(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子的実体の電子顕微鏡観察を行う方法であって、
二次元で規則的に反復するタンパク質層を用意するステップと、
前記分子的実体がその上に支持されている前記タンパク質層の電子顕微鏡観察を行って、画像を得るステップと、を含み、
前記タンパク質層が、遺伝学的に融合して一緒になっている少なくとも２つの単量体をそれぞれが含むタンパク質プロトマーを含み、前記単量体がそれぞれ、それぞれのオリゴマー集合体の単量体であり、
前記プロトマーが、
Ｏが３、４又は６に等しい、位数Ｏの二面体点群に属し、二次元に伸長する１セットの位数２のＯ本の回転対称軸を有する第１のオリゴマー集合体の単量体である第１の単量体と、
位数２の回転対称軸を有する第２のオリゴマー集合体の単量体である、前記第１の単量体に遺伝学的に融合している第２の単量体と
を含み、
前記プロトマーの前記第１の単量体が集合して、前記第１のオリゴマー集合体となり、前記プロトマーの前記第２の単量体が集合して、前記第２のオリゴマー集合体となり、前記第２のオリゴマー集合体の位数２の前記回転対称軸が、前記第１のオリゴマー集合体の１つの、前記１セットの位数２の回転対称軸のうちの１つと一線上に整列されており、２つのプロトマーがその周りに対称に配置されており、かつ
前記タンパク質層が、それぞれが前記タンパク質層の反復構造における所定の位置に結合している分子的実体を支持している、
方法。
【請求項２】
分子的実体を支持するタンパク質層を用意する前記ステップが、前記タンパク質層を作製するステップと、続いてそれに前記分子的実体を結合させるステップとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質層に前記分子的実体を結合させる前記ステップが溶液中で行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
電子顕微鏡観察を行う前記ステップの前に、前記分子的実体をタンパク質格子に対して整列させるステップをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記分子的実体をタンパク質格子に対して整列させるステップが、前記タンパク質格子に電場をかけるステップを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記分子的実体をタンパク質格子に対して整列させるステップが、前記タンパク質格子を最小エネルギー状態にまで冷却するステップを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記画像のデータ分析を行うステップをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記データ分析が二次元結晶解析によるデータ分析である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記データ分析が、前記タンパク質格子の構成要素を同定するステップと、電子顕微鏡観察を行う前記ステップで得られた画像から前記構成要素を減算して、前記分子的実体の画像を得るステップと、前記分子的実体の画像の単粒子再構成を行うステップとを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２のオリゴマー集合体が位数２の二面体点群又は位数２の円状点群（ｃｙｃｌｉｃ  ｐｏｉｎｔ  ｇｒｏｕｐ）に属する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記プロトマーが前記単量体に関して同種である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第２のオリゴマー集合体が位数２の二面体点群に属する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２のオリゴマー集合体が、前記第２の単量体及び第３の単量体の異種オリゴマー集合体であり、前記タンパク質層が、前記第２の単量体と共に集合して、前記第２のオリゴマー集合体となる前記第３の単量体をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第３の単量体が、ビオチン又はペプチドに結合できる結合部位を有する単量体であり、前記第２の単量体が、前記結合部位に結合できるアプタマーである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第３の単量体がストレプトアビジンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２の単量体がストレプタグＩ（配列番号３）である、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記プロトマーが前記単量体に関して異種である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記タンパク質層が２つのタイプのタンパク質プロトマー、
位数２の円状点群に属する異種オリゴマー集合体である第２のオリゴマー集合体の単量体である第２の単量体と遺伝学的に融合している、Ｏが３、４又は６に等しい、位数Ｏの二面体点群に属する前記第１のオリゴマー集合体の単量体である第１の単量体を含む第１のタイプのプロトマーと
位数２又はＯの二面体点群に属する第３のオリゴマー集合体の単量体である第４の単量体と遺伝学的に融合している、前記第２のオリゴマー集合体の単量体である第３の単量体を含む第２のタイプのプロトマーと
を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第３のオリゴマー集合体が位数Ｏの二面体点群に属し、前記第３のオリゴマー集合体が前記第１のオリゴマー集合体と同じである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記それぞれのオリゴマー集合体の前記単量体のそれぞれが、天然に存在するタンパク質であるか、又は天然に存在するタンパク質に基づいており、前記それぞれのオリゴマー集合体の単量体の集合に実質的に影響を与えることなく、ペプチド要素が、前記天然に存在するタンパク質から欠失し、前記タンパク質内で置換され、又は前記タンパク質に付加されている、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記プロトマー中で、前記単量体が連結基を介して遺伝学的に融合している、請求項１１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記連結基が、集合前の、その正常形態にある前記プロトマー中の前記第１の単量体及び前記第２の単量体に対して、集合済みの層における、（ａ）その天然形態にある前記第１のオリゴマー集合体の中で、前記第１のオリゴマー集合体の前記１セットの位数Ｎの回転対称軸の前記１つの周りで対称となっている配置にある前記第１の単量体の末端、及び（ｂ）その天然形態にある前記第２のオリゴマー集合体の中で、前記第２のオリゴマー集合体の前記位数Ｎの回転対称軸の周りで対称となっている配置にある前記第２の単量体の末端の位置及び方位の一方又は両方の任意の相違を低減するように方向付けられている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記タンパク質層の構成要素が、前記分子的実体がそれぞれ結合したアフィニティータグを有し、それにより前記分子的実体が結合している、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記分子的実体が、前記タンパク質層の構成要素に結合したペプチドアフィニティータグを有するタンパク質を含み、それにより前記タンパク質層に結合している、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記分子的実体がタンパク質を含み、前記タンパク質層の構成要素及び前記分子的実体が両方とも、相互に結合したそれぞれのアフィニティータグを有し、それにより前記分子的実体が前記タンパク質層に結合している、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記分子的実体が、前記タンパク質層の構成要素に遺伝学的に融合しており、それにより前記タンパク質層に結合している、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は二次元で規則的に反復するタンパク質層に関する。一態様では、タンパク質層は、オリゴマー集合体の単量体から自己集合可能な対称性オリゴマー集合体をベースにしている。この層は、ナノメートルの桁から百ナノメートルの桁までの大きさを有する細孔を有しうる。タンパク質層は、多くの潜在的な用途を有するナノ構造であり、例えば、マトリックスとして、電子顕微鏡観察又はＸ線結晶解析用の分子的実体を支持する。別の態様では、本発明は、電子顕微鏡観察を行うためのタンパク質層の使用に関する。
【０００２】
国際公開第００／６８２４８号パンフレットは、自己集合可能な対称性オリゴマー集合体をベースにした規則的タンパク質構造を開示する。詳細には、国際公開第００／６８２４８号パンフレットは、それぞれが、それぞれの対称性オリゴマー集合体の単量体である少なくとも２つの単量体（国際公開第００／６８２４８号パンフレットでは「オリゴマー形成ドメイン」と呼ばれている）を含むタンパク質プロトマー（国際公開第００／６８２４８号パンフレットでは「融合タンパク質」と呼ばれている）から形成される構造を開示する。オリゴマー集合体への単量体の自己集合は、それ自体、規則的構造の集合を引き起こす。離散構造及び一、二及び三次元に伸長する構造を含めた、いくつかの異なったタイプの構造が開示されている。
【０００３】
国際公開第００／６８２４８号パンフレットでは、自己集合の際に望ましい規則的構造を与えるように、プロトマー内の単量体の相対的方位が選択されている。上記単量体は、上記プロトマーにおける単量体の必要な相対的方位を与えるように慎重に選択される堅固な連結基を介して融合して一緒になっている。例えば、国際公開第００／６８２４８号パンフレットで報告されている実験室生成では、ある範囲にわたって漸増的な長さを有する連続的な介在αヘリックスセグメントの形態にある連結基によって接続されている単量体を、コンピュータープログラムを用いてモデリングすることで、プロトマーの選択が行われた。したがって、例えば、国際公開第００／６８２４８号パンフレットで示唆されている、三次元で反復する規則的構造を有する格子は、単一の回転軸に関して対称であるそれぞれの２量体又は３量体オリゴマー集合体の２つの単量体を含むプロトマーから形成される。上記２つの単量体の相対的方位は、上記２つのオリゴマー集合体の回転対称軸の間で特定の角度の交差が生じるように選択される。したがって、２つのオリゴマー集合体の間には単一の融合があり、オリゴマー集合体の相対的方位は、融合をもたらす連結基の慎重な選択によって制御される。国際公開第００／６８２４８号パンフレットは、個別のケージ及び一次元で伸長する繊維のタンパク質構造の実験室生成を報告するのみである。
【０００４】
