(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
医療用リパーゼであって、
（ａ）配列番号：２のアミノ酸１〜269の配列に対して少なくとも90％の同一性を有し；
（ｂ）リパーゼ活性を有し；そして
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸１〜269の配列に比べて、置換N33Q、T231R、N233R及びD254Sを含み、そして配列番号：２のN33Q＋T231R＋N233Rである参照リパーゼに比べて改良された消化性能を有する；
ことを特徴とするリパーゼ。
【請求項２】
配列番号：２のアミノ酸１〜269の配列に対して置換：N33Q＋G91T＋K98I＋T114I＋G163K＋T231R＋N233R＋D254Sを含む、請求項１に記載のリパーゼ。
【請求項３】
プロテアーゼ及び／又はアミラーゼとの組み合わせにおける、請求項１又は２に記載のリパーゼ。
【請求項４】
請求項３に記載のプロテアーゼ及び／又はアミラーゼとの組み合わせにおけるリパーゼにおいて、
（i）当該プロテアーゼが、
ａ）配列番号：３のアミノ酸１〜274の配列を有するプロテアーゼ；
ｂ）配列番号：４のアミノ酸１〜188の配列を有するプロテアーゼ；及び
ｃ）配列番号：５のアミノ酸１〜188の配列を有するプロテアーゼ、
から成る群から選択されるプロテアーゼに対して少なくとも90％の同一性を有し；
（ii）前記アミラーゼが、
ａ）配列番号：６のアミノ酸１〜481の配列を有するアミラーゼ；
ｂ）配列番号：７のアミノ酸１〜481の配列を有するアミラーゼ；
ｃ）配列番号：８のアミノ酸１〜483の配列を有するアミラーゼ、
から成る群から選択されるアミラーゼに対して少なくとも90％の同一性を有する、
ことを特徴とする請求項３に記載のリパーゼ。
【請求項５】
少なくとも１種の医薬として許容される賦形剤と共に、請求項１又は２に記載のリパーゼ又はリパーゼ混合物を含んで成る医薬組成物。
【請求項６】
プロテアーゼ及び／又はアミラーゼを更に含んで成る、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記プロテアーゼ及び／又はアミラーゼが請求項４に記載したとおりである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
消化系疾患、膵臓外分泌不全、膵炎、嚢胞性繊維症、I型糖尿病及び／又はII型糖尿病の治療のための医薬の製造における、請求項１又は２に記載のリパーゼ又はリパーゼ混合物の使用。
【請求項９】
アミラーゼ及び／又はプロテアーゼの使用をさらに含む、請求項８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表への言及：
本出願は、コンピューター読み取り可能形での配列表を含む。そのコンピューター読み取り可能形は、引用により本明細書に組込まれる。
【０００２】
本発明は、（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜269の配列に対して少なくとも50％の同一性を有し；（ｂ）リパーゼ活性を有し；そして（ｃ）配列番号2のアミノ酸１〜269の配列に比較して、置換N33Q、T231R及びN233R、並びに下記：E1*,D,N；Q4H,P,R；D5E；N8L,Q；Q9H；F10L; N11C,D,H,L,P,Q,R,S; G23E; N26A,H,I；D27I,N,Q,R,S,V; P29T; A30T,V; T37K,M; G38A,D,F,H,I,K,L,M,N,P,Q1S,T,W,Y; N39H,S; E43K;K46M; A49T; L52I,R; E56K,Q,R,S; D57G,N; V60E,S; G61R; V63R; A68V; L69I; N71I,S;N73Q,Y; I76T; R84E; I86F,L; E87A,H,K,R;I90L,V;G91A,C,E,F,K,L,M,N,S,T,V,W,Y;L93*,F;N94*K,Q,R,S;F95*;D96*,E,G,N,R,S,W,Y;L97M,Q;K98I,T;E99D;N101Q;D102E,G,Y;R108M;G109A;D111A,E,N,S;G112A;T114I;S115L;W117C,D,E,F,G,H,I,K,L,P,S,T,V,Y;D122E,N;Q126L;V128A;D130H;H135D;P136H;Y138F;V141E,L;A150V;V154F,I,L;A155V;G156R;G161A,E;N162G,S,T;G163A,C,D,E,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;D167E;V168M;V176A,D,F,G,H,I,K,M,N,Q,T,W; G177A; R179T; L185M; G190C,D; N200Q,S; R205I;L206F; E210D,R,V,Y; S216P; E219D; G225P; T226N; L227F,G; P229R;E239D;G240L;D242E;T244S;G246A;Q249R;N251Q,S;D254A,G,I,K,L,M,N,R,Q,S,Y;I255A,F;P256A,F,G,H,I,L,M,N,Q,S,T,V,W,Y; 及び L269F,Hから選択された少なくとも１つの追加の置換を含んで成る、薬剤として使用するためのリパーゼに関する。
【０００３】
本発明はさらに、リパーゼのインビトロ消化性能を決定し、そして任意には、それを比較するための方法にも関する。
本発明のリパーゼは、プロテアーゼ及び/又はアミラーゼと組合して使用され得る。医学的指標の例は、消化障害、膵臓外分泌機能不全（PEI）、膵炎、嚢胞性線維症、糖尿病Ｉ型及び/又は糖尿病II型の処理である。
【０００４】
配列番号２のリパーゼは、ヒューミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginose）DSM4109（異名：サーモミセス・ラヌギノサス（Thermomyces lanuginosus））由来の野生型リパーゼである。
【背景技術】
【０００５】
アメリカ特許第5,614,189号（EP600868B1号）は、膵臓酵素置換療法、例えば嚢胞性線維症を有する患者の処理へのヒューミコラ・ラヌギノサ由来のリパーゼの使用を記載する。このリパーゼは、ヒューミコラ・ラヌギノサDSM4109からであり、そして配列番号２のアミノ酸１〜269のアミノ酸配列を有する。
【０００６】
WO 92/05249号、WO 92/19726号、WO 94/25577号、WO 95/09909号、WO 95/22615号、WO97/04079号、WO 97/07202号、WO 99/42566号、WO 00/32758号、WO 00/60063号、WO 01/83559号、 WO01/83559号、WO 2002/055679号、WO 2002/062973号、WO 2002/062973号、 WO 2004/099400及びWO 2004/111216号は、配列番号２の多くの変異体を記載するが、しかしその医薬使用については記載していない。
【０００７】
WO2006/136159号は、配列番号１のアミノ酸１〜269を有するリパーゼ及びその変異体N33Qの医薬使用を記載する。
医薬使用のための改良されたリパーゼについての必要性が当業界において存在する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、医薬使用のための改良されたリパーゼを提供する。好ましくは、本発明に従って使用するための酵素は、インビボ及び/又はインビトロでの改良された効力；改良された活性；改良された安定性を有し；プロテアーゼによる分解に対して安定し；胆汁塩の存在下で安定し；そして/又は低められたアレルギー性を有する。より好ましくは、本発明のリパーゼは、次の置換：N33Q+T231R+N233Rを有する、配列番号２の配列を有する対照リパーゼに比較して、インビトロで改良された消化性能を有する。
【０００９】
本発明は、（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜269の配列に対して少なくとも50％の同一性を有し；（ｂ）リパーゼ活性を有し；そして（ｃ）配列番号2のアミノ酸１〜269の配列に比較して、置換N33Q、T231R及びN233R、並びに下記：E1*,D,N；Q4H,P,R；D5E；N8L,Q；Q9H；F10L; N11C,D,H,L,P,Q,R,S; G23E; N26A,H,I；D27I,N,Q,R,S,V; P29T; A30T,V; T37K,M; G38A,D,F,H,I,K,L,M,N,P,Q1S,T,W,Y; N39H,S; E43K;K46M; A49T; L52I,R; E56K,Q,R,S; D57G,N; V60E,S; G61R; V63R; A68V; L69I; N71I,S;N73Q,Y; I76T; R84E; I86F,L; E87A,H,K,R;I90L,V;G91A,C,E,F,K,L,M,N,S,T,V,W,Y;L93*,F;N94*K,Q,R,S;F95*;D96*,E,G,N,R,S,W,Y;L97M,Q;K98I,T;E99D;N101Q;D102E,G,Y;R108M;G109A;D111A,E,N,S;G112A;T114I;S115L;W117C,D,E,F,G,H,I,K,L,P,S,T,V,Y;D122E,N;Q126L;V128A;D130H;H135D;P136H;Y138F;V141E,L;A150V;V154F,I,L;A155V;G156R;G161A,E;N162G,S,T;G163A,C,D,E,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;D167E;V168M;V176A,D,F,G,H,I,K,M,N,Q,T,W; G177A; R179T; L185M; G190C,D; N200Q,S; R205I;L206F; E210D,R,V,Y; S216P; E219D; G225P; T226N; L227F,G; P229R;E239D;G240L;D242E;T244S;G246A;Q249R;N251Q,S;D254A,G,I,K,L,M,N,R,Q,S,Y;I255A,F;P256A,F,G,H,I,L,M,N,Q,S,T,V,W,Y; 及び L269F,Hから選択された少なくとも１つの追加の置換を含んで成る、薬剤として使用するためのリパーゼに関する。
【００１０】
本発明はさらに、消化障害、PEI、膵炎、嚢胞性線維症、糖尿病Ｉ型及び/又は糖尿病II型の処理のための薬剤の製造のためへのそのようなリパーゼの使用、プロテアーゼ及び/又はアミラーゼの使用を、任意にはさらに包含するそれらの使用、及び任意にはプロテアーゼ及び/又はアミラーゼと組合わしてのそれらの病状の処理への使用のためのそのようなリパーゼに関する。
【００１１】
本発明はさらに、そのようなリパーゼ、及び少なくとも１つの医薬的に許容できる助剤材料、任意にはプロテアーゼ及び/又はアミラーゼを含んで成る医薬組成物に関する。
本発明はまた、治療的有効量のそのようなリパーゼ、任意には、プロテアーゼ及び/又はアミラーゼと共に投与することによる、消化障害、PEI、膵炎（急性及び/又は慢性）、嚢胞性線維症、糖尿病Ｉ型及び/又は糖尿病II型の処理方法にも関する。
【００１２】
最終的に、本発明は、インビトロでのリパーゼ消化性能を決定し、そして任意には、それを比較するための方法；及び一定のリパーゼ、例えば
（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜269の配列に対して少なくとも50％の同一性を有し；（ｂ）リパーゼ活性を有し；そして（ｃ）配列番号2のアミノ酸１〜269の配列に比較して、次の位置：9, 30, 38, 39, 63, 112, 114, 115, 117, 122, 128, 130, 136, 154, 155, 156, 161 , 163, 168, 185, 190, 239, 及び246から選択された少なくとも１つの位置で置換を含んで成るリパーゼ；及び
【００１３】
（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜269の配列に対して少なくとも50％の同一性を有し；（ｂ）リパーゼ活性を有し；そして（ｃ）配列番号2のアミノ酸１〜269の配列に比較して、次の置換：E1N;Q4H;N8L,Q;Q9H;NHC,D,H,L,P,S; G23E; D27I; P29T; A30T,V; T37K,M; G38A,D,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,S,T,W,Y; N39H,S; D57N; G61R; V63R; N71I,S; N73Q,Y; I76T; I86F,L; E87H; G91F,K,L,M,V,Y; N94Q; F95*; D96*; N101Q; D111E; G112A; T114I; S115L; W117C,D,E,F,G,H,I,K,L,P,S,T,V,Y; D122E,N; Q126L; V128A, D130H, H135D, P136H; V141E,L;V154F,I,L;A155V;G156R;G161A,E;N162G,S;G163A,C,D,E,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y; V168M; L185M; G190C,D; R205I; G240L; G246A; N251Q,S;及びL269F,Hから選択された少なくとも１つの置換を含んで成るリパーゼ；又は
【００１４】
（C2）配列番号２のアミノ酸１〜269の配列に比較して、示される位置で次のアミノ酸：1N;4H;8L,Q;9H;11C,D,H,L,P,S;23E;27I;29T;30T,V;37K,M;38A,D,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,S,T,W,Y; 39H,S; 57N; 61 R; 63R; 71 I,S; 73Q,Y; 76T; 86F,L; 87H; 91 F,K,L,M,V,Y; 94Q; 95*; 96*; 101Q;111E; 112A; 1141; 115L; 117C,D,E,F,G,H,I,K,L,P,S,T,V,Y; 122E,N; 126L; 128A, 130H,135D,136H;141E,L;154F,I,L;155V;156R;161A,E;162G,S;163A,C,D,E,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y; 168M; 185M; 190C,D; 2051; 240L; 246A; 251Q,S; 及び269F,Hの少なくとも１つを含んで成るリパーゼに関する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の特定の記載：
リパーゼ：
リパーゼは、リパーゼ活性を有するポリペプチドである。次においては、本発明の組成物、方法及び使用のためのリパーゼは、本発明のリパーゼとして言及される。本発明のリパーゼは、活性を包含するカルボン酸エステルヒドロラーゼEC3.1.1.-, 例えばEC3.1.1.3トリアシルグリセロールリパーゼ、EC3.1.1.4ホスホリパーゼA2、EC3.1.1.5リソホスホリパーゼ、EC3.1.1.26ガラクトリパーゼ、EC3.1.1.32ホスホリパーゼA1、EC3.1.1.73フェルロイルエステラーゼであり得る。特定の態様においては、リパーゼは、EC3.1.1.3トリアシルグリセロールリパーゼである。もう１つの特定の態様においては、リパーゼは、EC3.1.1.4ホスホリパーゼA2活性を有し、すなわち反応：ホスファチジルコリン＋H(2)O =1-アシルグリセロホスホコリン＋カルボキシレート（２位置に結合される脂肪酸を除去する）を触媒する。さらに特定の態様においては、リパーゼは、EC3.1.1.32ホスホリパーゼA1活性を有し、すなわち反応：ホスファチジルコリン＋H(2)O＝２−アシルグリセロホスホコリン＋カルボキシレートを触媒する。
【００１６】
EC番号は、それぞれ補足１−５：1-5; Eur. J. Biochem., 1995, 232: 1-6; Eur. J. Biochem., 1996, 237: 1-5; Eur. J. Biochem., 1997, 250: 1-6; and Eur. J. Biochem., 1999, 264: 610-650を包含する、NC-IUBMB, Academic Press, San Diego, Californiaからの酵素命名法1992を言及する。その命名法は規則的に補充され、そして更新される：例えばwww.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.htmlでのWorld Wide Webを参照のこと。
本発明のリパーゼは、親リパーゼの変異体であり得る。
【００１７】
変異体：
用語、変異体は、１又は複数の変更、例えば、親リパーゼに比較して、ポリペプチドにおける１又は複数の特定位置での１又は複数の特定アミノ酸残基の置換、挿入、欠失及び/又は切断を含んで成るリパーゼとして、本明細書においては定義される。
【００１８】
親リパーゼ：
用語、新規リパーゼとは、変異体が比較され、そして一列整列されるポリペプチドを言及する。親リパーゼの特定の例は、修飾、例えば置換、挿入、欠失及び/又は切断が、本発明のリパーゼ変異体を生成するために行われるリパーゼである。親リパーゼは、天然に存在する（野生型）リパーゼであるか、又はそれは、いずれかの適切な手段により調製される、その変異体であり得る。親はまた、同じ染色体遺伝子座を占有する遺伝子の複数の他の形のいずれかによりコードされるポリペプチドである対立遺伝子変異体でもあり得る。
【００１９】
特定の態様においては、親リパーゼは、配列番号２で示されるT. ラヌギノサスリパーゼのアミノ酸1〜269の配列に対して少なくとも50％の同一性を有するアミノ酸配列を有する菌類リパーゼである。親リパーゼは、酵素リパーゼ、例えばカンジダ（Candida）、クルイベロミセス（Kiuyveromyces）、ピチア（Pichia）、サッカロミセス（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharornyces）又はヤロウィア（Yarrowia）ポリペプチド；又はより好ましくは糸状菌リパーゼ、例えばアクレモニウム（Acremonium）、アスペルギラス（Aspergillus）、アウレオバシジウム（Aureobasidium）、クリプトコーカス（Cryptococcus）、フィロバシジウム（Filobasidium）、ヒューミコラ（Humicola）、マグナポルテ（Magnaporthe）、ムコル（Mucor）、マイセリオプソラ（Myceliophthora）、ネオカリマスフィックス（Neocallimastix）、ネウロスポラ（Neurospora）、パエシロミセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、シゾフィラム（Schizophyllum）、タラロミセス（Talaromyces）、サーモアスカス（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）又はトリコダーマ（Trichoderma）リパーゼ、又はそれらのいずれかの変異体であり得る。
【００２０】
好ましい親リパーゼは、子嚢菌リパーゼであり、好ましくはヒューミコラ、タラロミセス又はサーモミセスの株、例えばヒューミコラ・フスコアトラ（Humicola fuscoatra）、ヒューミコラ・グリセア（Humicola grisea）、ヒューミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、ヒューミコラ・ルテア（Humicola lutea）、ヒューミコラ・ニグレスセンス（Humicola nigrescens）、ヒューミコラsp.（Humicola sp.）, ヒューミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）（サーモミセス・ラヌギノサス（Thermomyces lanoginosus））、サーモミセス・イバダネンシス（Thermomyces ibadanensis）、サーモミセス・ベルコサス（Thermomyces verrucosus）、タラロミセス・サーモフィラス（Talaromyces thermophilus）、タラロミセス・エメルソニ（Talaromyces emersonii）又はタラロミセス・ビソクラミドイデス（Talaromyces byssochlamydoides）の株から誘導されるか、又はそれらのいずれかの変異体である。特定の態様においては、親リパーゼは、（i）配列番号２のアミノ酸１〜269を有するヒューミコラ・ラヌギノサスリパーゼ、又は（ii）その変異体である。
【００２１】
リパーゼ変異体の命名法：
本発明においては、リパーゼ変異体におけるアミノ酸残基位置の特定の番号付けが使用される。既知リパーゼのアミノ酸配列を一列整列することにより、いずれかのリパーゼ酵素におけるいずれかのアミノ酸残基にアミノ酸位置番号を企画することが可能である。
【００２２】
本明細書に記載される一列整列方法を用いてもう１つのリパーゼのアミノ酸配列される、配列番号２で開示されるリパーゼのアミノ酸配列から始まる番号付けシステムを用いて、いずれかの他のリパーゼにおける個々のアミノ酸残基の位置を示すことが可能である。従って、配列番号２のアミノ酸１〜269の配列と比較される本発明のいずれかのリパーゼに関して、個々の位置及び/置換は、配列番号２のアミノ酸1〜26aの位置に対応する。
【００２３】
本発明の種々のリパーゼ変異体を記載する場合、下記に記載される命名法が、容易な参照のために適合される。すべての場合、許容されるIUPAC一文字又は三文字アミノ酸略語が使用される。
【００２４】
アミノ酸置換に関しては、次の命名法が使用される：元のアミノ酸、位置、置換されるアミノ酸。従って、位置26でのイソロイシンによるアスパラギンの置換は、N26Iとして示される。複数の突然変異は、追加の印（＋）により分離され、例えばN33Q+E210D+T231R+N233Rは、それぞれ、グルタミン（Q）によりアスパラギン、アスパラギン酸（D）によりグルタミン酸（E）、アルギニン（R）によりトレオニン（T）、及びアルギニン（R）によりアスパラギン（N）を置換する、位置33、210、231及び233での突然変異を表す。
【００２５】
アミノ酸欠失に関しては、次の命名法が使用される：元のアミノ酸、位置、*。従って、位置１でのグルタミン酸（E）の欠失は、“E1*”として示される。複数の欠失は、追加の印（“＋”）により分離され、例えばそれぞれ位置93, 94, 95及び96でのロイシン（L）、アスパラギン（N）、フェニルアラニン（F）及びアスパラギン酸（D）の欠失は、"L93*+N94*+F95*+D96*"として示される。
【００２６】
従って、本発明のためには、欠失は実際、置換、すなわち無による元のアミノ酸の置換の例として考慮され得る。従って、配列番号２のアミノ酸１〜269のリパーゼの次の変異体は、合計11の置換を含むと言われる：他のアミノ酸への７つの置換、及び無への４個の置換、すなわち４個の欠失：
D27R+N33Q+G91A+L93*+N94*+F95*+D96*+D111A+T231R+N233R+P256T。
【００２７】
従って、特定のアミノ酸が複数の異なったアミノ酸により置換されるか、又は欠失され得る場合、これは置換として示され、ここで欠失を包含する他の置換は、コンマ（“,”）により分離される。例えば、“E1*D, N”とは、親リパーゼ（E1）における位置１でのグルミング、アスパラギン（H）により置換され得る。
【００２８】
一列整列及び同一性の計算：
このセクションは、本発明のリパーゼ、アミラーゼ及びプロテアーゼ（本発明の酵素）に適用される。
２種のアミノ酸配列間の関係は、パラメーター“同一性”により記載される。
【００２９】
本発明のためには、２種のアミノ酸配列は、EMBOSSパッケージ (http://emboss.org)バージョン2.8.0からのNeedleプログラムを用いることにより決定される。このNeedle−プログラムは、Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. MoI. Biol. 48, 443-453に記載される世界的一列整列アルゴリズムを実行する。使用される置換マトリックスはBLOSUM62であり、ギャップ開放ペナルティーは10であり、そしてギャップ延長ペナルティーは0.5である。
【００３０】
本発明のアミノ酸配列（“発明の配列”、例えば次の４個の置換を有する配列番号２のアミノ酸１−269の配列を有する変異体LVA023：N33Q+E210D+T231R+N233R）と、異なったアミノ酸配列（“外来性配列”、例えば配列番号２のアミノ酸１−269）との間の同一性の程度は、“発明の配列”の長さ、又はいずれにせよ、最も短い“外来性配列”の長さにより割り算された、２種の配列一列整列での正確な適合の数として計算される。結果は、％同一性で表される。
【００３１】
正確な適合は、“発明の配列”及び“外来性配列”がオーバーラップの同じ位置において同一のアミノ酸残基を有する場合、発生する（下記一列整列の例においては、これは“|”により表される）。配列の長さは、配列におけるアミノ酸残基の数である（例えば、配列番号２の長さは269である）。
下記純粋に推定的な一列整列の例においては、オーバーラップは、配列１のアミノ酸配列“HTWGER-NL”又は配列番号２のアミノ酸配列“NGWGEDANL”である。この例においては、ギャップは、“−”により示される。
【００３２】
【化１】
0005406040.tif 000002
【００３３】
従って、配列２に対する配列１の同一性の％は、6/12＝0.5であり、50％に対応する。
特定の態様においては、配列番号２のアミノ酸１−269に対するポリペプチドのアミノ酸配列の同一性の％は、i)２種のアミノ酸を、BLOSUM62置換マトリックス、10のギャップ開放ペナルティー及び0.5のギャップ延長ペナルティーを伴って、Needleプログラムを用いて、一列整列し；ii)前記一列整列における正確な適合の数を計数し；iii)２種のアミノ酸配列の最短の長さにより前記正確な適合の数を割り算し；そしてiv) iii)の割り算の結果を％に転換することにより決定される。
【００３４】
好ましい態様においては、本発明のリパーゼは、配列番号２のアミノ酸１〜269を有するリパーゼに対して少なくとも51％同一である。追加は好ましい態様においては、それは、配列番号２のアミノ酸１〜269を有するリパーゼに対して、少なくとも52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%、又は少なくとも60%同一性である。さらなる好ましい態様においては、同一性の％は、少なくとも61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%、又は少なくとも70%である。さらなる好ましい態様においては、同一性の％は、少なくとも71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%,又は少なくとも80%である。さらなる好ましい態様においては、同一性の％は、少なくとも81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%,又は少なくとも90%である。さらにより好ましい態様においては、同一性の％は、少なくとも91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,又は少なくとも99%である。
【００３５】
もう１つの好ましい態様においては、親リパーゼは、配列番号２のアミノ酸１〜269を有するリパーゼに対して少なくとも51％同一性である。さらなる好ましい態様においては、それは、配列番号２のアミノ酸１〜269を有するリパーゼに対して少なくとも52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,又は少なくとも99%同一である。
【００３６】
改良される性質：
本発明は、医薬使用のための改良されたリパーゼを提供する。好ましくは、本発明に従っての使用のための酵素は、インビボ及び/又はインビトロでの改良された効力；改良された活性；改良された安定性を有し；プロテアーゼによる分解に対して安定し；塩の存在下で安定し；そして/又は低められたアレルギー性を有する。
【００３７】
本発明のリパーゼは、WO2006/136159号の例５に記載されるように、均質性に精製される。精製されたリパーゼ調製物は、SDS−PAGEにより分析され得、そしてリパーゼは、30〜40kDaでの主要タンパク質バンドとして同定され得る。クーマシー染色されたSDS−PAGEゲルの濃度計走査により、このバンドは好ましくは、90〜97％のタンパク質スペクトルを構成する。前記濃度計は例えば、BIO-RADからのGS−800検量された濃度計である。
【００３８】
本発明のリパーゼは、対照リパーゼに比較して、改良された消化性能、好ましくは改良されたインビトロ消化性能を有する。
消化性態様は好ましくは、（I）消化モデルを用いて、（II）ペプシンの存在下でpH3での安定性を決定することにより、及び/又は（III ）胆汁塩の存在下でpH5での活性を決定することにより測定される。
【００３９】
さらに下記に論じられる方法（I）, (III )の個々に関して、配列２のリパーゼ変異体N33Q+T231R+N233Rは、対照リパーゼの好ましい例である（WO2006/136159号に開示される）。対照リパーゼの他の例は、配列番号１のリパーゼ（配列番号２のN33Q＋T231R）、及び配列番号２のリパーゼである。対照リパーゼのさらなる例は、配列番号１のアミノ酸＋１〜＋269のリパーゼ及びその変異体N33Qの平均である。
【００４０】
消化モデル（I）は、次の段階：
ａ）対照リパーゼを選択し；
ｂ）それぞれ、100部/体積の食餌と、20部/体積のペプシン及び30部/体積のリパーゼ又は対照リパーゼとを混合し；
ｃ）i)０又はii)10部/体積の緩衝液（0.8MのMES、0.8Mの酢酸ナトリウム、0.8Mのイミダゾール、pH7.0）を添加し、ここで段階i)はpH3の胃段階として言及され得、そして段階ii)はpH5の胃段階として言及され得；
ｄ）振盪下で37℃で１時間インキュベートし；
ｅ）20部/体積の胆汁塩、及びi)25又はii)15部/体積の緩衝液（0.8MのMES、0.8Mの酢酸ナトリウム、0.8Mのイミダゾール、pH7.0）を添加し、ここで段階i)はpH3の胃段階として言及され得、そして段階ii)はpH5の胃段階として言及され得；
ｆ）振盪下で37℃で２時間インキュベートし；
ｇ）1Mのリン酸中、50部/体積の10％Triton-X100を添加し；
ｈ）遊離脂肪酸の体積を決定し；
i)下記等式：
FFA＝FFAmax*[E]/（[E]＋K）
[式中、FFAは開放される遊離脂肪酸の量であり、FFAmaxは、リパーゼ食餌から遊離することができる遊離脂肪酸の最大量であり、「E」はリパーゼ濃度であり、そしてKはFFAmaxの半分を遊離するリパーゼ濃度である]に、用量応答曲線を適合し；
ｊ）次の通りに改良因子（IF）：
IF＝K（対照）/K(リパーゼ)
[ここでK（対照）は、FFAmaxの半分を遊離する対照リパーゼの濃度であり、そしてK（リパーゼ）は、FFAmaxの半分を遊離するリパーゼ濃度である]を計算することをを含んで成る、消化性能の新規決定方法を表す。
【００４１】
消化性能はまた、次の段階：
i)対照リパーゼを選択し；
ii)それぞれ、５部/体積のリパーゼ又は対照リパーゼと、５部/体積の
ａ）0.001％のTriton−X100及び10mMのNaClを含む希釈剤、又は
ｂ）150μg/mlのペプシン、4mMのCaCl2、0.01％のTriton-X100及び50mMのシトレート、pH3.0を含むペプシン処理溶液（ここでa）は未処理のサンプルとして言及され、そしてｂ）はペプシン処理されたサンプルとして言及される）とを混合し；
iii)段階ii)のサンプルを、20℃で３時間インキュベートし；
iv)段階iii)の個々のサンプルに、1mMのPNP−パルミテート、1.2％のTriton-X100、4mMのCaCl2、100mMのTRIS, pH8.0を含む、55部/体積の基質、及び
ａ）5部/体積のペプシン処理溶液、又は
ｂ）5部/体積の希釈剤（ここでａ）は未処理のサンプルを言及し、そしてｂ）はペプシン処理されたサンプルを言及する）を添加し；
v）iv)サンプルのOD405を一定間隔で読み取ることにより基質の分解を追跡し；
vi)直線範囲に落ちるv）からのデータを集め、そしてそれぞれ、ペプシン処理されたサンプル及び未処理のサンプルについて、mOD（ミリOD）/時でのリパーゼ活性を計算し；
vii)ペプシン処理されたサンプルのリパーゼ活性を、未処理のサンプルのリパーゼ活性により、それらが段階vi)に起因する場合、割算し、そしてその結果に100を掛算することにより％残留リパーゼ活性（％RA）を計算し；そして所望には、
viii)リパーゼの％RAと、対照リパーゼの％RAとを比較することにより、ペプシンの存在下でpH3での安定性を決定することを含んで成る、上記（II）として言及されるpH3の新規ペプシン安定性試験によって決定される。
【００４２】
消化性能はまた、下記段階：
i)対照サンプルを選択し；
ii)それぞれ、10部/体積のリパーゼ又は対照リパーゼと、23部/体積のａ）水、又はｂ）20mMの胆汁塩とを混合し、ここでａ）は未処理のサンプルとして言及され、そしてｂ）は胆汁塩サンプルとして言及され；
iii)ii)の個々のサンプルに、25mMのスクシネート中、1mMのPNPオレエート、2mMのCaCl2、1.2％のTriton−X100、pH5.0を含む、200部/体積の基質を転化し；
iv)段階iii)の直後、個々のサンプルから、60部/体積の前記得られる混合物を除き、そしてその15部/体積を、４つの別々の区画中に４度、移し；
v）１，２，３及び４時間後、60部/体積の100mMのTRIS（pH8.0）を、iv)の４つの区画のそれぞれの区画に添加し、すぐにOD405を読み取り、そして１，２，３及び４時間の読み取りの線状範囲に基づいて、mOD/時での活性を計算し；
vi)それぞれ、リパーゼ及び対照リパーゼの胆汁塩安定性比率に達するよう、リパーゼ及び対照リパーゼについて、胆汁塩サンプルの段階v)で得られる活性を、段階v）でまた得られるような未処理のサンプルの活性により割算し；そして
vii)リパーゼの胆汁塩安定性比率を、対照リパーゼの胆汁塩を安定性比率により割算する（得られる比率はリパーゼの改良因子として定義され得る）ことにより、胆汁塩の存在下でpH5での活性を定義する段階を含んで成る、対照リパーゼに比較して、リパーゼのインビトロでの消化性能を決定することを含んで成る、上記（III ）として言及されるpH5での新規胆汁塩活性試験によっても決定され得る。
【００４３】
方法（I）、（II）及び（III ）は、高い割合がまた、インビボで改良され得る、改良されたリパーゼを同定することが、驚くべきことには見出された。
【００４４】
方法（I）：
消化モデル（上記に（I）として言及される）は、膵臓外分泌機能不全を有する単胃動物（例えば、ブタ及びヒト）における消化を模倣する。
Triton X-100 (C14H22O(C2H4O)n) (CAS No. 9002-93-1)は、親水性酸化ポリエチレン基（平均して、それは9.5の酸化エチレン単位、すなわちｎ＝９〜10を有する）及び親油性又は疎水性炭化水素基を有する非イオン性界面活性剤である。炭化水素基は、４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニル基である。
【００４５】
用語“部/体積”とは好ましくは、ul, uL, μl又はμLとして短縮され得るマイクロリッターを示す。
インビトロ消化モデルの特定の態様においては、（ａ）ペプシン濃度は700mg/mlであり；（ｂ）リパーゼ及び/又は対照リパーゼは、４種の異なった濃度で、それぞれ好ましくは二重反復して分析され；そして/又は（ｃ）反応はマイクロタイタープレートのウェルにおいて生じる。
【００４６】
インビトロ消化モデルの追加の特定態様においては、（ｄ）胆汁塩の濃度は50g/lであり；（ｅ）段階（ｅ）における胆汁塩及び緩衝液の添加の後、得られるpHは、5.7〜6.0の範囲であり；そして/又は（ｆ）段階ｇ）における添加される場合、Triton-X100は、反応を停止するよう作用する。
【００４７】
インビトロ消化モデルのさらに追加の特定態様においては、（ｇ）遊離脂肪酸の量が、適切な希釈、例えば、好ましくは１％Triton-X100における125〜250倍の希釈の後、決定され、そして好ましくは例３）に記載される、Wako ChemicalsからのNEFA Cキットを用いて決定され；（ｈ）段階ｉ）における用量応答曲線は、応答、すなわちリパーゼ用量の関数としての遊離脂肪酸の量を示す曲線を言及し；そして/又は（ｉ）FFAmaxが、リパーゼについて、すなわち対照リパーゼ及び問題のリパーゼについて同一であることを仮定する。
【００４８】
インビトロ消化モデルの追加の特定においては、（ｊ）活性部位滴定（AST, 例６）が、リパーゼ濃度を決定するために使用され；そして/又は（ｋ）A280が、好ましくは吸光係数1.24A280/mgを用いて、リパーゼ濃度を決定するために使用される。
【００４９】
改良されたリパーゼは、1.00以上の改良因子を有するリパーゼとして定義される。特定の態様においては、（ｉ）改良因子は平均であり；（ii）改良因子は、平均改良因子−標準偏差であり；そして/又は（iii）改良因子が1.0以上又は１以上である。平均及び標準偏差は、実験変動を考慮して、そして当業界において知られているようにして、例えば標準偏差＝（Sum（IF−Avg（IF））/（ｎ−１））∧0.5（ここで、IFは改良因子であり、Avg（IF）は計算された改良因子の平均であり、そしてｎは計算された改良因子の数である）を用いて計算され得る。逆にされたｖは、指数を意味する。
【００５０】
インビトロ消化モデルの食餌は好ましくは、250〜400gの脂肪/kg、さらにより好ましくは300〜350gの脂肪/kg、最も好ましくは313〜340gの脂肪/kgを含む。炭水化物及びタンパク質の含有率は関連しないが、しかし好ましくは、それは、通常の及び典型的な食餌必要条件及び推薦、例えば250〜500g/kgの炭水化物含有率及び10〜200g／kgのタンパク質含有率を表す。食餌は、例えば食餌I（340gの脂肪/kg、450gの炭水化物/kg、20gのタンパク質/kg）、又は食餌II（313gの脂肪/kg、350gの炭水化物/kg及び1469のタンパク質/kg）から選択され得る。
【００５１】
食餌Iは、24.72部/重量の牛乳（1.5％の脂肪）、29.9b/重量のオリーブ油、87部/重量のCalshake（Fresenlus Kabiから市販されており、そして2077kJ/gのエネルギー含有率、4.3の牛乳タンパク質/100gのタンパク質含有率及び24.4gの脂肪/100gの脂肪含有率を有する）、及び9.9部/重量のMethocel（Food Grade, E5 Premium LV FG (E464); Dow）を含む。成分は、例えばUltraTurrex (YellowLine Dl 25塩基性)を用いて、２分間、混合される。任意には、食餌は、0.5μg/mlのSAVINASE 16.0 LEX プロテアーゼ (Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Denmarkから市販される)により、pH8.0で50℃で４時間、処理され、粘度が低められる。続いて、プロテアーゼは、pHを３に低め、そして70℃で30分間、又は50℃で60分間インキュベートすることにより不活性化される。用語、“重量部”とは好ましくは、グラム(ｇ)を言及する。
【００５２】
食餌IIは、73g/kg（湿量）の家禽類の肉（Altromin）、73g/kgのエンドウ飼料、73g/kgのカゼイン（酸性条件下で沈殿された、Altrominからの）、290g/kgの小麦粉、290g/kgのジャガイモ澱粉、125g/kgのラード、76g/kgのビタミン、ミネラル及び微量元素及び375g/kgの牛クリーム（33％ン脂肪）を含む。
【００５３】
方法（II）：
次のことが、ペプシンの存在下でpH3での安定性を測定することにより消化性能を決定する、上記（II）として言及される方法の特定の態様である：
（ａ）段階ii)に使用されるリパーゼは、好ましくは次の通りにして調製される培養上清液であり：リパーゼを発現できる、単一の酵母コロニー、例えばサッカロミセス・セレビシアエJG169（例えば、アメリカ特許第7,217,433号を参照のこと）が、１部/体積（例えば、1ml）の適切な培地（例えば、例８の種培養培地）中に採取され、そして30℃及び250rpmで一晩、増殖される。リパーゼの発現は、0.020部/体積（例えば、20μl）の前記得られる種培養物を、１部/体積の適切な培地（例えば、例８の最適化された培地）中に接種し、そして、30℃及び250rpmで４〜６日間、培養することにより達成される。培養は、例えばマイクロタイタープレート、例えば24ウェルプレートにおいて、又は振盪フラスコにおいて実施され得る。リパーゼサンプルは、希釈剤により、例えば25倍に適切に希釈され得：
【００５４】
（ｂ）段階iii)の３時間のインキュベーションは室温であり；
（ｃ）段階v)のOD405の読取は、６度、実施され；そして基質添加の15分後、早く、及び基質転換の18時間後、実施され；
（ｄ）段階vi)においては、リパーゼ活性が、それぞれ、ペプシン処理されたサンプル及び未処理のサンプルについて、mOD/時で計算され、そして線状範囲にあるv)からのデータが集められ；
ｅ）段階vii)においては、ペプシン処理されたリパーゼの段階vi)からの速度を、未処理の状態のその速度により割算し、そしてその結果に100を掛けることにより、％残留リパーゼ活性（％RA）を計算し；そして/又は
（ｆ）段階v）においては、OD540が読取られ、そしてOD405読み取りからOD540読み取りを引き算することにより、バックグラウンドODを補正するために使用される。
【００５５】
方法（III ）：
次のことが、胆汁塩の存在下でpH5での活性を測定することにより消化性能を決定する方法（上記（III ）として言及される）の特定の態様である：
（ａ）段階ii）に使用されるリパーゼが精製され；（ｂ）リパーゼが、希釈剤（例えば、0.01％のTriton−X100, 10mMのNaCl）により、適切に希釈され、典型的には、25〜200倍、例えば約8μg/lに希釈され；（ｃ）精製されたリパーゼサンプルの濃度が、吸光係数1.24A280/mgを用いて、280nmでの吸光度から決定され；（ｄ）約0.100〜0.475のODが線状範囲にあり；そして/又は（ｅ）胆汁塩は、蒸留水において20mMに製造されたSigma B−8756である。
【００５６】
段階vi)におけるさらなる特定の態様においては、pH5.0での胆汁塩の存在下での活性の割合は、“胆汁塩なし”の活性に関して、時間及び希釈度について補正されたすべての線状データの平均により割算された、“胆汁塩”の活性に関して、時間及び希釈度について補正された段階v)において得られたすべての線状データの平均を計算することにより％として表される。
【００５７】
（A）第１の特定の態様においては、本発明のリパーゼは、配列番号２のリパーゼに比較して、次の置換、好ましくは置換組を有するリパーゼ間から選択される：
N33Q+E87K+T231R+N233R;
N33Q+N94K+T231R+N233R;
N33Q+D96Y+T231R+N233R;
N33Q+K98I+T231R+N233R;
A30V+N33Q+K98I+T231R+N233R;
N33Q+E87K+D96E+T231R+N233R;
N26I+N33Q+T231R+N233R;
A30T+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+G91V+T231R+N233R;
N33Q+G91A+T231R+N233R;
N33Q+G91V+L97M+T231R+N233R;
N33Q+K98I+T231R+N233R;
N33Q+L69I+G91E+T231R+N233R;
P29T+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+G91V+T231R+N233R;
N33Q+K98I+T231R+N233R;
N33Q+G91E+T231R+N233R; 及び
N33Q+N94K+T231R+N233R。
【００５８】
第２の特定の態様においては、本発明のリパーゼは、配列番号２のリパーゼに比較して、次の置換、好ましくは置換組を有するリパーゼ間から選択される：
N33Q+K98I+T231R+N233R;
A30V+N33Q+K98I+T231R+N233R;
N33Q+G91V+T231R+N233R;
N33Q+G91A+T231R+N233R;
N33Q+G91V+L97M+T231R+N233R;
N33Q+K98I+T231R+N233R;
N33Q+L69I+G91E+T231R+N233R;
P29T+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+G91V+T231R+N233R;
N33Q+K98I+T231R+N233R; 
N33Q+G91E+T231R+N233R;及び
N33Q+N94K+T231R+N233R。
【００５９】
第３の特定の態様においては、本発明のリパーゼは、配列番号２のリパーゼに比較して、次の置換、好ましくは置換組を有するリパーゼ間から選択される：
N33Q+K98I+T231R+N233R;
N33Q+G91V+T231R+N233R;
N33Q+G91A+T231R+N233R;
N33Q+G91V+L97M+T231R+N233R;
N33Q+K98I+T231R+N233R;
N33Q+L69I+G91E+T231R+N233R;
N33Q+G91E+T231R+N233R;及び
N33Q+N94K+T231R+N233R。
【００６０】
第４の特定の態様においては、本発明のリパーゼは、配列番号２のリパーゼに比較して、次の置換、好ましくは置換組を有するリパーゼ間から選択される：
N33Q+G91V+T231R+N233R;
N33Q+G91A+T231R+N233R;
N33Q+K98I+T231R+N233R; 及び
N33Q+G91E+T231R+N233R。
【００６１】
上記に列挙される置換（前記４種の特定態様の個々）を有する、配列番号２のアミノ酸１〜269のリパーゼの変異体はすべて、改良されたインビトロ消化性能、すなわち少なくとも1.50 (又は1.5), 2.00 (又は2.0), 2.50 (又は2.5), 3.00 (又は3.0), 3.50 (又は3.5), 又は少なくとも4.00 (又は4.0), 好ましくは少なくとも5.00 (又は 5.0), 6.00 (又は 6.0), 7.00 (又は7.0), 8.00 (又は8.0), 9.00 (又は9.0), 10.00 (又は10.0), 又は少なくとも11.00 (又は11.0)の改良因子（IF）を有する。pH3の胃段階が好ましくは使用される。好ましい食餌は、食餌IIである。活性部位滴定（AST, 例６）及び/又はA280が、好ましくは吸光係数1.24A280/mgを用いて、リパーゼ濃度を決定するために使用され得る。
【００６２】
（B）もう１つの第１の特定態様においては、本発明のリパーゼは、配列番号２のリパーゼに比較して、次の置換、好ましくは置換類を有するリパーゼ間から選択される：
D27V+N33Q+V60S+D96W+T231R+N233R+Q249R;
D27V+N33Q+V60S+T231R+N233R+Q249R;
Q9H+N33Q+D102E+T231R+N233R;
N33Q+D111E+T231R+N233R;
N33Q+D122E+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91A+L93*+N94*+F95*+D96*+D111A+T231R+N233R+P256T;
N11R+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+N39H+T231R+N233R;
N33Q+P229R+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+G163K+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+N233R+P256T;
【００６３】
