(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で示される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼクレノー断片に基づいて８７９〜８８１位のモチーフＣ配列ＱＶＨ中で、少なくともアミノ酸残基Ｑ８７９及びＨ８８１が親油性アミノ酸残基で置換されてなる改変されたモチーフＣ配列を有し、かつ対応する野生型ポリメラーゼと比較して増大したミスマッチ識別を有する、ＡファミリーＤＮＡポリメラーゼまたはそのクレノー断片。
【請求項２】
上記ＡファミリーＤＮＡポリメラーゼまたはそのクレノー断片は、細菌ＤＮＡポリメラーゼに由来するものである、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼまたはそのクレノー断片。
【請求項３】
上記ＡファミリーＤＮＡポリメラーゼまたはそのクレノー断片は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼまたは耐熱性クレノー断片である、請求項１または２に記載のＤＮＡポリメラーゼまたはそのクレノー断片。
【請求項４】
上記ＡファミリーＤＮＡポリメラーゼまたはそのクレノー断片は、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・フィリホルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、ロドサーマス・オバメンシス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ）、またはバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＡファミリーＤＮＡポリメラーゼから成る群から選択されるポリメラーゼに由来するものである、請求項１から３のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼまたはそのクレノー断片。
【請求項５】
８７９〜８８１位のモチーフＣ配列ＱＶＨ中で８８０位のアミノ酸残基がＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＡｌａまたはＴｙｒであることを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼまたはそのクレノー断片。
【請求項６】
８８０位のアミノ酸残基がＶａｌまたはＩｌｅである、請求項５に記載のＤＮＡポリメラーゼまたはそのクレノー断片。
【請求項７】
親油性アミノ酸残基がＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、ＭｅｔおよびＴｒｐから選択されることを特徴とする、請求項１から６のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼまたはそのクレノー断片。
【請求項８】
親油性アミノ酸残基がＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅから選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼまたはそのクレノー断片。
【請求項９】
モチーフＣ配列ＱＶＨが配列ＬＶＬまたはＬＶＧで置換されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼまたはそのクレノー断片。
【請求項１０】
（ｉ）７８２〜７８４位の配列ＱＶＨがＬＶＬまたはＬＶＧで置換されている、配列番号４に示す配列を含むＴａｑポリメラーゼである；または
（ｉｉ）８７９〜８８１位の配列ＱＶＨがＬＶＬまたはＬＶＧで置換されている、配列番号２に示す配列を含むクレノー断片である、
請求項１から９のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼまたはそのクレノー断片。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼまたはそのクレノー断片をコードするＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項１１に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載のベクターで形質転換されている、および／または請求項１１に記載のＤＮＡを含む、宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載の宿主細胞を培養すること、およびＤＮＡポリメラーゼまたはクレノー断片を培養物または培養物上清から単離することを含む、請求項１から１０のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼまたはそのクレノー断片の調製のための方法。
【請求項１５】
請求項１から１０のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼまたはそのクレノー断片の、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅、及びクローニングを含む検査法並びに分子生物学的方法における使用。
【請求項１６】
請求項１から１０のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼを用いることを含む、個別試料中の一つ以上の標的核酸における少なくとも一つの配列変異体の存在または不存在を決定する方法。
【請求項１７】
下記の段階を含む、請求項１６に記載の方法：
ａ）添加：
・デオキシヌクレオシド三リン酸；
・請求項１から１０のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ；
・プライマーが検出すべき標的核酸の各配列変異体について加えられることを特徴とし、そのプライマーは検出すべき配列変異体と相補的な配列を有し、および標的核酸中の検出すべき配列変異体は識別プライマーの少なくとも一つの３'末端、３'−隣接末端または３'−隣接−隣接末端ヌクレオチド残基と相補的であることを特徴とする、少なくとも一つの識別ヌクレオチド残基を含む少なくとも一つの識別プライマー；
・識別プライマーの伸長によって形成されるプライマー伸長産物と相補的である、少なくとも一つの他のプライマー；
ｂ）検出すべき配列変異体を有する標的核酸を試料が含む場合に限って識別プライマーの伸長産物が相当に得られることを特徴とする、プライマー伸長反応を実施；
ｃ）プライマー伸長反応の産物をテンプレート核酸から分離；
ｄ）段階ｂ）およびｃ）を繰り返して増幅産物を得る；並びに
ｅ）増幅産物の存在または不存在から、配列変異体の存在または不存在を決定。
【請求項１８】
段階ｄ）において、ポリメラーゼ連鎖反応によって段階ｂ）およびｃ）を繰り返して増幅産物を得る、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
段階ｂ）からｅ）がリアルタイムＰＣＲまたはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲとして実施されることを特徴とする、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１から１０のいずれか１項に記載の少なくとも一つのＤＮＡポリメラーゼを含む、個別試料中の一つ以上の標的核酸において少なくとも一つの配列変異体の存在または不存在を決定するためのキット。
【請求項２１】
下記の成分のうち一つ以上をさらに含む、請求項２０に記載のキット：
・標的核酸中の検出すべき配列変異体が識別プライマーの少なくとも一つの３'末端、３'−隣接末端または３'−隣接−隣接末端ヌクレオチド残基と相補的であることを特徴とする、少なくとも一つの識別ヌクレオチド残基を含む一つ以上の識別プライマー；
・前記識別プライマーの伸長によって形成されるプライマー伸長産物と相補的である一つ以上の他のプライマー；
・デオキシヌクレオシド三リン酸；
・緩衝液；
・定量化試薬；および
・ポリメラーゼ−遮断抗体。
【請求項２２】
定量化試薬が介在型試薬または副溝に結合する試薬である、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
ポリメラーゼ遮断抗体がＴａｑブロック（ＴａｑＢｌｏｃｋ）である、請求項２１または２２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミスマッチ識別の増大を有する特別の突然変異を持つＤＮＡポリメラーゼ、その調製および使用に関する。この突然変異を持つ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、診断法および分子生物学的方法、たとえば、対立遺伝子特異的ＰＣＲに特に適している。
【背景技術】
【０００２】
最初のヒトゲノム配列が公開されて以来、研究は一塩基突然変異（「一塩基多型」、ＳＮＰ）のような個人間の遺伝的差異の発見に焦点を当てている。これは、ゲノム中の一塩基変異は、異なる薬剤耐性または幅広い疾患への素因を伴うことがますます明らかになっているため興味が持たれる。将来的には、医学的に有意義なヌクレオチド変異の知識が、治療を個別の遺伝子供給に適合させることを可能にし、および無効なまたは副作用を生じさえする薬剤を用いる治療を防ぐことができる（シー（Ｓｈｉ），Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．１，３６３−３６５（２００１））。ヌクレオチド変異の時間効率および費用効率の良い同定を可能にする開発が、薬理遺伝学におけるさらなる進歩に繋がることは明らかである。
