(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’及び３’末端を２個のセグメントＦ１及びＦ２により規定されるヌクレオチド配列Ｓについて、前記ヌクレオチド配列Ｓの少なくとも１個の内部セグメントＤの一致度を保存しながらランダムに突然変異させることが可能なＰＣＲ法であって、
ｉ）ランダムに突然変異を導入しながら配列Ｓを増幅するように、セグメントＦ１及びＦ２のそれぞれセンス及びアンチセンスプライマーである少なくとも２個のプライマーを使用して配列Ｓの全長にエラープローンＰＣＲを実施する段階；
ｉｉ）ランダムに突然変異させたＳのコピーに対応する得られた増幅産物を精製する段階；
ｉｉｉ）少なくとも
−突然変異させたＳのコピーのＦ１−Ｄ領域を増幅するために、Ｆ１に対応するセンスプライマー及びセグメントＤの全長とハイブリダイズするアンチセンスプライマー、
−突然変異させたＳのコピーのＤ−Ｆ２領域を増幅するために、セグメントＤの全長とハイブリダイズするセンスプライマー及びＦ２のアンチセンスプライマー
をそれぞれセンスプライマーとアンチセンスプライマーの対として使用することにより、段階ｉｉ）で精製した増幅産物から出発して高忠実度ＰＣＲを実施する段階、
ｉｖ）セグメントＤがその一致度を保存している、段階ｉ）で突然変異させた配列ＳのセグメントＦ１−Ｄ及びＤ−Ｆ２のコピーから構成される、段階ｉｉｉ）で得られた増幅産物を精製する段階；
ｖ）それぞれＦ１とＦ２に対応するセンスプライマーとアンチセンスプライマーを使用して、段階ｉｖ）で精製した増幅産物から出発して高忠実度ＰＣＲを実施する段階、
ｖｉ）セグメントＤがその一致度を保存している、段階ｉ）で突然変異させたヌクレオチド配列Ｓに対応する、得られたＰＣＲ産物を精製する段階
を含む前記方法。
【請求項２】
５’及び３’末端を２個のセグメントＦ１及びＦ２により規定されるヌクレオチド配列Ｓについて、前記ヌクレオチド配列Ｓの少なくともＮ個の内部セグメントＤ１からＤＮの一致度を保存しながらＰＣＲにより多様化する方法であって、
ｉ）ランダムに突然変異を導入しながら配列Ｓを増幅するように、セグメントＦ１及びＦ２のそれぞれセンス及びアンチセンスプライマーである少なくとも２個のプライマーを使用して配列Ｓの全長にエラープローンＰＣＲを実施する段階；
ｉｉ）ランダムに突然変異させたＳのコピーに対応する得られた増幅産物を精製する段階；
ｉｉｉ）少なくとも
−突然変異させたＳのコピーの少なくともＦ１−ＤＮ領域を増幅するために、Ｆ１に対応するセンスプライマー及びＤＮ全長とハイブリダイズするアンチセンスプライマー、
−突然変異させたＳのコピーの少なくともＤＮ−Ｆ２配列を増幅するために、セグメントＤＮの全長とハイブリダイズするセンスプライマー及びＦ２のアンチセンスプライマー
をそれぞれセンスプライマーとアンチセンスプライマーの対として使用することにより、段階ｉｉ）で精製した増幅産物から出発して高忠実度ＰＣＲを実施する段階；
ｉｖ）セグメントＤの配列がその一致度を保存している、段階ｉ）で突然変異させた配列ＳのセグメントＦ１−ＤＮ及びＤＮ−Ｆ２のコピーから構成される、段階ｉｉｉ）で得られた増幅産物を精製する段階；
ｖ）Ｆ１及びＦ２の少なくとも１対のセンスプライマーとアンチセンスプライマーを使用して、段階ｉｖ）で得られた増幅産物から出発して高忠実度ＰＣＲを実施する段階；
ｖｉ）少なくともセグメントＤＮの配列がその一致度を保存している、前記インサートのランダムに突然変異させたヌクレオチド配列に対応する、段階ｖ）で得られたＰＣＲ産物を精製する段階
を含む前記方法。
【請求項３】
５’及び３’末端を２個のセグメントＦ１及びＦ２により規定されるヌクレオチド配列Ｓについて、前記ヌクレオチド配列Ｓの少なくともＮ個の内部セグメントＤ１からＤＮを保存しながらＰＣＲにより多様化する方法であって、
ｉ）ランダムに突然変異を導入しながら配列Ｓを増幅するようにセグメントＦ１及びＦ２のそれぞれセンス及びアンチセンスプライマーである少なくとも２個のプライマーを使用して配列Ｓの全長にエラープローンＰＣＲを実施する段階；
ｉｉ）得られた増幅産物を精製する段階；
ｉｉｉ）少なくとも
−セグメントＤＮがその一致度を保存している突然変異させたＳのコピーのＦ１−ＤＮ領域を増幅するために、Ｆ１に対応するセンスプライマー及びＤＮの全長とハイブリダイズするアンチセンスプライマー；
−セグメントＤＮ−１がその一致度を保存している突然変異させたＳのコピーのＤＮ−１−Ｆ２領域を増幅するために、Ｆ２のアンチセンスプライマー及びセグメントＤＮ−１の全長とハイブリダイズするセンスプライマー
をセンスプライマーとアンチセンスプライマーの対として使用することにより、段階ｉｉ）で精製した増幅産物から出発して高忠実度ＰＣＲを実施する段階；
ｉｖ）少なくとも１対のＦ１及びＦ２のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを使用して、段階ｉｉｉ）で得られた増幅産物から出発して高忠実度ＰＣＲを実施する段階；
ｖ）少なくともセグメントＤＮ及びＤＮ−１の配列がその一致度を保存している、ランダムに突然変異させたヌクレオチド配列Ｓに対応する、段階ｉｖ）で得られたＰＣＲ産物を精製する段階
を含む前記方法。
【請求項４】
配列Ｓが該当蛋白質をコードする遺伝子配列であることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
該当蛋白質がＴ型バクテリオファージの蛋白質ＧＰ１２等のバクテリオファージの標的蛋白質であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
該当蛋白質が受容体に対する特異性を改変することが所望されるリガンド蛋白質であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
該当蛋白質が可変領域又は超可変領域を改変することが所望される免疫グロブリンであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヌクレオチド配列Ｓの所定のドメイン又はセグメントの一致度を維持しながら前記配列をＰＣＲによりランダムに多様化するための非常に一般的な方法、こうして多様化されたヌクレオチド配列のバンク、より詳細には、改変型バクテリオファージの標的蛋白質をコードする配列のバンクに関する。
【背景技術】
【０００２】
バクテリオファージは細菌に特異的に感染し、細菌内で複製することが可能なウイルスである。その存在は２０世紀初頭に英国人フレデリック・トウォートとケベック人フェリックス・デレルにより発見された。
【０００３】
バクテリオファージは細菌が存在する全生態学的地位を占める。バクテリオファージはその宿主の内側で休止状態を保つことができる溶原性ファージと、活発に複製し、細菌細胞を溶菌する溶菌性ファージの２種類に大別される。溶菌性の場合には、感染性の多数のバクテリオファージが環境に放出される。
【０００４】
急速に突然変異する可能性のある宿主に対してその感染性を維持するために、バクテリオファージは常に進化し続けている。従って、天然ではそれらが寄生する細菌種に対して特異度が高く、非常に多様化している。
【０００５】
その発見以来、バクテリオファージは抗生物質時代よりもずっと以前から細菌感染に対する防除手段とみなされていた。
【０００６】
そこで、病原性細菌に感染した患者を治療するためにこの細菌に特異的なバクテリオファージを自然界で同定するアプローチがロシアと旧ソビエト連邦諸国で２０世紀前半に開発された。
【０００７】
しかし、２０世紀の後半には、バクテリオファージにより提供される可能性を最大限に活用しないまま、一般にスペクトルの著しく広い抗生物質の大量利用が一般化した。
【０００８】
今日では、抗生物質多耐性細菌株の出現と、科学団体が新規抗生物質を開発する際に直面する問題により、特に院内汚染の場合に根絶しにくい細菌感染を治療するためにバクテリオファージが再び注目されている［Ｔｈｉｅｌ，Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４，２２：３１−３６］。
【０００９】
しかし、特に細菌はその外壁の構成成分を遮蔽又は改変することによりバクテリオファージを避けることができるため、バクテリオファージの使用にはいくつかの問題が残っている。
