(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステロイドに由来するセコジオンを還元する酸化還元酵素活性を有するポリペプチドであって、配列番号８の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を示す核酸配列によってコードされることを特徴とする該ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号３のアミノ酸配列を有し、および／または配列番号８の核酸配列によりコードされることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
カンジダ・マグノリアエ（Candida magnoliae）ＣＢＳ  ６３９６から得られる、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
一般式Ｉのセコジオン誘導体を還元するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用であって、
【化４】
0005627546.tif 000007
R1は、水素またはC1−C4アルキル基であり、
R2は、水素、C1−C8アルキル基、またはエステルであり、
R3は水素、メチル基、またはハロゲンであり、
構造要素
【化５】
0005627546.tif 000008
は、ベンゼン環、または０、１もしくは２のC−C二重結合を有するC6環を表し、
二重結合は、６／７または７／８位において含まれていてよく、
１、２、４、５、６、７、８、１１、１２、および１６位の炭素が、それぞれ、水素、C1−C4アルキル基、ハロゲン、及びフェニル基から選択される置換基を有することを特徴とする該使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般式Ｉのセコジオン誘導体のエナンチオ選択的な酵素的還元の方法に関するものであり、ここで、セコジオン誘導体は、コファクターとしてNADHまたはNADPHの存在下、酸化還元酵素／脱水素酵素を用いて還元される。
【背景技術】
【０００２】
ステロイドホルモンの工業的調製には、互いに独立した二つの方法があり、つまり、一方は植物源由来の天然ステロイド化合物から出発し、もう一方は、プロキラル前駆体からエナンチオ選択的な合成により完全に合成される方法である。特に、天然に生じるステロイド中に含まれない構造要素を導入できるため、それら二つの方法のうち、ステロイド全合成はますます重要性を増している。
【０００３】
鏡像異性的に純粋なステロイドの全合成の重要な要素は、よって一般式Ｉの化合物であり、セコステロイド、８，１４−セコ−ゴナ−テトラエン−１４，１７−ジオン、またはセコジオンとも呼ばれる。このグループの具体的な代表は、例えば、メチルセコジオン（式II、１３−メチル−３−メトキシ−８，１４−セコ−ゴナ−１，３，５（１０），９（１１）−テトラエン−１４，１７−ジオン）およびエチルセコジオン（式III、１３−エチル−３−メトキシ−８，１４−セコ−ゴナ−１，３，５（１０），９（１１）−テトラエン−１４，１７−ジオン）があり、それらは、例えば、薬理活性化合物であるエチルエストラジオール（式IV）およびノルゲストレル（式V）から生産することができる。
【０００４】
【化１】
0005627546.tif 000002
【０００５】
鏡像異性的に純粋なステロイド化合物の調製における重要な工程は、ケト基の一つをヒドロキシ基とするエナンチオ選択的な還元による、式Iの化合物（例えばIIおよびIII）の、前もって作った不斉C−１３を用いた光学的に活性な化合物への変換である。結果として生じる光学的に活性なヒドロキシセコステロイド化合物（セコール（secoles）、式VIからIX）は、連続的に、環化によりキラルステロイド化合物へと処理することができ、その間、キラリティーは維持される。
【０００６】
式Iの化合物のケト基のエナンチオ選択的な還元により、４つの光学的に活性な化合物が、理論的には、形成されうる（式VIからIX）。
【０００７】
【表１】
0005627546.tif 000003
【０００８】
ヒドロキシ基が１７位においてβ−立体配置を示す式VIの化合物は、それらが天然のエストロンの誘導体となるため、特に経済的に興味深い。そのような化合物は、１７−β−ヒドロキシセコステロイドとも呼ばれる。
【０００９】
さまざまな微生物を用いた、一般式Iのセコジオン誘導体の立体選択的な還元は、特に６０年代および７０年代に徹底的に実験された。そうすることで、カンジダ属、デバロマイセス属、クロエケラ属、ピキア属、クリプトコッカス属、ロドトルラ属、トルロプシス属、およびハンゼヌラ属のさまざまな酵母株が、セコジオンを多様なヒドロキシ化合物に還元できることを示すことができた（米国特許3616226、米国特許1252524、米国特許3616225）。
【００１０】
特に、例えばＳ．ウバルム（S. uvarum）等のようなサッカロマイセス属の酵母は、例えば各１７−β−ヒドロキシセコステロイドを調製するために有利に使用されうる（Kosmol et al; Liebigs Ann. Chem. 701,199 (1967)）。例えばサッカロマイセス・ドロソフィラルム（Saccharomyces drosophilarum）等のような他の酵母株は、セコジオンを還元し、好ましくは対応する１４−α−ヒドロキシセコステロイドとする（Acta microbiol. Acad. Sci. hung. 22,463-471 (1975)）。さらに、１４−α−ヒドロキシセコステロイドは、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）を用いたセコジオンの還元によっても記載されている（Kosmol et al.; Liebigs Ann. Chem. 701,199 (1967)）。
