(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼをコードするトランスフェクトされた非相同性ポリヌクレオチド配列、ここにおいて、当該非相同性ポリヌクレオチド配列は、細菌による主要発酵生成物としてのエタノールの産生を促進するのに十分な機能レベルで発現する、及び
（ｂ）ｂｕｄＢ又はｂｕｄＲのポリヌクレオチド配列中の欠失突然変異、ここにおける突然変異は、突然変異がない組み換え細菌性ホスト細胞によるエタノール産生に比べて、組み換え細菌性ホスト細胞によるエタノール産生を増大させる、
を含んでなる細菌であり、細菌性ホスト細胞がクレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）である、サッカライドを分解するのに適している組み換え細菌性ホスト細胞。
【請求項２】
前記ホスト細菌が、クレブシエラ・オキシトカＰ２株（ＡＴＣＣ５５３０７）である、請求項１に記載の組み換え細菌性ホスト細胞。
【請求項３】
前記突然変異が、ブタンジオール又は２，３−ブタンジオールの産生を減少する、請求項１又は２に記載の組み換え細菌性ホスト細胞。
【請求項４】
当該突然変異が、ｂｕｄＢ遺伝子の中にある、請求項１〜３の何れか一項に記載の組み換え細菌性ホスト細胞。
【請求項５】
前記突然変異が、当該細胞中でのα−アセトラクテート・デカルボキシラーゼ及び／又はα−アセトラクテート・シンターゼの発現を低減又は消去する、請求項１〜４の何れか一項に記載の組み換え細菌性ホスト細胞。
【請求項６】
前記アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼが、ザイモモナス属由来である、請求項１〜５の何れか一項に記載の組み換え細菌性ホスト細胞。
【請求項７】
前記ザイモモナス属が、ザイモモナス・モビリスである、請求項６に記載の組み換え細菌性ホスト細胞。
【請求項８】
ＢＷ１９（ＮＲＲＬＢ−３０８５８）及びＢＷ２１（ＮＲＲＬＢ−３０８５９）よりなる群から選ばれるクレブシエラ・オキシトカ株からなる組み換え細菌性ホスト細胞。
【請求項９】
（ａ）アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼをコードするトランスフェクトされた非相同性ポリヌクレオチド配列、ここにおいて、当該非相同性ポリヌクレオチド配列は、ホスト細胞による主要発酵生成物としてのエタノールの産生を促進するのに十分な機能レベルで発現する、及び
（ｂ）細胞でブタンジオールの産生を減少する、ｂｕｄＢ又はｂｕｄＲにおける欠失突然変異、ここにおける突然変異は、突然変異がない細胞によるエタノール産生に比べて、細胞によるエタノール産生を増大させる、
を含んでなる、細菌性ホスト細胞がクレブシエラ・オキシトカである、組み換え細菌性ホスト細胞。
【請求項１０】
サッカライド源を、請求項１〜９の何れか一項に記載の組み換え細菌性ホスト細胞と接触させ、これによりサッカライド源からエタノールを産生することを含んでなる、サッカライド源からエタノールを産生する方法。
【請求項１１】
（ａ）選択条件下での組み換え細菌性ホスト細胞による最適な生育及びエタノール産生を支援する選択培地を選択すること、
（ｂ）サッカライド源を添加すること、及び
（ｃ）選択培地及び条件でのエタノール産生のために最適化された組み換え細菌性ホスト細胞を添加すること、
を含んでなる、請求項１〜９の何れか一項に記載の組み換え細菌性ホスト細胞によるオリゴサッカライド源から最適化されたエタノールを産生するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本発明は、２００５年７月１日出願の米国特許仮出願第６０／６９６，０７６号の優先権を主張し、その全ての内容を参照として本明細書に明確に組み込む。
【０００２】
（米国政府との利害関係に関する声明）
本発明に対する資金は、米国農務省の助成金第０１−３５５０４−１０６６９号、及び米国エネルギー省のＦＧ０２−９６ＥＲ２０２２２号に基づき、米国政府により一部が提供された。米国政府は、本発明に対するある特定の権利及び資格を有している。
【背景技術】
【０００３】
自動車用燃料としてエタノールの使用は、石油ベースの燃料に対してよりクリーンな燃焼で再生可能な代替をもたらす［１］。エタノール生産のために最近用いられている技術は、別の市場を有している、サトウキビ汁（糖蜜）及びコーンスターチのような食用穀物をベースにしている［２］。これら原料のコストは、総生産コストの４０％に相当すると予測されている［３］。一方、食用ではないリグノセルロースバイオマスは、石油と対抗できるコストで入手できる［４］。リグノセルロース糖をエタノールに変換するための改良された微生物の継続的な開発により、石油への依存の減少及び現存の植物原料からの新規な製造の可能性がもたらされる。
【０００４】
クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）のエタノール産生株が開発されている［５，６］。これらの菌株は、リグノセルロースバイオマス由来の各種糖単量体（グロコース、キシロース及びアラビノースのような）を代謝することが示されている［５〜７］。このような菌株は、セルロースでの同時糖化発酵（ＳＳＦ）処理においてよく機能することができる［８〜１０］。Ｋ．オキシトカＰ２として知られているＫ・オキシトカのエタノール産生株は、オリゴサッカライドのエタノールへの変換に関与する酵素である、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｐｄｃ）及びアルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈＢ）をコードするザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）の遺伝子を含有していることが記載されている。これらの遺伝子は、Ｐ２株のゲノム中に染色体上で組み込まれている。
【０００５】
大腸菌（Escherichia coli）の類似株と対照的に、Ｋ．オキシトカは、セロビオース、セロトリオース、キシロビオース、キシロトリオース及びアラビノシドを包含する、リグノセルロースバイオマスから多くの可溶性生成物を代謝するという潜在的な能力を有している［６、１４、１５］。ｐＨ５．２（菌体酵素にほぼ最適な）でリグノセルロースから不完全に加水分解された生成物を効率的に代謝するＫ．オキシトカＰ２の能力は、同時糖化発酵（ＳＳＦ）処理時に更なる利点を提供する［８］。これらの条件下で、Ｋ．オキシトカＰ２は、サッカロミセス・セレビジア（Saccharomyces cerevisiae）が同等の発酵速度及び収率を達成するのに必要とする菌体セルロースの半分以下を必要とするだけである［９］。
【０００６】
高いエタノール産生及び収率を支援する、メタノール産生の細菌を生育するための安価な工業用培地の入手が、バイオマス原料からのエタノール生産にとって必須である［１７、１８］。しかしながら、穀物とは異なって、セルロースバイオマスの加水分解物は、本質的に栄養が乏しいので、これを補給しなけらばならない［１６］。従って、エタノール産生のためのＫ．オキシトカＰ２の以前の使用では、酵母抽出物及びＤｉｆｃｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（登録商標）のような実験室用の栄養物を含有する、複合の生育培地中での細胞の培養を必要としていた。しかしながら、リグノセルロースからエタノールのような汎用化学品の商業的な生産にこのような栄養物を使用することは実用的ではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
組み換えエタノール産生の細菌株をエタノール源として提供する可能性を実現化するためには、安価な最小培地中での生育時に効率的にエタノールを産生できる細菌のような新規及び改良された株、並びにこれらの細胞を支援できる新規な培地が、明らかに必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、生育及びエタノールの高収率産生のために最適化されている組み換えホスト細胞、及びこれら細胞の作製及び使用に関する。本発明は更に、組み換え微生物によるエタノールの経済的な産生のために最適化されている新規な培地に関する。
【０００９】
微生物よる発酵時に、培地中の糖含有基質は、エタノール及び多くの不要な副生成物に変換される。本発明による組み換え細胞は、エタノール以外の１つ又はそれ以上の生成物の産生の原因となる遺伝子を制御（例えば、下方規制）するように遺伝子操作によって改変され、これにより突然変異していない親株に比べて、これらの細胞による糖からのエタノール産生を増大させる。組み換え細菌の新規及び改良された株は、安価な試薬を含有する最小生育培地中での発酵に適した条件下で生育させる場合、優れたエタノール産生及び収率を達成することができる。ある特定の株は、最適化培地の特定な態様において、優れたエタノール産生のために最適化される。エタノール産生のために最適化されたシステムは、選択最適化最小培地と選択培地中での使用のために最適化された組み換えホスト細胞を組み合わせたものである。好ましいシステムは、リグノセルロースをサッカライド源として用いるＳＳＦによる効率的なエタノール産生に適している。
【００１０】
従って、本発明の一態様は、
（ａ）糖をエタノールに変換する酵素をコードする非相同性ポリヌクレオチド配列（ここにおいて、ホスト細胞は、細菌による主要発酵生成物としてのエタノールの産生を促進するのに十分な機能レベルで、非相同性ポリヌクレオチド配列を発現する）、及び
（ｂ）細胞の代謝経路において、糖からエタノール以外の生成物を産生するタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列中の突然変異（ここにおける突然変異は、前記突然変異がない細胞によるエタノール産生に比べて、この細胞による増大したエタノール産生をもたらす）、
を含んでなる、サッカライドを分解するのに適している組み換えホスト細胞である。
組み換えホスト細胞のある態様では、この突然変異は、欠失、挿入又は塩基置換の突然変異である。
【００１１】
本発明による組み換えホスト細胞は、細菌、真菌若しくは酵母のような単細胞又は多細胞の微生物、並びに線虫、昆虫、は虫類、鳥、両生動物、及び哺乳動物類を含む高等真核生物を包含する適当なホスト生物から作製することができる。酵母ホスト細胞は、例えば、サッカロミセス属（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces）、ハンゼヌラ属（Hansenula）、パチオソレン属（Pachyosolen）、クルベロミセス属（Kluyveromyces）、デバリオミセス属（Debaryomyces）、ヤロウイア属（Yarrowia）及びピキア属（Ｐichia）由来である。細菌性ホスト細胞は、グラム陽性及びグラム陰性細菌から選ばれる。好ましいグラム陰性細菌は、エルウィニア属（Erwinia）及びクレブシエラ属（Klebsiella）の株のような腸内細菌である。グラム陽性細菌性ホスト細胞は、バチルス属（Bacillus）、ゲオバチルス属（Geobacillus）、クロストリジウム属（Clostridium）、連鎖球菌（Streptococcus）及びセルロモナス属（Cellulomonas）を包含する。
【００１２】
本発明による細菌性ホスト細胞のある態様では、非相同性ポリヌクレオチド配列が、糖のエタノールへの変換に関与する酵素である、アルコールデヒドロゲナーゼ及び／又はピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする。
【００１３】
組み換え細胞のある態様は、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）由来ののもので、これは尿素を窒素源として用いる固有の能力を有している。これらの株は、尿素様化合物を決められた窒素源として含有する最小培地で用いるためのホスト生物として特に適している。このような適しているホスト株の１つは、クレブシエラ・オキシトカＰ２株（ＡＴＣＣ５５３０７）である。
【００１４】
上記のように、本発明による組み換えホスト細胞は、細胞の代謝経路において糖からエタノール以外の生成物を産生するタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列中に突然変異を含んでいる。細胞の種々の態様では、エタノール以外の生成物は、ホルメート、ラクテート、スクシネート、アセテート、アセトイン、ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、キシリトール、ブチレート、ピルベート、プロピオネート、イソプロピルアルコール、１−プロパノール、２−プロパノール、プロパンジオール、シトレート、グルタメート及びアセトンから選ばれる。
【００１５】
組み換え細胞の一態様では、代謝経路は、ブタンジオール経路である。この経路からもたらされる糖代謝の副生成物は、アセトイン及び２，３−ブタンジオールであって、これらはそれぞれαーアセトラクテート・デカルボキシラーゼ及びαーアセトラクテート・シンターゼによって産生される。従って、ある態様では、細胞は、ブタンジオール代謝経路に関与する酵素をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列中に突然変異を含んでいる。突然変異したポリヌクレオチド配列は、ｂｕｄＡ、ｂｕｄＢ、ｂｕｄＲ若しくはｂｕｄＣ遺伝子、又はこれらのホモログ若しくは機能的変異体のヌクレオチド配列を含有することができる。ある態様では、ｂｕｄＡ及びｂｕｄＢ遺伝子の片方又は両方に欠失突然変異を含んでいる。この欠失突然変異は、細胞において酵素αーアセトラクテート・デカルボキシラーゼ及びαーアセトラクテート・シンターゼのうちの少なくとも片方、好ましくは両方の発現を低減又は消去して、この細胞によるエタノール産生を、突然変異がない細胞によるエタノール産生に比べて増大させる。
【００１６】
上記細菌株の何れも、遺伝子組み換え用の遺伝子を得るために、そしてある態様では変更の遺伝子配列を含有するＤＮＡ断片の再挿入を行うためのホストとして供用するために、使用することができる。
【００１７】
本発明による組み換え細菌性ホスト細胞のある好ましい態様は、ＢＷ１５（ＮＲＲＬＢ−３０８５７）、ＢＷ１９（ＮＲＲＬＢ−３０８５８）及びＢＷ２１（ＮＲＲＬＢ−３０８５９）を包含するクレブシエラ・オキシトカ株によって代表され、これらは国立農業利用研究センター（National Center for Agricultural Utilization Research；Peoria, IL, USA）の農業研究サービス培養コレクション（Agricultural Reserch Service Culture Collection; ＡＲＳＣＣ）に２００５年６月２８日付けで寄託された。
【００１８】
他の態様では、本発明は、サッカライド源からエタノールを産生する方法を提供する。サッカライド源を、上記のような本発明による組み換えホスト細胞に接触させて、サッカライド源からエタノールを産生する。
【００１９】
本発明は更に、サッカライド源からエタノールを産生するために最適化した組み換えホスト細胞を作製する方法を提供する。この方法は、
（ａ）エタノール産生の親ホスト細胞を、親細胞によってエタノールを産生するのに適した条件下で、選択培地及びオリゴサッカライド源に接触させること、
（ｂ）選択された条件下の培地中で前記サッカライド源から産生されるエタノールのレベルを測定すること、
（ｃ）選択された条件下の培地中で増大した発現を有する望ましくない副生成物を同定するために、サッカライド源から産生されるエタノール以外の少なくとも１つの生成物のレベルを測定すること、そして
（ｄ）代謝経路において、望ましくない副生成物を産生するタンパク質をコードする遺伝子のポリヌクレオチド配列を突然変異させ（ここにおける突然変異は、代謝経路中の少なくとも１つの遺伝子産物の発現を低減又は消去して、突然変異なしの親細胞によるエタノール産生に比べて、前記細胞によるエタノール産生を増大させる）、これによりサッカライド源からのエタノール産生を最適化した組み換えホスト細胞を作製すること；
を含んでなる。
【００２０】
本方法のある態様は更に、遺伝子の突然変異を包含する単離されたポリヌクレオチド断片を作製すること、及びこの突然変異したポリヌクレオチド断片を親細胞へ導入することを含んでなる。この方法のある態様では、突然変異は欠失、挿入、又は塩基置換である。
【００２１】
本方法のある態様では、細胞は、最小培地でエタノールを産生するように最適化される。上記の適切なホスト細胞は何れも、本方法で最適化されるための親ホスト細胞株として使用することができる。
【００２２】
更なる別な態様では、本発明は、サッカライドを分解するのに適した組み換えホスト細胞による生育及びエタノール産生を支援する新規な最小培地を提供する。本発明による培地は、決められた窒素源；コーンスティープリカー（ＣＳＬ）、酵母自己消化物及び／又は抽出物、トウモロコシ加工副産物、大豆加工副産物又は使用済みの発酵培養液のような複合の窒素源；ホスフェイト源；及びマグネシウム源を包含する。
【００２３】
最小培地のある態様は、尿素様化合物を決められた窒素源として含んでいる。本発明による尿素をベースとする最小培地の各種態様では、尿素窒素の濃度が、約０．１〜１００ｍＭ、好ましくは約２．０〜２０ｍＭ、そしてより好ましくは約８〜１２ｍＭである。低い製造コストとするために、本発明の最小培地は、複合の窒素源、例えばコーンスティープリカー（ＣＳＬ）の低濃度を含有することもできる。幾つかの態様では、ＣＳＬの濃度は、約０．１〜１００ｇ／Ｌ、好ましくは約１〜２０ｇ／Ｌ、そしてより好ましくは約５〜１０ｇ／Ｌである。
【００２４】
最小培地のある態様は、サッカライドを分解するのに適している組み換えホスト細胞による、生育及びエタノール産生を支援するために最適化されている。例えば、ある培地は、これらを同時糖化発酵での使用に適合できるように、酸性ｐＨでの生育及びエタノール産生を支援するように最適化される。
【００２５】
本発明によるある培地は、上記の方法で作製された本明細書に記載の組み換えホスト細胞による、生育及びエタノール産生を支援するように最適化されている。１つの好ましい態様は、クレブシエラ・オキシトカの組み換え株による、生育及びエタノール産生を支援するように最適化された培地である。
【００２６】
