(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
CD20発現癌の処理のための薬剤の製造のためへの、抗-Bcl-２活性剤と組み合せてのタイプII抗−CD20抗体の使用において、
前記タイプII抗-CD20抗体が、ヒト型化B-Lyl抗体であり、そして高められた抗体依存性細胞性細胞毒性（ADCC）を有し、
前記抗-Bcl-２活性剤が、ABT−263又はABT−737から選択され、ここで、ABT−263が、式Ｉ：
【化１】
0005416124.tif 000014
で示され、そしてABT−737が、式II：
【化２】
0005416124.tif 000015
で示され、
前記ヒト型化B-Lyl抗体が、配列番号３〜配列番号19のいずれかに示される重鎖可変領域（VH）のアミノ酸配列を含んでなり、そして配列番号20に示される軽鎖可変領域（VL）のアミノ酸配列を含んで成る、
ことを特徴とする前記使用。
【請求項２】
前記タイプII抗−CD20抗体のFc領域のオリゴ糖の少なくとも40％又はそれ以上がフコシル化されていないことを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記CD20発現癌が、B−細胞非ホジキンリンパ腫（NHL）である、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
CD20発現癌の処理のための、抗-Bcl-２活性剤とタイプII抗−CD20抗体との組み合せ剤において、
前記タイプII抗-CD20抗体が、ヒト型化B-Lyl抗体であり、そして高められた抗体依存性細胞性細胞毒性（ADCC）を有し、
前記抗-Bcl-２活性剤が、ABT−263又はABT−737から選択され、ここで、ABT−263が、式Ｉ：
【化３】
0005416124.tif 000016
で示され、そしてABT−737が、式II：
【化４】
0005416124.tif 000017
で示され、
前記ヒト型化B-Lyl抗体が、配列番号３〜配列番号19のいずれかに示される重鎖可変領域（VH）のアミノ酸配列を含んでなり、そして配列番号20に示される軽鎖可変領域（VL）のアミノ酸配列を含んで成る、
ことを特徴とする前記組み合せ剤。
【請求項５】
前記タイプII抗−CD20抗体のFc領域のオリゴ糖の少なくとも40％又はそれ以上がフコシル化されていないことを特徴とする、請求項４に記載の組み合せ剤。
【請求項６】
前記CD20発現癌が、B−細胞非ホジキンリンパ腫（NHL）である、請求項４又は５に記載の組み合せ剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌、特にCD20発現癌の処理のための薬剤の製造のためへの、抗−Bcl−２活性剤を組合してのタイプII抗−CD20抗体の使用に向けられる。
【背景技術】
【０００２】
CD20分子（また、ヒトB−リンパ球−制限された分化抗体又はBp35とも呼ばれる）は、pre-B及びヒトBリンパ球上に位置する、約35kDの分子量を有する疎水性トランスメンブランタンパク質である（Valentine, M.A., et al., J. Biol. Chem. 264 (19) (1989) 11282-11287; 及び Einfield, D.A., et al. EMBO J. 7(3) (1988) 711-717）。CD20は、末梢血液又はリンパ器官からの90％以上のB細胞の表面上に見出され、そして初期プレ−B細胞成長の間、発現され、そして血漿細胞分化まで、存続する。CD20は、正常B細胞及び悪性B細胞の両者上に存在する。特に、CD20は、90％以上のB細胞非ボジキンリンパ腫（NHL）上で発現されるが（Anderson, K.C., et al., Blood 63(6) (1984) 1424-1433）、しかし造血幹細胞、プロ−B細胞、正常血漿細胞、又は他の正常組織上には見出されない（Tedder, T.F., et al., J, Immunol. 135(2) (1985) 973-979）。
【０００３】
CD20タンパク質の85個のアミノ酸のカルボキシル末端領域は、細胞質内に位置する。この領域の長さは、他のB細胞−特異的表面構造体、例えばそれぞれ、３，３，28, 15及び16個のアミノ酸の比較的短い細胞質内領域を有する、LgM、IgD及びIgG H鎖又は組織適合性抗体クラスII又はβ細胞の長さと対照をなす（Komaromy, M., et al., NAR 11 (1983) 6775-6785）。最後の61個のカルボキシル末端アミノ酸のうち、21個は酸性残基であり、ところがわずか２個は塩基性であり、このことは、この領域が強い負の実効電荷を有することを示す。GenBank受託番号は、NP-690605である。CD20は、B細胞の活性化及び分化工程における初期段階の調節に関与され（Tedder, T.F., et al., Eur. J. Immunol. 16 (1986) 881-887）、そしてカルシウムイオンチャネルとして機能する（Tedder, T.F., et al., J. Cell. Biochem. 14D (1990) 195）と思われる。
【０００４】
CD20結合及び生物学的活性のそれらのモードにおいて有意に異なる２種の異なったタイプ抗−CD20抗体が存在する（Cragg, M.S., et al., Blood 103 (2004) 2738-2743;及びCragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1052）。リツキシマブ（rituximab）のようなタイプI抗体は、補体介在性細胞毒性において有能であり、ところがトシツモマブ（Tositumomab）（B1）、11B8、AT80又はヒト適合されたB-Ly1抗体のようなタイプII抗体は、付随するホスファチジルセリン暴露によるカスパーゼ無関係アプトーシスを通して標的細胞の死を効果的に開始せしめる。
タイプI及びタイプII抗−CD20抗体の共有する通常の特徴が表１に要約されている。
【０００５】
【表１】
0005416124.tif 000002
【０００６】
Bcl-2ファミリーのタンパク質は、発生上の役割により、及び複数のストレスシグナルに応答して誘発される、プログラムされた細胞死を調節する（Cory. S., and Adams, J.M., Nature Reviews Cancer 2 (2002) 647-656; Adams, Genes und Development 17 (2003) 2481-2495; Danial, N.N., 及び Korsmeyer, SJ., Cell 116 (2004) 205-219）。細胞生存性は、Bcl-2自体、及び３又は４個の保存されたBcl-2相同性（BH）領域を担持する、いくつかの近親体（Bcl-xL、Bcl-W, Mcl-1及びAl）により促進されるが、アポプトーシスは２種のサブファミリーにより駆動される。
【０００７】
細胞死についての初期シグナルは、種々のグループのBH3−のみタンパク質、例えば小さなBH3相互作用ドメインのみを通常有する、Bad, Bid, Bim, Puma及びNoxaにより伝えられる（Huang and Strasser, Cell 103 (2000) 839-842）。しかしながら、BH1-BH3を含む、Bax又はBak, 多−ドメインタンパク質が細胞死への傾倒のために必要とされる（Cheng, et al., Molecular Cell 8 (2001) 705-711; Wei, M.C., et al., Science 292 (2001) 727-730; Zong, W.X., et al., Genes and Development 15 148 (2001) 1-1486）。活性化される場合、それらはミトコンドリアの外側の膜を透過することができ、そして細胞を分解するカスパーゼを活性化するために必要とされるプロ−アポプトーシス原性因子（例えば、シトクロムC）を開放する（Wang, K., Genes and Development 15 (2001) 2922-2933; (Adams, 2003 supra); Green, D.R., 及び Kroemer, G., Science 305 (2004) 626-629）。
【０００８】
Bcl-1ファミリーのそれらの３種の分派のメンバー間の相互作用は、細胞が生存するか、又は死亡するかどうかを指図する。BH3−のみタンパク質が例えばDNA損傷に応答して活性化されている場合、それらはそれらの前−生存類緑上のグループに、それらのBH3ドメインを通して結合することができる（Sattler, et al., Science 275 (1997) 983-986）。BH3−のみ及びBcl-2-様タンパク質がBax及びBakの活性化をいかに制御するかは、いまだ十分には理解されていない（Adams, 2003 前記）。
【０００９】
ほとんどの注意がBaxに集中されて来た。この可溶性モノマータンパク質（Hsu, Y.T., et al., Journal of Biological Chemistry 272 (1997) 13289-1 3834; Wolter, K.G., et al., Journal of Cell Biology 139 (1997) 1281-92）は通常、たぶんそのサイトゾル局在化を考慮にして、そのグループ中に挿入されるその膜標的化ドメインを有する（Nechushtan, A., et al., EMBO Journal 18 (1999) 2330- 2341; Suzuki, et al., Cell 103 (2000) 645-654;Schinzel, A., et al., J Cell Biol 164 (2004) 1021-1032）。いくつかの無関係なペプチド/タンパク質がBax活性を調節するために提供されて来たが（Lucken-Ardjomande, S., and Martinou, J.C., J Cell Sci 118 (2005) 473-483を再考のこと）、しかしそれらの生理学的関連性は、確立されるべき残っている。
【００１０】
他方では、Baxは、一定のBH3−のみタンパク質による直接的な関係を通して活性化され得（Lucken-Ardjomande, S., and Martinou, J. C, 2005 前記）、詳細される最良のものは、Bidの切断された形、すなわちtBidである（Wei, M. C, et al., Genes und Development 14 (2000) 2060-2071; Kuwana, T., et al., Cell 111 (2002) 331-342; Roucou, X., et al., Biochemical Journal 368 (2002) 915-921; Cartron, P.F., et al., MoI Cell 16 (2004) 807-818）。Adams, 2003前記に論じられるように、Bcl-2が直接的にBaxに関与する最も古いモデル（Oltvai, Z.N., et al., Cell 74 (1993) 609-619）は、Bcl-2が膜結合され、ところがBaxはサイトゾル性であり、そしてそれらの相互作用は細胞溶解のために使用される界面活性剤に高く依存すると思われるので、問題が多くなって来た（Hsu, Y.T., and Youle, 1997 前記）。
【００１１】
それにもかかわらず、BaxのBH3領域はBcl-2との結合を介在することができ（Zha, H., and Reed, J., Journal of Biological Chemistry 272 (1997) 31482-88; Wang, K., et al., Molecular und Cellular Biology 18 (1998) 6083-6089）、そしてBcl-2は、ヘテロダイマーが検出され得なくてもBaxのオリゴマー化を妨げる（Mikhailov, V., et al., Journal of Biological Chemistry 276 (2001) 18361-18374）ことが十分に確立されている。従って、前−生存タンパク質がBax活性化を直接的に又は間接的に抑制するかどうか不確定のままである。
【００１２】
Bax及びBakはほとんどの環境下で機能的に同等であると思われるが（Lindsten, T., et al., Molecular Cell 6 (2000) 1389-1399; Wei, M.C., et al., 2001 前記）、それらの調節における実質的な差異が健康な細胞におけるそれらの明確な局在化から予測される。大部分サイドゾルであるBaxとは異なって、Bakはミトコンドリアの外膜及び健康的な細胞の小胞体上の複合体に存在する（Wei, M. C, et al., 2000 supra; Zong, W.X., et al., Journal of Cel l Biology 162 (2003) 59-69）。
