(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
二糖分析によって決定されるΔＤｉ−ｄｉＳＥの含有率が３０〜１００％であるコンドロイチン硫酸を有効成分とする、神経細胞のインビトロ用細胞死抑制試薬。
【請求項２】
コンドロイチン硫酸Ｅを有効成分とする、神経細胞のインビトロ用細胞死抑制試薬。
【請求項３】
細胞死が、興奮性アミノ酸受容体を介して惹起される細胞死である、請求項１又は２に記載のインビトロ用細胞死抑制試薬。
【請求項４】
興奮性アミノ酸受容体を介して惹起される細胞死が、下記群から選択される１又は２以上の物質によって惹起される細胞死である、請求項３に記載のインビトロ用細胞死抑制試薬；
Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸、カイニン酸、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソオキサゾールプロピオン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸。
【請求項５】
細胞死がアポトーシスである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のインビトロ用細胞死抑制試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コンドロイチン硫酸を有効成分とする神経細胞の細胞死抑制剤、これを用いた細胞死抑制方法及び細胞死耐性を獲得した神経細胞の製造方法、及び上記製造方法によって製造される神経細胞等、並びにコンドロイチン硫酸を有効成分とする神経細胞の保護剤、及びこれを用いた保護方法、並びに上記細胞死抑制剤又は神経細胞の保護剤を応用した組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
以下に、本明細書において用いる略号を示す。
ＮＭＤＡ：Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸
ＡＭＰＡ：α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソオキサゾールプロピオン酸
ＫＡ：カイニン酸
従来より、グルタミン酸及びアスパラギン酸等の興奮性アミノ酸によって、神経細胞のの細胞死が引き起こされることが知られており、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンが興奮性アミノ酸による神経細胞の細胞死を抑制することについても知られている（非特許文献１等）。しかしながら、コンドロイチン硫酸Ｅが神経細胞の細胞死を抑制する効果については知られていない。
【０００３】
一方、例えば脳性麻痺等の周生期脳障害においては、仮死や脳出血後における興奮性アミノ酸の放出による神経細胞の細胞死が原因の一つであることも知られている（非特許文献２等）。
【０００４】
【非特許文献１】オカモト  Ｍら、ニューロサイエンス・レターズ、１９９４年、第１７２巻、ｐ．５１−５４
【非特許文献２】ジョンストン  ＭＶら、ブレイン・パソロジー、２００５年、第１５巻、第３号、ｐ．２３４−２４０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、神経細胞の細胞死を効果的に抑制するために用いることができる神経細胞の細胞死抑制剤、及び当該細胞死抑制剤を用いた細胞死抑制方法、並びに、上記の細胞死抑制剤を応用することにより細胞死耐性を獲得した神経細胞及びその製造方法を提供すること等を課題とする。また本発明は、神経細胞を変性及び変質等から保護するために用いることができる神経細胞の保護剤、及び当該保護剤を用いた神経細胞の保護方法を提供すること等を課題とする。また本発明は、上記の神経細胞の細胞死抑制剤又は保護剤を応用した組成物を提供すること等を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、コンドロイチン硫酸Ｅが神経細胞の細胞死を抑制する効果を有し、神経細胞の細胞死抑制剤の有効成分として非常に好適であること等を見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は下記のものを提供する。
（１）二糖分析によって決定されるΔＤｉ−ｄｉＳＥの含有率が３０〜１００％であるコンドロイチン硫酸を有効成分とする、神経細胞の細胞死抑制剤。
（２）コンドロイチン硫酸Ｅを有効成分とする、神経細胞の細胞死抑制剤。
【０００７】
（以下、上記（１）及び（２）をまとめて「本発明細胞死抑制剤」ということがある。）
（３）細胞死が、興奮性アミノ酸受容体を介して惹起される細胞死である、上記（１）又は（２）に記載の細胞死抑制剤。
（４）興奮性アミノ酸受容体を介して惹起される細胞死が、下記群から選択される１又は２以上の物質によって惹起される細胞死である、上記（３）に記載の細胞死抑制剤；
ＮＭＤＡ、ＫＡ、ＡＭＰＡ、グルタミン酸、アスパラギン酸。
（５）細胞死がアポトーシスである、上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載の細胞死抑制剤。
（６）神経細胞に上記（１）〜（５）のいずれか１つに記載の細胞死抑制剤を接触させるステップを少なくとも含む、神経細胞の細胞死抑制方法（以下、「本発明細胞死抑制方法」という）。
（７）神経細胞に上記（１）〜（５）のいずれか１つに記載の細胞死抑制剤を接触させるステップを少なくとも含む、細胞死耐性を獲得した神経細胞の製造方法（以下、「本発明神経細胞製造方法」という）。
（８）上記（７）に記載の製造方法によって製造される、細胞死耐性を獲得した神経細胞（以下、「本発明神経細胞」という）。
【０００８】
さらに本発明は、下記のものをも提供する。
（９）神経細胞と、上記（１）〜（５）のいずれか１つに記載の細胞死抑制剤とを有効成分として少なくとも含む組成物（以下、「本発明組成物１」という）。
（１０）二糖分析によって決定されるΔＤｉ−ｄｉＳＥの含有率が３０〜１００％であるコンドロイチン硫酸を有効成分とする、神経細胞の保護剤。
（１１）コンドロイチン硫酸Ｅを有効成分とする、神経細胞の保護剤。
（以下、上記（１０）及び（１１）をまとめて「本発明保護剤」ということがある。）
（１２）神経細胞に上記（１０）又は（１１）に記載の保護剤を接触させるステップを少なくとも含む、神経細胞の保護方法（以下、「本発明保護方法」という）。
（１３）神経細胞と、上記（１０）又は（１１）に記載の保護剤とを有効成分として少なくとも含む組成物（以下、「本発明組成物２」という）。
【発明の効果】
【０００９】
本発明細胞死抑制剤、本発明細胞死抑制方法、又は本発明組成物１によれば、神経細胞の細胞死を非常に効果的に、且つ簡便に抑制することができる。またこれらは、試薬、医薬、健康食品及び機能性食品等、並びにこれらの利用等において好適に用いることができる。また、本発明神経細胞は、細胞死耐性を獲得した神経細胞であることから、神経細胞の過剰な細胞死によって引き起こされる疾患又は障害の治療、改善、緩和又は予防等を目的とした移植用の細胞等として好適に用いることができる。また、本発明神経細胞製造方法によれば、本発明神経細胞を効率的且つ簡便に製造することができる。また本発明保護剤、本発明保護方法、又は本発明組成物２によれば、神経細胞を細胞死、変性及び変質等の原因となる刺激及び変化等から、非常に効果的に、且つ簡便に保護することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、発明を実施するための最良の形態により本発明を詳説する。
