(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）グルコラフェニンを含有する十字花植物種子の水性抽出物を調製する工程、
（ｉｉ）水性抽出物を吸着剤と接触させる工程、
（ｉｉｉ）水性抽出物から吸着剤を除去してグルコラフェニンを含有するグルコシノレート含有抽出物を得る工程、
（ｉｖ）グルコシノレート含有抽出物を乾燥して、乾燥されたグルコシノレート含有抽出物を得る工程、
（ｖ）少なくとも一部の乾燥されたグルコシノレート含有抽出物を溶媒と混合して、グルコシノレート含有懸濁液を形成する工程、
（ｖｉ）任意選択的に、不溶物質を除去して、清澄化されたグルコシノレート含有懸濁液を形成する工程、
（ｖｉｉ）工程（ｖ）または（ｖｉ）のいずれかからのグルコシノレート含有懸濁液を触媒と接触させる工程、
（ｖｉｉｉ）グルコラファニンを含有する化学的予防剤前駆体が富化された抽出物を得るのに十分な時間にわたって、温度２５℃から４５０℃、圧力１０から１００００ｐｓｉで水素を導入する工程、
を特徴とする、グルコラフェニンを含有する十字花植物種子の調製物におけるグルコラファニンを含有する化学的予防剤前駆体を富化する方法。
【請求項２】
工程（ｖｉｉｉ）の化学的予防剤前駆体が富化された抽出物をろ過することにより、清澄化された化学的予防剤前駆体が富化された抽出物を形成する工程を更に含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
化学的予防剤前駆体が富化された抽出物を得るのに十分な時間にわたって、温度２５から１００℃、圧力１０から１００ｐｓｉで水素を導入することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
清澄化された化学的予防剤前駆体が富化された抽出物を乾燥して、乾燥された化学的予防剤前駆体が富化された抽出物を形成する工程を更に含むことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
化学的予防剤前駆体が富化された抽出物は、グルコラファニン対グルコラフェニンの割合が少なくとも１対１であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
グルコシノレート含有懸濁液を、１から２５重量％の量の触媒と接触させることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
触媒は、白金、パラジウム、ニッケル、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
十字花植物種子の水性抽出物を、十字花植物種子を、温度９０℃から１１０℃の水と、少なくとも１０分間にわたって接触させることにより形成することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
十字花植物種子は、ダイコン種子であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
吸着剤は、活性炭、シリカ、各種化学修飾シリカ、漂白用粘土、およびそれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
吸着剤は、活性炭であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
１から２０％の吸着剤を前記水性抽出物と混合することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
溶媒は、エタノールであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
水素を１から２４時間にわたって導入することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｖｉｉｉ）の化学的予防剤前駆体が富化された抽出物を、１から２５％の量の触媒と接触させ、化学的予防剤前駆体が富化された抽出物を得るのに十分な時間にわたって温度２５℃から４５０℃、圧力１０から１００００ｐｓｉで水素を導入する二次水素化ステップを更に含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
二次水素化ステップにおいて、化学的予防剤前駆体が富化された抽出物を得るのに十分な時間にわたって、温度２５から１００℃、圧力１０から１００ｐｓｉで水素を導入することを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
二次水素化ステップの化学的予防剤前駆体が富化された抽出物は、グルコラファニン対グルコラフェニンの割合が少なくとも５対１であることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
