(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
滲出型加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）を処置、安定化および／または予防するための医薬の製造における抗Ｃ５剤の使用であって、該抗Ｃ５剤は、Ｃ５補体に結合し、かつ以下の構造：
【化３】
0005406534.tif 000022
を有するペグ化されたアプタマーであって、該式において、アプタマーは、ｆＣｍＧｆＣｆＣＧｆＣｍＧｍＧｆＵｆＣｆＵｆＣｍＡｍＧｍＧｆＣＧｆＣｆＵｍＧｍＡｍＧｆＵｆＣｆＵｍＧｍＡｍＧｆＵｆＵｆＵＡｆＣｆＣｆＵｍＧｆＣｍＧ−３Ｔ（配列番号４）であり、ここで、ｆＣおよびｆＵは２’−フルオロヌクレオチドであり、ｍＧおよびｍＡは２’−ＯＭｅヌクレオチドであり、全ての他のヌクレオチドは２’−ＯＨであり、そして、３Ｔは、逆位デオキシチミジンを示し、
ここで、該医薬は、ＶＥＧＦに対するアンタゴニスト抗体または抗体フラグメントである抗ＶＥＧＦ剤と逐次的にまたは同時に投与され、
該医薬および該抗ＶＥＧＦ剤が、投与前の被験体の視力レベルに対して、該被験体において視力レベルを改善するのに有効な量で投与される、使用。
【請求項２】
前記医薬が、眼投与、硝子体内投与、または、眼周囲投与によって投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記医薬がデポー製剤である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記抗ＶＥＧＦ剤がＶＥＧＦに対するアンタゴニスト抗体フラグメントである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記ＶＥＧＦに対するアンタゴニスト抗体フラグメントがラニビズマブである、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記抗ＶＥＧＦ剤がＶＥＧＦに対するアンタゴニスト抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記ＶＥＧＦに対するアンタゴニスト抗体がベバシズマブである、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
滲出型加齢性ＡＭＤを処置、安定化および／または予防するための組成物であって、該組成物は：
（ａ）Ｃ５補体に結合し、かつ以下の構造：
【化３Ａ】
0005406534.tif 000023
を有するペグ化されたアプタマーであって、該式において、アプタマーは、ｆＣｍＧｆＣｆＣＧｆＣｍＧｍＧｆＵｆＣｆＵｆＣｍＡｍＧｍＧｆＣＧｆＣｆＵｍＧｍＡｍＧｆＵｆＣｆＵｍＧｍＡｍＧｆＵｆＵｆＵＡｆＣｆＣｆＵｍＧｆＣｍＧ−３Ｔ（配列番号４）であり、ここで、ｆＣおよびｆＵは２’−フルオロヌクレオチドであり、ｍＧおよびｍＡは２’−ＯＭｅヌクレオチドであり、全ての他のヌクレオチドは２’−ＯＨであり、そして、３Ｔは、逆位デオキシチミジンを示す、ペグ化されたアプタマー；および
（ｂ）ＶＥＧＦに対するアンタゴニスト抗体または抗体フラグメントである抗ＶＥＧＦ剤；ならびに
薬学的に受容可能な担体または希釈剤を含有し、該ペグ化されたアプタマーおよび該抗ＶＥＧＦ剤が、投与前の被験体の視力レベルに対して、該被験体において視力レベルを改善するのに有効な量で投与される、組成物。
【請求項９】
眼投与、硝子体内投与、または、眼周囲投与のために処方される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
デポー製剤である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記抗ＶＥＧＦ剤がＶＥＧＦに対するアンタゴニスト抗体フラグメントである、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ＶＥＧＦに対するアンタゴニスト抗体フラグメントがラニビズマブである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記抗ＶＥＧＦ剤がＶＥＧＦに対するアンタゴニスト抗体である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＶＥＧＦに対するアンタゴニスト抗体がベバシズマブである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
滲出型加齢性ＡＭＤを処置、安定化および／または予防するための薬学的組合せ物であって、該組合せ物は、抗Ｃ５剤および抗ＶＥＧＦ剤を含有し、ここで、
該抗Ｃ５剤と該抗ＶＥＧＦ剤とは、逐次的にまたは同時に投与され；
該抗Ｃ５剤は、Ｃ５補体に結合し、かつ以下の構造：
【化３Ａ】
0005406534.tif 000024
を有するペグ化されたアプタマーであって、該式において、アプタマーは、ｆＣｍＧｆＣｆＣＧｆＣｍＧｍＧｆＵｆＣｆＵｆＣｍＡｍＧｍＧｆＣＧｆＣｆＵｍＧｍＡｍＧｆＵｆＣｆＵｍＧｍＡｍＧｆＵｆＵｆＵＡｆＣｆＣｆＵｍＧｆＣｍＧ−３Ｔ（配列番号４）であり、ここで、ｆＣおよびｆＵは２’−フルオロヌクレオチドであり、ｍＧおよびｍＡは２’−ＯＭｅヌクレオチドであり、全ての他のヌクレオチドは２’−ＯＨであり、そして、３Ｔは、逆位デオキシチミジンを示す、ペグ化されたアプタマーであり；そして
該抗ＶＥＧＦ剤は、ＶＥＧＦに対するアンタゴニスト抗体または抗体フラグメントであり、該抗Ｃ５剤および該抗ＶＥＧＦ剤が、投与前の被験体の視力レベルに対して、該被験体において視力レベルを改善するのに有効な量で投与される、組合せ物。
【請求項１６】
前記抗Ｃ５剤および前記抗ＶＥＧＦ剤が、眼投与、硝子体内投与、または、眼周囲投与によって投与される、請求項１５に記載の薬学的組合せ物。
【請求項１７】
前記抗Ｃ５剤および前記抗ＶＥＧＦ剤の各々が別々の組成物中に存在する、請求項１５に記載の薬学的組合せ物。
【請求項１８】
前記抗Ｃ５剤および前記抗ＶＥＧＦ剤が同じ組成物中に存在する、請求項１５に記載の薬学的組合せ物。
【請求項１９】
前記組成物がデポー製剤である、請求項１７または１８に記載の薬学的組合せ物。
【請求項２０】
前記抗ＶＥＧＦ剤がＶＥＧＦに対するアンタゴニスト抗体フラグメントである、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の薬学的組合せ物。
【請求項２１】
前記ＶＥＧＦに対するアンタゴニスト抗体フラグメントがラニビズマブである、請求項２０に記載の薬学的組合せ物。
【請求項２２】
前記抗ＶＥＧＦ剤がＶＥＧＦに対するアンタゴニスト抗体である、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の薬学的組合せ物。
【請求項２３】
前記ＶＥＧＦに対するアンタゴニスト抗体がベバシズマブである、請求項２２に記載の薬学的組合せ物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本特許出願は、米国仮特許出願第６０／７８０，９０５号（２００６年３月８日出願）および米国仮特許出願第６０／８４８，２７４号（２００６年９月２９日出願）（これらの各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される）に基づく優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般的に核酸の分野に関し、より詳しくは、補体関連型の眼科系、心臓系、炎症性、喘息性および自己免疫の障害、虚血性再灌流障害および／または特にＣ５媒介性補体活性化が関与している他の疾患もしくは障害における治療剤および診断剤として有用な補体系のタンパク質に対する結合能を有するアプタマーに関する。好ましい実施形態において、本発明は、より詳しくは、眼障害の治療および検出のための、例えばこれに限定されないが、Ｃ５媒介性障害（Ｃ５媒介性眼障害など）の治療および検出のための方法および材料に関する。本発明は、さらに、補体系のタンパク質（例えば、Ｃ５タンパク質）に対する結合能を有するアプタマーの投与のための材料および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
アプタマーは、定義によると、高い特異性および親和性でタンパク質などの一部の標的に、ワトソン−クリック塩基対合以外の相互作用によって結合する単離された核酸分子である。アプタマーは、核酸系分子であるが、アプタマーと遺伝子やｍＲＮＡなどの他の核酸分子との間には基本的な違いが存在する。後者の場合、その核酸構造は、その線形の塩基配列によって情報をコードし、したがって、この配列は情報蓄積機能に重要である。全く対照的に、アプタマーの機能は、具体的な標的分子の結合に基づき、保存された線形の塩基配列ではなく、特定の二次／三次構造に依存性である。すなわち、アプタマーは非コード配列である。アプタマーが有し得るいかなるコード可能性も全く偶発的なものであり、アプタマーのそのコグネイト標的に対する結合において何の役割も果たさない。したがって、同じ標的、および該標的上の同じ部位にすら結合するアプタマーが類似した線形の塩基配列を共有することはあり得るが、ほとんどは共有していない。
【０００４】
また、アプタマーは、ある種のタンパク質に結合する天然に存在する核酸配列とは区別されなければならない。このような後者の配列は、天然の核酸の転写、翻訳および輸送に関与しているタンパク質、すなわち、核酸結合タンパク質の特定のサブグループに結合する生物体のゲノムに内包された天然に存在する配列である。他方で、アプタマーは、短鎖の単離された天然に存在しない核酸分子である。核酸結合タンパク質に結合するアプタマーは確認され得るが、ほとんどの場合、かかるアプタマーは、自然界にある核酸結合タンパク質によって認識される配列に対してほとんど、または全く配列同一性を有しない。より重要なことには、アプタマーは、事実上、任意のタンパク質（核酸結合タンパク質だけでなく）、ならびにほぼ任意の目的の標的、例えば、小分子、炭水化物、ペプチドなどに結合し得るものである。ほとんどの標的には、タンパク質であっても、これらが結合する天然の核酸配列は存在せず、かかる配列を有する配列標的（すなわち、核酸結合タンパク質）では、かかる配列は、強固に結合するアプタマーと比較べて自然界で使用される結合親和性が比較的低い結果、アプタマーと異なる。
【０００５】
アプタマーは、ファージディスプレイによって作製されるペプチドまたは抗体と同様、選択された標的に特異的に結合し、標的の活性または結合相互作用を、例えば、アプタマーの結合によってモジュレートし、その標的が機能する能力をブロックし得る。抗体の場合と同様、この標的への特異的結合という機能的特性は固有の特性である。また、抗体の場合と同様、当業者は、アプタマーが標的に対してどのような構造的特徴を有するか正確に知らないかもしれないが、当業者には、正確な構造的定義がなくても、どのようにしてかかる分子を同定し、作製し、使用するかがわかる。
【０００６】
アプタマーはまた、単一の一見軽微な構造的変化が、アプタマーの結合および／または他の活性（１種類または複数種）に劇的に効果をもたらし得る（次数の大きさが数倍）という点で、小分子治療剤と類似している。他方において、一部の構造的変化は、いかなる効果もほとんど、または全く有しない。これは、アプタマーの二次／三次構造の重要性に起因する。換言すると、アプタマーは、その所与の標的に特異的に結合するための化学的接触をもたらす固定されたコンホメーション内に保持された三次元構造である。その結果、（１）一部の領域もしくは特定の配列は、（ａ）標的との特異的接触点および／または（ｂ）該分子を標的と接触した状態に配置する配列として必須である；（２）一部の領域もしくは特定の配列は一連の変動性を有する、例えば、ヌクレオチドＸはピリミジンでなければならないか、もしくはヌクレオチドＹはプリンでなければならないか、もしくはヌクレオチドＸとＹは相補的でなければならない；ならびに（３）一部の領域もしくは特定の配列は任意のものであり得る、すなわち、これらは、本質的にスペーシングエレメントである、例えば、所与の長さの任意のヌクレオチド鎖であり得るか、もしくはＰＥＧ分子などの非ヌクレオチドスペーサーでさえあり得る。
【０００７】
ランダム配列オリゴヌクレオチドのプールからの試験管内選択プロセスによって見出されるため、アプタマーは、１３０種を超えるタンパク質（例えば、増殖因子、転写因子、酵素、免疫グロブリンおよびレセプター）に対して作製されている。典型的なアプタマーは、１０〜１５ｋＤａの大きさ（２０〜４５ヌクレオチド）であり、その標的にナノモル以下の親和性で結合し、密接に関連した標的を識別する（例えば、アプタマーは、典型的には、同じ遺伝子ファミリーの他のタンパク質には結合しない）。一連の構造の研究により、アプタマーは、抗体−抗原複合体における親和性および特異性をもたらす結合相互作用（例えば、水素結合、静電気的相補性、疎水性接触、立体的排除）と同じ型のものを利用し得ることが示されている。
【０００８】
アプタマーは、治療剤および診断剤として使用するためのいくつかの望ましい特性、例えば、高い特異性および親和性、生物学的有効性、ならびに優れた薬物動態特性を有する。また、これらは、抗体および他のタンパク質の生物学に対して特異的競合的利点を提供する。例えば：
１）速度および制御。アプタマーは、完全に試験管内プロセスによって作製され、最初のリード化合物（例えば、治療剤リード化合物）の速やかな作製が可能になる。試験管内選択によって、アプタマーの特異性および親和性が厳重に制御されることが可能となり、リード化合物、例えば、毒性および非免疫原性標的の両方に対するリード化合物の作製が可能になる。
【０００９】
２）毒性および免疫原性。一類型としてのアプタマーは、治療上許容され得る毒性および免疫原性の欠如が実証されている。多くのモノクローナル抗体の有効性は、抗体自体に対する免疫応答によって大きく制限され得るが、アプタマーに対して抗体を惹起することは、ほとんどの場合、極めて困難である。それは、アプタマーが、ＭＨＣを介してＴ細胞によって提示され得ず、免疫応答は、一般的に核酸断片を認識することに慣れていないためである。
【００１０】
３）投与。現在承認されているほとんどの抗体治療剤は、静脈内注入（典型的には、２〜４時間にわたって）によって投与されるものであるが、アプタマーは、皮下注射によって投与され得る（アプタマーの皮下投与によるバイオアベイラビリティは、サルでの研究において＞８０％である（非特許文献１））。この差は、主に、ほとんどの治療用ＭＡｂは可溶性が比較的低く、したがって大容量が必要であることによる。良好な可溶性（＞１５０ｍｇ／ｍＬ）および比較的低い分子量（アプタマー：１０〜５０ｋＤａ；抗体：１５０ｋＤａ）を有するため、アプタマーの週用量は、０．５ｍＬ未満の容量の注射によって送達され得る。また、アプタマーのサイズが小さいことにより、抗体または抗体フラグメントの浸透は許容されない立体構造的制限部の領域内に浸透するのが可能になり、アプタマー系治療剤または予防剤のまた別の利点が提示される。
【００１１】
４）拡張可能性およびコスト。治療用アプタマーは、化学的に合成され、そのため、製造の要望を満たすために、必要に応じて容易に拡張され得る。製造の拡張における困難性により、現在、一部の生物学的反応の利用可能性が制限されており、大規模タンパク質生産工場の資本コストは莫大であるが、単一の大規模オリゴヌクレオチド合成装置では、１００ｋｇ／年の作製向上が可能であり、必要とされる初期投資額は、比較的控えめである。アプタマー合成のための物品の現在のコストは、キログラム規模で＄５００／ｇと推定され、高度に最適化された抗体と同等である。物品コストを５年で＜＄１００／ｇに低下させるために、プロセス開発における継続的な改善が期待されている。
【００１２】
５）安定性。治療用アプタマーは、化学的に頑強である。これらは、熱および変性剤などの因子への曝露後、活性を回復するように内因的に適合されており、長期間（＞１年）、室温で凍結乾燥粉末として保存が可能である。対照的に、抗体は、冷蔵状態で保存しなければならない。
【００１３】
補体系。補体系は、調節されたカスケード系において供に作用し、細胞外形態の病原体（例えば、細菌）を攻撃する少なくとも２０〜３０種類の血漿タンパク質および膜タンパク質の一群を含む。補体系には、３つの異なる酵素活性化カスケード、古典的、レクチン経路および第二経路（図１）が含まれ、これらは、Ｃ５の活性化において集結し、膜攻撃経路として知られる非酵素的経路をもたらす。
【００１４】
第１の酵素的活性化カスケードは、古典的経路として知られるものであり、いくつかの成分、Ｃｌ、Ｃ４、Ｃ２、Ｃ３およびＣ５（該経路内の順に列挙）を含む。補体系の古典的経路の開始は、免疫賦活剤および非免疫賦活剤の両方による第１の補体成分（Ｃ１）の結合および活性化後に起こる。Ｃ１は、成分Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒおよびＣ１ｓのカルシウム依存性複合体を含み、Ｃ１ｑ成分の結合を介して活性化される。Ｃ１ｑは、６つの同一のサブユニットを含有し、各サブユニットは、３つの鎖（Ａ、ＢおよびＣ鎖）を含む。各鎖は球形の頭部領域を有し、これはコラーゲン様テイルに連結されている。抗原−抗体複合体によるＣ１ｑの結合および活性化は、Ｃ１ｑ頭部基領域を介して起こる。数多くの非抗体Ｃ１ｑ活性化剤（例えば、タンパク質、脂質および核酸）が、コラーゲン様茎部領域上の異なる部位を介してＣ１ｑに結合し、これを活性化する。Ｃ１ｑによる補体活性化因子の分子認識により、コンホメーションの変化が誘導され、これによってプロ酵素Ｃ１ｒの自己賦活が刺激され、続いて、Ｃ１ｓのタンパク質分解的活性化が触媒される。次いで、Ｃｓによって補体成分Ｃ４およびＣ２の活性化が触媒され、Ｃ３コンバターゼとしての機能を果たすＣ４ｂＣ２ａ複合体が形成される。
【００１５】
第２の酵素的活性化カスケードは、レクチン経路として知られるものであり、ＭＢＬ／ＭＡＳＰ−２複合体がＣ１の代わりをしている以外は第一のものと類似している。マンナン結合レクチン（ＭＢＬ）は、細菌の表面上のマンノース含有多糖類を直接認識し、Ｃ１のＣ１ｑ成分と構造的および機能的に類似している。活性化因子へのＭＢＬの結合により、ＭＢＬ結合型プロテアーゼ２（ＭＡＳＰ−２）の活性化が誘導される。次に、ＭＡＳＰ−２によって、Ｃ４およびＣ２の活性化がＣ１ｓの機能と同様の様式で触媒され、
Ｃ３コンバターゼの形成がもたらされる。
【００１６】
第３の酵素的活性化カスケードは、第二経路として知られるものであり、補体系の活性化および増幅の速やかな抗体非依存性経路である。第二経路は、いくつかの成分、Ｃ３、Ｂ因子およびＤ因子（該経路内の順に列挙）を含む。第二経路の活性化は、Ｃ３のタンパク質分解的切断形態であるＣ３ｂが、細菌などの表面活性化因子に結合された場合に起こる。次いで、Ｂ因子がＣ３ｂに結合され、Ｄ因子によって切断されて、Ｃ３コンバターゼＣ３ｂＢｂが生じる。Ｃ３コンバターゼ活性の増幅は、さらなるＣ３ｂが生成され、沈着されると起こる。この増幅応答は、正の調節因子タンパク質プロペルジン（Ｐ）の結合によってさらに補助され、それによって、活性コンバターゼが分解に対して安定化され、その半減期が１〜２分間から１８分間に伸びる。
【００１７】
したがって、３つのすべての経路によって、Ｃ３因子をＣ３ａとＣ３ｂに分裂させるＣ３コンバターゼが生成される。この点で、両方のＣ３コンバターゼ（古典的／レクチンおよび第２）は、さらに、Ｃ５コンバターゼ（Ｃ４ｂ２ａ３ｂおよびＣ３ｂ３ｂＢｂ）に合成される。これらの複合体は、続いて、補体成分Ｃ５を２つの成分：Ｃ５ａポリペプチド（９ｋＤａ）とＣ５ｂポリペプチド（１７０ｋＤａ）に切断する。Ｃ５ａポリペプチドは、７回膜貫通Ｇタンパク質共役型レセプター（これは、元々、白血球と関連していたが、現在では、さまざまな組織、例えば、肝細胞およびニューロン上で発現されることが知られている）に結合する。Ｃ５ａ分子は、ヒト補体系の主要な化学走化性成分であり、さまざまな生物学的応答、例えば、白血球化学走性、平滑筋収縮、細胞内シグナル伝達経路の活性化、好中球−内皮接着、サイトカインおよび脂質メディエータ放出ならびに酸化体形成を誘発し得る。Ｃ５ａ分子は、ヒト補体系の主要な化学走性成分であり、さまざまな生物学的応答、例えば、白血球走化性、平滑筋収縮、細胞内シグナル伝達経路の活性化、好中球内皮接着、サイトカインおよび脂質メディエータ放出ならびに酸化性物質の形成を誘発し得る。
【００１８】
より大きなＣ５ｂ断片は、補体カスケードの後期成分、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９に逐次結合し、Ｃ５ｂ−９膜攻撃複合体（「ＭＡＣ」）を形成する。Ｃ５ｂ−９ＭＡＣは赤血球を直接溶解し、大量の場合は、白血球に対して溶解性であり、筋肉などの組織、上皮細胞および内皮細胞に対して損傷性である。溶解量以下では、ＭＡＣは、接着分子、細胞内カルシウム増加およびサイトカイン放出の上方調節を刺激し得る。また、Ｃ５ｂ−９ＭＡＣは、細胞溶解を引き起こすことなく内皮細胞および血小板などの細胞を刺激し得る。Ｃ５ａおよびＣ５ｂ−９ＭＡＣの非溶解性効果は、場合によっては、かなり類似している。
【００１９】
補体系は、健康の維持において重要な役割を有するが、疾患を引き起こす可能性または疾患に寄与する可能性を有する。例えば、補体系は、冠動脈バイパス移植術（「ＣＡＢＧ」）手術、数多くの腎臓系、リウマチ性、神経科系、皮膚科系、血液系、血管／肺、アレルギー、感染症ならびに生体適合性／ショック疾患および／または状態に関する副作用に関与している。補体系は、必ずしも疾患状態の唯一の原因ではないが、病因に寄与するいくつかの因子の１つであり得る。
【非特許文献１】Ｔｕｃｋｅｒら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、１９９９年、Ｂ．７３２、ｐ．２０３−２１２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
最近、データにより、補体は眼疾患にも関与していることが示されている。したがって、補体関連型眼障害の治療における治療剤および診断剤としての使用のための補体系の新規のインヒビターを入手することが有益であり得る。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
（発明の概要）
本発明は、補体関連型眼疾患（本明細書において眼障害ともいう）の治療、予防および／または安定化のための材料および方法を提供する。
【００２２】
本発明の一部のある実施形態において、抗補体アプタマーは、補体成分またはそのバリアントの機能をモジュレートする。特に好ましい実施形態では、抗補体アプタマーは、補体成分またはそのバリアントの機能を、好ましくは生体内で、好ましくは脊椎動物において、好ましくは哺乳動物において、より好ましくはヒトの生体内において阻害するか、または低下させる。本発明の一部のある実施形態において、例えば、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５および／またはＢ因子が補体標的である場合、アプタマーによってモジュレートされる（好ましくは、阻害される）機能は、補体タンパク質の切断である。本発明の一部のある実施形態において、例えば、Ｃ２ｂ、Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｂ因子および／またはプロペルジンが補体標的である場合、アプタマーによってモジュレートされる（好ましくは、阻害される）機能は、活性補体成分の凝集体、例えば、コンバターゼまたは膜攻撃複合体などの合成である。本発明の一部のある実施形態において、例えば、Ｃ３ｂ、Ｄ因子、Ｃ１（例えば、Ｃ１ｒおよび／またはＣ１ｓ）および／またはマンノース結合型セリンプロテアーゼ（「ＭＡＳＰ」）が補体標的である場合、アプタマーによってモジュレートされる（好ましくは、阻害される）機能は、酵素活性である。本発明の一部のある実施形態において、例えば、Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、Ｃ３ａレセプターまたはＣ５ａレセプターが補体標的である場合、アプタマーによってモジュレートされる（好ましくは、阻害される）機能は、リガンド／レセプター結合である。
【００２３】
一実施形態において、抗Ｃ５剤を、それを必要とする被験体に、眼障害を安定化、治療および／または予防するのに充分な量で投与する工程を含む、Ｃ５、Ｃ５ａおよび／またはＣ５ｂ−９媒介性の眼障害を安定化、治療および／または予防する方法を提供する。一部のある実施形態では、安定化、治療および／または予防される眼障害が新生血管形成眼障害である。一部のある実施形態では、安定化、治療および／または予防される眼障害が、糖尿病性網膜症または黄斑変性、特に、加齢性黄斑変性（「ＡＭＤ」）である。一部のある実施形態では、安定化、治療および／または予防されるＡＭＤが滲出型のＡＭＤである。一部のある実施形態では、安定化、治療および／または予防されるＡＭＤが非滲出型のものである。
【００２４】
一部のある実施形態において、治療有効量の抗補体アプタマーを、それを必要とする被験体に投与する工程を含む、補体媒介性眼障害を安定化、治療および／または予防する方法を提供する。一部のある実施形態において、抗補体アプタマーの治療有効量は、眼障害が安定化、治療および／または予防されるのに充分な量である。本発明の一部のある実施形態において、被験体は脊椎動物であり、一部のある実施形態では、哺乳動物であり、一部のある実施形態では、ヒトである。一部のある実施形態において、安定化、治療および／または予防される補体媒介性眼障害は、急性もしくは慢性炎症性および／または免疫媒介性の眼障害である。一部のある実施形態では、治療、予防および／または安定化される補体媒介性眼障害は、炎症性結膜炎、例えば、アレルギー性および巨大乳頭性結膜炎、黄斑浮腫、ブドウ膜炎、眼内炎、強膜炎、角膜の潰瘍、ドライアイ症候群、緑内障、虚血性網膜疾患、角膜移植片拒絶、眼内レンズ移植などの眼内手術に関連する合併症および白内障手術に伴う炎症、ベーチェット病、シュタルガルト病、免疫複合体脈管炎、フックス病、フォークト−小柳−原田病、網膜下線維症、角膜炎、硝子体網膜炎症、眼の寄生虫外寄生／移動、色素性網膜炎、サイトメガロウイルス網膜炎および脈絡膜の炎症からなる群より選択される。一部のある実施形態では、安定化、治療および／または予防される眼障害が黄斑変性、特に、加齢性黄斑変性（「ＡＭＤ」）である。一部のある実施形態では、安定化、治療および／または予防される眼障害が非滲出性（「乾性」および／または「萎縮性」）の型のＡＭＤである。一部のある実施形態では、安定化、治療および／または予防される眼障害が新生血管形成眼障害、例えば、糖尿病性網膜症または滲出性（「湿性」）の型のＡＭＤ．などである。
【００２５】
一部のある実施形態において、抗Ｃ５剤を、それを必要とする被験体に、Ｃ５、Ｃ５ａおよび／またはＣ５ｂ−９媒介性の新生血管形成眼障害を安定化するのに充分な量で投与することを含む、Ｃ５、Ｃ５ａおよび／またはＣ５ｂ−９媒介性の新生血管形成眼障害、特に、滲出型のＡＭＤまたは糖尿病性網膜症を安定化する方法を提供する。一部のある実施形態において、抗Ｃ５剤は、抗Ｃ５剤投与時の被験体の視力レベルと比較して該被験体において少なくとも同じレベルの視力を維持するのに充分な量で投与される。一部のある実施形態では、抗Ｃ５剤は、抗Ｃ５剤投与時の被験体とほぼ同じレベルの網膜血管密度が該被験体において維持されるのに充分な量で投与される。
【００２６】
一部のある実施形態において、抗補体アプタマーを、それを必要とする被験体に、補体媒介性の新生血管形成眼障害を安定化するのに充分な量で投与することを含む、補体媒介性の新生血管形成眼障害、特に、滲出型のＡＭＤまたは糖尿病性網膜症を安定化する方法を提供する。一部のある実施形態では、抗補体アプタマーが、抗補体アプタマーの投与時の被験体の視力レベルと比較して該被験体において少なくとも同じレベルの視力を維持するのに充分な量で投与される。一部のある実施形態では、抗補体アプタマーが、アプタマー投与時の被験体とほぼ同じレベルの網膜血管密度が該被験体において維持されるのに充分な量で投与される。一部のある実施形態では、抗補体アプタマーが、抗補体アプタマーの投与時の被験体の新生血管形成随伴出血、体液貯留、網膜剥離および／または瘢痕化のレベルと比べると、該被験体において新生血管形成随伴出血、体液貯留、網膜剥離および／または瘢痕化のレベルが安定化または維持されるのに充分な量で投与される。
【００２７】
一部のある実施形態において、抗Ｃ５剤を、それを必要とする被験体に、Ｃ５、Ｃ５ａおよび／またはＣ５ｂ−９媒介性の新生血管形成眼障害の症状を低減させるのに充分な量で投与することを含む、Ｃ５、Ｃ５ａおよび／またはＣ５ｂ−９媒介性の新生血管形成眼障害、特に、滲出型のＡＭＤまたは糖尿病性網膜症を処置する方法。一部のある実施形態において、抗Ｃ５剤は、抗Ｃ５剤投与時の被験体の視力レベルと比べて該被験体において視力レベルを改善するのに充分な量で投与される。一部のある実施形態では、抗Ｃ５剤は、抗Ｃ５剤投与時の被験体の網膜血管密度のレベルと比べて該被験体において網膜血管密度のレベルを低減させるのに充分な量で投与される。
【００２８】
一部のある実施形態において、抗補体アプタマーを、それを必要とする被験体に、補体媒介性の新生血管形成眼障害の症状を低減させるのに充分な量で投与することを含む、補体媒介性の新生血管形成眼障害、特に、滲出型のＡＭＤまたは糖尿病性網膜症を処置する方法を提供する。一部のある実施形態において、抗補体アプタマーは、抗補体アプタマーの投与時の被験体の視力レベルと比べて該被験体において視力レベルを改善するのに充分な量で投与される。一部のある実施形態では、抗補体アプタマーが、抗補体アプタマーの投与時の被験体の網膜血管密度のレベルと比べると、該被験体において網膜血管密度のレベルを低減させるのに充分な量で投与される。一部のある実施形態では、抗補体アプタマーが、抗補体アプタマーの投与時の被験体の新生血管形成随伴出血、体液貯留、網膜剥離および／または瘢痕化レベルのレベルと比べると、該被験体において新生血管形成随伴出血、体液貯留、網膜剥離および／または瘢痕化のレベルを低減させるのに充分な量で投与される。
【００２９】
一部のある実施形態において、抗補体アプタマーを被験体に、補体媒介性の新生血管形成眼障害の臨床症状を予防するのに充分な量で投与する工程を含む、被験体において臨床的な補体媒介性の新生血管形成眼障害、特に、滲出型のＡＭＤまたは糖尿病性網膜症を予防する方法を提供する。一部のある実施形態において、抗補体アプタマーは、被験体において臨床的視力低下を予防するのに充分な量で投与される。一部のある実施形態では、抗補体アプタマーは、被験体において、臨床的血管新生眼疾患と相関する網膜血管密度のレベルを予防するのに充分な量で投与される。一部のある実施形態では、被験体は、新生血管形成眼障害を発症するリスクがある被験体である。一部のある実施形態では、該方法は、さらに、抗補体アプタマーの投与前に、被験体に補体媒介性の新生血管形成眼障害を発症するリスクがあるか否かを同定することを含む。一部のある実施形態では、該同定工程は、被験体においてドルーゼンの存在および／または網膜の色素沈着変化を検出すること、および臨床的視力低下の非存在を検出することを含む。一部のある実施形態では、該同定工程は、野生型Ｈ因子と比べた被験体の補体Ｈ因子における変化を検出することを含む。野生型Ｈ因子のアミノ酸配列は、Ｒｉｐｏｃｈｅら（１９８８）Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｆａｃｔｏｒ  Ｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４９、  ５９３−６０２に報告されている。被験体において補体媒介性の新生血管形成眼障害、特に、糖尿病性網膜症を安定化、治療および／または予防する方法が提供される一部のある実施形態では、抗補体アプタマーの投与経路は、経眼または眼周囲投与である。
【００３０】
一部のある実施形態において、抗Ｃ５剤を被験体に投与することを含む、被験体においてＣ５、Ｃ５ａおよび／またはＣ５ｂ−９媒介性の臨床的新生血管形成眼障害、特に、滲出型のＡＭＤまたは糖尿病性網膜症を予防する方法であって、抗Ｃ５剤を被験体に、Ｃ５、Ｃ５ａおよび／またはＣ５ｂ−９媒介性の新生血管形成眼障害の臨床症状を予防するのに充分な量で投与する工程を含む方法を提供する。一部のある実施形態では、抗Ｃ５剤は、被験体において臨床的視力低下を予防するのに充分な量で投与される。一部のある実施形態では、抗Ｃ５剤は、被験体において、臨床的血管新生眼疾患と相関する網膜血管密度のレベルを予防するのに充分な量で投与される。一部のある実施形態では、被験体は、新生血管形成眼障害を発症するリスクがある被験体である。一部のある実施形態では、該方法は、さらに、抗Ｃ５剤の投与前に、被験体にＣ５、Ｃ５ａおよび／またはＣ５ｂ−９媒介性の新生血管形成眼障害を発症するリスクがあるか否かを同定することを含む。一部のある実施形態では、該同定工程は、被験体においてドルーゼンの存在を検出すること、および臨床的視力低下の非存在を検出することを含む。一部のある実施形態では、該同定工程は、被験体の補体Ｈ因子における変化を検出することを含む。
【００３１】
上記の方法の一部のある実施形態では、該方法は、さらに、被験体に、抗ＶＥＧＦ剤、特に、核酸分子、アプタマー、アンチセンス分子、ＲＮＡｉ分子、タンパク質、ペプチド、環状ペプチド、抗体または抗体フラグメント、糖、ポリマーおよび小分子からなる群より選択される抗ＶＥＧＦ剤を投与する工程を含む。
【００３２】
上記の方法の一部のある実施形態では、該方法は、さらに、被験体に抗ＰＤＧＦ剤を投与する工程を含み、特に、抗ＰＤＧＦ剤は、核酸分子、アプタマー、アンチセンス分子、ＲＮＡｉ分子、タンパク質、ペプチド、環状ペプチド、抗体または抗体フラグメント、糖、ポリマーおよび小分子からなる群より選択される。
【００３３】
上記の方法の一部のある実施形態では、該方法は、さらに、抗血管形成剤を被験体に投与することを含む。一部のある実施形態では、抗血管形成剤はポルフィリン誘導体である。一部のある実施形態において、ポルフィリン誘導体は、注射用ベルテポルフィン（Ｖｉｓｕｄｙｎｅ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅａｓｔ  Ｈａｎｏｖｅｒ、ＮＪ）である。一部のある実施形態では、該方法は、さらに、ポルフィリン誘導体をレーザー光で活性化する工程を含む。
【００３４】
一実施形態において、抗Ｃ５剤を、それを必要とする被験体に、非滲出型のＡＭＤが安定化、治療および／または予防されるのに充分な量で投与することを含む、Ｃ５、Ｃ５ａおよび／またはＣ５ｂ−９媒介性の非滲出型のＡＭＤを安定化、治療および／または予防する方法を提供する。非滲出型のＡＭＤが安定化される一実施形態では、抗Ｃ５剤が、抗Ｃ５剤投与時の被験体のドルーゼンのレベルと比較したとき、ほぼ同じレベルのドルーゼンを維持するのに充分な量で投与される。非滲出型のＡＭＤが安定化される一実施形態において、抗Ｃ５剤は、抗Ｃ５剤投与時の被験体の視力と比較したとき、該被験体においてほぼ同じ視力レベル量を維持するのに充分な量で投与される。非滲出型のＡＭＤが処置される一実施形態において、抗Ｃ５剤は、抗Ｃ５剤投与時の被験体のドルーゼンのレベルと比較したとき、ドルーゼンのレベルを低減させるのに充分な量で投与される。非滲出型のＡＭＤが処置される一実施形態において、抗Ｃ５剤は、抗Ｃ５剤投与時の被験体の視力と比較して該被験体の視力を改善するのに充分な量で投与される。非滲出型のＡＭＤが予防される一実施形態において、該方法は、抗Ｃ５剤を、それを必要とする被験体に、Ｃ５、Ｃ５ａおよび／またはＣ５ｂ−９媒介性の非滲出性ＡＭＤの臨床症状を予防するのに充分な量で投与することを含む。一部のある実施形態では、抗Ｃ５剤は、被験体において臨床的視力低下を予防するのに充分な量で投与される。一部のある実施形態では、抗Ｃ５剤は、臨床ドルーゼンのレベルの累積を予防するのに充分な量で投与される。一部のある実施形態において、被験体は、非滲出性ＡＭＤを発症するリスクがある被験体である。一部のある実施形態では、該方法は、さらに、抗Ｃ５剤の投与前に、被験体にＣ５、Ｃ５ａおよび／またはＣ５ｂ−９媒介性の非滲出性ＡＭＤを発症するリスクがあるか否かを同定することを含む。一部のある実施形態では、該同定工程は、被験体においてドルーゼンの存在を検出すること、および臨床的視力低下の非存在を検出することを含む。一部のある実施形態では、同定工程は、被験体の補体Ｈ因子における変化を検出することを含む。
【００３５】
上記の方法の一部のある実施形態では、抗Ｃ５剤は、核酸分子、アプタマー、アンチセンス分子、ＲＮＡｉ分子、タンパク質、ペプチド、環状ペプチド、抗体または抗体フラグメント、糖、ポリマーおよび小分子からなる群より選択される。特別な実施形態では、抗Ｃ５剤はＣ５特異的アプタマーであり、より詳しくは、配列番号１〜６７、７５〜８１および８８〜９８からなる群より選択されるＣ５特異的アプタマーである。好ましい一実施形態において、上記の方法における使用のためのＣ５特異的アプタマーは、ＡＲＣ１８７（配列番号５）およびＡＲＣ１９０５（配列番号６７）からなる群より選択される。
【００３６】
上記の方法の一部のある実施形態では、抗Ｃ５剤は眼投与によって、特に、硝子体内投与によって送達される。上記の方法の一部のある実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤、抗ＰＤＧＦ剤および／または抗血管形成剤が眼投与によって送達される。上記の方法の一部のある実施形態では、投与される抗Ｃ５剤、抗ＶＥＧＦ剤、抗ＰＤＧＦ剤および／または抗血管形成剤がプロドラッグである。上記の方法の一部のある実施形態では、被験体がヒトである。
【００３７】
用語「抗Ｃ５剤投与時」は、上記の方法において用いる場合、抗Ｃ５剤投与の前に対象の症状が臨床的に測定された時点を包含する。
【００３８】
一実施形態において、治療有効量の抗補体アプタマーを、それを必要とする被験体に投与することを含む、補体媒介性の非滲出型のＡＭＤを安定化、治療および／または予防する方法を提供する。非滲出型のＡＭＤが安定化される一実施形態において、抗補体アプタマーは、抗補体アプタマーの投与時の被験体のドルーゼンのレベルと比較したとき、ほぼ同じレベルのドルーゼン（例えば、大きさ、数、面積および／または形態構造）を維持するのに充分な量で投与される。非滲出型のＡＭＤが安定化される一実施形態において、抗補体アプタマーは、地図状萎縮、例えば、網膜の色素上皮、光レセプターおよび／または脈絡膜毛細管の萎縮の進行を安定化するのに充分な量、抗補体アプタマーの投与時の被験体のレベルと比較したとき地図状萎縮をほぼ同じレベルに維持するのに充分な量で投与される。非滲出型のＡＭＤが安定化される一実施形態において、抗補体アプタマーは、抗補体アプタマーの投与時の被験体の視力と比較したとき、該被験体において、ほぼ同じ視力レベル量を維持するのに充分な量で投与される。
【００３９】
非滲出型のＡＭＤが処置される一実施形態において、抗補体アプタマーは、抗補体アプタマーの投与時の被験体のドルーゼンのレベルと比較したとき、ドルーゼン、特に、大きいもので、軟性であるドルーゼンのレベルを低減させるのに充分な量で投与される。非滲出型のＡＭＤが処置される一実施形態において、抗補体アプタマーが、抗補体アプタマーの投与時の被験体の視力と比較したとき被験体の視力を改善するのに充分な量で投与される。
【００４０】
非滲出型のＡＭＤが予防される一実施形態において、該方法は、抗補体アプタマーを、それを必要とする被験体に、補体媒介性非滲出性ＡＭＤの臨床症状を予防するのに充分な量で投与することを含む。一部のある実施形態では、抗補体アプタマーが、被験体において臨床的視力低下を予防するのに充分な量で投与される。一部のある実施形態では、抗補体アプタマーは、臨床ドルーゼン、特に、大きいもので、軟性であるドルーゼンのレベルの累積を予防するのに充分な量で投与される。一部のある実施形態では、抗補体アプタマーは、地図状萎縮の臨床レベルを予防するのに充分な量で投与される。一部のある実施形態では、抗補体アプタマーは、非滲出型のＡＭＤを有する被験体に、該被験体において滲出性ＡＭＤの進行を予防するのに充分な量で投与される。一部のある実施形態では、抗補体アプタマーは、加齢性黄斑症（ドルーゼンの存在、網膜の色素沈着変化および／または小領域の萎縮を特徴とする）を有する被験体に、該被験体において滲出性ＡＭＤの進行または地図状萎縮の臨床レベルを予防するのに充分な量で投与される。
【００４１】
一部のある実施形態において、被験体は、非滲出性ＡＭＤを発症するリスクがある被験体である。一部のある実施形態において、該方法は、さらに、抗補体アプタマーの投与前に、被験体に補体媒介性非滲出性ＡＭＤを発症するリスクがあるか否かを同定することを含む。一部のある実施形態では、該同定工程は、被験体においてドルーゼン（特に、大きいもので、軟性であるドルーゼン）の存在、網膜の色素沈着および／または萎縮の範囲の変化を検出すること、ならびに臨床的視力低下の非存在を検出することを含む。一部のある実施形態では、同定工程は、野生型と比較した被験体の補体Ｈ因子における変化を検出することを含む。
【００４２】
上記の方法の一部のある実施形態では、抗補体アプタマーは、古典的補体経路の成分、第２補体経路の成分およびレクチン経路の成分からなる群より選択される補体標的を阻害する。一部のある実施形態では、抗補体アプタマーは、膜攻撃経路の補体標的を阻害する。一部のある実施形態において、抗補体アプタマーは、Ｃ１、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ａレセプター、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ５ａ、Ｃ５ａレセプター、Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃｌ、Ｃ８、Ｃ９、Ｂ因子、Ｄ因子、プロペルジン、マンナン結合レクチン（以下、本明細書において「ＭＢＬ」）、ＭＢＬ結合型セリンプロテアーゼ１（「ＭＡＳＰ１」）およびＭＢＬ結合型セリンプロテアーゼ２（「ＭＡＳＰ２」）からなる群より選択される補体標的を阻害する。一部のある実施形態では、抗補体アプタマーは、Ｃ３ａ、Ｃ３ａレセプター、Ｃ５ａおよびＣ５ａレセプターからなる群より選択される補体標的に対して親和性および高い特異性を有するアプタマーではない。一部のある実施形態では、抗補体アプタマーは、Ｂ因子およびＤ因子からなる群より選択される補体標的に対して親和性および高い特異性を有するアプタマーではない。
【００４３】
上記の方法の一部のある実施形態では、抗補体アプタマーは、被験体に眼投与によって、特に、硝子体内または眼周囲投与によって送達される。一部のある実施形態では、被験体に投与される抗補体アプタマーは、デポー製剤に含まれる。
【００４４】
用語「抗補体アプタマー投与時」は、本明細書で用いる場合、対象の症状が臨床的に測定または評価された時点を包含し、この場合、測定または評価は、抗補体アプタマー投与前から抗補体アプタマー投与後まで（直後での測定を含む）、例えば、投与１２時間後、２４時間後または４８時間後まで範囲の時点のものである。
【００４５】
一部のある実施形態において、治療有効量の、例えば、補体媒介性眼障害を安定化、治療および／または予防するのに充分な量の抗補体アプタマーを含む眼科用医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物に、薬学的に許容され得る担体または希釈剤を含めてもよい。この態様において、本発明は、眼の補体標的の機能を生体内で、特にヒト被験体において阻害するアプタマーまたはその塩の治療有効量、および薬学的に許容され得る担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。一部のある実施形態では、眼科用医薬組成物は、デポー製剤を含むものである。
【００４６】
一実施形態において、上記の方法における使用のための抗補体アプタマーは、Ｃ５を生体内で、好ましくはヒトＣ５を阻害するアプタマーである。特別な一実施形態において、上記の方法における使用のための、ＰＥＧ部分にコンジュゲートさせたＡＲＣ１８６（配列番号４）による抗Ｃ５アプタマー、またはＡＲＣ１８６（配列番号４）によるヌクレオチド配列を含むアプタマーを提供する。特別な実施形態では、このＡＲＣ１８６アプタマー／ＰＥＧコンジュゲートは、Ｃ５補体タンパク質に対して、配列番号４による配列からなるがＰＥＧ部分を欠くアプタマーと実質的に同じ結合親和性を含む。実質的に同じ結合親和性は、本明細書で用いる場合、ドットブロット解析によって測定される解離定数における約２以下〜１０倍の差、好ましくは、２以下〜５倍の差を意味する。一部のある実施形態において、解離定数は、以下の実施例ＩＡに記載のような競合ドットブロット解析によって測定される。一部のある実施形態では、ポリエチレングリコール部分は、１０ｋＤＡより大きい分子量、特に、２０ｋＤＡ、より特別には３０ｋＤＡ、さらに特別には４０ｋＤＡの分子量を含む。一部のある実施形態では、ＰＥＧ部分は、ＡＲＣ１８６（配列番号４）の５’末端にコンジュゲートされる。一部のある実施形態において、アプタマー／ＰＥＧコンジュゲートは、２コンパートメントモデルにおいて、以下の実施例５Ｅに記載の方法によって測定したとき、霊長類にて、少なくとも１５時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間の半減期、好ましくは終末半減期を含む。一部のある実施形態において、アプタマー／ＰＥＧコンジュゲートは、２コンパートメントモデルにおいて、ラットにて少なくとも１０時間、好ましくは少なくとも１５時間の半減期、好ましくは終末半減期を含む。一部のある実施形態では、ＡＲＣ１８６（配列番号４）の５’末端にコンジュゲートさせたＰＥＧは、４０ｋＤａのＰＥＧである。特別な実施形態において、４０ｋＤａのＰＥＧは分枝ＰＥＧである。一部のある実施形態において、４０ｋＤａの分枝ＰＥＧは、１，３−ビス（ｍＰＥＧ−［２０ｋＤａ］）−プロピル−２−（４’−ブタミド）である。他の実施形態では、４０ｋＤａの分枝ＰＥＧは、２，３−ビス（ｍＰＥＧ−［２０ｋＤａ］）−プロピル−１−カルバモイルである。
【００４７】
４０ｋＤａの分枝ＰＥＧが１，３−ビス（ｍＰＥＧ−［２０ｋＤａ］）−プロピル−２−（４’−ブタミド）である実施形態において、以下に示す構造を有するアプタマーを提供する：
【００４８】
【化１】
0005406534.tif 000002
ここで、ｆＣおよびｆＵ＝２’−フルオロヌクレオチド、ならびにｍＧおよびｍＡ＝２’−ＯＭｅヌクレオチドであり、すべての他のヌクレオチドは２’−ＯＨであり、３Ｔは、逆位デオキシチミジンを示す。
【００４９】
４０ｋＤＡの分枝ＰＥＧが２，３−ビス（ｍＰＥＧ−［２０ｋＤａ］）−プロピル−１−カルバモイルである実施形態において、以下に示す構造を有するアプタマーを提供する：
【００５０】
【化２】
0005406534.tif 000003
ここで、ｆＣおよびｆＵ＝２’−フルオロヌクレオチド、ならびにｍＧおよびｍＡ＝２’−ＯＭｅヌクレオチドであり、すべての他のヌクレオチドは２’−ＯＨであり、３Ｔは、逆位デオキシチミジンを示す。
【００５１】
本発明のこの態様の一部のある実施形態において、リンカーはアルキルリンカーである。特別な実施形態では、アルキルリンカーは、２〜１８個の連続するＣＨ２基を含む。好ましい実施形態において、アルキルリンカーは２〜１２個の連続するＣＨ２基を含む。特に好ましい実施形態において、アルキルリンカーは３〜６個の連続するＣＨ２基を含む。
【００５２】
特別な一実施形態において、以下に示す構造を有するアプタマーＡＲＣ１８７（配列番号５）を提供する：
【００５３】
【化３】
0005406534.tif 000004
ここで、ｆＣおよびｆＵ＝２’−フルオロヌクレオチド、ならびにｍＧおよびｍＡ＝２’−ＯＭｅヌクレオチドであり、すべての他のヌクレオチドは２’−ＯＨであり、３Ｔは、逆位デオキシチミジンを示す。
【００５４】
別の実施形態において、以下に示す構造を有するアプタマーＡＲＣ１９０５（配列番号６７）を提供する：
【００５５】
【化４】
0005406534.tif 000005
ここで、ｆＣおよびｆＵ＝２’−フルオロヌクレオチド、ならびにｍＧおよびｍＡ＝２’−ＯＭｅヌクレオチドであり、すべての他のヌクレオチドは２’−ＯＨであり、３Ｔは、逆位デオキシチミジンを示す。
【００５６】
一実施形態において、被験体において補体媒介性眼障害を処置、安定化および／または予防するのに有効な量のＡＲＣ１８６（配列番号４）、ＡＲＣ１８７（配列番号５もしくはＡＲＣ１９０５（配列番号６７）またはその塩を含む眼科用医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物に、薬学的に許容され得る担体または希釈剤を含めてもよい。この態様において、本発明は、Ｃ５補体タンパク質の切断を生体内で阻害するアプタマーまたはその塩の治療有効量、および薬学的に許容され得る担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。本発明のこの態様では、生体内における眼疾患の処置、安定化および／または予防における使用のためのＡＲＣ１８６（配列番号４）、ＡＲＣ１８７（配列番号５）またはＡＲＣ１９０５（配列番号６７）の医薬組成物が提供される。また、本発明のこの態様では、被験体において補体媒介性眼疾患の処置、安定化および／または予防のための医薬組成物の調製における使用のためのＡＲＣ１８６（配列番号４）、ＡＲＣ１８７（配列番号５）またはＡＲＣ１９０５（配列番号６７）を提供する。
【００５７】
別の実施形態では、本発明の補体媒介性の眼の治療法における使用のための医薬組成物の調製における使用のための、配列番号１〜６９、７５、７６、８１、９１、９５および９６からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む抗Ｃ５アプタマーの治療有効量を含む本発明の眼科用医薬組成物を提供する。この態様において、本発明は、Ｃ５補体タンパク質の切断を生体内で阻害するアプタマーまたはその塩の治療有効量、および薬学的に許容され得る担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
【００５８】
別の態様において、本発明は、医薬組成物を提供する。一実施形態において、ＡＲＣ１８７（配列番号５もしくはＡＲＣ１９０５（配列番号６７）またはその塩の治療有効量を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物に、薬学的に許容され得る担体または希釈剤を含めてもよい。この態様において、本発明は、Ｃ５補体タンパク質の切断を生体内で阻害するアプタマーまたはその塩の治療有効量、および薬学的に許容され得る担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。本発明のこの態様では、生体内での疾患の治療、予防または改善における使用のためのＡＲＣ１８７（配列番号５）またはＡＲＣ１９０５（配列番号６７）の医薬組成物が提供される。また、本発明のこの態様では、医薬組成物の調製における使用のためのＡＲＣ１８７（配列番号５）またはＡＲＣ１９０５（配列番号６７）が提供される。
【００５９】
本発明の別の態様では、治療法を提供する。一実施形態において、本発明の方法は、Ｃ５補体タンパク質および／またはその誘導体Ｃ５ａやＣ５ｂ−９によって媒介される疾患を治療、予防または改善することを含み、該方法は、ＡＲＣ１８７（配列番号５もしくはＡＲＣ１９０５（配列番号６７）またはその塩を含む医薬組成物を脊椎動物に投与することを含む。一部のある実施形態では、該方法は、本発明の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む。一部のある実施形態では、哺乳動物がヒトである。
【００６０】
一部のある実施形態において、処置されるＣ５補体タンパク質、Ｃ５ａおよび／またはＣ５ｂ−９媒介性疾患は、急性虚血性疾患（心筋梗塞、脳卒中、虚血性／再灌流障害）；急性炎症性疾患（感染性疾患、敗血症、ショック、急性／超急性移植片拒絶）；慢性炎症性および／または免疫媒介性疾患、例えば、糖尿病性網膜症、黄斑変性（例えば、滲出性および非滲出性形態のＡＭＤ）、また、例えば、アレルギー、喘息、慢性関節リウマチ、および他のリウマチ性疾患、多発性硬化症および他の神経科系疾患、乾癬および他の皮膚科系疾患、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ））；ならびに亜急性／慢性炎症性および／または免疫媒介性疾患（例えば、移植片拒絶、糸球体腎炎および他の腎疾患ならびに眼疾患）である。一部のある実施形態において、処置されるＣ５補体タンパク質、Ｃ５ａおよび／またはＣ５ｂ−９媒介性疾患としては、透析あるいは血液が合成チューブおよび／または異物上および／またはその内部を通過する環境と関連する補体活性化が挙げられる。一部のある実施形態では、処置されるＣ５補体タンパク質、Ｃ５ａおよび／またはＣ５ｂ−９媒介性疾患は、ＣＡＢＧ術に関連する心筋損傷、バルーン式血管形成術に関連する心筋損傷および再狭窄に関連する心筋損傷からなる群より選択される。一部のある実施形態では、処置されるＣ５補体タンパク質、Ｃ５ａおよび／またはＣ５ｂ−９媒介性障害は、ＣＡＢＧ術に関連する心筋損傷、バルーン式血管形成術に関連する心筋損傷、再狭窄に関連する心筋損傷、ＣＡＢＧ術に関連する補体タンパク質媒介性合併症、経皮的冠動脈インターベンションに関連する補体タンパク質媒介性合併症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、急性移植片拒絶、超急性移植片拒絶、亜急性移植片拒絶、および慢性移植片拒絶からなる群より選択される。一部のある実施形態において、処置されるＣ５補体タンパク質Ｃ５ａおよび／またはＣ５ｂ−９媒介性疾患は、ＣＡＢＧ術に関連する合併症である。特別な一実施形態において、処置される疾患は、ＣＡＢＧ術に関連する心筋損傷である。本発明の治療法の特別な一実施形態において、症状を軽減、安定化および／または予防する疾患は、眼障害、特に、糖尿病性網膜症、滲出性および／または非滲出性ＡＭＤである。
【００６１】
一部のある実施形態において、本発明の方法は、ＡＲＣ１８７（配列番号５）またはＡＲＣ１９０５（配列番号６７）を含む医薬組成物を、内在性Ｃ５補体タンパク質の約０．５〜約１０倍であるアプタマー血漿濃度が達成されるように投与することを含む。一部のある実施形態では、医薬用のＡＲＣ１８７（配列番号５）またはＡＲＣ１９０５（配列番号６７）のアプタマー組成物は、内在性Ｃ５補体タンパク質の約０．７５〜約５倍、０．７５〜約３倍および１．５〜約２倍であるアプタマー血漿濃度が達成されるように投与され、一方、他の実施形態では、アプタマー組成物は、内在性補体タンパク質と同等の濃度が達成されるように投与される。一部のある実施形態では、ＡＲＣ１８７（配列番号５）またはＡＲＣ１９０５（配列番号６７）を含む本発明の医薬組成物は、約５μＭ、約４μＭ、約３μＭ、約２μＭ、約１．５μＭ、約１μＭまたは約５００ｎＭのアプタマー血漿濃度が達成されるように投与される。
【００６２】
本発明のアプタマー血漿濃度が達成されるのに充分な、投与の経路、持続時間および速度の任意の組合せが使用され得る。一部のある実施形態において、医薬組成物は静脈内投与される。一部のある実施形態において、医薬組成物は、ボーラスとして、および／または連続注入によって投与される。
【００６３】
ＣＡＢＧ術と関連する合併症、特に、ＣＡＢＧ術と関連する心筋損傷を治療、予防および／または改善する特別な実施形態において、本発明の方法は、医薬組成物を手術の前に投与すること、投与を少なくとも２４時間、一部のある実施形態において約４８時間、または一部のある実施形態において約７２時間継続することを含む。本発明のこの態様の特定の実施形態において、内在性補体タンパク質濃度の約２倍の血漿アプタマー濃度が、より低用量のアプタマーの静脈内注入の前、同時またはその後に、治療対象の患者の体重１ｋｇあたり約０．７５〜１．２５、好ましくは約１ｍｇのアプタマーの静脈内ボーラスの投与によって達成され、ここで、ｍｇは、コンジュゲートされたＰＥＧの重量は含まない。一部のある実施形態において、該より低用量は、０．００１〜０．００５ｍｇ／ｋｇ／分の範囲から選択される速度で注入され、ここで、ｍｇは、コンジュゲートされたＰＥＧの重量は含まない。特定の実施形態において、該より低用量は、約０．００１３ｍｇ／ｋｇ／分の速度で注入される。アプタマー／コンジュゲートが充分に長い半減期を含む本発明のこの態様のさらに他の実施形態において、アプタマー医薬組成物は、１日１回または２回、静脈内ボーラス投与として投与され得る。
【００６４】
本発明の別の態様において、診断方法を提供する。一実施形態において、該診断方法は、ＡＲＣ１８７（配列番号５）またはＡＲＣ１９０５（配列番号６７）を、Ｃ５補体タンパク質またはそのバリアントを含むことが疑われる組成物と接触させること、およびＣ５補体タンパク質またはそのバリアントの存在または非存在を検出することを含む。一部のある実施形態において、補体タンパク質またはバリアントは、脊椎動物のもの、特に哺乳動物のもの、より特別にはヒトのものである。本発明は、試験管内または生体内診断剤としての使用のためのＡＲＣ１８７（配列番号５）またはＡＲＣ１９０５（配列番号６７）の組成物を提供する。
【００６５】
本発明の別の態様において、
【００６６】
【化５】
0005406534.tif 000006
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むアプタマーを提供する。別の実施形態において、医薬組成物の調製における使用のための、
【００６７】
【化６】
0005406534.tif 000007
のいずれか１つを提供する。この態様において、本発明は、Ｃ５補体タンパク質の切断を生体内で阻害するアプタマーまたはその塩の治療有効量、および薬学的に許容され得る担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
【００６８】
特別な一実施形態において、配列番号１によるヌクレオチド配列を含むアプタマーを提供する。特別な一実施形態において、配列番号６１、配列番号６２および配列番号６４〜配列番号６６からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むアプタマーを提供する。アプタマーが配列番号６１、配列番号６２および配列番号６４〜配列番号６６からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む一部のある実施形態では、アプタマーは、Ｃ５補体タンパク質に対して、配列番号４による配列からなるがＰＥＧ部分を欠くアプタマーと実質的に同じ結合親和性を含む。
【００６９】
アプタマーが配列番号６１、配列番号６２および配列番号６４〜配列番号６６からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む一部のある実施形態において、アプタマーは、以下の実施例５Ｅにおいて測定したとき２コンパートメントモデルにおいて、霊長類で、少なくとも１５、好ましくは少なくとも３０時間の半減期、好ましくは終末半減期を含む。アプタマーが配列番号６１、配列番号６２および配列番号６４〜配列番号６６からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む一部のある実施形態において、アプタマーは、２コンパートメントモデルにおいて、ラットで、少なくとも１時間半、好ましくは少なくとも７時間の半減期、好ましくは終末半減期を含む。
【００７０】
アプタマーが配列番号６１、配列番号６２および配列番号６４〜配列番号６６からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む本発明のこの態様の一部のある実施形態において、アプタマーは、以下のような５’リンカーを用いて合成される：
【００７１】
【化７】
0005406534.tif 000008
一部のある実施形態において、リンカーは、以下のような：Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）ｎ５’アプタマー３’（式中、ｎ＝２〜１８、好ましくは、ｎ＝２〜１２、より好ましくはｎ＝３〜６、より好ましくは、ｎ＝６）アルキルリンカーであり、
【００７２】
【化８】
