(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式ＩＩ：
【化２８】
0005422382.tif 000050
または、
式ＩＩＩ：
【化２９】
0005422382.tif 000051
（式中；
ＲＧは求核体または求電子体を含む反応性基であって、該反応性基は試料の１以上の反応性分析物と反応して、それにより、１以上の標識された分析物を形成することができる）
によって表される化合物、またはその塩形態および／もしくは水和物形態。
【請求項２】
前記化合物は、切断可能なリンカーを介して固体支持体に連結されている、請求項１に記載の化合物、またはその塩形態および／もしくは水和物形態。
【請求項３】
式ＩＩｓｓ：
【化３１】
0005422382.tif 000052
または、
式ＩＩＩｓｓ：
【化３２】
0005422382.tif 000053
（式中；
ｉ）ＲＧは求核体または求電子体を含む反応性基であって、該反応性基は試料の１以上の反応性分析物と反応して、それにより、１以上の標識された分析物を形成することができ；
ｉｉ）ＳＳは、固体支持体であり；および
ｉｉｉ）ＣＬは切断可能なリンカーである）
によって表される請求項２記載の化合物、またはその塩形態および／もしくは水和物形態。
【請求項４】
ＲＧがカルボン酸、スルホン酸、カルボン酸ハライド、スルホニルハライド、活性エステル、混合無水物、イソシアネートまたはイソチオシアネート基である請求項１〜３いずれか１記載の化合物。
【請求項５】
ＲＧがマレイミド基、アルキルハライド基、α−ハロ−アシル基、α−ハロチオン基またはα−ハロイミン基である請求項１〜３いずれか１記載の化合物。
【請求項６】
ＲＧがトリチル−ハライドまたはシリル−ハライド基である請求項１〜３いずれか１記載の化合物。
【請求項７】
ＲＧがアミン基、ヒドロキシル基、またはチオール基である請求項１〜３いずれか１記載の化合物。
【請求項８】
ａ）各試料が１以上の反応性分析物を含む２以上の試料を、同位体的にコードされた同位体および／または同重体標識試薬の組の異なる標識試薬と反応させ、それにより、各々が１以上の標識された分析物を含む２以上の差次的に標識された試料を形成する工程であって、該組の異なる標識試薬は、
式ＩＩ：
【化２８】
0005422382.tif 000054
または、
式ＩＩＩ：
【化２９】
0005422382.tif 000055
（式中；
ＲＧは求核体または求電子体を含む反応性基であって、該反応性基は試料の１以上の反応性分析物と反応して、それにより、各試料において１以上の標識された分析物を形成する）
によって表される化合物またはその塩形態および／もしくは水和物形態である、工程；次いで、
ｂ）２以上の差次的に標識された試料、またはその部分を混合して、それにより、試料混合物を生成する工程
を含む方法。
【請求項９】
工程ｂ）が１以上の較正標準を混合する工程をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
さらに：
ｃ）前記試料混合物、またはその画分を電気泳動により分離する工程を含む請求項８または９記載の方法。
【請求項１１】
前記電気詠動分離が１Ｄ電気詠動分離、２Ｄ電気詠動分離および／またはキャピラリー電気詠動分離である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
さらに：
ｄ）共移動する差次的に標識された分析物の１以上のサブ−試料を電気詠動分離から収集する工程を含む請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
さらに：
ｅ）前記サブ−試料の１つ、またはその画分に対して第１の質量分光分析を行う工程；
ｆ）該第１の質量分光分析からの選択された電荷対質量比の差次的に標識された分析物のイオンを解離エネルギーに付して、それにより、サインイオン、および選択されたイオンの少なくともいくつかの娘断片イオンを形成する工程；次いで、
ｇ）該選択されたイオン、該サインイオンおよび／または該娘断片イオン、またはその画分の第２の質量分析を行う工程；
を含む請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
さらに：
ｈ）前記第２の質量分析における各サインイオンの総質量および相対量、および前記娘断片イオンのいくつかまたは全ての総質量および／または絶対質量を決定する工程；
を含む請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
さらに：
ｉ）前記娘断片イオンの分析によって選択された電荷対質量比に関連した標識された分析物を決定する工程；
を含む請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
さらに：
ｊ）異なる選択された電荷対質量比の差次的に標識された分析物の選択されたイオンについて工程（ｆ）〜（ｈ）または（ｆ）〜（ｉ）を１回以上反復する工程；
を含む請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
さらに：
ｋ）各回異なるサブ−試料で、工程（ｅ）〜（ｈ）、（ｅ）〜（ｉ）または（ｅ）〜（ｊ）を１回以上反復する工程；
を含む請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
さらに：
工程（ｃ）〜（ｈ）を１回以上反復する工程；
を含む請求項１５〜１７いずれか１記載の方法。
【請求項１９】
前記組の各異なる標識試薬は、各異なる試料が該組の異なる標識試薬を運ぶ支持体と反応するように、支持体結合されかつ切断可能なリンカーを通じて該支持体に連結されていて、前記方法は、さらに、工程（ａ）を行う後であるが工程（ｂ）を行う前に、
該切断可能なリンカーを切断することにより、各支持体から標識された分析物を放出する工程であって、各差次的に標識された試料が１以上の標識された分析物を含み、ここで、特定の試料に会合した標識された分析物がそれに結合した固有の質量のレポーター部分によって同定可能および／または定量可能である、工程
を含む請求項８〜１８いずれか１記載の方法。
【請求項２０】
前記方法は、さらに、工程（ａ）を行う後であるが工程（ｂ）を行う前に、
各支持体を洗浄して、支持体結合された標識試薬の反応性基と反応しない各試料の成分を除去する工程
を含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法は、さらに、工程（ａ）を行う後であるが工程（ｂ）を行う前に、
各試料の標識された分析物を収集する工程
を含む請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記組の、それぞれ支持体結合され、異なる同位体的にコードされた標識試薬が、
式ＩＩｓｓ：
【化３５】
0005422382.tif 000056
または、
式ＩＩＩｓｓ：
【化３６】
0005422382.tif 000057
（式中；
ｉ）ＲＧは求核体または求電子体を含む反応性基であって、該反応性基は試料の１以上の反応性分析物と反応して、それにより、１以上の標識された分析物を形成し；
ｉｉ）ＳＳは、固体支持体であり；および
ｉｉｉ）ＣＬは切断可能なリンカーである）
によって表される化合物、またはその塩形態および／もしくは水和物形態である、請求項１９〜２１記載の方法。
【請求項２３】
さらに：
各試料および／または試料混合物を少なくとも１つの酵素で消化して、該試料または試料混合物の成分を部分的にまたは完全に分解する工程を含む請求項８〜２２いずれか１記載の方法。
【請求項２４】
前記第２の質量分析において固有の質量の各サインイオンの相対量を他のサインイオンに対して決定する請求項１５〜１８いずれか１記載の方法。
【請求項２５】
決定された分析物と会合した固有の質量の各サインイオンの相対量が、試料混合物を形成することにより２以上の差次的に標識された試料の各々における決定された分析物の相対量を決定するために混合された、それぞれ差次的に標識された試料の量と相関している請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
ｉ）前記試料混合物が前記決定された分析物についての較正標準の既知量を含み、該較正標準は前記決定された分析物についての固有の質量のレポーター部分を含み、また、各固有のレポーター部分に対応する各固有のサインイオンの絶対量を、前記較正標準に関連する固有のサインイオンの量を参照して決定し；および
ｉｉ）前記試料混合物の各異なる試料における決定された分析物の絶対量を、固有の質量の各異なるサインイオンの絶対量を参照して決定する
請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
ｉ）各固有のレポーター部分に対応する各固有のサインイオンの絶対量を、較正曲線を参照して決定し；および
ｉｉ）前記試料混合物の各異なる試料における決定された分析物の絶対量を、固有の質量の各異なるサインイオンの絶対量を参照して決定する
請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
さらに、異なる選択された電荷対質量比の標識された分析物の選択されたイオンについて工程（ｆ）〜（ｉ）を１回以上反復して、それにより、前記試料混合物を形成するために混合された２以上の差次的に標識された試料の各々における１以上の他の決定された分析物の相対量を同定し、および／または決定する工程を含む請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
さらに、異なる選択された電荷対質量比の標識された分析物の選択されたイオンについて工程（ｆ）〜（ｉ）を１回以上反復して、それにより、前記試料混合物を形成するために混合された２以上の差次的に標識された試料の各々における１以上の他の決定された分析物の絶対量を同定し、および／または決定する工程を含む請求項２６または２７記載の方法。
【請求項３０】
前記分析物がペプチドであって、前記試料混合物を形成するために混合された２以上の差次的に標識された試料の各々における１以上の蛋白質の同一性および相対量を、該試料混合物を形成するために混合された２以上の差次的に標識された試料の各々における１以上のペプチドの同一性および相対量に基づいて決定する請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
前記分析物がペプチドであって、前記試料混合物を形成するために混合された２以上の差次的に標識された試料の各々における１以上の蛋白質の同一性および絶対量を、該試料混合物を形成するために混合された２以上の差次的に標識された試料の各々における１以上のペプチドの同一性および絶対量に基づいて決定する請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
前記分析物がペプチド、蛋白質、核酸、炭水化物、脂質、ステロイド、ビタミン、プロスタグランジン、または１５００ダルトン（Ｄａ）未満の分子量を有する他の小分子である請求項８〜２９いずれか１記載の方法。
【請求項３３】
少なくとも２つの差次的に標識された分析物を含む混合物であって、該混合物は、各試料が同位体的にコードされた異性体および／または同重体標識試薬の組からの異なる標識試薬で標識された少なくとも２つの異なる試料の標識反応の産物を混合することによって形成され、ここで該混合物の各々差次的に標識された分析物は、
式ＩＩＡ：
【化４０】
0005422382.tif 000058
または、
式ＩＩＩＡ：
【化４１】
0005422382.tif 000059
によって表される化合物、またはその塩形態および／もしくは水和物形態である、混合物。
【請求項３４】
１以上の前記分析物がペプチドおよび／または蛋白質である請求項３３記載の混合物。
【請求項３５】
１以上の前記分析物が核酸である請求項３３記載の混合物。
【請求項３６】
１以上の前記分析物が炭水化物、アミノ酸、脂質、ステロイド、ビタミンおよび／またはプロスタグランジンである請求項３３記載の混合物。
【請求項３７】
１以上の前記分析物が１５００ダルトン未満の質量を有する小分子である請求項３３記載の混合物。
【請求項３８】
２以上の前記分析物が異なる分析物タイプのものである請求項３３記載の混合物。
【請求項３９】
少なくとも２つの差次的に標識された分析物を含む混合物であって、該混合物は、各試料が同位体的にコードされた異性体および／または同重体標識試薬の組からの異なる標識試薬で標識されている少なくとも２つの異なる試料の標識反応の産物を混合することによって形成され、ここで、該混合物の各々差次的に標識された分析物は、
式ＩＩｓｓＡｘ：
【化４３】
0005422382.tif 000060
または、
式ＩＩＩｓｓＡｘ：
【化４４】
0005422382.tif 000061
（式中、Ｑ’は固体支持体からの該差次的に標識された分析物の切断によって形成された官能基である）
によって表される化合物、またはその塩形態および／もしくは水和物形態である、混合物。
【請求項４０】
請求項１〜７いずれか記載の少なくとも１つの化合物、またはその塩形態および／もしくは水和物形態を含むキット。
【請求項４１】
さらに、２以上の異なる試料において１以上の前記分析物を定量するためのアッセイを行うために選択された少なくとも１つのさらなる試薬を含む請求項４０記載のキット。
【請求項４２】
前記少なくとも１つのさらなる試薬が標識された較正標準である請求項４１記載のキット。
【請求項４３】
式ＩＩＡ：
【化４０】
0005422382.tif 000062
または、
式ＩＩＩＡ：
【化４１】
0005422382.tif 000063
によって表される化合物、またはその塩形態および／もしくは水和物形態。
【請求項４４】
前記化合物は、支持体結合されている、請求項４３に記載の化合物、またはその塩形態および／もしくは水和物形態。
【請求項４５】
ＩＩｓｓＡ：
【化１４−１】
0005422382.tif 000064
または、
ＩＩＩｓｓＡ：
【化１４−２】
0005422382.tif 000065
（式中；
ｉ）ＳＳは、固体支持体であり；および
ｉｉ）ＣＬは切断可能なリンカーである）
によって表される化合物、またはその塩形態および／もしくは水和物形態。
【請求項４６】
前記化合物が同位体的にコードされている請求項１〜７または４３〜４５のいずれか１記載の化合物、またはその塩形態および／もしくは水和物形態。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書で用いるセクションの見出しは構成上の目的だけのものであり、断じて本明細書に記載された主題を限定すると解釈されるべきではない。
【０００２】
（分野）
本発明は、質量分析技術を用いる分析物決定に関する方法、混合物、キットおよび組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
（序論）
本発明は、質量分析による分析物の決定に関する。種々の実施形態において、質量分光分析は電気詠動分離技術とカップリングさせることができる。分析物は注目するいずれの分子でもあり得る。分析物（天然および／または合成物）の非限定例は、限定されないが、蛋白質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、アミノ酸、ビタミン、ステロイド、プロスタグランジンおよび／または１５００ダルトン（Ｄａ）未満の質量を有する他の小分子を含む。分析物は、複合混合物における分析物の相対的および／または絶対的定量を可能とする固有の標識試薬を用いて決定することができる。標識試薬は、複合試料混合物の分析のために異性体および／または同重体組で用いることができ、標識試薬は異性体および／または同重体であり得る。
【０００４】
反応性基が組成物の分析物反応形態で分析物によって置き換えられていてよい、レポーター部分、バランス（またはリンカー）部分および反応性基を含む異性体および／または同重体標識試薬が知られている。これらの３つの要素を含む標識試薬および標識された分析物の例は、例えば、公開された同時係属かつ共同所有された特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７および特許文献８に開示されている。異性体および／または同重体の標識試薬の組を用いて、例えば、２以上の異なる試料の分析物を標識することができ、組の異なる標識試薬は、全て、同一の総質量を有するが、各レポーター部分は、該組の各レポーター部分が固有の総質量を有し、固有の総質量の対応するサインイオンを生じるように一意的にコードすることができる。該組の全ての試薬は同一の総質量を有することができるが、固有の総質量のレポーター部分を含むことができるゆえに、バランス部分（またはリンカー）は、概して（必ずしもそうではないが）、１以上の重原子同位体を含んで、それにより、該組の各標識試薬のレポーター／リンカー組合せが同一総質量を有するように、それぞれ固有のレポーターの質量の「バランスをとる」。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００４／０２１９６８５号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／０１１４０４２号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００５／０１４７９８２号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００５／０１４７９８５号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００５／０１４７９８７号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００５／０１４８７７１号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２００５／０１４８７７３号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２００５／０１４８７７４号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書において記載するのは異性体および／または同重体組で用いることができる新規の標識試薬であり、標識試薬はコードされていない検出可能な標識を含む。図１ａは本発明の例示的な標識試薬（および標識された分析物）の要素、および質量分析計における分子の可能な断片化特性のいくらかの情報を示す。示されたように、リンカー部分は直鎖または分岐様式にて標識試薬（または標識された分析物）の要素を連結することができる。異性体および／または同重体組で用いる場合、組の標識試薬の種々のコードされていない検出可能な標識は、全て：１）独立して検出可能であり；２）同一総質量を含むことができ；および３）同一の正味の電荷を含むことができる。従って、本明細書に開示される標識試薬は、非質量分析方法によって独立して検出することができる部分、ならびに質量分析計において独立して検出することができる異なる部分の双方を含むことができる。特に、本明細書で記載された新規な標識試薬は、例えば、質量分光分析と組み合わせた電気詠動分離方法で用いることができ、コードされていない検出可能な標識の特性を用いて、電気泳動分離の間および／または後に標識された分析物の混合物を見出し、および／または定量することができ、質量分析を用いて、試料における対象の分析物、またはその画分を同定し、および／または定量することができる。
【０００７】
いくつかの実施形態において、標識試薬および／または標識された分析物は支持体結合され得る。図１ｂは、本発明の例示的な支持体結合された標識試薬（および支持体結合された標識された分析物）の要素、および質量分析計における分子の断片化特性についてのいくらかの情報を示す。示されるように、リンカー部分は、直鎖または分岐様式にて支持体結合された標識試薬（または支持体結合された標識された分析物）の要素を連結させることができる。
【０００８】
本発明の実施形態は、複合試料混合物の多重分析に特によく適している。例えば、本発明のいくつかの実施形態は、プロテオミック分析および／またはゲノミック分析において、ならびにゲノミックおよび／またはプロテオミック分析に関する相関研究のために用いることができる。本発明のいくつかの実施形態は、脂質、ステロイド、ビタミン、プロスタグランジンおよび／またはアミノ酸分析についてなどの、小分子分析について用いることができる。異性体および／または同重体試薬を用いることができる実験分析は、限定されないが、経時的研究、バイオマーカー分析、多重プロテオミック分析、マッドピッド実験、アフィニティプルダウン、翻訳後修飾（ＰＴＭｓ）の決定（例えば、米国特許出願公開番号ＵＳ２００５−０２０８５５０Ａ１）、および多重対照実験を含む。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
塩形態および／または水和物形態を含めた式Ｉ：
【化２７】
0005422382.tif 000002
（式中；
ｉ）ＲＧは求核体または求電子体を含む反応性基であって、該反応性基は試料の１以上の反応性分析物と反応して、それにより、１以上の標識された分析物を形成することができ；
ｉｉ）ＲＰは、固定された電荷を含み、または質量分析計においてイオン化可能であるレポーター部分であって、該レポーター部分は、結合Ｘの断片化に際して、質量分析計においてサインイオンを生成することができ；
ｉｉｉ）ＤＬはコードされていない検出可能な標識であり；
ｉｖ）ＬＫは直鎖または分岐状であり得るリンカー部分であって、ＬＫは反応性基をレポーター部分およびコードされていない検出可能な標識双方に連結しており；
ｖ）Ｘは、レポーター部分をリンカー部分またはコードされていない検出可能な標識に連結する共有結合であって、Ｘは質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能であり；
ｖｉ）Ｙは、反応性基をリンカー部分に連結する共有結合、または連結基であって、Ｙは、必要に応じて、質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能であり；
ｖｉｉ）Ｗは、コードされていない検出可能な標識をリンカー部分に連結する共有結合、または連結基であって、Ｗは、必要に応じて、光、熱および／または化学試薬の適用によって切断可能であり、および／または質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能であり；および
ｖｉｉｉ）ｍおよびｎは各々０または１であり、但し、ｍ＋ｎ＝１であり；
ここで、該化合物は、必要に応じて、切断可能なリンカーを介して固体支持体に連結されている）
によって表される化合物。
（項目２）
式ＩＩ：
【化２８】
0005422382.tif 000003
（式中、ＲＧは反応性基である）
によって表される項目１記載の化合物。
（項目３）
式ＩＩＩ：
【化２９】
0005422382.tif 000004
（式中、ＲＧは反応性基である）
によって表される項目１記載の化合物。
（項目４）
塩形態および／または水和物形態を含めた式Ｉｓｓ：
【化３０】
0005422382.tif 000005
（式中；
ｉ）ＲＧは求核体または求電子体を含む反応性基であって、該反応性基は試料の１以上の反応性分析物と反応して、それにより、１以上の標識された分析物を形成することができ；
ｉｉ）ＲＰは、固定された電荷を含み、または質量分析計においてイオン化可能であるレポーター部分であって、該レポーター部分は、結合Ｘの断片化に際して、質量分析計においてサインイオンを生成することができ；
ｉｉｉ）ＤＬはコードされていない検出可能な標識であり；
ｉｖ）ＬＫは直鎖または分岐状であり得るリンカー部分であって、ＬＫは反応性基をレポーター部分およびコードされていない検出可能な標識双方に連結しており；
ｖ）Ｘは、レポーター部分をリンカー部分またはコードされていない検出可能な標識に連結する共有結合であって、Ｘは質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能であり；
ｖｉ）Ｙは、反応性基をリンカー部分に連結する共有結合、または連結基であって、Ｙは、必要に応じて、質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能であり；
ｖｉｉ）Ｗは、コードされていない検出可能な標識をリンカー部分に連結する共有結合、または連結基であって、Ｗは、必要に応じて、光、熱および／または化学試薬の適用によって切断可能であり、および／または質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能であり；および
ｖｉｉｉ）ｍおよびｎは各々０または１であり、但し、ｍ＋ｎ＝１であり；および
ｉｘ）ＳＳは、標識試薬のレポーター部分が切断可能なリンカーを介して共有結合により連結された固体支持体である）
によって表される項目１記載の化合物。
（項目５）
式ＩＩｓｓ：
【化３１】
0005422382.tif 000006
（式中、ＲＧは反応性基であり、ＳＳは固体支持体であって、およびＣＬは切断可能なリンカーである）
によって表される項目４記載の化合物。
（項目６）
式ＩＩＩｓｓ：
【化３２】
0005422382.tif 000007
（式中、ＲＧは反応性基であり、ＳＳは固体支持体であって、およびＣＬは切断可能なリンカーである）
によって表される項目４記載の化合物。
（項目７）
ＲＧがカルボン酸、スルホン酸、カルボン酸ハライド、スルホニルハライド、活性エステル、混合無水物、イソシアネートまたはイソチオシアネート基である項目１〜６いずれか１記載の化合物。
（項目８）
ＲＧがマレイミド基、アルキルハライド基、α−ハロ−アシル基、α−ハロチオン基またはα−ハロイミン基である項目１〜６いずれか１記載の化合物。
（項目９）
ＲＧがトリチル−ハライドまたはシリル−ハライド基である項目１〜６いずれか１記載の化合物。
（項目１０）
ＲＧがアミン基、ヒドロキシル基、またはチオール基である項目１〜６いずれか１記
載の化合物。
（項目１１）
ａ）各試料が１以上の反応性分析物を含む２以上の試料を、同位体的にコードされた同位体および／または同重体標識試薬の組の異なる標識試薬と反応させ、それにより、各々が１以上の標識された分析物を含む２以上の差次的に標識された試料を形成する工程であって、該組の異なる標識試薬は、塩形態および／または水和物形態を含めた、式Ｉ：
【化３３】
0005422382.tif 000008
（式中；
ｉ）ＲＧは求核体または求電子体を含む反応性基であって、該反応性基は試料の１以上の反応性分析物と反応して、それにより、各試料において１以上の標識された分析物を形成し；
ｉｉ）ＲＰは、固定された電荷を含み、あるいは質量分析計においてイオン化可能であるレポーター部分であって、該レポーター部分は結合Ｘの断片化に際して質量分析計においてサインイオンを生成することができ、各レポーター部分の総質量、およびその対応するサインイオンは該組の各標識試薬について異なり；
ｉｉｉ）ＤＬはコードされていない検出可能な標識であって、該組の各標識試薬が異なる独立して検出可能なコードされていない検出可能な標識を含み、各コードされていない検出可能な標識は、該組の標識試薬の他のコードされていない検出可能な標識と同一の総質量および同一の正味の電荷を有し；
