＤ４０」は、ＣＤ４０のショートアイソフォームおよびロングアイソフォームの両方を含む。
【００２２】
ＣＤ４０抗原は、本明細書中の他のところに記載されるような、種々の細胞タイプの表面上に提示される。「表面上に提示される」および「表面上に発現される」によって、ＣＤ４０抗原の全てまたは一部が細胞の外部へ暴露される。提示または発現されるＣＤ４０抗原は、完全にまたは部分的にグリコシル化され得る。
【００２３】
「アゴニスト活性」によって、物質がアゴニストとして作用することが意図される。アゴニストは、細胞上の受容体と結合し、そして該受容体の天然リガンドによって開始されるものに類似するかまたはこれと同一である反応または活性を開始する。例えば、ＣＤ４０のアゴニストは、以下に限られないが、以下の応答のいずれかまたは全てを誘導する：細胞増殖および／または分化；ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン、ＶＣＡＭ等の分子を介しての細胞間接着のアップレギュレーション；ＶＥＧＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＴＮＦ等の炎症性サイトカインの分泌；ＴＲＡＦ（例えば、ＴＲＡＦ−１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３）、ＭＡＰキナーゼ（例えば、ＮＩＫ（ＮＦ−κＢ誘導キナーゼ）、Ｉ−カッパＢキナーゼ（ＩＫＫ  α／β））、転写因子ＮＦ−κＢ、Ｒａｓ等の経路ならびにＭＥＫ／ＥＲＫ経路、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路、Ｐ３８ＭＡＰＫ経路等によるＣＤ４０受容体を介してのシグナル変換；ＸＩＡＰ、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−ｘ等の分子による抗アポトーシスシグナルの変換；Ｂおよび／またはＴ細胞記憶産生（ｍｅｍｏｒｙ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）；Ｂ細胞抗体産生；Ｂ細胞アイソタイプスイッチング、ＩＩ型ＭＨＣおよびＣＤ８０／８６の細胞表面発現のアップレギュレーション等。
【００２４】
「アンタゴニスト活性」によって、物質がアンタゴニストとして作用することが意図される。例えば、ＣＤ４０のアンタゴニストは、アゴニストリガンド（特に、ＣＤ４０Ｌ）へのＣＤ４０受容体の結合によって誘導される応答のいずれかの誘導を防止または減少させる。アンタゴニストは、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、好ましくは４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、より好ましくは７０％、８０％、８５％、そして最も好ましくは９０％、９５％、９９％または１００％、アゴニスト結合に対する応答のいずれか１つまたはそれ以上の誘導を減少させ得る。抗ＣＤ４０治療剤（例えば、抗ＣＤ４０抗体）のアンタゴニスト活性およびＣＤ４０リガンド結合特異性を測定するための方法は、当業者に公知であり、そして標準競合的結合アッセイ、Ｂ細胞による免疫グロブリン分泌をモニタリングするためのアッセイ、Ｂ細胞増殖アッセイ、Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ様Ｂ細胞増殖アッセイ、抗体産生についてのＴ細胞ヘルパーアッセイ（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｈｅｌｐｅｒ  ａｓｓａｙｓ）、Ｂ細胞増殖共刺激アッセイ、およびＢ細胞活性化マーカーのアップレギュレーションについてのアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＷＯ００／７５３４８および米国特許第６，０８７，３２９号に開示されるアッセイを参照のこと。また、２００３年１１月４日、２００３年１１月２６日、および２００４年４月２７日に出願され、そしてそれぞれ米国特許出願第６０／５１７，３３７号（代理人整理番号ＰＰ２０１０７．００１（０３５７８４／２５８４４２））、第６０／５２５，５７９号（代理人整理番号ＰＰ２０１０７．００２（０３５７８４／２７１５２５））、および第６０／５６５，７１０号（代理人整理番号ＰＰ２０１０７．００３（０３５７８４／２７７２１４））が割り当てられた「Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  Ａｎｔｉ−ＣＤ４０  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒｉｒ  Ｕｓｅ」という表題の仮出願、ならびに２００４年１１月４日に出願され、そしてＷＯ２００５／０４４８５４として公開された「Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  Ａｎｔｉ−ＣＤ４０  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒｉｒ  Ｕｓｅ」という表題が再び付けられた国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３７１５２号（代理人整理番号ＰＰ２０１０７．００４（０３５７８４／２８２９１６））を参照のこと；これらの各々の内容は、それら全体が、参照により本明細書中に組み込まれる。
【００２５】
「顕著な」アゴニスト活性によって、Ｂ細胞応答アッセイにおいて測定される場合の、中性物質またはネガティブコントロールによって誘導されるアゴニスト活性よりも少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％高いアゴニスト活性が意図される。好ましくは、「顕著な」アゴニスト活性は、Ｂ細胞応答アッセイにおいて測定される場合の、中性物質またはネガティブコントロールによって誘導されるアゴニスト活性よりも少なくとも２倍高いまたは少なくとも３倍高いアゴニスト活性である。したがって、例えば、目的のＢ細胞応答がＢ細胞増殖である場合、「顕著な」アゴニスト活性は、中性物質またはネガティブコントロールによって誘導されるＢ細胞増殖のレベルよりも少なくとも２倍高いまたは少なくとも３倍高いＢ細胞増殖のレベルの誘導である。１実施形態において、ＣＤ４０へ結合しない非特異的免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１）が、ネガティブコントロールとして役立つ。「顕著なアゴニスト活性を有さない」物質は、Ｂ細胞応答アッセイ等のバイオアッセイにおいて測定される場合の、中性物質またはネガティブコントロールによって誘導されるアゴニスト活性よりも約２５％以下より高い、好ましくは、中性物質またはネガティブコントロールによって誘導されるアゴニスト活性よりも約２０％以下より高い、１５％以下より高い、１０％以下より高い、５％以下より高い、１％以下より高い、０．５％以下より高い、または約０．１％以下より高いアゴニスト活性を示す。
【００２６】
本発明のある実施形態において、抗ＣＤ４０治療剤は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体である。このような抗体は、ヒト細胞上のＣＤ４０抗原へ結合される場合に、上述の顕著なアゴニスト活性を有さない。本発明の１実施形態において、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、１細胞性応答において顕著なアゴニスト活性を有さない。本発明の別の実施形態において、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、２以上の細胞性応答（例えば、増殖および分化、または増殖、分化、および、Ｂ細胞について、抗体産生）のアッセイにおいて顕著なアゴニスト活性を有さない。本発明のある実施形態において、目的の抗ＣＤ４０治療剤は、本明細書以下で記載されるような、完全なヒトモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９、あるいはその抗原結合性フラグメントである。
【００２７】
当該分野において公知のアッセイのいずれかが、抗ＣＤ４０治療剤が１以上のＢ細胞応答のアンタゴニストとして作用するかどうかを測定するために使用され得る。ある実施形態において、治療剤は、Ｂ細胞増殖、Ｂ細胞分化、抗体産生、細胞間接着、Ｂ細胞記憶産生（Ｂ  ｃｅｌｌ  ｍｅｍｏｒｙ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、アイソタイプスイッチング、ＩＩ型ＭＨＣおよびＣＤ８０／８６の細胞表面発現のアップレギュレーション、ならびにＶＥＧＦ、ＩＬ−８、ＩＬ−１２およびＴＮＦ等の炎症性サイトカインの分泌からなる群から選択される少なくとも１つのＢ細胞応答のアンタゴニストとして作用する抗ＣＤ４０抗体である。特に興味深いのは、ヒトＢ細胞の表面上のヒトＣＤ４０抗原へ結合される際に、Ｂ細胞増殖に関して顕著なアゴニスト活性を有さないアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体である。
【００２８】
１つのこのような実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、本明細書以下の実施例４に記載されるもののようなＢ細胞増殖アッセイにおいて測定されるＢ細胞増殖のアンタゴニストであり、そしてアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、中性物質またはネガティブコントロールによって誘導されるＢ細胞増殖よりも約２５％以下より高い、好ましくは、中性物質またはネガティブコントロールによって誘導されるＢ細胞増殖よりも約２０％以下より高い、１５％以下より高い、１０％以下より高い、５％以下より高い、１％以下より高い、０．５％以下より高い、または約０．１％以下より高いレベルでＢ細胞増殖を刺激する。
【００２９】
他の実施形態において、前記抗ＣＤ４０抗体は、別のＣＤ４０抗体（例えば、本明細書以下の実施例４に記載されるもののようなＢ細胞増殖アッセイにおいて測定されるＳ２Ｃ６抗ＣＤ４０抗体）によって誘導されるＢ細胞増殖のアンタゴニストであり、そして該アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の存在下において他の抗ＣＤ４０抗体によって刺激されるＢ細胞増殖のレベルは、該アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の非存在下において他の抗ＣＤ４０抗体によって誘導されるＢ細胞増殖の約２５％以下（即ち、少なくとも７５％阻害）、好ましくは、該アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の非存在下において他の抗ＣＤ４０抗体によって誘導されるＢ細胞増殖の約２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、１％以下、０．５％以下、または約０．１％以下である。
【００３０】
なお他の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、本明細書以下の実施例４に記載のＢ細胞活性かアッセイにおいて測定される細胞株ＥＬ４Ｂ５によって誘導されるＢ細胞増殖のアンタゴニストであり、そして該アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の存在下においてＥＬ４Ｂ５によって刺激されるＢ細胞増殖のレベルは、該アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の非存在下においてこの細胞株によって誘導されるＢ細胞増殖の約２５％以下（即ち、少なくとも７５％阻害）、好ましくは、該アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の非存在下においてこの細胞株によって誘導されるＢ細胞増殖の約２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、１％以下、０．５％以下、または約０．１％以下である。
【００３１】
なお他の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、本明細書以下の実施例４に記載されるＢ細胞による抗体産生についてのヒトＴ細胞ヘルパーアッセイ（ｈｕｍａｎ  Ｔ−  ｃｅｌｌ  ｈｅｌｐｅｒ  ａｓｓａｙ）において測定されるヒトＢ細胞によるヒトＴ細胞誘導抗体産生のアンタゴニストである。この様式において、該アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の存在下においてＴ細胞によって刺激されるＢ細胞によるＩｇＧ抗体産生、ＩｇＭ抗体産生、またはＩｇＧおよびＩｇＭの両方の抗体産生のレベルは、該アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の非存在下においてＴ細胞によって刺激されるＢ細胞によるそれぞれの抗体産生の約５０％以下（即ち、少なくとも７５％阻害）、好ましくは、該アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の非存在下においてＴ細胞によって刺激されるＢ細胞によるそれぞれの抗体産生の約２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、１％以下、０．５％以下、または約０．１％以下である。
【００３２】
「ＣＤ４０リガンド」によって、１またはそれ以上のＣＤ４０シグナル伝達経路に結合しそしてこれを活性化し得る任意のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質が意図される。したがって、「ＣＤ４０リガンド」としては、全長ＣＤ４０リガンドタンパク質、ならびにＣＤ４０発現細胞上における結合およびＣＤ４０シグナル伝達刺激の作用を行うに十分な活性を保持するそれらの変異体およびフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。天然ＣＤ４０リガンド、例えば、ヒトＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ；ＣＤ１５４としても公知）に対する修飾としては、置換、欠失、切断、伸長、融合タンパク質、フラグメント、ペプチド模倣物等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のある実施形態において、エクスビボ予測アッセイは、生物学的サンプルのＣＤ４０発現細胞上におけるＣＤ４０シグナル伝達を刺激するための、可溶性ＣＤ４０Ｌ、例えば、可溶性組換えヒトＣＤ４０Ｌ（Ａｌｅｘｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｎｇｈａｍ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）の使用を含む。
【００３３】
「ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達」によって、細胞表面受容体ＣＤ４０とＣＤ４０リガンドとの相互作用から生じる生物学的活性のいずれもが意図される。ＣＤ４０シグナル伝達の例は、ＣＤ４０発現細胞の増殖および生存、ならびにＣＤ４０発現細胞中の１以上のＣＤ４０シグナル伝達経路の刺激へ導くシグナルである。ＣＤ４０「シグナル伝達経路」または「シグナル変換経路」は、ＣＤ４０受容体とＣＤ４０リガンド（例えば、ＣＤ４０Ｌ）との相互作用から生じ、そして、該シグナル経路介して伝達された場合に、該シグナル伝達カスケードにおいて１以上の下流の分子（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）の活性化へ導くシグナルを発生させる、少なくとも１つの生化学反応、または一群の生化学反応を意味するように意図される。シグナル変換経路は、細胞表面ＣＤ４０受容体から原形質膜を横切って、そして一連のシグナル変換分子中の１以上を介して、細胞の細胞質を介して、そして場合によっては、細胞の核への、シグナルの伝達へ導く多数のシグナル変換分子を含む。本発明に特に興味深いのは、ＡＫＴシグナル伝達経路（これは、ＡＫＴの活性化、および最終的にＮＦ−κＢシグナル伝達経路を介してのＮＦ−κＢの活性化へ導く）；およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達経路（それぞれＥＲＫおよびｐ３８の活性化へ導く、ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路およびＭＥＫ／ｐ３８シグナル伝達経路を含む）を含む、ＣＤ４０シグナル変換経路である。これらのシグナル伝達経路の活性化と遮断とのバランスは、本明細書以下で記載される細胞生存またはアポトーシスのいずれかを好む。
【００３４】
本発明の方法は、エクスビボ予測アッセイ、および、検出工程において、またはこれらのエクスビボ予測アッセイにおいて検査される候補抗ＣＤ４０治療剤として、抗体を使用する、予測アッセイに関する。以下の用語および定義は、このような抗体に適用される。
【００３５】
「抗体」および「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同一の構造的特徴を有する糖タンパク質である。これらの用語は同意語として使用される。場合によっては、免疫グロブリンの抗原特異性が知られているかもしれない。
【００３６】
用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、そして完全に組み合わされた抗体、抗原へ結合し得る抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖抗体、ダイアボディ、キメラ抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｈｉｍｅｒａｓ）、ハイブリッド抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体等）、ならびに前述のものを含む組換えペプチドを網羅する。
【００３７】
用語「モノクローナル抗体」および「ｍＡｂ」は、本明細書中で使用される場合、抗体の実質的に均一な母集団から得られた抗体をいい、即ち、該母集団を含む該個々の抗体は、少量で存在し得る可能な自然に生じる突然変異を除いて同一である。
【００３８】
「天然抗体」および「天然免疫グロブリン」は、通常、２本の同一の軽（Ｌ）鎖および２本の同一の重（Ｈ）鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖へ連結されており、一方、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なっている。重鎖および軽鎖はまた一定間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、１つの末端に可変ドメイン（ＶＨ）、それに続く多数の定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）および他方の末端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常領域は、重鎖の第１の定常領域と並んでおり、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと並んでいる。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の界面を形成していると考えられている。
【００３９】
用語「可変」は、可変ドメインの特定部分が抗体間で配列が（ｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）広範囲に異なるという事実をいう。可変領域は、抗原結合特異性を与える。しかし、可変性は、抗体の可変ドメインにわたって均等には分配されていない。それは、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの両方において、相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中される。可変ドメインのより高度に保存される部分は、フレームワーク（ＦＲ）領域にある。天然の重鎖および軽鎖の可変領域は、各々、４つのＦＲ領域を含み、大部分は、３つのＣＤＲによって連結された、βプリーツシート立体配置を採用し、これらは、ループ連結を形成し、そして場合によっては、該βプリーツシート構造の一部を形成する。各鎖中のＣＤＲは、ＦＲ領域によって近位に保持されており、そして他の鎖からのＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１−３２４２，Ｖｏｌ．Ｉ，ｐａｇｅｓ  ６４７−６６９を参照のこと）。定常領域は、抗体が抗原へ結合する際に直接関与せず、しかし、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞毒性における抗体の沈降、補体依存性細胞傷害の開始、およびマスト細胞脱顆粒等の、種々のエフェクター機能を示す。
【００４０】
用語「超可変領域」は、本明細書中で使用される場合、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（即ち、軽鎖可変ドメインにおける残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、および８９−９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおける３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）、および９５−１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）ならびに／あるいは「超可変ループ」由来のそれらの残基（即ち、軽鎖可変ドメイン中の残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、および９１−９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、および９６−１０１（Ｈ３）；Ｃｌｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，（１９８７）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７）を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書中で考えられるように、超可変領域残基とは異なる可変ドメイン残基である。
【００４１】
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の部分、好ましくは、インタクトな抗体の抗原結合性または可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；ダイアボディ；線形抗体（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１０：１０５７−１０６２）；一本鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。抗体のパパイン消化によって、各々が単一の抗原結合性部位を有する、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる、２つの同一の抗原結合性フラグメントと、その名称が容易に結晶化するその能力を反映する残基「Ｆｃ」フラグメントとが作製される。ペプシン処理によって、２つの抗原結合性部位を有しかつ依然として抗原を架橋し得るＦ（ａｂ’）２フラグメントが作製される。
【００４２】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、堅い非共有性結合での、１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインからなる。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を規定するのは、この立体配置である。集合的に、６つのＣＤＲは、抗体へ抗原結合特異性を与える。しかし、単一の可変ドメイン（または、抗原について特異的である３つのみのＣＤＲを含むＦｖの半分）でさえ、全結合部位よりも低い親和性であるが、抗原を認識しそしてこれに結合する能力を有する。
【００４３】
Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂフラグメントは、抗体ヒンジ領域由来の１以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基を加えることによって、Ｆａｂ’フラグメントとは相違している。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’についての本明細書中での表示である。Ｆａｂ’フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの重鎖ジスルフィド架橋を還元することによって作製される。抗体フラグメントの他の化学的カップリングはまた公知である。
【００４４】
任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる、２つの明確に異なるタイプの１つへ帰属され得る。
【００４５】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは、異なるクラスへ帰属され得る。ヒト免疫グロブリンの５つの主要なクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、そして、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２へさらに分割され得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置は、周知である。異なるアイソタイプは、異なるエフェクター機能を有する。例えば、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプは、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）活性を有する。
【００４６】
用語「標識」は、本明細書中で使用される場合、「標識化」抗体を作製するように抗体へ直接的にまたは間接的に結合される検出可能な化合物または組成物をいう。標識は、それ自体で検出可能であってもよく（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）、または、酵素標識の場合、検出可能な基質化合物または組成物の化学的変化を触媒し得る。
【００４７】
「宿主細胞」は、本明細書中で使用される場合、組換えベクターまたは他のトランスファーポリヌクレオチドについてのレシピエントとして使用され得るかまたは使用された微生物または真核細胞または単細胞体として培養された細胞株をいい、そしてトランスフェクトされた元々の細胞の子孫を含む。単一細胞の子孫は、自然な、偶然の、または意図的な突然変異に起因して、元々の親とは形態学的にまたはゲノムもしくはトータルＤＮＡ補体的に必ずしも完全に同一ではないかもしれないと理解される。
【００４８】
「ヒトエフェクター細胞」は、１以上のＦｃＲを発現し、そしてエフェクター機能を行う白血球である。好ましくは、該細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、そして抗原依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）エフェクター機能を行う。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、マクロファージ、好酸球および好中球が挙げられ、ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。ＡＤＣＣ活性を有する抗体は、典型的に、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプのものである。ＩｇＧ１およびＩｇＧ３抗体を単離することに加えて、このようなＡＤＣＣ媒介性抗体は、非ＡＤＣＣ抗体由来の可変領域または可変領域フラグメントをＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプ定常領域へ工作することによって作製され得ることに注意のこと。
【００４９】
用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域へ結合する受容体を記載するために使用される。好ましいＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。しかし、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体へ結合するもの（γ受容体）であり、そしてＦｃγＲＩ、Ｆｃ７γＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体（これらの受容体の対立遺伝子多型およびあるいはスプライスされた形態を含む）を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、その細胞質ドメインが主に相違する類似のアミノ酸配列を有する、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）を含む。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（Ｄａｅｒｏｎ（１９９７）  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４を参照のこと）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ（１９９１）  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２；Ｃａｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４；およびｄｅ  Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−３４１に概説される。将来同定されるものも含む他のＦｃＲは、本明細書中において用語「ＦｃＲ」によって含まれる。該用語はまた、胎児への母性ＩｇＧの移動を担う新生児受容体ＦｃＲｎを含む（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７およびＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９）。
【００５０】
ヒト抗体を作製するための多くの方法が存在する。例えば、分泌細胞が、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）での感染によって不死化され得る。しかし、ＥＢＶ感染細胞は、クローン化するのが困難であり、そして通常、比較的低い収率の免疫グロブリンしか産生しない（Ｊａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｂｅｌｌ（１９８７）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １００：５−４０）。将来において、ヒトＢ細胞の不死化は、所定の組み合わせのトランスフォーミング遺伝子を導入することによって、場合により達成されるかもしれない。このような可能性は、ＳＶ４０ラージ発癌タンパク質およびＨ−ｒａｓの発癌性対立遺伝子と共のテロメラーゼ触媒サブユニットの発現が、正常なヒト上皮および線維芽細胞の腫瘍形成性変換を生じさせたという最近の実証によって強調される（Ｈａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｎａｔｕｒｅ  ４００：４６４−４６８）。免疫付与時に、内因性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体のレパートリーを産生し得るトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することが、現在可能である（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ（１９９５）  Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−８５１；Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６−１５６；Ｇｒｅｅｎ（１９９９）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１−２３；Ｔｏｍｉｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：７２２−７２７；Ｌｉｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：３６４−３７０において概説される）。例えば、キメラおよび生殖細胞（ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ）突然変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合体欠失は、内因性抗体の産生の完全な阻害を生じる（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１−２５５５）。このような生殖細胞（ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ）突然変異マウスにおけるヒト生殖細胞（ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ）免疫グロブリン遺伝子の導入は、抗原投与時にヒト抗体の産生を生じる（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８）。Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６）は、抗原が投与された際に高親和性完全ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスの株を作製した。これは、上述の内因性ＪＨセグメントへの欠失を伴うマウスへのメガ塩基対ヒト重鎖および軽鎖座の生殖細胞統合（ｇｅｒｍ−  ｌｉｎｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）によって達成された。これらのマウス（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）ＩＩテクノロジー（Ａｂｇｅｎｉｘ；Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））は、約６６ＶＨ遺伝子、完全ＤＨおよびＪＨ領域、ならびに３つの異なる定常領域を含む１，０２０ｋｂのヒト重鎖座を有し、そしてまた３２Ｖκ遺伝子、Ｊκセ��メント、およびＣκ遺伝子を含む８００ｋｂのヒトを有する。このようなマウスにおいて産生された抗体は、遺伝子再配列、集合、およびレパートリーを含む、全ての点で、ヒトにおいて見られるものに非常によく似ている。該ヒト抗体は、マウス座において遺伝子再配列を防止する内因性セグメントの欠失に起因して、内因性抗体に対して優先的に発現される。このようなマウスは、特に興味深い抗原で免疫化され得る。
