(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖類、パパイヤおよび海藻を、乳酸菌と酵母とで共棲発酵してなる発酵エキスのメタノール抽出物を有効成分とする、血管新生阻害剤。
【請求項２】
前記メタノール抽出物がメラノイジンを含有することを特徴とする、請求項１記載の血管新生阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラノイジンを有効成分とする血管新生阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は、黄体形成、排卵、胚発生、胎盤形成や創傷治癒などの通常の生理条件下において観察される現象であるが、成長期を過ぎると体内で血管新生が起こる場面は悪性腫瘍細胞その他に限定される。
【０００３】
血管新生の機序としては、悪性腫瘍で説明すれば次のように考えられている。まず、悪性腫瘍細胞から血管内皮細胞増殖因子(Vascular Endothelial Growth Factor、以下、単にＶＥＧＦと称する。)が産生され、これが内皮細胞細胞膜上のＶＥＧＦ受容体に結合する。この結合により細胞が刺激されてタンパク質分解酵素の一種であるマトリックスメタロプロテアーゼ(以下、ＭＭＰと称する)が放出される。ＭＭＰは血管の基底膜及び細胞外マトリックスを分解、破壊し血管透過性を亢進させ、これにより血管内皮細胞が遊走し、増殖し、細胞外マトリックスへ接着する。この接着により血管内皮細胞が分化して血管腔を形成し、新しい直鎖状の血管を生成する。新生血管の周囲は、平滑筋細胞や血管壁細胞により支持され、安定した血管となる。
【０００４】
血管新生が病因になり又は病態の悪化に関与している疾患としては、上記した悪性腫瘍のほかに糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、炎症性皮膚疾患、関節炎リウマチ、変形性関節症、粥状動脈硬化症、心筋梗塞等の閉塞性疾患等などがある。
【０００５】
血管新生が悪性腫瘍などの様々の疾病の発症や進行に関与しているため、これらの治療と予防を目的として種々の血管新生阻害剤が開発されている。たとえば、メリッサ葉抽出物と、イチョウ抽出物またはチクロピジンのいずれかとを含む血管新生阻害用組成物がある(特許文献１）。メリッサ葉抽出物は、乾燥メリッサ葉を水性アルコールで抽出および濃縮したものである。メリッサ葉抽出物は、ＭＭＰのタンパク分解活性の阻害活性を有し、これによって血管新生を抑止しうるという。
【０００６】
また、アスペルギルス属から生産されたＲＫＢ−３３８４ＨＳ−Ａと称される特定構造の化合物からなる血管新生阻害剤もある（特許文献２）。実施例では、ＲＫＢ−３３８４ＨＳ−Ａが、１〜３０μｇ／ｍｌの濃度でＶＥＧＦによって誘導されるＨＵＶＥＣ細胞の走化性を抑制し、これによって血管新生が阻害されている。
【０００７】
また、ストレプトミセス属に属する放線菌の培養液から単離したＲＱＮ−１８６９０Ａと称される化合物からなる血管新生阻害剤もある（特許文献３）。実施例では、ＲＱＮ−１８６９０Ａが、０．０８μｇ／ｍｌの濃度でＶＥＧＦによって誘導されるＨＵＶＥＣ細胞の走化性を５０％抑制している。
【０００８】
さらに、霊芝（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ｌｕｃｉｄｕｍ）から得られる特定構造のガノデリン酸Ｆを有効成分とする血管新生阻害剤（特許文献４）や担子菌類の子から抽出した無水グルタミン酸を有効成分とする血管新生阻害剤もある（特許文献５）。実施例では、マウスの右腹部皮下に酸性線維芽細胞増殖因子（以下、ａＦＧＦ）を添加したマトリゲル  マトリックスにａＦＧＦと上記成分を配合したものを移植し、所定期間後のマトリゲル重量とマトリゲル中のヘモグロビン量を測定している。これらの化合物は、マトリゲルの重量およびヘモグロビン量の増加が少ないことで、血管新生抑制効果を示している。
【０００９】