0005406534.tif 000009
ここで、ｆＣおよびｆＵ＝２’−フルオロヌクレオチド、ならびにｍＧおよびｍＡ＝２’−ＯＭｅヌクレオチドであり、すべての他のヌクレオチドは２’−ＯＨであり、３Ｔは、逆位デオキシチミジンを示す。得られるアミン修飾型アプタマーは、１０ｋＤａのＰＥＧ、２０ｋＤａのＰＥＧ、３０ｋＤａのＰＥＧおよび４ＯｋＤａの線状ＰＥＧからなる群より選択されるＰＥＧ部分にコンジュゲートさせたものであり得る。一部のある実施形態において、配列番号１、配列番号２および配列番号６〜配列番号６６からなる群、特に、配列番号６１、配列番号６２および配列番号６４〜配列番号６６からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むアプタマーまたはその塩の治療有効量を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物に、薬学的に許容され得る担体または希釈剤を含めてもよい。本発明のこの態様では、生体内での疾患の治療、予防または改善における使用のための、配列番号２および配列番号６〜配列番号６６からなる群、特に、配列番号６１、配列番号６２および配列番号６４〜配列番号６６からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むアプタマーを含む医薬組成物が提供される。
【００７３】
別の実施形態において、配列番号２および配列番号６〜配列番号６６からなる群、特に、配列番号６１、配列番号６２および配列番号６４〜配列番号６６からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むアプタマーまたはその塩を含む医薬組成物を、脊椎動物に投与することを含む、Ｃ５補体タンパク質によって媒介される疾患を治療、予防または改善する方法を提供する。本発明のこの態様の一部のある実施形態において、該方法は、本発明の医薬組成物を哺乳動物に、好ましくはヒトに投与することを含む。
【００７４】
一部のある実施形態において、処置されるＣ５補体タンパク質、Ｃ５ａおよび／またはＣ５ｂ−９媒介性疾患は、急性虚血性疾患（心筋梗塞、脳卒中、虚血性／再灌流障害）；急性炎症性疾患（感染性疾患、敗血症、ショック、急性／超急性移植片拒絶）；慢性炎症性および／または免疫媒介性疾患、例えば、糖尿病性網膜症、黄斑変性（例えば、滲出性および非滲出性形態のＡＭＤ）、また、例えば、アレルギー、喘息、慢性関節リウマチおよび他のリウマチ性疾患、多発性硬化症および他の神経科系疾患、乾癬および他の皮膚科系疾患、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；ならびに亜急性／慢性炎症性および／または免疫媒介性疾患（例えば、移植片拒絶、糸球体腎炎および他の腎疾患）ならびに眼疾患である。一部のある実施形態では、処置されるＣ５補体タンパク質、Ｃ５ａおよび／またはＣ５ｂ−９媒介性疾患としては、透析あるいは血液が合成チューブおよび／または異物上および／またはその内部を通過する環境と関連する補体活性化が挙げられる。一部のある実施形態では、処置されるＣ５補体タンパク質Ｃ５ａおよび／またはＣ５ｂ−９媒介性疾患は、ＣＡＢＧ術に関連する心筋損傷、バルーン式血管形成術に関連する心筋損傷および再狭窄に関連する心筋損傷からなる群より選択される。一部のある実施形態では、処置されるＣ５補体タンパク質、Ｃ５ａおよび／またはＣ５ｂ−９媒介性障害は、ＣＡＢＧ術に関連する心筋損傷、バルーン式血管形成術に関連する心筋損傷、再狭窄に関連する心筋損傷、ＣＡＢＧ術に関連する補体タンパク質媒介性合併症、経皮的冠動脈インターベンションに関連する補体タンパク質媒介性合併症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、急性移植片拒絶、超急性移植片拒絶、亜急性移植片拒絶、および慢性移植片拒絶からなる群より選択される。一部のある実施形態において、処置されるＣ５補体タンパク質Ｃ５ａおよび／またはＣ５ｂ−９媒介性疾患は、ＣＡＢＧ術に関連する合併症である。特別な一実施形態において、処置される疾患は、ＣＡＢＧ術に関連する心筋損傷である。本発明の治療法の特別な一実施形態において、症状を軽減、安定化および／または予防する疾患は眼障害、特に、糖尿病性網膜症、滲出性および／または非滲出性ＡＭＤである。
【００７５】
一部のある実施形態において、本発明の方法は、配列番号２および配列番号６〜配列番号６６からなる群、特に、配列番号６１、配列番号６２および配列番号６４〜配列番号６６からなる群より選択されるヌクレオチド配列有するアプタマーを含む医薬組成物を、患者に、内在性Ｃ５補体タンパク質の約０．５〜約１０倍であるアプタマー血漿濃度が達成されるように投与することを含む。一部のある実施形態では、アプタマー医薬組成物は、内在性Ｃ５補体タンパク質の約０．７５〜約５倍、０．７５〜約３倍および１．５〜約２倍であるアプタマー血漿濃度が達成されるように投与され、一方、他の実施形態では、アプタマー組成物は、内在性補体タンパク質と同等の濃度が達成されるように投与される。一部のある実施形態では、本発明の医薬組成物は、約５μＭ、約４μＭ、約３μＭ、約２μＭ、約１．５μＭ、約１μＭまたは約５００ｎＭのアプタマー血漿濃度が達成されるように投与される。
【００７６】
本発明のアプタマー血漿濃度が達成されるのに充分な、投与の経路、持続時間および速度の任意の組合せが使用され得る。一部のある実施形態において、医薬組成物は静脈内投与される。一部のある実施形態において、医薬組成物は、ボーラスとして、および／または連続注入によって投与される。
【００７７】
ＣＡＢＧ術と関連する合併症、特に、ＣＡＢＧ術と関連する心筋損傷を治療、予防および／または改善する特別な実施形態において、本発明の方法は、医薬組成物を外科手術の前に投与すること、および投与を少なくとも２４時間、一部のある実施形態において約４８時間、または一部のある実施形態において約７２時間継続することを含む。本発明のこの態様の特別な一実施形態において、所望のアプタマー血漿濃度、例えば、一部のある実施形態において内在性補体タンパク質濃度の２倍が、より低用量のアプタマーの静脈内注入の前、同時またはその後に、治療対象の患者への静脈内ボーラスの投与によって達成される。アプタマー／コンジュゲートが充分に長い半減期を含む本発明のこの態様のさらに他の実施形態において、アプタマー医薬組成物は、１日１回または２回、静脈内ボーラス投与として投与され得る。
【００７８】
本発明の別の態様において、診断方法を提供する。一実施形態において、該診断方法は、組成物を、配列番号２および配列番号６〜配列番号６６からなる群、特に、配列番号６１、配列番号６２および配列番号６４〜配列番号６６からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むアプタマーと接触させること、ならびに該組成物においてＣ５補体タンパク質またはそのバリアントの存在または非存在を検出することを含む。一部のある実施形態において、補体タンパク質またはバリアントは脊椎動物のもの、特に哺乳動物のもの、より特別にはヒトのものである。本発明は、試験管内または生体内診断剤としての使用のための、配列番号２および配列番号６〜配列番号６６からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むアプタマーを有するアプタマー組成物を提供する。本発明において、医薬組成物の調製における使用のための、配列番号２および配列番号６〜配列番号６６からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むアプタマーを提供する。
【００７９】
本発明の別の態様において、配列番号７５〜８１、配列番号８３および配列番号８８〜９８からなる群より選択される配列のいずれか１つと８０％同一であるヌクレオチド配列を含むアプタマーを提供する。一部のある実施形態では、配列番号７５〜８１および配列番号８８〜９８からなる群より選択される配列のいずれか１つの非反復領域と８０％同一であるヌクレオチド配列を含むアプタマーを提供する。別の実施形態において、配列番号７５〜８１、配列番号８３および配列番号８８〜９８からなる群より選択される配列のいずれか１つと９０％同一であるヌクレオチド配列を含むアプタマーを提供する。特別な一実施形態において、配列番号７５〜８１および配列番号８８〜９８からなる群より選択される配列のいずれか１つの非反復領域と９０％同一であるヌクレオチド配列を含むアプタマーを提供する。また別の実施形態において、配列番号７５〜８１および配列番号８８〜９８からなる群より選択される配列のいずれか１つに含まれる４０個の連続するヌクレオチドと同一である４０個の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むアプタマーを提供する。別の実施形態において、配列番号７５〜８１、配列番号８３および配列番号８８〜９８からなる群より選択される配列のいずれか１つに含まれる３０個の連続するヌクレオチドと同一である３０個の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むアプタマーを提供する。また別の実施形態において、Ｃ５補体タンパク質に特異的に結合し、配列番号７５〜８１、配列番号８３および配列番号８８〜９８からなる群より選択される配列のいずれか１つに含まれる１０個の連続するヌクレオチドと同一である１０個の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むアプタマーを提供する。好ましい一実施形態において、配列番号７５〜８１、配列番号８３および配列番号８８〜９８からなる群より選択されるヌクレオチド配列のいずれか１つによるヌクレオチド配列を含むアプタマーを提供する。
【００８０】
一部のある実施形態において、上記の本発明のアプタマーは、さらに、核酸配列の糖鎖の位置における化学的置換；リン酸主鎖の位置における化学的置換；および塩基の位置における化学的置換からなる群より選択される化学修飾を含むものであり得る。一部のある実施形態において、該修飾は、修飾ヌクレオチドの組込み；３’キャッピング、高分子量の非免疫原性の化合物へのコンジュゲーション；親油性化合物へのコンジュゲーション；およびリン酸主鎖の修飾からなる群より選択される。
【００８１】
本発明のこの態様の好ましい実施形態において、アプタマーは、Ｃ５補体タンパク質またはそのバリアントの機能をモジュレートするものである。特に好ましい実施形態において、アプタマーは、Ｃ５補体タンパク質またはそのバリアントの機能を、好ましくは生体内で、より好ましくはヒト生体内において阻害するものである。本発明のこの態様の一実施形態において、アプタマーによってモジュレートされる（好ましくは、阻害される）機能は、Ｃ５補体タンパク質の切断である。
【００８２】
別の態様の一部のある実施形態において、本発明は、Ｃ５補体タンパク質の切断を生体内でブロックするアプタマーまたはその塩の治療有効量、および薬学的に許容され得る担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
【００８３】
一部のある実施形態において、配列番号７５〜８１、配列番号８３および配列番号８８〜９８からなる群より選択されるヌクレオチド配列と８０％同一である、好ましくは９０％同一であるヌクレオチド配列を含むアプタマーまたはその塩の治療有効量を含む医薬組成物を提供する。一部のある実施形態では、配列番号７５〜８１、配列番号８３および配列番号８８〜９８からなる群より選択されるヌクレオチド配列非反復領域と８０％同一である、好ましくは９０％同一であるヌクレオチド配列を含むアプタマーまたはその塩の治療有効量を含む医薬組成物を提供する。他の実施形態において、配列番号７５〜８１、配列番号８３および配列番号８８〜９８からなる群より選択されるヌクレオチド配列の４０、３０または１０個のヌクレオチドと、それぞれ同一である４０、３０または１０個の連続するヌクレオチドを有するアプタマーの治療有効量を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物に、薬学的に許容され得る担体または希釈剤を含めてもよい。本発明のこの態様では、生体内での疾患の治療、予防または改善における使用のための医薬組成物であって、配列番号３〜４、配列番号７５〜８１、配列番号８３および配列番号８８〜９８からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するアプタマーまたはその塩を含む医薬組成物が提供される。この態様では、医薬組成物の調製における使用のための、配列番号３〜４、配列番号７５〜８１、配列番号８３および配列番号８８〜９８からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するアプタマーが提供される。この態様において、本発明は、Ｃ５補体タンパク質の切断を生体内で阻害するアプタマーまたはその塩の治療有効量、および薬学的に許容され得る担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
【００８４】
一部のある実施形態において、処置されるＣ５補体タンパク質、Ｃ５ａおよび／またはＣ５ｂ−９媒介性疾患は、急性虚血性疾患（心筋梗塞、脳卒中、虚血性／再灌流障害）；急性炎症性疾患（感染性疾患、敗血症、ショック、急性／超急性移植片拒絶）；慢性炎症性および／または免疫媒介性疾患、例えば、糖尿病性網膜症、黄斑変性（例えば、滲出性および非滲出性形態のＡＭＤ）、また、例えば、アレルギー、喘息、慢性関節リウマチおよび他のリウマチ性疾患、多発性硬化症および他の神経科系疾患、乾癬および他の皮膚科系疾患、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、亜急性／慢性移植片拒絶、糸球体腎炎および他の腎疾患）；ならびに眼疾患である。一部のある実施形態では、処置されるＣ５補体タンパク質、Ｃ５ａおよび／またはＣ５ｂ−９媒介性疾患としては、透析あるいは血液が合成チューブおよび／または異物上および／またはその内部を通過する環境と関連する補体活性化が挙げられる。一部のある実施形態では、処置されるＣ５補体タンパク質Ｃ５ａおよび／またはＣ５ｂ−９媒介性疾患は、ＣＡＢＧ術に関連する心筋損傷、バルーン式血管形成術に関連する心筋損傷および再狭窄に関連する心筋損傷からなる群より選択される。一部のある実施形態では、処置されるＣ５補体タンパク質、Ｃ５ａおよび／またはＣ５ｂ−９媒介性障害は、ＣＡＢＧ術に関連する心筋損傷、バルーン式血管形成術に関連する心筋損傷、再狭窄に関連する心筋損傷、ＣＡＢＧ術に関連する補体タンパク質媒介性合併症、経皮的冠動脈インターベンションに関連する補体タンパク質媒介性合併症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、急性移植片拒絶、超急性移植片拒絶、亜急性移植片拒絶、および慢性移植片拒絶からなる群より選択される。一部のある実施形態において、処置されるＣ５補体タンパク質Ｃ５ａおよび／またはＣ５ｂ−９媒介性疾患は、ＣＡＢＧ術に関連する合併症である。特別な一実施形態において、処置される疾患は、ＣＡＢＧ術に関連する心筋損傷である。本発明の治療法の特別な一実施形態において、症状を軽減、安定化および／または予防する疾患は眼障害、特に、糖尿病性網膜症、滲出性および／または非滲出性ＡＭＤである。
【００８５】
一部のある実施形態において、本発明の方法は、配列番号３〜４、配列番号７５〜８１、配列番号８３および配列番号８８〜９８からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するアプタマーを含む医薬組成物を、患者に、内在性Ｃ５補体タンパク質の約０．５〜約１０倍であるアプタマー血漿濃度が達成されるように投与することを含む。一部のある実施形態において、アプタマー医薬組成物は、内在性Ｃ５補体タンパク質の約０．７５〜約５倍、０．７５〜約３倍および１．５〜約２倍であるアプタマー血漿濃度が達成されるように投与され、一方、他の実施形態では、アプタマー組成物は、内在性補体タンパク質と同等の濃度が達成されるように投与される。一部のある実施形態では、本発明の医薬組成物は、約５μＭ、約４μＭ、約３μＭ、約２μＭ．約１．５μＭ、約１μＭまたは約５００ｎＭのアプタマー血漿濃度が達成されるように投与される。
【００８６】
本発明のアプタマー血漿濃度が達成されるのに充分な、投与の経路、持続時間および速度の任意の組合せが使用され得る。一部のある実施形態において、医薬組成物は静脈内投与される。一部のある実施形態において、医薬組成物は、ボーラスとして、および／または連続注入によって投与される。
【００８７】
ＣＡＢＧ術と関連する合併症、特に、ＣＡＢＧ術と関連する心筋損傷を治療、予防および／または改善する特別な実施形態において、本発明の方法は、医薬組成物を外科手術の前に投与すること、および投与を少なくとも２４時間、一部のある実施形態において約４８時間、または一部のある実施形態において約７２時間継続することを含む。本発明のこの態様の特別な一実施形態において、所望のアプタマー血漿濃度、例えば、一部のある実施形態において内在性補体タンパク質濃度の２倍が、より低用量のアプタマーの静脈内注入の前、同時またはその後に、治療対象の患者への静脈内ボーラスの投与によって達成される。アプタマー／コンジュゲートが充分に長い半減期を含む本発明のこの態様のさらに他の実施形態において、アプタマー医薬組成物は、１日１回または２回、静脈内ボーラス投与として投与され得る。
【００８８】
別の実施形態において、Ｃ５補体タンパク質またはそのバリアントを含むことが疑われる組成物を、配列番号７５〜８１、配列番号８３および配列番号８８〜９８からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むアプタマーと接触させること、ならびにＣ５補体タンパク質またはそのバリアントの存在または非存在を検出することを含む、診断方法を提供する。一部のある実施形態において、補体タンパク質またはバリアントは脊椎動物のもの、特に哺乳動物のもの、より特別にはヒトのものである。本発明は、試験管内または生体内診断剤としての使用のための、配列番号７５〜８１、配列番号８３および配列番号８８〜９８からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むアプタマーを有するアプタマー組成物を提供する。
【００８９】
一部のある実施形態において、配列番号６８および６９からなる群より選択されるヌクレオチド配列から本質的になるヌクレオチド配列を含むアプタマーを提供する。一部のある実施形態では、配列番号６８および６９からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなるヌクレオチド配列を含むアプタマーを提供する。本発明のこの態様の一部のある実施形態において、アプタマーは診断方法において使用され得る。
【００９０】
一実施形態において、本発明の方法は、補体媒介性眼障害の処置、安定化および／または予防に関し、該方法は、治療有効量の抗補体アプタマーを、それを必要とする被験体に投与する工程を含む。一実施形態において、処置される眼障害は黄斑変性である。一実施形態において、処置される眼障害は新生血管形成眼障害である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９１】
（発明の詳細な説明）
本発明の１つ以上の実施形態の詳細を、以下の付随の説明に示す。本明細書に記載のものと類似または均等の任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料を以下に記載する。本発明の他の特徴、目的および利点は、該記載から明らかとなるであろう。本明細書において、文脈から明白にそうでないことが示される場合以外は、単数形は複数も含む。特に記載のない限り、本明細書において用いるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。矛盾する場合は、本明細書に従うものとする。
【００９２】
抗Ｃ５剤および眼障害
最近のデータにより、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）は炎症媒介性疾患でもあり、補体活性化がある役割を果たしていることが示されている。加齢性黄斑変性（「ＡＭＤ」）は、慢性で進行性の目の疾患であり、米国、欧州および日本において、回復不可能な失明の主な原因となっている。ＡＭＤは、黄斑と呼ばれる網膜の中心部分の進行性の変質を特徴とする。ＡＭＤへの進行の最も明白な指標は、網膜下の黄白色の沈着物であって、網膜細胞の代謝性老廃物由来物質の斑であるドルーゼンの出現である。ドルーゼンの出現は、両方の形態のＡＭＤ：滲出性（「湿性」）および非滲出性（「乾性」）に重要な成分である。湿性ＡＭＤは、網膜直下での新たな血管成長が、ブルーフ膜として知られる膜を貫通して網膜層内に進入した場合に起こる。この異常な血管成長は、一般的に、新脈管形成または（脈絡膜）新生血管形成と呼ばれている。このような新たな血管は、脆弱である傾向にあり、多くの場合、出血して液体が黄斑内に漏出し、場合によっては突発性の、多くの場合で重症な視野の断裂がもたらされる。新たな治療（例えば、ＬｕｃｅｎｔｉｓＴＭ）によって、新脈管形成を停止させ、液体の蓄積を逆転させることができ、少数の患者においては視野を回復させることすらできるが、血管新生病変は、多くの場合、網膜細胞に対して瘢痕化および／または損傷をもたらし、永久的な失明が引き起こされる。湿性ＡＭＤは、一般的に、補体タンパク質（例えば、補体Ｈ因子（ＣＦＨ））を含有するドルーゼンの発生と蓄積が先に起こる。多数の中型から大型のドルーゼンの存在は、地図状萎縮および／または新生血管形成を特徴とする後期疾患への進行の最大リスクと関連している。湿性ＡＭＤを有する患者の大部分は、該疾患の診断後、数ヶ月から２年以内に罹患した目が重症な失明に陥るが、失明は、数時間または数日以内に起こることもあり得る。乾性ＡＭＤは、より緩徐であり、黄斑内の光感受性細胞がゆっくりと萎縮している場合に起こり、罹患した目の中心視野が徐々にぼやけてくる。失明は、ドルーゼンの形成および蓄積によって悪化し、場合によっては、網膜が変質するが、異常な血管成長および出血はない。
【００９３】
病変部内に観察されるドルーゼンおよび炎症性細胞内には、補体成分および炎症の他のメディエータがみられ、これらによりＡＭＤ関連失明が引き起こされる（Ｈａｉｎｅｓら（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０８：４１９−４２１）。ＡＭＤは、補体調節経路における遺伝的欠陥と強く関連している（Ｈａｉｎｅｓら、２００５年）。補体Ｈ因子（ＣＦＨ）をコードする遺伝子における変異は、ＡＭＤと関連する新生血管形成および失明への前駆物質であるドルーゼンの発生に対して、大きくまたは完全に影響を及ぼすことで、ＡＭＤのリスクの増大に寄与するようである（Ｅｄｗａｒｄｓら（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０８：４２１−４２４）。ＣＦＨの主な機能は、Ｃ３ｂに結合して不活化すること、またはＣ３ｂからのＢｂ因子の解離を刺激することにより、第二カスケードコンバターゼの活性を下方調節することである（Ｈａｇｅｍａｎら（２００５）ＰＮＡＳ  １０２（２）：７２２７−７２３２）。最近の遺伝子データにより、湿性ＡＭＤ型ドルーゼンを有する人は、ＣＦＨ対立遺伝子を保有する可能性が５０〜７０％であることが示されており、補体インターベンションとＡＭＤ治療の間に極めて予測的かつ協力な相関性をもたらす（Ｋｌｅｉｎら（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０８：３８５−３８９）。その活性化をブロックするアプタマーである抗Ｃ５は、患者が、ＡＭＤと関連している欠陥性ＣＦＨ遺伝子を保有している場合であってもブロックする。同様に、第二カスケードの標的、例えば、Ｂ因子、Ｄ因子およびプロペルジン、共通カスケード成分（特に、Ｃ３）ならびに膜攻撃複合体の成分の活性を阻害するアプタマーは、患者が、ＡＭＤと関連している欠陥性のＣＦＨ遺伝子を保有している場合であっても活性を阻害する。補体Ｈ因子（ＣＦＨ）遺伝子のいくつかのハプロタイプは、人が黄斑変性（ＡＭＤ）を発症するリスクと関連していることが測定されている。特に、第１染色体上の補体Ｈ因子（ＣＦＨ）のアミノ酸４０２におけるチロシン−ヒスチジン変化は、疾患易罹患性と強く関連するＣＦＨ遺伝子変異の形成をもたらす。該配列変化は、ＣＦＨのヘパリンおよびＣ−反応性タンパク質に結合する領域内である。その遺伝子構成にＣＦＨ遺伝子のこの変異が含まれる人は、ＡＭＤを発症しやすい。米国の黄斑変性１５００万例の約半数は、ＣＦＨ遺伝子変異が原因である可能性がある。黄斑変性を発症する確率は、ＣＦＨ遺伝子変異を有する場合、約２．５〜５．５倍増加する。
【００９４】
ＣＦＨ遺伝子は、炎症性経路（第二補体経路）の調節に関与している。これは、炎症もまた、黄斑変性の発生に重要な役割を果たしていることを示唆する。また、炎症マーカーであるＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）の血中レベルは、黄斑変性において上昇することもわかっている（Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００５年４月１５日；３０８（５７２０）：４１９−２１、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００５年４月１５日；３０８（５７２０）：４２１−４、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００５年４月１５日；３０８（５７２０）：３８５−９）。Ｈ因子のヘパリンおよびＣＲＰ結合領域内でのその位置に基づいて、Ｙ４０２Ｈ変異により、宿主細胞表面へのＨ因子のプロテオグリカンおよびＣＲＰ媒介性の漸増が破壊され得、Ｈ因子が、これらの細胞上に沈着するＣ３ｂを下方調節する能力が妨げられ得る。抑制されないため、宿主組織内での補体経路の増幅により、Ｃ５ａおよびＣ５ｂ−９が無制御に放出されるため、網膜および周囲の血管において炎症が引き起こされる。ＣＦＨは、無制御な補体活性化および炎症を抑制するため、ＣＦＨにおける変異により、炎症およびその影響が増大する。黄斑変性内で起こる過剰な補体（炎症性経路）活性化を低下させることにより、疾患進行を遅らせることが可能であり得る。さらに、そのうち、その遺伝子変異の検出を画像化技術と組合せて使用し、現在可能なよりも早期に進行ＡＭＤを発症するリスクの高い個体が同定されるようになるであろう（ＪＡＭＡ．２００５年４月２０日；２９３（１５）：１８４１０）。
【００９５】
また、補体活性化は、糖尿病性網膜症などの他の眼疾患にも関与しており、網膜血管損傷を悪化または起始させる（Ｚｈａｎｇら、（２００２）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５１：３４９９）。増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）は糖尿病の合併症であり、これは、網膜血管の変化によって引き起こされる。網膜内の血管が損傷されると、血液が漏出し、脆弱な刷毛様の分岐および瘢痕組織が生成され得る。これにより、網膜から脳に送られる視野像がぼやけたり、またはゆがんだりすることがあり得る。糖尿病患者の２５％は、糖尿病性網膜症を患っており、発症率は、Ｉ型糖尿病で、５年後に６０％まで、１０〜１５年後に８０％増大すると推定される。該疾患は、高血糖、基底膜肥厚、周皮細胞喪失、微細動脈瘤および前網膜新生血管形成を特徴とし、これらは、出血および部分網膜剥離により盲目となり得る。非増殖性糖尿病性網膜症は、網膜内微細動脈瘤、出血、神経線維層梗塞、硬性白斑および微小血管異常を特徴とする。黄斑浮腫は、失明の主要な機構である。これは、黄斑（網膜の中心領域）の毛細管内での微細動脈瘤からの血管漏出に起因する。漏出は、硬性白斑または類嚢胞変化を伴う黄斑肥厚に進行し得、これは、多くの場合、種々の程度の中心部の失明をもたらす。増殖性糖尿病性網膜症は、網膜の新生血管形成を特徴とする。これは、網膜の新生血管形成の存在、位置、重症度および随伴出血活発度に従って等級分けされる。これは、重症な失明を伴う。糖尿病性網膜症の病態は、以下の疾患状態に起因し得る。循環系の問題により、網膜領域に酸素枯渇または虚血性状態が引き起こされる。新生血管形成により、充分な酸素レベルを維持するために硝子体内で新たな血管の成長の開始が引き起こされる。新たに形成された毛細管からの血液滲出および瘢痕組織の形成により、網膜上に牽引力が生じ、小さな裂傷が引き起こされる。裂傷が生じた後、網膜層下または層間に液体が溜まり、剥離が起こる。患者は、出血、浮腫および瘢痕組織形成により、視野のぼやけ、飛蚊症、閃光盲および突発性失明を経験する。
【００９６】
低レベルの構成的補体活性化は、通常、非糖尿病性目において起こり、これは、非糖尿病性ラットの目内部のＭＡＣおよび補体調節タンパク質の存在によって示され、糖尿病性患者において補体調節不全が起こっていることを示す（Ｓｏｈｎら、（２０００）ＩＯＶＳ  ４１：３４９２）。また、Ｃ５ｂ−９沈着が糖尿病性ヒトドナーの網膜血管において検出されており（ここで、非糖尿病性ヒトドナーには存在しない）（Ｚｈａｎｇら）、ＣＤ５５およびＣＤ５９の発現の低下が糖尿病性網膜において示されており（Ｚｈａｎｇら）、グリケート結合（ｇｌｙｃａｔｅｄ）ＣＤ５９が糖尿病性患者の尿中に存在するが、非糖尿病性患者には存在しない（Ａｃｏｓｔａら、（２００２）ＰＮＡＳ  ９７、５４５０−５４５５）。さらに、補体および血管系は、Ｉ型糖尿病において活性化されることが知られている。例えば、Ｈａｎｓｅｎ、Ｔ．Ｋ．ら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、５３：１５７０−１５７６（２００４）を参照のこと。Ｃ５ａは、免疫系および補体系との相互作用によって内皮細胞を活性化する。例えば、Ａｌｂｒｅｃｈｔ、Ｅ．Ａ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、１６４：８４９−８５９（２００４）を参照のこと。血管系は、眼疾患（例えば、糖尿病性網膜症）において活性化される。例えば、Ｇｅｒｔ、Ｖ．Ｂ．ら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ、４３：１１０４−１１０８（２００２）を参照のこと。また、補体系も糖尿病性網膜症において活性化される。例えば、Ｇｅｒｔ、Ｖ．Ｂ．ら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ、４３：１１０４−１１０８（２００２）およびＢａｄｏｕｉｎ、Ｃら、Ａｍ  Ｊ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ、１０５：３８３−３８８（１９８８）を参照のこと。
【００９７】
ブドウ膜炎はブドウ膜の炎症をいい、ブドウ膜は、強膜（線維性層）と網膜（視野を担う光感受性層）との間に存在し、虹彩、毛様体および脈絡膜（網膜に栄養分を与える血管層および結合組織層）で構成される色素性血管膜（または層）である。ブドウ膜の複雑な解剖学的構造のため、多くの異なる型のブドウ膜炎が存在し、ブドウ膜と他の眼球構造物（例えば、網膜）との解剖学的関係のため、ブドウ膜炎は、多くの場合、他の組織の炎症（例えば、網膜炎）を伴う。ブドウ膜炎は、一般的に、前部ブドウ膜炎（主に、虹彩および随伴する毛様体が侵され、したがって、虹彩と角膜の間の前眼房および内包される透明な眼房水液が侵される）、中間部ブドウ膜炎（毛様体のすぐ後部の毛様体輪および網膜の前面「縁」が侵される）、または後部ブドウ膜炎（透明なゼラチン様の硝子体液で満たされ、網膜と直接接触している、虹彩後部の後眼房が侵される）に分類される。ブドウ膜炎には、任意のまたはあらゆる部分のブドウ膜（例えば、脈絡膜炎、虹彩炎）が包含され得る。前部ブドウ膜炎は、最も一般的な形態であり、多くの場合、慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患と関連している。中間部ブドウ膜炎は、２番目に一般的な形態である。後部ブドウ膜炎は、最も一般的でない形態であり、全身性感染（例えば、ウイルス、細菌、真菌もしくは寄生虫）後に生じ得るか、または自己免疫疾患と関連するものであり得る。また、自己免疫性ブドウ膜炎は、全身性の関与なく生じるものであり得る。ブドウ膜炎はまた、外傷（例えば、損傷、手術など）の結果として、または原因不明（「特発性」）で起こり得る。病因とは無関係に、ブドウ膜を侵す任意の炎症状態が、定義により、ブドウ膜炎をもたらす。
【００９８】
眼の組織および液性物は、通常、多くの補体成分、例えば、Ｂ因子ならびにＣ２、Ｃ４、Ｃ３、Ｃ５、Ｃ６およびＣ７を、ブドウ膜組織内に（Ｂｒａｗｍａｎ−Ｍｉｎｔｚｅｒ  Ｏ、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．１９８９年１０月；３０（１０）：２２４０−４）、Ｃ１、Ｃ４、Ｃ３およびＣ５を眼房水中に（Ｍｏｎｄｉｎｏ  ＢＪ、Ａｒｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１９８３年３月；１０１（３）：４６５−８）、ならびにＣ１、Ｃ４、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ５、Ｃ６およびＣ７を角膜内に（Ｍｏｎｄｉｎｏ  ＢＪ、Ａｒｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１９８１年８月；９９（８）：１４３０−３）含有する。これらの補体成分および関連補体調節タンパク質は、眼組織において正常な免疫監視機構に重要であると考えられている。
【００９９】
ブドウ膜炎の病因における補体の活性化に重要な役割は、網膜の脈管炎を有する（対照）患者と比べた場合の前部ブドウ膜炎を有する患者におけるＣ４（Ｃ４Ｂ２）アロタイプの発生数の増加（Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ  Ｄ、Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８８年４月；２１（４）：２３３−７．）；特発性ブドウ膜炎を有する患者における血漿Ｃ３ｄおよび補体含有免疫複合体の増大（Ｖｅｒｇａｎｉ  Ｓ、Ｂｒ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１９８６年１月；７０（ｌ）：６０−３）；全身性炎症性疾患および併発ブドウ膜炎を有する患者における涙液（涙）中の補体媒介性溶血活性ならびにＣ３およびＣ４レベルの増大；（Ｄｒｏｚｄｏｖａ  ＥＡ、Ｖｅｓｔｎ  Ｏｆｔａｌｍｏｌ．２００４年７〜８月；１２０（４）：２４−６）；ならびに初期事象としてブドウ膜炎における眼球の血管膜における免疫複合体および補体の沈着（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ  ＧＲ、Ｔｒａｎｓ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｓｏｃ  Ｕ  Ｋ．１９８１年９月；１０１（Ｐｔ  ３）（３）：２９７−３００）によって示されている。補体活性化は、ブドウ膜炎眼内成分を伴ういくつかの炎症性および／または自己免疫疾患、例えば、ベーチェット病（Ｃｕｃｈａｃｏｖｉｃｈ  Ｍ、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２００５年７月〜８月；２３（４  補足  ３８）：Ｓ２７−３４、Ｂａｒｄａｋ  Ｙ、Ｏｃｕｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｎｆｌａｍｍ．２００４年３月；１２（ｌ）：５３−８）、フックス異色素性虹彩毛様体炎（Ｌａ  Ｈｅｙ  Ｅ、Ａｍ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１９９２年１月１５日；１１３（ｌ）：７５−８０）、フォークト−小柳−原田病（Ｓａｋａｍｏｔｏ  Ｔ、Ａｒｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１９９１年９月；１０９（９）：１２７０−４）、ならびに網膜下線維症および慢性ブドウ膜炎（Ｐａｌｅｓｔｉｎｅ  ＡＧ、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ．１９８円６月；９２（６）：８３８−４４）に関与している。
【０１００】
また、実験的に誘導したブドウ膜炎のいくつかの動物モデルで、補体活性化がブドウ膜炎の病因に重要であること（Ｊｈａ  Ｐ、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．２００６年３月；４７（３）：１０３０−８、Ｋａｓｐ  Ｅ、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２年５月；８８（２）：３０７−１２）、補体活性化が補体調節タンパク質によって厳密に調節されていること（Ｂａｒｄｅｎｓｔｅｉｎ  ＤＳ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００１年１２月；１０４（４）：４２３−３０、Ｓｏｈｎ  ＪＨ、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．２０００円１０月；４１（ｌｌ）：３４９２−５０２）が示されている。補体媒介性ブドウ膜炎のこれらのモデルでは、コブラ毒因子（ＣＶＦ）での治療による補体枯渇または補体活性化経路（Ｃ３）の重要な成分の遺伝的枯渇などによって、誘導したブドウ膜炎の予防または重症度の有意な低下がもたらされる。
【０１０１】
集合的に、データは、補体成分および調節タンパク質が眼組織およびブドウ膜の重要な通常の構成成分であること、特に、補体活性化は、自己免疫ブドウ膜炎の実験モデルにおいてブドウ膜炎の一因となっていること、ならびにヒトにおいて補体活性化がブドウ膜炎と関連していることを示す。したがって、一部のある実施形態において、ブドウ膜炎の発生、持続時間および／または重症度を低下させるための本発明の方法における使用のための、Ｃ５活性化のまえの第二および古典的補体活性化経路ならびにその後のＣ５ａおよびＣ５ｂ−９（ＭＡＣ）の生成を停止させるアプタマーを提供する。
【０１０２】
緑内障は、視神経および網膜に対する損傷の結果、失明が起こる一群の疾患をいい、通常、眼圧（「ＩＯＰ」）の上昇を伴う。原発性開放隅角緑内障は、最も一般的な形態であり、経時的な液体排出路（すなわち、小柱網）緩徐な狭小または閉塞によって引き起こされ、眼房水の蓄積によってＩＯＰの上昇がもたらされる。緑内障は、開放隅角と閉塞隅角の２つのカテゴリーに分類される。原発性開放隅角緑内障は、ゆっくりと無痛的に発症し、多くの場合、数年間、顕著な失明はない。続発性開放隅角緑内障は、他の疾患（例えば、ブドウ膜炎もしくは他の炎症性疾患、糖尿病、腫瘍、白内障）、閉鎖性（ｂｌｕｎｔ）損傷またはステロイド類などのある種の薬物によって引き起こされる。閉塞隅角緑内障（狭隅角緑内障または急性緑内障とも呼ばれる）は、虹彩の位置のずれによって引き起こされ、眼房水排出の突発性閉塞およびＩＯＰの急上昇がもたらされる。閉塞隅角緑内障の症状は、失明の他、目の痛みおよび悪心が挙げられる。一部の個体では、ＩＯＰの上昇なく神経損傷が起こり、この型の緑内障は、正常眼圧（正常眼圧または低眼圧）緑内障として知られている。この型の緑内障の神経損傷の原因は不明である。
【０１０３】
緑内障の病因における補体の役割は：１）ラット緑内障モデルにおける実験的ＩＯＰ上昇での、補体成分ｍＲＮＡ（Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ３）の網膜の発現の増大（Ａｈｍｅｄ，Ｆ、Ｂｒｏｗｎ，ＫＭ、Ｓｔｅｐｈａｎ，ＤＡ、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ＪＣ、Ｊｏｈｎｓｏｎ，ＥＣ、Ｔｏｍａｒｅｖ，ＳＩ（２００４）ＩＯＶＳ  ４５、１２４７−５４）；２）カニクイザル緑内障モデルでの、補体成分ｍＲＮＡ（Ｃ４、Ｂ、Ｃ１ｑ、Ｃ３）の網膜の発現の増大（Ｍｉｙａｈａｒａ，Ｔ、Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｔ、Ａｋｉｍｏｔｏ，Ｍ、Ｋｕｒｏｋａｗａ，Ｔ、Ｓｈｉｂｕｋｉ，Ｈ、Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，Ｎ（２００３）ＩＯＶＳ  ４４、４３４７−５６）；３）緑内障のマウスおよびサルモデル由来の網膜のグリア細胞におけるＣ１ｑ  ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現の増大（Ｓｔａｓｉ，Ｋ、Ｎａｇｅｌ，Ｄ、Ｙａｎｇ，Ｘ、Ｗａｎｇ，Ｒ、Ｒｅｎ，Ｌ、Ｐｏｄｏｓ，ＳＭ、Ｍｉｔｔａｇ，Ｔ、Ｄａｎｉａｓ，Ｊ（２００６）ＩＯＶＳ  ４７、１０２４−２９）；４）ヒト被験体のグリア細胞におけるＣ１ｑの免疫組織化学的染色（Ｓｔａｓｉら、２００６年）によって示されている。実験的緑内障マウスにおける補体Ｃ１ｑ発現は、経時的ＩＯＰの上昇と相関し、網膜の神経節細胞に対する損傷の前に起こるようであり、これは、補体が疾患の病因に寄与している可能性を示す（Ｓｔａｓｉら、２００６年）。抗補体アプタマー（例えば、抗Ｃ５アプタマー）での治療は、高眼圧または低眼圧緑内障における神経変性に対する保護的効果を有し得る。
【０１０４】
したがって、一部のある実施形態では、本発明は、補体媒介性眼障害の治療のための抗Ｃ５剤を提供する。一部のある実施形態では、本発明の抗Ｃ５剤は単独で使用され、一方、他の実施形態では、抗ＶＥＧＦおよび／または抗ＰＤＧＦ剤と組合せて使用される。
【０１０５】
本発明の他の実施形態は、補体媒介性眼障害の処置、安定化および／または予防のための抗補体アプタマーを提供する。抗補体アプタマーは、ＳＥＬＥＸＴＭ法によって作製され得る。特別な実施形態では、本発明は、抗補体アプタマー、例えば、抗Ｃ５アプタマーを被験体に、眼障害の少なくとも１つの症状、特に、糖尿病性網膜症、滲出性および／または非滲出性ＡＭＤの症状を低減、安定化および／または予防する方法において投与することを含むものである。
【０１０６】
Ｃ５特異的アプタマー
補体媒介性眼障害の症状の治療、安定化、予防および／または低減における使用のためのＣ５特異的アプタマーは、ＳＥＬＥＸＴＭ法によって作製され得る。特別な実施形態では、本発明は、抗Ｃ５アプタマー剤を被験体に、眼障害の少なくとも１つの症状、特に、糖尿病性網膜症、滲出性および／または非滲出性ＡＭＤの症状を低減、安定化および／または予防する方法において投与することを含むものである。
【０１０７】
アプタマーは、分子に対して、古典的ワトソン−クリック塩基対合以外の相互作用による特異的結合親和性を有する核酸分子である。
【０１０８】
アプタマー、ファージディスプレイによって生成されるペプチドまたはモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）と同様、選択した標的に特異的に結合する能力を有し、標的の活性を、例えばアプタマーへの結合によってモジュレート能力を有し、その標的が機能する能力をブロックし得るものである。ランダム配列オリゴヌクレオチドのプールからの試験管内選択プロセスによって作製されるため、アプタマーは、１００種類を超えるタンパク質、例えば、増殖因子、転写因子、酵素、免疫グロブリンおよびレセプターに対して作製されている。典型的なアプタマーは１０〜１５ｋＤａの大きさ（３０〜４５ヌクレオチド）であり、その標的にナノモル以下の親和性で結合し、密接に関連した標的を識別する（例えば、アプタマーは、典型的には、同じ遺伝子ファミリーの他のタンパク質には結合しない）。一連の構造の研究により、アプタマーは、抗体−抗原複合体における親和性および特異性をもたらす結合相互作用（例えば、水素結合、静電気的相補性、疎水性接触、立体的排除）と同じ型のものを利用し得ることが示されている。
【０１０９】
アプタマーは、治療剤および診断剤として使用のためのいくつかの望ましい特性、例えば、高い特異性および親和性、生物学的有効性、ならびに優れた薬物動態特性を有する。
【０１１０】
ＳＥＬＥＸＴＭ法
アプタマーの作製に適した方法（一般的に図２に示す）は、「試験管内人工進化（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）」（「ＳＥＬＥＸＴＭ」）と称される方法を用いるものである。ＳＥＬＥＸＴＭプロセスは、標的分子に対して高度に特異的な結合性を有する核酸分子の試験管内進化のための方法であり、例えば、米国特許出願第０７／５３６，４２８号（１９９０年６月１１日出願、現在は放棄されている）、米国特許第５，４７５，０９６号（発明の名称「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ」）、および米国特許第５，２７０，１６３号（また、ＷＯ９１／１９８１３も参照）（発明の名称「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ」）に記載されている。選択および増幅の反復サイクルを行なうことにより、ＳＥＬＥＸＴＭを用いて任意の所望のレベルの目標の結合親和性を有するアプタマーが得られ得、これを、本明細書では「核酸リガンド」ともいう。
【０１１１】
ＳＥＬＥＸＴＭプロセスは、核酸が、さまざまな二次元および三次元構造を形成する充分な能力、およびモノマー系であれポリマー系であれ、事実上あらゆる化合物とのリガンドとして作用する（すなわち、特異的結合対を形成する）ように、そのモノマー内で充分な化学的万能性を有するというユニークな洞察に基づくものである。任意の大きさまたは組成の分子が標的として供され得る。
【０１１２】
ＳＥＬＥＸＴＭプロセスは、標的に結合する能力に基づく。したがって、ＳＥＬＥＸＴＭ手順によって得られるアプタマーは、標的結合特性を有する。しかしながら、ＳＥＬＥＸＴＭそれ自体では、他のアプタマーまたは標的特性に選択されず、ＳＥＬＥＸＴＭ誘導アプタマーが、所望の標的に結合すること以外の任意の特性を有することは当然予測され得ないが、得られるアプタマーが他の特性を有することは期待され得る。したがって、アプタマーが標的に結合すること以外に、標的に対して特定の効果を有することは期待され得るが、所与のアプタマーが何の効果も持たないことがあり得、またはいくつかの効果を有することもあり得る。例えば、標的が多くの細胞表面レセプターと相互作用するタンパク質である場合、アプタマーは、該タンパク質と１種類以上のかかるレセプターとの間の結合をブロックもしくは増強いずれかを行なうために作用するものであり得るか、または該相互作用に対してなんら有しないものであり得る。別の例では、標的は触媒性の種であり得、アプタマーは、その触媒機能の有効性をブロックもしくは増強するもの、または該触媒機能に対して効果を有しないものであり得る。しかしながら、適切なアッセイにおいて試験する前まで、当業者は、所与のアプタマーに特性があるとすれば、実際にどのような特性を有するのかを予測することができなかった。実際、単なる標的結合では、アプタマー結合の作用によって標的に奏功され得る機能的効果（もしある場合）に関する情報はもたらされない。
【０１１３】
標的分子の特性の改変には、標的の特性に変化をもたらすために、アプタマーが標的上の特定の位置に結合することが必要とされる。理論的には、ＳＥＬＥＸＴＭにより、個々のアプタマーが標的上の異なる部位に結合する多数のアプタマーの特定がもたらされ得る。実際、アプタマー−標的結合相互作用は、多くの場合、相互作用のための安定で到達可能な構造的界面をもたらす標的上の１つまたは比較的少数の好ましい結合部位において起こる。さらにまた、ＳＥＬＥＸＴＭが生理学的標的分子において行なわれる場合、当業者は、一般的には、標的に対するアプタマーの位置を制御することができない。したがって、標的上のアプタマー結合部位の位置は、標的分子に対して所望の効果をもたらし得る、または何の効果も有しないものであり得る潜在的ないくつかの結合部位のうちの１つまたはその近傍である場合もあり、そうでない場合もある。
【０１１４】
アプタマーが、その標的結合能のおかげで、ある効果を有することがわかった場合であっても、その存在を予測すること、またはそのような効果であるかを事前に知ることはできない。ＳＥＬＥＸＴＭ実験を行なう際に、当業者は、ある標的に対するアプタマーを得ることが可能である程度、アプタマーが標的結合特性を有するといういくらかの確実性がわかり得るにすぎない。ＳＥＬＥＸＴＭ実験は、特定される一部のアプタマーは、標的に対して結合すること以外にもある効果を有するという期待において行なわれ得るが、これは、不確定である。
【０１１５】
ＳＥＬＥＸＴＭ法は、出発点として、ランダム化配列を含む単鎖オリゴヌクレオチドの大きなライブラリーまたはプールに依存する。該オリゴヌクレオチドは、修飾または未修飾のＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであり得る。一部のある例において、該プールは、１００％ランダムまたは部分ランダムオリゴヌクレオチドを含む。他の例において、該プールは、少なくとも１つの固定配列および／または保存配列がランダム化配列内に組み込まれたランダムまたは部分ランダムオリゴヌクレオチドを含む。他の例において、該プールは、少なくとも１つの固定配列および／または保存配列が、その５’および／または３’末端を含有するランダムまたは部分ランダムオリゴヌクレオチドを含む（これは、該オリゴヌクレオチドプールのすべての分子によって共有される配列を含み得る）。固定配列は、そのプール内のオリゴヌクレオチドに共通する配列であって、予め選択された目的のために組み込まれた、例えば、ＣｐＧモチーフ（さらに後述する）、ＰＣＲプライマーのハイブリダイゼーション部位、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ７およびＳＰ６）のプロモーター配列、制限部位、またはホモポリマー配列（例えば、ポリＡまたはポリＴ配列など）、触媒性コア、アフィニティカラムへの選択的結合のための部位、ならびに目的のオリゴヌクレオチドのクローニングおよび／または配列決定を助長する他の配列などの配列である。保存配列は、前述の固定配列以外の、同じ標的に結合するいくつかのアプタマーによって共有される配列である。
【０１１６】
該プールのオリゴヌクレオチドは、好ましくは、ランダム化配列部分ならびに効率的な増幅に必要な固定配列を含む。典型的には、出発プールのオリゴヌクレオチドは、５’および３’末端固定配列を含有し、これは、３０〜５０個のランダムヌクレオチドの内部領域と隣接している。ランダム化ヌクレオチドは、いくつかの様式、例えば、化学合成およびランダムに切断された細胞内核酸からのサイズ選択にて作製され得る。試験核酸における配列変異体もまた、選択／増幅の反復の前またはその最中での変異誘発によって導入または増大させ得る。
【０１１７】
該オリゴヌクレオチドのランダム配列部分は、任意の長さのものであり得、リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを含むものであり得、修飾された、または非天然ヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体を含むものであり得る。例えば、米国特許第５，９５８，６９１号；米国特許第５，６６０，９８５号；米国特許第５，９５８，６９１号；米国特許第５，６９８，６８７号；米国特許第５，８１７，６３５号；米国特許第５，６７２，６９５号およびＰＣＴ公開公報ＷＯ９２／０７０６５を参照のこと。ランダムオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合ヌクレオチドから、当該技術分野でよく知られた固相オリゴヌクレオチド合成手法を用いて合成され得る。例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４６７（１９８６）およびＦｒｏｅｈｌｅｒら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：５５７５−５５７８（１９８６）を参照のこと。ランダムオリゴヌクレオチドはまた、トリエステル合成法などの液相法を用いて合成され得る。例えば、Ｓｏｏｄら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．４：２５５７（１９７７）およびＨｉｒｏｓｅら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．、２８：２４４９（１９７８）を参照のこと。自動ＤＮＡ合成装置で行なわれる典型的な合成により、ほとんどのＳＥＬＥＸＴＭ実験に充分な数の１０１４〜１０１６個の個々の分子が得られる。配列設計においてランダム配列の領域を充分に大きくすることにより、各合成分子が非反復配列を提示し得る可能性が増大する。
【０１１８】
オリゴヌクレオチドの出発ライブラリーは、ＤＮＡ合成装置での自動化学合成によって作製され得る。ランダム化配列を合成するため、すべての４種類のヌクレオチドの混合物を、合成プロセス中の各ヌクレオチド添加工程で添加し、ヌクレオチドのランダム組込みを行なわせる。上記のように、一実施形態において、ランダムオリゴヌクレオチドは、完全にランダムな配列を含むものであるが、他の実施形態において、ランダムオリゴヌクレオチドは、非ランダムまたは部分ランダム配列の鎖を含むものであってもよい。部分ランダム配列は、４種類のヌクレオチドを異なるモル比で、各添加工程において添加することにより創製され得る。
【０１１９】
オリゴヌクレオチドの出発ライブラリーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、置換されたＲＮＡもしくはＤＮＡまたはその組合せであり得る。ＲＮＡライブラリーが出発ライブラリーとして使用される場合、これは、典型的には、ＤＮＡラブラリーを合成、任意選択でＰＣＲ増幅し、次いで、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたは修飾Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡラブラリーを試験管内で転写し、転写されたラブラリーを精製することにより作製される。次いで、核酸ライブラリーを標的と、結合に有利な条件下で混合し、同じ一般的選択スキームを用いて結合、分離および増幅の工程ごとの反復に供し、事実上、任意の所望の基準の結合親和性および選択性が得られる。より具体的には、出発核酸プールを含有する混合物から始めて、ＳＥＬＥＸＴＭ法は、（ａ）混合物を標的と、結合に有利な条件下で接触させる工程；（ｂ）非結合核酸を、標的分子に特異的に結合した核酸から分離する工程；（ｃ）核酸−標的複合体を解離させる工程；（ｄ）核酸−標的複合体から解離させた核酸を増幅して核酸のリガンド富化混合物を得る工程；および（ｅ）結合、分離、解離および増幅の工程を所望されるだけ多数サイクル反復し、標的分子に対して高度に特異的で高親和性の核酸リガンドを得る工程を含む。ＲＮＡアプタマーが選択される場合、ＳＥＬＥＸＴＭ法は、さらに、（ｉ）工程（ｄ）での増幅前に、核酸−標的複合体から解離させた核酸を逆転写する工程；および（ｉｉ）該プロセスを再度始める前に、工程（ｄ）で増幅させた核酸を転写する工程を含む。
【０１２０】
多数の可能な配列および構造を含む核酸混合物では、所与の標的に対して広範な結合親和性が存在する。標的に対してより高い親和性（より小さい解離定数）を有するものは、非常に標的に結合し易い。分離、解離および増幅後、第２の核酸混合物を作製し、より高い結合親和性の候補を富化させる。得られる核酸混合物が主に唯一または数種類の配列で構成されるようになるまで、さらに選択を繰り返すことにより、次第に最良のリガンドに好都合になる。次いで、これらは、クローニングされ、配列決定され、１）標的結合親和性；および２）標的機能を奏する能力について、リガンドまたはアプタマーが個々に試験され得る。
【０１２１】
選択および増幅のサイクルは、所望の目的が達成されるまで反復する。最も一般的な場合では、選択／増幅は、サイクルの反復において結合強度の有意な改善が得られなくなるまで継続される。該方法では、典型的には、およそ１０１４の異なる核酸種がサンプリングに使用されるが、約１０１８もの多くの異なる核酸種がサンプリングに使用されることもあり得る。一般的に、核酸アプタマー分子は、５〜２０サイクルの手順で選択される。一実施形態において、最初の選択段階でのみ不均一系が導入され、反復工程中では生じない。
【０１２２】
ＳＥＬＥＸＴＭ法の一実施形態では、選択プロセスが、選択された標的に非常に強く結合する核酸リガンドの単離において非常に効率的であるため、必要とされる選択および増幅のサイクル１回だけである。かかる効率的な選択は、例えば、クロマトグラフィー型のプロセスで行なわれ得、この場合、カラムに結合された標的と会合する核酸の能力が、該カラムが最大親和性の核酸リガンドの分離および単離を充分に許容させることができるような様式で作用する。
【０１２３】
多くの場合、ＳＥＬＥＸＴＭの反復的工程を、単一の核酸リガンドが同定されるまで行なうことは、必ずしも望ましくはない。標的特異的核酸リガンド溶液は、いくつかの保存配列、および標的に対する核酸リガンドの親和性に有意に影響を与えることなく置換または付加が行われたものであり得るいくつかの配列を有する核酸構造またはモチーフのファミリーを含み得る。完了前にＳＥＬＥＸＴＭプロセスを終了させることにより、核酸リガンド溶液のファミリーのいくつかの構成員の配列を決定することが可能である。
【０１２４】
核酸には、さまざまな一次、二次および三次構造が存在することがわかっている。非ワトソン−クリック型相互作用に最も一般的に関与することが示されている構造またはモチーフは、ヘアピンループと呼ばれ、対称および非対称突出部、シュードノットおよびその無数の組合せである。かかるモチーフは、既知のほとんどすべての場合、３０ヌクレオチド以下の核酸配列に形成されたのもであり得ることが示されている。この理由のため、多くの場合、連続ランダム化セグメントを用いるＳＥＬＥＸＴＭ手順は、約２０〜約５０ヌクレオチド、一部のある実施形態においては約３０〜約４０ヌクレオチドのランダム化セグメントを含有する核酸配列で開始することが好ましい。一例において、５’固定：ランダム：３’固定配列は、約３０〜約５０ヌクレオチドのランダム配列を含む。
【０１２５】
中心的なＳＥＬＥＸＴＭ法は、いくつかの特定の目的が達成されるように変形されている。例えば、米国特許第５，７０７，７９６号には、特定の構造的特性を有する核酸分子、例えば、湾曲ＤＮＡを選択するために、ゲル電気泳動と組み合わせたＳＥＬＥＸＴＭの使用が記載されている。米国特許第５，７６３，１７７号には、標的分子と結合および／または光架橋できる、および／または標的分子を光不活化できる光反応性基を含有する核酸リガンドを選択するためのＳＥＬＥＸＴＭに基づいた方法が記載されている。米国特許第５，５６７，５８８号および米国特許第５，８６１，２５４号には、標的分子に対して高親和性を有するオリゴヌクレオチドと低親和性を有するオリゴヌクレオチドの高度に効率的な分離を達成するＳＥＬＥＸＴＭに基づいた方法が記載されている。米国特許第５，４９６，９３８号には、ＳＥＬＥＸＴＭプロセスを行なった後に、改善された核酸リガンドを得るための方法が記載されている。米国特許第５，７０５，３３７号には、リガンドをその標的に共有結合させる方法が記載されている。
【０１２６】
ＳＥＬＥＸＴＭはまた、標的分子上の１つより多くの部位に結合する核酸リガンドを得るため、および標的上の特異的部位に結合する非核酸種を含む核酸リガンドを得るために使用され得る。ＳＥＬＥＸＴＭは、任意の想定され得る標的、例えば、大小の生体分子、例えば、核酸結合タンパク質および核酸結合することがわかっていないタンパク質（その生物学的機能の一部として）、ならびに補因子および他の小分子に結合する核酸リガンドを単離および同定するための手段を提供する。例えば、米国特許第５，５８０，７３７号には、ＳＥＬＥＸＴＭにより同定された、カフェインおよびその密接に関連した類縁体であるテオフィリンに高親和性で結合できる核酸配列が開示されている。
【０１２７】