ｉｖ）ＬＫは直鎖または分岐状であり得るリンカー部分であって、ＬＫは反応性基をレポーター部分およびコードされていない検出可能な標識双方に連結させ、該組の各異なる試薬のリンカー部分の質量は、レポーター部分およびリンカー部分の組合せについての凝集体総質量が該組の各標識試薬について同一であるように、該組の異なる標識試薬についてのレポーター部分の間の総質量の差を補正し；
ｖ）Ｘはレポーター部分をリンカー部分またはコードされていない検出可能な標識に連結する共有結合であって、Ｘは質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能であり；
ｖｉ）Ｙは、反応性基をリンカー部分に連結させる共有結合、または連結基であって、Ｙは、必要に応じて、質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能であり、但し、Ｙが連結基であるとき、その総質量は該組の各標識試薬について同一であり；
ｖｉｉ）Ｗは、コードされていない検出可能な標識をリンカー部分に連結させる共有結合、または連結基であって、Ｗは、必要に応じて、光、熱および／または化学試薬の適用によって切断可能であり、および／または質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能であり、但し、Ｗが連結基であるとき、その総質量は該組の各標識試薬について同一であり；および
ｖｉｉｉ）ｍおよびｎは、各々、０または１であり、但し、ｍ＋ｎ＝１である）
によって表される工程；次いで、
ｂ）２以上の差次的に標識された試料、またはその部分、および必要に応じて１以上の較正標準を混合して、それにより、試料混合物を生成する工程
を含む方法。
（項目１２）
さらに：
ｃ）試料混合物、またはその画分を電気泳動により分離する工程を含む項目１１記載
の方法。
（項目１３）
電気詠動分離が１Ｄ電気詠動分離、２Ｄ電気詠動分離および／またはキャピラリー電気詠動分離である項目１２記載の方法。
（項目１４）
さらに：
ｄ）共移動する差次的に標識された分析物の１以上のサブ−試料を電気詠動分離から収集する工程；次いで
ｅ）必要に応じて、適当な条件下で１以上のサブ−試料を処理して、それにより、サブ−試料の差次的に標識された分析物またはサブ−試料からコードされていない検出可能な標識を切断する工程であって、ここで、ｍは０であり、ｎは１であって、Ｗは、光、熱または化学試薬の適用によって切断可能な共有結合、または連結基である、工程；
を含む項目１２記載の方法。
（項目１５）
さらに：
ｆ）サブ−試料の１つ、またはその画分に対して第１の質量分光分析を行う工程；
ｇ）該第１の質量分光分析からの選択された電荷対質量比の差次的に標識された分析物のイオンを解離エネルギーに付して、それにより、サインイオン、および選択されたイオンの少なくともいくつかの娘断片イオンを形成する工程；次いで、
ｈ）選択されたイオン、サインイオンおよび／または娘断片イオン、またはその画分の第２の質量分析を行う工程；
を含む項目１４記載の方法。
（項目１６）
さらに：
ｉ）第２の質量分析における各サインイオンの総質量および相対量、および娘断片イオンのいくつかまたは全ての総質量および／または絶対質量を決定する工程；
を含む項目１５記載の方法。
（項目１７）
さらに：
ｊ）娘断片イオンの分析によって選択された電荷対質量比に関連した標識された分析物を決定する工程；
を含む項目１６記載の方法。
（項目１８）
さらに：
ｋ）異なる選択された電荷対質量比の差次的に標識された分析物の選択されたイオンについて工程（ｇ）〜（ｉ）または（ｇ）〜（ｊ）を１回以上反復する工程；
を含む項目１７記載の方法。
（項目１９）
さらに：
ｌ）各回異なるサブ−試料で、工程（ｆ）〜（ｉ）、（ｆ）〜（ｊ）または（ｆ）〜（ｋ）を１回以上反復する工程；
を含む項目１８記載の方法。
（項目２０）
さらに：
工程（ｄ）〜（ｉ）を１回以上反復する工程；
を含む項目１７〜１９いずれか１記載の方法。
（項目２１）
該組の各異なる標識試薬は、各異なる試料が該組の異なる標識試薬を運ぶ支持体と反応するように、支持体結合されかつ切断可能なリンカーを通じて支持体に連結されていて、前記方法は、さらに、工程（ａ）を行う後であるが工程（ｂ）を行う前に；
ｉ）必要に応じて各支持体を洗浄して、支持体結合された標識試薬の反応性基と反応しない各試料の成分を除去する工程；
ｉｉ）切断可能なリンカーを切断することにより、各支持体から標識された分析物を放出する工程であって、各差次的に標識された試料が１以上の標識された分析物を含み、ここで、特定の試料に会合した標識された分析物がそれに結合した固有の質量のレポーター部分によって同定可能および／または定量可能である、工程；次いで、
ｉｉｉ）必要に応じて、各試料の標識された分析物を、工程（ｂ）に従って混合する前に収集する工程
を含む項目１１〜２０いずれか１記載の方法。
（項目２２）
該組の、それぞれ支持体結合され、異なる同位体的にコードされた標識試薬が、塩形態および／または水和物形態を含めた式Ｉｓｓ：
【化３４】
0005422382.tif 000009
（式中；
ｉ）ＲＧは求核体または求電子体を含む反応性基であって、該反応性基は試料の１以上の反応性分析物と反応して、それにより、１以上の標識された分析物を形成し；
ｉｉ）ＲＰは、固定された電荷を含み、あるいは質量分析計においてイオン化可能であるレポーター部分であって、該レポーター部分は結合Ｘの断片化に際して質量分析計においてサインイオンを生成することができ、各レポーター部分の総質量、およびその対応するサインイオンは該組の各標識試薬について異なり；
ｉｉｉ）ＤＬはコードされていない検出可能な標識であって、該組の各標識試薬が異なる独立して検出可能なコードされていない検出可能な標識を含み、各コードされていない検出可能な標識は、該組の標識試薬の他のコードされていない検出可能な標識と同一の総質量および同一の正味の電荷を有し；
ｉｖ）ＬＫは直鎖または分岐状であり得るリンカー部分であって、ＬＫは反応性基をレポーター部分およびコードされていない検出可能な標識双方に連結させ、該組の各異なる試薬のリンカー部分の質量は、レポーター部分およびリンカー部分の組合せの凝集体総質量が該組の各標識試薬について同一であるように、該組の異なる標識試薬についてのレポーター部分の間の総質量の差を補正し；
ｖ）Ｘはレポーター部分をリンカー部分またはコードされていない検出可能な標識に連結させる共有結合であって、Ｘは質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能であり；
ｖｉ）Ｙは、反応性基をリンカー部分に連結させる共有結合、または連結基であって、Ｙは、必要に応じて、質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能であり、但し、Ｙが連結基であるとき、その総質量は該組の各標識試薬について同一であり；
ｖｉｉ）Ｗは、コードされていない検出可能な標識をリンカー部分に連結する共有結合、または連結基であって、Ｗは、必要に応じて、光、熱および／または化学試薬の適用によって切断可能であり、および／または質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能であり、但し、Ｗが連結基であるとき、その総質量は該組の各標識試薬について同一であり；
ｖｉｉｉ）ｍおよびｎは、各々、０または１であり、但し、ｍ＋ｎ＝１であり；および
ｉｘ）ＳＳは、標識試薬のレポーター部分が切断可能なリンカーを通じて共有結合により連結している固体支持体である）
によって表される項目２１記載の方法。
（項目２３）
標識試薬の１つが式ＩＩｓｓ：
【化３５】
0005422382.tif 000010
（式中、ＲＧは反応性基であり、ＳＳは固体支持体であって、ＣＬは切断可能なリンカーである）
によって表される項目２２記載の方法。
（項目２４）
標識試薬の１つが式ＩＩＩｓｓ：
【化３６】
0005422382.tif 000011
（式中、ＲＧは反応性基であり、ＳＳは固体支持体であって、ＣＬは切断可能なリンカーである）
によって表される項目２２記載の方法。
（項目２５）
さらに：
各試料および／または試料混合物を少なくとも１つの酵素で消化して、該試料または試料混合物の成分を部分的にまたは完全に分解する工程を含む項目１１〜２４いずれか１記載の方法。
（項目２６）
第２の質量分析において固有の質量の各サインイオンの相対量を他のサインイオンに対して決定する項目１７〜２０いずれか１記載の方法。
（項目２７）
決定された分析物と会合した固有の質量の各サインイオンの相対量が、試料混合物を形成することにより２以上の差次的に標識された試料の各々における決定された分析物の相対量を決定するために混合された、それぞれ差次的に標識された試料の量と相関している項目２６記載の方法。
（項目２８）
ｉ）試料混合物が決定された分析物についての較正標準の既知量を含み、該較正標準は決定された分析物についての固有の質量のレポーター部分を含み、また、各固有のレポーター部分に対応する各固有のサインイオンの絶対量を、較正標準に関連する固有のサインイオンの量を参照して決定し；および
ｉｉ）試料混合物の各異なる試料における決定された分析物の絶対量を、固有の質量の各異なるサインイオンの絶対量を参照して決定する
項目２７記載の方法。
（項目２９）
ｉ）各固有のレポーター部分に対応する各固有のサインイオンの絶対量を、較正曲線を参照して決定し；および
ｉｉ）試料混合物の各異なる試料における決定された分析物の絶対量を、固有の質量の各異なるサインイオンの絶対量を参照して決定する
項目２７に記載の方法。
（項目３０）
さらに、異なる選択された電荷対質量比の標識された分析物の選択されたイオンについて工程（ｇ）〜（ｊ）を１回以上反復して、それにより、試料混合物を形成するために混合された２以上の差次的に標識された試料の各々における１以上の他の決定された分析物の相対量を同定し、および／または決定する工程を含む項目２７記載の方法。
（項目３１）
さらに、異なる選択された電荷対質量比の標識された分析物の選択されたイオンについて工程（ｇ）〜（ｊ）を１回以上反復して、それにより、試料混合物を形成するために混合された２以上の差次的に標識された試料の各々における１以上の他の決定された分析物の絶対量を同定し、および／または決定する工程を含む項目２８または２９記載の方法。
（項目３２）
分析物がペプチドであって、試料混合物を形成するために混合された２以上の差次的に標識された試料の各々における１以上の蛋白質の同一性および相対量を、試料混合物を形成するために混合された２以上の差次的に標識された試料の各々における１以上のペプチドの同一性および相対量に基づいて決定する項目３０記載の方法。
（項目３３）
分析物がペプチドであって、試料混合物を形成するために混合された２以上の差次的に標識された試料の各々における１以上の蛋白質の同一性および絶対量を、試料混合物を形成するために混合された２以上の差次的に標識された試料の各々における１以上のペプチドの同一性および絶対量に基づいて決定する項目３１記載の方法。
（項目３４）
分析物がペプチド、蛋白質、核酸、炭水化物、脂質、ステロイド、ビタミン、プロスタグランジン、または１５００ダルトン（Ｄａ）未満の分子量を有する他の小分子である項目１１〜３１いずれか１記載の方法。
（項目３５）
少なくとも１つの差次的に標識された試料が式ＩＩまたは式ＩＩＩ：
【化３７】
0005422382.tif 000012
【化３８】
0005422382.tif 000013
（式中、ＲＧは反応性基である）
の、同位体的にコードされた標識試薬で標識された項目１１〜３４いずれか１記載の方法。
（項目３６）
少なくとも２つの差次的に標識された分析物を含む混合物であって、該混合物は、各試料が同位体的にコードされた異性体および／または同重体標識試薬の組からの異なる標識試薬で標識された少なくとも２つの異なる試料の標識反応の産物を混合することによって形成され、ここで該混合物の各々差次的に標識された分析物は、塩形態および／または水和物形態を含めた式ＩＡ：
【化３９】
0005422382.tif 000014
（式中；
ｉ）ＲＰは固定された電荷を含み、あるいは質量分析計においてイオン化可能であるレポーター部分であって、該レポーター部分は結合Ｘの断片化に際して質量分析計においてサインイオンを生成することができ、また、各レポーター部分、およびその対応するサインイオンの総質量は、該組のいずれの標識試薬が試料を標識するのに用いられたかに応じて各異なる試料について異なり；
ｉｉ）ＤＬは該組の各異なる標識試薬について異なるコードされていない検出可能な標識であって、各異なるコードされていない検出可能な標識は該組における他のものから独立して検出可能であり、また、各異なるコードされていない検出可能な標識は該組の他の
標識試薬の他のコードされていない検出可能な標識と同一の総質量および同一の正味の電荷を有し；
ｉｉｉ）ＬＫは直鎖または分岐状であり得る連結部分であって、ＬＫは分析物をレポーター部分およびコードされていない検出可能な標識双方に連結させ、ここで、該組の各異なる標識試薬の連結部分の質量は、レポーター部分および連結部分の組合せについての凝集体総質量が該組の各標識試薬について同一であるように、該組の異なる標識試薬についてのレポーター部分間の総質量の差を補正し；
ｉｖ）Ｘはレポーター部分をリンカー部分またはコードされていない検出可能な標識に連結させる共有結合であって、結合Ｘは質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能であり；
ｖ）Ｙは分析物をリンカー部分に連結させる共有結合または連結基であって、Ｙは、必要に応じて、質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能であり、但し、Ｙが連結基であるとき、その総質量は該組の各標識試薬について同一であり；
ｖｉ）Ｗはコードされていない検出可能な標識をリンカー部分に連結する共有結合または連結基であって、Ｗは、必要に応じて、光、熱および／または化学試薬の適用によって切断可能であり、および／または質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能であり、但し、Ｗが連結基であるとき、その総質量は該組の各標識試薬について同一であり；および
ｖｉｉ）ｍおよびｎは各々０または１であり、但し、ｍ＋ｎ＝１である）
によって表される、混合物。
（項目３７）
１以上の分析物がペプチドおよび／または蛋白質である項目３６記載の混合物。
（項目３８）
１以上の分析物が核酸である項目３６記載の混合物。
（項目３９）
１以上の分析物が炭水化物、アミノ酸、脂質、ステロイド、ビタミンおよび／またはプロスタグランジンである項目３６記載の混合物。
（項目４０）
１以上の分析物が１５００ダルトン未満の質量を有する小分子である項目３６記載の混合物。
（項目４１）
２以上の分析物が異なる分析物タイプのものである項目３６記載の混合物。
（項目４２）
少なくとも１つの標識された分析物が式ＩＩＡ：
【化４０】
0005422382.tif 000015
によって表される項目３６〜４１いずれか１記載の混合物。
（項目４３）
少なくとも１つの標識された分析物が式ＩＩＩＡ：
【化４１】
0005422382.tif 000016
によって表される項目３６〜４１いずれか１記載の混合物。
（項目４４）
少なくとも２つの差次的に標識された分析物を含む混合物であって、該混合物は、各試料が同位体的にコードされた異性体および／または同重体標識試薬の組からの異なる標識試薬で標識されている少なくとも２つの異なる試料の標識反応の産物を混合することによって形成され、ここで、該混合物の各々差次的に標識された分析物は、塩形態および／または水和物形態を含めた式ＩｓｓＡｘ：
【化４２】
0005422382.tif 000017
（式中；
ｉ）ＲＰは固定された電荷を含み、あるいは質量分析計においてイオン化可能であるレポーター部分であって、該レポーター部分は結合Ｘの断片化に際して質量分析計においてサインイオンを生成することができ、ここで、各レポーター部分、およびその対応するサインイオンの総質量は、該組のいずれの標識試薬が試料を標識するのに用いられたかに応じて各異なる試料について異なり；
ｉｉ）ＤＬは該組の各異なる標識試薬について異なるコードされていない検出可能な標識であって、各異なるコードされていない検出可能な標識は該組における他のものから独立して検出可能であり、また、各異なるコードされていない検出可能な標識は該組の他の標識試薬の他のコードされていない検出可能な標識と同一の総質量および同一の正味の電荷を有し；
ｉｉｉ）ＬＫは直鎖または分岐状であり得る連結部分であって、ＬＫは分析物をレポーター部分およびコードされていない検出可能な標識双方に連結させ、ここで、該組の各異なる標識試薬の連結部分の質量は、レポーター部分および連結部分の組合せについての凝集体総質量が該組の各標識試薬について同一であるように、該組の異なる標識試薬についてのレポーター部分間の総質量の差を補正し；
ｉｖ）Ｘはレポーター部分をリンカー部分またはコードされていない検出可能な標識に連結させる共有結合であって、結合Ｘは質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能であり；
ｖ）Ｙは分析物をリンカー部分に連結させる共有結合または連結基であって、Ｙは、必要に応じて、質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能であり、但し
、Ｙが連結基であるとき、その総質量は該組の各標識試薬について同一であり；
ｖｉ）Ｗはコードされていない検出可能な標識をリンカー部分に連結する共有結合または連結基であって、Ｗは、必要に応じて、光、熱、化学試薬の適用によって切断可能であり、および／または質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能であり、但し、Ｗが連結基であるとき、その総質量は該組の各標識試薬について同一であり；および
ｖｉｉ）ｍおよびｎは各々０または１であり、但し、ｍ＋ｎ＝１であり；
ｖｉｉｉ）Ｑ’は固体支持体からの差次的に標識された分析物の切断によって形成された官能基である）
によって表される、混合物。
（項目４５）
少なくとも１つの標識された分析物が式ＩＩｓｓＡｘ：
【化４３】
0005422382.tif 000018
（式中、Ｑ’は固体支持体からの差次的に標識された分析物の切断によって形成された官能基である）
によって表される項目４４記載の混合物。
（項目４６）
少なくとも１つの標識された分析物が式ＩＩＩｓｓＡｘ：
【化４４】
0005422382.tif 000019
（式中、Ｑ’は固体支持体からの差次的に標識された分析物の切断によって形成された官能基である）
によって表される項目４４記載の混合物。
（項目４７）
項目１〜１０いずれか記載の少なくとも１つの化合物を含むキット。
（項目４８）
さらに、２以上の異なる試料において１以上の分析物を定量するためのアッセイを行うために選択された少なくとも１つのさらなる試薬を含む項目４７記載のキット。
（項目４９）
少なくとも１つのさらなる試薬が標識された較正標準である項目４８記載のキット。
（項目５０）
塩形態および／または水和物形態を含めた、式ＩＡ：
【化４５】
0005422382.tif 000020
（式中；
ｉ）ＲＰは固定された電荷を含む、あるいは質量分析計においてイオン化可能であるレポーター部分であって、該レポーター部分は結合Ｘの断片化に際して質量分析計においてサインイオンを生成することができ；
ｉｉ）ＤＬはコードされていない検出可能な標識であり；
ｉｉｉ）ＬＫは直鎖または分岐状であり得るリンカー部分であって、ＬＫは分析物をレポーター部分およびコードされていない検出可能な標識双方に連結させ；
ｉｖ）Ｘはレポーター部分をリンカー部分またはコードされていない検出可能な標識に連結する共有結合であって、Ｘは質量分析計において解離エネルギーの適用によって切断可能であり；
ｖ）Ｙは分析物をリンカー部分に連結する共有結合または連結基であって、Ｙは、必要に応じて、質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能であり；
ｖｉ）Ｗはコードされていない検出可能な標識をリンカー部分に連結する共有結合または連結基であって、Ｗは、必要に応じて、光、熱および／または化学試薬の適用によって切断可能であり、および／または質量分析計において解離エネルギーの適用によって切断可能であり；および
ｖｉｉｉ）ｍおよびｎは、各々、０または１であり、但し、ｍ＋ｎ＝１であり；
ここで、該化合物は必要に応じて支持体結合されている）
によって表される化合物。
（項目５１）
塩形態および／または水和物形態を含めた、式ＩｓｓＡ：
【化４６】
0005422382.tif 000021
（式中；
ｉ）ＲＰは固定された電荷を含む、あるいは質量分析計においてイオン化可能であるレポーター部分であって、該レポーター部分は結合Ｘの断片化に際して質量分析計においてサインイオンを生成することができ；
ｉｉ）ＤＬはコードされていない検出可能な標識であり；
ｉｉｉ）ＬＫは直鎖または分岐状であり得るリンカー部分であって、ＬＫは分析物をレポーター部分およびコードされていない検出可能な標識双方に連結させ；
ｉｖ）Ｘはレポーター部分をリンカー部分またはコードされていない検出可能な標識に連結する共有結合であって、Ｘは質量分析計において解離エネルギーの適用によって切断可能であり；
ｖ）Ｙは分析物をリンカー部分に連結する共有結合または連結基であって、Ｙは、必要に応じて、質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能であり；
ｖｉ）Ｗはコードされていない検出可能な標識をリンカー部分に連結する共有結合または連結基であって、Ｗは、必要に応じて、光、熱および／または化学試薬の適用によって切断可能であり、および／または質量分析計において解離エネルギーの適用によって切断可能であり；
ｖｉｉｉ）ｍおよびｎは、各々、０または１であり、但し、ｍ＋ｎ＝１であり；および
ｉｘ）ＳＳは、標識試薬のレポーター部分が切断可能なリンカーを通じて共有結合により連結された固体支持体である）
によって表される化合物。
（項目５２）
前記化合物が同位体的にコードされている項目１〜１０、５０または５１のいずれか１記載の化合物。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
当業者であれば、以下に記載する図面は説明目的のみのためであることを理解するであろう。図面は、断じて、本教示の範囲を限定することを意図していない。
【図１ａ】図１ａは、要素の形態で表された例示的な標識試薬の種々の断片化特性の説明図である。
【図１ｂ】図１ｂは、要素の形態で表された例示的な支持体結合された標識試薬のある断片化特性の説明図である。
【図２ａ】図２ａは、一般式によって表された種々の標識試薬のある断片化特性の説明図である。
【図２ｂ】図２ｂは、種々の標識試薬のある断片化特性の説明図である。
【図２ｃ】図２ｃは、種々の標識試薬のある断片化特性の説明図である。
【図３ａ】図３ａは、一般式によって表された種々の標識された分析物のある断片化特性の説明図である。
【図３ｂ】図３ｂは、種々の標識された分析物のある断片化特性の説明図である。
【図３ｃ】図３ｃは、種々の支持体結合された標識された分析物のある断片化特性の説明図である。
【図３ｄ】図３ｄは、固体支持体から放出された種々の標識された分析物のある断片化特性の説明図である。
【図４ａ】図４ａは、例示的な同重体化合物の説明図である。
【図４ｂ】図４ｂは、例示的な異性体同重体化合物の説明図である。
【図５】図５は、あるＮ−メチルピペラジン系レポーター部分から生成され得る種々の可能なレポーターイオン（サインイオン）の説明図である。
【図６】図６は、支持体結合された標識された分析物を調製し、続いて、固体支持体から標識された分析物を放出させるための、支持体結合された標識試薬を用いるプロセスの説明図である。
【図７】図７は、種々の活性エステルの合成のためのスキームの説明図である。
【図８ａ】図８ａは、式ＩＩおよびＩＩＩの試薬を標識するための可能な同位体コード化戦略の説明図である。
【図８ｂ】図８ｂは、式ＩＩｓｓおよびＩＩＩｓｓの試薬を標識するための可能な同位体コード化戦略の説明図である。
【図９ａ】図９ａは、代表的な標識試薬に対する予言的な合成経路の一部を説明する。
【図９ｂ】図９ｂは、代表的な標識試薬に対する予言的な合成経路の（図９ａに関する）残りの部分を示す。
【図１０】図１０ａ〜１０ｄは、コードされたＮ−Ｆｍｏｃ，Ｎ’−メチル−エチレンジアミンの合成のための種々の工程を説明する。
【図１１】図１１は、コードされたレポーター／リンカー部分の一部の合成を説明する。
【図１２】図１２は、コードされたレポーター／リンカー部分の一部の合成を説明する。
【図１３ａ】図１３ａは、代表的な標識試薬に対する予言的な合成経路の一部を説明する。
【図１３ｂ】図１３ｂは、代表的な標識試薬に対する予言的な合成経路の（図１３ａに関する）残りの部分を説明する。
【図１４】図１４は、コードされていない検出可能な標識に対する提案された合成経路を説明する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
限定されないが、特許、特許出願、論文、書籍、論説、およびインターネットウェブページを含めた、本出願で引用した全ての文献および同様な資料は、そのような文献および同様の資料の形式にかかわらず、いずれかのおよび全ての目的のために、本明細書において参照によりその全体が明確に組み込まれる。
【００１１】
定義：
本明細書を解釈する目的で以下の定義が適用され、適切な場合には常に、単数で用いる用語は複数も含み、その逆も成立する。以下に記載するいずれかの定義は、参照により本明細書に組み込まれるいずれの書類も含め、いずれかの他の書類におけるその語句の用法と矛盾する場合には、（例えば、当該用語がもともと使用されている書類を解釈するにおいて）反対の意味が明確に意図されていない限り、以下に記載する定義が本明細書およびその付随する特許請求の範囲を解釈する目的で常に支配する。本明細書において、「または」の使用は、別途記載されない限り、または「および／または」の使用が明らかに不適切でない限り、「および／または」を意味する。本明細書において、「ある」の使用は、別途記載されない限り、あるいは「１以上」の使用が明らかに不適切でない限り、「１以上」を意味する。「含む」、「含んでいる」、「包含する」、および「含めた」の使用は互換可能であって、限定的であることを意図しない。更に、１以上の実施形態の記載が用語「含む」を用いる場合、当業者であれば、いくつかの特定の場合において、実施形態は、別法として言葉「実質的にからなる」および／または「からなる」を用いて記載できることを理解するであろう。いくつかの実施形態において、工程の順序、またはある動作を実行するための順序は、本教示が操作可能な状態である限り、重要ではないことも理解されるべきである。更に、いくつかの実施形態において、２以上の工程または動作は同時に行うことができる。
【００１２】
