(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式ＩａおよびＩｂの化合物：
【化１】
0005511689.tif 000005
ならびにその薬学的に許容される互変異性体、塩、立体異性体およびエナンチオマー（そのすべての比率での混合物を含む）。
【請求項２】
ウイルス性疾患および／または癌腫の予防および／または治療を目的とした薬剤を調製するための、請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項３】
ウイルス性疾患が、リンパ球性脈絡髄膜炎、ウイルス性肝炎、ウイルス性心筋炎、ＡＩＤＳ、ヘルペス、乳頭腫およびウイルス性肺感染症の群から選択されることを特徴とする、
請求項２に記載の使用。
【請求項４】
癌腫が、結腸癌、乳癌、胃癌および肺癌の群から選択されることを特徴とする、
請求項２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス性疾患および／または癌腫の治療上の処置のための、ＳＧＫ１（血清およびグルココルチコイド依存性キナーゼ１）を阻害する化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血清およびグルココルチコイド依存性キナーゼ１（ＳＧＫ１）は、真核細胞中に遍在するタンパク質である。ＳＧＫ１は、例えば、細胞収縮などの細胞のストレスならびに例えば、グルココルチコイドおよびミネラルコルチコイドなどのホルモンの制御下にある。ＳＧＫ１は、インスリンおよび成長因子によって、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼおよびＰＤＫ１（３−ホスホイノシチド依存性キナーゼ１）を介して活性化される。
【０００３】
ＳＧＫ１はもともと、ラット乳癌細胞からクローン化された（Webster MK, Goya L, Firestone GL. J. Biol. Chem. 268 (16): 11482-11485, 1993；Webster MK, Goya L, Ge Y, Maiyar AC, Firestone GL. Mol. Cell. Biol. 13 (4): 2031-2040, 1993）。ヒトキナーゼｈＳＧＫは、細胞容積調節性遺伝子として、肝細胞からクローン化された（Waldegger S, Barth P, Raber G, Lang F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4440-4445, 1997）。ラットキナーゼ（Chen SY, Bhargava A, Mastroberardino L, Meijer OC, Wang J, Buse P, Firestone GL, Verrey F, Pearce D. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 2514-2519, 1999；Naray-Fejes-Toth A, Canessa C, Cleaveland ES, Aldrich G, Fejes-Toth G. J. Biol. Chem. 274: 16973-16978, 1999）は、上皮Ｎａ+チャネル（ＥＮａＣ）を刺激することが示されている。ＥＮａＣの活性が増加すると、高血圧を伴うことがさらに示されている（Warnock DG. Kidney Ind. 53 (1): 1824, 1998）。
【０００４】
ｈＳＧＫは、脳においても発現され（Waldegger S, Barth P, Raber G, Lang F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4440-4445, 1997）、脳でｈＳＧＫは電圧依存性Ｋ+チャネルＫｖ１．３を調節する。Ｋｖ１．３タイプのこれらのＫ+チャネルは、神経細胞の興奮性の調節（Pongs O. Physiol. Rev. 72: 69-88, 1992）、細胞増殖の調節（Cahalan MD and Chandy KG. Cur. Opin. Biotech. 8 (6): 749-756, 1997）およびアポトーシス細胞死の調節（Szabo I, Gulbin E, Apfel H, Zhan X, Barth P, Busch AE, Schlottmann K, Pongs O, Lang F. J. Biol. Chem. 271: 20465-20469, 1999；Lang F, Szabo I, Lepple-Wienhues A, Siemen D, Gulbins E. News Physiol. Sci. 14: 194-200, 1999）に関与することが示されている。Ｋｖ１．３は、リンパ球の増殖および機能の調節においてさらに重要である（Cahalan MD and Chandy KG, Cur. Opin. Biotech. 8 (6): 749-756, 1997）。ＳＧＫファミリーのさらなる２つのメンバーであるＳＧＫ２およびＳＧＫ３がクローン化されている（Kobayashi T, Deak M, Morrice N, Cohen P. Biochem. J. 344: 189-197, 1999）。ＳＧＫは、セリン／トレオニン−タンパク質キナーゼファミリーを形成し、それらは転写調節および転写後調節され得ることがさらに示されている。同様のＳＧＫ１、ＳＧＫ２およびＳＧＫ３はまた、例えば、インスリンおよびＩＧＦ１によって、ＰＩ３キナーゼ経路を介して活性化される。しかし、ＳＧＫタンパク質ファミリーは、今のところ、完全には特徴付けられていない。
【０００５】
とりあえず、ＳＧＫ１は、多様な治療上および診断上の適用のための標的としても知られている。
【０００６】
例えば、DE 197 08 173は、ｈＳＧＫ１が、細胞容積の変化によって病態生理学的に影響される多くの疾患、例えば、高ナトリウム血症、低ナトリウム血症、糖尿病、腎不全、異化亢進、肝性脳症および微生物感染またはウイルス感染などのための有意な診断上の潜在的可能性を有することを示している。