【００１１】
ゲスターゲン剤およびエストロゲン剤は、避妊薬として、およびホルモン補充療法において、世界中で広く使用されている。今まで、エストロゲン誘導体およびゲスターゲン誘導体のほとんどの合成は、上記の反応原理に基づいており、その重要な工程はセコジオンの、対応する１７−β−ヒドロキシセコステロイドへのエナンチオ選択的な還元である。
【００１２】
そうすることで、今まで、セコジオン誘導体の立体選択的な還元は、ピキア属またはサッカロマイセス属のさまざまな酵母株を用いる全細胞生体内変換として行われてきた。しかし、それらの方法は、１％をはるかに下回る非常に低い基質濃度（通常１から５ｇ／ｌ）しか適さないという不都合がある（米国特許3697379、Current Science, Feb. 5 (1984), Vol 53. No. 3, p. 124、Indian Journal of Experimental Biology, Vol.27, August 1989, p. 742-743）。よって、特に、反応物の再処理および大きな容量からの単離、ならびに大量のバイオマスからの分離が非常に複雑になる。発明者の知る限りでは、還元に関与する酵素は、今まで単離、同定、開示されていない。同様に、それによりセコジオン誘導体の還元が達成される酸化還元酵素をコードするDＮＡ配列は、まだ同定されていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
したがって、本発明の目的は、一般式Iのセコジオン誘導体、特に式IIおよびIIIのセコジオン誘導体をエナンチオ選択的に還元することができる方法を提供することである。このようにして、特に、対応する１７−β−ヒドロキシセコステロイドの合成も実現可能とする。
【００１４】
第一の面では、前記目的は、本発明に従い、一般式Iのセコジオン誘導体のエナンチオ選択的な酵素的還元の方法によって達成され、
【化２】
0005627546.tif 000004
ここで、環構造は、一またはいくつかのヘテロ原子を含み、または含まず、
R1は、水素またはC1−C4アルキル基であり、
R2は、水素、C1−C8アルキル基、または例えばエステル等のような先行技術において知られているOHのための保護基であり、
R3は水素、メチル基、またはハロゲンであり、
構造要素
【化３】
0005627546.tif 000005
は、ベンゼン環、または０、１もしくは２のC−C二重結合を有するC6環を表し、
二重結合は、６／７または７／８位において任意に含まれ、
１、２、４、５、６、７、８、９、１１、１２、および１６位の炭素は、それぞれ、水素、C1−C4アルキル基、ハロゲン、またはフェニル基で置換される、
セコジオン誘導体は、コファクターとしてNADHまたはNADPHの存在下、酸化還元酵素／脱水素酵素を用いて還元され、
該方法は、セコジオン誘導体が、反応バッチ中で、≧１０g／lの濃度で使用されること、および酸化還元酵素／脱水素酵素により形成される、酸化されたコファクターNADまたはNADPが連続的に再生されることを特徴とする。
【００１５】
この方法は、先行技術を上回る、セコジオン誘導体のエナンチオ選択的な酵素的還元の顕著な改善を示す。本発明に従う方法は、遊離の酵素を用いた、先行技術に記載された濃度をはるかに超える濃度範囲における、セコジオン誘導体の、さまざまな対応するヒドロキシセコステロイドへの還元を可能にする。
【００１６】
第二の面では、上記目的は、本発明に従い、一般式Iのセコジオン誘導体のエナンチオ選択的な酵素的還元の方法によって達成され、ここで、セコジオン誘導体は、コファクターとしてNADHまたはNADPHの存在下、酸化還元酵素／脱水素酵素を用いて還元され、該方法は、酸化還元酵素／脱水素酵素が、
ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％のアミノ酸が一致するアミノ酸配列を含む、
ｂ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０の核酸配列によりコードされる、または
ｃ）ストリンジェントな条件下、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０にハイブリダイズする核酸配列によってコードされる
ことを特徴とする。
【００１７】
本発明者は、セコジオン誘導体をヒドロキシセコステロイドに還元することができ、工業規模で組換えて産生されうる酸化還元酵素を同定した。本発明に従う方法により、現在使用されている全細胞を用いた方法よりも、顕著に高い基質濃度を達成することができる。
【００１８】
本発明に従う方法において、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５、またはそれらのポリペプチドに由来するポリペプチドを有する酸化還元酵素は、完全に精製された状態で、部分的に精製された状態で、または配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５のポリペプチドを含む細胞として、使用することができる。それによって、使用される細胞は、自然の、透過処理された、または溶解された状態で提供されうる。好ましくは、酸化還元酵素およびそれに由来する誘導体は、それぞれ、例えば大腸菌等のような適した宿主生物中で過剰発現され、組換えポリペプチドは、一般式Iのセコジオン誘導体の還元のために使用される。
