(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−末端からＣ−末端の順番で、（ａ）所望によりシグナルペプチド；（ｂ）配列番号：１９のアミノ酸３４から９８２を含むポリペプチド；（ｃ）所望によりリンカー；および（ｄ）配列番号：１９のアミノ酸１００２から１２２８を含むポリペプチドを含む、融合ポリペプチド。
【請求項２】
リンカーがポリペプチドリンカーである、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
ポリペプチドリンカーが配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７および配列番号：１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
シグナルペプチドがＩｇＧまたはアルファクロトーに由来する、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
シグナルペプチドが配列番号：８または配列番号：９の配列を有する、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
融合ポリペプチドが（ａ）シグナルペプチドを含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
融合ポリペプチドが（ｃ）リンカーを含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
融合ポリペプチドが（ａ）シグナルペプチドおよび（ｃ）リンカーを含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
Ｎ−末端からＣ−末端の順番で、配列番号：１９のアミノ酸１から９８２；所望によりリンカー；および配列番号：１９のアミノ酸１００２から１２２８を含む配列を有する、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】
Ｎ−末端からＣ−末端の順番で、所望によりシグナルペプチド；および配列番号：１９のアミノ酸３４から１２２８を含む配列を有する、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号：１９の配列を含む配列を有する融合ポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号：１９の配列を有する融合ポリペプチド。
【請求項１３】
Ｎ−末端からＣ−末端の順番で、配列番号：２０のアミノ酸１から９７４および配列番号：２０のアミノ酸９９４から１２２０を含む配列を有する、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号：１９のアミノ酸３４から１２２８を含む配列を有する、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号：２０の配列を含む配列を有する融合ポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号：２０の配列を有する融合ポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１に記載の融合ポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１に記載の融合ポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
【請求項１９】
請求項１８に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１８に記載の核酸を含むベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．背景
アルファ−クロトー(Klotho)遺伝子は、細胞外ドメインおよび短い細胞質ドメインを有する１３０ｋＤａの１回膜貫通型タンパク質をコードする。アルファ−クロトータンパク質の細胞外ドメインは、ＫＬ−Ｄ１およびＫＬ−Ｄ２と称される２つのサブドメインを含む。これらの２つのサブドメインは、細菌および植物のβ−グルコシダーゼと配列相同性を共有している。アルファ−クロトータンパク質の細胞外ドメインは、膜貫通ドメインにより細胞表面に結合しているか、または開裂し、細胞外環境へ放出され得る。細胞外ドメインの開裂は、その場の低い細胞外Ｃａ２＋濃度によって、促進されるようである。
【背景技術】
【０００２】
アルファ−クロトーに加えて、アルファ−クロトーのホモログであるベータ−クロトーが同定されている（Ito et al., Mech. Dev. 98:115-9 (2000)）。ベータ−クロトーも、細胞外ＫＬ−Ｄ１およびＫＬ−Ｄ２サブドメインを有する１回膜貫通型タンパク質である。
【０００３】
アルファ−クロトー発現の調節によって、哺乳動物における老化関連特徴が示されることが証明されている。アルファ−クロトー遺伝子において機能喪失突然変異型のマウスホモ接合型は、寿命の短縮、皮膚萎縮、筋肉疲労、動脈硬化症、肺気腫および骨粗鬆症を含むヒトの老化に類似した特徴を発生させる（Kuro-o et al., Nature, 390:45-51 (1997)）。対照的に、マウスにおけるアルファ−クロトー遺伝子の過剰発現は、寿命を延長させ、野生型マウスと比較して酸化ストレスに対する抵抗性を増加させる（Kurosu et al., Science 309:1829-1833 (2005); Yamamoto et al., J. Biol. Chem. 280:38029-38034 (2005)）。
【０００４】
繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、多数の生物において発現される相同ポリペプチド増殖因子のファミリーを構成する（Ornitz and Itoh, Genome Biol. 2: reviews, 3005.1-3005.12 (2001)）。脊椎動物種において、ＦＧＦは遺伝子構造およびアミノ酸配列において高度に保存されている（互いに１３−７１％のアミノ酸同一性を有する）。ヒトにおいて、２２の既知のＦＧＦファミリーメンバーがある（ＦＧＦ１５はヒトＦＧＦ１９のマウスオルソログであり、したがってヒトＦＧＦ１５はない）。初期発生中、ＦＧＦは細胞増殖、移動および分化を調節するが、成体において、ＦＧＦはホメオスタシス、組織修復機能および損傷応答を維持する。
【０００５】
ＦＧＦは、細胞表面ＦＧＦ受容体に結合し、それにより活性化されることにより増殖因子として機能する。ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）は、ＦＧＦＲの自己リン酸化、ＦＲＳ２（ＦＧＦ受容体基質２）およびＥＲＫ１／２（細胞外シグナル−調節タンパク質キナーゼ１／２）のリン酸化を介してシグナル伝達を活性化する、およびＥｇｒ−１（初期増殖応答−１）を活性化する、チロシンキナーゼ受容体である。ＦＧＦは、また、へパラン硫酸プロテオグリカンに対して高親和性を有する。ＦＧＦに結合するとき、へパラン硫酸はＦＧＦＲの活性化を高める。
【０００６】
最近の研究によって、ＦＧＦ２３およびアルファ−クロトー間の機能的なクロストークを示す、ＦＧＦ２３−欠損マウスおよびアルファ−クロトー−欠損マウス間で著しく類似の生物学的特徴が証明された（Shimada et al., J. Clin. Invest. 113:561-568 (2004); Yoshida et al. Endocrinology 143:683-689 (2002)）。これらの研究では、ＦＧＦ２３と同種のＦＧＦ受容体を介する結合およびシグナル伝達の両方に関して、ＦＧＦ２３の必須のパートナーとしてアルファ−クロトーの同定に至った（Urakawa et al., Nature 22:1524-6 (2007)）。アルファ−クロトー遺伝子は、主に腎臓、副甲状腺および脈絡叢において発現する。アルファ−クロトーの組織特異的発現は、これらの組織におけるＦＧＦ２３シグナル伝達の活性化を限定するという仮説が立てられている。
【０００７】
ＦＧＦ２３／アルファ−クロトーと同様に、ベータ−クロトーは、ＦＧＦ１９およびＦＧＦ２１それぞれの同種のＦＧＦ受容体を介する結合およびシグナル伝達の両方に関して、ＦＧＦ１９およびＦＧＦ２１の必須のパートナーである（Ogawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:7432-7 (2007); Lin et al., J. Biol Chem. 282:27227-84 (2007);およびWu et al., J. Biol. Chem. 282:29069-72 (2007)）。このような研究は、また、組織特異的な代謝活性の調節におけるベータ−クロトーの関与を証明した。ベータ−クロトーは、脂肪組織における炭水化物および脂質代謝を調節するための補因子として、ＦＧＦ２１と共に作用することが最初に示された。ＦＧＦ１９とともにベータ−クロトーは、肝臓における胆汁酸代謝を調節する。したがって、ベータ−クロトー欠損マウスにおける胆汁合成の増加を説明する（Ito et al., J Clin Invest. 2005 Aug;115(8):2202-8）。
【０００８】
米国特許第６，５７９，８５０号は、アルファ−クロトーポリペプチドを含むポリペプチドおよび組成物を記載している。ヒトおよびマウスアルファ−クロトーポリペプチドを記載している。該特許は、該ポリペプチドを含む組成物が早期老化に類似した症候群の処置、成人疾患の処置および老化の抑制において有用であることも記載している。
【０００９】
米国特許第７，２２３，５６３号は、ＦＧＦ２３ポリペプチド配列をコードする単離された核酸またはこのような単離された核酸を含む組換え細胞を記載している。該特許はさらに、低リン酸血症性および高リン酸血症性障害、骨粗鬆症、皮膚筋炎および冠動脈疾患を診断および処置する方法に関する。
【００１０】
米国特許第７，２５９，２４８号は、ＦＧＦ２１ポリペプチド配列をコードする単離された核酸を記載している。該特許はさらに、肝臓疾患、胸腺機能関連状態を診断および処置する方法ならびに精巣の状態を処置する方法に関する。
【発明の概要】
【００１１】
２．発明の概要
本発明は、クロトー融合ポリペプチドまたは可溶性クロトーポリペプチドにて加齢関連状態または代謝障害を予防または処置するための方法、キットおよび組成物に関する。本発明のクロトー融合ポリペプチドはクロトータンパク質またはその活性なフラグメント（例えば、ｓクロトー）から形成される。いくつかの態様において、本発明はクロトータンパク質またはその活性なフラグメントおよび繊維芽細胞増殖因子またはその活性なフラグメントを含む、クロトー融合ポリペプチドを提供する。
【００１２】
第１の局面において、本発明はクロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインおよび繊維芽細胞増殖因子またはそれらの活性なフラグメントを有する、融合ポリペプチドを提供する。クロトー細胞外ドメインはアルファまたはベータクロトーアイソフォームのいずれかに由来であり得る。さらに、クロトー融合ポリペプチドのＦＧＦ成分は繊維芽細胞増殖因子−１９、繊維芽細胞増殖因子−２１および繊維芽細胞増殖因子−２３に関して主に記載されているが、２３の既知のＦＧＦのすべてが本発明の実施において使用することができると考えられる。本出願の読者は、アルファまたはベータ細胞外ドメインとそれぞれのヒトＦＧＦタンパク質またはそれらの活性なフラグメントのそれぞれのすべての組み合わせが、個々にまたは具体的に考えられると想定できる。
【００１３】
本発明において、クロトータンパク質の細胞外ドメインはクロトータンパク質のＫＬ−Ｄ１およびＫＬ−Ｄ２ドメインの１つまたは両方を含むことができる。いくつかの態様において、本発明のクロトー融合ポリペプチドはクロトータンパク質の少なくとも２つの細胞外サブドメインを有する。例えば、２つの細胞外サブドメインは、タンデムリピートにおける２つのＫＬ−Ｄ１ドメイン、タンデムリピートにおける２つのＫＬ−Ｄ２ドメインまたは１つのＫＬ−Ｄ１ドメインおよび１つのＫＬ−Ｄ２ドメインであり得る。１つの態様において、本発明の融合ポリペプチドは全長アルファクロトータンパク質のアミノ酸２８−２９２を含む。他の態様において、本発明の融合ポリペプチドは全長ベータクロトータンパク質のアミノ酸５２−９９７を含む。
【００１４】
本発明において、クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインおよびＦＧＦまたはそれらの活性なフラグメントを含むポリペプチドは、ペプチド結合によりインフレームで、互いに共有結合、例えば、化学的に結合または融合されていてもよい。それらは、また、リンカーを介して連結されていてもよい。ポリペプチドリンカーの非限定的な例は配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７および１８である。このようなリンカーは配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７および１８の少なくとも１から最大約３０までの繰り返しを含み得る。
【００１５】
本発明において、クロトータンパク質の細胞外サブドメインおよび繊維芽細胞増殖因子は、種々の方向および様式において互いに作動可能に連結することができる。例えば、クロトータンパク質の細胞外サブドメインは繊維芽細胞増殖因子のＮ−末端に作動可能に連結されていてよく、あるいは繊維芽細胞増殖因子はクロトータンパク質の細胞外サブドメインのＮ−末端に作動可能に連結されていてもよい。
【００１６】
１つの態様において、本発明はクロトータンパク質のｓクロトーおよびリンカーを含む融合ポリペプチドを提供する。他の態様において、本発明はアルファクロトータンパク質のｓクロトーおよびリンカーを含む融合ポリペプチドを提供する。他の態様において、本発明はベータクロトータンパク質のｓクロトーおよびリンカーを含む融合ポリペプチドを提供する。さらに他の態様において、本発明はヒトＦＧＦタンパク質またはそれらの活性なフラグメント（例えば、シグナルペプチドを有さない）およびリンカーを提供する。加齢関連状態または代謝障害を処置または予防するための本発明の融合タンパク質を含む医薬組成物およびその使用も本発明に包含される。
【００１７】
１つの態様において、本発明は、ＦＧＦ−２３に（直接的にまたはリンカーを介して間接的に）融合されたシグナルペプチドを有するアルファクロトータンパク質のｓクロトーを含む融合ポリペプチドを提供する。他の態様において、本発明は、ＦＧＦ−２３に（直接的にまたはリンカーを介して間接的に）融合されたシグナルペプチドを有さないアルファクロトータンパク質のｓクロトーを含む融合ポリペプチドを提供する。他の態様において、本発明は、シグナルペプチドを有さないＦＧＦ−２３に（直接的にまたはリンカーを介して間接的に）融合されたシグナルペプチドを有するアルファクロトータンパク質のｓクロトーを提供する。他の態様において、本発明は、シグナルペプチドを有さないＦＧＦ−２３に（直接的にまたはリンカーを介して間接的に）融合されたシグナルペプチドを有さないアルファクロトータンパク質のｓクロトーを含む融合ポリペプチドを提供する。
【００１８】
１つの態様において、本発明は、ＦＧＦ−２３（Ｒ１７９Ｑ）変異体に（直接的にまたはリンカーを介して間接的に）融合されたシグナルペプチドを有するアルファクロトータンパク質のｓクロトーを含む融合ポリペプチドを提供する。他の態様において、本発明は、ＦＧＦ−２３（Ｒ１７９Ｑ）変異体に（直接的にまたはリンカーを介して間接的に）融合されたシグナルペプチドを有さないアルファクロトータンパク質のｓクロトーを含む融合ポリペプチドを提供する。他の態様において、本発明は、シグナルペプチドを有さないＦＧＦ−２３（Ｒ１７９Ｑ）変異体に（直接的にまたはリンカーを介して間接的に）融合されたシグナルペプチドを有するアルファクロトータンパク質のｓクロトーを提供する。他の態様において、本発明は、シグナルペプチドを有さないＦＧＦ−２３（Ｒ１７９Ｑ）変異体に（直接的にまたはリンカーを介して間接的に）融合されたシグナルペプチドを有さないアルファクロトータンパク質のｓクロトーを含む融合ポリペプチドを提供する。
【００１９】
１つの態様において、本発明は、（１）シグナルペプチドを有するアルファクロトータンパク質のｓクロトー；（２）リンカー；および（３）シグナルペプチドを有さないＦＧＦ−２３（Ｒ１７９Ｑ）変異体を含む、融合ポリペプチドを提供する。他の態様において、本発明は、（１）シグナルペプチドを有さないアルファクロトータンパク質のｓクロトー；（２）リンカー；および（３）シグナルペプチドを有さないＦＧＦ−２３（Ｒ１７９Ｑ）変異体を含む、融合ポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、本発明の融合ポリペプチドはグリコシル化される。
【００２０】
１つの態様において、本発明は、（１）シグナルペプチドを有するアルファクロトータンパク質のｓクロトー（配列番号：４４または配列番号：４５）；（２）配列番号：１１を含むリンカー；および（３）シグナルペプチドを有さないＦＧＦ−２３（Ｒ１７９Ｑ）変異体（配列番号：４３）を含む、融合ポリペプチドを提供する。他の態様において、本発明は、（１）シグナルペプチドを有さないアルファクロトータンパク質のｓクロトー（配列番号：７）；（２）配列番号：１１を含むリンカー；および（３）シグナルペプチドを有さないＦＧＦ−２３（Ｒ１７９Ｑ）変異体（配列番号：４３）を含む、融合ポリペプチドを提供する。１つの態様において、本発明は配列番号：１９、２０、４０または４１のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、本発明の融合ポリペプチドはグリコシル化される。
【００２１】
１つの態様において、本発明はシグナルペプチドを有するアルファクロトータンパク質のｓクロトー（配列番号：４４または配列番号：４５）；および配列番号：１１を含むリンカーを含む、融合ポリペプチドを提供する。他の態様において、本発明はシグナルペプチドを有さないアルファクロトータンパク質のｓクロトー（配列番号：７）；および配列番号：１１を含むリンカーを含む、融合ポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、本発明の融合ポリペプチドはグリコシル化される。
【００２２】
１つの態様において、本発明はヒトＦＧＦタンパク質またはそれらの活性なフラグメント（例えば、シグナルペプチドを有さない）；および配列番号：１１を含むリンカーを含む、融合ポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、本発明の融合ポリペプチドはグリコシル化される。
【００２３】
１つの態様において、本発明は、筋萎縮のような加齢関連状態を処置および／または予防するための、（１）シグナルペプチドを有するアルファクロトータンパク質のｓクロトー（配列番号：４４または配列番号：４５）；（２）配列番号：１１を含むリンカー；および（３）シグナルペプチドを有さないＦＧＦ−２３（Ｒ１７９Ｑ）変異体（配列番号：４３）を含む、（例えば、グリコシル化された、またはグリコシル化されていない）融合ポリペプチドを（例えば、唯一の薬学的に活性な成分として）含む（例えば、筋肉内投与形態における）医薬組成物；および該医薬組成物の使用を提供する。他の態様において、本発明は、筋萎縮のような加齢関連状態を処置および／または予防するための、（１）シグナルペプチドを有さないアルファクロトータンパク質のｓクロトー（配列番号：７）；（２）配列番号：１１を含むリンカー；および（３）シグナルペプチドを有さないＦＧＦ−２３（Ｒ１７９Ｑ）変異体（配列番号：４３）を含む、（例えば、グリコシル化された、またはグリコシル化されていない）融合ポリペプチドを（例えば、唯一の薬学的に活性な成分として）含む（例えば、筋肉内投与形態における）医薬組成物；および該医薬組成物の使用を提供する。１つの態様において、本発明は、筋萎縮のような加齢関連状態を処置および／または予防するための、配列番号：１９、２０、４０または４１のアミノ酸配列を含む、（例えば、グリコシル化された、またはグリコシル化されていない）融合ポリペプチドを（例えば、唯一の薬学的に活性な成分として）含む（例えば、筋肉内投与形態における）医薬組成物；および該医薬組成物の使用を提供する。
【００２４】
１つの態様において、本発明は、筋萎縮のような加齢関連状態を処置および／または予防するための、シグナルペプチドを有するアルファクロトータンパク質のｓクロトー（配列番号：４４または配列番号：４５）；および配列番号：１１を含むリンカーを含む、（例えば、グリコシル化された、またはグリコシル化されていない）融合ポリペプチドを（例えば、唯一の薬学的に活性な成分として）含む（例えば、筋肉内投与形態における）医薬組成物；および該医薬組成物の使用を提供する。他の態様において、本発明は、筋萎縮のような加齢関連状態を処置および／または予防するための、シグナルペプチドを有さないアルファクロトータンパク質のｓクロトー（配列番号：７）；および配列番号：１１を含むリンカーを含む、（例えば、グリコシル化された、またはグリコシル化されていない）融合ポリペプチドを（例えば、唯一の薬学的に活性な成分として）含む（例えば、筋肉内投与形態における）医薬組成物；および該医薬組成物の使用を提供する。
【００２５】
１つの態様において、本発明はヒトＦＧＦタンパク質またはそれらの活性なフラグメント（例えば、シグナルペプチドを有さない）；および配列番号：１１を含むリンカーを含む、（例えば、グリコシル化された、またはグリコシル化されていない）融合ポリペプチドを（例えば、唯一の薬学的に活性な成分として）含む医薬組成物を提供する。
【００２６】