【００５１】
このような免疫を与えられた動物由来の血清は、初期抗原に対する抗体反応性についてスクリーニングされ得る。リンパ球は、リンパ節または脾臓細胞から単離され得、そしてＣＤ１３８陰性およびＣＤ１９陽性細胞について選択することによって、Ｂ細胞についてさらに選択され得る。１態様において、このようなＢ細胞培養物（ＢＣＣ）は、上述のハイブリドーマを作製するために骨髄腫細胞へ融合され得る。
【００５２】
別の態様において、このようなＢ細胞培養物は、好ましくは、初期抗原に対する反応性についてさらにスクリーニングされ得る。このようなスクリーニングとしては、標的／抗原タンパク質を用いての酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、目的の抗原に結合する公知の抗体を用いての競合アッセイ、ならびに標的抗原を発現する一過性にトランスフェクトされたＣＨＯまたは他の細胞へのインビトロ結合が挙げられる。
【００５３】
本発明の予測アッセイにおける使用のための、バイオマーカー、サイトカインマーカー、ＣＤ４０関連因子、および臨床的に有用な予測マーカー
ある実施形態において、本発明の方法は、細胞生存、増殖、アポトーシス、およびＣＤ４０シグナル伝達経路の１以上のバイオマーカーの発現レベルの変化をモニタリングするためのエクスビボ予測アッセイの使用を含む。該エクスビボ予測アッセイは、単独で、または例えば以下の他の予測アッセイと組み合わせて使用され得る：他のＣＤ４０関連因子の発現に基づいて、ならびに／あるいは抗ＣＤ４０治療剤で発揮されるものとは異なる作用機序を有する標準的な治療剤での治療介入では結果の悪い予後を示す他の臨床的に有用な予測マーカーの有無または上昇もしくは低下された発現に基づいて、抗ＣＤ４０治療剤での治療に応答性である、炎症性疾患または自己免疫疾患を有する候補被験者同定する予測アッセイ。「抗ＣＤ４０治療剤での治療に応答性」によって、抗ＣＤ４０治療剤で治療した場合に、治療が求められる自己免疫疾患および／または炎症性疾患に関してポジティブな治療応答を有する候補被験者（即ち、本明細書以下で記載の炎症性疾患または自己免疫疾患を有する個人）が意図される。
【００５４】
（エクスビボ予測アッセイにおける使用のためのバイオマーカー）
シグナル伝達経路は、シグナル変換を促進するタンパク質ファミリーによって特徴付けられる。タンパク質および核酸分子を指す場合、用語「ファミリー」は、共通の構造ドメインまたはモチーフを有し、そして本明細書中で記載される十分なアミノ酸またはヌクレオチド配列相同性を有する、２またはそれ以上のタンパク質または核酸分子を意味するように意図される。このようなファミリーメンバーは、天然または非天然であり得、そして同一または異なる種由来であり得る。例えば、ファミリーは、ヒト起源の第１タンパク質、ならびにヒト起源の他の異なるタンパク質を含み得、または代わりに、非ヒト起源の相同体を含み得る。ファミリーのメンバーはまた、共通の機能的特徴を有し得る。
【００５５】
セリン／トレオニンキナーゼのＡＫＴ（プロテインキナーゼＢについて、場合によってはＰＫＢと呼ばれる）ファミリーは、細胞増殖、生存、および代謝に一体的に関与する。ＰＫＢは、レトロウイルス癌遺伝子として元々同定された。現在、ＡＫＴファミリーの３つの変異体、４８０残基ＡＫＴ−１、４８１残基ＡＫＴ−２、および４７９残基ＡＫＴ−３がキャラクタライズされている。本発明の目的について、ＡＫＴファミリーのタンパク質のメンバーは、一般的に、ＡＫＴタンパク質と呼ばれ、しかし、本発明の方法は、ＡＫＴの全ての３つの形態、即ち、ＡＫＴ−１、ＡＫＴ−２およびＡＫＴ−３、ならびにそれらの変異体に適用されることが認識される。
【００５６】
ＡＫＴは、ＰＨ（プレクストリン相同）ドメインを含む、増殖因子調節されたセリン／トレオニンキナーゼである。このＰＨドメインは、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ホスファチジルイノシトール−３，４−ビホスフェート、およびホスファチジルイノシトール−３，４，５−トリホスフェートの脂質産物と相互作用し、これは、細胞の細胞質ゾルからその原形質膜へのＡＫＴのトランスロケーションを生じさせる。このトランスロケーションは、上流の活性化キナーゼＰＤＫ１（ホスホイノシチド依存性キナーゼ１）へＡＫＴを提示するために、必要とされる。種々の生存および増殖因子、例えば、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、インスリン、トロンビン、およびＮＧＦは、ＡＫＴのトランスロケーションを活性化することが知られている。ＡＫＴ／ＰＫＢタンパク質の活性化（即ち、リン酸化）形態は、ＧＳＫ−３（グリコーゲン合成酵素キナーゼ３）、ｅＮＯＳ（内皮一酸化窒素合成酵素）、ＦＫＨＲ１（フォークヘッド転写因子ファリーメンバー１）、Ｂａｄ（Ｂｃｌ−２プロアポトーシスファミリーメンバー）、およびｐ２１  ＣＩＰ（細胞周期進行のインヒビター）を含む多数の基質をリン酸化する。これらの作用は、アポトーシスの抑制、グルコース代謝の制御、細胞増殖、転写、翻訳、細胞移動、および血管新生等の多様な生物学的効果を生じさせ得る。活性化ＡＫＴ（即ち、ｐ−ＡＫＴ）は、下流のエフェクター分子のリン酸化を含むいくつかの異なる経路を介して細胞生存を促進する。まず、ｐ−ＡＫＴは、Ｂａｄ／Ｂｃｌ−ｘｌ複合体のＢａｄ成分をリン酸化することによって、アポトーシスを阻害する。リン酸化Ｂａｄは、１４−３−３へ結合し、Ｂａｄ／Ｂｃｌ−ｘｌ複合体の分離を生じさせ、そしてそれによってＢｃｌ−ｘｌを遊離させて細胞生存を可能にする。次に、Ｉカッパ−Ｂ（Ｉκ−Ｂ）ファミリーの阻害タンパク質との結合によって細胞質中で不活性に維持されているＮＦ−κＢは、ＮＦ−κＢ誘導キナーゼ（ＮＩＫ）との相互作用によって活性化され得るか、またはそれは、ＡＫＴシグナル伝達経路によって活性化され得る。この様式において、活性化ＡＫＴ（即ち、ｐ−ＡＫＴ）は、Ｉκ−Ｂキナーゼ多タンパク質複合体（ＩＫＫ−α／β）の中間リン酸化を介して、Ｉκ−Ｂファミリー（例えば、Ｉκ−Ｂα）のＮＦ−κＢ阻害分子を活性化し；Ｉκ−Ｂの活性化は、その分解および以前に結合されたＮＦ−κＢの放出へ導き、これは、この転写因子の活性化へ導く。ＮＦ−κＢの活性化形態は、次いで、核へトランスロケートしそして数百の遺伝子の発現を調節してアポトーシスを妨害し得る。ＡＫＴが細胞生存を促進しそしてアポトーシスを妨害する別の手段は、タンパク質分解酵素カスパーゼ９またはフォークヘッド転写因子（例えば、ＦＫＨＲＬ１）のリン酸化による。
【００５７】
ある実施形態において、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達を遮断するかまたはこれに干渉する抗ＣＤ４０治療剤での治療から恩恵を受ける炎症性疾患または自己免疫疾患を有する被験者を同定するための本発明の方法は、ＡＫＴおよびＮＦ−κＢシグナル伝達経路を介してのＣＤ４０シグナル伝達に対する抗ＣＤ４０治療剤の効果をモニタリングするためのエクスビボ予測アッセイの使用を含む。この様式において、候補被験者から回収されたテスト用生物学的サンプルを、本明細書以下で記載のＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達の調節を可能にするに十分な時間の間、目的の抗ＣＤ４０治療剤と接触させ、そして次いで、そのサンプルを、リン酸化ＡＫＴ（ｐ−ＡＫＴ）、リン酸化ＰＩ３Ｋ（ｐ−ＰＩ３Ｋ）、リン酸化ＰＤＫ１（ｐ−ＰＤＫ１）、リン酸化ＩＫＫ−α／β（ｐ−ＩＫＫ−α／β）、リン酸化Ｉκ−Ｂ（ｐ−Ｉκ−Ｂ；例えば、ｐ−Ｉκ−Ｂα）、および活性化ＮＦ−κＢからなる群から選択される少なくとも１つのＣＤ４０シグナル伝達バイオマーカーの発現レベルの変化についてアッセイする。コントロール用生物学的サンプルについて観察されたものに対する、抗ＣＤ４０治療剤とのインキュベーションに対する応答におけるＣＤ４０Ｌ刺激されたＣＤ４０発現細胞を含むテスト用生物学的サンプル中のこれらのリン酸化バイオマーカーの低下された発現レベルの検出は、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達のダウンレギュレーションを示し、したがって、抗ＣＤ４０治療剤でのポジティブな治療結果を示す。ある実施形態において、ＡＫＴおよびＮＦ−κＢシグナル伝達経路を介してのＣＤ４０シグナル伝達の任意の所定のバイオマーカーの発現レベルは、コントロール用生物学的サンプル中において検出されるものに対して少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％減少される。
【００５８】
ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用はまた、ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路、ＭＥＫ／ｐ３８シグナル伝達経路、およびＭＥＫＫ／ＪＮＫＫ／ＪＮＫシグナル伝達経路を含む、ＭＡＰＫシグナル伝達カスケードの活性化へ導く。全てのＭＡＰＫ経路は、連続するリン酸化事象を介して作動し、転写因子をリン酸化しそして遺伝子発現を調節する。それらはまた、細胞内事象を調節するために、細胞質ゾル標的をリン酸化し得る。それらのカスケードは、細胞増殖、分化、発生、細胞周期、および発癌性シグナルの伝達の調節に関与する。本発明の方法に対して特に興味深いのは、ＭＥＫ／ＥＲＫおよびＭＥＫ／ｐ３８シグナル伝達経路の活性化である。
【００５９】
ＭＡＰキナーゼ（細胞外シグナル調節プロテインキナーゼ、またはＥＲＫとも呼ばれる）は、スリーキナーゼカスケード（ｔｈｒｅｅ−ｋｉｎａｓｅ  ｃａｓｃａｄｅ）における終末酵素であり、ここで、各酵素は、該配列における次のメンバーをリン酸化しそしてそれによって活性化する。各ＭＡＰＫモジュールは、３つのプロテインキナーゼからなる：ＭＡＰＫキナーゼキナーゼ（またはＭＥＫＫ）、これはＭＡＰＫキナーゼ（またはＭＥＫ）を活性化し、これは、次いで、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ酵素を活性化する。ＭＥＫＫは、触媒コア内のＳｅｒまたはＴｈｒ残基（Ｓｅｒ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）においてＭＥＫ酵素の１以上を二重にリン酸化し、そしてそれによって活性化する、セリン／トレオニン特異的プロテインキナーゼである。ＭＥＫは、ＭＡＰＫのＴＸＹコンセンサス配列内のＴｈｒおよびＴｙｒの両方をリン酸化することによってＭＡＰＫを活性化する、セリン／トレオニン／チロシン特異的プロテインキナーゼである。この二重リン酸化は活性化のために必要とされる。ＥＲＫ１（ｐ４４）、ＥＲＫ２（ｐ４２）、ｐ３８／ＨＯＧ、およびＪＮＫ／ＳＡＰＫは、平行経路で関連するなお別個のターミナルＭＡＰＫを示す。
【００６０】
ある実施形態において、抗ＣＤ４０治療剤での治療から恩恵を受ける炎症性疾患または自己免疫疾患を有する被験者を同定するための本発明の方法は、ＭＥＫ／ＥＲＫおよびＭＥＫ／ｐ３８経路を介してのＣＤ４０シグナル伝達に対する抗ＣＤ４０治療剤の効果をモニタリングするためのエクスビボ予測アッセイの使用を含む。この様式において、候補被験者から回収されたテスト用生物学的サンプルを、本明細書以下で記載のＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達の調節を可能にするに十分な時間の間、目的の抗ＣＤ４０治療剤と接触させ、そして次いで、そのサンプルを、リン酸化ＭＥＫ（ｐ−ＭＥＫ）、例えば、ｐ−ＭＥＫ１、ｐ−ＭＥＫ２、ｐ−ＭＥＫ３およびｐ−ＭＥＫ６、リン酸化ＥＲＫ（ｐ−ＥＲＫ）、例えば、ｐ−ＥＲＫ１またはｐ−ＥＲＫ２、ならびにリン酸化ｐ３８（ｐ−ｐ３８）からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤ４０シグナル伝達バイオマーカーの発現レベルの変化についてアッセイする。コントロール用生物学的サンプルについて観察されたものと比較した、抗ＣＤ４０治療剤とのインキュベーションに対する応答におけるＣＤ４０Ｌ刺激されたＣＤ４０発現細胞を含むテスト用生物学的サンプル中のこれらのリン酸化バイオマーカーの低下された発現レベルの検出は、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達のダウンレギュレーションを示し、したがって、抗ＣＤ４０治療剤でのポジティブな治療結果を示す。ある実施形態において、ＭＥＫ／ＥＲＫおよびＭＥＫ／ｐ３８経路を介してのＣＤ４０シグナル伝達の任意の所定のバイオマーカーの発現レベルは、コントロール用生物学的サンプル中において検出されるものに対して少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％減少される。
【００６１】
ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達を遮断するかまたはこれに干渉する抗ＣＤ４０治療剤での治療に対する候補被験者の応答性はまた、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達の任意のサイトカインマーカーの発現レベルに対する該治療剤のエクスビボ効果をモニタリングすることによって、アッセイされ得る。インビボでのその天然リガンドによるＣＤ４０の結合は、ＣＤ４０発現細胞のタイプに依存して、多数の炎症性サイトカインのアップレギュレーションを生じさせる。正常なＢ細胞のエクスビボＣＤ４０Ｌ刺激は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン（ＩＬ）−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、およびマクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）が挙げられるがこれらに限定されないいくつかのサイトカインの産生のアップレギュレーションを生じさせ、一方、単球のエクスビボＣＤ４０Ｌ刺激は、本明細書以下で記載されるように、ＶＥＧＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＭＣＰ−１およびＭＩＰ−１βの産生のアップレギュレーションを生じさせる。
【００６２】
本発明のスクリーニング方法によれば、候補被験者から回収されたテスト用生物学的サンプルを、本明細書以下で記載のＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達の調節を可能にするに十分な時間の間、目的の抗ＣＤ４０治療剤と接触させ、そして次いで、そのサンプルを、ＶＥＧＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＭＣＰ−１およびＭＩＰ−１βからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインマーカーの発現レベルの変化についてアッセイする。サイトカインの発現レベルは、本明細書以下において記載されるように、当該分野において公知の任意の検出方法を使用して、達成され得る。コントロール用生物学的サンプルについて観察されたものと比較した、抗ＣＤ４０治療剤とのインキュベーションに対する応答におけるＣＤ４０Ｌ刺激されたＣＤ４０発現細胞を含むテスト用生物学的サンプル中のこれらのサイトカインマーカーの低下された発現レベルの検出は、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達のダウンレギュレーションを示し、したがって、抗ＣＤ４０治療剤でのポジティブな治療結果を示す。ある実施形態において、任意の所定のサイトカインの発現レベルは、コントロール用生物学的サンプル中において検出されるものに対して少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％減少される。
【００６３】
ＡＫＴ、ＮＦ−κＢおよびＭＡＰＫシグナル伝達経路は、全て、細胞増殖および生存に関与する。免疫系において、アポトーシスは、Ｔ細胞レパートリーの選択、自己反応性ＴおよびＢリンパ球の欠失、免疫応答の終了に続く末梢エフェクターＴ細胞の除去、免疫記憶の調節、ならびにＣＴＬおよびＮＫ細胞による標的細胞の細胞傷害性において重要な役割を果たす。ＣＤ４０発現細胞におけるＣＤ４０生存シグナル伝達を遮断しかつ細胞アポトーシスプロセスを促進し得る治療剤は、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達に関連する自己免疫および／または炎症性成分を有する疾患を治療することにおいて有利であり得る。
【００６４】
したがって、ＣＤ４０発現細胞におけるＣＤ４０シグナル伝達をモニタリングすることに加えて、抗ＣＤ４０治療剤での治療から恩恵を受ける炎症性疾患または自己免疫疾患を有する被験者を同定するための本発明の方法は、アポトーシスの１以上のバイオマーカー、特に、切断されたカスパーゼタンパク質および切断されたポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）を含むがこれらに限定されない細胞プロアポトーシスタンパク質の発現に対する抗ＣＤ４０治療剤の効果をモニタリングするエクスビボ予測アッセイの使用を含む。アッセイされ得るアポトーシスの追加のバイオマーカーとしては、細胞表面での原形質膜の変化、例えば、細胞表面ホスファチジルセリン（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ）（ＰＳ）の存在、およびゲノムＤＮＡの切断またはフラグメント化が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＳは、通常、原形質膜の内側にもっぱら局在しており、しかし、その間細胞膜がインタクトなままであるアポトーシス細胞死の初期の間、細胞の外部表面へトランスロケートされる。細胞表面ＰＳおよびゲノムＤＮＡフラグメント化の存在は、例えば、本明細書以下で記載されるように、それぞれ、アネキシンＶ染色およびＴＵＮＥＬ染色によって検出され得る。コントロール用生物学的サンプルについて観察されたものと比較した、抗ＣＤ４０治療剤とのインキュベーションに対する応答におけるＣＤ４０Ｌ刺激されたＣＤ４０発現細胞を含むテスト用生物学的サンプル中のアポトーシスのこれらのバイオマーカーの１以上の増加された発現レベルの検出は、抗ＣＤ４０治療剤でのポジティブな治療結果を示す。ある実施形態において、アポトーシスの任意の所定のバイオマーカーの発現レベルは、コントロール用生物学的サンプル中において検出されるものに対して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、またはそれ以上、増加される。
【００６５】
代わりに、または上述のエクスビボアッセイと組み合わせて、本発明の方法は、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーである抗アポトーシスタンパク質、ＩＡＰアポトーシス阻害剤タンパク質（ＩＡＰ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、およびＴＮＦ受容体関連因子−１（ＴＲＡＦ−１）を含むがこれらに限定されない細胞増殖および／または生存のバイオマーカーである１以上のタンパク質の使用を含む。コントロール用生物学的サンプルについて観察されたものと比較した、抗ＣＤ４０治療剤とのインキュベーションに対する応答におけるＣＤ４０Ｌ刺激されたＣＤ４０発現細胞を含む生物学的サンプル中の細胞増殖および／または細胞生存のこれらのバイオマーカーの低下された発現レベルの検出は、抗ＣＤ４０治療剤でのポジティブな治療結果を示す。ある実施形態において、コントロール用生物学的サンプル中において検出されるものに対して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％減少される。
【００６６】
カスパーゼファミリーのタンパク質のメンバーは、細胞アポトーシスの主要なエフェクターである。カスパーゼは、不活性前駆形態またはいわゆる「チモーゲン」として細胞内に存在するシステインプロテアーゼである。チモーゲンは、死受容体媒介経路またはアポトーシスのミトコンドリア経路を介して、アポトーシスの誘導に続いて、切断され、活性化酵素を形成する。例えば、Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）  Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２２：１５−２０を参照のこと；その全体が参照により本明細書中に組み込まれる。アポトーシス経路に依存して、種々のカスパーゼがアポトーシスプロセスを開始させ、カスパーゼ８および１０は死受容体経路を開始させ、そしてカスパーゼ９はミトコンドリア経路を開始させる。活性イニシエータカスパーゼは、次いで、エフェクターカスパーゼ、例えば、カスパーゼ３、６および７を活性化し（即ち、切断し）、アポトーシスを誘導する。これらのエフェクターカスパーゼは、アポトーシスを受ける細胞中において観察される典型的な形態学的変化へ導く重要な（ｋｅｙ）細胞タンパク質を切断する。
【００６７】
したがって、ある実施形態において、抗ＣＤ４０治療剤での治療から恩恵を受ける炎症性疾患または自己免疫疾患を有する被験者を同定するための本発明の方法は、アポトーシスに関連する特定の細胞タンパク質のタンパク質分解をモニタリングするためのエクスビボ予測アッセイの使用を含む。例えば、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ−１）は、アポトーシスの間、特異的に切断される。ＰＡＲＰ−１は、いくつかの各タンパク質へのポリ（ＡＤＰ−リボース）鎖の付加を触媒するＤＮＡ結合タンパク質であり、ＤＮＡ損傷修復において重要な役割を果たすと考えられている。ＰＡＲＰ−１は、細胞ストレス、例えば、熱ショック、電離放射線、発癌物質への暴露、および化学療法薬剤での治療の間、迅速に活性化される（Ｓｃｏｖａｓｓｉ  ａｎｄ  Ｐｏｉｒｉｅｒ（１９９９）  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９：１２５−１３７；Ｗｙｌｌｉｅ（１９９７）  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７３：１８９−１９７）。アポトーシスの間、活性化された（即ち、切断された）カスパーゼ３は、次に、ＰＡＲＰ−１を切断し；実際に、８９ｋＤａおよび２４ｋＤａタンパク質分解フラグメントの分離は、アポトーシスの顕著な特徴として受容される（Ｓｃｏｖａｓｓｉ  ａｎｄ  Ｐｏｉｒｉｅｒ（１９９９）前述；Ｗｙｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）前述）。本明細書中に記載のエクスビボ予測アッセイは、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達を調節しおよび／またはＡＤＣＣを調節する抗ＣＤ４０治療剤に対する応答において候補被験者から得られたテスト用生物学的サンプル中における、１以上の切断されたカスパーゼタンパク質（例えば、切断されたカスパーゼ３、切断されたカスパーゼ７、および切断されたカスパーゼ９）のレベル、ならびに必要に応じて、切断ＰＡＲＰ−１、細胞表面ＰＳ、および／またはゲノムＤＮＡフラグメント化のレベルの変化をモニタリングする。生物学的サンプル中のアポトーシスバイオマーカーの上昇されたレベルは、本明細書以下で記載のものを含む、当業者に公知の任意の方法を使用して検出され得る。
【００６８】
細胞生存および増殖のバイオマーカーとしては、Ｂｃｌ−２ファミリーのタンパク質のメンバーである抗アポトーシスタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。少なくとも１６メンバーを含むＢｃｌ−２ファミリーのタンパク質は、細胞アポトーシスの調節に関与する。該ファミリーメンバーのいくつかは、抗アポトーシス性、例えば、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘｌ、Ｍｃｌ−ｌ、Ｂｃｌ−ｗ、およびＡｌであり、そしてしたがって細胞生存のバイオマーカーであり、そして他のものはプロアポトーシス性（例えば、Ｂｉｄ、Ｂｉｍ、Ｂｉｋ、Ｂｍｆ、Ｂａｄ、Ｈｒｋ、ＢＮＩＰ３、Ｂａｘ、Ｂａｋ、およびＢｏｋ）であり、そしてしたがってアポトーシス活性のバイオマーカーである。Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーは、ミトコンドリア外膜における孔形成（ここを通って、シトクロムｃ（Ｃｙｔ  ｃ）および他の膜間タンパク質が通過することができる）；ならびにプロアポトーシスファミリーメンバーと抗アポトーシスファミリーメンバーとの間のヘテロ二量化を含む、多くの異なる機構を介して作用すると示唆されている。
【００６９】
ＣＤ４０シグナル伝達およびアポトーシスの調節に対する抗ＣＤ４０治療剤の効果は、細胞生存／アポトーシスのこれらのバイオマーカーの１以上をモニタリングするための本明細書中に記載のエクスビボ予測アッセイで評価され得る。特に興味深い細胞生存のバイオマーカーとしては、抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−ｘｌおよびＭｃｌ−ｌが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
ミトコンドリア膜タンパク質Ｂｃｌ−２をコードする、ｂｃｌ−２遺伝子は、最初、Ｂ細胞リンパ腫において同定され（Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２６：１０９７）、ここで、原因である遺伝子病変は、免疫グロブリンプロモーターの制御下でｂｃｌ−２遺伝子を置く染色体転座（ｔ（１４：１８））とキャラクタライズされた。Ｂｃｌ−２の得られる過剰発現は、そうでなければＢ細胞恒常性を維持するアポトーシス細胞死の正常な進行を遅延させ、Ｂ細胞の蓄積および濾胞性リンパ腫を生じさせる（Ａｄａｍｓ  ａｎｄ  Ｃｏｒｙ，１９９８；Ｃｏｒｙ（１９９４）  Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．３４５：２８９）。Ｂｃｌ−２は、ホモ二量体として存在し得るか、またはｂａｘを有するヘテロ二量体を形成し得る。ヘテロ二量体として、ｂａｘはアポトーシスを誘導するように作用する。しかし、ｂａｘ−Ｂｃｌ−２複合体の形成はアポトーシスを遮断する。Ｂｃｌ−２発現はまた、薬剤耐性の発達において役割を果たし得る。
【００７１】
ｂｃｌ−２遺伝子と相同性を有するいくつかの遺伝子が、引き続いてキャラクタライズされ、以下が挙げられる：ａｌ、これは、ＧＭ−ＣＳＦまたはＬＰＳに対する応答においてマクロファージ中において迅速に誘導される、８０アミノ酸Ａｌタンパク質をコードする（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：１９７９−１９８８）；ｍｃｌ−１、マクロファージ分化を受ける骨髄細胞系における初期応答遺伝子（Ｋｏｚｏｐａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：３５１６−３５２０）；ならびにｂａｋ、アポトーシスを増強し得るｂｃｌ−２相同体（Ｃｈｉｔｔｅｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：７３３；Ｋｉｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：７３６）。ｂｃｌ−２遺伝子産物と相互作用するおよび／またはこれと構造的に関連する他のタンパク質、例えば、Ｂｃｌ−ｘｌおよびＢｃｌ−ｘｓ（Ｂｏｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７４：５９７）；Ｃｅｄ−９（Ｖａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：１９５５）もまた同定された。
【００７２】
Ｂｃｌ−２タンパク質に密接に関連するｂｃｌ−ｘ遺伝子産物Ｂｃｌ−ｘもまた、アポトーシスから細胞を保護する。ヒトＢｃｌ−ｘの選択的スプライシングは、少なくとも２つの異なるＢｃｌ−ｘ  ｍＲＮＡ種、Ｂｃｌ−ｘｌおよびＢｃｌ−ｘｓを生じさせ得る。ラージｂｃｌ−ｘ  ｍＲＮＡの主要なタンパク質産物（２３３アミノ酸）、Ｂｃｌ−ｘｌは、増殖因子撤退時に細胞死を阻害し（Ｂｏｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７４：５９７−６０８）、そしてそのトランスジェニック発現は、胸腺細胞成熟化を変化させ、増加された数の成熟胸腺細胞へ導く（Ｃｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：８２１−８２８；Ｇｒｉｌｌｏｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：１９７３−１９８３）。
【００７３】
骨髄細胞白血病に関連する遺伝子ｍｃｌ−１は、骨髄細胞白血病における分化のプログラミングの間初期に発現されるタンパク質、Ｍｃｌ−１をコードする（例えば、米国特許出願公開第２００２００８６３２１号を参照のこと）。Ｍｃｌ−１のカルボキシル部分は、Ｂｃｌ−２との相同性を共有する。Ｂｃｌ−２ファミリーの他のメンバーと同様に、Ｍｃｌ−１は、生存能から死へ、または増殖から分化への、細胞運命における遷移のプログラミングとの関連によって特徴付けられる。
【００７４】
Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーに加えて、本発明の方法における使用のための細胞生存バイオマーカーとしては、バキュロウイルスＩＡＰ遺伝子と関係するアポトーシスのインヒビターの遺伝子ファミリーのメンバーが挙げられる（Ｂｉｍｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：２５２１−２５２８；Ｃｌｅｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４：５２１２−５２２２；Ｄｕｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９６）１５：２６８５−２６９４；Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ｃｅｌｌ  ８３：１２５３−１２６２；Ｌｉｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｎａｔｕｒｅ  ３７９：３４９−３５３；Ｒｏｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ｃｅｌｌ  ８３：１２４３−１２５２；Ｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ｃｅｌｌ  ８０：１６７−１７８）。少なくとも８個のヒトＩＡＰが同定された（Ｓａｌｖｅｓｅｎ  ａｎｄ  Ｄｕｃｋｅｔｔ（２００２）  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：４０１−４１０）。
【００７５】
ＩＡＰは、進化的に高度に保存されており；それらは、１〜３の約７０アミノ酸アミノ末端Ｃｙｓ／ＨｉｓバキュロウイルスＩＡＰ繰り返し（ＢＩＲ）およびＲＩＮＧフィンガーという名のカルボキシ末端亜鉛結合ドメインによって構成された類似の構造を共有する。ＩＡＰファミリータンパク質は、アポトーシスおよび腫瘍形成の調節において潜在的に重要な役割を有すると認識されている（Ｄｅｖｅｒａｕｘ  ａｎｄ  Ｒｅｅｄ（１９９９）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：２３９−２５２；Ｔａｍｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）  Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６：１７９６−１８０３）。
【００７６】
ＩＡＰは、上流および末端カスパーゼを阻害することによって、細胞死を抑制する（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（１９９５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：１４５６を参照のこと）。カスパーゼ３および７の活性化（即ち、切断された）形態は、ＸＩＡＰ、ｃ−ＩＡＰ１およびｃ−ＩＡＰ２によって直接阻害され（例えば、Ｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）（前述）を参照のこと）、これらはまた、プロカスパーゼ９のシトクロムｃ誘導活性化を遮断することによって、プロカスパーゼ３、６および７のタンパク質分解プロセッシングを防止し得る（Ｄｅｖｅｒａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  ＥＭＢＯ  Ｊ．１７：２２１５−２２２３）。ＩＡＰファミリーに関連する種々のアポトーシスインヒビターをコードする核酸の治療的および診断的使用が、特許文献に記載された。例えば、国際特許出願番号ＷＯ９７／０６２５５、ＷＯ９７／２６３３１、およびＷＯ９７／３２６０１を参照のこと。細胞生存のバイオマーカーとして使用され得るＩＡＰタンパク質の例としては、ＸＩＡＰ、ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２、およびサバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
