(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンフィレグリン特異的インヒビターとしてのアンフィレグリンに対する中和抗体または少なくとも１個のアンフィレグリンに対する結合部位を含む前記中和抗体フラグメントを含有する、Ｇタンパク質−結合レセプターの刺激により誘発されるＥＧＦＲチロシンリン酸化によって引き起こされるか、あるいはこれに関連する疾病の治療のための医薬組成物であって、その際、疾病が扁平上皮細胞癌である医薬組成物。
【請求項２】
更に、ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７の特異的なインヒビターとしてのＴＡＣＥに対するアンチセンスまたはｓｉＲＮＡが含有される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
付加的に、製薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤および／またはアジュバンドを含む、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞または生物中におけるＧタンパク質またはＧタンパク質−結合レセプター（ＧＰＣＲ）介在シグナル伝達による、レセプターチロシンキナーゼのトランス活性化の調節に関し、この場合、これは、メタロプロテアーゼＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７の活性および／またはレセプターチロシンキナーゼリガンドであるアンフィレグリンの活性の阻害を含む。
【背景技術】
【０００２】
Ｇタンパク質−結合レセプター（ＧＰＣＲ）とＥＧＦＲシグナル系との間の伝達は、増殖因子前駆体ｐｒｏＨＢ−ＥＧＦ（１−３）の細胞表面タンパク分解を含む。しかしながら、ヒト癌細胞におけるＥＧＦＲシグナルトランス活性化の分子的機序については、あまり知られていない。
【０００３】
Ｇタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲｓ）とＥＧＦＲとの間のレセプター間伝達は、繊維芽細胞、ケラチノサイトおよび平滑筋細胞を含む種々の細胞型において生じる（４）。細胞のＧＰＣＲアゴニストでの処理によって、ＥＧＦＲの活性およびチロシンリン酸化が生じ、引き続いてＥＧＦＲ−特異的、細胞内シグナルの発生を導く（５）。ＥＧＦＲトランス活性化シグナルの急速なキネティクスおよびＥＧＦＲリガンドの放出がＧＰＣＲ刺激後には検出できないといった事実から、ＥＧＦＲトランス活性化の機序は、細胞間構成要素上でのみ応答するものであると提案された（５，６）。これとは対照的に、ＥＧＦＲトランス活性化の機序概念は、ＧＰＣＲ刺激細胞の細胞表面で、ヘパリン−結合ＥＧＦ−様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）のタンパク分解的放出を含む（１）。ＨＢ−ＥＧＦ、ならびにトランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦａ）およびアンフィレグリン（ＡＲ）は、ＥＧＦ−様リガンドファミリーに属するものであって、この場合、これらは、直接的にＥＧＦＲを活性化する。これらの分子は、膜貫通前駆物質として合成され、かつ、タンパク分解により、可溶性および拡散性増殖因子を生じる（７）。ＥＧＦＲシグナルトランス活性化のＨＢ−ＥＧＦ−依存的機序は、血管平滑筋細胞（８）、心臓内皮細胞（９）および心筋細胞（１０）におけるＧＰＣＲマイトジェンシグナル化における研究によってさらに試験的サポートが得られている。重要であるのは、最近のデータが、病理生物学的プロセスの病因、たとえば嚢胞性繊維芽症（３）、心臓肥大（２）および胃腸肥大（１１）でのＥＧＦＲシグナルトランス活性化経路を包含していることである。さらに、増加した証拠としては、異所のＧＰＣＲシグナルとヒト癌の増殖および進行との間の直接的相互関係を立証するものである（１２）。近年になって、ＧＰＣＲ−ＥＧＦＲのクロストーク経路が、頭部および頸部の扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）細胞において広範囲に確立され、かつＧＰＣＲアゴニスト、たとえばＬＰＡおよびカルバコールが、ＨＮＳＣＣ細胞の増殖および遊走挙動を、ＥＧＦＲトランス活性化を介して調整することが証明された。したがって、分子的機序の基礎をなすＥＧＦＲシグナルトランス活性化の解明は、癌腫、たとえば扁平上皮細胞癌の予防および治療のための新規ストラテジーを導きうるものといえる。
【０００４】
ここで、ＧＰＣＲアゴニストであるリソホスファチジル酸（ＬＰＡ）またはカルバコールによって刺激された扁平上皮細胞癌細胞により、特に、メタロプロテアーゼ依存性分解およびＥＧＦＲリガンドアンフィレグリン（ＡＲ）の放出が生じることが証明された。さらに、ｓｉＲＮＡ干渉によるＡＲ遺伝子サイレンシングまたは中和抗体によるＡＲ生物学的活性の阻害は、ＧＰＣＲ−誘発ＥＧＦＲチロシンリン酸化、下流のマイトジェンシグナル発生、Ａｋｔ／ＰＫＢの活性化、細胞増殖および遊走を阻害する。さらに、扁平上皮細胞癌細胞中での、ドミナントネガティブ突然変異体の発現またはＲＮＡ干渉によるメタロプロテアーゼ−分解ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７の遮断が、ＧＰＣＲ刺激されたＡＲ放出およびＥＧＦＲ依存性細胞応答を抑止する。したがって、ＴＡＣＥおよび／またはＡＲは、ＧＰＣＲ介在型シグナル化のエフェクターとして機能してもよいことから、細胞性受容クロストークネットワークの重要な要素とされる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Amour, A. et al. TNF-alpha converting enzyme (TACE) is inhibited by TIMP-3. FEBS Lett 435,39-44. (1998).
【非特許文献２】Asakura, M. et al. Cardiac hypertrophy is inhibited by antagonism of ADAM12 processing of HB-EGF: metalloproteinase inhibitors as a new therapy. Nat Med 8,35-40. (2002).
【非特許文献３】Bar-Sagi, D. & Hall., A. Ras and Rho GTPases: a family reunion. Cell 103,227-38. (2000).
【非特許文献４】Carpenter, G. Employment of the epidermal growth factor receptor in growth factor-independent signaling pathways. J Cell Biol 146,697- 702. (1999).
【非特許文献５】Cook, P. W. et al. A heparin sulfate-regulated human keratinocyte autocrine factor is similar or identical to amphiregulin. Mol Cell Biol 11, 2547-57. (1991).
【非特許文献６】Daub, H. , Weiss, F. U., Wallasch, C. & Ullrich, A. Role of transacti- vation of the EGF receptor in signalling by G-protein-coupled receptors. Nature 379,557-60. (1996).
【非特許文献７】Diaz-Rodriguez, E. , Montero, J. C., Esparis-Ogando, A. , Yuste, L. & Pandiella, A. Extracellular Signal-regulated Kinase Phosphorylates Tumor Necrosis Factor alpha-converting Enzyme at Threonine 735: A Potential Role in Regulated Shedding. Mol Biol Cell 13,2031-44.(2002)
【非特許文献８】Eguchi, S. , Dempsey, P. J. , Frank, G. D., Motley, E. D. & Inagami, T. Activation of MAPKs by angiotensin Il in vascular smooth muscle cells. Metalloprotease-dependent EGF receptor activation is required for activation of ERK and p38 MAPK but not for JNK. J Biol Chem 276, 7957-62. (2001).
【非特許文献９】Elbashir, S. M. et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 411, 494-8. (2001).
【非特許文献１０】Faure, M. , Voyno-Yasenetskaya, T. A. Bourne, H. R. cAMP and beta gamma subunits of heterotrimeric G proteins stimulate the mitogen- activated protein kinase pathway in COS-7 cells. J Biol Chem 269, 7851-4. (1994).
【非特許文献１１】Fujiyama, S. et al. Angiotensin AT (1) and AT (2) receptors differentially regulate angiopoietin-2 and vascular endothelial growth factor expression and angiogenesis by modulating heparin binding-epidermal growth factor (EGF) -mediated EGF receptor transactivation. Circ Res 88,22-9. (2001).
【非特許文献１２】Gschwind, A., Prenzel, N. & Ullrich, A. Lysophosphatidic Acid-induced Squamous Cell Carcinoma Cell Proliferation and Motility Involves Epidermal Growth Factor Receptor Signal Transactivation. Cancer Res 62,6329-6336. (2002).
