(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
−  少なくとも１種のヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素阻害剤またはその生理学的に許容される塩の１種、
−  少なくとも１種のファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤またはその生理学的に許容される塩の１種、および
−  少なくとも１種の抗ＨＩＶ薬
を含む組成物であって、
前記ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤はスタチンのファミリーの１分子またはその生理学的に許容される塩の１種であって、アトルバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、リバスタチン、メバスタチン（またはコンパクチン）、フルインドスタチン、ベロスタチン、フラバスタチン、ダルバスタチン、セリバスタチン、ペントスタチン、ロスバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチンまたはそれらの生理学的に許容される塩からなる群から選択され、
前記ファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤はアミノビホスホネート（ＮＢＰ）ファミリーの１分子またはその生理学的に許容される塩の１種を含む群から選択され、
前記アミノビホスホネートは、
−  アレンドロ酸またはそのイオン型、アレンドロネート、
−  クロドロン酸またはそのイオン型、クロドロネート、
−  エチドロン酸またはそのイオン型、エチドロネート、
−  イバンドロン酸またはそのイオン型、イバンドロネート、
−  メドロン酸またはそのイオン型、メドロネート、
−  ネリドロン酸またはそのイオン型、ネリドロネート、
−  オルパドロン酸またはそのイオン型、オルパドロネート、
−  パミドロン酸またはそのイオン型、パミドロネート、
−  リセドロン酸またはそのイオン型、リセドロネート、
−  チルドロン酸またはそのイオン型、チルドロネート、
−  ゾレドロン（もしくはゾレンドロン）酸またはそのイオン型、ゾレドロネート（もしくはゾレンドロネート）、
−  ４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメタンジホスホン酸またはそのイオン型、ジメチルアミノメタンジホスホネート、
−  α−アミノ−（４−ヒドロキシベンジリデン）ジホスホネート
から選択することができ、
前記抗ＨＩＶ薬はプロテアーゼ阻害剤または逆転写酵素阻害剤であることを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤が水溶性スタチンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤がゾレドロン酸またはそのイオン型、ゾレドロネートである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記抗ＨＩＶ薬がホスアンプレナビル、ロピナビル、リトナビル、アンプレナビル、アタザナビルおよびインジナビルを含む群から選択されたプロテアーゼ阻害剤である、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記抗ＨＩＶ薬がジドブジン、ラミブジン、ジダノシンおよびエプジコムを含む群から選択された逆転写酵素阻害剤である、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
ＨＩＶ感染患者に対し、その治療のために投与される請求項１乃至５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記投与が、経口または注射によって実施される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
プロテアーゼ阻害剤または逆転写酵素阻害剤である抗ＨＩＶ薬による抗ＨＩＶ治療によって患者に引き起こされる早期老化の副作用を治療するために投与される組成物であって、少なくとも１種のヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素阻害剤および少なくとも１種のファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤を含み、
前記ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は、スタチンファミリーの一分子またはその生理学的に許容される塩の１種であって、アトルバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、リバスタチン、メバスタチン（またはコンパクチン）、フルインドスタチン、ベロスタチン、フラバスタチン、ダルバスタチン、セリバスタチン、ペントスタチン、ロスバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチンおよびそれらの生理学的に許容される塩からなる群から選択され、
前記ファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤はアミノビホスホネート（ＮＢＰ）ファミリーの１分子またはその生理学的に許容される塩の１種を含む群から選択され、
前記アミノビホスホネートは、
−  アレンドロ酸またはそのイオン型、アレンドロネート、
−  クロドロン酸またはそのイオン型、クロドロネート、
−  エチドロン酸またはそのイオン型、エチドロネート、
−  イバンドロン酸またはそのイオン型、イバンドロネート、
−  メドロン酸またはそのイオン型、メドロネート、
−  ネリドロン酸またはそのイオン型、ネリドロネート、
−  オルパドロン酸またはそのイオン型、オルパドロネート、
−  パミドロン酸またはそのイオン型、パミドロネート、
−  リセドロン酸またはそのイオン型、リセドロネート、
−  チルドロン酸またはそのイオン型、チルドロネート、
−  ゾレドロン（もしくはゾレンドロン）酸またはそのイオン型、ゾレドロネート（もしくはゾレンドロネート）、
−  ４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメタンジホスホン酸またはそのイオン型、ジメチルアミノメタンジホスホネート、
−  α−アミノ−（４−ヒドロキシベンジリデン）ジホスホネート
から選択することができることを特徴とする組成物。
【請求項９】
前記ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤が水溶性スタチンである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤がゾレドロン酸またはそのイオン型、ゾレドロネートである、請求項８又は９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記投与が、ヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素阻害剤０．０１から２ｍｇ／ｋｇ体重の用量およびファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤０．０１から４０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で実施される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１２】
前記投与が、経口または注射によって実施される、請求項８乃至１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
ＨＩＶ感染患者に治療のために投与される組成物であって、前記組成物は、
ｉ．少なくとも１種のヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素阻害剤および少なくとも１種のファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤を含む混合物と、
ｉｉ．プロテアーゼ阻害剤または逆転写酵素阻害剤である抗ＨＩＶ薬と
を含み、
前記ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は、スタチンファミリーの一分子またはその生理学的に許容される塩の１種であって、アトルバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、リバスタチン、メバスタチン（またはコンパクチン）、フルインドスタチン、ベロスタチン、フラバスタチン、ダルバスタチン、セリバスタチン、ペントスタチン、ロスバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチンおよびそれらの生理学的に許容される塩からなる群から選択され、
前記ファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤はアミノビホスホネート（ＮＢＰ）ファミリーの１分子またはその生理学的に許容される塩の１種を含む群から選択され、
前記アミノビホスホネートは、
−  アレンドロ酸またはそのイオン型、アレンドロネート、
−  クロドロン酸またはそのイオン型、クロドロネート、
−  エチドロン酸またはそのイオン型、エチドロネート、
−  イバンドロン酸またはそのイオン型、イバンドロネート、
−  メドロン酸またはそのイオン型、メドロネート、
−  ネリドロン酸またはそのイオン型、ネリドロネート、
−  オルパドロン酸またはそのイオン型、オルパドロネート、
−  パミドロン酸またはそのイオン型、パミドロネート、
−  リセドロン酸またはそのイオン型、リセドロネート、
−  チルドロン酸またはそのイオン型、チルドロネート、
−  ゾレドロン（もしくはゾレンドロン）酸またはそのイオン型、ゾレドロネート（もしくはゾレンドロネート）、
−  ４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメタンジホスホン酸またはそのイオン型、ジメチルアミノメタンジホスホネート、
−  α−アミノ−（４−ヒドロキシベンジリデン）ジホスホネート
から選択することができ、
前記投与は前記混合物と前記抗ＨＩＶ薬とが任意の順番で同時、連続または交互になされる、ＨＩＶ感染患者の治療のための組成物。
【請求項１４】
前記混合物および前記抗ＨＩＶ薬が共投与される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記抗ＨＩＶ薬がホスアンプレナビル、ロピナビル、リトナビル、アンプレナビル、アタザナビルおよびインジナビルを含む群から選択されたプロテアーゼ阻害剤である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記抗ＨＩＶ薬がジドブジン、ラミブジン、ジダノシンおよびエプジコムを含む群から選択された逆転写酵素阻害剤である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１７】
前記投与の少なくとも１種が、経口または注射によって実施される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１８】
前記投与が、ヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素阻害剤０．０１から２ｍｇ／ｋｇ体重の用量およびファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤０．０１から４０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で実施される、請求項１３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００８年１月３日出願の仏国特許出願第０８／５００１９号に関する。本出願はまた、２００６年７月５日出願の仏国特許出願第０６／０６０９７号および対応する２００７年７月５日出願のＰＣＴ出願、表題「Ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ  ｄｅｓｔｉｎｅ  ａｕ  ｔｒａｉｔｅｍｅｎｔ  ｄｅｓ  ｍａｌａｄｉｅｓ  ａｖｅｃ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ｅｔ／ｏｕ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｄｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｐｒｅｎｙｌｅｅｓ」（「Ｄｒｕｇ  ｉｎｔｅｎｄｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ａｎｄ／ｏｒ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｅｎｙｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」）に関する。上記で参照した特許出願それぞれの全内容は本明細書に参考として組み込む。
【０００２】
本発明は、ＨＩＶ感染患者を治療するための抗ＨＩＶ組成物および方法に関する。
【０００３】
本発明は、例えば、特定の抗ＨＩＶ治療によって引き起こされる副作用、例えば、プロテアーゼ阻害剤または逆転写酵素阻害剤によって引き起こされ得る早期老化および脂肪萎縮症の治療に非常に有用である。
【０００４】
以下の記載において、括弧内の参考文献（Ｘ）は、実施例の最後の参考文献リストを意味する。括弧内に著者名および日付のある参考文献はまた、この文献リストを意味する。
【背景技術】
【０００５】
真核細胞の核は、多孔性２重膜である核膜によって境界が定められており、核と細胞質の２つの区画間の分子交換を制御している。この核膜は核の内容物、すなわち遺伝物質および核ゲノムの機能に必要な酵素的機構の全てを部分的に隔離する。
【０００６】
核膜は、２種類の同心円状の膜、すなわち小胞体とつながった外膜および内膜から構成される。内膜の内側面には、核ラミナと呼ばれる高密度の繊維網が接している。これは、本質的にラミンの重合体および関連タンパク質からなるタンパク質ネットワークである。脊椎動物では、ラミンは２つのサブクラス、Ａ型のラミン（ラミンＡおよびＣ）ならびにＢ型のラミン（ラミンＢ１、Ｂ２およびＢ３）に区別されており、いずれもラミナの生成に関与している。後者は、核膜の内膜に結合したその他のタンパク質と関連することによって適切な位置に保たれている（例えば、Ｇｒｕｅｎｂａｕｍら、２００５（１９）参照)。
【０００７】
ラミンは、中間径フィラメントファミリー（Ｖ型）に属するフィラメント状タンパク質で、いずれも共通の構造を有し、短い球状Ｎ末端（頭部）部分が複数のアルファヘリックスに構成された長い中央ドメイン（ロッドドメイン）によってもう１つの球状Ｃ末端（尾部）部分から隔てられている。球状の尾部は特に、合成後の核への移行を可能にする核内移行シグナル（ＮＬＳ）を含有する。中央ドメインは、２つの並行したラミン分子が会合し、二量体の「頭尾（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）」会合によってフィラメントを構成するのを可能にする。この構造により、非常に耐久性のある機械的特性がもたらされる。
【０００８】
ラミンＡおよびラミンＢのみが前駆体合成後に成熟する（Ｇｒｕｅｎｂａｕｍら、２０００（２０）参照）。ラミンＣは直接成熟型で合成される。
【０００９】
ラミンＡおよびラミンＢの前駆体の終端は、特徴的なＣａａＸモチーフである（Ｃはシステインであり、ａは荷電していない脂肪鎖を有するアミノ酸であり、Ｘは任意のアミノ酸であり、この場合はメチオニンである。Ｌｅｖｙ  ＆  Ｃａｕ  ２００３（２９）参照）。
【００１０】
Ｃ末端ＣａａＸモチーフによって、ファルネシルトランスフェラーゼによる脂肪酸（一般的に、Ｃ１５脂肪酸、ファルネシル）の結合が可能になる。このプレニル化（ファルネシルモチーフは、イソプレニンと呼ばれるＣ５ベースの脂肪族単位から生じる）によって、プレラミンは細胞基質で合成された後、小胞体の膜内に入ることができる。プレラミンは、小胞体の外膜にそれ自体が挿入されておりその活性部位が細胞基質にあるエンドプロテアーゼの作用を受ける。プレラミンＡの特異的エンドプロテアーゼはＦａｃｅ1（またはＺＭＰＳＴＥ２４、亜鉛メタロプロテアーゼ、酵母ＳＴＥ２４ホモログ）であり、一方Ｆａｃｅ２（またはＲｃｅ１、Ｒａｓ変換酵素）はプレラミンＢに特異的である。これらの酵素は、システインとその次の（脂肪族）アミノ酸との間のペプチド結合の加水分解を触媒し、プレラミンを３アミノ酸だけ短縮する。その後、ファルネシル化されたシステインのカルボキシル末端は、イソプレニルシステイン−カルボキシメチルトランスフェラーゼ（ＩＣＭＴ）によって認識され、ＩＣＭＴはエステル化によって該末端にメチル基を結合させる。
【００１１】
プレラミンＡの成熟の場合のみ、引き続きＦａｃｅ１による第２のエンドプロテアーゼ切断が行われ、１５アミノ酸のファルネシルペプチドおよび成熟ラミンＡが放出される。もはや脂肪酸を含んでいないこのラミンＡは可溶性となり、自身の核移行シグナルによって核内に運び込まれ、核ラミナ自体ならびに核区画の残りの部分に局在し、正に核の骨格を構成する（Ｇｒｕｅｎｂａｕｍら、２００５（１９））。他方、成熟ラミンＢは依然としてＣ末端にファルネシル化およびメチルエステル化されたシステインを有している。したがって、成熟ラミンＢは小胞体の外膜に、次いで核膜の核質側の面に挿入された状態を維持し、専ら核ラミナにおいて、成熟ラミナＢが固定されている核膜の内膜下に局在する。
【００１２】
プレニル化とは、システインのチオール基に、炭素原子１５個のファルネシル鎖、したがってファルネシル化によって、または炭素原子２０個のゲラニルゲラニル鎖、したがってゲラニルゲラニル化によって（Ｒｅｉｄら、２００４（３９））、または任意のその他のイソプレン誘導体を結合させることを意味する。
【００１３】
Ｃ末端コンセンサス配列（ＣａａＸ）を認識するファルネシル−トランスフェラーゼ（ＦＴａｓｅ）によって触媒されるファルネシル化は、好ましくはモチーフのシステイン残基にファルネシル基を結合させる。
【００１４】
ゲラニルゲラニル化は、モチーフのシステイン残基にゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ（ＧＧＴａｓｅ）によってゲラニルゲラニル基を結合させることである。
【００１５】
これらの脂肪酸は、ヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡに基づいて細胞が特にコレステロール、ステロイド、ヘモグロビンのヘムおよびユビキノンを生成するために使用する生合成方法によって産生される（Ｈａｍｐｔｏｎら、１９９６（２０））。
【００１６】
プレニル化タンパク質のファミリーは、ヒトゲノム中約３００の構成要素を含み、その大多数はＣ末端モチーフＣａａＸによって特定することができる（Ｒｅｉｄら、２００４（３９））。Ｒａｓ、ＲｈｏおよびＲａｂファミリーのタンパク質（Ｌｅｕｎｇら、２００６（２８））、ミトコンドリアへの輸送機能を保証するある種のタンパク質（ＨＤＪ２）、ある種の有糸分裂タンパク質（ＣＥＮＰＥ、ＣＥＮＰＦ）は特にプレニル化されている（Ｗｉｎｔｅｒ−Ｖａｎｎ  ＆  Ｃａｓｅｙ、２００５（５１））。一般的に、ＣａａＸモチーフにおいてＸがセリン、メチオニン、システイン、アラニンまたはグルタミン酸である場合、好ましく付加されるイソプレノイドはファルネシルである。Ｘがロイシンである場合、ＣａａＬモチーフの認識は、ゲラニルゲラニル基の転移を触媒するＧＧＴａｓｅによって行われることが好ましいであろう（Ｂａｓｓｏら、２００６（１））。イソプレンから得られたその他の基をこのシステインに結合させることもおそらく可能であるが、文献には記載されていない。
【００１７】
ヒトにおいては、３種類のラミン遺伝子が存在する。１ｑ２１．２−ｑ２１．３に位置するＬＭＮＡ遺伝子（Ｗｙｄｎｅｒら、１９９６（５２））は、選択的スプライシングによってラミンＡおよびラミンＣを生じる。ＬＭＮＡ遺伝子は１２個のエキソンからなる。エキソン１の開始部は、ラミンＡおよびＣに共通の球状Ｎ末端をコードし、エキソン１の端部およびエキソン７の開始部までは、中央のヘリックス部分をコードし、最後に、その他のエキソンが球状Ｃ末端をコードする（Ｌｅｖｙ  ＆  Ｃａｕ）、２００３（２９））。
【００１８】
実際に、該遺伝子はスプライシングの違いによる４種の生成物をコードし、そのうちラミンＣおよびプレラミンＡが主な２つである（Ｌｉｎ  ＆  Ｗｏｒｍａｎ、１９９３（３１））。したがって、ラミンＡおよびラミンＣは、プレメッセンジャーのエキソン１０の位置で選択的スプライシング部位を使用して別々に産生され、ラミンＣがエキソン１から１０によってコードされ、ラミンＡがエキソン１から９、エキソン１０の最初の９０塩基対およびエキソン１１および１２（ラミンＡに特異的）によってコードされる。
【００１９】
したがって、プレラミンＡおよびラミンＣのペプチドは、最初の５６６アミノ酸の位置は同一であり、一方、ラミンＣおよびプレラミンＡのＣ末端部はそれぞれ６個および９８個の特異的アミノ酸を含有する。
【００２０】
Ｂ型のラミンは３つの異なるタンパク質（Ｓｈｅｌｔｏら、１９８１（４３））、すなわち、ラミンＢ１、Ｂ２（この２つのアイソフォームが最も代表的である）およびＢ３を含む。ＬＭＮＢ１遺伝子は５ｑ２３．３〜ｑ３１．１に位置し、ラミンＢ１をコードする１１個のエキソンを含む（Ｌｉｎ  ＆  Ｗｏｒｍａｎ、１９９５（３０））。ＬＭＮＢ２遺伝子は１９ｐ１３．３に位置し、選択的スプライシング機構によってラミンＢ２およびＢ３をコードする（Ｂｉａｍｏｎｔｉら、１９９２（２））。
【００２１】
