(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨量減少を予防又は治療するための医薬品の製造における、免疫グロブリン結合タンパク質（ＢｉＰ）、又は野生型配列の少なくとも９０％を含むその断片若しくは前記野生型配列と少なくとも９０％の同一性を有するその相同体の使用。
【請求項２】
骨吸収を予防又は治療するための医薬品の製造における、免疫グロブリン結合タンパク質（ＢｉＰ）、又は野生型配列の少なくとも９０％を含むその断片若しくは前記野生型配列と少なくとも９０％の同一性を有するその相同体の使用。
【請求項３】
骨量減少又は骨吸収が、筋骨格系疾患に関連していることを特徴とする、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
筋骨格系疾患が骨粗しょう症であることを特徴とする、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
破骨細胞成熟の阻害剤、減少剤、又は予防剤の製造における、免疫グロブリン結合タンパク質（ＢｉＰ）又は野生型配列の少なくとも９０％を含むその断片若しくは前記野生型配列と少なくとも９０％の同一性を有するその相同体の使用。
【請求項６】
破骨細胞が破骨細胞前駆体、多核前駆体、又は成熟破骨細胞であることを特徴とする、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
（ｉ）免疫グロブリン結合タンパク質（ＢｉＰ）活性を調節する薬剤を選択するステップ、及び
（ii）前記薬剤存在下における破骨細胞成熟を測定するステップ、
を含む、骨破壊又は骨量減少を調節する薬剤を同定するためのアッセイ方法であって、前記薬剤非存在下における破骨細胞成熟と前記薬剤存在下における破骨細胞成熟との差が、骨破壊又は骨量減少を調節する薬剤の指標となることを特徴とする、前記方法。
【請求項８】
薬剤が免疫グロブリン結合タンパク質（ＢｉＰ）活性を増大又はアップレギュレートすることを特徴とする、請求項７に記載のアッセイ方法。
【請求項９】
（ａ）破骨細胞分化の１又は複数の異なる段階にある、１又は複数の破骨細胞に、免疫グロブリン結合タンパク質（ＢｉＰ）を添加するステップ、及び
（ｂ）破骨細胞形成に対する免疫グロブリン結合タンパク質（ＢｉＰ）の効果を決定するステップ、
を含む、破骨細胞分化に対する免疫グロブリン結合タンパク質（ＢｉＰ）、又は野生型配列の少なくとも９０％を含むその断片若しくは前記野生型配列と少なくとも９０％の同一性を有するその相同体の効果を決定する方法。
【請求項１０】
免疫グロブリン結合タンパク質（ＢｉＰ）が０．０２〜２０μｇ／ｍｌの濃度で添加されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＴＲＡＰ活性、ＶｎＲ、及び／又はＦアクチンリングを測定することによって破骨細胞数を定量することを特徴とする、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
骨吸収を定量する任意のステップを含む、請求項９〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
１又は複数の破骨細胞特異的マーカーの発現をＰＣＲを用いて測定することで、破骨細胞分化を確認することを特徴とする、請求項９〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
破骨細胞特異的マーカーがカルシトニン受容体遺伝子又はカテプシンＫ遺伝子であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
（ａ）免疫グロブリン結合タンパク質（ＢｉＰ）の存在下及び非存在下において破骨細胞を分化させるステップ、及び
（ｂ）免疫グロブリン結合タンパク質（ＢｉＰ）非存在下において分化させた破骨細胞と比べて、免疫グロブリン結合タンパク質（ＢｉＰ）存在下で分化させた破骨細胞中で異なる発現をしている１又は複数のタンパク質を同定するステップ、
を含む、破骨細胞分化中に免疫グロブリン結合タンパク質（ＢｉＰ）によって調節されている１又は複数のタンパク質を同定する方法。
【請求項１６】
タンパク質がシグナル伝達分子又は転写因子であることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
培養の始めの２４〜７２時間、又は多核破骨細胞が存在する、培養の終わりの方の２４〜７２時間、免疫グロブリン結合タンパク質（ＢｉＰ）を添加することを特徴とする、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
タンパク質又は該タンパク質をコードする核酸を、ｑｔ−ＲＴ−ＰＣＲ及び／又はウェスタンブロットで検出することを特徴とする、請求項１５〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
骨粗しょう症の予防又は治療のための医薬品の製造における、免疫グロブリン結合タンパク質（ＢｉＰ）、又は野生型配列の少なくとも９０％を含むその断片若しくは前記野生型配列と少なくとも９０％の同一性を有するその相同体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨量減少又は骨吸収を予防又は治療するための組成物の製造におけるＢｉＰの使用に関する。本発明はまた、診断方法及びアッセイ方法のような方法、医薬組成物、トランスジェニック動物、並びにそれらの作製方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
骨リモデリングの調節異常は、多くの疾患の病態で大きな位置を占めている。そのような状態では、未だ未知の異常な介在物質ネットワークによって、骨吸収を行う破骨細胞集団の産生及び活性化が増大している。この１０年間で、造血幹細胞及び単球／マクロファージ前駆体の破骨細胞系への関連付け及び分化、破骨細胞増殖、並びに破骨細胞活性化を調節する主要なシグナル伝達経路及び転写因子が同定された（非特許文献１〜５）。破骨細胞前駆体上で構成的に発現しているＮＦ−κＢ活性化受容体（ＲＡＮＫ）を介した、ＲＡＮＫリガンド（ＲＡＮＫＬ）結合後のシグナルが、マクロファージコロニー活性化因子（Ｍ−ＣＳＦ）と一緒に、成熟破骨細胞の産生につながる複雑な一連のイベントを起こすということが認識されている。インビボにおいて、Ｍ−ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬはどちらも骨芽細胞によって提供され、おとり受容体オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）と共に（非特許文献６及び７）、破骨細胞分化及び骨吸収の調節に貢献する。骨芽細胞成分を介して、全身性ホルモン及びサイトカインがこの過程に間接的に影響し、ＯＰＧに対するＲＡＮＫＬの比率が破骨細胞形成の調節に重要である。しかし、関節リウマチ（ＲＡ）のような病理状態においては、活性化Ｔ細胞、線維芽細胞様滑膜細胞、及びその他の間質細胞によってＲＡＮＫＬがさらに提供される（非特許文献８〜１０）。ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫ結合は、複数の重要な段階を介して細胞シグナル伝達カスケードを活性化する。この過程は、Ｓｒｃ−及びフォスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＥ３Ｋ）を介するＡｋｔの活性化に依存し、又、ＴＮＦ受容体関連因子タンパク質（ＴＲＡＦｓ）のリクルート、マイトジェン活性化プロテインキナーゼカスケード（ＥＲＫ、ＪＮＫ、及びｐ３８）にも依存し、これら全てのＲＡＮＫシグナル伝達経路は最終的に収束し、様々な転写因子ファミリー、例えばＮＦ−κＢ（非特許文献１１）、活性化タンパク質−１（ＡＰ−１）（非特許文献１２）、特にｃ−Ｆｏｓ（非特許文献１３）、及び活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）、特にＮＦＡＴｃ１（非特許文献１、５、１４、及び１５）などを活性化する。これらのシグナル伝達分子及び転写因子が、破骨細胞の分化及び活性化に重要な役割をもっていることが、機能喪失型マウス変異体においてインビボで明確に証明されている（非特許文献５）。
【０００３】
免疫グロブリン結合タンパク質（ＢｉＰ）又はグルコース制御性タンパク質（Ｇｒｐ）７８として以前から様々に知られているヒト分子シャペロンの抗炎症特性が報告されている（非特許文献１６）。ＢｉＰをコードする遺伝子はクローニングされ、組換えヒト（ｒｈｕ）タンパク質が発現されている（特許文献１）。
【０００４】
コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）を有するマウスにｒｈｕＢｉＰを投与すると、実験的関節炎の誘導が予防された（非特許文献１７）。ｒｈｕＢｉＰに反応するＴ細胞クローンがサイトカインＩＬ−１０、ＩＬ−４、及びＩＬ−５を産生するという発見（非特許文献１７）、並びにＢｉＰで刺激された末梢血（ＰＢ）単核細胞（ＭＣ）が高濃度のＩＬ−１０を産生し、それに付随してＴＮＦ−α産生が減弱されるという発見によって、ＢｉＰの抗炎症の作用機序が示された。ＰＢＭＣではまた、産生されるＩＬ−１Ｒのアンタゴニスト及び可溶性ＴＮＦＲIIの量が増大していた（非特許文献１８）。ＢｉＰに応答してＰＢＭＣから放出されるサイトカインは破骨細胞形成を調節する（非特許文献１９及び２０）。
【０００５】
ＢｉＰによるこれらの細胞外機能が生物学的関連を有するという事実を裏付けるために、滑液のイムノアッセイにより、ＲＡ患者由来の滑液の大半が可溶性ＢｉＰを含んでいることが明らかにされた（非特許文献１８）。また、ＣＤ８６及びＨＬＡ−ＤＲ発現のダウンレギュレーションに続いて単球（ＭＯ）の抗原提示機能が減少すること（非特許文献１８）、並びに精製ＰＢＭＯが未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）に成熟するのをＢｉＰが遅らせる又は妨げること（非特許文献２１）が知られている。
【０００６】
望ましくない免疫応答を治療するための薬剤の製造におけるＢｉＰの使用が特許文献２に記載されている。
【０００７】
骨は、骨芽細胞及び破骨細胞と呼ばれるスペシャリスト細胞によってそれぞれ絶え間なく形成又は消化されている。骨形成及び骨溶解の間のバランスが崩れることで、骨侵食が生じたり又は骨が薄くなる多くの疾患がある。したがって、当該分野で、この過程を調節（例えば予防）する薬物の開発が必要とされている。
【特許文献１】国際公開第００／２１９９５号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０２／０７２１３３号パンフレット
【非特許文献１】Boyle WJ, Simonet WS, Lacey DL. Osteoclast differentiation and activation. Nature 2003; 423(6937):337-342
【非特許文献２】Chambers TJ. Regulation of the differentiation and function of osteoclasts. J Pathol 2000; 192(1):4-13
【非特許文献３】Roodman GD. Cell biology of the osteoclast. Exp Hematol 1999; 27(8):1229-1241
【非特許文献４】Suda T, Takahashi N, Udagawa N, Jimi E, Gillespie MT, Martin TJ. Modulation of osteoclast differentiation and function by the new members of the tumor necrosis factor receptor and ligand families. Endocr Rev 1999; 20(3):345-357
【非特許文献５】Wagner EF, Karsenty G. Genetic control of skeletal development. Curr Opin Genet Dev 2001; 11(5):527-532
【非特許文献６】Degli-Esposti M. To die or not to die--the quest of the TRAIL receptors. J Leukoc Biol 1999; 65(5):535-542
【非特許文献７】Lubberts E, van den BL, Oppers-Walgreen B, Schwarzenberger P, Coenen-de Roo CJ, Kolls JK et al. IL-17 promotes bone erosion in murine collagen-induced arthritis through loss of the receptor activator of NF-kappa B ligand/osteoprotegerin balance. J Immunol 2003; 170(5):2655-2662
【非特許文献８】Udagawa N. The mechanism of osteoclast differentiation from macrophages: possible roles of T lymphocytes in osteoclastogenesis. J Bone Miner Metab 2003; 21(6):337-343
【非特許文献９】Rifas L, Arackal S, Weitzmann MN. Inflammatory T cells rapidly induce differentiation of human bone marrow stromal cells into mature osteoblasts. J Cell Biochem 2003; 88(4):650-659
【非特許文献１０】Takayanagi H, Iizuka H, Juji T, Nakagawa T, Yamamoto A, Miyazaki T et al. Involvement of receptor activator of nuclear factor kappaB ligand/osteoclast differentiation factor in osteoclastogenesis from synoviocytes in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 2000; 43(2):259-269
【非特許文献１１】Jimi E, Aoki K, Saito H, D'Acquisto F, May MJ, Nakamura I et al. Selective inhibition of NF-kappaB blocks osteoclastogenesis and prevents inflammatory bone destruction in vivo. Nat Med 2004; 10(6):617-624
【非特許文献１２】Eferl R, Wagner EF. AP-1: a double-edged sword in tumorigenesis. Nat Rev Cancer 2003; 3(11):859-868
【非特許文献１３】Grigoriadis AE, Wang ZQ, Cecchini MG, Hofstetter W, Felix R, Fleisch HA et al. c-Fos: a key regulator of osteoclast-macrophage lineage determination and bone remodeling. Science 1994; 266(5184):443-448
【非特許文献１４】Lee ZH, Kim HH. Signal transduction by receptor activator of nuclear factor kappa B in osteoclasts. Biochem Biophys Res Commun 2003; 305(2):211-214
【非特許文献１５】Takayanagi H, Kim S, Koga T, Nishina H, Isshiki M, Yoshida H et al. Induction and activation of the transcription factor NFATc1 (NFAT2) integrate RANKL signaling in terminal differentiation of osteoclasts. Dev Cell 2002; 3(6):889-901
【非特許文献１６】Corrigall VM, Bodman-Smith MD, Fife MS, Canas B, Myers LK, Wooley P et al. The human endoplasmic reticulum molecular chaperone BiP is an autoantigen for rheumatoid arthritis and prevents the induction of experimental arthritis. J Immunol 2001; 166(3):1492-1498
【非特許文献１７】Bodman-Smith MD, Corrigall VM, Kemeny DM, Panayi GS. BiP, a putative autoantigen in rheumatoid arthritis, stimulates IL-10-producing CD8-positive T cells from normal individuals. Rheumatology (Oxford) 2003; 42(5):637-644