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、第一に、細胞中のＧタンパク質またはＧタンパク質結合レセプター介在シグナル伝達による、レセプターチロシンキナーゼのトランス活性化を調整するための方法に関し、この場合、この方法は、メタロプロテアーゼＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７の活性および／またはレセプターチロシンキナーゼリガンドであるアンフィレグリンの活性の阻害を含む。
【０００７】
本発明によれば、用語「阻害」は、好ましくは「特異的」阻害に関し、その際、ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７および／またはアンフィレグリンの活性は選択的に阻害され、すなわち、他のメタロプロテアーゼ、たとえばＡＤＡＭ１２または他のレセプターチロシンキナーゼリガンド、たとえばＨＢ−ＥＧＦの活性をあまり阻害しない。ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７および／またはアンフィレグリンの選択的阻害によって、レセプターチロシンキナーゼトランス活性化の高い特異的分解が達成されてもよく、これらは、好ましくない副作用の発生が減少されうることから、製薬学的適用のために重要である。
【０００８】
さらに、用語"阻害"は、好ましくは"直接的な"阻害に関し、その際、インヒビターは、直接的にＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７および／またはアンフィレグリンと結合するか、あるいは、これらをコードする核酸分子と結合する。しかしながら、本発明はさらに、"間接的な"阻害を包含し、その際、インヒビターは、直接的にＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７および／またはアンフィレグリンと結合しないが、しかしながら、これらの前駆体または代謝物質、特にアンフィレグリン前駆体であるプロアンフィレグリンと結合する。
【０００９】
用語"活性"は、好ましくは、ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７によるプロアンフィレグリンの分断および／またはレセプターチロシンキナーゼの活性化、たとえばアンフィレグリンによるＥＧＦＲの活性化に関する。本発明のＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７インヒビターは、好ましくは、セレプターチロシンキナーゼリガンドであるアンフィレグリンの分断および放出の阻害を可能にする。本発明のアンフィレグリンインヒビターは、好ましくは、アンフィレグリンの生物学的活性、特にＥＧＦＲチロシンキナーゼリン酸化、下流のマイトジェンシグナル発生、Ａｋｔ／ＰＫＢの活性、細胞増殖および／または遊走の抑制が可能である。
【００１０】
本発明の他の態様は、Ｇタンパク質またはＧタンパク質結合レセプター介在シグナル伝達による、レセプターチロシンキナーゼのトランス活性化により生じるか、あるいはこれに随伴して生じる、疾病の予防および／または治療のための、メタロプロターゼＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７のインヒビターおよび／またはレセプターチロシンキナーゼリガンドアンフィレグリンのインヒビターの使用に関する。このような型の疾病の存在は、ｍＲＮＡレベルでの、Ｇタンパク質および／またはＧＰＣＲ発現の測定によって（ｃＤＮＡアレイ分析、ＳＡＧＥ、ノーザンブロット等）および／またはタンパク質レベルでの測定によって（ウエスタンブロット分析、イムノフルオレセンス顕微観察、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術等）定めることができる。さらに、このような疾病の型の存在は、ゲノムおよび／またはＧタンパク質またはＧＰＣＲｓをコードするｍＲＮＡ分子中における活性化された突然変異体の発生および／またはウイルス性コード化ＧＰＣＲｓの存在を測定することによって定めることができる。さらに、ＧＰＣＲアゴニスト、たとえばＬＰＡおよび／またはアンフィレグリンの高いレベルは、血清中および／または疾病に影響する組織中で測定することができる。このような疾病の型は、増加したレセプターチロシンキナーゼ発現とは無関係であることが示された。
【００１１】
たとえば、疾病は高増殖性疾病、たとえば癌、たとえば扁平上皮細胞癌または他の疾病、たとえば、高増殖性皮膚疾患、たとえば乾癬であってもよい。
【００１２】
ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７およびアンフィレグリンの活性は、核酸レベルにおいて、たとえば遺伝子レベルまたは転写レベルにおいて阻害されていてもよい。遺伝子レベルでの阻害は、部分的または完全な遺伝子の不活性化、すなわち遺伝子分裂による不活性化を含んでもよい。他方では、阻害は転写レベルで、たとえばアンチセンス分子、たとえばＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子または核酸類似体、リボザイム、たとえばＲＮＡ分子または核酸類似体またはＲＮＡ干渉能を有するｓｉＲＮＡ分子（ＲＮＡｉ）、たとえばＲＮＡ分子または核酸分子を、直接的にＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７および／またはアンフィレグリンｍＲＮＡに対して適用することによって生じうる。ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７の発現を阻害するアンチセンス分子は、たとえばＵＳ特許６１８０４０３で記載されている（この場合、これらは、本明細書中で参考のために引用されている）。
【００１３】
さらに、ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７および／またはアンフィレグリンの活性は、タンパク質レベルで阻害することができ、この場合、これらは、たとえば、結果としてＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７および／またはアンフィレグリン活性の特異的阻害を生じる化合物を適用することによって阻害することができる。タンパク質レベルでの阻害は、たとえば、抗体または抗体フラグメントを、直接的にＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７および／またはアンフィレグリンに対して適用することを含んでいてもよい。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、組換え抗体、たとえば一本鎖抗体または少なくとも１個の抗体結合部位を含むこのような抗体のフラグメント、たとえばタンパク質分解抗体フラグメント、たとえばＦａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２フラグメントまたは組換え抗体フラグメント、たとえば、ｓｃＦｖフラグメントであってもよい。治療目的のために、特にヒトの治療のために、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体の適用は特に好ましい。
【００１４】
抗体または抗体フラグメントは、ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７のメタロプロテアーゼ−領域に対して、あるいは、分子の他の部分に対して直接的に適用されてもよい。抗体または抗体フラグメントは、選択的に、ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７の成熟形またはＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７の前駆体を、免疫沈降によって示すように認識することができる。二者択一的に、抗体または抗体フラグメントは、ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７の成熟形および前駆体の双方を認識することができる。
