(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．1（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域（ＶＬ）、およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２（配列番号２）で表されるアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列を含むマウスモノクローナル抗体。
【請求項２】
前記軽鎖の可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列はそれぞれ以下の配列からなる請求項１記載のマウスモノクローナル抗体。
CDR1：Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His; 
24                      30                  35              39      
CDR2：Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser;      
55                      61     
CDR3：Phe Gln Ser Thr His Val Pro His Thr. 
94                      100     102
【請求項３】
前記重鎖の可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列はそれぞれ以下の配列からなる請求項１記載のマウスモノクローナル抗体。
CDR1：Asp Phe Ser Met Asn;   
31              35      
CDR2: Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly; 
50                  55                  60                  65  66     
CDR3: Ile Asp Tyr. 
99      101
【請求項４】
2004年7月16日、中国微生物培養所蔵センターに、分類名  ＢＡＬＢ／ｃマウスハイブリドーマ、寄託番号  ＣＧＭＣＣ１１９２で寄託されているハイブリドーマ株。
【請求項５】
ハイブリドーマ株は、モノクローナル抗体を生産することができ、生産されるモノクローナル抗体の免疫グロブリンサブタイプは、ＩｇＧ３κである請求項４記載のハイブリドーマ株。
【請求項６】
ＴＲＡＩＬと同様に、ＤＲ５と結合することができるが、ＴＲＡＩＬが結合する位置と異なる位置に結合するモノクローナル抗体ＡＤ５−１０を生産する請求項４記載のハイブリドーマ株。
【請求項７】
体外（in vitro）で殺腫瘍活性を有するモノクローナル抗体ＡＤ５−１０を生産する請求項４記載のハイブリドーマ株。
【請求項８】
ＴＲＡＩＬおよび他の化学療法薬と相乗効果を発揮して腫瘍細胞を殺すモノクローナル抗体ＡＤ５−１０を生産する請求項７記載のハイブリドーマ株。
【請求項９】
ヌードマウス内に移植されたヒト腫瘍の成長および形成を阻害するモノクローナル抗体ＡＤ５−１０を生産する請求項７記載のハイブリドーマ株。
【請求項１０】
カスパーゼ依存アポトーシスシグナル伝達およびカスパーゼ非依存アポトーシスシグナル伝達の双方を誘発するモノクローナル抗体ＡＤ５−１０を生産する請求項７記載のハイブリドーマ株。
【請求項１１】
適切な細胞系統においてＴＲＡＩＬが引き起こすシグナル伝達経路と異なるシグナル伝達経路を引き起こすモノクローナル抗体ＡＤ５−１０を生産する請求項７記載のハイブリドーマ株。
【請求項１２】
癌治療薬の生産に請求項１記載のマウスモノクローナル抗体のＩｇＧを使用する薬剤の生産方法。
【請求項１３】
癌治療の組み換え単一抗体治療薬の生産に、請求項１記載のマウスモノクローナル抗体、および前記マウスモノクローナル抗体のＦａｂまたはＦ（ａｂ’）2を使用する薬剤の生産方法。
【請求項１４】
癌治療薬の生産において、請求項１記載のマウスモノクローナル抗体のＦａｂまたはＦ（ａｂ’）2に、ヒトＩｇＧのＦｃを組み合わせて得られるマウス−ヒトキメラ抗体を使用する薬剤の生産方法。
【請求項１５】
再形成されたモノクローナル抗体の生産において、請求項１記載のマウスモノクローナル抗体を使用するモノクローナル抗体の生産方法。
【請求項１６】
癌治療の遺伝子治療薬の生産において、薬学的に適用可能なベクターと組み合わせて、請求項１記載のマウスモノクローナル抗体のＦａｂ，Ｆ（ａｂ’）2を使用する薬剤の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，ＴＲＡＩＬ）受容体（death receptor 5，ＤＲ５）に対するモノクローナル抗体（以下、ＡＤ５−１０と称す）に関する。モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ株、重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列およびその製法と用途に関し、特に、組み換えＤＲ５細胞外領域でマウスを免疫することによりマウス抗ヒトＤＲ５モノクローナル抗体を生産する方法およびその性質と前記モノクローナル抗体の使用に関する。本発明の前記マウス抗ヒトＤＲ５モノクローナル抗体、およびそのＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2は単体で使用することができ、また癌やＡＩＤＳに対する顕著な治療効果を得るためにＴＲＡＩＬや他の化学療法薬と併用することができる。また、モノクローナル抗体の遺伝子は癌やＡＩＤＳの遺伝子治療のための適切なベクターに結合することができる。