一方、微生物の中で人間や動物、作物や自然環境に対して無害で有益な働きを持つ微生物は有用微生物と称され、光合成細菌、乳酸菌、酵母、放線菌、糸状菌、担子菌、枯草菌などが知られている。光合成細菌は、光をエネルギー源として抗酸化物質、アミノ酸、糖類、各種生理活性物質を生成し、乳酸菌が生成する乳酸や酢酸は、抗菌力が強いため有害菌の増殖を抑制することができる。また、酵母は、糖をアルコールに変えるほか他の有用菌の活性を増進させることができる。更に、放線菌は、抗菌物質を生成し、糸状菌は、繊維質など難分解性の炭水化物を分解し、糖化させることができる。このような有用微生物を利用した発酵は、酒、味噌、醤油、その他の発酵食品の生産に必須の工程である。
【００１０】
このような発酵食品の一つである醤油や味噌などには、還元糖とアミノ化合物とのメイラード反応生成物であるメラノイジンと総称される化合物が含有されることが知られている。生成経路は十分に解明されていないが、糖類から生成したＤ−グルコシドがエナミノールを経由してアマドリ化合物になり、オソンやフルフラール類などを中間体としアミノ化合物と縮重合反応して生成する、と考えられている。還元糖やアミノ化合物の種類によって異なる生成物ができるため、メラノイジンは種々の物質の集合体である。
【００１１】
メラノイジンには、抗酸化活性があることが知られている。抗酸化物質は、有毒な活性酸素や各種フリーラジカルを消去できるため、味噌仕込み混合物にプロテアーゼを添加して抗酸化力に優れるメラノイジンの含有量を増加させ、高抗酸化活性に優れる味噌を製造するという技術が開発されている（特許文献６）。
【００１２】
また、メラノイジンをインターロイキン−１２産生促進剤と使用する技術もある（特許文献７）。インターロイキン−１２はアレルギー反応抑制効果が高いため、メラノイジンによるインターロイキン−１２産生促進により、アレルギー反応を効果的に抑制しうるという。実施例では、Ｄ−グルコースとε−アミノ−Ｎ−カプロン酸とを蒸留水中で９５℃、４時間還流してメラノイジンを得ている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特許第４１７３７３３号公報
【特許文献２】特許第３９１３５４２号公報
【特許文献３】特許第４４５２７８７号公報
【特許文献４】特許第４５０６０７９号公報
【特許文献５】特許第４６８１８０１号公報
【特許文献６】特開２００６−３３３７７６号公報
【特許文献７】特開２００５−２２５８３３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
前記したように悪性腫瘍や糖尿病性網膜症などは、その進行に伴い血管が新生され、血管新生が病態悪化の一因となっている。したがって、血管新生を阻害しうる薬剤は、このような疾患の治療剤として使用されるのみならず予防剤としても有効である。また、血管新生阻害剤が使用される疾患は、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、炎症性皮膚疾患、関節炎リウマチ、変形性関節症、粥状動脈硬化症、心筋梗塞等の閉塞性疾患等など長期に亘る慢性疾患が多い。上記特許文献１記載の血管新生抑制剤はイチョウ葉抽出物を使用するものであるが、イチョウ葉は食品ではない。また、特許文献２〜４に記載される化合物もそれ自体が食品ではない。よって、血管新生によって疾患が悪化する悪性腫瘍や糖尿病性網膜症などの予防にも使用しうる、食品由来の新規な血管新生阻害剤の開発が望まれる。
【００１５】
一方、メラノイジンは、還元糖とアミノ化合物とのメイラード反応物であり、味噌や醤油などの発酵工程でも産生される発酵産物である。上記特許文献６に示すように発酵産物から得たメラノイジンに抗酸化作用が期待され、特許文献７に示すように糖質とアミノ酸との加熱で生成したメラノイジンにインターロイキン−１２産生促進作用が期待されている。しかしながら、メラノイジンによる血管新生抑制効果については全く知られていない。
【００１６】