【００１０】
バクテリオファージの複製サイクルには、バクテリオファージが宿主細菌を認識してその壁に接着する段階が実際に必要であり、バクテリオファージが細菌に感染できるか否か、即ちそのキャプシドに含まれる遺伝材料を細菌の細胞質の内側に注入できるか否かはこの段階により決定される。
【００１１】
例えば、バクテリオファージＴ４は大腸菌型の細菌に感染するバクテリオファージであり、その複製サイクルは３７℃で約３０分間である。この複製サイクルはバクテリオファージが細菌を認識した直後に吸収透過段階から開始する。その結果、宿主細菌の遺伝子発現がすぐに停止し、感染から５分後にファージの複製に必要な酵素が合成された後、ＤＮＡが複製され（１０分後に開始）、ウイルスが形成される（１２分後に開始）。複製サイクルの結果、細菌は破壊され（３０分後）、溶菌された細菌１個当たり約５０個のバクテリオファージが環境に放出される。
【００１２】
細菌への接着は主にバクテリオファージに結合する役割をもつ基盤の蛋白質により確保され、認識は特に「尾部繊維」と呼ばれる周辺繊維を形成する蛋白質により確保される。但し、尾部繊維と基盤の蛋白質はバクテリオファージの認識と細菌壁接着に同時に関与する場合もある。これらの所謂「標的」蛋白質全体を本願の図１及び３に示す。
【００１３】
ファージＴ４でこの認識又は接着に関与する蛋白質としては、特に基盤の糖蛋白質ＧＰ１２と、尾部繊維の糖蛋白質ＧＰ３６、ＧＰ３７及びＧＰ３８を挙げることができる。
【００１４】
バクテリオファージの認識システムに対して耐性の細菌の出現を制限するために、同一細菌を標的とすることが可能な異なる型のバクテリオファージを同時に使用することが一般に提案されている。
【００１５】
これらのバクテリオファージを自然界から採取又はコレクションから入手し、「バクテリオファージカクテル」なるものを形成する。
【００１６】
しかし、これらのバクテリオファージカクテルを開発するためには、天然環境で採取されるバクテリオファージが多くの場合にそうであるように、カクテルを構成するバクテリオファージが溶菌性で非溶原性又は部分的に非溶原性となるようにこれらのバクテリオファージを個々に厳密に選択する必要がある。
【００１７】
その実効力を確認するにはバクテリオファージを個々に試験する必要があり、更に該当細菌毎に異なるカクテルを準備する必要があるため、バクテリオファージカクテルの開発には時間と労力がかかる。
【００１８】
国際公開第０１／５１０６６号パンフレットはリステリア症の原因となる細菌リステリア・モノサイトゲネスＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを死滅させるために生鮮食品の防腐剤として使用される６種類の異なるバクテリオファージを含むこのようなバクテリオファージ製剤について記載している。この天然製剤は食肉又は乳製品に噴霧するように噴霧器にパッケージングされている。これらのバクテリオファージはリステリア属の細菌にしか感染せず、多細胞生物の細菌には感染することができないので、この製剤はヒト、動物又は植物に無害である。
【００１９】
天然バクテリオファージの選択に伴う問題を解決するために、国際公開第０６／０６６２２４号パンフレットには所定のビルレンス因子を特異的に標的とするように標的蛋白質を改変したバクテリオファージを取得するための方法が提案されている。ビルレンス因子とは細菌が感染を生じるために必要であると記載されている分子である。これらの分子は例えばリポ多糖等の外部構造の成分よりも感染中に変異を受けにくい安定な成分であるとみなされている。より詳細には、この方法は文献に記載されているビルレンス因子（例えば大腸菌のＯｍｐＣ）を認識することが可能な天然バクテリオファージに由来する蛋白質（例えばファージＴ４のＧＰ３７）を選択し、この蛋白質をコードする遺伝子をバクテリオファージλに導入し、この蛋白質を改変するためにバクテリオファージλを利用することを提案している。蛋白質の改変はビルレンス因子の認識に関与する各種ドメイン（例えばＧＰ３７のＨｉｓドメイン）間の交換により実施される。その後、標的ビルレンス因子と接着する能力についてファージλを試験する。この方法はファージディスプレイ法に類似しており、ビルレンス因子を標的とすることが可能なバクテリオファージλの各種変異体を単離し、こうして各種標的蛋白質を得ることができる。これらの各種標的蛋白質に対応する遺伝子をその後、感染性バクテリオファージに導入することができる。こうしてこれらのバクテリオファージは当初の標的ビルレンス因子をもつ細菌に対して活性のファージカクテルを構成することができる。
【００２０】
この方法により、バクテリオファージカクテルを開発するために多様化バクテリオファージを取得する技術は前進した。しかし、依然としてこのようなカクテルは当初の標的ビルレンス因子を発現する細菌種のみを標的とする。
【００２１】
従って、この方法はビルレンス因子の同定が予め可能であった培養可能な病原性細菌にしか利用することができない。
【００２２】
バクテリオファージの利用をより汎用性にするためには、例えば感染スペクトルを改変又は拡大したバクテリオファージを創製することにより、より多数の種に対して感染性のバクテリオファージを得ることが有用であろう。このようなバクテリオファージは新規細菌種、特に新興又は院内感染由来の病原性細菌に対して利用できよう。
【００２３】
しかし、その感染スペクトルを改変したファージの作製には、バクテリオファージの取得がバクテリオファージを形質転換後に複製する細菌宿主に依存するという技術的制約がある。ファージの遺伝子改変段階は一般に単一細菌宿主内で数個の複製段階を含む。
【００２４】
上記従来技術の文献に記載されている実験では、ビルレンス因子を標的とするように機能するバクテリオファージを改変するために多数の複製サイクルが必要である。バクテリオファージのゲノムを形質転換するために最も多用される技術である相同組換えは細菌内で多数の連続複製及び選択サイクルが必要である。一方、改変されたバクテリオファージはその通常の宿主と異なる宿主に感染する能力を獲得するのに成功したとしても、その複製に使用した宿主に感染する能力を失う場合もある。従って、このようなバクテリオファージは選択から除外され、実験者から見逃される。その結果、獲得可能な改変型ファージの多用性が著しく低下する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２５】
【特許文献１】国際公開第０１／５１０６６号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０６／０６６２２４号パンフレット
【非特許文献】
【００２６】
【非特許文献１】Ｔｈｉｅｌ，Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４，２２：３１−３６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
上記問題を解決するために、本発明はランダムに作製されたＤＮＡ配列をその遺伝子に挿入することにより、ヌクレオチド配列、特にバクテリオファージの標的蛋白質をコードするヌクレオチド配列をランダムに多様化することからなる新規方法を提案する。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
この方法は特に発現ベクター又は相同組換えベクターへのクローニングの目的でランダムに突然変異させたセグメントを含む遺伝子のコピーを作製するために特に有用である。
【００２９】
本発明によるこの方法はバクテリオファージの標的蛋白質を多様化し、多様な宿主特異性の組換えバクテリオファージを相同組換えにより得るために当初は開発された。
【００３０】
しかし、この方法は全ＤＮＡ又はＲＮＡ配列に適用できるので、バクテリオファージの分野のみに限定されない。
【発明の効果】
【００３１】
特に医療分野では、蛋白質の機能に一般に不可欠である定常領域の一致度を維持しながら、可変領域の遺伝子配列をランダムに改変することが所望されるため、利用範囲が広い。
【００３２】