逆（ｃｏｕｎｔｅｒ−）ＳＥＬＥＸＴＭは、１つ以上の非標的分子に対する交差反応性を有する核酸リガンド配列を排除することにより、標的分子に対する核酸リガンドの特異性を改善する方法である。逆ＳＥＬＥＸＴＭは、（ａ）核酸の候補混合物を調製する工程；（ｂ）該候補混合物を標的と接触させる工程、ここで、標的に対し、候補混合物と比べて増大した親和性を有する核酸は、候補混合物の残部から分離され得る；（ｃ）親和性が増大した核酸を候補混合物の残部から分離する工程；（ｄ）親和性が増大した核酸を標的から解離させる工程；ｅ）親和性が増大した核酸を１種類以上の非標的分子と、該非標的分子（１種または複数種）に対して特異的親和性を有する核酸リガンドが除去されるように接触させる工程；ならびにｆ）標的分子のみに対して特異的親和性を有する核酸を増幅し、標的分子への結合に対して比較的高い親和性および特異性を有する核酸配列が富化された核酸の混合物を得る工程で構成される。ＳＥＬＥＸＴＭについて上記のように、選択および増幅のサイクルは、必要に応じて、所望の目的が達成されるまで反復される。
【０１２８】
治療剤、診断剤およびワクチンとしての核酸の使用において遭遇する潜在的な問題の１つは、ホスホジエステル形態のオリゴヌクレオチドが、所望の効果が発現される前に、細胞内酵素および細胞外酵素（例えば、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼなど）によって体液中で急速に分解され得ることである。したがって、ＳＥＬＥＸＴＭ法は、リガンドに対して改善された特性（例えば、改善された生体内安定性または改善された送達特性など）を付与する修飾ヌクレオチドを含有する高親和性核酸リガンドの同定を包含する。かかる修飾の例としては、糖鎖および／またはリン酸基および／または塩基の位置における化学的置換が挙げられる。ＳＥＬＥＸＴＭで同定される修飾ヌクレオチド含有核酸リガンドは、例えば、米国特許第５，６６０，９８５号（これには、リボースの２’位、ピリミジンの５位およびプリンの８位が化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドが記載されている）、米国特許第５，７５６，７０３号（これには、種々の２’修飾ピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドが記載されている）、ならびに米国特許第５，５８０，７３７号（これには、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）および／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）置換基で修飾された１つ以上のヌクレオチドを含有する高度に特異的な核酸リガンドが記載されている）に記載されている。
【０１２９】
本発明において想定される核酸リガンドの修飾としては、限定されないが、さらなる電荷、分極性、疎水性、水素結合、静電気的相互作用および流動性を、核酸リガンド塩基または核酸リガンド全体に組み込む他の化学的基を提供するものが挙げられる。ヌクレアーゼに抵抗性であるオリゴヌクレオチド集団を作製するための修飾もまた、１つ以上の置換ヌクレオチド間結合、改変糖鎖、改変塩基またはその組合せを含み得る。かかる修飾としては、限定されないが、２’位の糖鎖修飾、５位のピリミジン修飾、８位のプリン修飾、環外アミンの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモまたは５−ヨード−ウラシルの置換；主鎖修飾、ホスホロチオエートまたはリン酸アルキル修飾、メチル化および通常でない塩基対合組合せ（例えば、イソ塩基であるイソシチジンとイソグアニジン）が挙げられる。修飾にはまた、３’および５’の修飾（キャッピング、例えば、エキソヌクレアーゼ抵抗性を増大させるための３’−３’−ｄＴキャップの付加など）も含まれ得る（例えば、米国特許第５，６７４，６８５号；同第５，６６８，２６４号；同第６，２０７，８１６号；および同第６，２２９，００２号（これらの各々は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
【０１３０】
一実施形態において、Ｐ（Ｏ）Ｏ基が、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯもしくはＣＨ２（「ホルムアセタール」）または３’−アミン（−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）（式中、各ＲまたはＲ’は独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換のアルキルである）で置き換えられたオリゴヌクレオチドが提供される。結合基は隣接するヌクレオチドに、−Ｏ−、−Ｎ−または−Ｓ−結合を介して結合され得る。オリゴヌクレオチド内のすべての結合が同一である必要はない。
【０１３１】
さらなる実施形態において、オリゴヌクレオチドは、修飾された糖鎖基を含み、例えば、ヒドロキシル基の１つ以上が、ハロゲン、脂肪族基で置き換えられているか、またはエーテルまたはアミンとして官能性付与されている。一実施形態において、フラノース残基の２’位は、Ｏ−メチル、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリル、Ｓ−アルキル、Ｓ−アリルまたはハロ基のいずれかで置換されている。２’−修飾糖の合成方法は、例えば、Ｓｐｒｏａｔら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：７３３−７３８（１９９１）；Ｃｏｔｔｅｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：２６２９−２６３５（１９９１）；およびＨｏｂｂｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２：５１３８−５１４５（１９７３）に記載されている。他の修飾も当業者に知られている。かかる修飾は、ＳＥＬＥＸＴＭプロセス前の修飾であってもよく、ＳＥＬＥＸＴＭプロセス後の修飾（以前に同定された非修飾リガンドの修飾）であってもよく、またはＳＥＬＥＸＴＭプロセスに組み込んでもよい。
【０１３２】
ＳＥＬＥＸＴＭプロセス前の修飾またはＳＥＬＥＸＴＭプロセスに組み込まれる修飾により、そのＳＥＬＥＸＴＭ標的に対する特異性と、改善された安定性（例えば、生体内安定性）の両方を有する核酸リガンドがもたらされる。核酸リガンドに行なわれるＳＥＬＥＸＴＭプロセス後の修飾により、核酸リガンドの結合能力に悪影響を及ぼすことなく、改善された安定性（例えば、生体内安定性）がもたらされ得る。
【０１３３】
ＳＥＬＥＸＴＭ法には、選択オリゴヌクレオチドを、他の選択オリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチド機能単位と組み合わせることが包含され、これは、米国特許第５，６３７，４５９号および米国特許第５，６８３，８６７号に記載されている。ＳＥＬＥＸＴＭ法には、さらに、選択された核酸リガンドを親油性または非免疫原性高分子量化合物と、診断用または治療用複合体にて組み合わせることが包含され、これは、例えば、米国特許第６，０１１，０２０号、米国特許第６，０５１，６９８号およびＰＣＴ公開公報ＷＯ９８／１８４８０に記載されている。これらの特許および出願書類には、広範な形状および他の特性と、オリゴヌクレオチドの効率的な増幅および複製特性ならびに他の分子の望ましい特性との組合せが教示されている。
【０１３４】
また、核酸リガンドをＳＥＬＥＸＴＭ法によってフレキシブル小ペプチドと特定することが探求されている。小ペプチドは柔軟性のある構造を有し、通常、溶液中で多数の配座異性体の平衡状態で存在し、したがって、最初は、結合親和性は、フレキシブルペプチドに結合されると、配座エントロピーの低下によって制限され得ると考えられていた。しかしながら、核酸リガンドを溶液中の小ペプチドと特定することの実現可能性は、米国特許第５，６４８，２１４号に示された。この特許には、１１アミノ酸のペプチドである物質サブスタンスＰに対する高親和性ＲＮＡ核酸リガンドが同定された。
【０１３５】
本発明の標的（１つまたは複数）に対して特異性および結合親和性を有するアプタマーは、典型的には、本明細書に記載のＳＥＬＥＸＴＭプロセスによって選択される。さらに、選択は、アプタマー分子を生体内分解に対して安定化させる修飾ヌクレオチドが組み込まれた配列を用いて行なわれ得る。
【０１３６】
２’修飾ＳＥＬＥＸＴＭ
アプタマーが治療剤または診断剤としての使用に適するようにするため、生体内で安全で安定的に合成することが安価であることが好ましい。野生型ＲＮＡおよびＤＮＡアプタマーは、ヌクレアーゼによって分解されやすいため、典型的には生体内で安定的ではない。ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性は、２’位における修飾基の組込みによって大きく増大され得る。
【０１３７】
２’−フルオロおよび２’−アミノ基は、オリゴヌクレオチドプール内に成功裏に組み込まれ、続いて、該プールからアプタマーが選択されている。しかしながら、このような修飾は、得られるアプタマーの合成コストを大きく増大させ、場合によっては、修飾オリゴヌクレオチドの分解、続くＤＮＡ合成の基質としての該ヌクレオチドの使用によって、修飾ヌクレオチドが宿主ＤＮＡ内に再利用され得るという可能性のため、安全性の懸念が誘導され得る。
【０１３８】
２’−Ｏ−メチル（「２’−ＯＭｅ」）ヌクレオチドを含有するアプタマーは、本明細書の一部のある実施形態において提供しているが、これは、これらの欠点の多くを解決する。２’−ＯＭｅヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ抵抗性であり、安価に合成される。２’−ＯＭｅヌクレオチドは生体系内で遍在性であるが、天然のポリメラーゼは、生理学的条件下で２’−ＯＭｅ  ＮＴＰを基質として受容せず、したがって、宿主ＤＮＡ内への２’−ＯＭｅヌクレオチドの再利用に対する安全性の懸念はない。２’−修飾アプタマーを作製するために使用されるＳＥＬＥＸＴＭ法は、例えば、米国特許仮出願第６０／４３０，７６１号（２００２年１２月３日出願）、米国特許仮出願第６０／４８７，４７４号（２００３年７月１５日出願）、米国特許仮出願第６０／５１７，０３９号（２００３年１１月４日出願）、米国特許出願第１０／７２９，５８１号（２００３年１２月３日出願）、米国特許出願第１０／８７３，８５６号（２００４年６月２１日出願、発明の名称「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」）、米国仮特許出願第６０／６９６，２９２号（２００５年６月３０日、発明の名称「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｌｌｙ  ２’−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ」）、および米国特許出願第１１／４８０，１８８号（２００６年６月３０出願、発明の名称「Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｌｌｙ  ２’Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ」）（これらの各々は、引用により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１３９】
本発明は、補体標的に結合し、その機能をモジュレートするアプタマーであって、オリゴヌクレオチドを非修飾オリゴヌクレオチドよりも酵素的および化学的分解ならびに熱分解および物理的分解に対して安定にする修飾ヌクレオチド（例えば、２’位に修飾を有するヌクレオチド）を含有するアプタマーを含む。好ましい一実施形態において、前記補体標的は補体タンパク質Ｃ５である。２’−ＯＭｅ含有アプタマーのいくつかの例が文献にある（例えば、Ｇｒｅｅｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２，６８３−６９５、１９９５年を参照のこと）が、これらは、ＣおよびＵ残基が２’−フルオロ（２’−Ｆ）置換され、ＡおよびＧ残基が２’−ＯＨである修飾転写物のライブラリーの試験管内選択によって作製されたものである。機能配列が同定されたら、各ＡおよびＧ残基を２’−ＯＭｅ置換に対する許容性について試験され、２’−ＯＭｅ残基として２’−ＯＭｅ置換に許容性であるすべてのＡおよびＧ残基を有するアプタマーが再合成された。この２工程様式で作製されるアプタマーのＡおよびＧ残基の大部分は、２’−ＯＭｅ残基による置換に許容性であるが、平均およそ２０％はそうでない。その結果、この方法を用いて作製されるアプタマーは、２〜４個の２’−ＯＨ残基を含む傾向があり、結果として、安定性と合成コストが損なわれる。オリゴヌクレオチドプールに使用される安定化ヌクレオチドをもたらすアプタマーを転写反応物内に組み込み、該プールから、ＳＥＬＥＸＴＭ（および／または任意のそのバリエーションおよび改善形、例えば、本明細書に記載のもの）によってアプタマーを選択および富化することにより（例えば、修飾ヌクレオチドを有するアプタマーオリゴヌクレオチドを再合成することにより）、本発明の方法は、選択したアプタマーオリゴヌクレオチドを安定化させる必要性を排除する。
【０１４０】
一実施形態において、本発明は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰおよびＵＴＰヌクレオチドの２’−ＯＨ、２’−Ｆ、２’−デオキシおよび２’−ＯＭｅ修飾の組合せを含むアプタマーを提供する。別の実施形態において、本発明は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰおよびＵＴＰヌクレオチドの２’−ＯＨ、２’−Ｆ、２’−デオキシ、２’−ＯＭｅ、２’−ＮＨ２および２’−メトキシエチル修飾の組合せを含むアプタマーを提供する。別の実施形態において、本発明は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰおよびＵＴＰヌクレオチドの２’−ＯＨ、２’−Ｆ、２’−デオキシ、２’−ＯＭｅ、２’−ＮＨ２および２’−メトキシエチル修飾の５６の組合せを含むアプタマーを提供する。好ましい一実施形態において、本発明は、すべてまたは実質的にすべて２’−ＯＭｅ修飾ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰおよび／またはＵＴＰヌクレオチドを含むアプタマーを提供する。
【０１４１】
本発明の２’修飾アプタマーは、野生型ポリメラーゼよりも高い組込み比率で、バルキー置換基をフラノースの２’位に有する修飾ヌクレオチドを有する修飾ポリメラーゼ（例えば、修飾Ｔ７ポリメラーゼ）を用いて選択される。例えば、６３９位のチロシン残基がフェニルアラニン（Ｙ６３９Ｆ）に交換された変異型Ｔ７ポリメラーゼは、２’デオキシ、２’アミノ−、および２’フルオロ−ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を容易に利用する（組み込む）が、バルキーな２’−置換基（例えば、Ｔ−ＯＭｅまたは２’−アジド（２’−Ｎ３）置換基など）を有するＮＴＰは、利用しない。バルキーな２’置換基の組込みのためには、Ｙ６３９Ｆ変異に加えてアラニン残基に交換されたヒスチジンを７８４位に有する変異型Ｔ７ポリメラーゼが報告されており（Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ）、限られた状況において修飾ピリミジンＮＴＰを組み込むために使用されている。Ｐａｄｉｌｌａ，Ｒ．およびＳｏｕｓａ，Ｒ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００２年、３０（２４）：１３８を参照のこと。６３９位のチロシン残基がフェニルアラニンに交換され、７８４位のヒスチジン残基がアラニンに交換され、リシン残基３７８がアルギニンに交換された（Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）変異型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、限られた状況において修飾プリンおよびピリミジンＮＴＰ（例えば、２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ）を組み込むために使用されているが、転写のために２’−ＯＨ  ＧＴＰの添加（ｓｐｉｋｅ）が必要とされる。Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒら、（２００５）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１２：２５−３３を参照のこと。理論に拘束されることを望まないが、Ｋ３７８Ｒ変異は、ポリメラーゼの活性部位付近ではなく、したがって、２’−ＯＭｅ修飾ＮＴＰの組込みに対して効果のないサイレント変異と考えられる。アラニン残基に交換されたヒスチジンを７８４位に有する（Ｈ７８４Ａ）変異型Ｔ７ポリメラーゼもまた報告されている。Ｐａｄｉｌｌａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００２年、３０：１３８。Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４変異型およびＨ７８４Ａ変異型Ｔ７ポリメラーゼにおいて、より小さなアミノ酸残基（アラニンなど）に対する変化によって、よりバルキーなヌクレオチド基質、例えば、２’−ＯＭｅ置換ヌクレオチドの組込みが可能になる。Ｃｈｅｌｌｉｓｅｒｒｙ、Ｋ．およびＥｌｌｉｎｇｔｏｎ、Ａ．Ｄ．、（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、９：１１５５−６０を参照のこと。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの活性部位に変異を有し、より容易にバルキーな２’修飾型基質を組み込むさらなるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、ロイシンに変更されたチロシン残基を６３９位に有する（Ｙ６３９Ｌ）変異型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼが報告されている。
【０１４２】
一般的に、本明細書に開示した条件下では、Ｙ６９３Ｆ変異型が、ＧＴＰ以外のすべての２’−ＯＭｅ置換ＮＴＰの組込みに使用され得、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ、Ｙ６３９Ｌ、Ｙ６３９Ｌ／Ｋ３７８Ｒ、Ｐ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４ＡまたはＰ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼが、本明細書に開示した条件下で、すべての２’−ＯＭｅ置換ＮＴＰ（例えば、２’−ＯＭｅ  ＧＴＰ）の組込みに使用され得ることがわかった。
【０１４３】
２’−修飾オリゴヌクレオチドは、完全に合成された修飾ヌクレオチドであってもよく、修飾ヌクレオチドのサブセットを有するものであってもよい。修飾は同じであっても異なるものであってもよい。一部または全部のヌクレオチドが修飾され得、修飾されたものは、同じ修飾を含むものであり得る。一部または全部のヌクレオチドが修飾され得、修飾されたものは、異なる修飾を含むものであり得、例えば、同じ塩基を含有するすべてのヌクレオチドが、１つの型の修飾を有するものであり得、一方で、他の塩基を含有するヌクレオチドが異なる型の修飾を有するものであり得る。すべてのプリンヌクレオチドが１つの型の修飾を有する（または非修飾である）ものであってもよく、一方で、すべてのピリミジンヌクレオチドが別の異なる型の修飾を有する（または非修飾である）ものであってもよい。このように、転写物または転写物のプールは、例えば、リボヌクレオチド（２’−ＯＨ）、デオキシリボヌクレオチド（２’−デオキシ）、２’−アミンヌクレオチド（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロヌクレオチド（２’−Ｆ）、および２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）ヌクレオチドなどの修飾の任意の組合せを用いて作製される。２’−ＯＨ  ＡおよびＧならびに２’−Ｆ  ＣおよびＵを含む転写混合物を「ｒＲｆＹ」と称し、これから選択されるアプタマーを「ｒＲｆＹ」アプタマーと称する。２’−ＯＭｅ  ＣおよびＵならびに２’−ＯＨ  ＡおよびＧを含む転写混合物を「ｒＲｍＹ」混合物と称し、これから選択されるアプタマーを「ｒＲｍＹ」アプタマーと称する。デオキシＡおよびＧならびに２’−ＯＭｅ  ＵおよびＣを含む転写混合物を「ｄＲｍＹ」混合物と称し、これから選択されるアプタマーを「ｄＲｍＹ」アプタマーと称する。２’−ＯＭｅ  Ａ、ＣおよびＵならびに２’−ＯＨ  Ｇを含む転写混合物を「ｒＧｍＨ」混合物と称し、これから選択されるアプタマーを「ｒＧｍＨ」アプタマーと称する。２’−ＯＭｅ  Ａ、Ｃ、ＵおよびＧならびに２’−ＯＭｅ  Ａ、ＵおよびＣならびに２’−Ｆ  Ｇを択一的に含む転写混合物を「択一的（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ）混合物」と称し、これから選択されるアプタマーを「択一的混合物」アプタマーと称する。２’−ＯＭｅ  Ａ、Ｕ、ＣおよびＧ（ここで、Ｇの１０％までがリボヌクレオチドである）を含む転写混合物を「ｒ／ｍＧｍＨ」混合物と称し、これから選択されるアプタマーを「ｒ／ｍＧｍＨ」混合物と称し、これから選択されるアプタマーを「ｒ／ｍＧｍＨ」アプタマーと称する。２’−ＯＭｅ  Ａ、ＵおよびＣならびに２’−Ｆ  Ｇを含む転写混合物を、「ｆＧｍＨ」混合物と称し、これから選択されるアプタマーを「ｆＧｍＨ」アプタマーと称する。２’−ＯＭｅ  Ａ、ＵおよびＣならびにデオキシＧを含む転写混合物を「ｄＧｍＨ」混合物と称し、これから選択されるアプタマーを「ｄＧｍＨ」アプタマーと称する。デオキシＡならびに２’−ＯＭｅ  Ｃ、ＧおよびＵを含む転写混合物を「ｄＡｍＢ」混合物と称し、これから選択されるアプタマーを「ｄＡｍＢ」アプタマーと称し、すべて２’−ＯＨ  ヌクレオチドを含む転写混合物を「ｒＮ」混合物と称し、これから選択されるアプタマーを「ｒＮ」、「ｒＲｒＹ」または「ＲＮＡ」アプタマ���アプタマーと称する。２’−ＯＨ  アデノシン三リン酸およびグアノシン三リン酸およびデオキシシチジン三リン酸およびチミジン三リン酸を含む転写混合物を、「ｒＲｄＹ」混合物と称し、これから選択されるアプタマーを「ｒＲｄＹ」アプタマーと称する。「ｍＲｍＹ」は、「ＭＮＡ」アプタマーとも称され、開始ヌクレオチド（これは、２’−ＯＨグアノシンまたは任意の野生型グアノシンである）以外は２’−Ｏ−メチルヌクレオチドのみを含有するものであり、ＳＥＬＥＸＴＭ後置換（可能な場合は、２’−ＯＭｅ  Ｇによる任意の２’−ＯＨ  Ｇの置換）によって、ｒ／ｍＧｍＨオリゴヌクレオチドから誘導されるものであり得る。あるいはまた、ｍＲｍＹアプタマーは、ｍＲｍＹ  ＳＥＬＥＸＴＭにより同定される。
【０１４４】
好ましい実施形態としては、２’−ＯＨ、２’−デオキシおよび２’−ＯＭｅヌクレオチドの任意の組合せが挙げられる。より好ましい実施形態としては、２’−デオキシおよび２’−ＯＭｅヌクレオチドの任意の組合せが挙げられる。さらにより好ましい実施形態は、２’−デオキシおよび２’−ＯＭｅヌクレオチドの任意の組合せによるものであって、ピリミジンが２’−ＯＭｅであるもの（例えば、ｄＲｍＹ、ｍＲｍＹまたはｄＧｍＨなど）である。
【０１４５】
本発明のアプタマーへの修飾ヌクレオチドの組込みは、選択プロセスの前）（例えば、ＳＥＬＥＸＴＭプロセス前修飾）になされる。任意選択で、修飾ヌクレオチドがＳＥＬＥＸＴＭプロセス前修飾によって組み込まれた本発明のアプタマーは、さらに、ＳＥＬＥＸＴＭプロセス後修飾（すなわち、ＳＥＬＥＸＴＭの後のＳＥＬＥＸＴＭプロセス後修飾）によって修飾され得る。ＳＥＬＥＸＴＭプロセス前修飾により、ＳＥＬＥＸＴＭ標的に対する特異性を有し、また、改善された生体内安定性を有する修飾核酸リガンドがもたらされる。ＳＥＬＥＸＴＭプロセス後修飾、すなわち、修飾（例えば、ＳＥＬＥＸＴＭプロセス前修飾によって組み込まれたヌクレオチドを有する先に同定されたリガンドの切断、欠失、置換またはさらなるヌクレオチド修飾）により、ＳＥＬＥＸＴＭプロセス前修飾によって組み込まれたヌクレオチドを有する核酸リガンドの結合能力に悪影響を及ぼすことなく、生体内安定性のさらなる改善がもたらされ得る。
【０１４６】
２’−修飾（例えば、２’−ＯＭｅ）ＲＮＡ転写物のプールを、ポリメラーゼが２’−修飾ＮＴＰを受容する条件下で作製するため、Ｙ６９３Ｆ、Ｙ６９３Ｆ／Ｋ３７８Ｒ、Ｙ６９３Ｆ／Ｈ７８４Ａ、Ｙ６９３Ｆ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ、Ｙ６９３Ｌ／Ｈ７８４Ａ、Ｙ６９３Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ、Ｙ６３９Ｌ、Ｙ６３９Ｌ／Ｋ３７８Ｒ、Ｐ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４ＡおよびＰ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼがすべて使用され得る。他のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、特に、バルキー２’−置換基に対して高い許容性を示すものもまた本発明において使用され得る。本明細書に開示した条件を用いて鋳型指向型重合に使用する場合、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ、Ｐ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４ＡまたはＰ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼが、すべて２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（例えば、２’−ＯＭｅ  ＧＴＰ）の組込みに使用され得、転写物の収量は、Ｙ６３９Ｆ、Ｙ６３９Ｆ／Ｋ３７８Ｒ、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ、Ｙ６３９Ｌ、Ｙ６３９Ｌ／Ｋ３７８Ｒ変異型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いることにより達成される収量よりも高い。Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ、Ｐ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４ＡおよびＰ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、高収量の２’修飾型（例えば、２’−ＯＭｅ）含有オリゴヌクレオチドを得るために、２’−ＯＨ  ＧＴＰとともに使用され得るが、必要ではない。
【０１４７】
他のポリメラーゼ、特に、バルキー２’−置換基に対して高い許容性を示すものもまた本発明において使用され得る。かかるポリメラーゼはこの能力について、本明細書に開示した転写条件下で修飾ヌクレオチドを組み込む能力をアッセイすることによりスクリーニングされ得る。
【０１４８】
いくつかの因子が、本明細書に開示した方法に有用な転写条件に重要であることが測定された。例えば、ＤＮＡ転写鋳型の５’末端の固定配列内に組み込まれたリーダー配列は、Ｙ６３９Ｆ／Ｋ３７８ＲまたはＹ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼが例えばｄＲｍＹまたはｒ／ｍＧｍＨ転写条件（後述）下で転写に使用される場合、修飾転写物の収率を増大させるのに重要であり得る。さらに、リーダー配列は、例えば、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４ＡまたはＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼが例えばｍＲｍＹ転写条件（後述）下で転写に使用される場合、修飾転写物の収率を増大を補助するために使用され得るが、必要ではない。リーダー配列は、典型的には６〜１５ヌクレオチド長であり、すべてプリン、またはプリンとピリミジンヌクレオチドの混合物で構成されるものであり得る。
【０１４９】
修飾ヌクレオチドが組み込まれた転写物の取得における別の重要な要素は、２’−ＯＨ  グアノシン（例えば、ＧＭＰ、ＧＴＰまたは別の非２’−ＯＭｅ非三リン酸）の存在または濃度である。転写は、２つの段階に分けられ得る：第１段階は開始であり、この間に、ＮＴＰがＧＴＰ（またはＧＭＰ、もしくは別の非２’−ＯＭｅ非三リン酸）の３’−ヒドロキシル末端に付加され、ジヌクレオチドがもたらされ、これは、次いで、約１０〜１２ヌクレオチド伸長される；第２段階は伸長であり、この間に、転写が進行し、最初の約１０〜１２ヌクレオチドの付加より長くなる。過剰の２’−ＯＭｅ  ＧＴＰを含有する転写混合物に添加される少量の２’−ＯＨ  ＧＴＰ（またはＧＭＰ、もしくは別の非２’−ＯＭｅ非三リン酸）は、２’−ＯＨ  ＧＴＰ（またはＧＭＰ、グアノシン、もしくは別の非２’−ＯＭｅ非三リン酸）を用い、ポリメラーゼに転写を開始させることを可能にするのに充分であることがわかった。したがって、例えば、ｄＲｍＹ転写混合物（デオキシプリンおよび２’ＯＭｅピリミジンを含有する）は、ポリメラーゼに転写を開始させることを可能にするために少量のＧＭＰの添加を必要とし、一方、ｒ／ｍＧｍＨ転写混合物（１０％までの２’−ＯＨ  ＧＴＰを含有）では、少量のＧＭＰを転写混合物に添加してもよいが、２’−ＯＨ  ＧＴＰが転写混合物中に既に存在するため、ポリメラーゼに転写を開始させることを可能にするのに必要ではない。いったん転写が伸長段階に入ると、２’−ＯＭｅと２’−ＯＨ  ＧＴＰ間の区別が低減し、２’−ＯＨ  ＧＴＰに対して２’−ＯＭｅ  ＧＴＰが過剰となることにより、主として２’−ＯＭｅ  ＧＴＰの組込みが可能になる。
【０１５０】
すぐ上に記載したように、転写を２’−ＯＨグアノシン（例えば、ＧＭＰ、ＧＴＰまたは別の非２’−ＯＭｅ非三リン酸）で初回刺激することは重要である。この効果は、最初のヌクレオチドに対するポリメラーゼの特異性に起因する。その結果、この様式で作製された任意の転写物の５’末端ヌクレオチドは、おそらく２’−ＯＨ  Ｇとなる。ＧＭＰの好ましい濃度は０．５ｍＭであり、さらにより好ましくは１ｍＭである。また、ＰＥＧ、好ましくはＰＥＧ−８０００を転写反応物中に含めることは、修飾ヌクレオチドの組込みを最大限にするのに有用であることがわかった。
【０１５１】
転写物への２’−ＯＭｅ置換ヌクレオチドの組込みにおける別の重要な因子は、ともに二価であるマグネシウムおよびマンガンを転写混合物中に使用することである。塩化マグネシウムおよび塩化マンガンの濃度の種々の組合せが、２’−Ｏ−メチル化された転写物の収率に影響を及ぼし、塩化マグネシウムおよび塩化マンガンの最適濃度は、二価金属イオンと錯体形成するＮＴＰの転写反応混合物中の濃度に依存することがわかった。すべて２’−Ｏ−メチル化された転写物（すなわち、すべて２’−ＯＭｅ  Ａ、ＣおよびＵならびに約９０％のＧヌクレオチド）の最大収率を得るためには、各ＮＴＰが０．５ｍＭの濃度で存在する場合、およそ５ｍＭ塩化マグネシウムおよび１．５ｍＭ塩化マンガンの濃度が好ましい。各ＮＴＰの濃度が１．０ｍＭである場合、およそ６．５ｍＭ塩化マグネシウムおよび２．０ｍＭ塩化マンガンの濃度が好ましい。各ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合、およそ９．６ｍＭ塩化マグネシウムおよび２．９ｍＭ塩化マンガンの濃度が好ましい。いずれの場合でも、これらの濃度から２倍まで逸脱しても、なお有意な量の修飾転写物が得られる。
【０１５２】
一部のある実施形態において、転写をＧＭＰまたはグアノシンで初回刺激することは好都合である。この効果は、最初のヌクレオチドに対するポリメラーゼの特異性に起因する。その結果、この様式で作製された任意の転写物の５’末端ヌクレオチドは、おそらく２’−ＯＨ  Ｇとなる。ＧＭＰ（またはグアノシン）の好ましい濃度は０．５ｍＭであり、さらにより好ましくは１ｍＭである。また、ＰＥＧ、好ましくはＰＥＧ−８０００を転写反応物中に含めることは、修飾ヌクレオチドの組込みを最大限にするのに有用であることがわかった。
【０１５３】
転写物への２’−ＯＭｅ  ＡＴＰ（１００％）、ＵＴＰ（１００％）、ＣＴＰ（１００％）およびＧＴＰ（約９０％）（「ｒ／ｍＧｍＨ」）の最大組込みのためには、下記の条件：ＨＥＰＥＳバッファー２００ｍＭ、ＤＴＴ  ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ５ｍＭ（各２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度が１．０ｍＭである場合は６．５ｍＭ）、ＭｎＣｌ２  １．５ｍＭ（各２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度が１．０ｍＭである場合は２．０ｍＭ）、２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各々）５００μＭ（より好ましくは、１．０ｍＭ）、２’−ＯＨ  ＧＴＰ  ３０μＭ、２’−ＯＨ  ＧＭＰ  ５００μＭ、ｐＨ７．５、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ１５単位／ｍｌ、無機ピロホスファターゼ５単位／ｍｌ、および少なくとも８ヌクレオチド長の全プリンリーダー配列が好ましい。本明細書で用いる場合、１単位のＹ６３９Ｆ／Ｈ７８４変異型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（または本明細書において特定される任意の他の変異型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ）は、ｒ／ｍＧｍＨ条件下で１ｎｍｏｌの２’−ＯＭｅ  ＮＴＰを転写物中に組み込むのに必要とされる酵素の量と規定する。本明細書で用いる場合、１単位の無機ピロホスファターゼは、ｐＨ７．２および２５℃で１分あたり１．０モルの無機オルトホスフェートを遊離させる酵素の量と規定する。
【０１５４】
転写物への２’−ＯＨ  ＧＴＰおよび２’−ＯＭｅ  ＡＴＰ、ＵＴＰおよびＣＴＰ（「ｒＧｍＨ」）の最大組込み（１００％）のためには、下記の条件：ＨＥＰＥＳバッファー２００ｍＭ、ＤＴＴ  ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ５ｍＭ（各ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合は９．６ｍＭ）、ＭｎＣｌ２  １．５ｍＭ（各ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合は２．９ｍＭ）、ＮＴＰ（各々）５００μＭ（より好ましくは、２．０ｍＭ）、２’−ＯＨ  ＧＭＰ  １ｎＭ、ｐＨ７．５、Ｙ６３９Ｆ／Ｋ３７８Ｒ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ２００ｎＭ、無機ピロホスファターゼ５単位／ｍｌ、および少なくとも８ヌクレオチド長のすべてプリンのリーダー配列が好ましい。
【０１５５】
転写物への２’−ＯＭｅ  ＡＴＰ（１００％）、２’−ＯＭｅ  ＵＴＰ（１００％）、２’−ＯＭｅ  ＣＴＰ（１００％）および２’−ＯＭｅ  ＧＴＰ（１００％）（「ｍＲｍＹ」または「ＭＮＡ」）の最大組込みのためには、下記の条件：ＨＥＰＥＳバッファー２００ｍＭ、ＤＴＴ  ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ８ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ２．５ｍＭ、２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各々）１．５ｍＭ、２’−ＯＨ  ＧＭＰ  １ｍＭ、ｐＨ７．５、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ２００ｎＭ、無機ピロホスファターゼ５単位／ｍｌ、および誘導した転写条件下での転写収量を増大させる任意選択のリーダー配列が好ましい。一実施形態において、任意選択のリーダー配列は、すべてプリンのリーダー配列である。別の実施形態において、任意選択のリーダー配列は、プリンとピリミジンの混合物である。
【０１５６】
転写物への２’−ＯＨ  ＡＴＰおよびＧＴＰ、ならびに２’−ＯＭｅ  ＵＴＰおよびＣＴＰ（「ｒＲｍＹ」）の最大組込み（１００％）のためには、下記の条件：ＨＥＰＥＳバッファー２００ｍＭ、ＤＴＴ  ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ５ｍＭ（各ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合は９．６ｍＭ）、ＭｎＣｌ２  １．５ｍＭ（各ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合は２．９ｍＭ）、ＮＴＰ（各々）５００μＭ（より好ましくは、２．０ｍＭ）、２’−ＯＨ  ＧＭＰ  １ｍＭ、ｐＨ７．５、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ２００ｎＭ、無機ピロホスファターゼ５単位／ｍｌ、および少なくとも８ヌクレオチド長のすべてプリンのリーダー配列が好ましい。
【０１５７】
転写物への２’−ＯＭｅ  ＡＴＰ、ＵＴＰおよびＣＴＰ（「ｒＧｍＨ」）の最大組込み（１００％）のためには、下記の条件：ＨＥＰＥＳバッファー２００ｍＭ、ＤＴＴ  ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ５ｍＭ（各２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合は９．６ｍＭ）、ＭｎＣｌ２  １．５ｍＭ（各２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合は２．９ｍＭ）、２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各々）５００μＭ（より好ましくは、２．０ｍＭ）、ｐＨ７．５、Ｙ６３９Ｆ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ１５単位／ｍｌ、無機ピロホスファターゼ５単位／ｍｌ、および少なくとも８ヌクレオチド長のすべてプリンのリーダー配列が好ましい。
【０１５８】
転写物への２’−ＯＭｅ  ＵＴＰおよびＣＴＰ（「ｒＲｍＹ」）の最大組込み（１００％）のためには、下記の条件：ＨＥＰＥＳバッファー２００ｍＭ、ＤＴＴ  ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ５ｍＭ（各２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合は９．６ｍＭ）、ＭｎＣｌ２  １．５ｍＭ（各２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合は２．９ｍＭ）、２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各々）５００μＭ（より好ましくは、２．０ｍＭ）、ｐＨ７．５、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ１５単位／ｍｌ、無機ピロホスファターゼ５単位／ｍｌ、および少なくとも８ヌクレオチド長のすべてプリンのリーダー配列が好ましい。
【０１５９】
転写物へのデオキシＡＴＰおよびＧＴＰならびに２’−ＯＭｅ  ＵＴＰおよびＣＴＰ（「ｄＲｍＹ」）の最大組込み（１００％）のためには、下記の条件：ＨＥＰＥＳバッファー２００ｍＭ、ＤＴＴ  ４０ｍＭ、スペルミン２ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ９．６ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ２．９ｍＭ、ＮＴＰ（各々）２．０ｍＭ、２’−ＯＨ  ＧＭＰ  １ｍＭ、ｐＨ７．５、Ｙ６３９Ｆ／Ｋ３７８７Ｒ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ２００ｎＭ、無機ピロホスファターゼ５単位／ｍｌ、および少なくとも８ヌクレオチド長のすべてプリンのリーダー配列が好ましい。
【０１６０】
転写物への２’−ＯＭｅ  ＡＴＰ、ＵＴＰおよびＣＴＰならびに２’−Ｆ  ＧＴＰ（「ｆＧｍＨ」）の最大組込み（１００％）のためには、下記の条件：ＨＥＰＥＳバッファー２００ｍＭ、ＤＴＴ  ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ９．６ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ２．９ｍＭ、２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各々）２．０ｍＭ、２’−ＯＨ  ＧＭＰ  １ｍＭ、ｐＨ７．５、Ｙ６３９Ｆ／Ｋ３７８Ｒ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ２００ｎＭ、無機ピロホスファターゼ５単位／ｍｌ、および少なくとも８ヌクレオチド長のすべてプリンのリーダー配列が好ましい。
【０１６１】
転写物へのデオキシＡＴＰならびに２’−ＯＭｅ  ＵＴＰ、ＧＴＰおよびＣＴＰ（「ｄＡｍＢ」）の最大組込み（１００％）のためには、下記の条件：ＨＥＰＥＳバッファー２００ｍＭ、ＤＴＴ  ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ９．６ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ２．９ｍＭ、ＮＴＰ（各々）２．０ｍＭ、２’−ＯＨ  ＧＭＰ  １ｍＭ、ｐＨ７．５、Ｙ６３９Ｆ／Ｋ３７８Ｒ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ２００ｎＭ、無機ピロホスファターゼ５単位／ｍｌ、および少なくとも８ヌクレオチド長のすべてプリンのリーダー配列が好ましい。
【０１６２】
上記（ａ）の各々について、転写は、好ましくは、約２０℃〜約５０℃、好ましくは約３０℃〜４５℃の温度、より好ましくは約３７℃で、少なくとも２時間の時間で行なわれ、（ｂ）では、５０〜３００ｎＭの二本鎖ＤＮＡ転写鋳型が使用され（第１回目では多様性を増大させるために２００ｎＭの鋳型が使用される（ｄＲｍＹ転写では３００ｎＭの鋳型が使用される））、後続の回では、およそ５０ｎＭ（最適化ＰＣＲ反応物の１／１０希釈度）が、本明細書に記載の条件を用いて使用される）。好ましいＤＮＡ転写鋳型は後述する（ここで、ＡＲＣ２５４およびＡＲＣ２５６は、すべて２’−ＯＭｅ条件下で転写を行ない、ＡＲＣ２５５は、ｒＲｍＹ条件下で転写を行なう）。
【０１６３】
【化９】
0005406534.tif 000010
本発明のｒＮ転写条件下では、転写反応混合物は、２’−ＯＨアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、２’−ＯＨグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、２’−ＯＨシチジン三リン酸（ＣＴＰ）、および２’−ＯＨウリジン三リン酸（ＵＴＰ）を含む。本発明のｒＮ転写混合物を用いて作製される修飾オリゴヌクレオチドは、実質的にすべて２’−ＯＨアデノシン、２’−ＯＨグアノシン、２’−ＯＨシチジン、および２’−ＯＨウリジンで構成される。ｒＮ転写の好ましい一実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨシチジンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨウリジンである配列を含む。ｒＮ転写のより好ましい実施形態において、得られる本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨシチジンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨウリジンである配列を含む。ｒＮ転写の最も好ましい実施形態において、本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨシチジンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨウリジンである配列を含む。
【０１６４】
ｒＲｍＹ転写条件下では、転写反応混合物は、２’−ＯＨアデノシン三リン酸、２’−ＯＨグアノシン三リン酸、２’−ＯＭｅシチジン三リン酸、および２’−ＯＭｅウリジン三リン酸を含む。本発明のｒＲｍＹ転写混合物を用いて作製される修飾オリゴヌクレオチドは、実質的にすべて２’−ＯＨアデノシン、２’−ＯＨグアノシン、２’−ＯＭｅシチジンおよび２’−ＯＭｅウリジンで構成される。好ましい一実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＭｅシチジンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＭｅウリジンである配列を含む。より好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＭｅシチジンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＭｅウリジンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＭｅシチジンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＭｅウリジンである配列を含む。
【０１６５】
ｄＲｍＹ転写条件下では、転写反応混合物は、２’−デオキシアデノシン三リン酸、２’−デオキシグアノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸、および２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸を含む。本発明のｄＲｍＹ転写条件を用いて作製される修飾オリゴヌクレオチドは、実質的にすべて２’−  デオキシアデノシン、２’−デオキシグアノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、および２’−Ｏ−メチルウリジンで構成される。好ましい一実施形態において、得られる本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−デオキシアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−デオキシグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。より好ましい実施形態において、得られる本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−デオキシアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−デオキシグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、得られる本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−デオキシアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−デオキシグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。
【０１６６】
ｒＧｍＨ転写条件下では、転写反応混合物は、２’−ＯＨグアノシン三リン酸、２’−ＯＭｅシチジン三リン酸、２’−ＯＭｅウリジン三リン酸、および２’−ＯＭｅアデノシン三リン酸を含む。本発明のｒＧｍＨ転写混合物を用いて作製される修飾オリゴヌクレオチドは、実質的にすべて２’−ＯＨグアノシン、２’−ＯＭｅシチジン、２’−ＯＭｅウリジン、および２’−ＯＭｅアデノシンで構成される。好ましい一実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＭｅシチジンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＭｅウリジンであり、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＭｅアデノシンである配列を含む。より好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＭｅシチジンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＭｅウリジンであり、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＭｅアデノシンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＭｅシチジンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＭｅウリジンであり、すべてのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルアデノシンである配列を含む。
【０１６７】
ｒ／ｍＧｍＨ転写条件下では、転写反応混合物は、２’−Ｏ−メチルアデノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸、２’−Ｏ−メチルグアノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸および２’−ＯＨグアノシン三リン酸を含む。本発明のｒ／ｍＧｍＨ転写混合物を用いて作製して得られる修飾オリゴヌクレオチドは、実質的にすべて２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、および２’−Ｏ−メチルウリジンで構成され、ここで、グアノシンヌクレオチドの集団は、最大約１０％の２’−ＯＨグアノシンを有する。好ましい実施形態において、得られる本発明のｒ／ｍＧｍＨ修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの約１０％以下が２’−ＯＨグアノシンである配列を含む。より好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの約１０％以下が２’−ＯＨグアノシンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの９０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの約１０％以下が２’−ＯＨグアノシンである配列を含む。
【０１６８】
ｍＲｍＹ（本明細書において、ＭＮＡともいう）転写条件下では、転写混合物は、２’−Ｏ−メチルアデノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸、２’−Ｏ−メチルグアノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸のみを含む。本発明のｍＲｍＹ転写混合物を用いて作製して得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり（該オリゴヌクレオチドの最初のグアノシンを除く）、すべてのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。
【０１６９】
ｆＧｍＨ転写条件下では、転写反応混合物は、２’−Ｏ−メチルアデノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸、および２’−Ｆグアノシン三リン酸を含む。本発明のｆＧｍＨ転写条件を用いて作製される修飾オリゴヌクレオチドは、実質的にすべて２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルシチジン、および２’−Ｆグアノシンで構成される。好ましい一実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｆグアノシンである配列を含む。より好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｆグアノシンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｆグアノシンである配列を含む。
【０１７０】
ｄＡｍＢ転写条件下では、リン酸塩、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸、２’−Ｏ−メチルグアノシン三リン酸、および２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸。本発明のｄＡｍＢ転写混合物を用いて作製される修飾オリゴヌクレオチドは、実質的にすべて２’−デオキシアデノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、および２’−Ｏ−メチルウリジンで構成される。好ましい一実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−  デオキシアデノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。より好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−  デオキシアデノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、得られる本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−デオキシアデノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。
【０１７１】
各場合において、転写産物は、次いで、アプタマーを特定するため、および／または所与の標的に対する結合特異性を有する配列の保存されたモチーフを決定するために、ＳＥＬＥＸＴＭプロセスにおけるライブラリーとして使用され得る。得られる配列は既に安定化されており、この工程は、安定化されたアプタマー配列を得るプロセスから排除され、結果として、より高度に安定化されたアプタマーが得られる。２’−ＯＭｅ  ＳＥＬＥＸＴＭプロセスの別の利点は、得られる配列には、該配列に必要とされる２’−ＯＨヌクレオチドが少なく、おそらく全くない可能性が高いことである。２’ＯＨヌクレオチドは、残留する範囲内で、ＳＥＬＥＸ後修飾を行なうことにより除去してもよい。
【０１７２】
後述するように、２’置換ヌクレオチドが充分に組み込まれる少量だがなお有用な収量の転写物は、上記の最適化条件以外の条件下で得られ得る。例えば、上記の転写条件に対するバリエーションとしては、以下のものが挙げられる：
ＨＥＰＥＳバッファー濃度は０〜１Ｍの範囲であり得る。本発明ではまた、５〜１０のｐＫａを有する他の緩衝剤、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなどの使用が想定される。
【０１７３】
ＤＴＴの濃度は０〜４００ｍＭの範囲であり得る。本発明の方法はまた、他の還元剤、例えば、メルカプトエタノールなどの使用を提供する。
【０１７４】
スペルミジンおよび／またはスペルミンの濃度は、０〜２０ｍＭの範囲であり得る。
【０１７５】
ＰＥＧ−８０００の濃度は０〜５０％（ｗ／ｖ）の範囲であり得る。本発明の方法はまた、他の親水性ポリマー、例えば、他の分子量のＰＥＧまたは他のポリアルキレングリコールなどの使用を提供する。
【０１７６】
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の濃度は０〜０．１％（ｗ／ｖ）の範囲であり得る。本発明の方法はまた、他の非イオン系デタージェント、例えば、他のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ  デタージェントなどの他のデタージェントの使用を提供する。
【０１７７】
ＭｇＣｌ２の濃度は０．５ｍＭ〜５０ｍＭの範囲であり得る。ＭｎＣｌ２の濃度は０．１５ｍＭ〜１５ｍＭの範囲であり得る。ＭｇＣｌ２およびＭｎＣｌ２の両方が記載の範囲内で存在しなければならず、好ましい実施形態では、約１０〜約３の比のＭｇＣｌ２：ＭｎＣｌ２で存在し、好ましくは、該比は約３〜５：１であり、より好ましくは、該比は約３〜４：１である。
【０１７８】
２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度（各ＮＴＰ）は、５μＭ〜５ｍＭの範囲であり得る。
【０１７９】
２’−ＯＨ  ＧＴＰの濃度は、０μＭ〜３００μＭの範囲であり得る。一部のある実施形態において、転写は、２’−ＯＨ  ＧＴＰの非存在下（０μＭ）で行なわれる。
【０１８０】
２’−ＯＨ  ＧＭＰ、グアノシンまたは２’位の糖鎖以外の位置が置換された他の２’−ＯＨ  Ｇの濃度は、０〜５ｍＭの範囲であり得、ここで、一部のある実施形態では、２’−ＯＨ  ＧＴＰを反応に含めず、２’−ＯＨ  ＧＭＰが必要とされ、５μＭ〜５ｍＭの範囲であり得る。
【０１８１】
ＤＮＡ鋳型の濃度は、５ｎＭ〜５μＭの範囲であり得る。
【０１８２】
変異型ポリメラーゼの濃度は、２ｎＭ〜２０μＭの範囲であり得る。
【０１８３】
無機ピロホスファターゼは、０〜１００単位／ｍｌの範囲であり得る。
【０１８４】
ｐＨはｐＨ６〜ｐＨ９の範囲であり得る。本発明の方法は、修飾ヌクレオチドが組み込まれたポリメラーゼの大部分が活性なｐＨ範囲内で行なわれ得る。
【０１８５】
転写反応は、約１時間〜数週間、好ましくは、約１〜約２４時間行なわれ得る。
【０１８６】
下記の実施例で記載するような生物学的アッセイによって示される最も高い親和性および特異的結合性を有する選択されたアプタマーは、Ｃ５補体タンパク質が病因に関与している状態を処置するのに適した治療剤である。
【０１８７】
アプタマー医化学
所望の標的に結合するアプタマーが特定されたら、任意選択で、特性されたアプタマー配列の結合特性および／または機能的特性を増大させるために、いくつかの手法が実施され得る。ＳＥＬＥＸＴＭプロセス（２’修飾ＳＥＬＥＸＴＭを含む）によって特定された所望の標的に結合するアプタマーは、所望の結合特性および／または機能的特性を有する最小アプタマー配列（本明細書において、「最小化構築物」ともいう）を得るために、任意選択で切断され得る。これを達成する方法の一例は、最小化構築物の設計の情報を得るためにフォールディングプログラムおよび配列解析（例えば、選択物から得られたクローン配列をアラインメントし、保存モチーフおよび／または共変動を調べる）を使用することによるものである。また、生化学的プロービング実験を行ない、アプタマー配列の５’および３’境を調べ、最小化構築物の設計の情報を得ることができる。次いで、最小化構築物を化学的に合成し、該構築物を誘導した非最小化配列と比較したときの結合特性および機能的特性について試験することができる。一連の５’、３’および／または内部欠失を含むアプタマー配列のバリアントもまた、直接化学的に合成され、該バリアントを誘導した非最小化アプタマー配列と比較したときの結合特性および／または機能的特性について試験され得る。
【０１８８】