加齢関連状態（例えば、筋萎縮）または代謝障害（例えば、糖尿病）を処置または予防するための本発明の融合タンパク質を含む医薬組成物およびその使用も、本発明に包含される。
【００２７】
１つの態様において、本発明は配列番号：１９と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である融合ポリペプチドを提供する。他の態様において、本発明は配列番号：２０と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である融合ポリペプチドを提供する。
【００２８】
１つの態様において、本発明は配列番号：４０と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である融合ポリペプチドを提供する。他の態様において、本発明は配列番号：４１と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である融合ポリペプチドを提供する。
【００２９】
１つの態様において、本発明はＦＧＦ−１９またはそれらの活性なフラグメントに（直接的にまたはリンカーを介して間接的に）融合したシグナルペプチドを有するベータクロトータンパク質のｓクロトーを含む融合ポリペプチドを提供する。他の態様において、本発明はＦＧＦ−１９またはそれらの活性なフラグメントに（直接的にまたはリンカーを介して間接的に）融合したシグナルペプチドを有さないベータクロトータンパク質のｓクロトーを含む融合ポリペプチドを提供する。他の態様において、本発明はＦＧＦ−２１またはそれらの活性なフラグメントに（直接的にまたはリンカーを介して間接的に）融合したシグナルペプチドを有するベータクロトータンパク質のｓクロトーを含む融合ポリペプチドを提供する。他の態様において、本発明はＦＧＦ−２１またはそれらの活性なフラグメントに（直接的にまたはリンカーを介して間接的に）融合したシグナルペプチドを有さないベータクロトータンパク質のｓクロトーを含む融合ポリペプチドを提供する。
【００３０】
本発明は、本明細書に記載されているクロトー融合ポリペプチドのいずれかをコードする核酸配列および該核酸を含む宿主細胞を提供する。
【００３１】
本発明は、また、本明細書に記載されているクロトー融合ポリペプチドのいずれかを有する組成物を提供する。本発明の組成物はさらにヘパリンを含むことができる。
【００３２】
本発明は、また、個体における加齢関連状態を処置または予防するための方法を提供する。個体（例えば、ヒト）は、加齢関連状態を処置または予防するために、クロトータンパク質（例えば、アルファクロトータンパク質）の少なくとも１つの細胞外サブドメインおよび繊維芽細胞増殖因子またはそれらの活性なフラグメントを有する、治療有効量のクロトー融合ポリペプチドを含む医薬組成物を投与される。特に、本発明は、アルファクロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインおよび繊維芽細胞増殖因子（またはそれらの活性なフラグメント）を有する、治療有効量の融合ポリペプチドを個体（例えば、ヒト）に投与することを含む、筋肉疲労を処置または予防する方法を提供する。
【００３３】
さらに、本発明は個体における代謝障害を処置または予防するための方法を提供する。個体は、代謝障害を処置するために、クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインおよび繊維芽細胞増殖因子（またはそれらの活性なフラグメント）を有する、治療有効量の本発明の融合ポリペプチドを含む医薬組成物を投与される。特に、ベータ−クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインおよび繊維芽細胞増殖因子２１を有する本発明の融合ポリペプチドは、代謝障害を処置するために有用である。
【００３４】
本発明のクロトー−ＦＧＦ２３融合ポリペプチドは、個体における高リン血症または石灰沈着症を処置または予防するために使用することができる。クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインおよび繊維芽細胞増殖因子を有する、薬理学的有効量の本発明のクロトー融合ポリペプチドを含む医薬組成物は、高リン血症または石灰沈着症を処置または予防するために投与される。特に、アルファクロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインおよび繊維芽細胞増殖因子２３を有する、本発明のクロトー融合ポリペプチドは、高リン血症または石灰沈着症を処置するために有用である。
【００３５】
本発明のクロトー−ＦＧＦ２３融合ポリペプチドは、個体における慢性腎臓疾患または慢性腎不全を処置または予防するために使用することができる。クロトータンパク質（例えば、アルファクロトータンパク質）の少なくとも１つの細胞外サブドメインおよび繊維芽細胞増殖因子を有する、治療有効量の本発明のクロトー融合ポリペプチドを含む医薬組成物は、慢性腎臓疾患または慢性腎不全を処置または予防するために投与される。
【００３６】
本発明のクロトー−ＦＧＦ２３融合ポリペプチドは、個体における癌（例えば、乳癌）を処置または予防するために使用することができる。クロトータンパク質（例えば、アルファクロトータンパク質）の少なくとも１つの細胞外サブドメインおよび繊維芽細胞増殖因子を有する、治療有効量の本発明のクロトー融合ポリペプチドを含む医薬組成物は、癌または乳癌を処置または予防するために投与される。
【００３７】
本発明は、薬物において使用するためのクロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインおよびＦＧＦまたはそれらの活性なフラグメントを含む、融合ポリペプチドを提供する。１つの態様において、本発明は、筋萎縮を処置または予防するために使用するための、クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインおよびＦＧＦまたはそれらの活性なフラグメントを含む、融合ポリペプチドを提供する。本発明は、また、治療有効量の可溶性クロトータンパク質を含む医薬組成物を必要とする個体に投与することを含む、加齢関連状態（例えば、筋萎縮）を処置または予防する方法を提供する。
【００３８】
本発明は、また、個体における加齢関連障害または代謝障害を処置または予防するためのキットを含む。該キットは使用のための指示書ならびにクロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインおよび繊維芽細胞増殖因子を有する、精製されたクロトー融合ポリペプチドを含む。
【００３９】
本発明は、また、本発明のクロトー融合ポリペプチドを生産するためのキットを提供する。本発明のキットは、使用のための指示書ならびにクロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインおよび繊維芽細胞増殖因子を有する、クロトー融合ポリペプチドをコードする核酸を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明のクロトー融合ポリペプチドのいくつかの異なる態様を説明する。示されている融合ポリペプチドは、繊維芽細胞増殖因子に作動可能に連結している１つ以上のクロトー細胞外サブドメインを含む。１つ以上のクロトー細胞外サブドメインを含むポリペプチドは、例えば、クロトーの細胞外ドメイン（例えば、ヒトクロトーのアミノ酸１から９８２）またはクロトーの活性なフラグメントを含む。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａの続きである。
【００４１】
【図２Ａ】図２Ａは、本発明のいくつかのクロトー融合ポリペプチドおよびそれらの成分（例えば、クロトー細胞外ドメイン、ＦＧＦ）のアミノ酸および核酸配列を説明する。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明のいくつかのクロトー融合ポリペプチドおよびそれらの成分（例えば、クロトー細胞外ドメイン、ＦＧＦ）のアミノ酸および核酸配列を説明する。
【図２Ｃ】図２Ｃは、本発明のいくつかのクロトー融合ポリペプチドおよびそれらの成分（例えば、クロトー細胞外ドメイン、ＦＧＦ）のアミノ酸および核酸配列を説明する。
【図２Ｄ】図２Ｄは、本発明のいくつかのクロトー融合ポリペプチドおよびそれらの成分（例えば、クロトー細胞外ドメイン、ＦＧＦ）のアミノ酸および核酸配列を説明する。
【図２Ｅ】図２Ｅは、本発明のいくつかのクロトー融合ポリペプチドおよびそれらの成分（例えば、クロトー細胞外ドメイン、ＦＧＦ）のアミノ酸および核酸配列を説明する。
【図２Ｆ】図２Ｆは、本発明のいくつかのクロトー融合ポリペプチドおよびそれらの成分（例えば、クロトー細胞外ドメイン、ＦＧＦ）のアミノ酸および核酸配列を説明する。
【図２Ｇ】図２Ｇは、本発明のいくつかのクロトー融合ポリペプチドおよびそれらの成分（例えば、クロトー細胞外ドメイン、ＦＧＦ）のアミノ酸および核酸配列を説明する。
【図２Ｈ】図２Ｈは、本発明のいくつかのクロトー融合ポリペプチドおよびそれらの成分（例えば、クロトー細胞外ドメイン、ＦＧＦ）のアミノ酸および核酸配列を説明する。
【図２Ｉ】図２Ｉは、本発明のいくつかのクロトー融合ポリペプチドおよびそれらの成分（例えば、クロトー細胞外ドメイン、ＦＧＦ）のアミノ酸および核酸配列を説明する。
【図２Ｊ】図２Ｊは、本発明のいくつかのクロトー融合ポリペプチドおよびそれらの成分（例えば、クロトー細胞外ドメイン、ＦＧＦ）のアミノ酸および核酸配列を説明する。
【図２Ｋ】図２Ｋは、本発明のいくつかのクロトー融合ポリペプチドおよびそれらの成分（例えば、クロトー細胞外ドメイン、ＦＧＦ）のアミノ酸および核酸配列を説明する。
【図２Ｌ】図２Ｌは、本発明のいくつかのクロトー融合ポリペプチドおよびそれらの成分（例えば、クロトー細胞外ドメイン、ＦＧＦ）のアミノ酸および核酸配列を説明する。
【図２Ｍ】図２Ｍは、本発明のいくつかのクロトー融合ポリペプチドおよびそれらの成分（例えば、クロトー細胞外ドメイン、ＦＧＦ）のアミノ酸および核酸配列を説明する。
【図２Ｎ】図２Ｎは、本発明のいくつかのクロトー融合ポリペプチドおよびそれらの成分（例えば、クロトー細胞外ドメイン、ＦＧＦ）のアミノ酸および核酸配列を説明する。
【図２Ｏ】図２Ｏは、本発明のいくつかのクロトー融合ポリペプチドおよびそれらの成分（例えば、クロトー細胞外ドメイン、ＦＧＦ）のアミノ酸および核酸配列を説明する。
【図２Ｐ】図２Ｐは、本発明のいくつかのクロトー融合ポリペプチドおよびそれらの成分（例えば、クロトー細胞外ドメイン、ＦＧＦ）のアミノ酸および核酸配列を説明する。
【００４２】
【図３Ａ】図３Ａ−３Ｃは、ｓクロトー−ＦＧＦ２３融合タンパク質のタンパク質発現を表す。図３Ａは、ｓクロトー−ＦＧＦ２３融合タンパク質が抗−ＦＧＦ２３抗体でのウェスタンブロッティングにより条件培地中で検出されたことを示す。
【図３Ｂ】図３Ａ−３Ｃは、ｓクロトー−ＦＧＦ２３融合タンパク質のタンパク質発現を表す。図３Ｂは、ｓクロトー−ＦＧＦ２３融合タンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色により条件培地中で検出されたことを示す。
【図３Ｃ】図３Ａ−３Ｃは、ｓクロトー−ＦＧＦ２３融合タンパク質のタンパク質発現を表す。図３Ｃは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色により分析された、高度に精製されたｓクロトー−ＦＧＦ２３−６×Ｈｉｓ融合タンパク質を示す。
【００４３】
【図４】図４は、ヘパリン（２０μｇ／ｍｌ）の存在または非存在下で、クロトー融合ポリペプチド、ＦＧＦ２３ポリペプチドのみ、可溶性クロトー（ｓクロトー）ポリペプチドのみ、および可溶性クロトーポリペプチドとＦＧＦ２３ポリペプチドのいずれかを含む条件培地で処理された細胞における、Ｅｇｒ−１の活性化レベルを比較するＥｇｒ−１ルシフェラーゼアッセイの結果を説明する。
【００４４】
【図５Ａ】図５Ａ−５Ｂは、ヘパリンの存在または非存在下で、精製されたクロトー融合ポリペプチド、ＦＧＦ２３ポリペプチドまたは可溶性クロトーポリペプチドで処理された細胞における、Ｅｇｒ−１の活性化レベルを比較するＥｇｒ−１ルシフェラーゼアッセイの結果を表す。図５Ａは、ヘパリン（２０μｇ／ｍｌ）の存在または非存在下で、ＦＧＦ２３のみ、ｓクロトー−Ｈｉｓ（１０ｎＭまたは２０ｎＭ）ならびにＦＧＦ２３およびｓクロトー−Ｈｉｓ（１０ｎＭまたは２０ｎＭ）の組合せで処理された細胞における、Ｅｇｒ−１の活性化レベルを比較する実験の結果を示す。
【図５Ｂ】図５Ａ−５Ｂは、ヘパリンの存在または非存在下で、精製されたクロトー融合ポリペプチド、ＦＧＦ２３ポリペプチドまたは可溶性クロトーポリペプチドで処理された細胞における、Ｅｇｒ−１の活性化レベルを比較するＥｇｒ−１ルシフェラーゼアッセイの結果を表す。図５Ｂは、ｓクロトー−ＦＧＦ２３−Ｈｉｓ融合物（０ｎＭ、０．６ｎＭ、１．２１ｎＭ、２．４１ｎＭ、４．８３ｎＭ、９．６５ｎＭおよび１９．３ｎＭ）で処理された細胞における、Ｅｇｒ−１ルシフェラーゼレポーター活性を示す。
【００４５】
【図６Ａ】図６Ａ−６Ｂは、Ｃ２Ｃ１２筋肉細胞における精製されたｓクロトー融合ポリペプチドでの処理の効果を説明する。図６Ａは、デキサメタゾン（１００μＭ）の存在または非存在下で、ＩＧＦ−１（１０ｎＭ）、ＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍｌ）、または精製されたクロトー融合ポリペプチド（２０ｎＭ）のいずれかで処理されたＣ２Ｃ１２筋肉細胞における、筋管直径の測定を示す。
【図６Ｂ】図６Ａ−６Ｂは、Ｃ２Ｃ１２筋肉細胞における精製されたｓクロトー融合ポリペプチドでの処理の効果を説明する。図６Ｂは、ラパマイシン（４０ｎＭ）の存在または非存在下で、ＩＧＦ−１（１０ｎＭ）、ＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍｌ）、または精製されたクロトー融合ポリペプチド（２０ｎＭ）によるＣ２Ｃ１２筋肉細胞におけるシグナル伝達経路タンパク質のリン酸化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
４．詳細な説明
本発明は、加齢関連状態および代謝障害を予防または処置するための方法、キットおよび組成物に関する。本発明の融合ポリペプチドはクロトータンパク質またはその活性なフラグメントを含む。いくつかの態様において、本発明の融合ポリペプチドは、繊維芽細胞増殖因子ポリペプチドまたはその活性なフラグメントに作動可能に連結しているクロトータンパク質またはその活性なフラグメントを含む。本発明のクロトー融合タンパク質またはｓクロトーは、サルコペニア、皮膚萎縮、筋肉疲労、脳萎縮、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、肺気腫、骨粗鬆症、骨関節症、免疫不全、高血圧、認知症、ハンチントン病、アルツハイマー病、白内障、加齢黄斑変性症、前立腺癌、卒中、期待寿命の低下(diminished life expectancy)、記憶障害、しわ、腎機能障害および加齢関連難聴を含む種々の加齢関連状態；ならびにＩＩ型糖尿病、メタボリック・シンドローム、高血糖および肥満を含む代謝障害の処置および予防において有用である。
【００４７】
本発明は、少なくとも一部分において、物理的制約条件（例えば、クロトーおよびＦＧＦポリペプチド両方の大きいサイズ）にもかかわらず、クロトー−ＦＧＦ融合ポリペプチドがＦＧＦ受容体の活性化において非常に有効である発見に基づく。これらの２つのタンパク質の融合物がヘテロ二量化、したがってタンパク質の活性化を妨げるであろう；例えば、タンパク質の結合ドメインが融合物により乱され得るか、または“シス”構造を構築するとき、タンパク質が空間的に間違った方向に向けられ得ることを考慮すると、この発見は予期されないものである。
【００４８】
単独で、または別のポリペプチドと一緒に投与されるクロトーまたはＦＧＦと比較して活性を増加させる、単一の治療タンパク質の投与を可能にするため、本明細書に記載されているクロトー−ＦＧＦ融合ポリペプチドには利点がある。２つの別々のポリペプチド（すなわち、クロトーポリペプチドおよび別のＦＧＦポリペプチド）よりもむしろ単一の融合ポリペプチドとしてのクロトーおよびＦＧＦの使用が、ＦＧＦ受容体の活性化にさらに有効である。
【００４９】
定義
本明細書において使用される“クロトーポリペプチド”、“クロトータンパク質”または“クロトー”は、野生型“クロトー”の活性なフラグメント、誘導体、模倣物、変異体および化学的に修飾された化合物またはそれらのハイブリッドを含む。活性なクロトーフラグメントは、ＦＧＦポリペプチドに結合する能力を有する。一般的に、活性なクロトーポリペプチドは少なくとも１つのクロトーサブドメイン（例えば、ＫＬ−Ｄ１およびＫＬ−Ｄ２）を含む。野生型クロトーは天然で見出されたとおりのアミノ酸配列を有する。本発明において使用するために適当な典型的なクロトーポリペプチドは、アルファ−クロトー（配列番号：２）およびベータ−クロトー（配列番号：４）を含む。アルファ−クロトーおよびベータ−クロトーのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいてそれぞれ受入番号ＮＭ＿００４７９５；ＮＰ＿００４７８６およびＮＭ＿１７５７３７；ＮＰ＿７８３８６４において見出せる。クロトーポリペプチドは米国特許第６，５７９，８５０号（この内容をその全体において出典明示により本明細書に包含させる）において記載されているものを含む。クロトーポリペプチドは、マウス（ＮＰ＿０３８８５１）、ラット（ＮＰ＿１１２６２６）、ウサギ（ＮＰ＿００１０７５６９２）のアルファ−クロトーおよびマウス（ＮＰ＿１１２４５７）のベータ−クロトーを含むヒト以外の他の種のものを含む。アルファ−クロトーを有することが予測される種は、チンパンジー（ＸＰ＿５２２６５５）、マカク（ＸＰ＿００１１０１１２７）、ウマ（ＸＰ＿００１４９５６６２）、ウシ（ＸＰ＿００１２５２５００）、カモノハシ（ＸＰ＿００１５１０９８１）およびニワトリ（ＸＰ＿４１７１０５）を含む。ベータ−クロトーを有することが予測される種は、チンパンジー（ＸＰ＿５２６５５０）、マカク（ＸＰ＿００１０９１４１３）、ウマ（ＸＰ＿００１４９５２４８）、イヌ（ＸＰ＿５３６２５７）、ラット（ＸＰ＿００１０７８１７８）、カモノハシ（ＸＰ＿００１５１２７２２）およびニワトリ（ＸＰ＿４２３２２４）を含む。クロトーポリペプチドは、配列番号：２または配列番号：４のアミノ酸配列と実質的に同一である；すなわち、配列番号：２または配列番号：４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列またはそれらの活性なフラグメントを有する。
【００５０】
本明細書において使用される“融合ポリペプチド”または“融合タンパク質”は、天然に同じポリペプチドに存在しない２つ以上の別々のポリペプチドまたはそれらの活性なフラグメントを含むポリペプチドを意味する。いくつかの態様において、２つ以上の別々のポリペプチドは、ペプチド結合によりインフレームで、互いに作動可能に共有結合、例えば、化学的に結合または融合されている。本明細書において使用される“クロトー融合ポリペプチド”は、クロトーポリペプチドのアミノ酸配列またはその活性なフラグメントを含む融合ポリペプチドである。
【００５１】
“繊維芽細胞増殖因子”および“ＦＧＦ”は、本明細書において互換的に使用され、ヒト対象を含む動物における細胞増殖、移動、分化、ホメオスタシス、組織修復および損傷応答を調節するポリペプチドを示す。ＦＧＦは、繊維芽細胞増殖因子受容体に結合し、ＦＧＦＲの自己リン酸化、ＦＲＳ２（ＦＧＦ受容体基質２）およびＥＲＫ１／２（細胞外シグナル−調節タンパク質キナーゼ１／２）のリン酸化およびＥｇｒ−１（初期増殖応答−１）の活性化を含む活性を調節する能力を有する。“ＦＧＦ”なる用語は、例えば、当分野で既知である、ならびに米国特許第７，２２３，５６３号および米国特許第７，２５９，２４８号（これらの内容をその全体において出典明示により本明細書に包含させる）において記載されている、野生型“ＦＧＦ”の活性なフラグメント、誘導体、模倣物、変異体および化学的に修飾された化合物またはそれらのハイブリッドを含む。野生型ＦＧＦは天然で見出されたとおりのアミノ酸配列を有する。本発明において使用するために適当な典型的な繊維芽細胞増殖因子は、繊維芽細胞増殖因子−１９（ＦＧＦ１９；配列番号：３１）、繊維芽細胞増殖因子−２１（ＦＧＦ２１；配列番号：３３）および繊維芽細胞増殖因子−２３（ＦＧＦ２３；配列番号：３５）を含む。ＦＧＦポリペプチドは、マウスＦＧＦを含むヒト以外の他の種のものを含む。一般的に、ＦＧＦポリペプチドは、配列番号：３１、配列番号：３３または配列番号：３５のアミノ酸配列と実質的に同一である；すなわち、配列番号：３１、配列番号：３３または配列番号：３５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列またはそれらの活性なフラグメントを有する。
【００５２】
“ＦＧＦ”なる用語は完全長ポリペプチドの活性なフラグメントを含む。対応するＦＧＦ受容体に結合することができる活性なＦＧＦフラグメントは、当分野で既知であり、本発明の使用において考慮される。本明細書に記載されている配列に基づいて、ＦＧＦの重複フラグメントが、例えば、Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)およびAusubel et al. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, Green & Wiley, New York)に記載されている標準組換え技術を使用して生産することができることは、当業者に理解される。本明細書に存在する記載に基づいて、ＦＧＦフラグメントの生物学的活性がＦＧＦ受容体への結合を含む当分野で既知の、および本明細書に記載されている方法により試験することができることは、当業者に理解される。同様に、必要なＦＧＦシグナル伝達機構（すなわちＦＧＦ受容体）を有する細胞培養モデルは、ＦＧＦフラグメントでトランスフェクトされ、次に野生型ＦＧＦと比較してＦＧＦシグナル伝達における変化に関して試験され得る。