ラミンＢが発生の初期段階から細胞全てにおいて構成的に発現されるのに対し、Ａ型のラミンは一般に胚幹細胞には存在せず（Ｓｔｅｗａｒｔら、１９８７（４５））、あらゆる分化した体細胞において発現される。それらの発現は、組織に応じて生存中ずっと調節を受ける（Ｄｕｑｕｅら、２００６（９））。ラミンＡの発現は特異的に阻止されているが、ラミンＣおよびその他のラミンは依然として発現しているマウスは明白な表現型を示さないので、それらの発現は必須ではないものと考えられる（Ｆｏｎｇら、２００６（１４））。
【００２２】
ラミンは、多種多様な機能を有する非常に多数のタンパク質を相手に相互作用し、したがって、ラミンは、ＤＮＡの複製および修復、転写およびスプライシングの制御ならびにクロマチン構造の組織化を含む数多くの核プロセスに関与する（Ｓｈｕｍａｋｅｒら、２００３（４４）、Ｚａｓｔｒｏｗら、２００４（５４）、Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎら、２００４（２６）、Ｇｒｕｅｎｂａｕｍら、２００５（１９）を参照のこと）。ラミナ構造の変化は、多数のヒトの遺伝性病変の原因となる。変化は、ラミン、またはラミナのその他のタンパク質をコードする遺伝子の突然変異に起因する。これらの病変は、総称してラミノパシーとして一緒に分類されている（Ｂｒｏｅｒｓら、２００６（５）、Ｍａｔｔｏｕｔら、２００６（３３））。近年、ラミノパシーの群にも属する病変を引き起こす、ラミン成熟に関与する酵素（特にＦａｃｅ１）の遺伝子の突然変異が特定された（Ｎａｖａｒｒｏら、２００４（３６）および２００５（３５））。
【００２３】
現時点では、ＬＭＮＢ１遺伝子またはＬＭＮＢ２遺伝子の突然変異に関連したヒトにおける唯一の病変は、ＬＭＮＢ１遺伝子の完全な重複によって引き起こされる白質ジストロフィーである（Ｐａｄｉａｔｈら、２００６（３７））。Ｂａｒｒａｑｕｅｒ−Ｓｉｍｏｎ症候群の患者のＬＭＮＢ２で見出された配列の変種の潜在的な関与については疑問が残る（Ｈｅｇｅｌｅら、２００６（２２））。しかし、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）実験によってインビトロにおいて、ならびにマウスモデルにおいて（Ｖｅｒｇｎｅｓら、２００４（５０））、Ｂ型ラミンが細胞の発生および完全性にとって不可欠であることが示された。実際に、ラミンＢ１欠損はマウスにおける周産期死亡の原因である。さらに、同じＬＭＮＢ１欠損マウスの胚の線維芽細胞の核は、ＬＭＮＡ遺伝子の突然変異を有する患者で観察されたものに類似した、核形態の著しい変化を示す。さらに、ラミンＢが有糸分裂中の分裂紡錘体の形成に必要であることが最近示されており、このことは、ラミンＢが細胞周期の間に活動的で多面的な役割を担い、それらの役割が核の構造の維持に限られるものではないことの立証につながる（Ｔｓａｉら、２００６（４８））。この後者の役割については、最近の文献が、ラミンＢの構造上の機能、すなわちラミンＢ１を人為的に除去した細胞は、細胞内に、回転する「漂う」核を有することを実証している（Ｌｉら、２００７（４５））。２つのラミンＢ１およびＢ２の間に存在する機能上の重複性はまた、これらのラミンの重要性を直接反映するものでもあることは疑いなく、高い淘汰圧をかけ、対応する遺伝子の配列のいかなる可能性のある突然変異の影響も覆い隠している。
【００２４】
ＬＭＮＡ遺伝子の突然変異に起因するラミンＡ／Ｃの機能的変化は、孤立した単独組織に影響を及ぼす軽度なものから周産期において致命的な全身性のものに及ぶ臨床的範囲における多種多様な病変を含む、少なくとも１５の障害の原因である。
【００２５】
ＬＭＮＡ遺伝子のいくつかの突然変異が、核膜中のタンパク質の集合を明らかに変化させ、その機能発現を妨害する。様々な組織の細胞において、核の形態が変化する。すなわち、細胞質中に遺伝物質を押し出すバルジを有することが多い（Ｇｏｌｄｍａｎら、２００４（１８））。
【００２６】
通常核膜と会合するタンパク質、ラミンＢ、特定の核膜孔タンパク質およびＬＡＰ２タンパク質は、これらのバルジの辺縁には存在しない。
【００２７】
これらの形態学的異常に続いて、機能的変化が生じ最終的に細胞死を引き起こす。ラミノパシーという用語に含まれる病変全ての中で、プレニル化されたタンパク質の異常な蓄積に関連するものだけが本発明に関係がある。
【００２８】
これらには主にハッチンソン−ギルフォード症候群または早老症症候群（Ｄｅ  Ｓａｎｄｒｅ−Ｇｉｏｖａｎｎｏｌｉら、２００３（７）、Ｅｒｉｋｓｓｏｎら、２００３（１１））および拘束性皮膚障害（Ｎａｖａｒｒｏら、２００４（３６））が含まれる。これら２つの症候群では、生理病理学的原因は、患者の細胞内における未成熟のファルネシル化プレラミンの蓄積および残存である。
【００２９】
出生期前後において致死的な拘束性皮膚障害が特徴とする臨床症候は、ほとんどが子宮内での運動を制限する皮膚欠損の結果である。この病状は非常にまれである。皮膚は硬く張りつめており、所々崩壊し、例えば腋窩または頚部での裂傷を引き起こす。睫毛、眉および体毛は存在しないか、または非常にまばらである。羊水過多であることが多く、胎児の運動の減少が妊娠６ヵ月から認められる。骨格レベルでは、Ｘ線撮影によって、あらゆる関節における収縮、先天性垂直距骨、貧弱で形成異常の二分割された鎖骨、細い肋骨、管状の腕部長骨および頭蓋の脱ミネラル化が示される。致死的な拘束性皮膚障害は劣性の常染色体によって遺伝する。
【００３０】
ＬＭＮＡおよびＺＭＰＳＴＥ２４／Ｆａｃｅ１の突然変異がこの病変について報告されている（Ｎａｖａｒｒｏら、２００４（３６））。いずれの場合も、生理病理学的機構は同じで、プレラミンＡは成熟することができず（Ｆａｃｅ１の無発現変異、またはプレラミンＡの突然変異による切断部位の消失）、ファルネシル化されたまま、したがって核膜に挿入されたまま維持される。細胞内におけるこれらの異常な前駆体の蓄積および残存は、おそらくラミンＢおよびＣがそれぞれの相手と正常に相互作用するのを妨げ、細胞の死、そして直ちに患者の死亡を引き起こす。当初考えられたように、細胞毒性をもたらすのは成熟ラミンＡの欠如ではなくファルネシル基の残存であることが、明白に実証された（Ｆｏｎｇら、２００４（１６））。
【００３１】
２００３年４月、下顎末端異形成症および早期老化を引き起こすある種の疾患に共通の症状の重複に基づいて、本発明者らは、早老症すなわち早期老化の最も典型的で最も深刻な形態が、ＬＭＮＡ遺伝子の突然変異に起因することを示した（Ｄｅ  Ｓａｎｄｒｅ−Ｇｉｏｖａｎｎｏｌｉら、２００３（７））。ハッチンソン−ギルフォード症候群とも呼ばれるこの疾患に罹患した小児は、最大で正常個体よりも１０倍速い加速老化を患い、平均余命は１３年以下である。ヨーロッパでは、およそ６００万人に１人の小児が罹患する。症状は、皮膚の老化、禿頭症、顎の大きさの縮小および老化に関係する問題、例えば関節の硬直および心血管障害である。心筋梗塞またはアテローム性動脈硬化を含む心血管障害は、死亡の原因となることが多い。
【００３２】
関与すると考えられる突然変異で、ＬＭＮＡ遺伝子のエキソン１１に位置するものは、プレｍＲＮＡの潜在的スプライシング部位を活性化し、１５０ヌクレオチドが欠失したｍＲＮＡを生じる（Ｄｅ  Ｓａｎｄｒｅ−Ｇｉｏｖａｎｎｏｌｉら、２００３（７）、Ｅｒｉｋｓｓｏｎら、２００３（１１））。この欠失ｍＲＮＡは、正常なラミンＡに成熟することができない異常なプレラミンＡ、プロゲリンに関与し、すなわち、プロテアーゼ認識部位を含むエキソン１１の５０個のアミノ酸が存在しないことにより、プロゲリンの２回目の切断が妨げられ、そのＣ末端にファルネシル基が維持される。したがってプロゲリンは核膜の核質側の面に挿入されたままとなり、核膜は特徴的な変化、すなわち細胞基質への核質のバルジおよび辺縁部ヘテロクロマチンの分布異常を有する（Ｇｏｌｄｍａｎら、２００４（１８））。さらに、プロゲリンの細胞毒性の原因は、成熟（切断、メチル化）を担う酵素のうちのいくつかが局在する小胞体包膜への固定にも必要とされるファルネシル基の残存である（Ｆｏｎｇら、２００４（１６））。
【００３３】
これらの全身性の病変は、通常老化に関連する徴候の早期出現を伴うという特殊な特徴を有する。これらに共通する生理病理学的特徴は、プレニル化ラミンを生成し、記載した結果を伴うことである。
【００３４】
最近の２つの研究によって、切断型または非切断型のファルネシル化プレラミンの核内蓄積を低減すると、細胞表現型の出現が有効に阻止されることが示された。第１の研究は、Ｆａｃｅ１プロテアーゼが欠損している早老マウスモデルに対して実施された（Ｐｅｎｄａｓら、２００２（３８））。このマウスを、半量のラミンＡを発現するマウス（Ｌｍｎａ＋／−マウス）と交配させると、Ｆａｃｅ１の欠如の影響が軽減される（Ｖｅｒｅｌａら、２００５（４９））。第２の研究は、潜在的スプライシング部位を標的とするモルホリノ（アンチセンスオリゴヌクレオチド）によってＨＧＰＳ患者の細胞を処理すると突然変異表現型が排除されることを示している（Ｓｃａｆｆｉｄｉ  ＆  Ｍｉｓｔｅｌｉ、２００５（４３））。
【００３５】
いくつかの最近の研究（Ｓｃａｆｆｉｄｉ  ＆  Ｍｉｓｔｅｌｉ、２００６（４２）参照）は、生理的な老化プロセスにおけるラミンＡの関与を示している。特に、生理的な老化の間に、エキソン１１の潜在的スプライシング部位を密かに使用して、プロゲリンはいかなるＬＭＮＡ遺伝子突然変異も有さない細胞によって合成されることが示された。このプロゲリンはラミナの細胞核の辺縁部に局在する。「正常に」老化している患者の細胞の核は、偶発的なスプライシング事象によって引き起こされるラミノパシーに特徴的なバルジを有することができ、このことが異常な細胞機能を引き起こし、おそらく少なくとも部分的に老化に関与するのであろう。
【００３６】
インビボにおいて、皮膚では、プロゲリンはまた、皮膚線維芽細胞および表皮細胞の小集団によって合成され、細胞内に年齢と共に蓄積する。したがって、プロゲリンは、皮膚老化のマーカーとなることができた（ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋら、２００７（３４））。
【００３７】
同一の分子機構が、早老症の個体における早期老化の徴候の原因となり、はるかに低いレベルで、突然変異を有さない個体の生理的な老化に関与するように思われる。
【００３８】
先行技術では、プロゲリンの病的な産生によって引き起こされた細胞表現型の改善への２つの治療的取り組みが記載されている。これらの解決策の第１は、エキソン１１のこの潜在的スプライシング部位を、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて（Ｓｃａｆｆｉｄｉ  ＆  Ｍｉｓｔｅｌｉ、２００５（４１））、またはｓｉＲＮＡを生産するレトロウイルスを用いて（Ｈｕａｎｇら、２００５（２５））処理することにより「マスキング」して、スプライセオソームによる使用をごく単純に阻止することである。その結果はインビトロでは有望であるが、これは「遺伝子」療法であり、この取り組みに基づく薬物の開発は、インビボでの効果を得るためのＯＡＳベクター化に関係する不都合全てを伴い、極めて長期的で複雑である。第２の解決策は、ファルネシルトランスフェラーゼ、すなわちファルネシルピロリン酸からプレラミンへのファルネシル基の転移を触媒する酵素を阻害することからなる。このような阻害剤（ＦＴＩ）を使用する場合、培養物のＨＧＰＳ（早老症）細胞において部分的にのみ「正常な」核膜が回復し、ＲＤマウス（ＫＯ  ＺＭＰＳＴＥ２４）の生存率は改善される（Ｇｌｙｎｎ  ＆  Ｇｌｏｖｅｒ、２００５（１７）、Ｃａｐｅｌｌら、２００５（６）、Ｔｏｔｈら、２００５（４７）、Ｆｏｎｇら、２００６（１５））。
【００３９】
しかし、ファルネシル化の阻害は代償性のゲラニルゲラニル化を誘導し得る（Ｂｉｓｈｏｐら、２００３（３）、Ｖａｒｅｌａら、２００８（５４再出）。
【００４０】
さらに、ＦＴＩはプロテアソームを阻害して細胞周期の停止を引き起こすことが最近報告された（Ｄｅｍｙａｎｅｔｓら、２００６（８）、Ｅｆｕｅｔ  ＆  Ｋｅｙｏｍａｒｓｉ、２００６（１０））。したがって、この処理が、おそらくユビキチン化はされるがプロテアソームによって分解されないプロゲリンの核質中への蓄積を引き起こすことは間違いない。
【００４１】
また、インビボにおけるプロゲリンのファルネシル化率の低下は非常に低く、５％程度であることが最近の研究で報告されているが（Ｙｏｕｎｇら、２００６（５３））、これはインビトロで観察された核の形態の回復を説明するには十分でない。
【００４２】
最後に、ＦＴＩはタンパク質のプレニル化経路のうち１経路のみに特異的であり、翻訳後のプレニル化の一般的阻害剤と考えることはできない。
【００４３】
さらに、この経路の酵素のうちの１つであるメバロン酸キナーゼが全く存在しないと幼少時に死亡することが報告されている（この酵素をコードする遺伝子の機能のホモ接合型突然変異による喪失、Ｈｏｆｆｍａｎｎら、２００３（２４）によって報告された症候群）。
【００４４】
抗ＨＩＶ治療および副作用
１．抗レトロウイルス治療を受けたＨＩＶ感染患者は、遺伝的早老性症候群の患者に認められるのと同等の加速老化の臨床的および生物学的徴候を示す。
【００４５】
抗レトロウイルス治療、すなわち、ヌクレオシド系（ＮＲＴＩ）または非ヌクレオシド系（ＮＮＲＴＩ）の逆転写酵素阻害剤およびウイルスプロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）は、ＡＩＤＳ感染患者の寿命を延長させることができ、その結果「生理学的な」老化が出現する（Ｃａｓａｕ  ２００５、Ｌｅｖｙら、２００３）。
【００４６】
しかし、感染自体および抗レトロウイルス治療は遺伝的加速老化症候群の患者に見られるのと同じ臨床的および生物学的徴候を示す（これらの症候群の最近の概説は、Ｎａｖａｒｒｏら、２００６を参照）。
【００４７】
ある種の症状はウイルス感染に直接関係すると思われる：
例えば、癌およびアテローム性動脈硬化の素因に関連した早期老化症候群であるウェルナー症候群（ＯＭＩＭ２７７７００）におけるヘリカーゼの突然変異は、ＨＩＶ−１のＬＴＲのトランス活性化およびウイルスの複製に不可欠の細胞タンパク質補助因子を漸加させる。感染細胞ではヘリカーゼの利用が極めて少ないため、老化および免疫抑制を引き起こし得る（Ｓｈａｒｍａら、２００７）。
【００４８】
マクロファージにおけるコレステロール輸送の変化がもう１つの例である。ウイルスタンパク質Ｎｅｆは、コレステロール流出を担うＡＢＣファミリーのパーミアーゼを阻害する（ＢｕｋｒｉｎｓｋｙおよびＳｖｉｒｉｄｏｖ、２００６；Ｍｕｊａｗａｒら、２００６；ＷａｎｇおよびＲａｄｅｒ、２００７）。マクロファージにコレステロールが蓄積すると、マクロファージは血管壁におけるアテローム斑の形成に関与する泡沫細胞に転換する（Ｐｅｎｎｉｎｇｓら、２００６）。抗レトロウイルス薬はまた、マクロファージのコレステロール流出を阻害し、アテローム斑の形成に関与する（Ａｚｚａｍら、２００６；Ｄｒｅｓｓｍａｎら、２００３；Ｗａｎｇら、２００７）。
【００４９】
数多くの臨床的および生物学的徴候はまた、抗レトロウイルス治療の結果であるものと思われる：抗レトロウイルス治療は、遺伝的早老性症候群、例えば、ハッチンソン−ギルフォード症候群（ＯＭＩＭ１７６６７０、Ｈｅｎｎｅｋａｍ、２００６参照）、下顎末端異形成症（ＯＭＩＭ２４８３７０）および致死性新生児型、ラミンＡおよびＣをコードするＬＭＮＡ遺伝子の変異またはラミンＡに成熟する間のプレラミンＡの切断に関与するＺＭＰＳＴＥ２４プロテアーゼ（ＦＡＣＥ１）の変異に関連した拘束性皮膚障害（ＯＭＩＭ２７５２１０）に認められる徴候を再現する：
【００５０】
・脱毛症（Ｔｏｒｒｅｓら、２００７；Ｗｉｗａｎｉｔｋｉｔ、２００４）、感染性皮膚化学的徴候とは無関係である（Ｍａｕｒｅｒ、２００５）。
【００５１】
・骨格系の異常、特に骨粗鬆症（BｒｏｗｎおよびＱａｑｉｓｈ、２００６；ＴｈｏｍａｓおよびＤｏｈｅｒｔｙ、２００３)、そのためにビタミンＤおよびビホスホネートによる正常化が提案されてきた（Ｍｏｎｄｙら、２００５）。
【００５２】
・筋萎縮症（Ｒｅｓｔｒｅｐｏら、２００６；Ｒｅｓｔｒｅｐｏら、２００４；Ｔｅｈｒａｎｚａｄｅｈら、２００４ａ；Ｔｅｈｒａｎｚａｄｅｈら、２００４ｂ）、特定の抗レトロウイルス治療によって阻害される（以下参照）２つのタンパク質分解系であるユビキチン−プロテアソーム系（ＣｏｉｓｔｅｌｌｉおよびＢａｃｃｉｎｏ、２００３）またはカルパイン（ＢａｒｔｏｌｉおよびＲｉｃｈａｒｄ、２００５；Ｃｏｓｔｅｌｌｉら、２００５）が関連。カルパイン３の筋突然変異は、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ２Ａ、ＯＭＩＭ２５３６００、Ｒｉｃｈａｒｄら、１９９５）形態の原因で、最初の徴候の１つが好酸球性筋炎である（Ｋｒａｈｎら、２００６）。
【００５３】
・心筋症（Ｂａｒｂａｒｏ、２００３；Ｒｅｓｔｒｅｐｏら、２００６）、心血管系の合併症（以下参照）とは関係なく、ＮＲＴＩのミトコンドリア毒性と関連がある（Ｌｅｗｉｓ、２００３）。
【００５４】
・心血管異常（ＭｏｎｄｙおよびＴｅｂａｓ、２００７）であって、脂質代謝障害（Ｈｕｉ、２００３；Ｊｏｎｅｓら、２００５；Ｍｏｙｌｅ、２００７）、アテローム（ｄｅ  Ｓａｉｎｔ  Ｍａｒｔｉｎら、２００６；ＴｈｏｍａｓおよびＳｍａｒｔ、２００７；ｖａｎ  Ｗｉｊｋら、２００６）、内皮細胞病変（Ｃｈｅｎら、２００５；Ｊｉａｎｇら、２００６；Ｚｈｏｎｇら、２００２）および脂肪細胞分化異常（Ｋｉｍら、２００６；Ｒｏｃｈｅら、２００２）を伴う。脂質代謝異常は、スタチン（Ｂｅｎｅｓｉｃら、２００４；Ｌｉａｎｇら、２００６；Ｍａｌｏｎら、２００６）またはコレステロールの腸吸収阻害剤（Ｎｅｇｒｅｄｏら、２００６）によって治療することができた。メタボリック症候群において変化するパラメータのいくつかを部分的に正常化するプラバスタチン（Ｙａｍａｇｉｓｈｉら、２００６）は、コレステロール血症をあまり改善することなく皮下脂肪組織の増加を引き起こす（Ｇｈａｒａｋｈａｎｉａｎら、２００６；Ｍａｌｌｏｎら、２００６）ことに注意されたい。
【００５５】
・低アンドロゲン血症に関連した臨床徴候は男性において頻繁に認められ（Ｃｏｈａｎ、２００６）、ＨＩＶ陽性の女性の早期閉経の症例は、いくつかの出版物の主題である（Ｃｏｈａｎ、２００６、Ｆｅｒｒｅｉｒａら、２００７）。
【００５６】
ウイルスプロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）は、プロテアーゼを含む複数の細胞標的を有する：
・プロテアソームの阻害（Ｐｉｃｃｉｎｉｎｉら、２００５）は、数多くの細胞機能、すなわちタンパク質代謝回転、細胞周期制御、アポトーシス、遺伝子転写、シグナル伝達、老化、ストレス応答など（Ｎａｕｊｏｋａｔら、２００７）に対するタンパク質分解性の会合の役割によって、変化に富んだ結果を有する。例えば、ＰＩが脂肪細胞分化を阻害する方法の１つには、脂肪細胞分化に関与するメタロプロテアーゼ（亜鉛）ＭＭＰ９をコードする遺伝子の転写を制御するＮＦｋＢ転写調節因子が産生されないことが必要である（Ｂｏｕｒｌｉｅｒら、２００５；Ｄｅ  Ｂａｒｒｏｓら、２００７）。
【００５７】
・別の例は、インシュリンが関与するシグナル伝達経路である（Ｒｕｄｉｃｈら、２００５；Ｓｃｈｕｔｔら、２００４）。ＰＩは、インシュリン分解酵素の活性を阻害し（Ｈａｍｅｌら、２００６）、インシュリン分泌を担うカリウムチャンネルを遮断し（Ｎｅｙｅら、２００６）、Ｇｌｕｔ４グルコース輸送体と相互作用し、（Ｈｅｒｔｅｌら、２００４）、輸送体の原形質膜への挿入を妨害する（Ｈｒｕｚ、２００６；Ｐａｒｋｅｒら、２００５）。
【００５８】
・同様に、ＰＩは、ＩＧＦ１を含むチロシンキナーゼ活性受容体の活性化によって関与するＡｋｔキナーゼによるシグナル伝達経路を遮断する（Ｇｕｐｔａら、２００５）。ＩＧＦ１は、筋萎縮または筋肥大を直接制御する（Ｇｌａｓｓ、２００３）。
【００５９】
・ＰＩは、Ｃａ＋＋依存性の細胞基質プロテアーゼであるカルパインを阻害することによって抗アポトーシス効果を発揮し（Ｇｈｉｂｅｌｌｉら、２００３；Ｌｉｃｈｔｎｅｒら、２００６）、自己貪食液胞の形成に不可欠なＡＴＧ５切断によるアポトーシス−自己貪食のバランスを制御する（Ｙｏｕｓｅｆｉら、２００６）。
【００６０】
・２種類のその他の酵素系、すなわち、腸または肝臓のサブファミリー３Ａの特定のＰ４５０シトクロム（Ｇｒａｎｆｏｒｓら、２００６）はＰＩによって阻害され、一方、サブファミリー２Ａのその他のＰ４５０シトクロムはその他の輸送体（Ｄｉｘｉｔら、２００７；Ｙｅｈら、２００６）と同時に誘導され（Ｙｅｈら、２００６）、ＲＥにおけるグルクロン酸抱合、特にビリルビンのグルクロン酸抱合（Ｚｈａｎｇら、２００５）は、ＰＩによって阻害される。
【００６１】
・複数の酵素活性の阻害、すなわち、プロテアソームが小胞体ストレス、ＵＰＲ（小胞体ストレス応答）の活性化および転写調節因子が出現した核の小胞体のシグナル伝達機構の関与を誘導する（Ｚｈｏｕら、２００６）。数多くの出版物が、コレステロールを含む脂質の代謝を調節する遺伝子の活性化を制御するＳＲＥＢＰ（ステロール応答因子結合タンパク質）アイソフォームの量の増加を示している（Ｃｏｌｇａｎら、２００７；Ｍｉｓｅｒｅｚら、２００２；Ｎｇｕｙｅｎら、２０００；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、２００４；Ｚｈｏｕら、２００６；Ｚｈｏｕら、２００５）。ＰＩによるＳＲＥＢＰ転写の誘導はまた、分化プロセスにおける脂肪細胞のトランスクリプトームの研究（チップ、定量的ＰＣＲ）によっても示されており（Ｐａｃｅｎｔｉら、２００６）、その効果はユビキチン−プロテアソーム系によってＳＲＥＢＰが分解されないと増加する。
【００６２】
ＰＩは、肝細胞および脂肪細胞におけるＳＲＥＢＰの核内蓄積を誘導し、脂質代謝に影響を及ぼす（脂肪酸およびコレステロールの合成を増加させる）（Ｈｕｉ、２００３；Ｒｉｄｄｌｅら、２００１）。
【００６３】
