(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリアセチルモノアシル型マンノシルエリスリトールリピドを生産する能力を有する、シュードザイマ チュラシマエンシス（Pseudozyma churashimaensis）に属する微生物であって、下記（ａ）及び（ｂ）で示される菌学的性質を有する微生物。
（ａ）形態学的性質
【表１】
0005622190.tif 000014
（ｂ）生理学的性質
【表２】
0005622190.tif 000015
【請求項２】
トリアセチルモノアシル型マンノシルエリスリトールリピドを生産する能力を有する、シュードザイマ チュラシマエンシス（Pseudozyma churashimaensis）に属する微生物であって、シュードザイマ チュラシマエンシス ＯＫ−９６（受託番号 FERM P-２１８９６）である微生物。
【請求項３】
シュードザイマ チュラシマエンシス ＯＫ−９６（受託番号 FERM P-２１８９６）である請求項１に記載の微生物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の微生物を培養し、得られた培養物あるいは分離菌体からマンノシルエリスリトールリピド−Ａを採取することを特徴とする、マンノシルエリスリトールリピドの製造方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の微生物を、炭素源として糖類を含有する培地に培養し、得られた培養物からトリアセチルモノアシル型マンノシルエリスリトールリピドを採取することを特徴とする、トリアセチルモノアシル型マンノシルエリスリトールリピドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖型バイオサーファクタントを生産する能力を有するサトウキビから単離した微生物、ならびにその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖脂質は、脂質に１〜１０数個の単糖が結合した物質であり、生体内において細胞間の情報伝達に関与し、神経系・免疫系の機能維持にも重要な役割を果たしていること等が明らかにされつつある。一方で、糖脂質は、糖の性質に由来する親水性と脂質の性質に由来する親油性の二つの性質を合わせ持つ両親媒性物質であり、このような性質を有する物質は界面活性物質と呼ばれている。
【０００３】
一方、一部の微生物はこれらの界面活性物質を効率良く生産することが知られており、この生物由来界面活性剤（バイオサーファクタント）は、安全性が高く、環境に対する負荷が少ない生分解性に優れた環境先進型界面活性剤として研究が進められている。現在、微生物が生産する界面活性物質としては、糖型、アシルペプチド型、リン脂質型、脂肪酸型及び高分子化合物型の５つに分類されているが、特にこの内の糖型の界面活性剤については、最もよく研究され、細菌及び酵母によって生産された多くの種類の物質が報告されている。
【０００４】
これらのバイオサーファクタントは、生分解性が高く、低毒性で環境に優しく、新規な生理機能を持つといわれている。このことから、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等にこれらのバイオサーファクタントを幅広く適用することは、持続可能社会の実現と高機能製品の提供という、両面を兼ね備えており極めて有意義である。
【０００５】
糖型バイオサーファクタントには、次のようなものが例として挙げられる。
【０００６】
ラムノリピド（Rhamnolipid；以下、ＲＬと省略する。）は、結核菌の抗生物質としてシュードモナス  アエルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）（緑膿菌）の培養液から最初に発見されている（非特許文献１参照）。
また、これまでにシュードモナス（Pseudomonas）属の細菌から４種類の同族体が報告されており、当初は数ｇ／Ｌ程度の生産量であったが、現在では１００ｇ／Ｌ以上の生産を可能にしている（非特許文献２参照）。
【０００７】
トレハロースリピド（Trehalose lipid；以下、ＴＬと省略する。）は、コリネバクテリウム（Corynebacterium）等の細胞表層物質として発見された。また、類似の物質が、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、ノカルディア（Nocardia）、ロドコッカス（Rodococcus）属細菌からも報告されている（非特許文献３参照）。
一般的に、細胞壁に結合しているために生産量は低いが、ロドコッカス エリスロポリス（Rodococcus erythropolis）を窒素制限下で培養を行うとサクシノイルトレハロースリピッドを３２ｇ／Ｌ生産することが報告されている（非特許文献４参照）。
【０００８】
ソホロースリピド（Sophorose lipids；「ソホロリピッド」とも言われる；以下、ＳＬと省略する。）は、Ｐ．Ａ．Ｇｏｒｉｎらによってスターメレラ（キャンディダ）・ボンビコーラ（Starmerella（Candida）bombicola）の培養液から発見されている（非特許文献５参照）。
その後、その他の酵母菌、例えば、キャンディダ・ボゴリエンシス（Candida bogoriensis）、キャンディダ・マグノリエ（Candida magnoliae）、キャンディダ・グロペンギッセリ（Candida gropengisseri）、キャンディダ・アピコーラ（Candida apicola）によっても、その培養液中に比較的多量に生産されることが報告されている（非特許文献６参照）。
