(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Y(Gly-X-Yはアミノ酸配列であり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す）を含有するコラーゲンの加水分解物を有効成分として含み、前記コラーゲンの加水分解物が25〜100質量%のコラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有する、アテローム性動脈硬化症の進行抑制薬または予防薬。
【請求項２】
コラーゲントリペプチドGly-X-Yが、Gly-Ala-Asp、Gly-Ala-Lys、Gly-Ala-Val、Gly-Pro-Gln、Gly-Pro-Met、Gly-Pro-Ile、Gly-Pro-Thr、Gly-Pro-Val、Gly-Ser-Hyp、Gly-Lys-Asp、Gly-Ala-Ala、Gly-Pro-Hyl、Gly-Leu-Hyp、Gly-Ala-Arg、Gly-Ala-Ser、Gly-Ala-Hyp、Gly-Gln-Glu、Gly-Glu-Gln、Gly-Pro-Ser、Gly-Pro-Lys、Gly-Pro-Ala、Gly-Pro-Pro、Gly-Pro-ArgおよびGly-Pro-Hypから成る群から選ばれる少なくとも1種のトリペプチドである請求項1に記載の進行抑制薬または予防薬。
【請求項３】
コラーゲンの加水分解物がコラーゲントリペプチドGly-X-Yの分解物であるGly-XまたはX-Yをさらに含有する請求項1又は2に記載の進行抑制薬または予防薬。
【請求項４】
少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Y(Gly-X-Yはアミノ酸配列であり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す）を含有するコラーゲンの加水分解物を有効成分として含み、コラーゲンの加水分解物が25〜100質量%のコラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有する、血中コレステロール低下薬。
【請求項５】
コラーゲントリペプチドGly-X-Yが、Gly-Ala-Asp、Gly-Ala-Lys、Gly-Ala-Val、Gly-Pro-Gln、Gly-Pro-Met、Gly-Pro-Ile、Gly-Pro-Thr、Gly-Pro-Val、Gly-Ser-Hyp、Gly-Lys-Asp、Gly-Ala-Ala、Gly-Pro-Hyl、Gly-Leu-Hyp、Gly-Ala-Arg、Gly-Ala-Ser、Gly-Ala-Hyp、Gly-Gln-Glu、Gly-Glu-Gln、Gly-Pro-Ser、Gly-Pro-Lys、Gly-Pro-Ala、Gly-Pro-Pro、Gly-Pro-ArgおよびGly-Pro-Hypから成る群から選ばれる少なくとも1種のトリペプチドである請求項4に記載の血中コレステロール低下薬。
【請求項６】
コラーゲンの加水分解物がコラーゲントリペプチドGly-X-Yの分解物であるGly-XあるいはX-Yをさらに含有する請求項4又は5に記載の血中コレステロール低下薬。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２００９年３月１１日出願の日本特願２００９−５７４４４号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、アテローム性動脈硬化症の進行抑制薬および予防薬並びに血中コレステロール低下薬に関する。より詳しくは、本発明は、コラーゲントリペプチドを含有するコラーゲンの加水分解物を有効成分として含むアテローム性動脈硬化症の進行抑制薬および予防薬並びに血中コレステロール低下薬に関する。さらに本発明は、コラーゲントリペプチドを含有するコラーゲンの加水分解物を有効成分として含む、血管の老化・炎症を抑え、予防する機能性食品及び特定保健用食品に関する。
【背景技術】
【０００３】
動脈硬化の予防については、その発生機序に関連するいくつかの因子に対して、それらを標的とした各種化合物質が特許出願されている（例えば、特許文献1〜5）。【０００４】
また、新規化合物のほかに、医療用活性炭を経口投与する方法（特許文献6）や、黒酵母の培養液を健康補助食品として摂取する方法（特許文献7）など、天然物質を摂取して動脈硬化を予防/改善する方法も多数提唱されている。【０００５】
一方、コラーゲンは多様な、しかし関連する分子のグループである。各々は異なる生化学的および物理的性質を有するが、それらはα鎖と呼ばれる３本のポリペプチド鎖から成る同様の３重らせんドメインを共通して含む。各α鎖は高い割合のグリシンを含み、グリシンは規則的に反復される３つのアミノ酸配列中に存在し、Gly-X-Yと表現できる。さらに、ここで概ねXで比較的多いアミノ酸はプロリンであり、Yで比較的多いアミノ酸はヒドロキシプロリンである。このコンホメーションでは、グリシンおよびペプチド結合は分子の内側に埋め込まれ、そのことがコラーゲンにタンパク質分解に対する高い耐性を与える。【０００６】
I型コラーゲンのペプチド結合をグリシンのアミノ末端で切断する細菌コラゲナーゼ(特許文献8、9)を用いて、コラーゲントリペプチド(CTP)というGly-X-Y配列を含む高度に精製された非抗原性および低アレルゲン性トリペプチド画分が得られる(特許文献10)。【０００７】
近年の研究は、CTPがコラーゲンの産生を、線維芽細胞の分泌活性をアップレギュレートすることによって調節できることを示唆しており、皮膚、骨、軟骨などといった多数の臓器において生物学的作用を示している(非特許文献1)。また、関節痛軽減効果（非特許文献2）などが示されている。【０００８】
CTPを有効成分とする創傷治癒剤、腱または靭帯の損傷等に対する改善、治癒促進または予防剤、腱または靭帯の改善または強化剤、競走馬の屈腱または靭帯の損傷または断裂に対する改善、治癒促進または予防剤、競走馬の屈腱または靭帯の改善または強化剤、その創傷治癒剤を含む機能性食品ならびに医薬品も提案している(特許文献11)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
[特許文献１]特開平１１−４９８０２号公報
[特許文献２]特開２００３−４８８８９号公報
[特許文献３]特開２００４−３５４７５号公報
[特許文献４]特開２００２−２７５０６２号公報
[特許文献５]特開２００５−２６３７５８号公報
[特許文献６]特開２００７−１８２４４８号公報
[特許文献７]特開２００２−２０４６８７号公報
[特許文献８]特開２０００−１０２３８１号公報
[特許文献９]特開２００４−３５０５１３号公報
[特許文献１０]特開２００７−２３１２２５号公報
[特許文献１１]特開２００５−２８１１８６号公報
[特許文献１２]特開２００１−３１５８６号公報
【非特許文献】
【００１０】
[非特許文献１]コラーゲン・トリペプチド「HACP」の骨・腱に対する効果、FFIジャーナル、210巻（9月号）、854-858（2005）
[非特許文献２]第12回日本関節症研究会学術集会/丸山公ら
[非特許文献３]Stehbens WE: Atherosclerosis and degenerative diseases of blood vessels. In. Vascular Pathology. ed by Stehbens and Lie JT, pp175-269, Chapman and Hall Medical, London, 1995
[非特許文献４]勝田  省吾:人体病理の立場から、動脈硬化、2001、28巻3号、69-73
[非特許文献５]Ross R: The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature 1993;362:801-809.
