(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞を殺滅する薬剤に対する疾患の感受性と相関するバイオマーカー候補をインビトロで同定する方法であって、
ａ）１又は複数の腫瘍細胞を
ｉ）前記腫瘍細胞を殺滅しうる濃度の薬剤；及び
ii）前記腫瘍細胞内のタンパク質のレベル又は活性を抑制する化合物
に曝露するステップと、
ｂ）前記１又は複数の腫瘍細胞の生存をモニターするステップと
を含み、前記腫瘍細胞が前記薬剤の存在にも関らず生存する場合に、前記タンパク質又はそれをコードする遺伝子を薬剤感受性と相関するバイオマーカー候補として同定する方法。
【請求項２】
化合物が核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
化合物がｓｉＲＮＡである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
化合物がタンパク質の発現レベルを低下させる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
化合物がタンパク質の発現をノックアウトする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
曝露するステップが、薬剤の存在下で腫瘍細胞をインキュベートするステップを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
１又は複数の腫瘍細胞を化合物ライブラリーに曝露する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
化合物ライブラリーがｓｉＲＮＡライブラリーである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
化合物ライブラリーがベクター化ＲＮＡ干渉ライブラリーである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ライブラリーがウイルスベクター化ＲＮＡ干渉ライブラリーである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
１又は複数の腫瘍細胞が患者から単離された、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
薬剤がＨＤＡＣ阻害剤である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
１又は複数の腫瘍細胞を薬剤の組合せに曝露する、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
薬剤と化合物により共処理したプレートにおけるコロニーの出現が、腫瘍細胞の生存を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
化合物が、ｓｈＲＮＡである、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
生存した腫瘍細胞を単離するステップ、抑制された遺伝子の同一性を決定するステップ、及びその後、機能アッセイにおいて前記遺伝子の役割を検証し、それらがバイオマーカーであるかを判断するステップをさらに含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
細胞を殺滅する薬剤に対する疾患の感受性と相関するバイオマーカー候補をインビトロで同定する方法であって、
ａ）１又は複数の細胞を
ｉ）前記細胞を殺滅しうる濃度の薬剤；及び
ii）前記細胞内のタンパク質のレベル又は活性を抑制する化合物
に曝露するステップと、
ｂ）前記１又は複数の細胞の生存をモニターするステップと
を含み、
前記薬剤単独の処理の効果がアポトーシスであり、前記細胞が前記薬剤の存在にも関らず生存する場合に、前記タンパク質及びそれをコードする遺伝子を薬剤感受性と相関するバイオマーカー候補として同定する方法。
【請求項１８】
薬剤と化合物により共処理したプレートにおけるコロニーの出現が、細胞の生存を示す、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
生存した細胞を単離するステップ、抑制された遺伝子の同一性を決定するステップ、及びその後機能アッセイにおいて前記遺伝子の役割を検証するステップをさらに含む、請求項１７又は１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の病態が特異的な治療に反応するかどうかを予測する単純な分子マーカーを同定する新規のスクリーニング法に関する。したがって、該方法は、薬剤開発計画を効率化し、臨床的状況でどのように薬剤を使用できるかに関する情報を提供する。
【背景技術】
【０００２】
治療用薬剤候補物質の大部分は、臨床試験中に発見される有害な代謝又は毒性のために、市販承認薬となることができない。さらに、臨床的状況に参入する多くの薬剤は、限定的な有効性及び毒性を示す。これらの失敗が開発費用のきわめて大きな損失を占める結果、前臨床開発段階において、薬剤候補物質の代謝及び毒性に関する特性、並びに疾患の予防又は治療においてそれらの物質が持ち得る有効性を、より信頼できるやり方で、より速やかに、より経済的に予測できる新規の技術に対する必要性が存在する。
【０００３】
新たな治療法の開発は、複雑で費用を要する。癌を例にとると、癌は、奏効する治療法が見つかりにくいと判明している複雑な遺伝子疾患である。さらに、臨床的な文脈において、腫瘍は、新規の治療に対する耐性を獲得することが多い。したがって、新規及び既存の薬剤に対する腫瘍の感受性を予測する簡単な検査法を開発する必要性は大きい。同じことは、他の病態、特に、細胞増殖が疾患病理の一因となる病態にあてはまる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明によれば、薬剤に対する疾患の感受性と相関するバイオマーカーを同定する方法であって、
ａ）細胞を
ｉ）薬剤；及び
ii）細胞内タンパク質のレベル又は活性を抑制する化合物
に曝露するステップと、
ｂ）細胞における表現型についてモニターするステップと
を含み、細胞を薬剤単独で処理するときに現れる表現型とは異なる細胞内表現型の出現から、タンパク質又はそれをコードする遺伝子を薬剤感受性と相関するバイオマーカーとして同定する方法が提供される。
【０００５】
本発明は、疾患バイオマーカーの同定を可能にするスクリーニング法である。同定できるバイオマーカーの種類のより、新規又は既存の薬剤に対する疾患の感受性が予測され、それによって、患者を奏効する可能性が高い群と奏効しない可能性が高い群とに層別化することが可能となる。これらのバイオマーカーは、薬剤開発における臨床的成功の確率を高め、疾患に対する治療法を「個別化する」ことにより、患者への治療上の利益を最大化する。
【０００６】
本発明は、特に、癌などの増殖性病態、及び細胞の分化又は増殖の速度の変化が関与する疾患に適用可能である。しかし、本発明により同定されるバイオマーカーを発現するいずれの疾患も、被験薬剤での治療の候補となる。
【０００７】
本発明の技術は、最大の臨床的有効性を達成するための経路が不明である薬剤に理想的に適している。同様に、本スクリーニング法は、薬剤作用に必要とされる重要な遺伝子についての情報をもたらす。例えば、抗癌剤について、本スクリーニング法は、腫瘍細胞殺滅に関与する重要な経路を同定する。
【０００８】