【０００３】
ＳＮＰはヒトゲノム中の遺伝子変異の大部分を占め、および個人差の９０％以上の原因である（クウォク（Ｋｗｏｋ），Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ ２，２３５−２５８（２００１）；クウォクおよびチェン（Ｃｈｅｎ），Ｃｕｒｒ．Ｉｓｓｕｅｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５，４３−６０（２００３）；トウィマン（Ｔｗｙｍａｎ）およびプリムローズ（Ｐｒｉｍｒｏｓｅ），Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ ４，６７−７９（２００３））。そのような遺伝子変異および他の核酸変異体、たとえば突然変異を検出するためには、さまざまな方法を用いることができる。たとえば、標的核酸の変異体の同定は、分析すべき核酸試料をその配列変異体に特異的なハイブリダイゼーションプローブと適当なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることによって実施できる（グオ（Ｇｕｏ）他，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５，３３１−３３５（１９９７））。
【０００４】
しかし、そのようなハイブリダイゼーション方法は、特に、そのような検定法の必要感度について臨床上の必要条件を満たさないことが見出されている。したがって、特にＰＣＲはまた、分子生物学試験法および診断試験法において、変異体の存在に関して試験すべき標的核酸がハイブリダイゼーションの前にポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される、突然変異、一塩基多形（ＳＮＰ）および他の対立遺伝子配列変異体の検出のために幅広い用途を見出している（サイキ（Ｓａｉｋｉ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９，４８７−４９０（１９８８））。そのような検定法のためのハイブリダイゼーションプローブとしては、一本鎖オリゴヌクレオチドが通常用いられる。そのような検定法の実施形態の改変は、蛍光ハイブリダイゼーションプローブを用いるものを含む（リヴァク（Ｌｉｖａｋ），Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．１４，１４３−１４９（１９９９））。一般的に、ＳＮＰおよび他の配列変異の決定のための方法は自動化が図られる（グート（Ｇｕｔ），Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１７，４７５−４９２（２００１））。
【０００５】
先行技術で既に公知である、配列変異体特異的ハイブリダイゼーションの代替法が、いわゆる対立遺伝子特異的増幅によって提供される（ニュートン（Ｎｅｗｔｏｎ）他，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７，２５０３−２５１６（１９８９）；ジャーマー（Ｇｅｒｍｅｒ）他，ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｓ．１０，２５８−２６６（２０００）；ギブズ（Ｇｉｂｂｓ）他，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７，２４３７−２４４８（１９８９）；ウー（Ｗｕ）他，ＰＮＡＳ ８６，２７５７−２７６９（１９８９）；イシカワ（Ｉｓｈｉｋａｗａ）他，Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４２，３１５−３１８（１９９５））。この検出方法では、増幅中に既に、検出すべき標的核酸の特定の一変異体だけに残基が相補的であるだけのいわゆる識別末端ヌクレオチド残基をプライマーの３'末端に有する、変異体特異的増幅プライマーが用いられる。この方法では、ヌクレオチド変異はＰＣＲ増幅後のＤＮＡ産物の存在または不存在によって判定される。対立遺伝子特異的増幅の原理は、対立遺伝子特異的プライマープローブの末端での標準的または非標準的プライマー−テンプレート複合体の形成に基づく。正しく対合した３'プライマー末端では、ＤＮＡポリメラーゼによる増幅が起こりうる一方、ミスマッチしたプライマー末端では、伸長は阻害される。
【０００６】
たとえば、米国特許第５，５９５，８９０号明細書は、対立遺伝子特異的増幅のためのそのような方法、および、たとえばｋ−ｒａｓがん遺伝子中の、臨床的に意義のある点突然変異の検出へのその適用を記載する。米国特許第５，５２１，３０１号明細書もまた、ＡＢＯ血液型系の遺伝子型決定のための、対立遺伝子特異的増幅のための方法を記載する。対照的に、米国特許第５，６３９，６１１号明細書は、鎌状赤血球性貧血の原因である点突然変異の検出に関する対立遺伝子特異的増幅の使用を開示する。
【０００７】
しかし、対立遺伝子特異的増幅は、低い選択性によって特徴づけられ、そのことがさらに複雑なおよびしたがって時間集約的および費用集約的な最適化段階を必要にする点で問題である。
【０００８】
配列変異体、多形および主に点突然変異を検出するためのそのような方法は、特に検出すべき配列変異体が、同一の核酸区域の（または同一の遺伝子の）主な変異体と比較して不十分である場合に、対立遺伝子特異的増幅を必要とする。
【０００９】
たとえば、播種性の腫瘍細胞が血液、血清または血漿といった体液中で、対立遺伝子特異的増幅によって検出される場合にそのような状況が起こる（米国特許第５，４９６，６９９号明細書）。この目的のためには、ＤＮＡはまず血液、血清または血漿といった体液から単離され、そのＤＮＡは播種性の腫瘍細胞に由来する不十分量のＤＮＡおよび非増殖細胞に由来する過剰量のＤＮＡから成る。したがって、腫瘍ＤＮＡについて重要なｋ−ｒａｓ遺伝子中の突然変異を、過剰量の野生型ＤＮＡの存在下で数コピーの腫瘍ＤＮＡから検出しなければならない。
【００１０】
先行技術で記載された、対立遺伝子特異的増幅のためのすべての方法には、標的核酸が検出すべき配列変異体に正確に対応しない、すなわち、少なくとも識別すべきヌクレオチド残基と相補的なヌクレオチドによってそこから識別されても、３'−識別ヌクレオチド残基の使用にもかかわらず、プライマー伸長が適当なＤＮＡポリメラーゼの存在下で起こる程度が低いという欠点がある。これは特に特定の配列変異体を、別の配列変異体を含む過剰のバックグラウンド核酸中で検出すべき場合に偽陽性結果を生じる。上述の通り、これはたとえば、播種性の腫瘍細胞の指標としての特定のｋ−ｒａｓ対立遺伝子の検出において当てはまる。公知の方法のもう一つの不利益は、３'末端で識別するオリゴヌクレオチド残基をいずれにしろ使用しなければならないという事実である。これらのＰＣＲを基礎とする方法の不利益の主な理由は、これらの方法で用いられるポリメラーゼが、塩基ミスマッチを十分に識別できないことである。したがって、ＰＣＲによって突然変異の存在または不存在についての明瞭な情報を直接得ることはまだ不可能である。現在まで、さらなる時間集約的および費用集約的精製法および分析法が、そのような突然変異の明瞭な診断のため常に必要とされている。したがって、対立遺伝子特異的ＰＣＲ増幅の選択性の増大を可能にする新規の方法は、ＰＣＲによる直接ＳＮＰ分析の信頼性および頑健性に重大な影響をもたらす。
【００１１】
一方、ＤＮＡポリメラーゼＩのタンパク質配列においてはいくつかの改変が既に記載されている。このように、米国特許第６，３２９，１７８号明細書は、Ａモチーフ（高度に保存された配列ＤＹＳＱＩＥＬＲ）中に突然変異が存在した、触媒活性の変化したＤＮＡポリメラーゼ変異体を記載する。加えて、ミニック（Ｍｉｎｎｉｃｋ），Ｔ．他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，３０６７−３０７５（１９９９）は、アラニン置換が行われているさまざまな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断片）変異体を記載する。記載された変異体の一部は、野生型と比較してより高いポリメラーゼ精度を示す。記載された変異体のうちの一つがＨ８８１Ａである；記載されたその他の変異体に関してはこれらの変異体の具体的な性質は示されていない。
【００１２】
したがって、それによって配列変異体特異的検出方法を可能にする、高い特異性を持つ配列変異体を提供することが本発明の目的であった。
【発明の開示】
【００１３】
驚くべきことに、ＡファミリーＤＮＡポリメラーゼの特別の変異体、すなわち保存されたＣモチーフおよび特にそのＱＨＶアミノ酸配列が改変されているものが、ミスマッチ識別の増大を示し、および配列変異体についての検出法に使用できることが見出されている。その耐熱性変異体は対立遺伝子特異的ＰＣＲに適する。詳細には、本発明は下記に関する：
（１）改変されたモチーフＣ配列および対応する野生型ポリメラーゼと比較して増大したミスマッチ識別を有するＡファミリーＤＮＡポリメラーゼ、またはそのクレノー断片；
（２）配列番号２で示される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼクレノー断片に基づいて８７９〜８８１位のモチーフＣ配列ＱＶＨ中で、少なくともアミノ酸残基Ｑ８７９が親油性アミノ酸残基で置換されていることを特徴とする、実施形態（１）の好ましいＤＮＡポリメラーゼ；