【０００７】
DE 199 17 990は、細胞容積依存性疾患の治療に用いることができるキナーゼ阻害剤、例えば、スタウロスポリン、ケレリトリンまたはトランス優位的に阻害するキナーゼ（ｔｒａｎｓｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｋｉｎａｓｅ）などを記載している。
【０００８】
加えて、WO 2004/079003 A1は、凝固障害、脈管障害、肺高血圧および動脈硬化のための、診断上および治療上の標的としてのＳＧＫ１の使用を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】DE 197 08 173
【特許文献２】DE 199 17 990
【特許文献３】WO 2004/079003 A1
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Webster MK, Goya L, Firestone GL. J. Biol. Chem. 268 (16): 11482-11485, 1993
【非特許文献２】Webster MK, Goya L, Ge Y, Maiyar AC, Firestone GL. Mol. Cell. Biol. 13 (4): 2031-2040, 1993
【非特許文献３】Waldegger S, Barth P, Raber G, Lang F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4440-4445, 1997
【非特許文献４】Chen SY, Bhargava A, Mastroberardino L, Meijer OC, Wang J, Buse P, Firestone GL, Verrey F, Pearce D. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 2514-2519, 1999
【非特許文献５】Naray-Fejes-Toth A, Canessa C, Cleaveland ES, Aldrich G, Fejes-Toth G. J. Biol. Chem. 274: 16973-16978, 1999
【非特許文献６】Warnock DG. Kidney Ind. 53 (1): 1824, 1998
【非特許文献７】Pongs O. Physiol. Rev. 72: 69-88, 1992
【非特許文献８】Cahalan MD and Chandy KG. Cur. Opin. Biotech. 8 (6): 749-756, 1997
【非特許文献９】Szabo I, Gulbin E, Apfel H, Zhan X, Barth P, Busch AE, Schlottmann K, Pongs O, Lang F. J. Biol. Chem. 271: 20465-20469, 1999
【非特許文献１０】Lang F, Szabo I, Lepple-Wienhues A, Siemen D, Gulbins E. News Physiol. Sci. 14: 194-200, 1999
【非特許文献１１】Kobayashi T, Deak M, Morrice N, Cohen P. Biochem. J. 344: 189-197, 1999
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
これとは対照的に、腫瘍の形成におけるＳＧＫ１の役割は、専門家の文献において、非常に論議を呼び、相反する議論の問題となっている。
【００１２】
本発明は現在、標的分子（標的）としてＳＧＫ１を使用する出願のさらなる新規な治療上および診断上の分野を提供する目的を有している。
【００１３】
本発明はまた、式Ｉ、Ｉａ、ＩｂおよびＩＩの化合物の光学活性の形（立体異性体）、エナンチオマー、ラセミ体、ジアステレオマーならびに水和物および溶媒和物に関する。化合物の溶媒和物は、不活性な溶媒分子が化合物上に付加し、それらの相互引力によって形成している付加物を意味する。溶媒和物は、例えば、一水和物もしくは二水和物またはアルコラートである。
【００１４】
本発明は、式Ｉの化合物ならびにその式Ｉａ（Ｓ配置）および式Ｉｂ（Ｒ配置）のエナンチオマー：
【００１５】
【化１】
0005511689.tif 000002
【００１６】
ならびにその薬学的に使用可能な互変異性体、塩、立体異性体およびエナンチオマー（そのすべての比率での混合物を含む）に関する。
【００１７】
式Ｉに描かれている化合物は、Ｎ’−［２−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−ヒドロキシ−アセチル］−２−エチル−４−ヒドロキシ−３−メチルベンゾヒドラジドである。この化合物は、好ましくは、薬剤として使用される。式Ｉによって描かれている化合物は、特に好ましくは、ウイルス性肝炎の予防および／または治療に用いられる。この理由は、驚いたことに、式Ｉの化合物がＳＧＫ１の阻害剤であることが見出されたからである。さらに、前記化合物はウイルス性疾患および癌性疾患の治療に適していることを示すことに成功した。式Ｉの化合物の調製を以下でより詳しく記載する。
【００１８】
本発明はまた、ウイルス性疾患および／または癌腫の予防および／または治療のための、式ＩＩの化合物
【００１９】
【化２】
0005511689.tif 000003
【００２０】
［式中、
Ｒ1、Ｒ2はそれぞれ、互いに独立して、Ｈ、ＣＨＯまたはアセチルを表し、
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、
Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11はそれぞれ、互いに独立して、