本発明による培地は、サッカライド源を更に包含することができる。ある態様では、サッカライド源は、リグノセルロースを包含する。本発明の新規な培地における尿素様化合物の使用は、細菌培養の生育培地で通常用いられている、ペプトンのようなタンパク性の窒素源及びアンモニアのような低分子の窒素源に比べて、その窒素源としてのコストが比較的低いので、特に利点がある。
【００２７】
単離されたポリヌクレオチド配列、これらの配列を含んでいるベクター及び単離されたポリペプチド配列も、本発明の範囲である。これらの配列は、本発明による単離されたポリヌクレオチド配列を発現する組み換えホスト細胞の構築、及びこれらの配列に突然変異を含んでいる組み換えホスト細胞の構築を含む、多くの用途で有用である。
【００２８】
多様な態様では、本発明は、単離されたポリペプチドを提供する。従って、一態様では、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又は７のアミノ酸配列を包含するポリペプチドの断片を提供し、ここにおける断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６又は７の少なくとも１５個の連続したアミノ酸を含んでいる。
【００２９】
別な態様は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又は７のアミノ酸配列を包含するポリペプチドの天然型対立遺伝子多型であり、ここにおけるポリペプチドは、厳しい条件下でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又は４を含有する核酸分子にハイブリダイズする、核酸分子によってコードされる。
【００３０】
他の態様は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又は４のヌクレオチド配列を包含する核酸に対して少なくとも６０％同一であるヌクレオチド配列を包含する、核酸分子によってコードされるポリペプチド；及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又は７のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％同一のアミノ酸配列を包含するポリペプチドを含む。
【００３１】
本発明の別の態様は、α−アセトラクテート・デカルボキシラーゼ及びα−アセトラクテート・シンターゼタンパク質のうちの少なくとも１つをコードする細菌遺伝子のポリヌクレオチド中に欠失突然変異を包含する、ベクターである。このベクターは、細菌性ホスト細胞に組み入れられると、このタンパク質の発現を低減又は消去することができる。
【００３２】
本発明は更に、本発明のタンパク質／ポリペプチドに特異的に結合する、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のような、抗体を特徴とする。
【００３３】
ある態様では、突然変異したポリヌクレオチド配列は、クレブシエラ種のｂｕｄＡ及びｂｕｄＢから選ばれる遺伝子に由来する。このポリヌクレオチド配列は、ｂｕｄＡ及びｂｕｄＢの両方での欠失突然変異を含むことができる。
【００３４】
このタイプの好ましいベクターは、α−アセトラクテート・デカルボキシラーゼ及びα−アセトラクテート・シンターゼタンパク質をコードする細菌性遺伝子のポリヌクレオチド配列中に欠失突然変異を包含し、ここにおけるベクターは、細菌性ホスト細胞に組み入れられる場合、これら遺伝子産物の発現を低減又は消去することができる。
【００３５】
このようなベクターの一態様は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に対して少なくとも８０％同一である、突然変異したｂｕｄＡＢポリヌクレオチド配列を包含する。別の態様は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に対して少なくとも８０％同一である、突然変異したｂｕｄＡＢポリヌクレオチド配列を包含する。
【００３６】
本発明によるベクターの特別な態様は、ポリヌクレオチド配列が、クレブシエラ種のｂｕｄＡ及びｂｕｄＢから選ばれる遺伝子に由来する、プラスミドである。典型的なプラスミドは、本明細書ではｐＬＯＩ３３１０又はｐＬＯＩ３３１３と示される。
【００３７】
本発明の更なる態様は、サッカライドを分解するのに適している組み換えホスト細胞によるサッカライド源からのエタノール産生に最適化されているシステムである。このシステムは、
（ａ）選択条件下でのホスト細胞による最適な生育及びエタノール産生を支援する選択培地；
（ｂ）サッカライド源；及び
（ｃ）選択培地及び条件でのエタノール産生のために最適化されている組み換えホスト細胞（この細胞は、
糖をエタノールに変換する酵素をコードする非相同性ポリヌクレオチド配列（ここにおいて、当該細胞は、当該ホスト細胞による主要発酵生成物としてのエタノールの産生を促進するのに十分な機能レベルで、当該非相同性ポリヌクレオチド配列を発現する）；及び
当該細胞の代謝経路において、前記条件下及び培地中で当該サッカライド源からエタノール以外の生成物を産生するタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列中の突然変異（ここにおける突然変異は、当該タンパク質の発現を低減又は消去し、これにより当該ホスト細胞によるエタノール産生を、突然変異がない細胞によるエタノール産生に比べて増大させて、エタノール産生を最適化する）を包含する）、
を含んでなる。
【００３８】
このシステムの一態様では、発酵反応が、最小培地中で行われる。ある態様では、この最小培地は、上記のような尿素ベースの培地である。
【００３９】
本発明による選択培地中でのエタノール産生に最適化された適切な組み換えホスト細胞の何れも、このシステムで使用できる。
【００４０】
このシステムのある態様では、サッカライド源が、リグノセルロースを包含する。
【００４１】
リグノセルロースをサッカライド源として用いる、ＳＳＦで使用するのに適している本発明のあるシステムでは、選択培地が上記のような尿素ベースの最小培地であり、そして組み換えホスト細胞が、ブタンジオール経路でのタンパク質をコードする遺伝子中に欠失突然変異を包含するクレブシエラ・オキシトカの株である。
【００４２】
更に別の態様では、本発明は、本発明の方法又はシステムによる組み換えホスト細胞の使用についての説明書と共に包装されている、上記の組み換えホスト細胞を包含するキットを提供する。
本発明の他の態様及び利点は以下で論じる。
【００４３】
（発明の詳細な説明）
Ｉ．定義
本明細書で用いる「組み換えホスト細胞」、「組み換え微生物」などの用語は、遺伝子操作、例えば、トランスフェクトされるような非相同性ポリヌクレオチド配列を取り込むことができる遺伝子操作に、適しているか又は操作しやすい細胞、又はそのように操作されている細胞を包含するように意図されている。前記細胞は、微生物又は高度な真核細胞であり得る。前記用語は、もともとトランスフェクトされている細胞の子孫を含むように意図されている。ある態様では、細胞は、細菌の細胞、例えば、グラム陽性細菌の細胞又はグラム陰性細菌の細胞である。後者の用語は、エシェリキア属、赤痢菌、シトロバクター属、サルモネラ属、クレブシエラ属、エンテロバクター属、エルウィニア属、クルイベラ属、セラチア属、セデセア属、モルガネラ属、ハフニア属、エドワードシエラ属、プロビデンシア属、プロテウス属及びエルシニア属のような、腸内細菌科（family Enterobacteriaceae）の条件嫌気性のグラム陰性細胞の全てを含むように意図されている。好ましい組み換えホストは、大腸菌又はクレブシエラ・オキシトカの細胞である。
【００４４】
「非相同性ポリヌクレオチドセグメント」又は「非相同性ポリヌクレオチド配列」という用語は、１つ又はそれ以上のポリペプチド又はポリペプチドの部分若しくは断片をコードするポリヌクレオチドセグメントを含むように意図されている。非相同性ポリヌクレオチドセグメントは、何れかの供給源、例えば真核生物、原核生物、ウィルス、又は合成ポリヌクレオチド断片から由来していてもよい。「非相同性ポリヌクレオチド配列」という用語は、生命体に自然に存在していないポリヌクレオチド配列、例えば生命体に導入された配列も示すことができる。一態様では、ポリヌクレオチド配列の遺伝子は、糖質のエタノールへの生物変換の少なくとも一工程に関与する。従って、この用語は、アルコールデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、分泌タンパク質（複数を含む）、又はポリサッカラーゼ（例えば、エンドグルカナーゼ又はエクソグルカナーゼのようなグルカナーゼ）、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、エンド−１，４−β−キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチンヒドロラーゼ、又はペクチン酸リアーゼのような、ポリペプチドをコードする遺伝子の何れかを含むように意図されている。
【００４５】
「ポリサッカラーゼ」、「セルラーゼ」又は「グルカナーゼ」という用語は、本明細書では互換的に使用され、結合糖成分、例えば、ジサッカライド、トリサッカライド、オリゴサッカライド（本明細書では複合糖とも呼ばれる複合糖質、例えば、セルロース、へミセルロース及びペクチンを含む、セロオリゴサッカライド及びリグノセルロースを包含する）の何れかを、触媒的な分解又は脱重合できるポリペプチドを含むように意図されている。この用語は、グルカナーゼのようなセルラーゼを包含するように意図されているが、好ましくは、エンドグルカナーゼを含み、これらに限定されないが、例えば、エクソグルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、エンド−１，４−β−キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチンヒドロラーゼ、ペクチン酸リアーゼ又はこれらのセルラーゼの何れかの組み合わせも含むように意図されている。
【００４６】
「エンドグルカナーゼ」という用語は、一般にポリマー基質内の内部β１−４グルコシル結合を加水分解し、そして鎖の末端にある結合を優先的に加水分解しないセルラーゼを包含するように意図されている。
【００４７】
「サッカライド」、「サッカライド源」、「オリゴサッカライド源」、「オリゴサッカライド」、「複合セルロース」、「複合糖質」、「複合糖」、「ポリサッカライド」、「糖源」、「発酵性糖源」などの用語は、１つ又はそれ以上の糖分子を包含する何れかの糖質源を含むように意図されている。
【００４８】
本明細書で用いるような用語「サッカライド」という用語は、例えば、ジサッカライド、トリサッカライド、オリゴサッカライド及びポリサッカライドを含む。これらの糖質は、何れかの未処理植物原料又は何れかの加工植物原料からの由来であってもよい。例としては、１つ又はそれ以上の結合の糖質部分、すなわち１個の糖残基を包含する、木材、紙、パルプ、植物由来の繊維又は合成繊維である。
【００４９】
一つの具体的なサッカライド源は、「リグノセルロース」であり、これは、殆どの植物材料の乾燥重量の約９０％に相当し、そして糖質、例えば、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン及び芳香族ポリマー（例えば、リグニン）を含む。セルロースは、リグノセルロースの乾燥重量の３０％〜５０％を占め、そしてセロビオース（グルコースの２量体）のホモポリマーである。同様に、ヘミセルロースは、リグノセルロースの乾燥重量の２０％〜５０％を占め、そしてアセチル及びグルクロニル側鎖を含有するペントース（キシロース、アラビノース）及びヘキソース（グルコース、マンノース、ガラクトース）糖の混合物を含む複合ポリマーである。ペクチンは、リグノセルロースの乾燥重量の１％〜２０％を占め、そしてグルクロン酸のメチル化ホモポリマーである。
【００５０】
その他のサッカライド源は、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、非晶性セルロース（例えば、酸膨張セルロース（acid-swollen cellulose)）、及びセロオリゴサッカライドセロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、及びセロペンタオースを含む。セルロース、例えば、非晶性セルロースは、紙又はパルプ源（例えば、それらの廃液を含む）又は例えば、トウモロコシの茎、大豆可溶分、又はビートパルプのような農業副産物からの由来であってよい。上記糖質ポリマーの何れか一つ又はそれらの組み合わせは、本発明の生成物及び方法による発酵によって、解重合及び続くエタノールへの生物変換のための糖源になり得る。
【００５１】
「核酸」という用語は、例えば、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含み、そして更に非コード調節配列及びイントロンを含むことができるポリヌクレオチド配列の核酸分子を包含するように意図されている。本発明による核酸分子は、ＤＮＡ分子（例えば、線状、環状、ｃＤＮＡ又は染色体のＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ）及びヌクレオチド類似体を用いて産生されたＤＮＡ又はＲＮＡの類似体を包含する。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であってもよいが、二本鎖ＤＮＡの方が有利である。
【００５２】
本発明の「単離された」核酸分子は、核酸由来の生命体の染色体ＤＮＡ中の核酸分子の元来側面にある配列（つまり、核酸分子の５’及び３’末端に位置する配列）を有していない核酸分子を包含する。多くの態様では、単離された核酸分子は、核酸分子が由来する微生物の染色体ＤＮＡ中の核酸分子の元来側面にあるヌクレオチド配列の約１０ｋｂ、５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、０．１ｋｂ、５０ｂｐ、２５ｂｐ又は１０ｂｐ以下を含有することができる。更に、ｃＤＮＡ分子のような、単離された核酸分子は、組み換え技術で作製される場合には他の細胞物質が実質的になくてよく、又は化学的に合成される場合には化学前駆物質又は他の化学品が実質的になくてよい。
【００５３】
本明細書で用いる「遺伝子」という用語は、例えば、ポリペプチドをコードする連続オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のようなコーディング配列を包含してもよく、又はそれ自身が生体内で機能を有していてもよい、酵素又はその他のポリペプチド分子を直接合成することができる核酸である。生体内の遺伝子は、本明細書で明示されるように、オペロンに集合させることができ、ここにおけるオペロンは、遺伝子間ＤＮＡによって他の遺伝子及び／又はオペロンから分離される。オペロン中に含まれる個々の遺伝子は、個々の遺伝子の間にある遺伝子間ＤＮＡなしで、重なり合うことができる。遺伝子の一態様は、ブタンジオールの代謝経路に関わるタンパク質、α−アセトラクテート・デカルボキシラーゼ及びα−アセトラクテート・シンターゼをそれぞれコードする、クレブシエラのｂｕｄＡ及びｂｕｄＢのような機能的な遺伝子座又はオペロンに位置する１つ又はそれ以上の遺伝子である。更に、「遺伝子」という用語は、選択された目的のための特定の遺伝子を包含するように意図されている。遺伝子は、ホスト細胞に内因性であってもよいし、例えばエピソームに保持されたプラスミド又はゲノムに安定に組み入れられたプラスミド（又はその断片）のように、ホスト細胞に組み換え技術によって導入されていてもよい。
【００５４】
本明細書に記載されているような「単離された遺伝子」は、遺伝子が由来する生命体の染色体ＤＮＡ中の遺伝子の元来側面にある配列を実質的に含まない（すなわち、第２若しくは別個のポリペプチド又はＲＮＡ分子、隣接する構造配列等、をコードする隣接コーディング配列を含まない）遺伝子を包含し、そして５’及び３’調節配列、例えば、プロモーター配列及び／又は終結配列を包含していてもよい。一態様では、単離された遺伝子は、ポリペプチドを主にコードする配列（例えば、ポリペプチドをコードする配列）を包含する。
【００５５】
本明細書で用いる「ホモログ」という用語は、ポリペプチド、又は野生型ポリペプチド若しくは本明細書に記載のポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも約３０〜３５％、有利には少なくとも約３５〜４０％、より有利には約４０〜５０％、そして更に有利には少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上の同一性を共有し、そして野生型ポリペプチド又はポリペプチドと実質的に同等な機能又は生物学的活性を有しているポリペプチドを含む。従って、「ホモログ」という用語は、「機能的な変異体」を、更には「オーソログ」（異なった種から得られる同等の遺伝子）をも包含するように意図されている。
【００５６】
例えば、ｂｕｄＡ又はｂｕｄＢホモログは、それぞれＳＥＱＩＤ ＮＯ：６及びＳＥＱＩＤ ＮＯ：７で示されているアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して、少なくとも約３０〜３５％、有利には少なくとも約３５〜４０％、より有利には約４０〜５０％、そして更に有利には少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上の同一性を共有し、そしてＳＥＱＩＤ ＮＯ：６又はＳＥＱＩＤ ＮＯ：７と示されているアミノ酸配列を有するペプチドと実質的に同等な機能又は生物学的活性（すなわち機能的に同等である）を有している（例えば、実質的に同等なα−アセトラクターゼ・デカルボキシラーゼ又はα−アセトラクターゼ・シンターゼ活性を有している）。核酸の遺伝子産物、又は本発明によるそのホモログの機能活性の測定法は公知であって、以下の実施例に記載されている。
【００５７】