[非特許文献６]渡辺照男ほか、粥状硬化（症）、綜合臨牀、1984、33：647-655
上記特許文献１〜１２及び非特許文献１〜６の全記載は、ここに特に開示として援用される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ヒトの動脈硬化（Atherosclerosis：アテローム性動脈硬化症）は生後まもなく発生し、ゆっくりと静かに進行する。50歳前後を過ぎるといろいろな臨床症状を呈するとともに、病変もさらに進行する（非特許文献３）。病理学的検証で、若年層でも強い動脈硬化を認める事例がある一方、高齢者の動脈にほとんど病変を認めない事例がみられることもある。これらは動脈硬化が長期間かけてゆっくり進行する現象であるからこそ、生活習慣や社会的要因など種々の因子が病変の程度に大きく影響することに起因する（非特許文献４）。かつてThomas Sydenhamが「ヒトは動脈とともに老いる“A man is as old as his arteries”」と述べたように、動脈硬化は人の加齢・老化と深く関係している。動脈は内膜・中膜・外膜の三層から成るが、動脈自体の加齢・老化は病理学的には内膜での平滑筋細胞の増生とコラーゲン線維を含む間質成分の蓄積によるびまん性肥厚、中膜の弾性線維の変性・断裂や線維化をさしており、動脈硬化と血管の老化はお互い密接な関係にある。【００１２】
近年益々重要な疾患になっているアテローム性動脈硬化は動脈の内膜に炎症反応が起こり平滑筋細胞、マクロファージ、Tリンパ球が浸潤・増殖すると共に内膜の細胞内外に脂質（主にコレステロールやコレステロールエステル）が蓄積し、内膜が肥厚してくる（プラーク形成）。こうした発生機序に基づき、近年ではアテローム性動脈硬化が血管における炎症の一種であると認識されている。細胞外に脂質が多量に沈着するとプラークは弱くなり、破裂・血栓形成を伴い急性心筋梗塞や脳梗塞が発症する。尚、本明細書において、アテローム性動脈硬化巣を単にプラークと表現することがある。【００１３】
動脈平滑筋細胞(SMC)は動脈の中膜の主な細胞成分であり、動脈に正常構造を与え、および、刺激に応じた血管収縮および拡張、コラーゲン、エラスチン、および他の細胞外マトリックスの成分の合成、多数のサイトカインの分泌など、重要な身体機能を与える。また、中膜平滑筋細胞の血管内膜への遊走および増殖は、アテローム性動脈硬化症の発生・進行の基礎となる重要な現象である（非特許文献５）。そのため、SMCは動脈の構造および機能の重要な決定因子であり、機能または分布の異常はアテローム性動脈硬化症や他の動脈病変の病理過程に深く関与する。【００１４】
アテローム性動脈硬化症の治療薬としては、例えば、高脂血症治療薬(スタチン系、フィブラート系)が用いられている。高脂血症治療薬は、主に血中の脂質改善を目的とする薬剤であり、SMCに直接作用してアテローム性動脈硬化症の進行を抑制するものではない。SMCといったコラーゲン産生細胞に対して直接的に作用することを狙った薬剤はこれまでにはない。【００１５】
化学物質、特に合成品は、まず人体への副作用などが懸念され、効果・効能の制御や実際に商品に至るまで多くの検証を行う必要があり、時間もかかる。天然物質については、経口摂取が可能な場合が多いが、効果・効能は様々であり、また、品質管理が難しいといった問題点が考えられる。さらにこれまでのところ、既存のどの製品もアテローム性動脈硬化症の予防や治療に決定的といえるものはない。【００１６】
また、２〜１５歳になるとほとんどの小児の動脈にアテローム性動脈硬化症の初期病変が観察される。思春期頃から病変の増加が著明となり、２０〜３０歳までには大動脈表面の約３０％を病変が占めるに至る（非特許文献６）。従って、アテローム性動脈硬化症を自覚し、または発症する前の健康な人々にとっても、血管の老化・炎症を抑え、予防する効果を有し、アテローム性動脈硬化症の進行を抑制または予防する効果を期待できる機能性食品及び特定保健用食品に対するニーズは存在する。【００１７】
そこで本発明の目的は、アテローム性動脈硬化の成り立ちに重要な役割を果たすSMCに対して何らかの作用を有する有効成分を含有する、新たなアテローム性動脈硬化症の治療薬あるいは予防薬を提供することにある。さらに本発明は、アテローム性動脈硬化に関連する血中コレステロールの低下効果を有する血中コレステロールの低下薬を提供することにある。加えて本発明は、アテローム性動脈硬化症に対して抑制効果を有する、アテローム性動脈硬化症の進行抑制および予防に有効な機能性食品及び特定保健用食品を提供することにある。【００１８】
前記CTPは、SMCに対して何らかの作用を有することは知られていなかった。そこで、本発明者らは、大動脈平滑筋細胞（AoSMC）を用いて、CTPが平滑筋細胞の遊走および増殖に対して、何らかの作用を有するか否かについて調査した。その結果、CTPを添加した平滑筋培養細胞の培養液において遊走性と増殖性が抑制されることが見出された。さらに、家族性高コレステロール血症モデルウサギを用いて、経口投与の実験を行ったところ、当初の予想を超えた効果として、アテローム性動脈硬化の発生・進行自体を抑制することができることが判明した。このような知見に基づいて本発明は完成された。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
上記課題を解決するための本発明は以下のとおりである。
［1］
少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Y(Gly-X-Yはアミノ酸配列であり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す）を含有するコラーゲンの加水分解物を有効成分として含む、アテローム性動脈硬化症の進行抑制薬または予防薬。
［2］
コラーゲンの加水分解物が25〜100質量%のコラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有する［1］に記載の進行抑制薬または予防薬。
［3］
コラーゲントリペプチドGly-X-Yが、Gly-Ala-Asp、Gly-Ala-Lys、Gly-Ala-Val、Gly-Pro-Gln、Gly-Pro-Met、Gly-Pro-Ile、Gly-Pro-Thr、Gly-Pro-Val、Gly-Ser-Hyp、Gly-Lys-Asp、Gly-Ala-Ala、Gly-Pro-Hyl、Gly-Leu-Hyp、Gly-Ala-Arg、Gly-Ala-Ser、Gly-Ala-Hyp、Gly-Gln-Glu、Gly-Glu-Gln、Gly-Pro-Ser、Gly-Pro-Lys、Gly-Pro-Ala、Gly-Pro-Pro、Gly-Pro-ArgおよびGly-Pro-Hypから成る群から選ばれる少なくとも1種のトリペプチドである［1］または［2］に記載の進行抑制薬または予防薬。
［4］
コラーゲンの加水分解物がコラーゲントリペプチドGly-X-Yの分解物であるGly-XまたはX-Yをさらに含有する［1］〜［3］のいずれかに記載の進行抑制薬または予防薬。
［5］
少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Y(Gly-X-Yはアミノ酸配列であり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す）を含有するコラーゲンの加水分解物を有効成分として含む、血中コレステロール低下薬。
［6］
コラーゲンの加水分解物が25〜100質量%のコラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有する［5］に記載の血中コレステロール低下薬。
［7］
コラーゲントリペプチドGly-X-Yが、Gly-Ala-Asp、Gly-Ala-Lys、Gly-Ala-Val、Gly-Pro-Gln、Gly-Pro-Met、Gly-Pro-Ile、Gly-Pro-Thr、Gly-Pro-Val、Gly-Ser-Hyp、Gly-Lys-Asp、Gly-Ala-Ala、Gly-Pro-Hyl、Gly-Leu-Hyp、Gly-Ala-Arg、Gly-Ala-Ser、Gly-Ala-Hyp、Gly-Gln-Glu、Gly-Glu-Gln、Gly-Pro-Ser、Gly-Pro-Lys、Gly-Pro-Ala、Gly-Pro-Pro、Gly-Pro-ArgおよびGly-Pro-Hypから成る群から選ばれる少なくとも1種のトリペプチドである［5］または［6］に記載の血中コレステロール低下薬。
［8］
コラーゲンの加水分解物がコラーゲントリペプチドGly-X-Yの分解物であるGly-XあるいはX-Yをさらに含有する［5］〜［7］のいずれかに記載の血中コレステロール低下薬。
［9］
少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Y(Gly-X-Yはアミノ酸配列であり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す）を含有するコラーゲンの加水分解物を有効成分として含む、血管の老化・炎症の抑制及び／又は予防に有効な機能性食品または特定保健用食品。
［10］
コラーゲンの加水分解物が15〜100質量%のコラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有する［9］に記載の機能性食品または特定保健用食品。
［11］
コラーゲントリペプチドGly-X-Yが、Gly-Ala-Asp、Gly-Ala-Lys、Gly-Ala-Val、Gly-Pro-Gln、Gly-Pro-Met、Gly-Pro-Ile、Gly-Pro-Thr、Gly-Pro-Val、Gly-Ser-Hyp、Gly-Lys-Asp、Gly-Ala-Ala、Gly-Pro-Hyl、Gly-Leu-Hyp、Gly-Ala-Arg、Gly-Ala-Ser、Gly-Ala-Hyp、Gly-Gln-Glu、Gly-Glu-Gln、Gly-Pro-Ser、Gly-Pro-Lys、Gly-Pro-Ala、Gly-Pro-Pro、Gly-Pro-ArgおよびGly-Pro-Hypから成る群から選ばれる少なくとも1種のトリペプチドである［9］または［10］に記載の機能性食品または特定保健用食品。
［12］
コラーゲンの加水分解物がコラーゲントリペプチドGly-X-Yの分解物であるGly-XあるいはX-Yをさらに含有する［9］〜［11］のいずれかに記載の機能性食品または特定保健用食品。
[13]