以下、本発明の方法と、特にバクテリオファージの分野における具体的なその適用について詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】バクテリオファージの各種構成成分を示すバクテリオファージＴ４の図である。本発明の範囲内にあると考える蛋白質を四角内に示す。
【図２】バクテリオファージＴ４の完全ゲノムの図である。本願に記載する遺伝子をオープンリーディングフレームに垂直な矢印により示す。
【図３】バクテリオファージの認識と宿主細菌接着に関与するバクテリオファージの基盤と尾部繊維の三次元図であり、本発明の方法により改変された標的蛋白質を視覚的に示す。
【図４】本発明による組換えバクテリオファージバンクの取得原理を要約するスキームである。左上の枠内はバクテリオファージの標的蛋白質をコードする３個の遺伝子にランダムに配列を作製したオリゴヌクレオチドを導入するための３個の相同組換えベクターを含む宿主細菌を示す。これらのベクターは遺伝的多様性の高い本発明の意味でのＤＮＡ構築物に相当する。バクテリオファージ感染と相同組換え後に、標的蛋白質を改変した多数のバクテリオファージ（バクテリオファージバンク）が得られ、「標的多様性ソース」を形成する。得られたバクテリオファージを潜在的新規宿主に対してスクリーニングし（ポジティブ選択）、これらの宿主に感染することが可能なバクテリオファージを選択する。ヒト又は動物に無害となるように、非細菌宿主（真核細胞）についても試験することができる。
【図５】バクテリオファージＴ４のＧＰ１２（上段）と、バクテリオファージＲＢ６９に存在するそのホモログ（下段）のポリペプチド配列のＢＬＡＳＴプロトコールによる比較。２個の蛋白質に共通のアミノ酸を中段に示す。記号「＋」はアミノ酸が類似していることを意味する。四角で囲んだＮ末端部分はバクテリオファージを細菌壁に結合することが可能なこれらの２個の蛋白質のドメインに対応する。このアンカードメインを本発明に従ってランダムに突然変異させた後に相同組換えによりファージのゲノムに挿入する。内部セグメントＤ１からＤ４は本発明に従ってＰＣＲにより実施されるランダム多様化プロセス中に保存される蛋白質の配列に対応する。
【図６】特に、ランダムに作製されたオリゴヌクレオチドを挿入するｇｐ１２のアンカードメイン１コピーを得るために本発明に従って実施されるＰＣＲ方法の各段階を要約する図である。配列一致度を保存しようとする内部セグメントＤ１からＤ４を長方形内に示す。これらのドメインは上記図５で記載したドメインに対応する。２個の外部セグメントはｇｐ１２のアンカードメインの配列を規定する。Ａ：ｇｐ１２のアンカードメインを高忠実度ＰＣＲにより増幅する。Ｂ：上記オリゴヌクレオチドを使用して独立して４回のエラープローンＰＣＲを実施する。Ｃ：Ｂで得られた増幅産物を精製し、同一の高忠実度ＰＣＲ反応で結合する。前記増幅産物はオーバーラップしているので、ドメインＤ１からＤ４が使用されるプライマーとハイブリダイズできるように十分に保存されている限り、各種フラグメントを結合することが可能である。Ｄ：段階Ｃで実施したＰＣＲの結果、ＰＡ−１とＰＢ−１の２個のフラグメントが得られ、ＧＰ１２のアンカードメインの外部セグメントに対応するプライマーを使用することにより結合する。最終的に、一致度が保存されたドメインＤ１からＤ４のレベル以外は配列がランダムに改変されたｇｐ１２のアンカードメイン１コピーが得られる。実施例で使用したプライマーを本図に記載する各段階に利用した。
【図７Ａ】本発明の方法により得られたＰＣＲ産物（ｇｐ１２−Ｍｕｔ）で直接得られたシーケンシングプロファイルを示す。プロファイルは自動シーケンサーから得られたデータに基づいて無料ＡｐＥ分析ソフトウェアを使用することにより作成した。ヌクレオチド１０８９から１１１０（配列番号１）に位置するｇｐ１２の部分のシーケンシング。保存された左側部分はドメインＤ１の３’部分（ヌクレオチド１０８９から１０９９）に対応する。右側部分はＤ１のすぐ下流に位置する領域（ヌクレオチド１１００から１１１０）内でＰＣＲプロセスにより生じたランダム突然変異を考慮したピーク重畳を示す。
【図７Ｂ】本発明の方法により得られたＰＣＲ産物（ｇｐ１２−Ｍｕｔ）で直接得られたシーケンシングプロファイルを示す。プロファイルは自動シーケンサーから得られたデータに基づいて無料ＡｐＥ分析ソフトウェアを使用することにより作成した。配列番号１のヌクレオチド１１９５から１２１２に位置するｇｐ１２の非突然変異領域で実施したシーケンシング（上段）と、本方法に従って得られたＰＣＲ産物の同一領域について実施したシーケンシング（下段）の比較。シーケンシングした領域は保存ドメインＤ１からＤ２に位置する。ｇｐ１２の初期配列へのランダムなヌクレオチド挿入を考慮した重畳ピークの存在（下段）が認められる。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
従って、より詳細には本発明はその５’及び３’末端を２個のセグメントＦ１及びＦ２により規定されるヌクレオチド配列Ｓの少なくとも１個の内部セグメントＤの一致度を保存しながら、前記ヌクレオチド配列をランダムに突然変異させることが可能なＰＣＲ法として、
ｉ）セグメントＦ１及びＦ２に対応するプライマーを使用して配列Ｓの全長にエラープローンＰＣＲを実施し、配列Ｓをその全長にわたってランダムに突然変異させる段階と；
ｉｉ）得られた増幅産物を溶出させる段階と；
ｉｉｉ）段階ｉ）で突然変異させたＳのうちで内部セグメントＤがその一致度を保存しているＦ１−Ｄ及びＤ−Ｆ２領域を増幅するように、少なくともＦ１とＤ及びＦ２とＤにそれぞれ対応するプライマー対を使用することにより、段階ｉｉ）で溶出させた増幅産物から出発して高忠実度ＰＣＲを実施する段階と；
ｉｖ）Ｆ１及びＦ２に対応するプライマーを使用することにより、段階ｉｉｉ）で得られた増幅産物から出発して高忠実度ＰＣＲを実施する段階と；
ｖ）ヌクレオチド配列Ｓに対応する寸法をもつ得られたＰＣＲ産物を精製する段階を含む方法に関する。
【００３５】
本発明のプライマーは配列Ｓの全部又は一部を形成するＤＮＡ鎖の１本の一部又は全部とハイブリダイズすることが可能な１本鎖核酸である。そのヌクレオチド鎖がＳのコーディング鎖の一部を数ヌクレオチド以内の誤差で再現するときにプライマーは「センス」であると言う。そのヌクレオチド鎖がＳの非コーディング鎖の一部を数ヌクレオチド以内の誤差で再現するときにプライマーは「アンチセンス」であると言う。
【００３６】
プライマーが配列Ｓの所定セグメント「に対応する」と言うときには、プライマーが２本鎖ＤＮＡ分子状のＳの一部に対してセンスでもアンチセンスでもよいという意味である。
【００３７】
本発明のＰＣＲ法は特に以下及び本願の実施例に記載するようにセンス及びアンチセンスＰＣＲプライマーを使用する。従って、本発明によると、
ｉ）セグメントＦ１及びＦ２のそれぞれセンス及びアンチセンスプライマーである少なくとも２個のプライマーを使用して配列Ｓの全長にエラープローンＰＣＲを実施し、ランダムに突然変異を導入しながら配列Ｓを増幅し；
ｉｉ）ランダムに突然変異させたＳのコピーに対応する得られた増幅産物を精製し；
ｉｉｉ）少なくとも
−突然変異させたＳのコピーのＦ１−Ｄ領域を増幅するために、Ｆ１に対応するセンスプライマーと、セグメントＤのアンチセンスプライマーと、
−突然変異させたＳのコピーのＤ−Ｆ２領域を増幅するために、セグメントＤに対応するセンスプライマーと、Ｆ２のアンチセンスプライマー
をそれぞれセンスプライマーとアンチセンスプライマーの対として使用することにより、段階ｉｉ）で精製した増幅産物から出発して高忠実度ＰＣＲを実施し、
ｉｖ）段階ｉ）で突然変異させた配列ＳのうちでセグメントＤがその一致度を保存しているセグメントＦ１−Ｄ及びＤ−Ｆ２のコピーから構成される段階ｉｉｉ）で得られた増幅産物を精製し；
ｖ）それぞれＦ１とＦ２に対応するセンスプライマーとアンチセンスプライマーを使用することにより、段階ｉｖ）で精製した増幅産物から出発して高忠実度ＰＣＲを実施し、
ｖｉ）段階ｉ）で突然変異させたヌクレオチド配列ＳのうちでセグメントＤがその一致度を保存しているものに対応する得られたＰＣＲ産物を精製する。
【００３８】
この方法は（蛋白質ＧＰ１２の場合のように）ヌクレオチド配列Ｓの数個の内部ドメインＤＮ（ここで、Ｎは１以上の整数とみなす）の一致度を保存しようとする場合に特に有利である。