一態様では、遺伝子は、糖質を生物変換してエタノール以外の生成物を産生する少なくとも一つの工程に関わる。このような生成物を本明細書では、「副生成物」又は「発酵副生成物」と呼ぶ。副生成物は、糖質（サッカライド）基質をエタノール産生に利用される以外の競合の代謝経路に転換することによって収量を減少させるので、エタノール発酵反応においては一般に望ましくない。従って、一態様では、後者の経路（例えば、ブタンジオール経路）に関わる酵素のようなタンパク質をコードする遺伝子は、細胞から除くのが望ましい目標であるので本発明では重要である。微生物中にあって糖質のエタノール以外の生成物への生物変換に関わる遺伝子の例は、細菌のｂｕｄＡ及びｂｕｄＢであって、これらは糖質源からブタンジオール及びアセトインの合成に関わる、α−アセトラクテート・デカルボキシラーゼ及びα−アセトラクテート・シンターゼをそれぞれコードする。その他の重要な遺伝子は、糖発酵のその他の望ましくない副生成物（これらに限定されないが、ホルメート、ラクテート、スクシネート、アセテート、アセトイン、キシリトール、ブチレート、ピルベート、プロピオネート、イソプロピルアルコール、１−プロパノール、２−プロパノール、プロパンジオール、シトレート、グルタメート及びアセトンを含む）を産生する代謝経路に関わるものを包含する。
【００５８】
本明細書で用いる「対立遺伝子多型（複数を含む）」は、機能的な及び非機能的なタンパク質の両方を包含する。機能的な対立遺伝子多型は一般に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又は７の１つ又はそれ以上のアミノ酸の同類置換のみを含むか、又はタンパク質の非臨界領域中の非臨界残基において置換、欠失又は挿入を含む。非機能的な対立遺伝子多型は一般に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又は７のアミノ酸の非同類置換、欠失、又は挿入若しくは中途切断を含むか、又は臨界的残基又は臨界的領域における置換、挿入又は欠失を含む。
【００５９】
本発明のポリヌクレオチド又はアミノ酸配列は更に、その他の系統群メンバー又は関連する配列、例えば、遺伝子がクローン化されていない生体内のｂｕｄＡ及びｂｕｄＢに関連する遺伝子を同定するために、公共のデータベースで検索するための「クエリー配列」として用いることができる。このような検索は、「Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215;403-10」のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて実施することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明のポリヌクレオチド分子と相同なヌクレオチド配列を求めるために、ＮＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝１００、語長＝１２）で実行することができる。ＢＬＡＳＴタンパク検索は、本発明のポリヌクレオチド分子と相同なアミノ酸配列を求めるために、ＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０、語長＝３）で実行することができる。比較するためのギャップ配列を得るためには、「Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17):3389-3402」に記載のようにして、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを用いることできる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いるときは、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）を用いることができる。「http://www.ncbi.nlm.nih.gov」を参照されたい。
【００６０】
本明細書で用いる「突然変異」は、１つ又はそれ以上の染色体の異常、又は遺伝子を作っているＤＮＡ配列の変化の何れかに関わる、生体の遺伝因子における比較的永久的な変化を示すように意図されている。本明細書で用いるような突然変異は、ＤＮＡ配列の欠失又は挿入によるか、１つ又はそれ以上の塩基の変換（例えば、点突然変異）によるか、重複、ミスセンス、反復又はナンセンス突然変異によるかの何れかによって作製されたＤＮＡ配列の変化を包含する。挿入、欠失及び塩基置換の突然変異を作製する方法は、当該技術分野で公知であり、そして例えば、「Sambrook et al. 」［２６］ の論文に記載されている。
【００６１】
「発酵（fermentation)」及び「発酵する(fermenting)」という用語は、複合糖を分解又は解重合して、この糖残渣をエタノール、アセテート及びスクシネートに生物変換することを含むように意図されている。この用語は、エタノールが、特に主要な発酵生成物として糖質から産生される、酵素の処理工程（例えば、細胞性又は無細胞性（例えば、溶解又は精製されたポリペプチド混合物）を包含するように意図されている。
【００６２】
「同時糖化発酵」又は「ＳＳＦ」という用語は、複合糖の分解又は解重合、及び発酵によるその糖残基のエタノールへの生物変換を同時に行うための、１つ又はそれ以上の組み換えホスト（又は、それらの抽出物（精製又は未精製の抽出物を含む））の使用を含むことを意図している。ＳＳＦは、バイオマスを分解して、最終的に細菌でエタノールに変換されるポリサッカライドにすることができる、公知の方法である。バイオマスの分解が自然に起こるものと見なすと、ＳＳＦは、菌類（又は菌類から抽出されるセルラーゼのような酵素）の活性と、エタノール産生の細菌（又はそれから誘導される酵素）の活性を組み合わせて、リグノセルロースのような糖源をエタノールに最終的に変換可能な単糖に分解する。ＳＳＦ反応は一般に、高価な菌体酵素の使用を最適化するために酸性のｐＨで実施される。
【００６３】
「転写制御」という用語は、転写のレベルで遺伝子の発現を調節する能力を含むように意図されている。好ましい態様では、転写及びそれによる遺伝子の発現は、対象の遺伝子のコード領域の５’末端付近に代用プロモーターを置換又は付加することによって調節し、これにより遺伝子発現の変化をもたらす。好ましい態様では、１つ又はそれ以上の遺伝子の転写制御は、このような遺伝子の最適発現、例えば好ましい比率をもたらすように改変される。この用語は、当該技術分野で認識されているような誘導の転写制御も含む。
【００６４】
「発現」という用語は、少なくともｍＲＮＡ生成レベルでの遺伝子の発現、及びポリペプチドレベルでもよい遺伝子の発現を含むように意図されている。
【００６５】
「発現生成物」という用語は、発現された遺伝子により得られた生成物、例えばポリペプチド又はタンパク質を含むように意図されている。
【００６６】
「増大した発現」及び「低減した発現」という用語は、少なくともｍＲＮＡ生成レベルでの遺伝子の発現、そして好ましくはポリペプチド又はタンパク質発現のレベルでの遺伝子発現における変化（それぞれ、上方制御及び下方制御）を含むように意図されている。
【００６７】
ポリペプチドに関する「増大した産生」及び「低減又は消滅した産生」という用語はポリペプチドの酵素活性レベルでの、ポリペプチド発現量における増大若しくは低減、又はそれらの組み合わせを含むように意図されている。
【００６８】
「活性」及び「酵素活性」という用語は、互換的に用いられ、そして好ましい条件下で生成される場合に選択されたポリペプチドによって通常もたらされる機能的な活性の何れをも含むように意図されている。α−アセトラクテート・デカルボキシラーゼ酵素（ｂｕｄＡによってコードされる）の活性は、例えば、糖質源からアセトイン生成物を産生することである。α−アセトラクテート・デカルボキシラーゼのような活性を検出するための技術は、当該技術分野において公知であり（例えば、「Blomqvist et al.」  ［３５］ を参照されたい）、そして本明細書の実施例に記載されている。
【００６９】
「由来（の）」という用語は、表記された原料からポリヌクレオチド断片の単離（全部又は部分）、又は表記された原料からポリヌクレオチドの精製を含むように意図されている。この用語は、例えば、直接的なクローニング、ＰＣＲ増幅、又は表示されたポリヌクレオチド原料に関連する配列由来の若しくはそれに基づく人工的な合成を含むように意図されている。本明細書に記載の検討において、例えば、ブタンジオール経路に関連する遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、細菌クレブシエラ・オキシトカのゲノムＤＮＡから増幅されたｂｕｄＡ及びｂｕｄＢ由来である。
【００７０】
「エタノール産生の」という用語は、糖質から主要発酵生成物としてエタノールを産生する微生物の能力を含むように意図されている。この用語は、これらに限定されないが、天然由来のエタノール産生の微生物、天然由来の又は導入された突然変異を有する微生物、及び遺伝子的に改変された微生物を含む。
【００７１】
「エタノール非産生の」という用語は、糖質から主要な非気体の発酵生成物としてエタノールを産生できない細胞を含むように意図されている。この用語は、非気体の発酵生成物の総量の４０％より少ない、例えば２０％、３０％、４０％を包含する少量発酵生成物としてエタノールを産生する微生物を含むように意図されている。
【００７２】
「主要発酵生成物」という用語は、非気体発酵生成物の総量の約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％より多くを含有する非気体発酵生成物を含むように意図されている。主要発酵生成物は、最も多い非気体生成物である。本発明のある態様では、主要発酵生成物が、エタノールである。更なる態様では、主要発酵生成物が、最小塩培地で生育するホストによって産生される。
【００７３】
本明細書で用いる「少量発酵生成物」という用語は、非気体生成物の総量の４０％より少ない、例えば２０％、３０％、４０％を含有する非気体発酵生成物を含むように意図されている。
【００７４】
「グラム陰性細菌」及び「グラム陽性細菌」という用語は、これらの用語の当該技術分野で認識されている定義のものを含むように意図されている。一般に、グラム陰性細菌は、例えば、エシェリキア属、赤痢菌、シトロバクター属、サルモネラ属、クレブシエラ属、エンテロバクター属、エルウィニア属、クルイベラ属、セラチア属、セデセア属、モルガネラ属、ハフニア属、エドワードシエラ属、プロビデンシア属、プロテウス属及びエルシニア属よりなる、腸内細菌科を包含する。その他のグラム陰性細菌は、これらに限定されないが、アシネトバクター属（Acinetobacter）、グルコノバクター属（Gluconobacter）、ジオバクター属（Geobacter）及びシェワネラ属（Shewanella）を包含する。グラム陽性細菌は、これらに限定されないが、バチルス属、ゲオバチルス属、クロストリジウム属、連鎖球菌、セルロモナス属、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、オエノコッカス属（Oenococcus）及び真正細菌（Eubacterium）を含む。
【００７５】
「決められた窒素源」という用語は、個別の窒素源、すなわち、本発明で使用するのに適している窒素源として提供可能な、単一の化学物質を意味するように意図されている。決められた窒素源の例としては、例えば、尿素及びアンモニアを含む。ある態様では、２つ又はそれ以上の決められた窒素源を用いることができる。
【００７６】
「決められた窒素源」と区別される「複合の窒素源」という用語は、本発明で使用するのに適している窒素源を共に提供する、化学物質の混合物を含むように意図されている。
【００７７】
「尿素」という用語は、式：（ＮＨ２）２ＣＯを有する有機化合物を示す。本明細書で用いる「尿素様化合物」という用語は、一般式：Ｒ１Ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲ２を有する尿素の多様な類縁体／誘導体を含む。尿素様化合物及びこれらの化合物の製造方法は、例えば、Ｍｕｚｉらの米国特許第６，８７５，７６４号（２００５）に記載されており、この開示の全ては本明細書に参照として取り込まれている。
【００７８】
ＩＩ．発酵の副生成物をもたらす代謝経路のタンパク質をコードする遺伝子において突然変異を包含する組み換えホスト細胞
検討したように、本発明はサッカライドを分解するのに適している、新規及び改良された組み換えホスト細胞に関する。この細胞は、発酵の不要な副生成物産生の代謝経路に関連する１つ又はそれ以上の遺伝子における突然変異を包含する。これらの経路の変動は、サッカライド出発原料のより多くの割合を、他の不要な発酵生成物ではなく、エタノールへ変換させる。
【００７９】
従って、ある態様では、本発明は、サッカライドを分解するのに適した組み換えホスト細胞を提供する。この細胞は、糖をエタノールに変換する酵素をコードする非相同なポリヌクレオチド配列を含有している。このホスト細胞は、主要発酵生成物としてエタノールの産生を促進するのに十分な機能レベルで非相同なポリヌクレオチド配列を発現する。組み換えホスト細胞は更に、糖源からエタノール以外の生成物を産生する、細胞の代謝経路のタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列中に突然変異を包含する。この突然変異の存在は、代謝経路の少なくとも１つのタンパク質の発現を低減又は消去し、これによりこの突然変異なしの組み換え細胞によるエタノール産生に比べて、この細胞によるエタノール産生を増大させる。
【００８０】
サッカライドの分解に適している組み換えホスト細胞は、線虫、昆虫、は虫類、鳥、両生動物、及び哺乳動物のような高等真核生物の細胞であってよい。細胞は、細菌、酵母若しくは真菌のような単細胞又は多細胞微生物の細胞であってもよい。本発明による組み換え酵母細胞は、例えば、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ハンゼヌラ属、パチオソレン属、クルベロミセス属、デバリオミセス属、ヤロウイア属及びピキア属由来のものである。
【００８１】
本発明による幾つかの細菌性ホスト細胞は、グラム陽性細菌由来である。この細胞のある具体例は、例えば、バチルス属、ゲオバチルス属、クロストリジウム属、連鎖球菌及びセルロモナス属由来である。
【００８２】
その他の細菌性ホスト細胞は、グラム陰性細菌由来である。ある態様では、この細菌は条件的嫌気性である。好ましい条件的嫌気性細胞は、腸内細菌科から選ばれ、これらに限定されないが、エシェリキア属、赤痢菌、シトロバクター属、サルモネラ属、クレブシエラ属、エンテロバクター属、エルウィニア属、クルイベラ属、セラチア属、セデセア属、モルガネラ属、ハフニア属、エドワードシエラ属、プロビデンシア属、プロテウス属、及びエルシニア属を含む。
【００８３】
検討したように、本発明の組み換えホスト細胞は、糖をエタノールに変換する酵素をコードする非相同性ポリヌクレオチド配列の１つ又はそれ以上を包含する。従って、これらの細胞は、エタノール産生である。エタノール産生の組み換えホスト細胞の構築に用いるためのに適切なポリヌクレオチド配列は、例えば、ザイモモナス・モビリスのような、細菌の天然由来のエタノール産生株の遺伝子をコードすることができる。糖をエタノールに変換する２つの好ましい非相同性遺伝子は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈ）及びピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｐｄｃ）を包含する。本発明の組み換え細胞は、これらの遺伝子の片方又は両方を包含し、そして更に糖のエタノールへの変換を補助するポリサッカラーゼのような酵素をコードするその他の非相同性ヌクレオチド配列を含んでいてもよい。好ましい非相同性遺伝子は、細菌の染色体中に組み込まれる。
【００８４】
エタノール産生の組み換えホスト細胞を作製する方法は、分子生物学の分野で公知である。適当な材料、方法及び組み換えホスト生物は、例えば、参照として本明細書に組み込まれている、米国特許第６，８４９，４３４号、同第６，３３３，１８１号、同第５，８２１，０９３号、同第５，４８２，８４６号、同第５，４２４，２０２号、同第５，０２８，５３９号、同第５，０００，０００号、同第５，４８７，９８９号、同第５，５５４，５２０号、及び同第５，１６２，５１６号に記載されており、そして本発明を実施するために利用することができる。
【００８５】
ある態様では、組み換えホスト細胞は、腸内細菌科由来のエタノール産生のグラム陰性細菌である。例えば、参照として本明細書に組み込まれている米国特許第５，８２１，０９３号のエタノール産生のホストは、ホストに適しており、そして特に、以下で検討する、大腸菌ＫＯ４株（ＡＴＣＣ５５１２３）、ＫＯ１１（ＡＴＣＣ５５１２４）、ＫＯ１２（ＡＴＣＣ５５１２５）及びクレブシエラ・オキシトカＰ２株（ＡＴＣＣ５５３０７）を含む。あるいは、本発明のエタノール非産生のホストは、糖をエタノールに変換する１つ又はそれ以上の適当な酵素をコードする非相同性ポリヌクレオチド配列を付加することによって、エタノール産生のホストに変換することができる。
【００８６】
本発明の幾つかの態様では、エタノール産生の組み換えホスト細胞が、エルウィニア属又はクレブシエラ属由来である。クレブシエラ・オキシトカ由来の組み換えホストは、ペントースとヘキソースの共発酵の効率、毒素に対する抵抗、複合サッカライドを解重合する酵素の産生（真菌性セルラーゼ添加による解重合の必要性を避けるか若しくは減じる）及び環境耐性を含む多くの便宜性を有していて、リグノセルロースのＳＳＦに特に適している。
【００８７】
エタノール産生性クレブシエラ属ホスト細胞に適しているものの１つは、Ｋ．オキシトカＭ５Ａ１の誘導体のＫ．オキシトカＰ２（「Wood, et al. (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58:2103-2110」及び米国特許第５，８２１，０９３号を参照されたい）である。有利なことに、Ｋ．オキシトカ株は、尿素を窒素源として使用できる固有の能力を有している。一態様では、エタノール産生の組み換え細菌は、少なくとも１つのエンドグルカナーゼ（例えば、ＥＧＹ又はＥＧＺ）をコードする少なくとも１つの非相同性ポリヌクレオチド断片（例えば、エルウィニア属由来のｃｅｌＹ又はｃｅｌＺ）を含有している。より好ましくは、エタノール産生の組み換えホスト細胞が、エンドグルカナーゼをコードする１つ又はそれ以上の非相同性ポリヌクレオチド断片を含有している。例えば、米国特許出願公開第２００４／０１５９９０号公報に記載されているような、ｃｅｌＹ及びｃｅｌＺは、機能的に組み込まれ、発現され、そしてエタノール産生の株Ｋ．オキシトカＰ２から分泌されて、同時にサッカライド基質（例えば結晶性セルロース）からエタノールを産生することができる。
【００８８】