【００５３】
ＦＧＦは、特に異なるＦＧＦサブファミリー中で、長さおよび一次配列両方において高度に異なるＮ−およびＣ−末端配列の横に配置されている、ＦＧＦ核相同性ドメイン（約１２０アミノ酸長）の相同性に基づいて７つのサブファミリーに分類される（Goetz et al., Molecular and Cellular Biology, 2007, Vol 27, 3417-3428）。ＦＧＦ活性ポリペプチドは、一般的に少なくとも１つのＦＧＦ核相同性ドメインを含む。いくつかの態様において、ＦＧＦ活性ポリペプチドは、ＦＧＦ核相同性ドメインに加えて、結合ＦＧＦ受容体においてさらなる特異性を与え得るフランキング配列を含み得る。リガンドの核領域が他のＦＧＦと比較して高い配列同一性を共有するため（ＦＧＦ１９対ＦＧＦ２１：３８％同一性；ＦＧＦ１９対ＦＧＦ２３：３６％同一性）、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１およびＦＧＦ２３はＦＧＦ１９サブファミリーに分類される。ＦＧＦ１９サブファミリーメンバーは内分泌腺系のシグナル伝達分子と同様に作用し、古典的なＦＧＦに珍しくない異なる生理学的プロセスを調節する（例えば、ＦＧＦ１９：エネルギーおよび胆汁酸ホメオスタシス；ＦＧＦ２１：グルコースおよび脂質代謝；およびＦＧＦ２３：リン酸塩およびビタミンＤホメオスタシス）。
【００５４】
本明細書において使用される“繊維芽細胞増殖因子受容体”および“ＦＧＦＲ”は、当分野で既知のＦＧＦＲ１−４のいずれか、またはそれらのスプライス変異体（例えば、ＦＧＦＲ１ｃ）を示す。本発明において使用するために適当な典型的な繊維芽細胞増殖因子受容体は、繊維芽細胞増殖因子受容体−１９（例えば、ＦＧＦＲ４−ベータクロトー）、繊維芽細胞増殖因子受容体−２１（例えば、ＦＧＦＲ１ｃ−アルファクロトー）および繊維芽細胞増殖因子受容体−２３（例えば、ＦＧＦＲ１ｃ−アルファクロトー、ＦＧＦＲ３−アルファクロトー、ＦＧＦＲ４−アルファクロトー）を含む。
【００５５】
本明細書において使用される“細胞外ドメイン”は、細胞の外側に存在する（例えば、細胞内または膜貫通領域を含まない）膜貫通タンパク質のフラグメントを示す。“クロトータンパク質の細胞外ドメイン”、“可溶性クロトー”または“ｓクロトー”（例えば、配列番号：７；配列番号：３９）は、繊維芽細胞増殖因子に結合することができる、および／または繊維芽細胞増殖因子に結合することにより繊維芽細胞増殖因子が繊維芽細胞増殖因子受容体に結合することを可能にすることができるクロトーポリペプチドの細胞外ドメインを示す。クロトー細胞外ドメインは、全長アルファクロトー配列（配列番号：２）のアミノ酸残基２８−９８２および全長ベータクロトー配列（配列番号：４）のアミノ酸残基５２−９９７に対応する。
【００５６】
“クロトータンパク質の細胞外サブドメイン”は、繊維芽細胞増殖因子を結合することができる、および／または繊維芽細胞増殖因子への結合により繊維芽細胞増殖因子の繊維芽細胞増殖因子受容体への結合を可能にすることができる、クロトーポリペプチドの細胞外ドメインの領域を示す。クロトー細胞外ドメインは、繰り返されている２つの相同サブドメイン、すなわち、ＫＬ−Ｄ１（配列番号：５）およびＫＬ−Ｄ２（配列番号：６）を有する。ＫＬ−Ｄ１およびＫＬ−Ｄ２は、それぞれ、全長アルファクロトーポリペプチド（配列番号：２）のアミノ酸残基５８−５０６および５１７−９５３、ならびに、それぞれ、全長ベータクロトーポリペプチド（配列番号：４）のアミノ酸残基７７−５０８および５７１−９６７に対応し、本発明において使用するために適当である。一般的に、少なくとも１つのクロトーサブドメインを含むポリペプチドは活性なクロトーポリペプチドである。本発明のポリペプチドにおいて使用するためのクロトー細胞外サブドメインは、それぞれ配列番号：５または配列番号：３７のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するアルファクロトーまたはベータクロトーＫＬ−Ｄ１ドメインであり得る。さらに、クロトーＫＬ−Ｄ１ドメインは、配列番号：５または配列番号：３７のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有し得る。クロトー細胞外サブドメインは、また、それぞれ配列番号：６または配列番号：３８のアミノ酸配列と実質的に同一であるアルファまたはベータクロトーポリペプチドＫＬ−Ｄ２ドメインであり得る。さらなる態様において、ＫＬ−Ｄ２ドメインは、配列番号：６または配列番号：３８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有する。
【００５７】
本明細書において使用される“シグナルペプチド”は、小胞体へのタンパク質の翻訳後輸送を指向して、切断され得るペプチド鎖（３−６０アミノ酸長）を意味する。本発明において使用するために適当な典型的なシグナルペプチドはクロトーシグナルペプチド（配列番号：１９）およびＩｇＧシグナルペプチド（配列番号：２０）を含む。
【００５８】
本明細書において使用される“リンカー”は、互いに結合することができるように、共有結合が２つ以上のポリペプチドまたは核酸を結合する機能の基（例えば、化学物質またはポリペプチド）を意味する。本明細書において使用される“ペプチドリンカー”は、２つのタンパク質を互いに結合する（例えば、クロトーの細胞外ドメインおよび繊維芽細胞増殖因子−２３を結合する）ために使用される１つ以上のアミノ酸を意味する。本発明において使用するために適当なペプチドリンカーは、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７および配列番号：１８により示されているアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むが、これらに限定されない。
【００５９】
本明細書において使用される“作動可能に連結している”は、生体分子と関連する生物学的機能、活性および／または構造を少なくとも保持することができるような２つ以上の生体分子の結合を意味する。ポリペプチドに関して、該用語は、２つ以上のポリペプチドの結合がそれぞれのポリペプチド成分の少なくともいくつかのそれぞれの個々の活性を保持する融合ポリペプチドとなることを意味する。２つ以上のポリペプチドは直接、またはリンカーを介して結合し得る。核酸に関して、該用語は、適当な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が第２のポリヌクレオチドに結合しているとき、第１のポリヌクレオチドが第１のポリヌクレオチドの転写を指向する第２のポリヌクレオチドに隣接して配置されることを意味する。
【００６０】
本明細書において使用される“特異的に結合する”は、第１の分子がそれ自体と他の標的分子間の非共有相互作用の形成をもたらす特定の構造を取ることができるため、第１の分子が暴露され得る多くの異なる型の分子の中から１つの標的分子に結合することができることを示す。第１の分子は安定な複合体を形成する標的に結合するが、他の何らかの非特異的な分子に対して、実質的にあまり、認識せず、接触せず、または第１の分子と複合体を形成しない。
【００６１】
本明細書において使用される“ポリペプチド変異体”または“タンパク質変異体”は、１つ以上のアミノ酸が参照配列から異なるアミノ酸により置換されているポリペプチドを示す。いくつかのアミノ酸が、以下に記載されているポリペプチド（保存的置換）の活性の性質を変化することなく広範に同様の性質を有して、他のものにより置換され得ることは当分野で理解されている。これらの用語は、また、１つ以上のアミノ酸が付加されたか、もしくは欠失されたか、または異なるアミノ酸で置換されたポリペプチド、例えば、タンパク質アイソフォームを包含する。本発明において使用するために適当な繊維芽細胞増殖因子−２３の典型的な変異体は繊維芽細胞増殖因子−２３変異体（Ｒ１７９Ｑ）である。
【００６２】
本明細書において使用される“医薬組成物”は、個体における疾患または障害を処置または予防するために投与され得る化合物（例えば、本発明の融合ポリペプチド）を含む組成物を意味する。
【００６３】
本明細書において使用される“個体”または“対象”は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えば、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジまたはネコを含むが、これらに限定されない哺乳動物を示す。
【００６４】
本明細書において使用される“処置”は、疾患の発症または進行を減少、抑制、減衰、軽減、阻止または安定させることを意味する。本発明との関係において、本発明のポリペプチドの投与は、サルコペニア、皮膚萎縮、筋肉疲労、脳萎縮、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、肺気腫、骨粗鬆症、骨関節症、免疫不全、高血圧、認知症、ハンチントン病、アルツハイマー病、白内障、加齢黄斑変性症、前立腺癌、卒中、期待寿命の低下、記憶障害、しわ、腎機能障害および加齢関連難聴を含む加齢関連状態；ならびにＩＩ型糖尿病、メタボリック・シンドローム、高血糖および肥満を含む代謝障害を処置するために使用され得る。
【００６５】
本明細書において使用される“予防”は、対象における障害の発症を減少させる、または障害またはそれに関連する症状を有する危険性を減少させることを意味する。本発明との関係において、本発明のポリペプチドの投与は、サルコペニア、皮膚萎縮、筋肉疲労、脳萎縮、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、肺気腫、骨粗鬆症、骨関節症、免疫不全、高血圧、認知症、ハンチントン病、アルツハイマー病、白内障、加齢黄斑変性症、前立腺癌、卒中、期待寿命の低下、記憶障害、しわ、腎機能障害および加齢関連難聴を含む加齢関連状態；ならびにＩＩ型糖尿病、メタボリック・シンドローム、高血糖および肥満を含む代謝障害を予防するために使用され得る。予防は、加齢関連状態または代謝障害の完全な、例えば、全体の欠如であり得る。予防は、また、対象における加齢関連状態または代謝障害の発症の可能性が本発明を受けていない対象よりも発症する可能性を低くするような、部分的なものであり得る。
【００６６】
本明細書において使用される“疾患”は、細胞、組織または臓器の正常機能を損なう、または妨げるすべての状態または障害を意味する。
【００６７】
本明細書において使用される“加齢関連状態”は、母集団における発生率または個体における重症度が年齢の進行と関連があるすべての疾患または障害を意味する。１つの態様において、加齢関連状態は、１００，０００個体以上の選択された母集団中で、３０−４０歳のヒト個体と比較して６０歳以上のヒト個体中で発生率が少なくとも１．５倍である疾患または障害である。本発明に関連する加齢関連状態は、サルコペニア、皮膚萎縮、筋肉疲労、脳萎縮、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、肺気腫、骨粗鬆症、骨関節症、免疫不全、高血圧、認知症、ハンチントン病、アルツハイマー病、白内障、加齢黄斑変性症、前立腺癌、卒中、期待寿命の低下、記憶障害、しわ、腎機能障害および加齢関連難聴を含むが、これらに限定されない。
【００６８】
本明細書において使用される“代謝障害”は、細胞におけるエネルギー生産または細胞、組織、臓器もしくは個体における毒素の蓄積に影響することにより、細胞、組織または臓器における正常機能を損なう、または妨げるすべての疾患または障害を意味する。本発明に関連する代謝障害は、ＩＩ型糖尿病、メタボリック・シンドローム、高血糖および肥満を含むが、これらに限定されない。
【００６９】
“有効量”は、有益な、または望ましい臨床結果をもたらすために十分な量である。本発明との関係において、それは、意図された薬理学的、治療または予防結果を引き起こすために十分なクロトー融合ポリペプチドまたはｓクロトーの量である。治療有効量は、障害または障害の１つ以上の症状（例えば、加齢関連状態または代謝障害）の予防または改善をもたらす。治療有効量は、対象および処置される疾患状態、対象の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与様式などに依存して変化し、当業者によって容易に決定することができる。
【００７０】
本明細書において使用される“クロトー核酸分子”はクロトータンパク質をコードする遺伝子である。典型的なヒトクロトー遺伝子はＧｅｎＢａｎｋ  受入番号  ＮＭ＿００４７９５（配列番号：１）で提供される。
【００７１】
本明細書において使用される“フラグメント”は、ポリペプチドまたは核酸分子の一部を示す。この一部は、好ましくは、参照核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上を含む。フラグメントは１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００または最大３０００ヌクレオチドまたはアミノ酸を含み得る。
【００７２】
“実質的に同一”なる用語は、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載されているアミノ酸配列のいずれか１つ）または核酸配列（例えば、本明細書に記載されている核酸配列のいずれか１つ）と少なくとも５０％同一性を示すポリペプチドまたは核酸分子を示す。好ましくは、このような配列は、アミノ酸レベルまたは核酸において、比較のために使用される配列と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％または８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一である。
【００７３】
本発明は、加齢関連状態および代謝障害を予防または処置するための方法、キットおよび組成物に関する。本発明はクロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを有する融合ポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、融合ポリペプチドはさらに繊維芽細胞増殖因子またはその活性なフラグメントを含む。クロトー細胞外ドメインはアルファまたはベータクロトーアイソフォームのいずれか由来であり得る。さらに、クロトー融合ポリペプチドのＦＧＦ成分は繊維芽細胞増殖因子−１９、繊維芽細胞増殖因子−２１および繊維芽細胞増殖因子−２３に関して主に記載されているが、２３の既知のＦＧＦまたはそれらの活性なフラグメントのすべてが本発明の実施において使用することができると考えられる。
【００７４】
クロトータンパク質の細胞外ドメインはクロトータンパク質のＫＬ−Ｄ１およびＫＬ−Ｄ２ドメインの１つまたは両方を含むことができる。いくつかの態様において、クロトー融合ポリペプチドはクロトータンパク質の少なくとも２つの細胞外サブドメインを有する。例えば、２つの細胞外サブドメインは、タンデムリピートにおける２つのＫＬ−Ｄ１ドメイン、タンデムリピートにおける２つのＫＬ−Ｄ２ドメインまたは１つのＫＬ−Ｄ１ドメインおよび１つのＫＬ−Ｄ２ドメインであり得る。
【００７５】
クロトータンパク質の細胞外サブドメインおよび繊維芽細胞増殖因子（またはそれらの活性なフラグメント）は、種々の方向および様式において互いに作動可能に連結することができる。例えば、クロトータンパク質の細胞外サブドメインは繊維芽細胞増殖因子のＮ−末端に作動可能に連結されていてよく、あるいは繊維芽細胞増殖因子は少なくとも１つのクロトータンパク質の細胞外サブドメインのＮ−末端に作動可能に連結されていてもよい。
【００７６】
本発明の融合ポリペプチドは、クロトー細胞外ドメイン、すなわち、ＫＬ−Ｄ１（配列番号：５）およびＫＬ−Ｄ２（配列番号：６）の１つまたは両方を含み得る。ＫＬ−Ｄ１およびＫＬ−Ｄ２は、それぞれ全長アルファクロトーポリペプチド（配列番号：２）のアミノ酸残基５８−５０６および５１７−９５３ならびに全長ベータクロトーポリペプチド（配列番号：４）のアミノ酸残基７７−５０８および５７１−９６７に対応し、本発明において使用するために適当である。クロトー融合ポリペプチドは、配列番号：５のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するアルファクロトーポリペプチドまたは配列番号：３７のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するベータクロトーポリペプチドのＫＬ−Ｄ１ドメインを有し得る。具体的には、クロトー融合ポリペプチドは、配列番号：５または配列番号：３７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有し得る。クロトー融合ポリペプチドは、配列番号：６のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するアルファクロトーポリペプチドまたは配列番号：３８のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するベータクロトーポリペプチドのＫＬ−Ｄ２ドメインを有し得る。具体的には、クロトー融合ポリペプチドは、それぞれ配列番号：６または配列番号：３８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有し得る。
【００７７】
いくつかの態様において、本発明のクロトー融合ポリペプチドは可溶性であり、ＦＧＦ受容体に結合することができる。
【００７８】
本発明のクロトー融合ポリペプチドは、クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを有するポリペプチドおよび繊維芽細胞増殖因子を接続するポリペプチドリンカーを含むことができる。適当なリンカーは当分野で既知であり、一般的にいくつかのＧｌｙおよびいくつかのＳｅｒ残基、例えば、（Ｇｌｙ４  Ｓｅｒ）３（配列番号：１１）、Ｇｌｙ４  Ｓｅｒポリペプチド（配列番号：１２）、Ｇｌｙ（配列番号：１３）、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ（配列番号：１４）、Ｇｌｙ  Ｓｅｒ（配列番号：１５）、Ｇｌｙ２  Ｓｅｒ（配列番号：１６）、Ａｌａ（配列番号：１７）およびＡｌａ  Ａｌａ（配列番号：１８）を含む。いくつかの態様において、リンカーは配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７または配列番号：１８のいずれかに記載されているアミノ酸配列の少なくとも２から最大約３０までの繰り返しを有する。
【００７９】
ポリペプチドリンカーが本発明のクロトー融合ポリペプチドに存在するとき、クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを有するポリペプチドは、ポリペプチドリンカーのＣ−末端にペプチド結合により接続されているＦＧＦと、リンカーポリペプチドのＮ−末端にペプチド結合により接続されていてもよい。あるいは、ＦＧＦは、ポリペプチドリンカーのＣ−末端にペプチド結合により接続されている、少なくとも１つのクロトーの細胞外サブドメインを有するポリペプチドと、リンカーポリペプチドのＮ−末端にペプチド結合により接続されていてもよい。化学的リンカーが、また、２つのポリペプチドを連結するために使用することができる。
【００８０】
本発明のクロトー融合ポリペプチドはシグナルペプチドを含み得る。クロトー融合ポリペプチドにおいて使用するための典型的なシグナルペプチドは、クロトーシグナルペプチド（配列番号：８）およびＩｇＧシグナルペプチド（配列番号：９）を含むが、これらに限定されない。
【００８１】
４．１．クロトーおよび繊維芽細胞増殖因子ポリペプチド
本発明のクロトー融合ポリペプチドは、天然のＦＧＦに相当する生物学的活性を示す、例えば、ＦＧＦ受容体に結合し、ＦＧＦ受容体、ＦＲＳ２（ＦＧＦ受容体基質２）およびＥＲＫ１／２（細胞外シグナル−調節タンパク質キナーゼ１／２）のリン酸化を誘導し、Ｅｇｒ−１（初期増殖応答−１）遺伝子を活性化させることが期待される。ＦＧＦは、ＦＧＦ受容体に結合する分泌ペプチド増殖因子である。ＦＧＦのアミノ酸および核酸配列は、当業者が容易に利用することができる。例えば、典型的なＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１およびＦＧＦ２３の核酸配列（配列番号：３０、３２および３４として本明細書に記載されている）は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて、それぞれアクセッションナンバー：ＮＭ＿００５１１７、ＮＭ＿０１９１１３およびＮＭ＿０２０６３８の下に見出すことができる。典型的なＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１およびＦＧＦ２３のアミノ配列（配列番号：３１、３３および３５として本明細書に記載されている）は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて、それぞれアクセッションナンバー：ＮＰ＿００５１０８、ＮＰ＿０６１９８６およびＮＰ＿０６５６８９の下に見出すことができる。さらに、ＦＧＦはタンパク質の発現に役立つ１つ以上の変化を含み得る（例えば、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変異体（配列番号：３６））。
