(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３９−デスメトキシ−４０−Ｏ−［２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオニル］ラパマイシンまたはその薬学的に許容され得る塩。
【請求項２】
３９−デスメトキシ−４０−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチルラパマイシンまたはその薬学的に許容され得る塩。
【請求項３】
薬剤として用いられる請求項１または２のいずれかの化合物。
【請求項４】
ガンおよび／またはＢ細胞系悪性腫瘍の治療、免疫抑制の誘導または維持、臓器移植拒絶反応、移植片対宿主拒絶病、自己免疫疾患、炎症疾患、血管疾患および線維症の治療、神経再生の刺激または感染症の治療に用いられる請求項１または２のいずれかの化合物。
【請求項５】
ガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍の治療薬として用いられる請求項１または２のいずれかの化合物。
【請求項６】
請求項１または２のいずれかの化合物を一以上の薬学的に許容され得る希釈剤または媒体と共に用いてなる薬剤組成物。
【請求項７】
ガンおよび／またはＢ細胞系悪性腫瘍の治療、免疫抑制の誘導または維持、臓器移植拒絶反応、移植片対宿主拒絶病、自己免疫疾患、炎症疾患、血管疾患および線維症の治療、神経再生の刺激または感染症の治療のための薬剤調製のための、請求項１または２のいずれかの化合物の使用。
【請求項８】
薬剤がガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍の治療用である請求項７の使用。
【請求項９】
請求項１または２のいずれかの化合物と、一以上の有効治療剤とからなる薬剤組成物。
【請求項１０】
一以上の有効治療剤が、メトトレキセート、リューコボリン、アドリアマイシン、プレニゾン、ブレオマイシン、シクロフォスファミド、５−フルオロウラシル、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ドキソルビシン、タモキシフェン、トレミフェン、酢酸メゲストロール、アナストロゾール、ゴセレリン、抗ＨＥＲ２単クローン抗体（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標名）など）、カペシタビン、塩酸ラロキシフェン、ＥＧＦＲ抑制剤、ＶＥＧＦ抑制剤、プロテアソーム抑制剤、ｈｓｐ９０抑制剤、アザチオプリン、コルチコステロイド、シクロフォスファミド、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、ミコフェノール酸モフェチル、ＯＫＴ−３、ＡＴＧ、アンフォテリシンＢ、フルサイトシン、エキノカンジン、グリセオフルビン、イミダゾール系およびトリアゾール系抗真菌剤よりなる群から選ばれる、請求項９の薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な３９−デスメトキシラパマイシン誘導体、その製造方法およびその用途に関する。別の観点において、本発明は３９−デスメトキシラパマイシン誘導体を、ガンおよび／またはＢ細胞系悪性腫瘍の治療、免疫抑制の誘導または維持、臓器移植拒絶反応、移植片対宿主拒絶病、自己免疫疾患、炎症疾患、血管疾患および線維症の治療、神経再生の刺激または感染症の治療に使用することについての用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラパマイシン（rapamycin、シロリムス）（図１）は、ピペコリン酸ラクトン（Ｐａｉｖａら、１９９１年）に連結された１，２，３−トリカルボニル部分を有する、ストレプトマイセス・ヒグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ＮＲＲＬ５４９１により産生される親油性マクロライド（Ｓｅｈｇａｌら、１９７５；Ｖｅｚｉｎａら、１９７５；米国特許第３，９２９，９９２号；米国特許第３，９９３，７４９号）。本発明の目的のため、ラパマイシンは、Ｆｉｎｄｌａｙら（１９８０年）または化情報索（第１１版インデックス蓄積本、１９８２〜１９８６年、ｐ６０７１９ＣＳ）の番号付け慣例よりは、ＭｃＡｌｐｉｎｅら（１９９１年）の番号付け慣例により記述される。
【０００３】
ラパマイシンは、その化合物によって示される広い活性スペクトルの故に顕著な薬理的価値を持つ。ラパマイシンは主としてカンジタ（Candida）属に対して、しかしまた糸状菌に対しても穏やかな抗菌活性を示す（Ｂａｋｅｒら、１９７８年；Ｓｅｈｇａｌら、１９７５年；Ｖｅｚｉｎａら、１９７５年；米国特許３，９２９，９９２；米国特許３，９９３，７４９）。ラパマイシンは、多くの細胞の種類において信号伝達経路を標的にすることにより、たとえば細胞サイクルのＧ１からＳ相への成長を許容するシグナリング経路を示すことにより細胞増殖を示す（Ｋｕｏら、１９９２年）。Ｔ細胞内でラパマイシンはＩＬ−２受容体およびその後の免疫抑制をもたらすＴ細胞自己増殖からのシグナリングを示す。ラパマイシンは多くの哺乳類細胞種の増殖を抑制する（Ｂｒｕｎｎら、１９９６年）から、ラパマイシンのこの抑制効果はＴ細胞に限らない。ラパマイシンは、したがって、臓器移植拒絶反応の予防や自己免疫疾患の治療において確立されたまたは予測される治療的適用を持った有力な免疫抑制剤である（Ｋａｈａｎら、１９９１年）。４０−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチル−ラパマイシン（ＳＤＺ  ＲＡＤ、ＲＡＤ００１、Ｃｅｒｔｉｃａｎ、エベロリムスeverolimus）は免疫抑制的薬理効果を示すラパマイシンの半合成相同物であり、抗ガン剤としての研究も進められている（Ｓｅｄｒａｎｉ，Ｒら、１９９８年；Ｋｉｒｃｈｎｅｒら、２０００年；米国特許５，６６５，７７２、Ｂｏｕｌａｙら、２００４年）。この薬剤は欧州で２００３年に免疫抑制剤として承認された。ラパマイシンエステル誘導体ＣＣＩ−７７９（Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ）は生体外で細胞成長を示し、生体内で腫瘍成長を示す（Ｙｕら、２００１年）。ＣＣＩ−７７９は潜在的抗ガン剤として現在第２相臨床試験が行われている。慢性尋常性乾癬の治療（ＫｉｒｂｙおよびＧｒｉｆｆｉｔｈｓ、２００１年）、ＰＣ１２細胞内神経突起伸長刺激などの潜在的効用（Ｌｙｏｎｓら、１９９４年）、機械的損傷後の血管および平滑筋細胞によるサイトカインに対する増殖反応の抑制（Ｇｒｅｇｏｒｙら、１９９３年）におけるラパマイシンの価値、および同種移植性線維症（allograft fibrosis）の予防におけるその役割（ＷａｌｌｅｒおよびＮｉｃｈｏｌｓｏｎ、２００１年）が熱心な研究領域となっている（ＫａｈａｎおよびＣａｍａｒｄｏ、２００１年）。最近の報告によれば、ラパマイシンは臓器移植患者に対する長期免疫抑制治療において、他の免疫抑制レジメより低い発ガン率を示し、この発ガン率低下は血管新生（angiogenesis）の抑制によるとされている（Ｇｕｂａら、２００２年）。イムノフィリンリガンドの神経向性作用はそれらの免疫抑制活性とは無関係であり（Ｓｔｅｉｎｅｒら、１９９７年）、親出願ＷＯ０１／０３６９２に要約される成熟ステロイド受容体複合体の分裂によって神経細胞刺激が増進されると報じられた。催奇的影響と共に高脂血症や血小板減少症などの副作用が報告されている（Ｈｅｎｔｇｅｓら、２００１年；ＫａｈａｎおよびＣａｍａｒｄｏ、２００１年）。
【０００４】
ラパマイシンのポリケチドバックボーンは、Ｉ型ポリケチド合成酵素を含む非常に大きな多機能タンパク質（ｒａｐＰＫＳ、Ｐａｉｖａら、１９９１年）により、全部で７個のプロピオン酸エステルおよび７個の酢酸エステルのユニットをシキマート由来シクロヘキサンカルボン酸スターターユニットにｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ縮合することにより合成される。Ｌ−リシン由来アミノ酸、ピペコリン酸がアミド架橋を経由してポリケチドバックボーンの最終酢酸エステルに縮合され（Ｐａｉｖａら、１９９３年）、次いでラクトン化によりマクロ環を形成する。
【０００５】
３つのラパマイシンＰＫＳ遺伝子、ＮＲＰＳエンコード遺伝子およびフランキング後期遺伝子配列および対応ポリペプチドの各々についてのヌクレオチド配列がＡｐａｒｉｃｉｏら、１９９６およびＳｃｈｗｅｃｋｅら、１９９５年によって同定され、受入番号Ｘ８６７８０の下にＮＣＢＩに寄託され、この配列に対する訂正が最近ＷＯ０４／００７７０９に発表された。
【０００６】
ラパマイシン生合成クラスタの最初の無酵素製品がプレラパマイシンである（ＷＯ０４／００７７０９、Ｇｒｅｇｏｒｙら、２００４年）。この完全にプロセス化されたラパマイシンの製造は、ラパマイシン後期遺伝子ＲａｐＪ、ＲａｐＮ、ＲａｐＯ、ＲａｐＭ、ＲａｐＱおよびＲａｐＩにエンコードされた酵素によるポリペプチド／ＮＲＰＳコアの追加的処理を必要とする。
【０００７】
今日までに特性付けられているラパマイシンの薬理作用は、ＦＫＢＰと名付けられたサイトソル受容体との相互作用によるメディエートされるものと考えられている。真核Ｔ細胞の主要な細胞内ラパマイシン受容体はＦＫＢＰ１２であり（ＤｉＬｅｌｌａおよびＣｒａｉｇ、１９９１年）、産生される複合体が標的タンパク質と特異的に相互作用して細胞の信号伝達カスケードを示す。
【０００８】
ラパマイシン−ＦＫＢＰ１２複合体の標的は酵母内においてＴＯＲ（ラパマイシン標的タンパク質）として同定され（Ａｌａｒｃｏｎら、１９９９年）、哺乳類タンパク質はＦＲＡＰ（ＦＫＢＰ−ラパマイシン付随タンパク質）ないしｍＴＯＲ（ラパマイシンの哺乳類標的タンパク質）として知られている（Ｂｒｏｗｎら、１９９４年）。
【０００９】
ｍＴＯＲ伝達経路と神経単位に局所化されるタンパク質向性との関連、翻訳調整に包含されるタンパク質のリン酸化状態に対するその作用、転写および翻訳レベルにおける翻訳メカニズムの化合物存在性、アミノ酸ペルミアーゼ活性、および代謝経路に含まれる多くの酵素の転写調整が記述されている（Ｒａｕｇｈｔら、２００１年）。ラパマイシン感応性シグナル経路はまた、胎児の脳発達、学習および記憶形成に重要な役割を果たすものと考えられている（Ｔａｎｇら、２００２年）。酵母内のＴＯＲタンパク質についての研究は、栄養感受性シグナル経路を調節する上でも役割を果たしていることを示した（Ｈａｒｄｗｉｃｋら、１９９９年）。同様に、ｍＴＯＲはタンパク質キナーゼＢ（ａｋｔ）の活性に対する直接標的物質であり、インシュリンの信号伝達において主要な役割を果たすものとして確認されている（Ｓｈｅｐｈｅｒｄら、１９９８年；Ｎａｖｅら、１９９９年）。哺乳類のＴＯＲはアクチン細胞骨格の分極化および翻訳開始の制御に関係していた（Ａｌａｒｃｏｎら、１９９９年）。ｍＴＯＲなどのホスファチジルイノストール−３−キナーゼは、細胞周期進行、付着、細胞生存および血管新生のような幾つかの腫瘍病原の見地で機能的である（ＲｏｙｍａｎｓおよびＳｉｅｇｅｒｓ、２００１年）。
【００１０】
ラパマイシンおよびラパマイシン相同物の薬物動態学的研究により、溶液中でより安定的であり、代謝攻撃に対してより抵抗性を持ち、および／または細胞膜透過性が向上され且つエフラックスが減少されていて、より優れた経口バイオアベイラビリティを示すような新規ラパマイシン化合物の開発に対する要求が実証された。
【００１１】
分子の化学的に利用可能な部位を用いて合成された一群のラパマイシン相同物が報告された。下記化合物に対する記述には、図１に記述されたラパマイシン分子の付番方式を適用させた。相同化または置換のための分子上の化学的に利用可能な部位には、Ｃ４０およびＣ２８ヒドロキシル基（例えば、米国特許第５，６６５，７７２号、米国特許第５，３６２，７１８号）、Ｃ３９およびＣ１６メトキシ基（例えば、ＷＯ９６／４１８０７号、米国特許第５，７２８，７１０号）、Ｃ３２、Ｃ２６およびＣ９ケト基（例えば、米国特許第５，３７８，８３６号、米国特許第５，１３８，０５１号、米国特許第５，６６５，７７２号）が含まれる。トリエンを標的にしたＣ１７、Ｃ１９および／またはＣ２１での水添は、抗真菌活性は維持するが、免疫抑制特性の相対的損失をもたらした（例えば、米国特許第５，３９１，７３０号、米国特許第５，０２３，２６２号）。分子の安全性に対する相当な改善（例えば、Ｃ３２、Ｃ４０および／またはＣ２８でのオキシムの形成、米国特許第５，５６３，１４５号、米国特許第５，４４６，０４８号）、代謝作用攻撃に対する耐性（例えば、米国特許第５，９１２，２５３号）、生体利用可能性（例えば、米国特許第５，２２１，６７０号、米国特許第５，９５５，４５７号、ＷＯ９８／０４２７９号）および前駆薬物の製造（例えば、米国特許第６，０１５，８１５号、米国特許第５，４３２，１８３号）が、相同化を通じて達成された。
【００１２】
しかしながら、より優れた代謝安定性、より優れた細胞膜透過性および／または減少されたエフラックス率を備えたより広範な群のラパマイシン誘導体のための要求がなお存在している。そのようなラパマイシン誘導体は広範な病状の治療により大きな有用性を持つであろう。本発明は、より優れた代謝安定性、より優れた細胞膜透過性および／または減少されたエフラックス率を備え、および／またはラパマイシンとは異なる細胞抑制プロファイルを備えた一群の３９−デスメトキシラパマイシン誘導体を提供する。この化合物は医療において、特にガンおよび／またはＢ細胞系悪性腫瘍の治療、免疫抑制の誘導または維持、臓器移植拒絶反応、移植片対宿主拒絶病、自己免疫疾患、炎症疾患、血管疾患および線維症の治療、神経再生の刺激または感染症の治療に有効である。
【発明の開示】
【００１３】
本発明はラパマイシンの３９−デスメトキシ誘導体、該化合物の調製方法、その中間産生物および該化合物の医療的用途のための方法に関する。
【００１４】
その最も広い観点において、本発明は、４０−ヒドロキシ位置がカルボン酸エステル、エーテル、リン酸エステル、ホスフィン酸エステル、アセタールまたはグリコシルとして誘導化されたことを特徴とするラパマイシンの３９−デスメトキシ誘導体を提供する。
【００１５】
本発明化合物の代謝安定性、細胞膜透過性、エフラックスおよびバイオアベイラビリティは下記のようにして試験することができる。
【００１６】
３９−デスメトキシラパマイシンがカルボン酸エステル、エーテルまたはアセタールとして誘導化される場合、誘導基は１２個を越えない炭素原子を含むことが好ましい（特に７個以下、さらには５個以下の炭素原子数が好ましい）。好ましくは、それは−ＣＦ２ＰＯ（ＯＨ）２、−ＰＯ（ＯＨ）２、−ＣＯＯＨ、−ＯＨおよび−ＮＨ２から、好ましくは−ＣＯＯＨおよび−ＯＨ、より好ましくは−ＯＨから選ばれる一以上の官能基（特には２以上の官能基）を含む。
【００１７】
３９−デスメトキシラパマイシンがグリコシル基由来のアセタールとして誘導化される場合、各グリコシルは好ましくは１２個を越えない炭素原子を含む（特に７個以下、さらには６個以下の炭素原子数が好ましい）糖またはグリコシドから形成することが好ましい。好ましくは、それは−ＣＯＯＨ、−ＯＨおよび−ＮＨ２から、好ましくは−ＮＨ２および−ＯＨ、より好ましくは−ＯＨから選ばれる一以上の官能基（特には２以上の官能基）を含む。
【００１８】
３９−デスメトキシラパマイシンがリン酸エステルとして誘導化される場合、好ましくはアルキル基は４個を越えない炭素原子を含む。
【００１９】
３９−デスメトキシラパマイシンがホスフィン酸エステルとして誘導化される場合、好ましくはアルキル基は４個を越えない炭素原子を含むことが好ましく、一例はホスフィン酸で形成されるエステルである。
【００２０】
誘導部分の具体例を下記に示す。
【００２１】
より具体的な観点において、本発明は、化１による３９−デスメトキシラパマイシン誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【００２２】
【化１】
0005422788.tif 000002
ここで、
Ｘは結合またはＣＨ２を表し、
Ｒ１はケト基または（Ｈ，Ｈ）を表し、
Ｒ２はＯＨまたはＯＭｅを表し、
Ｒ３はＨ、ＯＨまたはＯＭｅを表し、
Ｒ４およびＲ５は各々独立してＨまたはＯＨを表し、
Ｒ６は−Ｒ７、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７、−（ＣＨ２）２−Ｏ−［ＣＲ２１Ｒ２２−Ｏ］ａ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２３；−ＣＲ２１Ｒ２２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２３；ＰＯＲ１９Ｒ２０、−ＰＯ（ＯＲ１９）（ＯＲ２０）またはＹ−Ｒ１５を表し、
Ｒ７は−（ＣＲ８Ｒ９）ｍ（ＣＲ１０Ｒ１１）ｐＣＲ１２Ｒ１３Ｒ１４を表し、
Ｒ８およびＲ９は各々独立してＣ１−Ｃ４アルキル、Ｃ２−Ｃ４アルケニルまたはＣ２−Ｃ４アルキニルを表し、これらのいずれの基においても−ＰＯ（ＯＨ）２、ＣＦ２ＰＯ（ＯＨ）２、−ＯＨ、−ＣＯＯＨまたは−ＮＨ２で任意に置換可能であり、あるいはＲ８およびＲ９は各々独立してＨ、トリフルオロメチルまたはＦを表し、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４は各々独立してＣ１−Ｃ４アルキル、Ｃ２−Ｃ４アルケニルまたはＣ２−Ｃ４アルキニルを表し、これらのいずれの基においても−ＰＯ（ＯＨ）２、ＣＦ２ＰＯ（ＯＨ）２、−ＯＨ、−ＣＯＯＨまたは−ＮＨ２で任意に置換可能であり、あるいはＲ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４は各々独立してＨ、−（ＣＲ８Ｒ９）ｑＮＨ２、−（ＣＲ８Ｒ９）ｑＯＨ、ＣＦ３、Ｆ、ＣＯＯＨから選択することができ、あるいはＲ１０とＲ１１またはＲ１２とＲ１３またはＲ１３とＲ１４は一緒になってそれらが結合している炭素と共にＣ３−Ｃ６シクロアルキルまたはＮ、ＯおよびＳから選ばれる一以上のヘテロ原子を含み５個までの−（ＣＲ８Ｒ９）ｑＯＨ、−（ＣＲ８Ｒ９）ｑＮＨ２または−ＣＯＯＨ基で任意に置換可能である３〜６員ヘテロアルキル環を形成しており、
