(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の測定対象成分を測定用抗体又は測定用抗原との抗原抗体反応により測定を行う免疫学的測定方法において、下記（１）〜（３）に記載のモノクローナル抗体および下記（４）に記載の断片からなる群から選ばれる１以上の添加により、前記抗原抗体反応以外の非特異反応であって、ＨＡＭＡに起因する非特異反応及び／又は異好性阻止試薬により抑制できない非特異反応を抑制することを特徴とする免疫学的測定方法。
（１）ヒト免疫グロブリンＭと特異的に反応し、溶液状態において１種類でヒト免疫グロブリンＭとの間で抗原抗体反応に基づく免疫凝集体を形成できる抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体。
（２）以下の工程を含む抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体の製造方法によって取得された（１）に記載の抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体。
工程１）ヒト免疫グロブリンＭを抗原として抗ヒト免疫グロブリンＭ抗体産生ハイブリドーマを取得する工程
工程２）工程１で取得したハイブリドーマが産生する抗体を、溶液状態のヒト免疫グロブリンＭと接触させて、当該溶液状態でヒト免疫グロブリンＭとの間で抗原抗体反応に基づく免疫凝集体を形成できる抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程
工程３）工程２で選択されたハイブリドーマが産生する抗体を取得する工程
（３）ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１３４であるハイブリドーマにより産生される、モノクローナル抗体。
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体に由来するＦａｂ部分を含みヒト免疫グロブリンＭとの結合能を有する断片。
【請求項２】
異好性阻止試薬が、抗ヒト免疫グロブリンＭポリクローナル抗体、抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体（但し、下記（１）〜（３）であるものは含まない）、ノーマルマウスＩｇＧ、からなる群より選択されるものである、請求項１に記載の免疫学的測定方法。
（１）ヒト免疫グロブリンＭと特異的に反応し、溶液状態において１種類でヒト免疫グロブリンＭとの間で抗原抗体反応に基づく免疫凝集体を形成できる抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体。
（２）以下の工程を含む抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体の製造方法によって取得された（１）に記載の抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体。
工程１）ヒト免疫グロブリンＭを抗原として抗ヒト免疫グロブリンＭ抗体産生ハイブリドーマを取得する工程
工程２）工程１で取得したハイブリドーマが産生する抗体を、溶液状態のヒト免疫グロブリンＭと接触させて、当該溶液状態でヒト免疫グロブリンＭとの間で抗原抗体反応に基づく免疫凝集体を形成できる抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程
工程３）工程２で選択されたハイブリドーマが産生する抗体を取得する工程
（３）ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１３４であるハイブリドーマにより産生される、モノクローナル抗体。
【請求項３】
異好性阻止試薬が、ＨＢＲ（ＳＣＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ，ＩＮＣ．製）である請求項１に記載の免疫学的測定方法。
【請求項４】
下記（１）〜（３）に記載のモノクローナル抗体および下記（４）に記載の断片からなる群から選ばれる１以上を含む、ＨＡＭＡ阻害剤。
（１）ヒト免疫グロブリンＭと特異的に反応し、溶液状態において１種類でヒト免疫グロブリンＭとの間で抗原抗体反応に基づく免疫凝集体を形成できる抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体。
（２）以下の工程を含む抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体の製造方法によって取得された（１）に記載の抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体。
工程１）ヒト免疫グロブリンＭを抗原として抗ヒト免疫グロブリンＭ抗体産生ハイブリドーマを取得する工程
工程２）工程１で取得したハイブリドーマが産生する抗体を、溶液状態のヒト免疫グロブリンＭと接触させて、当該溶液状態でヒト免疫グロブリンＭとの間で抗原抗体反応に基づく免疫凝集体を形成できる抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程
工程３）工程２で選択されたハイブリドーマが産生する抗体を取得する工程
（３）ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１３４であるハイブリドーマにより産生される、モノクローナル抗体。
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体に由来するＦａｂ部分を含みヒト免疫グロブリンＭとの結合能を有する断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒト免疫グロブリンＭと特異的に反応し、溶液状態でもヒト免疫グロブリンＭとの間で抗原抗体反応に基づく凝集を起こすことのできるモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体に由来する機能性断片、及びこれらを使用する免疫学的測定方法、測定試薬ならびに測定キット、さらに該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。
また、本発明は非特異反応の抑制剤及びこれを用いた免疫学的測定方法に関し、より詳細にはヒト免疫グロブリンＭに起因する非特異反応の抑制剤及びこれを用いた免疫学的測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
診断薬で汎用される測定方法として、予めアナライト（測定対象物質）を抗原として作製された抗体を用い、被験試料中に存在するアナライトを検出する免疫学的測定方法が挙げられる。なかでも免疫凝集測定方法は、抗体によるアナライトの架橋作用によって形成される格子状の免疫複合体の凝集度合いに基づいて、試料中のアナライトを定性もしくは定量的に測定する方法である。免疫凝集測定方法は光学的な検出に適しており、自動化も容易なことから、さまざまな検査項目に適用されている汎用性の高い測定方法である。
一方、免疫応答の最初期に産生されるヒト免疫グロブリンＭは、血漿中に概ね５０〜２００ｍｇ／ｄＬ（５００〜２０００μｇ／ｍＬ）含まれ、基準濃度範囲外の低値では多発性骨髄腫や蛋白漏出性胃腸症、高値では膠原病やマクログロブリン血症というようにさまざまな疾患の可能性を示すマーカーとなっている。
ヒト免疫グロブリンＭ診断薬に関しても免疫凝集測定方法を原理とする製品が複数実用化されているが、これまではポリクローナル抗体が用いられてきた。
ポリクローナル抗体は多様な反応性を有する抗体の集合体であり、アナライト分子上の複数のエピトープ（抗原決定基）に結合するため凝集力が強く、分子内に同一のエピトープが複数存在しないアナライトの免疫凝集測定方法に最適な抗体である。しかしながらその反面、複数のエピトープと結合するポリクローナル抗体は特異性が低いという大きな課題を有している。実際にヒト免疫グロブリンを例にとると、体内には免疫グロブリンＧをはじめとして構造の類似した５種類の免疫グロブリンが存在するため、免疫グロブリンＭ特異的なポリクローナル抗体を調製する際には、その他の免疫グロブリンと交差反応する抗体画分を除去する処理操作が欠かせず、膨大な手間と労力を要していた。
一方、単一の抗体から構成されるモノクローナル抗体は特定のエピトープに結合するため特異性が高く、調製が容易で性能が安定しているうえに、近年では遺伝子組換えを利用した修飾や改変も容易となったことから、診断用途のみならず治療分野でもその存在感を高めており、その適用領域はますます拡大している。