さらに、現在では、３００ｇ／Ｌ以上の生産を可能にしている（非特許文献７参照）。
【０００９】
セロビオースリピド（Cellobiose lipid；以下、ＣＬと省略する。）は、ウスチラジン酸（ustilagic acid）、フロキュロシン（flocculosin）とも呼ばれる抗微生物活性の高い糖脂質である。
また、ＣＬはウスチラゴ  マイディス（Ustilago maydis）により１５ｇ／Ｌ（非特許文献８参照）以上生産されるほか、クリプトコッカス・フミコーラ（Cryptococcus humicola）（非特許文献９参照）、シュードザイマ・フロキュローサ（Pseudozyma flocculosa）（非特許文献１０参照）、シュードザイマ・フジフォルメータ（Pseudozyma fusiformata）（非特許文献１１参照）などからも生産されることが報告されている。
【００１０】
マンノシルエリスリトールリピド（ＭＥＬ）は、高い界面活性作用を有し、界面活性剤又はファインケミカルの種々の触媒として用いられる。ヒト急性前骨髄性白血病細胞性ＨＬ６０株にマンノシルエリスリトールリピッドを作用させると顆粒系を分化させる白血病細胞分化誘導作用があり、また、ラット副腎髄質褐色細胞腫由来のＰＣ１２細胞にマンノシルエリスリトールリピドを作用させると神経突起の伸長が生ずる神経系細胞株分化誘導作用等の生理活性作用を有する。更に、微生物産生の糖脂質として初めて、メラノーマ細胞のアポトーシスを誘導することが可能となり、癌細胞増殖抑制作用がある。これらの生理作用から見て、マンノシルエリスリトールリピドには抗ガン剤等の医薬としての用途が期待される。また、マンノシルエリスリトールリピド（ＭＥＬ）には生分解性があり、高い安全性を有すると考えられる（非特許文献１２等参照）。
【００１１】
ＭＥＬは、マンノースあるいはヒドロキシル基が一部アセチル化したマンノースと、エリスリトールを糖骨格（親水基）として、１〜３本の脂肪酸を親水基として有する糖脂質である。ＭＥＬの一般式１を化１に示す。
【化１】
0005622190.tif 000002
上記一般式１中、Ｒ１〜Ｒ４は、互いに同一であっても異なっていてもよく、水素原子、アセチル基、又は炭素原子数３以上の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を表す。
この式において、Ｒ３およびＲ４がアセチル基である構造物はＭＥＬ-Ａ、Ｒ４がアセチル基でありＲ３が水素である構造物はＭＥＬ-Ｂ、Ｒ３がアセチル基でありＲ４が水素である構造物はＭＥＬ-Ｃ、Ｒ３およびＲ４が水素である構造物はＭＥＬ-Ｄと定義されている。
【００１２】
現在ＭＥＬは、洗剤、化粧品等幅広い分野で工業利用が進められており、ＭＥＬの遺伝子導入剤としての利用（特許文献１参照）およびリポソーム形成剤としての利用（特許文献２参照）、ＭＥＬのスキンケアおよびヘアケア剤としての利用（特許文献３参照）、乳化剤・可溶化剤（特許文献４参照）、タンパク質分離用担体（特許文献５参照）などの報告がある。
【００１３】
マンノシルエリスリトールリピド（ＭＥＬ）については、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．ＳＹ１６株を用いて２１１ｇ／Ｌの大豆油から２００時間で９５ｇ／Ｌ（生産速度：０．４７５ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：４５％）のＭＥＬの生産が可能であることが報告されている（非特許文献１３参照）。また、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ Ｔ−３４株を用いて大豆油から６日間で４７ｇ／Ｌ（生産速度：０．３２ｇ／Ｌ／ｈ）のＭＥＬの生産が可能であることが報告されている（非特許文献１４参照）。Pseudozyma aphidis株を用いて８０質量％の植物油脂から流加培養法により２４時間で１３．９ｇ／Ｌ（生産速度：０．５７ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：９２質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが報告されている（非特許文献１５参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開２００５−２８１１４６号公報
【特許文献２】特開２００６−１７４７２７号公報
【特許文献３】ＷＯ２００７／０６０９５６
【特許文献４】特開２００７−１８１７８９号公報
【特許文献５】特開２００６−３１０９５９号公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】「ジャーナル  オブ  ザ  アメリカン  ケミカル  ソサイティ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）」，７１巻，ｐ４１２４−４１２６（１９４９）．
【非特許文献２】「アプライド  マイクロバイオロジー  アンド  バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，５１巻，ｐ２２−３２（１９９９）．