【００１５】
モノクローナル抗体は、公知方法によって、たとえばＫｏｅｈｌｅｒら（Nature 256(1975), 495-497）、Ｃｏｌｅら（Mol. Cell. Biol. 62 (1984), 109-120）またはＫｏｚｂｏｒら（J. Immunol.Meth. 81 (1985), 31-42）によって記載された、ハイブリドーマ技術によって製造することができる（これらは、本明細書中において参考のために示す）。キメラまたはヒト化抗体は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（Proc. natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 6851-6855）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら（Nauture 312 (1984), 604-608）、Ｔａｋｅｄａら（Nature 314 (1985), 452-454）、Ｊｏｎｅｓら（Nature321(1986),522-525）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（Nature 322 (1988), 323-327）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（Science 239 (1988), 1534-1536）またはＱｕｅｅｎら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 10029-10033）に記載された技術によって製造することができる（この場合、これらの文献は参考のために示す）。抗体または抗体フラグメントを製造するための他の方法は、Ｂｕｒｔｏｎ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 11120-11123）、Ｏｒｌａｎｄｉら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 3833-3837）、Ｗｉｎｔｅｒら（Nature 349 (1991), 293-299）またはＨｕｓｅら（Science 254 (1989), 1275-1281）によって記載されている（この場合、これらの文献は、参考のために示す）。
【００１６】
さらに、ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７および／またはアンフィレグリンの低分子量のインヒビターを使用することができる。ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７インヒビターの例は、スルホン酸またはホスフィン酸誘導体、たとえばスルホンアミド、スルホンアミドヒドロオキサム酸、ホスフィン酸アミドヒドロオキサム酸であり、たとえばＷＯ９８／１６５０３、ＷＯ９８／１６５０６、ＷＯ９８／１６５１４、ＷＯ９８／１６５２０、Ｍａｃ  Ｐｈｅｒｓｏｎら（J. Med. Chem. 40, (1997), 2525）、Ｔａｍｕｒａら（J.Med. Chem. 41 (1998), 690）、Ｌｅｖｉｎら（Bioorg. & Med. Chem. Lett. 8 (1998), 2657）、Ｐｉｋｕｌら（J.Med. Chem. 41 (1998), 3568）、ＷＯ９７／１８１９４、ＥＰ−Ａ−０８０３５０５、ＷＯ９８／０８８５３、ＷＯ９８／０３１６６およびＥＰ−Ａ−１２７９６７４に記載されている（これらの文献は、参考のために示す）。他のインヒビターは、以下に示すスクリーニング法によって同定することができる。
【００１７】
治療目的のために、医薬は、付加的に製薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤および／またはアジュバントを含む医薬組成物の形で投与される。
【００１８】
本発明への使用に適した医薬組成物は、活性成分が、その意図される目的を達成するための有効量で含まれる組成物を含む。治療的有効量は、患者における症状の改善または延命を生じる化合物量を意味するものと解される。このような化合物の毒性および治療的有効性は、細胞培養または実験動物での標準的な製薬学的方法によって測定することができ、この場合、これらは、たとえばＬＤ５０（全対象の５０％が致死する量）およびＥＤ５０（全対象の５０％において治療的有効性が認められる量）によって測定することができる。本発明の方法において使用される任意の化合物に関して、治療的有効量は、細胞培養アッセイから最初に算定することができる。たとえば、投与量は、動物モデル中で、細胞培養において定められたＩＣ５０を含む、循環する濃度範囲を達成するように処方することができる（すなわち、それぞれ、増殖因子レセプター活性の半最大値（half-maximal）を達成する試験化合物の濃度）。このような情報は、ヒトにおいて使用可能な容量をより正確に定めるために使用することができる。毒性と治療効果との間の投与量比は、治療インデックスであり、かつＬＤ５０とＥＤ５０との比として示すことができる。高い治療インデックスを示す化合物が好ましい。正確な処方、投与経路および投与量は、それぞれ医師により患者の状態から選択することができる（たとえば、Finglら、1975、"The pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1, p.1）。
【００１９】
投与量および投与間隔は、レセプター調節作用を維持するためにか、あるいは最少有効濃度（ＭＥＣ）のために十分な活性部分の血漿レベルを提供するために、別個に調整することができる。ＭＥＣは、それぞれの化合物に関して可変であるが、しかしながらｉｎ  ｖｉｔｒｏデータ、たとえば、ここに記載されたアッセイを用いてのレセプターの５０〜９０％阻害を達成するために必要な濃度から算定することができる。化合物は、時間の１０〜９０％、好ましくは３０〜９０％および最も好ましくは５０〜９０％に亘って、ＭＥＣの上廻る血漿レベルを維持する処方を用いて投与しなければならない。ＭＥＣを達成するのに必要な投与量は、個々の特徴および投与経路に依存しうる。局所適用または選択的投与の場合には、薬剤の有効な局所的濃度は、血漿濃度に関連するものではない。
【００２０】
勿論、投与された組成物の正確な量は、治療された患者、患者の体重、症状の重症度、投与方法および担当医師の判断に依存することができる。抗体または治療的に活性の核酸分子および他の化合物に関しては、たとえば０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、特に好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の日用量が適している。
【００２１】
適した投与経路は、たとえば、経口、直腸、経粘膜、または腸管投与を含み；非経口投与、この場合、これらは、筋肉内、皮下、脊髄内注射、ならびにクモ膜下注射、直接的な脳室内注射、静脈内、腹膜内、鼻腔内、または眼球内注射を含んでいてもよい。
【００２２】
二者択一的に、化合物は、全身的投与法ではなくむしろ局所において投与されてもよく、たとえば、化合物の直接的な固体癌への注入、しばしばデポー処方または一定の放出処方であってもよい。
【００２３】
さらに、薬剤は、標的化された薬剤運搬系の形で投与されてもよく、たとえば腫瘍特異的抗体で被覆されたリポソームの形で投与されてもよい。リポソームは、標的化し、かつ腫瘍によって選択的に取り込まれうる。
【００２４】
