(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（ＩＩ）：
【化１】
0005622834.tif 000009
［式中、Ｒ１がＯＨであり、Ｒ２がＨであるか、又はＲ１がＨであり、Ｒ２がＯＨである］
で表される化合物。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物を有効成分として含むシクロオキシダーゼ−２阻害剤。
【請求項３】
請求項２に記載のシクロオキシダーゼ−２阻害剤を含有する抗炎症剤。
【請求項４】
請求項２に記載のシクロオキシダーゼ−２阻害剤を含有する化粧料。
【請求項５】
請求項２に記載のシクロオキシダーゼ−２阻害剤を含有する芳香剤。
【請求項６】
請求項２に記載のシクロオキシダーゼ−２阻害剤を含有するアロマテラピー用エッセンシャルオイル。
【請求項７】
一般式（ＩＩ）：
【化２】
0005622834.tif 000010
［式中、Ｒ１がＯＨであり、Ｒ２がＨであるか、又はＲ１がＨであり、Ｒ２がＯＨである］
で表される化合物の製造方法であって、カラハナエノンをＣＹＰ２Ａ６又はＣＹＰ２Ａ６を発現することができる細菌であるネズミチフス菌（Salmonella typhimurium） OY1002/2A6（受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−１４９２）により生物変換することを特徴とする製造方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カラハナエノン（karahanaenone）を生物変換（biotransformation）して得られる化合物、該化合物を有効成分として含有するシクロオキシダーゼ−２阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
カラハナエノン（２，２，５−トリメチル−４−シクロヘプテン−１−オン）はホップ油等より得られる７員環モノテルペン化合物であり、香料において重要な化合物の１つである。また、カラハナエノンは、防虫剤又は化粧品等の防腐剤として商業的に使用されている。
【０００３】
カラハナエノンは、下記式（Ｉ）：
【０００４】
【化１】
0005622834.tif 000002
【０００５】
で表される構造を有している。カラハナエノンの誘導体として、Ｎ−ｐ−ヒドロキシフェニル−３，３，６−トリメチル−５−シクロヘプテン−２−オン−１−カルボキシアミド及び２−ヒドロキシ−Ｎ−ｐ−ヒドロキシフェニル−３，３，６−トリメチル−５−シクロヘプテン−１−カルボキシアミドが美白作用を有することが報告されている（特許文献１）。また、本発明者らは、カラハナエノンを種々の微生物により生物変換してカラハナエノールを得たことを報告している（非特許文献１）。非特許文献１には、カラハナエノンを、Glomerella cingulata、Aspergillus niger、Strepomyces aureofaciens、及びBacillus subtilisによって生物変換することによりカラハナエノール（２，２，５−トリメチル−４−シクトヘプテン−１−オール）の（Ｓ）−エナンチオマーが得られること、及びFusarium salaniによって生物変換することによりカラハナエノールの（Ｒ）−エナンチオマーが得られることが記載されている。
【０００６】
しかしながら、上記化合物以外のカラハナエノンの誘導体は報告されておらず、また、他の微生物によるカラハナエノンの生物変換も知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平７−６１９０５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Miyazawa M. et al.,:Tetrahedron:Asymmetry, 6(9), pp.2121-2122, 1995.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、カラハナエノンを生物変換して得られる化合物、該化合物を有効成分として含有するシクロオキシダーゼ−２阻害剤に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、カラハナエノンを原料として生物変換することにより、新規な化合物を得た。さらに、この新規化合物は、シクロオキシダーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害活性を有することを見出し、さらに検討を加えて、本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち、本発明は以下の化合物、該化合物を含むシクロオキシダーゼ−２阻害剤等を提供する。
