(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
様々な組織および器官中のｉｎ  ｖｉｖｏ細胞死を評価するのを補助するために、被験体から得た体液試料中の細胞特異的、組織特異的および／または器官特異的無細胞ｍｉＲＮＡを検出および定量する方法であって、ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞死が特定の組織および／または器官の障害と関係があり、該方法は：
該体液試料を該試料中の無細胞ｍｉＲＮＡの１つまたは複数の特異的配列に関して分析することを含み、該分析が該特異的ｍｉＲＮＡ配列の一部分と相補的であるプライマーおよび／またはプローブを用いて該ｍｉＲＮＡを検出するステップを含む、方法。
【請求項２】
過剰または不十分なｉｎ  ｖｉｖｏ細胞死が特定の組織の障害と関係がある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記体液試料が尿である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記尿試料の分析ステップが、ハイブリダイゼーション、サイクリングプローブ反応、ポリメラーゼ連鎖反応、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応、単鎖の立体配座多型を分析するためのＰＣＲ、およびリガーゼ連鎖反応からなる群から選択される技法を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記尿試料中の核酸の分解を低減させる、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
核酸の分解の低減が、（１つまたは複数の）ＲＮＡｓｅ阻害剤の添加、熱不活性化によって、またはグアニジン−ＨＣｌ、グアニジンイソチオシアネート、Ｎ−ラウロイルサルコシン、およびドデシル硫酸ナトリウムからなる群から選択される化合物で前記尿試料を処理することによってヌクレアーゼ活性を阻害することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記尿試料が膀胱中に１２時間未満保持されている、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記体液試料が血清である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記血清試料の分析ステップが、ハイブリダイゼーション、サイクリングプローブ反応、ポリメラーゼ連鎖反応、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応、単鎖の立体配座多型を分析するためのＰＣＲ、およびリガーゼ連鎖反応からなる群から選択される技法を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記障害が病原体感染である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記病原体がウイルスである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ウイルスがエプスタインバーウイルスである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記障害が脳卒中である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記障害がアルツハイマー病である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記障害がパーキンソン病である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記障害が妊娠および／または胎児の病状と関係がある、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記胎児の病状がダウン症候群である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
組織または器官中の過剰な細胞死と関係がある障害の結果として、泌尿器系以外の領域由来の無細胞ｍｉＲＮＡを、被験体から得た尿試料中において検出する方法であって、該方法は：
該尿試料を該試料中の無細胞ｍｉＲＮＡの１つまたは複数の特異的配列に関して分析することを含み、該分析が該特異的ｍｉＲＮＡ配列の一部分と相補的であるプライマーおよび／またはプローブを用いて該ｍｉＲＮＡを検出するステップを含む、方法。
【請求項１９】
被験体から得た体液試料中の特異的無細胞ｍｉＲＮＡの定量分析による被験体の疾患または疾患の治療のモニタリングを補助する方法であって、該方法は：
該試料を、対象とする細胞、組織または器官中で特異的に発現されるかまたは過剰発現される無細胞ｍｉＲＮＡの１つまたは複数の特異的配列に関して分析することを含み、該分析が該特異的ｍｉＲＮＡ配列の一部分と相補的であるプライマーおよび／またはプローブを用いて該ｍｉＲＮＡを検出するステップを含み、ここで、該体液試料は、該被験体から定期的に得られる、方法。
【請求項２０】
前記体液試料が尿である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記体液試料が血清である、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２００７年８月２２日に出願された、米国仮出願第６０／９６５，８７１号（この内容は、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、体液中の無細胞低分子ＲＮＡ、特にマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）配列の単離および検出用の非侵襲的方法を提供する。より具体的には、本発明は、臨床診断および治療モニタリング用に、ｍｉＲＮＡレベルに関して尿および他の体液を分析することによる、ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞死を検出する方法を含む。
【背景技術】
【０００３】
細胞死は、多細胞生物の発達および機能の正常な構成要素である。自然な過程である細胞死は、内的要因によって引き起こされる多数の疾患の病状に関与する。細胞死は、外部の物理的、化学的、または生物学的因子によって引き起こされる疾患も伴う。
【０００４】
異なる形態および分子特性を特徴とする、２つの主な型の細胞死（壊死およびアポトーシス）が存在する（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。壊死は重度の分子および／または構造損傷に直接起因する壊滅的代謝不全と考えられ、炎症および周囲の細胞に対する二次的損傷をもたらす。アポトーシスは、壊死よりはるかに多く見られる生物学的現象であり、ホルモン、サイトカインなどの特異的シグナルによって、成長または接着因子などの特異的シグナルの不在によって、または完全性の壊滅的消失を引き起こさない分子の損傷によって誘導される可能性がある。アポトーシスは、整然とした特異的なカスケードの分子事象の開始に関与する活性細胞応答の結果である。アポトーシスは、特徴的なクロマチン凝縮および辺縁化（ｍａｒｇｉｎａｔｉｏｎ）、核フラグメンテーション、細胞収縮、膜ブレブ形成および酵素によるヌクレオソーム間（ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｓｏｍａｌ）の核ＤＮＡのフラグメンテーションの出現をもたらす（非特許文献７；非特許文献８）。特異的形態によって特徴付けられる他のさらに稀な形の細胞死、例えばいわゆる自己貪食性細胞死も記載されてきている（Ｂｒｅｄｅｓｅｎら、Ｓｔｒｏｋｅ．３８巻（補遺２号）：６５２〜６６０頁（２００７年）。
【０００５】
細胞死の特異的機構および型と無関係に、死につつある細胞型を検出するための方法は、様々な疾患の診断に重要であり、疾患および治療モニタリングに重要であり、かつ鑑別診断に有用である。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける特異的細胞死を検出することができる方法は、細胞死の予防または誘導を目的とする薬剤の開発、および新たに開発された薬剤の細胞毒性の分析に有用である。
【０００６】
