(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）鎖間（ｉｎｔｅｒｓｔｒａｎｄ）非共有結合が形成されたパラレル（ｐａｒａｌｌｅｌ）アミノ酸鎖、又はアンチパラレル（ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ）アミノ酸鎖を含む構造安定化部位（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）と、
（ｂ）前記構造安定化部位の両末端に結合された、ターゲット結合部位Ｉ（ｔａｒｇｅｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  Ｉ）及びターゲット結合部位ＩＩ（ｔａｒｇｅｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ＩＩ）であって、前記ターゲット結合部位Ｉ及び前記ターゲット結合部位ＩＩのアミノ酸残基の数がそれぞれ２〜５０の整数であり、ターゲットに協調的に作用して前記ターゲットに結合する活性を有するペプチドである、前記ターゲット結合部位Ｉ及び前記ターゲット結合部位ＩＩと、を含むことを特徴とするターゲットに特異的に結合する二座ペプチドバインダー（ｂｉｐｏｄａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｅｒ）。
【請求項２】
構造安定化部位に形成された鎖間非共有結合が、水素結合、静電気的相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、パイ−パイ相互作用、陽イオン−パイ相互作用、又はこれらの組み合わせである請求項１に記載の二座ペプチドバインダー。
【請求項３】
構造安定化部位のアミノ酸鎖が、リンカーで連結される請求項１から２のいずれかに記載の二座ペプチドバインダー。
【請求項４】
構造安定化部位が、β−ヘアピンモチーフ、リンカーで連結されたβ−シートモチーフ、ロイシンジッパーモチーフ、リンカーで連結されたロイシンジッパーモチーフ、ロイシンリッチモチーフ、又はリンカーで連結されたロイシンリッチモチーフである請求項１から３のいずれかに記載の二座ペプチドバインダー。
【請求項５】
構造安定化部位が、β−ヘアピンモチーフである請求項４に記載の二座ペプチドバインダー。
【請求項６】
β−ヘアピンモチーフが、配列番号１〜１９で構成された群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項５に記載の二座ペプチドバインダー。
【請求項７】
β−ヘアピンモチーフが、配列番号２、配列番号１４、又は配列番号１８から選択されるアミノ酸配列を含む請求項６に記載の二座ペプチドバインダー。
【請求項８】
β−ヘアピンモチーフが、下記一般式Ｉで表される請求項５に記載の二座ペプチドバインダー。
［一般式Ｉ］
Ｘ１−Ｔｒｐ（Ｘ２）Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５（Ｘ’２）Ｘ６−Ｘ７
Ｘ１は、Ｓｅｒ又はＧｌｙ−Ｇｌｕであり、Ｘ２及びＸ’２は、それぞれ独立してＴｈｒ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、又はＴｙｒであり、Ｘ３は、Ｔｒｐ又はＴｙｒであり、Ｘ４は、タイプＩ、タイプＩ’、タイプＩＩ、タイプＩＩ’、タイプＩＩＩ、又はタイプＩＩＩ’ターン配列であり、Ｘ５は、Ｔｒｐ又はＰｈｅであり、Ｘ６は、Ｔｒｐ又はＶａｌであり、Ｘ７は、Ｌｙｓ又はＴｈｒ−Ｇｌｕである。
【請求項９】
β−ヘアピンモチーフが、下記一般式ＩＩで表される請求項５に記載の二座ペプチドバインダー。
［一般式ＩＩ］
Ｘ１−Ｔｒｐ−Ｘ２−Ｔｙｒ−Ｘ３−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｘ４
Ｘ１は、Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、又はＬｙｓ−Ｌｙｓであり、Ｘ２は、Ｇｌｎ又はＴｈｒであり、Ｘ３は、タイプＩ、タイプＩ’、タイプＩＩ、タイプＩＩ’、タイプＩＩＩ、又はタイプＩＩＩ’ターン配列であり、Ｘ４は、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ−Ｇｌｕ、又はＧｌｎ−Ｇｌｕである。
【請求項１０】
β−ヘアピンモチーフが、下記一般式ＩＩＩで表される請求項５に記載の二座ペプチドバインダー。
［一般式ＩＩＩ］
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｔｒｐ−Ｘ４−Ｘ５−Ｔｈｒ−Ｘ６−Ｘ７
Ｘ１は、Ｌｙｓ又はＬｙｓ−Ｌｙｓであり、Ｘ２は、Ｔｒｐ又はＴｙｒであり、Ｘ３は、Ｖａｌ又はＴｈｒであり、Ｘ４は、タイプＩ、タイプＩ’、タイプＩＩ、タイプＩＩ’、タイプＩＩＩ、又はタイプＩＩＩ’ターン配列であり、Ｘ５は、Ｔｒｐ又はＡｌａであり、Ｘ６は、Ｔｒｐ又はＶａｌであり、Ｘ７は、Ｇｌｕ又はＧｌｎ−Ｇｌｕである。
【請求項１１】
β−ヘアピンモチーフが、下記一般式ＩＶで表される請求項５に記載の二座ペプチドバインダー。
［一般式ＩＶ］
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｔｒｐ−Ｘ４
Ｘ１は、Ｌｙｓ−Ｔｈｒ又はＧｌｙであり、Ｘ２は、Ｔｒｐ又はＴｙｒであり、Ｘ３は、タイプＩ、タイプＩ’、タイプＩＩ、タイプＩＩ’、タイプＩＩＩ、又はタイプＩＩＩ’ターン配列であり、Ｘ４は、Ｔｈｒ−Ｇｌｕ又はＧｌｙである。
【請求項１２】
一般式Ｉで表されるβ−ヘアピンモチーフにおいて、Ｘ１は、Ｓｅｒ又はＧｌｙ−Ｇｌｕであり、Ｘ２及びＸ’２は、それぞれ独立してＴｈｒ、Ｈｉｓ、又はＶａｌであり、Ｘ３は、Ｔｒｐ又はＴｙｒであり、Ｘ４は、タイプＩ、タイプＩ’、タイプＩＩ又はタイプＩＩ’ターン配列であり、Ｘ５は、Ｔｒｐ又はＰｈｅであり、Ｘ６は、Ｔｒｐ又はＶａｌであり、Ｘ７は、Ｌｙｓ又はＴｈｒ−Ｇｌｕである請求項８に記載の二座ペプチドバインダー。
【請求項１３】
ターゲット結合部位Ｉ及びターゲット結合部位ＩＩのアミノ酸数が、それぞれ２〜２０の整数である請求項１から１２のいずれかに記載の二座ペプチドバインダー。
【請求項１４】
構造安定化部位、ターゲット結合部位Ｉ又はターゲット結合部位ＩＩに追加的に機能性分子が結合されている請求項１から１３のいずれかに記載の二座ペプチドバインダー。
【請求項１５】
機能性分子が、検出可能な信号を発生させるラベル、化学薬物、バイオ薬物、細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）、又はナノ粒子である請求項１４に記載の二座ペプチドバインダー。
【請求項１６】
ターゲットが、生化学物質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、細胞、組織、化合物、金属、又は非金属物質である請求項１から１５のいずれかに記載の二座ペプチドバインダー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二座ペプチドバインダー及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、Ｂ細胞が生産する血漿タンパク質の一種である免疫グロブリン蛋白質であって、外部から入った抗原の特定部位を特異的に認識して結合することにより、抗原を非活性化するか無力化させる。このような抗原−抗体反応の特異性と高度の親和度及び数千万種類の抗原を区別できる抗体の多様性を応用して、今日の診断剤と治療剤などを始めとした多くの種類の抗体製品が出現するようになった。現在ＦＡＤでは、２１個の単一クローン抗体を承認し、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）及びハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）のような抗体は、他の治療で全く反応を示さなかった患者の５０％以上で効果を示し、実質的に様々な研究において、単一クローン抗体を利用してリンパ腫、大腸癌又は乳癌などに成功的な臨床治療を示している。治療用抗体の全体市場規模は、２００４年１００億ドル規模から２０１０年には３００億ドルに、年平均２０％の成長率を示すと推定しており、その市場規模は、幾何級数的に増加すると推定されている。抗体を利用した新薬開発が活発になる理由は、薬品の開発期間が短く、投資費用が少なくて、副作用が容易に予測可能であるからである。また、生薬としての抗体は、人体に影響がほとんどなく、体内における半減期が低分子量薬品に比べ圧倒的に長くて、患者に親和的である。このような有用性にもかかわらず、人間において単一クローン抗体は、外来抗原と認識され、酷いアレルギー反応又は過敏反応を起こしたりもする。また、このような抗癌機能の単クローン抗体を臨床的に使用する場合、生産コストが高いため、治療剤としての値段が急激に上昇するという短所があり、抗体を培養する方法及び精製方法など、広範囲な分野の技術が各種知的所有権により保護されているため、高いライセンシング費を支払わなければならない。
【０００３】
したがって、この問題を解決するために、米国を中心にヨーロッパ連合で、抗体代替蛋白質の開発が始動期にある。抗体代替蛋白質は、抗体のように不変領域と可変領域を持てるように作った組み換え蛋白質であって、大きさが小さくて安定した蛋白質の一定部分を無作為配列のアミノ酸に変えてライブラリーを作り、これを標的物質に対してスクリーニングをして、高い親和力と良い特異性を有した物質を見つけることができる。例えば、抗体代替蛋白質の中、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）とアフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）は、標的物質に対してピコモル（ｐｉｃｏｍｏｌｅ）程度の親和力を有した例示が報告されている。このような抗体代替蛋白質は、大きさが小さくて安定しているため、癌細胞に深く浸透可能であり、一般に免疫反応が少ないと報告されている。そして何よりも、広範囲な抗体特許問題から放れることができ、バクテリアから容易に大量精製できるため、生産コストが低くて、経済的に抗体より大きい長所を有する。現在開発された抗体代替蛋白質は４０個があるが、この中、ベンチャー会社や多国的製薬会社で商用化を試みている抗体代替蛋白質は、フィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン、リポカリン、ＬＤＬＲ−Ａドメイン、クリスタリン、プロテインＡ、アンキリンリピート（Ａｎｋｙｒｉｎ  ｒｅｐｅａｔ）、ＢＰＴＩという蛋白質を利用しており、ターゲットに対するピコモルで数ナノモル程度の高い親和力を有している。その中、アドネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎ）、アビマー、クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメインは、現在ＦＤＡ臨床実験が進行中である。
【０００４】
本発明は、今までの蛋白質を利用した抗体代替蛋白質とは異なるペプチド基盤抗体代替蛋白質に焦点を合わせた。ペプチドは、抗体に比べ、適切な薬物動力学、大量生産性、低い毒性、抗原性抑制及び低い生産単価などにより、現在抗体治療剤に代わって多様に活用されている。治療用薬としてのペプチドの長所は、生産単価が低く、安全生及び反応性が高くて、特許ロイヤルティが相対的に低くて、所望しない免疫システムに露出が少なく、ペプチド自体に対する抗体生産を抑制することができて、合成による変形が容易で正確であるということである。しかしながら、大部分のペプチドは、抗体に比べ、特定蛋白質ターゲットに対して低い親和力及び特異性を示すため、多様な応用分野に使用できないという短所がある。したがって、ペプチドの短所を克服できる新しいペプチド基盤抗体代替蛋白質の開発に対する要求が当業界に台頭されている。したがって、本発明者らは、生物学的ターゲット分子に高い親和性で特異的結合が可能なペプチド物質を開発するために鋭意研究した。これは、現在非常に多いターゲットに対して報告された、低い親和力を有したペプチドを利用して、速い時間内に高い親和性及び特異性を有した新薬候補を製造できる技術になると期待される。
【０００５】
本明細書全体にかけて多数の特許文献及び論文が参照されて、その引用が表示されている。引用された特許文献及び論文の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、生物学的ターゲット分子に非常に高い親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）で特異的に結合可能なペプチド物質を開発するために鋭意研究した。その結果、比較的リジッド（ｒｉｇｉｄ）なペプチド骨格を有する構造安定化部位の両末端に無作為的（ｒａｎｄｏｍ）にペプチドを結合させて、この２つのペプチドを共同にターゲット分子に結合させる場合は、大きく増加された結合能及び特異性を有する二座ペプチドバインダーを得ることができることを確認することにより、本発明を完成した。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、二座ペプチドバインダー（ｂｉｐｏｄａｌ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｅｒ）の製造方法を提供することにある。
【０００８】
本発明の他の目的は、生物学的ターゲット分子に結合する二座ペプチドバインダーを提供することにある。
【０００９】
本発明のまた他の目的は、二座ペプチドバインダーをコーディングする核酸分子を提供することにある。
【００１０】
本発明のまた他の目的は、二座ペプチドバインダーの発現用ベクターを提供することにある。
【００１１】
本発明の更に他の目的は、二座ペプチドバインダーの発現用ベクターを含む形質転換体を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明及び請求の範囲及び図面により、更に明確にされる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の一様態によると、本発明は、以下の段階を含む、生物学的ターゲット分子に結合する二座ペプチドバインダー（ｂｉｐｏｄａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｅｒ）の製造方法を提供する：
（ａ）（ｉ）鎖間（ｉｎｔｅｒｓｔｒａｎｄ）非共有結合が形成されるパラレル（ｐａｒａｌｌｅｌ）アミノ酸鎖、アンチパラレル（ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ）アミノ酸鎖、又はパラレル（ｐａｒａｌｌｅｌ）及びアンチパラレル（ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ）アミノ酸鎖を含む構造安定化部位（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）と、（ｉｉ）前記構造安定化部位の両末端に結合されており、無作為的に選択されたｎ個のアミノ酸を含むターゲット結合部位Ｉ（ｔａｒｇｅｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  Ｉ）及び無作為的に選択されたｍ個のアミノ酸を含むターゲット結合部位ＩＩ（ｔａｒｇｅｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ＩＩ）とを含む二座ペプチドバインダーのライブラリーを提供する段階と、
（ｂ）前記ライブラリーと前記ターゲットとを接触させる段階と、
（ｃ）前記ターゲットと結合された前記二座ペプチドバインダーを選択する段階。
【００１４】
本発明の他の様態によると、本発明は、（ａ）鎖間（ｉｎｔｅｒｓｔｒａｎｄ）非共有結合が形成されたパラレル（ｐａｒａｌｌｅｌ）アミノ酸鎖、アンチパラレル（ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ）アミノ酸鎖、又はパラレル（ｐａｒａｌｌｅｌ）及びアンチパラレル（ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ）アミノ酸鎖を含む構造安定化部位（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）と、（ｂ）前記構造安定化部位の両末端に結合されており、無作為的に選択されたｎ個のアミノ酸を含むターゲット結合部位Ｉ（ｔａｒｇｅｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  Ｉ）及び無作為的に選択されたｍ個のアミノ酸を含むターゲット結合部位ＩＩ（ｔａｒｇｅｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ＩＩ）とを含む、ターゲットに特異的に結合する二座ペプチドバインダーを提供する。