【００１９】
配列番号１のポリペプチドをコードする配列番号６のDNA配列は、例えば、生物クロロフレクサス・アウランティアクス（Chloroflexus aurantiacus）DSM 635のゲノムから得ることができる。
【００２０】
配列番号２のポリペプチドをコードする配列番号７のDNA配列は、例えば、生物ルブロバクター・キシラノフィラス（Rubrobacter xylanophilus）DSM 9941のゲノムから得ることができる。
【００２１】
配列番号３のポリペプチドをコードする配列番号８のDNA配列は、例えば、酵母カンジダ・マグノリアエ（Candida magnoliae）CBS 6396から得ることができる。
【００２２】
配列番号４および配列番号５の酸化還元酵素は、例えば、カンジダ・マグノリアエ（Candida magnoliae）DSMZ 70638からホモロジースクリーニングによって得ることができる。
【００２３】
ストリンジェントな条件下、例えば配列番号６にハイブリダイズする核酸配列は、DNAプローブとして配列番号６または配列番号６の部分配列を用いて、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法、または同等の方法により同定することができる、ポリヌクレオチドであると理解される。このために、フィルター上に固定されたポリヌクレオチドは、例えば、６０℃、０．７−１M塩化ナトリウム溶液中で、配列番号６にハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションは、例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition （Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）または同様の出版物に記載の通りに行われる。続いて、フィルターは、０．１から２倍濃度のSSC溶液を用いて６５℃で洗浄され、ここで、１倍濃度のSSC溶液は、１５０mＭ塩化ナトリウムと１５mMクエン酸ナトリウムからなる混合物であると理解される。
【００２４】
配列表が提供している配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のポリヌクレオチドに、前記ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも６０％の同一性、よりよくは少なくとも８０％の同一性、さらによりよくは９５％の同一性を示すべきである。
【００２５】
さらなる面では、上記目的は、本発明に従い、一般式Iのセコジオン誘導体のエナンチオ選択的な酵素的還元の方法によって達成され、ここで、セコジオン誘導体は、コファクターとしてNADHまたはNADPHの存在下、酸化還元酵素／脱水素酵素を用いて還元され、該方法は、酸化還元酵素／脱水素酵素が、２３０から２６０アミノ酸長を有し、［配列番号１８から配列番号４２］
nalvtgasrgig、nalvtggsrgig、nalitggsrgig、nalitgasrgig、nalitggsrgmg、halvtgasrgig、
gysvtla、gynvtla、gysvtlv、gynvtlv、
fkgaplpa、fkaaplpa、
fvsnag、ffsnag、fvcnag、fvanag、
spialtkal、spvaltkti、spialtktl、spvamtkal、sqialtkal、
avysask、avysatk、
pikgwiおよびpisgwi
からなる群から選択される一またはいくつかの部分配列を含むことを特徴とする。
【００２６】
本発明に従う方法において、NADHまたはNADPHはコファクターとして使用される。「NADP」という用語により、リン酸ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドが理解され、「NADPH」という用語により、還元されたリン酸ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドが理解される。「NAD」という用語は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを意味し、「NADH」という用語は、還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを意味する。
【００２７】
セコジオン誘導体が反応バッチ中で、≧１０g／lの濃度で使用され、酸化還元酵素／脱水素酵素により形成される酸化されたコファクターNADまたはNADPが連続的に再生される、本発明の好ましい実施態様に従うと、酸化還元酵素／脱水素酵素は
ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％のアミノ酸が一致するアミノ酸配列を含む、
ｂ）酸化還元酵素／脱水素酵素が、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０の核酸配列によりコードされる、または
ｃ）ストリンジェントな条件下、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０にハイブリダイズする核酸配列によってコードされる。
【００２８】