国際公開第００／６８２４８号パンフレットの教示を、二次元で反復するタンパク質層に適用すると、以下の困難に遭遇するであろうと予測される。第１に、層を構築するのに適したプロトマー内の単量体の相対的方位を選択する必要性から生じる、設計上の困難があるであろうと予測される。これはおそらく、タンパク質層を形成するのに利用可能なオリゴマー集合体のタイプの数を減少させ、それゆえ、適したタンパク質を特定するのを困難にするであろう。第２に、集合中に、実施上の困難に遭遇するであろうと予測される。国際公開第００／６８２４８号パンフレットで開示された構造は、オリゴマー集合体間で単一の融合を形成する、プロトマー内の単量体間の融合の硬性に依拠している。国際公開第００／６８２４８号パンフレットは、プロトマー内の単量体の相対的方位が、結果として生じる構造におけるオリゴマー集合体の相対的方位を制御していることを教示しており、それゆえ、望ましい相対的方位から離れて、融合を屈曲させると、自己集合の信頼度が低減するであろうと予測される。そのような問題は、反復単位のサイズが増大するのに従って、より深刻になり、それによって、比較的大きなサイズの細孔を有する格子の信頼できる生成に実施上の制限を与えるであろうと予測される。
【０００５】
これらの予測されている問題が軽減されうる、異なったタイプの構造を有するタンパク質層を提供することが望ましいであろう。
【０００６】
本発明の第１の態様によると、二次元で規則的に反復するタンパク質層であって、
タンパク質層が、遺伝学的に融合して一緒になっている少なくとも２つの単量体をそれぞれが含むタンパク質プロトマーを含み、単量体がそれぞれ、それぞれのオリゴマー集合体の単量体であり、プロトマーが、
Ｏが３、４又は６に等しい、位数Ｏの二面体点群に属し、二次元に伸長する１セットの位数２のＯ本の回転対称軸を有する第１のオリゴマー集合体の単量体である第１の単量体と、
位数２の回転対称軸を有する第２のオリゴマー集合体の単量体である、前記第１の単量体に遺伝学的に融合している第２の単量体とを含み、
プロトマーの上記第１の単量体が集合して、前記第１のオリゴマー集合体となり、プロトマーの上記第２の単量体が集合して、前記第２のオリゴマー集合体となり、前記第２のオリゴマー集合体の位数２の前記回転対称軸が、前記第１のオリゴマー集合体の１つの、前記１セットの位数２の回転対称軸のうちの１つと一線上に整列されており、２つのプロトマーがその周りに対称に配置されているタンパク質層が提供される。
【０００７】
上記１セットの前記第１のオリゴマー集合体のＯ本の回転対称軸と同じ位数２の回転対称軸を有する第２のオリゴマー集合体を用いる結果として、上記オリゴマー集合体が融合して、それらの対称軸が整列され、かつ２つのプロトマーがその周りに対称に配置される。これは、第１のオリゴマー集合体と、第２のオリゴマー集合体との間で２方面の融合体が存在することを意味する。
【０００８】
さらに、上記タンパク質層の反復パターンは、第１のオリゴマー集合体の回転対称軸の配置に由来しており、プロトマー内の単量体の相対的方位には依存していない。第１のオリゴマー集合体は二面体であるので、上記１セットの位数２のＯ本の対称軸は同一平面上にある。したがって、上記プロトマーは、集合して、上記１セットのＯ本の対称軸と同じ対称性を有する層を構築する。
【０００９】
したがって、本発明によるタンパク質層は、二次元で反復する層を築くのに適した対称性を有するオリゴマー集合体を選択することによって設計されうる。融合して一緒になっている、選択されたオリゴマー集合体の単量体を含むプロトマーが生成される。続いて、適した条件下で、上記プロトマーの自己集合が可能にされる。
【００１０】
理解の補助とするため、本発明によるタンパク質層１の特定の例を図示する図１を参照のこと。図１は、二次元で無限に反復するタンパク質層１の一部のみを示す。タンパク質層１はプロトマー２から構築されている。タンパク質層１は、この例では位数４の二面体点群に属し、それゆえ、１セットの位数２の４本の回転対称軸を有する（位数４の１本の回転対称軸に加えて）第１のオリゴマー集合体３を含む。第１のオリゴマー集合体３の単量体５のそれぞれは、第２のオリゴマー集合体４の第２の単量体６と融合しており、第２のオリゴマー集合体４は、この例では、位数２の二面体点群に属し、それゆえ、位数２の回転対称軸を有する。結果として、第２の単量体６は集合して、第２のオリゴマー集合体４を構築し、第２のオリゴマー集合体４は、それらの位数２の回転対称軸が、第１のオリゴマー集合体３の位数２の回転対称軸に沿って整列され、第１のオリゴマー集合体３と、第２のオリゴマー集合体４との間に２方面の融合体を伴って配置される。したがって、タンパク質層１の対称性は、上記１セットの位数２の４本の回転対称軸の対称性と同じであり、この場合位数４の回転対称である。
【００１１】
したがって、本発明は、国際公開第００／６８２４８号パンフレットで用いられたものとは異なるクラスのオリゴマー集合体を使用するものである。本発明は、プロトマー内の単量体の相対的方位を制御する必要性によって制限されないという利点を提供する。したがって、プロトマー内の単量体の相対的方位が、より重要性の低い制約であるという点で、タンパク質構造の設計が補助される。同様に、下記に、より詳細に記述する通り、タンパク質層の、より信頼できる構築が可能である。
【００１２】
本発明の他の態様によれば、自己集合してそのようなタンパク質層を形成できる個々のプロトマー、並びにプロトマーをコードするポリヌクレオチド、プロトマーを発現できるベクター及び宿主細胞、並びにプロトマーを作製する方法が提供される。
【００１３】
二次元で規則的に反復するタンパク質層のとりわけ有利な使用は、分子的実体の電子顕微鏡観察を行うことであると理解されている。したがって、本発明の第２の態様によれば、分子的実体の電子顕微鏡観察を行う方法であって、
タンパク質層を用意するステップであって、タンパク質層が、二次元で規則的に反復し、それぞれがタンパク質層の反復構造における所定の位置に結合している分子的実体を支持する構造を有するステップと、
分子的実体がその上に支持されているタンパク質層の電子顕微鏡観察を行って、画像を得るステップとを含む方法が提供される。
【００１４】
上記方法は、限定されるものではないが、本発明の第１の態様によるタンパク質層を含めた、二次元で規則的に反復するいかなるタンパク質層にも適用可能である。
【００１５】
したがって、上記タンパク質層は、分子的実体の支持体として働く。上記分子的実体はそれぞれ、上記タンパク質層の反復構造における所定の位置にあるので、上記分子的実体は、規則的アレイで支持されている。これは、位置が既知である多数の個別な分子的実体の画像化をそれが可能にするので、電子顕微鏡観察における重要な利点を提供する。これは、得られた画像のさまざまな形態のデータ分析を促進し、それによって、上記分子的実体の構造の調査を可能にする。
【００１６】
これより、添付図面を参照して、非限定的な例によって、本発明をより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】タンパク質層の模式図である。
【図２】異種オリゴマー集合体を含有するタンパク質層の模式図である。
【図３】用意された特定のタンパク質層の電子顕微鏡写真である。
【図４】透過電子顕微鏡の模式図である。
【図５】電子顕微鏡観察を行う方法のフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明によるタンパク質層は、相互に整列された位数２の回転対称軸で融合して一緒になった際に、二次元で反復可能な反復単位を生成するオリゴマー集合体を選択することによって設計できる。反復単位の対称性、及びそれゆえタンパク質層全体の対称性は、オリゴマー集合体の対称性に依存するので、これは、適切な対称性を提供する四次構造を有するいくつかのオリゴマー集合体の選択を要する。オリゴマー集合体の対称性は概ね、タンパク質に関する科学文献で、例えば、タンパク質データバンク（Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）；Ｈ．Ｍ．Ｂｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，Ｚ．Ｆｅｎｇ，Ｇ．Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ，Ｔ．Ｎ．Ｂｈａｔ，Ｈ．Ｗｅｉｓｓｉｇ，Ｉ．Ｎ．Ｓｈｉｎｄｙａｌｏｖ及びＰ．Ｅ．Ｂｏｕｒｎｅ；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２８、２３５〜２４２ページ（２０００年）から利用可能であるので、これは直接的な課題である。タンパク質データバンクは、生体高分子の構造データの単一の世界的アーカイブであり、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇなどのウェブサイトを介しても利用可能である。
【００１９】
一部の場合には、層全体にわたって、反復単位が同じ方位で反復する。他の場合には、２つ以上の隣接した反復単位が共に単位格子を形成し、それが、層全体にわたって、同じ方位で反復するが、単位格子内の反復単位は異なった方位に配置されている。
【００２０】
二次元で規則的に反復する構造を生成するオリゴマー集合体の例を以下に示す。
【００２１】
第１のオリゴマー集合体は、Ｏが３、４又は６に等しい、位数Ｏの二面体点群に属し、それゆえ、同一平面にある１セットの位数２のＯ本の回転対称軸を、それらに垂直な位数Ｏの単一の回転対称軸に加えて含めた、二次元で伸長する回転対称軸を伴った四次構造を有する。
【００２２】
第２のオリゴマー集合体は、前記第１のオリゴマー集合体の上記セットのＯ本の回転対称軸と同じ位数２の回転対称軸を伴った四次構造を有する。例えば、第２のオリゴマー集合体は、位数２の二面体点群又は位数２の円状点群（ｃｙｃｌｉｃ  ｐｏｉｎｔ  ｇｒｏｕｐ）に属しうる。第２のオリゴマー集合体は、位数Ｏの回転対称軸を有しない。
【００２３】
構築された第１のオリゴマー集合体には、必然的に、かつ定義により、第１のオリゴマー集合体の上記１セットの位数２のＯ本の回転対称軸それぞれの周りに対称に配置された、複数の群の第１の単量体が存在する。これは、対称性が、回転対称軸の周りにそのように配置される同一な単量体から生じるからである。
【００２４】
第１のオリゴマー集合体の１セットの位数２のＯ本の回転対称軸の１つの周りに対称的に配置される第１のオリゴマー集合体に第２の単量体が融合する結果として、第２のオリゴマー集合体は、同様に、第１のオリゴマー集合体の上記１セットの位数２のＯ本の回転対称軸の１つの周りに対称的に保持される、融合した第２の単量体の群で保持されることとなる。
【００２５】
加えて、必然的に、かつ定義により、第２の単量体は、第２のオリゴマー集合体内で、第２のオリゴマー集合体の位数２の回転対称軸の周りにも対称的な配置で集合する。したがって、第１のオリゴマー集合体の上記１セットのＯ本の回転対称軸と同じ位数２の回転対称軸を、第２のオリゴマー集合体が有することの結果は、相互に一線上に整列したそれらの位数２の対称軸で、第１のオリゴマー集合体及び第２のオリゴマー集合体が構築されることである。両方のオリゴマー集合体の対称性から、これが最も安定した配置ということになる。これは、第１のオリゴマー集合体と、第２のオリゴマー集合体との間に、２方面の融合体を生じる結果となる。第１のオリゴマー集合体及び第２のオリゴマー集合体のそれぞれの中に、回転対称軸の周りに配置された２つの単量体があり、上記単量体のそれぞれが、それぞれのプロトマーの中で、もう一方のオリゴマー集合体の単量体と融合している。
【００２６】
上述の通り、上記１セットの回転対称軸に、第１のオリゴマー集合体のすべての回転対称軸が含まれるわけではない。そうではなく、上記セットは、第２のオリゴマー集合体の回転対称軸と同じ位数２のものである、第１のオリゴマー集合体の回転対称軸を含む。
【００２７】
