(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性型グレリンの産生を評価するための活性型グレリン産生評価方法であって、
胃癌上皮細胞であるＡＧＳ細胞にグレリンの遺伝子を導入した細胞の培地に、オクタン酸と酢酸を添加したもの、と、オクタン酸とオレイン酸又はエイコサペンタエン酸を添加したものとを用いて活性型グレリンの産生を評価することを特徴とする活性型グレリン産生評価方法。
【請求項２】
活性型グレリンの産生を評価するために用いる活性型グレリン産生評価細胞であって、
胃癌上皮細胞であるＡＧＳ細胞にグレリンの遺伝子を導入しオクタン酸と酢酸、オクタン酸とオレイン酸又はエイコサペンタエン酸を添加したそれぞれの培地で培養した細胞としたことを特徴とする活性型グレリン産生評価細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性型グレリンの産生を評価するための活性型グレリン産生評価方法、及び、活性型グレリンの産生を評価するために用いる活性型グレリン産生評価細胞に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
グレリンは、成長ホルモン分泌促進因子として発見された２８個のアミノ酸からなるペプチドホルモンである（特許文献１参照。）。このグレリンは、主に胃から産生されて血中に分泌され、下垂体に働きかけて成長ホルモンの分泌を促進し、また、視床下部摂食調節領域に働きかけて食欲を増進させる。そのため、グレリンの活性を利用することによる摂食障害の改善や、グレリンの活性を抑制することによる肥満の防止が創薬ターゲットとして期待されている。
【０００３】
このグレリンの活性発現には、２８個のアミノ酸のうちのＮ末端から３番目のセリンが脂肪酸であるオクタン酸（カプリル酸）でアシル化（アルカノイル化）されることが必須とされ、アシル化に食物中の脂肪酸が利用されることが動物実験により明らかとなっている。
【０００４】
そのため、脂肪酸の細胞内への取り込み又はアシル化を阻害することができれば、グレリンの活性発現を抑制することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開ＷＯ０１／０７４７５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明では、脂肪酸の細胞内への取り込み又はアシル化を阻害することによりグレリンの活性発現を抑制することができる物質を探索することを目的とし、活性発現したグレリン（活性型グレリン）の産生を評価するための活性型グレリン産生評価方法を構築することにした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
請求項１に係る本発明では、活性型グレリンの産生を評価するための活性型グレリン産生評価方法において、胃癌上皮細胞であるＡＧＳ細胞にグレリンの遺伝子を導入した細胞の培地に、オクタン酸と酢酸を添加したもの、と、オクタン酸とオレイン酸又はエイコサペンタエン酸を添加したものとを用いて活性型グレリンの産生を評価することにした。
【０００８】
また、請求項２に係る本発明では、活性型グレリンの産生を評価するために用いる活性型グレリン産生評価細胞において、胃癌上皮細胞であるＡＧＳ細胞にグレリンの遺伝子を導入しオクタン酸と酢酸、オクタン酸とオレイン酸又はエイコサペンタエン酸を添加したそれぞれの培地で培養した細胞とすることにした。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、胃癌上皮細胞であるＡＧＳ細胞にグレリンの遺伝子を導入した細胞を用いることで、活性型グレリンの産生を評価することができ、グレリンの活性発現を抑制することができる物質を探索することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＡＧＳ細胞におけるグレリン、ＧＯＡＴ、ＰＣ１／３、ＰＣ２、Ｆｕｒｉｎの各ｍＲＮＡの発現（ａ）、グレリンタンパク質の発現（ｂ）。
【図２】活性型グレリン産生評価細胞におけるグレリンタンパク質の発現。
【図３】活性型グレリン産生評価細胞のスクリーニング。
【図４】活性型グレリン産生評価細胞におけるデスアシル型グレリンの分泌（ａ）、オクタン酸添加による活性型グレリンの分泌の変化（ｂ）。
【図５】活性型グレリン産生評価細胞の活性型及びデスアシル型グレリンの分泌に及ぼす酢酸、オレイン酸、エイコサペンタエン酸の影響。
【図６】活性型グレリン産生評価細胞の生存率に及ぼす酢酸、オレイン酸、エイコサペンタエン酸の影響。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明では、まず、活性型グレリンの産生を評価することができる細胞（活性型グレリン産生評価細胞）について検討した。
【００１２】
活性型グレリン産生評価細胞には、ヒトの胃癌上皮細胞であるＡＧＳ細胞を用いた。ＡＧＳ細胞は、10%FBS添加D-MEM培地にて培養した。
【００１３】
ＡＧＳ細胞について、グレリン、グレリンのアシル化を担う酵素として知られているＧＯＡＴ（Ghrelin O-acyltransferase），プレプログレリンからグレリンへのプロセッシングでの関与が知られているＰＣ１／３（Prohormone convertase 1/3）やＰＣ２やＦｕｒｉｎのｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）により調べた。なお、ＲＴ−ＰＣＲでは、培養した細胞からトリゾールによりＲＮＡを回収した後に、SuperScriptIIIを用いて逆転写反応したサンプルを鋳型にして、特異的プライマーにてＰＣＲを行った。