【非特許文献１８】Corrigall VM, Bodman-Smith MD, Brunst M, Cornell H, Panayi GS. The stress protein, BiP, stimulates human peripheral blood mononuclear cells to express an anti-inflammatory cytokine profile and to inhibit antigen presenting cell function: relevance to the treatment of inflammatory arthritis. Arthritis Rheum 2004; 50:1167-1171
【非特許文献１９】Miossec P, Chomarat P, Dechanet J, Moreau JF, Roux JP, Delmas P et al. Interleukin-4 inhibits bone resorption through an effect on osteoclasts and proinflammatory cytokines in an ex vivo model of bone resorption in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 1994; 37(12):1715-1722
【非特許文献２０】Yang SY, Wu B, Mayton L, Mukherjee P, Robbins PD, Evans CH et al. Protective effects of IL-1Ra or vIL-10 gene transfer on a murine model of wear debris-induced osteolysis. Gene Ther 2004; 11(5):483-491
【非特許文献２１】Vittecoq O, Corrigall VM, Bodman-Smith MD, Panayi GS. The molecular chaperone BiP (GRP78) inhibits the differeniation of normal human monocytes into immature dendritic cells. Rheumatology (Oxford) 2003; 42 suppl:43
【発明の開示】
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、ＢｉＰが骨吸収及び破骨細胞の成熟を阻害、予防、又は減弱するという驚くべき発見に一部基づいている。特定の理論に制限する意図はないが、この阻害効果は、分化の過程で活性化される必須のシグナル伝達経路の調節を介していると考えられる。したがって、ＢｉＰはとりわけ骨量減少の調節において治療用途をもつ。
【０００９】
国際公開第０２／０７２１３３号では、ＢｉＰが免疫調節特性を有することが教示されており、また、望ましくない免疫応答の治療又は予防におけるＢｉＰの使用が記載されている。さらに、自己免疫疾患の治療におけるＢｉＰの使用も開示されている。例として、上記の引用は、ＢｉＰと共に培養したヒト血液単核細胞がＩＬ−１０を放出し、ＩＬ−１０が該文献中で論じている自己免疫疾患（例えば関節リウマチ（ＲＡ））をダウンレギュレートし得ることを教示している。さらに、Corrigall VM, Bodman-Smith MD, Fife MS, Canas B, Myers LK, Wooley P et al. The human endoplasmic reticulum molecular chaperone BiP is an autoantigen for rheumatoid arthritis and prevents the induction of experimental arthritis. J Immunol 2001; 166(3):1492-1498は、ＢｉＰを関節リウマチの進行阻害に使用することができること、及びＢｉＰがこの疾患の免疫治療の候補であることを教示している。したがって、ＢｉＰの免疫調節性及び抗炎症性という特性が開示されているものの、本明細書にある、骨吸収及び破骨細胞の成熟をＢｉＰが直接調節できるという驚くべき発見は先行技術のどこにも開示されていない。
【００１０】
Ｍ−ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬ存在下で培養したヒトＰＢＭＣ及びマウス骨髄マクロファージ（ＢＭＭ）を用いたインビトロでの破骨細胞分化アッセイを行った。その結果、マウス及びヒト両方の分化アッセイで、酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ（ＴＲＡＰ）、ビトロネクチン受容体（ＶｎＲ、αｖβ３）のどちらかを染色して可視化した破骨細胞の数、又はＦアクチンリングの存在数の減少が示され、この減少は吸収活性の低下と並行していた（図３）。さらに、成熟破骨細胞にＢｉＰを添加すると、破骨細胞の数が減少した（図４）。本明細書に記載されている更なる一連の実験では、ＢｉＰへの応答による、精製ＰＢＭＯにおける遺伝子発現の全体的変化も調べた。アフィメトリクス社の遺伝子アレイ技術を用いた実験により、精製ＰＢＭＯをＢｉＰで処理すると、刺激をしなかったＰＢＭＯと比べて多くの遺伝子のダウンレギュレーション及びアップレギュレーションが生じることが示された。ＢｉＰは、破骨細胞の分化において必須であるか、又は重要な役割を果たしている、ＶｎＲ（Teti A, Migliaccio S, Baron R. The role of the alphaVbeta3 integrin in the development of osteolytic bone metastases: a pharmacological target for alternative therapy? Calcif Tissue Int 2002; 71(4):293-299）、ＣＤ４４（Vignery A. osteoclasts and giant cells: macrophage-macrophage fusion mechanism. Int J Exp Pathol 2000; 81(5):291-304.）、オステオポンチン（Sodek J, Zhu B, Huynh MH, Brown TJ, Ringuette M. Novel functions of the matricellular proteins osteopontin and osteonectin/SPARC. Connect Tissue Res 2002; 43(2-3):308-319.）、ＩＫＫ（Lee ZH, Kim HH. Signal transduction by receptor activator of nuclear factor kappa B in osteoclasts. Biochem Biophys Res Commun 2003; 305(2):211-214）、及びｃ−Ｆｏｓ（Grigoriadis AE, Wang ZQ, Cecchini MG, Hofstetter W, Felix R, Fleisch HA et al. c-Fos: a key regulator of osteoclast-macrophage lineage determination and bone remodeling. Science 1994; 266(5184):443-448）の発現をダウンレギュレートする（図５）。
【００１１】
［本発明の観点の要約］
第１の観点では、骨量減少の予防又は治療のための医薬品の製造における、ＢｉＰ、又はその変異体、相同体、誘導体、若しくは断片の使用を提供している。
【００１２】
第２の観点では、骨吸収の予防又は治療のための医薬品の製造における、ＢｉＰ、又はその変異体、相同体、誘導体、若しくは断片の使用を提供している。
【００１３】
第３の観点では、破骨細胞の成熟の調節におけるＢｉＰの使用を提供している。
【００１４】
第４の観点では、有益な予防効果又は治療効果を生じさせるためにＢｉＰ、又はその変異体、相同体、誘導体、若しくは断片を投与することを含む、骨量減少を予防又は治療する方法を提供している。
【００１５】
第５の観点では、有益な予防効果又は治療効果を生じさせるためにＢｉＰ、又はその変異体、相同体、誘導体、若しくは断片を投与することを含む、骨吸収を予防又は治療する方法を提供している。
【００１６】
第６の観点では、破骨細胞をＢｉＰ、又はその変異体、相同体、誘導体、若しくは断片と接触させることを含む、破骨細胞の発達の調節方法を提供している。
【００１７】
第７の観点では、（ａ）対象中におけるＢｉＰ活性を検出するステップと、（ｂ）そのＢｉＰ活性を非罹患コントロールのＢｉＰ活性と比較するステップと、（ｃ）コントロールから得られた値と対象から得られた値を比較するステップとを含む骨量減少に起因又は関連する疾患又は症候群の診断方法を提供している。ここで、コントロールから得られた値と対象から得られた値の差は、対象が上記疾患又は症候群に罹患しているかの指標となる。
【００１８】
第８の観点では、（ｉ）ＢｉＰ活性を調節する薬剤を選択するステップと、（ii）上記薬剤の存在下で破骨細胞の成熟を測定するステップとを含む骨破壊又は骨量減少を調節する薬剤を同定するアッセイ方法を提供している。ここで薬剤非存在下における破骨細胞の成熟と薬剤存在下における破骨細胞の成熟の差は、骨破壊又は骨量減少を調節する薬剤の指標となる。
【００１９】
第９の観点では、（ａ）本発明の第８の観点のアッセイ方法を行うステップと、（ｂ）骨破壊又は骨量減少を調節する１又は複数の薬剤を同定するステップと、（ｃ）上記の同定した１又は複数の薬剤を大量に調製するステップとを含むプロセスを提供している。
【００２０】
第１０の観点では、本発明の第８の観点のアッセイ方法によって得られた薬剤を提供している。
【００２１】
第１１の観点では、（ａ）ＢｉＰを、１又は複数の異なる破骨細胞分化段階にある１又は複数の破骨細胞に添加するステップと（ｂ）破骨細胞形成に対するＢｉＰの効果を決定するステップとを含むＢｉＰ又はその変異体、相同体、誘導体、若しくは断片の破骨細胞分化に対する効果を決定する方法を提供している。
【００２２】
第１２の観点では、本発明は破骨細胞分化中にＢｉＰによって調節される１又は複数のタンパク質の同定方法に関しており、該方法は（ａ）ＢｉＰ存在下及び非存在下において破骨細胞を分化させるステップと、（ｂ）ＢｉＰ存在下で分化した破骨細胞中で、ＢｉＰ非存在下で分化させた破骨細胞と比較して異なる発現をしている１又は複数のタンパク質を同定するステップとを含む。
【００２３】
第１３の観点では、本発明は、骨粗しょう症の予防又は治療のための医薬品の製造における、ＢｉＰ又はその変異体、相同体、誘導体、若しくは断片の使用に関する。
【００２４】
［好ましい実施形態］
好ましくは、本発明は骨量減少に対する医薬品の製造におけるＢｉＰの使用に関する。
【００２５】
好ましくは、本発明は骨吸収に対する医薬品の製造におけるＢｉＰの使用に関する。
【００２６】
好ましくは、本発明は骨量減少の治療における使用のためのＢｉＰに関する。
【００２７】
好ましくは、本発明は骨吸収の治療における使用のためのＢｉＰに関する。
【００２８】
好ましくは、骨量減少又は骨吸収は、がん又はがん転移に関連する骨破壊である。この骨破壊は、本明細書に記載されているその他の形態の骨量減少と同じ生物学的基礎を有する。
【００２９】
好ましくは、骨量減少又は骨吸収は筋骨格系疾患に関連したものである。
【００３０】
好ましくは、筋骨格系疾患は骨粗しょう症である。
【００３１】
好ましくは、調節は破骨細胞の成熟又は発達の阻害、減少、又は予防である。
【００３２】
好ましくは、破骨細胞成熟の調節はインビボ又はインビトロで行われる。
【００３３】
好ましくは、破骨細胞は破骨細胞前駆体、多核前駆体、又は成熟破骨細胞である。
【００３４】
好ましくは、本発明の第７の観点の方法において、ＢｉＰ活性はコントロールから得られた値と比較して減少している。
【００３５】
好ましくは、本発明の第７の観点の方法は、破骨細胞の発達又は骨吸収を測定する任意のステップを含む。
【００３６】
好ましくは、本明細書に記載されている薬剤はＢｉＰ活性を増大又はアップレギュレ−トする。
【００３７】
好ましくは、本発明の第１１の観点の方法において、ＢｉＰは０．０２〜２０μｇ／ｍｌの濃度で添加される。
【００３８】
好ましくは、破骨細胞の数は、ＴＲＡＰ活性、ＶｎＲ、及び／又はＦアクチンリングを測定することで定量される。
【００３９】
好ましくは、本発明の第１１の観点の方法は、骨吸収を定量する任意のステップを含む。
【００４０】
好ましくは、破骨細胞の分化は、ＰＣＲを用いて、１又は複数の破骨細胞特異的マーカーの発現を測定することで確認される。
【００４１】
好ましくは、破骨細胞特異的マーカーはカルシトニン受容体遺伝子又はカテプシンＫ遺伝子である。
【００４２】
好ましくは、本発明の第１２の観点により同定されるタンパク質はシグナル伝達分子又は転写因子である。
【００４３】
好ましくは、本発明の第１２の観点の方法において、ＢｉＰは培養の初めから２４〜７２時間の間、又は多核破骨細胞が存在する培養の終わりの方の２４〜７２時間に添加される。
【００４４】
好ましくは、タンパク質をコードする核酸又はタンパク質は、ｑｔ−ＲＴ−ＰＣＲ及び／又はウェスタンブロッティングによって検出される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
ＢＩＰ
本明細書において「ＢｉＰ」という用語は、国際公開第００／２１９９５号に開示されている７８ｋＤの小胞体シャペロンタンパク質を指す。好ましくは、ＢｉＰポリペプチドは国際公開第００／２１９９５号の２３頁の別表（Appendix）２に示されているアミノ酸配列を有する。好ましくは、ＢｉＰタンパク質は国際公開第００／２１９９５号に配列番号１又は配列番号２として示されているアミノ酸配列を有する。好ましくは、本明細書のＢｉＰ配列は、上述のポリペプチド中に存在する６Ｈｉｓタグのようなタグをもたない。本明細書において「アミノ酸配列」という用語は、用語「ポリペプチド」及び／又は用語「タンパク質」と同義である。ある場合には、「アミノ酸配列」という用語は「ペプチド」という用語と同義で用いられている。ある場合には、「アミノ酸配列」という用語は「タンパク質」という用語と同義で用いられている。
【００４６】
好ましくは、ＢｉＰタンパク質は、国際公開第００／２１９９５号に配列番号３として記載されているヌクレオチド配列によってコードされる。ヌクレオチド配列は、起源がゲノム、合成、又は組換え体である、ＤＮＡ又はＲＮＡであってよい（例えばｃＤＮＡ）。ヌクレオチド配列は２本鎖でもよいし、センス鎖若しくはアンチセンス鎖の１本鎖であってもよいし、又はその組合せであってもよい。ヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ技術を用いて調製されてもよい（例えば組換えＤＮＡ）。特に、大腸菌内でのＢｉＰの発現方法及び組換えタンパク質の精製方法が、国際公開第００／２１９９５号に開示されている。ヌクレオチド配列は天然の形態と同一でもよいし、その断片、相同体、変異体、又は誘導体であってもよい。
【００４７】
本明細書において「ＢｉＰ活性」という用語は、ＢｉＰの発現及び／又は活性のレベル及び／又はパターンを指す。
【００４８】
破骨細胞
本明細書において、「破骨細胞」という用語は、骨芽細胞によって新しい骨に置き換えられるように、活発に骨を吸収する細胞を指す。本用語は少なくとも破骨細胞前駆体、多核破骨細胞前駆体、及び成熟破骨細胞を包含する。
【００４９】
例えば骨粗しょう症のような筋骨格系疾患で見られるように、破骨細胞が骨を異常なレベル（例えば異常に高いレベル）で吸収し且つ骨芽細胞が正常レベルで骨を形成している疾患では、破骨細胞は治療標的となる。一例として、治療方針は、破骨細胞数の減少又は破骨細胞の吸収活性の減少に依存してもよい。骨吸収と骨形成の平衡を回復するためにこの方針を利用することができる。本発明において、治療標的は、ＢｉＰを用いた破骨細胞の発達の調節（例えば阻害）、好ましくは破骨細胞の成熟の調節（例えば阻害）である。
【００５０】
本発明において、実施例に記載されているように、破骨細胞の分化及び発達も破骨細胞の成熟に含まれる。破骨細胞の成熟としては特に制限されないが、破骨細胞前駆体又は多核前駆体の、成熟破骨細胞への成熟（例えば分化）が含まれる。
【００５１】
骨形成及び骨吸収プロセスにおける骨芽細胞及び破骨細胞の役割についてのレビューには、H. Fleisch, Bisphosphonates In Bone Disease, From The Laboratory To The Patient, 3rd Edition, Parthenon Publishing (1997)を参照することができる。
【００５２】