さらに、単一の活性なアプタマー配列（すなわち、ＳＥＬＥＸＴＭプロセス、（２’修飾ＳＥＬＥＸＴＭを含む）によって特定された所望の標的に結合するアプタマー、または単一の最小化アプタマー配列における配列要件を調べるため、ドープ再選択法が使用され得る。ドープ再選択法は、対象の単一の配列に基づいて設計された合成の縮重したプールを用いて行なわれる。縮重のレベルは、通常、野生型ヌクレオチド、すなわち対象の単一の配列と７０％〜８５％異なる。一般に、中立変異を有する配列はドープ再選択プロセスによって同定されるが、場合によっては、配列変化により親和性の改善がもたらされ得る。次いで、ドープ再選択法を用いて特定されたクローンからの複合配列情報は、最小結合モチーフを同定するため、および最適化の取り組みを補助するために使用され得る。
【０１８９】
ＳＥＬＥＸＴＭプロセス（２’修飾ＳＥＬＥＸおよびドープ再選択法を含む）を用いて特定されたアプタマー配列および／または最小化アプタマー配列はまた、任意選択で、アプタマー医化学を用いてＳＥＬＥＸＴＭ後に最適化され、該配列のランダムもしくは特異的変異誘発を行ない、結合親和性および／または機能的特性を増大させ得るか、あるいはまた、該配列内のどの位置が結合活性および／または機能的特性に不可欠であるかが調べられ得る。
【０１９０】
アプタマー医化学は、複数組のバリアントアプタマーを化学的に合成するアプタマー改善手法である。これらの組のバリアントは、典型的には、親アプタマーとは単一の置換基が導入されていることで異なり、互いにこの置換基の位置で異なる。次いで、これらのバリアントを互いと、および親と比較する。特性における改善は、特定の治療基準を満たすのに必要なのは、単一の置換基を含むことだけであるのに充分に意味深いことがあり得る。
【０１９１】
あるいはまた、その組の単一のバリアントから収集される情報を用いて、１つより多くの置換基が同時に導入されているさらなる複数組のバリアントが設計され得る。設計ストラテジーの一例において、単一置換基バリアントのすべてをランク付けし、上位４つを選択し、これらの４つの単一置換基バリアントの可能なあらゆる２つ１組（６）、３つ１組（４）および４つ１組（１）の組合せを合成し、アッセイする。第２の設計ストラテジーでは、最良の単一置換基バリアントを、新たな親とみなし、この最高ランクの単一置換基バリアントを含む可能なあらゆる２つ１組の置換基バリアントを合成し、アッセイする。他のストラテジーも使用され得、このようなストラテジーは、さらに改善されたバリアントの同定を継続しながら、置換基の数が徐々に増加するように反復して適用され得る。
【０１９２】
アプタマー医化学は、特に、全体ではなく局所の置換基の導入を探索するための方法として使用され得る。アプタマーは、転写によって作製したライブラリー内に見出されるため、ＳＥＬＥＸＴＭプロセス中に導入される任意の置換基が全体的に導入されるはずである。例えば、ホスホロチオエート結合をヌクレオチド間に組み込むことが所望される場合、該結合は、Ａすべて（またはＧ、Ｃ、Ｔ、Ｕすべてなど）にのみ導入され得る（全体置換）。ホスホロチオエートが一部のＡ（または一部のＧ、Ｃ、Ｔ、Ｕなど）（局所置換）に必要とされるが、他のＡでは許容され得ないアプタマーは、このプロセスでは容易に見出され得ない。
【０１９３】
アプタマー医化学プロセスに利用され得る置換基の種類は、固相合成試薬として作製できる可能性、およびオリゴマー合成スキームに導入できる可能性によってのみ制限される。該プロセスは、もちろんヌクレオチド単独に限定されない。アプタマー医化学スキームは、立体的嵩高さ、疎水性、親水性、親油性、疎油性正電荷、負電荷、中性電荷、双性イオン、極性、ヌクレアーゼ抵抗性、立体構造による剛性、立体構造による柔軟性、タンパク質結合特性、質量を導入する置換基を含むものであり得る。アプタマー医化学スキームは、塩基修飾、糖鎖修飾またはホスホジエステル結合修飾を含むものであり得る。
【０１９４】
治療用アプタマーの状況においておそらく有益な置換基の種類を考慮する場合、以下のカテゴリーの１つ以上：
（１）既に体内に存在する置換基、例えば、２’−デオキシ、２’−リボ、２’−Ｏ−メチルプリンもしくはピリミジンまたは５−メチルシトシン
（２）既に承認された治療剤の一部である置換基、例えば、ホスホロチオエート結合オリゴヌクレオチド
（３）上記の２つのカテゴリーのうちの一方に加水分解または分解される置換基、例えば、メチルホスホネート結合オリゴヌクレオチド
の１つに含まれる置換を導入することが望ましいことがあり得る。本発明のアプタマーとしては、本明細書に記載のアプタマー医化学によって開発されたアプタマーが挙げられる。
【０１９５】
本発明のアプタマーの標的結合親和性は、アプタマーと標的（例えば、タンパク質）間の一連の結合反応によって評価され得、この場合、微量の３２Ｐ−標識アプタマーを、標的の希釈列とともに緩衝培地中でインキュベートし、次いで、真空濾過マニホールドを用いてニトロセルロース濾過によって解析する。本明細書においてドットブロット結合アッセイという場合、この方法では、（上から下に）ニトロセルロース、ナイロンフィルター、およびゲルブロット紙からなる３層の濾過媒体を使用する。標的に結合したＲＮＡは、ニトロセルロースフィルター上に捕捉されるが、非標的結合ＲＮＡは、ナイロンフィルター上に捕捉される。ゲルブロット紙は、これ以外のフィルターの支持媒体として含める。濾過後、フィルター層を分離し、乾燥させ、リン光体スクリーン上で露光し、リン光体画像化システムを用いて定量する。定量結果を用いて、アプタマー結合曲線が作製され得、これから解離定数（ＫＤ）が算出され得る。好ましい一実施形態において、結合反応の実施に使用される緩衝培地は、１×ダルベッコＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋含有）＋０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡである。
【０１９６】
一般的に、アプタマーが標的の機能的活性、すなわちアプタマーの機能的活性をモジュレートする能力は、標的の生物学的機能に応じて種々である試験管内および生体内モデルを用いて評価され得る。一部のある実施形態では、本発明のアプタマーは、標的の既知の生物学的機能を阻害するものであり得る。一方、他の実施形態では、本発明のアプタマーは、標的の既知の生物学的機能を刺激するものであり得る。本発明のアプタマーの機能的活性は、補体成分標的の既知の機能が測定されるように設計された試験管内および生体内モデルを用いて評価され得る。
【０１９７】
本発明のアプタマーは、当業者が使用する任意の数の手法に従い、常套的に診断目的に適合させ得る。診断的利用には、生体内診断適用または試験管内診断適用の両方が含まれ得る。診断剤は、ユーザーが特定の現場または濃度で所与の標的の存在を特定することを可能に得ることだけが必要である。単純に、標的と結合対を成し得る能力は、診断目的のための正のシグナルを誘発するのに充分であり得る。また、当業者は、かかるリガンドの存在を追跡するための標識タグを組み込むために、任意のアプタマーを当該技術分野で知られた手順によって適合させることができよう。かかるタグは、いくつかの診断手順において使用され得る。
【０１９８】
アプタマー治療剤の薬物動態および生体分布のモジュレーション
アプタマーを含むすべてのオリゴヌクレオチド系治療剤の薬物動態特性が所望の医薬適用と適合するように調整することは重要である。細胞外標的に指向されるアプタマーは、細胞内送達に伴う問題点（アンチセンスおよびＲＮＡｉ系治療剤の場合のような）はもたないが、かかるアプタマーは、やはり、標的の器官および組織に分布され、体内に（非修飾状態で）所望の投与レジメンに整合する期間滞留され得るものでなければならない。
【０１９９】
したがって、本発明は、アプタマー組成物の薬物動態、特に、アプタマー薬物動態を整調できる可能性に影響を及ぼす材料および方法を提供する。アプタマー薬物動態を整調できる可能性（すなわち、モジュレートできる可能性）は、アプタマーへの修飾性部分（例えば、ＰＥＧポリマー）のコンジュゲーションおよび／または修飾ヌクレオチド（例えば、２’−フルオロもしくは２’−Ｏ−メチル）の組込みにより核酸の化学組成を改変することによって達成される。アプタマー薬物動態の整調できる可能性は、既存の治療適用の改善、あるいはまた、新しい治療適用の開発に用いられる。例えば、一部のある治療適用、例えば、速やかな薬物クリアランスまたは排出が所望され得る抗新生物形成性または急性医療状況では、血液循環中のアプタマーの滞留時間を低減させることが望ましい。あるいはまた、他の一部の治療適用、例えば、治療剤の全身循環が所望される維持療法では、血液循環中のアプタマーの滞留時間を増大させることが望ましい。
【０２００】
また、アプタマー薬物動態の整調可能性は、被験体内でのアプタマー治療剤の生体分布を変更するために用いられる。例えば、一部のある治療適用では、特定の組織型または特定の器官（もしくは１組の器官）を標的化する取り組みにおいて、アプタマー治療剤の生体分布を改変するのが望ましいことがあり得る。このような適用において、アプタマー治療剤は、優先的に特定の組織または器官（１つまたは複数）内に蓄積される。他の治療適用においては、アプタマー治療剤が優先的に罹患組織内に蓄積されるように、細胞マーカーもしくは所与の疾患と関連する症状、細胞損傷または他の異常な病態を示す組織を標的化するのが望ましいことがあり得る。例えば、米国特許仮出願第６０／５５０７９０号（２００４年３月５日出願、発明の名称「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｐａｍｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」）および米国特許非仮出願第１１／０７５，６４８号（２００５年３月７日出願、発明の名称「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｐｔａｍｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」）に記載のように、アプタマー治療剤のＰＥＧ化（例えば、２０ｋＤａ  ＰＥＧポリマーを用いたＰＥＧ化）を用い、ＰＥＧ化されたアプタマー治療剤が優先的に炎症組織内に蓄積されるように炎症組織を標的化する。
【０２０１】
アプタマー治療剤（例えば、アプタマーコンジュゲートまたは改変された化学特性（例えば、修飾ヌクレオチドなど）を有するアプタマー）の薬物動態および生体分布プロフィールを調べるため、さまざまなパラメータをモニターする。かかるパラメータとしては、例えば、アプタマー組成物の半減期（ｔ１／２）、血漿クリアランス（Ｃｌ）、分布容積（Ｖｓｓ）、濃度時間曲線下面積（ＡＵＣ）、観察された最大血清または血漿濃度（Ｃｍａｘ）、および平均滞留時間（ＭＲＴ）が挙げられる。本明細書で用いる場合、用語「ＡＵＣ」は、アプタマー投与後のアプタマー治療剤の血漿濃度対時間のプロットの下側の面積をいう。ＡＵＣ値を用いて、所与のアプタマー治療剤のバイオアベイラビリティ（すなわち、アプタマー投与後の血液循環中の投与されたアプタマー治療剤のパーセント）および／または全クリアランス（Ｃｌ）（すなわち、アプタマー治療剤が血液循環から除去される速度）が推定される。分布容積は、アプタマー治療剤の血漿濃度を、体内に存在するアプタマーの量と関連させる。Ｖｓｓが大きいほど、より多くのアプタマーが血漿外に見られる（すなわち、管外遊出が多い）。
【０２０２】
本発明は、アプタマーをモジュレート性（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）部分、例えば、小分子、ペプチドもしくはポリマー末端基にコンジュゲートさせること、または修飾ヌクレオチドをアプタマー内に組み込むことにより、生体内で、安定化されたアプタマー組成物の薬物動態および生体分布を制御された様式でモジュレートするための材料および方法を提供する。本明細書に記載のように、モジュレート性部分のコンジュゲーションおよび／またはヌクレオチド（１つまたは複数）の化学組成の改変により、血液循環中のアプタマー滞留時間および組織への分布の基本的態様が改変される。
【０２０３】
ヌクレアーゼによるクリアランスに加え、オリゴヌクレオチド治療剤は、腎臓での濾過による排出に供される。そのため、静脈内投与されたヌクレアーゼ抵抗性オリゴヌクレオチドは、典型的には、濾過が抑止され得ない限り＜１０分の生体内半減期を示す。これは、血流から組織内への速やかな分布を助長すること、またはオリゴヌクレオチドの見かけ分子量を糸球体での有効なサイズ排除より上に増大させることのいずれかによってなされ得る。小型治療剤のＰＥＧポリマーへのコンジュゲーション（ＰＥＧ化）により、後述するように、血液循環中のアプタマーの滞留時間が劇的に延長され得、それにより、投与頻度が低減され、血管標的に対する有効性が増強される。
【０２０４】
さらに、眼組織からのアプタマー濾過もまた、本発明のアプタマーの見かけ分子量を増加させることにより（ＰＥＧポリマーへのコンジュゲーションなどにより）、モジュレート（特に、ブロック）され得る。
【０２０５】
アプタマーは、さまざまなモジュレート性部分、例えば、高分子量ポリマー、例えば、ＰＥＧ；ペプチド、例えば、Ｔａｔ（ａ  １３−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＩＶ  Ｔａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｖｉｖｅｓ、ら（１９９７）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（２５）：１６０１０−７））、Ａｎｔ（１６−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｔｈｉｒｄ  ｈｅｌｉｘ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ  ｈｏｍｅｏｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｐｉｅｔｅｒｓｚ、ら（２００１）、Ｖａｃｃｉｎｅ  １９（１１−１２）：１３９７−４０５））およびＡｒｇ７（ａ  ｓｈｏｒｔ，ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ  ｃｈａｒｇｅｄ  ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｅａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ  ｐｏｌｙａｒｇｉｎｉｎｅ（Ａｒｇ７）（Ｒｏｔｈｂａｒｄ、ら（２０００）、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６（１１）：１２５３−７；Ｒｏｔｈｂａｒｄ、Ｊら（２００２）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５（１７）：３６１２−８））；ならびに小分子、例えば、コレステロールなどの親油性化合物などにコンジュゲートさせ得る。本明細書に記載の種々のコンジュゲートのうち、アプタマーの生体内特性は、ＰＥＧ基との複合体化によって非常に顕著に改変される。例えば、上記の米国特許非仮出願（米国特許第１１／０７５，６４８号、２００５年３月７日出願、発明の名称「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｐｔａｍｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」）に記載のように、アプタマー治療剤と２０ｋＤａのＰＥＧポリマーとのコンジュゲーションにより、腎臓濾過が障害され、健常組織および炎症組織の両方へのアプタマー分布が促進される。さらにまた、２０ｋＤａ  ＰＥＧポリマー−アプタマーコンジュゲートは、アプタマーの腎臓での濾過の抑制において、４０ｋＤａ  ＰＥＧポリマーとほぼ同程度に有効であることが示されている。ＰＥＧ化の効果の１つはアプタマークリアランスに対するものであるが、２０ｋＤａ部分の存在によってもたらされる長時間の全身曝露によってもまた、組織、特に、高度に灌流された臓器のものおよび炎症部位のものへのアプタマーの分布が助長される。アプタマー−２０ｋＤａ  ＰＥＧポリマーコンジュゲートは、炎症部位へのアプタマー分布を指向し、その結果、ＰＥＧ化されたアプタマーが炎症組織内に優先的に蓄積される。一部のある場合では、２０ｋＤａ  ＰＥＧ化アプタマーコンジュゲートは、細胞（例えば、腎臓細胞など）の内部に到達することが可能である。
【０２０６】
全般的に、低分子量モジュレート性部分（例えば、コレステロールおよび細胞透過性ペプチド）によってもたらされるアプタマー薬物動態および組織分布に対する効果は、典型的には、ヌクレオチドのＰＥＧ化または修飾（例えば、化学組成の改変）の結果もたらされるものより顕著でない。理論に拘束されることを意図しないが、血漿リポタンパク質とのコレステロール媒介性会合（アンチセンスコンジュゲートの場合に起こることを前提とする）は、アプタマー−コレステロールコンジュゲートフォールド構造の特定の状況において妨げられる、および／またはコレステロール基の親油性の性質の態様と関連することが示唆される。コレステロールと同様、Ｔａｔペプチドタグの存在により、血流からのアプタマークリアランスが促進され、４８時間で、比較的高レベルのコンジュゲートが腎臓に見られる。巨大分子が細胞膜を横切って通過するのを試験管内で媒介することが当該技術分野において報告されている他のペプチド（例えば、Ａｎｔ、Ａｒｇ７）は、血液循環からのアプタマークリアランスを促進しないようである。しかしながら、Ｔａｔと同様、Ａｎｔコンジュゲートは、他のアプタマーと比べ、腎臓内に有意に蓄積される。理論に拘束されることを意図しないが、生体内で３次元的にフォールドされたアプタマーの状況において、ＡｎｔおよびＡｒｇ７ペプチドモジュレート性部分の好ましくない提示により、これらのペプチドがアプタマー輸送特性に影響する能力が障害されることが考えられ得る。
【０２０７】
修飾ヌクレオチドはまた、アプタマーの血漿クリアランスをモジュレートするために使用され得る。例えば、例えば、２’−フルオロ、２’−ＯＭｅおよび／またはホスホロチオエート安定化化学基が組み込まれた非コンジュゲートアプタマー（これは、試験管内および生体内で高度なヌクレアーゼ安定性を示すため、現在のアプタマーの作製に典型的である）は、非修飾アプタマーと比べた場合、血漿からの速やかな損失（すなわち、速やかな血漿クリアランス）および組織内（主に、腎臓内）への速やかな分布を示す。
【０２０８】
ＰＡＧ−誘導体化核酸
上記のように、高分子量非免疫原性ポリマーでの核酸の誘導体化は、核酸の薬物動態および薬力学的特性を改変するより有効な治療用薬剤とする潜在性を有する。活性における好ましい変化は、ヌクレアーゼによる分解に対する抵抗性の増大、腎臓を介する濾過の低減、免疫系に対する曝露の低減、および身体中への治療剤の分布の改変を誘導し得るものである。
【０２０９】
本発明のアプタマー組成物は、ポリアルキレングリコール（「ＰＡＧ」）部分を用いて誘導体化したものであり得る。ＰＡＧ−誘導体化核酸の例は、米国特許出願第１０／７１８，８３３号（２００３年１１月２１日出願）（引用により、その全体が本明細書に組み込まれる）に見られる。本発明に使用される典型的なポリマーとしては、ポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）（ポリ（エチレンオキシド）（「ＰＥＯ」）としても知られる）およびポリプロピレングリコール（例えば、ポリイソプロピレングリコール）が挙げられる。さらに、異なるアルキレンオキシド（例えば、エチレンオキシドとプロピレンオキシド）のランダムまたはブロックコポリマーが、多くの適用用途において使用され得る。その最も一般的な形態では、ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧなど）は、各末端がヒドロキシル基で終結した線状ポリマー：ＨＯ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨである。このポリマー、α，ω−ジヒドロキシルポリ（エチレングリコール）はまた、ＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨで表されることがあり得、この場合、−ＰＥＧ−記号は、下記の構造的単位：−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−（式中、ｎは、典型的には約４〜約１０，０００の範囲である）を表すことは理解されよう。
【０２１０】
治療適用に適したＰＡＧポリマーは、典型的には、水および多くの有機溶媒中に可溶性であり、毒性がなく、免疫原性がないという特性を有する。ＰＡＧの使用の一例は、不溶性分子に該ポリマーを共有結合させて、得られるＰＡＧ−分子「コンジュゲート」を可溶性にすることである。例えば、水不溶性薬物であるパクリタキセルは、ＰＥＧにカップリングさせると、水溶性となることが示されている。Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、６０：３３１−３３６（１９９５）。ＰＡＧコンジュゲートは、多くの場合、可溶性および安定性を増強するためだけでなく、分子の血液循環半減期を延長させるためにも使用される。
【０２１１】
治療剤の生体分布を改変するためにＰＡＧ誘導体化（例えば、ＰＥＧコンジュゲーション）ができる可能性は、いくつかの要素、例えば、コンジュゲートの見かけ上の大きさ（例えば、流体力学的半径として測定）と関連している。大きなコンジュゲート（＞１０ｋＤａ）は、腎臓による濾過より有効にブロックすること、および結果として小型巨大分子（例えば、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の血清半減期を増大させることがわかっている。ＰＥＧコンジュゲートが濾過をブロックする能力は、およそ５０ｋＤａまでＰＥＧの大きさとともに増大することが示されている（さらなる増加は、半減期が、腎臓による排除ではなくマクロファージ媒介性代謝によって規定されるため、最小限に有益な効果しかない）。
【０２１２】
本発明のＰＡＧ誘導体化化合物は、典型的には、５〜８０ｋＤの大きさであるが、任意の大きさが使用され得、選択は、アプタマーおよび適用に依存する。本発明の他のＰＡＧ誘導体化化合物は１０〜８０ｋＤの大きさである。本発明のさらに他のＰＡＧ誘導体化化合物は１０〜６０ｋＤａの大きさである。一部のある実施形態において、本発明の組成物に誘導体化されるＰＡＧ部分は、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０または８０ｋＤａの大きさのＰＥＧである。一部のある実施形態において、ＰＥＧは線状ＰＥＧであり、一方、他の実施形態では、ＰＥＧは分枝のＰＥＧである。さらに他の実施形態では、ＰＥＧは、図４に示すような４ＯｋＤａの分枝のＰＥＧである。一部のある実施形態において、４０ｋＤａの分枝のＰＥＧは、図５に示すように、アプタマーの５’末端に結合される。
【０２１３】
本発明は、多重ＰＥＧ化核酸を含む高分子量ＰＥＧ−核酸（好ましくは、アプタマー）コンジュゲートの合成の費用効果の大きい経路を提供する。また、本発明は、ＰＥＧ結合多量体オリゴヌクレオチド、例えば、二量体化アプタマーを包含する。生物学的に発現されるタンパク質治療剤とは対照的に、核酸治療剤は、典型的には、活性化された単量体ヌクレオチドから化学的に合成される。ＰＥＧ−核酸コンジュゲートは、同じ反復的単量体合成を用いてＰＥＧを組み込むことにより調製され得る。例えば、ホスホロアミダイト形態への変換によって活性化されたＰＥＧは、固相オリゴヌクレオチド合成に組み込み得る。あるいはまた、オリゴヌクレオチド合成は、反応性ＰＥＧ結合部位の部位特異的組込みにより終了させ得る。
【０２１４】
活性化ＰＥＧ
高分子量ＰＥＧ（＞１０ｋＤａ）の作製は、困難で、非効率的および高価であり得る。高分子量ＰＥＧ−核酸コンジュゲートの合成に対する経路として、これまでの研究は、より高分子量の活性化ＰＥＧの作製に集中されていた。かかる分子を作製するための方法は、２つ以上のＰＥＧが、活性化された基を有する中心コアに結合された分枝鎖活性化ＰＥＧの形成を伴う。このような高分子量ＰＥＧ分子の末端部分、すなわち、比較的非反応性のヒドロキシル（−ＯＨ）部分は、１つ以上のＰＥＧを他の化合物に該化合物の反応性部位において結合させるために、活性化され得るか、または官能性部分に変換され得る。分枝鎖の活性化ＰＥＧは２つより多くの末端を有し、２つ以上の末端が活性化されている場合、かかる活性化された高分子量ＰＥＧ分子を、本明細書において多重活性化ＰＥＧという。一部のある場合では、分枝鎖ＰＥＧ分子内のすべての末端が活性化されているわけではない。分枝鎖ＰＥＧ分子内の任意の２つの末端が活性化されている場合、かかるＰＥＧ分子を二重活性化ＰＥＧという。分枝鎖ＰＥＧ分子の１つの末端だけが活性化されている一部のある場合、かかるＰＥＧ分子を単一活性化されているという。このアプローチの一例として、リシンコアへの２つのモノメトキシＰＥＧの結合によって調製、続いて、反応のために活性化された活性化ＰＥＧが報告されている（Ｈａｒｒｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ、ｖｏｌ．２：２１４−２２１、２００３年）。
【０２１５】
図６に示すように、線状ＰＥＧ分子は、二官能性であり、場合によっては、「ＰＥＧジオール」と呼ばれる。ＰＥＧ分子の末端部分は、比較的非反応性のヒドロキシル部分であり、該−ＯＨ基は、ＰＥＧを他の化合物に該化合物の反応性部位において結合させるために活性化され得るか、または官能性部分に変換され得る。かかる活性化されたＰＥＧジオールを、本明細書において二重活性化ＰＥＧという。例えば、ＰＥＧジオールの末端部分は、比較的非反応性のヒドロキシル部分−ＯＨを、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのスクシンイミジル活性エステル部分と置換することにより、アミノ部分との選択的反応のための活性な炭酸エステルとして官能性付与されている。あるいはまた、ＰＥＧジオールは、さまざまな基、例えば限定されないが、α−ハロ酢酸、エピハロヒドリン、マレエート、タルタレーソおよび適切な操作後、活性化カルボニルまたはコンジュゲーションのための同等物がもたらされ得る炭水化物を用いて活性化され得る。ＰＥＧの他の活性化方法は、Ｒｏｂｅｒｔｓら、（２００２）Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５４：５４９−４７６、（引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。上記の方法の１つを用いたＰＥＧの活性化に加え、ＰＥＧ分子の末端アルコール官能基の一方または両方を修飾することにより、核酸への異なる型のコンジュゲーションが可能となり得る。例えば、末端アルコール官能基の一方をアミンまたはチオールに変換すると、尿素およびチオウレタンコンジュゲートへのアクセスが可能になる。
【０２１６】
多くの適用において、一方の末端のＰＥＧ分子を本質的に非反応性部分でキャップし、ＰＥＧ分子を一官能性（単一活性化されたもの）とすることが望ましい。一般的に、活性化ＰＥＧに対して多数の反応部位を示すタンパク質治療剤の場合、二官能性活性化ＰＥＧは、広範な架橋をもたらし、官能性が不充分な凝集体が得られる。単一活性化ＰＥＧを作製するため、典型的には、ＰＥＧジオール分子の末端上の１つのヒドロキシル部分を、非反応性メトキシ末端部分−ＯＣＨ３で置換する。ＰＥＧ分子他方の非キャップ末端は、典型的には、表面またはタンパク質などの分子上の反応性部位での結合のために活性化され得る反応性末端部分に変換する。
【０２１７】
１つ以上のＰＥＧにコンジュゲートさせたアプタマー
最も一般的には、高分子量ＰＡＧ−核酸コンジュゲートの合成は、５’末端への遊離第１級アミンの付加によってなされている（固相合成の最後のカップリング工程で、修飾ホスホロアミダイトを用いて組み込まれる）。このアプローチを用い、反応性ＰＥＧ（例えば、アミンと反応して結合を形成するように活性化されたもの）を、精製オリゴヌクレオチドと合わせ、カップリング反応を溶液中で行なう。
【０２１８】
また、高分子量ＰＡＧ−核酸−ＰＡＧコンジュゲートは、一官能性活性化ＰＥＧと、１つより多くの反応性部位を含む核酸との反応によって調製され得る。一実施形態において、該核酸は二重反応性であり、２つの反応性部位：５’−アミノ基、および慣用的なホスホルアミダイト合成によってオリゴヌクレオチド内に導入された３’−アミノ基を含む（
３’−アミン固相で開始、例えば、図６に示す３’−５’−ジ−ＰＥＧ化）。代替的な実施形態において、反応性部位は、例えば、第１級アミンの結合部位としてピリミジンの５位、プリンの８位またはリボースの２’位を用い、内部の位置に導入され得る。かかる実施形態において、核酸は、いくつかの活性化された部位または反応性部位を有し得、多重に活性化されていると言える。
【０２１９】
核酸−ＰＥＧ−核酸コンジュゲートを作製するため、最初に核酸を、単一の反応性部位（例えば、単一活性化されたもの）を有するように合成する。好ましい実施形態において、この反応性部位は、オリゴヌクレオチドの固相合成の最後の工程として、修飾ホスホルアミダイトの付加によって５’末端に導入されたアミノ基である。別の好ましい実施形態において、該合成は、３’−アミン修飾剤を用いること、加えて、アミンを５’末端に導入し、３’，５’−ジ−アミン  オリゴヌクレオチドを得ることにより行なわれる。修飾オリゴヌクレオチドの脱保護および精製後、活性化ＰＥＧの自発的加水分解を最小限にする溶液中で、高濃度で再構成する。好ましい一実施形態において、オリゴヌクレオチドの濃度は１ｍＭであり、再構成された溶液は２００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３バッファー（ｐＨ８．３）を含有する。該コンジュゲートの合成は、高度に精製された活性化ＰＥＧの低速の段階的付加によって開始される。好ましい一実施形態において、ＰＥＧは、ｐ−ニトロフェニルカーボネートとして活性化されたものである。反応後、ＰＥＧ−核酸コンジュゲートをゲル電気泳動または液体クロマトグラフィーによって精製し、完全コンジュゲート種、部分コンジュゲート種および非コンジュゲート種に分離する。
【０２２０】
１つのＰＥＧにコンジュゲートさせた多数のアプタマー
本発明はまた、２つ以上の核酸部分が少なくとも１つのポリアルキレングリコール部分に共有結合によりコンジュゲートされた高分子量アプタマー組成物を包含する。ポリアルキレングリコール部分は安定化部分としての機能を果たす。安定化部分は、本発明の高分子量アプタマー組成物の薬物動態および薬力学的特性を改善する分子または分子の一部分である。一部のある場合では、安定化部分は、２つ以上のアプタマーもしくはアプタマードメインを近接させるか、または本発明の高分子量アプタマー組成物の全体的な回転自由度の低減をもたらす分子または分子の一部分である。安定化部分は、ポリアルキレングリコール、例えば、ポリエチレングリコールであり得、線状または分枝鎖のホモポリマーまたはヘテロポリマーであり得る。他の安定化部分としては、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などのポリマーが挙げられる。オリゴヌクレオチドもまた安定化部分であり得、かかるオリゴヌクレオチドとしては、修飾ヌクレオチドおよび／または修飾された連結部、例えば、ホスホロチオエートなどが挙げられ得る。
【０２２１】
安定化部分は、アプタマー組成物に一体化された部分であり得る、すなわち、アプタマーに共有結合されたものであり得る。ポリアルキレングリコール部分がいずれかの末端でアプタマーに、ポリアルキレングリコールが核酸部分を一緒にして１つの分子に連結するように共有結合された組成物では、ポリアルキレングリコールは、連結部分と言える。かかる組成物では、共有結合分子の一次構造は核酸−ＰＡＧ−核酸の線状配列を含む。ＰＥＧ安定化部分がアプタマーの異なる部分分離するリンカーとしての機能を果たす組成物の一例は、ＰＥＧが単一のアプタマー配列内で高分子量アプタマー組成物の線状配列が、例えば、核酸−ＰＥＧ−核酸（−ＰＥＧ−核酸）ｎ（式中、ｎは１以上である）となるようにコンジュゲートされた組成物である。
【０２２２】
核酸−ＰＥＧ−核酸コンジュゲートを作製するため、最初に核酸を、単一の反応性部位（例えば、単一活性化されたもの）を有するように合成する。好ましい実施形態において、この反応性部位は、オリゴヌクレオチドの固相合成の最後の工程として、修飾ホスホロアミダイトの付加によって５’末端に導入されたアミノ基である。修飾オリゴヌクレオチドの脱保護および精製後、活性化ＰＥＧの自発的加水分解を最小限にする溶液中で、高濃度で再構成する。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドの濃度は１ｍＭであり、再構成された溶液は２００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３バッファー（ｐＨ８．３）を含有する。該コンジュゲートの合成は、高度に精製された二官能性ＰＥＧの低速の段階的付加によって開始される。好ましい一実施形態において、ＰＥＧジオールは、ｐ−ニトロフェニルカーボネートとしての誘導体化によって、両方の末端が活性化（二重活性化）されている。反応後、ＰＥＧ−核酸コンジュゲートをゲル電気泳動または液体クロマトグラフィーによって精製し、完全コンジュゲート種、部分コンジュゲート種および非コンジュゲート種に分離する。多数のＰＡＧ分子が連結された（例えば、ランダムまたはブロックコポリマーとして）、またはより小型のＰＡＧ鎖を連結し、種々の長さ（または分子量）が得られ得る。非ＰＡＧリンカーは、種々の長さのＰＡＧ鎖間に使用され得る。
【０２２３】
また連結性ドメインは、１つ以上のポリアルキレングリコール部分が自身に結合された結合されたものであり得る。かかるＰＡＧは、種々の長さのものであり得、該組成物の所望の分子量を得るための適切な組合せで使用され得る。
【０２２４】
特定のリンカーの効果は、その化学組成および長さの両方によって影響され得る。長すぎるが、短すぎるか、または標的と好ましくない立体的および／またはイオン相互作用を形成するリンカーは、アプタマーと補体成分標的との複合体の形成を妨げる。核酸間の間隔に延在するのに必要であるより長いリンカーは、リガンドの有効濃度が減少することにより結合安定性が低減され得る。したがって、多くの場合、標的に対するアプタマーの親和性を最大限にするため、リンカーの組成および長さを最適化することが必要である。
【０２２５】
補体系タンパク質Ｃ５に対する結合親和性を有するアプタマー
一部のある実施形態において、本発明の材料には、生体内および／または細胞系アッセイにおいて、補体タンパク質Ｃ５に特異的に結合し、生体内および／または細胞系  アッセイにおいて補体タンパク質Ｃ５の活性を機能的にモジュレート（例えば、ブロック）する約１５〜約６０ヌクレオチド長の一連の核酸アプタマーが包含される。
【０２２６】
本発明の一部のある実施形態において、補体タンパク質Ｃ５に特異的に結合でき、モジュレートすることができるアプタマーを本明細書に記載する。このようなアプタマーは、さまざまな補体関連型疾患または障害、例えば、補体関連心臓障害（例えば、心筋損傷；冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）術に関連するＣ５媒介性補体合併症（例えば、術後出血など）、全身性好中球および白血球活性化、心筋梗塞のリスク増大、ならびに認知機能不全の増大；再狭窄；ならびに経皮的冠動脈インターベンションに関連するＣ５媒介性補体合併症）、虚血−再灌流障害（例えば、心筋梗塞、脳卒中、凍傷）、補体関連炎症性障害（例えば、喘息、関節炎、敗血症および器官移植後の拒絶）、ならびに補体関連自己免疫障害（例えば、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ））などの治療、改善および／または予防の低毒性で安全かつ有効なモダリティをもたらす。Ｃ５阻害が望ましい他の適応症としては、例えば、肺の炎症（Ｍｕｌｌｉｇａｎら（１９９８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：５０３）、体外補体活性化（Ｒｉｎｄｅｒら（１９９５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６：１５６４）、抗体媒介性補体活性化（Ｂｉｅｓｅｃｋｅｒら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：２６５４）、糸球体腎炎および他の腎臓系疾患、眼適応症、例えば、Ｃ５媒介性眼組織損傷、例えば、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）（滲出性および／または非滲出性の両方）ならびに発作性夜間ヘモグロビン尿症が挙げられる。これらのアプタマーはまた、診断剤においても使用され得る。
【０２２７】
一部のある実施形態において、本発明のアプタマーは、本発明の方法におけるさまざまな補体関連型眼疾患または障害、例えば、急性もしくは慢性炎症性および／または免疫媒介性眼障害、炎症性結膜炎（例えば、アレルギー性結膜炎および巨大乳頭性結膜炎）、黄斑浮腫、ブドウ膜炎、眼内炎、強膜炎、角膜の潰瘍、ドライアイ症候群、緑内障、虚血性網膜疾患、角膜移植片拒絶、眼内レンズ移植などの眼内手術に関連する合併症および白内障手術に伴う炎症、ベーチェット病、免疫複合体脈管炎、フックス病、フォークト−小柳−原田病、網膜下線維症、角膜炎、硝子体網膜炎症、眼の寄生虫外寄生／移動、色素性網膜炎、サイトメガロウイルス網膜炎および脈絡膜の炎症、黄斑変性、加齢性黄斑変性（「ＡＭＤ」）、非滲出性（「乾性」）の型のＡＭＤ、または新生血管形成眼障害（例えば、糖尿病性網膜症もしくは滲出性（「湿性」）の型のＡＭＤなどの処置、安定化および／または予防の低毒性で安全かつ有効なモダリティとして使用され得る。また、このようなアプタマーは眼科用診断剤においても使用され得る。
【０２２８】
このようなアプタマーは、本明細書に記載の修飾、例えば、親油性または高分子量化合物（例えば、ＰＥＧ）へのコンジュゲーション、キャッピング部分の組込み、修飾ヌクレオチドの組込み、およびリン酸主鎖に対する修飾などを含むものであってもよい。
【０２２９】
本発明の一実施形態において、Ｃ５補体タンパク質に結合する単離された天然に存在しないアプタマーを提供する。別の実施形態において、補体媒介性眼障害を処置、安定化および／または予防するための本発明の方法における使用のための、Ｃ５補体タンパク質に結合する単離された天然に存在しないアプタマーを提供する。一部のある実施形態において、該単離された天然に存在しないアプタマーは、１００μＭ未満、１μＭ未満、５００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ、１ｎＭ未満、５００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満のＣ５補体タンパク質に対する解離定数（「Ｋｄ」）を有する。本発明の一部のある実施形態において、解離定数は、以下の実施例１に記載のようなドットブロット滴定によって決定される。
【０２３０】
別の実施形態において、本発明の方法における使用のためのアプタマーは、Ｃ５補体タンパク質の機能をモジュレートする、特に、Ｃ５補体タンパク質の機能および／またはＣ５補体タンパク質バリアントの機能を阻害するものである。Ｃ５補体タンパク質バリアントは、本明細書で用いる場合、Ｃ５補体タンパク質の機能と本質的に同じ機能を果たすバリアントを包含する。Ｃ５補体タンパク質バリアントは、好ましくは、実質的に同じ構造を含むものであり、一部のある実施形態では、以下のアミノ酸配列（配列番号１０２）（Ｈａｖｉｌａｎｄら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１年１月ｌ日；１４６（ｌ）：３６２−８に示されている）を含むＣ５補体タンパク質のアミノ酸配列と、８０％配列同一性、より好ましくは９０％配列同一性、より好ましくは９５％配列同一性を含むものである。
【０２３１】
【化１０】
0005406534.tif 000011
本発明の一部のある実施形態において、標的バリアントの配列同一性は、後述するＢＬＡＳＴを用いて決定される。２つ以上の核酸またはタンパク質の配列に関連する用語「配列同一性」は、下記の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、または目視検査によって測定したとき、最大対応で比較およびアラインメントしたとき、同じであるか、または特定パーセントの同じアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する２つ以上の配列または部分配列をいう。配列比較では、典型的には、１つの配列が、試験配列と比較する参照配列としての機能を果たし得る。配列比較アルゴリズムを用いる場合は、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要であれば部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムにより、指定したプログラムパラメータに基づいて、試験配列（１つまたは複数）について参照配列に対する配列同一性割合を計算する。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索の方法、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実施（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ  ａｎｄ  ＴＦＡＳＴＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、または目視検査（概要はＡｕｓｕｂｅｌら（後掲）を参照）によって行なわれ得る。
【０２３２】
配列同一性割合の決定に適したアルゴリズムの一例は、ベーシック局所アラインメント検索ツール（以下、本明細書において「ＢＬＡＳＴ」）に用いられるアルゴリズムであり、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１５：３３８９−３４０２（１９９７）を参照のこと。ＢＬＡＳＴ解析を行なうためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（以下、本明細書において「ＮＣＢＩ」）から公に入手可能である。ＮＣＢＩから入手可能なソフトウエア、例えば、ＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列用）およびＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸配列用）を用いた配列同一性の決定に用いられるデフォルトパラメータは、ＭｃＧｉｎｎｉｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３２：Ｗ２０−Ｗ２５（２００４）に記載されている。
【０２３３】
本発明の別の実施形態において、配列番号１〜２、５〜６７、７５〜８１、８３または８８〜９８のいずれか１つを含むアプタマーと実質的に同じＣ５補体タンパク質への結合能力を有するアプタマーが提供される。本発明の別の実施形態において、アプタマーは、配列番号１〜２、５〜６７、７５〜８１、８３または８８〜９８のいずれか１つを含むアプタマーと実質的に同じ構造およびＣ５補体タンパク質への結合能力を有する。別の実施形態において、本発明のアプタマーは、配列番号２、５〜６７、７５〜８１、８３または８８〜９８のいずれか１つによる配列（任意の化学的修飾を含む）を有する。別の実施形態において、本発明のアプタマーは、医薬組成物中の活性成分として使用される。別の実施形態において、本発明のアプタマーまたは該アプタマーを含む組成物は、さまざまな補体関連疾患または障害、例えば、補体関連心臓障害（例えば、心筋損傷；冠動脈バイパス移植術（ＣＡＢＧ）に関連するＣ５媒介性補体合併症（例えば、術後出血など）、全身性好中球および白血球活性化、心筋梗塞のリスク増大ならびに認知機能不全の増大；再狭窄；ならびに経皮的冠動脈インターベンションに関連するＣ５媒介性補体合併症）、虚血−再灌流障害（例えば、心筋梗塞、脳卒中、凍傷）、補体関連炎症性障害（例えば、喘息、関節炎、敗血症および器官移植後の拒絶）、ならびに補体関連自己免疫障害（例えば、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、肺の炎症、体外補体活性化、抗体媒介性補体活性化、および補体関連眼疾患（糖尿病性網膜症など）ならびに加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）からなる群より選択されるいずれか１つを処置するために使用される。
【０２３４】
一実施形態において、本発明の抗Ｃ５アプタマーは、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド（「２’−ＯＭｅ」）および２’−ＯＨプリン残基の混合物を含むものである。修飾された抗Ｃ５アプタマーの説明的な一般配列（配列番号１）を、以下に表１に示し、構造を図３Ａに示す。プリン（ＡおよびＧ）の圧倒的多数が、２’−ＯＨのままであるＧ残基の２つだけ（白抜きで示した残基）を除き、２’−ＯＭｅに対して修飾されている。丸で囲まれた残基は、アプタマーの抗Ｃ５活性を実質的に改変することなく、２’−Ｈに対して同時に修飾され得るピリミジンのサブセットを表す（以下の表１のＡＲＣ３３０（配列番号２，図３Ｂ）を参照）。図３Ａに示す下線の残基は、２’−フルオロまたは２’−Ｈ修飾（しかし２’−ＯＭｅではない）のいずれかを含有するものであり得るピリミジン残基を表し、一方、四角で囲まれた残基は、２’−フルオロまたは２−ＯＭｅ修飾（しかし２’−Ｈではない）のいずれかを含有するものであり得るピリミジン残基を表す。矢印（→）で示した残基は、２’−フルオロ修飾を含有するものでなければならない。矢印（→）で示した残基に２’−フルオロ修飾がない場合、得られるアプタマーにもたらされる溶血性活性は、実質的に減少する。好ましい実施形態において、本発明の抗Ｃ５アプタマーは、配列番号１によるヌクレオチド配列を含むものである。
【０２３５】
本発明による抗Ｃ５アプタマーの一例は、図３Ｃに示されたＡＲＣ１８６（配列番号４）であり、これは、米国特許第号６，３９５，８８８（引用により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。ＡＲＣ１８６の２１個のすべてのピリミジン残基が２’−フルオロ修飾を有する。３つの２’−ＯＨプリン残基（図３Ｃにおいて白抜きで示す）を除くプリンの大部分（１４残基）が２’−ＯＭｅ修飾を有する。本発明の抗Ｃ５アプタマーはまた、２’−フルオロ修飾と２’−Ｈ修飾の種々の混合物を含むものであり得る。例えば、本発明の別の抗Ｃ５アプタマーは、図３Ｂに示すＡＲＣ３３０（配列番号２）である。ＡＲＣ３３０（配列番号２）は、７つの２’−Ｈ修飾（図３Ｂにおいて丸で囲まれた残基）、２’−フルオロ修飾を有する１４個のピリミジン残基、２’−ＯＭｅ修飾を有する１４個のプリン残基、および３つの２’−ＯＨプリン残基（図３Ｂにおいて白抜きで示す）を含む。
【０２３６】
２’−フルオロ修飾、２’−ＯＭｅ修飾、２’−ＯＨプリン残基および種々の大きさの非免疫原性高分子量化合物（例えば、ＰＥＧ）へのコンジュゲーション（これらの各々は、ＡＲＣ１８６（配列番号４）から誘導されたものである）の混合物を含むアプタマーの他の組合せを、以下の表１に記載する。本発明は、以下の表１に記載のアプタマーを包含する。また、本発明は以下に記載のものであるが、表示した３’キャップ（例えば、逆位デオキシチミジンキャップ）を欠くアプタマーおよび／または３’キャップを表示していないが３’キャップ（例えば、逆位ｄＴ）を含む以下に表示したアプタマーを含む。
【０２３７】
本発明の一部のある実施形態に記載の方法における使用のための抗Ｃ５アプタマーは、後述の配列番号１〜６９、７５、７６、８１、９１、９５および９６のいずれか１つを含むアプタマーであり得る。
【０２３８】
特に記載のない限り、以下の表１のヌクレオチド配列は５’から３’方向に記載している。表１の個々の配列の各々について、すべての２’−ＯＭｅプリンまたはピリミジン修飾には、対応するヌクレオチドの前に「ｍ」を示す；すべての２’−フルオロピリミジン修飾には、対応するヌクレオチドの前に「ｆ」を示す；すべてのプリンまたはピリミジンデオキシ修飾には、対応するヌクレオチドの前に「ｄ」を示す；およびヌクレオチドの前に「ｍ」、「ｆ」または「ｄ」がないプリンまたはピリミジンはいずれも２’−ＯＨ残基を示す。さらに、「３Ｔ」は逆位デオキシチミジンを示し、「ＮＨ」はヘキシルアミンリンカーを示し、「ＮＨ２」はヘキシルアミン末端基を示し、「ＰＥＧ」は、表示された分子量を有するポリエチレングリコール基を示し、「ビオチン」は、５’末端にコンジュゲートされたビオチンを有するアプタマーを示す。
【０２３９】
【表１−１】
0005406534.tif 000012
【０２４０】
【表１−２】
0005406534.tif 000013
【０２４１】
【表１−３】
0005406534.tif 000014
【０２４２】
【表１−４】
0005406534.tif 000015
【０２４３】
【表１−５】
0005406534.tif 000016
【０２４４】
【表１−６】
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本発明は、さらに、以下の表２のアプタマーを包含する。表２のアプタマーは、５’から３’の方向に表示しており、示したｄＲｍＹ  ＳＥＬＥＸＴＭ条件下で選択したアプタマーのリボヌクレオチド配列を表す。この選択から誘導された（配列表に反映したもの）本発明の一部のある実施形態において、プリン（ＡおよびＧ）はデオキシであり、ピリミジン（ＵおよびＣ）は２’−ＯＭｅである。一部のある実施形態において、アプタマーはキャップ（例えば、３’逆位ｄＴ）を含むものである。一部のある実施形態において、アプタマーはＰＥＧを含むものである。
【０２４５】
【表２】
0005406534.tif 000018
補体タンパク質Ｃ５に結合する本発明の他のアプタマーを、以下に実施例３に記載する。Ｃ５特異的アプタマーは、米国特許仮出願第６０／５４４，５４２号、同第６０／５４７，７４７号、同第６０／５８１，６８５号および同第６０／６０８，０４８号（その各々は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）にさらに記載されている。
【０２４６】
一部のある実施形態において、本発明のアプタマー治療剤は、標的に対して大きな親和性および特異性を有するとともに、該アプタマー治療剤が患者または被験体の体内で分解したときに、天然に存在しないヌクレオチド置換に由来する有害な副作用を低下させる。一部のある実施形態では、本発明のアプタマー治療剤を含有する治療用組成物は、フッ素含有ヌクレオチドを含まないか、または量が少ない。
【０２４７】
本発明のアプタマーは、当該技術分野で知られた任意のオリゴヌクレオチド合成手法、例えば、当該技術分野でよく知られた固相オリゴヌクレオチド合成手法を用いて合成され得る（例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４６７（１９８６）およびＦｒｏｅｈｌｅｒら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：５５７５−５５７８（１９８６）を参照のこと）ならびに液相方法、例えば、トリエステル合成法（例えば、Ｓｏｏｄら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．４：２５５７（１９７７）およびＨｉｒｏｓｅら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．、２８：２４４  （１９７８）を参照のこと）。
【０２４８】
本発明はまた、本発明の抗Ｃ５剤を、それぞれ、ＰＤＧＦおよび／またはＶＥＧＦおよび／またはそのコグネイトレセプターＰＤＧＦＲおよびＶＥＧＦＲに特異的なアプタマーとともに、眼障害を安定化、治療および／または予防する本発明の方法において使用することを包含する。したがって、この方法は、リガンド（例えば、ＰＤＧＦまたはＶＥＧＦ）とその標的（例えば、コグネイトレセプター）との結合をブロックする本発明のアプタマーを作製するための使用であり得る。
【０２４９】
本発明の方法における使用のための抗ＰＤＧＦアプタマーの例は、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３９９７５（２００５年１１月２日出願、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されており、特に、ＡＲＣ５１３、ＡＲＣ５９４、ＡＲＣ１２７およびＡＲＣ４０４がそこに開示されている。
【０２５０】
本発明の方法における使用のためのＶＥＧＦ特異的アプタマーの例は、米国特許第５，９１９，４５５号、同第５，９３２，４６２号、同第６，１１３，９０６号、同第６，０１１，０２０号、同第６，０５１，６９８号、および同第６，１４７，２０４号に開示されている。例えば、本発明の抗Ｃ５剤との組み合わせで眼障害の治療における使用に特に有用なアプタマーは、ペグ化および非ペグ化形態のＥＹＥ００１（以前はＮＸ１８３８）、特に、ペガプタニブナトリウム注射（Ｍａｃｕｇｅｎ（登録商標）、Ｅｙｅｔｅｃｈ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．およびＰｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．ＮＹ、ＮＹ）であり得る。
【０２５１】
抗Ｃ５抗体剤
本発明の抗Ｃ５剤には、補体タンパク質Ｃ５に指向されるアンタゴニスト抗体およびＣ５媒介性眼障害の治療におけるその使用が包含される。本発明のＣ５アンタゴニスト抗体は、Ｃ５に強固に結合し、その活性化および切断を抑制する。特別な実施形態において、本発明は、抗Ｃ５抗体剤を被験体に、眼障害の少なくとも１つの症状、特に、糖尿病性網膜症、滲出性および／または非滲出性ＡＭＤの症状を低減、安定化および／または予防する方法において投与することを含むものである。
【０２５２】
本発明のアンタゴニスト抗体としては、阻害性モノクローナル抗体が挙げられる。モノクローナル抗体またはその断片には、免疫グロブリンのすべてのクラス（ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡなど）、またはそのサブクラス（ＩｇＧサブクラスなど）またはその混合物が包含される。ＩｇＧおよびそのサブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３またはＩｇＧＭなどは有用である。ＩｇＧのサブタイプであるＩｇＧ．ｓｕｂ．１／ｋａｐｐａおよびＩｇＧ．ｓｕｂ．２ｂ／ｋａｐｐは、有用な実施形態として包含される。断片として挙げられ得るのは、１つまたは２つの抗原相補的結合部位を有し、哺乳動物（哺乳動物Ｃ５）に対して高い結合活性および中和活性示すあらゆる切断型または修飾型抗体フラグメント、例えば、抗体に対応する結合部位を有し、軽鎖重鎖によって形成される該抗体の一部分（Ｆｖ、ＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）２断片など）、または単鎖断片などである。Ｆｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２などの切断型二本鎖断片は、特に有用である。このような断片は、例えば、酵素的手段（パパインもしくはペプシンなどの酵素による抗体のＦｃ部分の除去による）化学的酸化または抗体遺伝子の遺伝子操作によって得られ得る。また、遺伝子操作された、非切断型断片を使用することも可能であり、好都合である。
【０２５３】
該新規な抗体、その抗体フラグメント、混合物または誘導体は、好都合には、１×１０−７Ｍ〜１×１０−１２  Ｍ、または１×１０−８Ｍ〜１×１０−１１Ｍ、または１×１０−９Ｍ〜５×１０−１０Ｍの範囲のＣ５に対する結合親和性を有する。
【０２５４】
遺伝子操作のための抗体遺伝子は、例えば、ハイブリドーマ細胞から、当業者にはわかる様式で単離され得る。この目的のため、抗体産生細胞を培養し、細胞の光学濃度充分になったとき、ｍＲＮＡを細胞から既知の様式で、細胞をグアニジニウムチオシアネートを用いて溶解させ、酢酸ナトリウムで酸性化し、フェノール、クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、イソプロパノールを用いて沈殿させ、エタノールで洗浄することにより単離する。次いで、逆転写酵素を用いてｍＲＮＡ  からｃＤＮＡを合成する。合成されたｃＤＮＡは、例えば、部位特異的変異誘発、適当な動物、真菌、細菌またはウイルス系のベクターへの挿入、逆位、欠失または塩基交換の導入によって、直接または遺伝子操作後に挿入され、適切な宿主生物体内で発現され得る。有用な細菌または酵母系のベクターは、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８／１９、ｐＡＣＹＣ１８４、λまたは酵母μベクター（細菌（大腸菌など）または酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなど）内での遺伝子のクローニングおよび発現用）である。
【０２５５】
さらにまた、本発明は、Ｃ５抗体を合成する細胞に関する。このようなものとしては、上記のような形質転換後の動物、真菌、細菌の細胞または酵母細胞が挙げられる。該細胞は、好都合には、ハイブリドーマ細胞またはトリオーマ細胞であり、典型的にはハイブリドーマ細胞である。このようなハイブリドーマ細胞は、例えば、既知の様式で、Ｃ５で免疫治療した動物から、その抗体産生Ｂ細胞を単離し、Ｃ５結合抗体についてこれらの細胞を選択し、続いて、これらの細胞を、例えば、ヒトもしくは動物の、例えば、マウス骨髄腫細胞、ヒトリンパ芽球様細胞もしくはヘテロハイブリドーマ細胞に融合させることにより（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒら、（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９６を参照のこと）、またはこれらの細胞を適切なウイルスに感染させて不死化細胞株を得ることにより作製され得る。融合によってハイブリドーマ細胞株は有用であり、マウスハイブリドーマ細胞株は、特に有用である。本発明のハイブリドーマ細胞株は、ＩｇＧ型の有用な抗体を分泌するものである。本発明のｍＡｂ抗体の結合性により、補体タンパク質Ｃ５と高い親和性で結合し、その生物学的（例えば、Ｃ５切断）活性が低減または中和される。
【０２５６】
さらに、本発明は、Ｃ５阻害活性を保持しつつ、医薬用薬剤としての使用に関連する１つ以上の他の特性、例えば、血清安定性または産生効率が改変された、これらの抗Ｃ５抗体の誘導体を包含する。かかる抗Ｃ５抗体誘導体の例としては、固相または液状担体、例えば、ポリエチレングリコール、ガラス、合成ポリマー（ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンなど）もしくは天然ポリマー（セルロース、セファロースもしくはアガロースなど）などに結合された、あるいは酵素、毒素または放射活性もしくは非放射活性マーカー（３Ｈ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、３６Ｃｌ、５７Ｃｏ、５５Ｆｅ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、７５Ｓｅなど）とのコンジュゲートである抗体の抗原結合領域に由来するペプチド、ペプチド模倣物、および抗体、抗体フラグメントまたはペプチド、あるいは、蛍光／化学発光標識（ローダミン、フルオレセイン、イソチオシアネート、フィコエリトリン、フィコシアニン、フルオレサミン、金属キレート化剤、アビジン、ストレプトアビジンもしくはビオチンなど）に共有結合された抗体、断片またはペプチドが挙げられる。