ａ．）本明細書で用いるとき、「分析物」とは、測定され得るいずれの対象の分子もいう。分析物の非限定例は、限定されないが、蛋白質、ペプチド、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、アミノ酸、炭水化物、脂質、ステロイド、ビタミン（例えば、（エルゴカルシフェロール）と称する場合がある）ビタミンＤ２、ビタミンＤ３（コレカルシフェロールと称される場合がある）、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＡ、ビタミンＡ２、ビタミンＥ、ビタミンＫ、およびその代謝産物）、プロスタグランジン、および１５００ダルトン（Ｄａ）未満の分子量を有する他の小分子を含む。分析物の源、または分析物を含む試料は、それがいずれかの源からのものであり得るので、限定ではない。分析物は天然または合成であり得る。分析物の源または分析物を含む試料の非限定例は、細胞または組織、あるいはその培養物（または継代培養物）を含む。分析物の源の非限定例は、限定されないが、粗のまたは処理された細胞溶解物、体液、組織抽出物、細胞抽出物、あるいはクロマトグラフィ分離、１Ｄ電気詠動分離、２Ｄ電気詠動分離、またはキャピラリー電気詠動分離等の分離プロセスからの画分（または部分）を含む。体液は、限定されないが、血液、尿、便、脊髄液、脳液、羊膜液、リンパ液、または腺分泌からの液を含む。処理された細胞溶解物とは、我々は、細胞溶解物が、細胞溶解するのに必要な処理に加えて処理されて、それにより、収集した物質のさらなる処理を行うことを意味する。例えば、試料は、細胞溶解物を１以上の蛋白質分解酵素で処理して、それにより、前駆体ペプチドおよび／または蛋白質を消化することによって形成されたペプチドである１以上の分析物を含む細胞溶解物であり得る。
【００１３】
ｂ．）それが用いられる文脈に基づいて明瞭に意図されていない場合（例えば、そうでないことを示す特別な構造を参照する場合）を除き、「エステル」とはエステルおよび／またはチオエステルを共にいう。
【００１４】
ｃ．）本明細書で用いるとき、「切断可能リンカー」とは、標識試薬または標識された分析物を支持体に切断可能に連結する固体支持体に共有結合により結合した部分をいい、切断可能リンカーにおける少なくとも１つの結合は、光、熱または化学試薬（疑いを回避する目的で、「化学試薬」は酵素を含むことが意図される）での処理によって切断され、それにより、標識または標識された分析物またはその断片を支持体から放出することができる。
【００１５】
ｄ．）本明細書で用いるとき、「断片化」とは、共有結合の破壊をいう。
【００１６】
ｅ．）本明細書で用いるとき、「断片」とは、断片化または断片化を引き起こす操作による産物をいう。
【００１７】
ｆ．）本明細書で用いるとき、「水和物形態」とは、化合物の任意の水和状態、または化合物の複数の水和状態の混合物をいう。例えば、本明細書において議論する標識試薬は半水和物、一水和物、二水和物などであり得る。更に、本明細書に記載される標識試薬の試料は、例えば、一水和物、二水和物および半水和物形態を同時に含むことができる。
【００１８】
ｇ．）本明細書で用いるとき、ハロゲン基またはハライドとは、−Ｆ（フッ素）、−Ｃｌ（塩素）、−Ｂｒ（臭素）、または−Ｉ（ヨウ素）をいう。
【００１９】
ｈ．）化合物に関して本明細書で用いるとき、「同位体濃縮された」とは、１以上の重原子同位体（例えば、ジューテリウム（すなわち、２Ｈ）、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、３４Ｓ、３７Ｃｌまたは８１Ｂｒ等の安定な同位体）が濃縮された化合物（例えば、標識試薬）をいう。同位体濃縮された化合物は合成により濃縮され得る。いくつかの実施形態において、不安定な同位体を用いることもできる（例えば、１４Ｃまたは３Ｈ）。「濃縮された」とは、我々は、重原子同位体の量が天然の同位体の存在量を超えることを意味する。種々の実施形態において、同位体濃縮された化合物は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０またはそれを超える同位体濃縮された部位を含むことができる。
【００２０】
同位体濃縮は１００％効果的ではない故に、濃縮がより少ない状態である化合物の試料中に不純物が存在する可能性があり、これらはより低い質量を有するであろう。同様に、過剰濃縮（例えば、望まない濃縮）のため、かつ天然の同位体存在量のため、より大きな質量を含む化合物の試料には不純物が存在し得る。いくつかの実施形態において、それぞれ取込まれた重原子同位体は、少なくとも８０パーセントの同位体純度にて同位体濃縮された部位に存在し得る。いくつかの実施形態において、それぞれ取込まれた重原子同位体は、少なくとも９３パーセントの同位体純度にて同位体濃縮された部位に存在し得る。いくつかの実施形態において、それぞれ取込まれた重原子同位体は、少なくとも９６パーセントの同位体純度にて同位体濃縮された部位に存在し得る。いくつかの実施形態において、それぞれ取込まれた重原子同位体は、少なくとも９８パーセント純度にて同位体濃縮された部位に存在し得る。
【００２１】
ｉ．）本明細書で用いるとき、「同位体濃縮された部位」とは、重原子同位体が原子の軽いバージョンの代わりに置き換えられた化合物における位置をいう（例えば、１２Ｃの代わりに１３Ｃ、１６Ｏの代わりに１８Ｏ、１４Ｎの代わりに１５Ｎ、または水素の代わりにジューテリウムの置換）。
【００２２】
ｊ．）化合物に関して本明細書で用いるとき、「軽い」とは、重原子同位体が濃縮されていない化合物をいう。原子に関して本明細書で用いるとき、「軽い」とは、原子の最低質量の同位体をいう。化合物に関して本明細書で用いるとき、「重い」とは、少なくとも１つの重原子同位体が濃縮された化合物をいう。原子に関して本明細書で用いるとき、「重い」とは、原子の重質量同位体をいう。
【００２３】
ｋ．）本明細書で用いるとき、「標識試薬」とは、決定のために分析物をマーキングするのに適した部分をいう。用語標識は、用語タグおよびマーク、ならびに他の同等な用語および句と同意義である。例えば、標識された分析物は、タグが付された分析物またはマーキングされた分析物をいうこともできる。従って、用語「標識」、「タグ」、「質量タグ」、「マーク」およびこれらの用語の誘導物は同等であって、互換可能であり、マーキングに適した、あるいは決定のためにマーキングされた分析物を有する部分をいう。時々、標識試薬はタグ付き試薬または質量タグ付き試薬をいうことができる。
【００２４】
ｌ．）本明細書で用いるとき、「天然の同位体存在量」とは、天然の同位体の天然での普及に基づいて化合物で見出される１以上の重い同位体のレベル（または分布）をいう。例えば、生きた植物体から得られた天然化合物は１２Ｃに対して約１．０８％１３Ｃを含有することができる。
【００２５】
ｍ．）本明細書で用いるとき、同重体は、名目上の総重量が同じの構造的に区別できない化合物（重原子同位体の同位体含有量および／または分布を除く）である。いずれかの疑いを避けるために、図４ａの化合物１〜４は、本明細書に記載された定義によって同重体である。比較により、本明細書で用いるとき、異性体は、名目上の総質量が同じの構造的に区別可能な化合物である。例示的な異性体同重体を図４ｂに示す。
【００２６】
ｎ．）本明細書で用いるとき、「支持体」、「固体支持体」、「固体担体」または「樹脂」とは、いずれの固相物質もいう。固体支持体は「支持体」、「合成支持体」、「固相」、「表面」、「膜」および／または「支持体」等の用語を含む。固体支持体はポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、およびポリアクリルアミド、ならびにその共重合体およびグラフト等の有機ポリマーから構成され得る。固体支持体はガラス、シリカ、制御されたポア−ガラス（ＣＰＧ）、または逆相シリカ等の無機性であってもよい。固体支持体の形状はビーズ、球形、粒子、顆粒、ゲル、膜または面の形態であり得る。面は平面、実質的に平面、または非平面であり得る。固体支持体は多孔性または非多孔性であり得、膨潤または非膨潤特性を有することができる。固体支持体はウェル、窪み、または他の容器、ベッセル、特徴または位置の形態に構成され得る。複数の固体支持体は試薬のロボット送達のためにアドレス可能な種々の位置においてアレイに、または検出方法および／または機器によって配置することができる。
【００２７】
ｏ．）本明細書で用いるとき、「支持体結合された」とは、固体支持体に共有結合により固定化された化合物をいう。
【００２８】
ｐ．）本明細書で用いるとき、「試料、またはその画分」または「試料画分」は、試料の画分をいうのに用いることができる。試料の画分は、試料の画分を簡単に回収することによって生成じされ得、他には、２以上の画分への試料の分画をもたらす分離プロセスを行うことによって生成され得る。記載の内容は他のことを指令しているのでなければが別途指示しない限り、これらの句は同等であって、互換可能であり、試料の画分（または部分）の作成のいずれのタイプもいう。
【００２９】
ｑ．）本明細書で用いるとき、「サインイオン」および「レポーターイオン」は互換可能であって、共に、質量分析計における標識試薬または標識された分析物の断片化によってレポーター部分から生成される固有の質量のサインイオンをいう。サインイオンまたはレポーターイオンを用いて、分析物を標識するのに用いる固有の標識試薬を同定することができ、ＭＳ／ＭＳ分析におけるそのピーク強度は、分析される試料（またはその画分）に存在する標識された分析物の量に相関され得る。本明細書で用いるとき、サインイオンまたはレポーターイオンは、単に、レポーターという場合がある。本明細書で用いるとき、レポーター部分は、単に、レポーターという場合もある。レポーター部分とは、標識試薬、標識された分析物またはその断片に結合された基をいい、レポーターイオンとは、標識試薬、標識された分析物またはその断片にレポーター部分を連結される結合の断片化に際して生じた断片イオンをいうことが理解されるべきである。従って、用語「レポーター」が用いられる文脈はその意図した意味を示す。また、句「固有のレポーター部分」は、「固有の質量のレポーター部分」と同等であって、それと互換可能であり、「固有のレポーターイオン」または「固有のサインイオン」は「固有の質量のレポーターイオン」または「固有の質量のサインイオン」と同等であってそれと互換可能であることが理解されるべきである。
【００３０】
ｒ．）本明細書で用いるとき、用語「塩形態」とは、化合物の塩、または化合物の塩の混合物をいう。加えて、化合物の双子イオン形態もまた用語「塩形態」にやはり含まれる。アミン、または他の塩基性基を有する化合物の塩は、例えば、（そのいずれの組合せも含む）塩化水素、臭化水素、酢酸、過塩素酸などの適当な有機または無機酸との反応によって得ることができる。第四級アンモニウム基を持つ化合物は、（そのいずれの組合せも含めた）塩化物、臭化物、ヨウ化物、アセテート、過塩素酸塩などのカウンターアニオンを含むこともできる。カルボン酸、または他の酸性官能基を有する化合物の塩は、化合物を適当な塩基、例えば、水酸化物塩基と反応させることによって調製することができる。従って、酸性官能基の塩は、（そのいずれの組合せも含めた）ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのカウンターカチオンを有してもよい。
【００３１】
ｓ．）本明細書で用いるとき、用語「ステロイド」は、限定されないが、コルチゾール、１１−デスオキシコルチゾール（化合物Ｓ）、コルチコステロン、テストステロン、エピテストステロン、デスオキシメチルテストステロン、テトラヒドロゲストリノン（ＴＨＧ）、エストラジオール、エストロン、４−ヒドロキシエストロン、２−メトキシエストロン、２−ヒドロキシエストロン、１６−ケトエストラジオール、１６アルファ−ヒドロキシエストロン、２−ヒドロキシエストロン−３−メチルエーテル、プレドニゾン、プレドニゾロン、プレグネノロン、プロゲステロン、デヒドロエピアンドロステン（ＤＨＥＡ）、１７ＯＨプレグネノロン、１７ＯＨプロゲステロン、１７ＯＨプロゲステロン、アンドロステロン、エピアンドロステロン、デルタ４アンドロステンジオン（Ｄ４Ａ）、スチグマステロールおよびコレステロールを含むことを意図する。
【００３２】
ｔ．）本明細書で用いるとき、「合成化合物」とは、天然に生じる経路の操作を含めたプロセスの操作によって生じる化合物をいう。かくして、合成化合物は、合成化学技術を用いて生成され得る。しかしながら、本明細書で用いるとき、「合成化合物」は、例えば、本明細書に記載された同位体濃縮された標識試薬、または標識試薬の中間体をそれにより生成するように変化させる、細菌または酵母等の生物への同位体濃縮された化合物の供給を例えば含めた酵素的方法によって生成される化合物を含めることも意図する。
【００３３】
ｕ．）本明細書で用いるとき、「合成により濃縮された」または「合成により濃縮された」とは、本明細書に記載された、それにより、同位体濃縮された標識試薬、または標識試薬に対する中間体等の合成化合物を生成する合成または天然プロセスの操作をいう。
【００３４】
ｖ．）原子または分子の質量は、しばしば、最も近い全数原子質量単位または原子質量または原子質量単位の最も近い１／１０または１／１００に近似され得ることは広く受け入れられている。本明細書で用いるとき、「総質量」とは、絶対質量、ならびに異なる原子タイプの同位体の使用があまりにも質量が近いので、それらは用いる異なる同位体タイプの質量の非常に小さな差を検出できるか否かにかかわらず、（レポーター／リンカー組合せの総質量が異性体および／または同重体標識試薬の組またはキット内で同一であるような）レポーターおよび／またはリンカー部分の質量のバランスをとる目的で機能的に同等である範囲内の近似的な質量をいう。
【００３５】
例えば、硫黄の通常の同位体は３２（実際の質量３１．９７２０）および３４（実際の質量３３．９６７８）の総質量を有し、酸素の通常の同位体は１６．０（実際の質量１５．９９４９）および１８．０（実際の質量１７．９９９２）の総質量を有し、炭素の通常の同位体は１２．０（実際の質量１２．０００００）および１３．０（実際の質量１３．００３３６）の総質量を有し、および窒素の通常の同位体は１４．０（実際の質量１４．００３１）および１５．０（実際の質量１５．０００１）の総質量を有する。これらの値は近似であるが、当業者であれば、組の１つの標識内の同位体濃縮された部位において１８Ｏ同位体（または３４Ｓ同位体）を用いると、（１６．０の総質量を有する酸素の同位体にわたって）更に２質量単位が、例えば、標識において他の箇所に、２つの１２Ｃ原子の代わりに２つの炭素１３Ｃ原子、２つの１４Ｎ原子の代わりに２つの１５Ｎ原子、１２Ｃおよび１４Ｎの代わりに１つの１３Ｃ原子および１つの１５Ｎ原子さえを取込んで、１８Ｏ（または３４Ｓ同位体）を補うことによって、１６Ｏ（または３２Ｓ同位体）を含む組の異なる標識において補うことができる。このようにして、該組の２つの異なる標識は同一の総質量を有することができる。というのは、それにより、組またはキットの標識の全てにおいて２ダルトンの質量の増加を達成するための、（２つの１２Ｃ原子の代わりの）２つの１３Ｃ原子、（２つの１４Ｎ原子の代わりの）２つの１５Ｎ原子、（１２Ｃおよび１４Ｎの代わりの）１つの１３Ｃおよび１つの１５Ｎ、または（１つの１６Ｏ原子の代わりの）１つの１８Ｏ原子（あるいは１つの３２Ｓの代わりの１つの３４Ｓ）の使用の間の質量の非常に小さな実際の差は、分析の性質に対して障害とはならないからである。
【００３６】
これは、図４ａを参照して説明することができる。図４ａにおいて、化合物３のレポーター／リンカー組合せ（図４ａ；分子式：Ｃ５１３ＣＨ１１１５Ｎ２Ｏ）は、２つの１５Ｎ原子および１つの１３Ｃ原子、および１３０．０８５の合計理論質量を有する。比較により、同重体１のレポーター／リンカー部分（図４ａ；分子式Ｃ５１３ＣＨ１１Ｎ２１８Ｏ）は１つの１８Ｏ原子および１つの１３Ｃ原子、および１３０．０９５の合計理論質量を有する。化合物１および３は、レポーター／リンカー部分のわずかな絶対質量の差があり得るが（各々、質量１３０．０９５  ｖｓ．質量１３０．０８５）、重原子同位体含有量を除いて、構造的に区別することができない同重体であり得る。しかしながら、化合物１および３のレポーター／リンカー部分の総質量は、本発明の目的では１３０．１である。というのは、これは、質量分析計が、同重体１および３から生じたレポーターイオンの絶対質量の間の小さな差を測定するのに十分に感受性であるか否かに関わらず、分析に障害とならないからである。
【００３７】
同様に、図４ｂを参照し、２つの異性体試薬が示され、化合物５および６のレポーター／リンカー部分の質量は、各々、１４４．１１１および１４４．１００である。これらの化合物のレポーター／リンカー部分の総質量は本発明の目的では１４４．１である。というのは、それは、質量分析計が化合物５および６から生じたレポーターイオンの絶対質量の間の小さな差を測定するのに十分感受性であるか否かに関わらず、分析に障害とならないからである。
【００３８】
図４ａおよび４ｂから、構造内の同一の重原子同位体の分布は、異性体および／または同重体標識試薬の組の作成のための唯一の考慮ではないことは明らかである。重原子同位体タイプを混合して、所望の重質量の異性体および／または同重体を達成するのが可能である。このように、重原子同位体の選択（組合せ）、ならびにそれらの分布は共に、本発明の実施形態で有用な異性体および／または同重体標識試薬の生産において考慮するために入手可能である。
【００３９】
ｗ．）本明細書で用いるとき、用語「アルキル」とは、完全に飽和され得る直鎖または分岐鎖のＣ２−Ｃ８炭化水素または環式Ｃ３−Ｃ８炭化水素（すなわち、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基またはシクロヘキシルメチレン基等のシクロアルキル基）をいう。本明細書で用いるとき、用語「アルキル」とは、置換または非置換であってよい基をいう。いくつかの実施形態において、用語「アルキル」は、アルキル鎖における１以上のメチレン基が−Ｏ−、−Ｓｉ−または−Ｓ−等のヘテロ原子によって置き換えられ得る化合物をいうことも意図される。いくつかの実施形態において、アルキル基は、完全に飽和され得る直鎖または分岐鎖のＣ２−Ｃ６炭化水素または環式Ｃ３−Ｃ６炭化水素であり得る。
【００４０】
ｘ．）本明細書で用いるとき、用語「アルキレン」とは、少なくとも２つの部分（例えば、−｛ＣＨ２｝−（メチレン）、−｛ＣＨ２ＣＨ２｝−（エチレン）、
【００４１】
【化１】
0005422382.tif 000022
など）へ少なくとも２つの結合点を含む直鎖または分岐鎖アルキル鎖または環式アルキル基をいい、括弧は結合点を示す。本明細書において用いる場合、用語「アルキレン」とは、置換または非置換であってよい基をいう。いくつかの実施形態において、用語「アルキレン」は、アルキレン基のアルキル鎖において、もしあれば、１以上のメチレン基が−Ｏ−、−Ｓｉ−または−Ｓ−等のヘテロ原子によって置き換えられ得る化合物をいうことも意図される。いくつかの実施形態において、アルキレン基はＣ１−Ｃ１０炭化水素であり得る。いくつかの実施形態において、アルキレン基はＣ２−Ｃ６炭化水素であり得る。
【００４２】
ｙ．）本明細書で用いるとき、用語「アルケニル」とは、１以上の二重結合を含む、直鎖または分岐鎖Ｃ２−Ｃ８炭化水素または環式Ｃ３−Ｃ８炭化水素をいう。本明細書で用いる場合、用語「アルケニル」とは、置換または非置換であってよい基をいう。いくつかの実施形態において、用語「アルケニル」は、アルケニル基のアルキル鎖において、もしあれば、１以上のメチレン基が−Ｏ−、−Ｓｉ−または−Ｓ−等のヘテロ原子によって置換され得る化合物をいうことも意図する。いくつかの実施形態においてアルキル基は、１以上の二重結合を含む直鎖または分岐鎖Ｃ２−Ｃ６炭化水素または環式Ｃ３−Ｃ６炭化水素であり得る。
【００４３】
ｚ．）本明細書で用いるとき、用語「アルケニレン」とは、少なくとも２つの部分への２つの結合点を含むアルケニル基をいう。本明細書で用いる場合、用語「アルケニレン」とは、置換または非置換であってよい基をいう。いくつかの実施形態において、用語「アルケニレン」は、アルケニレン基のアルキル鎖において、もしあれば、１以上のメチレン基が−Ｏ−、−Ｓｉ−または−Ｓ−等のヘテロ原子によって置換され得る化合物をいうことも意図する。
【００４４】
ａａ．）本明細書中で用いるとき、用語「アルキニル」とは、１以上の三重結合を含む直鎖または分岐鎖Ｃ２−Ｃ８炭化水素または環式Ｃ３−Ｃ８炭化水素をいう。本明細書で用いる場合、用語「アルキニル」とは、置換または非置換であってよい基をいう。いくつかの実施形態において、用語「アルキニル」は、アルキニル基のアルキル鎖において、もしあれば、１以上のメチレン基が−Ｏ−、−Ｓｉ−または−Ｓ−等のヘテロ原子によって置き換えられ得る化合物をいうことも意図する。いくつかの実施形態において、アルキニル基は、１以上の三重結合を有する、直鎖または分岐鎖Ｃ２−Ｃ６炭化水素または環式Ｃ３−Ｃ６炭化水素であり得る。
【００４５】
ａｂ．）本明細書で用いるとき、用語「アルキニレン」とは、少なくとも２つの部分への２つの結合点を含むアルキニル基をいう。本明細書で用いる場合、用語「アルキニレン」とは、置換または非置換であってよい基をいう。いくつかの実施形態において、用語「アルキニレン」は、アルキニレン基のアルキル鎖において、もしあれば、１以上のメチレン基が−Ｏ−、−Ｓｉ−または−Ｓ−等のヘテロ原子によって置き換えられ得る化合物をいうことも意図する。
【００４６】
ａｃ．）本明細書で用いるとき、用語「脂肪族」とは、前記定義の直鎖、分岐鎖、または環式アルキル、アルケニル、およびアルキル部分のいずれもいう。本明細書で用いる場合、用語「脂肪族」とは、置換または非置換であってよい基をいう。
【００４７】
ａｄ．）本明細書で用いるとき、用語「アリール」は、単独で、または別の部分（例えば、アリールアルキルなど）の一部としての、フェニル等の炭素環式芳香族基をいう。アリール基は、炭素環式芳香族環が別の炭素環式芳香族基に縮合した（例えば、１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントラシル、２−アントラシルなど）、あるいは炭素環式芳香族環が１以上の炭素環式非芳香族環に縮合した（例えば、テトラヒドロナフタレン、インダンなど）縮合多環式芳香族環系も含む。本明細書で用いるとき、用語「アリール」とは、置換または非置換であってよい基をいう。
【００４８】
ａｅ．）本明細書で用いるとき、用語「ヘテロアリール」とは、とりわけ、独立して、窒素、硫黄および酸素から選択される１、２、３または４のヘテロ原子を含む芳香族複素環をいう。本明細書で用いるとき、用語「ヘテロアリール」とは、置換または置換であってよい基をいう。ヘテロアリールは、シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール環等の１または２の環に縮合していてよい。分子へのヘテロアリールの結合点は、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、またはアリール環上にあってもよく、ヘテロアリール基は炭素またはヘテロ原子を通じて結合していてよい。ヘテロアリール基の例は、その各々が必要に応じて置換されていてよい、イミダゾリル、フリル、ピロリル、チエニル、チアゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、ピリジニル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル、キノニル、イソキノリニル、インダゾリル、ベンゾキサゾリル、ベンズイソオキサゾリル、ベンズフリル、ベンゾチアゾリル、インドリジニル、イミダゾピリジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、オキサゾリル、テトラゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンズイソチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、インドリル、テトラヒドロインドリル、アザインドリル、イミダゾピリジル、キナゾリニル、プリニル、ピロロ［２，３］ピリミジニル、ピラゾロ［３，４］ピリミジルまたはベンゾ（ｂ）チエニルを含む。
【００４９】
ａｆ．）本明細書で用いるとき、用語「アリーレン」とは、少なくとも２つの部分への少なくとも２つの結合点を含むアリールまたはヘテロアリール基をいう（例えば、フェニレンなど）。炭素環式非芳香族環に縮合したアリーレンの結合点は芳香族、非芳香族環のいずれかにあってよい。本明細書で用いるとき、用語「アリーレン」とは、置換または置換であってよい基をいう。
【００５０】
ａｇ．）本明細書で用いるとき、用語「アリールアルキル」とは、アルキレンリンカーを介して別の部分に結合したアリールまたはヘテロアリール基をいう。本明細書で用いるとき、用語「アリールアルキル」とは、置換または非置換であってよい基をいう。いくつかの実施形態において、用語「アリールアルキル」は、アリールアルキル基のアルキル鎖において、もしあれば、１以上のメチレン基が−Ｏ−、−Ｓｉ−または−Ｓ−等のヘテロ原子で置換され得る化合物をいうことも意図する。
【００５１】
ａｈ．）本明細書で用いるとき、用語「アリールアルキレン」とは、少なくとも２つの部分への少なくとも２つの結合点を有するアリールアルキル基をいう。第２の結合点は芳香族環またはアルキレン基のいずれかにあり得る。本明細書で用いるとき、用語「アリールアルキレン」とは、置換または非置換であってよい基をいう。いくつかの実施形態において、用語「アリールアルキレン」は、アリールアルキレン基のアルキル鎖において、もしあれば、１以上のメチレン基が−Ｏ−、−Ｓｉ−または−Ｓ−等のヘテロ原子によって置換され得る化合物をいうことも意図する。アリールアルキレンが置換されている場合、置換基は芳香族環またはアリールアルキレンのアルキレン部のいずれかまたは双方にあってよい。
【００５２】
ａｉ．）本明細書で用いるとき、用語「必要に応じて置換されている」および「置換または非置換の」は同等であって、互換可能である。いずれかのアルキル、アルキレン、アルケニル、アルケニレン、アルキニル、アルキニレン、アリール、アリールアルキル、アリーレン、ヘテロアリールまたはアリールアルキレン基についての適当な置換基は、本発明の実施形態で用いる反応条件下で安定ないずれの置換基も含む。適当な置換基の非限定例は：アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃブチル、ｔ−ブチル、シクロヘキシルなど）基、ハロアルキル（例えば、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル−など）基、アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシなど）基、アリール（例えば、フェニル）基、アリールアルキル（例えば、ベンジル）基、ニトロ基（−ＮＯ２）、シアノ基（−ＣＮ）、四級化された窒素原子またはハロゲン基（例えば、フッ素、塩素、臭素、および／またはヨウ素）を含むことができる。
【００５３】
加えて、アルキル、アルキレン、アルケニル、アルケニレン、アルキニル、アルキニレン、アリール、アリールアルキル、アリーレン、ヘテロアリールまたはアリールアルキレン基の部が、必要に応じて、＝ＯまたはＳで置換されていてよい。
【００５４】