【背景技術】
【０００２】
死受容体（death receptor）は、大きく分けて腫瘍壊死因子受容体（TNFR）スーパーファミリーに属し、細胞外領域（extracellular domain）にシステイン含有量の多い領域を有し、細胞内領域に死領域（death domains (DD)）を有する特徴を有している。死領域は死受容体のアポトーシスによる細胞死を誘発する機能に寄与するが、時には他のシグナルを伝達する。腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド、ＴＲＡＩＬ（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，ＴＲＡＩＬ）（Ｗｉｌｅｙ  ＳＲ，Ｓｃｈｏｏｌｅｙ  Ｋ，Ｓｍｏｌａｋ  Ｐら、アポトーシスを誘発するＴＮＦファミリーの新しい仲間の同定と特徴、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１９９５年、３巻、６７３−６８２頁）は、その死領域と結合し腫瘍細胞を殺すが、ヒト正常細胞のほとんどには無害な、２つの細胞死シグナル伝達経路、すなわち死受容体経路およびミトコンドリア経路を引き起こす。ＨＩＶに感染したヒトＴリンパ球は、正常Ｔ細胞に比べて、ＴＲＡＩＬおよびＴＲＡＩＬ受容体誘導細胞毒性に、より感受性が高い。これらの研究は、癌あるいはＡＩＤＳ治療においてＴＲＡＩＬおよびＴＲＡＩＬ受容体が魅力的な可能性を示唆している。
【０００３】
ＴＲＡＩＬ受容体は今までに５つ同定されている。すなわち、ＤＲ４（死受容体４(death receptor 4)またはＴＲＡＩＬ−Ｒ１）、ＤＲ５（死受容体５(death receptor 5)，ＴＲＡＩＬ−Ｒ２，ＴＲＩＣＫ２またはＫＩＬＬＥＲ）、ＤｃＲ１（おとり受容体１(decoy receptor 1 )，ＴＲＩＤ，ＴＲＡＩＬ−Ｒ３またはＬＩＴ）、ＤｃＲ２（ＴＲＡＩＬ−Ｒ４またはＴＲＵＮＤＤ）、オステオプロテグリン（Osteoprotegerin（ＯＰＧ））である。ＤＲ4およびＤＲ５は細胞内死機能領域を有し、アポトーシスシグナルを伝達することができる。ＤｃＲ１は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）を介して細胞膜上に固定されており死領域を全く含まないので、細胞死シグナルを伝達することができない。ＤｃＲ２は不完全な死領域を有しており、従ってこれも細胞死シグナルを伝達することができない。ＤｃＲ１はＴＲＡＩＬが受容体の死領域に結合することを阻害することができる。不完全な死領域を有するＤｃＲ２はおとり受容体として機能し、ＴＲＡＩＬと競合結合することによりＴＲＡＩＬの殺活性を阻害する。オステオプロテグリンはＴＲＡＩＬに対する分泌性の受容体であり、ＴＲＡＩＬに結合しＴＲＡＩＬの機能を阻害することができる。
【０００４】
従来技術によって、ＤＲ４またはＤＲ５に対するモノクローナル抗体は、正常細胞に毒性を与えることなく腫瘍細胞を殺すことができることが明らかにされている。しかしながら、ＤＲ４およびＤＲ５の細胞外領域は種々の抗原決定基から構成されているため、モノクローナル抗体の生物活性と関連する抗原決定基との関係は従来技術では明らかにされていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の第１の目的は、配列表に示された重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を有する、ヒトＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ５に対するモノクローナル抗体（以下、ＡＤ５−１０と称す）を提供することである。
【０００６】
本発明の第２の目的は、抗ヒトＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ５モノクローナル抗体（ＡＤ５−１０）を生産する方法を提供することである。
【０００７】
本発明の第３の目的は、抗ヒトＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ５モノクローナル抗体（ＡＤ５−１０）を生産するハイブリドーマ株を提供することである。
【０００８】
本発明の第４の目的は、サブタイプがＩｇＧ３κであるモノクローナル抗体を提供することである。
【０００９】
本発明の第５の目的は、体外（in vitro）で各種の腫瘍細胞系統にアポトーシスを誘発するモノクローナル抗体を提供することである。