本発明による手法において、該方法は、細胞又は細胞集団を２つの実体に曝露するステップを含む。細胞を薬剤に曝露するのは、この実体が検討対象であるからであり、このことにより、該方法がこの特定の薬剤に特異的なものとなる。第二に、潜在的に該薬剤に対する感受性を必要とするタンパク質のレベル又は活性を調節する化合物に細胞を曝露する。この方法の設計の結果、細胞を薬剤に曝露した結果薬剤に曝露したが阻害化合物には曝露しなかった細胞と比較して異なる表現型が現れる場合は、レベル又は活性を調節されたタンパク質が薬剤の作用機序に関与すると考えられるため、このタンパク質を有用なバイオマーカーと同定する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
その方法の働きは、ゲノム規模でのｓｉＲＮＡによるノックダウンスクリーニング法を用いて、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ，Histone deacetylase）阻害剤への感受性に影響する機能的に重要な遺伝子を同定する実施例により、例示することができる。ＨＤＡＣ阻害剤は、新規の抗癌剤の特に重要な一群である。化学的に異なるＨＤＡＣ阻害剤が、特に末梢Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、及びアンドロゲン非依存性前立腺癌を含めて、臨床開発中である。しかし、臨床的有用性（例えば、反応性の腫瘍、病期、関連する薬剤併用法）が、現時点では予測できない。腫瘍の感受性パターンについての情報をもたらすバイオマーカーは、薬剤の臨床的有益性を最大化すること、及びＨＤＡＣ阻害剤同士を識別することのいずれにおいても重要な前進をもたらすと考えられる。記載の実施例は、ＨＤＡＣ阻害剤に重点を置くが、疾患の治療を奏効させるために細胞成長、細胞分化、又は細胞増殖の遅延化を要する、他のクラスの作用機序に基づく治療法にも、同様に適用される。
【００１０】
本明細書では、癌及び他のヒト疾患との関連で選択されたヒト遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡライブラリーを用いての、ＨＤＡＣ阻害剤に関する試験により、該スクリーニングプラットフォームの妥当性を確認した。ＨＤＡＣ阻害剤は、腫瘍細胞を殺滅する。ｓｉＲＮＡライブラリー及び適切なＨＤＡＣ阻害剤で処理した腫瘍細胞は、ｓｉＲＮＡが標的とする遺伝子が喪失しているために生存する。該遺伝子が細胞内に存在し活性であったならばＨＤＡＣ阻害剤が誘導しているはずのアポトーシスを回避することで、該腫瘍細胞は生存する。すなわち、ＨＤＡＣ阻害剤に対する感受性を与えるためには、該遺伝子の発現が必要である。したがって、この方法は、ＨＤＡＣ阻害剤の標的である遺伝子を、バイオマーカーとして同定する。図１は、その方法が働くしくみを図示する。
【００１１】
本発明の方法は、疾患バイオマーカーを同定することにより、特定の薬剤に対する細胞の反応を評価する。したがって、本発明は、特定の薬剤での処理に対する特定の細胞の適合性を評価する多数の異なる方式で用いることができる。
【００１２】
１つの例は、例えば、特定の患者から採取した腫瘍細胞の診断における臨床評価である。これらの仮定的腫瘍細胞が、高いレベルの遺伝子Ｘ又は遺伝子Ｘがコードする活性タンパク質を有することが判明し、遺伝子Ｘが、特定の薬剤又は薬剤の組合せに対する感受性に関与すると本発明の方法により同定される場合、該薬剤又は薬剤の組合せは、該患者における優れた治療候補物質であり、該腫瘍は該薬剤に対してより良好に反応する可能性が高い。逆に、遺伝子Ｘ又はそのコードするタンパク質が低いレベルで存在するにすぎない場合は、該腫瘍がその特定の薬剤に良好に反応する可能性は低い。
【００１３】
薬剤又は薬剤組合せの定量的効果も、評価することができる。例えば、細胞内タンパク質のレベル又は活性を阻害する化合物を個別の試験に用いて、異なる程度で遺伝子を阻害してよく、また、これら個別の試験においては、細胞の表現型をモニターすることができ、これは異なる薬剤条件下であってもよい。異なる薬剤条件とは、異なる薬剤濃度、異なる回数の薬剤曝露、異なる薬剤組合せなどを含むことを意味する。当然ながら、本システムでは、異なる薬剤濃度、異なる薬剤曝露回数、及び異なる薬剤組合せの様々な組合せをも調べることができる。
【００１４】
臨床的状況においては、疾患進行の様々な段階により薬剤の有効性及び薬剤の組合せが変化するので、疾患進行中におけるバイオマーカーの一時的な調節を探索することも、きわめて興味深いであろう。現時点では、こうした変化を評価する方法はきわめて限られている。本発明により、各患者だけでなく疾患の特定の段階にも個別化した治療を案出することを目的として、一時的効果を評価することが可能となる。
【００１５】
本発明は、腫瘍などの特定の疾患が、突然変異に対し感受性である程度を評価することをも可能にする。正常組織における発現及び患者集団内における任意の多型的影響も、本ツールを用いる試験の対象となりやすい。
【００１６】
薬剤治療の作用機序を解析することもできる。例えば、薬剤治療が発現レベルに影響するしくみを評価することができる。
【００１７】
別の適用は、製薬企業が、より有効に自社の薬剤及びリード化合物を位置づけることを可能にする。特定の疾患の治療に向けた開発中に有望となる薬剤は、部分的に理解されるにすぎない場合もある作用機序が理解されるために有望となるのが通例である。本発明の方法は、薬剤の作用機序の詳細な解明を可能とすることで、その十分な可能性をいっそう容易に実現することができる。こうしたことが可能なのは、異なる患者のサブグループ（例えば、性別又は人種に基づく）、異なる病期、異なる遺伝子多型（例えば、Ｐ４５０、又はＦｃ受容体）などの間における有効性の差を容易に示すことができるためである。
【００１８】
いくつかの製薬企業が同一の標的に向けて臨床開発中の化合物を有する場合が多い。本発明は、企業が、特定の疾患、又は病期、又は患者集団について、自社の薬剤を他社との比較で位置づけることを可能にする。これは、企業が、自社薬剤の有効性を識別し、現在のところ安全性の注意を強化する薬剤承認機関に有用性を示し、製薬企業の動機づけに対する懐疑が深まり薬剤費負担者における費用負担感が高まる時勢に新規の治療パラダイムを推し進める一助となるであろう。
【００１９】
本発明の関連する適用は、有害な副作用を示した、又は本来の処方目的である病態の治療に無効であることが判明した薬剤に、新規、安全で有効な適用を見出すことであろう。
【００２０】
インビトロでは有望な抗腫瘍有効性を示すが、インビボでは現在のところ有効であることが示されていないＣＤＫ阻害剤のクラスが、一例を提供する。これは、おそらく、研究者らが、いまだ臨床的状況に応じたこれらの使用を個別化できるほど正確には作用機序を探索していないためである。本発明の方法は、この正確な作用機序を究明することを可能にするであろう。
【００２１】
上市を取り下げられた薬剤の例も多数存在する。長期使用中に薬剤が心臓発作及び脳卒中などの心血管事象のリスクを増大させることがあるという証拠を理由に、関節炎、急性疼痛、及び疼痛をともなう月経周期の徴候及び症状の緩和に用いるＣＯＸ−２選択的非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ，non-steroidal anti-inflammatory drug）であるVioxx（ロフェコキシブ）を、Merck社が世界規模で自主的に取り下げた例がある。Vioxxにも安全で有効な治療法が存在する可能性はきわめて高いが、こうした治療法を同定する既存の方法は、きわめて限られている。これに対して、本発明は、こうした手法を可能にする。
【００２２】
本発明のスクリーニング法の別の適用は、薬剤の投与による毒性作用を受けやすい組織又は患者さえも同定する際にある。例えば、薬剤への感受性に必要であると同定された特定の遺伝子が、正常な非罹患組織において高いレベルで発現する場合、この組織は、該薬剤に対して感受性であると同定することができる。この知見を用いて、健康な組織における毒性を制限することができる。これは、多くの薬剤、特に抗癌剤においてよく見られる。