【０２５７】
該新規な抗体、その抗体フラグメント、混合物および誘導体は、乾燥（例えば、凍結乾燥）後、上記の担体への結合後、または他の医薬活性物質および医薬調製物の作製のための補助物質との製剤化後、直接使用され得る。活性物質および補助物質の例として挙げられ得るものは、他の抗体、抗菌作用もしくは静菌作用を有する抗菌活性物質（一般的には抗生物質など）またはスルホンアミド、抗腫瘍剤、水、バッファー、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックス、不活性ビヒクルまたは非経口用製品用の慣用的な他の物質（アミノ酸、増粘剤もしくは糖類など）である。このような医薬調製物は、疾患を処置するために使用され、血管新生眼障害ならびにＡＭＤ（滲出性および／または非滲出性）および糖尿病性網膜症などの疾患の少なくとも１つの症状の発生の安定化、低減および／または予防するのに有用である。
【０２５８】
該新規な抗体、その抗体フラグメント、混合物または誘導体は、治療もしくは診断において直接、あるいは固相または液相担体、酵素、毒素、放射活性もしくは非放射活性標識または上記のような蛍光／化学発光標識へのカップリング後に使用され得る。
【０２５９】
本発明のヒトＣ５モノクローナル抗体は、当該技術分野で知られた任意の手段によって得られ得る。例えば、哺乳動物はヒトＣ５で免疫処置される。精製ヒトＣ５は市販されている（例えば、Ｑｕｉｄｅｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡまたはＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから）。あるいはまた、ヒトＣ５は、ヒト血漿から容易に精製され得る。抗ヒトＣ５抗体の生成に使用される哺乳動物は限定されず、霊長類、齧歯類（マウス、ラットもしくはウサギなど）、ウシ、ヒツジ、ヤギまたはイヌであり得る。
【０２６０】
次に、脾臓細胞などの抗体産生細胞を、免疫治療動物から取り出し、骨髄腫細胞と誘導させる。骨髄腫細胞は当該技術分野で周知である（例えば、ｐ３ｘ６３−Ａｇ８−６５３、ＮＳ−０、ＮＳ−１またはＰ３Ｕ１細胞が使用され得る）。細胞融合操作は、当該技術分野で知られた任意の慣用的な方法によって行なわれ得る。
【０２６１】
該細胞は、細胞融合操作に供された後、次いでＨＡＴ選択培地中で、ハイブリドーマが選択されるように培養される。次いで、抗ヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする。このスクリーニングは、例えば、産生されるモノクローナル抗体が、ヒトＣ５が固定化されたウェルに結合されるサンドイッチ型酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）などによって行なわれ得る。この場合、二次抗体として、免疫治療動物の免疫グロブリンに特異的な抗体（これは、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼなどの酵素で標識される）が使用され得る。標識は、標識酵素をその基質と反応させ、発色を測定することにより検出され得る。基質としては、３，３−ジアミノベンジジン、２，２−ジアミノビス−ｏ−ジアニシジン、４−クロロナフタノール、４−アミノアンチピリン、ｏ−フェニレンジアミンなどが使用され得る。
【０２６２】
上記の操作によって、抗ヒトＣ５抗体を産生するハイブリドーマが選択され得る。次いで、選択したハイブリドーマを、慣用的な限界希釈法または軟寒天法によってクローニングする。所望により、クローニングしたハイブリドーマは、血清含有培地または無血清培地を用いて大規模培養してもよく、マウスの腹腔内に接種し、腹水から回収してもよく、それにより多数のクローニングハイブリドーマが得られ得る。
【０２６３】
選択した抗ヒトＣ５モノクローナル抗体のうち、Ｃ５切断能力を有するもの（例えば、細胞系Ｃ５アッセイ系において）を、次いで、さらなる解析および操作のために選択する。抗体がＣ５切断をブロックする場合、これは、試験したモノクローナル抗体が、ヒトＣ５のＣ５活性を低減または中和する能力を有することを意味する。すなわち、該モノクローナル抗体は、特異的にＣ５切断および活性化を認識および／または干渉する。
【０２６４】
本明細書におけるモノクローナル抗体には、さらに、所望の生物学的活性を示すものである限り、抗Ｃ５抗体を可変（超可変を含む）ドメインを定常ドメインと（例えば、「ヒト化」抗体）、または軽鎖を重鎖と、または１つの種に由来する鎖を別の種に由来する鎖とスプライシングすることにより、または異種タンパク質との融合により作製されるハイブリッドおよび組換え抗体（起源の種または免疫グロブリンのクラスもしくはサブクラス指定とは無関係に）ならびに抗体フラグメント［例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２およびＦｖ］が包含される［例えば、米国特許第４，８１６，５６７号およびＭａｇｅおよびＬａｍｏｙｉ、ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ｐｐ．７９−９７（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）を参照のこと］。
【０２６５】
したがって、用語「モノクローナル」は、得られる抗体の特徴が実質的に均質な抗体集団に由来していることを示し、なんら特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈すべきでない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ方法（最初に、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）によって報告）によって作製されたものであってもよく、組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製されたものであってもよい。また、「モノクローナル抗体」は、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載の手法を用いて作製されたファージライブラリーから単離されたものであってもよい。
【０２６６】
「ヒト化」形態の非ヒト（例えば、マウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含む特異的なキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２もしくは抗体の他の抗原結合部分配列など）である。大抵、ヒト化抗体は、レシピエント抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）ＣＤＲ由来の残基で置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が対応する非ヒトＦＲ残基で置き換えられている。さらにまた、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも輸入（ｉｍｐｏｒｔ）されたＣＤＲまたはＦＲ配列にも見られない残基を含むものであり得る。このような修飾は、抗体性能をさらに精密化および最適化するために行なわれる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインを実質的にすべて含み、ここで、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ残基のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。また、ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部分を含む。
【０２６７】
非ヒト抗体のヒト化方法は、当該技術分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。このような非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、「輸入」残基と呼ばれ、典型的には「輸入」可変ドメインから採取されたものである。ヒト化は、本質的にＷｉｎｔｅｒおよび共同研究者（Ｊｏｎｅｓら、（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６）の方法に従って、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより行なわれ得る。したがって、かかる「ヒト化」抗体はキメラ抗体であって、インタクトなヒト可変ドメインの相当少ない部分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたものである。実際、ヒト化抗体は、典型的には、一部のＣＤＲ残基および場合によっては一部のＦＲ残基も齧歯類抗体の類縁部位由来の残基で置換されたヒト抗体である。
【０２６８】
ヒト化抗体の作製に使用されるヒト可変ドメイン（軽鎖および重鎖ともに）の選択は、抗原性を低下させるのに非常に重要である。いわゆる「ベストフィット（ｂｅｓｔ−ｆｉｔ）」法に従い、齧歯類抗体の可変ドメインの配列を、ヒト可変ドメインの既知配列のラブラリー全体に対してスクリーニングする。次いで、齧歯類のものに最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワーク（ＦＲ）とする（Ｓｉｍｓら、（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：２２９６；ならびにＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１）。別の方法では、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのすべてヒト抗体のコンセンサス配列由来の特定のフレームワークが使用される。いくつかの異なるヒト化抗体に対して同じフレームワークを使用してもよい（Ｃａｒｔｅｒら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８９：４２８５；およびＰｒｅｓｔａら、（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｏｌ．、１５１：２６２３）。
【０２６９】
抗体を、抗原に対する高い親和性および他の有利な生物学的特性を保持するようにヒト化することは、さらに重要である。この目的を達成するため、有用な方法の一例に従い、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の３次元モデルを使用し、親配列および種々の概念的ヒト化作製配列の解析プロセスによって調製される。３次元免疫グロブリンモデルは、一般的に利用可能であり、当業者には熟知されている。選択した候補免疫グロブリン配列の考えられ得る３次元コンホメーション構造を図示および表示するコンピュータープログラムが利用可能である。このような表示を検討することにより、候補免疫グロブリン配列の機能発揮における該残基の考えられえる役割の解析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の解析が可能になる。このようにして、所望の抗体特性（例えば、標的抗原（１種類または複数種）に対する親和性の増大）が得られるようにＦＲ残基が選択され、コンセンサス配列および輸入配列から合成され得る。一般に、ＣＤＲ残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合への影響に関与している。
【０２７０】
また、Ｃ５に指向されるヒトモノクローナル抗体も本発明に包含される。かかる抗体は、ハイブリドーマ法によって作製され得る。ヒトモノクローナル抗体産生のためのヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株は、例えば、Ｋｏｚｂｏｒ（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３、３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ｐｐ．５１−６３  （Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７年）；およびＢｏｅｍｅｒら、（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７：８６−９５に記載されている。
【０２７１】
ここに、免疫処置すると、内因性の免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の完全体のレパートリーを産生し得るトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することが可能になった。例えば、キメラおよび生殖細胞系変異型マウスにおける抗体重鎖連結領域（Ｊ．ｓｕｂ．Ｈ）遺伝子のホモ接合型欠失によって、内因性の抗体産生の完全な阻害がもたらされることが報告されている。かかる生殖細胞系（ｇｅｍ−ｌｉｎｅ）変異型マウスへのヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの導入により、抗原刺激されると、ヒト抗体の産生がもたらされる（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、９０：２５５１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ、３６２：２５５−２５８；およびＢｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、（１９９３）Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．、７：３３を参照のこと）。
【０２７２】
あるいはまた、ファージディスプレイ手法（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２−５５３）は、ヒト抗体および抗体フラグメントを試験管内で、非免疫治療ドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから作製するために使用され得る（概説については、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎら、（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、３：５６４−５７１を参照のこと）。Ｖ−遺伝子セグメントいくつかの供給源がファージディスプレイに使用され得る。例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４−６２８）により、免疫治療マウスの脾臓由来のＶ遺伝子の小さなランダムコンビナトリアルラブラリーから抗オキサゾロン抗体の多様なアレイが単離された。Ｖ遺伝子のレパートリーは、非免疫治療されたヒトドナーから構築され得、多様なアレイの抗原（自己抗原を含む）に対する抗体が、本質的にＭａｒｋｓら（（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１−５９７、またはＧｒｉｆｆｉｔｈら、（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．、１２：７２５−７３４）に記載の方法に従って単離され得る。
【０２７３】
自然な免疫応答では、抗体遺伝子により変異が高率で蓄積される（体細胞超変異）。導入された一部に変異によってより高い親和性が賦与され、高親和性表面免疫グロブリンをディスプレイするＢ細胞が、その後の抗原刺激中に優先的に  複製され、分化される。この自然なプロセスは、「鎖シャッフリング」として知られる手法を用いることにより模倣され得る（Ｍａｒｋｓら、（１９９２）Ｂｉｏ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、１０：７７９−７８３を参照のこと）。この方法において、ファージディスプレイによって得られたヒト「一次」抗体の親和性は、重鎖および軽鎖のＶ領域遺伝子を、非免疫治療ドナーから得たＶドメイン遺伝子の天然に存在するバリアント（レパートリー）のレパートリーで逐次置き換えることにより改善され得る。この手法により、ｎＭ範囲の親和性を有する抗体および抗体フラグメントの作製が可能になる。非常に大きなファージ抗体レパートリーを作製するためのストラテジーは、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら（（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２１：２２６５−２２６６）に記載されている。
【０２７４】
遺伝子シャッフリングはまた、齧歯類抗体からヒト抗体を誘導するために使用され得、この場合、ヒト抗体は、出発齧歯類抗体と類似した親和性および特異性を有する。この方法（「エピトープインプリンティング」とも呼ばれる）従い、ファージディスプレイ手法によって得られた齧歯類抗体の重鎖または軽鎖のＶドメイン遺伝子を、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置き換え、齧歯類−ヒトキメラが作出される。抗原に対する選択により、機能性抗原結合部位を回復し得るヒト可変部の単離がもたらされる、すなわち、エピトープがパートナーの選択を支配する（インプリンティングを行なう）。残留齧歯類Ｖドメインを置き換えるために該プロセスを反復すると、ヒト抗体が得られる（ＰＣＴ  ＷＯ９３／０６２１３（１９９３年４月１日公開）を参照のこと）。ＣＤＲグラフティングによる従来の齧歯類抗体のヒト化とは異なり、この手法は、齧歯類起源のフレームワークまたはＣＤＲ残基をもたない完全にヒト型の抗体を提供する。
【０２７５】
本発明の方法において抗Ｃ５剤として使用され得るモノクローナル抗体および抗体フラグメントの一例は、それぞれ、エクリズマブ（ＳｏｌｉｒｉｓＴＭとしても知られる、Ａｌｅｘｉｏｎ、Ｃｈｅｓｈｉｒｅ、ＣＴ）およびペキセリズマブ（Ａｌｅｘｉｏｎ、Ｃｈｅｓｈｉｒｅ、ＣＴ）であり、ともにＵＳＳＮ  ６，３５５，２４５（引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【０２７６】
また、本発明は、眼障害を安定化、治療および／または予防する本発明の方法において、本発明の抗Ｃ５剤を、それぞれ、ＰＤＧＦおよび／またはＶＥＧＦおよびそのコグネイトレセプターＰＤＧＦＲおよび／またはＶＥＧＦＲに指向されるアンタゴニスト抗体とともに使用することを包含する。したがって、この方法は、リガンド（例えば、ＰＤＧＦまたはＶＥＧＦ）のその標的（例えば、コグネイトレセプターなど）との結合をブロックする本発明の抗体アンタゴニストを作製するために使用され得る。したがって、本発明のＰＤＧＦアンタゴニスト抗体としては、ＰＤＧＦならびにＰＤＧＦＲ標的に指向される抗体が挙げられる。
【０２７７】
本発明の方法における抗Ｃ５剤との使用のためのＶＥＧＦに指向されるアンタゴニスト抗体の例は、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）としても知られる、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）（米国特許第６，０５４，２９７号（引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載）；およびラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）としても知られる、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）。
【０２７８】
アンチセンスおよびリボザイム抗Ｃ５剤
本発明の抗Ｃ５剤には、Ｃ５に対して標的化され、メッセンジャーＲＮＡからのタンパク質翻訳を阻害することにより、または対応するＣ５ｍ  ＲＮＡの分解を標的化することによりＣ５阻害効果を発揮するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムが包含される。眼障害を処置する方法における抗Ｃ５アンチセンスおよびリボザイム剤の使用もまた提供する。特別な実施形態において、本発明は、抗Ｃ５アンチセンスまたはリボザイム剤を被験体に、眼障害の少なくとも１つの症状、特に、糖尿病性網膜症、滲出性および／または非滲出性ＡＭＤの症状を低減、安定化および／または予防する方法において投与することを含むものである。
【０２７９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムの設計および合成方法は、当該技術分野において知られている。さらなる手引きを本明細書において提供する。
【０２８０】
特異的かつ有効なｍＲＮＡ標的化オリゴヌクレオチド（アンチセンスＯＤＮ）およびリボザイムの設計における課題の１つは、標的ｍＲＮＡ（これ自体は、部分自己対合二次構造体にフォールディングされている）内でのアンチセンス対合のアクセス可能な部位の同定に関するものである。ＲＮＡ対合のアクセス可能性を予測するためのコンピューター補助アルゴリズムと分子スクリーニングとの組合せにより、ほとんどのｍＲＮＡ標的に対して指向される特異的かつ有効なリボザイムおよび／またはアンチセンスオリゴヌクレオチドの作製が可能になる。実際、アンチセンスまたはリボザイムインヒビターに対する標的ＲＮＡ分子のアクセス可能性を測定するためのいくつかのアプローチが報告されている。アプローチの一例では、できるだけ多くのアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを適用する試験管内スクリーニングアッセイが使用される（Ｍｏｎｉａら、（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、２：６６８−６７５；およびＭｉｌｎｅｒら、（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５：５３７−５４１を参照のこと）。別の例では、ＯＤＮのランダムライブラリーが使用される（Ｈｏら、（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２４：１９０１−１９０７；Ｂｉｒｉｋｈら、（１９９７）ＲＮＡ  ３：４２９−４３７；およびＬｉｍａら、（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２：６２６−６３８）。アクセス可能な部位は、ＲＮアーゼＨ切断によってモニターされ得る（Ｂｉｒｉｋｈら、前掲；およびＨｏら、（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６：５９−６３を参照のこと）。ＲＮアーゼＨは、ＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖のホスホジエステル主鎖の加水分解性切断を触媒する。
【０２８１】
別のアプローチでは、半ランダムキメラ化学的合成ＯＤＮのプールの使用を伴うものを用いて、試験管内合成ＲＮＡ標的上のＲＮアーゼＨによって切断されるアクセス可能な部位を同定する。次いで、プライマー伸張解析を用いて標的分子内のこのような部位を同定する（Ｌｉｍａら（前掲）を参照のこと）。ＲＮＡにおけるアンチセンス標的の設計のための他のアプローチは、ＲＮＡのコンピューター補助フォールディングモデルに基づくものである。有効な切断をスクリーニングするためのランダムリボザイムライブラリーの使用に関するいくつかの報告が発表されている（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、（１９９５）ＲＮＡ  １：５９８−６０９；Ｌｉｅｂｅｒら、（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１５：５４０−５５１；およびＶａｉｓｈら、（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３６：６４５９−６５０１を参照のこと）。
【０２８２】
ＯＤＮおよびＲＮアーゼＨのランダムまたは半ランダムライブラリーを用いる他の試験管内アプローチは、コンピューターシミュレーション（Ｌｉｍａら、前掲）よりも有用であり得る。しかしながら、試験管内合成されたＲＮＡの使用では、最近の観察結果によりポリヌクレオチドのアニーリング相互作用がＲＮＡ結合タンパク質によって影響されることが示されているため、生体内でのアンチセンスＯＤＮのアクセス可能性は予測されない（Ｔｓｕｃｈｉｈａｓｈｉら、（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６７：９９−１０２；Ｐｏｒｔｍａｎら、（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊ．、１３：２１３−２２１；およびＢｅｒｔｒａｎｄおよびＲｏｓｓｉ（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊ．、１３：２９０４−２９１２を参照のこと）。米国特許第６，５６２，５７０号（その内容は引用により明細書に組み込まれる）は、生体内条件を模倣する細胞抽出物の存在下で、ｍＲＮＡ内のアクセス可能な部位を決定するための組成物および方法を提供する。
【０２８３】
簡単には、この方法は、天然または試験管内合成ＲＮＡを、規定のアンチセンスＯＤＮ、リボザイムまたはＤＮＡザイム、あるいはランダムもしくは半ランダムＯＤＮ、リボザイムまたはＤＮＡザイムラブラリーとともに、ハイブリダイゼーション条件条件下、内因性ＲＮＡ結合タンパク質を含有する細胞抽出物を含む反応培地中、または１種類以上のＲＮＡ結合タンパク質の存在のため細胞抽出物を模倣する反応培地中でインキュベーションすることを伴う。標的ＲＮＡ内のアクセス可能な部位に相補的な任意のアンチセンスＯＤＮ、リボザイムまたはＤＮＡザイムは、該部位にハイブリダイズする。規定のＯＤＮまたはＯＤＮラブラリーを使用する場合、ＲＮアーゼＨをハイブリダイゼーション中に存在させるか、またはハイブリダイゼーションが起こったらハイブリダイゼーション後に添加し、ＲＮＡ切断する。ＲＮアーゼＨは、リボザイムまたはＤＮＡザイムを使用する場合に存在させ得るが、ハイブリダイゼーションが起こった場合は、リボザイムおよびＤＮＡザイムがＲＮＡを切断するため、必要ではない。場合によっては、内因ｍＲＮＡ、ＲＮＡ結合タンパク質およびＲＮアーゼＨを含有する細胞抽出物中のランダムまたは半ランダムＯＤＮラブラリーが使用される。
【０２８４】
次に、種々の方法を用いて、アンチセンスＯＤＮ、リボザイムまたはＤＮＡザイムが結合し、切断が起こった標的ＲＮＡ上の該部位が特定され得る。例えば、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ依存性ポリメラーゼ連鎖反応（ＴＤＰＣＲ）がこの目的に使用され得る（ＫｏｍｕｒａおよびＲｉｇｇｓ（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２６：１８０７−１１を参照のこと）。逆転写工程を用いてＲＮＡ鋳型をＤＮＡに変換した後、ＴＤＰＣＲを行なう。本発明では、ＴＤＰＣＲ法に必要な３’末端を、任意の適当なＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）により目的の標的ＲＮＡ逆転写することにより作出する。これは、第１のＯＤＮプライマー（ＰＩ）を、標的ＲＮＡ分子の試験対象下の部分の下流（すなわち、ＲＮＡ分子の５’から３’への方向）の領域内のＲＮＡにハイブリダイズさせることにより行なわれる。ｄＮＴＰの存在下でのポリメラーゼは、Ｐ１の３’末端からＲＮＡはＤＮＡを複製し、アンチセンスＯＤＮ／ＲＮアーゼＨ、リボザイムまたはＤＮＡザイムのいずれかによってもたらされる切断部位で複製を終了する。新たなＤＮＡ分子（第１鎖ＤＮＡとよぶ）は、ＲＮＡ上に存在する対応のアクセス可能な標的配列を特定するのに使用される、ＴＤＰＣＲ法のＰＣＲ部分の第１の鋳型として供される。
【０２８５】
例えば、ＴＤＰＣＲ手順が次いで使用され得、すなわち、グアノシン三リン酸（ｒＧＴＰ）を用いて逆転写されたＤＮＡを、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）の存在下で反応させ、（ｒＧ）２〜４テイルをＤＮＡ分子の３’末端上に付加する。次に、３’２〜４突出端を有する二本鎖ＯＤＮリンカーを（ｒＧ）２〜４テイルと対合する一方の鎖上にライゲートさせる。次いで、２種類のＰＣＲプライマーを添加する。第１のものは、ＴＤＰＣＲリンカー鎖に相補的であり、（ｒＧ）２〜４テイル（場合によっては、短鎖ともいう）にライゲートさせたリンカープライマー（ＬＰ）である。他方のプライマー（Ｐ２）は、Ｐ１と同じであるが、Ｐ１に関してネスト化されたものであり得る、すなわち、Ｐ１が結合した領域の少なくとも一部上流（すなわち、ＲＮＡ分子の５’から３’への方向）であるが、標的ＲＮＡ分子の試験対象下の部分の下流である領域内の標的ＲＮＡに相補的である。すなわち、標的ＲＮＡ分子のアクセス可能な結合部位を有するか否かを調べる試験対象下の部分は、Ｐ２に相補的な領域の上流部分である。次いで、ＰＣＲを、既知の様式でＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で行ない、プライマーＬＰおよびＰ２によって規定されるＤＮＡセグメントを増幅させる。次いで、増幅産物を種々の任意の既知の方法によって捕捉し、続いて、自動ＤＮＡ配列解析装置において配列決定すると、正確な切断部位の特定が得られ得る。この部位が特定されたら、試験管内または生体内使用のための規定配列のアンチセンスＤＮＡまたはリボザイムが合成され得る。
【０２８６】
特異的遺伝子の発現におけるアンチセンスインターベンションは、合成アンチセンスオリゴヌクレオチド配列の使用によって行なわれ得る（例えば、Ｌｅｆｅｂｖｒｅ−ｄ’Ｈｅｌｌｅｎｃｏｕｒｔら、（１９９５）Ｅｕｒ．Ｃｙｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．、６：７；Ａｇｒａｗａｌ（１９９６）ＴＩＢＴＥＣＨ、１４：３７６；およびＬｅｖ−Ｌｅｈｍａｎら、（１９９７）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｔｈｅｒａｐ．ＣｏｈｅｎおよびＳｍｉｃｅｋ編、（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと）。簡単には、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、短鎖のＤＮＡ配列、典型的には１５〜３０量体であり得るが、目的の標的ｍＲＮＡを補完してＲＮＡ：ＡＳ二本鎖が形成されるように設計された７量体程度に小さいこともあり得る（Ｗａｇｎｅｒら、（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ、３７２：３３３を参照のこと）この二本鎖形成により、当該ｍＲＮＡのプロセッシング、スプライシング、輸送または翻訳が抑制される。さらに、ある種のＡＳヌクレオチド配列は、との標的ｍＲＮＡとハイブリダイズすると、細胞ＲＮアーゼＨ活性を惹起してｍＲＮＡ分解をもたらすものであり得る（Ｃａｌａｂｒｅｔｔａら、（１９９６）Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２３：７８を参照のこと）。かかる場合では、ＲＮアーゼＨにより二本鎖のＲＮＡ成分が切断され、ＡＳが放出されて、さらに、別の分子の標的ＲＮＡとハイブリダイズする可能性があり得る。さらなる作用様式は、ＡＳとゲノムＤＮＡが相互作用して転写的に不活性な三重結合を形成することに起因するものである。
【０２８７】
本明細書において上記のアンチセンス配列に加えて、またはその代わりに非限定的な例として、リボザイムが遺伝子機能の抑制に利用され得る。これは、アンチセンス療法が化学量論的考慮事項によって制限される場合、特に、必要である。次いで、同じ配列を標的化するリボザイムが使用され得る。リボザイムは、標的ＲＮＡ内の特異的部位を切断するＲＮＡ触媒能を有するＲＮＡ分子である。リボザイムによって切断されるＲＮＡ分子の数は、１：１の化学量論によって推測される数よりも多い（ＨａｍｐｅｌおよびＴｒｉｔｚ（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２８：４９２９−３３；およびＵｈｌｅｎｂｅｃｋ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ、３２８：５９６−６００を参照のこと）。したがって、本発明はまた、ＰＤＧＦまたはＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ種のアクセス可能なドメインに標的化され、適切な触媒中心を含むリボザイム配列の使用を可能にする。リボザイムは、当該技術分野で知られているようにして作製および送達され、本明細書においてさらに論考している。リボザイムは、アンチセンス配列と組み合わせて使用され得る。
【０２８８】
リボザイムは、ＲＮＡのホスホジエステル結合切断を触媒する。いくつかのリボザイムの構造的ファミリー、例えば、第Ｉ群イントロン、ＲＮアーゼＰ、Δ肝炎ウイルスリボザイム、ハンマーヘッド型リボザイムおよびヘアピン型リボザイム（最初に、タバコ輪点ウイルスサテライトＲＮＡ（ｓＴＲＳＶ）のマイナス鎖から誘導）が同定されている（Ｓｕｌｌｉｖａｎ（１９９４）Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇ．、（補足）１０３：９５Ｓ；および米国特許第５，２２５，３４７号を参照のこと）。後者の２つのファミリーは、リボザイムが、ローリングサークル型複製中に生じたオリゴマーからモノマーに分離すると考えられているウイロイドおよびウイルソイドに由来する（Ｓｙｍｏｎｓ（１９８９）ＴＥＢＳ、１４：４４５−５０；Ｓｙｍｏｎｓ（１９９２）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６１：６４１−７１を参照のこと）。ハンマーヘッド型およびヘアピン型リボザイムモチーフは、遺伝子療法のためのｍＲＮＡのトランス切断に最も一般的に適合されたものである。本発明に利用されるリボザイム型は、当該技術分野において既知のようにして選択される。ヘアピン型リボザイムは、現在、臨床試験中であり、特に有用な型である。一般に、リボザイムは３０〜１００ヌクレオチド長である。
【０２８９】
ｍＲＮＡを特異的認識配列部位で切断するリボザイムは、特定のｍＲＮＡを破壊するのに使用され得るが、ハンマーヘッド型リボザイムの使用が特に有用である。ハンマーヘッド型リボザイムはｍＲＮＡを、標的ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成するフランキング領域によって指令される位置で切断する。唯一の要件は、標的ｍＲＮＡが以下の２塩基配列：５’−ＵＧ−３’を有することである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および作製は、当該技術分野でよく知られており、ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ  （（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ、３３４：５８５）により充分に記載されている。
【０２９０】
また、本発明のリボザイムには、ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（以下、本明細書において「Ｃｅｃｈ型リボザイム」）、例えば、テトラヒメナ好熱菌に天然に存在し、Ｔｈｏｍａｓ  Ｃｅｃｈおよび共同研究者によって広く記載されたもの（ＩＶＳまたはＬ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡとして知られる）ものも包含される（Ｚａｕｇら、（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２４：５７４−５７８；ＺａｕｇおよびＣｅｃｈ（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３１：４７０−４７５；Ｚａｕｇら、（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ、３２４：４２９−４３３；国際特許出願番号Ｗ０８８／０４３００；ＢｅｅｎおよびＣｅｃｈ（１９８６）Ｃｅｌｌ、４７：２０７−２１６を参照のこと）。Ｃｅｃｈ型リボザイムは８塩基対活性部位を有し、これは、標的ＲＮＡの切断が行なわれた後、標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズする。本発明には、８塩基対活性部位配列を標的化するＣｅｃｈ型リボザイムが包含される。本発明は特定の作用機構理論に限定されないが、最近の報告で、ハンマーヘッド型リボザイムがＲＮＡ翻訳および／またはｍＲＮＡ標的の特異的切断をブロックすることにより機能することが示されているため、本発明におけるハンマーヘッド型リボザイムの使用は、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦ指向性アンチセンスの使用よりも利点を有し得る。
【０２９１】
アンチセンスアプローチの場合と同様、リボザイムは、修飾オリゴヌクレオチド（例えば、安定性、標的化の改善のためなど）で構成されたものであり得、標的ｍＲＮＡを発現する細胞に送達される。有用な送達方法は、強力な構成的ｐｏｌ  ＩＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩプロモーターの制御下のリボザイム「コード」ＤＮＡ構築物の使用を伴うものであり、その結果、トランスフェクト細胞は、標的化されたメッセンジャーを破壊し、翻訳を阻害するのに充分な量のリボザイムを産生する。リボザイムは、アンチセンス分子とは異なり、触媒性であるため、効率に必要とされる細胞内濃度はより低い。
【０２９２】
上記のように、ヌクレアーゼ抵抗性が必要な場合は、当該技術分野で知られた方法であって、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドまたはリボザイムの生物学的活性に実質的に干渉しない任意の方法によって、使用方法および送達方法に対して必要に応じて提供される（Ｉｙｅｒら、（１９９０）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、５５：４６９３−９９；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（１９８５）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５４：３６７−４０２；ＳｐｉｔｚｅｒおよびＥｃｋｓｔｅｉｎ（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１８：１１６９１−７０４；Ｗｏｏｌｆら、（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１８：１７６３−６９；およびＳｈａｗら、（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８：１１６９１−７０４）。アプタマーについて上記のように、ヌクレアーゼ抵抗性を増強するためにアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムに対してなされ得る非限定的な代表的な修飾としては、リン酸主鎖内のリンもしくは酸素ヘテロ原子の修飾、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖鎖間結合または短鎖ヘテロ原子もしくは複素環状糖鎖間結合が挙げられる。これらとしては、例えば、２’−フッ化、Ｏ−メチル化、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートおよびモルリホリノオリゴマーの調製が挙げられる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムは、４〜６個の３’末端ヌクレオチド塩基を連結するホスホロチオエート結合を有するものであり得る。あるいはまた、ホスホロチオエート結合は、すべてのヌクレオチド塩基を連結するものであり得る。ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドは通常、動物において有効濃度で有意な毒性を示さず、充分な薬力学的半減期を示し（Ａｇａｒｗａｌら、（１９９６）ＴＥＢＴＥＣＨ、１４：３７６を参照のこと）、ヌクレアーゼ抵抗性である。あるいはまた、ＡＳ−ＯＤＮでのヌクレアーゼ抵抗性は、３’末端にヌクレオチド配列ＣＧＣＧＡＡＧＣＧを有する配列を形成する９ヌクレオチドループを有することによりもたらされ得る。また、アビジン−ビオチンコンジュゲーション反応の使用も、血清ヌクレアーゼ分解に対するＡＳ−ＯＤＮ保護の改善に使用され得る（ＢｏａｄｏおよびＰａｒｄｒｉｄｇｅ（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．、３：５１９−２３を参照のこと）。この概念によれば、ＡＳ−ＯＤＮ剤は、その３’末端がモノビオチン化されている。アビジンと反応させると、これらは、非コンジュゲートＯＤＮよりも６倍改善された安定性を有する強固なヌクレアーゼ抵抗性複合体を形成する。
【０２９３】
他の研究により、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの生体内伸張が示されている（Ａｇａｒｗａｌら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８：７５９５）。このプロセスは、おそらく異質ＡＳ−オリゴヌクレオチドを循環系から除去するスカベンジャー機構として有用であり、伸張が起こる結合オリゴヌクレオチド内の遊離３’末端の存在に依存する。したがって、この重要な位置における部分ホスホロチオエート、ループ保護またはビオチン−アビジンは、このようなＡＳ−オリゴデオキシヌクレオチドの安定性を確保するのに充分なはずである。
【０２９４】
上記の修飾塩基の使用に加え、ヌクレオチドの構造が基本的に改変されており、治療用または実験用試薬としてより良好に適合されたヌクレオチドの類縁体が調製され得る。ヌクレオチド類縁体の一例はペプチド核酸（ＰＮＡ）であり、これは、ＤＮＡ（またはＲＮＡ）内のデオキシリボース（またはリボース）リン酸主鎖が、ペプチドに見られるものと類似したポリアミド主鎖で置き換えられたものである。ＰＮＡ類縁体は、酵素による分解に対して抵抗性であること、および生体内および試験管内で長寿命を有することが示されている。さらに、ＰＮＡは、ＤＮＡ分子よりも相補ＤＮＡ配列に対してより強力結合することが示されている。この観察結果は、ＰＮＡ鎖とＤＮＡ鎖間の電荷反発力の欠如によるものである。オリゴヌクレオチドに対してなされ得る他の修飾としては、ポリマー主鎖、モルリホリノポリマー主鎖（例えば、米国特許第５，０３４，５０６号（その内容は、引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）、環状主鎖もしくは非環状主鎖、糖模倣物または任意の他の修飾（例えば、オリゴヌクレオチドの薬力学的特性が改善され得るもの）が挙げられる。
【０２９５】
本発明のさらなる態様は、例えば、Ｃ５酵素によりアンチセンス手法およびリボザイム手法の両方のいくつかの機構的特徴が組み込まれるため、標的ｍＲＮＡの発現を減少させるためのＤＮＡ酵素の使用に関する。ＤＮＡ酵素は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと酷似して特定の標的核酸配列を認識するが、リボザイムと酷似して触媒的および特異的に標的核酸を切断するように設計される。
【０２９６】
現在、２つの基本的な型のＤＮＡ酵素が存在し、これらはともに、ＳａｎｔｏｒｏおよびＪｏｙｃｅによって同定された（例えば、米国特許第６，１１０，４６２号を参照のこと）。１０〜２３種類のＤＮＡ酵素は、２つのアームが連結されたループ構造を含むものである。この２つのアームにより、特定の標的核酸配列が認識されることによって特異性がもたらされるが、ループ構造は、生理学的条件下で触媒機能をもたらす。
【０２９７】
簡単には、標的核酸を特異的に認識して切断するＤＮＡ酵素を設計するためには、当業者はまず、非反復標的配列を特定しなければならない。これは、アンチセンスオリゴヌクレオチドで概要を示したものと同じアプローチを用いて行なわれ得る。場合によっては、非反復配列または実質的な配列は、およそ１８〜２２ヌクレオチドのＧ／Ｃ高含有配列である。高いＧ／Ｃ含量により、ＤＮＡ酵素と標的配列間のより強力な相互作用の保証が補助される。
【０２９８】
ＤＮＡ酵素を合成する場合、該酵素をそのメッセージに標的させる特異的アンチセンス認識配列は、該ＤＮＡ酵素の２つのアームが含まれ、該ＤＮＡ酵素のループが該２つの特異的アーム間に配置されるようにように分割される。
【０２９９】
ＤＮＡ酵素の作製および投与方法は、例えば、米国特許第６，１１０，４６２号を見るとよい。同様に、試験管内または生体内でのＤＮＡリボザイムの送達方法としては、本明細書に概要を示したＲＮＡリボザイムの送達方法が挙げられる。さらに、当業者には、アンチセンスオリゴヌクレオチドと同様、ＤＮＡ酵素は、安定性を改善するため、および分解に対する抵抗性を改善するため任意選択的に修飾され得ることは認識されよう。
【０３００】
また、本発明は、本発明の抗Ｃ５剤を、ＰＤＧＦおよび／またはＶＥＧＦ発現に指向されるアンチセンス剤、リボザイム剤および／またはＤＮＡ酵素剤とともに、眼障害を安定化、治療および／または予防する本発明の方法において使用することを包含する。したがって、この方法は、本発明の抗Ｃ５剤との使用のための、ＰＤＧＦおよび／またはＶＥＧＦ発現をブロックまたは阻害するアンチセンス剤、リボザイム剤および／またはＤＮＡ酵素剤を作製するための使用であり得る。
【０３０１】
抗Ｃ５  ＲＮＡｉ剤
本発明の一部のある実施形態は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によってＣ５の抑制を行なうための材料および方法を利用するものである。したがって、本発明の抗Ｃ５剤には、抗Ｃ５  ＲＮＡｉ剤が包含される。本発明は、本発明の眼障害を処置する方法における抗Ｃ５  ＲＮＡｉ剤の使用を包含する。特別な実施形態において、本発明は、抗Ｃ５  ＲＮＡｉ剤を被験体に、眼障害の少なくとも１つの症状、特に、糖尿病性網膜症、滲出性および／または非滲出性ＡＭＤの症状を低減、安定化および／または予防する方法において投与することを含むものである。
【０３０２】
ＲＮＡｉは、真核生物細胞において起こり得る配列特異的な転写後遺伝子抑制のプロセスである。一般に、このプロセスは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって誘導される特定配列のｍＲＮＡの分解を伴い、ここで、二本鎖ＲＮＡは該配列に相同である。例えば、特定の単鎖ｍＲＮＡ（ｓｓ  ｍＲＮＡ）の配列に対応する長鎖ｄｓＲＮＡの発現は、該メッセージを不安定化し、それにより、対応する遺伝子の発現に「干渉」する。したがって、任意の選択された遺伝子は、該遺伝子のｍＲＮＡの前部または実質的な部分に対応するｄｓＲＮＡを導入することにより抑制され得る。長鎖ｄｓＲＮＡが発現されると、これは、初期にリボヌクレアーゼＩＩＩによって２１〜２２塩基対長程度のより短鎖のｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドにプロセッシングされると思われる。したがって、ＲＮＡｉは、比較的短鎖の相同ｄｓＲＮＡの導入または発現によって行なわれ得る。実際、比較的短鎖の相同ｄｓＲＮＡの使用は、後述するような一定の利点を有し得る。
【０３０３】
哺乳動物細胞は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって影響される少なくとも２つの経路を有する。ＲＮＡｉ（配列特異的）経路では、開始ｄｓＲＮＡが、まず、上記のような短鎖の干渉性（ｓｉ）ＲＮＡに分解される。ｓｉＲＮＡは、各３’末端に２つのヌクレオチド突出端を有するおよそ１９ヌクレオチドのｓｉ  ＲＮＡで構成された約２１ヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖を有する。短鎖干渉性ＲＮＡは、特異的メッセンジャーＲＮＡが分解の標的となるのを可能にする配列情報を提供すると考えられている。対照的に、非特異的経路は、少なくとも約３０塩基対長であれば任意の配列のｄｓＲＮＡによって誘発される。非特異的効果は、ｄｓＲＮＡが２つの酵素：ＰＫＲ（二本鎖ＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ）（これは、その活性形態において、翻訳開始因子ｅＩＦ２をリン酸化し、すべてのタンパク質合成を停止させる）と、２’、５’オリゴアデニレートシンテターゼ（２’、５’−ＡＳ）（これは、あらゆるｍＲＮＡを標的化する非特異的酵素であるＲＮアーゼＬを活性化する分子を合成する）を活性化するために生じる。非特異的経路は、ストレスまたはウイルス感染に対する宿主応答で提示され得、一般に、本発明の特に有用な方法では非特異的経路の効果は最小限である。重要なことに、非特異的経路を誘導するには、より長鎖のｄｓＲＮＡが必要とされるようであり、したがって、約３０塩基対より短いｄｓＲＮＡが、ＲＮＡｉによる遺伝子抑制の実行に特に有用である（例えば、Ｈｕｎｔｅｒら、（１９７５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５０：４０９−１７；Ｍａｎｃｈｅら、（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１２：５２３９−４８；Ｍｉｎｋｓら、（１９７９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５４：１０１８０−３；およびＥｌｂａｓｈｉｒら、（２００１）Ｎａｔｕｒｅ、４１１：４９４−８を参照のこと）。
【０３０４】
ＲＮＡｉの実行に使用される特定の二本鎖オリゴヌクレオチドは３０塩基対長未満であり、約２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８または１７塩基対のリボ核酸を含むものであり得る。任意選択で、本発明のｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドに３’突出端末端を含めてもよい。非限定的な例示的な２−ヌクレオチド３’突出端は、任意の型のリボヌクレオチド残基で構成されたものであり得、２’−デオキシチミジン残基で構成されていることすらあり、これは、ＲＮＡ合成のコストが削減され、細胞培養培地中およびトランスフェクト細胞内でのｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ抵抗性が増強され得る（Ｅｌｂａｓｈｉら、（２００１）Ｎａｔｕｒｅ、４１１：４９４−８を参照のこと）。
【０３０５】
また、５０、７５、１００あるいは５００塩基対またはそれ以上もの長鎖のｄｓＲＮＡが、本発明の特定のある実施形態で使用されることがあり得る。ＲＮＡｉが実行されるためのｄｓＲＮＡの例示的な濃度は、約０．０５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、１．０ｎＭ、１．５ｎＭ、２５ｎＭまたは１００ｎＭであるが、処置される細胞の性質、遺伝子標的および当業者に容易にわかる他の要素に応じて他の濃度も使用され得る。例示的なｄｓＲＮＡは、化学的に合成されるもの、または適切な発現ベクターを用いて試験管内もしくは生体内で生成されるものであり得る。例示的な合成ＲＮＡとしては、使用すること  当該技術分野で知られた方法（例えば、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ＲＮＡホスホルアミダイトおよびチミジンホスホルアミダイト（Ｐｒｏｌｉｇｏ、Ｇｅｒｍａｎｙ））を用いて化学的に合成される２１ヌクレオチドのＲＮＡが挙げられる。合成オリゴヌクレオチドは、当該技術分野で知られた方法を用いて脱保護およびゲル精製され得る（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒら、（２００１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１５：１８８−２００を参照のこと）。より長鎖のＲＮＡは、当該技術分野で知られたプロモーター（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターなど）から転写され得る。単一のＲＮＡ標的は、試験管内プロモーターの下流の可能な両方の向きに配置されていると、標的の両方の鎖が転写され、所望の標的配列のｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドが作製される。
【０３０６】
該オリゴヌクレオチドの設計に用いられる具体的な配列は、標的（例えば、Ｃ５）の発現される遺伝子メッセージ内に含まれた任意の連続したヌクレオチド配列であり得る。当該技術分野で知られたプログラムおよびアルゴリズムを用いて、適切な標的配列が選択され得る。また、最適配列は、先でさらに記載したように、特定の単鎖核酸配列の二次構造が予測されるように、およびフォールディングされたｍＲＮＡの露出された単鎖領域内におそらく存在している配列の選択が可能となるように設計されたプログラムを用いて選択され得る。適切なオリゴヌクレオチドを設計するための方法および組成物は、例えば、米国特許第６，２５１，５８８号（その内容は、引用により本明細書に組み込まれる）を見るとよい。ｍＲＮＡは、一般的に、そのリボヌクレオチド配列内にタンパク質合成を指令する情報を含む線状分子と考えられている。しかしながら、研究により、ほとんどのｍＲＮＡには、いくつかの二次構造および三次構造が存在することが明らかになっている。ＲＮＡ内の二次構造構成要素は、ほとんどが同じＲＮＡ分子の異なる領域間のワトソン−クリック型相互作用によって形成されている。重要な二次構造の構成要素としては、分子内二本鎖領域、ヘアピン型ループ、二本鎖ＲＮＡにおける隆起および内部ループが挙げられる。三次構造の構成要素は、二次構造の構成要素が互いに、または単鎖領域と接触してより複雑な３次元構造がもたらされた場合に形成される。いくつかの研究により、多数のＲＮＡ二本鎖構造の結合エネルギーが測定されており、ＲＮＡの二次構造を予測するのに使用され得る一組の規則が誘導されている（例えば、Ｊａｅｇｅｒら、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８６：７７０６（１９８９）；およびＴｕｒｎｅｒら、（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、１７：１６７を参照のこと）。該規則は、ＲＮＡ構造の構成要素の同定に有用であり得、特に、ＲＮＡｉ、リボザイムまたはアンチセンス手法の無効化を標的化するｍＲＮＡの特に有用なセグメントであり得る単鎖ＲＮＡ領域の同定に有用である。したがって、ＲＮＡｉを媒介するｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計、ならびに本発明の適切なリボザイムおよびハンマーヘッド型リボザイム組成物の設計のためのｍＲＮＡ標的の特定のセグメントが同定され得る。
【０３０７】
ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは細胞内に、担体組成物（例えば、リポソームなど、これは当該技術分野で知られており、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｍｄ．）である）を、接着細胞株について製造業者により示されたようにして使用し、異種標的遺伝子を用いたトランスフェクションによって導入され得る。内在遺伝子を標的化するためのｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドのトランスフェクションは、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行なわれ得る。トランスフェクション効率は、ｐＡＤ３をコードするｈＧＦＰのコトランスフェクション後の哺乳動物細胞株の蛍光顕微鏡検査を用いて確認され得る（Ｋｅｈｌｅｎｂａｃｋら、（１９９８）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１４１：８６３−７４）。ＲＮＡｉの有効性は、ｄｓＲＮＡの導入後、いくつかの任意のアッセイによって評価され得る。これらとしては、限定されないが、新たなタンパク質合成が抑制された後の内因性プールのターンオーバーに充分な時間後、標的化された遺伝子産物を認識する抗体を用いるウエスタンブロット解析、および存在する標的ｍＲＮＡのレベルを測定するノザンブロット解析が挙げられる。
【０３０８】
本発明における使用のためのＲＮＡｉ手法のなおさらなる組成物、方法および適用は、米国特許第６，２７８，０３９号、同第５，７２３，７５０号および同第５，２４４，８０５号（これらは、引用により本明細書に組み込まれる）に示されている。
【０３０９】
また、本発明は、本発明の抗Ｃ５剤をＲＮＡｉ剤とともに、ＰＤＧＦおよび／またはＶＥＧＦ抑制のために、眼障害を安定化、治療および／または予防するための本発明の方法において使用することを包含する。したがって、この方法は、本発明の抗Ｃ５剤との使用のための、ＰＤＧＦおよび／またはＶＥＧＦを抑制するＲＮＡｉ剤作製するための使用であり得る。
【０３１０】
タンパク質およびポリペプチド抗Ｃ５剤
本発明の一部のある実施形態において、抗Ｃ５剤またはタンパク質またはポリペプチドである。本発明は、眼障害を処置する方法における抗Ｃ５タンパク質またはポリペプチド剤の使用を包含する。特別な実施形態において、本発明は、抗Ｃ５タンパク質またはポリペプチド剤を被験体に、眼障害の少なくとも１つの症状、特に、糖尿病性網膜症、滲出性および／または非滲出性ＡＭＤの症状を低減、安定化および／または予防する方法において投与することを含むものである。
【０３１１】
例えば、可溶性切断型の補体レセプター１型であって、抗Ｃ５タンパク質またはポリペプチド剤であるＴＰ１０（Ａｖａｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｅｄｈａｍ、ＭＡ）（例えば、米国特許第５，２１２，０７１号、同第５２５２，２１６号、同第５，２５６，６４２号、同第５，４５６，９０９号、同第５，４７２，９３９号、同第５，８４０，８５８号、同第５，８５６，２９７号、同第５，８５８，９６９号、同第５，９８１，４８１号、同第６，０５７，１３１号、同第６，１６９，０６８号および同第６，３１６，６０４号（その各々は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載）が、本発明の方法において使用され得る。ＡＰＴ０７０（Ｍｉｒｏｃｏｃｅｐｔ（登録商標）（Ｉｎｆｌａｚｙｍｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＴＤ．、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｂ．Ｃ．Ｃａｎａｄａ）としても知られる）も本発明の方法において使用され得る。
【０３１２】
また、本発明は、本発明の抗Ｃ５剤をタンパク質および／またはポリペプチド抗ＰＤＧＦおよび／または抗ＶＥＧＦ剤とともに、眼障害を安定化、治療および／または予防するための本発明の方法において使用することを包含する。
【０３１３】
小分子抗Ｃ５剤