セコジオン誘導体が反応バッチ中で、≧１０g／lの濃度で使用され、酸化還元酵素／脱水素酵素により形成される酸化されたコファクターNADまたはNADPが連続的に再生される方法の他の好ましい実施態様に従うと、酸化還元酵素／脱水素酵素は、２３０から２６０アミノ酸長を有し、［配列番号１８から配列番号４２］nalvtgasrgig、nalvtggsrgig、nalitggsrgig、nalitgasrgig、nalitggsrgmg、halvtgasrgig、gysvtla、gynvtla、gysvtlv、gynvtlv、fkgaplpa、fkaaplpa、fvsnag、ffsnag、fvcnag、fvanag、spialtkal、spvaltkti、spialtktl、spvamtkal、sqialtkal、avysask、avysatk、pikgwiおよびpisgwiからなる群から選択される一またはいくつかの部分配列を含む。
【００２９】
本発明の第二および第三の面を参照する本発明に従う方法において、酸化還元酵素／脱水素酵素により形成される酸化されたコファクターNADまたはNADPは、好ましくは連続的に再生される。
【００３０】
本発明に従うすべての方法の好ましい実施態様に従うと、酸化されたコファクターNADまたはNADPは、アルコールの酸化によって再生される。
【００３１】
そうすることで、例えばエタノール、２−プロパノール、２−ブタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−ヘキサノール、２−ヘプタノール、２−オクタノール、またはシクロヘキサノール等のような、一級および二級アルコールは、共基質（cosubstance）として好ましく使用される。再生のための共基質（cosubstance）の割合は、全容量に基づいて、容量で５から９５％まで及んでいてもよい。
【００３２】
一般式RXRYCHOHを有する２級アルコールは、コファクターの再生産のために好ましく使用され、ここでRXおよびRYは、それぞれ、水素、分岐したまたは分岐していないC1−C8アルキル基、およびCtotal≧３である。
【００３３】
本発明に従う方法の他の好ましい実施態様に従うと、酸化還元酵素／脱水素酵素はコファクターの再生のためにさらに加えられる。
【００３４】
適したNADH依存性アルコール脱水素酵素は、例えば、パン酵母から、カンジダ・パラプローシス（Candida parapsilosis） (CPCR) (米国特許 5,523,223および米国特許 5,763,236、Enzyme Microb. Technol., 1993, 15(11):950-8)、ピキア・カプスラータ（Pichia capsulata）(ドイツ特許10327454.4)から、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）(RECR) (米国特許5,523,223)、ノカルジア・フスカ（Norcardia fusca）(Biosci. Biotechnol. Biochem., 63(10), 1999, p. 1721-1729; Appl. Microbiol. Biotechnol, 2003, 62(4):380-6; Epub 2003, Apr. 26) 、またはロドコッカス・ルバー（Rhodococcus ruber）(J. Org. Chem., 2003, 68(2):402-6).から得ることができる。それらのアルコール脱水素酵素に適した共基質は、例えば、２−プロパノール（イソプロパノール）、２−ブタノール、２−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−オクタノール、またはシクロヘキサノール等の、既に記載した２級アルコールである。
【００３５】
NADPHの再生に適した２級アルコール脱水素酵素は、例えば、上記に記載したもの、およびラクトバチルス目の生物、例えば、ラクトバチルス・ケフィア（Lactobacillus kefir）(米国特許5,200,335)、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）(ドイツ特許19610984 A1; Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 2000 Dec; 56 Pt 12:1696-8)、ラクトバチルス・マイナー（Lactobacillus minor）(ドイツ特許10119274)、ラクトバチルス・カルノサム（Leuconostoc carnosum）(A 1261/2005, Kl. C12N)から単離されたもの、または前述の通り、サーモアネロビウム・ブロッキ（Thermoanerobium brockii）、サーモアネロビウム・エタノリカス（Thermoanerobium ethanolicus）またはクロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）から単離されたものである。
【００３６】
しかし、他の酵素システムも、理論上、コファクターの再生のために使用することができる。例えば、コファクターの再生は、NADまたはNADP依存性ギ酸脱水素酵素を用いて実施されうる（Tishkov et al., J. Biotechnol. Bioeng. [1999] 64, 187-193, Pilot-scale production and isolation of recombinant NAD and NADP specific formate dehydrogenase）。ギ酸脱水素酵素の適した共基質は、例えば、ギ酸アンモニウム、ギ酸ナトリウム、またはギ酸カルシウム等のギ酸の塩である。
