(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）陽イオン性界面活性剤を用いて安定化されている被験試料から得られる沈殿をｐＨ７ないし９の緩衝剤、塩基、及び両親媒性試薬を含む可溶化溶液を用いて可溶化し、混合物を得ること；
（ｂ）溶解溶液が３〜１０Ｍの濃度のリチウム塩、緩衝剤及び両親媒性試薬を含むが、グアニジウム塩および尿素を含まない、７より大きいｐＨに緩衝された溶解溶液と前記混合物を接触させて単離試料を作製すること；
（ｃ）単離試料中のＲＮＡを含む核酸が固相担体へ結合するように、単離試料を固相担体と接触させること；
（ｄ）固相担体を一つ以上の洗浄溶液で洗浄して、ＲＮＡを含む結合した核酸以外の物質を除去すること；および
（ｅ）ＲＮＡを得るために、結合したＲＮＡを固相担体から溶出すること
を含む、ＲＮＡを含む被験試料からＲＮＡを単離するための方法。
【請求項２】
（ａ）陽イオン性界面活性剤を用いて安定化されている被験試料から得られる沈殿をｐＨ７ないし９の緩衝剤、塩基、及び両親媒性試薬を含む可溶化溶液を用いて可溶化し、混合物を得ること；
（ｂ）溶解溶液が３〜１０Ｍの濃度のリチウム塩、緩衝剤及び両親媒性試薬を含むが、グアニジウム塩および尿素を含まない、７より大きいｐＨに緩衝された溶解溶液と前記混合物を接触させて単離試料を作製すること；
（ｃ）単離試料を、（１）緩衝剤、リチウム塩、および両親媒性試薬を含む結合溶液、または（２）リチウム塩およびアルコールを含む洗浄溶液のどちらかと接触させて結合試料を作製すること；
（ｄ）結合試料中のＤＮＡを含む核酸が固相担体へ結合するように、結合試料を固相担体と接触させること；
（ｅ）固相担体を一つ以上の洗浄溶液で洗浄して、ＤＮＡを含む結合した核酸以外の物質を除去すること；および
（ｆ）ＤＮＡを得るために、結合したＤＮＡを固相担体から溶出すること
を含む、ＤＮＡを含む被験試料からＤＮＡを単離するための方法。
【請求項３】
可溶化溶液中の緩衝剤がトリスＨＣｌである、請求項１または２の方法。
【請求項４】
可溶化溶液中のトリスＨＣｌが１０から２０ｍＭの濃度で存在する、請求項３の方法。
【請求項５】
可溶化溶液中の塩基が、２０から５０ｍＭの濃度で存在するトリス塩基である、請求項１または２の方法。
【請求項６】
可溶化溶液中の両親媒性試薬が洗浄剤である、但し、前記洗浄剤は、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）類、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）類、テルジトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）及びイゲパール（Ｉｇｅｐａｌ）からなる群から選択される、請求項１から５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
可溶化溶液がさらにキレート剤を含む、請求項１または２の方法。
【請求項８】
可溶化溶液中のキレート剤がエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）である、請求項７の方法。
【請求項９】
可溶化溶液中のＥＤＴＡが１から２０ｍＭの濃度で存在する、請求項８の方法。
【請求項１０】
（ａ）被験試料を、グアニジウム化合物と、およびアルコールと接触させ、混合物を得ること；
（ｂ）前記混合物を遠心分離して、粗溶解物沈澱および上清を生じること；
（ｃ）上清を除去すること；
（ｄ）溶解溶液が３〜１０Ｍの濃度のリチウム塩、緩衝剤及び両親媒性試薬を含むが、グアニジウム塩および尿素を含まない、７より大きいｐＨに緩衝された溶解溶液と粗溶解物沈殿を接触させて単離試料を作製すること；
（ｅ）単離試料中のＲＮＡを含む核酸が固相担体へ結合するように、単離試料を固相担体と接触させること；
（ｆ）固相担体を一つ以上の洗浄溶液で洗浄して、ＲＮＡを含む結合した核酸以外の物質を除去すること；および
（ｇ）ＲＮＡを得るために、結合したＲＮＡを固相担体から溶出すること
を含む、ＲＮＡを含む被験試料からＲＮＡを単離するための方法。
【請求項１１】
前記被験試料が血液試料である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
溶解溶液中の緩衝剤がトリス−ＨＣｌであり、溶解溶液のｐＨが少なくとも８であり、溶解溶液中の緩衝剤のｐＫａが少なくとも８であり、溶解溶液中の緩衝剤が５０から１５０ｍＭの濃度で存在し、並びに／または溶解溶液中の両親媒性試薬が洗浄剤および／もしくは界面活性剤である、但し、前記洗浄剤は、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）類、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）類、テルジトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）及びイゲパール（Ｉｇｅｐａｌ）からなる群から選択される、請求項１から１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
溶解溶液が塩基をさらに含む、請求項１から１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
溶解溶液中のリチウム塩が塩化リチウムまたは臭化リチウムである、請求項１から１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
溶解溶液中の両親媒性試薬が、一つ以上の洗浄剤および／または一つ以上の界面活性剤の組み合わせである、但し、前記洗浄剤は、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）類、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）類、テルジトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）及びイゲパール（Ｉｇｅｐａｌ）からなる群から選択される、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
溶解溶液がさらに、キレート剤を含む、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
溶解溶液中のキレート剤が１から１００ｍＭの濃度で存在する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
溶解溶液中のキレート剤がＥＤＴＡまたはＣＤＴＡである、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
試料を、プロテイナーゼＫを含むプロテイナーゼＫ溶液と接触させることをさらに含む、請求項１から１８の何れか１項に記載の方法。
【請求項２０】
プロテイナーゼＫが１０から２５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
結合溶液中の緩衝剤が、ｐＨ少なくとも７のトリス緩衝剤である、請求項２に記載の方法。
【請求項２２】
結合溶液中のトリス緩衝剤が５０から１５０ｍＭの濃度で存在する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
結合溶液がさらに、結合溶液のｐＨを７以上に調整するための塩基を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
塩基がアルカリ金属水酸化物である、請求項１３又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
アルカリ金属水酸化物が、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたは水酸化リチウムである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
結合溶液中のリチウム塩が、塩化リチウムまたは臭化リチウムである、請求項２及び２１から２５の何れか１項に記載の方法。
【請求項２７】
結合溶液中のリチウム塩が５から１５Ｍの間の濃度で存在する、請求項２及び２１から２６の何れか１項に記載の方法。
【請求項２８】
結合溶液中の両親媒性試薬が洗浄剤および／または界面活性剤である、但し、前記洗浄剤は、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）類、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）類、テルジトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）及びイゲパール（Ｉｇｅｐａｌ）からなる群から選択される、請求項２及び２１から２７の何れか１項に記載の方法。
【請求項２９】
界面活性剤がジエチレングリコールモノエチルエーテル（ＤＧＭＥ）である、請求項１２又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
洗浄剤および／または界面活性剤が５から１５％の濃度で存在する、請求項６、１２、２８及び２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
結合溶液中の両親媒性試薬が、一つ以上の洗浄剤および／または一つ以上の界面活性剤の組み合わせである、但し、前記洗浄剤は、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）類、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）類、テルジトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）及びイゲパール（Ｉｇｅｐａｌ）からなる群から選択される、請求項２及び２１から３０の何れか１項に記載の方法。
【請求項３２】
一つ以上の洗浄溶液が５０％より大きい濃度でアルコールを含む、請求項１から３１の何れか１項に記載の方法。
【請求項３３】
一つ以上の洗浄溶液中のアルコールがエタノールまたはメタノールである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
第一の洗浄溶液（洗浄溶液Ｉ）が濃度４から１０Ｍのアルカリ金属塩を含む、請求項１から３３の何れか１項に記載の方法。
【請求項３５】
洗浄溶液Ｉ中のアルカリ金属塩がナトリウムまたはリチウム塩である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
洗浄溶液Ｉがさらに濃度２５から８０％のアルコールを含む、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