第１のオリゴマー集合体及び第２のオリゴマー集合体の対称性の特定の選択は、上記プロトマーが集合して層を構築する際に、それらの回転対称軸が一線上に整列しているオリゴマー集合体を生じる結果となる。したがって、融合したオリゴマー集合体の相対的配置、及びそれゆえタンパク質層全体の相対的配置は、それゆえ、第１のオリゴマー集合体及び第２のオリゴマー集合体の回転対称軸の配置に由来する。詳細には、上記タンパク質層は、上記１セットの位数２のＯ本の回転対称軸と同じ対称性を有する。上記タンパク質層の対称性は、プロトマー内の単量体の相対的方位に依存しない。換言すれば、本発明は、上記タンパク質層の二次元反復パターンが、オリゴマー集合体の回転対称軸の配置のみに基づいたものでありうるという利点を提供する。これは、タンパク質層で使用するのに適したオリゴマー集合体の選択を容易にすることによって、タンパク質層の設計における利点を提供する。設計中、その非集合形態にある個々のプロトマー内の単量体の相対的方位は、例えば、国際公開第００／６８２４８号パンフレットにおいて存在するものよりはるかに低い制約となる。
【００２８】
上記層の自己集合中にも利点がある。詳細には、２つの所与のオリゴマー集合体の間における２方面の融合体の形成は、２つのオリゴマー集合体の間の比較的堅固な結合を生じる結果となる。これは、集合過程中オリゴマー集合体の相対運動を低減し、オリゴマー集合体が正しい相対的位置にある層の信頼できる形成を補助する。
【００２９】
これより、プロトマーの形態及び生成について説明する。本発明は、それらが国際公開第００／６８２４８号パンフレットとは異なった単量体を含むという点で異なっているプロトマーを用いるが、プロトマーの形態及び生成、それ自体は、プロトマーをコードするポリヌクレオチドと同様に、国際公開第００／６８２４８号パンフレットに開示されているものと同じでありえ、それゆえ、この開示を参照により本明細書に組み込む。
【００３０】
これより、単量体それら自体の性質を説明する。
【００３１】
単量体は、タンパク質層を生成するのに適した条件下で自己集合できるオリゴマー集合体の単量体である。それらが集合して、必要な対称性を有する四次構造を構築するという条件で、単量体の二次構造及び三次構造は本来重要ではない。しかし、そのタンパク質が異種発現系で容易に発現及びフォールディングされるならば、それが有利である（例えば、Ｅ．Ｃｏｌｉでプラスミド発現ベクターを用いて）。
【００３２】
単量体は、天然に存在するタンパク質でもよく、又は、上記単量体が集合してそれらのそれぞれのオリゴマー集合体を構築するのに、その改変が実質的に影響を与えないという条件で、ペプチド要素が天然に存在するタンパク質から欠失し、天然に存在するタンパク質内で置換され、又は天然に存在するタンパク質に付加されることによって改変されていてもよい。そのような改変は、本来、多くの異なった目的のために知られており、それらを本発明の単量体に適用することができる。換言すれば、単量体は、天然に存在するタンパク質の相同体、断片及び／又は融合タンパク質でありうる。
【００３３】
単量体は、化学的に改変されたもの、例えば、翻訳後修飾されたものでもよい。例えば、それは、グリコシル化されたものでも、改変アミノ酸残基を含むものでもよい。
【００３４】
単量体は、直接的に融合して一緒になってもよいが、単量体は、ペプチド要素又は非ペプチド要素の連結基によって融合されることが好ましい。概して、連結基による２つのタンパク質の連結は、他の目的のために知られており、そのような連結基を本発明に適用することができる。
【００３５】
適切なオリゴマー集合体の選択の別の因子は、（ａ）その天然形態にある（すなわち第２のオリゴマー集合体と融合していない）第１のオリゴマー集合体内で配置された際の第１の単量体の末端、及び（ｂ）その天然形態にある（すなわち第１のオリゴマー集合体と融合していない）第２のオリゴマー集合体内で配置された際の第２の単量体の末端の位置及び方位である。その天然形態にあるオリゴマー集合体における末端の配置に関するそのような情報は、通常、複数のオリゴマー集合体について、例えば上述のタンパク質データバンクから、取得可能である。理想的には、これらの末端は、構築されたタンパク質層の中でそれらが融合して一緒になって、回転対称軸の周りに対称的に配置された２方面の融合体を構成するであろうから、同じ分離及び方位を有するべきである。そうは言っても、２方面の融合体近くでの単量体の変形によって、及び／又は連結基の使用によって、いかなる相違も収容できるので、分離及び方位が同じであることは必須ではない。したがって、一般論として、融合して、２方面の融合体に一緒になるべき両方のオリゴマー集合体の末端によって、オリゴマー集合体の集合、及びそれゆえタンパク質層の構築が阻害されない融合体の形成が可能となるオリゴマー集合体を選択するべきである。
【００３６】
上述した、２方面の融合体近くの単量体の変形について考慮すれば、集合過程の信頼度を低減させる傾向を有するであろうそのような変形を最小限にすることが望ましい。しかし、単量体の間に連結基が融合されるならば、そのような変形は、連結基それ自体によって、少なくとも部分的に吸収することができる。これは、単量体の変形を低減し、天然に存在するタンパク質の一部でないことに関連して連結基は集合過程に参加しないので、それによって、自己集合の信頼度を増大させる。連結基を使用することの特定の利点が存在する。
【００３７】
さらに、連結基は、集合前の、その正常形態にあるプロトマー内の第１の単量体及び第２の単量体に対して、第１の単量体及び第２の単量体の末端の位置及び／又は方位におけるそのような相違を低減させるよう方向付けられるように特に設計できる。上記に論じた通り、オリゴマー集合体について一般に取得可能である、それらの天然形態にある第１のオリゴマー集合体及び第２のオリゴマー集合体の中の第１の単量体及び第２の単量体の末端の位置及び方位を使用し、従来のモデリング技法を用いて、適切な連結基を設計することが可能である。
【００３８】
通常、単量体は、それらの末端で融合する。代替として、天然に存在するオリゴマー集合体の天然のフォールディング及び対称性が同じままで残る限り、単量体は、ポリペプチド鎖内の代替の位置で融合してもよい。例えば、単量体の一方を、もう一方の単量体の構造的に許容性がある部分、例えばオリゴマー集合体の外に伸びるループの中に挿入してもよい。また、単量体のトランケーションも可能であり、構造の検討によって推定することができる。
【００３９】
二次元で反復するタンパク質層を生成する、オリゴマー集合体の対称性の一部の例は以下の通りである。
【００４０】
これらの例において、第１のオリゴマー集合体は、Ｏが３、４又は６に等しい、位数Ｏの二面体点群に属する。したがって、第１のオリゴマー集合体は、位数Ｏの主要回転対称軸を有し、すべて主要回転対称軸に垂直に伸長する位数２のＯ本の回転対称軸も有する。二次元で伸長する層を発生させるために、第１のオリゴマー集合体と、第２のオリゴマー集合体との間の２方面の融合体を伴った、第１のオリゴマー集合体の位数２のＯ本の回転対称軸と一線上に整列する位数２の回転対称軸を有するように、第２のオリゴマー集合体を選択する。したがって、この場合、位数２のＯ本の回転対称軸が、第１のオリゴマー集合体の上記１セットの回転対称軸を構成する（すなわちＮがＯに等しい）。
【００４１】
一部のクラスのタンパク質層では、プロトマーが、単量体に関して同種であり、すなわち、タンパク質層内に単一タイプのプロトマーが存在する。この場合、第２のオリゴマー集合体は、位数２の二面体点群に属するものでありうる。
【００４２】
例えば、表１は、タンパク質層を形成できる一部の単純な同種プロトマーを表す。
【００４３】
【表１】
0005570416.tif 000002
【００４４】
表１では、そのプロトマーのそれぞれの単量体が属するオリゴマー集合体を表す文字によって、各プロトマーが特定されている。詳細には、文字ｄは、二面体点群を表し、その後の数字は、二面体点群の位数を特定する。表１における次の２カラムでは、第１のオリゴマー集合体における第１の単量体の数Ｍ及び第１のオリゴマー集合体の上記１セットの回転対称軸の位数Ｎが与えられており、この場合Ｎは２である。最終カラムは、この結果得られたタンパク質層の対称性を示す。これらの場合のそれぞれにおいて、第２のオリゴマー集合体は、位数２の二面体点群に属する。
【００４５】
したがって、タンパク質層を可視化することは容易である。詳細には、第１のオリゴマー集合体は、位数Ｏの主要回転対称軸に垂直である上記１セットの位数２のＯ本の回転対称軸がそれから共通平面中に外向きに伸長するノードとして可視化できる。第２のオリゴマー集合体は、第１のオリゴマー集合体の上記１セットの位数２のＯ本の回転対称軸のそれぞれの軸と一線上に整列された、上記ノードから伸長する線形リンクとして可視化できる。このようにして、オリゴマー集合体の間の空間に細孔を有する層の形成を可視化することは容易である。したがって、上記層の対称性は、第１のオリゴマー集合体の上記１セットの位数２のＯ本の回転対称軸の対称な配置に由来すると考えられるであろう。
【００４６】
プロトマーが単量体に関して同種であるタンパク質層の１タイプでは、第２のオリゴマー集合体が同種オリゴマー集合体である。この場合、タンパク質層は、上記プロトマーのみからなる。
【００４７】
プロトマーが単量体に関して同種であるそのようなタンパク質層の別のタイプでは、第２のオリゴマー集合体が、前記第２の単量体及び第３の単量体の異種オリゴマー集合体である。この場合、タンパク質層は、プロトマーと、加えて、前記第２の単量体と共に集合して前記第２のオリゴマー集合体となる第３の単量体とからなる。
【００４８】
したがって、プロトマーは単独では集合してタンパク質層全体を構築することができない。異種オリゴマー集合体の第２の単量体は、その異種オリゴマー集合体の第３の単量体の非存在下で自己集合して、異種オリゴマー集合体全体を構築することはできない。これは、そうでなければプロトマーの生成を混乱させうるであろうタンパク質層全体の構築を行わないでも、第１のオリゴマー集合体を構築できるので、タンパク質層製造中の利点を提供する。これは、二段階過程での生成を可能にする。
【００４９】
第２のオリゴマー集合体として有利に使用できる特定の異種オリゴマー集合体は、ビオチン又はペプチドに結合できる結合部位を有する単量体と、前記結合部位に、好ましくは非共有結合によって結合できるアプタマーとを含むものである。アプタマーは、プロトマーの第２の単量体として使用される。ビオチンに結合できる結合部位を有する単量体は、プロトマー内で遺伝学的に融合していない、タンパク質層の第３の単量体である。第２のオリゴマー集合体の構築の際に、第３の単量体は相互に集合し、アプタマーは、それぞれがそれぞれの第３の単量体に結合することによって第２のオリゴマー集合体を構築する。
【００５０】
これを図２に模式的に示す。図２は、このタイプの単一の第２のオリゴマー集合体４を含有するタンパク質格子１の一部分の一例を示す。そうでなければ、タンパク質格子は、図１に示した例と同じ様式で反復する。この例では、第１のオリゴマー集合体３は、位数４の二面体点群に属し、それゆえ、１セットの位数２の４本の回転対称軸を有する。第１のオリゴマー集合体３の単量体５のそれぞれは、アプタマーである第２の単量体６と融合する。タンパク質格子１は、第２のオリゴマー集合体４の部分として一緒に集合する第３の単量体７をさらに含む。第２の単量体６は、それぞれがそれぞれの第３の単量体７に結合することによって、集合して第２のオリゴマー集合体４を構築する。したがって、第２のオリゴマー集合体４では、第２の単量体６は、第３の単量体７と同じ対称性で保持されるが、第２の単量体６は、相互には集合しない。
【００５１】