血液中または他の体液中の、例えば抗原、酵素および他のタンパク質などの組織特異的マーカーの検出に基づく、疾患関連の過剰な細胞死の診断用の幾つかの臨床試験が存在する。血液中の肝臓特異的酵素の活性の測定は、例えば、肝細胞死を評価するために広く使用されている方法である（Ａｍａｃｈｅｒら、Ｒｅｇｕｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ａｐｒ；２７巻（２号）：１１９〜１３０頁（１９８８年）；Ｓａｌａｓｐｕｒｏら、Ｅｎｚｙｍｅ．３７巻：８７〜１０７頁（１９８７年）；Ｈｅｒｌｏｎｇ、Ｈｏｓｐ．Ｐｒａｃｔ．（Ｏｆｆ  Ｅｄ）．２９巻（１１号）：３２〜３８頁（１９９４年））。心筋細胞特異的抗原のレベルの評価も、心筋梗塞を診断するために使用されてきている（Ｍａｉｒら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ．３７巻：１０７７〜１０８４頁（１９９９年）；Ｎｕｎｅｓら、Ｒｅｖ  Ｐｏｒｔ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２０巻：７８５〜７８８頁（２００１年））。しかしながら、このような技法の数は、有意な、組織特異的結果を与えるための分析用の検出のマーカーおよび方法が知られている疾患に限られている（Ｏｈ  Ｓら、Ｃｕｒｒ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｒｅｐ．３巻：１２〜１８頁（２００１年）；Ｒｏｃｈｌｉｎｇら、Ｃｌｉｎ  Ｃｏｒｎｅｒｓｔｏｎｅ．３巻（６号）：ｌ〜１２頁（２００１年））。他の方法は、分析用試料を得るために、疾患状態を有する疑いがある特異的組織の侵襲的生検を必要とする。しかしながら、幾つかの器官および組織、例えば脳の生検は非常に侵襲的であり、しばしば実施するのが困難である。
【０００７】
哺乳動物生物における主な型の細胞死であるアポトーシス、すなわちプログラムされた細胞死は、ヌクレオソーム間の核ＤＮＡのフラグメンテーションを伴うことはよく知られている。多くの研究室は、このＤＮＡの一部分が血液中に現れることを実証している（Ｌｏ  Ｙ．Ｍ．Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．９４５巻：１〜７頁（２００１年）；Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎら、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．９４５巻：２３９〜２４９頁（２００１年）；Ｔａｂａｃｋら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．６巻：２７３〜２７８頁（２００４年）；Ｂｉｓｃｈｏｆｆら、Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｕｐｄａｔｅ．８巻：４９３〜５００頁、（２００２年））。経腎ＤＮＡ（Ｔｒ−ＤＮＡ）と呼ばれるこのフラグメント状ＤＮＡは腎臓障壁を通過し、尿中で検出することができることも示されている。（Ｂｏｔｅｚａｔｕら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．４６巻：１０７８〜１０８４頁、（２０００年）；Ｓｕら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ．６巻：１０１〜１０７頁（２００４年）；Ｓｕら、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．１０２２巻：８１〜８９頁（２００４年）。
【０００８】
無細胞血漿ＤＮＡとＴｒ−ＤＮＡは両方共に診断ツールとして使用することができるが、細胞死などの組織特異的事象を評価するとき、それらはかなり限られた手法となる。したがって、特定の組織および器官中の死につつある細胞のレベルを検出するその能力のために、非侵襲的であり、より広範囲の特異的病状の目安を与える分析法は、患者中の様々な疾患の状態または病状を診断およびモニタリングするのに有用である可能性がある。さらに、疾患療法に対する患者の応答性をモニタリングするための手段を与える組織特異的分析法は、療法有効性、および薬剤治療の場合は、薬剤投与に必要とされる最適用量を決定するのに有用である可能性がある。
【０００９】
これらの問題に対処するために、本発明は、例えば血清および尿などの体液中の、ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞死をモニタリングするための診断ツールとしての、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の使用に焦点を当てる。無細胞血漿ＤＮＡおよびＴｒ−ＤＮＡと異なり、多くのｍｉＲＮＡは細胞、組織および器官特異的発現プロファイルを示す（Ｌｉａｎｇら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、８巻：１６６頁（２００７年）；Ｌｕｋｉｗら、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ．１８巻：２９７〜３００頁（２００７年）；Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａら、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．１２巻：７３５〜７３９頁（２００２年）；Ｃｈｅｎら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．３８巻：２２８〜２３３頁（２００６年）；Ｂｅｕｖｉｎｋら、Ｊ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３５巻：ｅ５２（２００７年））。さらに、ｍｉＲＮＡ細胞および組織特異的プロファイルと異なる病状および腫瘍型の相関関係は実証されている（Ｖｉｓｏｎｅ  Ｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２６巻：７５９０〜７５９５頁（２００７年）；Ｎｅｌｓｏｎら、Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．６６巻：４６１〜４６８頁（２００７年）；Ｎｅｇｒｉｎｉら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１２０巻：１８３３〜１８４０頁（２００７年）；Ｃｈａｎｇら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．８巻：２１５〜２３９頁（２００７年）；Ｊａｙら、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２６巻：２９３〜３００頁（２００７年））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｋｅｒｒら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．（１９７２年）２６巻、２３９〜２５７頁
【非特許文献２】Ｕｍａｎｓｋｙ、Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．（１９８２年）９７巻、５９１〜６０２頁
【非特許文献３】Ｕｍａｎｓｋｙら、Ａｄｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、（１９９７年）４１巻、３８３〜４０７頁
【非特許文献４】Ａｍｅｉｓｅｎ、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．（２００４年）１１巻、４〜１０頁
【非特許文献５】Ｌｏｃｋｓｈｉｎら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（２００４年）３６巻、２４０５〜１９頁
【非特許文献６】Ｇ．Ｋｒｏｅｍｅｒら、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（２００５年）１２巻、１４６３〜１４６７頁
【非特許文献７】Ｕｍａｎｓｋｙら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．（１９８１年）６５５巻、９〜１７頁
【非特許文献８】Ａｒｅｎｄｓら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．（１９９０年）１３６巻、５９３〜６０８頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって、本発明は、例えば血清および尿などの体液中の、特異的病状に特徴的な組織特異的ｍｉＲＮＡの検出によって、ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞死を測定するための方法を提供する。体液中のｍｉＲＮＡの検出に基づく本発明の方法は、診断またはモニタリング試験のさらなる開発に使用される。
【００１２】
本発明は、体液から得た無細胞核酸中の特異的ｍｉＲＮＡ配列のレベルを分析することであって、前記ｍｉＲＮＡが身体中で死につつある細胞に由来すること、および得られた分析結果を使用して、患者中の疾患または異常な医学的状態の状況を決定することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞死を検出および測定するための新規な方法に関する。