・脂肪細胞のインビトロ分化を分析している同じパリのチームによる３つの文献は、ＰＩがインシュリン抵抗性症候群、すなわちラミンＡ局在の異常と関連した核質におけるＳＲＥＢＰの局在異常を引き起こし（Ｃａｒｏｎら、２００１）、ＳＲＥＢＰ切断を阻害し（ゴルジプロテアーゼＳ−１ＰおよびＳ−２Ｐによる、Ｓｅｉｄａｈら、２００６参照）、脂質代謝酵素の合成に影響を及ぼし、すなわちラミンＡの成熟異常が生じるが、ラミンＢの成熟は変化せず（Ｃａｒｏｎら、２００３）、ＬＭＮＡ遺伝子の変異に関連した脂肪萎縮症に認められるミトコンドリアストレスとＰＩ処理によって得られたストレスは類似している（Ｃａｒｏｎら、２００７）ことを次々と示している。
【００６４】
これらの研究の利点の１つは、特定のＰＩがプレラミンＡの成熟に関与するプロテアーゼ（ＦＡＣＥ１またはＺＭＰＳＴＥ２４）を阻害することを強く示唆していることで、データはアメリカのチームによって確かめられた（Ｃｏｆｆｉｎｉｅｒら、２００７）。対照的に、これらのＰＩは、切断が成熟に必要なプレラミンＢの切断だけでなくＲａｓ単量体タンパク質Ｇの切断に関与するプロテアーゼＦＡＣＥ２（またはＲｃｅ１、Ｒａｓ変換酵素１）の活性には影響を及ぼさない（ＷｒｉｇｈｔおよびＰｈｉｌｉｐｓ、２００６）。最近の定量的ＲＴ−ＰＣＲ研究によって、ＰＩはラミンＣをコードするｍＲＮＡの量を変化させずにラミンＡをコードするｍＲＮＡの量の減少を引き起こすことが示されている（Ｍｉｒａｎｄａら、２００７）。
【００６５】
・ＰＩは、ミトコンドリアに向かうシグナルの切断、ミトコンドリアタンパク質の再生およびミトコンドリアの融合およびアポトーシスに関連する特定のミトコンドリアＧＴＰａｓｅ（ＯＰＡ１）の制御を担うミトコンドリアプロテアーゼを阻害する（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙら、２００２；Ｒｏｅｈｌ  ＷｈｉｔｅおよびＬａｕｒｉｎｇ、２００７）。
【００６６】
・カルパインに対する作用とは関係なく（前記参照）、ＰＩは、アポトーシス誘発刺激によって引き起こされる内膜の脱分極をタンパク質ＵＣＰ２で遮断することによって、Ｔリンパ球に抗アポトーシス効果を発揮する（Ｍａｔａｒｒｅｓｅら、２００３；Ｍａｔａｒｒｅｓｅら、２００５）。
【００６７】
・したがって、ＰＩはこうしてＡＩＤＳウイルスに特異的なアスパルチルプロテアーゼの様々な酵素を阻害することに注意されたい（Ｄｕｎｎら、２００２）。文献は現在この点に関しては言及してないが、ＰＩはまた、ある種の真核細胞アスパルチルプロテアーゼ（「Ｄｅｇｒａｄｏｍｅ」：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｏｖｉ．ｅｓ／ｄｅｇｒａｄｏｍｅ／のサイトを参照）、例えば、ペプチダーゼペプチドシグナルであるプレセリン、またはユビキチン化タンパク質を分解するためにプロテアソームおよびユビキチン化タンパク質の両方に結合できるＤｄｉ１（ＤＮＡ損傷誘導タンパク質）を阻害することができる（Ｓｉｒｋｉｓら、２００６）。
【００６８】
ウイルスのヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）はまた複数の細胞標的を有し、そのうちの最も重要なものの１つがミトコンドリアである：
・あまり研究されていないウイルスの非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤は、Ｔ細胞系のアポトーシスを誘導する間、ウイルス酵素に対してより特異的な作用を有するものと思われる（Ｐｉｌｏｎら、２００２）。
【００６９】
・ＮＲＴＩは、核ＤＮＡに組み込まれ（Ｏｌｉｖｅｒｏら、１９９９）、その突然変異誘発効果が細胞周期の遮断の原因となり得る（Ｏｌｉｖｅｒｏら、２００５）。ミトコンドリアのＤＮＡ複製および修復（ＨｕｄｓｏｎおよびＣｈｉｎｎｅｒｙ、２００５）を担うガンマポリメラーゼＤＮＡの突然変異が報告された（Ｙａｍａｎａｋａら、２００７）。
【００７０】
・少数の出版物によって、ＮＲＴＩは、分枝を組み込んだ糖前駆体のゴルジ体におけるヌクレオチド輸送体を妨害することによって、Ｎ−グリコシル化（小胞体における）、Ｏ−グリコシル化および分枝を組み込んだ糖の改変（ゴルジ体における）を阻害することが示されている（Ｌｉｚｚｉら、２００７）。いくつかの筋ジストロフィーは、グリコシル化の遺伝的異常に関連している（Ｍｕｎｔｏｎｉら、２００４；ＰｅｒｃｉｖａｌおよびＦｒｏｅｈｎｅｒ、２００７）。
【００７１】
・ＮＲＴＩは、特殊化された輸送体ファミリーによってミトコンドリアマトリクスのデオキシヌクレオシド２リン酸に輸送され、ＤＮＡポリメラーゼガンマによってミトコンドリアＤＮＡに組み込まれる前にミトコンドリアキナーゼによってリン酸化される（Ｐａｌｍｉｅｒｉ、２００４）。
【００７２】
・ＮＲＴＩの遺伝毒性は、ミトコンドリアＤＮＡ突然変異率の増加およびミトコンドリアにおけるそのコピー数の減少の原因となる（ＫｏｈｌｅｒおよびＬｅｗｉｓ、２００７、Ｏｌｉｖｅｒｏ、２００７）。
【００７３】
・ミトコンドリアＤＮＡの異常およびＤＮＡポリメラーゼガンマ作用の異常は、呼吸鎖およびＡＴＰ合成酵素の複合体を、核ゲノムによってコードされ移入されたタンパク質と共に構成する内膜の１３個のタンパク質の合成に影響を及ぼす。ミトコンドリアＤＮＡおよびそのポリメラーゼの破壊は、例えば、シトクロム酸化酵素ＩＩの量の減少（Ｖｉｄａｌら、２００６）、活性酸素種（ＲＯＳ）の産生（Ｊｉａｎｇら、２００７）と共に脂肪萎縮症および心血管合併症に関与する肝細胞、脂肪細胞、心筋細胞および上皮細胞への影響の原因となる。
【００７４】
血漿乳酸レベルの上昇は、抗レトロウイルス治療によって引き起こされるミトコンドリア機能不全の判定基準の１つである（２００７；Ｊｏｈｎら、２００１）。
【００７５】
・ＮＲＴＩはまた、テロメラーゼ活性を阻害し、テロメアの短小化を引き起こす（Ｏｌｉｖｅｒｏ、２００７；Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、２００１）。
【００７６】
結論として、抗レトロウイルス治療は正常な老化または加速老化を説明しようとするいくつかの細胞理論において一緒に分類された代謝機構および経路に影響を及ぼす：
・「ミトコンドリア理論」：
・ＬＭＮＡ遺伝子が早老症に関与するという発見と共に２００３年に出現した「核およびラミン」理論、
・「テロメア」理論、
・特にタンパク質ｐ５３、ＮＦ−κＢによる「遺伝子転写調節」理論、
・いくつかが膜受容体によって活性化されるシグナル伝達経路の関与する「代謝」理論、
・早期老化、または対照的に、寿命延長のいくつかの動物モデルは、これらの理論のそれぞれに関与する代謝経路と相互作用の間、細胞規模では細胞基質と特にタンパク質分解機構との間（Ｇｒｉｌｌａｒｉら、２００６）、ミトコンドリア、核および原形質膜の間（Ｉｒｍｉｎｇｅｒ−Ｆｉｎｇｅｒ、２００７；Ｋｅｎｙｏｎ、２００５；ＭａｒｔｉｎおよびＬｏｅｂ、２００４；ＱｕａｒｒｉｅおよびＲｉａｂｏｗｏｌ、２００４）に部分的重複があることを示している。
【００７７】
早期老化、または対照的に、寿命延長のいくつかの動物モデルは、これらの理論のそれぞれに関与する代謝経路と相互作用の間、細胞規模では細胞基質と特にタンパク質分解機構（Ｇｒｉｌｌａｒｉら、２００６）、ミトコンドリア、核および原形質膜の間（Ｉｒｍｉｎｇｅｒ−Ｆｉｎｇｅｒ、２００７；Ｋｅｎｙｏｎ、２００５；ＭａｒｔｉｎおよびＬｏｅｂ、２００４；ＱｕａｒｒｉｅおよびＲｉａｂｏｗｏｌ、２００４）に部分的重複があることを示している。
【００７８】
２．老化の「ミトコンドリア」理論（添付の図６）
老化のミトコンドリア理論の主要な３つの構成成分は、ｉ／呼吸鎖の複合体ＩおよびＩＩによる活性酸素種（ＲＯＳ）産生の増加、ｉｉ／それらの機能不全の進行、ならびにｉｉｉ／ミトコンドリアＤＮＡ損傷の蓄積である（Ｂａｌａｂａｎら、２００５；Ｍｅｉｓｓｎｅｒ、２００７；Ｗａｌｌａｃｅ、２００５）。
【００７９】
ミトコンドリアＤＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼガンマを標的とするＲＯＳの影響に対して核ＤＮＡよりも敏感である（Ｇｒａｚｉｅｗｉｃｚら、２００２；Ｒｉｃｈｔｅｒら、１９８８）。プルーフリーディング機能においてＤＮＡポリメラーゼガンマ発現が欠如している２種類のマウスモデルは、ミトコンドリアＤＮＡの突然変異によって老化が加速していることを示す（Ｋｕｊｏｔｈら、２００５；Ｔｒｉｆｕｎｏｖｉｃら、２００４）。ＲＯＳのミトコンドリア毒性は、寿命が延長しているトランスジェニックマウスモデルではミトコンドリアに対するペルオキシソームカタラーゼの過剰発現によって除去することができる（Ｓｃｈｒｉｎｅｒら、２００５）。
【００８０】
ヒトにおいて、老化には、呼吸鎖の機能を含むミトコンドリア機能の低下（Ｓｈｏｒｔら、２００５；Ｔｒｉｆｕｎｏｖｉｃら、２００５）、および神経変性疾患に非常に特異的に認められるミトコンドリアＤＮＡ欠落の増加（Ｂｅｎｄｅｒら、２００６；Ｋｒａｙｔｓｂｅｒｇら、２００６）が伴う。
【００８１】
まだ理解の不十分なミトコンドリアから核へのシグナル伝達機構によって、特に老化段階またはＲＯＳ誘導性病理においてタンパク質ｐ３２が関与するようになっている（Ｊｉａｎｇら、１９９９；Ｓｔｏｒｚ、２００６）。核ゲノムによってコードされ、次いでミトコンドリアマトリクスに輸送されたこのタンパク質は、転写（Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙら、２００４）およびｍＲＮＡのスプライシング（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ−Ｍａｈｒｔら、１９９９）を制御する核質に再度搬出される（Ｂｒｏｋｓｔａｄら、２００１）。このタンパク質は、核膜の核質面に局在するラミンＢ受容体と相互作用する（Ｍｙｌｏｎｉｓら、２００４；ＳｉｍｏｓおよびＧｅｏｒｇａｔｏｓ、１９９４）。
【００８２】
核からミトコンドリアへのシグナル伝達機構には、細胞基質で合成され、次にミトコンドリアへ輸送される、核ゲノムによってコードされる約１５００個のタンパク質が関与する（Ｃａｌｖｏら、２００６；Ｔｒｕｓｃｏｔｔら、２００３）。
【００８３】
これらのタンパク質の中で、ｐ５３はマウスモデルにおける加速された老化に関与し（Ｔｙｎｅｒら、２００２）、「核」理論の場合では調節解除に関係する（以下参照）。タンパク質ｐ５３はミトコンドリアでの呼吸を制御し（Ｍａｔｏｂａら、２００６）、核遺伝子転写を制御することによって酸化促進物質および抗酸化物質としての効果を発揮する（ＢｅｎｓａａｄおよびＶｏｕｓｄｅｎ、２００５；Ｓａｂｌｉｎａら、２００５）。ｐ５３は、ＤＮＡポリメラーゼガンマと相互作用することによってミトコンドリアＤＮＡの安定性を維持する（Ａｃｈａｎｔａら、２００５）。
【００８４】
最後に、ミトコンドリア分裂（分割）および融合の機構は、ミトコンドリア外膜（Ｄｒｐ１、ミトフシンなど）およびミトコンドリア内膜（ＯＰＡ１）の複数のＧＴＰアーゼおよび複数の関連タンパク質（Ｆｉｓ１など）に関連があり、細胞老化プロセスを調節し、すなわち融合が持続してミトコンドリアネットワークが延長すると細胞老化プロセスが誘導され、内膜の２面の間の潜在的な違いが減少し、ＲＯＳの産生およびＤＮＡ病変が増加する。これらの表現型の変更は、ミトコンドリアネットワークを分断することによって中和される（Ｌｅｅら、２００７）。
【００８５】
３．「核およびラミン」理論における遺伝的加速老化症候群の機構
ラミンは、核質に限定して局在する中間体フィラメント形成タンパク質である。ＬＭＮＡ遺伝子は主に、選択的スプライシングによって生成されるラミンＡおよびＣをコードする。２種類のその他の遺伝子はラミンＢ１およびＢ２をコードする。
【００８６】
ラミンＡおよびＢは、細胞基質内において前駆体の形態で合成され、複数の成熟ステップを受ける。３種類のタンパク質は、Ｃ末端にＣａａＸボックス（システイン、２個の脂肪族アミノ酸、１個の無関係なアミノ酸）を有する。このＣａａＸ配列は、ラミンＡおよびＢ（およびヒトゲノムの約３００個のその他のタンパク質）をファルネシル化することができる。ファルネシル残基（１５個の炭素原子を有するイソプレノイド）は、コレステロール合成経路の中間ステップで合成される（添付の図７）。細胞基質酵素、ファルネシルトランスフェラーゼはシステインのファルネシル残基に結合させる。
【００８７】
脂肪酸残基の存在によって、小胞体（ＥＲ）の包膜の細胞基質層にプレラミンＡおよびＢを固定することができる。その後プレラミンＡおよびＢはＦＡＣＥ１（ＺＭＰＳＴＥ２４）またはＦＡＣＥ２（Ｒｃｅ１）それぞれによって切断され、Ｃ末端最後の３個のアミノ酸ａａＸを失う。ＥＲの包膜にまだ固定されているタンパク質は、既にファルネシル化されているシステインにメチル基を結合する第２の酵素、ＩＣＭＴの作用を受ける。
【００８８】
ラミンＢの成熟は、このステップで終結する。これらのタンパク質はＥＲの核膜面、次いで核膜の細胞基質面を滑り、核膜孔を通過し、核膜の核質層に局在して、そこでこれらのタンパク質は核ラミナの形成に関与するようになり、ラミンＢ受容体を含む複数のタンパク質と相互作用する。核膜に固定されることによって、ラミンＢは核マトリクス中には存在せず、核質内にあって核膜からは遠位にある。
【００８９】
同一Ｃ末端システイン上でファルネシル化され、カルボキシメチル化されたプレラミンＡは、最後の１５個のアミノ酸がＦＡＣＥ１によって（おそらくＲｃｅ１によって）タンパク質分解的に切断することによって最終的な成熟ステップを受ける。ラミンＡはＥＲへの固定が解除されて可溶性になり、全可溶性タンパク質のように、必要な移行複合体を動員する核内移行シグナルによって核膜孔を通って核質内へ輸送される（ラミンＣのように）（添付の図８）。
【００９０】
核質において、ラミンＡ（およびＣ）は、核膜下の核ラミナに局在し、核膜の核質層に挿入された数多くのタンパク質と相互作用する。ラミンＡおよびＣはまた（ラミンＢとは異なり）、核質の残部に分散し、核マトリクスまたは核骨格の形成に関与するようになる（添付の図６）。
【００９１】
核マトリクスは、核ゲノムの機能、すなわち、複製、ＤＮＡ修復、ＲＮＡ転写、ｍＲＮＡスプライシング、その他のＲＮＡの成熟などを制御し、ラミンＡおよびＣを含むその構成要素は、遺伝的ラミノパシーで認められた異常によって示されるように、核質に輸送された多数のタンパク質（ｐ５３、ＳＲＥＢＰなど）と相互作用する（Ｂｒｏｅｒｓら、２００６；Ｖｌｃｅｋら、２００１；ＶｌｃｅｋおよびＦｏｉｓｎｅｒ、２００６）。核膜および膜貫通タンパク質の核質勾配、ならびにラミナのラミンは、使用前および遺伝子発現調節中に転写調節因子の保存に関与する（ＨｅｅｓｓｅｎおよびＦｏｒｎｅｒｏｄ、２００７；Ｓｈａｋｌａｉら、２００７）。
【００９２】
１９９９年から発見された最初のラミノパシーは、所与の組織、骨格筋、心筋などで顕著な疾患として示されたが、ラミンはいたる所に存在するタンパク質である（ＶｌｃｅｋおよびＦｏｉｓｎｅｒ、２００７ａ；ＶｌｃｅｋおよびＦｏｉｓｎｅｒ、２００７ｂ；ＷｏｒｍａｎおよびＢｏｎｎｅ、２００７）。脂肪萎縮症は脂質代謝異常およびインシュリン抵抗性と関連があり、脂肪組織の体内分布の障害を伴い、抗レトロウイルス治療中に認められる脂肪萎縮症と類似している（Ｃａｐｅａｕら、２００５）。
【００９３】
「全身性」ラミノパシー、すなわち下顎末端異形成症（ＯＭＩＭ  ２４８３７０；（Ａｇａｒｗａｌら、２００３；Ｎｏｖｅｌｌｉら、２００２）、ハッチンソンギルフォード早老症（ＯＭＩＭ  １７６６７０；（Ｄｅ  Ｓａｎｄｒｅ−Ｇｉｏｖａｎｎｏｌｉら、２００３；Ｅｒｉｋｓｓｏｎら、２００３）、拘束性皮膚障害（ＯＭＩＭ  ２７５２１０；（Ｎａｖａｒｒｏら、２００５；Ｎａｖａｒｒｏら、２００４）は２００２年以後に発見された。これらは、患者の体組織全て、すなわち皮膚および付属器、骨格筋および心筋、骨および軟骨組織、脂肪組織およびその代謝産物に関与するが、特に、加速した老化を伴い、最も重篤なのは拘束性皮膚障害で、出生時に死亡する。これら３種の疾患は、ラミンＡおよびＣをコードするＬＭＮＡ遺伝子の突然変異またはプレラミンを２段階で切断するＥＲのプロテアーゼをコードするＦＡＣＥ１遺伝子（ＺＭＰＳＴＥ２４）のいずれかの変異と関連がある。ＬＭＮＡ遺伝子の突然変異は、プレラミンＡのＦＡＣＥ１による認識部位の消失を引き起こし、このタンパク質は切断されず、したがってファルネシル残基を保持し、ラミンＢのように包膜を滑ることによって核質に輸送される（Ｐａｎら、２００７）。ファルネシル化プレラミンＡは核膜の核質側に固定されたままになり、ラミナの構築およびラミナと包膜の膜タンパク質との間の相互作用を破壊し、特徴的な核変形に関与する（Ｇｏｌｄｍａｎら、２００４）。
【００９４】
核マトリクスの残部はラミンＡを有さず、多数の機能的結果、例えば、ｐ５３の下流経路の活性化（Ｖａｒｅｌａら、２００５）、有糸分裂の異常（Ｃａｏら、２００７；Ｄｅｃｈａｔら、２００７）およびＤＮＡ修復の異常（Ｌｉｕら、２００５；Ｌｉｕら、２００６；Ｌｉｕら、２００７ｂ）などが生じ、細胞老化をもたらす（Ｋｕｄｌｏｗら、２００７）。早老症患者の細胞のトランスクリプトームの分析によって、アテローム性動脈硬化に関与する遺伝子発現の異常が示された（Ｃｓｏｋａら、２００４）。
【００９５】
ある種の抗レトロウイルス薬、特に、ＺＭＰＳＴＥ２４（ＦＡＣＥ１）を阻害するＰＩで治療された患者における加速老化は、同じ機構に従うものと考えられる。
【００９６】
早老症に関与するＬＭＮＡ遺伝子の突然変異によって、潜在的スプライシング部位が曝露され、１５０ヌクレオチドが欠如したプロゲリンをコードするｍＲＮＡ、５０個のアミノ酸が欠如し、ファルネシル基を保持したプレラミンＡの合成が引き起こされる。同様のタンパク質が、年齢に伴うスプライシング機構の誤差によるＬＭＮＡ遺伝子のいかなる変異も存在しない生理学的老化の間に産生される（ＳｃａｆｆｉｄｉおよびＭｉｓｔｅｌｉ、２００６）。プロゲリンは、基底膜下ならびに表皮細胞中に局在する皮膚線維芽細胞に蓄積される。それは、皮膚老化のマーカーとなることができた（ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋら、２００７）。
【００９７】
早老症の患者の細胞に見出される核の変更（細胞基質への核質のバルジ、包膜の崩壊、核輪郭の不規則性など）はまた、核膜およびラミナを一時的に崩壊させることによって、核膜孔によって核質に輸送するには大きすぎる複合体であるＡＩＤＳウイルスの組み込み前複合体の侵入を容易にする、ウイルスタンパク質Ｖｐｒによって誘導される一時的変更と類似している（ｄｅ  Ｎｏｒｏｎｈａら、２００１）。これらの核輸送機構の最近の概説（ＳｕｚｕｋｉおよびＣｒａｉｇｉｅ、２００７）。
【００９８】
エメリ−ドレフュス型筋ジストロフィーでは変異するエメリンを含む核膜の核質面の複数のタンパク質は、ＡＩＤＳウイルスの核質への貫通および分裂しない細胞の感染に不可欠であることも示されている（ＪａｃｑｕｅおよびＳｔｅｖｅｎｓｏｎ、２００６）。
【００９９】
したがって、遺伝的ラミノパシーという用語は、ラミンをコードする遺伝子、非常に具体的には、ラミンＡおよびＣをコードするＬＭＮＡにおける変異から生じる病変を含むが、ラミン成熟に関与するタンパク質を含む関連タンパク質の変異によって引き起こされる病変も含む。
【０１００】
したがって、核マトリクスのレベルでＰＩによって誘導される異常は、後天性および医原性のラミノパシーを表す。遺伝的であろうと後天的であろうと、各マトリクスにおけるこれらの異常はゲノムの不安定性および細胞老化をもたらす（Ｍｅｈｔａら、２００７；ＯｂｅｒｄｏｅｒｆｆｅｒおよびＳｉｎｃｌａｉｒ、２００７）。
【０１０１】
４．老化の「テロメア」理論
細胞老化は、核有糸分裂において短小化するテロメアの長さを測定する「時計」、すなわち、触媒性テロメラーゼサブユニットの活性によって補償することができる現象によって制御される（ＧｉｌｓｏｎおよびＧｅｌｉ、２００７；ＳｔｅｗａｒｔおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ、２００６）。
【０１０２】
特に単核化した血液細胞におけるテロメア長の直接測定を可能にする定量的ＰＣＲ（Ｃａｗｔｈｏｎ、２００２；ＧｉｌおよびＣｏｅｔｚｅｒ、２００４；Ｎｊａｊｏｕら、２００７）が出現する前は、テロメラーゼ活性の測定（ＴＲＡＰアッセイ）は、抗レトロウイルス薬で治療された患者の細胞で実施され、特に、分析したＴリンパ球のサブタイプに応じて、結果が変動していた（Ｅｆｆｒｏｓ、２０００）。
【０１０３】
ＮＲＴＩは、テロメラーゼ活性を阻害する（Ｏｌｉｖｅｒｏ、２００７、Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、２００１）。
【０１０４】
ラミンＡの異常は、テロメラーゼ活性の抑制を引き起こし、テロメア短小化の加速をもたらす。これらの効果は、細胞が触媒性テロメラーゼサブユニットを過剰発現するように形質移入されていようといなかろうと、早老症の患者の細胞で認められる（Ｗａｌｌｉｓら、２００４）。早老症におけるように、形質移入後正常な、変異した、または欠失したラミンＡを過剰発現する健康な被験者の線維芽細胞で、同等の結果が得られた（Ｈｕａｎｇら、２００８）。したがって、核マトリクスおよびラミナのレベルで核マトリクスに関連した核膜のタンパク質は、直接的または間接的にテロメラーゼ活性を制御する（Ｐａｎｄｉｔａら、２００７）。
【０１０５】
５．特定の転写調節因子、特に、ｐ５３およびＮＦ−κＢは、老化またはその調節に関与する。
【０１０６】
タンパク質ｐ５３（Ｚａｆｏｎ、２００７）およびＮＦ−κＢ（ＨａｙｄｅｎおよびＧｈｏｓｈ、２００４）のファミリーは、多数の遺伝子の転写を制御し、老化現象に関与する。これらのタンパク質はまた、老化のその他の理論で記載された機構に関与し、互いに関連している。
【０１０７】
細胞周期の制御、ストレス応答、腫瘍形成およびＤＮＡ損傷修復におけるよく特徴付けられたその機能と並んで（Ｆｕｓｔｅｒら、２００７；ＨｅｌｔｏｎおよびＣｈｅｎ、２００７；ＳｅｎｇｕｐｔａおよびＨａｒｒｉｓ、２００５）、ｐ５３は細胞老化に関与する（例えば、（ＢａｕｅｒおよびＨｅｌｆａｎｄ、２００６；Ｂｅｎ−ＰｏｒａｔｈおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ、２００５；ＰａｐａｚｏｇｌｕおよびＭｉｌｌｓ、２００７；ＳｈａｒｐｌｅｓｓおよびＤｅＰｉｎｈｏ、２００２；Ｔｙｎｅｒら、２００２参照）。外膜のアポトーシス性分子との相互作用によるアポトーシスの活性化におけるｐ５３の役割とは関係なく（Ｍａｎｆｒｅｄｉ、２００３；Ｍｉｈａｒａら、２００３；Ｍｏｌｌら、２００５）、タンパク質ｐ５３はまた、変異がウェルナー症候群の原因となる（Ｂｒｏｓｈら、２００１；Ｓｏｍｍｅｒｓら、２００５）ヘリカーゼの機能化、テロメア調節（Ｗｙｎｆｏｒｄ−Ｔｈｏｍａｓ、１９９６）およびミトコンドリア呼吸の制御（Ｍａｔｏｂａら、２００６）におけるラミノパシーによって誘導される異常と関与する（Ｖａｒｅｌａら、２００５）。ｐ５３はまた、「インシュリン−ＩＧＦ１−ｋｌｏｔｈｏ」代謝経路を調節する（以下参照）。
