(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クリプトキサンチン及び／又はクリプトキサンチンの脂肪酸エステルを含有するドライマウス若しくはドライアイの治療又は予防のための、アクアポリンの産生を促進する医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体内のアクアポリン産生を促進するアクアポリン産生促進剤に関し、また皮膚外用剤、飲食品、医薬品、飼料、サプリメント等に配合し、アクアポリンの産生能力を高める事のできるアクアポリン産生促進剤に関する。さらに詳しくは皮膚中に存在するアクアポリンの産生を促進し、保湿性や柔軟性の向上に関与するものである。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は人間の体内と体外を仕切る器官であり、細菌類などの外敵に対する免疫機能や、体内の水分の保持作用など多岐にわたる機能を有している。また皮膚は大きく分けて表皮・真皮・皮下組織の３層の構造をとっている。表皮はさらに体の内側から順に、基底層、有棘層、顆粒層、角質層という４つの層で構成されている。基底層に存在する細胞はおおよそ１４日間をかけ角質層直下まで移動し、さらに扁平な形態に変化しつつ１４日間で角質層中を外側に向かって移動し、最終的には垢などの形となって剥離する。このターンオーバーを継続する事で多岐にわたる皮膚の機能を支えている。
【０００３】
一方、ヒトでは１３種同定されている水チャネルであるアクアポリンだが、その種類は現在３種に大別される。一つは水分子のみを透過させるアクアポリン、もう一つは水分子のほかにグリセリンなどの低分子を透過させるアクアポリン、最後の一つは機能が未知なものである。（非特許文献１）
【０００４】
上記のように、皮膚の柔軟性、保水性の保持、外界からの異物の侵入の防御機構には、特に角質中の水分が重要である。角質は水の供給源となる血管を含まないため、角質への水の供給は主にアクアポリンの働きによる。
【０００５】
このアクアポリンは、アクアグリセロポリン（アクアポリン３）と呼ばれ、水とグリセリンを皮膚に供給することによって皮膚の保水性を維持する役割を果たしていることが明らかとなっている。（非特許文献２）
【０００６】
また老化によるアクアポリン発現量の減少などはその他の様々な疾患とも関係が深いことが知られている。例えば、ドライマウスやドライアイは分泌される唾液や涙の減少に伴って発生し、脳浮腫からの回復にはアクアポリンが必要であることも明らかとなっている。また脂肪細胞からのグリセロールの分泌を行うアクアポリン７、水晶体で発現しているアクアポリン０の減少に伴い白内障が発生する。（非特許文献３）
【０００７】
従来知られたアクアポリン産生促進剤としては、ノウゼンハレン科植物より得られる抽出物やオールトランスレチノイン酸が知られている。（特許文献１、非特許文献４）
しかしながら、前記抽出物は効果を発揮させるのには大量の投与が必要であったり、オールトランスレチノイン酸は使用を続けると腎不全や肝不全を引き起こすレチノイン酸症候群を引き起こす点で安全性に問題があるなど、安全で十分な効果を奏する化合物は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００４−１６８７３２号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ａｇｒｅ  Ｐ  ．  Ｐｒｏｃ  Ａｍ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｏｃ、３（１）、５−１３、２００６．
【非特許文献２】Ｈａｒａ−Ｃｈｉｋｕｍａ  Ｍ  ｅｔａｌ．，  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ．  ９７（７）  ４７９−８６  ２００５．
【非特許文献３】佐々木  成編  「水とアクアポリンの生物学」  中山書店
【非特許文献４】Ｂｅｌｌｅｍｅｒｅ  Ｇ  ｅｔａｌ．，  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  １２８（３）  ５４２−８  ２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、安全性が高く、継続摂取可能なアクアポリンの産生を促進する化合物を見出すことにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、このような課題を解決するために鋭意検討の結果、クリプトキサンチン及び／またはその誘導体がアクアポリンの産生促進作用を有することを見出し本発明に至った。