ここでＹは結合、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−または−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−であり、
Ｒ１５は化２、化３または化４のいずれかであり、
【化２】
0005422788.tif 000003
【化３】
0005422788.tif 000004
【化４】
0005422788.tif 000005
Ｒ１６は各々独立してＨまたはＯＨであり、
Ｒ１７はＨ、ＯＨおよびＮＨ２から独立して選ばれ、
Ｒ１８はＨ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＯＨおよび−ＣＯＯＨから選ばれ、
ただしＲ１６、Ｒ１７およびＲ１８から選ばれる２以上の基はＨまたはＣＨ３を表し、
Ｒ１９およびＲ２０は各々独立してＨまたはＣ１−Ｃ４アルキルをあらわし、あるいはＲ１９およびＲ２０の両方で＝ＣＨ２を示し、
Ｒ２１はＨ、ＣＨ３から独立して選ばれ、
Ｒ２２はＨ、−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ２、−ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＨＣｌ２、−ＣＣｌ３、−ＣＨ（ＯＨ）Ｍｅ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（Ｃｌ）Ｍｅから独立して選ばれ、
Ｒ２３は独立してＲ７、Ｙ−Ｒ１５または５または６員アリルまたはヘテロアリル環であって任意にＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２およびＮＨ２から選ばれる1〜３個の基で置換されるもの、
ａは０または１を表し、
ｍ、ｐおよびｑは各々独立して０〜４の整数を表し、
ただしＲ７部分は１２個を超える炭素原子を含有せず、-ＰＯ（ＯＨ）２、-ＣＦ２ＰＯ（ＯＨ）２、-ＣＯＯＨ、ＯＨまたはＮＨ２から選ばれる１以上の官能基を有し、あるいはそれらの薬学的に許容可能な塩である。
【００２３】
上記構造は代表的な互変異体を示しており、本発明は化１の化合物のあらゆる互変異体、たとえばエノール化合物が示される場合のケト化合物およびその逆を包含する。
【００２４】
具体的な立体異性体が特定的に示されない限り（たとえば、構造式中の立体中心における太字または点線の結合により、構造式中にＥまたはＺ配置を有する二重結合が示されることにより、または立体科学を示す術後を用いることにより）、すべての立体異性体は純粋化合物としてであれその混合物としてであれ、本発明の範囲内に含まれる。そうでないように示されない限り、個々のエナンチオマー、ジアステレオマー、幾何異性体、およびこれらの組み合わせおよび混合物はすべて本発明に包含される。多形結晶体、溶媒和物および水和物もまた本発明に包含される。
【００２５】
さらに別の観点において、本発明は化１で示される３９-デスメトキシラパマイシン誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を薬剤として用いる用途を提供する。
【００２６】
定義
冠詞“ａ”または“ａｎ”はここでは一または一以上（すなわち少なくとも一）の文法上の対象物を指すために用いられる。一例として、“ａｎ  ａｎａｌｏｇｕｅ”は一つの相同物または一以上の相同物を意味する。
【００２７】
ここで用いる「相同物」の語は、ある化合物と構造的に近似しているが組成において（たとえば１個の原子が他に置換され、あるいは特定の１個の官能基が存在または不存在）若干異なる化合物を意味する。
【００２８】
特に、「３９-デスメトキシラパマイシン相同物」の語はＷＯ２００４／００７７０９の方法によって製造される、および／または化１で示される３９−デスメトキシラパマイシン化合物である。この化合物はまた「親化合物」として参照され、これらの語を本出願において互換的に使用する。本出願において「３９−デスメトキシラパマイシン相同物」の語は３９−デスメトキシラパマイシンそれ自体に対する参照を含む。
【００２９】
ここで用いる「誘導体」の語は、半合成有機化学により親化合物から変性された化合物を指す。
【００３０】
特に、「３９−デスメトキシラパマイシン誘導体」の語は、化１で示される３９−デスメトキシラパマイシン誘導体、またはその薬学的に許容され得る塩を意味し、３９−デスメトキシラパマイシン相同物の半合成変性によって製造される。該化合物はまた「本発明化合物」または「ラパマイシンの３９−デスメトキシ誘導体」として参照され、本出願においてこれらの語を互換的に使用する。
【００３１】
ここで用いる「自己免疫疾患」の語は、限定的ではないが、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、重症筋無力症および多発性硬化症を含む。
【００３２】
ここで用いる「炎症疾患」の語は、限定的ではないが、乾癬、皮膚炎、湿疹、脂漏、炎症性腸疾患（限定的ではないが潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む）、肺炎（限定できではないが喘息、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、急性呼吸窮迫症候群および気管支炎を含む）、リウマチ性関節炎および眼ブドウ膜炎を含む。
【００３３】
ここで用いる「ガン」の語は、限定的ではないが、皮膚や限定的ではないがたとえば胸腺、前立腺、肺、腎臓、膵臓、胃または腸などの体器官中の悪性の細胞成長を意味する。ガンは隣接組織に侵入して、離れた器官、たとえば非限定的例示として骨や肝臓、肺または脳などに拡がっていく（転移）傾向がある。ここで用いる「ガン」の語は、非限定的な例示としてメラノーマ、リンフォーマ、白血病、繊維肉腫、横紋筋肉腫および悪性肥満細胞腫などの転移性腫瘍細胞タイプと、非限定的な例示として結腸大腸ガン、前立腺ガン、小細胞肺ガンおよび非小細胞肺ガン、乳ガン、膵臓ガン、膀胱ガン、腎臓ガン、胃ガン、グリオブラストーマ、肝ガン、卵巣ガンなどの細胞ガンタイプの両方を含む。
【００３４】
ここで用いる「Ｂ細胞系悪性腫瘍」の語は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）などの疾患群を含む。これは血液または造血器官の新生物疾患である。これは骨髄および免疫システムの機能不全を生じさせ、宿主を感染や出血しやすいものにする。
【００３５】
ここで用いる「血液疾患」の語は、限定的ではないが、超増殖性血管障害（レステノシスおよび血管閉塞など）、アテローム性動脈硬化症、心血管疾患、脳血管障害および末梢性血液疾患（冠状動脈疾患、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、非アテローム性動脈硬化症または血管壁損傷など）を含む。
【００３６】
ここで用いる「神経再生」の語は神経細胞成長刺激を意味し、神経突起伸長および神経細胞の機能的回復を含む。神経再生がその治療に顕著に有効であろうとされる疾患および疾病は、限定的ではないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏、筋萎縮性側索硬化症、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベル麻痺、筋ジストロフィー、脳卒中、進行性筋萎縮症、進行性球脊髄性筋萎縮症、変形性頸椎症、ギラン・バレー症候群、痴呆症、末梢性神経障害および末梢神経損傷を含む、これらは身体的損傷（脊髄損傷またはトラウマ、座骨神経や顔面神経の外傷や損傷など）によって生ずるか、あるいは病状（糖尿病など）によって生ずるかを問わない。
【００３７】
ここで用いる「線維症」の語は、細胞外マトリックスの過剰産生に関連する疾患を意味し、（限定的ではないが）サルコイドーシス、ケロイド、糸球体腎炎、末期腎臓疾患、肝繊維化症（非限定的例示として肝硬変、アルコール性肝障害および脂肪肝を含む）、慢性腎障害、手術創癒着、動脈硬化症、心臓繊維化症、肺線維症（非限定的例示として突発性肺線維症および突発性繊維性肺胞炎を含む）、黄斑変性症、新生児および糖尿病網膜症、化学療法または放射線誘発線維症を含む。
【００３８】
ここで用いる「移植片対宿主拒絶病」の語は、同種幹細胞／骨髄移植後に見られる合併症を意味する。それは、ドナーから与えられた感染と闘う細胞が患者の体を異なるまたは異質であると認識したときに発症する。これらの感染攻撃細胞は、感染を攻撃するかの如く、患者の体内組織を攻撃する。移植片対宿主拒絶病は、それが移植後最初の１００日以内に発症すれば急性とされ、移植後１００日経過後に発症すれば慢性とされる。これに関連する主な組織は肝臓、消化管および皮膚である。慢性移植片対宿主拒絶病は幹細胞／骨髄移植患者の約１０〜４０％に発生する。
【００３９】
ここで用いる「バイオアベイラビィリティ」の語は、投与後の薬剤または他の物質が生物学的活性領域で吸収されまたは有効に働く程度ないし割合を意味する。この性質は、化合物の可溶性、消化管への吸収率、タンパク質結合および代謝の程度などの数多くの要因に依存する。ここに当業界において当業者に良く知られている様々なバイオアベイラビィリティ試験を記述する（さらにＴｒｅｐａｎｉｅｒら、１９９８年、Ｇａｌｌａｎｔ−Ｈａｉｄｎｅｒら、２０００年も参照されたい）。
【００４０】
ここで用いる「水溶性」の語は、水性媒体、たとえばｐＨ７．４におけるリン酸緩衝サリン（ＰＢＳ）中の溶解性を意味する。
【００４１】
化１の化合物のような本発明化合物の薬学的に許容可能な塩は、薬学的に許容可能な無機または有機の酸または基から形成される慣習的な塩を含み、さらに第四アンモニウム酸添加塩をも含む。好適な酸塩についてより詳しく例示すれば、塩化水素、臭化水素、硫酸、リン酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、蟻酸、乳酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、パルモイン酸、マロン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、ナフタリン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ヒドロキシナフタリン酸、よう化水素酸、リンゴ酸、ステロイン酸、タンニン酸などである。シュウ酸などの他の酸はそれ自身は薬学的に許容可能なものではないが、塩として調製することにより本発明化合物およびその薬学的許容可能塩を得るための中間生成物として有用である。より詳しく好適な基酸を例示すれば、ナトリウム、リチウム、カリウム、マグネシウム、アルミニウム、カルシウム、亜鉛、Ｎ−Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミンおよびプロカインの塩である。以降において本発明による化合物を参照するときは化１の化合物とその薬学的許容可能な塩の両方を含む。
【００４２】
アルキル、アルケニルおよびアルキニル基は直鎖または分枝である。
【００４３】
Ｃ１−Ｃ４アルキル基の例はメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピルおよびｎ−ブチルを含む。
【００４４】
Ｃ２−Ｃ４アルケニル基の例はエテニルおよび２−プロペニルを含む。
【００４５】
Ｃ２−４アルキニル基の例はエチニルを含む。
【００４６】
Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基は３〜６個の炭素原子を含むシクロアルキル環を意味し、それらは任意に分枝していても良い。例示すればシクロプロピル、シクロブチル、メチル−シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルである。
【００４７】
Ｎ、ＯおよびＳから選ばれる１以上のヘテロ原子を含む３〜６員ヘテロアルキル環は、１個または２個のヘテロ原子を含み、特に１個のヘテロ原子を含む。例示すればフラン、ピラン、オキセタン、オキシラン、ピペリジン、ピロリジン、アゼチジン、アジリジン、チイラン、チエタン、チオフェン、チオピランおよびモルフォリンを含む。
【００４８】
３〜６員ヘテロアルキル環についての任意置換の例は、−ＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、ＮＨ２、ＣＨ２ＮＨ２およびＣＯＯＨを含む。特に３〜６員ヘテロアルキル環は置換されていないか、あるいは１個または２個、たとえば１個の置換基で置換されている。
【００４９】
発明の記述
本発明は上述の３９−デスメトキシラパマイシン誘導体、該化合物の調製方法、その中間産生物および該化合物の医療的用途を提供する。
【００５０】
好ましくはＲ７は７個以下、特に５個以下の炭素原子を含む。
【００５１】
Ｒ７は好ましくは−ＰＯ（ＯＨ）２、−ＯＨ、−ＣＯＯＨおよび−ＮＨ２から、より好ましくは−ＯＨ、−ＣＯＯＨまたは−ＮＨ２から、特に−ＯＨおよび−ＣＯＯＨから、とりわけＯＨから選ばれる１以上の官能基を含む。好ましくはＲ７は２以上の置換基、たとえば２つのＯＨ基を含む。
【００５２】
好ましくはＸはＣＨ２を表す。
【００５３】
好ましくはａは０を表す。
【００５４】
好ましくはｐは０または１を表す。
【００５５】
好ましくはｍは０または１を表す。
【００５６】
好ましくはｑは０、１または２を表す。
【００５７】
好ましくはＲ１１はＨを表す。好ましくはＲ１２はＨを表す。
【００５８】
好ましくはＲ１３はＨまたはＯＨを表す。
【００５９】
ｐが１を表すとき、好ましくはＲ１０はＭｅ、ＯＨまたはＣＨ２ＯＨを表す。
【００６０】
ｐが１を表すとき、好ましくはＲ１１はＭｅ、ＨまたはＣＨ２ＯＨを表す。
【００６１】
ｍとｐが共に０を表すとき、好ましくはＲ１２とＲ１３は共にＨを表し、Ｒ１４は−（ＣＲ８Ｒ９）ｑ−ＯＨを表し、ここでｑは０または１を表し、Ｒ８とＲ９は共にＨを表す。
【００６２】
ｐが１を表しｍが０を表すとき、好ましくはＲ１０とＲ１１は共にＨを表し、Ｒ１２はＨを表し、Ｒ１３はＨ、ＯＨまたはＮＨ２を表し、Ｒ１４は−（ＣＲ８Ｒ９）ｑ−ＯＨを表し、ここでｑは０または１を表し、Ｒ８とＲ９は共にＨを表す。
【００６３】
Ｒ６が−ＰＯＲ１５Ｒ１６を表すとき、好ましくはＲ１５とＲ１６は共にＣＨ３を表すかまたは共にＣＨ２ＣＨ３を表す。
【００６４】
好ましくはＲ６は、ヒドロキシ酢酸、３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルプロピオン酸、２，３−ジヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシ−２−ヒドロキシメチルプロピオン酸または２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸によるエステル形成由来の残留物を表す。
【００６５】
化合物の一例セットにおいてＲ６はC(O) Ｒ７を表す。
【００６６】
好ましくはＲ７は、ヒドロキシ酢酸、３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルプロピオン酸、２，３−ジヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシ−２−ジヒドロキシメチルプロピオン酸および２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸からなる群から選ばれる酸、特に２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸で大環状アルコールを縮合することにより形成される部分である。
【００６７】
Ｒ１５が化２を表すとき、この部分の例は、（１）グルコース（すなわちＲ１８がＣＨ２OＨを表し、各Ｒ１６およびＲ１７がＯＨを表す）、たとえばＤ−グルコース、（２）グルコサミン（すなわちＲ１８がＣＨ２OＨを表し、各Ｒ１６がOHを表し、Ｒ１７がＮＨ２を表す）、たとえばＤ−グルコサミン、（３）グルクロン酸（すなわちＲ１８がＣOＯＨを表し、各Ｒ１６およびＲ１７がＯＨを表す）、たとえばＤ−グルクロン酸、および（４）アラビノース（すなわちＲ１８がＨを表し、各Ｒ１６およびＲ１７がＯＨを表す）、たとえばＤ−アラビノースでアセタールを形成することにより形成される部分を含む。
【化２】
0005422788.tif 000006
【００６８】
Ｒ１５が化３を示すとき、この部分の例は、フルクトース（すなわちＲ１６が各々ＯＨを表す）、たとえばＤ−フルクトースでアセタールを形成することにより形成される部分を含む。
【化３】
0005422788.tif 000007
【００６９】
Ｒ１５が化４を示すとき、この部分の例は、グルクロン酸（すなわち各Ｒ１６がＯＨを表す）、たとえばＤ−グルクロン酸でエステルを形成することにより形成される部分を含む。
【化４】
0005422788.tif 000008
【００７０】
概して言えば、本発明化合物は化５の３９−デスメトキシラパマイシン相同物の半合成誘導により産生される。
【化５】
0005422788.tif 000009
【００７１】
すなわち、化１の化合物またはその薬学的に許容可能な塩の調製方法は、
