(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
既知の標的ヌクレオチド配列と、目的とする1つまたは複数の未知のヌクレオチド配列(例えば、1つまたは複数のゲノム遺伝子座)との相互作用の頻度を解析する方法であって、
(a)核内空間(nuclear space)で近接する目的とする未知のヌクレオチド配列であるDNA配列に結合した標的ヌクレオチド配列を含む架橋DNAの試料を準備するステップと、
(b)ステップ(a)の架橋DNAを第1の制限酵素で消化するステップと、
(c)ステップ(b)の架橋DNAをライゲーションするステップと、
(d)ステップ(c)の架橋DNA中の架橋を加熱によって及び／又はプロテイナーゼを用いて脱架橋するステップと、
(e)ステップ(d)のDNAを第2の制限酵素で消化するステップと、
(f)既知のヌクレオチド組成の1つまたは複数のDNA配列を、目的とする1つまたは複数の未知のヌクレオチド配列に隣接する利用可能な第2の制限酵素消化部位に結合するようにステップ(e)のDNAをライゲーションするステップと、
(g)ステップ(f)の目的とする1つまたは複数の未知のヌクレオチド配列を、少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅するステップであって、各プライマーは、目的とする1つまたは複数のヌクレオチド配列に隣接するDNA配列にハイブリダイズするステップと、
(h)ステップ(g)の増幅配列をアレイにハイブリダイズするステップと、
(i)ステップ(h)においてハイブリダイズしたヌクレオチド配列の量から、既知の標的ヌクレオチド配列と1つまたは複数の未知のヌクレオチド配列との間の相互作用の頻度を判定するステップとを含む方法。
【請求項２】
ステップ(f)におけるライゲーション反応が、DNA環の形成をもたらす、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
標的ヌクレオチド配列が、ゲノム再編成、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、マトリックス結合領域、遺伝子座制御領域、転写ユニット、複製起点、組換えホットスポット、転座ブレイクポイント、セントロメア、テロメア、遺伝子密度の高い領域、遺伝子密度の低い領域、反復エレメントおよび(ウイルス)組込み部位からなる群から選択される、請求項1または請求項2に記載の方法。
【請求項４】
標的ヌクレオチド配列が、疾患に関連したもしくは疾患を引き起こすヌクレオチド配列、または疾患に関連したもしくは疾患を引き起こす遺伝子座から線状DNA鋳型上で最大15Mbもしくは15Mbを超える位置にあるヌクレオチド配列である、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
標的ヌクレオチド配列が、AML1、MLL、MYC、BCL、BCR、ABL1、IGH、LYL1、TAL1、TAL2、LMO2、TCRα/δ、TCRβおよびHOX、または疾患に関連したその他の遺伝子座からなる群から選択される、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
第1の制限酵素が、6〜8bpの認識部位を認識する制限酵素である、請求項1から5のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
第1の制限酵素が、BglII、HindIII、EcoRI、BamHI、SpeI、PstIおよびNdeIからなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
第2の制限酵素が、4または5bpのヌクレオチド配列認識部位を認識する制限酵素である、請求項1から7のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
第2の制限酵素認識部位が、標的ヌクレオチド配列の第1の制限部位から約350bpを超える位置にある、請求項1から8のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
DNAまたはヌクレオチド配列が標識されている、請求項1から9のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
既知の標的ヌクレオチド配列と、1つまたは複数の未知のヌクレオチド配列(例えば、1つまたは複数のゲノム遺伝子座)との相互作用の頻度を解析する方法であって、
(a)核内空間(nuclear space)で近接する未知のヌクレオチド配列であるDNA配列に結合した標的ヌクレオチド配列を含む架橋DNAの試料を準備するステップと、
(b)ステップ(a)の架橋DNAを第1の制限酵素で消化するステップと、
(c)ステップ(b)の架橋DNAをライゲーションするステップと、
(d)ステップ(c)の架橋DNA中の架橋を加熱によって及び／又はプロテイナーゼを用いて脱架橋するステップと、
(e)ステップ(d)のDNAを第2の制限酵素で消化するステップと、
(f)ステップ(e)のDNAを環状化するステップと、
(g)ステップ(f)の環状化DNAにおける標的ヌクレオチド配列にライゲーションされる1つまたは複数の未知のヌクレオチド配列を増幅するステップと、
(h)場合により、ステップ(g)の増幅配列をアレイにハイブリダイズするステップと、
(i) ステップ(h)においてハイブリダイズした又はステップ(g)において増幅したヌクレオチド配列の量から既知の標的ヌクレオチド配列と1つまたは複数の未知のヌクレオチド配列との間の相互作用の頻度を判定するステップと
を含む方法。
【請求項１２】
第1および第2のヌクレオチド配列を含み、第1および第2のヌクレオチド配列の各末端が異なる制限酵素認識部位により分離され、前記第1のヌクレオチド配列が既知の標的ヌクレオチド配列であり、前記第2のヌクレオチド配列が架橋ゲノムDNAにより得ることができる該標的ヌクレチド配列に核内空間(nuclear space)で近接する未知のヌクレオチド配列である、環状ヌクレオチド配列からなるDNA。
【請求項１３】
環状ヌクレオチド配列の製造方法であって、
(a)核内空間(nuclear space)で近接する目的とする未知のヌクレオチド配列であるDNA配列に結合した既知の標的ヌクレオチド配列を含む架橋DNAの試料を準備するステップと、
(b)ステップ(a)の架橋DNAを第1の制限酵素で消化するステップと、
(c)ステップ(b)の架橋DNAをライゲーションするステップと、
(d)ステップ(c)の架橋DNA中の架橋を加熱によって及び／又はプロテイナーゼを用いて脱架橋するステップと、
(e)ステップ(d)のDNAを第2の制限酵素で消化するステップと、
(f)ステップ(e)のDNAを環状化するステップと
を含む方法。
【請求項１４】
標的ヌクレオチド配列と、1つまたは複数のヌクレオチド配列(例えば、1つまたは複数のゲノム遺伝子座)との相互作用の頻度を解析する方法であって、請求項12に記載の環状ヌクレオチドを使用することを含む方法。
【請求項１５】
特定の疾患状態の指標である1つまたは複数のDNA-DNA相互作用を同定する方法であって、請求項1から11のいずれかに記載のステップ(a)〜(i)を実施するステップを含み、その際、ステップ(a)において架橋DNAの試料は疾患および非疾患細胞から得られ、ならびに、疾患および非疾患細胞由来のDNA配列間の相互作用の頻度間の差は、DNA-DNA相互作用が特定の疾患状態の指標であることを示す、前記方法。
【請求項１６】
DNA-DNA相互作用の変化により引き起こされる、またはDNA-DNA相互作用の変化に関連した疾患もしくは症候群の診断または予後判定のためのデータを得る方法であって、請求項1から11のいずれかに記載のステップ(a)〜(i)を実施するステップを含み、その際、ステップ(a)が、被験体由来の架橋DNAの試料を準備することを含み;ステップ(i)が、DNA配列間の相互作用の頻度を、影響を受けない対照の頻度と比較することを含み;対照から得られた値と被験体から得られた値との差が、被験体が前記疾患もしくは症候群に罹患していることを示す、または被験体が前記疾患もしくは症候群に罹患するであろうことを示す、前記方法。
【請求項１７】
相互作用の低頻度から高頻度への移行が、平衡および/または不平衡のブレイクポイン
トの位置を示す、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
対照と比較した被験体試料のDNA-DNA相互作用頻度の逆パターンが、平衡および/または不平衡の逆位を示す、請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
対照と比較した被験体試料のDNA-DNA相互作用頻度の減少が、より遠位領域のDNA-DNA相互作用頻度の増加と併せて、平衡および/または不平衡の欠失を示す、請求項16に記載の方法。
【請求項２０】
対照と比較した被験体試料のDNA-DNA相互作用頻度の増加または減少が、平衡および/もしくは不平衡の重複または挿入を示す、請求項16に記載の方法。
【請求項２１】
スペクトル核型分析および/またはFISHが、方法の実施前に使用される、請求項16から20のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
疾患が遺伝疾患である、請求項16から21のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
疾患が癌である、請求項16から22のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
DNA-DNA相互作用の変化により引き起こされる、またはDNA-DNA相互作用の変化に関連した疾患もしくは症候群の診断または予後判定のためのデータを得る方法であって、請求項1から11のいずれかに記載のステップ(a)〜(i)を実施するステップを含み、その際、ステップ(a)が、被験体由来の架橋DNAの試料を準備することを含み;該方法が、(j)疾患に関連したゲノム再編成を起こしている1つまたは複数の遺伝子座を同定する追加のステップを含む、前記方法。
【請求項２５】
2つ以上の増幅配列が差別的に標識される、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
2つ以上の増幅配列が異なる染色体上にある場合、前記配列が同一に標識される、請求
項24に記載の方法。
【請求項２７】
2つ以上の増幅配列が、DNA-DNA相互作用シグナル間の最小限の重複には十分遠く離れた同一染色体上にある場合、前記配列が同一に標識される、請求項24に記載の方法。
【請求項２８】
DNA-DNA相互作用を調節する1つまたは複数の剤を同定するアッセイ方法であって、
(a)試料を1つまたは複数の剤と接触させるステップと、
(b)請求項1から11のいずれかに記載のステップ(a)から(i)を実施するステップであって、
そのステップ(a)が、試料から架橋DNAを得ることを含むステップと
を含み、(i)剤の存在下におけるDNA配列間の相互作用の頻度と、(ii)剤の非存在下におけるDNA配列間の相互作用の頻度との差が、DNA-DNA相互作用を調節する剤を示す、前記アッセイ方法。
【請求項２９】
平衡および/または不平衡のブレイクポイント(例えば、転座)の位置を検出する方法であって、
(a)請求項1から11のいずれかに記載のステップ(a)から(i)を実施するステップと、
(b)DNA配列間の相互作用の頻度を対照の頻度と比較するステップと
を含み、対照と比較した試料におけるDNA-DNA相互作用の低頻度から高頻度への移行がブレイクポイントの位置を示す、前記方法。
【請求項３０】
平衡および/または不平衡の逆位の位置を検出する方法であって、
(a)請求項1から11のいずれかに記載のステップ(a)から(i)を実施するステップと、
(b)DNA配列間の相互作用の頻度を対照の頻度と比較するステップと
を含み、対照と比較した試料のDNA-DNA相互作用頻度の逆パターンが逆位を示す、前記方法。
【請求項３１】
欠失の位置を検出する方法であって、
(a)請求項1から11のいずれかに記載のステップ(a)から(i)を実施するステップと、
(b)DNA配列間の相互作用の頻度を対照の頻度と比較するステップと
を含み、対照と比較した試料のDNA-DNA相互作用頻度の減少が欠失を示す、前記方法。
【請求項３２】
重複の位置を検出する方法であって、
(a)請求項1から11のいずれかに記載のステップ(a)から(i)を実施するステップと、
(b)DNA配列間の相互作用の頻度を対照の頻度と比較するステップと
を含み、対照と比較した被験体試料のDNA-DNA相互作用頻度の増加または減少が重複または挿入を示す方法。
【請求項３３】
試料における1つまたは複数のDNA-DNA相互作用を同定するための、請求項12に記載の環状ヌクレオチド配列からなるDNAの使用。
【請求項３４】
DNA-DNA相互作用の変化により引き起こされる、またはDNA-DNA相互作用の変化に関連した疾患もしくは症候群の診断または予後判定の補助のための、請求項12に記載の環状ヌクレオチド配列からなるDNAの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核内空間(nuclear space)における2つ以上のヌクレオチド配列の相互作用頻度の解析に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類の核構造に関する研究は、2メートルのDNAが、細胞型を同定する遺伝子の正確な発現を可能にしつつ、直径10μmの核内にいかに折り畳まれるか、およびこれが、各細胞周期の間にいかに忠実に増殖されるかを理解することを目的としている。この分野における進歩は、顕微鏡的研究によるところが大きく、ゲノムが核内空間に非ランダムに配列されていることを明らかにした。例えば、高密度に充填されたヘテロクロマチンは、より開放された (open)ユークロマチンから分離され、染色体は、核内空間で異なる領域を占める。複雑な関係が、核配置と転写活性の間に存在している。転写は、核内部全体にわたって生じるが、染色体上に群がる活性遺伝子は、これらの染色体テリトリーの末端または外側に選択的に位置する。染色体テリトリー、セントロメアまたは核周縁部など比較的大きな核の目印と比較して測定した場合、個々の遺伝子は、この転写状態が変化すると移動することができる。さらに、β-グロビン遺伝子座および数種類の、選択された、他の遺伝子について、蛍光in-situハイブリダイゼーション(FISH)により最近証明されたように、染色体上でメガ塩基対の数十倍離れた、活発に転写された遺伝子は、核内で結合することができる。転写に加えて、ゲノム構造は、複製、組換えおよび遺伝子座の転位する可能性(悪性腫瘍につながりうる)の調整、ならびに後成的プログラムの設定およびリセットに関連している。これらの知見に基づき、細胞核におけるDNAの構造的構成は、ゲノム機能の重要な寄与因子であると考えられている。
【０００３】
in vivoでのゲノム遺伝子座の空間構成に対する洞察を可能にする様々なアッセイが開発された。RNA-TRAPと呼ばれる1つのアッセイが開発された(Carter et al. (2002) Nat. Genet. 32, 623)。これは、新生RNA転写物に対する西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)を標的化し、続いて近接するクロマチンにおけるHRP触媒ビオチン沈降を定量することに関わる。
【０００４】
開発された別のアッセイは、染色体コンフォメーションキャプチャ(chromosome conformation capture)(3C)技術と呼ばれており、ゲノム領域の構造的構成を研究するためのツールを提供する。3C技術は、2つの所与のDNA制限断片間の架橋頻度に関する定量的PCR解析に関し、核内空間における断片の近接性の尺度を提供する(図1参照)。元々は、酵母の染色体コンフォメーションを解析するために開発された(Dekker et al., 2002)この技術は、複雑な哺乳類遺伝子クラスターにおける遺伝子発現とクロマチン折り畳みとの関係を調べるのに適している(例えば、Tolhuis et al., 2002; Palstra et al., 2003;およびDrissen et al., 2004参照)。簡単には、3C技術は、細胞のin vivoでのホルムアルデヒド架橋、および制限酵素によるクロマチンの核消化、続いて1つの複合体に架橋されたDNA断片のライゲーションに関わる。ライゲーション産物は、次いでPCRにより定量化される。PCR増幅ステップは、増幅する各DNA断片に関する配列情報の知識を必要とする。故に、3C技術は、選択されたDNA断片間の相互作用頻度の尺度を提供する。
【０００５】
核内空間で互いに接触するDNA遺伝子座について、偏りのない方法で全ゲノムを体系的にスクリーニングすることができるハイスループット技術がきわめて必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、3C技術を改善することを探究するものである。
【０００７】
現在応用されている3C技術は、PCR増幅ステップの限界のため、限られた数の選択されたDNA-DNA相互作用を解析することができるのみであり、解析する各断片に関する特定の配列情報の知識を必要とする。さらに、遠距離(long-range)DNA相互作用の候補として、制限断片を選択するには、目的とする遺伝子座に関する多くの予備知識(例えば、高感受性部位の位置)を必要とするが、これは通常、入手不可能である。これまでに記載された多くの遠距離DNA-DNA相互作用の機能的関連性を考えれば、遺伝子プロモーター、エンハンサー、インスレーター、サイレンサー、複製起点もしくはMAR/SARなど目的とする配列、または遺伝子密度の高い領域もしくは遺伝子密度の低い領域、もしくは反復エレメントなど目的とするゲノム領域にループするDNAエレメントをランダムにスクリーニングする能力は、調節ネットワークに関わる配列のマッピングを大いに促進することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、4C技術(すなわち、共局在化クロマチンのキャプチャおよび特性化(capture and characterise co-localised chromatin))に関し、核内空間における2つ以上のヌクレオチド配列の相互作用頻度のハイスループット解析を提供する。
【０００９】
4C(capture and characterize co-localized chromatin)技術は、最適な遺伝子座と相互作用するDNA断片について、偏りのないゲノムワイドな検索を可能にする3C技術の修正版である。簡単には、3C解析は、通常通り行われるが、PCRステップを省略している。3C鋳型は、目的とする多くの異なるヌクレオチド配列(目的とする遺伝子のゲノム環境を表す)にライゲーションされたベイト(例えば、目的とする遺伝子を包含する最適な制限断片)を含有する。鋳型は、別の、第2の制限酵素により切断され、ライゲーションされる。有利には、標的ヌクレオチド配列にライゲーションされる、目的とする1つまたは複数のヌクレオチド配列は、少なくとも1つ(好ましくは、少なくとも2つ)のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅され、少なくとも1つのプライマーは、目的とするヌクレオチド配列に隣接するDNA配列にハイブリダイズする。典型的には、これは、独立した増幅反応間で再現性が高く、所与の組織に特異的なPCR断片のパターンをもたらす。1つの実施形態では、HindIIIおよびDpnIIが、第1および第2の制限酵素として使用される。次に、典型的には、制限酵素の同じ組合せにより消化されるゲノムDNAを含有する対照試料と比較して、増幅断片は標識されてよく、場合によりアレイにハイブリダイズされてよい。
【００１０】
本発明の1つの好ましい実施形態では、第2の制限酵素により切断されるライゲーションされた断片は、次いで、小さなDNA環を形成するため再ライゲーションされる。
【００１１】
3C技術は、したがって、標的ヌクレオチド配列と相互作用する、目的とするすべてのヌクレオチド配列が増幅されるように修正された。特に、これは、解析したい断片に特異的なプライマーによる増幅反応を行う代わりに、目的とするヌクレオチド配列に隣接するDNA配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、増幅が行われることを意味する。有利には、4Cは、PCR増幅ステップに含まれるPCRプライマーの設計に偏らないため、相互作用しているDNAエレメントの完全ゲノムを検索するのに使用することができる。
【００１２】
本発明の概要的態様
本発明の態様は、添付の特許請求の範囲に示されている。
【００１３】
第1の態様では、(a)架橋DNAの試料を準備するステップと、(b)架橋DNAを第1の制限酵素で消化するステップと、(c)架橋ヌクレオチド配列をライゲーションするステップと、(d)脱架橋するステップと、(e)ヌクレオチド配列を第2の制限酵素で消化するステップと、(f)既知のヌクレオチド組成の1つまたは複数のDNA配列を、目的とする1つまたは複数のヌクレオチド配列に隣接する利用可能な第2の制限酵素消化部位にライゲーションするステップと、(g)目的とする1つまたは複数のヌクレオチド配列を、少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅するステップであって、各プライマーは、目的とするヌクレオチド配列に隣接するDNA配列にハイブリダイズするステップと、(h)増幅配列をアレイにハイブリダイズするステップと、(i)DNA配列間の相互作用の頻度を判定するステップとを含む、標的ヌクレオチド配列と、目的とする1つまたは複数のヌクレオチド配列(例えば、1つまたは複数のゲノム遺伝子座)との相互作用の頻度を解析する方法が提供される。
【００１４】
第2の態様では、(a)架橋DNAの試料を準備するステップと、(b)架橋DNAを第1の制限酵素で消化するステップと、(c)架橋ヌクレオチド配列をライゲーションするステップと、(d)脱架橋するステップと、(e)ヌクレオチド配列を第2の制限酵素で消化するステップと、(f)ヌクレオチド配列を環状化するステップと、(g)標的ヌクレオチド配列にライゲーションされる1つまたは複数のヌクレオチド配列を増幅するステップと、(h)場合により、増幅配列をアレイにハイブリダイズするステップと、(i)DNA配列間の相互作用の頻度を判定するステップとを含む、標的ヌクレオチド配列と、1つまたは複数のヌクレオチド配列(例えば、1つまたは複数のゲノム遺伝子座)との相互作用の頻度を解析する方法が提供される。
【００１５】
第3の態様では、第1および第2のヌクレオチド配列を含み、第1および第2のヌクレオチド配列の各末端が異なる制限酵素認識部位により単離され、前記第1のヌクレオチド配列が標的ヌクレオチド配列であり、前記第2のヌクレオチド配列が架橋ゲノムDNAにより得ることができる環状ヌクレオチド配列が提供される。
【００１６】
第4の態様では、(a)架橋DNAの試料を準備するステップと、(b)架橋DNAを第1の制限酵素で消化するステップと、(c)架橋ヌクレオチド配列をライゲーションするステップと、(d)脱架橋するステップと、(e)ヌクレオチド配列を第2の制限酵素で消化するステップと、(f)ヌクレオチド配列を環状化するステップとを含む、環状ヌクレオチド配列の製造方法が提供される。
【００１７】
第5の態様では、環状ヌクレオチド配列を使用するステップを含む、標的ヌクレオチド配列と、1つまたは複数のヌクレオチド配列(例えば、1つまたは複数のゲノム遺伝子座)との相互作用の頻度を解析する方法が提供される。
【００１８】
第6の態様では、環状ヌクレオチド配列にハイブリダイズする、またはハイブリダイズすることができる1つまたは複数のプローブを含む、支持体に固定化されたプローブアレイが提供される。
【００１９】
第7の態様では、ゲノムDNAにおける第1の制限酵素の第1の制限酵素認識部位の各々に隣接する核酸配列に対し順次相補的なプローブセットが提供される。
【００２０】
第8の態様では、(a)ゲノムDNAにおける第1の制限酵素の第1の制限酵素認識部位の各々を特定するステップと、(b)ゲノムDNAにおける第1の制限酵素の第1の制限酵素認識部位の各々に隣接する配列にハイブリダイズすることができるプローブを設計するステップと、(c)プローブを合成するステップと、(d)プローブを互いに結合させてプローブセット、または実質的なプローブセットを形成するステップとを含む、プローブセットの製造方法が提供される。
【００２１】
第9の態様では、本明細書に記載の方法により得られる、または得ることができるプローブセットまたは実質的なプローブセットが提供される。
【００２２】
第10の態様では、本明細書に記載のプローブアレイ、または実質的なプローブセットを含むアレイが提供される。
【００２３】
第11の態様では、本明細書に記載のプローブセットを含むアレイが提供される。
【００２４】
第12の態様では、本明細書に記載の実質的なプローブアレイ、または実質的なプローブセットを固体支持体に固定化するステップを含む、アレイの製造方法が提供される。
【００２５】
第13の態様では、本明細書に記載のプローブアレイ、またはプローブセットを固体支持体に固定化するステップを含む、アレイの製造方法が提供される。
【００２６】
第14の態様では、本明細書に記載の方法により得られる、または得ることができるアレイが提供される。
【００２７】
第15の態様では、本発明の第1および第2の態様のステップ(a)〜(i)を実施するステップを含み、ステップ(a)では架橋DNAの試料が疾患および非疾患細胞から得られ、ならびに疾患および非疾患細胞由来のDNA配列間の相互作用の頻度間の差が、DNA-DNA相互作用が特定の疾患状態を示していることを示す、特定の疾患状態を示す1つまたは複数のDNA-DNA相互作用を同定する方法が提供される。
【００２８】
第16の態様では、本発明の第1および第2の態様のステップ(a)〜(i)を実施するステップを含み、ステップ(a)が、被験体由来の架橋DNAの試料を準備することを含み;ステップ(i)が、DNA配列間の相互作用の頻度を、影響を受けない対照の頻度と比較することを含み;対照から得られた値と被験体から得られた値との差が、被験体が疾患もしくは症候群に罹患していることを示す、または被験体が疾患もしくは症候群に罹患するであろうことを示す、DNA-DNA相互作用の変化により引き起こされる、もしくはDNA-DNA相互作用の変化に関連した疾患または症候群の診断または予後方法が提供される。
【００２９】
第17の態様では、本発明の第1および第2の態様のステップ(a)〜(i)を実施するステップを含み、ステップ(a)が、被験体由来の架橋DNAの試料を準備することを含み;(j)疾患に関連したゲノム再編成を起こした1つまたは複数の転座を同定する追加のステップを含むDNA-DNA相互作用の変化により引き起こされる、またはDNA-DNA相互作用の変化に関連した疾患もしくは症候群の診断または予後方法が提供される。
【００３０】
第18の態様では、(a)試料を1つまたは複数の剤と接触させるステップと、(b)本発明の第1および第2の態様のステップ(a)から(i)を実施するステップであって、そのステップ(a)が、試料由来の架橋DNAの試料を準備することを含むステップとを含み、(i)剤の存在下におけるDNA配列間の相互作用の頻度と、(ii)剤の非存在下におけるDNA配列間の相互作用の頻度との差が、DNA-DNA相互作用を調節する剤を示すDNA-DNA相互作用を調節する1つまたは複数の剤を同定するアッセイ方法が提供される。
【００３１】
第19の態様では、(a)本発明の第1および第2の態様のステップ(a)から(i)を実施するステップと、(b)DNA配列間の相互作用の頻度を対照の頻度と比較するステップとを含み、対照と比較した試料におけるDNA-DNA相互作用の低頻度から高頻度への移行がブレイクポイントの位置を示す、平衡および/または不平衡ブレイクポイント(例えば、転座)の位置を検出する方法が提供される。
【００３２】
第20の態様では、(a)本発明の第1および第2の態様のステップ(a)から(i)を実施するステップと、(b)DNA配列間の相互作用の頻度を対照の頻度と比較するステップとを含み、対照と比較した試料のDNA-DNA相互作用頻度の逆パターンが逆位を示す、平衡および/または不平衡逆位の位置を検出する方法が提供される。
【００３３】
第21の態様では、(a)本発明の第1および第2の態様のステップ(a)から(i)を実施するステップと、(b)DNA配列間の相互作用の頻度を対照の頻度と比較するステップとを含み、対照と比較した試料のDNA-DNA相互作用頻度の減少が欠失を示す、欠失の位置を検出する方法が提供される。
【００３４】
第22の態様では、(a)本発明の第1および第2の態様のステップ(a)から(i)を実施するステップと、(b)DNA配列間の相互作用の頻度を対照の頻度と比較するステップとを含み、対照と比較した被験体のDNA-DNA相互作用頻度の増加または減少が重複または挿入を示す、重複の位置を検出する方法が提供される。
【００３５】
第23の態様では、本明細書に記載のアッセイ方法により得られる、または得ることができる剤が提供される。
【００３６】
第24の態様では、試料における1つまたは複数のDNA-DNA相互作用を同定するための環状ヌクレオチド配列の使用が提供される。
【００３７】
第25の態様では、DNA-DNA相互作用の変化により引き起こされる、またはDNA-DNA相互作用の変化に関連した疾患もしくは症候群の診断または予後のための、環状ヌクレオチド配列の使用が提供される。
【００３８】
第26の態様では、試料における1つまたは複数のDNA-DNA相互作用を同定するための、本明細書に記載のプローブアレイまたはプローブセットの使用が提供される。
【００３９】
第27の態様では、DNA-DNA相互作用の変化により引き起こされる、またはDNA-DNA相互作用の変化に関連した疾患もしくは症候群の診断または予後のための、本明細書に記載のプローブアレイまたはプローブセットの使用が提供される。
【００４０】
第28の態様では、試料における1つまたは複数のDNA-DNA相互作用を同定するための、本明細書に記載のアレイの使用が提供される。
【００４１】
第29の態様では、DNA-DNA相互作用の変化により引き起こされる、またはDNA-DNA相互作用の変化に関連した疾患もしくは症候群の診断または予後のための、本明細書に記載のアレイの使用が提供される。
【００４２】
第30の態様では、実質的に本明細書に記載の、実施例または図面のいずれかの参照による、方法、プローブアレイ、プローブセット、方法、アレイ、アッセイ方法、剤、または使用が提供される。
【００４３】
好ましい実施形態
好ましくは、ステップ(f)のライゲーション反応は、DNA環の形成をもたらす。
【００４４】
好ましくは、標的ヌクレオチド配列は、ゲノム再編成、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、マトリックス結合領域、遺伝子座制御領域、転写ユニット、複製起点、組換えホットスポット、転座ブレイクポイント、セントロメア、テロメア、遺伝子密度の高い領域、遺伝子密度の低い領域、反復エレメントおよび(ウイルス)組込み部位からなる群から選択される。
【００４５】
好ましくは、標的ヌクレオチド配列は、疾患に関連したもしくは疾患を引き起こすヌクレオチド配列、または疾患に関連したもしくは疾患を引き起こす遺伝子座から線状DNA鋳型上で最大15Mbもしくは15Mbを超える位置にあるヌクレオチド配列である。
【００４６】
好ましくは、標的ヌクレオチド配列は、AML1、MLL、MYC、BCL、BCR、ABL1、IGH、LYL1、TAL1、TAL2、LMO2、TCRα/δ、TCRβおよびHOX、または「ヒトにおける不平衡染色体異常に関するカタログ(Catalogue of Unbalanced Chromosome Aberrations in Man)」第2版、Albert Schinzel、ベルリン: Walter de Gruyter、2001年、ISBN 3-11-011607-3に記載の疾患に関連したその他の遺伝子座からなる群から選択される。
【００４７】
好ましくは、第1の制限酵素は、6〜8bpの認識部位を認識する制限酵素である。
【００４８】
好ましくは、第1の制限酵素は、BglII、HindIII、EcoRI、BamHI、SpeI、PstIおよびNdeIからなる群から選択される。
【００４９】
好ましくは、第2の制限酵素は、4または5bpのヌクレオチド配列認識部位を認識する制限酵素である。
【００５０】
好ましくは、第2の制限酵素認識部位は、標的ヌクレオチド配列の第1の制限部位から約350bpを超える位置にある。
【００５１】
好ましくは、ヌクレオチド配列は標識されている。
【００５２】
好ましくは、プローブは、ゲノムDNAにおける第1の制限酵素の第1の制限酵素認識部位の各々の各側に隣接する核酸配列に対し順次相補的である。