【非特許文献３】「バイオサーファクタント  アンド  バイオテクノロジー（Ｂｉｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」，（米国），マーシャル  デッカー  インコーポレーション  ニューヨーク（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９８７）．
【非特許文献４】「ジャーナル  オブ  バイオテクノロジー（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，（英国），１３巻，ｐ２５７−２６６（１９９０）．
【非特許文献５】「カナデアン  ジャーナル  オブ  ケミストリー（Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．）」，３９巻，ｐ８４６−８５５（１９６１）．
【非特許文献６】「ジャーナル  オブ  バイオテクノロジー（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，３３巻，ｐ１４７−１５５（１９９０）．
【非特許文献７】「バイテクノロジー  レターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．）」，２０巻，ｐ８０５−８０７（１９９８）．
【非特許文献８】「アプライド  マイクロバイオロジー  アンド  バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，（ドイツ），スプリンガー−バーラグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ），５１巻，ｐ３３−３９（１９９９）．
【非特許文献９】「バイオキミカ  エト  バイオフィジカ  アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ）」，（オランダ），エルゼビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ），１５５８巻，ｐ１６１−１７０（２００２）．
【非特許文献１０】「アンチマイクロバイアル・エージェンツ・アンド・ケモセラピー（Antimicrobial Agents and Chemiotherapy）４９巻、ｐ１５９７−１５９９（２００５）
【非特許文献１１】「フェムス  イースト  リサーチ（ＦＥＭＳ ＹＥＡＳＴ Ｒｅｓ．）」，（オランダ），エルゼビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ），５巻，ｐ９１９−９２３（２００５）．
【非特許文献１２】「ジャーナル  オブ  バイオサイエンス  アンド  バイオテクノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）９４巻、ｐ１８７−２０１（２００２）．
【非特許文献１３】「アプライド  マイクロバイオロジー  アンド  バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，７０巻，ｐ３９１−３９６（２００６）．
【非特許文献１４】「バイテクノロジー  レターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．）」，１４巻，ｐ３０５−３１０（１９９２）．
【非特許文献１５】「アプライド  マイクロバイオロジー  アンド  バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，６８巻，ｐ６０７−６１３（２００５）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
バイオサーファクタントには汎用の界面活性剤と比較して環境適合性、生体適合性に優れ、様々な生理活性が認められているが、既存の界面活性剤と同様の幅広い用途に利用されているとはいえず。例えば食品用途等に使用するには制約があった。これは、多くの場合生産微生物に病原性は知られていないものの、自然界からの単離源が明確でないため、安全性に対する知見に乏しいことによる。特に微生物生産物を食品用途等に展開するためには、使用微生物の単離源が重要視される。例えば、酒類やパンの製造に利用される出芽酵母、乳酸菌や枯草菌（納豆菌）等は、食品分野で活躍する微生物として一般的に良く知られている。これらの微生物は全て食品中から容易に単離可能な微生物である。
【００１７】
さらに、バイオサーファクタントの生産効率を高め、生産コストの低減を図ることや、新しい機能性を備えた同族体の生産技術を開発して、幅広い用途へ展開するために、新たなバイオサーファクタント生産菌の探索・取得が強く望まれているのが現状である。
【００１８】
そこで、食用されている植物から新たに、バイオサーファクタント生産菌を単離し、当該微生物を用いたバイオサーファクタンント製造技術を開発することができれば、得られるバイオサーファクタントは安全性の面で大きな利点を獲得することとなり、生産微生物も含めた生産物全体の適用用途が大きく拡充されるものと期待される。
【００１９】
