(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、２型糖尿病、並びに２型糖尿病に起因する、メタボリックシンドローム、耐糖能異常、肥満症及び脂質異常症からなる群から選択される代謝性疾患を予防又は治療し得る物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質の存在下、セレクチンをＰＳＧＬ−１に接触させる工程；
（ｂ）被験物質の存在下におけるセレクチンとＰＳＧＬ−１との結合能を測定し、該結合能を被験物質の非存在下におけるセレクチンとＰＳＧＬ−１との結合能と比較する工程；及び、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、セレクチンとＰＳＧＬ−１との結合能の低下をもたらす被験物質を前記の代謝性疾患を予防又は治療し得る物質として選択する工程。
【請求項２】
前記の工程（ａ）が、該被験物質の存在下、セレクチン又はその発現細胞を、ＰＳＧＬ−１又はその発現細胞に接触させることにより行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記の工程（ｂ）における結合能の測定が、フローサイトメトリー法及び表面プラズモン共鳴法からなる群から選択される方法を用いて行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
セレクチンがＰ−セレクチンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
以下の工程を含む、２型糖尿病、並びに２型糖尿病に起因する、メタボリックシンドローム、耐糖能異常、肥満症及び脂質異常症からなる群から選択される代謝性疾患を予防又は治療し得る物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質とＰＳＧＬ−１タンパク質又はそれをコードする遺伝子の発現を測定可能な細胞とを接触させる工程；
（ｂ）被験物質を接触させた細胞における発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞における発現量と比較する工程；及び、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、発現量を低下させた被験物質を前記の代謝性疾患を予防又は治療し得る物質として選択する工程。
【請求項６】
前記の工程（ａ）の細胞が白血球である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記の工程（ｂ）における発現量の測定が、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノザンブロッティング法、放射性同位元素免疫測定法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法およびレポーターアッセイ法からなる群から選択される方法を用いて行われる、請求項５又は６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、代謝性疾患の予防及び／又は治療剤及びそのスクリーニング方法に関する。より具体的には、本発明は、ＰＳＧＬ−１に対する阻害物質を含有する、メタボリックシンドローム、２型糖尿病、耐糖能異常、肥満症又は脂質異常症などの代謝性疾患の予防及び／又は治療剤、並びにＰＳＧＬ−１の機能阻害を指標とする代謝性疾患の予防及び／又は治療剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
先進各国において、生活習慣病、特にメタボリックシンドロームの罹患者が近年著しく増加しており、医療における重大な問題となっている。メタボリックシンドロームの患者においては、内臓脂肪型肥満、高血糖、高血圧、高脂血症などの症状が重積しており、これらの症状の重積により、心筋梗塞や脳梗塞などの動脈硬化性疾患を発症する可能性が高くなっている。メタボリックシンドロームの診断基準は世界的に統一されておらず、例えば我が国においては、内臓脂肪型肥満を必須項目とし、更に高血圧、高血糖及び血清脂質異常のうちの２項目以上に該当する場合にメタボリックシンドロームと診断される。【０００３】
メタボリックシンドロームの近年の流行は、飽食と運動不足によるところが大きいため、その治療方針として食事療法及び運動療法がこれまで重視されてきた。しかしながら、これらの療法は、患者自身の生活習慣の根本的な改善を強いることが多く、それゆえ実現が困難であることが多い。一方、メタボリックシンドロームの主要な病態である高血圧、高血糖及び血清脂質異常のそれぞれに対する薬物療法も試みられており、例えば、高トリグリセリド／低ＨＤＬ−コレステロール血症にはフィブラート系又はスタチン系薬剤；糖代謝異常にはスルホニルウレア系薬剤、速効型インスリン分泌促進薬、α−グルコシダーゼ阻害剤又はインスリン抵抗性改善剤；高血圧にはアンジオテンシン変換酵素阻害剤又はアドレナリンα受容体アンタゴニストなどが利用されている。しかしながら、これらの薬物療法は、医療費が高価であることや必ずしも治療効果が確実でないことなどの問題点がある。また、内臓脂肪型肥満に対する薬物療法としては、中枢性の食欲抑制剤による間接的な予防又は治療がなされているのみである。【０００４】
メタボリックシンドロームや２型糖尿病をはじめとする生活習慣病の発症において、インスリン抵抗性の重要性が広く認識されている。インスリン抵抗性とは、骨格筋細胞、肝細胞、脂肪細胞などにおいて、インスリン感受性が低下することにより、インスリン分泌は保たれているものの、その作用が低下した状態をいう。インスリン抵抗性が高インスリン血症、次いで耐糖能異常、更には高血圧や脂質代謝異常を惹き起こすと考えられている（非特許文献１）。インスリン抵抗性の発症メカニズムは完全に明らかにされているわけではないが、従来過栄養状態や運動不足によりもたらされる内臓脂肪の蓄積及び増加が重要視されてきた。更に、近年になって、肥満とインスリン抵抗性との間には炎症が介在していることが明らかにされてきており、脂肪細胞の肥大化・壊死とそれを冠状に取り囲むマクロファージの集積が、炎症とインスリン抵抗性をもたらしているという認識が広まっている。【０００５】
ＰＳＧＬ−１は、白血球と血管内皮細胞との接着に関与する細胞表面の分子であるＰ−セレクチンのリガンドとしてクローニングされた膜タンパク質である（特許文献１、非特許文献２）。ＰＳＧＬ−１は、２２０ｋＤａのジスルフィド結合ホモダイマーシアロムチンであり、ほとんどの血液白血球（例えば、好中球、単球、マクロファージ、Ｂ細胞のサブセット、及び全てのＴ細胞）はＰＳＧＬ−１を発現することが知られている。炎症において非常に重要な過程である傷害組織への白血球の遊走及び浸潤には多種多様な細胞接着分子が関与しており、炎症の初期段階に観察されるローリングと呼ばれる現象は、セレクチンとそれらに特異的な糖鎖リガンドとの相互作用（例えばＰ−セレクチンとＰＳＧＬ−１との相互作用）を介して行われることが分かっていた（非特許文献３及び４）。しかしながら、メタボリックシンドロームや２型糖尿病をはじめとする生活習慣病の発症において、ＰＳＧＬ−１が重要な役割を果たしていることはこれまで知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表平０８−５０２８８６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｒｅａｖｅｎ  ＧＭ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ；３７（１２）：１５９５−１６０７（１９８８）