【００８２】
クロトータンパク質は、細胞外ドメインおよび短い細胞質ドメインを有する１３０ｋＤａの１回膜貫通型タンパク質である。クロトーのアミノ酸および核酸配列は、当業者が容易に利用することができる。例えば、典型的なアルファ−クロトーおよびベータ−クロトーの核酸配列（配列番号：７および８として本明細書に記載されている）は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて、それぞれアクセッションナンバー：ＮＭ＿００４７９５およびＮＭ＿１７５７３７の下に見出すことができる。典型的なアルファ−クロトーおよびベータ−クロトーのアミノ酸配列（配列番号：２および４として本明細書に記載されている）は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて、それぞれアクセッションナンバー：ＮＰ＿００４７８６およびＮＰ＿７８３８６４の下に見出すことができる。
【００８３】
本発明のクロトー融合ポリペプチドは、繊維芽細胞増殖因子受容体に結合することができ、繊維芽細胞増殖因子−１９（配列番号：３１）、繊維芽細胞増殖因子−２１（配列番号：３３）、繊維芽細胞増殖因子−２３（配列番号：３５）またはそれらの変異体（繊維芽細胞増殖因子−２３変異体（Ｒ１７９Ｑ）（配列番号：３６）を含む）のいずれかに作動可能に連結しているアルファ−クロトーまたはベータ−クロトー細胞外ドメインを有する。
【００８４】
具体的には、本発明のクロトー融合ポリペプチドは、繊維芽細胞増殖因子−２３（配列番号：３５）または繊維芽細胞増殖因子−２３変異体（Ｒ１７９Ｑ）（配列番号：３６）に作動可能に連結しているアルファ−クロトー（配列番号：２）を含み得る。さらに、本発明のクロトー融合ポリペプチドは、繊維芽細胞増殖因子−１９（配列番号：３１）に作動可能に連結しているベータ−クロトー（配列番号：４）を有し得る。本発明のクロトー融合ポリペプチドは、繊維芽細胞増殖因子−２１（配列番号：３３）に作動可能に連結しているベータ−クロトー（配列番号：４）を含み得る。
【００８５】
本発明は、種々のクロトーおよびＦＧＦ遺伝子およびこれらの遺伝子によってコードされるタンパク質のホモログを含む。遺伝子に関して、“ホモログ”は遺伝子の少なくとも一部と実質的に同一である核酸配列もしくはその相補鎖またはそれらの一部を意味する、ただし、核酸配列が遺伝子によってコードされるタンパク質と実質的に同じ活性／機能を有するタンパク質をコードする。本明細書に記載されている遺伝子のホモログは、推定ホモログのアミノ酸または核酸配列と遺伝子またはそれらによってコードされるタンパク質配列間の同一性パーセントにより同定することができる（例えば、クロトーおよびＦＧＦをコードする遺伝子に対する核酸配列またはそれらの相補鎖）。同一性パーセントは、例えば、視覚的検査により、または当分野で既知の、または本明細書に記載されている種々のコンピュータープログラムを使用することにより測定され得る。配列同一性は、一般的に、配列分析ソフトウェア（例えば、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, BLAST, BESTFIT, GAPまたはPILEUP/PRETTYBOXプログラム）を使用して測定される。このようなソフトウェアは、種々の置換、欠失および／または他の修飾に関して相同性の程度を割り当てることにより、同一または同様の配列を合わせる。保存的置換は、一般的に、以下のグループ内の置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を測定するための典型的な手段において、密接な関連配列を示すプロバビリティスコアｅ−３からｅ−１００を使用するＢＬＡＳＴプログラムが使用され得る。
【００８６】
本明細書において使用される“相同性”および“相同”なる用語は、理論上共通の遺伝的先祖を有するタンパク質を示すことに限定せず、進化した遺伝的に関連し得ないが、それにもかかわらず、同様の機能を行い、および／または同様の構造を有するようなタンパク質を含む。本明細書に記載されている機能的相同性の種々のタンパク質は、また、ホモログである対応するタンパク質の活性を有するタンパク質を含む。機能的相同性を有するタンパク質に関して、それらがそれらのアミノ酸配列において有意な同一性を有する必要はなく、むしろ、機能的相同性を有するタンパク質は同様の、または同一の活性を有することにより定義される。例えば、クロトー分子に関して、ポリペプチドはＦＧＦポリペプチドへの結合の機能的特徴と有し、ＦＧＦＲへのＦＧＦの結合が可能であるべきである。ＦＧＦ分子に関して、ポリペプチドはＦＧＦＲに結合し、ＦＧＦＲの活性化（例えば、リン酸化）を引き起こす機能的特徴を有するべきである。ＦＧＦ受容体へのＦＧＦ結合および／またはＦＧＦシグナル伝達経路の活性化を評価するためのアッセイは、当分野で既知であるか、または本明細書に記載されている（実施例２参照）。クロトー活性を評価するためのアッセイも、当分野で既知であるか、本明細書に記載されている（例えば、ＦＧＦポリペプチドへの結合）。構造的相同性を有するタンパク質は、類似の三次（または四次）構造を有するものとして定義されるが、それらをコードする遺伝子に対するアミノ酸同一性または核酸同一性は必ずしも必要ではない。ある特定の状況では、構造的ホモログはタンパク質の活性部位または結合部位のみで構造的相同性を維持するタンパク質を含み得る。
【００８７】
構造的および機能的相同性に加えて、本発明は、さらに本明細書に記載されている種々のクロトーおよびＦＧＦアミノ酸配列とアミノ酸同一性を有するタンパク質を包含する。２つのアミノ酸配列の同一性／相同性パーセントを決定するために、該２つの配列を最適な比較目的のために並べる（例えば、一方のタンパク質のアミノ酸配列と最適なアライメントのために、ギャップをもう一方のタンパク質のアミノ酸配列に導入することができる）。次に、対応するアミノ酸位置のアミノ酸残基を比較する。一方の配列の位置がもう一方の配列の対応する位置に同じアミノ酸残基が存在するとき、それらの分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、配列において共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一の位置の＃／位置の全＃×１００）。
【００８８】
本明細書に記載されている本発明の分子のアミノ酸配列は、本明細書に記載されているアミノ酸配列と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一または相同であるアミノ酸配列を有する。
【００８９】
本明細書に記載されている本発明の分子の核酸配列は、本明細書に記載されている核酸配列とハイブリダイズするか、または本明細書に記載されている核酸配列と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一または相同である核酸配列を有する。
【００９０】
本発明の融合ポリペプチドにおいて使用するために適当な核酸分子は、ストリンジェント条件下で、クロトーまたはＦＧＦをコードする核酸分子の相補体にハイブリダイズするクロトーまたはＦＧＦ核酸配列を有し得る。本明細書において使用される“ストリンジェント条件下でハイブリダイズする”なる用語は、互いに少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％以上相同である核酸配列が一般的に互いにハイブリダイズの維持下にて、ハイブリダイゼーションおよび洗浄する条件を表すことを意図する。このようなストリンジェント条件は当業者に既知であり、Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York (2001), 6.3.1-6.3.6において見出すことができる。特定の非限定的な例のストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で約４５℃でハイブリダイゼーション、次に０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で５０−６５℃での１回以上の洗浄である。
【００９１】
４．２．本発明のクロトー−ＦＧＦ融合ポリペプチド
本発明のいくつかの態様において、クロトー融合ポリペプチドは、クロトーポリペプチドの第１のポリペプチド配列またはそれらの活性なフラグメントおよびＦＧＦをコードする第２のポリペプチド配列またはそれらの活性なフラグメントを有するポリペプチド鎖を有する。
【００９２】
本発明は、配列番号：１９−２８に存在するアミノ酸配列と少なくとも約９５％以上相同である融合ポリペプチドを含む。配列番号：１９のアミノ酸配列は、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変異体（配列番号：３６）のＮ−末端に結合しているクロトー細胞外ドメインを有するクロトー融合ポリペプチドをコードする。配列番号：２０のアミノ酸配列は、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変異体のＮ−末端に結合しているシグナルペプチドを欠いているクロトー細胞外ドメインのＮ−末端に結合しているＩｇＧシグナルペプチドを有するクロトー融合ポリペプチドをコードする。配列番号：２１のアミノ酸配列は、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変異体のＮ−末端に結合しているＫＬ−Ｄ１細胞外サブドメインを有するクロトー融合ポリペプチドをコードする。配列番号：２２のアミノ酸配列は、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変異体のＮ−末端に結合しているＫＬ−Ｄ２細胞外サブドメインを有するクロトー融合ポリペプチドをコードする。配列番号：２３のアミノ酸配列は、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変異体のＮ−末端に結合している２つのＫＬ−Ｄ１細胞外サブドメインを有するクロトー融合ポリペプチドをコードする。配列番号：２４のアミノ酸配列は、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変異体のＮ−末端に結合している２つのＫＬ−Ｄ２細胞外サブドメインを有するクロトー融合ポリペプチドをコードする。配列番号：２５のアミノ酸配列は、クロトー細胞外ドメインのＮ−末端に結合しているＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変異体を有するクロトー融合ポリペプチドをコードする。配列番号：２６のアミノ酸配列は、ＫＬ−Ｄ１細胞外サブドメインのＮ−末端に結合しているＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変異体を有するクロトー融合ポリペプチドをコードする。配列番号：２７のアミノ酸配列は、ＫＬ−Ｄ２細胞外サブドメインのＮ−末端に結合しているＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変異体を有するクロトー融合ポリペプチドをコードする。配列番号：２８のアミノ酸配列は、２つのＫＬ−Ｄ１細胞外サブドメインのＮ−末端に結合しているＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変異体を有するクロトー融合ポリペプチドをコードする。配列番号：２９のアミノ酸配列は、２つのＫＬ−Ｄ２細胞外サブドメインのＮ−末端に結合しているＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変異体を有するクロトー融合ポリペプチドをコードする。
【００９３】
本発明のクロトー融合ポリペプチドは、配列番号：７に記載されているアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含み得る。配列番号：７のアミノ酸配列はシグナルペプチドを欠いているクロトー細胞外ドメインをコードする。
【００９４】
対象融合タンパク質は本明細書に記載されており、当分野で既知の方法を使用して製造することができる。例えば、本発明の融合ポリペプチドは米国特許第６，１９４，１７７号に記載されているとおりに構築され得る。クロトーポリペプチドの使用は米国特許第６，５７９，８５０号に記載されている。ＦＧＦ核酸分子の使用は米国特許第７，２２３，５６３号に記載されている。
【００９５】
いくつかの態様において、クロトーをコードする核酸分子は、ＰＣＲによりクローニングされ、インフレームで、ＦＧＦをコードする核酸分子と結合される。クロトー−ＦＧＦ融合ポリペプチドをコードする核酸は、発現を可能にするプロモーターに作動可能に連結している。次に、融合ポリペプチドをコードする核酸分子を発現のための宿主細胞にトランスフェクトする。最終構築物の配列はシーケンシングにより確認することができる。
【００９６】
本発明の融合タンパク質を製造するとき、クロトーの細胞外サブドメインをコードする核酸分子を、インフレームでＦＧＦをコードする核酸分子に融合する。得られた核酸分子の発現は、ＦＧＦポリペプチドに関してＮ−末端で融合しているクロトーの細胞外サブドメインを生じる。融合物は、クロトーの細胞外サブドメインがＦＧＦポリペプチドに関してＣ−末端で融合しているものも可能である。融合タンパク質を製造するための方法は当分野で既知である。
【００９７】
本発明の融合ポリペプチドは、共有結合されている、一方のポリペプチドが１つのタンパク質配列またはドメイン、例えばクロトー由来であり、そして、もう一方のポリペプチドが別のタンパク質配列またはドメイン、例えばＦＧＦ由来である、少なくとも２つのポリペプチドを有する。本発明の融合ポリペプチドのクロトーおよびＦＧＦは当業者に既知の方法により連結することができる。これらの方法は化学的および組換え方法両方を含む。
【００９８】
本発明の融合ポリペプチドに組み込まれるドメインをコードする核酸は、組換え遺伝の分野における通常の技術を使用して得ることができる。本発明において使用される一般的な方法を記載している基本的な文献は、Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990);およびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994-1999)を含む。本発明のクロトー融合ポリペプチドをコードする核酸において、配列番号：１および配列番号：３それぞれにより示されているアルファ−クロトーまたはベータ−クロトーをコードする核酸配列が使用され得る。クロトー融合ポリペプチドをコードする核酸において、配列番号：３０、配列番号：３２および配列番号：３４それぞれにより示されているＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１またはＦＧＦ２３をコードする核酸配列が使用され得る。本明細書に記載されている本発明の分子の核酸配列は、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：３０、配列番号：３２または配列番号：３４とハイブリダイズするか、または少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一または相同である核酸配列を含む。
【００９９】
クロトーおよびＦＧＦペプチドをコードする核酸配列は、種々の方法のいずれかを使用して得ることができる。例えば、ポリペプチドをコードする核酸配列は、プローブとのハイブリダイゼーションによりｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡライブラリーからクローニングされるか、またはオリゴヌクレオチドプライマーとの増幅技術を使用して単離され得る。より一般的には、増幅技術はＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型を使用してクロトーおよびＦＧＦ配列を増幅および単離するために使用される（例えば、Dieffenfach & Dveksler, PCR Primers: A Laboratory Manual (1995)、参照）。あるいは、重複オリゴヌクレオチドは合成的に生産し、１つ以上のドメインを生産して連結することができる。クロトーまたはＦＧＦをコードする核酸は、また、プローブとして抗体を使用して発現ライブラリーから単離することができる。
【０１００】
本発明において、クロトーおよびＦＧＦは、アミノ酸リンカーを含む共有結合リンカー、例えば、ポリグリシンリンカー、または炭水化物リンカー、脂質リンカー、脂肪酸リンカー、ポリエーテルリンカーを含む別のタイプの化学リンカー、例えば、ＰＥＧなどで直接、または、それらを介してのいずれかで連結することができる（例えば、Hermanson, Bioconjugate techniques (1996)、参照）。融合物／融合ポリペプチドを形成するポリペプチドは、一般的に、Ｃ−末端からＮ−末端に連結するが、それらは、Ｃ−末端からＣ−末端、Ｎ−末端からＮ−末端またはＮ−末端からＣ−末端に連結することもできる。１つ以上のポリペプチドドメインが、本発明の融合ポリペプチド内の内部の位置に挿入され得る。融合タンパク質のポリペプチドは任意の順番であり得る。融合ポリペプチドは、隣接して融合タンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドを製造することにより、１つのタンパク質配列からのアミノ酸鎖、例えば、クロトーの細胞外サブドメインと別のタンパク質配列からのアミノ酸鎖、例えば、ＦＧＦの共有結合により生産され得る。融合タンパク質におけるアミノ酸の異なる鎖は、互いに直接的にスプライシングされるか、化学結合基またはアミノ酸結合基を介して互いに間接的にスプライシングされ得る。アミノ酸結合基は、約２００以上のアミノ酸長または一般的に１から１００アミノ酸長であり得る。いくつかの態様において、プロリン残基がリンカーに組み込まれ、リンカーによる重要な二次構造成分の構成を妨げる。リンカーは、しばしば、組換え融合タンパク質の一部として合成される柔軟なアミノ酸部分配列であり得る。このような柔軟なリンカーは当業者に既知である。
【０１０１】
本発明において、クロトーの細胞外サブドメインのアミノ酸配列またはそのフラグメントは、ペプチドリンカーを介してＦＧＦに連結されていてもよい。典型的なペプチドリンカーは当分野で既知であり、本明細書に記載されている。例えば、ペプチドリンカーは、一般的に、いくつかのＧｌｙおよびいくつかのＳｅｒ残基、例えば：（Ｇｌｙ４  Ｓｅｒ）３（配列番号：１１）、Ｇｌｙ４  Ｓｅｒポリペプチド（配列番号：１２）、Ｇｌｙ（配列番号：１３）、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ（配列番号：１４）、Ｇｌｙ  Ｓｅｒ（配列番号：１５）、Ｇｌｙ２  Ｓｅｒ（配列番号：１６）、Ａｌａ（配列番号：１７）およびＡｌａ  Ａｌａ（配列番号：１８）を含む。特に、本発明の融合タンパク質において使用するためのペプチドリンカーは、柔軟なヒンジとして作用し得る。
【０１０２】
クロトーまたはＦＧＦのシグナル配列は、本発明の融合タンパク質へのクロトーの導入前に、除去され得る。融合タンパク質のクロトーまたはＦＧＦに対するシグナル配列は、例えば、配列番号：１９により示されているポリペプチドを含み得る。しかしながら、このような配列は、また、除去されるか、または異なるタンパク質のシグナル配列、例えば、ＩｇＧシグナル配列（配列番号：９）で置き換えられ得る。一般的に、本発明の医薬組成物はクロトーおよびＦＧＦの成熟形態を含む。
【０１０３】
一般的に、イントロンは、融合ポリペプチドへの導入の前に、クロトーまたはＦＧＦ部分のいずれか１つまたは両方から除外される。
【０１０４】
本発明の融合ポリペプチドは、１つ以上の活性アミノ酸側鎖に共有結合した１つ以上のポリマーを含み得る。非限定的な例として、このようなポリマーは、１つ以上の遊離のシステインスルフヒドリル残基と結合することができるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み、それにより、タンパク質が酸化条件に暴露されたとき、ジスルフィド結合および凝集の形成をブロックすることができる。加えて、本発明の融合ポリペプチドのペグ化は、半減期、溶解度およびプロテアーゼ抵抗性の増加のようなこのような改良された特性を提供することが期待される。あるいは、本発明の融合ポリペプチドは、遊離アミノ基、例えば、リシンイプシロンまたはＮ−末端アミノ基へのポリマーの共有結合的付加により修飾され得る。共有結合修飾に対して好ましいシステインおよびリシンは、受容体結合、ヘパリン結合または適当なタンパク質フォールディングに関連しないものある。特定のアミノ酸残基の修飾が望ましいタンパク質の活性に影響するか否かを測定するために、融合ポリペプチドの生化学的および／または生物学的活性をアッセイするための方法が使用され得ることは、当業者に明らかである。他の同様の適当な修飾が考えられ、当分野で既知である。
【０１０５】
本発明は、また、配列番号：１９−２８に存在するアミノ酸配列と少なくとも約９５％以上相同である融合ポリペプチドの発現に関する。
【０１０６】
４．３．本発明の融合ポリペプチドの発現
本発明の融合タンパク質を発現するために、本明細書に記載されているいずれかの方法または当分野で既知である方法により得られるＤＮＡ分子を、当分野で既知の技術により適当な発現ベクターに挿入することができる。例えば、二本鎖ｃＤＮＡは、ホモポリマーの付加または合成ＤＮＡリンカーの使用に関連する制限酵素結合または平滑末端ライゲーションにより、適当なベクターにクローニングすることができる。ＤＮＡリガーゼは、通常、ＤＮＡ分子をライゲートするために使用され、望ましくない結合はアルカリホスファターゼでの処理により避けることができる。
