(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の特定の種の存在の検出方法であって、
ａ）ハイブリダイゼーションアッセイでプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）を検出するためのプローブと前記サンプルを、前記プローブにプラスモディウム属（Ｐｌｓｙａｓｍｏｄｉｕｍ）核酸にハイブリダイズさせる条件下で接触させる工程であって、前記プローブがプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の種間を識別し、かつ、前記プローブがＰＧｅｎｕｓ１(配列番号１)、ＰＧｅｎｕｓ２(配列番号２)、ＭａｌＦ１(配列番号３)、ＭａｌＦ２(配列番号４)、Ｍａｌ１．８Ｆ(配列番号５)、Ｍａｌ１．８Ｒ(配列番号６)、ＰＶ１(配列番号７)、ＰＶ２(配列番号８)、ＰＦ１(配列番号９)、ＰＦ２(配列番号１０)、ＰＦ３(配列番号１１)、ＰＦ４(配列番号１２)、ＰＦ５(配列番号１３)、ＰＭ１(配列番号１４)およびＰＯ１(配列番号１５)若しくはそれらの完全長の相補配列よりなる群から選択される、工程；および
ｂ）前記サンプル中で前記プラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）核酸に結合した前記プローブを、前記サンプル中のプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の存在の指示として検出する工程
を含んでなる、上記方法。
【請求項２】
ＰＧｅｎｕｓ１(配列番号１)、ＰＧｅｎｕｓ２(配列番号２)、ＭａｌＦ１(配列番号３)、ＭａｌＦ２(配列番号４)、Ｍａｌ１．８Ｆ(配列番号５)、Ｍａｌ１．８Ｒ(配列番号６)、ＰＶ１(配列番号７)、ＰＶ２(配列番号８)、ＰＦ１(配列番号９)、ＰＦ２(配列番号１０)、ＰＦ３(配列番号１１)、ＰＦ４(配列番号１２)、ＰＦ５(配列番号１３)、ＰＭ１(配列番号１４)およびＰＯ１(配列番号１５)よりなる群から選択されるプローブの完全な配列若しくはそれらの完全長の相補配列からなる核酸フラグメント。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
プラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）は寄生性原生動物の一属である。この属への感染はマラリアとして知られる。該寄生生物はその生活環に２宿主すなわち蚊媒介物および脊椎動物宿主を常に有する。熱帯熱マラリア原生動物（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原生動物（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原生動物（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）および卵形マラリア原生動物（Ｐ．ｏｖａｌｅ）を包含する最低１０種がヒトを感染させる。マラリアは熱帯および亜熱帯地域に広まっている感染性疾患である。マラリアは男性、女性および小児の生存に対する脅威である。それは毎年３億と５億人の間を感染させ、そして大部分はサハラ以南のアフリカの幼児で年に１と３百万の間の死亡を引き起こす。
【０００２】
マラリアは最も一般的な感染性疾患の１つでありかつ大きな公衆衛生上の問題である。該疾患はプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の寄生原生動物により引き起こされる。最も重大な形態の該疾患は熱帯熱マラリア原生動物（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）および三日熱マラリア原生動物（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）により引き起こされるが、しかし他の関連種（卵形マラリア原生動物（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ）および四日熱マラリア原生動物（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ））もまたヒトを感染させ得る。感染種を決定することは患者の処置の経過を決定するのに役立つ。
【０００３】
マラリアの好ましくかつ最も信頼できる診断は、該４種の主要寄生生物種のそれぞれが識別する特徴を有するため、血液塗沫標本の顕微鏡検査である。２種の血液塗沫標本が伝統的に使用される。薄層は通常の血液塗沫標本に類似であり、そして、該寄生生物の外見がこの標本中で最良に保存されるために種の同定を可能にする。厚層は顕微鏡学者が大量の血液をスクリーニングすることを可能にし、そして薄層より約１１倍より感受性であり、従って低レベルの感染を拾い上げることは厚層上でより容易であるが、しかし該寄生生物の外見ははるかにより歪められ、そして従って多様な種間を識別することははるかにより困難であり得る。
【０００４】
厚層から、経験を積んだ顕微鏡学者は、赤血球の約０．００００００１％までの寄生生物レベル（すなわち寄生生物血症）を検出し得る。しかしながら、顕微鏡的診断は全４種の初期栄養体（「環状」）が同一に見えるため困難であり得、そして単一の環状に基づき種を診断することは決して可能でなく；種の同定は常に数種の栄養体に基づく。
【０００５】