【００３９】
従って、上記方法は、
ｉ）セグメントＦ１及びＦ２のそれぞれセンス及びアンチセンスプライマーである少なくとも２個のプライマーを使用して配列Ｓの全長にエラープローンＰＣＲを実施し、ランダムに突然変異を導入しながら配列Ｓを増幅する段階と；
ｉｉ）ランダムに突然変異させたＳのコピーに対応する得られた増幅産物を精製する段階と；
ｉｉｉ）少なくとも
−突然変異させたＳのコピーの少なくともＦ１−ＤＮ領域を増幅するために、Ｆ１に対応するセンスプライマーと、ＤＮのアンチセンスプライマーと、
−突然変異させたＳのコピーの少なくともＤＮ−Ｆ２配列を増幅するために、ＤＮに対応するセンスプライマーと、Ｆ２のアンチセンスプライマー
をそれぞれセンスプライマーとアンチセンスプライマーの対として使用することにより、段階ｉｉ）で精製した増幅産物から出発して高忠実度ＰＣＲを実施する段階と；
ｉｖ）段階ｉ）で突然変異させた配列ＳのうちでセグメントＤの配列がその一致度を保存しているセグメントＦ１−ＤＮ及びＤＮ−Ｆ２のコピーから構成される段階ｉｉｉ）で得られた増幅産物を精製する段階と；
ｖ）Ｆ１及びＦ２の少なくとも１対のセンスプライマーとアンチセンスプライマーを使用することにより、段階ｉｖ）で得られた増幅産物から出発して高忠実度ＰＣＲを実施する段階と；
ｖｉ）前記インサートのランダムに突然変異させたヌクレオチド配列のうちで少なくともセグメントＤＮの配列がその一致度を保存しているものに対応する段階ｖ）で得られたＰＣＲ産物を精製する段階を含む。
【００４０】
同一方法は、後続ドメインＤＮ及びＤＮ＋１を考慮することにより、以下のように表すこともできる。
ｉ）セグメントＦ１及びＦ２に対応するプライマーを使用して配列Ｓの全長にエラープローンＰＣＲを実施し、配列Ｓをその全長にわたってランダムに突然変異させ；
ｉｉ）得られた増幅産物を溶出させ；
ｉｉｉ）段階ｉ）で突然変異させたＳのうちで内部セグメントＤＮ＋１及びＤＮがその一致度を保存している少なくともＦ１−ＤＮ＋１及びＤＮ−Ｆ２領域を増幅するように、少なくともＦ１とＤＮ＋１及びＦ２とＤＮにそれぞれ対応するプライマー対を使用することにより、段階ｉｉ）で溶出させた増幅産物から出発して高忠実度ＰＣＲを実施し；
ｉｖ）Ｆ１及びＦ２に対応するプライマーを使用することにより、段階ｉｉｉ）で得られた増幅産物から出発して高忠実度ＰＣＲを実施する。
【００４１】
ドメインをＤＮ−１及びＤＮと表すこともできる。
ｉ）セグメントＦ１及びＦ２のそれぞれセンス及びアンチセンスプライマーである少なくとも２個のプライマーを使用して配列Ｓの全長にエラープローンＰＣＲを実施し、ランダムに突然変異を導入しながら配列Ｓを増幅し；
ｉｉ）得られた増幅産物を精製し；
ｉｉｉ）少なくとも
−突然変異させたＳのコピーのうちでセグメントＤＮがその一致度を保存しているＦ１−ＤＮ領域を増幅するために、Ｆ１に対応するセンスプライマーと、ＤＮのアンチセンスプライマーと；
−突然変異させたＳのコピーのうちでセグメントＤＮ−１がその一致度を保存しているＤＮ−１−Ｆ２領域を増幅するために、Ｆ２のアンチセンスプライマーと、ＤＮ−１に対応するセンスプライマー
をセンスプライマーとアンチセンスプライマーの対として使用することにより、段階ｉｉ）で精製した増幅産物から出発して高忠実度ＰＣＲを実施し；
ｉｖ）Ｆ１及びＦ２の少なくとも１対のセンスプライマーとアンチセンスプライマーを使用することにより、段階ｉｉｉ）で得られた増幅産物から出発して高忠実度ＰＣＲを実施し；
ｖ）ランダムに突然変異させたヌクレオチド配列Ｓのうちで少なくともセグメントＤＮ及びＤＮ−１の配列がその一致度を保存しているものに対応する段階ｉｖ）で得られたＰＣＲ産物を精製する。
【００４２】
本発明の好ましい１態様によると、前記方法はバクテリオファージの標的蛋白質をコードする配列の所定の可変領域にランダムに作製されたオリゴヌクレオチドを導入するために有用である。バクテリオファージの標的蛋白質とは、バクテリオファージの認識と宿主細菌接着に関与する蛋白質として定義される。これらの蛋白質はファージＴ４の尾部繊維又は基盤を構成するものから選択することが好ましい。本発明の方法に特に適切な蛋白質は基盤の蛋白質ＧＰ１２であり、そのヌクレオチド配列は配列番号１に対応する。他の好ましい標的蛋白質は尾部繊維の遠位部分を構成するＧＰ３６、ＧＰ３７又はＧＰ３８である。当然のことながら、他のバクテリオファージに寄生する上記蛋白質の相同蛋白質も好ましい。
【００４３】
「相同配列」とは、異なる種の２つの生物に存在する一致度が少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％である配列を意味する。
【００４４】
本願では、本発明により特に好ましいバクテリオファージＴ４の蛋白質ＧＰ１２の改変を例にとって説明する。蛋白質ＧＰ１２はＤ１からＤ４と呼ぶ所定のセグメントの完全性を維持しながら変異を導入することが望ましいアンカードメインをもち（図５）、前記セグメントはＴ型バクテリオファージの相同蛋白質で保存されたドメインに対応する。
【００４５】
好ましくは、接着又は認識機能に関与する蛋白質のドメインに対応する蛋白質の遺伝子のセグメント、より好ましくは可変領域に対応するセグメントを改変する。
【００４６】
「可変領域」とは、２個の相同配列を比較した場合に保存度の低い配列のセグメントを意味する。
【００４７】
逆に、保存度の高いドメインの一致度は保存することが好ましく、このようなドメインは場合によりこれらの配列によりコードされる蛋白質の機能に一般に不可欠である。
【００４８】
本発明により使用されるＰＣＲプロトコールは当業者に周知の標準プロトコールである。これらのプロトコールの実施方法も本発明の特徴である。
【００４９】
「エラープローンＰＣＲ」とは、ＤＮＡ配列の忠実な複製を実現できない条件下で実施されるポリメラーゼ連鎖反応を意味する。この型の反応は文献に記載されているように、低ストリンジェンシー条件下でマンガン塩の存在下にＴａｑ型の旧来のポリメラーゼを利用することにより実施することができる［Ｃａｄｗｅｌｌ，Ｒ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．１９９２，Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｂｙ  ＰＣＲ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．，２：２８−３３］。
【００５０】
他方、高忠実度ＰＣＲは非常に低い複製エラー率でＤＮＡ鋳型を増幅することが可能なポリメラーゼ連鎖反応である。この型の反応は文献に記載されているように、例えばストリンジェント条件下でＰｆｕ型ポリメラーゼを利用することにより実施することができる［Ｉｎｍｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｄｓ．，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９８９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ］。
【００５１】
保存セグメント間に位置する配列Ｓのサブ領域を増幅する段階ｉｉｉ）で述べた高忠実度ＰＣＲ反応は別々に実施することが好ましい。
【００５２】
本願の実施例において、文字Ｆは「センス」（ないし「フォワード」）プライマーを表し、文字Ｒはアンチセンス（ないし「リバース」）プライマーを表す。
【００５３】
本方法は所定のセグメントを選択的にランダムに変異させることが所望される任意ヌクレオチド配列に適用することができる。
【００５４】
本発明の方法は多数の治療分野で適用することができる。
【００５５】
前記方法の実施は、その遺伝子配列の特定ドメインをランダムに改変することにより蛋白質の活性又はリガンドとの相互作用のスペクトルを改変しようとする場合に実際に特に有用である。
【００５６】
従って、本発明は例えば、配列Ｓが該当蛋白質をコードする遺伝子配列であると想定する。
【００５７】
本発明の好ましい１態様によると、該当蛋白質はＴ型バクテリオファージの蛋白質ＧＰ１２等のバクテリオファージの標的蛋白質である。
【００５８】