二次水素化ステップの化学的予防剤前駆体が富化された抽出物を、１から２５％の量の触媒と接触させ、化学的予防剤前駆体が富化された抽出物を得るのに十分な時間にわたって温度２５℃から４５０℃、圧力１０から１００００ｐｓｉで水素を導入する三次水素化ステップを更に含むことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
三次水素化ステップにおいて、化学的予防剤前駆体が富化された抽出物を得るのに十分な時間にわたって、温度２５から１００℃、圧力１０から１００ｐｓｉで水素を導入することを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
三次水素化ステップの化学的予防剤前駆体が富化された抽出物は、グルコラファニン対グルコラフェニンの割合が、少なくとも１００対１であることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
グルコラフェニンが、化学的予防剤前駆体が富化された抽出物中で、ＨＰＬＣにより検出できないことを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
（ｉ）グルコラフェニンを含有する十字花植物種子の水性抽出物を調製する工程、
（ｉｉ）水性抽出物を吸着剤と接触させる工程、
（ｉｉｉ）水性抽出物から吸着剤を除去してグルコラフェニンを含有するグルコシノレート含有抽出物を得る工程、
（ｉｖ）グルコシノレート含有抽出物を乾燥して、乾燥されたグルコシノレート含有抽出物を得る工程、
（ｖ）少なくとも一部の乾燥されたグルコシノレート含有抽出物を溶媒と混合して、グルコシノレート含有懸濁液を形成する工程、
（ｖｉ）任意選択的に、不溶物質を除去して、清澄化されたグルコシノレート含有懸濁液を形成する工程、
（ｖｉｉ）工程（ｖ）または（ｖｉ）のいずれかからのグルコシノレート含有懸濁液を、触媒と接触させる工程、
（ｖｉｉｉ）グルコラファニンを含有する化学的予防剤前駆体が富化された抽出物を得るのに十分な時間にわたって、温度２５℃から４５０℃、圧力１０から１００００ｐｓｉで水素を導入する工程、
を含む方法により形成されることを特徴とする、グルコラファニンを含有する化学的予防剤前駆体が富化された抽出物。
【請求項２３】
工程（ｖｉｉｉ）の化学的予防剤前駆体が富化された抽出物をろ過して、清澄化された化学的予防剤前駆体が富化された抽出物を形成する工程を更に含むことを特徴とする、請求項２２に記載の化学的予防剤前駆体が富化された抽出物。
【請求項２４】
化学的予防剤前駆体が富化された抽出物を得るのに十分な時間にわたって、温度２５から１００℃、圧力１０から１００ｐｓｉで水素を導入することを特徴とする、請求項２２に記載の化学的予防剤前駆体が富化された抽出物。
【請求項２５】
化学的予防剤前駆体が富化された抽出物は、グルコラファニン対グルコラフェニンの割合が、少なくとも１対１であることを特徴とする、請求項２２に記載の化学的予防剤前駆体が富化された抽出物。
【請求項２６】
十字花植物種子は、ダイコン種子であることを特徴とする、請求項２２に記載の化学的予防剤前駆体が富化された抽出物。
【請求項２７】
前記方法が、化学的予防剤前駆体が富化された抽出物を１から２５％の量の触媒と接触させ、化学的予防剤前駆体が富化された抽出物を得るのに十分な時間にわたって、温度２５℃から４５０℃、圧力１０から１００００ｐｓｉで水素を導入する二次水素化ステップを更に含むことを特徴とする、請求項２２に記載の化学的予防剤前駆体が富化された抽出物。
【請求項２８】
二次水素化ステップにおいて、化学的予防剤前駆体が富化された抽出物を得るのに十分な時間にわたって、温度２５から１００℃、圧力１０から１００ｐｓｉで水素を導入することを特徴とする、請求項２７に記載の化学的予防剤前駆体が富化された抽出物。
【請求項２９】
二次水素化ステップの化学的予防剤前駆体が富化された抽出物は、グルコラファニン対グルコラフェニンの割合が、少なくとも５対１であることを特徴とする、請求項２７に記載の化学的予防剤前駆体が富化された抽出物。
【請求項３０】
前記方法が、二次水素化ステップの化学的予防剤前駆体が富化された抽出物を、１から２５％の量の触媒と接触させ、化学的予防剤前駆体が富化された抽出物を得るのに十分な時間にわたって、温度２５℃から４５０℃、圧力１０から１００００ｐｓｉで水素を導入する三次水素化ステップを更に含むことを特徴とする、請求項２７に記載の化学的予防剤前駆体が富化された抽出物。
【請求項３１】
三次水素化ステップにおいて、化学的予防剤前駆体が富化された抽出物を得るのに十分な時間にわたって、温度２５から１００℃、圧力１０から１００ｐｓｉで水素を導入することを特徴とする、請求項３０に記載の化学的予防剤前駆体が富化された抽出物。
【請求項３２】
三次水素化ステップの化学的予防剤前駆体が富化された抽出物のグルコラファニン対グルコラフェニンの割合が、少なくとも１００対１であることを特徴とする、請求項３０に記載の化学的予防剤前駆体が富化された抽出物。
【請求項３３】
グルコラフェニンが、化学的予防剤前駆体が富化された抽出物中で、ＨＰＬＣにより検出できないことを特徴とする、請求項３０に記載の化学的予防剤前駆体が富化された抽出物。
【請求項３４】