【０１０８】
ＮＦ−κＢはまた、多くの代謝経路に関与する。培養した線維芽細胞においてＲＮＡ干渉によってＮＦ−κＢを不活性化すると、代謝経路は老化から防御される（Ｈａｒｄｙら、２００５）。同様に、マウス上皮細胞においてＮＦ−κＢを発現させることによって誘導できる遮断は、マイクロアレイによって分析された数多くの遺伝子の発現を変更することによって老化を遅延させる（Ａｄｌｅｒら、２００７）。
【０１０９】
６．カロリー制限およびインシュリン、ＩＧＦ１およびｋｌｏｔｈｏホルモンのシグナル伝達経路による老化の「代謝」理論は、原形質膜、核およびミトコンドリアに関連する。
【０１１０】
カロリー制限は、齧歯類の寿命を延長させる（ＢｏｒｏｎｅおよびＧｕａｒｅｎｔｅ、２００５）。カロリー制限は、ヒストン（クロマチンの再構築を伴う）（ＶｉｊｇおよびＳｕｈ、２００６）、数多くのその他の核タンパク質（ｐ５３を含む転写因子、ＤＮＡ修復に関連したタンパク質など）、ならびに細胞基質（チューブリン）およびミトコンドリアのタンパク質を標的とする脱アセチル化酵素サーチュインを活性化する（ＧｕａｒｅｎｔｅおよびＰｉｃａｒｄ、２００５；ＮｏｒｔｈおよびＶｅｒｄｉｎ、２００４；ＰｏｒｃｕおよびＣｈｉａｒｕｇｉ、２００５）。
【０１１１】
カロリー制限は、内皮型ＮＯ合成酵素、ｅＮＯＳの発現によってミトコンドリアの生合成を引き起こし（ＮｉｓｏｌｉおよびＣａｒｒｕｂａ、２００６；Ｎｉｓｏｌｉら、２００５）、ＲＯＳ産生の増加をもたらす（ＧｒｅｄｉｌｌａおよびＢａｒｊａ、２００５）。
【０１１２】
老化に関連したインシュリンおよびＩＧＦシグナル伝達経路（Ｂａｒｔｋｅ、２００５；ＲｕｓｓｅｌｌおよびＫａｈｎ、２００７）は、カロリー制限によって阻害される（Ｈｏｌｚｅｎｂｅｒｇｅｒら、２００４；Ｍａｓｏｒｏ、２００４）。
【０１１３】
カロリー制限はまた、ｋｌｏｔｈｏホルモンによって調節されるシグナル経路を阻害し（Ｋｕｒｏｓｕら、２００５；Ｕｎｇｅｒ、２００６）、ｋｌｏｔｈｏホルモンの変異はマウスにおける早期老化を伴う（Ｋｕｒｏ−ｏら、１９９７）。ｋｌｏｔｈｏは、ＦＧＦ−２３受容体によって誘導される応答の調節因子である（Ｋｕｒｏｓｕら、２００６）。ｋｌｏｔｈｏおよびＦＧＦ−２３の変異は、ビタミンＤ過剰症によって引き起こされることが知られており、ビタミンＤ効果を増加させる遺伝子の欠失によって修正される同じ早期老化表現型を誘導する（ＲａｚｚａｑｕｅおよびＬａｎｓｋｅ、２００６）。ｋｌｏｔｈｏはまた、Ｗｎｔ受容体の応答を遮断し、老化に関与する代謝経路の多様性を示す（Ｌｉｕら、２００７ａ）。最後に、インシュリンは、ホスファチジル−イノシトール３キナーゼによって、ｋｌｏｔｈｏの膜貫通前駆体のＡＤＡＭファミリーのメタロプロテアーゼによる切断およびｋｌｏｔｈｏの細胞外媒体への放出を促進する（Ｃｈｅｎら、２００７）。
【０１１４】
タンパク質ｐ５３はまた、これらの代謝経路の調節に関与する（Ｃａｍｐｉｓｉ、２００４；ｄｅ  Ｏｌｉｖｅｉｒａ、２００６；Ｋｉｍら、２００７；Ｓｃｈｍｉｄら、２００７）。
【０１１５】
タンパク質ｐ６６ｓｈｃは、インシュリンおよびＩＧＦ１の原形質膜受容体、核およびミトコンドリアの間の情報交換シグナルの１つである（ＭａｒｔｉｎおよびＦｒｉｅｄｍａｎ、２００４）。ＫＯ  ｐ６６ｓｈｃ−／−マウスは、ストレスへの高い抵抗性および寿命の延長を示す（Ｍｉｇｌｉａｃｃｉｏら、１９９９）。Ｐ６６ｓｈｃはｐ５３の標的で、ミトコンドリアに局在し、代謝およびミトコンドリアのＲＯＳ産生を制御する（Ｍｉｇｌｉａｃｃｉｏら、２００６；Ｎｅｍｏｔｏら、２００６；Ｏｒｓｉｎｉら、２００４；Ｔｒｉｎｅｉら、２００２）。ｐ６６ｓｈｃの欠如は、心筋幹細胞の老化を阻害し、心筋発作を防御し、２つの現象は糖尿病によって誘導される（Ｒｏｔａら、２００６）。ｐ６６ｓｈｃはまた、酸化還元酵素である。細胞ストレスに応じて、ｐ６６ｓｈｃは、ミトコンドリアに輸送され、シトクロムＣによって伝達される電子を使用してＨ２Ｏ２を合成する（すなわち、細胞Ｈ２Ｏ２の３０％、残部はペルオキシソームによって産生される）膜間腔に局在する（Ｇｉｏｒｇｉｏら、２００５）。Ｈ２Ｏ２は、寿命を調節するための細胞内シグナルである（Ｇｉｏｒｉｏら、２００７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０１１６】
【特許文献１】仏国特許出願第０６／０６０９７号
【非特許文献】
【０１１７】
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０１１８】
長い研究の末、本発明者らは、ヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素阻害剤（スタチンファミリー）およびファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤（アミノビホスホネートファミリー、ＮＢＰ）またはそれらの生理学的に許容される塩の１種の組み合わせは、Ｃ１５およびＣ２０、または特徴付けられていない形態によるタンパク質プレニル化経路全体に対して作用するという意味で、細胞内におけるプレニル化タンパク質の蓄積および／または残存に関連する病理学的または非病理学的状態の有効な治療であることを示した。本発明者らはまた、ヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素阻害剤およびファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤の組み合わせが早老症の患者の線維芽細胞における正常な表現型の回復において相加的効果を有することを確認した。組み合わせの効果は、１つまたはもう１つの阻害剤を個々に使用した効果よりも明らかに優れている（Ｖａｒｅｌａら、２００８（５４再出））。
【０１１９】
早老症の患者の細胞に対して組み合わせを用いると、タンパク質プレニル化が阻害され、したがって、ファルネシル化されていないプレラミンＡが出現し、核の徴候が改善され、ＤＮＡ再分配の異常が部分的に改善される。プレニル化阻害はまた、拘束性皮膚障害のマウスモデルにおいて認められ、マウスの寿命は一部回復する（Ｖａｒｅｌａら、２００８（５４再出））。抗レトロウイルス治療は、複数の代謝経路および複数の細胞区画、細胞基質、核質およびミトコンドリアを標的とする。
【０１２０】
これらの治療の副作用は、ＬＭＮＡ遺伝子またはＺＭＰＳＴＥ２４遺伝子の突然変異によって引き起こされる遺伝的ラミノパシーの患者で認められる臨床的および生物学的徴候のいくつかを再度生じさせる。これらの突然変異に共通な点は、それらがラミンＡまたはプレラミンＡに結合したファルネシル基を保持していることである。このファルネシル基は、ラミンＡをラミナレベルで核膜の核質側に固定し、一方、核質の残部は可溶性ラミンＡを含まない。
【０１２１】
ラミンＡ分布のこれら２つの異常は、いくつかの核代謝経路（ＤＮＡ複製および修復、遺伝子転写、テロメア短小化など）のレベルの有害な結果を引き起こし、ミトコンドリアを含むその他の細胞区画にも有害な影響を与える。細胞の一般的な機能不全は、老化を加速させ、細胞寿命を短縮させる。
【０１２２】
レトロウイルス治療の１ファミリー、プロテアーゼ阻害剤は、ＺＭＰＳＴＥ２４を阻害し、プレラミンＡの成熟を遮断し、ファルネシル化プレラミンＡの細胞内の残存を引き起こす。添付の図９は、本発明者らによって開発され、プレラミンの成熟異常およびそれらの機能的結果に基づく老化理論を概略的に示している。
【０１２３】
さらに、ウイルスプロテアーゼ阻害剤である、抗レトロウイルス薬の第２のファミリーのウイルスヌクレオチド逆転写酵素阻害剤のミトコンドリアに対する間接的効果は、その機能異常が老化に関係することが知られている小器官ミトコンドリアを直接破壊する。
【０１２４】
したがって、これら２種類の抗レトロウイルス治療がＡＩＤＳウイルスに感染した患者において老化の加速を引き起こす機構を分析し、これらの機構が遺伝的ラミノパシーの患者において老化の加速を引き起こす機構と同等であることを確かめるのが目的である。
【課題を解決するための手段】
【０１２５】
本発明者らは、抗レトロウイルス治療の前述の副作用を、
−  少なくとも１種のヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素阻害剤またはその生理学的に許容される塩の１種、および
−  少なくとも１種のファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤またはその生理学的に許容される塩の１種
を含む組成物、またはそれらを組み合わせた治療によって最小限に抑えることができることを推定した。
【０１２６】
したがって、本発明は、少なくとも１種のヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素阻害剤、少なくとも１種のファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤またはその生理学的に許容される塩の１種および抗ＨＩＶ薬を含む抗ＨＩＶ組成物に関する。
【０１２７】
この組成物は、例えば、細胞内におけるプレニル化タンパク質の蓄積および／または残存に関連する病理学的または非病理学的状態を治療するために企図することができる。特に、本発明によれば、この組成物はＨＩＶ感染患者の治療に有用である。
【０１２８】
本発明はまた、抗ＨＩＶ薬が抗レトロウイルス薬または抗レトロウイルス薬の混合物である本発明の組成物に関する。
【０１２９】
本発明はまた、抗ＨＩＶ薬がプロテアーゼ阻害剤または逆転写酵素阻害剤である本発明の組成物に関する。
【０１３０】
本発明はまた、抗ＨＩＶ薬がホスアンプレナビル、ロピナビル、リトナビル、アンプレナビル、アタザナビルおよびインジナビルを含む群から選択されたプロテアーゼ阻害剤である本発明の組成物に関する。
【０１３１】
本発明はまた、抗ＨＩＶ薬がジドブジン、ラミブジン、ジダノシンおよびエプジコムを含む群から選択された逆転写酵素阻害剤である本発明の組成物に関する。
【０１３２】
本発明の組成物では、抗ＨＩＶ薬はまた、ウイルスの１種または複数の抗プロテアーゼおよび／またはウイルスの１種または複数の逆転写酵素阻害剤および／またはウイルスの細胞侵入の１種または複数の阻害剤および／または１種または複数のインテグラーゼ阻害剤および／または抗ウイルス効果を有するその他の任意の治療薬、特に国内および／または国際規制委員会および科学団体によって認識されている任意の治療薬を組み合わせたものであってもよい。
【０１３３】
本発明はまた、ヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素阻害剤およびファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤の両方である化合物を使用した本発明の組成物に関する。
【０１３４】
非常に具体的には、本発明による組成物は、プロゲリンの細胞内での蓄積および／または残存に関連した副作用を発症しているＨＩＶ感染患者の治療を企図しており、さらにより具体的には、切断型もしくは修飾型、または非切断型もしくは非修飾型のファルネシル化プレラミンＡの細胞内での蓄積および／または残存に関連した状態の治療を企図している。
【０１３５】
本発明によれば、任意のファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤またはその生理学的に許容される塩の１種を本発明による組成物の調製に使用することができる。
【０１３６】
生理学的に許容される塩は、例えば、塩化水素酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸またはリン酸、カルボン酸、例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、シュウ酸、グリオキシル酸、アスパラギン酸など、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸などのアルカンスルホン酸およびベンゼンスルホン酸もしくはパラトルエン酸などのアルカンアリールスルホン酸で形成される塩であってもよい。
【０１３７】
特に、ファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤は、ポリホスホネートファミリーの構成要素の１つ、特にアミノビホスホネート（ＮＢＰ）、またはその生理学的に許容される塩の１種であってもよい。
【０１３８】
ポリホスホネートは、骨粗鬆症および骨再生の治療に通常使用される合成分子である。
【０１３９】
ホスホネートという用語は、ホスフェートと非常に類似した分子に適用する。
【０１４０】
0005570999.tif 000002
【０１４１】
ビホスホネート（ＢＰ）の核は、例えば、ＡＴＰのようにＰ−Ｏ−Ｐ結合と同等であるが、酸素が炭素によって置換されている。これはこれらの分子に非常に特異的な安定性をもたらしている。
【０１４２】
単純なビホスホネートは、ＡＤＰと同等で、２個のリン酸基（Ｏ３Ｐ−）がビビホスホネート基によって置換されている。
【０１４３】
0005570999.tif 000003
【０１４４】
中心の炭素は、リン酸の酸素とは異なり、２つの結合にまた関与することができ、これはビホスホネートの特異性を構成するこの炭素に付加した基の性質である。
【０１４５】
「側」鎖（Ｒ１およびＲ２）がアミン官能基（ＮＨ）、またはより一般的には１個または複数の窒素原子を含むとき、アミノビホスホネートまたはＮＢＰと称する。
【０１４６】
もちろん、その他の置換基を酸素に結合させることができる。
【０１４７】
ピロリン酸または溶液中のピロリン酸塩（ＰＰｉ）は、
【０１４８】
0005570999.tif 000004
基質輸送体として数多くの代謝反応で使用され、反応の終了時に回復する。ピロリン酸塩に結合した分子を使用する代謝経路の１つは、タンパク質プレニル化の代謝経路である。
【０１４９】
イソペンテニル−ＰＰ（Ｃ５をベースにした単位）をゲラニル−ＰＰ（Ｃ１０）に付加してファルネシルＰＰとする、ファルネシルピロリン酸合成酵素（ＦＰＳ）によって触媒される反応は、ＰＰｉを遊離する。
【０１５０】
ＮＢＰによって特異的に阻害されるのはこの段階である。
【０１５１】
この点に関して、一例として、アミノビホスホネート（ファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤）は、
−  アレンドロ酸またはそのイオン型、アレンドロネート
−  クロドロン酸またはそのイオン型、クロドロネート、
−  エチドロン酸またはそのイオン型、エチドロネート、
−  イバンドロン酸またはそのイオン型、イバンドロネート、
−  メドロン酸またはそのイオン型、メドロネート、
−  ネリドロン酸またはそのイオン型、ネリドロネート、
−  オルパドロン酸またはそのイオン型、オルパドロネート、
−  パミドロン酸またはそのイオン型、パミンドロネート、
−  リセドロン酸またはそのイオン型、リセドロネート、
−  チルドロン酸またはそのイオン型、チルドロネート、
−  ゾレドロン酸またはそのイオン型、ゾレドロネート、
−  ４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメタンジホスホン酸またはそのイオン型、ジメチルアミノメタンジホスホネート、
−  α−アミノ−（４−ヒドロキシベンジリデン）ジホスホネート
から選択することができる。
【０１５２】
好ましくは、本発明によれば、ゾレドロン酸（ゾレンドロン酸とも呼ぶ）またはそのイオン型、ゾレドロネート（ゾレンドロネートとも呼ぶ）を使用することが好ましい。
【０１５３】
本発明によれば、任意のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤またはその生理学的に許容される塩の１種を組成物の調製に使用することができる。
【０１５４】
特に、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は、脂溶性もしくは水溶性のスタチンファミリーの１分子、またはその生理学的に許容される塩の１種であることができる。
【０１５５】
スタチンは、真菌で同定された。スタチンは、コレステロールおよびステロイドの生合成における重要な酵素で、メバロン酸（溶液中ではメバロネート）におけるコエンザイムＡに結合したヒドロキシメチルグルタレートの還元を触媒するＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素に対して阻害活性を有する。
【０１５６】
この阻害は、それらの構造がヒドロキシメチルグルタレート骨格と類似していることによって保証される。関与した代謝経路は、コレステロール生合成の代謝経路であることは明らかであるが、プレニル基、細胞中の約３００種のタンパク質を修飾し、親脂質性の尾部を結合させ、特に膜への固定を可能にするために使用される５個のイソプレン炭素をベースにした単位の重合体の合成経路でもある。
【０１５７】
いずれもピルビン酸およびＨＭＧ−ＣｏＡから得られる主要なポリプレンは、ゲラニル（Ｃ１０）、ファルネシル（Ｃ１５）およびゲラニル−ゲラニル（Ｃ２０）である。
【０１５８】
スタチンは全て全面的に肝臓選択的であるが、どのスタチンも細胞に侵入する様式は同じではない。実際に、プラバスタチンおよびロスバスタチンはいずれも親水性で、したがって、親脂質性であるその他のいずれのものとも異なり水溶性であり、したがって、原形質膜（脂質二重層）から自由に拡散することができ、それによって高い毒性が確実に説明される。水溶性スタチンは、細胞に侵入するために特異的な輸送体、有機アニオン輸送体３、またはＯＡＴ３、またはＳＬＣ２２Ａ８を必要とする（Ｔａｋｅｄａａら、２００４（４６））。
【０１５９】
スタチンは通常高コレステロール血症を治療するために使用され、それらの副作用は稀であるが、詳細に特徴付けられている。これらは特に、横紋筋融解症の症例で（使用した分子によって症例の１から７％、Ｅｖａｎｓら、２００２（１２））、その早期徴候、治療患者の筋肉痛は、治療の即時中断の原因となる。
【０１６０】
この点に関して、および一例として、スタチンはアトルバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、リバスタチン、メバスタチン（またはコンパクチン）、フルインドスタチン、ベロスタチン、フラバスタチン、ダルバスタチン、セリバスタチン、ペントスタチン、ロスバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチンまたはそれらの生理学的に許容される塩の１種から選択することができる。
【０１６１】
ロバスタチン、プラバスタチンおよびシンバスタチンは、真菌代謝から得られる分子であり、一方、その他（アトルバスタチン、セリバスタチン、フラバスタチン、ピタバスタチンおよびロスバスタチン）は、完全に合成されている。好ましくは、本発明によれば、半天然の水溶性スタチンであるプラバスタチンを使用する。
【０１６２】
もちろん、本発明によれば、１種、２種以上のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤と関連して１種、２種以上のファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤を使用することが可能である。
【０１６３】
本発明の特定の形態によれば、この組成物は、ＨＩＶ感染患者の治療および抗ＨＩＶ治療の副作用の治療の両方を企図することができ、例えば、皮膚老化、体毛もしくは毛髪の脱毛、骨粗鬆症および脂肪萎縮症の治療を企図することができる。
【０１６４】
本発明によれば、ファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤およびＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は、生理学的有効量で組成物中に存在することが有利である。
【０１６５】
一般的に、投与する量は、患者、病変、投与様式などにしたがって適合させることができる。所望によりその他の活性成分または任意の担体と組み合わせて反復使用することもできると考えられる。
【０１６６】
一般的に、阻害剤の１日用量は、所望する効果を得るために必要な最小限の用量である。
【０１６７】
本発明によれば、ヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素阻害剤、ファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤および抗ＨＩＶ薬は組成物中で、１種または複数の不活性な、すなわち、生理学的に不活性で毒性のない賦形剤もしくは担体と混合して使用することができる。例えば、ＨＩＶ感染患者の治療を企図した薬剤および付随する抗ＨＩＶ薬で通常使用される成分を挙げることができる。
【０１６８】
本発明の組成物はまた、少なくとも１種のその他の活性成分、特に、例えば、同時もしくは別々に使用するため、または使用するガレノス製剤にしたがって徐々に拡散使用するための別の治療活性成分を含めることができる。このその他の成分は、例えば、ＨＩＶ感染患者で発症し得る日和見疾患の治療で使用される活性成分であってもよい。
【０１６９】
本発明の組成物は、ＨＩＶ感染患者の治療ならびに抗ＨＩＶ薬の使用によって引き起こされる皮膚障害の予防および／または治療の両方に使用することができる組成物である。この組成物は、ＨＩＶ感染患者の多重療法の一部として使用することができる。抗ＨＩＶ薬は、単一剤または多剤（複数の抗ＨＩＶ薬の混合物）であってもよい。多重療法（例えば、２重、３重もしくは４重療法）の場合、阻害剤の混合物は１種または複数の抗ＨＩＶ薬を伴うことができる。