【００５３】
好ましくは、プローブは、ゲノムDNAにおける第1の制限酵素の第1の制限酵素認識部位の各々から300塩基対未満である核酸配列に対し順次相補的である。
【００５４】
好ましくは、プローブは、ゲノムDNAにおける第1の制限酵素の第1の制限酵素認識部位の各々から300bp未満である配列に相補的である。
【００５５】
好ましくは、プローブは、ゲノムDNAにおける第1の制限酵素の第1の制限酵素認識部位の各々から200bpおよび300bpの間である配列に相補的である。
【００５６】
好ましくは、プローブは、ゲノムDNAにおける第1の制限酵素の第1の制限酵素認識部位の各々から100bpおよび200bpの間、または0および100bpの間である配列に相補的である。
【００５７】
好ましくは、2つ以上のプローブは、ゲノムDNAにおける第1の制限酵素の各第1の制限酵素認識部位に隣接する配列にハイブリダイズすることができる。
【００５８】
好ましくは、プローブは重複または一部重複している。
【００５９】
好ましくは、重複は、10ヌクレオチド未満である。
【００６０】
好ましくは、プローブ配列は、第1の制限酵素の第1の制限酵素認識部位の各々と、第2の制限酵素の最初に近接する第2の制限酵素認識部位の各々との間の配列のすべてまたは一部に一致する。
【００６１】
好ましくは、各プローブは、少なくとも25merである。
【００６２】
好ましくは、各プローブは、25〜60merである。
【００６３】
好ましくは、プローブは、PCR増幅産物である。
【００６４】
好ましくは、アレイは、約300,000〜400,000プローブを含む。
【００６５】
好ましくは、アレイは、約385,000以上のプローブ、好ましくは約750,000プローブ、より好ましくは6×750,000プローブを含む。
【００６６】
好ましくは、アレイは、より低い解像度での所与の種の完全ゲノムの表示を含む、または表示からなる。
【００６７】
好ましくは、アレイに、線状染色体鋳型上に順に並んだ2、3、4、5、6、7、8、9または10プローブ毎から1つが含まれている。
【００６８】
好ましくは、相互作用の低頻度から高頻度への移行が、平衡および/または不平衡のブレイクポイントの位置を示す。
【００６９】
好ましくは、対照と比較した被験体試料のDNA-DNA相互作用頻度の逆パターンが、平衡および/または不平衡逆位を示す。
【００７０】
好ましくは、対照と比較した被験体試料のDNA-DNA相互作用頻度の減少が、より遠位領域のDNA-DNA相互作用頻度の増加と併せて、平衡および/または不平衡欠失を示す。
【００７１】
好ましくは、対照と比較した被験体試料のDNA-DNA相互作用頻度の増加または減少が、平衡および/もしくは不平衡の重複または挿入を示す。
【００７２】
好ましくは、スペクトル核型分析および/またはFISHは、前記方法を実施する前に使用される。
【００７３】
好ましくは、疾患は遺伝疾患である。
【００７４】
好ましくは、疾患は癌である。
【００７５】
好ましくは、2つ以上の増幅配列は特異的に標識される。
【００７６】
好ましくは、2つ以上の増幅配列が異なる染色体上にある場合、前記配列は同一に標識される。
【００７７】
好ましくは、2つ以上の増幅配列が、DNA-DNA相互作用シグナル間の最小限の重複には十分遠く離れた同一染色体上にある場合、前記配列は同一に標識される。
【００７８】
好ましくは、診断または予後は、出生前診断または出生前予後である。
【発明の効果】
【００７９】
本発明は、いくつかの利点を有する。これらの利点は、以下の説明で明らかとなろう。
【００８０】
例として、本発明は、とりわけ商業的に有用なヌクレオチド配列、方法、プローブおよびアレイを提供するため、有利である。
【００８１】
さらなる例として、本発明は、核内空間における2つ以上のヌクレオチド配列の相互作用頻度のハイスループット解析を提供するため、有利である。
【００８２】
さらなる例として、本発明が有利であるのは、従来の3C技術を用いると、一つ一つのDNA-DNA相互作用は、固有のプライマー対を含有する固有のPCR反応により解析されなければならないためである。ハイスループット解析は、したがって、PCRが自動化される場合にのみ可能であるが、非常に多くのプライマーの費用はきわめて高額となる。したがって、DNA-DNA相互作用のハイスループット(ゲノムワイド)解析は、従来の3C技術では実施不可能である。反対に、本発明は今や、数千のDNA-DNA相互作用の同時スクリーニングを可能にする。本発明によるDNA-DNA相互作用のハイスループット解析は、解析の規模および解像度を大幅に向上させるであろう。
【００８３】
さらなる例として、本発明が有利であるのは、従来の3C技術を用いると、スクリーニングは、解析においてオリゴヌクレオチドプライマーが設計され、並べられ、含まれるDNA配列に偏るためである。このようなオリゴヌクレオチドプライマーの選択は、典型的には、例えば、調べているヌクレオチド配列に架橋すると考えられる(遠位の)エンハンサーおよび/または他の調節エレメント/高感受性部位の位置に関する知見に基づく。故に、従来の3Cが、PCR増幅ステップに含まれるPCRプライマーの設計に偏っているのに対し、4Cは偏りがなく、相互作用しているDNAエレメントの完全ゲノムを検索するのに使用することができる。これは、4Cにおける架橋配列の増幅が、調べているヌクレオチド配列に架橋する配列に関する予測された知見に基づかないためである。それどころか、4Cの1つの実施形態では、第1(標的)のヌクレオチド配列に架橋する配列は、このヌクレオチド配列にハイブリダイズするPCRプライマーを用いて増幅することができる。故に、本発明は、DNA-DNA相互作用に関する偏りのないゲノムワイドなスクリーニングを可能にする。
【００８４】
さらなる例として、本発明が有利であるのは、従来の3C技術を用いることが、単一のDNA-DNA相互作用の選択的増幅を可能にするのみであったためである。これは、アレイにハイブリダイズする場合は役に立たない。この技術は、第1(標的)のヌクレオチド配列と相互作用するすべての断片が、今や増幅、例えば、選択的に増幅されるように改良された。
【００８５】
さらなる例として、本発明が有利であるのは、4C技術が、核酸、例えば、染色体におけるあらゆる種類の転座、欠失、逆位、重複およびその他のゲノム再編成などの平衡または不平衡遺伝子異常を検出するのに使用することができるためである。(DNA断片の近接性を測定する)4C技術は、特定の転座、欠失、逆位、重複およびその他のゲノム再編成(例えば、平衡または不平衡の転座、欠失、逆位、重複およびその他のゲノム再編成)を獲得する被験体の素因を判定することもできる。現在の戦略に優る利点は、「4C-ベイト」(解析される第1および第2の制限酵素認識部位により定義される)が、変化から離れたところにある(例えば、最大1メガ塩基以上)場合でも、4C技術の解像度は再編成を検出するのに使用することができるため、変化の正確な位置を知る必要がない点にある。別の利点は、間に変化が生じた2つの(第1の)制限部位を決めるのに使用することができるため、4C技術は変化の正確なマッピングを可能にする点である。別の利点は、細胞を固定前に培養する必要がない点である。故に、例えば固形腫瘍は、ゲノム再編成を解析することもできる。
【００８６】
さらなる例として、本発明が有利であるのは、4C技術が、前癌状態で、すなわち、すべての細胞がこれらの変化を含有する前に、変化(例えば、再編成)を検出することもできるためである。故に、この技術は、疾患の診断においてだけでなく、疾患の予後においても使用することができる。
【００８７】
さらなる例として、本発明によるアレイ設計は、設計が、1アレイ当たりのゲノムの大部分を表すことを可能にするため、Nimblegenゲノムタイリングアレイなどの既存のゲノムタイリングアレイと比較した場合、特に有利である。例として、ヘキサヌクレオチド配列を認識する制限酵素については、それぞれ約385,000プローブを有する約3アレイがあれば、例えば、完全なヒトまたはマウスのゲノムをカバーするのに十分であろう。6bp超を認識する制限酵素については、約385,000プローブの1アレイを、例えば、完全なヒトまたはマウスのゲノムをカバーするのに使用することができる。このアレイ設計の利点は、(1)各プローブが、それぞれが独立したライゲーション事象を解析し、結果の解釈をきわめて容易にするため、有益であること、(2)ゲノムの大規模な表示を、単一のアレイにスポットすることができ、費用効果が高いことである。
【００８８】
4C技術は、元来、細胞遺伝学的解析(光学顕微鏡検査、FISH、SKYなど)により検出された特性の乏しい再編成をファインマッピングするのに、有利には使用することができる。
【００８９】
4C技術は、複数の遺伝子座の近くで生じた再編成の組合せを単一のアレイで同時スクリーニングするのに、有利に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９０】
3C技術
3C方法は、Dekker et al. (2002)、Tolhuis et al. (2002)、Palstra et al. (2003)、Splinter et al. (2004)およびDrissen et al. (2004)において詳細に記載されている。簡単には、3Cは、架橋DNAを第1の制限酵素で消化し、続いて非常に低いDNA濃度でのライゲーションにより実施される。これらの条件下では、分子内である架橋断片のライゲーションは、分子間であるランダム断片のライゲーションよりきわめて有利となる。次いで脱架橋され、個々のライゲーション産物が検出され、遺伝子座特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により定量される。2つの特定の遺伝子座の架橋頻度(X)は、対照および架橋鋳型を用いた定量的PCR反応により決定され、Xは、架橋鋳型および対照鋳型により得られた産物量の比として表される。
【００９１】
本発明により、3C鋳型は、Splinter et al., (2004) Methods Enzymol. 375, 493-507(すなわち、ホルムアルデヒド固定、(第1の)制限酵素消化、架橋DNA断片の再ライゲーションおよびDNA精製)により記載された方法を用いて調製される。簡単には、細胞、組織または核などの試料は、ホルムアルデヒドなどの架橋剤を用いて固定化される。第1の制限酵素消化は、次いで、DNAが架橋核との関連で消化されるように行われる。分子内ライゲーションは、次いで、低DNA濃度(例えば、約3.7ng/μl)で行われる。低DNA濃度は、非架橋DNA断片間のライゲーション(すなわち、分子間ライゲーションまたはランダムライゲーション)より、架橋DNA断片間のライゲーション(すなわち、分子内ライゲーション)に有利に働く。次に、脱架橋され、DNAは精製されうる。得られた3C鋳型は、ライゲーションされた制限断片を含有する。なぜなら、制限断片は元々核内空間で近接していたためである。
【００９２】
第1の制限酵素は、分子内ライゲーションのステップの前にDNAを消化するのに使用されるため、第1の制限酵素に対する酵素認識部位は、第1(標的)のヌクレオチド配列およびライゲーションされたヌクレオチド配列を分離することになる。したがって、第1の認識部位は、第1(標的)のヌクレオチド配列とライゲーションされたヌクレオチド配列(すなわち、ライゲーションされた第2配列)との間に位置する。
【００９３】
ヌクレオチド配列
本発明は、データベースで入手することができる、ヌクレオチド配列(例えば、3C鋳型、4C鋳型、DNA鋳型、増幅鋳型、DNA断片およびゲノムDNA)の使用を伴う。
【００９４】
ヌクレオチド配列は、ゲノム起源、合成起源または組換え起源のDNAまたはRNA、例えば、cDNAであってよい。例えば、組換えヌクレオチド配列は、PCRクローニング法を用いて製造されうる。これには、クローニングしたい配列領域に隣接するプライマー対を作製すること、プライマーを、例えば、哺乳類(例えば、動物またはヒトの細胞)または非哺乳類細胞から得られたmRNAまたはcDNAと接触させること、所望の領域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行うこと、増幅断片を単離すること(例えば、アガロースゲルでの反応混合物の精製により)および増幅DNAを回収することを伴うであろう。プライマーは、増幅DNAが、適切なクローニングベクターにクローニングされうるように、適切な制限酵素認識部位を含有するよう設計されてよい。
【００９５】
ヌクレオチド配列は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖を示すものであれ、またはこの組合せを示すものであれ、二本鎖または一本鎖であってよい。
【００９６】
いくつかの態様では、ヌクレオチド配列は、一本鎖のプライマーおよびプローブなどの一本鎖DNAであることが好ましい。
【００９７】
いくつかの態様では、ヌクレオチド配列は、二本鎖の3C鋳型および4C鋳型などの二本鎖DNAであることが好ましい。
【００９８】
いくつかの態様では、ヌクレオチド配列は、1つまたは複数のゲノム遺伝子座などのゲノムDNAであることが好ましい。
【００９９】
いくつかの態様では、ヌクレオチド配列は、染色体DNAであることが好ましい。
【０１００】
ヌクレオチド配列は、第1(標的)のヌクレオチド配列および/または第2のヌクレオチド配列を含むことができる。
【０１０１】
第1および第2の制限酵素認識部位は、互いに異なり、典型的にはヌクレオチド配列において1回のみ生じるであろう。
【０１０２】
1つの態様では、第1および第2の制限酵素認識部位により分離される(例えば、分割または分断される)第1のヌクレオチド配列、および(例えば、ライゲーションされる)第2のヌクレオチド配列を含み、前記第1のヌクレオチド配列は、標的ヌクレオチド配列であり、前記第2のヌクレオチド配列は、架橋ゲノムDNA(例えば、in vivoまたはin vitroにおける)により得ることができる、環状ヌクレオチド配列が提供される。第1および第2の制限酵素認識部位は、互いに異なり、典型的にはヌクレオチド配列において1回のみ現れるであろう。
【０１０３】
さらなる態様では、第1および第2の制限酵素認識部位により分離される(例えば、分割または分断される)第1のヌクレオチド配列、および(例えば、ライゲーションされる)第2のヌクレオチド配列を含み、前記第1のヌクレオチド配列は、標的ヌクレオチド配列であり、前記第1および第2のヌクレオチド配列は、(a)架橋ゲノムDNA(例えば、in vivoまたはin vitroにおける)と、(b)架橋DNAを第1の制限酵素で消化するステップと、(c)架橋ヌクレオチド配列をライゲーションするステップと、(d)脱架橋するステップと、(e)ヌクレオチド配列を第2の制限酵素で消化してヌクレオチド配列を環状化させるステップとを含む方法により得ることができる、環状ヌクレオチド配列が提供される。
【０１０４】
好ましくは、第2のヌクレオチド配列は、第1(標的)のヌクレオチド配列を交差(intersect)(例えば、分岐(bisect))する。したがって、ヌクレオチド配列は、第1(標的)のヌクレオチド配列を2つの部分または断片-ほぼ2つの同じ大きさの部分または断片など、に分離する第2のヌクレオチド配列を含む。典型的には、部分または断片は、少なくとも約16ヌクレオチド長となろう。
【０１０５】
第1のヌクレオチド配列
第1のヌクレオチド配列は、標的ヌクレオチド配列である。
【０１０６】
本明細書では、用語「標的ヌクレオチド配列」とは、これが架橋する1つまたは複数の配列(例えば、目的とする1つもしくは複数のヌクレオチド配列、または未知のヌクレオチド配列組成の1つもしくは複数の配列)を同定するためにベイト(bait)配列として使用される配列を言う。
【０１０７】
標的ヌクレオチド配列は、既知の配列である。
【０１０８】
架橋は、標的ヌクレオチド配列およびこれに架橋された配列が、元々核内空間で近接していたことを示している。配列が互いに近接する頻度を判定することで、例えば、核の空間状況における染色体コンフォメーションおよび染色体領域を理解することができる(例えば、in vivoまたはin vitroにおいて)。さらに、例えば、エンハンサーまたは他の転写調節エレメントが、シスまたはトランスに位置する遠位プロモーターと情報を交換する場合、ゲノム内の複雑な構造的構成を理解することができる。さらに、同一染色体上(シス)に存在するヌクレオチド配列のほか、他の染色体上(トランス)に存在するヌクレオチド配列に関連した所与のゲノム領域の位置を理解することもできる。故に、核内空間で部位を共有することが多い異なる染色体上のヌクレオチド配列をマッピングすることができる。さらに、平衡および/または不平衡転座、欠失、逆位、重複およびその他のゲノム再編成(例えば、1つまたは複数の染色体における欠失または転座)などの平衡および/または不平衡の遺伝子異常を検出することもできる。この際、遺伝子異常は、変化が生じた位置でDNA-DNA相互作用の変化をもたらすが、これは検出されうる。
【０１０９】
本発明による第1(標的)のヌクレオチド配列は、核内空間における1つまたは複数の他の配列との相互作用頻度を判定したい、いずれの配列でありうる。
【０１１０】
1つの実施形態では、第1の制限部位から約350bp以上のところで第1(標的)のヌクレオチド配列を切断する第2の制限酵素が選択されるため、第1(標的)のヌクレオチド配列は、約350bp長を超えるであろう。
【０１１１】
これは、トポロジー的制約による環状形成の偏りを最小化することができる(Rippe et al. (2001) Trends in Biochem. Sciences 26, 733-40)。
【０１１２】
適切には、第2のヌクレオチド配列を増幅するのに使用される少なくとも2つの増幅プライマーの最小長が、それぞれ約16塩基であることから、増幅後の第1(標的)のヌクレオチド配列は、少なくとも約32bpを含む。
【０１１３】
好ましい態様では、第1(標的)のヌクレオチド配列は、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、マトリックス結合領域、遺伝子座制御領域、転写ユニット、複製起点、組換えホットスポット、転座ブレイクポイント、セントロメア、テロメア、遺伝子密度の高い領域、遺伝子密度の低い領域、反復エレメント、(ウイルス)組込み部位、欠失および/または変異が影響(例えば、疾患的、生理的、機能的または構造的影響、例えばSNP(一塩基多型))と関係した1つのヌクレオチド配列、もしくはこのような欠失および/または変異を含有する1つまたは複数のヌクレオチド配列、または核内空間における相互作用の頻度を判定したいいずれの配列を、完全にもしくは部分的に(例えば、断片)含んでよく、またはこれらの近くに(例えば、近接して)いてよい。
【０１１４】
上述のように、第1(標的)のヌクレオチド配列は、遺伝子異常-欠失および/または変異など-が、影響(例えば、疾患)と関係したヌクレオチド配列を、完全にもしくは部分的に(例えば、断片)含んでよく、またはこれらの近くに(例えば、近接して)いてよい。本発明のこの実施形態により、第1(標的ヌクレオチド配列)は、したがって、変化が遺伝子疾患もしくは先天性疾患などの疾患に関連している、もしくは相関しているゲノム領域に隣接した(物理的DNA鋳型上で)、またはこのゲノム領域のヌクレオチド配列(例えば、遺伝子または遺伝子座)であってよい。言い換えれば、第1(標的)のヌクレオチド配列は、臨床的表現型との関連に基づいていてよく、またはこれに基づき選択されてよい。好ましい実施形態では、変化は、1つまたは複数の染色体における変化であり、疾患は、例えば、染色体内での1つもしくは複数の欠失、1つもしくは複数の転座、1つもしくは複数の重複、および/または1つもしくは複数の逆位などの結果でありうる。
【０１１５】
このような遺伝子/遺伝子座の非限定例は、様々なリンパ芽球性白血病におけるAML1、MLL、MYC、BCL、BCR、ABL1、免疫グロブリン遺伝子座、LYL1、TAL1、TAL2、LMO2、TCRα/δ、TCRβ、HOXおよびその他の遺伝子座である。
【０１１６】
その他の例は、以下のような電子データベースに記載されている。
【０１１７】
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=cancerchromosomes
http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman
http://www.progenetix.net/progenetix/P14603437/ideogram.html 
http://www.changbioscience.com/cytogenetics/cyto1.pl?query=47,xy
http://www.possum.net.au/
http://www.lmdatabases.com/
http://www.wiley.com/legacy/products/subject/life/borgaonkar/index.html
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM
http://www.sanger.ac.uk/PostGenomics/decipher/
http://agserver01.azn.nl:8080/ecaruca/ecaruca.jsp
その他の例は、「Catalogue of Unbalanced Chromosome Aberrations in Man」2nd edition. Albert Schinzel. Berlin: Walter de Gruyter, 2001. ISBN 3-11-011607-3に記載されている。
【０１１８】
1つの実施形態では、用語「隣接した」とは、2つの隣接した配列間に介在ヌクレオチドが存在しないように「直接隣接して」いることを意味する。
【０１１９】
別の実施形態では、ヌクレオチド配列および第1の制限酵素認識部位との関連における用語「隣接した」とは、ヌクレオチド配列と第1の制限酵素認識部位との間に介在ヌクレオチドが存在しないように「直接隣接して」いることを意味する。
【０１２０】
第2のヌクレオチド配列
第2のヌクレオチド配列は、架橋ゲノムDNA(in vivoまたはin vitroにおける)により得ることができ、得られ、特定され、または同定することができる。
【０１２１】
第2のヌクレオチド配列(例えば、目的とするヌクレオチド配列)は、試料を架橋剤で処理し、架橋DNA断片を消化/ライゲーションした後で、第1(標的)のヌクレオチド配列にライゲーションされるようになる。このような配列は、元々核内空間で近接していたため、第1(標的)のヌクレオチド配列に架橋され、およびライゲーション条件が、ランダムライゲーション事象よりも架橋DNA断片間(分子内)ライゲーションに有利なため、第1(標的)のヌクレオチド配列にライゲーションされる。
【０１２２】
変化-転座、欠失、逆位、重複およびその他のゲノム再編成-に基づく疾患は、一般に異常なDNA-DNA相互作用が原因である。4C技術は、主にゲノム部位の分離関数であるDNA-DNA相互作用頻度を測定する。すなわち、DNA-DNA相互作用頻度は、同一の物理的DNA鋳型上に存在する2つのDNA遺伝子座間の直線距離(キロ塩基)に反比例する(Dekker et al., 2002)。故に、新規のおよび/または物理的に異なるDNA鋳型を生じさせる変化は、変化したDNA-DNA相互作用を伴い、これは4C技術により測定されうる。
【０１２３】
適切には、第2のヌクレオチド配列は、少なくとも40塩基対である。
【０１２４】
ホルムアルデヒドなどの架橋剤は、タンパク質を他の近隣のタンパク質および核酸に架橋するのに使用することができる。故に、2つ以上のヌクレオチド配列は、これらのヌクレオチド配列(の1つ)に結合したタンパク質を介してのみ架橋することができる。ホルムアルデヒド以外の架橋剤も、ヌクレオチド配列を直接架橋するような架橋剤を含め、本発明により使用することができる。DNAを架橋する剤の例には、紫外線、マイトマイシンC、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、1,3-ブタジエンジエポキシド、シスジクロロジアミン白金(II)およびシクロホスファミドが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２５】
適切には、架橋剤は、約2オングストロームなどの比較的短い距離を架橋することで、脱架橋されうる密接な相互作用を選択する架橋を形成するであろう。
【０１２６】
架橋は、例えば、室温で、2%ホルムアルデヒド中で細胞をインキュベートする、例えば、2%ホルムアルデヒドを補充したDMEM-10%FCS 10ml中で1×107細胞を室温で10分間インキュベートすることにより行うことができる。
【０１２７】
第1の制限酵素
本明細書では、用語「第1の制限酵素」とは、架橋DNAを消化するのに使用される最初の制限酵素を言う。
【０１２８】
第1の制限酵素は、解析する標的配列(例えば、遺伝子座)の種類により選択されるであろう。消化条件を最適化するための予備実験が行われることが望ましい。
【０１２９】
第1の制限酵素は、DNAの少なくとも6bp以上の配列を認識する制限酵素から選択されることができる。
【０１３０】
DNAの6bp配列を認識する制限酵素には、AclI、HindIII、SspI、BspLU11I、AgeI、MluI、SpeI、BglII、Eco47III、StuI、ScaI、ClaI、AvaIII、VspI、MfeI、PmaCI、PvuII、NdeI、NcoI、SmaI、SacII、AvrII、PvuI、XmaIII、SplI、XhoI、PstI、AflII、EcoRI、AatII、SacI、EcoRV、SphI、NaeI、BsePI、NheI、BamHI、NarI、ApaI、KpnI、SnaI、SalI、ApaLI、HpaI、SnaBI、BspHI、BspMII、NruI、XbaI、BclI、MstI、BalI、Bsp1407I、PsiI、AsuIIおよびAhaIIIが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３１】
DNAの6bpを超える配列を認識する制限酵素には、BbvCI、AscI、AsiSI、FseI、NotI、PacI、PmeI、SbfI、SgrAI、SwaI、SapI、Cci NI、FspAI、MssI、SgfI、SmiI、SrfIおよびSse8387Iが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３２】
本発明のいくつかの態様では、6bp配列を認識する制限酵素の場合、BglII、HindIIIまたはEcoRIが好ましい。
【０１３３】
用語「第1の制限酵素認識部位」とは、第1の制限酵素により認識され、切断されるヌクレオチド配列の部位を言う。
【０１３４】
第2の制限酵素
本明細書では、用語「第2の制限酵素」とは、第1の制限酵素消化、架橋DNAライゲーション、脱架橋および(任意の)DNA精製後に使用される第2の制限酵素を言う。1つの実施形態では、第2の制限酵素は、目的とするヌクレオチド配列に明確なDNA末端を提供するのに使用される。これにより、既知のヌクレオチド組成の配列を、目的とするヌクレオチド配列に隣接する第2の制限酵素認識部位にライゲーションすることが可能になる。
【０１３５】
1つの実施形態では、既知のヌクレオチド組成の配列を、目的とするヌクレオチド配列に隣接する(例えば、目的とするヌクレオチド配列の各側または末端にある)第2の制限酵素認識部位にライゲーションすることには、標的ヌクレオチド配列に隣接する第2の制限酵素認識部位と、目的とする架橋されたヌクレオチド配列との間の分子内ライゲーションに有利な希釈条件下でのライゲーションが伴う。この結果、既知の標的ヌクレオチド配列が、目的とする未知の配列に隣接するDNA環の形成が効果的に得られる。
【０１３６】
別の実施形態では、既知のヌクレオチド組成の配列を、目的とするヌクレオチド配列に隣接する(例えば、目的とするヌクレオチド配列の各側または末端にある)第2の制限酵素認識部位にライゲーションすることには、既知のヌクレオチド組成の固有のDNA配列を付加すること、続いて、目的とするヌクレオチド配列に隣接する第2の制限酵素認識部位と、既知のヌクレオチド組成の導入された固有のDNA配列との間の分子間ライゲーションに有利な条件下で、ライゲーションすることが伴う。
【０１３７】
1つの実施形態では、第2の制限酵素は、第1の制限部位の約350bp(例えば、350〜400bp)の中に第2の制限酵素部位がないように選択される。
【０１３８】
別の実施形態では、第2の制限酵素は、同じ第2の制限酵素部位が、ライゲーションされたヌクレオチド配列(すなわち、ライゲーションされた架橋配列)に位置する可能性があるように選択される。第1(標的)のヌクレオチド配列および架橋されたヌクレオチド配列の末端は、適合性のある付着(または平滑)末端であってよいため、配列は、DNAを環状化するためにライゲーションすることもできる。したがって、消化ステップには、分子内相互作用に有利な希釈条件下でのライゲーション、および場合により、適合性のある末端を介したDNAの環状化が続く。
【０１３９】
好ましくは、第2の制限酵素認識部位は、4または5bpのヌクレオチド配列認識部位である。DNAの4または5bp配列を認識する酵素には、TspEI、MaeII、AluI、NlaIII、HpaII、FnuDII、MaeI、DpnI、MboI、HhaI、HaeIII、RsaI、TaqI、CviRI、MseI、Sth132I、AciI、DpnII、Sau3AIおよびMnlIが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４０】
好ましい実施形態では、第2の制限酵素は、NlaIIIおよび/またはDpnIIである。
【０１４１】
用語「第2の制限酵素認識部位」とは、第2の制限酵素により認識され、切断されるヌクレオチド配列の部位を言う。
【０１４２】
第2の制限酵素による消化後、さらなるライゲーション反応が行われる。1つの実施形態では、このライゲーション反応は、既知のヌクレオチド配列組成のDNA配列を、標的ヌクレオチド配列にライゲーションされる1つまたは複数の配列の第2の制限酵素認識部位に結合させる。
【０１４３】
第3の制限酵素
本明細書では、用語「第3の制限酵素」とは、増幅前に環状DNAを直線化するために、第2の制限酵素のステップ後、場合により使用することができる第3の制限酵素を言う。
【０１４４】
好ましくは、第3の制限酵素は、6bp以上のヌクレオチド認識部位を認識する酵素である。
【０１４５】
好ましくは、第3の制限酵素は、第1および第2の制限酵素認識部位の間の第1(標的)のヌクレオチド配列を消化する。当業者には明らかなように、第3の制限酵素は、増幅プライマーがもはやハイブリダイズできないような、第1および第2の制限酵素認識部位に近すぎる第1(標的)のヌクレオチド配列は消化しないことが望ましい。したがって、第3の制限酵素認識部位は、増幅プライマーがハイブリダイズできるように、使用するプライマーの長さと少なくとも同じ距離だけ第1および第2の制限酵素認識部位から離れた位置にあることが好ましい。
【０１４６】
好ましい実施形態では、第3の制限酵素は、DNAの6bp配列を認識するものである。
【０１４７】
用語「第3の制限酵素認識部位」とは、第3の制限酵素により認識され、切断されるヌクレオチド配列の部位を言う。
【０１４８】
認識部位
制限エンドヌクレアーゼは、DNAの糖-リン酸骨格を切断する酵素である。最も実用的な設定では、所与の制限酵素は、一続きのわずか数塩基内の二本鎖DNAの両鎖を切断する。制限酵素の基質は、制限部位/配列と呼ばれる二本鎖DNAの配列である。
【０１４９】
制限認識部位の長さは、使用する制限酵素により異なる。認識配列の長さは、酵素が、DNA配列においてどれほど頻繁に切断するかを決定する。
【０１５０】
例として、いくつかの制限酵素は、DNAの4bp配列を認識する。DNAの4bp配列を認識する配列および酵素には、AATT (TspEI)、ACGT (MaeII)、AGCT (AluI)、CATG (NlaIII)、CCGG (HpaII)、CGCG (FnuDII)、CTAG (MaeI)、GATC (DpnI、DpnII、Sau3AI & MboI)、GCGC (HhaI)、GGCC (HaeIII)、GTAC (RsaI)、TCGA (TaqI)、TGCA (CviRI)、TTAA (MseI)、CCCG (Sth132I)、CCGC (AciI)およびCCTC (MnlI)が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５１】