原理的には、同一のエピトープを複数持つアナライトの免疫凝集測定方法においてモノクローナル抗体の利用も可能であるが、分子内に同一エピトープが１０箇所存在するような免疫グロブリンＭに関しては、モノクローナル抗体では効率的に凝集を形成できないと考えられており、免疫凝集測定方法にモノクローナル抗体が利用されることはなかった。血漿免疫グロブリンＭは図１に示すようにＹ字形の単位構造５個が、Ｙ字形の尾部を中心に先端部を外周側に向けて配位し星型を形成している。Ｙ字形は免疫グロブリンの単位構造であり、ヒンジ部分が柔軟に可動することはよく知られているが、さらに非特許文献１の電子顕微鏡像に示されるように、５個のＹ字型単位構造が（ｂ）Ｙ字形の尾部を中心に先端部を外周側に向けて平面状に配位した星型構造や、（ｃ）Ｙ字形の尾部を支点として先端部を同一方向に向けて配位した「かに形」と記述される構造を形成できることから、Ｙ字形尾部の接合部も柔軟に可動することが確認されている。
このように免疫グロブリンＭ分子中の各サブユニットの接合部は柔軟に可動し、立体的な構造が容易に変化するため、抗免疫グロブリンＭモノクローナル抗体は、二分子の免疫グロブリンＭに結合して分子間架橋を形成せずに、大部分が図２に示したように一分子の免疫グロブリンＭ上の二箇所のエピトープと結合するいわゆる分子内架橋の状態となってしまう。したがって、ヒト免疫グロブリンＭの免疫凝集測定方法において、モノクローナル抗体では効率的に凝集を形成することができないと考えられ、やむを得ず複数のエピトープに結合するポリクローナル抗体が利用されてきた。また、モノクローナル抗体を用いることができたとしても、それは複数のモノクローナル抗体を組み合わせてポリクローナル抗体の作用をさせる例であり（例えば特許文献４実施例３）、１種類のモノクローナル抗体でヒト免疫グロブリンＭを凝集させるような性質を有するモノクローナル抗体の存在はこれまで知られていなかった。また、これまで抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ作製時の選別操作は、ヒト免疫グロブリンＭあるいは抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体を固相化した条件下で評価した反応性の強さを指標としており、溶液状態における両者の反応性が指標とされることはなかった（特許文献１〜３）。
【０００３】
また、近年では技術の進歩によって様々な物質を抗原とした抗体の作製が可能となってきたことから、免疫学的測定方法を利用した検査用試薬の利用件数は増加の一途をたどっているが、それに伴って従来よりもさらに高性能を求められるようになり、非特異反応の発生を厳密に回避する必要性が生じてきている。
非特異反応とは被験試料中の因子によって特異反応にもとづかない結合が促進されたり、特異的な免疫反応が妨げられたりする現象で測定過誤の原因となる。非特異反応の原因因子として異好性抗体やリウマチ因子（ＲＦ）の存在が明らかとなっている。
異好性抗体とは、免疫学的測定方法の主成分である動物由来抗体に対して反応性を示すヒト抗体の総称であり、ＨＡＭＡ（ヒト抗マウス免疫グロブリン抗体）が代表的なものとして知られている。その成因としては、食事や動物との接触、生物学的製剤の投与といったような無自覚下における抗原感作によって産生されるケースに加え、抗原未感作の抗体が異好性を示す可能性もあるため解明されていない部分も多い。一方、リウマチ因子は関節リウマチ患者に出現し、結合部位も特定されていることから、異好性抗体とは別の概念として捉えられているが、動物由来抗体に対して反応性を示すという性質は共通しており、非特許文献２に記載されたようにその実体はいずれもヒトの免疫グロブリンＧや免疫グロブリンＭであることが知られている。
これまでも異好性抗体による非特異反応の対策として、非特許文献３、４記載の抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体を成分とする異好性阻止試薬ＨＢＲが製品化されており、免疫学的測定方法を原理とする各種検査で利用されてきた。
また、測定に用いる抗体と同種動物から調製したヒト免疫グロブリンＭ型自然抗体に対するポリクローナル抗体を添加する特許文献５の非特異反応の抑制策や、リウマチ因子の反応部位に対する各種動物抗体を添加する特許文献６記載の非特異反応抑制策も考案されている。しかしながらいずれもポリクローナル抗体の利用であるため、各種動物に免疫するための大量の抗原を長期的に要するうえに、前者は自然抗体による非特異反応しか抑制できず、後者が認識するＲＦ因子の反応部位はそもそも可変性を持つため、その非特異反応の抑制効果は限定的である。実際、免疫学的測定方法を利用した検査項目および検査数の増加に伴い、従来の対策法では非特異反応の抑制効果が十分に発揮されない検体が見出されるようになってきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開昭６０−４２４００号公報
【特許文献２】特開昭６３−５８２６０号公報
【特許文献３】特表平６−５０４４２４号公報
【特許文献４】特開昭６０−２３７３６３号公報
【特許文献５】特許第４０６５６００号公報
【特許文献６】特開平０７−０１２８１８号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ロアット  免疫学要説  原著第３版  図2.16
【非特許文献２】臨床化学 ;第23巻補冊175a-1〜175a-10 (1994）
【非特許文献３】異好性阻止試薬HBRに関わる宣伝資料（長瀬産業1993）
【非特許文献４】CLIN.CHEM. 45/7,942-956 （1999)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ヒト免疫グロブリンＭと特異的に反応し、溶液状態でヒト免疫グロブリンＭとの間で抗原抗体反応に基づく免疫凝集体を形成できる抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体の機能性断片、及びこれらを使用する免疫学的測定方法、測定試薬ならびに測定キット、さらに該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供することを課題とする。
また、本発明は、ヒト免疫グロブリンＭに起因する非特異反応の抑制剤及びこれを用いた免疫学的測定方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行ったところ、ヒト免疫グロブリンＭに反応するモノクローナル抗体の選別において、溶液状態での反応性を評価指標とすることで、１種類でヒト免疫グロブリンＭを分子間架橋し凝集することができ、実用的な免疫凝集測定を達成できる新規のモノクローナル抗体を見出し本発明を完成するに至った。このようにして得られたモノクローナル抗体は、従来の固相化した抗原を用いる評価法では必ずしも高い反応性を示さないモノクローナル抗体であった。
【０００８】
また、本発明者らは、驚くべきことに上記１種類でヒト免疫グロブリンＭを凝集できる性質を持つ抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体によって、従来法では阻止できないような非特異反応であっても、強く抑制されることを見出した。したがって本発明の別の目的は、１種類でヒト免疫グロブリンＭを凝集できる抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体を含む非特異反応の抑制剤を提供することである。
また、本発明のさらに別の目的は、抗原抗体反応を利用した免疫学的測定方法において、１種類でヒト免疫グロブリンＭを凝集できる抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体を添加することにより、非特異反応を抑制し正確な測定値を得ることを特徴とする免疫学的測定方法、測定試薬及び測定キットに関する。
具体的には本発明は、以下の構成を有する。
（１）ヒト免疫グロブリンＭと特異的に反応し、溶液状態でヒト免疫グロブリンＭとの間で抗原抗体反応に基づく免疫凝集体を形成できる抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体。