【００１２】
すなわち、本発明の第一は、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体を含有することを特徴とするアクアポリン産生促進剤を要旨とするものであり、好ましくはクリプトキサンチンがカンキツ類由来であり、さらに好ましくはカンキツ類が温州みかんである。
【００１３】
本発明の第二は皮膚のシミ、皺、肌荒れ、たるみなどの老化に伴う皮膚の増悪やドライマウス、ドライスキン、鼻腔乾燥に伴う出血、皮膚乾燥による掻痒感、気道乾燥による咳及び痰、肺水腫、脳浮腫、白内障、唾液分泌不全、メタボリックシンドローム、アトピー性皮膚炎、乾癬、乾皮症、魚鱗癬の治療又は予防に用いられる事を要旨とするものである。
【００１４】
本発明の第三は、前記したいずれかに記載のアクアポリン産生促進剤を含有する皮膚外用剤、飲食品、医薬品、又は飼料を要旨とするものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、アクアポリン産生促進作用が高いクリプトキサンチン及び／又はその誘導体を含有しているため、少量の摂取で効果が得られ、安全性が高く、また皮膚外用剤や飲食品、医薬品、飼料などに配合した場合に配合設計が容易であるという作用効果を得ることが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】培養細胞ＮＨＥＫへのβ−クリプトキサンチンの作用を示す図である。
【図２】培養細胞ＮＨＥＫへのオールトランスレチノイン酸の作用を示す図である。
【図３】培養細胞ＮＨＥＫへのβ−クリプトキサンチン及びその誘導体の作用を示す図である。
【図４】３次元ヒト皮膚モデルへのβ−クリプトキサンチンの作用を示す図である。
【図５】３次元ヒト皮膚モデルへのオールトランスレチノイン酸の作用を示す図である。
【図６】３次元ヒト皮膚モデルへのβ−クリプトキサンチン及びその誘導体の作用を示す図である。
【図７】β−クリプトキサンチン及びその誘導体の配合乳液の肌の水分量への影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。最初に第一の本発明であるアクアポリン産生促進剤について説明する。クリプトキサンチンはカロテノイドの１種である。本発明で用いられるクリプトキサンチンは、α型でもβ型でもよく、特に限定されるものではない。また、本発明で用いられるクリプトキサンチンの誘導体としては、クリプトキサンチンから誘導される化合物であれば特に限定されず、例えばクリプトキサンチンの脂肪酸エステルなどが挙げられ、具体的には、ステアリルエステル、パルミトイルエステル、ミリストリルエステル、ラウリルエステルなどの誘導体も含まれる。
【００１８】
本発明で用いられるクリプトキサンチン及び／又はその誘導体は、その由来については特に限定されないが、中でもカンキツ類由来のものが好ましい。本発明におけるカンキツ類とは、ミカン科などに属する植物を挙げることができる。より具体的には、温州みかん、イヨカン、夏みかん、オレンジ、カボス、カワバタ、キシュウミカン、清見、キンカン、グレープフルーツ、ゲッキツ、三宝柑、シイクワサー、ジャバラ、スウィーティー、スダチ、ダイダイ、タチバナ、デコポン、ナツダイダイ、ハッサク、ネーブルオレンジ、バレンシアオレンジ、晩白柚、ヒュウガナツ、ブンタン、ポンカン、マンダリンオレンジ、ヤツシロ、ユズ、ライム、レモン、カラタチ（これらと同等又は類似の品種のものも含む）などを例示することができる。その中でも温州みかんがクリプトキサンチン及び／又はその誘導体の含有率が高く望ましい。
【００１９】
本発明のアクアポリン産生促進剤においては、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体を含有する限りはその比率については限定されないが、例えばクリプトキサンチン及び／又はその誘導体を０．００００１質量％以上１００質量％以下、好ましくは０．０００１質量％以上８０質量％以下、更に好ましくは０．０１質量％以上５０質量％以下の割合で含有しておればよい。
【００２０】
本発明のアクアポリン産生促進剤は、上記クリプトキサンチン及び／又はその誘導体を含有していることにより、アクアポリンの産生を促進するものであり、その中でも特にアクアポリン３の産生をより効果的に促進することができる。
本発明のアクアポリン産生促進剤は、他のアクアポリン産生促進作用を有する物質と混合してもよく、例えば、副作用を起こさない範囲内で、合成レチノイドや他のカロテノイド、オールトランスレチノイン酸などを適宜含有させることができる。またその他の成分を添加物として含んでいても良く、特に限定されるものではないが、例えば、ビタミンＣなどの各種ビタミン類や、アミノ酸およびオリゴ糖、ミネラル等などが適宜含有させることができる。