第二の洗浄溶液（洗浄溶液ＩＩ）が、６ないし８のｐＨでの緩衝剤および濃度５０から９０％のアルコールを含む、請求項１から３６の何れか１項に記載の方法。
【請求項３８】
洗浄溶液ＩＩ中の緩衝剤が濃度５０から１５０ｍＭのトリス−ＨＣｌである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
洗浄溶液ＩＩがキレート剤をさらに含む、請求項３７又は３８に記載の方法。
【請求項４０】
洗浄溶液ＩＩ中のキレート剤が濃度１から２０ｍＭのＥＤＴＡまたはＣＤＴＡである、請求項３９に記載の方法
【請求項４１】
一つ以上の洗浄溶液が、濃度１０から５０％でアルコールを、濃度２から５Ｍでアルカリ金属塩を、および濃度２５から１００ｍＭでキレート剤を含むＤＮＡ分解酵素洗浄溶液である、請求項１または１０に記載の方法。
【請求項４２】
アルコールがエタノールまたはメタノールである、請求項３６、３７又は４１に記載の方法。
【請求項４３】
ＤＮＡ分解酵素洗浄溶液中のキレート剤がＥＤＴＡ、ＣＤＴＡまたはクエン酸塩である、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項４４】
ＤＮＡ分解酵素洗浄溶液中のアルカリ金属塩がリチウム塩である、請求項４１から４３の何れか１項に記載の方法。
【請求項４５】
リチウム塩が塩化リチウムまたは臭化リチウムである、請求項３５又は４４に記載の方法。
【請求項４６】
固相担体が、シリカ、セルロース、酢酸セルロース、ニトロセルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、またはポリフッ化ビニリデン、またはその組み合わせの成分を含む、請求項１から４５の何れか１項に記載の方法。
【請求項４７】
生物材料を固相担体と接触させる前に、固相担体がＲＮＡ分解酵素溶液で前処理される、請求項２に記載の方法。
【請求項４８】
段階（ａ）におけるアルコールが、エタノールまたはメタノール、もしくはメタノールおよびエタノールの組み合わせである、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項４９】
段階（ａ）におけるアルコールが、３０％ないし１００％の濃度で存在する、請求項１０に記載の方法。
【請求項５０】
段階（ａ）におけるアルコールが、７０％ないし９５％の濃度で存在する、請求項１０に記載の方法。
【請求項５１】
グアニジウム化合物が塩酸グアニジンを含む処方である、請求項１０に記載の方法。
【請求項５２】
（ａ）試料を第一および第二のチューブに分けること；
（ｂ）請求項１の方法にしたがって、第一のチューブ中の試料からＲＮＡを単離すること；および
（ｃ）請求項２の方法にしたがって、第二のチューブ中の試料からＤＮＡを単離すること
を含む、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を試料から単離するための方法。
【請求項５３】
（ａ）陽イオン性界面活性剤を用いて安定化されている試料から得られる沈殿をｐＨ７ないし９の緩衝剤、塩基、及び両親媒性試薬を含む可溶化溶液で可溶化し、混合物を得ること；
（ｂ）混合物を第一および第二のチューブに分けること；
（ｃ）下記を含む方法にしたがって、第一のチューブ中の混合物からＲＮＡを単離すること
（ｉ）溶解溶液が３〜１０Ｍの濃度のリチウム塩、緩衝剤及び両親媒性試薬を含むが、グアニジウム塩および尿素を含まない、７より大きいｐＨに緩衝された溶解溶液と試料を接触させて単離試料を作製すること；
（ｉｉ）単離試料中のＲＮＡを含む核酸が固相担体へ結合するように、単離試料を固相担体と接触させること；
（ｉｉｉ）固相担体を一つ以上の洗浄溶液で洗浄して、ＲＮＡを含む結合した核酸以外の物質を除去すること；および
（ｉｖ）ＲＮＡを得るために、結合したＲＮＡを固相担体から溶出すること；および
（ｄ）下記を含む方法にしたがって、第二のチューブ中の混合物からＤＮＡを単離すること
（ｉ）溶解溶液が３〜１０Ｍの濃度のリチウム塩、緩衝剤及び両親媒性試薬を含むが、グアニジウム塩および尿素を含まない、７より大きいｐＨに緩衝された溶解溶液と混合物を接触させて単離試料を作製すること；
（ｉｉ）単離試料を、（１）緩衝剤、リチウム塩、および両親媒性試薬を含む結合溶液、または（２）リチウム塩およびアルコールを含む洗浄溶液のどちらかと接触させて結合試料を作製すること；
（ｉｉｉ）結合試料中のＤＮＡを含む核酸が固相担体へ結合するように、結合試料を固相担体と接触させること；
（ｉｖ）固相担体を一つ以上の洗浄溶液で洗浄して、ＤＮＡを含む結合した核酸以外の物質を除去すること；および
（ｖ）ＤＮＡを得るために、結合したＤＮＡを固相担体から溶出すること
を含む、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を試料から単離するための方法。
【請求項５４】
別々に包装された
（ａ）ｐＨ７〜９の緩衝剤、塩基、及び両親媒性試薬を含む可溶化溶液；
（ｂ）３〜１０Ｍの濃度のリチウム塩、緩衝剤及び両親媒性試薬を含むが、グアニジウム塩および尿素を含まない、７より大きいｐＨに緩衝された溶解溶液；
（ｃ）４〜１０Ｍの濃度のアルカリ金属塩を含む洗浄I溶液または緩衝剤、リチウム塩及び両親媒性試薬を含む結合溶液；
（ｄ）ｐＨ６ないし８の緩衝剤及５０〜９０％の濃度のアルコールを含む洗浄II溶液；および
（ｅ）ＲＮＡ、ＤＮＡ、または両方の試料からの単離のための手順書
を含むパッケージを含む、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは両方を単離するためのキットであって、請求項１から５５の何れか１項に記載の方法に用いるためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本特許出願は２００４年１１月５日出願の米国出願第６０／６２５，５１３号明細書、および２００５年９月１３日出願の米国出願第６０／７１６，４５１号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
本特許出願は、参照により全体が本開示に含まれる、記載の出願の利益を主張する。
【０００３】
本発明は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または両方を、試料から単離するための材料および方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）といった核酸は、分子生物学の分野において研究および臨床分析のために広く用いられている。ＤＮＡおよびＲＮＡを生物試料から単離するためのいくつかの方法が存在し、その方法は細胞の破壊核酸を溶液中へ遊離することを伴う。ＲＮＡは分解に非常に敏感である。したがって、ＲＮＡをＲＮＡ分解酵素（たとえばＲＮＡ分解酵素）による酵素消化から保護するための方法もまた存在する。ＲＮＡは次いで、ＤＮＡ、タンパク質、および他の夾雑物から分離されうる。これらの単離工程は通常、別々の段階で、ＲＮＡアーゼ活性を阻害する条件下で細胞が溶解され、次いで精製が行われる、段階的な方法で実施される。ＲＮＡの以降の精製前に試料の保存を可能にするため、回収の時点でＲＮＡを安定化するための方法もまた開発されている。
【０００５】
現在の核酸安定化製品システムでは、精製の限られた選択肢しか可能でない。たとえば、これらの安定化製品システムおよびその試薬は、回収チューブの製造元によって特に設計された精製製品だけにユーザーを限定する。その方法は、専用の資本設備が必要であるか、使用が難しいか、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を同一の試料から単離する能力が限られている点で、汎用性が限定されている。したがって、ユーザーは、ＲＮＡまたはＤＮＡのための「安定化」チューブを選択する必要があり、およびそれぞれのための別々の核酸単離キットを購入する必要がある。
【発明の開示】
【０００６】
本発明によって扱われる処方および方法は、ＲＮＡ、またはＤＮＡ、または両方の、同一の試料からの抽出および精製を可能にし、そのようにしてユーザーに利益を提供する。加えて、本発明によって扱われる処方および方法は、多数の製造元の回収チューブで使用でき、それによって容易な、柔軟な、および費用対効果の高い解決手法を、選択する回収チューブにかかわらずユーザーに提供できる。
【０００７】
生物試料中の核酸の保存および安定化のための回収チューブおよび試薬の開発と共に、ＲＮＡ、またはＤＮＡ、または両方を、同一の試料から効果的に単離する選択肢をエンドユーザーに可能にする方法が必要とされる。現在、ユーザーは、ＤＮＡおよびＲＮＡ用に別々のキットおよび別々の回収チューブを購入しなければならない。試料の保存または安定化用に、市販されるいくつかの方法が存在する。しかし、同一のチューブからＤＮＡおよびＲＮＡの両方の抽出を可能にする材料および方法もキットも入手可能でない。
【０００８】
本発明は、安定化試料からの粗溶解物の調製、粗溶解物をｐＨ約７ないし９の緩衝剤、塩基、両親媒性試薬を含む可溶化溶液と接触させること；溶解溶液が複合化塩を含む、約７より大きいｐＨに緩衝された溶解溶液と接触させて単離試料を作製すること；単離試料中の実質的に未分解のＲＮＡを含む核酸が固相担体へ結合するように、単離試料を固相担体と接触させること；固相担体を一つ以上の洗浄溶液で洗浄して、実質的に未分解のＲＮＡを含む結合した核酸以外の物質を除去すること；および実質的に純粋なおよび未分解のＲＮＡを得るために、結合した実質的に未分解のＲＮＡを固相担体から溶出することを含む、ＲＮＡを含む被験試料からＲＮＡを単離するための方法を提供する。
【０００９】
本発明はまた、安定化試料からの粗溶解物の調製、粗溶解物をｐＨ約７ないし９の緩衝剤、塩基、両親媒性試薬を含む緩衝剤を含む可溶化溶液と接触させること；溶解溶液が複合化塩を含む、約７より大きいｐＨに緩衝された溶解溶液と試料を接触させて単離試料を作製すること；単離試料を、（１）緩衝剤、リチウム塩、および両親媒性試薬を含む結合溶液、または（２）リチウム塩およびアルコールを含む洗浄溶液のどちらかと接触させて結合試料を作製すること；結合試料中の実質的に未分解のＤＮＡを含む核酸が固相担体へ結合するように、結合試料を固相担体と接触させること；固相担体を一つ以上の洗浄溶液で洗浄して、実質的に未分解のＤＮＡを含む結合した核酸以外の物質を除去すること；および実質的に純粋なおよび未分解のＤＮＡを得るために、結合した実質的に未分解のＤＮＡを固相担体から溶出することを含む、ＤＮＡを含む被験試料からＤＮＡを単離するための方法も提供する。
【００１０】
本発明はまた、試料を第一および第二のチューブに分けること（または可溶化溶液を試料に添加した後、試料を分けること；上記に記載されたＲＮＡ単離方法にしたがって、第一のチューブ中の試料からＲＮＡを単離すること；および上記に記載されたＤＮＡ単離方法にしたがって、第二のチューブ中の試料からＤＮＡを単離することを含む、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を試料から単離するための方法も提供する。