少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Y(Gly-X-Yはアミノ酸配列であり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す）を含有するコラーゲンの加水分解物の有効量を患者に投与することを含む、アテローム性動脈硬化症の進行抑制または予防する方法。
[14]
コラーゲンの加水分解物が25〜100質量%のコラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有する[13]に記載の進行抑制または予防方法。
[15]
コラーゲントリペプチドGly-X-Yが、Gly-Ala-Asp、Gly-Ala-Lys、Gly-Ala-Val、Gly-Pro-Gln、Gly-Pro-Met、Gly-Pro-Ile、Gly-Pro-Thr、Gly-Pro-Val、Gly-Ser-Hyp、Gly-Lys-Asp、Gly-Ala-Ala、Gly-Pro-Hyl、Gly-Leu-Hyp、Gly-Ala-Arg、Gly-Ala-Ser、Gly-Ala-Hyp、Gly-Gln-Glu、Gly-Glu-Gln、Gly-Pro-Ser、Gly-Pro-Lys、Gly-Pro-Ala、Gly-Pro-Pro、Gly-Pro-ArgおよびGly-Pro-Hypから成る群から選ばれる少なくとも1種のトリペプチドである[13]または[14]に記載の進行抑制または予防方法。
[16]
コラーゲンの加水分解物がコラーゲントリペプチドGly-X-Yの分解物であるGly-XまたはX-Yをさらに含有する[13]〜[15]のいずれかに記載の進行抑制または予防方法。
[17]
アテローム性動脈硬化症の進行抑制または予防に用いるための、少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Y(Gly-X-Yはアミノ酸配列であり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す）を含有するコラーゲンの加水分解物。
[18]
コラーゲンの加水分解物が25〜100質量%のコラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有する[17]に記載のコラーゲンの加水分解物。
[19]
コラーゲントリペプチドGly-X-Yが、Gly-Ala-Asp、Gly-Ala-Lys、Gly-Ala-Val、Gly-Pro-Gln、Gly-Pro-Met、Gly-Pro-Ile、Gly-Pro-Thr、Gly-Pro-Val、Gly-Ser-Hyp、Gly-Lys-Asp、Gly-Ala-Ala、Gly-Pro-Hyl、Gly-Leu-Hyp、Gly-Ala-Arg、Gly-Ala-Ser、Gly-Ala-Hyp、Gly-Gln-Glu、Gly-Glu-Gln、Gly-Pro-Ser、Gly-Pro-Lys、Gly-Pro-Ala、Gly-Pro-Pro、Gly-Pro-ArgおよびGly-Pro-Hypから成る群から選ばれる少なくとも1種のトリペプチドである[17]または[18]に記載のコラーゲンの加水分解物。
[20]
コラーゲンの加水分解物がコラーゲントリペプチドGly-X-Yの分解物であるGly-XまたはX-Yをさらに含有する[17]〜[19]のいずれかに記載のコラーゲンの加水分解物。
[21]
少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Y(Gly-X-Yはアミノ酸配列であり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す）を含有するコラーゲンの加水分解物の有効量を患者に投与することを含む、血中コレステロールを低下させる方法。
[22]
コラーゲンの加水分解物が25〜100質量%のコラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有する[21]に記載の血中コレステロールを低下させる方法。
[23]
コラーゲントリペプチドGly-X-Yが、Gly-Ala-Asp、Gly-Ala-Lys、Gly-Ala-Val、Gly-Pro-Gln、Gly-Pro-Met、Gly-Pro-Ile、Gly-Pro-Thr、Gly-Pro-Val、Gly-Ser-Hyp、Gly-Lys-Asp、Gly-Ala-Ala、Gly-Pro-Hyl、Gly-Leu-Hyp、Gly-Ala-Arg、Gly-Ala-Ser、Gly-Ala-Hyp、Gly-Gln-Glu、Gly-Glu-Gln、Gly-Pro-Ser、Gly-Pro-Lys、Gly-Pro-Ala、Gly-Pro-Pro、Gly-Pro-ArgおよびGly-Pro-Hypから成る群から選ばれる少なくとも1種のトリペプチドである[21]または[22]に記載の血中コレステロールを低下させる方法。
[24]
コラーゲンの加水分解物がコラーゲントリペプチドGly-X-Yの分解物であるGly-XあるいはX-Yをさらに含有する[21]〜[23]のいずれかに記載の血中コレステロールを低下させる方法。
[25]
血中コレステロールの低下に用いるための、少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Y(Gly-X-Yはアミノ酸配列であり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す）を含有するコラーゲンの加水分解物。
[26]
コラーゲンの加水分解物が25〜100質量%のコラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有する[25]に記載のコラーゲンの加水分解物。
[27]
コラーゲントリペプチドGly-X-Yが、Gly-Ala-Asp、Gly-Ala-Lys、Gly-Ala-Val、Gly-Pro-Gln、Gly-Pro-Met、Gly-Pro-Ile、Gly-Pro-Thr、Gly-Pro-Val、Gly-Ser-Hyp、Gly-Lys-Asp、Gly-Ala-Ala、Gly-Pro-Hyl、Gly-Leu-Hyp、Gly-Ala-Arg、Gly-Ala-Ser、Gly-Ala-Hyp、Gly-Gln-Glu、Gly-Glu-Gln、Gly-Pro-Ser、Gly-Pro-Lys、Gly-Pro-Ala、Gly-Pro-Pro、Gly-Pro-ArgおよびGly-Pro-Hypから成る群から選ばれる少なくとも1種のトリペプチドである[25]または[26]に記載のコラーゲンの加水分解物。
[28]
コラーゲンの加水分解物がコラーゲントリペプチドGly-X-Yの分解物であるGly-XあるいはX-Yをさらに含有する[25]〜[27]のいずれかに記載のコラーゲンの加水分解物。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、アテローム性動脈硬化症の新たな治療薬（進行抑制薬）および予防薬、並びにアテローム性動脈硬化症の治療及び予防等に有効な、血中コレステロール低下薬を提供することができる。さらに本発明によれば、血管の老化・炎症の抑制及び／又は予防に有効な機能性食品または特定保健用食品を提供することもできる。本発明の進行抑制薬、予防薬、血中コレステロール低下薬、機能性食品および特定保健用食品に有効成分として含有されるコラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有するコラーゲン加水分解物は、生体由来の安全性の高い物質であり、平滑筋細胞の遊走性と増殖性を抑制する効果があり、かつアテローム性動脈硬化の発生・進行自体を抑制する効果を有することから、生体に安全でアテローム性動脈硬化の発症抑制ができるものである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図1は、ヒト大動脈平滑筋細胞(AoSMC)の遊走に対するCTPの作用についての実験結果を示す。倒立顕微鏡下の一低倍率視野中の遊走AoSMCである。Aは対照群であり、BはCTP3μg/ml群である。
【図２】図2は、ヒト大動脈平滑筋細胞(AoSMC)の遊走に対するさまざまな濃度のCTP30の作用の結果を示す。対照群(CTP30:0μg/ml)における遊走細胞数に対する百分率で表示してある。
【図３】図3は、AoSMCのPCNAタンパク質発現に対するCTP30の作用についての実験結果を示す。図3AはCTP30へ24時間曝露後のAoSMCに発現されるPCNAのSDS-PAGEの電気泳動像を示す。図3Bは、バンドの相対強度の平均±SDを表す(PCNA/チューブリン)。
【図４】図4は、ヒト大動脈平滑筋細胞(AoSMC)におけるPCNA陽性比に対するCTP30の作用についての実験結果を示す。免疫細胞化学法によってPCNA陽性AoSMCは茶色の核を示し、PCNA陰性AoSMCは青色の核を示す。
【図５】図5は、ヒト大動脈平滑筋細胞(AoSMC)におけるPCNA陽性比に対するCTP30の作用についての実験結果を示す。PCNA陽性細胞の割合(平均±SD)を表した。
【図６】図6は、ヒト大動脈平滑筋細胞(AoSMC)の増殖に対するさまざまな濃度のCTP30の作用の経時変化を示す。AoSMCに各濃度のCTP30を記載の時間投与し、5個の高倍率視野(×200)中の細胞総数を計算した。各値は3回の独立した実験の平均±SDを表す。
【図７】図7は、実施例2におけるCTP30投与群と対照群の血中総コレステロール量についての比較結果を示す。
【図８】図8は、CTP30投与群の大動脈の観察写真を示す。
【図９】図9は、対照群の大動脈の観察写真を示す。
【図１０】図10は、アテローム性動脈硬化を起こしている病変(プラーク)の面積をもとめた大動脈の3領域(左から大動脈弓部、胸部大動脈および腹部大動脈)を示す。
【図１１】図11は、ヒト大動脈平滑筋細胞（AoSMC）の遊走に対するさまざまな濃度のCTP90の作用の結果を示す。対照群（CTP90:0μg/ml)における遊走細胞数に対する百分率で表示してある。
【図１２】図12は、ヒト大動脈平滑筋細胞（AoSMC）におけるPCNA陽性比に対するCTP90の作用についての実験結果を示す。PCNA陽性細胞の割合（平均±SD）を表した。
【図１３】図13は、ヒト大動脈平滑筋細胞（AoSMC）の増殖に対するさまざまな濃度のCTP90の作用の経時的変化を示す。AoSMCに各濃度のCTP90を記載の時間投与し、5個の高倍率視野（×200）中の細胞総数を計算した。各値は3回の独立した実験の平均±SDを表す。