＜１＞ 本発明細胞死抑制剤
本発明細胞死抑制剤は、二糖分析によって決定されるΔＤｉ−ｄｉＳＥの含有率が３０〜１００％であるコンドロイチン硫酸を有効成分とする、神経細胞の細胞死抑制剤を提供する。
【００１１】
上記において二糖分析は、コンドロイチン硫酸に作用して不飽和二糖を生成させる酵素を用いてコンドロイチン硫酸を酵素処理し、該コンドロイチン硫酸の構成二糖を反映して生成する不飽和二糖を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、同定及び定量することを意味する。
【００１２】
上記の酵素としては、最終的に不飽和二糖まで分解できる限りにおいて特に限定されないが、例えばコンドロイチナーゼを用いることができる。
【００１３】
上記のＨＰＬＣによる方法は、当業者には公知の方法であり、コンドロイチン硫酸を酵素処理して得た不飽和二糖の溶出位置を、標準不飽和二糖の溶出位置と比較することにより行うことができる。ＨＰＬＣの溶出位置は、通常紫外部（例えば波長２３２nm）の吸収によりモニターし、各二糖単位のコンドロイチン硫酸中での含量は、その溶出パターンの積分値（面積）を濃度既知の標準不飽和二糖の溶出パターンの積分値（面積）と比較することにより求めることができる。
【００１４】
近接する溶出位置をもつΔＤｉ−ＵＡ２Ｓ〔2-acetamido-2-deoxy-3-O-(2-O-sulfo- β-D-gluco-4-enopyranosyluronic acid)-D-galactose 〕、ΔＤｉ−４Ｓ及びΔＤｉ−６Ｓの区別、並びに、ΔＤｉ−ｄｉＳＢ 〔2-acetamido-2-deoxy-3-O-(2-O-sulfo- β-D-gluco-4-enopyranosyluronic acid)-4-O-sulfo-D-galactose 〕及びΔＤｉ−ｄｉＳE の厳密な区別は、特異的なスルファターゼ（例えばコンドロ−６−スルファターゼ等）による消化により行うことができる。
【００１５】
すなわち、例えば不飽和二糖をコンドロ−６−スルファターゼにより処理した結果、ＨＰＬＣの溶出位置がΔＤｉ−４Ｓの位置にシフトした分がΔＤｉ−ｄｉＳＥであると同定される。また、溶出位置が近接する不飽和二糖同士の分離が可能なカラム（例えば、ゾルバックス SAX(Zorbax SAX)カラム；Rockland Technologies 社製等）を用いて、これら不飽和二糖を厳密に区別することが可能である。
【００１６】
なお、グルコサミノグリカン中のＤ−グルクロン酸残基の１位とＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基の４, ６−二硫酸化物の３位とがグリコシド結合した構造、及びＬ−イズロン酸残基の１位とＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基の４, ６−二硫酸化物の３位とがグリコシド結合した構造は、二糖分析においてはいずれもΔＤｉ−ｄｉＳＥ として検出される。
【００１７】
なお、より具体的な二糖分析の方法については、後述する製造例を参照されたい。
【００１８】
上記の本発明細胞死抑制剤における有効成分のコンドロイチン硫酸は、二糖分析によって決定されるΔＤｉ−ｄｉＳＥの含有率が３０〜１００％であることを特徴としている。
【００１９】
このようなコンドロイチン硫酸は、上記の二糖分析における特徴を有している限りにおいて、その起源等によって特に限定されるものではなく、天然から得られるコンドロイチン硫酸及び天然から得られるコンドロイチン硫酸を化学的又は酵素的に改変したコンドロイチン硫酸（以下、「半合成コンドロイチン硫酸」と記載することがある）のいずれであってもよい。
【００２０】
本発明細胞死抑制剤の有効成分としては、コンドロイチン硫酸Ｅを用いることが最も好ましい。
【００２１】
すなわち、本発明細胞死抑制剤は、コンドロイチン硫酸Ｅを有効成分とする、神経細胞の細胞死抑制剤を提供する。
【００２２】
コンドロイチン硫酸Ｅは、例えば、イカやナマコ等に例示される当該コンドロイチン硫酸Ｅを含む原料から、物理的抽出法、酵素抽出法、有機溶媒分画法、イオン交換樹脂分画法に例示される通常の方法を、単独で、又は組み合わせて採用することにより、抽出・精製して得ることができる。
【００２３】
なお、原料としてイカを用いる場合、イカの軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ｅを用いることが好ましく、マイカ及び／又はアカイカの軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ｅを用いることがより好ましい。なお、イカ軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ｅは、生化学工業株式会社より市販されており、本発明においてはこのような市販のコンドロイチン硫酸を用いることもできる。
【００２４】
一方、二糖分析によって決定されるΔＤｉ−ｄｉＳＥの含有率が３０〜１００％である半合成コンドロイチン硫酸の具体例としては、例えばガラクトサミン６位硫酸化コンドロイチン硫酸Ｅ及びガラクトサミン６位硫酸化コンドロイチン硫酸Ａが例示される。
【００２５】
ガラクトサミン６位硫酸化コンドロイチン硫酸Ｅは、例えば上述したようなコンドロイチン硫酸Ｅを出発物質として、またガラクトサミン６位硫酸化コンドロイチン硫酸Ａはコンドロイチン硫酸Ａを出発物質として用い、ガラクトサミンの６位を特異的に硫酸化することにより得ることができる。ガラクトサミンの６位を特異的に硫酸化する方法としては、例えば特公平６−９９４８５号公報や K. Nagasawa, H. Uchiyama, N. Wajima, Carbohydr. Res., 158, 183 (1986)に記載の方法を挙げることができる。この方法は、ヘキソサミン残基の４位が硫酸化されているコンドロイチン硫酸の塩を、極性有機溶媒中で硫酸化試薬と反応させることによりヘキソサミン残基の６位を特異的に硫酸化するという方法である。この反応に用いることのできる極性有機溶媒は、反応に影響しないものであればどのような溶媒でもよく、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、ピリジン、トリメチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などを挙げることができる。硫酸化試薬は、例えばピリジン−ＳＯ3複合体、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド−ＳＯ3 複合体、トリメチル（又はトリエチル）アミン−ＳＯ3 複合体等を用いることができる。硫酸化反応の反応温度は、−１０〜３０℃、好ましくは０〜１０℃である。反応時間は、３０分間〜５時間であり、好ましくは１時間〜２時間である。反応により得られるコンドロイチン硫酸は、通常の分離方法によって反応混合物から単離することができ、必要により精製することができる。
【００２６】
また近年、コンドロイチンやコンドロイチン硫酸のＮ−アセチルガラクトサミン残基の６位に選択的に硫酸基を転移する酵素である「コンドロイチン  ６−スルホトランスフェラーゼ」が精製されており（J. Biol. Chem. 268(29), 21968-21974 (1993)）、このスルホトランスフェラーゼを用いて、酵素的に６位に選択的に硫酸基を導入する方法によっても上記コンドロイチン硫酸を調製することができる。