【０１０７】
したがって、本発明は、本明細書に記載されている核酸分子（例えば、遺伝子または遺伝子をコードする組換え核酸分子）を含むベクター（例えば、組換えプラスミドおよびバクテリオファージ）を含む。“組換えベクター”なる用語は、組換えベクターが由来する天然または非人工の核酸分子において含まれる核酸配列よりも、より多い、より少ない、または異なる核酸配列を含むように、変化、修飾または加工されたベクター（例えば、プラスミド、ファージ、ファスミド、ウイルス、コスミド、フォスミドまたは他の精製された核酸ベクター）を含む。例えば、組換えベクターは、本明細書において定義されている調節配列、例えば、プロモーター配列、終結配列および／または人工リボソーム結合部位（ＲＢＳ）に作動可能に連結しているクロトー−ＦＧＦ２３融合物をコードする核酸配列を含み得る。ベクターに包含されている遺伝子または核酸の発現が可能である組換えベクターを“発現ベクター”と称する。
【０１０８】
真核生物宿主において、異なる転写および翻訳調節配列は、宿主の性質に依存して使用され得る。それらはアデノウイルス、ウシパピローマ・ウイルス、シミアン・ウイルスなどのウイルス源由来であり得、調節シグナルは高レベルの発現を有する特定の遺伝子と関連している。例えば、ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター、ＳＶ４０早期プロモーター、酵母菌ｇａ１４遺伝子プロモーターなどを含むが、これらに限定されない。転写開始調節シグナルは、遺伝子の発現を調節することができるように抑制または活性化することができるものを選択され得る。
【０１０９】
本明細書に記載されているいくつかの本発明の分子において、融合ポリペプチドの１つ以上のポリペプチド鎖をコードする核酸配列を有する１つ以上のＤＮＡ分子は、望ましいＤＮＡ分子を宿主細胞に組み込むことができる１つ以上の調節配列に作動可能に連結している。導入されたＤＮＡにより安定に形質転換された細胞は、例えば、発現ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することにより、選択することができる。選択可能なマーカー遺伝子は、発現する核酸配列に直接結合するか、または共−トランスフェクションにより同じ細胞に導入することができる。さらなる因子が、また、本明細書に記載されているタンパク質の最適な合成のために必要であり得る。使用するさらなる因子がどれであるかは、当業者に明白である。
【０１１０】
特定のプラスミドまたはウイルスベクターの選択において重要な因子は、ベクターを含む受容細胞が認識され、ベクターを含まない受容細胞から選択される容易さ；特定の宿主において望ましいベクターのコピーの数；および、異なる種の宿主細胞間のベクターを“往復する”ことができることが望ましいかどうかを含むが、これらに限定されない。
【０１１１】
発現に関するＤＮＡ配列を含むようにベクターを構築するとき、例えば、形質転換、トランスフェクション、コンジュゲイション(conjugation)、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム−沈降、直接マイクロインジェクションなどを含むが、これらに限定されない、当分野で既知の１つ以上の種々の適当な方法により、適当な宿主細胞に導入され得る。
【０１１２】
宿主細胞は原核生物または真核生物のいずれかであり得る。真核生物宿主細胞の例は、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト、サル、マウスおよびチャイニーズハムスター（ＣＨＯ）細胞を含む。このような細胞は、例えば、正しいフォールディングまたはグリコシル化を含むタンパク質の翻訳後修飾を容易にする。さらに、酵母細胞も本発明の融合ポリペプチドを発現するために使用することができる。多くの哺乳動物細胞のように、酵母細胞も、例えば、グリコシル化を含むタンパク質の翻訳後修飾を可能にする。酵母菌におけるタンパク質の生産のために利用することができる強いプロモーター配列および高コピー数プラスミドのどれを利用するかにおいては、多くの組換えＤＮＡ戦略が存在する。酵母菌の転写および翻訳機構は、クローニングされた哺乳動物の遺伝子産物におけるリーダー配列を認識することができ、それによりリーダー配列を有するペプチド（すなわち、前−ペプチド）の分泌を可能にする。本発明の融合ポリペプチドの高収率生産の特に好ましい方法は、ＤＨＦＲ−欠損ＣＨＯ細胞におけるジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）増幅の使用を介して、米国特許第４，８８９，８０３号に記載されているメトトレキサートのレベルの連続的な増加の使用によるものである。得られたポリペプチドをグリコシル化してもよい。
【０１１３】
１つ以上のベクターの導入後、宿主細胞を、通常、ベクター含有細胞の増殖を選択する選択培地中で増殖させる。組換えタンパク質の精製は、当分野で既知の、または本明細書に記載されているいずれかの方法、例えば、抽出、沈降、クロマトグラフィーおよび電気泳動法に関するいずれかの慣用の方法により実施することができる。タンパク質を精製するために使用され得るさらなる精製方法は、標的タンパク質を結合するモノクローナル抗体を使用するアフィニティークロマトグラフィーである。一般的に、組換えタンパク質を含む粗製造物を、適当なモノクローナル抗体が固定されているカラムに通過させる。不純物は通過するが、タンパク質は、通常、特異的な抗体を介してカラムに結合する。カラムを洗浄後、タンパク質を、例えば、ｐＨまたはイオン強度を変化させることにより、ゲルから溶離する。
【０１１４】
４．４．融合ポリペプチド活性を評価するためのアッセイ
本明細書に記載されているアッセイ（実施例２、参照）および当分野で既知のものを、本発明の融合ポリペプチドのクロトーまたはＦＧＦ活性を検出するために使用することができる。適当な活性アッセイは受容体結合アッセイ、細胞増殖アッセイおよび細胞シグナル伝達アッセイを含む。例えば、融合ポリペプチドがクロトーまたはＦＧＦ活性を有するか否かを測定するために使用され得る結合アッセイは、融合ポリペプチドのＦＧＦ受容体への結合をアッセイすることを含む。ＦＧＦ受容体結合アッセイは、競合および非競合アッセイ両方を含むが、これらに限定されない。例えば、ＦＧＦ受容体結合は、ＦＧＦ受容体を発現する細胞を標識ＦＧＦ（例えば、放射性標識）と接触させ、非標識クロトー−ＦＧＦ融合ポリペプチドの濃度を増加させることにより検出することができる。同じ受容体への結合に対して競合する２つのリガンドを、細胞を含む反応混合物に加える。次に細胞を洗浄し、標識ＦＧＦを測定する。非標識融合ポリペプチドの存在下で受容体に対する標識ＦＧＦの量の減少は、受容体へのクロトー−ＦＧＦ融合ポリペプチドの結合を示す。あるいは、クロトー−ＦＧＦ融合ポリペプチドを標識し、細胞への融合ポリペプチドの直接結合を検出してもよい。
【０１１５】
クロトーまたはＦＧＦ活性は、また、融合ポリペプチドが細胞応答を誘導するか否かを決定することにより測定することができる。例えば、いくつかの態様において、クロトー−ＦＧＦ融合ポリペプチドの生物学的活性を検出するためのアッセイは、ＦＧＦ受容体を発現する細胞を融合ポリペプチドと接触させ、細胞応答、例えば、細胞増殖またはＥｇｒ−１活性化、Ｃ２Ｃ１２細胞における筋管直径をアッセイし、融合ポリペプチドの存在および非存在下で細胞応答を比較することを含む。融合ポリペプチド複合体の非存在下と比較して融合ポリペプチド複合体の存在下での細胞応答の増加は、融合ポリペプチドが生物学的活性を有することを示す。また、受容体からの下流シグナル伝達事象の増加も、生物学的活性（例えば、ＦＧＦＲ、ＦＲＳ２、ＥＲＫ１／２、ｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化など）の証拠として、測定することができる。
【０１１６】
４．５  医薬組成物および処置法
本発明は、また、１つ以上の本発明の融合ポリペプチドおよび薬学的に許容される希釈剤または担体を含む医薬組成物に関する。該医薬組成物は薬学的に有効量のヘパリンをさらに含むことができる。このような医薬組成物はキットまたは容器に含まれ得る。このようなキットまたは容器は、融合ポリペプチドのインビボ半減期またはインビトロ寿命の延長に関する指示書と共にパッケージされていてもよい。所望により関連して、このようなキットまたは容器は、医薬または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する行政機関により指示されている形での通知であってよく、この通知は、ヒト投与のための製造、使用または販売の代理店による支持を表す。このような組成物は、医薬組成物を患者に投与することにより、患者、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおける疾患または疾患症状（例えば、加齢関連状態または代謝障害）を処置、予防または改善する方法において使用され得る。
【０１１７】
一般的に、本発明の医薬組成物の治療有効量は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇから０．００１ｍｇ／ｋｇ；０．００１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ体重または約０．０２ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ体重である。一般的に、融合ポリペプチドの治療有効量は、例えば、約０．００１ｍｇから約０．０１ｍｇ、約０．０１ｍｇから約１００ｍｇまたは約１００ｍｇから約１０００ｍｇである。好ましくは、融合ポリペプチドの治療有効量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇから２ｍｇ／ｋｇである。
【０１１８】
融合ポリペプチドに関する最適な医薬製剤は、投与経路および望ましい用量に依存して当業者により決定することができる（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Pa.、参照、この文献の全体を出典明示により本明細書に包含させる）。
【０１１９】
本発明の融合ポリペプチドは、固体、液体または気体（エアロゾル）の形態であってよい医薬組成物として投与され得る。典型的な投与経路は、経口、局所、非経腸、舌下、経直腸、膣、皮内および鼻腔内を含むが、これらに限定されない。非経腸投与は、皮下注射、静脈内、筋肉内、腹膜内、胸膜内、胸骨内注射または注入技術を含む。好ましくは、組成物は非経腸的に投与される。さらに好ましくは、組成物は静脈内に投与される。本発明のポリペプチドが対象への組成物の投与時に生物学的に利用可能にするように、本発明の医薬組成物を処方することができる。例えば、錠剤が単一の投与単位であり、エアロゾル形態の本発明のポリペプチドの容器が複数の投与単位を入れることができるとき、組成物は１つ以上の投与単位の形態を取ることができる。
【０１２０】
医薬組成物の製造において使用される物質は使用される量において非毒性であり得る。医薬組成物における活性成分の最適な用量が種々の因子に依存することは当業者に明らかである。関連因子は、対象の型（例えば、ヒト）、対象の健康全般、処置の必要な対象の加齢関連状態または代謝障害の型、多剤レジメンの一部としての組成物の使用、本発明のポリペプチドの特定の形態、投与様式および使用される組成物を含むが、これらに限定されない。
【０１２１】
薬学的に許容される担体またはビヒクルは、組成物が、例えば、錠剤または粉末形態で存在できるような粒子であり得る。担体は、例えば、経口シロップまたは注射可能な液体である組成物と共に液体であり得る。加えて、担体は、例えば、吸入投与に有用なエアロゾル組成物を提供するために気体であり得る。
【０１２２】
“担体”なる用語は、本発明のポリペプチドと一緒に投与される希釈剤、アジュバントまたは賦形剤を示す。このような医薬担体は、液体、例えば、水および油（石油、動物性、植物性または合成のものを含む）、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などであり得る。担体は、塩水、アカシア・ゴム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイダルシリカ、ウレアなどであり得る。加えて、補助剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤および着色剤を使用することができる。１つの態様において、対象に投与されるとき、本発明のポリペプチドおよび薬学的に許容される担体は滅菌される。本発明のポリペプチドが静脈内投与されるとき、水は好ましい担体である。塩水および水性デキストロースおよびグリセロール溶液は、また、液体担体、特に注射可能溶液として使用され得る。適当な医薬担体は、また、賦形剤、例えば、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、ライス、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを含む。望ましいとき、本組成物は少量の湿潤剤もしくは乳化剤またはｐＨ緩衝剤を含み得る。
【０１２３】
組成物は、経口投与用であり得、そのとき、組成物は好ましくは固体または液体形態であり、半固体、半液体、懸濁液およびゲル形態が本明細書において固体または液体のいずれかとして考慮される形態内に含まれる。
【０１２４】
経口投与用の固体組成物として、組成物は、粉末、顆粒、圧縮錠剤、錠剤、カプセル、チューインガム、ウエハースなどの形態に製剤化することができる。このような固体組成物は一般的に１つ以上の不活性な希釈剤を含む。加えて、１つ以上の以下のものが存在し得る：結合剤、例えば、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、微結晶性セルロースまたはゼラチン；賦形剤、例えば、デンプン、ラクトースまたはデキストリン、崩壊剤、例えば、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、プリモゲル、コーンデンプンなど；滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはステロテックス；流動促進剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えば、スクロースまたはサッカリン、香味剤、例えば、ペパーミント、サルチル酸メチルまたはオレンジ香味剤、ならびに着色剤。
【０１２５】
医薬組成物がカプセル、例えば、ゼラチンカプセルの形態であるとき、医薬組成物は、上記の型の物質に加えて、液体担体、例えば、ポリエチレングリコール、シクロデキストリンまたは脂肪油を含むことができる。
【０１２６】
医薬組成物は液体の形態、例えば、エリキシル、シロップ、溶液、エマルジョンまたは懸濁液であり得る。液体は経口投与または注射による送達のために有用であり得る。経口投与用のとき、組成物は１つ以上の甘味剤、防腐剤、色素／着色料および香味料を含み得る。注射による投与用の組成物において、また、１つ以上の界面活性剤、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、緩衝剤、安定剤および等張剤を含み得る。
【０１２７】
溶液、懸濁液または他の形態であろうとなかろうと、本発明の液体組成物は、また、１つ以上の以下のものを含むことができる：滅菌希釈剤、例えば、注射用水、塩水溶液、好ましくは生理食塩水、リンガー溶液、等張塩化ナトリウム、固定油、例えば、溶媒または懸濁媒体として働くことができる合成モノもしくはジグリセリド、ポリエチレングリコール、グリセリン、シクロデキストリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸；緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩および等張化剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース。非経腸用の組成物は、ガラス、プラスチックまたは他の物質製であるアンプル、使い捨て注射器または複数回バイアルに包まれていてもよい。生理食塩水は好ましいアジュバントである。注射可能な組成物は好ましくは滅菌である。
【０１２８】
医薬組成物は、適当な用量が得られる有効量の本発明の化合物（例えば、融合ポリペプチド）を含む。医薬組成物は、それぞれの障害に対して現在処方されている既知の有効量の化合物を含み得る。
【０１２９】
加齢関連状態または代謝障害の予防、処置および／または管理において有効である予防および／または治療レジメンにおいて使用される本発明のポリペプチドの投与経路は、当分野で既知の他の治療に対して現在処方されている投与形路に基づくことができる。本発明のポリペプチドは、任意の便利な経路、例えば、注入またはボーラス注射により、上皮性または皮膚粘膜裏当てを介する吸収（例えば、経口粘膜、経直腸および腸粘膜など）により投与することができる。投与は全身的または局所的であり得る。種々の送達系は、例えば、マイクロ粒子、マイクロカプセル、カプセルなどが知られており、本発明のポリペプチドを投与するために有用であり得る。１つ以上の本発明のポリペプチドが対象に投与され得る。投与の方法は、経口投与および非経腸投与；皮内、筋肉内、腹膜内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、舌下、鼻腔内、大脳内、脳室内、髄腔内、膣内、経皮を含むが、これらに限定されない非経腸投与、経直腸的、吸入による、または、眼、鼻、耳または皮膚への局所的を含むが、これらに限定されない。
【０１３０】
本発明のポリペプチドは非経腸的に投与され得る。具体的には、本発明のポリペプチドは静脈内に投与され得る。
【０１３１】
肺投与は、また、例えば、吸入器または噴霧器、およびエアロゾル剤との製剤の使用により、またはフルオロ炭素または合成肺界面活性剤でのかん流を介して、使用することができる。本発明のポリペプチドは、また、伝統的な結合剤および担体、例えば、トリグリセリドと一緒に坐薬として製剤化することができる。
【０１３２】
本発明のポリペプチドは制御放出系において送達することができる。例えば、ポンプを使用することができる（Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 1987, 14, 201; Buchwald et al., Surgery 1980, 88: 507; Saudek et al., N. Engl. J. Med. 1989, 321: 574、参照）。ポリマー物質も、本発明のポリペプチドの制御放出のために使用することができる（Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, FL, 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York, 1984; Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 1983, 23, 61、参照；Levy et al., Science 1985, 228, 190; During et al., Ann. Neurol., 1989, 25, 351; Howard et al., J. Neurosurg., 1989, 71, 105も参照）。具体的には、制御放出系を、本発明のポリペプチドの標的、例えば、脳の近接に置き、必要な量を全身投与量に対してほんのわずかにできる（例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, 1984, pp. 115-138、参照）。Ｌａｎｇｅｒによる文献（Science 1990, 249, 1527-1533）において論じられている他の制御放出系を使用することができる。
【０１３３】
本発明のポリペプチドの制御または持続放出を達成するために使用されるポリマー物質は、例えば、米国特許第５，６７９，３７７号；米国特許第５，９１６，５９７号；米国特許第５，９１２，０１５号；米国特許第５，９８９，４６３号；米国特許第５，１２８，３２６号；ＰＣＴ公開ＷＯ９９／１５１５４；およびＰＣＴ公開ＷＯ９９／２０２５３において記載されている。持続放出製剤において使用されるポリマーの例は、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−コ−ビニルアセテート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ酸無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）およびポリオルトエステルを含むが、これらに限定されない。好ましくは、持続放出製剤において使用されるポリマーは、不活性、浸出される不純物なし、保存に安定、滅菌かつ生分解性である。
【０１３４】
一般的に、本発明の医薬組成物の治療有効量は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇから０．００１ｍｇ／ｋｇ；０．００１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ体重または約０．０２ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０１３５】
他の態様において、予防および／または治療レジメンは、少なくとも０．０１μｇ／ｍＬから少なくとも４００μｇ／ｍＬの本発明のポリペプチドの血漿レベルを達成する、有効量の本発明のポリペプチドを患者に１回以上投与することを含む。
【０１３６】