D27R+N33Q+G91A+D96E+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T;
D27R+N33Q+G91A+N94S+D111A+T231R+N233R+P256T;
N33Q+N200S+T231R+N233R;
N33Q+N39S+T231R+N233R;
N33Q+E210R+T231R+N233R;
N33Q+N39H+T231R+N233R+D254R;
N33Q+T231R+N233R+D254R;
N33Q+N94R+T231R+N233R;
N33Q+D96R+T231R+N233R;
D27N+N33Q+T231R+N233R;
D27N+N33Q+E56R+T231R+N233R;
N33Q+L227F+T231R+N233R;
N33Q+N73Y+G225P+T231R+N233R;
N33Q+G225P+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254S;
【００６４】
N33Q+D96G+T231R+N233R;
N33Q+D96N+T231R+N233R+D254S;
N33Q+T231R+N233R+D254G;
N33Q+D130H+T231R+N233R;
N33Q+E87A+T231R+N233R; 
N33Q+T231R+N233R+E239D;
N33Q+D111A+T231R+N233R+D254G;
N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G;
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
【００６５】
Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R;
Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+E210D+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G177A+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+G246A;
D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27Q+N33Q+G91T+G163K+E219D+T231R+N233R;及び
N33Q+G91T+E219D+T231R+N233R。
【００６６】
もう１つの第２の特定態様においては、本発明のリパーゼは、配列番号２のリパーゼに比較して、次の置換、好ましくは置換類を有するリパーゼ間から選択される：
D27V+N33Q+V60S+D96W+T231R+N233R+Q249R;
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91A+D96E+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T;
N33Q+N39S+T231R+N233R;
N33Q+N94R+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254S;
N33Q+D96N+T231R+N233R+D254S;
N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G;
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R; 
N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R+P256T;及び 
D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S。
【００６７】
もう１つの第３の特定態様においては、本発明のリパーゼは、配列番号２のリパーゼに比較して、次の置換、好ましくは置換類を有するリパーゼ間から選択される：
N33Q+D96N+T231R+N233R+D254S; 
N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S; 
N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S; 
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S; 
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254；及び
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R。
【００６８】
もう１つの第４の特定態様においては、本発明のリパーゼは、配列番号２のリパーゼに比較して、次の置換、好ましくは置換類を有するリパーゼ間から選択される：
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R。
【００６９】
上記に列挙される置換（前記４種の特定態様の個々）を有する、配列番号２のアミノ酸１〜269のリパーゼの変異体はすべて、改良されたインビトロ消化性能、すなわち少なくとも1.50 (又は1.5), 2.00 (又は2.0), 2.50 (又は2.5), 3.00 (又は3.0), 3.50 (又は3.5), 又は少なくとも4.00 (又は4.0), 好ましくは少なくとも5.00 (又は 5.0), 6.00 (又は 6.0), 7.00 (又は7.0), 8.00 (又は8.0), 9.00 (又は9.0), 10.00 (又は10.0), 又は少なくとも11.00 (又は11.0)の改良因子（IF）、好ましくは平均IF−標準偏差を有する。pH3の胃段階が好ましくは使用される。好ましい食餌は、食餌Iである。活性部位滴定（AST, 例６）及び/又はA280が、好ましくは吸光係数1.24A280/mgを用いて、リパーゼ濃度を決定するために使用され得る。
【００７０】
(C) さらなる第１の特定態様においては、本発明のリパーゼは、配列番号２のリパーゼに比較して、次の置換、好ましくは置換類を有するリパーゼ間から選択される：
N33Q+E219D+T231R+N233R;
N33Q+W117L+T231R+N233R;
D27Q+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+G91T+T231R+N233R;
D27S+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+N233R+P256T; 
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
Q4R+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+D96W+T231R+N233R; 及び
N33Q+G91N+T231R+N233R。
【００７１】
さらなる第２の特定態様においては、本発明のリパーゼは、配列番号２のリパーゼに比較して、次の置換、好ましくは置換類を有するリパーゼ間から選択される：
N33Q+E219D+T231R+N233R; 
D27Q+N33Q+T231R+N233R; 
N33Q+G91T+T231R+N233R;及び
D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T。
【００７２】
さらなる第３の特定態様においては、本発明のリパーゼは、配列番号２のリパーゼに比較して、次の置換、好ましくは置換類を有するリパーゼ間から選択される：
N33Q+E219D+T231R+N233R;及び
N33Q+G91T+T231R+N233R。
【００７３】
上記に列挙される置換（前記４種の特定態様の個々）を有する、配列番号２のアミノ酸１〜269のリパーゼの変異体はすべて、改良されたインビトロ消化性能、すなわち少なくとも1.50 (又は1.5), 2.00 (又は2.0), 2.50 (又は2.5), 3.00 (又は3.0), 3.50 (又は3.5), 又は少なくとも4.00 (又は4.0), 好ましくは少なくとも5.00 (又は 5.0), 6.00 (又は 6.0), 7.00 (又は7.0), 8.00 (又は8.0), 9.00 (又は9.0), 10.00 (又は10.0), 又は少なくとも11.00 (又は11.0)の改良因子（IF）、好ましくは平均IF−標準偏差を有する。pH3の胃段階が好ましくは使用される。好ましい食餌は、食餌IIである。活性部位滴定（AST, 例６）及び/又はA280が、好ましくは吸光係数1.24A280/mgを用いて、リパーゼ濃度を決定するために使用され得る。
【００７４】
(D)第１の特定態様においては、本発明のリパーゼは、配列番号２のリパーゼに比較して、次の置換、好ましくは置換類を有するリパーゼ間から選択される：
N33Q+D167E+T231R+N233R;
N33Q+E87A+T231R+N233R; 
N33Q+E210V+T231R+N233R;
N33Q+E56K+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254G ;
N33Q+D96S+T231R+N233R;
N33Q+D122N+T231R+N233R;
N26A+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+N162T+T231R+N233R;
N33Q+A150V+N162G+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+G240L;
N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R;
Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+E210D+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
【００７５】
N33Q+G91T+E219D+T231R+N233R;
N33Q+G163R+T231R+N233R;
N33Q+G163N+T231R+N233R;
N33Q+G163C+T231R+N233R;
N33Q+G163Q+T231R+N233R;
N33Q+G163E+T231R+N233R;
N33Q+G163H+T231R+N233R;
N33Q+G163I+T231R+N233R;
N33Q+G91K+T231R+N233R;
N33Q+G91M+T231R+N233R;
N33Q+G91F+T231R+N233R;
N33Q+G91S+T231R+N233R;
N33Q+G91W+T231R+N233R;
N33Q+G91Y+T231R+N233R;
N33Q+G163Y+T231R+N233R;
【００７６】
N33Q+G163V+T231R+N233R;
N33Q+G91C+T231R+N233R;
N33Q+G91Y+Q126L+T231R+N233R;
N33Q+G91M+G161E+T231R+N233R;
N33Q+V128A+T231R+N233R;
N33Q+V128A+T231R+N233R; 
N33Q+G163E+T231R+N233R;
N33Q+G163V+L185M+T231R+N233R;
N33Q+G38A+T231R+N233R;
N33Q+G163A+T231R+N233R;
N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R;
N33Q+G163M+T231R+N233R;
N33Q+G91V+T231R+N233R;
N33Q+ D111A+T231R+N233R+Q249R;
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T;
【００７７】
N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+T231R+N233R;
N33Q+W117L+T231R+N233R+D254S;
N33Q+T231R+N233R+P256T;
N33Q+T231R+N233R+D242E;
N33Q+E87R+T231R+N233R;
N33Q+E56R+T231R+N233R;
N33Q+N162G+T231R+N233R;
N33Q+G91L+T231R+N233R;
N33Q+E87H+T231R+N233R;
N33Q+D96N+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S;
N33Q+L227F+T231 R+N233R+D254S;
N33Q+G163A+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T;
【００７８】
N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254A;
N33Q+T231R+N233R+D254N;
N33Q+T231R+N233R+D254L;
N33Q+T231R+N233R+D254K;
N33Q+T231R+N233R+D254M;
D27V+N33Q+V60S+G91T+D96W+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+D96N+L227G+T231R+N233R+Q249R;
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R;
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R; 
D27Q+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+W117L+L227G+T231R+N233R+Q249R;
D5E+N33Q+W117L+L227G+T231R+N233R+Q249R;
D27Q+N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R;
【００７９】
N33Q+D96E+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R;
D27R+N33Q+E56K+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+E56S+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+A155V+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S;
N33Q+D111A+W117L+T231R+N233R+D254S;
N33Q+T231R+N233R+P256N;
N33Q+T231R+N233R+P256G;
N33Q+T23 R+N233R+P256H;
N33Q+T231R+N233R+P256M;
【００８０】
N33Q+T231R+N233R+P256W;
N33Q+T231R+N233R+P256Y;
N33Q+T231R+N233R+P256F;
N33Q+T231R+N233R+P256V;
N33Q+G91M+G163W+T231R+N233R;
N33Q+G91M+G163T+T231R+N233R;
N33Q+G91M+G163D+T231R+N233R;
N33Q+G91K+G163W+T231R+N233R;
N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R;
N33Q+V176N+T231R+N233R;
N33Q+V176D+T231R+N233R;
N33Q+W117F+T231R+N233R;
N33Q+V176I+T231R+N233R; 
N33Q+D111N+T231R+N233R;
N33Q+D111N+G225P+T231R+N233R;
【００８１】
N33Q+D111N+S216P+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R;
N33Q+G91M+G163P+T231R+N233R;
N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R;
N33Q+W117D+T231R+N233R;
N33Q+W117H+T231R+N233R;
N33Q+W117C+T231R+N233R;
N33Q+W117C+T231R+N233R;
N33Q+W117K+T231R+N233R;
N33Q+W117V+T231R+N233R;
N11S+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+W117E+V176K+T231R+N233R;
N33Q+W117G+T231R+N233R;
N33Q+W117P+T231R+N233R;
N33Q+W117S+T231R+N233R;
【００８２】
N33Q+W117T+T231R+N233R;
N33Q+W117I+T231R+N233R;
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N33Q+V176M+T231R+N233R;
N33Q+V176H+T231R+N233R;
N33Q+V176A+T231R+N233R;
D27V+N33Q+L227F+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+W117Y+T231R+N233R;
N33Q+W117Y+V176D+T231R+N233R;
D27R+N33Q+P136H+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N11R+N33Q+T231R+N233R+T244S;
N33Q+G91T+D96N+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G161A+T231R+N233R;
N33Q+G38I+G177A+T231R+N233R;
【００８３】
N33Q+N101Q+T231R+N233R;
N33Q+N94Q+T231R+N233R;
N11Q+N33Q+T231R+N233R; 
N8Q+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+N251Q;
N33Q+N200Q+T231R+N233R;
N33Q+G177A+T231R+N233R;
N33Q+N73Q+T231R+N233R;
N33Q+I86L+T231R+N233R;
N33Q+K98I+G163K+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+G91T+D96E+D111 A+G163A+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+K98I+G163K+N200Q+T231R+N233R+N251S;
N33Q+G38S+G163K+T231R+N233R;
【００８４】
N33Q+G38Y+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G38N+N73Q+T231R+N233R;
N33Q+G38D+R84E+T231R+N233R;
N33Q+G38Q+T231R+N233R;
N33Q+G38I+T231R+N233R;
N33Q+G38K+T231R+N233R;
N33Q+G38F+T231R+N233R;
N33Q+G38H+N200Q+T231R+N233R+N251S;
N33Q+G38L+T231R+N233R;
N33Q+G38P+T231R+N233R;
N33Q+G38T+T231R+N233R;
N11R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
【００８５】
N11R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163A+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+V176Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N33Q+W117I+V176Q+T231R+N233R+P256A;
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R+P256A;
N33Q+W117I+V176Q+T231R+N233R;
N33Q+G177A+T231R+N233R+G246A;
E1NN33QT231RN233R; 
N33QG38HT231RN233R;
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S;
N33Q+K98I+T231R+N233R;
D27R+N33Q+W117I+V176Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G163W+T231R+N233R;
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R;
【００８６】
D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T;
N33Q+T231R+N233R+D254Q;
N11R+N33Q+G91T+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176W+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G163D+T231R+N233R;
N33Q+G163D+T231R+N233R;
N33Q+G163P+T231R+N233R;
E1D+N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+V176W+T231R+N233R;
Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+L206F+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+T37K+N71I+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+W117S+T231R+N233R;
N33Q+G61R+V63R+G156R+V176W+T231R+N233R+P256I;
N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R;
【００８７】
N33Q+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+G91T+N94S+D111A+G163T+V176W+T231R+N233R;
N33Q+G91T+N94S+D111A+S115L+G163T+V176I+T231R+N233R;
N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231 R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D242E+D254S+P256T;
D27R+N33Q+G38A+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+E210D+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L;
N33Q+G38A+G91T+G163A+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R+D254I;
N11R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R;
N11R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+E56Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S;
N11R+D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
【００８８】
N11R+N33Q+G38A+G91T+G112A+G163A+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+E210D+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254I;
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176T+T231R+N233R+D254S;
N11 R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91M+G163T+T231R+N233R+D254S;
N11 R+N33Q+G38A+G91T+G163K+V176D+T231R+N233R+D254S;
N33Q+E56Q+G156R+V176W+T231R+N233R;
E1D+N33Q+G38A+G91T+N94R+D111A+W117L+V176W+T231R+N233R;
N33Q+G163K+G177A+T231R+N233R+G246A;
N11R+N33Q+E56Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+I90L+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+E219D+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+N33Q+I90L+G91T+N94S+D96E+G163K+T231R+N233R+D254S;
【００８９】
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176I+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163A+V176T+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163L+V176I+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163L+V176T+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S; 
N11R+N33Q+G91T+G163P+V176I+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S+P256N;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S+P256T;
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+G163A+E210V+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L;
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L;
N33Q+E210Y+T231R+N233R+D254Y+I255F;
N33Q+L93F+D102Y+T231R+N233R;
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
【００９０】
N11S+N33Q+T231R+N233R;
N11R+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N33Q+W117Y+V176T+T231R+N233R;
N8L+N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R;
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254A+P256F;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+P256F;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S+P256F;
N11R+N33Q+G38A+G91T+G156R+G163K+V176T+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91K+D96S+G163T+T231R+N233R+Q249R;
N11R+N33Q+G91T+G163N+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163T+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R+D254S;
【００９１】
N11R+N33Q+G91K+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+G23E+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+V141E+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+L52R+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+V141L+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11 R+N33Q+T37K+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+A68V+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11 R+N33Q+G91T+G163A+V176I+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+T37M+G91T+G163P+V176T+T231R+N233R+D254S; 
N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S+P256I;
N33Q+G38S+G156R+G163K+V176W+T231R+N233R;
N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163K+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163Q+V176G+T231R+N233R+D254S;
【００９２】
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163T+V176G+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G38A+G91T+N94R+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S;
E1*+N11R+N33Q+G38A+G91N+N94R+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S;
E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R;
E1N+F10L+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R;
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S;
E1N+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R;
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+L227F+T231R+N233R;
E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R;
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+L227F+T231R+N233R+D254S;
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S+I255A+P256Q;
E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G156R+V176W+T231R+N233R+P256I;
N33Q+G91T+N94S+D111A+G156R+G163T+V176W+T231R+N233R;
【００９３】
N33Q+G91T+N94S+D111A+G156R+G163T+V176I+T231R+N233R;
N11R+N33Q+G38A+G91T+D102G+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+N33Q+G38A+G91T+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
E1N+N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+G246A+D254S;
N11R+D27R+N33Q+D57G+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+I86F+L93F+D102Y+E210Y+L227F+T231R+N233R+D254Y+I255F+L269F;
N33Q+I86F+L93F+D102Y+E210Y+L227F+T231R+N233R+D254Y+I255F;
N11C+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11L+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11H+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11D+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+D96W+G163K+T231R+N233R+D254S; 
D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11P+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
【００９４】
Q4R+D27N+N33Q+G38A+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+EΞ210V+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L;
N11 R+N33Q+E56Q+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S;及び
N11R+N33Q+G91T+G163K+L227G+P229R+T231R+N233R+D254S。
【００９５】
第２の特定態様においては、本発明のリパーゼは、配列番号２のリパーゼに比較して、次の置換、好ましくは置換類を有するリパーゼ間から選択される：
N33Q+E87A+T231R+N233R;
N33Q+E210V+T231R+N233R;
N33Q+E56K+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254G ;
N33Q+D96S+T231R+N233R;
N33Q+N162T+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+G240L;
N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G163N+T231R+N233R;
N33Q+G163Q+T231R+N233R;
N33Q+G163E+T231R+N233R;
N33Q+G91M+T231R+N233R;
N33Q+G91F+T231R+N233R;
N33Q+G163Y+T231R+N233R;
【００９６】
N33Q+G91Y+Q126L+T231R+N233R;
N33Q+V128A+T231R+N233R;
N33Q+G38A+T231 R+N233R;
N33Q+G163M+T231R+N233R;
N33Q+D111A+T231R+N233R+Q249R;
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T;
N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+T231R+N233R; 
N33Q+W117L+T231R+N233R+D254S;
N33Q+T231R+N233R+P256T;
N33Q+T231R+N233R+D242E;
N33Q+E87R+T231R+N233R;
N33Q+E56R+T231R+N233R;
N33Q+N162G+T231R+N233R;
N33Q+G91L+T231R+N233R;
【００９７】
N33Q+E87H+T231R+N233R;
N33Q+D96N+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S;
N33Q+L227F+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254L;
N33Q+T231R+N233R+D254K;
N33Q+T231R+N233R+D254M;
D27V+N33Q+V60S+G91T+D96W+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+D96N+L227G+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R;
D27Q+N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+D96E+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R;
D27R+N33Q+E56K+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
【００９８】
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231 R+N233R+D254S+P256T;
N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S;
N33Q+T231R+N233R+P256N;
N33Q+T231R+N233R+P256G;
N33Q+T231R+N233R+P256M ;
N33Q+T231R+N233R+P256W;
N33Q+W117F+T231R+N233R;
N33Q+D111N+G225P+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R;
N33Q+W117C+T231R+N233R; 
N33Q+W117C+T231R+N233R;
N33Q+W117K+T231R+N233R;
N11S+N33Q+T231R+N233R;
【００９９】
N33Q+W117G+T231R+N233R;
N33Q+W117P+T231R+N233R;
N33Q+W117S+T231R+N233R;
N33Q+W117T+T231R+N233R;
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N11R+N33Q+T231R+N233R+T244S;
N33Q+G91T+D96N+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G38I+G177A+T231R+N233R;
N33Q+N101Q+T231R+N233R;
N33Q+N94Q+T231R+N233R;
N11Q+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+G177A+T231R+N233R;
N33Q+N73Q+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
【０１００】
D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163A+T231R+N233R+D254S+P256T;
N33Q+G38I+T231R+N233R;
N33Q+G38F+T231R+N233R;
N33Q+G38H+N200Q+T231R+N233R+N251 S;
N33Q+G38T+T231R+N233R;
N11R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163A+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+V176Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R+P256A;
N33Q+W117I+V176Q+T231R+N233R;
N33Q+G177A+T231R+N233R+G246A;
N33Q G38HT231RN233R;
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S;
【０１０１】
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G163W+T231R+N233R; 
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T;
N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+V176W+T231R+N233R;
Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+L206F+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+W117S+T231R+N233R;
N33Q+G61R+V63R+G156R+V176W+T231R+N233R+P256I;
N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R;
N33Q+G91T+N94S+D111A+S115L+G163T+V176I+T231 R+N233R;
N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D242E+D254S+P256T;
D27R+N33Q+G38A+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R;
【０１０２】
N11R+D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+N33Q+G38A+G91T+G112A+G163A+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+E210D+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254I;
N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163K+V176D+T231R+N233R+D254S;
E1D+N33Q+G38A+G91T+N94R+D111A+W117L+V176W+T231R+N233R;
N33Q+G163K+G177A+T231R+N233R+G246A;
N11R+N33Q+E56Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+I90L+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+E219D+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176I+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163A+V176T+T231R+N233R+D254S; 
【０１０３】
N11R+N33Q+G91T+G163L+V176I+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163L+V176T+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163P+V176I+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S+P256N;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S+P256T;
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+G163A+E210V+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L;
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L;
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N11R+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N33Q+W117Y+V176T+T231R+N233R;
N8L+N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254A+P256F;
【０１０４】
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S+P256F;
N11R+N33Q+G91T+G163N+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163T+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91K+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+V141E+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+L52R+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+T37K+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+A68V+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163A+V176I+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+T37M+G91T+G163P+V176T+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S+P256I;
N33Q+G38S+G156R+G163K+V176W+T231R+N233R;
N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163K+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
【０１０５】
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163Q+V176G+T231R+N233R+D254S; 
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163T+V176G+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G38A+G91T+N94R+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S;