以上事情を鑑みて、本発明では、化粧品、食品、食品添加物、医薬、農畜水産業関連品（飼料、飼料添加物、肥料、農薬、魚餌）、洗剤など、生体に対する安全性がより求められる用途に対して、従来よりも適応性に優れたバイオサーファクタントを提供するべく、安全な環境から単離した微生物、ならびにそれを用いるバイオサーファクタントの発酵製造方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者は、上記課題を解決するため上記バイオサーファクタント生産菌を探索した結果、日常的に食用されている砂糖の原料となる「サトウキビ」から、新種の酵母であるシュードザイマ  チュラシマエンシス（Pseudozyma churashimaensis）(Ustilago esculenta)を単離することに成功した。そして、当該酵母がバイオサーファクタントの１種であるマンノシルエリスリトールリピド（ＭＥＬ）を生産すること、及び既存のＭＥＬだけでなく、既存の生産菌ではほとんど生産できないトリアセチルモノアシル型マンノシルエリスリトールリピドを生産できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２１】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕トリアセチルモノアシル型マンノシルエリスリトールリピドを生産する能力を有する、シュードザイマ チュラシマエンシス（Pseudozyma churashimaensis）に属する微生物であって、下記（ａ）及び（ｂ）で示される菌学的性質を有する微生物。
（ａ）形態学的性質
【表１】
0005622190.tif 000003
（ｂ）生理学的性質
【表２】
0005622190.tif 000004
〔２〕トリアセチルモノアシル型マンノシルエリスリトールリピドを生産する能力を有する、シュードザイマ チュラシマエンシス（Pseudozyma churashimaensis）に属する微生物であって、シュードザイマ チュラシマエンシス ＯＫ−９６（受託番号 FERM P-２１８９６）である微生物。
〔３〕シュードザイマ チュラシマエンシス ＯＫ−９６（受託番号 FERM P-２１８９６）である上記〔１〕に記載の微生物。
〔４〕上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の微生物を培養し、得られた培養物あるいは分離菌体からマンノシルエリスリトールリピド−Ａを採取することを特徴とする、マンノシルエリスリトールリピドの製造方法。
〔５〕上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の微生物を、炭素源として糖類を含有する培地に培養し、得られた培養物からトリアセチルモノアシル型マンノシルエリスリトールリピドを採取することを特徴とする、トリアセチルモノアシル型マンノシルエリスリトールリピドの製造方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、古くから広く食される植物であるサトウキビに常在する微生物、より具体的にはシュードザイマ  チュラシマエンシス(Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ｃｈｕｒａｓｈｉｍａｅｎｓｉｓ)を提供することができる。
当該微生物を生産微生物として用いることにより、得られたバイオサーファクタントの安全性を確保するとともに、これまで利用に制限があった食品用途や家畜飼料、魚餌、農業用途に直接使用できる界面活性剤としての利用が見込まれ、バイオサーファクタントの普及の拡大に著しく貢献できるものと期待される。
【００２３】
さらに本発明に係る製造方法によれば、副生物を生じることなく選択的にＭＥＬ−Ａを生産することができる。すなわち、従来の方法では、精製過程を必要とするＭＥＬ−ＢとＭＥＬ−Ｃを含まないＭＥＬ−Ａを、微生物の培養のみで得ることが可能となる。特に、油脂等の疎水性基質を用いず、糖質(グルコースやショ糖)のみを炭素源として含有する培地を用いても、ＭＥＬを生産できるため、ＭＥＬの単離も簡便となる。さらに、本発明の上記微生物は、トリアセチル型ＭＥＬを生産する能力を有する。このトリアセチルモノアシル型ＭＥＬは、ＭＥＬ−Ａに上記定義上属し、その界面活性作用自体は、従来のＭＥＬ−Ａ（ジアセチルジアシル型）と大差がないが、特に、トリアセチルモノアシル型ＭＥＬは脂肪酸が一本であるため、脂肪酸を二本もつ従来のＭＥＬ−Ａと比べて水分子に対する親和性が向上している。また、分子構造の違いに起因する分子間相互作用の点で差違があり、従来のＭＥＬ−Ａとは異なるナノ材料としての応用が期待されるものである。
【００２４】
以上のように、本発明によれば、ＭＥＬ−Ａのみを生産可能になり、例えば界面活性剤として使用する場合には精製ステップの簡略化が可能であることから、ＭＥＬ生産コストの低減が可能となる。また、特に上記したトリアセチルモノアシル型ＭＥＬは、水分子に対する親和性が向上している点、また従来のＭＥＬ−Ａとは異なるナノ材料としての利用が期待できる点で特筆すべきものである。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】実施例１において、培地に添加する炭素源の種類のＭＥＬ生産に対する影響を調べたＴＬＣの結果を示すグラフである。
【図２】実施例１において、培地に添加する炭素源の種類のＭＥＬ生産に対する影響を調べたＨＰＬＣ定量の結果を示すグラフである。
【図３】実施例２において、培養液から抽出直後の糖脂質成分と精製後の糖脂質成分をＴＬＣ分析によって解析した図である。
【図４】実施例２において、各糖脂質成分（ＧＬ−Ａ，ＧＬ−Ｂ，ＧＬ−Ｃ）の１Ｈ−ＮＭＲ解析の結果を示す図である。