本発明の一部のある実施形態において、抗Ｃ５剤は、小分子、特に有機小分子である。本発明は、眼障害を処置する方法における小分子抗Ｃ５剤の使用を包含する。特別な実施形態において、本発明は、小分子抗Ｃ５剤を被験体に、眼障害の少なくとも１つの症状、特に、糖尿病性網膜症、滲出性および／または非滲出性ＡＭＤの症状を低減、安定化および／または予防する方法において投与することを含むものである。
【０３１４】
また、本発明は、本発明の抗Ｃ５剤を小分子抗ＰＤＧＦおよび／または抗ＶＥＧＦ剤とともに、眼障害を安定化、治療および／または予防するための本発明の方法において使用することを包含する。例えば、本発明の抗Ｃ５剤は、抗ＰＤＧＦ剤メシル酸イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．Ｅａｓｔ  Ｈａｎｏｖｅｒ、ＮＪ）とともに使用され得る。また、本発明の抗Ｃ５剤は、抗ＶＥＧＦ剤、例えば、ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標）Ｏｎｙｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡおよびＢａｙｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒｔｉｏｎ、Ｗｅｓｔ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）；リンゴ酸スニチニブ（ｓｕｎｉｔｎａｂ）（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．ＮＹ、ＮＹ）などとともに使用され得る。
【０３１５】
抗Ｃ３アプタマー
一部のある実施形態において、本発明の材料には、補体タンパク質Ｃ３に高い特異性で結合し、生体内および／または細胞系アッセイにおいて補体タンパク質Ｃ３活性を機能的にモジュレート（例えば、ブロック）する一連の核酸アプタマーが包含される。このようなアプタマーは、本発明の方法におけるさまざまな補体関連型眼疾患または障害、例えば、急性もしくは慢性炎症性および／または免疫媒介性眼障害、炎症性結膜炎（例えば、アレルギー性結膜炎および巨大乳頭性結膜炎）、黄斑浮腫、ブドウ膜炎、眼内炎、強膜炎、角膜の潰瘍、ドライアイ症候群、緑内障、虚血性網膜疾患、角膜移植片拒絶、眼内レンズ移植などの眼内手術に関連する合併症および白内障手術に伴う炎症、ベーチェット病、免疫複合体脈管炎、フックス病、フォークト−小柳−原田病、網膜下線維症、角膜炎、硝子体網膜炎症、眼の寄生虫外寄生／移動、色素性網膜炎、サイトメガロウイルス網膜炎および脈絡膜の炎症、黄斑変性、加齢性黄斑変性（「ＡＭＤ」）、非滲出性（「乾性」）の型のＡＭＤ、または新生血管形成眼障害（例えば、糖尿病性網膜症もしくは滲出性（「湿性」）の型のＡＭＤなどの処置、安定化および／または予防の低毒性で安全かつ有効なモダリティをもたらす。また、このようなアプタマーは眼科用診断剤においても使用され得る。
【０３１６】
本発明の方法における使用のためのこのようなアプタマーは、本明細書に記載のような修飾、例えば、親油性または高分子量化合物（例えば、ＰＥＧ）へのコンジュゲーション、キャッピング部分の組込み、修飾ヌクレオチドの組込み、およびリン酸主鎖への修飾などを含むものであり得る。
【０３１７】
一実施形態において、補体媒介性眼障害を処置、安定化および／または予防するための本発明の方法における使用のための、Ｃ３補体タンパク質に結合する単離された天然に存在しないアプタマーを提供する。一部のある実施形態では、本発明の方法における使用のための単離された天然に存在しないアプタマーは、Ｃ３補体タンパク質に対して１００μＭ未満、１μＭ未満、５００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、５００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満の解離定数（「ＫＤ」）を有する。本発明の一部のある実施形態において、解離定数は、以下の実施例２に記載のドットブロット滴定によって測定される。
【０３１８】
別の実施形態において、本発明の方法における使用のためのアプタマーは、Ｃ３補体タンパク質の機能をモジュレートするもの、特に、Ｃ３補体タンパク質の機能および／またはＣ３補体タンパク質バリアントの機能を阻害するものである。Ｃ３補体タンパク質バリアントは、本明細書で用いる場合、Ｃ３補体タンパク質の機能と本質的に同じ機能を発揮するバリアントを包含する。Ｃ３補体タンパク質バリアントは、好ましくは、実質的に同じ構造を含むものであり、一部のある実施形態では、Ｄｅ  Ｂｒｕｉｊｎ，ＭＨおよびＦｅｙ，ＧＨ（１９８５）Ｈｕｍａｎ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｃ３：ｃＤＮＡ  ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２、７０８−１２に示されたアミノ酸配列を含むＣ３補体タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも８０％配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％配列同一性を含むものである。
【０３１９】
補体タンパク質Ｃ３に結合する本発明の他のアプタマーは、米国特許出願第６，１４０，４９０号、同第６，３９５，８８８号および同第６，５６６，３４３号（その各々は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）にさらに記載されている。
【０３２０】
抗Ｃｌｑアプタマー
一部のある実施形態において、本発明の材料には、補体タンパク質Ｃ１ｑに高い特異性で結合し、生体内および／または細胞系アッセイにおいて補体タンパク質Ｃ１ｑの活性を機能的にモジュレート（例えば、ブロック）する一連の核酸アプタマーが包含される。
【０３２１】
このようなアプタマーは、本発明の方法におけるさまざまな補体関連型眼疾患または障害、例えば、急性もしくは慢性炎症性および／または免疫媒介性眼障害、炎症性結膜炎（例えば、アレルギー性結膜炎および巨大乳頭性結膜炎）、黄斑浮腫、ブドウ膜炎、眼内炎、強膜炎、角膜の潰瘍、ドライアイ症候群、緑内障、虚血性網膜疾患、角膜移植片拒絶、眼内レンズ移植などの眼内手術に関連する合併症および白内障手術に伴う炎症、ベーチェット病、免疫複合体脈管炎、フックス病、フォークト−小柳−原田病、網膜下線維症、角膜炎、硝子体網膜炎症、眼の寄生虫外寄生／移動、色素性網膜炎、サイトメガロウイルス網膜炎および脈絡膜の炎症、黄斑変性、加齢性黄斑変性（「ＡＭＤ」）、非滲出性（「乾性」）の型のＡＭＤ、または新生血管形成眼障害（例えば、糖尿病性網膜症もしくは滲出性（「湿性」）の型のＡＭＤなどの処置、安定化および／または予防の低毒性で安全かつ有効なモダリティをもたらす。また、このようなアプタマーは眼科用診断剤においても使用され得る。
【０３２２】
本発明の方法における使用のためのこのようなアプタマーは、本明細書に記載のような修飾、例えば、親油性または高分子量化合物（例えば、ＰＥＧ）へのコンジュゲーション、キャッピング部分の組込み、修飾ヌクレオチドの組込み、およびリン酸主鎖への修飾などを含むものであり得る。
【０３２３】
一実施形態において、補体媒介性眼障害を処置、安定化および／または予防するための本発明の方法における使用のための、Ｃ１ｑ補体タンパク質に結合する単離された天然に存在しないアプタマーを提供する。一部のある実施形態では、本発明の方法における使用のための単離された天然に存在しないアプタマーは、Ｃ１ｑ補体タンパク質に対して１００μＭ未満、１μＭ未満、５００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、５００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満の解離定数（「ＫＤ」）を有する。本発明の一部のある実施形態において、解離定数は、以下の実施例２に記載のドットブロット滴定によって測定される。
【０３２４】
別の実施形態において、本発明の方法における使用のためのアプタマーは、Ｃ１ｑ補体タンパク質の機能をモジュレートするものであり、特に、Ｃ１ｑ補体タンパク質の機能および／またはＣ１ｑ補体タンパク質バリアントの機能を阻害するものである。Ｃ１ｑ補体タンパク質バリアントは、本明細書で用いる場合、Ｃ１ｑ補体タンパク質の機能と本質的に同じ機能を発揮するバリアントを包含する。Ｃ１ｑ補体タンパク質バリアントは、好ましくは、実質的に同じ構造を含むものであり、一部のある実施形態では、Ｓｅｌｌａｒ，ＧＣ、Ｂｌａｋｅ，ＤＪおよびＲｅｉｄ，ＫＢ（１９９１）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ａ−、Ｂ−  ａｎｄ  Ｃ−ｃｈａｉｎｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｓｕｂｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｃ１ｑ．Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｈｕｍａｎ  Ｃ１ｑ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２７４、４８１−９０に示されたアミノ酸配列を含むＣ１ｑ補体タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも８０％配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％配列同一性を含むものである。
【０３２５】
補体タンパク質Ｃ１ｑに結合する本発明の他のアプタマーは、米国特許第６，１４０，４９０号、同第６，３９５，８８８号および同第６，５６６，３４３号（その各々は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）にさらに記載されている。
【０３２６】
一部のある実施形態において、本発明のアプタマー治療剤、例えば、抗Ｃ５、Ｃ３および／またはＣ１ｑは、その標的に対して大きな親和性および高い特異性を有するが、アプタマー治療剤が患者または被験体の体内で分解された場合、天然に存在しないヌクレオチド置換に由来する有害な副作用は低減されている。
【０３２７】
本発明の抗補体アプタマー、例えば、本発明の抗Ｃ５、Ｃ３および／またはＣ１ｑアプタマーは、当該技術分野で知られた任意のオリゴヌクレオチド合成手法、例えば、当該技術分野でよく知られた固相オリゴヌクレオチド合成手法（例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４６７（１９８６）およびＦｒｏｅｈｌｅｒら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：５５７５−５５７８（１９８６）を参照のこと）ならびに液相法、例えば、トリエステル合成法（例えば、Ｓｏｏｄら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．４：２５５７  （１９７７）およびＨｉｒｏｓｅら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．、２８：２４４９  （１９７８）を参照のこと）を用いて合成され得る。
【０３２８】
また、本発明は、本発明の抗補体アプタマー（例えば、抗Ｃ５、Ｃ３および／またはＣ１ｑアプタマー）を、それぞれ、ＰＤＧＦおよび／またはＶＥＧＦおよび／またはそのコグネイトレセプターＰＤＧＦＲおよびＶＥＧＦＲに対するアプタマーとともに、眼障害を安定化、治療および／または予防する本発明の方法において使用することを包含する。
【０３２９】
本発明の方法における使用のための抗ＰＤＧＦアプタマーの例は、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３９９７５（２００５年１１月２日出願、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されており、特に、ＡＲＣ５１３、ＡＲＣ５９４、ＡＲＣ１２７およびＡＲＣ４０４がそこに開示されている。
【０３３０】
本発明の方法における使用のためのＶＥＧＦ特異的アプタマーの例は、米国特許第  号５，９１９，４５５号、同第５，９３２，４６２号、同第６，１１３，９０６号、同第６，０１１，０２０号、同第６，０５１，６９８号、および同第６，１４７，２０４号に開示されている。例えば、本発明の抗補体アプタマー（特に、抗Ｃ５アプタマー）と組み合わせて眼障害の治療において使用するのに特に有用なアプタマーは、ペグ化および非ペグ化形態のＥＹＥ００１（以前はＮＸ１８３８）、特に、ペガプタニブナトリウム注射（Ｍａｃｕｇｅｎ（登録商標）、Ｅｙｅｔｅｃｈ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．およびＰｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．ＮＹ、ＮＹ）であり得る。
【０３３１】
医薬組成物
本発明はまた、抗Ｃ５剤を含有する医薬組成物、特に、補体タンパク質Ｃ５に結合するアプタマー分子を含有する医薬組成物、特に、補体タンパク質Ｃ５に結合してその切断を抑制するアプタマーを含有する医薬組成物を包含する。一部のある実施形態において、該組成物は内服に適したものであり、有効量の本発明の薬理学的に活性な化合物を、単独または１種類以上の薬学的に許容され得る担体との組合せで含む。該化合物は、毒性があったとしても非常に低いという点で特に有用である。
【０３３２】
本発明の組成物は、疾患または障害などの病態を治療または予防するため、または患者においてかかる疾患または障害の症状を改善するために使用され得る。例えば、本発明の組成物は、補体関連心臓障害（例えば、心筋損傷；冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）術に関連するＣ５媒介性補体合併症（例えば、術後出血など）、全身性好中球および白血球活性化、心筋梗塞のリスク増大ならびに認知機能不全の増大；再狭窄；ならびに経皮的冠動脈インターベンションに関連するＣ５媒介性合併症）；虚血−再灌流障害（例えば、心筋梗塞、脳卒中、凍傷）；補体関連炎症性障害（例えば、喘息、関節炎、敗血症および器官移植後の拒絶）；ならびに補体関連自己免疫障害（例えば、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥまたは狼瘡）；肺の炎症；体外補体活性化；抗体媒介性補体活性化、および補体媒介性眼適応症（血管新生眼障害など、特に、糖尿病性網膜症）ならびに加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）などと関連する病態を治療または予防するために使用され得る。特別な一実施形態において、本発明の組成物は、Ｃ５媒介性眼障害、特に、糖尿病性網膜症、滲出性および／または非滲出性ＡＭＤの症状を低減、安定化および／または予防するために使用され得る。
【０３３３】
一部のある実施形態において、本発明の組成物は、患者において眼の疾患または障害などの病態を安定化、治療および／または予防するために使用され得る。例えば、本発明の組成物は、補体関連型眼障害、例えば、急性もしくは慢性炎症性および／または免疫媒介性眼障害、炎症性結膜炎（例えば、アレルギー性結膜炎および巨大乳頭性結膜炎）、黄斑浮腫、ブドウ膜炎、眼内炎、強膜炎、角膜の潰瘍、ドライアイ症候群、緑内障、虚血性網膜疾患、角膜移植片拒絶、眼内レンズ移植などの眼内手術に関連する合併症および白内障手術に伴う炎症、ベーチェット病、免疫複合体脈管炎、フックス病、フォークト−小柳−原田病、網膜下線維症、角膜炎、硝子体網膜炎症、眼の寄生虫外寄生／移動、色素性網膜炎、サイトメガロウイルス網膜炎および脈絡膜の炎症、黄斑変性、加齢性黄斑変性（「ＡＭＤ」）、非滲出性（「乾性」）の型のＡＭＤ、または新生血管形成眼障害（例えば、糖尿病性網膜症もしくは滲出性（「湿性」）の型のＡＭＤなどと関連する病態を安定化、治療および／または予防するために使用され得る。
【０３３４】
本発明の組成物は、本発明の抗Ｃ５剤が阻害する補体タンパク質Ｃ５、または本発明の抗Ｃ５剤が特異的に結合する補体タンパク質Ｃ５に関連または由来する疾患または障害を患っているか、またはその素因がある被験体への投与に有用である。一部のある実施形態において、本発明の組成物は、本発明の抗補体アプタマーが阻害する補体タンパク質および／または本発明の抗補体アプタマーが高い特異性で結合する補体タンパク質に関連または由来する眼の疾患または障害を患っているか、またはその素因がある被験体への投与に特に有用である。
【０３３５】
一部のある実施形態において、補体媒介性眼障害を有するか、またはその素因がある被験体の治療のための組成物を提供する。特別な実施形態では、補体媒介性眼障害、特に、非滲出型のＡＭＤおよび／または新生血管形成眼障害、特に、糖尿病性網膜症および滲出型ＡＭＤを有するか、またはそのリスクがある被験体の治療のための組成物を提供する。一部のある実施形態において、該リスクのある被験体は、ドルーゼンおよび／または網膜の色素沈着変化を有するが、臨床的視力低下はない被験体である。ドルーゼンは、間接眼底鏡を用いて検出され、典型的には、網膜の赤い背景に対して黄色の斑および粒子として出現する。臨床的失明は、Ｅａｒｌｙ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ  Ｓｔｕｄｙ  Ｃｈａｒｔ（「ＥＴＤＲＳチャート」）を用いて、１〜３ラインの視力の低下で示される。黄斑変性に伴う他の視野の変化としては、ゆがみおよび／またはアムスラー図表を用いて検出される盲点（暗点）、暗順応の変化（網膜杆細胞の健康の診断）または色解釈の変化（網膜錐体細の健康の診断）が挙げられる。一部のある実施形態では、該リスクのある被験体は、野生型と比較したとき被験体の補体Ｈ因子における変化を有する被験体である。例えば、Ｅｄｗａｒｄｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第３０８巻、ｐｐ４２１−４２２（２００５）、Ｈａｇｅｍａｎ，Ｇ．ら、ＰＮＡＳ、第１０２巻、ｐｐ．７２２７−７２３１（２００５）、およびＨａｉｎｅｓ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第３０８巻、ｐｐ４１９−４２１（２００５）に記載された変形例を参照のこと。一部のある実施形態において、該リスクのある被験体は、ドルーゼン、失明なしおよび補体Ｈ因子の変化の組合せを有する被験体である。一部のある実施形態では、該リスクのある被験体は、ドルーゼンが検出された被験体である。一部のある実施形態では、治療対象の該リスクのある被験体は、ドルーゼンが検出され、臨床的視力低下および／または視野における他の変化が存在する被験体である。
【０３３６】
本発明の組成物は、病態、一部のある好ましい実施形態では眼の病態を有する患者または被験体を処置するための方法において使用され得る。本発明の方法は、患者または被験体に、抗Ｃ５剤、特に、Ｃ５特異的アプタマーまたはこれを含む組成物を、抗Ｃ５剤が補体タンパク質Ｃ５に結合するように、補体タンパク質Ｃ５への結合によってその生物学的機能が改変され（例えば、その切断生体内が抑制され）、それによりＣ５媒介性病態が処置されるように投与することを伴う。特別な実施形態では、本発明の抗Ｃ５剤、特に、本発明のＣ５特異的アプタマーの結合により、患者の、特に網膜の組織、ＲＰＥ細胞、脈絡膜血管および／または網膜の毛細管内のＶＥＧＦおよび／またはＰＤＧＦの発現および／またはｂＦＧＦおよび／または内皮細胞増殖を刺激する他の増殖因子のレベルが低下し、それにより、ＶＥＧＦおよび／またはＰＤＧＦ媒介性障害、特に、血管新生眼障害（例えば、ＡＭＤおよび／または糖尿病性網膜症など）が処置される。
【０３３７】
一実施形態において、本発明の抗補体アプタマー、特に、本発明の抗Ｃ５アプタマーは、被験体に、眼でのＶＥＧＦおよび／またはＰＤＧＦ生体内発現のレベルを低下させるのに充分な量で、経眼的または眼周囲に投与される。本発明の方法の特別な一実施形態において、本発明の抗補体アプタマー、特に抗Ｃ５アプタマーを投与される被験体は、ＶＥＧＦおよび／またはＰＤＧＦ発現の低下によって、新生血管形成眼障害の少なくとも１つの症状の予防、安定化および／または低減が補助される血管新生眼障害を有するか、またはそのリスクがあると同定された被験体である。
【０３３８】
眼に病態を有する患者または被験体、すなわち、本発明の方法によって処置される患者または被験体は、脊椎動物、より詳しくは哺乳動物、より特別にはヒトであり得る。
【０３３９】
実際、本発明の抗Ｃ５剤、特に、本発明のＣ５特異的アプタマーまたはその薬学的に許容され得る塩もしくはプロドラッグは、その所望の生物学的活性が奏される（例えば、アプタマー標的のそのレセプターの結合が阻害される、標的タンパク質の切断が抑制される）充分な量で投与される。
【０３４０】
本発明の一態様には、Ｃ５媒介性補体障害用の他の治療剤と組み合わせた本発明のアプタマー組成物が包含される。一実施形態において、本発明では、補体媒介性眼障害用の他の治療剤と組み合わせた本発明のアプタマー組成物を記載する。本発明のアプタマー組成物は、例えば、１種類より多くのアプタマーを含有するものであり得る。一例において、１種類以上の本発明の化合物を含有する本発明のアプタマー組成物は、別の有用な組成物、例えば、抗炎症剤、免疫抑制剤、抗ウイルス剤などと組み合わせて投与される。さらにまた、本発明の化合物は、上記のような細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤または化学療法剤、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、分裂抑制剤または細胞傷害性抗生物質と組み合わせて投与され得る。特別な実施形態では、本発明の抗Ｃ５剤、例えば、一般に、かかる組合せにおける使用が既知の治療用薬剤の現在利用可能な投薬形態などが好適である。
【０３４１】
「併用療法」（または「共療法」）は、本発明の抗Ｃ５剤、特に、Ｃ５特異的本発明のアプタマー組成物および少なくとも第２の薬剤を、これらの治療用薬剤の共作用による有益な効果を提供することが意図される特定の治療レジメンの一部として投与することを含む。該組合せの有益な効果としては、限定されないが、治療用薬剤の組合せによりもたらされる薬物動態的または薬力学的共作用が挙げられる。これらの治療用薬剤の組合せでの投与は、典型的には、規定の期間（選択される組合せに応じて、通常、数分間、数時間、数日間または数週間）にわたって行なわれる。一部のある実施形態において、第２の薬剤は、抗ＶＥＧＦ剤および／または抗ＰＤＧＦ剤であり得る。
【０３４２】
該方法がさらに被験体に抗ＶＥＧＦ剤を投与する工程を含む上記の方法の実施形態において、抗ＶＥＧＦ剤は、核酸分子、アプタマー、アンチセンス分子、ＲＮＡｉ分子、タンパク質、ペプチド、環状ペプチド、抗体または抗体フラグメント、糖、ポリマーおよび小分子からなる群より選択されるものであり得る。
【０３４３】
該方法がさらに被験体に抗ＰＤＧＦ剤を投与する工程を含む上記の方法の実施形態において、抗ＰＤＧＦ剤は、核酸分子、アプタマー、アンチセンス分子、ＲＮＡｉ分子、タンパク質、ペプチド、環状ペプチド、抗体または抗体フラグメント、糖、ポリマーおよび小分子からなる群より選択されるものであり得る。
【０３４４】
該方法がさらに抗血管形成剤を被験体に投与することを含む上記の方法の一部のある実施形態において、抗血管形成剤はポルフィリン誘導体である。一部のある実施形態において、ポルフィリン誘導体は、注射用ベルテポルフィン（Ｖｉｓｕｄｙｎｅ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅａｓｔ  Ｈａｎｏｖｅｒ、ＮＪ）である。一部のある実施形態では、該方法は、さらに、ポルフィリン誘導体をレーザー光で活性化する工程を含む。
【０３４５】
「併用療法」は、一般的ではないが、２種類以上のこのような治療用薬剤を、偶発的および随意的に本発明の組合せがもたらされる個々の単独療法レジメンの一部として投与することが包含され得る。「併用療法」は、これらの治療用薬剤の逐次的な投与（すなわち、各治療用薬剤は、異なる時点で投与される）、ならびにこれらの治療用薬剤または該治療用薬剤の少なくとも２種類の実質的に同時の投与を包含することが意図される。実質的に同時の投与は、例えば、被験体に、各治療用薬剤を固定比率で有する単一のカプセルを投与すること、または治療用薬剤の各々の単一のカプセルを多重に投与することによりなされ得る。別の実施形態において、実質的に同時の投与は、例えば、被験体に、各治療用薬剤を固定比率で有する単一のシリンジを投与すること、または治療用薬剤の各々の単一のカプセルを多重に投与することによりなされ得る。
【０３４６】
各治療用薬剤の逐次的または実質的に同時の投与は、任意の適切な経路、例えば、限定されないが、経表面的経路、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、経眼経路および粘膜組織を介する直接吸収によって行なわれ得る。治療用薬剤は、同じ経路または異なる経路で投与され得る。例えば、選択された組合せの第一の治療用薬剤が注射によって投与され得、一方、該組合せの他方の治療用薬剤が経表面的に投与され得る。
【０３４７】
あるいはまた、例えば、すべての治療用薬剤を経表面的に投与してもよく、またはすべての治療用薬剤を注射によって投与してもよい。治療用薬剤が投与される順序は、特に記載のない限り、偏狭的に不可欠でない。「併用療法」にはまた、他の生物学的に活性な成分とのさらなる組合せでの上記の治療用薬剤の投与が包含され得る。併用療法が非薬物療法をさらに含む場合、該非薬物療法は、治療用薬剤と非薬物療法の組合せの共作用による有益な効果が得られる限り、任意の適当な時点で行なわれ得る。例えば、適切な場合では、非薬物療法を一時的に治療用薬剤の投与から除いた場合でも、なお、有益な効果が、おそらく数日間または数週間すら得られる。
【０３４８】
本発明の治療用組成物または薬理学的組成物は、一般的に、薬学的に許容され得る媒体中に溶解または分散された治療活性成分（１種類または複数種）の有効量を含む。薬学的に許容され得る媒体または担体としては、任意のあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。医薬的に活性な物質用のかかる媒体および薬剤の使用は、当該技術分野で知られている。また、補助的な活性成分を本発明の治療用組成物中に組み込んでもよい。
【０３４９】
医薬組成物または薬理学的組成物の調製は、本発明の開示に鑑みると、当業者には充分わかる。典型的には、かかる組成物は、液状の液剤もしくは懸濁剤いずれかとしての注射用剤；注射前に液状にされる液剤もしくは懸濁剤に適した固形形態；錠剤もしくは経口投与用の他の固形剤；時限的カプセルとして、または現在使用されている任意の他の形態、例えば、点眼剤、クリーム剤、ローション剤、軟膏、吸入剤などに調製され得る。手術野の特定の部分を処置するための、外科医、内科医または医療従事者による滅菌製剤（生理食塩水系洗浄液など）の使用は、特に有用であり得る。組成物はまた、微小デバイス、微粒子または海綿状物質によって送達され得る。
【０３５０】
製剤化されると、治療剤は、投薬製剤と適合する様式で、薬理学的に有効な量などで投与される。製剤は、上記の注射用溶液型などの様々な投薬形態で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなどもまた使用され得る。
【０３５１】
この状況において、投与される活性成分の量および組成物の容量は、治療対象の宿主動物に依存する。投与に必要とされる活性化合物の正確な量は、担当医師判断に依存し、各個体に対して特有である。
【０３５２】
典型的には、活性化合物を分散させるのに必要とされる最小容量の組成物が使用される。また、投与に適したレジメンは種々であり得るが、最初に該化合物を投与し、その結果をモニタリングし、次いで、さらに間隔をあけてさらに制御された用量を得ることが典型であり得る。
【０３５３】
例えば、錠剤またはカプセル剤（例えば、ゼラチンカプセル剤）の形態の経口投与では、活性な薬物成分は、経口用の非毒性の薬学的に許容され得る不活性担体、例えば、エタノール、グリセロール、水などと合わされ得る。さらに、所望の場合または必要な場合は、適当な結合剤、滑沢剤、崩壊剤および着色剤もまた、混合物中に組み込まれ得る。好適な結合剤としては、デンプン、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、デンプンペースト、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン、天然の糖類（例えば、グルコースまたはβ−ラクトースなど）、コーン甘味料、天然および合成のゴム（例えば、アカシア、トラガカントまたはアルギン酸ナトリウムなど）、ポリエチレングリコール、ワックスなどが挙げられる。このような投薬形態に使用される滑沢剤としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、シリカ、タルク、ステアリン酸、そのマグネシウムもしくはカルシウムの塩および／またはポリエチレングリコールなどが挙げられる。崩壊剤としては、限定されないが、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムデンプン、寒天、アルギン酸もしくはそのナトリウム塩、または発泡性混合物などが挙げられる。希釈剤としては、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよび／またはグリシンが挙げられる。
【０３５４】
本発明の化合物はまた、時限的放出および徐放性の錠剤またはカプセル剤、丸剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、懸濁剤、シロップ剤および乳剤などの経口投薬形態で投与され得る。
【０３５５】
注射用組成物は、好ましくは、水性等張性の溶液または懸濁液であり、坐剤は、脂肪性エマルジョンまたは懸濁液から好都合に調製される。該組成物は、滅菌されたもの、および／または佐剤（保存剤、安定化剤、湿潤剤または乳化剤、溶解促進剤、浸透圧を調節するための塩および／または緩衝剤など）を含有するものであり得る。また、該組成物は、他の治療上有益な物質を含有していてもよい。該組成物は、それぞれ慣用的な混合、増粒またはコーティング方法に従って調製され、典型的には、約０．１〜７５％、好ましくは約１〜５０％の活性成分を含有する。
【０３５６】
液状、特に注射用の組成物は、例えば、溶解、分散などによって調製され得る。活性化合物は、医薬的に純粋な溶媒、例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなどに溶解させるか、またはこれらと混合し、それにより注射用液剤または懸濁剤を形成する。さらに、注射前に液体中に溶解するのに適した固形形態もまた製剤化され得る。
【０３５７】
本発明の化合物は、静脈内（ボーラスおよび注入の両方）、腹腔内、皮下または筋肉内形態で、すべて、製薬技術分野の当業者によく知られた形態を用いて投与され得る。注射用剤は、慣用的な形態で、液状の液剤または懸濁剤のいずれかとして調製され得る。
【０３５８】
注射による非経口投与は、一般的に、皮下、筋肉内または静脈内注射および注入のために使用される。さらに、非経口投与アプローチの一例では、米国特許第３，７１０，７９５号（引用により、本明細書に組み込まれる）による、一定レベルの投薬の維持が確保される低速放出系または徐放系の埋入が用いられる。
【０３５９】
さらにまた、本発明に好ましい化合物は、鼻腔内形態で、適当な鼻腔内ビヒクル、吸入剤の経表面的使用によって、または経皮的経路によって、当業者によく知られた経皮的皮膚パッチの形態を用いて投与され得る。経皮的送達系の形態で投与されるためには、投薬量の投与は、もちろん、投薬レジメンの間、断続的ではなく連続的である。他の好ましい経表面用調製物としては、クリーム剤、軟膏、ローション剤、エーロゾルスプレー剤およびゲル剤が挙げられ、このとき、活性成分の濃度は、典型的には０．０１％〜１５％（ｗ／ｗまたはｗ／ｖ）の範囲であり得る。
【０３６０】
固形組成物用には、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどの賦形剤が使用され得る。上記に規定の活性化合物はまた、担体として例えばポリアルキレングリコール（例えば、プロピレングリコール）を用い、坐剤として製剤化され得る。一部のある実施形態において、坐剤は、脂肪性エマルジョンまたは懸濁液から好都合に調製される。
【０３６１】
本発明の化合物はまた、リポソーム送達系、例えば、小型の単層小胞、大型の単層小胞および多層小胞の形態で投与され得る。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンを含むさまざまなリン脂質から形成され得る。一部のある実施形態では、米国特許第５，２６２，５６４号に記載のようにして、脂質成分の膜を薬物の水性溶液で水和させ、該薬物をカプセル封入する脂質層を形成させる。例えば、本明細書に記載のアプタマー分子は、当該技術分野で知られた方法を用いて構築される親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物との複合体として提供され得る。核酸会合複合体の一例は、米国特許第６，０１１，０２０号に示されている。
【０３６２】
また、本発明の化合物は、標的化可能な薬物担体としての可溶性ポリマーとカップリングさせ得る。かかるポリマーとしては、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシエチルアスパナミドフェノール、またはパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリシンが挙げられ得る。さらにまた、本発明の化合物は、薬物の制御放出を達成するのに有用な類型の生分解性ポリマー、例えば、ポリ乳酸、ポリεカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレートおよびヒドロゲルの架橋または両親媒性ブロックコポリマーとカップリングさせ得る。
【０３６３】
好ましい一実施形態において、本発明の化合物は、眼窩内または眼組織もしくは眼周囲組織（１種種類もしくは複数種）への直接的な硝子体内、眼周囲、前眼房内、結膜下または経強膜注射によって、眼の区画に送達され得る。本発明の化合物は、腱下（ｓｕｂｔｅｎｏｎ）腔または球後腔内に注射され得る。本発明の化合物はまた、目およびその組織への全身の血流または体液によって眼の区画または組織に送達され得、そのため、静脈内、筋肉内または皮下送達経路によって投与される。本発明の医薬組成物の非経口全身注射、結膜下、硝子体内または経強膜投与は、眼疾患および／または眼に徴候を有する全身疾患の治療のための治療剤の全身投与の補助として有用であり得る。糖尿病性網膜症および／またはベーチェット病を安定化、治療および／または予防するための本発明の方法の一部のある実施形態において、抗補体アプタマーは全身投与されず、好ましくは眼投与される。
【０３６４】
本発明の化合物はまた、生物分解性ミクロサイズのポリマー系、例えば、マイクロデバイス、ミクロ粒子または海綿状物質の外科的埋入によって、あるいは眼疾患の治療中に埋入される他の低速放出経強膜デバイスによって、あるいは眼科用送達デバイス、例えば、ポリマーコオンタクトレンズ徐放性送達デバイスによって、眼の区画または組織にデポー剤または徐放性のゲルもしくはポリマー製剤にて投与され得る。本発明の化合物はまた、眼の区画または組織に経表面的に投与され得る。例えば、点眼剤の形態、本発明の化合物が負荷されたコンタクトレンズの形態、または目の表面から後部への薬物送達のために電流を用いたイオン導入によって投与され得る。
【０３６５】
所望により、投与される医薬組成物にはまた、少量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、ならびに他の物質（例えば、酢酸ナトリウムおよびオレイン酸トリエタノールアミンなど）を含めてもよい。
【０３６６】
アプタマーを用いる投薬レジメンは、さまざまな要素、例えば、患者の型、種、年齢、体重、性別および病状；治療対象の状態の重篤度；投与経路；患者の腎臓および肝臓の機能；ならびに使用される具体的なアプタマーまたはその塩に従って選択される。当業者である医師または獣医には、該状態の進行を抑制、対抗または停止するのに必要とされる薬物の有効量を容易に決定および処方することができよう。
【０３６７】
本発明の経口投薬量は、記載の効果のために使用される場合、経口で約０．０５〜７５００ｍｇ／日の範囲である。該組成物は、好ましくは、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００．０、２５０．０、５００．０および１０００．０ｍｇの活性成分を含有する分割錠の形態で提供される。本発明の化合物は単回日用量で投与されるものであってもよく、全日投薬量を１日２回、３回または４回の分割用量で投与されるものであってもよい。
【０３６８】
本発明のアプタマー組成物の注入投薬量、鼻腔内投薬量および経皮的投薬量は、０．０５〜７５００ｍｇ／日の範囲である。本発明のアプタマー組成物の皮下、静脈内および腹腔内投薬量は、０．０５〜３８００ｍｇ／日の範囲である。
【０３６９】
本発明のアプタマー組成物の経眼投薬量は、１週間に１回から３ヶ月に１回までの例えば硝子体内注射によるか、または徐放性デバイスもしくは製剤による眼投与で０．００１〜１０ｍｇ／目の範囲である。
【０３７０】
本発明のアプタマー化合物の有効血漿レベルは、０．００２ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬの範囲である。本発明のアプタマー化合物の有効経眼レベル２０ｎＭ〜２５０μＭの範囲であり得る。
【０３７１】
治療の有効性
血管新生障害
血管新生障害、例えばＡＭＤ、特に滲出型ＡＭＤまたは糖尿病性網膜症の治療の有効性は、新脈管形成が遅滞または減弱されているか否かを調べる一般に認められた任意の測定方法によって評価される。これには、直接観察および間接評価（例えば、自覚症状または客観的な生理学的徴候を評価することによるものなど）が含まれる。例えば、治療の有効性は、新生血管形成、微小血管症、血管漏出もしくは血管浮腫またはその任意の組合せの予防、安定化および／または逆転に基づいて評価され得る。また、血管新生眼障害の抑制を評価するための治療の有効性は、視力の安定化または改善の観点から規定されるものであり得る。
【０３７２】
血管新生眼障害の症状の安定化、低減および／または該障害の予防における抗Ｃ５剤単独または抗ＶＥＧＦ剤および／または抗ＰＤＧＦ剤との組み合わせでの有効性の測定において、患者は、注射の数日後および次の注射の直前に眼科医によって臨床的に評価されることもあり得る。また、ＥＴＤＲＳ視力、コダクローム写真撮影およびフルオレセイン血管造影が毎月行なわれ得る。
【０３７３】
血管新生眼障害の症状の安定化、低減および／または該障害の予防における、抗補体アプタマー単独または抗ＶＥＧＦ剤および／または抗ＰＤＧＦ剤との組み合わせでの有効性の測定において、患者は、注射の数日後および次の注射の直前に眼科医によって臨床的に評価されることもあり得る。また、ＥＴＤＲＳ視力、眼底写真撮影、光コヒーレンストモグラフィーおよびフルオレセイン血管造影が毎月行なわれ得る。
【０３７４】
例えば、眼の新生血管形成を処置するための抗Ｃ５剤、特にＣ５特異的アプタマー単独または抗ＶＥＧＦ剤および／または抗ＰＤＧＦ剤との組合せでの有効性を評価するため、抗Ｃ５剤、特にＣ５特異的アプタマー単独または抗ＶＥＧＦ剤および／または抗ＰＤＧＦ剤との組み合わせでの単回または反復いずれかの硝子体内注射を、加齢性黄斑変性に続発性の中心窩下脈絡膜新生血管形成に冒された患者において、眼科技術分野でよく知られた標準的な方法に従って投与することを伴う試験が行なわれる。加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）に続発性の中心窩下脈絡膜新生血管形成（ＣＮＶ）を有する患者には、抗Ｃ５剤、特にＣ５特異的アプタマーおよび／またはＶＥＧＦ特異的アプタマーおよび／またはＰＤＧＦ特異的アプタマーの単回硝子体内注射が与えられ得る。有効性は、例えば、眼科的評価および／またはフルオレセイン血管造影によってモニターされる。治療の３ヶ月後に安定な、または改善された視野を示す（例えば、ＥＴＤＲＳチャートにおいて視野の３ライン以上の改善を示す）患者は、有効投薬量を受けているとみなされる。
【０３７５】
他の眼の障害
炎症性結膜炎（例えば、アレルギー性結膜炎および巨大乳頭性結膜炎）、黄斑浮腫、ブドウ膜炎、眼内炎、強膜炎、角膜の潰瘍、ドライアイ症候群、緑内障、虚血性網膜疾患、糖尿病性網膜症、角膜移植片拒絶、眼内レンズ移植などの眼内手術に関連する合併症および白内障手術に伴う炎症、ベーチェット病、シュタルガルト病、免疫複合体脈管炎、フックス病、フォークト−小柳−原田病、網膜下線維症、角膜炎、硝子体網膜炎症、眼の寄生虫外寄生／移動、色素性網膜炎、サイトメガロウイルス網膜炎および脈絡膜の炎症の治療は、当該技術分野で一般に認められた方法によって評価される。眼障害の症状の安定化、低減および／または予防における抗補体アプタマー単独または別の薬剤との組み合わせの有効性の測定において、患者は、眼科医によって臨床的に評価されることもあり得る。臨床評価は、注射の数日後および次の注射の直前に行なわれ得る。臨床評価には、直接観察および間接評価（例えば、自覚症状または客観的な生理学的徴候を評価することによるものなど）が含まれ得る。例えば、治療の有効性は、血管漏出もしくは血管浮腫またはその任意の組合せの予防、安定化および／または逆転に基づいて評価され得る。緑内障の場合、治療の有効性は、眼底写真撮影または光コヒーレンストモグラフィーを用いてモニターされ得る網膜神経線維層または視神経の健常性の安定化に関して評価され得る。
【０３７６】
本明細書に挙げたすべての刊行物および特許文献は、引用によって、かかる各刊行物または文献が具体的かつ個々に本明細書に組み込まれているかのように本明細書に組み込まれる。刊行物および特許文献の引用は、いずれも関連する先行技術であるとの是認であることは意図されず、その内容および日時に関する是認を構成するものでもない。次に、本発明を書面による記述によって説明するが、当業者には、本発明がさまざまな実施形態で実施され得ること、ならびに前述の記載および以下の実施例は、例示の目的のためであって、以下の特許請求の範囲の限定ではないことが認識されよう。
【実施例】
【０３７７】
（実施例１）
古典的および第二補体経路における抗Ｃ５アプタマー活性
実施例１Ａ：溶血アッセイ
ＣＨ５０試験により、抗体コートヒツジ赤血球の標準化された懸濁液において、補体系が血清試験試料中で細胞の５０％を溶解する能力が測定される。０．２％ヒト血清の溶液を抗体コートヒツジ赤血球（Ｄｉａｍｅｄｉｘ  ＥＺ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ＣＨ５０  Ｋｉｔ、Ｄｉａｍｅｄｉｘ  Ｃｏｒｐ．、Ｍｉａｍｉ、ＦＬ）と、種々の抗Ｃ５アプタマーの存在下または非存在下で混合した。アッセイは、キットプロトコルに従って、カルシウム、マグネシウムおよび１％ゼラチンを含有するベロナール緩衝生理食塩水（ＧＶＢ＋＋補体バッファー）中で行ない、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、試料を遠心分離し、インタクトな赤血球をペレット化した。上清みの４１２ｎｍにおける光学密度（ＯＤ４１２）を読み取り、可溶性ヘモグロビンの放出（これは、溶血の程度に比例する）を定量した（Ｇｒｅｅｎら，（１９９５）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：６８３−９５）。アプタマーがＣ５活性化をブロックしたことを確認するため、一部の溶血上清みをＣ５ａおよびＣ５ｂ−９の存在について、ＥＬＩＳＡ（Ｃ５ｂ−９  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ，Ｑｕｉｄｅｌ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｃ５ａ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって、ＥＬＩＳＡキットプロトコルに従って解析した。
【０３７８】
反応混合物への非ＰＥＧ化抗Ｃ５アプタマー（ＡＲＣ１８６）（配列番号４）の添加により、溶血は、図７Ａのグラフに示されるように用量依存的に阻害され、ＩＣ５０は０．５±０．１ｎＭ（図７Ｂ参照）であり、値は、ニトロセルロース濾過によって求められたＫＤと整合する。非常に高いアプタマー濃度（＞１０ｎＭ）では、溶血の程度は、本質的にバックグラウンド（血清添加なし）と識別不可能であり、これは、ＡＲＣ１８６（配列番号４）が完全に補体活性をブロックし得ることを示した。ＡＲＣ１８６（配列番号４）アプタマーと、２０ｋＤａ（ＡＲＣ６５７；配列番号６１）、３０ｋＤａ（ＡＲＣ６５８；配列番号６２）、分枝鎖４０ｋＤａ（１，３−ビス（ｍＰＥＧ−［２０ｋＤａ］）−プロピル−２−（４’−ブタミド）（ＡＲＣ１８７；配列番号５）、分枝鎖４０ｋＤａ（２，３−ビス（ｍＰＥＧ−［２０ｋＤａ］）−プロピル−１−カルバモイル）（ＡＲＣ１９０５；配列番号６７）、線状４０ｋＤａ（ＡＲＣ１５３７；配列番号６５）、および線状２×２０ｋＤａ（ＡＲＣ１７３０；配列番号６６）ＰＥＧ基とのコンジュゲーションは、ＣＨ５０溶血アッセイにおいて、アプタマー阻害活性に対してほとんど効果を有しなかった（図７Ａ〜図７Ｄ）。
【０３７９】
さらなる研究において、ＰＥＧ化抗Ｃ５アプタマーＡＲＣ１９０５（分枝鎖４０ｋＤａ（２，３−ビス（ｍＰＥＧ−［２０ｋＤａ］）−プロピル−１−カルバモイル）；配列番号６７）の阻害活性を、その非ＰＥＧ化前駆体ＡＲＣ６７２（配列番号６３）（これは、末端５’−アミンを含有する）と、上記のＣＨ５０  溶血アッセイにおいて比較した。ヒト血清（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｏｕｔｈｆｉｅｌｄ、ＭＩ）の溶液を抗体コートヒツジ赤血球（Ｄｉａｍｅｄｉｘ  ＥＺ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ＣＨ５０  Ｋｉｔ、Ｄｉａｍｅｄｉｘ  Ｃｏｒｐ．、Ｍｉａｍｉ、ＦＬ）と、それぞれ種々の濃度のＡＲＣ１９０５およびＡＲＣ６２７の存在下または非存在下で、各アッセイにおける血清の最終濃度が０．１％となるように混合し、アッセイは、製造業者の推奨するプロトコルに従って行なった。溶血反応物は、１時間３７℃で、細胞が懸濁状態であることが確保されるように攪拌しながらインキュベートした。インキュベーションの最後に、インタクトな細胞を遠心分離（２０００ｒｐｍ、２分間、室温）によってペレット化し、２００μＬの上清みを平底ポリスチレンプレート（ＶＷＲ、カタログ番号６２４０９−００３）に移した。上清みの４１５ｎｍにおける光学密度（ＯＤ４１５）を読み、可溶性ヘモグロビンの放出を定量した。測定した各アプタマー濃度における阻害％を、等式  阻害％＝１００−１００×（Ａ試料−Ａ血清無し）／（Ａアプタマーなし−Ａ血清無し）を用いて計算した。式中、Ａ試料は、種々のアプタマー濃度における試料の吸光度であり、Ａ血清無しは、血清の非存在下におけるバックグラウンド溶血による吸光度（１００％阻害対照）であり、Ａアプタマーなしは、アプタマーの非存在下における基底補体活性による吸光度（０％阻害対照）である。ＩＣ５０値は、等式  阻害％＝（阻害％）最大×［インヒビター］ｎ／（ＩＣ５０ｎ＋［インヒビター］ｎ）＋バックグラウンドを用いて、阻害％対［インヒビター］のプロットから求めた。ＩＣ９０およびＩＣ９９値はＩＣ５０値から、等式  ＩＣ９０＝ＩＣ５０×［９０／（１００−９０］１／ｎおよびＩＣ９０＝ＩＣ５０×［９９／（１００−９９］１／ｎを用いて算出した。このパラレル試験におけるＡＲＣ１９０５およびＡＲＣ６２７のＩＣ５０値は、それぞれ、０．６４８＋／−０．０５２１および０．９１３＋／−０．０６７９であり（図５８もまた参照）、ＰＥＧ化は、アプタマー機能に対する効果が、あったとしてもほとんどないことがさらに確認される。
【０３８０】
溶血上清みのＥＬＩＳＡ解析により、この機能阻害がＣ５ａ放出のブロックと相関することが示された。したがって、溶血データは、ＡＲＣ１８６（配列番号４）およびそのＰＥＧ化されたコンジュゲートが、Ｃ５のコンバターゼ触媒性活性化をブロックすることによって機能を果たす非常に強力な補体インヒビターであることを示す。
【０３８１】
非ＰＥＧ化物質を用いた溶血アッセイにより、抗Ｃ５アプタマーがいくつかの非霊長類種、例えば、ラット、モルモット、イヌおよびブタ由来のＣ５と交差反応しないことが示された。しかしながら、有意な阻害活性が霊長類血清、例えば、カニクイザル、マカク属サルおよびチンパンジー由来の血清のスクリーニングにおいて観察された。抗Ｃ５アプタマーの試験管内有効性をカニクイザル血清において、ＡＲＣ１８６（配列番号４）の３０ｋＤａ−ＰＥＧ類縁体であるＡＲＣ６５８（配列番号６２）を用いてさらに調査した。並列比較（ｎ＝３）において、ＡＲＣ６５８は、ヒト補体活性を０．２１±０．０ｎＭのＩＣ５０で、およびカニクイザル補体活性を１．７±０．４ｎＭのＩＣ５０で阻害した（図８）。したがって、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）は、この測定では、ヒトと比較するとカニクイザル血清において効力が８±３倍低い。
【０３８２】
関連した研究において、ヒツジ赤血球の溶血によってアッセイされた分枝鎖４０ｋＤａ（２，３−ビス（ｍＰＥＧ−［２０ｋＤａ］）−プロピル−１−カルバモイル）ＰＥＧ化抗Ｃ５アプタマーであるＡＲＣ１９０５（配列番号６７）の、古典的な補体経路活性化に対する効果を、ヒト（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｏｕｔｈｆｉｅｌｄ、ＭＩ）、カニクイザル（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ、Ｈｉｃｋｓｖｉｌｌｅ、ＮＹ）またはラットの血清（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ、Ｈｉｃｋｓｖｉｌｌｅ、ＮＹ）の存在下で調査した。これらのアッセイは、高度に希釈した血清中で（ヒトおよびカニクイザルでは０．１％、ラットでは０．３％）で、すぐ上に記載したヒツジ赤血球の溶血に対するＡＲＣ１９０５の阻害効果をＡＲＣ６７２との比較に用いたものと同じ条件下で行なった。並列比較では、試験管内補体活性の完全な阻害（９０〜９９％）が、ＡＲＣ１９０５を用いてヒトおよびカニクイザル両方の血清において達成可能であったが、ラット補体試料では、ＡＲＣ１９０５は、特異的阻害活性はほとんどあるいは全く示されなかった（図５９Ａ）。ＡＲＣ６５８と同様、ＡＲＣ１９０５は、該アッセイ条件下で、カニクイザル補体活性に対する効力が約１０倍低く、図５９Ｂに報告しているようにＩＣ９０およびＩＣ９９値に反映されている。
【０３８３】
ニトロセルロースフィルター結合アッセイ。個々のアプタマーを、γ−３２Ｐ−ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）とのインキュベーションによって、５’末端を３２Ｐ標識した。放射性標識アプタマーを遊離ＡＴＰから、ゲル濾過後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製分離した。抗Ｃ５アプタマー親和性を測定するため、放射性標識されたアプタマー（≦１０ｐＭ）を漸増濃度（０．０５〜１００ｎＭ）の精製Ｃ５タンパク質（Ｑｕｉｄｅｌ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）とともに、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有するリン酸緩衝生理食塩水中、室温（２３℃）および３７℃で１５分間および４時間インキュベートした。結合反応物をニトロセルロース濾過により、Ｍｉｎｉｆｏｌｄ  Ｉドットブロット、９６ウェル真空濾過マニホールド（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）を用いて解析した。（上から下に向かって）Ｐｒｏｔｒａｎニトロセルロース（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐナイロン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）およびＧＢ００２ゲルブロット紙（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）からなる３層濾過媒体を用いた。ニトロセルロース層は、核酸よりタンパク質に選択的に結合するものであり、タンパク質リガンドとの複合体中の抗Ｃ５アプタマーを優先的に保持したが、非複合体化抗Ｃ５アプタマーはニトロセルロースを通過し、ナイロンに付着した。ゲルブロット紙は、単に他のフィルターの支持媒体として含めた。濾過後、フィルター層を分離し、乾燥し、リン光体スクリーン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に露光し、Ｓｔｏｒｍ  ８６０  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（登録商標）ブロット画像化システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて定量した。
【０３８４】
図９および図１０に示すように、漸増Ｃ５濃度により、ニトロセルロース膜上に捕捉されるＡＲＣ１８６の割合が向上する。結合ＡＲＣ１８６の漸増Ｃ５濃度に対する依存性は、単一部位結合モデル（Ｃ５＋ＡＲＣ１８６←→Ｃ５・ＲＣ１８６；結合％＝Ｃ最大／（１＋ＫＤ／［Ｃ５］）；Ｃ最大は、飽和［Ｃ５］における最大結合％である；ＫＤは解離定数である）によって充分説明される。１５分間ならびに４時間のいずれかのインキュベーション後での、２つの温度におけるＡＲＣ１８６結合曲線を、それぞれ図９および１０に示す。１５分間のインキュベーション後における２３℃および３７℃でのＡＲＣ１８６結合曲線は、誤差内で本質的に識別不可能であり、０．５〜０．６ｎＭのＫＤ値をフィットさせた（図９）。２３℃および３７℃での結合曲線間の差は、インキュベーション時間を延長すると、より顕著になる。４時間のインキュベーション後（図１０）、２３℃で観察されたＫＤは０．０８±０．０１ｎＭに減少するが、３７℃で観察されたＫＤは、未変化のままである（０．６±０．１ｎＭ）。
【０３８５】
室温での長時間インキュベーションの必要性の根拠を示すため、この温度における親和性を、速度論的方法を用いてさらに検討した。Ｃ５・ΑＲＣ１８６の解離を示す逆反応の速度は、ｖｒｅｖ＝ｋ−ｌ［Ｃ５・ΑＲＣ１８６］であり、式中、ｖｒｅｖは反応速度（単位はＭ分−１）であり、ｋ−ｌは、一次解離速度定数（単位は分−１）である。Ｃ５・ΑＲＣ１８６複合体の形成を示す順反応の速度は、Ｖｆｏｒ＝ｋｌ［Ｃ５］［ＡＲＣ１８６］であり、式中、Ｖｆｏｒは反応速度（単位はＭ分−１）であり、ｋｌは二次会合速度定数（単位はＭ−１分−１）である。データは、擬一次仮定（一方の反応体（この場合、Ｃ５）の濃度を他方より大過剰に維持し（［Ｃ５］＞＞［ＡＲＣ１８６］、したがって、反応仮定において本質的に未変化に維持されるようにする）を用いて解析した。このような条件下で、順反応は、一次反応の反応速度式ｖｆｏｒ＝ｋｌ’［ＡＲＣ１８６］（式中、ｋｌ’＝ｋｌ［Ｃ５］）によって示される。
【０３８６】
Ｃ５・ＡＲＣ１８６の解離を解析するため、放射性標識ＡＲＣ１８６（≦１０ｐＭ）を、５ｎＭ  Ｃ５タンパク質を含む１ｍＭ  ＭｇＣｌ２含有リン酸緩衝生理食塩水で、室温（２３℃）で予め平衡化した。解離反応を、遊離Ｃ５を捕捉する機能を果たす非標識ＡＲＣ１８６（１μＭ）の添加によって開始し、結合体および遊離体の放射性標識ＡＲＣ１８６を分離するニトロセルロース濾過によって停止した。解離反応開始から濾過までの持続時間を変えることにより、ＡＲＣ１８６解離の経時変化を得た。解離の経時変化は、ニトロセルロースフィルター上に捕捉される放射性標識ＡＲＣ１８６のパーセントの減少として観察され（Ｃ５に結合された割合に等しい）、これは、単一指数関数的減衰によって良好に示され、この場合、結合ＡＲＣ１８６％＝１００×ｅ−ｋ−ｌｔ（図１１参照）である。この方法で求められる解離速度定数、ｋ−ｌの値は０．０１３±０．０２分−１であり、５３±８分の半減期（ｔ１／２＝Ｉｎ２／ｋ−ｌ）に相当する。
【０３８７】
会合反応を解析するため、Ｃ５・ＡＲＣ１８６の形成の平衡化速度定数（ｋｅｑ）を、種々の濃度のＣ５タンパク質（１〜５ｎＭ）の存在下で測定した。複合体の形成を、Ｃ５タンパク質および放射性標識ＡＲＣ１８６を１ｍＭ  ＭｇＣｌ２含有ＰＢＳ中で室温（２３℃）にて一緒に混合することにより開始させ、ニトロセルロース濾過によって分離することにより停止した。解離反応について記載のように、反応開からと濾過までの持続時間を変えることにより、複合体形成の経時変化を得た。平衡化の経時変化は、ニトロセルロースフィルター上に捕捉される放射性標識ＡＲＣ１８６のパーセント増加として観察され、単一指数関数的減衰によって良好に示され、この場合、結合ＡＲＣ１８６％＝１００×ｅ−ｋ−ｌｔである。１、２および４ｎＭ  Ｃ５の平衡化の経時変化図１２に示す。予測されたとおり、ｋｅｑの値は［Ｃ５］とともに線形的に増加する（ｋｅｑ（１ｎＭ）＝０．１９±０．０２分−１；ｋｅｑ（２ｎＭ）＝０．３９±０．０３分−１；ｋｅｑ（３ｎＭ）＝０．５９±０．０５分−１；ｋｅｑ（４ｎＭ）＝０．７７±０．０６分−１；ｋｅｑ（５ｎＭ）＝０．８８±０．０６分−１）。該実験条件下では、ｋｅｑ、ｋｌおよびｋ−ｌ間の関係ｋｅｑ＝ｋｌ［Ｃ５］＋ｋ−ｌである。したがって、ｋｌの推定値は、ｋｅｑ対［Ｃ５］のプロットの傾きから誘導され（図１２挿入図参照）、この場合では０．１８±０．０１ｎＭ−１分−１である。
【０３８８】
これらのデータは、低Ｃ５濃度（例えば、０．１ｎＭ）条件下において、Ｃ５と放射性標識ＡＲＣ１８６の混合物が平衡に達するために、長時間のインキュベーションが必要とされることを示す。このような条件下では、ｋｅｑ＝（０．１８±０．０１ｎＭ−１分−１）（０．１ｎＭ）＋０．０１３分−１＝０．０３分−１であり、２２分の半減期に相当する。したがって、ほぼ２時間の室温インキュベーション（半減期の約５倍）が、完全な（＞９５％）平衡化に必要とされる。短いインキュベーション時間（例えば、１５分）では、上記の１５分（ＫＤ＝０．５ｎＭ）対４時間（ＫＤ＝０．０８ｎＭ）インキュベーションで観察された親和性の差に示されるように、複合体の実際の親和性が有意に過小評価される。室温ＫＤの代替的な推定値は、ＫＤ＝ｋ−ｌ／ｋｌの関係に従う速度論データから計算され得る。この場合、算出されるＫＤは０．０７±０．０１ｎＭであり、上記の熱力学的方法によって求められるＫＤと完全に整合する。
【０３８９】
また、Ｃ５に対するＡＲＣ１８６（配列番号４）の特異性を、ニトロセルロース濾過アッセイにおいて、補体カスケードのＣ５の上流および下流両方の補体成分との比較によって評価した。精製ヒトタンパク質およびタンパク質複合体は、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｔｙｌｅｒ、ＴＸ）から、例えば、Ｃ１ｑ（カタログ番号Ａ０９９．１８；２．３μＭ）、Ｃ３（カタログ番号Ａ１１３ｃ．８；２７μＭ）、Ｃ５（カタログ番号Ａ１２０．１４；５．４μＭ）、Ｃ５ａ  ｄｅｓ  Ａｒｇ（カタログ番号Ａ１４５．６；６０μＭ）、ｓＣ５ｂ−９（カタログ番号Ａ１２７．６；１μＭ）、Ｂ因子（カタログ番号Ａ１３５．１２；１１μＭ）およびＨ因子（カタログ番号Ａ１３７．１３Ｐ；６．８μＭ）を購入した。ＰＢＳ＋１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡおよび０．００２ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡ中でタンパク質の連続希釈を行ない、１〜４時間２５℃または３７℃でインキュベートすることにより結合反応を確立させ、次いで、上記のニトロセルロース濾過装置に適用した。解離定数ＫＤを、等式：ニトロセルロース結合％＝大きさ（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）×［Ｃ５］／（ＫＤ＋［Ｃ５］）へのデータのフィットにより、ニトロセルロース結合％対［Ｃ５］の半対数プロットから求めた。