E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R;
E1N+F10L+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R;
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S;
E1N+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R;
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+L227F+T231 R+N233R;
E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R;
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+L227F+T231R+N233R+D254S;
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S+I255A+P256Q;
E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G156R+V176W+T231R+N233R+P256I;
N11 R+N33Q+G38A+G91T+D102G+S115L+G 163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+N33Q+G38A+G91T+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
【０１０６】
E1N+N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+G246A+D254S;
N11R+D27R+N33Q+D57G+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R;
N11C+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11L+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11H+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11D+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+D96W+G163K+T231 R+N233R+D254S;
D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11P+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
Q4R+D27N+N33Q+G38A+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L;
N11R+N33Q+E56Q+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S;及び
N11R+N33Q+G91T+G163K+L227G+P229R+T231R+N233R+D254S。
【０１０７】
第３の特定態様においては、本発明のリパーゼは、配列番号２のリパーゼに比較して、次の置換、好ましくは置換類を有するリパーゼ間から選択される：
N33Q+E87A+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254G;
N33Q+T231R+N233R+G240L;
N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91Y+Q126L+T231R+N233R;
N33Q+G163M+T231R+N233R;
N33Q+D111A+T231R+N233R+Q249R;
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T;
N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S;
N33Q+W117L+T231R+N233R+D254S;
N33Q+T231R+N233R+D242E;
N33Q+E87R+T231R+N233R;
N33Q+E56R+T231R+N233R;
N33Q+N162G+T231R+N233R;
【０１０８】
N33Q+T231R+N233R+D254L;
N33Q+T231R+N233R+D254K;
D27V+N33Q+V60S+G91T+D96W+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+D96N+L227G+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R;
D27Q+N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+D96E+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S;
N33Q+T231R+N233R+P256N;
N33Q+T231R+N233R+P256M;
D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R;
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N33Q+G91T+D96N+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G38I+G177A+T231R+N233R;
【０１０９】
N33Q+G177A+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163A+T231R+N233R+D254S+P256T;N33Q+G38F+T231R+N233R;
N33Q+G38H+N200Q+T231R+N233R+N251S;
N11R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+N233R+D254S; 
D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+N33Q+G91T+W1171+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27R+N33Q+V176Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R+P256A;
N33Q+W117I+V176Q+T231R+N233R;
N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+V176W+T231R+N233R;
Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+L206F+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R;
N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
【０１１０】
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D242E+D254S+P256T;
D27R+N33Q+G38A+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R;
N11R+D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+N33Q+G38A+G91T+G112A+G163A+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254I;
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163K+V176D+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G163K+G177A+T231R+N233R+G246A;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S+P256T;
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163L+V176I+T231 R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163P+V176I+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G 163L+T231R+N233R+D254S+P256N;
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+G163A+E210V+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L;
【０１１１】
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L;
N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254A+P256F; 
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S+P256F;
N11R+N33Q+G91T+G163T+T231R+N233R+D254S;
N 11 R+N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91K+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+L52R+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+T37K+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11 R+N33Q+A68V+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+T37M+G91T+G163P+V176T+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G38S+G156R+G163K+V176W+T231R+N233R;
N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163K+S216P+L227G+231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163T+V176G+T231R+N233R+D254S;
E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R;
【０１１２】
E1N+F10L+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R;
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S;
E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R;
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+L227F+T231R+N233R+D254S;
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S+I255A+P256Q;
N11R+N33Q+G38A+G91T+D102G+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+N33Q+G38A+G91T+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
E1N+N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+G246A+D254S;
N11R+D27R+N33Q+D57G+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R;
N11C+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11L+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
【０１１３】
N11H+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11D+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+D96W+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11P+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+E56Q+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S; 及び
N11R+N33Q+G91T+G163K+L227G+P229R+T231R+N233R+D254S。
【０１１４】
第４の特定態様においては、本発明のリパーゼは、配列番号２のリパーゼに比較して、次の置換、好ましくは置換類を有するリパーゼ間から選択される：
N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S;
N33Q+E87R+T231R+N233R;
D27V+N33Q+V60S+G91T+D96W+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+D96E+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R;
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163A+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R+P256A;
N11R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R;
N11R+N33Q+G38A+G91T+G112A+G163A+T231R+N233R+D254S;
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L;
N11R+N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+L52R+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
E1N+N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+G246A+D254S;
N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R;
N11L+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+D96W+G163K+T231R+N233R+D254S; 及び
D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T。
【０１１５】
第５の特定態様においては、本発明のリパーゼは、配列番号２のリパーゼに比較して、次の置換、好ましくは置換類を有するリパーゼ間から選択される：
N11R+N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R+D254S; 
N33Q+G38S+G156R+G163K+V176W+T231R+N233R ;及び 
N11L+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S。
【０１１６】
上記に列挙される置換（前記５種の特定態様の個々）を有する、配列番号２のアミノ酸１〜269のリパーゼの変異体はすべて、改良されたインビトロ消化性能、すなわち少なくとも1.50 (又は1.5), 2.00 (又は2.0), 2.50 (又は2.5), 3.00 (又は3.0), 3.50 (又は3.5), 又は少なくとも4.00 (又は4.0), 好ましくは少なくとも5.00 (又は 5.0), 6.00 (又は 6.0), 7.00 (又は7.0), 8.00 (又は8.0), 9.00 (又は9.0), 10.00 (又は10.0), 又は少なくとも11.00 (又は11.0)の改良因子（IF）、好ましくは平均IF−標準偏差を有する。pH5の胃段階が好ましくは使用される。好ましい食餌は、食餌Iである。活性部位滴定（AST, 例６）が、リパーゼ濃度を決定するために使用され得る。
【０１１７】
(E) 第１の特定態様においては、本発明のリパーゼは、配列番号２のリパーゼに比較して、次の置換、好ましくは置換類を有するリパーゼ間から選択される：
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T;
N33Q+E210D+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R;
N33Q+D111A+T231R+N233R;
N33Q+G91T+T231R+N233R;
D27Q+N33Q+T231R+N233R;
Q9H+N33Q+D102E+T231R+N233R;
N33Q+E56Q+T231R+N233R;
N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91A+D96E+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T;
N33Q+N39S+T231R+N233R;
N33Q+N94R+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G;
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
【０１１８】
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N33Q+T231R+N233R;
K98I+T231R+N233R+N251S;
N33Q+G163P+T231R+N233R;
N33Q+G163D+T231R+N233R;
N33Q+G163T+T231R+N233R;
N33Q+G163W+T231R+N233R;
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R;
N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S;
D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T;
N33Q+T231R+N233R+P256A; 
N33Q+T231R+N233R+P256S;
【０１１９】
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S;
N33Q+S115L+T231R+N233R;
N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S;
D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T;
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+K98l+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L;及び
N33Q+G91T+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L。
【０１２０】
第２の特定態様においては、本発明のリパーゼは、配列番号２のリパーゼに比較して、次の置換、好ましくは置換類を有するリパーゼ間から選択される：
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T;
N33Q+E210D+T231 R+N233R;
N33Q+T231R+N233R;
N33Q+D111A+T231R+N233R;
N33Q+G91T+T231R+N233R;
N33Q+N94R+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G163P+T231R+N233R;
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S;及び
N33Q+G91T+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L。
【０１２１】
第３の特定態様においては、本発明のリパーゼは、配列番号２のリパーゼに比較して、次の置換、好ましくは置換類を有するリパーゼ間から選択される：
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G91T+T231R+N233R;
D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;及び
N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S。
【０１２２】
上記に列挙される置換（前記５種の特定態様の個々）を有する、配列番号２のアミノ酸１〜269のリパーゼの変異体はすべて、改良されたインビトロ消化性能、すなわち少なくとも1.50 (又は1.5), 2.00 (又は2.0), 2.50 (又は2.5), 3.00 (又は3.0), 3.50 (又は3.5), 又は少なくとも4.00 (又は4.0), 好ましくは少なくとも5.00 (又は 5.0), 6.00 (又は 6.0), 7.00 (又は7.0), 8.00 (又は8.0), 9.00 (又は9.0), 10.00 (又は10.0), 又は少なくとも11.00 (又は11.0)の改良因子（IF）、好ましくは平均IF−標準偏差を有する。pH３の胃段階が好ましくは使用される。好ましい食餌は、食餌Iである。活性部位滴定（AST, 例６）ガリパーゼ濃度を決定するために使用され得る。
【０１２３】
(F) 第１の特定態様においては、本発明のリパーゼは、配列番号２のリパーゼに比較して、次の置換、好ましくは置換類を有するリパーゼ間から選択される：
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T;
N33Q+E210D+T231R+N233R;
N33Q+D111A+T231R+N233R;
N33Q+G91T+T231R+N233R;
D27Q+N33Q+T231R+N233R;
Q9H+N33Q+D102E+T231R+N233R;
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R;
N33Q+E56Q+T231R+N233R;
N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R;
N33Q+N94R+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G;
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S; 
【０１２４】
D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N33Q+T231R+N233R;
K98I+T231R+N233R+N251S;
N33Q+G163P+T231R+N233R;
N33Q+G163D+T231R+N233R;
N33Q+G163T+T231R+N233R;
N33Q+G163W+T231R+N233R;
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R;
N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S;
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T;
N33Q+T231R+N233R+D254Q;
N33Q+T231R+N233R+D254I;
N33Q+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+T231R+N233R+P256A;
【０１２５】
N33Q+T231R+N233R+P256L;
N33Q+T231R+N233R+P256S;
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S;
N33Q+S115L+T231R+N233R;
N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R;
D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N33Q+G161A+T231R+N233R;
N33Q+G38M+T231R+N233R;
N33Q+G38F+T231R+N233R;
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+K98l+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L; 及び
N33Q+G91T+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L。
【０１２６】
第２の特定態様においては、本発明のリパーゼは、配列番号２のリパーゼに比較して、次の置換、好ましくは置換類を有するリパーゼ間から選択される：
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T;
N33Q+E210D+T231R+N233R;
N33Q+D111A+T231R+N233R;
N33Q+G91T+T231R+N233R;
D27Q+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+E56Q+T231 R+N233R;
N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R;
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G;
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G163P+T231R+N233R;
【０１２７】
N33Q+G163D+T231R+N233R;
N33Q+G163W+T231R+N233R;
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254Q;
N33Q+T231R+N233R+D254I;
N33Q+T231R+N233R+P256S;
N33Q+S115L+T231R+N233R;
N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+G38M+T231R+N233R;
N33Q+G38F+T231R+N233R;
N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+K98l+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L;及び
N33Q+G91T+T114I+G163K+T231 R+N233R+D254S+P256L。
【０１２８】
第２の特定態様においては、本発明のリパーゼは、配列番号２のリパーゼに比較して、次の置換、好ましくは置換類を有するリパーゼ間から選択される：
N33Q+E210D+T231R+N233R;
N33Q+G91T+T231R+N233R;
D27Q+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R;
D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+G38M+T231R+N233R;
N33Q+G38F+T231R+N233R;
N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S。
【０１２９】
上記に列挙される置換（前記３種の特定態様の個々）を有する、配列番号２のアミノ酸１〜269のリパーゼの変異体はすべて、改良されたインビトロ消化性能、すなわち少なくとも1.50 (又は1.5), 2.00 (又は2.0), 2.50 (又は2.5), 3.00 (又は3.0), 3.50 (又は3.5), 又は少なくとも4.00 (又は4.0), 好ましくは少なくとも5.00 (又は 5.0), 6.00 (又は 6.0), 7.00 (又は7.0), 8.00 (又は8.0), 9.00 (又は9.0), 10.00 (又は10.0), 又は少なくとも11.00 (又は11.0)の改良因子（IF）、好ましくは平均IF−標準偏差を有する。pH3の胃段階が好ましくは使用される。好ましい食餌は、食餌Iである。活性部位滴定（AST, 例６）及び/又はA280が、好ましくは吸光係数1.24A280/mgを用いて、リパーゼ濃度を決定するために使用され得る。
【０１３０】
本発明のリパーゼは、少なくとも1.2, 1.4, 1.6, 1.8又は少なくとも2.0の対照に対する胆汁塩比較改良度を有することができる。より好ましくは、本発明のリパーゼは、少なくとも2.2, 2.5, 2.8又は少なくとも3.0の対照に対する胆汁塩比較改良度を有する。さらにより好ましくは、本発明のリパーゼは、少なくとも3.2, 3.4, 3.6, 3.8又は少なくとも4.0の対照に対する胆汁塩比率改良度を有することができる。それらの比較はまた、例えば３×、３倍、又は300％（すべてを3.0の比率に対応する）として言及され、そして他の比率に関しても同じである。
【０１３１】
特定の態様においては、本発明のリパーゼは、配列番号２のリパーゼに比較して、次の置換、好ましくは置換組を有するリパーゼ間から選択される：
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T;
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+P256T;
D27I+N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+T231R+N233R+G163S;
N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210V+T231R+N233R;
Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+R205I+L206F+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R;
D27R+N33Q+T37K+N71I+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
Q4H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154L+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
【０１３２】
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163S+E210V+T231R+N233R+D254K+P256A;
N33Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+D254G+P256A;
D27R+N33Q+L52I+V60E+G91N+N94R+D111A+T114I+V168M+E210D+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+T114I+R179T+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+A30V+N33Q+G91N+N94R+G109A+D111A+G190D+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91 N+N94R+K98I+D111A+N162S+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N26H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154F+G190C+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27N+N33Q+G91T+T114I+G163S+E210D+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R;
D27R+N33Q+T37K+N71I+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91T+T114I+G163W+E210D+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91 N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
【０１３３】
D27R+N33Q+G91 N+N94R+L97M+D111A+S216P+T226N+L227G+T231R+N233R+P256T+L269H;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G91T+T114I+E210V+T231R+N233R+D254K+P256A；
D27R+N33Q+N71S+G91N+N94R+D111A+H135D+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T; 
N33Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R;
D27R+N33Q+I76T+G91N+N94R+R108M+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+N39S+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+A49T+G91N+N94R+D111A+Y138F+G163R+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S;及び
N33Q+G91T+K98I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L。
【０１３４】
より好ましい態様においては、本発明のリパーゼは、配列番号２のリパーゼに比較して、次の置換、好ましくは置換組を有するリパーゼ間から選択される：
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+P256T;
D27I+N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+P256T; 
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+T231R+N233R+G163S;
N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210V+T231R+N233R; 
Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+R205I+L206F+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R; 
D27R+N33Q+T37K+N71I+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
Q4H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154L+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163S+E210V+T231R+N233R+D254K+P256A;
N33Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+D254G+P256A;
【０１３５】
D27R+N33Q+L52I+V60E+G91N+N94R+D111A+T114I+V168M+E210D+S216P+L227G+T231R+N233R+
P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+T114I+R179T+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+A30V+N33Q+G91N+N94R+G109A+D111A+G190D+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+N162S+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N26H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154F+G190C+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27N+N33Q+G91T+T114I+G163S+E210D+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91 N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R;
D27R+N33Q+T37K+N71I+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91T+T114I+G163W+E210D+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S;及び
N33Q+G91T+K98I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L。
【０１３６】
最も好ましい態様においては、本発明のリパーゼは、配列番号２のリパーゼに比較して、次の置換、好ましくは置換組を有するリパーゼ間から選択される：
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+P256T;
D27I+N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+T231R+N233R+G163S;
N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210V+T231R+N233R;
Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+R205I+L206F+S216P+L227G+T231R+ N233R+P256T;
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114l+G163K+E210D+T231R+N233R;及び
N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S。
【０１３７】
上記に列挙される置換（前記３種の対応の個々）を有する配列番号２のアミノ酸１〜269のリパーゼの変異体はすべて、改良されたインビトロ消化性能、すなわちペプシンの存在下でpH3での改良された安定性、より特定には、75μg/mlのペプシンの存在下で、pH3.0及び20℃（又は室温で）での３時間のインキュベーションの後、pH8.0及び20℃（又は室温で）でPNP−パルミテート上で測定される改良された残留活性、好ましくは、例８の方法により決定される場合、改良％残留活性（％RA）を有する。特定の態様においては、％RAは少なくとも50、少なくとも70、少なくとも80又は少なくとも90％である。改良比率は、対照リパーゼの％RAに対する問題のリパーゼの％RAの比率として定義される。改良比率は好ましくは、少なくとも1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 又は少なくとも4.5である。改良比率は、対照リパーゼ（例えば、所望には、配列番号２又はリパーゼ、又はもう１つの対照リパーゼ）の％RAにより問題のリパーゼの％RAを割算することにより、表10における結果から計算され得る。
【０１３８】
本発明のリパーゼは、少なくとも1.2, 1.4, 1.6, 1.8又は少なくとも2.0の対照に対する胆汁塩比較改良度を有することができる。より好ましくは、本発明のリパーゼは、少なくとも2.2, 2.5, 2.8又は少なくとも3.0の対照に対する胆汁塩比較改良度を有する。さらにより好ましくは、本発明のリパーゼは、少なくとも3.2, 3.4, 3.6, 3.8又は少なくとも4.0の対照に対する胆汁塩比率改良度を有することができる。それらの比較はまた、例えば３×、３倍、又は300％（すべてを3.0の比率に対応する）として言及され、そして他の比率に関しても同じである。
【０１３９】
特定の態様においては、本発明のリパーゼは、配列番号２のリパーゼに比較して、次の置換、好ましくは置換組を有するリパーゼ間から選択される：
D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R;
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T；
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G91T+T114I+E210V+D254K+P256A;
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163S+E210V+D254K+P256A;
L52I+V60E+T114I+V168M+E21OD;
D27R+N33Q+A49T+G91N+N94R+D111A+Y138F+G163R+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T; 
D27R+N33Q+I76T+G91N+N94R+R108M+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T; 及び
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T。
【０１４０】
さらに好ましくは、本発明のリパーゼは、配列番号２のリパーゼに比較して、次の置換、好ましくは置換組を有するリパーゼ間から選択される：
D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R;
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;及び
N33Q+G91T+T114I+E210V+D254K+P256A。
【０１４１】
さらにより好ましくは、本発明のリパーゼは、配列番号２のリパーゼに比較して、次の置換、好ましくは置換組を有するリパーゼ間から選択される：
D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R;
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T; 及び
N33Q+G91T+T114I+E210V+D254K+P256A。
【０１４２】
最も好ましい態様においては、本発明のリパーゼは、配列番号２のリパーゼに比較して、次の置換、好ましくは置換組を有するリパーゼ間から選択される：
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T。
【０１４３】
上記に列挙される置換（４種の態様の個々）を有する配列番号２のアミノ酸１〜269のリパーゼの変異体はすべて、改良されたインビトロ消化性能、すなわち2mMの胆汁塩の存在下でpH5.0でのPNP−オレエート上での改良された活性、より特定には、例９における方法により決定されるような改良された胆汁塩比率を有する。
【０１４４】
さらなる特定の態様においては、本発明のリパーゼは、配列番号２のリパーゼに比較して、次の置換、好ましい置換組を有するリパーゼ間から選択される。
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G; 
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S; 及び 
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S。
【０１４５】
最も好ましいリパーゼは、配列番号２のリパーゼ比較して、次の置換、好ましくは置換組を含んで成る：
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231 R+N233R+D254S。
【０１４６】
特定の態様においては、本発明のリパーゼは、活性情況において、低いpHで改良された活性を有し、ここで低いpHとは、４〜７の範囲のpH、例えばpH4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5又は7.0を意味する。好ましい低いpHは、pH6.0である。好ましい態様においては、pH6.0での活性は、i)37℃で；ii)好ましくは8mMの濃度でのトリリノレイン基質により；iii)好ましくは10mMの濃度での、酵素及び基質のインキュベーションの間、存在する胆汁塩により；iv)100mMのイミダゾール、100mMのアセテート、100mMのマロン酸、pH6.0のアッセイ緩衝液を用いて；v）好ましくは1mMの濃度での、酵素及び基質のインキュベーションの間、存在するCaCl2により；及び/又はvi)0.001mgのEP/ml（EP=酵素タンパク質、A280に基づく）に対応する精製されたリパーゼの量により決定される。
【０１４７】
追加の好ましい態様においては、vii)酵素は、5mMのNaHPO4、pH7.0により、アッセイの前、希釈され（例えば、アッセイための 適切な濃度を得るために）；iix)酵素及び基質が30分間インキュベートされ；ix)酵素及び基質がマイクロタイタープレート（MTP）においてインキュベートされ、そして好ましくは700rpmで振盪され；x)酵素反応が好ましくは、停止溶液（2.2％のTriton-x100, 0.22Mのリン酸）、より好ましくはペプシン（70mg/l）を含むその溶液により停止され；xi)酵素反応の結果として生成される遊離脂肪酸が、酵素色彩試験、例えばNafaCにより決定され；そして/又はxii) pH6.0での活性の改良性が、対照リパーゼ、例えば配列番号１又は２、好ましくは２のアミノ酸１〜269を有するリパーゼの同じ条件下での活性に対して、又は変異体LV2934に対して示される。
【０１４８】
前記試験方法に関する詳細のためには、例３を参照のこと。pH6.0での改良された活性のリパーゼ変異体の特定例（配列番号２のアミノ酸１〜269を有するリパーゼンに関しての）は、LVA049, LVA349, LVA023, LVA099, SEQ ID NO: 1, LVA061 , LV2934, LV1330, LVA043, LVA041 , LVA012, LV1857, 及び LV1855である（それらの構造にていては表１を参照のこと)。LVA049, LVA349, LVA023, 及びLVA099リパーゼ変異体が特に好ましい（配列番号１のリパーゼに比較して改良される）。LVA049及びLVA34のリパーゼ変異体がより好ましい。pH活性点の観点から、最も好ましいリパーゼは、LFA049リパーゼ変異体である。