さらなる例として、いくつかの制限酵素は、DNAの6bp配列を認識する。DNAの6bp配列を認識する配列および酵素には、AACGTT (AclI)、AAGCTT (HindIII)、AATATT (SspI)、ACATGT (BspLU11I)、ACCGGT (AgeI)、ACGCGT (MluI)、ACTAGT (SpeI)、AGATCT (BglII)、AGCGCT (Eco47III)、AGGCCT (StuI)、AGTACT (ScaI)、ATCGAT (ClaI)、ATGCAT (AvaIII)、ATTAAT (VspI)、CAATTG (MfeI)、CACGTG (PmaCI)、CAGCTG (PvuII)、CATATG (NdeI)、CCATGG (NcoI)、CCCGGG (SmaI)、CCGCGG (SacII)、CCTAGG (AvrII)、CGATCG (PvuI)、CGGCCG (XmaIII)、CGTACG (SplI)、CTCGAG (XhoI)、CTGCAG (PstI)、CTTAAG (AflII)、GAATTC (EcoRI)、GACGTC (AatII)、GAGCTC (SacI)、GATATC (EcoRV)、GCATGC (SphI)、GCCGGC (NaeI)、GCGCGC (BsePI)、GCTAGC (NheI)、GGATCC (BamHI)、GGCGCC (NarI)、GGGCCC (ApaI)、GGTACC (KpnI)、GTATAC (SnaI)、GTCGAC (SalI)、GTGCAC (ApaLI)、GTTAAC (HpaI)、TACGTA (SnaBI)、TCATGA (BspHI)、TCCGGA (BspMII)、TCGCGA (NruI)、TCTAGA (XbaI)、TGATCA (BclI)、TGCGCA (MstI)、TGGCCA (BalI)、TGTACA (Bsp1407I)、TTATAA (PsiI)、TTCGAA (AsuII)およびTTTAAA (AhaIII)が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５２】
さらなる例として、いくつかの制限酵素は、DNAの7bp配列を認識する。DNAの7bp配列を認識する配列および酵素には、CCTNAGG (SauI)、GCTNAGC (EspI)、GGTNACC BstEIIおよびTCCNGGA PfoIが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５３】
さらなる例として、いくつかの制限酵素は、DNAの8bp配列を認識する。DNAの8bp配列を認識する配列および酵素には、ATTTAAAT (SwaI)、CCTGCAGG (Sse8387I)、CGCCGGCG (Sse232I)、CGTCGACG (SgrDI)、GCCCGGGC (SrfI)、GCGATCGC (SgfI)、GCGGCCGC (NotI)、GGCCGGCC (FseI)、GGCGCGCC (AscI)、GTTTAAAC (PmeI)およびTTAATTAA (PacI)が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５４】
いくつかのこれらの酵素は、in vivoでメチル化されうる配列CGを含有する。いくつかの制限酵素は、このメチル化に感受性であり、メチル化配列を切断しないであろう。例えば、HpaIIは、配列CCmGGを切断しないであろうが、一方、このアイソシゾマーであるMspIは、この修飾に対して非感受性であり、メチル化配列を切断するであろう。したがって、いくつかの例では、真核生物のメチル化感受性酵素は使用されない。
【０１５５】
1つの実施形態では、認識部位は消化部位である。
【０１５６】
1つの実施形態では、制限酵素認識部位は、制限酵素消化部位である。
【０１５７】
環状化
本発明の1つの実施形態により、4Cの材料は、3C鋳型を第2の制限酵素で消化し、続いてライゲーションしてDNA環を生成することで製造される。
【０１５８】
好ましくは、第2の制限酵素は、第1の制限部位から約350bp(例えば、350〜400bp)を超える位置の第1(標的)のヌクレオチド配列を切断するように選択される。有利には、これは、トポロジー的制約による環状形成の偏りを最小化することができる(Rippe et al. (2001) Trends in Biochem. Sciences 26, 733-40)。
【０１５９】
好ましくは、第2の制限酵素は、4または5bpの制限酵素認識部位を認識するフリークエントカッター(frequent cutter)である。故に、増幅中のすべてのライゲーション断片に関する同等な増幅効率のための最小の制限断片を得ることができる。
【０１６０】
第2の制限酵素の消化およびライゲーション前、DNA鋳型は、第1の制限部位から約350〜400bpを超える位置にある第1(標的)のヌクレオチド配列の1つの第2の酵素認識部位、およびライゲーションされているヌクレオチド配列に(すなわち、第2のヌクレオチド配列に)位置する別の第2の酵素認識部位を含むであろう。
【０１６１】
好ましくは、第2の制限酵素消化ステップは、1時間超から一晩行われ、続いて酵素の熱不活化が行われる。
【０１６２】
好ましくは、この反応混合物中のDNAは、当技術分野で公知の従来の方法/キットを用いて精製される。
【０１６３】
第2の制限酵素消化ステップ後、第2の制限酵素部位は、第1(標的)のヌクレオチド配列の第1の制限部位から350〜400bpを超える位置にあるであろう。別の第2の制限酵素部位は、ライゲーションされたヌクレオチド配列(すなわち、第2のヌクレオチド配列)に位置するであろう。第1(標的)のヌクレオチド配列およびライゲーションされたヌクレオチド配列の末端は、適合性のある末端を有するため、配列は、DNAを環状化するためにライゲーションされうる。
【０１６４】
消化ステップは、次いで、分子内相互作用に有利な希釈条件下でのライゲーション、および適合性のある末端を介したDNAの環状化が続く。
【０１６５】
好ましくは、ライゲーション反応は、約1〜5 ng/μlのDNA濃度で行われる。
【０１６６】
好ましくは、ライゲーション反応は、1時間を超える間(例えば、2、3、4時間以上)約16〜25℃で行われる。
【０１６７】
したがって、ライゲーション反応後、環状DNAが製造されうる。環状DNAは、少なくとも第2の制限酵素または第1および第2の制限酵素の認識部位を含むであろう。第1(標的)のヌクレオチド配列を含有する環状DNAでは、第1の制限酵素認識部位および第2の制限酵素認識部位は、第1(標的)のヌクレオチド配列およびライゲーションされたヌクレオチド配列(すなわち、第2のヌクレオチド配列)の末端を決めるであろう。したがって、第1(標的)のヌクレオチド配列およびライゲーションされたヌクレオチド配列は、第1の制限酵素認識部位および第2の制限酵素認識部位により分離(例えば、分割)される。
【０１６８】
増幅
1つまたは複数の増幅反応は、4C DNA鋳型を増幅するために行われうる。
【０１６９】
DNA増幅は、当技術分野で公知のいくつかの異なる方法を用いて行われうる。例えば、DNAは、ポリメラーゼ連鎖反応(Saiki et al., 1988);ライゲーション仲介(ligation mediated) PCR、Qbレプリカーゼ増幅(Cahill, FosterおよびMahan, 1991; ChetverinおよびSpirin, 1995; Katanaev, KurnasovおよびSpirin, 1995);リガーゼ連鎖反応(LCR)(Landegren et al., 1988; Barany, 1991);自己持続型配列複製システム(self-sustained sequence replication system)(Fahy, KwohおよびGingeras, 1991)および鎖置換増幅(Walker et al., 1992)を用いて増幅することができる。
【０１７０】
好ましくは、DNAは、PCRを用いて増幅される。「PCR」とは、ゲノムDNAにおける混合物のヌクレオチド配列の断片濃度を、クローニングまたは精製することなく上昇させる方法を記載するK. B. Mullis、米国特許第4,683,195号、第4,683,202号および第4,965,188号の方法を言う。
【０１７１】
1つの実施形態では、逆PCRが使用される。(Ochman et al (1988) Genetics 120(3), 621-3により記載された)逆PCR(IPCR)は、既知の配列領域に隣接するDNA配列の迅速なin vitro増幅方法である。この方法は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用するが、通常の方向とは逆向きのプライマーを有する。逆プライマーの鋳型は、環を形成するためにそれ自体がライゲーションされている制限断片である。逆PCRは、例えば、転位因子に隣接する配列の増幅および同定など、分子遺伝学において多くの用途を有する。増幅の効率性および再現性を高めるため、DNA環は、増幅前に第3の制限酵素により直線化されることが好ましい。好ましくは、6bp以上のカッターである第3の制限酵素が使用される。好ましくは、第3の制限酵素は、第1および第2の制限酵素部位間の第1(標的)のヌクレオチド配列を切断する。
【０１７２】
第2の制限酵素による3C鋳型の消化、任意の環状化、ライゲーション(例えば、希釈条件下のライゲーション)および第1(標的)のヌクレオチド配列を含有する環の任意の線状化は、増幅のためのDNA鋳型をもたらす(「4C DNA鋳型」)。
【０１７３】
増幅ステップでは、各プライマーが、目的とするヌクレオチド配列に隣接するDNA配列にハイブリダイズする、少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマーが使用される。好ましい実施形態では、各プライマーが、目的とするヌクレオチド配列に隣接する標的配列にハイブリダイズする、少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマーが使用される。
【０１７４】
1つの実施形態では、プライマーハイブリダイゼーションの関連での用語「隣接する(flank)」は、少なくとも1つのプライマーが、目的とするヌクレオチド配列の一方の末端(例えば、5'末端)に隣接するDNA配列にハイブリダイズし、少なくとも1つのプライマーが、目的とするヌクレオチド配列の他方の末端(例えば、3'末端)でDNA配列にハイブリダイズすることを意味する。好ましくは、少なくとも1つのフォワードプライマーは、目的とするヌクレオチド配列の一方の末端(例えば、5'末端)に隣接するDNA配列にハイブリダイズし、少なくとも1つのリバースプライマーは、目的とするヌクレオチド配列の他方の末端(例えば、3'末端)でDNA配列にハイブリダイズすることを意味する。
【０１７５】
1つの好ましい実施形態では、プライマーハイブリダイゼーションの関連での用語「隣接する(flank)」は、少なくとも1つのプライマーが、目的とするヌクレオチド配列の一方の末端(例えば、5'末端)に隣接する標的配列にハイブリダイズし、少なくとも1つのプライマーが、目的とするヌクレオチド配列の他方の末端(例えば、3'末端)で標的配列にハイブリダイズすることを意味する。好ましくは、少なくとも1つのフォワードプライマーは、目的とするヌクレオチド配列の一方の末端(例えば、5'末端)に隣接する標的配列にハイブリダイズし、少なくとも1つのリバースプライマーは、目的とする標的配列の他方の末端(例えば、3'末端)でDNA配列にハイブリダイズすることを意味する。
【０１７６】
本明細書では、用語「プライマー」とは、精製制限消化のような自然発生のものであれ、合成的に生成されたものであれ、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下(すなわち、ヌクレオチドおよび例えばDNAポリメラーゼなどの誘導剤の存在下、ならびに適切な温度およびpHで)に置かれた場合に、合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを言う。プライマーは、好ましくは、最大の増幅効率のためには一本鎖であるが、二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、プライマーは先ず、伸長産物の調製に使用される前に、鎖を分離するために処理される。好ましくは、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘導剤の存在下で伸長産物合成を刺激するのに十分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマー源および方法の使用を含め、多くの要因により異なるであろう。
【０１７７】
適切には、プライマーは、少なくとも15、好ましくは少なくとも20、例えば少なくとも25、30または40ヌクレオチド長となろう。好ましくは、増幅プライマーは、16から30ヌクレオチド長である。
【０１７８】
好ましくは、プライマーは、第1(標的)のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列を分離する第1および第2の制限酵素認識部位に、できるだけ近接するように設計される。プライマーは、第1および第2の制限酵素認識部位から約100ヌクレオチド以内で−例えば約90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1ヌクレオチドなど、離れるように設計されてよい。
【０１７９】
適切には、増幅プライマーは、伸長が制限部位を横切り第2のヌクレオチド配列に直進するように、増幅プライマーの3'末端が、第1および第2の制限酵素認識部位に向かって外側を向くように設計される。
【０１８０】
使用される増幅方法が逆PCRの場合、増幅反応は、4C鋳型DNA約100〜400ng(約50μl PCR反応混合物当たり)、または複製PCR反応が再現可能な結果をもたらし(図1参照)、PCR反応当たり最大数のライゲーション事象を含む他のDNA量で行われることが好ましい。
【０１８１】
好ましくは、逆PCR増幅反応は、メーカーの使用説明書に従い緩衝液1を用いて、Expand Long Template PCR System (Roche)により行われる。
【０１８２】
試料
本明細書では用語「試料」は、この本来の意味を有する。試料は、架橋されるまたは架橋されることができるDNAを含む、いずれかの物理的実体であってよい。試料は、生物材料であってよく、または生物材料由来であってよい。
【０１８３】
試料は、1つまたは複数の実体、例えば、1つもしくは複数の細胞、1つもしくは複数の核、または1つもしくは複数の組織試料であってよく、または1つもしくは複数の細胞由来、1つもしくは複数の核由来、または1つもしくは複数の組織試料由来であってよい。実体は、染色体などのDNAが存在するいずれかの実体であってよく、またはDNAが存在するいずれかの実体由来であってよい。試料は、1つもしくは複数の単離された細胞、または1つもしくは複数の単離された組織試料、または1つもしくは複数の単離された核であってよく、または1つもしくは複数の単離された細胞由来、または1つもしくは複数の単離された組織試料由来、または1つもしくは複数の単離された核由来であってよい。
【０１８４】
試料は、生細胞および/もしくは死細胞および/もしくは核溶解物および/もしくは単離されたクロマチンであってよく、または生細胞由来および/もしくは死細胞由来および/もしくは核溶解物由来および/もしくは単離されたクロマチン由来であってよい。
【０１８５】
試料は、罹患被験体および/もしくは非罹患被験体であってよく、または罹患被験体由来および/もしくは非罹患被験体由来であってよい。
【０１８６】
試料は、疾患に罹患している疑いのある被験体であってよく、または疾患に罹患している疑いのある被験体由来であってよい。
【０１８７】
試料は、将来疾患に罹患する可能性について試験される予定の被験体であってよく、または将来疾患に罹患する可能性について試験される予定の被験体由来であってよい。
【０１８８】
試料は、患者の生存物質もしくは非生存物質であってよく、または患者の生存物質由来もしくは非生存物質由来であってよい。
【０１８９】
3C鋳型の調製に使用するための細胞および組織の固定は、Splinter et al., (2004) Methods Enzymol. 375, 493-507に詳述されている。
【０１９０】
標識
好ましくは、ヌクレオチド配列(例えば、増幅された4C鋳型、プライマーまたはプローブなど)は、アレイハイブリダイゼーションなどの下流適用に役立つように標識される。例として、4C DNA鋳型は、ランダムプライミングまたはニックトランスレーションにより標識されうる。
【０１９１】
様々な標識(例えば、レポーター)が、特に増幅ステップの間、本明細書に記載のヌクレオチド配列を標識するのに使用されうる。適切な標識には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、または発色剤のほか、基質、補因子、阻害剤、磁性粒子などが含まれる。このような標識の使用を教示する特許には、US-A-3817837、US-A-3850752、US-A-3939350、US-A-3996345、US-A-4277437、US-A-4275149およびUS-A-4366241が含まれる。
【０１９２】
さらなる標識には、β-ガラクトシダーゼ、インベルターゼ、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール、アセチルトランスフェラーゼ、β-グルクロニダーゼ、エキソ-グルカナーゼよおびグルコアミラーゼが含まれるが、これらに限定されない。蛍光標識も、具体的には特定の化学特性により合成される蛍光試薬と同様に、使用されうる。蛍光性を測定するための様々な方法が利用可能である。例えば、蛍光標識のなかには励起または発光スペクトルの変化を示すもの、1つの蛍光レポーターが蛍光性を失う共鳴エネルギー移動を示すもの(2番目は、蛍光性が増加する)、蛍光性の消失(消光)または出現を示すもの(いくつかのレポーターは回転運動をする)がある。
【０１９３】
十分な標識物質を得るため、反応当たりの増幅サイクル数を増やす代わりに複数の増幅物をプールすることができる。あるいは、標識されたヌクレオチドは、増幅反応の最終サイクルに組み込むことができる(例えば、PCR30サイクル(標識なし)+PCR10サイクル(標識をプラスする))。
【０１９４】
アレイ
特に有利な実施形態では、本明細書に記載の方法により調製される4C DNA鋳型は、アレイにハイブリダイズすることができる。したがって、アレイ(例えば、マイクロ-アレイ)技術は、第1(標的)のヌクレオチド配列と核部位を高頻度で共有するゲノム断片などのヌクレオチド配列の同定に使用することができる。
【０１９５】
発現アレイおよびゲノムアレイなどの既存のアレイは、本発明により使用することができる。しかし、本発明は、本明細書に記載の新規アレイ(例えば、DNAアレイ)の提供も模索する。
【０１９６】
「アレイ」は、合成的にまたは生合成的に製造することができ、様々な異なるフォーマット(例えば、可溶性分子のライブラリ;および樹脂ビーズに連結したオリゴライブラリ、シリカチップ、または他の固体支持体)における生物活性をスクリーニングすることができる、意図的に生成された一群の核酸である。それに加えて、用語「アレイ」には、本質的にはいずれの長さの核酸(例えば、1から約1000ヌクレオチドモノマー長)でも基質にスポットして製造することができる核酸ライブラリが含まれる。
【０１９７】
アレイ技術およびアレイに関連した様々な方法および適用は、一般に多数のテキストおよび文献に記載されている。これらには、Lemieux et al., 1998, Molecular Breeding 4, 277-289、Schena and Davis. Parallel Analysis with Biological Chips. in PCR Methods Manual (eds. M. Innis, D. Gelfand, J. Sninsky)、Schena and Davis, 1999, Genes, Genomes and Chips. In DNA Microarrays: A Practical Approach (ed. M. Schena), Oxford University Press, Oxford, UK, 1999, The Chipping Forecast (Nature Genetics special issue; January 1999 Supplement)、Mark Schena (Ed.), Microarray Biochip Technology, (Eaton Publishing Company)、Cortes, 2000, The Scientist 14[17]:25、Gwynne and Page, Microarray analysis: the next revolution in molecular biology, Science, 1999 August 6、および Eakins and Chu, 1999, Trends in Biotechnology, 17, 217-218が含まれる。
【０１９８】
アレイ技術は、分子生物学における従来技術の短所を克服する。従来技術は、一般に「1つの実験に1つの遺伝子」ベースで機能する結果、ロースループットとなり、遺伝子機能の「全体像」を理解することができない。現在、アレイ技術の主な適用には、配列(遺伝子/遺伝子変異)の同定および遺伝子の発現レベル(存在量)の判定が含まれる。遺伝子発現プロファイリングは、場合によりプロテオミクス技術を併用して、アレイ技術を利用することができる(Celis et al, 2000, FEBS Lett, 480(1):2-16; Lockhart and Winzeler, 2000, Nature 405(6788):827-836; Khan et al., 1999, 20(2):223-9)。アレイ技術の他の適用も、当技術分野で周知である;例えば、遺伝子発見、癌研究(Marx, 2000, Science 289: 1670-1672; Scherf, et al, 2000, Nat Genet;24(3):236-44; Ross et al, 2000, Nat Genet. 2000 Mar;24(3):227-35)、SNP解析(Wang et al, 1998, Science, 280(5366):1077-82)、創薬、薬理ゲノミクス、疾患診断(例えば、マイクロ流体工学装置の利用: Chemical & Engineering News, February 22, 1999, 77(8):27-36)、毒性学(Rockett and Dix (2000), Xenobiotica, 30(2):155-77; Afshari et al., 1999, Cancer Res1;59(19):4759-60)およびトキシコゲノミクス(機能ゲノミクスおよび分子毒性学の混成)など。
【０１９９】
一般に、いずれのライブラリも、ライブラリメンバーを空間的に分離してアレイに順序正しく配列することができる。アレイイングに適切なライブラリの例には、核酸ライブラリ(DNA、cDNA、オリゴヌクレオチドなどのライブラリを含む)、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質のライブラリのほか、とりわけリガンドライブラリなど、いずれの分子を含むライブラリが含まれる。
【０２００】
試料(例えば、ライブラリメンバー)は、一般に、試料の拡散および混合をするため、固相、好ましくは固体基質に固定化(fixed)または固定化(immobilized)される。好ましい実施形態では、リガンドに結合しているDNAライブラリが調製されうる。特に、ライブラリは、プラスチックおよびガラスなどの膜および非多孔性基質を含む、実質的平面固相に固定化されうる。さらに、試料は、好ましくは指標づけ(すなわち、特定の試料への参照またはアクセス)が容易になるように配列される。典型的には、試料は、格子構造におけるスポットとして適用される。一般的なアッセイシステムは、この目的のため適合されうる。例えば、アレイは、1つのウェルに複数の試料、または各ウェルに1つの試料のいずれかによりマイクロプレート表面に固定化することができる。さらに、固体基質は、ニトロセルロース膜またはナイロン膜など、膜であってよい(例えば、ブロッティング実験に使用される膜)。あるいは、基質には、ガラスベース、またはシリカベースの基質が含まれる。故に、試料は、例えば、電荷相互作用による、またはウェルの壁もしくは底、もしくは膜表面への化学結合による、当技術分野で周知のいずれか適切な方法により固定化される。配列および固定化の他の手段は、例えば、ピペッティング、ドロップタッチ(drop-touch)、圧電手段、インクジェットおよびバブルジェット(登録商標)技術、静電塗布などが使用されうる。シリコンベースチップの場合、試料をチップに配列および固定化するのにフォトリソグラフィーが利用されうる。
【０２０１】
試料は、固体支持体に「スポット」されることで配列することができる。これは、試料を析出するのに手またはロボット工学を利用して行うことができる。一般に、アレイは、マクロアレイまたはマイクロアレイとして記載されうるが、この違いは試料スポットの大きさである。マクロアレイは、典型的には、約300ミクロン以上の試料スポットサイズを含有し、既存のゲルおよびブロットスキャナーにより容易に撮像することができる。マイクロアレイの試料スポットサイズは、典型的には直径200ミクロン未満であり、これらのアレイは通常、数千のスポットを含有している。故に、マイクロアレイは、カスタムメイドを必要とする可能性のある、特殊化されたロボット工学および撮像設備を必要としうる。器具は、一般にCortese, 2000, The Scientist 14[11]:26による概説に記載されている。
【０２０２】
DNA分子の固定化されたライブラリの生成法は、当技術分野で記載されている。一般に、ほとんどの従来技術の方法は、固体基質上の様々な離散した位置で様々な配列置換を形成するのに、例えばマスキング法を用いる、一本鎖核酸分子ライブラリの合成方法を記載していた。米国特許第5,837,832号は、非常に大規模な組込み技術に基づきシリコン基質に固定化されたDNAアレイを生成する、改善された方法を記載している。特に、米国特許第5,837,832号は、基質上の空間的に定義された位置で特定のプローブセットを合成するための「タイリング(tiling)」と呼ばれる戦略を記載している。これは、本発明の固定化されたDNAライブラリを生成するのに使用することができる。米国特許第5,837,832号も、使用することができる先行方法に関する参考文献を提供している。
【０２０３】
アレイは、光析出化学を用いて形成することもできる。
【０２０４】
ペプチド(またはペプチドミメティクス)アレイも、アレイ中の離散した所定位置に、それぞれ異なるライブラリメンバー(例えば、固有のペプチド配列)を置くような形で、表面上で合成することができる。各ライブラリメンバーの識別は、アレイにおける空間的位置により決定される。所与の分子(例えば、標的またはプローブ)と反応ライブラリメンバーとの間の結合相互作用が生じるアレイ中の位置が決定されることで、空間的位置ベースで反応ライブラリメンバーの配列を同定する。これらの方法は、米国特許第5,143,854号; WO90/15070およびWO92/10092; Fodor et al. (1991) Science, 251: 767; Dower and Fodor (1991) Ann. Rep. Med. Chem., 26: 271に記載されている。
【０２０５】
検出を助けるため、いずれかの容易に検出可能なレポーター(例えば、蛍光、生物発光、リン光、放射活性などのレポーター)などの標識が典型的には使用される(上述)。このようなレポーター、この検出、標的/プローブとの結合などは、本明細書の他の箇所で論じられている。プローブおよび標的の標識は、Shalon et al., 1996, Genome Res 6(7):639-45でも開示されている。
【０２０６】
DNAアレイの特定の例は、以下の通りである。
【０２０７】
フォーマットI: プローブcDNA(500〜5,000塩基長)は、ガラスなどの固体表面にロボットスポッティングにより固定化され、別々にまたは混合して標的セットに曝露される。この方法は、スタンフォード大学(Ekins and Chu, 1999, Trends in Biotechnology, 1999, 17, 217-218)で開発されたと広く考えられている。
【０２０８】
フォーマットII: オリゴヌクレオチド(20〜25merオリゴ、好ましくは、40〜60 merオリゴ)またはペプチド核酸(PNA)プローブのアレイは、in situ(オンチップ)で、または従来型合成に続くオンチップ固定化により合成される。アレイは、標識された試料DNAに曝露され、ハイブリダイズされ、および相補配列の識別/存在量が判定される。このようなDNAチップは、GeneChip(登録商標)の商標下、Affymetrix, Inc.により販売されている。AgilentおよびNimblegenも、適切なアレイ(例えば、ゲノムタイリングアレイ)を提供している。
【０２０９】
いくつかの市販のマイクロアレイフォーマットの例は、以下の表1に示される(Marshall and Hodgson, 1998, Nature Biotechnology, 16(1), 27-31も参照のこと)。
【表１】
0005416405.tif 000002
【０２１０】
0005416405.tif 000003
【０２１１】
アレイベースアッセイからのデータを生むため、プローブとヌクレオチド配列との間のハイブリダイゼーションの有無を表すシグナルが検出される。本発明は、さらに直接および間接標識法を企図するものである。例えば、直接標識は、アレイ関連プローブにハイブリダイズするヌクレオチド配列に蛍光色素を直接組み込む(例えば、色素は、標識されたヌクレオチドまたはPCRプライマーの存在下で、酵素合成によりヌクレオチド配列に組み込まれる)。直接標識スキームは、典型的には類似の化学構造および特性を有する蛍光色素ファミリーを用いて、強力なハイブリダイゼーションシグナルをもたらし、実施するのが簡単である。核酸の直接標識を含む好ましい実施形態では、シアニンまたはアレクサのアナログが多重蛍光比較アレイ解析で利用される。他の実施形態では、間接標識スキームが、マイクロアレイプローブへのハイブリダイゼーションの前後にエピトープを核酸に組み込むのに利用されうる。1つまたは複数の染色手順および試薬が、ハイブリダイズされた複合体を標識するのに使用される(例えば、エピトープに結合する蛍光分子により、色素分子が、ハイブリダイズされた種のエピトープと結合することから蛍光シグナルをもたらす)。
【０２１２】
データ分析も、アレイを伴う実験の重要な一部である。アレイ実験からの生データは、典型的には画像である。これは、マトリクス、すなわち行が、例えば遺伝子を表し、列が、例えば組織または実験条件など様々な試料を表し、各細胞中の数が、例えば特定の試料において特定の配列(好ましくは、第1(標的)のヌクレオチド配列にライゲーションされている第2配列)の発現を特徴づける表に変換される必要がある。これらのマトリクスは、基礎的な生物学的過程に関するいずれかの知見を抽出すべき場合は、さらに解析されなければならない。データ解析の方法(スーパーバイズドデータ解析(supervised data analysis)およびアンスーパーバイズドデータ解析(unsupervised data analysis)のほか、バイオインフォマティクスアプローチを含む)は、Brazma and Vilo J (2000) FEBS Lett 480(1):17-24に開示されている。
【０２１３】
本明細書では、標識され、続いてアレイにハイブリダイズされる1つまたは複数のヌクレオチド配列(例えば、DNA鋳型)は、明確なサインを伴う配列の、短い一続きのヌクレオチド配列、すなわち、3C手順の間に第1(標的)のヌクレオチド配列にライゲーションされた第1の制限酵素認識部位と、これらのそれぞれ隣接する第2の制限認識部位との間のヌクレオチド配列全域を含む。
【０２１４】
単一のアレイは、複数(例えば、2つ以上)のベイト配列を含んでよい。
【０２１５】
プローブ
本明細書では、用語「プローブ」とは、目的とする別の分子(例えば、別のオリゴヌヌレオチド)にハイブリダイズすることができる分子(例えば、オリゴヌクレオチド。精製制限消化のような自然発生であるか、合成、組換えまたはPCR増幅により生成されるかに関わらず)を言う。プローブがオリゴヌクレオチドである場合、これらは一本鎖または二本鎖であってよい。プローブは、特定の標的(例えば、遺伝子配列)の検出、同定および単離に有用である。本明細書では、酵素(例えば、ELISA、および酵素ベースの組織化学アッセイ)、蛍光、放射活性、および発光システムを含む(しかし、これらに限定されない)いずれかの検出システムにおいて検出できるような1つの標識で、本発明に使用されるプローブが標識されうることが企図される。
【０２１６】