【０１７０】
抗ＨＩＶ薬はまた、ウイルスの１種または複数の抗プロテアーゼおよび／またはウイルスの１種または複数の逆転写酵素阻害剤および／またはウイルスの細胞侵入の１種または複数の阻害剤および／または１種または複数のインテグラーゼ阻害剤および／または抗ウイルス効果を有するその他の任意の治療薬、特に国内および／または国際規制委員会および科学団体によって承認された任意の治療薬を組み合わせたものであってもよい。
【０１７１】
したがって、本発明はまた、本発明による組成物の投与を含む、ＨＩＶ感染患者の治療プロセスに関する。本発明の組成物は前記に定義された通りである。
【０１７２】
本発明によれば、投与は、抗ＨＩＶ組成物の投与について当業者に公知の経路のいずれかによって実施することができる。例えば、経口投与または注射であってもよい。
【０１７３】
前記で示したように、本発明の組成物の投与用量は、患者の必要性に左右され、何が患者によって生理学的に許容されるかを考慮することによっても決定される。
【０１７４】
本発明の組成物における阻害剤の量は、一例として、ヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素阻害剤０．０１から２ｍｇ／ｋｇ体重の用量およびファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤０．０１から４０ｍｇ／ｋｇ体重の用量の投与を可能にするようなものであってもよい。
【０１７５】
本発明によれば、一例として、本発明の組成物中のファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤とヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素阻害剤またはそれらの生理学的に許容される塩の１つとの比は、０．０１から０．２の間、好ましくは０．０５から０．３５であることができる。
【０１７６】
本発明の組成物中の抗ＨＩＶ薬の量は、ＨＩＶ感染患者の治療における当業者の現在の知識に応じて通常決定される。例えば、ＨＩＶ感染患者において通常使用されるものから選択することができる。
【０１７７】
この文書で記載した抗ＨＩＶ薬例のそれぞれおよびこの文書で記載した抗ＨＩＶ薬の混合物または組み合わせのそれぞれについての抗ＨＩＶ薬濃度の例は、ＶＩＤＡＬ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ（商標登録されている）、例えば、２００７年版に挙げられている。この辞書に示された濃度はまた、ヒト用に認可されたものである。
【０１７８】
本発明はまた、抗ＨＩＶ治療を受けている患者において引き起こされる早期老化および／または脂肪萎縮症の副作用を治療する方法であって、少なくとも１種のヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素阻害剤および少なくとも１種のファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤を含む混合物を投与することを含む方法に関する。
【０１７９】
投与の条件、量および経路は、この文書で記載した通り、例えば前記の通りであることができる。抗ＨＩＶ薬は、例えば、抗ＨＩＶ薬または前記で定義した通りの組み合わせである。
【０１８０】
本発明は一般的に、例えば、早期老化に医原性効果を有する治療のための補助剤として前述した阻害剤の混合物を適用することに関し、例えば、特にこの医原性効果を引き起こす「少なくとも１種の抗プロテアーゼを含む抗ＨＩＶ療法の補助剤」を適用することを含む。したがって、この文書で引用した副作用を引き起こす任意の治療は、本発明が関与する。
【０１８１】
本発明はまた、任意の順番で、
−  少なくとも１種のヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素阻害剤および少なくとも１種のファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤を含む混合物を投与するステップ、
−  抗ＨＩＶ薬を投与するステップ
を含み、該投与が同時、連続または交互である、ＨＩＶ感染患者の治療方法に関する。
【０１８２】
本発明によれば、前記混合物および前記抗ＨＩＶ薬は、共投与することができる。これには、前記で定義した本発明の方法が関与する。
【０１８３】
本発明によれば、抗ＨＩＶ薬は前記で定義した通りであることができる。
【０１８４】
本発明によれば、投与の少なくとも１つは、経口または注射によって実施することができる。２つの投与は、同様の方法または異なる方法で実施することができる。
【０１８５】
言い換えると、この記載において、一組成物について述べている場合でも、該組成物の各化合物は、その他の化合物と同時に投与してもよく（例えば、単一の組成物中で、または２種類の組成物中または３種類の組成物中で、これらの組成物はそれぞれ前述の化合物の１つまたはいくつかを含み、各化合物または組成物（複数可）の投与様式は同一であるか、または異なっていてもよい）、あるいは互いに独立して、例えば、連続的であってもよく、例えば、ヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素阻害剤の独立した投与、少なくとも１種のファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤の独立した投与および抗ＨＩＶ薬の独立した投与であってもよく、これらの投与は同じ患者に前述の順番または別の順番で同時に、または連続的に、または交互に実施する。これらの様々な投与は、互いに独立して、または一緒の様式で（組成物または共投与）、同一または異なる投与様式（注射、経口経皮摂取、局所塗布など）によって、１日１回または数回で、１日または数日連続して、または連続しないで実施することができる。
【０１８６】
本発明によれば、阻害剤の前記混合物の投与は、例えば、ヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素阻害剤０．０１から２ｍｇ／ｋｇ体重の用量およびファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤０．０１から４０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で実施することができる。
【０１８７】
抗ＨＩＶ薬の投与は、前記で指示したように実施することができる。
【０１８８】
単なる一例として、前記で定義した本発明の方法の１つまたはその他の実施のための投薬量を以下の表に記載する。本発明による組成物中の阻害剤および抗ＨＩＶ薬の量の例は、この表から得ることができる。
【０１８９】
0005570999.tif 000005
【０１９０】
本発明によれば、本発明を実施するために使用できる抗ＨＩＶ薬に関する投薬量は、当業者には公知であり得る。例えば、ＶＩＤＡＬ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ（商標登録されている）、例えば、２００７年版に記載された投薬量であってもよい。前述した抗ＨＩＶ薬の例のそれぞれおよび前述した抗ＨＩＶ薬の混合物もしくは会合物のそれぞれについてまた、本発明を実施するために使用できる投薬量はＶＩＤＡＬ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ（商標登録されている）、例えば、２００７年版に見出されるだろう。
【０１９１】
その他の利点はまた、例示目的であり、添付の図面に示された以下の実施例から当業者には明らかになり得る。
【図面の簡単な説明】
【０１９２】
【図１】高用量の水溶性スタチン（プラバスタチンＰ、２０から１００μＭ）およびアミノビホスホネート（ＮＢＰ、ゾレドロネートＺ、２０から１００μＭ）で処理した「正常な」対照線維芽細胞のウェスタンブロットで得られた結果を示した図である（ＡからＩの列はそれぞれＰ２０／Ｚ２０、Ｐ２０／Ｚ６０、Ｐ２０／Ｚ１００、Ｐ６０／Ｚ２０、Ｐ６０／Ｚ６０、Ｐ６０／Ｚ１００、Ｐ１００／Ｚ２０、Ｐ１００／Ｚ６０、Ｐ１００／Ｚ１００である）。列Ｊは、プレラミンＡの存在する陽性試験（ＤＲ患者の線維芽細胞）で、列Ｋは、溶媒（ＰＢＳ）のみで処理した陰性試験である。
【図２】生成物それぞれの有効用量で得られた結果を示した図である。
【図３】２種類の生成物を一緒に投与して得られた優れた効果を示した図である。
【図４】２種類の生成物の組み合わせの老化した細胞への作用を示した図である。
【図５】細胞培養条件に応じた有糸分裂指数の測定値によって線維芽細胞の細胞増殖を示した図である。有糸分裂指数は、各処置に応じて、観察した部分の核の全数に対して（分裂過程に入った）印を付けた核の数の間の比に対応する。
【図６】老化のミトコンドリア理論を示した概略図である。抗レトロウイルス治療のミトコンドリア標的。説明：ＮＲＴＩ：逆転写酵素のヌクレオシド阻害剤、ＰＩ：プロテアーゼ阻害剤、ｍｔＤＮＡ：ミトコンドリアＤＮＡおよびＲＯＳ：活性酸素種。
【図７】イソプレノイドの生合成経路およびそれらの阻害剤を示した概略図である。  ＮＢＰ：アミノビホスホネート  ＦＴＩ：ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤  ＧＧＴＩ：ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ阻害剤
【図８】プレラミンＡの翻訳後成熟、その核内輸送および核質への局在を示した概略図である。  ａ：正常なプレラミンＡ  ｂ：早老症（プロゲリン）における、または拘束性皮膚障害におけるＺＭＰＳＴＥ２４プロテアーゼの変異中のプレラミンＡ成熟の欠如。ＡＩＤＳウイルスのプロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）はＺＭＰＳＴＥ２４を阻害する。  ＮＰＣ：核膜孔  ＮＥ：核膜  ＨＧＰＳ：ハッチンソンギルフォード早老症候群  ＲＤ：拘束性皮膚障害
【図９】ラミンの異常およびそれらの機能的結果に基づいた老化理論を示す概略図である。説明：ＰＩ：ウイルスプロテアーゼ阻害剤。
【図１０】プレラミンＡフェニル化の阻害がファルネシルトランスフェラーゼの阻害およびＩ型ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼの両方を必要とすることを示したウェスタンブロットである。ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤および／またはＩ型ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼで処理したＨｅＬａ細胞におけるラミンＡ／Ｃの検出。ＬＡ＝ラミンＡ、ＬＣ＝ラミンＣ、Ｐｒｅ＝プレラミンＡ。
【図１１】未処理細胞（ａ）、ＦＴＩ（２．５μＭ、ｂ）またはプラバスタチン＋ゾレドロネートミックス（各1μＭ、ｃ）で治療した早老症患者の細胞の核膜から抽出したタンパク質の質量分析を示した図である。
【図１２】Ｚｍｐｓｔｅ２４−／−マウスの未処理線維芽細胞（ａ）またはプラバスタチン＋ゾレドロネートミックス（各1μＭ、ｂ）で処理した線維芽細胞の核膜から抽出したタンパク質の質量分析を示した図である。
【図１３】ラミンＡ（対照細胞）およびプレラミンＡ（Ｚｍｐｓｔｅ２４−／−マウス細胞）は、質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ）によって分析した。ａ、ｂ：ファルネシル化（ａ）およびゲラニルゲラニル化（ｂ）トリプシンペプチドに対応するスペクトルの部分。
【図１４】対照細胞および早老症患者におけるプレラミンＡの蓄積に対するプラバスタチン＋ゾレドロネートの組み合わせの共同作用を示す様々な実験の結果を示す図である。（ａ）プラバスタチンおよび／またはゾレンドロネートで処理した未処理ヒト線維芽細胞におけるラミンＡ／ＣおよびプレラミンＡの免疫組織化学的検出。（ｂ）正常なヒト線維芽細胞およびプラバスタチン＋ゾレンドロネートの組み合わせで処理した早老症患者のラミンＡ／ＣおよびプレラミンＡの免疫組織化学的検出。（ｃ）早老症患者の細胞の核形態に対するプラバスタチン＋ゾレドロネート処理の効果の定量分析。（ｄ）ファルネソール、ゲラニルゲラニオールまたは２種類の化合物の存在下での早老症患者の細胞の核形態に対するプラバスタチン＋ゾレドロネート処理の効果の定量分析。エラーバー＝平均±平均の標準誤差。スケールバー＝１０μｍ。
【図１５】早老症患者の細胞における核形態の正常化および核質中の核ラミナのＡ／ＣラミンおよびＢ１ラミンのアイソフォームの部分的再配置の誘導を示すプラバスタチン＋ゾレドロネートによる治療の結果を示した図である。（Ａ）免疫蛍光法および共焦点顕微鏡。各パネルのａからｃの画像は、重ねた２７枚の画像の平均強度を投射したもので、ＰＢＳでインキュベートした早老症細胞ではカルレティキュリンによって示された核網の細管が示されている。画像ｄからｌ：厚さ０．２μｍで単離された共焦点切片。プラバスタチン＋ゾレドロネート処理の効果（ｇ）および（ｈ）。（８）Ｂ１ラミンおよびカルレティキュリンの共存。スケールバー＝５μｍ。
【図１６】ファルネソール、ゲラニルゲラニオールまたは２種類の分子の存在下で、培養したＺｍｐｓｔｅ２４−／−マウス（ａ）および対照マウス（ｂ）の細胞の核形態に関連した、または関連しないプラバスタチンおよびゾレンドロネートの効果を示した図である。
【図１７】早老症患者の細胞におけるＤＮＡの２本鎖切断修復（ＤＳＢ）の異常に対するプラバスタチン＋ゾレドロネート処理の効果を示した図である。照射して２４時間後に検出されたＨ２ＡＸホスホリル化ヒストンの斑点の免疫検出で、斑点は未修復の２本鎖切断に対応する（上の画像）。核はＤＡＰＩで染める（下の画像）。下の曲線：ＰＢＳでインキュベートするか、またはプラバスタチン＋ゾレドロネートで処理した対照細胞（黒丸）および早老症細胞（白丸）における照射後の時間によるＨ２ＡＸホスホリル化ヒストン斑点数の変化。各曲線は、少なくとも３回の実験の平均±平均の標準偏差を表す。
【図１８】Ｚｍｐｓｔｅ２４−／−マウスの早老性表現型に対するプラバスタチン＋ゾレドロネート処理の効果を示した図である。（ａ）３月齢のＺｍｐｓｔｅ２４＋／＋マウスおよびＺｍｐｓｔｅ２４−／−マウスおよびプラバスタチン＋ゾレドロネートの組み合わせで処理したＺｍｐｓｔｅ２４−／−マウスを表す写真。スケールバー＝１ｃｍ。（ｂ）３月齢Ｚｍｐｓｔｅ２４＋／＋マウス（ｎ＝１２）、Ｚｍｐｓｔｅ２４−／−マウス（ｎ＝１３）および処理したＺｍｐｓｔｅ２４−／−マウス（ｎ＝１５）の体重。（ｃ）治療したＺｍｐｓｔｅ２４−／−マウスの寿命の著しい延長を示すカプラン−マイヤー曲線。（ｄ）Ｚｍｐｓｔｅ２４−／−処理マウスおよび未処理マウスの脛骨のコンピュータ処理マイクロ断層撮影法による３次元表示（上の画像）。下の図は、Ｚｍｐｓｔｅ２４−／−未処理マウスおよび処理マウスの相対的骨量および骨梁数を表す。（ｅ）Ｚｍｐｓｔｅ２４＋／＋、Ｚｍｐｓｔｅ２４−／−および処理したＺｍｐｓｔｅ２４−／−マウスの肝細胞の核異常の定量。白い矢印は、異常な核を示す。スケールバー＝１μｍ。（ｆ）定量的ＲＴ−ＰＣＲによって分析した、Ｚｍｐｓｔｅ２４＋／＋、Ｚｍｐｓｔｅ２４−／−および処理したＺｍｐｓｔｅ２４−／−マウスの肝臓および心臓におけるｐ５３の標的遺伝子の相対的発現。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバーは、平均±平均の標準誤差を表す。
【図１９】Ｚｍｐｓｔｅ２４−／−マウスの寿命に対するプラバスタチン単独またはゾレドロネートの効果。プラバスタチン単独（ａ）およびゾレンドロネート単独（ｂ）で処理したＺｍｐｓｔｅ２４−／−マウス（白い菱形）および未処理マウス（黒丸）のカプラン−マイヤー曲線。
【図２０】Ｌｍｎａ−／−マウスの寿命に対するプラバスタチン＋ゾレンドロネート処理の効果：未処理マウス（黒丸、ｎ＝１１）と比較したプラバスタチン＋ゾレドロネートで処理したＬｍｎａ−／−マウス（ｎ＝１２、白い菱形）のカプラン−マイヤー曲線。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【０１９３】
水溶性ヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素阻害剤（水溶性スタチン：プラバスタチン）およびファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤（アミノビホスホネート：ゾレドロネート）の組み合わせの正常細胞培養および早老症細胞培養に対する相加的効果
Ａ．方法
Ａ．１．細胞および細胞培養
細胞系は、Ｃｏｒｉｎｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの対照線維芽細胞ＡＧ１６４０９か、または拘束性皮膚障害の患者の生検が得られた線維芽細胞である。それらを、Ｐ２培養室内で５％ＣＯ２の下で３７℃で培養する。
【０１９４】
通常の完全培養培地は、
−  牛胎児血清２０％（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
−  Ｌ−グルタミン２００ｍＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
−  ペニシリン／ストレプトマイシン／ファンギゾン１Ｘ（保存液１００Ｘ、Ｃａｍｂｒｅｘ）の混合物を補給した、
−  ＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
【０１９５】
Ａ．２．細胞収集
細胞の収集は、以下のように（大フラスコ、７５ｃｍ２、ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ用プロトコール）トリプシン処理することによって実施する。
−  培地を超音波処理し、
−  細胞をＰＢＳ  １Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１０ｍｌで洗浄し、
−  トリプシン／ＥＤＴＡ１Ｘ（Ｃａｍｂｒｅｘ）の溶液５ｍｌを添加し、
−  フラスコを３７℃で約６分間インキュベートし、この時間は細胞を脱離するためにかかる時間であり、
−  トリプシンは完全培地１５ｍｌで希釈することによって阻害し、
−  細胞を１６℃で１０００ｒｐｍで10分間遠心分離することによってペレットにして、
−  外ペレットをＰＢＳ  １Ｘ  ２ｍｌに再懸濁し、同一条件下で再び遠心分離する。
【０１９６】
得られた細胞は、後で使用するために凍結させるか、またはこの洗浄ペレットから継代培養する。
【０１９７】
Ａ．３．処理
使用したプラバスタチン（水溶性スタチン）溶液は以下のように調製する。
【０１９８】
プラバスタチン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ４４９８）４０ｍｇを滅菌水に入れ、１０ｍＭ保存溶液を作製する。
【０１９９】
試験した最終濃度は、完全培地で保存溶液を希釈することによって得られた５００ｎＭ、１、５、５０および１００μＭであった。
【０２００】
使用したゾレンドロネート溶液（ＮＢＰ）は以下のように調製する。
【０２０１】
（１−ヒドロキシ−２−イミダゾール−１−イル−１−ホスホノ−エチル）ホスホン酸保存溶液（０．８ｍｇ／ｍｌ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）は、濃度２ｍＭに調節する。
【０２０２】
試験した最終濃度は、完全培地で保存溶液を希釈することによって得られた５００ｎＭ、１、５、５０および１００μＭであった。
【０２０３】
Ａ．４．ウェスタンブロット
Ａ．４．１  細胞の調製
ウェスタンブロット実験用に、細胞は以下のように処理する。
【０２０４】
約７．５×１０５細胞を大フラスコに接種し、集密に近づくまで（４日間）前記の条件下で培養する。
【０２０５】
４日後、細胞をＰＢＳ  １Ｘで洗浄し、処置物で置換した完全培地に入れる。
【０２０６】
細胞は３７℃のインキュベータ内で処理時間（６から７２時間、連続的に、または同時に）インキュベートする。
【０２０７】
処理後、細胞をトリプシン処理し（前記プロトコール）、得られたペレットはタンパク質抽出を行うまで−８０℃で保存する。
【０２０８】
Ａ．４．２  ウェスタンブロット用のタンパク質抽出
細胞ペレットを溶解緩衝液３００μｌに入れる。
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００            １％
ＳＤＳ                            ０．１％
デオキシコール酸ナトリウム        ０．５％
ＮａＣｌ                          ５０ｍＭ
ＥＤＴＡ                          １ｍＭ
ＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ７．４        ２０ｍＭ
プロテアーゼ阻害剤                ５０ｍｌ当たり１錠
（Ｒｏｃｈｅ  １１６９７４９８００１）
【０２０９】
即時調合して、以下を添加する。
バナジン酸ナトリウム                      １ｍＭ
ＰＭＳＦ                                  １ｍＭ
【０２１０】
細胞を３０秒間２回超音波処理に曝露する（Ｂｒａｎｄｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ  Ｂ１５）。
【０２１１】
細胞残渣は、４℃で１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。
【０２１２】
タンパク質上清は、使用するまで−８０℃で保存する。
【０２１３】
タンパク質アッセイは、解凍時に実施する。
【０２１４】
４．３  ウェスタンブロット
−  ゲル
ラミンＡ／Ｃの様々な形態を検出するため、通常８％アクリルアミドゲルを使用する。