【００２１】
本発明のアクアポリン産生促進剤は、体内に取り込むことでアクアポリンの産生の促進作用を発揮するものであるため、その体内への取り込み方法は限定されるものではなく、例えば経口摂取でも経皮吸収でもよい。
【００２２】
本発明のアクアポリン産生促進剤を摂取する方法としては、単独でそのまま摂取しても良いし、液体、乳化剤、ペースト、ゲル、粉末、錠剤、顆粒、ペレット、カプセル、シロップ、懸濁液、ドリンク、スティック、固形状などに加工して摂取してもよい。
【００２３】
次に、上記したアクアポリン産生促進剤の製造方法について説明する。製造方法としては、カンキツ類を搾汁しその残さから、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体を含有する組成物を得る方法、カンキツ類に酵素を添加して酵素処理して、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体を含有する組成物を得る方法、及びカンキツ類に有機溶剤を添加し該有機溶剤中に、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体を含有する組成物を抽出する方法などが挙げられる。以下、順次これらの方法について説明する。なお、得られた組成物中にクリプトキサンチン及び／又はその誘導体が存在することは、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等により定量的に確認することができる（実施例参照）。
【００２４】
カンキツ類を搾汁した残さ、すなわち搾汁粕は、例えば、カンキツ類の果実をインライン搾汁機、チョッパーヘルパー搾汁機、ブラウン搾汁機などにより搾汁した後、パドル型又はスクリュー型のフィニシャーなどでろ過又は篩別、または遠心分離によって果汁を調製した搾汁残渣を集めることにより調製される。
【００２５】
酵素処理は、カンキツ類の果実そのまま、あるいはすりつぶし、破砕、粉砕、加熱、脱水、乾燥などの物理的処理を行なったもの、さらに上記のようにして得られる搾汁残さに対して酵素を添加することにより行なわれる。
【００２６】
酵素処理に使用する酵素としては、カンキツ類に含まれる有機物、特に細胞壁などを構成する生体高分子などを分解できることが出来るものであれば、特に限定されず、例えば、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、キシラーゼ、プロテアーゼ、ペプチターゼ、リパーゼ、マレーションエンザイム（細胞壁崩壊酵素）などが用いられる。これらの中でも、糖質加水分解酵素であるセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、キシラーゼ、マレーションエンザイムが、有効成分であるクリプトキサンチン及び／又はその誘導体含有量を高める効率が高く好ましい。
【００２７】
添加する酵素剤は、これらの精製酵素を用いても良いし、これらの活性を示す微生物菌体や培養物、これらの粗精製物を用いても良い。これらの酵素は単独で用いても良いし、２種類以上の酵素を混合して用いてもよい。添加する酵素の量は特に限定されず、酵素の反応性に応じて添加すればよい。例えば、ペクチナーゼを用いる場合であれば、被処理物１００ｇに対して１〜１００，０００ユニットであることが好ましく、更に１０〜１０，０００ユニットであることがより好ましい。
【００２８】
上記酵素を添加した後、攪拌などにより酵素と被処理物を均一に混合して酵素反応を進行させる。このときの反応温度としては酵素が失活せず、かつ腐敗の起こりにくい条件、またクリプトキサンチン及び／又はその誘導体が喪失しない条件下で行うことが望ましい。具体的には、温度としては０〜９０℃、好ましくは０〜８０℃、更に好ましくは０〜７０℃である。反応のｐＨとしては酵素の至適条件下で行うのが望ましいことは言うまでもなく、ｐＨ２〜１２、好ましくはｐＨ２．５〜８である。反応時間としては使用する搾汁残渣と酵素の量に依存するが、通常１〜４８時間に設定するのが作業上好ましい。反応の際、この反応物を攪拌しながら反応を行っても良いし、静置反応でも良い。
【００２９】
酵素処理終了後、酵素処理された反応物をそのまま本発明のアクアポリン産生促進剤として用いてもよいし、何らかの加工を行ってもよい。具体的には、反応物を固液分離した残さ、あるいはその残さを乾燥させたもの、固液分離せず反応物をそのまま乾燥させたものなどを用いてもよい。また溶剤や水、超臨界二酸化炭素などを用いて成分などを抽出したものを用いてもよい。更に、引き続いて不純物類を取り除いてもよい。不純物の除去方法としては、例えば水洗浄、有機溶媒洗浄、シリカゲルカラムや樹脂カラム、逆相カラムなどを通す方法、活性炭処理、極性の異なる溶媒による分配、再結晶法、真空蒸留法などが挙げられる。特に酵素処理反応物を固液分離した後、固形分に再度水を添加・攪拌した後に固液分離する水洗浄は、酵素処理で生成した糖などの反応生成物を容易に除去できるため好ましい方法である。