（２）以下の工程を含む抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体の製造方法によって取得された前記（１）に記載の抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体。
工程１）ヒト免疫グロブリンＭを抗原として抗ヒト免疫グロブリンＭ抗体産生ハイブリドーマを取得する工程
工程２）工程１で取得したハイブリドーマが産生する抗体を、溶液状態のヒト免疫グロブリンＭと接触させて、当該溶液状態でヒト免疫グロブリンＭとの間で抗原抗体反応に基づく免疫凝集体を形成できる抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程
工程３）工程２で選択されたハイブリドーマが産生する抗体を取得する工程
（３）以下の（ａ）又は（ｂ）の抗体。
（ａ）ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１３４であるハイブリドーマにより産生される、モノクローナル抗体。
（ｂ）上記（ａ）の抗体と交差反応性を有する前記（１）に記載の抗体。
（４）前記（１）〜（３）のいずれかに記載の抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体に由来する機能性断片。
（５）前記（１）〜（３）のいずれかに記載のモノクローナル抗体、及び／または前記（４）に記載のモノクローナル抗体に由来する機能性断片を用いることを特徴とする、試料中のヒト免疫グロブリンＭを測定する免疫凝集測定方法。
（６）前記（１）〜（３）のいずれかに記載のモノクローナル抗体、及び／または前記（４）に記載のモノクローナル抗体に由来する機能性断片を用いることを特徴とする、試料中のヒト免疫グロブリンＭを測定する免疫凝集測定試薬及び測定キット。
（７）前記（１）又は（２）に記載のモノクローナル抗体を産生することを特徴とするハイブリドーマ。
（８）ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１３４であるハイブリドーマ。
（９）以下の工程を含むことからなる、抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体の製造方法。
工程１）ヒト免疫グロブリンＭを抗原として抗ヒト免疫グロブリンＭ抗体産生ハイブリドーマを取得する工程
工程２）工程１で取得したハイブリドーマが産生する抗体を、溶液状態のヒト免疫グロブリンＭと接触させて、当該溶液状態でヒト免疫グロブリンＭとの間で抗原抗体反応に基づく免疫凝集体を形成できる抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程
工程３）工程２で選択されたハイブリドーマが産生する抗体を取得する工程
（１０）前記（１）〜（３）のいずれかに記載のモノクローナル抗体、及び／または前記（４）に記載のモノクローナル抗体に由来する機能性断片を含む、ヒト免疫グロブリンＭに起因する非特異反応の抑制剤。
（１１）試料中の測定対象成分を測定用抗体又は測定用抗原との抗原抗体反応により測定を行う免疫学的測定方法において、前記（１）〜（３）のいずれかに記載のモノクローナル抗体、及び／または前記（４）に記載のモノクローナル抗体に由来する機能性断片を含む、ヒト免疫グロブリンＭに起因する非特異反応の抑制剤の添加により、前記抗原抗体反応以外のヒト免疫グロブリンＭに起因する非特異反応を抑制することを特徴とする免疫学的測定方法。
（１２）測定用抗体又は測定用抗原が不溶性担体に担持されていることを特徴とする、前記（１１）に記載の免疫学的測定方法。
（１３）不溶性担体がラテックス、金属コロイド、シリカからなる前記（１２）に記載の免疫学的測定方法。
（１４）前記（１）〜（３）のいずれかに記載のモノクローナル抗体、及び／または前記（４）に記載のモノクローナル抗体に由来する機能性断片を含む、ヒト免疫グロブリンＭに起因する非特異反応の抑制剤及び試料中の測定対象成分を測定するための測定用抗体または測定用抗原を含むことを特徴とする免疫学的測定試薬及び測定キット。
（１５）測定用抗体又は測定用抗原が不溶性担体に担持されていることを特徴とする、前記（１４）に記載の免疫学的測定試薬及び測定キット。
（１６）不溶性担体がラテックス、金属コロイド、シリカからなる前記（１５）に記載の免疫学的測定試薬及び測定キット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のモノクローナル抗体により、ヒト免疫グロブリンＭ特異的な検出方法を提供するとともに、高品質で安価なヒト免疫グロブリンＭの免疫凝集測定試薬及び測定キットを提供することが可能となった。
また、本発明のモノクローナル抗体の選択方法は、溶液状態における凝集性の強さを指標に選択されるため、精度高く目的とするモノクローナル抗体を得ることができ効率的である。
【００１０】
また、本発明の非特異反応の抑制剤によれば、免疫グロブリンＭと1：1の分子内架橋を形成せず免疫グロブリンＭの影響を効率的に中和できるため、これを用いた免疫学的測定方法、免疫学的測定用試薬及び測定キットでは、ヒト免疫グロブリンＭに起因する従来型の非特異反応に加えて、既知の対策で回避できなかった非特異反応も抑制することができる。従って、幅広い測定項目及び試料について、従来の測定方法よりも正確な測定値を与えることが可能となり検査数が増加傾向にある免疫学的測定方法に好適に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ヒト免疫グロブリンＭの構造模式図である。
【図２】ヒト免疫グロブリンＭと従来の抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体の結合様式を示す図である。
【図３】本発明の抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体を用いた免疫凝集測定試験結果を示す図である（実施例１）。
【図４】ＰＳＡ測定ラテックス試薬で正常検体を測定した際の、本発明の非特異反応の抑制剤、対照の非特反応の阻止剤の影響を示す図である。
【図５】ＰＳＡ測定ラテックス試薬で非特異反応検体を測定した際の、本発明の非特異反応の抑制剤、対照の非特異反応の阻止剤の抑制効果を示す図である。
【図６】インスリン測定試薬で非特異反応検体を測定した際の、本発明の非特異反応の抑制剤、対照の非特異反応の阻止剤の抑制効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体）
本発明の抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンＭと特異的に反応し、溶液状態でヒト免疫グロブリンＭ分子同士の分子間架橋を形成し、１種類で免疫凝集測定が可能という特性を有するモノクローナル抗体であれば特に限定されない。ここでヒト免疫グロブリンＭと特異的に反応するとは、ヒト免疫グロブリンＭとは抗原抗体反応を起こすが、他のヒト免疫グロブリンとは抗原抗体反応を起こさないことをいう。これまで免疫凝集の形成有無に着目した免疫グロブリンＭに対するモノクローナル抗体の探索は行われておらず、本発明の１種類でヒト免疫グロブリンＭを凝集できる抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体は新規である。
また、従来の抗免疫グロブリンＭモノクローナル抗体は２分子の免疫グロブリンの分子間を架橋するのではなく、１分子の免疫グロブリンの分子内を架橋することしかできなかった。しかし、本発明の１種類でヒト免疫グロブリンＭを凝集できるモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンＭの分子間を架橋できるため、ヒト免疫グロブリンＭの影響を効率的に中和し、ヒト免疫グロブリンＭに起因する非特異反応を強力に抑制することが可能となり、後述するように、非特異反応の抑制剤として好適に用いることができる。
このような本発明の抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体の具体例としては、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１３４であるハイブリドーマにより産生される、モノクローナル抗体が挙げられ、さらに、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１３４であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体と交差反応性を有する抗体も本発明の抗体の範囲に含まれる。ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１３４であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体と交差反応性を有する抗体には、当該抗体と同一のエピトープ(抗原決定基)のアミン酸配列を特異的に認識しうる抗体が含まれる。