【図１４】図14は、アザン染色によるウサギ・アテローム性動脈硬化巣（プラーク）の線維化の解析結果を示す。図A:濃青色の部分（黒の矢印）はコラーゲン線維の多い進行した線維化領域を示す。図B:淡青色の部分（青の矢印）はコラーゲン線維の少ない初期の線維化領域を示す。
【図１５】図15は、ウサギ・アテローム性動脈硬化巣（プラーク）の線維化に対するCTP30の作用を示す。対照群（control）、CTP30投与群（CTP）における濃青色の部分（fibrosis）と淡青色の部分（sparse collagen）の面積率（%）を比較したものである。
【図１６】図16は、免疫組織化学によるウサギ・アテローム性動脈硬化巣（プラーク）における平滑筋細胞とマクロファージの解析結果を示す。A（RAM11）：プラークにおけるマクロファージ（褐色の細胞）の局在を示し、B（HHF35）：プラークにおける平滑筋細胞（褐色の細胞）の局在を示す。
【図１７】図17は、アテローム性動脈硬化巣（プラーク）におけるSMCとマクロファージの構成に対するCTP30の作用の結果を示す。
【図１８】図18は、CTP30投与群と対照群の、プラーク中のSMCとマクロファージの構成（面積）比の比較を示す。
【図１９−１】図19-1は、GELITA-SOL DA（以下、DA）の投与24時間の遊走細胞を計数し、対照群において遊走したAoSMCの細胞数を100％として表した。値は4回の独立した実験の相対平均±SD（対照群の％）を示している。
【図１９−２】図19-2は、DAの投与48時間の遊走細胞を計数し、対照群において遊走したAoSMCの細胞数を100％として表した。値は4回の独立した実験の相対平均±SD（対照群の％）を示している。
【図１９−３】図19-3は、GELITA-SOL LDA Aggl.（以下、LDA）の投与24時間の遊走細胞を計数し、対照群において遊走したAoSMCの細胞数を100％として表した。値は4回の独立した実験の相対平均±SD（対照群の％）を示している。
【図１９−４】図19-4は、LDAの投与48時間後の遊走細胞を計数し、対照群において遊走したAoSMCの細胞数を100％として表した。値は4回の独立した実験の相対平均±SD（対照群の％）を示している。
【図２０−１】図20-1は、AoSMCの増殖に対するDAの3種類の濃度（3、30、300 μg/ml）の作用と対照群（0μg/ml）の経時変化を示す。AoSMCに各濃度のDAを記載の時間投与し、その後、5個の高倍率視野（×200）中の細胞総数を計算した。値は3回の独立した実験の平均±SDを表す。
【図２０−２】図20-2は、AoSMCの増殖に対するLDAの3種類の濃度（3、30、300 μg/ml）の作用と対照群（0μg/ml）の経時変化を示す。AoSMCに各濃度のLDAを記載の時間投与し、その後、5個の高倍率視野（×200）中の細胞総数を計算した。各値は3回の独立した実験の平均±SDを表す。
【図２１−１】図21-1は、AoSMCにおけるPCNA陽性細胞比に対するDAの3種類の濃度（3、30、300 μg/ml）と対照群（0μg/ml）の作用を示す。各値は3回の独立した実験の平均±SDを表し、PCNA陽性細胞の割合を表した。
【図２１−２】図21-2は、AoSMCにおけるPCNA陽性細胞比に対するLDAの3種類の濃度（3、30、300 μg/ml）と対照群（0μg/ml）の作用を示す。各値は3回の独立した実験の平均±SDを表し、PCNA陽性細胞の割合を表した。
【図２２】図22は、比較例で使用したGelita社のCP成分（DAおよびLDA）及び実施例で使用したCTP30及び90それぞれのHPLCのクロマトグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
[アテローム性動脈硬化症の進行抑制薬]
本発明の第１の態様は、アテローム性動脈硬化症の進行抑制薬である。アテローム性動脈硬化症は、大動脈や脳動脈、冠動脈などの比較的太い動脈に起こり、動脈の内膜にコレステロールやコレステロールエステルなどの脂肪からなるドロドロの粥状物質がたまってアテローム性プラーク（粥腫斑）ができ、次第に肥厚することで生じ、徐々に動脈の内腔を狭めていく。本発明によれば、アテローム性動脈硬化症の進行を抑制することができる。
【００２３】
本発明のアテローム性動脈硬化症の進行抑制薬は、少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Y(Gly-X-Yはアミノ酸配列であり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す）を含有するコラーゲンの加水分解物を有効成分として含むものである。このコラーゲンの加水分解物は、好ましくは25〜100質量%のコラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有するものである。コラーゲントリペプチドGly-X-Yの含有率は、コラーゲントリペプチドGly-X-Yの効果のみを選択的に得たい場合には、より高い含有量であることが好ましく、その場合には30〜100質量%、より好ましくは50〜100質量%、さらに好ましくは80〜100質量%の範囲であることができる。本発明のアテローム性動脈硬化症の進行抑制薬は、コラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有すれば、所望の効果を得られる一方で、コラーゲントリペプチドGly-X-Yの純度を高めるためには、高度の精製が必要になることから、製造コストが高くなる傾向がある。従って、所望の効能とコスト(費用)を考慮して、使用するコラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有するコラーゲンの加水分解物の含有量(純度)を決めることができる。
【００２４】
また、コラーゲンの加水分解物に含有されるコラーゲントリペプチドGly-X-Yは、例えば、Gly-Ala-Asp、Gly-Ala-Lys、Gly-Ala-Val、Gly-Pro-Gln、Gly-Pro-Met、Gly-Pro-Ile、Gly-Pro-Thr、Gly-Pro-Val、Gly-Ser-Hyp、Gly-Lys-Asp、Gly-Ala-Ala、Gly-Pro-Hyl、Gly-Leu-Hyp、Gly-Ala-Arg、Gly-Ala-Ser、Gly-Ala-Hyp、Gly-Gln-Glu、Gly-Glu-Gln、Gly-Pro-Ser、Gly-Pro-Lys、Gly-Pro-Ala、Gly-Pro-Pro、Gly-Pro-ArgおよびGly-Pro-Hypから成る群から選ばれる少なくとも1種のトリペプチドであることができる。これらのトリペプチドは、ほとんどが親水性を示す物である。
【００２５】
コラーゲンの加水分解物は、上記コラーゲントリペプチドGly-X-Y以外に、コラーゲンの加水分解物ではあるが、トリペプチドよりも分子量の大きいアミノ酸の4量体以上の加水分解物と、コラーゲントリペプチドGly-X-Yの分解物であるGly-XまたはX-Yをさらに含有することができる。Gly-X及びX-Yはいずれもジペプチドであり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す。実施例で使用するCTP30の場合、コラーゲントリペプチドGly-X-Yの含有量が25〜35質量%、Gly-X及びX-Yの含有量が約10質量%、残りがトリペプチドよりも分子量の大きいアミノ酸の4量体以上の加水分解物である。アミノ酸の4量体以上の加水分解物は、最大でも分子量が6000程度である。この点は、図22に示すCTP30のHPLCのクロマトグラムからも明らかである。また、実施例で使用するCTP90の場合、コラーゲントリペプチドGly-X-Yの含有量が85〜100質量%であり、残りがGly-X及びX-Yとトリペプチドよりも分子量の大きいアミノ酸の4量体以上の加水分解物である。この点は、図22に示すCTP90のHPLCのクロマトグラムからも明らかである。
【００２６】
コラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有するコラーゲンの加水分解物は、I型コラーゲンのペプチド結合をグリシンのアミノ末端で切断する細菌コラゲナーゼ(特許文献8、9)を用いて加水分解することで得られる。コラーゲンの加水分解物に含まれるコラーゲントリペプチドGly-X-Yの種類は、加水分解の原料となるコラーゲンの種類や加水分解に使用するコラゲナーゼの種類や加水分解条件等により変化する。さらに、加水分解物は、種々の方法による精製処理に供することによって、Gly-X-Y配列を有するコラーゲントリペプチド(CTP)を含む高度に精製された非抗原性および低アレルゲン性トリペプチド画分を含む加水分解物とすることもできる。
【００２７】
本発明のアテローム性動脈硬化症の進行抑制薬は、有効成分であるコラーゲンの加水分解物を、コラーゲンの加水分解物に含まれるコラーゲントリペプチドGly-X-Yの濃度によっても異なるが、例えば、コラーゲントリペプチドGly-X-Y濃度が30%のコラーゲンの加水分解物の場合、体重1kg当たり10〜1000mg、1日1回または2〜3回に分けて経口投与することができる。有効成分であるコラーゲンの加水分解物は、粉末または錠剤とすることができる他、水溶液とすることもできる。また投与形態は、経口に限らず、注射等も利用できる。
【００２８】
[アテローム性動脈硬化症の予防薬]
本発明の第２の態様は、アテローム性動脈硬化症の予防薬である。アテローム性動脈硬化症は、大動脈や脳動脈、冠動脈などの比較的太い動脈に起こり、動脈の内膜にコレステロールやコレステロールエステルなどの脂肪からなるドロドロの粥状物質がたまってアテローム性プラーク（粥腫斑）ができ、次第に肥厚することで動脈の内腔を狭め、臨床症状が出現してくる。本発明によれば、アテローム性動脈硬化症の発症を予防することができる。
【００２９】
本発明のアテローム性動脈硬化症の予防薬が有効成分として含有するコラーゲンの加水分解物は、上記進行抑制薬で説明したものと同様である。
【００３０】
本発明のアテローム性動脈硬化症の予防薬は、コラーゲンの加水分解物に含まれる有効成分のコラーゲントリペプチドGly-X-Yの濃度によっても異なるが、例えば、コラーゲントリペプチドGly-X-Y濃度が30%のコラーゲンの加水分解物の場合、体重1kg当たり10〜1000mg、1日1回または2〜3回に分けて経口投与することができる。有効成分であるコラーゲンの加水分解物は、粉末または錠剤とすることができる他、水溶液とすることもできる。また投与形態は、経口に限らず、注射等も利用できる。