【００１１】
本発明はまた、ＲＮＡを含む被験試料から実質的に純粋なおよび未分解のＲＮＡを単離するための方法も提供する。本方法は、テンパス（Ｔｅｍｐｕｓ）（商標）安定化剤（たとえば米国特許第５，９７２，６１３号明細書および国際出願第ＷＯ ９９／２９８４０明細書を参照）といったグアニジウム安定化剤で安定化した被験試料を、アルコールと接触させること；被験試料を遠心分離して、粗溶解物沈澱および上清を生じること；上清を除去すること；溶解溶液が複合化塩を含む、約７より大きいｐＨに緩衝された溶解溶液と粗溶解物沈殿を接触させて単離試料を作製すること；単離試料中の実質的に未分解のＲＮＡを含む核酸が固相担体へ結合するように、単離試料を固相担体と接触させること；固相担体を一つ以上の洗浄溶液で洗浄して、実質的に未分解のＲＮＡを含む結合した核酸以外の物質を除去すること；および実質的に純粋なおよび未分解のＲＮＡを得るために、結合した実質的に未分解のＲＮＡを固相担体から溶出することを含む。この工程で用いられうるアルコールは、エタノールまたはメタノール、もしくはメタノールおよびエタノールの組み合わせでありうる。アルコールは、濃度約３０％ないし１００％、または７０％ないし９５％で存在する。なお、遠心分離工程の後に上清を被験試料から除去する際に、安定化剤からグアニジウムが実質的に除去されて、その結果、粗溶解物沈殿がグアニジウムを実質的に含まないようにすることに留意するべきである。「実質的に含まない」の語は、安定化剤の初期開始量の１％未満（たとえば、０．５％または０．１％未満、またはさらには０．０１％未満）が、粗溶解物中に存在することを意味する。残留しうる任意の残存グアニジウムは、その後の精製工程の化学作用に影響を及ぼさない。
【００１２】
本発明は、核酸を含む物質を可溶化するための処方を提供し、処方は、濃度約１０から２０ｍＭおよびｐＨ約７ないし９のトリス−ＨＣｌ、濃度約２０ないし５０ｍＭのトリス塩基、濃度約５から１５％のトリトン−Ｘ、および濃度約１から２０ｍＭのＥＤＴＡを含む。
【００１３】
本発明は、（別々に包装された）可溶化溶液、溶解溶液、洗浄I溶液または結合溶液、洗浄II溶液、およびＲＮＡ、ＤＮＡ、または両方の試料からの単離のための手順を含むパッケージを含む、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは両方を単離するためのキットを提供する。
【００１４】
本発明の別の特徴および効果は、下記の詳細な説明からおよび請求項から明らかである。特に定義されない限り、本願明細書で用いられるすべての技術的および科学的な用語は、本発明が帰属する分野で当業者によって一般的に理解される意味を有する。本明細書中に言及されるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参照は、参照により全体が本開示に含まれる。コンフリクトする場合には、定義を含めた本明細書が優先するだろう。開示された材料、方法および実施例は、単に例示的であり限定を意図していない。本明細書中に記載されたのと類似または均等の方法および物質が、本発明を実施するために用いられうることを、当業者は理解するであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
核酸精製または単離
生物科学、医学および薬学における発展は、遺伝子を研究することへの関心を高めており、およびさまざまな試料から核酸を得るための洗練された方法の必要性を強めている。たとえば、リボ核酸は細胞の遺伝的期限および機能的活動の幅広い情報を提供する。そのような情報は、たとえば、臨床で、感染症の診断、発がん遺伝子を発現している細胞の検出、遺伝疾患の検出、宿主防御機構の状態監視、患者における遺伝子発現に対する薬物の影響の検討、および薬物の副作用および毒性作用の検討に使用されうる。
【００１６】
液相精製および固相精製の２つの一般的分類に分けられる、多数の核酸精製方法が存在する。液相精製では、核酸は液相中に留まり、一方で不純物は沈澱および／または遠心分離によって除去される。代替的に、核酸不純物が残る一方で核酸が沈澱で取り出される。固相精製では、核酸は固相担体へ結合し、一方で不純物は選択的に溶出される。たとえば、液相精製によって単離されたＲＮＡが液相中に留まり、一方で不純物が沈澱および／または遠心分離といった過程によって除去される。固相精製では、ＲＮＡは固相担体へ結合し、一方でＤＮＡ、タンパク質、およびリン脂質といった不純物は選択的に溶出される。両方の精製分類は、実質的に未分解のＲＮＡを得ることを目的とする。両方の精製戦略は、多数の段階および、しばしば危険な試薬を必要とする従来の方法、およびより少数の段階および通常は危険性のより低い試薬を必要とするより迅速な方法を使用する。ＲＮＡ精製の場合には、開始材料（たとえば、生物材料）が細胞を含む場合、液相および固相方法の両方が細胞またはウイルスの同時破壊、または溶解段階を必要とする。破壊、または溶解段階は、ＤＮＡ、脂質、糖質、タンパク質などといった夾雑物と混合したＲＮＡを結果として生じる。そのような混合物はまた、実質的に未分解のＲＮＡを得ることに干渉しないように、除去および／または不活性化されなければならない、ＲＮＡを分解するＲＮＡ分解酵素を含む。
【００１７】
従来、液相ＲＮＡ単離方法は液相−液相抽出（すなわち、フェノール−クロロホルム）およびアルコール沈澱を使用している。一つの一般的に用いられている。液相−液相ＲＮＡ抽出方法は、チョムゼンスキー（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ）およびサッチ（Ｓａｃｃｈｉ）の「酸グアニジウムフェノール」抽出法である（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ Ｐ．，Ｓａｃｃｈｉ Ｎ．，酸グアニジウムチオシアナート−フェノール−クロロホルム抽出によるＲＮＡ単離の一段階法（Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｂｙ ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ），Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １６２： １５６−９ ［１９８７］；米国特許第５，９４５，５１５号、第５，３４６，９９４号、および第４，８４３，１５５号明細書）。この方法は：（１）試料をグアニジウムイソチオシアナート（ＧＩＴＣ）溶液で抽出し、酸性媒体、フェノール、およびクロロホルムを連続して加える；（２）フェノールによって変性されたタンパク質が、中間層に見られる核酸から除去されうるように、混合物を遠心分離して相を分離させる；（３）沈澱し、およびそれによってＲＮＡを濃縮するように、アルコールを加える；および（４）精製されたＲＮＡを洗浄しおよび再水和することを含む。この方法はＲＮＡの精製を確実にすることが実証されているが、クロロホルムおよびフェノールといった危険な試薬を使用し、労働集約的であり、および有機試薬が精製試料中に残存しやすい。
【００１８】
陽イオン性洗浄剤による核酸の沈殿は、液相技術の別の一例である（米国特許第５，９８５，５７２号、第５，７２８，８２２号および第５，０１０，１８３号明細書（マックファーレン（ＭａｃＦａｒｌａｎｅ））。たとえば、米国特許第５，９８５，５７２号は、選択された第４級アミン界面活性剤を用いる生物試料からＲＮＡを単離する方法を開示している。危険でない液相精製方法が、低いｐＨの溶解および沈殿試薬を用いてヒース（Ｈｅａｔｈ）（米国特許第５，９７３，１３７号明細書）によって開示された。しかし液相法には、長い沈殿段階を含み、およびしたがって自動化が困難であるという重大な欠点がある。そのようにして、ハイスループットＲＮＡ精製の必要性が固相方法の開発に役立った。一部の実施形態では、ＲＮＡ単離は、グアニジウムイソチオシアナート中で細胞を均質化することを含み、次いで、ナトリウム酢酸塩およびフェノール、およびクロロホルム／イソアミルアルコールが連続的に添加される。グアニジウムのカオトロピック塩を用いる、細胞を溶解しおよびＲＮＡ分解酵素を阻害するためのいくつかの方法が公知である。遠心分離後ＲＮＡは、アルコールの添加によって、上層から沈殿する。別の方法は、加熱フェノールの細胞懸濁液への添加、次いでアルコール沈殿を含む。これらの方法はユーザーにとって危険であり、および用いられる試薬の処理は費用がかかりうる。
【００１９】
実質的に未分解のＤＮＡは、当業者に公知のさまざまな液相および固相方法によって単離されうる。たとえばＤＮＡは、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）他，１９８９，『分子クローニング：実験の手引き』（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），コールドスプリングハーバーラボラトリー社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），ニューヨーク）またはパーシング（Ｐｅｒｓｉｎｇ）他（編），（１９９３），『診断分子細菌学：原理および応用』（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（全米微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ），ワシントンＤＣ）に記載されたような定型的な技法によって単離されうる。
【００２０】
固相ＤＮＡ精製では、膜濾過器、磁気ビーズ、金属酸化物、およびラテックス粒子を含む多数の固相担体が用いられてきた。おそらく、最も広く用いられる固相担体は、シリカ系粒子である（たとえば、米国特許第５，２３４，８０９号（ブーム（Ｂｏｏｍ）他）；国際公開第ＷＯ ９５／０１３５９号（コルパン（Ｃｏｌｐａｎ）他）；米国特許第５，４０５，９５１号（ウッドアード（Ｗｏｏｄａｒｄ））；国際公開第ＷＯ ９５／０２０４９（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ））号；第ＷＯ ９２／０７８６３号（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ）明細書を参照）。たとえば、米国特許第５，２３４，８０９号（ブーム（Ｂｏｏｍ）他）明細書中に開示された方法は、ＤＮＡをシリカ粒子へ結合するのに高濃度のカオトロピック溶液を用い、および全血からＤＮＡを精製するのに６つの遠心分離段階および５つの試薬を必要とする。この方法の欠点は、微粒子懸濁液の使用、多数の遠心分離段階の使用、およびグアニジウムイソチオシアナートおよびアセトンといった危険な試薬の使用である。