【００１２】
項１．一般式（ＩＩ）：
【００１３】
【化２】
0005622834.tif 000003
【００１４】
［式中、Ｒ１はＨ又はＯＲ３（ここで、Ｒ３は、Ｈ又は水酸基の保護基を示す）を示し、Ｒ２は、Ｒ１がＨのときにはＯＲ３を示し、Ｒ１がＯＲ３のときにはＨを示す］
で表される化合物。
【００１５】
項２．一般式（ＩＩ）において、Ｒ１がＯＨであり、Ｒ２がＨである上記項１に記載の化合物。
【００１６】
項３．一般式（ＩＩ）において、Ｒ１がＨであり、Ｒ２がＯＨである上記項１に記載の化合物。
【００１７】
項４．上記項１〜３に記載のいずれか１項に記載の化合物を有効成分として含むシクロオキシダーゼ−２阻害剤。
【００１８】
項５．上記項４に記載のシクロオキシダーゼ−２阻害剤を含有する抗炎症剤。
【００１９】
項６．上記項４に記載のシクロオキシダーゼ−２阻害剤を含有する化粧料。
【００２０】
項７．上記項４に記載のシクロオキシダーゼ−２阻害剤を含有する芳香剤。
【００２１】
項８．上記項４に記載のシクロオキシダーゼ−２阻害剤を含有するアロマテラピー用エッセンシャルオイル。
【００２２】
項９．一般式（ＩＩ）：
【００２３】
【化３】
0005622834.tif 000004
【００２４】
［式中、Ｒ１はＨ又はＯＲ３（ここで、Ｒ３は、Ｈ又は水酸基の保護基を示す）を示し、Ｒ２は、Ｒ１がＨのときにはＯＲ３を示し、Ｒ１がＯＲ３のときにはＨを示す］
で表される化合物の製造方法であって、カラハナエノンをＣＹＰ２Ａ６又はＣＹＰ２Ａ６を発現することができる細菌により生物変換し、必要に応じて水酸基を保護することを特徴とする製造方法。
【００２５】
項１０．前記ＣＹＰ２Ａ６を発現することができる細菌が、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium） OY1002/2A6（受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−１４９２）である、上記項９に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の一般式（ＩＩ）で表される化合物は新規であり、高いシクロオキシダーゼ−２阻害活性を有しているため、抗炎症剤として有用である。また、芳香剤、入浴剤、アロマテラピーエッセンシャルオイル等に含有させて、リラクゼーション効果、リフレッシュ効果等の心身の癒し効果を発揮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】実施例２で得られた化合物２ａについて観測されたＨＭＢＣを示す。
【図２】実施例２で得られた化合物２ａの（Ｓ）−（−）−ＭＴＰＡエステルと（Ｒ）−（−）−ＭＴＰＡエステルとの間のプロトン化学シフトの差 (△δ値,δS-δR)を示す。
【図３】実施例２で得られた化合物２ｂについて観測されたＨＭＢＣを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、一般式（ＩＩ）：
【００２９】
【化４】
0005622834.tif 000005
【００３０】
［式中、Ｒ１はＨ又はＯＲ３（ここで、Ｒ３は、Ｈ又は水酸基の保護基を示す）を示し、Ｒ２は、Ｒ１がＨのときにはＯＲ３を示し、Ｒ１がＯＲ３のときにはＨを示す］
で表される化合物（以下、「化合物（ＩＩ）」ともいう）である。
【００３１】
Ｒ３で示される水酸基の保護基としては、水酸基の保護基として用いることができる基であれば特に限定はなく、例えば、アシル基（アセチル、プロパノイル、ベンゾイル等）、シリル基（トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基等）、アルキル基（メチル、エチル、プロピル、ブチル等）、アルケニル基（アリル、クロチル等）、アラルキル基（ベンジル、フェネチル等）、アルコキシアルキル基（メトシキメチル基等）、スルホニル基（メタンスルホニル、ベンゼンスルホニル等）などが挙げられる。
【００３２】
化合物（ＩＩ）には、下記一般式（ＩＩａ）：
【００３３】
【化５】
0005622834.tif 000006
【００３４】
（式中、Ｒ３は、前記と同様である）で表される化合物（以下、「化合物（ＩＩａ）」ともいう）、及び下記一般式（ＩＩｂ）：
【００３５】
【化６】