上述のコンドロイチン硫酸Ｅ及び半合成コンドロイチン硫酸の調製方法/入手方法は例示のためのものであり、最終的に本発明細胞死抑制剤の有効成分のコンドロイチン硫酸が得られる限り、調製方法は特に限定されない。
【００２７】
以下、コンドロイチン硫酸Ｅ及び半合成コンドロイチン硫酸の具体的な製造例と分析結果を例示する。
製造例１：マイカ軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ｅの製造
マイカより採取した軟骨２４０ｇを細断し、２０分間煮沸した後、水２４０mlとアクチナーゼ（科研製薬株式会社製）２．４ｇで、pH７．５、５５℃の条件下で一晩抽出した。この抽出液に炭酸ナトリウム１．２ｇを添加して、pH１０．５、５０℃の条件下で１時間攪拌した後、ろ過し、ろ液を２００mlまでに濃縮した。この濃縮溶液を０．５N ＮａＯＨ水溶液及び０．２％ＮａＨＳＯ3 水溶液により３５℃で２時間アルカリ処理した後、エタノール２００ml、エタノール＋３％酢酸ナトリウム（pH４．８）２００ml、エタノール＋３％酢酸ナトリウム（pH４．８）２４０mlで３回分画し、その溶液を、レジンＨＰＡ−１１Ｍ（三菱化成株式会社（現三菱化学株式会社）製）に吸着させた。塩化ナトリウム濃度を３．７M にしたときの溶出液を濃縮、ろ過し、純水に対して透析したものを２００mlまで濃縮した。この濃縮溶液に活性炭０．５ｇを加え、pH４．８、５０℃条件下で１時間攪拌した。その後、ろ過、精密ろ過を行い、４倍量のエタノールを加えて得た沈殿物を乾燥し、コンドロイチン硫酸Ｅロット１（マイカ軟骨由来）を得た。
【００２８】
また上記と同様の方法で、マイカより採取した別のロットの軟骨から、コンドロイチン硫酸Ｅロット２（マイカ軟骨由来）を得た。
製造例２：アカイカ軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ｅの製造
製造例１と同様の方法で、アカイカより採取した軟骨から、コンドロイチン硫酸Ｅ（アカイカ軟骨由来）を調製した。
製造例３：アカイカ軟骨由来のガラクトサミン６位硫酸化コンドロイチン硫酸Ｅの製造
製造例２で調製したアカイカ軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ｅのガラクトサミン残基の６位の特異的硫酸化を、後述する製造例４と同様に行い、ガラクトサミン６位硫酸化コンドロイチン硫酸Ｅ（アカイカ軟骨由来）を得た。
製造例４：チョウザメ脊索由来のガラクトサミン６位硫酸化コンドロイチン硫酸Ａの製造
チョウザメ脊索由来のコンドロイチン硫酸Ａ（平均分子量：１万、生化学工業株式会製）３ｇを水１５０mlに溶解し、６℃でDowex ５０〔Ｈ+ 〕カラム（ダウケミカル製）でイオン交換した後、１０％トリ−ｎ−ブチルアミン／エタノールでpH５．０に調整し、ジエチルエーテル３００mlで２回洗浄した。２０℃で減圧下でエーテルを留去した後、水層を凍結乾燥し、さらに五酸化リン存在下に減圧乾燥してコンドロイチン硫酸Ａのトリ−ｎ−ブチルアミン塩を調製した。この塩をＤＭＦ３００mlに溶解した後に、０℃でピリジン−ＳＯ3 複合体（アルドリッチ社製）７．５ｇ／ＤＭＦ１００mlをゆっくり滴下し、１時間攪拌して硫酸化した。水１００mlを添加して反応を止め、０．１N ＮａＯＨ水溶液でpH９．０に調整した後、流水で透析し、４０℃下、エバポレーターで濃縮し、イオン交換（ＳＡ−１２Ａ（三菱化学株式会社製）：１５０ml及びＰＫ−２２０（三菱化学株式会社製）：１５０ml）に付した。１N ＮａＯＨ水溶液で中和した後、４０℃下、エバポレーターで濃縮し、５％になるように酢酸ナトリウムを加え、５倍量のエタノールを加えて得た沈殿物を乾燥し、ガラクトサミン６位硫酸化コンドロイチン硫酸Ａ（チョウザメ脊索由来）を得た。
製造例５：クジラ軟骨由来のガラクトサミン６位硫酸化コンドロイチン硫酸Ａの製造
クジラ軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ａ（平均分子量：２万５千〜５万、生化学工業株式会社製）を上記製造例４と同様に処理し、ガラクトサミン６位硫酸化コンドロイチン硫酸Ａロット１（クジラ軟骨由来）を得た。
【００２９】
また、クジラより採取した別のロットの軟骨から、上記と同様の方法でガラクトサミン６位硫酸化コンドロイチン硫酸Ａロット２（クジラ軟骨由来）を調製した。
【００３０】
上記で製造したコンドロイチン硫酸Ｅ及び半合成コンドロイチン硫酸について、コンドロイチン硫酸Ａ及びコンドロイチン硫酸Ｃの標準標品をスタンダードとしたゲル浸透クロマトグラフィー(gel permeation chromatography；以下、「ＧＰＣ」とする) を用いた光散乱法によって求めた分子量、及び硫黄含量の測定結果を下記表１に、また、二糖分析の測定結果を下記表２に示す。
【００３１】
【表１】
0005622346.tif 000002
【００３２】
【表２】
0005622346.tif 000003
表２中で、「N.D.」は検出限界以下であることを示す。また、表２中で０Ｓ、４Ｓ、６Ｓ、ｄｉＳＤ、ｄｉＳＥ及びｔｒｉＳは、コンドロイチナーゼＡＢＣ（リアーゼの一種）処理により生成した後述の式（１）の不飽和二糖を表し、その硫酸基組成と共に下記表３に示す。
【００３３】
【表３】
0005622346.tif 000004
本発明細胞死抑制剤の有効成分のコンドロイチン硫酸は、その薬学上許容しうる塩であってもよい。例えば、アルカリ金属塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との間で形成された塩又はジエタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基との塩のうち、薬学上許容しうる塩を本発明において用いることができる。
【００３４】
本発明細胞死抑制剤の有効成分のコンドロイチン硫酸の分子量は、特に限定されないが、より効果的な神経細胞の細胞死抑制効果を得ることが期待されるといった観点から、平均分子量が５ｋＤａ〜１５０ｋＤａのコンドロイチン硫酸を用いることが好ましく、５ｋＤａ〜１００ｋＤａのコンドロイチン硫酸を用いることがより好ましく、５ｋＤａ〜７５ｋＤａのコンドロイチン硫酸を用いることが極めて好ましく、２５ｋＤａ〜７５ｋＤａのコンドロイチン硫酸を用いることが最も好ましい。
【００３５】
なおコンドロイチン硫酸の平均分子量は、同一試料でも測定方法や測定条件等によって多少異なることは当業者にとって常識であり、本発明細胞死抑制剤の有効成分のコンドロイチン硫酸は、上記平均分子量の範囲のものに厳密に限定されるべきものではない。
【００３６】
本発明細胞死抑制剤は、神経細胞の細胞死を抑制する目的で用いることができる。
【００３７】
上記の神経細胞は、その由来によって特に限定されるものではないが、具体的な由来としては、例えば大脳皮質（なかでも大脳新皮質、海馬等の大脳辺縁系皮質等）、間脳（なかでも視床、視床下部、大脳基底核等）、小脳、橋、延髄及び脊髄等の中枢神経系、又は体表、深部組織及び内臓器官等に分布する末梢神経系に例示される神経系を構成する組織又は器官等が例示されるが、なかでも中枢神経系を構成する組織又は器官等であることが好ましく、なかでも大脳皮質であることがより好ましい。また、神経細胞は、例えばヒト由来の胚性幹細胞等の幹細胞を分化させて得られるものであってもよい。
【００３８】
神経細胞は、その存在形態によって特に限定されるものではなく、例えば上記の神経系を構成する器官又は組織等の一部分として存在するものであってもよく、当該器官又は組織等から分離又は単離された細胞として存在するものであってもよいが、後者であることが好ましい。また、神経細胞は例えば生物体内に存在するものであってもよく、生物体外に摘出、分離又は単離されたものであってもよいが、後者であることが好ましい。生物体外に摘出、分離又は単離され、且つ神経系を構成する器官又は組織等から分離又は単離された神経細胞としては、例えば大脳皮質を由来として分離、培養して得られる神経細胞が好ましいものとして例示される。当該神経細胞のより具体的な入手方法等については、後述する実施例を参照されたい。