ａｊ．）本明細書で用いるとき、用語「活性エステル」とは、塩基性条件下でアミン、アルコールおよびある種のチオールと容易に反応して、各々、アミド、エステルおよびチオエステルを供することができる化合物をいう。活性エステルが有機化学の分野においてよく確立された用語である証拠として、：Ｌｅｏ  Ａ  Ｐａｑｕｅｔｔｅ，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｖｏｌ．２，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５を更に参照されたい。
【００５５】
ａｋ．）本明細書で用いるとき、用語「複素環式環」とは、環において少なくとも２つの異なる元素の原子を含むいずれの環式分子構造もいう。複素環式環が有機化学の分野においてよく確立した用語である証拠として、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９７を更に参照されたい。
【００５６】
ａｌ．）本明細書で用いるとき、用語「脱離基」とは、反応の基質の残存または主要部として見なされるものからの置換または変位反応の間に離れる、いずれの原子または基、荷電、または非荷電もいう。脱離基が有機化学の分野においてよく確立された用語である証拠として、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９７を更に参照されたい。
【００５７】
ａｍ．）本明細書で用いるとき、用語「保護基」とは、分子中の官能基と反応し、それと結合して、該分子の引き続いての反応に官能基が参画するのを妨げる基をいうが、その基は、続いて除去されて、それにより、保護されていない官能基を再生することができる。保護基が有機化学の分野においてよく確立された用語であるという証拠として、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９７を更に参照されたい。
【００５８】
（種々の実施形態の説明）
この「一般的」セクションにおいて以下に記載された議論は、本明細書に記載された本発明の種々の実施形態のいくつか、または全てに関与することができることが理解されるべきである。
【００５９】
１．一般
標識試薬：
先に議論したように、質量分析を用いる分析物の分析で用いることができる標識試薬は、レポーター部分、バランス部分（またはリンカー部分）および反応性基を含むことができる。本明細書に開示された新規な標識試薬は、クロモフォア、フルオロフォア、スピン標識、酵素または化学発光化合物等の少なくとも１つのコードされていない検出可能な標識も含み、いくつかの実施形態においては、その塩形態および／または水和物形態を含めた、一般式Ｉ：
【００６０】
【化２】
0005422382.tif 000023
によって表すことができる。ＲＧは以下により詳細に記載されるように反応性基である。ＲＰは後により詳細に記載されるようにレポーター部分である。ＤＬは以下により詳細に議論するようにコードされていない検出可能な標識である。ＬＫは以下により詳細に記載されているようにリンカー部分である。Ｘは以下により詳細に記載されるように共有結合である。ＹおよびＷは、各々、独立して、以下により詳細に記載されるように共有結合または連結基であり、ｍおよびｎは各々０または１であり、但し、ｍ＋ｎ＝１である。
【００６１】
いくつかの実施形態において、標識試薬は支持体結合されていてよい。かくして、いくつかの実施形態において、標識試薬は、塩形態および／または水和物形態を含めた、一般式Ｉｓｓ：
【００６２】
【化３】
0005422382.tif 000024
によって表すことができる。ＲＧは以下により詳細に記載されるように反応性基である。ＲＰは以下により詳細に記載されるようにレポーター部分である。ＤＬは以下により詳細に議論されるようにコードされていない検出可能な標識である。ＬＫは以下により詳細に記載されるようにリンカー部分である。ＳＳは、標識試薬のレポーター部分「ＲＰ」が以下により詳細に記載されるように切断可能なリンカーを介して共有結合により連結した固体支持体である。Ｘは以下により詳細に記載されるように共有結合である。ＹおよびＷは、各々、独立して、以下により詳細に記載されるように共有結合または連結基であって、ｍおよびｎは各々０または１であり、但し、ｍ＋ｎ＝１である。
【００６３】
反応性基：
種々の実施形態で用いられる標識試薬の（短縮形「ＲＧ」を使用して表される場合がある）反応性基は、試料の１以上の反応性分析物の１以上の官能基と反応することができるいずれの求電子または求核基を含むこともできる。反応性基は分析物の官能基と反応することにより、分析物を標識試薬に共有結合により連結させる。かくして、各標識試薬は、試料の１以上の反応性分析物と反応することにより試料からの１以上の標識された分析物を形成することができる。
【００６４】
いくつかの実施形態においては、反応性基は、リンカー部分（すなわち、バランス部分）と会合する電子または基を含むと理解されよう。例えば、反応性基が活性エステルまたはカルボン酸ハライド基であるとき、活性エステルまたはカルボン酸ハライドのカルボニル基は、いくつかの実施形態においては、異性体および／または同重体標識試薬の組内のレポーター部分の質量のバランスをとる目的でリンカー部分と会合されると考えることができ、ここで、カルボニル炭素は標識試薬において、および標識された分析物において存在する。このことは典型的には明らかであり、ここで、重原子同位体は異性体および／または同重体標識試薬の組の標識試薬のいくらかまたは全てのカルボニル基に含まれる。結果として、いくつかの実施形態においては、反応性基は反応性基の脱離基を単に表すと理解することができる一方、他の実施形態においては、反応性基は、リンカー部分と会合するさらなる原子または部分を含むことができる。かくして、反応性基が以下に議論する特異的部分のいくつかによって表される場合、分析物は、リンカー部分の一部であると考えることができる、またはできない１以上のさらなる原子または基を通じてリンカー部分（すなわち、バランス部分）に連結されていてよいことも理解されるべきである。
【００６５】
反応性基は予め存在することができるか、あるいはそれはインサイチュで調製することができる。反応性基のインサイチュ調製は、反応性分析物の不在下で進行させることができ、あるいはそれは反応性分析物の存在下で進行させることができる。例えば、カルボン酸基は水溶性カルボジイミド（例えば、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩；ＥＤＣ）とインサイチュで修飾されることにより、分析物のアルキルまたはアリールアミン基等の求核体と反応することができる求電子基を調製することができる。いくつかの実施形態において、標識試薬のカルボン酸基のＥＤＣによる活性化は、アミン（または他の求核体）含有分析物の存在下で行うことができる。いくつかの実施形態において、アミン（または他の求核体）含有分析物は、ＥＤＣとの初期反応を行った後に加えることもできる。他の実施形態において、反応性基は、保護基のインサイチュ除去によってインサイチュで生成され得る。その結果、求核体および／または求電子体の反応によって分析物の誘導体化を行うことができる任意の既存のまたは新たに生じた試薬も、本発明の方法、混合物、キットおよび／または組成物の実施形態によって意図される。
【００６６】
標識試薬の反応性基が求電子体を含む場合、それは分析物の適当な求核基と反応することができる。標識試薬の反応性基が求核体を含む場合、それは分析物の適当な求電子基と反応することができる。適当な求核基および求電子基の多数の対が知られており、しばしば、化学および生化学の分野において用いられる。（例えば、蛋白質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、ステロイド、ビタミン、プロスタグランジン、または１５００ダルトン未満の質量を有する他の小分子等の）分析物にカップリングして、それらの誘導体化を行うことができる適当な求核または求電子基を含む試薬の非限定例は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃａｔａｌｏｇ  ＆  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（ａ  Ｐｅｒｓｔｏｒｐ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ），Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ６１１０５，ＵＳＡに記載されている。他の適当な試薬は当該分野で良く知られており、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ等の多数の他の販売業者から商業的に入手可能である。
【００６７】
標識試薬の反応性基は、アミン反応性基を含むことができる。例えば、アミン反応性基は活性エステルであり得る。活性エステルはペプチド合成において周知であり、ペプチド合成で通常用いられる条件下でアミノ酸のＮ−αアミンと容易に反応され得るある種のエステルをいう（Ｌｅｏ  Ａ  Ｐａｑｕｅｔｔｅ，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｖｏｌ．２，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５参照）。アミン反応性活性エステル基はＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル（ＮＨＳＳ）、ペンタフルオロフェニルエステル（Ｐｆｐ）、２−ニトロフェニルエステル（２−ＮＰ）、３−ニトロフェニルエステル（３−ＮＰ）、４−ニトロフェニルエステル（４−ＮＰ）、２，４−ジニトロフェニルエステル（２，４−ＮＰ）、ペンタフルオロフェニルエステル（Ｐｆｐ）、ペンタクロロフェニルエステル（Ｐｃｐ）、３−ヒドロキシ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オンエステル（Ｄｈｂｔ）、ヒドロキシピロリジノンエステル（ＮＨＰ）、２，４−ジハロフェニルエステル、２，２，２−トリフルオロエタニルエステルまたは１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパニルエステルであり得る。例えば、（可変ＲＧが反応性基の脱離基部のみと同意義である状況におけるようないくつかの実施形態において、本明細書では概してＺ’と称する）活性エステルの脱離基は以下の式：
【００６８】
【化４】
0005422382.tif 000025
（式中、Ｘ’は−Ｏ−または−Ｓ−であって、各Ｘ”は他の−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−ｌから独立している）によって表すことができる（Ｎ−メチルピペラジン化合物の活性エステルの合成のより詳細な記載については米国公開特許出願番号ＵＳ２００５−０１４８７７１Ａ１、および該活性エステルに対する種々の合成経路の説明については図７参照）。これまでの全ては活性エステルのアルコールまたはチオール脱離基であって、該アルコールまたはチオール脱離基は、アミノ酸のＮ−α−アミンの、活性エステル基のカルボニル炭素との反応によって置き換えられ得る。したがって、本明細書に記載されたいずれの適当な標識／タグ付き試薬の活性エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル）も、本明細書で提供される開示と組み合わせて、周知の手法を用いて調製することができるのは当業者に明らかなはずである（例えば：Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（１９９６）“Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ”ｉｎ  “Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，ｐａｇｅｓ  １３７−１６５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）も参照；“Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  Ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，ｅｄｉｔｏｒ：Ｒｏｇｅｒ  Ｅｐｔｏｎ，ＳＰＣＣ（ＵＫ）Ｌｔｄ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，１９９０）も参照）。
【００６９】
いくつかの実施形態において、標識試薬の反応性基は混合無水物を含むことができる。というのは、混合無水物は、アミン基と効果的に反応して、それにより、アミド結合を生成することが知られているからである。混合無水物は周知であり、しばしば、有機および／またはペプチド化学の分野において適用される周知の方法を用いて調製することができる。
【００７０】
いくつかの実施形態において、標識試薬の反応性基は、酸フッ化物基（Ｃａｒｐｉｎｏら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１２：９６５１（１９９０）参照）または酸塩化物基等のカルボン酸ハライド基であり得る。酸ハライド基と分析物のアミンとの反応は、アミドを形成する。酸ハライド基と分析物のヒドロキシルまたはチオール基との反応は、各々、エステルまたはチオエステルを生成する。
【００７１】
いくつかの実施形態において、反応性基はスルホニルハライドのスルホン酸基であり得る。スルホン酸であるとき、それは分析物との反応のために活性化され得る。スルホニルハライドであるとき、それは分析物と直接反応され得る。というのは、これは活性化形態であるからである。
【００７２】
いくつかの実施形態において、反応性基はイソシアネートまたはイソチオシアネート基であり得る。
【００７３】
いくつかの実施形態において、標識試薬の反応性基はチオール反応性基を含むことができる。例えば、チオール反応性基はマレイミド基、アルキルハライド基、α−ハロ−アシル基、α−ハロチオン基またはα−ハロイミン基であり得る。「ハライド基」または「ハロ」または「ハロ基」とは、我々は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素の原子を意味する。該チオール反応性基は周知であり、しばしば、ペプチド化学の分野において適用される方法を用いて調製され得る。
【００７４】
いくつかの実施形態において、標識試薬の反応性基はヒドロキシル反応性基を含むことができる。例えば、ヒドロキシル反応性基はトリチル−ハライドまたはシリル−ハライド反応性基であり得る。トリチル−ハライド反応性基は置換されていてよく（例えば、Ｘ’’’−メトキシトリチル、Ｘ’’’−ジメトキシトリチル、Ｘ’’’−トリメトキシトリチル等）、あるいは置換されていなくてもよく、ここで、Ｘ’’’は反応性基をリンカー（すなわち、バランス）に連結する結合である。シリル反応性部分は、Ｘ’’’−ジメチルシリル、Ｘ’’’−ジトリエチルシリル、Ｘ’’’−ジプロピルシリル、Ｘ’’’−ジイソプロピルシリル等のアルキル置換シリルハライドであり得、ここで、Ｘ’’’は反応性基をリンカー（すなわち、バランス）に連結させる結合である。該反応性基は周知であり、核酸化学の分野においてしばしば適用される方法を用いて調製され得る。
【００７５】
いくつかの実施形態において、標識試薬の反応性基はアミン基、ヒドロキシル基、チオール基、またはヒドラジド基等の求核体を含む。いくつかの実施形態において、求核反応性基はアミノアルキル基、ヒドロキシアルキル基またはチオアルキル基であり得る。該反応性基は周知であり、しばしば、有機化学の分野において適用される方法を用いて調製され得る。
【００７６】
レポーター部分：
本発明の実施形態において使用される標識試薬の（短縮形「ＲＰ」を使用して表される場合がある）レポーター部分は、決定され得る固有の質量（または質量分析計においては電荷対質量比）を有する基である。従って、いくつかの実施形態においては、異性体および／または同重体標識試薬の組の各レポーター部分が固有の総質量を有し、およびその対応するサインイオンは該組の各標識試薬について異なる。
【００７７】
異なるレポーター部分は１以上の重原子同位体を含み、それらの固有の総質量を達成することができる。例えば、炭素（１２Ｃ、１３Ｃおよび１４Ｃ）、窒素（１４Ｎおよび１５Ｎ）、酸素（１６Ｏおよび１８Ｏ）、硫黄（３２Ｓおよび３４Ｓ）または水素（水素、ジューテリウムおよびトリチウム）の同位体が存在し、レポーター部分の多様な基の調製で用いられ得る。これらは限定的ではない。というのは、他の軽および重原子同位体もまたレポーター部分で用いられ得るからである。軽および重原子同位体を含むレポーター部分を調製するのに適当な基本的な出発物質は、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｒｐ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＭＡ（ｗｗｗ．ｉｓｏｔｏｒｐ．ｃｏｍにおける「基本的出発物質」のリスト参照）およびＩｓｏｔｅｃ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈの部門）等の種々の商業的源から入手可能である。Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｒｐ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＩｓｏｔｅｃもまた、慣用的な合成規約下で所望の化合物をやはり調製するであろう。Ｉｄ．
レポーター部分は固定された電荷を含むことができるか、あるいは分析プロセスの間にイオン化されたようになることができる。レポーター部分は固定された電荷を含むことができ、またはイオン化されるようになることができる故に、標識試薬は単離することができ、あるいはそれを用いて、塩（または塩の混合物）または双子イオン形態にて反応性分析物を標識することができよう。レポーター部分（またはレポーターイオン）のイオン化は、質量分析計におけるその決定を容易とする。したがって、標識された分析物におけるレポーター部分の存在は、サインイオン（またはレポーターイオン）と称される場合がある断片イオンとして決定され得る。Ｎ−メチルピペラジンレポーター部分の種々のレポーターイオンは図５に示される。イオンの分子式は１３ＣＣ５Ｈ１３Ｎ２＋、１３ＣＣ５Ｈ１３１５ＮＮ＋、１３Ｃ２Ｃ４Ｈ１３１５ＮＮ＋および１３Ｃ３Ｃ３Ｈ１３１５ＮＮ＋である。
【００７８】
イオン化した場合、サインイオン（すなわち、レポーターイオン）は１以上の正味の正または負の電荷を含むことができる。かくして、レポーターイオンは１以上の酸性基および／または塩基性基を含むことができる。というのは、そのような基は、質量分析計において容易にイオン化され得るからである。例えば、レポーター部分は１以上の塩基性窒素原子（正の電荷）および／またはカルボン酸基、スルホン酸基またはリン酸基等の１以上のイオン化可能な酸性基（負の電荷）を含むことができ、但し、レポーター部分が正味の正または負の電荷を含むレポーターイオンを生成するように、塩基性または酸性基の一方または他方のより多くがバランス上にあるものとする。少なくとも１つの塩基性窒素を含むレポーター部分の非限定例は、置換または非置換のモルホリン、ピペリジン、またはピペラジン含有化合物を含む。
【００７９】
固有のレポーター部分は、対象の試料と会合されていてよく、それにより、その試料の１または多数の分析物を該固有のレポーター部分で標識する。このように、（一般に、質量分析計においてサインイオン（すなわち、レポーターイオン）として検出される）固有のレポーター部分についての情報を、該試料の分析物の１つまたは全てについての情報と関連づけることができる。
【００８０】
しかしながら、固有のレポーター部分は、サインイオンが決定される場合、分析物に物理的に連結される必要はない。むしろ、サインイオンの固有の総質量は、例えば、標識された分析物のイオンが断片化されて、それにより、娘断片イオンおよびサインイオンを生成させた後に、タンデム質量分析計の第２の質量分析において決定され得る。
【００８１】
決定されたサインイオンを用いて、決定された分析物が由来する試料を同定することができる。さらに、他のサインイオンの量に対する、あるいは較正標準に関連するサインイオンに対する、固有のサインイオンの（しばしば、濃度および量として表される）量（例えば、試料で予測される、および特異的レポーター部分で標識された分析物）を用いて、（試料混合物を形成するのに用いたもの等の）試料における分析物の（しばしば、濃度および／または量として表される）相対および／または絶対量を決定することができる。いくつかの実施形態において、内部較正標準を用いるよりはむしろ、絶対的定量は、較正曲線での種々のサインイオンのピーク強度の比較に基づいて決定することができる。従って、特定の試料における１以上の分析物の量等の情報は、各特定の試料を標識するのに用いるレポーター部分と関連づけることができる。分析物の同一性も決定する場合、その情報は、異なるサインイオンに関する情報と相関させて、それにより、１つの試料における、または複数の試料における各標識された分析物の同一性および量の決定を容易にすることができる。
【００８２】
いくつかの実施形態において、レポーター部分は、置換または非置換のＮ−アルキル化酢酸部分のメチレン炭素に共有結合により連結された窒素原子を含むことができ、ここで、酢酸部分のカルボン酸（またはチオカルボン酸）基のカルボニル基はそうではないが、置換または非置換のメチレン炭素はレポーターの一部である。かくして、いくつかの実施形態において、カルボン酸（またはチオカルボン酸）基を用いて、レポーターをリンカーに連結させることができるが、それはレポーターの一部と考えられない。窒素原子は１、２または３の基でアルキル化され得る。例えば、窒素原子を含む部分は、メチル、エチルまたはプロピル基等の置換された第一級アミン、またはジメチルアミン、ジエチルアミン、ジ−ｎ−プロピルアミンまたはジイソプロピルアミン等の置換された第二級アミンである。かくして、例えば、レポーター部分「ＲＰ」は、以下のように、式Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、およびＸ９によって示すことができ、ここで、レポーター部分「ＲＰ」は、角括弧によって区切られている。
【００８３】
【化５】
0005422382.tif 000026
レポーター部分は、それに、分析物がＮ−アルキル酢酸部分のカルボニル炭素を介して（直接的にまたは間接的に）連結された、置換または非置換のＮ−アルキル化酢酸部分のメチレン炭素に共有結合により連結された環窒素原子を含む５、６または７員複素式環であり得、ここで、カルボン酸基のカルボニル基はそうではないが、置換または非置換のチレン炭素はレポーターの一部である。複素環式環は芳香族または非芳香族であり得る。かくして、レポーター部分は式Ｙ−Ｊ−によって表すことができ、式中、基Ｙは５、６または７員の複素環式環を表すことができ、基Ｊは、置換または非置換の酢酸部分の置換または非置換のメチレン基を表すことができる。複素環式環は置換または非置換であり得る。例えば、複素環式部分の置換基はアルキル、アルコキシおよび／またはアリール基を含むことができる。置換基は、分析物を支持体に連結させるのに適した、アミン、ヒドロキシルまたはチオール基等の保護または非保護基を含むことができる（図６参照）。複素環式環は、１以上のケイ素、窒素、酸素、および／またはイオウ原子等のさらなるヘテロ原子を含むことができる。かくして、例えば、レポーター部分（ＰＲ）は、以下のように式Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、Ｘ１６、Ｘ１７、Ｘ１８、Ｘ１９、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２４、Ｘ２５およびＸ２６によって表すことができ、式中、レポーター部分「ＰＲ」は角括弧によって区切られている。
【００８４】
【化６】
0005422382.tif 000027
レポーター部分は、それが、分析物の分析に典型的な条件下で実質的にサブ断片化されないように選択され得る。いずれの疑いも回避するために、これは、任意であって、要求される特徴ではない。例えば、レポーターは、それが、質量分析計において標識された分析物の断片化を引き起すように適用された解離エネルギーの条件下で実質的にサブ−断片化しないように選択され得る。「実質的にサブ−断片化しない」とは、レポーターの断片が、標識された分析物の成功裏の決定に適用される場合に、バックグラウンドノイズを超えて検出するのが困難または不可能であることを意味する。
【００８５】
いくつかの実施形態において、レポーターイオンの総質量は、決定されるのが求められる分析物の質量、または分析物の予測された断片のいずれかの質量と比較して異なるように意図的に選択され得る（すなわち、「静かなゾーン」）。例えば、蛋白質またはペプチドが分析物である場合、レポーターイオンの総質量は、いずれかの天然に生じるアミノ酸またはペプチド、またはその予測される断片イオンと比較して異なるように選択され得る。これは分析物の決定を容易にすることができる。というのは、分析物に応じて、同一の一致した質量を有する試料の任意の可能な成分の欠如は、任意の分析の結果に信頼性を加えることができるからである。ペプチドに関してほとんどバックグラウンドが予測され得ない質量範囲の例は表１に見ることができる。
【００８６】
表１：ペプチド分析に関連した標識断片イオンｍ／ｚの選択のための可能な「静かなゾーン」
【００８７】
【表１−１】
0005422382.tif 000028
【００８８】
【表１−２】
0005422382.tif 000029
。
【００８９】
レポーター部分は非ポリマーであり得る。レポーター部分は、その質量が２５０原子質量単位（ａｍｕ）未満であることを示すｍ／ｚのサインイオンを生成するように選択され得る。レポーター部分は、２００ａｍｕ未満のｍ／ｚのサインイオンを生成するように選択され得る。レポーター部分は、１５０ａｍｕ未満のｍ／ｚのサインイオンを生成するように選択され得る。そのような小分子は、第１の質量分析における同一の一致した質量を有する試料の他の成分を含まない、第２の質量分析において容易に決定され得る。この関係において、第２の質量分析は、第１の質量分析において決定された選択されたイオンについて、典型的には、タンデム質量分析計にて、（または、例えば、一段階機器におけるポストソース分解によって）行うことができる。特定の電荷対質量比のイオンは、可能な断片化およびさらなる質量分析のために第１の質量分析から特異的に選択され得るので、第１の質量分析からの非選択イオンは第２の質量分析に向けて運ばれず、従って、第２の質量分析のスペクトルに悪影響を与えない。さらに、質量分析計の感度、および（定量目的での）検出器の直線性は、この低い質量範囲においてかなり頑強であり得る。加えて、質量分析計技術の現在の状態は、この質量範囲において１ダルトン未満のベースライン質量分解を可能にすることができる。全てのこれらの理由で、前記した特性を保有するレポーターは、本明細書に記載した方法を利用して複合混合物からの決定された分析物のかなり正確な定量を提供することができる。