【００２３】
疾患の感受性を予測するバイオマーカーは、臨床的状況において重要であるが、新規薬剤の作用機序を理解するためにも重要な示唆を投げかける。ここでも癌領域を例にとると、ＨＤＡＣ阻害剤は、強力なアポトーシス誘導剤として知られている。しかし、作用機序の点で、アポトーシス効果を媒介する、重要な下流標的が何であるのかは明らかでない。本発明の方法を用いて同定されるバイオマーカーは、腫瘍細胞がアポトーシス過程に入るしくみを説明する際に、作用機序に関する重要な手がかりを与えるであろう。
【００２４】
本発明の方法は、細胞を、ｉ）薬剤候補物質と、ii）潜在的に薬剤に対する感受性を必要とするタンパク質のレベル又は活性を調節する化合物と、に曝露するステップを含む。
【００２５】
薬剤候補物質は、いかなる薬剤であってもよい。例は、細胞増殖性障害、自己免疫性／炎症性疾患、心血管疾患、神経及び精神疾患、発達性疾患、遺伝子疾患、代謝疾患、感染症、並びに他の病態を含む。特に重要なのは、異常な細胞増殖が役割を果たす疾患であり、癌、新生物、脳腫瘍、神経膠腫、骨腫瘍、肺癌、乳癌、前立腺癌、結腸癌、血管腫、骨髄増殖性疾患、白血病、血液疾患、血管新生性疾患、皮膚疾患、線維症、心血管疾患、及び子宮内膜症を含む。同様の例は、当業者の知るところであろう。
【００２６】
本明細書において本発明が例示される一例としての薬剤の好ましいクラスは、ＨＤＡＣ阻害剤のクラスである。他の例は、当業者には明らかであろうが、オーロラキナーゼ阻害剤、ｃｄｋ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、並びにクエルセチン及びその同族体などの天然産物、特に、複数の標的及び経路を有すると考えられる天然産物を含む。
【００２７】
本発明に従って薬剤の組合せを調べてもよい。例えば、一部の薬剤は、相加効果又は相乗効果のいずれかにより、併用すると良好に作用することが知られている。同様に、作用機序効果が適合し合わない、又は相互作用し合うために、併用すると良好に作用しない薬剤も多い。薬剤の組合せを一緒に調べることにより、本発明に従ってこれらすべてのシナリオを評価してよい。組合せは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ以上の異なる薬剤を含んでよい。併用する場合、薬剤は、同一濃度又は異なる濃度で用いてよい。薬剤は、推奨される用量又は推奨される用量範囲内において用いてよい。或いは、薬剤は、推奨される用量よりも低い又は高い濃度で用いることにより、例えば、探索されていない可能性のある作用機序を探索すること、又は、過剰投与の副作用可能性を究明することができる。
【００２８】
本発明によれば、細胞を薬剤に曝露する。一般に、細胞集団を薬剤に曝露する。「曝露される」とは、細胞が薬剤に接触し、その結果、その効果が現れる可能性があることを意味する。一般に、曝露の最も適切な形態は、細胞が成長する培地内に、薬剤を適切な濃度で組み込むことを含む。薬剤は、当然ながら、異なる濃度における異なる細胞集団に適用し、そうすることで、用量反応評価を行うことができる。
【００２９】
細胞は、潜在的に薬剤に対する感受性を必要とするタンパク質のレベル又は活性を調節する化合物にも曝露する。本発明の１つの利点は、薬剤の作用機序を、その作用機序についてのいかなる既存の知識、又は該薬剤が作用するしくみについての予測なしに探索できるということである。したがって、本発明を実施するのに適した１つの方法は、化合物ライブラリーへの細胞集団の曝露を含み、ライブラリー中の各化合物が、薬剤の作用機序に関与する可能性のある遺伝子又はタンパク質を標的とする。
【００３０】
該化合物は、特定の薬剤の作用機序に関与する可能性のあるタンパク質のレベル又は活性を調節しなければならない。「調節する」という用語は、抑制のほか促進をも含む。タンパク質の活性又はレベルは、野生型の１０％、２０％、４０％、８０％、１５０％、５００％、１０００％以上の強度に調節してよい。該化合物は、タンパク質の発現又は活性レベルを抑制、阻害、又は「ノックアウト」できることが好ましい。該化合物は、タンパク質の発現レベルを抑制、阻害、又はノックアウトできることがより好ましい。該化合物は、野生型レベルの５０％未満、２５％、１０％、１％、０．１％、０．０１％、０．００１％以下に該発現レベルを抑制することが好ましい。
【００３１】
本発明に従って使用することができる核酸化合物の例は、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、及び、アンチセンスＲＮＡなどのアンチセンス核酸を含む。理論上は、抗体又は小分子化合物のライブラリーを用い得ると考えられる。ＲＮＡｉ、及び、具体的には、いずれｓｉＲＮＡ分子を産生するｓｈＲＮＡの使用が、特に好ましい。ｓｉＲＮＡは、ベクター、特にウイルスベクターを用いて送達してもよく、又は合成ｓｉＲＮＡとして直接細胞に導入してもよい。合成ｓｉＲＮＡの直接導入を用いる際の１つの問題は、半減期の短さであり、これが、遺伝子発現に対する長期的効果を減殺する。しかし、ｓｉＲＮＡ技術における進歩は、数年のうちに、半減期を著明に改善する可能性が高い。
【００３２】
例えば、細胞内に組み込むｓｉＲＮＡベクターライブラリーに細胞を曝露することができる。感染の多重性を統一化することができ、その結果、各細胞が平均で単一のベクターを組み込み、このベクターが、特定の遺伝子発現をノックダウンするｓｉＲＮＡ種を発現する。したがって、各細胞において、１つの遺伝子の発現をノックアウトすることで、該遺伝子の不在における薬剤の効果を評価することができる。薬剤の存在にもかかわらず細胞が生存するのであれば、該遺伝子は、薬剤感受性に必要であると推測することができる。したがって、特定の遺伝子が過剰発現する細胞は、該薬剤での有効な治療についての良好な候補となる。
【００３３】
本発明によれば、ベクター化ＲＮＡ干渉ライブラリーを用いることが好ましい。これは、例えば、レンチウイルス、アデノウイルス（ベルギー、Galapagos社製）、ポックスウイルスなど（例えば、Chen et al., 2005, J. RNAi and Gene Silencing, 1(1); 5-11を参照のこと）を用いる、ウイルスベクター化ＲＮＡ干渉ライブラリーでよい。ウイルスに基づくライブラリー（レトロウイルスライブラリーを含む）は、細胞内に核酸を効率的に送達するので、良好に作用する。例えば、レトロウイルスはＤＮＡに統合されることによって、クロマチン環境の影響を受けるため、ここでも今後数年間の改善がこの問題を解消すると見込まれるものの、発現レベルは低下し得る。
【００３４】
ライブラリーを用いる考えに対する変更は、当業者が理解する通り、当然ながら可能である。例えば、ｓｉＲＮＡライブラリーの場合、感染の多重性は、遺伝子のノックダウンが効率的に生じることを確保するため、例えば、１未満〜１００超の間で変化してよい。さらに、異なる化合物（例えば、ｓｉＲＮＡ）を用いて、選択した遺伝子（例えば１０、１００、１０００、１００００の遺伝子）の異なる部分を標的とすること、又は単一の遺伝子の異なる部分を標的とすることさえも可能である。例えば、単一遺伝子の異なる部分に対する化合物（例えば、ｓｉＲＮＡ）を用いて、スプライス変異体の識別効果を探索し得ると考えられる。
【００３５】
阻害化合物の効果を条件化する、例えば、誘導可能なプロモーターを用い、必要時に投与できる特定の誘導剤の存在下において化合物（例えば、ｓｉＲＮＡ）の発現を条件化することもできる。
【００３６】