上記で検討したように、ＳＳＦによるエタノール産生の工程は、組み換えホスト細胞によりエタノール以外の不要な発酵副生成物の産生が伴うことは公知である。基質である糖の、エタノール以外の生成物を産生する別の代謝経路への転換は、別の経路がない場合の理論的な可能性より低い生産性及び収率をもたらす。本発明による組み換えホスト細胞は、不要な副生成物の産生能力を減少した又は産生できないことの効果によって、この問題を低減するように改変される。この細胞の各種態様では、選択された発酵副生成物を産生する能力を低減又は消去するように、改変される。組み換えホスト細胞のある態様は、これらに限定されないが、ホルメート、ラクテート、スクシネート、アセテート、アセトイン、ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、キシリトール、ブチレート、ピルベート、プロピオネート、イソプロピルアルコール、１−プロパノール、２−プロパノール及びアセトンを包含する、副生成物を産生できないことである。
【００８９】
上記のように不要な副生成物の産生を不能にするために、本発明による組み換えホスト細胞の幾つかの具体例は、糖原料からエタノール以外の生成物を産生する、細胞中の代謝経路のタンパク質をコードする１つ又はそれ以上のポリヌクレオチド配列中に欠失突然変異を含有している。この細胞の幾つかの具体例は、細胞において糖からホルメート、ラクテート、スクシネート、アセテート、アセトイン、ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、キシリトール、ブチレート、ピルベート、プロピオネート、イソプロピルアルコール、１−プロパノール、２−プロパノール、又はアセトンを産生する１つ又はそれ以上の代謝経路に関わるタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列中に欠失突然変異を有している。
【００９０】
欠失突然変異に関する本発明の一態様は、細胞の選択された代謝経路と関連すると知られている、「はじき出し（knocking out）」遺伝子に関する。細菌細胞のような細胞に存在する、選択された代謝生成物を産生する生物化学的な経路についての解明が進んでいる。糖からのエタノール以外の生成物（例えば、ホルメート、ラクテート、スクシネート、アセテート、アセトイン及び２，３−ブタンジオールのような生成物）を産生するための細菌のような細胞に存在する代謝経路は報告されており、例えば、化学文献の検索によって容易に確認することができる。
【００９１】
ホルメート、ラクテート、スクシネート、アセテート、アセトイン、ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、キシリトール、ブチレート、ピルベート、プロピオネート、イソプロピルアルコール、１−プロパノール、２−プロパノール又はアセトンを産生する代謝経路に関わるタンパク質又はその機能的な断片をコードする遺伝子のノックアウトは、糖発酵のこのような不要な副生成物の産生ができない組み換えホストをもたらす。
【００９２】
組み換えホスト細胞の幾つかの態様では、欠失突然変異は、ブタンジオール代謝経路に関わる酵素をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列中にある。この経路は、細菌細胞により糖原料からアセトイン及び２，３−ブタンジオールの産生をもたらす。幾つかの態様では、欠失突然変異が、酵素α−アセトラクテート・デカルボキシラーゼ及びα−アセトラクテート・シンターゼをそれぞれコードする、ｂｕｄＡ及びｂｕｄＢの片方又は両方にある。ブタンジオール経路によるこれらの副生成物の産生は、これら２つの酵素の作用によって引き起こされる。これらの酵素の発現を低減又は消去する欠失突然変異は、糖原料からアセトイン及び２，３−ブタンジオールの産生ができないエタノール産生の組み換えホスト細胞をもたらし、これにより、この突然変異が存在しない組み換え細胞と比べて、糖原料からの増大したエタノール産生を示す。
【００９３】
本発明によって提供されるホスト細胞のある態様は、ｂｕｄＡ及びｂｕｄＢ遺伝子の両方に欠失突然変異を含有しているエタノール産生の組み換え細菌である。これらの遺伝子に欠失を保持する１つの好ましいホスト細胞は、Ｋ．オキシトカＢＷ２１と称されている、Ｋ．オクトシカＰ２の変異株である。以下に示すように、この株は窒素源として尿素様化合物を含有する最小培地でのエタノール産生に有利に用いることができ、そして酸性のｐＨ範囲の培地で行われる発酵反応で用いるのに特に適している。
【００９４】
ＩＩＩ．単離された核酸分子及びポリペプチド
別の態様では、本発明は、酵素α−アセトラクテート・デカルボキシラーゼ及びα−アセトラクテート・シンターゼをそれぞれコードする、ｂｕｄＡ及びｂｕｄＢ遺伝子配列を包含する単離された核酸分子を特徴としている。この核酸は、グラム陰性及びグラム陽性の細菌、例えば、グラム陰性細菌であるクレブシエラ・オキシトカ由来である。
【００９５】
単離されたゲノム核酸は、ブタンジオール経路の上記遺伝子（すなわち、ｂｕｄＡ及びｂｕｄＢ）、及び調節領域（例えば、プロモーター（複数を含む）及びリボソーム結合部位（複数を含む））を包含する側面にある領域、更にエタノール産生に関わる、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈ）及びピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｐｄｃ）のような他の関連する遺伝子を包含することを特徴とする。
【００９６】
検討したように、本発明は、とりわけクレブシエラ株由来のｂｕｄＡ及びｂｕｄＢ遺伝子のそれぞれをコードする配列の全長若しくは部分を、コードする新規な核酸を提供する。これらの遺伝子は、これらの遺伝子によってコードされる酵素の活性からもたらされる不要な発酵副生成物の増大した産生を発見することによって単離された。より具体的には、これら副生成物の産生が、上記のＯＵＭのような望ましい、安価な生育培地中で実施される発酵反応において、エタノール産生の細菌中で増大することが、実証された。
【００９７】
これらの生成物の産生を消去するために、エタノール産生の生成細胞の副生成物を作る能力を消去するために遺伝学的戦略を立てた。一例として、ｂｕｄＡ及びｂｕｄＢの一部をコードする遺伝子を最初にクレブシエラ・オキシトカからクローンした。次いで単離された配列を、効力がないようにするために、ｂｕｄＢ遺伝子の大きな断片を除去する遺伝子操作を実施した。ｂｕｄＡ及びｂｕｄＢ遺伝子はこれまで、クレブシエラ・オキシトカから単離されたことがない。従って、本発明はある態様で、新規なＤＮＡ配列、及びこれらのＤＮＡ配列に基づく予測アミノ酸配列を提供する。
【００９８】
本発明による新規な核酸の一態様は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又は４に記載されているヌクレオチド配列を包含する単離された核酸分子である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３として本明細書で示されている核酸は、タンパク生成物であるα−アセトラクテート・デカルボキシラーゼをコードする、クレブシエラ・オキシトカのｂｕｄＡ遺伝子からの推定全長コード配列に対応する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４として本明細書で示されている核酸は、タンパク生成物であるα−アセトラクテート・シンターゼをコードする、同種のｂｕｄＢ遺伝子からの部分コード配列に対応する。
【００９９】
本発明のその他の新規な配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及び４に対応する推定アミノ酸配列であり（以下に記載する）、これらは本明細書でそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６及び７で示されている。
【０１００】
本発明による核酸の一態様は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又は７と記載されているアミノ酸配列を包含するポリペプチドをコードする単離された核酸分子である。
【０１０１】
本発明は更に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又は７と記載されているアミノ酸配列を包含するポリペプチドの天然型対立遺伝子多型をコードする単離された核酸分子である。
【０１０２】
別の態様では、単離された核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又は７と記載されているアミノ酸配列を包含するポリペプチドのホモログをコードする。更なるｂｕｄＡ及びｂｕｄＢの核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７と記載されているアミノ酸配列を含有しているポリペプチドのホモログをコードする（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７と記載されているアミノ酸配列を含有しているポリペプチドに対して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれ以上同一であり、このポリペプチドと実質的に同一の活性を有するポリペプチドをコードする）ものである。
【０１０３】
更なる他の態様は、以下の単離された核酸分子を含む。一態様は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３若しくは４のヌクレオチド配列又はそれらの相補体に対して、少なくとも６０％同一であるヌクレオチド配列を包含する核酸分子である。多くの態様では、本発明の単離された核酸分子は、本明細書でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４と記載されている核酸配列に対して、少なくとも約６０〜６５％、有利には少なくとも約７０〜７５％、より好ましくは少なくとも約８０〜８５％、そしてより有利には少なくとも約９０〜９５％又はそれ以上同一であるヌクレオチド配列を包含する。
【０１０４】
更なる別な態様は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３若しくは４のヌクレオチド配列又はそれらの相補体を包含する核酸の、少なくとも１００個のヌクレオチド断片を包含する核酸分子である。
【０１０５】
本発明による核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又は７のアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を包含するポリペプチドをコードするものであってもよい。
【０１０６】
別の態様は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又は７のアミノ酸配列を包含するポリペプチドの断片をコードする核酸分子であって、ここにおける断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又は７のアミノ酸配列の少なくとも１５個の連続したアミノ酸残基を包含する。
【０１０７】
別の態様では、単離された核酸分子は、厳しい条件下で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４と記載される核酸配列を有している核酸分子にハイブリダイズする。別の態様では、単離されたｂｕｄＡ又はｂｕｄＢの核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子の全部又は部分にハイブリダイズする。
【０１０８】
適当なハイブリダイゼーション条件は、当業者に公知であり、そして例えば、「Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc. (1995), sections 2, 4 and 6」に見い出すことができる。更なる厳しい条件は、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), chapters 7, 9 and 11」に見い出すことができる。
【０１０９】
厳しいハイブリダイゼーション条件の、特別な限定されない例として、約６５〜７０℃で、４×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のハイブリダイゼーション（又は、約４２〜５０℃で、４×ＳＳＣ＋５０％のホルムアミド中のハイブリダイゼーション）、次いで約６５〜７０℃で、１×ＳＳＣ中で１回又はそれ以上の洗浄を含む。非常に厳しいハイブリダイゼーション条件の、特別な限定されない例として、約６５〜７０℃で、１×ＳＳＣ中のハイブリダイゼーション（又は、約４２〜５０℃で、１×ＳＳＣ＋５０％のホルムアミド中のハイブリダイゼーション）、次いで約６５〜７０℃で、０．３×ＳＳＣ中で１回又はそれ以上の洗浄を含む。低い程度の厳しいハイブリダイゼーション条件の、特別な限定されない例として、約５０〜６０℃で、４×ＳＳＣ中のハイブリダイゼーション（又は、約４０〜４５℃で、６×ＳＳＣ＋５０％のホルムアミド中の代替のハイブリダイゼーション）、次いで約５０〜６０℃で、２×ＳＳＣ中で１回又はそれ以上の洗浄を含む。上記の値の中間の範囲、例えば、６５〜７０℃又は４２〜５０℃も本発明に含まれるものと意図されている。ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４及び１．２５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を、ハイブリダイゼーション及び緩衝液の洗浄で、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌ及び１５ｍＭのクエン酸ナトリウムである）と置き換えることができ、ハイブリダイゼーションが完了した後、洗浄をそれぞれ１５分間実施する。
【０１１０】
長さ５０塩基対より少ないと予測されるハイブリッドのためのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの溶解温度（Ｔｍ）よりも５〜１０℃低くすべきであり、このＴｍは、以下の式に従って決められる。
長さ１８塩基対より少ないハイブリッドのためには、Ｔｍ（℃）＝２（Ａの数＋Ｔ塩基数）＋４（Ｇの数＋Ｃ塩基数）。
長さ１８〜４９塩基対の範囲のハイブリッドのためには、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（Ｇ（％）＋Ｃ）−６００／Ｎ）。ここにおけるＮは、ハイブリッド中の塩基の数であり、そして［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度（１×ＳＳＣ＝０．１６５Ｍに対する［Ｎａ＋］）である。
【０１１１】
当業者には認識されているが、追加の試薬を、膜（例えば、ニトロセルロース又はナイロン膜）への核酸分子の非特異的ハイブリダイゼーションを低減するために、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄緩衝液に加えることができる。試薬には、これらに限定されないが、ブロッキング剤（例えば、ＢＳＡ又はサケ若しくはニシン精子担体のＤＮＡ）、洗浄剤（例えば、ＳＤＳ）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、フィコール（Ficoll）、ＰＶＰ等が含まれる。ナイロン膜を使用する場合、具体的な、追加の限定されない厳しいハイブリダイゼーション条件は、約６５℃における０．２５〜０．５ＭのＮａＨ２ＰＯ４、７％のＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、次いで６５℃における０．０２ＭのＮａＨ２ＰＯ４、１％のＳＤＳ（またあるいは、０．２×ＳＳＣ、１％のＳＤＳ）で１回又はそれ以上の洗浄である。例えば、「Church and Gilbert (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1991-1995」を参照されたい。
【０１１２】
別の態様では、単離された核酸分子は、本明細書に記載のｂｕｄＡ又はｂｕｄＢのヌクレオチド配列に相補的な（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載のヌクレオチド配列に相補的な）ヌクレオチド配列を包含する。
【０１１３】
本発明の更なる他の態様は、突然変異ｂｕｄＡ又はｂｕｄＢの核酸分子又は遺伝子を特徴としている。一般に、本明細書に記載されているような突然変異の核酸分子又は突然変異の遺伝子は、この突然変異でコードされ得るポリペプチド又はペプチドが、野生型の核酸分子又は遺伝子によってコードされるポリペプチド又はペプチドとは異なった活性を示すように、少なくとも１つの改変（例えば、塩基置換、挿入、欠失）を含むヌクレオチド配列を有している核酸分子又は遺伝子を包含する。
【０１１４】
本発明による単離された突然変異の核酸分子の一態様は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載されているクレブシエラ・オキシトカから突然変異したｂｕｄＡＢヌクレオチド配列を包含する。突然変異したクレブシエラｂｕｄＡＢヌクレオチド配列を包含する核酸の別の種類では、突然変異した（欠失した）ｂｕｄＡ及びｂｕｄＢコード配列が、突然変異ｂｕｄＡ及びｂｕｄＢ遺伝子の間に挿入された、ＦＲＴ部位が側面にあるテトラサイクリン遺伝子によって分離される。後者の配置を包含するＤＮＡ構築物は、本明細書でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８として示されている。以下の実施例４及び５も参照されたい。
【０１１５】