（３）実施形態（１）または（２）に記載の前記ＤＮＡポリメラーゼまたはそのクレノー断片をコードするＤＮＡ配列；
（４）実施形態（３）に記載のＤＮＡ配列を含むベクター；
（５）実施形態（４）に記載のベクターを用いて形質転換されている、および／または実施形態（３）に記載のＤＮＡを含む、宿主細胞；
（６）実施形態（５）に記載の宿主細胞を培養しおよびＤＮＡポリメラーゼまたはクレノー断片を培養物または培養物上清から単離することを含む、実施形態（１）または（２）に記載のＤＮＡポリメラーゼまたはそのクレノー断片の調製のための方法；
（７）実施形態（１）または（２）に記載のＤＮＡポリメラーゼまたはクレノー断片の、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅、クローニング、などを含む、診断法および分子生物学的方法における使用；
（８）実施形態（１）または（２）に記載のＤＮＡポリメラーゼを用いた、個別試料中の一つ以上の標的核酸における少なくとも一つの配列変異体の存在または不存在を決定するための方法；および
（９）実施形態（１）または（２）に記載の少なくとも一つのＤＮＡポリメラーゼを含む、実施形態（８）の方法に記載の個別試料中の一つ以上の標的核酸における少なくとも一つの配列変異体の存在または不存在を決定するためのキット。
【００１４】
【表１】
0005570682.tif 000002
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、ミスマッチ識別の高い能力を有する変異体ＡファミリーＤＮＡポリメラーゼ、またはそのクレノー断片に関する。ミスマッチ識別の高い能力は、相補的塩基の組み込み中およびまた既にプライマーのテンプレートとのアニーリング中のワトソン−クリック則に従った高い選択性、すなわち、対応する開始ポリメラーゼ（野生型）と比較して高い伸長選択比（Ｆマッチ／Ｆミスマッチ）（たとえば、実施例２に記載の蛍光試験系で測定される）を意味するが、天然酵素中の特定のアミノ酸配列を突然変異させることによって達成できる。それによって生じたＤＮＡポリメラーゼの性質は、現在市販されている「最先端」野生型ポリメラーゼの性質よりも優れている。ＤＮＡポリメラーゼの活性の選択性の増大は、化学的に修飾されたプライマーを使用する必要が無いため、突然変異または多形の検出のためのより信頼性の高い系、下流の時間集約的および費用集約的な精製および分析法を伴わない対立遺伝子特異的ＰＣＲによる直接診断、および高い持続性を可能にする。
【００１６】
下記の定義は本出願全体に適用されるが、それらはしかし本発明を限定しないと解釈される。「ＡファミリーＤＮＡポリメラーゼ」（「ポリメラーゼＩ」ともいう）とは、配列ＤＹＳＱＩＥＬＲを有するＡモチーフを活性部位に含むＤＮＡポリマー化酵素である。それらはまた、Ｃモチーフに突然変異を有する本明細書に記載の酵素を含む。特に、それらはまた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよびその変異体を含む。
【００１７】
ここで用いられる「クレノー断片」の語は、ポリメラーゼ活性および３'→ ５'エキソヌクレアーゼ活性の両方を有する（しかし５'→ ３'エキソヌクレアーゼ活性は無い）ＡファミリーＤＮＡポリメラーゼの任意のＣ末端断片を意味する。ここで用いられる「ベクター」は、目的のＤＮＡ（特に、本発明に記載のＡファミリーＤＮＡポリメラーゼの配列である）に加えて目的ＤＮＡの発現を調節する調節配列もまた含む、プラスミド、コスミド、ファージミドおよびウイルスを含む。
【００１８】
「宿主細胞」の語は、たとえば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（特に大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ、ＤＨ５α、Ｂｌ２１（ＤＥ３）、Ｍ１５[ｐＲＥＰ４]、ＳＧ１３００５[ｐＲＥＰ４]、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ）、ハロモナス・エロンガータ（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｅｌｏｎｇａｔａ）、カウロバクター（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、ハロバクテリウム・ハロビウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｏｂｉｕｍ）などといった原核細胞、および、たとえば酵母および他の真菌細胞、植物および細胞培養物中の単離ヒト細胞を含む動物細胞といった真核細胞の両方を含む。さらに、「宿主細胞」の語はまた、たとえば小麦胚芽抽出物およびウサギ網状赤血球抽出物（ＲＲＬ）といった、ｍＲＮＡを与えられた際にそれを翻訳できる細胞抽出物に関する。さらに、「宿主細胞」はまた、たとえばＴ７発現系、ｐＢＡＤ発現系、チオフュージョン（ＴｈｉｏＦｕｓｉｏｎ）（商標）発現系、ｔｒｃ発現系、ＰＬ発現系、ピュアプロ（ＰｕｒｅＰｒｏ）（商標）カウロバクター発現系、微生物培地および培地成分、キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）ｐＱＥ発現系およびノバジェン社（Ｎｏｖａｇｅｎ）ｐＥＴ発現系、などといったｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系を含む。
【００１９】
本発明の実施形態（１）および（２）は、ミスマッチ識別の増大を有することによって天然に存在するＤＮＡポリメラーゼと区別され、ミスマッチ識別の増大が結果として酵素活性の選択性の増大を生じる、ＡファミリーＤＮＡポリメラーゼまたはそのクレノー断片に関する。本発明に記載のＤＮＡポリメラーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、アクイフェックス （Ａｑｕｉｆｅｘ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、クラミドフィラ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、クロロフレクサス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドサーマス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）などに由来するポリメラーゼといった細菌ＤＮＡポリメラーゼだけでなく、特に、たとえばサーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・フィリホルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、ロドサーマス・オバメンシス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などといった耐熱性生物のポリメラーゼに由来する。特に、本発明の実施形態（１）に記載のＤＮＡポリメラーゼまたはそのクレノー断片中で、少なくとも一つのアミノ酸残基、好ましくは、８７９〜８８１位（配列番号２に示す大腸菌ＤＮＡポリメラーゼクレノー断片に基づく）のモチーフＣ配列ＱＶＨ中のＱおよび／またはＨが親油性アミノ酸残基で置換されている。
【００２０】
本発明の実施形態（２）では、少なくとも配列番号２に基づくアミノ酸残基Ｑ８７９が、親油性アミノ酸残基で置換されている。実施形態（２）の好ましい一態様では、モチーフＣ配列ＱＶＨ中のアミノ酸残基Ｈ８８１がさらに親油性アミノ酸残基で置換されている。
【００２１】
実施形態（１）および（２）のさらなる好ましい一態様では、８８０位（配列番号２に基づく）のアミノ酸残基はＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＡｌａおよびＴｙｒから、より好ましくはＶａｌおよびＩｌｅから選択される。
【００２２】
本発明の意味において「親油性アミノ酸残基」は、アミノ酸残基Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏなどを含む。好ましい残基はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅである。本発明によると、モチーフＣ配列ＱＶＨは好ましくは配列ＬＶＬ、ＬＶＧ、ＱＶＬ、ＰＩＬ、ＱＶＶ、ＬＶＡ、ＬＡＡ、ＬＶＶ、ＬＶＩ、ＩＶＩ、ＩＩＩ、ＶＶＶ、ＱＶＶ、ＱＶＡなどで置換されており、ＬＶＬおよびＬＶＧでの置換が特に好ましい。
【００２３】
上述の交換に加えて、本発明に記載のポリメラーゼは、欠失、置換および／または付加（最大各２０アミノ酸残基）といったより多くの突然変異を、野生型と比較してより高い伸長比（Ｆマッチ／Ｆミスマッチ）がそれによって悪い影響を受けない限り、含みうる。置換は特に、上記のＱＶＨ中の少なくとも一つの残基を親油性アミノ酸残基で置換することに加えて行われる、モチーフＣ配列中のさらなる（好ましくは保存的）交換を含む。したがって、本発明はまた、特に、Ｃモチーフ中のＱＶＨの代わりにアミノ酸配列ＬＶＮ、ＬＹＨ、ＰＬＱ、ＬＶＱ、ＱＤＬ、ＱＥＬ、ＱＵＶなどを含むＤＮＡポリメラーゼを含む。
【００２４】
加えて、Ｃモチーフ中のＱＶＨの代わりに配列ＱＶＮを持つＤＮＡポリメラーゼはまた、野生型と比較してより高い伸長比（Ｆマッチ／Ｆミスマッチ）を有することが見出されている。