Ｈ、Ａ、ＯＳＯ2Ａ、Ｈａｌ、ＮＯ2、ＯＲ12、Ｎ（Ｒ12）2、ＣＮ、Ｏ−ＣＯＡ、−［Ｃ（Ｒ12）2］nＣＯＯＲ12、Ｏ−［Ｃ（Ｒ12）2］0ＣＯＯＲ12、ＳＯ3Ｈ、−［Ｃ（Ｒ12）2］nＡｒ、−ＣＯ−Ａｒ、Ｏ−［Ｃ（Ｒ12）2］nＡｒ、−［Ｃ（Ｒ12）2］nＨｅｔ、−［Ｃ（Ｒ12）2］nＣ≡ＣＨ、Ｏ−［Ｃ（Ｒ12）2］nＣ≡ＣＨ、−［Ｃ（Ｒ12）2］nＣＯＮ（Ｒ12）2、−［Ｃ（Ｒ12）2］nＣＯＮＲ12Ｎ（Ｒ12）2、Ｏ−［Ｃ（Ｒ12）2］nＣＯＮ（Ｒ12）2、Ｏ−［Ｃ（Ｒ12）2］0ＣＯＮＲ12Ｎ（Ｒ12）2、ＮＲ12ＣＯＡ、ＮＲ12ＣＯＮ（Ｒ12）2、ＮＲ12ＳＯ2Ａ、Ｎ（ＳＯ2Ａ）2、ＣＯＲ12、Ｓ（Ｏ）mＡｒ、ＳＯ2ＮＲ12またはＳ（Ｏ）mＡを表し、
Ｒ3およびＲ4は一緒になって、ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨも表し、
Ｒ3およびＲ4、Ｒ7およびＲ8
またはＲ8およびＲ9は一緒になって、３、４または５個のＣ原子を有するアルキレンも表し、
ここで、１個または２個のＣＨ2基は、酸素で置き換えられていてもよく、
Ａは、１〜６個のＣ原子を有する非分枝もしくは分枝のアルキルを表し、１〜７個のＨ原子は、Ｆで置き換えられていてもよく、
または３〜７個のＣ原子を有する環状アルキルを表し、
Ａｒは、フェニル、ナフチルまたはビフェニルを表し、そのそれぞれが非置換であるか、またはＨａｌ、Ａ、ＯＲ12、Ｎ（Ｒ12）2、ＮＯ2、ＣＮ、フェニル、ＣＯＮ（Ｒ12）2、ＮＲ12ＣＯＡ、ＮＲ12ＣＯＮ（Ｒ12）2、ＮＲ12ＳＯ2Ａ、ＣＯＲ12、ＳＯ2Ｎ（Ｒ12）2、Ｓ（Ｏ）mＡ、−［Ｃ（Ｒ12）2］n−ＣＯＯＲ12および／または−Ｏ［Ｃ（Ｒ12）2］o−ＣＯＯＲ12で一置換、二置換もしくは三置換されており、
Ｈｅｔは、１〜４個のＮ、Ｏおよび／またはＳ原子を有する、単環式または二環式の飽和、不飽和または芳香族の複素環を表し、この複素環は、Ｈａｌ、Ａ、ＯＲ12、Ｎ（Ｒ12）2、ＮＯ2、ＣＮ、ＣＯＯＲ12、ＣＯＮ（Ｒ12）2、ＮＲ12ＣＯＡ、ＮＲ12ＳＯ2Ａ、ＣＯＲ12、ＳＯ2ＮＲ12、Ｓ（Ｏ）mＡ、＝Ｓ、＝ＮＲ12および／または＝Ｏ（カルボニル酸素）で一置換、二置換または三置換されていてもよく、
Ｒ12は、ＨまたはＡを表し、
Ｈａｌは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを表し、
ｍは、０、１または２を表し、
ｎは、０、１、２または３を表し、
ｏは、１、２または３を表す］、
ならびにそれらの薬学的に使用可能な互変異性体、塩、立体異性体およびエナンチオマー（そのすべての比率での混合物を含む）に関する。
【００２１】
式ＩＩの化合物はまた、それらの薬学的に使用可能な誘導体、塩、溶媒和物および立体異性体（そのすべての比率での混合物を含む）であり得る。
【００２２】
この類の化合物のさらなる特性および特徴ならびに代表例の調製に関しては、本出願者のWO 2007/093264 A1に言及されており、この開示内容は、明示的な参照として、本記述内容に完全に組み込まれる。
【００２３】
好ましい実施形態では、式ＩＩの化合物は、Ｎ’−［２−ヒドロキシ−２−（３，４−ジフルオロフェニル）アセチル］−４−ヒドロキシ−２−エチル−３−メチルベンゾヒドラジドおよびＮ’−［２−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−ヒドロキシアセチル］−２−エチル−４−ヒドロキシ−３−メチルベンゾヒドラジドから選択される。好ましくは、最後に言及された式Ｉの化合物であり、その調製は、既に言及されているが、以下にも記載される。
【００２４】
ウイルス性疾患は、リンパ球性脈絡髄膜炎、ウイルス性肝炎、ウイルス性心筋炎、ＡＩＤＳ、ヘルペス、乳頭腫およびウイルス性肺感染症の群から選択されることが好ましい。本発明の目的のために、ヘルペスおよび乳頭腫は、ヘルペスウイルスまたは乳頭腫ウイルスによって引き起こされる感染症または感染性疾患を意味することを意図する。
【００２５】
癌腫は、結腸癌、乳癌、胃癌および肺癌の群から選択されることが好ましい。
【００２６】
さらに、式ＩＩの化合物は、医薬製剤の形で存在し得る。このタイプの医薬製剤は、任意の所望の適した経路、例えば経口、直腸、経鼻、局所、経膣または非経口経路による投与に適合させることができる。このタイプの製剤は、薬剤部門において知られている方法、例えば前記化合物を（１種もしくは複数種の）添加剤または（１種もしくは複数種の）補助剤と組み合わせることによる方法を用いて調製することができる。
【００２７】
式ＩＩの化合物の可能な医薬製剤のさらなる特徴および詳細に関しては、同様にWO 2007/093264 A1に言及されている。
【００２８】
本発明の化合物の治療有効量は、例えば、個人または動物の年齢および体重、治療を必要とする正確な状態およびその重症度、製剤の性質および投与経路を含む多くの因子によって決まり、治療を行う医師または獣医によって最終的に決定される。しかし、治療のための本発明による化合物の有効量は、一般に、１日当たりレシピエント（哺乳動物）の体重１ｋｇにつき０．１から１０００ｍｇまでの範囲であり、特に１日当たり０．１から１００ｍｇ／ｋｇ体重までの範囲であり、特に典型的には１日当たり１から１０ｍｇ／ｋｇ体重までの範囲である。それ故に、体重７０ｋｇの成熟哺乳動物に対する１日当たりの実際量は、通常、７０から７００ｍｇの間であり、この量は、１日当たりの単回用量として、またはより通常では、１日当たりの一連の分割用量（例えば、２、３、４、５または６回など）で、全日用量が同じになるように投与することができる。塩もしくは溶媒和物の有効量またはその生理学的に機能的な誘導体の有効量は、本発明自体による化合物の有効量の割合として決定することができる。類似の用量が、以上に言及されている他の状態の治療に適していると仮定することができる。
【００２９】