上記現状に鑑み、本発明は食品を原料として生成されるメラノイジンを有効成分とする血管新生阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、メラノイジンの効果について詳細に検討したところ、酵母と乳酸菌との共棲発酵産物から抽出されるメラノイジンに血管新生阻害作用があることを見出し、本発明を完成させた。乳酸菌と酵母との共棲発酵により、加熱することなく、褐色のメラノイジンが産生されることは知られておらず、このようなメラノイジンが優れた血管新生阻害作用も全く知られていない。
【００１８】
すなわち本発明は、メラノイジンを有効成分とする、血管新生阻害剤を提供するものである。
【００１９】
また本発明は、前記メラノイジンが、乳酸菌と酵母とを共棲発酵してなる発酵エキスからの抽出物であることを特徴とする、上記血管新生阻害剤を提供するものである。
【００２０】
また本発明は、前記メラノイジンが、多糖類と、野菜・果物と、海藻とを、前記共棲発酵したものであることを特徴とする、上記血管新生阻害剤を提供するものである。
【００２１】
また本発明は、前記野菜・果物が、パパイヤである、上記血管新生阻害剤を提供するものである。
【００２２】
また本発明は、前記多糖類が、米、米糠および／または玄米であることを特徴とする、上記血管新生阻害剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、メラノイジンを有効成分とする血管新生阻害剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】製造例２で製造した発酵エキスのスチレン系合成吸着剤吸着物のメタノール溶出画分のゲルろ過ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す図である。
【図２】製造例２で得た褐色物質のＵＶスペクトルを示す図である。
【図３】製造例１で得たメラノイジンのＵＶスペクトルを示す図である。
【図４】実施例１において、培地のみを培養後したウェルについて、管腔を染色した後の撮像画像を示す図である。
【図５】実施例１において、スラミンを添加して培養後したウェルについて、管腔を染色した後の撮像画像を示す図である。
【図６】実施例１において、発酵エキス１％希釈液を添加して培養後したウェルについて、管腔を染色した後の撮像画像を示す図である。
【図７】実施例１において、発酵エキス１０％希釈液を添加して培養後したウェルについて、管腔を染色した後の撮像画像を示す図である。
【図８】実施例１において、製造例２で得たメラノイジンを添加して培養後したウェルについて、管腔を染色した後の撮像画像を示す図である。
【図９】実施例１において、本発明のメラノイジンの血管新生阻害効果を説明する図である。（Ａ）は、管腔の面積を、（Ｂ）は管腔の長さを評価した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、メラノイジンを有効成分とする、血管新生阻害剤である。メラノイジンは、糖質とアミノ化合物との反応産物の総称であるから、糖質やアミノ化合物の種類が異なればメラノイジンも異なる。また、発酵は、有用微生物の作用によって有機化合物を加工する工程であるから、使用する微生物が異なれば、更にさまざまなメラノイジンが生産される。本発明によれば、少なくとも乳酸菌と酵母との共棲発酵によって生成されるメラノイジンは、血管新生阻害作用を有する。
【００２６】
本発明で使用するメラノイジンは、乳酸菌と酵母とを共棲発酵してなる発酵エキスからの抽出物である。少なくとも乳酸菌と酵母とを使用することで、メラノイジンを生成することができる。乳酸菌は、糖質から乳酸を生成するが、発酵液中に生成した乳酸によって培養液に含まれるタンパク質がペプチドやアミノ酸に分解される。また、アミラーゼ活性を有する乳酸菌は、米や玄米に含まれるアミラーゼを単糖に分解することができる。また、酵母は嫌気性条件下で糖類からアルコールと二酸化炭素を生成するが、タンパク分解酵素を含む酵母は培養液中のタンパク質をペプチドやアミノ酸に分解することができ、酵母が体内で摂取した糖から、ビタミンやアミノ酸などを生産することができる。なお、本発明は、少なくとも乳酸と酵母とを使用すればよく、更に、本発明の効果を損なわない範囲で麹菌、枯草菌、糸状菌、光合成細菌などが発酵系に含有されるものであってもよい。原料に付着する全ての細菌を除去することは困難である。