【０１４９】
もう１つの特定の態様においては、本発明のリパーゼは、安定性の情況において、低いpHでの改良された安定性を有し、ここで低いpHとは、２〜６の範囲のpH、例えばpH2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5又は6.0を意味する。好ましい低いpHは3.0である。精製されたリパーゼ酵素の安定性は、所望するpH（例えば、3.0）で、37℃で1, 15, 45及び120分間、前記酵素をインキュベートすることにより決定され、これに続いて、残留リパーゼ活性は、pH8及び室温（RT）でのｐ-ニトロフェニルカプリレートに基づいて測定される。
【０１５０】
好ましい態様においては、i)安定性プレインキュベーションのために使用される緩衝液（安定性緩衝液）は、所望するpH（例えば、3.0）に調節された、200mMのイミダゾール、200mMのアセテート、200mMのマロン酸であり；ii)酵素はまず、20mMのNaH2PO4, pH7.0, 0.01％のTriton-X100により、0.4又は0.8mgの酵素タンパク質/mlの作業溶液に、好ましくはA280に基づいて希釈され；iii)プレインキュベーションの間の酵素濃度は、0.05又は0.1mgの酵素タンパク質/mlであり、そしてこの希釈のためには、緩衝液は好ましくは、酵素希釈緩衝液（20mMのアセテート、pH6.0、0.01％のTriton-X100）であり；iv)プレインキュベーションは、振盪下で、好ましくは700rpm下で、マイクロタイタープレート（MTP）において実施され；v)残留活性（RA）の続く決定のためには、プレインキュベーション段階から回収される酵素含有アリコートが、次の残留活性緩衝液（RA緩衝液）により、少なくとも20倍に希釈され；200mMのトリス（トリス−ヒドロキシメチルアミノメタン）、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、pH8.0、0.4％のTriton-X100、1mMのCaCl2；vi)残留活性が、pH8.0及びRTでｐ−ニトロフェニルカプリレートに基づいて測定され、そして405nmで５分間、動力学的に（速度；比率）、測定され；vii)％残留活性が次の通りにして計算され：個々の回収（1, 15, 45, 120分又は1,60, 120分）について個々のpH内の速度が、胆汁塩又はペプシンを適用できる場合、酵素を有さない対照についてこの速度を控除され（下記iixを参照のこと）；そしてix)この補正された速度が、個々のpH内の最高の値により割算され、そして100により掛け算される。任意には、酵素は、iix)好ましくは、10mMの濃度での胆汁塩の存在下で、及び/又はix)ペプシン（70mg/l）の存在下で、プレインキュベートされる。この試験方法についてのより詳細に関しては、例４を参照のこと。
【０１５１】
さらなる特定の態様においては、本発明のリパーゼは、緩衝液におけるpH3.0での120分のインキュベーションの後、少なくとも60, 65, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90又は92の、上記及び例４に記載のようにして決定される％残基活性を有する。
さらなる特定の態様においては、本発明のリパーゼは、緩衝液におけるpH3.0での60分のインキュベーションの後、少なくとも82, 83, 84, 85, 86, 87, 88又は少なくとも89の、上記及び例４に記載のようにして決定される％残基活性を有する。
【０１５２】
さらなる特定の態様においては、本発明のリパーゼは、ペプシンの存在下でのpH3.0での45分のインキュベーションの後、少なくとも35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92又は94の、上記及び例４に記載のようにして決定される％残基活性を有する。
【０１５３】
さらなる特定の態様においては、本発明のリパーゼは、ペプシンの存在下でのpH3.0での60分のインキュベーションの後、少なくとも20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 82, 84, 86, 88又は少なくとも89の、上記及び例４に記載のようにして決定される％残基活性を有する。
【０１５４】
さらなる特定の態様においては、本発明のリパーゼは、ペプシンの存在下でのpH3.0での120分のインキュベーションの後、少なくとも8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48又は50の、上記及び例４に記載のようにして決定される％残基活性を有する。
【０１５５】
さらなる特定の態様においては、本発明のリパーゼは、胆汁塩の存在下でのpH3.0での15分のインキュベーションの後、少なくとも2, 4, 6, 8, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70又は少なくとも71の、上記及び例４に記載のようにして決定される％残基活性を有する。
pH3.0での改良された安定性のリパーゼ変異体の特定の例は、次のものである（配列番号２のアミノ酸１〜269の配列を有するリパーゼに対する）：LV2934, LVA043, LVA049, LV1855, LV1865, LV1874, LV1889, LV1857, LVA012, LVA023, LVA041 , LVA061及びLVA099。
【０１５６】
ペプシンの存在下でpH3.0で改良された安定性を有する特に好ましいリパーゼは、次のものである：LVA043, LV1855, LV1865, LV1874, LV1889, LV1857, LVA012及びLVA099。
ペプシンの存在下でpH3.0で改良された安定性を有するリパーゼのさらなる例は、次のものである：LVA147, LVA315, LVA317, LVA319及びLVA714。それらは、配列番号２、１及びLV2934のリパーゼのいずれかに比較して改良される。胆汁塩の存在下でpH3.0で改良された安定性を有するもう１つの特に好ましいリパーゼ変異体は、LVA349である。それらのリパーゼ変異体の構造体については、表１及び例４を参照のこと。
【０１５７】
低い程度に精製されたリパーゼ調製のために、例えばスクリーニングのために有用であるもう１つの特定の態様においては、pH3.0での安定性が次の通りにして測定される：最初に、酵素が、pH3.0及び室温で、75μg/mlのペプシンの存在下で３時間プレインキュベートされ、そして次に、残留リパーゼ活性が時間に対してアッセイをモニターリングする速度アッセイにより測定される。好ましい態様においては、i)残留活性アッセイのための基質は、４−ニトロフェノールパルミテート、好ましくは1mMのPNP−パルミテート、1.2％のTriton-X100、4mMのCaCl2、100mMのTRIS, pH8.0であり；ii)残留活性アッセイのために、OD405読み取りが、基質添加の15分後から、基質添加の後18時間、取られ；iii)OD405読み取りがmOD/時として表され；iv)線状範囲にあるデータが集められ、そして個々のペプシン処理されたサンプルの残留リパーゼ活性が、その対応する末処理のサンプルの残留リパーゼ活性と比較され；v)％残留活性（％RA）が、末処理状態の速度により処理された状態の速度を割算し、そしてその結果に100を掛けることにより計算される。
【０１５８】
さらなる詳細については例８を参照のこと。次の変異体は、配列番号２のアミノ酸１〜269の配列を有するリパーゼ比較して、ペプシンの存在下でpH3.0で、改良された安定性を有する：配列番号１のアミノ酸１〜269を有するリパーゼ、LVAR0002b, LVAR0003, LVAROOHa, LVAR0013, LVAR0014, LVAR0015, LVAR0016, LVAR0017, LVAR0045, LVAR0046, LVAR0047, LVAR0048, LVAR0050, LVAR0051 , LVAR0052, LVAR0053, LVAR0054, LVAR0055, LVAR0056, LVAR0057, LVAR0058, LVAR0059, LVAR0061 , LVAR0062, LVAR0063, LVAR0064, LVAR0065, LVAR0066, LVAR0067, LVAR0068, LVAR0069, LVAR0070, LVAR0071 , LVAR0072, LVAR0101 , LVAR0102, and LVAR0106. Preferred variants are: LVAROOHa, LVAR0013, LVAR0017, LVAR0046, LVAR0052, LVAR0055, LVAR0061 , LVAR0063, LVAR0068, LVAR0070, LVAR0071 , LVAR0072, LVAR0014, LVAR0015, LVAR0057, LVAR0101, LVAR0102及びLVAR0106。特に好ましいリパーゼ変異体は、次のものである：LVAR0014, LVAR0015, LVAR0057, LVAR0101 , LVAR0102及び LVAR0106。それらの変異体の構造は、表６及び９に示される。
【０１５９】
もう１つの特定の態様においては、本発明のリパーゼは、ペプシンの存在下で、例えば70mg/mlのペプシンの存在下で、好ましくは所望するpH（例えば、pH 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5又は6.0）及び37℃で、15, 45, 60及び/又は120分間、安定している。さらなる詳細については、例４を包含する上記セクションを参照のこと。
【０１６０】
さらなる特定の態様においては、本発明のリパーゼは、胆汁塩の存在下で、例えば10mg/mlの胆汁塩の存在下で、好ましくは所望するpH（例えば、pH 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5又は6.0）及び37℃で、15, 45及び/又は120分間、安定している。さらなる詳細については、例４を包含する上記セクションを参照のこと。
【０１６１】
さらに特定の態様においては、本発明のリパーゼは、対照リパーゼ、例えば配列番号２のアミノ酸１〜269の配列を有するリパーゼ、又は配列番号１のアミノ酸１〜269の配列を有するリパーゼに比較して、改良されたホスホリパーゼ活性を有する。ホスホリパーゼ活性は、次ぎの通りにして決定され得る：i)精製された酵素が、酵素希釈緩衝液（20mMの酢酸ナトリウム、0.01％（w/w）のTriton-X100, pH5.0）により、例えばA280に基づいて、5mgのEP/mlに希釈され；ii)１−ミリストイル−２−パルミトイル−sn−グリセロ−３−ホスホコリンに対する活性が、好ましくは、40℃で20分間、決定され；iii)遊離される遊離脂肪酸が、好ましくは50％メタノール、0.1％TFA（matrix）において20mg/mlの２，５−ジヒドロ−安息香酸と共に混合した後、MALDI−TOF MSにより、決定され、そして定量化され；iii)MSピークの相対的シグナル強度（個々のピーク下の面積）が、ホスホリパーゼA1とA2活性との間の分布の計算のために使用される。
【０１６２】
対照リパーゼ、例えば配列番号２のアミノ酸１〜269を有するリパーゼ、又は配列番号１のアミノ酸１〜269を有するリパーゼに比較して、加水分解の後、残存する改良された％末消化リン脂質を有するリパーゼは、改良されたホスホリパーゼ活性を有する。
配列番号２に比較して、改良されたホスホリパーゼ活性を有するリパーゼ変異体の特定の例は、次のものである：LV1889, LVA023, LV1330, LV1855, LV1865, LV1874, LV1889, LVA043, LVA049, LV1857及びLV1232。好ましいリパーゼは、LV1232及びLV1889である。
【０１６３】
さらに特定の態様においては、本発明のリパーゼは、配列番号２のアミノ酸１〜269を有するリパーゼ、配列番号１のアミノ酸１〜269を有するリパーゼ、及び/又はLV2934（配列番号１の脱グリコシル化された変異体N33Q）に比較して、インビトロ消化モデルにおいて改良された性能を有する。インビトロモデルは、実験部分に記載される食餌IIを用いる。
【０１６４】
手短には、100μlの食餌が20μlのペプシン（700mg/ml）及び30μlのリパーゼ（４種の濃度、二重反復）と共に、マイクロタイタープレートのウェルにおいて混合され、これが、25μlの緩衝液（0.8MのMES（２−［N−モルホリノ］エタンスルホン酸）、0.8Mの酢酸ナトリウム、0.8Mのイミダゾール、pH7.0）及び20μlの胆汁塩（100mM）（5.7〜60のpHをもたらす）の添加の前、振盪しながら（750rpm）37℃で１時間インキュベートされる。次に、プレートが、攪拌下で37℃で２時間インキュベートされ、その後、1Mのリン酸中、50μlの10％Triton-X100の添加により、反応が停止される。１％Triton-X100により125〜250倍に希釈した後、遊離脂肪酸の量が、比色キット、例えばNEFA Cキットを用いて、例３に記載のようにして決定される。
【０１６５】
インビトロでの改良された性能のリパーゼの例は、次ぎのものである：LVAR0003, LVAR0045, LVAR0046, LVAR0047, LVAR0050, LVAR0051 , LVAR0052, LVAR0053, LVAR0054, LVAR0056, LVAR0057, LVAR0061 , LVAR0062, LVAR0063, LVAR0064, LVAR0065, LVAR0067, LVAR0069及びLVAR0072。他の例は次のものである：LVAR0074, LVAR0076, LVAR0077, LVAR0078, LVAR0079, LVAR0080, LVAR0086, LVAR0088, LVAR0091 , LVAR0094, LVAR0095, LVAR0096, LVAR0099, LVAR0101 , LVAR0102, LVAR0103, LVAR0104, LVAR0106及びLVAR0108。
【０１６６】
好ましい例は次のものである：LVAR0003, LVAR0013, LVAR0032, LVAR0050, LVAR0058及び LVAR0069。より好ましい例は次のものである：LVAR0063, LVAR0067, LVAR0069, LVAR0079, LVAR0080, LVAR0094, LVAR0095, LVAR0096, LVAR0099, LVAR0101 , LVAR0102, LVAR0103, LVAR0104, LVAR0106及びLVAR0108。最も好ましい例は、LVAR0094, LVAR0099, LVAR0095及び LVAR0106である。
【０１６７】
さらなる特定の態様においては、本発明のリパーゼは、インビボでの改良された性能を有する。そのインビボ性能は、例10に記載のように、誘発された膵臓外分泌機能不全（PEI）を有する雌Gottingenミニブタ（Ellegaard）におけるリパーゼスクリーニング試験、及び例11に記載のような十分なインビボ消化能力試験において確立され得る。性能は、配列番号２のアミノ酸１〜269を有するリパーゼ、配列番号１のアミノ酸１〜269を有するリパーゼ、及び/又は配列番号１のアミノ酸１〜269を有するリパーゼの脱グリコシル化された変異体N33QであるLV2934に対して改良され得る。この試験のより詳細については、例10を参照のこと。
【０１６８】
本発明のリパーゼは好ましくは、少なくとも１つの次の置換を含んで成る：N26I, D27Q, D27R, D27Y, P29T, A30T, A30V, T32I, N33Q, N33T, N33Y, P42L, E43D, E43K, E43M, E43V, A49T, L69I, E87K, E99D, E99K, E99P, E99S, E99T, G163K, S216P, L227G, T231R, N233R, D234K, E239V。
【０１６９】
本発明のリパーゼは好ましくは、少なくとも１つの次の置換を含んで成る：N26I, D27Q, D27R, D27Y, P29T, A30T, A30V, T32I, N33Q, N33T, N33Y, P42L, E43D, E43K, E43M, E43V, A49T, E56C, E56S, D57A, D57G, D57N, V60L, L69I, E87K, G91A, G91 E, G91N, G91R, G91 S, G91T, G91V, G91W, L93F, N94K, N94R, N94S, D96E, D96G, D96L, D96N, D96S, D96V, D96W, D96Y, L97M, L97Q, K98I, E99D, E99K, E99P, E99S, E99T, D111A, D111S, T114I, L147S, G163K, E210D, S216P, L227G, T231R, N233R, D234K, E239V, Q249R, N251S, D254N, P256T, G263Q, L264A, I265T, G266D, T267A及び/又は L269N。
【０１７０】
特定の態様においては、本発明のリパーゼは、次ぎのものではない：（i）配列番号１のアミノ酸１〜269を有するリパーゼ；（ii）（i）のリパーゼの変異体N33Q；（iii）配列番号１のアミノ酸-5- 269 (-5 〜+269), -4-269 (-4〜+269), -3-269 (-3〜+269), -2-269 (-2 〜+ 269), -1-269 (-1〜+269)及び2-269；（iv）(iii)の配列のいずれか1つの変異体N33Q；（v）アミノ末端メチオニン残基を有する態様（i）, (ii), (iii)及び/又は（iv）のいずれか１つ、ポリヒスチジン域を有する態様（i）, (ii), (iii)及び/又は（iv）のいずれか１つ；（vi）WO2006/136159号のp5の第４〜18行上に定義されるような少なくとも１つの保存性置換を有する態様（i）, (ii), (iii), (iv)及び/又は（v）のいずれか１つ；（vii）WO2006/136159号のp6の第４〜14行上に定義されるような前述の態様のいずれか１つのフラグメント；（iix）WO 2006/136159号のp6、第34行〜p7、第11行に定義されるような変異体の特定の混合物；及び/又は（ix）WO2006/136159号において医薬使用のために特別に開示されるリパーゼ。
【０１７１】
本発明の特に好ましいリパーゼは次のものである：LV1232, LV1855, LV1857, LV1865,LV1874及びLV1889。
本発明の他の特に好ましいリパーゼは、親リパーゼの変異体であり、そして（T231R＋N233R）及びさらに、次の置換の少なくとも１つを含んで成るリパーゼである：N26I, D27Q, D27R, D27Y, A30V, T32I, N33Y, P42L, E43K, E43M, E43V, A49T, E56A, E56C, E56K, E56R, E56S, D57A, D57G, D57N, E87K, G91E, G91N, G91 R, G91V, G91W, L93F, N94K, N94R, D96G, D96L, D96N, D96S, D96V, D96W, D96Y, L97M. L97Q, K98I, E99K, E99P, E99S, E99T, D111A, D111S, T114I, L147S, G163K, S216P, L227G, D234K, E239V, Q249R, D254N, G263Q, L264A, I265T, G266D及び/又は L269N。
【０１７２】
リパーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ：
次のリパーゼはまた、本発明の範囲内ni包含される：それぞれ、配列番号２のアミノ酸-5〜-1、配列番号２の-4〜-1、配列番号２の-3〜-1、配列番号２の-2〜-1及び配列番号２の-1に対応する、次のN−末端延長：SPIRR, PIRR, IRR, RR及びRのいずれか１つを、さらに含んで成る、請求項に記載され、そして本明細書に開示されるリパーゼのいずれか１つ。それらのN−末端バージョンのいずれかの混合物が、特別に本明細書に包含される。
【０１７３】
特定の態様においては、本発明のリパーゼの比活性は、配列番号２のアミノ酸１〜269を有するリパーゼの比活性の少なくとも50％である。さらなる特定の態様においては、変異体リパーゼの比活性は、配列番号２のアミノ酸１〜269を有するリパーゼの比活性の少なくとも60, 70, 75, 80, 85, 90又は少なくとも95％である。
【０１７４】
比活性は、本明細書における例１のリパーゼアッセイのいずれかを用いて測定され得るが、しかし好ましくは、例１のLU−アッセイを用い、そして例えば例２に記載のように酵素タンパク質含有率（A280及びGPMAW）を決定するか、又はアミノ酸分析を用いて、LU/mg酵素タンパク質で測定される。アミノ酸分析においては、リパーゼサンプルのペプチド結合が、酸加水分解にゆだねられ、続いて、例えばBie & Bemtsen A/S, Sandbaekvej 5-7, DK-2610 Roedovre, Denmarkから市販されているBiochrom 20 Plus Amino Acid Analyser上で、その製造業者の説明書に従って、開放されるアミノ酸の分離及び定量化を行う。それぞれ個々のアミノ酸の量は、ニンヒドリンとの反応により決定される。
【０１７５】
もう１つの特定の態様においては、本発明のリパーゼは、追加のリパーゼと組合して使用され得る。追加のリパーゼの例は、哺乳類リパーゼ及び微生物リパーゼである。好ましい哺乳類リパーゼは、ブタ又は雄牛からの膵臓抽出物、例えばパンクレアチンである。パンクレアチンは、被覆されていない（生の）生成物の形で、又は配合された生成物（腸溶性被覆された（胃酸に対する耐性を付与するために）、又は非機能的に被覆された（被覆されているが、しかし胃酸に対する耐性は付与しない））の形で使用され得る。パンクレアチンは実質的に、さらなる酵素活性成分、例えば膵臓プロテアーゼ及び/又は膵臓アミラーゼを含んで成る。微生物リパーゼは、例えば細菌又は細菌リパーゼに基づかれるか、又は由来することができる。
【０１７６】
細菌リパーゼは、例えばバチルス又はシードモナスに由来し、菌類リパーゼは例えば、リゾパス、カンジダ又はヒューミコラ、例えばリゾパス・テレマー、リゾパス・ジャバニカス、リゾパス・オリザエ又はヒューミコラ・ラヌギノサに由来し、特にAmano Pharmaceuticals, Japanから市販されている製品Lipase D2TM 又はLipase D Amano 2000TM (リパーゼ、EC3.1.1.3)のいずれかである。
【０１７７】
本発明のリパーゼは、下記のように、アミラーゼを伴って又は伴わないで、プロテアーゼと組合して使用され得る。用語“プロテアーゼ”とは、本明細書においては、ペプチド結合を加水分解する酵素として定義される。それは、EC3.4酵素グループ（その13種の亜綱の個々を包含し、それらの酵素は“EC3.4.-.-酵素グループに属する”として言及される）に属するいずれかの酵素を包含する。
【０１７８】
プロテアーゼの例は、哺乳類プロテアーゼ及び菌類プロテアーゼである。好ましい哺乳類プロテアーゼは、例えばブタ又は雄牛からの膵臓抽出物、例えばパンクレアチンである。パンクレアチンは、被覆されていない（生の）生成物の形で、又は配合された生成物（上記のように、腸溶性被覆された、又は非機能的に被覆された）の形で使用され得る。パンクレアチンは実質的に、さらなる酵素活性成分、例えば膵臓リパーゼ、BSSL（胆汁塩刺激されたリパーゼ）、及び/又は膵臓アミラーゼを含んで成る。
【０１７９】
微生物プロテアーゼは、例えば細菌又は菌類株に基づくか又はそれに由来することができる。プロテアーゼは、アスペルギラス株、例えばアスペルギラス・オリザエ又はアスペルギラス・メレウスに由来し、特にAmano Pharmaceuticals, Japanから入手できる製品Prozyme 6TM（中性、アルカリ性プロテアーゼE3.4.2.63）である。細菌プロテアーゼの例は、バチルス及びノカルジオプシスからのプロテアーゼ、例えば配列番号３のアミノ酸1-274のアミノ酸配列を有するバチルス・リケニホルミスプロテアーゼ、配列番号４のアミノ酸1-188のアミノ酸配列を有するノカルジオプシスsp. プロテアーゼ、又は配列番号５のアミノ酸1-188のアミノ酸配列を有するノカルジオプシス・ダソンビエレイsubsp.ダソンビエレイプロテアーゼからのプロテアーゼである。配列番号３のアミノ酸1-274のプロテアーゼは例えば、WO2006 /136160 号に記載のようにして調製され得る。配列番号４−５のアミノ酸1-188のプロテアーゼは、WO2001/58276号及びWO2004/111244号に記載のようにして調製され得る。
【０１８０】
好ましい態様においては、本発明のプロテアーゼは、（i）配列番号３のアミノ酸1-274, (ii)配列番号４のアミノ酸1-188, 及び/又は配列番号５のアミノ酸1-188のいずれかを有するか、又は含んで成るプロテアーゼに対して少なくとも70％同一である。（i）、（ii）又は（iii）のいずれかのさらなる好ましい態様においては、同一性の程度は、少なくとも71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%、又は少なくとも99％である。（i）、（ii）又は（iii）の他の態様においては、同一性の程度は、少なくとも約50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%、又は少なくとも69％である。
【０１８１】
上記のようなプロテアーゼと共に又はそれを伴わないでの本発明のリパーゼは、アミラーゼと組合して使用される。
本明細書においては、アミラーゼは、澱粉及び他の線状及び枝分かれ鎖のオリゴ−多糖の末端−加水分解を触媒する酵素である。澱粉のアミロース部分は、１，４−α−グルコシド結合に富んでおり、そしてアミロペクチン部分は、１，４−α−のみならず、また、１，６−α−グルコシド結合を含む枝分かれ鎖である。特定の態様においては、アミラーゼは、EC3.2.1.1グループに属する酵素である。
【０１８２】
特定の態様においては、アミラーゼは哺乳類アミラーゼ、又は細菌アミラーゼである。哺乳類アミラーゼの例は、例えばブタ又は雄牛からの膵臓抽出物、例えばパンクレアチンである。パンクレアチンは、被覆されていない（生の）生成物の形で、又は配合された生成物（上記のように、腸溶性被覆された、又は非機能的に被覆された）の形で使用され得る。パンクレアチンは実質的に、さらなる酵素活性成分、例えば膵臓プロテアーゼ、及び/又は膵臓リパーゼを含んで成る。微生物アミラーゼは例えば、細菌又は菌類株、例えばバチルス、シュードモナスアスペルギラス又はリゾパスに基づくか、又はそれに由来することができる。
【０１８３】
アミラーゼは特に、アスペルギラス株、例えばアスペルギラス・ニガー、アスペルギラス・オリザエ又はアスペルギラス・メレウス由来のもの、例えばAmano Pharmaceuticals, Japanから市販されているアスペルギラス・オリザエ由来のもの、例えばAmano Pharmaceuticals, Japanから市販されているアスペルギラス・オリザエ由来の製品Amylase A1TM、又はExtract−Chemie, Germanyから市販されているアスペルギラス・メレウス由来のAmylase ECTMであり得る。
【０１８４】
好ましいアミラーゼは、配列番号６のアミノ酸1−481（例えば、そのアミノ酸1−481、1−484又は1−486）、配列番号７のアミノ酸1−481、及び/又は配列番号８のアミノ酸1−483を含んで成るアミラーゼである。好ましい態様においては、アミラーゼは、（i）配列番号６のアミノ酸1−481、（ii）配列番号７のアミノ酸1−481、及び/又は（iii）配列番号８のアミノ酸1−483のいずれかに対して少なくとも70％同一であるアミノ酸配列を有するか、又は含んで成るアミラーゼである。
【０１８５】
配列番号６−８のアミラーゼは例えば、“医薬使用のためのアミラーゼ”の名称の及びSolvay Pharmaceuticals GmbH and Novozymes A/Sにより2005年6月24日に出願された同時継続WO2006 /136161 号に記載のようにして調製され得る。（i）、（ii）又は（iii）のいずれかの追加の好ましい態様においては、同一性の程度は、少なくとも71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%、又は少なくとも99％である。（i）、（ii）又は（iii）のいずれかの他の態様においては、同一性の程度は、少なくとも約50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%、又は少なくとも69％である。
【０１８６】
一般的に、リパーゼ、プロテアーゼ及びアミラーゼ酵素（この後、“酵素”、すなわち本発明の酵素）は、中性又は野生型酵素（動物、特に哺乳類、例えばヒト又はブタ酵素から；植物から；又は微生物から得られる）であり得るが、しかしまた、所望する酵素活性を示すいずれかの変異体、フラグメント、等、並びに合成酵素、例えばシャフリングされた、ハイブリッド又は、キメラ酵素、及びコンセンサス酵素であり得る。
【０１８７】
特定の態様においては、酵素は、動物、たとえばヒトに暴露される場合、低い免疫原応答をもたらすよう企画された低アレルギー性変異体である。免疫学的応答は、酵素に暴露される動物の免疫系によるいずれかの応答として理解されるべきである。１つのタイプの免疫学的応答は、暴露された動物における高められたレベルのIgEを導くアレルギー応答である。低アレルギー性変異体は、当業界において知られている技法を用いて調製され得る。例えば、酵素は、免疫学的応答に関与する酵素の一部又はエピトープを保護するポリマー成分により接合され得る。
【０１８８】
ポリマーによる接合は、WO96/17929号、WO98/30682gou、WO98/35026号及び/又はWO99/00489号に記載のように、酵素へのポリマーのインビトロ化学的カップリングを包含する。接合は、さらに又は他方では、酵素へのポリマーのインビボカップリングを包含する。そのような接合は、酵素をコードするヌクレオチド配列を遺伝的に構築し、酵素における追加のグリコシル化部位をコードするコンセンサス配列を挿入し、そして酵素をグリコシル化できる宿主において酵素を発現することによって達成され得る。例えば、WO00/26354号を参照のこと。低アレルギー性変異体を供給するもう１つの手段は、酵素モノマーが他の酵素モノマーのエピトープを保護し、そしてそれにより、オリゴマーの抗原性を低める、酵素の自己オリゴマー化を引き起こすために、酵素をコードするヌクレオチド配列の遺伝的構築である。そのような生成物及びそれらの調製法は、例えばWO96/16177号に記載されている。
【０１８９】
免疫学的応答に関与するエピトープは、種々の方法、例えばWO00/26230号に記載されるファージ表示法、又はEP561907号に記載されるランダムアプローチにより同定され得る。エピトープが同定されると、そのアミノ酸配列は、既知の遺伝子操作技法、例えば特定部位の突然変異誘発により酵素の変更された免疫学的性質を生成するために変更され得（例えば、WO00/26230号、WO00/26354号及び/又はWO00/22103号を参照のこと）、そして/又はポリマーの接合がエピトープを保護するために、ポリマーのためのエピトープに十分に接近して行われ得る。
【０１９０】
特定の態様においては、酵素は、（i）pH2−8、好ましくはまた、pH3−7、より好ましくはpH4−6で安定性であり；(ii)pH4−9、好ましくは4−8で活性的であり；（iii）ペプシン及び他の消化プロテアーゼ（例えば、膵臓プロテアーゼ、すなわち主にトリプシン及びキモトリプシン）による分解に対して安定性であり；そして/又は胆汁塩の存在下で活性的である。
【０１９１】
用語“〜と組合して”とは、リパーゼ、プロテアーゼ及び/又はアミラーゼの本発明に従っての組合された使用を言及する。組合された使用は、同時であり、重複し、又は連続的であり得、それらの３種の用語は一般的に、医師により行われる処方により中断される。
用語“同時”とは、酵素が、それらが１又は複数の別々の医薬製品と同時に投与される場合、又はそれらが１つの及び同じ医薬組成物において投与される場合、同時に活性的である環境を言及する。
【０１９２】
用語“連続的”とは、1及び/又は２種の酵素が第１、及び第２、及び/又は第３の酵素と連続的に作用する、そのような情況を言及する。連続的作用は、別々の医薬配合物として又問題の酵素を所望する間隔で投与するか、又は問題の酵素が、異なった開放時間を得、改良された生成物安定性を付与し、又は酵素投与量を最適化するために、異なって配合されている（区分された）、１つの医薬組成物として投与することにより得られる。
【０１９３】
用語“重複”とは、酵素活性期間が完全に同時でも又は完全に連続的でもなく、すなわち酵素が両者とも、又はすべて活性的である一定の期間が存在するそのような情況を言及する。
用語“１つの（ａ）”とは、例えば本発明のプロテアーゼ、リパーゼ、及び/又はアミラーゼに関して使用される場合、少なくとも１種を意味する。特定の態様においては、“１つの”とは、１，２，３，４，５、等を再び意味する、“１つ又はそれ以上”又は“少なくとも１つ”を意味する。
【０１９４】
本発明の酵素の活性は、いずれかの適切なアッセイを用いて測定され得る。一般的に、アッセイ−pH及びアッセイ−温度が、問題の酵素に適合され得る。アッセイ−pH−値の例は、pH2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 又は12である。アッセイ−温度の例は、30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90, 又は95℃である。好ましいpH値及び温度は、生理学的範囲において、4, 5, 6, 7又は8のpH値及び30, 35, 37又は40℃の温度である。
【０１９５】
適切な酵素アッセイの例は、実験部分に包含さる。他の例は、プロテアーゼ及びアミラーゼ活性についてのFIP又はPh. Enr.アッセイである。それらのアッセイは、例えばそれぞれ、同時継続出願WO 2006/136160号及びWO 2006/136161号に記載される。
【０１９６】
薬剤：
本明細書においては、用語“薬剤”とは、疾病の徴候を処理し、予防し、そして/又は軽減する；好ましくは疾病の徴候を処理し、そして/又は軽減する、化合物、又は化合物の混合物を意味する。薬剤は、医者により処方され得るか、又はそれは店頭取引製品であり得る。
【０１９７】
医薬組成物：
本発明の酵素の単離、精製及び濃縮は、従来の手段により実施され得る。例えばそれらは、当業界において知られている種々の方法、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング及びサイズ排除）、電気泳動方法（例えば、分離用等電点電気泳動）、示差溶解性（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、SDS−PAGE又は抽出（但し、それらだけには限定されない）により精製され得る（例えば、Protein Purification, J.C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publlishers, New York, 1989を参照のこと）。
【０１９８】
配列番号２のリパーゼ、例えば配列番号１のリパーゼの変異体は、アメリカ特許第5,869,438号（ここで、配列番号１は、ここにおける配列番号２のリパーゼをコードするDNA配列である）に基づいて、すなわち前記アメリカ特許の配列番号１の修飾（この修飾は、ここにおける配列番号１と２との間のアミノ酸差異に影響を及ぼす）であるDNA配列の適切な宿主細胞における組換え発現により調製され得る。そのような修飾は、当業界において知られているように、特定部位の突然変異誘発により行われ得る。
【０１９９】
特定の態様においては、個々の酵素の濃縮された固体又は液体調製物は、別々に調製される。それらの濃縮物はまた、下記により詳細に説明されるように、少なくとも一部、別々に配合され得る。
【０２００】
さらなる特定の態様においては、酵素は、固体濃縮物の形で、本発明の医薬組成物に導入される。酵素は、当業界において知られているように、種々の方法により固体状態にされる。例えば、固体状態は、酵素が高度な規則形で配置されている結晶、又は酵素分子が低い程度の規則形か又は不規則な形で配置されている沈殿物のいずれかであり得る。
【０２０１】
結晶化は例えば、EP691982号に記載されているように酵素のpIに近いpHで、及び例えば10mS/cm又はそれ以下の低い導電率で行われ得る。特定の態様においては、本発明に従っての使用のためのリパーゼは、EP600868B1の例１に記載のようにして調製され得る結晶性リパーゼである。さらに、リパーゼ結晶は、WO2006/044529号に記載のようにして架橋をされ得る。
【０２０２】
種々の沈殿方法、例えば塩、例えば硫酸アンモニウム及び/又は硫酸ナトリウムによる；有機溶媒、例えばエタノール及び/又はイソプロパノールによる；又はポリマー、例えばPEG（ポリエチレングリコール）による沈殿が当業界において知られている。他においては、酵素は、当業界において知られている種々の方法、例えば凍結乾燥、蒸発（例えば、減圧下で）、及び/又は噴霧乾燥により、溶媒（典型的には、水）を除去することにより、溶液から沈殿され得る。
【０２０３】
さらなる特定の態様においては、酵素の固体濃縮物は、その固体濃縮物の合計タンパク質用量に対して、少なくとも50％（w/w）の含有率の活性酵素のタンパク質を有する。さらなる特定の態様においては、固体濃縮物の合計タンパク質含有率に対して、活性酵素のタンパク質の含有率は、少なくとも55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 又は95%(w/w)である。タンパク質含有率は、BIO-RADからのGS-800校正密度計を用いて、クーマシー染色されたSDS−PAGEゲルの濃度計走査により；Rocheから市販されている、市販のキット、例えばProtein Assay ESL（注文番号1767003）を用いて；又はWO01/58276号の例８に記載される方法に基づいて、当業界において知られているようにして測定され得る。
【０２０４】
好ましくは、プロテアーゼ酵素タンパク質は、クーマシー染色されたSDS−PAGEゲルの濃度計走査により測定される場合、少なくとも50％、より好ましくは少なくとも55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 又は97%の本発明への使用のための固体プロテアーゼ濃縮物のタンパク質範囲を構成する。アスペルギラスにおいて発現され、そして例５において説明されるようにして、配列番号１の種々のN-末端形の混合物を含んで成るリパーゼに関しては、SDS−PAGEゲル上での適切なバンドは、34−40kDaの分子量に対応して位置する。グリコシル化されていない変異体、例えば配列番号１のN33Q(LV2934)に関しては、適切なバシドは、30kDa近くで位置する。
【０２０５】
本発明の医薬組成物は、少なくとも１つの医薬的に許容できる助剤、又は補助材料、例えば（i）少なくとも１つのキャリヤー及び/又は賦形剤；又は（ii）少なくとも１つのキャリヤー、賦形剤、希釈剤及び/又はアジュバントと共に、好ましくは濃縮された酵素調製物、好ましくは固体の濃縮物の形で、酵素を含んで成る。任意の他の成分の非制限的な例（すべては医薬的に許容できる）は、すべて医薬的に許容できる、砕解剤、滑剤、緩衝剤、保湿剤、保存剤、風味剤、溶媒、可溶化剤、沈殿防止剤、乳化剤、安定剤、推進薬及びビークルである。
【０２０６】
一般的に、問題の医学的徴候に依存して、本発明の組成物は、当業界において知られているすべての投与の態様、好ましくは例えば、腸内投与（消化管を通して）のために企画され得る。従って、組成物は、固体、半固体、液体又は気体形、例えば錠剤、カプセル、粉末、顆粒、微小球体、軟骨、クリーム、発泡体、液体、坐剤、注射、吸入、ゲル、ローション及びエアロゾルの形であり得る。医者は、最も適切な投与路を選択し、そしてもちろん、危険な又は他方では、不都合な投与路を実質的に回避することを知っているであろう。
従って、次の方法及び補助材料は単なる例示であり、そして制限的ではない。
【０２０７】
固体経口制剤に関しては、酵素は、ペレット、微小ペレット、錠剤、微小錠剤、粉末、顆粒又はカプセルを製造するために、単独で、又は例えば従来のキャリヤー、例えば結晶性又は微結晶性セルロース、セルロース誘導体、アカシア、トウモロコシ澱粉又はゼラチン；砕解剤、例えばトウモロコシ澱粉、ジャガイモ澱粉又はナトリウムカルボキシメチルセルロース；滑剤、例えばカルナバ蝋、ホワイト蝋、セラック、水を含まないコロイド状シリカ、ポリエチレングリコール（PEG, またマクロゲルとして知られている）1500〜20000、特にPEG4000, PEG6000, PEG8000, ボビドン、タルク、モノレイン又はステアリン酸マグネシウム；及び所望には、希釈剤、アジュバント、緩衝剤、保湿剤、保存剤、例えばメチルパラヒドロキシペンゾエート（E218）、着色剤、例えば二酸化チタン（E171）と共に、適切な添加剤と組合して使用され得る。経口製剤は、PEIの医学的徴候の処理のための好ましい製剤の例である。
【０２０８】
酵素はまた、一般的には、水性溶媒、例えば水、又は非水性溶媒、例えば植物油又は他の類似する油、合成脂肪酸グリセリド、高脂肪酸のエステル、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、例えばPEG4000又は低級アルコール、例えば線状又は枝分かれC1-C4アルコール、例えば２−プロパノール；及び所望には、従来の補助材料又は添加剤、例えば溶解剤、アジュバント、希釈材、等張剤、沈殿防止剤、乳化剤、安定剤及び保存剤に、それらを溶解し、懸濁し、又は乳化することにより、液体経口製剤に配合され得る。
【０２０９】
さらに、酵素は一般的に、種々の塩基と共に混合し、例えば塩基又は水溶性塩基を乳化することにより、直腸投与のための坐薬に製造され得る。坐薬は、室温で固化されるが、体温で溶融する、ビークル、例えばココアバター、カルボワックス及びポリエチレングリコールを含むことができる。
【０２１０】
供給ビークルとしてのリポソームの使用は、可能性ある一般的な興味のもう１つの方法である。リポソームは、標的部位の細胞と融合し、そして内腔の内容物を細胞内に供給する。リポソームは、接触を維持するために種々の手段、単離、結合剤及び同様のものを用いて、融合のために十分な時間、細胞と接触して維持される。リポソームは、膜の融合に介在する精製されたタンパク質又はペプチド、例えばSendaiウィルス又はインフルエンザウィルス、等により調製され得る。脂質は、既知のリポソーム形成脂質、例えばカチオン性又は両性イオン脂質、例えばホスファチジルコリンのいずれかの有用な組合せであり得る。残る脂質は通常、中性又は酸性脂質、例えばコレステロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール及び同様のものであろう。リポソームを調製するためには、Kato et al. (1991 ) J. Biol. Chem. 266:3361により記載される方法が使用され得る。
【０２１１】
経口又は直腸投与のための単位用量形、例えばシロップ、エリキシル、粉末及び懸濁液が供給され得、ここで個々の用量単位、例えばカプセル、錠剤又は坐剤は、予定された量の組成物を含む。同様に、注射のための単位用量形又は静脈内投与は、無菌水、通常の塩溶液又はもう１つの医薬的に許容できるキャリヤーに溶液としての組成物に酵素を含んで成ることができる。
【０２１２】
用語“単位用量形”とは、本明細書において使用される場合、ヒト及び動物対象のための単位用量として適切な、生理学的に別々の単位を言及し、個々の単位は、所望する効果を生成するのに十分な量で、予測される量の酵素を含む。
特定の態様においては、本発明の医薬組成物は、腸、好ましくは経口投与のためである。
【０２１３】
さらなる特定の態様においては、経口組成物は、（i）酵素結晶を含む液体組成物；（ii）(高く)精製された酵素の沈殿物の液体懸濁液；（iii）固体形又は溶解された形で酵素を含むゲル：（iv）固定された酵素又は粒子及び同様のものに吸着された酵素の液体懸濁液；又は（v）酵素含有の粉末、ペレット、顆粒又は微小球の形、所望には、酸安定性被膜により任意に被覆される、錠剤、カプセル又は同様のものの形での固体組成物である。
【０２１４】
組成物のもう１つの特定の態様においては、酵素は区分され、すなわち分離用被膜によりお互い分離される。
組成物のさらなる特定の態様においては、プロテアーゼは、組成物中の他の酵素成分、例えばリパーゼ及び/又はアミラーゼから分離される。
【０２１５】
酵素の投与量は、投与される特定の酵素、投与の頻度、投与の態様、徴候の重症度、及び副作用に対する対象の感受性、及び同様のものに依存して、広く変化することであろう。特定の酵素のいくつかが、他のものより有能であり得る。
【０２１６】
本発明の酵素の固体経口製剤の例は、次のものを含んで成る：（i）本発明のリパーゼ；（ii）ａ）配列番号３のアミノ酸１−274を有するプロテアーゼ、ｂ）配列番号４のアミノ酸１−188を有するプロテアーゼ、及びｃ）配列番号５のアミノ酸１−188を有するプロテアーゼ、から成る群から選択されたプロテアーゼに対して少なくとも70％の同一性を有するプロテアーゼ；及び/又は（iii）ａ）配列番号６のアミノ酸１−481を有するアミラーゼ、ｂ）配列番号７のアミノ酸１−481を有するアミラーゼ、及びｃ）配列番号８のアミノ酸１−483を有するアミラーゼ、から成る群から選択されたアミラーゼに対して少なくとも70％の同一性を有するアミラーゼ；ここで好ましくは、（i）, (ii)及び（iii）の酵素の予測される毎日の臨床学的投与量は次の通りである（すべては、mg酵素タンパク質/kg体重（bw）である）：（i）のリパーゼに関しては、0.01-1000, 0.05-500, 0.1-250,又は 0.5-100mg/kg（bw）；（ii）のアミラーゼに関しては、0.001-250, 0.005-100, 0.01-50, 又は0.05-10mg/kg（bw）；（iii）のプロテアーゼに関しては、0.005-500, 0.01-250, 0.05-100,又は 0.1-50mg/kg（bw）；である。
【０２１７】
本発明の酵素の固体経口製剤の好ましい例は、（i）本発明のリパーゼ；及び（ii）；配列番号６のアミノ酸1−481を含んで成るアミラーゼ及び/又は（iii）配列番号３のアミノ酸1−274を含んで成る、好ましくは有するプロテアーゼを含んで成る。
【０２１８】
予測される毎日の臨床学的投与量は次の通りである（すべては、mg酵素タンパク質/kg体重（bw）である）：（i）のリパーゼに関しては、0.1-250, 0.5-100, 又は1-50mg/kg（bw）；（ii）のアミラーゼに関しては、0.01-50, 0.05-10, 又は0.1-5mg/kg（bw）；（iii）のプロテアーゼに関しては、0.05-100, 0.1-50, 又は 0.5-25 mg/kg（bw）である。
アミド（ペプチド）結合、及びアミノ及びカルボキシ末端は、経口投与に対してより高い安定性に修飾され得る。カルボキシ末端はアミド化され得る。
【０２１９】
消化異常、PEI、膵炎、嚢胞性線維症、I型及びII型糖尿病の処理のための適切な本発明の医薬組成物の特定の態様は、本発明の酵素をペレット中に導入することにより調製され得る。ペレットは一般的に、10〜90％（w/w, 得られるペレットの乾量に対して）の生理学的に許容できる有機ポリマー、10〜90％（w/w, 得られるペレットの乾量に対して）のセルロース又はセルロース誘導体、及び80〜20％（w/w, 得られるペレットの乾量に対して）の酵素を含んで成り、ここで前記有機ポリマー、セルロース誘導体及び酵素の合計量は、それぞれの場合、100％に近づく。
【０２２０】