0005622834.tif 000007
【００３６】
（式中、Ｒ３は、前記と同様である）で表される化合物（以下、「化合物（ＩＩｂ）」ともいう）が含まれる。
【００３７】
上記化合物の中でも、一般式（ＩＩａ）において、Ｒ３がＨである化合物（６−ヒドロキシカラハナエノン）、及び一般式（ＩＩｂ）において、Ｒ３がＨである化合物（１０−ヒドロキシカラハナエノン）が、高いシクロオキシダーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害活性を有することから好ましい。
【００３８】
本発明の一般式（ＩＩ）で表される化合物は、次に示すようにカラハナエノンを生物変換（biotransformation）し、必要に応じ水酸基を保護することにより製造される。
【００３９】
カラハナエノンの生物変換には、例えば、生体内酵素であるＣＹＰ２Ａ６、又は該酵素を発現することができる細菌が用いられる。ＣＹＰ２Ａ６を発現することができる細菌として、例えば、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium） OY1002/2A6を挙げることができる。Salmonella typhimurium OY1002/2A6は、２０１２年１２月２０日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−１４９２で受領された。
【００４０】
生物変換の具体的な方法としては、基質であるカラハナエノンを、ＣＹＰ２Ａ６又は該酵素を発現することができる細菌で処理し、産生された代謝産物を採取することにより行われる。ここで、「処理」とは、カラハナエノンと酵素又は細菌との接触、カラハナエノンを細菌の培養培地に含有させて行う培養、発酵等の該技術分野で通常行われる微生物変換手段を含む意味で用いられており、「採取」とは、該技術分野で通常行われる分離、抽出及び精製手段を含む工程を意味している。
【００４１】
カラハナエノンのＣＹＰ２Ａ６による生物変換は、例えば、カラハナエノン及びＣＹＰ２Ａ６を含む混合液を、ＣＹＰ２Ａ６の酵素反応が起こる条件下におくことにより行うことができる。
【００４２】
カラハナエノンのＣＹＰ２Ａ６を発現することができる細菌による生物変換は、例えば、ＣＹＰ２Ａ６を発現することができる細菌の培養培地に、カラハナエノンを含有させて培養することにより行うことができる。
【００４３】
ＣＹＰ２Ａ６を発現することができる細菌の培養に用いられる培地としては、使用する菌の育成あるいは所望の微生物変換に適した慣用の培地を適宜選択することができ、当該菌が利用し得る栄養源を含むものであれば液状でも固状でもよい。この培地には、当該菌を培養するために必要な物質、例えば、当該菌が同化し得る炭素源、消化し得る窒素源及び無機物等が適宜配合される。培地のｐＨ及び温度条件は、使用する菌の育成に好適な範囲であればどのような条件でも使用することができる。
【００４４】
生物変換の後、代謝産物を分離又は抽出し、必要に応じて、アルミナカラムクロマトグラフィー又はシリカゲルクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の適当な分離精製手段を１種若しくは２種以上組み合わせて精製することにより、一般式（ＩＩ）で表される化合物（特にＲ３＝Ｈの化合物）を得ることができる。具体的には実施例１を参照。
【００４５】
得られた６−ヒドロキシカラハナエノン又は１０−ヒドロキシカラハナエノンは、必要に応じ、公知の方法を用いて水酸基を保護することができる。具体的な保護基としては、上記Ｒ３で示した通りである。各種保護基（Ｒ３）の導入は、いずれも公知の方法を用いて行うことができる。
【００４６】
一般式（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）で表される化合物（特にＲ３＝Ｈ）は、ＣＯＸ−２阻害作用を有している。一般式（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）で表される化合物はそのままＣＯＸ−２阻害剤として用いることが可能である。
【００４７】
ＣＯＸ−２阻害剤は、各種用途に用いることができる。例えば、ＣＯＸ−２阻害剤を化粧料として用いる場合、抗炎症剤として用いることができる。
【００４８】
本発明のＣＯＸ−２阻害剤における上記有効成分の含量は、化粧料等に含有されたときの最終的な上記有効成分の含量が重要であるため特に限定されないが、通常、０．０１〜１００重量％程度、好ましくは０．１〜１００重量％程度である。
【００４９】