【００１５】
本発明者らは、生物学的ターゲット分子に非常に高い親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）で特異的に結合可能なペプチド物質を開発するために鋭意研究した。その結果、比較的リジッド（ｒｉｇｉｄ）なペプチド骨格を有する構造安定化部位の両末端に無作為的（ｒａｎｄｏｍ）にペプチドを結合させて、この２つのペプチドを共同にターゲット分子に結合させる場合は、大きく増加された結合能及び特異性を有する二座ペプチドバインダーを得ることができることを確認した。
【００１６】
本発明の基本的な戦略は、リジッドなペプチド骨格の両末端に、ターゲットに結合されるペプチドを連結することである。この場合、リジッドなペプチド骨格は、二座ペプチドバインダーの全体的な構造を安定化させる作用をして、ターゲット結合部位Ｉ及びターゲット結合部位ＩＩがターゲット分子に結合されることを強化させる。
【００１７】
本発明で利用可能な構造安定化部位は、パラレルアミノ酸鎖、アンチパラレルアミノ酸鎖、又はパラレル及びアンチパラレルアミノ酸鎖を含み、鎖間（ｉｎｔｅｒｓｔｒａｎｄ）水素結合、静電気的相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、パイ−パイ相互作用、陽イオン−パイ相互作用、又はこれらの組み合わせによる非共有結合が形成される蛋白質構造モチーフを含む。鎖間水素結合、静電気的相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、パイ−パイ相互作用、陽イオン−パイ相互作用、又はこれらの組み合わせにより形成される非共有結合は、構造安定化部位の堅固性（ｒｉｇｉｄｉｔｙ）に寄与する。
【００１８】
本発明の好ましい具現例によると、構造安定化部位における鎖間（ｉｎｔｅｒｓｔｒａｎｄ）非供給結合は、水素結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、パイ−パイ相互作用、又はこれらの組み合わせを含む。
【００１９】
選択的に、構造化安定化部位に共有結合があり得る。例えば、構造化安定化部位に二硫化結合を形成させて、構造安定化部位の堅固性を更に増加させることができる。このような共有結合による堅固性の増加は、二座ペプチドバインダーのターゲットに対する特異度及び親和度を考慮して付与する。
【００２０】
本発明の好ましい具現例によると、構造安定化部位のアミノ酸鎖は、リンカーで連結されている。本明細書で鎖を言及しながら使用される用語‘リンカー’は、鎖と鎖を連結する物質を意味する。例えば、構造安定化部位としてβ−ヘアピンが利用される場合は、β−ヘアピンにあるターン配列がリンカーの役割をして、ロイシンジッパーが利用される場合は、ロイシンジッパーの２つのＣ−末端を連結する物質（例えば、ペプチドリンカー）がリンカーの役割をする。
【００２１】
リンカーは、パラレルアミノ酸鎖、アンチパラレルアミノ酸鎖、又はパラレル及びアンチパラレルアミノ酸鎖を連結する。例えば、パラレル方式で整列された少なくとも２つの鎖（好ましくは２つの鎖）、アンチパラレル方式で整列された少なくとも２つの鎖（好ましくは２つの鎖）、パラレル及びアンチパラレル方式で整列された少なくとも３つの鎖（好ましくは３つの鎖）をリンカーが連結するようになる。
【００２２】
本発明の好ましい具現例によると、リンカーは、ターン配列又はペプチドリンカーである。
【００２３】
本発明の好ましい具現例によると、前記ターン配列は、β−ターン、γ−ターン、α−ターン、π−ターン、又はω−ループである（Ｖｅｎｋａｔａｃｈａｌａｍ  ＣＭ  （１９６８），  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，  ６，  １４２５−１４３６；  Ｎｅｍｅｔｈｙ  Ｇ  ａｎｄ  Ｐｒｉｎｔｚ  ＭＰ．  （１９７２），  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  ５，  ７５５−７５８；  Ｌｅｗｉｓ  ＰＮ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９７３），  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  ３０３，  ２１１−２２９；  Ｔｏｎｉｏｌｏ  Ｃ．  （１９８０）  ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ９，  １−４４；  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ＪＳ．  （１９８１），  Ａｄｖ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．，  ３４，  １６７−３３９；  Ｒｏｓｅ  ＧＤ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８５），  Ａｄｖ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．，  ３７，  １−１０９；  Ｍｉｌｎｅｒ−Ｗｈｉｔｅ  ＥＪ  ａｎｄ  Ｐｏｅｔ  Ｒ．  （１９８７），  ＴＩＢＳ，  １２，  １８９−１９２；  Ｗｉｌｍｏｔ  ＣＭ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  ＪＭ．  （１９８８），  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２０３，  ２２１−２３２；  Ｍｉｌｎｅｒ−Ｗｈｉｔｅ  ＥＪ．  （１９９０），  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２１６，  ３８５−３９７；  Ｐａｖｏｎｅ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６），  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，  ３８，  ７０５−７２１；  Ｒａｊａｓｈａｎｋａｒ  ＫＲ  ａｎｄ  Ｒａｍａｋｕｍａｒ  Ｓ．  （１９９６），  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，  ５，  ９３２−９４６）。最も好ましくは、本発明で利用されるターン配列は、β−ターンである。
【００２４】
ターン配列としてβ−ターンが利用される場合、好ましくは、タイプＩ、タイプＩ’、タイプＩＩ、タイプＩＩ’、タイプＩＩＩ、又はタイプＩＩＩ’ターン配列であり、より好ましくは、タイプＩ、タイプＩ’、タイプＩＩ、又はタイプＩＩ’ターン配列であり、更に好ましくは、タイプＩ’又はタイプＩＩ’ターン配列であり、最も好ましくは、タイプＩ’ターン配列である（Ｂ．  Ｌ．  Ｓｉｂａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９８９，  ２０６，  ４，  ７５９−７７７；  Ｂ．  Ｌ．  Ｓｉｂａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １９９１，  ２０２，  ５９−８２）。
【００２５】
本発明の他の好ましい具現例によると、本発明でターン配列として利用できるものは、Ｈ．  Ｊａｎｅ  Ｄｙｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２５５：４６２−４７１（１９９８）に開示されており、前記文献は、本明細書に参照として取り込まれる。ターン配列として利用できるものは、次のアミノ酸配列を含む：Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ；又はＡｌａ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ（Ｘは、２０個のアミノ酸から選択される）。
【００２６】
本発明の一具現例によって、構造安定化部位としてβ−シート又はロイシンジッパーが利用される場合、パラレル方式で整列された２つの鎖又はアンチパラレル方式で整列された２つの鎖をペプチドリンカーが連結することが好ましい。
【００２７】
ペプチドリンカーは、当業界に公知された如何なるものでも利用可能である。適したペプチドリンカーの配列は、下記のような要素を考慮して選択することができる：（ａ）柔軟な延長されたコンフォメーション（ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に適用できる能力；（ｂ）生物学的ターゲット物質と相互作用する２次構造を生成しない能力；及び（ｃ）生物学的ターゲット分子と相互作用する疎水性残基又は電荷を有する残基の不在。好ましいペプチドリンカーは、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、及びＳｅｒ残基を含む。Ｔｈｒ及びＡｌａのような他の中性アミノ酸もリンカー配列に含まれる。リンカーに適したアミノ酸配列は、Ｍａｒａｔｅａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ４０：３９−４６（１９８５）；  Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：８２５８−８５６２（１９８６）；米国特許第４，９３５，２３３号明細書、米国特許第４，７５１，１８０号明細書、及び米国特許第５，９９０，２７５号明細書に開示されている。ペプチドリンカー配列は、１〜５０アミノ酸残基で構成できる。
【００２８】
本発明の好ましい具現例によると、構造安定化部位は、β−ヘアピンモチーフ、リンカーで連結されたβ−シートモチーフ、又はリンカーで連結されたロイシンジッパーモチーフであり、より好ましくは、構造安定化部位は、β−ヘアピンモチーフ又はリンカーで連結されたβ−シートモチーフであり、最も好ましくは、β−ヘアピンモチーフである。
【００２９】
本明細書で用語‘β−ヘアピン’は、２つのβ鎖を含む最も簡単な蛋白質モチーフを意味し、この２つのβ鎖は、互いにアンチパラレルな整列を示す。このβ−ヘアピンにおいて、２つのβ鎖は、一般にターン配列により連結される。
【００３０】
好ましくは、β−ヘアピンに適用されるターン配列は、タイプＩ、タイプＩ’、タイプＩＩ、タイプＩＩ’、タイプＩＩＩ、又はタイプＩＩＩ’ターン配列であり、より好ましくは、タイプＩ、タイプＩ’、タイプＩＩ、又はタイプＩＩ’ターン配列であり、更に好ましくは、タイプＩ’又はタイプＩＩ’ターン配列であり、最も好ましくは、タイプＩ’ターン配列である。また、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ；又はＡｌａ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ（Ｘは、２０個のアミノ酸から選択される）で表されるターン配列もβ−ヘアピンに利用できる。
【００３１】
本発明の例示的な実施例によると、タイプＩターン配列は、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒであり、タイプＩ’ターン配列は、Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓであり、タイプＩＩターン配列は、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ；又はＡｌａ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ（Ｘは、２０個のアミノ酸から選択される）であり、タイプＩＩ’ターン配列は、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ又はＧｌｕ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｙｓである。
【００３２】
β−ヘアピンコンフォメーションを有するペプチドは、当業界によく知られている。例えば、米国特許第６，９１４，１２３号明細書及びＡｎｄｒｅａ  Ｇ．  Ｃｏｃｈｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ，  ９８（１０）：５５７８−５５８３に開示されているトリプトファンジッパー、国際公開第２００５／０４７５０３号明細書に開示されている鋳型−固定されたβ−ヘアピンミメティック、米国特許第５，８０７，９７９号明細書に開示されているβ−ヘアピン変形体がよく知られている。その他にも、β−ヘアピンコンフォメーションを有するペプチドは、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｒｅｇａｎ  （１９９５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：９８０−９８２；  Ｃｈｏｕ  ＆  Ｆａｓｓｍａｎ  （１９７８）  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ４７：２５１−２７６；  Ｋｉｍ  ＆  Ｂｅｒｇ  （１９９３）  Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２６７−２７０；  Ｍｉｎｏｒ  ＆  Ｋｉｍ  （１９９４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３６７：６６０−６６３；  Ｍｉｎｏｒ  ＆  Ｋｉｍ  （１９９３）  Ｎａｔｕｒｅ  ３７１：２６４−２６７；  Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （１９９４）  ３３：５５１０−５５１７；  Ｓｅａｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｎａｔ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ２：９９９−１００６；  Ｈａｑｕｅ  ＆  Ｇｅｌｌｍａｎ  （１９９７）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１９：２３０３−２３０４；  Ｂｌａｎｃｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１５：５８８７−５８８８；  ｄｅ  Ａｌｂａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｆｏｌｄ．  Ｄｅｓ．  １：  １３３−１４４；  ｄｅ  Ａｌｂａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  ６：２５４８−２５６０；  Ｒａｍｉｒｅｚ−Ａｌｖａｒａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｎａｔ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ３：６０４−６１２；  Ｓｔａｎｇｅｒ  ＆  Ｇｅｌｌｍａｎ  （１９９８）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２０：４２３６−４２３７；  Ｍａｙｎａｒｄ  ＆  Ｓｅａｒｌｅ  （１９９７）  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １２９７−１２９８；  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ７８９−７９０；  Ｍａｙｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２０：１９９６−２００７；  及びＢｌａｎｃｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｎａｔ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  １：５８４−５９０に開示されており、前記文献は、本明細書に参照として取り込まれる。