【００１０】
本発明の第６の目的は、ヌードマウス内でヒト腫瘍の生成および成長を阻害するモノクローナル抗体を提供することである。
【００１１】
本発明の第７の目的は、ある種の細胞系統において、ＴＲＡＩＬによって誘発されるシグナルから異なる細胞シグナルを誘発するモノクローナル抗体を提供することである。
【００１２】
本発明の第８の目的は、ＴＲＡＩＬと顕著な相乗効果を発揮して殺腫瘍活性を高めるモノクローナル抗体を提供することである。
【００１３】
本発明の第９の目的は、癌および／またはＡＩＤＳ治療の治療薬の開発において、前記モノクローナル抗体または遺伝子工学によってつくられたヒト−マウスキメラ抗体および再形成抗体の全分子、Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）2，単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）の用途を提供することである。
【００１４】
本発明の第１０の目的は、抗癌剤及び／または抗ＡＩＤＳ剤の生産において、ある種のベクターと結合し得る遺伝子を有するモノクローナル抗体を提供することである。
【００１５】
本発明の第１１の目的は、殺腫瘍活性を高め、化学療法薬の投与を減らして、治療効果を促進し毒作用および副作用を少なくするために、前記モノクローナル抗体の化学療法薬、例えば、８−クロロアデノシン、５−ＦｕおよびアクチノマイシンＤとの併用方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記の目的を達成するために、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．1（配列番号１）を有する軽鎖の可変領域（ＶＬ）、およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２（配列番号２）を有する重鎖の可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列を構成要素とするマウスモノクローナル抗体を提供する。
【００１７】
前記モノクローナル抗体の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列CDR1,CDR2およびCDR3はそれぞれ以下の配列を有する。
CDR1：Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His;
24                      30                  35              39
CDR2：Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser;
55                      61
CDR3：Phe Gln Ser Thr His Val Pro His Thr
94                     100     102
【００１８】
前記モノクローナル抗体の重鎖の可変領域のアミノ酸配列のCDR11,CDR22およびCDR33はそれぞれ以下の配列を有する。
CDR11：Asp Phe Ser Met Asn;
31              35
CDR22：Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly;
50                  55                  60                  65  66
CDR33：Ile Asp Tyr.
99     101
【００１９】
本発明は、ＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ５細胞外領域に対するモノクローナル抗体を生産する方法を提供する。ここで前記モノクローナル抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．1（配列番号１）を有する軽鎖の可変領域（ＶＬ）、およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２（配列番号２）を有する重鎖の可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列を含む。
【００２０】
前記生産方法は、以下の工程からなる。
ヒトＤＲ５ｃＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてＤＲ５細胞外領域ｃＤＮＡを増幅し、増幅したｃＤＮＡを原核細胞発現ベクター内にクローニングして、発現プラスミドを得る工程、
ＤＲ５細胞外領域を発現する組み換え細菌株を得るために、前記発現プラスミドを大腸菌に導入して形質転換する工程、および組み換えＤＲ５細胞外タンパク質を有する前記細菌株を培養する工程、
組み換えＤＲ５細胞外タンパク質によりマウスを免疫する工程、およびマウスの脾臓細胞をＳＰ２／Ｏ骨髄腫細胞と融合し、モノクローナル抗体を生産するＡＤ５−１０と称されるハイブリドーマ株を生産する工程。
【００２１】