【００３０】
カンキツ類及び／又は上述したカンキツ類の酵素処理物に、有機溶剤を添加し該有機溶剤中に、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体を含有する組成物を抽出する方法において用いられる溶剤としては、原料であるカンキツ類又はその加工品よりアクアポリン産生促進作用を持つ画分が得られるものであれば、本発明の効果を損なわない範囲でいかなるものでもよい。また、一種類の溶剤を単独で用いても複数の溶剤を混合して用いてもよい。そのような溶剤としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール等のアルコール類、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、グリセリン等の多価アルコール、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等のエーテル類、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、へキサン、ペンタン等の脂肪族炭化水素類、トルエン等の芳香族炭化水素類、ポリエチレングリコール等のポリエーテル類、ピリジン類等が使用できる。これらのうち、エタノールは抽出されるクリプトキサンチン及び／又はその誘導体の抽出効率が高く好ましい。また、これらの有機溶媒で抽出する際には抽出効率を上げるために、例えば水、界面活性剤等の添加物を本発明の効果を損なわない範囲で加えることが出来る。さらに、上記有機溶媒による抽出のほか、超臨界抽出法も利用することができる。
【００３１】
本発明の別の発明は、上記したようなアクアポリン産生促進剤を含有する皮膚外用剤、飲食品、医薬品、及び飼料である。
【００３２】
本発明の皮膚外用剤とは、例えば、乳液、クリーム、化粧水（ローション）、パック、洗浄剤、メーキャップ化粧料、頭皮・毛髪用品、分散液、軟膏、液剤、エアゾール、貼付剤、パップ剤、リニメント剤、オイル、リップ、口紅、ファンデーション、アイライナー、頬紅、マスカラ、アイシャドー、マニキュア・ペディキュア（及び除去剤）、シャンプー、リンス、ヘアトリートメント、パーマネント剤、染毛料、ひげ剃り剤、石けん（ハンドソープ、ボディソープ、洗顔料）、歯磨き剤、洗口料などが挙げられる。
本発明のアクアポリン産生促進剤を含有する皮膚外用剤においては、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体を含有する限りはその比率については限定されないが、例えばクリプトキサンチン及び／又はその誘導体を０．００００１質量％以上１００質量％以下、好ましくは０．０００１質量％以上８０質量％以下、更に好ましくは０．０１質量％以上５０質量％以下の割合で含有しておればよく、上記範囲であれば、十分にアクアポリン産生促進作用が得られる。
本発明のアクアポリン産生促進剤を含有する皮膚外用剤は、対象の年齢や肌の状態により異なるが、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体としての使用量が、１日あたり、約０．０００００１〜１００ｇであることが好ましい。
【００３３】
本発明の飲食品とは、一般飲食品に加えて、サプリメント、食品添加物、特定保健用食品、健康食品、機能性食品、医薬部外品など、すべての食品及び／又は飲料が含まれる。該食品及び／又は飲料は特に限定されるものではなく、例えば上記の医薬品的な形態のものに加え、パン、うどん、そば、ご飯等、主食となるもの、チーズ、ウインナー、ソーセージ、ハム、魚肉加工品等の食品類、アイスクリーム、クッキー、ケーキ、ゼリー、プリン、キャンディー、チューインガム、ヨーグルト、グミ、チョコレート、ビスケットなどの菓子類、ジャムなどの調味料類、果汁飲料、清涼飲料水、酒類、栄養ドリンク、コーヒー飲料、茶、牛乳などの飲料が挙げられる。
本発明のアクアポリン産生促進剤を含有する飲食品においては、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体を含有する限りはその比率については限定されないが、例えばクリプトキサンチン及び／又はその誘導体を０．００００１質量％以上１００質量％以下、好ましくは０．０００１質量％以上８０質量％以下、更に好ましくは０．０１質量％以上５０質量％以下の割合で含有しておればよく、上記範囲であれば、十分にアクアポリン産生促進作用が得られる。