【００２７】
本発明において、「共棲発酵」とは、乳酸菌と酵母とを共棲培養して行う発酵であり、また、「発酵エキス」とは、共棲発酵の発酵液から微生物および原料残渣を除去したものである。
【００２８】
乳酸菌や酵母の共棲培養の栄養原は、多糖類と、野菜・果物と、海藻である。前記多糖類としては、米、米糠、玄米、酒粕、蒸留粕、麦糠、ビール粕、米粉、麦粉、澱粉、イモ類などの天然原料由来の多糖類が好ましい。より好ましくは、米、米糠、玄米、酒粕、米粉であり、特に好ましくは、米、米糠および／または玄米である。玄米や米糠には、アミラーゼを含む胚芽が含まれるため、澱粉のアミロースやアミロペクチンをグルコース、マルトース、オリゴ糖に変換することができ、多糖類を原料として円滑に乳酸菌と酵母による共棲発酵を行うことができる。
【００２９】
野菜・果物の種類は特に問わないが、ミネラルや酵素を多く含むものを好適に使用することができる。糖類、タンパク質とを含むものが好ましい。たとえば、パパイヤ、パイナップル、リンゴ、オレンジ、バナナ、ダイコン、ニンジン、キャベツ、キノコなどを好適に使用することができる。好ましくは、パパイヤである。パパイヤは、パパインなどのタンパク分解酵素を多く含み、培養液中のタンパク質をペプチドやアミノ酸に分解することができ、積極的なメラノイジン形成に関与する。パパイヤは、可食しうればよく完熟に限定されず未成熟の青パパイヤであってもよい。青パパイヤの酵素量は完熟パパイヤよりも含有量が多く、特に好ましい。
【００３０】
海藻としては特に限定はなく、昆布、ヒジキ、モズク、若布などの褐藻類、アサクサノリ、テングサなどの紅藻類、アオサ、アオノリ、カサノリ、サボテングサ、フサイワヅタ、ミルなどの緑藻類などを好適に使用することができ、より好ましくは褐藻類である。特には、昆布、ヒジキ、モズクなどが好ましい。これら海藻には、ミネラルや多糖類のほかアミノ酸が含まれる。
【００３１】
本発明で使用する乳酸菌や酵母は、共棲発酵によって最終的に発酵エキス中にメラノイジンを生産できればよい。乳酸菌としては、ラクトバシラス属、ビフィドバクテリウム属、エンテロコッカス属、ラクトコッカス属、ペディオコッカス属、リューコノストック属、ストレプトコッカス属などがあり、使用する原料に応じて適宜選択することができる。本発明では、米、米糠、玄米、酒粕、蒸留粕、麦糠、ビール粕、米粉、麦粉、澱粉などの天然原料由来の多糖類を使用するため、糖類を資化できる乳酸菌を使用することが好ましい。このような、糖類を資化できる乳酸菌としては、ラクトバシラス属、ストレプトコッカス属、リューコノストック属などの乳酸菌がある。
ラクトバシラス属の乳酸菌としては、ラクトバシラス  カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバシラス  プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバシラス  ラクティス（Lactobacillus lactis）、ラクトバシラス  アミロフィルス（Lactobacillus amylophilus）、ラクトバシラス  サシドフィルス（Lactobacillu sacidophilus）、ラクトバシラス  ブルガリクス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバシラス  サンフランシスコ（Lactobacillus sanfrancisco）、ラクトバシラス  フェルメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバシラス  ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバシラス  ラムノズス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバシラス  パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）などがある。