【００１３】
（機能性断片）
本発明には、酵素的消化により得られる該モノクローナル抗体のFab部分を含む機能性断片や遺伝子組換えによって作製される該モノクローナル抗体のFab部分を含む機能性断片に関わらず、該モノクローナル抗体に由来するFab部分を含む機能性断片を有するものであれば利用できる。従って、本発明の機能性断片の「機能性」の意味は、具体的にはヒト免疫グロブリンＭとの結合能を有することをいう。
【００１４】
（測定対象試料）
本発明の抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体または該モノクローナル抗体断片を用いたヒト免疫グロブリンＭの免疫凝集測定方法の測定対象試料は、生体試料であればよく、例えば血液、血清、血漿、尿などの体液である。
【００１５】
（測定方法）
本発明のヒト免疫グロブリンＭの免疫凝集測定方法は、本発明の抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体と測定対象試料を任意の方法で混合して免疫凝集を形成させ、ヒト免疫グロブリンＭを測定する測定方法であれば特に限定はない。また免疫凝集の形成をより促進させるために該モノクローナル抗体とはエピトープの異なる他の抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体を併用しても良く、併用するモノクローナル抗体の特性に関しては特に制限がない。
【００１６】
（免疫凝集測定試薬及び測定キット）
本発明の抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体または該モノクローナル抗体断片を用いたヒト免疫グロブリンＭの免疫凝集測定試薬及びキットは、試料のイオン強度や浸透圧などを緩衝する成分や免疫学的凝集を増強する成分を含んでもよい。前記試料のイオン強度や浸透圧などを緩衝する成分としては、例えば、酢酸，クエン酸，リン酸，トリス，グリシン，ホウ酸，炭酸，グッドの緩衝液や、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩などがあげられ、前記免疫学的凝集を増強する成分としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、リン脂質ポリマーなどがあげられる。
【００１７】
また本発明の抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体または該モノクローナル抗体断片を用いたヒト免疫グロブリンＭの免疫凝集測定試薬及び測定キットは、光学的な測定が可能であり、分光光度計や、分光光度測定を測定原理とした日立社製自動分析装置の他に、東芝社製ＴＢＡシリーズ、日本電子社製ＢＭシリーズ、オリンパス社製ＡＵシリーズ、積水メディカル社製ＣＰ２０００といった汎用自動分析装置、さらには近赤外を測定波長とした装置（三菱化学ヤトロン社製ＬＰＩＡ等）、散乱光強度を測定する装置（デイドベーリング社製ＢＮシステム等）などを用いても測定ができる。
【００１８】
本発明の抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体を作製する技術に関して特に制限はないが、マウスハイブリドーマを作製する方法が一般的である。本発明の抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体の選定のための評価方法は、溶液状態において、ヒト免疫グロブリンＭを凝集させる凝集性の強さを指標に選択される。この結果、ヒト免疫グロブリンＭに特異的に反応し、かつ、単独でヒト免疫グロブリンＭを凝集させるという性質を有する抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体を得ることができる。
また、本発明の抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体調製後の構造改変や修飾に関して、該モノクローナル抗体のヒト免疫グロブリンＭとの反応特性を大きく損なわない限り特に制限はない。
【００１９】
（ハイブリドーマ）
本発明の抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体を産生するために用いるハイブリドーマは、ヒト免疫グロブリンＭと特異的に反応し、かつ溶液状態でヒト免疫グロブリンＭとの間で抗原抗体反応に基づく免疫凝集を形成できる抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナルを産生できるハイブリドーマであればいずれでもよく、産生されるモノクローナル抗体が溶液状態においてヒト免疫グロブリンＭとの免疫凝集形成能の高いものが選択される。すなわち、本発明の抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体は以下の工程１）〜３）を経て製造される。
工程１）ヒト免疫グロブリンＭを抗原として抗ヒト免疫グロブリンＭ抗体産生ハイブリドーマを取得する工程
工程２）工程１で取得したハイブリドーマが産生する抗体を、溶液状態においてヒト免疫グロブリンＭと接触させて、当該溶液状態でヒト免疫グロブリンＭとの間で抗原抗体反応に基づく免疫凝集体を形成できる抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程
工程３）工程２で選択されたハイブリドーマが産生する抗体を取得する工程
上記工程２で選択されたハイブリドーマとしては、例えばＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１３４が挙げられる。
上記製造工程におけるハイブリドーマの選択は、より具体的には精製抗体を用いて溶液状態のヒト免疫グロブリンと反応させることで、溶液状態における免疫凝集形成能の違いによる選択工程が挙げられるが、本選択工程の前に、精製抗体を用いずにハイブリドーマ培養上清などを用い、まずＥＬＩＳＡ法などの固相状態における抗ヒト免疫グロブリンＭ抗体産生ハイブリドーマの選択工程を予め行えば、より効率的に本発明の抗体産生ハイブリドーマを選択することができる。
このような選択工程を経て得られた抗体は、ヒト免疫グロブリンＭに特異的に反応し、かつ、溶液状態において１種類でヒト免疫グロブリンＭとの間に分子間架橋を形成して免疫凝集体を形成できるという性質を有する。
【００２０】
（用途）
本発明の抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンＭに特異的に反応し、かつ、１種類でヒト免疫グロブリンを凝集させるという性質を用いる用途であればいずれにも適用することができ、上述のヒト免疫グロブリンＭの免疫凝集測定方法のほかに、ヒト免疫グロブリンＭに起因する非特異反応の抑制剤としての使用が好適な例として挙げられる。本発明の抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンＭと1：1で分子内架橋しないことからヒト免疫グロブリンＭを効率的に中和でき、ヒト免疫グロブリンＭに起因する非特異反応の抑制剤として好適に用いることができるのである。本発明の抗体が、従来の非特異反応の阻止剤をもってしても抑制できなかったようなヒト免疫グロブリンＭに起因する非特異反応を抑制できるメカニズムは、明確でないものの、溶液状態のヒト免疫グロブリンＭを凝集できるという性質が大きく関わっているものと考えられる。例えば、溶液状態のヒト免疫グロブリンＭを凝集できるという性質を有する抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体は、異好性抗体型、リウマチ因子（ＲＦ）型等に関わらず、ヒト免疫グロブリンＭ分子内で普遍的に存在するエピトープを認識している可能性が考えられる。
したがって、本発明でいうヒト免疫グロブリンＭに起因する非特異反応とは、ヒト免疫グロブリンＭが原因となっている全ての非特異反応を指し、前記非特異反応には、異好性抗体やリウマチ因子（ＲＦ）となって動物由来抗体と反応してしまうヒト免疫グロブリンＭのように発生機序が公知の非特異反応に加え、機序が不明の非特異反応も含まれる。このように、本発明の抑制剤は、前記原因の因子の実体がヒト免疫グロブリンＭである全ての非特異反応を対象とする。