前述で用いた化合物ライブラリーは、例えば、１００より大きい、１０００より大きい、１０，０００より大きい、１５，０００より大きい、２０，０００より大きい、２５，０００より大きい、３０，０００より大きい、３５，０００より大きい、又はこれを超える多数の異なる遺伝子を標的とすることが好ましい。ライブラリーの化合物が標的とする遺伝子は、ゲノム規模（例は、ドイツ、ヒルデン、Qiagen社製；米国、ラファイエット、Dharmacon社製）であってよい。近年、大規模ライブラリーも、学術研究者により（Paddison et al., 2004, Nature 428; 427-431; Berns et al., 2004, Nature, 428; 431-437; Michiels et al., 2002, Nat. Biotechnol. 201154-1157）また商業的に（ベルギー、Galapagos社；スウェーデン、Genordia AB社）構築されている。ライブラリーの化合物が標的とする遺伝子は、特定の疾患（例えば、癌、神経変性疾患、炎症性障害）に特異的であってよい。
【００３７】
本発明書で例示したスクリーニング法は、癌及び他のヒト疾患との関連により選択した、約１３，０００のヒト遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡライブラリーを用いる。ｓｉＲＮＡライブラリー及び適切な薬剤で処理した細胞は、ｓｉＲＮＡが標的とする遺伝子が喪失しているために生存する。該遺伝子が細胞内に存在し活性であったならばＨＤＡＣ阻害剤が誘導しているはずのアポトーシスを回避することで、該細胞は生存する。
【００３８】
その方法の結果は、細胞内の表現型を探索することで評価する。細胞内の表現型は、対照細胞との比較により評価することが好ましい。対照細胞は、薬剤候補物質で処理するが、潜在的に薬剤に対する感受性を必要とするタンパク質のレベル又は活性を調節する化合物には曝露しないでおくことが適切である。こうして、観察されるいずれの表現型も、化合物の効果と特異的に関連付けることができる。
【００３９】
処理済み細胞と対照細胞との表現型における差異は潜在的に重要である。表現型は、細胞の全般的な機能又は外見に関連する場合もあり、特定のタンパク質のレベル又は活性の増減など、分子的表現型の場合もある。この意味で、特異的な表現型を、ＲＴ−ＰＣＲ、免疫組織化学法、ウェスタンブロット法、ＤＮＡブロット法などの分子的技法を用いて調べることができる。
【００４０】
好ましい一実施形態において、観察される表現型は、細胞の生存又は増殖特性である。例えば、ｓｉＲＮＡベクターを用いて特定の遺伝子発現をノックアウトする前述の発明の例示において、生存は、薬剤に対する感受性に必要な遺伝子のノックアウトを示す。生存は、当業者が理解する通り、いくつかの異なるやり方で評価することができる。例は、当技術分野ではよく知られる、細胞生死判別アッセイを含む。本明細書で用いる実施例において、細胞の生存は、薬剤とｓｉＲＮＡをコードするウイルスライブラリーとにより共処理したプレートにおけるコロニーの出現を探索することによりモニターした。
【００４１】
本発明のさらなる態様によれば、各種遺伝子が、ＨＤＡＣ阻害剤に対する細胞の感受性に関与している。これらの発見は、いくつかの発展を可能にする。例えば、ＨＤＡＣ阻害剤により良好に反応しやすい群別に、腫瘍を層別化することができる。これら遺伝子の１つ又は複数に対する患者の発現プロファイルに関して個別の評価を行うことができ、これらの評価に基づき、患者が、ＨＤＡＣ阻害剤での治療に適した候補であるかどうかについての診断を定式化することができる。そうであれば、治療が最も良好にとるべき形態（例えば、用量、投与回数、及び投与法、薬剤の組合せ）について、より詳細な評価を行うことができる。
【００４２】
本明細書に記載した種類のスクリーニング法は、酵素など周知の治療標的を、薬剤感受性の決定因子として同定する可能性も高い。したがって、こうした知見は、臨床評価において有効となる可能性の高い薬剤の組合せを予測するであろう。例えば、ＨＤＡＣ阻害剤の文脈では、スクリーニング法で同定された治療標的に対する薬剤との併用で、該阻害剤を腫瘍の治療に用いることができると考えられる。
【００４３】
これらの発見はまた、ＨＤＡＣ阻害剤の作用方式の機序についての理解を推し進める。本明細書において、発明者らは、ＨＤＡＣ阻害剤が影響を及ぼし、アポトーシス効果に必要とされる重要な調節経路を同定した。発明者らは、ノックダウンスクリーニング法により同定されたタンパク質が、それ自体、アセチル化による修飾を受ける、或いはまた、アセチル化による制御を受ける他のタンパク質と相互作用すると考えられるため、これらタンパク質が修飾を受け、アポトーシスに必要な経路において機能することが可能になると仮定している。これら新規のエフェクタータンパク質の役割を解明すれば、ＨＤＡＣ阻害剤により標的とされ、アポトーシスの誘導に必要な、本質的経路を同定することになるであろう。
【００４４】
例えば、これらの発見は、薬剤小分子など、これらの遺伝子がコードするタンパク質の活性に影響する制御因子の開発を可能にするため、ＨＤＡＣ阻害剤を用いて治療することのできる疾患及び生理学的状態を精密に定めることを可能にする。例えば、こうした制御分子は、これらのタンパク質のアセチル化状態に影響を及ぼすこともあり、又はこれらのタンパク質がＨＤＡＣ阻害剤によりアセチル化を受ける他のタンパク質と相互作用する能力に影響することもある。
【００４５】
本明細書において、ＨＤＡＣ阻害剤の作用に対する感受性にとって不可欠であると高い信頼性で同定される遺伝子は、本明細書の図２に挙げた遺伝子を含む。これらの遺伝子は、ｈＨＲＡＤ２３Ｂ（ＮＭ＿００２８７４、ヒトｒａｄ  ２３Ｂ）、ＲＦＣ１（ＮＭ＿００２９１３、複製因子Ｃ１）、ＭＹＤ８８（ＮＭ＿００２４６８、骨髄分化主要反応遺伝子８８）、ＰＴＢＰ１（ＮＭ＿００２８１９、ポリピリミジントラクト結合タンパク質１）、ＰＰＰ４Ｒ１（ＮＭ＿００５３１４、タンパク質ホスファターゼ４調節サブユニット１）、ＬＩＦ（ＮＭ＿００２３０９、白血病阻害因子）、ＬＩＦＲ（ＮＭ＿００２３１０、白血病阻害因子受容体）である。同定された他の遺伝子は、ＳＣＢＧＢ２Ａ２（ＮＭ＿００２４１１；セクレトグロビン、ファミリー２Ａ、メンバー２）、ＨＬＡ−ＤＱＢ１（ＮＭ＿００２１２３；主要組織適合抗原複合体、クラスＩＩ、ＤＱベータ１）、ＰＶＲＬ１（ＮＭ＿００２８５５、ポリオウイルス受容体様１）、ＳＥＲＰＡ１０（ＮＭ＿０１６１８６、セルピンＡ１０）、ＨＥＸＢ（ＮＭ＿０００５２１、ヘキソサミニダーゼＢ）、ＰＰＡＴ（ＮＭ＿００２７０３、ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼ）、ＬＤＨＢ（ＮＭ＿００２３００、乳酸デヒドロゲナーゼＢ）、ＭＡＮ２Ａ１（ＮＭ＿００２３７２、マンノシダーゼ２Ａメンバー１）、ＰＬＥＣＫ２（ＮＭ＿０１６４４５、プレクストリン２）、及びＳＡＲＴ２（ＮＭ＿０１３３５２、Ｔ細胞により認識された扁平上皮癌抗原）を含む。
【００４６】
これらの発見は、ＨＤＡＣ阻害剤での治療に対する感受性について、特定の患者又は患者症例を評価するのに適切な診断用薬剤及び方法の開発を可能にするので、ＨＤＡＣ阻害剤により良好に反応しやすい群別に腫瘍を層別化することができる。それは、これらタンパク質をコードする遺伝子内部における突然変異及び多型（ＳＮＰなど）を同定するための道筋をも開くため、ＨＤＡＣ阻害剤を用いる治療に対する個々の患者の潜在的可能性の評価を可能にする。
【００４７】