本発明の他の態様は、Ｇタンパク質またはＧタンパク質結合レセプター介在シグナル伝達によるレセプターチロシンキナーゼトランス活性化の調節因子を同定するための方法であり、この場合、これらの方法は、試験化合物が、ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７の活性および／またはアンフィレグリンの活性を阻害可能であるか否かについて測定するものである。この方法は、スクリーニング方法として適しており、たとえば、Ｇタンパク質シグナル伝達の調節を可能にする新規化合物または化合物群を同定するためのハイスループットスクリーニング法である。さらに方法は、化合物の製薬学的効果および／または副作用を特徴付けるための有効な方法として適している。方法は、単離されたタンパク質、細胞抽出物、組換え細胞または遺伝子導入された非−ヒト動物の使用を含む。組換え細胞または遺伝子導入された非−ヒト動物は、好ましくは、相当する野生型細胞または動物と比較しての改変されたＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７および／またはアンフィレグリン発現を示す。
【００２５】
適したレセプターチロシンキナーゼの例は、ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲファミリーの他の群、たとえばＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４、ＰＤＧＦＲ、血管内皮増殖因子レセプターＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、Ｔｒｋレセプター、ＦＧＦＲ−１またはＩＧＦ−１レセプターであるが、しかしながら、他の型の増殖因子レセプター、たとえばＴＮＦレセプター１、ＴＮＦレセプター２、ＣＤ３０およびＩＬ−６レセプターは、Ｇタンパク質／ＧＰＣＲ介在シグナル伝達のための標的である。
【００２６】
さらに、本発明は、以下の図および実施例によって説明することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】Ａ：ＥＧＦＲシグナルトランス活性化を示す図、Ｂ：ＥＧＦ様前駆体発現のフローサイトメトリー分析を示す図、Ｃ：ｐｒｏＡＲのＬＰＡ−誘導タンパク質分解プロセッシングを示す図、Ｄ：ＡＲのＧＰＣＲ−誘導タンパク質分解放出を示す図。
【図２】Ａ：ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によるＥＧＦ様増殖因子前駆体発現の遮断を示す図、Ｂ．ＥＧＦＲチロシンリン酸化含量に関するアッセイを示す図、Ｃ．ＬＰＡ−誘導による細胞遊走のためのＡＲ要求性を示す図、Ｄ：抗ＡＲ−中和抗体およびヘパリンのＧＰＣＲ−誘導ＥＧＦＲおよびＳＨＣチロシンリン酸化上での効果を示す図、Ｅ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＳＨＣを用いてのＧｒｂ２の結合を示す図、Ｆ：ＧＰＣＲ−誘導ＥＲＫ／ＭＡＲＫ活性およびＡｋｔ／ＰＫＢリン酸化を示す図、Ｇ：ＬＰＡ−誘導ＤＮＡ合成上のＡＲ阻害の効果を示す図。
【図３】Ａ：ＨＮＳＣＣ細胞系においてＴＡＣＥの発現を示す図、Ｂ：ＥＧＦＲ−シグナルトランス活性化阻害を示す図、Ｃ：レトロウイルス遺伝子導入後のＳＣＣ−９細胞中の、野生型およびドミナントネガティブＴＡＣＥまたはＨＡ−タグＡＤＡＭ１２の発現を示す図、Ｄ．フローサイトメトリー分析およびＡＲ  ＥＬＩＳＡ測定を示す図、Ｅ：ＧＰＣＲ刺激されたＥＧＦＲ−シグナルトランス活性化上のドミナントネガティブＴＡＣＥの効果を示す図。
【図４】Ａ：ＴＡＣＥ  ｓｉＲＮＡによる内在性ＴＡＣＥ発現の遮断を示す図、Ｂ：ＴＡＣＥノックダウンによる細胞表面上でのｐｒｏＡＲの堆積を示す図、Ｃ：ＴＡＣＥを要求するＥＧＦＲ−シグナルトランスミッションを示す図、Ｄ：ＬＰＡに対して応答する扁平上皮細胞癌細胞運動性を示す図。
【図５】メタロプロテアーゼ−領域に対して製造されたモノクローナル抗体を用いての成熟ＴＡＣＥタンパク質の免疫沈降を示す図。
【図６】内在性ＴＡＣＥタンパク質の免疫沈降を示す図。
【図７】モノクローナル抗体のＴＥＣＥ−結合のフローサイトメトリー分析を示す図。
【図８】ＴＡＣＥ活性を必要とする、ＥＧＦＲシグナル活性化を示す図。
【図９】ＴＡＣＥ活性を必要とする、ＥＧＦＲシグナルトランス活性化を示す図。
【００２８】
図１  ＥＧＦＲのＧＰＣＲ刺激は、リガンド−依存性機序を含み、かつ、細胞表面からのＡＲ放出が付随する。ａ：ＥＧＦＲシグナルトランス活性化は、メタロプロテアーゼ活性およびＥＧＦＲ細胞外領域を必要とする。ＳＣＣ−９細胞は、マリンマステート（ＢＢ２５１６、１０μＭ；２０分）、抗−ＥＧＦＲ抗体ＩＣＲ−３Ｒ（２０μｇ／ｍＬ；６０分）またはＰＴＸ（１００ｎｇ／ＭＬ；１８時間）でプレインキュベートされ、かつＬＰＡ（１０μＭ）、カルバコール（Ｃａｒ、１ｍＭ）、ＥＧＦ（７．５ｎｇ／ｍＬ）またはペルバナデート（ＰＶ、１ｍＭ）で３分間に亘って処理した。引き続き、細胞抽出物を抗−ＥＧＦＲ抗体タンパク質で免疫沈降（ＩＰ）させたものを、抗ホスホチロシン抗体でイムノブロットし（ＩＢ）、かつ抗−ＥＧＦＲ抗体で再度プローブした。ｂ：ＥＧＦ様前駆体発現のフローサイトメトリー分析。ＳＣＣ−９細胞を捕集し、かつ表面に関してＨＢ−ＥＧＦ、ＴＧＦａまたはＡＲを染色し、かつフローサイトメトリーにより分析した。コントロール細胞を、ＦＩＴＣ−結合二次抗体のみでラベルした。ｃ：ｐｒｏＡＲのＬＰＡ−誘導タンパク質分解プロセッシング。ＳＣＣ−９細胞を、バチマステート（ＢＢ９４、１０μＭ）またはＰＴＸでプレインキュベートし、かつ、ＬＰＡまたはＴＰＡ（１μＭ）で５分に亘って刺激した。細胞を培養し、かつ細胞表面ＡＲ密度をフローサイトメトリーにより分析した。ｄ：ＡＲのＧＰＣＲ−誘導タンパク質分解放出。ＳＣＣ−９細胞をバチマステートまたはビヒクルでプレインキュベートし、その後に、アゴニストを用いて１２０分に亘って刺激した。調整された培地を捕集し、かつ全ＡＲ量についてＥＬＩＳＡにより分析した。それぞれのバーは、３重の値の平均値である（平均値±s.d.）.。＊Ｐ＜０．０３  アゴニストとＢＢ９４＋アゴニストとの差。
【００２９】
図２  ＧＰＣＲ刺激は、ＥＧＦＲ−依存型シグナルおよび生物学的応答を誘発するためにＡＲを必要とする。ａ：ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によるＥＧＦ様増殖因子前駆体発現の遮断。ＳＣＣ−９細胞はｓｉＲＮＡで、２日間に亘って培養されたｐｒｏＡＲ、ｐｒｏＨＢ−ＥＧＦまたはｐｒｏＴＧＦαについて感染させ、かつ前記のようにＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現について分析するか、あるいは、ｂ：ＬＰＡまたはカルバコールで刺激し、かつＥＧＦＲチロシンリン酸化含量に関してアッセイした。ｃ：ＬＰＡ−誘導による細胞遊走に関するＡＲ要求性。ＳｉＲＮＡ−感染ＳＣＣ−９細胞を、化学誘引物質としてのファイブロネクチンに向かってのウェル間の遊走について分析した。それぞれのバーは、４重の値の平均値である（平均値±ｓ．ｄ．）。＊，Ｐ＜０．００１  コントロールｓｉＲＮＡ＋ＬＰＡとｐｒｏＡＲｓｉＲＮＡ＋ＬＰＡ。ｄ：抗ＡＲ−中和抗体およびヘパリンの、ＧＰＣＲ−誘導ＥＧＦＲおよびＳＨＣチロシンリン酸化上での効果。ＳＣＣ−９細胞を、抗−ＡＲ抗体（ａＡＲ  Ａｂ、５０μｇ／ｍＬ、６０分）またはヘパリン（１００ｎｇ／ｍＬ、１５分）で予め処理し、かつ、３分に亘って（ＥＧＦＲ）または５分に亘って（ＳＨＣ）前記のように刺激した。沈降したＥＧＦＲおよびＳＨＣを、抗ホスホチロシン抗体でイムノブロットし、その後に同様のフィルターを、抗ＥＧＦＲおよび抗ＳＨＣ抗体でそれぞれ再度プロービングした。ｅ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＳＨＣを用いてのＧｒｂ２の結合。ＳＣＣ−９細胞をインヒビターでプレインキュベートし、かつ前記のように５分に亘って刺激した。ライセートを、ＧＳＴ−Ｇｒｂ−２融合タンパク質またはＧＳＴのみでインキュベートした。タンパク質を、モノクローナル抗ＳＨＣ抗体でイムノブロットした。ｆ：ＡＲは、ＧＰＣＲ−誘導ＥＲＫ／ＭＡＲＫ活性およびＡｋｔ／ＰＫＢリン酸化のために必要とされる。ＳＣＣ−９またはＳＣＣ−１５細胞を、インヒビターでプレインキュベートし、かつ７分に亘って刺激した。リン酸化されたＥＲＫ１／２を、全ライセートを抗−ホスホ−ＥＲＫ抗体を用いてのイムノブロットによって検出した。同様のフィルターを、抗−ＥＲＫ抗体で再度プローブした。３個の別個の試験からのＥＲＫリン酸化の定量的分析（平均値±ｓ．ｄ）。＊，Ｐ＜０．０５  ＬＰＡとインヒビター＋ＬＰＡとの差異。Ａｋｔ／Ｐｋｂの刺激。細胞ライセートを、抗−ホスホ−Ａｋｔ／ＰＫＢ抗体でのイムノブロットし、引き続いて同様のフィルターを、抗−Ａｋｔ／ＰＫＢ抗体を用いての再度プローブすることにより処理した。ｇ：ＬＰＡ−誘導ＤＮＡ合成上のＡＲ阻害の効果。ＳＣＣ−１５細胞を前記のようにインヒビターを用いて処理し、かつリガンドの存在下または不在下で、１８時間に亘ってインキュベートした（ＬＰＡ；ＡＲ、１０ｎｇ／ｍｌ）。細胞をその後に３Ｈ−チミジンでパルスラベルし、かつチミジンの取り込みを、液体シンチレーションカウンターにより測定した。定量的分析は、３個の独立した試験によりおこなった（平均値±ｓ．ｄ．）。＊，Ｐ＜０．００１  ＬＰＡとインヒビター＋ＬＰＡ。