本発明の核酸分子（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のヌクレオチド配列を有している核酸分子）は、標準的な分子生物学技術及び本明細書で提供されている配列情報を用いて単離することができる。例えば、核酸分子は、標準的なハイブリダイゼーション及びクローニング技術を用いて単離できる（例えば、「Sambrook, J., Fritsh, E.F., and Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989」に記載のように）か、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の配列に基づいて設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって単離することができる。ｂｕｄＡの推定全長コード配列及びｂｕｄＢの部分コード配列を包含するクレブシエラ・オキシトカ及び関連する株からのＤＮＡ断片の増幅に適しているプライマーは、本明細書にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と記載されているヌクレオチド配列を有していてもよい。本発明の核酸は、鋳型としてのｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はその代替のゲノムＤＮＡ、及び適当なオリゴヌクレオチドプライマーを用い、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って増幅することができる。適切なＰＣＲプライマーは、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及び２を有するように、設計できる。
【０１１６】
突然変異核酸分子又は突然変異遺伝子は、改良されたα−アセトラクテート・デカルボキシラーゼ又はα−アセトラクテート・シンターゼの活性、例えば、基質親和性、熱安定性、種々のｐＨでの活性；又はコドンの使用（例えば、受容ホスト細胞中での改善された発現のため）を有するポリペプチドをコードすることができる。
【０１１７】
あるいは、本発明による突然変異核酸分子又は突然変異遺伝子は、α−アセトラクテート・デカルボキシラーゼ又はα−アセトラクテート・シンターゼ活性を低減させた、又は活性のないポリペプチドをコードすることができる。α−アセトラクテート・デカルボキシラーゼ又はα−アセトラクテート・シンターゼの発現又は活性が欠損している、クレブシエラ・オキシトカ由来の突然変異したｂｕｄＡＢポリペプチドをコードする突然変異核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５又は８の配列を有することができる。α−アセトラクテート・デカルボキシラーゼ又はα−アセトラクテート・シンターゼの低減した活性又は活性がない状態を検出する方法は、公知であるか、又は例えば以下の実施例に記載されている。
【０１１８】
本発明は更に、異種ポリペプチドをコードする上記の核酸分子及びヌクレオチド配列の何れかを包含する単離された核酸分子を含む。ある態様では、本発明の異種ポリヌクレオチド配列は、グラム陽性又はグラム陰性細菌由来の、単離されたピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｐｄｃ）核酸配列又は遺伝子、及び／又は単離されたアルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈ）核酸配列又は遺伝子を包含する核酸を特徴としている。有利には、このｐｄｃ核酸又は遺伝子は、グルコノバクター属、リゾビウム属（Rhizobium）、ブラディリゾビウム属（Bradyrhizobium）、アルカリゲネス属（Alcaligenes）、ロドバクター属（Rhodobacter）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、アゾスピリルム属（Azospirillum）、ロドスピリルム属（Rhodospirillum）、スフィンゴモナス属（Sphingomonas）、バークホルデリア属（Burkholderia）、デスルフォモナス属（Desulfomonas）、ゲオスピリルム属（Geospirillum）、スクシノモナス属（Succinomonas）、アエロモナス属（Aeromonas）、シュワネラ属（Shewanella）、ハロクロマチウム属（Halochromatium）、シトロバクター属、エシェリキア属、クレブシエラ属、ザイモモナス属（例えば、ザイモモナス・モビリス）、ザイモバクター属（Zymobacter）（例えば、ザイモバクター・パルメ（Zymobacter palmae））、及び酢酸菌属（Acetobacter）（例えば、酢酸菌パストリアヌス菌（Acetobacter pasteurianus））よりなる群から選ばれるグラム陰性微生物由来である。
【０１１９】
他の態様では、ｐｄｃ核酸又は遺伝子は、フィブロバクター属（Fibrobacter）、アシドバクター属（Acidbacter）、バクテロイデス属（Bacteroides）、スフィンゴバクテリウム属（Sphingobacterium）、アクチノミセス属（Actinomyces）、コリネバクテリウム属、ノカルジア属（Nocardia）、ロドコッカス属、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）、バチルス属、ゲオバチルス属、パエニバチルス属（Paenibacillus）、スルホバチルス属（Sulfobacillus）、クロストリジウム属、アナエロバクター属（Anaerobacter）、真正細菌、連鎖球菌、ラクトバチルス属、ロイコノストック属（Leuconostoc）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、ラクトコッカス属、サーモビフィダ属（Thermobifida）、セルロモナス属、及びサルシナ属（Sarcina）（例えば、サリシナ・ベントリキュリ（Sarcina ventriculi））よりなる群から選ばれるグラム陽性微生物由来である。
【０１２０】
上記で検討のように、本発明の別な態様は、新規な単離されたポリペプチド（例えば、ブタンジオール代謝経路で活性な単離された酵素、例えばクレブシエラ・オキシトカ由来のα−アセトラクテート・デカルボキシラーゼ又はα−アセトラクテート・シンターゼ）を特徴としている。一態様では、ポリペプチドは、組み換えＤＮＡ技術によって作製されて、本発明の微生物から、標準的なポリペプチド精製技術を用いる適切な精製スキームによって単離できる。別の態様では、ポリペプチドは標準的なペプチド合成技術を用いて、化学的に合成される。
【０１２１】
単離又は精製されたポリペプチド（例えば、単離又は精製されたα−アセトラクテート・デカルボキシラーゼ又はα−アセトラクテート・シンターゼ）は、ポリペプチドが由来している微生物からの細胞物質又はその他の夾雑ポリペプチドを実質的に含まない、また化学合成の場合には化学的な前駆物質又はその他の化学物質を実質的に含まない。一態様では、単離又は精製されたポリペプチドは、約３０％（乾燥重量で）以下の夾雑ポリペプチド又は化学物質、より有利には約２０％以下の夾雑ポリペプチド又は化学物質、更により有利には約１０％以下の夾雑ポリペプチド又は化学物質、そして最も有利には約５％以下の夾雑ポリペプチド又は化学物質を有している。
【０１２２】
一態様では、本発明の単離されたポリペプチド（例えば、単離されたα−アセトラクテート・デカルボキシラーゼ又は単離されたα−アセトラクテート・シンターゼ酵素）は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されているようなアミノ酸配列を包含する。
【０１２３】
別の態様では、本発明の単離されたポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載されているポリペプチドの少なくとも１つのホモログである（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列に対して、少なくとも約３０〜４０％同一の、有利には少なくとも約４０〜５０％同一の、より有利には少なくとも約５０〜６０％同一の、更により有利には少なくとも約６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜９５％又はそれ以上同一のアミノ酸配列を包含し、そしてそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列によってコードされるポリペプチドと実質的に同じ活性を有している）。
【０１２４】
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸の同一性の割合を測定するために、最適な比較を目的として配列を整列させる（例えば、第１のアミノ酸又は核酸配列にギャップを導入することで、第２のアミノ酸又は核酸配列と最適な位置合わせができる）。第１配列の位置が、第２配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドで占められている場合、この分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性の割合は、配列が共有する同一性の位置数の関数である（すなわち、同一性（％）＝同一性の位置の数／位置の総数×１００）であり、最適な位置合わせとするために必要なギャップの数及びそのギャップの大きさを計算に取り入れることが有利である。
【０１２５】
配列の比較及び２つの配列間の同一性の割合の測定は、数学アルゴリズムを用いて実行することができる。配列の比較に用いられる数学アルゴリズムの、特別な非限定的な例は、ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2246-68）であり、「Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77」として改良されている。このようなアルゴリズムは、ＡｌｔｓｃｈｕｌらのＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０；Altschul et al. (1990) J.Mol. Biol. 215:403-10）に組み込まれる。本発明の核酸分子に相同な核酸配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝１００、語長＝１２）でＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を実施することができる。本発明のポリペプチド分子に相同なアミノ酸配列を求めるために、ＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０，語長＝３）でＢＬＡＳＴポリペプチド検索を実施することができる。比較のためのギャップのある位置合わせを得るために、「Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Research 25 (17):3389-3402」に記載のように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを用いることができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合は、それぞれのプログラムのデフォルト・パラメータ（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）を用いることができる。「http://www.ncbi.nlm.nih.gov」を参照されたい。配列の比較に用いられる数学アルゴリズムの、別に特殊なその他の非限定的な例は、ＭｙｅｒｓとＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Myers and Miller (1988) Comput Appl Biosci. 4:11-17）である。このようなアルゴリズムは、例えば、ＧＥＮＥＳＴＲＥＡＭネットワークサーバー（IGH Montpellier, France) で、又はＩＳＲＥＣサーバーで得られる、ＡＬＩＧＮプログラムに組み込まれる。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを使用する場合は、ＰＡＭ１２０の重量残渣表、１２ギャップ長ペナルティー及び４ギャップペナルティー（PAM120 weight residue table, a gap length penalty of 12 and a gap penalty of 4）を用いることができる。
【０１２６】
別の態様では、２つのアミノ酸配列間の同一性の割合は、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスの何れか、並びに１２、１０、８、６又は４のｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ及び２、３又は４のｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔを用いる、ＧＣＧソフトウェアーパッケージ中のＧＡＰプログラムを使用して測定することができる。更なる別の態様では、２つの核酸配列間の同一性の割合は、ｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ：５０及びｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ：３を用いる、ＧＣＧソフトウェアーパッケージ（「http://www.gcg.com」で利用可能）中のＧＡＰプログラムを使用して得ることができる。
【０１２７】
ＩＶ．ベクター
本発明は更に、プラスミドベクターを包含するベクター（例えば、組み換えベクター）を特徴としている。本発明によるベクターは、本明細書に記載の核酸分子（例えば、単離の又は組み換えの核酸分子及び／又は遺伝子）を含有している。特に、組み換えベクターは、本明細書に記載のような細菌遺伝子産物、有利にはｂｕｄＡ及びｂｕｄＢ遺伝子産物（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又は４）、又はホスト細胞においてこれらの遺伝子産物の発現を低減又は消去する、突然変異のｂｕｄＡ及びｂｕｄＢ配列（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５又は８）をコードする核酸配列を包含することを特徴としている。これらの配列は、より有利には、グラム陰性又はグラム陽性細菌のｂｕｄＡ及びｂｕｄＢ遺伝子産物であり、更により有利には、クレブシエラ属又はエルウィニア属由来のｂｕｄＡ及びｂｕｄＢ遺伝子産物である。
【０１２８】
本発明によるベクターの一態様は、α−アセトラクテート・デカルボキシラーゼ及びα−アセトラクテート・シンターゼタンパク質のうちの少なくとも１つをコードする細菌遺伝子中に突然変異を包含するポリヌクレオチド配列を含み、ここにおけるベクターは、細菌ホスト細胞に組み入れられると、当該タンパク質の発現を低減又は消去することができる。
【０１２９】
ベクターの一態様では、ポリヌクレオチド配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又は４に記載されているヌクレオチド、又は以下に述べるようなその機能的断片を包含する、単離された核酸分子中に突然変異を包含している。この突然変異は、欠失、挿入又は塩基置換の突然変異であってよい。
【０１３０】
好ましい一態様では、ポリヌクレオチド配列中の突然変異は、欠失突然変異である。このタイプのベクターの幾つかの種類は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５又は８に記載されているようなクレブシエラ・オキシトカ由来の突然変異ｂｕｄＡＢポリヌクレオチド配列を包含する。その他のベクターは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５又は８に少なくとも８０％の同一性があるポリヌクレオチド配列に突然変異を包含する。
【０１３１】
本発明によるベクターの別な好ましい態様は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５又は８に記載されている、突然変異ｂｕｄＡＢポリヌクレオチド配列を包含するプラスミドベクターである。ｐＬＯＩ３３１０又はｐＬＯＩ３３１３と呼ばれている、このタイプのプラスミドの例が、本明細書に記載されている。例えば、以下の実施例４及び５を参照されたい。
【０１３２】
本発明によるベクターの別な態様は、クレブシエラ・オキシトカ由来のタンパク質α−アセトラクテート・デカルボキシラーゼをコードする、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載のポリヌクレオチド配列を包含する。
【０１３３】
組み換えベクター（例えば、プラスミド、ファージ、プラスミド、ウィルス、コスミド又はその他の精製された核酸ベクター）は、組み換えベクターが由来する野生型又は天然型核酸分子に含まれるものよりも、より大きな、より小さな又は異なった核酸分子を含有するように、変更、修正又は改変することができる。有利には、この組み換えベクターは、本明細書で定義されているような調節配列、例えば、プロモーター配列、終結配列及び／又は人工リボソーム結合部位（ＲＢＳｓ）に操作して結合できる、ｂｕｄＡ及びｂｕｄＢ遺伝子、又はｂｕｄＡ及びｂｕｄＢ遺伝子又はその突然変異を含んでいる組み換え核酸分子を包含する。
【０１３４】
一般に、ｂｕｄＡ及びｂｕｄＢ遺伝子又は突然変異は、ヌクレオチド配列の発現（例えば、増強された、増大した、構成的な、定常的な、弱めた、低減した又は抑制された発現）、有利にはヌクレオチド配列によってコードされる遺伝子産物の発現（例えば、組み換え核酸分子が、本明細書で定義されているような、組み換えベクター中に含まれ、これが微生物に組み込まれているとき）を許容する形で、調節配列に操作して結合できる。
【０１３５】
この調節配列は、他の核酸配列の発現に影響を及ぼす（例えば、調節又は規制する）核酸配列を包含する。一態様では、調節配列は、目的の調節配列及び遺伝子で自然界に見られる、例えば天然の位置及び／又は方向で観察されるように、目的の特別の遺伝子に関連する類似又は同一の位置及び／又は方向にある組み換え核酸分子又は組み換えベクター中に含まれる。例えば、目的の遺伝子は、天然の生命体中の目的の遺伝子に付随又は隣接している調節配列に操作して結合できる（例えば、「天然の」調節配列に、例えば「天然の」プロモーターに操作して結合できる）、組み換え核酸分子又はベクター中に包含されていてもよい。あるいは、目的となる遺伝子は、天然の生命体中の他の（例えば、異なった）遺伝子に付随もしくは隣接している調節配列に操作して結合できる、組み換え核酸分子又はベクター中に包含されていてもよい。
【０１３６】