上記の工程によって生産されたハイブリドーマ株は、2004年7月16日、中国微生物培養所蔵センターに、分類名  ＢＡＬＢ／ｃマウスハイブリドーマ、寄託番号  ＣＧＭＣＣ１１９２で寄託されている。
【００２２】
本発明のハイブリドーマ株は、モノクローナル抗体を生産することができ、生産されるモノクローナル抗体の免疫グロブリンのサブタイプは、ＩｇＧ３κである。
【００２３】
さらに、前記ハイブリドーマ株によって生産されたモノクローナル抗体は、ＡＤ５−１０と名づけられている。このような抗体は、ＴＲＡＩＬと同様に、ＤＲ５と結合することができるが、ＴＲＡＩＬが結合する位置と異なる位置に結合する。
【００２４】
前記ハイブリドーマ株は、体外（in vitro）において強い殺腫瘍活性を有するモノクローナル抗体ＡＤ５−１０を生産することができる。前記モノクローナル抗体ＡＤ５−１０は、ＴＲＡＩＬおよび他の化学療法薬と相乗効果を発揮して、ヌードマウス内に移植されたヒト腫瘍の成長および形成を阻害するだけでなく、腫瘍細胞を殺すことができる。
前記ハイブリドーマ株によって生産された前記モノクローナル抗体ＡＤ５−１０は、カスパーゼ（caspase）依存アポトーシスシグナル伝達およびカスパーゼ非依存アポトーシスシグナル伝達の双方を誘発し、適切な細胞系統においてＴＲＡＩＬが引き起こすシグナル伝達経路と異なるシグナル伝達経路を引き起こす。
【００２５】
本発明はさらに、癌および／またはＡＩＤＳ治療薬の生産にマウスモノクローナル抗体ＡＤ５−１０のＩｇＧを使用することを提供する。また、癌および／またはＡＩＤＳ治療の組み換え単一抗体治療薬の生産に、マウスモノクローナル抗体ＡＤ５−１０及び、そのＦａｂ，Ｆ（ａｂ’）2、または、マウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列と８０％同一の配列とＦｃとの組み合わせを使用することを提供する。
【００２６】
さらに、本発明は、癌および／またはＡＩＤＳ治療薬の生産における、マウス−ヒトキメラ抗体の形成に、マウスモノクローナル抗体およびそのＦａｂ，Ｆ（ａｂ’）2、または、マウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列と８０％同一の配列と、ヒトＩｇＧのＦｃとの組み合わせを使用することを提供する。
【００２７】
また、本発明は、再形成されたモノクローナル抗体の生産において、完全なマウスモノクローナル抗体またはマウスモノクローナル抗体とアミノ酸配列が８０％同一の配列を使用することを提供する。
【００２８】
最後に、本発明によれば、癌および／またはＡＩＤＳ治療の遺伝子治療薬の生産において、薬学的に適用可能なベクターと組み合わせて、前記マウスモノクローナル抗体のＦａｂ，Ｆ（ａｂ’）2、およびアミノ酸配列が前記Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）2と８０％同一の配列を使用することができる。
【００２９】
上記のように、本発明は、現代バイオテクノロジー、および遺伝子工学プロセスなどに応用され、ＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ５細胞外領域の組み換え水溶性タンパク質を生産する方法を提供する。よって抗ＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ５モノクローナル抗体、すなわちＡＤ５−１０を得るために、組み換えタンパク質が抗原として用いられ、ハイブリドーマ技術によりＢＡＬＢ／ｃ系統マウスが免疫される。前記モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列がｃＤＮＡクローニングによって得られ、前記モノクローナル抗体はサブタイプがＩｇＧ３κの抗ＤＲ５モノクローナル抗体であり、新規でかつ未発表であることが確認された。前記モノクローナル抗体は、体外（in vitro）において各種腫瘍細胞系統のアポトーシス活性を強く誘発し、ヌードマウスにおいてヒト腫瘍の形成と成長を顕著に阻害する。前記モノクローナル抗体はＴＲＡＩＬとの相乗効果により、腫瘍細胞を殺す効果を促進することが初めて示された。前記モノクローナル抗体はまた、体内（in vivo）および体外（in vitro）双方において腫瘍細胞を殺すために、他の化学療法薬と共に併用することができ、治療効果を高め、化学療法薬の服用量および毒性を減らすことができる。従って、前記モノクローナル抗体は新しい抗癌薬及び／または抗ＡＩＤＳ薬の開発に重要である。
【００３０】
すなわち、本発明は、ヒトＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ５に対するモノクローナル抗体、ＡＤ５−１０に関し、前記モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の可変領域は、配列表に示されるアミノ酸配列を有する。
【００３１】
また、本発明は、抗ヒトＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ５モノクローナル抗体、すなわちＡＤ５−１０を生産する方法を提供するもので、主に以下に示される工程を有する；
ヒトＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ５細胞外領域をコード化するｃＤＮＡが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅され、ヒトＤＲ５の全ｃＤＮＡが鋳型とされる工程、
前記ｃＤＮＡは原核生物発現ベクターに挿入され、ＤＲ５細胞外領域を発現する発現プラスミドが形成される工程、
ＤＲ５細胞外領域を発現する組み換え細菌株が、組み換えられた発現プラスミドによって形質転換された大腸菌によって確立される工程、
ＤＲ５細胞外領域を発現する前記組み換え細菌株が培養され、誘発され、分離され、そして精製された後、ＤＲ５細胞外領域の組み換えペプチドが前記細菌から得られる工程、
ＤＲ５細胞外領域組み換えタンパク質によってマウスを免疫し、さらにそのマウスの脾臓細胞がＳＰ２／Ｏ骨髄腫細胞と融合されてスクリーニングされた後、ヒトＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ５に対する、モノクローナル抗体（ＡＤ５−１０と称す）を生産するハイブリドーマ株が得られる工程、
本発明の方法によって得られたハイブリドーマ株は、2004年7月16日、中国微生物培養所蔵センターに、分類名  ＢＡＬＢ／ｃマウスハイブリドーマ、寄託番号  ＣＧＭＣＣ１１９２で寄託されている。
【００３２】
本発明はまた、癌および／またはＡＩＤＳ治療薬の生産におけるモノクローナル抗体の用途に関する。前記モノクローナル抗体およびその組み換え誘導体は、各種癌および／またはＡＩＤＳ治療薬の開発に使用できる可能性を有する。
【００３３】
すなわち、本発明は、ヒトＤＲ５の全ｃＤＮＡを鋳型としてＤＲ５細胞外領域を発現する発現プラスミドを構築するために、ヒトＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ５の細胞外領域をコード化するｃＤＮＡを増幅し、ｃＤＮＡを原生生物ベクターに複製することである。前記発現プラスミドは、大腸菌を形質転換してＤＲ５細胞外領域を発現する組み換え細菌を確立する。ＤＲ５細胞外領域の遺伝子組み換えタンパク質は、ＤＲ５細胞外領域を発現する前記組み換え細菌系統が培養され、誘発され、分離され、そして精製された後、前記細菌から得られる。マウスを、前記組み換えタンパク質によって免疫し、前記マウスの脾臓細胞がＳＰ２／Ｏ骨髄腫細胞と融合されて、抗ヒトＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ５モノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞を確立する。前記モノクローナル抗体はＡＤ５−１０と命名されている。本発明で用いられる原生生物ベクターはｐＥＴ１５−ｂであり、大腸菌株はＢＬ２１（ＤＥ３）である。
【００３４】
本発明のＤＲ５に対するモノクローナル抗体のＩｇＧサブタイプは、ＩｇＧ３κであり、前記ＩｇＧ３κは、ＤＲ５と特異的に結合し、またＴＲＡＩＬと同時にＤＲ５に結合し、肝臓癌あるいは肺癌などの腫瘍細胞を殺す機能を誘発し強化する。ＤＲ５に対するモノクローナル抗体はＴＲＡＩＬとの相乗効果により腫瘍細胞に対する殺腫瘍活性を高め、ＤＲ５のアポトーシスシグナル伝達を促進することができることが示されている。
【００３５】
ＤＲ５に対するモノクローナル抗体は、投与量に依存するが、白血病細胞、肝臓および肺癌細胞を殺すことが、体外（in vitro）での研究によって示された。
【００３６】
ＤＲ５に対するモノクローナル抗体は、ヌードマウスを用いたヒト白血病、肝臓および肺癌細胞の研究によって、対照グループとの比較により、阻害率約８０％で、阻害期間がより長く、投与を中止した後に腫瘍細胞の大きさが回復しないことから、腫瘍の形成および成長を強く抑制することが、体内（in vivo）での研究によって示された。
【００３７】
毒性試験から、本発明のＤＲ５に対するモノクローナル抗体は、１５０ｍｇ／ｋｇの投与量をマウスの腹部に注射した後、マウスの顕著な死亡を引き起こすことがなく、また１ヶ月および２ヶ月の観察期間後、マウスの食欲、機能、皮膚および体毛などの異常も見られないことを示している。組織学的分析から、マウス内の肝臓などの臓器において病理変化が見られないことが示され、従って、本モノクローナル抗体は毒性および副作用がなく、安全で有効である。
【発明の効果】
【００３８】
本発明の長所および効果は、マウスをＤＲ５細胞外領域の組み換えタンパク質およびハイブリドーマ技術によって免疫することによって、前記未発表のＤＲ５に対するモノクローナル抗体が得られることである。前記モノクローナル抗体のサブタイプは、ＩｇＧ３κであり、重鎖および軽鎖のＣＤＲ領域に新規なアミノ酸配列を有する。前記モノクローナル抗体は体外（in vitro）において、ヒト原発性正常リンパ球に毒性を与えることなく、各種腫瘍細胞にアポトーシスを誘発することができ、また、体内（in vivo）で動物の臓器に毒性および副作用を与えることなく、ヒトの肝臓癌、肺癌および白血病細胞の形成及び成長の抑制に顕著な活性を示す。さらに、前記モノクローナル抗体は安全で効果的な、新規の抗腫瘍薬、および抗ＡＩＤＳ薬として開発される可能性があることを示している。