【００２１】
別の例では、米国特許第５，４９６，５６２号（バーゴイン（Ｂｕｒｇｏｙｎｅ））明細書は、４回のフェノール洗浄および５回のイソプロパノール洗浄中に４つの試薬を使用する、乾燥血液を含むセルロース濾紙を精製する方法を記載する。乾燥後に、濾紙の小片が正方形から切り取られ、およびＰＣＲ増幅のための基質として直接用いられる。結合ＤＮＡの分析のための使用にもかかわらず、これらの方法は依然として多数の段階および危険な試薬が必要である。
【００２２】
試料
生物試料といった試料は、さまざまな手段によって回収されうる。たとえば、試料を回収しおよび保存するために試料回収容器が用いられる。一部の実施形態では、回収容器は弾力性のある停止具を有するガラスまたはプラスチック製チューブである。別の実施形態では採血チューブが用いられ、チューブは真空にされて大量の血液をチューブへ回収する。一部の実施形態では、特定の試験のための血液試料を調製するために、回収チューブは、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）といったさまざまな添加物を有しうる。別の実施形態では、添加物は抗血液凝固剤である。一部の場合では、抗血液凝固添加物は水溶液中で緩衝されたクエン酸塩またはヘパリンである。別の場合では、水性クエン酸塩は指定された量の血液試料と組み合わされて、特定の試験を実施するために必要な抗凝固剤の量を決定する。しかし、添加物は試料中の核酸を安定化しないため、こういった処理された回収チューブは主として血清学的試験のために用いられる。
【００２３】
試料−回収容器は、さまざまな試料を回収しおよび／または保存するために用いられる。特定の実施形態では、試料回収容器は、生物流体または試料（たとえば、全血、骨髄、血斑、血清、血漿、軟膜調製物、唾液および脳脊髄液、口腔スワブ、培養細胞、細菌の細胞懸濁液、心臓、肝臓および脳といった動物の固体組織、糞および尿といった体内老廃物、空気、水、堆積物または土壌から採取された環境試料、植物組織、酵母、細菌、ウイルス、マイコプラズマ、菌類、原生動物、リケッチア、および他の小さな微生物細胞を回収しおよび／または保存するのに用いられる。別の実施形態では、試料回収容器は、生物材料の溶解物、ホモジネート、または部分的に精製された試料を回収しおよび／または保存するのに用いられる。別の場合では、生物材料は、核酸の粗混合物または部分的に精製された混合物を含む。
【００２４】
最近紹介されているいくつかの市販製品は、生物試料（たとえば、血液）を回収チューブ中に保存し、およびまた核酸を「安定化」する。「安定化」は、ＲＮＡを分解から保護するのに、および以降の核酸の精製のための試料の保存を可能にするのに、特に有用である。プレアナリティクス社（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）（商標）（カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ））は、ＤＮＡまたはＲＮＡの安定化のための採血チューブを提供する（米国特許第６，６１７，１７０号明細書）。これらのチューブの商品名はパックスジーン（ＰＡＸｇｅｎｅ）（商標）ＤＮＡ回収チューブ、およびパックスジーン（ＰＡＸｇｅｎｅ）（商標）ＲＮＡ回収チューブである。これらのチューブは、シュウ酸テトラデシルトリメチルアンモニウムおよび酒石酸の処方を使用する。パックスジーン（ＰＡＸｇｅｎｅ）（商標）血液チューブは、全血の採血および血液試料中のＲＮＡの安定化に用いられるプラスチック真空チューブである。プレアナリティクス社（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）（商標）はさらに、これらの回収チューブからのＤＮＡまたはＲＮＡのどちらかの精製用の別々のキットを提供する。
【００２５】
アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）（カリフォルニア州フォスターシティ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ））は、ＲＮＡの安定化のための採血チューブを市場に出しおよび販売している。これらのチューブの商品名は、テンパス（Ｔｅｍｐｕｓ）（商標）ＲＮＡ回収チューブである。これらのチューブは、塩酸グアニジンを含む処方を使用する。この産物の溶液は、室温にて最高５日間全血由来の総ＲＮＡを安定化させる。
【００２６】
アンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ）（テキサス州オースチン（Ａｕｓｔｉｎ））は、ＲＮＡ安定化のための試薬を提供する（米国特許第６，５２８，６４１号明細書）。この試薬の商品名は、ＲＮＡレーター（ＲＮＡｌａｔｅｒ）（商標）溶液である。この試薬は硫酸アンモニウムの処方を使用する。ＲＮＡレーター（ＲＮＡｌａｔｅｒ）（商標）は、無傷の未凍結組織、および細胞試料中の細胞ＲＮＡを安定化させおよび保護する、水性の組織および細胞保存試薬である。ＲＮＡレーター（ＲＮＡｌａｔｅｒ）（商標）は、無傷で未凍結の組織および細胞試料中の細胞ＲＮＡを安定化させおよび保護する貯水組織および保存用の記憶試薬である。ＲＮＡレーター（ＲＮＡｌａｔｅｒ）（商標）は、直ちに試料を処理するまたは以降の処理のために液体窒素中で試料を凍結させる必要性をなくす。ユーザーは、少なくとも一つの寸法が０．５ｃｍ未満となるよう保存する組織試料を切断し、および試料から核酸を精製する準備ができるまで組織試料を５倍量のＲＮＡレーター（ＲＮＡｌａｔｅｒ）（商標）中に浸す。
【００２７】
オメガバイオテク社（Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏ−Ｔｅｋ）は、ＲＮＡの安定化のための試薬を市場に出しおよび販売している。この試薬の商品名はＲＮＡセーファー（ＲＮＡｓａｆｅｒ）（商標）安定化試薬である。この試薬はひとたび試料に塗布されると、細胞および組織を透過し、および室温にてＲＮＡ分解酵素を不活性化する。試料は、ＲＮＡセーファー（ＲＮＡｓａｆｅｒ）（商標）安定化試薬中で−２０°Ｃにて最長１２ヶ月まで保存されうる。
【００２８】
本発明の方法
試薬
本発明は、いくつかの分類の試薬：希釈溶液、可溶化溶液、溶解溶液、プロテイナーゼＫ溶液、結合溶液、洗浄溶液、および溶出溶液を扱う。
【００２９】
（ｉ）希釈溶液：一部の実施形態では、粗溶解物の調製を円滑にするために、安定剤の存在下で、希釈剤が生物材料へ添加される。テンパス（Ｔｅｍｐｕｓ）（商標）溶液の製造元（アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．））は、ＰＢＳを使用するよう指定している。パックス（ＰＡＸ）システムは希釈溶液を必要としない。下記の実施例４に記載される一実施形態では、本工程の頑健性を改善するためにアルコールが使用された。
【００３０】
（ｉｉ）可溶化溶液：可溶化溶液は、遠心分離後に試料沈澱を溶解して粗溶解物を生じるのに用いられる。一部の実施形態では、可溶化溶液処方は、緩衝剤、塩基、洗浄剤または界面活性剤またはその混合物といった両親媒性試薬、および随意的なキレート剤を含む。たとえば、可溶化溶液は、トリスＨＣｌといった緩衝材を、ｐＨ７〜９（たとえば、ｐＨ７．１、７．３、７．５、７．８、８．０、８．２、８．６、８．８、８．９、または９）で含みうる。一部の実施形態では、緩衝剤濃度は１０〜２０ｍＭ（たとえば、１０．５ｍＭ、１１ｍＭ、１１．７ｍＭ、１２ｍＭ、１２．５、ｍＭ、１３ｍＭ、１３．６ｍＭ、１４ｍＭ、１４．２ｍＭ、１４．８ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、または１９．５ｍＭ）でありうる。塩基濃度は、２０〜５０ｍＭ（たとえば、２１ｍＭ、２５ｍＭ、２７ｍＭ、３１ｍＭ、３５ｍＭ、３８ｍＭ、４２ｍＭ、４７ｍＭの、または４９ｍＭのトリス塩基）でありうる。一部の場合では、可溶化溶液はさらに両親媒性試薬を含みうる。両親媒性試薬は、炭化水素鎖のような疎水性官能基に結合した親水基を有しおよび界面活性を有する化合物または分子を含む。一部の場合では、両親媒性試薬は洗浄剤である。陰イオン性、陽イオン性、および両性イオン性洗浄剤が使用されうる。一部の場合には、非イオン性洗浄剤が核酸単離に使用される。別の実施形態では、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）類の非イオン洗浄剤が使用される（たとえば、ツイーン−２０、ツイーン−４０、ツイーン−６０、ツイーン−８０など）。一部の場合では、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）類洗浄剤が使用される（たとえば、Ｘ−１００、Ｘ−１１４、ＸＬ−８０Ｎなど）。別の場合には、テルジトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）（たとえば、ＸＤ、ＴＭＮ−６）、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）またはイゲパール（Ｉｇｅｐａｌ）（たとえば、ＮＰ−４０）洗浄剤が使用される。一部の実施形態では、非イオン性洗浄剤は濃度５〜１５％（たとえば、約５％、７％、８％、１０％、１２％、または１４％のトリトン−Ｘ）で使用される。別の実施例では、キレート剤エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）が濃度１〜２０ｍＭ（たとえば、５〜１０ｍＭ、６〜９ｍＭ、７〜８ｍＭ、８ｍＭ、または７．５ｍＭ）で添加される。
【００３１】
（ｉｉｉ）溶解溶液：溶解溶液は、核酸を放出するのに効率的な（たとえば、生物試料中の細胞の）溶解を可能にし、核酸−分解酵素の活性を効果的に阻害し、および選択した固相担体へ核酸が結合するのを可能にする。本発明の溶解溶液は、（トリス−ＨＣｌといった）緩衝剤、（ナトリウム塩類たとえば塩化ナトリウム、またはリチウム塩類たとえば塩化リチウムまたは臭化リチウム、といった）アルカリ金属塩、（洗浄剤、または界面活性剤、またはそれらの混合物といった）両親媒性試薬、および随意的に（ＥＤＴＡまたはＣＤＴＡといった）キレート試薬を含む。本発明の溶解溶液は、グアニジウム塩類、尿素などといった強いカオトロピック物質の添加を必要としない点で独特である。グアニジウム塩類および尿素は、水の構造を破壊し、およびそれによって、疎水性相互反応の強さを低下させる傾向があり、結果として他の溶質分子に対する急激な作用を生じるカオトロピック塩である。たとえば、尿素は、水中に溶解される際に、タンパク質の二次、三次、および四次構造を破壊し、および引き続きＲＮＡからのタンパク質の解離を引き起こす。グアニジウム塩類および尿素は、吸熱性反応によって水中に溶解する。グアニジウム塩類および尿素の両方は、相対的なカオトロピック強度にしたがって陽イオンおよび陰イオンを格付けする広く用いられている系である、ホフマイスター（Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ）シリーズによって定義されるように、強いカオトロピック塩であると考えられる（Ｆ．ホフマイスター（Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ），『塩類の作用の理解について』（Ｏｎ ｔｈｅ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓａｌｔｓ）， Ａｒｃｈ． Ｅｘｐ． Ｐａｔｈｏｌ． Ｐｈａｒｍａｋｏｌ．（ライプツィヒ（Ｌｅｉｐｚｉｇ））２４（１８８８）２４７−２６０）。