ＸＩＡＰは、最も広範囲に発現され、そしてカスパーゼの最も強力なインヒビターである（例えば、Ｔａｋａｈａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：７７８７；Ｒｅｅｄ（１９９４）  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２４：１を参照のこと）。サバイビンは、約１６．５ｋＤａの細胞質タンパク質であり（例えば、米国特許出願公開第２００３０１００５２５号を参照のこと）、単一のＢＩＲ、およびＲＩＮＧフィンガーの代わりの高電荷カルボキシル末端コイルドコイル領域を含み、これは、Ｂ細胞前駆体中に移動される際に、増殖因子（ＩＬ−３）撤去によって誘導されるアポトーシスを阻害する（Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．３：９１７−９２１）。外因性サバイビンタンパク質の過剰発現は、用量依存性様式で、ｐ５３誘導アポトーシスから細胞を救い、このことは、サバイビンの損失が、ｐ５３依存性アポトーシス経路を少なくとも部分的に媒介することを示唆している（Ｍｉｒｚａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２１：２６１３−２６２２）。
【００７８】
本発明の方法における使用のための細胞生存の別の代表的なバイオマーカーは、ＴＲＡＦ−１である。ＴＲＡＦファミリーメンバーは、ＣＤ４０の細胞質ドメインへ結合し、そしてＢ細胞生存、増殖、分化、アイソタイプスイッチング、胚中心の発達および液性記憶応答を調節する、複数のシグナル伝達経路の活性化を媒介する（例えば、Ｐｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１４２４６−１４２５４を参照のこと）。ＣＤ４０受容体の活性化は、ＴＲＡＦ−１遺伝子の転写（Ｓｃｈｗｅｎｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（２７）：１９３６８−１９３７４）およびヒト単球におけるＴＲＡＦ−１発現の強力なアップレギュレーション（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｉｎｔｅｒｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３（３）：２７３−２８３）を生じさせ得ることが報告された。ＣＤ４０受容体活性化に対する応答におけるＴＲＡＦ−１遺伝子発現の変化は、薬物効果を予測し、それによって、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達および細胞生存／アポトーシスの調節に対する抗ＣＤ４０治療剤の効果を評価および／またはモニタリングするための好適なバイオマーカーを提供する。ＴＲＡＦ−１発現の変化は、本明細書以下に記載されるように、ノザンブロットまたは定量ＲＴ−ＰＣＲ等の技術によってｍＲＮＡレベルで、あるいは例えばウエスタンブロットによってタンパク質レベルで、容易に検出され得る。
【００７９】
細胞生存の前述のバイオマーカーは、これらのバイオマーカーの１つまたは全てを含む任意の組み合わせで、ならびに細胞増殖の他のバイオマーカーと組み合わせて、本明細書に記載のエクスビボ予測アッセイにおいてモニタリングされ得る。したがって、１実施形態において、本明細書に記載のエクスビボ予測アッセイはまた、候補被験者由来のテスト用生物学的サンプル中において、細胞増殖バイオマーカーＫｉ６７の発現をモニタリングするために使用される。
【００８０】
Ｋｉ６７は、静止細胞のＧ０期にはないが、分裂細胞のＧ１、Ｓ、ＭおよびＧ２期にある細胞の核中に存在する細胞周期関連核蛋白質である（Ｇｅｒｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３，１７１０−１７１５）。これらの理由のために、それは細胞増殖マーカーとして使用される。
【００８１】
したがって、本発明のエクスビボ予測アッセイにおいてモニタリングされるバイオマーカーとしては、上述の細胞生存およびアポトーシスタンパク質、ならびに本明細書で上述のＣＤ４０シグナル伝達経路に関与するタンパク質が挙げられる。モニタリングは、タンパク質または核酸レベルであり得る。したがって、バイオマーカーとしては、これらのタンパク質およびこれらのタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。検出がタンパク質レベルである場合、バイオマーカータンパク質は、全長ポリペプチドまたはその任意の検出可能なフラグメントを含み、そしてこれらのタンパク質配列の変異体を含み得る。同様に、検出がヌクレオチドレベルである場合、バイオマーカー核酸としては、全長コード配列を含むＤＮＡ、全長コード配列のフラグメント、これらの配列の変異体、例えば、自然に生じる変異体またはスプライス変異体、あるいはこのような配列の相補体が挙げられる。バイオマーカー核酸としてはまた、ＲＮＡ、例えば、目的のバイオマーカータンパク質をコードする全長配列を含む、ｍＲＮＡ、目的の全長ＲＮＡのフラグメント、またはこれらの配列の変異体が挙げられる。バイオマーカータンパク質およびバイオマーカー核酸としてはまた、これらの配列の変体が挙げられる。「フラグメント」によって、ポリヌクレオチドの部分またはアミノ酸配列の部分およびしたがってそれによってコードされるタンパク質が意図される。バイオマーカーヌクレオチド配列のフラグメントであるポリヌクレオチドは、一般的に、少なくとも１０、１５、２０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、または１，４００連続ヌクレオチド、あるいは本明細書中に開示される全長バイオマーカーポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチドの数までを含む。バイオマーカーポリヌクレオチドのフラグメントは、一般的に、少なくとも１５、２５、３０、５０、１００、１５０、２００、または２５０連続アミノ酸、あるいは本発明の全長バイオマーカータンパク質中に存在するアミノ酸の総数までをコードする。「変異体」は、実質的に類似の配列を意味するように意図される。一般的に、本発明の特定のバイオマーカーの変異体は、当該分野において公知の配列アラインメントプログラムによって決定されるように、そのバイオマーカーと少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上配列同一性を有する。前記タンパク質およびこれらのマーカーの各々についての対応のコード配列は、当該分野において公知である。本明細書以下の実施例３の表６を参照のこと。
【００８２】
（他の予測アッセイにおける使用のためのＣＤ４０関連因子および臨床的に有用な予測マーカー）
本発明の方法によれば、抗ＣＤ４０治療剤での治療から恩恵を受ける炎症性疾患または自己免疫疾患を有する患者の個人または部分母集団がまた、１以上のＣＤ４０関連因子の有無、あるいは上昇されたまたは低下されたレベルを求める予測アッセイを使用して同定され得る。これらのＣＤ４０関連因子に基づいて抗ＣＤ４０治療剤での治療に応答性であると同定された被験者が、該抗ＣＤ４０治療剤で治療され得る。あるいは、それらは、本明細書に記載のエクスビボ予測アッセイを使用して、抗ＣＤ４０治療剤での治療から恩恵を受ける可能性についてさらにスクリーニングされ得、例えば、該炎症性疾患または自己免疫疾患が、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達を遮断するかまたはＡＤＣＣ活性を調節するか、あるいはこれらの作用機序の両方を有する、抗ＣＤ４０治療剤での治療に対してより応答性であるかどうかを同定する。
【００８３】
目的のＣＤ４０関連因子としては、細胞表面ＣＤ４０抗原の発現レベル、細胞表面ＣＤ４０Ｌの発現レベル、可溶性ＣＤ４０（ｓＣＤ４０）の循環レベル、および可溶性ＣＤ４０Ｌ（ｓＣＤ４０Ｌ）の循環レベルが挙げられるが、これらに限定されない。この様式において、候補被験者から回収された生物学的サンプルを、これらのＣＤ４０関連因子の少なくとも１つの発現レベルについて分析する。これらのＣＤ４０関連因子の発現レベルは、自己免疫疾患および／または炎症性疾患についての予測マーカーとして使用され得る。それらは、抗ＣＤ４０治療剤に応答するかまたは応答しない被験者の診断法として有用であり得る。
【００８４】
当該分野において公知の任意の方法が、これらのマーカーの分析について使用され得る。例えば、候補被験者から得られた血液サンプル中の、ｓＣＤ４０またはｓＣＤ４０Ｌの循環レベルは、例えば、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、電気化学発光（ＥＣＬ）、ウエスタンブロット、多重化技術、または他の類似の方法によって測定され得る。ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌの細胞表面発現は、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学、ウエスタンブロット、免疫沈降、磁気ビーズ選択、細胞表面ＣＤ４０を発現する細胞の定量によって測定され得る。ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ  ＲＮＡ発現レベルは、ＲＴ−ＰＣＲ、Ｑｔ−ＰＣＲ、マイクロアレイ、ノザンブロット、または他の類似の技術によって測定され得る。ＣＤ４０抗原、ＣＤ４０Ｌ、および可溶性ＣＤ４０Ｌについての配列は、当該分野において公知である。例えば、本明細書以下の実施例３の表７を参照のこと。ある実施形態において、ＣＤ４０発現細胞によって分泌されるｓＣＤ４０とこれらの細胞の表面からタンパク質分解的に切断されるｓＣＤ４０との区別を確認するために、ｓＣＤ４０が単離され、そして配列決定される。分泌されるｓＣＤ４０および／またはタンパク質分解的に切断されたｓＣＤ４０の発現レベルは、目的の抗ＣＤ４０治療剤での治療に対する疾患の応答性および／または疾患状態に対して相互に関連付けられ得る。
【００８５】
本発明の他の実施形態において、抗ＣＤ４０治療剤での治療から恩恵を受ける炎症性疾患または自己免疫疾患を有する患者の部分母集団が、当該分野において公知の１以上の臨床的に有用な予測マーカーについて候補被験者をスクリーニングすることによって同定される。臨床的に有用なマーカーの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：血清インターロイキン（ＩＬ）−１８、このレベルは原発性胆汁性肝硬変の重篤度に関連する（Ｙａｍａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）  Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２２：２２７−２３１）；可溶性細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）、この発現は初期の疾患においてよりも後期の原発性胆汁性肝硬変においてより大きく、そしてこれは組織学的進行に相互に関係がある（Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２０：８８２−８８８）；ＩＣＡＭ−１およびＣＤ４０等の細胞接着分子の細胞発現、これは、ループス腎炎の結果を予測するに役立つ（Ｄａｎｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ（２００１）  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．６０：２２１５−２２２１）；血清可溶性ＩＬ−２受容体（ｓＩＬ−２Ｒ）レベル、これは、関節リウマチ（ＲＡ）における臨床疾患活性の優れたモニターであるようである（Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．１：３５３−３６１）；腸管多剤耐性タンパク質（ＭＤＲＩ）、このレベルは生体肝移植の結果についての強力な予後指標である（Ｈａｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．６９：３０８−３１６）；血清ロイシンアミノペプチダーゼ、この増加されたレベルは全身性エリテマトーデスについての活性指標であり得る（Ｉｎｏｋｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ）３８：７０５−７０８）；Ｃ反応性タンパク質、これは炎症の一般的な指標である；ならびにアルファ１−アンチトリプシン、これはクローン病、結腸炎および回腸炎における疾患活性の指標である（Ｍｅｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ８９：１３−１８）；これらの参考文献は、それらの全体が、参照により本明細書中に組み込まれる。
【００８６】
したがって、現存の治療剤に対してあまり応答性でない自己免疫および／または炎症性疾患を有する患者の部分母集団が、これらの臨床的に有用な予測マーカーの１以上を使用する本明細書中に開示される予測アッセイを含む、現在使用されるアッセイ方法によって容易に同定され得る。これらの臨床的に有用な予測マーカーに基づいてこれらの部分母集団の１つに入る被験者が同定されると、該被験者は、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達および／またはＡＤＣＣ活性を調節する抗ＣＤ４０治療剤でこの被験者を治療することの利益を評価するために、本明細書の上記で同定されたエクスビボ予測アッセイの１以上を使用してさらにスクリーニングされ得る。
【００８７】
予測アッセイ
本発明のある実施形態において、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達を調節するか、ＡＤＣＣを調節するか、または両方を調節する、抗ＣＤ４０治療剤での潜在的な治療的利益が、ＣＤ４０発現細胞におけるＣＤ４０シグナル伝達の刺激によって媒介される自己免疫疾患および／または炎症性疾患について治療介入の必要がある候補被験者から回収された生物学的サンプル中における、細胞増殖および生存、細胞アポトーシス、ならびにＣＤ４０シグナル伝達経路の上述のバイオマーカーの１以上の発現レベルの変化をモニタリングするエクスビボ予測アッセイを使用して評価される。「ＣＤ４０発現細胞」によって、ＣＤ４０抗原を発現する細胞が意図される。細胞中のＣＤ４０発現を検出するための方法は、当該分野において周知であり、そしてＰＣＲ技術、免疫組織化学、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ等が挙げられるが、これらに限定されない。エクスビボアッセイが、生物学的サンプル中の目的の１以上のバイオマーカーの発現レベルの好ましい変化を生じさせる場合、該抗ＣＤ４０治療剤での治療介入が正当化される。さらに、本明細書中で議論されるバイオマーカー、サイトカインマーカー、およびＣＤ４０関連因子が、本明細書中に開示されるエクスビボ予測アッセイを使用してスクリーニングされていてもされていなくてもよい被験者における抗ＣＤ４０治療剤の治療効果をモニタリングするために、そしてしたがって同一の抗ＣＤ４０治療剤でのさらなる治療が正当化されるかどうか、または代替の治療プロトコルが必要であるかもしくは望ましいかどうかを決定するために、使用され得る。抗ＣＤ４０治療剤での治療が、本発明の方法によって決定されるように、正当化される場合、該治療剤が、任意の好適な投与経路によって投与され得る。
【００８８】
ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達を調節するか、ＡＤＣＣを調節するか、または両方を調節する、抗ＣＤ４０治療剤での治療介入について考慮されている候補被験者は、ＣＤ４０発現細胞におけるＣＤ４０シグナル伝達によって媒介されるいずれかの炎症性疾患または自己免疫疾患で苦しめられおり得るか、あるいはこれらが発症するかまたは再発するという危険な状態にあり得る。炎症性疾患は、炎症および組織破壊、またはそれらの組み合わせによって特徴付けられる。「炎症性疾患」は、任意の炎症性免疫介在性プロセスを含み、ここで、免疫応答の開始事象または標的は、例えば、同種抗原、異種抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、未知の抗原、またはアレルゲンを含む、非自己抗原を含む。
【００８９】
さらに、本発明の目的について、用語「炎症性疾患」は「自己免疫疾患」を含む。本明細書中で使用される場合、用語「自己免疫」は、一般的に、「自己」抗原を関与させる炎症性免疫介在性プロセスを含むように理解される。自己免疫疾患において、自己抗原は、宿主免疫応答を誘導する。
【００９０】
また、本発明の方法は、組織移植片拒絶に関連する炎症の治療についての抗ＣＤ４０治療剤の効果を評価するために使用され得る。「移植片（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）拒絶」または「移植片（ｇｒａｆｔ）拒絶」は、ＨＬＡ抗原および血液型抗原等を含むがこれらに限定されない移植片に対する任意の宿主開始免疫応答（ｈｏｓｔ−ｍｏｕｎｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）をいう。
【００９１】
本発明はまた、例えば骨髄移植に関連するもの等の、対宿主性移植片病の治療についての抗ＣＤ４０治療剤の効果を評価するために使用され得る。このような対宿主性移植片病において、ドナー骨髄は、リンパ球およびリンパ球へ成熟する細胞を含む。ドナーのリンパ球は、非自己としてレシピエントの抗原を認識し、そして炎症性免疫応答を開始させる。したがって、本明細書中で使用される場合、「対宿主性移植片病」または「対宿主性移植片反応」は、ドナーリンパ球が宿主抗原に対して反応する任意のＴ細胞媒介性免疫応答をいう。
【００９２】
自己免疫および／または炎症性疾患の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、円盤状ループス（ｄｉｓｃｏｉｄ  ｌｕｐｕｓ）、ループス腎炎、サルコイドーシス、若年性関節炎を含む炎症性関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、ライター症候群、強直性脊椎炎、および痛風性関節炎、臓器または組織移植片の拒絶、超急性、急性、または慢性拒絶および／または対宿主性移植片病、多発性硬化症、高ＩｇＥ症候群、結節性多発性動脈炎、原発性胆汁性肝硬変、炎症性腸疾患、クローン病、セリアック病（グルテン過敏性腸症）、自己免疫性肝炎、悪性貧血、自己免疫性溶血性貧血、乾癬、強皮症、重症筋無力症、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性甲状腺炎、グレーヴズ病、橋本甲状腺炎、免疫複合体病、慢性疲労免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、多発性筋炎および皮膚筋炎、クリオグロブリン血症、血栓溶解、心筋症、尋常性天疱瘡、間質性肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病、１、２、３および４型遅延型過敏症、アレルギーまたはアレルギー性障害（ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）、治療用タンパク質に対する望ましくない／意図的でない免疫応答（例えば、米国特許出願第ＵＳ２００２／０１１９１５１号およびＫｏｒｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）  Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：３４９−６０を参照のこと）、ぜん息、チャーグ−ストラウス症候群（アレルギー性肉芽腫症）、アトピー性皮膚炎、アレルギー性および刺激性接触皮膚炎、じんま疹（ｕｒｔｅｃａｒｉａ）、ＩｇＥ媒介性アレルギー（ＩｇＥ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｌｌｅｒｇｙ）、アテローム性動脈硬化症、脈管炎、特発性炎症性ミオパシー（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍｙｏｐａｔｈｉｅｓ）、溶血性疾患、アルツハイマー病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー等。いくつかの他の実施形態において、本発明の方法は、以下が挙げられるがこれらに限定されない肺炎症についての抗ＣＤ４０治療剤での治療から恩恵を受ける個人を同定するために使用される：肺移植片拒絶、ぜん息、サルコイドーシス、気腫、嚢胞性線維症、特発性肺線維症、慢性気管支炎、アレルギー性鼻炎および肺のアレルギー性疾患、例えば過敏性肺炎、好酸球性肺炎、骨髄および／または肺移植または他の原因に起因する閉塞性細気管支炎、移植片アテローム性動脈硬化症／移植片静脈硬化症、ならびに自己免疫疾患（例えば、関節リウマチおよびエリテマトーデス）、脈管、コラーゲンから生じる肺線維症。
【００９３】
他の実施形態において、本発明の方法は、その作用機序がＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達の調節、ＡＤＣＣの調節、または両方によるものとは異なる他の公知の治療的処置に対して最初に耐性である、あるいはこれに対する耐性を生じる、自己免疫疾患および炎症性疾患を同定および処置するために有用である。前記エクスビボ予測アッセイが、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達を調節するか、ＡＤＣＣを調節するか、または両方を調節する１以上の抗ＣＤ４０治療剤での治療介入が望ましい患者の部分母集団を同定するために、使用され得る。
【００９４】
用語「予後」は、当該分野において認識され、そして治療介入に対する応答の起こり得るコース（ｌｉｋｅｌｙ  ｃｏｕｒｓｅ）、および疾患または疾患進行の起こり得るコースについて、特に、疾患寛解、疾患再発および死の可能性についての予測を含む。本発明のエクスビボ予測アッセイは、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達を調節するか、ＡＤＣＣを調節するか、または両方を調節する、特定の抗ＣＤ４０治療剤または抗ＣＤ４０治療剤のクラスに対する、候補被験者の応答を予測するために使用され得る。「候補被験者の応答を予測すること」によって、目的の被験者が特定の抗ＣＤ４０治療剤でポジティブまたはネガティブな結果を経験する可能性を評価することが意図される。本発明の目的について、本発明のエクスビボ予測アッセイの文脈において「ポジティブな治療結果を示す」は、候補被験者が、考慮中の抗ＣＤ４０治療剤での治療に対する応答において有利な結果を経験する増加された可能性を意味するように意図され、そしてしたがって、その抗ＣＤ４０治療剤での治療介入は正当化される。対照的に、「ネガティブな治療結果を示す」は、患者が、考慮中の抗ＣＤ４０治療剤での治療介入から恩恵を受けない増加された可能性を意味するように意図され、したがって、その抗ＣＤ４００治療剤での治療介入は正当化されない。
【００９５】
ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達を調節する抗ＣＤ４０治療剤での治療介入で達成され得る有利な結果は、任意のポジティブな治療的応答を含む。自己免疫疾患および／または炎症性疾患に関しての「ポジティブな治療的応答」によって、これらの抗体またはその抗原結合性フラグメントとの抗炎症性活性に関連する該疾患の改善、ならびに／あるいは該疾患に関連する症状の改善が意図される。即ち、抗増殖性効果；ＣＤ４０発現細胞のさらなる増殖の防止；炎症性サイトカイン、接着分子、プロテアーゼ、免疫グロブリン（ＣＤ４０保有細胞がＢ細胞である場合）、それらの組み合わせ等を含むがこれらに限定されない炎症性応答の減少、抗炎症性タンパク質の増加された産生、自己反応性細胞の数の減少、免疫寛容の増加、自己反応性細胞生存の阻害、ならびに／あるいはＣＤ４０発現細胞の刺激によって媒介される１以上の症状の減少が観察され得る。このようなポジティブな治療的応答は、投与経路に限定されず、そしてドナー、ドナー組織（例えば、臓器かん流等）、ホスト、それらの任意の組み合わせ等への投与を含み得る。
【００９６】
臨床応答は、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）スキャン、Ｘ線画像法、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、フローサイトメトリーまたは蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）分析、組織学、肉眼病理学（ｇｒｏｓｓ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）、および血液化学（ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、クロマトグラフィー等によって検出可能な変化が挙げられるがこれらに限定されない）等のスクリーニング技術を使用して評価され得る。これらのポジティブな治療的応答に加えて、抗ＣＤ４０治療剤での治療を受ける被験者は、該疾患に関連する症状の改善の有利な効果を経験し得る。
【００９７】
ある実施形態において、本発明の方法における使用のためのエクスビボ予測アッセイは、以下を含む：本明細書中に記載の抗ＣＤ４０治療剤での治療介入についての予測（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）が必要である被験者由来のテスト用生物学的サンプルおよびコントロール用生物学的サンプルを提供すること、ここで、該テスト用およびコントロール用生物学的サンプルは、インビトロまたはエクスビボのいずれかで、ＣＤ４０リガンドで刺激されたＣＤ４０発現細胞を含む；該テスト用生物学的サンプルと有効量の目的の抗ＣＤ４０治療剤とを接触させること；このテスト用生物学的サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを検出すること、ここで、該バイオマーカーは、目的の抗ＣＤ４０治療剤の作用機序に依存して、細胞アポトーシスのバイオマーカー、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達経路のバイオマーカー、および細胞生存のバイオマーカーからなる群から選択される；ならびに、該テスト用生物学的サンプル中の該バイオマーカーのレベルと、該抗ＣＤ４０治療剤と接触されていない、該コントロール用生物学的サンプル中で検出される該バイオマーカーのレベルとを比較すること。抗ＣＤ４０治療剤が、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達を遮断するかまたはこれに干渉し、そしてまたＡＤＣＣを調節するアンタゴニストである場合、細胞増殖および生存、アポトーシス、ならびにＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達のこれらのバイオマーカーのいずれかまたは全てについての本明細書中に開示されるエクスビボ予測アッセイは、その抗ＣＤ４０治療剤での治療に対して応答性である炎症性疾患または自己免疫疾患を有する被験者を同定するために、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達によってアップレギュレートされるサイトカインマーカーについてのアッセイ、および／または本明細書中に記載のＣＤ４０関連因子の１以上についてのアッセイと組み合わせてあるいは単独で、該治療剤の可能性のある有利な効果を評価するために使用され得る。抗ＣＤ４０治療剤が、ＡＤＣＣ活性を調節することによるその作用機序を有する場合（例えば、抗ＣＤ４０抗体）、アポトーシスの１以上のマーカーについてのエクスビボ予測アッセイが、その抗ＣＤ４０治療剤での治療に対して応答性である炎症性疾患または自己免疫疾患を有する被験者を同定するために、本明細書中に記載の１以上のＣＤ４０関連因子についてのアッセイと組み合わせてあるいは単独で、該治療剤の可能性のある有利な効果を評価するために使用され得る。
【００９８】
本発明のエクスビボ予測アッセイによれば、目的の抗ＣＤ４０治療剤と接触されているテスト用生物学的サンプル中の、１以上のバイオマーカー、および必要に応じて１以上のサイトカインマーカーの発現レベルが、コントロール用生物学的サンプル中の該バイオマーカーおよび必要に応じてサイトカインマーカーの発現レベルと比較される。「テスト用生物学的サンプル」によって、候補被験者から得られたＣＤ４０発現細胞を含む生物学的サンプルが意図され、そしてこれは、候補被験者の治療のための考慮中の抗ＣＤ４０治療剤と接触される。「コントロール用生物学的サンプル」によって、テスト用生物学的サンプルと比較され得る生物学的サンプルが意図され、ここで、それはまた、ほぼ同じ数および種類のＣＤ４０発現細胞を含み、そしてテスト用生物学的サンプルを得るために使用されたものと等しい様式および同じ時間枠で候補被験者から得られており、そしてこれは、テストサンプルと同一の実験条件下に供され、しかしこれは、目的の抗ＣＤ４０治療剤とは接触されない。テスト用生物学的サンプルおよびコントロール用生物学的サンプルは、被験者から得られた単一の生物学的サンプルから提供され得、そしてその一方がテスト用生物学的サンプルと呼ばれそしてそのもう一方がコントロール用生物学的サンプルと呼ばれるサブサンプルへ分割され得る。あるいは、テスト用生物学的サンプルおよびコントロール用生物学的サンプルは、２以上の生物学的サンプルから提供され得、これらはプールされ得、そして次いで上述のサブサンプルへ細分され得るか、あるいはこれらは、個々に、テスト用生物学的サンプルおよびコントロール用生物学的サンプルを示し得る。
【００９９】
候補被験者から得られたＣＤ４０発現細胞が、生物学的サンプルの回収前にインビボでＣＤ４０Ｌによって構造的に刺激されているかもしれないと認識される一方、ＣＤ４０関連活性、例えば、細胞増殖およびＣＤ４０シグナル伝達の刺激に対する抗ＣＤ４０治療剤のアンタゴニスト効果が効果的に評価され得るように、テスト用およびコントロール用生物学的サンプルのＣＤ４０発現細胞をエクスビボで刺激することが好ましい。
【０１００】
この様式において、ＣＤ４０発現細胞のテスト用生物学的サンプルと目的の抗ＣＤ４０治療剤とを接触させる前に、候補被験者から回収された任意の所定の生物学的サンプル中のＣＤ４０発現細胞は、エクスビボ予測アッセイにおいて使用されるテスト用およびコントロール用生物学的サンプルのＣＤ４０発現細胞上におけるＣＤ４０シグナル伝達のアップレギュレーションを確実にするために、例えばＣＤ４０Ｌで刺激され得る。可溶性ＣＤ４０Ｌが挙げられるがこれに限定されないＣＤ４０Ｌの任意の供給源が使用され得る。他の好適なＣＤ４０刺激分子としては、例えば、ＣＤ４０の細胞外ドメインへ特異的に結合するアゴニスト抗体が挙げられ得る。したがって、ある実施形態において、好適なＣＤ４０刺激分子としては、膜結合ＣＤ４０Ｌ（例えば、細胞の原形質膜へ結合されたＣＤ４０Ｌ、例えば、ＣＤ４０Ｌを発現するホルムアルデヒド固定ＣＨＯ細胞トランスフェクタント；またはリポソームもしくはミセル等の合成脂質ベースの支持体へ組み込まれたＣＤ４０Ｌ）、可溶性ＣＤ４０Ｌ、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体、例えば、抗ヒトＣＤ４０抗体Ｇ２８−５（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。１以上のＣＤ４０シグナル伝達経路を刺激するための、回収された生物学的サンプルまたはそのサブサンプルの細胞と接触される刺激分子の有効量は、使用されるリガンドのタイプ等の因子（例えば、単量体または多量体；溶解性および透過性等）およびＣＤ４０発現細胞上のＣＤ４０受容体の量に依存する。好ましくは、約１．０ｎＭ〜約１ｍＭのＣＤ４０Ｌまたは可溶性ＣＤ４０Ｌが、ＣＤ４０シグナル伝達を刺激するために使用される。
【０１０１】
ある実施形態において、生物学的サンプルまたはそのサブサンプル中のＣＤ４０発現細胞は、ＣＤ４０シグナル伝達を刺激するに十分な時間の間、可溶性ＣＤ４０Ｌと共に該生物学的サンプルまたはそのサブサンプルをインキュベートすることによって、接触工程前に、可溶性組換えヒトＣＤ４０Ｌ（Ａｌｅｘｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｎｇｈａｍ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で刺激される。ある実施形態において、インキュベーション時間は、約１０分〜約４時間である。インキュベーション期間の間存在する可溶性ＣＤ４０Ｌの量は、滴定によって容易に測定される。１実施形態において、可溶性ＣＤ４０Ｌの量は約１μｇ／ｍＬである。テスト用生物学的サンプルを目的の抗ＣＤ４０治療剤と接触させるための任意の受理可能なプロトコルが、本発明のエクスビボ予測アッセイにおいて使用され得る。考慮される因子としては、生物学的サンプルまたはそのサブサンプルを含む容器中の接触される細胞の数；テスト用生物学的サンプルと接触される抗ＣＤ４０治療剤の濃度；テスト用生物学的サンプル中における細胞と抗ＣＤ４０治療剤とのインキュベーション時間；適用可能である場合、テスト用生物学的サンプルと接触される、刺激分子、例えば、ＣＤ４０Ｌ、可溶性ＣＤ４０Ｌ、またはその刺激性フラグメントもしくは変異体の濃度；ならびに、適用可能である場合、テスト用生物学的サンプル中の該細胞との該刺激分子のインキュベーション時間が挙げられるが、これらに限定されない。このような因子の決定は、テストされる生物学的サンプルのタイプ、保持容器のサイズ、該容器中の液体の量、試験される抗ＣＤ４０治療剤の化学的組成（即ち、サイズ、量（ｃｈａｒｇｅ）等）等の変数に基づいて、当業者によって達成され得る。