【０３９０】
図１３に示す結果は、アプタマーは、本質的に、Ｃ５ａを認識しない（ＫＤ＞＞３μＭ）が、おそらくＣ５ｂ成分との相互作用により可溶性Ｃ５ｂ−９（ＫＤ＞０．２μＭ）に対して弱い親和性を示す。他の補体成分は、アプタマーに対して中程度から弱い親和性を示す。非活性化Ｃ３は、本質的にアプタマーに結合しない。しかしながら、Ｈ因子（ＫＤは約１００ｎＭ）および、程度はかなり低いがＣ１ｑ（ＫＤ＞０．３μＭ）は結合する。総合すると、データは、ＡＲＣ１８６（配列番号４）が、主にＣ５ｂドメインの認識によって高親和性でヒトＣ５に結合することを示す。したがって、ＡＲＣ１８６およびそのＰＥＧ化誘導体、例えばＡＲＣ１９０５は、細菌のオプソニン作用に重要なＣ３ｂの生成または調節因子によるＣ活性化の生得的な制御を妨げないはずである。
【０３９１】
アプタマーと高分子量ＰＥＧ部分とのコンジュゲーションにより、立体障害の可能性が誘導され、親和性の低下がもたらされる。ＰＥＧ修飾アプタマーは、このようなアプタマーが標的タンパク質の非存在下であってもニトロセルロースに付着する傾向があるため、直接結合についてニトロセルロース濾過アッセイでは容易に評価されない。しかしながら、このようなアプタマーの相対親和性は、標的に対する結合（競合結合アッセイとして知られるニトロセルロース濾過によって測定、３７℃で実施）について、放射性標識された非ＰＥＧ化アプタマー（≦１０ｐＭ）と競合する比較能力から評価され得る。コールド（ｃｏｌｄ）（すなわち、非放射性標識）競合体の濃度を増大させるにつれて、標的タンパク質に結合される放射性標識されたアプタマーの割合は減少する。図１４に示されるように、コールドＡＲＣ１８６（配列番号４）またはＰＥＧ化アプタマー（ＡＲＣ６５７（配列番号６１）、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）およびＡＲＣ１８７（配列番号５））（０．０５〜１０００ｎＭ）の濃度の増大により、２ｎＭ  Ｃ５タンパク質の存在下で、結合に関して放射性標識ＡＲＣ１８６（配列番号４）と容易に競合する。さらに、すべての４種類のアプタマーの滴定曲線はほぼ重複し、これは、ＡＲＣ６５７、ＡＲＣ６５８およびＡＲＣ１８７の場合のＰＥＧ−コンジュゲーションが、Ｃ５に対するアプタマーの親和性に対してほとんど、または全く効果がないことを示す。
【０３９２】
同様の研究において、Ｃ５への結合に対するＰＥＧコンジュゲーションの効果を、ＡＲＣ６７２（５’末端アミンを有するＡＲＣ１８６；配列番号６３）と、ＡＲＣ１９０５（分枝鎖４０ｋＤａ（２，３−ビス（ｍＰＥＧ−［２０ｋＤａ］）−プロピル−１−カルバモイル）ＰＥＧとコンジュゲートされたＡＲＣ６２７）とを、競合結合アッセイを用いて比較することにより試験した。各アプタマーの１０μＭストックをＰＢＳ＋１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、０．００２ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡ中にて調製し、連続希釈して＞１００倍範囲のアプタマー濃度を含む１０×試料列を作製した。次いで、各試料の１２μＬアリコートを９６ウェルプレート内で９６μＬの３２Ｐ−放射性標識ＡＲＣ１８６に添加し、標識およびコールド競合体の１．１×溶液を作製した。次いで、９０μＬの標識／競合体溶液を、１０μＬの１０×Ｃ５タンパク質に添加し、反応を開始した。各反応における放射性標識ＡＲＣ１８６の最終濃度を一定に保持した。結合反応を１５〜３０分３７℃で平衡化させ、次いで、上記のニトロセルロースフィルター装置にて濾過した。データ解析の目的のため、コールド競合体アプタマーを、ＡＲＣ１８６／Ｃ５相互作用の競合的インヒビターとして扱った；阻害％は、データを競合体のない対照反応物（０％阻害対照）に対して標準化することにより計算した。ＩＣ５０値は、等式：阻害％＝大きさ×［競合体］ｎ／（ＩＣ５０ｎ＋［競合体］ｎ）へのデータのフィットによる阻害％対［ＡＲＣ６７２］または［ＡＲＣ１９０５］の半対数プロットから求めた。
【０３９３】
図６０に示されるように、分枝鎖４０ｋＤａ（２，３−ビス（ｍＰＥＧ−［２０ｋＤａ］）−プロピル−１−カルバモイル）ＰＥＧの付加は、競合的結合による測定時では、アプタマー親和性に対してほとんど、または全く効果がなかった。図６０のＩＣ５０対Ｃ５データに対する直線フィットのｙ切片により、ＡＲＣ６７２およびＡＲＣ１９０５について、それぞれ、ＫＤ値は０．４６＋／−０．１４９ｎＭおよび０．７１＋／−０．１３０ｎＭと概算された。値はともに、３７℃でＡＲＣ１８６について求められたＫＤに近い。
【０３９４】
また、ＡＲＣ１９０５とＣ５間の相互作用の温度依存性を、競合アッセイによって推定した。ＡＲＣ１９０５を連続希釈し、上記の１０×試料列を作製した。結合反応を１〜４時間２５℃または３７℃で平衡化させ、次いで、ニトロセルロースフィルター装置にて濾過した。阻害割合は、データを、競合体を含まない対照反応物（０％阻害対照）またはＣ５タンパク質を含まない対照反応物（１００％阻害対照）に対して標準化することにより計算した。ＩＣ５０値を、等式：阻害％＝大きさ×［競合体］ｎ／（ＩＣ５０ｎ＋［競合体］ｎ）へのデータのフィットによる阻害％対［ＡＲＣ６７２］または［ＡＲＣ１９０５］の半対数プロットから求めた。図６１に示されるように、ＡＲＣ１９０５は、２５℃および３７℃の両方でＣ５に高親和性で結合する。ＩＣ５０対Ｃ５データのｙ切片から、それぞれ、２５℃および３７℃のＫＤ値０．１５±０．０４８ｎＭおよび０．６９±０．１４８ｎＭが得られた。値はともに、上記のＡＲＣ１８６／Ｃ５相互作用について求められたＫＤ値と整合する。
【０３９５】
実施例１Ｂ：全血アッセイ
補体系の第二経路に対する抗Ｃ５アプタマーの効果を、以下の全血アッセイを用いて解析した。抗凝固剤の非存在下、血液を正常ヒト志願者から採取した。血液のアリコート（抗凝固剤を含有しない）を、漸増濃度のＡＲＣ１８６（配列番号４）とともに５時間、室温または３７℃でインキュベートした。試料を遠心分離して血清を単離し、血清中のＣ５ｂの存在を、ｓＣ５ｂ−９  ＥＬＩＳＡ（Ｃ５ｂ−９  ＥＬＩＳＡキット、Ｑｕｉｄｅｌ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって検出した。図１５に示されるように、異なる温度でインキュベートされた試料間の抗補体活性（Ｃ５ｂ−９の生成に反映される）は、３μＭで分岐した。室温でのデータにより、定量的阻害に必要とされるアプタマーの濃度は、Ｃ５の既報の濃度はおよそ４００ｎＭであるが、３〜６μＭの範囲内であるがことが示された。この結果は、１０倍モル過剰より多くの抗Ｃ５アプタマー（ＡＲＣ１８６；配列番号４）が、完全なＣ５の阻害活性に必要とされ得ることを示す。
【０３９６】
実施例１Ｃ：ザイモサンによる補体活性化
ザイモサンは、酵母細胞壁の多糖成分であり、第二補体カスケードの強力な活性化剤である。血液、血漿または血清のエキソビボ試料へのザイモサンの添加により、補体活性化産物、例えば、Ｃ５ａおよびＣ５ｂ−９の可溶性型（ｓＣ５ｂ−９）の蓄積がもたらされる。非希釈ヒト血清（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）、クエン酸塩添加ヒト全血（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）またはカニクイザル血清（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）の試料に、漸増濃度のＡＲＣ６５８（配列番号６２）（ＡＲＣ１８６（配列番号４）の３０Ｋ  ＰＥＧ類縁体）を添加した。補体を活性化するため、ザイモサン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）含有１０×懸濁液を試料に最終濃度５ｍｇ／ｍＬまで添加した。１５分間３７℃でのインキュベーション後、ザイモサン粒子を遠心分離によって除去し、補体活性化の程度をＣ５ａおよび／またはｓＣ５ｂ−９  ＥＬＩＳＡ（Ｃ５ｂ−９  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ、Ｑｕｉｄｅｌ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｃ５ａ  ＥＬＩＳＡキット、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって測定した。
【０３９７】
アプタマーの非存在下では、ザイモサン処理により血清または全血Ｃ５の約５０％が活性化されるのに対して、未処理試料では約１％活性化である。抗Ｃ５アプタマーの５０ｎＭまで（血中Ｃ５濃度の約１０％）の添加は、ｓＣ５ｂ−９形成に対してほとんど効果がなかった。しかしながら、漸増濃度のＡＲＣ６５８（配列番号６２）でのＣ５のさらなる滴定によって、Ｃ５活性化は、図１６に示されるように用量依存的に阻害された。ヒト血清または全血では、定量的（約９９％）阻害が、０．８〜１μＭ  ＡＲＣ６５８（配列番号６２）（Ｃ５に対して約２モル当量に相当するアプタマー）で観察された。カニクイザル血清中において同等の阻害を達成するには、より高濃度のアプタマーが必要であった。この場合、９９％阻害は、１０μＭアプタマーすなわちＣ５に対して約２０モル当量のアプタマーの存在下でのみ達成された。
【０３９８】
同様の研究において、ＡＲＣ１９０５（ＡＲＣ１８６の分枝鎖４０ｋＤａ（２，３−ビス（ｍＰＥＧ−［２０ｋＤａ］）−プロピル−１−カルバモイル）ＰＥＧ化型）の阻害効果を、ヒトおよびカニクイザル試料において、第二経路により補体活性化するザイモサンを用い、以下のようにして試験した。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のザイモサンＡは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．（カタログ番号Ｚ４２５０−１Ｇ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の製品であった。ザイモサンＡは粉末の製品であり、ダルベッコのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ，カタログ番号１４１９０−１４４）に再懸濁し、５０ｍｇ／ｍＬの懸濁液を得た。プールされた凍結正常ヒト血清（カタログ番号ＩＰＬＡ−ＳＥＲ）を、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｏｕｔｈｆｉｅｌｄ、ＭＩ）から購入した。プールされた凍結マカク属サル血清（カタログ番号ＣＹＮＳＲＭ）を、Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ（Ｈｉｃｋｓｖｉｌｌｅ、ＮＹ）から購入した。該供給元から得た５〜１０ｍＬ血清のバイアルを３７℃で解凍し、アリコート（約１ｍＬ）を採取し、−２０℃で保存した。アリコートは、必要に応じて使用直前に３７℃でのインキュベーションによって解凍し、実験中は氷上で保存した。各アッセイでの血清の最終濃度は約１００％であった。ＡＲＣ１９０５の２０μＭストックを０．９％生理食塩水中で調製し、連続希釈し、約９０倍範囲アプタマー濃度を含む１０×試料列を作製した。また、アプタマーなし（生理食塩水のみ）の試料も陰性（０％阻害）対照として含めた。
【０３９９】
９０μＬの血清を９６ウェルＰＣＲプレート（ＶＷＲ，カタログ番号１４４２−９５９６）のウェル内にピペッティングした。１０μＬのアプタマー試料を室温で、直接血清中に希釈して混合した。８μＬの５０ｍｇ／ｍＬのザイモサンを、別の９６ウェルＰＣＲプレートのウェル内にピペッティングした。両プレートを同時に３７℃で１５分間プレインキュベートした。プレインキュベーションの直後、８０μＬの血清／アプタマー混合物を８μＬのザイモサンに直接添加して混合し、ザイモサンの最終濃度を５ｍｇ／ｍＬとした。反応プレートを密閉し、１５分間３７℃でインキュベートした。インキュベーションの最後に、ウェル内への８μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡのピペッティングおよび混合によって、反応をクエンチした。ザイモサンを遠心分離（３７００ｒｐｍ、５分間、室温）によってペレット化し、約８０ｕＬのクエンチされた上清みを新たな９６ウェルＰＣＲプレートに移し、密閉した。上清みを液体窒素中でフラッシュ凍結し、−２０℃で保存した。ザイモサン非依存性バックグラウンド活性化の対照のため、ザイモサンの代わりに８μＬの生理食塩水を添加したこと以外は、厳密に上記のようにして血清試料を調製および処理した。
【０４００】
Ｃ５活性化の程度は、各ザイモサン活性化試料中に生成されたＣ５ａの相対レベル（Ｃ５ａ  ＥＬＩＳＡ（ＡＬＰＣＯ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｗｉｎｄｈａｍ、ＮＨ、カタログ番号ＥＩＡ−３３２７）によってＣ５ａ  ＥＬＩＳＡキットプロトコルに従って測定）から求めた。Ｃ５ａ  ＥＬＩＳＡキットはヒト特異的試薬を含み、血漿または血清試料中でのヒトＣ５ａ（ｈＣ５ａ）の解析用に構成されている。したがって、カニクイザル濃度標準を用い、カニクイザルＣ５ａに対するＥＬＩＳＡの応答を特性評価することが必要であった。１組のカスタム標準を調製するため、ヒトまたはカニクイザル血清の０．５ｍＬのアリコートを、５ｍｇ／ｍＬのザイモサンとともに１５分間３７℃でインキュベートし、１２．５μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡでクエンチし、遠心分離してザイモサンを除去した。ザイモサン活性化ヒト血清試料中のＣ５ａの濃度は、キットに備えられたｈＣ５ａ標準血漿との比較により、およそ２μｇ／ｍＬ  ｈＣ５ａであると測定された。カニクイザル試料中のＣ５ａの濃度は、ヒトＣ５ａ当量（ｈＣ５ａ当量）で示すと、およそ０．６μｇ／ｍＬ  ｈＣ５ａ当量であると測定された。０．４〜４００ｎｇ／ｍＬ  ｈＣ５ａまたは０．１２〜１２０ｎｇ／ｍＬ  ｈＣ５ａ当量の範囲を含む標準列を、ラット血清（ＥＬＩＳＡに干渉しない）中への希釈によって調製した。標準を、ＥＬＩＳＡキットプロトコルに指示されたようにしてタンパク質沈降試薬で前処理し、さらに希釈せずにＥＬＩＳＡプレートに適用した。ＥＬＩＳＡプレートを４５０ｎｍの最大吸光度（Ａ４５０）において、ＶｅｒｓａＭａｘ  ＵＶ／可視光吸光度プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて読み取りを行なった。Ａ４５０は、低Ｃ５ａでは、０．１〜０．２の低値でＣ５ａ濃度により異なり、高Ｃ５ａでは、約３．５で安定状態であった。アッセイ試料中でのＣ５ａの定量の目的のため、定量の上限および下限は、それぞれ、ヒトでは２５および０．７８ｎｇ／ｍＬ  ｈＣ５ａとし、カニクイザルでは１５および０．９４ｎｇ／ｍＬ  ｈＣ５ａ当量とした。Ａ４５０対ｎｇ／ｍＬ  ｈＣ５ａまたはｈＣ５ａ当量を、図６２に示すようにプロットし、等式ｙ＝（（Ａ−Ｄ）／（ｌ＋（ｘ／Ｃ）Ｂ））＋Ｄを用いたデータへの４パラメータフィットにより標準曲線を得た。
【０４０１】
Ｃ５ａ解析の直前、アッセイ試料（生理食塩水のみの対照およびザイモサンなし対照を含む）を、ＥＬＩＳＡキットプロトコルに指示されたようにしてタンパク質沈降試薬で前処理し、次いで、０．９％生理食塩水中で連続希釈した。非希釈アッセイ試料（一部のザイモサンなし対照を含む）中のＣ５ａレベルは、典型的には、定量上限（ＵＬＯＱ）を超えた。したがって、全範囲のアッセイ試料Ｃ５ａ濃度が包含されるように、１／５、１／５０および１／２５０の希釈物を試験した。Ｃ５ａレベルを、適切な（ヒトまたはカニクイザル）標準曲線との比較によって定量し、希釈物に対して補正した。各アプタマー濃度での阻害％を、等式  阻害％＝１００−１００×（Ｃ５ａ試料−Ｃ５ａザイモサンなし）／（Ｃ５ａ試料のみ−Ｃ５ａザイモサンなし）を用いて計算した。ＩＣ５０値を、等式  阻害％＝（阻害％）最大×［ＡＲＣ１９０５］ｎ／（ＩＣ５０ｎ＋［ＡＲＣ１９０５］ｎ）＋バックグラウンドを用いた阻害％対［ＡＲＣ１９０５］のプロットから求めた。ＩＣ９０およびＩＣ９９値はＩＣ５０値から、等式  ＩＣ９０＝ＩＣ５０×［９０／（１００−９０］１／ｎおよびＩＣ９９＝ＩＣ５０×［９９／（１００−９９］１／ｎを用いて算出した。
【０４０２】
Ｃ３活性化（共通の補体経路におけるＣ５のすぐ上流の段階）の程度を、各ザイモサン活性化試料中に生成されたＣ３ａの相対レベル（Ｃ３ａ  ＥＬＩＳＡ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＯｐｔｉＥＩＡ  Ｃ３ａ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ、カタログ番号５５０４９９、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）によってＣ３ａ  ＥＬＩＳＡキットプロトコルに従って測定）から測定した。
【０４０３】
Ｃ３ａ解析の直前、試料（生理食塩水のみの対照およびザイモサンなし対照を含む）を０．９％生理食塩水中で連続希釈した。Ｃ３ａ  ＥＬＩＳＡは、Ｃ５ａのものより感度が高い；したがって、全範囲の試料Ｃ３ａ濃度が包含されるように、１／５００、１／５０００および１／２５，０００の希釈物が必要であった。Ｃ５ａ解析のために調製したカスタム標準の代わりにヒト血清由来のキット標準を使用した。Ｃ３ａレベルはあまり大きく異ならなかったため、ヒト特異的標準は、その相対レベルの充分な表示を提供した。
【０４０４】
Ｃ５ａおよびＣ３両方のＥＬＩＳＡから得られたデータを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを用いて解析し、平均阻害％値を、Ｋａｌｅｉｄａグラフ（バージョン３．５１、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いてプロットした。ＩＣ５０、ＩＣ９０およびＩＣ９９値を、ＥｘｃｅｌへのＸＬｆｉｔ４．１プラグインを用いて求めた。このアプローチによって測定されたヒトおよびカニクイザル補体活性化に対するＡＲＣ１９０５の比較効果を、図６３および図６４にまとめる。これらの図からわかるように、第二経路による完全なＣ５活性化の阻害は、試験管内でＡＲＣ１９０５により、ヒトおよびカニクイザル血清の両方において達成可能である。ヒト血清では、非希釈試料中での９０％Ｃ５活性化の阻害に必要とされるＡＲＣ１９０５の濃度は４４２±２３ｎＭであり、Ｃ５の平均モル濃度とほぼ同等であった。しかしながら、ＡＲＣ１９０５は、該アッセイ条件下でカニクイザル補体活性に対する効力は４〜６倍低く、これはＩＣ９０およびＩＣ９９値に反映されている。
【０４０５】
Ｃ３ａレベルによって測定されたＡＲＣ１９０５Ｃ３活性化の効果を図６５にまとめる。補体経路の最終段階を特異的に標的化する理論的根拠は、Ｃ５ａおよび膜攻撃複合体（ＭＡＣ）の炎症促進機能が、Ｃ３ａおよびＣ３ｂの生成において上流因子が病原体と戦う機能が最高度に達するのを損なうことなく、ブロックされることである。図６５のデータは、ＡＲＣ１９０５が２μＭまではＣ３ａ生成を阻害しないことを示し、上流補体の活性化は、ＡＲＣ１９０５によってマイナスの影響を受けないことを示す。第二経路Ｃ５活性化の本質的に完全なブロックは、ＡＲＣ１９０５を用いてヒトおよびカニクイザル血清試料の両方で達成された。ＡＲＣ１９０５は、このアッセイ条件下では、ヒトＣ５活性化よりもカニクイザルＣ５活性化の阻害において、効力の次数が小さかった。理論に拘束されることを望まないが、Ｃ３の活性化が阻害されなかったため、補体活性化に対するＡＲＣ１９０５の阻害効果はＣ５に特異的である。
【０４０６】
実施例１Ｄ：補体活性化のチュービングループモデル
心肺バイパス回路に見られるような、異物への曝露によって誘発される補体活性化をブロックする抗Ｃ５アプタマーの能力を試験するため、本発明者らは、Ｎｉｌｓｓｏｎおよびその共同研究者（Ｇｏｎｇら、（１９９６）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６，２２２−９；Ｎｉｌｓｓｏｎら、（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９２、１６６１−７）によって記載されたチュービングループモデルを使用した。Ｔｙｇｏｎ  Ｓ−５０−ＨＬ培地／外科用チュービング（１／４インチ内径）（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｃｏｒｐ．（（Ｌｉｍａ、ＯＨ）、カタログ番号００５４２）を、およそ３００ｍｍ（およそ９ｍＬ容）の長さに切断し、０．４単位／ｍＬのヘパリン（Ｃｅｌｓｕｓ）および種々の濃度のＡＲＣ６５８（配列番号６２）（０〜５μＭ）を含有する５ｍＬのヒトドナー血を充填した。各長さのＴｙｇｏｎチュービングを、短い切片（約５０ｍｍ）の非外科用シリコーン製連結チュービング（３／８インチ内径）（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｃｏｒｐ．（Ｒ−３６０３型、カタログ番号００２７１）により、Ｇｏｎｇらに記載のようにして１つのループに封止した。チュービングループを１時間、およそ３０ｒｐｍで３７℃の水浴中で回転させた。次いで、ループ内容物を、ＥＤＴＡ（１０ｍＭ最終濃度）を入れたポリプロピレン円錐チューブ内に注入し、補体活性化をクエンチした。血小板が不充分な血漿を遠心分離によって単離し、Ｃ５ａおよびＣ３ａについてＥＬＩＳＡ（Ｃ３ａ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ、Ｑｕｉｄｅｌ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｃ５ａ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって解析した。
【０４０７】
アプタマーの非存在下における全補体活性化は、ザイモサンアッセイと比べて少量であった。典型的には、Ｃ５ａレベルは、１時間のインキュベーション後に、およそ６ｎｇ／ｍＬ増加し、これは、利用可能なＣ５の＜１％の活性化に相当した。それにもかかわらず、この増加は再現可能であり、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）での滴定によって阻害された。図１７に示されるように、３００〜４００ｎＭのＡＲＣ６５８（配列番号６２）は、９９％Ｃ５活性化の阻害を達成するのに充分であり、血中のＣ５のモル濃度とほぼ同等または若干少ないレベルであった。なんら理論に拘束されることを望まないが、Ｃ５活性化の９９％阻害を得るために必要とされるアプタマーは、このモデルではザイモサンモデルよりも少ないが、この観察結果は、該２つのアッセイで用いた補体活性化刺激の実質的な差を反映するものであり得る。また、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）が、補体カスケードにおいてＣ５より早期に活性化段階をブロックしないことを確認するための対照として、Ｃ３ａ生成をモニターした。Ｃ３ａレベルは、１時間のインキュベーション後におよそ４０００ｎｇ／ｍＬ増加し、これは、利用可能なＣ３のほぼ１０％の活性化に相当した。Ｃ５ａ生成とは対照的に、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）で滴定したとき、Ｃ３ａ生成の用量依存的阻害はほとんど観察されず、これは、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）がＣ５切断を特異的にブロックすることを示す。
【０４０８】
チュービングループモデル研究を、抗Ｃ５アプタマーＡＲＣ１９０５（配列番号６７）を用いて繰返した。ＡＲＣ１９０５を０．９％生理食塩水中で連続希釈し、１００倍倍範囲のアプタマー濃度（該アッセイにおいて最終１０〜１０００ｎＭ）を含む２０×試料列を作製した。非特異的オリゴヌクレオチド効果を制御するため、無関連アプタマー（ＡＲＣ１２７）を含有する試料を含めた。また、アプタマーなし（生理食塩水のみ）試料を陰性対照として含めた。単一のドナー血液試料を、標準的な静脈切開法によって内部志願者から採取した。全血を５例の別々のドナーから、直接６０ｍＬ容シリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）、カタログ番号３０９６５３）内に採取し、アリコートを直接、ビバリルジン（最終２０μＭ）（Ｐｒｏｓｐｅｃ−Ｔａｎｙ  Ｔｅｃｈｎｏｇｅｎｅ  Ｌｔｄ．、（Ｉｓｒａｅｌ）、ロット番号１０５ＢＩＶ０１）＋／−アプタマー中に採取した。補体活性化を妨害するヘパリンの代わりに、直接的なトロンビンインヒビターである抗凝固剤ビバリルジンを使用した。
【０４０９】
チュービングループモデルを、本質的にすぐ上に記載のとおりに行なった。チューブの約３００ｍｍ切片（直径１／４インチ、容量約９ｍＬ）に、５ｍＬの血液／アプタマー／ビバリルジン試料を、血液をドナーから採取した直後に充填した。次いで、チューブを短い切片（約５０ｍｍ）のシリコーン製連結チュービングによってループ状に確実に固定し、約４ｍＬのガス容量を得た。インキュベーション中、チュービングループを３７℃の水浴中で１時間、垂直方向に３２ｒｐｍで回転させた。インキュベーション後、５ｍＬの全試料を、１００μＬの０．５ＭのＥＤＴＡを入れた１５ｍＬ容円錐チューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）、カタログ番号４３０７６６）に移し、１０ｍＭの最終ＥＤＴＡ濃度とした。１ｍＬの血漿上清みを、４℃（３，３００ｒｐｍ、２０分間）での遠心分離（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５８０４）後の各クエンチ試料から回収した。上清みを液体窒素中でフラッシュ凍結し、−２０℃で保存した。バックグラウンド活性化の対照のため、ＣＰＢ前試料を、５ｍＬの新鮮血を直接氷上で、１００μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを入れた１５ｍＬ容円錐チューブに添加することにより調製した。この試料を血漿に対して加工治療し、上記のようにして保存した。
【０４１０】
Ｃ５活性化の程度を、各活性化試料で得られたＣ５ａの相対レベル（すぐ上に記載のＣ５ａ  ＥＬＩＳＡによって測定）から測定した。Ｃ５ａ  ＥＬＩＳＡは、非希釈血漿試料においてＥＬＩＳＡキットプロトコルに従って行ない、試料Ｃ５ａレベルを、製造業者によって設けられたＣ５ａ標準との比較によって定量した。各アプタマー濃度でのＣ５生成の阻害％を、等式  阻害％＝１００−１００×（Ｃ５ａ試料−Ｃ５ａＣＰＢ前）／（Ｃ５ａ試料のみ-Ｃ５ａＣＰＢ前）を用いて計算した。ＩＣ５０値は、等式  阻害％＝（阻害％）最大×［ＡＲＣ１９０５］ｎ／（ＩＣ５０ｎ＋［ＡＲＣ１９０５］ｎ）＋バックグラウンドを用いた阻害％対［ＡＲＣ１９０５］のプロットから求めた。ＩＣ９０およびＩＣ９９値は、ＩＣ５０値から、等式  ＩＣ９０＝ＩＣ５０×［９０／（１００−９０］１／ｎおよびＩＣ９９＝ＩＣ５０×［９９／（１００−９９］１／ｎを用いて算出した。
【０４１１】
Ｃ３活性化の程度を、各活性化試料において得られたＣ３ａの相対レベル（すぐ上に記載のＣ３ａ  ＥＬＩＳＡによって測定）から測定した。Ｃ３ａ解析の直前、試料（生理食塩水のみの対照およびＣＰＢ前対照を含む）を０．９％生理食塩水中で連続希釈した。Ｃ３ａ  ＥＬＩＳＡは、Ｃ５ａのものより感度が高い；したがって、試料Ｃ３ａ濃度が包含されるように、１／５０００の希釈物の希釈物が必要であった。試料Ｃ３ａレベルをキット標準との比較によって定量し、阻害％を、Ｃ５ａで記載のようにして計算した。データを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを用いて解析し、平均阻害％値を、Ｋａｌｅｉｄａグラフ（バージョン３．５、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いてプロットした。ＩＣ５０、ＩＣ９０およびＩＣ９９値を、ＥｘｃｅｌへのＸＬｆｉｔ４．１プラグインを用いて求めた。
【０４１２】
５例のドナーにおける、補体活性化に対するＡＲＣ１９０５および無関連アプタマーＡＲＣ１２７の平均効果を図６６にまとめる。図６７に示されるように、Ｃ５活性化の完全なブロック（Ｃ５ａの生成に反映される）は、＜５００ｎＭのＡＲＣ１９０５で達成されたが、無関連アプタマーは１μＭまで阻害効果はなかった。平均全血ＩＣ５０、ＩＣ９０およびＩＣ９９値は、それぞれ、１１９±２８．６ｎＭ、２６８±３９．２ｎＭおよび６９４±２４１ｎＭであった（図６６）。理論に拘束されることは望まないが、ＡＲＣ１９０５は、総量のおよそ４５％を構成している細胞血容量から排除されると想定するのが妥当である。したがって、血漿中でのＣ５阻害を反映するように調整したＩＣ５０、ＩＣ９０およびＩＣ９９値は、２１６±５２．０ｎＭ、４８７±７１ｎＭおよび１２６１±４３８ｎＭであった。これらの値は、血清中でのザイモサン誘導型補体活性化のＡＲＣ１９０５阻害について計算されたパラメータと整合し、これは、細胞血成分がＡＲＣ１９０５抗Ｃ５活性を有意に妨害しないことを示す。Ｃ３ａ生成は、ＡＲＣ１９０５または１μＭまでの無関連アプタマーによって阻害されなかった。理論に拘束されることを望まないが、これは、ＡＲＣ１９０５が、Ｃ３コンバターゼ反応を阻害せず、第二カスケード活性化に寄与する他の段階、例えば、Ｃ３沈着およびコンバターゼ合成などもブロックしないことを示す。
【０４１３】
（実施例２）
デノボ選択および配列
ｄＲｍＹプールによるＣ５選択
２つの選択法を実施し、ｄＲｍＹアプタマーがヒト完全長Ｃ５タンパク質であると特定した。Ｃ５タンパク質（Ｑｕｉｄｅｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡまたはＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）は、完全長（「ＦＬ」）で、部分トリプシン処理（「ＴＰ」）された形態で使用し、選択法はともに、疎水性プレート上に固定化させたタンパク質標的に対する直接的選択法であった。両選択法により、天然非選択プールと比べて完全長Ｃ５結合が有意に富化されたプールを得た。この実施例に示した配列はすべて、５’から３’に示す。
【０４１４】
プールの調製：配列を有するＤＮＡ鋳型
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＧＴＴＣＴＡＣＮ（３０）ＧＧＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＡＴＣＧＡＴＧ（ＡＲＣ５２０；配列番号７０）の配列を有するＤＮＡ鋳型を、ＡＢＩ  ＥＸＰＥＤＩＴＥＴＭ  ＤＮＡ合成装置を用いて合成し、標準的な方法によって脱保護した。鋳型を、５’プライマーＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＧＴＴＣＴＡＣ（配列番号７１）および３’プライマーＣＡＴＣＧＡＴＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＣＣ（配列番号７２）を用いて増幅し、次いで、Ｙ６３９Ｆ単一変異型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いる試験管内転写用の鋳型として使用した。転写は、２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭスペルミジン、０．０１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０％ＰＥＧ−８０００、９．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．９ｍＭ  ＭｎＣｌ２、２ｍＭ  ＮＴＰ、２ｍＭ  ＧＭＰ、２ｍＭスペルミン、０．０１単位／μｌ  無機ピロホスファターゼ、およびＹ６３９Ｆ単一変異型Ｔ７ポリメラーゼを用いて行なった。
【０４１５】
選択：第１回目において、陽性選択工程を、ニトロセルロースフィルター結合カラムにおいて行なった。簡単には、１×１０１５分子（０．５ｎｍｏｌ）のプールＲＮＡを、３ｕＭの完全長Ｃ５または２．６ｕＭの部分トリプシン処理したＣ５を含む１００μＬの結合バッファー（１×ＤＰＢＳ）中で、１時間室温にてインキュベートした。ＲＮＡ：タンパク質複合体と遊離ＲＮＡ分子を、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ（Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）製の０．４５ｕｍニトロセルローススピンカラムを用いて分離した。カラムを１ｍＬの１×ＤＰＢＳで予備洗浄し、次いで、ＲＮＡ：タンパク質含有溶液をカラムに添加し、遠心分離機内で１５００ｇにて２分間スピンした。１ｍＬで３回のバッファー洗浄を行ない、非特異的結合剤をフィルターから除去し、次いで、フィルターに結合されたＲＮＡ：タンパク質複合体を、２００μｌの溶出バッファー洗浄液（７Ｍ尿素、１００ｍＭ  酢酸ナトリウム、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、９５℃に予備加熱）で２回溶出した。溶出されたＲＮＡを、沈殿させた（２μＬグリコーゲン、１容量のイソプロパノール、１／２容量のエタノール）。ＲＮＡを、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲＴＭ系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）により、製造業者の使用説明書に従って、上記の配列番号７２の３’プライマーを用いて逆転写した後、ＰＣＲ増幅を行なった（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．４、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｕＭプライマー配列番号７１および配列番号７２、０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．０５単位／μＬのＴａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ））。ＰＣＲ鋳型を、Ｃｅｎｔｒｉｃｅｐカラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）を用いて精製し、次の回のプールを転写するために使用した。
【０４１６】
後続の回の選択では、結合ＲＮＡと遊離ＲＮＡの分離を、Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ疎水性プレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）において行った。各回は、完全長Ｃ５および部分トリプシン処理Ｃ５の両方２０ｐｍｏｌを、プレートの表面に、１時間室温にて１００μＬの１×ＤＰＢＳ中で固定化することにより開始した。次いで、上清みを除去し、ウェルを１２０μＬの洗浄バッファー（１×ＤＰＢＳ）で４回洗浄した。次いで、タンパク質ウェルを、０．１ｍｇ／ｍＬの酵母ｔＲＮＡおよび０．１ｍｇ／ｍＬのサケ精子ＤＮＡを競合体として含有する１×ＤＰＢＳバッファーでブロックした。使用したプール濃度は、常に、タンパク質濃度の少なくとも５倍過剰とした。また、プールＲＮＡを室温で１時間、空のウェル内でインキュベートして柔軟性（ｐｌａｓｔｉｃ）結合配列（あれば）を除去し、次いで、タンパク質を含まないブロックしたウェル内でインキュベートし、陽性選択段階の前に、競合体結合配列（あれば）を該プールから除去した。次いで、プールＲＮＡを室温で１時間、インキュベートし、ＲＴミックス（３’プライマー、配列番号７２およびＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の添加によって、固定化Ｃ５に結合されたＲＮＡを選択プレート内で直接逆転写した後、６５℃で１時間インキュベーションした。得られたｃＤＮＡを、ＰＣＲ（Ｔａｑポリメラーゼ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）のための鋳型として用いた。増幅されたプール鋳型ＤＮＡを、Ｃｅｎｔｒｉｓｅｐカラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）によって製造業者の推奨する条件に従って脱塩し、次の回の選択のためのプールＲＮＡの転写をプログラムするために使用した。転写されたプールは、各回１０％ポリアクリルアミドゲル上でゲル精製した。
【０４１７】
選択の進行は、サンドイッチフィルター結合（ドットブロット）アッセイを用いてモニターした。５’−３２Ｐ標識プールＲＮＡ（微量濃度）を、Ｃ５、１×ＤＰＢＳ＋０．１ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡおよび０．１ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡとともに室温で３０分間インキュベートし、次いで、ドットブロット装置（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ）内のニトロセルロースおよびナイロンフィルターサンドイッチに適用した。ニトロセルロースに結合されたプールＲＮＡのパーセントを計算し、およそ３回ごとにシングルポイント（ｓｉｎｇｌｅ  ｐｏｉｎｔ）スクリーニング（＋／−３００ｎＭ  Ｃ５）によってモニターした。プールのＫｄ測定値は、タンパク質の滴定および上記のドットブロット装置を用いて測定した。
【０４１８】
選択データ：両選択法により、天然プールに対して１０回の後、富化された。図１８参照。第１０回目では、プールのＫｄは、完全長でおよそ１１５ｎＭおよびトリプシン処理選択で１５０ｎＭであったが、結合度は、両方において安定状態で、わずか約１０％であった。Ｒ１０プールを、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてクローニングし、配列決定した。
【０４１９】
配列情報：各プール由来の４５個のクローンを配列決定した。Ｒ１０完全長プールは、単一のクローンＡＲＣ９１３（配列番号７５）によって優位に占められ、これは該プールの２４％を構成し、２組の複製物および単一の配列が残部を構成した。Ｒ１０トリプシン処理プールは、８コピーの同じ配列ＡＲＣ９１３（配列番号７５）を含んでいたが、該プールは、別の配列（ＡＭＸ２２１．Ａ７；４６％）によって優位に占められていた。クローンＡＲＣ９１３（配列番号７５）は、約１４０ｎＭのＫｄを有し、結合度は２０％となった。図１９参照。
【０４２０】
表３に示された個々の配列は、５’から３’の方向に表示されており、示したｄＲｍＹ  ＳＥＬＥＸＴＭ条件下で選択されたアプタマーのリボヌクレオチド配列を表す。この選択によって誘導される（および配列表に反映された）本発明の実施形態では、プリン（ＡおよびＧ）はデオキシであり、ピリミジン（ＵおよびＣ）は２’−ＯＭｅである。表３に示した配列は、キャッピング（例えば、３’逆位ｄＴ）を含むもの、または含まないものであり得る。以下のアプタマーの特有の配列は、固定配列の直後の２３位のヌクレオチドから始まり、すぐ後に、ＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＧＵＵＣＵＡＣ（配列番号７３）が続き、３’の固定核酸配列ＧＧＵＣＧＡＵＣＧＡＵＣＧＡＵＣＡＵＣＧＡＵＧ（配列番号７４）に接するまでに及ぶ。
【０４２１】
【表３】
0005406534.tif 000019
溶血アッセイ：補体系の古典的経路に対するＡＲＣ９１３（配列番号７５）の効果を、前述の溶血アッセイを用いて解析し、ＡＲＣ１８６（配列番号４）（抗Ｃ５アプタマー、陽性対照）および非選択ｄＲｍＹプール（陰性対照）の両方と比較した。溶血性阻害のアッセイでは、０．２％ヒト全血清の溶液を、抗体コートヒツジ赤血球（Ｄｉａｍｅｄｉｘ  ＥＺ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ＣＨ５０  Ｔｅｓｔ、Ｄｉａｍｅｄｉｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉａｍｉ、ＦＬ）と、滴定されたＡＲＣ９１３（配列番号７５）の存在下で混合した。該アッセイは、カルシウム、マグネシウムおよび１％ゼラチンを含有するベロナール緩衝生理食塩水（ＧＶＢ  補体バッファー）中で行ない、１時間２５℃でインキュベートした。インキュベーション後、試料を遠心分離した。上清みの４１５ｎｍにおける光学密度（ＯＤ４１５）を読み取った。溶血活性の阻害を対照と比較した溶血活性％として示す。図２０参照。アプタマーのＩＣ５０は約３０ｎＭであると算出された。
【０４２２】
（実施例３）
組成および配列最適化
実施例３Ａ：ＡＲＣ９１３の最小化：
ＡＲＣ９１３（配列番号７５）を基礎とする６種類の構築物を転写し、ゲル精製し、Ｃ５に対する結合についてドットブロットにて試験した。ＡＲＣ９５４は、１３０ｎＭのＫｄおよび２０％の結合度を有する親クローンと類似していたが、ＡＲＣ８７４（配列番号７６）は、１ｕＭのＫｄでＣ５に結合された唯一の他のクローンであった。
【０４２３】
表４に示された個々の配列は、５’から３’の方向に表示されており、示したｄＲｍＹ  ＳＥＬＥＸ条件下で選択された選択されたアプタマーから誘導した。この選択によって誘導される（および配列表に反映された）本発明の実施形態では、プリン（ＡおよびＧ）はデオキシであり、ピリミジン（ＵおよびＣ）は２’−ＯＭｅである。表４に示した配列は、キャッピング（例えば、３’逆位ｄＴ）を含むもの、または含まないものであり得る。
【０４２４】
【表４】
0005406534.tif 000020
実施例３Ｂ：ＡＲＣ９１３の最適化：ドープ再選択
Ｃ５結合親和性に対するクローンＡＲＣ９１３（配列番号７５）の最適化および重要な結合要素の決定の両方を行なうため、ドープ再選択を行なった。ドープ再選択法は、活性なクローンまたはミニマー内での配列要件を検討するために使用される。選択法は、単一の配列を基に設計された合成の縮重したプールを用いて行なわれる。縮重のレベルは、通常、７０％〜８５％の野生型ヌクレオチドで異なる。一般に、中立変異が観察されるが、場合によっては、配列変化により、親和性の改善がもたらされ得る。次いで、複合配列情報は、最小結合モチーフを同定するため、および最適化の取り組みを補助するために使用され得る。
【０４２５】
プールの調製：鋳型配列ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＧＴＴＣＴＡＣＮ（３０）ＧＴＴＡＣＧＡＣＴＡＧＣＡＴＣＧＡＴＧ（配列番号８２）は、ＡＲＣ９１３（配列番号７５）を基礎とし、１５％レベルで（すなわち、各ランダム（「Ｎ」）位に）ドープしたランダム領域由来の各残基を用いて合成し、残基は、野生型配列ＣＴＴＧＧＴＴＴＧＧＣＡＣＡＧＧＣＡＴＡＣＡＴＡＣＧＣＡＧＧＧＧＴＣＧＡＴＣＧ（配列番号８３）に見られるヌクレオチドである可能性を８５％、その他の３つのヌクレオチドの１つである可能性を１５％有する。
【０４２６】
ドープ再選択用の鋳型およびＲＮＡプールを、本質的に上記のようにして調製した。鋳型は、プライマーｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＧＴＴＣＴＡＣ（配列番号８４）およびＣＡＴＣＧＡＴＧＣＴＡＧＴＣＧＴＡＡＣ（配列番号８５）を用いて増幅した。２つの選択法を、完全長Ｃ５を用いて行ない、一方の選択では、より高濃度の塩を洗浄工程で用いた。選択プロトコルは上記のようにして行なったが、２つの例外を伴った：１）第１回目（およびすべての後続の回）は、疎水性プレートにおいて行ない、陽性段階のみとした；ならびに２）選択中、競合体は全く使用しなかった。Ｃ５濃度およびＲＮＡプール濃度は、それぞれ、２００ｎＭおよび１ｕＭで一定に維持した。
【０４２７】
ドープ再選択データ。通常選択法および高塩選択法の両方により、天然プールに対してに対して５回の後、富化された。第５回でのプールのＫｄは、高塩選択でおよそ１６５ｎＭ、および通常塩選択で１７５ｎＭであった。結合度は、両方において安定状態で約２０％であった。Ｒ４プールを、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いてクローニングし、各プール由来の４８個のクローンを配列決定した。各プール由来の１２個のクローンを転写し、シングルポイントドットブロットアッセイにおいて５００ｎＭ  Ｃ５でアッセイした。解離定数（Ｋｄ）を再度、前述のドットブロットアッセイを用いて測定した。Ｋｄを、シングルポイントスクリーニングで同定された最良の１１個のクローンについて、等式：結合したＲＮＡの割合＝大きさ＊Ｋｄ／（Ｋｄ＋［Ｃ５］）にデータをフィットさせることにより推定した。最良の３つのＫｄを有するクローンは、配列番号９１（７３ｎＭ）、配列番号９６（８４ｎＭ）および配列番号９５（９２ｎＭ）であった。これらの１１個のクローンの配列を以下に表５に示す。
【０４２８】
表５に示した配列は、５’から３’の方向に表示されており、示したｄＲｍＹ  ＳＥＬＥＸ条件下で選択されたアプタマーのリボヌクレオチド配列を表す。この選択によって誘導される（および配列表に反映された）本発明の実施形態、本文に示したような残基のｄＲｍＹ組合せを含む対応する配列では、プリン（ＡおよびＧ）はデオキシであり、ピリミジン（ＵおよびＣ）は２’−ＯＭｅである。表５に示された配列の各々は、キャッピング（例えば、３’逆位ｄＴ）を含むもの、または含まないものであり得る。以下のアプタマーの各々の特有の配列は、５’固定配列の直後の２３位のヌクレオチドから始まり、すぐ後に、ＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＧＵＵＣＵＡＣ（配列番号８６）が続き、３’の固定核酸配列ＧＵＵＡＣＧＡＣＵＡＧＣＡＵＣＧＡＵＧ（配列番号８７）に接するまでに及ぶ。
【０４２９】
【表５】
0005406534.tif 000021
実施例３Ｃ：ＡＲＣ１８６の４０ｋＤａ分枝鎖ＰＥＧ修飾
オリゴヌクレオチド５’ＮＨ２−ｆＣｍＧｆＣｆＣＧｆＣｍＧｍＧｆＣｆＵｆＣｆＣｍＡｍＧｍＧｆＣＧｆＣｆＵｍＧｍＡｍＧｆＵｆＣｆＵｍＧｍＡｍＧｆＵｆＵｆＵＵＡｆＣｆＣｆＵｍＧｆＣｍＧ−３Ｔ−３’（ＡＲＣ６７２、配列番号６３）を、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ＤＮＡ合成装置（ＡＢＩ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）において、推奨された製造業者の手順に従い、標準的な市販の２’−ＯＭｅ  ＲＮＡおよび２’−Ｆ  ＲＮＡおよびＴＢＤＭＳ保護ＲＮＡホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）ならびに逆位デオキシチミジンＣＰＧ支持体を用いて合成した。末端アミン機能を、５’−アミノ修飾体である６−（トリフルオロアセチルアミノ）ヘキシル−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホロアミダイト、Ｃ６−ＴＦＡ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）により結合した。脱保護後、オリゴヌクレオチドを、Ｓｕｐｅｒ  Ｑ  ５ＰＷ（３０）樹脂（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でのイオン交換クロマトグラフィーによって精製し、エタノール沈殿させた。
【０４３０】
アミン修飾アプタマーを、合成後に異なるＰＥＧ部分にコンジュゲートさせた。アプタマーを、１．５〜３ｍＭの濃度まで水／ＤＭＳＯ（１：１）溶液に溶解した。炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．５）を１００ｍＭの最終濃度まで添加し、オリゴを一晩、等容量のアセトニトリルに溶解した１．７モル過剰の所望のＰＥＧ試薬（例えば、ＡＲＣ１９０５  ４０ｋＤａ  Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ  ＧＬ２−４００ＮＰ  ｐ−ニトロフェニル炭酸エステル［ＮＯＦ  Ｃｏｒｐ、Ｊａｐａｎ］またはＡＲＣ１８７  ４０ｋＤａ  ｍＰＥＧ２−ＮＨＳエステル［Ｎｅｋｔａｒ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ  ＡＬ］）と反応させた。得られた生成物を、Ｓｕｐｅｒ  Ｑ  ５ＰＷ（３０）樹脂（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でのイオン交換クロマトグラフィーによって精製し、Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＣＧ３００−Ｓ樹脂（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ）上で行なう逆相クロマトグラフィーを用いて脱塩し、凍結乾燥した。ＡＲＣ１８７（配列番号５）の構造を図２１に示し、ＡＲＣ１９０５（配列番号６７）の構造を図２２に示す。
【０４３１】
（実施例４）
単離された灌流された心臓モデル
実施例４Ａ：ＡＲＣ１８６を用いた原理の証明
ヒト血漿中の補体成分Ｃ５の平均濃度は、およそ５００ｎＭである。Ｋｒｅｂｓ  Ｈｅｉｎｓｅｌｅｉｔバッファーで灌流した単離されたマウス心臓を６％ヒト血漿に曝露すると、ヒト補体カスケードが活性化され、Ｃ５のＣ５ａおよびＣ５ｂへの切断がもたらされる。続いて、Ｃ５ｂ成分は補体成分Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９と、「膜攻撃複合体」（「ＭＡＣ」またはＣ５ｂ−９）としても知られる複合体を形成し、これは、心臓血管および心筋細胞を損傷し、したがって、心筋機能不全（拡張終期圧の増大、不整脈）および不全収縮に至る（Ｅｖａｎｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３２、１１８３−１１９５（１９９５））。以前に、ヒトＣ５切断をブロックするモノクローナルの単鎖抗体（ＰｅｘｅｌｉｚｕｍａｂまたはＰｅｘｅｌｉｚｕｍａｂの単鎖ｓｃＦｖ型）がこのモデルにおいて試験され、心筋障害および機能不全を抑制することが示された（Ｅｖａｎｓら、１９９５年）。
【０４３２】
このモデルを用い、Ｃ５ブロッキングアプタマーＡＲＣ１８６（配列番号４）が、Ｐｅｘｅｌｕｚｉｍａｂと同様、単離された灌流マウス心臓に対するヒトＣ５媒介性補体損傷を阻害することを確立した。Ｃ５７  Ｂｌ／６マウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から購入した。簡単には、深い麻酔の誘導後、各マウスの心臓を取り出し、心臓をＫｒｅｂｓ  Ｈｅｉｎｓｅｌｅｉｔバッファーで連続的に灌流する大動脈内に挿入したブラント針上に置いた。圧力変換器（Ｍｏｕｓｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を左心室内に挿入し、心拍数および心室内圧の連続測定を可能にした。１５分間の平衡化（この間、ベースライン測定を行なった）後、続いて、心臓を、バッファーおよび６％ヒト血漿＋／−種々の濃度のアプタマーで灌流した（図２３参照）。この研究中、およびＥｖａｎｓらに記載のように、本発明者らは、Ｋｒｅｂｓ  Ｈｅｉｎｓｅｌｅｉｔバッファー＋６％ヒト血漿で灌流した心臓は、血漿を灌流液に添加して５分以内に機能不全となったが、バッファー単独で連続的に灌流した心臓は、２時間を越えて鼓動が継続されたことを示した。したがって、各実験の長さを、随意裁量で１５分間と規定した。ＡＲＣ１８６を用いた、この研究の概要を図２３に示す。
【０４３３】
心室内圧を連続してモニターおよび記録し、圧力波形を得た（図２４および図２５）。最下部の偏向点は拡張終期圧（「ＥＤＰ」）を表し、最も高い偏向点は、収縮期圧（「ＳＰ」）を表す。ベースライン圧力波は、波形上で「０」と表示した黒い垂直線の左側に出現している。既報のように（Ｅｖａｎｓら、１９９５年）、６％ヒト血漿で灌流した心臓は、左心室の拡張終期圧が急速に増大し、５分以内に、最終的に不全収縮が最高度に達した（心臓が停止した）（図２４）。無関連アプタマーをヒト血漿に５０倍モル過剰で添加した場合も、ＥＤＰの増大および不全収縮が観察された（図２４）。
【０４３４】
ＡＲＣ１８６を同等モルで系に添加した場合もまた、ＥＤＰの急激な増大が見られ、不全収縮が最高度に達した（図２５）。補体媒介性損傷、ＥＤＰの増大および不全収縮を受けた心臓のすべての３つの群において、心臓は、実験の最後までに、明らかに浮腫および腫脹していた。ＡＲＣ１８６を血漿に１０倍または５０倍（図２５）モル過剰で添加した場合、心室の圧力波は正常に維持され、不全収縮は観察されなかった。また、前述の浮腫および腫脹は、これらの群において明白ではなかった。
【０４３５】
各実験中、心拍数を５分間のインターバルで記録し、各インターバルでの各群の平均心拍数グラフで示した。図２６に示されるように、アプタマーなし、または無関連アプタマーを伴って灌流した心臓は、通常、５分以内で急速に不全収縮を発現した。系に同等モルで添加されたＡＲＣ１８６では、不全収縮の発生が若干遅かった。しかしながら、この郡の心臓は最終的に機能不全となった。血漿に１０倍または５０倍モル過剰で添加されたＡＲＣ１８６では、各実験の持続時間中、心拍数が保持された。
【０４３６】
ベースラインに対する心臓重量の増加割合を、不全心臓（アプタマーなしまたは５０倍モル過剰の無関連アプタマー）の代表的な試料について計算し、ＡＲＣ１８６保護心臓（１０倍および５０倍モル過剰のＡＲＣ１８６）と比較した。図２７に示されるように、ＡＲＣ１８６保護心臓は、対照群の不全心臓よりも重量増加が有意に少なかった。
【０４３７】
ＡＲＣ１８６は、Ｃ５切断を阻害するがＣ３切断は阻害しないため、Ｃ５切断生成物（Ｃ５ａまたはＣ５ｂ）ではなくＣ３切断生成物（Ｃ３ａ）が、ＡＲＣ１８６によって保護された単離された心臓から流出される排出液中に見られるはずである。ＡＲＣ１８６がヒト血漿Ｃ５の切断を阻害したことを直接示すため、ヒト補体タンパク質Ｃ５ａおよびＣ５ｂ（Ｃ５切断生成物）ならびにＣ３ａ（Ｃ３切断生成物）の相対レベルを、種々の群由来のバッファー排出液中で市販のＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｃ５ｂ−９  ＥＬＩＳＡキット、Ｑｕｉｄｅｌ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｃ５ａ  ａｎｄ  Ｃ３ａ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって測定した。ＡＲＣ１８６は、ヒト血漿Ｃ５切断ならびにＣ５ａ（図２８）およびＣ５ｂ−９（図２９）の生成を用量依存的に阻害した。対照的に、ＡＲＣ１８６は、ヒトＣ３のＣ３ａおよびＣ３ｂ（図３０）の切断に対して効果がなく、該分子のＣ５特異性がさらに示された。
【０４３８】
いったん生成されると、補体Ｃ３ｂおよびＣ５ｂ断片は、補体活性化部位の近傍の組織上に局所的に沈着する。実験終了後、マウス心臓をＯＣＴ培地（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｌｃ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）中で凍結し、切片化し、次いで標準的な免疫組織化学法を用い、ヒトＣ３ｂ（クローンＨ１１、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）、ヒトＣ５ｂ−９（クローンａＥ１１、ＤＡＫＯ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）または対照マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）の存在について染色した。研究の結果を図３１に示す。
【０４３９】
この研究において記載のように、Ｃ５ブロッキングアプタマーＡＲＣ１８６は、補体系に対する抗Ｃ５抗体Ｐｅｘｅｌｕｚｉｍａｂの効果を試験した既報の研究（Ｅｖａｎｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３２：１１８３、（１９９５）において記載されたモデルに基づき、Ｋｒｅｂｓ  Ｈｅｉｎｓｅｌｅｉｔバッファーおよび６％ヘパリン化ヒト血漿で灌流した単離されたマウスの心臓を用いる補体成分Ｃ５媒介性組織損傷のエキソビボモデルにおいて試験した。このモデルを用い、Ｃ５ブロッキングアプタマーが、（ａ）ヒト血漿Ｃ５の切断を阻害する（がＣ３の切断は阻害しない）、（ｂ）マウス心臓組織上へのヒトＣ５ｂの沈着を阻害する（がＣ３ｂの沈着は阻害しない）および（ｃ）臨床的に関連性のある濃度（５μＭ、１０倍モル過剰のアプタマー対Ｃ５）でヒトＣ５ｂ−９媒介性心筋機能不全を阻害することが示された。これらのデータは、ヒト補体カスケードが生理学的に関連性のある様式で活性化された場合、Ｃ５ブロッキングアプタマーは、血漿Ｃ５の切断を阻害でき、心筋障害および機能不全が予防され得ることを示す。
【０４４０】
実施例４Ｂ：ＰＥＧ化されたアプタマーの有効性
この研究に用いた材料および方法は、上記の実施例４Ａに記載のものと厳密に同じであった。実験計画および結果を図３２に示す。実験の前半では、ヒトヘパリン化血漿（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ，Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を補体の供給源として使用し、後半では、ヘパリン化マカク属サル血漿（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を補体の供給源として使用した。ＰＥＧ化されたアプタマー（ＡＲＣ６５８；配列番号６２）を系に漸増モル比で添加した。関連性のある心室の圧力追跡はすべて収集したが、表には、拡張終期圧（ＥＤＰ）の増大の存在または非存在、不全収縮が起こったか否か、および心不全（ＥＤＰの上昇および不全収縮の存在として規定）までの時間を示す。
【０４４１】
ヒト血漿を用いた実験では、ＡＲ６５８（配列番号６２）の最適用量は同等モル（５００ｎＭ）であると決定されたが、非ヒト霊長類血漿を用いた実験では、心臓をＣ５ｂ媒介性損傷から保護するのに５０倍モル過剰（２５μＭ）が必要であった（図３２参照）。
【０４４２】
これらのデータは、試験管内データによって示されたヒト対非ヒト霊長類のＣ５での抗Ｃ５アプタマーの親和性における差と整合する。なんら理論に拘束されることを望まないが、実施例５に記載した本発明者らのその後のマカク属サルＰＫ／ＰＤ試験において、本発明者らは、ザイモサン媒介性血漿Ｃ５切断を阻害するのに３０倍モル過剰のアプタマーが必要であることをさらに示し、これは、アプタマーは、ヒトＣ５よりも低い親和性で霊長類Ｃ５に結合するという見解をさらに支持する。
【０４４３】
集合的に、これらの研究は、両方のＣ５ブロッキングアプタマーＡＲＣ１８６（配列番号４）およびＡＲＣ６５８（配列番号６２）（より高い程度で）が、マウスの単離された灌流心臓モデルにおいて効果的であることを示す。また、このモデルで、マカク属サル血漿Ｃ５媒介性心臓損傷（３０＋モル過剰）を阻害するには、ヒトＣ５媒介性心臓損傷（同等モル）と比べて、有意に多くのＡＲＣ６５８（配列番号６２）をしなければならないことが示され、これは、アプタマーが霊長類Ｃ５に対して、より低い親和性を有することが示された試験管内データことをさらに支持する。最後にこれらのデータにより、ＰＫ／ＰＤ研究において生体内Ｃ５ブロックを実証するためには、マカク属サルに、３０倍モル過剰より多くを投与する必要があり得ることが示された。