【００１３】
それにもかかわらず、細胞毒性シグナルの受容に基づいて、Bax及びBakの両者はコンホメーションを変え、そしてBaxはオリガネラ膜に移行し、ここでBax及びBakの両者が結合することができるホモ−オリゴマーを形成し、膜透過性を導く（Hsu, Y.T., et al., PNAS 94 (1997) 3668-3672; Wolter, K.G., et al., 1997 前記; Antonsson, B., et al., Journal of Biological Chemistry 276 (2001) 11615-11623; Nechushtan, A., et al., Journal of Cell Biology 153 (2001) 1265-1276; Wei, M.C., et al., 2001前記; Mikhailov, V., et al., Journal of Biological Chemistry 278 (2003) 5367-5376）。
【００１４】
種々のBcl-2インヒビターが存在し、それらのすべてはBcl-2ファミリーのタンパク質の阻害性前生存メンバーの同じ性質を有し、そして従って、癌の処理のための有望な候補体である。そのようなBcl-2インヒビターは例えば、Oblimersen、 SPC- 2996、 RTA-402、 Gossypol、 AT-101 、 Obatoclax mesylate、 A-371191、 A- 385358、 A-438744、 ABT-737、 AT-101、 BL-I l、 BL-193、 GX-15-003、 2- Methoxyantimycin A3、 HA- 14-1、 KF-67544、プルプロガリン、 TP-TW-37、 YC- 137 及び Z-24であり、そして例えばZhai, D., et al., Cell Death and Differentiation 13 (2006) 1419-1421に記載される。
Smith, M. R., et al, Molecular Cancer Therapeutics 3(12) (2004) 1693-1699 及び Ramanarayanan, J. et al., British Journal of Haematology 127(5) (2004) 519-530は、アンチセンスBcl-2オリゴヌクレオチド（Oblimersen）とタイプI抗−CD20抗体（リッキシマブ）との組み合わせを言及する。
【発明の概要】
【００１５】
本発明は、CD20発現癌の処理のための薬剤の製造のためへの、抗−Bcl−２活性剤と組合してのタイプII抗−CD20抗体の使用を含んで成る。
本発明はさらに、CD20発現癌を有する患者の処理のための薬剤の製造のためへの、抗−Bcl−２活性剤と組合してのタイプII抗−CD20抗体の使用を含んで成る。
【００１６】
好ましくは、前記抗−Bcl-2活性剤は、5μM又はそれ以下の抗−Bcl-2阻害活性のIC50を有するBcl-2インヒビターである。
好ましくは、前記タイプII抗体は、リツキシマブ（rituximab）に比較して、0.3〜0.6、より好ましくは0.35〜0.55及びさらにより好ましくは0.4〜0.5の前記タイプII抗−CD20抗体のRaji細胞（ATCC−No. CCL-86）上のCD20への結合能力の比率を有する。
【００１７】
好ましくは、前記タイプII抗−CD20抗体は、ヒト適合されたB-Lyl抗体である。
好ましくは、前記タイプII抗−CD20抗体は、高められた抗体依存性細胞毒性（ADCC）を有する。
好ましくは、前記抗−Bcl−２活性剤は、Oblimersen、 SPC- 2996、 RTA-402、 Gossypol、 AT-101 、 Obatoclax mesylate、 A-371191、 A- 385358、 A-438744、 ABT-737、 AT-101、 BL-I l、 BL-193、 GX-15-003、 2- Methoxyantimycin A3、 HA- 14-1、 KF-67544、プルプロガリン、 TP-TW-37、 YC- 137 及び Z-24から成る群、好ましくはABT-263及び ABT-737から成る群から選択される。好ましくは、CD20発現癌は、B-細胞非−ホジキンリンパ腫（NHL）である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、SU-DHL-4 DLBCL B-細胞 非ホジキンリンパ腫（NHL）に対する、Bcl-2インヒビター（ABT-737）(IC50のBcl-2阻害活性：0.040μM)と、リツキシマブに比較して、0.44の前記タイプII抗−CD20抗体のRaji細胞（ATCC−No. CCL-86）上のCD20への結合能力の比率を有するタイプII抗−CD20抗体(B-HH6-B-KV1 GE)との組合せ処理の抗腫瘍活性を示す。腫瘍体積[mm3]の平均値がy軸にプロットされ；腫瘍細胞の注入後の日数がx軸上にプロットされる。説明：A）ビークル（○）、B)ヒト適合されたB-1y1（B-HH6-B-KV1 GE） 10mg/kg 週１度（□）、C)Bcl-2インヒビターABT-737 100mg/kg, ２日ごとに（△）、及びD)ヒト適合されたB-ly1（B-HH6-B-KV1 GE）10mg/kg、週１度、Bcl-2インヒビターABT-737と共に同時投与される（100mg/kg ２日ごと）（×）。
【００１９】
【図２】図２は、Raji細胞（ATCC-No. CCL-86）に対するタイプI抗−CD20抗体（Cy5-リツキシマブ＝空白の棒）及びタイプII抗−CD20抗体（Cy50ヒト適合されたB-Ly1 B-HH6-B-KV1 GE＝黒の棒）の平均蛍光強度（MFI, 左のｙ軸）；リツキシマブに比較して、タイプI抗−CD20抗体（リツキシマブ）及びタイプII抗−CD20抗体（B-HH6-B-KV1 GE）のCD20への結合能力の比率（右のｙ軸）を示す。
【００２０】
【図３】図３は、Z138ヒト非ホジキンリンパ腫（NHL）に対する２種のタイプII抗−CD20抗体の処理の抗腫瘍活性を示す。両抗体はヒト適合されたB-Ly1抗−CD20抗体；１）B-HH6-B-KV1糖構築された（GE）及び２）B-HH6-B-KV1野生型（wt, 非−糖構築された）である。腫瘍体積[mm3]の平均値がy軸にプロットされ；腫瘍細胞の注入後の日数がx軸上にプロットされる。説明：A）ビークル（○）、B)ヒト適合されたB-Ly1 GE（B-HH6-B-KV1 GE） 30mg/kg 週１度（△）、及びC)ヒト適合されたB-Ly1 wt（B-HH6-B-KV1 wt）30mg/kg、週１度（×）。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の特定の記載：
用語“抗体”とは、種々の形の抗体、例えば完全な抗体、ヒト抗体、ヒト適合された抗体及び遺伝子工学的に構築された抗体、例えばモノクローナル抗体、キメラ抗体又は組換え抗体、並びに本発明の特徴的性質が保持される限り、そのような抗体のフラグメントを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【００２２】
用語“モノクローナル抗体”又は“モノクローナル抗体組成物”とは、本明細書において使用される場合、単一アミノ酸組成物の抗体分子の調製を言及される。従って、用語“ヒトモノクローナル抗体”とは、ヒト生殖系免疫グロブリン配列に由来する可変及び不変領域を有する、単一結合特異性を示す抗体を言及する。１つの態様においては、ヒトモノクローナル抗体は、ヒトH鎖トランスジーン及び不滅化された細胞に融合されるヒトL鎖トランスジーンを含んで成るゲノムを有する、トランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られるB細胞を包含するハイブリドーマにより生成される。
【００２３】
好ましくは、前記タイプII抗−CD20抗体は、モノクローナル抗体である。
用語“キメラ抗体”とは、通常組換えDNA技法により調製される、可変領域、すなわち１つの源又は種からの結合領域、及び異なった源又は種に由来する不変領域の少なくとも一部を含んで成るモノクローナル抗体を言及する。ネズミ可変領域及びヒト不変領域を含んで成るキメラ抗体が好ましい。そのようなネズミ/ヒトキメラ抗体は、ネズミ免疫グロブリン可変領域をコードするDNAセグメント及びヒト免疫グロブリン不変領域をコードするDNAセグメントを含んで成る、発現された免疫グロブリン遺伝子の生成物である。
【００２４】
本発明により包含される他の形の“キメラ抗体”は、その綱又は亜綱がオリジナル抗体のそれから修飾されているか又は変更されているそれらである。そのような“キメラ”抗体はまた、“クラススイッチ抗体”としても言及される。キメラ抗体を生成するための方法は、当業界において現在良く知られている、従来の組換えDNA及び遺伝子トランスフェクション技法を包含する。例えば、Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855;US 5,202,238 及びアメリカ特許第5,204,244号を参照のこと。
【００２５】
用語“ヒト適合された抗体”とは、その骨格又は“相補性決定領域”（CDR）が、親イムノグロブリンのCDRに比較して、異なった特異性の免疫グロブリンのCDRを含んで成るよう修飾されている抗体を言及する。好ましい態様においては、ネズミCDRは、“ヒト適合された抗体”を調製するために、ヒト抗体の骨格領域中に移植される。例えば、Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; and Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270を参照のこと。特に好ましいCDRは、キメラ及び二官能性抗体のために上記に示される抗原を認識する配列を表すそれらに対応する。
【００２６】
用語“ヒト抗体”とは、本明細書において使用される場合、ヒト生殖系免疫グロブリン配列に由来する可変及び不変領域を有する抗体を包含することを意図する。ヒト抗体は技術的に良く知られている（van Dijk, M.A., and van de Winkel, J. G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374）。そのような技法に基づけば、多くの種類の標的物に対するヒト抗体が生成され得る。ヒト抗体の例は例えば、Kellermann, S. A., et al., Curr Opin Biotechnol. 13 (2002) 593-597に記載される。
【００２７】
用語“組換えヒト抗体”とは、本明細書において使用される場合、組換え手段により調製され、発現され、創造され、又は単離されるすべてのヒト抗体、例えば宿主細胞、例えばNSO又はCHO細胞から又はヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスゲニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体、又は宿主細胞中にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現された抗体を意味する。そのような組換えヒト抗体は、転位された形で、ヒト生殖系免疫グロブリン配列に由来する可変及び不変領域を有する。本発明の組換えヒト抗体は、インビボ体細胞超突然変異にゆだねられている。従って、組換え抗体のVH及びVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系VH及びVL領域に由来し、そしてその配列に関連しているが、天然においては、ヒト抗体生殖系レパートリー内にインビボで存在することができない配列である。
【００２８】
本明細書において使用される場合、“特異的に結合する”又は“〜に対して特異的に結合する”とは、CD20抗原に特異的に結合する抗体を言及する。好ましくは、結合親和性は、10-9 モル/1又はそれ以下(例えば10-10 モル/1)の KD-値、好ましくは 10-10 モル/1 又はそれ以下 (e.g. 10- mol/1)のKD-値のものである。結合親和性は、標準結合アッセイ、例えばCD20発現細胞に対するスキャッチャード・プロット分析により決定される。
【００２９】
用語“核酸分子”とは、本明細書において使用される場合、DNA分子及びRNA分子を包含することを意図する。核酸分子は一本鎖又は二本鎖であり得るが、しかし好ましくは二本鎖DNAである。
“不変ドメイン”は、抗原への結合には直接関与されないが、しかしエフェクター機能（ADCC, 補体結合及びCDC）に関与される。
【００３０】