【０１０２】
１実施形態において、好適な数のＣＤ４０発現細胞を含むテスト用生物学的サンプルまたはそのサブサンプルが、９６ウェル組織培養皿へ添加される。細胞の好適な数は、本明細書中の他の箇所で記載される１以上の検出方法を使用して１以上のＣＤ媒介活性（即ち、細胞増殖および細胞生存、アポトーシスのレベル、ＣＤ４０シグナル伝達経路）の変化が検出され得る細胞数である。ある実施形態において、好適な細胞数は、９６ウェル組織培養皿の１ウェル当たり約１〜約１ｘ１０６細胞である。組織培養皿への細胞の添加に続いて、細胞は、該細胞と抗ＣＤ４０治療剤との接触前に、約０〜約９６時間、プレインキュベートされ得る。ある実施形態において、細胞は、本明細書で上述のＣＤ４０刺激分子と共にプレインキュベートされる。
【０１０３】
有効量の抗ＣＤ４０治療剤が、本明細書中の他の箇所で開示される１以上の検出方法を使用して調節が検出可能となるように、目的のＣＤ４０媒介活性（即ち、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達、ＣＤ４０へ結合する薬剤のＡＤＣＣ活性、または両方）の調節を提供するために、テスト用生物学的サンプルの細胞へ添加される。有効量は、当然ながら、試験される抗ＣＤ４０治療剤に依存する。一般的に、抗ＣＤ４０治療剤の有効量は、９６ウェルプレートの１ウェル当たり約１ｎＭ〜約１０ｍＭの薬剤である。１実施形態において、抗ＣＤ４０治療剤は、アンタゴニスト  抗ＣＤ４０抗体、例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９完全ヒトモノクローナル抗体、またはその抗原結合性フラグメントであり、そして有効量は、約０．０１μｇ／ｍＬ〜約３０μｇ／ｍＬであり、約０．０１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、および３０μｇ／ｍＬ、ならびに約０．０１μｇ／ｍＬ〜約３０μｇ／ｍＬの他のこのような値を含む。テスト用生物学的サンプルまたはそのサブサンプル中の細胞は、抗ＣＤ４０治療剤を細胞と相互作用させかつ１以上の生物学的応答を生じさせるに好適な長さの時間の間、インキュベートさせる。ある実施形態において、抗ＣＤ４０治療剤とテスト用生物学的サンプルまたはそのサブサンプルの細胞との好ましいインキュベーション時間は、約１分〜約４８時間である。他の実施形態において、インキュベーション時間は、約２０分、約３０分、約１時間、約４時間、約１２時間、約２２時間、または約２４時間である。
【０１０４】
テスト用およびコントロール用生物学的サンプルとして役立つ生物学的サンプルは、ＣＤ４０抗原を発現する細胞を含む細胞、組織または体液の任意のコレクションであり得る。このような生物学的サンプルの例としては、血液、リンパ、組織サンプル、スミア等が挙げられるが、これらに限定されない。生物学的サンプルは、当該分野における任意の受理可能な手順を使用して、例えば、体液の針吸引、組織サンプルの除去等によって、候補被験者から回収され得る。生物学的サンプルがアッセイ前に保存されなければならない場合、生物学的サンプルは、スライドガラスへ移され得るか、あるいは後での調製のために凍結され得るかまたは固定液中に直ぐに配置され得る。
【０１０５】
前述されるように、タンパク質またはヌクレオチドレベルでの目的のバイオマーカーの検出は、当業者に公知の任意の方法を使用して達成され得る。「発現を検出すること」または「のレベルを検出すること」によって、生物学的サンプル中のバイオマーカータンパク質または遺伝子の量または存在を測定することが意図される。したがって、「発現を検出すること」は、バイオマーカーが、発現されていない、検出可能に発現されていない、低レベルで発現されている、通常レベルで発現されている、または過剰発現されていると測定される場合を含む。ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達に対する抗ＣＤ４０治療剤の効果を測定するために、ＣＤ４０リガンドで（インビボまたはエクスビボのいずれかで）刺激されたＣＤ４０発現細胞を含むテスト用生物学的サンプルが、該治療剤に細胞応答を生じさせるに十分な時間の間、抗ＣＤ４０治療剤と接触され、そして次いで、そのテスト用生物学的サンプル中の目的の１以上のバイオマーカーの発現レベルが、該抗ＣＤ４０治療剤と接触されていないコントロール用生物学的サンプル中で検出される発現レベルと比較される。ある実施形態において、細胞のコントロール用生物学的サンプルは、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達に干渉しない中性物質またはネガティブコントロールと接触される。例えば、１実施形態において、ＣＤ４０へ結合しない非特異的免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１）がネガティブコントロールとして役立つ。検出は、経時でのバイオマーカーの変化のモニタリングを可能にする時間の間、起こり得る。検出はまた、目的の任意の所定のバイオマーカーについての「用量応答」曲線を作成するために、種々の濃度の抗ＣＤ４０治療剤への暴露を伴って起こり得る。
【０１０６】
テスト用およびコントロール用生物学的サンプル中の、本発明のバイオマーカー、および必要に応じてサイトカインマーカーの発現を検出するための方法は、核酸またはタンパク質レベルでの該マーカーの量または存在を測定する任意の方法を含む。このような方法は、当該分野において周知であり、そしてウエスタンブロット、ノザンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、免疫蛍光検査法、フローサイトメトリー、免疫組織化学、核酸ハイブリダイゼーション技術、核酸逆転写法、および核酸増幅法が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、バイオマーカーの発現は、例えば、特定のバイオマーカータンパク質に対して指向される抗体を使用して、タンパク質レベルにおいて検出される。これらの抗体は、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、多重化技術（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、免疫沈降、または免疫組織化学技術等の種々の方法で使用され得る。ある実施形態において、サイトカインマーカーの検出は、電気化学発光（ＥＣＬ）によって達成される。バイオマーカーおよび必要に応じてサイトカインマーカーについてのこれらの検出方法のいずれも、臨床情報の評価、従来の予測方法、他のＣＤ４０関連因子の発現、特に細胞表面ＣＤ４０および／またはＣＤ４０Ｌの発現ならびに可溶性ＣＤ４０および／またはＣＤ４０Ｌの循環レベル、ならびに本明細書において上述のものに限定されないがこれらを含む、当該分野において公知の臨床的に有用な予測マーカーの発現または存在と組み合わされ得る。この様式において、開示される方法は、自己免疫疾患または炎症性疾患が本明細書中に記載の抗ＣＤ４０治療剤での治療介入から恩恵を受ける候補被験者のより正確な決定を可能にし得る。
【０１０７】
したがって、ある実施形態において、ＣＤ４０発現細胞に関連する炎症性または自己免疫疾患を有する候補被験者は、本明細書に記載のエクスビボ予測アッセイを使用して、目的の抗ＣＤ４０治療剤に対する応答性について試験され、ここで、１以上のＣＤ４０媒介活性に対する該治療剤の効果が評価される。エクスビボ予測アッセイのさらなる改良が望ましい場合、候補被験者は、本明細書上記に記載の１以上のＣＤ４０関連因子、本明細書上記に記載のものを含む１以上の臨床的に有用な予測マーカー、または両方の、発現のレベルまたは発現の非存在について、検査され得る。この様式において、ＣＤ４０発現細胞を含む生物学的サンプルは、候補被験者から回収され得、そして目的のＣＤ４０関連因子および／または臨床的に有用な予測マーカーの発現のレベルまたは発現の非存在について評価され得る。本明細書上記に記載のＣＤ４０発現細胞を含む任意の生物学的サンプルが、これらの予測アッセイのために回収され得る。さらに、当業者に公知の任意の検出方法が、本明細書の他の箇所で記載されるように、目的のＣＤ４０関連因子および／または臨床的に有用な予測マーカーの発現のレベルまたは発現の非存在を検出するために使用され得る。
【０１０８】
１以上のＣＤ４０関連因子の発現レベルが、抗ＣＤ４０治療剤での治療に応答性である炎症性疾患または自己免疫疾患を有する被験者を同定するために評価される場合、生物学的サンプルが被験者から回収され、そしてそのサンプル中の発現レベルが、コントロールまたは参照標準中のその因子の発現レベルと比較される。細胞表面ＣＤ４０および／または細胞表面ＣＤ４０Ｌの発現レベルについて、ＣＤ４０発現および／またはＣＤ４０Ｌ発現細胞を含む任意の生物学的サンプルが、本明細書上記に記載のように、使用され得る。ｓＣＤ４０および／またはｓＣＤ４０Ｌの循環レベルについて、血液サンプルあるいは血漿または血清等の血液成分を含むサンプルが、候補被験者から得られ得る。「コントロール」または「参照標準」によって、同一の生物学的供給源のものであり（即ち、組織または体液）かつ炎症性または自己免疫疾患を有する被験者と該疾患に苦しんでいない健常者とを区別する基準が意図される。当業者は、該疾患を有さない健常者および該疾患を有する被験者中のこれらのＣＤ４０関連因子（即ち、細胞表面ＣＤ４０、細胞表面ＣＤ４０Ｌ、ｓＣＤ４０、ｓＣＤ４０Ｌ）の発現レベルを測定し、年齢、性別、人種等について制御し、そしてこれらの発現レベルを比較して健常者において予期される標準的な発現レベルを決定することによって、参照標準を提供することができる。ある実施形態において、炎症性または自己免疫疾患を有する候補被験者における発現レベルは、参照標準における発現レベルよりも少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％高い。抗ＣＤ４０治療剤での治療の適用性は、１以上のこれらのＣＤ４０関連因子の発現レベルを検出することによって評価され得ることが認識され、ここで、参照標準と比べて生物学的サンプル中の増加された発現レベルは、該被験者が目的の抗ＣＤ４０治療剤での治療に応答性であろう炎症性または自己免疫疾患を有することを確立するに十分であり、ＣＤ４０媒介活性に対する抗ＣＤ４０治療剤のエクスビボ効果（例えば、細胞生存および増殖、ならびに／あるいはＡＤＣＣ活性）についてさらにスクリーニングする必要がない。
【０１０９】
本発明はまた、本発明のエクスビボ予測アッセイを行うためのキットを包含する。例えば、該キットは、生物学的サンプル中において、タンパク質または核酸レベルで、本明細書中に記載のバイオマーカー、例えば、アポトーシス、細胞増殖または生存、あるいはＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達経路のバイオマーカーを検出し得る標識された化合物または薬剤と、目的の抗ＣＤ４０治療剤との該サンプルのインキュベーションに続いて、該サンプル中の該バイオマーカーの量を測定するための手段（例えば、目的のバイオマーカーをコードするＲＮＡへ結合するオリゴヌクレオチドプローブまたは抗体）とを含み得る。キットは、目的の各個のバイオマーカーを検出し得る個々の標識された化合物または薬剤と該サンプル中の各バイオマーカーの量を検出するための手段とを含めることによって、目的の複数のバイオマーカーの検出を可能にするように包装され得る。キットはまた、該エクスビボ予測アッセイが抗ＣＤ４０治療剤でのポジティブな治療結果を示す結果を生じる場合に被験者を治療するための指示書を含み得る。
【０１１０】
抗体ベースのキットについて、該キットは、例えば、以下を含み得る：（１）目的のバイオマーカーへ結合する第１抗体（例えば、固体支持体へ結合される）；および、必要に応じて、（２）該バイオマーカーまたは該第１抗体へ結合し、そして検出可能な薬剤へ結合されている、第２の異なる抗体。オリゴヌクレオチドベースのキットについて、該キットは、例えば、以下を含み得る：（１）バイオマーカーをコードする核酸配列へハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（例えば、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド）、または（２）目的のバイオマーカーをコードする核酸分子を増幅するに結うような一対のプライマー。キットはまた、例えば、緩衝液、保存剤、またはタンパク質安定剤を含み得る。キットはまた、検出可能な薬剤（例えば、酵素または基質）を検出するに必要な成分を含み得る。キットはまた、アッセイされそして含まれるテストサンプルと比較され得るコントロールサンプルまたは一連のコントロールサンプルを含み得る。キットの各成分は、通常、個々の容器内に入れられ、そして種々の容器の全ては、試験された被験者が抗ＣＤ４０治療剤での治療についての候補であるかどうかを観察するための指示書と共に、単一のパッケージ内にある。
【０１１１】
検出方法
候補被験者の生物学的サンプル中のバイオマーカー、サイトカインマーカー、または目的のＣＤ４０関連因子タンパク質（例えば、細胞生存または増殖のバイオマーカー、アポトーシスのバイオマーカー、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０  シグナル伝達経路のバイオマーカー、循環可溶性ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌ、細胞表面ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌ、あるいは臨床的に有用な予測マーカー）を特定しそして定量するための任意の手段が、考慮される。したがって、ある実施形態において、生物学的サンプル中の目的のバイオマーカータンパク質の発現レベルは、そのバイオマーカータンパク質またはその生物学的に活性な変異体と特異的に相互作用し得る結合性タンパク質の手段によって検出される。好ましくは、標識された抗体、その結合性部分、または他の結合パートナーが、使用され得る。用語「標識」は、本明細書中で使用される場合、「標識された」抗体を作製するように、抗体へ直接的にまたは間接的に結合されている検出可能な化合物または組成物をいう。標識は、それ自体検出可能であってもよく（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）、あるいは、酵素標識の場合、検出可能な基質化合物または組成物の化学変化を触媒してもよい。バイオマーカータンパク質の検出のための抗体は、起源がモノクローナルであってもポリクローナルであってもよく、あるいは合成的にまたは組換えで作製されてもよい。複合化タンパク質の量、例えば、結合性タンパク質（例えば、該バイオマーカータンパク質へ特異的に結合する抗体）と結合されたバイオマーカータンパク質の量は、当業者に公知の票銃的なタンパク質検出方法を使用して測定される。免疫アッセイ設計、理論およびプロトコルの詳細なレビューは、当該分野における多数のテキストにおいて見られ得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ））；Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９４）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照のこと）。
【０１１２】
種々のアッセイが、標識された抗体でタンパク質を検出するために利用可能である。ワンステップアッセイにおいて、検出される目的の標的タンパク質は、もしそれが存在するならば、固定化され、そして標識された抗体と共にインキュベートされる。標識された抗体は、固定化された標的タンパク質分子へ結合する。結合されていない分子を除去するために洗浄した後、標識の存在についてサンプルをアッセイする。標準形式において、１サンプル当たり単一のタンパク質がアッセイされる。最近の多重化技術を使用して、複数のタンパク質が、各検出工程について異なる標識を使用することによって、単一のサンプル中においてアッセイされ得る。
【０１１３】
ツーステップアッセイにおいて、目的の固定化された標的タンパク質分子が、標識されていない抗体と共にインキュベートされる。次いで、標的タンパク質−非標識抗体複合体は、存在する場合、該非標識抗体について特異的である第２の標識抗体へ結合される。サンプルが洗浄され、標識の存在についてアッセイされる。
【０１１４】
抗体を標識するために使用されるマーカーの選択は、適用に依存して変化する。しかし、マーカーの選択は、当業者に容易に決定され得る。これらの標識抗体は、目的のバイオマーカータンパク質の存在を検出するために、免疫学的検定ならびに組織学的適用において使用され得る。標識抗体は、ポリクローナルであってもモノクローナルであってもよい。さらに、目的のタンパク質を検出することにおける使用のための抗体は、本明細書中の他の箇所に記載されるように、放射性原子、酵素、発色性または蛍光性部分、あるいは比色タグで標識され得る。タグ標識の選択は、所望の検出制限に依存する。酵素アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、典型的に、酵素でタグ付けされた複合体と酵素基質との相互作用によって形成される着色産物の検出を可能にする。検出可能な標識として役立ち得る放射性核種としては、例えば、Ｉ−１３１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｙ−９０、Ｒｅ−１８８、Ｒｅ−１８６、Ａｔ−２１１、Ｃｕ−６７、Ｂｉ−２１２、およびＰｄ−１０９が挙げられる。検出可能な標識として役立ち得る酵素の例としては、ホースラディシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、およびグルコース６リン酸デヒドロゲナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。発色部分としては、フルオレセインおよびローダミンが挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、当該分野において公知の方法によって、これらの標識へ結合され得る。例えば、酵素および発色分子は、ジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド等のカップリング剤によって抗体へ結合され得る。あるいは、結合は、リガンド−レセプター対を介して生じ得る。好適なリガンド−レセプター対の例は、ビオチン−アビジンまたはビオチン−ストレプトアビジン、および抗体−抗原である。
【０１１５】
ある実施形態において、本発明は、血清または他の生物学的流体中の、本明細書中において上述のような１以上のバイオマーカーまたは目的の他のタンパク質を検出するためのサンドイッチ技術の使用を考慮する。国際公開番号ＷＯ９３／０９４３７に記載されるように、このような技術は、目的のタンパク質を結合し得る２つの抗体を使用する：例えば、これらの一方は、検出可能な化合物で標識されているが溶液中に遊離しており、これらのもう一方は、固体支持体上へ固定されている。第２抗体について使用され得る化学標識の例としては、放射性同位体、蛍光化合物、および酵素、あるいは反応物質または酵素基質へ暴露されると着色されたまたは電気化学的に活性な生成物を生じる他の分子が挙げられるが、これらに限定されない。目的のバイオマーカーまたは他のタンパク質を含有するサンプルが、このシステムへ置かれると、目的のバイオマーカーまたは他のタンパク質は、固定化抗体および標識抗体の両方へ結合する。結果は、支持体表面上の「サンドイッチ」免疫複合体である。複合体化されたタンパク質は、結合されていないサンプル成分および過剰の標識抗体を洗浄除去し、そして支持体表面上のタンパク質へ複合体化された標識抗体の量を測定することによって、検出される。サンドイッチ免疫学的検定法は、十分な検出限界を有する標識が使用される場合、非常に特異的かつ非常に高感度である。
【０１１６】
生物学的サンプルは個々にスクリーニングされ得；あるいは、生物学的流体の多数のサンプルが、例えば、広範囲に使用されかつ容易に自動化可能である従来の９６ウェルマイクロタイターフォーマットを使用して、同時にスクリーニングされ得る。９６ウェルプレートを熱量測定的に分析するために、いくつかの市販の分光器（「プレートリーダー」）もまた存在する。さらに、生物学的サンプルが、当該分野において周知の方法を使用して、１つのバイオマーカー、または複数のマーカー、例えば一団のバイオマーカーについてスクリーニングされ得る。
【０１１７】
好ましい実施形態において、生物学的サンプル（例えば、体液のサンプル）中の１以上のバイオマーカーまたは目的の他のタンパク質の発現が、ラジオイムノアッセイまたは酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、競合的結合酵素免疫測定法、ドットブロット（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｇｕｉｄｅ  （２ｎｄｅｄ．；Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（１９９１）を参照のこと）、ウエスタンブロット（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｖｏｌ．３，Ｃｈａｐｔｅｒ  １８（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）を参照のこと）、クロマトグラフィー、好ましくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、あるいは当該分野に公知の他のアッセイによって検出される。したがって、検出アッセイは、免疫ブロット、免疫拡散、免疫電気泳動、または免疫沈降等の工程を含み得るが、これらに限定されない。
【０１１８】
任意の所定のタンパク質検出アッセイについて、ＣＤ４０発現細胞を含む生物学的サンプルまたはそのサブサンプルが、抗体−抗原複合体の形成を可能にするに十分な時間の間、結合パートナー、例えば、目的のバイオマーカーまたは他のタンパク質についての、抗体、または検出可能に標識された抗体と接触され、そして次いで、抗体結合が、本明細書上記で記載の任意の手段によって検出される。バイオマーカー、ＣＤ４０関連因子、および本明細書中に記載の臨床的に有用な予測マーカーに対する抗体および検出可能に標識された抗体は、当該分野において周知であり、そして市販されている。例えばＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ；ＤＡＫＯ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ等から市販される、アポトーシス、細胞生存、およびＣＤ４０  シグナル伝達経路、ならびに臨床的に有用な予測マーカーに対して特異的な抗体を例えば参照のこと。あるいは、抗体またはこれらの抗体の検出可能に標識された形態は、当該分野に周知の抗体産生法を使用して、作製され得、そして本明細書以下においてさらに説明される。
【０１１９】
カスパーゼのバイオマーカーについての多数のアッセイキットが市販されている。例えば、Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｃａｓｐａｓｅｓ  Ａｓｓａｙ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）は、マクロプレートにおけるカスパーゼ活性の定量的インビトロ測定についての蛍光分析である。アッセイは、例えば、９６ウェルプレートにおける１００の検査、および３８４ウェルプレート（Ｃａｔ．Ｎｏ．３００５３７２）における４００の検査を可能にする、ハイスループットスクリーニングのために特に有用である。このアッセイは、例えば血清または血漿を含む生物学的サンプル中の、カスパーゼ−２、カスパーゼ−３、カスパーゼ−７、および少ない程度に、カスパーゼ−６、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９、およびカスパーゼ−１０を含む、いくつかのカスパーゼの検出を可能にする。Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡＰＬＵＳアッセイ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１７７４４２５；Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）は、それぞれＤＮＡおよびヒストンへ向けられたマウスモノクローナル抗体を使用する、定量サンドイッチ−酵素−イムノアッセイ原理に基づく。このアッセイは、アポトーシスから死んだ細胞の細胞質へ放出されるモノおよびオリゴヌクレオソームの特異的検出および定量を可能にする。それは、細胞溶解産物、血清、培養上澄み液等を含む、種々のサンプルについて使用され得る。
【０１２０】
細胞表面ＰＳは、ＰＳについてのアネキシンＶの高親和性に基づく、任意の市販のアネキシンＶ染色試薬を使用して検出され得る。例えば、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅから市販されるアネキシンＶ染色試薬を参照のこと。ＦＩＴＣをアネキシンＶへ結合することによって、フローサイトメトリーにより単一細胞に基づくアポトーシス細胞を同定および定量することが可能である。ＦＩＴＣ−アネキシンＶ（緑色蛍光）および失活（ｎｏｎ−ｖｉｔａｌ）色素ヨウ化プロピジウム（赤色蛍光）で細胞を同時に染色することは、インタクトな細胞（ＦＩＴＣ−ＰＩ−）、初期アポトーシス（ＦＩＴＣ＋ＰＩ−）、および後期アポトーシスまたは壊死細胞（ＦＩＴＣ＋ＰＩ＋）の識別を提供し得る。
【０１２１】
さらに、生物学的サンプル中の上昇されたアポトーシスは、アポトーシスの特徴であるＤＮＡフラグメント化を検出する核酸ベースの方法で確認され得る。アガロースゲルにおける電気泳動を使用して分割された場合、アポトーシスＤＮＡは、例えば壊死または他の非特異的ＤＮＡ分解において観察される核酸のスミアとは対照的に、最初、特徴的な「はしご（ｌａｄｄｅｒ）」パターンを有する。ＤＮＡフラグメント化を検出するための一般的な組織化学技術は、末端標識されたＤＮＡを使用する。このようなもののためのキット、例えば、ＡＰＯＬＥＲＴ  ＤＮＡ  フラグメント化キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）は、市販されている。このアッセイは、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Ｔｄｔ）によるｄＵＴＰニック末端標識化（ＴＵＮＥＬ）に基づき、ここで、Ｔｄｔは、アポトーシスを受ける細胞中のフラグメント化ＤＮＡの遊離３’ヒドロキシル末端でのフルオレセイン−ｄＵＴＰの組込みを触媒する。
【０１２２】
当該分野において公知の任意の方法が、サイトカインマーカーの産生を検出するために使用され得る。標準的なアッセイはＥＬＩＳＡ形式を含み、ここで、１サンプル当たり１サイトカインが測定される。あるいは、より感受性の高い技術は、電気化学発光（ＥＣＬ）である。１実施形態において、サイトカイン産生は、例えば、高性能サイトカインアッセイのための市販のＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）システム（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）等のマルチアレイシステムを使用して、ＥＣＬを使用してアッセイされる。サンプル中の複数のサイトカイン（または他の被分析物）を１度で測定することを可能にする他のフォーマットとしては、多重化技術（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が挙げられる。１つのこのような製品は、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ビーズテクノロジー（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ）であり、ここで、特定のバイオアッセイに特異的な試薬（例えば、サイトカインに対する抗体）でコーティングされた１００色までの着色マイクロスフェアが、一緒に混合され得、そしてレーザー技術を使用して分析され得る。
【０１２３】
候補被験者から得られた生物学的サンプル中の、本明細書中に記載の１以上のバイオマーカー、サイトカイン、ＣＤ４０関連因子、および臨床的に有用な予測マーカーの存在はまた、核酸レベルで測定され得る。発現を評価するための核酸ベースの技術は、当該分野において周知であり、そして例えば、生物学的サンプル中のバイオマーカーｍＲＮＡのレベルを測定することが挙げられる。多くの発現検出法は、単離されたＲＮＡを使用する。ｍＲＮＡの単離に対して選択しない任意のＲＮＡ単離技術が、ＲＮＡの精製のために使用され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄ．（１９８７−１９９９）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）。さらに、多数の組織サンプルは、例えば米国特許第４，８４３，１５５号に開示されるシングルステップＲＮＡ単離法等の、当業者に周知の技術を使用して、容易に処理され得る。
【０１２４】
したがって、ある実施形態において、目的のバイオマーカーまたは他のタンパク質の検出は、核酸プローブを使用して核酸レベルでアッセイされる。用語「核酸プローブ」は、特に意図される標的核酸分子、例えば、ヌクレオチド転写物へ選択的に結合し得る任意の分子をいう。プローブは、当業者によって合成され得、あるいは好適な生物学的調製物から誘導され得る。プローブは、例えば、放射性標識、蛍光標識、酵素、化学発光タグ、比色タグ、あるいは上記で議論されるかまたは当該分野において公知である他の標識またはタグで、標識されるように特異的に設計され得る。プローブとして使用され得る分子の例としては、ＲＮＡおよびＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２５】
例えば、単離されたｍＲＮＡは、サザンまたはノザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応分析およびプローブ分析が挙げられるがこれらに限定されない、ハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイにおいて使用され得る。ｍＲＮＡレベルの検出のための１つの方法は、単離されたｍＲＮＡと、検出される遺伝子によってコードされるｍＲＮＡへハイブリダイズし得る核酸分子（プローブ）とを接触させることを含む。核酸プローブは、例えば、全長ｃＤＮＡ、またはその部分、例えば、長さが少なくとも７、１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチドであり、かつ、本明細書上記に記載のバイオマーカー、ＣＤ４０関連因子、または臨床的に有用な予測マーカーをコードするｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡへストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするに十分であるオリゴヌクレオチドであり得る。ｍＲＮＡとプローブとのハイブリダイゼーションは、目的のバイオマーカーまたは他の標的タンパク質が発現されていることを示す。
【０１２６】
１実施形態において、ｍＲＮＡは、固体表面上に固定化され、そして、例えば、単離されたｍＲＮＡをアガロースゲル上で移動させそしてゲルから膜（例えば、ニトロセルロース）へｍＲＮＡを移すことによって、プローブと接触される。代替の実施形態において、プローブが固体表面上へ固定化され、そしてｍＲＮＡが、例えば遺伝子チップアレイにおいて、該プローブと接触される。当業者は、目的のバイオマーカーまたは他のタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを検出することにおける使用のために、公知のｍＲＮＡ検出法を容易に採用し得る。
【０１２７】
サンプル中の目的のｍＲＮＡのレベルを測定するための代替の方法は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号を参照のこと）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８９−１９３）、自立配列複製（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７）、ローリングサークル複製（米国特許第５，８５４，０３３号）または任意の他の核酸増幅法による核酸増幅のプロセス、続いて、当業者に周知の技術を使用しての増幅された分子の検出を含む。これらの検出スキームは、特に、このような分子が非常に少ない数で存在する場合の核酸分子の検出について有用である。本発明の特定の態様において、バイオマーカー発現、ＣＤ４０関連因子または他の臨床的に有用な予測マーカーの発現は、定量蛍光ＲＴ−ＰＣＲ（即ち、ＴａｑＭａｎ（登録商標）システム）によって評価される。
【０１２８】
目的のＲＮＡの発現レベルは、メンブレンブロット（例えば、ノザン、ドット等のハイブリダイゼーション分析において使用される）、マイクロウェル、サンプルチューブ、ゲル、ビーズまたはファイバー（または結合された核酸を含む固体支持体）を使用して、モニタリングされ得る。米国特許第５，７７０，７２２号、第５，８７４，２１９号、第５，７４４，３０５号、第５，６７７，１９５号および第５，４４５，９３４号を参照のこと。これらは、参照により本明細書中に組み込まれる。発現の検出はまた、溶液中において核酸プローブを使用することを含み得る。
【０１２９】