これは、タンパク質格子の形成を促進する際の利点を提供する。タンパク質格子１は、上記に論じた通り、オリゴマー集合体３及びオリゴマー集合体４が両方とも位数２の対称軸を有するので、依然として、第１のオリゴマー集合体３と第２のオリゴマー集合体４との間の２方面の融合体を有する。しかし、これは、第２の単量体７それら自体が相互に集合することを必要とせずに実現される。第１のオリゴマー集合体３及び第２のオリゴマー集合体４の両方が、同時に構築される必要がある、図１に示すタンパク質格子１とは対照的に、これが、第１のオリゴマー集合体４の構築を補助する。代わりに、第３の単量体７が集合し、第２の単量体６はそれぞれ個別にそれぞれの第３の単量体７と集合する。
【００５２】
第３の単量体は、通常、結合部位を含む。そのような結合部位は、ペプチド部分又は非ペプチド部分に結合できるものでありうる。好ましい実施形態では、結合部位がビオチンに結合できる。この場合、第３の単量体は、そのような結合部位を有するいかなるタイプのものでもよく、例えば、ストレプトアビジン、アビジン又はニュートラビジンでありうる。
【００５３】
「ストレプトアビジン」、「アビジン」又は「ニュートラビジン」という用語は、本明細書で使用される場合、文脈によって別段のことが要求されない限り、これらの分子の変種を包含する。そのような変種は、通常、元の配列の相同体、すなわち、通常は、配列番号４又は配列番号５に示す配列の相同体である。上記変種は、元の配列の断片また元の配列の相同体でありうる。変種タンパク質は、追加配列（通常は非ストレプトアビジン、非アビジン又は非ニュートラビジン配列）を含むものでもよく、それゆえ、前記元の配列、相同体又は断片を含む融合タンパク質でありうる。
【００５４】
変種配列は、本明細書に言及する任意の構造特性など、元の配列の構造特性を保持することが好ましい。さらに、変種配列は通常、ビオチン及び／又はペプチド（配列番号３のペプチドなど）に結合する能力を保持する。一実施形態では、変種配列は、元の配列を認識できる抗体によって認識できる。当然ながら、変種配列は、本明細書に記載のタンパク質層を形成する特性を保持しているであろう。
【００５５】
結合部位に結合できるアプタマーである第２の単量体は、限定されるものではないが、ストレプタグ（ｓｔｒｅｐｔａｇ）Ｉ、ストレプタグＩＩ又はナノタグ（ｎａｎｏｔａｇ）を含めた、さまざまなペプチドタグの任意のもでありうる。好ましいアプタマーは、長さ７〜２０アミノ酸、例えば長さ９〜１５アミノ酸のペプチドである。アプタマーは、配列番号３との相同性を有するもの、例えば、配列番号３と共通の（すなわち同一な）少なくとも６、７又は８アミノ酸を有するものでありうる。
【００５６】
概して、第１のオリゴマー集合体１は、必要な対称性を有するいかなるタイプのものでもよい。１つの可能な例は、Ｅ．ＣｏｌｉのＡＬＡＤ（δアミノレブリン酸脱水素酵素）である。第１のオリゴマー集合体を選択するための他の規準を以下に述べる。
【００５７】
アプタマーは、第１の単量体の末端に融合するものでありうる。末端が使用される場合には、第１のオリゴマー集合体は、好ましくは、位数２の対称軸の近く（通常１５Å以内）にある末端を有するべきである。
【００５８】
代替として、第１のオリゴマー集合体特性の四次構造が実質的に影響されずに残っているという条件及びアプタマーが、末端に融合する必要のないものであるという条件で、アプタマーは、概して、末端以外の位置に融合するものでもよい。例えば、ストレプタグＩは、ストレプトアビジンに結合するのに、遊離Ｃ末端を必要とする。この場合も、アプタマーが、位数２の対称軸の近く（通常１５Å以内）にある位置で、構築されたオリゴマー集合体内に位置する結果となる第１の単量体のペプチド配列内の位置に、アプタマーが融合することが好ましい。
【００５９】
任意選択で、プロトマー内において、第１の単量体と、アプタマーである第２の単量体との間に連結基があってもよい。連結基は、通常、長さが１〜１０アミノ酸の範囲のものでありうるであろう。連結基は、格子の構築を補助する有利な柔軟性を提供できるであろう。例えば、第１の単量体がＥ．ｃｏｌｉのＡＬＡＤであり、第２の単量体がストレプタグＩである場合、長さが１又は２アミノ酸の連結基を用意することが好ましい。
【００６０】
任意選択で、追加タンパク質融合体を、第１の単量体又は第３の単量体の任意の遊離末端に遺伝学的に融合させてもよい。これは、格子への機能付与を可能にするために行うことができるであろう。適した追加タンパク質の非限定的な特定の例は、ヘキサヒスチジンタグ、特異的アフィニティーペプチド、アンキリンリピート及びカルモジュリンであり、これらのそれぞれが、この集合体が自己集合して格子を構築する能力に影響を与えずに、Ｅ．ｃｏｌｉのＡＬＡＤ−ストレプタグＩのＮ末端に遺伝的に融合できると文献に示されている。
【００６１】
他のクラスのタンパク質層では、プロトマーが単量体に関して異種であり、すなわち、タンパク質層に、２つ以上のタイプのプロトマーが存在する。
【００６２】
２つのタイプのプロトマーの集合を実現するために、上記２つのタイプのプロトマーは、位数２の円状点群に属するものでありうる同じ異種オリゴマー集合体の異なった単量体を含有する。したがって、第１のタイプのプロトマーは、位数２の円状点群に属する異種オリゴマー集合体である第２のオリゴマー集合体の単量体である第２の単量体と遺伝学的に融合している、Ｏが３、４又は６に等しい、位数Ｏの二面体点群に属する前記第１のオリゴマー集合体の単量体である第１の単量体を含む。さらに、第２のタイプのプロトマーは、その第２のオリゴマー集合体の単量体である第３の単量体を含む。第２のタイプのプロトマーでは、第３の単量体が、第３のオリゴマー集合体の単量体である第４の単量体に遺伝学的に融合しており、第３のオリゴマー集合体は、位数２又はＯの二面体点群に属する。
【００６３】
したがって、異なったタイプのプロトマーの集合が可能となっている場合、異種オリゴマー集合体が構築され、それによって、２つのタイプのプロトマーが連結される。しかし、単一のタイプのプロトマーは、単独では、集合して、タンパク質層全体を構築することができない。異種オリゴマー集合体の個々の単量体は、その異種集合体の他の異なった単量体の非存在下では、自己集合して、異種オリゴマー集合体全体を構築することができない。これは、同種である第１のオリゴマー集合体の単量体の自己集合の結果として、各タイプのプロトマーを別々に生成及び集合させ、但しタンパク質層全体を構築せずに、反復パターンの単位格子におけるそれぞれの個別の構成要素を構築することができるので、タンパク質層製造中の利点を提供する。これは、上記複数の構成要素を一緒にするまで、層の構築を回避できるので、異種プロトマーの利点である。さもなければ、層の構築によって、プロトマーそれら自体の生成が妨害されうるであろう。これは、二段階過程での生成を可能にする。
【００６４】
最も単純なタイプのタンパク質層では、両方のタイプのプロトマーにおける第１のオリゴマー集合体が、二面体点群に属する同種オリゴマー集合体の単量体である。したがって、個々のタイプのプロトマーもそうでありうる。例えば、表２は、タンパク質層を形成できる一部の単純な異種プロトマーを表す。
【００６５】
【表２】
0005570416.tif 000003
【００６６】
表２では、第１のカラムが２つのタイプのプロトマーを特定している。各プロトマーは、プロトマーのそれぞれの単量体が属するオリゴマー集合体を表す文字によって特定されている。詳細には、文字ｄは、二面体点群を表し、文字ｃは、円状点群に属する異種オリゴマー集合体の単量体を表す。添字の数は、この場合も、その点群の位数を表す。添字の大文字Ａ及びＡ＊は、同じ異種集合体の２つの異なった単量体を特定するのに使用されている。
【００６７】
表２では、第２のカラムは、それぞれのタイプのプロトマーの集合体から生じる構成要素が属する点群を特定している。その構成成分の点群を指していることを示すのに大文字が使用されていることを除いて、プロトマーの単量体に関しても同様の表記法が使用されている。したがって、大文字Ｄは、構成成分が二面体点群に属することを示し、数は点群の位数を示す。
【００６８】
表２における次の４カラムでは、第１のオリゴマー集合体における第１の単量体及び第３のオリゴマー集合体における第４のオリゴマーの数Ｍ、並びに第１のオリゴマー集合体及び第３のオリゴマー集合体の上記１セットのＯ本の回転対称軸の位数Ｎ（＝２）が示されている。最終カラムは、この結果得られたタンパク質層の対称性を示す。
【００６９】
表２におけるすべての例で、第１のタイプのプロトマーの第１のオリゴマー集合体は、Ｏが３、４又は６に等しい、位数Ｏの二面体点群に属する。
【００７０】
表２における最初の３つの例で、第２のタイプのプロトマーの第１のオリゴマー集合体は、ＬがＯに等しい、位数Ｌの二面体点群に属する。したがって、これらの３つの例は、表１における対応する同種プロトマーの３つの例と空間的に同じ配置を有する。表２における最初の３つの例で、２つのタイプのプロトマーの第１のオリゴマー集合体は、同じオリゴマー集合体でも、異なったオリゴマー集合体でもよい。
【００７１】
表２における２番目の３つの例では、第２のタイプのプロトマーの第１のオリゴマー集合体は、Ｌが２に等しい、位数Ｌの二面体点群に属する。下記に示す点を除いて、これらの３つの例は、表１における、対応する同種プロトマーの３つの例と空間的に同じ配置を有する。単一の循環オリゴマー集合体によって連結されている位数Ｏの２つの二面体オリゴマー集合体の代わりに、位数Ｏの２つの二面体オリゴマー集合体の間の連結は、位数２の二面体オリゴマー集合体のいずれかの側で、位数２の２つの循環オリゴマー集合体を含む鎖によって形成されるように伸長している。したがって、異種オリゴマー集合体の反復単位は、タンパク質層内のノードと考えることができる位数Ｏの二面体オリゴマー集合体間の反復単位のリンクの長さを効果的に伸長すると考えられるであろう。したがって、対応する同種プロトマーの使用と比較して、タンパク質層内の細孔のサイズも増大している。
【００７２】
タンパク質層の上記の例は、タンパク質層を形成できるプロトマーの最も単純な形態を表すと考えられており、その理由で好ましい。しかし、適した対称性を有するオリゴマー集合体の単量体から形成された他のプロトマーもタンパク質層を形成できるであろうことは理解されよう。例えば、表１に列挙したものより多数の単量体を有する他の同種プロトマーもタンパク質層を形成できるであろう。同様に、他の異種プロトマーも、タンパク質層を形成できるであろう。これらには、表２の例にあるものより多数の単量体を有する２つのタイプのプロトマーが含まれるか、又は２つ以上のタイプのプロトマーが含まれうる。
【００７３】
単量体のそれぞれについて、必要な対称性を有するオリゴマー集合体の大きな選択範囲が存在する。本発明は、原則として、必要な対称性を伴った四次構造を有するいかなるオリゴマー集合体も使用できるので、特定のオリゴマー集合体に限定されない。しかし、例として、表３は、表１及び２にあるものを含めた、さまざまな点群のオリゴマー集合体の可能な選択範囲の一部を示す。
【００７４】
【表３】
0005570416.tif 000004
【００７５】
したがって、本発明は、集合して、タンパク質層を構築できる１つ又は複数のタンパク質プロトマーを提供する。プロトマーの単量体は、いかなる長さのものでもよいが、通常は長さ５〜１０００アミノ酸を有し、好ましくは少なくとも２０のアミノ酸、及び／又は好ましくは最長５００アミノ酸を有する。
【００７６】
本発明は、本発明のタンパク質プロトマーをコードするポリヌクレオチドを提供する。上記ポリヌクレオチドは通常、コード配列の５及び／又は３末端より先の追加配列を含むであろう。上記ポリヌクレオチドは通常、コードされているプロトマーの長さの３倍の長さを有する。上記ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ又はｃＤＮＡを含めた、ＲＮＡでも、ＤＮＡでもよい。上記ポリヌクレオチドは、１本鎖でも、２本鎖でもよい。