【非特許文献２】Ｓａｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ；７５（６）：１１７９−１１８６（１９９３）
【非特許文献３】Ｔｅｄｄｅｒ  ＴＦ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．；９（１０）：８６６−７３（１９９５）
【非特許文献４】Ｙａｎｇ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．；８１（１）：１−７（１９９９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述した当該技術分野における現状から分かるように、メタボリックシンドロームや２型糖尿病などの生活習慣病に対する有効且つ患者にとって容易な新規の治療及び予防法に対する需要が存在している。特に、それらの生活習慣病の基盤であるインスリン抵抗性、脂肪細胞の炎症、及び肥満に対して、単独で効果をもたらす薬剤に対する期待及び重要性は非常に大きいといえよう。本発明は、メタボリックシンドロームや２型糖尿病などの生活習慣病における根本的病態の予防及び／又は治療に対して単独で効果をもたらし得る予防及び／又は治療剤やそのスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、大きな社会問題にもなっている糖尿病、高脂血症及び高血圧などの生活習慣病の予防及び治療に以前より力を注いできた。そのなかで、集積した生活習慣病の各病態を個別に予防又は治療するのではなく、生活習慣病の根本的病態を単独の治療で予防及び／又は治療し得る薬剤の必要性を痛切に感じ、そのための研究を重点的に行ってきた。その結果、細胞接着関連分子であるＰＳＧＬ−１を阻害することにより、生活習慣病の根本的病態を予防及び／又は治療し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１０】
即ち、本発明は以下の通りである：
［１］ＰＳＧＬ−１に対する阻害物質を有効成分として含有する、代謝性疾患の予防及び／又は治療剤。
［２］代謝性疾患が、メタボリックシンドローム、２型糖尿病、耐糖能異常、肥満症又は脂質異常症である、上記［１］記載の剤。
［３］ＰＳＧＬ−１に対する阻害物質が、ＰＳＧＬ−１に対する特異的中和抗体、或いはＰＳＧＬ−１の発現を特異的に阻害可能なアンチセンス核酸若しくは小分子量干渉ＲＮＡ、又はこれらを哺乳動物細胞内において発現可能な発現ベクターである、上記［１］記載の剤。
［４］以下の工程を含む、代謝性疾患を予防又は治療し得る物質のスクリーニング方法：
（Ｉ）被験物質がＰＳＧＬ−１の機能を阻害するか検定すること、及び
（ＩＩ）ＰＳＧＬ−１の機能を阻害した被験物質を代謝性疾患を予防又は治療し得る物質として選択すること。
［５］代謝性疾患が、メタボリックシンドローム、２型糖尿病、耐糖能異常、肥満症又は脂質異常症である、上記［４］記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の剤は、内臓脂肪へのマクロファージの浸潤を抑制し、以って脂肪組織における炎症及びインスリン抵抗性の発症を阻害し得る。従って、本発明の剤を使用することにより、食事療法又は運動療法を行うことなく、メタボリックシンドローム、２型糖尿病、耐糖能異常、肥満症又は脂質異常症などの代謝性疾患に対する予防及び／又は治療効果を得ることが可能である。これらの代謝性疾患を予防及び／又は治療することにより、係る代謝性疾患に起因する動脈硬化性疾患の予防及び／又は進展抑制をすることも可能となる。本発明はまた、これらの代謝性疾患を予防又は治療し得る物質のスクリーニング方法も併せて提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】８週齢ｄｂ／ｄｂマウス及びＢＬ６マウスの体重、内臓脂肪重量及び各種代謝データの測定結果を示す図である（ｎ＝１０、平均±標準エラー、★：Ｐ＜０．０００１、★★：Ｐ＜０．００５）。（Ａ）は体重（ｇ）、（Ｂ）は精巣周囲脂肪重量（ｇ）、（Ｃ）は血清ＬＤＬ（ｍｇ／ｄｌ）、（Ｄ）は随時血糖（ｍｇ／ｄｌ）、（Ｅ）は随時ＩＲＩ（ｎｇ／ｍｌ）、（Ｆ）はＨｂＡ１ｃ（％）の測定結果を示している。
【図２】８週齢ｄｂ／ｄｂマウス及びＢＬ６マウスの内臓脂肪における各種遺伝子発現の定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる測定結果を示す図である（ｎ＝１０、平均±標準エラー、★：Ｐ＜０．００５、★★：Ｐ＜０．０５）。（Ａ）はＦ４／８０、（Ｂ）はＭＣＰ−１、（Ｃ）はＰＳＧＬ−１、（Ｄ）はＰ−セレクチン、（Ｅ）はＥ−セレクチン、（Ｆ）はＩＣＡＭ−１の測定結果を示している。縦軸はインデックス値を示している。
【図３】１９週齢高脂肪食負荷マウス及び低脂肪食負荷マウスの体重、内臓脂肪重量及び各種代謝データの測定結果を示す図である（白丸：低脂肪食負荷マウス（ＬＦ；ｎ＝９）、黒三角：高脂肪食負荷マウス（ＨＦ；ｎ＝１１）、平均±標準エラー、★：Ｐ＜０．０００５、★★：Ｐ＜０．００１）。（Ａ）は体重（横軸：週齢数（ｗ）、縦軸：体重（ｇ））、（Ｂ）は精巣周囲脂肪重量（ｇ）、（Ｃ）は血清ＬＤＬ（ｍｇ／ｄｌ）、（Ｄ）は空腹時血糖（ｍｇ／ｄｌ）、（Ｅ）は空腹時ＩＲＩ（ｎｇ／ｍｌ）、（Ｆ）はＨｂＡ１ｃ（％）の測定結果を示している。
【図４】１９週齢高脂肪食負荷マウス及び低脂肪食負荷マウスに対するインスリン負荷試験(ＩＴＴ)及び腹腔内グルコース負荷試験(ＩＰＧＴＴ)の結果を示す図である（白丸：低脂肪食負荷マウス（ＬＦ；ｎ＝９）、黒三角：高脂肪食負荷マウス（ＨＦ；ｎ＝１１）、平均±標準エラー、★：Ｐ＜０．００５、★★：Ｐ＜０．０５）。（Ａ）はＩＰＧＴＴ血糖値（ｍｇ／ｄｌ）、（Ｂ）はＩＰＧＴＴ血漿インスリン値（ｎｇ／ｍｌ）、（Ｃ）はＩＴＴ血糖値のインスリン負荷前血糖値に対する割合（％）を示している。（Ａ）〜（Ｃ）において、横軸は負荷開始後の時間（分）を示す。なお、「前」は負荷前であることを意味する。
【図５】１９週齢高脂肪食負荷マウスの内臓脂肪組織における各種遺伝子発現の定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる測定結果を示す図である（低脂肪食負荷マウス（ＬＦ）：ｎ＝９、高脂肪食負荷マウス（ＨＦ）：ｎ＝１０、平均±標準エラー、★：Ｐ＜０．００１）。（Ａ）はＣＤ６８、（Ｂ）はＭＣＰ−１、（Ｃ）はＰＳＧＬ−１、（Ｄ）はＰ−セレクチン、（Ｅ）はＥ−セレクチン、（Ｆ）はＩＣＡＭ−１の測定結果を示している。縦軸はインデックス値を示している。
【図６】高脂肪食負荷後の１７週齢ＢＬ６マウス及びＰＳＧＬ−１ノックアウトマウスにおける体重、内臓脂肪重量及び各種代謝データの測定結果を示す図である（高脂肪食負荷ＢＬ６マウス（ＷＴ−ＨＦ）：ｎ＝７、高脂肪食負荷ＰＳＧＬ−１ノックアウトマウス（ＫＯ−ＨＦ）：ｎ＝８、平均±標準エラー、★：Ｐ＜０．００５、★★：Ｐ＜０．０５））。（Ａ）は体重（ｇ）、（Ｂ）は精巣周囲脂肪重量／体重比（％）、（Ｃ）は総コレステロール（ｍｇ／ｄｌ）、（Ｄ）はＬＤＬ（ｍｇ／ｄｌ）、（Ｅ）は中性脂肪（ｍｇ／ｄｌ）、（Ｆ）は血清ＦＦＡ（μＥｑ／ｌ）、（Ｇ）は空腹時血糖（ｍｇ／ｄｌ）、（Ｈ）は空腹時ＩＲＩ（ｎｇ／ｍｌ）、（Ｉ）はＨｂＡ１ｃ（％）、（Ｊ）は血清レプチン（ｎｇ／ｍｌ）、（Ｋ）は血清アディポネクチン（μｇ／ｍｌ）の測定結果を示している。