本発明の１実施形態において、マイクロアレイが、１以上のバイオマーカー、ＣＤ４０関連因子、および／または臨床的に有用な予測マーカーの発現を検出するために使用される。マイクロアレイは、異なる実験間での再現性のために、この目的のために特によく適している。ＤＮＡマイクロアレイは、多数の遺伝子の発現レベルの同時測定のための１つの方法を提供する。各アレイは、固体支持体へ結合された捕捉プローブの再現可能なパターンからなる。標識されたＲＮＡまたはＤＮＡは、アレイ上の相補プローブへハイブリダイズし、次いで、レーザスキャニングによて検出される。アレイ上の各プローブについてのハイブリダイゼーション強度が測定され、相対的遺伝子発現レベルを示す定量値へ変換される。米国特許第６，０４０，１３８、第５，８００，９９２号および第６，０２０，１３５号、第６，０３３，８６０号、および第６，３４４，３１６号を参照のこと。これらは、参照により本明細書中に組み込まれる。高密度オリゴヌクレオチドアレイは、サンプル中の多数のＲＮＡについての遺伝子発現プロフィールを測定するために特に有用である。
【０１３０】
機械的合成法を使用するこれらのアレイの合成のための技術は、例えば、米国特許第５，３８４，２６１号に記載されており、その全体が、参照により本明細書中に組み込まれる。平面アレイ表面が好ましいが、アレイは、実質的に任意の形状の表面上において、または多様な表面上においてさえ、作製され得る。アレイは、ビーズ、ゲル、ポリマー表面、ファイバー（例えば、光ファイバー）、ガラス、または任意の他の好適な支持体上のペプチドまたは核酸であり得る。米国特許第５，７７０，３５８号、第５，７８９，１６２号、第５，７０８，１５３号、第６，０４０，１９３号および第５，８００，９９２号を参照のこと。これらの各々は、全ての目的についてその全体が本明細書中に組み込まれる。アレイは、診断または包括的なデバイスの他の取り扱いを可能にするような様式で、パッケージされ得る。例えば、米国特許第５，８５６，１７４号および第５，９２２，５９１号を参照のこと。これらは、参照により本明細書中に組み込まれる。
【０１３１】
１つのアプローチにおいて、サンプルから単離されたトータルｍＲＮＡは、標識されたｃＲＮＡへ変換され、そして次いで、オリゴヌクレオチドアレイへハイブリダイズされる。各サンプルは別個のアレイへハイブリダイズされる。相対的転写物レベルが、サンプル中およびアレイ上に存在する好適なコントロールを参照して算出され得る。
【０１３２】
抗ＣＤ４０治療剤
本明細書中に記載のエクスビボ予測アッセイは、目的の抗ＣＤ４０治療剤での治療から恩恵を受ける、ＣＤ４０発現細胞に関連する炎症性疾患および／または自己免疫疾患を有する被験者を同定するために使用され得る。特に興味深いのは、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達を調節するおよび／またはＡＤＣＣを調節する抗ＣＤ４０治療剤である。このような抗ＣＤ４０治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＤ４０へ結合されると、ＣＤ４０Ｌ媒介性シグナル伝達を遮断するかもしくはこれに干渉するおよび／またはＡＤＣＣ活性を調節するアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、ＣＤ４０Ｌアンタゴニスト（抗ＣＤ４０Ｌ抗体を含む）、ＣＤ４０へ結合し得るがＣＤ４０シグナル伝達を誘導しないＣＤ４０Ｌの突然変異形態、可溶性ＣＤ４０、ＣＤ４０を含む融合タンパク質の可溶性形態、ならびにＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０相互作用を崩壊させるかもしくはこれに干渉するおよび／またはＣＤ４０シグナル伝達に干渉する薬剤、例えば、米国特許出願公開第２００４００６７９８２号（これは、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）に開示されるＣＤ４０：ＣＤ４０Ｌ結合妨害化合物。特に興味深いのは、アンタゴニスト抗ＣＤ４０治療剤、例えば、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達を遮断するに役立つ、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびアンタゴニスト抗ＣＤ４０Ｌ抗体、またはそれらの抗原結合性フラグメント、ならびにＡＤＣＣを調節する抗ＣＤ４０治療剤、例えば、抗ＣＤ４０抗体およびその抗原結合性フラグメントである。
【０１３３】
（抗ＣＤ４０抗体）
ＣＤ４０に対するモノクローナル抗体は、当該分野において公知である。例えば、ＭｃＭｉｃｈａｅｌ，ｅｄ．（１９８７；１９８９）  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  ＩＩＩ  ａｎｄ  ＩＶ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）におけるＢ細胞抗原に関する箇所；米国特許第５，６７４，４９２号；第５，８７４，０８２号；第５，６７７，１６５号；第６，０５６，９５９号；ＷＯ００／６３３９５；国際公開番号ＷＯ０２／２８９０５およびＷＯ０２／２８９０４；Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：１４２５；Ｖａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：１４６３；Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）  ＰＮＡＳ  ８３：４４９４；Ｐａｕｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：５９０；Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１５３５；Ｊａｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１８６１；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９Ｉ）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：１８３６；Ｇａｓｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８；Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ３：８；ならびにＢａｎｃｈｅｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７０を参照のこと；これらの全ては、参照により本明細書中に組み込まれる。他の抗ＣＤ４０モノクローナル抗体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ヒト化抗ＣＤ４０抗体、例えば、ＳＧＮ−４０（Ｔａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４：２８４６−５２；米国特許第６，８３８，２６１号）、これは、マウス抗ＣＤ４０抗体ＳＧＮ−１４（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：３２２５−３１）のヒト化形態である；および米国特許出願公開第２００４／０１２０９４８号に開示されるアゴニストおよびアンタゴニスト抗体；それらの全体が、参照により本明細書中に組み込まれる。
【０１３４】
１実施形態において、前記エクスビボ予測アッセイは、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体での治療の適合性または効果を検査するために使用される。本発明の方法における使用のためのアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体としては、ヒト細胞の表面上で発現されたヒトＣＤ４０抗原へ特異的に結合し得る、モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントが挙げられる。ある実施形態において、本発明の方法における使用のためのアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、ＣＤ４０細胞表面抗原について強い単一部位結合親和性を示す。このようなモノクローナル抗体は、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ等の標準アッセイを使用して測定した場合、少なくとも１０−５Ｍ、少なくとも３×１０−５Ｍ、好ましくは少なくとも１０−６Ｍ〜１０−７Ｍ、より好ましくは少なくとも１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍの、ＣＤ４０についての解離平衡定数（ＫＤ）を示す。Ｂｉａｃｏｒｅ分析は当該分野において公知であり、そして詳細は、「ＢＩＡａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｈａｎｄｂｏｏｋ」に提供される。ＷＯ０１／２７１６０に記載の方法が、結合親和性を調節するために使用され得る。
【０１３５】
特に興味深いのは、ヒト細胞上のＣＤ４０抗原へ結合される場合に、本明細書上記に定義される顕著なアゴニスト活性を有さないがアンタゴニスト活性を示す、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体である。本発明の１実施形態において、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、Ｂ細胞応答において顕著なアゴニスト活性を有さない。本発明の別の実施形態において、１以上のＢ細胞応答（例えば、増殖と分化、または、増殖と分化と抗体産生）のアッセイにおいて顕著なアゴニスト活性を有さない。好適なモノクローナル抗ＣＤ４０抗体は、ヒト定常領域を有し；好ましくは、それらはまた、完全にまたは部分的にヒト化されたフレームワーク領域を有し；そして最も好ましくは、完全なヒト抗体またはその抗原結合性フラグメントである。このようなモノクローナル抗体の例は、ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２と本明細書中で呼ばれる抗体である。
【０１３６】
モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２は、本発明の方法における使用についてアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体を示す。ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２抗体は、ハイブリドーマ細胞株１３１．２Ｆ８．５．９（本明細書中において細胞株５．９と呼ばれる）および１５３．８Ｅ２．Ｄ１０．Ｄ６．１２．１２（本明細書中において細胞株１２．１２と呼ばれる）から産生されるＩｇＧ１アイソタイプの完全ヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体である。これらの細胞株は、ヒトＩｇＧ１重鎖座およびヒトκ鎖座を含む免疫化ゼノタイピック（ｘｅｎｏｔｙｐｉｃ）マウス由来の脾細胞を使用して作製された（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ａｂｇｅｎｉｘ；Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。脾臓細胞は、マウスメラノーマＳＰ２／０細胞（Ｓｉｅｒｒａ  ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）と融合された。得られたハイブリドーマを数回サブクローン化し、安定な細胞株５．９および１２．１２を作製した。本発明の他の抗体は、ヒト免疫グロブリン座遺伝子導入マウスを使用して、あるいは当該分野において公知のおよび／または本明細書中に記載の他の方法によって、同様に作製され得る。
【０１３７】
ＣＨＩＲ−１２．１２抗体の可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列、ならびにＣＨＩＲ−５．９抗体の可変領域のアミノ酸配列が開示される。より詳細には、ｍＡｂ  ＣＨＩＲ−１２．１２についての軽鎖および重鎖についてのリーダー、可変、および定常領域についてのアミノ酸配列を、配列番号２（ｍＡｂ  ＣＨＩＲ−１２．１２の軽鎖についての完全配列）、配列番号４（ｍＡｂ  ＣＨＩＲ−１２．１２の重鎖についての完全配列）、ならびに配列番号５（配列番号４に記載のｍＡｂ  ＣＨＩＲ−１２．１２の重鎖の変異体についての完全配列、ここで、該変異体は、配列番号４の１５３位のアラニン残基についてのセリン置換を含む）に記載する。ｍＡｂ  ＣＨＩＲ−１２．１２の軽鎖および重鎖をコードするヌクレオチド配列を、配列番号１（ｍＡｂ  ＣＨＩＲ−１２．１２の軽鎖についてのコード配列）および配列番号３（ｍＡｂ  ＣＨＩＲ−１２．１２の重鎖についてのコード配列）に記載する。ＣＨＩＲ−５．９  ｍＡｂについての軽鎖および重鎖についてのリーダー、可変、および定常領域についてのアミノ酸配列を、配列番号６（ｍＡｂ  ＣＨＩＲ−５．９の軽鎖についての完全配列）、配列番号７（ｍＡｂ  ＣＨＩＲ−５．９の重鎖についての完全配列）、ならびに配列番号８（配列番号７に記載のｍＡｂ  ＣＨＩＲ−５．９の重鎖の変異体についての完全配列、ここで、該変異体は、配列番号７の１５８位のアラニン残基についてのセリン置換を含む）に記載する。さらに、ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２抗体を発現するハイブリドーマを、それぞれ、ＰＴＡ−５５４２およびＰＴＡ−５５４３の特許寄託名でＡＴＣＣに寄託した。
【０１３８】
アンタゴニスト活性に加えて、本発明の方法における使用のための抗ＣＤ４０抗体は、腫瘍細胞に対して別の作用機構を有し得る。例えば、天然ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２抗体は、ＡＤＣＣ活性を有する。あるいは、ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２  抗体の可変領域は、ＡＤＣＣ活性を有する別の抗体アイソタイプ上において発現され得る。本明細書下記に記載されるように、細胞毒、治療剤、または放射性金属イオンもしくは放射性同位体へ、ＣＨＩＲ−５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２の天然形態、組換え形態、または抗原結合性フラグメントを結合させることも可能である。
【０１３９】
ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡタイプアッセイにおいて可溶性ＣＤ４０へ結合し、細胞表面ＣＤ４０へのＣＤ４０リガンドの結合を防止し、そしてフロサイトメトリーアッセイによって測定されるように、予め結合されているＣＤ４０リガンドを置換する。抗体  ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２は、ＣＤ４０へ結合することについて互いに競合するが、１５Ｂ８［２０００年１０月２日に出願された「Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉ−ＣＤ４０  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」という表題の米国仮出願シリアル番号６０／２３７，５５６、ならびに２００１年１０月２日に出願された「Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉ−ＣＤ４０  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」とまた表題が付けられたＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳＯｌ／３０８５７（代理人整理番号ＰＰ１６０９２．００３）に記載される抗ＣＤ４０モノクローナル抗体；これらは両方とも、それらの全体が、参照により本明細書中に組み込まれる］とは競合しない。ヒト健常者由来のＢ細胞の増殖に対する効果についてインビトロで試験される場合、ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体として作用する。さらに、ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２は、健常者由来のヒトリンパ球の強力な増殖を誘導しない。これらの抗体は、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によって、ＣＤ４０発現標的細胞を死滅させ得る。ＢｉａｃｏｒｅＴＭアッセイによって測定される場合、ヒトＣＤ４０についてのＣＨＩＲ−５．９の結合親和性は１．２ｘ１０−８Ｍであり、そしてＣＨＩＲ−１２．１２の結合親和性は５ｘ１０−１０Ｍである。
【０１４０】
上述のモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２の結合特徴を共有する他のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（１）それぞれ特許寄託番号ＰＴＡ−５５４２および特許寄託番号ＰＴＡ−５５４３としてＡＴＣＣへ寄託された、１３１．２Ｆ８．５．９（本明細書中で細胞株５．９と呼ばれる）および１５３．８Ｅ２．Ｄ１０．Ｄ６．１２．１２（本明細書中で細胞株１２．１２と呼ばれる）という名のハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体；（２）配列番号２に示される配列、配列番号４に示される配列、配列番号５に示される配列、配列番号２および配列番号４に示される両方の配列、ならびに配列番号２および配列番号５に示される両方の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；（３）配列番号６に示される配列、配列番号７に示される配列、配列番号８に示される配列、配列番号６および配列番号７に示される両方の配列、ならびに配列番号６および配列番号８に示される両方の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；（４）配列番号１に示される配列、配列番号３に示される配列、ならびに配列番号１および配列番号３に示される両方の配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体；（５）ハイブリドーマ細胞株５．９または１２．１２によって産生されるモノクローナル抗体に結合し得るエピトープに結合するモノクローナル抗体；（６）配列番号１０または配列番号１２に示されるアミノ酸配列の残基８２〜８７を含むエピトープへ結合するモノクローナル抗体；（７）競合的結合アッセイにおいてモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２と競合するモノクローナル抗体；ならびに（８）ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体あるいは前記項目（１）〜（７）の前記モノクローナル抗体の抗原結合性フラグメントであるモノクローナル抗体、ここで該フラグメントは、ヒトＣＤ４０抗原へ特異的に結合する能力を保持している。
【０１４１】
当業者は、本明細書中に記載の抗体およびこれらの抗体の抗原結合性フラグメントが、当該分野において周知の方法を使用して組換えで作製されそして本明細書以下で記載される抗体およびその抗原結合性フラグメントを含み、そして例えば、組換えで作製されたモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２を含むことを認識する。
【０１４２】
さらなるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体としては、５Ｄ１２、３Ａ８および３Ｃ６と呼ばれるモノクローナル抗体が挙げられ、これらは、それぞれＡＴＣＣアクセッション番号ＨＢ  １１３３９、ＨＢ  １２０２４およびＨＢ  １１３４０を有するハイブリドーマによって分泌される。例えば、米国特許第６，３１５，９９８号を参照のこと；その全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
【０１４３】
他のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、当該分野において公知である。例えば、米国特許出願公開番号２００２０１４２３５８および２００３００５９４２７に開示されるＦ４−４６５という名のハイブリドーマによって産生されるヒト抗ＣＤ４０抗体を参照のこと；それらの全体が参照により本明細書中に組み込まれる。Ｆ４−４６５は、ＨＡＣマウスから得られ（Ｋｕｒｏｉｗａ  ｅｔ  ａｌ（２０００）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１０：１０８６（２０００））、そしてしたがってヒトラムダ軽鎖を発現する。
【０１４４】
（アンタゴニスト抗−ＣＤ４０Ｌ抗体）
ＣＤ４０Ｌへ結合しそしてそれによってＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用またはＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達に干渉する抗体は、当該分野において公知である。例としては、国際特許公開ＷＯ９５／０６６６６に開示されるものが挙げられるが、これらに限定されず、その内容は、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる。具体例としては、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．２０１１０−２２０９に寄託され、そしてそれぞれＡＴＣＣアクセッション番号ＨＢ１１７１３およびＨＢ１１７１２が付与された、それぞれ、８９−７６および２４−３１ハイブリドーマによって産生される、８９−７６および２４−３１と言う名のアンタゴニスト抗ＣＤ４０Ｌ抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４５】
抗体の作製
本発明の方法における使用のための抗体、例えば、本明細書中に開示されるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、および目的のバイオマーカーまたは他の臨床的に有用な予測マーカーへ特異的に結合する任意の抗体は、当業者に公知の任意の抗体産生方法を使用して作製され得る。したがって、ポリクローナル血清が従来の方法によって調製され得る。一般的に、目的の抗原（例えば、ＣＤ４０抗原またはＣＤ４０Ｌ抗原）を含有する溶液が、先ず、好適な動物、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、またはヤギを免疫化するために使用され得る。ウサギまたはヤギが、得られ得る血清の量、ならびに標識された抗ウサギおよび抗ヤギ抗体の利用可能性に起因して、ポリクローナル血清の調製のために好ましい。
【０１４６】
ポリクローナル血清は、トランスジェニック動物、好ましくは、ヒト免疫グロブリン座を有するマウスにおいて、調製され得る。好ましい実施形態において、目的のタンパク質（例えば、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌ）を発現するＳｆ９細胞が、免疫原として使用される。生理食塩水中において、好ましくはフロイント完全アジュバント等のアジュバント中において、該抗原含有溶液を混合または乳化し、そして該混合液または乳化液を非経口的に（一般的に、皮下または筋肉内に）注射することによって、免疫化はまた行われ得る。５０−２００μｇ／注射の用量が典型的に十分である。免疫化は、一般的に、好ましくはフロイント完全アジュバントを使用して、生理食塩水中の該タンパク質の１以上の注射で、２〜６週間、高められる。あるいは、本発明の目的のためにインビボ免疫化と等価であると考えられる場合、当該分野に公知の方法を使用してインビトロ免疫化によって、抗体を作製してもよい。ガラスまたはプラスチック容器へ免疫化された動物を出血させ（ｂｌｅｅｄ）、血液を２５℃で１時間インキュベートし、続いて４℃で２〜１８時間インキュベートすることによって、ポリクローナル抗血清が得られる。血清は遠心分離（例えば、１０分間１，０００×ｇ）によって回収される。１出血当たり約２０〜５０ｍＬが、ウサギから得られ得る。
【０１４７】
Ｓｆ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞の作製は、米国特許第６，００４，５５２号に開示されており、これは参照により本明細書中に組み込まれる。ＣＤ４０の場合、手短に言えば、ヒトＣＤ４０をコードする配列が、トランスファーウイルスを使用してバキュロウイルスへ組換えられた。該プラスミドが、野生型バキュロウイルスＤＮＡと共に、Ｓｆ９細胞へ共トランスフェクトされた。組換えバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞が同定され、そしてクローン化で精製された。
【０１４８】
好ましくは、抗体は、性質がモノクローナルである。「モノクローナル抗体」によって、実質的に均一の抗体の母集団から得られる抗体が意図され、即ち、該母集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る可能性のある自然に生じる突然変異を除けば同一である。該用語は、抗体の種または供給源に関して限定されない。該用語は、完全な免疫グロブリン、ならびにフラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖおよび抗体の抗原結合性機能を保持する他のものを包含する。モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、単一の抗原部位、例えば、抗ＣＤ４０抗体または抗ＣＤ４０Ｌ抗体の場合、それぞれ、ＣＤ４０細胞表面抗原またはＣＤ４０Ｌ細胞表面抗原に対して指向されている。さらに、種々の決定基（エピトープ）に指向される種々の抗体を典型的に含む従来の（ポリクローナル）抗体調製とは対照的に、各ポリクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基へ指向される。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な母集団の抗体から得られるという抗体の特徴を示し、そして任意の特定の方法によって抗体の作製が必要とされると解釈されない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製されても、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）によって作製されてもよい。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７；および米国特許第５，５１４，５４８号に記載される技術を使用して、ファージ抗体ライブラリから単離されてもよい。
【０１４９】
「エピトープ」によって、抗体が作製されそして抗体が結合する抗原性分子の部分が意図される。エピトープは、線形アミノ酸残基（即ち、エピトープ内の残基が、線形様式で、１つずつ連続的に配置されている）、非線形アミノ酸残基（本明細書中において「非線形エピトープ」と呼ばれ；これらのエピトープは、連続的に配置されていない）、または線形および非線形アミノ酸残基の両方を含み得る。
【０１５０】
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９６の方法、またはその修飾法を使用して作製され得る。典型的に、マウスが、抗原を含有する溶液で免疫化される。生理食塩水中において、好ましくはフロイント完全アジュバント等のアジュバント中において、抗原含有溶液を混合または乳化し、そして該混合液または乳化液を非経口的に注射することによって、免疫化は行われ得る。当該分野において公知の任意の免疫化法が、本発明のモノクローナル抗体を得るために使用され得る。動物の免疫化後、脾臓（および必要に応じて、いくつかの大きなリンパ節）が除去され、そして単一細胞へ分離される。脾臓細胞は、目的の抗原でコーティングされたプレートまたはウェルへ細胞懸濁液を適用することによって、スクリーニングされ得る。前記抗原に特異的な免疫グロブリンが結合されたＢ細胞発現膜は、該プレートに結合し、そして洗い流されない。得られるＢ細胞、または全ての分離される脾臓細胞は、次いで、誘導され、メラノーマ細胞と融合され、ハイブリドーマが作製され、そして選択培地において培養される。得られる細胞は、連続希釈によりめっきされ、そして目的の抗原へ特異的に結合する（そして無関係の抗原へ結合しない）抗体の産生についてアッセイされる。次いで、選択されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を分泌するハイブリドーマが、インビトロ（例えば、培養瓶または中空繊維リアクターにおいて）またはインビボ（マウス中の腹水として）で培養される。
【０１５１】
本発明の方法における使用のための抗体、例えば、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはアンタゴニスト抗ＣＤ４０Ｌ抗体が、組換えＤＮＡ法を使用して作製される場合、該モノクローナル抗体をコードするＤＮＡが、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子へ特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離されそして配列決定される。本明細書中に記載のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単離されると、ＤＮＡは、発現ベクター中へ配置され得、これは次いで、宿主細胞（例えば、大腸菌細胞、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはそうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないメラノーマ細胞）へトランスフェクトされ、組換え宿主細胞中におけるモノクローナル抗体の合成が得られる。抗体をコードするＤＮＡの細菌中における組換え発現についての総説としては、Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２５６およびＰｈｉｃｋｔｈｕｎ（１９９２）  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．１３０：１５１が挙げられる。あるいは、抗体は、米国特許第５，５４５，４０３号；第５，５４５，４０５号；および第５，９９８，１４４号に開示されるように、ＣＨＯ細胞株等の細胞株中において産生され得る；これらは、参照により本明細書中に組み込まれる。手短に言えば、細胞株は、それぞれ軽鎖および重鎖を発現し得るベクターでトランスフェクトされる。別個のベクター上の２つのタンパク質をトランスフェクトすることによって、キメラ抗体が作製され得る。別の利点は、抗体の正しいグリコシル化である。
【０１５２】
ある実施形態において、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９抗体、あるいはそれらの抗原結合性フラグメントが、マーカーとしてグルタミン合成酵素を使用する、ＧＳ遺伝子発現系（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，Ｎｅｗ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ）を使用してＣＨＯ細胞中において産生される。また、米国特許第５，１２２，４６４号；第５，５９１，６３９号；第５，６５８，７５９号；第５，７７０，３５９号；第５，８２７，７３９号；第５，８７９，９３６号；第５，８９１，６９３号；および第５，９８１，２１６号を参照のこと；これらの内容は、それらの全体が、参照により本明細書中に組み込まれる。
【０１５３】
さらに、本発明の方法における使用のための抗体は、所望の結合特性を有するキメラ抗体であり得る。したがって、例えば、本発明の方法における使用のためのキメラ抗ＣＤ４０抗体は、本明細書中に記載のＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体の結合特性を有し得る。「キメラ」抗体によって、最も好ましくは組換えデオキシリボ核酸技術を使用して誘導され、かつ、ヒト（免疫学的に「関連する」種、例えば、チンパンジーを含む）および非ヒト成分の両方を含む抗体が意図される。したがって、キメラ抗体の定常領域が、最も好ましくは、天然ヒト抗体の定常領域と実質的に同一であり；キメラ抗体の可変領域が、最も好ましくは、非ヒト供給源から誘導され、そして目的の抗原（例えば、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌ抗原）に対して所望の抗原特異性を有する。非ヒト供給源は、ヒト抗原またはヒトＣＤ４０抗原を含む材料に対する抗体を作製するために使用され得る任意の脊椎動物供給源であり得る。このような非ヒト供給源としては、げっ歯類（例えば、ウサギ、ラット、マウス等；例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと；これは参照により本明細書中に組み込まれる）および非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など；例えば、米国特許第５，７５０，１０５号および第５，７５６，０９６号を参照のこと；これらは参照により本明細書中に組み込まれる）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中において使用される場合、句「免疫学的に活性な」は、例えばキメラ抗ＣＤ４０抗体またはキメラ抗ＣＤ４０Ｌ抗体を参照して使用される場合、それぞれ、ヒトＣＤ４０またはヒトＣＤ４０Ｌへ結合するキメラ抗体を意味する。
【０１５４】