背景となる情報として、破骨細胞は骨リモデリングに関わる骨吸収細胞である。破骨細胞は多核の食細胞であり、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼという酵素が豊富で、単球／マクロファージ系の細胞由来の前駆体が融合することで形成される。破骨細胞の分化制御に非常に重要な複数の分子が同定されている（Br Med J 1997; 315:469-472）。初期破骨細胞前駆体で発現している転写因子ＰＵ−１は、破骨細胞及び単球の分化の初期段階で必須であり、一方、ｃ−ｆｏｓ及びＮＮ−κＢ等の転写因子は、方向付けされた前駆体（committed precursors）が成熟破骨細胞へ分化するのを刺激するのに重要な役割を果たしている。破骨細胞の形成及び活性化は、破骨細胞前駆体と骨髄間質細胞の接近（close contact）にも依存する。間質細胞は、破骨細胞及びマクロファージの両方が共通の前駆体から分化する際に必須なサイトカインＭ−ＣＳＦを分泌する。間質細胞はまた、細胞表面にＲＡＮＫリガンド（ＲＡＮＫＬ）と呼ばれる分子を発現し、これは破骨細胞前駆体上に存在するＲＡＮＫ（Receptor Activator of Nuclear Factor Kappa B）と呼ばれる別の細胞表面受容体と相互作用し、破骨細胞前駆体から成熟破骨細胞への分化を促進する。このＲＡＮＫ−ＲＡＮＫＬ相互作用は、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）と呼ばれる別の分子によって遮断される。オステオプロテゲリンはＲＡＮＫの「おとり」リガンドであり、破骨細胞形成の強力な阻害剤として働く。成熟破骨細胞は骨表面上に密着シールを形成し（form a tight seal）、波状縁を通して破骨細胞の下の空間（ハウシップ窩）に塩酸及びタンパク質分解酵素を分泌して骨を吸収する。この波状縁の形成は、細胞膜結合シグナル伝達タンパク質であるｃ−ｓｒｃの存在に大きく依存する。破骨細胞が分泌した塩酸はヒドロキシアパタイトを溶かし、タンパク質分解酵素（主にカテプシンＫ及びマトリックスメタロプロテイナーゼ）がコラーゲン及びその他の基質タンパク質を分解することを可能にする。破骨細胞活性の制御に重要な分子として同定されたものとして、破骨細胞内の水素イオン形成を触媒するカルボニックアンヒドラーゼII（Ｃａ−II）、破骨細胞のプロトンポンプのサブユニットをコードするＴＣＩＲＧ１、並びにコラーゲン及びその他の非コラーゲンタンパク質を分解するカテプシンＫ等を挙げることができる。吸収が終わると、骨形成の始まりを知らせるいわゆる逆転相（reversal phase）において、破骨細胞はプログラム細胞死（アポトーシス）を起こす。
【００５３】
骨量減少
骨量減少に関連する又は関係する疾患としてとしては特に制限されないが、パジェット病、原発性骨粗しょう症及び続発性骨粗しょう症、閉経後骨粗しょう症、老人性骨粗しょう症、グルココルチコイド誘発性骨粗しょう症、歯周病、歯槽骨の喪失、骨切り術後の骨量減少及び小児突発性骨量減少（childhood idiopathic bone loss）、骨粗しょう症の長期合併症（例えば、脊椎の湾曲及び身長の低下）、補綴手術、並びに股関節、膝関節等の人工関節の弛緩を挙げることができる。
【００５４】
骨量減少は骨破壊、骨侵食、骨の菲薄化、又は骨の消化を特徴としてもよい。本明細書で明らかになるように、これは骨の堆積と骨の吸収のバランスの病理的変化によって引き起こされることがある。
【００５５】
別の実施形態では、骨量低下（low bone mass）に関連する状態の治療においてＢｉＰが使用されてもよい。そのような状態は、World Health Organization Assessment of Fracture Risk and its Application to Screening for Postmenopausal Osteoporosis (1994). Report of a World Health Organization Study Group. World Health Organization Technical Series 843による基準で定義されている年齢特異的な正常値よりも骨量レベルが下であることで明らかとなる。「骨量低下に伴う状態」という語句は、脊椎動物、例えば、骨粗しょう症のような疾患を発症する確率が平均よりも有意に高いことが知られている哺乳動物（例えば閉経後の女性、５０歳を越える男性）をも意味する。骨量を増大又は増強するその他の用途として、骨の修復、骨折の治癒速度の促進、全置換骨移植手術（replacing bone graft surgery entirely）、骨移植の成功率の増大、顔面形成術若しくは上顎形成術若しくは下顎形成術後の骨折治癒、補綴への内部成長（prosthetic ingrowth）、脊椎骨癒合、又は長骨の伸張を挙げることができる。
【００５６】
非常に好ましい実施形態では、骨吸収を予防又は治療するために、ＢｉＰを使用する。本発明では、直接又は間接的に破骨細胞の形成又は活性を変えることにより骨吸収を調節（例えば予防）することで、骨吸収を予防又は治療する。直接又は間接的に破骨細胞の形成又は活性を変えることによって、存在する骨がミネラル相及び／又は有機基質相（organic matrix phase）から除去されるのを阻害することで、骨吸収を調節することができる。ヒト及びその他の哺乳動物の様々な疾患が、異常な骨吸収を伴うか又は異常な骨吸収に関連している。そのような疾患としては特に制限されないが、骨粗しょう症、グルココルチコイド誘発性骨粗しょう症、パジェット病、異常に亢進した骨の代謝回転、歯周病、歯牙喪失、骨折、補綴周辺での骨溶解、骨形成不全症、転移性骨疾患、悪性高カルシウム血症、及び多発性骨髄腫等を挙げることができる。
【００５７】
好ましくは、骨量減少又は骨吸収は、骨粗しょう症又はパジェット病のような筋骨格系疾患に関連している。
【００５８】
好ましくは、骨量減少又は骨吸収が、骨粗しょう症又はパジェット病のような筋骨格系疾患の根底にある。
【００５９】
非常に好ましい実施形態においては、骨量減少又は骨吸収に関連する状態は骨粗しょう症である。
【００６０】
骨粗しょう症は社会上の大きな健康問題である。骨量の減少を起こす疾患は他にもあるが（すなわちパジェット病）、骨粗しょう症はずば抜けて最も多く、ヘルスケアの観点から最も費用がかかる疾患である。エストロゲンは骨代謝を直接及び間接的に制御するホルモンであり、閉経後の女性におけるエストロゲン産生の減少及び加齢に伴うアンドロゲン（これは男性で酵素によってエストロゲンに変換される）産生の低下は、骨粗しょう症リスクの原因となっている。４６歳以上では、女性の８５％及び男性の１５％が骨粗しょう症であると推定されている。骨粗しょう症では、骨芽細胞による骨形成の減退がみられ、これは通常、老化過程により起こる。骨粗しょう症に関する最も残念な誤解の１つは、それが高齢者だけの疾患であると広く信じられていることである。閉経後骨粗しょう症は最も多い高齢女性疾患（ageing women’s diseases）の１つであるが、障害を引き起こす骨量減少へのプロセスはずっと早くに始まる。実際、２５〜３５歳の女性人口の驚くほど大部分が、加速する骨量減少に罹患していると推定されている。女性の生涯における骨の喪失の半分もが、更年期症状が現れ始める前にすでに起こっている。
【００６１】
「続発性骨粗しょう症」の治療方法も本発明の範囲に含まれる。「続発性骨粗しょう症」としては特に制限されないが、哺乳動物（ヒトを含む）などの脊椎動物における、グルココルチコイド誘発性骨粗しょう症、甲状腺機能亢進症により誘発される骨粗しょう症、固定化により誘発される骨粗しょう症（immobilization-induced osteoporosis）、ヘパリン誘発性骨粗しょう症、及び免疫抑制薬により誘発される骨粗しょう症等を挙げることができる。
【００６２】
骨量減少又は骨吸収の有無は、当該分野で公知の様々な方法で決定することができ、例えば骨吸収評価（Bone Resorption Assessment）の実施などがある。これは骨量減少の生化学的マーカーを非観血的に評価するものである。他の基準（例えば骨密度）を用いて、問題が起こるずっと前に骨量減少速度を測定することもできる。骨の基質骨格（matrix framework）が吸収されると、コラーゲン分子を安定化している架橋（例えばデオキシピリジニウム（Ｄ−ｐｙｄ）及び／又はピリジニウム（Ｐｙｄ））が尿中に排出され、その濃度を正常な濃度と比較すれば、どれだけの速さで骨が減少しているかの指標になる。これらのマーカー値が高ければ、それは体が置換できるよりも速い速度で骨が失われていることを示している。
【００６３】
あるいは、脊椎及び／又は大腿骨頚の二重エネルギーＸ線吸収（ＤＥＸＡ）スキャンのような臨床技術によって、骨量減少又は骨吸収を調べることもできる。
【００６４】
哺乳動物において、骨の成長は促進されることもある。骨成長の促進が有益な状態としては、脊椎動物、例えば哺乳動物（ヒトを含む）における、骨移植片の強化、脊椎骨癒合の誘導、長骨伸張の亢進、顔面形成術、上顎形成術、及び／又は下顎形成術の後の骨折治癒の亢進等を挙げることができる。
【００６５】
診断
別の観点では、本発明は、骨量減少又は骨吸収に起因する又は関連する疾患又は症候群の診断方法に関する。
【００６６】
疾患の診断の基礎を提供するためには、正常な又は標準的なＢｉＰの発現及び／又は活性のレベル又はパターンが確立されねばならない。これは、１又は複数の正常な対象（例えば正常な動物又はヒト対象）からのサンプルにおけるＢｉＰの発現及び／又は活性のレベル又はパターンを検査することで達成することができる。サンプルにおけるＢｉＰの発現及び／又は活性の標準的なレベル又はパターンは、ＢｉＰの発現及び／又は活性のレベル又はパターンが既知のポジティブコントロールの希釈系列と比較することで定量することができる。その後、正常サンプルから得られた標準値を、骨量減少又は骨吸収に起因又は関連する疾患に罹患している可能性のある対象由来サンプルから得られた値と比較することができる。コントロールと対象の値のずれを用いて病状の有無を決定することができる。通常このずれは、疾患に罹患している可能性のある対象からのサンプルにおける、コントロールと比べたときのＢｉＰの発現及び／又は活性のレベル又はパターンの減少である。
【００６７】
診断に至るためには、破骨細胞及び骨芽細胞の定量が必要になることがある。これは特に、例えば筋骨格系疾患（例、骨粗しょう症）で見られるように、破骨細胞が異常なレベル（例えば異常に高いレベル）で骨を吸収し、且つ骨芽細胞が正常レベルで骨を形成している疾患で必要である。破骨細胞と骨芽細胞の両方を定量することで、骨吸収と骨形成の間の平衡を調べることができ、また、この平衡のアンバランスに関連する疾患又は症候群の有無を調べることができる。
【００６８】
ＢｉＰポリヌクレオチド、又はその断片、変異体、相同体、若しくは誘導体は、診断テストの基礎を提供することができる。診断目的のために、ＢｉＰポリヌクレオチド配列又はその一部を利用して、ＢｉＰ遺伝子の発現及び／又は活性を検出及び定量してもよい。例えば、ＢｉＰをコードするポリヌクレオチド配列（例えば国際公開第００／２１９９５号の配列番号３）をサンプルのハイブリダイゼーション又はＰＣＲ法に利用して、ＢｉＰ発現の異常を検出することができる。そのような定性的又は定量的方法の形態としては、サザン解析、ノザン解析、ドットブロット、又はその他のメンブレン関連技術、ＰＣＲ技術、ディップスティック、ピン、又はチップ技術、及びＥＬＩＳＡ又はその他の多数試料用の慣習的技術等を挙げることができる。これらの技術は全て当該技術分野でよく知られており、実際、多くの市販の診断キットの基礎となっている。
【００６９】
例えば、ヒトなどの対象からサンプルを採取して診断アッセイを行ってもよい。ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡのような核酸をサンプルから抽出する。ＢｉＰ発現を検出するために、ＰＣＲ（例えば、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ））を用いることができる。ＢｉＰを検出するためのＰＣＲプライマーを設計することができ、そのようなプライマーの例は、国際公開第００／２１９９５号に記載されている。
【００７０】
ＢｉＰの診断アッセイはまた、サンプル中のポリペプチドの検出に（好ましくは標識と融合させた）抗体を利用した方法も含んでもよい。上記サンプルは、例えば、体液、細胞（骨からの細胞、又は骨に由来する細胞（例、破骨細胞））、組織、そのような組織の切片又は抽出物を含む。ポリペプチド及び抗体は、修飾して用いても、修飾せずに用いてもよい。しばしば、ポリペプチド及び抗体は共有結合的に又は非共有結合的にレポーター分子に結合させて標識される。非常に多くのレポーター分子が当業者に知られている。ＢｉＰ特異的抗体も、本明細書に記載されている疾患の診断に有用である。特異性が確立されているポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を用いた競合結合アッセイ又は免疫放射定量法の様々なプロトコールが当業者によく知られている。そのようなイムノアッセイは、通常、ＢｉＰとその特異的抗体（又は、同様な受容体結合分子）との複合体形成、及び複合体形成の測定を含む。イムノアッセイは、ＢｉＰ上の２箇所の干渉しないエピトープに反応するモノクロナール抗体（monoclonal antibodies）を用いた、２箇所のモノクローナルに基づくイムノアッセイ（two-site, monoclonal based immunoassay）であってもよい。競合結合アッセイを用いてもよい。そのようなアッセイの例はMaddox DE et al (1983, J Exp Med 158:121 1)に記載されている。
【００７１】
診断アッセイは、特定の治療処置方法（therapeutic medical regime）の効果を評価するために合わせてもよく、動物実験又は臨床試験に用いられてもよよく、又は個々の患者の治療をモニターするために用いられてもよい。疾患の診断の基礎を提供するために、上述したように、正常な、標準的な、又はコントロールのＢｉＰ発現プロフィールを確立しなければならない。標準の値と対象の値の間のずれが、病状の有無を確定する。もし１又は複数の病状が確定されれば、既存の薬剤を投与してもよく、また、治療プロフィール又は治療値を作成することができる。最後に、値が正常な又は標準のパターンに向かう又は戻るかを評価するために、定期的にアッセイを繰り返してもよい。数日又は数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示すために、連続的な治療プロフィールを使用してもよい。
【００７２】
したがって、別の観点では、少なくとも骨破壊又は骨量減少を予防又は治療するための薬物又は治療法の有効性を決定する方法（好ましくはインビトロの方法）が提供される。該方法は、（ａ）上記薬物又は治療法の下におけるＢｉＰ活性を測定するステップと、（ｂ）少なくとも、コントロールと比べて、上記薬物又は治療法が、骨破壊又は骨量減少の予防又は治療に有効であるかを決定するステップとを含む。
【００７３】
好ましくは、骨破壊又は骨量減少に起因又は関連する疾患に罹患している可能性のある対象におけるＢｉＰの発現及び／又は活性のレベル又はパターンは、コントロールから得られた標準値と比べて減少している。
【００７４】
診断方法は、破骨細胞成熟又は骨吸収を検出する任意のステップを含んでもよい。
【００７５】
サンプル
本明細書において「サンプル」という用語は、その自然な意味を有する。
【００７６】
サンプルは、本発明の方法によってＢｉＰの発現及び／又は活性のレベル及び／又はパターンを検査される、どのような物理的物体（physical entity）でもよい。サンプルは、破骨細胞の発達又は骨吸収が測定される、どのような物理的物体でもよい。
【００７７】
サンプルは生物学的材料、例えば組織、細胞（例えば破骨細胞）、又は体液などであってもよいし、又はそれらに由来してもよい。組織、細胞、又は体液は骨であってもよいし、又は骨に由来してもよい。
【００７８】
サンプルは生検又は剖検でもよいし、あるいは生検又は剖検に由来してもよい。
【００７９】
アッセイ方法
別の観点では、本発明は骨破壊又は骨量減少を調節する薬剤を同定するアッセイを提供する。
【００８０】
好ましくは、ＢｉＰの発現及び／又は活性のレベル又はパターンを低下させるか、又は減少させるか、又は弱めるＢｉＰのアンタゴニストである１又は複数の薬剤を同定するためにアッセイ方法を用いることができる。
【００８１】
好ましくは、ＢｉＰの発現及び／又は活性のレベル及び／又はパターンを強化、亢進、又は増大させるＢｉＰのアゴニストである１又は複数の薬剤を同定するために本発明のアッセイ方法が用いられる。アゴニストは、ＢｉＰの発現及び／又は活性を強化、亢進、又は増大させることで、骨量減少又は骨消化に関連する異常（例えば、骨粗しょう症に関連する又は骨粗しょう症の原因となる、骨量減少又は骨吸収）を調節することができる。アゴニストには、ＢｉＰの発現及び／又は活性を強化、亢進、又は増大させることで、破骨細胞の成熟を阻害、減少、又は低下させるという利点がある。
【００８２】
ＢｉＰの活性及び／又は発現を調節する薬剤を同定するためのハイスループットスクリーニングに、融合タンパク質を用いてもよい（D. Bennett et al., J Mol Recognition, 8: 52-58 (1995)及びK. Johanson et al., J Biol Chem, 270(16): 9459-9471 (1995)参照）。スクリーニングのための別の技術として、国際公開第８４／０３５６４号に詳細に記載されている方法に基づく、好適な結合アフィニティーを有する薬剤のハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）が提供される。スクリーニングの一般的な参照には、Handbook of Drug Screening, edited by Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B. Fernandes. New York, NY, Marcel Dekker, 2001 (ISBN 0-8247-0562-9)を参照のこと。
【００８３】
本発明のアッセイ方法は、定量アッセイはもちろん、小スケール及び大スケール両方の薬剤スクリーニングに適していると予想される。
【００８４】
スクリーニング方法は、直接又は間接的に薬剤に結合させた標識を用いて、ＢｉＰへの薬剤の結合を測定してもよい。あるいは、スクリーニング方法は、標識した競合物との競合を含んでもよい。
【００８５】
複数の薬剤がスクリーニングされてもよい。
【００８６】