【００３９】
他の国内および外国において特許化された同様の生産物と比較して、サブタイプがＩｇＧ３κであり、ＴＲＡＩＬと非競合的にＤＲ５と結合し、ＴＲＡＩＬと共に相乗的に殺腫瘍活性を高める、前記モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の新規アミノ酸配列は、まだ報告されておらず、当業者にとって容易ではない。
発明の詳細な説明
【実施例１】
【００４０】
２つのプライマー（Ｐ５およびＰ３）が従来技術に従って合成された。ヒトＤＲ５全長含有ｃＤＮＡが鋳型とされてＰＣＲが行われ、ＤＲ５細胞外領域の遺伝子画分が増幅される。得られた遺伝子断片は、Ｎｃｏ  ＩおよびＢａｍＨ  Ｉエンドヌクレアーゼの切断により、原核細胞発現ベクターｐＥＴ  １５ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）に連結され、大腸菌ＢＬ２１を形質転換させる。同定された陽性株が、０．１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）中、３７℃の条件下で、４時間処理されて、発現が誘発され、発現物が得られた。前記発現物は、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によって精製されて、組み換えＤＲ５細胞外領域水溶性タンパク質、すなわち免疫薬剤としてのタンパク質が得られる。
Ｐ５：ＧＧＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＡＧＴＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴＣＡＣＣ  Ｎｃｏ切断部を含む
Ｐ３：ＧＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＡＴＧＣＣＴＧＡＧＡＧＡＧＡＡＣＡ  ＢａｍＨ  Ｉ切断部を含む
【００４１】
生後４−６週のメスＢＡＬＢ／ｃ系統マウス（国立薬品および生物品管理所、北京）が、ＤＲ５細胞外領域タンパク質８０ｇを２週間間隔で、４回腹部皮下注射により免疫された。抗体を有する前記マウスは、血液検査の後、前記タンパク質を静脈注射によって再度免疫された。最終投与から３日後、前記マウスは死亡し、マウスの脾臓から得られたリンパ球がＳＰ２／Ｏ骨髄腫細胞に融合され（ＰＥＧ法）、融合細胞がＨＡＴ培地中で選別され、さらに陽性クローンが、細胞培地の上澄み液中において、抗体力価に基づくＥＬＩＳＡ法を用いて選別された。結果を図６に示す。
【００４２】
陽性クローンの培養された上澄みは、Ｊｕｒｋａｔ細胞に効果を示し、腫瘍を殺すための抗体を生産することのできる細胞株が選別された。
【実施例２】
【００４３】
ＡＤ５−１０とその抗原の特異的結合が、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）を用いて測定された。ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ、ＵＳＡ）が、大腸菌中で発現された組み換えヒトＤＲ４またはＤＲ５細胞外領域タンパク質で一晩被覆され、室温で２時間、５％脂肪乳中で阻害され、異なる濃度の前記ＡＤ５−１０を加えて、３７℃４時間保持し、ウサギＨＲＰ−結合抗マウスＩｇＧ複合体（北京中山会社）を加え、３７℃１時間保持した。ｏ−フェニレンジアミンを含有した発色試薬（ｏ−フェニレンジアミン０．４ｍｇ／ｍｌ、過酸化水素０．０４５％、リン酸水素２ナトリウム０．７３％、クエン酸０．４７％）を1：５０００に希釈した溶液で発色させ、２Ｍ硫酸を加え３０分間保持して反応を止めた。酵素標識体マイクロタイター測定器、Ｗｅｌｌｓｃａｎ  ＭＫ３（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、フィンランド）によって、波長４９２ｎｍの吸収が測定された。
【実施例３】
【００４４】
ＭＴＳ分析を用いて、体外（in vitro）においてＡＤ５−１０で処理された腫瘍細胞の生存率、及びＡＤ５−１０が抹消血液中のヒト正常リンパ球に与える影響について調べられた。対数増殖期間における腫瘍細胞、または新たに抹消血液から分離された正常リンパ球が、９６穴プレート中で培養され、さらに、濃度の異なるＡＤ５−１０（１ｎｇ／ｍｌ〜２０００ｎｇ／ｍｌ）、水溶性の組み換えＴＲＡＩＬ（１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ）、および８−クロロアデノシン（８−Ｃｌ−Ａｄｏ  ６ｍｇ／ｍｌ）、アクチノマイシンＤ（ａｃｔ  Ｄ  ０．５ｍｇ／ｍｌ）などの化学療法薬中で培養された。処理後、ＭＴＳ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を加え２〜４時間反応した後、全自動複数穴分光光度計、Ｗｅｌｌｓｃａｎ  ＭＫ３（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、フィンランド）を用いて、波長４９２ｎｍにおける各穴の吸光度（ＯＤ値）が測定された。細胞が全く存在していない穴のＯＤ値は０と考えられる。また細胞の生存率は、対照穴のＯＤ値に対する処理された穴のＯＤ値の比に等しい。対応する結果を図２に示す。
