(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘモグロビンを含有する試料中に、イミノカルボン酸又はその塩を共存させることを特徴とするヘモグロビンの安定化方法であって、
前記イミノカルボン酸又はその塩が下記式（２）
【化１】
0005422108.tif 000006
（式中、Ｘは水素原子、アルカリ金属又はアンモニウム基を表す。）で表される３−ヒドロキシ−２，２'−イミノジコハク酸又はその塩であり、
前記３−ヒドロキシ−２，２'−イミノジコハク酸又はその塩の濃度が０．０１０ないし０．２００ｍｏｌ／Ｌの範囲である、
ヘモグロビンの安定化方法。
【請求項２】
前記ヘモグロビンを含有する試料が糞便、尿又は血液である請求項１に記載のヘモグロビンの安定化方法。
【請求項３】
前記ヘモグロビンを含有する試料が水溶液である請求項１に記載のヘモグロビンの安定化方法。
【請求項４】
下記式（２）
【化２】
0005422108.tif 000007
（式中、Ｘは水素原子、アルカリ金属又はアンモニウム基を表す。）で表される３−ヒドロキシ−２，２'−イミノジコハク酸又はその塩を含有する、ヘモグロビンの保存溶液であって、
前記３−ヒドロキシ−２，２'−イミノジコハク酸又はその塩の濃度が０．０１０ないし０．２００ｍｏｌ／Ｌの範囲である、ヘモグロビンの保存溶液。
【請求項５】
請求項４に記載のヘモグロビンの保存溶液中に、試料として糞便を懸濁させた糞便懸濁液。
【請求項６】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のヘモグロビンの安定化方法のための、下記式（２）で表される３−ヒドロキシ−２，２'−イミノジコハク酸又はその塩の使用。
【化３】
0005422108.tif 000008
（式中、Ｘは水素原子、アルカリ金属又はアンモニウム基を表す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘムタンパク質の安定化方法に関し、特に糞便、尿又は血液試料中のヘムタンパク質検査におけるヘムタンパク質の安定化方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、大腸癌などの消化器系疾患のスクリーニング方法として、消化器官からの出血に起因する糞便中のヒトヘモグロビン（便潜血）の検出が広く行われている。このヒトヘモグロビンの検出方法は、従来の化学的な発色反応に基づく試験紙法に代わり、ヒトヘモグロビンに特異的な抗体を利用した免疫学的手法であり、食事制限を必要としない手軽な検査方法として定着している。
【０００３】
ヒトヘモグロビンの免疫学的検出法としては、例えば寒天平板内で抗ヒトヘモグロビン抗体と被検試料中のヒトヘモグロビンとの沈降線を利用する一次元免疫拡散法、抗ヒトヘモグロビン抗体を感作したラテックス粒子を用いるラテックス凝集法、酵素や放射性元素で標識した抗ヒトヘモグロビン抗体を用いる酵素免疫法や放射性免疫法、抗ヒトヘモグロビン抗体を感作した金コロイド粒子を用いる金コロイド凝集比色法等が挙げられる。
【０００４】
しかしながら、ヒトヘモグロビンは、被検液中では徐々に変性し、抗原性が低下するという性質を有している。また、被検液中のヒトヘモグロビンは、保存温度等の保存条件によって変性が促進されたり、糞便中の細菌や消化酵素によって分解されてしまうことも多い。このような変性・分解の結果、ヒトヘモグロビンの立体構造が破壊されて抗原性の低下を招くことになる。このため、免疫学的なヒトヘモグロビンの測定方法においては、ヘモグロビンの変性・分解は誤った診断結果を惹起する。
【０００５】
一方、便潜血検査においては、被験者自身が自宅などで採取した糞便を便溶解液を含む密閉容器に溶解して検査に供することが多い。この場合、糞便中のヒトヘモグロビンは、溶液中で数日間放置されたり、郵便等の輸送手段を利用することによって高温下に置かれることも多い。また、検査機関で採便する場合においても、他項目の検査を実施しているため、便潜血の検査までに多くの時間を要することもある。このような状況下では、前述したように、ヒトヘモグロビンの変性・分解が生じるため、精度良く測定する際の妨げとなっていた。
【０００６】
このような溶液中でのヒトヘモグロビンの変性・分解を防止するため、例えばチメロサールやクロルヘキシジン等一般的抗菌剤を添加する方法（例えば、特許文献１参照）の他に、糖類を添加する方法（例えば、特許文献２参照）、ヒト以外の動物ヘモグロビンの添加（例えば、特許文献３参照）、ヒト以外の動物血清の添加（例えば、特許文献４参照）、溶菌酵素の添加（例えば、特許文献５参照）、鉄プロトポルフィリンの添加（例えば、特許文献６参照）等が提案されている。