【００３７】
本発明に従う方法において達成されるTTN（全変換率＝還元されたセコジオン化合物のモル／使用されたコファクターのモル）は、通常１０2から１０5に及ぶが、好ましくは、≧１０3である。
【００３８】
好ましい実施態様に従って、本発明に従う方法は水有機二相系で行われる。
【００３９】
したがって、セコジオン誘導体の変換は、例えば、コファクター再生のための２−アルコール、酸化還元酵素、水、コファクター、およびセコジオン化合物を含む二相系で起こる。しかしながら、コファクター再生に関与しない、つまり、いかなる被酸化性のヒドロキシ基を含まない追加の有機溶媒を含むこともできる。ジエチルエーテル、三級ブチルメチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、酢酸エチル、酢酸ブチル、ヘプタン、ヘキサン、トルエン、ジクロロメタン、シクロヘキサン、またはそれらの混合物は、追加の有機溶媒として好ましく使用される。
【００４０】
それによって、二相系の非水混和性有機成分の量は、反応バッチの全容量に基づいて、１０％から９０％、好ましくは２０％から８０％に及んでもよい。水の量は、反応バッチの全容量に基づいて、９０％から１０％、好ましくは８０％から２０％に及んでもよい。
【００４１】
バッファーを水に添加することができ、例えば、５から１０、好ましくは６から９のpH値を有する、リン酸カリウム、tris／HCl、グリシン、またはトリエタノールアミンバッファーがある。また、バッファーは、両方の酵素を安定または活性化するためのイオン、例えばマグネシウムイオンまたは亜鉛イオンを含むことができる。
【００４２】
さらに、使用される酵素の安定化のためにさらなる添加剤は、本発明に従う方法において使用することができ、例えばグリセロール、ソルビトール、１，４−DL−ジチオトレイトール（DTT）またはジメチルスルホキシド（DMSO）がある。
【００４３】
コファクターNAD(P)Hの濃度は、水相に基づいて、０．００１mMから１０mM、特に０．０１mMから１．０mMに及ぶ。使用される酵素の特定の性質によって、温度は１０℃から７０℃、好ましくは２０℃から３５℃とすることができる。
【００４４】
通常、還元されるセコジオン誘導体は、水にあまり溶解しない。したがって、反応中、基質は完全に、または不完全に溶解した状態で提供されうる。基質が反応混合物中に完全に溶解しない場合、基質の一部は固体で存在し、よって第三の固相を形成しうる。反応混合物は、変換中、一時的にエマルジョンを形成してもよい。
【００４５】
本発明に従う方法において、一般式Ｉのセコジオン誘導体は、反応バッチ中で、全容量に基づいて、好ましくは１０ｇ／ｌから５００ｇ／ｌ、好ましくは２５ｇ／ｌから３００ｇ／ｌ、特に好ましくは５０ｇ／ｌから２００ｇ／ｌの量で使用される。
【００４６】
本発明の好ましい実施態様は、１３−エチル−３−メトキシ−８，１４−セコ−ゴナ−１，３，５（１０），９（１１）−テトラエン−１４，１７−ジオン（エチルセコジオン−式III）または１３−メチル−３−メトキシ−８，１４−セコ−ゴナ−１，３，５（１０），９（１１）−テトラエン−１４，１７−ジオン（メチルセコジオン−式II）が、セコジオン誘導体として使用されることをさらに特徴とする。
【００４７】
本発明に従う方法は、例えば、ガラスまたは金属で作られた反応容器中で行われる。このために、成分はそれぞれ反応容器に移され、例えば窒素または空気の雰囲気下で撹拌される。反応時間は、使用されるセコジオン化合物および酸化還元酵素によって、１時間から７日間、特に２時間から４８時間に及ぶ。その時間中、セコジオン化合物は、少なくとも５０％まで、対応するヒドロキシセコステロイド化合物に還元される。
【００４８】
以下に、本発明は、より詳細に実施例によって説明される。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００４９】
クロロフレクサス・アウランティアクス（Chloroflexus auratiacus）DSM 635からの酸化還元酵素のクローニング
Ａ）クロロフレクサス・アウランティアクス（Chloroflexus auratiacus）DSM 635の培養
クロロフレクサス・アウランティアクス（Chloroflexus auratiacus）DSM 635の細胞は、細菌のインキュベーター中、４８℃、光の下、以下の培養液（pH８．２）中で培養された：０．１％酵母抽出物、０．１％グリシルグリシン、０．０１％リン酸水素二ナトリウム・二水和物、０．０１％硫酸マグネシウム・七水和物、０．０１％硝酸カリウム、０．０５％硝酸ナトリウム、０．０１％塩化ナトリウム、０．００５％塩化カルシウム・二水和物、５ｍｌの０．０１％クエン酸鉄（III）溶液、１ｍｌの微量元素溶液ＳＬ-６［５００μｌ／ｌ硫酸、２．２８ｇ／ｌ硫酸マンガン・一水和物、５００ｍｇ／ｌ硫酸亜鉛・七水和物、５００ｍｇホウ酸、２５ｍｇ／ｌ硫酸銅・五水和物、２５ｍｇ／ｌモリブデン酸ナトリウム・二水和物、４５ｍｇ／ｌ塩化コバルト・六水和物］。培養１２日目、細胞は遠心分離により培養液から分離され、−８０℃にて保存された。
【００５０】
Ｂ）選択的な酸化還元酵素をコードする遺伝子の増幅