候補化合物が抗体やペプチドのようなタンパク質である場合、ファージディスプレイ技術を用いて、候補化合物のライブラリーをスクリーニングしてもよい。ファージディスプレイは、組換えバクテリオファージを用いる分子的スクリーニング手法である。この技術は、各ファージ又はファージミドが特定の候補化合物を発現するように、候補化合物のライブラリーをコードする遺伝子でバクテリオファージを形質転換することを含む。形質転換したバクテリオファージ（固体支持上に結合されていることが好ましい）は、適当な候補化合物を発現し、それをファージコート上に提示する。アフィニティー相互作用に基づく選択戦略によって、ＢｉＰと相互作用できる特定の候補化合物を集める。その後、うまく得られた候補薬剤の特徴を決定する。ファージディスプレイには、標準的なアフィニティーリガンドスクリーニング法にはない利点がある。ファージの表面では候補薬剤が３次元構造で提示されるため、天然の構造により近い。これによって、スクリーニングのための、より強く、より特異性の高いアフィニティー結合を得ることができる。
【００８７】
化合物ライブラリーの別のスクリーニング方法では、化合物ライブラリーを発現する組換えＤＮＡ分子で安定に形質転換された真核又は原核の宿主細胞が用いられる。そのような細胞は、生きているものでも固定されたものでも、標準的な結合パートナーのアッセイに使用できる。細胞応答の高感度な検出方法を記載しているParce et al. (1989) Science 246:243-247及び Owicki et al. (1990) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 87:4007-4011も参照のこと。競合アッセイは特に有用であり、１２５Ｉ−抗体のような標識抗体と、結合組成物への結合アフィニティーが測定されている候補化合物のような被検サンプルと、化合物ライブラリーを発現している細胞とを一緒にインキュベートする。その後、結合した、標識されていない結合パートナーを分離して、結合の程度を評価する。結合した被検サンプルの量は、結合した標識抗体の量に反比例する。
【００８８】
結合の程度を評価するために、結合した結合パートナーと遊離の結合パートナーを分離するための、数多くの方法のどれを用いてもよい。この分離ステップは通常、細胞膜の、フィルターへの接着とそれに続く洗浄、続く洗浄によるプラスチックへの接着、又は遠心分離等の手順を含む。
【００８９】
候補化合物の別のスクリーニング技術では、好ましい結合アフィニティーを有する新規化合物のハイスループットスクリーニングを提供する方法が含まれる。この方法は国際公開第８４／０３５６４号に詳細に記載されている。始めに、固体支持体（例、プラスチックピン、又はその他の適当な表面）上で、大量の異なる小さなペプチド薬剤を合成する。その後、全てのピンを、溶解させたタンパク質と反応させ、洗浄する。次のステップは、結合したタンパク質の検出を含む。検出はモノクローナル抗体を用いることで達成され得る。このようにしてタンパク質と特異的に相互作用する化合物を同定することができる。
【００９０】
ＢｉＰと相互作用することができそうな候補化合物を合理的に設計するために、タンパク質及び／又はそのインビボにおける結合パートナーの、分子形状の構造的研究を基礎にしてもよい。どの部位が、具体的な他のタンパク質と相互作用するのかを決定する方法の１つは、物理的構造を決定することである（例えばＸ線結晶構造解析や２次元ＮＭＲ技術）。これらは、どのアミノ酸残基が分子的に接触する領域を形成するかについての指針を与える。タンパク質の構造決定の詳細な説明には、例えばBlundell and Johnson (1976) Protein Crystallography, Academic Press, New York.を参照のこと。
【００９１】
ＢｉＰの活性及び／又は発現を調節する薬剤が同定されたら、該薬剤存在下における破骨細胞成熟又は骨吸収を、例えば本明細書に記載の方法を用いて、測定することができる。ａ）薬剤非存在下における破骨細胞成熟又は骨吸収と、ｂ）薬剤存在下における破骨細胞成熟又は骨吸収との差は、薬剤が骨破壊を調節できるかどうかの指標となる。
【００９２】
この差は、薬剤存在下における破骨細胞成熟の減少又は阻害であることが好ましい。
【００９３】
この差は、薬剤存在下における骨吸収の減少又は阻害であることが好ましい。
【００９４】
ほんの一例として、破骨細胞成熟又は骨吸収を評価するために、ＢｉＰの添加を例えば前駆体分化の初期段階、又は多核細胞形成後に行う、パルス実験を用いてもよい。適当な時間に細胞を固定して、例えばＴＲＡＰ活性を組織化学的に染色するか又は２３Ｃ６抗体（例えば、eBioscience Inc.社のカタログ番号１４−０５１９）などの抗体及びＴＲＩＴＣファロイジンを使った免疫局在解析でそれぞれＶｎＲ及びＦアクチンリングを染色し、破骨細胞の数を定量してもよい。象牙質切片から破骨細胞を取り除き、トルイジンブルーで染色して吸収を定量してもよい。破骨細胞の分化を更に確認するために、カルシトニン受容体やカテプシンＫのような破骨細胞特異的マーカー遺伝子の発現をリアルタイムＰＣＲで測定するなどの分子技術を用いてもよい。
【００９５】
調節
ＢｉＰ並びに骨吸収の調節及び破骨細胞成熟の調節との関係において、「調節」という用語は、好ましくは、ＢｉＰを用いた破骨細胞の成熟及び骨吸収の予防、抑制、緩和、減少、阻害、又は予防を意味する。
【００９６】
したがって、本発明はとりわけ、ＢｉＰの発現及び／又は活性のレベル及び／又はパターンを調節する又は調節に影響を与えるアッセイ方法、プロセス、及び薬剤に関する。一例として、ＢｉＰの発現及び／又は活性のレベル及び／又はパターンが予防、抑制、緩和、減少、阻害、又は予防されると、その後、骨芽細胞成熟及び骨吸収が修復、亢進、又は増大される。好ましくは、ＢｉＰの発現及び／又は活性のレベル及び／又はパターンが修復、亢進、又は増大され、骨芽細胞成熟及び骨吸収が予防、抑制、緩和、減少、阻害、又は予防される。
【００９７】
薬剤
薬剤は、有機化合物又はその他の化学薬品であってもよい。薬剤は、好ましいソース（天然であれ人工物であれ）から得られる又は生産される化合物であってよい。薬剤はアミノ酸分子、ポリペプチド、若しくはその化学的誘導体、又はその組合せであってもよい。薬剤はさらに、ポリヌクレオチド分子（センス鎖又はアンチセンス鎖分子であってよい）、又は抗体（例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、又はヒト化モノクローナル抗体）であってもよい。
【００９８】
抗体産生ヒト細胞株を必要としない、ヒトの特徴を備えたモノクローナル抗体を作製する様々な戦略が開発されてきた。例えば、有用なマウスモノクローナル抗体を、齧歯類からの可変領域とヒトからの定常領域とをつなぐことで「ヒト化」することが行われてきた（Winter, G. and Milstein, C. (1991) Nature 349, 293-299）。これによって、ヒトの、その抗体に由来する抗マウス免疫原性は低下したものの、外来Ｖ領域のフレームワークの特性による残存抗原性は保持されたままである。その上、抗原結合特異性は本質的にマウスドナーのものである。ＣＤＲ移植及びフレームワーク操作（欧州特許第０２３９４００号）により、抗体操作が改良及び洗練され、ヒトの治療目的に許容されるヒト化マウス抗体の産生が可能となった。ヒト化抗体は、当該技術分野で周知なその他の方法（例えば米国特許第２３９４００号に記載されている）により得てもよい。
【００９９】
薬剤は、加水分解性の二官能性リンカー等のリンカーによって物体（例えば有機分子）に付着されていてもよい。
【０１００】
物体は、化合物ライブラリーから設計又は獲得してもよく、化合物ライブラリーにはペプチド、及び有機小分子のようなその他の化合物も含まれてよい。
【０１０１】
一例として、物体は天然物質、生物学的高分子、又は生物材料（細菌、菌類、又は動物（特に哺乳動物）の細胞又は組織など）抽出物、有機又は無機分子、合成薬剤、準合成薬剤、構造的又は機能的模倣薬（mimetics）、ペプチド、ペプチド模倣薬、完全タンパク質から切断したペプチド、人工的に合成したペプチド（例として、ペプチド合成機の使用、又は組換え技術、又はその組合せによる）、組換え薬剤、抗体、天然又は非天然薬剤、融合タンパク質又はその同等物、並びにこれらの変異体、誘導体、又はその組合せであってもよい。
【０１０２】
通常、物体は有機化合物である。有機化合物が２つ以上のヒドロカルビル基を有することもある。ここで、「ヒドロカルビル基」という用語は、少なくともＣ及びＨを有し且つ場合によって１以上の好適な置換基を有する基を意味する。そのような置換基の例としてハロ、アルコキシ、ニトロ、アルキル基、環状基（cyclic group）等を挙げることができる。置換基が環状基である可能性のほかに、置換基の組合せによって環状基が形成されていてもよい。ヒドロカルビル基が２つ以上のＣを含む場合、それらの炭素がお互いに結合されている必要はない。例えば、炭素の少なくとも２つが、好適な元素又は基でつながっていてもよい。したがって、ヒドロカルビル基はヘテロ原子を含んでいてもよい。好適なヘテロ原子は、当業者に明らかであるが、例えば硫黄、窒素、及び酸素を含む。ある適用においては、物体は少なくとも１つの環状基を含むことが好ましい。環状基は非縮合多環基（non-fused polycyclic group）のような多環基であってもよい。ある適用では、物体は、他のヒドロカルビル基につながれた上記環状基を少なくとも１つ含む。
【０１０３】
物体は、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基、又はヨード基などのハロ基を含んでもよい。
【０１０４】
物体は、１又は複数のアルキル基、アルコキシ基、アルケニル基、アルキレン基、及びアルケニレン基（分枝鎖又は非分枝鎖でもよい）を含んでもよい。
【０１０５】
上記の通り、薬剤は抗体でもよい。
【０１０６】
ＢｉＰに対する抗体を作製するために当該技術分野で周知の手法を用いることができる。このような抗体として、限定されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーから作製したフラグメント等を挙げることができる。中和抗体、すなわちＢｉＰの生物学的活性を調節し得る抗体が診断及び治療に特に好ましい。
【０１０７】
抗体産生には、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス等の様々な宿主を、１又は複数の、本明細書に記載のポリペプチド又は免疫原生を有する上記ポリペプチドの一部、変異体、相同体、断片、若しくは誘導体、又はオリゴペプチドを注射して免疫化してもよい。宿主の種によっては、免疫応答を増大させるために様々なアジュバントを使用してもよい。そのようなアジュバントとしては特に制限されないが、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルジェル、並びに界面活性物質（リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペット・ヘモシアニン、及びジニトロフェノールなど）を挙げることができる。ＢＣＧ（Bacilli Calmette-Guerin）及びCorynebacterium parvumが有用なヒトアジュバントであると考えられ、これらを使用してもよい。
【０１０８】
好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。
【０１０９】
モノクローナル抗体の調製には、継代細胞株によって培地中に抗体分子を産生させる技術であれば、どのような技術を用いてもよい。これらには、限定されるものではないが、Koehler and Milstein (1975) Nature 256:495-497に原記載のあるハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kosbor et al (1983) Immunol Today 4:72及びCote et al (1983) Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030）、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole et al (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss Inc, pp 77-96）が含まれる。さらに、「キメラ抗体」作製のために開発された技術である、マウス抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子へスプライシングして適切な抗原特異性と生物学的活性を有する分子を得るという技術を用いることもできる（Morrison et al (1984) Proc Natl Acad Sci 81:6851-6855、Neuberger et al (1984) Nature 312:604-608、及びTakeda et al (1985) Nature 314:452-454）。あるいは、単鎖抗体作製用に記載されている技術（米国特許第４９４６７７９号）を、阻害剤特異的単鎖抗体の作製に応用することもできる。
【０１１０】
抗体作製は、リンパ球集団においてインビボの産生を誘導するか、又は組換え免疫グロブリンライブラリー若しくは特異性の非常に高い結合試薬のパネルをスクリーニングすることにより行うこともできる（Orlandi et al, 1989, Proc Natl Acad Sci 86: 3833-3837、及びWinter G and Milstein C ,1991, Nature 349:293-299に開示されている）。
【０１１１】
ＢｉＰ特異的な結合部位を含む抗体断片を作製してもよい。例えば、そのようは断片としては特に制限されないが、抗体分子をペプシン消化して得られるＦ（ａｂ’）２フラグメント、及びＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することで得られるＦａｂフラグメントを挙げることができる。あるいは、求める特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントを素早く且つ容易に得ることができるように、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築してもよい（Huse WD et al (1989) Science 256:1275-1281）。
【０１１２】
あるいは、例えばファージがコート表面に多様な相補性決定領域（ＣＤＲｓ）をもつｓｃＦｖフラグメントを発現させている、ファージディスプレイライブラリーのスクリーニングを含む技術がある。この技術は当業者によく知られている。
【０１１３】
好ましくは、抗体はヒト化抗体である。
【０１１４】
ヒト化抗体は、マウス抗体の定常領域をヒトタンパク質で置き換えることで得られてきたが、抗体の可変領域の部分をヒトタンパク質に置き換えることで得てもよい。一般的に、ヒト化抗体は５〜１０％がマウス、９０〜９５％がヒトのものである。ヒト化抗体は、マウス抗体及びキメラ抗体で見られた免疫応答に対抗するために開発された。臨床試験で使用されたヒト化抗体のデータから、ヒト化抗体に対するヒト免疫系の応答は最小限であるか又は全くないことが示されている。
【０１１５】
ヒト化抗体へのより高度なアプローチでは、ヒト由来定常領域を提供するだけでなく、可変領域の修飾も行われる。これにより、抗体の形状をヒトのものにできるだけ近い形状へと再形成する（reshape）ことができる。重鎖及び軽鎖の両方の可変領域は、問題の抗原への反応性が異なり且つ結合能を決定する３つの相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を含み、ＣＤＲｓには、ＣＤＲｓの足場を提供すると推定されており、種内で比較的保存されている４つのフレームワーク領域（ＦＲｓ）が隣接する。特定の抗原に関する非ヒト抗体を調製したら、修飾するヒト抗体内のＦＲｓに非ヒト抗体由来ＣＤＲｓを継ぎ合わせることで、可変領域を「再形成」又は「ヒト化」することができる。このようなアプローチは、例えばCancer Res (1993) 53:851-856、Nature (1988) 332:323-327、Science (1988) 239:1534-1536、Proc Natl Acad Sci USA (1991) 88:4181-4185、及びJ Immunol (1992) 148:1149-1154に報告がある。
【０１１６】
本発明によると、薬剤は、ＢｉＰをコードするヌクレオチド配列に結合するか又はコーディングヌクレオチド配列若しくは対応するＲＮＡ転写物に関連する領域を調節して、ＢｉＰの転写又は翻訳の速度を調節（例えば促進）することができる。例えば、ＢｉＰのｍＲＮＡへの転写を調節するか、又はｍＲＮＡプロセシングを調節する等により、ＢｉＰの発現を調節してもよい。ＢｉＰタンパク質の発現を調節する手段として、ＢｉＰｍＲＮＡからＢｉＰへの翻訳を制御してもよい。そのような調節には、例えば転写や翻訳に影響する薬剤の使用等の、当該技術分野で公知の方法を利用することができる。
【０１１７】
そのような薬剤は、更に別の物体の活性をも調節してもよい。
【０１１８】
薬剤がＢｉＰの発現及び／又は活性を増大、亢進、又はアップレギュレートすることが特に好ましい。この点に関して、薬剤は、例えば相同組換えで挿入された、ＢｉＰの発現を増大、亢進、又はアップレギュレートする調節配列（例えばプロモーターやエンハンサー）であってもよい。調節配列の挿入後、ＢｉＰと調節配列を操作して連結する（operably linked）ことが好ましい。ＢｉＰをコードする配列に「操作して連結された」調節配列は、コントロール配列が発現される条件下でコーディング配列が発現されるように連結される。
【０１１９】
プロドラッグ
物体はプロドラッグに由来してもよいと当業者には理解される。プロドラッグの例として、ある種の保護基を挙げることができ、該保護基はそれ自体は薬理学的活性をもたなくてもよいが、ある場合には、投与（例えば、経口的又は非経口的に）された後に体内で代謝されて薬理学的に活性な物体になってもよい。
【０１２０】