本発明のアクアポリン産生促進剤を含有する飲食品は、摂取者の体重や年齢や肌の状態により異なるが、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体としての摂取量が、１日あたり、約０．０００００１〜１００ｇであることが好ましい。
【００３４】
本発明の医薬品としては、注射剤、輸液、散剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、腸溶剤、懸濁剤、シロップ剤、内服液剤、トローチ剤、乳剤、外用液剤、湿布剤、点鼻剤、点耳剤、点眼剤、吸入剤、軟膏剤、ローション剤、座剤、経腸栄養剤などの形態で摂取することが出来る。
本発明のアクアポリン産生促進剤を含有する医薬品においては、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体を含有する限りはその比率については限定されないが、例えばクリプトキサンチン及び／又はその誘導体を０．００００１質量％以上１００質量％以下、好ましくは０．０００１質量％以上８０質量％以下、更に好ましくは０．０１質量％以上５０質量％以下の割合で含有しておればよく、上記範囲であれば、十分にアクアポリン産生促進作用が得られる。
本発明のアクアポリン産生促進剤を含有する医薬品は、対象の年齢や肌の状態により異なるが、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体としての投与量が、１日あたり、約０．０００００１〜１００ｇであることが好ましい。
【００３５】
本発明の飼料とは、本発明のアクアポリン産生促進剤に、例えば、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦などの穀類、ふすま、米ぬかなどのぬか類、コーングルテンミール、コーンジャムミールなどの粕類、脱脂粉乳、ホエー、魚類、骨粉などの動物性飼料類、ビール酵母などの酵母類、リン酸カルシウム、炭酸カルシウムなどのカルシウム類、ビタミン類、油脂類、アミノ酸類、糖類などを配合することにより製造することができる。飼料の形態としては、ペットフード、家畜飼料、養殖魚用飼料などに用いることができる。またペットフードとして用いる場合には、上記飲食品と同じ形態のものを用いても何ら問題がない。
本発明のアクアポリン産生促進剤を含有する飼料においては、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体を含有する限りはその比率については限定されないが、例えばクリプトキサンチン及び／又はその誘導体を０．００００１質量％以上１００質量％以下、好ましくは０．０００１質量％以上８０質量％以下、更に好ましくは０．０１質量％以上５０質量％以下の割合で含有しておればよく、上記範囲であれば、十分にアクアポリン産生促進作用が得られる。
本発明のアクアポリン産生促進剤を含有する飼料は、対象の種や肌の状態により異なるが、例えば体重約６０ｋｇとすると、クリプトキサンチン及び／又はその誘導体としての摂取量が、１日あたり、約０．０００００１〜１００ｇであることが好ましい。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を実施例により具体的に示す。なお本発明はこの実施例によりその範囲を限定するものではない。なお、実施例中、特に断りのない限り、「部」は「質量部」を、「％」は「質量％」をそれぞれ意味する。
実施例中、β−クリプトキサンチン及び／又はその誘導体の含量の測定は、その粉体、濃縮残存物をサンプルとして用い（β―クリプトキサンチンの定量）又はその粉体、濃縮残存物を８０℃、１Nの水酸化カリウム水溶液で６０分処理することで全てβ―クリプトキサンチン単体に変換したものをサンプルとして用い（β―クリプトキサンチン及びその誘導体をβ―クリプトキサンチンのフリー体として定量）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により行なった。すなわち、ＨＰＬＣ装置として、ＬＣ−１０Ａ（島津製作所製）を用い、ＲｅｓｏｌｖｅＣ１８（φ３．９×１５０ｍｍ、ウォーターズ社製）カラムを接続し、メタノールを等量加えた試料を導入した。移動相には、メタノール：酢酸エチル＝７：３、カラム温度３０℃、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長４５０ｎｍで分析した。
【００３７】
実施例１