【００３３】
β−ヘアピンコンフォメーションを有するペプチドを構造安定化部位として利用する場合、最も好ましくは、トリプトファンジッパーモチーフを利用する。
【００３４】
本発明の好ましい具現例によると、本発明で利用されるトリプトファンジッパーは、下記一般式Ｉで表される：
［一般式Ｉ］
Ｘ１−Ｔｒｐ（Ｘ２）Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５（Ｘ’２）Ｘ６−Ｘ７
【００３５】
Ｘ１は、Ｓｅｒ又はＧｌｙ−Ｇｌｕであり、Ｘ２及びＸ’２は、それぞれ独立してＴｈｒ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、又はＴｙｒであり、Ｘ３は、Ｔｒｐ又はＴｙｒであり、Ｘ４は、タイプＩ、タイプＩ’、タイプＩＩ、タイプＩＩ’、タイプＩＩＩ、又はタイプＩＩＩ’ターン配列であり、Ｘ５は、Ｔｒｐ又はＰｈｅであり、Ｘ６は、Ｔｒｐ又はＶａｌであり、Ｘ７は、Ｌｙｓ又はＴｈｒ−Ｇｌｕである。
【００３６】
より好ましくは、前記一般式Ｉにおいて、Ｘ１は、Ｓｅｒ又はＧｌｙ−Ｇｌｕであり、Ｘ２及びＸ’２は、それぞれ独立してＴｈｒ、Ｈｉｓ、又はＶａｌであり、Ｘ３は、Ｔｒｐ又はＴｙｒであり、Ｘ４は、タイプＩ、タイプＩ’、タイプＩＩ、又はタイプＩＩ’ターン配列であり、Ｘ５は、Ｔｒｐ又はＰｈｅであり、Ｘ６は、Ｔｒｐ又はＶａｌであり、Ｘ７は、Ｌｙｓ又はＴｈｒ−Ｇｌｕである。
【００３７】
更に好ましくは、前記一般式Ｉにおいて、Ｘ１は、Ｓｅｒ又はＧｌｙ−Ｇｌｕであり、Ｘ２及びＸ’２は、それぞれ独立してＴｈｒ、Ｈｉｓ、又はＶａｌであり、Ｘ３は、Ｔｒｐであり、Ｘ４は、タイプＩ、タイプＩ’、タイプＩＩ、又はタイプＩＩ’ターン配列であり、Ｘ５は、Ｔｒｐであり、Ｘ６は、Ｔｒｐであって、Ｘ７は、Ｌｙｓ又はＴｈｒ−Ｇｌｕである。
【００３８】
より更に好ましくは、前記一般式Ｉにおいて、Ｘ１は、Ｓｅｒであり、Ｘ２及びＸ’２は、Ｔｈｒであり、Ｘ３は、Ｔｒｐであり、Ｘ４は、タイプＩ’又はタイプＩＩ’ターン配列であり、Ｘ５は、Ｔｒｐであり、Ｘ６は、Ｔｒｐであって、Ｘ７は、Ｌｙｓである。
【００３９】
最も好ましくは、前記一般式Ｉにおいて、Ｘ１は、Ｓｅｒであり、Ｘ２及びＸ’２は、Ｔｈｒであり、Ｘ３は、Ｔｒｐであり、Ｘ４は、タイプＩ’ターン配列（ＥＮＧＫ）又はタイプＩＩ’ターン配列（ＥＧＮＫ）であり、Ｘ５は、Ｔｒｐであり、Ｘ６は、Ｔｒｐであって、Ｘ７は、Ｌｙｓである。
【００４０】
本発明に適したトリプトファンジッパーの例示的なアミノ酸配列は、配列番号１〜３及び５〜１０に記載されている。
【００４１】
本発明で構造安定化部位として利用可能なβ−ヘアピンペプチドは、蛋白質ＧのＢ１ドメイン由来のペプチド、即ち、ＧＢ１ペプチドである。
【００４２】
本発明でＧＢ１ペプチドが利用される場合、好ましくは、構造安定化部位は、下記一般式ＩＩで表される：
［一般式ＩＩ］
Ｘ１−Ｔｒｐ−Ｘ２−Ｔｙｒ−Ｘ３−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｘ４
【００４３】
Ｘ１は、Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、又はＬｙｓ−Ｌｙｓであり、Ｘ２は、Ｇｌｎ又はＴｈｒであり、Ｘ３は、タイプＩ、タイプＩ’、タイプＩＩ、タイプＩＩ’、タイプＩＩＩ、又はタイプＩＩＩ’ターン配列であり、Ｘ４は、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ−Ｇｌｕ、又はＧｌｎ−Ｇｌｕである。
【００４４】
より好ましくは、前記一般式ＩＩの構造安定化部位は、下記一般式ＩＩ’で表される：
［一般式ＩＩ’］
Ｘ１−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｘ２−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｘ３
【００４５】
Ｘ１は、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ又はＬｙｓ−Ｌｙｓであり、Ｘ２は、タイプＩ、タイプＩ’、タイプＩＩ、タイプＩＩ’、タイプＩＩＩ、又はタイプＩＩＩ’ターン配列であり、Ｘ３は、Ｔｈｒ−Ｇｌｕ又はＧｌｎ−Ｇｌｕである。
【００４６】
本発明に適したＧＢ１β−ヘアピンの例示的なアミノ酸配列は、配列番号４及び１４〜１５に記載されている。
【００４７】
本発明で構造安定化部位として利用可能なβ−ヘアピンペプチドは、ＨＰペプチドである。本発明でＨＰペプチドが利用される場合、好ましくは、構造安定化部位は、下記一般式ＩＩＩで表される：
［一般式ＩＩＩ］
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｔｒｐ−Ｘ４−Ｘ５−Ｔｈｒ−Ｘ６−Ｘ７
【００４８】
Ｘ１は、Ｌｙｓ又はＬｙｓ−Ｌｙｓであり、Ｘ２は、Ｔｒｐ又はＴｙｒであり、Ｘ３は、Ｖａｌ又はＴｈｒであり、Ｘ４は、タイプＩ、タイプＩ’、タイプＩＩ、タイプＩＩ’、タイプＩＩＩ、又はタイプＩＩＩ’ターン配列であり、Ｘ５は、Ｔｒｐ又はＡｌａであり、Ｘ６は、Ｔｒｐ又はＶａｌであって、Ｘ７は、Ｇｌｕ又はＧｌｎ−Ｇｌｕである。
【００４９】
本発明で構造安定化部位として利用可能なまた他のβ−ヘアピンペプチドは、下記一般式ＩＶで表される：
［一般式ＩＶ］
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｔｒｐ−Ｘ４
【００５０】
Ｘ１は、Ｌｙｓ−Ｔｈｒ又はＧｌｙであり、Ｘ２は、Ｔｒｐ又はＴｙｒであり、Ｘ３は、タイプＩ、タイプＩ’、タイプＩＩ、タイプＩＩ’、タイプＩＩＩ、又はタイプＩＩＩ’ターン配列であり、Ｘ４は、Ｔｈｒ−Ｇｌｕ又はＧｌｙである。
【００５１】
一般式ＩＩＩ及びＩＶのβ−ヘアピンの例示的なアミノ酸配列は、配列番号１１〜１２、１５及び１６〜１９に記載されている。
【００５２】
本発明によると、構造安定化部位として、リンカーで連結されたβ−シートを利用することができる。β−シート構造において、パラレル又はアンチパラレルな、好ましくは、アンチパラレルな２つのアミノ酸鎖が伸びた構造（ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｆｏｒｍ）からなっており、アミノ酸鎖間に水素結合が形成される。
【００５３】
β−シート構造において、２つのアミノ酸鎖の隣接した２つの末端は、リンカーにより連結される。リンカーとしては、上述の多様なターン配列又はペプチドリンカーが利用できる。ターン配列がリンカーとして利用される場合、β−ターン配列が最も好ましい。
【００５４】
本発明の他の変形例によると、構造安定化部位としてロイシンジッパーモチーフ又はリンカーで連結されたロイシンジッパーモチーフが利用できる。ロイシンジッパーモチーフは、パラレルな２つのα−鎖のダイマー化を引き起こす保存性ペプチドドメインであり、一般に、遺伝子発現に関与する蛋白質に発見されるダイマー化ドメインである（“Ｌｅｕｃｉｎｅ  ｓｃｉｓｓｏｒｓ”．  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｒｅｖｉｓｅｄ）．  （１９９７）．  Ｅｄ．  Ｄａｖｉｄ  Ｍ．  Ｇｌｉｃｋ．  Ｌｏｎｄｏｎ：  Ｐｏｒｔｌａｎｄ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ  ＷＨ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１７５９−１７６４）。ロイシンジッパーモチーフは、一般にヘプタッド（ｈｅｐｔａｄ）反復配列を含み、ロイシン残基が４番目又は５番目に位置している。例えば、本発明に利用できるロイシンジッパーモチーフは、ＬＥＡＬＫＥＫ、ＬＫＡＬＥＫＥ、ＬＫＫＬＶＧＥ、ＬＥＤＫＶＥＥ、ＬＥＮＥＶＡＲ、又はＬＬＳＫＮＹＨのアミノ酸配列を含む。本発明で利用されるロイシンジッパーモチーフの具体的な例は、配列番号３９に記載されている。ロイシンジッパーモチーフのそれぞれの半分は、短いα−鎖からなっており、α−鎖間の直接的なロイシン接触がある。転写因子にあるロイシンジッパーモチーフは、一般に疎水性ロイシンジッパー部位及び塩基性部位（ＤＮＡ分子の主グルーブと相互作用する部位）からなっている。本発明でロイシンジッパーモチーフが利用される場合は、塩基性部位は必ずしも必要なわけではない。ロイシンジッパー構造において、２つのアミノ酸鎖（即ち、２つのα−鎖）の隣接した２つの末端は、リンカーにより連結できる。リンカーとしては、上述の多様なターン配列又はペプチドリンカーが利用でき、好ましくは、ロイシンジッパーモチーフの構造に影響を及ぼさないペプチドリンカーが利用される。
【００５５】
上述の構造安定化部位の両末端には、無作為アミノ酸配列が結合される。前記無作為アミノ酸配列がターゲット結合部位Ｉ及びターゲット結合部位ＩＩを形成する。本発明の最も大きい特徴の一つは、構造安定化部位の両側末端にターゲット結合部位Ｉ及びターゲット結合部位ＩＩを連結して、二座方式でペプチドバインダーを製作することである。ターゲット結合部位Ｉ及びターゲット結合部位ＩＩは、互いに協同的に（ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）ターゲットに結合することにより、ターゲットに対する親和度を大きく増加させる。
【００５６】
ターゲット結合部位Ｉのアミノ酸数ｎは、特に制限されず、好ましくは、２〜１００の整数、より好ましくは、２〜５０の整数、更に好ましくは、２〜２０の整数、最も好ましくは、３〜１０の整数である。
【００５７】
ターゲット結合部位ＩＩのアミノ酸数ｍは、特に制限されず、好ましくは、２〜１００の整数、より好ましくは、２〜５０の整数、更に好ましくは、２〜２０の整数、最も好ましくは、３〜１０の整数である。
【００５８】
ターゲット結合部位Ｉ及びターゲット結合部位ＩＩには、それぞれ異なる又は同一な数のアミノ酸残基が含まれる。ターゲット結合部位Ｉ及びターゲット結合部位ＩＩには、それぞれ異なる又は同一なアミノ酸配列が含まれて、好ましくは、それぞれ異なるアミノ酸配列が含まれる。
【００５９】
ターゲット結合部位Ｉ及び／又はターゲット結合部位ＩＩに含まれるアミノ酸配列は、線形のアミノ酸配列又は環形のアミノ酸配列である。ターゲット結合部位のペプチド配列の安定性を増加させるために、ターゲット結合部位Ｉ及び／又はターゲット結合部位ＩＩに含まれるアミノ酸配列の少なくとも一つのアミノ酸残基は、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に変形できる。
【００６０】
生物学的ターゲット分子に結合される本発明の二座ペプチドバインダーは、生体内生理学的反応の調節、生体内物質の検出、インビボ分子イメージング、インビトロ細胞イメージング及び薬物伝達用ターゲッティングをする際に利用でき、エスコート分子としても利用できる。
【００６１】
本発明の好ましい具現例によると、構造安定化部位、ターゲット結合部位Ｉ、又はターゲット結合部位ＩＩ（より好ましくは、構造安定化部位、更に好ましくは、構造安定化部位のリンカー）に追加的に機能性分子が結合されている。前記機能性分子の例は、検出可能な信号を発生させるラベル、化学薬物、バイオ薬物、細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）、又はナノ粒子を含むが、これらに限定されるものではない。
【００６２】
前記検出可能な信号を発生させるラベルは、Ｔ１造影物質（例えば、Ｇｄキレート化合物）、Ｔ２造影物質（例えば、超常磁性物質（例えば、マグネタイト、Ｆｅ３Ｏ４、γ−Ｆｅ２Ｏ３、マンガンフェライト、コバルトフェライト、及びニッケルフェライト））、放射性同位元素（例えば、１１Ｃ、１５Ｏ、１３Ｎ、Ｐ３２、Ｓ３５、４４Ｓｃ、４５Ｔｉ、１１８Ｉ、１３６Ｌａ、１９８Ｔｌ、２００Ｔｌ、２０５Ｂｉ、及び２０６Ｂｉ）、蛍光物質（フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、フィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ロダミン、リサミン（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）、そしてＣｙ３とＣｙ５）、化学発光団、磁気粒子、マス標識又は電子密集粒子を含むが、これらに制限されるものではない。
【００６３】
前記化学薬物は、例えば、抗炎症剤、鎮痛剤、抗関節炎剤、鎮痙剤、抗鬱剤、抗精神病薬物、神経安定剤、抗不安剤、麻薬拮抗剤、抗パーキンソン疾患、コリン性アゴニスト、抗癌剤、抗血管新生抑制剤、免疫抑制剤、抗ウイルス剤、抗生剤、食欲抑制剤、鎮痛剤、抗コリン剤、抗ヒスタミン剤、抗片頭痛剤、ホルモン剤、冠状血管、脳血管、又は末梢血管拡張剤、避妊薬、抗血栓剤、利尿剤、抗高血圧剤、心血管疾患治療剤、美容成分（例えば、シワ改善剤、皮膚老化抑制剤、及び皮膚美白剤）などを含むが、これらに限定されるものではない。
【００６４】
前記バイオ薬物は、インシュリン、ＩＧＦ−１（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １）、成長ホルモン、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦｓ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ）、ＧＭ−ＣＳＦｓ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ）、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、インターロイキン−１アルファ及びベータ、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−６、インターロイキン−２、ＥＧＦｓ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ）、カルシトニン（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ）、ＡＣＴＨ（ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、ＴＮＦ（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ）、アトビスバン（ａｔｏｂｉｓｂａｎ）、ブセレリン（ｂｕｓｅｒｅｌｉｎ）、セトロレリックス（ｃｅｔｒｏｒｅｌｉｘ）、デスロレリン（ｄｅｓｌｏｒｅｌｉｎ）、デスモプレシン（ｄｅｓｍｏｐｒｅｓｓｉｎ）、ジノルフィンＡ（ｄｙｎｏｒｐｈｉｎ  Ａ）（１−１３）、エルカトニン（ｅｌｃａｔｏｎｉｎ）、エレイドシン（ｅｌｅｉｄｏｓｉｎ）、エプチフィバチド（ｅｐｔｉｆｉｂａｔｉｄｅ）、ＧＨＲＨ−ＩＩ（ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ＩＩ）、ゴナドレリン（ｇｏｎａｄｏｒｅｌｉｎ）、ゴセレリン（ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）、ヒストレリン（ｈｉｓｔｒｅｌｉｎ）、リュプロレリン（ｌｅｕｐｒｏｒｅｌｉｎ）、リプレシン（ｌｙｐｒｅｓｓｉｎ）、オクトレオチド（ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ）、オキシトシン（ｏｘｙｔｏｃｉｎ）、ピトレシン（ｐｉｔｒｅｓｓｉｎ）、セクレチン（ｓｅｃｒｅｔｉｎ）、シンカリド（ｓｉｎｃａｌｉｄｅ）、テルリプレシン（ｔｅｒｌｉｐｒｅｓｓｉｎ）、チモペンチン（ｔｈｙｍｏｐｅｎｔｉｎ）、チモシン（ｔｈｙｍｏｓｉｎｅ）α１、トリプトレリン（ｔｒｉｐｔｏｒｅｌｉｎ）、ビバリルジン（ｂｉｖａｌｉｒｕｄｉｎ）、カルベトシン（ｃａｒｂｅｔｏｃｉｎ）、シクロスポリン、エキセジン（ｅｘｅｄｉｎｅ）、ランレオチド（ｌａｎｒｅｏｔｉｄｅ）、ＬＨＲＨ（ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、ナファレリン（ｎａｆａｒｅｌｉｎ）、副甲状腺ホルモン、プラムリンチド（ｐｒａｍＬｉｎｔｉｄｅ）、Ｔ−２０（ｅｎｆｕｖｉｒｔｉｄｅ）、チマルファシン（ｔｈｙｍａｌｆａｓｉｎ）、ジコノチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びｓｉＲＮＡなどがあるが、これらに限定されるものではない。
【００６５】