【００３９】
上記において生物体は、その種類によって特に限定されるものではないが、例えばヒト、マウス、ラット、ブタ、ウマ、イヌ及びネコ等に例示される動物であることが好ましく、なかでもヒトであることがより好ましい。また上記の生物体は、その生死状態によっても特に限定されるものではなく、生存状態、死亡状態、仮死状態及び脳死状態等に例示されるいずれの状態であってもよい。また上記の生物体は、その年齢等によっても特に限定されるものではないが、例えば胎児であることが好ましい。
【００４０】
また、神経細胞はその種類も特に限定されるものではないが、例えば興奮性神経細胞であることが好ましい。
【００４１】
上記の細胞死の種類は特に限定されず、壊死（necrosis）であってもよく、プログラムされた細胞死（programmed cell death）であってもよいが、プログラムされた細胞死であることが好ましく、なかでもアポトーシスであることがより好ましい。
【００４２】
また、上記の細胞死が惹起されるメカニズムについても特に限定されないが、本発明細胞死抑制剤は、例えばグルタミン酸、アスパラギン酸、ＮＭＤＡ、ＫＡ又はＡＭＰＡに例示される興奮性アミノ酸等に対する受容体である、興奮性アミノ酸受容体を介して惹起される神経細胞の細胞死を抑制する目的で好適に用いることができる。
【００４３】
また、細胞死がアポトーシスである場合、本発明細胞死抑制剤はカスパーゼ３の活性を抑制することにより、細胞死を抑制する効果を発揮することが好ましい。したがって本発明細胞死抑制剤は、「カスパーゼ３の活性抑制剤」なる概念をも包含する。
【００４４】
本発明細胞死抑制剤は、神経細胞の細胞死を抑制する目的で用いられる限りにおいて、その使用方法によって限定されるものではない。よって、本発明細胞死抑制剤を用いるタイミングは、神経細胞の細胞死を抑制する効果が期待されるタイミングである限りにおいて特に限定されず、神経細胞の細胞死が誘発される前のタイミングで本発明細胞死抑制剤を当該神経細胞に接触させてもよく、神経細胞の細胞死が誘発された後のタイミングで本発明細胞死抑制剤を当該神経細胞に接触させてもよく、上記の両方のタイミングで本発明細胞死抑制剤を当該神経細胞に接触させてもよいが、神経細胞の細胞死が誘発される前のタイミングで本発明細胞死抑制剤を当該神経細胞に接触させることが、細胞死が誘発される前の段階において神経細胞に細胞死に対する耐性を獲得させておくことにより、細胞死を効果的に予防することが期待されるといった観点から好ましいといえる。なお、本明細書においては、細胞死に対する耐性を、単に「細胞死耐性」と記載することがある。
【００４５】
上記において「誘発」とは、神経細胞の細胞死の原因となり得る現象が起こることを意味するが、このような現象としては、例えばグルタミン酸、ＮＭＤＡ、ＫＡ及びＡＭＰＡ等の興奮性アミノ酸の増加等が例示される。
以上に説明した様に、本発明細胞死抑制剤は、神経細胞に細胞死耐性を獲得させるために用いられる「耐性付与剤」、及び神経細胞の「細胞死予防剤」の概念をも包含する。
本発明細胞死抑制剤を当該神経細胞に接触させる方法は、本発明細胞死抑制剤の有効成分のコンドロイチン硫酸の分子と神経細胞とが接触する条件である限りにおいて限定されない。接触を行う時間としては、好ましくは１〜４８時間が例示され、より好ましくは３〜２４時間が例示される。また接触を行う際の温度についても特に限定されないが、２０℃〜４０℃であることが好ましく、３７℃であることがより好ましい。
【００４６】
本発明細胞死抑制剤は、神経細胞の細胞死を抑制する目的で用いられる限りにおいて、その品目等によっても限定されるものではないが、具体的な品目としては、例えば試薬、医薬、健康食品及び機能性食品等が例示される。以下、上記の各品目について、その使用目的、使用方法及び使用形態等の詳細について具体例を示すが、これらはあくまでも例示であり、本発明細胞死抑制剤はこれらによって限定的に解釈されるべきものではない。
【００４７】
本発明細胞死抑制剤を試薬として用いる場合、インビトロにおいて用いてもよく、インビボにおいて用いてもよい。
当該試薬をインビトロで用いる場合、例えば神経細胞に細胞死耐性を獲得させる目的で、細胞死が誘発される前の神経細胞に接触させることにより用いることができる。この様にして得られる細胞死耐性を獲得した細胞は、神経細胞の細胞死が関連する疾患又は障害、好ましくは神経細胞の過剰な細胞死によって引き起こされる疾患又は障害の治療、改善、緩和又は予防等を目的とした移植のために用いられる神経細胞として、好適に用いることができる。このような疾患又は障害の具体例としては、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳性麻痺等の周生期脳障害、脳梗塞、仮死、脳出血及び脳の物理的損傷に伴う疾患又は障害等が挙げられる。当該神経細胞及びその製造方法等については、後述する＜３＞本発明神経細胞製造方法及び＜４＞本発明神経細胞における説明を参照されたい。
【００４８】
上記試薬をインビボで用いる場合、例えばマウス、ラット、ブタ、ウマ、イヌ及びネコ等に例示される動物の脳室内、又は脳脊髄液腔内等に例示される部位に、当該試薬を投与することにより用いることができる。投与の方法については特に限定されないが、具体的には後述する本発明細胞死抑制剤を医薬として用いる場合における説明を参照されたい。
【００４９】
本発明細胞死抑制剤を医薬として用いる場合、例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、脳性麻痺等の周生期脳障害、脳梗塞、仮死、脳出血及び脳の物理的損傷に伴う疾患又は障害等に例示される、神経細胞の細胞死によって引き起こされる疾患又は障害、より好ましくは神経細胞の過剰な細胞死によって引き起こされる疾患又は障害の治療、改善、緩和又は予防等を目的として用いることができる。
【００５０】
すなわち、本発明細胞死抑制剤は、上記のような疾患又は障害の「治療剤」、「改善剤」、「緩和剤」及び「予防剤」の概念をも包含する。
【００５１】
本発明細胞死抑制剤を医薬として用いる場合において、当該医薬はその投与対象によって特に限定されるものではないが、例えばヒト、ウマ、イヌ及びネコ等の動物を投与対象とすることが好ましい。
【００５２】
また、上記医薬は、その投与方法によっても特に限定されるものではないが、例えば注射、経口等の投与方法によって経口又は非経口的に投与することができるが、例えば脳室内注射及び脊髄液腔内注射に例示される注射によって投与することが好ましい。上記の投与方法は、対象となる疾患又は障害の性質や重篤度等に応じて、適宜選択することができる。
本発明細胞死抑制剤は、これらの投与方法に応じて適宜製剤化することができる。選択し得る剤型も特に限定されず、例えば注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等）、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、リポ化剤、軟膏剤、ゲル剤、スプレー剤、坐剤等から広く選択することができる。
【００５３】
また、これらの製剤調製にあたり慣用の賦形剤、結合剤、滑沢剤、その他着色剤、崩壊剤等通常医薬品の製剤上用いられる成分を配合することができる。さらに、本発明細胞死抑制剤には、有効成分のコンドロイチン硫酸以外の物質として、細胞死抑制作用を有する他の物質を有効成分として配合することもできる。