本発明はまた、ウイルス性疾患および／または癌腫の予防および／または治療を目的とした薬剤を調製するための、式ＩＩの化合物の使用に関する。さらなる特徴および詳細に関しては、上記に言及されている。
【００３０】
最後に、本発明はまた、式ＩＩの化合物の治療有効量を投与することを含む、ウイルス性疾患および／または癌腫の予防および／または治療のための方法に関する。「治療有効量」という表現は、本明細書では、この量を投与されていない対応患者と比較して、以下の効果、すなわち、疾患、症候群、状態、愁訴、障害もしくは副作用の、改善された治療効果、回復、予防もしくは治癒または疾患、愁訴もしくは障害の進行の軽減をも有する前記化合物の量、またはそれに基づく薬剤もしくは医薬品の量を意味する。さらなる特徴および詳細に関しては、同様に上記に言及されている。
【００３１】
本発明はさらにまた、本出願者のWO 2006/105850 A1に記載され、式Ｉによって描かれている、ウイルス性疾患および／または癌腫の予防および／または治療のための化合物に関する。これらの化合物のさらなる特性および特徴ならびに調製に関しては、本出願者のWO 2006/105850 A1に言及されており、この開示内容は、明示的な参照として、本記述内容に完全に組み込まれる。
【００３２】
本発明の既存の特徴およびさらなる特徴は、従属請求項および図と組み合わせて、好ましい実施形態の以下の記載から生じる。本明細書における個々の特徴は、いずれの場合にも、単独でまたは個々に互いに組み合わせて達成され得る。
【００３３】
図は以下を示す。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ＳＧＫ１ノックアウトマウスにおいて、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）に対するＣＤ８+Ｔ細胞応答の高まりを示す。
【図２】ＳＧＫ１ノックアウトマウスおよびＳＧＫ１野生型同胞マウスの種々の組織におけるＬＣＭＶのウイルス複製を示す。
【図３】ＳＧＫ１ノックアウトマウスおよび野生型同胞マウスにおけるＬＣＭＶ抗原の免疫組織化学的検査の結果を示す。
【図４】ＳＧＫ１がウイルス性肝炎の経過に及ぼす影響を示す。
【図５】ＳＧＫ１阻害剤がウイルス性肝炎の経過にもたらす効果を示す。
【図６】ＳＧＫ１野生型マウスと比較したＳＧＫ１ノックアウトマウスにおける結腸癌の発現を示す。
【図７】ＳＧＫ１阻害剤による結腸癌の抑制を示す。
【図８】ＳＧＫ１阻害剤Ｎ’−［２−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−ヒドロキシアセチル］−２−エチル−４−ヒドロキシ−３−メチルベンゾヒドラジドＩ（ＥＭＤ６３８６８３）の合成スキームを示す。
【図９】エナンチオマーのＳＧＫ１阻害剤Ｎ’−［（Ｓ）−２−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−ヒドロキシアセチル］−２−エチル−４−ヒドロキシ−３−メチル−ベンゾヒドラジド（Ｉａ）  Ｎ’−［（Ｒ）−２−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−ヒドロキシアセチル］−２−エチル−４−ヒドロキシ−３−メチルベンゾヒドラジド（Ｉｂ）の合成スキームを示す。
【００３５】
実施例
Ｉ．Ｎ’−［２−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−ヒドロキシアセチル］−２−エチル−４−ヒドロキシ−３−メチルベンゾ−ヒドラジド（ＥＭＤ６３８６８３）
７０．０ｇのＮ’−［２−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−ヒドロキシアセチル］−２−エチル−４−メトキシ−３−メチルベンゾ−ヒドラジド（Ａ１）を、３５０ｍｌのジクロロメタン中に懸濁させる。次いで、１０５ｍｌの三臭化ホウ素を滴下する。反応混合物を室温で３時間撹拌する。続いて、得られた溶液を１リットルの氷水中に注意深くデカンテーションする。水相を５００ｍｌの酢酸エチルで２回抽出する。次いで、合わせた有機相を３００ｍｌの水で１回抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥し、続いてろ過する。ろ液を真空中で濃縮する。次いで、得られた残渣を、活性炭を使用して５００ｍｌのアセトニトリルから再結晶し、３２．２ｇの表題化合物を、融点１８７．４℃（ＭＳ：３６５（ＭＨ+）、ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．２９（シクロヘキサン／メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル１：４、体積部）を有する無色固体として得る。
Ｉａ．Ｎ’−［（Ｓ）−２−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−ヒドロキシアセチル］−２−エチル−４−ヒドロキシ−３−メチル−ベンゾヒドラジド
ａ）ラセミ体のクロマトグラフ分割（図示せず）：
５００ｍｇの例１（ＥＭＤ６３８６８３）を、４回に分けて、５ｍｌの２−プロパノールおよび５ｍｌのｎ−ヘプタンに、いずれの場合にも高温で溶かす。続いて、この溶液を、２連続のＣｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ（５×２０ｃｍ）クロマトグラフィーカラム（Ｄａｉｃｅｌ）上で、溶媒混合物ｎ−ヘプタン／２−プロパノール（４：１、体積部；０．８ｍｌ／分）を用いてクロマトグラフィーにかける（保持時間：６．１１分）。合わせた生成物画分を真空中で蒸発乾燥させ、２４５ｍｇの表題化合物を、分析的および鏡像異性的に純粋な形で、融点２０２．３℃を有する無色固体として得る。ＭＳ：３６５（Ｍ＋Ｈ+）、３８２（Ｍ＋ＮＨ4+）；ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．２９（シクロヘキサン／メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル１：４、体積部）；［α］20D＝＋３０．４°（ｃ＝０．０２０１ｇ／２ｍｌのメタノール）。