【００９０】
リンカー（またはバランス）部分：
標識試薬の（短縮形「ＬＫ」を使用して称する場合がある）リンカー（またはバランス）部分を、本発明の実施形態で用いて、レポーター部分（ＲＰ）およびコードされていない検出可能な標識（ＤＬ）を、分析物との反応が起こっているか否かに応じて、分析物または反応性基に連結させることができる。リンカー部分は分岐状、または非分岐状であり得る。例えば、リンカーは分岐状であり得レポーターおよびコードされていない検出可能な標識は、各々、他方から独立して、リンカーに連結されれば、直鎖であってもよく、そこでは、コードされていない検出可能な標識およびレポーター部分は順次リンカー部分に連結される（図１ａおよび１ｂを参照）。コードされていない検出可能な標識は、直接的または間接的にリンカーに連結され得る。
【００９１】
リンカーは、中性種を生成する（すなわち、質量分析計においてニュートラルロスを受ける）ように選択され得、ここで、リンカーをレポーター部分に連結させる結合（すなわち、Ｘ結合）およびリンカーを分析物（いくつかの実施形態において、これはＹである）に連結させる結合または基の双方が、質量分析計において断片化される。いくつかの実施形態において、リンカー部分は、サブ−断片化を含めた解離エネルギーに付した場合にサブ−断片化して、それにより、リンカーの中性断片のみを生成するように設計され得る。いくつかの実施形態において、リンカーは、１以上の検出可能な断片を生じさせるように設計され得る。
【００９２】
異性体および／または同重体標識試薬の組を含む組および／またはキットで用いる場合、リンカー部分は、該組の各異なる試薬のリンカー部分の質量が、レポーター部分およびリンカー部分の組合せの凝集体総質量が組の各標識試薬で同一であるような、組の異なる標識試薬についてのレポーター部分間の総質量の差を補正するように、１以上の重原子同位体を含むことができる。かくして、レポーター／リンカー組合せ（すなわち、レポーター／リンカー部分）の凝集体総質量（すなわち、全体として採用された総質量）は、混合物の各標識された分析物について、または組および／またはキットの標識試薬について、（総質量基準で）同一であり得る。さらに詳しくは、リンカー部分は、異なる試料からの標識された分析物のレポーター部分間の総質量の差を補正することができ、ここで、レポーター部分の固有の総質量は、それから標識された分析物が由来する試料に相関し、およびレポーター／リンカー組合せの凝集体総質量は、それが由来する試料に拘わらず、試料混合物の各標識された分析物について同一である。このように、２以上の異なる試料における同一分析物の総質量は、標識され、次いで、混合されて試料混合物を生成する場合に、同一の総質量を有することができる。
【００９３】
例えば、標識された分析物、または分析物を標識するための組および／またはキットの標識試薬は異性体および／または同重体であり得る。かくして、（試料混合物からの）特定の電荷対質量比のイオンが、試料混合物の第１の質量分析から質量分析計において選択されたるとき（すなわち、選択されたイオン）、同一混合物をなす異なる試料からの同一分析物は、試料混合物におけるそれらの各濃度および／または量に比例して選択されたイオンで表すことができる。というのは、それらは全て、いずれの標識が分析物に連結されたかに拘わらず、同一の総質量を有するからである。従って、リンカーは、レポーターおよびコードされていない検出可能な標識を分析物に連結させるのみならず、固有のレポーター部分の異なる質量を補正するように働いて、それにより、種々の試料の標識された分析物におけるレポーター／リンカー部分の総質量を協調させる。
【００９４】
リンカーは標識試薬におけるレポーター部分についての質量バランスとして作用し得るので、リンカー中の原子の数が大きくなれば、組および／またはキットの異なる異性体／同重体標識試薬の可能な数はより大きくなる。異なって述べると、一般に、リンカーが含む原子の数が大きくなれば、潜在的なレポーター／リンカー組合せの数は大きくなる。というのが、同位体はリンカー中のせいぜい任意の位置において置換されて、それにより、リンカー部の異性体および／または同位体を生成することができるからであり、ここで、リンカー部を用いて、レポーター部の異なる質量を相殺し、それにより、固有の異性体および／または同重体標識試薬の組を作り出す。標識試薬のそのような多様な組は、同一および／または異なる試料における分析物の多重分析に特によく適している。
【００９５】
組および／またはキットの標識試薬の合計数は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上であり得る。質量バランスの考慮に基づき、組またはキットの標識試薬の多様性は、レポーターおよびリンカー部分の原子の数、軽同位体を置換するのに入手可能な重原子同位体、および同位体を合成により置くことができる種々の合成配置によってのみ制限される。しかしながら、前記で示唆したように、多数の同位体濃縮された基本的な出発物質は、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｒｐ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＩｓｏｔｅｃ等の製造業者から容易に入手可能である。そのような同位体濃縮された基本的な出発物質は、同重体および／または同位体標識試薬の組を生成するのに用いた合成プロセスにおいて当業者によって用いることができるか、あるいは同重体および／または異性体標識試薬の組を生成するのに用いた合成プロセスで用いられ得る同位体濃縮された出発物質（すなわち、合成により濃縮された化合物）を生成するのに用いられ得る。
【００９６】
レポーター／リンカー組合せ（すなわち、レポーター／リンカー部分）：
標識試薬は、結合Ｘを介して相互に直接連結されるレポーター部分およびリンカー部分を含むことができる。前記したように、レポーター／リンカー部分は、標識試薬の組および／またはキットの各メンバーについて、または標識された分析物の混合物における各標識された分析物について、総質量が同一であり得る。さらに、レポーター部分を（直接的または間接的に）リンカー部分に連結する結合（すなわち、結合Ｘ）は、解離エネルギーに付して、それにより、サインイオン（すなわち、レポーターイオン）をリンカー部分、リンカー／分析物および／またはリンカー／分析物／コードされていない検出可能な標識部分から放出される場合に、選択されたイオンの少なくとも一部において、断片化するように設計され得る。従って、（質量分析計において電荷対質量（ｍ／ｚ）比として観察された）サインイオンの総質量、およびその強度（すなわち、そのピーク強度）は、ＭＳ／ＭＳ分析において直接観察され得る。
【００９７】
レポーター／リンカー部分は、組またはキットの種々の標識試薬の中で同一または異なる重元素同位体の種々の組合せを含むことができる。科学文献において、これは、時々、「コード化」、「同位体コード」と、あるいは単に「コード」といわれてきた。例えば、Ａｂｅｒｓｏｌｄらは同位体コードアフィニティタグを開示している（ＩＣＡＴ；ＷＯ００／１１２０８参照）。１つの点において、Ａｂｅｒｓｏｌｄらの試薬は、Ａｂｅｒｓｏｌｄが同位体および／または同重体標識試薬等の２以上の同一質量標識試薬を教示しない本明細書に記載された標識試薬とは異なる。むしろ、Ａｂｅｒｓｏｌｄらは、それらの標識試薬の「軽い」および「重い」バージョンについて教示する。コードされていない検出可能な標識を含むＩＣＡＴ試薬のバージョンは（ＶＩＣＡＴと称される場合がある）、ＷＯ２００４／０１９０００、Ｌｕら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７６：４１０４−４１１１（２００４）に、およびＢｏｔｔａｒｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１５（２）：３８０−３８８（２００４）に記載されている。
【００９８】
いくつかの実施形態において、レポーターおよび／またはリンカー部分は、標識試薬または標識された分析物を支持体に固定化するのに用いられ得る原子または基を含むことができる。固定化は直接的または間接的であり得る。例えば、直接的な固定化は、レポーターに関連する原子または基（例えば、レポーターのアルキルアミン置換基）が、支持体の反応性基（例えば、切断可能リンカーの反応性基）と直接相互作用して、可動化を行うとき、起こり得る。比較として、間接的な固定化は、例えば、レポーターの置換基（例えば、レポーターおよび／またはリンカーのアルキルアミン置換基）が修飾され（例えば、ビオチニル化され）、かつ修飾基が支持体（例えば、アビジンまたはストレプトアビジン）の反応性基と相互作用して固定化を行うとき、起こる。結果として、本発明では、分析物が支持体結合された標識試薬と反応され得、ここで、各支持体が、異なる試料が異なる支持体と反応するように固有の標識試薬を含む実施形態、ならびに各異なる試料が異なる標識試薬と反応し、かつ反応産物が、その後、同一または異なる支持体に固定化される実施形態が考えられる。いずれにせよ、試料混合物は、一般には、質量分析による分析のために支持体から標識された分析物を切断することによって得られる（図６参照）。各試料の放出された標識分析物は必要に応じて別々に収集され得るか、あるいはそれらは切断プロセスの間に混合されて、それにより、試料混合物を形成することができる。収集される場合、放出された標識分析物は、その後、混合して、試料混合物を形成することができる。
【００９９】
コードされていない検出可能な標識：
本明細書に記載された標識試薬は、（短縮形「ＤＬ」の使用により称される場合がある）コードされていない検出可能な標識を含む。本明細書で開示された標識試薬と共に用いられ得るコードされていない検出可能な標識（部分）の非限定例は、限定されないが、クロモフォア、フルオロフォア、スピンラベル、酵素または化学発光化合物を含む。「コードされていない」とは、我々は、検出可能な標識が１以上の重原子同位体が合成により濃縮されていないことを意味する。従って、コードされていない検出可能な標識はレポーターイオン（サインイオン）を生成せず、リンカー−（バランス）部分の一部を表さない。
【０１００】
フルオロフォアの非限定例は、５（６）−カルボキシフルオレセイン（Ｆｌｕ）、６−（（７−アミノ−４−メチルクマリン−３−アセチル）アミノ）へキサン酸（Ｃｏｕ）、５（および６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（Ｒｏｘ）、シアニン２（Ｃｙ２）染料、シアニン３（Ｃｙ３）染料、シアニン３．５（Ｃｙ３．５）染料、シアニン５（Ｃｙ５）染料、シアニン５．５（Ｃｙ５．５）染料、シアニン７（Ｃｙ７）染料、シアニン９（Ｃｙ９）染料（シアニン染料２、３、３．５、５および５．５はＡｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬからＮＨＳエステルとして入手できる）またはＡｌｅｘａ染料シリーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を含む。
【０１０１】
酵素の非限定例はポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、クレノウＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、セケナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ１およびｐｈｉ２９ポリメラーゼ）アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、大豆ペルオキシダーゼ（ＳＢＰ）、リボヌクレアーゼおよびプロテアーゼを含む。
【０１０２】
異性体および／または同重体標識試薬の組では、各コードされていない検出可能な標識は、同様な条件下で該組の標識試薬の他のコードされていない検出可能な標識と同一の総質量および同一の正味の電荷を有する。各異なるコードされていない検出可能な標識は、独立して、該組における他のものから検出可能である。例えば、図８ａおよび８ｂに示された標識試薬のフルオロフォア（すなわち、コードされていない検出可能な標識）は、識別可能な蛍光プロフィール、生理学的ｐＨにおける同一の正味の電荷を有し、同一の公称総質量を有すると考えられる。
【０１０３】
各コードされていない検出可能な標識は組内で独立して検出可能である故に、いくつかの実施形態においては、コードされていない検出可能な標識は、以下に記載されるような電気詠動分離の間に特定の標識された分析物の相対濃度（または対象の他の条件）の差があるように見える場合、決定のために用いられ得る。かくして、いくつかの実施形態において、対象の分析物は、（電気詠動分離および）ＭＳ分析および定量に先行する分析に基づいてＭＳ分析のために思慮深く選択され得、（および、ある程度、定量され）得る。このようにして、量が変化したように見えない、あるいは予測される量を参照して相対的定量において異なるように見えない分析物のＭＳｎ分析をスキップし、それにより、時間および源のより効果的な使用を可能にすることができる。
【０１０４】
結合Ｘ：
Ｘは、レポーターの原子およびリンカー部分またはコードされていない検出可能な標識の原子間の結合である。本明細書に開示された種々の標識試薬の結合Ｘは、解離エネルギーに付された場合、選択されたイオンの少なくとも一部において断片化することができる。従って、解離エネルギーのレベルは、結合Ｘが標識された分析物の選択されたイオンの少なくとも一部において断片化できるように質量分析計において調節され得る。結合Ｘの断片化は、レポーター（すなわち、サインイオン）が分析物のイオンから独立して決定され得るように、分析物からレポーターを放出する。
【０１０５】
結合またはリンカー基Ｙ：
Ｙは、リンカー部分（「ＬＫ」）を反応性基（「ＲＧ」）に連結させる結合または連結基である。結合または連結基であるかを問わず、Ｙは必要に応じて、質量分析計における解離エネルギーの適用によって断片化可能である。Ｙが連結基であるとき、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、アリーレン基、またはアリールアルキレン基であり得る。Ｙが連結基であるとき、必要に応じて、１以上の重原子同位体を含んでもよい。Ｙが連結基であって、標識試薬が異性体および／または同重体標識試薬の組で用いられるとき、その総質量は該組の各標識試薬について同一である。
【０１０６】
Ｙが断片化可能であるとき、Ｙの断片化は、結合Ｘが既に断片化されているか否かに依って、分析物、またはその断片からレポーター／リンカー／コードされていない検出可能な標識部分を放出させる。結合であるとき、結合Ｙは結合Ｘよりもより不安定であり得る。結合Ｘは結合Ｙよりも不安定であり得る。結合ＸおよびＹは同一の相対的不安定性のものであり得る。
【０１０７】
対象の分析物が蛋白質またはペプチドである場合、結合ＸおよびＹの相対的不安定性はアミド（ペプチド）結合に関して調節され得る。結合Ｘ、結合Ｙ、または結合ＸおよびＹの双方は、典型的なアミド（ペプチド）結合と比較してより不安定であるか、同等に不安定であるか、またはより安定であり得る。例えば、解離エネルギーの条件下で、結合Ｘおよび／または結合Ｙは、Ｚ’’’−ｐｒｏダイマーまたはＺ’’’−ａｓｐダイマーのペプチド結合と比較して断片化の傾向を低くすることができ、ここで、Ｚ’’’はいずれかの天然アミノ酸であり、ｐｒｏはプロリンであって、ａｓｐはアスパラギン酸である。いくつかの実施形態において、結合ＸおよびＹは、典型的なアミド結合と近似的に同一レベルの解離エネルギーで断片化するであろう。いくつかの実施形態において、結合ＸおよびＹは、典型的なアミド結合と比較して、より高いレベルの解離エネルギーで断片化するであろう。
【０１０８】
結合ＸおよびＹは、結合Ｙの断片化の結果、結合Ｘの断片化がもたらされ、およびその逆も成立するように存在することもできる。このように、結合ＸおよびＹの双方は、実質量の分析物、またはその娘断片イオンが第２の質量分析において部分的標識を含まないように実質的に同時に断片化することができる。「実質量の分析物」とは、我々は、２５％未満、より好ましくは１０％未満の部分的に標識化された分析物がＭＳ／ＭＳスペクトルで決定され得ることを意味する。
【０１０９】
いくつかの実施形態においては、第２の質量分析（ＭＳ／ＭＳ）のスペクトルにおいて分析物の標識されたおよび標識されていない断片間に明瞭な境界があり得る故に、この特徴は、娘断片イオンのスペクトルのコンピュータ支援分析からの分析物の同定を単純化することができる。さらに、分析物の断片イオンは、ある実施形態においては、レポーター／リンカー／検出可能な部分で十分に標識でき、または標識できない（しかしながら、部分的に標識できない）故に、同位体が第２の質量分析において常套的に決定された部分的に標識された分析物の単一の不安定な結合の各側に存在する場合に当てはまるように、分解された結合にわたる同位体分布によって引き起された娘断片イオンの質量のばらつきはほとんどまたは全く無いようにすることができる。
【０１１０】
結合またはリンカー基Ｗ：
Ｗは、リンカー部分（「ＬＫ」）をコードされていない検出可能な標識（「ＤＬ」）に連結させる結合または連結基である。Ｗは、必要に応じて、光、熱または化学試薬の適用によって切断可能であり、および／または質量分析計における解離エネルギーの適用によって断片化可能（すなわち、切断可能）である。Ｗが連結基であるとき、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、アリーレン基、またはアリールアルキレン基であり得る。Ｗが連結基であるとき、必要に応じて、１以上の重原子同位体を含んでもよい。Ｗが連結基であって、標識試薬を異性体および／または同重体標識試薬の組で用いるとき、その総質量は該組の各標識試薬について同一である。Ｗが連結基であるいくつかの実施形態において、Ｗは、例えば、：Ｋａｔｅｓら、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００により詳細に記載されているようなＸＡＬ、ＰＡＬまたはＨＭＰＢのごとき切断可能な部分を含むことができる。
【０１１１】
可能なリンカーを含む支持体結合された標識試薬：
いくつかの実施形態によると、試料からの分析物は、標識試薬を含む固体支持体と反応することができ（各試料が異なる固体支持体と反応し、従って、各試料の標識された分析物が異なるレポーター部分を含み）、反応性基と反応しない試料の成分は必要に応じて洗浄除去され得る。次いで、切断可能リンカーを切断し、それにより、支持体からレポーター／リンカー／コードされていない検出可能な標識／分析物複合体を放出させる条件下で支持体を処理することによって、標識された分析物を各固体支持体から除去することができる。切断可能リンカーを切断して、それにより、２以上の異なる試料を得る条件下で各支持体を同様に処理することができ、各試料は１以上の標識された分析物を含み、ここで、特定の試料と会合した標識された分析物はそれに結合した固有のレポーター部分によって同定され、および／または定量され得る。次いで、収集された試料を混合して、以下に記載するように、試料混合物を形成することができる。
【０１１２】
切断可能リンカーを介して標識試薬を支持体に結合させるのに用いられ得る種々の支持体は商業的に入手可能である。いくつかの実施形態において、標識試薬はレポーター部分を介して支持体に結合され得る。一般に、標識試薬は、切断可能なリンカーの官能基と反応して、それにより、標識試薬を支持体に切断可能に連結させることができる求電子または求核基を含むであろう。いくつかの実施形態において、標識試薬は、切断可能なリンカーを担う支持体上で合成され得る。なお他の実施形態において、切断可能なリンカーを含む標識試薬を支持体と反応させ、それにより、切断可能なリンカーを含む支持体結合された標識試薬を形成することができる。
【０１１３】
例えば、標識試薬のレポーター部分のアミノ、ヒドロキシルまたはチオール基は、適当な支持体の切断可能なリンカーと反応され得る。切断可能なリンカーは「立体障害切断可能リンカー」であり得る。切断可能リンカーの切断は、標識または標識された分析物を支持体から放出させるであろう。立体障害固体支持体の非限定例は：塩化トリチル樹脂（トリチル−Ｃｌ，Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｐ／Ｎ  ０１−６４−００７４）、塩化２−クロロトリチル樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｐ／Ｎ  ０１−６４−００２１）、ＤＨＰＰ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｐ／Ｎ  Ｑ−１７５５）、ＭＢＨＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐ／Ｎ  ４００３７７）、塩化４−メチルトリチル樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｐ／Ｎ  ０１−６４−００７５）、塩化４−メトキシトリチル樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｐ／Ｎ  ０１−６４−００７６）、ヒドロキシ−（２−クロロフェニル）メチル−ＰＳ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｐ／Ｎ  ０１−６４−０３４５）、Ｒｉｎｋ酸樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｐ／Ｎｓ  ０１−６４−０３８０、０１−６４−０２０２）、ＮｏｖａＳｙｎ  ＴＧＴアルコール樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｐ／Ｎ  ０１−６４−００７４）を含む。多数の他の切断可能なリンカーが当該分野で知られており、それを用いて、商業的に入手可能な物質、常套的実験および本明細書で提供された教示のみを用いて適当な支持体を調製することができる。
【０１１４】
例えば、レポーター部分は、それの適当な支持体への切断可能な結合を容易にする原子または基を含む５、６または７員の複素環式環であり得る。例えば、該基はアミノ、ヒドロキシルまたはチオール基を含むアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレンまたはアルキルアリーレン基であり得る。いくつかの実施形態において、複素環式環はさらなる官能基を必要としない。例えば、切断可能なリンカーに結合した原子はピペラジン環の第二級窒素であり得る。例示的なピペラジン化合物およびその製造方法の議論は、公開された米国特許出願番号：ＵＳ２００４−０２１９６８５Ａ１に見出すことができる。リンカー部分を含む支持体と、レポーター部分のアミノ、ヒドロキシルまたはチオール基との反応は、標識試薬を含む支持体を形成することができる。支持体と、支持体結合された標識試薬との反応は、支持体合された標識された分析物を生成することができる。切断可能なリンカーは光、熱または化学試薬によって切断可能なように選択され得るので、適切な処理は、以下に記載するように試料混合物を生成するのに用いられ得る標識された分析物を放出するであろう。
【０１１５】
図６を参照し、支持体に切断可能に連結された例示的な標識試薬が示される。示されたように、ビーズ化支持体に連結されたトリチル基は、切断可能なリンカーである（例えば、塩化トリチル樹脂（トリチル−Ｃｌ，Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｐ／Ｎ  ０１−６４−００７４））。示されたように、標識試薬のアルキル化ピペラジンレポーター部分の連結された官能基Ｑは、支持体結合されたトリチル基に切断可能に連結され、反応性基の脱離基Ｚ’は分析物の官能基によって置き換えられて、それにより、支持体結合された標識された分析物を形成することができる。例えば、標識試薬の反応性基はカルボン酸であり得、これは分析物（例えば、ペプチド）のアミン官能基との反応のためにインサイチュで活性化されて、それにより、支持体結合された標識された分析物を形成する。示したように、支持体の酸での処理は、標識試薬のレポーター部分の官能基Ｑ’の再生によって支持体から標識された分析物を放出させる。
【０１１６】
質量分析計／質量分析（ＭＳ）：
本発明の方法は、タンデム質量分析計、および分子イオンを選択し、断片化する能力を有する他の質量分析計を用いて実施することができる。タンデム質量分析計（および、程度は低いが、一段階質量分析計）は、それらの質量−対−電荷（ｍ／ｚ）比に従って分子イオンを選択し、断片化し、次いで、得られた断片（娘）イオンスペクトルを記録する能力を有する。さらに詳しくは、娘断片イオンスペクトルは、選択されたイオンを解離エネルギーに付すことによって生成され得る（例えば、衝突誘起解離（ＣＩＤ））。例えば、特定のｍ／ｚ比の標識されたペプチドに対応するイオンは、第１の質量分析から選択され、第２の質量分析において断片化されて、再分析され得る。そのようなタンデム質量分析を行うことができる代表的な機器は、限定されないが、磁場型、タンデム飛行時間、三連四重極、イオン−トラップ、およびハイブリッド四重極時間飛行（Ｑ−ＴＯＦ）質量分析計を含む。
【０１１７】
これらのタイプの質量分析計は、限定されないが、電子スプレイイオン化（ＥＳＩ）およびマトリックス支援レーザー脱着イオン化（ＭＡＬＤＩ）を含めた種々のイオン化源と組合せて用いられてよい。イオン化源を用いて、分析物は固定された電荷を既に保有しない第１の質量分析のための荷電した種を生成することができる。さらなる質量分析機器および断片化方法は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ機器におけるポストソース分解、およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（飛行時間）−ＴＯＦ  ＭＳを用いる高エネルギーＣＩＤを含む。タンデム質量分析計の最近のレビューについては、Ｒ．Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ  ａｎｄ  Ｄ．Ｇｏｏｄｌｅｔｔ，Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０１：２６９−２９５（２００１）を参照されたい。
【０１１８】
解離エネルギーによる断片化：
結合は、質量分析計で起こるプロセスの結果として断片化できることはよく認められている。さらに、結合断片化は、イオンを解離エネルギーに付すことによって質量分析計において誘導され得る。例えば、解離エネルギーは、衝突誘起解離（ＣＩＤ）によって質量分析計において生成され得る。質量分析計においてイオンを断片化するのに用いることができる解離エネルギーの他の非限定例は、限定されないが、衝突活性化解離（ＣＡＤ）、光誘起解離（ＰＩＤ）、表面誘起解離（ＳＩＤ）、電子誘起解離（ＥＩＤ）、電子捕獲解離（ＥＣＤ）、黒体輻射赤外解離（ＢＩＲＤ）、ポストソース分解またはその組合せを含む。質量分析の当業者であれば、断片化を引き起こす解離エネルギーを与えるための他の例示的な技術は、限定されないが、光解離、電子捕獲および表面誘起解離を含むことを認識するであろう。
【０１１９】