【００３２】
強いカオトロピック塩とは異なり、アルカリ金属塩（たとえば、塩化ナトリウム、塩化リチウムおよび臭化リチウム）の水中での反応は発熱反応であり、および強いコスモトロピックなリチウムイオンによって表される猛烈なイオン−双極子相互作用、および結果として生じる高い溶解度を示す。このような差は、グアニジウム塩類のような強いカオトロピック物質と、本発明のアルカリ金属塩特に塩化リチウムとの差を示す。
【００３３】
溶解溶液の第一の成分は、溶液のｐＨを維持する緩衝剤（たとえば、トリス緩衝剤または任意の公知の緩衝剤）である。たとえば、緩衝剤のｐＨは、少なくとも約８、少なくとも約８．５、または少なくとも約９でさえ（たとえば、８．１、８．４、８．６、８．７、８．９、９．１、または９．５）ありうる。緩衝剤は、少なくとも約８（たとえば、８．１、８．３、８．５、８．６、８．８、または８．９）のｐＫａを有してもよく、および濃度５０〜１５０ｍＭ（たとえば、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１２０ｍＭ、または１４０ｍＭ）で使用されうる。一部の実施形態では、トリス緩衝剤が適切な緩衝剤である。一部の場合では、ｐＨ８．０および濃度１００ｍＭを有するトリス緩衝剤が使用される。一部の別の実施形態では、塩基が溶解溶液のｐＨを調整するのに使用されうる。塩基は、溶液のｐＨを７以上（たとえば、ｐＨ７．５、８、８．５、または９．０）へと増加させることができるものでありうる。一部の場合では、塩基はアルカリ金属水酸化物でありうる。こういったアルカリ金属水酸化物は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、および水酸化リチウムを含むがそれらに限定されない。
【００３４】
溶解溶液の別の成分は、タンパク質、リン脂質などといった他の夾雑物のではなく核酸が優先的に固相担体へ結合できるよう、核酸に独特の結合特性を与える複合化塩（たとえば、ＲＮＡ−複合化塩）である。一部の実施形態では、こういった複合化塩は、ナトリウム塩、または塩化リチウムまたは臭化リチウムのようなリチウム塩といった、任意の公知の複合化塩でありうる。塩は濃度３〜１０Ｍ（たとえば、４Ｍ、５Ｍ、６Ｍ、７Ｍ、８Ｍ、または９Ｍ）で存在しうる。その理由は、ＤＮＡおよびＲＮＡの固相担体への優先的な結合は高濃度のアルカリ金属塩によって強化されるからである。特定の実施形態では、塩化リチウムは溶解溶液中で濃度４Ｍで使用される。
【００３５】
溶解溶液は、さらに一つ以上の両親媒性試薬を含む。両親媒性試薬は、炭化水素鎖のような疎水性官能基に結合した親水基を有しおよび界面活性を有する化合物または分子を含む。一部の実施形態では、両親媒性試薬は洗浄剤である。陰イオン性、陽イオン性、および両性イオン性洗浄剤のすべてが使用されうるが、核酸単離は非イオン性洗浄剤の使用によって最適に達成される。任意の非イオン性洗浄剤が使用されうるが、非イオン性洗浄剤の例は、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）類（ツイーン−２０、ツイーン−４０、ツイーン−６０、ツイーン−８０など）、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）類（Ｘ−１００、Ｘ−１１４、ＸＬ−８０Ｎなど）、テルジトール類（Ｔｅｒｇｉｔｏｌｓ）（ＸＤ、ＴＭＮ−６など）およびノニデット類（Ｎｏｎｉｄｅｔｓ）またはイゲパール（Ｉｇｅｐａｌ）（ＮＰ−４０など）の洗浄剤である。非イオン性洗浄剤は濃度５〜１５％（たとえば、約１０％、１１％、１２％、１３％、または１４％）で使用されうる。別の実施形態では、両親媒性試薬はジエチレングリコールモノエチルエーテル（ＤＧＭＥ）といった界面活性剤である。界面活性剤は、濃度５〜１５％（たとえば、６％、１０％、１１％、１２％、１３％、または１４％）で使用されうる。一部の場合では、洗浄剤および界面活性剤の組み合わせが使用されうる。一部の場合では、洗浄剤および界面活性剤、トリトン−ＸおよびＤＧＭＥの組み合わせが使用される。この組み合わせは、濃度５〜１５％（たとえば、１０％、１１％、１２％、１３％、または１４％）でありうる。たとえば組み合わせは、５％のトリトン−Ｘおよび５％のＤＧＭＥである。
【００３６】
ＲＮＡのような核酸の分解を防止するために、ヌクレアーゼ遊離水が溶解溶液中に使用される。一部の実施形態では、キレート剤も、夾雑する核酸の分解を防止するのに使用されうる。キレート剤の使用は、追加的な夾雑問題を引き起こしうる核酸ポリマーのより小さい断片への分解を防止する。キレート剤は、濃度１〜１００ｍＭ（たとえば、２ｍＭ、５ｍＭ、８ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３５ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、６５ｍＭ、７５ｍＭ、８５ｍＭ、または９５ｍＭ）で、または濃度１〜１０ｍＭ（たとえば、１．５ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、または９ｍＭ）で存在しうる。一部の場合では、キレート剤ＥＤＴＡが使用される。一部の場合では、キレート剤ＣＤＴＡが使用される。
【００３７】
本発明の溶解溶液は有利である。中性から高ｐＨ緩衝剤中における高濃度の複合化塩および高濃度の洗浄剤の独特の組み合わせは、フェノール、クロロホルムおよびグアニジウム塩類といった試薬の使用を伴うことなく、（ＲＮＡ分解酵素といった）核酸に有害な酵素を不活性化する。加えて、溶液は核酸に高い結合特性を与え、その結果核酸は選択された固相担体へ強く結合する。
【００３８】
（ｉｖ）随意的なプロテイナーゼＫ溶液：一部の実施形態では、ＲＮＡ精製の間、ユーザーは追加的なプロテイナーゼＫ段階を実施する。一部の実施形態では、ＤＮＡ精製の間、ユーザーは追加的なプロテイナーゼＫ段階を実施する。適切なプロテイナーゼＫ溶液は、約１０〜２５ｍｇ／ｍＬ（たとえば、１０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、または２５ｍｇ／ｍＬ）でプロテイナーゼＫを含む。一部の場合では、適切なプロテイナーゼＫ溶液は、濃度２０ｍｇ／ｍＬでプロテイナーゼＫを有する。
【００３９】
（ｖ）結合溶液：ＤＮＡの固相担体への結合を改善するために、安定化試料からＤＮＡを精製する際に結合溶液が使用されうる。結合は、塩濃度の大幅な増加によって、または脱水、またはその両方によって、改善されうる。本発明は、下記の成分を有する結合溶液を扱う：緩衝剤、アルカリ金属塩、および洗浄剤または界面活性剤またはそれらの混合物といった両親媒性試薬。
【００４０】
結合溶液の第一の成分は、溶液のｐＨを維持する緩衝剤である。たとえば、ｐＨは少なくとも約７（たとえば、７．５、８、８．５、９、または９．５）でありうる。緩衝剤は濃度５０〜１５０ｍＭ（たとえば、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１２０ｍＭ、または１４０ｍＭ）で使用されうる。一部の実施形態では、トリス緩衝剤が適切な緩衝剤である。随意的に、塩基が結合溶液のｐＨを調整するのに使用されうる。塩基は、溶液のｐＨを７以上（たとえば、ｐＨ７．５、８、８．５、または９．０）へと増加させることができるものでありうる。一部の実施形態では、塩基はアルカリ金属水酸化物でありうる。こういったアルカリ金属水酸化物は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、および水酸化リチウムを含む。
【００４１】
結合溶液の別の成分は、タンパク質、リン脂質などといった他の夾雑物よりも、核酸が優先的に固相担体へ結合できるよう、核酸に独特の結合特性を与える複合化塩である。たとえば、こういった複合化塩は、ナトリウム塩、または塩化リチウムまたは臭化リチウムのようなリチウム塩といった、任意の公知の複合化塩でありうる。塩は濃度５〜１５Ｍ（たとえば、約６Ｍ、７Ｍ、８Ｍ、９Ｍ、１０Ｍ、１１Ｍ、１２Ｍ、１３Ｍ、あるいは約１４Ｍ）で存在しうる。その理由は、ＤＮＡの固相担体への優先的な結合は高濃度のアルカリ金属塩によって強化されるからである。
【００４２】
結合溶液の別の成分は、両親媒性試薬である。両親媒性試薬は、炭化水素鎖のような疎水性官能基に結合した親水基を有しおよび界面活性を有する化合物または分子を含む。一部の実施形態では、両親媒性試薬は洗浄剤である。陰イオン性、陽イオン性、および両性イオン性洗浄剤のすべてが使用されうるが、核酸単離は非イオン性洗浄剤の使用によって最適に達成される。任意の非イオン性洗浄剤が使用されうるが、非イオン性洗浄剤の例は、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）類（ツイーン−２０、ツイーン−４０、ツイーン−６０、ツイーン−８０など）、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）類（Ｘ−１００、Ｘ−１１４、ＸＬ−８０Ｎなど）、テルジトール類（Ｔｅｒｇｉｔｏｌｓ）（ＸＤ、ＴＭＮ−６など）およびノニデット類（Ｎｏｎｉｄｅｔｓ）またはイゲパール（Ｉｇｅｐａｌ）（ＮＰ−４０など）の洗浄剤である。非イオン性洗浄剤は濃度５〜１５％（たとえば、約１０％、１１％、１２％、１３％、または１４％）で使用されうる。別の実施形態では、両親媒性試薬はジエチレングリコールモノエチルエーテル（ＤＧＭＥ）といった界面活性剤である。界面活性剤は、濃度５〜１５％（たとえば、６％、１０％、１１％、１２％、１３％、または１４％）で使用されうる。一部の場合では、洗浄剤および界面活性剤の組み合わせが使用されうる。一部の場合では、洗浄剤および界面活性剤、トリトン−ＸおよびＤＧＭＥの組み合わせが使用される。この組み合わせは、濃度５〜１５％（たとえば、１０％、１１％、１２％、１３％、または１４％）でありうる。たとえば組み合わせは、５％のトリトン−Ｘおよび５％のＤＧＭＥである。
【００４３】