化粧料とする場合、上記ＣＯＸ−２阻害剤を含み、化粧料におけるＣＯＸ−２阻害剤の含量は、下記に示す化粧料における上記有効成分の含量を満足するような範囲であることが望ましい。化粧料には、上記ＣＯＸ−２阻害剤に加え、必要に応じて、粉末、顔料、油脂類、保湿剤、界面活性剤、酸化防止剤、増粘剤、洗浄剤、賦形剤、乳化剤、可塑剤、防腐剤、防黴剤、ｐＨ調整剤、紫外線吸収剤、アミノ酸、香料等の通常の化粧料に用いられる成分を本発明の効果を損なわない範囲で適当に配合することができる。化粧料の剤型は任意であり、溶液系、可溶化系、乳化系、粉末分散系、水−油二層系、水−油−粉末三層系等のような剤型であり得る。皮膚への安全性の点からｐＨ４〜８程度に調整されることが好ましい。
【００５０】
化粧料としては、皮膚、顔皮、口唇等に適用されるあらゆる化粧料が含まれ、本発明の化粧料の用途は、例えば、化粧水、乳液、クリーム、美容液、パック、ファンデーション、口紅、リップケア、アイシャドー、ボディーローション、ボディークリーム、クレンジングフォーム、洗顔料、ハンドソープ、ボディーソープ等に用いることができる。化粧料における上記有効成分の含量は、化粧料の使用目的、剤型、組成、設定される使用期限、設定される保存状態、共存する成分等によって異なるが、０．００１〜５重量％程度、好ましくは０．０５〜１重量％程度、より好ましくは０．１〜１重量％程度である。
【００５１】
また、ＣＯＸ−２阻害剤は、強いＣＯＸ−２阻害活性を有することから、例えば、入浴剤、芳香剤、アロマテラピー用エッセンシャルオイル、香水、整髪料等の製品に加えて用いることもできる。
【００５２】
ＣＯＸ−２阻害剤は、各製品全体に対し、通常０．０１〜１００重量％程度（好ましくは、０．１〜５重量％程度）含有していればよい。
【００５３】
ＣＯＸ−２阻害剤を含む上記の製品を用いた場合には、その香りによるリラクゼーション効果、リフレッシュ効果が発揮され、またストレスの多い現代社会において心身の癒し効果が発揮される。
【００５４】
また、ＣＯＸ−２阻害剤は、アロマテラピー用エッセンシャルオイルとして用いた場合、他の天然植物精油と混合して用いることもできる。また、該アロマテラピー用エッセンシャルオイルを所定の場所に撒布、拡散して、吸入し得る形態で使用することもできる。該オイルは、拡散器（ディフューザー）等を用いて撒布、拡散してもよい。撒布・拡散場所としては、例えば、家庭の部屋内、ホテルの部屋、会議室、病室の他、人の集まる催し物会場、休憩広場、各種リラクゼーション施設等に撒布することができる。
【００５５】
また、ＣＯＸ−２阻害剤は、例えば、清涼飲料、乳製品（加工乳、ヨーグルト）、菓子類（ゼリー、チョコレート、ビスケット、ガム、錠菓）等の各種飲食品に配合することもできる。
【実施例】
【００５６】
次に、実施例を用いて本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されるものではない。
【００５７】
以下の実施例に使用する原料は、以下のとおりである。
【００５８】
カラハナエノンは、大洋香料株式会社（Taiyo Co., Ltd.）から入手した。（Ｒ）−（−）−ＭＴＰＡ−Ｃｌ及び（Ｓ）−（−）−ＭＴＰＡ−Ｃｌは、東京化成工業株式会社（Tokyo Chemical Industry Co. Ltd. (TCI)）から購入した。バキュロウイルス感染した昆虫細胞中で発現した組換えＣＹＰ２Ａ６は、BD Gentest社から入手した。
【００５９】
また、Salmonella typhimurium OY1002/2A6は、Aryal, P.; Yoshikawa, K.; Terashita, T.; Guengerich, F. P.; Shimada, T.; Oda, Y. Development of a new genotoxicity test system with Salmonella typhimurium OY1001/1A2 expressing human CYP1A2 and NADPH-P450 reductase. Mutation Research 442(2), 113-120(1999)及びAryal, P.; Terashita, T.; Shimada, T.; Oda, Y. Use of genetically engineered Salmonella typhimurium OY1002/1A2 strain coexpressing human cytochrome P450 1A2 and NADPH-cytochrome P450 reductase and bacterial O-acetyltransferase in SOS/umu assay. Environmental and Molecular Mutagenesis 36(2), 121-126(2000)の記載を参考にして、プラスミドpCW’/2A6: hNPR (イソプロピル β-D-チオガラクトピラノシド (IPTG)-誘導的２シストロン性構築物中のCYP2A6のcDNA及びNADPH-P450 レダクターゼを運ぶプラスミド)及びプラスミドpOA101 (umuC”lacz融合遺伝子を運ぶプラスミド) を S. typhimurium TA1535に導入することによって製造した。