「ヒト化」によって、非ヒト免疫グロブリン配列から誘導される最小限の配列を含有する抗体の形態が意図される。大部分について、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、ここで、該レシピエントの超可変領域（相補性決定領域またはＣＤＲとしても公知）由来の残基が、所望の特性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類等の非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基によって置換されている。句「相補性決定領域」は、天然免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性および特異性を一緒に規定するアミノ酸配列をいう。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ（１９８７）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ（１９９１）  Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）を参照のこと。句「定常領域」は、エフェクター機能を与える抗体分子の部分をいう。ヒト疾患の治療におけける使用のための非免疫原性抗体を作製することに関する以前の研究において、マウス定常領域が、ヒト定常領域によって置換された。被験者（ｓｕｂｊｅｃｔ）ヒト化抗体の定常領域が、ヒト免疫グロブリンから誘導された。しかし、これらのヒト化抗体は、依然として、ヒトにおいて望まれないそして潜在的に危険な免疫応答を生じ、そして親和性の損失が存在した。本発明の方法における使用のための、ヒト化抗体、例えば、ヒト化抗ＣＤ４０抗体は、目的の親抗体、例えば、本明細書中に記載のＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体によって示されるものと類似の結合特性を有する。
【０１５５】
ヒト化は、ヒト抗体の対応の配列の代わりにげっ歯類または突然変異げっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列を使用することによって、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６）に従って本質的に行われ得る。また、米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６１号；第５，６９３，７６２号；第５，８５９，２０５号を参照のこと；参照により本明細書中に組み込まれる。ある場合において、ヒト免疫グロブリンの１以上の可変領域のフレームワーク領域中の残基が、対応の非ヒト残基によって置換される（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６１号；第５，６９３，７６２号；および第６，１８０，３７０号を参照のこと）。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体において見られない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体性能をさらに改善するために（例えば、所望の親和性を得るために）行われる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、そして典型的には２つの可変ドメインから実質的に全て構成されてなり、ここで、全てまたは実質的に全ての超可変領域が、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、そして全てまたは実質的に全てのフレームワーク領域が、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、必要に応じて、さらに、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にヒト免疫グロブリンのもの、の少なくとも部分を含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）  Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９；およびＰｒｅｓｔａ（１９９２）  Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６を参照のこと；参照により本明細書中に組み込まれる。したがって、このような「ヒト化」抗体は、実質的にヒト可変ドメイン未満（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ  ａｎ  ｉｎｔａｃｔ  ｈｕｍａｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ）が非ヒト種由来の対応の配列によって置換されている抗体を含み得る。実際には、ヒト化抗体は、典型的に、いくつかのＣＤＲ残基および場合によってはいくつかのフレームワーク残基が、げっ歯類抗体における類似部位由来の残基で置換されているヒト抗体である。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６１号；第５，６９３，７６２号；第５，８５９，２０５号を参照のこと。また、米国特許第６，１８０，３７０号、および国際公開番号ＷＯ０１／２７１６０を参照のこと；ここで、ヒト化抗体および所定の抗原に対する改善された親和性を有するヒト化抗体を作製するための技術が開示されている。
【０１５６】
本発明はまた、不活性化内因性免疫グロブリン（Ｉｇ）座を特徴とする、非ヒト哺乳動物宿主、より詳細にはトランスジェニックマウス中において産生された、異種または修飾化抗体を使用して行われ得る。このようなトランスジェニックマウスにおいて、宿主免疫グロブリンの軽鎖および重鎖サブユニットの発現のためのコンピテント内因性遺伝子が、非機能的にされており、そして類似のヒト免疫グロブリン座で置換されている。これらのトランスジェニック動物は、軽鎖または重鎖宿主免疫グロブリンサブユニットの実質的に非存在下で、ヒト抗体を産生する。例えば、米国特許第５，８７７，３９７号および第５，９３９，５９８号を参照のこと；参照により本明細書中に組み込まれる。
【０１５７】
ある実施形態において、例えばＣＤ４０に対する完全ヒト抗体は、トランスジェニックマウスを免疫化することによって得られる。１つのこのようなマウスは、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術（Ａｂｇｅｎｉｘ；Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して得られ、そして米国特許第６，０７５，１８１号、第６，０９１，００１号、および第６，１１４，５９８号に開示されており、これらの全てが参照により本明細書中に組み込まれる。本明細書中に開示される抗体を作製するために、ヒトＩｇＧ１重鎖座およびヒトＫ軽鎖座が遺伝子導入されたマウスが、ヒトＣＤ４０を発現するＳｆ９細胞で免疫化された。マウスはまた、他のアイソタイプについてトランスジェニックであり得る。本発明の方法において有用な完全なヒト抗ＣＤ４０抗体は、本明細書中に開示されるＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体によって示されるものと類似の結合特性によって特徴付けられる。
【０１５８】
目的の特定の抗体（例えば、抗ＣＤ４０抗体または抗ＣＤ４０Ｌ抗体）のフラグメントが、それらが全長抗体の所望の親和性を保持する限り、本発明の方法における使用に好適である。したがって、例えば、抗ＣＤ４０抗体のフラグメントは、ＣＤ４０  Ｂ細胞表面抗原へ結合する能力を保持する。このようなフラグメントは、対応の全長抗体と類似の特性によって特徴付けられる。したがって、例えば、全長アンタゴニスト  抗ＣＤ４０抗体のフラグメントは、ヒト細胞の表面上に発現されたヒトＣＤ４０抗原へ特異的に結合し、そして、ヒトＣＤ４０発現細胞上のＣＤ４０抗原へ結合される場合に、顕著なアゴニスト活性を有さないが、アンタゴニスト活性を示す。このようなフラグメントは、本明細書中において「抗原結合性」フラグメントと呼ばれる。
【０１５９】
抗体の好適な抗原結合性フラグメントは、全長抗体の部分、一般的にはその抗原結合性または可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメントならびに一本鎖抗体分子が挙げられるが、これらに限定されない。「Ｆａｂ」によって、軽鎖および重鎖の部分から構成されてなる免疫グロブリンの一価の抗原結合性フラグメントが意図される。Ｆ（ａｂ’）２によって、両方の軽鎖および両方の重鎖の部分を含む免疫グロブリンの二価の抗原結合性フラグメントが意図される。「一本鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントによって、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含むフラグメントが意図され、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。例えば、米国特許第４，９４６，７７８号、第５，２６０，２０３号、第５，４５５，０３０号、および第５，８５６，４５６号を参照のこと；参照により本明細書中に組み込まれる。一般的に、Ｆｖポリペプチドは、さらに、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦｖに抗原結合のために望ましい構造を形成させるＶＨとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  （１９９４）  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｖｏｌ．１１３，ｅｄ．Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９−３１５を参照のこと。本明細書中に開示されるアンタゴニスト  抗ＣＤ４０抗体の抗原結合性フラグメントはまた、本明細書以下に記載されるように、細胞毒へ結合されて標的細胞の死を生じさせ得る。
【０１６０】
抗体または抗体フラグメントは、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）および米国特許第５，５１４，５４８号に記載の技術を使用して作製される抗体ファージライブラリから単離され得る。Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７は、ファージライブラリを使用しての、マウスおよびヒト抗体それぞれの単離を記載している。引き続いての刊行物は、チェイン・シャッフリング（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３）、ならびに非常に大きなファージライブラリを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染およびインビボ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６）によって高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の作製を記載する。したがって、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離についての伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術の実行可能な代替法である。
【０１６１】
種々の技術が、抗体フラグメントの作製のために開発されてきた。伝統的に、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解消化によって誘導された（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）およびＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１を参照のこと）。しかし、これらのフラグメントは、現在、組換え宿主細胞によって直接産生され得る。例えば、抗体フラグメントは、上述の抗体ファージライブラリから単離され得る。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを形成するために、大腸菌から直接回収されそして化学的にカップリングされ得る（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７）。別のアプローチによれば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、組換え宿主細胞培養物から直接単離され得る。抗体フラグメントの作製のための他の技術は、当業者に明らかである。
【０１６２】
本発明の方法における使用のためのアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体としては、以下が挙げられる：本明細書中に開示されるＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体、ならびにこの抗体とは異なるが該ＣＤＲを保持する抗体；１以上のアミノ酸付加、欠失、または置換を有する抗体、ここで、アンタゴニスト活性は、Ｂ細胞増殖および／または分化の阻害によって測定される。本発明はまた、脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）抗体、特に脱免疫化アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体を含み、これは、例えば、国際公開番号ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００３４３１７に記載されるように作製され得；参照により本明細書中に組み込まれる。この様式において、本発明のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体中の残基は、ヒトＣＤ４０発現細胞に対するそれらのアンタゴニスト活性を保持しつつ、ヒトに対する非免疫原性またはより低い免疫原性を該抗体に与えるように修飾され、ここで、このような活性は本明細書中の他の箇所に記載のアッセイによって測定される。目的の抗体、例えば、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはアンタゴニスト抗ＣＤ４０Ｌ抗体、あるいはそれらのフラグメントを含む融合タンパク質もまた、本発明の範囲内にあり、この融合タンパク質は、当該分野において公知であるように、合成されるかまたは対応のポリヌクレオチドベクターから発現され得る。このような融合タンパク質は、本明細書中の他の箇所に記載されるように、抗体の複合化を参照して説明される。
【０１６３】
目的の結合特異性を有する任意の公知の抗体は、例えば、特許公開番号ＥＰ  ０  ９８３  ３０３  Ａ１、ＷＯ００／３４３１７およびＷＯ９８／５２９７６に記載の方法を使用して作製される配列変化を有し得；参照により本明細書中に組み込まれる。例えば、ＣＤＲ中の配列は、抗体をＩＩ型ＭＨＣへ結合させ、そして望まれないヘルパーＴ細胞応答を誘導し得る。保存的置換は、該抗体に結合活性を保持させ得るが、望まれないＴ細胞応答を誘導するその能力を失わせ得る。任意のこのような保存的または非保存的置換は、本明細書中の他の箇所に記載されるもの等の分野で認識される方法を使用して行われ得、そして得られる抗体はまた、本発明の方法において使用され得る。変異体抗体は、本明細書中に記載の方法を使用して、特定の活性、例えば、アンタゴニスト活性、親和性、および特異性について、慣用的に試験され得る。
【０１６４】
抗ＣＤ４０治療剤がアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体である場合、任意の上述の方法、または本明細書中に開示されていない任意の他の方法によって作製されるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９抗体と類似の様式で使用され得、ここで、それは、以下の生物学的活性の少なくとも１つを有する：インビトロおよび／またはインビボにおいて：Ｔ細胞によって刺激される正常ヒト末梢Ｂ細胞による免疫グロブリン分泌の阻害；ＣＤ４０Ｌ発現細胞または可溶性ＣＤ４０リガンド（ｓＣＤ４０Ｌ）によって刺激される正常ヒト末梢Ｂ細胞の生存および／または増殖の阻害；ジャーカトＴ細胞によって刺激される正常ヒト末梢Ｂ細胞の生存および／または増殖の阻害；ｓＣＤ４０Ｌまたは固相ＣＤ４０Ｌによって刺激される任意の細胞中における「生存」抗アポトーシス細胞内の阻害；ならびに、ｓＣＤ４０Ｌまたは固相ＣＤ４０Ｌとの結合時の任意の細胞中におけるＣＤ４０シグナル変換の阻害、ＣＤ４０保有標的細胞またはＣＤ４０への同族リガンドを有する細胞（Ｔ細胞およびＢ細胞を含むが、これらに限定されない）の欠失、アネルギーおよび／または耐性誘導、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の増殖または活性化の誘導（例えば、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ干渉によるドナー同種抗原特異的組織拒絶、ｖａｎ  Ｍａｕｒｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：５４０１−５４０４を参照のこと）、任意の機構による細胞傷害性（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、増殖のダウンレギュレーション、および／または標的細胞中のアポトーシスが含まれるが、これらに限定されない）、標的細胞サイトカイン分泌および／または細胞表面分子発現の調節、ならびにそれらの組み合わせ。このような生物学的活性についてのアッセイは、本明細書、ならびに２００３年１１月４日、２００３年１１月２６日、および２００４年４月２７日に出願され、そしてそれぞれ米国特許出願第６０／５１７，３３７号（代理人整理番号ＰＰ２０１０７．００１（０３５７８４／２５８４４２））、第６０／５２５，５７９号（代理人整理番号ＰＰ２０１０７．００２（０３５７８４／２７１５２５））、および第６０／５６５，７１０号（代理人整理番号ＰＰ２０１０７．００３（０３５７８４／２７７２１４））が与えられた「Ａｎｔａｇｏｎｉｓｕｔ  Ａｎｔｉ−ＣＤ４０  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ」という表題の仮出願、ならびに２００４年１１月４日に出願され、「Ａｎｔａｇｏｎｉｓｕｔ  Ａｎｔｉ−ＣＤ４０  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ」という表題がまた付けられた国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３７１５２（代理人整理番号ＰＰ２０１０７．００４（０３５７８４／２８２９１６））に記載されるように行われ得る；これらの各々の内容は、それらの全体が、参照により本明細書中に組み込まれる。また、Ｓｃｈｕｌｔｚｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：８２００−８２０４；Ｄｅｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２：６−１５；Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：６８８−６９７；Ｎｏｅｌｌｅ（１９９８）  Ａｇｅｎｔｓ  Ａｃｔｉｏｎｓ  Ｓｕｐｐｌ．４９：１７−２２；Ｌｅｄｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３：７７−８６；Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３：１２；Ｋｗｅｋｋｅｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７９：４３９−４４４；ならびに米国特許第５，６７４，４９２号および第５，８４７，０８２号に記載のアッセイを参照のこと；参照により本明細書中に組み込まれる。
【０１６５】
本明細書中に記載のＣＤ４０抗原エピトープに特異的なアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体を検出するための代表的なアッセイは、「競合的結合アッセイ」である。競合的結合アッセイは、未知物質が、その特異的抗体への標識された既知のリガンドの結合を該するそれらの能力によって検出および定量される、血清学的アッセイである。これはまた、競合的阻害アッセイと呼ばれる。代表的な競合的結合アッセイにおいて、標識されたＣＤ４０ポリペプチドが、例えば、本発明のモノクローナル抗体の１以上のエピトープに対して惹起されたモノクローナル抗体と組み合わせて、サンプル中の候補抗体によって沈降される。目的のエピトープと特異的に反応する抗ＣＤ４０抗体は、ＣＤ４０タンパク質または目的のＣＤ４０タンパク質の特定のエピトープを含むタンパク質のフラグメントに対して作製された一連の抗体をスクリーニングすることによって、同定され得る。例えば、ヒトＣＤ４０について、目的のエピトープは、配列番号９に記載の配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１５２８５４をまた参照のこと）によってコードされる、配列番号１０に記載のヒトＣＤ４０のショートアイソフォーム（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿６９０５９３を参照のこと）、あるいは配列番号１１に記載の配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ６０５９２およびＮＭ＿００１２５０を参照のこと）によってコードされる、配列番号１２に記載のヒトＣＤ４０のロングアイソフォーム（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ４３０４５およびＮＰ＿００１２４１を参照のこと）の線形および／または非線形アミノ酸残基を含む。あるいは、前もって同定された好適なアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体を用いての競合的結合アッセイが、前もって同定された抗体に匹敵するモノクローナル抗体を選択するために、使用され得る。
【０１６６】
このようなイムノアッセイにおいて使用される抗体は、標識されていても標識されていなくてもよい。非標識抗体は、凝集反応において利用され得；標識抗体は、広範囲の標識を利用する、広範囲のアッセイにおいて使用され得る。抗ＣＤ４０抗体と目的のエピトープとの抗体−抗原複合体の形成の検出は、該抗体へ検出可能な物質を結合させることによって、促進され得る。好適な検出手段としては、放射性核種、酵素、補酵素、蛍光体（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒｓ）、化学発光体（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒｓ）、色原体、酵素基質または補因子、酵素阻害剤、補欠分子族複合体、フリーラジカル、粒子、色素等の標識の使用を含む。好適な酵素の例としては、ホースラディシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；好適な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；好適な蛍光材料の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリンが挙げられ；発光材料の例は、ルミノールであり；生物発光材料の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ；好適な放射性材料の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、または３Ｈが挙げられる。このような標識された試薬は、種々の周知のアッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫法、例えば、ＥＬＩＳＡ、蛍光免疫測定法等において使用され得る。例えば、米国特許第３，７６６，１６２号；第３，７９１，９３２号；第３，８１７，８３７号；および第４，２３３，４０２号を参照のこと。
【０１６７】
任意の前述の抗体、例えば、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗体フラグメントは、本発明の方法における使用の前に、複合化され得る。複合化された抗体を作製する方法は、当該分野において公知である。したがって、抗体は、間接的な標識化または間接的な標識化アプローチを使用して、標識され得る。「間接的な標識化」または「間接的な標識化アプローチ」によって、キレート剤が抗体へ共有結合され、そして少なくとも１つの放射性核種が該キレート剤へ挿入されることが意図される。例えば、Ｓｒｉｖａｇｔａｖａ  ａｎｄ  Ｍｅａｓｅ（１９９１）  Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏ．１８：５８９−６０３に記載のキレート剤および放射性核種を参照のこと；参照により本明細書中に組み込まれる。好適な標識としては、フルオロフォア、発色団、放射性原子（特に、３２Ｐおよび１２５Ｉ）、高電子密度試薬、酵素、および特異的結合パートナーを有するリガンドが挙げられる。酵素は典型的にそれらの活性によって検出される。例えば、ホースラディシュペルオキシダーゼは、分光光度計で定量可能な、青色色素へ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を変換するその能力によって通常検出される。「特異的結合パートナー」は、例えば抗原およびそれに特異的なモノクローナル抗体の場合のように、高特異性を有するリガンド分子を結合し得るタンパク質をいう。他の特異的結合パートナーとしては、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧおよびプロテインＡ、ならびに当該分野における多数のレセプター−リガンドカップルが挙げられる。同一の標識がいくつかの異なる様式で役立ち得るため、上記の説明は種々の標識を別個のクラスへ分類するように意味されないことが、理解される。例えば、１２５Ｉは、放射性標識または高電子密度試薬として役立ち得る。ＨＲＰは、酵素またはｍＡｂについての抗原として役立ち得る。さらに、所望の効果のために種々の標識が組み合され得る。例えば、ｍＡｂおよびアビジンはまた、本発明の実施において標識を必要とし：したがって、ｍＡｂをビオチンで標識し、そしてその存在を、１２５Ｉで標識されたアビジンで、またはＨＲＰで標識された抗ビオチンｍＡｂで検出してもよい。他の置換および可能性は、当業者に容易に明らかであり、そして本発明の範囲内の等価物として考えられる。
【０１６８】
あるいは、目的の抗体、例えば、抗ＣＤ４０抗体は、「直接的な標識化」または「直接的な標識化アプローチ」を使用して標識され得、ここで、放射性核種が抗体へ（典型的にアミノ酸残基を介して）直接共有結合される。好ましい放射性核種は、Ｓｒｉｖａｇｔａｖａ  ａｎｄ  Ｍｅａｓｅ（１９９１）（前述）に提供されている。間接的な標識化アプローチが特に好ましい。また、例えば、国際出願番号ＷＯ００／５２０３１およびＷＯ００／５２４７３、ここで、放射性標識を抗体へ結合するためにリンカーが使用されている；ならびに米国特許出願第６，０１５，５４２号に記載の抗ＣＤ４０抗体の標識化形態を参照のこと；参照により本明細書中に組み込まれる。
【０１６９】
抗体の変異体
本発明の方法は、当該分野に公知の抗体の変異体を使用して行われ得る。このような変異体は、親抗体の所望の結合特性を保持する。したがって、例えば、試験される抗ＣＤ４０治療剤がアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体である場合、変異体抗体は、親のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９抗体の、結合特性を保持する。抗体変異体を作製するための方法は、当該分野において一般的に利用可能である。下記の議論はアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の変異体を参照するが、該方法は、目的の任意の抗体、例えば、本明細書中に開示されるバイオマーカーまたは臨床的に有用な予測マーカーへ特異的に結合する抗体に一般的に適用可能である。
【０１７０】
例えば、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、本明細書中に記載のＣＨＩＲ−５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体）のアミノ酸配列変異体は、目的の抗体をコードするクローン化ＤＮＡ配列における突然変異によって、作製され得る。突然変異誘導およびヌクレオチド配列改変のための方法は、当該分野において周知である。例えば、Ｗａｌｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇａａｓｔｒａ，ｅｄｓ．（１９８３）  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；米国特許第４，８７３，１９２号；ならびにそれらにおいて引用される文献参照のこと；参照により本明細書中に組み込まれる。目的のポリペプチドの生物学的活性に影響を与えない好適なアミノ酸置換についてのガイダンスは、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９７８）  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）におけるモデルにおいて見られ得、参照により本明細書に組み込まれる。保存的置換、例えば、１つのアミノ酸を類似の特性を有する別のもので交換することが、好ましいかもしれない。保存的置換の例としては、Ｇｌｙ⇔Ａｌａ、Ｖａｌ⇔Ｉｌｅ⇔Ｌｅｕ、Ａｓｐ⇔Ｇｌｕ、Ｌｙｓ⇔Ａｒｇ、Ａｓｎ⇔Ｇｌｎ、およびＰｈｅ⇔Ｔｒｐ⇔Ｔｙｒが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７１】
目的の抗体（例えば、目的のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体ポリペプチド）の変異体を作製することにおいて、変異体が、所望の活性（即ち、類似の結合親和性）を有し続け、そして、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の場合、ヒト細胞の表面上に発現されるヒトＣＤ４０抗原へ特異的に結合し得、そしてヒトＣＤ４０発現細胞上のＣＤ４０抗原け結合される場合、顕著なアゴニスト活性を有しないがアンタゴニスト活性を示すように、修飾が行われる。明らかに、変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡにおいてなされた任意の突然変異は、読み取り枠の外に該配列を配置してはならず、そして好ましくは、第２のｍＲＮＡ構造を生じさせ得る相補領域を作製しない。例えば、ＥＰ特許出願公開第７５，４４４号を参照のこと。
【０１７２】
さらに、抗体、例えば、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の定常領域は、多数の様式でエフェクター機能を変化させるように突然変異され得る。例えば、米国特許第６，７３７，０５６Ｂ１および米国特許出願公開第２００４／０１３２１０１Ａ１号を参照のこと、これらは、Ｆｃ受容体への抗体結合を最適にするＦｃ変異を開示する。
【０１７３】
好ましくは、参照抗体、例えば、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の変異体は、該参照抗体、例えば、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体分子、例えば、本明細書中に記載のＣＨＩＲ−５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体について、または該参照抗体分子のより短い部分に対して、少なくとも７０％または７５％配列同一性、好ましくは少なくとも８０％または８５％配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％または９５％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。より好ましくは、該分子は、少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を共有する。本発明の目的について、パーセント配列同一性は、１２のギャップオープンペナルティーおよび２のギャップエクステンションペナルティーを含むアフィンギャップサーチ（６２のＢＬＯＳＵＭマトリクス）を使用して、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジーサーチアルゴリズムを使用して、同定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジーサーチアルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９において教示されている。変異体は、わずか１〜１５アミノ酸残基、わずか１〜１０アミノ酸残基、例えば６〜１０、わずか５、わずか４、３、２または１アミノ酸残基だけ、例えば、参照抗体、例えば、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体と相違しているかもしれない。
【０１７４】
２つのアミノ酸配列の最適なアラインメントに関して、変異体アミノ酸配列の連続セグメントは、参照アミノ酸配列に関して、追加のアミノ酸残基または欠失されたアミノ酸残基を有し得る。参照アミノ酸配列への比較のために使用される連続セグメントは、少なくとも２０の連続アミノ酸残基を含み、そして３０、４０、５０、またはそれ以上のアミノ酸残基であり得る。保存的残基置換またはギャップに関連する配列同一性についての補正が、行われ得る（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジーサーチアルゴリズムを参照のこと）。
【０１７５】
治療方法