アレイおよびマイクロアレイに関して、用語「プローブ」は、前記プローブにハイブリダイズしているヌクレオチド配列を検出する目的で、アレイに添加されるいずれかのハイブリダイズ可能な物質を指すために使用される。好ましくは、これらのプローブは、25〜60mer以上である。
【０２１７】
プローブ設計のための戦略は、WO95/11995、EP717,113およびWO97/29212に記載されている。
【０２１８】
4Cは、相互作用に関する偏りのないゲノムワイドな検索を可能にするため、ゲノム中のすべての可能性ある(例えば、固有の/非反復的)第1の制限酵素認識部位をインタロゲートする(interrogate)プローブを伴うアレイを製造することが有利である。故に、アレイ設計は、第1の制限酵素の選択のみによって決まり、実際の第1または第2のヌクレオチド配列には依存しない。
【０２１９】
既存のアレイは、本発明により使用することができるが、代替のコンフィギュレーションを使用することが好ましい。
【０２２０】
1つの実施形態では、アレイ上の1つまたは複数のプローブは、第1の制限酵素により消化される部位に近接してハイブリダイズすることができるように設計される。より好ましくは、プローブは、第1の制限酵素認識部位の約20bp以内にある。より好ましくは、プローブは、第1の制限酵素認識部位の約50bp以内にある。
【０２２１】
適切には、プローブは、第1の制限酵素認識部位の約100bp以内(例えば、約0〜100bp、約20〜100bp)にある。
【０２２２】
好ましいコンフィギュレーションでは、単一の、固有のプローブは、第1の制限酵素により消化される部位の各側の約100bp以内に設計される。
【０２２３】
別の好ましいコンフィギュレーションでは、第1の制限部位により消化される部位の位置と比較して、第2の制限酵素により消化される部位の位置が考慮される。このコンフィギュレーションでは、単一の、固有のプローブは、所与の長さのプローブが第1および第2の制限酵素認識部位間に設計されるのに十分離れた距離に、最も近い第2の制限酵素認識部位を有する第1の制限酵素により消化される部位の、各側にのみ設計される。このコンフィギュレーションでは、例えば、プローブは、同じ側の10bp以内に第2の制限酵素認識部位を有する特定の第1の制限酵素の側に、設計されることはない。
【０２２４】
別のコンフィギュレーションでは、アレイ上のプローブは、これらが、第1の制限酵素により消化される部位のどちらかの側でハイブリダイズできるように設計される。適切には、第1の制限酵素認識部位の各側で単一のプローブが使用されうる。
【０２２５】
さらに別のコンフィギュレーションでは、2つ以上のプローブ(例えば、3、4、5、6、7または8以上)は、第1の制限酵素認識部位の各側に設計することができる。これは、次いで、同じライゲーション事象を調べるのに使用することができる。各第1の制限酵素認識部位に関連したプローブの数および位置に関しては、近隣の第2の制限酵素認識部位の正確なゲノム位置が考慮されうる。
【０２２６】
さらに別のコンフィギュレーションでは、2つ以上のプローブ(例えば、3、4、5、6、7または8以上)は、最も近い第2の制限酵素認識部位とは無関係に、各第1の制限酵素認識部位の近くに設計することができる。このコンフィギュレーションでは、プローブはすべて、第1の制限酵素認識部位に依然として近接しているはずである(好ましくは、制限部位の300bp以内)。
【０２２７】
有利には、後者の設計、および第1の制限酵素認識部位(の側)毎に1プローブを使用する設計もまた、所与の第1の制限酵素を併用した、異なる第2の制限酵素の使用を可能にする。
【０２２８】
有利には、第1の制限酵素認識部位毎に複数(例えば、2、3、4、5、6、7または8以上)のプローブを使用することは、個々のプローブのパフォーマンスの低さにより偽陰性結果が生まれる問題を最小限にすることができる。さらに、これはまた、単一チップ実験で得られたデータの信頼性を向上させ、統計的に健全な結果を引き出すのに必要なアレイ数を減らすこともできる。
【０２２９】
アレイに使用するプローブは、40ヌクレオチド長を超えてよく、等温であってよい。
【０２３０】
好ましくは、反復DNA配列を含有するプローブは、除外される。
【０２３１】
第1のヌクレオチド配列に隣接するまたは近接する制限部位を診断するプローブは、きわめて強力なハイブリダイゼーションシグナルをもたらすと予測され、これもまたプローブ設計から除外されうる。
【０２３２】
アレイは、哺乳類を含む(例えば、ヒト、マウス(例えば、第7染色体))、脊椎動物(例えば、ゼブラフィッシュ)、または非脊椎動物(例えば、細菌、酵母、真菌または昆虫(例えば、ショウジョウバエ))のゲノムを含む、いずれかのゲノムを含んでよい。
【０２３３】
さらなる好ましい実施形態では、アレイは、各固有の第1の制限認識部位の付近、および制限酵素消化部位にできるだけ近接して、2〜6プローブを含有する。
【０２３４】
好ましくは、制限酵素消化部位からの最大距離は、約300bpである。
【０２３５】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、哺乳類または非哺乳類ゲノムを含む、HindIII、EcoRI、BglIIおよびNotIなどの制限酵素のためのアレイが提供される。有利には、本明細書に記載のアレイ設計は、解析が同じ種で行われるならば、標的配列毎にアレイを再設計する必要を回避する。
【０２３６】
プローブセット
本明細書では、用語「プローブセット」とは、ゲノムにおける第1の制限酵素の第1の制限酵素認識部位の各々にハイブリダイズする一組のまたは一群のプローブを言う。
【０２３７】
したがって、さらなる態様では、ゲノムDNAにおける第1の制限酵素の第1の制限酵素認識部位の各々に隣接する核酸配列に対し、順次相補的なプローブセットが提供される。
【０２３８】
適切には、プローブセットは、ゲノムDNAにおける第1の制限酵素認識部位の各々に隣接する最初の25〜60(例えば、35〜60、45〜60、または50〜60)以上のヌクレオチドに対し、順次相補的である。プローブセットは、第1の制限酵素認識部位の片(例えば、どちらか一方の)側または両側に対し、順次相補的であってよい。したがって、プローブは、ゲノムDNAにおける第1の制限酵素の第1の制限酵素認識部位の各々の各側に隣接する核酸配列に対し、順次相補的であってよい。
【０２３９】
セットのための1つまたは複数のプローブを設計することができるウィンドウ(例えば、第1の制限酵素認識部位から300bp以下、例えば、250bp、200bp、150bpまたは100bp)を既定することも可能である。プローブを設計するための範囲内にあるウィンドウを決めるのに重要な因子は、例えば、GC含量、ヘアピン構造を形成することができるパリンドローム配列の不在、1種類のヌクレオチドの伸長に対する最大サイズなどである。したがって、プローブセットは、ゲノムDNAにおける第1の制限酵素認識部位の各々から300bp未満である核酸配列に対し、順次相補的であることができる。
【０２４０】
各制限部位付近の最適なプローブを特定するため、第1の制限酵素認識部位から約100bpのウィンドウを決めることも可能である。
【０２４１】
本発明のさらなる実施形態では、プローブセットは、ゲノムDNAにおける第1の制限酵素認識部位の各々から300bp未満である配列に相補的であり、ゲノムDNAにおける第1の制限酵素認識部位の各々から200bpおよび300bpの間である配列に相補的であり、および/またはゲノムDNAにおける第1の制限酵素認識部位の各々から100bpおよび200bpの間である配列に相補的である。
【０２４２】
本発明のさらなる実施形態では、プローブセットは、ゲノムDNAにおける第1の制限酵素認識部位の各々から0〜300bpである配列に相補的であり、ゲノムDNAにおける第1の制限酵素認識部位の各々から0〜200bpである配列に相補的であり、および/またはゲノムDNAにおける第1の制限酵素認識部位の各々から0bpおよび100bpの間(例えば、ゲノムDNAにおける第1の制限酵素認識部位の各々から約10、20、30、40、50、60、70、80または90bp)である配列に相補的である。
【０２４３】
ゲノムDNAにおける第1の制限酵素の各第1の制限酵素認識部位に隣接する配列にハイブリダイズすることができる2つ以上のプローブも、設計することができる。
【０２４４】
プローブは重複、または一部重複していてよい。プローブが重複している場合、重複は、好ましくは、10ヌクレオチド未満である。
【０２４５】
各第1の制限酵素認識部位に隣接する最初の1〜300ヌクレオチド(例えば、1〜20、1〜40、1〜60、1〜80、1〜100、1〜120、1〜140、1〜160、1〜180、1〜200、1〜220、1〜240、1〜260または1〜280ヌクレオチド)を表すPCR断片も、使用することができる。
【０２４６】
PCR断片は、第1の制限酵素認識部位、および最初に隣接する第2の制限酵素認識部位に隣接される各ゲノム部位と正確に一致するプローブとして使用することもできる。したがって、プローブ配列は、第1の制限酵素認識部位の各々と、最初に隣接する第2の制限酵素認識部位の各々との間の配列のすべてまたは一部に一致しうる。
【０２４７】
典型的には、プローブ、プローブアレイまたはプローブセットは、支持体に固定化されるであろう。支持体(例えば、固体支持体)は、ガラス、シリカ、プラスチック、ナイロンまたはニトロセルロースなどの様々な材料から作製することができる。支持体は、好ましくは剛性であり、平面を有する。支持体は、典型的には、約1〜10,000,000離散した空間的に応答可能な領域、またはセルを有する。約10〜1,000,000または約100〜100,000または約1000〜100,000セルを有する支持体が、一般的である。セル密度は、典型的には、1平方センチメートル内に少なくとも約1000、10,000、100,000または1,000,000セルである。他の支持体では、プールされたプローブ混合物またはプローブセットで占められているセルもあれば、少なくとも合成方法により得ることができる純度まで、1種類のオリゴヌクレオチドにより占められているセルもある。
【０２４８】
好ましくは、本明細書に記載のアレイは、第1の制限酵素認識部位毎に1を超えるプローブを有し、6bpの場合、切断制限酵素は、例えば、ヒトまたはマウスゲノムにつき約750,000回存在する。
【０２４９】
>6bp認識配列を認識する制限酵素では、各制限部位の各側に1プローブを有し、例えば、完全なヒトまたはマウスのゲノムを含むのに、約2×750,000プローブの単一アレイが使用されうる。
【０２５０】
好ましいアレイ設計では、アレイ上に存在する所与のヌクレオチド配列のプローブ分子の合計数は、このようなアレイにハイブリダイズされる4C鋳型に存在する相同断片に対し、過剰である。4C技術の性質から、線状クロマチン鋳型上の解析されるヌクレオチド配列に近接したゲノム領域を表す断片は、4Cハイブリダイゼーション試料においては過剰となろう(図2に記載の通り)。こうした豊富な断片のハイブリダイゼーション効率に関する定量的情報を得るには、ハイブリダイズされる試料量を減らし、および/またはアレイ上の所与のオリゴヌクレオチド配列プローブの分子数を増やす必要がありうる。
【０２５１】
故に、例えば、遺伝子プロモーターエレメントに頻繁に接触する調節DNAエレメントの検出には、選択されたゲノム領域(例えば、約0.5〜10Mb)のみを表すプローブを有するが、各固有のプローブがアレイ上の複数(例えば、約100、200、1000)箇所に存在しているアレイを使用する必要がありうる。このような設計は、部位(例えば、目的とする遺伝子)周辺の局所(例えば、約10Mb以内)の欠失、逆位、重複などのゲノム再編成を検出する診断目的にも好まれうる。
【０２５２】
アレイは、約3×750,000プローブ、4×750,000プローブ、5×750,000プローブ、または好ましくは、6×750,000プローブを含む。より好ましくは、アレイは、各制限部位の各側に2、3、4、5、6、7または8以上のプローブを有する6×750,000プローブを含む。最も好ましくは、アレイは、各制限部位の各側に3プローブを有する6×750,000プローブを含む。
【０２５３】
プローブセットまたはプローブアレイは、支持体上で段階的に合成されてよく、または前合成形態で付加することができる。合成の1つの方法は、VLSIPS.TM.(米国特許第5,143,854号およびEP476,014に記載)である。これは、高密度の、小型アレイにおいてオリゴヌクレオチドプローブの合成を導く光の使用を伴う。合成サイクル回数を減らすマスク設計のアルゴリズムは、米国特許第5,571,639号および米国特許第5,593,839号に記載されている。アレイは、EP624,059に記載されているように、機械的に制約された流出経路により、モノマーを支持体の細胞に送達するコンビナトリアル方法で合成することもできる。アレイは、インクジェットプリンターを用いてスポッティング試薬で支持体上に合成することもできる(例えば、EP728,520参照)。
【０２５４】
本発明の関連では、用語「実質的なプローブセット」「実質的なプローブアレイ」は、プローブセットまたはプローブアレイが、完全なプローブセットまたはプローブアレイの少なくとも約50、60、70、80、90、95、96、97、98または99%を含むことを意味する。好ましくは、プローブセットまたはプローブアレイは、完全なプローブセット(すなわち、100%)である。
【０２５５】
好ましい実施形態では、アレイは、所与のゲノムに存在する各第1の制限酵素認識部位の側毎に、単一の固有なプローブを含む。このプローブ数が、単一のアレイに含有されうるプローブ数を超える場合、アレイは、例えば、アレイ上に存在する線状染色体鋳型上に順に並んだ2、3、4、5、6、7、8、9、10、102、103または104などのプローブ毎に1つのプローブを有し、低解像度ではあるが、好ましくは所与の種の完全ゲノムの表示を依然として含有しうる。完全なヒト、または他の、ゲノムを準最適な解像度で含むようなアレイは、例えば、転座パートナーを見出す場合、同じゲノムの一部を含む高解像度のアレイよりも好ましい場合がある。
【０２５６】
好ましくは、低解像度での所与の種の完全ゲノムの表示は、それぞれが、第1の制限酵素による消化後に得られた単一の制限断片を表すアレイ上のプローブにより得られる。好ましくは、これは、同じ制限断片にハイブリダイズする、2番目、3番目、4番目、5番目、6番目、7番目、8番目、9番目、10番目、20番目、30番目、40番目、50番目、60番目、70番目、80番目、90番目または100番目等毎のプローブをすべて無視することで得られる。
【０２５７】
好ましくは、低解像度での所与の種の完全ゲノムの表示は、線状染色体鋳型に沿って等しく分布したプローブを含む。好ましくは、これは、最も高いプローブ密度を示すようなゲノム領域の1つまたは複数のプローブを無視することで得られる。
【０２５８】
ハイブリダイゼーション
本明細書では、用語「ハイブリダイゼーション」には、「核酸の一本鎖が、塩基対合を介して相補鎖と一緒になるプロセス」のほか、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術において実施される増幅プロセスが当然含まれる。
【０２５９】
選択的ハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド配列は、一般に、少なくとも20、好ましくは少なくとも25または30、例えば少なくとも40、60または100以上の連続ヌクレオチド領域上の対応する相補的ヌクレオチド配列と、少なくとも75%、好ましくは少なくとも85または90%、およびより好ましくは少なくとも95%または98%相同となろう。
【０２６０】
「特異的ハイブリダイゼーション」とは、ストリンジェントな条件下(例えば、65℃および0.1×SSC{1×SSC=0.15M NaCl、0.015M Na-クエン酸 pH7.0})、特定のヌクレオチド配列に対してのみの分子の結合、重複、またはハイブリダイゼーションを言う。ストリンジェントな条件は、プローブが、この標的配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしないであろう条件である。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる環境においては異なる。より長い配列は、具体的には高温でハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびpHでの特定の配列の融点温度(Tm)よりも約5℃低くなるように選択される。Tmは、標的配列に相補的なプローブの50%が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度(既定されたイオン強度、pH、および核酸濃度下の)である。(標的配列は、一般に、Tmでは、過剰に存在するため、プローブの50%は、平衡状態で占められる)。典型的には、ストリンジェントな条件には、pH7.0から8.3で少なくとも約0.01から1.0MのNaイオン濃度(または他の塩)の塩濃度が含まれ、および温度は、短いプローブに対し少なくとも約30℃である。ストリンジェントな条件は、(ホルムアルデヒドまたはテトラアルキルアンモニウム塩などの脱安定剤の添加により達成することもできる。
【０２６１】
当業者には明らかなように、最大ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、同一のヌクレオチド配列を同定または検出するのに使用することができるのに対し、中(または低)ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、類似のまたは関連したポリヌクレオチド配列を同定または検出するのに使用することができる。
【０２６２】
方法は、プローブアレイの、標識または非標識ヌクレオチド配列へのハイブリダイゼーションについても記載されている。特定のハイブリダイゼーション反応条件は、ハイブリダイゼーションを変更する(例えば、プローブ/標的の結合ストリンジェンシーを増加または減少させる)のに調節することができる。例えば、反応温度、陰イオンおよび陽イオンの濃度、界面活性剤の添加などはすべて、アレイプローブおよび標的分子のハイブリダイゼーション特性を変更することができる。
【０２６３】
相互作用頻度
制限断片のライゲーション頻度の定量は、制限断片の架橋頻度の指標をもたらす。適切には、これは、Splinter et al. (2004)(上述)により記載された、従来の3C技術で使用されるようなPCRを用いて達成することができる。簡単には、PCR産物の形成は、エチジウムブロマイド染色されたアガロースゲルでの単離後、シグナル相互作用をTyphoon 9200撮像装置(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)によりスキャンして測定することができる。適切には、いくつかの対照が、同じくSplinter et al. (2004)(上述)に記載されているように、データの正しい解釈のため使用されうる。
【０２６４】
本明細書に記載の4C技術は、核内空間における2つ以上のヌクレオチド配列の相互作用頻度のハイスループット解析を提供するため、制限断片のライゲーション頻度は、本明細書に記載のアレイにより定量化されることが好ましい。
【０２６５】
定量では、4C試料で得られたシグナルは、対照試料で得られたシグナルに対し正規化することができる。4C試料および対照試料は、様々な識別可能標識(例えば、色素)で標識され、アレイに同時にハイブリダイズされる。対照試料は、典型的には、すべてのDNA断片(すなわち、第1(標的)のヌクレオチド配列にライゲーションされている可能性のあるすべての第2のヌクレオチド配列)を、等モル量で含有し、およびハイブリダイゼーション効率の偏りを除外するため、これらは、第2のヌクレオチド配列に類似したサイズとなるべきである。故に、対照鋳型は、典型的には、第1および第2の制限酵素の両方で消化され、4C鋳型と同じ方法(例えば、ランダムプライミング)で標識される、ゲノムDNA(4C鋳型を得るのに使用されるのと同じ遺伝的背景の)を含有するであろう。このような対照鋳型は、ハイブリダイゼーション効率のプローブ間の差を是正できるようにする。試料アレイシグナルに対し4Cシグナルを正規化することは、ランダム事象に比べ濃縮の観点から結果を表せるようにする。
【０２６６】
標識された4C鋳型は、特異的に標識された対照試料の有無、および1つまたは複数の特異的に標識された他の4C鋳型の有無に関わらず、アレイにハイブリダイズすることもできる。他の4C鋳型は、この4C鋳型とは無関係でありえ、例えば、この4C鋳型は、異なる組織から得られてよく、および/または異なる逆PCRプライマーセットにより得られてよい。例えば、第1の4C鋳型は、患者材料であってよく、第2の4C鋳型は、健常被験体または対照試料由来であってよい。
【０２６７】
ゲノム再編成に期待されるべき顕著なハイブリダイゼーションパターンを前提にすると、罹患被験体を健常被験体と必ずしも比較する必要はないであろう。したがって、複数(例えば、2つ以上)の4C鋳型は、同じ患者または被験体由来の異なる遺伝子座をインタロゲートする各々が、1つ(例えば、1つまたは複数の)アレイにハイブリダイズされてよい。
【０２６８】
4C鋳型は、特異的に標識されてよく(例えば、2色または多色ハイブリダイゼーションで)、および/または転座が、通常、異なる染色体上にある、もしくはDNA-DNA相互作用シグナル間の最小限の重複には十分遠く離れた同じ染色体上にあるような場合は、同一に標識されてよい。例えば、T-細胞白血病を伴う被験体由来の材料は、(転座を検出するため、1色で標識された)TCRα/δ、および(他の遺伝的再編成を検出するため、それぞれが同じ2番目の色で標識された)MLL、TAL1、HOX11およびLMO2の4C鋳型を得るために処理されうる。これらの5つの4C鋳型は、1つのアレイにハイブリダイズすることができる。これは、疾患に関連したゲノム再編成について、複数の転座での同時解析を可能にするであろう。
【０２６９】
相互作用頻度の定量では、絶対シグナル強度または対照試料と比べたシグナル比を、検討することもできる。さらに、線状染色体鋳型上で隣接するプローブのシグナルは、相互作用している染色体領域を同定するのに使用することができる。こうした位置情報は、好ましくは、プローブを線状染色体鋳型に並べ、およびスライディングウィンドウアプローチにより、例えば、実施平均(running mean)または実施中央値(running median)アプローチを用いて、絶対シグナル強度、または対照試料シグナルと比べたシグナル比を解析して、解析される。
【０２７０】
アッセイ方法
本発明のさらなる態様では、DNA-DNA相互作用を調節する1つまたは複数の剤を同定するためのアッセイ方法を提供する。
【０２７１】
本明細書中に使用されるように、用語「調節する」は、DNA-DNA相互作用を阻止する、減少させる、抑制する、回復させる、上昇させる、増加させる、または影響を与えることを言う。
【０２７２】
場合により、2つ以上の剤を、DNA-DNA相互作用を調節する際に使用するために共に評価することが望ましいかもしれない。これらの場合では、第1の剤と同時にまたはその後に上記付加的な剤(複数可)を加えることにより、アッセイを容易に修飾することが可能である。
【０２７３】
本発明の方法はまたスクリーニングであってよく、それによって、多くの剤が、DNA-DNA相互作用の活性の調節について試験される。
【０２７４】
本発明のアッセイ方法は、剤の小規模なスクリーニングおよび大規模なスクリーニングの両方ならびに定量アッセイに適しているであろうということが期待される。
【０２７５】
上記治療薬の医学的使用は、剤開発プログラム自体および上記剤を含む医薬組成物のように本発明の範囲内にある。剤開発プログラムは、例えば、本明細書中に記載される方法により同定したまたは同定可能な剤を利用すること、任意選択で薬を修飾すること(例えば、その構造を修飾することおよび/または上述の成分を含む新規な組成物を提供すること)、ならびにさらなる研究(例えば、毒性研究および/または活性、構造、もしくは機能に関する研究)を実施することを含んでいてもよい。治験を非ヒト動物に対して実施してもよく、最終的にヒトに実施してもよい。上記治験は、異なる投薬レベルの効果(複数可)を決定することを一般に含むであろう。剤開発プログラムは、スクリーニングにより同定された成分を分析するためにコンピュータを利用してもよい(例えば、構造および/または機能を予測する、可能性として考えられるアゴニストまたはアンタゴニストを同定する、類似する構造または機能を有している可能性がある他の成分を調査する等のために)。
【０２７６】
診断試験
現在、様々なゲノム再編成は、利用可能な分子細胞遺伝学的手法により検出するのが困難なままである。アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション法(アレイ-CGH)は、染色体の増幅および/または欠失を35〜300Kbの解像度で検出するための新規に開発された手法であるが、この手法は、平衡転座および染色体逆位を検出するのに適していない。他方、スペクトル核型分析(SKY)または従来の核型分析は、染色体の転座および数的変化の検出のために患者材料に対して実施することが多いが、転座ブレイクポイントを明示するための解像度が低く、通常、それぞれ10〜50Mbおよび5〜10Mbである。結果的に、両方の方法、特にSKYにより得られた結果は、時間浪費ならびに蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)および分子ブレイクポイントクローニング戦略のような労働集約的な確証実験につながるであろう。
【０２７７】
4C技術は、物理的に結合したDNA配列間の変化した相互作用頻度に基づき、任意の染色体再配列を検出することができる手順を含んでいる。したがって、4C技術は、ほとんどのヒト悪性腫瘍/多発性先天奇形または精神遅滞についての(頻発する)染色体再配列の同定に有用である。4C技術の重要な利点は、わずか数千の塩基対の領域に対する、ブレイクポイントの非常に正確なマッピングを可能にすることである。4C技術の他の利点は、4C-ベイト配列がブレイクポイントから1〜5Mb離れて位置する場合でさえもブレイクポイントが検出可能となるので、ブレイクポイントの正確な位置について予備知識が必要とされないことである。これはまた、同じベイト配列を、広大なブレイクポイントエリアにわたる特異的な染色体再配列の検出に使用することができるといった利点も有している。4C技術によるゲノム再編成の正確なマッピングは、疾患または遺伝的障害の根底にある異常に発現した遺伝子(複数可)の同定を著しく容易にするであろうし、このマッピングは、重要なことには、遺伝子型と表現型の相関についてより理解するのに貢献し、治療意思決定を援助し、重要な予後予測情報を補足するであろう。
【０２７８】
本発明の一実施形態では、疾患の診断または予後についての基準を提供するために、被験体からの正常値または標準値を確定する。これは、動物またはヒト等の正常被験体から取り出した試料を試験することにより達成されてもよい。DNA-DNA相互作用の頻度は、試料を陽性対照の希釈系と比較することにより定量化してもよい。次いで、正常試料から得た標準値を、疾患または障害に冒されたまたは冒された可能性のある被験体からの試料から得た値と比較してもよい。標準値および被験体の値の間の偏差は疾患状態の存在を確定する。
【０２７９】
特定の療法治療計画の有効性を評価するために上記診断アッセイを調整してもよく、動物研究、臨床治験、または個々の患者の治療の監視に使用してもよい。疾患の診断についての基準を提供するために、DNA-DNA相互作用についての正常プロファイルまたは標準プロファイルを確定してもよい。正常試料から得た標準値を、障害または疾患に冒された可能性のある被験体からの試料から得た値と比較してもよい。標準値および被験体の値の間の偏差は疾患状態の存在を確定する。疾患を確定する場合、既存の治療薬を投与してもよく、治療プロファイルまたは治療値を生成してもよい。最終的に、値が正常パターンまたは標準パターンに進むまたは戻るかどうかを評価するために定期的に方法を繰り返してもよい。数日または数ヶ月の期間にわたる治療の有効性を示すために治療プロファイルを継続して使用してもよい。
【０２８０】
4C技術は、分析するヌクレオチド配列に対してシスで結合した少なくとも5MbのゲノムDNAを正確に検出する(図2〜3および5を参照)。有利に、再配列した配列および好ましい4C配列(ベイト)の間のゲノム部位の分離における変化が伴う任意のゲノム異常を検出するために4C技術を使用してもよい。上記変化は、例えば、ゲノム部位の分離の増加もしくは減少であってもよくまたは4C配列(ベイト)に近位の(例えば、15Mbまでもしくは15Mbを超える)配列の過少表現(欠失などの場合)もしくは過剰表現(重複などの場合)であってもよい。通常、上記ゲノム異常またはゲノム再編成は、癌(例えば白血病)および本明細書中に記載されるような他の遺伝的疾患または先天性疾患等の疾患の原因であるまたはそれに関連する。
【０２８１】
遺伝子異常(例えば、平衡および/または不平衡なゲノム異常または染色体異常等のゲノム異常または染色体異常)は、核酸(例えば染色体)の再配列、転座、逆位、挿入、欠失、および他の変異、さらに染色体の一部または全体の損失または獲得を含むが、これらに限定されない。それらは、悪性腫瘍等の先天性障害および後天性疾患を含む遺伝的障害または遺伝的疾患の主な原因である。多く再配列では、2つの異なる染色体が関与している。この場合、正常な生理的環境の特定の染色体から遺伝子(または遺伝子の断片)が除去され、関連しない遺伝子または遺伝子の断片(癌遺伝子または癌原遺伝子であることが多い)に隣接する受入染色体に配置される。
【０２８２】
悪性腫瘍は、急性白血病、悪性リンパ腫、および固形腫瘍を含みうる。変更の非限定的な例は、NHLで頻繁に発生するt(14;18)、小児期前駆B-ALLで頻繁に見つけられるt(12;21)、および急性白血病における11q23(MLL(骨髄性リンパ性白血病または混合系統白血病)遺伝子)異常の存在である。
【０２８３】
染色体テリトリー11q23におけるMLL遺伝子は、ALLおよび急性骨髄性白血病(AML)の両方におけるいくつかの転座に関与している。現在まで、少なくとも10個の相手遺伝子が同定された。t(4;11)(q21;q23)、t(11;19)(q23;p13)、およびt(1;11)(p32;q23)等のこれらの転座のいくつかは主にALLで発生するが、t(1;11)(q21;q23)、t(2;11)(p21;q23)、t(6;11)(q27;q23)、およびt(9;11)(p22;q23)のような他の転座は、AMLで観察されることがより多い。11q23領域を含む再配列は、小児急性白血病で非常に頻繁に発生し(約60〜70%)、より低率であるが小児期および成人の白血病(各約5%)において発生する。
【０２８４】
リンパ性悪性腫瘍における再配列は、Ig遺伝子またはTCR遺伝子に関与することが多い。例として、バーキットリンパ腫で見つけられる転座の3型(t(8;14)、t(2;8)、およびt(8;22))が挙げられ、MYC遺伝子は、Ig重鎖(IGH)、Igカッパ(IGK)、またはIgラムダ(IGL)の遺伝子セグメントにそれぞれ連関する。この分類における転座の他の一般的な型は、主なNHL型の1つである濾胞性リンパ腫の約90%に観察されるt(14;18)(q32; q21)である。この転座では、BCL2遺伝子が、JH遺伝子セグメント内のまたはそれに隣接するIGH座内の領域に再配列する。この染色体異常の結果として、プログラム細胞死を阻害することにより増殖調節における生存因子としての役割を果たすBCL2タンパク質が過剰発現する。
【０２８５】
BCL2遺伝子は3つのエキソンからなるが、これらは広大なエリアに散在している。これらのうち、最後のエキソンは広大な3'非翻訳領域(3'UTR)をコードしている。この3'UTRは、多くのt(14;18)ブレイクポイントがクラスター形成している2つの領域のうちの1つであり、「主なブレイクポイント領域」と呼ばれており、t(14;18)転座に関与する他のブレイクポイント領域は、BCL2座の20〜30kb下流に位置し、「小さなクラスター領域」と呼ばれている。3番目のBCL2ブレイクポイントエリアであるVCR(変異クラスター領域)はBCL2座の5'側に位置し、変異転座、つまりt(2;18)およびt(18;22)に関与する他のブレイクポイントエリアの間にあり、IGK遺伝子セグメントおよびIGL遺伝子セグメントが相手遺伝子である。
【０２８６】
したがって、例として、4C技術は、所与の臨床表現型とのそれらのよくある関連に基づいて選択された座の近くまたは座における遺伝子異常についての患者材料のスクリーニングに適用することができる。上記座のさらなる非限定的な例は、AML1、MLL、MYC、BCL、BCR、ABL1、免疫グロブリン座、LYL1、TAL1、TAL2、LMO2、TCRα/δ、TCRβ、HOX、および様々なリンパ芽球性白血病における他の座である。