【図７】高脂肪食負荷後のＢＬ６マウス及びＰＳＧＬ−１ノックアウトマウスに対するインスリン負荷試験(ＩＴＴ)及び腹腔内グルコース負荷試験(ＩＰＧＴＴ)の結果を示す図である（白丸：高脂肪食負荷ＢＬ６マウス（ＷＴ−ＨＦ；ｎ＝９）、黒三角：高脂肪食負荷ＰＳＧＬ−１ノックアウトマウス（ＫＯ−ＨＦ；ｎ＝８）、平均±標準エラー、★：Ｐ＜０．０５）。（Ａ）はＩＰＧＴＴ血糖値（ｍｇ／ｄｌ）、（Ｂ）はＩＰＧＴＴ血漿インスリン値（ｎｇ／ｍｌ）、（Ｃ）はＩＴＴ血糖値のインスリン負荷前血糖値に対する割合（％）を示している。（Ａ）〜（Ｃ）において、横軸は負荷開始後の時間（分）を示す。なお、「前」は負荷前であることを意味する。
【図８】高脂肪食負荷後のＢＬ６マウス及びＰＳＧＬ−１ノックアウトマウスにおける内臓脂肪組織の染色像、及び内臓脂肪細胞の面積を示す図である。（Ａ）は高脂肪食負荷ＢＬ６マウス（ＷＴ−ＨＦ；ｎ＝１８１８細胞）の内臓脂肪のＰＡＳ染色像（×２００）、（Ｂ）は高脂肪食負荷ＰＳＧＬ−１ノックアウトマウス（ＫＯ−ＨＦ；ｎ＝１８３４細胞）の内臓脂肪のＰＡＳ染色像（×２００）、（Ｃ）は高脂肪食負荷ＢＬ６マウス（ＷＴ−ＨＦ）及びＰＳＧＬ−１ノックアウトマウス（ＫＯ−ＨＦ）の内臓脂肪細胞の面積（μｍ２；平均±標準エラー、★：Ｐ＜０．０００１）を示している。
【図９】高脂肪食負荷後のＢＬ６マウス及びＰＳＧＬ−１ノックアウトマウスの内臓脂肪における各種遺伝子発現の定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる測定結果を示す図である（高脂肪食負荷ＢＬ６マウス（ＷＴ−ＨＦ）：ｎ＝７、高脂肪食負荷ＰＳＧＬ−１ノックアウトマウス（ＫＯ−ＨＦ）：ｎ＝７、平均±標準エラー、★：Ｐ＜０．０１、★★：Ｐ＜０．０５））。（Ａ）はＦ４／８０、（Ｂ）はＭＣＰ−１、（Ｃ）はＮＯＳ  ２（ｉＮＯＳ）、（Ｄ）はレプチンの測定結果を示している。縦軸はインデックス値を示す。
【図１０】高脂肪食負荷後のＢＬ６マウス（ＷＴ−ＨＦ）及びＰＳＧＬ−１ノックアウトマウス（ＫＯ−ＨＦ）における肝臓重量および肝臓中性脂肪含量ならびに肝臓のＨＥ染色像を示す図である。（Ａ）の左グラフは両マウスの肝臓重量（単位：ｇ）を示しており、右グラフは両マウスの肝臓中性脂肪含量（単位：ｍｇ／ｇ）を示している。（Ｂ）は両マウスについてそれぞれ肝臓組織のＨＥ染色像（×２００）を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、ＰＳＧＬ−１に対する阻害物質を有効成分として含有する、代謝性疾患の予防及び／又は治療剤を提供する。
【００１４】
本発明の剤の阻害対象である「ＰＳＧＬ−１」は、Ｏ−グリコシル化細胞外シアロムチンを有する公知の接着分子である。ＰＳＧＬ−１としては、上記特許文献１に開示されているヒトＰＳＧＬ−１、若しくは他の様々な哺乳動物におけるそのオルソログ、例えば、マウスＰＳＧＬ−１（Ｙａｎｇ  Ｊ．他，Ｂｌｏｏｄ，Ｍａｙ  １５；８７（１０）：４１７６−８６（１９９６））、又はそれらの天然のアレル体などを挙げることができる。ＰＳＧＬ−１のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ）配列も公知である。ヒトＰＳＧＬ−１及びマウスＰＳＧＬ−１のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列を、それぞれ配列番号１乃至４に例示する（配列番号１：ヒトＰＳＧＬ−１のｍＲＮＡ配列（ＮＣＢＩアクセッション番号  ＮＭ＿００３００６）；配列番号２：配列番号１のｍＲＮＡ配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション番号  ＮＰ＿００２９９７）；配列番号３：マウスＰＳＧＬ−１のｍＲＮＡ配列（ＮＣＢＩアクセッション番号  ＮＭ＿００９１５１）；配列番号４：配列番号３のｍＲＮＡ配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション番号  ＮＰ＿０３３１７７））。
【００１５】
本発明の剤における有効成分である、「ＰＳＧＬ−１に対する阻害物質」には、ＰＳＧＬ−１タンパク質の活性を阻害する物質（以下、ＰＳＧＬ−１活性阻害物質ともいう）とＰＳＧＬ−１の発現を阻害する物質（以下、ＰＳＧＬ−１発現阻害物質ともいう）とが含まれる。なお、本明細書において用語「阻害」とは、阻害対象（例えば、活性又は発現）を完全に或いは部分的に抑制又は減少させることを意味する。
【００１６】
ＰＳＧＬ−１の活性とは、セレクチンへの結合活性を意味する。セレクチンとしては、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン及びＬ−セレクチンを挙げることができるが、ＰＳＧＬ−１はＰ−セレクチンへの親和性が最も高い。本発明の剤で用いることのできるＰＳＧＬ−１活性阻害物質としては、例えば、特異的中和抗体（抗ＰＳＧＬ−１ポリクローナル抗体、抗ＰＳＧＬ−１モノクローナル抗体など）、セレクチン（Ｐ−セレクチンなど）との結合を阻害する物質（例えば、フコイダン、スルファチド、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸などのグリコサミノグリカンなど）、活性中心に結合する低分子物質などを挙げることができ、特異的中和抗体が好ましく、抗ＰＳＧＬ−１モノクローナル抗体がより好ましい。また、セレクチンに対する特異的中和抗体（抗Ｐ−セレクチンポリクローナル抗体、抗Ｐ−セレクチンモノクローナル抗体など）、可溶性セレクチンなどもＰＳＧＬ−１活性阻害物質として用いることができる。ＰＳＧＬ−１活性阻害物質は、後述するスクリーニング方法を用いて、選択、同定又は確認することができる。
【００１７】
本発明で用いることのできるＰＳＧＬ−１発現阻害物質としては、例えば、ＰＳＧＬ−１の発現を特異的に阻害可能なアンチセンス核酸若しくは小分子量干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ）、ＰＳＧＬ−１  ｍＲＮＡを特異的に切断可能なリボザイム、これらを哺乳動物細胞内において発現可能な発現ベクターなどを挙げることができる。また、ＰＳＧＬ−１発現阻害物質の例として、インフリキシマブ（レミケード）などの抗ＴＮＦα抗体製剤、エタネルセプト（エンブレル）などの可溶性ＴＮＦα受容体製剤、メソトレキセート（リウマトレックス）、タクロリムス；ＦＫ５０６（プログラフ）、シクロスポリン；ＣｙＡ（ネオーラル）、シクロフォスファミド（エンドキサン）、アザチオプリン（イムラン）、ミゾリビン（ブレディニン）、ＭＭＦ（セルセプト）などの免疫抑制剤などを挙げることができる。ＰＳＧＬ−１発現阻害物質は、後述するスクリーニング方法を用いて、選択、同定又は確認することができる。
【００１８】
上記アンチセンス核酸としては、ＰＳＧＬ−１の転写産物（ｍＲＮＡ又は初期転写産物）と特異的にハイブリダイズして、ＰＳＧＬ−１の翻訳を阻害し得る核酸をいう。核酸としては、ＤＮＡであっても、ＲＮＡであっても、或いはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであっても良い。
アンチセンス核酸の長さとしては、ＰＳＧＬ−１の転写産物と特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限はないが、合成の容易さや抗原性の観点などから、下限としては通常１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のものが挙げられ、上限としては通常１００塩基以下、好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２４塩基以下のものが挙げられる。従って、アンチセンス核酸としては、例えば１０塩基以上１００塩基以下、好ましくは１５塩基以上３０塩基以下、より好ましくは１５塩基以上２４塩基以下のオリゴヌクレオチドが使用され得る。