“可変領域”（L鎖の可変領域（VL）、H鎖の可変領域（VH））は、本明細書において使用される場合、抗原への抗体の結合において直接関与するL鎖及びH鎖の対の個々を示す。ヒト可変L及びH鎖のドメインは、同じ一般構造を有し、そして個々のドメインは４個の骨格（FR）領域を含んで成り、それらの配列は広く保存され、３個の“超可変領域”（又は相補性決定領域、CDR）により結合される。骨格領域は、ｂ−シートコンホメーションを採用し、そしてCDRはｂ−シート構造体を結合するループを形成することができる。個々の鎖におけるCDRは、骨格領域によりそれらの立体構造を保持され、そして他の鎖からのCDRと共に抗原結合部位を形成する。抗体H及びL鎖CDR3領域は、本発明の抗体の結合特異性/親和性において特に重要な役割を演じ、そして従って、本発明のさらなる目的を提供する。
【００３１】
用語“超可変領域”又は“抗体の抗原−結合部分”とは、本明細書において使用される場合、抗原結合を担当できる抗体のアミノ酸残基を言及する。超可変領域は“相補性決定領域”又は“CDR”からのアミノ酸残基を含んで成る。“骨格”又は“FR”領域は、本明細書において定義されるように超可変領域残基以外のそれらの可変ドメイン領域である。従って、抗体のL鎖及びH鎖は、N−末端からC−末端の方に、ドメインFRl、 CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3及びFR4を含んで成る。特に、H鎖のCDR3は、ほとんど抗原結合に寄与する領域である。CDR及びFR領域は、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. ( 1991)の標準の定義、及び/又は“超可変ループ”からのそれらの残基に従って決定される。
【００３２】
用語“CD20”及び“CD20抗原”は、本明細書において交換可能的に使用され、そして天然において細胞により発現されるか、又はCD20遺伝子によりトランスフェクトされた細胞上に発現される、ヒトCD20のいずれかの変異体、イソフォーム及び種相同体を包含する。CD20抗原への本発明の抗体の結合は、CD20を不活性化することによる、CD20を発現する細胞（例えば、腫瘍細胞）の殺害を仲介する。CD20を発現する細胞の殺害は、１又は複数の次の機能により生じ得る：細胞死/アポプトーシス湯初、ADCC及びCDC。
【００３３】
CD20の異名は、当業界において認識されるように、B−リンパ球抗原CD20、B−リンパ球表面抗原B1, Leu-16, Bp35, BM5及びLF5を包含する。
用語、本発明の“抗−CD20抗体”は、CD20抗原に対して特異的に結合する抗体である。CD20抗原への抗−CD20抗体の結合性質及び生物学的活性に依存して、２種のタイプの抗−CD20抗体（タイプI及びタイプII抗−CD20抗体）は、Cragg, M.S., et al., Blood 103 (2004) 2738-2743; and Cragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1052に従って識別され得、表2を参照のこと。
【００３４】
【表２】
0005416124.tif 000003
【００３５】
タイプI及びII抗−CD20抗体の１つの必須性質は、それらの結合モードである。従って、タイプI及びII抗−CD20抗体は、リツギシマブに比較して、前記抗−CD20抗体のRaji細胞（ATCC No. CCL-86）上のCD20への結合能力の比率により分類され得る。
【００３６】
タイプII抗−CD20抗体は、リツキシマブに比較して、0.3〜0.6、好ましくは0.35〜0.55、より好ましくは0.4〜0.5の前記タイプII抗−CD20抗体のRaji細胞（ATCC−No. CCL-86）上のCD20への結合能力の比率を有する。そのようなタイプII抗−CD20抗体の例は、例えばtositumomab (Bl IgG2a)、ヒト適合されたB-Ly1抗体IgGl (a chimeric humanized IgGl antibody as disclosed in WO 2005/044859号に開示されるようなキメラ性、ヒト適合されたIgGl抗体)、11B8 IgGl WO 2004/035607号に開示されるような)、及び AT80 IgGlを包含する。
【００３７】
好ましくは、前記タイプII抗−CD20抗体は、ヒト適合されたB-Ly1抗体と同じエピトープに結合されるモノクローナル抗体である（WO2005/044859号に開示されるような）。タイプII抗体に比較してタイプI抗−CD20抗体は、リツキシマブに比較して、0.8〜1.2、好ましくは0.9〜1.1の前記II抗−CD20抗体のRaji細胞（ATCC−No. CCL-86）上のCD20への結合能力の比率を有する。そのようなタイプI抗−CD20抗体の例は、例えばリツキシマブ、1F5 IgG2a (ECACC, hybridoma; Press, et al., Blood 69/2 (1987) 584-591)、HI47 IgG3 (ECACC、ハイブリダーマ)、2C6 IgGl (WO 2005/103081号に開示されるような)、2F2 IgGl (WO 2004/035607号WO 2005/103081号に開示されるような) 及び2H7 IgGl (WO 2004/056312号に開示されるような)を包含する。
【００３８】
“抗−CD20抗体のRaji細胞（ATCC−No. CCL-86）上のCD20への結合能力の比率”は、例２に記載されるように、Raji細胞（ATCC-No. CCL-86）と共にFACSArray(Becton Dickinson)においてCy5により接合される抗−CD20抗体、及びCy5により接合されるリツキシマブを用いて、直接的免疫蛍光測定（平均蛍光強度（MFI）が測定される）により決定され、そして次の通りに計算される：
【００３９】
Raji細胞（ATCC−No. CCL-86）上のCD20への結合能力の比率＝MFI（Cy5−抗−CD20抗体）/MFI（Cy5-リツキシマブ）×Cy5−ラベリング比率（Cy5-リツキシマブ）/Cy5−ラベリング比率（Cy5−抗−CD20抗体）。
MFIは平均蛍光強度である。“Cy5−ラベリング比率”とは、本明細書において使用される場合、分子抗体当たりCy5−ラベル分子の数を意味する。
【００４０】
典型的には、前記タイプII抗体は、リツキシマブ（rituximab）に比較して、0.3〜0.6、好ましくは0.35〜0.55、より好ましくは0.4〜0.5の前記タイプII抗−CD20抗体のRaji細胞（ATCC−No. CCL-86）上のCD20への結合能力の比率を有する。
好ましい態様においては、前記タイプII抗−CD20抗体、好ましくはヒト適合されたB-Ly1抗体は、高められた抗体依存性細胞毒性（ADCC）を有する。
【００４１】
“高められた抗体依存細胞毒性（ADCC）を有する抗体”とは、その用語が本明細書において定義される場合、当業者に知られているいずれかの適切な方法により決定される場合、高められたADCCを有する抗体を意味する。１つの許容されるインビトロADCCアッセイは、次の通りである：
【００４２】
１）前記アッセイは、抗体の抗原−結合領域により認識される標的抗原を発現することが知られている標的細胞を使用し；
２）前記アッセイは、エフェクター細胞として、ランダムに選択された健康ドナーの血液から単離されたヒト末梢血液単核細胞（PBMC）を使用し；
３）前記アッセイは、次のプロトコールに従って実施され：
【００４３】
i)PBMCが標準の密度遠心分離方法を用いて単離され、そしてRPMI細胞培養培地に５×106個の細胞/mlで懸濁され；
ii)標的細胞が標準の組織培養方法により増殖され、90％以上の生存性を有する指数増殖期から収穫され、RPMI細胞培養培地により洗浄され、100μCiの51Crによりラベルされ、細胞培養培地により２度、洗浄され、そして細胞培養培地に105個の細胞/mlの密度で再懸濁され；
【００４４】
iii)100μlの上記最終標的細胞懸濁液が、96ウェルマイクロタイタープレートの個々のウェルに移され；
iv)抗体が、細胞培養培地により、4000ng/ml〜0.04ng/mlまで連続的に希釈され、そして50μlのその得られる抗体溶液が、96ウェルマイクロタイタープレートにおける標的細胞に添加され、上記全濃度範囲をカバーする種々の抗体濃度で三重反復して試験され；
【００４５】
v)最大開放（MR）対照に関しては、ラベルされた標的細胞を含むプレートにおける３個の追加のウェルが、抗体溶液（上記iv）の代わりに、非イオン性界面活性剤（Nonidet, Sigma, St. Louis）の２％（VN）水溶液50μlを受け；
vi)自発的開放（SR）対照に関しては、ラベルされた標的細胞を含むプレートにおける３個の追加のウェルが、抗体溶液（上記iv）の代わりに、RPMI細胞培養培地50μlを受け；
【００４６】
vii)次に96−ウェルマイクロタイタープレートが、50xyで１分間、遠心分離され、そして4℃で１時間インキュベートされ；
viii)50μlのPBMC懸濁液（上記i）が個々のウェルに添加され、25：１のエフェクター：標的細胞比率が得られ、そしてプレートが、5％CO2雰囲気下で37℃で４時間、インキュベーターに配置され；
ix)個々のウェルからの細胞フリー懸濁液が収穫され、そして実験的に開放された放射能（ER）が、γカウンターを用いて定量化され；
【００４７】
x)特定溶解の百分率が、式（ER-MR）/（MR-SR）×100に従って、個々の抗体濃度について計算され、ここでERはその抗体濃度について定量化された平均放射能（上記ixを参照のこと）であり、MRはMR対照（上記vを参照のこと）について定量化された平均放射能であり（上記ixを参照のこと）、そしてSRはSR対照（上記Viを参照のこと）について定量化された平均放射能であり（上記ixを参照のこと）；
【００４８】
４）“高められたADCC”とは、上記試験される抗体濃度範囲内で観察される特定溶解の最大百分率の上昇として、及び/又は上記試験される抗体濃度範囲内で観察される特定溶解の最大百分率の半分を達成するために必要とされる抗体濃度の低下として定義される。ADCCの上昇は、ADCCに対して相対的であり、当業者に知られている同じ標準の生成、精製、配合及び貯蔵方法を用いて、同じタイプの宿主細胞により生成されるが、しかしGnTIII を過剰発現するよう構築された宿主細胞によっては生成されていない、同じ抗体により介在される、上記アッセイにより測定される。
【００４９】
前記“高められたADCC”は、前記抗体の糖構及びアメリカ特許第6,602,684号に記載されるように、それらのオリゴ糖成分を構築することによりモノクローナル抗体の前記天然の細胞介在性エフェクター機能を増強することを意味する。
【００５０】
用語“補体−依存性細胞毒性（CDC）”とは、補体の存在下で、本発明の抗体によるヒト腫瘍標的細胞の溶解を言及する。CDCは好ましくは、補体の存在下で本発明の抗−CD20抗体によるCD20発現細胞の調製物の処理により測定される。CDCは、抗体が、４時間後、20％又はそれ以上の腫瘍細胞の溶解（細胞死）を、100nMの濃度で誘発する場合、見出される。前記アッセイは好ましくは、51Cr又はEuラベルされた腫瘍細胞及び開放される51Cr又はEuの測定により実施される。対照は、抗体を伴わないで、補体と共に腫瘍標的細胞をインキュベートすることを包含する。
【００５１】
典型的には、IgG1イソタイプのタイプII抗−CD20抗体は、特徴的CDC性質を示す。タイプII抗−CD20抗体は、IgG1イソタイプのタイプI抗体に比較して、低められたCDC（IgG1イソタイプの場合）を有する。好ましくは、タイプII抗−CD20抗体は、IgG1イソタイプ抗体である。
【００５２】
“リツキシマブ”抗体（参照抗体；タイプI抗−CD20抗体の例）は、ヒトCD20抗体に対して向けられた、遺伝子構築されたキメラヒトγ1ネズミ不変領域含有モノクローナル抗体である。このキメラ抗体は、ヒトγ1不変ドメインを含み、そしてIDEC Pharmaceuticals Corporationに譲渡された、1998年4月17日に発行されたアメリカ特許第5,736,137号（Andersen, K. C.,など.）において名称“C288”により同定される。リツキシマブは、再発されたか又は屈折する低グレード又は小胞性CD20陽性B細胞非ホジキンリンパ腫を有する患者の処理のために承認される。作用研究のインビトロ機構は、リツキシマブがヒト補体−依存性細胞毒性（CDC）を示すことを示している（Reff, et. al, Blood 83(2) (1994) 435-445）。さらに、抗体依存性細胞性（CDC）を測定するアッセイである。
【００５３】