しかし、活性部位又は相互作用ドメインを変異させることが所望される任意の該当治療又は診断用蛋白質でもよく、例えば受容体に対する特異性を改変することが所望されるリガンド蛋白質や、抗体の検出を目的として可変領域又は超可変領域を改変することが所望される免疫グロブリンが挙げられる。
【００５９】
本願は本発明による遺伝子配列の改変から予想される多数の用途の観点から限定されない。
【００６０】
配列ＳがＲＮＡとして存在する場合には、本発明の方法に先立ち、通常のプロトコールに従ってポリヌクレオチドとしての前記配列のコピーを取得する逆転写段階を実施することができる。
【００６１】
本発明の特定方法により得られる増幅産物は内部ドメインＤＮの一致度が保存されたランダムな多様化ヌクレオチド配列Ｓのバンクを構成する。
【００６２】
従って、本発明は本発明により得られたＰＣＲ産物にも関し、前記産物は配列Ｓのランダム突然変異から得られるポリヌクレオチド変異体から構成され、前記配列Ｓの１個以上の内部ドメインＤが保存されていることを特徴とする。
【００６３】
換言するならば、本発明によると、ＰＣＲによりランダムに突然変異させたヌクレオチド配列Ｓの変異体から構成されるポリヌクレオチドバンクを得ることができ、前記変異体が無傷ないしその一致度が保存された前記配列Ｓの１個以上の内部セグメントＤを含むことを特徴とする。
【００６４】
一般に、内部ドメインＤＮは本発明の方法によると、使用するＰＣＲ条件、特に本発明の方法の段階ｉｉｉ）及びｖ）で実施する高忠実度ＰＣＲの条件に応じて野生型蛋白質中の元の配列に対して＞５０％、好ましくは＞７０％、より好ましくは＞９０％、更には＞９９％の一致度を保存している。
【００６５】
本発明のヌクレオチド配列バンクを構成するポリヌクレオチド変異体は発現ベクターに直接クローニングすることもできるが、当業者に容易に入手可能な相同組換えベクターにクローニングすることがより好ましく、本発明の構築物全体を形成することができる。
【００６６】
本発明の方法によると、特に遺伝子を部分的にランダム突然変異させるという問題を解決することができる。実際に、従来技術ではオリゴヌクレオチドをランダムに作製した後に一致度を保存しようとする遺伝子の配列の部分にクローニングすることによりこれらのオリゴヌクレオチドを結合することが必要であった。しかし、数個のオリゴヌクレオチドを遺伝子の異なる場所に挿入する必要がある場合に、この作業は非常に面倒であり、得られる配列の多様性に関する結果は期待外れである。
【００６７】
これに対して、本発明のＤＮＡ構築物は全体的に見ると、より詳細には改変蛋白質をコードする非常に多数の異なるヌクレオチド配列をゲノムに組込むことができる。
【００６８】
従って、本発明はヌクレオチド配列Ｓによりコードされる蛋白質の多様化方法として、上記に定義したようなＰＣＲ産物又はポリヌクレオチドバンクに含まれる前記ヌクレオチド配列Ｓのポリヌクレオチド変異体を適切な発現宿主で発現させることを特徴とする方法にも関する。
【００６９】
前記方法は特に、
−少なくとも１個のドメインＤが同一のままである突然変異ヌクレオチド配列Ｓに対応する本発明の方法の段階ｖｉ）で得られたＰＣＲ産物を発現ベクターにクローニングする段階と、
−配列Ｓによりコードされるポリペプチドの発現を可能にする宿主細胞を形質転換する段階と、
−少なくとも１個のドメインＤが同一のままである前記突然変異ヌクレオチド配列Ｓを前記宿主細胞で発現させて多様化蛋白質を得る段階と、
−得られた各種蛋白質を精製する段階から構成することができる。
【００７０】
これらの段階は当業者に周知の技術により実施される［Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌ  Ｄ．Ｗ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＨＳＬ  Ｐｒｅｓｓ］。
【００７１】
一旦蛋白質に翻訳されると、上記バンクに含まれるヌクレオチド配列はポリヌクレオチド配列の一致度が保存された内部ドメインＤＮを含むランダムに作製された多様なポリペプチド配列を示す蛋白質を発現することができる。
【００７２】
この点で、本発明は上記のようなヌクレオチド配列バンクの発現により得られる蛋白質バンクに関し、前記蛋白質はその一致度が保存された内部セグメントＤＮを含むランダムに作製された多様なポリペプチド配列を示す。
【００７３】
従って、本方法は例えばリガンドとの相互作用、触媒活性、毒性又は輸送に関与するこれらの蛋白質の配列をランダムに変異させることにより、所定の機能的特異性を変更させることが所望される任意蛋白質の標的改変を可能にする。
【００７４】
その標的蛋白質を突然変異させたバクテリオファージの形質転換における本発明の方法により得られた多様化配列の適用：
本発明の好ましい１態様によると、標的蛋白質をコードするバクテリオファージの遺伝子に得られた増幅産物を相同組換えにより挿入する。
【００７５】
本発明の好ましいＤＮＡ構築物は好ましくは、
−宿主細菌における前記構築物の倍加を可能にする領域と；
−標的蛋白質をコードする遺伝子のレベルでバクテリオファージのゲノムにおける相同組換えを可能にする領域を含み、後者領域は標的蛋白質をコードする前記遺伝子の配列に相同な２個のＤＮＡ配列を含み、前記配列は好ましくは上記ＰＣＲ法により配列をランダムに作製したオリゴヌクレオチドを含む挿入セグメントを規定する。
【００７６】
本発明の好ましい１態様によると、相同組換えを可能にする領域は標的蛋白質をコードする遺伝子の全部又は一部、好ましくは遺伝子の配列の全長を含む。
【００７７】
好ましくは、この第２の領域は上記ランダム突然変異法により取得可能な増幅産物から構成される。
【００７８】
本発明の好ましい１態様によると、ファージの標的蛋白質をコードする数個の遺伝子を本発明の方法に従って相同組換えにより同時に突然変異させる。このような結果を達成するために、本発明は各々異なる遺伝子を標的とする異なるベクターを使用して宿主細菌を順次形質転換しようとするものである。
【００７９】
大腸菌宿主細菌で本発明によりバクテリオファージＴ４の遺伝子ＧＰ１２、ＧＰ３７又はＧＰ３８を同時に改変することが可能な好ましいベクターは例えばベクターｐＡＣＹＣ１８４（ＡＴＣＣ３７０３３）、ｐＢＡＤ１８−Ｋ（ＡＴＣＣ８７３９７）及びＲＲ１（ＡＴＣＣ８７０７６）である。このようなベクターは各種抗生物質に対する耐性を付与するマーカーをもつという利点があり、宿主細菌に一旦組込まれると、異なるベクター間で組換えを生じることが可能な共通のヌクレオチド配列をもたない。
【００８０】
本発明のバクテリオファージは好ましくは天然又は改変型の溶菌性バクテリオファージである。
【００８１】
好ましくは、使用するバクテリオファージは当業者に周知のバクテリオファージＴ４、Ｔ５、Ｔ６及びＴ７等のＴ型ファージ、特にゲノムが配列決定されているファージＴ４である［Ｍｉｌｌｅｒ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４  ｇｅｎｏｍｅ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，２００３，６７（１）：８６−１５６］。バクテリオファージのゲノムの全長配列はＧｅｎｂａｎｋから入手可能である（ＡＦ１５８１０１）。
【００８２】
本発明の宿主細菌は改変しようとするファージを複製するために一般に使用されている細菌である。好ましくは、宿主細菌は相同組換えによりファージを改変させることが可能な本発明のＤＮＡ構築物を使用して形質転換することが可能な株である。
【００８３】
この宿主細菌を本発明のＤＮＡ構築物により形質転換することにより、形質転換宿主細菌の１個以上のバンクが得られる。このバンクの細菌は各々ファージの標的蛋白質の１個以上を異なる方法で相同組換えによる形質転換することが可能な構築物を潜在的に含む。
【００８４】
宿主細菌のこのようなバンクは複製保存できるという利点がある。このようなバンクは標的蛋白質がランダムに改変された組換えバクテリオファージの作製に有用な再生可能な中間産物を構成する。
【００８５】
本発明の方法を用いると、非常に多様な組換えバクテリオファージの集合を得ることが可能である。
【００８６】
これらのバクテリオファージは本発明の意味でのバクテリオファージバンクを形成する。