生理学的に許容できる有機ポリマーは、ポリエチレングリコール1500、ポリエチレングリコール2000、ポリエチレングリコール3000、ポリエチレングリコール4000、ポリエチレングリコール6000、ポリエチレングリコール8000、ポリエチレングリコール10000、ポリエチレングリコール20000、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリオキシエチレン、ポリオキシエチレン/ポリオキシプロピレンのコポリマー、及び前記有機ポリマーの混合物から成る群から選択され得る。ポリエチレングリコール4000が、生理学的に許容できる有機ポリマーとして好ましい。
【０２２１】
セルロース又はセルロース誘導体は、セルロース酢酸セルロース、セルロース脂肪酸エステル、硝酸セルロース、セルロースエーテル、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、メチルエチルセルロース、及びメチルヒドロキシプロピルセルロースから選択され得る。セルロース、特に微晶性セルロースが、セルロース又はセルロース誘導体として好ましい。
【０２２２】
得られるペレットは、適切な腸溶性被膜、他の非機能的被膜により被覆されるか、又はそのような被膜なしに、直接的に使用され得る。さらに、得られるペレットは、上記に詳細に記載されたように、障害又は疾病の治療のために適切なサイズのカプセル、例えばハードゼラチンカプセル又はゼラチンフリーのカプセル中に充填され得る。本発明の態様においては、異なった酵素型、特にリパーゼ、プロテアーゼ及び/又はアミラーゼから生成されたペレットが、前記カプセル中に充填され得る。異なった酵素型によりカプセルを充填したが、単一酵素型（すなわち、リパーゼ、プロテアーゼ又はアミラーゼ）の用量が、特定された量のいずれかのリパーゼ、プロテアーゼ及び/又はアミラーゼをカプセルに添加することにより、一定の徴候グループ又は一定の患者サブグループの特定の必要性に適合され得、すなわちリパーゼ：プロテアーゼ：アミラーゼのそれらの特定の比率で変化するカプセルが生成され得る。
【０２２３】
本発明のリパーゼの好ましい医薬組成物、特に本明細書において言及された好ましい賦形剤を含んで成る配合物が、WO2005/092370号に記載されている。特に好ましい態様においては、医薬組成物は、モノ−、ジ−及びトリ−アシルグリセルド及びポリエチレングリコール（PEG）のマイクロゲルグリセリド混合物、脂肪族C6-C22 カルボン酸のモノ−及びジ−エステル、及びまた、たぶん低割合のグリセロール及び遊離ポリエチレングリコールを含んで成る。
【０２２４】
マイクロゲルグリセリド混合物に含まれるポリエチレングリコール（PEG）は好ましくは、分子当たり平均して６〜多くとも40の酸化エチレン単位、又は200〜2000の分子量を有するPEGである。
【０２２５】
本発明のもう１つのさらなる観点は、界面活性剤、補助−界面活性剤及び親油性相から成る、10以上から又は10に等しいLVB値（親水性−親油性バラシス）及び30℃以上か又は30℃に等しい融点を有するシステムを含んで成る、本発明の酵素の医薬組成物を提供する。好ましい態様においては、前記システムは、10〜16好ましくは12〜15のLVB値を有し、そして30〜600℃の融点を有する。特に、LVB値及び融点により特徴づけられるシステムは、モノ−、ジー及びトリグリセリド及びポリエチレングリコール（PEG）のモノ−及びジエステルと、8〜24、好ましくは8〜18個の炭素原子を有する脂肪族カルボン酸との混合物であり、それにより、前記ポリエチレングリコールは、好ましくは、分子当たり約６〜約32の酸化エチレン単離を有し、そして前記システムは任意には、遊離グリセリン及び/又は遊離ポリエチレングリコールを含む。そのようなシステムのLVB値は好ましくは、PEGの鎖長により調節される。そのようなシステムの融点は、脂肪酸の鎖長、PEGの鎖長及び脂肪酸鎖の飽和の程度、及び従って、マクロゲルグリセリド混合物の調製のための出発油により調節される。
【０２２６】
“脂肪族C8-C18カルボン酸”とは、カプリル酸（C8）、カプリン酸（C10)、ラウリン酸（C12), ミリスチン酸（C14）、パルミチン酸（C16）及びステアリン酸（C18）が、それらの酸が飽和化される場合、有意な及び種々の割合で含まれる混合物、及びその対応する不飽和C8-C18カルボン酸を表す。それらの脂肪酸の割合は、出発油に従って変化できる。
【０２２７】
モノ−、ジ−及びトリアシルグリセリド及びポリエチレングリコール（PEG）のモノ−及びジエステルと、８〜18個の炭素原子を有する脂肪族カルボン酸とのそのような混合物は、例えば200〜1500の分子量を有するポリエチレングリコールと出発油との間の反応により得られ、ここで前記出発油はカプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸及びリノレン酸を、個々に含むか又は混合物として含む群から選択される脂肪酸とのトリグリセリド混合物から成る。任意には、そのような反応の生成物はまた、低い割合のグリセリン及び遊離ポリエチレングリコールを含むことができる。
【０２２８】
そのような混合物は、商品名Gelucire（商標）として市販されている。本発明の１つの好都合な態様は、商品名Gelucire（商標）として知られている製品のうち、特に“Gelucire（商標）50/13”及び/又は“Gelucire（商標）44/14”が本発明の医薬製剤への使用のための適切な混合物を表すことを提供する。
【０２２９】
Gelucire（商標）50/13は、モノ−、ジ及びトリグリセリド及びポリエチレングリコールのモノ−及びジエステルと、それぞれ結合された脂肪酸の主要割合を生成する、40％〜50％及び48％〜58％でのパルミチル酸（C15）及びステアリン酸（C18）との混合物である。カプリ酸（C8）及びカプリン酸（C10）の割合は個々の場合、３％以下であり、そしてラウリン酸（C12）及びミリスチン酸（C14）の割合は個々の場合、５％以下である。
【０２３０】
Gelucire（商標）44/14は、モノ−、ジ−及びトリアシルグリセリド及びポリエチレングリコールのモノ−及びジエステルの混合物であり、パルミチン酸（C16）のそれぞれの割合は４〜25％であり、ステアリン酸（C18）は５〜35％であり、カプリル酸（C8）は15％以下であり、カプリン酸（C10）は12％以下であり、ラウリン酸（C12）は30〜50％であり、そしてミリスチン酸（C14）は５〜25％である。Gelucire（商標）44/14は、例えばヤシ油及びポリエチレングリコール1500を用いてのアルコール分解/エステル化反応により調製され得る。
【０２３１】
本発明の好ましい態様は、モノ、ジ−及びトリグリセリド及びポリエチレングリコールの混合物、脂肪酸C8-C18カルボン酸のモノ−及びジエステル、及びまた、たぶん低い割合のグリセリン及び遊離ポリエチレングリコールを含むシステムを含んで成る、本発明の酵素の医薬組成物を提供し、ここで前記システムは、40℃〜55℃の融点及び12〜15の範囲のLVB値を有する。より好ましくは、システムは、44℃〜50℃の融点及び13〜14の範囲のLVB値を有する。他方では、システムは、約44℃の融点及び14のLVB値を有し、又はシステム約50℃の融点及び13のLVB値を有する。
【０２３２】
処理方法：
本発明のリパーゼは、任意には、プロテアーゼ及び/又はアミラーゼ（本発明の酵素）と組合して、動物における種々の疾病又は障害及び/又は予防処理において有用である。用語、動物とは、すべての動物及び特にヒトを包含する。動物の例は、非反芻動物、及び反芻動物、例えば、羊、ヤギ、及び牛、例えば蓄牛、及び乳牛及び子牛を包含する。特定の態様においては、動物は非反芻動物である。非反芻動物は、単一の胃を有する動物、例えば馬、ブタ（子ブタ、成長しているブタ及び雌ブタを包含するが、但しそれらだけには限定されない）；家禽類、例えば七面鳥、鴨及び鶏（ブロイラー鶏、産卵鶏を包含するが、但しそれらだけには限定されない）；子牛；ペット、例えばネコ及び犬；及び魚（サケ、マス、ティラピア、ナマズ、及び鯉を包含するが、但しそれだけには限定されない）；及び甲殻類（小エビ及び車えびを包含するが、但しそれだけには限定されない）を包含する。特定の態様においては、動物は哺乳類、より特定にはヒトである。
【０２３３】
例えば、酵素は、消化障害、例えば胃及び膵臓から通常分泌される消化酵素の胃腸管への不十分な生成及び/又は分泌により、しばしば引起される消化不良の処理において有用である。
【０２３４】
さらに、酵素PEIの処理において特に有用である。PEIは、Borgstrom 試験 (JOP. J Pancreas (Online) 2002; 3(5): 116-125)を用いて確かめられ得、そしてそれは、疾病及び病状、例えば膵癌、膵臓及び/又は胃の手術、例えば膵臓の全体的又は部分的切開、胃切除、後胃腸バイパス手術（例えば、Billroch II胃腸切断）；慢性膵炎；Shwachman Diamond症候群；膵臓又は通常の胆管の管閉塞（例えば、新形成からの）；及び/又は嚢胞性繊維症（濃粘液が膵臓の管を阻止する固有の疾病）により引起され得る。酵素はまた、急性膵炎の処理においても有用である。
【０２３５】
消化障害に対する酵素の効果は、EP0600868号に一般的に記載のようにして、測定され、ここで例２は胃の条件下でのリパーゼ安定性試験を測定するためのインビトロ消化試験を記載し、そして例３は胆汁塩の存在下でのリパーゼ活性についてのインビトロ消化試験を記載する。対応する試験がプロテアーゼのために構築され得る。また、WO02/060474号は、適切な試験、例えば（１）ブタ試験飼料における脂質消化を測定するためのインビトロ試験、及び（２）脂肪、タンパク質及び澱粉の消化が測定される、膵臓不十分ブタによるインビボ試験を開示する。
【０２３６】
もう１つの例として、酵素は、I及び/又はII型糖尿病の処理において、特に後での合併症を低める観点から、通常この疾病に付随する消化障害の糖尿病治療における補助処理のために有用である。
【０２３７】
酵素の糖尿病に対する効果が、WO00/54799号に記載される１又は複数の方法により、例えばグリコシル化されたヘモグロビンのレベル、血液グルコースレベル、低血糖攻撃、脂溶性ビタミン、例えばビタミンA、D及びEの状態、インスリンの必要とされる毎日の用量、体重の基準及び高血糖期間を調節することにより決定され得る。
本明細書に記載される発明は、本明細書に開示される特許の態様により範囲を限定されるものではない。何故ならば、それらの態様は本発明のいくつかの観点を例示するものである。いずれかの同等の態様が本発明の範囲内で意図される。実際、本明細書に示され、そして記載されるそれらの修飾の他に、本発明の種々の修飾は、前述の記載から当業者に明らかになるであろう。そのような修飾はまた本発明の範囲内にある。
【０２３８】
特定の態様：
本発明はまた、配列番号２のアミノ酸1〜269の配列に比較して、請求項１〜２及び５〜９のいずれか１項記載の置換、例えば置換N33Q、T231R及びN233R、及び次のものから選択された少なくとも１つの追加の置換を含んで成る、薬剤として使用するためのリパーゼにも関する：E1*,D,N；Q4H,P,R；D5E；N8L,Q；Q9H；F10L; N11C,D,H,L,P,Q,R,S; G23E; N26A,H,I；D27I,N,Q,R,S,V; P29T; A30T,V; T37K,M; G38A,D,F,H,I,K,L,M,N,P,Q1S,T,W,Y; N39H,S; E43K;K46M; A49T; L52I,R; E56K,Q,R,S; D57G,N; V60E,S; G61R; V63R; A68V; L69I; N71I,S;N73Q,Y; I76T; R84E; I86F,L; E87A,H,K,R; I90L,V; G91A,C,E,F,K,L,M,N,S,T,V,W,Y; L93*,F;N94*K,Q,R,S;F95*;D96*,E,G,N,R,S,W,Y;L97M,Q;K98I,T;E99D;N101Q;D102E,G,Y;
R108M;G109A;D111A,E,N,S;G112A;T114I;S115L;W117C,D,E,F,G,H,I,K,L,P,S,T,V,Y;D122E,N;Q126L;V128A;D130H;H135D;P136H;Y138F;V141E,L;A150V;V154F,I,L;A155V;G156R;G161A,E;N162G,S,T;G163A,C,D,E,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;D167E;V168M;V176A,D,F,G,H,I,K,M,N,Q,T,W; G177A; R179T; L185M; G190C,D; N200Q,S; R205I;L206F; E210D,R,V,Y; S216P; E219D; G225P; T226N; L227F,G; P229R; E239D; G240L; D242E; T244S; G246A;Q249R;N251Q,S;D254A,G,I,K,L,M,N,R,Q,S,Y;I255A,F;P256A,F,G,H,I,L,M,N,Q,S,T,V,W,Y; 及び L269F,H；前記リパーゼはさらに、
【０２３９】
（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜269の配列に対して少なくとも50％の同一性を有し；
（ｂ）非常に低い（好ましくは、低い、中位の、中位の高い、高い、又は最も好ましくは非常に高い）緊縮条件下で、（i）引用により本明細書に組込まれるアメリカ特許第5,869,438号の配列番号１のコード配列（配列番号２のリパーゼをコードするDNA配列）、又は(ii)(i)の十分の長さの相補鎖とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ；そして/又は
（ｃ）さらに、好ましくは保存性質の、配列番号１の成熟ポリペプチドの１又は複数（例えば、いくつかの）のアミノ酸の置換、欠失及び/又は挿入を含んで成る変異体である。
【０２４０】
非常に低い〜非常に高い緊縮条件は、５×SSPE、0.3％SDS、200μg/mlの剪断され、そして変性されたサケ精子DNA、及び25％ホルムアミド（非常に低い及び低い緊縮性）、35％ホルムアミド（中位のおよび中位の高い緊縮性）、又は50％ホルムアミド（高い及び非常に高い緊縮性）において、標準のサザンブロット方法に従って、最適には12〜24時間、42℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションとして定義される。キャリヤー材料は最終的に、２×SSC, 0.2％SDSを用いて、好ましくは45℃（非常に低い緊縮性）、より好ましくは50℃（低い緊縮性）、より好ましくは55℃（中位の緊縮性）、より好ましくは60℃（中位の高い緊縮性）、さらにより好ましくは65℃（高い緊縮性）、及び最も好ましくは70℃（非常に高い緊縮性）で、それぞれ15分間、３度、洗浄される。
【０２４１】
保存性質のアミノ酸変化は、タンパク質の折りたたみ及び/又は活性に有意に影響を与えず、そして典型的には１〜約30個のアミノ酸の小さな欠失；小さなアミノ−又はカルボキシル−末端拡張、例えばアミノ末端メチオニン残基；約20〜25個までの残基の小さなリンカーペプチド；又は実効電荷又は他の機能、例えばポリ−ヒスチジン路、高原性エピトープ又は結合ドメインを変えることにより精製を促進する小さな拡張を包含する。
【０２４２】
さらに、本発明は、親酵素における１又は複数の位置に対応する１又は複数の位置で変更を含んで成る、薬剤として使用のための親リパーゼの変異体に関し、ここで
（ａ）前記変更は独立して、
（i）前記位置のすぐ下流のアミノ酸の挿入、
（ii）前記位置を占有するアミノ酸の欠失、及び/又は
（iii）前記位置を占有するアミノ酸の置換であり；
（ｂ）前記変更は、請求項１〜２及び５〜９のいずれか１項記載の変更から選択され；
（ｃ）前記変異体は、リパーゼ活性を有し；そして
（ｄ）個々の位置は、配列番号２のアミノ酸配列を有する酵素のアミノ酸配列の位置に対応する。
【０２４３】
特定の態様においては、変異体及び/又は親は、配列番号２のアミノ酸１〜269の配列に対して少なくとも50％の同一性を有する。
【０２４４】
変異体における変更の合計数は好ましくは、22, 21, 20, 19, 18, 17及び16である。より好ましくは、変更の合計数は、15、さらにより好ましくは14、さらにより好ましくは13、さらにより好ましくは12、さらにより好ましくは11、さらにより好ましくは10、さらにより好ましくは9、さらにより好ましくは8、さらにより好ましくは7、さらにより好ましくは6、さらにより好ましくは5、さらにより好ましくは6、さらにより好ましくは7、さらにより好ましくは6、さらにより好ましくは5、さらにより好ましくは5、さらにより好ましくは4、さらにより好ましくは4、さらにより好ましくは3、さらにより好ましくは2、及び最も好ましくは１である。
【０２４５】
変異体は、１又は複数の相同親リパーゼをコードする１又は複数のポリヌクレオチドをシャフリングすることにより生成され得る。用語“シャフリング”とは、出発ヌクレオチド配列に比較して、交換された多くのヌクレオチドを有する、組換えされたヌクレオチド配列（すなわち、シャフリングサイクルにゆだねられたヌクレオチド配列）をもたらす、複数の相同ヌクレオチド配列間のヌクレオチド配列の組換えを意味する。
【０２４６】
配列番号２のリパーゼの次の変異体が、請求項６及び９記載のリパーゼの例である；
LVA012
=LVA013 D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T;
LVA023 N33Q+E210D+T231R+N233R; 
LVA041 N33Q+D111A+T231R+N233R;
LVA043 N33Q+G91T+T231R+N233R;
LVA055 N33Q+E219D+T231R+N233R;
LVA060 N33Q+W117L+T231R+N233R;
LVA061 D27Q+N33Q+T231R+N233R; 
LVA063 N33Q+G91T+T231R+N233R;
LVA089 D27S+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+N233R+P256T;
LVA094 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+T231R+N233R+P256T;
LVA099 D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVA103 Q4R+N33Q+T231R+N233R; 
LVA113 N33Q+T231R+N233R+Q249R;
LVA120 N33Q+D96W+T231R+N233R;
【０２４７】
LVA129 D27V+N33Q+V60S+D96W+T231R+N233R+Q249R;
LVA130 D27V+N33Q+V60S+T231R+N233R+Q249R;
LVA139 Q9H+N33Q+D102E+T231R+N233R; 
LVA140 N33Q+D111E+T231R+N233R;
LVA143 N33Q+D122E+T231R+N233R;
LVA147 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVA162 N33Q+D167E+T231R+N233R;
LVA179 N33Q+G91N+T231R+N233R; 
LVA180 N33Q+T231R+N233R+P256T;
LVA182
D27R+N33Q+G91 A+L93*+N94*+F95*+D96*+D111A+T231R+N233R+P256T;
LVA185 N11R+N33Q+T231R+N233R;
LVA198 N33Q+N39H+T231R+N233R; 
LVA202 N33Q+P229R+T231R+N233R; 
LVA206 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+G163K+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVA208 N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R;
【０２４８】
LVA210 D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVA211 D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+N233R+P256T;
LVA214 N33Q+E87A+T231R+N233R;
LVA216 N33Q+E56Q+T231R+N233R;
LVA217 N33Q+E210V+T231R+N233R; 
LVA218 N33Q+E56K+T231R+N233R;
LVA220 N33Q+T231R+N233R+D254G;
LVA221 N33Q+D96S+T231R+N233R;
LVA222 N33Q+D122N+T231R+N233R;
LVA228 N26A+N33Q+T231R+N233R; 
LVA229 N33Q+N162T+T231R+N233R;
LVA230 N33Q+A150V+N162G+T231R+N233R;
LVA231 N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R;
LVA234 N33Q+T231R+N233R+G240L;
LVA238 D27R+N33Q+G91A+D96E+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T; 
【０２４９】
LVA241 D27R+N33Q+G91A+N94S+D111A+T231R+N233R+P256T;
LVA243 N33Q+N200S+T231R+N233R;
LVA245 N33Q+N39S+T231R+N233R;
LVA247 N33Q+E210R+T231R+N233R;
LVA248 N33Q+N39H+T231R+N233R+D254R; 
LVA249 N33Q+T231R+N233R+D254R;
LVA250 N33Q+N94R+T231R+N233R;
LVA252 N33Q+D96R+T231R+N233R;
LVA254 D27N+N33Q+T231R+N233R;
LVA256 D27N+N33Q+E56R+T231R+N233R; 
LVA257 N33Q+L227F+T231R+N233R;
LVA272 N33Q+N73Y+G225P+T231R+N233R;
LVA273 N33Q+G225P+T231R+N233R;
LVA275 N33Q+T231R+N233R+D254S;
LVA277 N33Q+D96G+T231R+N233R; 
【０２５０】
LVA279 N33Q+D96N+T231R+N233R+D254S; 
LVA280 N33Q+T231R+N233R+D254G;
LVA281 N33Q+D130H+T231R+N233R;
LVA284 N33Q+E87A+T231R+N233R;
LVA287 N33Q+T231R+N233R+E239D; 
LVA307 N33Q+D111A+T231R+N233R+D254G;
LVA308 N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S;
LVA310 N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S;
LVA315 N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G;
LVA317 N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S; 
LVA319 N11R+N33Q+G91T+G163K+T231 R+N233R+D254S;
LVA325 Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVA327 N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R;
LVA330 Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+E210D+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVA331 Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
【０２５１】
LVA333 N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R+P256T;
LVA334 N33Q+G177A+T231R+N233R; 
LVA338 N33Q+T231R+N233R+G246A;
LVA341 D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA345 D27Q+N33Q+G91T+G163K+E219D+T231R+N233R;
LVA347 N33Q+G91T+E219D+T231R+N233R;
LVA349 K98I+T231R+N233R+N251S; 
LVA353 N33Q+G163R+T231R+N233R;
LVA355 N33Q+G163N+T231R+N233R;
LVA357 N33Q+G163C+T231R+N233R;
LVA359 N33Q+G163Q+T231R+N233R;
LVA360 =LVA415 N33Q+G163E+T231R+N233R;
LVA362 N33Q+G163H+T231R+N233R;
LVA364 N33Q+G163I+T231R+N233R;
LVA368 N33Q+G163P+T231R+N233R;
【０２５２】
LVA370 N33Q+G163D+T231R+N233R; 
LVA371 N33Q+G91K+T231R+N233R; 
LVA373 N33Q+G91M+T231R+N233R;
LVA375 N33Q+G91F+T231R+N233R;
LVA379 N33Q+G91S+T231R+N233R;
LVA381 N33Q+G91W+T231R+N233R; 
LVA383 N33Q+G91Y+T231R+N233R;
LVA387 N33Q+G163T+T231R+N233R;
LVA389 N33Q+G163W+T231 R+N233R;
LVA391 N33Q+G163Y+T231R+N233R;
LVA393 N33Q+G163V+T231R+N233R; 
LVA399 N33Q+G91C+T231R+N233R;
LVA411 N33Q+G91 Y+Q126L+T231R+N233R;
LVA412 N33Q+G91M+G161 E+T231R+N233R;
【０２５３】
LVA413
=LVA414 N33Q+V128A+T231R+N233R; 
LVA416 N33Q+G163V+L185M+T231R+N233R;
LVA417 N33Q+G38A+T231R+N233R;
LVA420 N33Q+G163A+T231R+N233R;
LVA421 N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R;
LVA437 N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R; 
LVA438 N33Q+G163M+T231R+N233R;
LVA440 N33Q+G91V+T231R+N233R;
LVA442 N33Q+D111A+T231R+N233R+Q249R;
LVA444 N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S;
LVA449 D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T; 
LVA450 D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T;
LVA451 N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S;
LVA453 N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+T231R+N233R;
LVA454 N33Q+W117L+T231R+N233R+D254S;
【０２５４】
LVA456 N33Q+T231R+N233R+P256T; 
LVA458 N33Q+T231R+N233R+D242E;
LVA460 N33Q+E87R+T231R+N233R;
LVA461 N33Q+E56R+T231R+N233R;
LVA463 N33Q+N162G+T231R+N233R;
LVA464 N33Q+G91L+T231R+N233R; 
LVA468 N33Q+E87H+T231R+N233R; 
LVA470 N33Q+D96N+T231R+N233R+Q249R;
LVA471 N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S;
LVA472 N33Q+L227F+T231R+N233R+D254S;
LVA473 D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T; 
LVA474 N33Q+G163A+T231R+N233R;
LVA480 D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA482 N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R;
LVA483 N33Q+T231R+N233R+D254A;
【０２５５】
LVA484 N33Q+T231R+N233R+D254N; 
LVA486 N33Q+T231R+N233R+D254Q;
LVA488 N33Q+T231R+N233R+D254I;
LVA490 N33Q+T231R+N233R+D254L;
LVA492 N33Q+T231R+N233R+D254K;
LVA494 N33Q+T231R+N233R+D254M; 
LVA503 N33Q+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R;
LVA505 D27V+N33Q+V60S+G91T+D96W+T231R+N233R+Q249R;
LVA506 N33Q+D96N+L227G+T231R+N233R+Q249R;
LVA507 D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R;
LVA509 D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R; 
LVA512 N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R;
LVA513 D27Q+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R;
LVA516 N33Q+W117L+L227G+T231R+N233R+Q249R;
LVA518 D5E+N33Q+W117L+L227G+T231R+N233R+Q249R;
LVA519 D27Q+N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R; 
【０２５６】
LVA520 N33Q+D96E+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R;
LVA523 D27R+N33Q+E56K+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVA526 D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T; 
LVA527 D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA530 D27R+N33Q+E56S+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVA532 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T; 
LVA535 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA540 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+A155V+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T; 
LVA542 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA547 N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S;
LVA548 N33Q+D111A+W117L+T231R+N233R+D254S;
LVA553 N33Q+T231R+N233R+P256A; 
LVA555 N33Q+T231R+N233R+P256N;
LVA561 N33Q+T231R+N233R+P256G;
LVA562 N33Q+T231R+N233R+P256H;
【０２５７】
LVA564 N33Q+T231R+N233R+P256L;
LVA565 N33Q+T231R+N233R+P256M; 
LVA566 N33Q+T231R+N233R+P256S;
LVA567 N33Q+T231R+N233R+P256W;
LVA569 N33Q+T231R+N233R+P256Y;
LVA576 N33Q+T231R+N233R+P256F;
LVA578 N33Q+T231R+N233R+P256V; 
LVA580 N33Q+G91M+G163W+T231R+N233R;
LVA581 N33Q+G91M+G163T+T231R+N233R;
LVA582 N33Q+G91M+G163D+T231R+N233R;
LVA583 N33Q+G91K+G163W+T231R+N233R;
LVA586 N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R; 
LVA602 N33Q+V176N+T231R+N233R;
LVA604 N33Q+V176D+T231R+N233R;
LVA614 N33Q+W117F+T231R+N233R;
【０２５８】
LVA620 N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S;
LVA622 N33Q+V176I+T231R+N233R; 
LVA623 N33Q+D111N+T231R+N233R;
LVA627 N33Q+D111N+G225P+T231R+N233R;
LVA629 N33Q+D111N+S216P+T231R+N233R;
LVA631 D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R;
LVA632 N33Q+G91M+G163P+T231R+N233R; 
LVA634 N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R; 
LVA639 N33Q+W117D+T231R+N233R;
LVA640 N33Q+W117H+T231R+N233R;
LVA649
=LVA650 N33Q+W117C+T231R+N233R; 
LVA651 N33Q+W117K+T231R+N233R;
LVA653 N33Q+W117V+T231R+N233R;
LVA656 N11S+N33Q+T231R+N233R;
【０２５９】
LVA658 N33Q+W117E+V176K+T231R+N233R;
LVA659 N33Q+W117G+T231R+N233R; 
LVA664 N33Q+W117P+T231R+N233R;
LVA665 N33Q+W117S+T231R+N233R;
LVA666 N33Q+W117T+T231R+N233R;
LVA667 N33Q+W117I+T231R+N233R;
LVA670 D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S; 
LVA672 N33Q+S115L+T231R+N233R;
LVA675 N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA696 N33Q+V176M+T231R+N233R;
LVA697 N33Q+V176H+T231R+N233R;
LVA700 N33Q+V176A+T231R+N233R; 
LVA702 D27V+N33Q+L227F+T231R+N233R+Q249R;
LVA705 N33Q+W117Y+T231R+N233R;
LVA707 N33Q+W117Y+V176D+T231R+N233R;
【０２６０】
LVA713 D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R;
LVA714 =LVAR714 D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S;
LVA715 D27R+N33Q+P136H+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
LVA718 N11R+N33Q+T231R+N233R+T244S;
LVA721 N33Q+G91T+D96N+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S; 
LVA722 N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S;
LVA723 N33Q+G161A+T231 R+N233R;
LVA731 N33Q+G38I+G177A+T231R+N233R;
LVA732 N33Q+N101Q+T231R+N233R;
LVA733 N33Q+N94Q+T231R+N233R; 
LVA734 N33Q+G161A+T231 R+N233R; 
LVA736 N11 Q+N33Q+T23 R+N233R;
LVA738 N8Q+N33Q+T231R+N233R;
LVA740 N33Q+T231R+N233R+N251Q;
LVA743 N33Q+N200Q+T231R+N233R; 
【０２６１】
LVA744 N33Q+G177A+T231R+N233R;
LVA746 N33Q+N73Q+T231R+N233R;
LVA749 N33Q+I86L+T231R+N233R;
LVA753 N33Q+K98I+G163K+T231R+N233R;
LVA754 D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T; 
LVA755 D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163A+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA770 D27R+N33Q+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R;
LVA771 N33Q+K98I+G163K+N200Q+T231R+N233R+N251S;
LVA772 N33Q+G38S+G163K+T231R+N233R;
LVA773 D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T; 
LVA774 N33Q+G38Y+T231R+N233R;
LVA777 D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVA778 D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVA782 N33Q+G38N+N73Q+T231 R+N233R;
LVA783 N33Q+G38D+R84E+T231 R+N233R; 
【０２６２】
LVA784 N33Q+G38Q+T231R+N233R;
LVA786 N33Q+G38I+T231R+N233R;
LVA788 N33Q+G38K+T231R+N233R;
LVA792 N33Q+G38F+T231R+N233R;
LVA799 N33Q+G38H+N200Q+T231R+N233R+N251S; 
LVA800 N33Q+G38L+T231R+N233R;
LVA801 N33Q+G38M+T231R+N233R;
LVA803 N33Q+G38F+T231R+N233R;
LVA804 N33Q+G38P+T231R+N233R;
LVA805 N33Q+G38T+T231R+N233R; 
LVA806 N11R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA808 D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA809 N11R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA811 D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163A+T231R+N233R+D254S+P256T; 
LVA813 D27R+N33Q+V176Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
【０２６３】
LVA814 N33Q+W117I+V176Q+T231R+N233R+P256A;
LVA816 N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R+P256A;
LVA817 N33Q+W117I+V176Q+T231R+N233R;
LVA818 N33Q+G177A+T231R+N233R+G246A;
LVA819 E1N+N33Q+T231R+N233R;
LVA821 N33Q G38H T231R N233R;
LVA829
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S; 
LVA830 N11R+N33Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S;
LVA831 N33Q+K98I+T231R+N233R;
LVA834 D27R+N33Q+W117I+V176Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
LVA835 N11R+N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA839 N33Q+G163W+T231R+N233R;
LVA841 N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R;
LVA842 D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA844 N33Q+T231R+N233R+D254Q;
【０２６４】
LVA846 N11R+N33Q+G91T+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA847 N11R+N33Q+G91T+G163K+V176W+T231R+N233R+D254S;
LVA848
=LVA849 N33Q+G163D+T231R+N233R;
LVA850 N33Q+G163P+T231R+N233R;
LVA853 E1D+N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+T231R+N233R+D254S;
LVA857 N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+V176W+T231R+N233R;
LUA860 Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+L206F+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVA862
D27R+N33Q+T37K+N711+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T; 
LVA863 D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T; 
LVA865 N33Q+W117S+T231R+N233R;
LVA866 N33Q+G61R+V63R+G156R+V176W+T231R+N233R+P256I;
LVA869 N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R; 
LVA871 N33Q+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R; 
【０２６５】
LVA873 N33Q+G91T+N94S+D111A+G163T+V176W+T231R+N233R;
LVA875 N33Q+G91T+N94S+D111A+S115L+G163T+V176I+T231R+N233R;
LVA877 N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T; 
LVA878 D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA880 N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA882 D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D242E+D254S+P256T;
LVA883 D27R+N33Q+G38A+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA888 Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+E210D+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L; 
LVA890 N33Q+G38A+G91T+G163A+T231R+N233R+D254S;
LVA892 N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R+D254I;
LVA896 N11R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R;
LVA897 N11R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R+D254S;
LVA899 N11R+N33Q+E56Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S; 
LVA904 N11R+D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA906 N11R+N33Q+G38A+G91T+G112A+G163A+T231R+N233R+D254S;
LVA907 N11R+N33Q+G91T+G163K+E210D+T231R+N233R+D254S;
【０２６６】
LVA913 N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254I; 
LVA915 N11R+N33Q+G91T+G163K+V176T+T231R+N233R+D254S;
LVA917 N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S;
LVA919 N11R+N33Q+G91M+G163T+T231R+N233R+D254S;
LVA921 N11 R+N33Q+G38A+G91T+G163K+V176D+T231R+N233R+D254S;
LVA925 N33Q+E56Q+G156R+V176W+T231R+N233R; 
LVA927E1D+N33Q+G38A+G91T+N94R+D111A+W117L+V176W+T231 R+N233R;
LVA928 N33Q+G163K+G177A+T231R+N233R+G246A;