顕微鏡検査が利用可能でない地域では、１滴の血液のみを必要とする抗原検出検査が存在する。ＯｐｔｉＭＡＬ−ＩＴ(R)（ＴＣＳ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、英国バッキンガム）は、熱帯熱マラリア原生動物（ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）を０．０１％寄生生物血症まで、および熱帯熱マラリア原生動物（ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）以外を０．１％まで確実に検出することができる。Ｐａｒａｃｈｅｃｋ−Ｐｆ(R)（Ｏｒｃｈａｒｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、インド）は寄生生物血症を０．００２％まで検出することができるが、しかし熱帯熱マラリア原生動物（ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）および熱帯熱マラリア原生動物（ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）以外のマラリアを識別することができない。寄生生物の核酸はポリメラーゼ連鎖反応を使用してもまた検出しうる。この技術は顕微鏡検査より正確である。しかしながらそれは高価でありかつ特化された実験室を必要とする。さらに、寄生生物血症の水準は、とりわけ寄生生物が血管壁に付着することが可能である場合に疾患の進行と必ずしも相関しない。制限された分子の方法、例えばＱＴ−ＮＡＳＢＡ
（ポリメラーゼ連鎖反応に基づく）リアルタイムの定量的な核酸配列に基づく増幅）がいくつかの臨床検査および迅速リアルタイムアッセイで利用可能であるが、しかし現在開発中にすぎない。従って、感受性のローテク診断ツールが現場で低レベルの寄生生物血症を検出するために開発される必要がある。
【０００６】
必要とされるものは、多様なマラリアを引き起こすプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種の迅速かつ正確な検出および識別のための試薬および方法である。
【発明の概要】
【０００７】
［発明の要約］
本発明は、例えばハイブリダイゼーションアッセイで異なる種のプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）寄生生物を検出および識別する核酸プローブに関する。従って、第一のアスペクトにおいて、本発明はハイブリダイゼーションアッセイでプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）を検出するためのプローブとして使用されるべき核酸フラグメントを特徴とする。本発明は、熱帯熱マラリア原生動物（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原生動物（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原生動物（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）および卵形マラリア原生動物（Ｐ．ｏｖａｌｅ）を識別し得るプローブ（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡ）もまた包含する。本発明の情況において、「を識別する」という用語（若しくは類似の用語）は、該プローブが１種からの核酸（例えばＲＮＡ、ＤＮＡ、ｒＲＮＡ［リボソームＲＮＡ］若しくはｒＤＮＡ［リボソームＤＮＡ］）に他３種より好都合に結合することを意味している。
【０００８】
第二のアスペクトにおいて、本発明は、ＰＧｅｎｕｓ１、ＰＧｅｎｕｓ２、Ｍａｌ  Ｆ１、ＭａｌＦ２、Ｍａｌ１．８Ｆ、Ｍａｌ１．８Ｒ、ＰＶ１、ＰＶ２、ＰＦ１、ＰＦ２、ＰＦ３、ＰＦ４、ＰＦ５、ＰＭ１、ＰＯ１と呼称されるプローブの１種若しくはそれ以上の好ましくは最低５、より好ましくは最低１０若しくは最も好ましくは最低１５の連続するヌクレオチドまたは配列全体、あるいはそれらの部分的若しくは完全長の相補配列から選択される配列を含有する核酸フラグメントを特徴とする。
【０００９】
第三のアスペクトにおいて、本発明は、配列番号１から配列番号１５と呼称されるプローブの１種若しくはそれ以上の最低５、好ましくは最低１０、より好ましくは最低１３若しくは最も好ましくは最低１５の連続するヌクレオチドまたは配列全体、あるいはそれらの部分的若しくは完全長の相補配列から選択される配列を含有する核酸フラグメントを特徴とする。
【００１０】
最後のアスペクトにおいて、本発明はサンプル中のプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の存在の検出方法を特徴とする。本方法において、サンプルを、プラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）核酸に核酸フラグメントをハイブリダイズさせる条件下で、ＰＧｅｎｕｓ１、ＰＧｅｎｕｓ２、Ｍａｌ  Ｆ１、ＭａｌＦ２、Ｍａｌ１．８Ｆ、Ｍａｌ１．８Ｒ、ＰＶ１、ＰＶ２、ＰＦ１、ＰＦ２、ＰＦ３、ＰＦ４、ＰＦ５、ＰＭ１若しくはＰＯ１の好ましくは最低５、最低１０、より好ましくは最低１３若しくは最も好ましくは最低１５の連続するヌクレオチドまたは配列全体から選択される配列、選択されるプローブ、あるいはそれらの部分的若しくは完全長の相補配列（あるいはそれらのいずれかの組合せ）を含有する核酸フラグメントと接触させる。サンプル中のプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）核酸に結合された核酸フラグメントの検出はサンプル中のプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の存在の指示として使用する。上で列挙されたプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の４種間を識別する本発明のプローブでの検出はプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）のその種の存在を示す。
【００１１】