上述の「細胞死抑制作用を有する他の物質」は、本発明細胞死抑制剤の有効成分のコンドロイチン硫酸との組合せ配合又は組合せ投与により、重篤な副作用が惹起されない限りにおいて、また、一方の物質が他方の物質の本来有する細胞死抑制作用を阻害する物質ではない限りにおいて、特に限定されない。
【００５４】
本発明細胞死抑制剤の有効成分のコンドロイチン硫酸の配合量並びに本発明細胞死抑制剤の投与量は、その製剤の投与方法、投与形態、使用目的、患者の具体的症状、患者の体重等に応じて個別的に決定されるべき事項であり、特に限定はされないが、コンドロイチン硫酸の臨床投与量として１日当り約０．１mg/kg 〜３００mg/kg を例示することができる。また、上記製剤の投与間隔は１日１回程度でも可能であり、１日２〜４回、又はそれ以上の回数に分けて投与することもできる。また、例えば点滴等により連続的に投与することも可能である。
【００５５】
なお、後述する実施例においては、本発明細胞死抑制剤のコンドロイチン硫酸の毒性は確認されなかった。コンドロイチン硫酸ナトリウムは、マウス（♂、♀）及びラット（♂、♀）に対する毒性が低いことは知られている。またコンドロイチン硫酸Ｅは、抗トロンビン活性がヘパリンに比較して極めて弱いことが報告されている（J. Biol. Chem., 265(26), 15424-15431, 1990）。これらのことから、本発明細胞死抑制剤の有効成分のコンドロイチン硫酸の安全性は高いといえる。
【００５６】
上記の医薬によって神経細胞の細胞死が抑制されたか否かは、例えば下記の様にして判断することができる。すなわち、当該医薬を用いることにより、神経細胞の細胞死によって引き起こされる疾患又は障害が引き起こされる確率が低減した場合、上記疾患又は障害の程度が改善された場合、又は、公知の臨床学的方法により神経細胞の細胞死が抑制されたことが確認された場合等においては、神経細胞の細胞死が抑制されたと判断することができる。
【００５７】
本発明細胞死抑制剤を健康食品又は機能性食品として用いる場合においては、例えば神経細胞の細胞死が関連する疾患又は障害、好ましくは神経細胞の過剰な細胞死によって引き起こされる疾患又は障害の改善、緩和又は予防等を目的として用いることができる。
【００５８】
本発明細胞死抑制剤の形態は、その摂取方法に応じて適宜選択することができ、例えばタブレットに例示される固形、粉末、顆粒、ゼリー及び液体等に例示される形態を選択することができる。
【００５９】
摂取量についても特に限定されないが、例えば大人が摂取する場合、一日当たり有効成分の重量として、例えば約１００〜２０００ｍｇ摂取することが好ましく、約２００〜１０００ｍｇ摂取することがより好ましい。
【００６０】
健康食品又は機能性食品の調製にあたっては、慣用の食用成分を配合することができる。さらに、有効成分のコンドロイチン硫酸以外の物質として、細胞死抑制作用を有する他の食用成分を有効成分として配合することもできる。
【００６１】
上記の健康食品又は機能性食品によって神経細胞の細胞死が抑制されたか否かは、上述した医薬の場合と同様の方法により、判断することができる。
＜２＞ 本発明細胞死抑制方法
本発明細胞死抑制方法は、神経細胞に本発明細胞死抑制剤を接触させるステップを少なくとも含む、神経細胞の細胞死抑制方法である。
【００６２】
上記の「本発明細胞死抑制剤」及び「接触」に関する説明については、＜１＞本発明細胞死抑制方法における説明を参照されたい。
【００６３】
本発明細胞死抑制方法は、例えば本発明細胞死抑制剤を生物体外において神経細胞に接触させる場合、上記以外のステップとして、例えば神経細胞を含む器官又は組織等を生物体外に摘出するステップ、上記の器官又は組織等から神経細胞を分離又は単離するステップ、本発明細胞死抑制剤を接触させる前に分離又は単離された神経細胞を培養するステップ、本発明細胞死抑制剤を接触させた後の神経細胞を培養するステップ、神経細胞が細胞死耐性を獲得したか否か、又は細胞死抑制効果が得られたか否かを評価するステップ等に例示されるその他のステップを含んでいてもよい。
【００６４】
上記の培養における培養温度は特に限定されないが、好ましくは２０℃〜４０℃、より好ましくは３７℃において培養することが好ましい。
【００６５】
また、細胞死耐性を評価するステップについては、後述する＜３＞本発明神経細胞製造方法における説明を参照されたい。
【００６６】
一方、例えば本発明細胞死抑制剤を生物体内において神経細胞に接触させる場合、上記以外のステップとして、例えば本発明細胞死抑制剤を接触させる前に神経細胞を含む器官又は組織等を露出させるステップ、及び本発明細胞死抑制剤を接触させた後に上記露出を行った部位を処置するステップ、細胞死抑制効果が得られたか否かを評価するステップ等に例示されるその他のステップを含んでいてもよい。
【００６７】
本発明細胞死抑制方法は、これを行う目的等によって特に限定されるものではないが、例えば神経細胞に細胞死耐性を獲得させることを目的として、又は、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳性麻痺等の周生期脳障害、脳梗塞、仮死、脳出血及び脳の物理的損傷に伴う疾患又は障害等に例示される、神経細胞の細胞死によって引き起こされる疾患又は障害、より好ましくは神経細胞の過剰な細胞死によって引き起こされる疾患又は障害の治療、改善、緩和又は予防すること等を目的として好適に行うことができる。これらに関する説明ついては、＜１＞本発明細胞死抑制剤における説明を参照されたい。
【００６８】
なお、本発明細胞死抑制方法において、本発明細胞死抑制剤を生物体内において神経細胞に接触させる場合、当該生物体はヒトを除く動物であることが好ましい。
＜３＞ 本発明神経細胞製造方法
本発明神経細胞製造方法は、神経細胞に本発明細胞死抑制剤を接触させるステップを少なくとも含む、細胞死耐性を獲得した神経細胞の製造方法である。
【００６９】
上記において、「神経細胞」、「本発明細胞死抑制剤」、「接触」に関する説明については、＜１＞本発明細胞死抑制方法における説明を参照されたい。
【００７０】
また、本発明神経細胞製造方法は、上記以外のステップとして、例えば神経細胞を含む器官又は組織等を生物体外に摘出するステップ、上記の器官又は組織等から神経細胞を分離又は単離するステップ、本発明細胞死抑制剤を接触させる前に分離又は単離された神経細胞を培養するステップ、本発明細胞死抑制剤を接触させた後の神経細胞を培養するステップ、神経細胞が細胞死耐性を獲得したか否かを評価するステップ等に例示されるその他のステップを含んでいてもよい。
【００７１】
上記の培養における培養温度は特に限定されないが、好ましくは２０℃〜４０℃、より好ましくは３７℃において培養することが好ましい。
【００７２】
神経細胞が細胞死耐性を獲得したか否かは、例えば下記のようにして評価することができる。すなわち、まず本発明細胞死抑制剤を接触させた後の神経細胞と、本発明細胞死抑制剤を接触させてないコントロールの神経細胞に、それぞれＮＭＤＡ、ＫＡ、ＡＭＰＡに例示される興奮性アミノ酸を加えて細胞死を誘発する。細胞死の誘発後、約２４時間後に、細胞死の程度を乳酸脱水素酵素（以下、「ＬＤＨ」と略記する）の活性を測定することにより、又は生存細胞の指標であるＭＡＰ２陽性細胞の数をカウントすることにより評価する。ＬＤＨは一般に、細胞死によって細胞外に放出される。従って、培地中のＬＤＨ活性が高い程細胞死の程度が高く、当該活性が低い程細胞死の程度が低いと評価することができる。本発明細胞死抑制剤を用いた場合において、コントロールの場合と比較して、上記の様にして評価される神経細胞の細胞死の程度が低ければ、神経細胞が細胞死耐性を獲得したものと評価することができる。