用語“ヒト適合されたB-Ly1抗体”とは、IgG1からのヒト不変ドメインによるキメラ化、及び続くヒト適合化により、ネズミモノクローナル抗−CD20抗体B-Ly1（ネズミH鎖（VH）の可変領域：配列番号1；ネズミL鎖（VL）の可変領域：配列番号２；Poppema, S. and Visser, L., Biotest Bulletin 3 ( 1987) 131-139を参照のこと）から得られた、WO2005/044859号及びWO2007/031875号に開示されるようなヒト適合されたB-Ly1抗体を言及する（WO2005/044859号及びWO2007/031875号を参照のこと。それらの“ヒト適合されたB-Ly1抗体”は、WO2005/044859号及びWO2007/031875号に、詳細に開示される。
【００５４】
好ましくは、“ヒト適合されたB-Ly1抗体”は、配列番号３〜20の群から選択されたH鎖（VH）の可変領域（WO2005/044859号及びWO2007/031875号）のB-HH2〜B-HH9及びB-HL8〜B-HL17)。特に、配列番号3, 4, 7, 9, 11, 13及び15（WO2005/044859号及びWO2007/031875号のB-HH2、BHH-3、B-HH6、B-HH8、B-HL8、B-HLIl 及び B-HL13）が好ましい。好ましくは、“ヒト適合されたB-Ly1抗体”は、配列番号20のL鎖（VL）の可変領域（WO2005/044859号及びWO2007/031875号のB-KV1）を有する。さらに、ヒト適合されたB-Ly1抗体は好ましくは、IgG1抗体である。
【００５５】
好ましくは、そのようなヒト適合されたB-Ly1抗体は、WO 2005/044859号、WO 2004/065540号、 WO 2007/031875号、Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 及び WO 99/154342号に記載される方法に従って、Fc領域において糖構築（GE）される。そのような糖構築された、ヒト適合B-Ly1抗体は、好ましくは低められたレベルのフコース残基を有する、Fc領域における変更されたパターンのグリコシル化を有する。好ましくは、少なくとも40％又はそれ以上（１つの態様においては、40％〜60％、もう１つの態様においては少なくとも50％、及びさらにもう１つの態様においては、少なくとも70％又はそれ以上）のFc領域のオリゴ糖はフルコシル化されない。さらに、Fc領域のオリゴ糖は好ましくは、二等分割される。
【００５６】
オリゴ糖成分は有意には、治療用糖タンパク質の効力に関連する性質、例えば物理的安定性、プロテアーゼ攻撃に対する耐性、免疫システムとの相互作用、薬物力学及び特定の生物学的活性に影響を及ぼすことができる。そのような性質は、オリゴ糖の存在又は不在のみならず、またオリゴ糖の特定構造にも依存する。オリゴ糖構造と糖タンパク質機能との間のいくつかの一般論が構成され得る。例えば、あるオリゴ糖構造は、特定の炭水化物結合タンパク質との相互作用を通して血流からの糖タンパク質の急速なクリアランスを仲介し、そして他の構造は抗体により結合され、そして所望しない免疫反応を誘発する（Jenkins, N., et al., Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-981）。
【００５７】
哺乳類細胞は、ヒト適用のために最も適合できる形でタンパク質をグリコシル化するそれらの能力のために、治療用糖タンパク質の生成のための好ましい宿主である（Cumming, D.A., et al., Glycobiology 1 (1991) 115- 130; Jenkins, N., et al., Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-981）。細菌は非常にまれにタンパク質をグリコシル化し、そして他のタイプの通常の宿主、例えば酵母、糸状菌、昆虫及び植物細胞のように、血流からの急速なクリアランスに関連するグリコシル化パターン、所望しない免疫相互作用及び、ある特定の場合、低められた生物学的活性をもたらす。哺乳類細胞間で、チャイニーズ・ハムスター卵巣（CHO）細胞が、過去20年間、最も共通して使用されてきた。
【００５８】
適切なグリコシル化パターンを付与する他に、それらの細胞は、遺伝子的に安定した、高い生産性のクローン細胞系の一定した生成を可能にする。それらは、血清フリー培地を用いて単純な生物反応器において高い密度に培養され得、そして安全且つ再生可能生物工程の開発を可能にする。他の共通して使用される動物細胞は、子供ハムスター肝臓（BHK）細胞、NSO-及びSP2/0−マウス骨髄腫細胞を包含する。より最近には、トランスジェニック動物からの生成がまた試験されている（Jenkins, N., et al., Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-981）。
【００５９】
すべての抗体はH鎖不変領域における保存された位置に炭水化物構造体を含み、そして個々のイソタイプは、タンパク質アセンブリー、分泌又は機能的活性に影響を及ぼす、明確なアレイのN−結合された炭水化物構造体を有する（Wright, A., and Monison, S. L., Trends Biotech. 15 (1997) 26-32）。典型的には、付随するN−結合される炭水化物の構造は、プロセッシングの程度に依存して相当に変化し、そして高−マンノース、多様−枝分れ、及び二触角状複合オリゴ糖を包含する（Wright, A., and Morrison, S. L., Trends Biotech. 15 (1997) 26-32）。典型的には、モノクローナル抗体さえ、多重糖形として存在するよう、特定のグリコシル化部位で結合されるコアーオリゴ糖構造体の異種プロセッシングが存在する。同様に、抗体グリコシル化における主要差異は細胞系間で存在し、そしてマイナーな差異でさえ、異なった培養条件下で増殖される所定の細胞系に見られることが示されている（Lifely, M. R., et al., Glycobiology 5 (1995) 813-822）。
【００６０】
単純な生成工程を維持し、そして所望しない副作用を潜在的に回避しながら、大きな上昇能力を得るための１つの手段は、Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 及びアメリカ特許第6,602,684号に記載されるように、それらのオリゴ糖成分を構築することにより、モノクローナル抗体の天然の細胞介在性エフェクター機能を増強することである。IgG1タイプの抗体、すなわち癌免疫療法において最も共通して使用される抗体は、個々のCH2ドメインにおけるAsn297で保存されたN−結合されたグリコシル化部位を有する糖タンパク質である。
【００６１】
Asn297に結合される２種の複合ニ蝕角状オリゴ糖は、CH2ドメイン間に包含され、ポリペプチド主鎖との集中的な接触を形成し、そしてそれらの存在が、エフェクター機能、例えば抗体依存性細胞毒性（ADCC)を介在する抗体のために必須である（Lifely, M. R., et al., Glycobiology5 (1995) 813-822; Jefferis, R., et al., Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76; Wright, A., and Morrison, S. L., Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32）。
【００６２】
β（１，４）−N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII （“GnTIII 7y）、すなわち二分割されたオリゴ糖の形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼのチャイニーズ・ハムスター卵巣（CHO）細胞における過剰発現が、構築されたCHO細胞により生成された抗神経芽腫キメラモノクローナル抗体（chCE7）のインビトロADCC活性を有意に高めることはこれまで示されている（Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 ( 1999) 176-180; 及び WO 99/154342号（それらは引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
【００６３】
抗体chCE7は、高い腫瘍親和性及び特異性を有するが、しかしGnTIII 酵素を欠いている標準の産業用細胞系において生成される場合、臨床学的に有用であるためには低過ぎる能力を有する多くの種類の末接合モノクローナル抗体に属する（Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180）。この研究は、ADCC活性の大きな上昇性が、不変領域（Fc）−結合された、ニ分割されたオリゴ糖、例えばニ分割された非−フコシル化されたオリゴ糖に比例して、天然に存在する抗体に見出されるレベル以上の上昇を導く、GnTIII を発現するための抗体生成細胞を構築することにより得られることを最初に示した。
【００６４】
用語“Bcl-2”とは、本明細書において使用される場合、Bcl-2タンパク質（Swiss Prot ID No.P10415）、すなわちBcl-2ファミリーメンバーのタンパク質を言及する（Cory, S., and Adams, j.M., Nature Reviews Cancer 2 (2002) 647-656; Adams, Genes und Development 17 (2003) 2481-2495; Danial, N.N., and Korsmeyer, S.J., Cell 116 (2004) 205-219; Petros, A. M., Biochim Biophys Acta 1644 (2004) 83-94）。
【００６５】
用語“抗−Bcl-2活性剤”は、“抗−Bcl-2アンチセンスヌクレオチド”、及び“Bcl-2インヒビター”を含んで成る。“抗−Bcl-2アンチセンスヌクレオチド”は、Bcl-2 mRNAレベルをダウン−レギュレートし、そしてBcl-2タンパク質発現を低める。そのような抗−Bcl-2アンチセンスヌクレオチドの例は、Oblimersen及びSPC−2996を包含する。用語“Bcl-2インヒビター”とは、本明細書において使用される場合、Bcl-2（“Bcl-2タンパク質リン酸化インヒビター”）、例えばRTA-402のリン酸化の阻害により、又はBcl-2タンパク質への結合、及び従って、Bad/Bcl-2複合体の破壊（それらは、“Bcl-2タンパク質インヒビター”として言及される）により、Bcl-2タンパク質相互作用活性を阻害する剤を言及する。
【００６６】
好ましくは、前記Bcl-2インヒビターは、Bcl-2タンパク質結合インヒビターである。そのようなBcl-2タンパク質結合インヒビターの直接的結合を通してのBcl-2阻害活性は、競争結合アッセイを通して測定され得る。従って、Bcl-2タンパク質活性の阻害のIC50は、例３に従って相同時間分解された蛍光（HTRF）アッセイにより決定され得る。好ましくは、抗−Bcl-2阻害活性のIC50は、5μMK又は以下、より好ましくは1μM又はそれ以下である。そのようなBcl-2タンパク質結合インヒビターは、化合物、例えばGossypol、 AT-101、 Obatoclax メシラート、 A-371191、 A-385358、 A-438744、 ABT-737、 ABT-263、 AT-101、 BL-11、 BL-193、 GX-15-003、 2-Methoxyantimycin A3、 HA-14-1、 KF-67544、プルプロガリン、 TP-TW-37、 YC- 137 及び Z-24、 好ましくは ABT-263 及びABT-737、好ましくはABT-263及びABT-737を包含する。
【００６７】
Oblimersenは、Bcl-2発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチド、その配列及びその調製は、例えばWO 95/08350号、WO 1999/051259号、WO 2002/017852号、WO 2004/056971号及びアメリカ特許第5,734,033号に記載されている。Oblimersen（又は他の異名：Genansense, G-3139, Oblimersenナトリウム）は、本明細書において使用される場合、18マーのアンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド（この配列は、
【００６８】
5'-TCTCCCAGCGTGCGCCAT-3'である）のヘプタデカナトリウム塩；
ヒトBCL2 cDNAのフラグメント32−49nt（開始コドン領域）からのアンチセンスオリヌクレオチドのヘプタデカナトリウム塩；
d(P-チオ)(T-C-T-C-C-C-A-G-C-G-T-G-C-G-C-C-A-T) DNAヘプタデカナトリウム塩；