（ａ）化５の３９−デスメトキシラパマイシン相同物（ＲＡはＨまたは（ＣＨ２）２−ＯＨ）またはその保護された誘導体を、ＨＯ−Ｒ６またはＲ６の活性化された誘導体と反応させる工程、
（ｂ）化１の化合物またはその塩を他の化１の化合物またはその薬学的に許容され得る塩に形質転換する工程、または、
（ｃ）保護された化１の化合物を脱保護する工程を含む。
【００７２】
ここで用いる「活性化された誘導体」の語は、非限定的例示として、エステルの場合であればカルボン酸、ハロゲン化アシル、混合酸無水物、対称酸無水物またはカルボン酸エステル、エーテルの場合であればハロゲン化アルキル、アルキルメシレート、アルキルトリフレート、アルキルトシレートまたは他の適当な活性化アルキル誘導体、リン酸エステルまたはホスホン酸エステルの場合であればクロロホスフェート、ジアルキルシアノホスフェート、ジアルキルジアルキルホスホラミデートまたはクロロホスファイト、グリコシル基由来アセタールの場合であればハロゲン化グリコシル、チオグリコシド、１−Ｏ−アシルグリコシド、オルトエステル、１−Ｏまたは１−Ｓ炭酸塩、トリクロロイミデート、４−ペンテニルグリコシド、グリコシルリン酸エステル、１−Ｏ−スルホニルまたは１−Ｏ−シリル化グリコシドなどのグリコシルドナーを用いることを意味する。
【００７３】
工程（ａ）において、化５の３９−デスメトキシラパマイシン相同物はＷＯ２００４／００７７０９に記述され、さらには後述実施例に述べるようにして調製することができる。
【００７４】
ここに記述される具体的方法および参照に加えて、当業者は、非限定的例示としてＶｏｇｅｌの実際有機化学の教本（Ｆｕｒｎｉｓｓら、１９８９年）やＭａｒｃｈの高等有機化学（ＳｍｉｔｈおよびＭａｒｃｈ、２００１年）にょうな合成法のための標準的教本参照を顧慮することができる。
【００７５】
さらに、当業者に知られている多くの標準的ヒドロキシ保護ストラテジーの一つによってヒドロキシル基を保護することができる。ヒドロキシル基は、限定的ではないがたとえば置換アルキルエーテル、置換ベンゼンエーテル、シリルエーテルなどのエーテルを生成させることによって保護することができる。好適には、シラン（限定的ではないが塩化シリル、シリルトリフラートを含む）の活性形態を適当な塩基の存在の下で３９−デスメトキシラパマイシンと反応させることにより、限定的ではないがたとえばトリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリルなどのシリルエーテルを生成させる。次いで酸加水分解またはフッ素酸アシスト開裂のいずれかにより保護基を除去することができる。アセトン誘導体の縮合に基づいて、１，２−ジオールがアセトニドとして保護され得る。これは酸触媒によって除去され得る。
【００７６】
化５の３９−デスメトキシラパマイシン相同物はさらなる半合成（すなわち工程（ａ））のためのテンプレートとしても用いることができる。Ｃ−４０におけるペンダントヒドロキシル基は、当業者に知られている多くの合成的形質転換を介して、たとえばアシル化、アルキル化、グリコシル化またはリン酸化などによって感応化され得る。
【００７７】
工程（ａ）において、Ｒ６が−Ｃ（Ｏ）Ｒ７またはＹ−Ｒ１５であって、ここでＲ１５が化４を表し、Ｙが結合であるとき、ヒドロキシエステルの形成ないしＯ−アシル化は、化５の化合物のヒドロキシルが好ましくは活性化状態である対応カルボキシル酸、たとえば化６または化７の化合物と反応することによって、あるいは化８の化合物と反応することによって、メディエートされ得る。
【化４】
0005422788.tif 000010
【化６】
0005422788.tif 000011
【化７】
0005422788.tif 000012
【化８】
0005422788.tif 000013
【００７８】
ここで、Ｗはカルボキシル酸を求核攻撃に対して活性化する基である。カルボキシル酸は非限定的例示としてハロゲン化アキル（たとえばＷ＝Ｃｌ）、混合酸無水物（すなわちＷ＝ＯＣ（Ｏ）Ｒ’）、対称酸無水物（Ｗ＝ＯＣ（Ｏ）Ｒ７）またはカルボキシルエステル（すなわちＷ＝ＯＲ’）の形成により活性化され得る。
【００７９】
化６、化７または化８の化合物はそれらの入手可能なカルボキシル酸から当業者に公知の標準的方法を用いて調製することができ、一つの特定の観点において、Ｒ７が−（ＣＲ８Ｒ９）ｍ（ＣＲ１０Ｒ１１）ｐＣＲ１２Ｒ１３Ｒ１４を表す化６の化合物は米国特許５，３６２，７１８、米国特許「５，６６５，７７２または欧州特許０６６３９１６に記述されるような方法を用いて調製することができる。
【００８０】
好ましくは３９−デスメトキシラパマイシン相同物を有機媒体中で塩基の存在下で酸塩化物または混合酸無水物と反応させる。塩基の非限定的例示は、ピリジン、４，４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、２，６−ルチジン、２，６−ジ−タート−ブチルピリジン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、他のトリアルキルアミン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７―エン（ＤＢＵ）または１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］ノン−５―エン（ＤＢＮ）を含む。
【００８１】
工程（ａ）において、Ｒ６が−Ｃ（Ｏ）Ｒ７またはＹ−Ｒ１５であって、ここでＲ１５が化４を表し、Ｙが−Ｃ（Ｏ）Ｏ−または−（ＣＨ２）２−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−を表すとき、該ヒドロキシエステルの形成は、化５の化合物または４０−Ｏ−（ヒドロキシエチル）−化５化合物のヒドロキシル基が化９の化合物のような活性化炭酸エステルを形成する試薬と反応させることを要求する。
【化４】
0005422788.tif 000014
【化９】
0005422788.tif 000015
【００８２】
化９においてＴは結合または−Ｏ（ＣＨ２）２−であり、Ｒ２４はアルキルまたはアリル基、好ましくはアリル基、特にパラ−ニトロフェニル基である。
【００８３】
化９の化合物は次いで化６、化７または化８の化合物と反応して、炭酸塩リンカー（carbonate linker）を介して、Ｒ６が４０−ヒドロキシル基または４０−Ｏ−（ヒドロキシルエチル）基に付着した化合物を生成する（ＷＯ２００４／１０１５８３）。
【００８４】
同様に、３９−デスメトキシラパマイシン相同物を適当に選択した活性化されたアルキル誘導体と反応させることにより、３９−デスメトキシラパマイシン相同物をＣ−４０において異なるヒドロキシエステルで誘導することができ、これによって４０−Ｏ−アルキル−３９−デスメトキシラパマイシン誘導体を生成する。活性化されたアルキル基は、非限定的例示としてハロゲン化アキル（ＲＣｌ、Ｒｌ、ＲＢｒ）、アルキルメシレート（ＲＯＳ（Ｏ）２ＣＨ３）、アルキルトリフレート（ＲＯＳ（Ｏ）２ＣＦ３）、アルキルトシレート（ＲＯＳ（Ｏ）２ＰｈＭｅ）の形成を含む多くの方法の一つにより活性化されたアルキル基を指す。活性化されたアルキル基は次いで有機溶媒中で適当な塩基の存在下において３９−デスメトキシラパマイシン相同物と反応する。反応条件を最適化する標準的方法が当業者によって採用されることができ、これにより他の反応位置におけるアルキル化を防止する。
【００８５】
同様に、３９−デスメトキシラパマイシン相同物をリン酸化することができ、これによりリン酸エステルの脱保護の後に４０−Ｏ−ホスフォ−３９−デスメトキシラパマイシン誘導体または４０−Ｏ−ジアルキルホスフォ−３９−デスメトキシラパマイシン誘導体を産生する。これらの塩は当業者に知られている方法で産生することができる。リン酸エステルは、３価ホスフェート（亜リン酸）が５価ホスフェートに酸化（好ましくは非限定的例示としてｍＣＰＢＡのような過酸活性によって）されているＯ−ホスファイトを介して、直接または間接に生成し得る。直接リン酸化方法は、非限定的例示として、好ましくは有機溶媒中でＤＭＰＡ存在下において３９−デスメトキシラパマイシン相同物を、保護されたクロロホスフェート（たとえば（ＢｎＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｃｌ、（アルキルＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｃｌ）と反応させ、または、トリエチルアミンなどの塩基の存在下において３９−デスメトキシラパマイシン相同物をオキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３）と反応させ、次いで得られたＯ−ジクロロホスフェート（すなわちＲＯＰ（Ｏ）Ｃｌ２）の酸加水分解またはジアルキルシアノホスフェートへの結合（ＷＯ０１／８１３５５）を行うことを含む。ジアルキルまたはジアリルクロロホスフェートは、塩基の存在下でジアルキルまたはジアリルホスファイト（すなわち（ＲＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｈ）を四塩化炭素と反応させることにより自然位で（in situ）生成させることができる。Ｏ−ホスフェートの生成（Ｏ−ホスフェートへの酸化のために）方法は、非限定的例示として、塩基（好ましくはテトラゾル）の存在下で３９−デスメトキシラパマイシン相同物ジアルキル−ジアルキルホスフォラミデート（dialkylphosphoramidate）に結合させること、塩基の存在下でクロロホスファイトを用いて結合すること（Ｅｖａｎｓら、１９９２年）を含む。保護基の選択は重要であり、ホスフェートのエチルおよびメチルエステルは酸性や塩基条件では容易にはリン酸化しない。好ましい保護基は、非限定的例示として、ベンジルエステル（ヨウ化ナトリウム／クロロトリメチルシラン促進加水分解を介して開裂、ＷＯ０１／８１３５５）または２−シアノエチルエステル（緩やかな塩基触媒開裂を介して開裂）を含む。同様に、４０−Ｏ−ジアルキルホスフォノ−３９−デスメトキシラパマイシン誘導体は３９−デスメトキシラパマイシン相同物を適当な活性化（上述）ジアルキルホスフォネートまたはジアルキルホスファイトと反応させることにより生成することができる。
【００８６】
工程（ａ）において、Ｒ１５が化２または化３の部分を示すとき、グリコシド結合の形成すなわちＯ−グリコシル化は、ヒドロキシル基が好ましくは活性化形態にある対応グリコシルドナー、たとえば化１０の化合物または化１１の化合物と反応することによってメディエートされ得る（ＴｏｓｈｉｍａおよびＴａｔｓｕｔａ（１９９３年）参照）。
【化１０】
0005422788.tif 000016
【化１１】
0005422788.tif 000017
【００８７】
非限定的例示として、ハロゲン化グリコシル（Ｚ＝Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ）、チオグリコシド（Ｚ＝ＳＭえ、Ｓｅｔ、ＳＰｈ、ＳＰｙ、ＳＣＮ）、１−Ｏ−アシルグリコシド（Ｚ＝ＯＣ（Ｏ）Ｒ）、オルトエステル（Ｚ＝ＯＣ（Ｍｅ）（Ｒ）（Ｏ−化１０／化１１のＣ２）、１−Ｏまたは１−Ｓ炭酸塩（Ｚ＝ＯＣ（Ｓ）ＳＭｅ、Ｚ＝ＯＣ（Ｏ）イミダゾール、Ｚ＝ＯＣ（Ｓ）イミダゾール、Ｚ＝ＳＣ（Ｓ）ＯＥｔ）、トリクロロイミデート（Ｚ＝ＯＣ（＝ＮＨ）ＣＣｌ３）、４−ペンテニルグリコシド（Ｚ＝ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、リン酸エステル（たとえばＺ＝ＯＰ（Ｏ）（ＯＰｈ）２）、１−Ｏ−スルホニル（Ｚ＝トシル）、または１−Ｏ−シリル化グリコシド（Ｚ＝ＯＴＭＳまたはＯＴＢＳ）を含むグリコシルドナーの使用に際し、３９−デスメトキシラパマイシン相同物を有機溶媒中で、好ましくは活性剤（たとえばルイス酸または重金属塩など、ＴｏｓｈｉｍａおよびＴａｔｓｕｔａ、１９９３年、参照）の存在下で、グリコシル化させることができる。用いる特定のグリコシルドナーおよび反応条件によって、αまたはβグリコシドのいずれが生成されるかが決定される。アシル化についての以前と同様、親化合物に存在するあらゆるヒドロキシル基は、グリコシルドナーの１当量を用いることが４０−Ｏ−アシル化をもたらすように保護され遮蔽され得る。グリコシルドナーに残るヒドロキシル基はたとえばＯ−酢酸エステル、Ｏ−ベンゾエート、１，２−アセトナイドなどで保護され、したがってさらに脱保護が必要となる。さらに、グリカールのような２−デオキシグリコシルを用いて（還元工程がまた要求される）、２’−デオキシ−３９−デスメトキシラパマイシングリコシドを生成させることができ、２，６−アンヒドロ−２−チオ糖のような２，６−ジデオキシグリコシルドナーを用いて２’−６’−ジデオキシ−３９−デスメトキシラパマイシングリコシドを生成させることができる。
【００８８】
工程（ｂ）において、塩の生成および交換は当業者に知られている従来法により行うことができる。化１の化合物の分子変換は既知の方法で行うことができ、たとえば本出願のどこかに記述されているように酸化／還元によりヒドロキシおよびケト基の変換を行うことができる。Ｒ６が−ＰＯ（ＯＨ）２を表す化１の化合物は、Ｒ６がＯＨを表す化１の対応化合物をリン酸化することで調製可能である。適当な条件は本出願のどこかで与えられる。
【００８９】
工程（ａ）および（ｃ）において、保護基の例およびその除去方法をＴ  Ｗ  Ｇｒｅｅｎｅ「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｊ  ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ、１９９１年）に見ることができる。適当なヒドロキシル保護基は、加水分解で除去することができるものとしてアルキル（たとえばメチル）、アセタール（たとえばアセトニド）およびアシル（たとえばアセチルまたはベンゾイル）、触媒加水分解で除去することができるものとしてアリルアルキル（たとえばベンジル）、または酸加水分解ないしフッ化イオンアシスト開裂により除去することができるものとしてシリルエーテルを含む。
【００９０】
工程（ａ）に加えて、Ｒ６がＲ７を示す化１の３９−デスメトキシラパマイシン相同物はリパーゼ触媒トランスエステル化によって合成することができる。非限定的例示として、化５の３９−デスメトキシラパマイシン相同物をリパーゼＰＳ−Ｃ「Ａｍａｎｏ」ＩＩの存在下で化１２のエステルと反応させることができる。この時の反応条件はGuら（２００５年）および本実施例に記述されている。この方法論はビニルエステルの使用に限定されず、トランスエステル化を他のリパーゼやエステラーゼで触媒作用を発揮させても良い。
【化１２】
0005422788.tif 000018
【００９１】
本発明の他の化合物はそれ自体既知である方法または上述の方法と相同的な方法によって調製することができる。
【００９２】
新規３９−デスメトキシラパマイシン誘導体は、免疫抑制剤、抗真菌剤、抗ガン剤、抗炎症剤、神経再生剤、または臓器移植拒絶反応、移植片対宿主拒絶病、自己免疫疾患、炎症疾患、血管疾患および／または線維症の治療薬として有効な化合物を製剤するために直接的に有用であり、また、さらに別の半合成または生物学的変換のためのテンプレートとして有用である。ラパマイシンおよびその相同物の半合成的誘導法は当業界において良く知られており、非限定的例示として、たとえば米国特許５，６６５，７７２、米国特許５，３６２，７１８、ＷＯ９６／４１８０７、米国特許５，７２８，７１０、米国特許５，３７８，８３６、米国特許５，１３８，０５１、米国特許５，６６５，７７２、米国特許５，９５５，４５７、ＷＯ９８／０４２７９、米国特許６，０１５，８１５および米国特許５，４３２，１８３に記述される改良を含む。
【００９３】
中間産生物（たとえば化５の化合物）の上記構造は互変異性化可能であり、代表的な互変異性体が示されている場合、すべての互変異性体、たとえばエノール化合物が示されている場合のケト化合物およびその逆も包含することが意図されていることを理解すべきである。
【００９４】
さらに別の観点において本発明は３９−デスメトキシラパマイシン誘導体の医療用途を提供する。さらに別の観点において本発明は３９−デスメトキシラパマイシン誘導体を免疫抑制の誘発または維持、神経再生の刺激、またはガン、Ｂ細胞系悪性腫瘍、真菌感染、臓器移植拒絶反応、移植片対宿主拒絶病、自己免疫疾患、炎症疾患、血管疾患および線維症の治療のための薬剤、または創傷治癒制御に用いる薬剤を製剤することの用途を提供する。
【００９５】
多剤耐性（ＭＤＲ）はガンおよびＢ細胞系悪性腫瘍の治療において重要な問題である。それは多くのガンにおいて薬剤耐性の開発を遅れさせる主要な原因となっている（Ｐｅｒｓｉｄｉｓ  Ａ、１９９９年）。ＭＤＲはアデノシン三リン酸結合カセットトランスポーター（ＡＢＣトランスポーター）の増大レベル、特にＰ糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）のためにエンコードするＭＤＲ１遺伝子またはＭＲＰ１をエンコードするＭＲＰ１遺伝子の発現の増加に関連する。ＭＤＲ１遺伝子発現レベルは異なるガン由来細胞ラインに亘って大きく変化し、幾つかの細胞ラインでは検出不能であるが、他の細胞ラインでは標準的対照と比較すると最大１０ないし１００倍の発現増加を示すことがある。
【００９６】