ターゲット結合部位Ｉ及び／又はターゲット結合部位ＩＩは、多様なターゲットに結合するアミノ酸配列を含むことができる。本発明の二座ペプチドバインダーによりターゲッティングできるものは、生化学物質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、細胞及び組織のような生物学的ターゲット、化合物、金属、又は非金属物質を含み、好ましくは、生物学的ターゲットである。
【００６６】
ターゲット結合部位が結合する生物学的ターゲットは、好ましくは、生化学物質、ペプチド、ポリペプチド、糖蛋白質、核酸、炭水化物、プロテオグリカン、脂質、又は糖脂質である。
【００６７】
例えば、ターゲット結合部位が結合する生化学物質は、多様な生体内代謝産物（例えば、ＡＴＰ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、炭水化物代謝産物、脂質代謝産物、及びアミノ酸代謝産物）を含む。
【００６８】
ターゲット結合部位が結合する例示的なペプチド又はポリペプチドは、酵素、リガンド、受容体、バイオマーカー、ホルモン、転写因子、成長因子、免疫グロブリン、信号伝達蛋白質、結合蛋白質、イオンチャンネル、抗原、付着蛋白質、構造蛋白質、調節蛋白質、毒素蛋白質、サイトカイン、及び血液凝固因子を含むが、これらに限定されるものではない。より詳細には、二座ペプチドバインダーのターゲットは、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｅｘｔｒａ  ｄｏｍａｉｎ  Ｂ（ＥＤ−Ｂ）、ＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＶＥＧＦＲ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＶＣＡＭ１（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）、ｎＡｃｈＲ（Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＨＳＡ（Ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）、ＭｙＤ８８、ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＥｐＣＡＭ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、ＴＮＦ−α（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ−α）、ＩｇＥ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｅ）、ＣＤ１１Ａ（α−ｃｈａｉｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  １）、ＣＤ３、ＣＤ２５、Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＩｂ／ＩＩＩａ、インテグリン、ＡＦＰ（Ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）、β２Ｍ（Ｂｅｔａ２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）、ＢＴＡ（Ｂｌａｄｄｅｒ  Ｔｕｍｏｒ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ＮＭＰ２２、Ｃａｎｃｅｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ  １２５、Ｃａｎｃｅｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ  １５−３、カルシトニン、Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ、Ｃｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎ  Ａ，エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ、Ｎｅｕｒｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｎｏｌａｓｅ、ＰＳＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ）、ＰＡＰ（Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、及びＴｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎを含むが、これらに限定されるものではない。
【００６９】
ターゲット結合部位が結合する例示的な核酸分子は、ｇＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｒＲＮＡ（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ）、ｒＤＮＡ（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ）、及びｔＲＮＡを含むが、これらに限定されるものではない。ターゲット結合部位が結合する例示的な炭水化物は、生体内炭水化物であって、単糖類、２糖類、３糖類、及び多糖類を含むが、これらに限定されるものではない。ターゲット結合部位が結合する例示的な脂質は、脂肪酸、トリアシルグリセロール、スフィンゴ脂質、ガングリオシド、及びコレステロールを含むが、これらに限定されるものではない。
【００７０】
本発明の二座ペプチドバインダーは、細胞表面に露出した生体分子（例えば、蛋白質）に結合することもできるが、細胞内生体分子（例えば、蛋白質）にも結合し、生体分子の活性を調節することができる。
【００７１】
二座ペプチドバインダーが細胞内蛋白質をターゲッティングする場合、好ましくは、二座ペプチドバインダーは、追加的に細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）を含む。
【００７２】
前記ＣＰＰは、当業界に公知された多様なＣＰＰを含み、例えば、ＨＩＶ−１  Ｔａｔ蛋白質、Ｔａｔペプチド類似体（例えば、オリゴアルギニン）、ＡＮＴＰペプチド、ＨＳＶ  ＶＰ２２転写調節蛋白質、ｖＦＧＦ由来のＭＴＳペプチド、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ、又はＰｅｐ−１ペプチドを含むが、これらに限定されるものではない。前記ＣＰＰを二座ペプチドに結合させる方法は、多様な方法があって、例えば、二座ペプチドの構造安定化部位にあるループ部分のリジン残基とＣＰＰを共有結合させる。
【００７３】
細胞内には、生理活性に重要な役割をする多くのターゲット蛋白質があり、ＣＰＰが結合された二座ペプチドバインダーは、細胞内に流入されて、このターゲット蛋白質に結合して活性を調節（例えば、抑制）する。下記実施例１９は、二座ペプチドバインダーの細胞内蛋白質に対するターゲッティングの具体的な例を示している。ＭｙＤ８８は、ＴＬＲ４、インターロイキン１受容体、ＲＡＣ１、ＩＲＡＫ２、及びＩＲＡＫ１と相互作用する細胞内蛋白質としてよく知られている。ＭｙＤ８８に結合特異性のあるＣＰＰ−二座ペプチドバインダーは、細胞内に入ってＭｙＤ８８の機能を抑制することにより、ＭＭＰ−１３の発現を効果的に遮断している。
【００７４】
上述のように、本発明の二座ペプチドバインダーは、典型的に‘Ｎ−ターゲット結合部位Ｉ−構造安定化部位の一鎖−リンカー−構造安定化部位の他の鎖−ターゲット結合部位ＩＩ−Ｃ’のコンストラクトを有する。
【００７５】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の二座ペプチドバインダーにおいて、ターゲット結合部位Ｉと構造安定化部位の一鎖との間及び／又は構造安定化部位の他の鎖−ターゲット結合部位ＩＩの間には、ターゲット結合部位と構造安定化部位間の相互構造的影響を遮断する構造影響抑制部位（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）を含む。回転部位には、ペプチド分子でΦとΨの回転が比較的自由なアミノ酸が位置する。好ましくは、ΦとΨの回転が比較的自由なアミノ酸は、グリシン、アラニン、及びセリンである。構造影響抑制部位には、１個〜１０個、好ましくは、１個〜８個、より好ましくは、１個〜３個のアミノ酸残基が位置することができる。
【００７６】
上述のコンストラクトを有する本発明の二座ペプチドバインダーのライブラリーは、当業界に公知された多様な方法で得られる。このライブラリーにおいて、二座ペプチドバインダーは無作為配列を有するようになり、これは、ターゲット結合部位Ｉ及び／又はターゲット結合部位ＩＩのどの位置でも配列選好度（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）がないか、又は指定（又は固定）されたアミノ酸残基がないことを意味する。
【００７７】
例えば、二座ペプチドバインダーのライブラリーは、固状支持体（例えば、ポリスチレン又はポリアクリルアミド樹脂）上で行われるスプリット合成方法（Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２；  ＷＯ  ９２／０００９１）によって構築できる。
【００７８】
本発明の好ましい具現例によると、二座ペプチドバインダーのライブラリーは、細胞表面展示（ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ）方式（例えば、ファージディスプレイ、バクテリアディスプレイ、又はイーストディスプレイ）で構築される。好ましくは、二座ペプチドバインダーのライブラリーは、プラスミド、バクテリオファージ、ファージミド、イースト、バクテリア、ｍＲＮＡ、又はリボゾームを基にするディスプレイ方法により製作できる。
【００７９】
ファージディスプレイは、ファージの表面上のコート蛋白質に融合された蛋白質形態で多様なポリペプチドをディスプレイする技術である（Ｓｃｏｔｔ，  Ｊ．  Ｋ．  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，  Ｇ．  Ｐ．  （１９９０）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：  ３８６；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）；  Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｏｗｍａｎ，  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００４））。フィラメント性ファージ（例えば、Ｍ１３）の遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩに発現しようとする遺伝子を融合させて、無作為ペプチドをディスプレイする。
【００８０】
ファージディスプレイには、ファージミドが利用できる。ファージミドは、バクテリアの複製原点（例えば、ＣｏｌＥ１）及びバクテリオファージのｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ部位の１コピーを有するプラスミドベクターである。このファージミドにクローニングされたＤＮＡ断片は、プラスミドのように増殖される。
【００８１】
二座ペプチドバインダーのライブラリーをファージディスプレイ方式で構築する場合、本発明の好ましい具現例は、下記の段階を含む：（ｉ）ファージコート蛋白質（例えば、Ｍ１３のようなフィラメント性ファージの遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩコート蛋白質）をコーディングする遺伝子と二座ペプチドバインダーをコーディングする遺伝子が融合された融合遺伝子；及び前記融合遺伝子に作動的に結合された転写調節配列（例えば、ｌａｃプロモーター）を含む発現ベクターのライブラリーを製作する段階；（ｉｉ）前記発現ベクターライブラリーを適した宿主に導入させる段階；（ｉｉｉ）前記宿主細胞を培養し、組み換えファージ又はファージミドウイルスパーティクルを形成させて、融合蛋白質が表面にディスプレイされるようにする段階；（ｉｖ）生物学的ターゲット分子と前記ウイルスパーティクルを接触させて、パーティクルをターゲット分子に結合させる段階；及び（ｖ）ターゲット分子に結合しなかったパーティクルを分離する段階。
【００８２】
ファージディスプレイを利用してペプチドライブラリーを構築して、これらのライブラリーをスクリーニングする方法は、米国特許第５，７２３，２８６号明細書、米国特許第５，４３２，０１８号明細書、米国特許第５，５８０，７１７号明細書、米国特許第５，４２７，９０８号明細書、米国特許第５，４９８，５３０号明細書、米国特許第５，７７０，４３４号明細書、米国特許第５，７３４，０１８号明細書、米国特許第５，６９８，４２６号明細書、米国特許第５，７６３，１９２号明細書、及び米国特許第５，７２３，３２３号明細書に開示されている。
【００８３】
二座ペプチドバインダーの遺伝子を含む発現ベクターを製作する方法は、当業界に公知された方法によって行うことができる。例えば、公知のファージミド又はファージベクター（例えば、ｐＩＧＴ２、ｆＵＳＥ５、ｆＡＦＦ１、ｆｄ−ＣＡＴ１、ｍ６６３、ｆｄｔｅｔＤＯＧ、ｐＨＥＮ１、ｐＣｏｍｂ３、ｐＣｏｍｂ８、ｐＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ＬａｍｄａＳｕｒｆＺａｐ、ｐＩＦ４、ＰＭ４８、ＰＭ５２、ＰＭ５４、ｆｄＨ、及びｐ８Ｖ５）に二座ペプチドバインダーの遺伝子を挿入させて発現ベクターを製作することができる。
【００８４】
大部分のファージディスプレイ方法がフィラメント性ファージを利用して行われるが、λファージディスプレイ（国際公開第９５／３４６８３号明細書；米国特許第５，６２７，０２４号明細書）、Ｔ４ファージディスプレイ（Ｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｇｅｎｅ  ２１５：４３９；  Ｚｈｕ  （１９９７）  ＣＡＮ  ３３：５３４）及びＴ７ファージディスプレイ（米国特許第５，７６６，９０５号明細書）も、二座ペプチドバインダーのライブラリーを構築する際に利用できる。
【００８５】
ベクターライブラリーを適した宿主細胞に導入させる方法は、多様な形質転換方法によって行うことができ、最も好ましくは、電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）方法によって行われる（参照：米国特許第５，１８６，８００号明細書、米国特許第５，４２２，２７２号明細書、米国特許第５，７５０，３７３号明細書）。本発明に適する宿主は、細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉのようなグラム陰性バクテリア細胞であり、適したＥ．ｃｏｌｉ宿主は、ＪＭ１０１，  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２  ｓｔｒａｉｎ  ２９４，  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｓｔｒａｉｎ  Ｗ３１１０、及びＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含むが、これらに限定されるものではない。宿主細胞は、形質転換前にコンピテンス細胞として用意することが好ましい（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（２００１））。形質転換された細胞の選別は、一般に抗生剤（例えば、テトラサイクリン及びアンピシリン）を含む培地で培養して行われる。選別された形質転換細胞をヘルパーファージの存在下で追加的に培養し、組み換えファージ又はファージミドウイルスパーティクルを生成させる。前記ヘルパーファージとして適したものは、Ｅｘヘルパーファージ、Ｍ１３−ＫＯ７、Ｍ１３−ＶＣＳ、及びＲ４０８を含むが、これらに限定されるものではない。
【００８６】