LVA929 N11R+N33Q+E56Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA930 N11R+N33Q+I90L+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA933 D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S+P256T; 
LVA934 D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+E219D+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA941 N11R+N33Q+I90L+G91T+N94S+D96E+G163K+T231R+N233R+D254S; 
LVA942 N11R+N33Q+G91T+G163K+V176I+T231R+N233R+D254S; 
LVA943 N11R+N33Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S; 
【０２６７】
LVA944 N11R+N33Q+G91T+G163A+V176T+T231R+N233R+D254S; 
LVA945 N11R+N33Q+G91T+G163L+V176I+T231R+N233R+D254S; 
LVA946 N11R+N33Q+G91T+G163L+V176T+T231R+N233R+D254S; 
LVA947 N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S; 
LVA948 N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S; 
LVA949 N11R+N33Q+G91T+G163P+V176I+T231R+N233R+D254S; 
LVA950 N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S+P256N; 
LVA952 D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S+P256T; 
LVA953 Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+G163A+E210V+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L;
LVA954 Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L;
LVA959 N33Q+E210Y+T231R+N233R+D254Y+I255F; 
LVA961 N33Q+L93F+D102Y+T231R+N233R; 
LVA962 D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S; 
LVA964 N11S+N33Q+T231R+N233R; 
LVA966 N11R+N33Q+T231R+N233R; 
【０２６８】
LVA968 N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S; 
LVA969 N33Q+W117Y+V176T+T231R+N233R; 
LVA970 N8L+N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S; 
LVA972 E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R; 
LVA973 N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S; 
LVA976 N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254A+P256F; 
LVA977 N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+P256F; 
LVA978 N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S+P256F; 
LVA979 N11R+N33Q+G38A+G91T+G156R+G163K+V176T+T231R+N233R+D254S; 
LVA980 N33Q+G91K+D96S+G163T+T231R+N233R+Q249R; 
LVA981 N11R+N33Q+G91T+G163N+T231R+N233R+D254S; 
LVA983 N11R+N33Q+G91T+G163T+T231R+N233R+D254S; 
LVA984 N11R+N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R+D254S; 
LVA985 N11R+N33Q+G91K+G163K+T231R+N233R+D254S; 
LVA987 N11R+G23E+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S; 
【０２６９】
LVA988 N11R+N33Q+G91T+V141E+G163K+T231R+N233R+D254S; 
LVA989 N11R+N33Q+L52R+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S; 
LVA990 N11R+N33Q+G91T+V141L+G163K+T231R+N233R+D254S; 
LVA991 N11R+N33Q+T37K+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S; 
LVA993 N11R+N33Q+A68V+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S; 
LVA994 N11R+N33Q+G91T+G163A+V176I+T231R+N233R+D254S; 
LVA995 N11R+N33Q+T37M+G91T+G163P+V176T+T231R+N233R+D254S; 
LVA997 N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S; 
LVA998 N11R+N33Q+G91T+G163K+T231 R+N233R+D254S+P256I; 
LVA999 N33Q+G38S+G 156R+G 163K+V176W+T231R+N233R; 
【０２７０】
LVA1000 N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163K+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA1002 N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S; 
LVA1003 N11R+N33Q+G38A+G91T+G163Q+V176G+T231R+N233R+D254S; 
LVA1004 N11R+N33Q+G38A+G91T+G163T+V176G+T231R+N233R+D254S; 
LVA1005 N11R+N33Q+G38A+G91T+N94R+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S; 
LVA1006 E1*+N11R+N33Q+G38A+G91N+N94R+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S;
LVA1007 E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R; 
LVA1008 E1N+F10L+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R; 
LVA1009 E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S; 
LVA1010 E1N+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R; 
LVA1011 E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+L227F+T231R+N233R; 
LVA1012 E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R; 
LVA1013 E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+L227F+T231R+N233R+D254S; 
LVA1014 E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S+I255A+P256Q;
LVA1015 E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S;
【０２７１】
LVA1017 N33Q+G156R+V176W+T231 R+N233R+P256I;
LVA1018 N33Q+G91T+N94S+D111A+G156R+G163T+V176W+T231R+N233R; 
LVA1019 N33Q+G91T+N94S+D111A+G156R+G163T+V176I+T231R+N233R; 
LVA1021 N11R+N33Q+G38A+G91T+D102G+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA1023 N11R+N33Q+G38A+G91T+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA1027 E1N+N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+G246A+D254S; 
LVA1028 N11R+D27R+N33Q+D57G+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA1029 N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R;
LVA1031 N33Q+I86F+L93F+D102Y+E210Y+L227F+T231R+N233R+D254Y+I255F+L269F; 
LVA1032 N33Q+I86F+L93F+D102Y+E210Y+L227F+T231R+N233R+D254Y+I255F;
LVA1033 N11C+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA1034 N11L+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA1035 N11H+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA1036 N11D+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S; 
LVA1037 N11R+N33Q+G91T+D96W+G163K+T231R+N233R+D254S;
【０２７２】
LVA1038 D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
LVA1040 N11P+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA1041 Q4R+D27N+N33Q+G38A+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+S216P+L227G+T231R+N233R+P256L;
LVA1044 N11R+N33Q+E56Q+G163K+T231R+N233R+D254S;
LVA1045 N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+D254S;
LVA1046 N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S; 
LVA1048 N11R+N33Q+G91T+G163K+L227G+P229R+T231R+N233R+D254S;
LVAR0074 N33Q+E87K+T231R+N233R;
LVAR0076 N33Q+N94K+T231R+N233R;
LVAR0077 N33Q+D96Y+T231R+N233R;
LVAR0079 N33Q+K98I+T231R+N233R; 
LVAR0080 A30V+N33Q+K98I+T231R+N233R;
LVAR0086 N33Q+E87K+D96E+T231R+N233R;
LVAR0088 N26I+N33Q+T231R+N233R;
LVAR0091 A30T+N33Q+T231R+N233R;
【０２７３】
LVAR0094 N33Q+G91V+T231R+N233R; 
LVAR0095 N33Q+G91A+T231R+N233R; 
LVAR0096 N33Q+G91V+L97M+T231R+N233R; 
LVAR0099 N33Q+K98I+T231R+N233R; 
LVAR0101 N33Q+L69I+G91E+T231R+N233R; 
LVAR0102 P29T+N33Q+T231R+N233R; 
LVAR0103 N33Q+G91V+T231R+N233R; 
LVAR0104 N33Q+K98I+T231R+N233R; 
LVAR0106 N33Q+G91E+T231R+N233R; 
LVAR0108 N33Q+N94K+T231R+N233R;
LVAR204 D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+N162S+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVAR205
D27R+N33Q+T37K+N711+G91 N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVAR207 D27R+N33Q+N39S+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVAR208 D27R+N33Q+I76T+G91N+N94R+R108M+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVAR209 D27R+N33Q+L52I+V60E+G91N+N94R+D111A+T114I+V168M+E210D+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T; 
【０２７４】
LVAR214 Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+R205I+L206F+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVAR215 Q4H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154L+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVAR216 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVAR218 D27R+N33Q+N71S+G91N+N94R+D111A+H135D+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVAR219 D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T; 
LVAR220 D27R+N33Q+G91N+N94R+L97M+D111A+S216P+T226N+L227G+T231R+N233R+P256T+L269H; 
LVAR223 D27R+N33Q+G91 N+N94R+D111A+T114I+R179T+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVAR225 D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R; 
LVAR226 G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVAR230 D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256;
LVAR231 D27R+A30V+N33Q+G91N+N94R+G109A+D111A+G190D+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVAR234 D27R+N33Q+A49T+G91N+N94R+D111A+Y138F+G163R+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVAR235 N26H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154F+G190C+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVAR277 N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163S+E210V+T231R+N233R+D254K+P256A;
【０２７５】
LVAR280 N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+T231R+N233R+G163S; 
LVAR281 N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R; 
LVAR282 N33Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+D254G+P256A; 
LVAR283 D27R+N33Q+G91T+T114I+G163W+E210D+T231R+N233R; 
LVAR284 D27N+N33Q+G91T+T114I+G163S+E210D+T231R+N233R+P256T; 
LVAR285 N33Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R; 
LVAR286 N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210V+T231R+N233R; 
LVAR287 N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+P256T; 
LVAR288 D27I+N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+P256T;
LVAR290 N33Q+G91T+T114I+E210V+T231R+N233R+D254K+P256A;
【０２７６】
LVAR828
=LVA828 N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R; 
LVAR861 G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVAR863 D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
LVAR955 N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S; 
LVAR956 N33Q+G91T+K98I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L; 
LVA957 N33Q+G91T+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L; 
LVAR1042 G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T; 及び
LVAR1043 D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T。
【０２７７】
次のものは、本発明の追加の特定の態様である（配列番号１のリパーゼは、配列番号２のアミノ酸〜269のリパーゼの変異体（T231R＋N233R）である：
１．（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜269の配列に対して少なくとも50％の同一性を有し；そして（ｂ）リパーゼ活性を有し；そして（ｃ）次の置換：N26I, D27Q, D27R, D27Y, P29T, A30T, A30V, T32I, N33Q, N33T, N33Y, P42L, E43D, E43K, E43M, E43V, A49T, E56A, E56C, E56K, E56R, E56S, D57A, D57G, D57N, V60L, L69I, E87K,G91A, G91 E, G91 N, G91 R, G91S, G91T, G91V, G91W, L93F, N94K, N94R, N94S, D96E, D96G, D96L, D96N, D96S, D96V, D96W, D96Y, L97M,L97Q, K98I, E99D, E99K, E99P, E99S, E99T, D111A, D111S, T114I, L147S, G163K, E210D, S216P, L227G, T231 R, N233R, D234K, E239V, Q249R, N251S, D254N, P256T, G263Q, L264A, I265T, G266D, T267A及びL269Nから選択された少なくとも１つの置換を含んで成り、ここで個々の位置は配列番号２のアミノ酸１〜269の位置に対応し；そして（ｄ）但し、（i）配列番号１のアミノ酸１〜269を有するリパーゼではなく、そして（ii）(i)のリパーゼの変異体N33Qではない、親リパーゼの変異体である、薬剤として使用するためのリパーゼ。
【０２７８】
２．（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜269の配列に対して少なくとも50％の同一性を有し；そして（ｂ）リパーゼ活性を有し；そして（ｃ）置換T231R及びN233R、及び次の置換：N26I, D27Q, D27R, D27Y, P29T, A30T, A30V, T32I, N33Q, N33T, N33Y, P42L, E43D, E43K, E43M, E43V, A49T, E56A, E56C, E56K, E56R, E56S, D57A, D57G, D57N, V60L, L69I, E87K,G91A, G91 E, G91 N, G91 R, G91S, G91T, G91V, G91W, L93F, N94K, N94R, N94S, D96E, D96G, D96L, D96N, D96S, D96V, D96W, D96Y, L97M,L97Q, K98I, E99D, E99K, E99P, E99S, E99T, D111A, D111S, T114I, L147S, G163K, E210D, S216P, L227G, T231 R, N233R, D234K, E239V, Q249R, N251S, D254N, P256T, G263Q, L264A, I265T, G266D, T267A及びL269Nから選択された少なくとも１つの置換を含んで成り、ここで個々の位置は配列番号２のアミノ酸１〜269の位置に対応し；そして（ｄ）但し、リパーゼは配列番号１のアミノ酸１〜269の変異体N33Qではない、親リパーゼの変異体である、薬剤として使用するためのリパーゼ。
【０２７９】
３．（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜269に対して少なくとも50％の同一性を有し；そして（ｂ）リパーゼ活性を有し；そして（ｃ）位置30、42、114及び/又は163の少なくとも１つの位置で少なくとも１つの置換を含んで成る（ここで、個々の位置は配列番号２のアミノ酸１〜269の位置に対応する）、親リパーゼの変異体である、薬剤として使用するためのリパーゼ。
【０２８０】
４．（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜269に対して少なくとも50％の同一性を有し；そして（ｂ）リパーゼ活性を有し；そして（ｃ）次の置換：A30T、A30V、P42L、T114I及びG163Kから選択された少なくとも１つの置換を含んで成る（ここで、個々の位置は配列番号２のアミノ酸１〜269の位置に対応する）、親リパーゼの変異体である、薬剤として使用するためのリパーゼ。
【０２８１】
５．（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜269に対して少なくとも50％の同一性を有し；そして（ｂ）リパーゼ活性を有し；そして（ｃ）次の変異体：
LVA012: D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T,
LVA023: N33Q+E210D+T231R+N233R,
LVA041 : N33Q+D111A+T231R+N233R,
LVA043: N33Q+G91T+T231R+N233R,
LVA049: N33Q+G163K+T231R+N233R,
LVA061 : D27Q+N33Q+T231R+N233R,
LVA099: D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T,
LVA349: K98I+T231R+N233R+N251S,
LV1232: G91A+D96W+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N,
LV1330: N33Q+D96S+T231R+N233R+Q249R,
LV1855: D27R+G91A+D111A+S216P+L227G+P256T,
LV1857: D27R+G9 N+N94R+D111A+S216P+L227G+P256T,
LV1865: D27R+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+P256T,
LV1874: D27R+G91S+D111A+S216P+L227G+P256T,
LV1889: D27R+G91T+D96N+D111A+S216P+L227G+P256T,
【０２８２】
LVAR0002b T32I+G91V+T231R+N233R,
LVAR0003: K98I+T231R+N233R,
LVAROOHa G91A+T231R+N233R,
LVAR0013: G91V+T231R+N233R,
LVARO014 N33Y+G91W+N94K+T231R+N233R,
LVAR0015 P42L+D57N+G91E+T231R+N233R,
LVAR0016 K98I+T231R+N233R,
LVAR0017 V60L+G91V+T231R+N233R, 
LVAR0032: D57G+L93F+T231R+N233R,
LVAR0045: A49T+E56R+E87K+E99S+T231R+N233R,
LVAR0046: E99T+T114I+D254N+T231R+N233R,
LVAR0047: D27Y+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R,
LVAR0048 E43K+E56S+E87K+T231R+N233R,
LVAR0050: E56S++E87K+D96L+E99D+T231R+N233R,
LVAR0051 : E56A+D57A+T114I+T231R+N233R,
【０２８３】
LVAR0052: G91E+T231R+N233R,
LVAR0053: E56K+D96G+D111A+T231R+N233R,
LVAR0054: E87K+D111S+T231R+N233R,
LVAR0055 E43V+G91R+T231R+N233R,
LVAR0056: E56S+E87K+T231R+N233R,
LVAR0057: E87K+G91E+T231R+N233R,
LVAR0058: D27Y+E87K+T231R+N233R,
LVAR0059 E43M+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R,
LVAR0061 : E56K+E87K+D111A+T231R+N233R,
LVAR0062: E87K+E99P+T231R+N233R,
LVAR0063: E87K+D96L+E99P+T231R+N233R,
LVAR0064: E56C+E87K+T231R+N233R,
LVAR0065: E56R+E87K+D96L+T231R+N233R,
LVAR0066 E43D+E56A+D57A+E87K+D111A+T231R+N233R,
LVAR0067: E56K+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R,
【０２８４】
LVAR0068 E87K+L147S+T231R+N233R,
LVAR0069: D27Y+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R,
LVAR0070 E43D+E87K+D96L+E99P+E239V+T231R+N233R,
LVAR0071 E43K+E56A+E87K+D234K+T231R+N233R,
LVAR0072: D96V+D111A+T231R+N233R,
LVAR0074: N33Q+E87K+T231R+N233R,
LVAR0076: N33Q+N94K+T231R+N233R,
LVAR0077: N33Q+D96Y+T231R+N233R,
LVAR0078: N33T+E43V+E56K+D96G+T231R+N233R,
LVAR0079: N33Q+K98I+T231R+N233R,
LVAR0080: A30V+N33Q+K98I+T231R+N233R,
LVAR0086: N33Q+E87K+D96E+T231R+N233R,
LVAR0088: N26I+N33Q+T231R+N233R, 
LVAR0091: A30T+N33Q+T231R+N233R,
LVAR0094: N33Q+G91V+T231R+N233R,
【０２８５】
LVAR0095: N33Q+G91A+T231R+N233R,
LVAR0096: N33Q+G91V+L97M+T231R+N233R,
LVAR0099: N33Q+K98I+T231R+N233R,
LVAR0101 : N33Q+L69I+G91E+T231R+N233R,
LVAR0102: P29T+N33Q+T231R+N233R,
LVAR0103: N33Q+G91V+T231R+N233R,
LVAR0104: N33Q+K98I+T231R+N233R,
LVAR0106: N33Q+G91E+T231R+N233R, 及び
LVAR0108: N33Q+N94K+T231R+N233R（ここで、個々の位置は配列番号２のアミノ酸１〜269の位置に対応する）から選択される、親リパーゼの変異体である、薬剤として使用するためのリパーゼ。
【０２８６】
６．（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜269に対して少なくとも50％の同一性を有し；そして（ｂ）リパーゼ活性を有し；そして（ｃ）位置30、42、114及び/又は163の少なくとも１つの位置で少なくとも１つの置換を含んで成る（ここで、個々の位置は配列番号２のアミノ酸１〜269の位置に対応する）、親リパーゼの変異体であるリパーゼ。
【０２８７】
７．（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜269に対して少なくとも50％の同一性を有し；そして（ｂ）リパーゼ活性を有し；そして（ｃ）次の置換：D27Y, P29T, A30T, A30V, T32I, N33T, N33Y, P42L, D57A, D57N, G91V, T1141, G163K, N251Sから選択された少なくとも１つの置換を含んで成る（ここで、個々の位置は配列番号２のアミノ酸１〜269の位置に対応する）、親リパーゼの変異体であるリパーゼ。
【０２８８】
８．（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜269に対して少なくとも50％の同一性を有し；そして（ｂ）リパーゼ活性を有し；そして（ｃ）次の変異体：
LVA012: D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T,
LVA023: N33Q+E210D+T231R+N233R,
LVA041 : N33Q+D111A+T231R+N233R,
LVA043: N33Q+G91T+T231R+N233R,
LVA049: N33Q+G163K+T231R+N233R,
LVA061 : D27Q+N33Q+T231R+N233R,
LVA099: D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T,
LVA349: K98I+T231R+N233R+N251S,
LV1232: G91A+D96W+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N,
LV1330: N33Q+D96S+T231R+N233R+Q249R,
LV1855: D27R+G91A+D111A+S216P+L227G+P256T,
LV1857: D27R+G9N+N94R+D111A+S216P+L227G+P256T,
LV1865: D27R+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+P256T,
LV1874: D27R+G91S+D111A+S216P+L227G+P256T,
LV1889: D27R+G91T+D96N+D111A+S216P+L227G+P256T,
【０２８９】
LVAR0002b T32I+G91V+T231R+N233R,
LVAR0003: K98I+T231R+N233R,
LVAROOHa G91A+T231R+N233R,
LVAR0013: G91V+T231R+N233R,
LVARO014 N33Y+G91W+N94K+T231R+N233R,
LVAR0015 P42L+D57N+G91E+T231R+N233R,
LVAR0016 K98I+T231R+N233R,
LVAR0017 V60L+G91V+T231R+N233R, 
LVAR0032: D57G+L93F+T231R+N233R,
LVAR0045: A49T+E56R+E87K+E99S+T231R+N233R,
LVAR0046: E99T+T114I+D254N+T231R+N233R,
LVAR0047: D27Y+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R,
LVAR0048 E43K+E56S+E87K+T231R+N233R,
LVAR0050: E56S++E87K+D96L+E99D+T231R+N233R,
LVAR0051 : E56A+D57A+T114I+T231R+N233R,
【０２９０】
LVAR0052: G91E+T231R+N233R,
LVAR0053: E56K+D96G+D111A+T231R+N233R,
LVAR0054: E87K+D111S+T231R+N233R,
LVAR0055 E43V+G91R+T231R+N233R,
LVAR0056: E56S+E87K+T231R+N233R,
LVAR0057: E87K+G91E+T231R+N233R,
LVAR0058: D27Y+E87K+T231R+N233R,
LVAR0059 E43M+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R,
LVAR0061 : E56K+E87K+D111A+T231R+N233R,
LVAR0062: E87K+E99P+T231R+N233R,
LVAR0063: E87K+D96L+E99P+T231R+N233R,
LVAR0064: E56C+E87K+T231R+N233R,
LVAR0065: E56R+E87K+D96L+T231R+N233R,
LVAR0066 E43D+E56A+D57A+E87K+D111A+T231R+N233R,
LVAR0067: E56K+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R,
【０２９１】
LVAR0068 E87K+L147S+T231R+N233R,
LVAR0069: D27Y+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R,
LVAR0070 E43D+E87K+D96L+E99P+E239V+T231R+N233R,
LVAR0071 E43K+E56A+E87K+D234K+T231R+N233R,
LVAR0072: D96V+D111A+T231 R+N233R,
LVAR0074: N33Q+E87K+T231R+N233R,
LVAR0076: N33Q+N94K+T231R+N233R,
LVAR0077: N33Q+D96Y+T231R+N233R,
LVAR0078: N33T+E43V+E56K+D96G+T231R+N233R,
LVAR0079: N33Q+K98I+T231R+N233R,
LVAR0080: A30V+N33Q+K98I+T231R+N233R,
LVAR0086: N33Q+E87K+D96E+T231R+N233R,
LVAR0088: N26I+N33Q+T231R+N233R, 
LVAR0091: A30T+N33Q+T231R+N233R,
LVAR0094: N33Q+G91V+T231R+N233R,
【０２９２】
LVAR0095: N33Q+G91A+T231R+N233R,
LVAR0096: N33Q+G91V+L97M+T231R+N233R,
LVAR0099: N33Q+K98I+T231R+N233R,
LVAR0101 : N33Q+L69I+G91E+T231R+N233R,
LVAR0102: P29T+N33Q+T231R+N233R,
LVAR0103: N33Q+G91V+T231R+N233R,
LVAR0104: N33Q+K98I+T231R+N233R,
LVAR0106: N33Q+G91E+T231R+N233R, 及び
LVAR0108: N33Q+N94K+T231R+N233R（ここで、個々の位置は配列番号２のアミノ酸１〜269の位置に対応する）から選択される、親リパーゼの変異体であるリパーゼ。
【０２９３】
９．薬剤として使用のためにプロテアーゼ又はアミラーゼと組合しての態様１〜８のいずれか１つのリパーゼ。
10.薬剤として使用のためにプロテアーゼ及びアミラーゼと組合しての態様１〜８のいずれか１つのリパーゼ。
【０２９４】
11.（i）前記プロテアーゼが、ａ）配列番号３のアミノ酸１〜274の配列を有するプロテアーゼ、ｂ）配列番号４のアミノ酸１〜188の配列を有するプロテアーゼ、及びｃ）配列番号５のアミノ酸１〜188の配列を有するプロテアーゼから成る群から選択されたプロテアーゼに対して少なくとも70％の同一性を有し；（ii）前記アミラーゼが、ａ）配列番号６のアミノ酸１〜481の配列を有するアミラーゼ、ｂ）配列番号７のアミノ酸１〜481の配列を有するアミラーゼ、及びｃ）配列番号８のアミノ酸１〜483の配列を有するアミラーゼから成る群から選択されたアミラーゼに対して少なくとも70％の同一性を有する態様９又は10のプロテアーゼ及び/又はアミラーゼと組合してのリパーゼ。
【０２９５】
12．消化障害、膵臓外分泌機能不全、膵炎、嚢胞性線維症、糖尿病Ｉ型及び/又は糖尿病II型の処理のための薬剤の製造のためへの態様１〜８のいずれか１つのリパーゼ又はリパーゼ混合物の使用。
13．プロテアーゼ又はアミラーゼの使用をさらに含んで成る態様12の使用。
14．プロテアーゼ及びアミラーゼの使用をさらに含んで成る態様12の使用。
15．前記プロテアーゼ及び/又はアミラーゼが態様11に定義される通りである態様13又は14の使用。
【０２９６】
16．消化障害、膵臓外分泌機能不全、膵炎、嚢胞性線維症、糖尿病Ｉ型及び/又は糖尿病II型の処理への使用のためへ態様１〜８のいずれか１つに定義されるようなリパーゼ。
17．プロテアーゼ又はアミラーゼと組合しての態様16のリパーゼ。
18．プロテアーゼ及びアミラーゼと組合して態様16のリパーゼ。
19．前記プロテアーゼ及び/又はアミラーゼが態様11に定義される通りである態様16又は17のリパーゼ。
20．態様１〜８のいずれか１つに定義されるようなリパーゼ又はリパーゼ混合物、及び少なくとも１つの医薬的に許容できる助剤材料を含んで成る医薬組成物。
【０２９７】
21．プロテアーゼ又はアミラーゼをさらに含んで成る態様20の組成物。
22．プロテアーゼ及びアミラーゼをさらに含んで成る態様20の組成物。
23．前記プロテアーゼ及び/又はアミラーゼが態様11に定義される通りである態様21又は22の組成物。
24．治療的有効量の態様１〜８のいずれか１つに定義されるようなリパーゼ又はリパーゼ混合物を投与することによる、消化障害、膵臓外分泌機能不全、膵炎、嚢胞性線維症、糖尿病Ｉ型及び/又は糖尿病II型の処理方法。
【０２９８】
25．治療有効量のプロテアーゼ又はアミラーゼを投与することをさらに含んで成る態様24の方法。
26．治療有効量のプロテアーゼ及びアミラーゼを投与することをさらに含んで成る態様24の方法。
27．前記プロテアーゼ及び/又はアミラーゼが態様11に定義される通りである態様25又は26の方法。
【０２９９】
種々の参照が本明細書において引用され、それらの開示は引用により本明細書に組込まれる。
【実施例】
【０３００】
使用される化学質は、少なくとも試薬品種の市販の製品である。脱イオン化された水は、MiIIi-Q システム (QPAK1 , Millipore, カタログ番号 CPMQ004R1)からである。
例１：酵素アッセイ：
ブタパンクレアチンのリパーゼ、プロテアーゼ及びアミラーゼ活性についてのアッセイは、FIP (Federation Internationale Pharmaceutique)により公開されている。IFIP−単位＝1Ph.Eur.−単位（ヨーロッパ薬局方）。アッセイは、例えば医薬酵素の標準化については、Federation Internationale Pharmaceutique, Scientific Section: International Commissionに記載されている。a) "Pharmaceutical Enzymes," Editors: R. Ruyssen and A. Lauwers, E. Story Scientia, Ghent, Belgium (1978), b) European Pharmacopoeia。また、Deemester et al in Lauwers A, Scharpe S (eds): Pharmaceutical Enzymes, New York, Marcel Dekker, 1997, p. 343-385も参照のこと。適切な酵素標準は、International Commission on Pharmaceutical Enzymes, Centre for Standards, Harelbekestraat 72, B-9000 Ghentから入手され得る。
【０３０１】
リパーゼFIPアッセイ、及びリパーゼ、プロテアーゼ及びアミラーゼについての他の適切なアッセイは下記に記載される。
【０３０２】
リパーゼFIPアッセイ：
パンクレアチンの脂肪分解活性を測定するために、ヨーロッパ薬局方5.1に公開される方法を使用した。特にことわらない限り、微生物リパーゼの脂肪分解活性の決定のために、RIPにより公開されるリゾパス・オリザエ（Rhizopus oryzae）リパーゼについてのアッセイを使用した。
【０３０３】
リパーゼpNPアッセイ：
基質：パラ−ニトロ−フェニル（pNP）バレレート：
アッセイpH：7.7。
アッセイ温度：40℃
反応時間：25分。
【０３０４】
黄色の消化された生成物は、405nmでの特徴的な吸光度を有する。その量を分光計により決定する。リパーゼ活性を、既知活性の酵素標準に対して決定することができる。活性は、リポラーゼ単位（LU）で表され得る。１LU（リポラーゼ単位）は、上記標準条件下で１分当たり1mモルの滴定可能酪酸を放す酵素の量である。1KLU＝1000LU。より詳細なアッセイの記載、AF96/6−GB（トリブチリン基質に基づくリパーゼ/エステラーゼ−pH−STAT方法）。及びLU標準は、Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Denmarkから、要求に応じて入手できる。
【０３０５】
リパーゼLUアッセイ：
このアッセイにおいては、pH7.00及び30℃（±1℃）での0.16Mのトリブチリン（グリセロールトリブチレート、Merck 1.01958.000）のリパーゼ触媒された分解に続いて、0.025Mのガス抜きされた、CO2フリーの水酸化ナトリウム（水酸化ナトリウムチトリソール、Merck9956）による開放される酪酸のpH−安定滴定を行う。滴定液の消費を、時間の関数として記録する。
【０３０６】
基質を、0.6％w/vのアラビアガム乳化剤により乳化する（20.0gのアラビアガム、89.5gのNaCl, 2.05gのKH2PO4に水を添加し、1.5Lにし、完全に溶解するまで放置し、2700mlのグリセロールを添加し、pHを4.5に調節し、90mlのトリブチリンを、300mlのアラビアガム乳化剤及び1410mlの脱イオン水と共に混合し、そして例えば7000rpmでのSilverson乳化機L4RTを用いて３分間、均質化し、そして次にpH4.75に調節する）。リパーゼサンプルを、まず、0.1Mのグリシン緩衝液（pH10.8）に希釈し、次の脱イオン水に希釈し、1.5−4.0LU/mlの活性レベルを定める。15mlの乳化された基質溶液を、滴定容器中に注ぐ。1.0mlのサンプル溶液を添加し、そしてpHを、滴定の間、7.0で維持する。一定のpHを維持するために１分当たり添加される滴定液の量を測定する。活性の計算は、滴定曲線の線状範囲の平均傾斜に基づかれる。既知活性の標準を、レベルを調べるために使用することができる。
【０３０７】
より詳細なアッセイの記載EB-SM-0095.02は、必要に応じて、Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Denmarkから入手できる。
【０３０８】
リパーゼpH安定アッセイ：
このアッセイは、0.65mMの胆汁塩の存在下でオリーブ油エマルジョンからの脂肪酸のリパーゼ触媒された開放に基づかれている。基質を、乳化剤としてのアラビアガムと共に乳化する（175gのオリーブ油を、630mlのアラビアガム溶液（4000mlの水中、474.6gのアラビアガム、64gの塩化カルシウム）と共にブレンダーにおいて15分間、乳化し；室温への冷却の後、pHを、4MのNaOHを用いて、pH6.8−7.0に調節する）。
【０３０９】
決定するために、19mlのエマルジョン及び10mlの胆汁塩溶液（492mgの胆汁塩を水に溶解し、そして500mlまで満たす）を、反応容器において混合し、そして36.9℃〜37.5℃まで加熱する。反応を、1.0mlの酵素溶液の添加により開始する。開放された酸を、0.1Mの水酸化ナトリウムの添加により、合計5分間、pH7.0で自動的に滴定する。活性を、第１回目と第５回目との間の滴定曲線の傾斜から計算する。検量のために、標準を、３種の異なった活性レベルで測定する。
【０３１０】
プロテアーゼSuc-AAPF-PNAアッセイ：
基質：Suc-AAPF−pＮA（Sigma（商標） S-7388）.