【００７７】
上記ポリヌクレオチドは、メチルホスホネート及びホスホロチオエートバックボーンなどの合成ヌクレオチド若しくは修飾ヌクレオチド、又は分子の３’末端及び／若しくは５’末端におけるアクリジン若しくはポリリシン鎖の付加を含みうる。
【００７８】
そのようなポリヌクレオチドは、標準的な技法を用いて、生成及び使用できる。例えば、国際公開第００／６８２４８号パンフレットでなされた、核酸及びそれらの使用に関するコメントは、本発明のポリヌクレオチドにも等しく当てはまる。
【００７９】
単量体は通常、遺伝子レベルにおけるそれぞれの遺伝子の融合によって、プロトマーを形成するように合成される（例えば、５’側の遺伝子の終止コドンを除去し、３’側の遺伝子までインフレームで読み続けることを可能にすることによって）。この場合、組換え体遺伝子は、単一ポリペプチドとして発現される。これらの遺伝子は、オリゴマー集合体特性の四次構造が実質的に影響されずに残っている限り、代わりに、末端以外の位置で融合させてもよい。詳細には、一遺伝子を、第２の遺伝子の構造的に許容性がある領域内に挿入して、インフレーム融合体を生成することができる。
【００８０】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含み、かつ本発明のタンパク質プロトマーを発現できる発現ベクターを提供する。そのようなベクターは、必要でありえ、かつタンパク質発現を可能にするために正しい方向性で配置されている、適切なイニシエーター、プロモーター、エンハンサー及び他のエレメント、例えばポリアデニル化シグナルなどを含みうる。
【００８１】
したがって、ベクター内のコード配列は、それらがコード配列の発現（通常は細胞内で）をもたらすように、そのようなエレメントに作用可能に連結されている。「作用可能に連結されている」という用語は、記述されている構成成分が、それらの意図された様式でそれらが機能するのを可能にする関係にある、近位の位置関係にあることを意味する。
【００８２】
上記ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス又はファージベクターでありうる。上記ベクターは、通常、複製開始点を有する。上記ベクターは、１つ又は複数の選択マーカー遺伝子、例えば、細菌プラスミドの場合にはアンピシリン耐性遺伝子、又は真菌ベクター用の耐性遺伝子を含みうる。
【００８３】
プロモーター及び他の発現調節シグナルは、発現することが設計されている宿主細胞と適合性があるように選択できる。例えば、酵母プロモーターには、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ４及びＡＤＨプロモーター、並びにＳ．ｐｏｍｂｅのｎｍｔ１及びａｄｈプロモーターが含まれる。哺乳動物プロモーターには、カドミウムなどの重金属に応答して誘導されうるメタロチオネインプロモーターが含まれる。ＳＶ４０ラージＴ抗原プロモーター又はアデノウイルスプロモーターなどのウイルスプロモーターも使用できる。
【００８４】
ｂ−アクチンプロモーターなどの哺乳類プロモーターも使用できる。組織特異的プロモーターがとりわけ好ましい。ウイルスプロモーター、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス末端反復配列（ＭＭＬＶ  ＬＴＲ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーター、アデノウイルス、ＨＳＶプロモーター（ＨＳＶ  ＩＥプロモーターなど）又はＨＰＶプロモーター、とりわけＨＰＶ上流調節領域（ＵＲＲ）も使用できる。
【００８５】
タンパク質プロトマーの発現に使用できる別の方法は、例えば、細菌性、酵母性又は哺乳動物性の無細胞発現である。
【００８６】
本発明には、本発明のプロトマーを発現するように改変された細胞も含まれる。そのような細胞には、一過性若しくは好ましくは安定的な、例えばバキュロウイルス発現系を用いた哺乳動物細胞若しくは昆虫細胞などの高等真核細胞株、酵母などの下等真核細胞、又は細菌細胞などの原核細胞が含まれる。本発明によるポリペプチドをコードするベクターの挿入によって改変できる細胞の特定の例には、哺乳動物のＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ及びＣＯＳ細胞が含まれる。好ましくは、選択される細胞株は、安定的であるのみでなく、ポリペプチドの成熟したグリコシル化も可能にするものであろう。発現は、形質転換された卵母細胞で行ってもよい。
【００８７】
本発明のタンパク質プロトマー、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞は、実質的に単離された形態で存在しうる。それらは、実質的に精製された形態であってもよく、その場合、それらは通常、タンパク質、ポリヌクレオチド、細胞又は調製物の乾燥質量の少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、９８％又は９９％を含むであろう。
【００８８】
プロトマーは、標準的な技法を用いて、ベクター及び宿主細胞を使用して調製してもよい。例えば、プロトマー（国際公開第００／６８２４８号パンフレットでは「融合タンパク質」と呼ばれている）を調製する方法に関して、国際公開第００／６８２４８号パンフレットでなされたコメントは、本発明によるプロトマーの調製にも等しく当てはまる。
【００８９】
プロトマーからのタンパク質層の構築は、単純に、オリゴマー集合体の単量体の自己集合に適した条件下にプロトマーを置くことによって行うことができる。通常、これは、プロトマーを溶液中、好ましくは水溶液中に入れることによって行われるであろう。通常、適した条件は、天然に存在するタンパク質が自然で自己集合する条件に相当するであろう。適した条件は、国際公開第００／６８２４８号パンフレットで具体的に開示されているものでよい。
【００９０】
同種プロトマーの場合には、これは、タンパク質層の直接的構築をもたらす。
【００９１】
異種プロトマーの場合には、構築が複数の段階で行われることが好ましい。第１の段階では、各タイプのプロトマーが別々に集合して、それぞれの個別の構成要素を構築する。第２の段階では、上記個別の構成要素が一緒にされ、集合して、タンパク質層を構築する。複数の異種プロトマーが使用される場合には、第１の段階と第２の段階の中間に、さらなる段階が存在することがあり、その段階では、それぞれの個別の構成要素が一緒にされ、集合して、より大きな中間構成要素を構築する。
【００９２】
これより、図２で示したタイプの一例である特定のタンパク質層がそれによって調製された方法を説明する。
【００９３】
プロトマーは、Ｅ．ｃｏｌｉのＡＬＡＤである第１の単量体と、ストレプタグＩである第２の単量体とからなっていた。第３の単量体はストレプトアビジンであった。
【００９４】
プロトマーは、標準的な技法を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドベクター中に調製した。上記Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドベクターは、配列番号１の配列を有するｐＵＣ１９誘導体であった。プロトマーの配列は、
ＭＴＭＧＳＭＴＤＬＩＱＲＰＲＲＬＲＫＳＰＡＬＲＡＭＦＥＥＴＴＬＳＬＮＤＬＶＬＰＩＦＶＥＥＥＩＤＤＹＫＡＶＥＡＰＧＶＭＲＩＰＥＫＨＬＡＲＥＩＥＲＩＡＮＡＧＩＲＳＶＭＴＦＧＩＳＨＨＴＤＥＴＧＳＤＡＷＲＥＤＧＬＶＡＲＭＳＲＩＣＫＱＴＶＰＥＭＩＶＭＳＤＴＣＦＣＥＹＴＳＨＧＨＣＧＶＬＣＥＨＧＶＤＮＤＡＴＬＥＮＬＧＫＱＡＶＶＡＡＡＡＧＡＸＦＩＡＰＳＡＡＭＤＧＱＶＱＡＩＲＱＡＬＤＡＡＧＦＫＤＴＡＩＭＳＹＳＴＫＦＡＳＳＦＹＧＰＦＲＥＡＡＧＳＡＬＫＧＤＲＫＳＹＱＭＮＰＭＮＲＲＥＡＩＲＥＳＬＬＤＥＡＱＧＡＮＣＬＭＶＫＰＡＧＡＹＬＤＩＶＲＥＬＲＥＲＴＥＬＰＩＧＡＹＱＶＳＧＥＹＡＭＩＫＦＡＡＬＡＧＡＩＤＥＥＫＶＶＬＥＳＬＧＳＩＫＲＡＧＡＤＬＩＦＳＹＦＡＬＤＬＡＥＫＫＩＬＲＲＳＡＷＲＨＰＱＦＧＧ（配列番号２）
である。
【００９５】
ストレプタグＩの配列は、
ＡＷＲＨＰＱＦＧＧ（配列番号３）
である。
【００９６】
ストレプトアビジンの配列（本明細書で記載の研究で使用される場合）は、
ＭＥＴ  ＧＬＵ  ＡＬＡ  ＧＬＹ  ＩＬＥ  ＴＨＲ  ＧＬＹ  ＴＨＲ  ＴＲＰ  ＴＹＲ  ＡＳＮ  ＧＬＮ  ＬＥＵ  ＧＬＹ  ＳＥＲ  ＴＨＲ  ＰＨＥ  ＩＬＥ  ＶＡＬ  ＴＨＲ  ＡＬＡ  ＧＬＹ  ＡＬＡ  ＡＳＰ  ＧＬＹ  ＡＬＡ  ＬＥＵ  ＴＨＲ  ＧＬＹ  ＴＨＲ  ＴＹＲ  ＧＬＵ  ＳＥＲ  ＡＬＡ  ＶＡＬ  ＧＬＹ  ＡＳＮ  ＡＬＡ  ＧＬＵ  ＳＥＲ  ＡＲＧ  ＴＹＲ  ＶＡＬ  ＬＥＵ  ＴＨＲ  ＧＬＹ  ＡＲＧ  ＴＹＲ  ＡＳＰ  ＳＥＲ  ＡＬＡ  ＰＲＯ  ＡＬＡ  ＴＨＲ  ＡＳＰ  ＧＬＹ  ＳＥＲ  ＧＬＹ  ＴＨＲ  ＡＬＡ  ＬＥＵ  ＧＬＹ  ＴＲＰ  ＴＨＲ  ＶＡＬ  ＡＬＡ  ＴＲＰ  ＬＹＳ  ＡＳＮ  ＡＳＮ  ＴＹＲ  ＡＲＧ  ＡＳＮ  ＡＬＡ  ＨＩＳ  ＳＥＲ  ＡＬＡ  ＴＨＲ  ＴＨＲ  ＴＲＰ  ＳＥＲ  ＧＬＹ  ＧＬＮ  ＴＹＲ  ＶＡＬ  ＧＬＹ  ＧＬＹ  ＡＬＡ  ＧＬＵ  ＡＬＡ  ＡＲＧ  ＩＬＥ  ＡＳＮ  ＴＨＲ  ＧＬＮ  ＴＲＰ  ＬＥＵ  ＬＥＵ  ＴＨＲ  ＳＥＲ  ＧＬＹ  ＴＨＲ  ＴＨＲ  ＧＬＵ  ＡＬＡ  ＡＳＮ  ＡＬＡ  ＴＲＰ  ＬＹＳ  ＳＥＲ  ＴＨＲ  ＬＥＵ  ＶＡＬ  ＧＬＹ  ＨＩＳ  ＡＳＰ  ＴＨＲ  ＰＨＥ  ＴＨＲ  ＬＹＳ  ＶＡＬ  ＬＹＳ  ＰＲＯ  ＳＥＲ  ＡＬＡ  ＡＬＡ  ＳＥＲ（配列番号４）
である。
【００９７】
参考に、アビジンの配列は、
ＡＲＫＣＳＬＴＧＫＷ  ＴＮＤＬＧＳＮＭＴＩ  ＧＡＶＮＳＲＧＥＦＴ  ＧＴＹＩＴＡＶＴＡＴ  ＳＮＥＩＫＥＳＰＬＨ  ＧＴＱＮＴＩＮＫＲＴ  ＱＰＴＦＧＦＴＶＮＷ  ＫＦＳＥＳＴＴＶＦＴ  ＧＱＣＦＩＤＲＮＧＫ  ＥＶＬＫＴＭＷＬＬＲ  ＳＳＶＮＤＩＧＤＤＷ  ＫＡＴＲＶＧＩＮＩＦ  ＴＲＬＲＴＱＫＥ  （配列番号５）
である。
【００９８】
５−アミノレブリン酸デヒドラターゼ（ＡＬＡＤ）をコードする遺伝子をＤＨ５αゲノムＤＮＡから増幅し、上述の通り、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ−ストレプタグＩ発現ベクター内に挿入して、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ遺伝子カセットを置換した。
【００９９】
その後、ＡＬＡＤ−ストレプタグＩプロトマーを調製した。発現培地には、０．１ｍＭＩＰＴＧが含有されていた。発現の誘導は以下の通りであった。すなわち、発現株の１０ｍｌ終夜培養物（３０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するＬＢブロス中）を、３０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する新たなＬＢブロス中に１：１００希釈した。細胞を０．６のＯＤ６００に相当する密度にまで、振盪しながら３７℃で培養し、その後、最終濃度１ｍＭにまでＩＰＴＧを添加することによって、標的タンパク質を発現するように誘発した。この培養物をさらに３時間振盪しながら３７℃で維持し、その後、遠心処理（５０００ｇ、１０分、４℃）によって細胞を採取した。細胞ペレットを２０ｍｌ緩衝液Ａ（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５）中に再懸濁した。細胞を超音波処理によって溶解させ、不溶性画分を遠心処理（２５０００ｇ、３０分、４℃）によって採取した。この画分を８Ｍ尿素中に溶解させ、遠心処理して（２５０００ｇ、３０分、４℃）、不溶性粒子を除去した。尿素で可溶化した物質を１６ｍｇ／ｍｌに濃縮し、０．２２μｍフィルターに通した。その後、この物質１滴（１μｌ）を、緩衝剤Ａのさらに大きな１滴（５μｌ）に直接注入した。