【図５】実施例２において、各糖脂質成分（ＧＬ−Ａ，ＧＬ−Ｂ，ＧＬ−Ｃ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ解析の結果を示す図である。
【図６】実施例３において、各濃度の各成分（ＧＬ−Ａ，ＧＬ−Ｂ，ＧＬ−Ｃ）の表面張力値を方対数グラフにスポットした図である。
【図７】実施例４において、各成分（ＧＬ−Ａ，ＧＬ−Ｂ，ＧＬ−Ｃ）の自己集合体形成能調べた顕微鏡観察の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明につきさらに詳しく説明する。
〈本発明の微生物〉
本発明に係る微生物は、ＭＥＬを生産する能力を有するＰｓｅｕｄｏｚｙｍａ属に属する新種の酵母である。該酵母はマンノシルエリスリトールリピドを生産し、該マンノシルエリスリトールリピドは生理活性が高く実用特性も優れていることから望ましい。また、該酵母は特にトリアセチルモノアシル型ＭＥＬを産生する点で特徴的な性質を有する。該当する微生物としては、シュードザイマ(Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ)属に属するＯＫ−９６株を挙げることができる。本菌株は、本発明者等が日本国内で採取した植物（サトウキビ）から分離した菌株であり、本菌株は、YM寒天培地、PDB寒天培地および5%麦芽エキス培地上にて25℃4日間培養で、全縁、円錐状、平滑、輝光、湿性でクリーム色から淡桃色のコロニーを形成する。YM液体培地およびPD液体培地、25℃下において、培養３日目に、細胞は楕円形から円筒形であり、極出芽によって増殖する。また、隔壁のある菌糸ならびに偽菌糸の形成が認められる。また、培養一カ月を経過した時点でも、明らかな有性生殖器の形成は認められない。これらの形態学的性質はPseudozyma属の一般的な形態学的特徴と一致し、加えて、Ｏｋ−９６株は糖発酵性を示さず、窒素源として硝酸塩を資化する点でもPseudozyma属の特徴と一致するので、本菌株はPseudozyma属に帰属する菌株といえる。
【００２７】
また、この分離されたＯＫ−９６株について、リボゾームRNA遺伝子の26SrDNA−D1/D2領域の塩基配列（rDNA配列）を決定し（配列番号１）、DNAデータベース（DDBJ）にアクセスし、FASTAプログラム（http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/fasta-j.html）を用いて相同性検索を行ったところ、シュードザイマ  アフィディス（Pseudozyma aphidis）CBS517.83TのrDNA配列と最も高い相同性（９９．５％）を示した。しかし、ＯＫ−９６株のITS1-５，８SrDNA−ITS2領域の塩基配列（配列番号２）については、データベース上において９９％以上の相同性を示したものはなく、Ustilago trichophora１３３４株の８SrDNA−ITS2と９４．１％の相同性を示したのが最高であった。各種ジュードザイマ属酵母に対しては、９２．６％の相同性（Pseudozyma hubeiensis  CBS1007７）が最高で、上記シュードザイマ  アフィディス（Pseudozyma aphidis）CBS517.83T配列とは９０．１％の相同性しか示さなかった。また、ＯＫ−９６株とシュードザイマ  アフィディス（Pseudozyma aphidis）CBS517.83Tとは、その生理性状試験尾の結果、本菌株がエリスリトールを資化せず、エタノールを資化し、ビタミン欠乏培地で生育を示した点で明らかに異なる。これらの点から、本菌株は担子菌門の一種であるシュードザイマ属の新たな種であることが分かり、シュードザイマ  チュラシマエンシス(Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ｃｈｕｒａｓｈｉｍａｅｎｓｉｓ)ＯＫ−９６株と命名した。
【００２８】
本菌株の形態学的観察結果及び生理性状試験の結果は、以下の表１、表２にまとめて示す。
本菌株は、平成２２年１月２６日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（IPOD）（茨城県つくば市東１−１−３）に受託番号FERM P-21896として寄託されている。
【００２９】
（ａ）形態学的性質
【表１】
0005622190.tif 000005
【００３０】
（ｂ）生理学的性質
【表２】
0005622190.tif 000006
【００３１】
（産生バイオサーファクタント）
本発明の微生物が産生するバイオサーファクタントは、マンノシルエリスリトール（ＭＥＬ）であり、具体的には、4-O-β-D-mannopyranosyl-erythritolを糖骨格とするＭＥＬ−Ａであり、ＭＥＬ−Ａとしては、以下の一般式において、Ｒ３およびＲ４がアセチル基であって、Ｒ１及びＲ２が炭素数４以上の飽和または不飽和の脂肪族アシル基である化合物と、Ｒ１、Ｒ３およびＲ４がともにアセチル基であって、Ｒ２が炭素数３以上の脂肪族アシル基である化合物が挙げられる。
【化２】
0005622190.tif 000007
本明細書において、ジアセチルジアシル型マンノシルエリスリトールリピド（ＭＥＬ）とは前者の化合物を意味し、トリアセチルモノアシル型マンノシルエリスリトールリピド（ＭＥＬ）とは後者の化合物を意味する。
【００３２】