生物学的ターゲット分子と結合するウイルスパーティクルの選別は、通常的にバイオパニング過程を通じて行うことができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）；  Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｏｗｍａｎ，  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００４））。
【００８７】
本発明の二座ペプチドバインダーの具体的な例は、配列番号２０〜３８及び４０〜４１に記載されている。
【００８８】
本発明の他の様態によると、本発明は、上述の二座ペプチドバインダーをコーディングする核酸分子を提供する。
【００８９】
本発明の他の様態によると、本発明は、二座ペプチドバインダーをコーディングする核酸分子を含む二座ペプチドバインダーの発現用ベクターを提供する。
【００９０】
本発明の他の様態によると、本発明は、二座ペプチドバインダーの発現用ベクターを含む形質転換体を提供する。
【００９１】
本明細書において、用語‘核酸分子’は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）、そしてＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有して、核酸分子において基本構成単位であるヌクレオチドは、天然のヌクレオチドだけではなく、糖又は塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む（Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｕｈｌｍａｎ及びＰｅｙｍａｎ，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  ９０：５４３−５８４（１９９０））。
【００９２】
本発明の好ましい具現例によると、本発明のベクターは、二座ペプチドバインダーをコーディングする核酸分子の他に、前記核酸分子に、転写を進行させることのできる強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーター及びＴ７プロモーターなど）、解読の開始のためのリボゾーム結合座及び転写／解読終結配列を含む。
【００９３】
本発明の好ましい具現例によると、本発明のベクターは、二座ペプチドバインダーをコーディングする核酸分子の５’−方向側にシグナル配列（例えば、ｐｅｌＢ）を追加的に含むことができる。また、本発明の好ましい具現例によると、本発明のベクターは、二座ペプチドバインダーがファージの表面によく発現されたのかを確認するためのタギング配列（例えば、ｍｙｃ  ｔａｇ）を追加的に含む。
【００９４】
本発明の好ましい具現例によると、本発明のベクターは、ファージコート蛋白質、好ましくは、Ｍ１３のようなフィラメント性ファージの遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩコート蛋白質をコーディングする遺伝子を含む。本発明の好ましい具現例によると、本発明のベクターは、バクテリアの複製原点（例えば、ＣｏｌＥ１）及び／又はバクテリオファージの複製原点を含む。一方、本発明のベクターは、選択標識として、当業界で通常的に利用される抗生剤耐性遺伝子を含むことができるが、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲネチシン、ネオマイシン、及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子を含むことができる。
【００９５】
本発明の形質転換体は、好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉのようなグラム陰性バクテリア細胞であり、適するＥ．ｃｏｌｉ宿主は、ＪＭ１０１、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２  ｓｔｒａｉｎ  ２９４、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｓｔｒａｉｎ  Ｗ３１１０、及びＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含むが、これらに限定されるものではない。本発明のベクターを宿主細胞内に運搬する方法は、ＣａＣｌ２方法（Ｃｏｈｅｎ，  Ｓ．Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｃ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９：２１１０−２１１４（１９７３））、ハナハン方法（Ｃｏｈｅｎ，  Ｓ．Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｃ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９：２１１０−２１１４（１９７３）；及びＨａｎａｈａｎ，  Ｄ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １６６：５５７−５８０（１９８３））、及び電気穿孔方法（米国特許第５，１８６，８００号明細書、米国特許第５，４２２，２７２号明細書、米国特許第５，７５０，３７３号明細書）などにより行うことができる。
【００９６】
本発明の二座ペプチドバインダーは、非常に低い水準（例えば、ｎＭ水準）のＫＤ値（解離常数）を示し、生物学的ターゲット分子に非常に高い親和度を示すペプチドを提供する。下記実施例に記載のように、モノポダル方式で製作されたバインダーと比較し、二座ペプチドバインダーは、約１０２倍〜１０５倍（好ましくは、約１０３倍〜１０４倍）高い親和度を示す。
【００９７】
本発明の二座ペプチドバインダーは、医薬としての用途を有するだけではなく、生体内物質の検出、インビボ分子イメージング、インビトロ細胞イメージング、及び薬物伝達用ターゲッティングをする際に利用でき、エスコート分子としても利用できる。
【発明の効果】
【００９８】
本発明の特徴及び利点を要約すると、以下のようである：
（ｉ）本発明は、新規なコンストラクトを有する二座ペプチドバインダーを提供する。
（ｉｉ）本発明の二座ペプチドバインダーにおいて、構造安定性部位の両末端に結合されている離隔された（ｄｉｓｔａｌ）２つのターゲット結合部位は、互いに協同的に（ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）、シナージック（ｓｙｎｅｒｇｅｔｉｃａｌｌｙ）にターゲットに結合する。
（ｉｉｉ）このため、本発明の二座ペプチドバインダーは、非常に低い水準（例えば、ｎＭ水準）のＫＤ値（解離常数）を示し、ターゲットに非常に高い親和度を示す。
（ｉｖ）本発明の二座ペプチドバインダーは、医薬としての用途を有するだけではなく、生体内物質の検出、インビボ分子イメージング、インビトロ細胞イメージング及び薬物伝達用ターゲッティングをする際に利用でき、エスコート分子としても利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１Ａ】構造安定化部位としてβ−ヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ）を含む二座ペプチドバインダー（ｂｉｐｏｄａｌ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｅｒ）の模式図を示す。
【図１Ｂ】構造安定化部位としてリンカーで連結されたβ−シートを含む二座ペプチドバインダー（ｂｉｐｏｄａｌ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｅｒ）の模式図を示す。
【図１Ｃ】構造安定化部位としてリンカーで連結されたロイシンジッパーモチーフを含む二座ペプチドバインダー（ｂｉｐｏｄａｌ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｅｒ）の模式図を示す。
【図１Ｄ】構造安定化部位としてリンカーで連結されたロイシン−リッチモチーフ（ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｍｏｔｉｆ）を含む二座ペプチドバインダー（ｂｉｐｏｄａｌ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｅｒ）の模式図を示す。
【図２】二座ペプチドバインダーライブラリーをクローニングするための戦略を示す。ｐＩＧＴ２ファージミドベクターマップにおいて、ｐｅｌＢシグナル配列、ｍｙｃ  ｔａｇは、目的遺伝子がファージの表面によく発現されたのかを確認するためのタギング配列である。プロモーターとしてｌａｃプロモーターが利用された。
【図３】フィブロネクチンＥＤ−Ｂバイオパニング過程の間、インプットファージに対するＥＤ−Ｂ、ストレプトアビジン及びＢＳＡのバイオパニング結果を示す。
【図４】フィブロネクチンＥＤ−Ｂバイオパニング過程の間、二座ペプチドバインダーライブラリーのバイオパニングの３次段階で回収した６０個の組み換えファージのＥＤ−Ｂ及びＢＳＡに対するＥＬＩＳＡ結果である。
【図５Ａ】フィブロネクチンＥＤ−Ｂ蛋白質に結合する特定二座ペプチドバインダーの親和力を測定した結果である。
【図５Ｂ】ＶＥＧＦに結合する特定二座ペプチドバインダーの親和力を測定した結果である。
【図５Ｃ】ＶＣＡＭ１に結合する特定二座ペプチドバインダーの親和力を測定した結果である。
【図５Ｄ】ｎＡｃｈＲ（Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に結合する特定二座ペプチドバインダーの親和力を測定した結果である。
【図５Ｅ】ＨＳＡ（Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）に結合する特定二座ペプチドバインダーの親和力を測定した結果である。
【図６Ａ】フィブロネクチンＥＤ−Ｂに対して特異性検査をするために、二座ペプチドバインダーを有している組み換えファージを、種々の蛋白質に対してＥＬＩＳＡを行って吸光度を測定した結果である。左側バーからストレプトアビジン、ＥＤ−Ｂ、アセチルコリン、α１、ＢＳＡ、ＶＣＡＭ、ＴＮＦ−α、トロンビン、ミオグロブリン、リソザイム、及びビスファチンに対する結果である。
【図６Ｂ】ＶＥＧＦに対して特異性検査をするために、二座ペプチドバインダーを有している組み換えファージを、種々の蛋白質に対してＥＬＩＳＡを行って吸光度を測定した結果である。
【図６Ｃ】ｎＡｃｈＲ断片ペプチドに対して特異性検査をするために、二座ペプチドバインダーを有している組み換えファージを、種々の蛋白質に対してＥＬＩＳＡを行って吸光度を測定した結果である。
【図６Ｄ】ＶＣＡＭ１に対して特異性検査をするために、二座ペプチドバインダーを有している組み換えファージを、種々の蛋白質に対してＥＬＩＳＡを行って吸光度を測定した結果である。
【図６Ｅ】ＨＳＡに対して特異性検査をするために、二座ペプチドバインダーを有している組み換えファージを、種々の蛋白質に対してＥＬＩＳＡを行って吸光度を測定した結果である。
【図６Ｆ】ＭｙＤ８８に対して特異性検査をするために、二座ペプチドバインダーを有している組み換えファージを、種々の蛋白質に対してＥＬＩＳＡを行って吸光度を測定した結果である。
【図７】二座ペプチドバインダーの共同作用効果の証明のための親和力を測定した結果である。
【図８】二座ペプチドバインダーにおいて、構造安定化部位をトリプトファンジッパーの代わりに種々のβ−ヘアピンモチーフに変えて、二座ペプチドバインダーの親和力を測定した結果である。
【図９】二座ペプチドバインダーにおいて、構造安定化部位をトリプトファンジッパーモチーフの代わりにロイシンジッパーモチーフに変えて、二座ペプチドバインダーの親和力を測定した結果である。
【図１０】癌バイオマーカーであるフィブロネクチンＥＤ−Ｂに特異的な二座ペプチドバインダーの癌標的化結果である。時間が経つにつれて、癌に二座ペプチドバインダーが蓄積されることがわかる。それぞれの臓器を分離して蛍光を測定した時も、癌に相当部分蓄積されることがわかる。
【図１１】細胞内に存在するＭｙＤ８８の活性を抑制する特異的な二座ペプチドバインダーの効果を証明した結果である。
【発明を実施するための形態】
【０１００】
以下、実施例を通じて本発明を更に詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
【実施例】
【０１０１】
実験材料及び実験方法
実施例１：ライブラリーの製作
二座ペプチドバインダー遺伝子の製作及びファージミドベクターへの挿入
２つのオリゴヌクレオチドＢｅｔａ−Ｆ１（５’−ＴＴＣＴＡＴＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＴＧＧＣＣ（ＮＮＫ）６ＧＧＡＴＣＴＴＧＧＡＣＡＴＧＧＧＡＡＡＡＣＧＧＡＡＡＡ−３’）及びＢｅｔａ−Ｂ１（５’−ＡＡＣＡＧＴＴＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣ（ＭＮＮ）６ＴＣＣＣＴＴＣＣＡＴＧＴＣＣＡＴＴＴＴＣＣＧＴＴ−３’）（Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、又はＣ；Ｋは、Ｇ又はＴ；Ｍは、Ｃ又はＡ）を合成した。２重鎖を作るために、４μＭ  Ｂｅｔａ−Ｆ１、４μＭ  Ｂｅｔａ−Ｂ１、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液４μＬ、ＥｘＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素１μＬ（Ｔａｋａｒａ，  Ｓｅｏｕｌ，  Ｋｏｒｅａ）及び１０×ＰＣＲバッファ５μＬを混合して、５０μＬになるように蒸留水を添加した混合液を２５個作った。この混合液をＰＣＲ反応（９４℃で５分間、６０サイクル：３０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間及び７２℃で７分間）をして、２重鎖を作った後、ＰＣＲ精製キット（ＧｅｎｅＡｌｌ，  Ｓｅｏｕｌ，  Ｋｏｒｅａ）を利用して精製し、二座ペプチドバインダー遺伝子を得た。二座ペプチドバインダーに挿入させる遺伝子をｐＩＧＴ２ファージミドベクター（Ｉｇ  ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｃｈｕｎｃｈｅｏｎ，  Ｋｏｒｅａ）に連結するために、インサート遺伝子とｐＩＧＴ２ファージミドベクターに制限酵素を処理した。約１１μｇのインサートＤＮＡをＳｆｉＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ，  Ｉｐｓｗｉｃｈ）及びＮｏｔＩ（ＮＥＢ，  Ｉｐｓｗｉｃｈ）でそれぞれ４時間ずつ反応した後、ＰＣＲ精製キットを利用して精製した。また、約４０μｇのｐＩＧＴ２ファージミドベクターをＳｆｉＩ及びＮｏｔＩでそれぞれ４時間ずつ反応した後、ＣＩＡＰ（Ｃａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（ＮＥＢ，  Ｉｐｓｗｉｃｈ）を入れて１時間反応した後、ＰＣＲ精製キットを利用して精製した。これらをＵＶ−可視光線分光器（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  ２１００ｐｒｏ，  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で定量し、２．９μｇのインサート遺伝子を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｎｅｅｒ，  Ｄａｅｊｅｏｎ，  Ｋｏｒｅａ）を利用してｐＩＧＴ２ファージミドベクター１２μｇと１８℃で１５時間連結した後、エタノールで沈殿させてＴＥバッファ１００μＬでＤＮＡを溶解させた。
【０１０２】
コンピテンス細胞の用意
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−ＢＬＵＥ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＵＳＡ）をＬＢ寒天プレートに線状塗抹した。寒天プレート培地で育った群落を５ｍＬのＬＢ培地に接種した後、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら一日間培養した。培養された１０ｍＬの細胞を２ＬのＬＢ培地に接種して、同じ方式で６００ｎｍの波長で吸光度が０．３〜０．４になるまで培養した。培養されたフラスコを３０分間氷に放置した後、４℃で４，０００×ｇで２０分間遠心分離し、沈殿した細胞を除いた上澄み液を全て除去し、１Ｌの冷却された滅菌蒸留水で懸濁させた。これを再び同じ方法で遠心分離して、上澄み液を除去した後、１Ｌの冷却された滅菌蒸留水で再懸濁させて、同じ方式で１０％グリセロール溶液４０ｍＬで洗浄を繰り返して遠心分離した後、最後に１０％グリセロール溶液４ｍＬで懸濁させた後、２００μＬずつ分株して液体窒素に冷凍させた後、−８０℃に保管した。