【００８７】
回収されるファージの数と多様性を決定するのは形質転換宿主細菌数であるので、本発明のバクテリオファージバンクが最大限多数の異なるバクテリオファージをカバーするためには、十分な数の形質転換宿主細菌を使用する必要がある。
【００８８】
この数が十分であるならば、本発明のバクテリオファージバンクは最低で同一バクテリオファージの少なくとも１０６個、好ましくは１０８個、より好ましくは１０１０個の異なる変異体を含み、前記変異体はその標的蛋白質の少なくとも１個の配列が相違する。
【００８９】
本発明のバンクにおけるバクテリオファージの多様性は単純な計数計算により立証することができる。
【００９０】
例えば、好ましくは
−少なくとも１２ヌクレオチドのランダム配列から構成される少なくとも３個のオリゴヌクレオチドの挿入により標的蛋白質をコードする３個の遺伝子が改変され；
−ヌクレオチド配列の１／３が標的蛋白質のレベルでポリペプチド修飾を受け；
−４個の塩基（Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ）うちの３個のみが元の蛋白質に対して突然変異を生じることができると仮定するならば、
ポリペプチドレベルで最低３２４通りの突然変異の可能性が得られ、約２．８×１０１１個の潜在的に異なるバクテリオファージ数に相当する。
【００９１】
以下の実験プロトコールは本発明の特許請求の範囲を限定せずに例示として本発明を例証することを目的とする。
【００９２】
ファージＴ４のｑｐ１２、ｑｐ３７及びｇｐ３８の変異体の配列の作製
以下、ｇｐ１２に使用する手順を記載するが、当業者は特に標的蛋白質をコードする他の遺伝子の改変にも容易に適用することができる。
【００９３】
ステップ１：ｇｐ１２遺伝子の作製
ｇｐ１２遺伝子は、
ｇｐ１２Ｆ  ５’−ＴＧＡＧＴＡＡＴＡＡＴＡＣＡＴＡＴＣＡＡＣＡＣＧ（配列番号２）、及び
ｇｐ１２Ｒ  ５’−ＴＧＡＴＴＣＴＴＴＴＡＣＣＴＴＡＡＴＴＡＴＧＴＡＣ（配列番号３）
をプライマーとして使用することにより、ファージ溶解液の濃縮培養液（下記参照）から得られた野生型Ｔ４のゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅する。
【００９４】
分取アガロースゲルで精製後、ｇｐ１２の受容体結合ドメインに対応するコーディング領域に点突然変異と挿入を導入する目的で、ＰＣＲ産物（ｇｐ１２Ａ）をエラープローンＰＣＲ反応の鋳型として使用する（図５参照）。
【００９５】
ステップ２：受容体結合ドメインへのランダム突然変異の導入
ランダムポリメラーゼエラーを誘導するようにＭｎ２の存在下で４回１組のネステッドＰＣＲ（各４０サイクル）を実施する。
【００９６】
反応容量１００μｌとし、１×反応緩衝液中、それぞれ終濃度４００ｎｇ及び３０ｐｍｏｌの鋳型及びプライマーと、０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ及びｄＧＴＰ（各）、１ｍＭ  ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ（各）、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．７ｍＭ  ＭｎＣｌ２及びＤＮＡ−ポリメラーゼＴａｑ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）５Ｕを使用してエラープローンＰＣＲを実施する。ＰＣＲは９６℃で２分後に、９５℃で１分、５６℃で１分及び７２℃で２分を３０サイクルと、７２℃で７分間最終伸長反応を実施する。
【００９７】
１回目の反応（Ｐ１−１）はプライマーとして、
ｐ１２ＮＦ１Ｆ  ５’−ＴＣＡＡＧＧＴＡＡＣＣＧＣＡＴＣＧＴＡＡＣ（配列番号４）
ｐ１２ＮＦ２Ｒ  ５’−ＡＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＡＴＧＴＣＡＧ（配列番号５）
を使用する。
【００９８】
２回目の反応（Ｐ２−１）はプライマーとして、
ｐ１２ＮＦ２Ｆ  ５’−ＴＧＣＣＡＴＧＧＴＧＧＡＡＣＴＧＴＴＣＡ（配列番号６）
ｐ１２ＮＦ３Ｒ  ５’−ＣＡＣＣＴＡＡＴＣＴＡＧＧＴＴＴＡＣ（配列番号７）
を使用する。
【００９９】
３回目の反応（Ｐ３−１）はプライマーとして、
ｐ１２ＮＦ３Ｆ  ５’−ＣＴＧＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＣＴＴＴ（配列番号８）
Ｐ１２ＮＦ４Ｒ  ５’−ＡＴＧＴＴＴＡＴＧＡＴＡＡＧＡＣＡＴ（配列番号９）
を使用する。
【０１００】
４回目の反応（Ｐ４−１）はプライマーとして、
Ｐ１２ＮＦ４Ｆ  ５’−ＧＴＡＡＡＣＣＴＡＧＡＴＴＡＧＧＴＧ（配列番号１０）
Ｐ１２ＮＦ５Ｒ  ５’−ＴＣＡＴＴＣＴＴＴＴＡＣＣＴＴＡＡＴＴＡＴ（配列番号１１）
を使用する。
【０１０１】
これらの反応産物は各々２個の他の反応産物と部分的にオーバーラップしており、使用するプライマーは蛋白質ｇｐ１２で保存された定常領域に対応する。これらのドメインは作製される最終突然変異遺伝子構造で忠実に保存されていなければならない。しかし、エラープローンＰＣＲ反応により作製されるフラグメントのうちには、これらの領域に完全に突然変異誘発されているものもある。無傷の領域を維持するためには、保存ドメインを保持したフラグメントのみを選択的に増幅することを目的とする高忠実度ＰＣＲを上記各産物に実施する必要がある。
【０１０２】
ステップ３：所望フラグメントの選択的増幅
これは各々２５サイクルからなる２組の高忠実度ＰＣＲ反応により実施する。
【０１０３】
反応容量５０μｌとし、１×ｐｆｕ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．０，１０ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ＭｇＳＯ４，６ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４，０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，０．１ｍｇ／ｍｌ  ＳＡＢ）に２００μＭ  ｄＮＴＰとポリメラーゼｐｆｕ（Ｐｒｏｍｅｇａ）５Ｕを加え、それぞれ終濃度２５０ｎｇ及び４０ｐＭの鋳型及びプライマーを使用して高忠実度ＰＣＲを実施する。ＰＣＲ条件は、９４℃で２０秒、４５℃で１５秒及び７２℃で３０秒を２０サイクル繰り返す。
【０１０４】
第１組の反応（Ｐ１−２からＰ４−２）では、５’末端をビオチン化した対応する「Ｆ」プライマー（例えば：ｐ１２ＮＦ１Ｆ）を使用することにより、上記各ＰＣＲ産物のアリコート（約２５０ｎｇ）を増幅する。これは、長さが実質的に等しいためにゲル電気泳動により分離できない増幅不能な鋳型（突然変異保存ドメイン）から所望産物を分離するために必要である。
【０１０５】
各反応の産物を次に（過剰のプライマーを除去するために）サイズ排除ミニカラムに通し、ストレプトアビジンビーズで個々に精製し、結合用緩衝液で洗浄し、溶出、沈殿させ、ｄｄＨ２Ｏに再懸濁する。
【０１０６】
第２組の反応では、精製した反応産物Ｐ１−２のアリコートを等量の反応産物Ｐ２−２と混合する。前記反応産物は共通のプライミング部位Ｆ２−Ｒ１及びＦ３−Ｒ２をもつ。従って、反応産物Ｐ２−２の「−」鎖は反応産物Ｐ１−２の「＋」鎖のプライマーとして使用され、Ｐ１−２の内部プライミング部位Ｆ２−Ｒ１でポリメラーゼによる伸長が開始する。この保存部位が有意に突然変異されている反応産物Ｐ１−２では伸長できない。
【０１０７】
同様に、反応産物Ｐ１−２の「＋」鎖は反応産物Ｐ２−２の「−」鎖のプライマーとして使用され、Ｐ２−２の内部Ｆ３−Ｒ２プライミング部位でポリメラーゼによる伸長が開始する。この保存部位が有意に突然変異されている反応産物Ｐ２−２では伸長できない。
【０１０８】
増幅に成功したＰＣＲ産物（ＰＡ−１）は４個の保存ドメイン（Ｆ１  ＋  Ｆ２−Ｒ１  ＋  Ｆ３−Ｒ２  ＋  Ｆ４−Ｒ３）の各々が非突然変異状態に維持されたフラグメントＰ１−２及びＰ２−２の融合体に対応する。
【０１０９】