【実施例４】
【００４５】
Ｊｕｒｋａｔ細胞のアポトーシスを誘発するＡＤ５−１０の試験が行われた。１０6個の対数増殖期間中のＪｕｒｋａｔ細胞が、濃度１００ｎｇ／ｍｌのＡＤ５−１０によって１時間処理された。同時に、処理されない細胞を対照細胞とした。処理細胞は遠心分離によって集められた。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した後、集められた細胞は、氷中で３０分間アネキシン−Ｖ／ＰＩ（宝賽会社、北京）により染色された。試料は、細胞のアポトーシスを調べるために、フロー血球計算器ＥｐｉｃｓＸＬ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＵＳＡ）により分析された。
【実施例５】
【００４６】
体内（in vivo）におけるＡＤ５−１０の殺腫瘍活性を分析するために、ＢＡＬＢ／ｃ系統ヌードマウスが、ＳＭＭＣ−７７２１細胞（マウス１匹当たり１０6個）を皮下注射された。注射２日後、早期治療グループ（ｎ＝１０）マウスが、腫瘍形成の阻害活性を調べるためにＡＤ５−１０を投与された。注射８日後、後期治療グループ（ｎ＝１０）マウスが、腫瘍形成の阻害活性を調べるために同様にＡＤ５−１０を投与された。投与量は、１５ｍｇ／ｋｇであり、合計３回投与された。陰性対照グループ（ｎ＝８）マウスは生理食塩水を投与された。陽性対照グループ（ｎ＝５）マウスはシクロホスファミド（ＣＴＸ、６０ｍｇ／ｋｇ）を投与された。上記のＡＤ５−１０の投与は、全て腹部注射により行なわれた。３週間後マウスは犠牲となり、腫瘍の重量から腫瘍成長が決定された。
【実施例６】
【００４７】
ウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）分析により、ＡＤ５−１０によって引き起こされる、カスパーゼ・カスケードおよびＰＡＲＰ（ポリＡＤＰ−リボースポリメラーゼ）開裂を調べた。対数増殖期間中のＪｕｒｋａｔ細胞が、濃度１００ｎｇ／ｍｌのＡＤ５−１０により、０，１５，３０，６０分間処理された後、集められた。集められた細胞は開裂溶液中で溶解され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥが行われた。ゲル中に分離されたタンパク質は引き続き二フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜上で電気泳動された。前記膜は標識された一次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＵＳＡ）と共にインキュベートされ、ＨＲＰ接合二次抗体（北京中山会社）とプローブ結合された。前記タンパク質は、ＥＣＬプラス−ウエスタンブロット分析装置システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｅｃｅｓ，ＵＳＡ）によって可視化された。
【実施例７】
【００４８】
ＡＤ５−１０をコードしたｃＤＮＡのクローニングが行われた。全ＲＮＡがＴＲＩｚｏｌ法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）により、ＡＤ５−１０ハイブリドーマ株から抽出された。鋳型とプライマーは、ＩｇＧの定常領域またはシグナル・ペプチド領域を相補し、ＡＤ５−１０をコードするｃＤＮＡはＲＴ−ＰＣＲによって増幅された。生産物は、ｐＭＤ１８−Ｔベクター（宝生物会社、大連）に挿入された。ＡＤ５−１０のｃＤＮＡ配列が全自動ＤＮＡシーケンサー（博並会社、上海）によって決定された。アミノ酸配列が前記ｃＤＮＡヌクレオチド配列から推定された。
【００４９】
以下に示すプライマーがｃＤＮＡクローニングに用いられた。プライマーの中には、Ｋ＝Ｇ／Ｔ，Ｍ＝Ａ／Ｃ，Ｒ＝Ａ／Ｇ，Ｓ＝Ｃ／Ｇ，Ｗ＝Ａ／Ｔ，Ｙ＝Ｃ／Ｔなどの変質プライマーも含まれる。
ＰＬＳＵ1：ＡＴＧ  ＧＡＧ  ＡＣＡ  ＧＡＣ  ＡＣＡ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＣＴＡ  Ｔ
ＰＬＳＵ2：ＡＴＧ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＣＡＡ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＡＴＴ  ＴＴＣ  ＡＧ
ＰＬＳＵ3：ＡＴＧ  ＧＡＧ  ＷＣＡ  ＣＡＫ  ＷＣＴ  ＣＡＧ  ＧＴＣ  ＴＴＴ  ＲＴＡ
ＰＬＳＵ4：ＡＴＧ  ＫＣＣ  ＣＣＷ  ＲＣＴ  ＣＡＧ  ＹＴＹ  ＣＴＫ  ＧＴ
ＰＬＳＵ5：ＡＴＧ  ＡＡＣ  ＴＴＧ  ＣＣＴ  ＧＴＴ  ＡＧＧ  ＣＴＧ  ＴＴＧ
ＰＬＳＵ6：ＡＴＧ  ＡＴＧ  ＡＧＴ  ＣＣＴ  ＧＣＣ  ＣＡＧ  ＴＴＣ  ＣＴＧ
ＰＨＳＵ1：ＡＴＧ  ＧＲＡ  ＴＧＳ  ＡＧＣ  ＴＧＫ  ＧＴＭ  ＡＴＳ  ＣＴＣ  ＴＴ
ＰＨＳＵ2：ＡＴＧ  ＲＡＣ  ＴＴＣ  ＧＧＧ  ＹＴＣ  ＡＧＣ  ＴＫＧ  ＲＴＴ  ＴＴ