また、アンチセンス核酸の標的配列についても、アンチセンス核酸がハイブリダイズすることによりＰＳＧＬ−１の翻訳が阻害される配列であれば特に制限はなく、ｍＲＮＡの全配列であっても部分配列（通常１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上；且つ通常１００塩基以下、好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２４塩基以下）であってもよいし、あるいは初期転写産物のイントロン部分であってもよいが、アンチセンス核酸としてオリゴヌクレオチドを使用する場合は、標的配列はＰＳＧＬ−１のｍＲＮＡの５’末端からコード領域のＣ末端までに位置することが望ましい。
アンチセンス核酸の具体例としては、例えばヒトＰＳＧＬ−１の場合、配列番号：１に記載したｍＲＮＡの１−１３６９位までの塩基配列に含まれる、通常１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、且つ通常１００塩基以下、好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２４塩基以下の長さの塩基配列に相補的な配列を持つオリゴヌクレオチドが挙げられ、或いは例えばマウスＰＳＧＬ−１の場合、配列番号：３に記載したｍＲＮＡの１−１４１２位までの塩基配列に含まれる、通常１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、且つ通常１００塩基以下、好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２４塩基以下の長さの塩基配列に相補的な配列を持つオリゴヌクレオチドが挙げられる。
上記アンチセンス核酸の合成は自体公知の方法で行えば良く、例えば、所望の塩基配列を持つオリゴヌクレオチドを市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を用いて合成すれば良い。
【００１９】
上記ｓｉＲＮＡは、ＰＳＧＬ−１の転写産物（ｍＲＮＡ又は初期転写産物）のコード領域内の部分配列（通常１８塩基以上、好ましくは２１塩基以上、且つ通常３０塩基以下、好ましくは２７塩基以下、より好ましくは２３塩基以下；初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相補的な配列を有する二本鎖オリゴＲＮＡであり、当該転写産物を特異的に認識して切断することによりＰＳＧＬ−１の発現を阻害し得るものであれば特に制限されない。ｓｉＲＮＡの長さは、通常２１〜２３塩基である。当業者は、配列番号：１に記載したヒトＰＳＧＬ−１のｍＲＮＡ配列又は配列番号：３に記載したマウスＰＳＧＬ−１のｍＲＮＡ配列をもとに、ヒト又はマウスのＰＳＧＬ−１の発現を阻害するために使用され得るｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖の配列を決定することができる。
ｓｉＲＮＡの合成は自体公知の方法で行えば良く、例えば、センス鎖及びアンチセンス鎖をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、それらをアニーリングさせることにより合成することができる。
【００２０】
また、上記発現ベクターとしては、当該技術分野で使用される任意のものを使用することができ、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが挙げられる。
【００２１】
本明細書において、用語「代謝性疾患」とは、様々な栄養素（例、タンパク質、脂質、糖質、無機塩類、ビタミンなど）の代謝経路において、先天的又は後天的な原因が働いて様々な段階で障害が起こり、その結果、血液中又は特定の臓器で代謝産物が過剰になったり或いは不足したりすることに起因する疾患又は状態を意味する。代謝性疾患の例としては、メタボリックシンドローム、糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠糖尿病など）、耐糖能異常、肥満症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、脂質異常症（高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、低ＨＤＬ血症、食後高脂血症など）、高血圧症などが挙げられる。
【００２２】
メタボリックシンドロームの診断基準について、日本では、２００５年に日本内科学会など８学会の委員で構成されたメタボリックシンドローム診断基準検討委員会によって制定され、報告された。
この報告によれば、メタボリックシンドロームとは、内臓脂肪蓄積（ウエスト周囲径が男性は８５ｃｍ以上、女性は９０ｃｍ以上）を必須項目として、それに加えて脂質代謝異常（高トリグリセライド血症（１５０ｍｇ／ｄｌ以上）且つ／又は低ＨＤＬコレステロール血症（４０ｍｇ／ｄｌ未満））、高血圧（収縮期血圧が１３０ｍｍＨｇ以上、且つ／又は拡張期血圧が８５ｍｍＨｇ以上）及び高血糖（空腹時血糖が１１０ｍｇ／ｄｌ以上）からなる３項目のうちの２項目以上が該当する場合をいう。
【００２３】
メタボリックシンドロームの診断基準は、欧米では米国高脂血症治療ガイドライン：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  ＰｒｏｇｒａｍのＡｄｕｌｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｐａｎｅｌ  ＩＩＩ（ＮＣＥＰ−ＡＴＰ  ＩＩＩ）及びＷＨＯより提唱されている（ＪＡＭＡ  ２００１；２８５：２４８６−９７、及びＤｉａｂｅｔ．  Ｍｅｄ．  １９９８；１５：５３９−５５３を参照）。ＮＣＥＰ−ＡＴＰ  ＩＩＩでは肥満（胴囲測定）、高中性脂肪、低ＨＤＬコレステロール、高血圧及び高血糖のうち以下の条件に３つ以上該当する場合と定義されている。
１）ウエスト（腹囲）が男性で１０２ｃｍ以上、女性で８８ｃｍ以上；
２）空腹時トリグリセライドが１５０ｍｇ／ｄｌ以上；
３）ＨＤＬコレステロールが男性で４０ｍｇ／ｄｌ未満、女性で５０ｍｇ／ｄｌ未満；
４）血圧が最大血圧で１３０ｍｍＨｇ以上又は最小血圧で８５ｍｍＨｇ以上；
５）空腹時血糖値が１１０ｍｇ／ｄｌ以上。
一方、ＷＨＯの診断基準では、高インスリン血症（非糖尿病患者の上位２５％）又は空腹時血糖１１０ｍｇ／ｄｌ以上に加え、内臓肥満、脂質代謝異常、高血圧、マイクロアルブミン尿症のうち以下の条件に２つ以上該当する場合と定義されている。
１）内臓肥満：ウエスト／ヒップ比＞０．９（男性）、＞０．８５（女性）又はＢＭＩが３０を上回る；
２）脂質代謝異常：血漿トリグリセリド１５０ｍｇ／ｄｌ以上；
３）高血圧：最大血圧１４０／最小血圧９０ｍｍＨｇ以上又は降圧剤内服中；
４）マイクロアルブミン尿症：尿中アルブミン排泄率２０μｇ／ｍｉｎ以上又は尿中アルブミン／クレアチニン比３０ｍｇ／ｇ以上。
本発明の剤は、上記した診断基準により決定されるメタボリックシンドロームの予防及び／又は治療剤として使用され得る。
【００２４】
糖尿病の判定基準については、１９９９年に日本糖尿病学会から新たな判定基準が報告されている。
この報告によれば、糖尿病とは、空腹時血糖値（静脈血漿におけるグルコース濃度）が１２６ｍｇ／ｄｌ以上、７５ｇ経口ブドウ糖負荷試験（７５ｇＯＧＴＴ）２時間値（静脈血漿におけるグルコース濃度）が２００ｍｇ／ｄｌ以上、随時血糖値（静脈血漿におけるグルコース濃度）が２００ｍｇ／ｄｌ以上のいずれかを示す状態である。また、上記糖尿病に該当せず、かつ、「空腹時血糖値（静脈血漿におけるグルコース濃度）が１１０ｍｇ／ｄｌ未満または７５ｇ経口ブドウ糖負荷試験（７５ｇＯＧＴＴ）２時間値（静脈血漿におけるグルコース濃度）が１４０ｍｇ／ｄｌ未満を示す状態」（正常型）でない状態を、「境界型」と呼ぶ。