得られたSalmonella typhimurium OY1002/2A6は、２０１２年１２月２０日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−１４９２で受領された。
【００６０】
上記以外の試薬及び溶剤は、和光純薬工業株式会社(Wako Pure Chemical Co., Ltd.)から購入した。
【００６１】
本実施例で記載されたスペクトルデータ等は、以下に示す測定機器及び測定条件を用いて測定したものである。
【００６２】
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、シリカゲル６０ＧＦ２５４を塗布したＴＬＣプレート(メルク社製、層厚０．２５ｍｍ)を用いて行った。カラムクロマトグラフィーは、７０−２３０メッシュシリカゲル（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ  ６０、メルク社製）を用いて行った。
【００６３】
ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）は、フレームイオン化検出器、キャピラリーカラム（ＨＰ−５、長さ３０ｍ、内径０．２５ｍｍ）、及びスプリット注入２０：１を備えたガスクロマトグラフ（ＨＰ−５８９０Ａ、ヒューレット−パッカード社製）を用いた。キャリヤーガスとしてヘリウムを１．０ｍＬ／分の流量で用いた。オーブン温度は、４℃／分の昇温速度で６５℃〜２６０℃にプログラムされた。インジェクター温度は２７０℃であった。検出器温度は２８０℃であった。ピーク面積は、ＨＰ３３９６  Ｓｅｒｉｅｓ  ２積分器（ヒューレット−パッカード社製）を用いて積分した。
【００６４】
ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）は、スプリット注入器、キャピラリーカラム（ＨＰ−５ＭＳ、長さ３０ｍ、内径０．２５ｍｍ）を備えたガスクロマトグラフ（ＨＰ−５８９０Ａ、ヒューレット−パッカード社製）を、質量分析計（５９７２Ａ、ヒューレット−パッカード社製）に直結した。昇温プログラムはＧＣと同一にした。キャリヤーガスとしてヘリウムを１．０ｍＬ／分の流量で用いた。イオン源部の温度は２８０℃であり、電子エネルギーは７０ｅＶであった。イオン化法は電子衝撃法（ＥＩ）を使用した。
【００６５】
比旋光度は、日本分光株式会社製  Ｊａｓｃｏ  ＬＴＤＤＩＰ−１０００で測定した。円偏光二色性（ＣＤ）は、日本分光株式会社製  Ｊａｓｃｏ  Ｊ−８００ＫＣＭ分光光度計を用いて測定した。核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲ）は、日本電子株式会社製ＪＥＯＬ  ＥＣＡ−８００（８００ＭＨｚ）分光計を用い、ＣＤＣｌ３中で測定し、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）を内部標準物質として使用して測定した。赤外線吸収スペクトル（ＩＲ）は、日本分光株式会社製  Ｊａｓｃｏ  ＦＴ／ＩＲ−４７０  ｐｌｕｓフーリエ変換赤外分光光度計で測定した。
【００６６】
実施例１（カラハナエノンのＣＹＰ２Ａ６による酵素変換）
ＣＹＰ２Ａ６（１０ｐｍｏｌ／ｍｌ）、ＮＡＤＰＨ生成系（０．５ｍＭ  ＮＡＤＰ＋、５ｍＭグルコース６−リン酸、０．５ユニットのグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ／ｍｌ）を含む１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．４）、メタノールに溶かした１００ｍＭカラハナエノン（最終溶剤濃度中に０．２ｖ／ｖ％）を含む標準反応混合物（最終容積０．５ｍｌ）を調製した。得られた混合物を３７℃で３０分間インキュベーションし、ジクロロメタンを１．５ｍｌ添加することにより反応を停止した。混合物を激しく混合し、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより、抽出物（有機層）を採取した。有機層をＧＣ−ＭＳで分析した。２つの代謝物（２ａ及び２ｂ）のピークを確認することができた。