【００２１】
本発明の抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体の非特異反応の抑制剤としての使用は、溶液状態であっても、固相状態であってもその効果を発揮することができる。本抑制剤の溶液状態の使用としては、試料溶液に本抑制剤を添加し、溶液状態でヒト免疫グロブリンＭと反応させて凝集させる場合が挙げられる。また、固相状態での使用としては、例えば、イムノクロマト法に用いられるサンプルパッドにあらかじめ本抑制剤溶液を添加して乾燥・固定化し、当該サンプルパッドに試料を滴下し通過する際に、試料溶液中のヒト免疫グロブリンＭを固定化された抑制剤によってトラップさせる場合などが挙げられる。
【００２２】
本発明の非特異反応の抑制剤は、試料中の測定対象成分を測定用抗体又は測定用抗原との抗原抗体反応により測定する免疫学的測定方法に用いることができ、これにより、前記抗原抗体反応以外のヒト免疫グロブリンＭに由来する非特異反応を効果的に抑制することができ、正確な免疫測定が可能となる。
【００２３】
１種類でヒト免疫グロブリンＭを凝集できる抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体を添加することにより、非特異反応を抑制し正確な測定値を得ることを特徴とする本発明の免疫学的測定方法、測定試薬及び測定キットの測定対象試料は、種々のヒト生体試料であってヒト免疫グロブリンＭに起因する非特異反応発生の可能性がある試料であれば特に限定されないが、例えば血液、血清、血漿、尿などの体液である。測定対象に関しても抗原抗体反応を利用できる分子であれば特に限定はなく、例えばＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）、Ｌｐ（ａ）、ＭＭＰ３（マトリクスメタロプロテイナーゼ３）、ＩＶ型コラーゲン、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）、インスリン、マイクロアルブミン、シスタチンＣ、抗リン脂質抗体、抗トレポネーマ・パリダム抗体、ＦＤＰ（フィブリン・フィブリノーゲン分解産物）、Ｄダイマー、ＳＦ（可溶性フィブリン）、ＴＡＴ（トロンビン-アンチトロンビンＩＩＩ複合体）、ＸＩＩＩ因子、ペプシノーゲンＩ・ＩＩなどに加えて、ハプテンであるフェニトイン、フェノバルビタール、カルバマゼピン、バルプロ酸、テオフィリンなどの薬物も挙げられる。但し、本発明の原理上、ヒト免疫グロブリンＭを測定対象分子とすることはできない。
【００２４】
本発明のヒト免疫グロブリンＭに起因する非特異反応の抑制剤に用いられる１種類でヒト免疫グロブリンＭを凝集できる抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体は、溶液状態および固相化状態いずれの状態でも添加でき、添加濃度は十分な非特異反応抑制効果を示し、かつ免疫学的測定の本反応に影響を及ぼさない濃度であれば特に制限はないが、０．０１〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲での利用が望ましく、０．０５〜１ｍｇ/ｍＬがより望ましい。また実際の測定に際しては、測定用抗体又は測定用抗原と被験試料を接触させる工程以前に、本発明の抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体と被験試料を接触させた方が非特異反応をより効率的に抑制できる。またその他の非特異反応抑制策や阻止成分の併用も可能である。
【００２５】
免疫学的測定に関わる成分（測定用抗体又は測定用抗原）を担持した不溶性担体を利用する、本発明の免疫学的測定方法、測定試薬及び測定キットにおいて、不溶性担体として用いられる素材は、検査薬の成分として利用可能な不溶性物質であれば特に制限はないが、具体的にはラテックス粒子、金属コロイド、シリカ、カーボンなどが挙げられ、ラテックス粒子が特に好適である。不溶性担体の素材及びサイズは、本発明の免疫学的測定方法、測定試薬及び測定キットの測定対象分子、検出原理などに応じて適宜選択できる。上記ラテックス粒子の場合では、フェニル基を有する重合性単量体と、フェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体との共重合体からなる担体粒子により構成されるものが好ましく、その平均粒子径は、透過型電子顕微鏡装置を用いた場合の測定で、０．０１〜１．５μｍであり、好ましくは０．０３〜０．８μｍ、より好ましくは０．０５〜０．５μｍである。
【００２６】
測定対象分子と特異的に結合する抗体に対する非特異因子の影響を抑制し、正確な測定値を得ることを特徴とする本発明の免疫学的測定方法において、検出原理としては酵素、蛍光、化学発光、濁度などいずれも利用でき、また操作・評価法ともに用手的、機械的いずれも利用できる。したがって本発明の免疫学的測定試薬及び測定キットとしてはＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、化学発光法、イムノクロマト法、免疫凝集法やラテックス免疫凝集法などいずれの形態も利用できる。特に免疫凝集法やラテックス免疫凝集法は、前述のヒト免疫グロブリンＭの免疫凝集測定試薬及び測定キットで用いられる機器が同様に用いられる。  
【００２７】
また、本発明のヒト免疫グロブリンＭに起因する非特異反応の抑制剤が用いられる免疫学的測定試薬及び測定キットは、主成分の他に、試料のイオン強度や浸透圧などを緩衝する成分や免疫学的凝集を増強する成分を含んでもよく、前述のヒト免疫グロブリンＭの免疫凝集測定試薬及び測定キットと同様の成分が挙げられる。
【実施例】
【００２８】
以下、１種類で免疫凝集を形成できる抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体の作製方法、該モノクローナル抗体を利用した免疫凝集測定方法、及び該モノクローナル抗体を非特異反応の抑制剤として利用した免疫学的測定方法の例を挙げて本発明の一部を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２９】
〔試験例１〕本発明の抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体の作製
（１）抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製
精製ヒト免疫グロブリンＭ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）１００μｇを１回の免疫に使用した。初回免疫はヒト免疫グロブリンＭとフロインドの完全アジュバンドを等量混合して調製したエマルジョン２００μＬを用い、これをＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔に注射した。追加免疫にはフロインドの不完全アジュバンドを使用して同様に調製したエマルジョン２００μＬを用い、２週間間隔で３回免疫を繰り返した。マウス眼底静脈より採血した血液中の抗体価をＥＬＩＳＡ法にて測定し、抗体価の高いマウスを選んで細胞融合に供した。４回目の免疫から２週間後にヒト免疫グロブリンＭ１００μｇを生理食塩液２００μＬに溶解したものをマウス腹腔に注射し、３日後に脾臓を摘出した。脾臓をＲＰＭＩ１６４０培地中でほぐした後、１５００ｒｐｍで遠心分離して脾細胞を回収した。これを牛胎児血清フリーのＲＰＭＩ１６４０培地で３回以上洗浄後、１５％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地２ｍＬを加えて懸濁し、脾細胞懸濁液とした。脾細胞とミエローマ細胞ＳＰ２／Ｏ−ＡＧ１４を６対１の割合で混合した後、５０％ポリエチレングリコール存在下で細胞融合させ、ハイブリドーマ（融合細胞）を得た。１５００ｒｐｍの遠心分離で沈殿部を集め、ＧＫＮ液（グルコース２ｇ、塩化カリウム０．４ｇ、塩化ナトリウム８ｇ、リン酸水素二ナトリウム１．４１ｇ及びリン酸二水素ナトリウム二水和物０．７８ｇを精製水に溶かして１リットルとしたもの）に懸濁、遠心分離により洗浄後、沈殿部を回収した。これを１５％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地３０ｍＬに懸濁したものを１ウェルあたり１００μＬ、及びフィーダー細胞としてＢＡＬＢ／ｃマウスの胸腺細胞を２．５×１０６個／ｍＬ含むＨＡＴ培地を１ウェルあたり２００μＬ９６穴マイクロプレート３枚にそれぞれ分注し、３７℃にて５％炭酸ガス培養器中でハイブリドーマを培養した。