【００７３】
本発明神経細胞製造方法によって製造される神経細胞については、後述する＜４＞本発明神経細胞を参照されたい。
＜４＞本発明神経細胞
本発明神経細胞は、本発明神経細胞製造方法によって製造される、細胞死耐性を獲得した神経細胞である。
【００７４】
本発明神経細胞製造方法については、上記＜３＞本発明神経細胞製造方法における説明を参照されたい。また、神経細胞が細胞死耐性を獲得したか否かについても、例えば上記＜３＞本発明神経細胞製造方法で例示した方法により確認することができる。
【００７５】
本発明神経細胞は、その使用目的及び使用方法等によって限定されるものではないが、
本発明神経細胞は、細胞死耐性を獲得した神経細胞であることから、例えば神経細胞の過剰な細胞死によって引き起こされる疾患又は障害の治療、改善、緩和又は予防等を目的とした移植用の細胞等として好適に用いることができる。
【００７６】
上記の移植において、本発明神経細胞が移植される部位については、特に限定されないが、例えば本発明神経細胞を、脳梗塞の治療、改善又は緩和等を目的とした移植用の細胞として用いる場合、梗塞部位に本発明神経細胞を移植することが好ましい。
＜５＞本発明組成物１
本発明組成物１は、神経細胞と、本発明細胞死抑制剤とを有効成分として少なくとも含む組成物である。
【００７７】
上記において、本発明細胞死抑制剤、及び「神経細胞」に関する説明ついては、上記＜１＞本発明細胞死抑制剤における説明を参照されたい。
【００７８】
本発明組成物１は、神経細胞及び本発明細胞死抑制剤以外の成分として、緩衝剤、保存剤等に例示されるその他の成分を含んでいてもよい。
【００７９】
本発明組成物１は、その使用目的及び使用方法等によって限定されるものではないが、例えば神経細胞の過剰な細胞死によって引き起こされる疾患又は障害の治療、改善、緩和又は予防等を目的とした細胞の移植のために用いられる組成物として好適に用いることができる。
【００８０】
発明組成物１のより具体的な使用方法については、上記＜４＞本発明神経細胞における「本発明神経細胞」なる用語を、「本発明組成物１」なる用語に置き換えた説明を参照することができる。
【００８１】
また上記の移植の方法についても、上記＜４＞本発明神経細胞における説明を参照されたい。
＜６＞本発明保護剤
本発明は、二糖分析によって決定されるΔＤｉ−ｄｉＳＥの含有率が３０〜１００％であるコンドロイチン硫酸を有効成分とする、神経細胞の保護剤を提供する。
【００８２】
また本発明は、コンドロイチン硫酸Ｅを有効成分とする、神経細胞の保護剤を提供する。
【００８３】
上記における、「二糖分析」及び「神経細胞」なる用語、並びに「ΔＤｉ−ｄｉＳＥの含有率が３０〜１００％であるコンドロイチン硫酸」に関する説明等については、＜１＞本発明細胞死抑制剤における説明を参照されたい。
【００８４】
本発明保護剤は、神経細胞を保護する目的として用いられるものである限り、その他の目的等によって限定されるものではないが、例えば神経細胞を、細胞死、変性及び変質等の原因となる刺激及び変化等から保護する目的で用いることができる。
【００８５】
上記の細胞死、変性及び変質等は、これらが惹起されるメカニズム等によって限定されるものではないが、例えばグルタミン酸、アスパラギン酸、ＮＭＤＡ、ＫＡ又はＡＭＰＡに例示される興奮性アミノ酸等に対する受容体である、興奮性アミノ酸受容体を介して惹起されるものであることが好ましい。また、上記の細胞死、変性及び変質等がアポトーシス、又はアポトーシスに関連して引き起こされる変性又は変質等である場合、本発明保護剤はカスパーゼ３の活性を抑制することにより、その神経細胞の保護効果を発揮することが好ましい。したがって本発明保護剤は、「カスパーゼ３の活性抑制剤」なる概念をも包含する。
【００８６】
本発明保護剤は、その使用方法によって限定されるものではないが、例えば本発明保護剤を、神経細胞を細胞死の原因となる刺激及び変化等から保護する目的で用いる場合、例えば＜１＞本発明細胞死抑制剤に記載の本発明細胞死抑制剤の使用方法と同様の方法により使用することができる。
【００８７】
本発明保護剤をその他の目的で用いる場合においては、＜１＞本発明細胞死抑制剤に記載の方法における「細胞死」なる用語を、「変性」又は「変質」等の用語に置き換えた説明を、使用方法の例示として参照することができる。
【００８８】
また、本発明保護剤は、神経細胞を保護する目的で用いられる限りにおいて、その品目等によっても限定されるものではないが、具体的な品目としては、例えば試薬、医薬、健康食品及び機能性食品等が例示される。各品目についての、その使用目的、使用方法及び使用形態等の詳細については、例えば本発明保護剤を、神経細胞を細胞死の原因となる刺激及び変化等から保護する目的で用いる場合、＜１＞本発明細胞死抑制剤における説明を参照することができる。また、本発明保護剤をその他の目的で用いる場合においては、＜１＞本発明細胞死抑制剤の各品目の説明における「細胞死」なる用語を、「変性」又は「変質」等の用語に置き換えた説明を、各品目の説明として参照することができる。
【００８９】
また、本発明保護剤によって神経細胞が保護されたか否かは、例えば本発明保護剤を、神経細胞を細胞死の原因となる刺激及び変化等から保護する目的で用いる場合、＜１＞本発明細胞死抑制剤に記載の方法と同様の方法により、判断することができる。また、本発明保護剤をその他の目的で用いる場合においては、＜１＞本発明細胞死抑制剤の「細胞死」なる用語を、「変性」又は「変質」等の用語に置き換えた説明を、本発明保護剤によって神経細胞が保護されたか否かを判断する方法の例示として参照することができる。
【００９０】
また、細胞死がアポトーシスである場合、本発明保護剤はカスパーゼ３の活性を抑制することにより、細胞死を抑制する効果を発揮することが好ましい。したがって本発明保護剤は、「カスパーゼ３の活性抑制剤」なる概念をも包含する。
【００９１】
本発明保護剤は、例えば生体外に摘出、分離又は単離された神経細胞を保存するために用いられる、「保存剤」の概念をも包含する。
＜７＞本発明保護方法
本発明保護方法は、神経細胞に本発明保護剤を接触させるステップを少なくとも含む、神経細胞の保護方法である。
【００９２】
上記の「本発明保護剤」については、＜６＞本発明保護剤を参照されたい。また、「神経細胞」、「接触」なる用語については、＜２＞本発明細胞死抑制方法における説明を参照されたい。
【００９３】
本発明保護方法は、＜２＞本発明細胞死抑制方法の場合と同様に、上記以外のステップを含んでいてもよい。
【００９４】
本発明保護方法は、例えば生体外に摘出、分離又は単離された神経細胞を保存するために行われる、「保存方法」の概念をも包含する。
【００９５】
なお、本発明保護方法において、本発明保護剤を生物体内において神経細胞に接触させる場合、当該生物体はヒトを除く動物であることが好ましい。
＜８＞本発明組成物２
本発明組成物２は、神経細胞と、本発明保護剤とを有効成分として少なくとも含む組成物である。
【００９６】
上記において、本発明保護剤、及び「神経細胞」に関する説明ついては、上記＜６＞本発明保護剤における説明を参照されたい。
【００９７】
本発明組成物２は、神経細胞及び本発明保護剤以外の成分として、緩衝剤、保存剤等に例示されるその他の成分を含んでいてもよい。
【００９８】
本発明組成物２は、その使用目的及び使用方法等によって限定されるものではないが、例えば神経細胞の過剰な細胞死によって引き起こされる疾患又は障害の治療、改善、緩和又は予防等を目的とした細胞の移植のために用いられる組成物として好適に用いることができる。