温州みかんから果汁を絞った後の残さ（みかんジュース粕、水分率約９０％）８００ｇに飲食品加工用のペクチナーゼ酵素剤であるスミチームＰＸ（新日本化学工業株式会社製、ペクチナーゼ５，０００ユニット／ｇ、アラバナーゼ９０ユニット／ｇ）１ｇとセルラーゼ／ヘミセルラーゼ酵素剤であるセルラーゼＹ−ＮＣ（ヤクルト薬品工業株式会社製セルラーゼ３０，０００ユニット／ｇ）１ｇを添加し、よくかき混ぜて室温８時間静置反応を行った。この反応液を遠心分離して上清を除去した後、水を添加して攪拌し、再度遠心分離により上清を除去した。この沈殿物を凍結乾燥機により乾燥し、ミキサー型粉砕機で粉砕・粉末化した。本粉末中にはβ−クリプトキサンチン及びその誘導体（β―クリプトキサンチンのフリー体換算）が０．５質量％（β―クリプトキサンチン：０．１質量％、その誘導体：０．４質量％）が含まれていた。
得られた温州みかん粉末を重量の３倍量のエタノールで抽出し、得られた抽出液をエバポレーターで減圧濃縮した。濃縮後の残存物を本発明の皮膚外用剤とした。この皮膚外用剤にはβ−クリプトキサンチン及びその誘導体（β―クリプトキサンチンのフリー体として換算）が２％（β―クリプトキサンチン：０．４質量％、その誘導体：１．６質量％）含まれていた。
【００３８】
実施例２
β‐クリプトキサンチン（標準サンプル）を使用して正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）に対するアクアポリン３発現促進作用を確認した。以下にその詳細を示す。
ＮＨＥＫ（クラボウ株式会社製）を２．５×１０３細胞／ウェルとなるように２４ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ社製）に播種後、３７℃で５％ＣＯ２インキュベーター（ＥＳＰＥＣ社製）で培養を行い、３日に一度培地（クラボウ株式会社製）交換を行いながら８０％コンフレントになるまで培養を継続した。その後、先ほどの培地から血清を除いたものに、β−クリプトキサンチン（標準サンプル、四国八洲社製）を、培地添加後の濃度が、それぞれ０（溶媒コントロール）、１、５、１０μＭとなるようにＤＭＳＯ（和光純薬社製）に溶解させた試料を添加し、細胞に培地を交換することで作用させた。対照群としては、すでにアクアポリン３の活性化作用が報告されているオールトランスレチノイン酸（和光純薬社製）を、培地添加後の濃度が、それぞれ０（溶媒コントロール）、１、５、１０μＭとなるようにＤＭＳＯ（和光純薬社製）に溶解させた試料を添加し、同様の培養実験を行った。培地交換後２４時間培養を行い、時間経過後培地をプレートから除去し、ＰＢＳで洗浄後、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を各ウェル５００μＬずつ添加し、懸濁することで細胞中のＲＮＡを溶解させた。その後、ＲＮＡを抽出し、逆転写酵素（タカラバイオ社製）でｃＤＮＡを作成した。
作成したｃＤＮＡを用いてリアルタイムＰＣＲ（アプライドシステムズジャパン社製）を使用してアクアポリン３の遺伝子量の定量を行った。
【００３９】
図１にβ−クリプトキサンチンの作用を示す。低濃度である１μＭではほとんどコントロールと差が無いが、５、１０μＭでは有意に発現量が上昇したことからβ−クリプトキサンチンはアクアポリン３産生促進作用を有することが分かった。
【００４０】
図２にオールトランスレチノイン酸の作用を示す。低濃度である１μＭではほとんどコントロールと差が無く、５、１０μＭでは発現量が有意に上昇したが、β−クリプトキサンチンの発現量に比べて上昇幅が少なかった。
【００４１】
実施例３
実施例１で得た皮膚外用剤を使用して実施例２と同様の実験を行った。すなわち誘導体を含むβ−クリプトキサンチン濃度２質量％（β―クリプトキサンチンのフリー体換算）、及びβ―クリプトキサンチンを、培地に添加したときの濃度が、それぞれ０（溶媒コントロール）、１、５、１０μＭとなるように調製した試料を培地に添加した。対照群としては、すでにアクアポリン３の活性化作用が報告されているオールトランスレチノイン酸（和光純薬社製）を、培地に添加したときの濃度が、それぞれ０（溶媒コントロール）、１、５、１０μＭとなるようにＤＭＳＯ（和光純薬社製）に溶解し調製した試料を添加し、同様の培養実験を行った。この培養液を使用してアクアポリン３の発現量の測定を行った。培養・測定方法は実施例２と同様である
【００４２】
実施例１で得た皮膚外用剤、及びオールトランスレチノイン酸のアクアポリン３の発現量の変化を図３に示す。誘導体を含むβ−クリプトキサンチンで培養した場合も実施例２で使用したβ−クリプトキサンチンで培養した図１と同様に、アクアポリン３の発現量が上昇していた。β―クリプトキサンチン単独と誘導体を含む皮膚外用剤による培養の間には発現量の有意な差は見られず、皮膚外用剤中に含有される誘導体もフリー体と同様にアクアポリン３の発現量を上昇させた。
【００４３】