ｂ）Ａ２から：
表題化合物は、化合物３に関して記載されているように、Ｎ’−［（Ｓ）−２−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−ヒドロキシアセチル］−４−ベンジルオキシ−２−エチル−３−メチルベンゾヒドラジド（Ａ２）から同様にして調製される。
Ｉｂ．Ｎ’−［（Ｒ）−２−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−ヒドロキシアセチル］−２−エチル−４−ヒドロキシ−３−メチル−ベンゾヒドラジド
ａ）ラセミ体のクロマトグラフ分割（図示せず）：
５００ｍｇの例１（ＥＭＤ６３８６８３）を、４回に分けて、５ｍｌの２−プロパノールおよび５ｍｌのｎ−ヘプタンに、いずれの場合にも高温で溶かす。続いて、この溶液を、２連続のＣｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ（５×２０ｃｍ）クロマトグラフィーカラム（Ｄａｉｃｅｌ）上で、溶媒混合物ｎ−ヘプタン／２−プロパノール（４：１、体積部；０．８ｍｌ／分）を用いてクロマトグラフィーにかける（保持時間：９．３６分）。合わせた生成物画分を真空中で蒸発乾燥させ、２５０ｍｇの表題化合物を、融点２０３．７℃を有する無色固体として得る。ＭＳ：３６５（Ｍ＋Ｈ+）；ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．２９（シクロヘキサン／メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル１：４、体積部）；［α］20D＝−２９．７°（ｃ＝０．０１８４ｇ／２ｍｌのメタノール）、エナンチオマー過剰率９８．２％。
ｂ）Ａ３から：
４５ｍｇのＮ’−［（Ｒ）−２−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−ヒドロキシアセチル］−４−ベンジルオキシ−２−エチル−３−メチル−ベンゾヒドラジド（Ａ３）を１００ｍｌのメタノールに溶かす。続いて、反応溶液をＨ−Ｃｕｂｅ（登録商標）（ＴｈａｌｅｓＮａｎｏ）中、１０％Ｐｄ／Ｃ（５５×４ｍｍカートリッジ）上で水素添加する（流速：１ｍｌ／分、方式：フルＨ2、３０℃、大気圧）。続いて、反応溶液を蒸発乾燥させ、分取用ＨＰＬＣ（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ（登録商標）ｐｒｅｐ  ＲＰ１８ｅ  １００〜２５ｍｍ、Ｍｅｒｃｋ；溶媒勾配：水／１〜５０体積％のアセトニトリル）を用いて精製し、凍結乾燥後、非晶形無色の凍結乾燥物（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｅ）として、１０ｍｇの表題化合物を得る；ＭＳ：７５１．２（２Ｍ＋Ｎａ+）；ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．３１（シクロヘキサン／メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル１：４、体積部）、エナンチオマー過剰率＞５０％。
【００３６】
中間化合物
Ａ１．Ｎ’−［２−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−ヒドロキシアセチル］−２−エチル−４−メトキシ−３−メチルベンゾヒドラジド
１０６．０ｇの３，５−ジフルオロフェニルヒドロキシアセトヒドラジド（Ｂ２）を８２０ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かす。１０４．９ｇの２−エチル−４−メトキシ−３−メチル安息香酸（Ｂ１）、１５３．９ｇのＮ−３−ジメチルアミノプロピル−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＤＡＰＥＣＩ）および４２．８ｇのヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を続いて加える。上記に列挙した化合物を加えている間、反応混合物を氷浴中で冷却する。次いで、溶液を室温で２４時間撹拌する。後処理については、反応混合物を３．５リットルの水で希釈する。得られた懸濁液を１時間撹拌し、続いてろ過分離し、追加の水で洗浄する。ろ過ケーキを２．５リットルのメタノールから再結晶し、１２９．０ｇの表題化合物を、融点１９７．１℃（ＭＳ：４０１（ＭＮａ+））を有する無色固体として得る。
Ａ２．Ｎ’−［（Ｓ）−２−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−ヒドロキシアセチル］−４−ベンジルオキシ−２−エチル−３−メチルベンゾヒドラジド
表題化合物は、中間体Ａ３に関して記載されているように、（Ｓ）−メチルオキサザボロリジン［（Ｓ）−Ｍｅ−ＣＢＳ］を使用し、同様にして調製される。
Ａ３．Ｎ’−［（Ｒ）−２−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−ヒドロキシアセチル］−４−ベンジルオキシ−２−エチル−３−メチルベンゾヒドラジド