請求項２２に記載の化学的予防剤前駆体が富化された抽出物の有効量を含むことを特徴とする食料品。
【請求項３５】
十字花植物種子はダイコン種子であることを特徴とする、請求項３４に記載の食料品。
【請求項３６】
請求項２２に記載の化学的予防剤前駆体が富化された抽出物の有効量を含むことを特徴とする医薬品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学防御前駆体化合物、ならびに各種食料品、医薬品、および健康補助食品に組み入れることができる化学防御前駆体化合物を富化した十字花植物種子の抽出物を製造する方法に関する。より詳細には、ダイコン種子抽出物中のグルコラフェニンに対するグルコラファニンの割合が増加した抽出物を供給するのに有効な水素化法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
食餌療法は癌発生のリスクを抑制する上で大きな役割を果たし、果実および野菜の摂取を増加することにより、ヒトにおける癌発生率を減少することができることは、一般に認められている。植物中の特定の微量な化学成分が存在することにより、哺乳動物細胞に供給すると、主要な保護機構をもたらすことができる。更に、植物から抽出された抗癌化学成分で強化するかまたは補充した、医薬品、栄養補給剤、または食料品を提供することにより、付加的な健康上の利点をもたらすことができる。米国食品産業の重要な傾向として、健康志向の食料品を推進している。
【０００３】
十字花科野菜は、哺乳動物細胞に供給された場合に発癌性物質の解毒機構を誘導すると思われる強力な化学的予防剤の植物化学物質前駆体、特に（スルフォラファングルコシノレートまたは４−メチルスルフィニルブチルグルコシノレートとしても知られている）グルコラファニン、およびその関連変換産物スルフォラファンを含有する。グルコシノレートは、双子葉類の（dicotyledenous）植物中に、最も一般的にはアブラナ科（十字花科）に見出される。グルコシノレートは、一般構造：
【０００４】
【化１】
0005390085.tif 000002
【０００５】
の硫黄含有化合物である。グルコシノレートには、アミノ酸由来のＲ基、およびスルホン化オキシムの炭素に対するチオグルコシド結合が含まれている。グルコシノレートのチオグルコシド結合は、β−チオグルコシダーゼで加水分解されて不安定なグルコシノレートアグリコンとなり、それが自発転位を受けてスルフォラファンなどの化学的予防剤イソチオシアネート、およびニトリル、チオシアネートなどの他の化合物となる。
【０００６】
特定の癌リスクを減少することに加え、グルコラファニンは、生理活性の変換産物スルフォラファンを介し、胃潰瘍の大部分を引き起こす原因である微生物を破壊するのに有効であることが最近示されており、循環器および眼の疾患を発症するリスクを減少する新規な手法を提供することもできる。これらの作用物質の天然含量が高い食料品、または十字花植物の化学的予防剤を添加含有した食品にラベル表示をする承認を得る努力がなされている。化学的予防剤の添加剤を含有する製品は、このようなラベル表示を付けていないが、すでに市場に出ている。
【０００７】
十字花科野菜は、良好な健康状態を維持するのに問題となり得るインドールグルコシノレート（例えば、４−ヒドロキシグルコブラシカン）など他の化合物も含有している。これらの化合物は、発癌性物質の解毒系の弱い誘導物質であるだけでなく、特定の前発癌性物質を生物活性化しうる系を誘導する可能性もある。従って、インドールグルコシノレートまたは他の有害化合物ができるだけ残留していないグルコラファニン含有調製物を製造することは有利である。
【０００８】
グルコシノレート、特にグルコラファニンの製造は、高コストのため問題がある。本発明までは、グルコラファニンの最適な製造源は、高価なブロッコリーの特定品種であった。グルコシノレートの相当な保健上の可能性は、グルコラファニンを調達する高コストのため、実現されていない。従って、グルコシノレート、特にグルコラファニンを高収率で製造する代替法を得る必要がある。
【０００９】
【非特許文献１】Talalay, P.ら、J. Nutr.、131 (11 Supp.): 30275〜30335 (2001)
【非特許文献２】Barillari, J.ら、J. Agric. Food Chem.、53: 9890〜9896 (2005)
【非特許文献３】West, L.、J. Agric. Food Chem.、52: 916〜926 (2004)
【非特許文献４】Westら、J. Chromatography A、966: 227〜232 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