本発明の本アスペクトの一態様において、核酸フラグメントは、プローブＰＧｅｎｕｓ
１の好ましくは最低５、より好ましくは最低１０若しくは最も好ましくは最低１５の連続するヌクレオチドまたは配列全体、あるいはそれらの完全長の相補配列から選択される配列を含有する。
【００１２】
本発明の本アスペクトの第二の態様において、核酸フラグメントは、プローブＰＧｅｎｕｓ２の好ましくは最低５、より好ましくは最低１０若しくは最も好ましくは最低１５の連続するヌクレオチドまたは配列全体、あるいはそれらの完全長の相補配列から選択される配列を含有する。
【００１３】
本発明の本アスペクトの第三の態様において、核酸フラグメントは、プローブＭａｌＦ１の好ましくは最低５、より好ましくは最低１０若しくは最も好ましくは最低１５または配列全体、あるいはそれらの完全長の相補配列から選択される配列を含有する。
【００１４】
本発明の本アスペクトのなお別の態様において、核酸フラグメントは、プローブＭａｌＦ２の好ましくは最低５、より好ましくは最低１０若しくは最も好ましくは最低１５ヌクレオチドまたは配列全体、あるいはそれらの完全長の相補配列から選択される配列を含有する。
【００１５】
本発明の本アスペクトのなお別の態様において、核酸フラグメントは、プローブＭａｌ１．８Ｆの好ましくは最低５、より好ましくは最低１０若しくは最も好ましくは最低１５ヌクレオチドまたは配列全体、あるいはそれらの完全長の相補配列から選択される配列を含有する。
【００１６】
本発明の本アスペクトのなお別の態様において、核酸フラグメントは、プローブＭａｌ１．８Ｒの好ましくは最低５、より好ましくは最低１０若しくは最も好ましくは最低１５ヌクレオチドまたは配列全体、あるいはそれらの完全長の相補配列から選択される配列を含有する。
【００１７】
プローブＰＧｅｎｕｓ  １、ＰＧｅｎｕｓ２、ＭａｌＦ１、ＭＡｌＦ２、Ｍａｌ１．８ＦおよびＭａｌ１．８Ｒの一利点は、それらが試験されたプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の全３種を検出するが、こうして単一のプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の種を検出することに制限されないことである。本発明の他の特徴および利点は、それらの以下の詳細な記述およびまた付随する請求の範囲からも明らかであろう。
【００１８】
特定の態様において、本発明はサンプル中のプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の存在の検出方法を企図しており、前記方法は、ハイブリダイゼーションアッセイでプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）を検出するためのプローブと前記サンプルを接触させる段階（前記プローブは、前記プローブをプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）核酸にハイブリダイズさせる条件下でプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の種を識別し）；および前記サンプル中の前記プラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）核酸に結合した前記プローブを前記サンプル中のプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の存在の指示として検出する段階を含んでなる。
【００１９】
先行する態様において、核酸フラグメントは、プローブＰＶ１、ＰＶ２、ＰＦ１、ＰＦ３、ＰＦ４、ＰＦ５、ＰＭ１若しくはＰＯ１それらの完全長の相補配列の最低５の連続するヌクレオチドから選択される配列を含んでなる。
【００２０】
他のアスペクトにおいて、本発明はサンプル中のプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の存在の検出方法を企図しており、前記方法は、前記核酸フラグメントにプラス
モディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）核酸にハイブリダイズさせる条件下で、ＰＧｅｎｕｓ１、ＰＧｅｎｕｓ２、ＭａｌＦ１、ＭａｌＦ２、Ｍａｌ１．８Ｆ、Ｍａｌ１．８Ｒ、ＰＶ１、ＰＶ２、ＰＦ１、ＰＦ２、ＰＦ３、ＰＦ４、ＰＦ５、ＰＭ１およびＰＯ１よりなる群から選択されるプローブの最低５の連続するヌクレオチド若しくはそれらの完全長の相補配列から選択される配列を含んでなる核酸フラグメントと前記サンプルを接触させる段階；および前記サンプル中の前記プラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）核酸に結合した前記核酸フラグメントを前記サンプル中のプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の存在の指示として検出する段階を含んでなる。
【００２１】
先行する態様において、核酸フラグメントは、ＰＧｅｎｕｓ１、ＰＧｅｎｕｓ２、ＭａｌＦ１、ＭａｌＦ２、Ｍａｌ１．８Ｆ、Ｍａｌ１．８Ｒ、ＰＶ１、ＰＶ２、ＰＦ１、ＰＦ２、ＰＦ３、ＰＦ４、ＰＦ５、ＰＭ１およびＰＯ１よりなる群から選択されるプローブの完全長配列、最低１５の連続するヌクレオチド、最低１０の連続するヌクレオチド、最低５の連続するヌクレオチド若しくはそれらの完全長の相補配列から選択される配列から構成する。
【００２２】
本発明はまた、ＰＧｅｎｕｓ１、ＰＧｅｎｕｓ２、ＭａｌＦ１およびＭａｌＦ２、Ｍａｌ１．８Ｆ、Ｍａｌ１．８Ｒ、ＰＶ１、ＰＶ２、ＰＦ１、ＰＦ２、ＰＦ３、ＰＦ４、ＰＦ５、ＰＭ１、ＰＯ１よりなる群から選択されるプローブの最低５の連続するヌクレオチド若しくはそれらの完全長の相補配列から選択される配列を含んでなる核酸フラグメントも企図している。
【００２３】