ゲノムDNAは、Manniatis & Sambrookによる「Molecular Cloning」に記載された方法に従って抽出された。得られた核酸は、NCBIデータベースに番号76258197で公開された遺伝子配列に由来する特異的なプライマーに関わるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のためのテンプレートとして役立った。そうすることで、プライマーは、発現ベクターへの次のクローニングのため、それぞれエンドヌクレアーゼNde IおよびHind IIIまたはSph Iの制限部位を有する５’末において提供された（配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３）。
【００５１】
増幅は、PCRバッファー［１０ｍＭ  Tris-HCl、（pH８．０）；５０ｍＭ塩化カリウム；１０ｍＭ硫酸マグネシウム；１ｍＭ  dNTP Mix；いずれの場合にも２０ｐＭｏｌのプライマーおよび２．５ＵのPlatinum Pfx DNA Polymerase（Invitrogen）］中で、５００ｎｇのゲノムDNAを用いて、以下の温度サイクルで行われた：
サイクル１：９４℃・２分
サイクル２ｘ３０：９４℃・３０秒、５６℃・３０秒、６８℃・６０秒
サイクル３：６８℃・７分、４℃・∞。
【００５２】
約７５０bpの大きさを有する、得られたPCR産物は、精製の後、１％アガロースゲル上でそれぞれエンドヌクレアーゼNde IとHind III、またはエンドヌクレアーゼSph IとHind IIIを用いて制限され（restricted）、それぞれpET21aベクター（Novagen）またはpQE70ベクター（Qiagen）のバックボーンにライゲートされた。バックボーンは、同じエンドヌクレアーゼで処理されている。２μｌのライゲーションバッチをE.coli Top10 F’cells（Invitrogen）に形質転換した後、アンピシリン（またはカナマイシン）耐性コロニーのプラスミドDNAは、それぞれエンドヌクレアーゼNde IとHind III、またはエンドヌクレアーゼSph IとHind IIIを用いた制限分析によって、７５０bpの大きさの挿入の存在がテストされた。フラグメントに陽性のクローン由来のプラスミド調製物は、配列分析がなされ、続いて、それぞれ、大腸菌Star（Invitrogen）および大腸菌RB791（genetic stock, Yale）に形質転換された。
【実施例２】
【００５３】
大腸菌中での組換えクロロフレクサス（chloroflexus）酸化還元酵素の発現
それぞれ、発現コンストラクトを用いて形質転換された大腸菌BL21 Star（Invitrogen、Karlsruhe、ドイツ）および大腸菌RB791（E. coli genetic stock, Yale、USA）は、それぞれアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）またはカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）を有する２００ｍｌLB培地（１％トリプトン、０．５％酵母抽出物、１％塩化ナトリウム）中で、５５０ｎｍにおける吸光度（OD）が０．５に届くまで培養された。組換えタンパク質の発現は、０．１mMの濃度でイソプロピルチオガラクトシド（IPTG）を添加することによって誘導された。２５℃において２２０rpmでの８時間または１６時間の誘導の後、細胞は回収され、−２０℃で凍結された。活性試験のために、１０mgの細胞は、５００μlの１００mM  TEAバッファーpH７．０と５００μlのガラスビーズと混合され、１０分間グローブミルを用いて消化された。得られたライセートは、それぞれの測定のため希釈された状態で使用された。活性試験は、以下の通りに構成された：８７０μlの１００mM  TEAバッファー  pH７．０、NADH１６０μg、希釈された細胞ライセート１０μl。反応は、１００μlの１００mM基質溶液を反応混合物に添加することにより開始された。
【００５４】
大量の酵素の回収のため、細胞３０gがトリエタノールアミンバッファー（１００mM、pH７、２mM塩化マグネシウム、１０％グリセロール）１５０mlに再懸濁され、高圧ホモジナイザーを用いて消化された。次に、酵素溶液は１５０mlのグリセロールと混合され、−２０℃で保存された。
【実施例３】
【００５５】
生物の培養およびエチルセコジオン（式III）の還元変換後のスクリーニング
スクリーニングのため、酵母株ピキア・ファリノサ（Pichia farinosa）DSM 70362、カンジダ・グロペンギエセリ（Candida gropengiesseri）MUCL 29836、カンジダ・バクチニ（Candida vaccinii）CBS 7318、ピキア・ファリノサ（Pichia farinosa）DSM 3316、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）CBS 1508およびカンジダ・マグノリアエ（Candida magnoliae）CBS 6396を、以下の培養液中で培養した：酵母抽出物（５）、ペプトン（５）、およびグルコース（２０）（括弧内の数字はいずれの場合もg／l）。培養液は１２１℃で滅菌され、酵母は２５℃、毎分１４０回転のシェーカー上で、さらなるpH調整なしで培養された。
【００５６】
式IIIのエチルセコジオンの、対応するヒドロキシセコステロイド化合物への還元変換は、以下の全細胞生体内変化バッチ中で試験された：新しく回収された細胞４００mgをバッチ中で、グルコース５０mg、式IIIのエチルセコジオン１０mg、および９００μlの１００mMトリエタノールアミンバッファー（TEA）pH７．０と一緒に、２８℃、１４００rpmで２４時間振とうした。次に、バッチをジクロロメタン１mlで抽出し、遠心分離し、窒素で乾燥し、アセトニトリル中に吸収された後、HPLC分析に加えた。