【０４４４】
（実施例５）
動物における抗Ｃ５アプタマーの薬物代謝および薬物動態
実施例５Ａ〜５Ｇにおいて、質量基準の濃度データすべて、ＰＥＧコンジュゲーションによってもたらされる質量とは無関係に、アプタマーのオリゴヌクレオチド部分の分子量のみを示す。
【０４４５】
実施例５Ａ：霊長類およびラット血漿中でのＣ５インヒビターＡＲＣ１８６の代謝安定性
アプタマーの非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチド前駆体（すなわち、ＡＲＣ１８６；配列番号４）を、その安定性、反応速度論および分解経路を評価するために、ラットおよびマカク属サル血漿（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）中で試験した。試験は、３７℃で９５％プール血漿（クエン酸塩添加）中５０時間にわたてインキュベートした５’末端放射性標識（３２Ｐ）アプタマーを用いて行なった。選択した時点で、アプタマー含有血漿のアリコートを採取し、直ちに液体窒素中でフラッシュ凍結し、−８０℃で保存した。血漿中のアプタマーおよびその代謝産物の検出および解析を、液液（フェノール−クロロホルム）抽出の後、ゲル電気泳動（１０％変性ポリアクリルアミド配列決定用ゲル上）および高分解能オートラジオグラフィーを用いて行なった。
【０４４６】
図３３は、ラットおよびマカク属サル血漿の両方におけるインキュベーション時間の関数としての、完全長アプタマーの残留割合の対数線形プロットを示す。両種における分解プロフィール本質的に一相系のようであり、速度定数はおよそｋ約０．００２時間−１である。
【０４４７】
実施例５Ｂ：静脈内投与後のラットにおけるＡＲＣ６５７、ＡＲＣ６５８およびＡＲＣ１８７の薬物動態
ＡＲＣ６５７（配列番号６１）、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）およびＡＲＣ１８７（配列番号５）の薬物動態プロフィールを評価するため、ならびに霊長類およびヒトに必要とされる投与レベルおよび頻度を推定するため、薬物動態試験を、カテーテル挿入Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）において行なった。アプタマーを、１０ｍｇ／ｍＬ（オリゴ重量）での注射用に標準的な生理食塩水にて製剤化し、予め滅菌した投与バイアル内に無菌的条件下で滅菌濾過（０．２μｍ）した。ラットでの研究に使用した投与経路は、１０ｍｇ／ｋｇの用量での尾静脈を介する静脈内ボーラスであった。試験集団（ａｒｍ）は１群あたり３匹の動物で構成し、該動物から、投与前および４８時間にわたる経過において指定の時点で逐次的採血を行なった。研究計画の概略を図３４に示す。血液試料を、外科的に埋入した頚静脈カテーテルから採取し、ＥＤＴＡコートチューブに直接移し、反転させることによって混合し、血漿の加工処理まで氷上に置いた。
【０４４８】
血漿を、血液／ＥＤＴＡチューブの５０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって回収し、上清み（血漿）を予備標識した新たなチューブに移した。血漿試料を、解析時点まで−８０℃で保存した。ＡＲＣ１８７に関する血漿試料の解析は、市販の蛍光核酸検出試薬ＯｌｉｇｒｅｅｎＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を入れたアッセイウェルへの血漿アリコートの直接添加を用いる均一系アッセイ形式を用いて行なった。光から保護して室温で短時間のインキュベーション期間（５分）後、アッセイプレートの読み取りを、蛍光プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＳ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）によって行なった。各ウェルからの蛍光シグナルはウェル内のアプタマーの濃度に比例し、試料濃度を、蛍光−濃度標準曲線からの蛍光値（二連または三連の曲線の平均値）の内挿によって計算した。平均血漿濃度は、各時点で各群の３匹の動物から得た。血漿濃度対時間データを、業界標準の薬物動態モデル設計Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＷｉｎＮｏｎＬｉｎＴＭバージョン４．０（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いたノンコンパートメント解析（ＮＣＡ）に供した。以下の主な薬物動態パラメータ：最大血漿濃度、Ｃ最大；濃度時間曲線下面積、ＡＵＣ；最終半減期、ｔ１／２；末端クリアランス、Ｃｌ；および定常状態の分布容積、Ｖｓｓについて推定値を得た。
【０４４９】
平均血漿濃度対時間データを図３５に示し、図３６にプロットする。濃度対時間データを、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎＴＭバージョン４．０を用いたノンコンパートメント解析（ＮＣＡ）に供した。この解析によって、図３７に示す値が得られた。
【０４５０】
予測されたとおり、４０ｋＤａアプタマーＡＲＣ１８７（配列番号５）は、最長の半減期を有し、２０ｋＤａアプタマーＡＲＣ６５７（配列番号６１）は最短であった。既知血漿容量（約４０ｍＬ／ｋｇ）に対する観察されたＶｓｓは、血管外空間におけるタンパク質および／または組織マトリックスへのＡＲＣ１８７（配列番号５）中程度の結合／封鎖を示した。５倍モル過剰のアプタマーの維持の必要性を仮定すると、この研究の結果によって、ＡＲＣ１８７（配列番号５）は、所望の血漿レベルを維持するのに必要とされるアプタマーの投与頻度および総量に関して有意な利点を提供することが示された。
【０４５１】
同様の組成のアプタマーを用いた齧歯類および霊長類における以前の研究（データ示さず）では、３０ｍｇ／ｋｇまでの用量において用量比例性／線形性が示されたため、この投与レベルが非線形薬物動態挙動をもたらすことは予測されない。
【０４５２】
実施例５Ｃ：静脈内投与後のマウスにおけるにおけるＡＲＣ１８７およびＡＲＣ１９０５の薬物動態
ＡＲＣ１８７（配列番号５）と異なる４０ｋＤａの分枝鎖ＰＥＧにコンジュゲートさせたＡＲＣ１８６（配列番号４）オリゴヌクレオチド主鎖の薬物動態プロフィールを評価するため、薬物動態試験を、雌ＣＤ−１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡから入手）において行なった。アプタマーを、２．５ｍｇ／ｍＬ（オリゴ重量）での注射用に標準的な生理食塩水にて製剤化し、予め滅菌した投与バイアル内に無菌的条件下で滅菌濾過（０．２μｍ）した。マウスでの研究に使用した投与経路は、１０ｍｇ／ｋｇの用量での尾静脈を介する静脈内ボーラスであった。試験集団は１群あたり３匹の動物で構成し、該動物から、投与前（すなわち、非投与対照群）および７２時間にわたる経過において指定の時点で末端採血を行なった。研究計画の概略を図３８Ａに示す。
【０４５３】
血液試料を末端心臓穿刺によって採取し、ＥＤＴＡコートチューブに直接移し、反転させることによって混合し、血漿の加工処理まで氷上に置いた。血漿を、血液／ＥＤＴＡチューブの５０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって回収し、上清み（血漿）を予備標識した新たなチューブに移した。血漿試料を、解析時点まで−８０℃で保存した。ＡＲＣ１８７および１９０５に関する血漿試料の解析は、市販の蛍光核酸検出試薬ＯｌｉｇｒｅｅｎＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を入れたアッセイウェルへの血漿アリコートの直接添加を用いる均一系アッセイ形式を用いて行なった。光から保護して室温で短時間のインキュベーション期間（５分）後、アッセイプレートの読み取りを、蛍光プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＳ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）によって行なった。各ウェルからの蛍光シグナルはウェル内のアプタマーの濃度に比例し、試料濃度を、蛍光−濃度標準曲線からの蛍光値（二連または三連の曲線の平均値）の内挿によって計算した。平均血漿濃度は、各時点で各群の３匹の動物から得た。血漿濃度対時間データを、業界標準の薬物動態モデル設計ソフトウエアＷｉｎＮｏｎＬｉｎＴＭバージョン４．０（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いたノンコンパートメント解析（ＮＣＡ）に供した。以下の主な薬物動態パラメータ：最大血漿濃度、Ｃ最大；濃度時間曲線下面積、ＡＵＣ；最終半減期、ｔ１／２；末端クリアランス、Ｃｌ；および定常状態の分布容積、Ｖｓｓについて推定値を得た。平均血漿濃度対時間データを図３８Ｂにプロットする。
【０４５４】
濃度対時間データを、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎＴＭバージョン４．０を用いたノンコンパートメント解析（ＮＣＡ）に供した。この解析によって、図３８Ｃに示す値が得られた。予測されたとおり、両社の４０ｋＤａ  ＰＥＧは、マウスにおいて同等の薬物動態を示した。
【０４５５】
すぐ上に記載したＯｌｉｇｒｅｅｎ解析に用いたＡＲＣ１８７および１９０５の同じ血漿試料を、有効高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）アッセイをＵＶ検出とともに用いて解析した。
【０４５６】
ＡＲＣ１８７およびＡＲＣ１９０５の平均血漿濃度値を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００３を用いて計算した。血漿濃度値が、投与前（時間０）において生体解析アッセイのＬＬＯＱ未満であった場合、０の値を割り当てた。投与後に得た試料のＬＬＯＱ未満の値は、平均血漿濃度の計算から除外した。平均血漿濃度データを、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ、バージョン５．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いたモデル非依存性ＰＫ解析において使用した。血漿濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ０〜最後）を、線状台形公式を用いて推定した。計算では、投与前試料以外は、以外、アッセイのＬＬＯＱ未満の値はいずれもＰＫパラメータ推定値の計算から除外した。見かけ上の最終半減期を、式  ｔ１／２＝０．６９３／λｚ（式中、λｚは濃度対時間曲線の終端の傾きの回帰から推定した消失速度定数である）を用いて計算した。終末期のピーク濃度後の後の少なくとも３つの血漿濃度値を用いてλｚを決定し、決定係数（ｒ２）は≧０．８５であることが必要であった。
【０４５７】
全般的に、ＨＰＬＣ解析により、すぐ上に記載のＯｌｉｇｒｅｅｎ解析は、ＡＲＣ１９０５およびＡＲＣ１８７が、平均Ｃ最大、ＡＵＣ０〜最後およびＡＵＣ０〜∞パラメータ推定値の比較に基づいて生物学的に等価であることがわかったことを示すことが確認される。ＡＲＣ１８７に対するＡＲＣ１９０５のＡＵＣ０〜最後およびＡＵＣ０〜∞の値における差（ＨＰＬＣによって測定）は、充分、生物学的等価性の許容基準の±２０％以内であった。
【０４５８】
実施例５Ｄ：静脈内ボーラス投与後のマウスにおけるＣ５インヒビターＡＲＣ６５７、ＡＲＣ６５８およびＡＲＣ１８７の組織取り込み研究
雌ＣＤ−１マウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から入手した。注射用のＡＲＣ６５７（配列番号６１）、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）およびＡＲＣ１８７（配列番号５）の製剤は、生理食塩水中５ｍｇ／ｍｌとした。投与製剤を、無菌的条件下で予め滅菌した投与バイアル内に滅菌濾過（０．２μｍ）し、動物に、静脈内ボーラスで尾静脈を介して２５ｍｇ／ｋｇの用量で与えた。研究は、４つの時間点ｔ＝投与前、３、６、１２時間の各々について３匹の動物の群で構成した。放血後、各動物の血管系を生理食塩水で充分に（Ｖ約３０ｍＬ）フラッシュ洗浄した。血管系内に残留する血液（あれば）を除去した。組織（心臓、肝臓、腎臓）を回収し、重量測定し、次いで、標準的な生理食塩水中５０％ｗ／ｖでホモジナイズし、解析時点までまで−８０℃で保存した。
【０４５９】
ＡＲＣ６５７（配列番号６１）、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）およびＡＲＣ１８７（配列番号５）に関する組織の解析を、ハイブリダイゼーション系ＥＬＩＳＡ型アッセイを用いて行なった。このアッセイでは、ビオチン化捕捉プローブを、９６ウェルマイクロプレートのウェル内に、結合溶液濃度１２５Ｎｍで３時間予備固定化した。プレートウェルを１×ＰＢＳで５回洗浄した。次いで、プレートを、１５０μｌ／ウェルの１×ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ含有ＴＢＳ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）でブロックした。プレートを再度洗浄し、被覆し、使用まで４℃で保存した。別のチューブ内で、試料（１種類または複数種）を、ＦＡＭ標識（５’−フルオレセイン）試料検出プローブを２００ｎＭで含有するバッファー中、９０℃で１０分間アニーリングさせ、次いで、氷上でクエンチした。また、血漿／組織の濃度標準および対照試料も試料検出プローブ溶液をプレアニーリングさせ、次いで、固定化ビオチン捕捉プローブを入れたアッセイプレートウェル内にピペッティングし、４５℃で２．５時間アニーリングさせた。次いで、プレートを再度洗浄し、１μｇ／ｍＬのホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート抗フルオレセインモノクローナル抗体（抗ＦＩＴＣ  ＭＡｂ−ＨＲＰ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を１×ＰＢＳ中に含む１×ＰＢＳを含有する溶液を１００μｌ／ウェルで充填し、およそ１時間インキュベートした。プレートを上記のようにして再度洗浄した。次いで、アッセイプレートェルに蛍光発生ＨＲＰ基質（ＱｕａｎｔａＢｌｕ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を含有する溶液１００μｌを充填し、光から保護して２０〜３０分インキュベートした。４５分間のインキュベーション後、１００μｌ／ウェルの停止溶液を添加して蛍光沈殿生成反応をクエンチした。プレート読み取りを、直ちに、蛍光マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＳ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）において、３２５ｎｍでの蛍光励起および４２０ｎｍでの発光検出にて行なった。各ウェルの読み取りは１０回行なった。３種類のすべてのアプタマーが、心臓組織内で３つの時点で検出可能であった（図３９）。
【０４６０】
実施例５Ｅ：静脈内投与後のマカク属サルにおけるＣ５インヒビターＡＲＣ６５７、ＡＲＣ６５８およびＡＲＣ１８７の薬物動態および薬力学  研究１
注射用のＡＲＣ６５７（配列番号６１）、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）およびＡＲＣ１８７（配列番号５）の製剤は、標準的な生理食塩水中１０ｍｇ／ｍＬとし、投与製剤を、無菌的条件下で予め滅菌した投与バイアル内に滅菌濾過（０．２μｍ）した。マカク属サルでの研究に使用した投与経路は、３０ｍｇ／ｋｇ（およそ５０倍モル過剰）の用量での外科的に埋入した大腿静脈カテーテルを介した静脈内ボーラスであった。研究計画の概略を図４０に示す。血液試料は、大腿静脈カテーテルから採取し、クエン酸ナトリウムコートチューブに直接移し、反転させることによって混合し、遠心分離して血漿（３０００ｒｐｍで５分間）を分離するまで氷上に置いた。次いで、血漿を２５０μｌのアリコートに分け、これを−８０℃で保存し、各試料のアリコートの１つをアプタマー濃度について、上記のラットＰＫのセクションで前述した蛍光系ＯｌｉｇｒｅｅｎＴＭアッセイを用いて評価した。
【０４６１】
主な血漿濃度対時間データを、表形式で図４１に示す。予測されたとおり、４０ｋＤａ  ＰＥＧアプタマーＡＲＣ１８７（配列番号５）は血漿中に最長時間、残存したが、２０ｋＤａ  ＰＥＧアプタマーＡＲＣ６５７（配列番号６１）は、最短量の時間、残存した。図４１に示すデータの詳しい検討により、このデータは、２コンパートメントモデルによって最良にフィットされたものであり得ることが示された。したがって、図４２に報告した薬物動態パラメータ推定値は、該２コンパートメントモデルから業界標準の薬物動態モデル設計ソフトウエアＷｉｎＮｏｎＬｉｎＴＭバージョン４．０（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いて誘導した。
【０４６２】
図４２に示されるように、すべてのアプタマーは、２３〜３０μＭの間の同様のＣ最大値を有し、これは、アプタマー用量（３０ｍｇ／ｋｇ）が、Ｃ５濃度に対して５０倍モル過剰の血漿アプタマー（５０倍モル過剰、約２５μＭ）を達成するのに充分であったことを示す。ＡＲＣ６５７（２０ｋＤａ  ＰＥＧ）（配列番号６１）およびＡＲＣ６５８（３０ｋＤａ  ＰＥＧ）（配列番号６２）は分子量が１０，０００異なるが、同様の曝露（ＡＵＣ）、ｔ１／２（α）およびｔ１／２（β）値を有した。対照的に、ＡＲＣ１８７（配列番号５）は、その他の分子よりも有意に高い曝露（ＡＵＣ）値、長いｔ１／２（α）および若干長いｔ１／２（β）を有した。
【０４６３】
続いて、薬物動態研究中に採取した血漿試料のさらなるアリコートを試験管内で解析し、霊長類Ｃ５ブロックの有効性を調べた。ザイモサン活性化アッセイを上記のようにして行ない、それぞれ生成した霊長類Ｃ５ｂ−９およびＣ５ａの量を調べた。データを、いくつかの異なる形式、例えば、Ｃ５ｂ−９濃度対試料時間（図４３ａ）、Ｃ５ｂ−９  濃度対アプタマー濃度（図４３ｂ）、Ｃ５ａ濃度対試料時間（図４３ｃ）、およびＣ５ａ濃度対アプタマー濃度（図４３ｄ）でプロットした。
【０４６４】
４０ｋＤａ  ＰＥＧアプタマーＡＲＣ１８７（配列番号５）は、霊長類Ｃ５切断（Ｃ５ｂ−９およびＣ５ａ濃度）を最長時間阻害した（図４３ａおよび図４３ｃ）。Ｃ５ｂ−９およびＣ５ａのデータをアプタマー濃度に対してプロットすると、Ｃ５ブロッキングアプタマーの濃度は、Ｃ５切断が完全に阻害されるためには、ＰＥＧ分子の大きさとは無関係に３０倍モル過剰を超えなければならないことが示された（図４３ｂおよび図４３ｄ）。
【０４６５】
要約すると、マカク属サルＰＫ／ＰＤ研究によるデータは、（ａ）予測されたとおり、ＰＥＧ基の大きさとは無関係に、マカク属サルにおいて生体内でＣ５切断を阻害するためには、少なくとも３０倍モル過剰のアプタマー（約１５μＭ血漿アプタマー濃度）が必要であったこと、（ｂ）Ｃ５ブロッキングアプタマーは、この種において顕在的毒性を引き起こさなかったこと、および（ｃ）動物に比較的高レベル（５０倍モル過剰）で投与した場合、血漿アプタマーレベルは、試料採取の期間中、充分、適切なアッセイ範囲内であり、薬物動態パラメータの計算が可能であったことを示す。
【０４６６】
実施例５Ｆ：静脈内投与後のマカク属サルにおけるＣ５インヒビターＡＲＣ６５８およびＡＲＣ１８７の薬物動態および薬力学−研究２
研究２は、以下のことを除き、上記の研究１と同様の計画であった。ａ）２種類の化合物だけ評価した（ＡＲＣ６５８（配列番号６２）およびＡＲＣ１８７（配列番号５）；ｂ）動物の数を１群あたり４匹に増やした；およびｃ）１分間血漿試料を除き、代わりに１４４時間試料を用いて最終半減期計算がより多くのデータ点に基づくことを確実にした。製剤およびこれらの２種類のアプタマーの投与、血液試料採取ならびに血漿単離手法は、研究１で上記の方法と同一とした。研究２の計画を図４４にまとめる。
【０４６７】
研究２の終了後、血漿アリコートを研究１に記載のようにして解析し、ａ）静脈内投与後、種々の時点での血漿中のアプタマーの濃度、およびｂ）Ｃ５ブロック有効性を測定した。
【０４６８】
血漿アプタマー濃度を時間の関数としてプロットし（図４５）、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）およびＡＲＣ１８７（配列番号５）の主なデータを表形式で、それぞれ図３９および４０に示す。４０ｋＤａ  ＰＥＧアプタマーＡＲＣ１８７（配列番号５）は血漿中に最長時間、残存した。図４５の詳しい検討により、このデータは、２コンパートメントモデルによって最良にフィットされたものであり得ることが示された。したがって、図４６に報告した薬物動態パラメータ推定値は、該２コンパートメントモデルからＷｉｎＮｏｎＬｉｎＴＭバージョン４．０（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて誘導した。
【０４６９】
上記のＰＫ／ＰＤ研究１および研究２において得られた薬物動態パラメータを比較すると、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）およびＡＲＣ１８７（配列番号５）のデータは、ＡＲＣ１８７のｔ１／２（α）測定値を除き、同様であった。なんら理論に拘束されることを望まないが、２つの研究間でのＡＲＣ１８７のｔ１／２（α）測定値における不一致は、おそらく、予備研究でのサンプルサイズが小さいことによるのものである。
【０４７０】
図４６に示されるように、Ｃ最大の値は、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）およびＡＲＣ１８７（配列番号５）で同様であった。対照的に、薬物曝露（ＡＵＣ）は、ＡＲＣ１８７（配列番号５）で治療した動物において有意に大きかった。また、ＡＲＣ１８７は、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）と比べて長いｔ１／２（α）およびｔ１／２（β）値を有した。これらのデータを、ＰＫ／ＰＤ研究１において得られたデータと合わせると、Ｃ５ブロッキングアプタマーＡＲＣ１８７は、所与の用量で最も有効な生体内Ｃ５ブロックをもたらし得ることが示される。
【０４７１】
続いて、薬物動態研究において採取した血漿試料のさらなるアリコートを試験管内解析し、霊長類Ｃ５ブロックの有効性を測定した。前述と同様、ザイモサン活性化アッセイを行ない、それぞれ生成した霊長類Ｃ５ｂ−９およびＣ５ａの量を測定した。データを、Ｃ５ｂ−９濃度対アプタマー濃度（図４７）およびＣ５ａ濃度対アプタマー濃度（図４８）としてプロットした。ＰＫ／ＰＤ研究１において先に示されたように、Ｃ５ブロッキングアプタマーの濃度は、霊長類Ｃ５切断が完全に阻害されるためには、ＰＥＧ分子の大きさとは無関係に３０倍モル過剰（血漿Ｃ５濃度に対するアプタマー）またはおよそ１５μＭを超えなければならない（図４１および図４２）。
【０４７２】
図３９および４０表のデータを詳しく検討することにより、３０ｍｇ／ｋｇのＩ．Ｖ．ボーラス後、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）は１５μＭより上でおよそ４時間維持されているが、ＡＲＣ１８７は、１５μＭより上でおよそ８時間維持されていることは明白である。したがって、類似した用量の薬物を与えると、４０ＫアプタマーＡＲＣ１８７は、３０ＫアプタマーＡＲＣ６５８（配列番号６２）のおよそ２倍長い時間、臨床的有効性をもたらす。
【０４７３】
要約すると、マカク属サルは、生体内でＣ５変換をブロックするためには、血漿Ｃ５に対して少なくとも３０倍モル過剰のアプタマーで治療しなければならない。これらのデータは、Ｃ５結合アプタマーは、ヒトＣ５よりも霊長類Ｃ５に対して低い親和性を有することが示された先の試験管内（溶血）およびエキソビボ（単離された灌流マウス心臓）研究と整合する。Ｃ５ブロッキングアプタマーは、Ｃ５濃度に対してアプタマーがおよそ５０倍モル過剰と同等である３０ｍｇ／ｋｇまでの用量での静脈内ボーラスとして安全に送達され得ることが示された。
【０４７４】
実施例５Ｇ：ボーラスＩＶ投与後のマカク属サルにおけるＡＲＣ１９０５
Ｃ５インヒビターＡＲＣ１９０５の薬力学を、静脈内投与後のマカク属サルにおいて評価した。注射用のＡＲＣ１９０５の製剤は、標準的な生理食塩水中７．５ｍｇ／ｍＬとし、投与製剤を、無菌的条件下で予め滅菌した投与バイアル内に滅菌濾過（０．２μｍ）した。カニクイザル（ｎ＝４）に、０（生理食塩水対照）または３０ｍｇ／ｋｇを静脈内ボーラス投与によって投薬した。血液試料は、末梢静脈または動脈アクセスポートから採取し、血液試料（０．５ｍＬ）を２カリウム（Ｋ２）ＥＤＴＡチューブ内に移し、溶氷（ｗｅｔ  ｉｃｅ）上に置き、およそ４℃で収集してから３０分以内に遠心分離した。
【０４７５】
血漿試料を試験管内で解析し、霊長類Ｃ５ブロックにおけるＡＲＣ１９０５の有効性を測定した。実施例１ＣにおいてＡＲＣ１９０５に関して前述したザイモサンアッセイを用い、生成した霊長類Ｃ５ａの量を測定した。投与の０．５時間後および２時間後でのザイモサン後のＣ５ａ値の低下は、およそ同じ濃度および同じ投与経路投与された場合、ＡＲＣ１９０５が、マカク属サルにおいてＡＲＣ１８７と同様の様式で、Ｃ５切断を生体内で阻害することを示す（ザイモサン活性化アッセイを用いて試験管内で測定したとき）。
【０４７６】
実施例５Ｈ：ボーラスＩＶ投与および注入後のマカク属サルにおけるＣ５インヒビターＡＲＣ１８７の薬物動態および薬力学
また、ＡＲＣ１８７（配列番号５）の薬物動態（ＰＫ）および薬力学的（ＰＤ）プロフィールを、静脈内負荷ボーラスの直後に静脈内注入を開始した後のマカク属サルにおいて評価した。この研究計画を図４９に示す。
【０４７７】
１ｕＭの標的定常状態血漿濃度を達成するのに必要な負荷ボーラス投与および注入の速度を、図５０に示すＩＶボーラス単独研究から誘導した薬物動態パラメータを用いて計算した。
【０４７８】
合計３匹のマカク属サルに、ＩＶボーラスのＡＲＣ１８７を１ｍｇ／ｋｇで投与した直後、０．００１３ｍｇ／ｋｇ／分の速度で４８時間のＩＶ注入を開始した。全血試料を、治療の０〜１９２時間後に採取し、溶氷上に保存し、血漿について加工処理し、次いで−８０Ｃで凍結保存した。血漿試料中のＡＲＣ１８７の濃度を、蛍光核酸染色アッセイ（実施例５Ｂに記載）およびＧＬＰ確認（ｖａｌｉｄａｔｅｄ）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）アッセイの両方を用いて測定した。サル血漿中のＡＲＣ１８７の測定のためのＨＰＬＣアッセイ法は、ＣｌｉｎＴｒｉａｌｓ  Ｂｉｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｃａｎａｄａ）によって確認した。確認研究は、米食品医薬品局（ＦＤＡ）医薬品安全性試験実施基準（ＧＬＰ）の規定（２１ＣＦＲ§５８）に準拠した。ＨＰＬＣアッセイ法は、選択性、線形性、定量下限（ＬＬＯＱ）、キャリーオーバー、アッセイ内の精密さおよび精度、アッセイ間の精密さおよび精度、ストック溶液安定性、注射媒体安定性、短期マトリックス安定性、凍結解凍安定性、長期マトリックス安定性ならびに希釈完全性に関して確認した。アッセイの使用可能な線状動的濃度範囲は、０．０８０〜５０．０μＭであると決定された。
【０４７９】
このような条件下で測定されたＡＲＣ１８７のＰＫプロフィールは、ＩＶボーラスＰＫパラメータのみを用いて得られた計算値プロフィールと充分適合した（図５１参照）。１ｕＭの目標血漿濃度は投与後＜５分で確立され、全注入持続時間中、維持された。注入停止後、アプタマーは約４０〜６０時間の最終クリアランス半減期ｔ１／２（β）を示した。
【０４８０】
マカク属サルにおけるＡＲＣ１８７（配列番号５）の薬力学的活性を、前述のザイモサン活性化アッセイでのＰＫ研究において採取した血漿試料を用いることによりエキソビボで評価したが、カニクイザル試料血漿を１０％ヒト血漿中に１０倍希釈し、次いで、５ｍｇ／ｍＬのザイモサンで処理するという変更を伴った。Ｃ５活性化（Ｃ５ａ切断生成物の出現によって反映される）を、ヒトＣ５ａに特異的なＥＬＩＳＡ（Ｃ５ａ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって測定した。次いで、各試料中の活性なＡＲＣ１８７の濃度を、既知ＡＲＣ１８７レベルで調製した試料を用い、ザイモサンアッセイから誘導した標準曲線との比較によって定量した（図５２参照）。この研究は、ＡＲＣ１８７がその抗補体活性を、注入の持続時間中および注入後、上記の薬物動態プロフィールと実質的に整合するレベルで維持することを示す。
【０４８１】
実施例５Ｉ：ヒト投与での必要量の予測
ＣＡＢＧ術と関連する合併症の予防、改善または治療のためのヒト投与での必要量は、以下の仮定に基づく。第１に、ＣＡＢＧ患者には、手術開始前に抗Ｃ５アプタマーの単回静脈内ボーラス投与で投与した後に連続注入を行ない、１．５μＭの定常状態血漿濃度を、ＣＡＢＧ術後２４〜４８時間確立および維持する。ボーラス投与および注入速度の推定値は、マカク属サルにおける前述のＩＶボーラス単独およびボーラス＋注入研究から誘導された薬物動態パラメータを用いた計算値に基づく。ボーラス投与ＡＲＣ１８７の推定値は１ｍｇ／ｋｇであり、随伴する注入速度は０．００１３ｍｇ／ｋｇ／分である。このボーラス＋４８時間注入レジメンでは、予測される薬物の全必要量は、ＡＲＣ１８７で０．４ｇであり、ここで質量は、オリゴヌクレオチドの重量のみを示す（図５３の表の第７欄を参照）。図５３に示す表の第２欄は、ＡＲＣ１８７のオリゴヌクレオチド部分にコンジュゲートされたＰＥＧ基の重量を示し、第３欄は、ＡＲＣ１８７のオリゴヌクレオチド部分の分子量を示し（ＡＲＣ１８６（配列番号４）をそのオリゴヌクレオチド配列として含む本明細書のすべてのアプタマーについても同じである）、第４欄は、上記の実施例３Ｃに記載のようなアミン反応性化学基を介してＡＲＣ１８６（配列番号４）にコンジュゲートされた４０ｋＤＡ  ＰＥＧの分子量を示し、第５欄は、２コンパートメントモデルにおけるＡＲＣ１８７のα段階の半減期を示し、第６欄は、２コンパートメントモデルにおけるＡＲＣ１８７のβ段階の半減期を示す。
【０４８２】
（実施例６）
抗Ｃ５アプタマーおよびヘパリン／プロタミン相互作用
抗Ｃ５アプタマーの予測される適用の一例は、冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）術に伴う炎症性副作用予防または軽減のための予防薬である。ＣＡＢＧ中、血栓症を予防するため、およびバイパスポンプの構成要素内の開通性を維持するために、典型的には、高濃度の抗凝固剤ヘパリン（３〜５単位／ｍＬまたは１〜２μＭ）が投与される。治療後、ヘパリンの効果の逆転および通常の止血の回復が、同様に高濃度のプロタミン（約５μＭ）の投与によって達成される。患者に対し、これらの薬物のいずれかの有効性が妨害される潜在的な危険性を考慮すると、抗Ｃ５アプタマーは、（１）いずれかの薬物の活性を改変しない、または（２）患者の抗凝固治療を複雑にし得る止血に対する内因性効果を示さないことが必要であった。
【０４８３】
ヘパリンは、正味負の電荷を有し、およそ１５ｋＤａの平均分子量を有する硫酸化多糖であり、凝固カスケード内のいくつかのプロテアーゼに対し、アンチトロンビンとの相互作用を促進することにより阻害効果を奏する。プロタミンは、高度に正の電荷を有するポリペプチドであり、少なくとも一部静電気的性である充分特性評価されていない相互作用によってヘパリン活性をブロックすることができる。ＡＲＣ１８７（配列番号５）の機能中心は、ヘパリンと同様、高度にアニオン性である。したがって、ＡＲＣ１８７はヘパリン結合部位またはプロタミンに非特異的に結合し、これらの分子の活性を妨害し得ることが考えられ得る。以下の研究により、ＡＲＣ１８７の内因性（すなわち、ヘパリン様）抗凝固特性、ヘパリン機能に対するＡＲＣ１８７の効果、プロタミンによるヘパリン中和に対するＡＲＣ１８７の効果、およびＡＲＣ１８７の補体阻害特性に対するプロタミンの効果を検討した。
【０４８４】
実施例６Ａ：凝固に対するＡＲＣ１８７の試験管内効果
血漿凝固能力に対するＡＲＣ１８７（配列番号５）の内因性効果を、それぞれ、凝固カスケードの外因性および内因性集団、プロトロンビン時間（ＰＴ）ならびに活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）の標準的な臨床試験を用いて検討した。図５４に示されるように、充分過剰の推定用量（２０μＭまで）の濃度でのクエン酸塩添加ヒト血漿の滴定により、ＰＴにおいて変化はもたらされず、ａＰＴＴが若干上昇したにすぎなかった。
【０４８５】
ヘパリンおよびプロタミンの機能に対するＡＲＣ１８７の試験管内効果を評価するため、３例の固体由来の血液を、ＣＡＢＧ術で用いられるヘパリンレベルと関連する用量である４〜５単位／ｍＬのヘパリン中に採取した。これらの試料の凝固能力を、手術中のヘパリン活性をモニターするために常套的に使用される全血凝固試験である活性凝固時間（ＡＣＴ）を用いて評価した。他の添加剤の非存在下におけるこれらのヘパリン濃度では、ＡＣＴが、約１５０秒間のベースライン値から４Ｕ／ｍＬのヘパリンの存在下で約５００秒間に、または５Ｕ／ｍＬのヘパリンの存在下で約８００秒間に有意に延長された。これらの試料への１０μＭ  ＡＲＣ１８７の添加は凝固時間に対してほとんど効果がなく、これは、ＡＲＣ１８７が、ヘパリンの抗凝固剤活性を妨害しないことを示す。
【０４８６】
ヘパリン抗凝固効果は、６〜８μＭまで（４Ｕ／ｍＬヘパリン）または１２μＭ（５Ｕ／ｍＬヘパリン）のプロタミンでの滴定によって容易に中和された。ヘパリンおよび中和濃度のプロタミンの存在下でのＡＣＴ値は、本質的にベースラインと識別不可能であった。ＡＲＣ１８７の核酸コア（１２ｋＤａ）はプロタミン（５ｋＤａ）より大きい分子量であるため、プロタミンへの等モル濃度のＡＲＣ１８７は、プロタミンの中和活性を完全に逆転させるのに充分であり得ることが予測され得る。しかしながら、ほぼ同等濃度のＡＲＣ１８７とのプロタミンのプレインキュベーションは、ＡＣＴに対してほとんど効果がなかった。中和濃度のプロタミンを含有する血液試料は、１０μＭのＡＲＣ１８７の存在下または非存在下で同様のＡＣＴ値を示し、これは、ＡＲＣ１８７がプロタミンの凝固促進活性に対し、あるとしてもわずかしか効果がないことを示す。これらの結果を図５５にまとめる。
【０４８７】
実施例６Ｂ：凝固に対するＡＲＣ１８７の生体内効果
抗Ｃ５アプタマーＡＲＣ１８７（配列番号５）の同時投与におけるヘパリンをプロタミン間の機能の相互作用を、臨床用量のヘパリンおよび臨床用量／臨床用量以下／臨床用量超過のプロタミンにおいて検討し、臨床血漿濃度以下／臨床血漿濃度超過のＡＲＣ１８７の存在が、プロタミンによるヘパリン抗凝固の逆転を妨害するか否かを調べた。この研究の結果を図５６にまとめる。簡単には、試験したすべてのヘパリン用量において、ベースラインＡＣＴ値は、１０ｕＭ（すなわち、臨床用量の１０倍モル過剰）のＡＲＣ１８７によって影響されなかった。同様に、ヘパリンによる抗凝固の程度は、１０ｕＭのＡＲＣ１８７によって影響されなかった。ＡＲＣ１８７の非存在下では、プロタミンの最小有効用量は約３０％（臨床用量＝１００％）であった。さらにまた、３０％プロタミンによるヘパリン抗凝固の逆転は、臨床用量の１０倍モル過剰（すなわち、１０ｕＭ）のＡＲＣ１８７によって影響されなかった。したがって、臨床状況（例えば、ＣＡＢＧ）における補体阻害のためのＡＲＣ１８７の使用は、典型的な用量でのヘパリンおよびプロタミンとの同時使用によって影響されないはずである。
【０４８８】
実施例６Ｃ：ＡＲＣ１８７抗補体機能に対するヘパリンおよびプロタミンの効果
ＡＲＣ１８７（配列番号５）の抗補体活性に対するヘパリンおよびプロタミンの効果を、実施例１に記載のようにしてザイモサンにより活性化したクエン酸塩添加全血試料において検討した。ザイモサン活性化の直前、ＡＲＣ１８７を４つ：１）処理なり（ヘパリンまたはプロタミンなし）；２）４Ｕ／ｍＬヘパリン；３）６μＭプロタミン；４）４Ｕ／ｍＬヘパリン＋６μＭプロタミンの条件下で処理したクエン酸塩添加血液試料中に滴定した。ザイモサンでの活性化後、Ｃ５活性化を血漿中のｓＣ５ｂ−９のＥＬＩＳＡ測定によって定量した（Ｃ５ｂ−９  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ、Ｑｕｉｄｅｌ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。各条件について、Ｃ５活性化の阻害割合対ＡＲＣ１８７濃度として示した結果は、誤差内で識別不可能であった（図５７参照）。すべての場合で、完全な阻害が１〜２μＭのＡＲＣ１８７により達成された。したがって、ヘパリンおよびプロタミンは別々または組合せで、そのＣＡＢＧ術における使用に関連性のある濃度において、ＡＲＣ１８７の抗補体活性に影響を及ぼさないようである。
【０４８９】
（実施例７）
脈絡膜新生血管形成
レーザー誘導型脈絡膜新生血管形成は、多くの場合、加齢性黄斑変性のモデルとして使用される。また、これは、糖尿病性網膜症のモデルとしても使用され得る。脈絡膜新生血管形成の予防ならびに安定化および／または退行に対する抗Ｃ５剤（これは、本発明の好ましい実施形態では、本明細書に記載の抗補体アプタマーである）の投与の効果を、このモデルにおいて、後述およびＫｒｚｙｓｔｏｌｉｋ，Ｍ．Ｇ．ら、Ａｒｃｈ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．、第１２０巻、ｐｐ３３８−３４６（２００２）に記載のようにして評価する。
【０４９０】
脈絡膜新生血管形成の予防を評価する場合、カニクイザル補体タンパク質Ｃ５に結合し、その機能を阻害する抗Ｃ５剤、特にＣ５特異的アプタマーを、各マカク属サルの一方の目に硝子体内注射し、一方、対照の目にはビヒクルを与える。アプタマー注射の数日から数週間後、レーザー光凝固術を、各カニクイザルの両方の目において行なう。各動物の両目を眼科検査、カラー写真撮影およびフルオレセイン血管造影によってモニターする。脈絡膜新生血管形成の発生（血管造影により評価）が、抗Ｃ５剤、特にＣ５特異的アプタマーで治療した目において対照の目よりも有意に少ない場合、特異的抗Ｃ５剤は有効であるとみなされる。脈絡膜新生血管形成の予防を抗Ｃ５剤と抗ＶＥＧＦ剤および／または抗ＰＤＧＦ剤との組合せでの治療について評価する場合、各動物の一方の目を、抗Ｃ５剤ならびに抗ＶＥＧＦ剤および／または抗ＰＤＧＦ剤でレーザー光凝固術の数日から数週間前に処置すること以外は上記の手順に従う。
【０４９１】
別の実施形態において、脈絡膜新生血管形成の予防を評価する場合、抗補体アプタマー、特に、カニクイザル補体タンパク質（Ｃ５またはＣ３など）の機能を阻害するアプタマーを、各マカク属サルの一方の目に硝子体内注射し、一方、対照の目にはビヒクルを与える。アプタマー注射の数日から数週間後、レーザー光凝固術を、各マカク属サルの両方の目において行なう。各動物の両目を眼科検査、カラー写真撮影およびフルオレセイン血管造影によってモニターする。脈絡膜新生血管形成の発生（血管造影により評価）が、抗補体アプタマーで治療した目において対照の目よりも有意に少ない場合、抗補体アプタマーは有効であるとみなされる。脈絡膜新生血管形成の予防を抗補体アプタマーと抗ＶＥＧＦ剤および／または抗ＰＤＧＦ剤との組合せでの治療について評価する場合、各動物の一方の目を、抗補体アプタマーと抗ＶＥＧＦ剤および／または抗ＰＤＧＦ剤でレーザー光凝固術の数日から数週間前に処置すること以外は上記の手順に従う。
【０４９２】
脈絡膜新生血管形成の安定化および／または退行を評価する場合、レーザー光凝固術を、各マカク属サルの両方の目において行なう。レーザー光凝固術の数日から数週間後、本発明の抗Ｃ５剤を硝子体内注射によって各動物の一方の目に投与し、一方、他方の目にはビヒクルを与える。一実施形態において、この抗Ｃ５剤は抗補体アプタマーである。好ましい一実施形態において、前記抗補体アプタマーは、Ｃ５および／またはＣ３阻害性アプタマーである。各動物の両目を眼科検査、カラー写真撮影およびフルオレセイン血管造影によってモニターする。脈絡膜新生血管形成の発生（血管造影により評価）が、抗Ｃ５剤で治療、特にＣ５アプタマーで治療した目において、対照の目と同じおよび／または有意に少ない場合、アプタマーは、それぞれ安定化および／または退行に有効であるとみなされる。脈絡膜新生血管形成の安定化および／または退行を、抗Ｃ５剤と抗ＶＥＧＦ剤および／または抗ＰＤＧＦ剤との組合せでの治療について評価する場合、各動物の一方の目を、抗Ｃ５剤ならびに抗ＶＥＧＦ剤および／または抗ＰＤＧＦ剤でレーザー光凝固術の数日から数週間後に処置すること以外は上記の手順に従う。
【０４９３】
すぐ上に記載のマカク属サルでの評価と同様、脈絡膜新生血管形成の予防、安定化および／または退行における単独または抗ＶＥＧＦ剤および／または抗ＰＤＧＦ剤との組み合わせでの抗Ｃ５剤および抗補体アプタマーの有効性は、マウスまたは他の種において、マウスＣ５補体タンパク質または他の種のＣ５補体タンパク質をモジュレートする抗Ｃ５剤を用いて評価され得る。別の実施形態において、すぐ上に記載のマカク属サルでの評価と同様、脈絡膜新生血管形成の予防、安定化および／または退行における単独または抗ＶＥＧＦ剤および／または抗ＰＤＧＦ剤との組み合わせでの抗補体アプタマーの有効性は、マウスまたは他の種において、対象のマウス補体タンパク質または対象の他の種の補体タンパク質をモジュレートする、特に阻害する抗補体アプタマーを用いて評価され得る。例えば、Ｂｏｒａら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｇｙ、１７４：４９１−４９７（２００５）を参照のこと。
【０４９４】
（実施例８）
非滲出性ＡＭＤの網膜変性マウスモデル
単球化学誘引タンパク質１（ＭＣＰ−１もしくはＣｃｌ−２）またはそのコグネイトＣ−Ｃケモカインレセプター２（Ｃｃｒ−２）のいずれかに変異を有するマウスモデルは、ヒト加齢性黄斑変性の症状、例えば、ドルーゼンの発生、光レセプター萎縮および脈絡膜新生血管形成を模倣する。Ａｍｂａｔｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００３年１月；９（１１）：１３９０−７を参照のこと。このマウスモデルは、網膜の色素上皮および脈絡膜内にＣ５の有意な蓄積を示し、これは、補体が疾患に随伴して発現されていることを示す。さらに、ＣＤ４６（補体の膜結合型調節因子）、ビトロネクチン（ＭＡＣの調節因子）およびＣ３ｃ（Ｃ３ｂの分解生成物）が、網膜の色素上皮および／または脈絡膜に存在し、これは、補体活性化が起こっていることを示す。
【０４９５】
網膜変性の安定化および／または退行を評価する場合、本発明の抗補体アプタマー、例えば、マウスＣ５またはＣ３阻害性アプタマーを硝子体内注射によって各動物の一方の目に投与し、一方、他方の目にはビヒクルを与える。各動物の両目を、網膜変性、例えば、ＲＰＥ／脈絡膜内の補体産物の蓄積、ＲＰＥおよび／または光レセプターの異常な電気生理学反応および／または限局性萎縮の発生、ならびに脈絡膜新生血管形成の発生についてモニターする。網膜変性の発生が、抗補体アプタマーで治療、特に、抗Ｃ５または抗Ｃ３アプタマーで治療した目において、対照の目と同じおよび／または有意に少ない場合、アプタマーは、それぞれ安定化および／または退行に有効であるとみなされる。
【０４９６】
ここに、本発明を書面による記述および実施例によって説明したが、当業者には、本発明がさまざまな実施形態において実施され得ること、および上記の記載および実施例は、例示の目的のためであって、以下の特許請求の範囲の限定のためでないことが認識されよう。
【図面の簡単な説明】
【０４９７】
【図１】図１は、補体系の古典経路および第二経路を示す図である。
【図２】図２は、ランダム配列オリゴヌクレオチドのプールからの試験管内アプタマー選択（ＳＥＬＥＸＴＭ）プロセスの概略図である。
【図３Ａ】図３Ａは、抗Ｃ５アプタマー（配列番号１）のヌクレオチド配列および二次構造を示す図であり、図において、下線の残基は、２’−Ｈピリミジン残基または２’−フルオロピリミジン残基のいずれかであり、四角で囲まれた残基は、２‘−フルオロピリミジン残基または２’−ＯＭｅピリミジン残基のいずれかであり、矢印（→）で示された残基は、２’−フルオロ修飾を含むはずである残基を表す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＡＲＣ３３０抗Ｃ５アプタマー（配列番号２）のヌクレオチド配列および二次構造を示す図であり、図において、丸で囲まれた残基は２’−Ｈ残基であり、ピリミジン残基は２’−フルオロ置換されたものであり、プリン残基の大部分は、白抜きで示した３つの２’−ＯＨプリン残基を除いて２’−ＯＭｅ置換されている。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＡＲＣ１８６抗Ｃ５アプタマー（配列番号４）のヌクレオチド配列および二次構造を示す図であり、図において、すべての２１個のピリミジン残基は、２’−フルオロ修飾を有し、プリン（１４残基）の大部分は、白抜きで示した３つの２’−ＯＨプリン残基を除いて２’−ＯＭｅ修飾を有する。
【図４】図４は、４０ｋＤ分枝鎖ＰＥＧ（１，３−ビス（ｍＰＥＧ−［２０ｋＤａ］）−プロピル−２−（４’−ブタミド）の図である。
【図５】図５は、アプタマーの５’末端に結合された４０ｋＤ分枝鎖ＰＥＧ（１，３−ビス（ｍＰＥＧ−［２０ｋＤａ］）−プロピル−２−（４’−ブタミド）の図である。
【図６】図６は、高分子量ＰＥＧ／核酸コンジュゲート合成のための種々のストラテジーを示す図である。
【図７−１】図７Ａは、ＰＥＧ化抗Ｃ５アプタマー（ＡＲＣ６５７（配列番号６１）、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）およびＡＲＣ１８７（配列番号５））による溶血の用量依存的阻害を、非ＰＥＧ化抗Ｃ５アプタマー（ＡＲＣ１８６（配列番号４））と比較するグラフである；図７Ｂは、図７Ａに示す溶血性アッセイに用いたアプタマーのＩＣ５０値の表である；図７Ｃは、ＰＥＧ化抗Ｃ５アプタマーＡＲＣ１８７（配列番号５）、ＡＲＣ１５３７（配列番号６５）、ＡＲＣ１７３０（配列番号（６６）およびＡＲＣ１９０５（配列番号６７）による溶血の用量依存的阻害を比較するグラフである；図７Ｄは、図７Ｃに示す溶血性アッセイに用いたアプタマーのＩＣ５０値の表である。
【図７−２】図７Ａは、ＰＥＧ化抗Ｃ５アプタマー（ＡＲＣ６５７（配列番号６１）、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）およびＡＲＣ１８７（配列番号５））による溶血の用量依存的阻害を、非ＰＥＧ化抗Ｃ５アプタマー（ＡＲＣ１８６（配列番号４））と比較するグラフである；図７Ｂは、図７Ａに示す溶血性アッセイに用いたアプタマーのＩＣ５０値の表である；図７Ｃは、ＰＥＧ化抗Ｃ５アプタマーＡＲＣ１８７（配列番号５）、ＡＲＣ１５３７（配列番号６５）、ＡＲＣ１７３０（配列番号（６６）およびＡＲＣ１９０５（配列番号６７）による溶血の用量依存的阻害を比較するグラフである；図７Ｄは、図７Ｃに示す溶血性アッセイに用いたアプタマーのＩＣ５０値の表である。
【図８】図８は、カニクイザル血清の補体対ヒト血清の補体の、抗Ｃ５アプタマーＡＲＣ６５８（配列番号６２）による溶血の阻害割合のグラフである。
【図９】図９は、１５分間のインキュベーション後、３７℃および室温（２３℃）の両方での精製Ｃ５タンパク質に対するＡＲＣ１８６（配列番号４）の結合を示すグラフである。
【図１０】図１０は、４時間のインキュベーション後、３７℃および室温（２３℃）の両方での精製Ｃ５タンパク質に対するＡＲＣ１８６（配列番号４）の結合を示す別のグラフである。
【図１１】図１１は、２３℃におけるＣ５・ＡＲＣ１８６複合体の解離の経時変化を示すグラフである。
【図１２】図１２は、２３℃でのＣ５・ＲＣ１８６複合体の形成における平衡化の経時変化を示すグラフである。
【図１３】図１３は、Ｃ５タンパク質に結合するＡＲＣ１８６（配列番号４）対補体カスケードの上流および下流タンパク質成分を示すグラフである。
【図１４】図１４は、非標識競合体ＡＲＣ１８６（配列番号４）、ＡＲＣ６５７（配列番号６１）、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）またはＡＲＣ１８７（配列番号５）の存在下で、Ｃ５に結合した放射能標識ＡＲＣ１８６（配列番号４）のパーセントを示すグラフである。
【図１５】図１５は、種々の濃度のＡＲＣ１８６（配列番号４）アプタマーの存在下、２５℃および３７℃で５時間インキュベートされた血液試料中に生成されたＣ５ｂ補体タンパク質の量を示すグラフである。
【図１６】図１６は、非希釈ヒト血清、クエン酸塩加ヒト全血またはカニクイザル血清中、ザイモサンの存在下でのＡＲＣ１８７（配列番号５）による補体阻害割合を示すグラフである。
【図１７】図１７は、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）が、実施例１Ｄに記載のチュービングループモデルにおいて、補体活性化（Ｃ５ａ）を充分阻害することを示すグラフである。
【図１８】図１８は、Ｃ５選択プールの第１０回目の解離定数を示すグラフである。解離定数（Ｋｄ）は、データを等式：結合したＲＮＡの割合＝大きさ＊Ｋｄ／（Ｋｄ＋［Ｃ５］）にフィットさせることにより推定した。「ＡＲＣ５２０」（配列番号７０）は、天然状態の非選択ｄＲｍＹプールを示し、「＋」は、競合体（０．１ｍｇ／ｍｌ  ｔＲＮＡ、０．１ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ）の存在を示す。
【図１９】図１９は、Ｃ５クローンの解離定数曲線を示すグラフである。解離定数（Ｋｄ）は、データを等式：結合したＲＮＡの割合＝大きさ＊Ｋｄ／（Ｋｄ＋［Ｃ５］）にフィットさせることにより推定した。
【図２０】図２０は、ＡＲＣ１８６（配列番号４）と比較したときの、種々の濃度の抗Ｃ５アプタマークローンＡＲＣ９１３（配列番号７５）溶血活性に対する阻害効果を示すＩＣ５０曲線を示すグラフである。
【図２１】図２１は、ＡＲＣ１８７（配列番号５）の構造を示す図である。
【図２２】図２２は、ＡＲＣ１９０５（配列番号６７）構造を示す図である。
【図２３】図２３は、第１の単離された灌流心臓試験の実験計画の概要を示す表である。
【図２４】図２４は、ヒト血漿に曝露した単離された心臓の左心室（ＬＶ）心室内圧の圧力追跡（Ａ）を、対照アプタマー溶液に曝露した単離された心臓のＬＶＰ圧力追跡（Ｂ）と比較するグラフである。
【図２５】図２５は、アプタマー／Ｃ５溶液（ここで、およそ５００ｎＭの濃度を、正常非希釈ヒト血漿中でのＣ５について測定した）のモル等量１０×および５０×に曝露した単離された心臓の左心室（ＬＶ）内の心室内圧の圧力追跡を比較するグラフである。
【図２６】図２６は、ヒト血漿および種々の血漿／アプタマー溶液に曝露した後の、単離されたマウス心臓の心拍数の変化（１分あたりの鼓動（ｂｐｍ））を比較するグラフである。
【図２７】図２７は、０〜１×モル比のＡＲＣ１８６（配列番号４）（不全心臓）、または１０〜５０×モル比（Ｃ５アプタマーで保護された心臓）を含有するヒト血漿への曝露の前後での単離されたマウス心臓の心臓重量の変化を比較するグラフである。
【図２８】図２８は、単離されたマウス心臓の灌流後での、種々のアプタマー濃度を含むヒト血漿中の相対Ｃ５ａ生成を比較するグラフである。相対Ｃ５ａ濃度は、吸光度単位（Ａｂ）としてプロットしており、ここで、読み値が高いほど、より高いＣ５ａレベルの存在を反映する。
【図２９】図２９は、単離されたマウス心臓の灌流後での、種々のアプタマー濃度を含むヒト血漿中の相対可溶性Ｃ５ｂ−９の生成を比較するグラフである。
【図３０】図３０は、マウス心臓排出液中でのＣ３切断に対するＡＲＣ１８６（配列番号４）の効果を示すグラフである。
【図３１】図３１は、単離された灌流マウス心臓試験での免疫組織化学染色の結果を示す表である。
【図３２】図３２は、ヒトまたは霊長類の血清中において、心臓をＣ５ｂ媒介性損傷から保護するために必要なＡＲＣ６５８（配列番号６２）のモル比を示す表である。
【図３３】図３３は、ラットおよびマカク属サル両方の血漿中における、インキュベーション時間の関数としての、完全長ＡＲＣ１８６の残留割合の対数線形プロットを示すグラフである。
【図３４】図３４は、実施例５に記載のようにして、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットで行なった薬物動態試験の実験計画を示す表である。
【図３５】図３５は、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける、時間に対するＡＲＣ６５７（配列番号６１）、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）またはＡＲＣ１８７（配列番号５）の平均血漿濃度を示す表である。
【図３６】図３６は、ラットにおいてアプタマーの静脈内投与後の、経時な、ＡＲＣ６５７（配列番号６１）、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）およびＡＲＣ１８７（配列番号５）の平均血漿濃度を示すグラフである。
【図３７】図３７は、図３５および３６に示す濃度対時間データのノンコンパートメント解析を示す表である。
【図３８Ａ】図３８Ａは、マウスにおけるＡＲＣ１８７（配列番号５）およびＡＲＣ１９０５（配列番号６７）の薬物動態試験の計画を示す表である。
【図３８Ｂ】図３８Ｂは、単回ＩＶボーラス投与後の、ＣＤ−１マウスにおけるＡＲＣ１８７（配列番号５）およびＡＲＣ１９０５（配列番号６７）の薬物動態プロフィールを示すグラフである。
【図３８Ｃ】図３８Ｃは、図３８Ｂに示す濃度対時間データのノンコンパートメント解析を示す表である。
【図３９】図３９は、静脈内投与後、マウス心臓組織内での列挙したアプタマーの検出を示す表である。
【図４０】図４０は、実施例５Ｅに記載した動物試験１の実験計画を示す表である。
【図４１】図４１は、マカク属サルに対するアプタマーの静脈内ボーラス投与後での、アプタマー血漿濃度対時間を示す表である。
【図４２】図４２は、試験１において、マカク属サルに静脈内投与されたＡＲＣ６５７（配列番号６１）、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）およびＡＲＣ１８７（配列番号５）の薬物動態パラメータを示す表である。
【図４３】図４３（ａ）および図４３（ｃ）は、マカク属サルへの抗Ｃ５アプタマーＡＲＣ６５７（配列番号６１）、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）またはＡＲＣ１８７（配列番号５）の静脈内投与後の、経時なｓＣ５ｂ−９およびＣ５ａの血漿濃度を示すグラフである；図４３（ｂ）および４３（ｄ）は、ｓＣ５ｂ−９およびＣ５ａの血漿濃度対抗Ｃ５アプタマー、ＡＲＣ６５７（配列番号６１）、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）またはＡＲＣ１８７（配列番号５）の濃度を示すグラフである。
【図４４】図４４は、実施例５Ｆに記載する試験２の実験計画を示す表である。
【図４５】図４５は、マカク属サルへのＡＲＣ６５８（配列番号６２）またはＡＲＣ１８７（配列番号５）の静脈内投与後、種々の時点での平均アプタマー血漿濃度を示すグラフである。
【図４６】図４６は、マカク属サルへの静脈内ボーラスアプタマー投与後での、濃度対時間データの２コンパートメント解析を示す表である。
【図４７】図４７は、カニクイザル血漿中のザイモサンの存在下での、Ｃ５ｂ−９  濃度対ＡＲＣ１８７（配列番号５）またはＡＲＣ６５８（配列番号６２）の濃度を示すグラフである。
【図４８】図４８は、カニクイザル血漿中のザイモサンの存在下での、Ｃ５ａ濃度対ＡＲＣ１８７（配列番号５）またはＡＲＣ６５８（配列番号６２）の濃度を示すグラフである。
【図４９】図４９は、マカク属サルへのＩＶボーラス＋注入投与中およびその後でのＡＲＣ１８７（配列番号５）のＰＫ−ＰＤ試験をまとめた表である。
【図５０】図５０は、ＩＶボーラス投与後のマカク属サルにおけるＡＲＣ１８７（配列番号５）の薬物動態パラメータをまとめた表である。
【図５１】図５１は、マカク属サルへのＩＶボーラス＋注入投与中およびその後での、ＡＲＣ１８７（配列番号５）の計算値および実際の測定値の薬物動態プロフィールを示すグラフである。
【図５２】図５２は、活性なＡＲＣ１８７（配列番号５）血漿レベルが、マカク属サルへのＩＶボーラス＋注入投与中およびその後で一定に維持されることを示すグラフである。
【図５３】図５３は、ＣＡＢＧ術における抗Ｃ５アプタマーに対して予測されるヒト投与での必要量を示す表である。
【図５４】図５４は、プロトロンビン時間（ＰＴ）および活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）によって測定したとき、ＡＲＣ１８７（配列番号５）が、凝固に対して相対的に試験管内効果を有しないことを示すグラフである。
【図５５】図５５は、ヘパリンの抗凝固活性およびプロタミンの凝固促進活性に対するＡＲＣ１８７（配列番号５）の試験管内効果をまとめた表である。
【図５６】図５６は、ＡＲＣ１８７（配列番号５）が、生体内でヘパリンの抗凝固の逆転に影響を及ぼさないことを示すグラフである。
【図５７】図５７は、ザイモサンの補体活性化の阻害によって測定したとき、ヘパリンおよびプロタミンの両方が、ＡＲＣ１８７（配列番号５）抗補体機能に対する効果を有しないことを示すグラフである。
【図５８】図５８は、抗Ｃ５アプタマーＡＲＣ１９０５（配列番号６７）またはＡＲＣ６７２（配列番号６３）の濃度の関数としての、ヒト血清の存在下でのヒツジ赤血球の溶血の阻害割合を示すグラフである。
【図５９】図５９Ａは、ヒト、カニクイザルおよびラット血清の存在下での、ＡＲＣ１９０５（配列番号６７）による溶血の阻害割合を示すグラフである；図５９Ｂは、ヒト、カニクイザルおよびラット血清中での、ＡＲＣ１９０５、抗Ｃ５アプタマーまたはＡＲＣ１２７、Ｃ５に結合しない無関連アプタマー（陰性対照）による補体活性化の阻害の平均ＩＣ５０値をまとめた表である。
【図６０】図６０は、競合結合アッセイにおける、非標識競合体ＡＲＣ１９０５（配列番号６７）またはＡＲＣ６７２（配列番号６３）の濃度（水平軸）の関数としての、放射能標識ＡＲＣ１８６（配列番号４）の阻害のＩＣ５０値（垂直軸）を示すグラフである。
【図６１】図６１は、競合結合アッセイにおける３７℃および２５℃での、非標識競合体ＡＲＣ１９０５（配列番号６７）の濃度（水平軸）の関数としての、放射能標識ＡＲＣ１８６（配列番号４）の阻害のＩＣ５０値（垂直軸）を示すグラフである。
【図６２】図６２は、ヒトＣ５ａ（ｈＣ５ａ）およびカニクイザルＣ５ａ（ｈＣ５ａ当量）の標準曲線を示すグラフである。
【図６３】図６３は、ザイモサン誘導型補体活性化アッセイにおいて測定したときの、ヒトおよびカニクイザル血清中での、ＡＲＣ１９０５（配列番号６７）によるＣ５活性化の阻害のＩＣ５０、ＩＣ９０およびＩＣ９９値をまとめた表である。
【図６４】図６４は、ザイモサン誘導型補体活性化アッセイにおいて測定したときの、ヒトおよびカニクイザル血清中での、ＡＲＣ１９０５（配列番号６７）の濃度の関数としてのＣ５ａ生成の阻害割合を示すグラフである。
【図６５】図６５は、ザイモサン誘導型補体活性化アッセイにおいて測定したときの、ヒトまたはカニクイザル血清中でのＣ３ａ生成に対するＡＲＣ１９０５（配列番号６７）の効果を示すグラフである。
【図６６】図６６は、補体活性化のチュービングループモデルにおいて測定したときの、５例のドナー由来のヒト血清中でのＡＲＣ１９０５補体活性化の阻害（配列番号６７）の平均ＩＣ５０、ＩＣ９０およびＩＣ９９値をまとめた表である。
【図６７】図６７は、ＡＲＣ１９０５、抗Ｃ５アプタマー、またはＡＲＣ１２７（補体活性のチュービングモデルにおいて、Ｃ５と結合しない無関連アプタマー）の濃縮機能としてのＣ５ａおよびＣ３ａの生成阻害率を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【配列表】
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