本発明のこの態様は、疾患を患う個人の、ＨＤＡＣ阻害剤での治療に対する感受性を診断する方法であって、前記患者由来の組織におけるｈＨＲＡＤ２３Ｂ、ＲＦＣ１、ＭＹＤ８８、ＰＴＢＰ１、ＰＰＰ４Ｒ１、ＬＩＦ、ＬＩＦＲ、ＳＣＢＧＢ２Ａ２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＰＶＲＬ１、ＳＥＲＰＡ１０、ＨＥＸＢ、ＰＰＡＴ、ＬＤＨＢ、ＭＡＮ２Ａ１、ＰＬＥＣＫ２、及びＳＡＲＴ２の群の遺伝子、又はこれらの発現産物のいずれか１つの配列、又は発現若しくは活性レベルを評価するステップと、前記配列、発現又は活性レベルを基準と比較するステップとを含み、前記基準と異なる配列、発現又は活性レベルが、ＨＤＡＣ阻害剤での治療に対する、基準状態と比べた感受性の変化を示す方法を提供する。一般に、基準レベルより著明に高いレベルは、該個人が、ＨＤＡＣ阻害剤での治療に対してより強く感受性であることを示す。基準レベルより著明に低いレベルは、ＨＤＡＣ阻害剤での治療に対して、該個人が耐性である可能性を示す。「著明な」とは、発現又は活性レベルが、基準レベルよりも１０％、２５％、５０％、１００％、２５０％、５００％、１０００％以上高いこと、低いことを意味する。
【００４８】
或いはｍＲＮＡ発現産物が検出されることもあるが、発現産物はタンパク質であることが好ましい。タンパク質を用いる場合、タンパク質は、そのタンパク質に特異的に結合することが好ましい抗体により検出してよい。「特異的に結合する」という用語は、該抗体が、標的ポリペプチドに対して、他の関連するポリペプチドに対する親和性よりも実質的に大きな親和性を有することを意味し、他のタンパク質と交差反応しないことが好ましい。本明細書において用いる「抗体」という用語は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖなど、問題となる抗原決定基に結合することのできる無傷の分子のほか、それらの断片をも指す。「実質的により大きな親和性」とは、本発明の標的ポリペプチドに対して、他の関連ポリペプチドに対する親和性と比べ測定可能な親和性の上昇が存在することを意味する。親和性は、標的ポリペプチドに対して、少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍、１０６倍以上であることが好ましい。抗体は、検出されたタンパク質に高い親和性で結合することが好ましく、１０−４Ｍ以下の解離定数を示すことが好ましく、１０−７Ｍ以下が好ましく、１０−９Ｍ以下が最も好ましい。ナノモル以下の親和性（０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１ｎＭ以下までも）が好ましい。
【００４９】
例えば、該方法は、（ａ）ｈＨＲＡＤ２３Ｂ、ＲＦＣ１、ＭＹＤ８８、ＰＴＢＰ１、ＰＰＰ４Ｒ１、ＬＩＦ、ＬＩＦＲ、ＳＣＢＧＢ２Ａ２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＰＶＲＬ１、ＳＥＲＰＡ１０、ＨＥＸＢ、ＰＰＡＴ、ＬＤＨＢ、ＭＡＮ２Ａ１、ＰＬＥＣＫ２、又はＳＡＲＴ２のタンパク質の１つに対する抗体など、これらのタンパク質のリガンドを、リガンド−タンパク質複合体の形成に適切な条件下において、生物学的試料に接触させるステップと、（ｂ）前記複合体を検出するステップとを含んでよい。
【００５０】
ｍＲＮＡ発現産物を用いる場合、ｍＲＮＡとプローブとの間のハイブリッド複合体の形成を可能にする厳密な条件下において、組織試料をプローブに接触させるステップと、複合体の形成を検出するステップとによりそれを検出することが好ましい。好ましい方法は、形成される複合体の量を、対照組織を用いた場合に形成される量と比較するステップであって、対照と試料との間で形成された複合体の量の違いが、癌の存在を示すステップを含む。被験組織が形成する複合体の量を正常組織の場合と比べた違いが、増加又は減少であることが好ましい。形成される複合体量の２倍（又は２分の１）の違いを著明であるとみなすことがより好ましい。形成される複合体量の３倍（又は３分の１）、４倍（又は４分の１）、５倍（又は５分の１）、１０倍（又は１０分の１）、２０倍（又は２０分の１）、５０倍（又は５０分の１）、又は１００倍（又は１００分の１）までもの増加又は減少が著明であることが、さらにより好ましい。
【００５１】
この代替方法において、該方法は、ａ）ｈＨＲＡＤ２３Ｂ、ＲＦＣ１、ＭＹＤ８８、ＰＴＢＰ１、ＰＰＰ４Ｒ１、ＬＩＦ、ＬＩＦＲ、ＳＣＢＧＢ２Ａ２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＰＶＲＬ１、ＳＥＲＰＡ１０、ＨＥＸＢ、ＰＰＡＴ、ＬＤＨＢ、ＭＡＮ２Ａ１、ＰＬＥＣＫ２、又はＳＡＲＴ２をコードする核酸分子とプローブとの間のハイブリッド複合体の形成を可能にする厳密な条件下において、患者由来の組織試料を核酸プローブに接触させるステップと、ｂ）ステップａ）で用いるのと同じ条件下において、基準試料をプローブに接触させるステップと、ｃ）前記試料におけるハイブリッド複合体の存在を検出するステップとを含んでよく、基準試料におけるハイブリッド複合体のレベルと異なる患者試料におけるハイブリッド複合体のレベルの検出が、ＨＤＡＣ阻害剤での治療に対する、疾患の基準状態と比べた感受性の変化を示す方法である。
【００５２】
該方法は、ａ）ｈＨＲＡＤ２３Ｂ、ＲＦＣ１、ＭＹＤ８８、ＰＴＢＰ１、ＰＰＰ４Ｒ１、ＬＩＦ、ＬＩＦＲ、ＳＣＢＧＢ２Ａ２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＰＶＲＬ１、ＳＥＲＰＡ１０、ＨＥＸＢ、ＰＰＡＴ、ＬＤＨＢ、ＭＡＮ２Ａ１、ＰＬＥＣＫ２、又はＳＡＲＴ２をコードする核酸分子とプライマーとの間のハイブリッド複合体の形成を可能にする厳密な条件下において、患者の組織からの核酸試料を核酸プライマーに接触させるステップと、ｂ）ステップａ）で用いるのと同じ条件下において、基準試料をプライマーに接触させるステップと、ｃ）試料として採取した核酸を増幅するステップと、ｄ）患者試料及び基準試料双方の増幅核酸レベルを検出するステップとを含んでよく、基準試料における増幅核酸レベルと著明に異なる患者試料における増幅核酸レベルの検出が、ＨＤＡＣ阻害剤での治療に対する、基準状態と比べた感受性の変化を示す方法である。
【００５３】
該方法は、ａ）疾患について調べる患者から組織試料を得るステップと、ｂ）組織試料からｈＨＲＡＤ２３Ｂ、ＲＦＣ１、ＭＹＤ８８、ＰＴＢＰ１、ＰＰＰ４Ｒ１、ＬＩＦ、ＬＩＦＲ、ＳＣＢＧＢ２Ａ２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＰＶＲＬ１、ＳＥＲＰＡ１０、ＨＥＸＢ、ＰＰＡＴ、ＬＤＨＢ、ＭＡＮ２Ａ１、ＰＬＥＣＫ２、又はＳＡＲＴ２をコードする核酸分子を単離するステップと、ｃ）ＨＤＡＣ阻害剤での治療に対する感受性の変化に関連する突然変異の存在を検出することで、患者を診断するステップとを含んでよい。この方法は、さらに、核酸分子を増幅して増幅産物を形成するステップと、増幅産物における突然変異の存在又は不在を検出するステップと、を含んでよい。患者における突然変異の存在又は不在は、ハイブリッド二重鎖分子を形成する厳密な条件下において、核酸分子にハイブリッド形成する核酸プローブと核酸分子を接触させるステップであって、ハイブリッド二重鎖分子が、該感受性プロファイル関連の突然変異に対応する任意の部分において、核酸プローブ鎖の非ハイブリッド形成部分を有するステップと、該プローブ鎖の非ハイブリッド形成部分の存在又は不在を、感受性に関連する突然変異の存在又は不在を示すものとして検出するステップにより検出してよい。
【００５４】
本発明のさらなる態様によれば、
ｉ）アクセッション番号ＮＭ＿００２８７４；ＮＭ＿００２９１３；ＮＭ＿００２４６８；ＮＭ＿００２８１９；ＮＭ＿００５３１４；ＮＭ＿００２３０９；ＮＭ＿００２３１０；ＮＭ＿００２４１１；ＮＭ＿００２１２３；ＮＭ＿００２８５５；ＮＭ＿０１６１８６；ＮＭ＿０００５２１；ＮＭ＿００２７０３；ＮＭ＿００２３００；ＮＭ＿００２３７２；ＮＭ＿０１６４４５；及びＮＭ＿０１３３５２のいずれか１つにおいて列挙される配列を含む、
ii）ｉ）による配列の断片である、
iii）ｉ）又はii）の相補配列を含む、
iv）高度に厳密な条件下で、ｉ）又はii）による核酸分子をハイブリッド形成する、