好適なプロドラッグとしては特に制限されないが、ドキソルビシン、マイトマイシン、フェノールマスタード（Phenol Mustard）、メトトレキサート、抗葉酸剤、クロラムフェニコール、カンプトテシン、５−フルオロウラシル、シアン化物、キニーネ、ジピリダモール、及びパクリタキセルを挙げることができる。薬剤（例えば、抗体やその断片）は興味のある酵素と化学的に連結させてもよい。あるいはこのコンジュゲートは、抗体可変領域の遺伝子と酵素をコードする遺伝子とを用いて、組換えＤＮＡ技術によって作製した融合タンパク質でもよい。プロドラッグは非毒性で、内在する酵素の作用に抵抗性であり、標的酵素によってのみ活性な薬物に変換されることが好ましい。ｍＡｂ−酵素コンジュゲートによる抗がん用プロドラッグの選択的活性化については、Senetr & Springer (2001) Advanced Drug Delivery Reviews 53, 247-264にレビューされている。
【０１２１】
さらに、「プロモイエティ」（pro-moieties）として知られる特定の部分（例えば“Design of Prodrugs” by H. Bundgaard, Elsevier, 1985に記載）を、薬剤の適当な官能基上に配置することができることも理解される。そのようなプロドラッグも本発明の範囲に含まれる。
【０１２２】
薬剤は、酸付加塩若しくは塩基塩のなどの薬学的に許容される塩、又はその溶媒和物（その水和物も含む）の形態であってよい。好適な塩についてのレビューには、Berge et al, J. Pharm. Sci., 1977, 66, 1-19を参照。
【０１２３】
本発明の薬剤は、その他の治療特性を示すことができてもよい。
【０１２４】
薬剤を１つ以上のその他の薬学的活性薬剤と組み合わせて使用してもよい。
【０１２５】
活性薬剤を組み合わせて投与する場合、活性薬剤の組合せは、同時に、又は時間を置いて、又は連続して投与してもよい。
【０１２６】
立体異性体及び幾何異性体
物体は、立体異性体及び／又は幾何異性体として存在してもよい。例えば、物体は１つ以上の不斉中心又は幾何中心を有してもよく、したがって２つ以上の立体異性体及び／又は幾何体で存在してもよい。本発明はこれらの物体の個々の立体異性体及び幾何異性体の全て、並びにその混合物の使用を包含する。
【０１２７】
薬学的塩（PHARMACEUTICAL SALT）
本発明の薬剤は薬学的に許容される塩の形態で投与されてもよい。
【０１２８】
薬学的に許容される塩は当業者には周知であるが、例えばBerge et al, J.Pharm.Sci., 66, 1-19 (1977)に記載されているものが含まれる。好適な酸付加塩は、非毒性の塩を形成する酸から形成され、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、リン酸水素塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、グルコン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、及びｐ−トルエンスルホン酸塩が含まれる。
【０１２９】
１つ以上の酸性部分が存在するとき、好適な薬学的に許容される塩基付加塩は、非毒性塩を形成する塩基から形成することができ、例えばアルミニウム塩、カルシウム塩、リチウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、亜鉛塩、及び薬学的活性アミン（例えばジエタノールアミン）塩が含まれる。
【０１３０】
薬剤の薬学的に許容される塩は適宜、薬剤の溶液と所望の酸又は塩基の溶液を混ぜることで即座に調製することができる。塩は、溶液から沈殿させ、濾過によって回収することもできるし、又は溶媒を蒸発させて回収することもできる。
【０１３１】
薬剤は多形相で存在してもよい。
【０１３２】
本発明の薬剤は１つ以上の不斉炭素原子を含んでもよく、したがって２つ以上の立体異性体として存在してもよい。薬剤がアルケニル又はアルケニレン基を含むとき、シス（Ｅ）及びトランス（Ｚ）異性体が生じてもよい。本発明は、薬剤の個々の立体異性体、及び（それが適当な場合には）その各々の互変異性型、その混合物を含む。
【０１３３】
ジアステレオ異性体又はシス及びトランス異性体の分離は定法によって行うことができる（例えば薬剤又はその好適な塩若しくは誘導体の立体異性体混合物の分別再結晶、クロマトグラフィー又はＨＰＬＣ）。薬剤の個々のエナンチオマーは、対応する光学的に純粋な中間体から調製されてもよく、又は好適なキラル支持体を用いた対応するラセミ化合物のＨＰＬＣ、若しくは対応するラセミ化合物と好適な光学的に活性な酸若しくは塩基との反応によって形成されたジアステレオ異性体塩の分別再結晶などによる、分離によって調製してもよい。
【０１３４】
薬剤には、薬剤又はその薬学的に許容される塩の、全ての好適な同位体変種（isotopic variations）も含まれる。薬剤又はその薬学的に許容される塩の同位体変種とは、少なくとも１つの原子が、同じ原子番号を有するがその原子質量が天然に通常見つかる原子質量とは異なる原子で置換されている、薬剤又はその薬学的に許容される塩として定義される。薬剤及びその薬学的に許容される塩に取り込まれてもよい同位体の例として、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、及び３６Ｃｌ（それぞれ水素、炭素、窒素、酸素、りん、硫黄、フッ素及び塩素の同位体）などを挙げることができる。薬剤及びその薬学的に許容される塩の、ある種の（例えば３Ｈ又は１４Ｃなどの放射性同位体が取り込まれている）同位体変種は、薬物及び／又は基質の組織分布の研究に有用である。トリチウム化した（すなわち３Ｈ）、及びカーボン１４（すなわち１４Ｃ）の同位体は、調製の容易さ及びその検出性のため、特に好ましい。さらに、ジューテリウム、すなわち２Ｈのような同位体による置換は、代謝安定性が大きくなるため治療上の利益をもたらすことがあり（例えば、インビボでの半減期が長くなったり、必要な投与量が少なくなる）、そのため、いくつかの状況下で好ましい。本発明の薬剤及びその薬学的に許容される塩の同位体変種は、一般的に、好適な試薬の適当な同位体変種を用いて、定法により調製できる。
【０１３５】
薬学的活性塩
薬剤は薬学的に許容される塩として投与されてもよい。通常、薬学的に許容される塩は適宜、所望の酸又は塩基を用いて即座に調製することができる。塩は、溶液から沈殿させて濾過によって回収することもできるし、溶媒を蒸発させて回収することもできる。
【０１３６】
化学合成法
薬剤は、化学合成技術を用いて調製してもよい。
【０１３７】
本発明の化合物の合成中、感受性の高い官能基の保護及び脱保護が必要になることがあることは当業者には明らかであろう。そのために、例えば“Protec-tive Groups in Organic Synthesis” by T W Greene and P G M Wuts, John Wiley and Sons Inc. (1991)、及び “Protecting Groups” by P.J.Kocienski, Georg Thieme Verlag (1994)に記載されている従来技術を用いることができる。
【０１３８】
一部の反応中においては（例えば、塩基に感受性の基を有する光学中心を含む基質との反応中で塩基が用いられる場合）、存在する立体中心が特定の条件下でラセミ化されることがある。これは例えばグアニル化ステップ中に起こり得る。このような潜在的問題は、反応順序、条件、試薬、保護／脱保護計画等の選択によって回避することができると考えられ、これは当業者には良く知られている。
【０１３９】
化合物及び塩は、定法により分離及び精製することができる。
【０１４０】
ジアステレオマーは定法によって分離することができ、例えば、式１の化合物又はその好適な塩若しくは誘導体の立体異性体混合物の分別結晶法、クロマトグラフィー、又はＨＰＬＣ等により分離することができる。式１の化合物の個々のエナンチオマーは、対応する光学的に純粋な中間体から調製してもよいし、又は、好適なキラル支持体を用いた対応するラセミ体のＨＰＬＣ、若しくは対応するラセミ体と好適な光学的活性な酸若しくは塩基との反応によって形成されたジアステレオマー塩の分別結晶法などによる、分離によって調製してもよい。
【０１４１】
薬剤又はその変異体、相同体、誘導体、断片、若しくは模倣薬は、薬剤の全体又は一部を合成する化学的方法を用いて作製してもよい。例えば、薬剤がペプチドを含む場合には、ペプチドを固相法で合成し、樹脂から切断して、分配高速液体クロマトグラフィーによって精製することができる（例えば、Creighton (1983) Proteins Structures And Molecular Principles, WH Freeman and Co, New York NY）。合成ペプチドの組成はアミノ酸分析又はシークエンシングにより確認することができる（例えばエドマン分解法；上述のCreighton）。
【０１４２】
ペプチド阻害剤（又はその変異体、相同体、誘導体、断片、若しくは模倣薬）の合成は、様々な固相技術を用いて行うことができ（Roberge JY et al (1995) Science 269: 202-204）、また、例えばABI 43 1 Peptide Synthesizer （Perkin Elmer社製）をメーカーの使用説明書に従って用いることで、合成を自動化することができる。さらに、変異形薬剤（variant agent）を作製するために、薬剤を含むアミノ酸配列を、直接合成の間に変化させたり、及び／又は化学的方法を用いて他のサブユニットの配列若しくはその一部と組み合わせてもよい。
【０１４３】
化学的誘導体
本明細書で、「誘導体」又は「誘導体化されている」という用語は薬剤の化学修飾を含む。そのような化学修飾の例として、ハロ基、アルキル基、アシル基、又はアミノ基による水素の置換がある。
【０１４４】
化学修飾
薬剤は修飾された薬剤であってもよく、例えば、限定されるものではないが、化学修飾された薬剤を挙げることができる。
【０１４５】
薬剤の化学修飾は、水素結合相互作用、電荷相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、又は双極子相互作用を増大又は減少させてもよい。
【０１４６】
１つの観点では、薬剤は他の化合物の開発のモデル（例えばテンプレート）となってもよい。
【０１４７】
医薬組成物
本発明の医薬組成物は、治療有効量の薬剤を含んでいてもよい。
【０１４８】
本発明の医薬組成物は、治療有効量のＢｉＰを含んでいてもよい。
【０１４９】
本発明の医薬組成物は、治療有効量の薬剤及びＢｉＰを含んでいてもよい。
【０１５０】
医薬組成物は、ヒト医学においてヒトに投与するためのものでもよいし、獣医学において動物に投与するためのものでもよく、通常、薬学的に許容される希釈剤、担体、又は賦形剤のどれか１つ以上を含んでいる。治療用の使用において許容される担体又は希釈剤は薬学分野でよく知られており、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)に記載されている。薬学的担体、賦形剤、又は希釈剤は、意図する投与経路及び標準的薬学実務に関連して選択することができる。医薬組成物は、担体、賦形剤、又は希釈剤として、あるいはそれらに加えて、好適な結合剤、潤滑剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤を含んでもよい。
【０１５１】
医薬組成物中に、保存剤、安定剤、色素、及び着香料を加えてもよい。保存剤の例として、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びｐ−ヒドロキシ安息香酸を挙げることができる。抗酸化剤及び懸濁剤を使用してもよい。
【０１５２】
送達系の違いに従って、組成物・製剤の必要量が異なってもよい。例として、本発明の医薬組成物は、ミニポンプを用いた投与用に処方してもよいし、あるいは、経粘膜経路での投与用に処方（例えば吸入用の鼻腔スプレー若しくはエアゾールとして、又は摂取可能な溶液として）してもよいし、あるいは、例えば静脈内、筋肉内、又は皮下経路によって送達用される非経口経路での投与用に注入可能な形態で処方してもよい。また、多くの経路によって投与できるように処方設計してもよい。
【０１５３】
薬剤が胃腸粘膜を介した経粘膜的に投与される場合、薬剤は胃腸管通過時に安定性を保てる方がよい。例えば、タンパク質分解に対する抵抗性、酸性ｐＨに対する安定性、及び胆汁の浄化効果（detergent effect）に対する抵抗性を有する方がよい。
【０１５４】
医薬組成物の投与は適宜、吸入による投与、坐剤若しくはペッサリーの形態での投与、ローション、溶液、クリーム、軟膏、若しくは散布粉剤の形態での局所投与、皮膚パッチを使用した投与、澱粉やラクトースなどの賦形剤を含有する錠剤の形態での経口投与、又はカプセル剤若しくはオビュール剤（ovules）を単独若しくは賦形剤と混合しての投与、又は矯味剤若しくは着色料を含有する溶液、懸濁液、若しくはエリキシル剤の形態での投与でもよいし、医薬組成物を静脈内、筋肉内、又は皮下などにに注射して非経口的に投与することもできる。非経口投与のためには、組成物を無菌水溶液の形態で使用することが最良であると考えられ、他の物質（例えば血液と等張な溶液にするために十分な塩又は単糖類）を含有してもよい。口腔投与又は舌下投与のためには、組成物は、従来からの方法で処方され得る錠剤又はトローチ剤の形態で投与されてもよい。
【０１５５】
薬剤をシクロデキストリンと組み合わせて使用してもよい。シクロデキストリンは薬物分子と包接体及び非包接体（non-inclusion complexes）を形成することが知られている。薬物−シクロデキストリン複合体を形成させることで、薬物分子の溶解性、溶解速度、生物学的利用能、及び／又は安定性を変えることができる。薬物−シクロデキストリン複合体は一般的に、ほとんどの剤形及び投与経路に有用である。薬物と直接複合体を形成させる代わりに、シクロデキストリンを例えば担体、希釈剤、又は可溶化剤のような補助添加物として使用してもよい。アルファ−、ベータ−、及びガンマ−シクロデキストリンが最も一般的に使用されており、国際公開第９１／１１１７２号、国際公開第９４／０２５１８号、及び国際公開第９８／５５１４８号に好適な例が記載されている。
【０１５６】
薬剤がタンパク質の場合、治療対象内でその場で（in situ in the subject being treated）タンパク質を調製してもよい。この点で、以下に記載するように上記タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、非ウイルス性の技術（non-viral techniques）（例えばリポソームの使用）及び／又はウイルス性の技術（viral techniques）（例えばレトロウイルスベクターの使用）を用いて、上記ヌクレオチド配列から上記タンパク質が発現されるように送達してもよい。
【０１５７】
投与
本明細書において、「投与」という用語は、ウイルス性の技術による送達又は非ウイルス性の技術による送達を含む。
【０１５８】
非ウイルス性の技術として特に制限されないが、トランスフェクション、脂質を仲介させるトランスフェクション、リポソーム、免疫リポソーム、リポフェクチン、カチオン性の面状両親媒性物質（cationic facial amphiphiles）（ＣＦＡｓ）、及びその組合せを挙げることができる。
【０１５９】
細胞への核酸の物理的注入は最も単純な遺伝子送達系を表している（Vile & Hart (1994) Ann. Oncol, suppl. 5, 59）。したがって、ヌクレオチド配列を含むベクターは、直接「裸の核酸コンストラクト（naked nucleic acid construct）」として投与されてもよい。また、該ベクターは宿主細胞ゲノムに相同なフランキング配列を更に含んでもよい。注入後、核酸は細胞に取り込まれて核に移動し、そこでエピソームの位置から一時的に発現されるか、又は宿主ゲノムへの組込みが起これば、安定に発現されてもよい。ＢｉＰをコードする遺伝子をプロモーター制御下に置いてもよい。物理的介入（例えば超音波を集束させる（focused ultrasound））によってトランスフェクションの効率を増大させてもよい。ＤＮＡでコーティングした金粒子を遺伝子銃で注入することで、インビボにおける細胞のトランスフェクション効率を上げてもよい（Fyan et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 11478）。
【０１６０】
リポソームは、核酸などの様々な物質を封入することができるリン脂質二重層膜から構成される小胞である。脂質と核酸を混ぜると、インビボ及びインビトロで細胞に形質移入することができる複合体（リポプレックス）が形成される。脂質を介する遺伝子送達では、様々な異なる細胞に形質移入することができ、特定の受容体との相互作用の必要がなく、複数回投与しやすいように脂質成分の免疫原生を最小化する必要もなく、大きなＤＮＡ配列を送達する能力を有する高性能ベクターも必要なく、生産しやすい必要もない。脂質膜へのポリエチレングリコール誘導体の挿入又はペグ化によって、投与後のリポソームの循環半減期が増大する。脂質膜の組成を変えることで、リポソームの薬物動態、生体分布、及び融合性（fusogenicity）を変えることができる。詳細には、特定のカチオン性脂質、例えばＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、及びＤＯＴＡＰをコレステロールやＤＯＰＥなどの中性脂質又はヘルパー脂質（neutral or helper co-lipids）と共にリポソーム中に組み込むことで、細胞膜との融合能及び内容物の細胞内への送達能を高めることができる。
【０１６１】