【００２５】
また、糖尿病の判定基準については、１９９７年にＡＤＡ（米国糖尿病学会）から、１９９８年にＷＨＯから、新たな判定基準が報告されている。
これらの報告によれば、糖尿病とは、空腹時血糖値（静脈血漿におけるグルコース濃度）が１２６ｍｇ／ｄｌ以上であり、７５ｇ経口ブドウ糖負荷試験２時間値（静脈血漿におけるグルコース濃度）が２００ｍｇ／ｄｌ以上を示す状態である。
また、上記報告によれば、耐糖能異常とは、空腹時血糖値（静脈血漿におけるグルコース濃度）が１１０ｍｇ／ｄｌ以上、１２６ｍｇ／ｄｌ未満であり、かつ、７５ｇ経口ブドウ糖負荷試験２時間値（静脈血漿におけるグルコース濃度）が１４０ｍｇ／ｄｌ以上２００ｍｇ／ｄｌ未満を示す状態である。さらに、ＡＤＡの報告によれば、空腹時血糖値（静脈血漿におけるグルコース濃度）が１１０ｍｇ／ｄｌ以上１２６ｍｇ／ｄｌ未満の状態をＩＦＧ（Ｉｍｐａｉｒｅｄ  Ｆａｓｔｉｎｇ  Ｇｌｕｃｏｓｅ）と呼ぶ。一方、ＷＨＯの報告によれば、７５ｇ経口ブドウ糖負荷試験２時間値（静脈血漿におけるグルコース濃度）が１４０ｍｇ／ｄｌ以上、２００ｍｇ／ｄｌ未満である状態をＩＧＴ（Ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）と呼ぶ。
本発明の剤は、上記した新たな判定基準により決定される糖尿病、耐糖能異常(ＩＦＧ、ＩＧＴ)の予防及び／又は治療剤としても使用され得る。
【００２６】
本発明の剤は、そのままあるいは薬理学的に許容し得る担体を配合し、経口的または非経口的に投与することができる。薬理学的に許容し得る担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などとして配合される。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を用いることもできる。
【００２７】
本発明の医薬は、経口投与する場合の剤形としては、例えば、錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤、マイクロカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などが挙げられ、また、非経口投与する場合の剤形としては、例えば、注射剤、注入剤、点滴剤、坐剤などが挙げられる。また、適当な基剤（例、酪酸の重合体、グリコール酸の重合体、酪酸−グリコール酸の共重合体、酪酸の重合体とグリコール酸の重合体との混合物、ポリグリセロール脂肪酸エステルなど）と組み合わせて徐放性製剤とすることも有効である。
【００２８】
本発明の医薬中のＰＳＧＬ−１に対する阻害物質の含有量は、医薬製剤の形態に応じて相違するが、通常製剤全体に対して２ないし８５重量％、好ましくは５ないし７０重量％である。
【００２９】
ＰＳＧＬ−１に対する阻害物質を上記の剤形に製する方法としては、当該分野で一般的に用いられている公知の製造方法を適用することができる。また、上記の剤形に製する場合には、必要に応じて、その剤形に製する際に製剤分野において通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤などの担体、甘味剤、界面活性剤、懸濁化剤、乳化剤などの各種製剤添加物などを適宜、適量含有させて製造することができる。
【００３０】
例えば、ＰＳＧＬ−１に対する阻害物質を錠剤に製する場合には、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤などを含有させて製造することができ、丸剤および顆粒剤に製する場合には、賦形剤、結合剤、崩壊剤などを含有させて製造することができる。また、散剤およびカプセル剤に製する場合には賦形剤などを、シロップ剤に製する場合には甘味剤などを、乳剤または懸濁剤に製する場合には懸濁化剤、界面活性剤、乳化剤などを含有させて製造することができる。
【００３１】
賦形剤の例としては、乳糖、白糖、ブドウ糖、でんぷん、ショ糖、微結晶セルロース、カンゾウ末、マンニトール、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウムなどが挙げられる。
【００３２】
結合剤の例としては、５ないし１０重量％デンプンのり液、１０ないし２０重量％アラビアゴム液またはゼラチン液、１ないし５重量％トラガント液、カルボキシメチルセルロース液、アルギン酸ナトリウム液、グリセリンなどが挙げられる。
【００３３】
崩壊剤の例としては、でんぷん、炭酸カルシウムなどが挙げられる。
【００３４】
滑沢剤の例としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、精製タルクなどが挙げられる。
【００３５】
甘味剤の例としては、ブドウ糖、果糖、転化糖、ソルビトール、キシリトール、グリセリン、単シロップなどが挙げられる。
【００３６】
界面活性剤の例としては、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリソルベート８０、ソルビタンモノ脂肪酸エステル、ステアリン酸ポリオキシル４０などが挙げられる。
【００３７】
懸濁化剤の例としては、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ベントナイトなどが挙げられる。
【００３８】
乳化剤の例としては、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、ポリソルベート８０などが挙げられる。
【００３９】
更に、ＰＳＧＬ−１に対する阻害物質を上記の剤形に製造する場合には、所望により、製剤分野において通常用いられる着色剤、保存剤、芳香剤、矯味剤、安定剤、粘稠剤などを適量添加することができる。
【００４０】
ＰＳＧＬ−１に対する阻害物質を含有する本発明の医薬は、安定かつ低毒性で安全に使用することができる。その１日の投与量は患者の状態や体重、ＰＳＧＬ−１に対する阻害物質の種類、投与経路などによって異なるが、当業者はこれらの要素を考慮して適切な量を決定することができる。また、投与は、１日１回の投与であっても、或いは２ないし３回に分けての投与であってもよい。
【００４１】
ＰＳＧＬ−１に対する阻害物質を非経口的に投与する場合は、通常、液剤（例、注射剤）の形で投与する。その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形にして、通常体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇ〜約１００ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。注射剤としては、静脈注射剤のほか、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などが含まれ、また持続性製剤としては、イオントフォレシス経皮剤などが含まれる。かかる注射剤は、自体公知の方法、すなわち、ＰＳＧＬ−１に対する阻害物質を無菌の水性液もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製される。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが挙げられ、溶解補助剤（例、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなど）などと併用してもよい。また、緩衝剤（例、リン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例、ベンジルアルコール、フェノールなど）などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、アンプルに充填される。