核酸分子であって、癌などの増殖性疾患、又は細胞の分化若しくは増殖の速度の変化が関与する疾患若しくは病態の診断又は治療に用いる核酸分子を提供する。
【００５５】
本発明のさらなる態様によれば、
ｉ）アクセッション番号ＮＭ＿００２８７４；ＮＭ＿００２９１３；ＮＭ＿００２４６８；ＮＭ＿００２８１９；ＮＭ＿００５３１４；ＮＭ＿００２３０９；ＮＭ＿００２３１０；ＮＭ＿００２４１１；ＮＭ＿００２１２３；ＮＭ＿００２８５５；ＮＭ＿０１６１８６；ＮＭ＿０００５２１；ＮＭ＿００２７０３；ＮＭ＿００２３００；ＮＭ＿００２３７２；ＮＭ＿０１６４４５；及びＮＭ＿０１３３５２のいずれか１つにおいて列挙される核酸配列がコードするアミノ酸配列を有する、
ii）ｉ）によるタンパク質の断片であって、ただし前記断片が、ｉ）若しくはii）の全長ポリペプチドが有する生物活性を保持する、又はｉ）若しくはii）のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する断片である、
タンパク質であって、癌などの増殖性疾患、又は細胞の分化若しくは増殖の速度の変化が関与する疾患若しくは病態の診断又は治療に用いるタンパク質を提供する。
【００５６】
本発明は、アクセッション番号ＮＭ＿００２８７４；ＮＭ＿００２９１３；ＮＭ＿００２４６８；ＮＭ＿００２８１９；ＮＭ＿００５３１４；ＮＭ＿００２３０９；ＮＭ＿００２３１０；ＮＭ＿００２４１１；ＮＭ＿００２１２３；ＮＭ＿００２８５５；ＮＭ＿０１６１８６；ＮＭ＿０００５２１；ＮＭ＿００２７０３；ＮＭ＿００２３００；ＮＭ＿００２３７２；ＮＭ＿０１６４４５；及びＮＭ＿０１３３５２のいずれか１つにおいて列挙される核酸配列がコードするアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的に結合し、該タンパク質の活性を阻害することが好ましい、抗体などのリガンドをも含む。こうしたリガンドは、癌などの増殖性疾患、又は細胞の分化若しくは増殖の速度の変化が関与する疾患若しくは病態の診断又は治療のための薬剤製造において用いてよい。
【００５７】
本発明の方法において用いる生物学的試料は、組織試料であることが好ましい。血液、尿、唾液、又は特定の組織生検など、任意の組織試料を用いてよい。細胞は、非侵襲的手順、例えば、循環腫瘍細胞を単離してバイオマーカー評価に必要な材料を提供することによって単離することが好ましい。
【００５８】
本発明は、前述のタンパク質、核酸分子、又はリガンドの治療的に有効な量を患者に投与することにより、このような治療を必要とする患者における疾患を治療する方法をも提供する。このような化合物は、薬剤組成物の形態で投与してよい。このような組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わせた化合物を含む。該化合物は、ＨＤＡＣ阻害剤との併用で、例えば、個別、同時、又は逐次投与により投与してよい。
【００５９】
本発明は、患者における疾患又は生理学的状態の治療的処置をモニターする方法であって、前記患者由来の組織における、本発明の前述の態様のいずれか１つによるタンパク質、核酸分子、又はリガンドの発現又は活性レベルを、一定期間にわたりモニターするステップを含み、該期間における前記発現又は活性レベルの、対照レベルに対する変化が、前記疾患又は生理学的状態の退縮を示す方法をも提供する。第１の時点における遺伝子又はそれがコードするタンパク質の発現又は活性レベルを、第２の時点における同一の発現産物の発現と比較してよく、ここで、第１の時点と比べた第２の時点における発現又は活性の変化は、該遺伝子が関与する疾患の退縮又は進行と相関している可能性がある。
【００６０】
本発明のさらなる態様は、ｈＨＲＡＤ２３Ｂ、ＲＦＣ１、ＭＹＤ８８、ＰＴＢＰ１、ＰＰＰ４Ｒ１、ＬＩＦ、ＬＩＦＲ、ＳＣＢＧＢ２Ａ２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＰＶＲＬ１、ＳＥＲＰＡ１０、ＨＥＸＢ、ＰＰＡＴ、ＬＤＨＢ、ＭＡＮ２Ａ１、ＰＬＥＣＫ２及びＳＡＲＴ２がコードするタンパク質のいずれか１つのアセチル化状態を調節することにより、増殖性疾患又は細胞の分化若しくは増殖の速度の変化が関与する病態（前述）を治療する方法を提供する。該方法は、複数の、例えば、２つの、３つの、４つの、５つの、６つの、７つの、８つの、又は９つすべてのこれらのタンパク質のアセチル化状態を調節してよい。これらのタンパク質のアセチル化状態は、本発明により抑制されることが好ましい。
【００６１】
本明細書に記載の方法は、インビボ又はインビトロにおいて実施してよい。
【００６２】
さらなる一態様において、本発明は、癌などの増殖性疾患、又は細胞の分化若しくは増殖の速度の変化が関与する疾患若しくは病態の治療及び／又は診断において有効な化合物を同定する方法であって、本発明の前述の態様のいずれか１つによるタンパク質、核酸分子、又はリガンドを、前記のタンパク質、核酸分子、又はリガンドに対する結合親和性を有すると思われる１つ又は複数の化合物に接触させるステップと、前記の核酸分子、タンパク質、又はリガンドに特異的に結合する化合物を選択するステップと、を含む方法を提供する。
【００６３】
本発明のさらなる態様によれば、患者を診断するため、特にＨＤＡＣ治療への適切性を評価するのに有用なキットであって、厳密な条件下において、本発明の前述の態様のいずれか１つによる核酸分子とハイブリッド形成する核酸プローブを含む第１の容器と、前記核酸分子を増幅するのに有用なプライマーを含む第２の容器と、該プローブ及びプライマーを用いて診断を容易にするための説明書と、を含むキットを提供する。
【００６４】
上記で概観した方法の１つを用いて診断を容易にするため、本発明は、さらなる態様において、少なくとも２つの核酸分子の配列であって、前記核酸分子の各々が、前述の発明の態様のいずれか１つによる核酸分子の配列に対応する、該核酸分子の配列に相補的である、又は該核酸分子に特異的にハイブリッド形成する核酸分子の配列を提供する。該配列は、少なくとも１〜９以上の前記核酸分子の配列に対応する、該核酸分子の配列に相補的である、又は該核酸分子に特異的にハイブリッド形成する核酸分子を含んでよい。該配列における核酸分子は、１２〜５０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、より好ましくは、４０〜５０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドからなってよい。或いは、該配列における核酸分子は、ＰＣＲで増幅したｃＤＮＡ挿入物であって、核酸分子が３００〜２０００ヌクレオチドであるｃＤＮＡ挿入物からなってよい。
【００６５】
これもまた診断に有用である関連の態様において、本発明は、少なくとも２つの異なる抗体種を含む抗体配列であって、各抗体種が、前述のタンパク質に免疫特異性である抗体配列を提供する。本発明は、前述の少なくとも２つのタンパク質種を含むタンパク質配列をも提供する。
【００６６】
本発明の診断方法において有用なキットは、こうした核酸、抗体、及び／又はタンパク質の配列を含んでよい。
【００６７】
本発明により、キットは、前述のタンパク質に結合する１つ又は複数の抗体、及び抗体とタンパク質との間の結合反応の検出に有用な試薬をも含んでよい。
【００６８】
本発明のさらなる態様によれば、前述した発明の任意の一態様による、より高いレベル、より低いレベル、又は不在レベルのタンパク質を発現するよう形質転換した非ヒト遺伝子組換え動物を提供する。前記遺伝子組換え動物は、トランスジェニック動物又はノックアウト動物であることが好ましい。該遺伝子組換え動物は、マウスなどのげっ歯類であることが最も好ましい。
【００６９】