あるいは、目的となる遺伝子は、別の生命体由来の調節配列に操作して結合できる、組み換え核酸分子又はベクター中に包含されていてもよい。例えば、その他の微生物由来の調節配列（例えば、その他の細菌の調節配列、バクテリオファージ調節配列など）は、目的の特別な遺伝子と操作して結合することができる。
【０１３７】
一態様では、調節配列が、非天然の又は非天然由来の配列（例えば、化学的に合成された配列を含む、改変された、突然変異した、置換された、誘導体化された又は削除された配列）である。有利な調節配列は、プロモーター、エンハンサー、終結シグナル、抗終結シグナル及びその他の発現制御因子（例えば、転写ｍＲＮＡ中にある、レプレッサー又は誘導物質が結合する配列、及び／又は転写及び／又は翻訳の調節ポリペプチドの結合部位）を含む。このような調節配列は、例えば、「Sambrook, J., Fritsh, E.F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, NY 1989」に記載されている。
【０１３８】
調節配列は、微生物中でヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの（例えば、構成的プロモーター又は強力構成的プロモーター）；微生物中でヌクレオチド配列の誘導発現を指示するもの（例えば、誘導プロモーター、例えばキシロース誘導プロモーター）；及び微生物中でヌクレオチド配列の発現を減衰又は抑制するもの（例えば、減衰シグナル又は抑制配列）を包含する。調節配列を除去又は欠失することにより目的となる遺伝子の発現を調節することも、本発明の範囲内である。例えば、負の転写調節に含まれる配列を、目的の遺伝子の発現を増大させるように除去することができる。
【０１３９】
一態様では、本発明の組み換え核酸分子又は組み換えベクターは、プロモーター又はプロモーター配列に操作して結合できる、少なくとも一つの細菌性ｂｕｄＡ又はｂｕｄＢ遺伝子産物をコードする核酸配列又は遺伝子を含む。本発明の有利なプロモーターは、天然のプロモーター、代理プロモーター（surrogate promotor）及び／又はバクテリオファージプロモーターを含む。一態様では、プロモーターは、生化学的なハウスキーピング遺伝子に関係するプロモーター又はエタノール産生の経路に関係するプロモーターである。別の態様では、プロモーターは、バクテリオファージプロモーターである。その他のプロモーターは、バチルス（例えば、バチルス・サブティリス）中で高レベルの発現を促進する、ｔｅｆ（翻訳伸長因子（ＴＥＦ）プロモーター）及びｐｙｃ（ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＹＣ）プロモーター）を含む。例えば、グラム陽性細菌中で使用するための更なる有利なプロモーターは、これらに限定されないが、ａｍｙＥプロモーター又はファージＳＰ０２プロモーターを含む。例えば、グラム陰性細菌中で使用するための更なる有利なプロモーターは、これらに限定されないが、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｅｔ、ｔｒｐ−ｔｅｔ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｌａｃＩｑ、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ＳＰ６、λ−ＰＲ又はλ−ＰＬを含む。
【０１４０】
その他の態様では、本発明の組み換え核酸分子又は組み換えベクターは、終結配列（複数を含む）（例えば、転写終結配列）を含む。一般に、終結配列は、遺伝子の転写を終結するのに役立つ調節配列を示す。終結配列（又は、タンデム転写終結因子）は更に、核酸分解酵素に対して、ｍＲＮＡを安定化させる（例えば、ｍＲＮＡに構造を加えることにより）のに役立てることができる。
【０１４１】
更なる他の態様では、本発明の組み換え核酸分子又は組み換えベクターは、当該配列を含有しているベクターの検出ができる配列（すなわち、検出可能及び／又は選択可能なマーカー）、例えば、栄養要求性変異に打ち勝つ配列、例えば、ｕｒａ３又はｉｌｖＥ、蛍光マーカー、及び／又は比色分析用マーカー（例えば、ｌａｃＺ／β−ガラクトシダーゼ）、及び／又は抗生物質耐性遺伝子（例えば、ｂｌａ又はｔｅｔ）を含む。
【０１４２】
本発明のｂｕｄＡ及びｂｕｄＢ遺伝子のうちの何れか１つは、１つ又はそれ以上のエタノール産生の遺伝子（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ（つまり、ａｄｈ）及びピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｐｄｃ））並びに／又は例えば、米国特許第５，８２１，０９３号；５，４８２，８４６号；５，４２４，２０２号；５，０２８，５３９号；５，０００，０００号；５，４８７，９８９号；５，５５４，５２０号及び５，１６２，５１６号に記載されているような、糖の発酵又は発酵に続く糖の分解に適した遺伝子産物をコードする遺伝子も包含する、ベクター中に導入することができる。このような２つ又はそれ以上の遺伝子は、別の調節因子（例えばプロモーター）、共通の調節因子（複数を含む）、天然の調節因子（複数を含む）、又はこれらの組み合わせを用いて、それぞれ独立して発現することができる。
【０１４３】
Ｖ．遺伝子欠損を包含する組み換えホスト細胞を作製する方法
上記に検討のように、本発明による組み換えホスト細胞は、サッカライドの発酵時にエタノール以外の生成物を産生することになる、代謝経路由来のタンパク質をコードする１つ又はそれ以上のポリヌクレオチド配列中に突然変異を包含する。欠失突然変異のような突然変異を包含する微生物を作製する遺伝子法は、当該技術分野で公知である。ＰＣＲベースの遺伝子のクローニング、プラスミドの構築及び遺伝子分析のような遺伝子構築物の単離及び操作するための遺伝子技術はよく確立されていて、分子生物学の技術分野では日常的である。例えば、「Ausubel et al., 1987; Miller, 1992」及び「Sanbrook and Russell, 2001」［２４〜２６］  のような方法論の論文を参照されたい。除去可能な抗生物質耐性遺伝子の使用を含む、染色体の欠失［２２］及び組み込みを作製する方法も、記載されている［２７〜２９］。
【０１４４】
改良されたエタノール産生の特質を有する模範的な組み換えホスト細胞を作製する方法の使用を、更に以下の実施例４及び５に示す。これらの実施例は、Ｋ．オキシトカ由来のブタンジオール経路（ｂｕｄＡＢ）中で遺伝子のＰＣＲによるクローニングすること、これらの遺伝子中に欠失突然変異（ノックアウト）を作製すること、そしてこの突然変異を含有するＤＮＡ構築物をＫ．オキシトカＰ２の染色体に組み入れて、Ｋ．オキシトカＢ１５、Ｂ１９及びＢＷ２１と呼ばれる、改良された株を提供すること、の詳細な記述を提供する。Ｂ１５及びＢ１９株は、ＦＲＴ側面のテトラサイクリン遺伝子の側面にある突然変異ｂｕｄＡＢ配列、すなわち、本明細書でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８と示されているポリヌクレオチド配列を包含する（以下の実施例５も参照されたい）。ＢＷ２１株は、ＢＷ１５及びＢＷ１９株と同じ突然変異ｂｕｄＡＢ配列を包含する（すなわち、本明細書でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５と呼ばれている突然変異ｂｕｄＡＢ配列）が；ＦＲＴ側面のテトラサイクリン遺伝子を欠損している。この遺伝子は、ＦＬＰリコンビナーゼを用いて除去した（実施例５も参照されたい）。このＢＷ２１株をテストし、親株のＰ２に比べて優れたエタノール産生の性質を示すことを明らかにした。
【０１４５】
更なる別の態様では、本発明は、サッカライド源からエタノールを産生するのに最適である組み換えホスト細胞を作製する方法を提供する。この方法は次の工程を包含している。
（ａ）エタノール産生の親ホスト細胞を、親細胞によるエタノール産生に適している条件下で、選択生育培地及びサッカライド源と接触させること、
（ｂ）選択された条件下で、オリゴサッカライド源からのエタノール産生のレベルを測定すること、
（ｃ）当該条件下で増大した発現を有する望ましくない副生成物を同定するために、サッカライド源から産生されるエタノール以外の生成物のうちの少なくとも１つ、好ましくは全てのレベルを測定すること、
（ｄ）代謝経路において、前記の望ましくない副生成物を産生するタンパク質をコードする遺伝子のポリヌクレオチド配列を突然変異させ（ここにおける突然変異は、代謝経路中の少なくとも１つの遺伝子産物の発現を低減又は消去して、突然変異なしの親細胞によるエタノール産生に比べて、選択培地中での突然変異細胞によるエタノール産生を増大させる）、これにより選択培地中でのエタノール産生を最適化した組み換えホスト細胞を作製すること。
【０１４６】
この方法のある態様は更に、遺伝子の突然変異を包含する単離されたポリヌクレオチド断片を作製すること、及び突然変異ポリヌクレオチド断片を親細胞に導入することを包含する。
【０１４７】
有利には、この方法は、特別な培養条件下、特別な選択培地中での最適なエタノール産生のために特注される組み換えホスト細胞を構築するために提供される。特別な培地での生育によるエタノール産生の親ホスト細胞中で上方調節された副生成物の確認を含む、この方法の工程（ｃ）は、親細胞の更なる遺伝子操作によって標的となりそして欠失される、対応する代謝経路を確認するために用いられる。
【０１４８】
この方法のある態様では、細胞が、最小培地でのエタノール産生のために最適化される。上記での検討のように、細菌のような組み換えホスト細胞によるエタノールの産生で用いられる生育培地のコストは、総生産コストにおいて大変重要な因子である。生産コストを抑制するために、最新の取り組みが、安価な原料由来の必須栄養素の最小量を含有する「最小培地」の開発をもたらした。（例えば、「最適化尿素培地」（ＯＵＭ）と呼ばれる、本明細書で開示された新規な尿素ベースの最小培地を含む、ＳＳＦに適している幾つかの最小培地の組成を示している、以下のＶＩ章及び表２を参照されたい。）  この方法の一態様は、ＯＵＭでのエタノール産生のために最適化された細胞、例えばＳＳＦに好ましいｐＨである、酸性のｐＨでのこの培地中で上方調節されるブタンジオール産生をコードするｂｕｄＡＢ遺伝子中に欠失を包含する、Ｋ．オキシトカＢＷ２１を作製する。
【０１４９】
ＶＩ．最小培地
別の態様では、本発明は、サッカライドを分解するのに適した組み換えホスト細胞による生育及びエタノール産生を支援する最小培地を提供する。本発明の最小培地は以下の主要成分を含有している。
決められた窒素源
複合の窒素源
ホスフェイト源
マグネシウム源
任意に、ＦｅＣｌ２及びＮｉＣｌ２のような金属イオン源が、クレブシエラ・オキシトカの誘導体のような、ある特定のエタノール産生の細菌株の酵素活性に有用なコファクターとして、培地のある態様に加えられる。
【０１５０】
本発明による最小培地のある態様では、決められた窒素源が、尿素様化合物である。尿素窒素の濃度範囲は、約０．１〜１００ｍＭ、好ましくは約２．０〜２０ｍＭ、そしてより好ましくは約８〜１２ｍＭである。
【０１５１】
最小培地中で使用する複合の窒素源は、これらに限定されないが、コーンスティープリカー（ＣＳＬ）、酵母自己消化物及び／又は抽出物、トウモロコシ加工副産物、大豆加工副産物、及び使用済みの発酵培養液（例えば酵母、ストレプトミセス、バチルスなどの微生物を用いる発酵液から）を含む多様な源から選ぶことができる。
【０１５２】
最小培地のある態様は、コーンスティープリカー（ＣＳＬ）を複合の窒素源として包含する。これらの培地においてＣＳＬの好ましい濃度範囲は、約０．１〜１００ｇ／Ｌ、好ましくは約１〜２０ｇ／Ｌ、そしてより好ましくは約５〜１０ｇ／Ｌである。
【０１５３】
本明細書に記載の検討から、総ホスフェイト及びマグネシウムのような他の成分の濃度範囲は、エタノールの産生に対してあまり重要ではないということが確認されている。これらの成分の最小有効濃度は、尿素及びＣＳＬについての上記のような実験に基づいて確認できるであろう。一般に、総ホスフェイトの有利な濃度は、約１０〜１００ｍＭ、そして好ましくは約１０〜１２ｍＭである。好ましいマグネシウムの濃度は、約０．１〜５．０ｍＭの範囲、そしてより好ましくは約０．２５〜１．０ｍＭの範囲である。
【０１５４】
一態様では、サッカライドを分解するのに適した組み換えホスト細胞による生育及びエタノール産生を支援するように最適化された最小培地を提供する。この培地のある態様は、選択された組み換えホスト細胞及び発酵の条件のために最適化される。使用されるエタノール産生の株にもよるが、最小培地の主要成分の濃度は、認容できる細胞の生育、及び糖基質の発酵時にエタノール産生の株による高レベルのエタノール産生に調和する成分の最小濃度を測定することにより費用効率に対して最適化される。（例えば、エタノール産生のＫ．オキシトカ株と共に使用されるのに特に適した尿素ベースの最小培地の最適化に関する、以下の実施例１〜３並びに表２及び３に記載の検討を参照されたい。）
【０１５５】
本発明による最適化培地のある態様は、リグノセルロースバイオマスのＳＳＦで用いられる方法及び条件に適している。上記に検討のように、動物には食べられないリグノセルロースは、エタノール産生用の豊富で安価な出発物質である。リグノセルロースの豊富な原料は、茎、葉、殻、さや、穂軸などの植物残渣、さらに木材、木材チップ、木材パルプ及び古紙も含む廃棄物に見い出せる。ＳＳＦは、リグノセルロースバイオマスをサッカライド源として用いて実施することができる。ＳＳＦ工程において、リグノセルロースを加水分解する菌体酵素（一般にセルラーゼ及びキシラナーゼ）によって可溶性の生成物が産生される。リグノセルロース生成物から生じる可溶性の生成物は、セロビオース、セロトリオース、キシロビオース、キシロトリオース及びアラビノシドを含有する。これらの可溶性の糖生成物は、同時に組み換え細菌のようなエタノール産生の微生物によってエタノールに変換される。重要なことは、ＳＳＦ反応を酸性のｐＨで行う必要があるので、この菌体酵素が、酸性のｐＨ（ｐＨ５．０近辺）で最適な性能を示すことである。
【０１５６】
上記に検討のように、エタノール産生用バイオマスの安価な原料としてのリグノセルロースの有利性に対する反論は、ＳＳＦ工程で使用するエタノール産生の細菌を支援するのに必要な栄養素が乏しいという不便性である。本発明は、一態様において、例えば、エタノール産生の細菌及びリグノセルロース出発物質でのＳＳＦで使用するために適している改善された最小培地を提供することによって、この問題に対処している。
【０１５７】
この培地は、細菌のエタノール産生の株の最大の生育及びエタノール産生を支援し、そしてアンモニア及び（ＮＨ４）２ＳＯ４のような単純な化学試薬を含む、従来使用されている窒素源を、総窒素源として尿素及び尿素様化合物の低レベルと置き換えることにより最小のコストにするように最適化されている。これらの化合物の置き換えは、他の窒素源の使用に対して重要なコスト利点を提供する。
【０１５８】
「最適化尿素培地１」（ＯＵＭ１）と称する、本発明による特に好ましい態様の最小培地は、下記の成分を示された濃度で包含する。
ＮＨ２ＣＯＮＨ２（尿素）        １０．０ｍＭ
ＣＳＬ                          １０．０ｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４                    １０．７ｍＭ
Ｎａ２ＨＰＯ４                  １．３ｍＭ
ＣａＣｌ２                      １ｍＭ
ＭｇＳＯ４                      １ｍＭ
ＦｅＣｌ２                      ０．０７４ｍＭ
ＮｉＣｌ２                      ０．００６８ｍＭ
発酵反応に用いるために、サッカライド源、例えば上記のような糖源であるグルコース（例えば、９０ｇ／Ｌで）又はリグノセルロース源を加える。
【０１５９】
ＶＩＩ．組み換えホスト細胞によるサッカライド源の発酵時における最適なエタノール産生の方法及びシステム
本発明の上記の最適化最小培地、並びに最大のエタノール産生及び最小の副生成物産生のために遺伝子操作で最適化した組み換え微生物を、有利に組み合わせてエタノール産生のシステムにできる。
【０１６０】
従って、別の態様では、本発明は、サッカライドを分解するのに適した組み換えホスト細胞によって、サッカライド源からエタノールを産生するために最適化されたシステムを提供する。このシステムは以下の要素を包含する：
（ａ）選択条件下でのホスト細胞による最適な生育及びエタノール産生を支援する選択培地；
（ｂ）サッカライド源；及び
（ｃ）選択培地及び条件でのエタノール産生のために最適化された組み換えホスト細胞、
この細胞は：
糖をエタノールに変換する酵素をコードする非相同性ポリヌクレオチド配列（ここにおける細胞は、当該ホスト細胞による主要発酵生成物としてのエタノールの産生を促進するのに十分な機能レベルで、当該非相同性ポリヌクレオチド配列を発現する）、及び
当該細胞の代謝経路において、前記条件下及び培地中で当該オリゴサッカライド源からエタノール以外の生成物を産生するタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列中の突然変異（ここにおける突然変異は、当該タンパク質の発現を低減又は消去し、これにより当該ホスト細胞によるエタノール産生を、突然変異がない細胞によるエタノール産生に比べて増大させて、エタノール産生を最適化する）を包含する。
【０１６１】
商業的利用に好ましいシステムの態様では、選択培地は、上記のような本発明による尿素ベースの最小培地のような、最小培地である。
【０１６２】
エタノール産生のために最適化された適切なホスト細胞は何れも、本システムで使用することができ、適切なサッカライド又はオリゴサッカライド源の何れも使用することができる。好ましい安価なサッカライド源は、リグノセルロース原料である。上記に検討のように、ＳＳＦ反応は、菌体酵素の性能を最適化するために、酸性のｐＨ範囲で最適に実施される。しかしながら、酸性条件は、細菌による発酵において、好ましいｐＨでの不要な副生成物の増大した産生及びそれに付随するエタノールの減少した産生のような、有害な影響を有する。
【０１６３】