技術的にも簡易であり、製造コストの観点からも魅力的である本発明の方法は、かかる改善を提供する。実際、本発明の方法は、比較的安価なダイコン種子由来の化学的予防剤前駆体の化合物、特にグルコラファニンを富化した抽出物の調製を可能にすると同時に、実質的に、より高価なブロッコリー品種から調製される抽出物の健康上の利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、化学的予防剤前駆体の組成物を富化した十字花植物種子の抽出物、特にダイコン種子抽出物、およびそれらの調製方法を対象としている。本発明の方法を使用する、十字花植物種子、好ましくはダイコン種子由来の水性抽出物の処理により、グルコラファニンなど特定の化学的予防剤前駆体の化合物（アルキルグルコシノレート）の量が実質的に増加する。該方法は、ダイコン種子中に発見される化合物であるグルコラフェニンをグルコラファニンに変換することにより、化学的予防剤前駆体を富化した十字花植物種子の抽出物を提供する。グルコラフェニンは、グルコラファニンと同様の化学構造を有しているが、同様の健康増進活性を有しているとは考えられていない。グルコラファニンおよびグルコラフェニンの構造を下記に示す。
【００１２】
【化２】
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【００１３】
本発明の方法により、グルコラフェニンは、（必要であれば追加の水素化ステップを使用してもよいが、通常、１つ、２つ、または３つの水素化ステップを含む）水素化反応を介してグルコラファニンへ変換される。通常、本発明の方法により製造された十字花植物種子の抽出物は、グルコラファニン対グルコラフェニンの割合が、少なくとも約１：１、好ましくは少なくとも約５：１、更により好ましくは少なくとも約１００：１であり、グルコラフェニンがもはやＨＰＬＣにより検出できないことが最も好ましい。得られる抽出物は、乾燥してもよいし、あるいは添加物として、種々の食料品、健康補助食品、または医薬品組成物に直接使用してもよい。
【００１４】
ダイコン種子などの十字花植物種子由来の化学的予防剤前駆体を富化する方法を提供する。十字花植物野菜からの種子は、化学的予防剤前駆体の植物化学物質の良好な供給源として特定されている。十字花植物科に属する特に有用なものとして、ブロッコリー、ケール、コラード、ケールキャベツ、マローステムケール、サウザンドヘッドケール、チャイニーズケール、カリフラワー、ポルトガルケール、メキャベツ、コールラビ、ジャージーケール、サボイキャベツ、コラード類、ボーレコール、ダイコンなど、およびその混合物が挙げられる。好ましい態様では、ダイコン種子を使用する。通常、カイワレ大根は、種子が発芽する際、グルコラフェニンが化学的予防剤前駆体ではない４−メチルチオ−３−ブテニルグルコシノレートに変換されるので、化学的予防剤前駆体の有用な供給源ではない。
【００１５】
通常、該方法には、十字花植物種子の水性抽出物の調製が含まれる。任意選択により、水性抽出物を細胞性物質から分離してもよい。水性抽出物は、良好な健康状態に問題である特定の化合物、すなわち特定のインドールグルコシノレート、ならびに望ましくない香味、匂い、および色を除去するための吸着剤と接触させる。使用してもよい吸着剤として、活性炭、シリカ、種々の化学修飾シリカ（Ｃ１８シリカなど）、および漂白用粘土など、ならびにそれらの混合物が挙げられる。吸着剤は、活性炭が好ましい。通常、種子材料の乾燥重量に対し、吸着剤約１から約２０重量％を水性抽出物と混合する。好ましい態様では、種子材料の乾燥重量に対し、吸着剤約８から約１２重量％を水性抽出物と混合する。別の態様では、水性抽出物を、吸着剤を含むカラムに通過させてもよい。
【００１６】
従来の技術（例えば、ろ過、デカント、遠心分離など）を使用して、水性抽出物を吸着剤から分離して、グルコシノレート含有抽出物を得る。次に、グルコシノレート含有抽出物を乾燥して、乾燥されたグルコシノレート含有抽出物を形成する。次に、乾燥されたグルコシノレート含有抽出物を溶媒中に懸濁させて、グルコシノレート含有懸濁液を形成する。
【００１７】
所望であれば、該懸濁液を水素化前に清澄化してもよい。低圧または高圧水素化法を使用して、グルコラフェニンをグルコラファニンに変換することができる。触媒をグルコシノレート含有懸濁液に添加し、水素化反応を、得られる生成物中のグルコラファニン対グルコラフェニンの所望の割合に応じて、（必要であれば、追加の水素化ステップを使用してもよいが）通常、１つ、２つ、または３つのステップの水素化反応で行う。適当な触媒として、パラジウム、白金、ニッケル、それらの任意の誘導体などが挙げられる。通常、水素化は温度約２５℃から約４５０℃で行い、水素は圧力約５０から約１００００ｐｓｉで導入される。各水素化反応の間に反応生成物をろ過して使用済み触媒を除去し、追加触媒を各反応前に添加する。通常、該方法は、グルコラファニン対グルコラフェニンの割合が約１：１、好ましくは約５：１、更により好ましくは少なくとも約１００：１、最も好ましくはグルコラフェニンがＨＰＬＣにより検出できない、化学的予防剤前駆体が富化された抽出物を得るのに有効である。
【００１８】