本発明はまた、ＰＧｅｎｕｓ１、ＰＧｅｎｕｓ２、ＭａｌＦ１およびＭａｌＦ２、Ｍａｌ１．８Ｆ、Ｍａｌ１．８Ｒ、ＰＶ１、ＰＶ２、ＰＦ１、ＰＦ２、ＰＦ３、ＰＦ４、ＰＦ５、ＰＭ１、ＰＯ１よりなる群から選択されるプローブの最低１０の連続するヌクレオチド若しくはそれらの完全長の相補配列から選択される配列を含んでなる核酸フラグメントも企図している。
【００２４】
本発明はまた、ＰＧｅｎｕｓ１、ＰＧｅｎｕｓ２、ＭａｌＦ１およびＭａｌＦ２、Ｍａｌ１．８Ｆ、Ｍａｌ１．８Ｒ、ＰＶ１、ＰＶ２、ＰＦ１、ＰＦ２、ＰＦ３、ＰＦ４、ＰＦ５、ＰＭ１、ＰＯ１よりなる群から選択されるプローブの選択される完全な配列若しくはそれらの完全長の相補配列を含んでなる核酸フラグメントも企図している。
【００２５】
特定の態様において、本発明は、種、熱帯熱マラリア原生動物（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原生動物（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原生動物（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）および卵形マラリア原生動物（Ｐ．ｏｖａｌｅ）を識別する核酸プローブの選択方法を企図しており、該方法は、熱帯熱マラリア原生動物（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原生動物（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原生動物（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）および卵形マラリア原生動物（Ｐ．ｏｖａｌｅ）からの核酸の最低５ヌクレオチドの配列に対応する若しくは相補的な核酸フラグメント若しくはポリペプチド核酸、ＰＮＡを製造すること；ハイブリダイゼーションアッセイでプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の種の１種若しくはそれ以上を検出するプローブの能力を比較すること；ならびにプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の１、２若しくは３種を検出するがしかしプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の全４種はしないプローブ（１種若しくは複数）を選択することを含んでなる。
【００２６】
本発明はまた、サンプル中の熱帯熱マラリア原生動物（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原生動物（Ｐ．Ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原生動物（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）および卵形マラリア原生動物（Ｐ．ｏｖａｌｅ）の検出および識別方法も企図しており、前記方法は、ｉ）マラリアを有することが疑われる被験体からのサンプル、なら
びにｉｉ）熱帯熱マラリア原生動物（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原生動物（Ｐ．Ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原生動物（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）および卵形マラリア原生動物（Ｐ．ｏｖａｌｅ）を検出および識別するのに適する核酸を含んでなるプローブを提供すること；前記プローブの標的へのハイブリダイゼーションに適する条件下で前記サンプルを前記プローブと接触させること；ならびにサンプル中の熱帯熱マラリア原生動物（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原生動物（Ｐ．Ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原生動物（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）および卵形マラリア原生動物（Ｐ．ｏｖａｌｅ）の存在（あれば）を決定することを含んでなる。
【００２７】
一態様において、該方法は、熱帯熱マラリア原生動物（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）を検出するためのプローブが、ＰＦ１、ＰＦ３、ＰＦ３、ＰＦ４若しくはＰＦ５の１種若しくはそれ以上の最低５の連続するヌクレオチドの核酸配列から選択されることを企図している。別の態様において、該方法は、該プローブがＰＦ１、ＰＦ２、ＰＦ３、ＰＦ４若しくはＰＦ５の１種若しくはそれ以上の最低１０の連続するヌクレオチドの核酸配列から選択されることを企図している。なお別の態様において、該方法は、該プローブがＰＦ１、ＰＦ２、ＰＦ３、ＰＦ４若しくはＰＦ５の１種若しくはそれ以上の最低１５の連続するヌクレオチドの核酸配列から選択されることを企図している。
【００２８】
一態様において、該方法は、三日熱マラリア原生動物（Ｐ．Ｖｉｖａｘ）を検出するためのプローブがＰＶ１若しくはＰＶ２の１種若しくはそれ以上の最低５の連続するヌクレオチドの核酸配列から選択されることを企図している。別の態様において、該方法は、該プローブがＰＶ１若しくはＰＶ２の１種若しくはそれ以上の最低１０の連続するヌクレオチドの核酸配列から選択されることを企図している。なお別の態様において、該方法は、該プローブがＰＶ１若しくはＰＶ２の１種若しくはそれ以上の最低１５の連続するヌクレオチドの核酸配列から選択されることを企図している。
【００２９】