予防および／または治療レジメンは、少なくとも０．０１μｇ／ｍＬから４００μｇ／ｍＬの本発明のポリペプチドの血漿レベルを維持する、有効量の本発明のポリペプチドを患者へ複数回投与することを含み得る。予防および／または治療レジメンにて、少なくとも１日、１月、２月、３月、４月、５月、６月、７月、８月または９月間投与され得る。
【０１３７】
予防および／または治療レジメンは、１つ以上のさらなる治療と組み合わせての本発明のポリペプチドの投与を含み得る。加齢関連状態または代謝障害の予防、処置および／または管理のために現在使用されている１つ以上の治療の推奨される用量は、Hardman et al., eds., Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis Of Basis Of Therapeutics, 10th ed., Mc-Graw-Hill, New York, 2001; Physician's Desk Reference (60th ed., 2006)（この内容を出典明示により本明細書に包含させる）を含むが、これらに限定されない当分野の参考文献から得ることができる。
【０１３８】
本発明は、クロトータンパク質およびＦＧＦのアゴニスト活性が望ましい障害を処置するための方法を含む。本発明のこのような方法の例は、加齢関連状態または代謝障害を含むが、これらに限定されない
【０１３９】
本発明は個体における加齢関連状態を処置または予防するための方法を含む。処置の必要な対象は、加齢関連状態を処置または予防するために、クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインおよび繊維芽細胞増殖因子を有する、薬理学的有効量のクロトー融合ポリペプチドを含む医薬組成物を投与される。いくつかの態様において、クロトー融合ポリペプチドは薬理学的有効量のヘパリンと共投与される。加齢関連状態はサルコペニア、皮膚萎縮、筋肉疲労、脳萎縮、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、肺気腫、骨粗鬆症、骨関節症、免疫不全、高血圧、認知症、ハンチントン病、アルツハイマー病、白内障、加齢黄斑変性症、前立腺癌、卒中、期待寿命の低下、記憶障害、しわ、腎機能障害および加齢関連難聴を含む。いくつかの態様において、クロトー融合ポリペプチドはアルファクロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外ドメインを含む。特定の態様において、アルファクロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外ドメインおよび繊維芽細胞増殖因子２３を含むクロトー融合タンパク質は、筋肉疲労に対して処置の必要な対象に投与される。
【０１４０】
本発明は、また、個体における代謝障害を処置または予防するための方法に関する。処置の必要な対象は、代謝障害を処置するために、クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインおよび繊維芽細胞増殖因子を有する、薬理学的有効量のクロトー融合ポリペプチドを含む医薬組成物を投与される。いくつかの態様において、クロトー融合ポリペプチドは薬理学的有効量のヘパリンと共投与される。該方法はＩＩ型糖尿病、メタボリック・シンドローム、高血糖および肥満の処置または予防において使用され得る。特定の態様において、ベータ−クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外ドメインおよび繊維芽細胞増殖因子２１を含むクロトー融合タンパク質は、代謝障害に対して処置の必要な対象に投与される。
【０１４１】
本発明は、また、個体における高リン血症または石灰沈着症を処置または予防するための方法を提供する。処置の必要な対象は、高リン血症または石灰沈着症を処置するために、クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインおよび繊維芽細胞増殖因子を有する、薬理学的有効量のクロトー融合ポリペプチドを含む医薬組成物を投与される。いくつかの態様において、クロトー融合ポリペプチドは薬理学的有効量のヘパリンと共投与される。特定の態様において、アルファクロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外ドメインおよび繊維芽細胞増殖因子２３を含むクロトー融合タンパク質は、高リン血症または石灰沈着症に対して処置の必要な対象に投与される。
【０１４２】
本発明は、また、個体における慢性腎臓疾患または慢性腎不全を処置または予防するための方法に関する。処置の必要な対象は、慢性腎臓疾患または慢性腎不全を処置するために、クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインおよび繊維芽細胞増殖因子を有する、薬理学的有効量のクロトー融合ポリペプチドを含む医薬組成物を投与される。いくつかの態様において、クロトー融合ポリペプチドは薬理学的有効量のヘパリンと共投与される。いくつかの態様において、アルファクロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外ドメインを含むクロトー融合タンパク質は、慢性腎臓疾患または慢性腎不全に対して処置の必要な対象に投与される。
【０１４３】
本発明は、また、個体における癌を処置または予防するための方法を含む。処置の必要な対象は、癌を処置するために、クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインおよび繊維芽細胞増殖因子を有する、薬理学的有効量のクロトー融合ポリペプチドを含む医薬組成物を投与される。該方法は乳癌の処置または予防において使用され得る。いくつかの態様において、クロトー融合ポリペプチドは薬理学的有効量のヘパリンと共投与される。いくつかの態様において、アルファクロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外ドメインを含むクロトー融合タンパク質は癌に対して処置の必要な対象に投与される。
【０１４４】
クロトー融合ポリペプチドを含む医薬組成物を投与することにより障害を処置する方法において、クロトー融合ポリペプチドはクロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインおよび繊維芽細胞増殖因子を有する。特定の態様において、クロトー融合タンパク質はベータクロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外ドメインおよび繊維芽細胞増殖因子２１を含む。
【０１４５】
クロトー融合ポリペプチド組成物は、当業者に既知の、および本明細書に記載されているいずれかの投与方法にしたがって投与され得る。投与の好ましい方法は皮下または静脈内を含む。他の有効な投与方法は本明細書に記載されている。
【０１４６】
４．６．処置法および有効性を評価するためのアッセイ方法
クロトー融合ポリペプチドを個体に投与することを提供する本発明の方法は、加齢関連障害または代謝障害を含む種々の障害を処置するために使用することができる。何らかの特定の理論に限定されることなく、クロトー／ＦＧＦ融合ポリペプチドは、クロトーまたはＦＧＦの調節異常がある障害を処置するために使用され得る。典型的な障害は代謝障害および加齢関連障害を含む。例えば、ＦＧＦ２３またはクロトーノックアウトマウス両方は、低い物理的活性、成長遅延、筋肉疲労、皮膚萎縮、アテローム性動脈硬化症、寿命の短縮などを含む種々の同様の表現型を示す（Razzaque and Lanske, J. of Endrocrinology, 194:1-10 (2007)、参照（これを出典明示により本明細書に包含させる））。
【０１４７】
特に、本発明のクロトー／ＦＧＦ２３融合ポリペプチドは、筋肉疲労を含む老化関連障害の処置において特に有用である。理論に束縛されることなく、ミネラル（例えば、リン酸塩およびカルシウム）およびビタミンＤホメオスタシスをコントロールするクロトーおよびＦＧＦ２３の能力は、これらのタンパク質が老化および筋萎縮を調節することを意味し得る。
【０１４８】
他方では、本発明のクロトー／ＦＧＦ１９融合ポリペプチドおよびクロトー／ＦＧＦ２１融合ポリペプチドは、代謝障害を処置するために使用され得る。例えば、ベータ−クロトーおよびＦＧＦ１９は、コレステロール７−α−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ７Ａ１）を調節することにより、胆汁酸ホメオスタシスをコントロールすることが示されている。胆汁ホメオスタシス障害の非限定的な例は胆汁うっ滞である。ベータ−クロトーおよびＦＧＦ２１は、脂肪細胞における脂肪分解を誘導し、したがって、脂肪貯蔵を減少させ、グルコース摂取を増加させることが示されている。脂肪分解／脂肪貯蔵障害の非限定的な例は代謝関連肥満および心臓血管疾患である。
【０１４９】
少なくとも、ＦＧＦ２３が尿におけるリン酸塩の排出を刺激することができ、それにより血清中のリン酸塩レベルを減少させる発見の一部に基づいて、本発明のクロトー−ＦＧＦ２３融合ポリペプチドは、個体における高リン血症または石灰沈着症を処置または予防するために使用することができる。例えば、患者におけるクロトーの欠損となるクロトーにおけるホモ接合型ミスセンス変異が深刻な腫瘍性石灰沈着症および動脈石灰化を引き起こし得ることが示されている（Ichikawa et al., J. Clin. Invest. 117:2684-2691 (2007)（これを出典明示により本明細書に包含させる））。個体は、高リン血症または石灰沈着症を処置または予防するために、クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインおよび繊維芽細胞増殖因子を有する、薬理学的有効量のクロトー融合ポリペプチドを含む医薬組成物を投与される。特に、アルファクロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外ドメインおよび繊維芽細胞増殖因子を含むクロトー融合ポリペプチドは、高リン血症または石灰沈着症を処置するために有用である。
【０１５０】
本発明のクロトー融合ポリペプチドは、また、個体における慢性腎臓疾患または慢性腎不全を処置または予防するために使用され得る。例えば、クロトー発現が、慢性腎不全を有さない患者の腎臓と比較して、慢性腎不全を有する患者の腎臓において減少していることが示されている（Koh et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 280:1015-1020 (2001)（これを出典明示により本明細書に包含させる））。個体は、慢性腎臓疾患または慢性腎不全を処置または予防するために、クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインおよび繊維芽細胞増殖因子を有する、薬理学的有効量のクロトー融合ポリペプチドを含む医薬組成物を投与される。特に、アルファクロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外ドメインを含むクロトー融合ポリペプチドは慢性腎臓疾患または慢性腎不全を処置するために有用である。
【０１５１】
本発明のクロトー融合ポリペプチドは、また、個体における癌を処置または予防するために使用され得る。例えば、クロトー発現が、正常乳癌組織と比較して、乳癌組織において減少していることが示されている（Wolf et al., Oncogene (2008)オンライン先行出版（これを出典明示により包含させる））。個体は、癌または乳癌を処置または予防するために、クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインおよび繊維芽細胞増殖因子を有する、薬理学的有効量のクロトー融合ポリペプチドを含む医薬組成物を投与される。特に、アルファクロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外ドメインを含むクロトー融合タンパク質は癌または乳癌を処置するために有用である。
【０１５２】
加齢関連障害または代謝障害における本発明のクロトー融合ポリペプチドの有効性を評価する、および／または有効量を決定するための方法は、例えば、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、霊長類またはいくつかの他の非ヒト）または他の動物（例えば、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュまたは無脊椎動物、例えば、昆虫または線虫）を使用する生物ベースアッセイを含む。クロトー融合ポリペプチドは、１回またはレジメン（定期的または不規則的）のとおりに生物体に投与することができる。次に生物体のパラメーター、例えば、加齢関連パラメーターを評価する。興味あるクロトー融合ポリペプチドは、参照、例えば、コントロール生物体のパラメーターと比較して、パラメーターにおける変化をもたらす。他のパラメーター（例えば、毒性、クリアランスおよび薬物動態学に関連する）も評価され得る。
【０１５３】
本発明のクロトー融合ポリペプチドは、特定の障害、例えば、本明細書に記載されている障害、例えば、加齢関連障害、代謝障害を有する動物を使用して、評価され得る。これらの障害は、また、生理学における試験ポリペプチドの効果を観察することができる感受性の系を提供することができる。典型的な障害は、脱神経、廃用性萎縮；代謝障害（例えば、肥満および／または糖尿病動物、例えば、ｄｂ／ｄｂマウスおよびｏｂ／ｏｂマウスの障害）；脳、肝臓虚血；シスプラチン／タキソール／ビンクリスチンモデル；種々の組織（異種移植）移植物；トランスジェニック骨モデル；疼痛症候群（炎症性および神経障害を含む）；パラコート、遺伝毒性および酸化ストレスモデル；および腫瘍Ｉモデルを含む。
【０１５４】
加齢関連障害を測定するために、動物モデルはカロリー制限されたときに変化した表現型を有する動物であり得る。例えば、Ｆ３４４ラットは、クロトー融合ポリペプチドを評価するために有用なアッセイ系を提供する。カロリー制限されたとき、Ｆ３４４ラットはネフロパシーに対して０から１０％の発生率を有する。しかしながら、自由食餌のとき、それらはネフロパシーに対して６０から１００％の発生率を有する。
【０１５５】
本発明のクロトー融合ポリペプチドを評価するために、それを動物（例えば、Ｆ３４４ラットまたは他の適当な動物）に投与し、動物のパラメーターを、例えば、期間後に評価する。動物は自由食餌または通常であり得る（例えば、カロリー制限下ではないが、いくつかのパラメーターはこのような条件下で評価することができる）。一般的に、このような動物のコホートはアッセイのために使用される。一般的に、試験ポリペプチドがカロリー制限と同様の動物対象の表現型の方向におけるパラメーターに作用するとき、試験ポリペプチドは動物における寿命調節を好ましく変化させるものとして示すことができる。このような試験ポリペプチドは、生物体からカロリー摂取を奪うことなく、少なくともいくつかのカロリー制限の寿命調節効果、例えば、このような効果の一部をもたらし得る。
【０１５６】
試験すべきパラメーターは、年齢関連または疾患関連パラメーター、例えば、動物モデルと関連する障害の症状であり得る。例えば、試験ポリペプチドをＳＨラットに投与することができ、血圧をモニタリングする。好ましいと示される試験ポリペプチドは、該ポリペプチドで処理されていない同様の参照動物と比較して、症状の改善を引き起こすことができる。障害または老化に関連する他のパラメーターは、抗酸化レベル（例えば、抗酸化酵素レベルまたは活性）、ストレス抵抗性（例えば、パラコート抵抗性）、中核温、グルコースレベル、インスリンレベル、甲状腺−刺激ホルモンレベル、プロラクチンレベルおよび黄体形成ホルモンレベルを含み得る。
【０１５７】
加齢関連障害を処置するための本発明のポリペプチドの有効性を測定するために、減少したクロトー発現を有する動物が使用され得る、例えば、変異クロトーを有するマウス；Kuroo, et al. Nature, 390; 45 (1997)およびU.S. Pub. No. 2003/0119910、参照（これら両方をそれら全体において出典明示により本明細書に包含させる）。例えば、試験ポリペプチドを変異マウスに投与し、加齢関連パラメーターをモニタリングする。好ましいと示される試験ポリペプチドは、該ポリペプチドで処理されていない同様の参照動物と比較して、症状の改善を引き起こすことができる。代謝障害または老化に関連するパラメーターは、体重の測定、生殖能力の獲得の検査、血糖レベルの測定、寿命の観察、皮膚の観察、歩行のような運動機能の観察などにより評価することができる。評価は、また、胸腺体重の測定、胸腔の内面上に形成された石灰化結節のサイズの観察などにより作ることができる。さらに、クロトー遺伝子またはクロトータンパク質に対するｍＲＮＡの定量も評価のために有用である。
【０１５８】
さらに、他のインビボモデルおよび生物アッセイは、代謝パラメーター、例えば、インスリン障害、ＩＩ型糖尿病に関連するパラメーターに対して動物を評価することを含む。典型的な代謝パラメーターは、グルコース濃度、インスリン濃度およびインスリン感受性を含む。
【０１５９】
別の典型的な系は、例えば、動物モデルにおける腫瘍を特徴とする。腫瘍は自発的なものまたは誘導されたものであり得る。例えば、腫瘍は例えば、ｐ５３＋またはｐ５３−であり得る種々の遺伝的構成を有する細胞から発生し得る。自己免疫性障害である生物体、例えば、ＳＬＥにかかりやすいＮＺＢマウスを使用することも可能である。骨疾患の特徴を評価するために、例えば、骨粗鬆症におけるモデルとして卵巣摘出した動物を使用することが可能である。同様に、関節疾患において、モデルはアジュバント関節炎に基づき（例えば、マウスが軟骨プロテオグリカン、高移動度グループタンパク質、連鎖球菌細胞壁物質またはコラーゲンの免疫を有し得る）；腎臓疾患において、ｋｄ／ｋｄマウスを使用することができる。認知、特に学習および記憶の動物モデルも利用することができる。糖尿病およびその合併症の動物モデル、例えば、ストレプトゾトシンモデルも利用することができる。イヌモデルを、例えば、卒中および虚血を評価するために使用することができる。
【０１６０】
試験ポリペプチドが寿命調節を変化することができるか否かの評価において、多くの加齢関連パラメーターまたはバイオマーカーをモニタリングまたは評価することができる。典型的な加齢関連パラメーターは、（ｉ）細胞または生物体の寿命；（ｉｉ）生物学的加齢依存発現パターンを有する細胞または生物体における遺伝子転写物または遺伝子産物の存在または不存在；（ｉｉｉ）ストレスに対する細胞または生物体の抵抗性；（ｉｖ）細胞または生物体の１つ以上の代謝パラメーター（典型的なパラメーターは循環インスリンレベル、血中グルコースレベル；脂肪含有量；中核温などを含む）；（ｖ）細胞または生物体に存在する複数の細胞の増殖能；および（ｖｉ）細胞または生物体の外見または挙動を含む。
【０１６１】
“平均寿命”なる用語は、生物体のコホートの死の年齢の平均を意味する。いくつかの場合において、“平均寿命”は、コントロール環境条件下で、遺伝的に同一の生物体のコホートを使用して評価される。事故による死は除外される。平均寿命がコントロール環境条件下で決定できないとき（例えば、ヒト）、十分に大きな母集団に対する信頼性のある統計情報（例えば、保険数理表から）を平均寿命として使用することができる。
【０１６２】
２つのこのような生物体、例えば、１つの参照生物体およびクロトー融合ポリペプチドで処理された１つの生物体間の分子差の特徴付けは、生物体の生理学的状態における違いを示すことができる。参照生物体および処理された生物体は、一般的に同じ実年齢である。本明細書において使用される“実年齢”なる用語は、あらかじめ選択された事象、例えば、受胎、定義されている胎生または胎児期、または、さらに好ましくは、出生からの経過時間を示す。生物体が比較分析のための“同じ”実年齢であるかどうかを決定するために、種々の基準が使用することができる。一般的に、必要とされる精度の程度は、野生型生物体の平均寿命と相関関係である。例えば、実験室野生型株Ｎ２がいくつかのコントロール条件下で平均約１６日間生存する線虫シー・エレガンスにおいて、同じ年齢の生物体は同じ日数の生存であってよい。マウスに関して、同じ年齢の生物体は、同じ週または月数；霊長類またはヒトに関して、同じ年数（または２、３または５年以内）などの生存であってよい。一般的に、同じ実年齢の生物体は、その種の野生型生物体の平均寿命の１５、１０、５、３、２または１％以内の時間の生存であってよい。好ましくは、生物体は成体であり、例えば、生物体は、少なくとも平均野生型生物体が繁殖能を有する齢に成熟する時間生存している。
【０１６３】
生物スクリーニングアッセイは、生物体が老化の明白な物理的特徴を示す前に実施することができる。例えば、生物体は、同じ種の野生型生物体の平均寿命の１０、３０、４０、５０、６０または７０％だけ生存した成体であり得る。代謝、免疫能力および染色体構造における加齢関連変化が報告されている。あらゆるこれらの変化を、試験対象（例えば、生物体ベースアッセイにおける）または患者（例えば、本明細書に記載されている治療処置の前、中または後）のいずれかに対して評価することができる。
【０１６４】
カロリー制限と関連するマーカーは、また、スクリーニングアッセイの対象生物体（または処置される対象）を評価することができる。これらのマーカーは加齢関連ではないかもしれないが、それらはクロトー経路が調節されるとき、変化する生理学的状態を示し得る。マーカーはｍＲＮＡまたはタンパク質であってよく、これらの多くはカロリー制限された動物において変化する。ＷＯ０１／１２８５１および米国特許第６，４０６、８５３号は典型的なマーカーを記載している。本明細書に記載されている動物細胞由来の細胞モデルまたは本明細書に記載されている動物モデルの類似物を細胞ベースアッセイのために使用することができる。