【０１００】
一般的に、多くの発現オプション及び精製オプションが利用可能である。別の繰り返しうまくいっているプロトコールは以下の通りである。
１．ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｓｔａｒ  Ｅ．ｃｏｌｉ単一コロニーを、ルリア−ベルターニ寒天プレートから、７５μｇ／ｍｌアンピシリン及び０．１ｍＭイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含有するルリア−ベルターニ培地５００ｍｌに移した。
２．この培養物を振盪しながら３７℃で１８時間インキュベートした。
３．遠心処理（５０００ｇ、５分）によって培養物を採取し、１０ｍｌの緩衝液「ＧＦ」（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％アジ化ナトリウム、ｐＨ８．０）中に再懸濁した。
４．超音波処理、凍結溶解、細胞溶解試薬（例えば「バグバスター（Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ）」）又はリゾチーム及びＤＮＡｓｅ処理を用いて、細胞を溶解させた。これらは当技術分野で標準的な技法である。
５．遠心処理（３００００ｇ、３０分）によって不溶性画分を除去した。
６．製造会社説明書に従って、ストレプ−タクチン（Ｓｔｒｅｐ−ｔａｃｔｉｎ）セファロース（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ）を用いて、融合タンパク質を可溶性画分から精製した。
７．スパロース（ｓｕｐｅｒｏｓｅ）６マトリックス及び緩衝液ＧＦを用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって、ストレプ−タクチンカラムから生じるデスチオビオチン夾雑物から、溶出タンパク質を分離した。
８．精製タンパク質は少なくとも６カ月間４℃で保存できた。
【０１０１】
精製されたＡＬＡＤ−ストレプタグＩプロトマー（約１ｍｇ／ｍｌ）を、市販のコア−ストレプトアビジンに等モル量で混合した。自己集合が直ちに開始し、結果のタンパク質格子を透過電子顕微鏡によって可視化した。図３は、単位格子サイズが１３ｎｍ×１３ｎｍであるタンパク質格子のネガティブ染色透過型電子顕微鏡写真を示す。電子顕微鏡写真の画像処理を行って、画像品質を増強させた。詳細には、電子顕微鏡写真をフーリエ変換し、フィルターに由来する空間群及び平均化を用いてフィルタリングし、その後再構成した。
【０１０２】
本発明によるタンパク質層は、多数の異なった使用を有する。一般的に、そのような使用は、規則的に反復する構造及び／又は構造内に存在する細孔を利用するであろう。本発明による層は、ナノメートルの桁から百ナノメートルの桁であることが予測されている寸法の細孔を有するように設計できる。層は、所望の使用に適した孔径で設計できる。
【０１０３】
タンパク質格子又は層の高度に定義づけられており、格別にサイズ決定され、かつ微細に制御された細孔サイズは、それらの構造の安定性と共に、それらを、細孔サイズがちょうど言及された範囲にある微小孔物質を必要とする適用に理想的なものとする。一例として、上記格子又は層は、濾過又は分離過程用のフィルター要素又は分子ふるいとして有用であると予測される。この使用では、これらの達成可能な細孔サイズ及び細孔サイズを設計する能力は特に有利である。
【０１０４】
別のクラスの使用では、分子的実体がタンパク質層に結合しているであろう。そのような結合は、従来の技法を用いて行うことができる。分子的実体は、適切なサイズのいかなる実体でもよく、通常は高分子実体、例えば、タンパク質、ＤＮＡなどのポリヌクレオチド又は非生物学的実体でありうる。分子的実体は、単一分子でも、複数の分子の複合体でもよい。したがって、タンパク質層は、例えば、薬物送達における使用のため、又は分子的実体を結晶化させるための分子的実体を保持するための生物学的マトリックスとして有用であると予測される。
【０１０５】
タンパク質層への分子的実体の結合は、多くの方法で行うことができる。
【０１０６】
一部のアプローチは、タンパク質プロトマー（又は層の他の構成要素）又は対象とする分子的実体のいずれか又は両方に「タグ付け」することを用いる。この関連では、タグ付けは、標的構造と強い相互作用を形成する、タグ又はアフィニティータグとして知られている構造の、タンパク質プロトマー（又は層の他の構成要素）又は標的分子的実体の一方又は両方への共有結合付加である。この目的には、通常、短いペプチドモチーフ（例えば、「ベルクロ」酸ペプチド又は塩基性ペプチドなどのヘテロ二量体コイルドコイル）が用いられる。タンパク質プロトマー（又は層の他の構成要素）又はタンパク質である分子的実体の場合、これは、タグをタンパク質層の構成要素又は分子的実体に遺伝学的に融合させること、すなわち、タグを構成するペプチド要素の追加配列を、例えばその末端の１つ又はループ領域内に有するタンパク質の遺伝子改変バージョンの発現によって実現できる。タグを付加する代替方法には、それが発現された後における、インテイン技法などの技法を介した、タンパク質の共有結合修飾が含まれる。
【０１０７】
１つのアプローチでは、標的構造が他のタンパク質プロトマー又は標的分子的実体に結合したさらに別のタグであること、すなわち、層の構成要素及び標的分子的実体の両方が、相互に結合するための相補的なアフィニティータグを含有することがある。
【０１０８】
別のアプローチでは、標的構造が、タンパク質プロトマー（又は層の他の構成要素）又は標的分子的実体の一部であること、すなわち、層の構成要素の１つ及び標的分子的実体が、層の他の構成要素及び標的分子的実体へのアフィニティーを有するアフィニティータグを有することがある。したがって、タンパク質層に分子的実体を結合させるために、層の構成要素は、プロトマー内の所定の位置で、対象とする分子的実体に結合したアフィニティータグを含みうる。代替として、対象とする分子的実体は、分子的実体内の所定の位置で、層の構成要素に結合したアフィニティータグを有しうる。
【０１０９】
タンパク質層の構成要素が既知なペプチド配列と強い相互作用を形成することが既知である場合、そのペプチド配列を、標的分子的実体に付加するべきタグとして用いることができる。そのような密接な結合パートナーが既知でない場合には、スクリーニングによって、適したタグを同定することができる。可能なスクリーニングのタイプは、ファージディスプレイ技法、又は多くの異なった短い（例えば３〜５０アミノ酸）ペプチドを生成するリダンダント化学ライブラリーアプローチである。最も密接な結合ペプチド要素は、標準的な技法、例えば、ファージディスプレイライブラリーの場合には、増幅及び配列決定を用いて、又はリダンダントライブラリーの場合にはペプチドの配列決定によって同定できる。
【０１１０】
代替アプローチは、標的分子的実体それ自体を、層の構成要素への直接的な遺伝的融合体として発現することである。
【０１１１】
別の代替アプローチは、代替のアフィニティーベースの結合手段又は共有結合手段を提供する、格子の特異的化学修飾を行うことである。例えば、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）基の取込みに、格子内における接近可能なスルフィドリル基の部位特異的誘導体化を用いることができ、ＮＴＡ基は、次に、金属イオン、したがってヒスチジンリッチ標的タンパク質の結合に用いることができる。
【０１１２】
層又は分子的実体上のアフィニティータグを用いて、タンパク質層に分子的実体を結合させるために、分子的実体を、形成前のタンパク質層中に拡散させ、それゆえ、例えば、結合した分子的実体を、タンパク質層におけるそれらの最低エネルギー配置へとアニーリングすることによって、それに結合した状態にすることができ、アニーリングは、液体窒素クライオストリーム中での制御された冷却を用いて行うことができる。代替として、タンパク質層の形成中に分子的実体をプロトマーに混合させて、層と共に集合させてもよい。
【０１１３】
別のクラスの使用では、有用な特性を有するタンパク質を、プロトマーの１つとして組み込むことができるであろう。
【０１１４】
実体がタンパク質層に結合されている一使用は、分子的実体のＸ線結晶解析を行うことである。この場合、タンパク質層の規則的構造によって、分子的実体が反復構造に対して所定の位置に保持されることが可能となり、それによって、それらが規則的アレイ及び規則的方位で保持される。Ｘ線結晶解析は、生化学研究及び合理的薬物設計において重要である。
【０１１５】
それに支持されている分子的実体のアレイを伴ったタンパク質層は、標準的なＸ線結晶解析技法を用いて調査できる。Ｘ線結晶解析における支持体としてのタンパク質層の使用は、Ｘ線結晶解析の現在の技法及びプロトコールに優る極めて多数かつ重要な利点を提供すると予測され、それらには以下のものが含まれる。
（１）有意に、より少量の分子が必要とされるであろう（おそらくミリグラムではなくマイクログラムの桁）。これは、以前には困難であった一部の標的の測定を可能にするであろう。
（２）アフィニティータグの使用は、多くの精製ステップへの通常の必要性なしに、構造決定を可能にするであろう。
（３）分子的実体を結晶させる必要がないであろう。これは、伝統的なＸ線構造決定における困難かつ時には打ち勝ちがたいステップである。
（４）必要な位相情報を得るために、新規結晶構造それぞれに関する結晶誘導体を得る必要がないであろう。大部分の散乱物質は、その都度、既知なタンパク質層であろうから、構造の決定は、結晶学の専門的技術が全くないか、あってもほとんどないコンピューター使用者によって、迅速に自動化及び実現できる。
（５）完全に新規な結晶化条件を必要とすることなく、タンパク質と化学物質（基質／薬物）との複合体及び他のタンパク質との複合体を試験できる。
（６）この方法は、極めて迅速であり、かつ一般的な適用性を有すると予測されており、それらは、時間及び費用の莫大な節約をもたらすであろう。
【０１１６】
生体内変換を触媒するのに使用するには、酵素をタンパク質層に結合させるか、タンパク質層の中に組み込むことができる。
【０１１７】
データ保存に使用するには、光学的又は電子的に活性なタンパク質を結合させることが可能でありうる。一例はバクテリオロドプシンであるが、他の多くのタンパク質がこの機能に使用できる。この場合、タンパク質層は、結合タンパク質を高度に順序づけられたアレイに保持し、それによって、アレイのアドレス指定を可能にする。上記タンパク質層は、データ保存で使用するためのタンパク質を保持する既存のマトリックスのサイズ制限を克服しうるであろう。
【０１１８】
ディスプレイで使用するには、それは、光活性又は蛍光性であるタンパク質を結合できるものでありうる。この場合、タンパク質層は、結合タンパク質を高度に順序づけられたアレイに保持し、それによって、画像を表示するための、アレイのアドレス指定を可能にする。
【０１１９】
荷電分離で使用するには、荷電分離過程を実施できるタンパク質を、タンパク質層に結合させるか、タンパク質層の中に組み込むことができる。その後、分離を行うように、例えば、ＡＴＰなどの「燃料」によって生化学的に、又はクロロフィルなどの光活性中心若しくはロドプシンなどの光活性タンパク質の場合には光学的にタンパク質を誘導できる。さまざまな電荷量分離過程、例えば、イオンポンピング又は光起電荷電の発生をこの方法で行うことができるであろう。