【００２５】
さらに、本発明は、ＱＶＨ配列が上述の通り交換されているＴａｑポリメラーゼを含む。特に好ましいのは、ＱＶＨ配列がＬＶＬまたはＬＶＧで交換されているＴａｑポリメラーゼである（配列番号４に示すＴａｑポリメラーゼタンパク質配列に基づき、７８２〜７８４位が交換によって影響されている）。
【００２６】
本発明に記載のクレノー断片では、ＱＶＨ中の少なくとも二つのアミノ酸残基が親油性アミノ酸残基で置換されているのが好ましい。上述のような二つの交換を有する配列のうち特に好ましいのは、クレノー断片についてもまた、ＬＶＬおよびＬＶＧである。
【００２７】
文献（ミニック（Ｍｉｎｎｉｃｋ），Ｔ．他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，３０６７−３０７５ （１９９９））から知られる変異体ＱＶＡと比較して、本発明に記載のポリメラーゼ変異体は、プライマー伸長の選択性の増大を有する（実施例７、図５）。図５に示す通り、ＱＶＡ変異体は、本発明に記載のＬＶＬ変異体と比較して、ミスマッチを伸長する本質的により高い傾向を有する。
【００２８】
このように、本発明に記載のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列は、野生型ＤＮＡポリメラーゼと比較して一つ以上の位置で変化させられており、およびこれはまた核酸レベルで反映されている。本発明はまた、本発明に記載のＤＮＡポリメラーゼのうちの一つまたはそのクレノー断片をコードするＤＮＡ配列に関する（本発明の実施形態（３））。本発明はまた、ＤＮＡポリメラーゼ（１）または（２）をコードするＤＮＡ配列を含むベクター、およびＤＮＡポリメラーゼ（１）または（２）をコードするＤＮＡ配列を含むベクターで形質転換された宿主細胞、および／またはＤＮＡポリメラーゼ（１）または（２）をコードするＤＮＡを含む宿主細胞に関する。本発明はまた、形質転換された宿主細胞を培養することおよびＤＮＡポリメラーゼまたはクレノー断片を培養または培養上清から単離することを含む、ＤＮＡポリメラーゼまたはそのクレノー断片を調製する方法に関する。
【００２９】
本発明の実施形態（１）または（２）に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、天然に存在するＤＮＡポリメラーゼと比較して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により高い選択性を有し、および個別のミスマッチと標準的複合体とをより良好に識別する。このことは、診断法（対立遺伝子特異的ＰＣＲ）および分子生物学的方法（ＰＣＲによるＤＮＡ増幅、クローニング）に用いられる際の変異体の性質の改善に繋がる。したがって、本発明はまた、本発明に記載のＤＮＡポリメラーゼまたはそのクレノー断片を使用できる方法に関する。
【００３０】
本発明の実施形態（１）または（２）に記載のＤＮＡポリメラーゼはまた、個別試料中の一つ以上の標的核酸における配列変異体の存在または不存在を判定するための方法に使用できる（実施形態（８））。そのような方法は好ましくは下記の段階のうち一つ以上を含む：
ａ）添加：
・デオキシヌクレオシド三リン酸；
・本発明に記載のＤＮＡポリメラーゼのうちの一つ；
・プライマーが検出すべき標的核酸の各配列変異体について加えられ、そのプライマーは検出すべき配列変異体と相補的な配列を有し、および標的核酸中の検出すべき配列変異体は識別プライマーの少なくとも一つの３'末端、３'−隣接末端または３'−隣接−隣接末端ヌクレオチド残基と相補的である、少なくとも一つの識別ヌクレオチド残基を含む少なくとも一つの識別プライマー；
・識別プライマーの伸長によって形成されるプライマー伸長産物と相補的である、少なくとも一つの他のプライマー；
ｂ）検出すべき配列変異体を有する標的核酸を試料が含む場合に限って識別プライマーの伸長産物が相当に得られることを特徴とする、プライマー伸長反応を実施；
ｃ）プライマー伸長反応の産物をテンプレート核酸から分離；
ｄ）たとえばポリメラーゼ連鎖反応によって、段階ｂ）およびｃ）を繰り返して増幅産物を得る；
ｅ）増幅産物の存在または不存在から、配列変異体の存在または不存在を決定。
【００３１】
これに関連して、本発明に記載の方法の説明に用いられる用語は下記の意味を有する：
【００３２】
「本発明に記載のＤＮＡポリメラーゼ」とは、活性部位に配列ＤＹＳＱＩＥＬＲを有するＡモチーフを含みおよびＣモチーフ中に特定の突然変異を含む、上記で定義される通りのＡファミリーＤＮＡポリメラーゼである。特に、それらはまた、Ｃモチーフ中に突然変異を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む。これらの突然変異は、ＣモチーフのＱＶＬアミノ酸残基の保存的置換、および／または上記で定義される非保存的置換である。
【００３３】
「耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ」とは、４２℃を上回る温度でさえ機能するポリメラーゼであり、および、特に、ＰＣＲを基礎とする増幅方法に使用できる。
【００３４】
特に、「伸長反応」の語は、少なくともポリメラーゼ、ヌクレオチド、一つ以上のテンプレートおよびプライマーを含む反応混合物を含む。反応条件は、プライマーがテンプレートとアニーリングでき、およびポリメラーゼがテンプレートと相補的なヌクレオチドを組み込むことによってプライマーの伸長を触媒するように選択される。形成される産物がプライマー伸長産物である。
【００３５】
「標的核酸」とは、配列をさらに本発明に記載の方法によって分析すべき生物試料に由来する核酸区域である。生物試料は通常ゲノムＤＮＡから成る。しかし、本発明に記載の方法は、ＲＮＡ配列変異体の分析にも同様に適する。試料が細胞材料から、または血液、血清、血漿、尿または唾液といった体液からのどちらから単離されたかは重要でない。
【００３６】
本発明に記載の「配列変異体」は、他の可能な標的核酸の配列から微小な差しか示さない、およびそれらの微小な差によって同定できる、特定の核酸配列を有する標的核酸を意味する。配列の差は、好ましくは１ないし３個の隣接するヌクレオチド残基に及ぶ。本発明は、単一のヌクレオチド残基に関する配列変異体（ＳＮＰ）の同定に特に適している。これは塩基交換でありうるが、しかし代替的に、ヌクレオチド付加または欠失でもありうる。この方法で、異なる対立遺伝子を互いに識別できる。点突然変異または多形もまた、この方法で検出できる。このように、特に、「配列変異体」はまた、予測的または診断的問題に関して分析される点突然変異および多形を含む。
【００３７】
テンプレートに従ったデオキシヌクレオチド三リン酸のポリマー化では、デオキシヌクレオチド三リン酸のポリマー化は一本鎖テンプレート核酸とハイブリダイズしたいわゆるプライマーの３'末端から行われ、標的核酸と相補的な配列を形成する。５'(３'方向でのそのようなポリマー化反応は、好ましくはクレノー・ポリメラーゼといったいわゆるＤＮＡポリメラーゼを用いて酵素的に実施される。特に好ましいのは、Ｔａｑポリメラーゼ（ロシュ・アプライド・サイエンス社（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）カタログ番号１１４６１６５）といった耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである。
【００３８】
本発明の意味内での「識別プライマー」は、分析すべき試料中に存在しうる別の配列変異体とは特定の差を有する特定の配列変異体と、正確に相補的であるプライマーである。これに関連して、「識別ヌクレオチド残基」とは、さまざまな既存の配列変異体中のさまざまなヌクレオチド残基によって相補鎖が形成されるヌクレオチド残基を意味する。
【００３９】
「３'末端ヌクレオチド残基」とは、遊離の３'−ＯＨ基を持つ、オリゴヌクレオチドプライマーの末端に位置するヌクレオチド残基である。「隣接末端ヌクレオチド残基」とは、オリゴヌクレオチドプライマーの、末端ヌクレオチド残基の５'−末端とリン酸基を介して結合しているヌクレオチド残基である。「隣接−隣接末端ヌクレオチド残基」とは、３'−末端が隣接末端ヌクレオチド残基の５'−末端とリン酸基を介して結合しているヌクレオチド残基をいう。
【００４０】
本発明に記載の方法の上記の説明から見られる通り、段階ａ）からｅ）は本質的に、特定の配列反応の存在または不存在に応じて、増幅産物を結果として生じるかまたは生じない増幅反応である。したがって、そのような方法は、先行技術から公知であるＰＣＲ反応用の手順に従って実施できる。
【００４１】
これに関連して、本発明はまた、本発明に記載の方法を実施するための物質を含むキットに関する。特に、そのようなキットは、本発明に記載のＤＮＡポリメラーゼを含む。任意に、そのようなキットは、一つ以上の（識別）プライマー、デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝液、より好ましくはピコグリーン（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ）（モレキュラー・プローブズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））、Ｓｙｂｒグリーン（ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ）（モレキュラー・プローブズ社）、エチジウムブロマイド、ゲルスター（Ｇｅｌｓｔａｒ）（キャンブレックス社（Ｃａｍｂｒｅｘ））およびビスタグリーン（Ｖｉｓｔａ Ｇｒｅｅｎ）（アマシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ））から成る群からの試薬が選択される、定量化試薬、特に介在型試薬、または副溝に結合する試薬、ポリメラーゼ遮断抗体、特にＴａｑブロック（ＴａｑＢｌｏｃｋ）、およびテンプレートに従うデオキシヌクレオチド三リン酸ポリマー化のための物質といった追加の成分を含みうる。さまざまな実施形態において、キットの各成分は代替的に、１個の保存容器に一緒に、または２個以上の保存容器に別々に、入れることができる。