一態様において、該方法は、四日熱マラリア原生動物（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）を検出するためのプローブがＰＭ１およびＰＦ１、ＰＦ２、ＰＦ３、ＰＦ４若しくはＰＦ５の１種若しくはそれ以上の最低５の連続するヌクレオチドの核酸配列から選択されることを企図しており、ならびに、サンプルは、ＰＭ１の最低５の連続するヌクレオチドのプローブの試験結果が陽性でありかつＰＦ１、ＰＦ２、ＰＦ３、ＰＦ４若しくはＰＦ５の最低５の連続するヌクレオチドのプローブの試験結果が陰性である場合に四日熱マラリア原生動物（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）について陽性である。別の態様において、該方法は、該プローブがＰＦ１、ＰＦ２、ＰＦ３、ＰＦ４若しくはＰＦ５の１種若しくはそれ以上の最低１０の連続するヌクレオチドおよびＰＭ１の最低１０の連続するヌクレオチドの核酸配列から選択されることを企図している。なお別の態様において、該方法は、該プローブがＰＦ１、ＰＦ２、ＰＦ３、ＰＦ４若しくはＰＦ５の１種若しくはそれ以上の最低１５の連続するヌクレオチドおよびＰＭ１の最低１５の連続するヌクレオチドの核酸配列から選択されることを企図している。
【００３０】
一態様において、該方法は、卵形マラリア原生動物（Ｐ．ｏｖａｌｅ）を検出するためのプローブが、ＰＯ１およびＰＦ１、ＰＦ２、ＰＦ３、ＰＦ４若しくはＰＦ５の１種若しくはそれ以上の最低５の連続するヌクレオチドの核酸配列から選択されることを企図しており、ならびに、サンプルは、ＰＯ１の最低５の連続するヌクレオチドのプローブの試験結果が陽性でありかつＰＦ１、ＰＦ２、ＰＦ３、ＰＦ４若しくはＰＦ５の最低５の連続するヌクレオチドのプローブの試験結果が陰性である場合に卵形マラリア原生動物（Ｐ．ｏｖａｌｅ）について陽性である。別の態様において、該方法は、該プローブがＰＦ１、ＰＦ２、ＰＦ３、ＰＦ４若しくはＰＦ５の１種若しくはそれ以上の最低１０の連続するヌクレオチドおよびＰＯ１の最低１０の連続するヌクレオチドの核酸配列から選択されることを企図している。なお別の態様において、該方法は、該プローブがＰＦ１、ＰＦ２、ＰＦ
３、ＰＦ４若しくはＰＦ５の１種若しくはそれ以上の最低１５の連続するヌクレオチドおよびＰＯ１の最低１５の連続するヌクレオチドの核酸配列から選択されることを企図している。
【００３１】
先行する態様のいずれにおいても、使用されるプローブ（１種若しくは複数）は、本明細書に開示されるところのヌクレオチド配列全体若しくはそれらの相補鎖、ならびに該プローブの５、１０若しくは１５の連続するヌクレオチドの相補配列のものでありうる。
【００３２】
［発明の詳細な記述］
本発明は、例えばハイブリダイゼーションアッセイでプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の寄生生物（例えば熱帯熱マラリア原生動物（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原生動物（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原生動物（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）および卵形マラリア原生動物（Ｐ．ｏｖａｌｅ））を検出するための核酸を特徴とする。本発明のプローブは生物学的サンプル中のプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の存在の検出方法で使用しうる。これらの方法において、本発明のプローブをハイブリダイゼーションアッセイで生物学的サンプル（例えば全血、ＣＳＦ若しくは組織サンプル）と接触させ、そして、該サンプル中の核酸に結合したプローブの検出を、該サンプル中のプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の存在の指示として使用する。本発明に包含されるプローブは、
Ａ（１）熱帯熱マラリア原生動物（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）からの核酸の最低１０ヌクレオチドの配列に対応する若しくは相補的な核酸フラグメント若しくはポリペプチド核酸、ＰＮＡ（すなわちプローブ）を製造すること、および（２）ハイブリダイゼーションアッセイで全部のプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の種を検出するプローブの能力を比較すること。他３種よりも好都合に熱帯熱マラリア原生動物（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）にハイブリダイズするプローブが本発明に包含される。
Ｂ（１）三日熱マラリア原生動物（Ｐ．ｖｉｖａｘ）からの核酸の最低１０ヌクレオチドの配列に対応する若しくは相補的な核酸フラグメント若しくはＰＮＡ（すなわちプローブ）を製造すること、および（２）ハイブリダイゼーションアッセイで全部のプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の種を検出する該プローブの能力を比較すること。他３種より好都合に三日熱マラリア原生動物（Ｐ．ｖｉｖａｘ）にハイブリダイズするプローブが本発明に包含される。
Ｃ（１）四日熱マラリア原生動物（Ｐ．ｍａｌａｉｉａｅ）からの核酸の最低１０ヌクレオチドの配列に対応する若しくは相補的な核酸フラグメント若しくはＰＮＡ（すなわちプローブ）を製造すること、および（２）ハイブリダイゼーションアッセイで全部のプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の種を検出する該プローブの能力を比較すること。他３種より好都合に四日熱マラリア原生動物（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）にハイブリダイズするプローブが本発明に包含される。