【０１２０】
ナノワイヤーとして使用するには、電気伝導ができるタンパク質を、タンパク質層に結合させるか、タンパク質層の中に組み込むことができる。異方性タンパク質層を使用すれば、特定の方向の電流を運ぶ能力を提供できうるであろう。
【０１２１】
モーターとして使用するには、膨張／収縮を誘発できるタンパク質を、タンパク質層に組み入れることができる。
【０１２２】
上記タンパク質格子は、鋳型として使用できる。例えば、タンパク質格子の細孔の中にシリコンを拡散させるか、又は別の方法で浸透させて、それによって、格子隙間を部分的又は完全に満たすことができるであろう。必要な場合には、その後、元の格子を含むタンパク質を、例えば、加水分解溶液の使用を介して除去することができる。
【０１２３】
実体がタンパク質層に結合している別の使用は、分子的実体の電子顕微鏡観察を行うことである。これは、実体の構造を決定するために行うことができる。上記実体は、高分子（例えばタンパク質又はＤＮＡ）又は高分子複合体（例えば、高分子と他の１つ又は複数の分子種との複合体）を含めた、いかなるタイプのものでもよい。
【０１２４】
まず、背景技術として、既知の電子顕微鏡観察技法について記述する。
【０１２５】
図４は、下記の通りに配置された透過型電子顕微鏡１０を模式的に示す。電子源１１は電子を発生する。対物レンズ系１２は、電子源１１からの電子ビームを試料１３へと方向付ける。影像レンズ系１４は、試料１３を透過した電子を、画像を生成するセンサー１５へと方向付ける。画像は、合焦画像でも、回折パターンでもよく、後者は、実体が規則的なアレイ（例えば、分子の管、２Ｄ結晶又は螺旋アレイ）で提示されている場合有用である。その分子種の複数の異なった視野に対応する複数の画像からの情報を、その後、３Ｄ再構成を生成するために結合することができる。
【０１２６】
試料調製及び顕微鏡内での提示は以下の通りに行われる。
【０１２７】
実際には、試料１３は、電子顕微鏡の試料ホルダー内で電子ビームに提示される。試料１３は、通常、銅グリッド上にマウンティングされる。これは、沈着炭素の薄層でコーティングされていてもよく、今度は、上記薄層がグリッドの穴の全体にわたって連続的であっても、試料が浮かぶ穴が残るように故意に不完全であってもよい（「レース状」炭素層）。
【０１２８】
試料マウンティングプロトコールの詳細は、試料が低温条件下で可視化されるか否かによる。
【０１２９】
低温条件用には、低温で氷を形成する傾向を最小限にするために凍結防止剤で増強されている媒体に試料１３を導入することができる。凍結防止剤の例には、グルコース及びトレハロースが含まれる。加えて、試料１３環境に、コントラスト増強成分を添加できる。コントラスト増強剤の一例はタンニンである。凍結保護の後に、試料１３を（場合によってはコーティングされた）銅グリッド上に導入し、１０００Åを超えない厚さの試料１３を生成させるために、過剰な試料及び包埋剤をブロッティングによって取り除き、グリッドを低温（＜２００Ｋ）環境中に導入する。冷却の速度は、凍結中における氷の形成と、その結果の試料損傷を回避するのに重要な因子である。高速冷却は、液体窒素中に、温度１２０Ｋ未満の気体窒素流中に、又は低温で、より揮発性が低い液体（プロパンなどの）の液槽中に、試料１３を投入することによって実現できる。凍結環境中への銅グリッドの迅速かつ再現可能な導入を確実にするのに、メカニカルステージを用いることができる。
【０１３０】
試料１３をガラス状凍結溶液で提示しない場合（すなわち非低温条件下）、画像化するべき物質の溶液を、炭素コーティングされた銅グリッド上に導入し、一定の時間、試料が炭素層に吸着するように放置し、その後、過剰な試料及び溶液をブロッティングによって取り除く。画像のコントラストを増強するため、及び放射線損傷の有害な帰結を最小限にするため、その後、試料１３を染色することができる。生物試料は本質的に低拡散を示すので、使用される染料は通常、それら自体で電子密度が高く、それゆえ強く拡散するものもある。したがって、使用される染色は通常、「陰性染色」であり、記録される画像は、染色されているところでは暗く、試料の存在によって染料が除去されている領域では、より明るい。酢酸ウラニルが陰性染料の一例である。
【０１３１】
データ収集は以下の通りに行われる。
【０１３２】
合焦画像を得る場合、実際には、完全な焦点から離れた画像が記録される。これは画像内にコントラストを生じさせるためになされるが、それは、画像の劣化をもたらす。詳細には、画像から計算されたフーリエ項を「コントラスト伝達関数」（ＣＴＦ）によって調節する。ＣＴＦは、散乱角に対応する関数である様式でフーリエ項の振幅を調節する。補正されたフーリエ項は、ひとたびデフォーカス及び非点収差の程度が特徴付けられたならば、通常、適切なスケーリングによって回復できる。所与のデフォーカスで、ＣＴＦは、特定の散乱角に対応するフーリエ項にゼロの値を採用するであろう。したがって、これらの項は、後工程によって回復させることができない。逆格子空間における、対応する穴を埋めるため、あるデフォーカスで記録された画像でゼロ（又はゼロ近く）に調節されるフーリエ項が別のデフォーカスで測定可能な振幅を有するであろうように、さまざまなデフォーカスで画像を記録する。
【０１３３】
電子と試料との非弾性相互作用は、エネルギーの堆積をもたらし、今度はこれが、試料に損傷を引き起こす。この損傷は、試料中の分子の構造を分解する。この理由で、画像及び回折パターンは、比較的低用量の電子を用いて記録される。この実験的な限界は、一画像の視野内で捕捉された各分子種の記録画像では、信号雑音比が比較的低いことを意味する。これは、各画像が保持する、試料の構造に関する情報が比較的低解像度であることへと転換される。一般的に、信号雑音比の増強は、電子ビームに対して同じ（又は同様な）方位で観察される複数の分子の画像を有効に平均化することによって実現される。
【０１３４】
各画像は、その分子種の電子密度（又は、より正確には電位）分布の投影に近似する。したがって、単一分子の単一画像は、その分子の三次元構造を推論するのに十分な情報を含有していない。したがって、画像は、ビームに対して複数の方位で、試料から記録されなければならない。
【０１３５】
周期構造には、試料の一画像ではなく、回折パターンを記録することによって、フーリエ成分を直接的に測定することができる。依然として、後工程で、実験及び装置の他の特徴について補正しなければならないが、このアプローチは、ＣＴＦによる調節の複雑化を回避する。周期的な試料（例えば、２Ｄ結晶又は螺旋アレイ）では、反復単位（すなわち単位格子）のサイズ及び形に特徴的な個別の方向に散乱が集中するようになり、連続的な散乱関数ではなく、拡散パターン中の回折スポットをもたらす。「ブラッグ増幅」というこの過程は、容易に記録可能なシグナルを生じる。回折パターンを記録することのさらなる利点は、散乱パターン（すなわち、記録された特性）の強度が暴露中における試料の全体的な動きから独立していることである。そのような動きは熱変動、並びに電子ビームによって引き起こされる試料の特異的な加熱及び荷電によって引き起こされうる。焦点電子ではなく散乱パターン（すなわち画像ではなく回折パターン）を記録することの不利は、散乱パターンの記録がフーリエ項に関する位相情報を失うことである。同時に、その画像が収集される場合には、局所的な不完全が修正されうるが、パターン回折が収集される場合には、修正されない（わずかである）。
【０１３６】
電子断層撮影の場合、可視化するべき分子種の単一の例をさまざまな方位の極めて低用量を用いて画像化する。したがって、単一分子種が画像化される。これは、ある試料の各代表的分子がわずかに異なっているかもしれず、それによって、複数の画像の平均化及び３Ｄ再構成の両方が不適切になるという、他のアプローチの潜在的批判に取り組むものである。それは、単一種によって許容されうる電子用量が複数の方位での画像化全体にわたって広げられ、最終的には、これによって、実現できる３Ｄ再構成の解像度が制限されるという不都合を有する。
【０１３７】
データ分析は以下の通りに行われる。
【０１３８】
電子顕微鏡観察からのデータを分析するのに用いられるプロトコールは、主として、試料が周期的である（すなわち、２Ｄ結晶であるか、螺旋アレイに提示されている）か、又は非周期的である、すなわち、局所的回転対称を有しても、有していなくてもよいが、有意な並進対称性がない分離粒子として提示されているかによる。いずれの場合も、画像（回折データではなく）が収集されており、画像のフーリエ変換領域における強度分布の分析によって、試料のデフォーカス及び非点収差が特定される。画像全体で変化しうるこれらの値に基づいて、ＣＴＦ効果を補うのに適した補正を計算することができる。
【０１３９】
データ分析の１つのタイプは、単一粒子再構成である。これは、以下に示す、個別な実体の画像からの三次元（３Ｄ）画像再構成を可能にする。
【０１４０】
非周期的な試料に関しては、画像（回折パターンではなく）が記録される。分析は、記録された画像上に試料を位置づけることから始まる。非染色生体分子に関しては、これは重大な問題を示す。すなわち、本質的に低い信号雑音比は、これらの分子がバックグラウンドに対して明確でない可能性を意味する。それらが可視的である場合でさえ、そのような分子の画像化は、同じ分子種の他の画像と比較したそれらの方位の特徴付けを妨げるほど乏しいものでありうる。この問題は、可視化される分子種が小さい場合には、より悪化する。実際には、併せた分子量が約１２５ｋＤａ未満の高分子（又は高分子複合体）の非晶質試料に従来のＥＭを適用することは容易に可能なことではない。
【０１４１】
複数の分子種の位置決定をして（高雑音）画像の「データセット」を構築した後、次の段階は分類である。この段階では、分子種の画像がグループ分けされ、それによって、同様な視野を表すものを相互に関連付けた。とりわけ、炭素支持体が使用される場合には、データセット中には有限なセットのそのような視野が存在しうる。そのようなクラスター内に含まれる粒子の画像を平均化して「クラス平均」が得られる。１セットのクラス平均の相対的方位は、「共通線」又は同様なアプローチによって決定される。最終的に、これは、３Ｄ再構成を可能にするために、複数の異なった視野からの情報が逆空間で集合するのを可能にする。
【０１４２】
別のタイプのデータ分析は、二次元（２Ｄ）結晶解析による分析である。これは周期的な試料に適用できる。データは、画像又は、回折パターンとして収集されたものでありうる。
【０１４３】
結晶格子の画像において、格子の幾何学的配置及び位置の認識は、画像化するべき分子種の複数のコピーの位置を予測するのに容易に利用される手段を提供する。平均化は、実空間（個々の単位格子画像が合計されている空間）で行うことも、逆空間で行うこともできる。後者のアプローチでは、画像をフーリエ変換して、その画像の、周期的特性を有する部分、すなわち分子の規則的アレイによる散乱の結果生じる１セットの回折点を生成させる。残りの散乱（すなわち、回折点の位置に相当しない強度）はバックグラウンド及び雑音に由来する。したがって、すべてのオフピーク強度をゼロに設定し、さらなるフーリエ変換を行うことによって、視野内の複数の単位格子を平均化することができる。この過程はフーリエフィルタリングと呼ばれる。「アンベンディング（ｕｎｂｅｎｄｉｎｇ）」という過程によって、実空間平均画像及びフーリエフィルタリングされた画像の両方を強化することができる。この過程で、格子の局所的な歪みを特定し（通常は自己相関法によって）、画像を補正するのに用いて、格子がいかなる局所的な歪みも受けていなかった場合に現れるであろう像を生成させることができる。
【０１４４】