【００３１】
以上の記載に基づいて、本発明の少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Y(Gly-X-Yはアミノ酸配列であり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す）を含有するコラーゲンの加水分解物の有効量を患者に投与することを含む、アテローム性動脈硬化症の進行抑制または予防する方法も実施できる。さらに、以上の記載に基づいて、本発明のアテローム性動脈硬化症の進行抑制または予防に用いるための、少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Y(Gly-X-Yはアミノ酸配列であり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す）を含有するコラーゲンの加水分解物も実施できる。
【００３２】
[血中コレステロール低下薬]
本発明の第３の態様は、血中コレステロール低下薬である。アテローム性動脈硬化症は、大動脈や脳動脈、冠動脈などの比較的太い動脈に起こり、動脈の内膜にコレステロールやコレステロールエステルなどの脂肪からなるドロドロの粥状物質がたまってアテローム性プラーク（粥腫斑）ができ、次第に肥厚することで動脈の内腔を狭め、臨床症状が出現してくる。本発明によれば、血中コレステロールを低下させることができ、その結果、アテローム性動脈硬化症等の血中コレステロールに起因する種々の疾患の発症を抑制又は予防することができる。
【００３３】
本発明の血中コレステロール低下薬が有効成分として含有するコラーゲンの加水分解物は、上記進行抑制薬で説明したものと同様である。
【００３４】
本発明の血中コレステロール低下薬の予防薬は、コラーゲンの加水分解物に含まれる有効成分のコラーゲントリペプチドGly-X-Yの濃度によっても異なるが、例えば、コラーゲントリペプチドGly-X-Y濃度が30%のコラーゲンの加水分解物の場合、体重1kg当たり10〜1000mg、1日1回または2〜3回に分けて経口投与することができる。有効成分であるコラーゲンの加水分解物は、粉末または錠剤とすることができる他、水溶液とすることもできる。また投与形態は、経口に限らず、注射等も利用できる。
【００３５】
以上の記載に基づいて、本発明の少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Y(Gly-X-Yはアミノ酸配列であり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す）を含有するコラーゲンの加水分解物の有効量を患者に投与することを含む、血中コレステロールを低下する方法も実施できる。さらに、以上の記載に基づいて、本発明の血中コレステロールの低下に用いるための、少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Y(Gly-X-Yはアミノ酸配列であり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す）を含有するコラーゲンの加水分解物も実施できる。
【００３６】
[機能性食品及び特定保健用食品]
本発明は、少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Y(Gly-X-Yはアミノ酸配列であり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す）を含有するコラーゲンの加水分解物を有効成分として含む、血管の老化・炎症の抑制及び／又は予防に有効な機能性食品及び特定保健用食品も包含する。
【００３７】
前述のように、２〜１５歳になるとほとんどの小児の動脈にアテローム性動脈硬化症の初期病変が観察される。思春期頃から病変の増加が著明となり、２０〜３０歳までには大動脈表面の約３０％を病変が占めるに至る（非特許文献６）。本発明の機能性食品及び特定保健用食品は、血管の老化・炎症の抑制及び／又は予防に有効であり、アテローム性動脈硬化症の進行抑制や予防を必要とする多くの人々に用いることができる。本発明の機能性食品及び特定保健用食品に含まれるコラーゲントリペプチドGly-X-Yの種類は、アテローム性動脈硬化症の進行抑制薬や予防薬に用いられるものと同様である。機能性食品及び特定保健用食品としては、例えば、少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有するコラーゲンの加水分解物を有効成分として含む錠剤、カプセル剤およびドリンク剤等のサプリメント、あるいは同じコラーゲンの加水分解物を配合した食品および飲料等を挙げることができる。本発明の機能性食品及び特定保健用食品は、アテローム性動脈硬化症の進行抑制および予防に有効であることから、アテローム性動脈硬化症の進行抑制および予防を必要とする多くの人々に用いられる。
【００３８】
機能性食品及び特定保健用食品におけるコラーゲンの加水分解物の濃度は、コラーゲントリペプチドGly-X-Yとして、好ましくは15質量%以上であることができる。前述のように、本発明のアテローム性動脈硬化症の進行抑制及び予防効果は、コラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有するコラーゲンの加水分解物を用いれば得られる一方で、コラーゲントリペプチドGly-X-Yの純度を高めるためには、高度の精製が必要になることから、製造コストが高くなる傾向がある。しかし、コラーゲントリペプチドGly-X-Yの濃度が低いコラーゲンの加水分解物では、コラーゲントリペプチドGly-X-Y以外の成分、特に、加水分解の程度が低い高分子量の成分が多くなり、食品への添加に支障をきたす場合もある。そこで、所望の効能とコスト(費用)、さらには食品への添加のし易さ等を考慮して、使用するコラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有するコラーゲンの加水分解物の純度を決めることが適当である。機能性食品においては、価格をある程度抑制したい場合があり、そのような場合には、コラーゲントリペプチドGly-X-Yの含有率は、好ましくは15〜25質量%であることが適当である。特定保健用食品においても、コラーゲントリペプチドGly-X-Yの含有率は、機能性食品と同様に15〜25質量%であることができる。但し、機能性食品よりは、効果の発現をより確実にしたい場合があり、そのような場合には、コラーゲントリペプチドGly-X-Yの含有率は、好ましくは25〜35質量%であることが適当である。
【００３９】
本発明の機能性食品は、コラーゲンの加水分解物に含まれる有効成分のコラーゲントリペプチドGly-X-Yの濃度によっても異なるが、例えば、コラーゲントリペプチドGly-X-Y濃度が20%のコラーゲンの加水分解物の場合、体重1kg当たり10〜1000mg、1日1回または2〜3回に分けて経口摂取することができる。本発明の機能性食品は、形態は特に制限はなく、固形、液状、流動物(例えば、ゲル、ペースト等)等であることができ、また、食品の種類にも特に制限はない。さらに、有効成分であるコラーゲンの加水分解物は、固形、液状、または流動物に適用が容易であるという観点からは、例えば、粉末または液体(水溶液または水分散物等)であることができる。本発明の機能性食品は、加齢に伴う血管の変化、特にアテローム性動脈硬化や血管の炎症を抑え、血管をよい状態に維持する機能を有する。そのため、このような機能を必要とするヒトへの使用に有用である。
【００４０】
本発明の特定保健用食品は、コラーゲンの加水分解物に含まれる有効成分のコラーゲントリペプチドGly-X-Yの濃度によっても異なるが、例えば、コラーゲントリペプチドGly-X-Y濃度が20%のコラーゲンの加水分解物の場合、体重1kg当たり10〜500mg、1日1回または2〜3回に分けて経口摂取することができる。本発明の特定保健用食品は、形態は特に制限はなく、固形、液状、流動物(例えば、ゲル、ペースト等)等であることができ、また、食品の種類にも特に制限はない。さらに、上述の医薬品と同様に錠剤、カプセル剤およびドリンク剤とすることもできる。また、有効成分であるコラーゲンの加水分解物は、食品の形態に応じて、例えば、粉末または液体(水溶液または水分散物等)であることができる。本発明の特定保健用食品は、血管の老化・炎症の抑制及び／又は予防に有効であり、アテローム性動脈硬化または血管の老化が心配な方(ヒト)及びアテローム性動脈硬化または血管の老化を予防・改善したい方(ヒト)に有用である。特定保健用食品とは、一般に、食品の持つ特定の保健の用途を表示して販売される食品である。本発明の特定保健用食品は、食品の持つ特定の保健の用途として、アテローム性動脈硬化または血管の老化の予防・改善を表示して販売されることが予定される食品である。
【実施例】
【００４１】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明する。【００４２】
実施例１
(平滑筋細胞培養実験方法)
細胞培養
ヒト大動脈平滑筋細胞(AoSMC)はロンザ・ウォーカーズビル（Lonza Walkersville）(米国、製品コードCC-2571)から購入し、基本培地(SmBM,CC-3181)およびSingleQuots(CC-4149)を含むSmGM-2バレットキット（BulletKit）(キャンブレックス（Cambrex）, CC-3182)中で37℃,5%CO2環境下で維持した。細胞を直径10cmのコラーゲンコート培養ディッシュにて37℃,5%CO2インキュベーター内で増殖させた。細胞が、70〜80%集密になり、プレート全体に多数の有糸分裂像を含む時に0.025%トリプシン、0.01%EDTAを含むハンクス緩衝塩類溶液(HBSS)を用いて継代した。トリプシン処理後、細胞を5%ウシ胎仔血清(FBS)を含むかまたは含まない培地に懸濁し、以後の実験に供した。【００４３】
AoSMCの遊走検定