洗浄剤または界面活性剤は、陰イオン性、陽イオン性、両性イオン性、または、非イオン性でありうる。一実施形態では、非イオン性洗浄剤が実施される。ＳＤＳのような一部の荷電した洗浄剤は、より高い濃度の塩溶液中には可溶化されたままでなく、および実際は、急速に沈殿する傾向がありうる。しかしながら、固相担体を前処理するために、こういった荷電した洗浄剤を、本発明の一実施形態に記載された条件を含むがそれらに限定されない特定の実験条件下で使用することができる。非イオン性洗浄剤の例は、ツイーン、トリトン、テルジトールおよびノニデットまたはイゲパール類の洗浄剤を含む。一実施形態では、界面活性剤はＤＧＭＥ（ジエチレングリコールモノエチルエーテル）である。ＤＮＡ精製の特定の場合では、試薬の数を減少することによってキットを簡易化するために、洗浄Ｉが結合溶液として使用されうる。
【００４４】
（ｖｉ）洗浄溶液：本発明はまた、タンパク質、リン脂質などといった非核酸夾雑物を核酸から除去するべく、核酸が結合した固相担体を洗浄するのに使用される一つ以上の洗浄溶液も教示する。洗浄溶液は、濃度５０％より大きい（たとえば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％）アルコールを含みうる。アルコールはたとえばエタノールまたはメタノールでありうる。一部の実施形態では、エタノールは濃度７５％で使用される。別の実施形態では、メタノールは濃度６５％で使用される。洗浄Ｉ溶液は、ナトリウムまたはリチウム塩（たとえば、塩化リチウムまたは臭化リチウム）といったアルカリ金属塩を高濃度４〜１０Ｍ（たとえば、５〜６Ｍ、４〜７Ｍ、５〜８Ｍ、６〜９Ｍ、６〜１０Ｍ、７〜１０Ｍ、５Ｍ、６Ｍ、７Ｍ、８Ｍ、９Ｍ、または１０Ｍ）で含む。本発明の目的のため、高い塩濃度とは、酵素活性を阻害し、核酸へと複合化し、および核酸の固相への結合のための塩析作用を提供するのに十分な高い塩濃度を意味する。洗浄Ｉ溶液はさらに、アルコール（たとえば、エタノールまたはメタノール）を含む。アルコール濃度は、２５〜８０％（たとえば、３０〜４０％、４０〜５０％、３５〜４５％、５５〜６５％、６０〜７０％、６５〜７５％、７０〜８０％、３０％、４０％、５５％、６０％、７０％、または７５％）である。一部の実施形態では、洗浄Ｉ溶液は濃度７０％でエタノールを含む。別の実施形態では、洗浄Ｉ溶液は濃度８０％でメタノールを含む。
【００４５】
洗浄ＩＩ溶液は、緩衝剤、アルコール、および随意的なキレート剤（たとえば、ＥＤＴＡまたはＣＤＴＡ）を含む。本発明の目的のため、洗浄ＩＩ溶液は、すべての残留する生物材料を除去するために最終洗浄を提供する。一部の実施形態では、緩衝剤の組成物は、６〜８といったｐＨ（たとえば、ｐＨ６．５、７または７．５）でのトリス−ＨＣｌでありうる。緩衝剤の濃度は５０〜１５０ｍＭ（たとえば、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１２０ｍＭ、または１４０ｍＭ）でありうる。洗浄ＩＩ溶液はさらに、アルコール（たとえば、エタノールまたはメタノール）を含みうる。アルコール濃度は、５０〜９０％（たとえば、５５〜６５％、６０〜７０％、６５〜７５％、７０〜８０％、５５％、６０％、６０％、７５％、８０％、または８５％）でありうる。ＥＤＴＡ濃度は、１〜２０ｍＭ（たとえば、５〜１０ｍＭ、７〜１５ｍＭ、１０〜１７ｍＭ、１５〜２０ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１５ｍＭ、１７ｍＭ、または１９ｍＭ）でありうる。特定の場合では、洗浄ＩＩは濃度８０％でエタノールをおよび濃度８ｍＭでＥＤＴＡを含む。別の場合では、洗浄ＩＩは濃度７０％でエタノールをおよび濃度１０ｍＭでＥＤＴＡを含む。特定の実施形態では、洗浄ＩＩは濃度６０％でメタノールをおよび濃度１２ｍＭでＥＤＴＡを含む。別の実施形態では、洗浄ＩＩは濃度７５％でメタノールをおよび濃度９ｍＭでＥＤＴＡを含む。
【００４６】
ＤＮＡ除去は、単離されたＲＮＡを必要とする特定の適用にとって望ましくまたは重要でさえありうる。本発明のＤＮＡ分解酵素洗浄溶液を使用するＤＮＡ分解酵素消化は、ＤＮＡ夾雑物をＲＮＡ試料から除去する有効な方法であることがこれまでわかっている。ＤＮＡ分解酵素洗浄溶液は、アルコール（たとえば、エタノールまたはメタノール）、塩、およびキレート剤（たとえば、ＥＤＴＡまたはＣＤＴＡ）を含む。アルコール濃度は、１０〜５０％（たとえば、１０〜３０％、２０〜４０％、３０〜５０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、または４５％）でありうる。一部の実施形態では、アルコールは濃度５０％のエタノールでありうる。特定の実施形態では、ＤＮＡ分解酵素洗浄溶液は、リチウム塩（たとえば、塩化リチウム、臭化リチウム）といった塩を含みうる。リチウム塩の濃度は、２〜５Ｍ（たとえば、３〜４Ｍ、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、または５Ｍ）でありうる。一部の場合では、ＤＮＡ分解酵素洗浄溶液は、濃度４Ｍで塩化リチウムを含みうる。特定の実施形態では、処方はキレート剤をさらに含みうる。特定の場合には、キレート剤はＥＤＴＡでありうる。別の場合では、キレート剤はクエン酸塩でありうる。キレート剤は濃度２５〜１００ｍＭ（たとえば、３０〜７０ｍＭ、４０〜８０ｍＭ、５０〜９０ｍＭ、３５ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７５ｍＭ、８５ｍＭ、または９５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）でありうる。一部の実施形態では、ＤＮＡ分解酵素洗浄溶液は、濃度３０％でエタノールを、濃度４ＭでＬｉＣｌを、および濃度５０ｍＭでＥＤＴＡを含む。別の実施形態では、ＤＮＡ分解酵素洗浄溶液は、濃度４０％でエタノールを、濃度５ＭでＬｉＣｌを、および濃度６５ｍＭでＥＤＴＡを含む。
【００４７】
（ｖｉｉ）溶出溶液：単離手順の結果として固相担体へ結合した実質的に未分解の核酸（たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、溶出溶液を用いて溶出されうる。生物材料を溶解しおよび核酸を固相担体へ結合する際に、および本発明によって教示される固相担体を洗浄する際に使用される試薬の簡易さは、簡易な溶出溶液に役立つ。さまざまな溶出溶液が当業者にとって公知である。一部の実施形態では、バーサジーン（Ｖｅｒｓａｇｅｎｅ）（商標）ＤＮＡ溶出溶液（ジェントラシステムズ社（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．）、ミネソタ州ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ））が、結合された実質的に未分解のＤＮＡを溶出するのに使用されうる。一部の場合では、トリス−ＥＤＴＡ（ＴＥ）が、結合された実質的に未分解のＤＮＡを溶出するために使用されうる。
【００４８】
実質的に未分解のＲＮＡは、固相担体へ結合され、ＲＮＡ溶出溶液を使用して溶出されうる。一部の実施形態では、バーサジーン（Ｖｅｒｓａｇｅｎｅ）（商標）ＲＮＡ溶出溶液（ジェントラシステムズ社（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．）、ミネソタ州ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ））が、結合された実質的に未分解のＲＮＡを溶出するのに使用されうる。特定の実施形態では、ＲＮＡ分解酵素遊離水が、結合された実質的に未分解のＲＮＡを溶出するのに使用されうる。別の実施形態では、水が、ＲＮＡ分解酵素を不活性化するピロ炭酸ジエチル（ＤＥＰＣ）といった物質で処理され、およびＲＮＡを溶出するために使用されうる。当業者に公知の別のＲＮＡ溶出溶液もまた使用されうる。たとえば、ジェントラ（Ｇｅｎｔｒａ）固相ＲＮＡ溶出溶液（ジェントラシステムズ社（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．）、ミネソタ州ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ））が使用されうる。
【００４９】
固相担体
さまざまな固相担体が、本発明において使用されうる。適切な固相担体は、たとえば、グラスファイバー、または、セルロース、酢酸セルロース、ニトロセルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、ポリフッ化ビニリデンのような他の物質、およびそれらの組み合わせといったシリカ系の担体を含む。一部の実施形態では、固相担体は、プラグ−フローまたは連続流れＤＮＡ単離方法を可能にするために、容器中に包まれうるかまたは固定されうる。一部の実施形態では、固相担体は、栓流または連続流のＤＮＡ単離方法を可能にするために容器に包まれるかまたは固定されうる。別の実施形態では、チューブまたはプレートのような適切な容器中に固定されまたは包まれうる膜、ディスクまたはシリンダーといった自立固相担体を作製するべく、固相担体の材料が充填されうる。一部の実施形態では、固相担体は、生物材料との最適な接触を可能にするために繊維性であるか微粒子でありうる。本発明の試薬とともに使用するため適した固相担体の大きさは、材料（たとえば生物材料）の量にしたがって変化しうる。たとえば、グラスファイバー膜は、異なる量のＤＮＡの結合、精製および溶出を可能にするために異なる大きさへと切断されうる。
【００５０】
本発明の試薬とともに使用するために適した固相担体の形状は、たとえば、シート、事前に切断されたディスク、シリンダー、単繊維、または微粒子から成る固相担体でありうる。適切な容器中に固定されまたは包まれうる膜、ディスクまたはシリンダーといった自立固相担体を作製するべく、固相担体の材料は充填されうる。必要に応じて、固相担体は適切な容器、たとえば、（ガスリー（Ｇｕｔｈｒｉｅ）カードといった）紙の形態、微小遠心管、スピンチューブ、９６穴プレート、チャンバー、またはカートリッジ）中に収容される。一例は、バスケット内で２ｍＬ遠心管に入れたワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）Ｄグラスファイバー膜である。固相担体が繊維を有する場合、固相担体は、繊維を適切に充填し、最適な核酸結合、およびタンパク質、リン脂質などといった夾雑物を洗い流すのを可能にするよう、適切な容器内に包まれうる。
【００５１】
一部の場合では、固相担体は、試料（たとえば生物試料）中に存在するＲＮＡを分解するためにＲＮＡ分解酵素溶液で前処理されうる。別の場合では、精製は、ＲＮＡ分解酵素処理したカラム（ジェントラシステムズ社（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．）、ミネソタ州ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ））の使用によって改善されうる。ＲＮＡ分解酵素処理したカラムは、試料（たとえば、生物試料）中に存在するＲＮＡを分解する。加えて、前処理されたカラムを使用することは、一部のＤＮＡ単離方法で必要とされているような、別々のＲＮＡ分解酵素消化段階の必要性をなくす。ＲＮＡ単離の一部の実施形態では、ＤＮＡ溶解溶液は、固相担体を作製する際に使用される材料（たとえばファイバーなど）に直接添加してもよく、および、最終的なユーザーがすぐ使える形態（たとえば、紙、スワブ、ディスク、プラグ、カラムなど）になる前に乾燥されてもよい。