【０１６５】
筋萎縮における試験ポリペプチドの効果を評価するためのモデルは、１）例えば、中部の腿で右坐骨神経を切断することによる脱神経から生じるラット内側腓腹筋の筋肉量喪失；２）固定、例えば、９０度の屈曲で固定された右足関節から生じるラット内側腓腹筋の筋肉量喪失；３）後肢懸垂から生じるラット内側腓腹筋の筋肉量喪失（例えば、米国２００３−０１２９６８６、参照）；４）悪液質サイトカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）での処理から生じる骨格筋萎縮（R. N. Cooney, S. R. Kimball, T. C. Vary, Shock 7, 1-16 (1997)）；および５）グルココルチコイド、デキサメタゾンでの処理から生じる骨格筋萎縮（A. L. Goldberg, J Biol Chem 244, 3223-9 (1969)）を含む。
【０１６６】
ＡＭＤに対する典型的な動物モデルは、滲出性（湿性）黄斑変性症を模倣するレーザー−誘導マウスモデル  Bora et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 100:2679-84 (2003)；ＡＭＤの“地図状萎縮”型と関連する特徴となるカテプシンＤの変異型を発現するトランスジェニックマウス（Rakoczy et al., Am. J. Pathol., 161:1515-24 (2002)）；およびＣＮＶとなる網膜色素上皮においてＶＥＧＦを過剰発現するトランスジェニックマウスSchwesinger et al., Am. J. Pathol. 158:1161-72 (2001)を含む。
【０１６７】
パーキンソン病の典型的な動物モデルは、ドーパミン神経毒１−メチル−４フェニル１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）での処理によりパーキンソン病になった霊長類（以下参照、例えば、米国特許公開第２００３００５５２３１号およびWichmann et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 991:199-213 (2003)；６−ヒドロキシドーパミン−障害ラット（例えば、Lab. Anim. Sci.,49:363-71 (1999)）；およびトランスジェニック無脊椎動物モデル（例えば、Lakso et al., J. Neurochem. 86:165-72 (2003)およびLink, Mech. Ageing Dev., 122:1639-49 (2001)）を含む。
【０１６８】
ＩＩ型糖尿病の典型的な分子モデルは、欠損Ｎｋｘ−２．２またはＮｋｘ−６．１を有するトランスジェニックマウス；（米国特許第６，１２７，５９８号）；ズッカー糖尿病肥満ｆａ／ｆａ（ＺＤＦ）ラット（米国特許第６，５６９，８３２号）；および自発的に肥満を発症し、次に頻繁に明白な２型糖尿病に進行するアカゲザル（Hotta et al., Diabets, 50:1126-33 (2001)；および２型糖尿病−様インスリン抵抗性を有するドミナント・ネガティブＩＧＦ−Ｉ受容体（ＫＲ−ＩＧＦ−ＩＲ）を有するトランスジェニックマウスを含む。
【０１６９】
ニューロパシーに対する典型的な動物および細胞モデルは、マウス（米国特許第５，４２０，１１２号）またはウサギ（Ogawa et al., Neurotoxicology, 21:501-11 (2000)）におけるビンクリスチン誘導感覚運動ニューロパシー；自律性ニューロパシーの試験のためのストレプトゾトシン（ＳＴＺ）−糖尿病ラット（Schmidt et al., Am. J. Pathol., 163:21-8 (2003)）；および進行性運動ニューロパシー（ｐｍｎ）マウス（Martin et al., genomics, 75:9-16 (2001)）を含む。
【０１７０】
高リン血症または腫瘍性石灰沈着症の典型的な動物モデルは、クロトーノックアウトマウスおよびＦＧＦ２３ノックアウトマウス（Yoshida et al., Endocrinology 143:683-689 (2002)）を含む。
【０１７１】
慢性腎臓疾患または慢性腎不全の典型的な動物モデルは、ＣＯＬ４Ａ３＋／−マウス（Beirowski et al., J. Am. Soc. Nephrol. 17:1986-1994 (2006)）を含む。
【０１７２】
癌の典型的な動物モデルは、当分野で既知であるヌードマウスへの癌細胞または組織の移植または注入を含む（Giovanella et al., Adv. Cancer Res. 44:69-120 (1985)）。例えば、乳癌の動物モデルは、乳癌細胞または組織を移植または注入されたヌードマウスを含む（例えば、Yue et al., Cancer Res. 54:5092-5095 (1994); Glinsky et al., Cancer Res. 56:5319-5324 (1996); Visonneau Am. J. Path. 152:1299-1311 (1998)）。
【０１７３】
当該組成物は、対象、例えば、成体対象、特に健康な成体対象または加齢関連疾患を有する対象に投与することができる。後者の場合、当該方法は、例えば、加齢関連疾患の症状または他の疾患のマーカーを特徴付けるために対象を評価し、それにより神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病または加齢関連疾患を有するか、またはこのような疾患になりやすい対象を同定することができる。
【０１７４】
骨格筋萎縮
クロトー融合ポリペプチドを個体に投与することを提供する本発明の方法は、骨格筋萎縮を処置するために使用することができる。筋萎縮は、多数の神経筋、代謝、免疫および神経障害および疾患ならびに飢餓、栄養欠損、代謝ストレス、糖尿病、老化、筋ジストロフィーまたはミオパシーを含む。筋萎縮は老化プロセス中に起こる。筋萎縮は、また、筋肉の使用の減少または不使用による。症状は骨格筋組織量の減少で引き起こされる。ヒト男性において、筋肉量は５０から８０齢の間に１／３に減少する。筋萎縮のいくつかの分子特徴は、ユビキチンリガーゼの上方調節および筋原線維タンパク質の喪失を含む（Furuno et al. , J. Biol. Chem., 265:8550-8557, 1990）。これらのタンパク質の崩壊は、例えば、アクチンの特異的成分であり、ミオシンの特定の筋肉中の３−メチル−ヒスチジン生産を測定することによって追跡することができる（Goodman, Biochem. J. 241:121-12, 1987 and Lowell, et al., Metabolism, 35:1121-112, 1986; Stein and Schluter, Am. J. Physiol. Endocrinol.Metab. 272: E688-E696, 1997）。クレアチンキナーゼの放出（細胞損傷マーカー）（Jackson, et al., Neurology, 41: 101 104, 1991）も示され得る。
【０１７５】
非−インスリン−依存糖尿病
クロトー融合ポリペプチドを個体に投与することを提供する本発明の方法は、非−インスリン−依存糖尿病を処置するために使用することができる。非−インスリン−依存糖尿病は、“成人発症型”糖尿病および２型糖尿病とも呼ばれる。２型糖尿病は、また、“非−２型肥満”および“２型肥満”を含む。ＩＩ型糖尿病は、（１）血中グルコースレベルバランスを維持するために必要な量未満のインスリンが生産される、膵臓−ベータ−島−細胞のインスリンの分泌の減少、および／または（２）体がインスリンに正常に応答しない“インスリン抵抗性”（米国特許第５，２６６，５６１号および米国特許第６，５１８，０６９号）により特徴付けることができる。例えば、グルコース−刺激インスリンレベルは、一般的に４．０ｎｍｏｌ／Ｌ以上に上がらない（米国特許第５，２６６，５６１号）。典型的なＩＩ型糖尿病の症状は、空腹時の高血糖（米国特許第５，２６６，５６１号）；疲労；過度の口渇；頻尿；視力障害；および感染率の増加を含む。ＩＩ型糖尿病の指標は膵島のアミロイド沈着を含む。
【０１７６】
ニューロパシー
ニューロパシーは、運動、感覚、感覚運動または自律神経を冒す全身性疾患、遺伝性疾患または毒物により引き起こされる中枢および／または末梢神経機能障害を含み得る（例えば、米国特許出願第２００３００１３７７１号、参照）。症状は神経損傷の原因および冒されている神経の特定の型に依存して変化し得る。例えば、運動ニューロパシーの症状は、物理的仕事を行うまたは筋力低下におけるぎこちなさ、軽い運動後の極度の疲労、立位または歩行の困難および神経筋反射の減衰または欠損を含む（米国特許出願第２００３００１３７７１号）。自律性ニューロパシーの症状は便秘、心臓の不規則性および姿勢低血圧反射の減衰を含む（米国特許出願第２００３００１３７７１号）。感覚ニューロパシーの症状は疼痛および無感覚；手、脚または足のチクチク感；ならびに接触に対する極端な感度を含み、網膜症の症状は視力障害、突然の失明、黒斑および点滅状態を含む。
【０１７７】
アルツハイマー病
クロトー融合ポリペプチドを個体に投与することを提供する本発明の方法は、アルツハイマー病（ＡＤ）を処置するために使用することができる。アルツハイマー病は、ニューロンの不可逆性喪失を引き起こす複雑な神経変性疾患である。それは、加齢関連状態でもある神経変性疾患の単に１つの例を提供する。アルツハイマー病の臨床的特徴は、記憶、判断、周りの物理的方向、および言語における進行性の障害を含む。ＡＤの神経病理学的特徴は領域特異的なニューロン脱落、アミロイド斑および神経原線維変化を含む。アミロイド斑は、８−アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰとしても既知）の分解産物であるアミロイドペプチド（ＡｐまたはＡｐ４２としても既知）を含む細胞外の斑である。神経原線維変化は異常に高リン酸化された微小管関連タンパク質のフィラメントから構成される不溶性細胞内凝集体であり、ｔａｕｔアミロイド斑および神経原線維変化はアポトーシスによりニューロン脱落となる二次事象に寄与し得る（Clark and Karlawish, Ann. Intern. Med. 138(5):400-410 (2003)）。例えば、ｐ−アミロイドは培養されたニューロンにおいてカスパーゼ−２−依存アポトーシスを誘導する（Troy et al. J Neurosci. 20(4):1386-1392）。斑の沈着は、in vivaで、同様の様式において近位ニューロンのアポトーシスを誘導し得る。
【０１７８】
遺伝学、生化学、生理学的および認知基準を含む種々の基準を、対象におけるＡＤを評価するために使用することができる。ＡＤの症状および診断は医師に知られている。ＡＤのいくつかの典型的な症状およびマーカーは以下のものである。これらの徴候およびＡＤと関連することが知られている他の徴候についての情報を、“ＡＤ関連パラメーター”として使用することができる。ＡＤ関連パラメーターは定性的または定量的情報を含むことができる。定量的情報の例は、１つ以上の特徴の数値、例えば、タンパク質の濃度または断層マップである。定性的情報は評価、例えば、医師のコメントまたは二者択一（“イエス”／“ノー”）などを含むことができる。ＡＤ−関連パラメーターは、対象がＡＤと診断されないか、またはＡＤの特定の徴候を有さないことを示す情報、例えば、典型的なＡＤの典型ではない認知試験結果、またはＡＤと関連しない遺伝的なＡＰＯＥ多型を含む。
【０１７９】
進行性の認識機能障害はＡＤの特徴である。この障害は、記憶、判断、意思決定、周りの物理的方向および言語の減衰として現れ得る（Nussbaum and Ellis, New Eng J. Med. 348(14):1356 35 1364 (2003)）。他の型の認知症の排除はＡＤの診断に役立てることができる。神経細胞死は、ＡＤ患者における進行性の脳萎縮を引き起こす。映像技術（例えば、磁気共鳴映像法またはコンピューター断層撮影）は、脳におけるＡＤ関連病変および／または脳萎縮を検出するために使用することができる。
【０１８０】
ＡＤ患者は疾患の病状によって生じる生化学的異常を示し得る。例えば、脳脊髄液におけるタウタンパク質のレベルはＡＤ患者において高まる（Andreasen, N. et al. Arch Neurol. 58:349-350 (2001)）。
【０１８１】
アミロイドベータ４２（Ａ，Ｂ４２）ペプチドのレベルは、ＡＤ患者のＣＳＦにおいて減少し得る。Ａｐ４２のレベルはＡＤ患者の血漿において増加し得る（Ertekein-Taner, N., et al. Science 290:2303 2304 (2000)）。対象からのサンプルにおいて生化学異常を検出するための技術は、当分野で既知の細胞、免疫および他の生物学的方法を含む。一般的なアドバイスのために、例えば、Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3r Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), (Harrow, E. and  Lane, D. (1988)Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)ならびにそれらの最新版に記載されている技術、参照。
【０１８２】
例えば、抗体、他の免疫グロブリンおよび他の特異的結合リガンドを、ＡＤと関連する生体分子、例えば、タンパク質または他の抗原を検出するために使用することができる。例えば、１つ以上の特異抗体を、サンプルを調べるために使用することができる。種々の方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、蛍光−ベースアッセイ、ウエスタンブロットおよびタンパク質アッセイが可能である。ポリペプチドアレイを生産する方法は、当分野において、例えば、De Wildt et al. (2000). Nature Biotech. 18, 989-994; Lucking et al. (1999). Anal. Biochem. 270, 103-111; Ge, H. (2000). Nucleic Acids Res. 28, e3, I-VII; MacBeath, G., and Schreiber, S.L. (2000). Science 289, 1760 to 1 763;およびＷＯ９９／５  １  ７７３Ａ１において記載されている。
【０１８３】
１つのアッセイにおいて、ＡＤの非ヒト動物モデル（例えば、マウスモデル）が、例えば、ポリペプチドまたは治療レジメンを評価するために使用される。例えば、米国特許第６，５０９，５１５号は、天然に学習および記憶試験で使用することができる１つのこのようなモデル動物を記載している。該動物は、該動物が誕生から短期間内、一般的に誕生から１年以内、好ましくは誕生から２から６月以内に進行性の神経障害を発症しているようなレベルで脳組織においてアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）配列を発現する。ＡＰＰタンパク質配列を胚形成期の動物または動物の原細胞、好ましくは１つの細胞または受精卵母細胞期および一般的に約８細胞期より遅くない細胞に導入する。次に受精卵または胚を里親のメスのように擬似−妊娠期間で発達させる。アミロイド前駆タンパク質遺伝子を、脳の皮質辺縁領域、進行性の神経疾患状態、例えばＡＤにおいて顕著に影響される脳の領域において、アミロイド前駆タンパク質の過剰な内因性発現および進行性の神経疾患の発症を引き起こす状態において、染色体に組み込まれるように動物胚に導入する。グリオーシスおよび臨床症状が、トランスジェニック動物モデルにおいて神経疾患を起こす。神経疾患の進行性の局面は、探索および／または運動行動の減少およびデオキシグルコース摂取／利用の減少および脳の皮質辺縁領域における異常肥大グリオーシスにより特徴付けられる。さらに、見られる変化は、いくつかの老化動物において見られるものと同様である。他の動物モデルは、また、ＵＳ５，３８７，７４２；５，８７７，３９９；６，３５８，７５２；および６，１８７，９９２に記載されている。
【０１８４】
パーキンソン病
クロトー融合ポリペプチドを個体に投与することを提供する本発明の方法は、パーキンソン病を処置するために使用することができる。パーキンソン病は、運動機能を調節する黒質線条体ドーパミン系の変性となる、黒質におけるドーパミンニューロンの神経変性を含む。この病状は、同様に、運動機能障害を引き起こす（例えば、Lotharius et al., Nat. Rev. Neurosci., 3:932-42 (2002)、参照）。典型的な運動症状は、無動症、前屈姿勢、歩行困難、姿勢の不安定、強硬症、筋硬直および振戦を含む。典型的な非運動症状は、鬱病、意欲の欠如、消極的な態度、認知症および消化器機能障害を含む（例えば、Fahn, Ann. N.Y. Acad. Sci., 991:1-14 (2003)およびPfeiffer, Lancet Neurol., 2:107-16 (2003)、参照）。パーキンソン病は６５から６９歳の個体の０．５から１パーセントおよび８０歳以上の個体の１から３パーセントで観察された（例えば、Nussbaum et al., N. Engl. J. Med., 348:1356-64 (2003)、参照）。パーキンソン病の分子マーカーは、芳香族性Ｌアミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）の減少（例えば、米国出願第２００２０１７２６６４号、参照）；および黒質線条体におけるドーパミン含量の喪失（例えば、Fahn, Ann. N.Y. Acad. Sci., 991:1-14 (2003)およびLotharius et al., Nat. Rev. Neurosci., 3:932-42 (2002)、参照）を含む。いくつかの家族性症例において、ＰＤはアルファ−シヌクレインおよびパーキン（Ｅ３ユビキチンリガーゼ）タンパク質をコードする単一の遺伝子の変異に関連する（例えば、Riess et al., J. Neurol. 250 Suppl 1:I3 10 (2003)およびNussbaum et al., N. Engl. J. Med., 348:1356-64 (2003)）。ニューロン特異的Ｃ−末端ユビキチンヒドロラーゼ遺伝子におけるミスセンス変異もパーキンソン病と関連する（例えば、Nussbaum et al. , N. Engl. J. Med., 348:1356-64 (2003)）。
【０１８５】
ハンチントン病
クロトー融合ポリペプチドを個体に投与することを提供する本発明の方法は、ハンチントン病を処置するために使用することができる。ハンチントン病におけるクロトー融合ポリペプチドの有効性を評価および／または有効量を決定するための方法は、例えば、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、霊長類または他の何らかの非ヒト）または他の動物（例えば、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュまたは無脊椎動物、例えば、昆虫または線虫）を使用する生物ベースアッセイを含む。ハンチントン病において多くの動物モデル系が利用できる。例えば、Brouillet, Functional Neurology 15(4): 239-251 (2000); Ona et al. Nature 399: 263-267 (1999), Bates et al. Hum Mol Genet. 6(10):1633-7 (1997); Hansson et al. J. of Neurochemistry 78: 694-703;およびRubinsztein, D. C., Trends in Genetics, Vol. 1S, No. 4, pp. 202-209（ＨＤの種々の動物および非ヒトモデルにおける確認）、参照。
【０１８６】
このような動物モデルの例は、Ｒ６／２系のトランスジェニックマウス系である（Mangiarini et al. Cell 87: 493-506 (1996)）。Ｒ６／２マウスはヒトＨＤ遺伝子のエクソン１を過剰発現する（内因性プロモーターのコントロール下）トランスジェニックハンチントン病マウスである。Ｒ６／２ヒトＨＤ遺伝子のエクソン１は広範なＣＡＧ／ポリグルタミン繰り返し（平均で１５０のＣＡＧ繰り返し）を有する。これらのマウスは、ヒトハンチントン病の多くの特徴を有する進行性の最終的に致命的な神経疾患を発症する。ハンチンチン（ＨＤエクソン１によってコードされる）のＮ末端部分により構成される異常凝集体が、Ｒ６／２マウスにおいて、細胞質および細胞の核において両方とも４５で観察される（Davies et al. Cell 90: 537-548 (1997)）。例えば、トランスジェニック動物におけるヒトハンチンチンタンパク質は、少なくとも５５のＣＡＧ繰り返しおよびさらに好ましくは約１５０のＣＡＧ繰り返しを含む遺伝子によってコードされる。これらのトランスジェニック動物はハンチントン病様表現型を発現することができる。
【０１８７】