【００１３】
本発明の方法は、無細胞核酸のアニオン交換体への吸着およびアニオン交換体からの溶出に基づくものであり、それによって１０ヌクレオチドより大きい核酸断片の濃縮および単離を可能にする。具体的には本発明は、（ｉ）体液中のｍｉＲＮＡの存在、（ｉｉ）例えば経腎ｍｉＲＮＡ（Ｔｒ−ｍｉＲＮＡ）など、それらが腎臓障壁を通過したことを意味する、泌尿器系の外側に位置する器官由来のｍｉＲＮＡの尿中における検出、ｉｉｉ）血清中のｍｉＲＮＡの検出、（ｉｖ）特定の細胞、組織および／または器官における細胞死と関係がある病状は前記器官に特異的なｍｉＲＮＡのレベルの変化を伴うことを実証する。
【００１４】
本発明は、様々な組織および器官中のｉｎ  ｖｉｖｏ細胞死を評価するために、体液中の細胞、組織および／または器官特異的無細胞ｍｉＲＮＡを検出および定量する方法であって、ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞死が特定の組織および／または器官の障害と関係があり、被験体から体液試料を得ること、および前記体液試料をｍｉＲＮＡの１つまたは複数の特異的配列に関して分析することを含み、前記分析が前記特異的ｍｉＲＮＡ配列の一部分と実質的に相補的であるプライマーおよび／またはプローブを用いて前記ｍｉＲＮＡを検出するステップを含む方法を提供する。本発明の幾つかの実施形態では、過剰または不十分なｉｎ  ｖｉｖｏ細胞死は特定の組織の障害と関係がある。
【００１５】
本発明の一実施形態では、体液は尿である。別の実施形態では、本発明の尿試料の分析法は、ハイブリダイゼーション、サイクリングプローブ反応（ｃｙｃｌｉｎｇ  ｐｒｏｂｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ポリメラーゼ連鎖反応、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応、単鎖の立体配座多型を分析するためのＰＣＲ、およびリガーゼ連鎖反応からなる群から選択される技法を含む。さらに別の実施形態では、前記尿試料中の核酸の分解を低減させる。
【００１６】
本発明の方法は、（１つまたは複数の）ＲＮＡｓｅ阻害剤の添加、熱不活性化によって、またはグアニジン−ＨＣｌ、グアニジンイソチオシアネート、Ｎ−ラウロイルサルコシン、およびドデシル硫酸ナトリウムからなる群から選択される化合物で前記尿試料を処理することによってヌクレアーゼ活性を阻害することを含む、核酸の分解の低減を含む。本発明の一実施形態では、尿試料は膀胱中に１２時間未満保持されている。
【００１７】
本発明の一実施形態では、体液は血清である。本発明の方法は、ハイブリダイゼーション、サイクリングプローブ反応、ポリメラーゼ連鎖反応、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応、単鎖の立体配座多型を分析するためのＰＣＲ、およびリガーゼ連鎖反応からなる群から選択される技法を含めた血清試料の分析を含む。
【００１８】
さらに別の実施形態では、本発明の方法は、組織または器官中の過剰または不十分な細胞死と関係がある特異的障害の特異的マーカーとして、無細胞ｍｉＲＮＡを検出することを含む。場合によっては、前記障害は病原体感染である。前記病原体はウイルスであることが好ましい。前記ウイルスはエプスタインバーウイルスであることがより好ましい。場合によっては、前記障害は、妊娠および／または胎児性またはダウン症候群と関係がある、脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病である。
【００１９】
本発明は、組織または器官中の過剰または不十分な細胞死と関係がある障害の結果として、被験体の泌尿器系以外の領域を含めた異なる器官および組織由来の無細胞ｍｉＲＮＡを尿中において検出する方法であって、被験体から尿試料を得ること、および前記尿試料をｍｉＲＮＡの１つまたは複数の特異的配列に関して分析することを含み、前記分析が前記特異的ｍｉＲＮＡ配列の一部分と実質的に相補的であるプライマーおよび／またはプローブを用いて前記ｍｉＲＮＡを検出するステップを含む方法を提供する。
【００２０】
本発明の方法は、体液中の特異的無細胞ｍｉＲＮＡの定量分析による被験体の疾患および／または治療モニタリングの方法であって、被験体から体液試料を定期的に得ること、および前記試料を、対象とする細胞、組織または器官中で特異的である／過剰発現されるｍｉＲＮＡの１つまたは複数の特異的配列に関して分析することを含み、前記分析が前記特異的ｍｉＲＮＡ配列の一部分と実質的に相補的であるプライマーおよび／またはプローブを用いて前記ｍｉＲＮＡを検出するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、体液は尿である。別の実施形態では、体液は血清である。
【００２１】
本発明の前述および他の目的、特徴、および利点は、添付の図面中に例示するように、本発明の実施形態のより特定の記載から明らかとなる。図面は必ずしもスケール表示、強調表示するものではなく、代わりに本発明の原理を例示するものである。
例えば、本発明は以下を提供する：
（項目１）
様々な組織および器官中のｉｎ  ｖｉｖｏ細胞死を評価するために、体液中の細胞、組織および／または器官特異的無細胞ｍｉＲＮＡを検出および定量する方法であって、ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞死が特定の組織および／または器官の障害と関係があり、該方法は：
（ａ）被験体から体液試料を得ること、および
（ｂ）該体液試料をｍｉＲＮＡの１つまたは複数の特異的配列に関して分析することを含み、該分析が該特異的ｍｉＲＮＡ配列の一部分と実質的に相補的であるプライマーおよび／またはプローブを用いて該ｍｉＲＮＡを検出するステップを含む、方法。
（項目２）
過剰または不十分なｉｎ  ｖｉｖｏ細胞死が特定の組織の障害と関係がある、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記体液が尿である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記尿試料の分析ステップが、ハイブリダイゼーション、サイクリングプローブ反応、ポリメラーゼ連鎖反応、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応、単鎖の立体配座多型を分析するためのＰＣＲ、およびリガーゼ連鎖反応からなる群から選択される技法を含む、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記尿試料中の核酸の分解を低減させる、項目３に記載の方法。
（項目６）
核酸の分解の低減が、（１つまたは複数の）ＲＮＡｓｅ阻害剤の添加、熱不活性化によって、またはグアニジン−ＨＣｌ、グアニジンイソチオシアネート、Ｎ−ラウロイルサルコシン、およびドデシル硫酸ナトリウムからなる群から選択される化合物で前記尿試料を処理することによってヌクレアーゼ活性を阻害することを含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記尿試料が膀胱中に１２時間未満保持されている、項目３に記載の方法。
（項目８）
前記体液が血清である、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記血清試料の分析ステップが、ハイブリダイゼーション、サイクリングプローブ反応、ポリメラーゼ連鎖反応、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応、単鎖の立体配座多型を分析するためのＰＣＲ、およびリガーゼ連鎖反応からなる群から選択される技法を含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記障害が病原体感染である、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記病原体がウイルスである、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記ウイルスがエプスタインバーウイルスである、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記障害が脳卒中である、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記障害がアルツハイマー病である、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記障害がパーキンソン病である、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記障害が妊娠および／または胎児の病状と関係がある、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記胎児性障害がダウン症候群である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