本発明の微生物を炭素源として糖類を使用して培養した場合には、培養液中にジアセチルジアシル型マンノシルエリスリトールリピド（ＭＥＬ）及びトリアセチルモノアシル型マンノシルエリスリトールリピド（ＭＥＬ）との混合物として蓄積される。両者は界面活性剤の性質には大差はないので、混合物のまま界面活性剤として使用してもよく、また、トリアセチルモノアシル型マンノシルエリスリトールリピド（ＭＥＬ）の水分子に対する親和性および／または分子間相互作用に着目すれば、さらに、ジアセチルジアシル型マンノシルエリスリトールリピド（ＭＥＬ）及びトリアセチルモノアシル型マンノシルエリスリトールリピド（ＭＥＬ）とを分離しても良い。
一方、本発明の微生物を炭素源として油脂類、脂肪酸あるいは脂肪酸エステルを炭素源として培養する場合には、ジアセチルジアシル型マンノシルエリスリトールリピド（ＭＥＬ）のみが得られる。上記培地の炭素源によって、蓄積されるジアセチルジアシル型マンノシルエリスリトールリピド（ＭＥＬ）は、そのマンノシル２位の脂肪族アシル基（上記一般式中、R1）の炭素数が若干異なる。
【００３３】
〈培地・培養条件〉
本発明の微生物の培養形態は液体培地を用いた回分培養あるいは培養系に炭素源および/または有機窒素源を連続添加する流加培養であり、通気攪拌することが望ましい。培地の初期ｐHは酸性から中性の範囲であれば特に問題は無いが、３．０−９．０に調整することが好ましく、６．０−８．０に調整することがより望ましい。培養に適した温度範囲は２０−３０℃、より好ましくは２２−２７℃である。
【００３４】
本発明において、培地は一般的な半合成培地を用いればよいが、ジアセチルジアシル型マンノシルエリスリトールリピド（ＭＥＬ）及びトリアセチルモノアシル型マンノシルエリスリトールリピド（ＭＥＬ）の混合物を培養液中に蓄積される場合には、炭素源として糖類を用いる。
一方、ジアセチルジアシル型マンノシルエリスリトールリピド（ＭＥＬ）のみを培養液中に蓄積させるには、炭素源として油脂類を用いる。
窒素源としては、有機窒素源と無機窒素源を組み合わせて用いることが望ましい。
糖類としては、本願発明の微生物が資化できるものあれば特に限定されるものではないが、例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトースなどの単糖類、ショ糖、マルトースなどの二糖類が用いられるが、好ましくはグルコースである。培養初発濃度は１０−２００ｇ／Ｌ、好ましくは５０−１５０ｇ／Ｌで用いられる。
【００３５】
用いる油脂類としては、特に限定されるものではないが、例えば、植物油、脂肪酸またはそのエステル類を用いても良い。
使用する植物油としては、例えばダイズ油、ナタネ油、コーン油、綿実油、ヒマワリ油、カポック油、ゴマ油、コメ油、落花生油、ベニバナ油、オリーブ油、アマニ油、キリ油、ヒマシ油、パーム油、パーム核油、ヤシ油もしくはこれらの混合物等が挙げられる。
使用する脂肪酸および脂肪酸エステルには、炭素鎖が１０−２４のもの、好ましくは炭素鎖が１６−１８の脂肪酸または脂肪酸エステルを用いることができる。これらの脂肪酸または脂肪酸エステルは分子内に１−３個の不飽和結合を含んでいてもよい。例えば、デカン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、トリデカン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ノナデカン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸などの飽和脂肪酸またはそのエステル、あるいはトウハク酸、リンデル酸、ツズ酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、ペトロセリン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、エルカ酸、ソルビン酸、リノール酸、リノエライジン酸、γ―リノレン酸、リノレン酸、アラキドン酸などの不飽和脂肪酸またはそのエステルが挙げられる。
培地に添加する上記油脂類の濃度は、２０−１００ｇ／Ｌ、好ましくは５０−８０ｇ／Ｌの範囲である。流加培養の様式をとる場合には、培地中濃度が上記の範囲に収まるように培養期間中に連続的もしくは断続的に添加する。
【００３６】
使用する有機窒素源としては、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、ポリペプトン、コーンスティープリカー、カザミノ酸、尿素などの内、一種類もしくは二種類以上を組み合わせて用いることができる。好ましくは酵母エキスを１−８ｇ／Ｌの濃度範囲で用いるとよい。
無機窒素源としては、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、アンモニアなどの内、一種類もしくは二種類以上を組み合わせて用いることができる。好ましくは硝酸ナトリウムを用いるとよい。
【００３７】
（マンノシルエリスリトールリピド（ＭＥＬ）の分離）
培養液中に蓄積されたＭＥＬ−Ａは、本菌株培養後、培養液を抽出することにより培養液から分離できる取得できる。抽出は、酢酸エチル、クロロホルム、メタノール、エタノール、ヘキサン、プロパノール等の有機溶媒を用い当技術分野において通常行われる方法にしたがって行えばよい。
有機溶媒によって抽出されたＭＥＬ−Ａが、ジアセチルジアシル型マンノシルエリスリトールリピド（ＭＥＬ）及びトリアセチルモノアシル型マンノシルエリスリトールリピド（ＭＥＬ）の混合物である場合、ジアセチルジアシル型マンノシルエリスリトールリピド（ＭＥＬ）とトリアセチルモノアシル型マンノシルエリスリトールリピド（ＭＥＬ）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー等で分離すればよい。