【００５２】
精製／単離方法
本発明は、パックスジーン（Ｐａｘｇｅｎｅ）（商標）、ＲＮＡセーファー（ＲＮＡｓａｆｅｒ）（商標）、ＲＮＡレーター（ＲＮＡｌａｔｅｒ）（商標）、およびテンパス（Ｔｅｍｐｕｓ）（商標）溶液の商品名の下で採用された試薬を含む安定化試薬中に保存された材料（たとえば生物材料）（「安定化試料」）から、ＤＮＡ、またはＲＮＡ、または両方を精製するための方法を提供する。本発明で教示される試薬および固相担体は、単離方法を代替するのに役に立つ。
【００５３】
一部の実施形態では、安定化試薬の以降の精製の前の粗溶解物の調製を円滑にするのに、希釈剤が安定化試薬の存在下で生物材料に添加される。
【００５４】
一部の実施形態では、安定化試薬を、溶解溶液と接触させる前に可溶化溶液と接触させる。安定化試薬が試料中の核酸を完全に溶解しおよび可溶化する別の場合では、可溶化溶液を必要としないことがある。
【００５５】
一部の実施形態では、溶解溶液および可溶化溶液は組み合わせられうる。
【００５６】
一部の場合では、試料を固相担体と接触させる前に、溶解溶液が安定化試料と接触させる。溶解溶液は、溶解物を固相担体へ添加する前に、材料（たとえば、生物材料）を溶解させおよび核酸を溶解物へと放出するのに使用される。加えて、溶解溶液は、ヌクレアーゼといった有害な酵素の悪影響を防止する。溶解溶液の量は、安定化試料の量に応じて増加または減少しうる。安定化試料がひとたび溶解すると、溶解物は次いで固相担体へ添加される。別の場合では、溶解溶液は固相担体へ直接添加されうり、それによって段階をなくし、およびさらに方法を簡易化する。本実施例では、安定化試料を前処理された固相担体と接触させる前に、溶解溶液を固相担体に塗布し、および次いで固相担体上で乾燥させてもよい。
【００５７】
ＲＮＡ分解酵素およびＤＮＡ分解酵素といった酵素は、カラムを前処理するのに固相担体に直接添加しうるか、または試料中に存在する夾雑ＲＮＡまたはＤＮＡを分解するのに溶解溶液に添加しうる。溶解および／またはＲＮＡ分解酵素またはＤＮＡ分解酵素で前処理したカラムを使用することによって、従来の方法で典型的に必要とされているような別々の溶解および／またはヌクレアーゼ消化段階の必要性をなくす。
【００５８】
溶解に続いてＤＮＡを精製する一部の実施形態では、核酸の固相担体への結合は、結合溶液を採用することによって改善されうる。結合は、塩濃度の大幅な増加によって、脱水によって、または、両方によって改善されうる。
【００５９】
核酸の溶解および結合の後、核酸が固相担体へ結合したまま残存するよう、すべての残留する生物材料は遠心分離、ピペット操作、圧力、真空といった適切な手段によって、または、これらの手段の洗浄溶液と組み合わせた使用によって随意的に除去される。一部の場合では、洗浄段階は、試料種のねばり強さおよび試料中の非核酸生物材料の量に応じて繰り返されうる。タンパク質、リン脂質などを含む非核酸生物材料の剰余物は、最初に遠心分離によって除去されうる。こうすることによって、未結合の夾雑物が固相担体から分離される。洗浄段階は、固相担体から実質的にすべての夾雑物を除き、および優先的に固相担体へ結合された核酸を残す。
【００６０】
引き続き、結合された核酸は、当業者に公知の適当な量の溶出溶液を使用して溶出されうる。固相担体は、核酸を固相担体から解放するために、次いで遠心分離されるかまたは圧力または真空に供してもよく、および次いで適切な容器中に回収されうる。
【００６１】
図１は、本発明を用いてＤＮＡ、ＲＮＡまたは両方を試料から単離するための手順を示す流れ図である。一部の実施形態では、ユーザーは、本発明中に扱われた方法にしたがって、試料からＤＮＡのみの単離を実施しうる。別の実施形態では、ユーザーは、本発明で扱われた方法にしたがってＲＮＡのみの単離を実施しうる。一部の場合では、同一の試料からＲＮＡおよびＤＮＡの両方の単離の実施を選択するユーザーは、回収の後に試料を分けるであろう。別の場合では、同一の試料からＲＮＡおよびＤＮＡの両方の単離の実施を選択するユーザーは、可溶化段階の後に試料を分けるであろう。
【００６２】
製造品
本発明で扱われる試薬、方法およびキットは、相対的に少ない不純物しか含まない実質的に純粋なおよび未分解の核酸を提供するため、その核酸は当業者に公知である下流の工程に使用されうる。本発明は、特に、本明細書に記載の試薬および随意的に固相担体と組み合わせて、本発明の方法にしたがってＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡおよびＲＮＡの両方を試料から精製するために使用されうる、特定の手順を含むキットを扱う。実質的に純粋な、未分解の核酸とは、核酸定量、制限酵素消化、ＤＮＡ配列決定、サザンブロッティングなどといったハイブリダイゼーション技術、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸配列準拠増幅（ＮＡＳＢＡ）、自己維持的配列複製（ＳＳＲまたは３ＳＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および転写媒介増幅（ＴＭＡ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、または他のＤＮＡ分析、およびＲＴ−ＰＣＲ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳、ノーザンブロッティング、マイクロアレイ分析および他のＲＮＡ分析といった増幅法を含むがそれらに限定されない、以降の分析での使用に適した核酸である。
【００６３】
本発明は、本明細書に含まれる詳細な実施例を参照することで、さらに記載される。これらの実施例は、さまざまな具体的なおよび実例的な実施形態および技法を図解するよう提供される。しかし、本発明の範囲内にとどまったまま、多数の変形および変更がなされうることを理解すべきである。
【実施例】
【００６４】
実施例１−プレアナリティクス（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ）（商標）パックスジーン（ＰＡＸｇｅｎｅ）（商標）採血チューブからのＲＮＡ精製
血液試料はドナーからパックスジーン（ＰＡＸｇｅｎｅ）（商標）回収チューブ（プレアナリティクス社（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）（商標）、カリフォルニア州バレンシア）へ採取された。試料は本質的に取扱説明書にしたがって処理された。試料は３０００ｘｇにて１０分間遠心分離された。パックスジーン（ＰＡＸｇｅｎｅ）（商標）ＲＮＡ回収チューブの遠心分離に際して得られた、結果として生じる試料沈澱は、総核酸、負に荷電したタンパク質、および陽イオン性界面活性剤カトリモックス（Ｃａｔｒｉｍｏｘ）（商標）の非水溶性沈澱であった。沈澱は総血液製剤夾雑物を洗浄された。沈澱に水５ｍＬを添加し、および試料を迅速にボルテックスした。チューブを次いで３０００ｘｇにて１０分間再び遠心分離し、および上清をデカントして、よりきれいな沈澱を得た。
【００６５】
結果として生じた試料沈澱は、溶解溶液（６Ｍ ＬｉＣｌ、５％トリトンＸ−１００、５％ ＤＧＭＥ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＴＲＩＺＭＡ、ｐＨ８．８）に容易に溶解せず、およびしたがって可溶化溶液が用いられた。１５０μＬの可溶化溶液（３８ｍＭ ＴＲＩＺＭＡ 塩基、１２ｍＭ ＴＲＩＺＭＡ ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５％ トリトン Ｘ−１００）を試料に添加した。沈澱を水またはトリスに再懸濁することが、沈澱を溶解溶液に可溶化するのに大部分の実施形態で役立つが、すべてではない。たとえば、高いかまたは異常なタンパク質レベルを有する血液ドナーは、タンパク質夾雑物の増加のため、このＲＮＡ単離に失敗する。しかし、非イオン性の完全に適合する洗浄剤（トリトンＸ−１００）を可溶化溶液に添加することは、沈澱を完全に可溶化する。この懸濁液は、溶解溶液に添加される際、タンパク質夾雑の失敗無しに、ＲＮＡが固相担体へ結合することを可能にする。可溶化溶液の緩衝材成分は、決定的な役割を果たすことが見出された。パックスジーン（ＰＡＸｇｅｎｅ）（商標）ＲＮＡ回収チューブは、酵素的分解を阻害するため、ＲＮＡを低ｐＨ成分と共に保存する。本発明の固相担体への溶解溶液中でのＲＮＡ結合はｐＨ８．５〜９．５にて最適に生じる。本実施例では、沈澱の低ｐＨが可溶化溶液の全体のｐＨを低下させ、一部の実施形態ではこの最適範囲を外れおよびまたタンパク質結合に有利になる。したがって、正しい結合ｐＨの緩衝剤の一定量を加えることは、沈澱からの痕跡量の酸性残存物があれば吸収し、および単離過程が失敗無しに進むことを可能にした。可溶化溶液の緩衝剤のｐＨは、したがって、安定化試料について持ち越される沈澱のｐＨに応じて調整を要しうると認識される。
【００６６】
溶解溶液３００μＬを試料に加え、および各試料と混合した。この場合、沈澱は溶解を要しなかったが、しかし溶解溶液処方（６Ｍ ＬｉＣｌ、５％ トリトン Ｘ−１００、５％ ＤＧＭＥ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＴＲＩＺＭＡ、ｐＨ８．８）は標的分子の固相担体への結合を円滑にした。プロテイナーゼＫ溶液１０μＬを各試料に加え、および各試料を１５分間氷上にてインキュベートした。全部の試料を結合カラム（バスケット内で２ｍＬ遠心管に入れたワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）Ｄグラスファイバー膜）に加え、および＞１３，０００ｘｇにて１分間遠心分離した。４００μＬの洗浄Ｉ溶液（５Ｍ ＬｉＣｌ、５５％エタノール）を各試料に加え、および各試料を＞１３，０００ｘｇにて２分間遠心分離した。次に、ＤＮＡ分解酵素洗浄溶液５０μＬを加え、および各試料を１５分間室温にてインキュベートした。２００μＬのＤＮＡ分解酵素洗浄溶液（３０％エタノール、３．５Ｍ ＬｉＣｌ、５０ｍＭクエン酸三ナトリウム）を加え、および＞１３，０００ｘｇにて１分間遠心分離した。別の２００μＬのＤＮＡ分解酵素洗浄溶液を加え、および各試料を＞１３，０００ｘｇにて１分間遠心分離し、次いで２００μＬの洗浄ＩＩ溶液（７０％エタノール、５ ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ ｍＭ トリス、ｐＨ７）を添加し、および＞１３，０００ｘｇにて１分間遠心分離した。この最後の段階を１回繰り返した。最後に、ＲＮＡを溶出するために、５０μＬのＤＥＰＣ処理水をカラムに加えた。