【００４２】
本発明の剤は、先に例示したような代謝性疾患（例えば、メタボリックシンドローム、２型糖尿病、耐糖能異常、肥満症、脂質異常症（高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、低ＨＤＬ血症、食後高脂血症など）など）に対して、単独で予防及び／又は治療効果をもたらし得る。しかしながら、ＰＳＧＬ−１に対する阻害物質を上記のような各疾患に適用する際には、それらの疾患に通常使用される薬剤又は治療法と適宜併用することも可能である。ＰＳＧＬ−１に対する阻害物質と他の薬剤を併用する場合、ＰＳＧＬ−１に対する阻害物質と併用薬剤の投与形態は特に限定されず、投与時に、ＰＳＧＬ−１に対する阻害物質と併用薬剤とが組み合わされていればよい。このような投与形態としては、例えば、（１）ＰＳＧＬ−１に対する阻害物質と併用薬剤とを同時に製剤化して得られる単一の製剤の投与、（２）ＰＳＧＬ−１に対する阻害物質と併用薬剤とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での同時投与、（３）ＰＳＧＬ−１に対する阻害物質と併用薬剤とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での時間差をおいての投与、（４）ＰＳＧＬ−１に対する阻害物質と併用薬剤とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での同時投与、（５）ＰＳＧＬ−１に対する阻害物質と併用薬剤とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での時間差をおいての投与（例、本発明の剤→併用薬剤の順序での投与、あるいは逆の順序での投与）などが挙げられる。併用薬剤の投与量は、臨床上用いられている用量を基準として適宜選択することができる。また、ＰＳＧＬ−１に対する阻害物質と併用薬剤の配合比は、投与対象、投与ルート、対象疾患、症状、組み合わせなどにより適宜選択することができる。例えば、投与対象がヒトである場合、ＰＳＧＬ−１に対する阻害物質１重量部に対し、併用薬剤を０．０１乃至１００重量部用いればよい。
【００４３】
本発明はまた、代謝性疾患を予防又は治療し得る物質のスクリーニング方法を提供する。当該スクリーニング方法は、以下の工程を含む：
（Ｉ）被験物質がＰＳＧＬ−１の機能（即ち、活性又は発現）を阻害するか検定すること、及び
（ＩＩ）ＰＳＧＬ−１の機能を阻害した被験物質を代謝性疾患を予防又は治療し得る物質として選択すること。
当該スクリーニング方法において、用語「代謝性疾患」は、その予防及び／又は治療剤の説明において記述したものと同義である。
以下、本発明のスクリーニング方法を詳述する。
【００４４】
スクリーニング方法に供される被験物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、タンパク質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。被験物質は、標識されていても未標識であってもよく、また、標識体と未標識体を所定の割合で含む混合物も被験物質として使用できる。標識用物質としては、例えば、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ等の蛍光物質、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン等の発光物質、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２３Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、ストレプトアビジン等の親和性物質などが挙げられる。
【００４５】
［ＰＳＧＬ−１活性阻害物質のスクリーニング方法］
ＰＳＧＬ−１の活性を阻害する物質（ＰＳＧＬ−１活性阻害物質）としては、ＰＳＧＬ−１とセレクチン（例えば、Ｐ−セレクチン）との結合を阻害する物質が挙げられる。以下、ＰＳＧＬ−１とセレクチンとの結合を阻害する物質（以下、ＰＳＧＬ−１結合阻害物質ともいう）のスクリーニング方法について説明する。
ＰＳＧＬ−１結合阻害物質のスクリーニング方法（以下、スクリーニング方法Ａともいう）は、以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む：
（ａ）被験物質の存在下、セレクチンをＰＳＧＬ−１に接触させる工程；
（ｂ）被験物質の存在下におけるセレクチンとＰＳＧＬ−１との結合能を測定し、該結合能を被験物質の非存在下におけるセレクチンとＰＳＧＬ−１との結合能と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、セレクチンとＰＳＧＬ−１との結合能の低下をもたらす被験物質を代謝性疾患を予防又は治療し得る物質として選択する工程。
【００４６】
スクリーニング方法Ａの工程（ａ）では、被験物質、セレクチンのいずれもがＰＳＧＬ−１と接触条件下におかれる。被験物質の存在下でのセレクチンのＰＳＧＬ−１に対する接触は、被験物質の存在下、セレクチン又はその発現細胞を、ＰＳＧＬ−１又はその発現細胞に接触させることにより行われ得る。また、ＰＳＧＬ−１に対して被験物質、セレクチンを接触させる順番は特に限定されず、いずれかを先にＰＳＧＬ−１に接触させても、同時に接触させてもよい。
セレクチン及びＰＳＧＬ−１は自体公知の方法により調製できる。それらは、例えば、セレクチン又はＰＳＧＬ−１の発現細胞（それぞれ、例えば、血管内皮細胞及び白血球）から単離・精製できる。しかしながら、迅速、容易かつ大量にそれらのタンパク質を調製し、また、それらのヒトタンパク質を調製するためには、遺伝子組換え技術により組換えタンパク質を調製するのが好ましい。組換えタンパク質は、細胞系、無細胞系のいずれで調製したものでもよい。
セレクチン又はＰＳＧＬ−１発現細胞は、セレクチン又はＰＳＧＬ−１を発現するものである限り特に限定されず、上述したセレクチン又はＰＳＧＬ−１の発現細胞、セレクチン又はＰＳＧＬ−１発現ベクターで形質転換された細胞などであり得る。該細胞は、当業者であれば容易に同定又は調製でき、初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株、市販の細胞株、セルバンクより入手可能な細胞株などを使用できる。
【００４７】
スクリーニング方法Ａの工程（ｂ）では、先ず、被験物質の存在下、セレクチンとＰＳＧＬ−１との結合能が測定される。測定される「結合能」としては、セレクチンとＰＳＧＬ−１との結合を評価できるものである限り特に限定されないが、結合量、結合強度（親和定数、結合速度定数、解離速度定数などのパラメーターを含む）、結合様式（濃度依存的結合を含む）が挙げられる。結合能の測定は、例えば、上述の標識用物質で標識されたセレクチンを利用してフローサイトメトリーなどの自体公知の方法により行われ得る。また、表面プラズモン共鳴を利用した結合能測定法（Ｂｉａｃｏｒｅなど）も好適に用いられる。
次いで、被験物質の存在下におけるセレクチンとＰＳＧＬ−１との結合能が、被験物質の非存在下におけるセレクチンとＰＳＧＬ−１との結合能と比較される。結合能の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。被験物質の非存在下におけるセレクチンとＰＳＧＬ−１との結合能は、被験物質の存在下におけるセレクチンとＰＳＧＬ−１との結合能の測定に対し、事前に測定した結合能であっても、同時に測定した結合能であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した結合能であることが好ましい。