P-チオチミジリル-(3'--5')-2'-デオキシ-P-チオシチジリル-(3'--5')- P-チオチミジリル-(3'-5')-2'-デオキシ-P-チオシチジリル-(3'-5')-2'-デオキシ-P- チオシチジリル-(3'-5')-2'-デオキシ-P-チオシチジリル-(3'-5')-2'-デオキシ-P-チオアデニリル-(3'- -5')-2'-デオキシ-P-チオグアニリル-(3'-5')-2'-デオキシ-P-チオシチジリル-(3'-5')-2'-デオキシ-P- チオグアニリル-(3'-5')-P-チオチミジリル-(3'-5')-2'-デオキシ-P-チオグアニリル-(3'-5')-2'- デオキシ-P-チオシチジリル-(3'-5')-2'-デオキシ-P-チオグアニリル-(3'-5')-2'-デオキシ-P- チオシチジリル-(3'-5')-2'-デオキシ-P-チオシチジリル-(3'--5')-2'-デオキシ-P-チオアデニリル-(3'- -5')-チミジンヘプタデカナトリウム塩を意味する。
【００６９】
SPC−2996、すなわちアンチセンスオリゴヌクレオチドは、16マーのアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであり、この配列は5'-CTCCCAACGTGCGCCA-3'であり、そしてヌクレオチド１，２，14及び15はヌクレアーゼ消化に対する増強された耐性を有するロックされた核酸（LNA）ヌクレオチドである。このアンチセンスLNAオリゴヌクレオチドは、ヒトBcl-2のヌクレオチド33-48（コード配列）を標的化する。
【００７０】
RTA-402は、本明細書において使用される場合、次のものを意味する：CDDO-Me、すなわちC28-トリテルペノイドのメチルエステル：オレアナントリテルペノイド２−シアノ−３，12−ジオキソオレアン−１，９−ジエン−28−オイック酸（CDDO）（例えば、Honda, T., Rounds BV Bore, L., et al. J Med Chem. 43 (2000) 4233-4246を参照のこと）を意味し、これはBcl-2タンパク質リン酸化を阻止する（Konopleva, M., et al., Blood 99 (2002) 326-35）。
【００７１】
ABT-737は、本明細書において使用される場合、N-[4-[4-(4'-クロロビフェニルl-2-イルメチル)ピペラジン- l-イル]ベンゾイル]-3-[3-(ジメチルアミノ)-l(R)-(フェニルスルファニルメチル)プロピルアミノ]-4- ニトロベンゼンスルホンアミド; 4-[4-(4'-クロロビフェニルl-2-イルメチル)ピペラジン-l-イル]-N- [3-[3-(ジメチルアミノ)-l(R)-(フェニルスルファニルメチル)プロピルアミノ]-4- ニトロフェニルスルホニル]ベンズアミド、下記式IのBcl-2インヒビター（WO 2006/099667号又はCorey, S., et al., Cancer Cell 8 (2005) 5-6に記載される）：
【００７２】
【化１】
0005416124.tif 000004
【００７３】
ABT-263は、本明細書において使用される場合、US2007/027,135号に記載される下記式IIのインヒビターを意味する：
【００７４】
【化２】
0005416124.tif 000005
【００７５】
A-371191は、本明細書において使用される場合、下記式III のBcl-2インヒビターを意味する：
【００７６】
【化３】
0005416124.tif 000006
【００７７】
A-385358は、本明細書において使用される場合、次のものを意味する：[(R)-4-(3-ジメチルアミノ-l-フェニルスルファニルメチル- プロピルアミノ)-N-[4-(4,4-ジメチル-ピペリジン-l-イル)-ベンゾイル]-3-ニトロベンゼン- スルホンアミド(例えば、Shoemaker, A.R., et al., Cancer Research 66 (2006) 8731-8739に開示される)、下記式IVのBcl-2インヒビター：
【００７８】
【化４】
0005416124.tif 000007
【００７９】
Gossypolは、本明細書において使用される場合、（＋）−Gossypol又は（−）−Gossypol（下記式VのBcl-2インヒビター）、又は純粋（＋）−Gossypol又は（−）−Gossypolのラセミ混合物を意味し、好ましくはGossypolは、純粋（−）−Gossypolを言及する：
【００８０】
【化５】
0005416124.tif 000008
【００８１】
AT-101は、本明細書において使用される場合、Ascenta Therapeutics AT-101の臨床学的鉛化合物、Bcl-2インヒビター及びR(−)−gossypalの誘導体を意味する。
【００８２】
Obatoclaxメシレート（又は他の異名：GX-015-070 ）は、本明細書において使用される場合、2-[2-(3,5-ジメチル-lH-ピロール-2-イルメチレン)-3-メトキシ-2H-ピロール-5-イル]- lH-インドールメタンスルホネート、Bcl-2 インヒビター（例えば、WO 2004/106328号、WO 2006/089397 号、及びWalensky, L.D., Cell Death and Differentiation, 13 (2006) 1339-1350に記載される）を意味する。
TW-37は、本明細書において使用される場合、下記式VIのBcl-2インヒビターを意味する：
【００８３】
【化６】
0005416124.tif 000009
【００８４】
BL-193は、本明細書において使用される場合、下記式VII のBcl-2インヒビターを意味する：
【００８５】
【化７】
0005416124.tif 000010
【００８６】
NSC-719664は、本明細書において使用される場合、２−メトキシ−アンチマイシンA3、すなわちアンチマイシンA3由来のBcl-2インヒビターを意味する。
YC-137は、例えばWalensky, L.D., Cell Death and Differentiation 13(2006) 1339-1350に記載される。
【００８７】
プロプロガリンは、例えばWalensky, L.D., Cell Death and Differentiation 13 (2006) 1339-1350に記載される。
HA-14-1は、例えばWalensky, L.D., Cell Death and Differentiation 13 (2006) 1339-1350に記載される。
【００８８】
Z-24は、本明細書において使用される場合、3Z−3−[（1H−ピロール−２−イル）メチリデン]−１−（１−ピペリジニルメチル）−１，３−2H−インドール−２−オン、すなわち下記式VIIIのBcl-2インヒビターを意味する：
【００８９】
【化８】
0005416124.tif 000011
【００９０】
好ましくは、抗−Bcl-2活性剤は、Oblimersen、 SPC- 2996、 RTA-402、 Gossypol、 AT-101 、 Obatoclaxメシレート、 A-371191、 A- 385358、 A-438744、 ABT-737、 AT-101、 BL-I l、 BL-193、 GX-15-003、 2- Methoxyantimycin A3、 HA- 14-1、 KF-67544、プルプロガリン、 TP-TW-37、 YC- 137 及び Z-24から選択される。
【００９１】
好ましくは、抗−Bcl-2活性剤は、5μM又はそれ以下の抗−Bcl-2阻害のIC50を有するBcl-2タンパク質結合インヒビターである。そのようなBcl-2タンパク質結合インヒビターは好ましくは、Gossypol、AT-IOl、Obatoclax メシレート、ABT-263 及びABT-737、より好ましくはABT-363又はABT-737ｋが選択される。
【００９２】
用語“C20抗原の発現”とは、それぞれ腫瘍又は癌、好ましくは非固形腫瘍からの細胞における、好ましくはT-又はB-細胞、より好ましくはB−細胞の細胞表面上のCD20抗原の発現の有意なしレベルを示すことが意図される。“CD20発現癌”を有する患者は、当業界において知られている標準アッセイにより決定され得る。例えば、CD20抗原発現は、免疫組織化学（IHC）検出、FACSを用いて、又はその対応するmRNAのPCRに基づく検出により測定される。
【００９３】
用語“CD20発現癌”とは、本明細書において使用される場合、癌細胞がCD20抗原の発現を示す、すべての癌を言及する。そのようなCD20発現癌は例えばリンパ腫、リンパ球性白血病、肺癌、 非小細胞肺 (NSCL) 癌、細気管支肺胞細胞癌、骨癌、 膵臓癌、皮膚癌、頭部又はネックの癌、 皮膚又は眼内の黒色腫、 子宮癌、 卵巣癌、直腸癌、肛門部の癌、 胃癌、 胃せん癌、結腸癌、 乳癌、 子宮癌、ファロピウス管の癌、子宮内膜の癌、頚部癌、 膣癌、外陰部癌、 ホジキンの疾患、 食道癌、 小腸癌、 内分泌系の癌、甲状腺、 副甲状腺癌、副腎癌、 柔組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、 前立腺癌、膀胱癌、腎臓及び輸尿管の癌、 腎細胞癌、 腎盂癌、中皮腫、 肝細胞癌、胆管癌、中枢神経系 (CNS)の腫瘍、脊椎軸腫瘍、脳幹膠腫、多形膠芽腫、星状細胞腫、神経鞘腫、 脳室上衣腫、髄芽腫、髄腹腫、扁平上皮癌、脳下垂体腺腫、 いずれかの上記癌の抗療性バーション、又は１又は複数の上記癌の組合せであり得る。
【００９４】
好ましくは、CD20発現癌は、本明細書において使用される場合、リンパ腫（好ましくは、B-細胞非ホジキンリンパ腫（NHL））及びリンパ球性白血病を言及する。そのようなリンパ腫及びリンパ球性白血病は、次のものを包含する：ａ）濾胞性リンパ腫、ｂ）小さな、非分割性細胞リンパ腫/バーキットリンパ腫（例えば、風土病性バーキットリンパ腫、散発性バーキットリンパ腫及び非−バーキットリンパ腫）、c）辺縁帯リンパ腫 (結節外辺縁帯B 細胞リンパ腫(粘液関連リンパ組織リンパ腫、MALT)、結節外辺縁帯B 細胞リンパ腫及び脾性辺縁帯リンパ腫)、d) マントル細胞リンパ腫 (MCL)、e)大細胞リンパ腫(B-細胞拡散性大細胞リンパ腫(DLCL)、拡散性混合された細胞リンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、一次縦隔性B 細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫-肺B-細胞リンパ腫) f) 毛状細胞リンパ腫、g ) リンパ球性リンパ腫、ワルデンストローム・マクログロブリン血症、h) 急性リンパ性白血病(ALL)、慢性リンパ性白血病(CLL)/ 小リンパ性白血病(SLL)、B-細胞前リンパ球性白血病、i) 形質細胞腫瘍、形質細胞性骨髄腫、多発性骨髄腫、プラズマ細胞腫、j)ホジキン病。
【００９５】
より好ましくは、CD20発現癌は、B−細胞非ホジキンリンパ腫（NHL）である。特にCD20発現癌は、マントル細胞リンパ腫（MCL）、急性リンパ球白血病（ALL）、慢性リンパ球性白血病（CLL）、B-細胞拡散性大細胞リンパ腫（DLCL）、バーキットリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、濾胞性リンパ腫、多発生骨髄腫、辺縁帯リンパ腫、移植後リンパ増殖性阻害（PTLD）、HIV関連のリンパ種、ワルデンストレームマクログロブリン血症、又は原発性CNSリンパ腫である。
【００９６】
用語“処理する”とは、本明細書において使用される場合、特にことわらない限り、患者における腫瘍、腫瘍転移又は他の癌原因性又は腫瘍性細胞の増殖の部分的又は完全な逆転、軽減、それらの進行の阻害、又は予防を意味する。用語“処理”とは、本明細書において使用される場合、特にことわらない限り、処理の行為を言及する。
【００９７】
用語“処理方法”又はその同等手段は、例えば癌に適用される場合、患者における癌細胞の数を減じるか又は排除するか、又は癌の症状を軽減するよう企画される方法又は作用を言及する。癌又は他の増殖性疾患の“処理方法”は、癌細胞又は他の疾患が実際、排除され、細胞又は疾患の数が実際、低められるか、又は癌又は他の疾患の症状が実際、軽減されることを必ずしも意味しない。しばしば、癌の処理方法は、低い成功の傾向を伴ってされ実施されるであろうが、しかし患者の病歴及びおおよその生存予期が与えられる場合でさえ、全体的に有用な作用を誘発するように思える。
【００９８】
用語“同時投与”とは、単一の製剤として、又は２種の別々の製剤として、前記タイプII抗−CD20抗−CD20及びBcl-2インヒビターの投与を言及する。同時投与は、同時又はいずれかの順序で連続的であり得、好ましくは、両（又はすべての）活性剤が生物学的活性を同時に発揮する間、一定の期間が存在する。前記タイプII抗−CD20抗体及び前記Bcl-2インヒビターは、同時に又は連続的に同時投与される（例えば、連続的注入を通して静脈内（i.v.）（抗体に関して静脈内、及びBcl-2インヒビターに関しては、実質的に静脈内、又はBcl-2インヒビターは経口投与される））。