衝突−誘起解離による結合を断片化するプロセスは、結合断片化が起こる地点まで、不活性ガスとの衝突を通じて、選択されたイオンの運動エネルギー状態を増加させることを含む。例えば、運動エネルギーは、衝突セル中での（窒素、ヘリウムまたはアルゴン）等の不活性ガスとの衝突によって移動され得る。イオンに移動され得る運動エネルギーの量は、衝突セルに入るガス分子の数に比例する。より多くのガス分子が存在する場合、より大きな量の運動エネルギーが選択されたイオンに移動され得、存在するガス分子がより少ない場合、より少ない運動エネルギーが移動する。
【０１２０】
したがって、質量分析計における解離エネルギーの適用が制御され得ることが明白である。また、ある種の結合は他の結合よりも不安定であるのはよく認められている。レポーター／リンカー／コードされていない検出可能な標識部位における結合の不安定性は、分析物の性質、およびレポーター／リンカー／コードされていない検出可能な標識部分の性質に依る。従って、解離エネルギーは、分析物および／または標識試薬（例えば、レポーター／リンカー組合せ）が決定可能な様式で断片化され得るように調節され得る。当業者であれば、どのようにして質量分析計の成分に対してそのような常套的調節をなして、それにより、適切なレベルの解離エネルギーを達成して、それにより、標識された分析物のイオンの少なくとも一部をサインイオン（すなわち、レポーターイオン）および娘断片イオンに断片化するのを認識するであろう。
【０１２１】
例えば、解離エネルギーは、第１の質量分析から選択され／単離されるイオンに適用され得る。タンデム質量分析計において、抽出されたイオンを解離エネルギーに付して、それにより、断片化を引き起こし、次いで、第２の質量分析計に移動させることができる。選択されたイオンは選択された電荷対質量比を有することができる。該電荷対質量比は、質量分析計の特徴に依存して、一定範囲の電荷に対する質量の比率内とすることができる。衝突誘起解離を用いる場合、イオンは、それらを、解離エネルギーを適用して、それにより、断片イオンを生成することができる衝突セルを通すことによって、第１の質量分析計から第２の質量分析計に移動され得る。例えば、分析のために第２の質量分析計に送られたイオンが、（もしあれば）残りの（断片化されていない）選択されたイオンのいくらか、または一部、ならびにレポーターイオン（サインイオン）、および標識された分析物の娘断片イオンを含むことができる。
【０１２２】
コンピュータ支援データベース分析による分析物の決定：
いくつかの実施形態において、分析物は、既知のまたは「理論的」分析物のスペクトルとのコンピュータ支援比較によって分析される娘−イオン断片化パターンに基づいて決定され得る。例えば、低エネルギーＣＩＤの条件下で断片化されたペプチドイオンの娘断片イオンスペクトルは、多くの区別される断片化事象の総和と考えることができる。共通の命名法は、分解されるアミド結合に従う娘断片イオン、および結合分裂後に電荷を保有するペプチド断片を区別する（Ｒｅｏｐｓｔｏｒｆｆら、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，１１：６０１（１９８８））。分裂性アミド結合のＮ−末端側の電荷−保持の結果、ｂ−タイプのイオンの形成がもたらされる。分解されたアミド結合のＣ−末端側に電荷が残ると、断片イオンはｙ−タイプのイオンといわれる。ｂ−およびｙ−タイプのイオンに加えて、ＣＩＤマススペクトルは他の診断断片イオンを含有してもよい（これらは、アンモニア（−１７ａｍｕ）のグルタミン、リシンおよびアルギニンからのニュートラルロス、またはセリンおよびスレオニン等のヒドロキシル含有アミノ酸からの水（−１８ａｍｕ）のロスによって生じたイオンを含む）；診断断片イオンならびにｂ−およびｙ−タイプのイオンは、全て、娘断片イオンである。ある種のアミノ酸は、他のものよりも低エネルギーＣＩＤの条件下でより容易に断片化することが観察されている。これは、プロリンまたはアスパラギン酸残基を含有するペプチドで特に明らかであり、アスパルチル−プロリン結合においてなおよりそうである（Ｍａｒｋ，Ｍ．ら、Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ．，１２：８３７−８４２（１９９８））。従って、Ｚ’’’−ｐｒｏダイマーまたはＺ’’’−ａｓｐダイマーのポリペプチドであって、式中、Ｚ’’’は任意の天然アミノ酸であり、ｐｒｏはプロリンであり、ａｓｐはアスパラギン酸であって、全ての他のアミノ酸ダイマーの組合せの間のペプチド結合と比較してより不安定な傾向があろう。
【０１２３】
従って、ペプチドおよび蛋白質試料については、低エネルギーＣＩＤスペクトルは、重複するｂ−およびｙ−シリーズのイオン、同一ペプチドからの内部断片イオン、およびイモニウムおよび他のニュートラルロスイオンにおける冗長な配列特異的情報を含む。親ペプチドのアミノ酸配列をデノボで組立てるためのそのようなＣＩＤスペクトルの解釈は興味深く、時間を消費するが、行うことができる。配列決定のためのコンピュータ支援デノボ方法における最近の進歩は、Ｈｕａｎｇ，Ｙ．，Ｒｏｓｓ，Ｏ，Ｓｍｉｒｎｏｖ，Ｉ，Ｍａｒｔｉｎ，Ｓ．およびＰａｐｐｉｎ，Ｄ．２００３，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ６ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｎｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  ＭＳ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｕｇ  ２４−２８，２００３，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ＣＡに記載されている。ペプチド配列の同定における最も重要な進歩は、ペプチドＣＩＤスペクトルを、蛋白質およびＤＮＡ配列データベースに既に存在するペプチド配列に相関させるコンピュータアルゴリズムの開発であった。そのようなアプローチは、ＳＥＱＵＥＳＴ（Ｅｎｇ，Ｊら、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，５：９７６−９８９（１９９４））およびＭＡＳＣＯＴ（Ｐｅｒｋｉｎｓ，Ｄ．ら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２０：３５５１−３５６７（１９９９））等のプログラムによって例示される。
【０１２４】
簡単に述べれば、実験的ペプチドＣＩＤスペクトル（ＭＳ／ＭＳスペクトル）を、蛋白質またはゲノム配列データベースから得られたペプチド配列から計算により生じた「理論的」娘断片イオンスペクトルと一致させ、または相関させる。一致または相関は、予測される質量とＭＳ／ＭＳ様式にて娘断片イオンの観察された質量との間の同様性に基づく。潜在的な一致または相関を、どのようによく実験的および「理論的」断片パターンが適合するかに従ってスコア取りする。所与のペプチドアミノ酸配列についてのデータベース検索に関する拘束はかなり区別的であるので、単一ペプチドＣＩＤスペクトルは、全ゲノムまたは発現された配列タグ（ＥＳＴ）データベースにおける任意の所与の蛋白質を同定するのに適切であり得る。他のレビューについては、：Ｙａｔｅｓ，Ｊ．Ｒ．Ｔｒｅｎｄｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６：５−８（２０００）およびＹａｔｅｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １９：８９３−９００（１９９８）を参照されたい。
【０１２５】
従って、ＭＳ／ＭＳスペクトルの娘断片イオン分析は、標識された分析物の分析物を決定するのに用いられ得るのみならず、決定された分析物が由来する分析物を決定するのにも用いられ得る。例えば、ＭＳ／ＭＳ分析におけるペプチドの同定を用いて、蛋白質の酵素消化の結果としてペプチドがそれから切断された蛋白質を決定することができる。そのような分析は、核酸、脂質ステロイドおよび／またはプロスタグランジン等の他の分析物に適用され得ると考えられる。
【０１２６】
Ｘ結合およびＹ結合：
レポーター部分の原子とリンカー部分の原子との間の結合はＸ結合である。標識された分析物における結合であると、リンカー部分の原子と分析物の原子との間の結合はＹ結合である。いくつかの実施形態において、Ｘ結合およびＹ結合は、解離エネルギーに付された場合に、選択されたイオンの少なくとも一部において断片化することができる。したがって、解離エネルギーは、いくつかの実施形態において、Ｘ結合およびＹ結合の双方が標識された分析物の選択されたイオンの少なくとも一部において断片化するように質量分析計において調節され得る。
【０１２７】
Ｘ結合の断片化は、レポーターイオンが分析物から独立して決定され得るように、レポーター部分を分析物から放出させる。Ｙ結合の断片化は、Ｙ結合が既に断片化されたか否かに依存して、レポーター／リンカー／コードされていない検出可能な標識部分を分析物から、またはリンカーを分析物から放出させる。いくつかの実施形態において、Ｘ結合はＹ結合よりも不安定であり得る。いくつかの実施形態において、Ｙ結合はＸ結合よりも不安定であり得る。いくつかの実施形態において、ＸおよびＹ結合が同一の相対的不安定性のものであり得る。簡単に述べれば、Ｘ結合は、断片化して、それにより、レポーターイオンを放出するように設計されるが、Ｙ結合は本発明の種々の実施形態において断片化してもしなくてもよい。標識試薬が断片化可能なＹ結合を含まないとき、娘イオン分析は、標識試薬による分析物の任意の修飾物の質量が関連分析において補正されるように調節され得る。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、対象の分析物が蛋白質またはペプチドである場合、ＸおよびＹ結合の相対的不安定性は、アミド（ペプチド）結合に関連して調節され得る。Ｘ結合、Ｙ結合、または結合ＸおよびＹ双方は、典型的なアミド（ペプチド）結合と比較してより不安定であるか、同等に不安定であるか、またはより安定であり得る。例えば、解離エネルギーの条件下では、Ｘ結合および／またはＹ結合は、Ｚ’’’−ｐｒｏダイマーまたはＺ’’’−ａｓｐダイマーのペプチド結合と比較して断片化の傾向を低くすることができ、式中、Ｚ’’’はいずれかの天然アミノ酸であり、ｐｒｏはプロリンであって、ａｓｐはアスパラギン酸である。いくつかの実施形態において、Ｘ結合およびＹ結合は、典型的なアミド結合とほぼ同一の解離エネルギーのレベルで断片化することができる。いくつかの実施形態において、ＸおよびＹ結合は、典型的なアミド結合と比較して、解離エネルギーのより大きなレベルにて断片化することができる。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、Ｘ結合およびＹ結合は、Ｘ結合の断片化の結果、Ｙ結合の断片化がもたらされ、および逆が成立するように存在することができる。このようにして、双方の結合ＸおよびＹは、分析物、またはその娘断片イオンの実質的な量は部分的標識を含まないように実質的に同時に断片化することができる。「分析物の実質量」とは、我々は、部分的に標識された分析物の２５％未満、好ましくは１０％未満が（例えば、ｎ’が１を超えるＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ’分析において）質量分析計で決定され得ることを意味する。
【０１３０】
いくつかの実施形態においては、（例えば、ＭＳ／ＭＳ分析における）マススペクトルにおいて分析物の標識されたおよび標識されていない断片の間に明瞭な境界があり得る故に、この特徴は、娘断片イオンのスペクトルのコンピュータ支援分析からの分析物の同定を単純化することができる。というのは、標識の残余物に対する補正を、分析物の娘断片イオンを分析するのに用いられる質量計算に適用される必要がないからである。さらに、分析物の断片イオンは、いくつかの実施形態において、十分に標識されているかまたは標識されていない（しかし、部分的に標識されていない）故に、同位体が、解離エネルギーレベルの適用によって引き起こされた標識された分析物の断片化に由来する部分的に標識された分析物の単一の不安定な結合の各側に存在する場合のように、破壊された結合にわたる同位体分布によって引き起こされた娘断片イオンの質量にばらつきはほとんどまたは全くないようにできる。
【０１３１】
分析物の標識：
先に議論したように、分析物は、標識試薬の反応性基と分析物の官能基とを反応させることによって標識され得る。分析物上の官能基は求電子基または求核基の一方であり得、標識試薬の官能基は求電子基または求核基の他方であり得る。求電子体および求核体と反応して、分析物と標識試薬との間に共有結合による連結を形成することができる。
【０１３２】
標識反応は溶液中で起こり得る。いくつかの実施形態において、分析物または標識試薬の一方は支持体結合され得る。標識反応は、時々、水性条件において行うことができる。水性条件は、蛋白質、ペプチドおよび／または核酸等の生体分子の標識のために選択され得る。標識反応は、時々、有機溶媒または有機溶媒の混合物中で行うことができる。有機溶媒は、小分子である分析物のために選択され得る。水および有機溶媒の混合物を広い範囲にわたって用いることができる。例えば、水および約５パーセント〜約９５パーセントの有機溶媒（ｖ／ｖ）の溶液を調製し、分析物を標識するのに用いることができる。いくつかの実施形態において、水および約５０パーセント〜約９５パーセントの有機溶媒（ｖ／ｖ）の溶液を調製し、分析物を標識するのに用いることができる。いくつかの実施形態において、水および約６５パーセント〜約８０パーセントの有機溶媒（ｖ／ｖ）の溶液を調製し、分析物を標識するのに用いることができる。有機溶媒の非限定例は、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、およびメタノール、エタノール、プロパノールおよび／またはブタノール等のアルコールを含む。当業者であれば、適当な溶媒条件を決定して、標識試薬の性質、および分析物の性質に応じて、当該分野で入手できる知識、および本明細書で提供された開示を常套的実験と組み合わせて用いるだけで、分析物標識を容易にすることができるであろう。
【０１３３】
標識反応を行う場合、ｐＨを調節することができる。ｐＨは４〜１０の範囲とすることができる。ｐＨはこの範囲外であり得る。一般に、非水性反応の塩基性は、非求核有機塩基の添加によって調節され得る。適当な塩基の非限定例は、Ｎ−メチルモルホリン、トリエチルアミンおよびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを含む。別法として、溶媒を含有する水のｐＨは、（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）または４−モルホリンエタンスルホン酸（ＭＥＳ）等の生物学的緩衝液、または炭酸ナトリウムおよび／または炭酸水素ナトリウム等の無機緩衝液を用いて調節され得る。反応性基の少なくとも１つは求電子性であり得るので、いずれの求核性基も含有しない緩衝液を選択するのが望ましくあり得る。当業者であれば、通常の実験の適用により、標識反応のｐＨを調節するのに用いられ得る他の緩衝液を同定して、分析物の標識試薬での標識を容易にすることができよう。従って、当業者であれば、溶媒およびｐＨの適当な条件を決定して、それにより、常套的実験と組合せて本明細書に提供される開示のみを用い、標識試薬の性質および分析物の性質に応じて、分析物の標識を容易にすることができよう。
【０１３４】
試料の処理：
本発明のある実施形態において、分析物の標識の前に、ならびに後に、試料を処理することができる。処理は、分析物の標識を容易にすることができる。該処理は、試料成分の分析を容易にすることができる。処理は試料の取り扱いを簡素化することができる。処理は、これまでの２以上を容易にすることができる。
【０１３５】
例えば、試料を酵素または化学物質で処理することができる。酵素は（蛋白質およびペプチドを分解するための）プロテアーゼ、（核酸を分解するための）ヌクレアーゼ、またはいくつかの他の酵素であり得る。酵素は、非常に予測可能な分解パターンを有するように選択され得る。２以上のプロテアーゼおよび／または２以上のヌクレアーゼ酵素を一緒に、あるいは他の酵素と共に用いて、それにより、試料の成分を分解させてもよい。
【０１３６】
例えば、蛋白質分解酵素トリプシンは、リシンまたはアルギニンと非特異的アミノ酸との間のペプチド結合を切断して、それにより、アミン末端（Ｎ−末端）およびリシンまたはアルギニンのカルボキシル末端アミノ酸（Ｃ−末端）を含むペプチドを生成するセリンプロテアーゼである。このように、蛋白質の切断からのペプチドは予測可能であって、トリプシン消化からの試料におけるそれらの存在および／または量は、それらの起源の蛋白質の存在および／または量を示すことができる。さらに、ペプチドの遊離アミン末端は、その標識を容易にする良好な求核体であり得る。他の例示的な蛋白質分解酵素はパパイン、ペプシン、ＡｒｇＣ、ＬｙｓＣｍＶ８プロテアーゼ、ＡｓｐＮ、プロナーゼ、ケモトリプシンおよびカルボキシペプチダーゼ（例えば、カルボキシペプチダーゼＡ、Ｂ、Ｃ等）を含む。
【０１３７】
例えば、理論的プロテインＧは、トリプシン等のプロテアーゼで消化した場合、３つのペプチド（例えば、ペプチドＢ、ＣおよびＤ）を生じるであろう。従って、トリプシン等の蛋白質分解酵素で消化されている、および分析した場合に、ペプチドＢ、ＣおよびＤを含有することが確認される試料は、元来プロテインＧを含んでいたと言うことができる。ペプチドＢ、ＣおよびＤの量は、消化された試料中のプロテインＧの量にも相関するであろう。このように、試料（またはその画分）中のペプチドＢ、ＣおよびＤの１以上の同一性および／または量の任意の決定を用いて、元の試料（またはその画分）中のプロテインＧを同定し、および／または定量することもできる。
【０１３８】
酵素の活性は予測可能である故に、公知の配列の蛋白質の分解から生じるペプチドの配列を予測することができる（“Ａｎａｌｙｔｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｂｙ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ”（コンピュータ支援データベース分析による分析物の決定）の見出しの下での前記議論参照）。この情報により、「理論的」ペプチド情報を生成することができる。現実の試料の質量分光分析からの（前記した）娘断片イオンのコンピュータ支援分析における「理論的」ペプチド断片の決定は、従って、１以上の未知の試料中の１以上のペプチドまたは蛋白質を決定するのに用いることができる（同文献）。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、試料の処理は、標識すべき分析物に対する前駆体の処理を含むことができる。例えば、標識すべき分析物は消化された蛋白質に由来するペプチドであって、標識試薬が、この例では、ペプチドまたはペプチド分析物のアミン基（例えば、リシンのＮ−α−アミン基およびＮ−ε−アミン基）と反応するように選択される場合、試料の蛋白質（分析物前駆体分子）は、標識反応を容易にするように処理することができる。この例においては、蛋白質を還元剤（例えば、トリス［２−カルボキシエチル］ホスフィン（ＴＣＥＰ））で還元することができ、次いで、ブロッキング試薬（例えば、メタンチオスルホン酸メチル（ＭＭＴＳ））との反応によってチオール基をブロックすることができる。このようにして、蛋白質のチオール基がブロックされ、従って、分析物のアミンと標識試薬との間の標識反応に干渉しない。
【０１４０】
当業者であれば、常套的実験の助けを借りて適合され得る容易に入手可能な試薬およびプロトコルを用いてある種の他の前駆体分子の処理を行うことができるのは認識するであろう。正確な選択または試薬および条件は、標識すべき分析物、および標識試薬の性質に応じて選択され得る。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、試料の処理は、標識試薬で標識されるか否かに拘わらず、分析物または分析物前駆体の固体支持体への固定化を含むことができる。固定化は、共有結合固定化、ならびに吸着、および固定化（例えば、静電的固定化）の他の非共有結合手段を含むことができる。いくつかの実施形態において、固定化は試料の複雑さの低減を容易にすることができる。いくつかの実施形態において、固定化は分析物標識を容易にすることができる。いくつかの実施形態において、固定化は分析物前駆体の標識を容易にすることができる。いくつかの実施形態において、固定化は、ある種の特定を含む試料成分の画分の選択的標識を容易にすることができる（例えば、それらはシステイン部分を含み、またはそれを欠如する）いくつかの実施形態において、固定化は、精製を容易にすることができる。固定化は、これまでの２以上を容易にすることができる。
【０１４２】
試料混合物の分離を含めた分離：
いくつかの実施形態において、標識された分析物の試料、または試料混合物の処理は分離を含むことができる。１以上の分離を、標識されたおよび／または標識されていない分析物、標識されたおよび／または標識されていない分析物前駆体、またはその画分について行うことができる。１以上の分離を、固相捕獲から得られた１以上の画分および／または分離プロセスの他の産物に対して行うことができる。分離はこれまでの試料タイプの２以上について行うことができ、異なるタイプの分離を質量分析の前に行うことができる。
【０１４３】
例えば、異なる試料からの差次的に標識された分析物を含む試料混合物を調製することができる。差次的に標識されたとは、我々は、標識の各々が、同定され得る固有の特性を含むことを意味する。本明細書で記載された標識は独立して検出可能な２つの特性を含むことができる。具体的には、それらは、コードされていない検出可能な標識、ならびにＭＳ／ＭＳ（またはＭＳｎ’分析）において固有の「サインイオン」を生じる固有のレポーター部分を含むことができる。例えば、試料混合物を分析するためには、試料混合物の成分を分離することができ、質量分析を試料混合物の画分に対してのみ行うことができる。このように、分析の複雑さを実質的に低減化することができる。というのは、分離された分析物は質量について個々に分析することができ、それにより、分析プロセスの感度を増大させるからである。勿論、試料混合物の１以上のさらなる画分について分析を１回以上反復して、それにより、試料混合物の全ての画分の分析、かくして、試料混合物の成分のより完全な分析を可能にすることができる。
【０１４４】
差次的に標識された同一の分析物が、試料混合物におけるそれらの存在量に比例した濃度または量にて共溶出する分離条件を用いて、試料混合物を含む試料の各々における各標識された分析物の量を決定することができ、但し、試料混合物に加えられた各試料の量は既知であるとする。従って、いくつかの実施形態において、試料混合物の分離は、質量分析（例えば、ＭＳ／ＭＳ分析）において決定されたシグナルと試料混合物における差次的に標識された分析物の量との間の相関を維持しつつ、分析を単純化することができる。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、分離をクロマトフラフィによって行うことができる。例えば、液体クロマトフラフィ／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を用いて、試料の分離および質量分析を行うことができる。さらに、対象の分析物を分離するのに適したいずれのクロマトフラフィ分離プロセスを用いることもできる。例えば、クロマトフラフィ分離は順相クロマトフラフィ、逆相クロマトフラフィ、イオン交換クロマトフラフィ（すなわち、アニオン交換クロマトフラフィまたはカチオン交換クロマトフラフィ）、サイズ排除クロマトフラフィまたはアフィニティクロマトグラフィであり得る。
【０１４６】
本明細書に記載された異性体および／または同重体標識試薬で標識された分析物を含む試料混合物を分析する場合、電気泳動分離が特に有用であり得る。用いられ得る電気詠動分離技術の非限定例は、限定されないが、１Ｄ電気詠動分離、２Ｄ電気詠動分離および／またはキャピラリー電気詠動分離を含む（Ｗｅｓｔｅｒｍｅｉｅｒ，Ｒ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｎ  ＧｍｂＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ，２００５およびＭ．Ｋｈａｌｅｄｉ，Ｍ．，Ｈｉｇｈ−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ｔｈｅｏｒｙ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９８）。分離の間または後に、コードされていない検出可能な標識を用いて、共溶出する標識された分析物の混合物を突き止めることができ、ここで、混合物は異なる異性体および／または同重体標識で差次的に標識された対象の分析物を含むことができ、ここで、各異なる標識は、いずれの試料に分析物が由来するかを示す。さらに、コードされていない検出可能な標識は独立して検出可能である故に、標識された分析物の相対量は、ある実施形態においては、決定され得、この情報を用いて、質量分析によるさらなる分析のために（ある基準に基づいて）共移動する標識された分析物のあるものを慎重に選択し、それにより、電気詠動分離に存在する全ての可能な標識された分析物を分析する必要性を回避する。
【０１４７】
例えば、電気詠動分離プロセスは、ある種の分析物については、試料混合物中のその標識された分析物の量に比例した、一定量の各同重体的に標識された分析物を含む混合物を生成することができる。さらに、どのようにして試料混合物を調製したかの知識から（試料および他の任意の成分の部分（例えば、試料混合物を調製するために加えた較正標準））、試料混合物中の標識された分析物の量を、逆に、それが由来する試料中のその標識された分析物の量に関連付けるのが可能である。観察された相対量に基づき、さらなる分析のために対象のある基準を満足する（例えば、１０％を超えて相対強度が異なる）標識された分析物のみを選択するのも可能である。例えば、単離された共移動する分析物のある混合物を、定量的情報を供する分析を含めた質量分析計での分析に付すこともできる。
【０１４８】
分析物の相対的および絶対的定量：
いくつかの実施形態において、試料混合物の差次的に標識された同一分析物の相対的定量が可能である。例えば、差次的に標識された同一の分析物の相対的定量は、（例えば、第１の質量分析で観察された、選択された標識された分析物についての第２の質量分析において）質量分析で決定されたレポーターイオン（すなわち、サインイオン）の相対量（例えば、報告されたピークの面積および／または高さ）の比較によって可能である。別の言い方をすれば、各レポーターを、試料混合物を生成するのに用いた特定の試料についての情報と相関させることができる場合、そのレポーターイオンの相対量は、質量分析で観察された他のレポーターイオンに関して、試料混合物中のその分析物の相対量である。試料混合物を形成するために合わせた成分が知られている場合（例えば、試料混合物を形成するために合わせた各試料の量）、試料混合物を調製するのに用いた各試料中の分析物の相対量を、選択された電荷対質量の標識された分析物について観察されたレポーターイオンの相対量に基づいて逆に計算することができる。第１の質量分析で観察された異なる標識された分析物の全てについてこのプロセスを反復することができる。このように、各反応性分析物の（しばしば、濃度および／または量で表された）相対量は、試料混合物を生成するのに用いた異なる試料の各々において決定され得る。