別の態様では、化学的予防剤前駆体が富化された十字花植物種子の抽出物を含む食料品および医薬品を提供する。化学的予防剤前駆体が富化された十字花植物種子の抽出物は、食料品に直接組み入れてもよいし、あるいは乾燥、冷却、冷凍、または凍結乾燥した後で食料品に組み入れてもよい。化学的予防剤前駆体が富化された抽出物を組み入れてもよい食料品として、食品サプリメント(food supplements)、飲料、ミルクセーキ、焼き菓子、茶、スープ、シリアル、丸薬、錠剤、サラダ、サンドイッチ、グラノーラ、サラダドレッシング、ソース、コーヒー、チーズ、ヨーグルト、エネルギーバーなど、およびそれらの混合物が挙げられる。サプリメント(supplements)には、栄養補助食品(dietary supplements)、栄養補給剤(nutritional supplements)、ハーブ系サプリメント(herbal supplements)などが挙げられる。本態様では、食料品１サービング当り約１から約１００ｍｇなど、有効量の化学的予防剤前駆体が富化された抽出物を、食料品に含むことができる。投与一回分当り約１０から約５０ｍｇなど、有効量の化学的予防剤前駆体が富化された抽出物を、医薬品組成物に組み入れることもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の方法は、十字花植物種子の抽出物中での化学的予防剤前駆体の費用効率の高い富化を提供する。より詳細には、本発明は、十字花植物種子、特にダイコン種子中に存在する化合物のグルコラフェニンを、化学的予防剤前駆体グルコラファニンに変換する方法を提供する。
【００２０】
本明細書で使用する場合、「化学的予防剤」および「化学的予防性化合物」は、発癌性物質の有毒作用、および腫瘍作用に対する哺乳動物の感受性を減少させるのに有効な植物起源の作用物質を示す。化学的予防剤の「前駆体」は、酵素的および／または化学的手段により、化学的予防剤を生じる作用物質を示す（非特許文献１参照）。こうした化学的予防剤前駆体の例として、グルコラファニンなどのアルキルグルコシノレートが挙げられる。
【００２１】
主反応を、図１に例示する。本発明の方法は、水素化反応を介し、グルコラフェニンをグルコラファニンに変換する。次にｉｎ  ｖｉｖｏで、グルコラファニンのチオグルコシド結合を腸微生物叢で加水分解して、不安定なグルコシノレートアグリコンとし、自発転位が行われてスルフォラファンなどのイソチオシアネート、ならびにニトリルおよびチオシアネートなど他の化合物となる。
【００２２】
本明細書で使用する場合、「水性抽出物」は、水１００％、またはエチルアルコールなどの有機溶剤の添加量２５％以下で調製した抽出物を意味する。
【００２３】
本明細書で使用する場合、「有効量」は、摂取により所望の効果または利益を提供する添加物の量である。通常、本発明の化学的予防剤が富化された抽出物は食料品１サービング当り約１から約１００ｍｇ、または医薬品組成物は投与一回分当り約１から約５０ｍｇである。
【００２４】
十字花植物種子、特にダイコン種子は、有用な出発原料である。通常、ダイコン種子は、他の十字花植物種子より多量のグルコラフェニンを含有する。自然では、ダイコン種子は、グルコラファニンよりも多量のグルコラフェニン（通常、グルコラファニン対グルコラフェニンの割合は約１：５０から約１：１５０の範囲）を含有する。自然では、ダイコン種子は、カイワレ大根より多量のグルコラフェニンを含有し、従って、本発明においては、ダイコン種子の方が有用である（非特許文献２参照）。その上、種子は、成長した植物より処理が容易で安価でもある。
【００２５】
癌の化学的予防剤の供給源として適当な種子は、一般に、アブラナ科由来の十字花科種子である。好ましくは、種子はダイコン種子である。請求項の範囲に記載されている方法で使用される特に有用なダイコンの品種は、チェリーベルおよびチャンピオンである。しかし、他の多くのダイコン品種も適している。
【００２６】
本発明の１つの実施形態を、図２に例示する。通常、本方法は、十字花植物種子を処理して水性抽出物を製造することにより行われる。処理される種子は、微粉砕し、脱脂された十字花植物種子であるのが好ましい。１つの態様では、十字花植物種子を、例えば参照により本明細書に組み込まれている非特許文献３に記載されているように、知られている脱脂法を使用し、水性抽出物を形成する前に脱脂してもよい（非特許文献３参照）。別の態様では、十字花植物種子を、水性溶媒の添加前またはその添加と同時に、すり砕くか、微粉砕するか、または混合してもよい。
【００２７】
水性抽出物は、当分野で知られている任意の方法により製造することができる。通常、十字花植物種子、好ましくはダイコン種子約１から約５部を、水性溶媒約５から約５０部と混合し、約９０℃から約１１０℃で、約５から約１５分間維持して、十字花植物種子の水性抽出物を形成する。水性溶媒は、水が好ましいが、該水性溶媒は、エチルアルコールなどの有機溶剤を含有する水性溶媒であってもよい。抽出後、種子材料残渣は、ろ過、遠心分離、デカントなどにより、十字花植物種子の水性抽出物から除去するのが好ましい。
【００２８】