組織または器官中の過剰な細胞死と関係がある障害の結果として、被験体の泌尿器系以外の領域由来の無細胞ｍｉＲＮＡを尿中において検出する方法であって、該方法は：
（ａ）被験体から尿試料を得ること、および
（ｂ）該尿試料をｍｉＲＮＡの１つまたは複数の特異的配列に関して分析することを含み、該分析が該特異的ｍｉＲＮＡ配列の一部分と実質的に相補的であるプライマーおよび／またはプローブを用いて該ｍｉＲＮＡを検出するステップを含む、方法。
（項目１９）
体液中の特異的無細胞ｍｉＲＮＡの定量分析による被験体の疾患および／または治療モニタリングの方法であって、該方法は：
（ａ）被験体から体液試料を定期的に得ること、および
（ｂ）該試料を、被験体とする細胞、組織または器官中で特異的である／過剰発現されるｍｉＲＮＡの１つまたは複数の特異的配列に関して分析することを含み、該分析が該特異的ｍｉＲＮＡ配列の一部分と実質的に相補的であるプライマーおよび／またはプローブを用いて該ｍｉＲＮＡを検出するステップを含む、方法。
（項目２０）
前記体液が尿である、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記体液が血清である、項目１９に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）を使用した濾過尿から抽出した核酸のポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真である。
【図２】ＥＢＶ由来ＢＡＲＴ１ｍｉＲＮＡ特異的ＲＴ−ＰＣＲ産物のポリアクリルアミドゲル分析の写真である。
【図３−１】図３Ａ〜３Ｇは、脳卒中後１２および２４時間の時間地点での、患者の尿試料中のｍｉＲＮＡの正規化濃度のドットプロット図である。
【図３−２】図３Ａ〜３Ｇは、脳卒中後１２および２４時間の時間地点での、患者の尿試料中のｍｉＲＮＡの正規化濃度のドットプロット図である。
【図３−３】図３Ａ〜３Ｇは、脳卒中後１２および２４時間の時間地点での、患者の尿試料中のｍｉＲＮＡの正規化濃度のドットプロット図である。
【図３−４】図３Ａ〜３Ｇは、脳卒中後１２および２４時間の時間地点での、患者の尿試料中のｍｉＲＮＡの正規化濃度のドットプロット図である。
【図４】ｍｉＲＮＡ１２９およびｍｉＲＮＡ２１９の濃度の変化と脳卒中の結果の間の相関関係を表す略図である。○および□として示した患者は脳卒中後１カ月でその臨床状態が改善し、×で示した患者の臨床状態は脳卒中後１カ月で悪化した。
【図５−１】アルツハイマー病を有する患者と年齢対応対照の無濾過尿試料中のｍｉＲＮＡの正規化濃度のドットプロット図である。
【図５−２】アルツハイマー病を有する患者と年齢対応対照の無濾過尿試料中のｍｉＲＮＡの正規化濃度のドットプロット図である。
【図５−３】アルツハイマー病を有する患者と年齢対応対照の無濾過尿試料中のｍｉＲＮＡの正規化濃度のドットプロット図である。
【図６−１】アルツハイマー病を有する患者と年齢対応対照の濾過尿試料中のｍｉＲＮＡの正規化濃度のドットプロット図である。
【図６−２】アルツハイマー病を有する患者と年齢対応対照の濾過尿試料中のｍｉＲＮＡの正規化濃度のドットプロット図である。
【図７−１】アルツハイマー病を有する患者と年齢対応対照の血清試料中のｍｉＲＮＡの正規化濃度のドットプロット図である。
【図７−２】アルツハイマー病を有する患者と年齢対応対照の血清試料中のｍｉＲＮＡの正規化濃度のドットプロット図である。
【図８−１】パーキンソン病を有する患者と年齢対応対照の尿試料中のｍｉＲＮＡの正規化濃度のドットプロット図である。
【図８−２】パーキンソン病を有する患者と年齢対応対照の尿試料中のｍｉＲＮＡの正規化濃度のドットプロット図である。
【図９】ダウン症候群の胎児を妊娠した女性と正常胎児を妊娠した女性の尿試料中のｍｉＲＮＡ−９の正規化濃度のドットプロット図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の技術は、低分子ＲＮＡ、特に経腎ｍｉＲＮＡ（Ｔｒ−ｍｉＲＮＡ）を含めた特異的マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が体液中に存在し、かつそれらの濃度は器官損傷または他の病状と関係がある細胞死を反映するという発見に基づく。したがって、対照群のそれより低いかまたは高いレベルでのこれらの核酸配列の存在は、異常または病的状態が、そこから試料を得た患者におそらく存在することを示す。
【００２４】
本発明の方法は、それらの固有の非侵襲的性質のため、以前の診断法、検出法およびモニタリング法に優る改善点を与える。
【００２５】
本発明の理解を容易にするために、幾つかの用語を以下に定義する：
用語「プライマー」は、プライマー延長が開始される条件下に置かれたとき、合成の開始地点として作用することができるオリゴヌクレオチドを指す。オリゴヌクレオチド「プライマー」は精製制限断片の消化などと同様に自然に存在する可能性があり、または合成によって生成することができる。
【００２６】
鋳型の特異的配列の鎖と「実質的に」相補的であるプライマーを選択する。プライマーは鋳型鎖とハイブリダイズしてプライマー延長が起こるほど十分相補的でなければならない。プライマー配列は鋳型の正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド断片を、プライマー配列の残り部分が鎖と実質的に相補的であるプライマーの５’末端と結合させることが可能である。プライマー配列がハイブリダイズし、それによってプライマーの延長産物の合成用の鋳型プライマー複合体を形成するほど鋳型の配列と十分な相補性を有するという条件で、非相補的塩基またはより長い配列をプライマー中に散在させることが可能である。
【００２７】
「標的」核酸は、ハイブリダイゼーション、増幅、または分析法の組合せを含めた、核酸配列を分析する任意の他の手段によって評価されるｍｉＲＮＡ配列である。
【００２８】
「ハイブリダイゼーション」法は、相補的配列と標的核酸（分析する配列）のアニーリングを含む。互いを発見し塩基対形成の相互作用によってアニーリングする相補的配列を含有する核酸の２ポリマーの能力は、十分理解されている現象である。ＭａｒｍｕｒおよびＬａｎｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ４６巻：４５３頁（１９６０年）ならびにＤｏｔｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ４６巻：４６１頁（１９６０年）による「ハイブリダイゼーション」プロセスの初期の観察は、近代生物学の必須ツールへのこのプロセスの改良に続いている。ハイブリダイゼーションには、スロット、ドットおよびブロットハイブリダイゼーション技法があるが、これらだけには限られない。
【００２９】
ハイブリダイゼーションが完全または部分的相補性を示すかどうか決定することは、幾つかの診断用途に重要である。例えば、単に病原体ｍｉＲＮＡの有無を検出することが望ましい場合、関連配列が存在するときは、ハイブリダイゼーション法はハイブリダイゼーションを保証することのみが重要であり、部分的に相補的なプローブと完全に相補的なプローブの両方がハイブリダイズする場合は、条件を選択することができる。しかしながら、他の診断用途は、ハイブリダイゼーション法が部分的相補性と完全相補性を区別することを必要とする可能性がある。遺伝的多型の検出を対象とする可能性がある。
【００３０】
本明細書で使用する用語「プローブ」は、精製制限断片の消化などと同様に自然に存在しようと、または合成によって生成しようと、プローブ中の少なくとも１つの配列と他の核酸中の配列の相補性またはそれらの再現性のある引力相互作用の他の手段のため、二本鎖構造または別の核酸の配列との他の複合体を形成する、オリゴヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。プローブは、特定遺伝子配列の検出、同定および単離において有用である。本発明中で使用する任意のプローブは、それが酵素（例えばＥＬＩＳＡ、および酵素系組織化学的アッセイ）、蛍光、放射活性、および発光の系だけには限られないが、これらを含めた任意の検出系中で検出可能であるように、任意の「レポーター分子」で標識されることは企図される。対象とする（すなわち、検出する）オリゴヌクレオチドがレポーター分子で標識されることがさらに企図される。対象とするプローブとオリゴヌクレオチドの両方が標識されることも企図される。本発明が任意の特定の検出系または標識に限られることを意図するものではない。
【００３１】
本明細書で使用する用語「ｍｉＲＮＡ」は、特に特異的タンパク質をコードするｍＲＮＡの安定性および翻訳の制御におけるその関与のために、代謝過程の制御において重要な役割を果たす、約１８〜２３ヌクレオチド長の低分子非コードの一本鎖ＲＮＡのサブクラスである。ｍｉＲＮＡは、ヘテロクロマチン形成およびゲノム再編成のような、他の重要な過程にも関与する。