培養上清中の抗ヒト免疫グロブリンＭ抗体の存在を、ヒト免疫グロブリンＭを固相化したＥＬＩＳＡ法で確認した。１０日後に全てのウェルでハイブリドーマの増殖を確認した。詳細には、１０μｇ／ｍＬのヒト免疫グロブリンＭ及び１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２；以下、ＰＢＳと略す）１００μＬを前記ハイブリドーマの増殖が確認された９６穴マイクロプレートに分注し、４℃で１晩放置した。次に、この９６穴マイクロプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０及び１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ３００μＬで３回洗浄した後、各ウェルの培養上清を５０μＬ／ウェル加え室温で１時間放置した。その後、当該プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ(以下、ＰＢＳ−Ｔと略す)で３回洗浄の後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体(ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社)を５０μＬ／ウェル加え、室温で１時間放置した。その後、当該プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、０．２％オルトフェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０μＬ／ウェルを加え、室温で１５分間放置後、４．５Ｎ硫酸５０μＬ／ウェルを加えて反応を停止させ、各ウェルの波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定し、ブランクと差のあるウェルを陽性ウェルとして選択した。
単クローン化は限界希釈法で行った。すなわちフィーダー細胞としてＢＡＬＢ／ｃマウスの胸腺細胞を１ウェルあたり１０６個ずつ分注した９６穴マイクロプレートに、前記陽性ウェル中のハイブリドーマを１０個／ｍＬとなるように希釈したものを０．１ｍＬずつ分注した。培地は、初回はＨＡＴ培地を、２回目以降は１５％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０を用い、３７℃にて５％炭酸ガス培養器中で１０日間培養した。ＥＬＩＳＡ法による陽性ウェルの選択及び限界希釈法による単クローン化操作を各３回繰り返して抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ２６種類（Ａ-Ｚ）を得た。
（２）モノクローナル抗体の生産
各ハイブリドーマの約１０５個をプリスタン前処理したマウス腹腔に投与し、生成した腹水をそれぞれ採取した。採取した各腹水から遠心分離により不溶物を除去し、等量の飽和硫安液を加え、撹拌しながら１晩放置後、遠心分離で沈殿を回収した。回収した沈殿を２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、同緩衝液で透析した。透析内容物それぞれを同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカラムに別個に吸着させた後、それぞれ同緩衝液中の塩化ナトリウム０〜３００ｍＭの濃度勾配で溶出させ、精製抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体を得た。Ａ-Ｚのハイブリドーマが産生した抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体をそれぞれａ-ｚとして以下の試験に用いた。
【００３０】
〔評価例〕
（１）評価例１  固相状態での反応性評価（従来型の評価法）
１μｇ／ｍＬのヒト免疫グロブリンＭを含むＰＢＳ５０μＬを９６穴マイクロプレートに分注し室温で１時間放置し、ヒト免疫グロブリンＭをマイクロプレートに固定した。次に３％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含むＰＢＳ２００μＬでブロッキングした後、各抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体を１μｇ／ｍＬ含むＰＢＳ５０μＬをウェルに加え室温で１時間放置した。その後、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄の後、ペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体を５０μＬ／ウェル加え、室温で１時間放置し、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルフォン酸（ＡＢＴＳ）（ＫＰＬ社製）基質液を５０μＬ／ウェル加え、室温で２０分間放置後、１％ＳＤＳ水溶液５０μＬ／ウェルを加えて反応を停止させ、波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、吸光度から各抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体の反応性の強さを順位で示した（表１）。
【００３１】
（２）評価例２  溶液状態での反応性評価（本発明の評価法）
２００μｇ／ｍＬのヒト免疫グロブリンＭを含むＰＢＳ１５０μＬに各抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体溶液（精製抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体４００μｇ／ｍＬ、３％ポリエチレングリコール６０００、５ｍＭクエン酸三ナトリウム、２．５ｍＭ塩化カルシウム（無水）を含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０）７５０μＬを加えて攪拌し、１０分後に日立Ｕ−３３１０分光光度計を用いて主波長３４０ｎｍ、副波長８００ｎｍの２波長で吸光度を測定した（吸光度２）。対照としてヒト免疫グロブリンＭを含まないＰＢＳ１５０μＬに各抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体溶液７５０μＬを加えて攪拌し、同一条件で吸光度を測定した（吸光度１）。吸光度２から吸光度１を減じて、ヒト免疫グロブリンＭ特異的な免疫凝集にともなう吸光度変化量を算出した（表1）。
【００３２】
【表１】
0005570391.tif 000002
【００３３】
（３）評価結果  
吸光度変化量から、抗体tは、ヒト免疫グロブリンＭと特異的に反応し、かつ溶液状態でヒト免疫グロブリンＭとの間で抗原抗体反応に基づく免疫凝集を形成できる抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナルであることがわかった。なお、従来型の評価法である固相状態の反応性評価では抗体k、zの反応性の強さが突出しており、６番目の強さではあるものの、強さがｋの半分以下である本発明のモノクローナル抗体ｔが選択される可能性は低い。また同時に、溶液状態でヒト免疫グロブリンＭとの間で抗原抗体反応に基づく免疫凝集体を形成できるという特性は反応性の強さに必ずしも一致していないことから、従来型の固相状態による反応性の評価のみでは本発明の特性を持つモノクローナル抗体を見出すことは極めて困難であることがわかる。なお、抗体ｔを産生するハイブリドーマＴは、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１３４として寄託されている。
【００３４】
〔実施例１〕
抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体による免疫凝集及び非特異反応の抑制剤としての利用可能性の確認
（１）ヒト免疫グロブリンＭ溶液の調製
ヒト免疫グロブリンＭ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）を２００μｇ／ｍＬ含む溶液を、ＰＢＳを用いて倍々の段階希釈を行い、１００、５０、２５μｇ／ｍＬのヒト免疫グロブリンＭ溶液を調製した。