ＰＨＳＵ3：ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＴＴＧ  ＧＧＧ  ＣＴＧ  ＣＴＣ  ＴＴＣ  Ｔ
ＰＨＳＵ4：ＡＴＧ  ＧＲＡ  ＴＧＧ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＧＴＧ  ＴＴＴ  ＭＴＳ  ＴＴ
ＰＨＳＵ5：ＴＧＡ  ＧＣＧ  ＴＳＡ  ＣＣＧ  ＣＣＧ  ＧＣＧ  ＴＧＣ  Ｔ
ＰＨＳＵ10：ＴＴＧ  ＣＴＡ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＡＴＧ  ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＧＣ
ＰＬＣＤ：ＴＴＡ  ＡＣＡ  ＣＴＣ  ＡＴＴ  ＣＣＴ  ＧＴＴ  ＧＡ
ＰＨＣＤ：ＴＴＴ  ＡＣＣ  ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＧＣＧ  ＧＧＡ  ＧＡＧ
ＰＨＣＤ3：ＴＴＴ  ＡＣＣ  ＡＧＧ  ＧＧＡ  ＧＣＧ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＧＴＴ
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ヒトＤＲ５抗原に対するＡＤ５−１０の結合を示している。図Ａは、ＡＤ５−１０がＤＲ５の細胞外領域に、単一箇所への典型的な結合形式で結合していることを示している。ここでＫｄ＝０．３ｎＭ（グラフパッドソフトウエアによる分析）である。図Ｂは、ＡＤ５−１０は、他の死受容体ＤＲ4と交差反応しないことを示している。
【図２】体外（in vitro）におけるＡＤ５−１０の殺腫瘍活性を示している。細胞の生存率はＭＴＳキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）により決定された。図Ａは、ヒトＴリンパ球白血病細胞Ｊｕｒｋａｔが、ＡＤ５−１０によって、示された濃度で８時間処理されたときの生存率を示している。図Ｂは、ヒト肝細胞癌化細胞ＳＭＭＣ−７７２１が、ＡＤ５−１０によって、示された濃度で２４時間処理されたときの生存率を示している。図Ｃは、ヒト乳腺癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１が、ＡＤ５−１０によって、示された濃度で２４時間処理されたときの生存率を示している。図Ｄは、ヒト神経膠腫細胞Ｕ２５１が、ＡＤ５−１０によって、示された濃度で２４時間処理されたときの生存率を示している。図Ｅは、１００ｎｇ／ｍｌの濃度で１時間ＡＤ５−１０によって処理され、アネキシン−ＶおよびＰＩで二重染色されたＪｕｒｋａｔ細胞のフローサイトメトリーを示している。
【図３】ＡＤ５−１０が、ヌードマウスに移植されたヒト腫瘍細胞の形成と成長を阻害することを示している。図Ａは、ＡＤ５−１０がヌードマウス内の肝臓癌細胞ＳＭＭＣ−７７２１の腫瘍形成を阻害することを示しており（ＣＴＸはシクロホスファミドである）、図Ｂは、ＡＤ５−１０がヌードマウス内の肝臓癌細胞ＳＭＭＣ−７７２１の腫瘍成長を阻害することを示している。
【図４】ＡＤ５−１０がＪｕｒｋａｔ細胞中において、カスパーゼ・カスケードおよびＰＡＲＰ（ポリＡＤＰ−リボースポリメラーゼ）開裂を活性化することを示している。
【図５】ヒト原発性正常リンパ球を体外（in vitro）において、ＡＤ５−１０、水溶性の組み換えＴＲＡＩＬ、および化学療法薬によって２４時間処理したときの、ＡＤ５−１０のヒト原発性正常リンパ球に対する影響を示している。細胞生存率は、ＭＴＳキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）によって決定された。
【図６】ヒトＤＲ５細胞外領域タンパク質の、誘発発現、分離、精製結果を示している。  図Ａにおいて、第１列は、空のｐＥＴ１５−ｂプラスミドを有する、ＢＬ２１（ＤＥ３）を含有している非誘発細菌の全タンパク質を示している。第２列は、空のｐＥＴ１５−ｂプラスミドを有する、ＢＬ２１（ＤＥ３）を含有しているＩＰＴＧによって誘発された細菌の全タンパク質を示している。第３列は、ｐＥＴ１５−ｂ／ＤＲ５プラスミドを有する、ＢＬ２１（ＤＥ３）を含有している非誘発細菌の全タンパク質を示している。第４列は、ｐＥＴ１５−ｂ／ＤＲ５プラスミドを有する、ＢＬ２１（ＤＥ３）を含有しているＩＰＴＧによって誘発された細菌の全タンパク質を示している。第５列は、順に、９４０００、６７０００、４３０００、３００００、２０１００、１４４００ｋＤの低分子量を有する基準タンパク質を示している。  図Ｂは、遺伝子組み換え細菌によって発現され、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によって、分離精製された生成物質であり、全列は、溶離液中において全成分は、０．２５−０．３５ＭのＮａＣｌ濃度であることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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