【００９９】
両治療剤が連続的に同時投与される場合、その用量は、２回の別々の投与で同じ日に投与され、又は１つの剤が１日目に投与され、そして第２の剤が２〜７日目、好ましくは２〜４日目に同時投与される。従って、用語“連続的に”とは、第１の抗体の投与の７日以内、好ましくは第１の抗体の投与の４日以内を意味し；そして用語“同時に”とは同じ時間を意味する。タイプII抗−CD20抗体及びBcl-2インヒビターの維持用量に関しての用語“同時投与”とは、処理サイクルが両薬剤のために適切である場合、維持用量が、例えば毎週、同時に同時投与され得ることを意味する。または、Bcl-2インヒビターは例えば１〜３日ごとに投与され、そしてタイプII抗−CD20抗体は毎週投与される。または、維持用量は、１日又は数日以内に、連続的に同時投与される。
【０１００】
抗体が、研究者、獣医、医師又は他の臨床医により探求される、組織、システム、動物又はヒトの生物学的又は医学的応答を誘発するであろう、それぞれの化合物又は組合せの量である“治療的有効量”（又は単純には、“有効量”）で患者に投与されることは明白である。
【０１０１】
前記タイプII抗−CD20抗体及び前記Bcl-2インヒビターの同時投与の量、及び同時投与のタイミングは、処理される患者のタイプ（種、性別、年齢、体重、等）及び状態、及び処理される疾病又は病状の重症度に依存するであろう。前記タイプII抗−CD20抗体及び前記Bcl-2インヒビターは、１度に、又は一連の処理にわたって、患者に適切に同時投与される。疾病のタイプ及び重症度に依存して、1μg /kg 〜50 mg/kg (例えば、0.1-20 mg/kg)の前記タイプII抗−CD20抗体及び1 mg /kg 〜 200 mg/kg (例えば、10-150 mg/kg)のBcl-2インヒビターが、患者への両薬物の同時投与のための初期候補体用量である。投与が静脈内である場合、前記タイプII抗−CD20抗体又は前記Bcl-2インヒビターについての初期注入時間は、続く注入時間よりも長く、例えば初期注入に関しては約90分、及び続く注入に関しては約30分（初期注入が十分い耐性である場合）である。
【０１０２】
前記タイプII抗−20抗体の好ましい投与量は、約0.05mg/kg〜約30mg/kgの範囲であろう。従って、約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、10 mg/kg 又は 30mg/kgの１又は複数の用量（又はそのいずれかの組合せ）が、患者に同時投与され得る。前期Bcl-2インヒビターの好ましい投与量は、約20mg/kg〜約150mg/kgの範囲であろう。患者のタイプ（種、性別、年齢、体重、等）及び状態、及び抗−CD20抗体及びBcl-2インヒビターのタイプに依存して、前記抗−CD20抗体の投与量及び投与スケジュールは、Bcl-2インヒビターの投与量とは異なる。例えば、前記抗−CD20抗体は、例えば１〜３週ごとに投与され得、そして前記Bcl-2インヒビターは、毎日又は２〜７日ごとに投与され得る。より高い初期負荷用量、続く１又は複数回の低い用量がまた投与され得る。
【０１０３】
好ましい態様においては、薬剤は、CD20発現癌を有する患者における転移又は一層の播種を妨げるか又は低めるために有用である。薬剤は、そのような患者の生存期間を高め、そのような患者の無進行生存期間を高め、応答の持続期間を高め、生存性、無進行生存期間、応答割合の持続期間又は応答の持続期間により測定される場合、処理された患者の統計学的に優位な及び臨床額的に意味のある改良性をもたらすために有用である。
【０１０４】
本発明においては、追加の他の細胞毒性、化学療法又は抗癌剤、又はそのような剤の効果を高める化合物（例えばサイトカイン）が、CD20発現癌のタイプII抗−CD20抗体及びBcl-2インヒビター組合せ処理に使用され得る。そのような分子は、意図する目的のために効果的である量で、組合して適切に存在する。好ましくは、タイプII抗−CD20抗体及びBcl-2インヒビター組合せ処理は、そのような追加の細胞毒性、化学療法又は抗癌剤、又はそのような剤の効果を増強する化合物を伴わないで使用される。
【０１０５】
そのような剤は、例えば次のものを包含する：アルキル化剤又はアルキル作用を有する剤、例えばサイクロホスファマイド(CTX; 例えば Cytoxan（商標）)、クロラムブシル(CHL; 例えば leukeran（商標）)、シスプラチン(CisP; 例えば platinol（商標）) 、ブスルファン(例えば myleran（商標）)、メルファラン、 カルムスチン(BCNU)、ストレプトゾトシン、トリエチレンメラミン(TEM)、マイトマイシンC、及び 同様のもの; 
【０１０６】
代謝拮抗物質、 例えばメトトレキセート(MTX)、エトポサイド(VP16; 例えばvepesid（商標）)、 6-メルカプトプリン(6MP)、 6-チオグアニン (6TG)、シタラビン(Ara-C)、 5-フロロウラシル(5-FU)、カペシタビン(例えば Xeloda（商標）)、ダカルバジン(DTIC)、及び 同様のもの; 
【０１０７】
抗生物質、例えばアクチノマイシンD、ドキソルビシン(DXR; 例えば adriamycin（商標）)、ダウノルビシン(ダウノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシン及び 同様のもの; 
アルカロイド類、例えばビンカアルカロイド、例えばビンクリスチン(VCR)、ビンブラスチン、及び 同様のもの; 及び
他の抗腫瘍剤、例えばパクリタクセル(例えば taxol（商標）) 及びパクリタクセル誘導体、静細胞薬、グルココルチコイド、例えばデキサメタゾン(DEX; 例えばdecadron（商標）) 及び コルチコステロイド、例えばプレドニソン、ヌクレオシド酵素インヒビター、例えばヒドロキシ尿素、
【０１０８】
アミノ酸消耗酵素、例えばアスパラギナーゼ、ロイコボリン及び 他の葉酸誘導体、及び類似する、種々の抗腫瘍剤。次の剤はまた、追加の剤として使用され得る：アルニフォスチン（arnifostine） (例えばethyol（商標）)、 ダクチノマイシン、メクロエタミン(窒素マスタード)、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、ロムスチン(CCNU)、ドキソルビシンリポ例えば doxil（商標）)、 ゲムシタビン (例えば gemzar（商標）)、ダウノルビシンリポ (例えば daunoxome（商標）)、プロカルバジン、マイトマイシン、ドセタクセル(例えば taxotere（商標）)、 アルデスロイキン、カルボプラチン、オキサリプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、 CPT 11 (イリノテカン)、 
【０１０９】
10-ヒドロキシ7-エチル-カンプトテシン(SN38)、フロクシウリジン、フルダラビン、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、 インターフェロンβ、 インターフェロンα、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパルガセ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル。好ましくは、タイプII抗−CD20抗体及びBcl-2インヒビター組合せ処理が、そのような追加の剤を伴わないで使用される。
【０１１０】
上記細胞毒性及び抗癌剤、及びタンパク質キナーゼインヒビターのような抗増殖性標的物−特異的抗癌剤の化学療法レジメへの使用は一般的に、癌治療技術においては十分に特徴づけられており、そして本明細書におけるそれらの使用は、耐性及び有効性をモニターするために、及び投与路及び投与量を、いくらかの調節を伴って調整するために同じ考慮下にある。例えば、細胞毒性剤の実際の投与量は、組織培養方法を用いることにより決定される患者の培養される細胞応答に依存して変化することができる。一般的に、投与量は、追加の他の剤の不在下で使用される量に比較して、低められるであろう。
【０１１１】
効果的細胞毒性剤の典型的な投与量は、製造業者により推薦される範囲で存在し、そしてインヒドロ応答、又は動物モデルにおける応答により示される場合、約１オーダーまでの濃度又は量、低められ得る。従って、実際の投与量は、医薬の判断、患者の状態、及び一次培養された悪性細胞又は組織培養された組織サンプルのインビトロ応答性に基づく治療方法の有効性、又は適切な動物モデルに観察される応答性に依存するであろう。
【０１１２】
本発明においては、有効量の電離放射線が使用され、そして/又は放射性医薬がCD20発現癌の組合せ処理に、タイプII抗−CD20抗体及びBcl-2インヒビターの他に使用され得る。放射線の源は、処理される患者の外部又は内部に存在する。その源が患者の外部に存在する場合、治療は外部ビーム放射線治療（EBRT）として知られている。放射線の源が患者の内部に存在する場合、処理は単距離放射線療法（BT）と呼ばれる。本発明において使用するための放射性原子は、ラジウム、セシウム−137、イリジウム−192、アメリシウム−241、金−198、コバルト−57、銅−67、テクネチウム−99、ヨウ素−123、ヨウ素−131及びインジウム−111から成る群から選択され得るが、但しそれらだけには限定されない。そのような放射性同位体により抗体をラベルすることもまた可能である。好ましくは、タイプII抗−CD20抗体及びBcl-2インヒビター組合せ処理が、そのような電離放射線なしに使用される。
【０１１３】
放射線療法は、切除できないか又は手術不可能な腫瘍及び/又は腫瘍転移を制御するための標準の処理法である。改良された結果が、放射線療法が化学療法と組合された場合、見出された。放射線療法は、標的領域に供給される高用量放射線が腫瘍及び正常組織における生殖細胞の死をもたらすであろう原理に基づかれる。放射線投与量レジメは一般的に、放射線吸収された用量（Gg）、時間及びフラクショネーションにより定義され、そして腫瘍学者により注意して定義されるべきである。患者が受ける放射線量は、種々の考慮に依存するが、しかし２つの最も重要なことは、身体の他の決定的な構造又は器官に関しての腫瘍の位置、及び腫瘍が拡散する程度である。
【０１１４】
放射線療法を受ける患者のための典型的な処理は、１〜６週間にわたっての処理スケジュールであり、そして10〜80Gyの合計用量が、１週５日間、約1.8〜2.0Gyの１回の毎日の用量で患者に投与される。本発明の好ましい態様においては、ヒト患者における腫瘍が本発明の組合せ処理及び放射線により処理される場合、相乗作用が存在する。言い換えれば、本発明の組合せを含んで成る剤による腫瘍増殖の阻害は、放射線、任意には追加の化学療法又は抗癌剤により組み合わされる場合、増強される。補助放射線治療のパラメーターが、例えばWO99/60023号に包含される。
【０１１５】
タイプII抗−CD20抗体は、既知方法に従って、ボーラスとしての静脈内投与により、又は一定期間にわたっての連続的注入により、筋肉内、腹腔内、脳脊髄、皮下、関節内、滑液包内又は鞘内路により、患者に投与される。抗体の静脈内又は皮下投与が好ましい。
Bcl-2インヒビターは、既知方法に従って、ボーラスとしての静脈内投与により、又は一定期間にわたっての連続的注入により、筋肉内、腹腔内、脳脊髄、皮下、関節内、滑液包内、鞘内又は経口路により、患者に投与される。Bcl-2インヒビターの静脈内、皮下又は経路投与が好ましい。
【０１１６】
本発明はさらに、CD20発現癌を有する患者の組み合わせ処理のための、タイプII抗−CD20抗体及び抗−Bcl−２活性剤を含んで成るキットを含んで成る。好ましい態様におては、キット容器はさらに、医薬的に許容できるキャリヤーを含むことができる。キットはさらに、好ましくは追加の別の容器に貯蔵される無菌希釈剤を含むことができる。キットはさらに、CD発現癌疾患、好ましくはB−細胞非ホジキンリンパ腫（NHL）のための方法としての組合された処理の使用を指図するプリントされた説明書を含んで成るパッケージ挿入物も包含する。
【０１１７】
用語“パッケージ挿入物”とは、指示、使用法、用量、管理、禁忌及び/又は治療製品の使用に関する警告についての情報を包含することができる、治療製品のコマーシャル・パッケージに通例包含される説明書を言及する。
好ましい態様においては、製品容器はさらに、医薬的に許容できるキャリアーを含むことができる。製品はさらに、別の追加の容器に好ましくは貯蔵される無菌の希釈剤を含むことができる。
【０１１８】