AoSMCの遊走は、孔径8.0μmのメンブランフィルター(直径6.5mm)を有するトランスウェル（Transwell Permeable Supports）(コーニング・インコーポレイテッド・ライフサイエンス社（Corning Incorporated Life Sciences）, 米国, No.3422)を用いて検定した。SmBM培地を用いて24時間培養したAoSMCをトリプシン処理し、濃度1×106細胞/mlでSmBMに懸濁した。細胞懸濁液100μl量を上室のウェルに入れ、CTP30(コラーゲントリペプチド含有率30%)をさまざまな濃度(0、3、30、300μg/ml)で含むSmGM650μlを下室のウェルに入れ、トランスウェルを37℃にて5%CO2インキュベーターでインキュベートした。12時間、24時間および48時間インキュベーションした後、上室のウェルを除去した。メンブランフィルターの穴を通って下室のウェルへ遊走し、下室の底面に付着したAoSMCを4%パラホルムアルデヒドで固定した後、AoSMC遊走の定量のために倒立顕微鏡(倍率×400)下で計数した。【００４４】
AoSMCに関するPCNAウェスタンブロットアッセイ
濃度1×105細胞/mlにて懸濁したAoSMCを6ウェルマイクロプレート(5ml/ウェル)に分配した。接着後、培地をさまざまな濃度(0、3、30、300μg/ml)でCTP30を含むSmGMで置き換えた。24時間インキュベート後、細胞を下記の通りウェスタンブロットアッセイのために回収した:細胞培養をリン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄し、次いでプロテアーゼインヒビターカクテル(コンプリートミニ（Complete mini）、EDTAフリー、ロシュ社（Roche）)を添加した溶解緩衝液(50mM トリス-HCl，150mM NaCl，1.0% ノニデット（Nonidet）P40)中で氷上にて溶解し、12,000 gにて20分間4℃で遠心分離した。上清を、試料緩衝液を添加することによって直ちに混合した。タンパク質濃度はビシンコニン酸タンパク質アッセイ試薬を用いて測定した。等量のタンパク質(30μg)を10%SDS-PAGEで単離し、およびイモビロン（Immobilon）転写膜(ミリポア社（Millipore）、米国)にブロットした。この転写膜を3%ウシ血清アルブミン含有トリス緩衝生理食塩水を用いて1時間25℃にてブロックし、次いで一次抗体(抗ヒトPCNA抗体、1:500)を用いて反応を行った。HRP結合ヤギ抗マウスIgG(ピアース社（PIERCE）、米国)およびスーパーシグナル（Supersignal）ウェスト・フェムト最大感度基質(ピアース社、米国)を一次抗体の検出に用いた。結果として生じる化学発光を冷却CCDカメラシステム(アトー社（ATTO）)で捕捉し、デンシトメトリー分析ImageJソフトウェア(NIH Image)によって定量した。【００４５】
AoSMCに関するPCNA陽性比検定
AoSMCをトリプシン処理し、濃度1×105細胞/mlにてSmGM培地に懸濁した。滅菌カバースライスを6ウェルマイクロプレートに入れ、次いで細胞懸濁液をウェルに分配した(5ml細胞/ウェル)。接着後（分配の約６時間後）、培地をさまざまな濃度(0、3、30、300μg/ml)でCTP30を含むSmGMに置き換えた。24時間インキュベート後、スライスを除去し、PCNA免疫細胞化学法をモノクローナルマウス抗ヒトPCNA抗体(ダコ・ジャパン社（DakoJapan）、日本、M0879)およびSAB-POキット(ヒストファイン（Histofine)、日本、コード424022)を用いて実施した。次いでスライスをヘマトキシリンで二重染色し、脱水、密封し、顕微鏡下で細胞計算に用いた。10個の高倍率視野(倍率×200)を各スライスについて選択し、細胞総数およびPCNA陽性細胞数を計算した(PCNA陽性比=陽性細胞数/細胞総数)。【００４６】
AoSMCに関する増殖検定
濃度1×105 細胞/mlにてSmGM培地に懸濁したAoSMCを、各ウェルに滅菌カバースライスを入れた6ウェルマイクロプレートに分配した。接着後、培地をさまざまな濃度(0、3、30、300μg/ml)でCTP30を含むSmGMに置き換えた。各0時間、24時間、48時間、72時間培養し、スライスを除去し、4%パラホルムアルデヒドで固定し、ヘマトキシリンで染色した。次いでスライスを脱水、密封し、顕微鏡下で細胞計算に用いた。5個の高倍率視野(倍率×200)を各スライスについて選択し、細胞総数を計算した。【００４７】
データ解析および統計評価
データはSocial Sciences 10.0統計ソフトウェアの統計パッケージを用いて分析した。一元ANOVA法に次いで最小有意差事後検定を用いて、群間の統計的有意性を判定した。【００４８】
(結果)
AoSMCにおける遊走に対するCTPの作用
CTP30のさまざまな濃度での投与後、12時間でAoSMCの明瞭な遊走を観察せず、24時間でごくわずかの遊走を認めた(結果記載せず)。図1は48時間での遊走細胞の像を示す。倒立顕微鏡下で下室のウェルの底面に付着した典型的な紡錘形として表される多数の遊走細胞を検出した。図2はAoSMCの遊走に対するCTP30の作用を示す。CTP30は3種類の濃度(3、30、300μg/ml)とも投与48時間後にAoSMCの遊走を強く阻害した。しかし異なるCTP30濃度間に有意差はみられなかった。【００４９】
図1，2は、ヒト大動脈平滑筋細胞(AoSMC)の遊走に対するさまざまな濃度のCTP30の作用を示す。AoSMCに各濃度のCTP30を48時間投与し、その後、遊走細胞を計算した。(図1)倒立顕微鏡下の一低倍率視野中の遊走AoSMC。A、Bはそれぞれ対照群およびCTP30 3μg/ml群である。(図2)各値は４回の独立した実験でカウントした相対平均±SD(対照群の%)を示し、対照群（CTP 0μg/ml）において遊走した平滑筋細胞数を100%として表示した。【００５０】
AoSMCにおけるPCNAタンパク質発現に対するCTPの作用
図3AはCTP30へ24時間曝露後のAoSMCに発現されるPCNAのSDS-PAGEの電気泳動像を示す。デンシトメトリーによって定量分析が実施された際、対照群に比較して300μg/ml CTP30が明らかに、AoSMCのPCNA発現を阻害できることを見出した。しかしこの作用は3μg/mlCTP群と30μg/mlCTP群で検出されなかった(図3に示す)。これらの結果はAoSMCにおけるPCNA発現の抑制は投与後24時間で高濃度のCTP30により強く起こることを示した。【００５１】
図3は、ヒト大動脈平滑筋細胞(AoSMC)におけるPCNA発現に対するさまざまな濃度のCTP30の作用を示す。AoSMCに各濃度のCTP30を24時間投与し、その後、上記実験方法に記載の通りウェスタンブロットを実施した。(図3A)AoSMCのPCNAのSDS-ポリアクリルアミドゲル(10%)電気泳動像;(図3B)各値は3回の独立した実験の平均であり、バンドの相対強度の平均±SDを表す(PCNA/チューブリン)。【００５２】
AoSMCにおけるPCNA陽性細胞比に対するCTPの作用
ウェスタンブロットで認められたPCNA発現の変化が、全ての細胞におけるダウンレギュレーションの結果であるか、またはPCNA陽性細胞比の減少の結果であるかを調べるため、さらにPCNA免疫細胞化学法を実施し、陽性比を計算した。図4はそれぞれさまざまなCTP30濃度の免疫細胞化学法結果を示す。図中に、PCNA陽性細胞は茶色の核および細い紡錘形を示すのが見られる。同時に、PCNA陰性細胞は青色の核を示し、広い細胞質を有する不整形の形態として現れる。図5に示す定量分析は、CTP30はCTP投与24時間後のPCNA陽性比を大きく低下できることを明らかにした。同時に、さまざまな濃度のこれらの3群間に有意差は無く、それは24時間でのこの作用に明瞭な用量依存性が無いことを示す。【００５３】
図4、5は、ヒト大動脈平滑筋細胞(AoSMC)におけるPCNA陽性比に対するさまざまな濃度のCTP30の作用を示す。AoSMCにさまざまな濃度のCTP30を24時間投与し、その後、上記実験方法に記載の通り、PCNA免疫細胞化学法を実施し10個の高倍率視野(×200)における陽性比を計算した。(図4)免疫細胞化学法によるPCNA陽性AoSMC (茶色の核)、PCNA陰性AoSMC (青色の核);(図5)各値は3回の独立した実験の平均±SDを表し、PCNA陽性細胞の割合を表した。【００５４】
AoSMC増殖に対するCTPの経時作用
図6に示すグラフによると、CTP30 300μg/ml群がCTP30投与後24時間に対照群と比較してAoSMCの増殖に対して明らかな阻害作用を示すことがわかるが、CTP30 3μg/ml群とCTP30 30μg/ml群は明らかな阻害作用を示すことができなかった。しかし、CTP30投与後、48時間および72時間の時点に、CTP30高濃度群(300μg/ml)および低濃度群(3μg/mlおよび30μg/ml)間の差は消滅し、すべてのCTP群が対照群と比較して明らかな阻害作用を示した。さらに、開始時の細胞数と比較して、各群の細胞は持続する増殖傾向を示したので、AoSMCに対するCTP30の毒性作用は除外することができる。【００５５】
図6は、ヒト大動脈平滑筋細胞(AoSMC)における増殖に対するさまざまな濃度のCTP30の作用の経時変化を示す。AoSMCに各濃度のCTP30を記載の時間投与し、その後、上記実験方法に記載の通り、5個の高倍率視野(×200)中の細胞総数を計算した。各値は3回の独立した実験の平均±SDを表す。【００５６】
(考察)
動脈中膜平滑筋細胞の内膜への遊走と内膜での増殖は、マクロファージやTリンパ球の浸潤・増殖と共にアテローム性動脈硬化症の成り立ちの主要な過程であることがよく知られている。動脈の内皮細胞障害に続いて、平滑筋細胞(SMC)は中膜から内膜へ遊走し、内膜で増殖する。内膜で平滑筋細胞はコラーゲン線維や弾性線維を産生し、さらに、一部の細胞は脂質を貪食し、泡沫細胞へ転換する。従って、平滑筋細胞と平滑筋細胞によって産生されたコラーゲン線維や他の細胞外マトリックス成分は、アテローム性プラークの主要な構造となる。多数の基礎および臨床研究は、SMCの増殖および遊走が治療効果に対して大きな影響を及ぼし、また、長期効果に直接影響することを示した。冠動脈アテローム性動脈硬化狭窄のための一般的な治療法である、経皮的冠動脈形成術(PTCA)のように、平滑筋細胞の内膜への遊走および増殖は、術後の再狭窄を結果として生じる最も重要な理由である。そのため、どのようにこの過程を調節し、およびSMCの遊走および増殖を阻害するかが、基礎医学だけでなく臨床治療分野でも大きな問題になっている。【００５７】