したがって、本発明のさらなる態様は、３９−デスメトキシラパマイシン誘導体をＭＤＲガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍の治療に用いる用途を提供する。一つの特定の態様において、本発明は３９−デスメトキシラパマイシン誘導体をＰ−ｇｐ発現ガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍の治療に用いる用途を提供する。さらにより好適な実施形態において、本発明は３９−デスメトキシラパマイシン誘導体を高Ｐ−ｇｐ発現ガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍の治療に用いる用途を提供する。特に、高Ｐ−ｇｐ発現ガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍は比較対照に比べて２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍または１００倍増大した発現を有する。適当な対照はＰ−ｇｐを発現しないか、Ｐ−ｇｐ発現レベルが低いか、あるいはＭＤＲ機能が低い細胞であり、当業者はそのような細胞ラインを知っているかあるいは認知することができる。適当な細胞ラインを非限定的に例示すれば、ＭＤＡ４３５／ＬＣＣ６、ＳＢＣ−３／ＣＤＤＰ、ＭＣＦ７、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ５２２、Ａ５４９／ＡＴＣＣ、ＥＫＶＸ、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＨＯＰ−１８、ＨＯＰ−９２、ＬＸＦＬ５２９、ＤＭＳ１１４、ＤＭＳ２７３、ＨＴ２９、ＨＣＣ−２９９８、ＨＣＴ−１１６、ＣＯＬＯ２０５、ＫＭ１２、ＫＭ２０Ｌ２、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＡＴＣＣ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＡ−Ｎ、ＢＴ−５４９、Ｔ−４７Ｄ、ＯＶＣＡＲ−３、ＯＶＣＡＲ−４、ＯＶＣＡＲ−５、ＯＶＣＡＲ−８、ＩＧＲＯＶ１、ＳＫ−ＯＶ−３、Ｋ−５６２、ＭＯＬＴ−４、ＨＬ−６０（ＴＢ）、ＲＰＭＩ−８２２６、ＳＲ、ＳＮ１２Ｃ、ＲＸＦ−６３１、７８６−０、ＴＫ−１０、ＬＯＸ  ＩＭＶＩ、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ、ＳＫ−ＭＥＬ−２、ＳＫ−ＭＥＬ−５、ＳＫ−ＭＥＬ−２８、Ｍ１４、ＵＡＣＣ−６２、ＵＡＣＣ−２５７、ＰＣ−３、ＤＵ−１４５、ＳＮＢ−１９、ＳＮＢ−７５、ＳＮＢ−７８、Ｕ２５１、ＳＦ−２６８、ＳＦ−５３９、ＸＦ４９８。
【００９７】
別の観点において本発明は３９−デスメトキシラパマイシン誘導体をＭＤＲガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍の治療用薬剤の調製に用いる用途を提供する。特定の態様において、本発明は３９−デスメトキシラパマイシン誘導体をＰ−ｇｐ発現ガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍の治療用薬剤の調製に用いる用途を提供する。さらにより好適な実施形態において、本発明は３９−デスメトキシラパマイシン誘導体を高Ｐ−ｇｐ発現ガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍の治療用薬剤の調製に用いる用途を提供する。特に、高Ｐ−ｇｐ発現ガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍は比較対照に比べて２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍または１００倍増大した発現を有する。適当な対照は上記のものである。
【００９８】
サンプル中のＰ−ｇｐ発現レベルを決定する方法は後述する。
【００９９】
したがって、別の観点において本発明は、３９−デスメトキシラパマイシン誘導体の治療的有効量を投与することからなるＰ−ｇｐ発現ガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍の治療法を提供する。特定のガン種におけるＰ糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）発現レベルは、限定的ではないがたとえばリアルタイムＲＴ−ＰＣＴ（Ｓｚａｋａｃｓら、２００４年；Ｓｔｅｉｎら２００２年；Ｌａｎｇｍａｎｎら、２００３年；Ａｌｖａｒｅｚら、１９９５年；Ｂｏｙｄら、１９９５年）を含む技術を用いて、免疫組織化学によって（Ｓｔｅｉｎら、２００２年）、またはマイクロアレイを用いて（Ｌｅｅら、２００３年）、当業者により決定することができる。これらの方法は単に例示として挙げたにすぎず、他の適当な方法も当業者に与えられるであろう。
【０１００】
当業者はルーチン的実験によって当該化合物の真菌成長抑制能力を決定することができるであろう（たとえばＢａｋｅｒ，Ｈら、１９７８年；ＮＣＣＬＳ  Ｒｅｆｅｒｎｃｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｂｒｏｔｈ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｆｏｒ  ｙｅａｓｔｓ：Ａｐｐｒｏｖｅｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｍ２７−Ａ、１７（９）、１９９７年）。さらに、当業者はルーチン的実験によって当該化合物の腫瘍細胞成長抑制能力を決定することができるであろう（Ｄｕｄｋｉｎ，Ｌら、２００１年；Ｙｕら、２００１年）。さらに別の観点において本発明化合物は免疫抑制を誘発するのに有用であり、この分野における化合物の効能を決定するためのアッセイは当業者に良く知られている。非限定的例示として、免疫抑制活性−Ｗａｒｎｅｒ，Ｌ．Ｍ．ら、１９９２年；Ｋａｈａｎら（１９９１年）およびＫａｈａｎ＆Ｃａｍａｒｄｏ、２００１年）；同種移植−Ｆｉｓｈｂｅｉｎ，Ｔ．Ｍ．ら、２００２年；Ｋｉｒｃｈｎｅｒら、２０００年；自己免疫／炎症性／喘息−Ｃａｌｓｏｎ，Ｒ．Ｐ．ら、１９９３年；Ｐｏｗｅｌｌ，Ｎ．ら、２００１年；糖尿病Ｉ−Ｒａｂｉｎｏｖｉｔｃｈ，Ａら、２００２年；乾癬−Ｒｅｉｔａｍｏ，Ｓ．ら、２００１年；慢性関節リウマチ−Ｆｏｅｙ，Ａ．ら、２００２年；線維症−Ｚｈｕ，Ｊ．ら、１９９９年；Ｊａｉｎ，Ｓ．ら、２００１年；Ｇｒｅｇｏｒｙら、１９９３年。
【０１０１】
本発明の３９−デスメトキシラパマイシン誘導体の免疫抑制誘発能力はこの目的のための標準的試験において実証することができる。さらに別の観点において本発明の３９−デスメトキシラパマイシン誘導体は抗繊維化、神経再生および抗血管形成のメカニズムに関連して有用であり、当業者はルーチン的実験によって当該化合物の血管形成阻止能力を決定することができるであろう（たとえばＧｕｂａ，Ｍ．ら、２００２年）。当業者はルーチン的実験によって、たとえば薬剤溶出ステント中で、当該化合物を血管超増殖の治療に用いることの有用性を決定することができるであろう（たとえばＭｏｒｉｃｅ，Ｍ．Ｃ．ら、２００２年）。加えて、当業者はルーチン的実験によって当該化合物の神経再生能力を決定することができるであろう（たとえばＭｙｃｋａｔｙｎ，Ｔ．Ｍ．ら、２００２年、Ｓｔｅｉｎｅｒら、１９９７年）。
【０１０２】
本発明はまた、３９−デスメトキシラパマイシン誘導体を薬学的に許容可能なキャリアと共に用いてなる薬剤化合物を提供する。
【０１０３】
臨床試験で用いられているＣＣＩ−７７９およびＲＡＤ００１などのラパマイシンおよび関連化合物は薬理プロファイルが不十分であり、水溶性が不十分であり、バイオアベイラビリティが不十分である。本発明は安定性および／または細胞膜透過性などの物性が向上された３９−デスメトキシラパマイシン誘導体を提供する。当業者は標準的方法を用いて本発明の与えられた化合物の可溶性を容易に決定することができるであろう。代表的な方法が本実施例に示されている。
【０１０４】
さらに、当業者であれば、本発明化合物の薬物動態プロファイルおよびバイオアベイラビリティを、当業者に知られている生体内および生体外の方法、たとえば非限定的な例示として、後述や実施例記載の方法を用いて決定することができるであろうし、他の代替的アッセイも、非限定的例示としてＧａｌｌａｎｔ−Ｈａｉｄｎｅｒら、２０００年およびＴｒｅｐａｎｉｅｒら、１９９８年に記述されたものをここで参照して、これらに記述されているように当業者に良く知られている。化合物のバイオアベイラビリティは多くの要因（水溶性、消化管吸収率、タンパク質結合および代謝の程度など）によって決定され、これらは後述するような生体外試験によって決定することができる。当業者には理解されていることであるが、これら要因の一以上の向上は化合物のバイオアベイラビリティを向上させることに繋がる。あるいは、化合物のバイオアベイラビリティは、下記に詳述するような生体内方法を用いて測定することも可能である。
【０１０５】
Ｃａｃｏ−２透過アッセイ
Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（ＩＶＴ  Ｉｎｃ．、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、米国）によって提供されるような、２４個のウェルＣｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌフォーマット内の合流型Ｃａｃｏ−２細胞（Ｌｉ，Ａ．Ｐ．、１９９２年；Ｇｒａｓｓ，Ｇ．Ｍ．ら、１９９２年；Ｖｏｌｐｅ，Ｄ．Ａ．ら、２００１年）を用いることができる。尖室（apical chamber）は０．１５ｍＬのハンクス平衡緩衝溶液（ＨＢＢＳ）ｐＨ７．４、１％ＤＭＳＯ、０．１ｍＭルシファー・イエローを含む。底室（basal chamber）は０．６ｍＬのＨＢＢＳ  ｐＨ７．４、１％ＤＭＳＯを含む。次いで対照および試験体を湿潤インキュベータ内で３７℃でインキュベートし、１３０ｒｐｍで１時間シェークした。ルシファー・イエローは細胞間（密着結合間）経路を介してのみ透過し、ルシファー・イエローについての高い見かけ透過係数（Ｐａｐｐ）はアッセイ中の細胞損傷を示し、全てのそのようなウェルは拒絶された。プロプラノロール（トランスポーター効果は知られていないが良好な受動的透過性を持つ）およびアセブタロール（Ｐ糖タンパク質による活性的エフラックスにより減衰されて受動的透過性が低い）を対照化合物として用いる。化合物を尖室または底室に適用する（０．０１ｍＭで）ことにより一方向および二方向フォーマットで試験することができる。尖室または底室中の化合物をＨＰＬＣ−ＭＳで分析する。結果を見かけ透過係数Ｐａｐｐ（ｎｍ／ｓ）およびフラックス率（「Ａ対Ｂ」対「Ｂ対Ａ」）として示す。
【０１０６】
Ｐａｐｐ（ｎｍ／ｓ）＝［ボリュームアクセプター／（面積×ドナー）］×（△アクセプター／△時間）
ボリュームアクセプター：０．６ｍＬ（Ａ＞Ｂ）および０．１５ｍＬ（Ｂ＞Ａ）
単分子層の面積：０．３３ｃｍ２
△時間：６０分
フラックス率についての正の値は細胞の尖端面からの活性的エフラックスを示す。
【０１０７】
ヒト肝ミクロソーム（ＨＬＭ）安定性アッセイ
肝ホモジェネートが、ＣＹＰ４５０ｓ（たとえばＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ１Ａ、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｅ１）エステラーゼ、アミダーゼおよびモノオキシゼナーゼを含む対フェースＩ（酸化的）酵素群固有脆弱性化合物の測定を与える。
【０１０８】
試験化合物をヒト肝ホモジェネートに露出し、ＬＣ−ＭＳでその消失を観測することにより半減期（Ｔ１／２）を決定した。０．００１ｍＭで化合物を４０分間、３７℃で、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４でインキュベートした。０．２５ｍｇ／ｍＬタンパク質、ＮＡＤＰＨの飽和レベルのヒト肝ミクロソーム細胞下分画を補因子として用いた。時間インターバルで試験サンプルにアセトニトリルを添加してタンパク質を沈殿させ、代謝を終了させた。サンプルを遠心処理し、ＨＰＬＣ−ＭＳにより親化合物を分析した。
【０１０９】
生体内バイオアベイラビリティアッセイ
生体内アッセイは化合物のバイオアベイラビリティを測定するためにも使用することができる（たとえばＣｒｏｗｅら、１９９９年を参照）。一般的に言えば、化合物を腹腔内（ｉｐ）または静脈（ｉｖ）および経口（ｐｏ）の両方で試験動物に投与し、血液サンプルを所定インターバルで取り出して薬剤のプラズマ濃度の経時的変化を調べる。プラズマ濃度の経時的変化は、標準モデルを用いたパーセンテージとして該化合物の絶対的バイオアベイラビリティを算定するために用いることができる。主なプロトコルの例を下記に挙げる。
【０１１０】
本発明化合物またはその親化合物をｉｖで３ｍｇ／ｋｇまたは本発明化合物または園生や化合物をｐｏで１０ｍｇ／ｋｇマウスに投薬する。血液サンプルを５分、１５分、１時間、４時間および２４時間のインターバルで取り出し、サンプル中の本発明化合物またはその親化合物の濃度をＨＰＬＣで同定する。次いで、プラズマ濃度の経時的変化を用いて、プラズマ濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ、全身循環に到達する不変薬剤の全量に正比例する）、最大（ピーク）プラズマまたは血中薬剤濃度、最大（ピーク）プラズマ薬剤濃度が発生する時間（ピーク時間）、などの主要なパラメータを得るために用いることができる。バイオアベイラビリティの正確な決定に用いられるその他の要因には、該化合物の消失半減期、全身クリアランス、定常状態分布容積およびＦ％が含まれる。次いでこれらのパラメータを非境界要素法または境界要素法で分析して、算定されたパーセンテージのバイオアベイラビリティを得る。この種の方法の一例がＧａｌｌａｎｔ−Ｈａｉｄｎｅｒら、２０００年およびＴｒｅｐａｎｉｅｒら、１９９８年に記載されており、それらをここで参照する。
【０１１１】
上述の３９−デスメトキシラパマイシン誘導体またはその処方は従来のいかなる方法によっても投与可能であり、限定的ではないがたとえば、非経口、経口、局所（口内、舌下、経皮を含む）的に投与することができ、ステントなどの医療器具を用いて投与することができ、吸入法や注射（皮下または筋肉）によっても投与可能である。治療は一度の投薬または一定期間に亘る複数回の投薬で行うことができる。
【０１１２】
本発明化合物を単独で投与することも可能であるが、薬剤処方として一以上の許容されるキャリアと共に存在させることが好ましい。キャリアは本発明化合物とコンパチブルであり且つそのレシピエントに対して有害でないという意味において「許容される」ものでなければならない。好適なキャリアの数例を下記に詳述する。
【０１１３】
本発明の３９−デスメトキシラパマイシン誘導体は単独または他の治療薬と組み合わせて投与することができ、２つ（またはそれ以上）の薬剤の併用投与は各々を単独で投与する場合に比べて格段に少ない投薬量で済み、したがってそれらの副作用を軽減させる。
【０１１４】
一つの実施形態において、免疫抑制の誘導または維持、臓器移植拒絶反応、移植片対宿主拒絶病、自己免疫疾患、神経変性症状、血管炎症疾患の治療のために、３９−デスメトキシラパマイシン誘導体を他の治療薬と併用投与する。好適な治療薬の非限定的例示として、アザチオプリン、コルチコステロイド、シクロフォスファミド、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、ミコフェノール酸モフェチル、ＯＫＴ−３およびＡＴＧなどの免疫調節剤を含む。
【０１１５】
別の実施形態において、３９−デスメトキシラパマイシン誘導体はガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍の治療のために他の治療薬と併用投与される。好適な治療薬の非限定的例示として、メトトレキセート、リューコボリン、アドリアマイシン、プレニゾン、ブレオマイシン、シクロフォスファミド、５−フルオロウラシル、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ドキソルビシン、タモキシフェン、トレミフェン、酢酸メゲストロール、アナストロゾール、ゴセレリン、抗ＨＥＲ２単クローン抗体（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標名）など）、カペシタビン、塩酸ラロキシフェン、ＥＧＦＲ抑制剤（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標）、Ｔａｒｃｅｖａ（商標名）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標名）など）、ＶＥＧＦ抑制剤（Ａｖａｓｔｉｎ（商標名）など）、プロテアソーム抑制剤（Ｖｅｌｃａｄｅ（商標名）など）、Ｇｌｉｖｅｃ（登録商標）、ｈｓｐ９０抑制剤（１７−ＡＡＧなど）を含む。加えて、３９−デスメトキシラパマイシン誘導体は非限定的例示として放射線療法や手術を含む他の療法と組み合わせて投与しても良い。
【０１１６】
一実施形態において、３９−デスメトキシラパマイシン誘導体は血管系疾患の治療のために他の治療薬と併用投与される。好適な治療薬の非限定的例示として、ＡＣＥ抑制剤、アンギオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、フィブリン酸誘導体、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ抑制剤、βアドレナリン遮断剤、カルシウムチャンネル遮断剤、抗酸化剤、抗凝集剤、血小板抑制剤（Ｐｌａｖｉｘ（商標名）など）を含む。
【０１１７】