【０１４９】
他の実施形態において、分析物の絶対的定量を決定することができる。これらの実施形態については、既知量の１以上の差次的に標識された分析物（較正標準）を試料混合物に加えることができるか、あるいはレポーターイオンの強度を較正曲線に相関させることができる。
【０１５０】
較正標準は、試料混合物の分析物を標識するのに用いた標識の組の異性体および／または同重体標識で標識された予測された分析物であり得るが、但し、較正標準についてのレポーター部分は、試料混合物を形成するのに用いた試料のいずれと比較しても固有のものであるとする。一旦、較正標準についてのレポーターイオンの相対量が、試料混合物の差次的に標識された分析物についてのレポーターイオンの相対量に関して決定されると、試料混合物に加えられた較正標準の量を参照して試料混合物中の差次的に標識された分析物の全ての（しばしば、濃度および／または量で表された）絶対量を計算するのが可能である。このように、（それについて、分析物が由来する試料に較正標準が存在する）各々差次的に標識された分析物の絶対量を、どのようにして試料混合物を調製したかの知識に基づいて決定することもできる。
【０１５１】
別法として、較正曲線を標識された分析物の代表的な試料の分析によって調製することができ、各試料は異なる既知量の標識された分析物を含む。分析された標識分析物についてのレポーターイオンのピークの強度を各標識された分析物の既知量に関してプロットして、それにより、標準曲線を作成することができる。一旦調製すると、未知の試料中のレポーターイオンの強度を標準曲線と比較して、それにより、検査試料中の分析物の量を決定することができる。
【０１５２】
前記に関わらず、レポーターイオン（サインイオン）の強度に対する修正を、適切であれば、レポーター部分内のいずれの天然に生じる、または人工的に作り出した同位体存在量に対してなすことができる。レポーター部分のサインイオンにおける不純物の同位体存在量について修正する多数の方法がある。そのような修正の例は、２００４年８月１２日に出願された、「Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  Ｆｏｒ  Ｄｅ−Ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｎｇ  Ａ  Ｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ」と題された、公開された同時係属の共同所有された米国仮特許出願番号ＵＳ２００５−０１１４０４２Ａ１に見出すことができる。基本的には、単一標識試薬の同位体クラスターに関連する上方質量および下方質量ピークの強度は、数学的式および計算を用いて標識試薬の重複する同位体クラスターの複雑なスペクトルの解析によって決定され得る。どのようにして値が決定されたかに拘わらず、各レポーターイオン（すなわち、サインイオン）の強度を正確に定量するためにより多くの注意が払われると、元の試料中の分析物の相対的および絶対的定量はより正確となる。
【０１５３】
プロテオミック分析：
本発明の実施形態は複雑な分析で用いられ得る。なぜならば、質量分析技術を用いて迅速かつ反復的に試料を多重化し、分析し、かつ再分析することができるからである。例えば、試料混合物を、１以上の試料中の１以上の分析物の量について分析することができる。分析物の（しばしば、濃度および／または量で表した）量を、試料混合物が含まれた試料について決定することができる。試料の処理および質量分析を迅速に行うことができる故に、試料混合物の多くの差次的に標識された分析物の量を、分析物が由来する試料中のそれらの相対および／または絶対量に関して決定できるように、これらの方法を多数回反復することができる。
【０１５４】
そのような迅速な多重分析が有用である１つの適用は、プロテオミック分析の領域におけるものである。プロテオミックスは、生物学的プロセスの構造、機能および調節の項目について、ゲノム配列にコードされた情報を記載するための実験的アプローチとして見ることができる。これは、細胞または組織によって発現された全蛋白質成分の系統的分析によって達成されてよい。本発明の方法、混合物、キットおよび／または組成物の実施形態と組み合わせて用いる質量分析は、そのような全体的な蛋白質分析のための１つの可能なツールである。従って、これらの標識試薬を用いることができる実験的分析は、限定されないが、経時的実験、バイオマーカー分析、多重プロテオミック分析、マッドピット分析、アフィニティプルダウン、翻訳後修飾（ＰＴＭｓ）の決定、および多数の対照実験を含む。
【０１５５】
ＩＩ  組成物
いくつかの実施形態において、本発明は、塩形態および／または水和物形態を含めた、式Ｉ：
【０１５６】
【化７】
0005422382.tif 000030
によって表される化合物に関し、式中、ｍおよびｎは各々０または１であり、但し、ｍ＋ｎ＝１であり、また、該化合物は、レポーター部分および／またはリンカー部分における１以上の重原子同位体で同位体的にコードすることができる。先により詳細に記載したように、反応性基「ＲＧ」は求電子体または求核体を含むことができ、ここで、該反応性基は試料の１以上の反応性分析物と反応して、それにより、１以上の標識された分析物を形成することができる。先により詳細に記載したように、レポーター部分「ＲＰ」は、固定された電荷を含むことができるか、あるいは質量分析計においてイオン化可能であり、ここで、該レポーター部分が、結合Ｘの断片化に際して質量分析計においてサインイオンを生成することができる。先により詳細に記載したように、「ＤＬ」はコードされていない検出可能な標識であり得る。先により詳細に記載したように、リンカー部分「ＬＫ」は直鎖または分岐状であり得、ここで、ＬＫは反応性基をレポーター部分およびコードされていない検出可能な標識の双方に連結する。先により詳細に記載したように、共有結合Ｘはレポーター部分をリンカー部分へ、またはコードされていない検出可能な標識へ連結させ、ここで、結合Ｘは質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能である。先により詳細に記載したように、Ｙは、反応性基をリンカー部分へ連結させる共有結合または連結基であり得、ここで、Ｙは、必要に応じて、質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能である。先により詳細に記載されたように、Ｗは、コードされていない検出可能な標識をリンカー部分に連結させる共有結合または連結基であり得、ここで、Ｗは、必要に応じて光、熱および／または化学試薬の適用によって切断可能であり、および／または質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能である。いくつかの実施形態において、化合物は、必要に応じて、切断可能なリンカーを介して固体支持体に連結される。いくつかの実施形態において、化合物はレポーター部分を介して固体支持体に連結される。式Ｉの標識試薬のある種の断片化特性を図２ａに示す。
【０１５７】
例えば、組成物は式ＩＩまたはＩＩＩ：
【０１５８】
【化８】
0005422382.tif 000031
（式中、ＲＧは反応性基であって、該化合物は同位体的にコードできる（図８ａを参照））によって表される化合物であり得る。式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの組成物を用いて、本明細書においてより詳細に議論されるように質量分析（例えば、タンデム質量分析）と組み合わせて電気詠動分離技術を利用することができる方法においてそれらの分析のために分析物を標識することができる。式ＩＩおよびＩＩＩの標識試薬の要素およびある種の断片化特性は図２ｂに示す。
【０１５９】
組成物は、同位体濃縮された（すなわち、コードされた）レポーター部分および／または同位体濃縮されたリンカー部分を含むことができる。例えば、レポーター部分および／またはリンカー部分は、各々、１以上の重原子同位体を含むように同位体濃縮され得る。いくつかの実施形態において、レポーター部分および／またはリンカー部分は、各々、２以上の重原子同位体を含むように同位体濃縮され得る。いくつかの実施形態において、レポーター部分および／またはリンカー部分は、３以上の重原子同位体を含むように同位体濃縮され得る。いくつかの実施形態において、レポーター部分および／またはリンカー部分は、各々、４以上の重原子同位体を含むように同位体濃縮され得る。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、レポーター部分は支持体に切断可能に連結され得る。「切断可能に連結した」とは、我々は、レポーター部分およびそれに共有結合により連結した何かが、選択された切断可能なリンカーの性質に基づいて、光、熱および／または化学試薬等の適当な剤での処理によって支持体から放出され得ることを意味する。切断可能なリンカーを含む種々の支持体は当該分野で周知である。例えば、トリチル部分を含む種々の支持体が商業的に販売されているか、あるいはそうでなければ、調製することができる（例えば、塩化トリチル支持体（トリチル−Ｃｌ）または塩化２−クロロトリチル支持体）。図６を参照し、支持体結合された標識試薬の実施形態が示され、そこで、標識試薬のレポーター部分はビス−Ｎ−アルキル化ピペラジン環を含み、ここで、Ｎ−アルキル化ピペラジン環の置換基の１つは官能基Ｑで終わるアルキル基であり、ここで、Ｑは、酸での支持体の処理に際して放出されて、それにより、標識された分析物を生成することができる。
【０１６１】
かくして、いくつかの実施形態において、本発明は、塩形態および／または水和物形態を含めた、式Ｉｓｓ：
【０１６２】
【化９】
0005422382.tif 000032
（式中、ｍおよびｎは、各々、０または１であり、但し、ｍ＋ｎ＝１であり、ここで、当該化合物はレポーター部分および／またはリンカー部分において１以上の重原子同位体で同位体的にコードされ得る）によって表される標識試薬組成物に関する。先により詳細したように、反応性基「ＲＧ」は、求核体または求電子体を含むことができ、ここで、該反応性基は試料の１以上の反応性分析物と反応して、それにより、１以上の標識された分析物を形成することができる。先により詳細に記載したように、レポーター部分「ＲＰ」は固定された電荷を含むことができ、あるいは質量分析計においてイオン化可能であり、ここで、該レポーター部分は、結合Ｘの断片化に際して質量分析計においてサインイオンを生成することができる。先により詳細に記載したように、「ＤＬ」はコードされていない検出可能な標識であり得る。先により詳細に記載したように、リンカー部分「ＬＫ」は直鎖または分岐状であり得、ここで、ＬＫは反応性基をレポーター部分およびコードされていない検出可能な標識双方に（直接的にまたは間接的に）連結させる（図１ａおよび１ｂを参照）。先により詳細に記載したように、共有結合Ｘはレポーター部分をリンカー部分へ、またはコードされていない検出可能な標識へ連結させ、ここで、結合Ｘは質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能である。先により詳細に記載したように、Ｙは、反応性基をリンカー部分に連結させる共有結合または連結基であり得、ここで、Ｙは、必要に応じて、質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能である。先により詳細に記載したように、Ｗは、コードされていない検出可能な標識をリンカー部分で連結させる共有結合または連結基であり得、ここで、Ｗは、必要に応じて、光、熱および／または化学試薬の適用によって切断可能であり、および／または質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能である。先により詳細に記載したように、ＳＳは、それに組成物のレポーター部分が切断可能なリンカーを通じて共有結合により連結された固体支持体である。式Ｉｓｓの標識試薬のある種の断片化特性を図２ａに示す。
【０１６３】
例えば、組成物は、式ＩＩｓｓまたはＩＩＩｓｓ：
【０１６４】
【化１０】
0005422382.tif 000033
【０１６５】
【化１１】
0005422382.tif 000034
（式中、ＲＧは反応性基であり、ＳＳは固体支持体であり、ＣＬは切断可能なリンカーであって、該化合物はレポーター部分および／またはリンカー部分において１以上の重原子同位体で同位体的にコードすることができる）によって表される化合物であり得る。式ＩＩｓｓおよびＩＩＩｓｓの標識試薬の要素およびある種の断片化特性を図２ｃに示す。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、前記した式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｉｓｓ、ＩＩｓｓまたはＩＩＩｓｓの化合物の基ＲＧはカルボン酸、スルホン酸、カルボン酸ハライド、スルホニルハライド、活性エステル、混合無水物、イソシアネートまたはイソチオシアネート基であり得る。いくつかの実施形態において、基ＲＧはマレイミド基、アルキルハライド基、α−ハロ−アシル基、α−ハロチオン基またはα−ハロイミン基であり得る。いくつかの実施形態において、基ＲＧはトリチルハライドまたはシリルハライド基であり得る。いくつかの実施形態において、基ＲＧはアミン基、ヒドロキシル基またはチオール基であり得る。
【０１６７】
述べたように、前記した組成物は塩形態および／または水和物形態で存在することができる。組成物が塩形態として存在するか否かは、典型的には、置換基の性質および数、ならびにそれが存在し、および／または単離された条件に依存するであろう。アミン等の塩基性基を酸での処理によってプロトン化して、それにより、アミンの塩を形成できることは周知である。例えば、ピペラジン含有標識試薬はモノＴＦＡ塩、モノＨＣｌ塩、ビスＴＦＡまたはビスＨＣｌ塩として得ることができる（例としては、米国特許出願公開番号ＵＳ２００５−０１４８７７１Ａ１参照）。当業者であれば、常套的な実験および本明細書に提供された開示だけを用い、本明細書に開示された組成物の塩形態の任意のカウンターイオンの電荷状態および性質をどのようにして操作するかを確実に認識するであろう。
【０１６８】
組成物が水和物として存在するか否かは、それが存在する、または単離された条件にも依る。水和物は、単に、１以上の複合体化した水分子を含む。本発明では、いずれの可能な水和物形態も考えられる。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に開示された標識試薬組成物で標識される分析物にも関する。かくして、いくつかの実施形態において、本発明は、塩形態および／または水和物形態を含めた、式ＩＡ−：
【０１７０】
【化１２】
0005422382.tif 000035
（式中、ｍおよびｎは、各々、０または１であり、但し、ｍ＋ｎ＝１であり、ここで、ＲＰ、Ｘ、ＷおよびＤＬは前記式Ｉの組成物について記載された通りであって、該化合物はレポーター部分および／またはリンカー部分において１以上の重原子同位体で同位体的にコードできる）によって表される標識された分析物組成物に関する。先により詳細に記載したように、リンカー部分「ＬＫ」は直鎖または分岐状であり得、ここで、ＬＫは分析物をレポーター部分およびコードされていない検出可能な標識双方に（直接的にまたは間接的に）連結させる。先により詳細に記載したように、Ｙは、分析物をリンカー部分に連結する共有結合または連結基であり得、ここで、Ｙは、必要に応じて、質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能である。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、本発明は、塩形態および／または水和物形態を含めた、式ＩｓｓＡ：
【０１７２】
【化１３】
0005422382.tif 000036
（式中、ｍおよびｎは、各々、０または１であり、但し、ｍ＋ｎ＝１であり、ここで、ＳＳ、ＲＰ、Ｘ、ＷおよびＤＬは前記式ＩｓｓＡの組成物について記載された通りであって、該化合物はレポーター部分および／またはリンカー部分において１以上の重原子同位体で同位体濃縮され得る）によって表される支持体結合された標識された分析物組成物にも関する。先により詳細に記載したように、リンカー部分「ＬＫ」は直鎖または分岐状であり得、ここで、ＬＫは分析物をレポーター部分およびコードされていない検出可能な標識双方に連結させる。先により詳細に記載したように、Ｙは、分析物をリンカー部分に連結する共有結合または連結基であり得、ここで、Ｙは、必要に応じて、質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能である。支持体結合された標識された分析物ＩｓｓＡのある種の断片化特性を図３ａに示す。
【０１７３】
例えば、支持体結合された標識された分析物は式ＩＩｓｓＡまたはＩＩＩｓｓＡ：
【０１７４】
【化１４】
0005422382.tif 000037
（式中、ＳＳは固体支持体であって、ＣＬは切断可能なリンカーである）によって表すことができる。標識された分析物ＩＩｓｓおよびＩＩＩｓｓＡの要素およびある種の断片化特性は図３ｃに示される。
【０１７５】
分析物は先に本明細書において記載した。いくつかの実施形態において、標識された分析物は標識された較正標準であり得る。本明細書中に記載したように、較正標準を既知量にて混合物に加えて、対象の分析物の絶対的定量分析を容易にすることができる。従って、いくつかの実施形態において、本発明は、較正標準である目的で前記したように標識試薬組成物で標識されている、対象のペプチド、蛋白質、核酸、炭水化物、ステロイド、脂質、アミノ酸、ビタミンまたはプロスタグランジン等の分析物に関する。かくして、標識された較正標準は、本明細書に記載したように標識試薬で標識された任意の分析物であり得る。典型的には、標識試薬が、それが、該テスト試料における該分析物の定量が注目されるものである対象の１以上の検査試料を標識するのに用いた標識試薬と比較して固有のレポーター部分を含むように、異性体および／または同重体標識試薬の組から選択される。
【０１７６】
ＩＩＩ．標識および分析の方法
本発明のいくつかの実施形態によると、分析物を前記した標識試薬で標識し、次いで、決定することができる。標識された分析物、分析物それ自体、分析物の１以上の断片、および／または標識の断片は質量分析によって決定され得る。いくつかの実施形態において、本発明の方法を、同一試料中の異なる分析物の分析のために、ならびに２以上の異なる試料中の同一および／または異なる分析物の多重分析のために用いることができる。２以上の試料を混合して、試料混合物を形成することができる。多重分析においては、標識試薬を用いて、分析物がいずれの試料混合物の試料に由来するかを決定することができる。分析物の（しばしば、濃度または量で表される）（異なる試料における同一分析物に関する）絶対および／または相対量は、同一混合物を形成するために合わされた２以上の試料の各々において決定され得る。さらに、分析物の断片（例えば、娘断片イオン）の質量分析を用いて、分析物に対する前駆体分子が分解した場合のように、分析物および／または分析物に対する前駆体を同定することができる。
【０１７７】
分析物で用いる試料は標識試薬の同位体的にコードされたバージョンで標識され得る分析物を含むいずれの試料であってもよい。例えば、試料は粗のまたは未処理の細胞溶解物、体液、組織抽出物または細胞抽出物であり得る。いくつかの実施形態において、標識前に試料を処理して、それにより、標識反応のために分析物、または試料の他の成分を調製することができる。試料は分離プロセスからの画分であり得る。試料中の分析物は、標識試薬で標識され得るいずれの分析物でもあり得る。例えば、分析物は、ペプチド、蛋白質、核酸、炭水化物、脂質、ステロイド、アミノ酸、ビタミン、プロスタグランジン、または１５００ダルトン（Ｄａ）未満の分子量を有する他の小分子であり得る。他の可能な分析物のタイプは本明細書に開示している。
【０１７８】
その結果、いくつかの実施形態において、本発明は、各試料が１以上の反応性分析物を含む２以上の試料を、標識試薬の組の異なる標識試薬と反応させて、それにより、各々が１以上の標識された分析物を含む２以上の差次的にされた試料を生じさせることを含む方法にも関する。標識試薬は同位体的にコードされた異性体および／または同重体標識試薬の組から選択され得、ここで、異なる標識試薬は、各々、固有の質量のレポーター部分を含む。レポーター部分は、本明細書に開示された特性を有するいずれのレポーター部分でもあり得る。例えば、レポーター部分は、置換または非置換のピペリジン、ピペラジンまたはモルホリン基を含むことができる。他のレポーター部分の例も先に記載している。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、本発明は、各試料が１以上の反応性分析物を含む２以上の試料を、同位体濃縮された異性体および／または同重体標識試薬の組の異なる標識試薬と反応させて、それにより、各々が１以上の標識された分析物を含む２以上の差次的に標識された試料を形成することに関し；ここで、該組の異なる標識試薬は、塩形態および／または水和物形態を含めた、式Ｉ：
【０１８０】
【化１５】
0005422382.tif 000038
（式中、ｍおよびｎは、各々、０または１であり、但し、ｍ＋ｎ＝１である）によって表される。該方法によると、（先により詳細に記載した）ＲＧは求核体または求電子体を含む反応性基であり、該反応性基は試料の１以上の反応性分析物と反応して、それにより、１以上の標識された分析物を形成する。（先により詳細に記載された）レポーター部分「ＲＰ」は固定された電荷を含むか、あるいは質量分析計においてイオン化可能であり、ここで、該レポーター部分は結合Ｘの断片化に際して質量分析計においてサインイオンを生成することができ、ここで、各レポーター部分、およびその対応するサインイオンの総質量は、該組の各標識試薬について異なっている。（先により詳細に記載された）コードされていない検出可能な標識「ＤＬ」は、該組の各試薬についての異なる独立して検出可能なコードされていない検出可能な標識であって、各コードされていない検出可能な標識は、該組の標識試薬の他のコードされていない検出可能な標識と同一総質量および同一の正味の電荷を有する。（先により詳細に記載された）リンカー部分「ＬＫ」は直鎖または分岐状であり得、ここで、ＬＫは反応性基をレポーター部分およびコードされていない検出可能な標識双方に（直接的または間接的に）連結させ、ここで、該組の各異なる試薬のリンカー部分の質量は、レポーター部分およびリンカー部分についての組合せの凝集体総質量が該組の各標識試薬と同一になるように、該組の異なる標識試薬のためのレポーター部分間の総質量の差を補正する。（先により詳細に記載された）共有結合Ｘは、レポーター部分をリンカー部分に、またはコードされていない検出可能な標識に連結させ、ここで、Ｘは質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能である。（先により詳細に記載された）Ｙは、反応性基をリンカー部分に連結する共有結合または連結基であり、ここで、Ｙは、必要に応じて、質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能であり、但し、Ｙが連結基であるとき、その総質量は該組の各標識試薬について同一である。（先に詳細に記載された）Ｗは、コードされていない検出可能な標識を連結部位に連結する共有結合または連結基であり、ここで、Ｗは、必要に応じて、光、熱および／または化学試薬の適用によって切断可能であり、および／または質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能であり、但し、Ｗが連結基であるとき、その総質量は該組の各標識試薬について同一である。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、各々差次的に標識された試料は式ＩＩまたは式ＩＩＩ：
【０１８２】
【化１６】
0005422382.tif 000039
（式中、ＲＧは反応基である）の標識試薬で標識される。いくつかの実施形態において、化合物ＩＩおよびＩＩＩは図８ａに示されたように同位体的にコードすることができる。
【０１８３】
標識プロセスは、各々が１以上の標識された分析物を含む２以上の差次的に標識された試料を生成することができる。一旦、各試料の分析物が、その試料に固有である標識試薬で標識されると、２以上の差次的に標識された試料またはその部分を混合して、試料混合物を生成することができる。試料混合物は、必要に応じて、前記した１以上の較正標準を含むことができる。
【０１８４】
試料混合物を生成するために合わされた標識された分析物の各試料の容量および／または量を記録することができる。試料混合物の合計試料容量および／または量に対する各試料の容量および／または量を用いて、試料混合物の分析からの各試料における同定された分析物の（しばしば濃度および／または量で表された）量を決定するのに用いることができる比を決定することができる。したがって、試料混合物は複合混合物を含むことができ、ここで、同一および／または異なる分析物の相対量は、２以上の試料の各々における分析物の量の相対的定量によって、あるいは較正標準を試料混合物にも加える場合、あるいはサインイオンについての較正曲線が入手できる場合は絶対的に、同定および／または定量され得る。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、該方法は、さらに、試料混合物またはその一部を電気泳動により分離することを含むことができる。例えば、電気詠動分離は１Ｄ電気詠動分離、２Ｄ電気詠動分離、および／またはキャピラリー電気詠動分離であり得る。
【０１８６】
２以上のコードされていない検出可能な標識は独立して検出可能であり得る。標識は独立して検出可能である故に、電気詠動分離の間に標識された分析物を突き止め、検出し、および／または定量することが可能である。例えば、独立して検出可能なコードされていない検出可能な標識を用いて、分離の間および／または後に１−Ｄまたは２−Ｄゲルにおいて標識された分析物を突き止めることができる。いくつかの実施形態において、標識を用いて、それらがゲルから切除され、以下に議論するように質量分析によるように、さらに分析することができるように、分離後にゲル中の標識された分析物を突き止めることができる。
【０１８７】