本発明は、前述の非ヒト遺伝子組換え動物を候補化合物に接触させ、該動物の生理学的状態に対する該化合物の効果を判定することにより、病態の治療に有効な化合物をスクリーニングする方法をも提供する。
【００７０】
本発明の実施は、別段に示さない限り、当業者の技術範囲内にある、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、及び免疫学の従来の技術を用いる。
【００７１】
最も一般的な分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、及び免疫学の技術は、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2001) Cold Harbor-Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.又はAusubel et al., Current protocols in molecular biology (1990) John Wiley and Sons, N.Y.に見出すことができる。
【００７２】
別段に定義しない限り、本発明書で用いる技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の技術者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００７３】
一般に、ＨＤＡＣ阻害剤に対する感受性が重要である可能性がある疾患は、癌などの細胞増殖性障害を含む。
［実施例］
【００７４】
材料と方法
細胞培養とトランスフェクション
細胞は、１０％FCS及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco社製）を含むDMEM培地（ＭＣＦ７、Ｕ２ＯＳ、及びＳＡＯＳ２細胞）又はRPMI-40培地（Ａ２７８０細胞）中で培養した。指示通りに、回収前の最終濃度１００ｎＭでオリゴフェクタミン（Invitrogen社製）を用いて、Ｕ２ＯＳ細胞に合成短ヘアピンｓｉＲＮＡ（Dharmacon社製）をトランスフェクトした。
【００７５】
ＦＡＣＳ分析
５０％エタノール／PBS中、４℃で一晩細胞を固定し、１倍濃度ＲＮＡｓｅ  Ａ及び２０ｎｇ／ｍｌヨウ化プロピジウムとともに３０分間インキュベートした。試料をFACScanフローサイトメーター（BD Bioscience社製）にかけ、CellQuestProソフトウェアを用いて分析した。
【００７６】
pRetroSuper ＲＮＡｉノックダウンスクリーニング法
マウス異所性受容体（Ｕ２ＯＳＥｃＲ）を発現するＵ２ＯＳ細胞に、pRetroSuper ＲＮＡｉライブラリー（Brummelkamp et al, 2002a/b）を感染させた。該ライブラリーの各プールは、ウェル当たり１００のｓｉＲＮＡを含んでいた。細胞の回収に最長７２時間をかけることでｓｉＲＮＡの発現及びノックダウンを可能とした後、細胞をプレートに播種し一晩置いた（プレート当たり細胞４０，０００個）。次いで、各プレートに、２μｌ  ＳＡＨＡを加えた（スクリーニング法の前に細胞数とＳＡＨＡ濃度を決定した）。次いで、１８〜３０日間にわたり、ＳＡＨＡ及びウイルスライブラリーで共処理したプレートにおいてコロニーが出現するまで、３日ごとにＳＡＨＡ含有培地を置換した。次いで、コロニーを採取し増殖させ、総ゲノムＤＮＡ及び総タンパク質を単離できるようにした（図１）。
【００７７】
ＤＮＡの分離、ＰＣＲ、及び遺伝子の同定
溶解緩衝液（１００ｍＭトリス［ｐＨ８．５］、０．２％SDS、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、及び１００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）を用いて、コロニー細胞からゲノムＤＮＡを分離し、３７℃で振とうしながら３０分間放置し、ＤＮＡを沈殿させた。次いで、溶解物に１容量のイソプロパノールを添加して１０ｍＭトリス［ｐＨ７．５］中にＤＮＡ沈殿物を溶解し、ＰＣＲに用いて問題となる遺伝子の同一性の決定を可能にした。ＰＣＲは、Expand Long Template PCR System（Roche社製）を用いて実施した。遺伝子挿入物は、以下のプライマーを用いて回収した。ｐＲＳ順行：5'-CCCTTGGAACCTCCTCGTTCGACC-3'及びｐＲＳ逆行：5’-CAGACGTGCTACTTCCATTTGTC-3’。各回のＰＣＲは、１．２％の１倍濃度TBE／アガロースゲルにおいて分析した。次いで、ＰＣＲ産物の配列を決定し（Lark Technologies社製）、対象となる遺伝子の同定を可能にした。
【００７８】
免疫ブロット法
細胞をPBSで洗浄し、TNN溶解緩衝液（５０ｍＭトリス［ｐＨ８］、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  NP-40、１ｍＭジチオスレイトール、及びプロテアーゼ阻害剤）中、４℃で２０分間溶解した。抽出物を１６，０００ｇで１０分間遠心分離し、細胞残屑を除去した。細胞溶解物を標準化し（ブラッドフォード法）、ポンソーＳ染色で等量のタンパク質添加量を確認した。SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ，polyacrylamide gel electrophoresis）による変性化の後、Protranニトロセルロース膜に電気転写して総タンパク質を分離し、次いで、抗体により精査した。用いた抗体は、ＲＦＣ−１、ＭＹＤ８８、ＬＩＦ、ＬＩＦＲ、及びｈｎＲＮＰＩ（サンタクルス、Biotechnology社製）、並びにｈＨＲ２３Ｂ（Biomol社製）であった。増強化学発光試薬（Pierce社製）を用いて、抗体結合を可視化した。
【００７９】
１．薬剤感受性遺伝子に対する機能ノックダウンスクリーニング法
ｓｈＲＮＡノックダウンスクリーニング法（Brummelkamp et al, 2002a）は、８，０００を超えるヒト遺伝子を標的とするｓｈＲＮＡ（pRetroSuperに含まれる）ライブラリーを使用し、各遺伝子につき３つのｓｈＲＮＡ表現ベクターを含む。ｓｈＲＮＡから産生されるｓｉＲＮＡは、強力で特異的な遺伝子発現の抑制を誘導し（Brummelkamp et al, 2002a, b）、pRetroSuperを用いるｓｉＲＮＡの安定的な発現は、長期間にわたる遺伝子発現の抑制を媒介する。これにより、長期のアッセイにおける機能喪失表現型の解析が可能となる。
【００８０】
発明者らは、スクリーニング法を精密化し、ＨＤＡＣ阻害剤が誘導するアポトーシスを同定するのに必要な遺伝子の同定を可能にした。該スクリーニング法の背景となる根拠は、ＨＤＡＣ阻害剤が誘導するアポトーシスに必要な遺伝子のノックダウンにより、ＨＤＡＣ阻害剤の存在下における細胞の増殖及び成長が可能となることである（図１）。次いで、これらの細胞を単離し、ノックダウン遺伝子を同定し、その後で、機能アッセイにおいて該遺伝子の役割を検証した。１３２個のコロニー中、約２５個が、決定すべき標的遺伝子の同定を可能にするＤＮＡ配列を産生した（これは、複数のウイルスｓｈＲＮＡ構築物に感染している細胞から生じ得る）。ｓｉＲＮＡが標的とする遺伝子（図２ａ）を、増殖制御に関わる経路への関与の類似性に基づき、適宜３つの群に分けた。該遺伝子の主要な特徴を、図２ｂにまとめる。
【００８１】
ｓｈＲＮＡ  ＤＮＡ配列により同定した遺伝子が、実際にノックダウンされていることを確認するため、コードされた一部のタンパク質の発現レベルを検討した。ＬＩＦ受容体及びＲＦＣ１の場合にほぼ完全なノックダウンが観察されたのに対して、ＭＹＤ８８、ｈｎＲＮＰＩ、及びｈＨＲ２３Ｂの場合には部分的なノックダウンが観察された（ＬＩＦの場合、抗体の品質がきわめて低く、ＰＰ４Ｒ１には抗体が入手できなかったので、これら２つの遺伝子には、最終的な検証を行うことができなかった）。遺伝子に特異的なプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲ法をも行い、pRetroSuper挿入物を含む細胞におけるこれら遺伝子のＲＮＡレベルを決定した。