実施例４
実施例２の結果を受け、より生体に近いモデルである３次元ヒト皮膚モデル（ＴＯＹＯＢＯ社製）を使用して実施例２と同様の実験を行った。今回は経皮吸収作用のモデルということで、３次元ヒト皮膚モデルのカップにβ−クリプトキサンチン（標準サンプル、四国八洲社製）又はオールトランスレチノイン酸（和光純薬社製）が０（溶媒コントロール）、１、５、１０μＭとなるように調製した溶液、
ＰＢＳ  ７５％
１，３−ブチレングリコール  ２０％
界面活性剤  ３％
試薬溶解液  ２％
を一日６時間２００μｌ塗布を行い、時間経過後にＰＢＳで洗浄し、培養を行った。塗布は毎日行い、３日間培養を行った。その後、中央部の細胞をバイオプシーパンチで分離し、細胞のみを回収し、実施例２で用いたのと同様の方法でｃＤＮＡを作成した。
【００４４】
図４にβ−クリプトキサンチンの作用を示す。１、５μＭではアクアポリン３の発現量が増加傾向にはあるが有意差は無かった。しかし１０μＭでは発現が溶媒コントロールに対して有意に上昇し、β−クリプトキサンチンのアクアポリン産生促進効果を確認した。
【００４５】
図５にオールトランスレチノイン酸の作用を示す。１、５μＭではアクアポリン３の発現量が増加傾向にはあるが有意差は無かった。しかし１０μＭではコントロールに比べ発現量が有意に上昇したが、その上昇はβ−クリプトキサンチンの発現量よりも少なかった。
【００４６】
実施例５
実施例３の結果を受け、実施例４と同様により生体に近いモデルである３次元ヒト皮膚モデルを使用して実験を行った。本実験は試薬溶解液を実施例１で作成した皮膚外用剤溶液に変えたほかは実施例４と同様であり、フリー体換算でのβ−クリプトキサンチン濃度も実施例４の０（溶媒コントロール）１、５、１０μＭになるように調製を行った。
【００４７】
図６に皮膚外用剤の作用を示す。１、５μＭではアクアポリン３の発現量が増加傾向にはあるが、有意差は無かった。しかし１０μＭでは発現量が溶媒コントロールに対して有意に上昇し、誘導体を含む皮膚外用剤のアクアポリン産生促進効果を確認した。
【００４８】
実施例６
実施例１の抽出物を使用して以下の処方例を作成した。ただし、この処方例をもって本発明の範囲を限定するものではない。
処方例１  乳液
抽出物                                                        １．００％
ショ糖脂肪酸エステル                                          ３．００％
グリセリン                                                  １２．００％
スクアラン                                                    ６．００％
ジメチルシリコーンオイル                                    ２４．００％
ポリプロピレングリコール                                      １．００％
増粘剤                                                        ０．０６％
脱イオン水                                                  ４７．６２％
防腐剤                                                        ０．２０％
エタノール                                                    ５．００％
０．１％水酸化ナトリウム水溶液                                ０．１２％
【００４９】
実施例７
処方例１の乳液と、処方例１から抽出物を抜いた乳液（プラセボ）を用いて女性２６人（３５〜５４才）を対象に１ヶ月間の二重盲検法を用いた使用試験を行った。試験期間中温州みかん、柿、マンゴーなどβ-クリプトキサンチンを多く含む食品の摂取は禁止し、塗布は夜間に０．５ｇ／日を上腕内側に行うこととした。試用期間終了後、コルネオメーター（ＣＫ社製）を使用して塗布部分の水分量の変化を試験の前後で測定を行った。なお試験前の両群間には水分量の有意な差は見られなかった。
【００５０】
図７にその結果を示す。温州みかん抽出物を含有することで、水分量は処方例１を用いたほうが改善したと感じる者が多かった。また試験期間中の皮膚のトラブルや処方成分の劣化などは見られなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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