またストレプトコッカス属の乳酸菌としては、ストレプトコッカス  ファエカリス（Streptococcus faecalis）、ストレプトコッカス  ファエシウム（Streptococcus faecium）などがある。
またリューコノストック属の乳酸菌としては、リューコノストック  マエセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）、リューコノストック  ラクティス（Leuconostoc lactis）などがある。
【００３２】
酵母としては、サッカロマイセス属、カンジダ属、トルロプシス属、ジゴサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、デバリオマイセス属、ゲオトリクム属、ウィッケルハミア属、フェロマイセス属などがある。本発明では、出芽酵母であるサッカロマイセス属、や分裂酵母であるシゾサッカロマイセス属、カンジダ属などを好適に使用することができる。好ましくは、サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である。
【００３３】
乳酸菌と酵母とを使用して共棲発酵するには、乳酸菌と酵母との共棲培養液に上記した原料の全てを一度に仕込んでもく、各原料の発酵段階を均一に調整するため、それぞれの原料を別個に乳酸菌や酵母の培養液に仕込んで予備発酵し、その後に混合して共棲発酵させてもよい。乳酸菌や酵母の種類、これらの栄養源とする多糖類や野菜・果物、海藻などの種類に応じて適宜選択することができる。
【００３４】
本発明で使用する乳酸菌や酵母は、予め予備培養したものを使用する。乳酸菌の予備培養液中の濃度は、１０５〜１０１０個／ｍＬであり、酵母の予備培養液中の濃度は、１０５〜１０１０個／ｍＬである。なお、原料（湿重量）の仕込み量は、予備培養液の０．０１〜１００ｗ／ｖ％、より好ましくは０．１〜３０ｗ／ｖ％である。多糖類１００質量部に対する野菜・果物の配合割合は、１〜１００質量部、より好ましくは３〜５０質量部である。また、多糖類１００質量部に対する海藻の配合割合は、０．１〜５０質量部、より好ましくは１〜３０質量部である。
【００３５】
多糖類として玄米と米糠とを使用し、野菜・果物としてパパイヤを、海藻として昆布とモズクを使用して発酵エキスを調製する方法を説明する。まず、蒸した玄米を乳酸菌と酵母との共棲培養液に仕込む。使用する乳酸菌として、多糖類を資化しうる乳酸菌を使用する。これにより、玄米に含まれる多糖類をスクロースやグルコースなどに分解することができる。乳酸菌により多糖類が分解され、かつ乳酸が産生される。酵母は、耐酸性に優れるため、乳酸酸性の発酵液の中でも増殖し、アミノ酸などを産生することができる。
上記玄米とは別個に、乳酸菌と酵母との共棲培養液にパパイヤと、海藻とをそれぞれ別個に仕込んで予備発酵させたものとを調製しておく。パパイヤは、タンパク分解酵素その他を多く含むため、これら酵素によって発酵液中に含まれる成分が更に分解される。各発酵液内の分解の程度が略均一になったらこれらを混合して共棲発酵させる。
【００３６】
発酵は、使用する微生物の種類や原料の種類、原料の仕込み量などによって適宜選択することができ、一般には、５〜１００週間、より好ましくは１０〜５０週間、特に好ましくは２０〜４０週間である。上記は、発酵の開始から終了までの時間である。また、発酵温度は２０〜４０℃である。発酵の進行に伴い、乳酸菌の培養液や酵母の培養液を追加してもよい。
【００３７】