同様の混合物を反応産物Ｐ３−２及びＰ４−２から作製する。これらの反応では、伸長の成功は無傷の内部保存部位Ｆ４−Ｒ３（Ｐ３−２）及びＦ５−Ｒ４（Ｐ４−２）に基づき、得られるＰＣＲ産物（ＰＡ−１及びＰＢ−１）は４個の保存ドメイン（Ｆ３−Ｒ２  ＋  Ｆ４−Ｒ３  ＋  Ｆ５−Ｒ４  ＋  Ｒ５）の各々が非突然変異状態で得られたフラグメントＰ３−２及びＰ４−２の融合体に対応する。
【０１１０】
融合ＰＣＲ産物の寸法は個々の鋳型の寸法と著しく異なるので、得られた産物を分取ゲル電気泳動により精製する。
【０１１１】
この第２組のＰＣＲ反応の収率を増加させるためには、伸長プロトコールを以下のように改変することができる：
反応混合物中の産物Ｐ１−２及びＰ２−２と、Ｐ３−２及びＰ４−２のみで１０サイクル。
【０１１２】
反応を中断し、プライマーｐ１２ＮＦ１Ｆ及びｐ１２ＮＦ３Ｒ各５０ｎｇを混合物ＰＡ−１に加え、プライマーｐ１２ＮＦ３Ｆ及びｐ１２ＮＦ５Ｒ各５０ｎｇを混合物ＰＢ−１に加えた後、ＰＣＲ反応を更に１５サイクル続ける。
【０１１３】
ステップ４：ｇｐ１２の突然変異アンカードメインの再構成
精製後、上記各種突然変異を導入したユニークなフラグメントにおいてｇｐ１２の全長受容体結合ドメインを再構成する目的で３０サイクルからなる高忠実度ＰＣＲ反応で産物ＰＡ−１及びＰＢ−１の等量アリコートを併用する。
【０１１４】
この場合、前回の反応と同様に、産物ＰＡ−１は産物ＰＢ−１の伸長プライマーとして使用され、産物ＰＢ−１は産物ＰＡ−１の伸長プライマーとして使用される。
【０１１５】
その寸法は個々の鋳型の寸法と著しく異なるので、最終融合ＰＣＲ産物（ｇｐ１２ＢＤ−Ｆｕ）をゲル電気泳動により精製する。
【０１１６】
収率を増加させるためには、反応混合物中の産物Ｐ１−２及びＰ２−２と、Ｐ３−２及びＰ４−２のみで１５サイクルからなる反応を実施することにより、伸長プロトコールを改変することができる。反応を中断し、プライマーｐ１２ＮＦ１Ｆ及びｐ１２ＮＦ５Ｒ各５０ｎｇを混合物に加えた後、ＰＣＲ反応を更に１５サイクル続ける。
【０１１７】
精製後、再構成したｇｐ１２の受容体結合ドメインのアリコート（約２５０ｎｇ）を４回１組の新規エラープローンＰＣＲ反応で鋳型として使用した後、上記のように選択的増幅とドメインの再構成を行う。
【０１１８】
しかし、各融合段階（上記段階３及び４）で各サブドメインに個々に導入される可能な全突然変異は再構成された最終受容体系列ドメインにランダムに混入されるので、保存ドメインに悪影響を与えずに実施可能な突然変異誘発サイクル数には限界がある。必要な選択的増幅段階を考慮すると、４連続サイクルを越える場合には新規に導入される全突然変異が保存ドメインに悪影響を与える確率又は突然変異していない元のＴ４配列に戻る復帰突然変異を導入する確率が高いと考えられる。
【０１１９】
ステップ５：ｇｐ１２遺伝子全体の改変コピーの再構成
１）受容体結合ドメインの上流のｇｐ１２のセグメントの増幅
上記のようにＰＣＲにより作製したｇｐ１２遺伝子（ｇｐ１２Ａ）を鋳型とし、プライマー
ｇｐ１２Ｆ  ５’−ＴＧＡＧＴＡＡＴＡＡＴＡＣＡＴＡＴＣＡＡＣＡＣＧ（配列番号１２）、及び
ｇｐ１２ＡＲ  ５’−ＧＴＴＡＣＧＡＴＧＣＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴ（配列番号１３）
と共に使用する。
【０１２０】
次に、得られた増幅産物を分取アガロースゲルで精製し、沈殿後、ｄｄＨ２Ｏに再懸濁する。
【０１２１】
２）ｇｐ１２の突然変異結合ドメインの増幅
ＰＣＲ産物（ｇｐ１２Ｂ）のアリコート（約５００ｎｇ）を等量の再構成したｇｐ１２の受容体結合ドメイン（ｇｐ１２ＢＤ−Ｆｕ）と共に高忠実度ＰＣＲ反応で使用する。なお、これらの２種類の産物は２０ｐｂしかオーバーラップしない。従って、ＰＣＲ反応条件はこの点を考慮して改変する必要がある。
【０１２２】
改変ＰＣＲ条件：Ａ）９６℃で３０分→９４℃で１分、４５℃で１０秒を５サイクル→Ｂ）９４℃で１分と５０℃で２０秒を５サイクル→Ｃ）９４℃で１分、５０℃で３０秒を５サイクル→最後にＤ）９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で５秒を１５サイクル。
【０１２３】
収率を増加させるためには、上記サブステップＤで反応を中断し、プライマーｇｐ１２Ｆ及びｐ１２ＮＦ５Ｒを混合物に導入することができる。次に反応を再開し、完了まで実施する。
【０１２４】
最終産物（ｇｐ１２−Ｍｕｔ）を分取アガロースゲルで精製し、沈殿させ、その使用時までｄｄＨ２Ｏに再懸濁する。
【０１２５】
ステップ６：得られたＰＣＲ産物ｇｐ１２−Ｍｕｔのシーケンシングによる検証
ドメインＤ１及びＤ２を無傷に保存しながら、確かに突然変異がランダムにｇｐ１２に導入されていることを検証するために、アガロースゲルで精製したＰＣＲ産物を自動シーケンシンサーによりシーケンシングする。シーケンシングはｇｐ１２（配列番号１）のヌクレオチド１０８９から１１１０（図６Ａ）と１１９５から１２１２（図６Ｂ）にそれぞれ対応する２部分で実施する。得られたシーケンシングプロファイルを図６に示す。ＰＣＲ産物のプロファイルをｇｐ１２の初期配列のプロファイルと比較すると、ｇｐ１２の予想プロファイルには多数の付加ピークが加わっていることが認められる。これらの付加ピークはＰＣＲ法により配列に導入された突然変異が高頻度であることを反映している。これらのピークはドメインＤ１のレベルには認められず、このドメインがｇｐ１２に対してその配列一致度を保存していることが確認される。
【０１２６】
相同組換え用代替ベクターへの突然変異ｇｐ１２−Ｍｕｔのクローニング
上記手順により、ｇｐ１２と同様にＴ４の突然変異遺伝子ｇｐ３７及びｇｐ３８も作製することができた。
【０１２７】
従って、以下の手順の目的は親バクテリオファージと異なる宿主標的親和性をもつＴ４の子孫を作製するように、バクテリオファージＴ４のゲノムへの相同組換えによる導入を助長するようにＴ４のこれらの変異遺伝子を導入することである。
【０１２８】
この目的のために、上記のように作製した突然変異遺伝子を代替ベクター（遺伝子毎に異なるベクター）に導入する必要がある。本例では、突然変異遺伝子の各々をクローニングするためにベクターｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＡＤ１８−Ｋ及びＲＲ１を使用する。
【０１２９】
選択したベクター（例えばｇｐ１２Ｍｕｔのクローニング用のｐＡＣＹＣ１８４）をＳｍａＩ部位のレベルで切断し、精製し、ｄｄＨ２Ｏ  ２０μｌに再懸濁し、ＰＣＲ産物ｇｐ１２Ｍｕｔと１：３の比で混合する。ライゲーション後、ＤＮＡを精製し、ｄｄＨ２Ｏに再懸濁し、「エレクトロコンピテント」細胞ＤＫ８（ＡＴＣＣ４７０３８）に形質転換する。このベクターはクロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃｈｌ）をもつ。従って、エレクトロポレーションと１時間の回復時間後に、クロラムフェニコール１７０μｇ／ｍｌを加えたＬＢ培地１０ｍｌに細胞を移し、常時曝気下に３０℃で４時間培養する。次に細胞をＬＢ培地プレート＋Ｃｈｌに撒き、一晩３０℃で培養する。挿入セグメントｇｐ１２Ｍｕｔの存在をＰＣＲにより検証するために数個のコロニーを採取し、濃縮細胞培養液（ＤＫ８−ｐ１２Ｃ）を調製するために数個の陽性コロニーをＬＢ培地＋Ｃｈｌで培養する。
【０１３０】
宿主細菌への突然変異遺伝子ｑｐ３７及びｑｐ３８の導入
ＤＫ８−ｐ１２Ｃの新鮮な一晩培養液を使用してエレクトロコンピテント細胞を作製する。
【０１３１】
ベクターｐＢＡＤ１８−ＫをＳｍａＩ部位のレベルで切断し、精製し、ｄｄＨ２Ｏ  ２０μｌに再懸濁し、ＰＣＲ産物ｇｐ３７Ｍｕｔと１：３の比で混合する。ライゲーション後、ＤＮＡを精製し、ｄｄＨ２Ｏに再懸濁し、「エレクトロコンピテント」細胞ＤＫ８−ｐ１２Ｃに形質転換する。
【０１３２】
この場合に使用するベクターはカナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎ）をもつ。従って、エレクトロポレーションと１時間の回復時間後に、クロラムフェニコール１７０μｇ／ｍｌとカナマイシン５０μｇ／ｍｌを加えたＬＢ培地１０ｍｌに移し、常時曝気下に３０℃で４時間培養する。次に細胞をＬＢ培地プレート＋Ｃｈｌ＋Ｋａｎに撒き、一晩３０℃で培養する。挿入セグメントｇｐ１２Ｍｕｔ及びｇｐ３７Ｍｕｔの存在をＰＣＲにより検証するために数個のコロニーを採取し、濃縮細胞培養液（ＤＫ８−ｐ１２Ｃ−ｐ３７Ｋ）を調製するために数個の陽性コロニーをＬＢ培地＋Ｃｈｌ＋Ｋａｎで培養する。