【００３０】
図３  ドミナントネガティブＴＡＣＥは、ＧＰＣＲ−誘導ＡＲ放出およびＥＧＦＲ−シグナル活性化を抑止する。ａ：ＴＡＣＥを、ＨＮＳＣＣ細胞系において発現させる。ＴＡＣＥを、モノクローナルＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７抗体を用いてライセートから免疫沈降した。ＨＥＫ−２９３細胞を、ポジティブコントロールとして役立つヒトＴＡＣＥｃＤＮＡを用いて感染させた。ｂ：Ｔｉｍｐ−３であってＴｉｍｐ−１ではないものは、ＥＧＦＲ−シグナルトランス活性化を阻害する。ＳＣＣ−９細胞を、ヒトＴｉｍｐ−１またはＴｉｍ−３をコードするレトロウイルスで感染させた。ＥＧＦＲ−活性を、前記に示すようにアゴニストで刺激した後に、イムノブロットにより測定した（左パネル）。Ｔｉｍｐ−１／３を有するＣ−末端ＶＳＶ−ｔａｇの発現は、抗−ＶＳＶ−抗体での全細胞ライセートをイムノブロットすることにより確認した（右パネル）。ｃ：レトロウイルス遺伝子導入後のＳＣＣ−９細胞中の、野生型およびドミナントネガティブＴＡＣＥまたはＨＡ−タグＡＤＡＭ１２の発現。全ライセートを前記のようにイムノブロットした。ｄ．ドミナントネガティブＴＡＣＥは、ＬＰＡ−誘導ｐｒｏＡＲ分断（左パネル）および細胞培地中へのＡＲ放出（右パネル）を、フローサイトメトリー分析およびＡＲ  ＥＬＩＳＡそれぞれによって測定した。ｅ：ＧＰＣＲ刺激されたＥＧＦＲ−シグナルトランス活性化上のドミナントネガティブＴＡＣＥの効果。
【００３１】
図４  ＴＡＣＥｓｉＲＮＡは、ＥＧＥＲシグナルトランスミッションおよび細胞遊走を、ＧＰＣＲアゴニストにより阻害した。ａ：ＴＡＣＥ  ｓｉＲＮＡは、内在性ＴＡＣＥ発現を遮断した。ＳＣＣ−９細胞を、ＴＡＣＥまたはＡＤＡＭ１２  ｓｉＳＮＡを用いてトランスフェクトした。遺伝子発現を、ＲＴ−ＰＣＲ（左パネル）またはポリクローナル抗−ＴＡＣＥ抗体を用いてのイムノブロット（右パネル）により分析した。ｂ：ＴＡＣＥノックダウンは、細胞表面上でのｐｒｏＡＲの堆積を示す。ｓｉＲＮＡ−感染ＳＣＣ−９細胞は、ＡＲ細胞表面に関する含量をＦＡＣＳによって分析した。ｃ：ＥＧＦＲ−シグナルトランスミッションは、ＧＰＣＲ活性上で、ＴＡＣＥを必要とした。ＳＣＣ−９細胞は、ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、かつ前記のようにアゴニストを用いて刺激した。ＥＧＦＲ、ＳＨＣ、ＥＲＫおよびＡｋｔの活性を、前記のように測定した。ｄ：ＬＰＡに対して応答する扁平上皮細胞癌細胞運動性は、ＴＡＣＥに依存する。ｓｉＲＮＡ−トランスフェクトされたＳＣＣ−９細胞を、ＬＰＡまたはＡＲを用いて処理し、かつトランスウェル遊走アッセイ中で分析した。
【００３２】
図５  メタロプロテアーゼ−領域に対して製造したモノクローナル抗体を用いての成熟ＴＡＣＥタンパク質の免疫沈降。ＴＡＣＥ−ヘマグルチニン（ＨＡ）を一時的に発現するＨＥＫ−２９３細胞を、２４時間に亘って血清枯渇させ（serum-starved）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶解バッファーで溶解し、この場合、このバッファーは、５μＭ  ＢＢ９４をメタロプロテーゼインヒビターとして含有するものである。粗ライセート２００μｇを、５μｇ  コントロールＩｇＧ（モノクローナル抗−ＨＡ抗体）または５μｇのモノクローナル抗−ＴＡＣＥ−抗体を用いての免疫沈降に使用した。その後に、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、タンパク質をニトロセルロースメンブレンにトランスファーした。免疫沈降されたＴＡＣＥタンパク質を、ポリクローナルＴＡＣＥ抗体を用いてのイムノブロットにより分析した（ＣＨＥＭＩＣＯＮ＃１９０２７）。
【００３３】
図６  内在性ＴＡＣＥタンパク質の免疫沈降。ＳＣＣ−９細胞は、２４時間に亘って血清−枯渇にし、かつメタロプロテアーゼインヒビターとして５μＭのＢＢ９４を含有するＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶解バッファーを用いて溶解した。２００μｇの粗ライセートを、５μｇコントロールＩｇＧ（モノクローナル抗−ＨＡ抗体）または５μｇモノクローナル抗−ＴＡＣＥ抗体を用いての免疫沈降に使用した。引き続いて、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動をおこない、タンパク質をニトロセルロースメンブレンにトランスファーした。免疫沈降されたＴＡＣＥタンパク質を、ＴＡＣＥ抗体を用いての免疫沈降により分析した（ポリクローナル抗体  ＣＨＥＭＩＣＯＮ  １９０２７）。
【００３４】
図７  モノクローナル抗体のＴＥＣＥ−結合のフローサイトメトリー分析。ＳＣＣ９−細胞を播種し、２４時間に亘って増殖させた。回収した後に、細胞をＴＡＣＥのメタロプロテアーゼ領域に対して生じるモノクローナルＴＡＣＥ抗体で、４５分に亘って染色した。リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）での染色の後に、細胞をフィコエリトリン（ＰＥ）−結合二次抗体を用いて４５分に亘ってインキュベートし、かつ再度ＰＢＳで洗浄した。細胞をBecton Dickinson FACS calibur Fow cytometer上で分析した。
【００３５】
図８  ＥＧＦＲシグナル活性化は、ＴＡＣＥ活性を必要とする。血清枯渇のＳＣＣ９細胞を３０分に亘って、前記に示したように５μｇコントロールＩｇＧ（モノクローナル抗ＨＡ−抗体）または５μｇ  モノクローナルＴＡＣＥ抗体を用いてプレインキュベートし、かつＬＰＡ（１０μＭ）で３分間に亘って処理した。溶解の後に、ＥＧＦＲを、抗−ＥＧＦＲ抗体を用いて免疫沈降した（ＩＰ）。チロシン−リン酸化ＥＧＦＲを、抗−ホスホチロシン（αＰＹ）でのイムノブロット（ＩＢ）により検出し、その後に、同様のフォルターを、抗−ＥＧＦＲ抗体を用いて再度プロービングした。
【００３６】
図９  ＥＧＦＲシグナルトランス活性化は、ＴＡＣＥ活性を必要とする。血清−枯渇のＳＣＣ９細胞を、３０分に亘って前記に示したように、５μｇコントロールＩｇＧ（モノクローナル抗−ＨＡ抗体）または５μｇモノクローナルＴＡＣＥ抗体を用いてプレインキュベートし、かつＬＰＡ（１０μＭ）で３分に亘って処理した。溶解後に、ＥＧＦＲを、抗−ＥＧＦＲ抗体を用いて免疫沈降した（ＩＰ）。チロシン−リン酸化ＥＧＦＲを、抗−ホスホチロシン（αＰＹ）抗体でイムノブロット（ＩＢ）することによって検出し、その後に同様のフィルターを、抗ＥＧＦＲ−抗体を用いて再度プロービングした。
【００３７】
例１  扁平上皮細胞癌中のＥＧＦＲシグナルトランス活性化。ＴＡＣＥによるプロアンフィレグリン分断の要求性。
【００３８】
１．方法
１．１  細胞培養、プラスミドおよびレトロウイルストランスフェクション