なお、酵母と乳酸菌とは、ともに嫌気的条件下でも好気的条件下でも生育することができ、酸素の有無で生産物も異なる。たとえば、酵母は、嫌気的条件下で糖を原料としてアルコールを生産するが、乳酸菌は、好気的条件下で乳酸の産生が進行する。本発明では、発酵の前半では乳酸菌の活性を高めることが好ましく、発酵の後半では他の微生物の活性を高めるように制御することが好ましい。発酵の前半を好気的条件に制御することで乳酸菌の産生する乳酸によって混入する雑菌を滅菌しうるからである。このような制御は、ｐＨ、溶存酸素量、温度を制御して行うことができる。これにより、乳酸菌と酵母とにより、長期間に亘る共棲発酵を行うことができる。
【００３８】
発酵の終了は、発酵液が褐色に変色することで知ることができる。なお、発酵終了後に、発酵液を酸素を供給しない条件で２〜１００週間熟成させてもよい。
【００３９】
上記方法は、多糖類、野菜・果物、および海藻とをそれぞれ別個に乳酸菌と酵母との共棲培養液で予備発酵する方法で例示したが、多糖類、野菜・果物、および海藻の全量を乳酸菌と酵母との予備発酵液に仕込んで共棲培養してもよく、多糖類を乳酸菌と酵母との共棲培養液で予備発酵し、野菜・果物と海藻とを乳酸菌の培養液で予備発酵し、これら予備発酵液を混合して共棲発酵してもよい。メラノイジンは、原料が微生物によって還元糖とアミノ化合物とに分解された後に共棲する微生物によって生成されると考えられる。したがって、発酵の全工程が共棲発酵である必要はない。なお、発酵工程で、仕込み水を添加し、必要に応じて菌液を追加してもよい。
【００４０】
発酵またはその後の熟成後、ろ過、遠心などにより乳酸菌、酵母その他の微生物を除去して発酵エキスとする。ｐＨは一般に４〜８．５である。
【００４１】
発酵エキスをイオン交換樹脂、あるいは合成吸着樹脂等で処理して、発酵産物であるメラノイジンを分離、回収することができる。イオン交換樹脂や合成吸着樹脂等によって、発酵エキスに含まれる有機酸等を除去し、褐色のメラノイジンを得ることができる。使用するイオン交換樹脂としては、イオン交換基がスルフォン酸基、リン酸基、カルボキシメチル基、ジエチルアミノ基、及び４級アミノエチル基等が使用可能であり、陽イオン交換樹脂でも陰イオン交換樹脂でも共に使用が可能である。また、合成吸着樹脂（三菱化学株式会社製のダイヤイオン、セパビーズなど）を利用することで、メラノイジンを得ることもできる。
【００４２】
本発明で使用するメラノイジンは、分子量５００〜３０００である。このメラノイジンは、後記する実施例に示すように、血管新生阻害作用を有することが判明した。
【００４３】
本発明のメラノイジンを有効成分とする血管新生阻害剤の投与経路としては、経口、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、動脈内、経皮、直腸、経鼻、眼球および局所投与などで投与することができる。疾患の種類や疾患の進行状況に応じて好適な投与経路を選択することができる。なお、投与量は、投与経路によって相違し、経口投与の場合は、１〜１００ｍｇ／日であり、一日に複数回に分割して摂取することができる。
【００４４】
本発明の血管新生阻害剤は、いかなる形態に調製してもよい。たとえば、注射用調製物（真性溶液、懸濁液、または乳濁液）や局所用調製物（軟膏、パッチ、スプレー、溶液など）、経口用量形態（錠剤、カプセル、軟カプセル、水溶性医薬、丸薬、顆粒剤）などに調製することができる。
【００４５】
本発明の血管新生阻害剤は、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、炎症性皮膚疾患、関節炎リウマチ、変形性関節症、粥状動脈硬化症、心筋梗塞等の閉塞性疾患等など長期に亘る慢性疾患の予防剤として使用することができる。
【実施例】
【００４６】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。
【００４７】
（製造例１）