【００４２】
下記の実施例から見られる通り、先行技術から利用可能な方法に対する特異性の改善に関しての観測可能な効果は、定量的方法で明らかに実証でき（実施例７、図５を参照）、およびＰＣＲ増幅条件下で、配列変異体特異的プライマーの伸長産物は実際に、分析する試料が検出すべき配列変異体を有する標的核酸を含む場合に限って得られるという結果を有する。この特異的作用は、当業者に公知である手段によって各ＰＣＲパラメーターを改善および最適化することによって最適化でき、およびそれぞれ検出すべき配列変異体へ適合させることができる。
【００４３】
本発明の別の一実施形態は、リアルタイムＰＣＲによる本発明に記載の方法の実施に関する。この方法では、増幅反応の最終産物はゲル電気泳動によって検出されず、しかし動力学的リアルタイム測定および定量化が可能となるように増幅反応の過程が適当な蛍光標識化ハイブリダイゼーションプローブによって追跡される。
【００４４】
本発明に記載の方法に用いられるハイブリダイゼーションプローブは通常は、増幅反応のアニーリング温度で標的核酸とハイブリダイズする、一本鎖核酸、たとえば一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡまたはその誘導体、または代替的にＰＮＡである。通常は、これらのオリゴヌクレオチドは２０ないし１００ヌクレオチドの長さを有する。
【００４５】
正確な検出形式に応じて、標識化はオリゴヌクレオチドの任意のリボースまたはリン酸基に導入できる。核酸分子の５'および３'末端での標識が好ましい。標識化の種類は、増幅反応のリアルタイムモードで検出可能でなければならない。これは、たとえば、蛍光標識を用いてだけでなく、ＮＭＲによって検出可能な標識を用いても代替的に可能である。
【００４６】
多数の異なる試験設定が可能である。下記の３つの検出形式は、本発明に関して特に適していることが証明されている：
【００４７】
１．ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ：この試験形式には、増幅される標的核酸の同一鎖の隣接する部位に相補的である二種類の一本鎖ハイブリダイゼーションプローブが同時に用いられる。両方のプローブは異なる蛍光成分で標識化されている。適当な波長の光での第一の成分の励起に際して、第一の成分は蛍光共鳴エネルギー転移の原理に従って吸収されたエネルギーを第二の成分へ転移し、そのため、両方のハイブリダイゼーション試料が検出すべき標的分子の隣接位置へ結合する際に、第二の成分の蛍光放出が測定できる。
【００４８】
代替的に、蛍光標識化プライマーおよび一種類だけの標識化オリゴヌクレオチドプローブを用いることができる（バーナード（Ｂｅｒｎａｒｄ）他，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３５，１００１−１０７（１９９８））。
【００４９】
２．ＴａｑＭａｎハイブリダイゼーションプローブ：一本鎖ハイブリダイゼーションプローブが二成分で標識化される。第一の成分が適当な波長の光で励起される際、吸収されたエネルギーは蛍光共鳴エネルギー転移の原理に従って第二の成分であるいわゆる消光剤へ転移される。ＰＣＲ反応のアニーリング段階中に、ハイブリダイゼーションプローブは標的ＤＮＡへ結合し、および以降の伸長期中にＴａｑポリメラーゼの５'→ ３'エキソヌクレアーゼ活性によって分解される。このようにして、励起された蛍光成分および消光剤は空間的に互いに分離され、そのため第一の成分の蛍光放出が測定できる。
【００５０】
３．分子ビーコン：これらのハイブリダイゼーションプローブもまた第一の成分および消光剤で標識化されており、標識は好ましくはプローブの両端に位置する。溶液中では、二つの成分はプローブの二次構造のために空間的に密に近接している。標的核酸へのハイブリダイゼーション後、両方の成分は互いに分離され、そのため、適当な波長の光での励起後、第一の成分の蛍光放出を測定できる（リザーディ（Ｌｉｚａｒｄｉ）他、米国特許第５，１１８，８０１号明細書）。
【００５１】
別の実施形態では、各増幅産物はまた、二本鎖核酸との相互作用に際して適当な波長の光での励起の際に対応する蛍光シグナルを放出する本発明に記載のＤＮＡ結合色素によって検出されうる。色素ＳｙｂｒグリーンおよびＳｙｂｒゴールド（モレキュラー・プローブズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））は、この用途に特に適することが証明されている。代替的に、介在型色素もまた使用しうる。
【００５２】
本発明は下記の実施例および図面によってさらに説明される。記載の手順は、本発明の制限でなく、改変後でさえ、本発明の対象をなお説明する単なる例と解釈されるべきである。
【実施例】
【００５３】
実施例１：ライブラリの構築およびクレノー断片変異体の精製
プラスミドｐＱＫＦ(（ブラックマン（Ｂｒａｋｍａｎ），Ｓ．，ニックチェン（Ｎｉｅｃｋｃｈｅｎ），Ｐ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ２００１，２，７７３−７；配列番号２６に示される同等のプラスミドｐＱＥ３０も参照）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（３'→ ５'ｅｘｏ(）のＮ末端６−ｈｉｓ標識化クレノー断片の、Ｔ５プロモーター／Ｄｏｕｂｌｅ ｌａｃオペレーター配列の調節下での発現を可能にする。Ｑ８７９、Ｖ８８０およびＨ８８１をコードするモチーフＣ配列への突然変異の導入は、二段階目がプライマー突然変異誘発によって実施された。ＰＣＲ反応は、ＰｆｕターボＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を用いることによって、および標準的条件下で実施した。最初のＰＣＲは、９つの標的位置それぞれについて４０％の非野生型ヌクレオチドを含むように構築された処理プライマーライブラリ（５´−ＧＴＡ ＣＧＴ ＡＴＧ ＡＴＣ ＡＴＧ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＧＡＴ ＧＡＡ ＣＴＧ ＧＴＡ ＴＴＴ−３´；配列番号５）および２３量体下流プライマー（５´−ＧＣＴ ＡＡＴ ＴＡＡ ＧＣＴ ＴＧＧ ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＣ−３´；配列番号６）を用いて実施し、１９５量体ＰＣＲ産物を生じた。第二のＰＣＲは、アガロースゲルで精製したその１９５量体、および２４量体アンチセンスプライマー（５´−ＴＡＣ ＡＴＧ ＧＡＣ ＣＴＴ ＴＡＣ ＴＴＣ ＧＡＡ ＣＧＣ−３´ 配列番号 ７）を用いることによって実施し、および４５７ｂｐ産物を生じ、それをＣｓｐ４５ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化しおよびｐＱＫＦ(へクローニングした。結果として生じたプラスミドライブラリで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ １ｂｌｕｅ （ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を形質転換し、クローンを寒天平板から選択しおよび別々にスーパーブロス（Ｓｕｐｅｒｂｒｏｔｈ）培地（１００μｇ／ｍｌ アンピシリン）入りの９６ウェルプレート中で一夜増殖させた。クレノー断片変異体は発現され、採取され、および培養物６００μｌ中で９６ウェルプレートを用いて記載の通り溶解された。得られた溶解物３００μｌを保存緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．３、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭベンズアミジン、１μｇ／ｍｌロイペプチンおよび１μｇ／ｍｌアプロニチン）９００μｌで希釈し、遠心分離しおよび−８０℃にて保存した。
【００５４】
プライマー伸長反応および定常状態動力学測定のためには、クレノー断片および選択された変異体を上記の通り発現し、およびＮｉ−ＮＴＡアガロース（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて取扱説明書に従って精製したが、溶解および洗浄段階のイミダゾールは省略した。得られた酵素は純度＞９５％であり、これはＳＤＳ ＰＡＧＥによってクマシーブルー染色を用いて確認された。緩衝液を置換後（５０％グリセロールを含む１００ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ６．５で）、ナノオレンジ（ｎａｎｏＯｒａｎｇｅ）アッセイ（モレキュラー・プローブズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））を用いて濃度を測定しおよび１μｇ／μｌへ調整した。
【００５５】