本明細書中に記載のエクスビボ予測アッセイはまた、ＣＤ４０発現細胞に関連する炎症性疾患および／または自己免疫疾患についての治療の必要がある被験者についての治療方法において使用され得る。したがって、ある実施形態において、エクスビボ予測アッセイは、候補被験者において行われ、そしてアッセイの結果が、抗ＣＤ４０治療剤での治療で好ましい応答を予測する場合、次いで、該被験者はその抗ＣＤ４０治療剤で処置される。上述されるように、エクスビボ予測アッセイから得られた情報は、抗ＣＤ４０治療剤での利益に関して決定を与えるために単独で使用され得る。あるいは、エクスビボ予測アッセイは、本明細書中に記載される１以上のＣＤ４０関連因子の発現レベルまたは発現の有無についてスクリーニングする予測アッセイ；特定の炎症性または自己免疫疾患についての１以上の臨床的に有用な予測マーカー（例えば、本明細書中に記載されるような臨床的に有用な予測マーカー）の発現レベルまたは発現の有無についてスクリーニングする予測アッセイ、あるいは両方と組み合わせて使用され得る。
【０１７６】
この様式において、本発明のエクスビボ予測アッセイを単独でまたは本明細書中に記載の他の予測アッセイと組み合わせて使用して同定された被験者は、候補被験者における疾患の治療について有利であるとスクリーニングプロセスにおいて同定された１以上の治療有効用量の抗ＣＤ４０治療剤でさらに治療され得る。「治療」は、被験者への抗ＣＤ４０治療剤の適用または投与、あるいは被験者由来の単離された組織または細胞株への抗ＣＤ４０治療剤の適用または投与として本明細書中において規定され、ここで、該被験者は、自己免疫疾患および／または炎症性疾患、自己免疫疾患および／または炎症性疾患に関連する症状、あるいは自己免疫疾患および／または炎症性疾患の発症への素因を有し、ここで、目的は、自己免疫疾患および／または炎症性疾患、自己免疫疾患および／または炎症性疾患の関連症状、あるいは自己免疫疾患および／または炎症性疾患の発症への素因を、治療、治癒、緩和、軽減、変化、緩和、改善、改善するか、またはこれに影響を与えることである。「治療」によって、被験者への抗ＣＤ４０治療剤を含む薬学的組成物の適用または投与、あるいは被験者由来の単離された組織または細胞株へのアンタゴニスト抗ＣＤ４０治療剤を含む薬学的組成物の適用または投与が意図され、ここで、該被験者は、自己免疫疾患および／または炎症性疾患、自己免疫疾患および／または炎症性疾患に関連する症状、あるいは自己免疫疾患および／または炎症性疾患の発症への素因を有し、ここで、目的は、自己免疫疾患および／または炎症性疾患、自己免疫疾患および／または炎症性疾患の関連症状、あるいは自己免疫疾患および／または炎症性疾患の発症への素因を、治療、治癒、緩和、軽減、変化、緩和、改善、改善するか、またはこれに影響を与えることである。
【０１７７】
「抗炎症性活性」によって、炎症の軽減または予防が意図される。本明細書中の他の箇所で記載される少なくとも１つの抗ＣＤ４０治療剤での治療は、自己免疫疾患および／または炎症性疾患の治療に関して有益である生理学的応答を生じさせ、ここで、該疾患は、ＣＤ４０抗原を発現する細胞を含む。本発明の方法は、増殖、活性化等の細胞における表現型変化を防止することにおいて有用であり得る。
【０１７８】
「治療有効用量または量」または「有効量」によって、投与されると、自己免疫疾患および／または炎症性疾患を有する患者の治療に関してポジティブな治療的応答をもたらす抗ＣＤ４０治療剤の量が意図される。本発明のある実施形態において、抗ＣＤ４０治療剤は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、アンタゴニスト抗ＣＤ４０Ｌ抗体、またはそれらの抗原結合性フラグメントであり、そして抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体、またはそれらの抗原結合性フラグメントの治療有効量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、または約７ｍｇ／ｋｇ〜約１２ｍｇ／ｋｇの範囲内にある。該治療方法は、抗ＣＤ４０治療剤、例えば、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、アンタゴニスト抗ＣＤ４０Ｌ抗体、またはその抗原結合性フラグメントの、治療有効量の単回投与あるいは治療有効量の複数回投与を含み得る。
【０１７９】
ある実施形態において、本発明のエクスビボ予測アッセイは、特定の抗ＣＤ４０治療剤での治療に対する応答性または応答性の欠如についての生理学的基準を確定するために、使用され得る。したがって、被験者における炎症性または自己免疫疾患が抗ＣＤ４０治療剤での治療に最初は応答性であり、そして該疾患のＣＤ４０発現細胞がこの治療ラインに対して耐性を生じる場合、該エクスビボ予測アッセイが、どのＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０相互作用がこれらのＣＤ４０発現細胞の耐性に寄与するのかを規定するために、使用され得る。
【０１８０】
ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達のバイオマーカー、即ち、アポトーシス、細胞増殖および生存のバイオマーカー、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達のサイトカインマーカー、ならびに本明細書中に記載のＣＤ４０関連因子はまた、抗ＣＤ４０治療剤での治療の効果をモニタリングするために、単独でまたはそれらのいずれかを組み合わせて、使用され得る。この様式において、抗ＣＤ４０治療剤での治療を受け、上述の予測アッセイを使用して抗ＣＤ４０治療剤での治療の適合性について予めスクリーニングされていてもまたはされていなくてもよい、被験者は、細胞アポトーシス、細胞増殖および生存、ならびに／あるいは１以上のＣＤ４０シグナル伝達経路の少なくとも１つのバイオマーカーの発現のインビボ変化についてモニタリングされ、ここで、抗ＣＤ４０治療剤での治療に続いて、サイトカイン産生が、（抗ＣＤ４０治療剤の作用機序に依存して）必要に応じてモニタリングされる。あるいは、またはさらに、該被験者は、抗ＣＤ４０治療剤での治療に続いて、細胞上の細胞表面ＣＤ４０抗原、細胞上の細胞表面ＣＤ４０Ｌ、循環レベルのｓＣＤ４０および循環レベルのｓＣＤ４０Ｌからなる群から選択される１以上の発現レベルのインビボ変化について、モニタリングされ得る。
【０１８１】
この様式において、第１の生物学的サンプルは、目的の抗ＣＤ４０治療剤での治療前に被験者から得られ、そして１以上のこれらのバイオマーカーおよび／またはＣＤ４０関連因子の発現レベルについてアッセイされ、アッセイされた各因子の発現のベースラインレベルを得る。この第１の生物学的サンプルは、「ベースライン生物学的サンプル」と呼ばれる。同一の組織タイプまたは体液の１以上の引き続いての生物学的サンプルが、該被験者から得られ、そして同一のバイオマーカーおよび／またはＣＤ４０関連因子についてアッセイされ、ここで、該引き続いての生物学的サンプルは、少なくとも１用量の目的の抗ＣＤ４０治療剤の投与に続いて得られる。モニタリングは、任意の所定の治療プロトコルの効果を確認するために、経時での単一のポイントで、または経時での複数のポイントで生じ得、ここで、抗ＣＤ４０治療剤が被験者へ投与される。アッセイされるバイオマーカーに依存して、２つの時点の間のバイオマーカーのレベルの低下または増加が、炎症性または自己免疫疾患の治療における抗ＣＤ４０治療剤の効果を示し得る。モニタリングが１以上のＣＤ４０関連因子の発現レベルの低下を示す場合、このような結果は、炎症性または自己免疫疾患の治療における抗ＣＤ４０治療剤の効果を示し得る。
【０１８２】
したがって、ある実施形態において、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達を遮断するかまたはこれに干渉する抗ＣＤ４０治療剤での被験者の治療の効果が、以下によってモニタリングされる：該被験者由来のベースライン生物学的サンプルを得ること、そして本明細書上記に記載の細胞生存および／またはＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達経路の１以上のバイオマーカーの発現レベルを検出すること；少なくとも１用量の治療剤、例えば、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９）またはそれらの抗原結合性フラグメントを該被験者に投与すること；例えば、約３０分〜約１２時間、約３０分〜約６時間、約３０分〜約４時間、および約１時間〜約４時間を含む、約３０分〜約２４時間内に、該被検者から引き続いての生物学的サンプルを得ること；ならびに、該引き続いての生物学的サンプル中の細胞生存および／またはＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達経路のバイオマーカーの発現レベルを検出すること；ここで、該ベースライン生物学的サンプル中の発現レベルと比較した場合の該引き続いての生物学的サンプル中の発現レベルの低下は、該抗ＣＤ４０治療剤での治療の効果を示す。検出は、本明細書中の他の箇所に開示の方法を含む、当該分野において公知の任意の方法を使用して達成され得る。ある実施形態において、発現レベルは、ベースライン生物学的サンプル中において検出されるものに比べて、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％減少される。少なくとも２５％のベースラインからのパーセント変化（即ち、ベースライン生物学的サンプルに比べて少なくとも２５％の減少）は、抗ＣＤ４０治療剤での効果を示し、少なくとも３０％または少なくとも４０％のパーセント変化によって中間的応答が示される。好ましくは、ベースラインからのパーセント変化は、少なくとも５０％（即ち、ベースライン生物学的サンプルに比べて少なくとも５０％の減少）またはそれ以上である。
【０１８３】
ある実施形態において、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達を遮断するかまたはこれに干渉する抗ＣＤ４０治療剤での被験者の治療の効果が、以下によってモニタリングされる：該被験者由来のベースライン生物学的サンプルを得ること、そして本明細書上記に記載のＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達経路のサイトカインマーカーの発現レベルを検出すること；少なくとも１用量の治療剤、例えば、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９）またはそれらの抗原結合性フラグメントを該被験者に投与すること；投与後、例えば、約２４時間〜約３週間（約４８時間、約７２時間、約１週間、または約２週間を含む）内に、該被検者から引き続いての生物学的サンプルを得ること；ならびに、該引き続いての生物学的サンプル中の細胞生存および／またはＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達経路のバイオマーカーの発現レベルを検出すること；ここで、該ベースライン生物学的サンプル中の発現レベルと比較した場合の該引き続いての生物学的サンプル中の発現レベルの低下は、該抗ＣＤ４０治療剤での治療の効果を示す。検出は、本明細書中の他の箇所に開示の方法を含む、当該分野において公知の任意の方法を使用して達成され得る。さらに、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達によって影響されないサイトカイン（例えば、ＩＬ−１ｂ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−１２；本明細書下記の実験セクションを参照のこと）が、データを標準化するためにコントロールとして使用され得る。ある実施形態において、発現レベルは、ベースライン生物学的サンプル中において検出されるものに比べて、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％減少される。少なくとも２０％のベースラインからのパーセント変化（即ち、ベースライン生物学的サンプルに比べて少なくとも２０％の減少）は、抗ＣＤ４０治療剤での効果を示す。ある実施形態において、血清または血清抽出物を含むベースライン生物学的サンプルは、サイトカインの引き続いての分析のために凍結される。
【０１８４】
他の実施形態において、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達を遮断するかまたはこれに干渉するか、あるいはその作用機序としてＡＤＣＣを有する、抗ＣＤ４０治療剤での被験者の治療の効果は、以下によってモニタリングされる：該被験者由来のベースライン生物学的サンプルを得ること、そして本明細書上記に記載の１以上のバイオマーカーの発現レベルを検出すること；少なくとも１用量の治療剤、例えば、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９）またはそれらの抗原結合性フラグメントを該被験者に投与すること；投与後、例えば、約８時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、または７２時間内に、そして必要に応じて再度、投与から約１週間、約２週間、または約３週間後に、該被検者から引き続いての生物学的サンプルを得ること；ならびに、該引き続いての生物学的サンプル中のアポトーシスのバイオマーカーの発現レベルを検出すること；ここで、該ベースライン生物学的サンプル中の発現レベルと比較した場合の該引き続いての生物学的サンプル中の発現レベルの上昇は、該抗ＣＤ４０治療剤での治療の効果を示す。検出は、本明細書中の他の箇所に開示の方法を含む、当該分野において公知の任意の方法を使用して達成され得る。ある実施形態において、発現レベルは、ベースライン生物学的サンプル中において検出されるものと比べて、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％またはそれ以上、増加される。少なくとも２０％またはそれ以上のベースラインからのパーセント変化（即ち、ベースライン生物学的サンプルに比べて少なくとも２０％の増加）は、抗ＣＤ４０治療剤での効果を示す。
【０１８５】
なお他の実施形態において、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達を遮断するかまたはこれに干渉し、ＡＤＣＣを調節し、あるいは両方を行う、抗ＣＤ４０治療剤での被験者の治療の効果は、以下によってモニタリングされる：該被験者由来のベースライン生物学的サンプルを得ること、そして本明細書上記に記載の１以上のＣＤ４０関連因子（即ち、細胞上の細胞表面ＣＤ４０および／またはＣＤ４０Ｌ、ならびに／あるいは循環レベルのｓＣＤ４０および／またはｓＣＤ４０Ｌ）の発現レベルを検出すること；少なくとも１用量の治療剤、例えば、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９）またはそれらの抗原結合性フラグメントを該被験者に投与すること；例えば、約１日（即ち、２４時間）、２日、３日、４日、または１週間内に、該被検者から引き続いての生物学的サンプルを得ること；ならびに、該引き続いての生物学的サンプル中のＣＤ４０関連因子の発現レベルを検出すること；ここで、該ベースライン生物学的サンプル中の発現レベルと比較した場合の該引き続いての生物学的サンプル中の発現レベルの低下は、該抗ＣＤ４０治療剤での治療の効果を示す。ある実施形態において、発現レベルは、ベースライン生物学的サンプル中において検出されるものに比べて、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％減少される。
【０１８６】
これらのアッセイのいずれか１つまたは組み合わせが、作用機序に依存して、目的の抗ＣＤ４０治療剤での炎症性または自己免疫疾患を有する被験者の治療の効果をモニタリングするために行われ得ることが、認識される。効果が実証されると、引き続いての用量の抗ＣＤ４０治療剤が、推奨される投与レジメンに従って、例えば、毎日、１日おきに、週３回、週２回、週１回、隔週、月１回等に、投与され得る。あるいは、目的のマーカー（即ち、細胞増殖および生存のバイオマーカー、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達経路のバイオマーカー、サイトカインマーカー、ＣＤ４０関連因子、およびそれらの任意の組み合わせ）のインビボ発現レベルが、投与頻度に対してのガイドとして役立ち得、そしてまた、投与される治療有効量についての指標として役立ち得る。この様式において、引き続いての生物学的サンプルが、目的のそれぞれのマーカーの発現レベルの受理可能な減少または増加を示し続ける場合、それぞれのマーカーの発現レベルがベースライン生物学的サンプル中において観察されるものに近づく時まで、抗ＣＤ４０治療剤でのさらなる投与が遅延され得る。いくつかのバイオマーカーは、治療剤の効果と独立して変動し得、これはまた半減期および滞留時間において変動するため、投与頻度へのガイドとして該マーカー（即ち、アポトーシス、細胞生存、ＣＤ４０シグナル伝達経路のバイオマーカー、サイトカインマーカー、および／またはＣＤ４０関連因子）の発現レベルを使用する場合、好ましくは少なくとも２つの連続的な指標（例えば、２４〜４８時間の期間内）が考慮される。
【０１８７】
これらのアッセイの結果が、細胞生存の１以上のバイオマーカー、ＣＤ４０シグナル伝達経路の１以上のバイオマーカー、および／または１以上のＣＤ４０関連因子の発現の減少に関して、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達の所望のダウンレギュレーションを示し続ける場合、抗ＣＤ４０治療剤でのさらなる治療が正当化される。経時での治療効果のモニタリングを可能にし、そして治療が継続されるべきかまたは停止されるべきかを決定するために、本明細書上記に記載されるように、生物学的サンプルが、治療期間の間、種々の時間間隔で回収され得る。
【０１８８】
以下の実施例は、例示のために提供され、そして限定のために提供されるものではない。
【実施例】
【０１８９】
（導入）
下記の実施例において使用したアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２である。ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２抗ＣＤ４０抗体は、ヒトＩｇＧ１重鎖座およびヒトκ軽鎖座を有するトランスジェニックマウス（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術（Ａｂｇｅｎｉｘ；Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））の免疫化によって作製される、ヒトＩｇＧ１サブタイプ抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）である。ＣＤ４０細胞外ドメインを発現するＳＦ９インタクト細胞を免疫原として使用した。
【０１９０】
手短に言えば、Ｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１１３：１４３によって以前に記載されるように、５０％ポリエチレングリコールを使用して、免疫化マウス由来の脾細胞を、ＳＰ  ２／０またはＰ３×６３Ａｇ８．６５３マウスメラノーマ細胞と１０：１の割合で融合した。融合された細胞を、ヒポキサンチン（０．１ｍＭ）、アミノプテリン（０．０１ｍＭ）、チミジン（０．０１６ｍＭ）、および０．５ｎｇ／ｍＬ  ｈＩＬ−６（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）が補充された完全ＩＭＤＭ培地において際懸濁させた。次いで、各ウェルが平均で１つの成長するハイブリドーマを含有するように、融合された細胞を９６ウェル組織培養プレートのウェルに分配した。
【０１９１】
１０〜１４日後、ハイブリドーマ母集団の上澄み液を、特異的抗体産生についてスクリーニングした。ハイブリドーマクローンによる特異的抗体産生のスクリーニングについて、各ウェルからの上澄み液をプールし、そして先ず、ＥＬＩＳＡによって抗ＣＤ４０活性特異性について試験した。次いで、陽性を、標準ＦＡＣＳアッセイを使用するＥＢＶ形質転換Ｂ細胞の蛍光細胞染色について使用した。陽性ハイブリドーマ細胞を、０．５ｎｇ／ｍＬ  ｈＩＬ−６を含有するＩＭＤＭ／ＦＢＳ中において限界希釈によって２回クローン化した。
【０１９２】
トータルで３１のマウス脾臓をマウスメラノーマＳＰ２／０細胞と融合し、ＥＬＩＳＡにおいて組換えＣＤ４０を認識する８９５の抗体を作製した。Ａｂｇｅｎｉｘ  ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術（Ａｂｇｅｎｉｘ；Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して作製されたハイブリドーマの平均約１０％が、ヒトカッパ鎖の代わりにマウスラムダ軽鎖を含有した。マウスラムダ鎖を含有する抗体を選択した。細胞表面ＣＤ４０への結合も示した２６０の抗体のサブセットを、さらなる分析のために選択した。一連のサブクローニング手順の間選択された安定なハイブリドーマを、結合および機能アッセイにおける更なるキャラクタライゼーションのために使用した。選択プロセスのさらなる詳細については、２００３年１１月４日、２００３年１１月２６日、および２００４年４月２７日に出願され、そしてそれぞれ米国特許出願第６０／５１７，３３７号（代理人整理番号ＰＰ２０１０７．００１（０３５７８４／２５８４４２））、第６０／５２５，５７９号（代理人整理番号ＰＰ２０１０７．００２（０３５７８４／２７１５２５））、および第６０／５６５，７１０号（代理人整理番号ＰＰ２０１０７．００３（０３５７８４／２７７２１４））が割り当てられた「Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  Ａｎｔｉ−ＣＤ４０  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒｉｒ  Ｕｓｅ」という表題の係属中の仮出願、ならびに２００４年１１月４日に出願され、そしてＷＯ２００５／０４４８５４として公開された「Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  Ａｎｔｉ−ＣＤ４０  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒｉｒ  Ｕｓｅ」という表題が再び付けられた国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３７１５２号（代理人整理番号ＰＰ２０１０７．００４（０３５７８４／２８２９１６））を参照のこと；これらの各々の内容は、それら全体が、参照により本明細書中に組み込まれる。
【０１９３】
７つの他のハイブリドーマ由来のクローンが、アンタゴニスト活性を有すると同定された。それらの相対的なアンタゴニスト力およびＡＤＣＣ活性に基づいて、２つのハイブリドーマクローンを、さらなる評価のために選択した（下記表１）。それらを１３１．２Ｆ８．５．９（５．９）および１５３．８Ｅ２．Ｄ１０．Ｄ６．１２．１２（１２．１２）と命名する。
【０１９４】
【表１】
0005421590.tif 000002
マウスハイブリドーマ株１３１．２Ｆ８．５．９（ＣＭＣＣ＃１２０４７）およびハイブリドーマ株１５３．８Ｅ２．Ｄ１０．Ｄ６．１２．１２（ＣＭＣＣ＃１２０５６）を、それぞれ、特許寄託番号ＰＴＡ−５５４２およびＰＴＡ−５５４３で、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０−２２０９（ＵＳＡ））へ寄託した。
【０１９５】
候補抗体の可変領域をコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲで増幅し、クローン化し、そして配列決定した。ＣＨＩＲ−１２．１２抗体の軽鎖および重鎖についてのアミノ酸配列を、配列番号２（ｍＡｂ  ＣＨＩＲ−１２．１２についての軽鎖）および配列番号４（ｍＡｂ  ＣＨＩＲ−１２．１２についての重鎖）に示す。ｍＡｂ  ＣＨＩＲ−１２．１２についての重鎖の変異体を配列番号５に示し、これは、配列番号４の１５３位のアラニン残基の代わりにセリン残基を有する点で配列番号４と相違している。ＣＨＩＲ−１２．１２抗体の軽鎖および重鎖をコードするヌクレオチド配列を、配列番号１（ｍＡｂ  ＣＨＩＲ−１２．１２の軽鎖についてのコード配列）および配列番号３（ｍＡｂ  ＣＨＩＲ−１２．１２の重鎖についてのコード配列）に示す。ＣＨＩＲ−５．９抗体の軽鎖および重鎖についてのアミノ酸配列を、配列番号６（ｍＡｂ  ＣＨＩＲ−５．９についての軽鎖）および配列番号７（ｍＡｂ  ＣＨＩＲ−５．９についての重鎖）に示す。ｍＡｂ  ＣＨＩＲ−５．９の重鎖の変異体を配列番号８に示し、これは、配列番号７の１５８位のアラニン残基の代わりにセリン残基を有する点で配列番号７と相違している。
【０１９６】
独立したハイブリドーマから誘導された抗体について予測されるように、相補性決定領域（ＣＤＲ）におけるヌクレオチド配列の実質的なバリエーションが存在する。ＶＨのＣＤＲ３領域の多様性は、抗体特異性を最も顕著に決定すると考えられる。
【０１９７】
ＦＡＣＳ分析によって示されるように、ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−  １２．１２は、ヒトＣＤ４０へ特異的に結合し、そしてＣＤ４０リガンド結合を防止し得る。両方のｍＡｂは、細胞表面ＣＤ４０へ予め結合されたＣＤ４０リガンドに競合してこれを除去し得る。ヒトＣＤ４０に対するＣＨＩＲ−５．９の結合親和性は１．２ｘ１０−８Ｍであり、そしてヒトＣＤ４０に対するＣＨＩＲ−１２．１２の結合親和性は５ｘ１０−１０Ｍである。
【０１９８】
ＣＨＩＲ−１２．１２およびＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体は、強力なアンタゴニストであり、そして正常なＢ細胞のインビトロＣＤ４０リガンド媒介性増幅を阻害し、ならびに、ＮＨＬおよびＣＬＬ患者由来の癌細胞のインビトロＣＤ４０リガンド媒介性増幅を阻害する。ＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体は、正常ヒトＢリンパ球において、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）によって媒介される生存およびシグナル伝達経路を直接阻害する。インビトロで、両方の抗体は、ＡＤＣＣによってＮＨＬ患者由来の原発性癌細胞を死滅させる。用量依存性抗腫瘍活性が、異種移植片ヒトリンパ腫モデルにおいて見られた。これらの結果のより詳細な説明、ならびにそれらを得るために使用したアッセイについては、２００３年１１月４日、２００３年１１月２６日、および２００４年４月２７日に出願され、そしてそれぞれ米国特許出願第６０／５１７，３３７号（代理人整理番号ＰＰ２０１０７．００１（０３５７８４／２５８４４２））、第６０／５２５，５７９号（代理人整理番号ＰＰ２０１０７．００２（０３５７８４／２７１５２５））、および第６０／５６５，７１０号（代理人整理番号ＰＰ２０１０７．００３（０３５７８４／２７７２１４））が割り当てられた「Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  Ａｎｔｉ−ＣＤ４０  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒｉｒ  Ｕｓｅ」という表題の係属中の仮出願、ならびに２００４年１１月４日に出願され、そしてＷＯ２００５／０４４８５４として公開された「Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  Ａｎｔｉ−ＣＤ４０  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒｉｒ  Ｕｓｅ」という表題が再び付けられた国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３７１５２号（代理人整理番号ＰＰ２０１０７．００４（０３５７８４／２８２９１６））を参照のこと；これらの各々の内容は、それら全体が、参照により本明細書中に組み込まれる。
【０１９９】
実施例１：ＣＨＩＲ−１２．１２はＣＤ４０Ｌ媒介性細胞シグナル伝達を遮断する
可溶性ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）は、Ｂ細胞を活性化し、そして生存および増殖の増強、ならびにＮＦ−κＢ、ＥＲＫ／ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ、およびｐ３８シグナル伝達経路の活性化を含む、種々の態様の機能的応答を誘導する。さらに、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０刺激は、正常なＢ細胞中における、切断ＰＡＲＰの還元および抗アポトーシスタンパク質、ＸＩＡＰおよびＭｃｌ−ｌの誘導によって、生存シグナルを提供する。ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０刺激はまた、ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ３にＣＤ４０細胞質ドメインへ結合させる。
【０２００】
下記の研究は、ＣＨＩＲ−１２．１２が、正常ヒトＢ細胞におけるこられの刺激効果の全てを直接阻害したことを実証する。例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２処理は、時間および用量依存カスパーゼ−９、カスパーゼ−３およびＰＡＲＰの増加した切断ならびにＸＩＡＰおよびＭｃＩ−Ｉの還元を生じさせ、Ｂ細胞アポトーシスを回復させた。ＣＨＩＲ−１２．１２での処理はまた、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０刺激の応答において、ＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）αおよびβ（ＮＦ−κＢ経路）、ＥＲＫ、ＡＫＴ、およびｐ３８のリン酸化を阻害した。さらに、ＣＨＩＲ−１２．１２は、初期ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０刺激無しには、これらのアポトーシス効果を誘導しないことが判った。
【０２０１】
ＣＨＩＲ−１２．１２は、ＰＡＲＰの切断を誘導することによって、ＣＤ４０リガンドにより媒介される生存を阻害した。
【０２０２】
これらの実験において、健康なドナー由来の０．６×１０６正常ヒトＢ細胞（８５−９５％のパーセント純度）を、１μｇ／ｍＬ  ｓＣＤ４０Ｌ（Ａｌｅｘｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｎｇｈａｍ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で刺激した。次いで、ＣＨＩＲ−１２．１２（１０μｇ／ｍＬ）およびコントロールＩｇＧを添加した。細胞を、０、２０分、２時間、６時間、１８時間、および２６時間で回収した。切断されたカスパーゼ−９、切断されたカスパーゼ−３、切断ＰＡＲＰ、およびβ−アクチンコントロールを、ウエスタンブロットによって細胞溶解物中において検出した。
【０２０３】
手短に言えば、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０刺激は生存シグナルを提供することが観察され、何故ならば、それは経時において切断されたカスパーゼ−９、切断されたカスパーゼ−３、または切断ＰＡＲＰの増加を生じさせず、細胞はアポトーシスを受けていなかったことを示すためである。しかし、ＣＨＩＲ−１２．１２での処理は、これらの切断産物の増加を生じさせ、ＣＨＩＲ−１２．１２処理は、ｓＣＤ４０Ｌ刺激された正常Ｂ細胞における生存シグナル伝達に対するＣＤ４０Ｌの効果を無効にし、Ｂ細胞アポトーシスを買いすくさせることを示す（データは示さず）。
【０２０４】
ＣＨＩＲ−１２．１２は、「生存」抗アポトーシスタンパク質の発現を阻害した。
【０２０５】
これらの実験において、健康なドナー由来の０．６×１０６正常ヒトＢ細胞（８５−９５％のパーセント純度）を、１μｇ／ｍＬ  ｓＣＤ４０Ｌ（Ａｌｅｘｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｎｇｈａｍ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で刺激した。次いで、ＣＨＩＲ−１２．１２（１０μｇ／ｍＬ）およびコントロールＩｇＧを添加した。細胞を、０、２０分、２時間、６時間、１８時間、および２６時間で回収した。Ｍｃｌ−ｌ、ＸＩＡＰ、ＣＤ４０、およびβ−アクチンコントロールを、ウエスタンブロットによって細胞溶解物中において検出した。手短に言えば、ｓＣＤ４０Ｌ刺激は、経時でのＭｃｌ−ｌおよびＸＩＡＰの持続した発現を生じさせた。しかし、ＣＨＩＲ  １２．１２でのｓＣＤ４０Ｌ刺激細胞の処理は、経時でのこれらのタンパク質発現の減少を生じさせた（データは示さず）。Ｍｃｌ−ｌおよびＸＩＡＰはアポトーシス経路を遮断し得る「生存」シグナルであるため、これらの結果は、ＣＨＩＲ−１２．１２処理がｓＣＤ４０Ｌ刺激正常Ｂ細胞中におけるアポトーシスに対する遮断を除去することを実証する。
【０２０６】
ＣＨＩＲ−１２．１２処理は正常Ｂ細胞におけるＩＫＫα（Ｓｅｒ１８０）およびＩＫＫβ（Ｓｅｒ１８１）のリン酸化を阻害した。
【０２０７】
これらの実験において、健康なドナー由来の０．６×１０６正常ヒトＢ細胞（８５−９５％のパーセント純度）を、１μｇ／ｍＬ  ｓＣＤ４０Ｌ（Ａｌｅｘｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｎｇｈａｍ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で刺激した。次いで、ＣＨＩＲ−１２．１２（１０μｇ／ｍＬ）およびコントロールＩｇＧを添加した。細胞を、０および２０分で回収した。リン酸化ＩＫＫα（Ｓｅｒ１８０）およびＩＫＫβ（Ｓｅｒ１８１）ならびにトータルＩＫＫαを、ウエスタンブロットによって細胞溶解物中において検出した。
【０２０８】
手短に言えば、ｓＣＤ４０Ｌによる刺激は、経時でのＩＫＫα（Ｓｅｒ１８０）およびＩＫＫβ（Ｓｅｒ１８１）のリン酸化を生じさせ；しかし、ＣＨＩＲ−１２．１２での処理は、正常Ｂ細胞においてｓＣＤ４０Ｌ刺激に対するこの応答を無効にした（データは示さず）。