【０１３３】
ＤＫ８−ｐ１２Ｃ−ｐ３７Ｋの新鮮な一晩培養液を使用してエレクトロコンピテント細胞を作製する。ベクターＲＲ１をＳｍａＩ部位のレベルで切断し、精製し、ｄｄＨ２Ｏ  ２０μｌに再懸濁し、ＰＣＲ産物ｇｐ３７Ｍｕｔと１：３の比で混合する。ライゲーション後、ＤＮＡを精製し、ｄｄＨ２Ｏに再懸濁し、「エレクトロコンピテント」細胞ＤＫ８−ｐ１２Ｃ−ｐ３７Ｋに形質転換する。この場合に使用するベクターはアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ）をもつ。従って、エレクトロポレーションと１時間の回復時間後に、クロラムフェニコール１７０μｇ／ｍｌ＋カナマイシン５０μｇ／ｍｌ＋アンピシリン６０μｇ／ｍｌを加えたＬＢ培地１０ｍｌに移し、常時曝気下に３０℃で４時間培養する。次に細胞をＬＢ培地プレート＋Ｃｈｌ＋Ｋａｎ＋Ａｍｐに撒き、一晩３０℃で培養する。挿入セグメントｇｐ１２Ｍｕｔ、ｇｐ３７Ｍｕｔ及びｇｐ３８Ｍｕｔの存在をＰＣＲにより検証するために数個のコロニーを採取し、濃縮細胞培養液（ＤＫ８−ｐ１２Ｃ−ｐ３７Ｋ−Ｐ３８Ａ）を調製するために数個の陽性コロニーをＬＢ培地＋Ｃｈｌ＋Ｋａｎ＋Ａｍｐで培養する。
【０１３４】
次に、非常に有効な組換え能を示すことが可能な宿主を構築する。
【０１３５】
大腸菌「ｍｉｎｉ−λ」宿主細菌の構築
ｒｅｃＡ＋又はｒｅｃＡ−バックグラウンドでドナーＤＮＡの有効な組換えを得るために、λの温度感受性リプレッサーｃｌの制御下の組換え遺伝子ｅｘｏ、ｂｅｔ及びｇａｍをもつプロファージλを含む大腸菌宿主を作製する。遺伝子ｅｘｏ、ｂｅｔ及びｇａｍは４２℃で容易に活性化し、３２℃で阻害することができる。λの機能を活性化させる時間を５分間に短縮すると、細胞は組換え能が高まり、線状ＤＮＡを破壊せずに吸収する。λ  Ｇａｍは大腸菌のヌクレアーゼＲｅｃＢＣＤによる線状ＤＮＡ攻撃を抑制し、ＥｘｏとＢｅｔａはこの線状ＤＮＡの組換え活性を生じる。更に重要な点として、この組換えは線状ＤＮＡから構成される基質の末端の３０から５０ｐｂに限定されたＤＮＡ相同度で有効である。
【０１３６】
λ  ｃｌ８５７のＤＮＡを鋳型として使用し、ａｔｔＰ−ｃｒｏ領域に由来するＤＮＡのＰＣＲ増幅用プライマーとしてオリゴヌクレオチド５’ＧＴＡＴＧＣＡＴＧＣＴＧＧＧＴＧＴＧＧ（ＭλＲｆ）及び５’ＣＧＣＡＣＴＣＴＣＧＡＴＴＣＧＴＡＧＡＧＣＣＴＣＧ（ＭλＲｒ）を使用する。
【０１３７】
一旦プロファージλがＰＣＲにより作製されると、例えばＬａｃＺによる選択によりプロファージλを低コピー数プラスミドｐＦＮ４７６（ＡＴＣＣ８６９６２）にクローニングすることが可能になる。
【０１３８】
ベクターｐＦＮ４７６をＳｍａＩ部位（平滑末端）のレベルで切断し、精製し、ｄｄＨ２Ｏ  ２０μｌに再懸濁し、プロファージλのＰＣＲ産物と１：３の比で混合する。ライゲーション後、ＤＮＡを精製し、ｄｄＨ２Ｏに再懸濁し、「エレクトロコンピテント」細胞ＤＫ８−ｐ１２Ｃ−ｐ３７Ｋ−ｐ３８Ａに形質転換する。回復後、細胞をＬＢ培地プレートＸ−ｇａｌ＋Ｃｈｌ＋Ｋａｎ＋Ａｍｐ（上記参照）に撒き、３０℃でインキュベートする。
【０１３９】
プロファージλの存在をＰＣＲにより検証するために数個のブランクコロニーを選択する。次に、後続操作で使用する濃縮細胞培養液（ＤＫ８−Ｔ４Ｍｕｔ−λ）を調製するためにプロファージλの陽性コロニー１個をＬＢ培地＋Ｃｈｌ＋Ｋａｎ＋Ａｍｐで一晩３０℃にて培養する。
【０１４０】
この段階で、形質転換宿主は高温でλにより誘導可能であり、ｌａｃＺ陽性であり、相同組換えにすぐに利用可能なＴ４の突然変異遺伝子ｇｐ１２、ｇｐ３７及びｇｐ３８のコピーを含む。
【０１４１】
宿主範囲を拡大したバクテリオファージＴ４の子孫の作製
ＤＫ８−Ｔ４Ｍｕｔ−λ細胞の新鮮な一晩培養液をＬＢ培地＋Ｃｈｌ＋Ｋａｎ＋Ａｍｐで３０℃にて調製する。
【０１４２】
バクテリオファージの添加前に細胞が指数増殖期に入るように確保するように、ＬＢ培地＋Ｃｈｌ＋Ｋａｎ＋Ａｍｐ  １０ｍｌ当たり一晩培養液の細胞０．０５ｍｌ以下の容量でＴ４感染のための培養を開始する。
【０１４３】
曝気を改善するために、これらの培養液は非気密性の栓をした枝付き２５０ｍｌ三角フラスコに入れ、３０℃の振盪機の水浴中で培養する。
【０１４４】
ＬＢ培地＋Ｃｈｌ＋Ｋａｎ＋Ａｍｐ中の細胞２５０ｍｌを細胞３×１０８個／ｍｌの密度で３０℃にて振盪培養する。
【０１４５】
次に指数増殖期の細胞の１０ｍｌアリコートを４２℃に予熱したＬＢ培地＋Ｃｈｌ＋Ｋａｎ＋Ａｍｐ  ４０ｍｌに移し、常時曝気下に４２℃で厳密に１５分間インキュベートする。トリプトファンを０．０２ｍｇ／ｍｌの濃度で加えた後、細胞１個当たり粒子約１０個の多重度でバクテリオファージＴ４を加える。培養液を３０℃の水浴に移し、厳密に２５分間増殖を続ける。
【０１４６】
この場合の目的は第１世代の子孫を単離し、この第１世代のバクテリオファージ子孫が繁殖性になる前に増殖を停止させることである。
【０１４７】
バクテリオファージの子孫の回収
５０００ｒｐｍで５分間遠心することにより細胞を採取し、上清を回収し、クロロホルム数滴を加え、混合物を再び１０分間６０００ｒｐｍで遠心する。５倍濃縮緩衝液を使用することにより、クロロホルムを除く上清を１×ＳＭ緩衝液の濃度（１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０１％ゼラチン及び５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７，５］）に調整し、分析時まで４℃で保存する。
【０１４８】
ペレットとして集めた細胞を０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ８．０）＋２５％蔗糖の溶液８ｍｌに再懸濁する。リゾチーム（５ｍｇ／ｍｌ）の１．６ｍｌアリコートを加え、混合物を５分間０℃でインキュベートする。０．２Ｍ  ＥＤＴＡ溶液３．２ｍｌを加え、混合物を更に１５分間０℃でインキュベートする。細胞溶解液を１０倍濃縮緩衝液により５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１００ｍＭ  ＭｎＣｌ２に調整し、１５℃で平衡化し、Ｄｎａｓｅ１（Ｓｉｇｍａ）１０Ｕを加えて２時間インキュベートする。次に混合物を６０００ｒｐｍで１０分間遠心する。透明上清を注意深く分取し、１×ＳＭ緩衝液の濃度に調整し、上記のように保存する。
【０１４９】
宿主範囲拡大の検証
病原性細菌株（エルシニア種、サルモネラ種、大腸菌０１５７  Ｈ７、エンテロバクター・サカザキ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｋａｚａｋｉｉ）等）の培養液を調製する。
【０１５０】
次に３ｍｌアリコートに子孫の濃縮培養液１ｍｌを感染させ、撹拌下に３０℃でインキュベートする。感染直後とその後６０分間おきに培養液の濁度を比色分析により測定する。５時間以内に培養液の濁度が著しく低下した場合には、試験した宿主に感染することが可能な粒子がＴ４の組換え子孫に存在していると判断する。培養液にクロロホルム数滴を加え、濁度の明白な低下を引き起こした後に、培養液を５０００ｒｐｍで５分間遠心する。
【０１５１】
上清を回収し、自然界では野生型バクテリオファージＴ４により攻撃することができない被験細菌に特異的なバクテリオファージ粒子を生産するための感染物質として使用する。
【図１】
0005622394.tif 000002
【図２】
0005622394.tif 000003
【図３】
0005622394.tif 000004
【図４】
0005622394.tif 000005
【図５】
0005622394.tif 000006
【図６】
0005622394.tif 000007
【図７Ａ】
0005622394.tif 000008
【図７Ｂ】
0005622394.tif 000009
【配列表】
0005622394000001.app