【０１０３】
電気穿孔法
ファージミドベクター１２μｇと二座ペプチドバインダーにインサートＤＮＡ  ２．９μｇを連結反応させた１００μＬを２５個に分株して、電気穿孔を行った。コンピテンス細胞を氷の上で溶かして、２００ｍＬのコンピテンス細胞を連結反応した溶液４μＬと混合した後、冷却して用意した０．２ｃｍのキュベットに入れた後、１分間氷の上に放置した。電気穿孔機（ＢｉｏＲａｄ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）を２００Ωで２５μＦ及び２．５ｋＶの条件にプログラムして、用意したキュベットの水気を除去して電気穿孔機に位置させた後、パルスを与えた（時間常数は、４．５ｍｓｅｃ〜５ｍｓｅｃ）。その後、直に３７℃に用意した２０ｍＭのグルコースの含まれた１ｍＬのＬＢ液体培地に入れて、得られた２５ｍＬの細胞を１００ｍＬ試験管に移した。１時間３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら培養した後、ライブラリーの数を測定するために、１０μＬを稀釈してアンピシリン寒天培地に塗抹した。残りの細胞を、１ＬのＬＢに２０ｍＭグルコース及び５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを入れて、３０℃で１日間培養した。４℃で４，０００×ｇで２０分間遠心分離し、沈殿した細胞を除いた上澄み液を全て除去し、４０ｍＬのＬＢで再懸濁させた後、グリセロールを最終濃度２０％以上入れて、−８０℃に保管した。
【０１０４】
ライブラリーで組み換えファージの生産とＰＥＧ沈殿
−８０℃に貯蔵された二座ペプチドバインダーライブラリーで組み換えファージを生産した。５００ｍＬフラスコに１００ｍＬのＬＢ液体培地にアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）及び２０ｍＭのグルコースを入れた後、−８０℃に保管されたライブラリー１ｍＬを追加して、１時間３７℃で１５０ｒｐｍの速度で混合しながら培養した。これに１×１０１１ｐｆｕのＥｘヘルパーファージ（Ｉｇ  ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｃｈｕｎｃｈｅｏｎ，  Ｋｏｒｅａ）を入れて、再び１時間同じ条件で培養した。１，０００×ｇで１０分間遠心分離して上澄み液を除去し、これにアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）及びカナマイシン（２５μｇ／ｍＬ）が含まれたＬＢ液体培地１００ｍＬを入れて、１日間培養し、組み換えファージを生産した。培養液を３，０００×ｇで１０分間遠心分離し、得られた上澄み液１００ｍＬにＰＥＧ／ＮａＣｌ  ２５ｍＬを混合して、氷に１時間放置させた後、４℃で２０分間１０，０００×ｇで遠心分離して、上澄み液は注意して除去し、２ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）でペレットを再懸濁させた。
【０１０５】
実施例２：蛋白質の準備
実施例に利用するフィブロネクチン（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）  ＥＤ−Ｂ、ＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＶＣＡＭ１（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）、ｎＡｃｈＲ（Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＨＳＡ（Ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）、及びＭｙＤ８８を下記のように用意した。
【０１０６】
フィブロネクチンＥＤ−Ｂ遺伝子の製作及び発現ベクターへの挿入
韓国生命工学研究院から部分的なヒトのフィブロネクチンＥＤ−Ｂ（ＩＤ＝ＫＵ０１７２２５）遺伝子を供給してもらった。プライマーＥＤＢ＿Ｆ１（５’−ＴＴＣＡＴＡＡＣＡＴＡＴＧＣＣＡＧＡＧＧＴＧＣＣＣＣＡＡ−３’）及びＥＤＢ＿Ｂ１（５’−ＡＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＧＴＴＴＧＴＴＧＴＧＴＣＡＧＴＧＴＡＧＴＡＧＧＧＧＣＡＣＴＣＴＣＧＣＣＧＣＣＡＴＴＡＡＴＧＡＧＡＧＴＧＡＴＡＡＣＧＣＴＧＡＴＡＴＣＡＴＡＧＴＣＡＡＴＧＣＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧＣＣＣＴＧＴＧ−３’）を合成して、２０ｐｍｏｌ  ＥＤＢ−Ｆ１、２０ｐｍｏｌ  ＥＤＢ−Ｂ１、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液４μＬ、ＥｘＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素１μＬ（１０Ｕ）及び１０×ＰＣＲバッファ５μＬを混合して、５０μＬになるように蒸留水を添加した混合液を製造した。この混合液をＰＣＲ反応（９４℃で５分間、３０サイクル：５５℃で３０秒間、７２℃で１分間及び９４℃で３０秒間）をしてＥＤＢインサートにした後、ＰＣＲ精製キットを利用して精製した。ＥＤＢインサート遺伝子をｐＥＴ２８ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に連結するために、ＥＤＢインサート遺伝子及びｐＥＴ２８ｂベクターに制限酵素を処理した。約２μｇのインサートＤＮＡをＢａｍＨＩ（ＮＥＢ，  Ｉｐｓｗｉｃｈ）及びＮｄｅＩ（ＮＥＢ，  Ｉｐｓｗｉｃｈ）で４時間ずつ反応した後、ＰＣＲ精製キットを利用して精製した。また、約２μｇのｐＩＧＴ２ファージミドベクターをＢａｍＨＩ及びＮｄｅＩで３時間ずつ反応した後、ＣＩＡＰを入れて１時間反応した後、ＰＣＲ精製キットを利用して精製した。これらをベクターとインサートが約１：３のモル比率になるように添加して、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｎｅｅｒ，  Ｄａｅｊｅｏｎ，  Ｋｏｒｅａ）を利用して１８℃で１０時間連結させて、ＸＬ−１コンピテント細胞に形質転換をした後、カナマイシンの含まれた寒天培地に塗抹した。寒天プレート培地で育った群落を５ｍＬのＬＢ培地に接種した後、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら１日間培養した後、プラスミドフラップキット（ＧｅｎｅＡｌｌ，  Ｓｅｏｕｌ，  Ｋｏｒｅａ）を利用してプラスミドを精製し、シーケンシングをして、クローニングが成功したかどうかを確認した。
【０１０７】
ＶＥＧＦ１２１遺伝子の製作及び発現ベクターへの挿入
サイトカインバンク（Ｊｅｏｎｊｕ，  Ｋｏｒｅａ）から部分的なヒトのＶＥＧＦ（ＩＤ＝Ｇ１５７）遺伝子を供給してもらった。プライマーＶＥＧＦ＿Ｆ１（５’−ＡＴＡＧＡＡＴＴＣＧＣＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡＡ−３’）及びＶＥＧＦ＿Ｂ１（５’−ＡＴＴＡＡＧＣＴＴＴＣＡＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＴＴＧＴＣＡＣＡＡＴＴＴＴＣＴＴＧＴＣＴＴＧＣ−３’）を合成して、２０ｐｍｏｌ  ＶＥＧＦ−Ｆ１、２０ｐｍｏｌ  ＶＥＧＦ−Ｂ１、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液４μＬ、ＥｘＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素１μＬ（１０Ｕ）及び１０×ＰＣＲバッファ５μＬを混合して、５０μＬになるように蒸留水を添加した混合液を製造した。この混合液をＰＣＲ反応（９４℃で５分間、３０サイクル：５５℃で３０秒間、７２℃で１分間及び９４℃で３０秒間）をしてＶＥＧＦインサートにした後、ＰＣＲ精製キットを利用して精製した。ＶＥＧＦインサート遺伝子をｐＥＴ３２ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に連結するために、ＶＥＧＦインサート遺伝子及びｐＥＴ３２ａベクターに制限酵素を処理した。約２μｇのインサートＤＮＡをＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ，  Ｉｐｓｗｉｃｈ）及びＨｉｎｄＩＩＩ（ＮＥＢ，  Ｉｐｓｗｉｃｈ）で４時間ずつ反応した後、ＰＣＲ精製キットを利用して精製した。これらをベクターとインサートが約１：３のモル比率になるように添加して、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｎｅｅｒ，  Ｄａｅｊｅｏｎ，  Ｋｏｒｅａ）を利用して１８℃で１０時間連結させて、ＸＬ−１コンピテント細胞に形質転換をした後、アンピシリンの含まれた寒天培地に塗抹した。寒天プレート培地で育った群落を５ｍＬのＬＢ培地に接種した後、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら１日間培養した後、プラスミドフラップキット（ＧｅｎｅＡｌｌ，  Ｓｅｏｕｌ，  Ｋｏｒｅａ）を利用してプラスミドを精製し、シーケンシングをして、クローニングが成功したかどうかを確認した。
【０１０８】
ＶＣＡＭ１遺伝子の製作及び発現ベクターへの挿入
韓国生命工学研究院からヒトのＶＣＡＭ１遺伝子を供給してもらった。ＶＣＡＭ１インサート遺伝子をｐＥＴ３２ａベクターに連結するために、ＶＣＡＭ１インサート遺伝子及びｐＥＴ３２ａベクターに制限酵素を処理した。これらをベクターとインサートが約１：３のモル比率になるように添加して、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｎｅｅｒ，  Ｄａｅｊｅｏｎ，  Ｋｏｒｅａ）を利用して１８℃で１０時間連結させて、ＸＬ−１コンピテント細胞に形質転換をした後、アンピシリンの含まれた寒天培地に塗抹した。寒天プレート培地で育った群落を５ｍＬのＬＢ培地に接種した後、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら１日間培養した後、プラスミドフラップキット（ＧｅｎｅＡｌｌ，  Ｓｅｏｕｌ，  Ｋｏｒｅａ）を利用してプラスミドを精製し、シーケンシングをして、クローニングが成功したかどうかを確認した。
【０１０９】
フィブロネクチンＥＤ−Ｂの発現及び精製
フィブロネクチンＥＤ−ＢをクローニングしたｐＥＴ２８ｂベクターをＢＬ２１細胞に形質転換した後、カナマイシンの含まれた寒天培地に塗抹した。寒天プレート培地で育った群落をカナマイシン（２５μｇ／ｍＬ）の含まれた５ｍＬのＬＢ培地に接種した後、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら１日間培養した後、カナマイシン（２５μｇ／ｍＬ）の含まれた５０ｍＬのＬＢ培地に移して３時間培養した。培養したＥ．ｃｏｌｉをカナマイシン（２５μｇ／ｍＬ）の含まれた２ＬのＬＢに接種して、ＯＤ＝０．６〜０．８まで培養した。その後、１ｍＭ  イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を入れて、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら８時間培養した。４，０００×ｇで２０分間遠心分離して、沈殿された細胞を除いた上澄み液を全て除去し、ライシスバッファ（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ  ８．０）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ及び５ｍＭイミダゾール）で懸濁させた。−８０℃に１日間保管した後、ソニケーターを利用してＥ．ｃｏｌｉを溶解させた後、１５，０００×ｇで１時間遠心分離して、上澄み液をＮｉ−ＮＴＡ親和性レジン（Ｅｌｐｉｓｂｉｏ，  Ｄａｅｊｅｏｎ，  Ｋｏｒｅａ）に結合させる。ライシスバッファでレジンを洗浄した後、イリュージョンバッファ（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ  ８．０），３００ｍＭ  ＮａＣｌ及び３００ｍＭ  イミダゾール）を利用して、Ｎ−末端Ｈｉｓ−ｔａｇ  ＥＤ−Ｂ蛋白質を溶出させて獲得した。このように獲得した蛋白質をＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）及びＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）バッファを利用して、ゲルろ過法（ｇｅｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）で純度の高いＥＤ−Ｂ蛋白質を得た。バイオパニングのためにＥＤ−Ｂ蛋白質にビオチンを連結した。６ｍｇのスルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン（ＰＩＥＲＣＥ，  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，  ＵＳＡ）及び１．５ｍｇのＥＤ−Ｂ蛋白質を常温で０．１Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ  ９．０）下で２時間反応し、反応しなかったスルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチンを除去するために、蛋白質をＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム及びＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）バッファを利用してゲルろ過法（ｇｅｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）でビオチン−ＥＤＢ蛋白質を精製した。
【０１１０】
ＶＥＧＦ１２１とＶＣＡＭ１−Ｔｒｘの発現及び精製
ＶＥＧＦ１２１とＶＣＡＭ１をクローニングしたｐＥＴ３２ａベクターをそれぞれＡＤ４９４細胞に形質転換した後、アンピシリンの含まれた寒天培地に塗抹した。寒天プレート培地で育った群落をアンピシリン（２５μｇ／ｍＬ）の含まれた５ｍＬのＬＢ培地に接種した後、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら１日間培養した後、アンピシリン（２５μｇ／ｍＬ）の含まれた５０ｍＬのＬＢ培地に移して３時間培養した。培養したＥ．ｃｏｌｉをアンピシリン（２５μｇ／ｍＬ）の含まれた２ＬのＬＢに接種して、ＯＤ＝０．６〜０．８まで培養した。その後、１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を入れて、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら８時間培養した。４，０００×ｇで２０分間遠心分離して、沈殿された細胞を除いた上澄み液を全て除去し、ライシスバッファ（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ  ８．０）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ及び５ｍＭイミダゾール）で懸濁させた。−８０℃に１日間保管した後、ソニケーターを利用してＥ．ｃｏｌｉを溶解させた後、１５，０００×ｇで１時間遠心分離して、上澄み液をＮｉ−ＮＴＡ親和性レジン（Ｅｌｐｉｓｂｉｏ，  Ｄａｅｊｅｏｎ，  Ｋｏｒｅａ）に結合させる。ライシスバッファでレジンを洗浄した後、イリュージョンバッファ（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ  ８．０）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ及び３００ｍＭイミダゾール）を利用して、Ｔｒｘ−ＶＥＧＦ１２１蛋白質を溶出させて獲得した。このように獲得した蛋白質をＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）及びＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）バッファを利用して、ゲルろ過法（ｇｅｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）で純度の高いＶＥＧＦ−ＴｒｘとＶＣＡＭ１−Ｔｒｘ蛋白質を得た。純粋なＶＥＧＦを得るために、トロンビンでＶＥＧＦとＴｒｘ間を切断し、ＶＥＧＦ１２１を得た。