本明細書において使用される場合、“医薬的に許容できるキャリヤー”とは、医薬投与に適合できるいずれか及びすべての材料、例えば溶媒、分散媒体、被覆剤、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤、及び医薬投与と適合できる他の材料及び化合物を包含する。いずれかの従来の媒体又は剤が活性化合物と適合できない限り、本発明の組成物へのその使用は企画されない。補助活性化合物がまた、組成物中に組み込まれ得る。
【０１１９】
医薬組成物：
医薬組成物は、本発明のタイプII抗−CD20抗体及び/又は抗−Bcl-2活性剤、及び医薬的に許容できる無機又は有機キャリヤーを加工することにより得られる。ラクトース、コーンスターチ又はその誘導体、タルク、ステアリン酸又はその塩、及び同様のものが、例えば、錠剤、被覆された錠剤、糖剤及びハードゼラチンカプセルのためのキャリヤーとして使用され得る。ソフトゼラチンカプセルのための適切なキャリヤーは例えば、植物油、ワックス、脂肪、半固体及び液体ポリオール及び同様のものである。活性物質の性質に依存して、キャリヤーは、ソフトゼラチンカプセルの場合、通常必要とされない。溶液及びシロップの製造のための適切なキャリヤーは、例えば水、ポリオール、グリセロール、植物油及び同様のものである。坐薬のための適切なキャリヤーは、例えば天然又は硬化油、ワックス、脂肪、半液体又は液体ポリオール及び同様のものである。
【０１２０】
医薬組成物はさらに、保存剤、溶解剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、風味剤、浸透圧を変えるための塩、緩衝液、マスク剤又は酸化防止剤を含むことができる。それらはまた、さらに他の治療的に価値ある物質を含むことができる。
本発明の１つの態様は、特にCD20発現癌への使用のための、前記タイプII抗−CD20抗体及び前記抗−Bcl-2活性剤の両者を含んでなる医薬組成物である。
【０１２１】
前記医薬組成物はさらに、１又は複数の医薬的に許容できるキャリヤーを含んで成る。
本発明はさらに、（i）第一の有効量のタイプII抗−CD20抗体、及び（ii）第２の有効量の抗−Bcl-2活性剤を含んで成る、特に癌への使用のための医薬組成物を供給する。そのような組成物は任意には医薬的に許容できるキャリヤー及び/又は賦形剤を含んで成る。
【０１２２】
本発明に従って使用されるタイプII抗−CD20抗体のみの医薬組成物は、所望する程度の純度を有する抗体と、任意な医薬的に許容できるキャリヤー、賦形剤又は安定剤（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)）とを混合することにより、凍結乾燥された製剤又は水溶液の形での貯蔵のために調製される。
【０１２３】
許容できるキャリヤー、賦形剤又は安定剤は、使用される用量及び濃度で賦形剤に対して非毒性であり、そして緩衝液、例えばリン酸、クエン酸及び他の有機酸緩衝液；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸及びメチオニン；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム塩化物；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンズエトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びm−クレゾール）；低分子量（約10個以下の残基）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニル、又はリシン；単糖、ニ糖及び他の炭水化物、例えばグルコース、マンノース又はデキストリン；キレート例、例えばEDTA；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成カウンターイオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えば、Zn−タンパク質錯体）；及び/又は非イオン性界面活性剤、例えばTWEENTM、PLURONICSTM又はポリエチレングリコール（PEG）を包含する。
【０１２４】
抗−Bcl-2活性剤のみ、例えばBcl-2インヒビターの医薬組成物は、それらの医薬性質に依存し；例えば小さな化合物、例えばABT−737又はABT-263に関しては、１つの配合物は例えば、次のものである；
【０１２５】
【表３】
0005416124.tif 000012
【０１２６】
製造方法：
１．品目１，２，３及び４を混合し、そして精製水と共に粒状化する。
２．前記粒状物を50℃で乾燥する。
３．前記粒状物を、適切なミル装置を通して圧縮する。
４．品目５を添加し、そして３分間、混合し；適切な圧力下で圧縮する。
【０１２７】
【表４】
0005416124.tif 000013
【０１２８】
製造方法：
１．品目１，２及び３を、適切なミキサーにおいて30分間、混合する。
２．品目４及び５を添加し、そして３分間、混合する：
３．適切なカプセル中に充填する。
本発明の１つのさらなる態様においては、本発明の医薬組成物は、前記タイプII抗−CD20抗体及び前記Bcl-2インヒビターについて２種の別々の配合物である。
【０１２９】
活性成分はまた、例えばコアセルベーション技法又はインターレイシャル重合により調製されたマイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに、コロイド状薬物供給システム（例えば、ポリソール、アルブミン微小球体、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに封入され得る。そのような技法は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示される。
【０１３０】
持効性製剤が調製され得る。持効性製剤の適切な例は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスを包含し、ここで前記マトリックスは、造形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形で存在する。持効性マトリックスの例は、次のものを包含する：ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（アメリカ特許第3,773,919号）、L−グルタミン酸及びγ−エチル−L−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOTTM（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから構成される注入できる微小球体）、及びポリ−D−（−）−３−ヒドロキシ酪酸。
【０１３１】
インビボ投与のために使用される製剤は無菌性であるべきである。これは、無菌濾過膜を通しての濾過により容易に達成される。
本発明はさらに、（i）第１の有効量のタイプII抗−CD20抗体；及び（ii）第２の有効量の抗−Bcl-2活性剤を、癌の処理の必要な対象に投与することを含んで成る、癌の処理方法を提供する。
【０１３２】
本発明はさらに、（i）第１の有効量のタイプII抗−CD20抗体；及び（ii）第２の有効量の抗−Bcl-2活性剤を、癌の処理の必要な対象に投与することを含んで成る、癌の処理方法を提供する。
【０１３３】
用語“患者”とは、本明細書において使用される場合、好ましくは、いずれかの目的のためのタイプII抗−CD20抗体による処理の必要なヒト（例えば、CD20発現癌を有する患者）、及びより好ましくは、癌、又は前癌状態又は病巣を処理するために、そのような処理を必要とするヒトを言及する。しかしながら、用語“患者”とはまた、中でも非ヒト動物、好ましくは哺乳類、例えばイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、羊及び非ヒト霊長類を言及する。
【０１３４】
本発明はさらに、CD20発現癌の処理のためのタイプII抗−CD20抗体、及び抗−Bcl-2活性剤を含んで成る。
本発明はさらに、CD20発現癌を有する患者の処理のためのタイプII抗−CD20抗体、及び抗−Bcl-2活性成分を含んで成る。
【０１３５】
本発明はさらに、CD20発現癌の処理への使用のためのタイプII抗−CD20抗体及び抗−Bcl-2活性剤を含んで成る。
本発明はさらに、CD20発現癌を有する患者の処理への使用のためのタイプII抗−CD20抗体及び抗−Bcl-2活性剤を含んで成る。
【０１３６】
好ましくは、前記抗−Bcl-2活性剤は、Oblimersen、 SPC- 2996、 RTA-402、 Gossypol、 AT-101 、 Obatoclaxメシレート、 A-371191、 A- 385358、 A-438744、 ABT-737、 AT-101、 BL-I l、 BL-193、 GX-15-003、 2- Methoxyantimycin A3、 HA- 14-1、 KF-67544、プルプロガリン、 TP-TW-37、 YC- 137 及び Z-24から選択される。
好ましくは、抗−Bcl-2活性剤は、５μM又はそれ以下の抗−Bcl-2阻害活性のIC50を有するBcl-2タンパク質結合インヒビターである。そのようなBcl-2タンパク質結合インヒビターは、好ましくは、Gossypol、AT-101、Obatoclaxメシレート、ABT-263及びABT-737、より好ましくはABT-263又はABT-737から選択される。
【０１３７】
好ましくは、前記タイプII抗−CD20抗体は、リツキシマブに比較して、0.3〜0.6、より好ましくは0.35〜0.55及びさらにより好ましくは0.4〜0.5の前記タイプII抗−CD20抗体のRaji細胞（ATCC−No. CCL-86）上のCD20への結合能力の比率を有する。
好ましくは、前記タイプII抗−CD20抗体は、ヒト適合されたB-Ly1抗体である。
好ましくは、前記タイプII抗−CD20抗体は、高められた抗体依存性細胞毒性（ADCC）を有する。
【０１３８】
好ましくは、前記タイプII抗−CD20抗体は、モノクローナル抗体である。
次の例、配列の列挙及び図は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は付随する請求項に示されている。修飾が本発明の範囲内で行われ得ることが理解される。
【０１３９】
配列の列挙：
配列番号１：ネズミモノクローナル抗-CD20抗体B-Ly1のH鎖の可変領域（VH）のアミノ酸配列。
配列番号２：ネズミモノクローナル抗-CD20抗体B-Ly1のL鎖の可変領域（VL）のアミノ酸配列。
配列番号３−19：ヒト適合されたB-Ly1抗体（B-HH2〜B-HH9、B-HL8及びB-HLlO 〜B-HL17）のH鎖の可変領域（VH）のアミノ酸配列。
配列番号20：ヒト適合されたB-Ly1抗体B-KV1のL鎖の可変領域（Vl）のアミノ酸配列。
【実施例】
【０１４０】
例１：
タイプII抗−CD20抗体（B-HH6-B-KV1 GE）とBcl-2インヒビター（ABT-737）との組合された処理の抗腫瘍活性。
試験剤：
タイプ II 抗-CD20 抗体 B-HH6-B-KV1 GE (=ヒト適合された B-Ly1、糖構築された B-HH6-B-KV1、WO 2005/044859号及びWO 2007/031875号を参照のこと)は、GlycArt, Schlieren, Switzerlandからの原液（ｃ＝9.4mg/ml）として供給された。抗体緩衝液は、ヒスチジン、トレハロース及びポリソルベート20を含んだ。抗体液体は、注入の前、原液からPBSにより適切に希釈された。
Bcl-2インヒビターABT-737は、化学粉末として供給され、そしてｃ＝10mg/mlを有する、5％グルコース溶液中、1.5％DMSO、5％Tween80、 30％１，２−プロパンジオールにおいて配合された。
【０１４１】
細胞系及び培養条件：
SU-DHL-4 ヒト 非-ホジキン-リンパ腫 (NHL) 細胞 (Chang, H., et al., Leuk. Lymphoma.8 (1992) 129-136)は、DSMZ, Braunschweigから提供された。腫瘍細胞系は、10％ウシ胎児血清（PAA Laboratories, Austria）及び2mMのL−グルタミンにより補充されたRPMI培地（PAA Laboratories, Austria）において、5％CO2で水飽和された雰囲気下で37℃で、通常通り培養された。継代５が移植のために使用された。
【０１４２】
動物：
雌のSCIDベージュマウス；年齢、生後４〜５週（Bomholtgard, Ry, Denmarkから購入された）を、遂行されるガイドライン（GV-Solas; Felasa；TierschG）に従って、12時間の明/12時間の暗の毎日のサイクルを伴って、特定病原フリーの条件下で維持した。実験研究プロトコールが、地方自治体により再考され、そして認可された。到着の後、動物は、１週間、動物飼育施設の検疫部分に維持され、新しい環境及び観察のために慣らされた。連続した健康モニターリングを通常通りに実施した。ダイエット食品（Provimi Kliba 3337）及び水（酸性化された、pH2.5〜3）は自由に与えられた。