上記実験結果では、大動脈中膜由来平滑筋細胞(AoSMC)における増殖および遊走に対するCTP30の作用を初めて示した。この結果によると、in vitroでのヒトAoSMCの増殖に対してだけでなく遊走に対しても、CTP30の顕著な阻害作用があることが分かる。CTP含有率の異なるCTP30およびCTP90とも、それぞれ3つの異なる濃度のすべてが同様の作用および阻害傾向を示すことができる。CTP投与後24時間で、CTP30 300μg/ml群は有意に総PCNA発現レベルを低下および細胞増殖を阻害できた。CTP含有率の低いCTP30では 3μg/ml群と30μg/ml群はこの時点(24時間)では有意な阻害作用を示すことができないが、培養時間の48時間および72時間後では有意な増殖阻害作用を示した。それは、高濃度での阻害作用の出現は低濃度よりも早く、この用量依存性は培養の初期(24時間)にだけ存在することを示唆した。CTP含有率の高いCTP90では、低濃度（3μg/ml、30μg/ml）でも投与後24時間で有意に細胞増殖を阻害したことはこの示唆を支持している。【００５８】
増殖性細胞核抗原(PCNA)は、自己免疫疾患(SLE)患者の血清中にある抗体に反応する細胞周期のDNA合成期(S期)に細胞の核で検出される抗原として最初に同定され、増殖細胞の指標として用いられた。ハンバート（Humbert）他はS期の異なる時点のPCNA強度を三次元表示で示し、PCNA発現レベルは時点によって大きく異なり、S期の中期で高く、初期または後期で低いことを示した(引用文献1-1)。上記実験結果では、CTP30の投与24時間後で、低濃度群(3μg/mlおよび30μg/ml)でPCNA陽性比の減少を誘導できることが示されたが、しかしPCNA発現レベルまたは細胞数のどちらも、いずれの群でも減少を示さなかった。本発明者らは、免疫組織化学によるPCNA陽性細胞の同定とウエスタンブロット解析によるPCNAタンパク質発現レベルおよび実際の細胞分裂・増殖に時間的差（time-lag）があるものと考えている。【００５９】
SMCの増殖および遊走は複雑な過程であり、種々の遺伝子と関連タンパク質の発現、例えば転写因子、サイクリン、サイクリン依存性キナーゼ(Cdk)、接着分子などが関与する。これまでに、コラーゲンまたは分解された断片と平滑筋細胞の間の増殖・遊走の関連が報告されている。線維性コラーゲンはCdk2阻害因子の調節を通じて動脈平滑筋細胞増殖を阻害しうること(引用文献1-2)、線維性コラーゲンはまた細胞応答および細胞周辺マトリックス環境に関与するヒト血管平滑筋細胞遺伝子を特異的に調節しうること(引用文献1-3)が報告されている。しかしCTPが増殖および遊走を阻害するといった知見はこれまで全く得られていなかった。【００６０】
本実験結果は、CTPがヒトAoSMCの増殖および遊走をin vitroで有意に阻害し、かつPCNA発現レベルおよびPCNA陽性細胞比を低下しうることを示している。同時に、この種の阻害作用は明らかな用量依存性または細胞毒性を有しない。今回の結果は、CTPがヒト動脈平滑筋細胞の遊走および増殖の効果的な調節因子であることを強く示唆し、かつCTPが医薬分野で心血管病変に使用できることを示唆するものである。【００６１】
実施例１における引用文献
(1-1) HUMBERT C, SANTISTEBAN M S, USSON Y, ROBERT-NICOUD M: Intranuclear co-location of newly replicated DNA and PCNA by simultaneous immunofluorescent labelling and confocal microscopy in MCF-7 cells. J Cell Sci. 1992 103: 97-103
(1-2) Koyama H, Raines EW, Bornfeldt KE, Roberts JM, Ross R. Fibrillar collagen inhibits arterial smooth muscle cell proliferation through regulation of Cdk2 inhibitors. Cell 1996; 87: 1069-1078
(1-3) Ichii T, Koyama H, Tanaka S, Kim S, Shioi A, Okuno Y, Raines EW, Iwao H, Otani S, Nishizawa Y. Fibrillar collagen specifically regulates human vascular smooth muscle cell genes involved in cellular responses and the pericellular matrix environment. Circ Res. 2001; 88: 460-467
上記引用文献1-1〜1-3の全記載は、ここに特に開示として援用される。【００６２】
実施例２
家族性高コレステロール血症モデルウサギ(KHCウサギ、体重約2kg、生後3ヶ月、生産地：日本医科学動物資材研究所、東京；購入先：三共ラボサービス株式会社、富山)5羽に、200mg/kgのCTP30(CTP30 400mgを5mlの蒸留水(ミリQ)に溶解したもの)を3ヶ月間経口投与し、CTP非添加蒸留水投与の対照群5羽と血中総コレステロール量について比較した。結果を図7に示す。3か月前と比較し、対照群では血中総コレステロールが8%低下していた。一方、CTP30投与群では、23.2%も低下しており、CTPは明らかに血中総コレステロール量の低下作用を示した。【００６３】
さらに、これらのウサギを犠牲死させ、大動脈を観察した。CTP投与群の大動脈の観察写真を図8に示し、対照群の大動脈の観察写真を図9に示す。さらに、アテローム性動脈硬化を起こしている病変(プラーク)の面積を図10に示す。3領域ごとに求めたデータを以下の表1に示す。具体的には、3領域におけるアテローム性動脈硬化巣（プラーク）の面積（デジタルカメラ画像を元に、病巣画像の面積をピクセル数で数値化し、大動脈表面の面積中の割合；％で表記）を比較した。この結果、対照群は大動脈総面積の16.4％にプラークが生じていたが、CTP投与群は、わずか4.5％であった。これは対照群で生じたプラーク面積の27.4％にしかすぎず、プラークの発生が強く抑制されているといえる。【００６４】
【表１】
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【００６５】
実施例３
CTP90（コラーゲントリペプチド含有率90%）の培養平滑筋細胞の遊走および増殖に及ぼす効果
〔実験方法〕
平滑筋細胞の遊走および増殖検定は先に述べたCTP30と同様の方法で行った。
（結果）
AoSMCにおける遊走に対するCTP90の作用
CTP90のさまざまな濃度での投与後、12時間でAoSMCの明瞭な遊走を観察せず、24時間でごくわずかの遊走を認めた（結果記載せず）。図11はAoSMCの遊走に対するCTP90の作用を示す。CTP90は3種類の濃度（3、30、300μg/ml）とも投与48時間後にAoSMCの遊走を阻害した。しかし異なるCTP90濃度間に有意差はみられなかった。【００６６】
図11は、ヒト大動脈平滑筋細胞（AoSMC）の遊走に対するさまざまな濃度のCTP90の作用を示す。AoSMCに各濃度のCTP90を48時間投与し、その後、遊走細胞を計数した。（図11）各値は4回の独立した実験の相対平均±SD（対照群の%）を表し、対照群において遊走した平滑筋細胞数を100％として表した。【００６７】
AoSMCにおけるPCNA陽性細胞比に対するCTP90の作用
図12は、ヒト大動脈平滑筋細胞（AoSMC）におけるPCNA陽性比に対するさまざまな濃度のCTP90の作用を示す。AoSMCに各濃度のCTP90を24時間投与し、その後、上記実験方法に記載の通り、PCNA免疫細胞化学法を実施し10個の高倍率視野（×200）における陽性比を計算した。図12各値は3回の独立した実験の平均±SDを表し、PCNA陽性細胞の割合を表した。【００６８】
AoSMC増殖に対するCTPの経時作用
図13に示すグラフによると、CTP90投与後、24時間、48時間および72時間の時点に、すべてのCTP群（3、30、300μg/ml）が対照群と比較して明らかな増殖速度への阻害作用を示した。さらに、開始時の細胞数と比較して、各群の細胞は持続する増殖傾向を示したので、AoSMCに対するCTP90の毒性作用は除外することができる。【００６９】
図13は、ヒト大動脈平滑筋細胞（AoSMC）における増殖に対するさまざまな濃度のCTP90の作用の経時変化を示す。AoSMCに各濃度のCTP90を記載の時間投与し、その後、上記実験方法に記載の通り、5個の高倍率視野（×200）中の細胞総数を計算した。各値は3回の独立した実験の平均±SDを表す。【００７０】
実施例４
ウサギ大動脈病変の病理組織学的及び免疫組織化学的解析
〔実験方法〕
実験群（CTP30投与）、対照群（CTP30非添加飲料水投与）とも3ヶ月後にウサギを屠殺し大動脈、心臓および他の臓器を採取し、ホルマリン固定した。大動脈は5mm間隔で全割標本を作製し、パラフィン包埋し、病理組織学的及び免疫組織化学的解析に供した。【００７１】
〔大動脈の病理組織学的解析〕
全大動脈標本についてHE染色、エラスチカ・ワンギーソン（EVG）染色、アザン（Azan）染色を行い、病変を観察した。大動脈弓部の病変の最も進行した標本、実験群5個、対照群5個について線維化の程度をアザン染色で比較検討した。各アザン染色標本はコラーゲン沈着の多い濃青色の部分（進行した線維化領域、図14A）とコラーゲン沈着の少ない淡青色の部分（初期の線維化領域、図14B）の面積をImage-Pro Plus5.1で解析・定量化した。定量化は実験群、対照群とも高倍率（×400）で任意の5視野について行った。【００７２】
〔結果〕
アテローム性動脈硬化巣（プラーク）の線維化に対するCTP30の作用
図15に示すようにCTP30投与群（実験群）ではCTP30非投与群（対照群）に比べて、進行した線維化領域、初期の線維化領域とも減少した。この所見は、CTP30が過剰の線維化を抑制することを示している。
なお、肺、肝臓、および腎臓を含む他臓器には線維化は認められず（結果記載せず）、副作用にあたる悪い影響はなかった。【００７３】
〔大動脈の免疫組織化学的解析〕
大動脈弓部の病変の最も進行した標本、実験群5個、対照群5個について、病変部を構成する細胞成分（平滑筋細胞とマクロファージ）を免疫組織化学的に解析した。【００７４】