【０２８７】
有利にも、遺伝子異常が疑われた場合、4C技術は、本明細書中に説明されるように異常の存在を確認し、マッピングするための最初の唯一のスクリーニングとして適用することができる。
【０２８８】
ゲノム再編成の検出
本発明の特に好ましい実施形態では、本明細書中に記載される方法はゲノム再編成の検出に使用することができる。
【０２８９】
現在、転座ブレイクポイント等のゲノム再編成は検出するのが非常に困難である。例えば、比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)マイクロアレイはいくつかの型の再配列を検出することができるが、転座を検出することはできない。患者において転座が疑われ、相手の染色体が知られていない場合、転座相手を見つけて、ブレイクポイント位置のおおよその推定値を得るためにスペクトル核型分析(SKY)を実施してもよい。しかしながら、解像度は非常に乏しく(通常、約50Mbよりも優れてはいない)、付加的な詳細マッピング(時間浪費であるのみならず高価である)が通常必要とされる。これは、通常、なおまた限られた解像度しか提供しない蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)を使用して行われる。FISHを使用すると、ブレイクポイントは、最大の解像度で±50kbの領域に位置づけることができる。
【０２９０】
DNA-DNA相互作用頻度は本来、ゲノム部位の分離関数である、つまり、DNA-DNA相互作用頻度は、同一の物理的なDNA鋳型上に存在する2つのDNA座の間の直線距離(キロ塩基で)に反比例する(Dekker et al., 2002)。したがって、1つまたは複数の新しい物理的なDNA鋳型を作成する転座は、ブレイクポイントの近くのDNA-DNA相互作用の変更が伴い、これは4C技術により測定することができる。転座が、傷ついた染色体(DNA)腕の物理的な結合(相互作用)の結果であるように、転座に基づく疾患は、通常、異常なDNA-DNA相互作用により引き起こされる。
【０２９１】
したがって、転座の検出については、4C技術を使用して、病気にかかっている被験体および病気にかかっていない被験体の間で異なるそれらのDNA-DNA相互作用を同定してもよい。
【０２９２】
例として、4C技術は、本明細書中に記載されるような所与の臨床表現型とのそれらのよくある関連に基づいて選択された座の近くの転座についての患者材料のスクリーニングに適用することができる。
【０２９３】
転座が患者において疑われるが、相手の染色体が知られていない場合、スペクトル核型分析(SKY)のような現在利用可能な方法を使用して最初にマッピングを実施してもよい。これにより転座相手を同定し、ブレイクポイント位置の非常におおまかな推定値が提供されてもよい(通常、解像度は約50Mbよりも優れてはいない)。次いで、例えば、2Mb、5Mb、10Mb、20Mb(または本明細書中に記載されるような他の間隔)毎に位置したこの領域における「ベイト」配列を使用して4C技術を適用し、ブレイクポイントを詳細にマッピングし、例えば転座の結果として誤って発現した遺伝子(複数可)を同定することができる。
【０２９４】
通常、転座は、4C-ベイト配列を含んでいる染色体以外の染色体または同一の染色体上の他のところにおける低度の相互作用頻度から高度の相互作用頻度への突然の移行として同定されるであろう。
【０２９５】
好ましい実施形態では、被験体からの試料は前癌状態にある。
【０２９６】
好ましい実施形態では、被験体からの試料は、出生前診断のための羊水穿刺により得られた培養されたまたは無培養の羊膜細胞からなる。
【０２９７】
好ましいアレイ設計では、単一のアレイ上に存在するプローブは、最大の解像度で所与の種の完全なゲノムを表示する。したがって、4C技術により転座等を検出するためのアレイは、所与の種(例えばヒト)のゲノムにおけるすべての第1の制限酵素認識部位のすべての側面に相補的な本明細書中に記載されるようなプローブを含む。
【０２９８】
他の好ましい設計では、単一のアレイ上に存在するプローブは、所与の種の完全なゲノムを表現するが、最大の解像度ではない。したがって、4C技術により転座等を検出するためのアレイは、所与の種(例えばヒト)のゲノムにおけるすべての第1の制限酵素認識部位の一方の側面のみに相補的な本明細書中に記載されるようなプローブを含む。
【０２９９】
他の好ましい設計では、単一のアレイ上に存在するプローブは、所与の種の完全なゲノムを表現するが、最大の解像度ではない。したがって、4Cの技術により転座、欠失、逆位、重複、および他のゲノム再編成を検出するためのアレイは、所与の種(例えばヒト)のゲノムの線状の鋳型に沿って順序づけられるようなすべての他の第1の制限酵素認識部位の一方の側面に相補的な本明細書中に記載されるようなプローブを含む。
【０３００】
したがって、4C技術により転座、欠失、逆位、重複、および他のゲノム再編成を検出するためのアレイは、第1の制限酵素での消化後に得られるような単一の制限断片をそれぞれ表現する本明細書中に記載されるようなプローブを含む。好ましくは、これは、すべての第2の、第3の、第4の、第5の、第6の、第7の、第8の、第9の、第10の、第20の、第30の、第40の、第50の、第60の、第70の、第80の、第90の、または第100等の同一の制限断片にハイブリダイズするプローブを無視することにより得られる。4C技術により転座、欠失、逆位、重複、および他のゲノム再編成を検出するためのアレイは、線状の染色体鋳型に沿って均等に分布した本明細書中に記載されるようなプローブを含んでいてもよい。好ましくは、これは、最も高度なプローブ密度を示すそれらのゲノム領域における1つまたは複数のプローブを無視することにより得られる。
【０３０１】
他の好ましい設計では、単一のアレイ上に存在するプローブは、所与の種の完全なゲノムを表現するが、最大の解像度ではない。したがって、4C技術により転座、欠失、逆位、重複、および他のゲノム再編成を検出するためのアレイは、所与の種(例えばヒト)のゲノムの線状の鋳型に沿って順序づけられるような、すべての第3の、第4の、第5の、第6の、第7の、第8の、第9の、第10の、第20の、第30の、第40の、第50の、第60の、第70の、第80の、第90の、または第100等の第1の制限酵素認識部位の一方の側面に相補的な本明細書中に記載されるようなプローブを含む。 4C技術により転座、欠失、逆位、重複、および他のゲノム再編成を検出するためのアレイは、完全なゲノムを表現するが100キロ塩基毎の単一のプローブである本明細書中に記載されるようなプローブを含んでいてもよい。4C技術により転座、欠失、逆位、重複、および他のゲノム再編成を検出するためのアレイは、唯一のプローブ配列により表現することができるゲノムにおけるすべての単一の第1の制限酵素認識部位を表現する本明細書中に記載されるようなプローブを含んでいてもよい。
【０３０２】
他の好ましいアレイ設計では、単一のアレイ上の本明細書中に記載されるようなプローブは、転座、欠失、逆位、重複、および他のゲノム再編成に関与することで知られているすべての座の周囲の約50kb、100kb、200kb、300kb、400kb、500kb、1Mb、2Mb、3Mb、4Mb、5Mb、6Mb、7Mb、8Mb、9Mb、または10Mb(例えば約50kb〜10Mb)等の所与のサイズのゲノム領域を表現する。
【０３０３】
他の好ましいアレイ設計では、単一のアレイ上の本明細書中に記載されるようなプローブは、転座、欠失、逆位、重複、および他のゲノム再編成に関与することで知られている座の選択物の周囲の約50kb、100kb、200kb、300kb、400kb、500kb、1Mb、2Mb、3Mb、4Mb、5Mb、6Mb、7Mb、8Mb、9Mb、または10Mb(例えば約50kb〜10Mb)等の所与のサイズのゲノム領域を表現する。選択物は、知識に基づく基準で考えることができ、例えば、選択物は、所与の型の疾患に関連する座のみを表現することができる。
【０３０４】
他の好ましいアレイ設計では、単一のアレイ上の本明細書中に記載されるようなプローブは、例えば100kb、200kb、300kb、400kb、500kb、600kb、700kb、800kb、900kb、1Mb、2Mb、3Mb、4Mb、5Mb、6Mb、7Mb、8Mb、9Mb、10Mb、20Mb、30Mb、40Mb、50Mb、60Mb、70Mb、80Mb、90Mb、または100Mb(例えば100kb〜10Mb)の1つの染色体または多数の染色体(の一部)の目的とするゲノム領域を表現し、各プローブは何倍も(例えば、10、100、1000倍)表現され、各プローブ配列でのハイブリダイゼーションシグナル強度の定量測定を可能にする。
【０３０５】
好ましい実験設計では、4C配列(ベイト)は、実際の再配列した配列(つまり転座の場合のブレイクポイント)から0kb、10kb、20kb、30kb、40kb、50kb、100kb、200kb、300kb、400kb、500kb、1Mb、2Mb、3Mb、4Mb、5Mb、6Mb、7Mb、8Mb、9Mb 10Mb、11Mb、12Mb、13Mb、14Mb、または15Mb(例えば約0〜15Mb)以上の範囲以内にある。
【０３０６】
好ましいハイブリダイゼーションでは、病気にかかっている被験体および病気にかかっていない被験体からの1つの配列(4Cベイト)で得られた2つの区別をして標識された4C鋳型が同一のアレイに同時にハイブリダイズされる。DNA-DNA相互作用の差異は、シス(4C-ベイトと同一の染色体上)およびトランス(転座相手上)におけるブレイクポイントの検出を可能にする。
【０３０７】
好ましいハイブリダイゼーションでは、病気にかかっている被験体および病気にかかっていない被験体からの1つの配列(4Cベイト)で得られた多数の区別をして標識された4C鋳型が同一のアレイに同時にハイブリダイズされる。DNA-DNA相互作用の差異は、シス(4C-ベイトと同一の染色体上)およびトランス(転座相手上)におけるブレイクポイントの検出を可能にする。
【０３０８】
有利に、マイクロアレイ上における二色分析の代わりに多色分析を利用して、単一のアレイへの2つより多くの試料の同時ハイブリダイゼーションを可能にしてもよい。したがって、多色ハイブリダイゼーションを4C技術で使用することができる。
【０３０９】
好ましいハイブリダイゼーションでは、病気にかかっている被験体からの1つの配列(4Cベイト)で得られた多数の区別をして標識された4C鋳型および病気にかかっていない被験体からの1つの区別をして標識された4C鋳型は同一のアレイに同時にハイブリダイズされる。DNA-DNA相互作用の差異は、シス(4C-ベイトと同一の染色体上)およびトランス(転座相手上)におけるブレイクポイントの検出を可能にする。
【０３１０】
他の好ましいハイブリダイゼーションでは、他の可能性として考えられる転座相手をそれぞれ表現する2つの異なる配列(4C-ベイト)で得られた病気にかかっていない同一の被験体からの2つの区別をして標識された4C鋳型が同一のアレイに同時にハイブリダイズされる。目的とする配列(4C-ベイト)を保有する染色体と無関係な染色体の線状の鋳型上に観察される強力なハイブリダイゼーションシグナルのクラスターにより転座相手染色体および転座相手上のブレイクポイントが同定されるであろう。
【０３１１】
他の好ましいハイブリダイゼーションでは、他の可能性として考えられる転座相手をそれぞれ表現する多数の異なる配列(4C-ベイト)で得られた病気にかかっていない同一の被験体からの多数の区別をして標識された4C鋳型が同一のアレイに同時にハイブリダイズされる。目的とする配列(4C-ベイト)を保有する染色体と無関係な染色体の線状の鋳型上に観察される強力なハイブリダイゼーションシグナルのクラスターにより目的とする配列についての転座相手染色体およびそのブレイクポイントが同定されるであろう。
【０３１２】
4C技術により転座、欠失、逆位、重複、および他のゲノム再編成の検出に使用される材料は、病気にかかっている被験体および/または病気にかかっていない被験体からの生細胞および/または死細胞および/または核溶解物および/または単離クロマチン等(本明細書中に記載されるような)を架橋すること(および記載されるようにさらに処理すること)により得ることができる。
【０３１３】
逆位の検出
逆位(例えば平衡な逆位)は、比較ゲノムハイブリダイゼーション手法等の方法により検出することはできないが、特に(平衡な)逆位が4C配列(ベイト)に近接する(例えば約1〜15Mbまでまたはそれ以上)場合、4C技術により検出することができる。
【０３１４】
(平衡な)逆位の検出は、病気にかかっている被験体および病気にかかっていない被験体の間で異なるそれらのDNA-DNA相互作用の同定に基づく。4C配列(ベイト)として利用される同一の染色体上の近傍の配列に対して測定されるように、逆位は、再配列した領域のすべての(しかし最も中心に位置づけられた)配列の物理的なDNA鋳型上での相対位置(キロ塩基で)を変化させるであろう。DNA-DNA相互作用頻度はゲノム部位の分離に反比例するので、病気にかかっている被験体は、病気にかかっていない被験体と比較して、再配列したゲノム領域に位置するすべてのプローブに対して逆のパターンのハイブリダイゼーション強度を生ずるであろう。それによって、4C技術は、(平衡な)逆位の位置およびサイズの同定を可能にする。
【０３１５】
本発明のこの態様によれば、好ましい特定の目的のためのアレイ設計は、逆位または他の再配列が疑われる座の周囲の約50kb、100kb、200kb、300kb、400kb、500kb、1Mb、2Mb、3Mb、4Mb、5Mb、6Mb、6Mb、7Mb、8Mb、9Mb、または10Mb(例えば50kb〜10Mb)等の所与のサイズのゲノム領域を表現する単一のアレイ上のプローブを含む。
【０３１６】
他の好ましい特定の目的のためのアレイ設計では、逆位または他の再配列が疑われる座の周囲の単一のアレイ上のプローブは、所与のサイズ(50kb、100kb、200kb、300kb、400kb、500kb、1Mb、2Mb等)のゲノム領域を表現する。シグナル強度の信頼できる定量分折については、アレイ上に存在するプローブの量は、通常、アレイにハイブリダイズする関連する断片の量に対してかなり過剰にある。したがって、アレイ上に何倍(例えば10、20、50、100、1000倍等)も存在する各プローブを有することが必要であるかもしれない。さらに、アレイにハイブリダイズする鋳型の量を滴定することが必要であるかもしれない。
【０３１７】
欠失の検出
欠失の検出は、病気にかかっている被験体および病気にかかっていない被験体の間で異なるそれらのDNA-DNA相互作用の同定に基づく。欠失は、欠失した領域の近く(例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、もしくは15Mbまたはそれ以上)に位置する4C配列(ベイト)とのDNA相互作用の欠如をもたらすであろう。これは、欠失が両方の対立遺伝子(ホモ接合)に存在する場合には、再配列した領域に位置するすべてのプローブに対するハイブリダイゼーションシグナルの完全な欠如をもたらし、欠失が一方の対立遺伝子のみ(ヘテロ接合)に存在する場合には、病気にかかっていない被験体に対する病気にかかっている被験体のシグナル強度の低下をもたらす可能性がある。欠失は、より遠位の配列を、分析される4C配列(ベイト)に対する物理的なDNA鋳型上でのより近接する近位に運び、欠失した領域を越えて直接的に位置するプローブについての強力なハイブリダイゼーションシグナルをもたらすであろう。
【０３１８】
重複(複数可)の検出
重複の検出は、病気にかかっている被験体および病気にかかっていない被験体の間で異なるそれらのDNA-DNA相互作用の同定に通常基づく。重複した領域のプローブは、対照の病気にかかっていない被験体からのシグナルと比較して、再配列した領域の近く(例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、もしくは15Mbまたはそれ以上)に位置する4C配列(ベイト)とのハイブリダイゼーションシグナルが増加するであろう。重複した領域を越えたプローブは4C配列からさらに離れ、結果的に、対照の病気にかかっていない被験体からのシグナルと比較して、ハイブリダイゼーションシグナルが減少するであろう。
【０３１９】
好ましくは、対照と比較した被験体試料に対するDNA-DNA相互作用頻度の増加または減少は重複または挿入を示す。
【０３２０】
好ましくは、対照と比較した被験体試料に対するDNA-DNA相互作用頻度の増加および/またはより遠位の領域についてのDNA-DNA相互作用頻度の低下は重複または挿入を示す。
【０３２１】
出生前診断
有利には、4C技術はまた出生前診断に使用することもできる。
【０３２２】
核酸は、当技術分野で知られている様々な方法を使用して胎児から得ることができる。例として、羊水穿刺は、羊水を得るために使用することができ、羊水から、懸濁液中の胎児の細胞を抽出し、数日間培養する(Mercier & Bresson (1995) Ann. Gnt., 38, 151-157)。次いで、細胞からの核酸を抽出することができる。絨毛膜絨毛の採取は、培養するステップを省き、羊水の採取を回避することを可能にする。これらの手法はより早期に適用してもよい(絨毛膜絨毛の採取については妊娠7週目までおよび羊水穿刺については13〜14週目まで)が、流産の危険性がわずかに増加する。
【０３２３】
臍帯のレベルでの胎児血液の直接的な採取もまた核酸を得るために使用することができるが、通常、この手法においては専門の臨床医のチームを必要とする(Donner et al. (1996) Fetal Diagn. Ther., 10, 192-199)。
【０３２４】
有利に、染色体および核酸における再配列、転座、逆位、挿入、欠失、および他の変異等の遺伝子異常(例えばゲノム異常または染色体異常)はこの段階で検出してもよい。
【０３２５】
好ましくは、第21染色体、第18染色体、第13染色体、X染色体、またはY染色体における再配列、転座、逆位、挿入、欠失、および他の変異ならびにさらに第21染色体、第18染色体、第13染色体、X染色体、またはY染色体の一部または全体の損失または獲得等の遺伝子異常(例えばゲノム異常または染色体異常)は、これらが胎児において大多数の異常の発生する染色体であるので、検出してもよい。
【０３２６】
ゲノム組込み部位の決定
4C技術はまた、多数のコピーがゲノムにおける異なる位置に挿入される場合でも(図4に記載されるように)、ウイルスおよびトランスジーン等のゲノム組込み部位の決定を可能にする。
【０３２７】
ある種の転座を獲得することに対する素因の決定
有利に、4C技術はまた、病気にかかっていない被験体に適用して、遺伝子異常に頻繁に関与する座のゲノム環境を測定することができる。このように、ある種の遺伝子異常を獲得する被験体の素因を決定することが可能である。
【０３２８】
したがって、本明細書中に記載される医学的使用の他に、本発明は診断に使用することができる。
【０３２９】
被験体
用語「被験体」は、動物およびヒト等の哺乳動物を含む。
【０３３０】
剤
剤は、有機化合物または他の化学物質であってもよい。剤は、天然または人工のいずれにせよ任意の適した供給源から得られるまたはそれにより生成される化合物であってもよい。剤は、アミノ酸分子、ポリペプチド、もしくはそれらの化学的誘導体、またはそれらの組合せであってもよい。剤はさらに、センスもしくはアンチセンス分子であってもよいポリヌクレオチド分子または抗体、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、もしくはモノクローナルヒト化抗体であってもよい。
【０３３１】
様々な戦略が、ヒト特性を有するモノクローナル抗体を生成するために開発されており、これは、抗体産生ヒト細胞株の必要性を回避する。例えば、有用なマウスモノクローナル抗体は、げっ歯類可変領域およびヒト定常領域を結合することにより「ヒト化」された(Winter, G. and Milstein, C. (1991) Nature 349, 293-299)。これは、抗体のヒト抗マウス免疫原性を低下させるが、残りの免疫原性は外来のV領域フレームワークによって維持される。さらに、抗原結合特異性は、本質的にマウスドナーの抗原結合特異性である。CDRの移植およびフレームワークの操作(EP0239400)が改善され、ヒトにおける治療上の使用に許容しうるヒト化マウス抗体を産生することが可能な抗体操作が適切に改良された。ヒト化抗体は、当技術分野でよく知られている他の方法を使用して得てもよい(例えば米国特許公開第239,400号に記載)。
【０３３２】
剤は、加水分解性の二官能性リンカーであってもよいリンカーにより実体(例えば有機分子)に結合してもよい。
【０３３３】
実体は、設計してもよく、化合物のライブラリから得てもよく、ペプチドおよび有機低分子等の他の化合物を含んでいてもよい。
【０３３４】
例として、実体は、細菌、菌類、または動物(特に哺乳類)の細胞または組織等の生体材料から作製された天然の物質、生体高分子、または抽出物、有機分子または無機分子、合成剤、半合成剤、構造的または機能的な模倣薬、ペプチド、ペプチド模倣薬、完全なタンパク質から切断されたペプチドまたは合成的に合成されたペプチド(例として、ペプチド合成機を使用してまたは組換え技術によりまたはそれらの組合せ等)、組換え剤、抗体、天然の剤または非天然の剤、融合タンパク質またはその均等物および突然変異体、誘導体、あるいはそれらの組合せであってもよい。
【０３３５】
通常、実体は有機化合物であろう。いくつかの例については、有機化合物は2つ以上のヒドロカルビル基を含むであろう。ここで、用語「ヒドロカルビル基」は、少なくともCおよびHを含む基を意味し、1つまたは複数の他の適した置換基を任意選択で含んでいてもよい。上記置換基の例は、ハロ基、アルコキシ基、ニトロ基、アルキル基、環式基等を含んでいてもよい。置換基が環式基である可能性の他に、置換基の組合せにより環式基を形成してもよい。ヒドロカルビル基が1つを超えるCを含む場合、それらの炭素は必ずしも互いに結合する必要はない。例えば、炭素のうちの少なくとも2つは適した元素または基を介して結合されてもよい。したがって、ヒドロカルビル基はヘテロ原子を含んでいてもよい。適したヘテロ原子は当業者にとって明らかであろうし、例えば、硫黄、窒素、および酸素を含む。いくつかの用途については、好ましくは、実体は少なくとも1つの環式基を含む。環式基は、融合していない多環基等の多環基であってもよい。いくつかの用途については、実体は、他のヒドロカルビル基に結合した少なくとも1つの上述の環式基を含む。
【０３３６】
実体は、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基、またはヨード基等のハロ基を含んでいてもよい。
【０３３７】
実体は、1つまたは複数のアルキル基、アルコキシ基、アルケニル基、アルキレン基、およびアルケニレン基を含んでいてもよく、それらは非分枝鎖または分枝鎖であってもよい。
【０３３８】
プロドラッグ
実体は、プロドラッグから誘導されてもよいことが当業者により十分に理解されるであろう。プロドラッグの例は、それ自体薬理活性を有していないが、ある種の例では投与されて(経口的にまたは非経口的に等)、その後、薬理学的に活性のある実体を形成するよう体内で代謝される可能性のあるある種の保護基(複数可)を含む。
【０３３９】
適したプロドラッグは、ドキソルビシン、マイトマイシン、フェノールマスタード(Phenol Mustard)、メトトレキセート、葉酸代謝拮抗薬、クロラムフェニコール、カンプトテシン、5-フルオロウラシル、シアニド、キニーネ、ジピリダモール、およびパクリタキセルを含んでいてもよいが、これらに限定されない。
【０３４０】
例えば"Design of Prodrugs" by H. Bundgaard, Elsevier, 1985に記載されるように、「プロ成分」として知られているある種の成分は剤の適切な官能基に配置されてもよいことがさらに十分に理解されるであろう。上記プロドラッグもまた本発明の範囲内に含まれる。
【０３４１】
剤は、酸付加塩または塩基塩等の薬学的に許容しうる塩またはそれらの水和物を含むそれらの溶媒和化合物の形態をしていてもよい。適した塩についての検討については、Berge et al, J. Pharm. Sci., 1977, 66, 1-19を参照。
【０３４２】
剤は他の治療特性を呈することができてもよい。
【０３４３】
剤は、1つまたは複数の他の薬学的に活性な剤と組み合わせて使用してもよい。
【０３４４】
活性な剤を組み合わせたものが投与される場合、活性な剤を組み合わせたものは同時に、個別に、または連続して投与されてもよい。
【０３４５】
立体異性体および幾何異性体
実体は、立体異性体および/または幾何異性体として存在してもよく、例えば、実体は、1つまたは複数の不斉中心および/または幾何学的中心を有していてもよく、したがって、2つ以上の立体異性体の形態および/または幾何学的な形態で存在していてもよい。本発明は、それらの実体のすべての個々の立体異性体および幾何異性体ならびにそれらの混合物の使用を企図する。
【０３４６】
医薬塩
剤は、薬学的に許容しうる塩の形態で投与されてもよい。
【０３４７】
薬学的に許容しうる塩は当業者によく知られており、例えば、Berge et al, in J.Pharm.Sci., 66, 1-19 (1977)により言及された塩を含む。適した酸付加塩は、無毒性の塩を形成する酸から形成され、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、グルコン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、およびp-トルエンスルホン酸塩を含む。
【０３４８】
1つまたは複数の酸性の成分が存在する場合、適した薬学的に許容しうる塩基付加塩は無毒性の塩を形成する塩基から形成することができ、アルミニウム塩、カルシウム塩、リチウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、亜鉛塩、およびジエタノールアミン等の薬学的に活性のあるアミンの塩を含む。
【０３４９】
剤の薬学的に許容しうる塩は、剤および所望の酸または塩基の溶液を共に適宜混合することにより容易に製造することが可能である。塩は、溶液から沈殿させて、濾過により収集するまたは溶媒の蒸発により回収してもよい。
【０３５０】
剤は、多形の形態で存在していてもよい。
【０３５１】
剤は、1つまたは複数の不斉炭素原子を含んでいてもよく、したがって、2つ以上の立体異性体の形態で存在する。剤がアルケニル基またはアルケニレン基を含んでいる場合は、シス(E)異性およびトランス(Z)異性がさらに生じるかもしれない。本発明は、剤の個々の立体異性体および適切な場合には、それらの個々の互変異性体の形態をそれらの混合物と共に含む。
【０３５２】
ジアステレオ異性体またはシス異性体およびトランス異性体の分離は従来の技術、例えば、剤または適した塩もしくはその誘導体の立体異性体混合物の分別結晶、クロマトグラフィー、またはH.P.L.C.により達成されてもよい。剤の個々の鏡像異性体はまた、対応する光学的に純粋な中間体からまたは適したキラル担体を使用した、対応するラセミ化合物のH.P.L.C.による等の分割によりまたは適した光学的に活性のある酸または塩基との対応するラセミ化合物の反応により形成されたジアステレオマー塩の分別結晶により適宜製造されてもよい。
【０３５３】
剤はまた、剤の適した同位体の変形形態またはそれらの薬学的に許容しうる塩をすべて含んでいてもよい。剤または薬学的に許容しうるその塩の同位体の変形形態は、同一の原子番号を有するが通常自然界で見つけられる原子質量とは異なる原子質量を有する原子と、少なくとも1つの原子が置換されるものとして定義される。剤および薬学的に許容しうるその塩に組み入れることができる同位体の例は、それぞれ、2H、3H、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、35S、18F、および36Cl等の水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素、および塩素の同位体を含んでいる。剤および薬学的に許容しうるその塩のある種の同位体の変形形態は、例えば、3Hまたは14C等の放射性同位体が組み入れられており、剤のおよび/または基質の組織分布研究に有用である。トリチウム化された、つまり3Hおよび炭素-14、つまり14Cの同位体は、それらの調製の容易性および検出性のために特に好まれる。さらに、重水素、つまり2H等の同位体での置換は、より顕著な代謝の安定性に起因するある種の治療上の利点、例えば、生体内での半減期の増加または投与必要量の低下をもたらす可能性があり、したがって、いくつかの状況では好ましい可能性がある。本発明の剤および薬学的に許容しうるその塩の同位体の変形形態は、一般に、適した試薬の適切な同位体の変形形態を使用して、従来の手順により製造することができる。
【０３５４】
薬学的に活性のある塩
剤は、薬学的に許容しうる塩として投与されてもよい。通常、薬学的に許容しうる塩は、適宜、所望の酸または塩基を使用することにより容易に製造することが可能である。塩は、溶液から沈殿させて、濾過により収集するまたは溶媒の蒸発により回収してもよい。
【０３５５】
化学合成方法
剤は、化学合成技術により製造してもよい。
【０３５６】
敏感な官能基は、本発明の化合物の合成中に、保護され、脱保護される必要がある可能性があることは当業者にとって明らかであろう。これは、例えば、"Protective Groups in Organic Synthesis" by T W Greene and P G M Wuts, John Wiley and Sons Inc. (1991)およびP.J.Kocienski, in "Protecting Groups", Georg Thieme Verlag (1994)に記載されるように、従来の技術により達成されてもよい。
【０３５７】
いくつかの反応の間に、存在する任意の立体中心は、例えば、塩基が、塩基に敏感な基を含む光学中心を有する基質との反応に使用される場合、ある種の状況下でラセミ化されうるという可能性がある。これは、例えばグアニル化のステップの間に可能性がある。当技術分野でよく知られているように、反応順序、状況、試薬、保護/脱保護の計画などの選択によりこのような起こりうる問題を回避することは可能なはずである。
【０３５８】
化合物および塩は従来の方法により分離され、精製されてもよい。
【０３５９】
ジアステレオマーの分離は従来の技術、例えば、式(I)の化合物または適した塩もしくはその誘導体の立体異性体混合物の分別結晶、クロマトグラフィー、またはH.P.L.C.により達成されてもよい。式(I)の化合物の個々の鏡像異性体はまた、対応する光学的に純粋な中間体からまたは適したキラル担体を使用した、対応するラセミ化合物のH.P.L.C.による等の分割によりまたは適切に光学的に活性のある酸または塩基との対応するラセミ化合物の反応により形成されたジアステレオマー塩の分別結晶により製造されてもよい。
【０３６０】
剤の全体をまたは部分的に合成するために化学的方法を使用して剤を生成してもよい。例えば、剤がペプチドを含む場合、ペプチドを固相法により合成し、樹脂から切り取り、調製用の高速液体クロマトグラフィーにより精製することができる(例えば、Creighton (1983) Proteins Structures And Molecular Principles, WH Freeman and Co, New York NY)。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはアミノ酸配列決定により確認してもよい(例えば、the Edman degradation procedure; Creighton, supra)。
【０３６１】
ペプチド阻害剤(またはその変異体、同族体、誘導体、断片、もしくは模倣体)の合成は様々な固相法を使用して実施することができ(Roberge JY et al (1995) Science 269: 202-204)、自動合成は、例えば、ABI 431 A ペプチド合成機(Perkin Elmer社)を使用し、メーカーにより提供された使用説明書に従って達成されてもよい。さらに、剤を含むアミノ酸配列は、直接合成中に変更しておよび/または化学的方法を使用して他のサブユニットからの配列またはその任意の部分と組み合わせて変異剤を生成してもよい。
【０３６２】
化学的誘導体
本明細書中で使用される用語「誘導体」または「誘導体化された」は剤の化学的修飾を含む。例示的な上記化学的修飾はハロ基、アルキル基、アシル基、またはアミノ基による水素の置換であろう。
【０３６３】
化学的修飾
剤は、これに限定されないが、化学的に修飾された剤等の修飾された剤であってもよい。
【０３６４】
剤の化学的修飾により、水素結合相互作用、電荷相互作用、疎水的相互作用、ファンデルワールス相互作用、または双極子相互作用を高めるまたは低下させてもよい。
【０３６５】
一態様では、剤は、他の化合物の開発のためのモデル(例えば鋳型)として働いてもよい。