一実施形態において、３９−デスメトキシラパマイシン誘導体は神経再生の刺激のための他の治療薬と併用投与される。好適な治療薬の非限定的例示として、神経成長因子、グリア細胞由来成長因子、脳由来成長因子、毛様体神経栄養因子、ニューロトロフィン−３などの神経栄養因子を含む。
【０１１８】
一実施形態において、３９−デスメトキシラパマイシン誘導体は感染症の治療のための他の治療薬と併用投与される。好適な治療薬の非限定的例示として、アンフォテリシンＢ、フルサイトシン、エキノカンジン（カスポファンギン、アニデュラファンギンまたはミカファンギンなど）、グリセオフルビン、イミダゾール系またはトリアゾール系抗真菌剤（クロトリマゾール、ミコナゾール、ケトコナゾール、エコナゾール、ブトコナゾール、オキシコナゾール、テルコナゾール、イトラコナゾール、フルコナゾオール、ボリコナゾールなど）を含む。
【０１１９】
当業者には明らかなことであろうが、併用投与には、同一の治療レジメの一部として２またはそれ以上の治療薬を患者に輸送するいかなる手段をも含む。２またはそれ以上の薬剤を単一の処方において同時に投与することも可能であるが、これは必須ではない。これらの薬剤は異なる処方で異なる時期にも投与可能である。
【０１２０】
処方は従来のように単位投薬形態として存在しても要旨、調剤分野で公知のいかなる方法によって調製しても良い。このような方法は、活性成分（本発明化合物）を一以上のアクセサリ成分を構成するキャリアに関連付けるステップを含む。一般的に言えば、活性成分を液体キャリアまたは微細に分割した固体キャリアまたはその両方に均一且つ周到に関連付けた後、必要であれば製品に仕上げることによって処方を調製する。
【０１２１】
本発明の３９−デスメトキシラパマイシン誘導体は通常の場合、活性成分からなる薬剤処方の形態で、任意的に非毒性の有機または無機、酸または基、添加塩、薬学的に許容し得る投薬形態で、経口または何らかの非経口ルートによって投与される。治療すべき疾患や患者および投薬ルートに応じて異なる投薬量で化合物を投与することができる。
【０１２２】
一例として、本発明化合物は、即時的または時間を置いたあるいはリリースコントロールされた投与のために、香料剤や着色剤を含み得る錠剤、カプセル、胚珠、エリキシル、溶液または懸濁液の形態にして、経口、口内または舌下に投与することができる。
【０１２３】
経口投与に適した３９−デスメトキシラパマイシン誘導体の溶液または懸濁液はまた、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドなどの賦形剤、ポリソルベート８０などの分散剤、表面活性剤、Ｐｈｏｓａｌ５０ＰＧ（フォスファチジルコリン、大豆脂肪酸、エタノール、モノ／ジグリセリド、プロピレングリコールおよびアスコルビン酸パルミチン酸エステルからなる）などの溶解剤を含むことができる。
【０１２４】
錠剤には、微結晶セルロース、ラクトース（ラクトース一水和物、ラクトース無水物など）、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素カルシウムおよびグリシンなどの賦形剤、デンプン（好ましくはコーン、ポテトまたはタピオカのデンプン）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウムなどの崩壊剤、ある種の錯体ケイ酸塩、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、マクロゴル８０００、サクロース、ゼラチン、アカシアなどの顆粒結合剤を含むことができる。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル、タルクなどの潤滑剤を含有しても良い。
【０１２５】
類似タイプの固形化合物はゼラチンカプセル内の充填物としても使用可能である。この態様における好適な賦形剤は、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖または高分子ポリエチレングリコールなどである。液体懸濁物および／またはエリキシルの場合、本発明化合物は様々な甘味剤または香料剤、着色剤または顔料、乳化剤および／または懸濁剤、水やエタノール、プロピレングリコール、グリセリンおよびこれらの混合物と組み合わせて用いることができる。
【０１２６】
錠剤は任意の一以上の副成分と共に圧縮または成型によって調製することができる。圧縮法による錠剤は、粉体または粒体のような自由流動形態にある有効成分を適当な機械の中で圧縮することによって調製することができる。該有効成分は、結合剤（ポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、潤滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、崩壊剤（グリコールデンプンナトリウム、架橋ポビドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムなど）、表面活性剤または分散剤と任意に混合して用いることができる。成型法による錠剤は、不活性希釈剤で湿潤された粉状の化合物を適当な機械の中で成型することによって調製することができる。錠剤には任意にコーティングまたはスコアリングが施され、たとえばヒドロキシプロピルメチルセルロースを様々な配合で用いて所望のリリースプロファイルを与えることにより、その中の有効成分のリリースを遅らせ、あるいは制御するように処方することができる。
【０１２７】
経口投与に適した本発明の処方は、各々が所定量の有効成分を含むカプセル剤、カシュ剤、錠剤などの個別ユニットとして、粉状物または粒状物として、水性液または非水性液中の溶液または懸濁液として、あるいは水中油型液体エマルジョンまたは油中水型液体エマルジョンとして、提供することができる。有効成分はボーラス（急速静注）投与、練り薬またはペーストとして提供することもできる。
【０１２８】
口内局所投与に適した処方は、香り付けされた通常はサクロースまたはアカシアまたはトラガントなどの基質内の活性成分からなるロゼンジ、ゼラチン、グリセリン、サクロース、アカシアなどの不活性基質内の活性成分からなる芳香製剤、適当な液体キャリア内の活性成分からなるマウスウォッシュを含む。
【０１２９】
上述の成分に加えて、本発明の処方は、問題となる処方のタイプを考慮して、当業界に公知である他の薬剤を含み得ることを理解しなければならない。たとえば、経口投与に適したものは香料剤を含むことができる。
【０１３０】
局所投与に適合した薬剤化合物は、軟膏、クリーム、ローション、パウダー、溶液、ペースト、ジェル、含浸包帯、スプレー、エアロゾル、オイル、経皮デバイス、ダスティングパウダーなどとして設計することができる。これらの化合物は活性剤を含む従来法で調剤可能である。これらは従来公知の親水性キャリアおよび添加剤、たとえば防腐剤、薬剤の浸透をアシストする溶媒、クリームまたは軟膏内のエモリエント、ローションのためのエタノールまたはオレイルアルコールを含むことができる。このようなキャリアは化合物の約１％〜約９８％存在することができる。より一般的にはこれらは化合物の約８０％を上限として存在する。例示的に述べるにすぎないが、クリームまたは軟膏は、十分な量の親水性材料と化合物の約５〜１０重量％を含む水とを混合して所望のコンシステンシーを有するクリームまたは軟膏として製造することができる。
【０１３１】
経皮投与に適合した薬剤化合物は、レシピエントの表皮と長時間密接し続けるように意図された不連続パッチとして提供することができる。たとえば、活性剤をパッチからイオントフォレーシスして供給することができる。
【０１３２】
口や皮膚などの外部組織への投与のために、化合物は好ましくは局所用の軟膏またはクリームとして提供される。軟膏として設計される場合は、活性剤をパラフィン系または水溶性の軟膏ベースと共に用いることができる。
【０１３３】
あるいは、活性剤を水中油クリームベースまたは油中水ベースと共にクリームに処方しても良い。
【０１３４】
静脈投与の場合、流体ユニットの単位投薬量フォームは、活性剤と、非限定的例示として水やアルコール、ポリオール、グリセリン、植物性油など、特に水が好ましいが、これらの無菌ベヒクルを用いて調製される。活性成分は、使用されるベヒクルと濃度に応じて、ベヒクルに懸濁または溶解され得る。溶液を調製する場合、活性成分は注射のために水に溶解し、適当なバイアルまたはアンプルに注入する前にフィルタ殺菌してシールする。
【０１３５】
好ましくは、局所麻酔薬、防腐剤、緩衝剤などの添加剤がベヒクルに溶解される。安定性を高めるために、バイアルに注入する前に化合物を凍結して真空下で水を除去することができる。凍結乾燥したパウダーは次いでバイアル内でシールされ、使用前に注射用の水バイアルが供給されて液体を再構成する。
【０１３６】
非経口投与懸濁液は、活性成分が溶解される代わりにベヒクル内に懸濁され、また、ろ過を伴わずに殺菌されることを除いて、溶液の場合とほぼ同様に調製される。活性成分は無菌ベヒクルに懸濁される前にエチレン酸化物に晒されることによって殺菌される。好ましくは、活性成分の均一な分散を促進させるために、界面活性剤または湿潤剤が化合物に含まれる。
【０１３７】
本発明化合物は、また、当業界において公知の医療機器を用いて投与することができる。たとえば、一実施例によれば、本発明の薬剤化合物は無針（needleless）皮下注射器を用いて投与することができる。このような注射器は、米国特許第５３９９１６３号、米国特許第５３８３８５１号、米国特許第５３１２３３５号、米国特許第５０６４４１３号、米国特許第４９４１８８０号、米国特許第４７９０８２４号または米国特許第４５９６５５６号に開示されている。本発明に有用な公知のインプラントおよびモジュールの例を挙げれば、制御された速度で投薬するためのインプラント可能なマイクロインフュージョンポンプ（micro-infusion pump）を開示する米国特許第４４８７６０３号、外皮を通して投薬する医療器具を開示する米国特許第４４８６１９４号、厳密な注入速度で薬剤をデリバーするための薬剤インフュージョンポンプを開示する米国特許第４４４７２３３号、連続薬剤デリバリーのための可変速度インプラント可能インフュージョン装置を開示する米国特許第４４４７２２４号、マルチチャンバーのコンパートメントを有する浸透性薬剤デリバリーシステムを開示する米国特許第４４３９１９６号、および、浸透性薬剤デリバリーシステムを開示する米国特許第４４７５１９６号である。一つの特定の実施形態において、３９−デスメトキシラパマイシン誘導体は、ＷＯ０１／８７２６３に記述されるものや関連する刊行物あるいはＰｅｒｉｎ（Ｐｅｒｉｎ、ＥＣ、２００５年）によって記述されるものに対応するような薬剤溶出ステントを用いて投与することができる。その他多くのインプラント、デリバリーシステムおよびモジュールが当業者に知られている。
【０１３８】
本発明の３９−デスメトキシラパマイシン誘導体の１回投薬量は特定の化合物、関係する疾患、サブジェクト、疾患の性質および深刻度、サブジェクトの物質的な条件、および選択された投薬経路によって変わる。適切な１回投薬量は当業者であれば容易に決定することができる。
【０１３９】
薬剤化合物には、投薬方法に依存して、本発明化合物が０．１重量％以上、好ましくは５〜６０重量％、より好ましくは１０〜３０％含まれる。
【０１４０】
当業者には認識し得るように、本発明化合物の１回投薬量の適量と投薬間隔は、治療する症状の性質および程度、投与の形態、経路および部位、治療患者の年齢および状態などによって決定され、最終的には医師が適切な投薬量を決定する。この投薬量は適切である限り頻繁に繰り返され得る。副作用が発症した場合は、通常の臨床プラクティスに基づいて投薬の量および／または頻度を変更または減少させる。
【実施例】
【０１４１】
一般的方法および材料
【０１４２】
材料
すべての試薬は市販品から入手したものであり、特記しない限りさらに精製すること無しに使用した。
【０１４３】
培養
Ｓ．ヒグロスコピカス  ＭＧ２−１０［ＩＪＭＮＯＱＬｈｉｓ］（ＷＯ０４／００７７０９；Ｇｒｅｇｏｒｙら、２００４年）を培地１の寒天プレート（下記）上で２８℃に維持した。芽胞株を培地１で培養した後に調製した。それは、２０％ｗ／ｖグリセリンと１０％ｗ／ｖラクトースを含む蒸留水に保存して−８０℃で保管した。凍結株０．１ｍｌを２５０ｍｌフラスコ中の５０ｍｌ培地２（下記）に接種することによって植物培養菌を調製した。この培養菌を３６〜４８時間、２８℃、３００ｒｐｍでインキュベートした。
【０１４４】
製造法
植物培養菌を２．５〜５％ｖ／ｖで培地３に接種した。６〜７日間にわたり２６℃、３００ｒｐｍで培養した。
【０１４５】
培養法
シクロヘキサンカルボン酸の供給／添加を接種２４〜４８時間後に行い、他に述べられていない限り１〜２ｍＭの最終濃度で供給した。
【０１４６】
培地１：
成分                      ソース        カタログ＃        Ｌ当たり
コーンスターチパウダー    Ｓｉｇｍａ    Ｃ−８１６０      ２．５ｇ
酵母エキス                Ｄｉｆｃｏ    ０１２７−１７        ３ｇ
炭酸カルシウム            Ｓｉｇｍａ    Ｃ５９２９            ３ｇ
硫酸鉄                    Ｓｉｇｍａ    Ｆ８６３３        ０．３ｇ
ＢＡＣＴＯ寒天            Ｄｉｆｃｏ  ２１４０−１０              ２０ｇ
小麦デンプン              Ｓｉｇｍａ    Ｓ２７６０          １０ｇ
水                                                            １Ｌ
その後培地を１２１℃で２０分間オートクレーブ殺菌
【０１４７】
培地２：ＲａｐＶ７菌種培地
成分                                                                                Ｌ当たり
トーストしたニュートリソイ（ＡＤＭ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  Ｌｔｄ）                    ５ｇ
Ａｖｅｄｅｘ  Ｗ８０  デキストリン（Ｄｅｙｍｅｒ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  Ｌｔｄ）    ３５ｇ
コーンスチープ固形物（Ｓｉｇｍａ）                                                      ４ｇ
グルコース                                                                            １０ｇ
（ＮＨ４）２ＳＯ４                                                                        ２ｇ
ラクチン酸（８０％）                                                              １．６ｍＬ
ＣａＣＯ３（Ｃａｌｔｅｃ）                                                              ７ｇ
１ＭのＮａＯＨでｐＨを７．５に調整
その後培地を１２１℃で２０分間オートクレーブ殺菌
殺菌後１６ｍＬの４０％グルコースを各７ｍＬの培地に添加
【０１４８】
培地３：ＭＤ６培地（発酵培地）
成分                                                                                Ｌ当たり
トーストしたニュートリソイ（ＡＤＭ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  Ｌｔｄ）                  ３０ｇ
コーンスターチ（Ｓｉｇｍａ）                                                          ３０ｇ
Ａｖｅｄｅｘ  Ｗ８０  デキストリン（Ｄｅｙｍｅｒ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  Ｌｔｄ）    １９ｇ
酵母（Ａｌｌｉｎｓｏｎ）                                                                ３ｇ
コーンスチープ固形物（Ｓｉｇｍａ）                                                      １ｇ
ＫＨ２ＰＯ４                                                                          ２．５ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４                                                                          ２．５ｇ
（ＮＨ４）２ＳＯ４                                                                      １０ｇ
ＮａＣｌ                                                                                ５ｇ
ＣａＣＯ３（Ｃａｌｔｅｃ）                                                            １０ｇ
ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ                                                                  １０ｍｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                                                                ２．５ｍｇ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                                                                １２０ｍｇ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                                                                  ５０ｍｇ
ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸一水和物）                                  ２１．２ｇ
１ＭのＮａＯＨでｐＨを６．０に調整
殺菌前にＳｉｇｍａのα−アミラーゼ（ＢＡＮ２５０）を１Ｌ培地に添加
培地を１２１℃で２０分間オートクレーブ殺菌
殺菌後０．３５ｍＬの滅菌４０％フルクトースと０．１０ｍＬのＬ−リシン（水中に１４０ｍｇ／ｍＬ、フィルター殺菌済）を各７ｍＬに添加
【０１４９】
培地４：ＲａｐＶ７ａ菌種培地
成分                                                                                Ｌ当たり
トーストしたニュートリソイ（ＡＤＭ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  Ｌｔｄ）                    ５ｇ
Ａｖｅｄｅｘ  Ｗ８０  デキストリン（Ｄｅｙｍｅｒ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  Ｌｔｄ）    ３５ｇ
コーンスチープ固形物（Ｓｉｇｍａ）                                                      ４ｇ
（ＮＨ４）２ＳＯ４                                                                        ２ｇ
ラクチン酸（８０％）                                                              １．６ｍＬ
ＣａＣＯ３（Ｃａｌｔｅｃ）                                                              ７ｇ
１ＭのＮａＯＨでｐＨを７．５に調整
その後培地を１２１℃で２０分間オートクレーブ殺菌
【０１５０】
培地５：ＭＤ６／５−１培地（発酵培地）
成分                                                                                Ｌ当たり
トーストしたニュートリソイ（ＡＤＭ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  Ｌｔｄ）                  １５ｇ
Ａｖｅｄｅｘ  Ｗ８０  デキストリン（Ｄｅｙｍｅｒ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  Ｌｔｄ）    ５０ｇ
酵母（Ａｌｌｉｎｓｏｎ）                                                                ３ｇ
コーンスチープ固形物（Ｓｉｇｍａ）                                                      １ｇ
ＫＨ２ＰＯ４                                                                          ２．５ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４                                                                          ２．５ｇ
（ＮＨ４）２ＳＯ４                                                                      １０ｇ
ＮａＣｌ                                                                              １３ｇ
ＣａＣＯ３（Ｃａｌｔｅｃ）                                                            １０ｇ
ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ                                                                ３．５ｍｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                                                                  １５ｍｇ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                                                                １５０ｍｇ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                                                                  ６０ｍｇ
ＳＡＧ４７１                                                                        ０．１ｍＬ
培地を１２１℃で３０分間オートクレーブ殺菌
殺菌後Ｌ当たり１５ｇフルクトースを添加
４８時間後０．５ｇ／ＬのＬ−リシンを添加
【０１５１】
分析法
方法Ａ
注入容量：０．００５〜０．１ｍＬ（感受性に応じた要求に従う）。ＨＰＬＣをアジレント「Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ」「Ｒａｐｉｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ」カートリッジＳＢ  Ｃ８上に、３ミクロン、３０ｍｍ×２．１ｍｍで、下記移動相で作動させた。
【０１５２】
移動相Ａ：純水中に０．０１％蟻酸
移動相Ｂ：アセトニトリル中に０．０１％蟻酸
流速：１ｍＬ／分
０分時の５％Ｂから２．５分時の９５％Ｂまでリニアグラジエントを用い、４分間９５％Ｂに維持し、次のサイクルまでに５％Ｂに戻した。検出は、２５４ｎｍでのＵＶ吸収および／またはＭｉｃｒｏｍａｓｓｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ−Ｍｉｃｒｏ装置を用いたエレクトロスプレーイオン化質量分析（ポジティブまたはネガティブ）によって行った。
【０１５３】
方法Ｂ
注入容量：０．０２ｍＬ。ＨＰＬＣを３ミクロンＢＤＳ  Ｃ１８  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ（ＴｈｅｒｍｏＨｙｐｅｒｓｉｌ−Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  Ｌｔｄ）カラム上に、１５０ｍｍ×４．６ｍｍで、５０℃に維持し、下記移動相で作動させた。
移動相Ａ：アセトニトリル（１００ｍＬ）、トリフルオラセト酸（１ｍＬ）、１Ｍ酢酸アンモニウム（１０ｍＬ）、脱イオン水と共に１Ｌまで調製
移動相Ｂ：脱イオン水（１００ｍＬ）、トリフルオラセト酸（１ｍＬ）、１Ｍ酢酸アンモニウム（１０ｍＬ）、アセトニトリルと共に１Ｌまで調製
流速：１ｍＬ／分
１０分間で５５％Ｂから９５％Ｂまでリニアグラジエントを用った後、９５％Ｂで２分間、５５％Ｂで０．５分間、５５％Ｂでさらに２．５分間維持した。化合物の検出は２８０ｎｍでのＵＶ吸収によって行った。
【０１５４】
方法Ｃ
ＨＰＬＣシステムとしてＡｇｉｌｅｎｔＨＰ１１００を用い、３ミクロンＢＤＳ  Ｃ１８  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ（ＴｈｅｒｍｏＨｙｐｅｒｓｉｌ−Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  Ｌｔｄ）カラム上に、１５０ｍｍ×４．６ｍｍで、４０℃に維持し、下記移動相で作動させた。
移動相Ａ：脱イオン水
移動相Ｂ：アセトニトリル
流速：１ｍＬ／分
このシステムをＢｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  Ｅｓｑｕｉｒｅ３０００エレクトロスプレー質量分析装置に接続した。５００〜１０００Ｄａｌｔｏｎの走査領域に亘ってポジティブ／ネガティブ切替を用いた。１０分間で５５％Ｂから９５％Ｂまでリニアグラジエントを用いた後、９５％Ｂで２分間、５５％Ｂで０．５分間、５５％Ｂでさらに２．５分間維持した。
【０１５５】
合成法
特記しない限り全ての反応は市場入手可能な乾燥溶媒を用いて無水条件下で行った。エレクトロスプレー源を備えたＢｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  Ｅｓｑｕｉｒｅ３０００＋質量分析装置に連結したＡｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣ上で、ＬＣ−ＵＶ−ＭＳにより反応をモニターした。水：アセトニトリルｖ：ｖ３０：７０〜１００％アセトニトリルの直線勾配で１０分間、次いで１００％アセトニトリルで５分間の無勾配期の処理により、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｈｙｐｅｒｃｌｏｎｅ  カラム、ＢＤＳ  Ｃ１８  ３ｕ（１５０×４．６ｍｍ）において１ｍＬ／分で分解が実行された。
【０１５６】
ＮＭＲスペクトルがＣＤＣｌ３中に記録され、δＨおよびδＣ化学シフトが溶媒（７．２６ｐｐｍおよび７７．０ｐｐｍ）参照付けられる。３９−デスメトキシラパマイシンおよびその誘導体はコンホマーの混合物として存在するので、すべてのアサインメントは主要コンホマーにのみ対応する。
【０１５７】
抗ガン作用のための生体外バイオアッセイ
化合物の抗ガン作用を、単分子層増殖アッセイ中の１２個のヒト腫瘍細胞ラインのパネルにおいて、ＦｒｅｉｂｕｒｇのＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ＯｎｃｏｌｏｇｙｍＯｎｃｏｔｅｓｔ  ＧｍｂＨの研究機関であるＯｎｃｏｓｔｅｓｔ試験場で生体外評価を行った。選択された１２個の細胞ラインの特性を表１に要約して示す。
【０１５８】
【表１】
0005422788.tif 000019
【０１５９】
Ｒｏｔｈら、１９９９年に記述されるように、ヒト腫瘍異種移植片からＯｎｃｏｔｅｓｔ細胞ラインが確立された。ドナー異種移植片の起源はＦｉｅｂｉｇら、１９９９年に記述された。他の細胞ラインが、ＮＣｌ（Ｈ４６０、ＳＦ−２６８、ＯＶＣＡＲ−３、ＤＵ１４５、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）から得られ、またはドイツ国ＢｒａｕｎｓｈｗｅｉｇのＤＳＭＺから購入することができる（ＬＮＣＡＰ）。
【０１６０】
他に特記しない限り、すべての細胞サインは、ＲＰＭＩ１６４０培地と、１０％ウシ胎児血清と０．１ｍｇ／ｍＬゲンタミシン（ＰＡＡ、ドイツ国コルベ）を含む「すぐに混合できる」培地にて、加湿雰囲気（９５％空気、５％二酸化炭素）中で３７℃で培養した。
【０１６１】
単分子層アッセイ−プロトコル１の要約：
変性ヨウ化プロピジウムアッセイを用いて、１２個のヒト腫瘍細胞ラインの成長に対する試験化合物の影響を評価した（Ｄｅｎｇｌｅｒら、１９９５年）。
【０１６２】
要約すれば、トリプシン化によって指数関数的位相培養（exponential phase cultures）から細胞を取り出し、細胞ラインに応じた細胞密度（５〜１０，０００の範囲で変動する細胞数／ウェル）にて９６ウェル底面平滑マイクロタイタープレートに接種してカウントした。２４時間後に回収して指数関数的な増殖を再開させた後、培養培地０．０１ｍｌ（プレート当たり６個の対照ウェル）またはマクベシン（macbecin）含有培地をウェルに添加した。各濃度を３つ培養した。３９−デスメトキシラパマイシンを２つの濃度（０．００１ｍＭおよび０．０１ｍＭ）で適用した。４日間の連続的インキュベーションの後、３９−デスメトキシラパマイシンを用いまたは用いずに細胞培養培地を０．２ｍｌの水性死細胞染色用蛍光色素ＰＩ溶液（７ｍｇ／ｌ）で置換した。生存細胞の割合を測定するため、プレート凍結によって細胞を透過させた。プレートを解凍した後、Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ４０００マイクロプレートリーダー（励起５３０ｎｍ、放出６２０ｎｍ）を用いて蛍光発光を測定して、生存可能な細胞の総数との直接関係を得た。
【０１６３】
増殖抑制が（被処理／対照）×１００（％Ｔ／Ｃ）として表された。活性化合物についてＩＣ５０およびＩＣ７０の値を細胞生存性に対する化合物濃度をプロットすることによって評価した。
【０１６４】
実施例１：３９−デスメトキシラパマイシンの発酵と単離
後述のようにＳ．ヒグロスコピカス  ＭＧ２−１０［ＩＪＭＮＯＱＬｈｉｓ］の培養菌を成長させ、シクロヘキサンカルボン酸（ＣＨＣＡ）で培養することにより３９−デスメトキシラパマイシンを産生した。
【０１６５】
液体培養
Ｓ．ヒグロスコピカス  ＭＧ２−１０［ＩＪＭＮＯＱＬｈｉｓ］の栄養体培養菌を「Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＆  Ｍｅｔｈｏｄｓ」に記述されるようにして培養した。産生培養を栄養体培養菌により０．５ｍＬで５０ｍＬチューブ内の７ｍＬ培地３に接種した。７日間に亘り２６℃、３００ｒｐｍで培養した。１：１アセトニトリルで３０分間シェイクして１ｍＬのサンプルを抽出し、１３，０００回転で１０分間延伸処理し、分析法Ｂに基づいて分析および定量化を行った（「Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＆  Ｍｅｔｈｏｄｓ」参照）。産生物の確認は分析法Ｃ（「Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＆  Ｍｅｔｈｏｄｓ」参照）を用いて質量分析により決定した。
【０１６６】
下記特性に記述した分析データを基に、観察されたラパマイシン相同物が所望の３９−デスメトキシラパマイシンであると認められた。
【０１６７】
発酵
Ｓ．ヒグロスコピカス  ＭＧ２−１０［ＩＪＭＮＯＱＬｈｉｓ］の培地４内の一次的栄養体培養菌を実質的に「Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＆  Ｍｅｔｈｏｄｓ」に記載されるところにより培養した。培地４内の二次的栄養体培養菌を１０％ｖ／ｖ、２８℃、２５０ｒｐｍで２４時間接種した。栄養体培養菌を５％ｖ／ｖで２０Ｌ発酵槽中の培地５（「Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＆  Ｍｅｔｈｏｄｓ」参照）に接種した。６日間、２６℃で培養し、インペラー先端速度を最小速度１．１８ｍｓ−１から最大速度２．７５ｍｓ−１の範囲で変化させることにより０．５ｖｖｍ．＞３０％溶解酸素を維持した。シクロヘキサンカルボン酸の供給を接種の２４時間後および４８時間後に行って、最終濃度２ｍＭを得た。
【０１６８】
抽出と精製
発酵汁（３０Ｌ）を等量メタノールで２時間撹拌した後、遠心処理（１０分間、３５００ｒｐｍ）して細胞をペレット状にした。上清をＤｉａｉｏｎ（登録商標）ＨＰ２０樹脂（４３ｇ／Ｌ）で１．５時間撹拌した後にろ過した。アセトン（合計量７．５Ｌ）で樹脂をバッチ洗浄してラパマイシン相同物を剥ぎ取り、溶剤を減圧下で除去した。得られた水性抽出物を水で２Ｌに希釈し、酢酸エチル（３×２Ｌ）で溶離した。溶剤を減圧下で除去して褐色油を得た（２０．５ｇ）。
【０１６９】
この抽出物をアセトンに溶解し、シリカに乾燥させ、シリカカラム（６×６．５ｃｍ径）に適用し、徐々に比率を変えたアセトン／ヘキサン（２０％−４０％）で抽出した。ラパマイシン相同物含有フラクションをプールし、溶剤を減圧下で除去した。残余物（２．６ｇ）をＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ２０でクロマトグラフィ処理し（３回バッチ）、１０：１０：１クロロホルム／ヘプタン／エタノールで抽出した。半精製されたラパマイシン相同物（１．７ｇ）をＧｉｌｓｏｎ  ＨＰＬＣを用いて逆位相（Ｃ１８）プレパラティブＨＰＬＣにより精製し、２１ｍＬ／分の６５％アセトニトリル／水でＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ２１．２×２５０ｍｍ  Ｌｕｎａ５μｍＣ１８ＢＤＳカラムを溶離した。最も純粋なフラクション（ＨＰＬＣ分析、方法Ｂにより同定）を結合し、溶媒を減圧下で除去して、３９−デスメトキシラパマイシン（５６３ｍｇ）を得た。