【０１１１】
一方、ＨＳＡは、Ｇｅｎｅｔｅｘ会社（Ｉｒｖｉｎｅ）から購入して利用した。ｎＡｃｈＲ（Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の断片ペプチドであるｂｉｏｔｉｎ−ＳＧＥＷＶＩＫＥＡＲＧＷＫＨＷＶＦＹＳＣＣＰＴＴＰＹＬＤＩＴＹＨ（３２ｍｅｒ）は、ＡＮＹＧＥＮ（Ｋｏｒｅａ，  Ｋｗａｎｇｊｕ）で合成した。Ｈｕｍａｎ  ＭｙＤ８８は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ｓｃ−４５４０ＷＢ）（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入した。
【０１１２】
実施例３：バイオパニング方法
ＢｉｏｔｉｎフィブロネクチンＥＤ−Ｂ蛋白質とＢｉｏｔｉｎ−ｎＡｃｈＲペプチドのバイオパニング方法
２ｍＬのストレプトアビジン（１０μｇ／ｍＬ）を９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の４０個のウェルに５０μＬずつ入れた後、４℃で一晩中放置し、翌日２０個のウェルにのみ０．１％のＰＢＳＴ（ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した後、ビオチンＥＤ−ＢとビオチンｎＡｃｈＲ（１０μｇ／ｍＬ）をそれぞれ入れて、常温で１時間放置した。その後、４０個のウェルの全てを０．１％ＰＢＳＴで３回洗浄して、ＰＢＳで稀釈した２％ＢＳＡを使用して常温で２時間ブロッキングした後、溶液を全て捨てて、０．１％ＰＢＳＴで３回洗浄した。これに二座ペプチドバインダー組み換えファージ含有溶液８００ｍＬ及び１０％ＢＳＡ  ２００ｍＬを混合し、ストレプトアビジン及びＢＳＡに結合するファージを除去するために、ストレプトアビジンにＢＳＡコーティングした２０個のウェルに入れて１時間２７℃に放置した。上澄み液を回収してＥＤ−ＢとｎＡｃｈＲが結合した２０個のウェルに移して、２７℃で４５分間放置した。２０個のウェルの溶液を全て除去して、０．５％ＰＢＳＴで１５回洗浄した後、０．２Ｍグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ２．２）１ｍＬを各ウェル当たり５０ｍＬずつ入れて２０分間ファージを溶離させて、１ｍＬをチューブに集めて、これに２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅ（ｐＨ  ９．０）１５０ｍＬを入れて溶液を中和させた。各バイオパニングにインプットファージ及びアウトプットファージの数を測定するために、ＯＤ＝０．７のＸＬ−１  ＢＬＵＥ細胞に混ぜて、アンピシリンの含まれた寒天培地に塗抹した。パニングを繰り返すために１０ｍＬのＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−ＢＬＵＥ細胞と混ぜて、３７℃で１時間２００ｒｐｍの速度で混合しながら培養した。アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）及び２０ｍＭ  グルコースを混合した後、２×１０１０ｐｆｕのＥｘヘルパーファージを添加して、３７℃で１時間２００ｒｐｍの速度で混合しながら培養した。培養液を１，０００×ｇで１０分間遠心分離した後、上澄み液は全て除去し、沈殿された細胞をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）及びカナマイシン（２５μｇ／ｍＬ）の含まれた４０ｍＬ  ＬＢ液体培地で再懸濁して、３０℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら１日間培養した。培養液を４，０００×ｇ、２０分間及び４℃の条件で遠心分離した。上澄み液に８ｍＬの５×ＰＥＧ／ＮａＣｌ［２０％  ＰＥＧ（ｗ／ｖ）及び１５％  ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）］を添加した後、４℃で１時間静置させた。遠心分離後、ＰＥＧ溶液を完全に除去して、１ｍＬのＰＢＳ溶液でファージペプチドペレットを溶かした後、２次バイオパニングに使用した。各パニング段階毎に上記と同一な方法を使用したが、洗浄過程は、段階別にそれぞれ２５回及び３５回（０．５％  ＰＢＳＴ）増加させた。
【０１１３】
ＶＥＧＦとＶＣＡＭ１−ＴｒｘとＨｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（ＨＳＡ），  ＭｙＤ８８のバイオパニング方法
ＶＥＧＦとＶＣＡＭ１−ｔｒｘとＨＳＡとＭｙＤ  ８８（５μｇ／ｍＬ）を９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の１０個のウェルに５０μＬずつ入れた後、４℃で一晩中放置し、翌日２％ＢＳＡを使用して常温で２時間ブロッキングした後、溶液を全て捨てて、０．１％ＰＢＳＴで３回洗浄した。これに二座ペプチドバインダー組み換えファージ含有溶液８００μＬ及び１０％ＢＳＡ  ２００μＬを混合し、ＶＥＧＦとＶＣＡＭ１−ＴｒｘとＨＳＡが結合した１０個のウェルに移して常温で１時間放置した。１０個のウェルの溶液を全て除去して、０．１％ＰＢＳＴで１０回洗浄した後、０．２Ｍグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ２．２）１ｍＬを各ウェル当たり５０ｍＬずつ入れて２０分間ファージを溶離させて、１ｍＬをチューブに集め、これに２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅ（ｐＨ  ９．０）１５０μＬを入れて溶液を中和させた。各バイオパニングにインプットファージ及びアウトプットファージの数を測定するために、ＯＤ＝０．７のＸＬ−１  ＢＬＵＥ細胞に混ぜて、アンピシリンの含まれた寒天培地に塗抹した。パニングを繰り返すために１０ｍＬのＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−ＢＬＵＥ細胞と混ぜて、３７℃で１時間２００ｒｐｍの速度で混合しながら培養した。アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）及び２０ｍＭ  グルコースを混合した後、２×１０１０ｐｆｕのＥｘヘルパーファージを添加して、３７℃で１時間２００ｒｐｍの速度で混合しながら培養した。培養液を１，０００×ｇで１０分間遠心分離した後、上澄み液は除去し、沈殿された細胞をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）及びカナマイシン（２５μｇ／ｍＬ）の含まれた４０ｍＬ  ＬＢ液体培地で再懸濁して、３０℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら１日間培養した。培養液を４，０００×ｇ、２０分間及び４℃の条件で遠心分離した。上澄み液に８ｍＬの５×ＰＥＧ／ＮａＣｌ［２０％  ＰＥＧ（ｗ／ｖ）及び１５％  ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）］を添加した後、４℃で１時間静置させた。遠心分離後、ＰＥＧ溶液を完全に除去して、１ｍＬのＰＢＳ溶液でファージペプチドペレットを溶かした後、２次バイオパニングに使用した。パニング段階毎に上記と同一な方法を使用したが、洗浄過程は、段階別にそれぞれ２０回及び３０回（０．１％  ＰＢＳＴ）増加させた。
【０１１４】
実施例４：フィブロネクチンＥＤ−ＢのインプットファージのＥＬＩＳＡ
二座ペプチドバインダーライブラリーの各インプットファージのＥＬＩＳＡを、ストレプトアビジン、ＢＳＡ、及びＥＤ−Ｂに対して行った。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに１０μｇ／ｍＬストレプトアビジンを各ウェル当たり５０ｍＬずつ１８個のウェルに入れて、１０μｇ／ｍＬ  ＢＳＡを各ウェル当たり５０ｍＬずつ９個のウェルに入れて、４℃で一晩中放置した。翌日、ストレプトアビジンのある１８個のウェルの中、９個のウェルのみを０．１％  ＰＢＳＴ（ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄し、ビオチンＥＤ−Ｂ（１０μｇ／ｍＬ）を入れて常温で１時間放置した。その後、全てのウェルを０．１％  ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＢＳで稀釈した２％  ＢＳＡを使用して常温で２時間ブロッキングした後、溶液を全て捨てて０．１％  ＰＢＳＴで３回洗浄した。これに二座ペプチドバインダー組み換えファージである１番目、２番目、及び３番目のインプットファージ８００ｍＬ及び１０％  ＢＳＡ  ２００ｍＬを混合して、１００ｍＬずつＥＤ−Ｂ、ストレプトアビジン及びＢＳＡウェルにそれぞれ３ウェルずつ分株して、２７℃で１時間３０分間静置した。０．１％  ＰＢＳＴ溶液で１０回洗浄した後、ＨＲＰ−コンジュゲート抗−Ｍ１３抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１：１，０００に稀釈して、２７℃で１時間反応した。０．１％  ＰＢＳＴで５回洗浄した後、ペロキシダーゼの基質であるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（ＢＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）溶液１００ｍＬを分株して、発色反応を誘導した後、１００ｍＬの１Ｍ  ＨＣｌを添加して反応を中止した。その後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【０１１５】
実施例５：フィブロネクチンＥＤ−Ｂ、ＶＥＧＦ、ＶＣＡＭ１、ｎＡｃｈＲ、ＨＳＡ，  ＭｙＤ８８蛋白質に特異的なファージペプチド検索（ファージＥＬＩＳＡ）
アウトプットファージ／インプットファージ比率が最も高いバイオパニング段階で回収したファージをＸＬ１−ＢＬＵＥ細胞に感染させた後、プラークがプレート当たり１００個〜２００個程度になるように塗抹した。滅菌されたチップを利用し、プラーク６０個を２ｍＬのＬＢ−アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）培養液に接種した後、３７℃で５時間振とう培養し、ＯＤ＝０．８〜１で５×１０９ｐｆｕのＥｘヘルパーファージを添加して、３７℃で１時間２００ｒｐｍの速度で混合しながら培養した。培養液を１，０００×ｇで１０分間遠心分離した後、上澄み液は全て除去し、沈殿された細胞をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）及びカナマイシン（２５μｇ／ｍＬ）の含まれた１ｍＬ  ＬＢ液体培地で再懸濁して、３０℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら１日間培養した。培養液を１０，０００×ｇ、２０分間及び４℃の条件で遠心分離して上澄み液を回収した後、２％の脱脂牛乳を入れて、これをファージペプチド検索に使用した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに５μｇ／ｍＬのＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ＥＤ−Ｂ、ＶＥＧＦ、ＶＣＡＭ１、Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ｎＡｃｈＲ）、Ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ、ＭｙＤ８８を各ウェル当たり５０ｍＬずつ３０個のウェルに入れて、また、１０μｇ／ｍＬのＢＳＡを各ウェル当たり５０ｍＬずつ３０個のウェルに入れて４℃で１日間放置した。翌日、全てのウェルを０．１％  ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＢＳで稀釈した２％脱脂牛乳を使用して常温で２時間ブロッキングした後、溶液を全て捨てて０．１％  ＰＢＳＴで３回洗浄した。各クローン別に増幅されたファージペプチド溶液１００ｍＬずつを全てのウェルに分株して、２７℃で１時間３０分間静置した。０．１％  ＰＢＳＴ溶液で５回洗浄した後、ＨＲＰ−コンジュゲート抗−Ｍ１３抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１：１，０００に稀釈して、２７℃で１時間反応した。０．１％  ＰＢＳＴで５回洗浄した後、ＴＭＢ溶液１００ｍＬを分株して発色反応を誘導した後、１００ｍＬの１Ｍ  ＨＣｌを添加して反応を中止した。４５０ｎｍで吸光度を測定し、ＢＳＡに比べて吸光度の高いクーロンを選択した。これらのファージをＸＬ１細胞に感染させた後、プラークがプレート当たり１００個〜２００個程度になるように塗抹した。滅菌されたチップを利用し、プラークを４ｍＬのＬＢ−アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）培養液に接種した後、３７℃で１日間振とう培養して、プラスミドフラップキットを利用してプラスミドを精製し、シーケンシングを依頼した（Ｇｅｎｏｔｅｃｈ，  Ｄａｅｊｅｏｎ，  Ｋｏｒｅａ）。シーケンシングプライマーは、ベクターシーケンスである５’−ＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＴＧＧＡＧＣ−３’を使用した。
【０１１６】
実施例６：フィブロネクチンＥＤ−Ｂ、ＶＥＧＦ、ｎＡｃｈＲバインディングアッセイ
ＤＮＡシーケンシングで重複して出たＥＤ−Ｂ、ＶＥＧＦ、ｎＡｃｈＲに特異的な二座ペプチドバインダーペプチドを合成（Ａｎｙｇｅｎ，韓国）した。親和度の測定は、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｘ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）を利用して行った。ＥＤ−ＢとｎＡｃｈＲは、ストレプトアビジンＳＡチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）にビオチン−ＥＤＢを２，０００  ＲＵだけ流して固定させた。ＶＥＧＦは、ＥＤＣ／ＮＨＳを利用してＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）に固定した。ランニングバッファとしてはＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）を使用して、フローは、分当たり３０ｍＬ流しながら、多様な濃度で動力学を測定した後、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）で親和度を計算した。
【０１１７】
実施例７：癌バイオマーカーであるフィブロネクチンＥＤ−Ｂに特異的な二座ペプチドバインダーの癌標的化
癌に多く分布するフィブロネクチンＥＤ−Ｂをターゲットする二座ペプチドバインダー（ペプチド２）にＣｙ５．５−ＮＨＳ蛍光ダイ（ｆｌｕｒｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｄｙｅ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）を５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ９．７）で１２時間常温反応した。反応後にＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）でＣｙ５．５と二座ペプチドバインダー−Ｃｙ５．５を分離した。Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにＨｕｍａｎ  Ｕ８７ＭＧ（ＡＴＣＣ）２×１０６細胞を皮下に入れて癌を１０日間育てた後、０．５ｎｍｏｌの二座ペプチドバインダー−Ｃｙ５．５を静脈注射で入れて、ＩＶＩＳ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｉｅｎｃｅ，  Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ）で蛍光を測定した。この実験は、癌バイオマーカーであるフィブロネクチンＥＤ−Ｂに特異的な二座ペプチドバインダーが、インビボ動物において癌に蓄積されることを証明する結果であって、実際、癌診断剤としての応用性を示す（図１１）。