グルコース２モル、グリシン２モル、炭酸水素ナトリウム０．２モル濃度の溶液をｐＨ６．８に調整した。９５℃で７ｈ還流を行いメラノイジンを合成した。反応液を冷却した後、透析膜（Ｖｉｓｋａｓｅ製、商品名「ＵＣ３６−３２−１００」）にて１週間透析を行った。内液を凍結乾燥し、乳鉢で粉砕して粉末状にした。この粉末状物の水溶液について、日本分光製Ｖ−５７０を使用してＵＶスペクトルを測定した。結果を図３に示す。ＵＶスペクトルは、特定の場所に吸収ピークが見られず、波長３００ｎｍから７００ｎｍにむかって吸収がなだらかに減少するものであった。
【００４８】
（製造例２）
乳酸菌として、ラクトバシラス  カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバシラス  プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバシラス  ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）を使用し、酵母としてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを使用した。これを米糠からなる培養液で予備発酵させた液を種菌発酵液とした。乳酸菌と酵母とを含む種菌発酵液に蒸し玄米を仕込み、乳酸菌の産生が促進される条件で一次発酵させた。同様にして乳酸菌と酵母とを含む種菌発酵液にパパイヤと海藻（昆布とモズク）とをそれぞれ別個に仕込み、玄米と同様に一次発酵させた。なお、仕込み原料は、蒸し玄米１００質量部に対し、パパイヤ２５質量部と海藻８質量部とし、全発酵液中の仕込み原料の比率は１．５質量％とした。その後、各共棲発酵液を混合した。溶存酸素量を調整して乳酸菌以外の菌の活性が促進する条件で発酵を継続した。なお、発酵工程では、必要に応じて純水や種菌発酵液を追加した。原料の分解が進み発酵液が褐色かつ澄明になったところを発酵の終点とした。一次発酵の開始から発酵の終了まで６ヶ月間を要した。ついで、発酵終了から６ヶ月間熟成した。熟成後の発酵液から直径０．４５μｍのフィルターを使用して菌体を除去し、発酵エキスを得た。ｐＨは６．０であった。
【００４９】
発酵エキスをスチレン系合成吸着剤（三菱化学株式会社製、商品名「ダイヤイオンＨＰ−２０）を通過させ、発酵エキスに含まれる発酵産物を吸着させた。その後、カラムを水にて洗浄し、メタノールで溶離し、褐色のメタノール溶出画分を分取した。
【００５０】
この褐色のメタノール溶出画分について、下記条件でゲルろ過ＨＰＬＣ分析を行った。ゲルろ過クロマトグラムを図１に示す。
【００５１】
ＨＰＬＣ分析条件
ポンプ：ＳＨＩＭＡＤＺＵ製、ＬＣ−１０ＡＤｖｐ
デガッサー：ＳＨＩＭＡＤＺＵ製、ＤＧＵ−１４Ａ
オートインジェクター：ＳＨＩＭＡＤＺＵ製、ＳＩＬ−１０ＡＤｖｐ
システムコントローラー：ＳＨＩＭＡＤＺＵ製、ＳＣＬ−１０Ａｖｐ
ダイオードアレイ検出器：ＳＨＩＭＡＤＺＵ製、ＳＰＤ−Ｍ１０Ａｖｐ
蒸発光散乱検出器：ＳＨＩＭＡＤＺＵ製、ＥＬＳＤ−ＬＴ
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  ＯＨ  ｐａｋ  ＳＢ−８０３  ＨＱ
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
移動相：１００ｍＭリン酸緩衝液
【００５２】
前記褐色の発酵産物の分子量分布を、プルランを分子量マーカーとして、上記ＨＰＬＣ測定条件と同条件において測定し、それにより較正曲線を作成し相対分子量分布を求めるサイズ排除クロマトグラフィー法により検討したところ、５００〜３０００であった。
【００５３】
ついで、前記褐色物質のＵＶスペクトルを測定した。測定は、日本分光製Ｖ−５７０を使用して行った。結果を図２に示す。ＵＶスペクトルは、特定の場所に吸収ピークが見られず、波長２００ｎｍから７００ｎｍにむかって吸収がなだらかに減少するものであった。このスペクトルは製造例１のメラノイジンと波形が類似するものであった。
【００５４】
また、褐色の発酵産物について、タンパク質、多糖、単糖は分光光度計を用いた比色法により、有機酸はイオンクロマトグラフィーにより、アミノ酸はアミノ酸アナライザーを使用し、脂質に関してはガスクロマトグラフィーを用いて分析を行った。同画分には、タンパク質、多糖、単糖、有機酸、アミノ酸、脂質は検出されなかった。よって、上記メタノール溶出画分の主成分をメラノイジンとした。