すべての細胞系（American Type Culture Collection, Manassas, VA）を、取り扱い説明書にしたがって、規定通りに増殖させた。ＨＥＫ−２９３細胞のトランスフェクションを、従来知られているように、リン酸カルシウム共沈により実施した（１）。抗−アンフィレグリン（ＡＲ）、抗−ＨＢ−ＥＧＦ中和抗体（R&D Systems, Minneapolis, MN、ＰＴＸ、ヘパリン（Sigma, St.Louis, MO）マリマステート（ＢＢ２５１６、Sugen Inc., South San Francisco, CA）、バチマステート（BB94, British Biotech, Oxford, UK）を血清枯渇細胞に、それぞれの増殖因子添加前に添加した。
【００３９】
ＡＤＡＭ１０、１２、１５および１７をコードする完全長ｃＤＮＡｓは、ＰＣＲによって、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーから増幅させ、かつ、ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen, Carlsbad, CA）およびｐＬＸＳＮベクター（Clontech, Palo Alto, CA）中でサブクローニングした。ウイルスからの保護のために、プロ−およびメタロプロテアーゼ領域を欠失するドミナントネガティブプロテアーゼコンストラクトを、従来の方法で製造した（２．２６）。すべてのプロテアーゼコンストラクトは、Ｃ−末端ヘマグルチニン（ＨＡ）ｔａｇを含み、抗−ＨＡモノクローナル抗体を用いて検出可能であった（Babco, Richmond, CA）。両栄養性パッケージング細胞系Ｐｈｏｅｎｉｘを、ｐＬＸＳＮレトロウイルス発現プラスミドを用いて、従来知られているリン酸カルシウム／クロロキン法によりトランスフェクトした（２９）。感染後２４時間で、ウイルス性上清を回収し、かつサブコンフルエントなＳＣＣ−９細胞のトランスフェクションのために使用した（５ｘ１０４細胞／６ウェルプレート）。
【００４０】
１．２タンパク質分析
細胞を溶解し、かつタンパク質を従来の方法で免疫沈降した（１３）。ウエスタンブロットを、標準的な方法で実施した。ヒトＥＧＦＲ（１０８．１）およびＳＨＣ（１）ならびにＧＳＴ−Ｇｒｂ２融合タンパク質（５）に対する抗体を、予め特徴付けした。ホスホチロシンを、４Ｇ１０モノクローナル抗体（UBI, Lake Placid, NY）を用いて検出した。ポリクローナル抗−ホスホ−ｐ４４／ｐ４２（Thr202/Tyr204）ＭＡＰＫ抗体および抗−ホスホ−Ａｋｔ（Ser473）抗体を、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Beverly, MA）から入手した。ポリクローナル抗−Ａｋｔ１／２および抗−ＥＲＫ２抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Santa Curz, CA）、抗−ＴＡＣＥ−抗体はＣｈｅｍｉｃｏｎ（Harrow, UK）からのものである。
【００４１】
１．３  フローサイトメトリー分析およびＥＬＩＳＡ
ＡＣＳ分析を従来の方法で実施した（１）。細胞を、ＨＢ−ＥＧＦ、ＡＲ（Ｒ＆Ｄ  Systems）またはＴＧＦａ（Oncogene, Boston, MA）に対するエクトドメイン−特異的抗体を用いて染色した。ＰＢＳで洗浄した後に、細胞をＦＩＴＣ−結合二次抗体を用いてインキュベートし、かつBacton Dickinson FACScalibur フローサイトメーター上で分析した。
【００４２】
遊離ＡＲの濃度は、サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステム）によって、モノクローナル抗−ＡＲ  キャプチャー抗体およびビオチン化ポリクローナル検出抗体を用いて測定した。スタンダードは、培地で希釈した組換えヒトＡＲを使用した。統計的分析に関しては、スチューデントのｔ−検定を使用し、２群間のデータを比較した。値は、平均値±ｓ．ｄとして少なくとも３重の試料で示した。Ｐ＜０．０５は、統計的な有意性が考慮された。
【００４３】
１．４ＲＮＡ干渉およびＲＴ−ＰＣＲ分析
内在遺伝子のターゲッティングのための２１−ヌクレオチドｓｉＲＮＡデュープレックス（Dharmacon Research, Lafayette, CO, USA）のトランスフェクションは、標的化された内在性遺伝子を、オリゴフェクタミン（Invitrogen）および４．２μｇ  ｓｉＲＮＡデュープレックス／６ウェルプレートを用いて、従来方法にしたがっておこなった（３０）。トランスフェクトしたＳＣＣ−９細胞を、血清−枯渇にし、かつトランスフェクションの４日後にアッセイをおこなった。サイレンシングにおける標的遺伝子中の最も高い効率は、重要な遺伝子の種々の領域を標的化するｓｉＲＮＡデュープレックスの混合物を用いて得られた。使用されたｓｉＲＮＡの配列は以下のとおりであった。
【００４４】
0005473960.tif 000002
【００４５】
標的遺伝子の特異的サイレンシングを、ウエスタンブロット（ＴＡＣＥ）およびＲＴ−ＰＣＲ分析によって確認した。ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Qiagen, Hilden, Germany）を用いて単離されたＲＮＡは、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Roche, Mannheim, Germany）を用いて逆転写した。ＰｕＲｅＴａｑ  Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ＰＣＲビーズ（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）を、ＰＣＲ増幅のために使用した。カスタムプライマー（Sigma Ark, Steinheim, Germany）はｐｒｏＡＲ、
【００４６】
0005473960.tif 000003
【００４７】
である。ＰＣＲ産物は、２．５％アガロースゲル上で電気泳動し、かつＤＮＡをエチジウムブロマイド染色によって可視化した。生成物の位置およびその大きさは、１００ｂｐラダー（GIBCO, Gaithersburg, Maryland）を用いて、ＵＶイルミネーション下で測定した。
【００４８】
１．５  増殖および遊走アッセイ
３Ｈ−チミジン取り込みアッセイ（５）のために、ＳＣＣ−１５細胞を、１２ウェルプレート中に３ｘ１０４細胞／ウェルで播種した。４８時間に亘っての血清枯渇後に、公知方法のように細胞をプレインキュベートし、かつ刺激した。１８時間後に細胞を、３Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ｍｌ）で、４時間に亘ってパルスラベルし、かつチミジン取り込みを、三塩化酢酸沈降によって測定し、その後に、液体シンチレーションカウンターを用いて測定した。
【００４９】
細胞運動性の分析は、従来技術のように、モディファイトＢｏｙｄｅｎチャンバーを用いて従来の方法のようにしておこなった（１３）。ｓｉＲＮＡｓでのトランスフェクトの２４時間後に、ＳＣＣ−９細胞を、ポリカーボネートメンブレン挿入物（６．５ｍｍ直径および８μｍ孔径）中に、１×１０５細胞／ウェルで、２４−トランスウェルディッシュ中で、アゴニストの存在下または不在下に播種した。低いチャンバーを、化学誘引物質としてファイブロネクチン１０μｇ／ｍｌを含有する、ＦＣＳ不含の標準培地で満たした。細胞は、３６時間に亘って遊走可能であった。インキュベーションの後に、非遊走細胞を、メンブレンの上表面から除去した。下表面へ移動した細胞を固定化し、かつクリスタルバイオレットで染色した。染色した細胞を１０％酢酸で可溶化し、５７０ｎｍでの吸収をマイクロプレートリーダーで測定した。
【００５０】
２．結果