【００３２】
用語「過剰」および「不十分な」ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞死は、特定の器官または組織中で死につつある細胞の数が、年齢および性別が対応した対照よりそれぞれ多いまたは少ないときの状況を記載する。
【００３３】
本明細書で使用する用語「精製」、「浄化（ｄｅｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ）」および「滅菌」は、試料からの（１つまたは複数の）夾雑物の除去を指す。
【００３４】
本明細書で使用する用語「実質的に精製された」および「実質的に単離された」は、それらの自然環境から取り出され、単離または分離され、それらが本来関連していた他の構成要素を、好ましくは６０％含まない、より好ましくは７５％含まない、および最も好ましくは９０％含まない核酸配列を指す。したがって「単離ポリヌクレオチド」は実質的に精製されたポリヌクレオチドである。本発明の方法を実施するために、必要ではないがポリヌクレオチドを実質的に精製することは可能であることは企図される。非精製形の核酸配列を検出するための様々な方法が当技術分野で知られている。
【００３５】
本明細書で使用する用語「ＰＣＲ産物」および「増幅産物」は、２サイクル以上の変性、アニーリングおよび延長のＰＣＲステップが終了した後に生成する化合物の混合物を指す。これらの用語は、１つまたは複数の標的配列の１つまたは複数のセグメントの増幅があった場合を含む。
【００３６】
本明細書で使用する用語「尿路」は、身体からの尿の分泌および排泄に関与する器官および導管を指す。
【００３７】
本明細書で使用する用語「患者」または「被験体」は、治療のレシピエントを指す。哺乳動物および非哺乳動物患者が含まれる。特定の実施形態では、患者は、ヒト、イヌ、ネズミ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ブタ、またはヤギなどの哺乳動物である。特定の実施形態では、患者はヒトである。
【００３８】
本発明の一実施形態では、検出するｍｉＲＮＡは、身体中の特定の細胞型、組織、または器官に由来し、そこで特異的に発現され、この場合前記ｍｉＲＮＡのレベルの変化は、前記組織の急性の病状、例えば心筋細胞の死と関係がある急性心筋梗塞、ニューロンおよびグリア細胞の死と関係がある脳卒中、ウイルスもしくは他の感染によって、または毒性物質の作用によって引き起こされる肝細胞の死と関係がある肝炎または肝硬変、異なる膵臓細胞の死と関係がある急性膵炎、移植器官中の過剰な細胞死と関係がある移植器官の拒絶、様々な器官の外傷性損傷、多数の急性感染、例えば肺および／または他の感染器官中での細胞死と関係がある結核などを示す。
【００３９】
本発明の別の実施形態では、検出するｍｉＲＮＡは、身体中の特定の細胞型、組織、または器官に由来し、そこで特異的に発現され、この場合前記ｍｉＲＮＡのレベルの変化は、前記組織の慢性の病状、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、ニューロンの死によって引き起こされるかまたはそれに付随する前頭側頭型認知症または中枢神経系の他の疾患、心筋細胞の死と関係がある慢性心不全、肺細胞の死と関係がある気腫、膵臓β細胞の死と関係がある１型糖尿病、腎細胞の死と関係がある糸球体腎炎、活発に増殖する前癌細胞のアポトーシス死と関係がある前癌状態、不十分な血液供給による広範囲の壊死細胞死と関係がある癌、および慢性的に感染した器官または組織中の細胞死などを示す。
【００４０】
本発明のさらに別の実施形態では、検出するｍｉＲＮＡは、身体中の特定の細胞型、組織、または器官に由来し、そこで特異的に発現され、かつ前記ｍｉＲＮＡのレベルの変化は、物理および化学物質の細胞毒性効果、例えば骨髄細胞を殺傷する比較的低い線量、胃腸系の上皮細胞の死をもたらすより高い線量、および脳のニューロンを殺傷するさらに高い線量と結び付けた放射線、ならびに天然または合成の毒性化合物によって誘導される異なる器官および組織中の細胞死と関係がある化学的細胞毒性などを示す。
【００４１】
本発明のさらに別の実施形態では、検出するｍｉＲＮＡは、身体中の特定の細胞型、組織、または器官に由来し、そこで特異的に発現され、かつ疾患の結果の予後判定に使用することができる。疾患の進行／退行、治療的または外科的介入の成功を示す、それぞれのｍｉＲＮＡのレベルの変化は、疾患および治療のモニタリングに使用する。
【００４２】
本発明の別の実施形態では、検出するｍｉＲＮＡは、移植された細胞、組織、または器官に由来し、かつそれらのレベルは拒絶反応のエピソードおよび対応する治療を示す。
【００４３】
本発明の別の実施形態では、検出するｍｉＲＮＡは、病原体に由来し、かつ感染の診断およびモニタリングに使用される。本発明の特定の実施形態では、病原体はウイルス、例えばエプスタインバーウイルスである。
【００４４】
本発明のさらに別の実施形態では、検出するｍｉＲＮＡは感染器官の細胞に由来し、かつ診断支援、感染組織損傷の評価、およびさらなる疾患および治療のモニタリングに使用することができる。
【００４５】
本発明のさらに別の実施形態では、検出するｍｉＲＮＡは妊婦の胎児に由来し、胎盤中の栄養膜の過剰な死によって特徴付けられる、例えば子癇前症などの、胎児の状態または病状に特徴的である。さらに別の実施形態では、検出するｍｉＲＮＡは妊婦の胎児に由来し、例えばダウン症候群および器官発達の遅れならびに過剰または抑制型細胞死を伴う他のトリソミーなどの、胎児の状態または病状に特徴的である。
【００４６】
本発明のさらに別の実施形態では、組織もしくは細胞特異的ｍｉＲＮＡ単独、またはそれと他のマーカーを組合せたレベルに関する情報を、例えば肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌、結腸直腸癌、膵臓癌および他の知られている癌などの、癌および前癌症状の診断またはモニタリングに使用する。
【００４７】
幾つかの実施形態では、細胞および／または組織特異的ｍｉＲＮＡのレベルを、血清中の遍在的ｍｉＲＮＡのレベル、尿中のアルブミンもしくはクレアチニンのレベル、または他の組織特異的胎児ｍｉＲＮＡの正規化用の胎盤特異的ｍｉＲＮＡのレベルを使用して正規化する。
【００４８】
本発明の一態様では、特異的ｍｉＲＮＡを検出するための前記尿試料の分析ステップは、ハイブリダイゼーション、サイクリングプローブ反応、ポリメラーゼ連鎖反応、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応、単鎖の立体配座多型を分析するためのＰＣＲ、およびリガーゼ連鎖反応からなる群から選択される技法を含む。
【００４９】
本発明の特定の態様では、前記尿試料中の核酸の分解を低減させる。核酸の分解を低減させる方法は、ＲＮＡｓｅ阻害剤の使用によって、またはグアニジン−ＨＣｌ、グアニジンイソチオシアネート、Ｎ−ラウロイルサルコシン、およびドデシル硫酸ナトリウムからなる群から選択される化合物で前記尿試料を処理することによってヌクレアーゼ活性を阻害することを含む。本発明の別の態様では、前記尿試料は膀胱中に１２時間未満保持されている。
【００５０】
本発明の一実施形態では、測定するｍｉＲＮＡ配列は、肺、心臓、肝臓、神経系、脳、血液、腎臓、骨、眼または膵臓だけには限られないが、これらから選択され得る身体中の組織と特に関連がある。
【００５１】
分析用に選択する組織は、正常または異常（例えば悪性）であってよい。悪性組織および腫瘍には、一般に癌腫、サルコーマ、メラノーマおよび白血病があり、およびより具体的には、胆道癌、膀胱細胞癌、骨癌、脳およびＣＮＳの癌、乳癌、子宮頸癌、絨毛癌、慢性骨髄性白血病、結腸癌、結合組織癌、皮膚Ｔ細胞白血病、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、濾胞性リンパ腫、胃癌、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、上皮内新生物、咽頭癌、リンパ腫、肝臓癌、肺癌（例えば、小細胞および非小細胞）、メラノーマ、多発性骨髄腫、神経芽腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、肉腫、皮膚癌、扁平上皮細胞癌、精巣癌、甲状腺癌、および腎臓癌と関係がある悪性組織および腫瘍から選択される。方法を使用して良性腫瘍と悪性腫瘍を区別することができる。
【００５２】
このような組織試料を採取することができる被験体は、癌を発症するリスクがある被験体を含む。癌を発症するリスクがある被験体は、癌を発症する高い確率（例えば、一般人内の確率より高い確率）を有する被験体である。これらの被験体には、例えば、その存在が一般人の可能性より高い癌を発症する可能性と相関関係があることが実証されている遺伝的異常を有する被験体、およびタバコ、アスベスト、もしくは他の化学的毒素などの癌誘発物質（すなわち発癌性物質）に曝された被験体、または以前に癌の治療を施され外見上寛解状態である被験体がある。