しかしながら、これらの公報に記載されたヒトヘモグロビン安定化技術では、糞便を含む被検液中のヒトヘモグロビンの変性・分解を十分に抑制することができない。
【０００７】
この他にも、エチレンジアミン４酢酸（以下、ＥＤＴＡと省略する）を用いたヘモグロビン安定化方法が提案されている（例えば、特許文献７参照）。
しかしながら、本発明者らによる追試の結果、ＥＤＴＡ単独では糞便中のヘモグロビンに対して十分な安定化作用を期待できないことが確認された。
そこで、本出願人は、ＥＤＴＡ単独よりも安定化効果の高い水溶性遷移金属錯体を添加する方法を提案している（例えば、特許文献８参照）。更に、本出願人は、フェロシアン
化合物と共存させたヘモグロビンの安定化方法（例えば、特許文献９参照）、ヘモグロビンの酵素分解産物を共存させたヘモグロビンの安定化方法（例えば、特許文献１０参照）、遷移金属類を共存させたヘムタンパク質の安定化方法（例えば、特許文献１１参照）、リンゴ酸などの有機酸を共存させたヘムタンパク質の安定化方法（例えば、特許文献１２参照）及び脱脂アルブミンを共存させたヘムタンパク質の安定化方法（例えば、特許文献１３参照）を既に提案している。
【０００８】
【特許文献１】特開昭６３−２７１１６０号公報
【特許文献２】特開昭６３−２４３７５６号公報
【特許文献３】特開平２−２９６１４９号公報
【特許文献４】特開平４−１４５３６６号公報
【特許文献５】特公平５−６９４６６号公報
【特許文献６】特開平５−２８１２２７号公報
【特許文献７】特開平５−９９９２３号公報
【特許文献８】特開平７−２２９９０２号公報
【特許文献９】特開平１１−１１８８０６号公報
【特許文献１０】特開平１１−２１８５３３号公報
【特許文献１１】特開２００１−２４９１３２号公報
【特許文献１２】特開２００３−０１４７６８号公報
【特許文献１３】特開２００３−１９４８２５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の第一の課題は、ヘモグロビンに代表されるヘムタンパク質の変性・分解作用に対して有効な、新規なヘムタンパク質の安定化方法を提供することにある。特に変性・分解作用の強い糞便成分と共存するヘモグロビンを効果的に安定化する技術の提供を目的とする。
本発明の第二の課題は、新規なヘムタンパク質の安定化剤を利用したヘムタンパク質の保存溶液を提供することにある。
本発明の第三の課題は、新規なヘムタンパク質の安定化方法に用いる特定の化合物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、下記（１）ないし（７）の構成からなるものである。
（１）ヘムタンパク質を含有する試料中に、イミノカルボン酸又はその塩を共存させることを特徴とするヘムタンパク質の安定化方法。
（２）前記イミノカルボン酸又はその塩が下記式（１）
【化１】
0005422108.tif 000002
（式中、Ｒは水素原子又は水酸基を表し、及び
Ｘは水素原子、アルカリ金属又はアンモニウム基を表す。）
で表される化合物並びにそれらの混合物である前記（１）のヘムタンパク質の安定化方法
。
（３）前記イミノカルボン酸塩が下記式（２）
【化２】
0005422108.tif 000003
（式中、Ｘは水素原子、アルカリ金属又はアンモニウム基を表す。）で表される３−ヒドロキシ−２，２’−イミノジコハク酸又はその塩である前記（１）又は（２）のヘムタンパク質の安定化方法。
（４）前記イミノカルボン酸又はその塩の濃度が０．００１ないし０．２００ｍｏｌ／Ｌの範囲である前記（１）ないし前記（３）のいずれか１つに記載のヘムタンパク質の安定化方法。
（５）前記ヘムタンパク質がヘモグロビン、ミオグロビン、ペルオキシターゼ又はカタラーゼである前記（１）記載のヘムタンパク質の安定化方法。
（６）前記ヘムタンパク質を含有する試料が糞便、尿又は血液である前記（１）記載のヘムタンパク質の安定化方法。
（７）前記（１）ないし前記（３）のいずれか１つに記載のイミノカルボン酸又はその塩を含有することを特徴とするヘムタンパク質の保存溶液。
（８）前記（１）ないし前記（６）のいずれか１項に記載のヘムタンパク質の安定化方法に用いるイミノカルボン酸又はその塩。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のヘムタンパク質の安定化方法では、ヘムタンパク質に対して強い変性・分解作用を持つ生体成分、特に糞便成分との共存下においても保護作用を得ることができる。従って、生体成分の分析、例えば糞便潜血の検出を目的とする試料に含まれるヘモグロビンの安定化に有用である。特に抗原構造の保護が要求される免疫学的な分析対象としてのヘムタンパク質について、その抗原性の維持に貢献する。本発明の方法、保存溶液及びヘムタンパク質の安定化方法に用いる化合物によって糞便試料中のヘモグロビンが効果的に安定化され、ヘモグロビンの変性・分解による偽陰性結果の防止を期待することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明について更に詳細に説明する。