【００６７】
実施例２（カラハナエノンのＣＹＰ２Ａ６を発現する細菌による生物変換）
ネズミチフス菌（S. typhimurium） OY1002/2A6（受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−１４９２）の単一コロニーを、３７℃において、アンピシリン（５０ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢ培地（４０ｍＬ）中で攪拌しながら（１６０ｒｐｍ）一晩生長させ、その培養物を、アンピシリン（５０ｍｇ／Ｌ）、１００ｍＭリン酸カリウムバッファー、１ｍＭ  ＩＰＴＧ、微量元素（２５０μＬ／Ｌ）、グリセリン（４．０ｍＬ／Ｌ）、０．５μＭ  δ−ＡＬＡ、及びカラハナエノンのＤＭＳＯ溶液（最終濃度：１００ｍｇ／Ｌ）を補充した改変ＬＢ培地（２０００ｍＬ）中で５０倍に希釈した。ＬＢ培地中でのインキュベーションは、曝気下、３７℃で攪拌しながら２０時間行った。次いで、培地をＮａＣｌで塩析し、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を蒸発させると粗抽出物が得られた（３１８２ｍｇ）。この抽出物を、酢酸エチル−ヘキサンを用いてＳｉＯ２カラムクロマトグラフィーにより分離することにより、代謝物２ａ（６．９％）及び代謝物２ｂ（４．３％）が単離された。
【００６８】
得られた化合物２ａ及び２ｂの構造決定は、以下のように行った。
化合物２ａ、油状物；
[α]D20 = +66.4°(c 1.0, CHCl3)；
HR-EIMS m/z 168.2335 [M]+ (calcd. for C10H16O2, 168.2338)；
IR(KBr) νmax 3393, 1700, 1652 cm-1；
1H-NMR (800 MHz, CDCl3)δ5.61 (1H, dd, J = 4.8, 7.2), 4.27 (ABX type, X part, 1H, dd ), 3.21 (1H, dd, J = 4.8, 11.2), 2.92 (1H, dd, J = 7.2, 11.2), 2.29 (ABX type, AB part, 2H, m), 1.81 (3H, s), 1.09 (3H, s), 1.09(3H, s)；
13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ214.3(C-1), 138.6 (C-5), 124.2 (C-4), 70.4 (C-6), 49.9 (C-2), 45.8 (C-3), 36.9 (C-7), 25.2 (C-9), 24.3 (C-8), 22.4 (C-10).
【００６９】
化合物２ａの化学構造について、ＨＲ−ＥＩＭＳより分子式Ｃ１０Ｈ１６Ｏ２が示唆された。ＩＲスペクトルより、水酸基（３３９３ｃｍ−１）、カルボニル基（１７００ｃｍ−１）及び二重結合（１６５２ｃｍ−１）の存在が示唆された。Ｃ−６位の水酸基の位置を１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ及びＨＭＢＣスペクトルより解明した（図１）。化合物２ａの絶対配置は、改変Mosher法(Ohtani et al. 1991, Journal of Organic Chemistry, 56(3), 1296-1298)を適用することにより確認した。化合物２ａの（Ｓ）−ＭＴＰＡ  エステル（２ａｓ）と（Ｒ）−ＭＴＰＡエステル（２ａｒ）との間のプロトン化学シフトの差（△δ値，δＳ−δＲ）（図２）は、Ｃ−６の立体配置がＲであることを示した。さらに、絶対構造を、円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルにおける３００ｎｍでの負のコットン（Cotton）効果からオクタント則（octant rule）を適用することにより立証した。以上より、化合物２ａの構造は、（６Ｒ）−ヒドロキシカラハナエノンであると決定した。化合物２ａは、新規化合物である。
【００７０】
なお、化合物２ａの（Ｓ）−ＭＴＰＡ  エステル (２ａｓ) 及び （Ｒ）−ＭＴＰＡエステル(２ａｒ)は、以下の方法で合成した。