アッセイ緩衝液：10OmM の琥珀酸, 10OmMの HEPES (Sigma H-3375), 10OmMの CHES (Sigma C-2885), 10OmMの CABS (Sigma C-5580), 1 mMの CaCl2, 15OmMの KCl, 0.01 % Triton（商標） X-100(次の分子式を有する非イオン性界面活性剤：C14H22O(C2H4O)n、ここで分子当たりの酸化エチレン単位の平均数は約９又は10である、CAS #: 9002-93-1)（HCI 又は NaOHによりpH 9.0に調節された）。
アッセイ温度：25℃。
【０３１１】
300μlの希釈されたプロテアーゼサンプルを、1.5mlのアッセイ緩衝液と共に混合し、そして活性反応を、1.5mlのpNA基質を添加することにより開始し（50mgを1.0mlのDMSOに溶解し、そしてさらに、0.01％のTriton（商標）X-100により45倍に希釈した）、そして混合の後、A405の上昇を、プロテアーゼ活性の測定として、分光計によりモニターした。プロテアーゼサンプルを、すべてのアッセイ測定値がアッセイについての用量−応答曲線の直線部分以内にあることを確認するために、活性測定の前、希釈した。
【０３１２】
プロテアーゼAUアッセイ：
変性されたヘモグロビン（ウレア含有の6.7mMのKH2PO4/NaOH緩衝液（pH7.50）中、0.65％（w/w））を、25℃で10分間、プロテアーゼにより分解し、そして分解されていないヘモグロビンを、トリクロロ酢酸（TCA）により沈殿せしめ、そして濾過により除去する。濾液中、TCA可溶性ヘモグロビン分解性生物を、Folin & Ciocalteuのフェノール試薬（2体積の脱イオン水に対する１体積のFolin−Ciocalteuフェノール試薬Merck9001.0500）により決定し、これは、いくつかのアミノ酸により青色を付与する（750nmで測定される）。
【０３１３】
活性単位（AU）を測定し、そして標準への参照により定義する。変性されたヘモグロビン基質を次の通りにして調製する：1154gのウレア（Hamstoff, Merck 8487）を、1000mlの脱イオン水に溶解し、240.3gのNaOHを添加し、そして次に、63.45gのヘモグロビン（Merck 4300）をゆっくり添加し、続いて315.6gのKH2PO4及び3260gの脱イオン水を添加する。pHを7.63に調節する。より詳細及び適切なアルカラーゼ標準は、必要に応じて、Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Denmark (assay no. EB-SM-0349.01 )から入手できる。
【０３１４】
アミラーゼ：
基質：Phadebas錠剤（Pharmacla Diagnostics：ウシ血清アルブミン及び緩衝物質と共に混合される不溶性の青色に着色された澱粉ポリマーを架橋し、そして錠剤に製造する）。
アッセイ温度：37℃。
アッセイpH：4.3（又は、7.0、所望により）。
反応時間：20分。
【０３１５】
水における懸濁の後、澱粉をα−アミラーゼにより加水分解し、可溶性青色フラグメントを得る。620nmで測定される、その得られる青色溶液の吸光度は、α−アミラーゼ活性の関数である。α−アミラーゼ活性を、例えば菌類α−アミラーゼ単位（FAU）で表される、既知活性の標準に対して決定することができる。１FAUは、標準のアッセイ条件で１時間当たり5.26gの澱粉（Merck, Amylum solubile Erg. B. 6, Batch 9947275）を分解する酵素の量である。より詳細なアッセイの説明、APTSMYQI-3207及びFAU標準は、Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Denmarkから、要求に応じて入手できる。
【０３１６】
例２：改良されたホスホリパーゼ活性を有するリパーゼ変異体：
下記表１に示されるリパーゼ変異体をコードするDNAを用いて、アメリカ特許第5,869,438号の例22に記載の方法（但し、PyrG選択がAMDS選択の代わりに使用された（WO2004/069872号に記載される））により、アスペルギラス・オリザエ株ToC1512（WO2005/070962号に記載される）を形質転換した。アスペルギラス・オリザエ宿主の胞子を、寒天スラントから採取し、そして10mlのYPM（10gの酵母抽出物、Difco＋20gのペプトン、Difco, １Lまでの水、オートクレープされ；そして２％（w/w）まで無菌濾過されたマルトース）の接種のために使用した。接種された管を、New Brunswick Scientific Innova 2300シェーカーにおいて、180rpmで３日間、30℃でインキュベートした。培養物をMira-Cloth (Calbiochem)により濾過し、0.45μmのフィルターにより無菌濾過することにより、上清液を収穫した。リパーゼ変異体を、アメリカ特許第5,869,438号の例23に一般的に記載のようにして、精製した。
【０３１７】
【表１】
0005406040.tif 000003
【０３１８】
次のリパーゼを比較のために使用し、そしてまた、上記のようにして調製した。
配列番号２のアミノ酸1〜269の配列を有し、そして例えばアメリカ特許第5,614,189号に医薬使用について記載される、ヒューミコラ・ラヌギノサDSM1800からの野生型リパーゼ、及びWO2006/136159号に医薬使用について記載される、配列番号１のアミノ酸１〜269を有する前記リパーゼの（T231R＋N233R）−変異体。
【０３１９】
次のリパーゼは、正の対照（ホスホリパーゼ活性について陽性）として作用する：
配列番号２に比較して、次の置換を有する変異体LV1232：G91A + D96W + E99K + G263Q + L264A + I265T + G266D + T267A + L269N。
それらのリパーゼを、次に記載のようにして、ホスホリパーゼ活性について試験した。
【０３２０】
酵素：
酵素サンプルを、酵素希釈緩衝液（20mMの酢酸ナトリウム、0.1％（w/w）Triton-X100、pH5.0）により、5mg/ml（ml当たりの酵素タンパク質（EP）のmg）に希釈した。酵素濃度を、A280及び計算されたモル吸光係数（プログラムGPMAW (Lighthouse Data, Odense, Denmark; http://welcome.to/gpmaw；また、Gill and von Hippel, 1989, Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data, Anal. Biochem. 182: 319-326も参照のこと）に基づいて決定した。
【０３２１】
基質：
Avanti Polar Lipids Inc., 700 Industrial Park Drive, Alabaster, AL 35007, US, カタログ番号850445)から市販されている、基質１−ミリストイル−２−パルミトイル−sn−グリセロ−３−ホスホコリン（“ホスファチジルコリン”と称す）の溶液を、次の通りにして調製した：
１．37.5mgのホスファチジルコリンを、750μlの脱イオン化された水に溶解し、
２．室温で１時間、撹拌し、
３．37.5μlの0.32MのCaCl2を添加し、
４．１〜２分間、撹拌し、
５．375μlの16mMのデオキシコール酸ナトリウムを添加し、
６．750μlの脱イオン水を添加し、
７．室温で30分間、撹拌する。
【０３２２】
酵素反応：
１．2mlのエペンドーフ管に100μlの基質を移し、
２．上記のようにして5mg/mlに希釈された酵素5μlを添加し、
３．エペンドーフサーモミキサーにおいて40℃、1000rpmで20分間インキュベートし、
４．10μlの反応混合物を、新しいエペンドーフ管に移し、そして990μlの50％エタノール（MeOH, 0.1(w/w)トリフルオロ酢酸（TFA）を添加し、
５．これを、このマトリックス：50％MeOH、0.1％TFA中、20mg/mlの2, 5−ジヒドロ安息香酸と共に混合した後、MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/lonization Time-Of-Flight質量分光法)により分析する。
【０３２３】
基質対照が包含され、ここで5μlの酵素希釈緩衝液が、段階２における酵素の変わりに、添加された。４回の独立した決定を、段階５における個々のサンプルについて行った。使用されるMALDI-TOF MS装置は、外部検量と共にレフレクターモードでの正のイオン化を伴ってのVoyager De PRO計測器（Calmix 2, Applied Biosystems）であった。
【０３２４】
異なった長さのエステル結合された酸を有するグリセロール基材の基質を選択することにより、酵素特異性（１−位置又は２−位置での攻撃）間を、消化されたグリセロール主鎖の質量を測定することにより識別することが可能である。種々の可能性ある消化されたグリセロール主鎖の質量は、次の通りである：
706Da    ホスファチジルコリン
496Da    A1加水分解（位置１でのホスファチジルコリン−ミリストイル（C14））
468Da    A2加水分解（位置２でのホスファチジルコリン−パルミトイル（C10））
258Da    A1及びA2加水分解（分解されていないホスファチジルコリン−C14及びC16）
【０３２５】
結果：
706, 496, 468及び258DaのMwを表すMSピークの相対的シグナル強度（個々のピーク下の面積）が、ホスホリパーゼA1及びA2（PLA1−及びPLA2-）活性間の分布の計算のための基礎として使用される。
【０３２６】
２種の異なった実験（I及びII）からの結果が、下記表２及び３に示されている。
一般的に、A2/A1に対するA1/A2の10〜15％以上のシグナル強度は、真の二重活性又は不純サンプルのいずれかを示すことができる。
【０３２７】
【表２】
0005406040.tif 000004
【０３２８】
【表３】
0005406040.tif 000005
【０３２９】
結論：
試験されるすべてのリパーゼは、いくらかの程度、ホスホリパーゼ活性を、主にPLA1−活性として有する。陽性対照LV1232は、両実験において高いホスホリパーゼ活性を示した。
配列番号１及び２の従来技術のリパーゼは、同じ実験（実験I）において試験される場合、ホスホリパーゼ活性に関して、ほとんど同じ性能を示し、加水分解の後、末消化のリン脂質を、それぞれ約44％及び42％残した。
【０３３０】
次にリパーゼ変異体が、配列番号２に比較して、改良されたホスホリパーゼ活性を有することが予測される：LV1232, LV1889 及び LVA023 (実験I)、 及び LV1232, LV1330, LV1855, LV1865, LV1874, LV1889, LVA043, LVA049, and LV1857（実験II）。変異体LV1232及びLV1889が特に、両実験において、非常に高く改良されたホスホリパーゼ活性を示す。
【０３３１】
例３：pH6で改良された活性を有するリパーゼ変異体：
上記表１に示される多くの精製されたリパーゼ変異体を、10mMの胆汁塩の存在下でpH6での活性について試験した。例１におけるように、配列番号２及び１のリパーゼを比較のために包含した。
【０３３２】
化学物質及び試薬：
pH6でのアッセイ緩衝液：100mMのイミダゾール、100mMのアセテート、10mMのマロン酸、pH6.0。
酵素希釈緩衝液：5mMのNaH2PO4、pH7.0。
7mMのCaCl2（Merck, 1.02382.0500）。
胆汁塩（80mM）：Solvay Pharmaceuticals, バッチ176.01-PA-7374からのリパーゼ活性化胆汁塩混合物。
トリリノレイン（グリセリルトリリノレエート、Sigma T9517）。
ペプシン：（Merck VL 317492437, カタログ番号1.0792.0001）。
停止溶液：10％Triton-X100, 1Mのリン酸。
【０３３３】
基質：
基質作業エマルジョンは、次の通りにして調製された：
１．2.188mlの胆汁塩（80mM）と、6.68mlの脱イオン水とを混合し、
２．0.133mlのトリリノレイン（グリセリルトリリノレエート、Sigma T9517）を添加し、
３．Ultraturexミキサー（yellow line Dl 25 basic）により室温で１分間、混合する。
これにより、19.44mMの胆汁塩及び15.56mMのトリリノレインを含む基質の作業エマルジョンを得る。
【０３３４】
酵素：
酵素サンプルを、5mMのNaH2PO4（pH7.0）により、0.07mg/ml（mgの酵素タンパク質/ml）に希釈した。酵素濃度は、A280 に基づいた。酵素を、5mMのNaH2PO4により２倍に希釈した（合計６回の希釈を行い、そして酵素を含まない緩衝液対照）。それらの希釈により、ウェルにおいて次の最終濃度の酵素を得る：0.01 mg/ml,0.05, 0.025, 0.0125, 0.0625, 0.03125及び0.015625 mg/ml。
【０３３５】
アッセイ方法：
１．マイクロタイタープレート（MTP）において、35μlのアッセイ緩衝液と25μlの7mMのCaCl2とを混合し、90μlの基質作業エマルジョンを添加する。37℃、700ppmで20分間プレインキュベーとする。
２．25μlのそれぞれの酵素希釈溶液を添加し、そして37℃及び700rpmで30分間インキュベートする（最終体積175μl）。胆汁塩及びトリリノレインの最終濃度は、MTPウェルにおいてそれぞれ10mM及び8mMである。
【０３３６】
３．50μlの停止溶液（10％のTriton-X100、1Mのリン酸）及び25μlのペプシン（700mg/l）を添加する。室温で10分間インキュベートする。プロテアーゼであるペプシンを、pHが続く方法（遊離脂肪酸（FFA）の決定）において高められる場合、リパーゼタンパク質の再活性化を回避するために、添加する。
４．Nefac（Wako, Nefa C ACS-ACOD Method Enzymatic 色彩試験コード番号999-75406）により、FFAの検出のために、１％Triton-X100においてすぐにはサンプルを10倍に希釈する。
【０３３７】
Nefacキット（Nefa C ACS-ACOD Method Enzymatic色彩試験コード番号999-75406）による遊離脂肪酸の検出：
１．溶液Aの製造：ボトルR1aを、10mlのボトルR1により溶解する（NefaCキットから）。溶液Bの製造：ボトルR2aを、20mlのボトルR2により溶解する（Nefacキットから）。
【０３３８】
２．Cal1 Nefa C標準オレイン酸（28.2mg/dl〜1mモル/L）を、１％のTriton-X100に希釈し、次の濃度のNefac標準を得る：1 mM, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.03125及び 0.015625 mM。
３．25μlの標準/リパーゼサンプルを、50μlの溶液Aと共に混合する。室温及び700rpmで15分間インキュベートする。
４．100mlの溶液Bを添加し、室温及び700rpmで15分間インキュベートする。
【０３３９】
結果：
mMでのFFAの濃度を、Nefa C標準曲線から決定する。リパーゼ活性結果を、下記ミカエリス−メンテン−様式に適合する：
A＝AO＋Amax*[E]/（[E]＋K)
V0を決定し（mモルFFA/g酵素/分）、そして配列番号１のリパーゼについてのVOに対する比率を決定する。配列番号１のリパーゼ及び変異体LV2934（配列番号１のグリコシル化されていない変異体）が、個々のMTPに基づいて、対照として包含された。
配列番号１に標準化された結果が、下記表４に示される。
【０３４０】
【表４】
0005406040.tif 000006
【０３４１】
結論：
上記結果に基づいて、LV1889, LV1874 及びLV1865を除いて、試験されたすべての変異体が、配列番号２のリパーゼに比較して、10mMの胆汁塩と共にトリリノレエートを用いて、pH6での高い活性を有することが予測される。
【０３４２】
LVA049, LVA349, LVA023及びLVA099リパーゼ変異体は、この観点から、配列番号２の比較リパーゼよりもより良であり、実際、配列番号１のリパーゼよりも良好である。これは特に、LVA049及びLVA349リパーゼ変異体であり、より特定にはLVA049リパーゼ変異体である。
【０３４３】
例４：pH3での改良された安定性を有するリパーゼ変異体：
上記表１に列挙される多くのリパーゼ変異体を、２〜８のpH範囲でのpH安定性について試験した。前の例におけるように、配列番号２及び１のリパーゼは、比較のために包含された。配列番号２のリパーゼの次の変異体をまた試験した：
LVA147: D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T 
LVA315: N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G 
LVA317: N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S 
LVA319: N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S
LVA714: D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S。
【０３４４】
個々の酵素を、２種の濃度（0.05及び1.0mgの酵素タンパク質/ml）で、二重反復して試験した。さらに、酵素を、胆汁塩（10mM）を伴って及びそれを伴わないで、及びペプシン（70mg/l）を伴って及びそれを伴わないで試験した。
手短には、酵素を、所望するpHで、37℃で1, 15, 45及び120分間（又は、1, 60及び120分間）インキュベートし、これに続いて、残留リパーゼ活性を、pH8及び室温（RT）で、p−ニトロフェニルカプリレートに対して測定した。
【０３４５】
化学物質/試験：
酵素希釈緩衝液：20mMのアセテート、pH6, 0.01％Triton-x100。
安定性緩衝液：200mMのイミダゾール、200mMのアセテート、200mMのマロン酸、pH2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0及び8.0に調節される。
【０３４６】
残留活性緩衝液（RA緩衝液）：200mMのトリス（トリス−ヒドロキシメチルアミノメタン、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、CAS−番号：77−86−１）、pH8、0.4％Triton-X100、1mMのCaCl2。
pNP−カプリレート（C8）：Sigma N−0752。
ペプシン（700mg/l）：Merck, VL 317492437 (1.0792.0001)。
胆汁塩（80mM）：Solvay Pharmaceuticalsからのリパーゼ活性化胆汁塩混合物（バッチ176.01−PA−7374）。
【０３４７】
酵素：
酵素を、A280 に基づいて、0.4又は0.8mgの酵素タンパク質/mlの作業溶液に、20mMのNaH2PO4、pH7.0、0.01％Triton-X100により希釈した。
【０３４８】
安定性アッセイ：
１）マイクロタイタープレート（MTP）の個々のウェルに、50μlの安定性緩衝液、20μlの0.1％Triton-X100、25μlの胆汁塩（80mM）又は20μlのペプシン（700mg/l）又は脱イオン水を添加する。脱イオン水を添加し、ウェル当たり175μlの最終体積にする。すべてのサンプルは、二重反復して製造された。37℃及び700rpmで20分間、予備加熱する。
【０３４９】
２）25μlの酵素を添加する（0.05又は0.1mg/mlの最終濃度の酵素タンパク質）。個々のpHのために、酵素対照、並びにペプシン及び胆汁塩を含まず、すなわち25μlの20mMのNaH2PO4, pH7.0, 0.01％Triton-X100をそれらのウェルに添加し、37℃, 700rpmで1, 15, 45及び120分間インキュベートする。
【０３５０】
３）20μlのアリコートを取り、そしてサンプルを180μlの残留活性緩衝液、pH8.0により希釈し、サンプルを氷上で維持する。
４）サンプルを希釈する（pHを８に高めるために、最少20倍に希釈する）。１分のサンプル（pH8）に対する初期残留活性（RA）を構成し、2Ox、4Ox、8Ox、16Ox及び32Oxに希釈し、アッセイにおける直線性を得るために必要とされる希釈度を決定する。
５）下記に記載のようにして、pH8.0でのpNP−カプリレート基質対するRAを測定する。
【０３５１】
基質：
基質原液を、14.2μlのｐ−ニトロフェニルカプリレート（Sigma N-0752）と、1mlの２−プロパノールとを混合することにより調製する。この原液を、残留活性緩衝液pH8.0により50倍に希釈し、作業溶液を得、この150μlを個々のウェルに添加する。
【０３５２】
残留活性（RA）を決定するための方法：
１）新しいMTPにおいて、20μlの希釈されたサンプル及び150μlの基質作業溶液を混合する。
２）405nmで５分間、運動性を測定する（最初に混合し、室温で12秒ごとに読取る）。
【０３５３】
結果：
％残留活性を次の通りにして計算する：個々の回収（1, 15, 45, 120分）についての個々のpH内の割合から、胆汁塩又はペプシンを有さない酵素対照についての割合が引き算される。次に、この補正された割合が、個々のpH内の最高値により割算され、そして100が掛け算される。
【０３５４】
下記表５〜表７は、配列番号２に比較して、改良されるそれらの変異体についてpH3での安定性を示す（それぞれ、ペプシンの存在下で、又は胆汁塩の存在下で、緩衝液における）。pH3での安定性結果のみが、このpHで最も明白な差異が観察されるので、示されている。
【０３５５】
【表５】
0005406040.tif 000007
【０３５６】
【表６】
0005406040.tif 000008
【０３５７】
【表７】
0005406040.tif 000009
【０３５８】
結論：
次のリパーゼ変異体が、配列番号２のリパーゼに比較して、pH3での改良された安定性を有する：LV2934, LVA043, LVA049, LV1855, LV1865, LV1874, LV1889, LV1857, LVA012, LVA023, LVA041 , LVA061 , LVA099, LVA147及びLVA714。
【０３５９】
次のリパーゼ変異体が、配列番号２のリパーゼに比較して、ペプシンに対するpH3での改良された安定性を有する：LVA043, LV1855, LV1865, LV1874. LV1889, LV1857, LVA012, LVA099, LVA315, LVA317, LVA319及びLVA714。
次の変異体が、配列番号のリパーゼに比較して、胆汁塩に対するpH3での改良された安定性を有する：LVA349。
【０３６０】
例５：リパーゼ変異体のマイクロ−精製：
下記表８に示される追加のリパーゼ変異体を、発酵上清液の無菌濾過を含めて例２に記載のようにして調製した。
【０３６１】
【表８】
0005406040.tif 000010
【０３６２】
無菌濾過されたリパーゼ−含有培養上清液を、次のプロトコールを用いてマイクロ−精製した：
フィルタープレート（Unifilter 800, 25μmの溶融吹込みポリプロピレンフィルター、Whatman）のウェルに、約50μlのXpressLine ProAクロマトグラフィー媒体を添加した（Upfront Chromatography A/S, Lersoe Parkalle 42, DK-2100 Copenhagen, Denmarkから市販されている）。クロマトグラフィー媒体を、200μlの1Mの酢酸ナトリウム（pH5.0）を添加することにより平衡化した。10分の撹拌の後、平衡化緩衝液を真空下で除去した（Uni−Vac3、Whatman）。平衡化段階を反復した。
【０３６３】
次に、100μlの結合緩衝液（1Mの酢酸ナトリウム、pH5.0）及び400μlの培養上清液を添加し、そしてクロマトグラフィー媒体と共に30分間、混合した。結合されていない材料を、真空下で除去した。結合段階を反復した。結合されたリパーゼを有するクロマトグラフィー媒体を、緩衝能力を低めながら（100/50/10mMの酢酸ナトリウム、pH5.0）、200μlの洗浄緩衝液により３度、洗浄した。個々の洗浄段階において、緩衝液を添加し、プレートを10分間、撹拌し、そして洗浄緩衝液を真空下で除去した。最終的に、結合されたリパーゼを、100μlの100mMのトリス、0.02％Brij35（ポリオキシエチレン（23）ラウリルエーテル）、pH9.0を、２度添加することにより溶出した。個々溶出段階に関しては、プレートを15分間、撹拌し、その後、溶出リパーゼを真空下でのマイクロタイタイープレートに集めた。
【０３６４】
例６：リパーゼ変異体の濃度の決定：
活性部位タイトレーション：
精製された（一般的に例２に記載のようにして精製され、そして/又は例６に記載のようにしてマイクロ−精製された）リパーゼ変体の濃度を、次に記載のようにして、バースト活性部位タイトレーションにより決定した。
【０３６５】
精製されたリパーゼを、必要なら、0.01％Triton-X100により希釈し、5μM以下の濃度を得た（150μgの酵素タンパク質/mlに対応する）。100μlの精製されたリパーゼを、ブラックマイクロタイタープレートのウェルにおいて1Mのトリス、4mMのSDS（ドデシル硫酸ナトリウム）、pH9.0に溶解された、約100μMのレソルフィン（エチルレソルフィニルヘプチルホスホネート；リパーゼインヒビター）と共に混合した。レソルフィンの精密な濃度は重要ではなく、それは、5μMのリパーゼに比較して、過剰に添加されるべきである。混合の直後、放されるレソルフィンからの蛍光の運動性を、１〜３時間ごとに測定した（バーストが終わるまで）（515nmでの励起、590nmでの発光、BMG LabTechnologies GmbHからのPOLARstar蛍光強度測定計測器上で測定された）。
【０３６６】
測定された蛍光値を、下記等式に適合する：
F = FO + Burst * (1-exp(-(t + dt) * ln(2) /T1/2) + Slope * (t + dt)
ここでFは測定された蛍光であり、FOはインヒビター及びリパーゼからの蛍光バックグラウンドであり、tは最初の蛍光測定以来の時間であり、dtはリパーゼとインヒビターとの混合から最初の蛍光測定までの時間であり、Burstは蛍光バーストであり、T1/2は、指数バーストのための半減期であり、そしてSlopeは、例えばリパーゼ−エチルヘプチルホスホネート複合体の加水分解及び/又はレソルフィンの漂白のために、蛍光の線状変化の傾斜である。
活性リパーゼ濃度を、計算されたバーストと、レソルフィン標準曲線の傾斜との間の比率として決定した（０〜4μM；マイクロタイタープレート上に包含される）。
【０３６７】
A280からの濃度決定：
精製されたリパーゼ変異体の濃度をまた、消衰係数1.24A280/mgを用いて、280nmでの吸光度から推定することもまた。
【０３６８】
例７：リパーゼ変異体のインビトロ試験：
精製されたリパーゼ変異体を、下記に記載のようにして、インビトロ消化モデルにおいて試験した。
２種の食餌（それぞれ食餌I及び食餌II）のいずれかを、インビトロモデルにおいて使用した。食餌Iの組成は、34％（w/w）の脂肪、45％（w/w）の炭水化物、２％（w/w）のタンパク質（残りは、水、塩、等）である。食餌IIの組成は、Fat313、タンパク質146及び澱粉358であり（窒素を含まない抽出物（NfE）は、432であることが計算され得る）、すべてはg/kg乾量である。
【０３６９】
食餌Iを、247.2gの牛乳（1.5％脂肪）、29.9gのオリーブ油、87gのCalshake（Fresenius Kabiから市販されており、そして2077kj/gのエネルギー含有率、4.3gの乳タンパク質/100gのタンパク質含有率及び24.4gの脂肪/100gの脂肪含有率を有する）、及び9.9gのMethocel（Food Grade, E5 Premium LV FG (E464); Dow）を、UltraTurrex (YellowLine Dl 25基本)を用いて、２分間、混合することにより調製した。粘度を低めるために、食餌を、pH8.0での0.5μg/mlのSAVINASE 16.0 LEX プロテラーゼ (Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Denmarkから市販される)により、50℃で４時間、処理した。次に、プロテアーゼを、pHを３に低め、そして70℃で30分、又は50℃で60分間インキュベートすることにより不活性化した。
【０３７０】
食餌IIは、73g/kg（湿量）の家禽ミール（Altromin）、73g/kgのエンドウ豆ミール、73g/kgのカゼイン（酸性条件下で沈殿された、Altrominからの）、290g/kgの小麦粉、290g/kgのジャガイモ澱粉、125g/kgのラード、76g/kgのビタミン、鉱物及び微量元素、375kg/kgの牛乳（33％の脂肪）から成る。
【０３７１】
100μlの食餌を、20μlのペプシン（(Merck VL 317492437, カタログ番号1.0792.0001 , 700 mg/ml)）及び30μlのリパーゼ（４種の濃度の二重反復）と共に、マイクロタイタープレートのウェルにおいて混合した。胃段階がpH5で実施される場合、10μlの緩衝液（0.8MのMES（２−[N−モルホリノ]エタンスルホン酸）、0.8Mの酢酸ナトリウム、0.8Mのイミダゾール、pH7.0）を添加し、ところがpH３が胃段階のために使用される場合、緩衝液は添加されなかった。
【０３７２】
マイクロタイタープレートを、37℃で１時間、振盪しながら（Eppendorf Thermomixer, 750 rpm）インキュベートし、その後、15μl（pH5が胃段階のために使用される場合）、又は25μl（pH3が胃段階のために使用される場合）の緩衝液（0.8MのMES（２−[N−モルホリノ]エタンスルホン酸）、0.8Mの酢酸ナトリウム、0.8Mのイミダゾール、pH7.0）及び20μlの胆汁塩（50g/l、500g/モルの平均分子量を用いて、100mMに対応する）を添加し、Solvay Pharmaceuticalsからのリパーゼ活性化胆汁塩混合物（バッチ176.01−PA−7374）は、5.7〜6.0のpHをもたらす。
【０３７３】