【００５７】
スクリーニング結果を表１にまとめる。
【表２】
0005627546.tif 000006
【００５８】
CBS6396株がエチルセコジオンの最も高い変換を示し、よって、cDNAライブラリーを調製するための出発生物として選ばれた。
【実施例４】
【００５９】
カンジダ・マグノリアエ（Candida magnoliae）CBS 6396からのcDNAライブラリーの調製と酸化還元酵素のクローニング
Ａ）単離（全およびmRNA）およびcDNAライブラリーの調製
生きた細胞６００mgを、氷冷LETSバッファー２．５ml中に再懸濁した。硝酸で洗浄されて３mlのフェノール（pH７．０）を用いて平衡されたガラスビーズ５ml（約２０g）を前記細胞懸濁液に加えた。バッチ全体は、交互にボルテックス３０秒と氷上で冷却３０秒、合わせて１０分間処理された。次に、氷冷LETSバッファーを添加し、これを再び勢いよくボルテックスした。前記細胞懸濁液は、４℃、１１０００gで５分間遠心分離された。水相は回収され、２回、等量のフェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコール（２４：２４：１）を用いて抽出された。続いてクロロフォルムを用いた抽出が行われた。最後の抽出の後、全RNAは、１／１０容量の５M塩化リチウムを添加することにより、−２０℃で４時間沈殿された。
【００６０】
得られた全RNA１mgは、Oligo-dT cellulose（NEB Biolabs）を用いて、mRNA分子を濃縮するために使用された。続く沈殿の後、mRNA５μgは、cDNA合成のために使用された（pBluescript IIXR cDNA Library Construction kit, Stratagene）。製品の使用説明書に従って作成されたライブラリーは、XL-10 Gold E.coliに形質転換され、ADH活性がスクリーニングされた。コファクターとしてのNADPHまたはNADHおよび基質としてのエチルセコジオン（式III）の吸光度の低下に基づいて、クローン（cM４）が同定、単離された。プライマーT７およびプライマーT3を用いて単離されたプラスミドの配列は、７８９bpのORFとなった。前記フラグメントは、２６２アミノ酸長を有する融合タンパク質をコードし、β−ガラクトシダーゼのａ−フラグメントと推定上の短鎖アルコール脱水素酵素からなる。
【００６１】
Ｂ）PCRによるカンジダ・マグノリアエ（Candida magnoliae）CBS 6396由来の短鎖ADHをコードする全長転写物の合成
特異的なプライマーが、適した発現系への全長転写物のクローニングのために作成された。そうすることで、それぞれNde IおよびSph Iの認識配列を有する５’プライマー、およびそれぞれXho IおよびSac Iの認識配列を有する３’プライマーが修正された（配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７）。カンジダ・マグノリアエ（Candida magnoliae）の発現ライブラリーのクローン（cM４）から単離されたプラスミドDNAは、ポリメラーゼ連鎖反応のためのテンプレートとして役立った。増幅は、PCRバッファー［１０ｍＭ  Tris-HCl（pH  ８．０）；５０ｍＭ塩化カリウム；１０ｍＭ硫酸マグネシウム；１ｍＭ  dNTP Mix；いずれの場合にも２０ｐＭｏｌのプライマーおよび２．５ＵのPlatinum Pfx DNAポリメラーゼ（Invitrogen）］中で、テンプレート５０ｎｇを用いて、以下の温度サイクルで行われた：
サイクル１：９４℃・２分
サイクル２x３０：９４℃・１５秒、５８℃・３０秒、６８℃・７５秒
サイクル３：６８℃・７分、４℃・∞。
【００６２】
得られたPCR産物は、精製の後、１％アガロースゲル上でそれぞれエンドヌクレアーゼNde IとXho I、またはエンドヌクレアーゼSph IとSac Iを用いて制限され、それぞれpET21aベクター（Novagen）またはpQME70ベクターのバックボーンにライゲートされた。バックボーンは、同じエンドヌクレアーゼで処理されている。２μｌのライゲーションバッチをE.coli Top10 F’cells（Invitrogen）に形質転換した後、アンピシリン（またはカナマイシン）耐性コロニーのプラスミドDNAは、それぞれエンドヌクレアーゼNde IとXho I、またはエンドヌクレアーゼSph IとSac Iを用いた制限分析によって、７５０bpの大きさの挿入の存在がテストされた。発現コンストラクトpET21−MgIVおよびpQME70−MgIVが配列決定された。短鎖酸化還元酵素をコードするカンジダ・マグノリアエ（Candida magnoliae）由来の遺伝子は、全長７２９bpのオープンリーディングフレームを有し（配列番号８に含まれる）、それは２４３アミノ酸からなるタンパク質に対応する（配列番号３）。
【実施例５】
【００６３】
大腸菌細胞における組換え酸化還元酵素の発現