【０３６６】
医薬組成物
さらなる態様では、本明細書中に記載されるアッセイ方法により同定され、薬学的に許容しうる担体、希釈剤、賦形剤、もしくはアジュバントおよび/またはそれらの組合せと混合される剤を含む医薬組成物が提供される。
【０３６７】
さらなる態様では、剤を含むワクチン組成物が提供される。
【０３６８】
さらなる態様では、医薬組成物を製造するための方法であって、アッセイにより同定された剤を、薬学的に許容しうる希釈剤、担体、賦形剤、もしくはアジュバントおよび/またはそれらの組合せと混合することを含む方法が提供される。
【０３６９】
さらなる態様では、疾患を阻止するおよび/または治療する方法であって、剤または医薬組成物またはワクチンを被験体に投与すること含む方法が提供される。
【０３７０】
医薬組成物は、ヒト医学および獣医学におけるヒトまたは動物の用法のためのものであってもよく、任意の1つまたは複数の薬学的に許容しうる希釈剤、担体、または賦形剤を通常含むであろう。治療上の使用についての許容しうる担体または希釈剤は医薬品技術においてよく知られており、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)に記載される。医薬品の担体、賦形剤、または希釈剤の選択は、意図した投与経路および標準的な医薬品の実施に関して選択することができる。医薬組成物は、担体、賦形剤、または希釈剤としてまたはそれに加えて、任意の適した結合剤(複数可)、滑沢剤(複数可)、懸濁化剤(複数可)、コーティング剤(複数可)、可溶化剤(複数可)を含んでいてもよい。
【０３７１】
防腐剤、安定剤、色素、および調味剤は医薬組成物中に提供されてもよい。防腐剤の例は、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびp-ヒドロキシ安息香酸のエステルを含む。酸化防止剤および懸濁化剤もまた使用してもよい。
【０３７２】
異なる送達システムに依存した異なる組成物/処方必要量があってもよい。例として、本発明の医薬組成物は、ミニポンプを使用してまたは例えば、吸入液剤もしくは吸入することができる液剤用の鼻噴霧器もしくは噴霧器のような粘膜経路によりまたは組成物が、送達のための注射可能な形態で、例えば、静脈内経路、筋肉内経路、または皮下経路により処方されて非経口的に投与するために処方されてもよい。あるいは、処方は、多くの経路で投与するために設計されてもよい。
【０３７３】
剤が、粘膜経路で胃腸粘膜を介して投与される場合、薬は、胃腸管を通過中安定であり続けることが可能であるべきであり、例えば、薬は、タンパク質分解性の分解に対して抵抗性があり、酸性pHで安定しており、胆汁の洗浄効果に対して抵抗性があるべきである。
【０３７４】
適切な場合には、医薬組成物は、吸入によって、坐剤もしくはペッサリーの形態で、皮膚パッチの使用によるローション剤、液剤、クリーム剤、軟膏剤、もしくは散布剤の形態で局所的に、デンプンもしくはラクトース等の賦形剤を含んでいる錠剤の形態で経口的に、カプセル剤もしくは膣坐剤を単独でもしくは賦形剤と混合して、または調味剤もしくは着色剤を含むエリキシル剤、液剤、もしくは懸濁液の形態で投与してもよく、あるいは医薬組成物は、非経口的に、例えば、静脈内に、筋肉内に、または皮下に注射することができる。非経口投与については、組成物は、他の物質、例えば血液と等張な液剤を作製するのに十分な塩または単糖を含んでいてもよい無菌水溶液の形態で最もよく使用されてもよい。口内投与または舌下投与については、組成物は、従来の方法で処方することができる錠剤または舐剤の形態で投与されてもよい。
【０３７５】
剤は、シクロデキストリンと組み合わせて使用してもよい。シクロデキストリンは剤分子と包接錯体および非包接錯体を形成することで知られている。剤-シクロデキストリン錯体の形成により、剤分子の溶解度、溶解速度、生物学的利用能、および/または安定性特性を修飾してもよい。剤-シクロデキストリン錯体はほとんどの剤形および投与経路に通常有用である。剤との直接的な錯体化の代わりとして、シクロデキストリンは、補助賦形剤として、例えば担体、希釈剤、または溶解剤として使用してもよい。アルファ-シクロデキストリン、ベータ-シクロデキストリン、およびガンマ-シクロデキストリンが最も一般に使用されており、適した例は、国際公開第91/11,172号、国際公開第94/02,518号、および国際公開第98/55,148号に記載される。
【０３７６】
剤がタンパク質である場合、上述のタンパク質は治療されている被験体においてin situで調製されてもよい。この点で、上述のタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、上述のタンパク質が上述のヌクレオチド配列から発現するように、非ウイルス技術(例えばリポソームの使用により)および/またはウイルス技術(例えばレトロウイルスベクターの使用により) の使用により送達されてもよい。
【０３７７】
本発明の医薬組成物は、従来の治療と組み合わせて使用されてもよい。
【０３７８】
投与
用語「投与された」は、ウイルス技術または非ウイルス技術による送達を含む。ウイルス送達機構は、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルス(AAV)ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびバキュロウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。非ウイルス送達機構は、脂質媒介性の形質移入、リポソーム、免疫リポソーム、リポフェクチン、カチオン性両親媒性物質(CFA)、およびそれらの組合せを含む。
【０３７９】
成分は単独で投与されてもよいが、例えば、成分が、意図した投与の経路および標準的な医薬品の実施に関して選択した適した医薬品の賦形剤、希釈剤、または担体と混合してある場合、医薬組成物として通常投与されるであろう。
【０３８０】
例えば、速効性、遅延性、修飾性、持続性、間欠的投与、または放出制御の用途のために、成分は、調味剤または着色剤を含んでいてもよい錠剤、カプセル剤、膣坐剤、エリキシル剤、液剤、または懸濁液の形態で投与することができる。
【０３８１】
医薬品が錠剤である場合、錠剤は、結晶セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、およびグリシン等の賦形剤、デンプン(好ましくはトウモロコシ、ジャガイモ、またはタピオカのデンプン)、グリコール酸ナトリウムデンプン(sodium starch glycollate)、クロスカルメロースナトリウム(croscarmellose sodium)、およびある種のケイ酸錯体(complex silicate)等の崩壊剤、ならびにポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC)、スクロース、ゼラチン、およびアカシア等の粒状結合剤を含んでいてもよい。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル、およびタルク等の平滑剤が含まれていてもよい。
【０３８２】
類似する種類の固形組成物がゼラチンカプセル剤中の賦形剤として使用されてもよい。好ましい賦形剤は、この点に関して、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖、または高分子ポリエチレングリコールを含む。水性懸濁液および/またはエリキシル剤については、剤は、様々な甘味剤または調味剤、着色物質または着色色素と、乳化剤および/または懸濁化剤と、ならびに水、エタノール、プロピレングリコール、およびグリセリン等の希釈剤と、ならびにそれらの組合せと組み合わせてもよい。
【０３８３】
投与(送達)の経路は、1つまたは複数の経口(例えば、錠剤、カプセル剤としてまたは吸入することができる液剤として)、局所的、粘膜(例えば、吸入のための鼻噴霧器または噴霧器として)、鼻、非経口(例えば注射可能な形態で)、胃腸内、脊髄内、腹腔内、筋肉内、静脈内、子宮内、眼内、皮内、頭蓋内、気管内、膣内、脳室内、脳内、皮下、眼(硝子体内または前房内を含む)、経皮、直腸、口内、膣、硬膜外、舌下を含んでいてもよいが、これらに限定されない。
【０３８４】
投与量レベル
通常、医師は、個々の被験体に最も適しているであろう実際の投与を決定するであろう。任意の特定の患者に対する投与についての特異的な投与量レベルおよび頻度は変動する可能性があり、使用した特異的な化合物の活性、その化合物の代謝安定性および作用の期間、年齢、体重、健康状態、性別、食餌、投与の方法および時間、排泄の割合、併用剤、特定の状態の重症度、ならびに治療を受ける個人を含む様々な要因に依存するであろう。
【０３８５】
処方
成分(複数可)は、1つまたは複数の適した担体、希釈剤、または賦形剤との混合による等して、当技術分野で知られている技術の使用により医薬組成物に処方されてもよい。
【０３８６】
疾患
本発明の態様は、国際公開第98/09,985号に記載されるような疾患の治療および/または阻止および/または診断および/または予後に使用されてもよい。 
参照を容易にするために、その明細書の一部を次に提供する:マクロファージ阻害活性および/またはT細胞阻害活性、したがって抗炎症活性、抗免疫活性、すなわち、炎症に関連しない反応を含む細胞性免疫反応および/または体液性免疫反応に対する阻害効果、ウイルスおよび/または他の細胞内病原菌に関連した疾患、マクロファージおよびT細胞が細胞外マトリックス成分およびフィブロネクチンに接着する能力ならびにT細胞中でアップレギュレートされたfas受容体発現の阻害、関節リウマチを含む関節炎、過敏症、アレルギー反応、喘息、全身性エリテマトーデス、膠原病、および他の自己免疫疾患に関連した炎症を含む不要な免疫反応および免疫性炎の阻害、アテローム性動脈硬化、動脈硬化、アテローム性動脈硬化心臓病、再潅流障害、心拍停止、心筋梗塞、血管の炎症性の障害、呼吸窮迫症候群、または他の心肺疾患に関連した炎症、消化性潰瘍、潰瘍性大腸炎、および胃腸管の他の疾患、肝線維症、肝硬変、または他の肝疾患、甲状腺炎または他の腺の疾患、糸球体腎炎または他の腎臓疾患および泌尿器疾患、耳炎または他の耳鼻咽喉疾患、皮膚炎または他の皮膚疾患、歯周病または他の歯疾患、睾丸炎もしくはエピディディモ(epididimo)-睾丸炎、不妊、睾丸損傷または他の免疫関連睾丸疾患、胎盤機能不全、胎盤不全、習慣性流産、子癇、子癇前症、および他の免疫関連婦人科疾患ならびに/または炎症関連婦人科疾患、後部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、結膜炎、脈絡網膜炎、ブドウ膜網膜炎、視神経炎、眼内炎症、例えば網膜炎もしくは嚢胞様黄斑浮腫、交感性眼炎、鞏膜炎、色素性網膜炎、変性fondus疾患の免疫成分および炎症性成分、眼の損傷の炎症性成分、感染により引き起こされた眼の炎症、増殖性硝子体網膜症、急性虚血性視神経症、例えば緑内障濾過手術後の過剰な瘢痕、眼の移植片に対する免疫反応および/または炎症反応、ならびに他の免疫関連眼疾患および炎症関連眼疾患に関連した炎症、中枢神経系(CNS)または任意の他の器官の両方で、免疫抑制および/または炎症抑制が有益であろう自己免疫疾患または自己免疫症状または自己免疫障害、パーキンソン病、パーキンソン病の治療からの合併症および/または副作用、エイズ関連認知症複合HIV関連脳症、ドヴィック病、シデナム舞踏病、アルツハイマー病、および他の成人病、CNSの疾患または障害、ストークスの炎症性成分、ポリオ後症候群、精神障害の免疫成分および炎症性成分、骨髄炎、脳炎、亜急性硬化全脳炎、脳脊髄炎、急性神経病、亜急性神経病、慢性神経病、ギランバレー症候群、シデナム舞踏病、重症筋無力症、大脳偽腫瘍、ダウン症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、CNS圧迫もしくはCNS損傷の炎症性成分またはCNSの感染、筋萎縮および筋ジストロフィーならびに免疫関連疾患および炎症関連疾患の炎症性成分、中枢神経系および末梢神経系の疾患または障害、外傷後の炎症、敗血症性ショック、感染症、手術の炎症性合併症または炎症性副作用、骨髄移植または他の移植の合併症および/または副作用、例えばウイルス担体との感染による遺伝子治療の炎症性のおよび/または免疫性の合併症および副作用に関連した炎症あるいはエイズに関連した炎症、体液性免疫反応および/または細胞性免疫反応を抑制��たは阻害すること、単球またはリンパ球の量を低下させることにより、単球増殖性疾患または白血球増殖性疾患、例えば白血病を治療するまたは寛解させること、角膜、骨髄、器官、水晶体、ペースメーカー、天然皮膚組織、または人工皮膚組織等の天然細胞または人工細胞、組織、および器官の移植の場合の移植片拒絶の阻止および/または治療用。特定の癌関連障害は、固形腫瘍、白血病等の血液由来の腫瘍、腫瘍転移、例えば血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、化膿性肉芽腫といった良性腫瘍、関節リウマチ、乾癬、例えば、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植片拒絶反応、血管新生緑内障、後水晶体線維増殖症、ルベオーシスといった眼の血管由来の疾患、オスラーウェーバー症候群、心筋血管形成、プラーク血管新生、毛細血管拡張症、血友病性関節、血管線維腫、創傷肉芽形成、冠動脈側副枝、大脳側副枝、動静脈奇形、虚血性肢血管形成、血管新生緑内障、後水晶体線維増殖症、糖尿病性血管新生、ヘリコバクター関連疾患、骨折、脈管形成、血液生成、排卵、月経および胎盤形成を含むが、これらに限定されない。
【０３８７】
好ましくは、疾患は、急性リンパ性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、副腎皮質癌、肛門癌、膀胱癌、血液癌、骨癌、脳腫瘍、乳癌、女性生殖器系の癌、男性生殖器系の癌、中枢神経系リンパ腫、子宮頚癌、小児期横紋筋肉腫、小児期肉腫、慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、結腸直腸癌、大腸癌、子宮内膜癌、子宮内膜肉腫、食道癌、眼癌、胆嚢癌、胃癌、消化管癌、毛様細胞性白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、ホジキン病、下咽頭癌、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、白血病、肝臓癌、肺癌、悪性線維性組織球腫、悪性胸腺腫、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄腫、鼻腔癌および副鼻腔癌、上咽頭癌、神経系癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、下垂体腫瘍、形質細胞新生物、原発性CNSリンパ腫、前立腺癌、直腸癌、呼吸系、網膜芽細胞腫、唾液腺癌、皮膚癌、小腸癌、軟部組織肉腫、胃癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、尿路系癌、子宮肉腫、腟癌、血管系、ワルデンストロームマクログロブリン血症、ならびにビルムス腫瘍等の癌である。
【０３８８】
キット
本発明の方法に使用される材料は、理想的にはキットの製造に最適である。
【０３８９】
上記キットは、それぞれが本明細書中に記載される方法で利用される1つまたは複数の様々な試薬(通常、濃縮された形態)を有する容器を含み、例えば、第1の制限酵素、第2の制限酵素、架橋薬、ライゲーション酵素(例えばリガーゼ)、および脱架橋するための剤(例えばプロテイナーゼK)を含む。
【０３９０】
オリゴヌクレオチドはまた、容器中に、任意の形態、例えば、凍結乾燥されてまたは溶解状態(例えば、蒸留水または緩衝液)等で提供されてもよい。
【０３９１】
本発明の好ましい態様では、本明細書中に記載されるようなプローブのセット、アレイ、および任意選択で1つまたは複数の標識を含むキットが提供される。
【０３９２】
使用説明書のセットもまた通常含まれるであろう。
【０３９３】
使用
有利に、本発明は、in vitroまたはin vivoでのゲノム座等のヌクレオチド配列の空間構成に関する情報を得るために使用することができる。
【０３９４】
例として、4C技術は、1つまたは複数の遺伝子座の3次元構成を研究するために使用することができる。特に、この技術は、1つまたは複数の遺伝子座の3次元構成における1つまたは複数の転写因子の役割を研究するために使用することができる。
【０３９５】
さらなる例として、4C技術は、トランス作用因子およびシス調節DNAエレメントの役割を研究するために使用することができる。
【０３９６】
さらなる例として、4C技術は、in vitroまたはin vivoでの広範囲の遺伝子調節を研究するために使用することができる。
【０３９７】
さらなる例として、4C技術は、染色体内の近位および相互作用を研究するために使用することができる。
【０３９８】
さらなる例として、4C技術は、染色体間の近位および相互作用を研究するために使用することができる。
【０３９９】
さらなる例として、4C技術は、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、遺伝子座制御領域、複製起点、MAR、SAR、セントロメア、テロメア、または調節ネットワークにおける目的とする他の配列と共に機能するヌクレオチド配列を同定するために使用することができる。
【０４００】
さらなる例として、4C技術は、変異および/または欠失が遠位の調節エレメントに偶然に影響を与え、そのために、それらのマッピングが上記情報を提供しない場合における表現型(疾患)に対する原因となる遺伝子を同定するために使用することができる。
【０４０１】
さらなる例として、4C技術は、遺伝子座、広大なゲノム領域、または完全な染色体の空間的コンフォメーションを最終的に再構築するために使用することができる。
【０４０２】
さらなる例として、4C技術は、核内空間においてある種の染色体を共に保持する、可能性のあるアンカー配列を明示するために使用することができる。
【０４０３】
さらなる例として、4C技術は、相互の染色体の配置を最終的に高解像度で再構築するために使用することができる。
【０４０４】
さらなる例として、4C技術は、転座、欠失、逆位、重複等のゲノム再編成および/またはゲノム異常を検出するまたは同定するために診断(例えば出生前診断)において使用することができる。
【０４０５】
一般的な組換えDNA方法論の技術
本発明は、特に示されていない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来の技術を使用し、それらの技術は当業者の能力の範囲内である。上記技術は文献中に説明される。例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning、A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press、Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.)、B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons、M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press、およびD. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Pressを参照。これらの全文のそれぞれが本明細書に引用される。
【０４０６】
本発明は、次に、実施例を介してさらに記載されることとなるが、実施例は、本発明を実施する際に当業者を援助するために貢献することが意味され、本発明の範囲を限定することは決して意図されない。
【実施例１】
【０４０７】
材料および方法
4C技術
3C技術の手順の最初のステップを前に記載したように実施し(Splinter et al. (2004). Methods Enzymol 375, 493-507 (2004)、HindIII断片間のライゲーション産物を得た。このHindIIIライゲーション3C鋳型(約50μg)を、DpnII(HS2、Rad23A)またはNlaIII(β-メジャー(major))のいずれかの第2のよくある切断用の制限酵素50Uと共に100ng/μlで一晩消化した。DNA環形成における制約を回避するために(Rippe et al. (1995) Trends Biochem Sci 20, 500-6)、注意して、HindIII制限部位から約350〜400bpの範囲内で切断しなかった、目的とする制限断片(つまり「ベイト(bait)」)を区別する第2の制限酵素を選択した。第2の制限酵素での消化後に、DNAをフェノール抽出し、エタノール沈殿し、その後、低濃度(200Uリガーゼ(Roche社)を使用した14ml中50μgの試料、4時間、16℃)でライゲーションさせ、DpnII形成またはDpnII環形成を促進した。ライゲーション産物をフェノール抽出し、担体としてグリコーゲン(Roche社)(20μg/ml)を使用してエタノール沈殿した。目的とする環を、第1および第2の制限酵素認識部位の中間のベイトを切り取る50Uの第3の制限酵素で、以下の制限酵素:SpeI(HS2)、PstI(Rad23A)、およびPflmI(β-メジャー)を使用して一晩消化することにより線状にした。この線状化ステップは、PCR増幅の最初のラウンドの間の続くプライマーハイブリダイゼーションを容易にするために実施した。消化産物を、QIAquickヌクレオチド除去(250)カラム(Qiagen社)を使用して精製した。
【０４０８】
PCR反応を、Expand Long Template PCRシステム(Roche社)を使用し、1.2kbまでのサイズの断片(4C-PCR断片の80%は600bp未満と小さい)の直線的な増幅を確実にするよう注意深く最適化された条件を使用して実施した。PCR条件は以下の通りであった:94℃で2分間、94℃で15秒間、55℃で1分間および68℃で3分間を30サイクル、次に、68℃で7分間の最終ステップ。増幅の直線的な範囲をなお示す鋳型の最大量を決定した。これについては、鋳型の階段希釈溶液をPCR反応に追加し、増幅したDNA材料をアガロースゲル上で泳動し、PCR産物を、ImageQuantソフトウェアを使用して定量化した。通常、50μl PCR反応当たり100〜200ngの鋳型が増幅の直線的な範囲における産物を生じた。16〜32のPCR反応物をプールし、QIAquickヌクレオチド除去(250)システム(Qiagen社)を使用してこの4C鋳型を精製した。精製した4C鋳型を標識し、標準的なChIP-chipプロトコール(Nimblegen Systems of Iceland, LLC)に従ってアレイにハイブリダイズした。4C手順で使用した第1および第2の酵素により消化した、区別をして標識したゲノムDNAは対照鋳型として使用し、ハイブリダイゼーション効率の差を修正した。各実験については、独立して処理した2つの試料を互い違いの色素配向により標識した。
【０４０９】
4C-プライマー配列は次のものを使用した。
【０４１０】
HS2:     5'-ACTTCCTACACATTAACGAGCC-3'、
5'-GCTGTTATCCCTTTCTCTTCTAC-3'
Rad23A:   5'-TCACACGCGAAGTAGGCC-3'、
5'-CCTTCCTCCACCATGATGA-3'
β-メジャー:   5'-AACGCATTTGCTCAATCAACTACTG-3'、
5'-GTTGCTCCTCACATTTGCTTCTGAC-3'
4Cアレイ
アレイおよび分析はNCBI作成のm34に基づいた。プローブ(60塩基長)は、HindIII部位の上流および下流の配列100bpから選択された。CG含有量を一様なハイブリダイゼーションシグナルのために50%に最適化した。クロスハイブリダイゼーションを阻止するために、非常に豊富な反復 (RepBase 10.09)3と任意の類似性を有するプローブをプローブセットから除去した。さらに、ゲノムにおいて2つより多くのBLASTヒットを生じたプローブもまたプローブセットから除去した。標準的な設定を使用したMegaBLAST(Zhang et al. (2000) J Comput Biol 7, 203-14)を使用して配列アラインメントを実施した。ヒットは、30nt以上のアラインメントとして定義した。
【０４１１】
4Cデータ分析
シグナル比4C-試料/ゲノムDNAを各プローブについて算出し、データは、Nimblegen Systems社により提供されたSignalMapソフトウェアにより可視化した。データは、Rパッケージ(http://www.r-project.org)、Spotfire、およびExcelを使用して分析した。未処理のハイブリダイゼーション比は、染色体鋳型に沿った20〜50の陽性4C-シグナルのクラスターを示した。これらのクラスターを明示するために、実施平均(running mean)を適用した。9〜39プローブの範囲の様々なウィンドウサイズを使用し、これらのプローブは、すべて、同一のクラスターを同定した。示した結果は、29プローブ(平均して60kb)のウィンドウサイズに基づいたものであり、ランダム化したデータを介して実施した実施平均と比較した。これを各アレイについて個別に行った。結果的に、すべての実測値を、その特定のアレイの振幅およびノイズと比べて評価した。(偽陽性の数)/(偽陽性の数+真陽性の数)として定義した誤検出率(FDR)を以下のように決定した:(ランダム化したセットにおける陽性の数)/(データにおける陽性の数)。トップダウン法を使用して、閾値レベルを決定し、閾値レベルについての最小値を確定した:FDR<0.05。
【０４１２】
次に、生物学的重複実験を比較した。両方の重複実験において閾値を満たしたウィンドウは陽性であると考えられた。ランダム化したデータを比較すると、両方の重複実験において閾値を超えるウィンドウはなかった。染色体鋳型上で直接的に隣接する陽性のウィンドウを連結し(ギャップは認められなかった)、陽性エリアを作成した。
【０４１３】
発現分析
各組織について、3つの別個のマイクロアレイをAffymetrix社製のプロトコールに従って実施した(マウス430_2アレイ)。データを、RMA caツール;www.bioconductor.org)を使用して標準化し、また、各プローブセットについて、3つのマイクロアレイの実測値を平均した。さらに、多数のプローブセットが同一の遺伝子を表現した場合、それらもまた平均した。Mas5calls(Affyライブラリ: www.bioconductor.org)を「存在(present)」、「非存在(absent)」、および「わずか(marginal)」の判定(call)を確定するために使用した。すべての3つのアレイにおける「存在」の判定および50よりも大きな発現値を有する遺伝子は発現していると判定された。「胎児肝臓の特異的遺伝子」は、胎児肝臓において発現しているという我々の基準を満たした遺伝子として分類され、胎児脳と比較して5倍を超えるより高度な発現値を有していた。各遺伝子の周囲の全体的な転写活性の尺度を提供するために、実施合計を適用した。これについては、我々は対数変換発現値を使用した。各遺伝子については、我々は、遺伝子自体を含む、遺伝子の開始の上流100kbおよび末端の下流100kbのウィンドウで見つかったすべての遺伝子の発現の合計を算出した。陽性4C領域内で見つかった活性遺伝子に対する結果としての値(それぞれ肝臓におけるHS2、脳におけるRad23A、および肝臓におけるRad23Aについてn=124、123、および208)を、陽性4Cエリアの外側の活性遺伝子について得られた値(それぞれn=153、301、および186；ここでn=153は、第7染色体の、ほとんどのセントロメア相互作用領域およびテロメアの間に存在する、かつ、活性があり相互作用しない遺伝子についての数に対応する）と比較し；これら2つの群を、片側ウィルコクソンの順位和検定(one tailed Wilcoxon rank sum test)を使用して比較した。
【０４１４】
FISHプローブ
以下のBACクローン(BACPAC Resources Centre)を使用した;Hbb-1に対するRP23-370E12、80.1Mbでのchr.7に対するRP23-317H16(OR遺伝子クラスター)、Urosに対するRP23-334E9、118.3Mbでのchr.7に対するRP23-32C19、130.1Mbでのchr.7に対するRP23-143F10、73.1Mbでのchr.7に対するRP23-470N5、135.0Mbでのchr.7に対するRP23-247L11(OR遺伝子クラスター)、Rad23Aに対するRP23-136A15、21.8Mbでのchr.8に対するRP23-307P24、および122.4Mbでのchr.8に対するRP23-460F21。第7染色体セントロメア特異的プローブについては、我々は、DNAセグメントD7Mit21にアニールするP1クローン5279(Genome Systems Inc.社)を使用した。ランダムプライム標識プローブを、BioPrime Array CGH Genomic Labeling System (Invitrogen社)を使用して製造した。標識化の前に、DNAをDpnIIで消化し、DNA clean and concentrator-5 キット(Zymo research社)で精製した。消化したDNA(300ng)を、SpectrumGreen dUTP (Vysis社)またはAlexa fluor 594 dUTP(Molecular probes社)により標識し、GFX PCR DNA and Gel Band Purification キット(Amersham Biosciences社)で精製し、取り込まれなかったヌクレオチドを除去した。標識プローブの特異性は、マウスES細胞から調製した分裂中期スプレッドで試験した。
【０４１５】
凍結-FISH
先に記載されるように凍結-FISHを実施した5。手短に言えば、E14.5肝臓およびE14.5脳を4%パラホルムアルデヒド/250mM HEPES、pH7.5中で20分間固定し、切って小組織ブロックにし、次に、8%パラホルムアルデヒド中4℃で2時間の再度の固定ステップを行った。固定された組織ブロックを2.3Mスクロース中に20分間室温で浸し、試料ホルダー上にマウントし、液体窒素中でスナップ凍結した。組織ブロックは切片化まで液体窒素中に保存した。約200nmの超薄凍結切片を、凍結-連結装置を装備したReichert Ultramicrotome E(Leica社)を使用して切り取った。スクロースで満たしたループを使用して、切片をカバーガラスに移動させ、-20℃で保存した。ハイブリダイゼーションのために、切片をPBSで洗浄してスクロースを除去し、2×SSC中1時間、37℃で250ng/ml RNaseで処理し、10分間、0.1M HCL中でインキュベートし、一連のエタノール中で脱水し、8分間、80℃、70%ホルムアミド/2×SSC、pH7.5中で変性させた。切片を、プローブハイブリダイゼーションの直前にもう一度脱水した。500ng標識プローブを5μgのマウスCot1 DNA(Invitrogen社)と共沈殿させ、hybmix(50%ホルムアミド、10%硫酸デキストラン、2×SSC、50mMリン酸緩衝液、pH7.5)中に溶解させた。プローブを5分間95℃で変性させ、30分間37℃で再アニールし、少なくとも40時間37℃でハイブリダイズした。ポストハイブリダイゼーション洗浄の後、核をPBS/0.05% Tween-20中20ng/ml DAPI(Sigma社)で対比染色し、Prolong Goldアンチフェード試薬(Molecular Probes社)中にマウントした。
【０４１６】
CCDカメラおよびIsis FISH Imaging Systemソフトウェア(Metasystems社)を装備したZeiss社製 Axio Imager Z1落射蛍光顕微鏡(×100プランアクロマート、1.4オイル対物レンズ)で画像を収集した。最小限の250のβ-グロビンまたはRad23Aの対立遺伝子を分析し、切片に適用したプローブの組合せを知らない人が、ゲノムの他のところに位置したBACとの重複または非重複を評価した。4C-陽性領域対4C陰性領域について測定した値の間の差異の有意性を評価するために適合度検定(G統計量)6を反復して実施した。結果の概要を表2に提供する。
【０４１７】
我々はバックグラウンド(0.4〜3.9%)および真(5〜20.4%)の相互作用頻度の間の統計的有意差を見つけたが、凍結-FISHにより測定したその頻度は、異なるFISHプロトコールを使用した他のFISHにより測定された頻度よりも低いことが明確である可能性がある。切片化によりいくつかの相互作用する遺伝子座が分離される可能性があり、そのため、凍結-FISH実測値は真の相互作用頻度をわずかに過小評価するであろう。他方で、今の2Dおよび3D FISH手順は、z-方向の限られた解像度により、これらのパーセンテージを過大評価するであろう。今後、より特異的なFISHプローブと組み合わせられた改良された顕微鏡検査技術が、真の相互作用頻度をより明らかにするであろう。