３０２ｍｇのＮ’−［２−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−オキソアセチル］−４−ベンジルオキシ−２−エチル−３−メチルベンゾ−ヒドラジド（Ｂ３）を２５ｍｌのテトラヒドロフランに溶かす。この溶液を、１７ｍｌのテトラヒドロフラン中、４９μｌのボラン／ジメチルスルフィド複合体および５５μｌの（Ｒ）−メチルオキサザボロリジン［（Ｒ）−Ｍｅ−ＣＢＳ、トルエン中１〜１．５Ｍ）の溶液に、（−）７８℃の温度で、５分間かけて滴下する。続いて、冷却浴を除去し、溶液を６時間撹拌し、その間反応溶液を室温に温める。次いで、１００ｍｌの水を加え、混合物を各回１５０ｍｌの酢酸エチルで３回抽出する。合わせた有機相を、水、０．１Ｍ  ＨＣｌおよび飽和ＮａＣｌ溶液の各４０ｍｌで洗浄し、ＮａＳＯ４で乾燥し、吸引ろ過分離し、蒸発乾燥させる。残渣を分取用ＨＰＬＣ（溶媒勾配：水／１〜５０体積％のアセトニトリル）を用いて精製し、６３ｍｇの表題化合物を、無色非晶形固体として得る。ＭＳ：９３２（２Ｍ＋Ｎａ+）；ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．５６（シクロヘキサン／メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル１：４、体積部）。
Ｂ１．２−エチル−４−メトキシ−３−メチル安息香酸
２０．０ｇの４−メトキシ−２，３−ジメチル安息香酸（Ｃ１）を、乾燥窒素雰囲気中で、１リットルのテトラヒドロフランに溶かし、続いて−７８℃に冷却する。次いで、３００ｍｌのｓｅｃ−ブチルリチウム（シクロヘキサン中１．４Ｍ）を滴下して、赤色溶液を得る。赤色溶液を−７８℃でさらに１時間撹拌する。次いで、３４．５ｍｌのヨウ化メチルを加え、得られた懸濁液を冷却することなく１時間撹拌する。続いて、３００ｍｌの水を加え、酢酸エチルを使用して、溶液を各回３００ｍｌの酢酸エチルで２回抽出する。続いて、水相をろ過し、ろ液を氷浴中で冷却し、塩酸（３．０Ｍ）を加えることによってｐＨ１に調節し、さらに３０分間撹拌する。次いで、懸濁液をろ過し、水で洗浄する。ろ過ケーキを真空中、１１０℃で乾燥し、２０．９ｇの表題化合物を、融点１８０℃（ＭＳ：１９５．２（ＭＨ+））を有する無色固体として得る。
Ｂ２．３，５−ジフルオロフェニルヒドロキシアセトヒドラジド
５．０ｇのメチル３，５−ジフルオロフェニルヒドロキシアセタート（Ｃ２）を４５．０ｍｌの２−プロパノールに溶かす。次いで、１．３２ｍｌのヒドラジン水和物を滴下し、反応混合物を還流下で１８時間保つ。続いて、溶液を蒸発乾燥させ、得られた残渣をシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィー（溶出勾配：酢酸エチル／０〜２０．０体積％のメタノール）によって精製し、３．７０ｇの表題化合物を、融点１１９．３℃（ＭＳ：２０２．８（ＭＨ+））を有する無色固体として得る。
Ｂ３．Ｎ’−［２−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−オキソアセチル］−４−ベンジルオキシ−２−エチル−３−メチルベンゾ−ヒドラジド
１７２ｍｇのＮ’−［２−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−ヒドロキシアセチル］−４−ベンジルオキシ−２−エチル−３−メチル−ベンゾヒドラジド（Ｃ３）を、乾燥窒素雰囲気下で、０．９ｍｌのジメチルスルホキシドおよび２８ｍｌのジクロロメタンに溶かす。続いて、１８５ｍｇのトリアセトキシペルヨージナン（Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ試薬）を加える。懸濁液を室温で１時間撹拌する。後処理については、１００ｍｌのジクロロメタンおよび３０ｍｌの０．５Ｍ  Ｎａ2Ｓ2Ｏ3溶液を加える。続いて、有機相を５０ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ3溶液で抽出し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、吸引ろ過分離し、蒸発乾燥させる。残渣をシリカゲル上でフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出勾配：シクロヘキサン／０〜３０体積％のメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル）を用いて精製し、１６３ｍｇの表題化合物を、非晶形固体として得る；ＭＳ：４５２．７（２Ｍ＋Ｈ+）；ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．３７（シクロヘキサン／酢酸エチル２：１、体積部）。
【００３７】
Ｃ１．４−メトキシ−２，３−ジメチル安息香酸
６０．０ｇの２，３−ジメチル−４−メトキシベンズアルデヒド（Ｄ１）を１．２０ｌのジメチルスルホキシドに溶かす。続いて、４８０ｍｌの水中、１３１．５ｇのリン酸二水素ナトリウムおよび１３２．２ｇの亜塩素酸ナトリウムの溶液を滴下し、その間反応浴の温度を４０℃未満に保つ。次いで、反応混合物を室温でさらに２時間撹拌する。後処理については、懸濁液を２．０ｌの水で希釈し、さらに１時間撹拌する。得られた沈殿をろ過し、水で洗浄し、真空中１００℃で乾燥し、６５．０ｇの表題化合物を、融点２１４℃（ＭＳ：１８１．２（ＭＨ+））を有する無色固体として得る。
【００３８】
Ｃ２．メチル３，５−ジフルオロフェニルヒドロキシアセタート
２５．０ｇの３，５−ジフルオロフェニルヒドロキシ酢酸（Ｄ２）を３２５ｍｌのメタノールに溶かす。続いて、３．９ｇのホウ酸を加え、反応混合物を室温で１８時間撹拌する。次いで、得られた溶液を蒸発乾燥させる。残渣を、１００ｍｌの酢酸エチルおよび１００ｍｌの水を使用して抽出する。続いて、水相を各回５０ｍｌの酢酸エチルで２回抽出する。合わせた有機相を、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過する。ろ液を真空中で蒸発乾燥させ、２５．５ｇの表題化合物を粗生成物として得る。１７ｍｌの酢酸エチルおよび１７０ｍｌのシクロヘキサンから再結晶することにより、融点６１．８℃（ＭＳ２０１．９（Ｍ+））を有する純粋な化合物Ｃ２を２３．５ｇ得る。
【００３９】
Ｃ３．Ｎ’−［２−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−ヒドロキシアセチル］−４−ベンジルオキシ−２−エチル−３−メチル−ベンゾヒドラジド