（２）抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体ｔ溶液の調製
３％のポリエチレングリコール６０００、５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、２．５ｍＭの塩化カルシウム（無水）を含むｐＨ８．０の１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（以下、抗体希釈液という）を用いて、本発明の抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体ｔを最終濃度４００μｇ／ｍＬとなるように希釈し抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体ｔ溶液を調製した。対照として抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体ｔの代わりに非特異反応の阻止剤として用いられている抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体を成分とする異好性阻止試薬ＨＢＲ（ＳＣＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ，ＩＮＣ．製、輸入元は長瀬産業株式会社）を最終濃度４００μｇ／ｍＬとなるように抗体希釈液で希釈し、異好性阻止試薬ＨＢＲ溶液を調製した。
（３）測定方法
日立７１７０形自動分析装置を用いて、免疫凝集測定を実施した。具体的には（１）で調製した各濃度のヒト免疫グロブリンＭ溶液３０μＬに、（２）で調製した抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体ｔ溶液１５０μＬまたは異好性阻止試薬ＨＢＲ溶液１５０μＬを加えて攪拌後３７℃で加温し、主波長３４０ｎｍ副波長８００ｎｍで１０分間の吸光度変化量を感度（ｍＡｂｓ）として測定した。結果を図３に示す。
（４）結果
本発明の抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体t（社内管理番号７３２２４）においてヒト免疫グロブリンＭ濃度２５μｇ／ｍＬから濃度依存的な感度上昇が認められ、１種類でヒト免疫グロブリンＭの実用的な免疫凝集測定が可能であることが確認された。なお、対照とした異好性阻止試薬ＨＢＲにおいては感度上昇が全く認められず、ヒト免疫グロブリンＭを凝集できないことが確認された。このことより、本発明の抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体は従来の非特異反応の阻止剤に用いられていた抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体とは明らかに異なる性質で、従来の非特異反応の阻止剤では抑制できなかったようなヒト免疫グロブリンＭに起因する非特異反応を抑制できる可能性が示唆された。
以下、いくつかの免疫反応測定における、本発明の非特異反応の抑制効果を確認した（実施例２〜４）。
【００３５】
〔実施例２〕非特異反応の抑制効果の確認「１」（ＰＳＡ測定用ラテックス試薬において
抗ＰＳＡモノクローナル抗体を利用したＰＳＡ測定用ラテックス試薬で確認された非特異反応に対する本発明の抑制効果を、汎用自動分析装置を利用した感度測定で確認した。ＰＳＡは前立腺の腺上皮細胞で特異的に産生される分子量約３４，０００の糖タンパク質で、高齢男性が罹患する代表的な悪性腫瘍のひとつである前立腺癌のスクリーニング（検診）に応用されている。
（１）試薬
（１−１）第一試薬
（i）基本試薬
０．５Ｍ  ＫＣｌ、０．１％  ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含む３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  緩衝液（ｐＨ７．０）
（ii）本発明試薬
上記基本試薬に一種類でヒト免疫グロブリンＭとの間で抗原抗体反応に基づく免疫凝集を形成できる抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体ｔ溶液を抗体の最終濃度２５、５０、１００μｇ／ｍＬになるように添加した試薬
(iii)対照試薬
基本試薬に市販の異好性阻止試薬ＨＢＲ、または抗ヒト免疫グロブリンＭヤギポリクローナル抗体（ＭＢＣ社製）を最終濃度２５、５０、１００μｇ／ｍＬになるように添加した試薬
（１−２）第二試薬
ナノピア(登録商標)ＰＳＡ  ＰＳＡラテックス試液  第２液（積水メディカル株式会社）
（２）測定装置
日立７１７０形自動分析装置：
パラメータ条件
（i）検体−第一試薬−第二試薬の量：４μＬ−１００μＬ−１００μＬ
（ii）分析法：２ポイントエンド法（測光ポイント１９−３４）
（iii）測定波長：主波長５７０ｎｍ／副波長８００ｎｍ
（３）測定試料
（i）正常検体
女性血清を用いた。女性血中にＰＳＡはほとんど存在しないか、存在してもごく微量であることから、陰性コントロールとして繁用される。
（ii）非特異反応検体
高値異常感度を示す女性血清を用いた。ＰＳＡは男性に特異的な抗原で、女性血清には本来見出されないものであるので、女性血清で高値異常感度を示すものは、ＰＳＡ含量とは無関係にラテックス凝集が惹起された非特異反応の結果と考えられる。具体的には、市販血清（Ｓｅｒｕｍ  ｆｒｏｍ  Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ−Ｆｒｅｅ  Ｗｈｏｌｅ  Ｂｌｏｏｄ、Ｎｏｒｍａｌ  Ｆｅｍａｌｅ、ＴＥＮＮＥＳＳＥＥ  ＢＬＯＯＤ  ＳＥＲＶＩＣＥＳ，ＩＮＣ．）の中から前記基本試薬と第二試薬との組み合わせにより、高い吸光度を示す女性血清をスクリーニングによって見出し、使用した。
（４）測定方法
第一試薬として基本試薬、本発明試薬および対照試薬、第二試薬としてナノピア（登録商標）ＰＳＡ  ＰＳＡラテックス試液第２液を使用して、日立７１７０形自動分析装置で正常検体ならびに非特異反応検体を測定し感度を確認した。
（５）測定結果
図４に示す正常検体の測定においては、本発明試薬、対照試薬ともに抗ヒト免疫グロブリンＭ抗体や異好性阻止試薬ＨＢＲの添加濃度に関わらず感度変化が認められないことから、検体中にPSAが存在せず、また抗ヒト免疫グロブリンＭ抗体やＨＢＲの添加が測定感度には一切影響を与えないことがわかる。一方、図５に示す非特異反応検体の測定においては、添加物ゼロの基本試薬で１５０ｍＡｂｓ以上の異常値が確認され、対照試薬である抗ヒト免疫グロブリンＭヤギポリクローナル抗体では１００μｇ／ｍＬの添加まで顕著な抑制効果は認められず、抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体を成分とする市販の異好性阻止試薬ＨＢＲの添加では阻止どころか、わずかではあるが感度の増加が認められる。
抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体ｔを添加した本発明の試薬では、２５μｇ／ｍＬの添加で顕著な異常値の低下が認められ、５０μｇ／ｍＬの添加でほぼ完全に非特異反応が抑制されている。本発明の測定方法は、非特異反応阻止の目的で用いられた従来型の抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体や、抗ヒト免疫グロブリンＭポリクローナル抗体といった対策法では阻止できないヒト免疫グロブリンＭに起因する非特異反応に対して、強い抑制効果を示すことが確認できた。
【００３６】
〔実施例３〕非特異反応抑制効果の確認「２」（ＣＲＰ測定用ラテックス試薬において）
抗ＣＲＰモノクローナル抗体を利用したＣＲＰ測定用ラテックス試薬で確認された、非特異反応に対する本発明の抑制効果を、汎用自動分析装置を利用した測定で確認した。ＣＲＰは、非特異的な炎症マーカーとしてよく知られている。
（１）試薬
（１−１）第一試薬
（i）基本試薬
５００ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）
（ii）本発明試薬
基本試薬に１種類でヒト免疫グロブリンＭとの間で抗原抗体反応に基づく免疫凝集を形成できる抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体ｔ溶液を抗体の最終濃度５０μｇ／ｍＬになるように添加した試薬
（iii）対照試薬
基本試薬に受身型の非特異反応抑制効果を示すノーマルマウスＩｇＧまたは市販の異好性阻止試薬ＨＢＲを５０μｇ／ｍＬ添加した試薬