吸着剤を、種子の抽出と同時に添加してもよいが、水性抽出物は、熱処理を伴う別のステップで、好ましくは種子材料残渣の除去後に、吸着剤で処理するのが好ましい。通常、種子材料の乾燥重量に対し、吸着剤約１から約２０重量％を、十字花植物種子の水性抽出物と混合し、温度約９０℃から約１１０℃で、約５から約１５分間加熱する。好ましい態様では、種子材料の乾燥重量に対し、吸着剤約８から約１２重量％を、十字花植物種子の抽出物と混合する。別の態様では、種子水性抽出物を、黒鉛化カーボンブラックなどの吸着剤を含有するカラムに通して、グルコシノレート含有抽出物を製造してもよい。通常、十字花植物種子の水性抽出物は、（例えば、吸着剤カラムを使用して）回分、半回分、半連続、または連続モードで、吸着剤と直接混合することができる。本明細書に使用する場合、吸着剤は、アルキルグルコシノレートよりもインドールグルコシノレーを優先的に吸着するのに有効な化合物を示す。吸着剤で種子水性抽出物を処理することは、望ましくない色、匂い、香味を除去する役目を果たし、重要なことには、著しい量のインドールグルコシノレートを除去する。有用な吸着剤として、活性炭、シリカ、各種の化学修飾シリカ（Ｃ１８シリカなど）、および漂白用粘土などが挙げられる。吸着剤は活性炭が好ましい。
【００２９】
水性抽出物を遠心分離および／またはろ過して使用済み吸着剤を除去し、清澄化されたグルコシノレート含有抽出物を形成することができる。吸着剤は、ろ過、限外ろ過、遠心分離、またはデカントなど、当分野で知られている任意の手段により、グルコシノレート含有抽出物から分離することができる。使用済み吸着剤の除去後、グルコシノレート含有抽出物の含水率を約１０％未満まで、好ましくは約５％未満まで減少するのに十分な時間にわたってグルコシノレート含有抽出物を乾燥して、乾燥されたグルコシノレート含有抽出物を形成する。通常、グルコシノレート含有抽出物は、それだけに限定されないが、凍結乾燥、噴霧乾燥、真空乾燥など、任意の知られている方法を使用して乾燥することができる。次いで、所望であれば、清澄化されたグルコシノレート含有抽出物を、限外ろ過で更に処理してもよい。
【００３０】
次いで、少なくとも一部の乾燥されたグルコシノレート含有抽出物を溶媒と混合して、グルコシノレート含有懸濁液を形成する。適当な溶媒として、例えば、エタノール、メタノール、水、またはそれらの混合物が挙げられる。通常、低圧水素化条件を使用する場合、溶媒は、エタノール、メタノール、またはそれらの混合物などの有機溶剤を含有すべきであり、通常、有機溶剤を少なくとも約５０％必要とする。溶媒はエタノールが好ましい。高圧水素化条件を使用する場合、（所望であれば、有機溶剤を含むことができるが）水性溶媒を単独で使用することができる。通常、乾燥されたグルコシノレート含有抽出物に添加される溶媒の量は、均質の懸濁液を形成するのに十分な溶媒を添加する限り、重要ではない。溶媒は、音波処理、振盪、またはマイクロ波処理など、当分野で知られている任意の手段により、乾燥抽出物と混合またはブレンドして、実質的に均質のグルコシノレート含有懸濁液を形成することができる。
【００３１】
任意選択的ではあるが、混合ステップの後、グルコシノレート含有懸濁液中の不溶物を除去するのが好ましい。不溶物は、例えば、ろ過、遠心分離、またはデカントなどを含む任意の慣用の技術により、グルコシノレート含有懸濁液から分離して、清澄化されたグルコシノレート溶液を形成することができる。不溶物は、孔径が０．４５ミクロンのフィルターを使用してろ過することにより、分離することが好ましい。
【００３２】
通常、水素化は、温度約２５℃から約４５０℃で、約１０から約１００ｐｓｉなどの比較的低い水素化圧を使用するか、または１０００から約１００００ｐｓｉなどの比較的高い水素化圧下で行うことができる。水素化反応は、連続、半連続、回分、または半回分のプロセスで行うことができる。低圧水素化装置などの水素化反応容器（Ｐａｒｒ  Ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｏｒ  Ｓｅｒｉｅｓ  ３９１６、Parr Instrument Co.、Moline、IL）中で、グルコシノレート含有懸濁液を触媒と接触させ、圧力約１０から約１００ｐｓｉ、好ましくは約５０から約８０ｐｓｉ、および温度約２５℃から約１００℃、好ましくは約２５℃から約５０℃の範囲で、グルコラファニン対グルコラフェニンの割合が少なくとも約１：１である化学的予防剤前駆体が富化された抽出物を得るのに十分な時間にわたって水素を導入する。高圧水素化は約５から約１２時間などのより少ない時間で行うことができるが、通常、水素化は、軽い振盪下、約１０から約２４時間行う。
【００３３】
それだけに限定されないが、ニッケル、パラジウム、または白金触媒などの各種の慣用の触媒を使用してもよい。触媒は、Sigma-Aldrich Corp.（Milwaukee、WI）の酸化白金（ＩＶ）など、白金触媒が好ましい。触媒は、約１から約２５％の範囲の量で、好ましくは約５から約２０％の範囲の量で通常使用される。
【００３４】
水素化後、反応生成物を、ろ過、限外ろ過、デカント、または遠心分離などにより清澄化して、使用済み触媒を除去する。当業者であれば、水素化後のグルコラファニン対グルコラフェニンの割合が、出発原料の十字花植物種子中のグルコラファニン対グルコラフェニンの割合に影響されることを認識されようが、一般には、反応生成物は、少なくとも約１対１のグルコラファニン対グルコラフェニンの割合を有する。
【００３５】