【０１１８】
実施例８：細胞内に存在するＭｙＤ８８に特異的な二座ペプチドバインダーの活性抑制実験
ＭｙＤ８８は、細胞内に存在する蛋白質であるため、二座ペプチドバインダーのｌｏｏｐのリジン（ｌｙｓｉｎｅ）残基を利用し、細胞透過ペプチド（ｃｅｌｌ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）である９個のアルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ）（Ａｎｙｇｅｎ，  韓国）を、ＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｓｉｇｍａ）を利用して二座ペプチドバインダーに共有結合させて、細胞透過を可能にした。ＭｙＤ８８の活性が活性化されるとＭＭＰ−１３の量が増加するため、ＭＭＰ−１３の量を測定すれば、ＭｙＤ８８の活性が抑制されるかどうか判別できる。ＭｙＤ８８の活性を活性化させるＩＬ−１ｂｅｔａ（１０  ｎｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ  ＭＮ）を軟骨細胞に処理した。その後、ＭｙＤ８８に特異的な二座ペプチドバインダー（表３ｆのペプチド１）を軟骨細胞に１０μＭ処理して、１２時間後にｍＲＮＡを分離した後、ＭＭＰ−１３とＧＡＰＤＨに対してＲＴ−ＰＣＲを進行した。また、軟骨細胞を破壊して細胞内蛋白質を得た後、Ａｎｔｉ−ＭＭＰ  １３抗体（Ａｂｃａｍ，  ａｂ３２０８，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）とセミドライｔｒａｎｓｆｅｒ機械（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）を利用しウェスタンブロッティングを行って、ＭＭＰ−１３の量を測定した。
【０１１９】
実験結果
実施例９：二座ペプチドバインダーライブラリーの製作
二座ペプチドバインダーの構造安定化部位としては、安定したβ−ヘアピンモチーフを使用した。特に、トリプトファン−トリプトファンアミノ酸の相互作用によりβ−ヘアピンモチーフ構造を安定にできるトリプトファンジッパー（Ａｎｄｒｅａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９８：５５７８−５５８３（２００１））を利用した。骨格であるトリプトファンジッパーのＮ−末端部分及びＣ−末端部分にそれぞれ６個のアミノ酸を無作為に配列することにより、２つの部分に可変的部位を生成した（図１Ａ）。これを二座ペプチドバインダーと命名し、両側の可変的部位を有しているため、抗原に共同作用で付くことができ、高い親和力及び特異性を有することができる。また、二座ペプチドバインダーの構造安定化部位は、図１Ｂ〜図１Ｅのように様々に構成できる。
【０１２０】
合成した２つの無作為配列オリゴヌクレオチドをＰＣＲ反応を通じて２重鎖にした後、制限酵素のＳｆｉＩ及びＮｏｔＩで切断した後、ｐＩＧＴ２ファージミドベクターにクローニングして、８×１０８以上のライブラリーを構築した（図２）。
【０１２１】
実施例１０：バイオパニング結果
二座ペプチドバインダーライブラリーをフィブロネクチンＥＤ−Ｂ、ＶＥＧＦ、ＶＣＡＭ１、ｎＡｃｈＲ、ＨＳＡ蛋白質に対して３〜５回にかけてバイオパニングを行って、各パニング段階で回収したファージペプチドのアウトプットファージ／インプットファージの比率を決定した（表１ａ）。
【０１２２】
フィブロネクチンＥＤ−Ｂ蛋白質に対するバイオパニング結果
【表１ａ】
0005390621.tif 000002
【０１２３】
ＶＥＧＦ蛋白質に対するバイオパニング結果
【表１ｂ】
0005390621.tif 000003
【０１２４】
ＶＣＡＭ１蛋白質に対するバイオパニング結果
【表１ｃ】
0005390621.tif 000004
【０１２５】
ｎＡｃｈＲ蛋白質に対するバイオパニング結果
【表１ｄ】
0005390621.tif 000005
【０１２６】
ＨＳＡ蛋白質に対するバイオパニング結果
【表１ｅ】
0005390621.tif 000006
【０１２７】
ＭｙＤ８８蛋白質に対するバイオパニング結果
【表１ｆ】
0005390621.tif 000007
【０１２８】
実施例１１：フィブロネクチンＥＤ−ＢのインプットファージＥＬＩＳＡ結果
二座ペプチドバインダーのライブラリーの各インプットファージをＥＤ−Ｂ、ストレプトアビジン及びＢＳＡに対してＥＬＩＳＡを行った。１番目のインプットファージの反応性は、ＥＤ−Ｂ、ストレプトアビジン及びＢＳＡのいずれも吸光度がほぼ等しいが、２番目のインプットファージからＥＤ−Ｂ吸光度が、ストレプトアビジンに比べ５．１倍、ＢＳＡに比べ３．４倍高かった。最後に３番目のインプットファージでは、ＥＤ−Ｂ吸光度が、ストレプトアビジンに比べ２２倍、ＢＳＡに比べ１５倍高い反応性を示し、ＥＤ−Ｂに対して成功的にバイオパニングがなされることが分かる（図３及び表２）。
【０１２９】
【表２】
0005390621.tif 000008
【０１３０】
実施例１２：フィブロネクチンＥＤ−Ｂ、ＶＥＧＦ、ＶＣＡＭ１、ｎＡｃｈＲ、ＨＳＡ及びＭｙＤ８８に対して特異的なファージペプチド検索（ファージＥＬＩＳＡ）及びシーケンシング
各ライブラリーのパニング段階の中、アウトプット／インプットの比率が最も高い段階で回収したファージをプラーク形態として確保した。各プラークから６０個のファージを増幅させた後、ＢＳＡに対してＥＬＩＳＡを行った（図４）。ＢＳＡに比べて吸光度の高いクローンを選択し、ＤＮＡシーケンシングを依頼した。これから重複したそれぞれの蛋白質に特異的なペプチドシーケンスを得た（表３）。
【０１３１】
【表３ａ】
0005390621.tif 000009
【０１３２】
【表３ｂ】
0005390621.tif 000010
【０１３３】
【表３ｃ】
0005390621.tif 000011
【０１３４】
【表３ｄ】
0005390621.tif 000012
【０１３５】
【表３ｅ】
0005390621.tif 000013
【０１３６】
【表３ｆ】
0005390621.tif 000014
【０１３７】
実施例１３：フィブロネクチンＥＤ−Ｂ、ＶＥＧＦ、ＶＣＡＭ１、ｎＡｃｈＲ及びＨＳＡの親和度の測定
フィブロネクチンＥＤ−Ｂ、ＶＥＧＦ、ＶＣＡＭ１、ｎＡｃｈＲ、及びＨＳＡに対する前記ペプチドを合成し、ＳＰＲ  Ｂｉａｃｏｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）を利用して親和度を測定した。フィブロネクチンＥＤ−Ｂに対する親和度を測定した結果、ペプチド１は、６２０ｎＭを示して、ペプチド２は、７５ｎＭを示し、ペプチド３は、２．５μＭを示した（図５Ａ）。ＶＥＧＦに対する親和度を測定した結果、ペプチド１は、６０ｎＭ、ペプチド２は、３２６ｎＭを示した（図５Ｂ）。ＶＣＡＭ１の断片ペプチドに対する親和度を測定した結果、ペプチド１は、３１８ｎＭを示した（図５Ｃ）。ｎＡｃｈＲの断片ペプチドに対する親和度を測定した結果、ペプチド１は、７３ｎＭを示した（図５Ｄ）。ＨＳＡの断片ペプチドに対する親和度を測定した結果、ペプチド１は、１１５ｎＭを示した（図５Ｅ）。
【０１３８】
実施例１４：フィブロネクチンＥＤ−Ｂ、ＶＥＧＦ、ＶＣＡＭ１、ｎＡｃｈＲ、ＨＳＡ、及びＭｙＤ８８に対する特異性分析
それぞれの蛋白質に特異的に結合する組み換えファージを、種々の蛋白質に対して特異性検査をＥＬＩＳＡを利用して行った。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにそれぞれの蛋白質５μｇ／ｍＬを５０ｍＬずつウェルに入れて、翌日０．１％  ＰＢＳＴ（ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄し、２％ＢＳＡを使用して常温で２時間ブロッキングした後、溶液を全て捨てて０．１％  ＰＢＳＴで３回洗浄した。これに本発明のペプチドを有する組み換えファージを２％ＢＳＡとよく混合し、１００ｍＬずつ１０個の蛋白質が結合されているウェルに分株し、２７℃で２時間静置した。０．１％  ＰＢＳＴ溶液で５回洗浄した後、ＨＲＰ−コンジュゲーション抗−Ｍ１３抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１：１，０００に稀釈して、２７℃で１時間反応した。０．１％  ＰＢＳＴで５回洗浄した後、ＴＭＢ溶液１００ｍＬを分株して発色反応を誘導した後、１００ｍＬの１Ｍ  ＨＣｌを添加して反応を中止した後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。図６Ａから分かるように、二座ペプチドバインダーで見つけたＥＤ−Ｂに特異的な表３ａのペプチド２は、他の蛋白質の吸光度と比較すると、３０倍以上の差を示し、これは、ペプチド２シーケンスがＥＤ−Ｂに対して特異的であることを示す結果である。図６Ｂ〜６Ｆから分かるように、表３ｂ〜３ｆのそれぞれのペプチド１に対する特異性分析結果、これらのそれぞれのペプチドは、ＶＥＧＦ、ＶＣＡＭ１、ｎＡｃｈＲ、ＨＳＡ、及びＭｙＤ８８に対して特異性を有するということが分かる。
【０１３９】
実施例１５：  ＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）の共同作用効果の確認
二座ペプチドバインダーの抗原に対する共同作用効果を証明するために、親和力が最もよい表３ａのＥＤ−Ｂに対するペプチド２のＮ−末端及びＣ−末端の一側部位のみをそれぞれ除去したペプチドを合成し、親和力を測定した。Ｎ−末端部分は、５９２μＭを有して、Ｃ−末端部分は、１２．８μＭを示した（図７）。二座ペプチドバインダーにおいて二座（ｂｉｐｏｄａｌ）を有していることから表す共同作用効果は、４３ｎＭの親和力であることを証明した（図５Ａ）。
【０１４０】
実施例１６：他のβ−ヘアピンに対するバインディングアッセイ
トリプトファンジッパーの外に、他のβ−ヘアピン骨格であるＧＢ１ｍ３及びＨＰ７に、ＥＤ−Ｂに特異的に結合するペプチド２のＮ−末端シーケンス（ＨＣＳＳＡＶ）とＣ−末端シーケンス（ＩＩＲＬＥＱ）を有するようにペプチドを合成した（Ａｎｙｇｅｎ，  韓国）。即ち、トリプトファンジッパーを含む二座ペプチドバインダーのシーケンスは、ＨＣＳＳＡＶＧＳＷＴＷＥＮＧＫＷＴＷＫＧＩＩＲＬＥＱであり、ＧＢ１ｍ３を含む二座ペプチドバインダーは、ＨＣＳＳＡＶＧＫＫＷＴＹＮＰＡＴＧＫＦＴＶＱＥＧＩＩＲＬＥＱであって、ＨＰ７を含む二座ペプチドバインダーは、ＨＣＳＳＡＶＧＫＴＷＮＰＡＴＧＫＷＴＥＧＩＩＲＬＥＱである。各ペプチドの親和度は、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｘ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して測定した。ストレプトアビジンＳＡチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）にビオチン−ＥＤＢを２，０００  ＲＵだけ流して固定した。ランニングバッファとしてはＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）を使用して、フローは、分当たり３０ｍＬ流しながら、多様な濃度で動力学を測定した後、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎで親和度を計算した。  親和度を測定した結果、ＧＢ１ｍ３が７０ｎＭ、ＨＰ７が８４ｎＭであって、トリプトファンジッパー（４３ｎＭ）と等しい親和力を有することを確認した（図８）。これは、全ての安定したβ−ヘアピンモチーフが構造安定化部位として機能することを証明する結果である。
【０１４１】
実施例１７：構造安定化部位としてロイシンジッパーを含む二座ペプチドバインダーに対するバインディングアッセイ
β−ヘアピン骨格の代わりに、構造安定化部位としてロイシンジッパーに、ＥＤ−Ｂに特異的に結合するペプチド２のＮ−末端シーケンス（ＨＣＳＳＡＶ）とＣ−末端シーケンス（ＩＩＲＬＥＱ）を有するようにＣＳＳＰＩＱＧＧＳＭＫＱＬＥＤＫＶＥＥＬＬＳＫＮＹＨＬＥＮＥＶＡＲＬＫＫＬＶＧＥＲ及びＩＩＲＬＥＱＧＧＳＭＫＱＬＥＤＫＶＥＥＬＬＳＫＮＹＨＬＥＮＥＶＡＲＬＫＫＬＶＧＥＲペプチドを合成した（Ａｎｙｇｅｎ，  韓国）。２つのペプチドをダイマーにした後、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｘ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して親和度を測定した。親和度を測定した結果、ロイシンジッパーは、５μＭの親和度を示して、これは、トリプトファンジッパー（４３ｎＭ）の親和度に劣る親和度ではあるが、ロイシンジッパーも二座ペプチドバインダーの構造安定化部位として機能することができることが分かる（図９）。
【０１４２】
実施例１８：癌バイオマーカーであるフィブロネクチンＥＤ−Ｂに特異的な二座ペプチドバインダーの癌標的化
癌に多く分布するフィブロネクチンＥＤ−Ｂをターゲッティングする二座ペプチドバインダーにＣｙ５．５蛍光ダイを付着した後、Ｈｕｍａｎ  Ｕ８７ＭＧ癌が存在するマウスに静脈注射で投与して、ＩＶＩＳ機会を利用し、二座ペプチドバインダーが癌にターゲットするかどうか蛍光を確認した（図１０）。実験結果、癌バイオマーカーであるフィブロネクチンＥＤ−Ｂに特異的な二座ペプチドバインダーは、癌組織に蓄積されることが観察されて、これは、本発明の二座ペプチドバインダーがインビボイメージングに利用できることを示す結果である。
【０１４３】
実施例１９：細胞内に存在するＭｙＤ８８に特異的な二座ペプチドバインダーの活性抑制
細胞内に存在するＭｙＤ８８の活性を抑制する特異的な二座ペプチドバインダーの効果を証明した結果である（図１１）。二座ペプチドバインダーに細胞透過ペプチド（ｃｅｌｌ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を付着すると、細胞内に入ることができる。これをＩＬ−１ｂｅｔａを処理した軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ）に１０μＭのＭｙＤ８８特異的な二座ペプチドバインダーを処理した時、ＭｙＤ８８の活性が抑制されることを、ＭＭＰ−１３のｍＲＮＡと蛋白質が減少されることから確認した。これは、二座ペプチドバインダーを利用して細胞内ターゲットの活性を抑制することができることを示した結果である。
【０１４４】
以上、本発明の特定な部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。
【図１Ａ】
0005390621.tif 000015
【図１Ｂ】
0005390621.tif 000016
【図１Ｃ】
0005390621.tif 000017
【図１Ｄ】
0005390621.tif 000018
【図２】
0005390621.tif 000019
【図３】
0005390621.tif 000020
【図４】
0005390621.tif 000021
【図５Ａ】
0005390621.tif 000022
【図５Ｂ】
0005390621.tif 000023
【図５Ｃ】
0005390621.tif 000024
【図５Ｄ】
0005390621.tif 000025
【図５Ｅ】
0005390621.tif 000026
【図６Ａ】
0005390621.tif 000027
【図６Ｂ】
0005390621.tif 000028
【図６Ｃ】
0005390621.tif 000029
【図６Ｄ】
0005390621.tif 000030
【図６Ｅ】
0005390621.tif 000031
【図６Ｆ】
0005390621.tif 000032
【図７】
0005390621.tif 000033
【図８】
0005390621.tif 000034
【図９】
0005390621.tif 000035
【図１０】
0005390621.tif 000036
【図１１】
0005390621.tif 000037
【配列表】
0005390621000001.app