【０１７０】
特性
３９−デスメトキシラパマイシンの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは標準（Ｐ．Ｌｏｗｄｅｎ、物理学博士、学位論文、ケンブリッジ大学、１９９７年）のそれと同等であった。13C-NMR (125 MHz), δc (ppm): 215.75, 208.27, 169.19, 166.71 , 140.13, 135.94, 133.61, 130.10, 129.62, 126.80, 126.33, 98.42, 84.77, 84.37, 75.85, 70.91, 67.10, 59.44, 55.82, 51.21 , 46.50, 44.17, 41.39, 40.70, 40.16, 38.74, 38.37, 35.44, 35.26, 35.08, 33.78, 33.64, 33.04, 32.37, 31.22, 30.41 , 27.24, 27.02, 25.27, 21.48, 20.58, 16.24, 15.95, 15.78, 13.74, 13.00, 10.12
【０１７１】
培養抽出物のＬＣＭＳおよびＬＣＭＳｎ分析は、新規ラパマイシン相同物のｍ／ｚ比がラパマイシンのそれよりも３０原子質量単位だけ小さく、メトキシ基の欠乏と一致することを示した。観測されたイオンは、［Ｍ−Ｈ］−８８２．３、［Ｍ＋ＮＨ４］＋９０１．４、［Ｍ＋Ｎａ］＋９０６．２、［Ｍ＋Ｋ］＋９２２．２。ナトリウム付加化合物のフラグメンテーションは、規定の解離経路（図２）（Ｊ．Ａ．Ｒｅａｔｈｅｒ、理学博士、学位論文、ケンブリッジ大学、２０００年）に従い、３９−デスメトキシラパマイシンとして予期されたイオンを与えた。この質量分析解離データは、シクロヘキシル成分を含むＣ２８−Ｃ４２フラグメントにメトキシ欠損が生じている新規ラパマイシン相同物の領域を限定している。
【０１７２】
この質量分析解離データは３９−デスメトキシラパマイシンに完全に合致している。
【０１７３】
実施例２：３９−デスメトキシ−４０−Ｏ−［２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオニル］ラパマイシン
下記工程により３９−デスメトキシラパマイシンから３９−デスメトキシ−４０−Ｏ−［２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオニル］ラパマイシンを合成した。
【０１７４】
２．１  ３９−デスメトキシ−２８−Ｏ−トリメチルシリルラパマイシンの合成
３９−デスメトキシラパマイシン（１７０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）およびイミダゾール（５１ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）を５ｍＬの酢酸エチルに０℃で溶解した。この冷たい溶液にクロロトリメチルシラン（７７ｍｇ、０．０９ｍＬ、０．７１ｍｍｏｌ）を１０分間に亘り滴状で添加した。さらに６０分間撹拌を連続して行って、２８，３９−ビス−Ｏ−トリメチルシリルエーテルの生成を完了した。この期間後、０．４ｍＬの０．５Ｎ硫酸水溶液を添加し、混合物を０℃で２．５時間撹拌した。２０ｍＬの酢酸エチルを添加し、塩水、飽和炭酸水素ナトリウム溶液および水で有機層を洗浄した。硫酸ナトリウムでの乾燥および減圧下での濃縮により、無色の固形物として２８−Ｏ−トリメチルシリルエーテルが産生され、これをさらに精製すること無しに次工程の反応に用いた。1H-NMR (400 MHz, CDCI3), δ (ppm): 4.07 (d, 1H, J=6.5 Hz, 0(28J-H)1 0.00 (s, 9H, 28-O-TMS). 
【０１７５】
２．２  ２，４，６−トリクロロ安息香酸２’，２’，５’−トリメチル−１’，３’−ジオキサン−５’カルボキシル無水物の合成
２，２−ジメトキシプロパン（１３．５ｇ、１３０ｍｍｏｌ）およびρ−トルエンスルホン酸一水和物（１００ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ、０．４ｍｏｌ％）を、アセトン（１００ｍＬ）中の２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸（１３．５ｇ、１００ｍｍｏｌ）溶液に添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌した。この時間の後、炭酸水素ナトリウム溶液を添加し、その混合物をさらに５分間撹拌した。上清を除去し、減圧下で濃縮した。得られた固体物をジエチルエーテル（３×５０ｍＬ）で処理し、組み合わせられた有機抽出物を減圧下で濃縮して白色の固形物１６．２ｇを産生した。1H-NMR (400 MHz, CDCI3), δ (ppm): 4.19 (d, 1H, J=12.0Hz) 3.68 (d, 1 H, J=12.0Hz) 1.45 (s, 1 H) 1.41 (s, 1H) 1.20 (s, 1 H).
【０１７６】
この物質を米国特許５，３６２，７１８の方法で活性化混合無水物に形質転換した。すなわち、アセトニド（１．０４ｇ、５．９８ｍｍｏｌ）を０℃に冷却したＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０．８３ｍＬ、５．９８ｍｍｏｌ）および２，４，６−トリクロロ安息香酸塩化物（０．９３ｍＬ、５．９８ｍｍｏｌ）の滴下添加で処理した。次いで反応物を室温で５時間撹拌した。得られた沈殿物をろ過し、ＴＨＦ（１０ｍＬ）で洗浄した。組み合わされたろ過物質を真空内で還元して白色のアモルファスを産生し、これをさらに精製すること無しに以下において用いた。
【０１７７】
２．３  ３９−デスメトキシラパマイシン  ２８−Ｏ−トリメチルシリルエーテル、２，２，５−トリメチル［１，３−ジオキサン］−５−カルボキシル酸の４０−エステルの合成
実施例２．１からの粗製２８−Ｏ−トリメチルシリル−３９−デスメトキシラパマイシン（２００ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌの３９−デスメトキシラパマイシンから）を２ｍＬのジクロロメタンに溶解した。溶液を０℃に冷却してＤＭＡＰ（１０２ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、１ｍＬジクロロメタン中の２，４，６−トリクロロ安息香酸２’，２’，５’−トリメチル−１’，３’−ジオキサン−５’カルボキシル無水物（１５９ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）溶液を１０分間に亘って添加した。反応混合物を０℃で５時間撹拌し、ＬＣ／ＭＳで形質転換をモニターした。反応混合物を７ｍＬのジクロロメタンで希釈し、５ｍＬの加水により冷却した。有機層を０．５Ｎ硫酸、炭酸水素ナトリウム溶液および水で順次に除去および洗浄した。硫酸ナトリウムでの乾燥および減圧下での濃縮により、無色の泡状物として表題の化合物が産生され、これをさらに精製すること無しに直ちに用いた。MS (ESI) m/z 1111 [M-H]"
【０１７８】
２．４  ３９−デスメトキシラパマイシン−４０−Ｏ−［２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオニル］ラパマイシン
実施例２．３からの粗製３９−デスメトキシラパマイシン−２８−Ｏ−トリメチルシリルエーテル  ２，２，５−トリメチル［１，３−ジオキサン］−５−カルボキシル酸の４０−エステルを２ｍＬアセトンに溶解し、０．５ｍＬの０．５Ｎ硫酸を添加した。反応混合物を室温で５時間撹拌し、次いで５ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム溶液と５ｍＬの水を添加して中和した。混合液を酢酸エチルで抽出し、組み合わされた有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥させた。減圧下での濃縮により無色の固形物が得られ、これをＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ２０にてサイズ排除クロマトグラフィにより精製した。溶離剤にはクロロホルム／ヘプタン／エタノール（ｖ：ｖ：ｖ＝１０：１０：１）を用いた。1H-NMR (500 MHz, CDCI3), δ (ppm): 4.72 (m, 1 H, C(40)-H), 3.87 (m, 2H), 3.69 (m, 2H), 1.03 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCI3), δ (ppm): 175.52, 74.04 (C(40)), 68.73 (2C), 48.90, 17.09. MS (ESI) m/z 1023 [M+Na]+
【０１７９】
実施例３：３９−デスメトキシ−４０−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチルラパマイシン
３．１  ２−（タート−ブチルジメチルシリル）オキシエチルトリフレート
６ｍＬのジクロロメタン中の２−（タート−ブチルジメチルシリル）−エチレングリコール（１２５ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ）および２，６−ルチデンlutidene（０．０８ｍＬ、０．６９ｍｍｏｌ）溶液を−７８℃に冷却した。トリフルオロメタンスルホン酸無水物（０．１１ｍＬ、０．６５ｍｍｏｌ）を５分間に亘って添加し、さらに１５分間−７８℃で撹拌を続けてトリフレートの生成を完了した。このトリフレートを下記３．２に記述の反応に自然位で（in situ）用いた。
【０１８０】
３．２  ４０−Ｏ−［２−（タート−ブチルジメチルシリル）］エチル−３９−デスメトキシラパマイシン
３９−デスメトキシラパマイシン（３００ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）および２，６−ジ−タート−ブチルピリジン（１．５ｍＬ、６．６８ｍｍｏｌ）を室温にて２−（タート−ブチルジメチルシリル）オキシエチルトリフレート（６ｍＬジクロロメタン中に０．６５ｍｍｏｌ）で処理した。この溶液を緩やかな窒素流でその当初容積の１／３に濃縮し、得られた懸濁液をさらに７２時間室温で撹拌した。この期間の後、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（５ｍＬ）および水（５ｍＬ）を添加し、この混合物を３０分間撹拌した。有機層を分離し、溶液相を酢酸エチル（２×５ｍＬ）で抽出した。組み合わされた有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下でのＵＳｈくして無色の油分を得た。ヘキサンからヘキサン／アセトン（ｖ：ｖ＝１：１）の勾配を用いたシリカカラムクロマトグラフィによる精製により無色の固形物としての製品を得た。1H-NMR (500 MHz, CDCI3), δ (ppm): 4.16 (d, 1H, J = 6.5 Hz, C(28)-H), 3.73 (t, 2H, J = 5.7 Hz), 3.52 (t, 2H, J = 5.7 Hz), 0.89 (s, 9H), 0.06 (s, 6H); 13C-NMR (125 MHz, CDCI3), δ (ppm): 76.61 (C-40), 69.31 (CH2), 63.03 (CH2), 25.92 (3C), 18.36, -5.23 (2C). MS (ESI) m/z 1065 [M+Na]+
【０１８１】
３．３  ３９−デスメトキシ−４０−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチルラパマイシン
２ｍＬアセトン中の４０−Ｏ−［２−（タート−ブチルジメチルシリル）］エチル−３９−デスメトキシラパマイシン（１６０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）の溶液を室温にて０．３ｍＬの０．５Ｎ硫酸で処理した。この溶液を室温で３時間放置し、その後５ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム溶液と１０ｍＬの水を添加して冷却した。この混合液を酢酸エチル（３×１０ｍＬ）で抽出し、組み合わされた有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下での濃縮により無色の固形物が得られ、これをＨＰＬＣ（水／アセトンｖｖ：ｖ＝２０／８０）でさらに精製した。1H-NMR (500 MHz, CDCI3), δ (ppm): 4.16 (d, 1H, J = 6 Hz), 3.70 (m, 2H), 3.57 (m, 2H), 3.20 (m,1H, C(40)-H); 13C-NMR (125 MHz, CDCI3), δ (ppm): 78.65 (C-40), 77.20 (C-28), 68.93 (CH2O),62.10 (CH2O).MS (ESI) m/z 951 [M+Na]+
【０１８２】
実施例４：３９−デスメトキシラパマイシンのリパーゼ触媒エステル化を通じた３９−デスメトキシ−４０−Ｏ−［２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオニル］ラパマイシン
無水タート−ブチルメチルエーテル（３．５ｍＬ）中の３９−デスメトキシラパマイシン（７２０ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）、ビニル２，２，５−トリメチル［１，３−ジオキサン］−５−カルボキシル酸（２４４ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ）、リパーゼＰＳ−Ｃ「アマノ」ＩＩ（７２０ｍｇ）および分子篩０．５ｎｍ（２５０ｍｇ）の混合物をアルゴン雰囲気中で４３℃に加熱した。４８時間後ＬＣ／ＭＳモニターは出発物質の完全な形質転換を示した。ＴＨＦ（１０ｍＬ）を添加し、混合物をセライトのパッドでろ過した。この酵素をＴＨＦ（２×１０ｍＬ）で洗浄し、組み合わされた有機抽出物を減圧下で濃縮した。残留物をＴＨＦ（５０ｍＬ）に溶解し、Ｈ２ＳＯ４（１５ｍＬ、０．５Ｎ）を添加した。この溶液を室温で５時間放置した後、ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ、５％）および塩水（５０ｍＬ）の添加により反応物を冷却した。この混合液をＥｔＯＡｃ（３×１００ｍＬ）で抽出し、組み合わされた有機抽出物をＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を除去して半固形物としての製品を得た。フラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン／アセトン  １：１）による精製により無色固形物としての製品を得た。ＮＭＲデータは実施例２．４と同じ。ナトリウム付加物のMS (ESI) m/z 1022 [M+Na]+ 断片化は図３に示す断片化パターンによりm/z 850, 728, 693, 614, 560, 545, 441および431でイオンを与えた。 
【０１８３】
実施例５：３９−デスメトキシ−４０−Ｏ−［２−ヒドロキシエチル  ３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロパノエート］ラパマイシン
無水タート−ブチルメチルエーテル（２ｍＬ）中の３９−デスメトキシ−４０−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチルラパマイシン（４０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）、ビニル２，２，５−トリメチル［１，３−ジオキサン］−５−カルボキシル酸（２５ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）、リパーゼＰＳ−Ｃ「アマノ」ＩＩ（４０ｍｇ）および分子篩０．５ｎｍ（４０ｍｇ）の混合物をアルゴン雰囲気中で４３℃に加熱した。７２時間後ＬＣ／ＭＳモニターは出発物質の完全な形質転換を示した。ＴＨＦ（１０ｍＬ）を添加し、混合物をセライトのパッドでろ過した。この酵素をＴＨＦ（２×１０ｍＬ）で洗浄し、組み合わされた有機抽出物を減圧下で濃縮した。残留物をアセトン（７．５ｍＬ）に溶解し、Ｈ２ＳＯ４（２．５ｍＬ、０．５Ｎ）を添加した。この溶液を室温で２時間放置した後、飽和ＮａＨＣＯ３（１０ｍＬ）および水（１０ｍＬ）の添加により反応物を冷却した。この混合液をＥｔＯＡｃ（３×１０ｍＬ）で抽出し、組み合わされた有機抽出物をＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を除去して黄色っぽい固形物としての製品を得た。７０：３０  ＭｅＣＮ／水から１００％ＭｅＣＮへの勾配を用いてＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ２１．２×５０ｍｍ  Ｌｕｎａ５μｍＣ１８ＢＤＳカラム上でプレパラティブＨＰＬＣにより１５分間精製して、無色固形物としての製品を得た。ナトリウム付加物のMS (ESI) m/z 1067 [M+Na]+ 断片化は図４に示す断片化パターンによりm/z 894, 772, 738, 614, 604, 589, 475および441でイオンを与えた。.