本発明による最適化されたシステムでは、生育の条件（ｐＨのような）又は最小培地自体の有害な影響は、特別な培地と、当該培地中での生育及びエタノール産生を特に最適化した組み換え細菌とを組み合わせることによって最小化することができる。例えば、特別な培地中でホストの望ましくない代謝経路が特別な培養条件下で改変される（例えば、上方調節される）ことが知られているならば、培地を、改変された経路を標的とする遺伝子的改変（例えば、欠失突然変異）を包含する選択された組み換えホスト細胞と組み合わせるように、システムを設計することができ、それによってこのような条件下で望ましくない生成物を低減又は消去することができる。従って、このシステムは、特別な最小培地中での発酵反応時のエタノール産生のために最適化される。
【０１６４】
本発明の最適化されたシステムの好ましい態様は、本明細書に記載のような新規なＯＵＭ培地、ＢＷ２１株のような最適化された組み換えクレブシエラ・オキシトカ株、及び糖源であるリグノセルロースの組み合わせである。エタノール産生のためのこの最適化システムは、リグノセルロースを含有するバイオマスからエタノールを産生する魅力ある安価な方法を提供する。
【０１６５】
ＳＳＦによるバイオマスの発酵の最適なエタノール産生の組み換え細菌株は、クレブシエラ・オキシトカＰ２である。ＳＳＦによるバイオマスの発酵のために最適化された本発明の組み換えホスト細胞の例は、ブタンジオール経路（アセトイン及び２，３−ブタンジオール）の副生成物を消去する欠失突然変異を有する点で親株と異なる、ＢＷ２１と称するクレブシエラ・オキシトカＰ２由来の改善されたエタノール産生の株である。本明細書の検討で示されるように、この経路は、決められた窒素源として尿素を含有する好ましい最小培地（ＯＵＭ１）中での発酵検討において、Ｐ２細胞を発育させて用いると、この経路が特異的に上方調節される。最適化されたＢＷ２１細胞中では、このような不要な遺伝子産物の発現が、遺伝子の欠失によって消去される。ＢＷ２１細胞によるエタノール産生のアッセイは、これらの細胞が、酸性ｐＨでの最小培地中で、親株Ｐ２よりも、更にＬ培地（Luria broth）のような富栄養培地中で生育させた場合よりも、エタノールを産生する優れた能力を有していることを実証した。従って、尿素様化合物を包含する最適な最小培地を、この特別な培地でエタノール産生に最適化された組み換えクレブシエラ株と組み合わせることにより、エタノール産生が、ＳＳＦに適した条件の酸性ｐＨでのシステムで、より高価な培地を用いて達成できるレベルまで最適化された。
【０１６６】
更なる態様では、本発明は、本発明の方法又はシステムによる組み換えホスト細胞を使用するための使用説明書と共に包装した、上記のような組み換えホスト細胞を包含するキットを提供する。
上記の方法の実施に一般的に有用な材料及び方法が更に、下記及び以下の実施例に記載されている。
（実施例）
【０１６７】
本発明を以下の実施例を参照して更に説明するが、これは限定するものとして解釈されるものではない。
材料及び方法
以下の材料及び方法は次の実施例を通して用いられる。
１ａ．株及びプラスミド
表１は、本発明の組み換え微生物を構築するために使用される生命体及びプラスミドを記載する。
【０１６８】
【表１】
0005437631.tif 000002
【０１６９】
１ｂ．生育培地及び条件
エタノール産生の株を、２％のグルコース及びクロラムフェニコール（１日おきに、４０又は６００ｍｇ／Ｌ）を含有するＬ寒天培地（Luria agar）［２４］上、アルゴン雰囲気下で保持した。その他の株を、糖を添加していないＬ寒天プレート上で適当な抗生物質と共に保持した。特に断りのない限り、アンピシリン（５０ｍｇ／Ｌ）、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）、アプラマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）及びテトラサイクリン（１２．５ｍｇ／Ｌ）を選択のために使用した。温度条件付きレプリコンのプラスミドを含有している株を３０℃で生育させた。その他の全ての株は、指摘されたものを除いて、３７℃で保持した。プラスミド調製物を、−２０℃で保存した。保存培養は、グリセロール中、−７５℃で保存した。
【０１７０】
１ｃ．遺伝子法
ＰＣＲベースの遺伝子のクローニング、プラスミドの構築及び遺伝子分析について、標準的な方法を用いた［２４〜２６］。組み込み、染色体の欠失、組み込み、及び移動可能な抗生物質抵抗遺伝子の使用についての方法を、既述のようにして用いた［２２、２７〜２９］。大腸菌ＤＨ５αを、構築のために使用した。
【０１７１】
１ｄ．ｂｕｄＡ及びｂｕｄＢ遺伝子の欠失
α−アセトラクテート・デカルボキシラーゼ（ｂｕｄＡ）及びα−アセトラクテート・シンターゼ（ｂｕｄＢ）の５’末端を含有するＤＮＡ断片を、鋳型としてのＫ．オキシトカ由来のゲノムＤＮＡ及びＴａｑＰＣＲマスターミックス（Qiagen）を用いるＰＣＲで増幅した。９４℃で３分間の初期変性の後、ＤＮＡを３０サイクル増幅した（９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で７０秒間の伸長）。７２℃で１０分間の最終伸長も含まれている。
【０１７２】
ｂｕｄＡＢ’ＤＮＡ断片を次のプライマー：
フォワードプライマー：５’ＧＣＴＧＡＡＴＣＧＧＧＴＣＡＡＣＡＴＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
リバースプライマー：５’−ＴＴＴＣＧＧＴＴＴＧＴＣＣＡＧＧＴＡＧＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
を用いて増幅して、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローンした。ｐＬＯＩ３３０１と呼ばれる、この断片の配列を決定して、ＧｅｎＢａｎｋに寄託した（受入番号：ＡＹ７２２０５６）。
【０１７３】
ｂｕｄＡＢに欠失を含有するＤＮＡ断片を調製するために、クローニング／欠失の以下の方法を用いた。この方法では、ｂｕｄＡ及びｂｕｄＢ遺伝子の中央領域を欠失して、２つのＦＲＴ部位が側面に位置したテトラサイクリン遺伝子で置き換えた。ｂｕｄＡ及びｂｕｄＢを欠失させて得られた構築物（ｂｕｄＡ’ＦＲＴ−ｔｅｔ−ＦＲＴ’ｂｕｄＢ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）を、温度条件付きベクターであるｐＳＣ１０１ｔｓに組み込んで、エタノール産生の細菌に安定に形質転換するために用いた。
【０１７４】
図１は、エタノール産生の細菌に導入された場合に、発酵によるブタンジオール生成物の消去をもたらす、ｂｕｄＡＢに欠失突然変異を包含する例示構築物（ｐＬＯＩ３３０１、ｐＬＯＩ３３１０及びｐＬＯＩ３３１３）を、調製する工程を示す概略図である。図１の更に詳細な説明及びこれらのプラスミドを作製するのに用いられる方法は、以下、特に実施例４に見い出される。
【０１７５】
１ｅ．クレブシエラ・オキシトカＰ２からのＢＷ２１株の作製
上の１ｄに記載のように調製された、ｂｕｄＡ及びｂｕｄＢに欠失突然変異を含有しているＤＮＡ構築物を、これらの構築物で形質転換された組み換え細菌を作製するために使用した。例えば、エタノール産生のクレブシエラ・オキシトカＭ５Ａ１株の形質転換を記載している実施例５を、参照されたい。次いで、バクテリオファージＰ１（大腸菌のファージ）を、Ｋ．オキシトカＭ５Ａ１中に構築されているｂｕｄＡＢ染色体欠失をＰ２株に形質導入してＢＷ２１株を作製するために用いた。
【０１７６】
１ｆ．ｂｕｄＡのアセトイン生成物の存在しないことをスクリーニングすることによるブタンジオール経路の評価
株は、ボーグ・プロスカウル（Vogues-Proskaur；ＶＰ）寒天法の変法を用いて、アセトイン産生についてスクリーニングしたが、この方法は、着色生成物の限界拡散によって感度を増強するために、ペトリプレートの代わりにマイクロタイタープレートを用い、「Blomqvist, et al.」［３５］に記載されている。各ウェルに１ｍｌの培地（１リットル当たり、２．５ｇのディフコバクトペプトン（Difco Bactopeptone）、１．０ｇのディフコ酵母抽出物、１０ｇのグルコース、１．０ｇのピルビン酸ナトリウム及び２５ｇの寒天）を入れて、接種した。２４時間後に、αーナフトールを５％含有する２．５ＮのＮａＯＨ溶液を２００μＬずつ各ウェルに加えた。室温で１時間着色を観察した。赤色着色がないことで、アセトイン（ｂｕｄＡ活性の生成物）のないことを確認した。更なる確認は、発酵生成物のＨＰＬＣ分析でなされた。
【０１７７】
２ａ．エタノール産生の細菌のための最小培地
公知の培地及び本明細書で開発された（最適化尿素培地１、ＯＵＭ１）培地の両方の成分を、表２に要約した。
【０１７８】
【表２】
0005437631.tif 000003
【０１７９】
それぞれの培地を、５０ｇ／Ｌ（２７８ｍＭ）のグルコース又は９０ｇ／Ｌ（５００ｍＭ）のグルコースの何れかを用いる発酵反応でテストした。成分は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社又はＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社の何れかから入手した。無機塩類は、試薬用の等級であった。尿素は、工業用の等級であった。Ｍ９培地は、既述［３０］のように調製して、更に鉄要求性Ｚ．モビリス アルコールデヒドロゲナーゼ［３１］の適切なレベルを確保するために０．０７ｍＭのＦｅＣｌ３を補充した。エタノール産生の大腸菌用のコーンスティープリカー（ＣＳＬ）培地（０．５％ＣＳＬ＋Ｍ）は、既に記載されている［３２］。Ｍ９及び０．５％ＣＳＬ＋Ｍ培地の両方は、Ｋ．オキシトカＭ５Ａ１のエタノール産生の誘導体用の培地を最適化するための出発点として用いた。尿素を窒素源として使用する場合に、ウレアーゼ活性のために０．００７ｍＭのＮｉＣｌ２を添加した。ＣＳＬのレベルは、乾燥重量ベースで示した。ＣＳＬの原液は、既述［３３］のようにして調製し、滅菌した。
【０１８０】
全ての培地の最適化の検討で、Ｋ．オキシトカＰ２を用いた。新たに生育したプレート（２４時間）から単離されたコロニーを、１ｍｌの脱イオンＨ２Ｏに再懸濁して、７５ｍｌの培地（５０ｇ／Ｌグルコース）を含有する１２５ｍｌのフラスコに接種（約５０μＬの接種材料）するために用いた。生育及びエタノール産生を、２４時間及び４８時間後に観察した。
【０１８１】
２ｂ．発酵条件
種培養物（２５０ｍｌフラスコ中に１５０ｍｌ）を、５０ｇ／Ｌのグルコースを含有する培地で３５℃（１２０ｒｐｍ）で１６時間生育させた。細胞を遠心分離（５０００×ｇ、５分間）して採取し、乾燥細胞重量で３３ｍｇ／Ｌの初期濃度（ＯＤ５５０ｎｍ＝０．１）を示す接種材料として用いた。発酵に用いるそれぞれの培地は、種生育にも用いたが、低いグルコース濃度（５０ｇ／Ｌ）で用いた。発酵容器は、既述されており［３４］、３５０ｍｌ（９０ｇ／Ｌのグルコース）の初期容量を含有していた。培養物を、３５℃（１５０ｒｐｍ）で培養した。培養液を、２ＮのＫＯＨを自動的に添加してｐＨ５．２に保持した（指示があるときを除いて）。
【０１８２】
２ｃ．分析方法
ボシュロムスペクトロニク（Bosch & Lomb Spectronic）７０分光光度計を用いるＯＤ５５０ｎｍの測定により、細胞集団を評価した。この測定器では、１単位のＯＤ５５０ｎｍが、０．３３ｍｇ（乾燥重量）／Ｌの細胞密度に相当する。Ｋ．オキシトカについての細胞密度の測定は、細胞の凝集性による大きな誤差を有している。エタノールは、既述［１１］のように、バリアン（Varian）モデル３４００Ｘを用いるガスクロマトグラフィーで測定した。その他の発酵生成物は、二重検出器（屈折率及びＵＶ２１０ｎｍ）［３３］を備えた、ヒューレットパッカード（Hewlett-Packard）モデル１０９０のシリーズＩＩクロマトグラフ及びバイオラードアミネックス（Bio-Rad Aminex）８７Ｈイオンパーティションカラム（４５℃；４ｍＭのＨ２ＳＯ４；０．４ｍｌ／ｍｉｎ；１０μＬの注入容量）を用いる、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって測定した。炭素バランスは、既述［２９，３６］のように計算した。発酵培地としてＬＢを用いた場合は、細胞集団は、複合培地成分から単独に作製されたものと仮定して、炭素バランスの計算に含めなかった。
【実施例１】
【０１８３】
Ｋ．オキシトカＰ２による生育及びエタノール産生のための最小培地
本実施例は、クレブシエラ株のような組み換えエタノール産生の細菌による生育及びエタノール産生のために最適化された、単独の窒素源として尿素を包含する新規な最小培地（ＯＵＭ１）の開発について記載する。この新規な培地は、Ｋ．オキシトカＰ２株を用いて、その生育及びエタノール産生の能力を幾つかの公知の培地と比較して、開発しそして最適化された。
【０１８４】
比較の目的で用いた既述の培地は、次の通りである：
Ｌ培地（ＬＢ）（Ausubel et al., 1989）;
Ｍ９培地（＋Ｆｅ）（Neidhardt et al., 1974）；
Ｕ−Ｍ９（＋Ｆｅ）、ここでは、ＮＨ４Ｃｌが、当量窒素の尿素に置き換わっている；
０．５％のコーンスティープリカー、ＣＳＬ＋Ｍ（Martinez et al., 1999）；
Ｕ−０．５％のＣＳＬ＋Ｍ、ここでは、（ＮＨ４）２ＳＯ４が、当量窒素の尿素に置き換わっている。
この新規な培地を、本明細書では「最適化尿素培地１号」（ＯＵＭ１）と称する。
上記培地のそれぞれの組成は、上記表２に示す。
【０１８５】
最適化培地を開発するための最初の検討において、生育及びエタノール産生の能力を、Ｍ９（＋Ｆｅ）及び０．５％のＣＳＬ＋Ｍ培地中でのｐＨ５．２にてテストしたＫ．オキシトカＰ２で比較した。ここで、後者の培地は、単独の窒素源としてアンモニアを有している。ｐＨ５．２でのＬＢ培地は、性能の基準を提供する対照として含まれている。図２Ａ及び２Ｂを参照すると、予想通りに［３２］、ＬＢ培地が、最も高い細胞収率（図２Ａ）及び最も速いエタノール産生（図２Ｂ）を支援した。同等のレベルのエタノールが、０．５％ＣＳＬ＋Ｍ及びＬＢで産生された（図２Ｂ）。
【０１８６】
表３は、Ｍ９及びＣＳＬ＋Ｍ培地の両方における、エタノール産生及び収率について、アンモニアを尿素に置き換えた効果を示している。見られるように、この交換は、エタノール産生において少しの減少をもたらした（Ｍ９については、７６％に対して７１％；ＣＳＬ＋Ｍについては、８３％に対して７８％）。表３でも見られるように、一般に、エタノール産生及び収率は、窒素源に関わらず、培地の栄養豊富度によって増加する（ＬＢ＞０．５％のＣＳＬ＋Ｍ＞Ｍ９＋Ｆｅ）。
【０１８７】
【表３】
0005437631.tif 000004
【実施例２】
【０１８８】
決められた窒素源として尿素を包含する最適化された最小培地
本実施例は、エタノール産生の細菌と共に用いる尿素を包含する最適化された最小培地を開発するための方法を記し、そして「ＯＵＭ１」と称する培地のような態様の処方を提供する。
【０１８９】
ＯＵＭ１と称する尿素ベースの培地（尿素を唯一の決められた窒素源として有している）を、上記のような方法を用いて、９０ｇ／ＬのグルコースでｐＨ５．２にてｐＨ制御した発酵でテストした。この培地でのエタノール産生は、Ｍ９（＋Ｆｅ）及びＣＳＬ＋Ｍ培地の尿素含有の処方よりも僅かに優れていて、高濃度の窒素、ホスフェート及びＣＳＬが必要ないということを確認した（図２Ｃ及び２Ｄ）。
【０１９０】
細胞生育検討の結果は、最大細胞密度が、Ｍ９（＋Ｆｅ）及び０．５％のＣＳＬ＋Ｍ培地中（図２Ａ）及びＯＵＭ１培地中（図２Ｃ）で全く同じであること示し、これらのそれぞれの培地中では低濃度の窒素（Ｍ９中の１９．０ｍＭ）及びホスフェート（０．５％のＣＳＬ＋Ｍ中の１０．３ｍＭ）で十分であることを示唆した。
【０１９１】
Ｍ９（＋Ｆｅ）及び０．５％のＣＳＬ＋Ｍの組成物に基づいて、ＯＵＭ１培地中の異なった濃度の栄養素：ホスフェート（１２〜７２ｍＭ）、マグネシウム（０．２５〜１．０ｍＭ）、ＣＳＬ（０〜１５ｇ／Ｌ）、及び尿素窒素（２．５〜１５ｍＭ）：を評価するようにフラスコ実験を設計した。コーンスティープリカー及び尿素の多種の濃度の結果を、それぞれ図３Ａ及び３Ｂに示す。規定の範囲内では、ＣＳＬ及び尿素のみが明確な最適条件、すなわちそれぞれ１０ｇ／Ｌ及び１０ｍＭを有していることを、このデータが示した。他の成分の全てのレベルで、４８時間後に同じ濃度のエタノール（１３．９±１．３ｇ／Ｌ）が産生された。低濃度でも十分であると考えられるが、１２ｍＭのＰＯ４−３、１ｍＭのＭｇＳＯ４及び１ｍＭのＣａＣｌ２を最適化尿素培地（ＯＵＭ１）用に選択した。（ＯＵＭ１培地の完全な処方については、表２を参照されたい）。
【実施例３】
【０１９２】
エタノール力価及び発酵副生成物の産生における酸性ｐＨの効果。
上記のように、ある特定タイプの発酵反応、例えば、発酵する糖がリグノセルロース原料由来である反応では、菌体ヒドロラーゼ及びセルラーゼが最適な性能を示す範囲である酸性のｐＨで、反応を実施することが望ましい。本実施例は、新たに開発された培地ＯＵＭ１を含む、種々の培地中で生育するエタノール産生の細菌Ｐ２株による発酵で、ｐＨがエタノール及び副産物の産生に及ぼす影響を記載する。
【０１９３】
再び表３を参照すると、ＯＵＭ１培地で生育するＰ２株による、グルコースからのエタノール産生の結果が、既述の培地で生育するこれらの細胞の結果と比較されている。表３で示すように、ＯＵＭ１培地のエタノール力価は一般に、ｐＨ５．２ではＬＢ培地で得られるものと同等であった。
【０１９４】
しかしながら、これらの検討においては、全ての培地でのエタノール力価は、既報の富栄養培地、例えば、より中性のｐＨでのＬ培地（ＬＢ）よりも低いｐＨ５．２でのものであることに注意されたい［５、６］。エタノール産生での低いｐＨの悪影響は、ＬＢ及びＯＵＭ１培地での発酵について確認された。表３に示すように、ＬＢ培地でＰ２株は、ｐＨ６．０及び６．８ではそれぞれ１００％及び９８％の収率でエタノールを産生したのに対して、ｐＨ５．２では収率が８５％に低下した。
【０１９５】
表３で示される発酵実験において、グルコース基質から作られる不要な副生成物（エタノールに加えて）、すなわち、ホルメート、ラクテート、スクシネート、アセテート、アセトイン及び２，３−ブタンジオールについてのレベルも測定した。ｐＨ５．２の全ての培地でＰ２株によって副生成物が産生されるが、２，３−ブタンジオール経路から予想外に高い濃度（７２ｍＭ）の生成物が、このｐＨでＯＵＭ１培地にて産生したことが見い出された（表３）。ＬＢ培地及びＯＵＭ１培地の両方で、ｐＨ５．２での発酵は、ｐＨ６．８に比べてより高い割合の中性の副生成物（アセトイン及び２，３−ブタンジオール）を含有していた。より具体的には、ＯＵＭ１培地では、中性の副生成物のレベルが、ｐＨ６．８よりもｐＨ５．２で４．５倍高かった。対照的に、ｐＨ６．８のＯＵＭ１培地では、ブタンジオール＋アセトインのレベルが減少した（７２ｍＭに対して１６ｍＭ）のに対し、アセテート及びホルメートの濃度はｐＨ６．８で増加した（それぞれ、９ｍＭに対して４７ｍＭ、及び＜１ｍＭに対して４４ｍＭ）。ＯＵＭ１培地の結果とは異なって、ＬＢ培地では、中性の副生成物は、ｐＨ５．２及びｐＨ６．８で比較的一定を保持していた（３８ｍＭに対して３１ｍＭ）のに対し、酸性副生成物は減少した（表３）。