本発明においては、ヘムタンパク質を含有する試料中に、イミノカルボン酸又はその塩を共存させる。このイミノカルボン酸は、公知のものの中から適宜選択できるが、特に前記式（１）で表される化合物が好ましく、より好ましくは前記式（２）で表される３−ヒドロキシ−２,２’−イミノジコハク酸又はその塩である。また、前記式（１）及び式（
２）においてＸで表されるアルカリ金属として、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウムが挙げられる。
また、本発明に用いられるイミノカルボン酸は、例えばアスパラギン酸とエポキシコハク酸を原料とする方法（例えば、特開平９−１８３７７３号公報）、マレイン酸とアンモニアを原料とする方法（例えば、米国特許第６３９８６３号明細書）、アスパラギン酸とマレイン酸を原料とする方法（例えば、特開平５−３２０１０９号公報）、マレイン酸半
エステルとマレイン酸、アンモニアを原料とする方法（例えば、特開平８−１２６３１号公報）によって合成されたものを使用することができる。
【００１３】
ヘムタンパク質を含有する試料中におけるイミノカルボン酸又はその塩の濃度は、０．００１ないし０．２００ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０５０ないし０．１５０ｍｏｌ／Ｌである。このイミノカルボン酸又はその塩の濃度が０．００１ｍｏｌ／Ｌ未満になると、ヘムタンパク質の安定化効果が不十分となる。一方、イミノカルボン酸又はその塩の濃度が０．２００ｍｏｌ／Ｌを超えると、溶解度が低下し、免疫反応も阻害される。
【００１４】
本発明においては、必須とはされないが、必要に応じて公知のタンパク質保護剤を加えることによってヘムタンパク質の安定化効果をより高めることができる。このようなタンパク質保護剤としては、アルブミンやゼラチンに代表される不活性タンパク質等を挙げることができる。
【００１５】
アルブミンは、任意のものを使用することができるが、特に動物の血清や卵に由来するアルブミンが好ましい。その具体例としては、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、並びにこれらの動物の幼獣、又は胎児の血液に由来するアルブミンが挙げられる。
このアルブミンには、上記したもの以外にその酵素分解物も知られているが、本発明におけるアルブミンには、このようなアルブミンから誘導されるタンパク質をも含めることができる。
【００１６】
上記タンパク質保護剤の他に、例えば微生物の不必要な繁殖を防ぐための抗菌剤やヘムタンパク質の保存に有利なｐＨを与える緩衝剤などこれまでに知られている多くのヘムタンパク質保護成分の添加も有効である。
抗菌剤としては、溶菌酵素、安息香酸エチル、ペニシリン、ファンギソン、ストレプトマイシン、あるいはセファマイシンの他に非ペニシリン系の一連の抗生物質等が挙げられる。また、トリプシンインヒビターやα２マクログロブリンのようなプロテアーゼ抑制物質もヘムタンパク質を安定化することが知られている。
【００１７】
分散媒のｐＨは、ヘムタンパク質を安定に保持できる範囲に設定する。極端な酸やアルカリ条件下ではヘムタンパク質の安定性を損なう恐れがあり、中性域のｐＨが望ましい。具体的には５ないし１０、好ましくは６ないし８程度のｐＨとする。
ｐＨ維持のためには適当な緩衝剤を利用することができる。例えば、ヒドロキシエチルピペラジン−２−エタンスルホン酸（以下、ＨＥＰＥＳと省略する）やピペラジン−ビス（２−エタンスルホン酸）（以下、ＰＩＰＥＳと省略する）等のグッド緩衝剤は、ヘムタンパク質の構造が最も安定化すると思われるｐＨ６ないし８を与えると同時に、免疫反応によってヘムタンパク質を検出する時の反応用緩衝液としても利用されているものであり、特に好ましい緩衝剤として挙げられる。この他、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液等を利用することもできる。
【００１８】
本発明のヘムタンパク質の安定化方法は、糞便、尿、血液試料中のヘムタンパク質の検出に利用することができる。ヘムタンパク質としては、ヘムを構成成分とするタンパク質の中から適宜選択でき、例えばヘモグロビン、ミオグロビン、ペルオキシターゼ又はカタラーゼが挙げられる。特に抗原構造の保護が要求される免疫学的な分析対象としてのヘムタンパク質について、その抗原性の維持に有用である。
【００１９】