多くの非脂質性ポリカチオン性ポリマーが、細胞内への送達を促進する複合体を核酸と形成する（Li and Huang (2000) Gene Ther. 7, 31）。好ましくは非脂質性ポリカチオン性ポリマーには、限定されるものではないが、ポリＬリジン、ポリエチレンイミン、ポリグルコサミン、及びペプトイドが含まれる。ポリエチレンイミンは、複合体を形成した核酸をエンドソーム内での分解から保護することができ、また、エンドソーム画分からの核酸の放出及びその後の核への移動を促進する技術を提供する（Boussif et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7297）。ペグ化ポリエチレンイミンポリマーは、血清タンパク質との相互作用を減少させて循環半減期を伸ばすことができ、また、大きな毒性を示すことなく遺伝子を細胞へ送達することができる。
【０１６２】
生物学的治療分子を放出するように遺伝子改変された細胞、例えば自己細胞、同種細胞、及び異種細胞を移植してもよい。細胞を完全に包んで宿主免疫系の攻撃から保護する選択透過膜で、移植された細胞が覆われていてもよい。このカプセル化方法は、同種及び異種のどちらのソースからでも、初代細胞又は初代株化細胞の神経移植を可能にする。様々な種類のカプセル化技術が当該技術分野で知られている。マイクロカプセル化は、小分子クラスターを薄い球状の半透過膜（通常は高分子電解質からなる）内に捕捉することを可能にする。
【０１６３】
ウイルスは、ヒト細胞に入って自身の遺伝子を発現させる特異的且つ効率的な手段を進化させてきており、ウイルスによる送達機構は、遺伝子送達用の魅力的な運搬体である。好ましくはウイルスの複製及び病原性に必要とされる配列が除かれるようにウイルスゲノムは改変されている。より好ましくは、ウイルスのコーディング配列はＢｉＰなどの外来遺伝子で置換されている。
【０１６４】
ウイルス性の送達機構としては特に制限されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルプスウイルス、ポックスウイルス、レンチウイルスベクター、バキュロウイルス、レオウイルス、ニューカッスル病ウイルス、アルファウイルス、及び水疱性口内炎ウイルスベクターを挙げることができる。
【０１６５】
レトロウイルスは１本鎖の二量体ＲＮＡウイルスであり、ｅｎｖ遺伝子にコードされる結合性の表面外被タンパク質によって細胞に入る。細胞に入った後、ｐｏｌ遺伝子にコードされる逆転写酵素がウイルスゲノムを２本鎖ＤＮＡコピーに転写し、この２本鎖ＤＮＡコピーは、分裂細胞の核に入ることができ、宿主ゲノム中にランダムに組み込まれ得る。好ましくは、ウイルス性の送達に使用されるレトロウイルスは、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子が除去されることで複製能が欠損されている。したがって、パッケージング配列を欠くプラスミドからレトロウイルスのｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子を発現するパッケージング細胞株において、感染性ではあるが複製欠損性であるレトロウイルス粒子が産生される。
【０１６６】
レトロウイルスのサブタイプであるレンチウイルスをレトロウイルスの代わりとしてもよい。ＨＩＶ、サル免疫不全ウイルス、及びネコ免疫不全ウイルスなどのレンチウイルスは、非分裂細胞に感染することができ、他のレトロウイルスと同じように組み込まれる。複製能を欠損させ、多段階弱毒化した（multiply attenuated）レンチウイルスベクターは、齧歯類及び霊長類の両方のＣＮＳ中において、様々な導入遺伝子を長期発現することが示されている（Bensadoun et al. (2000) Exp. Neurol. 164, 15-24、Kordower et al. (2000) Exp. Neurol. 160, 1-16）。レンチウイルスベクターは注入部位から２〜３ｍｍ拡散し、多数のニューロンを遺伝子導入することができ、少なくとも１年は遺伝子発現が維持される。
【０１６７】
その他のウイルスとしてアデノウイルスがあり、これには２本鎖ＤＮＡを有するウイルスが含まれる。６つの群（Ａ〜Ｆ）の４０を超えるアデノウイルス血清型が同定されている。Ｃ群のウイルス（血清型Ａｄ２及びＡｄ５）が、遺伝子送達用の候補として最も広く評価されている（Zhang (1999) Cancer Gene Ther. 6, 11）。アデノウイルスは、コクサッキーウイルスとアデノウイルスとの受容体に結合することで細胞に入る。この受容体はウイルスのアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列と細胞インテグリンの相互作用を助ける。内部移行後、ウイルスは細胞のエンドソームを逃れて、一部は解離して、核に移行して、そこでウイルス遺伝子発現が始まる。アデノウイルスは複製できないことが好ましい。これは、初期アデノウイルス遺伝子Ｅ１〜Ｅ４などのアデノウイルス遺伝子を１又は複数除去することで達成され得る。これはアデノウイルスゲノムの全コーディング配列の除去まで拡張してもよい。そのようなウイルスをＢｉＰ遺伝子のパッケージングに使用してもよいが、ＢｉＰ遺伝子を含む感染性で複製不能なアデノウイルスのパッケージングを容易にするために必要なウイルス遺伝子機能を全て供給するヘルパーウイルス存在下において、産生細胞株中で成長させなけれなばならない。
【０１６８】
アデノ随伴ウイルスは、疾患を引き起こすことが知られていない天然のヒトウイルスである１本鎖ＤＮＡウイルスである。アデノ随伴ウイルスはヘパラン硫酸との結合を介して細胞に入るが、複製には、いわゆるヘルパーウイルス（例えばアデノウイルス又はヘルペスウイルス）との共感染が必要である。アデノ随伴ウイルスベクターは多くの潜在的利点を有する。アデノ随伴ウイルスは、非分裂細胞に感染し、宿主ゲノム中に安定に組み込まれ、維持される。組み込みは第１９番染色体中の部位特異的場所に選択的に起こり、挿入による突然変異誘発のリスクが低くなる。しかし、アデノ随伴ウイルスベクターでは特徴的この組込みは失われている。なぜなら、複製能をもつアデノ随伴ウイルスが生じるリスクを減らすために、ｒｅｐタンパク質が除去されているためである。
【０１６９】
単純ヘルペスウイルスは、７０以上のウイルスタンパク質をコードする約１５０ｋｂｐの直鎖状２本鎖ＤＮＡゲノムを有する大きなウイルスである。このウイルスは、ウイルス性糖タンパク質を細胞表面のヘパラン硫酸残基に結合させることで細胞内へ入る。単純ヘルペスウイルスは、前初期遺伝子ＩＣＰＤ、ＩＣＰ４、１０Ｐ２２、及びＩＣＰ２７などの少数の遺伝子を不活化させることで複製能が欠損されていることが好ましい。単純ヘルペスウイルスの大多数の遺伝子はウイルス性ベクターの作製に影響することなく取り除けるので、複数の遺伝子及びその調節因子を含む大きな核酸配列を単純ヘルペスウイルスベクター中にパッケージングすることができる。
【０１７０】
ポックスウイルスは２本鎖ＤＮＡウイルスであり、ワクシニア、及びカナリア痘ウイルス（すなわちＡＬＶＡＣ）が含まれる。好ましくは、ポックスウイルスはＢｉＰ遺伝子を含む組換えポックスウイルスである。
【０１７１】
成分は単独で投与されてもよいが、一般的には医薬組成物として投与される（例えば成分が、意図する投与経路及び標準的な薬学的実務に関連して選択される好適な薬学的賦形剤、希釈剤、又は担体と混合されるとき）。
【０１７２】
例えば、成分は錠剤、カプセル剤、オビュール剤、エリクシル剤、液剤、又は懸濁液の形態で投与することができ、即効性、遅延放出性、放出調節性、徐放性、パルス放出性、又は制御放出性の適用のために矯味剤又は着色料を含んでもよい。
【０１７３】
医薬品が錠剤であれば、錠剤は、微結晶性セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、及びグリシンなどの賦形剤；デンプン（好ましくはコーン、ポテト、又はタピオカのデンプン）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、及び特定の複合ケイ酸塩などの崩壊剤；並びにポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチン、及びアカシアなどの造粒結合剤（granulation binders）を含有してもよい。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、グリセリルベヘネート、及びタルクなどの潤滑剤を含有してもよい。
【０１７４】
ゼラチンカプセル錠において、同様な種類の固形組成物を賦形剤として用いてもよい。この点で好ましい賦形剤には、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖又は高分子量ポリエチレングリコールが含まれる。水性の懸濁液及び／又はエリクシル剤では、薬剤を、様々な甘味料又は矯味剤、着色料又は色素；並びに乳化及び／又は懸濁剤；並びに水、エタノール、プロピレングリコール、及びグリセリンなどの希釈剤；並びにこれらの組合せと組み合わせてもよい。
【０１７５】
投与（送達）経路としては特に制限されないが、１又は複数の経口（例えば錠剤、カプセル剤、又は摂取可能な溶液として）、局所、粘膜（例えば吸引用の鼻腔スプレー又はエアゾールとして）、鼻、非経口（例えば注入できる形態）、胃腸、脊髄内、腹腔内、筋肉内、静脈内、子宮内、眼内、皮内、頭頭内、気管内、膣内、脳質内、大脳内、皮下、眼（硝子体内、又は前房内を含む）、経皮、直腸、頬側、膣、硬膜外、舌下を挙げることができる。
【０１７６】
用量
通常、個々の対象に最も適した実際の投与量は医師が決定する。特定の患者に対する具体的な用量及び投与の頻度は変更されてもよいし、様々な要素に左右される。そのような要素には、具体的な使用される化合物の活性、その化合物の代謝安定性及び活性時間、年齢、体重、全体的な健康状態、性別、食生活、投与の方法及び時間、排出速度、薬の組合せ、特定の状態の重症度、並びに個人個人が現在受けている個々の治療が含まれる。この量は日常的な実験によって決定することができ、十分に医師の判断の範囲である。一般的に、有効な投与量は０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは０．０５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。
【０１７７】
製剤
成分は、当該分野で公知の技術を用いて、例えば１又は複数の好適な担体、希釈剤、又は賦形剤と混合することで、医薬組成物に製剤してもよい。
【０１７８】
断片／変異体／相同体／誘導体
本発明はＢｉＰの断片、変異体、相同体、及び誘導体の使用を包含する。
【０１７９】
「変異体」という用語は、野生型配列とは異なる天然のポリペプチド又はヌクレオチド配列を指す。
【０１８０】
「断片」という用語は、ポリペプチド配列又はヌクレオチド配列が野生又は複数つ以上含んでもよいし、小さな部分を複数含んでもよい。配列はその他の配列要素を含んでもよく、例えば他のタンパク質との融合タンパク質であってもよい。好ましくは、配列は野生型配列の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％を含む。
【０１８１】
「相同体」という用語は、対象のアミノ酸配列及び対象のヌクレオチド配列とある程度の相同性を有する物体を意味する。ここで、「相同性（homology）」という用語は「同一性（identity）」と等しく扱うことができる。
【０１８２】
本発明において、相同配列は、対象配列と同一性が少なくとも７５％、８５％、又は９０％、好ましくは同一性が少なくとも９５％、９６％、９７％、又は９８％であるアミノ酸配列を含むように選ばれる。通常、相同体は対象アミノ酸配列と同じ活性部位等を含む。相同性は類似性（similarity）（すなわち、類似の化学的特性・機能を有するアミノ酸残基）の観点からも考慮することができるが、本発明においては相同性を配列同一性の観点から表すことが好ましい。
【０１８３】
本発明において、相同配列は、対象配列と同一性が少なくとも７５％、８５％、又は９０％、好ましくは同一性が少なくとも９５％、９６％、９７％、又は９８％であるヌクレオチド配列を含むように選ばれる。相同体は通常、活性部位等をコードする、対象配列と同じ配列を含む。相同性は類似性（すなわち、類似の化学的特性・機能を有するアミノ酸残基）の観点からも考慮することができるが、本発明においては相同性を配列同一性の観点から表すことが好ましい。
【０１８４】
相同性の比較は肉眼で行うこともできるが、より一般的には、簡便に利用できる配列比較プログラムを利用して行う。そのような市販のコンピュータープログラムは２つ以上の配列間の％相同性（% homology）を計算できる。
【０１８５】
％相同性は隣接する配列に対して計算してもよい。すなわち、１つの配列を他の配列と並べ、１つの配列中の各アミノ酸を直接、他方の配列中の対応するアミノ酸と１残基ずつ比較する。これは「ギャップなし」アラインメントと呼ばれる。通常、このようなギャップなしアラインメントは、比較的少ない残基数に対してだけ行われる。
【０１８６】
これは非常に単純で一貫性のある方法ではあるが、例えば１つの挿入又は欠失がある以外は同一である一組の配列で、その１つの挿入又は欠失によって、続くアミノ酸残基がアラインメントから外れて全体のアラインメントを行ったときに％相同性が大きく減少する可能性が考慮されていない。そこで、ほとんどの配列比較法は、挿入及び欠失の可能性を考慮した、全体の相同性スコアに過度のペナルティを課さない最適なアラインメントを作成するように設計されている。これは局所的な相同性を最大にするように配列アラインメント中に「ギャップ」を挿入することで達成されている。
【０１８７】
しかし、更に複雑な方法では、同一アミノ酸数が同じであれば、できるだけギャップが少ないアラインメントが（２つの比較配列間の高い相関性を反映して）ギャップの多いアラインメントよりも高いスコアを得るように、アラインメント中に生じた各ギャップに対して「ギャップペナルティ」が課される。ギャップの存在に比較的高いペナルティを課し、ギャップに続く各残基にそれより低いペナルティを課す「アフィンギャップコスト」が通常用いられる。これは最も一般的に使用されているギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティは当然、よりギャップの少ない最適化されたアラインメントを作成する。ほとんどのアラインメントプログラムでは、ギャップペナルティを変更することができる。しかし、このような配列比較用のソフトウェアを使用するときは、デフォルトの値を用いることが好ましい。例えばＧＣＧウィスコンシン・ベストフィット・パッケージを使用するときは、アミノ酸配列のデフォルトのギャップペナルティは、ギャップに対しては−１２であり、各延長部に対しては−４である。
【０１８８】
したがって、最大の％相同性の計算には、ギャップペナルティを考慮した最適なアラインメントの作成が第１に必要である。そのようなアラインメントを行うための好適なコンピュータープログラムはＧＣＧウィスコンシン・ベストフィット・パッケージ(University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387)である。配列比較を行うことができるその他のソフトウェアとしては特に制限されないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ausubel et al., 1999 ibid - Chapter 18参照）、ＦＡＳＴＡ（Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410）、及びＧＥＮＥＷＯＲＫＳの比較ツール一式を挙げることができる。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡは両方ともオフライン及びオンラインでの検索が可能である（Ausubel et al., 1999 ibid, pages 7-58 to 7-60参照）。しかし、いくつかの適用では、ＧＣＧベストフィットプログラムの使用が好ましい。BLAST 2 Sequenceと呼ばれる新しいツールもタンパク質及びヌクレオチド配列の比較に利用可能である（FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8参照）。
【０１８９】
最終的な％相同性は同一性の点から計測することができるが、通常、アラインメントプロセス自体はオール・オア・ナッシングなペア比較に基づいてなされるわけではない。その代わり、一定の尺度の類似性スコア行列が一般的に用いられ、化学的類似性及び進化距離に基づいて、各ペアワイズ比較にスコアを付ける。一般的に用いられているそのような行列の例としてＢＬＯＳＵＭ６２行列（ＢＬＡＳＴプログラムセットのデフォルトの行列）がある。ＧＣＧウィスコンシン・プログラムは一般的に共通のデフォルト値を用いるか、又は、供給されれば、カスタマイズしたシンボル比較表を用いる（より詳細にはユーザーマニュアルを参照）。いくつかの適用にはＧＣＧパッケージの共通デフォルト値を、あるいは他のソフトウェアの場合では、ＢＬＯＳＵＭ６２のようなデフォルトの行列を用いることが好ましい。
【０１９０】
ソフトウェアが最適なアラインメントを作成したら、％相同性、好ましくは％配列同一性を計算することができる。ソフトウェアは通常これを配列比較の一部として行い、結果の数値を与える。
【０１９１】
配列には、サイレント変異を起こして機能的に同等な物質を生じる、アミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換があってもよい。物質の二次結合活性（secondary binding activity）が維持される限りで、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性といった性質の類似性に基づいて計画的にアミノ酸を置換してもよい。例えば、負の電荷をもつアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正の電荷をもつアミノ酸にはリジン及びアルギニンが含まれ、親水性値の似た、非荷電性の極性頭部基をもつアミノ酸にはロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、及びチロシンが含まれる。