【実施例２】
【０４１８】
3C手順(つまりホルムアルデヒド固定、(第1の)制限酵素による消化、架橋DNA断片の再ライゲーション、およびDNA精製)は、記載されるように(Splinter et al., (2004) Methods Enzymol. 375: 493-507)本質的に行い、核内空間において元々近接していたためにライゲーションする制限断片を含んでいるDNA混合物(「3C鋳型」)を得る。
【０４１９】
逆PCRを実施して、所与の制限断片(「ベイト」;プロモーター、エンハンサー、インスレーター、マトリックス結合領域、複製起点、または任意の他の第1の(標的)ヌクレオチド配列を含んでいるために選択された)にライゲーションしたすべての断片を増幅する。このために、DNA環は、第2の制限酵素 (好ましくは、テトラまたはペンタヌクレオチド配列を認識するよくあるカッター) で3C鋳型を消化し、次に、分子内の相互作用に有利なような希釈条件下でライゲーションさせることにより作成される。形態上の制約による環形成における偏りを最小限にするために(Rippe et al, (2001) Trends in Biochem. Sciences 26, 733-40)、好ましくは、第1の制限部位から>350〜400bpでベイトを切り取る第2の制限酵素を選択するべきである。逆PCRの増幅効率および再現性を増加させるために、環を、PCR増幅の前に、診断用の第1および第2の制限部位の間のベイトを切り取る制限酵素(例えば6bp以上のカッター)により最適に線状化する。
【０４２０】
第2の制限酵素での3C鋳型の消化、希釈条件下でのライゲーションを介した環状化、およびベイト含んでいる環の線状化は、上記DNA操作に対して標準的な条件下で実施し、逆PCR増幅のためのDNA鋳型を得る(「4C鋳型」)。
【０４２１】
したがって、10μgの3C鋳型を、20Uの第2の制限酵素を有する100μl中で消化し(一晩)、次に、酵素の熱不活性化およびDNA精製を行う。ライゲーションを、50U T4リガーゼを有する10ml(1ng/μl DNA)中で実施し(16℃で4時間、室温で30分間)、次にDNA精製を行う。最終的に、目的とする環の線状化は、20Uの制限酵素を有する100μl中で行い(一晩)、DNA精製をもう一度行う。
【０４２２】
逆PCRについては、2つのベイト特異的プライマーを設計し、それぞれは、第1の制限酵素認識部位および直接的に近接する第2の制限酵素認識部位にできるだけ近接し、伸長が、制限部位を横切って、ベイトにライゲーションした断片に直ちに進むように、それぞれは3'末端が外側を向いている。これらのプライマーでの逆PCRは、4C鋳型の100〜400ngのDNA(50μl PCR反応混合物当たり)上で好ましくは実施され、PCR反応当たり最大数のライゲーション事象を含む。我々は、Expand Long Template PCR System(Roche社)を適用する逆PCRを、緩衝液1を使用し、メーカーの手順に従って実施する。
【０４２３】
以下のPCRサイクルを実施する:
1.94℃で2分間
2.94℃で15秒間
3.55℃で1分間
4.68℃で3分間
5.ステップ2〜4を29回(または25〜40回のいずれか)繰り返す
6.68℃で7分間
7.終了
ゲル電気泳動を、個々のPCR反応の間の再現性を分析するために実施する。通常は、同様な産物パターンが得られるべきである。
【０４２４】
ランダムプライミングによる標識化およびアレイハイブリダイゼーションのための十分な材料を得るために、多数のPCR反応物(それぞれ、PCRの30サイクル後に得られる)をプールすることができる(反応当たりのPCRサイクルの数を増加させる代わりに)。ランダムプライムド標識化の代わりとして、標識したヌクレオチドをPCRの最後のサイクルに組み入れることができる(例えば30サイクル(非標識)+10サイクル(標識))。
【実施例３】
【０４２５】
4C技術を使用した転座の検出
4C技術は、健常な被験体からの細胞中、ならびに配列Xに近接するブレイクポイントを有する染色体Aおよび染色体Bの間で単一の相互転座を保有する患者からの細胞中、の所与の染色体A上に存在する所与の配列Xに対する相互作用頻度を測定するために使用する(図9に示すように)。
【０４２６】
正常細胞では、この分析により、染色体A上の配列Xの0.2〜10Mbの範囲内に位置する(ほとんど)すべてのプローブに対するハイブリダイゼーションシグナルが上昇する(つまり、Xとの高頻度の相互作用)ことが明らかにされる。(強力な架橋シグナルを示す染色体テリトリーの実際のサイズは、たいてい、アレイにハイブリダイズした試料の複雑さに依存する)。同一の染色体A上の他のところおよび他の染色体上で、ハイブリダイゼーションシグナルが上昇したプローブの上記広大な領域(線状のDNA鋳型上)は観察されない。
【０４２７】
しかしながら、患者細胞では、ブレイクポイントの片方に位置するすべての染色体Aプローブでのハイブリダイゼーションシグナルは約50%低下し(染色体Aの一方のコピーはまだ無傷であり、正常なシグナルを生成するであろう)、特有の(つまり、正常細胞中に存在しない)上昇したハイブリダイゼーションシグナルの濃度が染色体B上のブレイクポイントに接するプローブについて観察される。実際、染色体B上でハイブリダイゼーションシグナルを示さないプローブ対強力なハイブリダイゼーションシグナルを示すプローブの間の突然の移行は染色体B上のブレイクポイントの位置を明らかにする。
【実施例４】
【０４２８】
4C技術結果の分析
4C技術を、マウスβ-グロビン遺伝子座制御領域(LCR)のゲノム環境を特徴づけるために使用し、その高感受性部位2(HS2)を含んでいる制限断片に注目した。LCRは、高度なレベルのβ-グロビン遺伝子発現に必要とされる強力な赤血球に特異的な転写調節エレメントである。β-グロビン遺伝子座は第7染色体上に97Mbの位置で存在し、嗅覚神経細胞でのみ転写される嗅覚受容体遺伝子の広大な2.9Mbのクラスターに属する。相互作用を2つの組織で分析した:LCRが活性であり、β-グロビン遺伝子が高度に転写されるE14.5胎児肝臓およびLCRが不活性であり、グロビン遺伝子がサイレントであるE14.5の胎児脳。両方の組織で、大多数の相互作用が第7染色体上の配列で見つかり、6つの関連がない染色体(8、10、11、12、13、14)で検出されたLCR相互作用は非常にわずかであった(図13a)。第7染色体上の最も強力なシグナルは、β-グロビンの染色体の位置付近を中心とした5〜10Mbの範囲内に見つかり、相互作用頻度は、物理的に結合したDNA配列の間の距離(塩基対で)に反比例するといった見解に一致した。この領域の相互作用を定量的に判断することは可能ではなかった。これらの近傍の配列が、非常に頻繁にβ-グロビンと共にあったので、我々のハイブリダイゼーション試料におけるそれらの広大な過剰表現により対応するプローブが一杯になったと我々は推論した。これは、我々が1:10および1:100に希釈した試料でのハイブリダイゼーションを実施した場合に確認され、シグナル強度は、この領域の外側および端のプローブで減少したが、この領域の内側のプローブでは減少しなかったことがわかった(データ掲載せず)。
【０４２９】
4C手順により高度に再現可能なデータが得られた。図2b〜cは、β-グロビン遺伝子からおよそ25Mbおよび80Mb離れた第7染色体上の2つの1.5Mb領域についての対照ハイブリダイゼーションシグナルに対する4C-シグナルの未処理の比を示す。このレベルの解像度では、別個に処理した試料からの結果はほとんど同様であった。胎児肝臓および胎児脳の両方において、陽性シグナルのクラスターが第7染色体上に同定され、β-グロビンから数十メガ塩基も離れた染色体の位置に同定されることが多かった。これらのクラスターは、通常、最小で20〜50のプローブからなり、増加したシグナル比が染色体鋳型上に並列した(図13b〜c)。アレイ上の各プローブは各別個のライゲーション事象を分析する。さらに、細胞当たり、HS2制限断片のコピーが2つだけ存在し、それぞれは1つの他の制限断片にライゲーションすることができるのみである。そのため、20以上の近隣の制限断片との別個のライゲーション事象の検出は、対応する座が多数の細胞においてβ-グロビンLCRと接触することを強く示す。
【０４３０】
これらのクラスターの統計的有意差を決定するために、個々の実験のデータを染色体マップ上に順序づけて、約60kbのウィンドウサイズで実施平均アルゴリズムを使用して分析した。ランダムにシャッフルしたデータの実施平均の分布を閾値値を設定するために使用して、5%の誤検出率を可能にした。この分析は、重複実験において再現性よく発見された胎児肝臓における66クラスターおよび胎児脳における45クラスターを同定した(図13d〜f)。実際に、高解像度FISHにより、上記クラスターが、真に、頻繁に相互作用する遺伝子座を表現することを確認した(以下参照)。
【０４３１】
したがって、4C技術は、ある染色体位置でクラスター形成した多数の制限断片との別個のライゲーション事象の検出により遠距離相互作用する遺伝子座を同定する。
【０４３２】
完全に別個の一連の4C実験は、異なる逆PCRプライマーセットを用いて実施し、HS2の約50kb下流に位置するβメジャー遺伝子のゲノム環境を調査した。胎児肝臓では、βメジャー遺伝子は高度に転写され、頻繁にLCRと接触する。HS2とほとんど同様な、βメジャーと遠距離相互作用するクラスターが発見され、胎児肝臓および胎児脳の両方において、これらの遺伝子座は頻繁にβ-グロビン遺伝子座と接触することをさらに実証した(図17)。
【実施例５】
【０４３３】
活性のあるβ-グロビン遺伝子座および不活性なβ-グロビン遺伝子座は別々のゲノム環境を占める
2つの組織間の比較により活発に転写された胎児肝臓におけるβ-グロビン遺伝子座は、その転写的にサイレントな脳中の対応物と完全に異なる座のセットと相互作用することが明らかにされた(τ=0.03;スピアマンの順位相関)(図13f)。これにより、プローブの配列組成は結果に影響を与えるということが否定された。胎児肝臓では、相互作用するDNAセグメントはβ-グロビン遺伝子座の周囲に集中した70Mb領域の範囲内に位置し、大多数(40/66)は第7染色体のテロメアに向かって位置した。胎児脳では、相互作用する遺伝子座は、胎児肝臓と比較して、β-グロビンからの同様の距離またはさらに長い距離のところに見つかり、大多数の相互作用(43/45)は第7染色体のセントロメアに向かって位置した。これらのデータは、活性のあるβ-グロビン遺伝子座および不活性なβ-グロビン遺伝子座が第7染色体の異なる部分と接触することを実証した。
【０４３４】
6つの他の染色体(8、10、11、12、13、および14)をマイクロアレイ上に表現させた。これらの染色体上の強力なハイブリダイゼーションシグナルは、まれであり、通常、線状のDNA鋳型上にばらばらに出現し、重複実験において不在であることが多かった。さらに、これらの染色体にわたる実施平均レベルは、第7染色体について評価されたレベルに再現性よく近接することは決してなかった(図19)。したがって、我々のデータは、β-グロビン遺伝子座が、たいてい、それ自体の染色体テリトリーの内側のこの座の好ましい位置と一致する同一の染色体の他のところにある座と接触することを示した。α-グロビン遺伝子座はまたアレイ(第11染色体)上にも存在し、β-グロビンとの相互作用について陽性と評価されなかったが、これは、マウスのα-グロビンおよびβ-グロビンが核内空間において頻繁に出会うことはないといったFISHによる最近の実証に一致したことに我々は注目する(Brown, J. M. et al. (2006) J Cell Biol 172, 177-87)。
【０４３５】
第7染色体上で観察された遠距離相互作用の関連をより理解するために、我々は、相互作用する座を遺伝子の染色体位置と比較した。さらに、Affymetrix社製発現アレイ分析を実施して、2つの組織においてこれらの位置での転写活性を決定した。胎児肝臓および胎児脳における相互作用するエリアの平均サイズは類似していた(それぞれ183kbおよび159kb)が、劇的な差異が、それらの遺伝子の含有量および活性において観察された。胎児肝臓では、β-グロビンと相互作用する座の80%が1つまたは複数の活発に転写された遺伝子を含んでいたが、胎児脳では、大多数(87%)が検出可能な遺伝子活性を示さなかった(図15)。したがって、β-グロビン遺伝子座は、2つの組織における非常に異なるゲノム環境に埋め込まれている。脳では、遺伝子座は活性がなく、遺伝子座は、第7染色体のセントロメアに向かって位置した転写サイレントな座と主に接触する。胎児肝臓では、座は高度に活性があり、座は、第7染色体のテロメア側に向かってより顕著に位置した、活発に転写された領域と優先的に相互作用する。重要なことには、4C技術は、UrosおよびEraf(β-グロビンから約30Mb離れている)の両方を、胎児肝臓における活性のあるβ-グロビン遺伝子座と相互作用する遺伝子として同定し、これは、FISHによりなされた先の観察に一致した(Osborne, C. S. et al. (2004) Nat Genet 36, 1065-71 (2004))。興味深いことには、脳では、接触は、第7染色体上に存在するβ-グロビンの両側に17Mbおよび37Mb離れて位置する2つの他の嗅覚受容体遺伝子クラスターとで観察された。
【０４３６】
第7染色体上のすべての転写領域が胎児肝臓における活性のあるβ-グロビン遺伝子座と相互作用するとは限らない。そのため、我々は、胎児肝臓における他の活性領域によってではなく相互作用する遺伝子座によって独占的に共有される共通因子を調査した。β-グロビン遺伝子、Uros、およびErafはすべて、転写因子の同一のセットにより調節される可能性のある赤血球特異的遺伝子であり、これらの因子が核内空間におけるそれらの標的遺伝子の発現を協調するということは魅力的な見解である。我々は、E14.5胎児肝臓からのAffymetrix社製発現アレイのデータを胎児脳のデータと比較し、胎児肝臓で優先的に(>5倍多く)発現した遺伝子を同定した。そのため、第7染色体上の活性遺伝子の28%は「胎児肝臓特異的」と分類され、そのうちの25%が共存エリアで発見された。したがって、我々は、共存エリアにおける「胎児肝臓特異的」遺伝子の富化を発見しなかった。より重要なことには、66箇所の相互作用する領域のうちの49箇所(74%)が「胎児肝臓特異的」を含まず、そのため、我々のデータは、核内空間における組織特異的遺伝子の協調的発現の証拠を示さなかったと結論づけられる。β-グロビン遺伝子は例外的に高度な率で転写され、座が、高度に発現した遺伝子または高密度の活性遺伝子を有するエリアである高度な転写活性のある他の領域と優先的に相互作用したかどうかが次に問われた。Affymetrix社の計数を遺伝子活性についての基準として使用し、我々は、実施合計(running sum)アルゴリズムを実施して、活発に転写された遺伝子の周囲の200kbの領域内の全体的な転写活性を測定した。この分析は、相互作用する遺伝子の周囲の転写活性が、第7染色体上の相互作用しない活性遺伝子の周囲よりも高度ではなかったということを明らかにした(p=0.9867;ウィルコクソン順位和)。
【実施例６】
【０４３７】
ハウスキーピング遺伝子のゲノム環境は組織間で大部分保存されている
次に、両方の組織で同様に発現する遺伝子はまたそのゲノム環境を切り換えるどうかを調査した。Rad23Aは、たいてい第8染色体上のハウスキーピング遺伝子の遺伝子高密度クラスターに存在する一様に発現する遺伝子である。E14.5胎児肝臓およびE14.5胎児脳の両方では、この遺伝子およびその直接的な近隣のものの多くは活性がある。4C分析を実施し、Rad23Aから70Mbまで離れた遺伝子座との多くの遠距離相互作用を同定した。重要なことには、Rad23Aとの相互作用は胎児肝臓および胎児脳の間で高度に相関した(τ=0.73;スピアマンの順位相関)(図15a)。これらの遺伝子座が共有する特徴はさらに、それらの遺伝子座が活発に転写される遺伝子類を含むということであった。したがって、両方の組織では、およそ70%が少なくとも1つの活性遺伝子を含んでいた(図15b〜c)。実施合計アルゴリズムにより決定されたように、相互作用する遺伝子の周囲の領域は、染色体上の他のところの活性遺伝子と比較して統計的に有意なより高度なレベルの遺伝子活性を示した(両方の組織についてp<0.001)。したがって、β-グロビン遺伝子座と異なり、遺伝子豊富領域に位置するRad23A遺伝子は、転写活性が増加した他の染色体テリトリーと、距離を超えて、優先的に相互作用する。Rad23Aを含んでいる染色体のエリアは、たいてい、その染色体テリトリーの端(90%)または外側(10%)に属することがFISHにより観察された(未出版, D. Noordermeer, M. Branco, A. Pombo and W. de Laat)。しかしながら、4C分析は染色体内の相互作用を明らかしたのみであり、第7染色体、第10染色体、第11染色体、第12染色体、第13染色体、または第14染色体上のエリアは、相互作用についての我々の厳格な基準を再現性よく満たさなかった。したがって、Rad23Aは、たいてい、2つの非常に異なる組織において類似する染色体内の相互作用に関与する。Rad23Aが、これらの関連がない染色体上に好ましい近隣の遺伝子座を有している場合、座は、本明細書で4C技術に使用した条件下で検出されるほど頻繁に相互作用しない。
【実施例７】
【０４３８】
高解像度顕微鏡検査による4C技術の確証
4C技術により得た結果を確証するために、凍結-FISH実験を実施した。凍結-FISHは最近開発された顕微鏡検査技術であり、核の超構造をよりよく保存するといった、最新の3D-FISHプロトコールに対する利点を有しており、超薄凍結切片の調製によるz-軸における改良された解像度を提供する(Branco, M. R. & Pombo, A (2006). PLoS Biol 4, e138)。4Cデータは、β-グロビンまたはRad23Aの対立遺伝子(常にn>250)が、E14.5肝臓およびE14.5脳から調製された200nmの超薄切片において、15を超える選択された染色体テリトリーとどれくらい頻繁に共存したかを測定することにより確認した。重要なことには、凍結-FISHにより測定された相互作用頻度はすべて、4C結果と完全に一致した(図17)。例えば、4C技術によりβ-グロビンと相互作用すると同定された遠位の領域は、4Cにより検出されなかった介在するエリアよりも頻繁に共存した(それぞれ、7.4%および9.7%対3.6%および3.5%)。さらに、胎児肝臓中ではなく胎児脳中でβ-グロビンと相互作用すると4C技術により同定された2つの遠位の嗅覚受容体遺伝子クラスターは、共存頻度が肝臓切片での3.6%および1.9%に対して脳切片では12.9%および7%とそれぞれ評価された。要約すると、4C技術により陽性に同定された遺伝子座について測定された共存頻度は、すべて、バックグラウンドの遺伝子座について測定された頻度よりも有意に高度であった(p<0.05;G-検査)。我々は、4C技術が、相互作用するDNA遺伝子座を忠実に同定すると結論づけた。最終的に、我々は、β-グロビンと相互作用すると同定されたその座もまた頻繁に互いに接触することを実証するために凍結-FISHを使用した。これは、胎児肝臓における広大な染色体の距離にわたり隔てられた2つの活性領域(図19)および脳の染色体上で遠く離れた2つの不活性OR遺伝子クラスター(図17)については真であった。興味深いことには、これらの2つの遠位のOR遺伝子クラスター間の頻繁な接触はまた胎児肝臓においても発見され、このOR遺伝子クラスターは、活発に転写されたβ-グロビン遺伝子座を含むOR遺伝子クラスターと相互作用しなかった。これらのデータは、別々のOR遺伝
子クラスター間の核相互作用が、分析した胎児脳組織の特色ではないことを示した。上記空間的接触が、嗅覚神経細胞当たり単一の対立遺伝子のみを転写することを確実にするために必要とされる多数のOR遺伝子間の連絡を促進すると推測することは魅惑的である(Shykind, B. (2005) Hum Mol Genet 14 Spec No 1, R33-9)。
【実施例８】
【０４３９】
活性クロマチンドメインおよび不活性クロマチンドメインの核構成
本明細書中に記載される観察は、活性ゲノム領域だけでなく不活性ゲノム領域が、多数の長距離の接触を伴う核内空間において別々の領域を形成することを実証し、各DNAセグメントが相互作用のそれ自体の好ましいセットを有することを強く示唆する。我々のデータは、β-グロビン遺伝子座がオンに切り換わった場合、β-グロビン遺伝子座は転写サイレントなゲノム環境を去り、活性ドメインとの相互作用が優遇される核エリアに入ることを示唆する。転写活性化の際の上記劇的な再配置は、おそらく、ある種の発現レベルに達し、より重要なことには、β-グロビンでの場合のように線状の染色体鋳型上の他の活性遺伝子から離れて存在する組織特異的遺伝子のみの特徴であろうということが予想される。不活性ゲノム座の間および活性ゲノム座の間の両方で同定される遠距離相互作用の広範囲にわたるネットワークは、間期中の動的移動の結果を越える染色体コンフォメーションにおける細胞間の相違を反映するということが提案される(Chakalova et al. (2005) Nat Rev Genet 6, 669-77 (2005))。推測上、細胞分裂後の異なる程度の脱凝縮が、活性のあるゲノム領域を駆動させて不活性クロマチンから遠ざけ(Gilbert, N. et al. (2004) Cell 118, 555-66 (2004))、類似するクロマチン組成の遠位の座の間の接触を、たいてい、クロマチン結合タンパク質間の親和性を介して安定させる。遠位の座の間の空間的並列は機能的であるかもしれないが、単に、染色体のアンフォールディングパターンの結果である可能性もある。個々の座が制限された核容量の範囲内で移動することができる一方、染色体の全体的なコンフォメーションは、細胞周期を通して、大部分維持され、細胞分裂にリセットを要求するであろう。この見解は、核内部におけるタグ付きDNA座の制限された運動を示す生細胞イメージング研究に一致し(Chubb et al. (2002) Curr Biol 12, 439-45 (2002))、核クロマチン位置情報が細胞集団中に保存されることなく細胞分裂の間に頻繁に広められるということを示す研究と十分に適合する(Essers, J. et al. Mol Biol Cell 16, 769-75 (2005); Ger
lich, D. et al. Cell 112, 751-64 (2003))。
【０４４０】
さらなる態様1
本発明のさらなる態様は、以下の番号付きパラグラフに記載されている。
【０４４１】
1.所与の種(例えば、ヒト)のゲノムにおけるあらゆる第1の制限酵素認識部位のあらゆる側に相補的なプローブセット。
【０４４２】
2.所与の種(例えば、ヒト)のゲノムにおけるあらゆる第1の制限酵素認識部位の片側のみに相補的なプローブセット。
【０４４３】
3.所与の種(例えば、ヒト)のゲノムの線状鋳型に沿って順に並んだ、あらゆるその他の第1の制限酵素認識部位の片側に相補的なプローブセット。
【０４４４】
4.所与の種(例えば、ヒト)のゲノムの線状鋳型に沿って順に並んだ、3番目、4番目、5番目、6番目、7番目、8番目、9番目、10番目、20番目、30番目、40番目、50番目、60番目、70番目、80番目、90番目または100番目毎の第1の制限酵素認識部位の片側に相補的なプローブセット。
【０４４５】
5.転座、欠失、逆位、重複およびその他のゲノム再編成に関与することが知られているすべての遺伝子座の周りの、所与のサイズ(例えば、約50kb、100kb、200kb、300kb、400kb、500kb、1Mb、2Mb、3Mb、4Mb、5Mb、6Mb、6Mb、7Mb、8Mb、9Mbまたは10Mb)(例えば、50kb〜10Mb)のゲノム領域を示すプローブセット。
【０４４６】
6.転座、欠失、逆位、重複(duplication)およびその他のゲノム再編成に関与することが知られている選択遺伝子座の周りの、所与のサイズ(例えば、約50kb、100kb、200kb、300kb、400kb、500kb、1Mb、2Mb、3Mb、4Mb、5Mb、6Mb、6Mb、7Mb、8Mb、9Mbまたは10Mb)(例えば、50kb〜10Mb)のゲノム領域を示すプローブセット。
【０４４７】
7.好ましくは、4C配列(ベイト)は、実際の再編成配列(すなわち、転座の場合はブレイクポイント)から約50kb、100kb、200kb、300kb、400kb、500kb、1Mb、2Mb、3Mb、4Mb、5Mb、6Mb、6Mb、7Mb、8Mb、9Mb、10Mb、11Mb、12Mb、13Mb、14Mbまたは15Mb以上の内側にある。
【０４４８】
8.各プローブが、第1の制限酵素による消化後に得られる、または得ることができる単一の制限断片を示す、所与の種の完全ゲノムを示すプローブセット。
【０４４９】
9.プローブが、線状染色体鋳型に沿って等しく分布された、所与の種の完全ゲノムを示すプローブセット。
【０４５０】
10.パラグラフ1〜10のいずれかに記載のプローブセットを含むアレイ。
【０４５１】
11.本明細書に記載のヌクレオチド配列またはプローブアレイまたはプローブセットまたはアレイを使用するステップを含む、標的ヌクレオチド配列と、1つまたは複数のヌクレオチド配列(例えば、1つまたは複数のゲノム遺伝子座)との相互作用の頻度を解析する方法。
【０４５２】
12.ヌクレオチド配列またはプローブアレイまたはプローブセットまたは本明細書に記載のアレイを使用するステップを含む、特定の疾患状態を示す1つまたは複数のDNA-DNA相互作用を同定する方法。
【０４５３】
13.ヌクレオチド配列またはプローブアレイまたはプローブセットまたは本明細書に記載のアレイを使用するステップを含む、DNA-DNA相互作用の変化により引き起こされる、またはDNA-DNA相互作用の変化に関連した疾患もしくは症候群の診断または予後方法。
【０４５４】
14.ヌクレオチド配列またはプローブアレイまたはプローブセットまたは本明細書に記載のアレイを使用するステップを含む、DNA-DNA相互作用を調整する1つまたは複数の剤(agent)を同定するアッセイ方法。
【０４５５】
15.ヌクレオチド配列またはプローブアレイまたはプローブセットまたは本明細書に記載のアレイを使用するステップを含む、ブレイクポイント(例えば、転座) の位置を検出する方法。
【０４５６】
16.ヌクレオチド配列またはプローブアレイまたはプローブセットまたは本明細書に記載のアレイを使用するステップを含む、逆位の位置を検出する方法。
【０４５７】
17.ヌクレオチド配列またはプローブアレイまたはプローブセットまたは本明細書に記載のアレイを使用するステップを含む、欠失の位置を検出する方法。
【０４５８】
18.ヌクレオチド配列またはプローブアレイまたはプローブセットまたは本明細書に記載のアレイを使用するステップを含む、重複の位置を検出する方法。
【０４５９】
19.最適なDNA断片に空間的に密接している(すべての)DNA断片を同定するための4C技術におけるマイクロアレイの使用。
【０４６０】
20.解析に含まれるゲノム領域(完全ゲノムまたはゲノムの一部でありうる)に存在する第1の制限酵素認識部位に直接隣接したDNA配列に相同なプローブを含有し、各プローブが、好ましくは固有の第1の制限酵素認識部位から100bp以内、もしくは最大300bp以内に位置するか、または各第1の制限酵素認識部位と、この最も近い第2の制限酵素認識部位との間に設計されるマイクロアレイ。
【０４６１】
21.選択された遺伝子座の配列に相補的なプローブを含み、所与の種の完全ゲノムを表示する本明細書に記載のアレイ。
【０４６２】
22.遺伝子座が、1つまたは複数の疾患に関連した遺伝子座である、パラグラフ21に記載のアレイ。
【０４６３】
23.選択された遺伝子座の配列には、前記遺伝子座から最大20Mb離れている配列が含まれる、パラグラフ21またはパラグラフ22に記載のアレイ。
【０４６４】
24.(a)架橋DNAの試料を準備するステップと、
(b)架橋DNAを第1の制限酵素で消化するステップと、
(c)架橋ヌクレオチド配列をライゲーションするステップと、
(d)脱架橋(reversing the cross linking)するステップと、
(e)ヌクレオチド配列を第2の制限酵素で消化するステップと、
(f)ヌクレオチド配列をライゲーションするステップと、
(g)少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて標的ヌクレオチド配列にライゲーションされた、目的とする1つまたは複数のヌクレオチド配列を増幅する(各プライマーは、目的とするヌクレオチド配列に隣接する既知のDNA配列にハイブリダイズする)ステップと、
(h)増幅配列をアレイにハイブリダイズするステップと、
(i)DNA配列間の相互作用の頻度を判定するステップと
を含む、標的ヌクレオチド配列と、目的とする1つまたは複数のヌクレオチド配列(例えば、1つまたは複数のゲノム遺伝子座)との相互作用の頻度を解析する方法。
【０４６５】
さらなる態様2
本発明のさらなる態様は、以下の番号付きパラグラフに記載されている。
【０４６６】
1.第1および第2の制限酵素認識部位により分離される第1および第2のヌクレオチド配列を含み、前記第1のヌクレオチド配列が標的ヌクレオチド配列であり、前記第2のヌクレオチド配列が架橋ゲノムDNAにより得ることができる環状ヌクレオチド配列。
【０４６７】
2.標的ヌクレオチド配列が、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、マトリックス結合領域、遺伝子座制御領域、転写ユニット、複製起点、組換えホットスポット、転座ブレイクポイント、セントロメア、テロメア、遺伝子密度の高い領域、遺伝子密度の低い領域、反復エレメントおよび(ウイルス)組込み部位からなる群から選択される、パラグラフ1に記載の環状ヌクレオチド配列。
【０４６８】
3.標的ヌクレオチド配列が、疾患に関連したもしくは疾患を引き起こすヌクレオチド配列である、または疾患に関連したもしくは疾患を引き起こす遺伝子座から線状DNA鋳型上で15Mb未満の位置にある、パラグラフ1に記載の環状ヌクレオチド配列。
【０４６９】
4.標的ヌクレオチド配列が、AML1、MLL、MYC、BCL、BCR、ABL1、IGH、LYL1、TAL1、TAL2、LMO2、TCRα/δ、TCRβおよびHOX、または「Catalogue of Unbalanced Chromosome Aberrations in Man」2nd edition. Albert Schinzel. Berlin: Walter de Gruyter, 2001. ISBN 3-11-011607-3に記載の疾患に関連したその他の遺伝子座からなる群から選択される、パラグラフ1〜3のいずれかに記載の環状ヌクレオチド配列。
【０４７０】
5.第1の制限酵素認識部位が、6〜8bpの認識部位であり、好ましくはBglII、HindIII、EcoRI、BamHI、SpeI、PstIおよびNdeIからなる群から選択される、パラグラフ1〜4のいずれかに記載の環状ヌクレオチド配列。
【０４７１】
6.第2の制限酵素認識部位が、4または5bpのヌクレオチド配列認識部位である、前記パラグラフのいずれかに記載の環状ヌクレオチド配列。
【０４７２】
7.第2の制限酵素認識部位が、第1の制限部位から約350bpを超える位置にある、前記パラグラフのいずれかに記載の環状ヌクレオチド配列。
【０４７３】
8.標識されている、前記パラグラフのいずれかに記載の環状ヌクレオチド配列。
【０４７４】
9.第1および第2の制限酵素認識部位により単離される第1および第2のヌクレオチド配列を含み、前記第1のヌクレオチド配列が標的ヌクレオチド配列であり、第2のヌクレオチド配列が架橋ゲノムDNAにより得ることができ、前記第2のヌクレオチド配列が標的ヌクレオチド配列に交差するヌクレオチド配列。
【０４７５】
10.(a)架橋DNAの試料を準備するステップと、
(b)架橋DNAを第1の制限酵素で消化するステップと、
(c)架橋ヌクレオチド配列をライゲーションするステップと、
(d)脱架橋するステップと、
(e)ヌクレオチド配列を第2の制限酵素で消化するステップと、
(f)ヌクレオチド配列を環状化するステップと
を含む、環状ヌクレオチド配列の製造方法。
【０４７６】
11.(a)架橋DNAの試料を準備するステップと、
(b)架橋DNAを第1の制限酵素で消化するステップと、
(c)架橋ヌクレオチド配列をライゲーションするステップと、
(d)脱架橋するステップと、
(e)ヌクレオチド配列を第2の制限酵素で消化するステップと、
(f)ヌクレオチド配列を環状化するステップと、
(g)標的ヌクレオチド配列にライゲーションされた1つまたは複数のヌクレオチド配列を増幅するステップと
を含む、環状ヌクレオチド配列の製造方法。
【０４７７】
12.環状標的ヌクレオチド配列が増幅前に直線化される、パラグラフ11に記載の方法。