【０１９６】
理論に制約されるものではないが、Ｐ２株による２，３−ブタンジオール経路からの中性の副生成物の増大した生成は、ＯＵＭ１培地の組成及び低ｐＨの両方に関連していると思われる。この知見は、Ｋ．オキシトカの野生株にある対応する酵素の報告されている活性と一致すると思われる。例えば、２，３−ブタンジオール経路の副生成物の生成に関連する酵素活性は、低ｐＨに応答して増大することが知られている［３５、３７、３８］。より中性に近いｐＨでは、ピルビン酸ギ酸リアーゼ、酢酸キナーゼ、及び乳酸デヒドロゲナーゼのような酸発生の活性が、より酸性の生成物を産生する［３９］。
【実施例４】
【０１９７】
エタノール産生の細菌中のｂｕｄＡＢオペロンの欠失のための構築
本実施例は、細菌（クレブシエラ・オキシトカ）由来の、ｂｕｄＡ遺伝子の推定全長ｃＤＮＡ配列、及びｂｕｄＢ遺伝子の部分ｃＤＮＡ配列の単離を、そしてブタンジオール経路にあるこれらの遺伝子が崩壊しているＤＮＡ断片の構築物を記載している。細菌細胞への導入に続く、これらの構築は、細胞によるサッカライドの発酵時に不要な２，３−ブタンジオール及びアセトインの産生を消去するために有用である。
【０１９８】
ｂｕｄＡ及びｂｕｄＢ遺伝子は、隣接してＫ．オキシトカゲノム中にあり、そして一緒にしてｂｕｄＡＢと称する。２つの遺伝子はそれぞれ、２，３−ブタンジオール及びアセトインの産生に関わる２つの酵素、すなわちα−アセトラクテート・デカルボキシラーゼ及びα−アセトラクテート・シンターゼをコードする。本実施例では、Ｋ．オキシトカＭ５Ａ１のｂｕｄＡＢ遺伝子における欠失を構築し、そしてＫ．オキシトカＰ２株に形質導入してＢＷ２１株を作製する。一般に、ＢＷ２１のような欠失突然変異株を構築するために用いられる方法は、前記、材料及び方法の１ａ〜ｃ項に記載されている。ｂｕｄＡＢ欠失のある新しい株を構築するために用いられるプラスミド及び菌株は、前記の表１に挙げられている。
【０１９９】
ｂｕｄＡＢ遺伝子は、Ｋ．オキシトカに今まで記載されていなかった。しかしながら、２つの関連する生命体、すなわちエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）及びルールテラ・テリゲナ（Roultella terrigena）（正式にはクレブシエラ・テリゲナ［３５、３７］）由来の同種の遺伝子は知られている。これらの配列及びＫ．ニューモニエ（K. pneumoniae）の部分（注釈なし）ゲノム［４０］に基づいて、上記のプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及び２）を、ｂｕｄＡＢ’を含有するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅のために設計した。
【０２００】
図１は、ｂｕｄオペロン及びこのＫ．オキシトカのオペロンに伴う２，３ブタンジオール発酵経路を欠失させるのに用いられるプラスミドの構築の過程を示す概念図である。挿入図（図１Ａ）は、オペロンの図表示である。図１Ａに示すように、このオペロンの発現は、低いｐＨで増大され、そしてＢｕｄＲ及びＦｎｒによって正に調節される。
【０２０１】
上記の方法に記載のように、α−アセトラクテート・デカルボキシラーゼの推定全長コード配列（ｂｕｄＡ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）及びα−アセトラクテート・シンターゼ（ｂｕｄＢ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）の５’末端を包含する部分コード配列を含有するＤＮＡ断片を、Ｋ．オキシトカ由来のゲノムＤＮＡを鋳型として用い、ＰＣＲで増幅した。（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及び４によってコードされるポリペプチドの予測されるアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６及び７に示されている）。図１Ｂの左上図は、指定されたＰＣＲプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及び２）で増幅されたＫ．オキシトカのｂｕｄＡ及びｂｕｄＢの比率を示している。
【０２０２】
図１Ｂの下部を参照すると、ｂｕｄＡＢを含有する増幅されたＤＮＡ断片は、ＰＣＲクローニングベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（表１に記載）にクローンされて、ｐＬＯＩ３０１（ｐＣＲ２．１ｂｕｄＡＢ’；図１Ｂの（１）で示されている）を生成する。
【０２０３】
ｂｕｄＡＢ遺伝子産物を消去するために、ｂｕｄＡＢ’断片の中央部を大きく欠失させて２つのＦＲＴ（Flp recombinase Recognition Target）部位に隣接するｔｅｔ遺伝子で置き換え、ｐＬＯＩ３３１０（ｂｕｄＡ’−ＦＲＴ−ｔｅｔ−ＦＲＴ−'ｂｕｄＢ’；図１Ｂ、（３））を生成した。切断ｂｕｄＡ及びｂｕｄＢ配列、並びに介在するＦＲＴ隣接テトラサイクリン遺伝子（ｂｕｄＡ’−ＦＲＴ−ｔｅｔ−ＦＲＴ−'ｂｕｄＢ’）を含有する核酸構築物を、本明細書でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８と称する。ｂｕｄＡＢ配列の中央部の欠失、及びｔｅｔ含有構築物による置換は、２つのＦＲＴ配列が側面にあるｔｅｔ遺伝子を含有しているｐＬＯＩ２０６５（図１Ｂ、（２））を用い、当該技術分野で公知の標準的な技術によって実施した（「Underwood et al., 2002」；表１も参照されたい）。側面のＦＲＴ部位は、染色体の組み込み後のマーカー除去を促進するために含有した［２０、２１、２７］。
【０２０４】
引き続く組み込み時のノイズを最小化するために、ｐＬＯＩ３３１０由来のｂｕｄＡ’−ＦＲＴ−ｔｅｔ−ＦＲＴ−'ｂｕｄＢ’を包含する２．１ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＡｐａＩ断片を、ｐＬＯＩ２７４５の対応する部位に結合させた（図１Ｂ、（４））。このベクターは、温度条件付きｐＳＣ１０１レプリコンを含有している（更に詳細には、表１を参照されたい）。得られた５５０２ｂｐのプラスミドを、ｐＬＯＩ３３１３（ｐＬＯＩ２７４５（ｂｕｄＡ’−ＦＲＴ−ｔｅｔ−ＦＲＴ−'ｂｕｄＢ’））と称した（図１Ｂ、（５））。
【実施例５】
【０２０５】
ｂｕｄＡＢ欠失があるエタノール産生の組み換えクレブシエラ細菌株の作製
上記の実施例３及び表３で明確にしたように、発酵反応時にエタノール産生の組み換えＫ．オキシトカＰ２株は、ＯＵＭ１発酵培地中にて酸性ｐＨで生育させると、低下したエタノール産生及びブタンジオール経路の副生成物の増大した産生を示す。上記に検討したように、ｂｕｄＡＢ遺伝子は、２，３−ブタンジオール及びアセトインの産生に関わる２つの酵素、すなわちα−アセトラクテート・デカルボキシラーゼ及びα−アセトラクテート・シンターゼをそれぞれコードする。本実施例は、突然変異細胞中でｂｕｄＡＢ遺伝子産物の発現の消去をもたらす、ｂｕｄＡＢ遺伝子における欠失突然変異を含んでいる、Ｐ２株由来の新規なエタノール産生のＫ．オキシトカ株であるＢＷ２１株の作製について記載する。
【０２０６】
ｂｕｄＡ’−ＦＲＴ−ｔｅｔ−ＦＲＴ−'ｂｕｄＢ’断片の、エタノール産生に有用なクレブシエラ株への組み込みのために、上記実施例４に記載のｐＬＯＩ３３１３プラスミドを、線形化し、ＰＣＲ増幅のための鋳型として用いた。ｂｕｄＡＢ欠失を含むＰＣＲ生成物を、Ｒｅｄリコンビナーゼ（ｐＬＯＩ３４２１；表１を参照されたい）の存在下に、エレクトロポレーションによって、Ｋ．オキシトカ株Ｍ５Ａ１株に組み込んだ。
【０２０７】
ｂｕｄＡＢ遺伝子産物の機能的な欠失を確認するために、１０個のクローンを、５％のグルコースを含有する最適化された尿素培地（ＯＵＭ１；上記の表２を参照されたい）で生育させて、アセトイン及び２，３−ブタンジオールの有無について、方法１ｆ項に記載のようにして選別した。これらの生成物が検出可能な濃度で存在しないことで、「欠失クローン」とも称されるが、うまく形質転換された細胞中でのｂｕｄＡＢ経路の欠失が確認された。クローンにおけるｂｕｄＡＢの欠損は、ＰＣＲ分析によっても確認された。
【０２０８】
ブタンジオール経路に欠失を有するＫ．オキシトカ（Ｐ２のような）のエタノール産生の株を構築するために、Ｋ．オキシトカＭ５Ａ１株（ＢＷ１５と称する）の１個のクローンを選択して、上記のように、バクテリオファージＰ１を用いてＫ．オキシトカＰ２に形質導入するためのドナーとして用いた。得られた１０個の形質導入株を、上記のようにアセトイン及びブタンジオールについて選別した。更なる検討のために１個の欠失クローンを選択して、ＢＷ１９と称した。次いで、ＦＬＰリコンビナーゼ（ｐＦＴ−Ｋ）を用いる標準的な操作で、ＦＲＴが側面にあるｔｅｔ遺伝子を除去した。ｂｕｄＡＢ欠失を有しているがＦＲＴが側面にあるｔｅｔを欠いている、得られた株を、Ｋ．オキシトカＢＷ２１と称した。ＦＲＴが側面にあるｔｅｔ遺伝子を除去した後の細胞に残存する切断ｂｕｄＡ及びｂｕｄＢ配列を包含する単離された核酸断片を、本明細書でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５と称する。
【実施例６】
【０２０９】
ｂｕｄＡＢの欠失のエタノール産生の細菌によるエタノールの収率の増加
本実施例は、新たに開発されたエタノール産生のＫ，オキシトカＢＷ２１株（実施例５に記載）による、グルコース発酵の改善されたエタノール産生及び副生成物の低減された産生について、親株であるＫ．オキシトカＰ２と比較して、記載する。
【０２１０】
再度表３を参照すると、ＯＵＭ１（９０ｇ／Ｌのグルコースを用いて）中での細胞の生育による発酵のエタノール及び副生成物の産生について、ｂｕｄＡＢ欠失の効果（親のＰ２株に対してＢＷ２１株）について、比較がなされている。
【０２１１】
表及び先に検討のように、ｐＨ５．２で行われた親株Ｐ２による発酵において、ブタンジオール経路（１モルの生成物当たり２モルのピルベート）からの不要な副生成物（アセトイン＋２，３−ブタンジオール）が、エタノール産生に利用できるグルコースの約１４％から産生された。まさに対照的に、ＢＷ２１株におけるアセトラクテート・シンターゼ及びアセトラクテート・デカルボキシラーゼをコードする遺伝子の欠失は、これらの副生成物の両方を実質的に消去した（表３）。ラクテート及びアセテートの濃度も、親株Ｐ２におけるよりＢＷ２１株では低かった。
【０２１２】
ｐＨ５．２でのＯＵＭ１培地で、ＢＷ２１株による副生成物の減少は、Ｐ２株に比べてエタノール力価及び収率の１２％増加を伴った（表３及び図４を参照されたい）。図４のグラフは、ＯＵＭ１培地でのＫ．オキシトカ株ＢＷ２１及びＰ２による細胞生育（４Ａ）及びエタノール産生（４Ｂ）の比較を示している。ＢＷ２１及びＰ２の生育比率は実質的に同じであるが、エタノール産生がＢＷ２１株で一貫して高かった。
【０２１３】
図５は、３つの尿素含有の培地、すなわちＵ−Ｍ９、Ｕ−０．５％のＣＳＬ＋Ｍ、及びＯＵＭ１（培地処方に関しては、表２を参照されたい）中で生育する親株Ｐ２、及びＯＵＭ１培地で生育する、ｂｕｄＡＢ欠失のＢＷ２１株についての、エタノール収率（グルコース１グラム当たりのグラム数で示す）及びエタノール生産性（エタノール産生の最大及び平均容積比として、１時間当たりのエタノールのｍＭで示す）の比較を示す。平均の生産性は、最初の７２時間について計算した。エタノール収率は、７２時間後に計算した。最大容積生産性は、発酵の初期、８時間〜２４時間の範囲に現れた。
【０２１４】
重要なことに、図５に見られるように、エタノールの収率及び生産性は、ＯＵＭ１培地で生育するＢＷ２１株が、テストしたどの培地で生育している親株Ｐ２よりも、一貫して高かった。
【実施例７】
【０２１５】
ＯＵＭ１培地でのｂｕｄＡＢ遺伝子欠損の組み換え細菌によるエタノールの経済的な産生
上記のように、生成物の収率及び細菌培養培地のような生産材料に関わるコストは、エタノールのような汎用化学製品の経済性において重要な因子である。Ｋ．オキシトカは、この細菌が元来尿素を窒素源として使用する能力を有しているので、エタノール産生の細菌として有利な選択肢である。同等の窒素原料として、尿素は通常、アンモニウム塩のコストの約半分で市販されている。窒素源としての尿素の使用は、更に付加的な利点を有している。アンモニウム塩の代謝と異なって、尿素の代謝は、培地の酸性化を助長しない［４１］ので、ｐＨを調節するために必要な塩基の量を減少させる。
【０２１６】
ＯＵＭ１と称される、本明細書に記載の新規な培地は、その他の塩及びコーンスティープリカーが低濃度であるという潜在的な節約を更に提供する。重量ベースで、ＯＵＭ１培地は、０．５％のＣＳＬ、０．０６％の尿素及び０．２％の無機塩、更に発酵性寒天から構成されている。このような発酵で用いる低いｐＨは、真菌性セルラーゼ及びキシラナーゼが、一般にｐＨ５付近で最適条件を示す［４２］ので、リグノセルロース原料に対して特に適している。
【０２１７】
本明細書で確認したように、ＳＳＦのための低いｐＨのこれら利点にもかかわらず、酸性のｐＨで発酵反応を行う不利な点は、エタノール産生の細菌のブタンジオール（及びアセトイン）産生のための経路が低いｐＨで活性化されて［４３］、副生成物の増加及びエタノール収率の低下をもたらすことである。しかしながら、本明細書で実証したように、この経路に特異的に関与する２つの遺伝子（ｂｕｄＡＢ）に欠失を有する、改良されたエタノール産生の組み換え細菌株の構築によって、この問題はうまく克服することができる。上記で示したように、これらの遺伝子の欠失によるブタンジオール反応生成物の消去は、親株Ｐ２よりも１２％高いエタノール収率を実現する、改善されたエタノール産生のクレブシエラ株（ＢＷ２１株で例示される）をもたらした。最も意義深いことに、ＯＵＭ１中でのｐＨ５．２で、ＢＷ２１によるグルコースからのエタノール産生は、ＬＢ培地での親株（Ｐ２株）のそれを、実質的に４８時間後に達成し、上回った。従って、この新規な株は、この生命体による安価な試薬からのエタノールの産生に最適化された新規な最小培地と共に、バイオマスからの手頃な価格の、再生可能なエネルギー源を作り出すという目標において、重大な進展をもたらす。
【０２１８】
引例
引例の概説は、本発明の正しい評価を高めるであろうと信じる。以下の文献は、下に示した番号で本明細書を通して参照されている。
【０２１９】
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【０２２０】
引例による援用
本明細書に開示された全ての特許、公開された特許出願及びその他の引例は、それらの全てを参照して本明細書に特別に取り込まれている。
【０２２１】
均等物
本明細書に記載の本発明の具体的な態様の多くの均等物を、当業者は認識できるであろう、又は単なる通常の実験を用いて確認できるであろう。このような均等物は、本願の特許請求の範囲に含まれるように意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０２２２】
【図１Ａ】図１は、本発明の態様によるブタンジオール経路のｂｕｄＡＢ遺伝子を欠如した、エタノール産生の組み換え細菌の構築で用いるベクター構築物及び工程を示す説明図である。  図１Ａは、オペロン及び転写調節を示す略図である。○で囲んである＋印は、ｂｕｄＡＢオペロンの発現が低いｐＨで増大し、そしてＢｕｄＲ及びＦｎｒによって正に調節されることを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂ（左上部）は、クローンｂｕｄＡＢ’に用いられるＰＣＲプライマーを示す。この図の下部において、本発明の態様による最小培地でのエタノール産生のために最適化された、エタノール産生の組み換え細菌の構築に用いるプラスミド（例えば、ｐＬＯＩ３３０１）が、図式的に示され、番号で示されている。
【図２−１】図２Ａ〜２Ｄは、本発明の態様による各種最小培地及び９０ｇ／Ｌのグルコースを含有するＬ培地での、エタノール産生の微生物Ｋ．オキシトカＰ２の組み換え株による発酵を示す４つのグラフである。図２Ａ及び２Ｂは、ＬＢ培地及びアンモニア窒素を含有する培地での結果を示す。記号：▲−ＬＢ；○−Ｍ９＋Ｆｅ；■−０．５％ＣＳＬ＋Ｍ。
【図２−２】図２Ａ〜２Ｄは、本発明の態様による各種最小培地及び９０ｇ／Ｌのグルコースを含有するＬ培地での、エタノール産生の微生物Ｋ．オキシトカＰ２の組み換え株による発酵を示す４つのグラフである。図２Ｃ及び２Ｄは、尿素窒素を用いた培地での結果を示す。記号：○−Ｕ−Ｍ９＋Ｆｅ；■−Ｕ−０．５％ＣＳＬ＋Ｍ；●−ＯＵＮ１。標準誤差は、ｎ≧３でデータに含まれている。
【図３】図３Ａ及びＢは、本発明の態様によるＫ．オキシトカＰ２株に最適化した尿素ベースの最小培地（ＯＵＭ１）での、Ｋ．オキシトカＰ２によるグルコースのエタノールへの発酵の態様を示す。データは、各種濃度のコーンスティープリカー（図３Ａ）及び尿素（図３Ｂ）を包含する培地で、４８時間のフラスコ培養による生育（斜線の棒、ＯＤ５５０）及びエタノール産生（塗りつぶした棒）を示している。標準誤差は、ｎ≧３でデータに含まれている。
【図４】図４Ａ及び４Ｂは、Ｋ．オキシトカのエタノール産生株による生育及びエタノール産生（９０ｇ／Ｌグルコース）における、ｂｕｄＡＢ遺伝子の欠失生成物の効果を示す２つのグラフである。図４Ａは生育を示し；図４Ｂはエタノール産生を示す。記号：○−ＢＷ２１株（ΔｂｕｄＡＢ）；●−Ｐ２株（親）。標準誤差は、ｎ≧３でデータに含まれている。改善されたエタノール産生は、糖基質からエタノール以外の生成物を産生する競合の代謝経路に関わる、ｂｕｄＡＢ遺伝子が欠如している突然変異株によって達成された。
【図５】図５は、本発明の態様による組み換え細菌（親株Ｐ２、及びｂｕｄＡＢ欠失のある突然変異株ＢＷ２１）による、エタノールの収率及び生産性の比較を示している。欠失の株によるエタノール産生は、親株の産生を上回っている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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