【００４８】
スクリーニング方法Ａの工程（ｃ）では、セレクチンとＰＳＧＬ−１との結合能の低下をもたらす被験物質が代謝性疾患を予防又は治療し得る物質として選択される。
【００４９】
［ＰＳＧＬ−１発現阻害物質のスクリーニング方法］
次に、ＰＳＧＬ−１の発現を阻害する物質（ＰＳＧＬ−１発現阻害物質）のスクリーニング方法（以下、スクリーニング方法Ｂともいう）について説明する。スクリーニング方法Ｂは、以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む：
（ａ）被験物質とＰＳＧＬ−１タンパク質又はそれをコードする遺伝子の発現を測定可能な細胞とを接触させる工程；
（ｂ）被験物質を接触させた細胞における発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞における発現量と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、発現量を低下させた被験物質を代謝性疾患を予防又は治療し得る物質として選択する工程。
【００５０】
スクリーニング方法Ｂの工程（ａ）では、被験物質がＰＳＧＬ−１タンパク質の発現を測定可能な細胞と接触条件下におかれる。ＰＳＧＬ−１タンパク質の発現を測定可能な細胞に対する被験物質の接触は、培養培地中で行われ得る。
「ＰＳＧＬ−１タンパク質又はそれをコードする遺伝子の発現を測定可能な細胞」とは、ＰＳＧＬ−１遺伝子の産物、例えば、転写産物、翻訳産物（即ち、タンパク質）の発現レベルを直接的又は間接的に評価可能な細胞をいう。ＰＳＧＬ−１遺伝子産物の発現レベルを直接的に評価可能な細胞は、ＰＳＧＬ−１遺伝子を天然で発現可能な細胞であり得、一方、ＰＳＧＬ−１遺伝子の産物の発現レベルを間接的に評価可能な細胞は、ＰＳＧＬ−１遺伝子転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞であり得る。
ＰＳＧＬ−１遺伝子を天然で発現可能な細胞は、ＰＳＧＬ−１遺伝子を潜在的に発現するものである限り特に限定されず、ＰＳＧＬ−１遺伝子を恒常的に発現している細胞、ＰＳＧＬ−１遺伝子を誘導条件下（例えば、薬物での処理）で発現する細胞などであり得る。該細胞は、当業者であれば容易に同定でき、初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株、市販の細胞株、セルバンクより入手可能な細胞株などを使用できる。ＰＳＧＬ−１遺伝子を天然で発現可能な細胞の例としては、白血球（例えば、好中球、単球、マクロファージ、Ｂ細胞のサブセット、及び全てのＴ細胞）が挙げられる。
ＰＳＧＬ−１遺伝子転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞は、ＰＳＧＬ−１遺伝子転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子を含む細胞である。ＰＳＧＬ−１遺伝子転写調節領域、レポーター遺伝子は、発現ベクター中に挿入されている。
ＰＳＧＬ−１遺伝子転写調節領域は、ＰＳＧＬ−１遺伝子の発現を制御し得る領域である限り特に限定されないが、例えば、転写開始点から上流約２ｋｂｐまでの領域、あるいは該領域の塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つＰＳＧＬ−１遺伝子の転写を制御する能力を有する領域などを挙げることができる。
レポーター遺伝子は、検出可能なタンパク質又は酵素をコードする遺伝子であればよく、例えばＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）遺伝子、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子、ＬＵＳ（ルシフェラーゼ）遺伝子、ＣＡＴ（クロラムフェニコルアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子などが挙げられる。
ＰＳＧＬ−１遺伝子転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子が導入される細胞は、ＰＳＧＬ−１遺伝子転写調節機能を評価できる限り、即ち、該レポーター遺伝子の発現量が定量的に解析可能である限り特に限定されない。しかしながら、ＰＳＧＬ−１遺伝子に対する生理的な転写調節因子を発現し、ＰＳＧＬ−１遺伝子の発現調節の評価により適切であると考えられることから、該導入される細胞としては、ＰＳＧＬ−１遺伝子を天然で発現可能な細胞が好ましい。
被験物質とＰＳＧＬ−１遺伝子の発現を測定可能な細胞とが接触される培養培地は、用いられる細胞の種類などに応じて適宜選択されるが、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地などである。培養条件もまた、用いられる細胞の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１２〜約７２時間である。
【００５１】
スクリーニング方法Ｂの工程（ｂ）では、先ず、被験物質を接触させた細胞におけるＰＳＧＬ−１遺伝子の発現量が測定される。発現量の測定は、用いた細胞の種類などを考慮し、自体公知の方法により行われ得る。
例えば、ＰＳＧＬ−１遺伝子の発現を測定可能な細胞として、ＰＳＧＬ−１遺伝子を天然で発現可能な細胞を用いた場合、発現量は、ＰＳＧＬ−１遺伝子の産物、例えば、転写産物又は翻訳産物を対象として自体公知の方法により測定できる。例えば、転写産物の発現量は、細胞からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲ、ノザンブロッティング等により測定され得る。また、翻訳産物の発現量は、細胞から抽出液を調製し、免疫学的手法により測定され得る。免疫学的手法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ７０：  ４１９−４３９  （１９８０））、蛍光抗体法などが使用できる。
一方、ＰＳＧＬ−１遺伝子の発現を測定可能な細胞として、ＰＳＧＬ−１遺伝子転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞を用いた場合、発現量は、レポーターのシグナル強度に基づき測定され得る。
次いで、被験物質を接触させた細胞におけるＰＳＧＬ−１遺伝子の発現量が、被験物質を接触させない対照細胞におけるＰＳＧＬ−１遺伝子の発現量と比較される。発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質を接触させない対照細胞におけるＰＳＧＬ−１遺伝子の発現量は、被験物質を接触させた細胞におけるＰＳＧＬ−１遺伝子の発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。
【００５２】
スクリーニング方法Ｂの工程（ｃ）では、ＰＳＧＬ−１遺伝子の発現量を低下させる被験物質が代謝性疾患を予防又は治療し得る物質として選択される。
【００５３】
以下に、試験例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【実施例】
【００５４】
試験例１： 糖尿病モデルマウスの代謝データおよび内臓脂肪におけるマクロファージ、接着分子の発現の検討
［実験］