【００３８】
〈ＭＥＬの構造決定〉
上記により得られる糖脂質成分の構造決定は、以下のようにして行うシュードザイマ  チュラシマエンシス(Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ｃｈｕｒａｓｈｉｍａｅｎｓｉｓ)ＯＫ−９６株を用いてグルコースあるいは大豆油を炭素源として培養して得られたＭＥＬの構造決定手法を例にして以下説明する）。
単離した糖脂質成分は、ＴＬＣプレート上で、アンスロン硫酸試薬で青緑色に呈色することにより糖脂質成分であると判断できる。この糖脂質について、1Ｈ、13Ｃ―ＮＭＲ解析を行い、得られたスペクトルと、構造既知であるＭＥＬのデータとを比較することで、構造解析を行う。
【００３９】
〈ＭＥＬの定量分析方法〉
全糖脂質量はアンスロン硫酸法を用いることで測定できる。ＭＥＬ同属体の含有量と存在比は薄相クロマトグラフィー（ＴＬＣ）法および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用することで測定できる。
【００４０】
以下に、本発明について実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
【実施例】
【００４１】
実施例１
（シュードザイマ  チュラシマエンシス(Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ｃｈｕｒａｓｈｉｍａｅｎｓｉｓ)を用いた、ＭＥＬの生産；使用する炭素源の影響)
〈種培養〉
ディープフリーザー（-８０℃）で冷凍保存されたシュードザイマ  チュラシマエンシス(Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ｃｈｕｒａｓｈｉｍａｅｎｓｉｓ)ＯＫ−９６株を３０ｍＬのＹＭ培地（グルコース１０ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ）に０．５ ｍＬ播種し、２８℃で１日間、振蕩培養した。
〈本培養〉
３００ｍＬ容量の三角フラスコに３０ｍＬの含有する炭素源を変えたＭＥＬ生産用培地を表３および４（ＭＥＬ生産培地組成）のごとく調製し、１２１℃、２０分間オートクレーブで滅菌した培地を用意した。上述の種培養液を１．５ｍＬを播種し、２５℃で５日間、振蕩培養を行った。培養終了後の培養液からＭＥＬ標品を酢酸エチルにて抽出した。抽出液中のＭＥＬ濃度はシリカゲルカラム（イナートシルＳｉｌ−１００Ａ）を接続したＨＰＬＣを用い、定量分析を行った。溶離液にはクロロホルム／メタノール混合溶媒を用い、流速１ｍＬ／ｍｉｎで混合比が１０：０から０：１０まで変化するように設定したグラジエントシステムにより溶出した。検出は蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ−ＬＴ、島津製作所製）を用いた。精製したＭＥＬを用いて検量線を作成し、ピークエリアからＭＥＬ濃度を算出した。
【００４２】
【表３】
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【００４３】
【表４】
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【００４４】
〈薄相クロマトグラフィー分析〉
図１に示すように、グルコース添加した培地で、糖脂質の生産を示す２つのスポットが得られた。すなわち、移動度が０．６６のＧＬ−Ａ、移動度が０．６２のＧＬ−Ｂが得られた。一方、大豆油を添加した培地では、１つのスポットが得られた。すなわち、移動度が０．６６のＧＬ−Ｃが得られた。炭素源として添加する糖の種類を変えても、植物油の種類を変えても、ＴＬＣの結果は同様になった。また、図１の結果から、スタンダードに用いた従来型のＭＥＬ−Ａの移動度が０．６６であるのに対して、ＧＬ−Ｂの移動度は０．６２であり、ＧＬ−Ｂの移動度が、明らかに移動度が小さい（極性が高い）ことが分かる。すなわち、ＧＬ−Ｂの水分子に対する親和性は従来型のＭＥＬ−Ａより大きいことが分かる。ＭＥＬの生産量を測定した結果は図２に示した。
【００４５】
実施例２
シュードザイマ  チュラシマエンシス(Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ｃｈｕｒａｓｈｉｍａｅｎｓｉｓ)ＯＫ−９６株が生産する糖脂質の構造解析
（糖脂質（ＭＥＬ）の精製）
実施例１と同様に培養した培養液から、酢酸エチルを用いて糖脂質を抽出・回収し、シリカゲルカラムを用いて、各成分（ＧＬ−Ａ，ＧＬ−Ｂ，ＧＬ−Ｃ）を精製した。精製された各糖脂質成分をＴＬＣ分析により分析した結果を図３に示す。
（糖脂質成分のＮＭＲ解析）
上記で得られた各成分（ＧＬ−Ａ，ＧＬ−Ｂ，ＧＬ−Ｃ）について、重水素化メタノール（CD3OD）を溶媒とする1H-ＮＭＲ解析により構造の同定を行った。その結果、シュードザイマ  チュラシマエンシス(Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ｃｈｕｒａｓｈｉｍａｅｎｓｉｓ)ＯＫ−９６株が生産する糖脂質は全て、マンノースの４位と６位の位置にアセチル基を有するＭＥＬ−Ａであることがわかった（図４中のピークｄおよびｅ）。すなわち、ＧＬ−Ａ，ＧＬ−Ｂ，ＧＬ−Ｃは既知のＭＥＬとほぼ同じ化学シフトを示した。さらに、ＧＬ−ＡとＧＬ−Ｂには、マンノースの２位の位置にアセチル基が存在することを示すピークが得られたことから、マンノースの２位の位置の脂肪酸が極端に短くなり、アセチル基となった構造物が主成分の一つとして含まれていることが分かった（図４中のピークｃ）。また、ＧＬ−Ｂにおいて、マンノースの２位の位置の脂肪酸鎖（アシル基）を示すピークが見られなかったことから、ＧＬ−Ｂに含まれるＭＥＬ−Ａのほとんどは、マンノースの２位の位置がアセチル基となった構造物であるといえる（図４中のピークａ）。それぞれの糖脂質に関して、1H-ＮＭＲ解析において帰属された化学シフトをまとめて表５に示す。