ＨＮＳＣＣ細胞中での、ＧＰＣＲ−誘導トランス活性化シグナルは、広汎性メタロプロテアーゼインヒビター、たとえばバチマステート（ＢＢ９４）（１３）およびマリマステート（ＢＢ２５１６；図１Ａ）に対して敏感である。ＥＧＦＲシグナルトランス活性化のリガンド依存性機序との一貫性に関しては、我々は、モノクローナル抗−ＥＧＦＲ抗体ＩＣＲ−３Ｒが、この場合、ＥＧＦ−様の増殖因子が、レセプターの細胞外領域と結合するのを防ぎ（１４）、ＳＣＣ−９細胞中で、ＧＰＣＲ−およびＥＧＦ−誘導ＥＧＦＲチロシンリン酸化を排除することが見出された（図１Ａ）。これとは対照的に、ＩＣＲ−３Ｒは、ペルバナデートによって、多くの細胞間タンパク質のチロシンリン酸化含量を増加させる、潜在的チロシンホスファターゼインヒビター（１５）によって誘導された応答と干渉することはなかった。従来の報告では、ＧＰＣＲ−誘導ＥＧＦＲチロシンリン酸化が、ＨＢ−ＥＧＦ（１−３）のタンパク質分解を必要とすることが証明され、これによって、ＨＢ−ＥＧＦまたは他のＥＧＦ−様増殖因子が、ＥＲＧＦＲトランス活性化経路中で、頭部および頸部癌細胞中に含まれるのではないかということが示唆された。ｃＤＮＡ顕微鏡分析よって、ＨＢ−ＥＧＦ、ＴＧＦαおよびＡＲ  ｍＲＮＡｓの、ＳＣＣ−４、ＳＣＣ−９、ＳＣＣ−１５およびＳＣＣ−２５細胞中での発現が見出された（データは示されていない）。さらに、これらリガンドの発現および細胞表面の局在は、フローサイトメトリーによって、エクトドメイン特異的抗体を用いて確認した（図１Ｂ、ＳＣＣ−９に関する典型的データ）。驚くべきことに、頭部および頸部癌細胞のＬＰＡ（１０μＭ）またはホルボールエステルＴＰＡ（１ｍＭ）での処理は、この場合、これらは、発散（shedding）の一般的誘導物質として作用し、内因性ｐｒｏＡＲの細胞表面含量を減少させる（図１Ｃ）。しかしながら、これらの細胞性内容物において、さらにＬＰＡは、ｐｒｏＴＧＦαまたはｐｒｏＨＢ−ＥＧＦのタンパク質分解を誘発しないが、その一方でＴＰＡでの刺激は、双方のＥＧＦ−様増殖因子前駆体（データは示していない）とのエクトドメイン分断を生じる。これらの図は、ＬＰＡ刺激が、ＨＮＳＣＣ中のｐｒｏＡＲの発散を誘発する。さらに、バチマステート（１０μＭ）は完全に、ｐｒｏＡＲのＬＰＡ−誘発エクトドメイン分解を回避し、これよって、ｐｒｏＡＲ発散のためのメタロプロテアーゼ活性要求性が確認された。Ｇｉ／Ｏファミリーの優性な百日咳毒（ＰＴＸ）−敏感性Ｇタンパク質が、ＬＰＡ−誘導ＥＧＦＲチロシンリン酸化の介在物質であり（図１Ａ）、ＰＴＸ（１００ｎｇ／ｍＬ）が部分的に、ＳＣＣ−９細胞の細胞表面上で、ｐｒｏＡＲシェーディングを阻害する（図１Ｃ）。
【００５１】
細胞表面ｐｒｏＡＲの減少に加えて、ＧＰＣＲ刺激は、サンドウイッチ−ＥＬＩＳＡ（図１Ｄ）によって測定されたように、細胞培地中で成熟ＡＲの堆積を生じる。カルバコールと応答してのＡＲ放出は、ＧＰＣＲ−リガンドに応じて放出されたＡＲの量およびＥＧＦＲチロシンリン酸化含量との間の直接的な相互関係を示唆する、ＬＰＡ刺激と比較して本質的に低いことが見出された（図１Ａ）。さらに、バチマステートでのプレインキュベーションは、細胞培地中での、ＧＰＣＲ−およびＴＰＡ−誘導されたＡＲの堆積を完全に回避し、その際、ＡＲ放出のメタロプロテアーゼ依存性が確認された（図１Ｄ）。
【００５２】
ＡＲ機能が、ＧＰＣＲ−誘導ＥＧＦＲチロシンリン酸化および下流の細胞性応答について要求されるか否かについて測定するために、３種の試験をおこなった。最初に、ＳＣＣ−９細胞中でｐｒｏＡＲ、ｐｒｏＨＢ−ＥＧＦおよびｐｒｏＴＧＦαの内在性発現をサイレンスにするために、ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）を使用した。標的化された遺伝子発現の効率および特異的ノックダウンは、ＲＴ−ＰＣＲによってモニタリングされ（図２Ａ）、その際、ｍＲＮＡ分解により生じる遺伝子サイレンシングを確認した。随伴的に、ＥＧＦＲトランス活性化シグナル上のｓｉＲＮＡの効果が試験された。図２Ｂに示すように、ｐｒｏＡＲに対するｓｉＲＮＡは、ＧＰＣＲ−誘発ＥＧＦＲチロシンリン酸化を完全にブロックする。ｐｒｏＨＢ−ＥＧＦおよびｐｒｏＴＧＦαに対するＳｉＲＮＡは、しかしながらｐｒｏＡＲのための特異的要求を試験するトランス活性化シグナルを著しく変更することはない。さらに、我々はｐｒｏＡＲノックダウンが、頭部および頸部癌細胞のＧＰＣＲ−誘導運動性に作用するか否かについて試験した。実際には、ｐｒｏＡＲｓｉＡＲは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＬＰＡ−誘発化学誘引的遊走を著しく抑制した（図２Ｃ）。
【００５３】
第二に、我々は、ＬＰＡによるＥＧＦＲチロシンリン酸化上のＡＲ中和抗体の効果について、扁平上皮細胞癌細胞系、ＳＣＣ−４、ＳＣＣ−９、ＳＣＣ−１５およびＳＣＣ−２５中で試験した。結果は、ヒトＡＲのエクトドメインに対して生じるポリクローナルヤギまたはモノクローナルマウス抗体で予め処理することによって、ＥＧＦＲトランス活性シグナルが抑制されることを示した（図２Ｄ、ＳＣＣ−９細胞中のポリクローナル抗−ＡＲ−抗体に関する典型的なデータ）。同様の結果は、頭部および頸部癌細胞の、カルバコールでの刺激上で得られた（データは示されていない）。対照的に、ＨＢ−ＥＧＦの特異的な阻害は、ジフテリア毒突然変異体ＣＲＭ１９７または抗−ＨＢ−ＥＧＦ中和抗体を用いて、ＬＰＡ−またはカルバコール−誘導ＥＧＦＲトランス活性化上での効果を示すことはなかった（データは示されていない）。
【００５４】
第三に、ＡＲが、ヘパリン結合ドメインを含有し、かつ、グリコ−スアミノグリカンヘパリンは、ケラチノサイト（１６）およびＭＣＦ−１０Ａ細胞（１７）中のＡＲ−誘導マイトージェン応答を阻害することから、ＥＧＦＲトランス活性化シグナル上のヘパリンの効果について評価した。予測されるように、ヘパリン（１００ｎｇ／ｍＬ）は、ＬＰＡにより生じるＥＧＦＲチロシンリン酸化を完全に遮断する（図２Ｄ）。これらの図に基づいて、ＡＲ機能がトランス活性化ＥＧＦＲの下流のＳＨＣ活性化に関して要求されるか否かについて試験し、それというのも、アダプタータンパク質ＳＨＣのチロシンリン酸化およびＳＨＣ−Ｇｒｂ２−Ｓｏｓ錯体の形成は、活性化ＥＧＦＲのＲａｓ／ＭＡＰＫカスケード（１８）と結合における重要な工程であることが知られている。実際には、ＡＲ遮断は、完全に、ＬＰＡ−誘発ＳＨＣ−チロシンリン酸化（図２Ｄ）を回避し、かつグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）Ｇｒｂ２融合タンパク質（図２Ｅ）に付随する。
【００５５】
いつかの試験では、ＥＧＦＲトランス活性化が１個の重要な機序であることが、ＧＰＣＲアゴニストがＥＲＫ／ＭＡＰＫ経路（４，１２、１９、２０）を活性化することにより示されていた。ＡＲが、ＨＮＳＣＣ細胞中でのＬＰＡ刺激されたＥＲＫ／ＭＡＲＫ活性のために必要とされるか否かについて決定するために、ＥＲＫ１／２活性上のＡＲ阻害の効果を試験した。図２Ｆに示すように、ＡＲ中和抗体、ヘパリンおよびバチマステートは、ＳＣＣ−９およびＳＣＣ−１５細胞中でのＬＰＡ−誘導ＥＲＫ活性を妨げる。そのマイトージェン効果に加えて、ＬＰＡは、ＥＲＫ／ＭＡＲＫ経路とＡｋｔ／ＰＫＢ（２１，２２）のホスホイノシチド３−キナーゼ（Ｐ１３Ｋ）−依存性リン酸化の双方を活性化することによって、生存因子として役割を有していてもよい。したがって、ＬＰＡ刺激が、頭部および頸部癌細胞中のＡｋｔ／ＰＫＢのリン酸化を誘導するか否かについての疑問が生じた。結果は、ＬＰＡがＳｅｒ−４７３で、Ａｋｔ／ＰＫＢのリン酸化を著しく増加させることを示した（図２Ｆ）。さらに、ＬＰＡによるＡｋｔ／ＰＫＢリン酸化は、WortmanninまたはＬＹ２９４００２（示されていない）によるＰＩ３Ｋ阻害に対して敏感であり、さらにＡＲ遮断またはバチマステート処理によって排除された（図２Ｆ）。
【００５６】