実施例２：スクリーニング
ライブラリをスクリーニングするための反応混合物は、１５０ｎＭテンプレート、２２５ｎＭプライマー、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．３、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＤＴＴ、０．０５％トリトン（登録商標）Ｘ−１００およびｄＮＴＰ各２００μＭを含んだ。反応は、３'末端塩基が第Ｖ因子ライデン突然変異に関与するヒトＳＮＰ Ｇ１６９１Ａへ結合するように設計されている２０量体プライマーＦＶＬ２０ＴＨ（５´−ＡＣＡ ＡＡＡ ＴＡＣ ＣＴＧ ＴＡＴ ＴＣＣ ＴＴ−３´；配列番号８）を含んだ。対合伸長効率の測定のためには、ヒト第Ｖ因子ＯＲＦの変異体対立遺伝子１６９１Ａをコードする９０量体テンプレートＴＦＶＬ９０Ａ（５´−ｇａｃ ａｔｃ ａｔｇ ａｇａ ｇａｃ ａｔｃ ｇｃｃ ｔｃｔ ｇｇｇ ｃｔａ ａｔａ ｇｇａ ｃｔａ ｃｔｔ ｃｔａ ａｔｃ ｔｇｔ ａａｇ ａｇｃ ａｇａ ｔｃｃ ｃｔｇ ｇａｃ ａｇｇ ｃａａ ｇｇａ ａｔａ ｃａｇ ｇｔａ ｔｔｔ−３´；配列番号９）を用い、結果としてＴＡ塩基対をプライマーの３'末端に生じた。ミスマッチしたプライマー末端を処理するクレノー変異体の活性へ到達するためには、対応する野生型対立遺伝子１６９１Ｇをコードする９０量体テンプレートＴＦＶＬ９０Ｇ（５´−ｇａｃ ａｔｃ ａｔｇ ａｇａ ｇａｃ ａｔｃ ｇｃｃ ｔｃｔ ｇｇｇ ｃｔａ ａｔａ ｇｇａ ｃｔａ ｃｔｔ ｃｔａ ａｔｃ ｔｇｔ ａａｇ ａｇｃ ａｇａ ｔｃｃ ｃｔｇ ｇａｃ ａｇｇ ｃｇａ ｇｇａ ａｔａ ｃａｇ ｇｔａ ｔｔｔ−３´；配列番号１０）を用い、結果としてＴＧミスマッチを３'プライマー末端に生じた。伸長選択性としての活性比の評価を可能にするために、両方の反応をライブラリの各要素について平行して実施した。反応混合物１０μｌを、３７℃に予熱した黒色３８４ウェルプレートへ自動液体操作装置（ハミルトン・マイクロラブ・スター社（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｍｉｃｒｏｌａｂ Ｓｔａｒ））を用いて入れ、次いで溶解物溶液５μｌを加えた。１０分後、クレノー変異体によって生じたｄｓＤＮＡを定量するために３．４ｘ ＳＹＢＲグリーンＩ（モレキュラー・プローブズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））を含んだ停止溶液（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ ７．３、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ） ３０μｌを加えることによって反応を停止した。蛍光強度は蛍光プレートリーダー（ポーラスター・オプティマ（Ｐｏｌａｒｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａ）、ＢＭＧラブテクノロジーズ社（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ））を用いて励起４８５ｎｍおよび測定５２０ｎｍで定量した。伸長選択性を測定するためには、測定された蛍光強度の比（Ｆマッチ／Ｆミスマッチ、任意単位）を用いた。野生型よりも高い伸長選択性比（Ｆマッチ／Ｆミスマッチ）を有するすべてのＤＮＡポリメラーゼは、伸長選択性の増大を有する酵素として同定された。
【００５６】
実施例３：プライマー伸長検定法
５'−32Ｐ標識化プライマーを含む特異的反応緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．３、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＤＴＴ、０．０５％トリトン（登録商標）Ｘ−１００）を二倍量のテンプレートと混合することによって、プライマー−テンプレート基質をアニーリングした。混合物を９５℃にて５分間加熱し、および続いて１時間にわたって冷却し室温とした。アニーリング後、ｄＮＴＰを加え、および溶液を３７℃にて５分間インキュベートした。１５μｌの反応を、５μｌの酵素溶液を含む１ｘ反応緩衝液をアニーリング混合物１０μｌへ加えることによって開始し、続いて３７℃にて１０分間インキュベートした。検定は適当な反応緩衝液中にプライマー１５０ｎＭ、テンプレート２２５ｎＭ、ｄＮＴＰ各１ｍＭおよび酵素５９０ｎＭを含んだ。１０分間インキュベート後、ゲル負荷緩衝液（８０％ホルムアミド、ＥＤＴＡ、２０ｍＭ）３０μｌを加えることによって反応を停止し、および産物混合物を１４％変性ＰＡＧＥによって分析した（図１および２を参照）。下記のプライマーおよびテンプレート配列を、さまざまなＳＮＰ（位置に下線）に関して使用した：
【００５７】
ヒトゲノム第Ｖ因子ライデンＤＮＡ配列：プライマー：５´−ＡＣＡ ＡＡＡ ＴＡＣ ＣＴＧ ＴＡＴ ＴＣＣ ＴＴ−３´（配列番号１１）、野生型テンプレート：５´−ＧＡＴ ＣＣＣ ＴＧＧ ＡＣＡ ＧＧＣ ＧＡＧ ＧＡＡ ＴＡＣ ＡＧＧ ＴＡＴ ＴＴＴ ＧＴ−３´（配列番号１２）、変異体テンプレート：５´−ＧＡＴ ＣＣＣ ＴＧＧ ＡＣＡ ＧＧＣ ＡＡＧ ＧＡＡ ＴＡＣ ＡＧＧ ＴＡＴ ＴＴＴ ＧＴ−３´（配列番号１２）。
【００５８】
ヒト体細胞ＢＲＡＦ−Ｔ１７９６Ａ突然変異：プライマー：５´−ＧＡＣ ＣＣＡ ＣＴＣ ＣＡＴ ＣＧＡ ＧＡＴ ＴＴＣ Ｔ−３´（配列番号１３）、野生型テンプレート：５´−ＧＧＴ ＣＴＡ ＧＣＴ ＡＣＡ ＧＴＧ ＡＡＡ ＴＣＴ ＣＧＡ ＴＧＧ ＡＧＴ ＧＧＧ ＴＣ−３´（配列番号１４）、変異体テンプレート：５´−ＧＧＴ ＣＴＡ ＧＣＴ ＡＣＡ ＧＡＧ ＡＡＡ ＴＣＴ ＣＧＡ ＴＧＧ ＡＧＴ ＧＧＧ ＴＣ−３´（配列番号１４）。
【００５９】
ヒトジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（ＤＰｙＤ）突然変異Ｇ７３５Ａ：プライマー：５´−ＧＴＴ ＴＴＡ ＧＡＴ ＧＴＴ ＡＡＡ ＴＣＡ ＣＡＣ ＴＴＡ Ｔ−３´（配列番号１５）、野生型テンプレート：５´−ＣＴＴ ＴＣＣ ＡＧＡ ＣＡＡ ＣＧＴ ＡＡＧ ＴＧＴ ＧＡＴ ＴＴＡ ＡＣＡ ＴＣＴ ＡＡＡ ＡＣ−３´（配列番号１６）、変異体テンプレート：５´−ＣＴＴ ＴＣＣ ＡＧＡ ＣＡＡ ＣＡＴ ＡＡＧ ＴＧＴ ＧＡＴ ＴＴＡ ＡＣＡ ＴＣＴ ＡＡＡ ＡＣ−３´（配列番号１６）。
【００６０】
ヒト酸性セラミダーゼ突然変異Ａ１０７Ｇ：プライマー：５´−ＣＧＴ ＴＧＧ ＴＣＣ ＴＧＡ ＡＧＧ ＡＧＧ ＡＴ−３´（配列番号１７）、野生型テンプレート：５´−ＡＡＡ ＴＣＡ ＡＣＣ ＴＡＴ ＣＣＴ ＣＣＴ ＴＣＡ ＧＧＡ ＣＣＡ ＡＣＧ ＴＡＣ−３´（配列番号１８）、変異体テンプレート：５´−ＡＡＡ ＴＣＡ ＡＣＣ ＴＧＴ ＣＣＴ ＣＣＴ ＴＣＡ ＧＧＡ ＣＣＡ ＡＣＧ ＴＡＣ−３´（配列番号１８）。
【００６１】
このように、８７９〜８８１位にＱＶＨを有する野生型酵素（図１および２）と比較して、８７９〜８８１位（配列番号２に示す大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来クレノー断片に基づく）にＬＶＬおよびＬＶＧを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩにおける突然変異（クレノー断片、５'(３'−エキソヌクレアーゼ欠損）。
【００６２】
実施例４：ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのクローニング
プラスミドｐＴＴＱ１８：：Ｔａｑ（配列番号２５）はエンゲルケ（Ｅｎｇｅｌｋｅ）他（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９０，１９１，３９６−４００（１９９０））によって構築され、およびＰｔａｃプロモーター／ｌａｃオペレーター配列の調節下でＴａｑＤＮＡポリメラーゼの発現を可能にする。ＬＶＬ突然変異はＴａｑＱＶＨモチーフへ、ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）クイックチェンジ（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ）（登録商標）キットを用いてＰＣＲによって導入された。結果として生じた変異体プラスミドおよび野生型プラスミドで、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１ Ｂｌｕｅ（ストラタジーン社）を形質転換した。クローンを選択し、およびスーパーブロス（Ｓｕｐｅｒｂｒｏｔｈ）（１００μｇ／ｍｌカルベニシリン）２０ｍｌ中で一夜増殖させた。Ｔａｑクローンの発現は、スーパーブロス（１００μｇ／ｍｌカルベニシリン）１Ｌ中の培養物で実施し、および１ｍＭ ＩＰＴＧを用いた１６時間の誘導後に細胞を採取した。Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼの精製は、エンゲルケ他 （Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９０，１９１，３９６−４００）によって記載された通り実施した。イオン交換による精製の代わりに、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）（登録商標）７５（アマシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ））のカラムを用いたゲルろ過を適用した。得られた酵素は純度＞９０％であり、これはＳＤＳ ＰＡＧＥによってクマシーブルー染色を用いて確認された。濃度はナノオレンジ（ｎａｎｏＯｒａｎｇｅ）アッセイ（モレキュラー・プローブズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））およびクマシーブルー染色したＳＤＳ ＰＡＧＥを用いて測定した。