【００１４】
その結果、図１（ａ）に示すように、ＡＧＳ細胞では、ＧＯＡＴ及びＦｕｒｉｎについては発現が認められた。このことから、ＡＧＳ細胞には、グレリンの正常なプロセッシング及びアシル化修飾に必要な因子が存在しているものと推察された。
【００１５】
しかしながら、図１（ａ）に示すように、ＡＧＳ細胞では、グレリンの発現がＧＯＡＴ及びＦｕｒｉｎと比較して低レベルであった。
【００１６】
このＡＧＳ細胞について、グレリンの分泌量をELISAにより測定した。なお、測定は、培地に１／１０容量の１mol／L塩酸を添加してサンプルを調製し、Active Ghrelin ELISA Kit及びDesacyl Ghrelin ELISA Kitを用いて行った。
【００１７】
また、ＡＧＳ細胞について、グレリンの発現をウエスタンブロット法により検出した。なお、検出は、細胞から調製したサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離した後に、ＰＶＤＦ膜に転写し、グレリンに対する特異的抗体を用いて行った。
【００１８】
その結果、図１（ｂ）（及び図４（ａ）参照）に示すように、グレリンは確認できなかった。ＲＴ−ＰＣＲによってグレリンのｍＲＮＡの発現レベルが低かったことを考え合わせると、ＡＧＳ細胞のグレリンタンパク質の発現量は非常に少ないと推察された。
【００１９】
以上のことから、ＡＧＳ細胞は、グレリンの正常なプロセッシング及びアシル化修飾に必要な因子が存在しているものの、活性型グレリンの産生を評価するための細胞（活性型グレリン産生評価細胞）として、そのまま利用することは困難であることがわかった。
【００２０】
そこで、本発明では、ＡＧＳ細胞にグレリンの遺伝子を導入することにした。
【００２１】
遺伝子導入は、発現ベクターpcDNA3にグレリンの全長ｃＤＮＡを挿入したプラスミドを作製し、リポフェクトアミン2000を用いてＡＧＳ細胞に導入した。
【００２２】
その結果、図２に示すように、グレリンの発現が確認できた。そして、G418添加培地で培養し、G418により安定発現細胞をスクリーニングし、クローニングした１０個の細胞のうち７個の細胞において、図３に示すように、グレリンの発現が確認できた。
【００２３】
このグレリンの発現が確認できた７個の細胞の中から最も発現が高かった＃８の細胞（以下、「AGS-GHRL8細胞」と呼ぶ。）について、さらに検討を行った。
【００２４】
AGS-GHRL8細胞についてデスアシル型グレリンの分泌量を測定したところ、図４（ａ）に示すように、ＡＧＳ細胞では確認できなかったデスアシル型グレリンの分泌が確認できた。
【００２５】
また、AGS-GHRL8細胞の培地に種々の濃度のオクタン酸を添加したところ、図４（ｂ）に示すように、オクタン酸の濃度に依存した活性型グレリンの分泌が確認できた。
【００２６】
以上のことから、ＡＧＳ細胞にグレリンの遺伝子（ｃＤＮＡ）を遺伝子導入した細胞では、正常に活性型グレリンを分泌する機構が存在することが示唆された。
【００２７】
これにより、ＡＧＳ細胞にグレリンの遺伝子を導入した細胞を用いることで活性型グレリンの産生を評価することができると考えられる。
【００２８】
本発明では、次に、ＡＧＳ細胞にグレリンの遺伝子を導入した細胞を活性型グレリン産生評価細胞として用い、活性型グレリンの産生を評価した。評価は、活性型グレリン産生評価細胞であるAGS-GHRL8細胞の培地に酢酸、オレイン酸、エイコサペンタエン酸をオクタン酸とともに添加し、活性型グレリン量とデスアシル型グレリン量を測定することで行った。
【００２９】
その結果、図５に示すように、AGS-GHRL8細胞の培地に何も添加していない状態では、わずかに活性型グレリンの分泌が認められ、AGS-GHRL8細胞の培地にオクタン酸だけを添加することで、活性型グレリン量が大幅に増大することが確認された。
【００３０】
さらに、図５に示すように、AGS-GHRL8細胞の培地にオクタン酸とともに酢酸（「ＡＡ」と表記。）を添加しても活性型グレリンの分泌に有意な低下は認められないが、オクタン酸とともにオレイン酸（「ＯＡ」と表記。）又はエイコサペンタエン酸（「ＥＰＡ」と表記。）を添加した場合には、活性型グレリンの分泌に有意な低下が認められた。
【００３１】
これら酢酸、オレイン酸、エイコサペンタエン酸がAGS-GHRL8細胞の生存率に及ぼす影響についてＭＴＴアッセイにて測定した。なお、ＭＴＴアッセイは、培地に試験試薬を添加し、２４時間培養後に、ＭＴＴを添加し、４時間後に細胞をＤＭＳＯに溶解し、595nmにおける吸光度を測定した。
【００３２】
その結果、図６に示すように、AGS-GHRL8細胞の生存率の大幅な低下は認められなかった。
【００３３】
このことから、オレイン酸及びエイコサペンタエン酸は、活性型グレリンの産生を抑制することができる物質であることが示唆された。
【００３４】
すなわち、オレイン酸又はエイコサペンタエン酸を用いて活性型グレリンの産生を抑制することができ、また、活性型グレリンの産生を抑制するための活性型グレリン産生抑制剤として、オレイン酸又はエイコサペンタエン酸を含有する物質を利用することができると考えられる。
【図１】
0005534367.tif 000002
【図２】
0005534367.tif 000003
【図３】
0005534367.tif 000004
【図４】
0005534367.tif 000005
【図５】
0005534367.tif 000006
【図６】
0005534367.tif 000007