コンピテント大腸菌StarBL21(De3)細胞(Invitrogen)およびRB791細胞(E. coli genetic stock, Yale, USA)は、それぞれ、酸化還元酵素をコードする発現コンストラクトpET21−MgIVおよびpQME70−MgIVで形質転換された。発現コンストラクトで形質転換された大腸菌コロニーは、それぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンまたは４０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２００ｍｌLB培地（１％トリプトン、０．５％酵母抽出物、１％塩化ナトリウム）中で、５５０ｎｍにおける吸光度が０．５に届くまで培養された。組換えタンパク質の発現は、０．１mMの濃度でイソプロピルチオガラクトシド（IPTG）を添加することによって誘導された。２５℃において２２０rpmでの１６時間の誘導の後、細胞は回収され、−２０℃で凍結された。活性試験のために、１０mgの細胞は、５００μlの１００mM  TEAバッファーpH７．０、１ｍM塩化マグネシウムおよび５００μlのガラスビーズと混合され、１０分間グローブミルを用いて消化された。得られたライセートは、それぞれの測定のため希釈された状態で使用された。
【００６４】
活性試験は、以下の通りに構成された：９６０μlの１００mM  TEAバッファー  pH７．０、１ｂｍM塩化マグネシウム、NADH１６０μg、希釈された細胞ライセート１０μl。反応は、１０μlの１００mM基質７０％メタノール溶液を反応混合物に添加することにより開始された。
【００６５】
大量の酵素の回収のため、細胞３０gがトリエタノールアミンバッファー（１００mM、pH７、２mM塩化マグネシウム、１０％グリセロール）１５０mlに再懸濁され、高圧ホモジナイザーを用いて消化された。次に、酵素溶液は１５０mlのグリセロールと混合され、−２０℃で保存された。
【実施例６】
【００６６】
酸化還元酵素  配列番号１によるエチルセコジオン（式III）の還元
エチルセコジオン（式III）の還元のため、バッファー（１００ｍＭリン酸カリウム、pH＝７、２ｍＭ塩化マグネシウム）８００μｌ、２−プロパノール１．２ｍｌ、ＮＡＤ０．０８ｍｇ、エチルセコジオン（式III）１００ｍｇおよび酵素懸濁液酸化還元酵素  配列番号１（実施例３参照）１ｍｌの混合物を、反応容器中、室温にて２４時間、ずっと一定に混合しながら培養した。９６時間後、使用したエチルセコジオン（式III）の＞９０％が還元されていた。
【００６７】
反応が完結すると、反応混合物は、ジクロロメタンを用いた抽出によって再処理され、産物を含む有機相が分離され、１７−β−ヒドロキシ化合物（エチルセコール）が、溶媒を蒸発／蒸留することによって得られた。
【００６８】
エチルセコジオンのエチルセコールへの変換は、HPLCによって追跡された。このために、分離カラムEC125/4 Nucleodur 100-5 C18ec（Machery-Nagel、Duren、ドイツ）は、アセトニトリルおよび水を溶媒として一緒に使用された。分析のため、３０％から７０％の溶媒中アセトニトリル部分の線形勾配が適用された。反応産物の同定は、基準物質と比較することによって行われた。
【実施例７】
【００６９】
酸化還元酵素  配列番号２によるエチルセコジオン（式III）の還元
エチルセコジオン（式III）の還元のため、バッファー（１００ｍＭ  トリエタノールアミン、pH＝８、２ｍＭ塩化マグネシウム）２５０μｌ、４−メチル−２−ペンタノール２５０μｌ、NAD０．０２ｍｇ、エチルセコジオン（式III）２５ｍｇおよび酵素懸濁液酸化還元酵素  配列番号２（実施例３参照）２５μｌの混合物を、反応容器中、室温にて９６時間、ずっと一定に混合しながら培養した。９６時間後、使用したエチルセコジオン（式III）の＞３０％がヒドロキシ化合物に還元されていた。
【００７０】
反応が完結すると、反応混合物は、ジクロロメタンを用いた抽出によって再処理され、産物を含む有機相が分離され、１７−β−ヒドロキシ化合物（エチルセコール）が、溶媒を蒸発／蒸留することによって得られた。
【実施例８】
【００７１】
酸化還元酵素  配列番号３によるエチルセコジオン（式III）の還元
エチルセコジオン（式III）の還元のため、バッファー（１００ｍＭ  トリエタノールアミン、pH＝７、２ｍＭ塩化マグネシウム）１００μｌ、４−メチル−２−ペンタノール４００μｌ、NADP０．０２ｍｇ、エチルセコジオン（式III）２５ｍｇおよび酵素懸濁液酸化還元酵素  配列番号３（実施例３参照）１００μｌの混合物を、反応容器中、室温にて７２時間、ずっと一定に混合しながら培養した。７２時間後、使用したエチルセコジオン（式III）の＞９５％がヒドロキシ化合物に還元されていた。
【実施例９】
【００７２】
酸化還元酵素  配列番号４によるエチルセコジオン（式III）の還元
エチルセコジオン（式III）の還元のため、バッファー（１００ｍＭ  トリエタノールアミン、pH＝９、２ｍＭ塩化マグネシウム）２００μｌ、２−ヘプタノール３００μｌ、NADP０．０２５ｍｇ、エチルセコジオン（式III）１００ｍｇおよび酵素懸濁液酸化還元酵素  配列番号４（実施例３参照）５０μｌの混合物を、反応容器中、室温にて７２時間、ずっと一定に混合しながら培養した。７２時間後、使用したエチルセコジオン（式III）の＞８０％がヒドロキシ化合物に還元されていた。
【実施例１０】
【００７３】
酸化還元酵素  配列番号５によるエチルセコジオン（式III）の還元
エチルセコジオン（式III）の還元のため、バッファー（１００ｍＭ  トリエタノールアミン、pH＝７、２ｍＭ塩化マグネシウム）３００μｌ、４−メチル−２−ペンタノール１．２ｍｌ、ＮＡＤＰ０．１２ｍｇ、エチルセコジオン（式III）１５０ｍｇおよび酵素懸濁液酸化還元酵素  配列番号５（実施例３参照）０．６ｍｌの混合物を、反応容器中、室温にて７２時間、ずっと一定に混合しながら培養した。７２時間後、使用したエチルセコジオン（式III）の＞９０％がヒドロキシ化合物に還元されていた。
【配列表】
0005627546000001.app