【００４６】
【表５】
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【００４７】
（糖脂質成分のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ解析）
上記で得られた各成分（ＧＬ−Ａ，ＧＬ−Ｂ，ＧＬ−Ｃ）の分子量を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによって解析した結果、ＧＬ−Ａの主成分の分子量は７０４．８、６７６．８、６４８．８、ＧＬ−Ｂの主成分の分子量は６４８．１、ＧＬ−Ｃの主成分の分子量は７０４．１、６７６．１であった。図５に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳで得られた分子量のピークを示す。これらの結果から、ＧＬ−Ａは、4-O-[(6',4'-di-O-acetyl-,3'-O-alka(e)noyl-2'-O-caproyl)- β-D-mannopyranosyl]-D-erythritol（一般式３）、4-O-[(6',4'-di-O-acetyl-,3'-O-alka(e)noyl-2'- O-butanoyl)-β-D-mannopyranosyl]-D-erythritol（一般式４）、4-O-[(6',4',2'-tri-O-acetyl-,3'-di-O-alka(e)noyl)-β-D-mannopyranosyl]-D-erythritol（一般式５）を主成分とするＭＥＬ−Ａ混合物の画分、ＧＬ−Ｂは、4-O-[(6',4',2'-tri-O-acetyl-,3'-di-O-alka(e)noyl)-β-D-mannopyranosyl]-D-erythritol（一般式５）が主成分のＭＥＬ-Ａ画分、ＧＬ−Ｃは4-O-[(6',4'-di-O-acetyl-,3'-O-alka(e)noyl-2'-O-caproyl)-β-D-mannopyranosyl]-D-erythritol（一般式３）、4-O-[(6',4'-di-O-acetyl-,3'-O-alka(e)noyl-2'- O-butanoyl)-β-D-mannopyranosyl]-D-erythritol（一般式４）を主成分とするＭＥＬ−Ａの混合物で  あることが分かった。化３に一般式３を示す。化４に一般式４を示す。化５に一般式５を示す。
【００４８】
【化３】
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【化４】
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【化５】
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【００４９】
実施例３
（ＭＥＬの界面活性測定）
〈表面張力測定〉
実施例２において、精製した各成分（ＧＬ−Ａ，ＧＬ−Ｂ，ＧＬ−Ｃ）の表面張力低下能を調べた。種々の濃度の各成分の水溶液を作成し、その表面張力をウイルヘルミー方式の表面張力計（ＣＢＶＰ−Ａ３，協和界面科学製）を用いて測定した。
【００５０】
各成分（ＧＬ−Ａ，ＧＬ−Ｂ，ＧＬ−Ｃ）について、上記の方法を用いて表面張力低下能を測定した。各濃度の各成分に対する表面張力は図６に示す値を示した。図６の曲線からＧＬ−Ａの臨界ミセル濃度（ｃｍｃ）は４．８６×  １０−６  Ｍであり、その時の表面張力値（γｃｍｃ値）は２９．２ｍＮ／ｍであった。ＧＬ−Ｂの臨界ミセル濃度（ｃｍｃ）は１．３６×  １０−６  Ｍであり、その時の表面張力値（γｃｍｃ値）は２９．３ｍＮ／ｍであった。ＧＬ−Ｃの臨界ミセル濃度（ｃｍｃ）は２．０８×  １０−６  Ｍであり、その時の表面張力値（γｃｍｃ値）は２８．７ｍＮ／ｍであった。既存の合成界面活性剤とくらべて、十分小さいｃｍｃ値ならびにγｃｍｃ値を示したことから、本発明で生産されるＭＥＬは界面活性剤として十分な機能を発揮できることが推察できる。
【００５１】
実施例４
（ＭＥＬの自己集合体形成能）
実施例２において、精製した各成分（ＧＬ−Ａ，ＧＬ−Ｂ，ＧＬ−Ｃ）の自己集合体形成能を調べた。各成分をガラスプレート上に塗りつけ、カバーガラスをかぶせた後、ガラスプレートとカバーガラスの間から水を侵入させ、各成分と水との境界を光学顕微鏡および偏光顕微鏡で観察した。その結果を、図７に示した。比較対象として、従来型ＭＥＬ−Ａの結果も示した。図７によると、従来型ＭＥＬ-Ａの液晶形成パターンと、ＧＬ−Ａ，ＧＬ−Ｂ，ＧＬ−Ｃの液晶形成パターンは、全く異なっており、本発明で生産されるＭＥＬ−Ａは、従来型ＭＥＬ−Ａと自己集合体形成能が異なることが分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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