【０１９２】
保存的な置換は、例えば下の表に従って行うことができる。２列目の同じブロックにあるアミノ酸、好ましくは３列目の同じ行にあるアミノ酸をお互いに置換してもよい。
【０１９３】
【表１】
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【０１９４】
本発明はまた、相同な置換（本明細書で使用されている置換及び交換は、どちらも現在存在するアミノ酸と代わりのアミノ酸との交換を意味する）、すなわち同等な置換（塩基性と塩基性、酸性と酸性、極性と極性などのような置換）が起こり得ることも包含している。非相同な置換、すなわち、ある種類の残基から別の種類への置換が起こってもよく、あるいはオルニチン（以下、Ｚと呼ぶ）、ジアミノ酪酸オルニチン（以下、Ｂと呼ぶ）、ノルロイシンオルニチン（以下、Ｏと呼ぶ）、ピリイルアラニン（pyriylalanine）、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、及びフェニルグリシンなどの非天然アミノ酸を含むことになってもよい。
【０１９５】
以下を含む非天然アミノ酸によって置換してもよい：アルファ＊及びアルファ二置換＊アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸＊、乳酸＊、天然アミノ酸のハロゲン誘導体（例えばトリフルオロチロシン＊、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｂｒ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｉ−フェニルアラニン＊）、Ｌ−アリルグリシン＊、β−アラニン＊、Ｌ−α−アミノ酪酸＊、Ｌ−γ−アミノ酪酸＊、Ｌ−α−アミノイソ酪酸＊、Ｌ−ε−アミノカプロン酸＃、７−アミノへプタン酸＊、Ｌ−メチオニンスルホン＃＊、Ｌ−ノルロイシン＊、Ｌ−ノルバリン＊、ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン＊、Ｌ−ヒドロキシプロリン＃、Ｌ−チオプロリン＊、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）のメチル誘導体（例えば４−メチル−Ｐｈｅ＊、ペンタメチル−Ｐｈｅ＊）、Ｌ−Ｐｈｅ（４−アミノ）＃、Ｌ−Ｔｙｒ（メチル）＊、Ｌ−Ｐｈｅ（４−イソプロピル）＊、Ｌ−Ｔｉｃ（１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸）＊、Ｌ−ジアミノプロピオン酸＃、及びＬ−Ｐｈｅ（４−ベンジル）＊。上記で議論した（相同又は非相同置換に関する）目的のために、誘導体の疎水性を示すのに＊の表記を使用し、一方、誘導体の親水性を示すのには＃を、両親媒性を示すのに＃＊を使用した。
【０１９６】
変異体アミノ酸配列は、配列中の２アミノ酸残基の間に挿入された好適なスペーサー基を含んでもよく、これにはグリシン残基やβアラニン残基などのアミノ酸スペーサーに加えて、メチル基、エチル基、又はプロピル基などのアルキル基が含まれる。１つ以上のアミノ酸残基がペプトイド型で存在する更なる変異体が当業者に十分理解される。誤解を避けるため、「ペプトイド型」とはα炭素置換基が、α炭素上ではなく残基の窒素原子上にある変異体アミノ酸残基を指す。ペプトイド型のペプチドの調製方法は当業者に知られている。例えばSimon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371及びHorwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134。
【０１９７】
本発明で使用するヌクレオチド配列は、その中に合成ヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドへの多くの異なる種類の修飾が当業者に知られている。これらには、メチルホスホン酸及びホスホロチオエートの骨格並びに／又は分子の３’末端及び／若しくは５’末端へのアクリジン若しくはポリリジン鎖の付加が含まれる。本発明の目的のために、当該分野で利用可能な、どのような方法でヌクレオチド配列を修飾してもよいことが理解される。そのような修飾は、本発明に有用なヌクレオチド配列のインビボにおける活性又は寿命を高めるために行ってもよい。
【０１９８】
好ましくは、断片は機能的断片である。ここで、「機能的断片」という用語は、全長ＢｉＰタンパク質の活性の少なくとも一部を発揮することができるＢｉＰ断片を指す。特に、機能的断片は以下の機能の少なくとも１つを有していてよい：ＣＤ１４＋細胞にＩＬ−１０を放出させる；増殖及びＩＬ−１０の放出をするようにＣＤ８＋細胞を刺激する；リコール抗原反応を阻害する；単球において、遊走阻止因子（ＭＩＦ）、可溶性ＴＮＦ受容体II、及びＴＩＭＰｓを含む一連の抗炎症性遺伝子の発現を活性化する；破骨細胞成熟を阻害する；骨吸収を阻害する。
【０１９９】
好ましくは、機能的断片は、少なくとも２０アミノ酸、より好ましくは少なくとも５０アミノ酸、最も好ましくは少なくとも１００アミノ酸の長さを有する。特に好ましい断片は、多くの天然ＢｉＰタンパク質に相同であることが分かっている保存領域を含む。そのような保存領域は特定の機能を有していると考えられる。
【０２００】
本明細書で使用される「機能的相同体」という用語は、全長ＢｉＰタンパク質の活性の少なくとも一部を保持している相同体を指す。特に機能的相同体が以下の機能の少なくとも１つを有していることが好ましい：ＣＤ１４＋細胞にＩＬ−１０を放出させる；増殖及びＩＬ−１０の放出をするようにＣＤ８＋細胞を刺激する；リコール抗原反応を阻害する；単球において、遊走阻止因子（ＭＩＦ）、可溶性ＴＮＦ受容体II、及びＴＩＭＰｓを含む一連の抗炎症性遺伝子の発現を活性化する；破骨細胞成熟を阻害する；骨吸収を阻害する。
【０２０１】
遺伝子治療
さらに、本発明はＢｉＰをコードするヌクレオチド配列をインビボで調節することを特徴とする遺伝子治療に関する。例えば、コーディングヌクレオチド配列、又はＢｉＰのコーディングヌクレオチド配列に関連する調節領域、又はその対応するＲＮＡ転写産物に結合する薬剤を投与して、転写速度又は翻訳速度を調節（好ましくは促進）することで、発現を調節することができる。
【０２０２】
例として、ＢｉＰをコードするヌクレオチド配列を、プロモーター又はプロモーター／エンハンサーなどの、相同又は非相同な発現調節因子の調節下においてもよい。エンハンサー及び／又はプロモーターは、ＢｉＰをコードするヌクレオチド配列が選択的に（preferentially）発現されるように、特定の組織において活性となってもよい。調節発現を付与するエンハンサー因子又はその他の因子は複数コピー存在してもよい。同様に、又はそれに加え、エンハンサ−及び／又はプロモーターは、１又は複数の細胞型中、例えば骨の１又は複数の細胞型（例えば破骨細胞）中において、選択的に活性をもってもよい。
【０２０３】
コーディングヌクレオチド配列の発現レベルは、プロモーター領域を操作することによって調節してもよい。例えば、プロモータ領域内の異なるドメインは異なる遺伝子調節活性を有していてもよい。これらの異なる領域の役割は、通常、特定の領域が欠失した異なるプロモーター変異体を有するベクターコンストラクトを用いて評価される（すなわち、欠失解析）。
【０２０４】
一般的な組換えＤＮＡ方法論的技術（GENERAL RECOMBINANT DNA METHODOLOGY TECHNIQUES）
本発明は、他に示していない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の従来技術を使用し、これらは通常の当業者の能力の範囲内である。このようは技術は文献に説明されている。例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press、Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.)、B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons、M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press、及びD. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNAMethods in Enzymology, Academic Pressを参照。これらの一般的テキストの各々を本明細書に参照により援用する。
【０２０５】
さらなる応用
好ましくは本発明は、破骨細胞発達及び／又は破骨細胞機能の予防又は阻害に応用される。
【０２０６】
本発明を実施例を用いてさらに記載するが、これらは当業者が本発明を実施する際の助けとなることを意図しており、本発明の範囲を何ら制限するものではない。
［実施例］
【実施例１】
【０２０７】
ＢｉＰ刺激は単球における抗炎症性遺伝子の活性化を誘導する。
【０２０８】
イントロダクション
ＢｉＰ、すなわちグルコース制御性タンパク質７８（ｇｒｐ７８）は、タンパク質の正確なフォールディングを担う機能のある小胞体（ＥＲ）シャペロンである。グルコース飢餓、低酸素、又は活性酸素種によってＥＲの機能が妨害され、折り畳まれていないタンパク質が蓄積されると、ＢｉＰのアップレギュレーションが誘導される。これらは炎症関節においてよく見られ、関節リウマチ（ＲＡ）の発症に影響する因子でもある。
【０２０９】
本発明者らは、プロテオミクスを用いて、ＲＡにおける自己抗原としてＢｉＰを単離及び同定した。続いて、ＲＡ患者の滑液（ＳＦ）から単離した単核球（ＭＣ）が組換えヒト（ｒｈｕ）ＢｉＰ存在下で増殖することを示した。これはＲＡ末梢血（ＰＢ）ＭＣ並びにＯＩＪＤから単離したＰＢＭＣ及びＳＦＭＣとは対照的であった。これらの細胞はＩＦＮγをほとんど又は全く産生しなかった。ＢｉＰで刺激したＰＢＭＣからの上清をサイトカイン分析したところ、ＩＬ−１０が高濃度で存在すること、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、及びＩＬ−１βがほとんど存在しないこと、並びにＩＬ−２又はＩＬ−１５が全く存在しないことが示された。
【０２１０】
ＲＡのモデル動物においては、ＢｉＰで事前に免疫しておくと、マウスでコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）の発症が予防されることが示されている。ＢｉＰの静脈内投与又は皮下投与はマウスのＣＩＡの初期段階に対しても治療効果があった。
【０２１１】
ＢｉＰの作用機序を更に調べるためにインビトロ試験を行い、ｒｈｕＢｉＰで刺激した精製単球のサイトカインプロフィールを２つの異なる遺伝子アレイ技術を用いて分析した。
【０２１２】
方法
免疫磁気ビーズを用いたネガティブアイソレーション（negative isolation）によって単球を精製した。ＢｉＰ（２０μｇ／ｍｌ）で２４時間刺激した又は刺激しなかったこれらの細胞からトータルＲＮＡを単離した。次いで、ＲＮＡをアフィメトリクス遺伝子アレイ（Ｕ９５  バージョン２）又はＲ＆Ｄサイトカイン遺伝子アレイ、にメーカーの説明書に従い用いた。１つの対象由来のサンプル２連（duplicate）をアフィメトリクスアレイに用い、２つの正常コントロール対象由来サンプル２連をＲ＆Ｄ遺伝子アレイに用いた。
【０２１３】
結果
結果を表１及び図６に示す。
【０２１４】
結論
ＢｉＰは、炎症反応中に単球において活性化される多くの遺伝子のダウンレギュレショーンを誘導した。これらの遺伝子には、抗原提示、接着及び細胞遊走、細胞シグナル伝達、並びに破骨細胞分化に関するものが含まれる。Ｒ＆Ｄサイトカイン遺伝子活性化アレイを用いて得られた結果とアフィメトリクスアレイを用いて得られた結果は一致していた。
【０２１５】
全体として、単球における遺伝子活性化の変化は、抗炎症特性を誘導した。
【０２１６】
要約
ＢｉＰは、受容体様分子を介してヒトの単球に結合することが示され、この受容体様分子は、ＨＳＰ６０又は７０及びｇｒｐ９４が利用しているものとは異なるようである。単球のＢｉＰ活性化の結果を調べるために２種類の遺伝子アレイを用いた。
【０２１７】
３７５個のサイトカイン／ケモカイン及びその受容体の限定的な遺伝子アレイを、正常な２個体からの単球（刺激なし、又はＢｉＰ刺激２４時間）に対して行った。続いて、アフィメトリクス遺伝子アレイを１つのサンプルについて２連で行い、Genespringソフトウェアを用いて解析した。
【０２１８】
アフィメトリクスアレイの結果、ＢｉＰによって９００個の遺伝子が影響を受け、その＞７５％がダウンレギュレートされることが示された。３つのアレイ全ての結果は、ＩＬ−１受容体アンタゴニストが増加している一方でＩＬ−１ベータが減少していることを示していた。ＨＬＡ−ＤＡ、ＣＤ４０、及びＣＤ８６、並びにｃ−ｆｏｓ、ＩＫＫアルファ、及び接着分子ＣＤ５４、アルファｖベータ３、ＣＤ１８、及びＣＤ１１ｃは全てダウンレギュレートされていた。ケモカインＧＲＯアルファ、ベータ、及びガンマ、並びにＩＬ−６、ＭＣＰ−１、及びＲＡＮＴＥＳが増加している一方、複数のケモカイン受容体がそれに伴いダウンレギュレートされていた（ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、及びＣＸＣＲ４）。
【０２１９】
ヒト単球をＢｉＰで刺激した後の遺伝子活性化の変化は、抗原提示、細胞遊走、及び炎症性サイトカイン産生に影響を与える。
【実施例２】
【０２２０】
ヒト及びマウスの系における、サイトカイン誘発破骨細胞形成のインビトロモデルにおけるＢｉＰによる阻害の確認及び最適化
全てのインビトロ実験はヒト細胞及びマウス細胞を用いて行った。単核球を単離するために、ヒト細胞を末梢血から密度遠心（Corrigall VM, Solau-Gervais E, Panayi GS. Lack of CD80 expression by fibroblast-like synoviocytes leading to anergy in T lymphocytes. Arthritis Rheum 2000; 43(7):1606-1615）で分離する。マウス細胞は、以前に記載の通りに（Li X, Udagawa N, Takami M, Sato N, Kobayashi Y, Takahashi N. p38 Mitogen-activated protein kinase is crucially involved in osteoclast differentiation but not in cytokine production, phagocytosis, or dendritic cell differentiation of bone marrow macrophages. Endocrinology 2003; 144(11):4999-5005）、５〜８週齢成獣マウスの大腿骨及び脛骨から単離した。ＴＲＡＰ陽性の細胞数（マウス）、又はビトロネクチン受容体（ＶｎＲ）及び／若しくはＦアクチンリングの発現陽性の細胞数（ヒト）によって、両方の系における破骨細胞分化を評価した。象牙質切片上で細胞を培養した後の吸収窩形成を定量することで、両方の系における吸収機能を評価する。実験条件の下、４〜５日後（マウス）又は１０〜１２日後（ヒト）に破骨細胞培養を回収し、マウス破骨細胞及びヒト破骨細胞に対してそれぞれ７日後及び１４日後に吸収アッセイを行う。
【０２２１】
Ｍ−ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）中で一晩培養後、ＰＢＭＣ（ヒト）又はＢＭＭ（マウス）を調製する。破骨細胞を作製するために、引き続き、Ｍ−ＣＳＦ依存性の非接着細胞を、Ｍ−ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）及びＲＡＮＫＬ（１０ｎｇ／ｍｌ）と共に、ＢｉＰ連続存在下（０．０２〜２０μｇ／ｍｌ）及び非存在下で培養した。破骨細胞分化の異なる段階に対するＢｉＰの効果を決定するために、前駆体分化の初期又は多核細胞形成後にＢｉＰを添加するパルス実験も行う。適当な時間に培養物を固定し、ＴＲＡＰ活性を組織学的に染色するか（マウス）、又は２３Ｃ６抗体及びＴＲＩＴＣファロイジンを用いた免疫学的局在決定法によってそれぞれＶｎＲ及びＦアクチンリングを染色し（ヒト）、破骨細胞数を定量する。象牙質切片から破骨細胞を除去し、トルイジンブルーで染色した後、吸収を定量する。リアルタイムＰＣＲを用いた分子技術でカルシトニン受容体及びカテプシンＫなどの破骨細胞特異的マーカー遺伝子の発現を測定することで、（特にマウス細胞での）破骨細胞の分化データを更に確認する。
【０２２２】
ＢｉＰはＰＢＭＣにおけるＩＬ−１０産生を刺激し（Corrigall VM, Bodman-Smith MD, Brunst M, Cornell H, Panayi GS. The stress protein, BiP, stimulates human peripheral blood mononuclear cells to express an anti-inflammatory cytokine profile and to inhibit antigen presenting cell function: relevance to the treatment of inflammatory arthritis. Arthritis Rheum 2004; 50:1167-1171）、ＩＬ−１０は破骨細胞の分化を阻害する（Hong MH, Williams H, Jin CH, Pike JW. The inhibitory effect of interleukin-10 on mouse osteoclast formation involves novel tyrosine-phosphorylated proteins. J Bone Miner Res 2000; 15(5):911-918）ことから、培養２４時間後に、マウス及びヒト破骨細胞前駆体によるＩＬ−１０産生について、ＥＬＩＳＡによるタンパク質レベルでの測定、又はリアルタイムＰＣＲによるｍＲＮＡレベルでの測定を行う。中和抗ＩＬ−１０又は抗ＩＬ−１０受容体モノクローナル抗体を用いた追加実験によって、ＢｉＰで見られる阻害効果がＩＬ−１０単独によるものか、他の因子によるものかを評価する。破骨細胞の数がアポトーシスにより減少している可能性も考慮し、ＢｉＰ処理した細胞のアポトーシスについて、ＤＡＰＩ染色を用いた形態学的検査、及びＴＵＮＥＬアッセイを用いた生化学的検査を行う。