本発明においては、ヘムタンパク質の安定化因子として作用するイミノカルボン酸又はその塩類を含有させたヘモグロビンの保存溶液を提供することができる。
更に、本発明の保存溶液には、必要に応じてタンパク質保護剤及び緩衝剤を含有させることができる。タンパク質保護剤及び緩衝剤としては、上記したものの中から適宜選択し
て使用することができる。
【００２０】
本発明は、前記ヘムタンパク質の安定化技術を応用したヘムタンパク質の免疫学的測定方法を提供することができる。免疫学的測定方法としては、例えばラテックス凝集反応法、金コロイド凝集反応法、イムノクロマトグラフ法又はＥＬＩＳＡ法等を挙げることができる。いずれの測定方法においても、ヘムタンパク質含有試料に、イミノカルボン酸又はその塩類を共存させることによって、保存中の抗原活性は保護され測定値の低下が抑制される。
【００２１】
本発明のヘムタンパク質の安定化方法は、生体試料中に存在する分析対象としてのヘムタンパク質を安定化するために有用である。特にヘムタンパク質を認識する抗体を用いた免疫学的手法によるヘムタンパク質の測定方法において、測定対象となるヘムタンパク質の抗原性を高度に安定化する。ヘムタンパク質を検出すべき生体試料には、糞便、尿、血液が知られている。特に糞便中のヘモグロビンは消化器における出血の指標となり、尿中のヘモグロビンは、尿路における出血の指標となる。
【００２２】
本発明の安定化方法を、糞便試料に存在するヘモグロビンに応用する場合には、糞便を懸濁させる保存溶液にイミノカルボン酸又はその塩類を添加しておくとよい。通常の糞便中のヘモグロビンの検出にあたっては、糞便を適当な保存液に懸濁させ必要に応じてろ過して免疫学的な分析用試料とする。
以下、実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。
【実施例】
【００２３】
実施例  各濃度のＨＩＤＳによるヘモグロビンの安定化効果
０．０５ｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ、０．９％の塩化ナトリウム、及び残部の純水からなるｐＨ７．０の溶液に、０ないし０．２ｍｏｌ／Ｌの３−ヒドロキシ−２,２’−イミノ
ジコハク酸４ナトリウム（ＨＩＤＳ）を以下の表１に示す濃度で各々添加した保存溶液を調製した。ＨＩＤＳは、（株）日本触媒製を使用した。
この保存溶液に溶血ヘモグロビン又は溶血ヘモグロビンと便検体との混合物を添加し、それぞれの試験液についてヘモグロビン濃度を測定した（直後濃度）。次いで、３７℃で２０時間保存した後のヘモグロビン濃度を前記直後濃度で除し、ヘモグロビンの残存率を算出した。
ヘモグロビンの濃度は、免疫学的ヘモグロビン測定試薬ＯＣオートＩＩＩ（栄研化学（株）製）を使用し、ＯＣセンサーＮＥＯ分析機（栄研化学（株）製）で測定した。
表１に示すように、ＨＩＤＳをヘモグロビンのみに添加した試験液の場合には、添加濃度０．００１ｍｏｌ／Ｌから安定化効果が見られる。また、ヘモグロビン及び便検体が存在する試験液の場合にも、添加濃度０．００５ｍｏｌ／Ｌから安定化効果が見られる。特にＨＩＤＳの添加濃度が０．０５０ｍｏｌ／Ｌ以上であるとき、ヘモグロビンの安定化効果が著しいことが分かる。
【表１】
0005422108.tif 000004
【００２４】
比較例
実施例の３−ヒドロキシ−２,２’−イミノジコハク酸４ナトリウム（ＨＩＤＳ）の代
わりに、エチレンジアミン−Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’−４酢酸（ＥＤＴＡ）、イミノジ酢酸（Ｉ
ＤＡ）、又はＮ−（２−ヒドロキシエチル）イミノジ酢酸（ＨＩＤＡ）を添加した以外は、実施例と同様な方法により、ヘモグロビンの安定化効果を調べた。
表２に示すように、ＥＤＴＡ、ＩＤＡ又はＨＩＤＡをキレート剤として使用した場合、ヘモグロビンのみの試験液においては僅かな安定化効果が見られた。しかしながら、糞便の共存下では、ＩＤＡ及びＨＩＤＡをキレート剤として使用した場合、安定化といえる水準の効果は見られなかった。ＥＤＴＡを使用した場合は、便検体の共存下でも、ヘモグロビンの安定化効果が幾らか高い水準で見られたものの、添加濃度０．０１０ｍｏｌ／Ｌ以上では実施例の保存溶液よりもヘモグロビンの安定化効果はより格段に小さいものであった。
【表２】
0005422108.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明によれば、ヘムタンパク質を含有する試料中に、イミノカルボン酸又はその塩を共存させることによって、ヘムタンパク質を安定に維持することができ、便潜血検査におけるヘモグロビンの変性・分解による偽陰性を防止することができる。その結果、より精度の高い便潜血検査を行うことができる。