化合物Ｃ３は、４−ベンジルオキシ−２−エチル−３−メチル安息香酸および中間体Ｂ２から出発して、Ａ１に関して記載されている調製と同様にして合成される。
【００４０】
Ｄ１．２，３−ジメチル−４−メトキシベンズアルデヒド
化合物Ｄ１は、ＡＢＣＲ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．ＫＧ．から購入した。
【００４１】
Ｄ２．３，５−ジフルオロフェニルヒドロキシ酢酸
化合物Ｄ２は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．から購入した。
【００４２】
生化学的アッセイ
例に記載された本発明による化合物を、以下に記載されるアッセイを用いて試験し、それらがキナーゼ阻害作用を有することを見出した。さらなるアッセイが文献から知られており、当業者によって容易に実施され得る（例えば、Dhanabal et al., Cancer Res. 59:189-197；Xin et al., J. Biol. Chem. 274:9116-9121；Sheu et al., Anticancer Res. 18:4435-4441；Ausprunk et al., Dev. Biol. 38:237-248；Gimbrone et al., J. Natl. Cancer Inst. 52:413-427；Nicosia et al., In Vitro 18:538-549を参照のこと）。
【００４３】
ＳＧＫ１タンパク質キナーゼの阻害は、フィルター結合法において決定することができる。
【００４４】
【表１】
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【００４５】
図１は、ＳＧＫ１ノックアウトマウス（ＳＧＫ１-/-、右側ドットプロット）およびそれらの野生型同胞マウス（ＳＧＫ１+/+、左側ドットプロット）の血液中のウイルス特異的（Ｔｅｔ−９Ｐ  ３３+）ＣＤ８+Ｔリンパ球のドットプロットを示す。この目的のために、ＳＧＫ１ノックアウトマウスおよび野生型同胞マウスを、それぞれ２×１０6ｐｆｕ（プラーク形成単位）のＬＣＭＶ（脈絡髄膜炎ウイルス）に感染させた。感染後８日目に、ウイルス特異的ＣＤ８+Ｔ細胞のためのいわゆるテトラマー法を用いて血液を染色し、続いて、ＦＡＣＳ解析（蛍光標識細胞分取（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）、フローサイトメトリー）を用いてウイルス特異的ＣＤ８+Ｔ細胞を同定し定量した。図１に描かれているドットプロットは、ＳＧＫ１ノックアウトマウスにおいて、ＬＣＭＶに対する免疫防御の高まりを立証している。
【００４６】
図２は、ＬＣＭＶに感染したＳＧＫ１ノックアウトマウス（ＳＧＫ１-/-、黒四角）およびそれらの野生型同胞マウス（ＷＴ、白四角）の、種々の組織におけるプラーク形成単位の数をグラフで再現したものである。この目的のために、ＳＧＫ１ノックアウトマウスおよび野生型同胞マウスを、いずれの場合にも２×１０6ｐｆｕ（プラーク形成単位）のＬＣＭＶに感染させた。感染後８日目に、いわゆるプラグアッセイを用いて、ウイルスの力価を種々の組織（腎臓、肺、脾臓および肝臓組織）において分析した。プラーク形成単位（ｐｆｕ）の数の１０を底とする対数は、いずれの場合にも、図２に描かれているグラフの縦座標にプロットされている。図２に再現されたグラフは、野生型同胞マウスに比べて、ＳＧＫ１ノックアウトマウスの方が、種々の組織におけるＬＣＭＶのプラーク形成単位の数が小さいことを示している。
【００４７】
図３は、ＳＧＫ１ノックアウトマウス（ＳＧＫ１-/-、右）および野生型同胞マウス（左）におけるＬＣＭＶ抗原の免疫組織化学的検査の結果を示す。この目的のために、ＳＧＫ１ノックアウトマウスおよび野生型同胞マウスを、それぞれ２×１０6ｐｆｕのＬＣＭＶに感染させた。感染後８日目に、ＳＧＫ１ノックアウトマウスおよび野生型同胞マウスからの肝臓組織を、続いてＬＣＭＶ抗原について免疫組織化学的に検査した。
【００４８】
図４は、ＳＧＫ１が、典型的な２種の肝炎マーカー、すなわち肝臓酵素アラニンアミノトランスフェラーゼ（左側のグラフ）およびビリルビン（右側のグラフ）に及ぼす影響を示す。両方のマーカーは、肝炎の場合に肝臓組織に出現が増加する。
【００４９】
アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の濃度は、組織液１リットル当たりの単位量（Ｕ／Ｌ）で表され、図４の左側のグラフの縦座標に再現されている。時間は、日で横座標に再現されている。ビリルビン濃度は、組織液１リットル当たりのμｍｏｌで表され、図４の右側のグラフの縦座標にプロットされている。時間は、日で表され、同様に横座標に再現されている。
【００５０】
図４に描かれているグラフは、アラニンアミノトランスフェラーゼおよびビリルビンの濃度が、ＬＣＭＶ誘発肝炎において、ＳＧＫ１ノックアウトマウス（ＳＧＫ１-/-、黒四角）の方が、野生型同胞マウス（ＷＴ、白四角）における対応値と比較して有意に減少していることを示している。これらのデータは、「スイッチングオフ」、すなわちＳＧＫ１の阻害が、治療上の観点から、ウイルス性肝炎の経過に好ましい効果を有することを確証している。加えて、図４に描かれているグラフは、ＳＧＫ３が、ウイルス性肝炎の経過に好ましい効果を有しないことを示している（この点においては、図４のグラフに描かれている黒丸を参照のこと。これがＳＧＫ３ノックアウトマウス（ＳＧＫ３-/-）の対応値を示す）。全体的に、ＳＧＫ１ノックアウトマウス、野生型同胞マウス（およびＳＧＫ３ノックアウトマウス）は、この場合にもそれぞれ２×１０6ｐｆｕのＬＣＭＶに感染させた。
【００５１】