【０１４３】
モニターリング：
動物は、臨床学的微候及び副作用の検出のために毎日、調整された。実験を通してモニターするために、動物の体重が、週２度、記録され、そして腫瘍体積は、病期分類の後、キャリパにより測定された。
【０１４４】
動物の処理：
動物の処理は、細胞移植の22日後、ランダムな日に開始した。単一の剤としての又は組合してのヒト適合されたタイプII抗−CD20抗体B-HH6-B-KV1 GE受容のグループ及びその対応ビークルグループが、10mg/kgの指示される投与量で、研究日22、 29、36及び43で、i.v.q7d処理された。Bcl-2インヒビターABT-737が、100mg/kgで２日ごとに（日23〜33、q2d）、及び低い耐性のために、50mg/kgの低められた用量で日41まで、i.p.投与された。
【０１４５】
インビボでの腫瘍増殖阻害研究：
ビークル対照を受ける腫瘍担持動物は、腫瘍負荷のために処理開始の15日後、除外された。単一の剤として週１度、B-HH6-B-KV1 GE（10mg/kg）による動物の処理は、対照に比較して、14日間異種移植片増殖を有意に阻害した（TGI87％）。しかしながら、毎週の抗体処理にもかかわらず、SU-DHL-4異種移植片は連続して成長した。対照的に、100mg/kgでの２日ごとに与えられるBcl-2インヒビターによる単一剤処理は、わずかに活性的であり、そして腫瘍は対照に類似して、連続的に増殖する。単一剤としての両化合物の適度な活性にもかかわらず、SU-DHL-4リンパ腫異種移植片は、組合せ下で完全な軽減を受けた。B-HH6-B-KV1 GE（10mg/kg）による毎週の処理及び２日ごとのBcl-2インヒビタ−ABT-737の注入は、最初の週以内にリンパ腫後退が生じ、そして続く組合せ処理機関において、すべてのSU-DHL-4腫瘍は腫瘍の完全な軽減を示し、そして再増殖は観察されなかった。
【０１４６】
例２：
リツキシマブに比較してタイプII抗−CD20抗体のRaji細胞（ATCC-No.CCL-86）上のCD20への結合能力の比率の決定：
Raji細胞（ATCC-No. CCL-86）を、10％FCS（Gibco, カタログ番号10500−064）を含むRPMI-1640倍地（PanBiotech GmbH, カタログ番号 PO4- 18500）における培養において維持した。タイプ II 抗-CD20 抗体 B-HH6-B-KV1 (ヒト適合された B-Ly1 抗体 )及びリツキシマブを、Cy5 モノ  NHS  エステル (Amersham GE Healthcare, カタログ番号 PAl5101) を用いて、その製造業者の指針に従ってラベルした。Cy5−接合されたリツキシマブは、抗体当たり2.0分子Cy5のラベリング比率を有した。Cy5-接合されたB-HH6-B-KV1は、抗体当たり2.2分子Cy5のラベリング比率を有した。
【０１４７】
両抗体の結合能力及びモードを決定し、そして比較するために、結合曲線（Cy5-接合されたリツキシマブ及びCy5-接合されたB-HH6-B-KV1の滴定による）を、バーキットリンパ腫細胞系Raji（ATCC−No. CCL-86）を用いて、直接的免疫蛍光により製造した。平均蛍光強度（MFI）を、それぞれCy5-接合されたリツキシマブ及びCy5-接合されたB-HH6-B-KV1についてEC50（最大強度の50％）として分析した。サンプル当たり5*105個の細胞を４℃で30分染色した。その後、細胞を培養培地により洗浄した。ヨウ化プロピジウム（PI）染色を用いて、死亡細胞を除去した。測定を、FACSArray (Becton Dickinson)を用いて実施した。ヨウ化プロピジウム（PI）を、Far Red Aで、そしてCy5をRed−Aで測定した。図２は、Cy5-ラベルされたB-HH6-B-KV1(黒の棒)及びCy5−ラベルされたリツキシム（空白の棒）のEC50（最大強度の50％）で結合についての平均蛍光強度（MFI）を示す。
【０１４８】
次に、Raji細胞（ATCC-No. CCL-86）上のCD20への結合能力の比率を、次の式に従って計算する：
MFI（Cy5−抗−CD20抗体）/MFI（Cy5-リツキシマブ）×Cy5ラベリング比率（Cy5-リツキシマブ）/Cy5ラベリング比率（Cy5−抗−CD20抗体）＝MFI（B-HH6-B-KV1）/ MFI（Cy5-リツキシマブ）×Cy5ラベリング比率（Cy5−リツキシマブ）/Cy5ラベリング比率（B-HH6-B-KV1）＝207/433×2.2/2.0＝0.44
従って、典型的なタイプII抗−CD20抗体としてのB-HH6-B-KV1は、リツキシマブに比較して、結合能力を低めることを示す。
【０１４９】
例３：
Bcl-2インヒビター（ABT−737）の抗−Bcl-2阻害活性のIC50値の決定：
Bcl-2及びBcl-xL結合−HTRFアッセイ方法：
化合物調製プレート：
化合物は、100％DMSO下で10mMの原液から、1.8mMで出発して連続的に希釈される（３倍、10点）。
試薬：
Bcl-2アッセイ：
【０１５０】
１）Bcl-2アッセイのためのビオチニル化された−BADペプチド（Bio-BAD）（BAD＝細胞死のアンタゴニスト；BADタンパク質はBCL2及びBAXに関連するアポプトーシス誘発物質）：
・5OmMトリス- HCL緩衝液、ウシ血清アルブミン (BSA) 0.2mg/mL、ジチオトレイトール1 mM 及び9% DMSOを含むアッセイ緩衝液においてBio-BADペプチド（73.64nM）を調製する。
【０１５１】
２）His6−Bcl2：
・5OmMトリス-HCL、ウシ血清アルブミン(BSA) 0.2mg/mL、ジチオトレイトール1mMを含むアッセイ緩衝液においてHis6-Bcl2（180nM）を調製する。
３）ランスユウロピウム−ストレプトアビジン（EU-SA）及び抗−6His APC：
・5OmM トリス-HCL、 BSA 0.2mg/mL、Eu-SA 4.5nM 及び 抗-6His APC 67.5nMを含む検出緩衝液中、溶液を調製する。
【０１５２】
最終アッセイ濃度：Bio-BAD (22.5nM)、His6-Bc-12 (8OnM)、 EU-SA (1nM)、 APC (15nM)。
Bcl-xL：
１）Bcl-xLアッセイのためのビオチニル化された−BADペプチド（Bio-RAD）：
・5OmM トリス- HCL、BSA 0.2mg/mL、ジチオトレイトール1mM 及び9% DMSOを含むアッセイ緩衝液においてBio−BADペプチド（9.82nM）を調製する。
【０１５３】
２）HisBcl-xL：
・5OmMトリス-HCL緩衝液、BSA 0.2mg/mL、ジチオトレイトール1mMを含むアッセイ緩衝液においてHis6-Bcl-xL（22.5nM）を調製する。
３）ランスユウロピウム−ストレプトアビジン（EU-SA）及び抗−6His APC：
・5OmM トリス-HCL、BSA 0.2mg/mL、Eu-SA 3.4nM 及び 抗-6His APC 45nMを含む検出緩衝液中、溶液を調製する。
最終アッセイ濃度：Bio-BAD (3nM)、His6-Bcl-xL(10nM)、 EU-SA (0.75nM)、抗-6His APC (10nM)。
【０１５４】
方法：
トランスファープレート：384−ウェルプレートトランスファープレート中に、化合物予備プレートからの化合物5μlを移行し（又は薬物を含まない対照ウェル中に5μlの100％DMSOを移行し）、そして55μlのBio−BAD溶液を添加する。トランスファープレートからの12μlを、アッセイプレートに移し、そして16μlのHis6−Bcl2又はHis6-BclXLのいずれかを試験ウェルのために又はアッセイ緩衝液をブランクのために添加する。37℃で１時間インキュベートする。８μlのEU-SA/APC溶液/ウェルを添加し、そして室温で１時間インキュベートする。プレートを、340nmの励起及び665/615nmの発光で均質の時間分解蛍光（HTRF）のために適切なプレートリーダー上で読取る。
【０１５５】
最終化合物濃度：50、16.7、5.6、1.85、0.62、0.21、0.07、0.03、0.01、0.004μM。
クロストーク補正；複数ウェル中に、EU-SA/APCを伴って及び伴わないで、16μlのアッセイ緩衝液、12μlのBio-BAD、8μlの検出緩衝液を添加する。
結果：ABT-737を、Bcl-2及びBcl-xL阻害について試験した；IC50値を、非線状曲線形適合（XLfitソフトウェア（ID Business Solution Ltd.,Guilford, Surrey, UK））を用いて計算した。
ABT-737のIC50（Bcl-2）：0.040μM
ABT-737のIC50（Bcl-xL）：の0.019μM
【０１５６】
例４：
SCIDベージュマウスにおけるZ138MCL異種移植片に対する糖構築された（GE）及び非糖構築された（野生型、wt）抗-CD20抗体（B-HH6-B-KV1 GE及びwt）の類似する抗腫瘍活性：
【０１５７】
試験剤：
タイプII抗−CD20抗体B-HH6-B-KV1（糖構築された（GE）及び野生型（wt））を、GlycArt, Schlieren, Switzerlandからの原液（c=9.4mg/ml及び12.5mg/ml）として供給した。抗体緩衝液は、ヒスチジン、トレハロース及びポリソルベート20を含んだ。
【０１５８】
両溶液は、注入の前、原液から、PBSにより適切に希釈された。
細胞系及び培養条件：
Zl38 ヒト B-細胞 非-ホジキン-リンパ腫 (NHL)細胞は、元々、Glycart (マントル細胞リンパ腫-MCL)から得られた。腫瘍細胞系は、10％ウシ胎児血清（PAA Laboratories, Austria）及び2mMのL−グルタミンにより補充されたDMEM培地（PAA Laboratories, Austria）において、5％CO2で水飽和された雰囲気下で37℃で、通常通り培養された。継代２が移植のために使用された。
【０１５９】
動物：
雌のSCIDベージュマウス；年齢、生後４〜５週（Bomholtgard, Ry, Denmarkから購入された）を、遂行されるガイドライン（GV-Solas; Felasa；TierschG）に従って、12時間の明/12時間の暗の毎日のサイクルを伴って、特定病原フリーの条件下で維持した。実験研究プロトコールが、地方自治体により再考され、そして認可された。到着の後、動物は、１週間、動物飼育施設の検疫部分に維持され、新しい環境及び観察のために慣らされた。連続した健康モニターリングを通常通りに実施した。ダイエット食品（Provimi Kliba 3337）及び水（酸性化された、pH2.5〜3）は自由に与えられた。
【０１６０】
モニターリング：
動物は、臨床学的微候及び副作用の検出のために毎日、調整された。実験を通してモニターするために、動物の体重が、週２度、記録され、そして腫瘍体積は、病期分類の最初に、キャリパにより測定された。
【０１６１】
動物の処理：
動物の処理は、s.c.細胞移植の14日後、ランダムな日に開始した。ヒト適合された抗−CD20抗体(B-HH6-B-KV1 GE及び wt)受容のグループ及びその対応ビークルグループが、10mg/kgの指示される投与量で、研究日14、20、27及び34で、i.v.q7d処理された。
【０１６２】
インビボでの腫瘍増殖阻害研究：
ビークル対照を受ける腫瘍担持動物は、腫瘍負荷のために処理開始の19日後、除外された。10mg/kgでのwtとしての又は糖構築されたB−HH6-B-KV1（B-HH6-B-KV1 GE及びwt）による毎週の動物の処理は、処理の開始後すぐに、異種移植片の増殖を阻害した。すべての抗体の終結の時点で、腫瘍は退行し、そしてその後、Z138腫瘍異種移植片のほとんどでは、完全な軽減を示した。
【０１６３】
この異種移植片モデルにおける抗CD20抗体B-HH6-B-KV1のwtバージョンと糖構築されたバージョンとの間に有意な差異は観察されなかった。これはありそうもないわけではない。なぜならば、マウスはそれらのNK細胞上に正しいFc受容体を発現せず、そしてさらに、SCIDベージュマウスは重度の三重免疫欠損のためにNK−介在性ADCCに関して無能であると思われるからである。従って、SCIDベージュマウスにおけるs.c.異種移植片モデルは、糖構築され、修飾された抗体によるヒトADCC介在性効果を模倣するためには適切ではない。
【図１】
0005416124.tif 000018
【図２】
0005416124.tif 000019
【図３】
0005416124.tif 000020
【配列表】
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