これらのトランスジェニックマウスは、誕生後８から１０週の体重増加の減少、寿命の減少および異常な足取りにより特徴付けられる運動障害、静止振戦、後肢抱擁および過活動により特徴付けられる（例えば、Ｒ６／２系；Mangiarini et al. Cell 87: 493-506 (1996)、参照）。表現型は運動機能低下の方向へ悪化する。これらのトランスジェニックマウスの脳は、神経化学的および組織学的異常、例えば、神経伝達物質受容体（グルタミン酸塩、ドーパミン）の変化、Ｎ−アセチルアスパラギン酸（完全なニューロンのマーカー）の濃度の減少ならびに線条体および脳サイズの減少を示す。したがって、評価は、神経伝達物質レベル、神経伝達物質受容体レベル、脳サイズおよび線条体サイズに関連するパラメーターを評価することを含むことができる。加えて、部分または完全長のトランスジェニック・ヒトハンチンチンタンパク質を含む異常凝集体は、これらの動物（例えば、Ｒ６／２トランスジェニックマウス系）の脳組織において存在する。例えば、Mangiarini et al. Cell 87: 493-506 (1996), Davies et al. Cell 90: 537-548 (1997), Brouillet, Functional Neurology 15(4): 239-251 (2000)およびCha et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 6480-6485 (1998)、参照。
【０１８８】
動物モデルにおける本明細書に記載されている試験ポリペプチドまたは既知のポリペプチドの効果を試験するため、異なる濃度の試験ポリペプチドを、例えば、試験ポリペプチドを動物の循環系に注射することにより、トランスジェニック動物に投与する。ハンチントン病のような症状が動物において評価され得る。次に、例えば、マウスモデルに関して上記されているハンチントン病のような症状の進行を、試験ポリペプチドでの処理が症状の軽減または遅延をもたらすか否かを決定するためにモニタリングする。他のアッセイにおいて、これらの動物におけるハンチンチンタンパク質凝集体の分離をモニタリングする。次に動物を殺し、脳スライスを得ることができる。次に脳スライスを、トランスジェニックヒトハンチンチンタンパク質、その一部、またはヒトハンチンチンタンパク質もしくはその一部を含む融合タンパク質を含む凝集体の存在に関して分析する。この分析は、例えば、脳組織のスライスを抗−ハンチンチン抗体で染色し、抗−ハンチントン抗体を認識するＦＩＴＣを結合させた二次抗体を加え（例えば、抗−ハンチンチン抗体はマウス抗−ヒト抗体であり、二次抗体はヒト抗体に特異的である）、蛍光顕微鏡法によりタンパク質凝集体を視覚化することを含むことができる。
【０１８９】
種々の方法がハンチントン病を評価および／またはモニタリングするために利用できる。該疾患に対する種々の臨床的症状および兆候は知られている。ハンチントン病は、運動障害、精神問題および認知変化を引き起こす。これらの症状の程度、発症年齢および症状は変化し得る。運動障害は速いランダムなダンスのような動きを含むことができ、舞踏病と呼ばれる。
【０１９０】
典型的な運動評価は、追跡眼球運動、サッカード開始、サッカード速度、構音障害、挺舌、指をたたく能力、回内／回外、げんこつ−手−手のひらの反復(a lo fist-hand-palm)、腕の硬直、動作緩慢、最大のジストニア（体幹、上および下肢）、最大の舞踏病（例えば、体幹、顔、上および下肢）、足取り、タンデム歩行および後方突進を含む。典型的な処置は、例えば、１年間にわたって、Total Motor Score 4（ＴＭＳ−４）、ＵＨＤＲＳの下位尺度を変化させることである。
【０１９１】
癌
クロトー融合ポリペプチドを個体に投与することを提供する本発明の方法は、癌を処置するために使用することができる。癌は、不適当に高レベルの細胞分裂、不適当に低いレベルのアポトーシスまたはその両方により誘導されるか、または引き起こされるすべての疾患を含む。癌の例は、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキン病）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、および固形腫瘍、例えば、肉腫および癌腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫(endotheliosarcoma)、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌腫、基底細胞癌腫、腺癌、汗腺癌腫、皮脂腺癌腫、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌腫、腎細胞癌腫、肝臓癌、胆管(nile duct)癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、肺癌腫、小細胞肺癌腫、膀胱癌腫、上皮性癌腫、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、神経鞘腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫および網膜芽腫）を含むが、これらに限定されない。リンパ組織増殖性障害も増殖性疾患と考慮される。
【０１９２】
本明細書で引用するすべての特許、特許出願および刊行物は、出典明示によりそれらの全体を本明細書に包含する。本発明はその態様について具体的に示され、記載されているが、本発明の範囲から逸脱することなく、形態における種々の変化および詳細が添付の特許請求の範囲内に包含されることは理解される得ることは当業者に明らかである。
【０１９３】
５．実施例
実施例１．クロトー融合ポリペプチドの発現および精製
クロトー融合ポリペプチドの発現
本発明のポリペプチドは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をアルファクロトーの細胞外ドメインおよびＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変異体を有する、クロトー融合ポリペプチドをコードする発現ベクターで一時的にトランスフェクトすることにより作った。発現したポリペプチドを含む条件培地を、クロトー、ＦＧＦ２３およびクロトー−ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）融合タンパク質のそれぞれの発現プラスミドの一時的なトランスフェクションにより製造した。トランスフェクションを、リポフェクタミン２０００（Invitrogen, Cat # 11668-019）を使用して６−ウェルプレートにて行った。トランスフェクションの５時間後、トランスフェクション混合物を、３ｍｌのＤＭＥＭプラス１％のＦＢＳで置き換えた。条件培地を、３ｍｌのＤＭＥＭプラス１％のＦＢＳの添加７２時間後に回収した。種々の一時的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の条件培地のサンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離し、ウエスタンブロットにより分析するか（図３Ａ）、またはクマシーブルーで染色した（図３Ｂ）。
【０１９４】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を種々のサンプルで実施した（レーン１、コントロール；レーン２、ＦＧＦ２３；レーン３、ｓクロトー；レーン４−６、ｓクロトー−ＦＧＦ２３）。クマシーブルー染色は、クロトー融合ポリペプチドをコードするベクターでトランスフェクトされていないサンプルを含むレーン１−３において存在しない、＞１８０ｋＤａバンド（図３Ｂ、右側に矢印で示されている）の高い発現を示した。培地に分泌されたクロトー融合ポリペプチドの質をウエスタンブロットにより評価した（図３Ａ）。抗−ＦＧＦ２３ラットモノクローナルＩｇＧ２Ａ（R&D Systems, Cat# MAB26291）を、ウエスタンブロットによるクロトー融合ポリペプチドを検出するための一次抗体として使用した。クマシー染色ゲルにおいて観察されたさらなるバンドがクロトー融合ポリペプチドであることをウエスタンブロットで確認した。クロトー融合ポリペプチドがクロトー融合ポリペプチドの期待された分子量を有することをウエスタンブロットで確認した。この分析はクロトー−ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）融合タンパク質の発現を示す。
【０１９５】
クロトー融合ポリペプチドの精製
本発明のポリペプチドを、アルファクロトーの細胞外ドメインおよびＦＧＦ２３  Ｒ１７９Ｑ変異体を有するクロトー融合ポリペプチドをコードする発現ベクターで一時的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養した条件培地から精製した。条件培地を製造するために、ｓクロトー−ＦＧＦ２３−６×Ｈｉｓをコードする発現ベクターを、発現培地（Ｆｒｅｅｓｔｙｐｅ  ２９３発現培地（GIBCO, Cat #12338）中で１０６細胞／ｍｌで４６４ｍｌのＨＥＫ２９３Ｔ細胞）で懸濁液中で培養されたＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした（１８ｍｌの２μｇ／ｍｌのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と混合された１８ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ  １（GIBCO, Cat #11058)中で５００μｇのＤＮＡ）。トランスフェクション後、培養物を増殖させた（１２０時間；３７℃  ５％ＣＯ２インキュベーター中；１２５ｒｐｍで振とう）。インキュベーション終了後、条件培地を遠心分離（１０００ｒｐｍで５分）により回収した。次に条件培地をニッケル−アガロースカラムに付した。ｓクロトー−ＦＧＦ２３−６×Ｈｉｓがカラムにしっかりと結合し、５０ｍＭのイミダゾールで溶離した。次に得られた精製された物質をＰＢＳ中で透析し、イミダゾールと取り除いた。精製されたｓクロトー−ＦＧＦ２３−６×ＨｉｓのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し（レーン１、精製されたｓクロトー−ＦＧＦ２３−６×Ｈｉｓ；レーン２、分子量マーカー）、クマシーブルーでの染色により分析した（図３Ｃ）。精製されたｓクロトー−ＦＧＦ２３−６×Ｈｉｓが期待された分子量を有することを染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで確認した。精製された物質で負荷されたレーンにおける完全長ｓクロトー−ＦＧＦ２３−６×Ｈｉｓ以外のタンパク質に対応するバンドを検出しないということは、ｓクロトー−ＦＧＦ２３−６×Ｈｉｓが精製されたことを示すものであった。
【０１９６】
実施例２．クロトー融合ポリペプチドの活性を評価するインビトロアッセイ
Ｅｇｒ−１−ルシフェラーゼ
発現したアルファクロトー融合ポリペプチドの生物学的活性を、Ｅｇｒ−１−ルシフェラーゼレポーターアッセイで試験した。ＦＧＦ２３受容体へのクロトー融合ポリペプチドの結合により、Ｅｇｒ−１プロモーターにより調節される、Ｅｇｒ−１の下流活性化およびルシフェラーゼレポーターの発現を引き起こした。Ｅｇｒ−１−ルシフェラーゼレポーター遺伝子はUrakawa et al. (Nature, 2006, Vol 444, 770-774)の報告に基づいて構築した。４８−ウェル  ポリ−Ｄ−リシン  プレートに播種したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、トランスフェクション正規化レポーター遺伝子（ウミシイタケルシフェラーゼ）と一緒にＥｇｒ−１−ルシフェラーゼレポーター遺伝子でトランスフェクトした。Ｅｇｒ−１ルシフェラーゼレポーター遺伝子のトランスフェクションの５時間後、トランスフェクション混合物を３ｍｌのＤＭＥＭプラス１％のＦＢＳで置き換えた。条件培地を、３ｍｌのＤＭＥＭプラス１％のＦＢＳの添加７２時間後に回収した。５時間後、トランスフェクション混合物を活性を試験するサンプルと置き換えた。最初の実験において、２０μｇ／ｍｌのヘパリン（Sigma, Cat#H8537；２ｍｇ／ｍｌの貯蔵物としてＤＭＥＭに溶解されている）の存在または非存在下で、５０％の条件培地（クロトー、ＦＧＦ２３、クロトーおよびＦＧＦ２３、ならびにクロトー−ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）融合タンパク質を含む）および１％のＦＢＳを有する５０％のＤＭＥＭを、Ｅｇｒ−１−ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験した（図４）。さらなる実験では、定義された量の精製されたポリペプチドを使用した（図５Ａおよび５Ｂ）。細胞を不活性な溶解緩衝剤（Promega, Cat #E194A）中で２０時間で溶解し、ルシフェラーゼ活性をＤｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ系（Promega, Cat #E2940）を使用して決定した。
【０１９７】
最初の実験において、クロトー融合ポリペプチド活性を非分画条件培地中で実施した。Ｅｇｒ−１−ルシフェラーゼレポーター遺伝子を使用して、これらの実験ではルシフェラーゼレポーターの発現における倍数変化を定量した（図４）。ＦＧＦ２３およびクロトータンパク質の細胞外ドメインの組合せを含む条件培地はＥｇｒ−１−ルシフェラーゼを活性化させたが、ＦＧＦ２３のみを含む条件培地またはクロトーの細胞外ドメインのみを含む条件培地ではＥｇｒ−１−ルシフェラーゼを活性化させなかった。融合タンパク質ｓクロトー−ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）を含む条件培地は、ＦＧＦ２３またはクロトーのいずれか単独を含む条件培地と対照的に、Ｅｇｒ−１−ルシフェラーゼレポーター遺伝子を活性化した。これらの実験において、融合タンパク質ｓクロトー−ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）を含む条件培地は、ＦＧＦ２３およびクロトーの組合せを含む条件培地よりも有意に良くＥｇｒ−１−ルシフェラーゼレポーター遺伝子を活性化した。ヘパリンの存在下で、融合タンパク質ｓクロトー−ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）を含む条件培地およびＦＧＦ２３およびクロトーの組合せを含む条件培地による誘導ではわずかに高まった。表１は、Ｅｇｒ−１−ルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、条件培地における種々のＦＧＦ−クロトー融合ポリペプチドの相対発現、および種々のＦＧＦ−クロトー融合ポリペプチドに対応する非分画条件培地の相対活性を示す。
【０１９８】
表１．ｓクロトー−ＦＧＦ２３融合物変異体の発現および活性
【表１】
0005627469.tif 000002
＊  活性の欠如は、低発現の結果であり得る
【０１９９】
Ｅｇｒ−１−ルシフェラーゼレポーターアッセイは、また、実施例１に記載されている精製方法を使用して、条件培地から精製された定義された量のタンパク質を使用して行った。発現したポリペプチドを含む非分画条件培地を使用する以前の結果と一致して、精製されたＦＧＦ２３およびｓクロトーの組合せでの処理ではルシフェラーゼレポーター活性が得られたが、精製されたＦＧＦ２３単独での処理では得られなかった（図５Ａ）。精製されたＦＧＦ２３およびｓクロトーの組合せによるルシフェラーゼレポーター活性は、さらに精製されたｓクロトーの用量に依存し、該効果はヘパリンの存在（２０μｇ／ｍｌ）により高められた。ルシフェラーゼ活性におけるｓクロトー−ＦＧＦ２３−６×Ｈｉｓ融合ポリペプチドの効果は、Ｅｇｒ−１−ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて、約１．２１ｎＭ程度の低濃度（１．２倍変化）および少なくとも最大約１９．３ｎＭまで（２．４倍変化）で検出することができた（図５Ｂ）。ルシフェラーゼ活性におけるｓクロトー−ＦＧＦ２３−６×Ｈｉｓ融合ポリペプチドの活性は、ヘパリン（２０μｇ／ｍｌ）の存在下で有意に高まった。ヘパリンの存在下で、ルシフェラーゼ活性におけるｓクロトー−ＦＧＦ２３−６×Ｈｉｓ融合ポリペプチドの効果は、約０．６ｎＭ程度の低濃度（２．０倍変化）で検出することができた。該結果は、精製されたｓクロトー−ＦＧＦ２３−６×Ｈｉｓが用量依存的にＥＧＲ−１−ｌｕｃレポーター遺伝子を誘導したこと、およびｓクロトー−ＦＧＦ２３−６×Ｈｉｓにおける処置を示した。
【０２００】
実施例３．筋肉細胞におけるクロトー融合ポリペプチドの効果を評価するインビトロアッセイ
発現したクロトー融合ポリペプチドの生物学的効果をＣ２Ｃ１２筋芽細胞で試験した。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞をＩＧＦ−１、ＦＧＦ２またはｓクロトー−ＦＧＦ２３で処理することにより、筋管増殖およびシグナル伝達タンパク質のリン酸化を引き起こした。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を、６ウェルのポリ−Ｄ−リシンおよびフィブロネクチン被覆プレートにおいて４０，０００細胞／ウェルの密度で、増殖培地中に（ＤＭＥＭおよびＦ１２、３対１）、１０％のＦＢＳ、１％のＧｌｕｔ；１％のＰ／Ｓ；１％のリノール酸；０．１％のＩＴＳ：［インスリン（１０ｍｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（５．５ｍｇ／ｍｌ）およびセレン（５ｎｇ／ｍｌ）］播種した。筋芽細胞がコンフルエンスに達した後（３日間）、培地を分化培地に変えた（２％のウマ血清；１％のＧｌｕｔ；１％のＰ／Ｓを有するＤＭＥＤ）。
【０２０１】
筋管直径実験のために、コンフルエント３日後、培地を分化培地に変え、細胞を、分化培地中でデキサメタゾン（１００μＭ）の存在または非存在下で、ＩＧＦ−１（１０ｎＭ）、ＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍｌ）またはｓクロトー−ＦＧＦ２３（２０ｎＭ）で２４時間処理した。処置終了後、細胞をグルタルアルデヒド（ＰＢＳ中で５％）で固定し、多重蛍光像を回収した。筋管直径をＰｉｐｅｌｉｎｅ  Ｐｉｌｏｔプログラムを使用して測定し、肥大または萎縮を測定した。
【０２０２】
シグナル伝達タンパク質リン酸化実験のために、コンフルエント３日後、培地を分化培地に変え、細胞を、ＦＢＳなしのＤＭＥＭで４時間飢餓にし、次にラパマイシン（４０ｎＭ）の存在または非存在下で、ＩＧＦ−１（１０ｎＭ）、ＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍｌ）またはｓクロトー−ＦＧＦ２３（２０ｎＭ）で３０分処理した。細胞をプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤の存在下でＲＩＰＡ緩衝剤中で溶解した。ウエスタンブロット分析を行い、膜を図で示されるように異なる抗体で探査し、スキャンしたＸ線フィルムを現像した。
【０２０３】
この試験の結果は、ｓクロトー−ＦＧＦ２３が、コントロールと比較して筋管直径の増加を引き起こし、ＩＧＦ−１およびＦＧＦ２の結果と同様にＣ２Ｃ１２筋管肥大を誘導することを示した（図５Ａ）。加えて、ｓクロトー−ＦＧＦ２３、ＩＧＦ−１およびＦＧＦ２での処理は、筋管直径の測定に基づいて、デキサメタゾンにより誘導された筋管萎縮を部分的に逆転させることができた。デキサメタゾンの存在または非存在下で、筋管形態における（筋管の厚さにより測定される）ｓクロトー−ＦＧＦ２３とＦＧＦ２間での差は、観察されなかった。ｓクロトー−ＦＧＦ２３、ＩＧＦ−１およびＦＧＦ２の栄養作用は統計学的に有意であった。
【０２０４】
Ｃ２Ｃ１２筋管における効果と一致して、ｓクロトー−ＦＧＦ２３融合タンパク質シグナル伝達はｐ７０Ｓ６ＫおよびＥＲＫのリン酸化を誘導したが、Ｃ２Ｃ１２筋管におけるＡＫＴまたはＦオキソにおいて誘導しなかった（図５Ｂ）。シグナル伝達におけるｓクロトー−ＦＧＦ２３の効果はＦＧＦ２と同様であったが、ＩＧＦ−１と異なっていた。ｓクロトー−ＦＧＦ２３によるＥＲＫリン酸化の程度は、ＩＧＦ−１またはＦＧＦ２未満であることが観察された。ｓクロトー−ＦＧＦ２３によるｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化は、ラパマイシン感受性であった。Ｃ２Ｃ１２細胞に関する実験において、ヘパリンはシグナル伝達を活性化するために必要ではなかった。これらの結果は、ｓクロトー−ＦＧＦ２３融合ポリペプチドがＣ２Ｃ１２筋管においてシグナル伝達を活性化させたことを示す。
【図１Ａ】
0005627469.tif 000003
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
0005627469.tif 000005
【図２Ｂ】
0005627469.tif 000006
【図２Ｃ】
0005627469.tif 000007
【図２Ｄ】
0005627469.tif 000008
【図２Ｅ】
0005627469.tif 000009
【図２Ｆ】
0005627469.tif 000010
【図２Ｇ】
0005627469.tif 000011
【図２Ｈ】
0005627469.tif 000012
【図２Ｉ】
0005627469.tif 000013
【図２Ｊ】
0005627469.tif 000014
【図２Ｋ】
0005627469.tif 000015
【図２Ｌ】
0005627469.tif 000016
【図２Ｍ】
0005627469.tif 000017
【図２Ｎ】
0005627469.tif 000018
【図２Ｏ】
0005627469.tif 000019
【図２Ｐ】
0005627469.tif 000020
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
0005627469.tif 000022
【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【配列表】
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