【００９９】
発明組成物２のより具体的な使用方法については、上記＜４＞本発明神経細胞における「本発明神経細胞」なる用語を、「本発明組成物２」なる用語に置き換えた説明を参照することができる。
【０１００】
また上記の移植の方法についても、上記＜４＞本発明神経細胞における説明を参照されたい。
【０１０１】
以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。
【実施例】
【０１０２】
以下の実施例においては下記の略号を用いる。
【０１０３】
ＣＳ：コンドロイチン硫酸
ＣＳ−Ａ：コンドロイチン硫酸Ａ
ＣＳ−Ｂ：コンドロイチン硫酸Ｂ
ＣＳ−Ｃ：コンドロイチン硫酸Ｃ
ＣＳ−Ｄ：コンドロイチン硫酸Ｄ
ＣＳ−Ｅ：コンドロイチン硫酸Ｅ
ＣＳ−Ａ（クジラ軟骨由来、約２５〜５０ｋＤａ、生化学工業株式会社製）：ＣＳ−Ａ（２５〜５０ｋＤａ）
ＣＳ−Ｂ（ブタ皮由来、１１〜２５ｋＤａ、生化学工業株式会社製）：ＣＳ−Ｂ（１１〜２５ｋＤａ）
ＣＳ−Ｃ（サメ軟骨由来、約４０〜８０ｋＤａ、生化学工業株式会社製）：ＣＳ−Ｃ（４０〜８０ｋＤａ）
ＣＳ−Ｄ（サメヒレ由来、約３０ｋＤａ、生化学工業株式会社製）：ＣＳ−Ｄ（３０ｋＤａ）
ＣＳ−Ｅ（イカ軟骨由来、約７５ｋＤａ、生化学工業株式会社製）：ＣＳ−Ｅ（７５ｋＤａ）
ＣＳ−Ｅ（イカ軟骨由来、２糖、生化学工業株式会社製）：ＣＳ−Ｅ（２糖）
ＣＳ−Ｅ（イカ軟骨由来、約３ｋＤａ、生化学工業株式会社製）：ＣＳ−Ｅ（３ｋＤａ）
ＣＳ−Ｅ（イカ軟骨由来、約５ｋＤａ、生化学工業株式会社製）：ＣＳ−Ｅ（５ｋＤａ）
ＣＳ−Ｅ（イカ軟骨由来、約１２ｋＤａ、生化学工業株式会社製）：ＣＳ−Ｅ（１２ｋＤａ）
ＣＳ−Ｅ（イカ軟骨由来、約２５ｋＤａ、生化学工業株式会社製）：ＣＳ−Ｅ（２５ｋＤａ）
なお、ＣＳ−Ｅ（２糖）、ＣＳ−Ｅ（３ｋＤａ）、ＣＳ−Ｅ（５ｋＤａ）、ＣＳ−Ｅ（１２ｋＤａ）及びＣＳ−Ｅ（２５ｋＤａ）は、分子量が約７５ｋＤａのＣＳ−Ｅを、羊睾丸ヒアルロニダーゼにより酵素分解することにより調製したものを使用した。
１  各種ＣＳの神経細胞の細胞死抑制効果の検証
各種ＣＳの、ＮＭＤＡによって誘発される神経細胞の細胞死を抑制する効果について検証した。
１−１  
ブルワー  ＧＪ（Ｂｒｅｗｅｒ  ＧＪ）ら、ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス・リサーチ、１９９３年、第３５巻、第５号、ｐ．５６７−５７６に記載の方法に従って、胎生16日齢ラット胎仔大脳皮質から単一細胞浮遊液を調製し、Ｂ−２７添加物（インビトロジェン）を含むNeurobasal medium（神経細胞培養用基礎培地、インビトロジェン）を用いて３７℃にて培養した。培養10〜14日目に各種ＣＳを上記培地中で１００μｇ／ｍｌとなるように添加するか、又はコントロールとして上記培地を添加し、２４時間後、上記の各培地にＮＭＤＡを加えて細胞死を誘発し、更に２４時間培養した。細胞死の程度を、上記培養後の各培地中に存在するＬＤＨの活性を、コー，Ｊ．Ｙ．（Ｋｏｈ，Ｊ．Ｙ．）ら、ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス・メソッズ、１９８７年、第２０巻、第１号、ｐ．８３−９０に記載の方法に従って測定し、評価した。また、生存細胞数を常法によって抗ＭＡＰ２抗体を用いてＭＡＰ２の蛍光免疫染色を行い、蛍光顕微鏡下２００倍で観察した５視野分のＭＡＰ２陽性細胞をカウントすることにより測定した。
【０１０４】
培地中のＬＤＨ活性の測定結果を図１に示す。
【０１０５】
ＣＳ−Ｅ（７５ｋＤａ）を用いて上記の処理を行った場合の培地中のＬＤＨ活性は、コントロールの約４０％に減少した。一方、他の種類のＣＳ、すなわちＣＳ−Ａ、ＣＳ−Ｂ、ＣＳ−Ｃ及びＣＳ−Ｄでは、コントロールと同程度か、又はそれ以上のＬＤＨ活性が確認された。
【０１０６】
ＭＡＰ２陽性細胞のカウント結果を図２に示す。ＣＳ−Ｅを用いて上記の処理を行った場合のＭＡＰ２陽性細胞数は、コントロールの約３倍であることが確認された。一方、他の種類のＣＳ、すなわちＣＳ−Ａ、ＣＳ−Ｂ、ＣＳ−Ｃ及びＣＳ−Ｄでは、上記のような顕著な生存細胞数の増加は確認されなかった。
【０１０７】
以上の結果より、上記のＣＳ−Ｅを、ＮＭＤＡによって細胞死が誘発される前に添加して培養することにより、神経細胞の細胞死を抑制することができることが確認され、ＣＳ−Ｅが神経細胞の細胞死抑制作用を有することが明らかになった。
１−２  ＣＳ−Ｅ濃度の検討
ＣＳ−Ｅ（７５ｋＤａ）の濃度を、それぞれ１、３、５、１０、５０、１００ μｇ／ｍｌと変化させることの他、上記１−１と同様の方法により、ＣＳ−Ｅで神経細胞を処理した上で、細胞死の誘発、培養を行い、培地中のＬＤＨ活性を測定した。
【０１０８】
測定結果を図３に示す。培地中のＬＤＨ活性は、ＣＳ−Ｅ濃度が１０、５０、１００ μｇ／ｍｌの場合において、それぞれコントロールの約９５、８４、７４％であり、当該範囲において濃度依存的に、且つ非常に効果的に神経細胞の細胞死を抑制できることが明らかになった。
１−３  ＣＳ−Ｅを用いた処理を行うタイミングの検討
ＣＳ−Ｅ（７５ｋＤａ）を用いた処理を行うタイミングを、培地にＮＭＤＡを添加する２４時間前、３時間前、直前、又はＮＭＤＡを添加した直後と変化させることの他、上記１−１と同様の方法により、ＣＳ−Ｅによる神経細胞の処理、細胞死の誘発、培養を行い、培地中のＬＤＨ活性を測定した。
【０１０９】
結果を図４に示す。培地中のＬＤＨ活性は、ＣＳ−Ｅを用いた処理を、ＮＭＤＡを加える２４時間前、３時間前、直前に行った場合、それぞれコントロールの約７０、８５、９２％と減少することが確認されたことから、ＮＭＤＡにより細胞死を誘発する前にＣＳ−Ｅを用いた処理を行うことにより、非常に効果的に神経細胞の細胞死を抑制することができることが明らかになった。特に、ＮＭＤＡによる神経細胞の細胞死の誘発を行う、２４時間前、又は３時間前にＣＳ−Ｅを用いた処理を行った場合おいて、コントロールと比して統計的に有意な神経細胞の細胞死の抑制効果が得られることが確認されたことから、神経細胞の細胞死の誘発を行う３時間程度以上前にＣＳ−Ｅによる処理を行うことにより、より効果的に神経細胞の細胞死を抑制できることが明らかになった。
１−４  ＣＳ−Ｅの分子量の検討
ＣＳ−Ｅ（７５ｋＤａ）以外のＣＳ−Ｅとして、ＣＳ−Ｅ（３ｋＤａ）、ＣＳ−Ｅ（５ｋＤａ）、ＣＳ−Ｅ（１２ｋＤａ）、ＣＳ−Ｅ（２５ｋＤａ）を用い、上記１−１と同様の方法により、ＣＳ−Ｅで神経細胞を処理した上で、細胞死の誘発、培養を行い、培地中のＬＤＨ活性を測定した。
【０１１０】
測定結果を図５に示す。培地中のＬＤＨ活性は、ＣＳ−Ｅ（３ｋＤａ）、ＣＳ−Ｅ（５ｋＤａ）、ＣＳ−Ｅ（１２ｋＤａ）、ＣＳ−Ｅ（２５ｋＤａ）、ＣＳ−Ｅ（７５ｋＤａ）を用いた場合において、それぞれコントロールの約８３％、４１％、３５％、１９％、１８％に減少した。よって、５ｋＤａ以上の分子量を有するＣＳ−Ｅが、より強い神経細胞の細胞死抑制作用を有することが明らかになった。
２  カスパーゼ３活性の検証
ＣＳ−Ｅが有する神経細胞の細胞死の抑制効果とアポトーシスとの関連を、培地中のカスパーゼ３活性を測定することにより検証した。
【０１１１】
ＣＳ−Ｅ（７５ｋＤａ）の濃度を、それぞれ１０、１００μｇ／ｍｌと変化させ、上記１と同様の方法により、ＣＳ−Ｅで神経細胞を処理した上で、神経細胞の細胞死の誘発、培養を行い、神経細胞の細胞死の誘発後（ＮＭＤＡ添加後）１時間、３時間、６時間及び１０時間における、培地中のカスパーゼ３活性を、BIOMOL QuantiZymeTM Assay System  CASPASE-3 Cellular Activity Assay Kit PLUS -AK-703（ＢＩＯＭＯＬ社）を用いて、細胞１個あたり、１分間に合成基質を1 fmol分解する活性（ｆｍｏｌ／ｍｉｎ／ｃｅｌｌ）測定した。