次に、プレートを、撹拌下で37℃で２時間インキュベートし、その後、1Mのリン酸中、50μlの10％Triton-X100を添加することにより反応を停止した。１％Triton-X100により125〜250倍に希釈した後、遊離脂肪酸の量を、例３に記載のようにして、Wako ChemicalsからのNEFACキットを用いて決定した。
【０３７４】
用量応答曲線を、下記等式に適合する：
FFA＝FFAmax*[E]/（[E]＋K）
式中、FFAは開放される遊離脂肪酸の量であり、FFAmaxは、リパーゼ食餌から遊離することができる遊離脂肪酸の最大量であり、「E」はリパーゼ濃度であり、そしてKはFFAmaxの半分を遊離するリパーゼ濃度である。
【０３７５】
FFAmaxがリパーゼに関して同一であると仮定すると、改良因子（IF）は、下記の通りに定義される：
IF＝K（対照）/K(リパーゼ)
ここでK（対照）は、FFAmaxの半分を遊離する対照リパーゼの濃度であり、そしてK（リパーゼ）は、FFAmaxの半分を遊離するリパーゼ変異体濃度である。
【０３７６】
下記表９及び表12が列挙される変異体に関して、対照リパーゼとして、配列番号１のリパーゼ、及びその脱グリコシル化された変異体N33Q（表１におけるLV2934）の平均、すなわちK(ref) = 1/2x (K(配列番号1) + K(LV2934))を使用した。
【０３７７】
下記表９及び表12に列挙されるリパーゼ変異体はすべて、1.0以上の改良因子を有する。これは、対照リパーゼに比較して、より低い量のそれらのリパーゼが、類似する効果を得るために必要とされることを意味する。配列番号２に関するいずれかのリパーゼ変異体の改良因子は、下記表９に示される、対照リパーゼに関する配列番号２の（定数）改良因子により割算される、対照リパーゼに関する問題のリパーゼ変異体の改良因子として計算され得る。例えば、活性部位滴定（AST, 例６）がリパーゼ濃度を決定するために使用される場合、及び問題の変異体についての改良因子が配列番号２のリパーゼに関して計算される場合、0.88、好ましくは0.9である配列番号２の平均IFにより、問題の変異体の平均IFを割算する。
【０３７８】
下記表10、表11、及び表13〜表23に列挙される追加のリパーゼ変異体に関して、配列番号１の脱グリコシル化された変異体N33Q（表１におけるLV2934）が対照リパーゼとして使用された。それらのリパーゼの個々のは、1.00以上の改良因子を有する（平均改良因子−標準偏差）。改良されたリパーゼの選択のためには、IF値及び標準偏差が２少数で使用された。続いて、それらの数字は１少数に切り上げられる。
【０３７９】
【表９】
0005406040.tif 000011
【０３８０】
【表１０】
0005406040.tif 000012
【０３８１】
【表１１】
0005406040.tif 000013
【０３８２】
【表１２】
0005406040.tif 000014
【０３８３】
【表１３】
0005406040.tif 000015
【０３８４】
【表１４】
0005406040.tif 000016
【表１５】
0005406040.tif 000017
【表１６】
0005406040.tif 000018
【表１７】
0005406040.tif 000019
【表１８】
0005406040.tif 000020
【表１９】
0005406040.tif 000021
【表２０】
0005406040.tif 000022
【表２１】
0005406040.tif 000023
【０３８５】
【表２２】
0005406040.tif 000024
【０３８６】
【表２３】
0005406040.tif 000025
【０３８７】
例８：ペプシンの存在下でpH3での改良された安定性を有するリパーゼ変異体：
例５における表８の変異体を、下記表24及び表25の変異体と共に、ペプシンの存在下でpH3での安定性についてスクリーンした。
【０３８８】
変異体を、配列番号１のアミノ酸21〜100の２種のランダム突然変異誘発された酵母ライブラリーから、標的化された次の変化：D27X, E43X, E56X, D57DA, D62DA, E87EK, D96DL, E99X, D111X, D234X Q249QR, D254DNを有する配列番号１の標的化された酵母ライブラリーから、標的化された次の変化：N11R, D27RQNV, G38X, D96EW, K98X, T114I, K163WA, E210VD, R231I, D254SGQIK及びP256TAと共にG91T及びG163Kを有する配列番号１の標的化された酵母ライブラリーから、G91T及びG163Kを有する配列番号１のランダム突然変異誘発されたライブラリーから、D27R, G91 N, N94R, D111A, S216P, L227G及びP256Tを有する配列番号１のランダム突然変異誘発されたライブラリーから選択されるか、又は配列番号１から生成される特定部位の突然変異誘発された変異体であった。酵母は、サッカロミセス・セレビシアエJG169（MATα; ura3-52; leu 2-3, 112; his 3-D200; pep 4-113; prd ::HIS3; prbl :: LEU2; cir+）である。
【０３８９】
【表２４】
0005406040.tif 000026
【０３９０】
【表２５】
0005406040.tif 000027
【０３９１】
原理：
スクリーニング方法は、75μg/mlのペプシンの存在下でpH3.0及び室温での３時間後、残留リパーゼ活性を測定する。残留リパーゼ活性を、非常に高い活性及び非常に低い活性のリパーゼのスクリーニングの間の検出を可能にするために、活性をモニターする速度アッセイより、一定時間にわたって測定する。
変異体の一次スクリーンにおいては、十分に高い希釈を、試験条件に対する培地又は発光成分の効果を最少にするために、ブイヨンサンプルに対して行う。一次相を通過する変異体は、試験サンプルのより高い希釈度及び反復試験を付加することにより追従スクリーニングにおける試験を受ける。
【０３９２】
材料及び方法：
一次スクリーニング培地：
1.7gの酵母窒素基材（YNB）、及び硫酸アンモニウム (Bio 101, カタログ番号4027-532)、 0.8 gの完全サプリメント混合物-ウラシル(CSM-ura) w/40 mg のアデニン(ADE) (Bio 101 , カタログ番号4512-722)、5 g のカザミノ酸(BD, カタログ番号223050)、100 mlの50% グルコース、50 mlの 0.5 M K2HPO4 (リン酸カリウム-ニ塩基性)、1 mlの100 mM CuSO4-SH2O (JD Baker, カタログ番号1843- 01)、1 ml の100 mg/mL アンピシリン（合計体積を脱イオン水により1Lに調節する）。培地をフィルター殺菌し、そして４℃で貯蔵した。
【０３９３】
最適化された培地：
6.7gのYNB、及び硫酸アンモニウム (Bio 101 , カタログ番号4027-532)、 5.9 g の 琥珀酸 (Sigma S-9512)、 0.8 g の CSM-ura w/40 mg ADE (Bio 101 , カタログ番号4512-722)、 20 gのガラクトース(Sigma, カタログ番号G-0625)、10 gのグルコース, 1 mlの100 mM CuSO4-5H2O 及び1 mlの100 mg/mL アンピシリン。pHをNaOHにより6.6に調節し、そして体積を、脱イオン水により１Lに調節する。
【０３９４】
種子培養培地：
次の成分を混合する：6.7 g のYNB 、及び硫酸アンモニウム (Bio 101 , カタログ番号4027- 532)、 5 g のカザミノ酸(BD, カタログ番号223050)、100 mlの 0.5 M琥珀酸(Sigma S- 9512)、855 ml の脱イオン水H2O。前記混合物をオートクレーブ処理する。２mlの10mg/mlのクロラムフェニコール及び40mlの50％グルコースを添加する。4℃で貯蔵する。
【０３９５】
基質及びペプシン処理を行うための原液：
1. 10% Triton-X100 (w/v) 
2. 1 Mの TRIS, pH 8.0
3. 10% (680 mM)の CaCl2*2H2O
4. 100 mMのクエン酸, pH 3.0
５．100mMのクエン酸、0.01％Triton-X100において製造された5mg/mlのブタペプシン（Sigma P-6887, 3280 U/mg固形物, 3370 U/mg ペプシン）
６．6.10％Triton-X100において製造された50mMの４−ニトロフェノール（PNP）パルミテートリパーゼ活性アッセイのための基質：
1 mM のPNP-パルミテート, 1.2%Triton-X100, 4 mMの CaCl2, 100 mMの TRIS, pH 8.0。
【０３９６】
ペプシン処理溶解：
150 ug/mLのペプシン, 4 mMの CaCl2, 0.01% Triton-X100, 50 mMの シトレート, pH 3.0。
希釈剤：
0.01％Triton-X100, 10mMのNaCl。
酵素：
一次スクリーンのためのリパーゼ変異体のブイヨンサンプルは、95ウェルプレートにおける一次スクリーン培地中に、寒天プレートから採取された個々のクローンに由来した。
【０３９７】
培養物の増殖：
３種の培地レセピーを用いて、リパーゼ変異体を増殖した。一次スクリーンレベルでの発現レベルは決定的ではないので、一次スクリーン培地を初期スクリーン段階のために使用した。酵母コロニーを発現する単一のリパーゼ変異体を、96ウェルプレートにおける180μlの一次スクリーン培地中に採取し、そして一次スクリーニングサンプルに関して、30℃及び250rpmで４〜６日間、増殖した。
【０３９８】
二次スクリーニングに関しては、一次スクリーニングプレートからの培養物20μlを、24ウェルプレートにおける1mlの種子培養培地中に移し、そして30℃及び250rpmで一晩、増殖した。リパーゼの発現は、30℃及び250rpmで４〜６日間、24ウェルプレートにおける1mlの最適化された培地中に20μlの種子培養物を接種することにより達成された。
いずれかの続くスクリーニングに関しては、単一の酵母コロニーを、24ウェルプレートにおける1mlの種子培養培地中に採取し、そして30℃及び250rpmで一晩、増殖した。リパーゼの発現は、30℃及び250rpmで４〜６日間、24ウェルプレートにおける1mlの最適化された培地中に20μlの種子培養物を接種することにより達成された。最適化された培地は、タンパク質発現レベルを最大にするために、24ウェルプレート及び振盪フラスコにおいて増殖するために使用された。
【０３９９】
スクリーニング方法：
一次スクリーンにおいて、サンプルを、希釈剤により25倍に希釈し、次にその5μlを、5μlの希釈剤又はペプシン処理溶液のいずれかを含む384ウェルプレートに添加した。
室温で３時間後、基質を次の通りに個々のサンプルに添加した：ペプシン処理されたサンプルを、55μlの基質＋5μの希釈剤と共に混合し、未処理のサンプルを、55μlの基質＋5μlのペプシン処理された溶液と共に混合した。ペプシンpHは3.0であり、そしてpHの変化について補正しないで、活性アッセイを２種の異なったpH値で行い、その結果、これは、リパーゼの安定性に対する効果を伴わないで、アッセイpHを標準化する（基質のpHが全体のpHを8.0に上げるのに十分である場合（ペプシンが不活性である場合）、それを最後に添加することにより）。
【０４００】
OD405読み取りを、384ウェルプレート当たり６度、行い；基質添加の15分後、及び基質添加の18時間後、行い、そしてmOD/時として表された。線状範囲にあるデーターを集め、そして個々のペプシン処理されたサンプルの残留リパーゼ活性と、その対応する末処理サンプル残留リパーゼ活性とを比較した。これは、％残留活性（％RA）として下記に報告された；末処理の状態の割合により、処理された状態の割合を割算し、そしてその結果に100を掛け算することにより計算される。
【０４０１】
プレートを移動し、そしてピペット段階を行うよう機能するBiomek FXワークステーション、アッセイプレートからのデータを記録するDXT 800プレートリーダー、ワークステーションへの及びそれへのプレートを輸送する回転コンベヤーベルトから構成されるシステムを用いて、自動化を達成することができる。この方法は、96ウェルプレート形式でサンプルを受容し、同じ形式で希釈を行い、次に処理及びアッセイ段階のために384ウェルプレートを使用する。
【０４０２】
結果：
二次スクリーンの後に測定される場合の個々のリパーゼ変異体について相対的残留物活性が下記表26及び表27に示される。それらの変異体の個々は、配列番号２のアミノ酸１〜269のリパーゼに比較して、改良されたRA（ペプシンの存在下でpH3での安定性）を有する。
【０４０３】
【表２６】
0005406040.tif 000028
【０４０４】
【表２７】
0005406040.tif 000029
【０４０５】
例９：胆汁塩の存在下での改良された活性を有するリパーゼ変異体：
胆汁塩の存在下で改良された活性を有するリパーゼ変異体を同定するために、次のアッセイを開発した。アッセイは、胆汁塩を含まない条件に比較して、2mMの胆汁塩の存在下でのリパーゼ活性を測定する。試験は、リパーゼ活性が、非常に高い活性及び非常に低い活性リパーゼの検出を可能にするために、一定時間、活性をモニターする速度アッセイにより測定されるよう設定される。このアッセイは、試薬の添加のタイミング、及びリパーゼが低いpHで基質と反応するpH5.0から、開放されるPNP基のOD405での読取りを可能にするpH8.0への調節を正確に調節するために自動化される。前記プレートは、pH調節の直後、読取られる。
【０４０６】
アッセイ基質及び胆汁塩処理のための原液：
1. 10% Triton-X100 (w/v)
2. 10O mMの TRIS, pH 8.0 
3. 100 mMのスクシネート, pH 5.0
4. 10% (680 mM)の CaCl2*2H2O
5. 蒸留水において製造された20 mM の胆汁塩 (Sigma B-8756)
6. 10% Triton-X100において製造された 50 mMの 4-ニトロフェノール(PNP)オレエート。
【０４０７】
リパーゼ活性アッセイのための基質：
1 mMの PNP-オレエート, 1.2%Triton-X100, 2 mMの CaCl2, 25 mMのスクシネート, pH 5.0。
希釈剤：
0.01% Triton-X100, 10 mM のNaCl。
【０４０８】
酵素：
精製されたリパーゼサンプルを、自動化された方法のために、約8μg/mlの希釈度に希釈する。精製されたリパーゼサンプルの濃度を、消衰係数1.24A280/mgを用いて、280nmでの吸光度から決定する。
【０４０９】
液体基材の胆汁塩アッセイスクリーニングの方法：
酵素サンプルを、希釈剤により25倍及び200倍に希釈し、次のその20μlを、96ウェルプレート反応プレートにおける23μlの水又は23μｌの20mMの胆汁塩のいずれかに添加する。この後、200μlの基質（25mlのスクシネート中、1mMのPNPオレエート、2mMのCaCl2、1.2％Triton-X100, pH5.0）を添加し、そして混合する。混合の直後、60μlを除き、そして15μlをピペットにより、４個の別々の384ウェルプレートに移し、ここで４重反復（４×96）が使用され、リパーゼサンプルの２つの希釈溶液の個々について、“＋”及び“−”胆汁塩条件が設定される。
【０４１０】
４個の384ウェルプレートを用いて、４つの時点を設定する（個々のプレートは個々の“＋”及び“−”胆汁塩のリパーゼの２種の希釈溶液を有する）。１，２，３及び４時間後、60μlの100mMのTRIS（pH8.0）を、適切なプレート及びコードラントに添加、そしてすぐに読取る（OD405及びOD540）。約0.1〜0.475間のODは、このアッセイのために使用される線状範囲である。pH5.0での胆汁塩の存在下での活性の割合を、“胆汁塩なし”での活性について、時間及び希釈度について補正されたすべての線状データの平均により割算された、“胆汁塩”活性について、時間及び希釈度について補正されたすべての線状データの平均を計算することにより、％として表す。対照（配列番号１の変異体N33Q）に対する活性の比率を、対照±胆汁塩の比率により、変異体±胆汁塩の比率を割算することにより計算し、そして倍率改良性（例えば、３×は300％を意味する）として報告する。
【０４１１】
【表２８】
0005406040.tif 000030
例10：インビボ消化能力試験（スクリーニング試験）：
本発明の選択された、精製されたヒューミコラ・ラヌギノサリパーゼ変異体を、誘発された膵臓外分泌機能不全症（PEI）を有する雌Gottingenミニブタ（Ellegaard）におけるリパーゼスクリーニングの試験において研究した。変異体のアミノ酸配列は、表１、７及び８に見出される。効力を、配列番号１のアミノ酸１〜269を有するリパーゼの変異体N33Q（変異体LV2934; 表12の対照リパーゼ）の効力に比較した。
【０４１２】
膵臓外分泌機能不全症（PEI）は、Tabeling など. (Tabelingなど. (1999): "Studies on nutrient digestibilities (pre-caecal and total) in pancreatic duct-ligated pigs and the effects of enzyme substitution", J. Anim. Physiol. A. Anim. Nutr. 82: 251-263) 、及び Gregory など. (Gregory など. (1999): "Growth and digestion in pancreatic duct ligated pigs, Effect of enzyme supplementation" in "Biology of the Pancreas in Growing Animals" (Pierzynowski & Zabielski eds), Elsevier Science BV, Amsterdam, pp 381-393)に記載のようにして、膵管の連結によりミニブタにおいて誘発され、そしてそれらはまた、回盲部の内典したカニューレにより固定され、ここですべてはイソフルオラン麻酔下にあり、そして約25kgの体重であった。研究の開始の前、手術からの回復は少なくとも４週間を要した。研究の開始の前、個々のブタのPEI状態を、大便キモトリプシン試験（lmmundiagnostik AG, Wiesenstrasse 4, D-64625 Bensheim, Germany, with catalogue No. K 6990から市販されている）により確かめた。
【０４１３】
アッセイ：
リパーゼ活性についてのスクリーニング試験を、３又は４匹のPEIミニブタの２つのグループにおいて実施した。研究の間、ブタは改良された代謝ケージに収容され、そして水を自由に飲むことができ、そして１日当たり２回の食事が供給された。
【０４１４】
試験食事：
247.2gのミルク；Fresenlus Kabiからの１×87gの香料Calshake（2077KJ/100g）；29.9gのオリーブ油；9.88gのMethocel（Colorcon GmbHからのMehocel E5）；及び0.368gの酸化クロム。Calshakeは、24.4％の脂肪、3.3％のラクトース、64.9％の炭水化物（49％の糖）、4.3％のタンパク質を含む。
【０４１５】
ミルク及び酸化クロムをUltraturaxホモジナイザー（9500rpm, 約1分）により平均化し、油を混合し、そして再び１〜２分間、均質化した。次に、Calshakeを混合し（１〜２分間、ミキサーにより撹拌される）、そして最終的に、Methocelを、Ultraturaxにより混合しながら、ゆっくり添加し、そして次に全食事を、約３分間、均質化した。
【０４１６】
性能：
リパーゼ効力を評価するために、ブタに１回の試験食事（51.6gの脂肪を含む）を供給し、この食事中には、異なった量の対照リパーゼ又は類似する量のリパーゼ変異体が給餌の直前、混合されている。
【０４１７】
対照リパーゼLV2934を、0.124, 1.24, 4.96又は18.61mgの酵素タンパク質/食事（それぞれ500, 5000, 20000及び75000FIP Uリパーゼ/食事に対応する）で投与し、そして本発明のリパーゼ変異体をまた、LV2934によるインビボ効力を比較するために、mg酵素タンパク質（1.24、4.96及び18.61mg/食事）に従って投与した。研究は、Latin Square企画に従って行われた。
【０４１８】
回腸キームスを、回腸における食事マーカー（緑色キームス）の最初の出現の後、合計８時間、集め、そして２時間のサンプルを-20℃で凍結した。少なくとも１日の洗浄を、それぞれの測定間で可能にした。低脂肪液体食事を、個々の試験の前、夜に与え、非試験食事からの食事含有物の干渉の傾向を低めた。
【０４１９】
分析：
凍結された回腸キームスサンプルを、凍結乾燥し、微粉砕し、そして乾燥物質（DM）及び脂肪について分析した（Naumann & Bassler 1993; Die chemische Untersuchung von Futtermitteln, 3. edition, VDLUFA-Verlag, Darmstadt (VDLUFA = Verband Deutscher Landwirtschaftlicher  Untersuchungs- und Forschungsanstalten）。DMを、凍結乾燥、続く103℃での８時間のインキュベーションの後、重量により評価し；乾燥サンプルの粗脂肪含有率を、酸加水分解及び石油エーテル抽出により、ANKOMXT15抽出機（Ankom Technology, Macedon, NY, USから入手できる；一度に15の抽出を実施できる）でのフィルターバッグ技法を用いて、決定し；Cr2O3をクロメートに酸化し、そしてPetry and Rapp ：Zeitung fur Tierphysiologie (1970), vol. 27, p. 181-189. (Petry & Rapp 1970; Z. Tierphysiol. 27; 181-189)により記載のようにして、365nmでの減衰（分光計）を通して計算した。
【０４２０】
消化能力値（脂肪吸収の係数；CFA）を、下記式に従ってのマーカー方法により評価した：
CFA（％）＝100−[飼料における％Cr2O3]*[ 回腸キームスにおける％脂肪]・100/[回腸キームスにおける％Cr2O3]*[飼料における％脂肪]。
【０４２１】
結果及び結論：
CFA結果が、表29に示される。リパーゼ投与量は、食事当たりのmg酵素タンパク質（mg/食事）で示される。
【表２９】
0005406040.tif 000031
追加のリパーゼ変異体、例えばLV1330, LV1855, LV1865, LV1874, LV1889, LVA043, LVA049, LVA012, LVA023, LVA099, LVA041 , LVA061, LVA103, LV1857, LV1232及び LVA473が、同じスクリーニング試験において研究される。
【０４２２】
試験されるすべてのリパーゼ変異体は、インビボにおいて活性的であり、そしてCFAにおいて用量依存性改良を引起された。リパーゼ変異体LVA129, LVA147, LVA238, LVA315, LVA317, LVA319及びLVA368はすべて、対照リパーゼに比較して、相当の改良される。
【０４２３】
例11：完全なインビボ消化試験：
精製されたリパーゼ変異体LVA319を、６匹の雌Gottingenミニブタ（Ellegaard）のグループにおける完全な消化研究において試験した。効力を、同じ食餌を供給されたPEIミニブタにおいて試験される配列番号１のリパーゼの効力に比較した。膵臓外分泌機能不全症（PEI）を、膵管の連結によりミニブタにおいて誘発し、そしてそれらをまた、回腸−盲腸再入カニューレにより固定し、すべてはイソフルオラン麻酔下で及び約25kgの体重で、次に記載のようにして実施された：Tabeling など. (Tabelingなど., 1999, "Studies on nutrient digestibilities (pre-caecal and total) in pancreatic duct-ligated pigs and the effects of enzyme substitution", J. Anim. Physiol. A. Anim. Nutr. 82: 251-263) 及び Gregory など. (Gregory など., 1999, "Growth and digestion in pancreatic duct ligated pigs, Effect of enzyme supplementation" in "Biology of the Pancreas in Growing Animals" (Pierzynowski & Zabielski eds), Elsevier Science BV, Amsterdam, pp. 381-393)。
【０４２４】
研究が開始される前、少なくとも４週を、手術から回復のために要した。研究の開始の前、個々のブタのPEI状態を、便キモトリプシン試験（lmmundiagnostik AG, Wiesenstrasse 4, D-64625 Bensheim, Germany,カタログ番号K 6990から市販されている）により確認した。
【０４２５】
アッセイ：
研究の間、ブタは、12：12時間の明暗サイクルに基づいて囲いに収容され、そして水へは自由に接近でき、そして１日２回の飼料が与えられた。
【０４２６】
試験食事：
研究の間、ブタは、200gの二重微粉砕された食餌（Altrominからの）、及び25gのオリーブ油、75gのクリーム及び1Lの水と共に混合された、0.625gのCr2O3を含む高脂肪“ヒト−様”食餌300gを、1日２度（8.00、20.00時）与えられた（表30を参照のこと）。試験食事は、ブタのための栄養必要条件により、31％の脂肪、15％のタンパク質、36％の澱粉、並びにビタミン、鉱物及び微量元素を含んだ。
【０４２７】
【表３０】
0005406040.tif 000032
【０４２８】
クリーム、及びオリーブ油、続いて水道水、及び最終的に、異なった量/異なった酵素サプリメントが、ブタに供給される直前、前もって計量された乾燥トウ（酸化クロムマーカーを含む）中に混合した。
【０４２９】
性能：
リパーゼ効力を評価するために、ブタは、１日当たり２回の300gの試験食事を供給され、この食事中に異なった量の２種のリパーゼの１つ又は他が供給の直前、混合された。投与される個々のリパーゼの量、すなわち微生物FIP Uリパーゼ/食事（リパーゼFIP単位、例１を参照のこと）での活性が、表15において括弧で示されている。個々の酵素の用量は、少なくとも14日間、供給され、すなわちブタは、高脂肪食餌＋個々の新規酵素用量を９日間、与えられ、その後、すべての便が次の日、集められ、計量され、そして分析まで-20℃で貯蔵された。
【０４３０】
分析：
個々のブタからの凍結された便を凍結乾燥し、再び計量し、そして粉砕した。次に、5日目の粉砕されたサンプル（毎日の便生成に従って）の個々のアリコートをプールし、そして一緒に混合し、すなわち個々の用量の酵素について、個々のブタについての１つのプールされたサンプルを与えた。個々のプールされたサンプルから、乾燥物質及び粗脂肪の含有率を決定した（Naumann & Bassler 1993; Die chemische Untersuchung von Futtermitteln, 3. edition, VDLUFA-Verlag, Darmstadt (VDLUFA = Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und For- schungsanstalten）。
【０４３１】
乾燥物質を、凍結乾燥、続く103℃での８時間のインキュベーションの後、評価し；乾燥されたサンプルの粗脂肪含有率を、ANKOMXT15抽出機におけるフィルターバッグ技法を用いて、酸加水分解及び石油エーテル抽出により決定し；Cr2O3をクロメートに酸化し、そしてPetry and Rapp ：Zeitung fur Tierphysiologie (1970), vol. 27, p. 181-189. (Petry & Rapp 1970; Z. Tierphysiol. 27; 181-189)に記載のようにして、365nmでの減衰（分光計）を通して計算した。
【０４３２】
消化能力値（脂肪吸収の係数；CFA）を、下記式に従ってのマーカー方法により評価した：
CFA（％）＝100−[飼料における％Cr2O3・便における％脂肪・100]/便における％Cr2O3・飼料における％脂肪]。
【０４３３】
結果及び結論：
表14における結果から、リパーゼ変異体LAV319が、配列番号１の対照リパーゼよりも、より良好に遂行することが明白である。
本発明のリパーゼは、試験された最低用量で高い効果的な改良性をすでに示しているので、脂肪消化において非常に強く且つ用量依存性の改良性を引起した。
【０４３４】
【表３１】
0005406040.tif 000033
【０４３５】
例12：医薬組成物：
ペレット：
精製されたリパーゼ変異体LVA129（例10においてインビボ試験された）の液体リパーゼ濃縮物を調製する。この液体濃縮物を従来の手段により乾燥し、そして乾燥された粉末のリパーゼタンパク質含有率を測定し、そして好ましくは、50％以上であるべきである。次に、500gの乾燥されたリパーゼ粉末を、市販のミキサーにおいて、200gの微晶性セルロース及び300gのポリエチレングリコール400（MacrogolTM 4000）と共にプレドライブレンドする。
【０４３６】
十分な量の通常使用される湿潤剤を添加し、そしてその得られる湿潤塊状物を室温で十分に混合する。均質化された塊状物を、0.8mmの穴の直径を有する穴開用ダイを備えた市販の押出し機において押出し、円柱上のペレットを形成した。生成される押出し物を、必要な量の通常使用される湿潤剤を添加することにより、市販の球状化機において、球状ペレットにする。ペレットを、約40℃の生成物温度で市販の真空乾燥機において乾燥した。次に、乾燥されたペレットを、0.7及び14mmのスクリーンを有する機械的篩機械を用いることにより分離した。0.7mm〜1.4mmの篩画分を集め、そしてサイズ２のカプセルにそれぞれ200mgのペレットの部分を充填した。
【０４３７】
得られるペレットを、例１に記載されるリパーゼpH−安定アッセイを適用することにより、脂肪分解活性について試験する。
得られるペレットを、Pharm. Eur. 2.9.1 (“錠剤及びカプセルの分解”セクション)（試験溶液：0.1Mのマロン酸、pH6.0−500ml、37℃）に従って、分解について試験する。
【配列表】
0005406040000001.app