パラフィン切片について抗平滑筋細胞抗体（HHF35、ダコ・ジャパン社、1：50）、抗マクロファージ抗体（RAM11、ダコ・ジャパン社、1：50）を用いて免疫染色を実施し各細胞の同定を行い、Image-Pro Plus5.1で定量解析した。定量化は実験群、対照群とも高倍率（×200）で任意の5視野について行った。図16はアテローム性動脈硬化巣のRAM11陽性（褐色）のマクロファージ、HHF35陽性（褐色）の平滑筋細胞を示す。【００７５】
〔結果〕
アテローム性動脈硬化巣（プラーク）における平滑筋細胞とマクロファージの構成に対するCTP30の作用
図17は、対照群（control）はCTP30投与群（CTP）に比べてプラークに細胞成分が多く存在し、また、平滑筋細胞（SMC）よりマクロファージ（M）が多いことを示しており、アテローム性動脈硬化巣(プラーク)の主要細胞はマクロファージであることを示している。また、図18は、CTP非添加の対照群（control）ではマクロファージは平滑筋細胞（SMC）の2倍以上存在しており、CTP30投与群（CTP）ではマクロファージと平滑筋細胞（SMC）はほぼ同じ比率で存在していることを表している。【００７６】
以上の結果は、CTP30はアテローム性動脈硬化巣（プラーク）において、マクロファージの浸潤・増生も抑制する効果を有することを示している。
〔考察〕
家族性高コレステロール血症モデルウサギを用いたin vivoの実験で、CTP30、3ヶ月投与群は対照群に比べて血中総コレステロールと大動脈表面のアテローム性動脈硬化病変（プラーク）の面積を有意に低下させた。また、過剰なコラーゲン線維の沈着（線維化）を抑制した。さらに、プラークの主要構成細胞であるマクロファージと平滑筋細胞を免疫組織化学的に解析したところ、CTP投与群は対照群に比べてマクロファージが明らかに減少していた。【００７７】
マクロファージはプラークで種々のサイトカイン・増殖因子やメタロプロテアーゼ等のタンパク質分解酵素を産生・分泌し病変を進展させる（引用文献4-1）。また、プラークに滲み込んだ脂質の大部分はマクロファージ由来の泡沫細胞に蓄積されており、泡沫細胞の崩壊によって細胞外にコレステロールやコレステロールエステルなどの脂質が貯留する。細胞外の脂質が多くなり、さらにマクロファージの放出するタンパク質分解酵素によってコラーゲン線維などの細胞外マトリックス成分が分解されプラークが弱くなり、破裂・血栓形成を伴い急性心筋梗塞や脳梗塞が発症するのでマクロファージの減少はプラークの発症・進展・破裂を抑制する効果がある（引用文献4-2）。【００７８】
CTPのマクロファージを減少させる作用機序は明らかでないが、血中コレステロールの低下がプラークにおけるマクロファージの集簇を低下させ、また、タンパク質分解酵素の発現・活性を低下させるといわれており（引用文献4-3）、CTPのコレステロール低下作用がその一因であると考えられる。【００７９】
実施例４における引用文献
(4-1) Ross R:Atherosclerosis-An inflammatory disease. N EnglJ Med, 1999, 340:115-126
(4-2) Libby P:Molecular bases of the acute coronary syndrome. Circulation, 1995, 91:2844-2850
(4-3) 相川眞範:脂質低下療法による動脈硬化病変の安定化,実験医学, 2000, 18:145-151
上記引用文献4-1〜4-3の全記載は、ここに特に開示として援用される。【００８０】
比較例１
GELITA-SOL DAおよびGELITA-SOL LDA  Aggl.の培養大動脈平滑筋細胞の遊走および増殖に及ぼす効果
非特許文献１２の実施例で使用されているコラーゲン加水分解物と同等品のGELITA-SOL DA（豚皮由来、平均分子量約5,000〜7,000、DGF社製）、およびGELITA-SOL LDA  Aggl.（豚皮由来、平均分子量約3,000、DGF社製）について、培養大動脈平滑筋細胞の遊走および増殖に及ぼす効果を検討した。【００８１】
（実験方法）
大動脈平滑筋細胞（AoSMC）の遊走および増殖実験は先に述べたCTP30（実施例1）およびCTP90（実施例3）と同様の方法で行った。【００８２】
（結果）
AoSMCの遊走に対するGELITA-SOL DA（以下、DA）、およびGELITA-SOL LDA Aggl.（以下、LDA）の作用
DAおよびLDAは3種類の濃度（3、30、300μg/ml）で投与した。24時間後、48時間後いずれもAoSMCの遊走を阻害せず、促進した。図19それぞれDAとLDAの投与24時間、および48時間後の遊走細胞を計数し、対照群において遊走したAoSMCの細胞数を100％として表した。各値は4回の独立した実験の相対平均±SD（対照群の％）を示している。図19から確認できるように、DA、LDA投与群は、対照群（DA 0μg/ml、LDA 0μg/ml）に比べて有意に遊走を促進した。【００８３】
これは実施例1、3 （図2、11）に示したCTPの遊走抑制効果に対して反対の効果を示している。ヒト大動脈平滑筋細胞の遊走を活発にするということは、アテローム性動脈硬化を発生・進行させる危険性を高めると考えられる。従って、非特許文献１２に記載のコラーゲン加水分解物と同等物であるDA、LDAは、アテローム性動脈硬化を発生・進行させる危険性を高めるものであると考えられる。【００８４】
Ao SMCの増殖に対するDA、およびLDAの経時作用
図20はAoSMCの増殖に対するDA、およびLDAの3種類の濃度（3、30、300 μg/ml）の作用と対照群（0μg/ml）の経時変化を示す。AoSMCに各濃度のDA、LDAを記載の時間投与し、その後、5個の高倍率視野（×200）中の細胞総数を計算した。各値は3回の独立した実験の平均±SDを表す。【００８５】
DA 300μg/ml投与後72時間で対照群と比較してAoSMCの増殖に対して促進作用を示したが、その他のDA投与群、LDA投与群とも明らかな促進作用・阻害作用を示さなかった。【００８６】
実施例1、3（図6、13）に示したCTPの細胞増殖に対する効果と比較すると、CTP30、90、およびDA、LDAはすべて培養時間に伴う細胞数の顕著な減少がみられなかったため、細胞毒性はないと考えられる。一方で、DA では300μg/ml投与後、有意にAoSMCを増殖させているため、アテローム性動脈硬化の発生機序に基づき考察すると、よい効果を与えないと予想される。即ち、非特許文献１２に記載のコラーゲン加水分解物と同等物であるDAは、アテローム性動脈硬化の発生機序に基づき考察すると、よい効果を与えないと予想される。【００８７】
AoSMCにおけるPCNA陽性細胞比に対するDA、LDAの作用
図21はAoSMCにおけるPCNA陽性細胞比に対するDAとLDAの3種類の濃度（3、30、300 μg/ml）と対照群（0μg/ml）の作用を示す。AoSMCに各濃度のDAとLDAを24時間投与し、その後、実施例1、3（図5、12）に記載の通り、PCNA免疫細胞化学法を実施し、10個の高倍率視野（×200）における陽性比を計算した。図21の各値は3回の独立した実験の平均±SDを表し、PCNA陽性細胞の割合を表した。DAおよびLDAの各濃度とも対照群に比べて、PCNA陽性細胞の割合を増加させる傾向を示した。【００８８】
CTPを添加して培養した場合のPCNA陽性細胞の割合に関する対照群との比較と比べると、DAおよびLDAはAoSMCの増殖期の細胞を増加させる効果を示しているといえる。【００８９】
AoSMCの活発な増殖はアテローム性動脈硬化症の進行を進める恐れがあるため、DAおよびLDAはアテローム性動脈硬化に関してはよい効果を示しておらず、むしろ負の効果（アテローム性動脈硬化の促進）を強く示唆する結果となった。【００９０】
参考例
上記比較例で使用したGelita社のCP成分（DAおよびLDA）及び実施例で使用したCTP30及び90それぞれのHPLCのクロマトグラムを図22に示す。HPLCの測定条件は以下のとおりである。
・カラム：Superdex Peptide 10/300 GL (GEヘルスケア・ジャパン株式会社)
・溶離液：10 mM Tris-HCl (pH7.4)、150 mM NaCl、5 mM CaCl2
・流速：1 mL/min
・分析時間：30min
・検出：UV (214 nm)【００９１】
前述のように、CTP30は、コラーゲントリペプチドGly-X-Yの含有量が25〜35質量%、Gly-X及びX-Yの含有量が約10質量%、残りがトリペプチドよりも分子量の大きいアミノ酸の4量体以上の加水分解物であり、アミノ酸の4量体以上の加水分解物は、最大でも分子量が6000程度である。CTP90は、コラーゲントリペプチドGly-X-Yの含有量が85〜100質量%であり、残りがGly-X及びX-Yとトリペプチドよりも分子量の大きいアミノ酸の4量体以上の加水分解物である。【００９２】
それに対して、DAは主成分が分子量約5,000〜10,000の範囲にあり、LDAは主成分が分子量約1,000〜8,000の範囲にあり、いずれも、コラーゲントリペプチドGly-X-Yの含有量は極わずかである。さらに、DAについては、CTP30において主成分に次いで含有量が多い分子量500〜1500のペプチドはほとんど含有せず、LDAについても、CTP30において主成分に次いで含有量が多い分子量500〜1500のペプチドの含有量は少ない。【００９３】
これらコラーゲンペプチドの組成と上記実施例及び比較例の結果から、主成分の分子量が約5,000〜10,000の範囲にあるコラーゲン加水分解物及び主成分の分子量が約1,000〜8,000の範囲にあるコラーゲン加水分解物は、アテローム性動脈硬化症の進行抑制薬または予防薬として有効性が疑わしいのに対して、本発明のコラーゲントリペプチドGly-X-Y（分子量は約300）を含有するコラーゲンの加水分解物は、アテローム性動脈硬化症の進行抑制薬または予防薬として有効であることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明は、アテローム性動脈硬化症の進行抑制薬及び予防薬、血中コレステロール低下薬、さらには血管の老化・炎症を抑え、予防する機能性食品及び特定保健用食品の製造分野に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図１９−４】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２】
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