【００６７】
上記の方法によって得られたＲＮＡの品質を試験するために、精製および再懸濁されたＲＮＡを１％アガロースゲルに負荷し、および分離に供した。上記の方法によって得られたＲＮＡは未変性でありおよび本質的にＤＮＡを含まなかった。
【００６８】
実施例２−プレアナリティクス（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ）（商標）パックスジーン（ＰＡＸｇｅｎｅ）（商標）採血チューブからのＤＮＡ精製
血液試料はドナーからパックスジーン（ＰＡＸｇｅｎｅ）（商標）回収チューブ（プレアナリティクス社（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）（商標）、カリフォルニア州バレンシア）へ採取された。試料は本質的に取扱説明書にしたがって処理された。試料は３０００ｘｇにて１０分間遠心分離された。パックスジーン（ＰＡＸｇｅｎｅ）（商標）ＲＮＡ回収チューブの遠心分離に際して得られた、結果として生じる試料沈澱は、総核酸、負に荷電したタンパク質、および陽イオン性界面活性剤カトリモックス（Ｃａｔｒｉｍｏｘ）（商標）の非水溶性沈澱であった。沈澱は総血液製剤夾雑物を洗浄された。沈澱に水５ｍＬを添加し、および試料を迅速にボルテックスした。チューブを次いで３０００ｘｇにて１０分間再び遠心分離し、および上清をデカントして、よりきれいな沈澱を得た。
【００６９】
１００μＬの可溶化溶液（３８ｍＭ ＴＲＩＺＭＡ 塩基、１２ｍＭ ＴＲＩＺＭＡ ＨＣｌ、１０ ｍＭ ＥＤＴＡ、５％トリトンＸ−１００、４ｍｇ／ｍＬのＲＮＡ分解酵素Ａ ２μＬ）を試料に添加した。試料をボルテックスして可溶化した。溶出溶液（６Ｍ ＬｉＣｌ、５％ トリトンＸ−１００、５％ ＤＧＭＥ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＴＲＩＺＭＡ、ｐＨ８．８）２００μＬおよびプロテイナーゼＫ溶液１０μＬを試料に添加し、ボルテックスして混合し、および各試料を１５分間氷上にてインキュベートした。試料に、結合溶液（１０Ｍ ＬｉＣｌ、１０％ ＤＧＭＥ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ トリス）３００μＬまたは洗浄Ｉ溶液（５Ｍ ＬｉＣｌ、５５％エタノール）を添加した。両溶液とも、ゲノムＤＮＡがグラスファイバー固相へ結合するのを可能にした。結合されたＤＮＡは、洗浄I溶液（５Ｍ ＬｉＣｌ、５５％エタノール）４００μＬで一回、および洗浄II溶液（７０％エタノール、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭトリス、ｐＨ７）２００μＬで二回洗浄した。ＤＮＡは引き続きＴＥ緩衝剤（トリス−ＥＤＴＡ）中に溶出した。
【００７０】
上記の方法によって得られたＤＮＡの品質を試験するために、精製および再懸濁されたＤＮＡを１％アガロースゲル上に負荷し、および電気泳動分離に従属させた。
【００７１】
総合すると、結果は、本発明の方法を用いて、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方が、プレアナリティクス（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ）（商標）のパックスジーン（ＰＡＸｇｅｎｅ）（商標）ＲＮＡ回収チューブを用いて採血した単一のチューブから、調製されうることを実証している。
【００７２】
実施例３−アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）テンパス（Ｔｅｍｐｕｓ）（商標）採血チューブからのＲＮＡ精製
血液３ｍＬがドナーからテンパス（Ｔｅｍｐｕｓ）（商標）チューブへ採取され、＜２５℃で混合した。製造元の指示にしたがった。試料を５０ｍＬチューブにデカントし、およびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）３ｍＬで希釈し、およびボルテックスして混合し、次いで２０００ｘｇにて３０分間４℃にて遠心分離した。
【００７３】
結果として生じた試料沈澱は容易に見えなかったが、溶解溶液中に直接溶解しおよび、他の結合試薬なしにグラスファイバー固相に直接添加しうる。沈殿を、溶出溶液（６Ｍ ＬｉＣｌ、５％ トリトンＸ−１００、５％ ＤＧＭＥ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＴＲＩＺＭＡ、ｐＨ８．８、およびＴＣＥＰ ３μＬ）３００μＬの添加によって可溶化し、および６０秒間ボルテックスした。試料を結合カラムに加えおよび３０００ｘｇにて６０秒間遠心分離した。試料を新しいチューブに移した。ＲＮＡを洗浄Ｉ ４００μＬを添加し、３０００ｘｇで３０秒間回転させて洗浄した。テンパス（Ｔｅｍｐｕｓ）（商標）回収チューブの技術は、任意のＤＮＡ分解酵素処理の必要性を軽減する。したがって、試料を、洗浄ＩＩ ２００μＬの添加および３０００ｘｇで３０秒間の回転によって洗浄した。洗浄ＩＩ ２００μＬを添加し、および試料を３０００ｘｇにて１２０秒間回転させた。ＲＮＡ分解酵素遊離水５０μＬを添加してＲＮＡを溶出しおよび試料を３０００ｘｇで１分間回転した。
【００７４】
この手順は、ＥＤＴＡチューブまたはパックスジーン（Ｐａｘｇｅｎｅ）回収チューブ中に回収され、および実施例１および２中の手順でまたは血液用のパックスジーン（Ｐａｘｇｅｎｅ）（商標）精製手順を用いて単離された血液の等価量と等しいかまたはそれより良い総ＲＮＡ収量を生成する。
【００７５】
実施例４−アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）テンパス（Ｔｅｍｐｕｓ）（商標）採血チューブからのエタノールを使用するＲＮＡ精製
血液３ｍＬがドナーから、テンパス（Ｔｅｍｐｕｓ）（商標）安定化剤約６ｍＬを含むテンパス（Ｔｅｍｐｕｓ）（商標）チューブへ採取され、＜２５℃で混合した。試料を約２時間室温にてインキュベートした。試料を次いで５０ｍＬチューブへとデカントし、および９５％エタノール３ｍＬを添加して総体積約１２ｍＬを得た。試料を約１２０秒間ボルテックスし、および次いで６０００ｘｇにて３０〜６０分間遠心分離した。上清をデカントし、およびチューブを約１２０秒間上下逆にして細胞沈殿を乾燥させた。
【００７６】
沈殿を、溶出溶液（６Ｍ ＬｉＣｌ、５％ トリトンＸ−１００、５％ ＤＧＭＥ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＴＲＩＺＭＡ、ｐＨ８．８、およびＴＣＥＰ ３μＬ）３００μＬの添加によって可溶化し、および６０秒間ボルテックスした。試料を結合カラムに加えおよび３０００ｘｇにて６０秒間遠心分離した。試料を新しいチューブに移した。ＲＮＡを洗浄I ４００μＬを添加し、３０００ｘｇにて１２０秒間回転させて洗浄した。ＤＮＡ分解酵素（２５Ｕ／５０μＬ）５０μＬを添加し、および約１５分間室温にてインキュベートした。次に、ＤＮＡ分解酵素洗浄（３．５Ｍ 塩化リチウム、５０ｍＭ クエン酸ナトリウムおよび３０％エタノール）２００μＬを添加し、およびチューブを３０００ｘｇで６０秒間遠心分離した。上清をデカントし、および洗浄ＩＩ ２００μＬを添加し、試料を３０００ｘｇにて１２０秒間回転させた。溶出溶液（ヌクレアーゼ遊離水、またはピロ炭酸ジエチル処理水または１０ｍＭ トリス、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）を添加してＲＮＡを溶出し、および試料を３０００ｘｇにて１分間回転させた。
【００７７】
図２は、初期の希釈段階中に（実施例３でのような）ＰＢＳの代わりにエタノールを添加することによって、より低い遠心分離速度でより多数のＲＮＡの収量を可能にすることを示す。ＰＢＳ中での最大の収量には遠心分離速度５５００ｘｇを必要とする一方、ほぼ同じ収量がエタノール中３０００ｘｇで得られうる。３０００ｘｇは、実験室で一般的に見い出されるはるかに一般的な遠心分離速度である。
【００７８】
発明者らは、この方法において、希釈剤としての異なる濃度のアルコールも試験した。結果を図３に示す。グラフは、異なる濃度のアルコールを希釈剤として用いた際の収量を示す。すべてのチューブは下記を有した。
全血  ３ｍＬ
テンパス（Ｔｅｍｐｕｓ）（商標）チューブ安定化剤  ６ｍＬ
希釈剤  ３ｍＬ
【００７９】
より速いＰＢＳ中の５５００ｘｇの遠心分離を用いると、１００％エタノールまたは１００％メタノール中で希釈する際には、ほぼ同じ収量のＲＮＡをより遠心分離速度で得ることができることがわかる。バイオ技術の実験室ではエタノールのほうがずっと一般的に見い出されるため、特定の実施形態ではエタノールは選択されている。高濃度のイソプロパノールは、沈殿しおよび単離を失敗させる傾向がある。
【００８０】
酒類の許認可および課税を回避するため、多数の試薬グレードのエタノール調製物が、５％メタノールおよび／または５％イソプロパノールによって変性させられる。多数のエタノール調製物もまた、純度１００％ではなく、濃度９５％（残り水）で一般に購入される。７０％エタノールもまた、一般的な実験室での濃度である。図４に表したグラフは、これらの微妙な処方の差を変化させる際に影響がないことを示す。
【００８１】
本発明の多数の実施形態がこれまで記載されてきた。それにもかかわらず、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、さまざまな変更がなされることが理解されるであろう。したがって別の実施形態は、下記の請求項の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】図１は、本発明を用いてＤＮＡ、ＲＮＡ、または両方を、パックスジーン（ＰＡＸｇｅｎｅ）血液ＲＮＡ回収チューブに回収された試料から単離するために、またはＲＮＡをテンパス（Ｔｅｍｐｕｓ）血液ＲＮＡ回収チューブに回収された試料から単離するために使用する手順を示す流れ図である。
【図２】図２は、テンパス（Ｔｅｍｐｕｓ）血液ＲＮＡ回収チューブからの粗溶解物の調製のためにさまざまな希釈および遠心分離条件を用いることの作用を図解する。
【図３】図３は、テンパス（Ｔｅｍｐｕｓ）血液ＲＮＡ回収チューブからの粗溶解物の調製のためにさまざまな希釈および遠心分離条件を用いることの作用を図解する。
【図４】図４は、テンパス（Ｔｅｍｐｕｓ）血液ＲＮＡ回収チューブからの粗溶解物の調製のためにさまざまな希釈および遠心分離条件を用いることの作用を図解する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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