【０２０９】
ＣＨＩＲ−１２．１２処理は、用量依存性様式で、ＣＤ４０リガンドにより媒介される生存を阻害した。
【０２１０】
これらの実験において、健康なドナー由来の０．６×１０６正常ヒトＢ細胞（８５−９５％のパーセント純度）を、１μｇ／ｍＬ  ｓＣＤ４０Ｌ（Ａｌｅｘｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｎｇｈａｍ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で刺激した。次いで、ＣＨＩＲ−１２．１２（０．０１、０．１、０．２、０．５、１．０μｇ／ｍＬ）およびコントロールＩｇＧを添加した。細胞を２４時間で回収した。切断ＰＡＲＰおよびβ−アクチンコントロールをウエスタンブロットによって細胞溶解物中において検出した。
【０２１１】
手短に言えば、ＣＨＩＲ−１２．１２処理は、用量依存様式で、ｓＣＤ４０Ｌ刺激細胞においてＰＡＲＰ切断の増加を生じさせ、そしてしたがって、ｓＣＤ４０Ｌ刺激された正常Ｂ細胞において生存シグナル伝達経路を無効にした（データは示さず）。
【０２１２】
ＣＨＩＲ−１２．１２治療は、用量依存性様式で「生存」抗アポトーシスタンパク質の発現を阻害した。
【０２１３】
これらの実験において、健康なドナー由来の０．６×１０６正常ヒトＢ細胞（８５−９５％のパーセント純度）を、１μｇ／ｍＬ  ｓＣＤ４０Ｌ（Ａｌｅｘｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｎｇｈａｍ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で刺激した。次いで、ＣＨＩＲ−１２．１２（０．５、２、および１０μｇ／ｍＬ）およびコントロールＩｇＧを添加した。細胞を２２時間で回収した。Ｍｃｌ−ｌ、ＸＩＡＰ、切断ＰＡＲＰ、およびβ−アクチンコントロールをウエスタンブロットによって細胞溶解物中において検出した。
【０２１４】
手短に言えば、ＣＨＩＲ−１２．１２処理は、用量依存様式で、ｓＣＤ４０Ｌ刺激された細胞中において、Ｍｃｌ−ｌおよびＸＩＡＰ発現を減少させ、そして切断ＰＡＲＰ発現を増加させ、そしてしたがって、ｓＣＤ４０Ｌ刺激された正常Ｂ細胞中において、アポトーシス経路に対するこれらの遮断を無効にした（データは示さず）。
【０２１５】
ＣＨＩＲ−１２．１２は、可溶性ＣＤ４０Ｌシグナル伝達の非存在下において、抗アポトーシスタンパク質、切断ＰＡＲＰ、およびＸＩＡＰの発現に影響を与えなかった。
【０２１６】
これらの実験において、健康なドナー由来の１．０×１０６正常ヒトＢ細胞（８５−９５％のパーセント純度）を、ＣＨＩＲ−１２．１２（１０μｇ／ｍＬ）およびコントロールＩｇＧのみで処理した（即ち、抗体を添加する前に、細胞はｓＣＤ４０Ｌで予め刺激しなかった）。細胞を０、４、１４、および１６時間で回収した。ＸＩＡＰ、切断ＰＡＲＰ、およびβ−アクチンコントロールをウエスタンブロットによって細胞溶解物中において検出した。
【０２１７】
手短に言えば、結果は、ｓＣＤ４０Ｌ刺激無しに、細胞は、ＩｇＧ処理コントロール細胞およびＣＨＩＲ−１２．１２細胞の両方において、増加された濃度の切断ＰＡＲＰを発現し、一方、ＸＩＡＰの発現は一定のままであることを示す（データは示さず）。これらのデータは、ＣＨＩＲ−１２．１２は、ＣＤ４０Ｌ刺激無しでは、正常なヒトＢ細胞においてアポトーシスを誘導しないことを示している。
【０２１８】
ＣＨＩＲ−１２．１２は、正常なＢ細胞におけるＩＫＫａ（Ｓｅｒｌ８０）およびｌＫＫβ（Ｓｅｒｌ８１）、ＡＫＴ、ＥＲＫ、およびｐ３８のリン酸化を阻害した。
【０２１９】
これらの実験において、健康なドナー由来の１．０×１０６正常ヒトＢ細胞（８５−９５％のパーセント純度）を、１％ＦＢＳ含有培地において血清飢餓させ（ｓｅｒｕｍ  ｓｔａｒｖｅ）、そして１μｇ／ｍＬ  ｓＣＤ４０Ｌ（Ａｌｅｘｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｎｇｈａｍ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で刺激した。培養物をＣＨＩＲ−１２．１２（１および１０μｇ／ｍＬ）およびコントロールＩｇＧｄ処理した。細胞を０および２０分で回収した。ホスホ−ＩＫＫα、ホスホ−ＩＫＫβ、トータルＩＫＫβ、ホスホ−ＥＲＫ、トータルＥＲＫ、ホスホ−ＡＫＴ、トータルＡＫＴ、ホスホ−ｐ３８、およびトータルｐ３８を、ウエスタンブロットによって細胞溶解物中において検出した。
【０２２０】
手短に言えば、ｓＣＤ４０Ｌ刺激は、ＩＫＫα／βリン酸化、ＥＲＫリン酸化、ＡＫＴリン酸化、およびｐ３８リン酸化の増加を生じさせ、したがって、細胞の生存およびまたは増殖へ導いた。ＣＨＩＲ−１２．１２での細胞の処理は、正常なＢ細胞におけるこれらのシグナル伝達経路に対するｓＣＤ４０Ｌ刺激の効果を無効にした（データは示さず）。
【０２２１】
ＣＨＩＲ−１２．１２は、ＣＤ４０シグナル伝達カスケードにおいて、ＰＩ３ＫおよびＭＥＫ  ／ＥＲＫ等の複数のシグナル伝達経路を阻害する。
【０２２２】
これらの実験において、健康なドナー由来の１．０×１０６正常ヒトＢ細胞（８５−９５％のパーセント純度）を、１％ＦＢＳ含有培地において血清飢餓させ（ｓｅｒｕｍ  ｓｔａｒｖｅ）、そして１μｇ／ｍＬ  ｓＣＤ４０Ｌ（Ａｌｅｘｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｎｇｈａｍ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で刺激した。培養物をまた、ＣＨＩＲ−１２．１２（１および１０μｇ／ｍＬ）、Ｗｏｒｔｍａｎｉｎ（ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴインヒビター；１および１０μＭ）、ＬＹ  ２９４００２（ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴインヒビター；１０および３０μＭ）、およびＰＤ９８０９５（ＭＥＫインヒビター；１０および３０μｇ／ｍＬ）で処理した。細胞を０および２０分で回収した。ホスホ−ＥＲＫ、ホスホ−ＡＫＴ、トータルＡＫＴ、ホスホ−ＩＫＫα／β、およびトータルを、ウエスタンブロットによって細胞溶解物中において検出した。
【０２２３】
手短に言えば、結果は、ＣＨＩＲ−１２．１２は、これらのシグナル変換分子の全てのリン酸化を無効にし、一方、前記シグナル変換インヒビターは、シグナル伝達の特異的無効化のみを示したことを示しており、ＣＨＩＲ−１２．１２は、ＣＤ４０Ｌ刺激によって媒介されるこれらのシグナル変換分子のアップストリームを恐らく阻害することを示している（データは示さず）。
【０２２４】
ＣＨＩＲ−１２．１２は、正常Ｂ細胞において、ＣＤ４０の細胞質ドメインへのシグナル伝達分子ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ３の結合を阻害する。
【０２２５】
これらの実験において、健康なドナー由来の４．０×１０６正常ヒトＢ細胞（８５−９５％のパーセント純度）を、１％ＦＢＳ含有培地において４時間血清飢餓させ（ｓｅｒｕｍ  ｓｔａｒｖｅ）、そして１μｇ／ｍＬ  ｓＣＤ４０Ｌ（Ａｌｅｘｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｎｇｈａｍ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で刺激した。細胞を０および２０分で回収した。ＣＤ４０を、ポリクローナル抗ＣＤ４０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ）を使用して免疫沈降させ、そして抗ＴＲＡＦ２  ｍＡｂ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ）、抗ＴＲＡＦ３  ｍＡｂ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ）、および抗ＣＤ４０  ｍＡｂ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ）で、ウエスタンブロットにおいてプローブした。
【０２２６】
手短に言えば、結果は、ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ３は、ｓＣＤ４０Ｌ刺激後、ＣＤ４０で共沈降したことを示している。対照的に、ＣＨＩＲ−１２．１２での処理は、ｓＣＤ４０Ｌ刺激された正常Ｂ細胞中において、ＣＤ４０−ＴＲＡＦ２／３シグナル伝達複合体の形成を無効にした。ＣＤ４０発現に変化はなかった（データは示さず）。
【０２２７】
理論に拘束されないが、これらの実験結果、および上述の実験における結果は、ＣＨＩＲ−１２．１２抗体が、特性の独特の組み合わせを有する二重作用アンタゴニスト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体であることを示している。この完全なヒトモノクローナル抗体は、Ｂ細胞の生存および増殖についてのＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達経路を遮断し；このアンタゴニズムは、最終的な細胞死へ導く。ＣＨＩＲ−１２．１２はまた、エフェクター細胞による認識および結合を媒介し、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を開始させる。ＣＨＩＲ−１２．１２がいったんエフェクター細胞へ結合されると、細胞溶解酵素が放出され、Ｂ細胞アポトーシスおよび溶解へ導く。ＣＨＩＲ−１２．１２は、前臨床モデルにおけるのと比較した場合、リツキシマブよりも強力な抗腫瘍抗体である。
【０２２８】
実施例２：ＣＤ４０＋細胞におけるＣＤ４０リガンド誘導性サイトカイン分泌の評価
そのリガンドによるＣＤ４０の刺激は、正常Ｂ細胞についての生存および増殖シグナルを提供する。アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体ＣＨＩＲ−１２．１２は、ヒト末梢血リンパ球の増殖を誘導しないが、ＣＤ４０Ｌ誘導リンパ球増殖を阻害する。ＣＤ４０シグナル伝達はまた、細胞を誘導し、種々のサイトカインを産生させる。この実施例において、正常Ｂ細胞および単球によるサイトカイン産生を調節するＣＨＩＲ−１２．１２の能力を試験した。
【０２２９】
細胞（１ウェル当たり１ｘ１０５細胞）を、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ４０トランスフェクトされた、ホルムアルデヒド固定化ＣＨＯ細胞、１ウェル当たり２ｘ１０５）の存在下または非存在下で、９６ウェルプレート中において培養した。細胞を、３７℃で２４時間、１０μｇ／ｍＬで、ｈｕｌｇＧｌ  （コントロール）またはＣＨＩＲ−１２．１２と共にインキュベートし、そして上澄み液を収穫した。ｈＩＬ−６、ｈＩＬ−８、ｈＩＬ−１０、ｈＴＮＦ−α、ｈＧＭ−ＣＳＦ、ｈＩＬ−１ｂ、ｈＩＬ−１２ｐ７０、ＭＣＰ−１およびＭＩＰ−１βベータの産生を、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）マルチアレイシステム（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）によって測定した。
【０２３０】
ＣＤ４０Ｌの非存在下でＣＨＩＲ−１２．１２のみで培養した細胞は、バックグラウンドを超えるいずれのサイトカインも産生せず、ＣＨＩＲ−１２．１２はサイトカイン産生についてアゴニスト活性を有さないことを示唆している。対照的に、正常Ｂ細胞中におけるｈＩＬ−１０、ｈＴＮＦ−α、ｈＩＬ−８、ｈＩＬ−６、ＭＣＰ−１およびＭＩＰ−１βのＣＤ４０Ｌ誘導産生（ｎ＝３）（表２）。これらの培養物へのＣＨＩＲ−１２．１２の添加は、全てのサイトカインの産生を阻害した（表３を参照のこと）。
【０２３１】
【表２】
0005421590.tif 000003
【０２３２】
【表３】
0005421590.tif 000004
ＣＨＩＲ−１２．１２は、ｈＩＬ−１０、ｈＴＮＦ−α、ｈＩＬ−８、ｈＩＬ−６、ＭＣＰ−１、およびＭＩＰ−１βのＣＤ４０誘導性単球産生を阻害する（ｎ＝１）（表４対表５）。
【０２３３】
【表４】
0005421590.tif 000005
【０２３４】
【表５】
0005421590.tif 000006
一緒になって、これらのデータは、ＣＨＩＲ−１２．１２が、ＣＤ４０リガンド媒介性生存、増殖およびサイトカイン産生についての強力なアンタゴニストであることを示している。
【０２３５】
ＣＤ４０連結はまた、正常内皮細胞および単球（Ｍｅｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）  Ｂｌｏｏｄ  ９６（１２）：３８０１−３８０８；Ｆｌａｘｅｎｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：７５０３−７５０９）ならびにリウマチ骨膜線維芽細胞（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．１６４：５０５５−５０６１）におけるＶＥＧＦの発現を誘導し得る。炎症性部位でのＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達は、線維芽細胞およびＶＥＧＦの組織単球／マクロファージ産生を刺激し、新脈管形成へ導き、これは、慢性炎症プロセスを促進および維持すると考えられる（例えば、Ｍｏｎａｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）  Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｉｎｆｌａｍｍ．Ａｌｌｅｒｇｙ  ３（１）：３５−４２を参照のこと）。したがって、ＶＥＧＦレベルの変化は、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達の有用なサイトカインマーカーを提供し得る。ＶＥＧＦは分泌タンパク質であるため、ＶＥＧＦタンパク質発現の変化は、ウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡ等の技術を使用して、細胞培養上澄み液中または患者血液サンプルから得られた血漿中において容易に検出され得る。あるいは、それは、ノザンブロットまたは定量ＲＴ−ＰＣＲ等の多数の技術のいずれかを使用して、細胞／組織サンプルから得られたｍＲＮＡから検出され得る。
【０２３６】
別の実験において、単球におけるＶＥＧＦのＣＤ４０Ｌ誘導産生を、上述のものと類似の様式で試験する。これらの細胞培養物へのＣＨＩＲ−１２．１２の添加は、ＶＥＧＦのＣＤ４０Ｌ誘導産生を阻害することが判る。
【０２３７】
実施例３：バイオマーカーおよび予測マーカー
本発明の方法において使用されるエクスビボ予測アッセイおよび追加の予測アッセイは、その成熟タンパク質配列およびヌクレオチド配列が当該分野において公知であるバイオマーカーの発現レベルについて生物学的サンプルをスクリーニングすることを必要とする。例えば、下記表２および３に示す情報を参照のこと。タンパク質レベル（例えば、抗体プローブ）または核酸レベル（例えば、ＰＣＲプローブ）で、これらのバイオマーカーを検出するためのプローブは、この配列情報に基づいて設計され得ること、およびプローブは、本明細書中に開示される配列の変異体を検出するように設計され得ることが、認識される。
【０２３８】
【表６】
0005421590.tif 000007
【０２３９】
【表７】
0005421590.tif 000008
実施例４：抗ＣＤ４０治療剤のアンタゴニスト活性についてのアッセイ
以下の実施例は、抗ＣＤ４０抗体のアンタゴニスト活性を評価するために使用され得る。これらのアッセイのためのヒトＢ細胞は、本質的にＤｅ  Ｇｒｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９０）９：３２１に記載されるように、例えば、扁桃摘出術を受ける個人から得られる扁桃からの単離によって、得ることができる。手短に言えば、該組織をメスの刃で分散し、食細胞およびＮＫ細胞を５ｍＭ  Ｌ−ロイシンメチルエステルでの処理によって枯渇させ、そしてＴ細胞を、２−アミノエチルイソチオウロニウムで処理したヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）での１サイクルのロゼッティング（ｒｏｓｅｔｔｉｎｇ）によって除去する。得られたＢリンパ球調製物の純度は、抗−（ＣＤ２０）  ｍＡｂ  Ｂ１（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｌｏｎｅ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＡ）または抗−（ＣＤ３）  ｍＡｂ  ＯＫＴ３（Ｏｒｔｈｏ，Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪ）およびウサギ抗−（マウスＩｇ）のＦＩＴＣ結合化Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）での間接的な免疫蛍光標識、ならびにＦＡＣＳ分析によって確認され得る。
【０２４０】
（Ｂ細胞増殖アッセイ）
Ｂ細胞（１ウェル当たリ４×１０４）を、平底９６ウェルマイクロタイタープレート中において、１０％ウシ胎児血清が補充された２００μＬ  ＩＭＤＭ中で培養する。Ｂ細胞を、固定化抗−（ＩｇＭ）抗体（Ｉｍｍｕｎｏｂｅａｄｓ；５μｇ／ｍＬ；ＢｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の添加によって刺激する。必要に応じて、１００Ｕ／ｍＬ組換えＩＬ−２を添加する。種々の濃度のテストモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、マイクロ培養物（ｍｉｃｒｏｃｕｌｔｕｒｅｓ）の開始時に添加し、そして増殖を１８時間パルシング（ｐｕｌｓｉｎｇ）後、（３Ｈ）−チミジンの組込みの測定によって第３日に評価する。
【０２４１】
アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、固定化抗ＩｇＭの存在下または固定化抗ＩｇＭおよびＩＬ−２の存在下において、ヒトＢ細胞増殖を顕著には共刺激しない。
【０２４２】
（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ様Ｂ細胞増殖アッセイ）
Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）  ２５１：７０によって記載されるものに類似の培養系においてＢ細胞増殖を刺激する抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の能力を試験するために、ヒトＦｃγＲＩＩのＨＲ対立遺伝子形態を発現するマウス３Ｔ６トランスフェクタント細胞を使用する。Ｂ細胞（１ウェル当たり２×１０４）を、１０％ウシ胎児血清および１００Ｕ／ｍＬ組換えＩＬ−４が補充された２００μＬ  ＩＭＤＭ中、１×１０４トランスフェクタント細胞（放射線照射、５０００Ｒａｄ）の存在下、平底マイクロウェル中において、培養する。Ｂ細胞の添加前に、３Ｔ６細胞を、少なくとも５時間、培養プラスチックへ付着させる。抗ＣＤ４０ｍＡｂを、１５ｎｇ／ｍＬから２０００ｎｇ／ｍＬまで変動する濃度で添加し、そしてＢ細胞の増殖を、［３Ｈ］チミジンでの１８時間パルシング（ｐｕｌｓｉｎｇ）後、第７日に、チミジン組込みの測定によって評価する。
【０２４３】
（アンタゴニスト抗ＣＤ４０  ｍＡｂを使用してのＳ２Ｃ６刺激化Ｂ細胞増殖の阻害）
アンタゴニスト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）または、上述のＢ細胞増殖アッセイを使用して、Ｓ２Ｃ６（ＳＧＮ−１４としても公知、これは、報告によれば、正常Ｂ細胞の増殖のＣＤ４０刺激のアゴニストである；Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：３２２５−３２３１）等の抗ＣＤ４０抗体によってＢ細胞増殖の刺激を阻害するそれらの能力によって特徴付けられ得る。ヒト扁桃Ｂ細胞（１ウェル当たり４×１０４）を、抗ＣＤ４０  ｍＡｂ  Ｓ２Ｃ６（１．２５μｇ／ｍＬ）およびＳｅｐｈａｒｏｓｅビーズ（５μｇ／ｍＬ）へカップリングされた抗ＩｇＭの存在下、マイクロウェル中、２００μＬで培養する。目的の種々の濃度の抗ＣＤ４０  ｍＡｂを添加し、そして［３Ｈ］−チミジン組込みを３日後に評価する。コントロール抗−（グルコセレブロシダーゼ）ｍＡｂとして、８Ｅ４が類似の濃度で添加され得る。Ｂａｒｎｅｖｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３４：５８５。アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、少なくとも７５％またはそれ以上、ｍＡｂ  Ｓ２Ｃ６によって抗ＩｇＭ誘導性ヒトＢ細胞増殖の共刺激を阻害し得る（即ち、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の存在下でのＳ２Ｃ６刺激化増殖は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の非存在下で観察されるもの２５％以下である）。対照的に、。β−グルコセレブロシダーゼに対して無関係ｍＡｂである８Ｅ４の等価量では、有意な阻害は見られない。Ｂａｒｎｅｖｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ（前出）。このような結果は、抗ＣＤ４０ｍＡｂは、ヒトＢ細胞の増殖についての刺激性シグナルを送達せず、しかし、逆に、別のｍＡｂでＣＤ４０を誘導することによって発せられる刺激性シグナルを阻害し得ることを示す。
【０２４４】
（ＥＬ４Ｂ５細胞でのＢ細胞活性化アッセイ）
Ｚｕｂｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８５）１３４：３６６２は、ＥＬ４Ｂ５としても公知の、マウス胸腺腫ＥＬ−４株の突然変異サブクローンが、マウス起源およびヒト起源の両方のＢ細胞を強力に刺激して、インビトロで免疫グロブリン分泌血漿細胞へ増殖および分化することを観察した。この活性化は、抗原独立性でありそして制限ＭＨＣではないことが判った。ヒトＢ細胞の最適な刺激のために、活性化ヒトＴ細胞由来の上澄み液の存在が必要とされ、しかしＢ細胞応答はまた、ＥＬ４Ｂ５細胞がホルボール−１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）またはＩＬ−Ｉで予め活性化される場合に生じた。Ｚｕｂｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９８７）  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９９：２８１；およびＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：２９５５。この培養系におけるＢ細胞活性化は効率的であり−限定希釈実験は、大部分のヒトＢ細胞が、活性化されて抗体分泌細胞へ増殖および分化し得ることを示した。Ｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８７）  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７：８８７。
【０２４５】
１０％熱不活性化ウシ胎児血清、５ｎｇ／ｍＬ  ホルボール−１２−ミリステート１３−アセテート（Ｓｉｇｍａ）および５％ヒトＴ細胞上澄み液が補充された２００μＬ  ＩＭＤＭ中、平底マイクロタイタープレート中において、Ｂ細胞（１ウェル当たり１０００）を、放射線照射（５０００  Ｒａｄ）ＥＬ４Ｂ５細胞（１ウェル当たり５×１０４）と共に培養する。ｍＡｂを培養物の開始時に種々の濃度で添加し、そして［３Ｈ］−チミジンでの１８時間パルシング後、第６日に、チミジン組込みを評価する。Ｔ細胞上澄み液の調製のために、精製Ｔ細胞を、１μｇ／ｍＬ  ＰＨＡおよび１０ｎｇ／ｍＬ  ＰＭＡの存在下で３６時間、１０６／ｍＬの密度で培養する。Ｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８７）１７：８８７。Ｔ細胞上澄み液を該細胞の遠心分離によって得、そして−２０℃で保存する。ＥＬ４Ｂ５−Ｂ細胞培養物中におけるヒトＢ細胞の増殖を増大させることにおけるＴ細胞上澄み液の効果を試験し、そして最も有効な上澄み液を実験において使用するためにプールする。ＥＬ４Ｂ５誘導性ヒトＢ細胞増殖に対する抗ＣＤ４０抗体の効果を評価する場合、ＭＯＰＣ−１４１（ＩｇＧ２ｂ）等のモノクローナル抗体が、コントロールとして添加され得る。
【０２４６】
アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、例えば、少なくとも７５％またはそれ以上、ＥＬ４Ｂ５細胞株によって刺激されたＢ細胞増殖を阻害し得る（即ち、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の存在下でのＥＬ４Ｂ５誘導性Ｂ細胞増殖は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の非存在下で観察されるものの２５％以下である）。対照的に、ＭＯＰＣ−１４１等のコントロール抗体は、ＥＬ４Ｂ５誘導性Ｂ細胞増殖に対して有意な効果を有さない。
【０２４７】
（Ｂ細胞による抗体産生についてのヒトＴ細胞ヘルパーアッセイ）
アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、Ｂ細胞による免疫グロブリン産生のアンタゴニストとして作用し得る。抗ＣＤ４０抗体は、Ｔ細胞ヘルパーアッセイにおける活性化Ｔ細胞で、接触依存性様式で、刺激されたＢ細胞による免疫グロブリン産生を阻害する該抗体の能力を評価することによって、このタイプのアンタゴニスト活性について試験され得る。この様式で、９６ウェル組織培養プレートを、抗ＣＤ３  ｍＡｂ  ＣＬＢ−Ｔ３／３（ＣＬＢ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の１：５００希釈の腹水でコーティングする。示されるように、共刺激ｍＡｂを添加する：抗ＣＤ２  ｍＡｂｓ  ＣＬＢ−Ｔ１１．１／１およびＣＬＢ−Ｔ１１．２／１（ＣＬＢ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、両方の腹水１：１０００、ならびに抗ＣＤ２８  ｍＡｂ  ＣＬＢ−２８／１（ＣＬＢ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。引き続いて、扁桃Ｔ細胞（放射線照射、３０００Ｒａｄ；１ウェル当たり１０５）、扁桃Ｂ細胞（１ウェル当たり１０４）、およびｒＩＬ−２（２０Ｕ／ｍＬ）を添加する。各細胞培養物の最終量は、２００μＬである。８日後、細胞を遠心分離で沈降させ、そして細胞を含まない上澄み液を収穫する。（希釈された）サンプル中のヒトＩｇＭおよびＩｇＧの濃度を、下記に記載するように、ＥＬＩＳＡによって評価する。
【０２４８】
１実施形態において、抗ＣＤ３  ｍＡｂを用いてそして異なるｍＡｂを用いてまたは用いずにコーティングした９６ウェルプレート中において、ヒト扁桃Ｂ細胞（１０４／ウェル）を、放射線照射された精製Ｔ細胞（３０００ｒａｄ、１０５／ウェル）と共に培養する。培養８日後に、Ｂ細胞による免疫グロブリン産生の測定のために、上澄み液を収穫する。Ｂ細胞による免疫グロブリン産生を、下記に記載されるＥＬＩＳＡによって評価する。目的の抗ＣＤ４０抗体を、培養物の開始から種々の濃度で添加する。コントロールとして、ｍＡｂ  ＭＯＰＣ−１４１が添加され得る。
【０２４９】
アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、少なくとも５０％またはそれ以上、ヒトＴ細胞によって刺激されるＢ細胞ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体産生を阻害し得る（即ち、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の存在下でのＴ細胞誘導性抗体産生は、アンタゴニスト  抗ＣＤ４０抗体の非存在下で観察されるものの５０％以下である）。対照的に、ＭＯＰＣ−１４１等のコントロール抗体は、Ｂ細胞によるＴ細胞誘導性抗体産生に対して有意な効果を有さない。
【０２５０】
（免疫グロブリン定量のためのＥＬＩＳＡアッセイ）
ヒトＩｇＭおよびＩｇＧの濃度をＥＬＩＳＡによって評価する。４℃で１６時間のインキュベーションによって、０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ＝９．６）中、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、４μｇ／ｍＬマウス抗ヒトＩｇＧ  ｍＡｂ  ＭＨ  １６−０１（ＣＬＢ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）または１．２μｇ／ｍＬマウス抗ヒトＩｇＭ  ｍＡｂ  ４１０２（Ｔａｇｏ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）でコーティングする。プレートをＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄し、そして１時間ＢＳＡで飽和させる。２回洗浄後、プレートを、種々の希釈のテストサンプルと共に、３７℃で１時間インキュベートする。３回洗浄後、結合されたＩｇを、１μｇ／ｍＬペルオキシダーゼ標識マウス抗ヒトＩｇＧ  ｍＡｂ  ＭＨ  １６−０１（ＣＬＢ）またはマウス抗ヒトＩｇＭ  ｍＡｂ  ＭＨ  １５−０１（ＣＬＢ）と共に３７℃で１時間インキュベーションすることによって検出する。プレートを４回洗浄し、そして結合されたペルオキシダーゼ活性を、基質としてのＯ−フェニレンジアミンの添加によって明らかにする。ヒト標準血清（Ｈ００、ＣＬＢ）を、各アッセイについての標準曲線を確立するために使用する。
【０２５１】
実施例５：ＣＨＩＲ−１２．１２処理は、正常ヒトＢ細胞中におけるＣＤ４０リガンド媒介性ＣＤ４０生存およびシグナル伝達経路を遮断する
ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）によるＣＤ４０の活性化は、正常なＢリンパ球の生存、増殖および分化を調節し得る。Ｂ細胞中において、ＣＤ４０の連結反応は、腫瘍壊死因子受容体関連因子（ＴＲＡＦ）とのその結合、ならびに細胞増殖および生存に関与する複数の下流のシグナル伝達経路の引き続いての活性化へ導く。この経路の活性化は、培養された正常Ｂ細胞へのＣＤ４０の添加がそれらの生存および増殖を促進する場合、エクスビボで実証され得る。下記に記載のさらなる研究を、正常ヒトＢ細胞中におけるＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０生存およびシグナル伝達経路に対するＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体の効果をさらにキャラクタライズするために行った。
【０２５２】
ＭＡＣＳ  Ｂ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＩＮＣ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用して、ネガティブセレクションによって、末梢血から正常ヒトＢ細胞を精製し、そして、１０μｇ／ｍＬのＣＨＩＲ−１２．１２またはアイソタイプコントロールｈｌｇＧ１の存在下にいおて、２μｇ／ｍＬの組換えヒト可溶性ＣＤ４０Ｌ（ｒｈｓＣＤ４０Ｌ）有りまたは無しで、２４時間培養した。細胞を溶解し、そして全ての細胞溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ならびにヒトｃＰＡＲＰ、Ｍｃ１−１、Ｂｃｌ−ｘｌ、ｐ−Ａｋｔおよびｐ−ｐ３８  ＭＡＰＫに特異的な抗体を使用するウエスタンブロッティングによって、分離した。全ての膜を剥離し、そして好適である場合、β−アクチンまたはトータルＡｋｔもしくはｐ３８  ＭＡＰＫタンパク質のいずれかについて再プローブした。結果を図１に示す。
【０２５３】
正常ヒトＢ細胞のＣＤ４０Ｌ刺激は、アポトーシスマーカー（ｃＰＡＲＰ）のレベルを減少させ、そして抗アポトーシスマーカー（Ｍｃｌ−ｌ、Ｂｃｌ−ｘｌ）の発現を増加させ、したがってこれらの細胞の増殖／生存を誘導する。さらに、ＣＤ４０Ｌ誘導性Ｂ細胞生存は、Ａｋｔおよびｐ３８  ＭＡＰＫのリン酸化と関連した。対照的に、エクスビボでのＣＤ４０Ｌ刺激された正常Ｂ細胞のＣＨＩＲ−１２．１２処理は、抗アポトーシスタンパク質Ｍｃｌ−ｌおよびＢｃｌ−ｘｌの発現を阻害し、そして、下流のシグナル伝達タンパク質のリン酸化を阻害し、最終的にはＢ細胞のアポトーシスへ導く。
【０２５４】
本明細書に記載の本発明の多くの修飾および他の実施形態が、前述の説明および関連の図面に示される技術を有するこれらの発明が属する当業者に明らかである。したがって、本発明は開示される特定の実施形態に限定されないこと、ならびに修飾および他の実施形態が添付の特許請求の範囲内に含まれるように意図されることが、理解される。特定の用語が本明細書中で使用されるが、それらは、一般的かつ記述的な意味でのみ使用され、そして限定のためではない。
【０２５５】
本明細書中に記載の全ての刊行物および特許出願は、本発明が属する当業者のレベルを示す。全ての刊行物および特許出願は、各々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれるように具体的かつ個々に示されるのと同程度に、参照により本明細書中に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２５６】
【図１】図１は、正常なヒトＢ細胞のシグナル伝達および生存がＣＤ４０Ｌによって誘導されそしてＣＨＩＲ−１２．１２によって遮断されることを示す。
【図１】
0005421590.tif 000009
【配列表】
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