８週齢のｄｂ／ｄｂマウス（ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／ｄｂ）及びＣ５７／ＢＬ６マウスの体重、脂肪重量及び各種代謝データを測定した。内臓脂肪組織からＲＮＡを抽出し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって、マクロファージのマーカーであるＦ４／８０、炎症のマーカーであるＭＣＰ−１、接着分子であるＰ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１などの遺伝子発現レベルを検討した。更に、ＤＮＡマイクロアレイを用いて、内蔵脂肪組織における遺伝子発現プロファイルを解析した。
［結果］
ｄｂ／ｄｂマウスでは対照群に比し、体重、内臓脂肪重量、ＬＤＬ、随時血糖及びＩＲＩの有意な増加を認め、ＨｂＡ１ｃには差は見られなかった（図１）。ＤＮＡマイクロアレイでは、対照群に比しｄｂ／ｄｂマウスで２倍以上の発現増加を認めた遺伝子は１００１あり、更にクラスター解析を行った結果、Ｌ−セレクチンやＰＳＧＬ−１をはじめとする４０の細胞接着分子関連遺伝子の発現増加を認めた（表１）。また、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより、ｄｂ／ｄｂマウスにおいて、Ｆ４／８０、ＭＣＰ−１、ＰＳＧＬ−１及びＰ−セレクチンの有意な発現増加を認めた（図２）。【００５５】
表１は、ｄｂ／ｄｂマウスとＢＬ６マウスの内臓脂肪を用いたＤＮＡマイクロアレイの結果を示す。野生型(ＢＬ６マウス)に比し、ｄｂ／ｄｂマウスで２倍以上の発現増加を認めた計１００１遺伝子をＧｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ  ｃａｔｅｇｏｒｙに従い分類した。【００５６】
【表１】
0005493234.tif 000002
【００５７】
試験例２：高脂肪食負荷マウスの代謝データおよび内臓脂肪におけるマクロファージ、接着分子の発現の検討
［実験］
７週齢のＣ５７／ＢＬ６マウスに低脂肪食及び高脂肪食を各々１２週間負荷し、インスリン負荷試験（ＩＴＴ）及び腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）を施行した。ＩＴＴではインスリン０．７単位／ｋｇを腹腔内投与し、負荷前並びに負荷後３０分、６０分及び１２０分の血糖値を測定し、負荷前血糖値との変化率を比較した。ＩＰＧＴＴではブドウ糖１．２ｇ／ｋｇを腹腔内投与し、負荷前並びに負荷後３０分、６０分及び１２０分の血糖値及びＩＲＩを測定した。また、試験例１と同様に各種代謝データの測定と内臓脂肪組織における遺伝子発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲとＤＮＡマイクロアレイとを用いて検討した。
［結果］
高脂肪食負荷マウスでは低脂肪食負荷群に比し、体重、内臓脂肪重量、ＬＤＬ、空腹時血糖、空腹時ＩＲＩ及びＨｂＡ１ｃの有意な増加を認めた（図３）。またＩＴＴとＩＰＧＴＴにて、高脂肪食群で耐糖能異常及びインスリン抵抗性を認めた（図４）。ＤＮＡマイクロアレイの結果では、対照群に比し高脂肪食群で２倍以上の発現増加を認めた遺伝子を５６６認め、クラスター解析にて、ＰＳＧＬ−１を含む３７の細胞接着分子関連遺伝子の発現増加を認めた（表２）。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲでは、ｄｂ／ｄｂマウスにおいてＣＤ６８、ＭＣＰ−１、ＰＳＧＬ−１及びＰ−セレクチンの有意な発現増加を認めた（図５）。【００５８】
表２は、高脂肪食負荷マウスと低脂肪食負荷マウスの内臓脂肪を用いたＤＮＡマイクロアレイの結果を示す。低脂肪食負荷マウスに比し高脂肪食負荷マウスで２倍以上の発現を認めた遺伝子をＧｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ  ｃａｔｅｇｏｒｙに従い分類した。【００５９】
【表２】
0005493234.tif 000003
【００６０】
試験例３：ＰＳＧＬ−１ノックアウトマウスの解析
［実験］
７週齢のＰＳＧＬ−１ノックアウトマウス及びＣ５７／ＢＬ６マウスに高脂肪食を１０週間負荷し、試験例２と同様にＩＴＴ及びＩＰＧＴＴを施行し、各種代謝データを測定した。また内臓脂肪からＲＮＡを抽出し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって炎症関連遺伝子の遺伝子発現レベルを検討した。更に、内蔵脂肪組織のＰＡＳ染色を行い、内蔵脂肪細胞の面積を測定した。更に、肝臓重量および肝臓中性脂肪含量の測定を行い、また、肝臓組織のＨＥ染色を行って肝臓組織の変化を検討した。
［結果］
高脂肪食負荷ＰＳＧＬ−１ノックアウトマウスとＣ５７／ＢＬ６マウスとでは、体重、脂肪重量、空腹時血糖及びＨｂＡ１ｃに差は見られなかったが、Ｔ−Ｃｈｏ、ＬＤＬ、ＴＧ、ＦＦＡ、空腹時ＩＲＩ及び血清レプチン濃度はＰＳＧＬ−１ノックアウトマウスにおいて有意な低下を認めた（図６）。ＩＴＴではＰＳＧＬ−１ノックアウトマウスで有意に耐糖能の改善を認め、ＩＰＧＴＴでも血糖値に差は見られなかったが、ＰＳＧＬ−１ノックアウトマウスで有意にＩＲＩの低下を認めた（図７）。また、内蔵脂肪組織のＰＡＳ染色にて脂肪細胞の面積の測定を行い、Ｃ５７／ＢＬ６マウスに比しＰＳＧＬ−１ノックアウトマウスにて脂肪細胞面積の減少を認めた（図８）。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにて、ＰＳＧＬ−１ノックアウトマウスでＦ４／８０、ＭＣＰ−１、ＮＯＳ２及びレプチンの有意なｍＲＮＡの発現低下を認めた（図９）。ＰＳＧＬノックアウトマウスでは肝臓重量の有意な減小が見られ、肝臓中性脂肪含量についても減少する傾向がみられた（図１０（Ａ））。また、ＨＥ染色像において、肝細胞障害（バルーニング変化）がＰＳＧＬ−１ノックアウトマウスで明らかに抑制されていた（図１０（Ｂ））。【００６１】
［結論］
ＰＳＧＬ−１は、白血球及び血管内皮細胞上に発現し、Ｐ−、Ｅ−及びＬ−セレクチンをリガンドとして機能し、炎症巣への白血球浸潤を誘導する分子である。今回の結果から、ＰＳＧＬ−１を阻害することにより、肥満マウスの内臓脂肪組織へのマクロファージの浸潤が減少し、内臓脂肪における炎症が抑制されてインスリン抵抗性が改善することが示された。ＰＳＧＬ−１を阻害することにより、メタボリックシンドロームの予防、及び肥満者におけるインスリン抵抗性の改善と糖尿病発症抑制が可能になる。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明の剤は、内臓脂肪へのマクロファージの浸潤を抑制し、以って脂肪組織における炎症及びインスリン抵抗性の発症を阻害し得る。従って、本発明の剤を使用することにより、食事療法又は運動療法を行うことなく、メタボリックシンドローム、２型糖尿病、耐糖能異常、肥満症又は脂質異常症などの代謝性疾患に対する予防及び／又は治療効果を得ることが可能である。これらの代謝性疾患を予防及び／又は治療することにより、係る代謝性疾患に起因する動脈硬化性疾患の予防及び／又は進展抑制をすることも可能となる。本発明はまた、これらの代謝性疾患を予防又は治療し得る物質のスクリーニング方法も併せて提供する。【００６３】
本発明は日本で出願された特願２００８−１２８０８６（出願日：２００８年５月１５日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図８】
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【配列表】
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