【００５３】
本発明の方法は、患者の体液からのｍｉＲＮＡの単離を含む。本発明の一態様では、対象とするｍｉＲＮＡは、血液、羊水、脳脊髄液、血漿、乳、精液、血清、痰、唾液および尿などの体液中で検出することができる。本発明の一態様では、ｍｉＲＮＡを尿中で検出する。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡを血清中で検出する。
【００５４】
本発明のｍｉＲＮＡ単離の本発明の方法は、市販のアニオン交換物質を使用することができる。強または弱アニオン交換体のいずれかを使用することができる。吸着および溶出用に選択した溶液を使用することによって、ｍｉＲＮＡを精製、濃縮、および実質的に単離することができる。
【００５５】
ｍｉＲＮＡとアニオン交換カラム材料の初期結合用に知られているイオン強度で溶液を使用することによって、タンパク質などの他の電気陰性分子（弱く結合した夾雑物）を含めた大部分の水溶性成分はカラムを介して洗浄することができる。溶出用に、理想的には核酸が完全に溶出する最小イオン強度に相当するｐＨに調節するためにバッファーと混合することが可能である、知られている濃度のＮａＣｌなどの塩を使用することによって、必要とされるイオン強度に到達させる。核酸より高いストリンジェンシーでアニオン交換樹脂と結合した夾雑物質はしたがってカラム内に残る可能性があり、すなわち強く結合した夾雑物は核酸から分離される。
【００５６】
好ましい弱交換体は、第一級、第二級、または第三級アミン基（すなわち、プロトン化可能アミン）が交換部位を与える交換体である。強塩基性アニオン交換体は、交換部位として第四級アンモニウム基（すなわち、プロトン化可能ではなく常に正に帯電している）を有する。両方の交換体は、そのそれぞれの吸収および溶出イオン強度および／または分離するｍｉＲＮＡに関するｐＨに関して選択される。溶液強度は結合強度より高い。
【００５７】
本発明の一態様では、尿から経腎ｍｉＲＮＡを単離するための方法を提供し、この方法は、被験体由来の尿を与えること、濾過または遠心分離によって尿から細胞および細胞残骸を場合によっては分離すること、ＥＤＴＡおよびＴｒｉｓ−ＨＣｌを尿に加えること、シリカを含まないアニオン交換樹脂を尿に加えること、混合物をインキュベートすること、尿からアニオン交換媒体を除去すること、および樹脂からｍｉＲＮＡを溶出することを含む。
【００５８】
尿からｍｉＲＮＡを単離する方法の一実施形態では、それを尿に加えた後のＥＤＴＡおよびＴｒｉｓ−ＨＣｌの濃度は１０〜１００ｍＭの範囲であり、かつ溶液のｐＨは約８．０と約８．５の間である。
【００５９】
さらなる実施形態では、アニオン交換媒体との吸着前に膜を介して、体液を場合によっては事前に濾過する。
【００６０】
さらなる実施形態では、アニオン交換媒体は、カチオン性第四級アンモニア基で官能化したセファロース系樹脂である。カチオン性アンモニア基で官能化したセファロース系樹脂の例には、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＡＮＸ−４  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）、およびＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−ＸＬ（商標）ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）がある。
【００６１】
さらなる実施形態では、アニオン交換媒体は、Ｑ−フィルターまたはＱ−樹脂などのセファロース系第四級アンモニウムアニオン交換媒体から選択される。
【００６２】
本発明のさらなる実施形態では、アニオン交換媒体を個別の担体に固定し、この場合このような担体は、媒体／核タンパク質結合複合体の輸送または保存に使用することができる、カラム、カートリッジまたは携帯型濾過システムである。
【００６３】
本発明の別の実施形態では、例えば同じ人間の尿試料中に存在するｍｉＲＮＡ配列の定期解析は、特定の器官または組織中の病的過程に関する初期情報を与えることができる。例えば、ｍｉＲＮＡ１２２は肝臓中でのみ合成され、その量の増大は肝炎または別の肝臓病状のマーカーとなり得る。アルツハイマー症候群はニューロン中で特異的に発現されるｍｉＲＮＡの濃度の増大を伴う可能性がある。
【００６４】
別の実施形態では、患者の体液試料中の組織特異的ｍｉＲＮＡのより詳細なモニタリングは、疾患の重篤度の推測、および治療努力の有効性の評価に有用である。
【００６５】
さらに別の実施形態では、腫瘍特異的変異の分析と組合せて、組織特異的ｍｉＲＮＡに関するデータは腫瘍局在の決定に役立つ可能性がある。
【００６６】
本発明の他の態様は、（１つまたは複数の）特異的ｍｉＲＮＡの発現の変化によって引き起こされるかまたはそれらに付随する疾患に関する。記載する技術はこのような型の病状の診断に役立つ。
【００６７】
さらに別の実施形態では、本発明の方法の適用を患者の尿中の合成ｓｉＲＮＡの薬物動態のモニタリングに広げて、ｓｉＲＮＡ薬剤設計の最適化を増進することができる。
【００６８】
他に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が関係する分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載する方法および物質と同等または均等な方法および物質を、本発明を実施する際に使用することができるが、適切な方法および物質を以下に記載する。本明細書で言及する全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全容を参照によって明確に組み込む。矛盾する場合には、定義を含めた本明細書が支配する。さらに、本明細書に記載する物質、方法、および実施例は単なる例示的なものであり、制限的であることは意図しない。
【実施例】
【００６９】
幾つかの実施例を示して本発明の様々な実施形態をより完全に例示する。これらの実施例は決して、添付の特許請求の範囲中に挙げる本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。
【００７０】
（実施例１）
尿からのｍｉＲＮＡの抽出：
採尿：これらの実験用に、患者またはボランティア由来の尿検体を滅菌１１０ｍｌ採尿カップ中に回収し、最終濃度１０ｍＭと１５０ｍＭの間、好ましくは５０ｍＭまでＥＤＴＡをすぐに補充した。検体は−８０℃で１０〜５０ｍｌのアリコート中に保存した。検体回収直後、ＥＤＴＡを加える前に、尿の任意選択の濾過をＳｔｅｒｉｃｕｐ（商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｖａｃｕｕｍ  Ｄｒｉｖｅｎ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、０．４５μＤｕｒａｐｏｒｅ（商標）フィルター）で実施した。
【００７１】
Ｑ結合：５０ｍｌチューブ中で、２０ｍＬの尿を等体積の５０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）および５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で希釈し、次いでそれに１〜２ｍｌのＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；１７−０５１０−１０）スラリーを補充し、室温で１０〜３０分間厳密に混合した。結合した核酸を有する樹脂を、スウィングバケット型ローターを使用して卓上型医療用遠心分離機中において、室温で５分間２０００ｇでの遠心分離によって回収した。約５００μｌ以外の全ての上清を吸引によって除去した。樹脂ペレットを残りの上清中に再懸濁し、Ｍｉｃｒｏ  Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎクロマトグラフィーカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）または同等物に移し、それは真空の遠心分離によっても操作した。カラム中の樹脂は、５００μｌの２×ＳＳＣ（３００ｍＭのＮａＣｌ／３０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０））または匹敵するイオン強度を有するバッファー（例えば、３００ｍＭのＮａＣｌまたはＬｉＣｌ）で３回洗浄した。核酸は高いイオン強度（例えば、１ＭのＮａＣｌまたはＬｉＣｌ）を有するＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅから溶出することができるが、以下に記載する方法はＲＮＡをより良く保つ。
【００７２】
Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）およびＴＲＩｚｏｌ（商標）相分離からの溶出：結合した核酸は５００μｌのＴＲＩｚｏｌ（商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でさらに溶出した。ＴＲＩｚｏｌからの核酸の抽出は製造者の勧告に従い実施した。簡単に言うと、相分離用に、ＴＲＩｚｏｌ溶出液に１００μｌのクロロホルムを補充し、激しく混合し、３〜５分間室温でインキュベートし、４℃において１５分間１２，０００×ｇで遠心分離にかけた。相間に接触させるのを避けながら、３００μｌの上相を新たな遠心分離管に移した。次いで核酸を沈殿させ、あるいはさらに浄化し、かつシリカカラムで脱塩した。
【００７３】
核酸の沈殿：核酸の沈殿用に、前に記載した調製物に１μｌの２０ｍｇ／ｍＬグリコーゲン（Ｒｏｃｈｅ）および３００μｌの１００％イソプロピルアルコールを補充した。核酸は遠心分離によって回収し、ペレットは２００μｌの７０％エタノールで２回洗浄し、室温で５分間放置して空気乾燥させ、次いで核酸を３０μｌの０．１ｍＭ ＥＤＴＡ／ｌ×ＲＮＡ  Ｓｅｃｕｒｅ（Ａｍｂｉｏｎ）中で溶かした。試料は６０℃で１０分間インキュベートして、任意の残留ＲＮａｓｅ活性を不活発にした。
【００７４】
核酸のシリカカラムでの浄化：シリカカラム（Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲクリーンカラムまたは同等物）との結合用に、３体積の９６％エタノールをＴＲＩｚｏｌ上相由来の核酸調製物に加え、かつ室温で３分間のインキュベーション後に、混合物をカラムに充填した。カラムは５００μｌの２Ｍ ＬｉＣｌ／８０％エタノールで２回、および５００μｌの８０％エタノールで２回洗浄した。核酸は５０μｌの０．１ｍＭ ＥＤＴＡ／１×ＲＮＡ  Ｓｅｃｕｒｅ（Ａｍｂｉｏｎ）で溶出した。試料は６０℃で１０分間インキュベートして、全ての残留ＲＮａｓｅを不活化した。
【００７５】
ＤＮａｓｅＩおよびＲＮａｓｅＡによる消化：前に記載したプロトコルを用いて尿から抽出した物質の核酸同一性を確認するために、本発明の調製物をＤＮａｓｅＩおよび／またはＲＮａｓｅＡで消化した。ＤＮａｓｅＩによる消化は、２単位のＲＮａｓｅ遊離ＤＮａｓｅＩ（ＮＥＢ）を含有するＤＮａｓｅＩ反応バッファー（ＮＥＢ）中で実施した。ＲＮａｓｅＡによる消化は、５０ｎｇ／ｍＬの煮沸したＲＮａｓｅＡを補充したＴＥバッファー中で実施した。試料は３７℃で６０分間インキュベートし、ローディング色素の添加後、試料は５％ポリアクリルアミド１×ＴＢＥゲルでの電気泳動にかけ、１／１００００希釈ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。図１に示すように、単離した物質は低分子量核酸、主にＲＮＡおよびそれらの断片を表す。さらに、（図１参照）、比較用に、Ｑ−樹脂由来の核酸を３ＭのＮａＣｌによって（レーン２および３）、およびＴｒｉｚｏｌ（商標）によって（レーン４および５）溶出した。
【００７６】
図１では、レーン１および５は、それぞれＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅから高塩濃度およびＴｒｉＺｏｌ溶出で単離した核酸を表す。レーン２および６、３および７、４および８は、それぞれＤＮＡｓｅ、ＲＮＡｓｅ、またはＤＮＡｓｅおよびＲＮＡｓｅを用いた処理後の核酸を表す。
【００７７】
さらに、ＲＮＡの存在および分子サイズを実証するために、精製した核酸のＲＮＡアリコートをＤＮａｓｅＩで消化した（レーン３および５）。
【００７８】
血清からのＲＮＡの抽出
これらの実験用に、１．２ｍｌのＴＲＩｚｏｌＬＳを０．４ｍｌの血清に加え、混合物は１０、１４，０００ｒｐｍで遠心分離にかけた。上清は２ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、０．３ｍｌのクロロホルムを加え、混合物は１５秒間振とう処理した。１５分間１４，０００ｒｐｍでの遠心分離後に、上清は５ｍｌのチューブに移し、エタノールを７０％の最終濃度まで加えた。混合物は真空マニホールド上のＱｕｉａｇｅｎ  Ｑｕｉｃｋカラムに充填し、カラムは０．５ｍｌの２Ｍ ＬｉＣｌ−８０％ＥｔＯＨで２回、０．５ｍｌの８０％エタノール−８０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で１回、および最後に０．５ｍｌの９５％エタノールで洗浄した。カラムは１．５ｍｌのエッペンドルフチューブにおいて３分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離にかけ、かつＲＮＡは４０μｌのＨ２Ｏで溶出した。
【００７９】
（実施例２）
この実施例は、死につつある細胞由来のｍｉＲＮＡが腎臓障壁を通過し、かつ患者の尿中で検出することができることを実証する。
【００８０】
尿中のヒトｍｉＲＮＡ分子の検出
この実施例中で分析したマイクロＲＮＡ種は、３つの異なる型、すなわち全てまたは複数の組織中で発現される遍在的ｍｉＲＮＡ、組織特異的ｍｉＲＮＡ、および発現が特定の組織または細胞型において有意に変わるｍｉＲＮＡに分類することができる。表１によって示すように、２０の異なるｍｉＲＮＡを１６の健常ボランティアおよび登録ドナーの尿から得て、市販のｍｉＲＮＡ発現分析キット（ＡＢＩ）を使用しリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって後に検出した。対応する合成ｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは標準として使用した。反応は供給者によって勧告されたように厳密に実施した。
【００８１】
【表１】
0005416110.tif 000002
全３型のｍｉＲＮＡを尿中ＲＮＡの大部分の調製物において検出した。最高コピー数は遍在的ｍｉＲＮＡに特徴的であった。しかしながら、組織特異的ｍｉＲＮＡまたは特定の組織もしくは細胞型で過剰発現されたｍｉＲＮＡも検出可能であった。死につつある細胞由来のｍｉＲＮＡの一部分は分解されていないが、血流中に出現し、最終的には尿中に排出されることを明らかに実証している。
【００８２】
（実施例３）
この実施例は、ヒト鼻咽頭癌（ＮＰＣ）細胞由来のｍｉＲＮＡが患者の腎臓障壁を通過することができ、かつリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって患者の尿中で検出することができることを実証する。
【００８３】
尿中のウイルス由来ｍｉＲＮＡ
幾つかのウイルスもｍｉＲＮＡをコードし生成することは知られている。エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）は鼻咽頭癌（ＮＰＣ）の発生に関与するので、本発明の系を使用して、ＮＰＣ細胞由来のウイルスｍｉＲＮＡが患者の尿に到達し、そこで検出することができるかどうか調べた。ＮＰＣ患者由来の尿試料を回収し、本出願の実施例１中に記載した手順に従い保存した。ＥＢＶ感染は尿中のウイルス特異的ＤＮＡ配列の検出によって確認した。健常ドナーから回収した尿はＥＢＶ特異的ＤＮＡ配列に陰性であった。２つのＥＢＶ特異的ｍｉＲＮＡ、ＢＡＲＴ３−３ｐおよびＢＡＲＴ１−３ｐをこの試験中で分析した：
【００８４】
【化１】
0005416110.tif 000003
逆転写は１５μｌで実施し、ＲＴ反応の１０分の１はＳｉｇｍａからのＪｕｍｐＳｔａｒｔＤＮＡポリメラーゼを使用したＰＣＲ増幅に施した。以下のプライマーを５００ｎＭの濃度で使用した：
【００８５】
【化２】
0005416110.tif 000004
産物は１５％のポリアクリルアミドゲル（ＰＡＡＧ）において分析した。
【００８６】
図２によって実証されるように、ＢＡＲＴ３とＢＡＲＴ１の両方のｍｉＲＮＡ種がＮＰＣ患者由来の尿中で検出されたが、健常ドナー由来の尿試料中では検出されなかった。これらのデータは、泌尿器系の外側に位置した死につつある細胞由来のｍｉＲＮＡが尿中で検出することができることを再度示す。図２中では、レーン１はマーカーを表し、レーン２および３は鼻咽頭癌を有する患者を表し、レーン４および５は対照患者を表し、かつレーン６は陽性対照を表し、それぞれの合成ｍｉＲＮＡを表す。
【００８７】
（実施例４）
この実施例は、患者の尿中のニューロン特異的ｍｉＲＮＡの濃度の測定によって、ｉｎ
ｖｉｖｏで脳卒中によって引き起こされるニューロン死を記録することができることを実証する。
【００８８】
脳卒中の診断
これらの実験用に、脳卒中を有する患者を、脳特異的ｍｉＲＮＡまたは脳卒中後に脳内で過剰発現されるｍｉＲＮＡの、濃度の変化の分析用に調べた。どの脳細胞型およびどの脳領域において、これらのｍｉＲＮＡが発現されるかは現在知られていないので、９個の異なる脳特異的ｍｉＲＮＡを試験した。
【００８９】
患者：尿試料を病院の救急治療室で受け入れた患者から回収した。脳卒中の診断は臨床症状に基づいた。尿試料は脳卒中後１２および２４時間で回収した。対照尿試料は、脳卒中症状がない年齢対応ボランティアによって与えられた。試料を回収し、本出願の実施例１中に記載した手順に従い保存した。