ＳＧＫ１阻害剤Ｎ’−［２−（３，５−ジフルオロ−フェニル）−２−ヒドロキシアセチル］−２−エチル−４−ヒドロキシ−３−メチルベンゾヒドラジドが、アラニンアミノトランスフェラーゼおよびビリルビンの濃度に及ぼす影響を、グラフで図５に示す。タイプ１０  Ｃ５７ＢＬ／６のＳＧＫ１野生型マウスには、プラセボ飼料を与えた。１週間後、実験動物の１群に、ＳＧＫ１阻害剤を投与した。ＳＧＫ１阻害剤は、飼料に、４．４６ｍｇ／ｇ飼料の混合比率で加えられていた。これは、約６００ｍｇ／ｋｇ体重の用量に相当する。他の群には、プラセボ飼料だけを投与し続けた。さらに１週間後、ＳＧＫ１ノックアウトマウスを、それぞれ２×１０6ｐｆｕのＬＣＭＶに感染させ、このようにしてウイルス性肝炎を誘発させた。アラニンアミノトランスフェラーゼの値を感染後８日目に測定し、ビリルビンの対応値を感染後１０日目に測定した。アラニンアミノトランスフェラーゼの濃度は、図５の左側のグラフの縦座標に再現されている（Ｕ／ｌ、組織液１リットル当たりの酵素単位）。ＬＣＭＶ感染後８日の期間を、横座標に示す。ビリルビン濃度（μｍｏｌ／ｌ）は、図５の右側のグラフの縦座標に描かれている。横座標は、ＬＣＭＶ感染後１０日の期間を示す。
【００５２】
図５のグラフに再現されている結果は、肝炎マーカーであるアラニンアミノトランスフェラーゼおよびビリルビンの濃度が、感染前にＳＧＫ１阻害剤を投与された実験動物（白四角）において有意に減少し、ＳＧＫ１阻害剤を投与されなかった実験動物（黒四角）とは対照的であることを実証している。これらのデータは、ＳＧＫ１阻害剤が、ウイルス性肝炎の経過に好ましい特性を有し、それ故に、ウイルス性肝炎の予防または治療に用いることができることを確証している。
【００５３】
図６は、ＳＧＫ１野生型マウス（ＳＧＫ+/+マウス）と比較したＳＧＫ１ノックアウトマウス（ＳＧＫ１-/-マウス）における結腸癌の発現を示す。この目的のために、結腸腫瘍を実験動物に化学的に誘発させた（Wang JG, Wang DF, Lv BJ, Si JM : A novel mouse model for colitis-associated colon carcinogenesis induced by 1,2-dimethylhydrazine and dextran sulfate sodium. World J Gastroenterol 2004; 10:2958-2962）。実験動物の中には、８週齢で化学的な腫瘍発生のサイクルを３回受けたものもあった。この目的のために、動物に、２０ｍｇ／ｋｇのジメチルヒドラジン（ＤＭＨ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ．ＭＯ．ＵＳＡ）を腹腔内投与した。開始１週間後、３０ｇ／ｌの合成デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ；分子量５０００；Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．Ｊａｐａｎ）を含む蒸留水を動物に７日間の３倍投与し、蒸留水をさらに１４日間の３倍投与した（全持続時間は、合計で３×（１＋２週）＝９週）。残りの実験動物（対照動物）には、代わりに２０ｍｇ／ｋｇの０．９％塩化ナトリウム溶液を腹腔内注入した。すべてのマウスを、２２週齢でエーテルで麻酔後に屠殺した。
【００５４】
図６にグラフで示されている化学的に誘発された腫瘍発生の結果は、ＳＧＫ１ノックアウトマウス（右に黒棒で再現されている）の化学的に誘発された結腸腫瘍に対する感受性が有意に減少し、ＳＧＫ１野生型マウス（左に白棒で再現されている）とは対照的であることを明らかに示している。この結果は、専門家の文献が、種々のタイプの癌腫に関して、癌組織におけるＳＧＫ１の下方調節を報告しており、（Rauhala HE, Porkka KP, Tolonen TT, Martikainen PM, Tammela TL, Visakorpi T: Dualspecificity phosphatase 1 and serum/glucocorticoid-regulated kinase are downregulated in prostate cancer. Int J Cancer 2005；Chu S, Rushdi S, Zumpe ET, Mamers P, Healy DL, Jobling T, Burger HG, Fuller PJ: FSH-regulated gene expression profiles in ovarian tumours and normal ovaries. Mol Hum Reprod 2002; 8:426-433；Chung EJ, Sung YK, Farooq M, Kim Y, Im S, Tak WY, Hwang YJ, Kim YI, Han HS, Kim JC, Kim MK: Gene expression profile analysis in human hepatocellular carcinoma by cDNA microarray. Mol Cells 2002; 14:382-387）、そのため、実際には、ＳＧＫ１の阻害が腫瘍増殖を促進するものと予想されていただけに、なおさら驚きである。
【００５５】
図７は、ＳＧＫ１阻害剤Ｎ’−［２−（３，５−ジフルオロ−フェニル）−２−ヒドロキシアセチル］−２−エチル−４−ヒドロキシ−３−メチルベンゾヒドラジドが、結腸癌の形成にもたらす効果を、グラフで示す。最初に、化学的に誘発された腫瘍発生を、図６に関する図の説明に記載されているように実施した。投与後１週目に、プラセボまたはＳＧＫ１阻害剤のいずれか一方を２０日間投与した。ＳＧＫ１阻害剤は、飼料に、４．４６ｍｇ／ｇ飼料の混合比率で加えられていた。これは、約６００ｍｇ／ｋｇ体重の用量に相当する。図７に示されているグラフは、ＳＧＫ１阻害剤を投与された実験動物の場合には、結腸腫瘍の増殖（右側の黒棒）が、投与されていない実験動物（左側の白棒）と比較して、有意に抑制されていることを明らかにしている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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