【００６３】
実施例５：ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによる触媒作用を用いたプライマー伸長
５'−32Ｐ標識化プライマーを含む特異的反応緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２５℃にてｐＨ９．２、１６ｍＭ硫酸アンモニウムおよび２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１％ツイーン（登録商標）２０）を二倍量のテンプレートと混合することによって、プライマー−テンプレート基質をアニーリングした。混合物を９５℃にて加熱し、および続いて１時間にわたって冷却し室温とした。アニーリング後、ｄＮＴＰを加え、および溶液を３７℃にて５分間インキュベートした。１５μｌの反応を、５μｌの酵素溶液を含む１ｘ反応緩衝液をアニーリング混合物１０μｌへ加えることによって開始し、続いて７２℃にて１０分間インキュベートした。検定は適当な反応緩衝液中にプライマー１５０ｎＭ、テンプレート２２５ｎＭ、ｄＮＴＰ各１ｍＭおよび、Ｔａｑ ＬＶＬ ＤＮＡポリメラーゼ（変異体ポリメラーゼ）０．５ｎｇおよびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ０．０６ｎｇを含んだ。１０分間インキュベート後、ゲル負荷緩衝液（８０％ホルムアミド、ＥＤＴＡ、２０ｍＭ）３０μｌを加えることによって反応を停止し、および産物混合物を１４％変性ＰＡＧＥによって分析した（図３を参照）。ＳＮＰヒトゲノム第Ｖ因子ライデンＤＮＡ配列、ヒト体細胞ＢＲＡＦ−Ｔ１７９６Ａ突然変異およびヒトジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（ＤＰｙＤ）突然変異Ｇ７３５Ａに関して用いられたプライマーおよびテンプレート配列については、実施例３を参照。
【００６４】
実施例６：リアルタイムＰＣＲ実験
リアルタイムＰＣＲはアイサイクラー（ｉＣｙｃｌｅｒ）（バイオラッド社（ＢＩＯＲＡＤ））システムを用いて実施した。反応は、各テンプレート４ｐＭを含むＴａｑＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２５℃にてｐＨ９．２、１６ｍＭ硫酸アンモニウムおよび２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１％ツイーン（登録商標）２０を含む総容量２０μｌ中で実施した。最終混合物は、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびＴＴＰ各２００μＭ）、プライマー（各プライマープローブおよび逆方向プライマーそれぞれ０．５μＭ）および１３ｎｇのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（配列番号４）、９５ｎｇのＴａｑＬＶＬ変異体由来ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号４、７８２〜７８４位にＬＶＬを有する）および１０，０００倍ＳｙｂｒグリーンＩ ＤＭＳＯ溶液（モレキュラー・プローブズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））の１／５０，０００水希釈液を含んだ。 すべてのＰＣＲ 増幅は下記のプログラムを用いて実施した：９５℃にて３分間最初の変性、次いで４０サイクルの９５℃にて３０秒間変性、５５℃にて３５秒間プライマーアニーリングおよび７２℃にて４０秒間伸長。示した結果は、少なくとも３回反復しおよび一つの親混合物に由来する独立した３連の測定から得られた。結果を図４に要約する。下記のＤＮＡ配列を用いた：
【００６５】
ＢＲＡＦに関する配列：プライマープローブＢｒａｆＴ：５´−ｄ（ＧＡＣ ＣＣＡ ＣＴＣ ＣＡＴ ＣＧＡ ＧＡＴ ＴＴＣ Ｔ）（配列番号１９）、逆方向プライマー：５´−ｄ（ＡＧＡ ＧＧＡ ＡＡＧ ＡＴＧ ＡＡＧ ＴＡＣ ＴＡＴ Ｇ）（配列番号２０）、標的テンプレートＢｒａｆＸ：５'−ｄ（ＣＡＡ ＣＴＧ ＴＴＣ ＡＡＡ ＣＴＧ ＡＴＧ ＧＧＡ ＣＣＣ ＡＣＴ ＣＣＡ ＴＣＧ ＡＧＡ ＴＴＴ ＣＸＣ ＴＧＴ ＡＧＣ ＴＡＧ ＡＣＣ ＡＡＡ ＡＴＣ ＡＣＣ ＴＡＴ ＴＴＴ ＴＡＣ ＴＧＴ ＧＡＧ ＧＴＣ ＴＴＣ ＡＴＧ ＡＡＧ ＡＡＡ ＴＡＴ ＡＴＣ ＴＧＡ ＧＧＴ ＧＴＡ ＧＴＡ ＡＧＴ ＡＡＡ ＧＧＡ ＡＡＡ ＣＡＧ ＴＡＧ ＡＴＣ ＴＣＡ ＴＴＴ ＴＣＣ ＴＡＴ ＣＡＧ ＡＧＣ ＡＡＧ ＣＡＴ ＴＡＴ ＧＡＡ ＧＡＧ ＴＴＴ ＡＧＧ ＴＡＡ ＧＡＧ ＡＴＣ ＴＡＡ ＴＴＴ ＣＴＡ ＴＡＡ ＴＴＣ ＴＧＴ ＡＡＴ ＡＴＡ ＡＴＡ ＴＴＣ ＴＴＴ ＡＡＡ ＡＣＡ ＴＡＧ ＴＡＣ ＴＴＣ ＡＴＣ ＴＴＴ ＣＣＴ ＣＴ）、Ｘ＝Ａ、ＢｒａｆＡ、Ｘ＝Ｔ、ＢｒａｆＴ（配列番号２１）。ＤＰｙＤに関する配列：プライマープローブＤｐｙＤＴ：５´−ｄ（ＧＴＴ ＴＴＡ ＧＡＴ ＧＴ ＴＡＡ ＡＴＣ ＡＣＡ ＣＴＴ ＡＴ）（配列番号２２）、逆方向プライマー：（５´−ｄ（ａａａ ｇｃｔ ｃｃｔ ｔｔｃ ｔｇａ ａｔａ ｔｔｇ ａｇ）（配列番号２３）、標的テンプレートＤＰｙＤＸ：５'−ｄ（ａａａ ａｔｇ ｔｇａ ｇａａ ｇｇｇ ａｃｃ ｔｃａ ｔａａ ａａｔ ａｔｇ ｔｃａ ｔａｔ ｇｇａ ａａｔ ｇａｇ ｃａｇ ａｔａ ａｔａ ａａｇ ａｔｔ ａｔａ ｇｃｔ ｔｔｔ ｃｔｔ ｔｇｔ ｃａａ ａａｇ ｇａｇ ａｃｔ ｃａａ ｔａｔ ｃｔｔ ｔａｃ ｔｃｔ ｔｔｃ ａｔｃ ａｇｇ ａｃａ ｔｔｇ ｔｇａ ｃａａ ａｔｇ ｔｔｔ ｃｃｃ ｃｃａ ｇａａ ｔｃａ ｔｃｃ ｇｇｇ ｇａａ ｃｃａ ｃｃｔ ｃｔｇ ｇｃｃ ｃｃａ ｔｇｔ ａｔｇ ｇｃｃ ｃｔｇ ｇａｃ ａａａ ｇｃｔ ｃｃｔ ｔｔｃ ｔｇａ ａｔａ ｔｔｇ ａｇｃ ｔｃａ ｔｃａ ｇｔｇ ａｇａ ａａａ ｃｇｇ ｃｔｇ ｃａｔ ａｔｔ ｇｇｔ ｇｔｃ ａａａ ｇｔｇ ｔｃａ ｃｔｇ ａａｃ ｔａａ ａｇｇ ｃｔｇ ａｃｔ ｔｔｃ ｃａｇ ａｃａ ａｃＸ ｔａａ ｇｔｇ ｔｇａ ｔｔｔ ａａｃ ａｔｃ ｔａａ ａａｃ）、Ｘ＝Ａ ＤｐｙＤＡ、Ｘ＝Ｔ、ＤｐｙＤＧ（配列番号２４）。オリゴヌクレオチドＢｒａｆＸおよびＤｐｙＤＸ（配列番号２１および２４）はＩＢＡ（ドイツ、ゲッチンゲン（Ｇoｔｔｉｎｇｅｎ）によって合成および精製された。
【００６６】
実施例７（比較例）：ミスマッチ識別の比較
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断片、５'→ ３'−エキソヌクレアーゼ欠損）の８７９〜８８１位（配列番号２）の、本発明に記載の変異体および文献から知られる変異体を、プライマー伸長の選択性について比較した。使用した変異体は、ＬＶＬ変異体（８７９〜８８１位にＬＶＬを有する配列番号２）および、ミニック（Ｍｉｎｎｉｃｋ），Ｔ．他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，３０６７−３０７５ （１９９９）（８７９〜８８１位にＨＶＡを有する配列番号２）からのＨ８８１Ａを有するクレノー断片に対応するＱＶＡ変異体であった。
記載の２種類の変異体を用いて、実施例３に記載のプライマー伸長検定を実施した。ヒトゲノム第Ｖ因子ライデンＤＮＡ配列を用いたミスマッチ識別を試験した：プライマー：５´−ＡＣＡ ＡＡＡ ＴＡＣ ＣＴＧ ＴＡＴ ＴＣＣ ＴＴ−３´（配列番号１１）、野生型テンプレート：５´−ＧＡＴ ＣＣＣ ＴＧＧ ＡＣＡ ＧＧＣ ＧＡＧ ＧＡＡ ＴＡＣ ＡＧＧ ＴＡＴ ＴＴＴ ＧＴ−３´（配列番号１２）、変異体テンプレート：５´−ＧＡＴ ＣＣＣ ＴＧＧ ＡＣＡ ＧＧＣ ＡＡＧ ＧＡＡ ＴＡＣ ＡＧＧ ＴＡＴ ＴＴＴ ＧＴ−３´（配列番号１２）。２つの変異体が標準的複合体と比較してミスマッチを伸長する傾向を比較した。図５に示す通り、ＱＶＡ変異体は、ＬＶＬ変異体と比較してミスマッチを伸長する相当高い傾向を有した。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断片、５'→ ３'エキソヌクレアーゼ欠損）の８７９〜８８１位（配列番号２）における突然変異の、プライマー伸長の選択性に対する影響を調べるための変性ＰＡＧＥ後のオートラジオグラフ。反応は、プライマー／テンプレート複合体１５０ｎＭ（プライマー： ５´−ＡＣＡ ＡＡＡ ＴＡＣ ＣＴＧ ＴＡＴ ＴＣＣ ＴＸ−３´、Ｘ＝Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ（配列番号１１）；テンプレート：５´−ＧＡ ＴＣＣ ＣＴＧ ＧＡＣ ＡＧＧ ＣＹＡ ＧＧＡ ＡＴＡ ＣＡＧ ＧＴＡ ＴＴＴ ＴＧＴ−３´、Ｙ＝Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ（配列番号１２）、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ＴＴＰ、ｄＧＴＰ各１ｍＭ、およびＤＮＡポリメラーゼ６００ｎＭを含んだ。３７℃にて１０分間、緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．３、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＤＴＴ、０．０５％トリトン（登録商標）Ｘ−１００）中でインキュベート。