【０４７８】
13.環状標的ヌクレオチド配列が、6bp以上の認識部位を認識する制限酵素を用いて線状化される、パラグラフ12に記載の方法。
【０４７９】
14.架橋ヌクレオチド配列が、PCRにより増幅される、パラグラフ10〜13のいずれかに記載の方法。
【０４８０】
15.架橋ヌクレオチド配列が、逆PCRにより増幅される、パラグラフ14に記載の方法。
【０４８１】
16.Expand Long Template PCR System (Roche)が使用される、パラグラフ14またはパラグラフ15に記載の方法。
【０４８２】
17.パラグラフ1〜9のいずれかに記載のヌクレオチド配列を使用するステップを含む、標的ヌクレオチド配列と、1つまたは複数のヌクレオチド配列(例えば、1つまたは複数のゲノム遺伝子座)との相互作用の頻度を解析する方法。
【０４８３】
18.パラグラフ1〜9のいずれかに記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズする、もしくはハイブリダイズすることができる1つまたは複数のプローブを含む、支持体に固定化されたプローブアレイ。
【０４８４】
19.ゲノムDNAにおける第1の制限酵素の第1の制限酵素認識部位の各々に隣接する核酸配列に対し順次相補的なプローブセット。
【０４８５】
20.プローブが、ゲノムDNAにおける第1の制限酵素の第1の制限酵素認識部位の各々の各側に隣接する核酸配列に対し順次相補的である、パラグラフ19に記載のプローブセット。
【０４８６】
21.プローブが、ゲノムDNAにおける第1の制限酵素の第1の制限酵素認識部位の各々から300塩基対未満である核酸配列に対し順次相補的である、パラグラフ19またはパラグラフ20にプローブセット。
【０４８７】
22.プローブが、ゲノムDNAにおける第1の制限酵素の第1の制限酵素認識部位の各々から300bp未満である配列に相補的である、パラグラフ19〜21のいずれかに記載のプローブセット。
【０４８８】
23.プローブが、ゲノムDNAにおける第1の制限酵素の第1の制限酵素認識部位の各々から200bpおよび300bpの間である配列に相補的である、パラグラフ19〜22のいずれかに記載のプローブセット。
【０４８９】
24.プローブが、ゲノムDNAにおける第1の制限酵素の第1の制限酵素認識部位の各々から100bpおよび200bpの間である配列に相補的である、パラグラフ19〜23のいずれかに記載のプローブセット。
【０４９０】
25.ゲノムDNAにおける第1の制限酵素の各第1の制限酵素認識部位に隣接する配列にハイブリダイズすることができる2つ以上のプローブが設計される、パラグラフ19〜24のいずれかに記載のプローブセット。
【０４９１】
26.プローブが重複または一部重複している、パラグラフ25に記載のプローブセット。
【０４９２】
27.重複が10ヌクレオチド未満である、パラグラフ26に記載のプローブセット。
【０４９３】
28.プローブ配列が、第1の制限酵素の第1の制限酵素認識部位の各々と、第2の制限酵素の最初に隣接する第2の制限酵素認識部位の各々との間の配列のすべてまたは一部に一致する、パラグラフ19〜27のいずれかに記載のプローブセット。
【０４９４】
29.各プローブが少なくとも25merである、パラグラフ19〜28のいずれかに記載のプローブセット。
【０４９５】
30.各プローブが25〜60merである、パラグラフ19〜29のいずれかに記載のプローブセット。
【０４９６】
31.(a)ゲノムDNAにおける第1の制限酵素の第1の制限酵素認識部位の各々を同定するステップと、
(b)ゲノムDNAにおける第1の制限酵素認識部位の各々に隣接する配列にハイブリダイズすることができるプローブを設計するステップと、
(c)プローブを合成するステップと、
(d)プローブを互いに結合させてプローブセットを形成する、または実質的なプローブセットを形成するステップと
を含む、プローブセットの製造方法。
【０４９７】
32.プローブがPCR増幅産物である、パラグラフ31に記載の方法。
【０４９８】
33.パラグラフ31またはパラグラフ32に記載の方法により得られる、または得ることができるプローブセットまたは実質的なプローブセット。
【０４９９】
34.パラグラフ18に記載のプローブアレイ、またはパラグラフ19〜30もしくは33のいずれかに記載の実質的なプローブセットを含むアレイ。
【０５００】
35.パラグラフ19〜30または33のいずれかに記載のプローブセットを含むアレイ。
【０５０１】
36.約300,000〜400,000プローブを含む、パラグラフ34またはパラグラフ35に記載のアレイ。
【０５０２】
37.約385,000以上のプローブ、好ましくは約750,000プローブ、より好ましくは6×750,000プローブを含む、パラグラフ34〜36のいずれかに記載のアレイ。
【０５０３】
38.プローブ数が、単一のアレイに含有されうるプローブ数を超える場合、アレイが、より低い解像度(resolusion)での所与の種の完全ゲノムの表示を含む、または該表示からなる、パラグラフ34〜37のいずれかに記載のアレイ。
【０５０４】
39.線状染色体鋳型上に順に並べられた2、3、4、5、6、7、8、9または10プローブに1つのプローブが、アレイに含有されている、パラグラフ38に記載のアレイ。
【０５０５】
40.パラグラフ18に記載の実質的なプローブアレイ、またはパラグラフ19〜30もしくは33のいずれかに記載の実質的なプローブセットを固体支持体に固定化するステップを含む、アレイの製造方法。
【０５０６】
41.パラグラフ18に記載のプローブアレイ、またはパラグラフ19〜30もしくは33のいずれかに記載のプローブセットを固体支持体に固定化するステップを含む、アレイの製造方法。
【０５０７】
42.パラグラフ40またはパラグラフ41に記載の方法により得られる、または得ることができるアレイ。
【０５０８】
43.(a)架橋DNAの試料を準備するステップと、
(b)架橋DNAを第1の制限酵素で消化するステップと、
(c)架橋ヌクレオチド配列をライゲーションするステップと、
(d)脱架橋するステップと、
(e)ヌクレオチド配列を第2の制限酵素で消化するステップと、
(f)ヌクレオチド配列を環状化するステップと、
(g)標的ヌクレオチド配列にライゲーションされる1つまたは複数のヌクレオチド配列を増幅するステップと、
(h)場合により、増幅配列をアレイにハイブリダイズするステップと、
(i)DNA配列間の相互作用の頻度を判定するステップと
を含む、標的ヌクレオチド配列と、1つまたは複数のヌクレオチド配列(例えば、1つまたは複数のゲノム遺伝子座)との相互作用の頻度を解析する方法。
【０５０９】
44.(a)疾患および非疾患細胞から架橋DNAの試料を準備するステップと、
(b)各試料中の架橋DNAを第1の制限酵素で消化するステップと、
(c)架橋ヌクレオチド配列をライゲーションするステップと、
(d)脱架橋するステップと、
(e)ヌクレオチド配列を第2の制限酵素で消化するステップと、
(f)ヌクレオチド配列を環状化するステップと、
(g)標的ヌクレオチド配列にライゲーションされる1つまたは複数の配列を増幅するステップと、
(h)場合により、増幅ヌクレオチド配列をアレイにハイブリダイズするステップと、
(i)DNA配列間の相互作用の頻度を判定するステップと
を含み、
疾患および非疾患細胞由来のDNA配列間の相互作用の頻度間の差は、DNA-DNA相互作用が特定の疾患状態を示していることを示す、特定の疾患状態を示す1つまたは複数のDNA-DNA相互作用を同定する方法。
【０５１０】
45.(a)被験体から架橋DNAの試料を準備するステップと、
(b)架橋DNAを第1の制限酵素で消化するステップと、
(c)架橋ヌクレオチド配列をライゲーションするステップと、
(d)脱架橋するステップと、
(e)ヌクレオチド配列を第2の制限酵素で消化するステップと、
(f)ヌクレオチド配列を環状化するステップと、
(g)標的ヌクレオチド配列にライゲーションされる1つまたは複数の配列を増幅するステップと、
(h)場合により、増幅ヌクレオチド配列をアレイにハイブリダイズするステップと、
(i)DNA配列間の相互作用の頻度を判定するステップと、
(j)DNA配列間の相互作用の頻度を、影響を受けない対照の頻度と比較するステップと
を含み、
対照から得られた値と被験体から得られた値との差は、被験体が疾患もしくは症候群に罹患していることを示す、または被験体が疾患もしくは症候群に罹患するであろうことを示す、DNA-DNA相互作用の変化により引き起こされる、またはDNA-DNA相互作用の変化に関連した疾患もしくは症候群の診断または予後方法。
【０５１１】
46.相互作用の低頻度から高頻度への移行がブレイクポイントの位置を示す、パラグラフ45に記載の方法。
【０５１２】
47.対照と比較した被験体試料のDNA-DNA相互作用頻度の逆パターンが逆位を示す、パラグラフ45に記載の方法。
【０５１３】
48.対照と比較した被験体試料のDNA-DNA相互作用頻度の減少が、より遠位領域のDNA-DNA相互作用頻度の増加と併せて欠失を示す、パラグラフ45に記載の方法。
【０５１４】
49.対照と比較した被験体試料のDNA-DNA相互作用頻度の増加または減少が重複または挿入を示す、パラグラフ45に記載の方法。
【０５１５】
50.スペクトル核型分析および/またはFISHが、方法の実施前に使用される、パラグラフ45〜49のいずれかに記載の方法。
【０５１６】
51.疾患が遺伝疾患である、パラグラフ45〜50のいずれかに記載の方法。
【０５１７】
52.疾患が癌である、パラグラフ45〜51のいずれかに記載の方法。
【０５１８】
53.(a)被験体から架橋DNAの試料を準備するステップと、
(b)架橋DNAを第1の制限酵素で消化するステップと、
(c)架橋ヌクレオチド配列をライゲーションするステップと、
(d)脱架橋するステップと、
(e)ヌクレオチド配列を第2の制限酵素で消化するステップと、
(f)ヌクレオチド配列を環状化するステップと、
(g)標的ヌクレオチド配列にライゲーションされる1つまたは複数の配列を増幅するステップと、
(h)1つまたは複数の増幅配列を標識するステップと、
(i)ヌクレオチド配列をアレイにハイブリダイズするステップと、
(j)DNA配列間の相互作用の頻度を判定するステップと、
(j)疾患に関連したゲノム再編成を起こしている1つまたは複数の遺伝子座を同定するステップと
を含む、DNA-DNA相互作用の変化により引き起こされる、またはDNA-DNA相互作用の変化に関連した疾患もしくは症候群の診断または予後方法。
【０５１９】
54.2つ以上の増幅配列が特異的に標識される、パラグラフ53に記載の方法。
【０５２０】
55.2つ以上の増幅配列が異なる染色体上にある場合、前記配列が同一に標識される、パラグラフ54に記載の方法。
【０５２１】
56.2つ以上の増幅配列が、DNA-DNA相互作用シグナル間の最小限の重複には十分遠く離れた同一染色体上にある場合、前記配列が同様に標識される、パラグラフ53に記載の方法。
【０５２２】
57.(a)試料を1つまたは複数の剤と接触させるステップと、
(b)試料から架橋DNAを得るステップと、
(c)架橋DNAを第1の制限酵素で消化するステップと、
(d)架橋ヌクレオチド配列をライゲーションするステップと、
(e)脱架橋するステップと、
(f)ヌクレオチド配列を第2の制限酵素で消化するステップと、
(g)ヌクレオチド配列を環状化するステップと、
(h)標的ヌクレオチド配列にライゲーションされる1つまたは複数のヌクレオチド配列を増幅するステップと、
(i)場合により、増幅ヌクレオチド配列をアレイにハイブリダイズするステップと、
(j)DNA配列間の相互作用の頻度を判定するステップと
を含み、
(i)剤の存在下におけるDNA配列間の相互作用の頻度と、(ii)剤の非存在下におけるDNA配列間の相互作用の頻度との差は、DNA-DNA相互作用を調節する剤を示す、DNA-DNA相互作用を調節する1つまたは複数の剤を同定するアッセイ方法。
【０５２３】
58.(a)架橋DNAの試料を準備するステップと、
(b)架橋DNAを第1の制限酵素で消化するステップと、
(c)架橋ヌクレオチド配列をライゲーションするステップと、
(d)脱架橋するステップと、
(e)ヌクレオチド配列を第2の制限酵素で消化するステップと、
(f)ヌクレオチド配列を環状化するステップと、
(g)標的ヌクレオチド配列にライゲーションされる1つまたは複数の配列を増幅するステップと、
(h)場合により、増幅ヌクレオチド配列をアレイにハイブリダイズするステップと、
(i)DNA配列間の相互作用の頻度を判定するステップと、
(j)DNA配列間の相互作用の頻度を対照の頻度と比較するステップと
を含む、
対照と比較した試料におけるDNA-DNA相互作用の低頻度から高頻度への移行は、ブレイクポイントの位置を示す、ブレイクポイント(例えば、転座)の位置を検出する方法。
【０５２４】
59.(a)架橋DNAの試料を準備するステップと、
(b)架橋DNAを第1の制限酵素で消化するステップと、
(c)架橋ヌクレオチド配列をライゲーションするステップと、
(d)脱架橋するステップと、
(e)ヌクレオチド配列を第2の制限酵素で消化するステップと、
(f)ヌクレオチド配列を環状化するステップと、
(g)標的ヌクレオチド配列にライゲーションされる1つまたは複数の配列を増幅するステップと、
(h)場合により、増幅ヌクレオチド配列をアレイにハイブリダイズするステップと、
(i)DNA配列間の相互作用の頻度を判定するステップと、
(j)DNA配列間の相互作用の頻度を対照の頻度と比較するステップと
を含み、
対照と比較した試料のDNA-DNA相互作用頻度の逆パターンは逆位を示す、逆位の位置を検出する方法。
【０５２５】
60.(a)架橋DNAの試料を準備するステップと、
(b)架橋DNAを第1の制限酵素で消化するステップと、
(c)架橋ヌクレオチド配列をライゲーションするステップと、
(d)脱架橋するステップと、
(e)ヌクレオチド配列を第2の制限酵素で消化するステップと、
(f)ヌクレオチド配列を環状化するステップと、
(g)標的ヌクレオチド配列にライゲーションされる1つまたは複数の配列を増幅するステップと、
(h)場合により、増幅ヌクレオチド配列をアレイにハイブリダイズするステップと、
(i)DNA配列間の相互作用の頻度を判定するステップと、
(j)DNA配列間の相互作用の頻度を対照の頻度と比較するステップと
を含み、
対照と比較した試料のDNA-DNA相互作用頻度の減少は欠失を示す、欠失の位置を検出する方法。
【０５２６】
61.(a)架橋DNAの試料を準備するステップと、
(b)架橋DNAを第1の制限酵素で消化するステップと、
(c)架橋ヌクレオチド配列をライゲーションするステップと、
(d)脱架橋するステップと、
(e)ヌクレオチド配列を第2の制限酵素で消化するステップと、
(f)ヌクレオチド配列を環状化するステップと、
(g)標的ヌクレオチド配列にライゲーションされる1つまたは複数の配列を増幅するステップと、
(h)場合により、増幅ヌクレオチド配列をアレイにハイブリダイズするステップと、
(i)DNA配列間の相互作用の頻度を判定するステップと、
(j)DNA配列間の相互作用の頻度を対照の頻度と比較するステップと
を含み、
対照と比較した被験体試料のDNA-DNA相互作用頻度の増加または減少は、重複または挿入を示す、重複の位置を検出する方法。
【０５２７】
62.パラグラフ57に記載のアッセイ方法により得られる、または得ることができる剤。
【０５２８】
63.試料における1つまたは複数のDNA-DNA相互作用を同定するための、パラグラフ1〜9のいずれかに記載のヌクレオチド配列の使用。
【０５２９】
64.DNA-DNA相互作用の変化により引き起こされる、またはDNA-DNA相互作用の変化に関連した疾患もしくは症候群の診断または予後のための、パラグラフ1〜9のいずれかに記載のヌクレオチド配列の使用。
【０５３０】
65.試料における1つまたは複数のDNA-DNA相互作用を同定するための、パラグラフ18に記載のプローブアレイの使用、またはパラグラフ19〜30もしくは33のいずれかに記載のプローブセットの使用。
【０５３１】
66.DNA-DNA相互作用の変化により引き起こされる、またはDNA-DNA相互作用の変化に関連した疾患もしくは症候群の診断または予後のための、パラグラフ18に記載のプローブアレイの使用、またはパラグラフ19〜30もしくは33のいずれかに記載のプローブセットの使用。
【０５３２】
67.試料における1つまたは複数のDNA-DNA相互作用を同定するための、パラグラフ34〜39または42のいずれかに記載のアレイの使用。
【０５３３】
68.DNA-DNA相互作用の変化により引き起こされる、またはDNA-DNA相互作用の変化に関連した疾患もしくは症候群の診断または予後のための、パラグラフ34〜39または42のいずれかに記載のアレイの使用。
【０５３４】
69.診断または予後が、出生前診断または出生前予後である、パラグラフ64、66または68のいずれかに記載の使用。
【０５３５】
70.実質的に本明細書に記載の、実施例または図面のいずれかの参照による方法。
【０５３６】
71.実質的に本明細書に記載の、実施例または図面のいずれかの参照によるプローブアレイ。
【０５３７】
72.実質的に本明細書に記載の、実施例または図面のいずれかの参照によるプローブセット。
【０５３８】
73.実質的に本明細書に記載の、実施例または図面のいずれかの参照による方法。
【０５３９】
74.実質的に本明細書に記載の、実施例または図面のいずれかの参照によるアレイ。
【０５４０】
75.実質的に本明細書に記載の、実施例または図面のいずれかの参照によるアッセイ方法。
【０５４１】
76.実質的に本明細書に記載の、実施例または図面のいずれかの参照による剤。
【０５４２】
77.実質的に本明細書に記載の、実施例または図面のいずれかの参照による使用。
【表２】
0005416405.tif 000004
【０５４３】
参考文献
0005416405.tif 000005
0005416405.tif 000006
【０５４４】
上記明細書で記載されたすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の範囲および思想から逸脱することのない、本発明の記載された方法およびシステムの様々な変更および変形形態が、当業者には明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態との関連で記載されているが、請求された本発明は、このような特定の実施形態に不当に制限されるべきでない。実際、分子生物学または関連分野の当業者には明らかな、本発明を実施するための記載された形態の様々な変更は、上記特許請求の範囲内であるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０５４５】
【図１】3C技術の原理を示す図である。
【図２】(a)4C技術の一実施形態の原理を示す図である。3C分析は、例えば制限酵素としてHindIII(H)を用いて通常通り実施される。脱架橋の後、DNA混合物は、多くの異なる断片にライゲーションした第1の(標的)ヌクレオチド配列を含むであろう。これらの断片は、逆PCR等の増幅方法を使用して、例えばDpnII環上で、第1の(標的)ヌクレオチド配列に特異的なプライマーを使用して増幅されて、標識されるであろう。標識された増幅産物は、本明細書中に記載されるようなアレイにハイブリダイズされてもよい。HindIIIとDpnIIは例として与えられるが、6または8および4または5のカッター等の制限酵素の他の組合せもまた使用することができる。(b)ゲル電気泳動により、2つの別個の胎児肝臓(L1、L2)および胎児脳(B1、B2)の試料から分離されたPCR結果。(c)マイクロアレイプローブの位置の略図。プローブはHindIII部位の100bpの範囲内で設計された。したがって、各プローブは、1つの可能性として考えられるライゲーションパートナーを分析する。
【図３】4C技術で、β-グロビン(第7染色体)のゲノム環境を検出した結果を示す図である。マウス第10染色体、第11染色体、第12染色体、第14染色体、第15染色体、第7染色体、および第8染色体上の約35Mbのゲノム領域に位置するプローブについての未処理の比(対照試料について得られたシグナルで割ったβ-グロビンHS2についての4Cシグナル)を示す(上から下;示した領域は、各対応するセントロメアからの同一の距離にある)。第7染色体(6列目)上の(グロビン)ベイトの周囲の強力なシグナルの大クラスターに注目されたい、これは、4C技術が、線状の染色体鋳型上で近接するゲノム断片を検出するということを実証する(相互作用頻度はゲノム部位の分離に反比例するという事実と一致する)。高いシグナル強度を示すベイトの周囲のシスに結合する領域は大であり(>5Mb)、例えば、転座は、ブレイクポイントから1MBを超えて離れたベイトでさえも検出することができることを暗示することに注目されたい。
【図４】4C技術で、Rad23A(第8染色体)のゲノム環境を検出した結果を示す図である。マウス第10染色体、第11染色体、第12染色体、第14染色体、第15染色体、第7染色体、および第8染色体上の約15Mb以上のゲノム領域に位置するプローブについての未処理の比(対照試料について得られたシグナルで割ったRad23Aについての4Cシグナル)を示す。(上から下;示された領域は、各対応するセントロメアからの同一の距離にある)。第8染色体上の(Rad23)ベイトの周囲の強力なシグナルの大クラスターに注目されたい(7列目)、これは、4C技術が、線状の染色体鋳型上で近接するゲノム断片を検出するということを実証する(相互作用頻度はゲノム部位の分離に反比例するという事実に一致する)。高いシグナル強度を示すベイトの周囲のシスに結合する領域は大であり(>5Mb)、例えば、転座は、ブレイクポイントから1MBを超えて離れたベイトでさえも検出することができることを暗示することに注目されたい。
【図５】転写組織(胎児肝臓)および非転写組織(胎児脳)についての第7染色体(約135Mb)上のβ-グロビンの4C相互作用(実施平均アプローチにより分析)を示す図である。β-グロビンとの遠距離相互作用は組織間で異なることに注目されたい(遺伝子の転写状態に依存するようである)。組織と無関係に、強力な4Cシグナルは、ベイトの周囲の大領域(>5Mb)の境界を定める。
【図６】UrosとErafは、胎児肝細胞においてβ-グロビンと相互作用することを示す図である。4Cアプローチは、2つの遺伝子、すなわちErafおよびUrosが、>30Mbを越えて、約30Mb離れて位置するβ-グロビン遺伝子座と相互作用することを明らかにする。これらの2つの相互作用は、Osborne et al., Nature Genetics 36, 1065 (2004)に記載されるように、以前に、異なる技術(蛍光発光in situハイブリダイゼーション)により発見された。この例は、4C技術により検出された遠距離相互作用がFISHにより確認することができ、真に核の近位を反映することを示す。
【図７】4C技術で、シスで結合した関連がないゲノム領域間の移行を正確に同定した結果を示す図である。これらの実験については、マウス第8染色体上のRad23A座に挿入された(相同組換えを介して)ヒトβ-グロビン遺伝子座制御領域(LCR)カセット(約20kb)を含むトランスジェニックマウスを使用した。4C技術は、挿入についてホモ接合であったトランスジェニックマウスのE14.5胎児肝臓で実施した。組込みカセット(HS2)内のHindIII断片は「4C-ベイト」として使用した。データは、4C技術が、トランスジェニックカセットの両端を正確に確定することを示し、(下列:ヒトLCR(約20kb)におけるプローブのみが4C-シグナルを生じ、約380kbのヒトβ-グロビン配列の残りのプローブはシグナルを生じない)、マウス第8染色体上の組込みの位置をはっきりと明らかにする(上のパネル:第8染色体上のシグナル(組込みの位置については矢印を参照)を6つの他のマウス染色体上のシグナルと比較)(完全な染色体を表す)。この例は、4C技術が、異所的に組み込まれたDNA断片(ウイルス、トランスジーン等)のゲノムの位置を検出するために使用することができることを示す。この例は、シスで結合した関連がないゲノム領域間の移行を正確に同定することができることを示し、この移行を、ゲノムのブレイクポイントおよび転座相手を同定するために使用することができる。
【図８】4C技術で、HS2およびβ-グロビンについてのプロファイルが非常に類似しているので再現可能なデータを生成した結果を示す図である。4つの生物学的に別個の4Cの実験を、β-グロビン遺伝子β-メジャー(上の2列)またはβ-グロビンHS2(下の2列)をベイトとして使用してE14.5胎児肝臓で実施した。これらのベイトは線状の染色体鋳型上で約40kb離れているが、核内空間において近接することが以前に示された(Tolhuis et al, Molecular Cell 10, 1453 (2002))。β-グロビン遺伝子座から20〜20Mb離れた、マウス第7染色体上の約5Mbの領域を表す。データは、別個の実験の間の高度な再現性を示し、核内空間において近接する2つの断片が、ゲノムにおける他のところに位置した相互作用する相手を共有することを実証する。
【図９】4C技術で、健常な人(上)および転座(A;B)を有する患者(下)からの細胞中の配列X(染色体A上)とのDNA-DNA相互作用頻度を測定するために適用した結果を示す図である。DNA-DNA相互作用頻度(Y軸)を表すシグナル強度は、線状の染色体鋳型(X軸)上に順序づけられたプローブに対してプロットする。正常細胞では、高頻度のDNA-DNA相互作用が配列Xの周囲の染色体A上に検出される。患者細胞では、相互作用頻度における50%の低下がブレイクポイント(breakpoint;BP)の片方に位置した染色体A上のプローブについて観察される(灰色の曲線(患者)を黒色の線(健常な人)と比較)。さらに、転座は、染色体Bの一部を、配列Xに対して物理的な近位の近接に運び、高頻度のDNA-DNA相互作用が染色体B上のこの領域について観察される。この染色体上での低度の相互作用頻度から高度の相互作用頻度への突然の移行によりそのブレイクポイントの位置が特徴づけられる。
【図１０】4C技術により(平衡)逆位(複数可)を検出することができることを示す図である。逆のパターンのDNA-DNA相互作用頻度(4C技術によりハイブリダイゼーションシグナル強度として測定した)が病気にかかっていない被験体(点線の曲線)と比較して、病気にかかっている対照(実線の曲線)で観察され、逆位の存在およびサイズを明らかにする。
【図１１】4C技術によるヘテロ接合欠失(複数可)検出を示す図である。病気にかかっていない被験体(黒色の曲線)と比較して病気にかかっている被験体(灰色の曲線)でDNA-DNA相互作用頻度が低下したプローブ(4C技術により、ハイブリダイゼーションシグナル強度として測定した)が、欠失した領域の位置およびサイズを明らかにする。病気にかかっている被験体の欠失した領域の残りのハイブリダイゼーションシグナルは、無傷の対立遺伝子(ヘテロ接合欠失)から生じる。欠失は、これらの領域が、4C配列(ベイト)により近接する物理的な近位に来るので、通常、欠失した領域を越えて直接的に位置するプローブについてのシグナル強度の増加を伴う(欠失の右側で灰色の曲線が黒色の曲線を超えていることに注目されたい)。
【図１２】4C技術により検出された重複を示す図である。正常被験体(点線の曲線)と比較して患者(実線の曲線)においてハイブリダイゼーションシグナルが増加したプローブは重複の位置およびサイズを示す。4C技術により検出される重複は、通常、重複した領域を越えたプローブについて、病気にかかっている被験体において、病気にかかっていない被験体に対して、ハイブリダイゼーションシグナルの減少が伴う。(重複は、4C配列からのそれらのゲノム部位の分離を増加させる)。
【図１３】4C技術により明らかにされたβ-グロビンとの遠距離相互作用を示す図である。a.第7染色体および2つの関連がない染色体(8および14)とのβ-グロビンHS2の相互作用を明らかにする対照ハイブリダイゼーションシグナルに対する4Cの未処理の比。b〜c.第7染色体上の2つの異なる1〜2Mb領域に沿ってプロットされた2つの別個の胎児肝臓試料(上、赤色)および胎児脳試料(下、青色)についての未処理のデータ。相互作用の高度に再現可能なクラスターが、2つの胎児肝臓試料(b)または2つの脳試料(c)で観察される。d〜e.同一の領域についての実施平均データ。誤検出率は5%に設定した(点線)。f. 第7染色体上の活性のある(胎児肝臓、上)および不活性な(胎児脳、下)β-グロビンの相互作用の領域の略図。
【図１４】活性β-グロビンおよび不活性β-グロビンは、活性染色体テリトリーおよび不活性染色体テリトリーとそれぞれ相互作用することを示す図である。a.胎児肝臓におけるβ-グロビン遠距離相互作用(4C実施平均、上)、胎児肝臓におけるマイクロアレイ発現分析(対数目盛り、中央)、および遺伝子Uros(β-グロビンから約30Mb離れている)を含んでいる4Mb領域に沿ってプロットされた遺伝子の位置(下)の間の比較、活性β-グロビンが他の活発に転写された遺伝子と優先的に相互作用することを示す。b.グロビンから約38Mb離れて位置するOR遺伝子クラスターの周囲の胎児脳における同様の比較、不活性β-グロビンは優先的に不活性領域と相互作用することを示す。c.遺伝子含有量および活性に関する胎児肝臓(左)および胎児脳(右)におけるβ-グロビンと相互作用する領域の特徴づけ。
【図１５】一様に発現したRad23Aは、胎児肝臓および胎児脳における非常に類似する活性のある領域と相互作用することを示す図である。a.胎児肝臓(上、赤色)および胎児脳(下、青色)における、活性Rad23Aと相互作用する第8染色体上の領域の略図。b.胎児肝臓におけるRad23A遠距離相互作用(4C実施平均)およびマイクロアレイ発現分析(対数目盛り)(上の2パネル)、胎児脳におけるRad23A遠距離相互作用(4C実施平均)およびマイクロアレイ発現分析 (対数目盛り)(パネル3および4)、ならびに第8染色体の3Mb領域に沿ってプロットされた遺伝子の位置(下のパネル)の間の比較。c.遺伝子含有量および活性に関する胎児肝臓(左)および胎児脳(右)におけるRad23Aと相互作用する領域の特徴づけ。
【図１６】凍結-FISHで、4C技術により真に相互作用する領域が同定されることを確認した結果を示す図である。a.10を超える核を示す(200nm)凍結切片の一部の例、そのうちのいくつかは、β-グロビン遺伝子座(緑)および/またはUros(赤色)を含んでいる。切片化のために、多数の核は、これらの2つの遺伝子座についてのシグナルを含んでいない。b〜d.完全な(b)および部分的な(c)重複シグナルおよび接触シグナル(d)の例、すべて、相互作用について陽性と評価された。e〜g.非接触対立遺伝子を含んでいる核(e〜f)およびβ-グロビンのみを含んでいる核(g)の例、すべて、相互作用について陰性と評価された。h〜i.凍結-FISH結果の略図。4C技術により陽性に同定された(赤色矢印)および陰性に同定された(青色矢印)領域について、β-グロビン(h)およびRad23A(i)との相互作用のパーセンテージを染色体の上に示す。同一のBACを2つの組織に使用した。胎児肝臓および胎児脳における2つの遠位のOR遺伝子クラスターの間の凍結-FISHにより測定した相互作用頻度を染色体の下に示す。
【図１７】HS2およびβ-メジャーの4C分析により高度に類似する結果が得られることを示す図である。(a)4つの別個のE14.5肝臓試料の未処理の4Cデータは非常に類似するパターンのHS2(上)およびβ-メジャー(下)との相互作用を示す。(b)HS-2実験における相互作用について陽性と評価されたプローブおよびβ-メジャー実験における相互作用について陽性と評価されたプローブの間に大きな重複が存在する。
【図１８】シスおよびトランスでの相互作用の間の比較を示す図である。(a)陽性に同定されたシスでの領域(第7染色体、上)およびα-グロビン遺伝子座を含んでいるトランスでの領域(chr.11、下)とのβ-グロビン相互作用を示す2つの別個の実験からの未処理の4Cデータ。(b)陽性に同定されたシスでの領域(第8染色体(上))および最も高い実施平均値に従って並べた場合に上位に現れたトランスでの領域とのRad23A相互作用を示す2つの別個の実験からの未処理の4Cデータ。トランスでの領域はどれも、シスでの遠い相互作用領域の同定を可能にした厳格な条件を満たさなかった。
【図１９】β-グロビンと相互作用する領域はまた頻繁に互いに接触することを示す図である。活発に転写された遺伝子を含み、胎児肝臓におけるβ-グロビンと相互作用することを4C技術により同定された2つの領域(ほぼ60Mb離れている)は、凍結-FISHによる5.5%の共存頻度(co-localization frequencies)を示し、バックグラウンド共存頻度を有意に超えた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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