アクリルアミド／ビスアクリルアミド３７／１            ８％
ＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ８．８                            ３７５ｍＭ
ＳＤＳ                                                ０．１％
ＡＰＳ                                                ０．１％
ＴＥＭＥＤ                                            ０．０１％
【０２１５】
濃縮ゲルを分離ゲル上に注ぐ。
アクリルアミド／ビスアクリルアミド３７．５／１            ３％
ＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ６．８                            ３７５ｍＭ
ＳＤＳ                                                ０．１％
ＡＰＳ                                                ０．１％
ＴＥＭＥＤ                                            ０．０１％
【０２１６】
試料のタンパク質濃度をアッセイし、画分をｑｓｆ１５μｌの溶解緩衝液で管当たり５０μｇに調節する。
【０２１７】
添加緩衝液５μｌを各試料に添加する。
ＳＤＳ                                              ４％
ＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ６．８                          １００ｍＭ
グリセロール                                        ２０％
β−メルカプトエタノール                            ２０％
ブロモフェノールブルー                              微量
【０２１８】
試料は、９５℃で５分間加熱することによって変性させ、ウェル中に沈着させる。
【０２１９】
移動は、緩衝液、
Ｔｒｉｓ塩基                                ０．３％
グリシン                                      １．４４％
ＳＤＳ                                        ０．１％
において５０、次いで１００ボルトで行う。
【０２２０】
−  転写
転写膜（Ｈｙｂｏｎ  Ｐ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、エタノール、その後滅菌水浴に５分間、転写緩衝液
Ｔｒｉｓ塩基                                  １２ｍＭ
グリシン                                        ９６ｍＭ
エタノール                                      ２０％
に１０分間浸漬することによって調製する。
【０２２１】
ゲルは、転写緩衝液中で２０分間湿らせ、次いでサンドイッチを組み立てる（Ｍｉｎｉｐｒｏｔｅａｎ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏｒａｄ）。
【０２２２】
転写は一般的に、冷却した容器内で、１０ボルトで一晩行う。
【０２２３】
該膜をＰＢＳ  １Ｘで濯ぎ、加湿した環境で保存し、検出時に使用する。
【０２２４】
−  検出
該膜は、室温で、飽和溶液、
カゼイン                                １０％
Ｔｗｅｅｎ２０                          ０．１％
ＰＢＳ                                  １Ｘ
でインキュベートする。
【０２２５】
洗浄緩衝液（Ｔｗｅｅｎ２０  ０．１％／ＰＢＳ  １Ｘ）で１０分間２回濯ぐ。
【０２２６】
一次抗体を飽和緩衝液（詳細および希釈は以下の免疫標識を参照のこと）で希釈する。
【０２２７】
該膜は、撹拌しながら室温で１時間、一次抗体でインキュベートする。
【０２２８】
その後、洗浄緩衝液で３回濯ぎ、同緩衝液で１５分間３回洗浄する。
【０２２９】
２次抗体（ペルオキシダーゼに結合した系、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）は、飽和緩衝液で１／１００００に希釈する。
【０２３０】
該膜は、撹拌しながら室温で３０から４５分間、この溶液でインキュベートする。
【０２３１】
その後、洗浄緩衝液で３回濯ぎ、次に同緩衝液で１５分間３回洗浄する。
【０２３２】
検出は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのＥＣＬ  Ｐｌｕｓウェスタンブロッティングシステムキットを使用して、製造者の指示に従って実施する。
【０２３３】
検出後、該膜をＢｉｏｍａｘ  ＭＲフィルム（Ｋｏｄａｋ）に、十分なシグナルを得るのに必要な時間量曝露する。
【０２３４】
Ａ．５免疫標識
Ａ．５．１細胞の調製
細胞培養物をトリプシン処理し、細胞をＮｅｕｂａｕｅｒ血球計数器で計数する。
【０２３５】
Ｌａｂｔｅｃｈ培養ウェル（Ｎｕｎｃ、参考番号１７７３９９）に、ウェル当たり５×１０４細胞の量で接種する。
【０２３６】
完全培養培地に処置（複数可）（スタチン、ＮＢＰ、両方）を補給し、細胞を臨機応変な時間で培養する。
【０２３７】
その後、培養培地を吸引し、ウェルを解体する。
【０２３８】
スライドは、ＰＢＳ  １Ｘで洗浄する。
【０２３９】
細胞は、パラホルムアルデヒド４％溶液（ＰＢＳに溶かす）で、室温で１０分間固定する。
【０２４０】
ＰＢＳ  １Ｘで１０分間洗浄を実施する。
【０２４１】
細胞は、エタノールの割合を高めた溶液中で３分間ずつ入れて（７０、９０、１００％、最後の浸漬は反復する）脱水する。
【０２４２】
乾燥後、スライドは使用するまで−８０℃で保存する。
【０２４３】
Ａ．５．２標識
解凍後、細胞を加湿した容器内で、透過溶液、
ＰＢＳ                                                    １Ｘ
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００                                    ０．５％
ＲＮＳ（ウサギの正常血清、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓ５０００）      ５％
プロテアーゼ阻害剤                                    ５０ｍｌに１錠
（Ｒｏｃｈｅ  １１６９７４９８００１）
の５０μｌ中で５分間室温でインキュベートする。
【０２４４】
１５分ずつ３回の予備インキュベーション浴は、インキュベーション溶液
ＰＢＳ                                              １Ｘ
ＲＮＳ                                              ５％
プロテアーゼ阻害剤                                ５０ｍｌに１錠
（Ｒｏｃｈｅ  １１６９７４９８００１）
５０μｌで実施する。
【０２４５】
一次抗体は、インキュベーション溶液５０μｌで１／１００に希釈し、加湿した容器内で室温で１時間細胞と接触させる。
【０２４６】
使用した1次抗体は２種類で、
−  マウス抗ラミンＡ／Ｃ（Ｎ末端側）、クローン４Ａ７、Ｇ．Ｍｏｒｒｉｓ（Ｏｓｗａｓｔｒｙ、ＵＫ）より恵与、
−  ヤギ抗プレラミンＡ（Ｃ末端１５ａａ）、製品ＳＣ６２１４、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．である。
【０２４７】
ＰＢＳ  １Ｘ  ５０μｌによる３回の洗浄は、それぞれ１５分間実施する。
【０２４８】
２次抗体とのインキュベーションは、加湿した容器内で室温でインキュベーション溶液５０ｍｌで１時間行う。第２抗体は、２種類で、
−  ロバ抗マウス、Ｊａｃｈｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、１／１００に希釈、
−  ロバ抗ヤギ、Ｊａｃｈｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、１／２００に希釈である。
【０２４９】
ＰＢＳ  １Ｘ  ５０μｌによる３回の洗浄は、それぞれ１５分間実施する。
【０２５０】
ＤＡＰＩ５０ｎｇ／ｍｌ溶液（ＳＥＲＶＡ、参照番号１８８６０）１００μｌとのインキュベーションは、加湿した容器内で室温で１５分間実施する。
【０２５１】
ＰＢＳ  １Ｘによる３回の洗浄は、スライドホルダータンク内でそれぞれ５分間実施する。
【０２５２】
最終洗浄は、ＰＢＳに溶かしたＴｗｅｅｎ２０の０．１％溶液中で５分間実施する。
【０２５３】
Ａ．５．３  表示
細胞を１滴のＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ）に浸し、対物カバーガラスで覆い、ｃｏｏｌＳＮＡＰカメラ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ）を備えた蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＤＭＲ、Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）で観察する。
【０２５４】
Ｂ．結果
Ｂ．１．ウェスタンブロット（図１）
「正常な」対照線維芽細胞は、水溶性スタチン（プラバスタチンＰ、２０から１００μＭ）およびアミノビホスホネート（ＮＢＰ、ゾレドロネートＺ、２０から１００μＭ）で一緒に処理した（ＡからＩの列はそれぞれＰ２０／Ｚ２０、Ｐ２０／Ｚ６０、Ｐ２０／Ｚ１００、Ｐ６０／Ｚ２０、Ｐ６０／Ｚ６０、Ｐ６０／Ｚ１００、Ｐ１００／Ｚ２０、Ｐ１００／Ｚ６０、Ｐ１００／Ｚ１００である）。ウェスタンブロットによって、２種類の分子の濃度の増加に応じて成熟していないプレラミンＡ（切断されていない）の大きさに対応するバンドの「出現」が示され、ファルネシル化がラミンＡの成熟に不可欠であることは確かである。この結果は、プレラミンＡのファルネシル化の阻害において、少なくとも生体外では、代謝経路の２箇所におけるファルネシル−ＰＰ合成の遮断が、１箇所だけの遮断よりも効果的であることを示している。
【０２５５】
Ｂ．２  免疫組織化学における応答用量および時間（図２）
応答用量および応答時間曲線によって、健康な対照細胞、次いでＨＧＰＳ患者細胞について２種類のパラメータを測定することによって最大効果を測定することが可能である。
【０２５６】
プラバスタチン（水溶性）／ゾレドロネート（ＮＢＰ）の最も効果的な組み合わせは、健康な細胞にプラバスタチン1μＭを２４時間投与し、ゾレンドロネートを１２時間投与すると得られた。毒性は認められなかった。ＨＰＧＳ細胞では（核の異常な細胞）同じ投与プロトコールを使用すると、「変形した」核の数は、７５％から４０％に減少した。健康な細胞で得られたプレラミンＡレベルを測定した。この測定値は最大レベルを示した。
【０２５７】
Ｂ．３  免疫組織化学処理の効果（図３）
プラバスタチンおよびゾレドロネートを一緒にした作用：処理した健康な細胞におけるプレラミンＡの生成レベル（３５％と推定）が、組み合わせの方が分子を単独で添加していたときよりも高いので（それぞれ２５％および１５％）、プラバスタチン１００μＭを１２時間、ゾレンドロネート２０μＭを６時間がより有効であることが示唆される。さらに、変形した核（正常細胞への毒性の徴候）の発生率は最小限であり（１０％未満）、プラバスタチンのみで処理された細胞におけるもの（約１２％）よりも少ない。
【０２５８】
Ｂ．４  免疫組織化学による老化細胞に対する作用（図４）
「継代」の数（細胞継代培養の回数）、したがって、細胞の年齢に応じて、異常な核の割合は増加する。この特性は、処理していないＨＧＰＳ細胞に特徴的である。ＨＧＰＳ細胞をプラバスタチン１μＭで２４時間、ゾレンドロネート１μＭで１２時間処理すると、この割合は維持されるか、むしろ少し減少する（プラセボで処理した細胞が８０％を上回るのに比較して、４０％未満である）。
【０２５９】
Ｂ．５  結論
プラバスタチン／ゾレンドロネートの組み合わせは、該分子を別々に投与してもほとんど影響が認められない用量で有効である。
【０２６０】
したがって、プレニル化経路遮断の生理学的効果は、細胞培養について出版された文献における単独処理で使用されたもの（Ｋｕｓｕｙａｍａら、２００６（２７）、血管前駆細胞に対するプラバスタチン単独１０μＭ、Ｆｌｉｎｔら、１９９７（１３）、新生仔ラットに対するプラバスタチン単独２５μＭ）よりもずっと少ない用量で得られる。
【実施例２】
【０２６１】
水溶性ヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素阻害剤およびファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤を含む本発明の組成物の老化したヒト線維芽細胞および若いヒト線維芽細胞の分裂に対する効果
Ａ．実施例の目的
この実施例では、水溶性ヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素阻害剤およびファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤を含む本発明の組成物の線維芽細胞の細胞分裂速度（有糸分裂指数）に対するインビトロ効果の評価を測定した。若いヒト線維芽細胞に対して老化したヒト線維芽細胞への組成物の効果の比較も実施した。この実験で使用した活性剤の数は４種で、生成物は組み合わせて使用した。使用した活性剤は、
Ａ１：ゾレンドロネート
Ａ２：アレンドロネート
Ｂ１：プラバスタチン
Ｂ２：シンバスタチン
である。
【０２６２】
この実施例で使用した特定の組み合わせは、Ａ１Ｂ１、Ａ１Ｂ２、Ａ２Ｂ１、Ａ２Ｂ２である。
【０２６３】
Ｂ．プロトコール
この実施例では、２種の線維芽細胞バッチ、老化した線維芽細胞（バッチ番号９０５２）および若い線維芽細胞（バッチ番号７０８０）は、提供された皿からトリプシン処理した後、牛胎児血清１０％を含有し、抗生物質を含まないＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地で２４時間培養した。
【０２６４】
様々な活性剤を最終濃度１μＭで、それぞれ２４時間添加した（化合物Ａ１、Ａ２およびＢ１については水で、化合物Ｂ２については１００％エタノールでストック溶液の１０００倍希釈を作製した）。
【０２６５】
有糸分裂指数は、細胞を活性剤組み合わせの１種と２４時間インキュベーションした後、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を４５分間取り込ませることによって評価した。免疫組織化学検出は、ＤＮＡ合成相（分裂前細胞）における細胞を示した。核（遺伝物質）の染色は、ジアミノ−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）の取り込みによって実施した。
【０２６６】
６つの顕微鏡視野（ＯＬＹＭＰＵＳ  ＩＸ  ７０）が得られ、有糸分裂指数の画像分析による測定（ＯＬＹＭＰＵＳ  ＡｎａｌｙＳＩＳ）を可能にした。有糸分裂指数は、取り込まれたＤＡＰＩを有する核の数に対する取り込まれたＢｒｄＵを有する核の数の比に対応する。平均指数は、標準偏差０．００５と０．０６１の間で統計学的に計算する。
【０２６７】
両側スチューデント検定によって、得られた結果の統計学的有意性を測定することが可能になった。
【０２６８】
Ｃ．結果
Ｃ．１  細胞の一般的目視観察
これらの結果は、研究前に、いかなる処理も受けていない老化した線維芽細胞では分裂能は非常に低いことを示している。
【０２６９】
若い線維芽細胞は、老化した線維芽細胞よりも優れた分裂能を示した。老化した線維芽細胞の分裂能は５％未満で、一方、若い線維芽細胞の分裂能は１５．６％であった。したがって、老化した未処理線維芽細胞と若い未処理線維芽細胞との間の分裂能の違いは３であった。
【０２７０】
この実施例では、線維芽細胞を試験した活性剤の組み合わせと２４時間インキュベートした後では、いかなる毒性も視覚的に認められなかった。
【０２７１】
この実施例では、エタノール（最終的に０．１％）には２４時間インキュベーションした後いかなる毒性効果も認められなかった。
【０２７２】
Ｄ．有糸分裂指数の評価（図５）
一般的に、ＤＮＡ合成相においていかなる処理もしていない老化した線維芽細胞の数は極めて低く、５％未満であった（図５、列１参照）。
【０２７３】
有糸分裂指数はまた、若い線維芽細胞でも余り高くなく、１５％程度であった（図５、列６参照）。いかなる処理もしていない老化した対照線維芽細胞と比較すると、エタノールに曝露した（０．１％−２４時間）対照線維芽細胞の有糸分裂指数に有意差は認められなかった（ｐ＝０．１１、ｎ＝６）。そこで値を一緒にした（対照、ｎ＝１２）。
【０２７４】
老化した線維芽細胞の有糸分裂指数に対して、図５、列２で示された結果は、Ａ１Ｂ１（ゾレンドロネート−プラバスタチン）が対照に対して活性化効果を有することを示している（２倍の最大刺激）（ｐ＜０．００１、ｎ≧６）。
【０２７５】
したがって、この実施例は、ゾレンドロネート−プラバスタチンの組み合わせの適用が老化した対象の線維芽細胞の細胞分裂に活性化効果を有することを示している。
【実施例３】
【０２７６】
水溶性ヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素阻害剤およびファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤の組み合わせの早老性症候群のマウスモデルに対する効果
本明細書で使用したＺｍｐｓｔｅ２４−／−ＫＯマウスは、Ｖａｒｅｌａら、２００５（４９）の引用文献に記載されているものである。２種類の分子（プラバスタチンおよびゾレンドロネート）の組み合わせの有効性の証拠は、スペインの研究室（Ｃ．Ｌｏｐｅｚ−Ｏｔｉｎ）と協力して報告した。この有効性は、生成物を別々に使用しても効果がない用量を一緒にして得られ、相加的効果であることを示している。
【０２７７】
２種類の分子（ゾレンドロ酸（Ｚｏｍｅｔａ（登録商標）１００μｇ／ｋｇ／日およびプラバスタチン１００ｍｇ／ｋｇ／日）は、ＰＢＳ  １Ｘで希釈し、１月齢のマウスに死ぬまで毎日腹腔内注射した。対照は、ＰＢＳ  １Ｘ単独で処理した同範囲の野生マウスである。
【０２７８】
処理したマウスの生存率は有意に改善され、雌では最大であり、寿命延長の平均は約８０％であった。疾患の臨床症状全ては、ＰＢＳ単独で処理した個体よりもかなり軽減された。特に、広範な脱毛領域を示すＰＢＳで処理したマウスと比較して、これらのマウスでは皮膚の処理および毛皮の再生長の効果が認められた。
【実施例４】
【０２７９】
水溶性ヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素阻害剤およびファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤の組み合わせの生体外ヒト皮膚抽出物に対する効果
Ａ．プロトコール
この実施例では、試験は約６０歳のドナーの皮膚について実施する。ヒト皮膚外植片の調製物２１個を作製し、ＢＥＭ培地中で生存を維持させる（ＢＩＯ−ＥＣのＥｘｐｌａｎｔｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）。
【０２８０】
外植片を、以下のように３個のバッチに６個ずつ、バッチＣ０１個には３個分配する。
−Ｃ０−対照移植片：外植片３個
−Ｃ−未処理対照：外植片６個
−Ｒ−陽性対照：外植片６個
−Ｐ−本発明の組成物によって処理した外植片、外植片６個
【０２８１】
Ａ．１  処理
処理は、異なる日、第１日目（Ｄ０）、外植片調製後２時間、次いでＤ＋１日、Ｄ＋２日、Ｄ＋４日、Ｄ＋６日、Ｄ＋８日およびＤ＋１０日に実施する。
【０２８２】
生成物は、以下の通り外植片に適用する：
−Ｃ−いかなる処理も受けていない外植片、
−Ｒ−それぞれ、Ｄ０、Ｄ＋２およびＤ＋４に陽性対照（レチノールクリーム）１ｍｇを受けた外植片、
−Ｐ１−それぞれ、各処理時間に、生成物Ｐ２ｍｇを受けた外植片。
【０２８３】
処理は、本発明の組成物の局所適用によって実施する。次に、組成物は、スパチュラを使用して外植片の表面全体に分配する。培養培地の半分を２日毎に新しいものと入れ替え、外植片は５％ＣＯ２を補給した湿潤な雰囲気で３７℃で生存を維持させる。
【０２８４】
Ａ．２．組織学のためのサンプリング
Ｄ０に、バッチＣ０の３個の外植片を得る。
【０２８５】
Ｄ＋６日およびＤ＋１１日に、各バッチの３個の外植片を得る。試料を２つに切断し、半分をホルムアルデヒドで固定し、他方の半分はＢＩＯ−ＥＣ手法「Ｐ００６−ＰＰＥＨ」にしたがって−８０℃で凍結する。
【０２８６】
Ｂ．組織学的研究
ホルムアルデヒドで固定して２４時間後、試料を脱水し、パラフィンを浸透させ、コーティングする。形態学的観察のために、５μｍの横断切片を作製する。
【０２８７】
Ｂ．１．第１ステップ：形態学的研究
上皮および皮膚構造の形態学的研究は、横断切片についてＭａｓｓｏｎトリクローム染色、すなわちＧｏｌｄｎｅｒの変法によって実施する。
Ｂ．２．第２ステップ：
Ｂ．２．１  ＫＩ６７の免疫標識
有糸分裂中の細胞の免疫標識は、ＤＡＢで検出される抗ＫＩ６７ポリクローナル抗体（Ｎｏｖｏ  Ｃａｓｔｒａ）によって凍結横断切片について実施する。陽性細胞は上皮全体の長さについて計数し、平均はｃｍ当たりの標識された細胞数について返した。
【０２８８】
Ｂ．２．２  コラーゲンＩの免疫標識：
コラーゲンＩの免疫標識は、ＦＩＴＣで検出される抗コラーゲンＩポリクローナル抗体によって凍結横断切片について実施する。核は、ヨウ化プロピジウムで対比染色する。
【０２８９】