【図２】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断片、５'→ ３'エキソヌクレアーゼ欠損）の８７９〜８８１位（配列番号２で示す大腸菌由来クレノー断片に基づく）における突然変異の、プライマー伸長の選択性に対する影響を調べるための変性ＰＡＧＥ後のオートラジオグラフ。反応は、プライマー／テンプレート複合体１５０ｎＭ[ａ：プライマー：５´−ＧＡＣ ＣＣＡ ＣＴＣ ＣＡＴ ＣＧＡ ＧＡＴ ＴＴＣ Ｔ−３´（配列番号１３）；テンプレート：５´−ＧＧＴ ＣＴＡ ＧＣＴ ＡＣＡ ＧＸＧ ＡＡＡ ＴＣＴ ＣＧＡ ＴＧＧ ＡＧＴ ＧＧＧ ＴＣ−３´、Ｘ＝ＡまたはＴ（配列番号１４）；ｂ：プライマー：５´−ＧＴＴ ＴＴＡ ＧＡＴ ＧＴＴ ＡＡＡ ＴＣＡ ＣＡＣ ＴＴＡ Ｔ−３´（配列番号１５）；テンプレート：５´−ＣＴＴ ＴＣＣ ＡＧＡ ＣＡＡ ＣＸＴ ＡＡＧ ＴＧＴ ＧＡＴ ＴＴＡ ＡＣＡ ＴＣＴ ＡＡＡ ＡＣ−３´、Ｘ＝ＡまたはＧ（配列番号１６）]、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ＴＴＰ、ｄＧＴＰ各１ｍＭ、およびＤＮＡポリメラーゼ６００ｎＭを含んだ。３７℃にて１０分間、緩衝液（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．３、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＤＴＴ、０．０５％トリトン（登録商標）Ｘ−１００）中でインキュベート。
【図３】ＴａｑＤＮＡポリメラーゼＩ中のＱＶＨモチーフにおける突然変異の、プライマー伸長の選択性に対する影響を調べるための変性ＰＡＧＥ後のオートラジオグラフ。反応は、プライマー／テンプレート複合体１５０ｎＭ[ａ：プライマー：５´−ＡＣＡ ＡＡＡ ＴＡＣ ＣＴＧ ＴＡＴ ＴＣＣ ＴＸ−３´、Ｘ＝Ｔ（配列番号１１）；テンプレート：５´−ＧＡ ＴＣＣ ＣＴＧ ＧＡＣ ＡＧＧ ＣＹＡ ＧＧＡ ＡＴＡ ＣＡＧ ＧＴＡ ＴＴＴ ＴＧＴ−３´、Ｙ＝ＡまたはＧ（配列番号１２）；ｂ：プライマー：５´−ＧＡＣ ＣＣＡ ＣＴＣ ＣＡＴ ＣＧＡ ＧＡＴ ＴＴＣ Ｔ−３´（配列番号１３）；テンプレート：５´−ＧＧＴ ＣＴＡ ＧＣＴ ＡＣＡ ＧＸＧ ＡＡＡ ＴＣＴ ＣＧＡ ＴＧＧ ＡＧＴ ＧＧＧ ＴＣ−３´、Ｘ＝ＡまたはＴ（配列番号１４）；ｃ：プライマー：５´−ＧＴＴ ＴＴＡ ＧＡＴ ＧＴＴ ＡＡＡ ＴＣＡ ＣＡＣ ＴＴＡ Ｔ−３´（配列番号１５）；テンプレート：５´−ＣＴＴ ＴＣＣ ＡＧＡ ＣＡＡ ＣＸＴ ＡＡＧ ＴＧＴ ＧＡＴ ＴＴＡ ＡＣＡ ＴＣＴ ＡＡＡ ＡＣ−３´、Ｘ＝ＡまたはＧ（配列番号１６）]、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ＴＴＰ、ｄＧＴＰ各１ｍＭ、およびＤＮＡポリメラーゼ０．６ｎｇを含んだ。３７℃にて１０分間、緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（２５℃にてｐＨ９．２）、１６ｍＭ硫酸アンモニウム、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１％ツイーン（登録商標）２０）中でインキュベート。
【図４】Ｔａｑ（ｗｔ）（配列番号４）およびＬＶＬ変異体（配列番号４、７８２〜７８４位にＬＶＬを有する）を用いたリアルタイムＰＣＲ実験。実験はアイサイクラー（ｉＣｙｃｌｅｒ）（バイオラッド社（ＢＩＯＲＡＤ））システムを用いて実施した。２０μｌでの典型的な反応は下記を含んだ：各テンプレート４０ｐＭを含むＴａｑＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（２５℃にてｐＨ９．２）、１６ｍＭ硫酸アンモニウム、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１％ツイーン（登録商標）２０、０．３ｍＭ ｄＮＴＰ）、プライマー２種類０．５μＭおよびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ９５ｎｇ、および１／５０，０００のＳｙｂグリーンＩ １０，０００倍ＤＭＳＯ溶液（モレキュラー・プローブズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））。ＰＣＲは下記のプログラムを用いて実施した：９５℃にて３０秒間、５５℃にて３５秒間、および７２℃にて４０秒間のサイクル。反応１ｗ、２ｗ、３ｗおよび４ｗは野生型酵素を用いて実施した一方、１ｍ、２ｍ、３ｍおよび４ｍはＬＶＬ変異体を用いて実施した。ＤＮＡ配列：  ａ：プライマープローブ：５´−ｄ（ＧＡＣ ＣＣＡ ＣＴＣ ＣＡＴ ＣＧＡ ＧＡＴ ＴＴＣ Ｔ）（配列番号１９）；逆方向プライマー：５´−ｄ（ＡＧＡ ＧＧＡ ＡＡＧ ＡＴＧ ＡＡＧ ＴＡＣ ＴＡＴ Ｇ）（配列番号２０）；テンプレート：５'−ｄ（ＣＡＡ ＣＴＧ ＴＴＣ ＡＡＡ ＣＴＧ ＡＴＧ ＧＧＡ ＣＣＣ ＡＣＴ ＣＣＡ ＴＣＧ ＡＧＡ ＴＴＴ ＣＸＣ ＴＧＴ ＡＧＣ ＴＡＧ ＡＣＣ ＡＡＡ ＡＴＣ ＡＣＣ ＴＡＴ ＴＴＴ ＴＡＣ ＴＧＴ ＧＡＧ ＧＴＣ ＴＴＣ ＡＴＧ ＡＡＧ ＡＡＡ ＴＡＴ ＡＴＣ ＴＧＡ ＧＧＴ ＧＴＡ ＧＴＡ ＡＧＴ ＡＡＡ ＧＧＡ ＡＡＡ ＣＡＧ ＴＡＧ ＡＴＣ ＴＣＡ ＴＴＴ ＴＣＣ ＴＡＴ ＣＡＧ ＡＧＣ ＡＡＧ ＣＡＴ ＴＡＴ ＧＡＡ ＧＡＧ ＴＴＴ ＡＧＧ ＴＡＡ ＧＡＧ ＡＴＣ ＴＡＡ ＴＴＴ ＣＴＡ ＴＡＡ ＴＴＣ ＴＧＴ ＡＡＴ ＡＴＡ ＡＴＡ ＴＴＣ ＴＴＴ ＡＡＡ ＡＣＡ ＴＡＧ ＴＡＣ ＴＴＣ ＡＴＣ ＴＴＴ ＣＣＴ ＣＴ）、Ｘ＝Ａ（野生型）（１）またはＴ（変異体）（２）（配列番号２１）。  ｂ：プライマープローブ：５´−ｄ（ＧＴＴ ＴＴＡ ＧＡＴ ＧＴ ＴＡＡ ＡＴＣ ＡＣＡ ＣＴＴ ＡＴ）（配列番号２２）；逆方向プライマー：５´−ｄ（ａａａ ｇｃｔ ｃｃｔ ｔｔｃ ｔｇａ ａｔａ ｔｔｇ ａｇ）（配列番号２３）；テンプレート：５'−ｄ（ａａａ ａｔｇ ｔｇａ ｇａａ ｇｇｇ ａｃｃ ｔｃａ ｔａａ ａａｔ ａｔｇ ｔｃａ ｔａｔ ｇｇａ ａａｔ ｇａｇ ｃａｇ ａｔａ ａｔａ ａａｇ ａｔｔ ａｔａ ｇｃｔ ｔｔｔ ｃｔｔ ｔｇｔ ｃａａ ａａｇ ｇａｇ ａｃｔ ｃａａ ｔａｔ ｃｔｔ ｔａｃ ｔｃｔ ｔｔｃ ａｔｃ ａｇｇ ａｃａ ｔｔｇ ｔｇａ ｃａａ ａｔｇ ｔｔｔ ｃｃｃ ｃｃａ ｇａａ ｔｃａ ｔｃｃ ｇｇｇ ｇａａ ｃｃａ ｃｃｔ ｃｔｇ ｇｃｃ ｃｃａ ｔｇｔ ａｔｇ ｇｃｃ ｃｔｇ ｇａｃ ａａａ ｇｃｔ ｃｃｔ ｔｔｃ ｔｇａ ａｔａ ｔｔｇ ａｇｃ ｔｃａ ｔｃａ ｇｔｇ ａｇａ ａａａ ｃｇｇ ｃｔｇ ｃａｔ ａｔｔ ｇｇｔ ｇｔｃ ａａａ ｇｔｇ ｔｃａ ｃｔｇ ａａｃ ｔａａ ａｇｇ ｃｔｇ ａｃｔ ｔｔｃ ｃａｇ ａｃａ ａｃＸ ｔａａ ｇｔｇ ｔｇａ ｔｔｔ ａａｃ ａｔｃ ｔａａ ａａｃ）、Ｘ＝Ａ（野生型）（３）またはＧ（変異体）（４）（配列番号２４）。
【図５】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断片、５'(３'エキソヌクレアーゼ欠損）の８７９〜８８１位（配列番号２）における突然変異の、プライマー伸長の選択性に対する影響の比較試験のための変性ＰＡＧＥ後のオートラジオグラフ。本発明に記載の変異体ＬＶＬを、文献（ミニック（Ｍｉｎｎｉｃｋ），Ｔ．他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，３０６７-３０７５ （１９９９））から知られる変異体ＱＶＡと比較した。反応は、プライマー／テンプレート複合体１５０ｎＭ（プライマー：５´−ＡＣＡ ＡＡＡ ＴＡＣ ＣＴＧ ＴＡＴ ＴＣＣ ＴＸ−３´、Ｘ＝Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ（配列番号１１）；テンプレート：５´−ＧＡ ＴＣＣ ＣＴＧ ＧＡＣ ＡＧＧ ＣＹＡ ＧＧＡ ＡＴＡ ＣＡＧ ＧＴＡ ＴＴＴ ＴＧＴ−３´、Ｙ＝Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ（配列番号１２）、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ＴＴＰ、ｄＧＴＰ各１ｍＭ、およびＤＮＡポリメラーゼ６００ｎＭを含んだ。３７℃にて１０分間、緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．３、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＤＴＴ、０．０５％トリトン（登録商標）Ｘ−１００）中でインキュベート。
【図１】
0005570682.tif 000003
【図２】
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【図３】
0005570682.tif 000005
【図４】
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【図５】
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