成長促進ＧＰＣＲシグナル化のためのＡＲ機能についての研究を進めるために、ＬＰＡ−誘導ＤＮＡ合成上のＡＲ阻害の効果について評価した。図２Ｇにおいて示すように、ＨＮＳＣＣ細胞は、ＡＲ阻害上でＬＰＡによって誘発されたＤＮＡ合成の割合の著しい減少を示し、この場合、これらは、ＬＰＡによる完全な増殖応答が、ＡＲを必要とすることを示唆するものである。さらに、バチマステートおよびＥＧＦＲ−特異的インヒビターチルホスチンＡＧ１４７８は、ＬＰＡによるＤＮＡ合成を、基底値を下廻るように減少させた。まとめると、これらのデータは、ＥＧＦＲ特性、マイトージェンおよび運動促進トランス活性化シグナルの、ＨＮＳＣＣ中での生成に関して、ＡＲが要求されることを実証した。
【００５７】
最近の観察において、マウスの繊維芽細胞中での、ｐｒｏＡＲおよび他のＥＧＦ様増殖因子前駆体の構造的発散における、メタロプロテアーゼ分解ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７の役割が示唆された（２３、２４）。さらに、ＴＡＣＥのタンパク質分解活性は、Ｔｉｍｐ−１ではなく、メタロプロテアーゼ−３（Ｔｉｍｐ−３）の組織インヒビターによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害されることが示された（２５）。ＴＡＣＥが広範囲に、ＨＮＳＣＣ細胞系（図３Ａ）中で発現することから、ＥＧＦＲトランス活性化シグナル上のＴｉｍｐ−１およびＴｉｍｐ−３の効果について試験した。確かに、レトロウイルス伝達によるＴｉｍｐ−１でなくＴｉｍｐ−３−の異所性発現は、ＳＣＣ−９細胞中でのＧＰＣＲ−誘導ＥＧＦＲチロシンリン酸化を阻害した（図３Ｂ）。さらに、ｐｒｏ−およびメタロプロテアーゼドメイン（２６）を欠失するドミナントネガティブＴＡＣＥの異所性発現（図３Ｃ）は、ＧＰＣＲ−誘導ｐｒｏＡＲ切断、成熟ＡＲの放出（図３Ｄ）およびＳＣＣ−９細胞中でのＥＧＦＲシグナル伝達を抑制した（図３Ｅ）。対照的に、ＧＰＣＲ−誘発ｐｒｏＨＢ−ＥＧＦプロセッシングにおいて含まれることが示された、ＡＤＡＭ１０（３）およびＡＤＡＭ１２（２）のドミナントネガティブ突然変異体と、類似のＡＤＡＭ１５突然変異体のいずれも、ＧＰＣＲ−誘導応答に影響しないことが示された（図３Ｅ、ＡＤＡＭ１２に関して示された典型的なデータ）。
【００５８】
ＨＮＳＣＣ中のＥＧＦＲトランス活性化経路に関しての、ＴＡＣＥの要求性を別個に証明するために、ＲＮＡ干渉によるＴＡＣＥの内在性発現を遮断した。ＴＡＣＥ発現の抑制は、ＲＴ−ＰＣＲおよびウエスタンブロット分析によってモニタリングした（図４Ａ）。興味深いことに、ＴＡＣＥのｓｉＲＮＡ−直接的阻害は、ＳＣＣ−９細胞の細胞表面上でのｐｒｏＲの堆積を生じる（図４Ｂ）。これは、ＴＡＣＥが、基礎的なｐｒｏＡＲエクトドメンプロセッシングにおいて含まれるといった見方を支持するものである。さらに、ＴＡＣＥ  ｓｉＲＮＡは、特異的にＧＰＣＲ−誘導ＥＧＦＲ、ＳＨＣ、ＥＲＫ／ＭＡＰＫおよびＡｋｔ／ＰＫＢ活性を抑制した（図４Ｃ）。最終的に、ＴＡＣＥｓｉＲＮＡは、さらにＬＰＡに応じてのＳＣＣ−９細胞の遊走を妨げる（図４Ｄ）。
【００５９】
３．考察
試験結果の増加した量は、ＥＧＦＲが、異なるＧＰＣＲシグナルの中心的インテグレーターとしての機能し、それによって下流の経路に集められるといった概念を支持するものである（４，６，１２）。存在するデータは、ヒト癌細胞での望ましくないＥＧＦＲトランス活性化機序を支持し、かつＧＰＣＲシグナル中のＴＡＣＥに関する新規生物学的機能を同定する。これらの結果は、ＴＡＣＥのＧＰＣＲ−誘導活性が、遊離ＡＲの量の増加に寄与しうるといった生物学的因果関係を有することを証明したものである。ＥＧＦＲのＨＢ−ＥＧＦ−依存型トランス活性化が、肺上皮細胞（３）およびＣＯＳ−７細胞（２７）中のＡＤＡＭ１０によってか、あるいは、心筋細胞（２）中のＡＤＡＭ１２によって介在されるといった他の機序が記載されている。しかしながら、膜貫通ｐｒｏＡＲが、ＧＰＣＲ刺激に応じて分解され、さらにＡＲが、ＧＰＣＲアゴニストにより、真の癌細胞特性を介在するための機能的等価物であることが初めて示された。ＴＡＣＥ−依存性ＡＲ放出は、ＧＰＣＲ−誘導ＥＧＦＲ刺激、ＥＲＫ／ＭＡＰＫ経路の活性、Ａｋｔ／ＰＫＢのリン酸化、細胞増殖および遊走の誘発に対して不可欠であることを示した。
【００６０】
ＴＡＣＥが、ヘテロ三量体Ｇタンパク質によってどのように活性化されるかについては知られていない。しかしながら、ＥＲＫは、ＴＰＡ刺激（２８）に応じてスレオニン７３５で、ＴＡＣＥの細胞質ドメインと結合し、かつリン酸化することが示されており、ＧＰＣＲ−誘導ＡＲ放出およびＥＧＦＲチロシンリン酸化は、ＨＮＳＣＣ細胞（観察については開示されていない）中で、ＭＥＫインヒビターに対して非感受性であり、その際、ＥＲＫは、ＥＧＦＲの上流に包含されるものではない。今後の研究の重要項目は、ＧＰＣＲシグナルトランスミッションが、どのように、ＡＤＡＭ１０／ＨＢ−ＥＧＦ、ＡＤＡＭ１２／ＨＢ−ＥＧＦまたはＴＡＣＥ／ＡＲモジュールによって、細胞型−または生理学的に依存する手段で、介在されるかを定義することであろう。したがって、これらの試験は、生理学的に重要なＧＰＣＲリガンド、ＴＡＣＥおよびＡＲの関連性を、重要な癌細胞の特徴付けの介在において証明したものにほかならない。
【００６１】
例２  ＴＡＣＥに対するモノクローナル抗体の製造および特徴付け
２．１モノクローナル抗体の製造
モノクローナル抗体（Ｍａｂｓ）は、ヒトＴＡＣＥ（ＡＤＡＭ１７）のメタロプロテアーゼドメインに対して製造された。組換えタンパク質は、ＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化に関して使用され（J.H. Peters, H. Baumgarten and M. Schulze, Monoclonale Antikoerper-Herstellung und Charakterisierung, Springer- Verlag, 1985, Berlin Heidelberg New York Tokio）、モノクローナル抗体の精製は、Ｔ−ＧｅｌＴＭ  Ａｂｓｏｒｂｅｎｔを用いておこなった（Pierce, Rockford, IL, USA）。
【００６２】
２．２機能的分析
ＴＡＣＥのメタロプロテアーゼ−ドメインを認識する８個のモノクローナル抗体を、ＥＬＩＳＡによって同定された。これらの抗体は、ヘマグルチニンエピトープ（ＴＡＣＥ−ＨＡ）でタグされた、ＴＡＣＥをコードする真核細胞性発現プラスミドで一時的にトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞のライセートを免疫沈降するために使用した（３１）。モノクローナル抗体４３２−２、４００−１、３４３−３および４３２−７は、特にＴＡＣＥの成熟体を免疫沈降するものであるのに対し、α−ＨＡ抗体は、優先的にＴＡＣＥの前駆体を免疫沈降した（図５）。
【００６３】
さらに、ＳＣＣ−９細胞のライセートからの内在性ＴＡＣＥタンパク質を免疫沈降するためのモノクローナル抗体の能力を試験した。ＭＡｂｓ４３２−２、４００−１、３４３−３および４３２−７は、ＴＡＣＥのメタロプロテアーゼドメインに対して製造され、特に、ＴＡＣＥの成熟体を免疫沈降するが、前駆体に関しては免疫沈降しないものであった（図６）。
【００６４】
モノクローナル抗体は、生存細胞の細胞表面上でのＴＡＣＥを検出するその能力に関して試験した。抗体４０２−６および３６８−３は、細胞表面が染色しないことを示すのに対し、３６７−３は、弱いシグナルを示した。対照的に、抗体３４３−３、３７４−５、４００−１、４３４−２および４３２−７は強いシグナルを示した（図７）。
【００６５】
最後に、扁平上皮細胞癌細胞系ＳＣＣ−９中での、ＬＰＡ−誘導ＥＧＦＲチロシンリン酸化上のモノクローナルＴＡＣＥ抗体の効果について試験した。結果は、３７４−５、４３２−２、４００−１および３６７−３での予めの処理が、ＬＰＡによって誘発されたＥＧＦＲシグナルトランス活性化を阻害するのに対し（図８）、ＥＧＦでのＥＧＦＲの直接的な刺激が、モノクローナルＴＡＣＥ抗体での前処理によって影響を受けないことを示した（図９）。
【００６６】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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