Ｂ．２．３  コラーゲンＩＩＩの免疫標識：
コラーゲンＩＩＩの免疫標識は、ＤＡＢで検出される抗コラーゲンＩＩＩポリクローナル抗体によって凍結横断切片について実施する。核は、Ｍａｓｓｏｎのヘマルンで対比染色する。
【０２９０】
Ｂ．２．４  コラーゲンＩＶの免疫標識
コラーゲンＩＶの免疫標識は、ＦＩＴＣで検出される抗コラーゲンＩＶポリクローナル抗体（Ｃｌｉｎｉｓｃｉｅｎｃｅ）によって凍結横断切片について実施する。核は、ヨウ化プロピジウムで対比染色する。
【０２９１】
Ｂ．２．５  コラーゲンＶＩＩの免疫標識
コラーゲンＶＩＩの免疫標識は、ＦIＣＴで検出される抗コラーゲンＶＩＩモノクローナル抗体によって凍結横断切片について実施する。核は、ヨウ化プロピジウムで対比染色する。
【０２９２】
Ｂ．２．６  ＰＥＣＡＭ１の免疫標識
Ｆａｓｔ−ｒｅｄで検出される抗ＰＥＣＡＭ−１モノクローナル抗体によって凍結横断切片について実施されるＰＥＣＡＭ−１の免疫標識によって、内皮細胞を視覚化することができる。
【実施例５】
【０２９３】
水溶性ヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素阻害剤およびファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤の組み合わせのインビトロにおける皮膚形成細胞培養物に対する効果
この実施例は、前記の実施例２で使用した活性剤と同じ組み合わせを使用する。これらの活性剤の様々な組み合わせは、皮膚老化に関与する生理学的パラメータに対する効果を評価するため、インビトロで使用する。
【０２９４】
この実施例で使用した組み合わせはそれぞれ、Ａ１Ｂ１、Ａ１Ｂ２、Ａ２Ｂ１、Ａ２Ｂ２である。これら４種の組み合わせは、複数の濃度で試験し、実験は３連で実施する（少なくとも３６個の実験点を表す）。
【０２９５】
４種類の組み合わせの濃度は、出願人によって提案され、したがって、単純な試験でなければ、インビトロにおける細胞傷害性は研究のこの段階で考慮される。実験は、実施例１で示したように線維芽細胞系の細胞培養物に対して実施する。この試験はまた、表皮細胞培養物に適用する。以下の変数は、指示した濃度の活性薬剤の４種類の組み合わせについて調べる。
−  有糸分裂指数の測定、
−  コラーゲン格子の収縮による細胞外マトリクス再構築の測定、
−  ＵＶＢ照射（日光浴条件と類似した光誘導ストレス）後のＤＮＡゲノム修復の測定。
【０２９６】
有糸分裂指数の測定は、細胞を活性剤に１回曝露した後実施する。該指数は、核全数について、蛍光にしたチミジン類似体を取り込んだ細胞核を画像分析で計数することによって評価する。複数の視野を分析する。写真は、イコノグラフィーのために実施する。
【０２９７】
活性剤に曝露した線維芽細胞によって誘導された細胞外マトリクスの再構築は、これらの細胞をコラーゲン格子に組み込み、これらの格子を収縮する能力を定量することによって評価する。収縮した表面評価は、再構築係数である。写真は、イコノグラフィーのために実施する。
【０２９８】
ＤＮＡゲノム修復の測定は、日光曝露状態を模倣したＵＶ−Ｂ線量で細胞を照射した後、実施する。目的はまず、３回にわたってモニターしたＤＮＡ修復における活性剤の効果を評価することである。定量は、シクロブタン型ピリミジンダイマー検出および免疫組織化学技術を用いたＵＶＢ照射による分析によって実施する。
【０２９９】
写真は、イコノグラフィーのために記録する。
【実施例６】
【０３００】
主な目的：細胞老化の核、ミトコンドリアおよび細胞基質マーカーに対するＨＩＶウイルスおよび抗レトロウイルス療法の影響の測定
第２の目的
−  ＨＩＶ感染患者における核、ミトコンドリアおよび細胞基質機能の変化の普及を分析すること。
−  これらの異常の出現率を測定すること。
−  抗レトロウイルスに対する曝露期間に応じてこれらの異常の種類および頻度を、全体的に、型および分子によって分析すること（累積曝露時間）。
−  細胞内ＨＩＶウイルス負荷に応じてこれらの異常の種類および頻度を分析すること。
−  ＨＩＶ感染追跡期間によってこれらの異常の種類および頻度を分析すること。
【０３０１】
Ａ．実験計画
実験計画の選択
この観察研究には、３つの患者群が含まれる。
−  Ａ群：いかなる抗レトロウイルス治療も受けていないＨＩＶ１感染患者。
−  Ｂ群：少なくとも１２ヵ月抗レトロウイルス治療を受けたＨＩＶ１感染患者。
−  Ｃ群：年齢および性別を一致させたＨＩＶ陰性対照。
【０３０２】
Ｂ．適性基準
試験対象基準：
−  年齢＞１８歳および＜６５歳：
−  インフォームドコンセント用紙に署名している；
−  少なくとも５年間ＥｌｉｓａおよびウェスタンブロットでＨＩＶ１陽性であることが確認されている；
−  ＨＩＶ２陰性；
−抗レトロウイルス治療を全く受けていないか、または少なくとも１２ヵ月間治療の第１選択として受けていない。
【０３０３】
●試験対象外基準：
−  年齢＜１８歳および＞６５歳：
−  インフォームドコンセント用紙に署名していない；
−ＨＩＶ２陽性
−  スタチンまたはアミノビホスホネートで治療を受けた患者
−  許可されていない併用治療：テストステロン、インシュリン依存性糖尿病治療。
【０３０４】
Ｃ．試験方法
評価した患者数：
−  Ａ群：ｎ＝５０
−  Ｂ群：ｎ＝１００
−  Ｃ群：ｎ＝５０を含む２００人の患者。
【０３０５】
追跡中、抗ウイルス治療を開始する必要のあるＡ群の患者は、治療開始時にさらに評価を行い、その日からＢ群の患者と一緒に分析を開始した。
【０３０６】
Ａ群に含まれた期間中に測定されたデータによって、ＨＩＶウイルスの核およびミトコンドリア機能に対する可能性のある直接的役割を測定することができる。
【０３０７】
試験中抗レトロウイルス治療変更を必要とするＢ群の患者は、治療に変化のあるとき、追跡の場合に行ったのと同一の臨床的および臨床関連的評価を行う。これらの患者の追跡データは、抗レトロウイルス薬に曝露した患者で認められた核およびミトコンドリア機能の破壊の発生率を計算するために考慮する。
【０３０８】
試験期間：
試験期間は３６ヵ月である。
【０３０９】
Ａ群およびＢ群の患者について
ＨＩＶ感染の病歴：
−  ＨＩＶ感染と診断された日
−  汚染の形態
−  ＣＤＣ分類
−  Ｃ分類について：ＡＩＤＳと定義される状態の診断
−  進行中の抗レトロウイルス治療（開始日、投与された分子）
【０３１０】
臨床検査：
−  体重、身長、肥満度指数
−  胴囲、腰囲、胴囲対腰囲の比率
【０３１１】
血液検査：
−  負荷されたＨＩＶウイルスの測定（検出閾値４０コピー／ｍｌ）
−  ＣＤ４およびＣＤ８リンパ球レベルの測定
−  糖血症、インシュリン血症、ＨＯＭＡ計算
−  総コレステロール、ＬＤＬ、ＨＤＬコレステロール
−  トリグリセリド
−  核およびミトコンドリア機能の分析、ＨＩＶプロウイルスＤＮＡおよび細胞ライブラリーの測定のために７．５ｍｌのＥＤＴＡ試験管３本をサンプリングする
【０３１２】
抗レトロウイルス薬が標的とする核、ミトコンドリアおよび細胞基質のタンパク質の分析。
−  ウェスタンブロットおよび免疫標識：
−  プロテアソーム活性の対象としてＮＦ  ＢおよびＩ  Ｂの産生；
−  ラミンＡおよびＢの成熟、核タンパク質モデル；
−  ＳＲＥＢＰアイソフォームの産生およびそれらの核輸送；
−  精製し、脱グリコシル化したＣＤ３６（±糖の３０ｋＤａ）（Ａｂｃａｍ）のＮ−およびＯ−グリコシル化；
−  ミトコンドリアプロテアーゼ活性（Ａｂｃａｍ）で測定した、切断された移行シグナルを有するＨｓｐ７０のミトコンドリアへの輸送；
−  ミトコンドリア「呼吸」機能、ＲＯＳ産生、シトクロム酸化酵素のサブユニットＩＩおよびＩＶの試験（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）
【０３１３】
抗レトロウイルス治療に感受性である可能性の調査は、ＰＩに対するウイルスプロテアーゼの感受性で示されたように（Ｂａｘｔｅｒら、２００６）、特定の標的の遺伝子型同定によって実施する：
−  プレラミンＡおよびＢ１／Ｂ２の成熟に関与するＺＭＰＳＴＥ２４およびＲｃｅ１（分子遺伝学研究室では日常的である）；
−  脂質代謝遺伝子転写に対して活性を有するＳＲＥＢＰドメインの産生を可能にするＳ１−ＰおよびＳ２−Ｐプロテアーゼ；
−  ミトコンドリアデオキシヌクレオシド輸送体。
【０３１４】
対照群Ｃについて：
臨床試験：
−  体重、身長、肥満度指数
−  胴囲、腰囲、胴囲対腰囲の比率
−  核およびミトコンドリアおよび細胞基質機能の分析、ＤＮＡおよびライブラリーにおける配置の分析のために７．５ｍｌのＥＤＴＡ試験管３本をサンプリングする
【０３１５】
再診
評価には以下を含める。
【０３１６】
臨床試験：
−  体重、身長、肥満度指数
−  胴囲、腰囲、胴囲対腰囲の比率
【０３１７】
血液検査：
−  負荷されたＨＩＶウイルスの測定（検出閾値４０コピー／ｍｌ）
−  ＣＤ４およびＣＤ８リンパ球レベルの測定
−  糖血症、インシュリン血症、ＨＯＭＡ計算
−  総コレステロール、ＬＤＬ、ＨＤＬコレステロール
−  トリグリセリド
−  核およびミトコンドリアおよび細胞基質機能の分析、ＨＩＶプロウイルスＤＮＡの測定ならびにＤＮＡおよび細胞ライブラリーにおける配置の分析のために７．５ｍｌのＥＤＴＡ試験管３本をサンプリングする。
【０３１８】
抗レトロウイルス薬が標的とする核、ミトコンドリアおよび細胞基質タンパク質の分析（前記参照）。
Ａ群の患者について
抗レトロウイルス治療の開始を必要とするＡ群の患者は、治療を開始したとき、追跡の場合に行ったのと同一の臨床的および臨床関連的評価を行う。これらの患者の追跡データは、治療した患者群（Ｂ群）ではこの日から分析する。
【０３１９】
Ｂ群の患者について
試験中に抗レトロウイルス治療を変更する場合、治療に変化のあるとき、追跡の場合に行ったのと同一の臨床的および臨床関連的評価を行う。これらの患者の追跡データは、抗レトロウイルス薬に曝露した患者で認められた核およびミトコンドリアの機能の破壊の発生率を計算するために考慮する。
【０３２０】
Ｄ．予測結果、全体像
ＡＩＤＳウイルスに感染し、抗レトロウイルス治療を受けている患者におけるインビボの結果、細胞培養におけるインビトロの結果から裏付けられるように、これらの処理、特にプロテアーゼ阻害剤が、遺伝的ラミノパシー（ファルネシル化プレラミンＡおよびプロゲリンの産生を伴う）または「生理学的」老化（プロゲリンの産生を伴う）と同様の機構による加速された老化を誘導する。
【０３２１】
早老症で使用した薬剤（スタチンおよびアミノビホスホネート）の組み合わせがＡＩＤＳウイルスに感染し、抗レトロウイルス治療を受け、治療試験の確立が可能な患者における老化の加速に対抗するために使用できるという仮説が裏付けられる。
【実施例７】
【０３２２】
スタチンおよびアミノビホスホネートに関連した処理は、早期老化のヒト徴候を再生したマウスモデルの寿命を延長させる。
この実施例はまた、Ｖａｒｅｌａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００８、７、７６７（５４再出）において出版されている。
【０３２３】
器具および方法
マウス
Ｚｍｐｓｔｅ２４−／−およびＬｍｎａ−／−マウスの作製は記載されている（Ｐｅｎｄａｓら、２００２（３８）；Ｓｕｌｌｉｖａｎら、１９９９（２８５）。マウスのコンピュータ処理骨マイクロ断層撮影法は、マイクロ−ＣＴ  ＳｋｙＳｃａｎ  １１７２システム（ＳｋｙＳｃａｎ−商標）を使用して実施した。）マウスに関する実験は全て、Ｏｖｉｅｄｏ大学（スペイン）の動物実験委員会が規定した規則によって管理される。ＰＢＳで希釈したプラバスタチン（１００ｍｇ／ｋｇ／日）およびゾレンドロネート（１００ｍｇ／ｋｇ／日）を毎日マウスに投与する。プラバスタチン−ゾレンドロネート処理を受けているマウスまたはＰＢＳのみを受けている対照マウスは、いかなる見かけ上の損傷もストレスも示さない。
【０３２４】
細胞培養
対照被験者（ＧＭ００３８）および早老症に罹患した患者および変異Ｇ６０８Ｇ（ＡＧ１１４９８およびＡＧ０１９７２）の保有者の皮膚線維芽細胞はコーリエル細胞集積所から入手した。ＨｅＬａ細胞は、アメリカ培養細胞系統保存機関から得た。細胞は１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）および１％抗生物質−抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ）を補給したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で培養する。線維芽細胞は、１２日齢マウスの尾由来である（Ｖａｒｅｌａら、２００５）。スタチンおよびアミノビホスホネートによる処理の濃度および期間は、図の説明に示す。ファルネソールおよび／またはゲラニルゲラニオールの存在下でのスタチン＋アミノビホスホネートで一緒に処理している間、プラバスタチン１ｍＭおよびゾレンドロネート１ｍＭを、ファルネソールおよび／またはゲラニルゲラニオールの濃度を増加させた培養培地に添加した。異常な核の割合は、処理を開始して４８時間後に測定する。
【０３２５】
免疫組織化学
線維芽細胞は、Ｌａｂ  Ｔｅｋ容器（Ｎａｌｇｅｎ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）で培養し、ＰＢＳで洗浄し、その後４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定する。細胞は、濃度を高めたエタノール浴で脱水し、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（０．５％）、５％血清（ヤギまたはウサギ）を含有するＰＢＳで２５℃で５分間透過させる。スライドをＰＢＳ中で２５℃で５分間予めインキュベートする。
【０３２６】
１次抗体の希釈は、ヤギ抗プレラミンＡポリクローナル抗体（Ｓｃ−６２１４、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）では１／１００、抗ラミンＡ／Ｃ抗体（Ｇ．Ｍｏｒｒｉｓによって恵与された４Ａ７）では１／４０、ウサギ抗カルレティキュリン抗体（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ）では１／２００およびＢ１抗ラミン抗体（Ａｂｃａｍ）では１／１００である。ＰＢＳで洗浄した後、スライドをインキュベーション溶液で希釈した２次抗体で２５℃で１時間インキュベートする。２次抗体の希釈は以下の通りである。ＦＩＴＣを結合したロバ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）では１／１００、Ａｌｅｘａ４８８を結合したロバ抗ヤギＩｇＧでは１／４００、Ａｌｅｘａ５６８を結合したロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）では１／８００およびテトラメチルローダミンイソチオシアネート（Ｓｉｇｍａ）を結合したロバ抗ウサギＩｇＧでは１／１００である。その後、細胞を洗浄し、核はＤＡＰＩ（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で２５℃で１５分間着色し、最後に０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで３回洗浄する。スライドはＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ）に載せる。デジタル画像は、ＣｏｏｌＳｎａｐカメラを備えたＬｅｉｃａ  ＤＭＲ顕微鏡またはＬｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ５共焦点顕微鏡で記録する。核は、ラミンＡ／Ｃに印を付けた後、細胞内で観察する。処理それぞれについて、１００個を上回る核を対照線維芽細胞中で分析した。分析した早老症を罹患した患者の細胞の核の数は２５０個（継代８）、１９８個（継代１３）および１５０（継代２０）である。
【０３２７】
Ｘ線照射およびＨ２ＡＸリン酸化ヒストンの研究
早老症患者の細胞および１ＢＲ３対照細胞をＰｈｉｌｉｐｓ  Ｘ装置で照射する。Ｘ線は、強度２０ｍＡで電圧２００ｋＶを印可したタングステン陽極によって、直径０．１ｍｍの銅フィルタを装着して発生させる。線量率は１．２４３Ｇｙ／分である。Ｈ２ＡＸリン酸化ヒストンは、１／８００に希釈したリン酸化セリン１３９を特に認識する抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ、Ｍｕｎｄｏｌｓｈｅｉｍ、Ｆｒａｎｃｅ）およびＦＩＴＣを結合した抗マウス抗体（１／１００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で検出する。修復期間に応じて２本鎖切断（ＤＳＢ）の数は式Ｎｔ＝Ｎ０（１／１＋βｔ）α（式中、αおよびβは調節可能なパラメータであり、ＮｔおよびＮ０は時間ｔおよび時間０におけるＤＳＢの数である）で調節する。
【０３２８】
ウェスタンブロット
細胞は以下の溶媒、Ｔｒｉｓ  ５０ｍＭ（ｐＨ７．４）、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、１％ＮＰ−４０、ＮａＦ  ５０ｍＭ、ジチオスレイトール１ｍＭ、ペプスタチンＡ  ２ｍｇ／ｍｌで、プロテアーゼ阻害剤（完全阻害剤カクテル、Ｒｏｃｈｅ）およびホスファターゼ阻害剤（ホスファターゼ阻害剤カクテルＩおよびＩＩ、Ｓｉｇｍａ）の存在下でホモゲナイズする。電気泳動後、タンパク質をニトロセルロース膜に移し、ＴＢＳ−Ｔ緩衝液（Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ、ｐＨ７．４、ＮａＣｌ  １５０ｍＭおよび０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）を使用して５％脱脂粉乳でブロックし、特異的抗ラミンＡ／Ｃ抗体（４Ａ７、１／５００）または特異的抗ラミンＡ（Ｃ２０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１／２５０）または抗ベータアクチン（Ａ５４４１、Ｓｉｇｍａ、１／５０００）のいずれかと共に１時間インキュベートする。抗体は、３％脱脂粉乳を含有するＴＢＳ−Ｔで希釈する。次いで、ブロットは、１．５％脱脂粉乳を含有するＴＢＳ−Ｔに溶かしたペルオキシダーゼ結合抗体（ヤギ抗マウスまたは抗ウサギ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）でインキュベートし、その後洗浄し、最後に化学ルミネセンス（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｗｅｓｔｅｒｎ化学ルミネセンスＨＲＰ基質、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ−商標）によって明示する。
【０３２９】
質量分析による解析
対照およびＺｍｐｓｔｅ２４−／−マウスの線維芽細胞ならびに早老症患者のリンパ芽球状細胞をホモゲナイズし、超遠心分離によって核を単離し、ＢｌｏｂｅｌおよびＰｏｔｔｅｒ，Ｖ．Ｒ．Ｎｕｃｌｅｉ  ｆｒｏｍ  ｒａｔ  ｌｉｖｅｒ：ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｈａｔ  ｃｏｍｂｉｎｅｓ  ｐｕｒｉｔｙ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｙｉｅｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５４、１６６２〜１６６５、１９６６で記載されたように核タンパク質を得た。核ラミナのタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分離し、ラミンＡ、プレラミンＡおよびプロゲリンを含有する切片を切り取った。ゲルの断片を炭酸水素アンモニウム／アセトニトリル混合物（７０／３０、２５ｍＭ）１８０ｍｌで２回洗浄し、乾燥させ（１５分、９０℃）、炭酸水素アンモニウム２５ｍＭに溶かしたトリプシン（１２ｎｇ／ｍｌ、Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化した（１時間、６０℃）。一般的実験では、ＣＨＣＡ（ａ−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸、Ｗａｔｅｒｓ）１ｍｌをＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ分光計に入れる。乾燥したら、ペプチド溶液１ｍｌおよびマトリクス（ＣＨＣＡ）１ｍｌを、レーザー源（Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＳＴＲ（商標）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を備えた分光計に入れる。２００回のレーザー発射を使用して収集したデータからＤａｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒプログラム（バージョン４．０．０．０、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析したスペクトルを得る。
【０３３０】
リアルタイムの定量的ＰＣＲ
ｐ５３の標的遺伝子（Ａｔｆ３、Ｇａｄｄ４５ｇおよびＣｄｋｎ１ａ、ｐ２１をコードする）の発現率は、装置ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して測定した。
【０３３１】
統計学的分析
異なるマウス群と、処理した、または処理していない細胞の間の違いは、スチューデント検定中に分析した。計算は、プログラムＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを使用して実施した。データは、平均数±平均の標準偏差として表す。
【０３３２】
結果