【００８２】
pRetroSuperベクター内の配列を、pRetroSuper挿入物と同じ配列を標的とする合成ｓｉＲＮＡの配列と比較した。該ＲＮＡの他の領域に由来し、ＲＦＣ−１及びｈＨＲ２３Ｂのノックダウンを生じることが既報（Anderson and Perkins, 2003；Glockzin et al, 2003）で示されている、他の２つの合成ｓｉＲＮＡをも検討した。ｈＨＲ２３Ｂに対して、pRetroSuperベクターから採取したｓｉＲＮＡ配列は、ｓｉＲＮＡとして導入して４８時間後に効果的なノックダウンを生じたが、ｈＨＲ２３Ｂ  ＲＮＡを標的とする他の２つの非関連の合成配列（HI及びHII）も、効果的なノックダウンを生じた（図４）。４８時間の処理後にｈＨＲ２３Ｂ  ｓｈＲＮＡによって生じたノックダウンレベルは、安定的なノックダウン細胞のレベルと同等であった。他の２つの配列（RA及びRB）によるＲＦＣ−１のノックダウンが４８時間後にきわめて効果的であったのに対し、pRetroSuper挿入物由来の配列に対する合成ｓｉＲＮＡは、４８時間の処理後において、ノックダウンを生じなかった（図４）。ｓｈＲＮＡ  Ａ及びＢによるノックダウンレベルは、スクリーニング法からの安定的な細胞系のノックダウンレベルと同等であった。送達方法によって、ｓｉＲＮＡの有効性は上下することがある（例えば安定的発現に対する一過性発現）ので、ノックダウンレベル間の差異は、異なる作用機序の結果である可能性がある。
【００８３】
本スクリーニング法により同定された遺伝子の、ＨＤＡＣ阻害剤に対する感受性の調節における役割を検証するために、発明者らは、ＨＤＡＣ阻害に対するノックダウンの効果を評価した。Ｒａｄ２３Ｂ及びＲＦＣ１を考えると、各遺伝子の異なる領域に対するｓｉＲＮＡの導入は、ＨＤＡＣ阻害剤が誘導するアポトーシスに対するＵ２ＯＳ細胞の感受性を低下させた（図５）。ｓｉＲＮＡ  ＲＦＣ１の場合、アポトーシスレベルの低下はきわめて著明であり、３５％にまで達した。したがって、ｓｉＲＮＡ  ＲＦＣ１の効果は、ＨＤＡＣ阻害剤に対する感受性に影響を与える遺伝子を同定するプラットフォームとしてのその方法の妥当性を確認する。
【００８４】
重要なことは、該プラットフォームが、今や、他の種類の薬剤、特に、細胞増殖の停止が薬剤治療の効果である薬剤に適用できることである。ＨＤＡＣ阻害剤が媒介するアポトーシスに関与する経路は、非常な多岐にわたる可能性がきわめて高いが、本明細書に記載のｓｉＲＮＡによる機能ノックダウンスクリーニング法によって、ＨＤＡＣ阻害剤が影響を及ぼし、アポトーシス効果に必要となる、重要な調節経路を同定することが可能となっている。
【００８５】
ノックダウンスクリーニング法により同定されたタンパク質は、それ自体アセチル化により修飾されるか、或いは、アセチル化の制御を受ける他のタンパク質と相互作用することにより、修飾を受け、アポトーシスに必要な経路において機能することが可能となる。これらの新規のエフェクタータンパク質の役割を解明することにより、ＨＤＡＣ阻害剤により標的とされ、アポトーシスの誘導に必要な、本質的経路が同定される可能性がある。同様に、これらの遺伝子は、ＨＤＡＣ阻害剤に対してより良好に反応しやすい群別に腫瘍を層別化することを可能にする、バイオマーカーをコードし得る。最も重要なことは、本明細書に記載のスクリーニング戦略は抗癌剤に適用できるので、他の標的にも一般に適用可能であることである。
【００８６】
（参考文献）
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【図面の簡単な説明】
【００８７】
[図１]機能ノックダウンスクリーニング法の結果の概要を示す図である。
【図１（ａ）】ｓｈＲＮＡスクリーニング戦略を示す図である。
【図１（ｂ）】機能的スクリーニング法において単離されたコロニーを示す図である。
【００８８】
[図２]ＨＤＡＣ阻害剤ノックダウンスクリーニング法において同定された遺伝子を示す図である。
【図２（ａ）】単離されたコロニーのゲノムＤＮＡからpRetroSuper挿入物をＰＣＲで増幅し、得られた配列をBLASTnで検索したところ、ＳＡＨＡ耐性コロニーにおけるノックダウン遺伝子の同定が可能となったことを示す図である。次いで、文献データベース検索からの知見により、これらの遺伝子に、細胞周期における関与可能性による優先順位をつけた。
【図２（ｂ）】ＳＡＨＡ感受性遺伝子である可能性の高い群の主要な機能、局在する場所、及び関連タンパク質を示す図である。
【図３】pRetroSuper由来のｓｈＲＮＡが、標的遺伝子に対して及ぼす効果を示す図である。単一の生存コロニーから増殖させた細胞由来の細胞抽出物をスクリーニングするウェスタンブロット分析により、ｓｈＲＮＡ挿入物の存在により同定した優先順位の高い群における遺伝子のノックダウンを判定した。
【００８９】
[図４]安定的ノックダウンと一過性ノックダウンとの比較を示す図である。
【図４（ａ）】ｈＨＲ２３Ｂに対する２つのノックダウンベクター（HI及びHII）を、pRetroSuper挿入物配列を含む短ヘアピンｓｉＲＮＡとともに、４８又は７２時間にわたりＵ２ＯＳ細胞に一過性にトランスフェクトし、対照ｓｉＲＮＡと比べて同様なレベルのノックダウンが産生されるかどうかを判定したことを示す図である。
【図４（ｂ）】ＲＦＣ−１に対する２つのノックダウンベクター（Ａ及びＢ）を、pRetroSuper挿入物配列を含む短ヘアピンｓｉＲＮＡとともに、４８時間にわたりＵ２ＯＳ細胞に一過性にトランスフェクトしたことを示す図である。次いで、両遺伝子のレベルを、スクリーニング法から単離した細胞において観察されるノックダウンレベルと比べた。ＰＣＮＡを、負荷対照として用いた。ＮＳ＝非特異的pRetroSuper、ｐＲＳ＝pRetroSuper。
【００９０】
[図５]合成ｓｉＲＮＡ  ＲＦＣ１が、ＨＤＡＣ阻害剤の感受性に対して及ぼす効果を示す図である。
【図５（ａ）】Ｕ２ＯＳ細胞をｓｉＲＮＡ  ＲＦＣ１の後、ＳＡＨＡ（前述）で処理し、ｓｕｂ−Ｇ１（アポトーシス）細胞のレベルを測定したことを示す図である。データは、ｓｉＲＮＡラミンによる対照処理の場合を１００％としたときの、ｓｕｂ−Ｇ１画分の百分率変化を示す。
【図５（ｂ）】表示の通りに処理したＵ２ＯＳ細胞を、抗ＲＦＣ１又は抗ラミンＡ／Ｃにより免疫ブロットしたことを示す図である。
【図１（ａ）】
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【図１（ｂ）】
0005528103.tif 000003
【図２（ａ）】
0005528103.tif 000004
【図２（ｂ）】
0005528103.tif 000005
【図３】
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【図４（ａ）】
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【図４（ｂ）】
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【図５（ａ）】
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【図５（ｂ）】
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【配列表】
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