最終生成物中のグルコラファニン対グルコラフェニンの所望の割合に応じて、一次水素化ステップからの生成物を、任意選択的に、二次水素化ステップで更に水素化して、グルコラファニン対グルコラフェニンの割合を増加させてもよい。二次水素化ステップは、一次水素化ステップからのろ過した生成物に、触媒を通常約１から約２５％、好ましくは約５から約２０％添加することにより行われる。二次水素化ステップは、温度約２５から約１００度で、振盪下、更に１０から約２４時間にわたって行われる。通常、該反応は、グルコラファニン対グルコラフェニンの割合が少なくとも約５対１、好ましくは１０対１である化学的予防剤前駆体が富化された抽出物を得るのに十分な時間にわたって行われる。二次水素化反応後、反応生成物を、ろ過、限外ろ過、デカント、または遠心分離などにより清澄化して、使用済み触媒を除去する。
【００３６】
再度、グルコラファニン対グルコラフェニンの所望の割合に応じて、二次水素化反応からの生成物に、任意選択的に、三次水素化ステップを行い、グルコラファニン対グルコラフェニンの割合を更に増加してもよい。三次水素化ステップは、二次水素化反応からの生成物に、触媒を通常約１から約２５％、好ましくは約５から約２０％添加することにより行われる。三次水素化ステップは、温度約２５から約１００度で、振盪下、更に１０時間から約２４時間にわたって行われる。通常、該反応は、少なくとも約１００対１のグルコラファニン対グルコラフェニンの割合を有し、好ましくはグルコラフェニンがもはやＨＰＬＣにより検出できないような化学的予防剤前駆体が富化された抽出物を得るのに十分な時間にわたって行われる。
【００３７】
所望であれば追加の水素化ステップを使用してもよいが、グルコラファニンがもはやＨＰＬＣにより検出できないように、実質的に全てのグルコラフェニンをグルコラファニンに変換するには、通常、低圧水素化装置を使用する３つの水素化ステップしか必要としない。低圧水素化を使用する場合、単独の水素化ステップで触媒量を増加する代わりに、上記条件で少なくとも２つの水素化ステップを使用するのが好ましい。通常、触媒の添加量を多くすると、不要な副反応が起こることが多い。更に、単独の水素化ステップで反応時間を増加すると、触媒が被毒されるので、通常、生成物中のグルコラファニン対グルコラフェニンの割合は実質的に増加しない。高圧水素化を使用する場合、必要に応じて追加の水素化ステップを当然に使用してもよいが、通常、グルコラファニン対グルコラフェニンの所望の割合を得るのに必要とされる水素化ステップ数は少なくなる。
【００３８】
三次水素化反応後、反応生成物をろ過、限外ろ過、デカント、または遠心分離などにより清澄化して、使用済み触媒を除去し、化学的予防剤前駆体が富化された抽出物を得てもよい。孔径０．４５マイクロメーターのフィルターを使用する限外ろ過を使用し、化学的予防剤前駆体が富化された抽出物をろ液として回収するのが好ましい。
【００３９】
少なくとも１つのステップの水素化プロセスは、回分、半回分、半連続、または連続モードで実施することができる。該プロセスは、連続モードで行うのが好ましい。
【００４０】
本発明の化学的予防剤前駆体が富化された抽出物は、更に、様々な形態に処理してもよい。例えば、化学的予防剤前駆体が富化された抽出物を、噴霧乾燥、凍結乾燥、または真空乾燥などにより乾燥して、乾燥された化学的予防剤前駆体が富化された抽出物を形成してもよい。化学的予防剤前駆体が富化された抽出物は、冷却また凍結により更に処理してもよいし、あるいは膜処理、クロマトグラフィー処理、または透析を行って、タンパク質およびポリサッカライドなどの高分子量化合物を除去して、化学的予防剤前駆体の単離物または精製生成物を形成してもよい。
【００４１】
化学的予防剤前駆体が富化された抽出物には、任意選択的な成分が有意なやり方で安定性に有害な影響を与えない限り、例えば、香味料、栄養素、ビタミン、着色剤、栄養補給の添加剤、抗酸化剤、プロバイオティクスなどの任意選択的な成分または要素が導入されていてもよい。特に、こうした任意選択的な成分の存在および量は、当然、抽出物が組み込まれる製品に応じて、かなり異なる。
【００４２】
本発明の化学防御物質前駆体が富化された抽出物を、食料品および医薬品を含む、種々の製品に含むことができる。また、化学的予防剤前駆体が富化された十字花植物種子抽出物を、食品栄養強化物として使用することができる。抽出物が組み込まれてもよい食料品として、食品サプリメント、飲料、ミルクセーキ、焼き菓子、茶、スープ、シリアル、丸薬、錠剤、サラダ、サンドイッチ、グラノーラ、サラダドレッシング、ソース、コーヒー、チーズ、ヨーグルト、エネルギーバーなど、およびそれらの混合物が挙げられる。サプリメントには、栄養補助食品、栄養補給剤、またはハーブ系サプリメントが挙げられる。本態様では、食料品は、食料品１サービング当り約１から約１００ｍｇなどの有効量の化学的予防剤前駆体が富化された抽出物を含有することができる。約１０から約５０ｍｇなどの有効量の化学的予防剤前駆体が富化された抽出物を、同様に、医薬品組成物に組み込むこともできる。
【００４３】