【００５５】
(実施例１）
血管新生キット（倉敷紡績株式会社製、商品名「血管新生キット  ＫＺ−１０００」）を用いた。キットに付属の２４ウェルプレートには、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）とヒト繊維芽細胞とが包埋されている。キットに添付された血管新生専用培地−２に、ＶＥＧＦ−Ａ（倉敷紡績株式会社製、商品名「ＫＺ−１３５０」）を最終濃度１０ｎｇ／ｍｌになるように添加して培地を調製した。
【００５６】
製造例２で得た発酵エキスを精製水で１％に希釈した発酵エキス１％希釈液、同１０％に希釈した発酵エキス１０％希釈液、製造例２で得たメラノイジン（精製水にて終濃度１００μｇ/ｍLに調製）を前記培地で１０倍に希釈し、０．２２μｍのフィルターでろ過して試験液とした。陰性対照は５０μＭのスラミンを含む培地を使用した。各試験液について３つのウェルを使用し、各ウェルに試験液をそれぞれ５００μｌずつ添加した。なお、培地のみをウェルに添加したものを対照とした。
【００５７】
試験液を添加した後、培養開始後４、７、９日目に培地交換を行い、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下に１０日間培養を行った。培養１１日目に、細胞を７０％エタノールで固定した。固定後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳにてウェルを洗浄し、その後に抗ＣＤ３１抗体を添加した。ついで１％ＢＳＡ／ＰＢＳでウェルを洗浄した後にアルカリフォスファターゼ標識抗ＩｇＧ抗体を添加した。蒸留水にてウェルを洗浄した後に５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスファターゼを添加し、形成された管腔を染色した。蒸留水で洗浄後に風乾し、各ウェルについて３枚の画像を撮影した。撮像画像を図４〜８に示す。撮像画像を血管新生定量ソフトウエア（倉敷紡績株式会社製、Ｖｅｒ．２）により解析して管腔の面積および長さを評価した。結果を表１および図９に示す。
【００５８】
図５に示すように、陰性対照であるスラミンを投与したウェルは、染色された帯状の管腔が観察されたが、培地のみのウェル（図４）と比較して管腔量が少なくかつ管腔の分岐も少なかった。一方、製造例２で得たメラノイジンを投与したウェル（図８）は、帯状の管腔が存在せず、スラミンよりも血管新生抑制効果が観察された。なお、発酵エキス１％希釈液（図６）および発酵エキス１０％希釈液（図７）でも、培地のみのウェルと比較して染色された管腔量が少なく血管新生抑制効果が観察された。なお、図９に示すように、スラミンと発酵エキス１％希釈液および発酵エキス１０％希釈液との血管新生抑制効果は、略同程度であった。
【００５９】
表１に示すように、スラミンを投与したウェルでは、培地のみのウェルと比較して管腔の面積が５０％、長さも７０％に低減していた。また、発酵エキス１％希釈液および発酵エキス１０％希釈液もともに培地のみのウェルと比較して管腔の面積が約５０％、長さも約７０％に低減したが、血管新生抑制効果に関する用量依存性は観察されなかった。一方、製造例２で得たメラノイジンは、培地のみのウェルと比較して管腔の面積が８％、長さも１３％に低減しており、極めて強い血管新生抑制効果が観察された。
【００６０】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明は、天然物の発酵産物から抽出されるメラノイジンを血管新生阻害剤として使用するもものであり、悪性腫瘍その他の予防や治療に使用でき有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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