化合物２ａ（４．４ｍｇ）を２ｍＬ  ＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、（Ｒ）−（−）−ＭＴＰＡ−Ｃｌ（１０．４ｍｇ）、Ｅｔ２Ｎ（５．３ｍｇ）及びＤＡＭＰ（０．５ｍｇ）とともに、窒素雰囲気下、室温で３０分間攪拌した。反応混合物を真空下で濃縮し、残渣をＣＨ２Ｃｌ２と水との間で分配した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。濾液を真空下で蒸発させ、残渣を酢酸エチル−ヘキサンを用いたＳｉＯ２カラムクロマトグラフィーにより精製すると、（Ｓ）−（−）−ＭＴＰＡエステルが得られた（２ａｓ，９．２ｍｇ）。化合物２（５．８ｍｇ）を（Ｓ）−（−）−ＭＴＰＡ−Ｃｌ（１１．０ｍｇ）、Ｅｔ２Ｎ（５．２ｍｇ）及びＤＡＭＰ（０．５ｍｇ）とともに、窒素雰囲気下、室温で３０分処理し、上記と同様の操作を行うことによって（Ｒ）−（−）−ＭＴＰＡエステルを得た（２ｂｒ，１２．８ｍｇ）。
【００７１】
化合物２ｂ、油状物；
[α]D20 = -6.5°(c 0.5, CHCl3)；
HR-EIMS m/z 168.2335 [M]+ (calcd. for C10H16O2, 168.2336)；
IR(KBr) νmax 3391, 1696 cm-1;
1H-NMR (800 MHz, CDCl3) δ 5.79 (1H, tm, J = 10.6), 3.99 (2H, s), 2.77 (2H, t, J = 11.0), 2.38 (2H, tm, J = 11.0), 2.31 (2H, d, J = 10.6), 1.11 (3H, s), 1.11 (3H, s);
13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 216.7 (C-1), 140.3 (C-5), 123.2 (C-4), 68.1 (C-10), 50.2 (C-2), 37.2 (C-7), 36.6 (C-3), 25.2 (C-8), 25.2 (C-9), 22.4. 
【００７２】
化合物２ｂの化学構造について、ＨＲ−ＥＩＭＳより分子式Ｃ１０Ｈ１６Ｏ２が示唆された。ＩＲスペクトルより、水酸基（３３９１ｃｍ−１）及びカルボニル基（１６９６ｃｍ−１）の存在が示唆された。Ｃ−１０位の水酸基の位置を１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ及びＨＭＢＣスペクトルより解明した（図３）。以上より、化合物２ｂの構造は、１０−ヒドロキシカラハナエノンであると決定した。化合物２ｂは、新規化合物である。
【００７３】
試験例１（ＣＯＸ−２活性阻害試験）
ＣＯＸ−２の阻害は、ＣＯＸ（羊由来）スクリーニングアッセイキット（Cayman Chemical, USA）を使用して比色分析で評価した。詳細には、ＣＯＸ−２（１０μｌ）、ヘム（１０μｌ）、阻害剤（１０μｌ）、及び０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（１５０μｌ）を含む混合液を２５℃で５分間インキュベートした。次いで、比色基質（ＴＭＰＤ）溶液（２０μｌ）及びアラキドン酸（２０μｌ）を混合液に添加した。この混合液を２５℃で５分間インキュベートした。５９０ｎｍの吸光度をマイクロプレートプレートリーダー（ＭＴＰ−８００Ｌａｂ，コロナ電機株式会社製）で測定した。試験サンプルの代わりに１０μｌエタノールを含むものをコントロールサンプルとした。酵素阻害率を次の式によって求めた。
ＣＯＸ−２活性（％）＝（１−Ｂ／Ａ）×１００
ここで、Ａは試験サンプルなしのコントロールの吸光度であり、Ｂは試験サンプルが存在するときの吸光度である。すべてのアッセイを２回行った。
【００７４】
カラハナエノン、カラハラエノン誘導体（２ａ、２ｂ）及びアスピリンについて試験した結果を表１に示す。なお、アスピリンは、ポジティブコントロールとして使用した。
【表１】
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【００７５】
上記の結果より、カラハナエノン及びその誘導体は、強いＣＯＸ−２阻害作用を示すことがわかった。特に、１０−ヒドロキシカラハナエノン（２ｂ）は、ポジティブコントロールであるアスピリンと同じくらい強いＣＯＸ−２阻害活性を有していることから、優れた抗炎症剤となり得ることがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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