（１−２）第二試薬
ＳＳタイプ  ピュアオート（登録商標）Ｓ  ＣＲＰラテックス ラテックス試液第２液（積水メディカル株式会社）
（１−３）キャリブレーター
ＳＳタイプ  ピュアオート（登録商標）Ｓ  ＣＲＰラテックス  キャリブレーター（積水メディカル株式会社）
（２）測定装置
日立７１７０形自動分析装置： 
パラメータ条件
（i）検体−第一試薬−第二試薬の量：３μＬ−１５０μＬ−５０μＬ
（ii）分析法：２ポイントエンド法（測光ポイント１９−３４）
（iii）測定波長：主波長５７０ｎｍ／副波長８００ｎｍ
（iv）キャリブレーション：スプライン
（３）測定試料
非特異反応検体１：一般血清から見出された高値異常検体
非特異反応検体２：一般血清から見出された高値異常検体
（４）測定方法
第一試薬として基本試薬、本願発明試薬および対照試薬、第二試薬としてＳＳタイプ  ピュアオート（登録商標）Ｓ  ＣＲＰラテックス ラテックス試液第２液を使用して、日立７１７０形自動分析装置で非特異反応検体を測定し測定値を確認した。
（５）測定結果
表２に示すように非特異反応検体１，２の正常測定値（ウサギポリクローナル抗体を利用した他社ラテックス試薬で確認した参考値。製品名：ＣＲＰ-ラテックス（ＩＩ）「生研」Ｘ２  デンカ生研社）に対して、基本試薬における測定値はそれぞれ５〜10倍の高値となる。ノーマルマウスＩｇＧ５０μｇ／ｍＬを添加した対照試薬では、非特異反応検体１で測定値の改善が認められ、非特異反応検体２では改善が認められない。したがって、非特異反応検体１は異好性抗体いわゆるＨＡＭＡ検体であることがわかる。異好性阻止試薬ＨＢＲを５０μｇ／ｍＬ添加した対照試薬においては、非特異反応検体１，２ともに測定値が正常測定値レベルまで低下し、改善が認められる。抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体ｔを添加した本発明試薬においても、非特異反応検体１，２ともに測定値が改善し、その効果は異好性阻止試薬ＨＢＲよりも強い。本願発明の測定方法は、異好性阻止試薬ＨＢＲが強い阻止効果を示すような従来型の非特異反応に対しても、同等以上に強い抑制効果を示すことが確認できる。
【００３７】
【表２】
0005570391.tif 000003
【００３８】
〔実施例４〕非特異反応抑制効果の確認「３」（インスリン測定用ラテックス試薬において）
本発明の非特異抑制剤の効果をインスリン測定用ラテックス試薬においても確認を行った。
（１）抗インスリンマウスモノクローナル抗体の取得
ヒトインスリン（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製 ３０−ＡＩ５１）を免疫原として、通常のモノクローナル抗体の取得方法により、抗原認識部位の異なる２種の抗インスリンマウスモノクローナル抗体を取得し、社内管理番号６６２２１、６６４１２とした（以下、それぞれ６６２２１抗体、６６４１２抗体という）。
（２）ラテックス粒子の作製
攪拌機、還流用冷却器、温度検出器、窒素導入管及びジャケットを備えたガラス製反応容器（容量２Ｌ）に、蒸留水１１００ｇ、スチレン２００ｇ、スチレンスルホン酸ナトリウム０．２ｇ、及び、蒸留水５０ｇに過硫酸カリウム１．５ｇを溶解した水溶液を仕込み、容器内を窒素ガスで置換した後、７０℃で攪拌しながら４８時間重合した。重合終了後、上記溶液をろ紙にてろ過処理し、ラテックス粒子を取り出した。得られたラテックス粒子の粒子径を透過型電子顕微鏡装置（日本電子社製、「ＪＥＭ−１０１０型」）を用いて１００００倍の倍率でラテックス粒子を撮影し、最低１００個以上の粒子について画像解析することにより平均粒子径を測定した。得られた平均粒子径は０．３μｍであった。
（３）抗インスリンモノクローナル抗体感作ラテックス溶液の調製
１）６６２２１抗体感作ラテックス粒子溶液の作製
平均粒子径０．３μｍの１．０％ラテックス溶液（５ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ８．５）に、０．６０ｍｇ／ｍＬ６６２２１抗体（５ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ８．５））を等量添加して４℃で２時間攪拌した。その後、等量の０．５％ＢＳＡを含む５ｍＭ  トリス緩衝液  （ｐＨ８．５）を添加して４℃で１時間攪拌した。次に、これを遠心して上清を除去後、沈殿を５ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ８．５）で再懸濁して、６６２２１抗体感作ラテックス溶液とした。
２）６６４１２抗体感作ラテックス粒子溶液の作製
６６４１２抗体を用いて上記１）と同じ方法により６６４１２抗体感作ラテックス粒子溶液を作製した。
（４）試薬
１）第一試薬の調製
（i）基本試薬
５００ｍＭ塩化ナトリウム、０．２％  ＢＳＡを含む５ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ８．５）
（ii）本発明試薬
基本試薬に、モノクローナル抗体ｔ溶液を抗体の最終濃度が５０μｇ／ｍＬになるように添加した試薬
（iii）対照試薬
本発明のモノクローナル抗体ｔの代わりに市販の異好性阻止試薬ＨＢＲを抗体の最終濃度５０μｇ／ｍＬになるように添加した試薬
２）第二試薬の調製
６６２２１抗体感作ラテックス粒子溶液及び６６４１２抗体感作ラテックス粒子溶液を等量混合し、５ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ８．５）で波長６００ｎｍでの吸光度が５．０Ａｂｓとなるように希釈して第二試薬とした。
（５）試料 
糖負荷試験後採取された血清検体を試料とした。
（６）測定方法
（i）本発明試薬及び対照試薬の測定
第一試薬と第二試薬を組合せ、日立７１７０形自動分析装置を用いて、試料中のインスリン濃度を測定した。具体的には、試料１０μLに第一試薬１５０μLを加えて37℃で5分間保温した後、第二試薬５０μLを加えて攪拌した。凝集形成に伴う吸光度変化を、その後５分間にわたり、主波長５７０nm、副波長８００nmで測定し、その吸光度変化量を濃度既知の標準物質を測定して得られる検量線にあてはめ、インスリン濃度を算出した。
（ii）基準試薬の測定
試料中のインスリン濃度をルミパルス(登録商標)インシュリンーＮ (富士レビオ社製) を用いて、添付文書及びメーカー推奨の方法に従って測定した。このインスリンの測定値と上記本発明試薬または対照試薬との相関を図６に示す。
（７）測定結果及び考察
図６の相関図において、対照試薬（ＨＢＲ）を用いた試験の相関図において乖離検体が認められるのに対し、本発明試薬を用いた本実施例では乖離が抑制され、ルミパルス(登録商標)インシュリンーＮと良好な相関効果が認められた。以上より、インスリン測定においても本発明試薬は、市販の異好性阻止試薬ＨＢＲで抑制できない非特異反応を抑制することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明のモノクローナル抗体は、溶液状態における凝集反応性の強さを指標に選択されるため、ヒト免疫グロブリンＭと効率的に反応し、より正確で安定したヒト免疫グロブリンＭの免疫凝集測定方法が可能となる。
また、本発明のモノクローナル抗体により、高品質で安価なヒト免疫グロブリンＭの免疫凝集測定試薬及び測定キットを提供する。
本発明の非特異反応の抑制剤、これを用いた免疫学的測定方法、免疫学的測定用試薬及び測定キットでは、ＨＡＭＡなどに起因する従来型の非特異反応に加えて、既知の対策で回避できなかった非特異反応に関しても、ヒト免疫グロブリンＭに起因すると考えられる非特異反応であれば、測定項目に関わらず抑制することができるため、これまでの測定法よりも正確な測定値を与える。
【受託番号】
【００４０】
〔寄託された微生物への言及〕
イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566）
ロ  イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成２０年９月１９日（原寄託日）
平成２１年６月９日（原寄託によりブタペスト条約に基づく寄託への移管日）
ハ  イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１３４
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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