Ｄ（１）卵形マラリア原生動物（Ｐ．ｏｖａｌｅ）からの核酸の最低１０ヌクレオチドの配列に対応する若しくは相補的な核酸フラグメント若しくはＰＮＡ（すなわちプローブ）を製造すること、および（２）ハイブリダイゼーションアッセイで全部のプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の種を検出する該プローブの能力を比較すること。他３種より好都合に卵形マラリア原生動物（Ｐ．ｏｖａｌｅ）にハイブリダイズするプローブが本発明に包含される、
により同定されうる。
【００３３】
熱帯熱マラリア原生動物（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原生動物（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原生動物（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）および卵形マラリア原生動物（Ｐ．ｏｖａｌｅ）核酸は、当該技術分野の標準的核酸単離法を使用して、感染した個体からの生物学的サンプル（全血、骨髄、ＣＳＦのような）から得ることができる。熱帯熱マラリア原生動物（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）（ならびに三日熱マラリア原生
動物（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原生動物（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）および卵形マラリア原生動物（Ｐ．ｏｖａｌｅ））は培養物からもまた得ることができる。例えば、プラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）リボソームＲＮＡをコードするＤＮＡは、本明細書に記述されかつ当該技術分野で既知の方法およびプライマーを使用して感染患者の全血サンプルから調製したＤＮＡのＰＣＲ増幅により得ることができる。
【００３４】
いかなるプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）配列（例えば５８、５．８Ｓ、１８Ｓ若しくは２８ＳリボソームＲＮＡをコードする配列）も、プローブの同定のための候補配列として選択しうる。好ましい配列は、ヒト以外のプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、または系統学的比較により決定されるところの例えばバベシア属（Ｂａｂｅｓｉａ）若しくはティレリア属（Ｔｈｉｌｅｒｉａ）のような他の寄生原生動物の類似の配列から分岐するものである。本発明の核酸プローブは長さ最低１０ヌクレオチドであり、そしてデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡプローブ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡプローブ）、ペプチド核酸（ＰＮＡプローブ）またはそれらの組合せ若しくは修飾を含有しうる。該プローブは一本鎖若しくは二本鎖であることができ、ならびに当該技術分野における多数の標準的方法のいずれによっても製造しうる。例えば、プローブは、化学合成、ベクター（例えば該プローブに対応する配列を含有するプラスミド）の制限エンドヌクレアーゼ消化、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、若しくは該プローブに対応する配列を含有するベクターのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により作成しうる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、ニューヨーク州ニューヨーク、１９９４（引用することにより本明細書に組込まれる）を参照されたい）。プローブは合成の間若しくは後に標識しうる。例えば、例えば放射性同位元素（例えばｐ３２、Ｓ３５若しくはＨ３）、ビオチンまたはジゴキシゲニンを含有する標識ヌクレオチドを合成の間にプローブに取り込みうる。ビオチンを含有するプローブは、蛍光色素（例えばフルオレセイン若しくはローダミン）または酵素（例えばアルカリホスファターゼ若しくはワサビペルオキシダーゼ）のような検出可能な標識を含有する、アビジン若しくはストレプトアビジンのような二次試薬の使用により検出する。同様に、ジゴキシゲニンを含有するプローブは標識抗ジゴキシゲニン抗体を使用することにより検出しうる。プローブは、例えば標準的方法（例えばＡｕｓｕｂｅｌら、上記を参照されたい）でのニックトランスレーションまたはＴ４  ＲＮＡリガーゼ、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、末端転移酵素若しくはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼの使用により合成後にもまた標識しうる。該プローブは該プローブの安定性を増大させるために修飾ヌクレオチドもまた含有しうる。例えばリボース基上に２’−０−アルキル基を含有するリボヌクレオチドを使用しうる。該プローブは固体支持体上への該プローブの捕捉を容易にする修飾もまた含有しうる。例えば、ポリｄＡ若しくはポリデアザグアノシン尾を、固体支持体、例えばポリｄＴ若しくはポリｄＣ標識磁性粒子へのプローブ結合を容易にするために、末端転移酵素を使用して該プローブの３’端に付加しうる。プローブは、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー若しくはゲル濾過クロマトグラフィーのような標準的方法を使用して使用前に精製しうる（例えばＡｕｓｕｂｅｌら、上記を参照されたい）。