【００９０】
ｍｉＲＮＡ種：尿由来のｍｉＲＮＡは、実施例１中に記載した手順に従い抽出した。６７５μｌの尿から単離したのと等しい量のＲＮＡに逆転写ＰＣＲを施し、かつＲＴ−ＰＣＲ混合物の１／１０に最終リアルタイムＰＣＲを施し、これは製造者によって与えられたプロトコルを使用して実施した。得られたデータは、尿中クレアチニン濃度ごとの再計算によって個々の腎臓濾過率に関して正規化した。これらの実験用に、同じ年齢群由来の健常ドナーから回収した尿試料をベースラインとして使用した。異なるｍｉＲＮＡ種は以下のように示す：
Ａ．ｈｓａ−ｍｉｒ−１２８ａ
Ｂ．ｈｓａ−ｍｉｒ−９
Ｃ．ｈｓａ−ｍｉｒ−１２７
Ｄ．ｈｓａ−ｍｉｒ−１３７
Ｅ．ｈｓａ−ｍｉｒ−１２９
Ｆ．ｈｓａ−ｍｉｒ−２１９
Ｇ．ｈｓａ−ｍｉｒ−２１８  。
【００９１】
図３Ａ〜３Ｇ中に要約した結果は、脳卒中後、脳細胞死の動態を反映する、幾つかの脳特異的ｍｉＲＮＡ（１２８ａ、１２９、２１８、２１９）のレベルの有意な増大があることを明らかに実証する。
【００９２】
（実施例５）
この実施例は、脳卒中後の患者の尿中のｍｉＲＮＡ濃度の動態は、疾患の結果に関する情報を与えることを実証する。
【００９３】
脳卒中のモニタリング
この実験用に、脳卒中を有する患者を、脳特異的ｍｉＲＮＡの濃度の変化と疾患の発生の間の相関関係の分析用に調べた。
【００９４】
患者：尿試料を病院の救急治療室で受け入れた患者から回収した。脳卒中の診断は臨床症状およびＭＲＩ分析に基づいた。尿試料は脳卒中後１２、２４、４８時間および１週間で回収した。患者の臨床状態は脳卒中後３０日で評価した。対照尿試料は、脳卒中症状がない年齢対応ボランティアによって与えられた。試料を回収し、本出願の実施例１中に記載した手順に従い保存した。
【００９５】
ｍｉＲＮＡ種：尿由来のｍｉＲＮＡは、実施例１中に記載した手順に従い抽出し、ＴａｑＭａｎ  ｍｉＲＮＡアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって分析した。４００μｌの尿から単離したのと等しい量のＲＮＡに逆転写ＰＣＲを施し、かつＲＴ−ＰＣＲ混合物の１／１０に最終リアルタイムＰＣＲを施し、これは製造者によって与えられたプロトコルを使用して実施した。得られたデータは、尿中クレアチニン濃度ごとの再計算によって個々の腎臓濾過率に関して正規化した。これらの実験用に、同じ年齢群由来の健常ドナーから回収した尿試料をベースラインとして使用した。
【００９６】
図４ＡおよびＢ中に要約した結果は、脳卒中後のＴｒ−ｍｉＲＮＡ１２９およびＴｒ−ｍｉＲＮＡ２１９の変化の動態は異なる患者において異なり、疾患の発生と相関関係があることを明らかに実証する。患者＃３における脳卒中後１週間でのニューロン死の増加は、患者の臨床状態の悪化に相当する。同時に、その経腎ニューロン特異的ｍｉＲＮＡが標準化する傾向があった２人の患者は、有意な改善を示した。
【００９７】
（実施例６）
アルツハイマー病の診断
アルツハイマー病は、特に皮質および海馬中の、ニューロンの死によって引き起こされる進行性神経疾患である。その診断は神経学的検査および認知症の他の原因の排除に基づき、一方で確定診断は検視解剖でのみ実施することができる。本発明は、アルツハイマー病を特徴付ける過剰なニューロン死が、患者の尿から単離した特異的脳ｍｉＲＮＡのレベルを測定することによって、モニターすることができることを実証する。
【００９８】
これらの実験用に、アルツハイマー病と診断された患者を、ニューロン死の結果としての脳特異的または過剰発現ｍｉＲＮＡの濃度の変化の分析用に調べた。
【００９９】
患者：尿および血清の試料は、様々な段階のアルツハイマー病と診断された患者から回収した。対照の尿および血清の試料は、アルツハイマー病の症状がない年齢対応ボランティアによって与えられた。試料を回収し、本出願の実施例１中に記載した手順に従い保存した。幾つかの尿試料は実施例１中に記載した回収後に濾過して、細胞および細胞残骸を除去した。
【０１００】
ｍｉＲＮＡ種：尿および血清由来のＲＮＡは、実施例１中に記載した手順に従い抽出した。
【０１０１】
一組の実験において、７５０μｌの尿から単離したのと等しい量のＲＮＡに逆転写ＰＣＲを施し、かつＲＴ−ＰＣＲ混合物の１／１０に最終リアルタイムＰＣＲを施し、これは製造者（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって与えられたプロトコルを使用して実施した。得られたデータは、尿中クレアチニン濃度ごとの再計算によって個々の腎臓濾過率に関して正規化した。図５は、幾つかの脳特異的ｍｉＲＮＡの濃度が、アルツハイマー病の患者の尿中で増大することを明らかに実証する。
【０１０２】
別組の実験において、濾過尿または血清から単離したＲＮＡを分析した。０．６ｍｌの尿または５０μｌの血清から単離したのと等しい量のＲＮＡに逆転写ＰＣＲを施し、かつＲＴ−ＰＣＲ混合物の１／１０に最終リアルタイムＰＣＲを施し、これは製造者（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって与えられたプロトコルを使用して実施した。尿中ｍｉＲＮＡに関して得たデータは、尿中クレアチニン濃度ごとの再計算によって個々の腎臓濾過率に関して正規化した。血漿中ｍｉＲＮＡに関して得たデータは遍在的ｍｉＲＮＡ−１６ごとに正規化した。図６および７は、幾つかのニューロン特異的ｍｉＲＮＡのレベルが、年齢対応対照と比較して、アルツハイマー病患者の濾過尿と血清の両方において高いことを示す。
【０１０３】
（実施例７）
パーキンソン病
パーキンソン病は、患者の運動能力および話力を悪化させることが多い中枢神経系の変性障害である。本発明は、パーキンソン病を特徴付けるドーパミン作動性ニューロンの過剰な神経死が、患者の尿から単離した特異的脳ｍｉＲＮＡのレベルを測定することによって、モニターすることができることを実証する。
【０１０４】
これらの実験用に、パーキンソン病と診断された患者を、ニューロン死の結果としての脳特異的ｍｉＲＮＡまたは過剰発現ｍｉＲＮＡの濃度の変化の分析用に調べた。
【０１０５】
患者：尿試料は、様々な段階のパーキンソン病と診断された患者から回収した。対照の尿試料は、パーキンソン病の症状がない年齢対応ボランティアによって与えられた。試料を回収し、本出願の実施例１中に記載した手順に従い保存した。
【０１０６】
ｍｉＲＮＡ種：これらの実験用に、尿由来のＲＮＡを実施例１中に記載した手順に従い抽出した。７５０μｌの尿から単離したのと等しい量のＲＮＡに逆転写ＰＣＲを施し、かつＲＴ−ＰＣＲ混合物の１／１０に最終リアルタイムＰＣＲを施し、これは製造者（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって与えられたプロトコルを使用して実施した。得られたデータは、尿中クレアチニン濃度ごとの再計算によって個々の腎臓濾過率に関して正規化した。図８は、幾つかの脳特異的ｍｉＲＮＡの濃度が、パーキンソン病を有する患者の尿中で増大することを実証する。
【０１０７】
（実施例８）
妊娠関連疾患または胎児疾患の出生前検診
ｍｉＲＮＡ分子に関する腎臓障壁の透過性の主たる発見は、先天性疾患の完全に非侵襲的な出生前診断を実施するための母体尿の使用に関する突破口を開く。このような非侵襲的スクリーニングは以下のように実施することができる。
【０１０８】
最初に、尿の試料を妊婦患者から集める。望ましい場合、尿試料中のｍｉＲＮＡを、前に記載した方法を使用して、次いで単離、精製および／または処理して分解を妨げる。次いでｍｉＲＮＡプロファイリングを定量的ＰＣＲまたはｍｉＲＮＡアレイを使用して実施し、得られたデータを使用して、他の病状に関して前に記載したように異なる胎児性病状を決定する。
【０１０９】
（実施例９）
ダウン症候群
これらの実験用に、正常胎児を妊娠した女性とダウン症候群胎児を妊娠した女性の間の母体尿中の脳特異的ｍｉＲＮＡの濃度の差を調べた。
【０１１０】
患者：尿試料は、羊水穿刺によってダウン症候群と診断された妊婦から回収した。対照の尿試料は、正常妊娠した年齢対応女性によって与えられた。試料を回収し、本出願の実施例１中に記載した手順に従い保存した。
【０１１１】
ｍｉＲＮＡ種：尿由来のｍｉＲＮＡを実施例１中に記載した手順に従い抽出した。７５０μｌの尿から単離したのと等しい量のＲＮＡに逆転写ＰＣＲを施し、かつＲＴ−ＰＣＲ混合物の１／１０に最終リアルタイムＰＣＲを施し、これは製造者によって与えられたプロトコルを使用して実施した。得られたデータは、胎盤特異的ｍｉＲＮＡ５１８ごとに正規化した。図９は、それぞれの対照と比較して不十分な細胞死を示す、正常妊娠した女性の尿と比較したダウン症候群胎児を妊娠している女性の尿中の脳特異的ｍｉＲＮＡ９の低い濃度を実証する。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【配列表】
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