下記実施例は、本発明を例証することを意図し、限定するものではない。他に特に記載のない限り、全ての％、部、および割合は、重量によるものである。本明細書に引用される（公報、特許、特許出願、および特許公報などを含む）全ての文献を、参照により本明細書に組み込む。
【実施例１】
【００４４】
一次（または単独）水素化ステップ
ダイコン種子（Ｄｉａｋｏｎ）（New England Seed Co.、Hartford、CTより入手）を、高速ブレンダー（Ｍｏｄｅｌ  ５００、Vita-Mix Corp.、Cleveland、OH）を使用し、アルゴン中で微粉砕した。ヘキサン（Sigma-Aldrich、Milwaukee、WI）を使用するソックスレー抽出法を介して、ヘキサン抽出脂質を除去し、および高真空下で残留溶媒を最少にした。種子材料を攪拌しながら沸騰水に入れ（水リットル当り種子材料１００ｇ）、１０分間にわたって保持した。混合物を、Ｗｈａｔｍａｎ＃２ろ紙を介して熱ろ過した。活性炭（Sigma-Aldrich、Milwaukee、WIより入手のＤＡＲＣＯ（登録商標）Ｇ−６０）を、種子材料１００ｇ当り活性炭１０ｇで添加し、該混合物をちょうど沸騰するようにした。室温まで冷却した際、活性炭を遠心分離（約７０００×Ｇ、３０分間）により除去し、上澄みをナイロン膜（０．４５ミクロン、次いで０．２ミクロン）を介してろ過し、清澄化された抽出物を得た。ろ液および再循環の流量がそれぞれ約２ｍｌ／分および約２００ｍｌ／分で動作させたタンジェンシャルフロー装置３０００ＭＷＣＯ（Ｕｌｔｒａｓｅｔｔｅ（商標）、Pall Corp.、East Hills、NY）を使用して、清澄化された抽出物を限外ろ過した。
【００４５】
ろ液を凍結乾燥し、参照として本明細書に組み込む非特許文献４に記載のように、ＨＰＬＣを使用し、ＹＭＣ  ＯＤＳ−Ａ  Ｃ１８カラム（Waters Co.、 Milford、 MA.から入手、１５０×４．６ｍｍｉ．ｄ．、粒径５マイクロメーター）を使用してグルコラフェニンを分析した（非特許文献４参照）。典型的には、種子２００ｇを一度に処理すると、グルコラフェニンを＞２５％含有する半精製抽出物の収率は＞２０ｇであった。グルコラファニン対グルコラフェニンの出発原料の割合を、ＨＰＬＣを使用して検出したところ、約１：９０であった。
【００４６】
乾燥されたグルコシノレート含有抽出物１／２ｇを、無水エタノール１５０ｍｌに懸濁させ、１０分間にわたって音波処理した。不溶物を０．４５ミクロンのナイロンフィルターを使用してろ過により分離し、ろ液を回収した。該ろ液を、２５０ｍｌ水素化反応ボトルへ移し、Sigma-Aldrich、Milwaukee、WIから入手した酸化白金（ＩＶ）１００ｍｇを添加した。反応ボトルを、低圧水素化装置（Ｐａｒｒ Ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｏｒ Ｓｅｒｉｅｓ ３９１６、Parr Instrument Co.、Moline、IL）に接続し、圧力６０ｐｓｉで水素を導入した。室温で１８時間軽い振盪を連続させた後、反応ボトルを取り外し、０．４５ミクロンのナイロンフィルターを使用して溶液をろ過し、使用済み触媒を除去した。ろ液を回収してＨＰＬＣにより分析したところ、グルコラファニン対グルコラフェニンの割合が、当初の十字花植物種子抽出物の当初の割合１：９０から、水素化後の約２：１の割合に、有意に増加したことが明らかになった。
【実施例２】
【００４７】
二次水素化ステップ
最初の反応ステップ後、実施例１のろ過された反応混合物に、酸化白金（ＩＶ）を更に１００ｍｇ添加し、水素化反応を約２４時間継続させたこと以外は、実施例１の実験を繰り返した。反応ボトルを取り外し、０．４５ミクロンのナイロンフィルターを使用して溶液をろ過して、使用済み触媒を除去した。ろ液を回収し、ＨＰＬＣにより分析したところ、グルコラファニン対グルコラフェニンの割合が、約１０：１まで更に増加したことが明らかになった。
【実施例３】
【００４８】
三次水素化ステップ
実施例２の実験を繰り返した。酸化白金（ＩＶ）１００ｍｇを、実施例２のろ過された反応混合物に添加し、水素化反応を約１８時間継続させた。反応ボトルを取り外し、０．４５ミクロンのナイロンフィルターを使用して溶液をろ過して、使用済み触媒を除去した。ろ物を回収してＨＰＬＣにより分析したところ、グルコラフェニンがもはやＨＰＬＣにより検出できず、グルコラファニン含有量が更に実質的に増加したことが明らかになっており、水素化反応が進んで本質的に完了したことを示唆している。
【００４９】
本発明を好ましい実施形態によって記載したが、当業者には、本発明が添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲内で修正して実施できることを認識されよう。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】グルコラフェニンをスルフォラファンへ変換する主反応の図である。
【図２】本発明の一般的なプロセスを図示する工程図である。
【図１】
0005390085.tif 000004
【図２】
0005390085.tif 000005