本発明のプローブはサンプル中のプラスモディウム属（���ｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の存在を検出するためのいかなる標準的ハイブリダイゼーションアッセイでも使用しうる。例えば、サザンブロット、ドットブロット、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、バイオセンサー若しくは二重プローブによるリアルタイムハイブリダイゼーション検出、サンドイッチ型ハイブリダイゼーションアッセイを使用しうる（例えば、米国特許出願第０７／８２６，６５７号［現在米国特許第５，５１９，１２７号］および米国特許第５，６２９，１５６号［国際特許公開第ＷＯ  ９４／１０３５５号］明細書（それらの全部は引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。あるいは、該プローブをポリメラーゼ連鎖反応アッセイでプライマーとして使用しうる（例えばＡｕｓｕｂｅｌら、上記を参照されたい）。本発明のプローブおよび方法を使用して分析しうる生物学的サンプルは、全血、ＣＳＦ、骨髄および例えば
脾からの組織サンプルを包含する。核酸は標準的方法によりサンプルから抽出し（細胞を無傷のまま保つｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの場合を除く）、そして上で列挙されたアッセイで該プローブを使用して分析する。単一プローブ若しくはプローブの組合せを該アッセイで使用しうる。（例えば本発明の方法において）該プローブとともに使用されるハイブリダイゼーション条件は、例えば２５℃〜４２℃で３０〜５０％ホルムアミド、若しくは２５〜３７℃の間のＧｕＳＣＮおよびホルムアミドの混合物の範囲内にある。「当業者により既知」であるとおり、ハイブリダイゼーション条件の選択はプローブの長さおよびヌクレオチド含量（すなわちＡＴと比較したＧＣ）に依存する。従って、ハイブリダイゼーション条件はこれらの因子に適応させるように調節しうる。加えて、多様な塩（例えばＮａＣｌと比較してグアニジンチオシアネート若しくはグアニジン塩酸塩）および変性剤（例えばＮＰ−４０、ドデシル硫酸ナトリウム）の使用は、当業者により容易に決定され得るとおり塩濃度および温度の調節を必要としうる。
【００３５】
本発明で使用しうるハイブリダイゼーション条件の制限しない例は後に続くとおりである。サザンブロット分析において、以下のハイブリダイゼーション条件、すなわち４２℃で２×ＳＳＣ中３０％ないし５０％ホルムアミドを使用しうる。ハイブリダイゼーション後に、標準的方法を使用してフィルターを洗浄する。例えば、２×ＳＳＣないし０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中２５℃で３回の１５分ハイブリダイゼーション後洗浄を、未結合のプローブを除去するために実施しうる。ＲＮＡブロットのため、３０％ホルムアミド中室温で一夜のハイブリダイゼーションを実施した。過剰のプローブは０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中３回の１５分洗浄を洗浄することにより除去した。
【００３６】
「ハイブリダイゼーション」という用語は相補核酸の対形成を指す。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強さ（すなわち核酸間の会合の強さ）は、核酸間の相補性の程度、関与する条件の緊縮性、形成されるハイブリッドのＴｍおよび該核酸内のＧ−Ｃ比のような因子により影響される。その構造内の相補核酸の対形成を含有する単一分子は「自己ハイブリダイズされる」と言われる。
【００３７】
適するハイブリダイゼーション条件を含むように多数の同等の条件を使用しうることが公知であり；プローブの長さおよび性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）ならびに標的の性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成、溶液中に存在若しくは固定、など）、ならびに塩の濃度および他の成分（例えばホルムアミド、デキストラン硫酸、ポリエチレングリコールの存在若しくは非存在）のような因子を考慮し、そしてハイブリダイゼーション溶液は、上で列挙された条件と異なるがしかし同等の低緊縮性ハイブリダイゼーションの条件を生成するように変動させうる。加えて、当該技術は高緊縮性の条件（例えばハイブリダイゼーションおよび／若しくは洗浄段階の温度を上昇させること、ハイブリダイゼーション溶液中でのホルムアミドの使用など）下のハイブリダイゼーションを促進する条件を知っている。
【００３８】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのため、以下の条件を米国特許第６，１６５，７２３号および米国特許出願第１１／４９４，４３０号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるとおり使用しうる。すなわち、室温と３７℃の間でＧｕＳＣＮ（プローブ配列に依存して１．５ないし３．５Ｍ）、若しくは室温と３７℃の間でＧｕＳＣＮおよびホルムアミドの混合物で３０分ないし１時間、次いでＳＳＣ（２×ないし０．１×）および０．１％ＳＤＳでの洗浄。
【００３９】
例示
さらなる詳述を伴わずに、当業者は、本明細書の記述に基づき本発明をその完全な程度まで利用し得ると考えられる。以下の特定の態様は従って単に具体的説明として解釈されるべきであり、そして何であれ決して本開示の残部を制限すると解釈されるべきでない。
【００４０】