【実施例３】
【０２２３】
破骨細胞形成及び骨吸収に関わる主要な細胞シグナル伝達経路へのＢｉＰの干渉
これは、細胞表面から転写因子（例えば、ＲＡＮＫ及びｃ−Ｆｍｓ、ＴＲＡＦｓ、ｃ−Ｆｏｓ、ＮＦＡＴｃ１、ＭＡＰＫ［ｐ３８、ｊｕｎ、及びＥＲＫ１／２］、ＩＫＫ及びＮＦ−κβ、並びにＡｋｔ）までの間の分子のリン酸化及び活性化を阻害することで直接調べるか、又はＩＬ−１０などの抑制性サイトカインの放出によって間接的に調べる。
【０２２４】
全てのインビトロ実験は、ヒト細胞及びマウス細胞を用いて行った。単核球を分離するために、ヒト細胞を末梢血から密度遠心で分離する（Corrigall VM, Solau-Gervais E, Panayi GS. Lack of CD80 expression by fibroblast-like synoviocytes leading to anergy in T lymphocytes. Arthritis Rheum 2000; 43(7):1606-1615）。マウス細胞は、以前に記載の通りに（Li X, Udagawa N, Takami M, Sato N, Kobayashi Y, Takahashi N. p38 Mitogen-activated protein kinase is crucially involved in osteoclast differentiation but not in cytokine production, phagocytosis, or dendritic cell differentiation of bone marrow macrophages. Endocrinology 2003; 144(11):4999-5005）、５〜８週齢成獣マウスの大腿骨及び脛骨から単離する。ＴＲＡＰ陽性の細胞数（マウス）、又はビトロネクチン受容体（ＶｎＲ）及び／若しくはＦアクチンリングの発現陽性の細胞数（ヒト）によって、両方の系における破骨細胞分化を評価した。象牙質切片上で細胞を培養した後に吸収窩形成を定量することで、両方の系における吸収機能を評価する。実験条件の下、４〜５日後（マウス）又は１０〜１２日後（ヒト）に破骨細胞培養物を回収し、マウス破骨細胞及びヒト破骨細胞に対してそれぞれ７日後及び１４日後に吸収アッセイを行う。
【０２２５】
ＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫ及びＭ−ＣＳＦ／ｃ−Ｆｍｓ結合の下流の細胞シグナル伝達カスケードにおける中心的な複数のタンパク質の発現を調べる。これらには、例えばＲＡＮＫ及びｃ−Ｆｍｓ、ＴＲＡＦ６、ｃ−Ｆｏｓ及びＮＦＡＴｃ１、ＭＡＰＫ、ＩＫＫ及びＮＦ−κＢ、並びにＡｋｔが含まれる。最近、破骨細胞形成にこれらが特に重要であることが示され、従って、これらはＢｉＰによる阻害効果の根底にある機構を解析するための開始点を提供する。特定のどのような理論にも限定されるものではないが、ＢｉＰはその阻害効果を、破骨細胞前駆体及び成熟破骨細胞の両方に発揮し得ることが予想される。そこで、Ｍ−ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬ存在下でＢＭＭ及びＰＢＭＣ培養物を調製し、ＢｉＰを最も効果的な濃度（実施例２で決定される）で、培養の初めの２４〜７２時間（すなわち破骨細胞前駆体）、又は多核破骨細胞がはっきりと現れている培養の終わりの方２４〜７２時間に添加する。適当な時間に培養物を回収し、ｃ−Ｆｍｓ、ＲＡＮＫ、ｃ−Ｆｏｓ、ＮＦＡＴｃ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＫ、及びＡｋｔ等のシグナル伝達分子／転写因子の発現を定量的リアルタイムＰＣＲ及びウェスタンブロッティングにより分析するために、ＲＮＡ又はタンパク質抽出物を調製した。ある場合には、ＢｉＰに５〜６０分曝したのち、ＭＡＰＫファミリーメンバーに対する効果を見るために、ｐＥＲＫ１／２、ｐｐ３８、及びｐＪＮＫに対するリン酸化特異的抗体（phospho-specific antibodies）を用いる。リアルタイムＰＣＲには適当なポジティブコントロール及びネガティブコントロールを用い、全ての遺伝子に対して特異的プライマー及び蛍光プローブを設計して用いる。ウェスタンブロッティング用のタンパク質ライセートを、以前の記述の通り（Corrigall VM, Arastu M, Khan S, Shah C, Fife M, Smeets T et al. Functional IL-2 receptor beta (CD122) and gamma (CD132) chains are expressed by fibroblast-like synoviocytes: activation by IL-2 stimulates monocyte chemoattractant protein-1 production. J Immunol 2001; 166(6):4141-4147、Sunters A, Thomas DP, Yeudall WA, Grigoriadis AE. Accelerated cell cycle progression in osteoblasts overexpressing the c-fos proto-oncogene: induction of cyclin A and enhanced CDK2 activity. J Biol Chem 2004; 279(11):9882-9891）プロテアーゼインヒビターを用いて調製する。ポリアクリルアミドゲルに等量をロードできるようにタンパク質含量を測定し、サンプルを変性条件下で電気泳動する。タンパク質をニトロセルロース上にブロットし、特異的１次抗体及び２次抗体で探索し、増強した化学発光によって可視化する。全ての抗体はChemicon社, Santa Cruz社及びSigma社から入手可能である。
【０２２６】
これらの実験は、破骨細胞の分化及び活性化に重要な役割を果たしていることが示されている主要シグナル伝達経路のどれがＢｉＰによって調節されているのかを決定するために利用できる。さらにこれらの実験は、ＢｉＰの作用機序が、前駆体細胞分化の調節と成熟破骨細胞の活性化とで異なるのかを明らかにすると考えられる。
【実施例４】
【０２２７】
破骨細胞分化を促進するように設計されたモデル動物を用いた、破骨細胞形成及び骨吸収に対するインビボにおけるＢｉＰ治療の有効性
卵巣摘出ＣＤ１マウスは自発的に破骨細胞を過剰産生し、骨粗しょう症様疾患を発症する。これを、疾患の異なる段階でＢｉＰで治療する。
【０２２８】
ヒトの疾患モデルを用いて、インビボにおけるＢｉＰの作用機序を決定する。ＲＡ炎症細胞のモデル動物を用いた骨量減少の実験では、Ｔリンパ球、並びにＲＡＮＫＬを発現でき、骨吸収を誘導できる活性化骨芽細胞等（Rifas L, Arackal S, Weitzmann MN. Inflammatory T cells rapidly induce differentiation of human bone marrow stromal cells into mature osteoblasts. J Cell Biochem 2003; 88(4):650-659、Takayanagi H, Iizuka H, Juji T, Nakagawa T, Yamamoto A, Miyazaki T et al. Involvement of receptor activator of nuclear factor kappaB ligand/osteoclast differentiation factor in osteoclastogenesis from synoviocytes in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 2000; 43(2):259-269）、並びに破骨細胞形成を促進するＴＮＦα及びＩＬ−１βなどのサイトカインの産生（Zwerina J, Hayer S, Tohidast-Akrad M, Bergmeister H, Redlich K, Feige U et al. Single and combined inhibition of tumor necrosis factor, interleukin-1, and RANKL pathways in tumor necrosis factor-induced arthritis: effects on synovial inflammation, bone erosion, and cartilage destruction. Arthritis Rheum 2004; 50(1):277-290）により、実験が複雑になることがある。さらに、Ｔ細胞サイトカインであるＩＬ−１７（Lubberts E, van den BL, Oppers-Walgreen B, Schwarzenberger P, Coenen-de Roo CJ, Kolls JK et al. IL-17 promotes bone erosion in murine collagen-induced arthritis through loss of the receptor activator of NF-kappa B ligand/osteoprotegerin balance. J Immunol 2003; 170(5):2655-2662）はこの活性を高めることがある。ＣＩＡの予防及び治療に関する最初のＢｉＰ実験のマウス材料は、破骨細胞の有無について詳細に調べる。ＴＲＡＰ用の切片を染色して各群の破骨細胞／切片の数を評価するか、又は当業者に公知の通常に技術により同定される破骨細胞マーカー遺伝子（例えばカテプシンＫ又はＭＭＰ−９）のインサイチュ・ハイブリダイゼーションにより破骨細胞を評価する。これにより、免疫細胞とサイトカインがＲＡに対するのと同様な役割を果たしている、抗原誘発関節炎モデルにおける、破骨細胞の発達に関するデータが得られる。
【０２２９】
炎症反応に依存しない、破骨細胞活性化及び骨量減少の非依存性モデルとして、骨破壊及び破骨細胞成熟を促進するモデル（卵巣摘出マウス（Libouban H, Moreau MF, Basle MF, Bataille R, Chappard D. Increased bone remodeling due to ovariectomy dramatically increases tumoral growth in the 5T2 multiple myeloma mouse model. Bone 2003; 33(3):283-292））を用いる。最初の例では、疾患誘導前にＢｉＰを単回投与することで、誘導１ヶ月後の測定において症状が予防されるという、ＢｉＰによるＣＩＡの予防プロトコール（Corrigall VM, Bodman-Smith MD, Fife MS, Canas B, Myers LK, Wooley P et al. The human endoplasmic reticulum molecular chaperone BiP is an autoantigen for rheumatoid arthritis and prevents the induction of experimental arthritis. J Immunol 2001; 166(3):1492-1498）を用いる。したがって、卵巣摘出（ｏｖｘ）モデルにＢｉＰを３つの時点で静脈内投与し、マウス６匹ずつの群に分ける。すなわち、エストロゲン枯渇（oestrogen withdrawal）後の破骨細胞による骨吸収の誘導をＢｉＰが予防することができるかを決定するために、ｏｖｘの１週間前、ｏｖｘと同時、又はｏｖｘ後１週間間隔で投与する。マウスを屠殺し、ｏｖｘ後１週間ごとに最大６週間までの骨を調べる。偽のコントロールのほかに、無関係なタンパク質（例えばヒト血清アルブミン）又は媒体で処理したコントロールマウス群を並行して用いる。マイクロＣＴ及び組織学的分析によって、骨ミネラル密度及び骨吸収を評価及び定量し、ＴＲＡＰ染色を用いて破骨細胞数を決定する。これらの実験は、卵巣摘出誘発性骨量減少の予防におけるＢｉＰの役割を更に調査するために行う。
【０２３０】
要約
ＢｉＰは、破骨細胞活性化が見られるリウマチ性疾患の新規な生物学的治療法である。ヒト及びマウスのインビトロ破骨細胞形成系における破骨細胞形成をＢｉＰが阻害するという考えを支持するインビボ及びインビトロ実験の証拠が提供されている。
【０２３１】
【表２】
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【０２３２】
末梢血単球を単離し、これを２４時間ＢｉＰ（２０ｍｇ／ｍｌ）で刺激する（ＭＯ＋ＢｉＰ）か又は刺激せずにおいた（ＭＯ）。サイトカイン遺伝子アレイのオートラジオグラフをデンシトメトリーを用いて分析し、最大を１００％とする発現百分率を与えるように標準化を行った、あるいは遺伝子活性は検出されなかった（ＮＤ）。示しされている結果は、ＢｉＰで刺激した単球については２つの対象からのものであり、刺激なしの単球については１つの対象からのものである。両方のサンプルをコントロール細胞と比較したときの、ＢｉＰで刺激されたサイトカインｍＲＮＡのアップレギュレーション又はダウンレギュレーションとして結果を示す。
【０２３３】
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(33) Libouban H, Moreau MF, Basle MF, Bataille R, Chappard D. Increased bone remodeling due to ovariectomy dramatically increases tumoral growth in the 5T2 multiple myeloma mouse model. Bone 2003; 33(3):283-292.
【０２３４】
上記明細書中に記載した全ての出版物を参照により本願明細書に援用する。本発明の記載の方法及び手順の様々な変更及びバリエーションは当業者にとって明らかであり、本発明の範囲及び趣旨から逸脱するものではない。特定の好ましい実施形態との関連で本発明を記載しているが、特許保護を求める発明はそのような特定の実施形態に過度に限定されるものではないと理解される。実際、生化学及び分子生物学、又は関連する分野の当業者にとって明らかな、本発明を実施するための記載されている方法の様々な変更が、以下の特許請求の範囲に含まれると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０２３５】
【図１】末梢血単球へのＢｉＰ．ＦＩＴＣの結合。ヒト血清アルブミン．ＦＩＴＣ（CLOSED）又はＢｉＰ．ＦＩＴＣ（OPEN）を用いてヒト単球を４℃で２０分染色し、フローサイトメトリーを用いて蛍光を測定した。FACscanヒストグラムはCellquestソフトウェアを用いて作製した。
【図２】マウス頭蓋冠モデルにおいてＢｉＰは骨吸収を阻害する。ＢｉＰ（１〜１０００ｎｇ／ｍｌ）を、ＲＡＮＫＬと５日間インキュベートしたマウス頭蓋冠に添加した。骨吸収はカルシウムの放出によって決定した。
【図３】Ｍ−ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬと共に添加したときの、破骨細胞分化に対するＢｉＰの効果。ヒト単球を、ＢｉＰ（０．０２〜２０μｇ／ｍｌ）及びＭ−ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬと共に１４日間培養した後、ＴＲＩＴＣ−ファロイジンを用いてＦアクチンリング陽性細胞を検出し、Ｍ−ＣＳＦ＋ＲＡＮＫＬのみでのコントロール培養と比較した。象牙質切片上の吸収窩をトルイジンブルーで染色して骨吸収を測定した。＊Ｐ＜０．０３。
【図４】成熟破骨細胞へのＢｉＰの添加。１０日目に、ヒト成熟破骨細胞にＢｉＰ（２〜５０μｇ／ｍｌ）を添加した。１４日目に、ＴＲＩＴＣ−ファロイジンを用いて、Ｆアクチンリングに陽性の細胞を測定した。
【図５】アフィメトリクス遺伝子アレイにより測定された、ＢｉＰによって誘導される遺伝子活性の倍数的減少。免疫磁気ビーズ法によるネガティブセレクション（negative immunomagnetic selection）及びＢｉＰ（２０μｇ／ｍｌ）存在下又は非存在下で２４時間培養することで調製した精製ヒト単球を用いて、２連の（duplicate）アフィメトリクス遺伝子アレイチップを分析した。ＢｉＰ処置細胞と休止細胞（resting cells）の間の遺伝子発現の差から、遺伝子発現の倍数的差が計算された。全てのデータ分析はGeneSpringソフトウェアにより行った。
【図６】アフィメトリクス遺伝子アレイ分析。精製した単球をＢｉＰで刺激するか又は刺激せずに、遺伝子活性をサンプル２連で測定及び比較した。Ｒ＆Ｄサイトカイン遺伝子アレイにおいても同様にアップレギュレーション又はダウンレギュレーションされていると記録された遺伝子（＊）、あるいはフローサイトメトリー及び/又はタンパク質産生によって検証された遺伝子（＿）に印を付けた。−２０倍の低下はＢｉＰ処置した単球において遺伝子活性がないことを模式的に示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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