結晶格子の回折パターンは、フーリエ成分の振幅を直接測定するのに使用できる。これらの項の位相は、タンパク質結晶解析で使用されるものと同様な方法を用いることによってのみ確定できる。これらには、同形置換（ＩＲ）、分子置換（ＭＲ）及び密度修正（ＤＭ）が含まれる。ＩＲには、構造の一部を付加（又は置換）する前後に回折を測定しなければならない。ＭＲには、既知の構造又は電子密度分布を用いて、未知構造の位相を計算することができる。ＤＭには、低解像度項の位相が利用可能でなければならず（例えば上記の画像の分析から）、位相が伸長するのに従って、漸進的に高い分離度項をこの過程に含めて、平均化及び溶媒平坦化（ｓｏｌｖｅｎｔ  ｆｌａｔｔｅｎｉｎｇ）を繰り返し課すことによって、高解像度項の位相調整を実現する。
【０１４５】
ビームに対する結晶の配置は、結晶内の反復単位の幾何学的配置（単位格子幾何学的配置）が既知であるという条件で、直接記録されるか、又は画像のフーリエ変換によって計算されうる、回折点の見かけの幾何学的配置から推論できる。格子の重要な部分の構造が既知である場合、実験的に記録された画像における、格子の方位を評価するのに、格子のこの部分の計算画像も使用できる。したがって、複数の傾き角で収集された、複数の方位の複数の画像からの情報を容易に併せて、３Ｄ画像再構成を行うことができる。
【０１４６】
これより、タンパク質格子上に支持された分子的実体の画像化への適用について説明する。タンパク質層の反復構造内の所定の位置に実体がそれぞれ支持されるので、恩恵が生じる。
【０１４７】
例えば、図４に示すような従来の透過電子顕微鏡１０が使用されうる。画像化は、図５に示す方法を用いて行われる。
【０１４８】
最初に、ステップＳ１で、分子的実体がそれに結合しているタンパク質格子を調製する。これは、上述の技法を用いて行われる。上記タンパク質格子を有する、透過電子顕微鏡１０用の試料１３を、上記に論じた通り、標準的な手順を使用して調製する。
【０１４９】
タンパク質層に実体を結合さるための２つのアプローチは以下の通りである。
【０１５０】
最初のアプローチでは、タンパク質層を含有する溶液（又は懸濁液）中に実体を添加する。それによって、溶液中の層に実体が結合する。その結果得られた層に、その後、上述の通り、低温電子顕微鏡観察用又は非低温電子顕微鏡観察用に、染色又は非染色で、試料調製を施す。
【０１５１】
第２のアプローチでは、最初に、コーティングされた銅グリッドの炭素層上に、上記タンパク質層を沈着させて、電子顕微鏡１０の試料ホルダーを形成させる。続いて、実体を導入する。この場合、炭素コーティングされたグリッド上に、タンパク質格子の懸濁液を置き、吸着を起こさせ、過剰な結晶及び周囲の溶液を除去し、標的分子種の溶液を導入する。インキュベーション中に、結晶への標的の結合が起こり、その後、過剰な標的及び周囲の溶液を除去する。これに続く、低温電子顕微鏡観察用又は非低温電子顕微鏡観察用の試料調製は、上述の通りである。
【０１５２】
分子的実体の構造の最適な解像度を得るには、あらゆる軸に対して、分子的実体が同一方位に整列されていることが好ましい。オプションであるステップＳ２では、タンパク質格子に対して、分子的実体を整列させる。
【０１５３】
独立的に、又は組み合わせて実行できる、分子整列の２つの可能な方法は以下の通りである。
【０１５４】
第１のアラインメント方法は、それらの内因的双極子又は誘発双極子によって分子的実体を整列させるために、「最初」のタンパク質層構成要素の主要な対称軸に平行なベクトルを有する電場をかけるものである。
【０１５５】
第２のアラインメント方法は、その間に、標的分子が同一の最小エネルギー配置にまでゆっくりと冷却される熱アニーリングの過程を介した、分子的実体とタンパク質層との間の極性及び／又は疎水性相互作用を利用するものである。
【０１５６】
ステップＳ３では、画像化を行って、画像を得る。そのようなデータ収集は、例えば、上述の通り、従来のＥＭ用の標準プロトコールを用いて行う。例として、画像は、一連のデフォーカスステップで収集でき、かつさまざまな角度にわたって格子を画像化する顕微鏡の傾斜台を用いても収集できる。標的分子の方位が良好な場合には、一連の電子線回折画像も有用に収集できる。
【０１５７】
ステップＳ４では、画像のデータ分析を行う。以下の通り、さまざまなデータ分析技術が適用できる。
【０１５８】
根底にある格子に対して、それぞれの結合標的分子のほぼ共通な方位を課すことが可能である場合には、上述の通り、２Ｄ結晶解析によるデータ分析を行うことができる。これは、標的分子の３Ｄ再構成の取得を可能にする。
【０１５９】
単一粒子画像再生ツールを、２Ｄ周期的アレイの画像再構成に理論的に適用することもでき、これが、改善された画像再構成を提供する場合には、タンパク質層及び結合の分子的実体を画像化するのに、そのアプローチも用いられる。ハイブリッド法は、それによって、２Ｄ結晶解析の一部のコンピューター技法が単一粒子像解析のコンピューター技法と併用される方法であるが、これが適している場合には、これも使用される。
【０１６０】
各結合標的分子のおよその共通方位を課すことが可能でない場合、単一粒子３Ｄ再構成及び２Ｄ結晶解析に関して上記に概説した方法の組合せを適用する。この組合せでは、タンパク質格子それ自体の構成要素を同定し、それらを画像から差し引く。
【０１６１】
タンパク質格子の構成要素は、上述の通り、タンパク質層及び結合分子的実体の１つ又は複数の記録画像の分析から取得できる。代替として、タンパク質格子の構成要素は、別個に取得された参照画像、又は事前に取得された保存画像から取得してもよい。
【０１６２】
これは、各画像の格子成分を同定して、除去することを可能にする。この結果得られる差分画像は、実体が、たとえ部分的にランダムな方位であっても、タンパク質層の構造と同じ反復パターンを有する位置に空間的に配置されていた場合記録されていたであろう単離された実体の画像である。
【０１６３】
その後、上述の通り、単一粒子再構成を行う。この過程は、それらがタンパク質層の既知な位置に結合する結果として、タンパク質層が画像上の容易に予測される位置で見出されるであろうという事実によって促進され、それらの位置及び方位は容易に特定される。参照画像のサブトラクションは、上述した、単一粒子３Ｄ再構成の第１ステップ（粒子ピッキング）を効果的に実現する。同様に、分子の整列の度合いは、粒子分類法に適用され、かつ寄与する可能性が高い。
【０１６４】
変種
本明細書では、タンパク質配列の相同体に言及する。そのような相同体は、通常、例えば少なくとも１５、２０、３０、１００アミノ酸以上の連続した領域にわたって、少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０、９０％、９５％、９７％又は９９％の相同性を有する。相同性は、アミノ酸の同一性に基づいて計算することもできる（時には「ハードホモロジー」と呼ばれる）。
【０１６５】
例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を計算するのに使用できるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供している（例えば、そのデフォルトセッティングで使用する）（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（１９８４年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２、３８７〜３９５ページ）。相同性を計算するか、又は配列を整列させる（同等又は対応する配列の同定など）のには、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．（１９９３年）、Ｊ  ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ３６：２９０〜３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９０年）、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３〜１０ページに記載されているＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いることができる（通常それらのデフォルト設定で）。
【０１６６】
ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して公的に利用可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させた際に、なんらかの正の値の閾値スコアＴに一致するか、それを満たすクエリー配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定する。Ｔは、近傍ワードスコアスコア閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、同上）と呼ばれる。これらの初期近隣ワードヒットは、それらを含有するＨＳＰを見出すための検索を開始するための種子として働く。ワードヒットは、累積整列スコアが増大できる限り、各配列に沿って両方向に伸長する。各方向におけるワードヒットの伸長が止まるのは、累積整列スコアが、それが達した最大の値からＸの量低下した場合、１つ又は複数の負スコアの残基配列の蓄積により、累積スコアがゼロ以下になった場合、又は配列のいずれかの末端に達した場合である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ及びＸは、整列の感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５〜１０９１９を参照）、５０の整列（Ｂ）、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両方の鎖の比較を用いる。
【０１６７】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計的分析を行う；例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５７８７を参照。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の尺度の１つが、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのアミノ酸配列間の一致が偶然起こる確率の指標を示す。例えば、ある配列が別の配列に類似していると考えられるのは、第２の配列と第１の配列とを比較して、最も小さい合計確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満そして最も好ましくは約０．００１未満である場合である。
【０１６８】
相同配列は通常、少なくとも２、５、１０又は２０個以上の変異（それらはアミノ酸の置換でも、欠失でも、挿入でもよい）で相違している。相同配列は通常、最大でも５、１０又は２０個以上の変異（それらはアミノ酸の置換でも、欠失でも、挿入でもよい）で相違している。通常、配列における最大４０％までのアミノ酸に変異導入されている。これらの変異は、相同性の計算に関して、上述の領域の任意のもの全体にわたって測定されうる。置換は、保存的な置換が好ましい。これらは以下の表によって定義する。第２のカラムの同じブロックにあるアミノ酸、及び好ましくは第３のカラムの同じ列にあるアミノ酸は、相互に置換できる。
【０１６９】
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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