【０１１２】
結果を図６に示す。
【０１１３】
１０μｇ／ｍｌ、及び１００ μｇ／ｍｌのＣＳ−Ｅで神経細胞を処理した場合、コントロールと比して、上記のいずれの時間においても、カスパーゼ３の活性が減少していることが確認された（図６）。アポトーシスを引き起こすカスケード反応の１段階として、カスパーゼ３の活性化があることが知られている。このことから、ＣＳ−Ｅによってカスパーゼ３の活性が抑制されることにより、神経細胞のアポトーシスが抑制されることが示唆された。
【０１１４】
また別のロットの神経細胞を用いて、同様の方法により、ＮＭＤＡ添加後５時間におけるカスパーゼ３活性を、それぞれ４プレートずつ（１プレートにつき細胞約1〜1.5×106個）測定して得られた結果を、図７に示す。
３  ＫＡ又はＡＭＰＡによって誘発される神経細胞の細胞死の抑制効果の検証
３−１  ＫＡによって誘発される神経細胞の細胞死の抑制効果の検証
細胞死の誘発に用いる興奮性アミノ酸を１００、又は１０００ μＭ／ｍｌのＫＡに変え、さらに処理に用いるＣＳ−Ｅの濃度をそれぞれ０、１０、１００ μｇ／ｍｌと変化させることの他、上記実施例１と同様の方法により、ＣＳ−Ｅ（７５ｋＤａ）で神経細胞を処理した上で、細胞死の誘発、培養を行い、培地中のＬＤＨ活性を測定した。
【０１１５】
結果を図８に示す。ＫＡ濃度１００ μＭ／ｍｌにおいては、処理に用いたＣＳ−Ｅの濃度がそれぞれ１０、１００ μｇ／ｍｌの場合、ＣＳ−Ｅで処理しなかった場合（０ μＭ／ｍｌ）に比べ、ＬＤＨ活性がそれぞれ約８０、６７％に減少した。また、ＫＡ濃度１０００ μＭ／ｍｌにおいては、処理に用いたＣＳ−Ｅの濃度がそれぞれ１０、１００ μｇ／ｍｌの場合、ＣＳ−Ｅで処理しなかった場合（０ μＭ／ｍｌ）に比べ、ＬＤＨ活性がそれぞれ約８０、７９％に減少した。以上のことから、ＣＳ−Ｅを、ＫＡによって細胞死を誘発する前に添加して培養することにより、神経細胞の細胞死を抑制することができることが確認され、ＣＳ−Ｅが神経細胞の細胞死抑制作用を有することが確認された。
３−２  ＡＭＰＡによって誘発される神経細胞の細胞死の抑制効果の検証
細胞死の誘発に用いる興奮性アミノ酸を１００、５００、又は１０００ μＭ／ｍｌのＡＭＰＡに変え、さらに処理に用いるＣＳ−Ｅの濃度をそれぞれ０、１０、１００ μｇ／ｍｌと変化させることの他、上記実施例１と同様の方法により、ＣＳ−Ｅ（７５ｋＤａ）で神経細胞を処理した上で、細胞死の誘発、培養を行い、培地中のＬＤＨ活性を測定した。
【０１１６】
結果を図９に示す。ＡＭＰＡ濃度１０ μＭ／ｍｌにおいては、処理に用いたＣＳ−Ｅの濃度がそれぞれ１０、１００ μｇ／ｍｌの場合、ＣＳ−Ｅで処理しなかった場合（０ μＭ／ｍｌ）に比べ、ＬＤＨ活性がそれぞれ約６７、２８％に減少した。ＡＭＰＡ濃度１００ μＭ／ｍｌにおいては、処理に用いたＣＳ−Ｅの濃度がそれぞれ１０、１００ μｇ／ｍｌの場合、ＣＳ−Ｅで処理しなかった場合（０ μＭ／ｍｌ）に比べ、ＬＤＨ活性がそれぞれ約６７、４２％に減少した。また、ＡＭＰＡ濃度５００ μＭ／ｍｌにおいては、処理に用いたＣＳ−Ｅの濃度がそれぞれ１０、１００ μｇ／ｍｌの場合、ＣＳ−Ｅで処理しなかった場合（０ μＭ／ｍｌ）に比べ、ＬＤＨ活性がそれぞれ約７９、５５％に減少した。また、ＡＭＰＡ濃度１０００ μＭ／ｍｌにおいては、処理に用いたＣＳ−Ｅの濃度がそれぞれ１０、１００ μｇ／ｍｌの場合、ＣＳ−Ｅで処理しなかった場合（０ μＭ／ｍｌ）に比べ、ＬＤＨ活性がそれぞれ約６１、３７％に減少した。以上のことから、ＣＳ−Ｅを、ＡＭＰＡによって細胞死を誘発する前に添加して培養することにより、神経細胞の細胞死を抑制することができることが確認され、ＣＳ−Ｅが神経細胞の細胞死抑制作用を有することが確認された。
４  ＮＭＤＡｃｕｒｒｅｎｔに対する影響の検証
上記１−１と同様の方法により神経細胞を培養し、培養１３日目にＣＳ−Ｅ 100 μg/mlを投与し、２４時間後（培養１４日目）に神経細胞のＮＭＤＡに対する反応をパッチクランプ法で測定した。パッチ電極で細胞を-80mV〜+40mVに電位固定した後、ＮＭＤＡ 50μMを他のガラス管を用いて細胞近傍に微量投与し、細胞膜に流れる電流を測定した。結果を図１０に示す。
【０１１７】
この結果により、本発明によれば、実質的にＮＭＤＡｃｕｒｒｅｎｔに対してほとんど影響を与えることなく、神経細胞の細胞死を抑制することも可能であることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】ＮＭＤＡによって神経細胞の細胞死を誘発した場合において、処理に用いたＣＳの種類及び分子量と、培地中のＬＤＨ活性との関係を示す図である。
【図２】ＮＭＤＡによって神経細胞の細胞死を誘発した場合において、処理に用いたＣＳの種類と、ＭＡＰ２陽性細胞数との関係を示す図である。
【図３】ＮＭＤＡによって神経細胞の細胞死を誘発した場合において、処理に用いたＣＳ−Ｅの濃度変化に伴う、ＬＤＨ活性の変化を示す図である。
【図４】ＮＭＤＡによって神経細胞の細胞死を誘発した場合において、ＣＳ−Ｅを用いた処理を行うタイミングと、ＬＤＨ活性との関係を示す図である。
【図５】ＮＭＤＡによって神経細胞の細胞死を誘発した場合において、処理に用いたＣＳ−Ｅの分子量と、ＬＤＨ活性との関係を示す図である。
【図６】ＮＭＤＡによって神経細胞の細胞死を誘発した場合（図中、ＰＣ、ＣＳ−Ｅ １０ μｌ／ｍｌ、ＣＳ−Ｅ １００ μｌ／ｍｌで示す）、及び神経細胞の細胞死を誘発しなかった場合（図中、ＮＣで示す）におけるカスパーゼ３活性（ｆｍｏｌ／ｍｉｎ／ｃｅｌｌ）の変化を、経時的に測定した結果を示す図である。ＣＳ−Ｅ １０ μｌ／ｍｌ、ＣＳ−Ｅ １００ μｌ／ｍｌは、それぞれ処理に１０ μｌ／ｍｌのＣＳ−Ｅ、１００μｌ／ｍｌのＣＳ−Ｅを用いた場合の結果を示す。また、ＰＣは、ＣＳ−Ｅを用いた処理を行わなかった場合の結果を示す。ＮＣは、ＣＳ−Ｅ及びＮＭＤＡを用いた処理を行わなかった場合の結果を示す。
【図７】ＮＭＤＡ添加後５時間における、ＮＭＤＡによって神経細胞の細胞死を誘発した場合（図中、ＰＣ、ＣＳ−Ｅ １００ μｌ／ｍｌで示す）、及び神経細胞の細胞死を誘発しなかった場合（図中、ＮＣで示す）におけるカスパーゼ３活性（ｆｍｏｌ／ｍｉｎ／ｃｅｌｌ）を測定した結果を示す図である。ＣＳ−Ｅ １００ μｌ／ｍｌは、処理に１００μｌ／ｍｌのＣＳ−Ｅを用いた場合の結果を示す。また、ＰＣは、ＣＳ−Ｅを用いた処理を行わなかった場合の結果を示す。ＮＣは、ＣＳ−Ｅ及びＮＭＤＡを用いた処理を行わなかった場合の結果を示す。
【図８】ＫＡによって神経細胞の細胞死を誘発した場合において、処理に用いたＫＡの濃度変化、及びＣＳ−Ｅの濃度変化と、ＬＤＨ活性との関係を示す図である。
【図９】ＡＭＰＡによって神経細胞の細胞死を誘発した場合において、処理に用いたＫＡの濃度変化、及びＣＳ−Ｅの濃度変化と、ＬＤＨ活性との関係を示す図である。
【図１０】ＣＳ−ＥのＮＭＤＡｃｕｒｒｅｎｔに対する影響を示す図である。縦軸は、各々の細胞で記録した電流をそれぞれの細胞膜容量で割った値であり、単位細胞膜表面積当たりに流れる電流を示している。Controlは、神経細胞の処理にＣＳ−Ｅを用いず、培養液を用いた場合の結果を示す。グラフはcontrol n=6, CS-E n=5の平均±SDを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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