【０１８４】
実施例６  ２７−Ｏ−デスメチル−３９−デスメトキシ−４０−Ｏ−［２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオニル］ラパマイシン
６．１  ２７−Ｏ−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシン、２，２，５−トリメチル［１，３−ジオキサン］−５−カルボキシル酸の４０−エステル
無水タート−ブチルメチルエーテル（２ｍＬ）中の２７−Ｏ−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシン（３０ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）、ビニル２，２，５−トリメチル［１，３−ジオキサン］−５−カルボキシル酸（３４ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）、リパーゼＰＳ−Ｃ「アマノ」ＩＩ（３０ｍｇ）および分子篩０．５ｎｍ（３０ｍｇ）の混合物をアルゴン雰囲気中で４３℃に７２時間加熱した。ＴＨＦ（１０ｍＬ）を添加し、混合物をセライトのパッドでろ過した。この酵素をＴＨＦ（２×１０ｍＬ）で洗浄し、組み合わされた有機抽出物を減圧下で濃縮して、黄色っぽい半固形物としての製品を得た。ヘキサン：アセトン（ｖ：ｖ＝２：１）を用いたフラッシュクロマトグラフィによる精製で薄黄色の固形物としての製品を得た。MS (ESI) m/z 1049 [M+Na]+
【０１８５】
６．２  ２７−Ｏ−デスメチル−３９−デスメトキシ−４０−Ｏ−［２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオニル］ラパマイシン
６．１からの材料をアセトン（６ｍＬ）に溶解し、Ｈ２ＳＯ４（２ｍＬ、０．５Ｎ）を添加した。この溶液を室温で２時間放置した後、飽和ＮａＨＣＯ３（１０ｍＬ）および水（１０ｍＬ）の添加により反応物を冷却した。この混合液をＥｔＯＡｃ（３×１０ｍＬ）で抽出し、組み合わされた有機抽出物をＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を除去して黄色っぽい固形物としての製品を得た。７０：３０  ＭｅＣＮ／水から１００％ＭｅＣＮへの勾配を用いてＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ２１．２×５０ｍｍ  Ｌｕｎａ５μｍＣ１８ＢＤＳカラム上でプレパラティブＨＰＬＣにより１５分間精製して、無色固形物としての製品を得た。ナトリウム付加物のMS (ESI) m/z 1009 [M+Na]+ 断片化は図５に示す断片化パターンによりm/z 836, 679, 600, 560, 531, 431, 427でイオンを与えた。1 H NMR (500 MHz1 CDCI3J δ ppm 4.73 (m, 1 H, C(40)-H), 4.32 (d, J=4.5 Hz, 1 H, 0(27J-H)1 4.19 (d, J=4.5 Hz, 1 H, C(28)-H), 3.89 (m, 2 H), 3.70 (m, 2 H) 1.03 (s, 3 H).
【０１８６】
実施例７：３９−デスメトキシ−４０−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチルラパマイシンおよび３９−デスメトキシ−４０−Ｏ−［２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオニル］ラパマイシンの抗ガン活性の生体外評価
単分子相増殖アッセイ中の１２個のヒト腫瘍細胞ラインのパネルにおいて、３９−デスメトキシ−４０−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチルラパマイシンおよび３９−デスメトキシ−４０−Ｏ−［２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオニル］ラパマイシンの抗ガン活性の生体外評価を、上記一般的方法におけるプロトコル１に記述したところにより変性ヨウ化プロピジウムアッセイを用いて行った。
【０１８７】
結果を下の表２に示す。各結果は２回の実験の平均値を示す。表３は試験細胞ラインに対するこれら化合物についての平均ＩＣ５０およびＩＣ７０を示し、ラパマイシンが対照として示されている。
【０１８８】
【表２】
0005422788.tif 000020
【０１８９】
【表３】
0005422788.tif 000021
【０１９０】
実施例８：生体外結合アッセイ
ＦＫＢＰ１２
ＦＫＢＰ１２は化学的変性剤である塩酸グアニジン（ＧｄｎＨＣｌ）中で可逆的にアンフォールドし、このアンフォールドをタンパク質の内在蛍光における変化によって観測した（Ｍａｉｎら、１９９８年）。ＦＫＢＰ１２の天然状態を特異的に結合し安定させるリガンドは、タンパク質がより高い化学的変性剤濃度でアンフォールドするように変性曲線をシフトする（Ｍａｉｎら、１９９９年）。安定性の相違から、下記式を用いてリガンド結合定数を求めることができる。
【０１９１】
【数１】
0005422788.tif 000022
ここで△Ｇａｐｐは遊離およびリガンド結合形態の間のアンフォールドの自由エネルギーにおける見掛け上の相違、△ＧＨ２ＯＤ−Ｎは遊離タンパク質水中アンフォールド自由エネルギー、［Ｌ］はリガンド濃度、Ｋｄはタンパク質−リガンド複合体の解離定数である（Ｍｅｉｅｒｉｎｇら、１９９２年）。アンフォールドの自由エネルギーは下記式を用いてアンフォールド変位中間点に関連付けることができる。
【０１９２】
【数２】
0005422788.tif 000023
ここでｍＤ−Ｎは与えられたタンパク質と与えられた変性剤についての定数であって残余物のアンフォールドへの露出度変化に比例する（Ｔａｎｆｏｒｄ１９６８年およびＴａｎｆｏｒｄ１９７０年）。［Ｄ］５０％はアンフォールド中間点に対応する変性剤濃度である。我々は△ＧＬＤ−ＮをＦＫＢＰ１２の安定性におけるラパマイシンと未知リガンド（同一リガンド濃度）の相違として下記のように定義する。
【０１９３】
【数３】
0005422788.tif 000024
ここで＜ｍＤ−Ｎ＞はアンフォールド変位の平均ｍ値であり、△［Ｄ］５０％はラパマイシン−ＦＫＢＰ１２アンフォールド変位と未知リガンド−ＦＫＢＰ１２複合体アンフォールド変位の中間点の相違である。［Ｌ］＞Ｋｄの条件では△△△ＧＤ−Ｎを下記式から２つの化合物の相対的Ｋｄｓに関連付けることができる。
【０１９４】
【数４】
0005422788.tif 000025
ここでＫｒａｐｄはラパマイシンの解離定数、Ｋｘｄは未知リガンドＸの解離定数である。したがって下記式が得られる。
【０１９５】
【数５】
0005422788.tif 000026
各変性曲線のフィッティングはｍＤ−Ｎのための値を生成し、この値を用いてｍ平均値＜ｍＤ−Ｎ＞および△［Ｄ］５０％、したがってＫｘｄを算出することができる。０．２ｎＭのＫｒａｐｄの文献値が用いられる。
【０１９６】
幾つかの場合においては、試験化合物の低い溶解性の故に、ラパマイシン対照実験におけるよりも低い試験化合物濃度が用いられた。これらの場合において、試験化合物濃度とラパマイシン対照濃度との相違を下記式を用いて考慮した。
【数６】
0005422788.tif 000027
【０１９７】
【表４】
0005422788.tif 000028
【０１９８】
ｍＴＯＲ
ｍＴＯＲの抑制は、ｍＴＯＲ経路およびｐ７０Ｓ６キナーゼおよびＳ６の代用マーカーのリン酸化レベルの測定によって間接的に確立されている（Ｂｒｕｎｎら、１９９７年；Ｍｏｔｈｅ−Ｓａｔｎｅｙら、２０００年；ＴｅｅおよびＰｒｏｕｄ、２００２年；ＨｕａｎｇおよびＨｏｕｇｈｔｏｎ、２００２年）。
【０１９９】
ＨＥＫ２９３細胞をＦＬＡＧがタグされたｍＴＯＲおよびｍｙｃがタグされた受容体と共感染させ、２４時間培養後、一晩血清飢餓させた。細胞を１００ｎＭインシュリンで刺激した後、収穫し、３回の凍結／融解サイクルで溶解した。溶解物をプールし、当量をｍＴＯＲ／受容体複合物のためのＦＬＡＧ抗体と免疫沈降させた。免疫沈降体を次のように処理した：化合物（０．００００１〜０．００３ｍＭ）で処理したサンプルを３０分間３０℃でＦＫＢＰ１２／ラパマイシン、ＦＫＢＰ１２／３９−デスメトキシラパマイシン誘導体またはベヒクル（ＤＭＳＯ）でプレインキュベートし、非処理サンプルをキナーゼ緩衝液中でインキュベートした。免疫沈降体を次いで３ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭのＭｎ２＋およびＧＳＴ−４Ｅ−ＢＰ１の基質存在下でキナーゼアッセイに生体外適用した。４倍サンプルバッファで反応を停止させ、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理し、ＰＶＤＦ膜に移して、Ｐｈｏｓｐｈｏ−４Ｅ−ＢＰ１（Ｔ３７／４６）のためにプルーブした。ウエスタンブロットバンドをＪ画像を用いた画像分析（http://rsb.info.nih.gov/ij/）により計量した。図６Ａはラパマイシン（黒塗り四角）および３９−デスメトキシ−４０−Ｏ−［２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオニル］ラパマイシン（黒塗り三角）についての用量反応曲線を示す。図６Ｂはラパマイシン（黒塗り四角）および３９−デスメトキシ−４０−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチルラパマイシン（黒塗り三角）についての用量反応曲線を示す。
【０２００】
代替的に、ＨＥＫ２９３細胞を６つのウェルプレートに接種して２４時間プレインキュベートし、一晩中血清飢餓させた。次いで細胞をベヒクルまたは化合物で３０分間３０℃で予備処理し、１００ｎＭインシュリンで３０分間３０℃で刺激し、３回の凍結／融解サイクルで溶解し、タンパク質濃度を分析した。等量タンパク質を供給してＳＤＳ−ＰＡＧＥジェル上で分離した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に湿潤転写し、Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ６（Ｓ２３５／３６）またはＰｈｏｓｐｈｏ−ｐ７０  Ｓ６Ｋ（Ｔ３８９）のためにプルーブした。ウエスタンブロットバンドをＪ画像を用いた画像分析（http://rsb.info.nih.gov/ij/）により計量した。
【０２０１】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【０２０２】
【図１】ラパマイシンの構造を示す。
【図２】３９−デスメトキシラパマイシンの断裂経路を示す。
【図３】３９−デスメトキシ−４０−Ｏ−［２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオニル］ラパマイシンの断裂経路を示す。
【図４】３９−デスメトキシ−４０−Ｏ−［２−ヒドロキシエチル  ３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロパノアート］ラパマイシンの断裂経路を示す。
【図５】２７−Ｏ−デスメチル−３９−デスメトキシ−４０−Ｏ−［２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオニル］ラパマイシンの断裂経路を示す。
【図６】３９−デスメトキシ−４０−Ｏ−［２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオニル］ラパマイシン（Ａ−黒塗三角）および３９−デスメトキシ−４０−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチルラパマイシン（Ｂ−黒塗り三角）のｍＴＯＲ抑制活性をラパマイシン（黒塗り四角）と比較して示す。
【図１】
0005422788.tif 000029
【図２】
0005422788.tif 000030
【図３】
0005422788.tif 000031
【図４】
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【図５】
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【図６】
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