ＨｅＬａ細胞は、指示した濃度のファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ−２７７、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および／またはゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ阻害剤Ｉ型（ＧＧＴＩ−２１４７）の存在下で培養した。２種類の阻害剤を組み合わせた場合のみ、各阻害剤を単独で使用した効果と比較して、細胞内で非プレニル化プレラミンＡが十分に形成される。
【０３３３】
これらの結果は、得られたウェスタンブロットの写真であり、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤および／またはＩ型ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼによって処理したＨｅＬａ細胞におけるＡ／Ｃラミンの検出を表している図１０に示す。ＬＡ＝ラミンＡ、ＬＣ＝ラミンＣ、Ｐｒｅ＝プレラミンＡ。
【０３３４】
これらの結果によって、本発明によれば、プレラミンＡのプレニル化阻害には、同時にファルネシルトランスフェラーゼおよびゲラニルゲラニルトランスフェラーゼＩ型を阻害することが必要であることが裏付けられる。
【０３３５】
ファルネシルトランスフェラーゼ（ＦＴＩ）阻害剤は、プロゲリン（早老症に罹患した患者の細胞における）およびＺｍｐｓｔｅ２４−／−マウス線維芽細胞の代償性ゲラニル化を誘導する。
【０３３６】
質量分析によって、予測通り、Ｚｍｐｓｔｅ２４マウスの細胞ではファルネシル化およびカルボキシメチル化されたトリプシン処理ペプチドの存在が示されるが、対照マウス細胞では示されない。これらの結果は、図１３ａに示されている。ファルネシル化ペプチドは３ＳＩＭ残基を欠如しており、このことはＺｍｐｓｔｅ２４はプレラミンＡの成熟中の第１の切断に必ずしも必要ではないことを示している。ＦＴＩ処理マウスの細胞において、ファルネシル化プレラミンＡの量の減少が認められた。ゲラニルゲラニル化ペプチドのスペクトルの一部の観察中、未処理Ｚｍｐｓｔｅ２４−／−マウスの細胞では検出可能なプレラミンＡ由来のペプチドは存在しなかった。しかし、ＦＴＩ処理後、プレラミンＡのゲラニルゲラニル化断片と質量が適合しているペプチドが検出された。これらの結果は、図１３ｂに示す。
【０３３７】
早老症患者の細胞では、図１１ａで示したように、いかなる処理もしないとファルネシル化およびカルボキシメチル化されたプロゲリンに対応するペプチドが検出される。ＦＴＩ−１２７で細胞を処理すると、図１１ｂに示したように、プロゲリンのゲラニルゲラニルペプチドに対応する質量のペプチドの出現が促進される。
【０３３８】
このデータは全体として、プロゲリンおよびプレラミンＡがＦＴＩの影響下で選択的方法でゲラニルゲラニル化されていることを示しており、早老性症候群のマウスモデルではＦＴＩ処理の効果が不十分であることを説明している。
【０３３９】
早老症患者およびＺｍｐｓｔｅ２４−／−マウスの細胞は、プレラミンＡおよびプロゲリンの交差プレニル化の防御を企図する療法計画を評価するために使用した。ラミンＡの異常変種のファルネシル化は、ファルネシルピロリン酸、すなわちファルネシルトランスフェラーゼの基質およびゲラニルゲラニルピロリン酸前駆体、すなわちＩ型ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼの基質の生合成経路に対して影響を有する薬剤によって阻害できるという仮説を確立した。したがって、この代謝経路の２つのステップで早老症患者の細胞に影響を及ぼすことが知られている２種類の薬剤、スタチンおよびアミノビホスホネートの効果を試験した。質量分析によって、図１１ｃで示したように、プラバスタチン（スタチン）ゾレンドロネート（アミノビホスホネート）の組み合わせは、プロゲリンのプレニル化されていないＣ末端に対応するペプチド、すなわち、ＦＴＩ処理細胞で検出できないペプチドの出現を誘発するが、ファルネシル化ペプチドもゲラニルゲラニル化ペプチドもそれ以上検出されないことが示される。スタチン＋アミノビホスホネート処理は、プロゲリンのプレニル化を阻害する。図１２に示したように、同様のことがプレラミンＡでも認められた。プレニル化されていないそのＣ末端ペプチドは、スタチンおよびアミノビホスホネートの混合物で処理した細胞では検出されたが、未処理細胞では検出されず、すなわち、ファルネシル化およびカルボキシメチル化されたペプチドが検出された。最後に、プラバスタチン＋ゾレンドロネート処理は、ゲラニルゲラニル化プレラミンＡには作用せず、これはＦＴＩとは異なる。
【０３４０】
図１３の説明：ラミンＡ（対照細胞）およびプレラミンＡ（Ｚｍｐｓｔｅ２４−／−マウス細胞）は、質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ）によって解析した。ａ、ｂ：ファルネシル化トリプシン処理ペプチド（ａ）およびゲラニルゲラニル化ペプチド（ｂ）に対応するスペクトルの一部。各ピークはラミンＡまたはプレラミンＡのトリプシン処理によるペプチドの理論的質量（括弧内）によって示される。残基の数は、青で示している。ペプチドの配列およびそれらの質量は赤で示している。Ｆａｒｎ＝ファルネシル処理、ＣＭ＝カルボキシメチル処理、Ｇｅｒ＝ゲラニルゲラニル処理。
【０３４１】
図１１の説明：未処理細胞（ａ）、ＦＴＩ（２．５μＭ、ｂ）またはプラバスタチン＋ゾレドロネート（各1μＭ、ｃ）の混合物で治療した早老症患者の細胞の核膜から抽出したタンパク質の質量分析。未修飾タンパク質、ファルネシル化タンパク質およびゲラニルゲラニル化タンパク質に対応するスペクトルの一部は、図の上、中央および下に示している。各ピークは、プロゲリンのトリプシン処理ペプチドに対応し、実験による測定されたモノアイソトピック質量および理論的質量（括弧内）によって示される。アミノ酸残基の数は、青で示している。ペプチドの配列およびそれらの質量は赤で示している。
【０３４２】
プロゲリンは、罹患していない細胞では主にファルネシル化（Ｆ）され、カルボキシメチル化（Ｃｍ）されているが（ａ、中央のパネル）、一方、ＦＴＩの影響によって、このピークはかなり低下し、プロゲリンはゲラニルゲラニル化され、ホスホリル化（ｂ、下のパネル）されるようである。プラバスタチンおよびゾレンドロネートで治療したのち、未修飾のプロゲリンが優勢な形態である。
【０３４３】
図１２の説明：未処理線維芽細胞（ａ）またはＺｍｐｓｔｅ２４−／−マウス由来のプラバスタチン＋ゾレドロネート（各1μＭ、ｂ）の混合物で処理した線維芽細胞の核膜から抽出したタンパク質の質量分析を示した図である。未修飾タンパク質、ファルネシル化タンパク質およびゲラニルゲラニル化タンパク質に対応するスペクトルの一部は、図の上、中央および下に示している。各ピークは、プロゲリンのトリプシン処理ペプチドに対応し、実験で測定されたモノアイソトピック質量および理論的質量（括弧内）によって示される。アミノ酸残基の数は、青で示している。ペプチドの配列およびそれらの質量は赤で示している。
【０３４４】
この図では、プレラミンＡは、未処理細胞では（ａ、中央のパネル）主にファルネシル化（Ｆ）され、カルボキシメチル化（Ｃｍ）されているが、一方、未修飾またはゲラニルゲラニル化形態は検出されないことを確認することができる。プラバスタチンおよびゾレンドロネートによる処理後、プレニル化ペプチドはもはや検出することはできず、プレラミンＡの未修飾形態が優勢である（ｂ、上のパネル）。
【０３４５】
プラバスタチン＋ゾレンドロネートによる処理によって、早老症患者細胞および培養しているＺｍｐｓｔｅ２４−／−マウス細胞の核異常が修正され、Ｘ線によって誘導されたＤＮＡ損傷修復機構が部分的に回復する（図１４、１５、１６および１７）。
【０３４６】
プラバスタチン＋ゾレンドロネート処理は、早老症患者細胞の細胞核におけるように、対照細胞の核にプレラミンＡが出現する原因となるが（図１４ａ）、後者の細胞では核形態を著しく改善する（図１４ｂ）。定量的分析によって、早老症患者の細胞では流路数の増加として核異常の増加が示され、この異常の数は、プラバスタチン＋ゾレンドロネート処理の影響下では減少する（図１４ｃ）。共焦点顕微鏡下で観察すると、早老症患者の細胞はラミンＡ／Ｃの凝集を含有しており、核質（核網）中の核膜の核質表面には深い陥入があり、抗カルレティキュリンによって示されている（図１５ａ〜ｆ）。これらのラミンＡ／Ｃ凝集は、対照被験者の細胞にはなく（図１４ｊ〜ｌ）、プラバスタチン＋ゾレンドロネート治療の影響下にある早老症患者の細胞からは消失している（図１４ｇ〜ｉ）。ラミンＢ１、すなわち核ラミナのファルネシル化成分の位置は、治療の効果によって変化し、治療がラミンのプレニル化を阻害することが裏付けられる。
【０３４７】
プラバスタチン＋ゾレンドロネート処理による核形状の改善がプロゲリンのプレニル化の事実と本当に関係があることを、細胞をファルネソールおよび／またはゲラニルゲラニオールとインキュベートすることによって調べた。細胞にファルネソールおよびゲラニルゲラニオールを補給すると、細胞がファルネシルピロリン酸およびゲラニルゲラニルピロリン酸を合成することができ、したがって、プラバスタチンおよびゾレンドロネートが存在するときでも、プロゲリンをプレニル化できる（図１４ｄ）。ファルネソールは、プラバスタチン＋ゾレンドロネート処理の効果を無効にし、このことは治療効果がファルネシルピロリン酸合成の阻害によって引き起こされることをさらに証明している。ゲラニルゲラニオールはまた、処理の効果を遮断し、このことはプロゲリンのゲラニルゲラニル化形態はまた、細胞に毒性であることを立証する（図１４ｄ）。同様の効果がＺｍｐｓｔｅ２４−／−細胞でも認められ（図１６ａ）、プロゲリンに関するデータはプレラミンＡ、Ｚｍｐｓｔｅ２４−／−細胞に蓄積するタンパク質に適用できることを示唆している。ファルネソールもゲラニルゲラニオールも対照線維芽細胞に対していかなる効果も有さず、これらの分子が人工産物を誘導する可能性は排除される（図１６ｂ）。
【０３４８】
最後に、プラバスタチン＋ゾレンドロネート処理が、ホスホリル化ヒストンＨ２ＡＸ斑点の数の減少を引き起こし、これらの斑点は、未修復ＤＮＡ２本鎖切断の数に比例している（図１７）。
【０３４９】
結論として、集めたインビトロデータによって、プラバスタチン＋ゾレンドロネートの組み合わせはファルネシル化およびゲラニルゲラニル化を部分的に阻害し、Ｚｍｐｓｔｅ２４−／−細胞および早老症患者におけるプレニル化されていないプレラミンＡおよびプロゲリンのラミナ内の位置の予測される変化および核質内再分布を引き起こすことが示唆される。同様に、ラミナ内のファルネシル化プロゲリン量の減少および核質への再配置によって、早老症患者の細胞に対する処理が有益な効果を有することが説明される。
【０３５０】
図１４の説明：早老症患者の対照細胞におけるプレラミンＡの蓄積に対するプラバスタチン＋ゾレドロネートの組み合わせの共同効果。
【０３５１】
（ａ）プラバスタチン（６０μＭ、１２ｈ）および／またはゾレンドロネート（６０μＭ、６ｈ）で、単独で、または組み合わせて処理した後の正常な未処理ヒト線維芽細胞におけるラミンＡ／ＣおよびプレラミンＡの免疫組織化学的検出。（ｂ）プラバスタチン＋ゾレンドロネート（各１μＭ）の組み合わせで２４時間処理した正常なヒト線維芽細胞および早老症患者の線維芽細胞におけるラミンＡ／ＣおよびプレラミンＡの免疫組織化学的検出。（ｃ）早老症患者の細胞の核形態に対するプラバスタチン＋ゾレドロネート処理（各１μＭ）の効果の定量的分析。処理および未処理細胞は、継代８（ｐ８）、１３（ｐ１３）および２０（ｐ２０）で抗ラミンＡ／Ｃ抗体で免疫的に標識した。白い矢印は、異常な核を示す。（ｄ）ファルネソール、ゲラニルゲラニオールまたは両化合物の存在下での早老症患者の細胞の核形態に対するプラバスタチン＋ゾレドロネート処理（各１μＭ）の効果の定量的分析。エラーバー＝平均±平均の標準誤差。スケールバー＝１０μｍ。
【０３５２】
図１５の説明：早老症患者の細胞において、プラバスタチン＋ゾレドロネート治療は、核形態を修正し、核ラミナから核質内へのラミンＡ／ＣおよびラミンＢ１アイソフォームの部分的再配置の誘導を導く。
【０３５３】
（Ａ）これらの早老症細胞では、処理未処理にかかわらず、ラミンＡ／Ｃおよびカルレティキュリンは共存する。免疫蛍光法および共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ５、２０４８×２０４８ピクセル画像の３Ｄスタック、０．２μｍ間隔、平均３列、３枚の画像の蓄積、１．７×ズーム）を使用して検討する。各パネルのａからｃの画像は、重ねた２７枚の画像の平均強度を投射したもので、ＰＢＳでインキュベートした早老症細胞ではカルレティキュリンによって印を付けた核網の細管が示されている。画像ｄからｌ：厚さ０．２μｍで単離された共焦点切片。プラバスタチン＋ゾレンドロネート処理は、早老症細胞の核の形態を修正し、核網の細管の数を減少させ（ｇ）、核ラミナの厚さを薄くする（ｈ）。
【０３５４】
（Ｂ）ラミンＢ１およびカルレティキュリンの共存。プラバスタチン＋ゾレンドロネート処理は、ラミンＢ１核質標識シグナルを増加させ、このタンパク質のファルネシル化が部分的に阻害されることを示している。スケールバー＝５μｍ。
【０３５５】
図１６の説明：ファルネシル化ピロリン酸およびゲラニルゲラニルピロリン酸前駆体は、培養したＺｍｐｓｔｅ２４−／−マウス細胞におけるプラバスタチン＋ゾレンドロネート処理の効果を無効にする。
【０３５６】
ファルネソール、ゲラニルゲラニオールまたは両分子の存在下で培養したＺｍｐｓｔｅ２４−／−マウス（ａ）および対照マウス細胞（ｂ）の核形態に対する、単独または組み合わせたプラバスタチン（１μＭ）およびゾレンドロネート（１μＭ）の効果の定量化。
【０３５７】
単独または組み合わせたファルネソール、ゲラニルゲラニオールは、Ｚｍｐｓｔｅ２４−／−細胞の核形態に対するプラバスタチン＋ゾレンドロネートの効果を無効にする。
【０３５８】
図１７の説明：プラバスタチン＋ゾレドロネート処理は、早老症患者の細胞におけるＤＮＡ２本鎖切断の修復（ＤＳＢ）の異常を部分的に修正する。
【０３５９】
対照線維芽細胞および早老症患者の線維芽細胞をプラバスタチン＋ゾレンドロネート混合物（各１μＭ）またはＰＢＳでインキュベートして、Ｘ線を照射した（２ｇｙ）。照射して２４時間後に検出されたホスホリル化ヒストンＨ２ＡＸの斑点の免疫検出したもので、斑点は未修復の２本鎖切断に対応する（上の画像）。核はＤＡＰＩで染める（下の画像）。
【０３６０】
下の図：ＰＢＳでインキュベートするか、またはプラバスタチン＋ゾレドロネートで処理した対照細胞（黒四角）および早老症細胞（白丸）における照射後の時間によるホスホリル化ヒストンＨ２ＡＸ斑点数の変化。各曲線は、少なくとも３回の実験の平均±平均の標準偏差を示す。
【０３６１】
プラバスタチン＋ゾレンドロネートの組み合わせによる処理は、Ｚｍｐｓｔｅ２４−／−マウスの早老性表現型を改善する（図１８、１９および２０）：
Ｚｍｐｓｔｅ２４−／−マウスおよび対照マウスは、毎日プラバスタチンおよびゾレンドロネートまたは両薬剤の組み合わせで、マウスにおいて非毒性であることが既に示された用量で処理した。既に早老症患者の細胞で観察されたように、プラバスタチンまたはゾレンドロネートのいずれの薬剤も単独ではＺｍｐｓｔｅ２４−／−マウスの寿命を延長させない（図１９）。しかし、両薬剤を組み合わせると、Ｚｍｐｓｔｅ２４−／−マウスの早老性表現型を著しく改善し、すなわち、この処理は体重増加の改善をもたらし、皮下脂肪の量を増加させ、脊柱後弯症および脱毛症の規模を軽減し、寿命を延長させる。生存時間は、１０１日から１７９日に延長し、最高生存時間は１５１日から２２２日に延長した（ｐ＜０．００１、図１８ｃ）。マウスにおける処理によって修正された全表現型徴候はまた、ヒトにおける早老症に特徴的であることに注意されたい。併用処理は、Ｚｍｐｓｔｅ２４−／−マウスおよび早老症もしくは関連する早老性症候群の患者の特徴の１つである骨密度の減少を修正する。コンピュータ処理骨マイクロ断層法は、骨のミネラル化の増加および処理したマウスの脛骨皮質の厚さの増加を示唆している（図１８ｄ）。同様に、Ｚｍｐｓｔｅ２４＋／＋、Ｚｍｐｓｔｅ２４−／−および処理したＺｍｐｓｔｅ２４−／−マウスの肝臓の核形態の定量化によって、プラバスタチン＋ゾレンドロネート処理がＺｍｐｓｔｅ２４−／−細胞核の形状を正常化することが示される（図１８ｅ）。処理はまた、Ｚｍｐｓｔｅ２４−／−マウスを正常化する（Ｖａｒｅｌａら、２００５（５４再出））（図１８ｆ）。最後に、処理がプレラミンＡを蓄積できないＬｍｎａ−／−マウスに対して効果を有し得るかどうかを確認した。プラバスタチン＋ゾレンドロネート処理は、これらのマウスの寿命に何ら影響を及ぼさず（図２０）、この処理が核膜内にファルネシル化プレラミンＡを蓄積するマウスにのみ作用できることをさらに裏付けている。
【０３６２】
図１８の説明：プラバスタチン＋ゾレンドロネート処理は、Ｚｍｐｓｔｅ２４−／−マウスの早老性表現型を改善する。
（ａ）３月齢のＺｍｐｓｔｅ２４＋／＋マウス、Ｚｍｐｓｔｅ２４−／−マウスならびにプラバスタチン（１日当たり１００ｍｇ／ｋｇ）およびゾレンドロネート（１日当たり１００ｍｇ／ｋｇ）で処理したＺｍｐｓｔｅ２４−／−マウスを示す写真。スケールバー＝１ｃｍ。（ｂ）３月齢Ｚｍｐｓｔｅ２４＋／＋マウス（ｎ＝１２）、Ｚｍｐｓｔｅ２４−／−マウス（ｎ＝１３）および処理したＺｍｐｓｔｅ２４−／−マウス（ｎ＝１５）の体重。（ｃ）未処理マウス（ｎ＝１３）と比較して処理したＺｍｐｓｔｅ２４−／−マウス（ｎ＝１５）の寿命の著しい延長を示すカプラン−マイヤー曲線。（ｄ）処理した、および未処理のＺｍｐｓｔｅ２４−／−マウスの脛骨の３Ｄコンピュータ処理マイクロ断層法による表示（上の図）。下のパネルは、未処理（ｎ＝６）および処理（ｎ＝５）Ｚｍｐｓｔｅ２４−／−マウスの相対的骨量（骨組織量／脛骨の量）および骨梁の数を示す。（ｅ）Ｚｍｐｓｔｅ２４＋／＋、Ｚｍｐｓｔｅ２４−／−および処理したＺｍｐｓｔｅ２４−／−マウスの肝細胞における核異常の定量化。白い矢印は、異常な核を示す。スケールバー＝１０μｍ。（ｆ）定量的ＲＴ−ＰＣＲによって分析した、Ｚｍｐｓｔｅ２４＋／＋、Ｚｍｐｓｔｅ２４−／−および治療したＺｍｐｓｔｅ２４−／−マウスの肝臓および心臓におけるｐ５３の標的遺伝子の相対的発現。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバーは、平均±平均の標準誤差を表す。
【０３６３】
図１９の説明：プラバスタチン単独、またはゾレンドロネート単独では、Ｚｍｐｓｔｅ２４−／−マウスの寿命を延長させない。
Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線は、プラバスタチン単独（ｎ＝５）（ａ）およびゾレンドロネート単独（ｎ＝５）（ｂ）は処理したＺｍｐｓｔｅ２４−／−マウス（白い菱形）および未処理（黒丸、ｎ＝１１）マウスの寿命を修正しないことを示している。
【０３６４】
図２０の説明：プラバスタチン＋ゾレンドロネート処理は、Ｌｍｎａ−／−マウスの寿命を修正しない。
Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線は、プラバスタチン＋ゾレンドロネートで処理したＬｍｎａ−／−マウス（ｎ＝１２、白い菱形）の寿命は、未処理マウス（黒丸、ｎ＝１１）と同等であることを示している。プラバスタチン＋ゾレンドロネート処理はラミンＡ／Ｃを欠如したマウスに対しては影響を及ぼさない。
【０３６５】
概略／結論／展望
ハッチンソンギルフォード早老症を含むいくつかのヒト早老性症候群は、核膜上における欠失したプレラミンＡ（プロゲリン）または欠失していないプレラミンＡのファルネシル化形態の蓄積によって引き起こされる。プロゲリンはまた、生理学的老化の間に産生される。早老症に罹患した患者の細胞で実施した最近の研究によって、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）が核の形態を改善することが示され、これらの阻害剤はこれらの破壊的な症候群の治療となり得ることを示唆している。
【０３６６】
本発明者らは、プレラミンＡおよびプロゲリンは、ファルネシルトランスフェラーゼが阻害されているとき、ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼによって選択的プレニル化を受けることを本明細書で示し、これによってこれらのの早老性症候群のマウスモデルの表現型改善においてはＦＴＩ効果の程度が低いことを説明することができる。
【０３６７】
スタチンおよびアミノビホスホネートの組み合わせがプレラミンＡおよびプロゲリンのファルネシル化ならびにゲラニルゲラニル化を効果的に阻害し、プレラミンＡの成熟に関与するメタロプロテアーゼＺｍｐｓｔｅ２４をコードする遺伝子を不活性化したマウスの老化の表現型を著しく改善することを示した。表現型の改善には、成長曲線、体重、脂肪萎縮症、脱毛および骨の異常の改善が含まれる。
【０３６８】
さらに、これらのマウスの寿命は、実質的に延長する。
【０３６９】
このデータは、核膜におけるプレニル化タンパク質の蓄積を伴うヒト早老性症候群に対する新たな治療的取り組みを切り開く。
【０３７０】
プラバスタチン＋アミノビホスホネート処理は、マルセイユにおいて、Ｎｉｃｏｌａｓ  Ｌｅｖｙの監督下にあり、厚生省（ＰＨＲＣ２００８）およびＦｒｅｎｃｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｍｙｏｐａｔｈｙ（ＡＦＭ）が資金提供し、ＡＦＳＳＡＰＳおよびＳｏｕｔｈ  Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎ  ＣＣＰから許可を受けているヨーロッパ治療試験（子供１５人）の枠組みの中で、早老症に罹患した子供に３年間適用する予定である。
【０３７１】
同様の処理は、Ｇｉｕｓｅｐｐｅ  Ｎｏｖｅｌｌｉの監督下で、ファルネシル化プレラミンＡの蓄積によるもう１つの早老性症候群である下顎末端異形成症に罹患した患者に対してまもなくローマでも行われる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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