熱帯熱マラリア原生動物（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原生動物（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、卵形マラリア原生動物（Ｐ．ｏｖａｌｅ）および四日熱マラリア原生動物（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）サンプルへのプローブＰＧｅｎｕｓ１、ＰＧｅｎｕｓ２、ＭａｌＦ１、ＭａｌＦ２、Ｍａｌ１．８Ｆ、Ｍａｌ１．８Ｒのハイブリダイゼーション
ドットブロット分析データを表１に示す。これらの実験において、それぞれの１８Ｓ  ｒＲＮＡサブユニットをコードするヌクレオチド配列を含有するプラスミドおよそ０．１μｇを１スポットあたりに使用した。該ブロットを、上述されたハイブリダイゼーション条件下でｄｉｇ標識プローブとハイブリダイズさせた。
【００４１】
ＲＮＡの場合、ＲＮＡを合成しそして６×ＳＳＣ中０．１μｇをニトロセルロースメンブレンにスポットした。ｄｉｇ標識プローブ（ジゴキシゲニン標識プローブ）とのハイブリダイゼーションをホルムアミド中室温で一夜実施した。本方法を使用して多様な生物体およびプローブの間のハイブリダイゼーションシグナルを比較した。
【００４２】
全部の種のプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の全種の１８ｒＤＮＡにハイブリダイズするプローブは、ＰＧｅｎｕｓ１、ＰＧｅｎｕｓ２、ＭａｌＦ１、ＭａｌＦ２、Ｍａｌ１．８ＦおよびＭａｌ１．８Ｒである。プローブＰＧｅｎｕｓ１、ＰＧｅｎｕｓ２およびＭａｌ１．８Ｒは全部のプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の種の１８Ｓ  ｒＲＮＡにハイブリダイズした。
【００４３】
プラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）１８Ｓ  ｒＲＮＡ特異的プローブ
本発明のプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）特異的プローブは、プローブＰＧｅｎｕｓ１、ＰＧｅｎｕｓ２、ＭａｌＦ１、ＭａｌＦ２、Ｍａｌ１．８ＦおよびＭａｌ１．８Ｒを包含し、それらは配列：
【００４４】
【化１】
0005511056.tif 000002
【００４５】
を有する。
【００４６】
プラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の種の１８Ｓ  ｒＲＮＡ特異的プローブ
本発明のプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の種の特異的プローブは、ＰＶ１、ＰＶ２、ＰＶ３、ＰＦ１、ＰＦ２、ＰＦ３、ＰＦ４、ＰＦ５、ＰＦ６、ＰＦ７、ＰＦ８、ＰＭ１、ＰＯ１から選択されるプローブの配列若しくはそれらの完全長の相補配列を
有するプローブＰＶ１を包含する。
【００４７】
三日熱マラリア原生動物（Ｐ．ｖｉｖａｘ）特異的プローブ
【００４８】
【化２】
0005511056.tif 000003
【００４９】
熱帯熱マラリア原生動物（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）特異的プローブ
【００５０】
【化３】
0005511056.tif 000004
【００５１】
四日熱マラリア原生動物（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）特異的プローブ
【００５２】
【化４】
0005511056.tif 000005
【００５３】
卵形マラリア原生動物（Ｐ．ｏｖａｌｅ）特異的プローブ
【００５４】
【化５】
0005511056.tif 000006
【００５５】
【表１】
0005511056.tif 000007
【００５６】
本発明の一例示において、サンプルをプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）スピーシーズの存在について試験し、そして、検出されたプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の種を本発明のプローブの使用により識別する。サンプルを、プローブＰＶ１および／若しくはＰＶ２、プローブＰＦ１、ＰＦ２、ＰＦ３、ＰＦ４および／若しくはＰＦ５、プローブＰＭ１ならびにプローブＰＯ１の最低５、１０若しくは１５の連続するヌクレオチドのプローブ、またはそれらのプローブ全体若しくは相補配列を用いて試験する。プローブＰＶ１および／若しくはＰＶ２について試験結果が陽性であるサンプルは三日熱マラリア原生動物（Ｐ．ｖｉｖａｘ）に感染していると決定する。プローブＰＦ１、ＰＦ２、ＰＦ３、ＰＦ４および／若しくはＰＦ５について試験結果が陽性であるサンプルは、熱帯熱マラリア原生動物（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に感染していると決定する。プローブＰＭ１について試験結果が陽性であるがしかしＰＦ１、ＰＦ３、ＰＦ３、ＰＦ４および／若しくはＰＦ５について陽性でないサンプルは四日熱マラリア原生動物（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）に感染していると決定する。プローブＰＯ１について試験結果が陽性であるがしかしＰＦ１、ＰＦ２、ＰＦ３、ＰＦ４および／若しくはＰＦ５について陽性でないサンプルは卵形マラリア原生動物（Ｐ．ｏｖａｌｅ）に感染していると決定する。
【００５７】
上の記述から、当業者は本発明の不可欠の特徴を容易に確かめ得、かつ、その技術思想および範囲から離れることなくそれを多様な使用および条件に適合させるように本発明の多様な変更および改変を行い得る。従って他の態様もまた請求の範囲内にある。
【配列表】
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