例えば、該方法は、さらに、電気詠動分離からの共移動する差次的に標識された分析物の１以上のサブ−試料（ｓｕｂ−ｓａｍｐｌｅ）を収集し、必要に応じて、適当な条件下で１以上のサブ−試料を処理して、それにより、サブ−試料の差次的に標識された分析物からコードされていない検出可能な標識を切断することを含むことができ、ここで、ｍは０であり、ｎは１であって、Ｗは光、熱または化学試薬の適用によって切断可能である共有結合または連結基である。一旦、コードされていない検出可能な標識が分析物から切断されると、それらを質量分析によるなどしてさらに分析することができ、ここで、レポーター部分の分析を用いて、以下に議論するように試料混合物を形成するのに用いる各試料に関連する分析物の相対および／または絶対量を決定し、および／または確認することができる。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、コードされていない検出可能な標識をキャピラリー電気詠動で用いて、標識された分析物を、それらがキャピラリーカラムを出る時に、検出し、および／または定量することができる。定量は、適当な検出器で、コードされていない検出可能な標識から生じたシグナルの強度の分析に基づいて決定され得る。好ましくは（しかしながら、必須ではないが）、組のコードされていない検出可能な標識は、電気泳動分離の間に同様な移動特性を有する（すなわち、それらは共移動する）ように選択される。いくつかの実施形態において、共移動する差次的に標識された分析物は、対象の条件について、コードされていない検出可能な標識の、独立して検出可能な特性に基づいて、必要に応じて分析され得、該条件の満足に基づいてさらなる分析のために慎重に選択され得、そうでなければ、該条件を満足するのに失敗したことに基づいて廃棄され得る。例えば、共移動する差次的に標識された分析物が対象の条件（例えば、独立して検出可能な２つの標識の相対量が１０％を超えて異なる）を満足すると、共移動する差次的に標識された分析物は引き続いて分析され得、質量分析によって定量され得るが、それらがそうでなければ、それらを廃棄する。このように、質量分析機器の最も有効かつ経済的な使用を達成することが可能である。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、該方法は、さらに、第１の質量分析計を用い、サブ−試料の１つ、またはその画分について第１の質量分光分析を行うことを含むことができる。次いで、第１の質量分析からの特定の電荷対質量比のイオンを選択することができる。選択されたイオンを解離エネルギーレベル（例えば、衝突誘起解離（ＣＩＤ））に付して、それにより、断片化を誘起することができる。例えば、結合Ｘの断片化は、標識された分析物からのイオン化されたレポーター部分（すなわち、レポーターイオンまたはサインイオン）の放出を引き起こすことができる。解離エネルギーによる選択されたイオンの断片化は、引き続いて分析して、分析物、および／または分析物に対する１以上の前駆体を決定することができる分析物の娘断片イオンを生成することもできる。かくして、次いで、イオン（残存する選択されたイオン、娘断片イオンおよびイオン化されたレポーター部分（すなわち、サインイオン））またはその画分を、分析のために第２の質量分析計に向けることができる。
【０１９０】
第２の質量分析計においては、第２の質量分析を選択されたイオン、サインイオン、および娘断片イオン、またはその画分について行うことができる。第２の質量分析は、選択された電荷対質量比で存在する各固有のレポーターイオンの総質量（またはｍ／ｚ）および相対量、ならびに試料混合物の少なくとも１つの標識された分析物の娘断片イオンのいくつかまたは全ての質量（総および／または絶対）を決定することができる。選択された電荷対質量比で存在する各分析物については、娘断片イオンを用いて、選択された電荷対質量比で存在する分析物を同定することができる。例えば、この分析は、「Ａｎａｌｙｔｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｂｙ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」（コンピュータ支援データベース分析による分析物決定）と題されたセクションにおいてすでに記載したように行うことができる。かくして、いくつかの実施形態において、該方法は、さらに、第２の質量分析において各サインイオンの総質量および相対量、および第２の質量分析において娘断片イオンのいくつかまたは全ての総質量および／または絶対質量を決定することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、さらに、娘断片イオンの分析によって、選択された電荷対質量比に関連する標識された分析物（および／またはそれに対する前駆体）を決定することを含む。
【０１９１】
いくつかの実施形態において、該プロセスの１以上の工程を一回以上反復することができる。例えば、いくつかの実施形態において、従前に選択された電荷対質量比とは異なる、第１の質量分光分析からの選択された電荷対質量比のイオンを解離エネルギーに対して処理して、それにより、既に記載したように、イオン化されたレポーター部分（すなわち、サインイオン）、および選択されたイオンの少なくともいくつかの娘断片イオンを形成することができる。選択されたイオン、レポーターイオンおよび／または娘断片イオン、またはその画分の第２の質量分析を行うことができる。第２の質量分析における各固有のサインイオンの総質量および相対量、ならびに娘断片イオンの質量（総または絶対）を決定することもできる。必要に応じて、選択された電荷対質量比に関連する標識された分析物（または前駆体分子）を、娘断片イオンの分析によって決定することができる。このようにして、第１の質量分析からの１以上のさらなる分析物を同定し、および／または定量するために、情報を利用可能にすることができる。
【０１９２】
いくつかの実施形態において、試料混合物が（例えば、電気詠動分離によって）分画されている場合、異なる収集されたサブ−試料について該プロセス（または該方法のある工程）を一回以上反復するのが有用であろう。試料の１以上のさらなる画分についてプロセスを反復することによって、試料混合物をより十分に分析することが可能である。その結果、該方法は、異なるサブ−試料を選択し、該サブ−試料について第１の質量分析を行い、ついで、従前に記載された後の工程の１以上を反復することを含むことができる。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、試料混合物が分画されている場合、電気詠動分離からの共移動する差次的に標識された分析物の１以上の異なるサブ−試料を収集することによって、プロセスを１回以上反復するのが有用であろう。プロセスを反復して、それにより、１以上のさらなるサブ−試料を収集することによって、試料混合物をより十分に分析することが可能である。その結果、該方法が、電気詠動分離からの共移動する差次的に標識された分析物の１以上の異なるサブ−試料を収集し、次いで、先に記載された１以上の後の工程を反復することを含むことができる。
【０１９４】
いくつかの実施形態においては、全プロセスを１回以上、かつこれらの反復の各々内で反復し、ある工程が前記したように１回以上反復することもできると考えられる。このように、試料混合物の内容物を調べて、最も十分に可能な程度まで決定することができる。いくつかの実施形態において、全プロセスを２以上の試料の新しい組について反復することもできる。
【０１９５】
先に議論したように、いくつかの実施形態において、異性体および／または同重体標識試薬の組の標識試薬を支持体に結合させることができる。従って、支持体からの標識された分析物の再捕獲の収容を除いて、前記した方法を支持体結合された試薬で実行することができる。かくして、いくつかの実施形態において、本発明は任意の前記開示方法を実行することに関し、ここで、該組の各異なる標識試薬は支持体結合され、各異なる試料が該組の異なる標識試薬を運ぶ支持体と反応するように切断可能なリンカーを通じて支持体に連結され、ここで、該方法は、さらに、試料を標識する工程を行う後であるが標識された試料を混合して試料混合物を調製する工程を行う前に：ｉ）必要に応じて、各支持体を洗浄して、支持体結合された標識試薬の反応性基と反応しない各試料の成分を除去し；ｉｉ）切断可能なリンカーを切断して、それにより、各支持体から標識された分析物を放出させ、各々差次的に標識された試料は１以上の標識された分析物を含み、ここで、特定の試料に関連する標識された分析物は、それに連結された固有の質量のレポーター部分によって同定および／または定量可能であり；次いで、ｉｉｉ）必要に応じて、工程（ｂ）に従ってそれらを混合する前に各試料の標識された分析物を収集することを含む。
【０１９６】
例えば、該方法は同位体的に標識する試薬の組で行うことができ、ここで、該組の各異なる標識試薬は、塩形態および／または水和物形態を含めた、式Ｉｓｓ：
【０１９７】
【化１７】
0005422382.tif 000040
（式中、ｍおよびｎは、各々、０または１であり、但し、ｍ＋ｎ＝１である）によって表される。該方法によると、（先により詳細に記載された）ＲＧは求核体または求電子体を含む反応性基であり、該反応性基は試料の１以上の反応性分析物と反応して、それにより、１以上の標識された分析物を形成する。（先により詳細に記載された）レポーター部分「ＲＰ」は固定された電荷を含むか、あるいは質量分析計においてイオン化可能であり、ここで、該レポーター部分は結合Ｘの断片化に際して質量分析計においてサインイオンを生成することができ、また、各レポーター部分、およびその対応するサインイオンの総質量は該組の各標識試薬について異なる。（先により詳細に記載された）コードされていない検出可能な標識「ＤＬ」は、該組の各試薬について異なる独立して検出可能なコードされていない検出可能な標識であって、各コードされていない検出可能な標識は、該組の標識試薬の他のコードされていない検出可能な標識と同一の総質量および同一の正味の電荷を有する。（先により詳細に記載された）リンカー部分「ＬＫ」は直鎖または分岐状であり得、ここで、ＬＫは反応性基をレポーター部分およびコードされていない検出可能な標識の双方に（直接的または間接的に連結させ）、ここで、該組の各異なる試薬のリンカー部分の質量は、レポーター部分およびリンカー部分の組合せの凝集体総質量が該組の各標識試薬について同であるように、該組の異なる標識試薬についてのレポーター部分間の総質量の差を補正する。（先により詳細に記載された）共有結合Ｘはレポーター部分をリンカー部分へ、またはコードされていない検出可能な標識へ連結させ、ここで、Ｘは質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能である。（先により詳細に記載された）Ｙは反応性基をリンカー部分に連結させる共有結合または連結基であり、ここで、Ｙは、必要に応じて、質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能であり、但し、Ｙが連結基であるとき、その総質量は該組の各標識試薬について同一である。（先により詳細に記載された）Ｗは、コードされていない検出可能な標識をリンカー部分に連結させる共有結合または連結基であって、Ｗは、必要に応じて、光、熱および／または化学試薬の適用によって切断可能であり、および／または質量分析計において解離エネルギーの適用によって切断可能であり、但し、Ｗが連結基であるとき、その総質量は該組の各標識試薬について同一である。（先により詳細に記載された）ＳＳは、それに標識試薬のレポーター部分が切断可能なリンカーを通じて共有結合により連結された固体支持体である。
【０１９８】
いくつかの実施形態において、標識試薬の１つは式ＩＩｓｓまたはＩＩＩｓｓ：
【０１９９】
【化１８】
0005422382.tif 000041
【０２００】
【化１９】
0005422382.tif 000042
（式中、ＲＧは反応性基であり、ＳＳは固体支持体であり、ＣＬは切断可能なリンカーである）によって表すことができる。いくつかの実施形態において、化合物ＩＩｓｓおよびＩＩＩｓｓは図８ｂで示されたように同位体的にコードされ得る。
【０２０１】
質量分析の分野における当業者であれば、前記で開示された方法に記載された第１および第２の質量分析を、タンデム質量分析計で行うことができる。タンデム質量分析を行うのに適した機器は本明細書において先に記載している。タンデム質量分析計は好ましいが、一段階質量分析計を用いてもよい。例えば、分析物の断片化を、コーン電圧断片化、続いての、一段階の四重極または飛行時間質量分析計を用いる得られた断片の質量分析によって誘起してよい。他の例においては、飛行時間またはタンデム飛行時間（ＴＯＦ−ＴＯＦ）質量分析計においてレーザー源、およびポストソース分解によって記録された得られた断片を用い、分析物を解離エネルギーレベルに付してもよい。
【０２０２】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、さらに、各試料および／または試料混合物を少なくとも１つの酵素で消化して、試料の分析物の標識を行う前に、試料および／または試料混合物の成分を部分的に、または完全に分解することを含むことができる（また、「Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ」（試料の処理）と題された前記セクション参照）。例えば、酵素は（蛋白質および／またはペプチドを分解するための）プロテアーゼ、または（核酸を分解するための）ヌクレアーゼであり得る。２以上の酵素を一緒に用いて、それにより、試料成分をさらに分解してもよい。例えば、酵素はトリプシン、パパイン、ペプシン、ＡｒｇＣ、ＬｙｓＣ、Ｖ８プロテアーゼ、ＡｓｐＮ、プロナーゼ、キモトリプシンまたはカルボキシペプダーゼ（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ等）等の蛋白質分解酵素であり得る。
【０２０３】
いくつかの実施形態において、方法は、さらに、第１の質量分析を行う前に電気詠動以外のさらなる分離プロセスの適用によって試料混合物を分離することを含むことができる（また「Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｍｉｘｔｕｒｅ」（試料混合物の分離を含めた分離）と題された前記セクション参照）。例えば、液体クロマトフラフィ／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を用いて、質量分析の前にそのような試料分離を行うことができる。
【０２０４】
いくつかの実施形態において、該方法は消化およびさらなる分離工程によって実施され得る。これらの工程は任意であるが、それらは、例えば、プロテオミック分析を行って、それにより、細胞における蛋白質のアップおよびダウンレギュレーションを決定する場合に、一緒に行うことができる。いくつかの実施形態において、該方法の工程は、消化および／または分離工程の有無で１回以上反復して、それにより、試料中の１以上の他の分析物、あるいは（支持体結合された標識試薬で標識された試料を含めた）２以上の試料の各々における１以上の分析物を同定および／または定量することができる。較正標準が試料混合物に存在するか否か、あるいはサインイオンについての較正曲線が利用できるか否かに応じて、特定の分析物の定量は他の標識された分析物に相対的であり得るか、あるいは絶対的であり得る。
【０２０５】
先に記載したように、娘断片イオンの（総または絶対）質量の分析によって選択されたイオンに関連する分析物を決定することが可能である。そのような決定の１つの方法は、「Ａｎａｌｙｔｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｂｙ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」（コンピュータ支援データベース分析による分析物の決定）と題されたセクションに記載されている。一旦、分析物が決定されると、第２の質量分析における各固有のレポーターイオンの総質量および相対量、および娘断片イオンの質量についての情報は、試料混合物についての他の情報を決定するための基礎を提供する。
【０２０６】
サインイオン（レポーターイオン）の相対量は、質量スペクトルにおけるピーク強度によって決定され得る。いくつかの実施形態において、各固有のサインイオンの量は、質量分析計を用いて得られたレポーターイオン（サインイオン）のピークの高さまたはピークの幅（またはピークの面積）の分析によって決定され得る。各試料は異なる標識試薬で標識され得、かつ各標識試薬は、試料混合物を処方するのに用いた特定の差次的に標識された試料に相関させることができる固有のサインイオンを生成する固有のレポーター部分を含むことができる故に、第２の質量分析におけることなるレポーターイオンの決定を用いて、選択された分析物のサインイオンが由来する差次的に標識された試料を同定することができる。（例えば、本発明の多重方法に従って）多数のサインイオンが見出される場合、各固有のサインイオンの相対量は、他のサインイオンに関連して決定され得る。第２の質量分析において決定された各固有のサインイオンの相対量は試料混合物における分析物の相対量に相関させることができる故に、試料混合物を形成するために合わされた差次的に標識された試料の各々における分析物の（しばしば、濃度および／または量として表した）相対量を決定することができる。さらに、決定される分析物が対象の別の化合物からの副産物である場合（例えば、分析物は、分析物が蛋白質の消化によって形成されたペプチドである場合のように分解反応の産物である）、元来の差次的に標識された試料の成分に対して、分析物についての定量情報を関連付けることが可能である。
【０２０７】
先に議論したように、この分析を、異なる電荷対質量比の選択されたイオンに対して１回以上反復して、それにより、試料混合物を形成するために合わせた各試料における１以上の他の決定された分析物の相対量を得ることができる。さらに、適切には、各固有のサインイオンに関連するピーク強度の修正を、「Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｔｅｓ」（分析物の相対的および絶対的定量）と題されたセクションに応じて先に議論したように、天然に生じる、または人工的に作り出された同位体存在量について行うことができる。
【０２０８】
例えば、分析物は試料または試料混合物中のペプチドであり得る。試料、または試料混合物中のペプチドの分析を用いて、試料または試料混合物中の同定可能な蛋白質の（しばしば、濃度および／または量として表される）量を決定することができ、ここで、１以上の試料中の蛋白質を第１の質量分析の前に分解することができ、ここで、試料中の蛋白質の量は、試料混合物を形成するために混合された２以上の差次的に標識された試料の各々における１以上のペプチドの同一性および相対量に基づいて決定される。さらに、異なる試料からの情報は、細胞の成長、発生、分化および／または死滅に影響し得る異なる濃度の基質と共にインキュベートされる細胞中の蛋白質の量に対する効果の比較についてのように、決定を行う目的で比較され得る。他の非限定例は、病気のおよび健康な組織または細胞培養の発現された蛋白質成分の比較を含むことができる。これは、細菌またはウイルス等の感染剤での感染、または癌等の他の病気状態に続いての細胞、組織または生物学的流体中の発現された蛋白質レベルの比較を含むことができる。他の例においては、経時的な蛋白質濃度の変化の実験を行って、細胞または組織の発現された蛋白質成分に対する薬物処理の効果を調べることができる。なお他の例において、経時的に採取された異なる試料からの情報を用いて、病気（例えば、癌）または感染の結果としての組織、器官または生物学的流体中の特異的蛋白質の濃度を検出し、モニタリングすることができる。そのような実験は１以上の対照試料を含むことができる。いくつかの実施形態において、実験を用いて、前記した対象の特徴の２以上を決定することができる。
【０２０９】
選択された電荷対質量比を有する、分析物に連結された固有のサイン部分を含む較正標準が、決定された分析物についての（しばしば、濃度および／または量として表される）既知量で試料混合物に加えられた場合、較正標準に関連する固有のサインイオンの量を用いて、試料混合物を形成するために合わせた試料の各々中の分析物の（しばしば、濃度および／または量として表された）絶対量を決定することができる。試料混合物中の較正標準のための固有のサインイオンに関連する分析物の量は既知であって、固有のサインイオンの相対量は、較正標準のサインイオンの強度を参照して選択されたイオンに関連する標識された分析物について決定できる故に、これは可能である。（較正標準のためのレポーター部分を含めた）固有のレポーター部分の各々について決定された、各固有のサインイオンの相対量は、試料混合物を形成するために合わせた各々差次的に標識された試料に関連する分析物の量に比例する故に、試料の各々中の分析物の（しばしば、濃度および／または量として表される）絶対量は、試料混合物を生成するために用いた処方に関連して計算された比に基づいて固有の質量の各異なるサインイオンの量を参照して決定することができる。適切には、固有のサインイオンの各々に関連するピーク強度の修正は、天然に生じるまたは人工的に作り出された同位体存在量について行うことができる。そのような分析方法は、特に、標識された分析物の予備的分離（例えば、液体クロマトグラフィまたは電気詠動分離）が第１の質量分析に先行する場合に、複雑な性質の多重試料のプロテオミック分析で特に有用であり得る。
【０２１０】
例えば、試料混合物が１００ｆｍｏｌ／ｍＬの較正標準を含み、かつ較正標準に関連する固有のサインイオンの相対強度が１であり、他方、第１の試料に関連する第１の他の固有のサインイオンの相対強度が１／２であって、第２の試料に関連する第２の他の固有のサインイオンの相対強度が２であるとき、（同等量の試料１および試料２を混合して、試料混合物を形成すると仮定して）試料混合物を形成するために混合した第１の差次的に標識された試料中の分析物の量は５０ｆｍｏｌ／ｍＬ（０．５×１００ｆｍｏｌ／ｍＬ）であり、および試料混合物を形成するために混合された第２の差次的に標識された試料中の分析物の量は２００ｆｍｏｌ／ｍＬ（２×１００ｆｍｏｌ／ｍＬ）である。さらに、例えば、分析物が特定の蛋白質に関連するペプチドであるとき、試料１中の蛋白質の量は５０ｆｍｏｌ／ｍＬであって、試料２中の蛋白質の量は２００ｆｍｏｌ／ｍＬであると推定できる。かくして、較正標準の存在は、試料混合物を形成するために混合された各々差次的に標識された試料中の標識された分析物（およびいくつかの場合においては、それらの前駆体）の絶対的定量を可能にする。
【０２１１】
分析物は前駆体分子であり得る故に、いくつかの実施形態においては、分析物はペプチドであり得、試料混合物を形成するために混合された２以上の差次的に標識された試料の各々における１以上の蛋白質の同一性および絶対量は、試料混合物を形成するために混合された２以上の差次的に標識された試料の各々中の１以上のペプチドの同一性および絶対量に基づいて決定することができる。
【０２１２】
先に議論したように、この分析を異なる電荷対質量比の選択されたイオンについて１回以上反復して、それにより、試料混合物を形成するために合わせた各試料中の１以上の他の決定された分析物の絶対量を得ることができる。さらに、適切には、各固有のレポーターイオンに関連するピーク強度の修正を、先に議論したように、天然に生じる、または人工的に作り出した同位体存在量について行うことができる。
【０２１３】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された方法は支持体結合された標識試薬で実施され得、ここで、該組の各異なる標識試薬は支持体結合されており、各異なる試料が該組の異なる標識試薬を運ぶ支持体と反応され得るように、切断可能なリンカーを通じてレポーター部分によって支持体に切断可能に連結されている。例示的な支持体は、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ」（組成物）と題されたセクションにて先に議論している（また、図６参照）。該方法に従うと、支持体を必要に応じて洗浄して、分析物が支持体結合された標識試薬と反応させた後であるが試料を混合する前に、標識試薬の反応性基と反応しない試料の成分を除去することができる。一旦、分析物が標識試薬と反応して、それにより、標識された分析物を形成し、洗浄工程が必要に応じて行われると、切断可能なリンカーが切断される条件下で支持体を処理することによって標識された分析物を支持体から放出させることができる。一旦切断されると、２以上の差次的に標識された試料の各々を必要に応じて収集することができ、各試料は１以上の標識された分析物を含み、ここで、特定の試料に関連する標識された分析物はそれに連結した固有のレポーター部分によって同定可能および／または定量可能である。それらが個々に収集されたか否かに拘わらず、切断の産物を混合して，試料混合物を形成することができる。
【０２１４】
ＩＶ．混合物
いくつかの実施形態において、本発明は混合物（すなわち、試料混合物）に関する。例えば、混合物は、同位体的にコードされた異性体および／または同重体標識を含む標識された分析物を含むことができる。標識された分析物の例示的混合物、およびそれらの調製および／または分析のための方法は、前記した、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」（標識および分析のための方法）と題されたセクションに記載している。
【０２１５】
混合物は、２以上の標識反応の産物の全てまたは一部を混合することによって形成することができ、ここで、各試料は標識試薬の組の異なる標識試薬で標識されていて、各標識試薬は固有の（総）質量のレポーター部分、ならびにコードされていない検出可能な標識を含む。各異なる標識試薬の固有のレポーター部分は、２以上の標識された分析物の各々がいずれの標識反応から由来するか（すなわち、起源となるか）を同定することができる。コードされていない検出可能な標識を用いて、電気泳動分離の間に標識された分析物を単離することができる。これらの方法に関連する標識試薬および標識された分析物の特徴は先に議論している。
【０２１６】
混合物の１以上の分析物はペプチドであり得る。混合物の１以上の分析物は蛋白質であり得る。混合物の１以上の分析物はペプチドおよび蛋白質であり得る。混合物の１以上の分析物は核酸分子であり得る。混合物の１以上の分析物は炭水化物であり得る。混合物の１以上の分析物は脂質であり得る。混合物の１以上の分析物はステロイドであり得る。混合物の１以上の分析物はビタミンであり得る。混合物の１以上の分析物はプロスタグランジンであり得る。混合物の１以上の分析物はアミノ酸であり得る。混合物の１以上の分析物は１５００ダルトン未満の質量を有する小分子であり得る。いくつかの場合には、分析物は種々の分析物のタイプの混合物であり得る。例えば、混合物の分析物は脂質およびステロイド；または２）蛋白質、ペプチド、アミノ酸、脂質、ステロイドおよび炭水化物を含む。混合物は、２以上の異なる分析物タイプを含む混合物を含めた、本明細書に開示された新規な標識試薬で標識されたいずれのタイプの差次的に標識された分析物も含むことができる。
【０２１７】
例えば、混合物は少なくとも２つの差次的に標識された分析物を含むことができ、ここで、該混合物は、各試料が同位体的にコードされた異性体および／または同重体標識試薬の組からの異なる標識試薬で標識された少なくとも２つの異なる試料の標識反応の産物を混合することによって形成され、ここで、混合物の各差次的に標識された分析物は、塩形態および／または水和物形態を含めた、式ＩＡ：
【０２１８】
【化２０】
0005422382.tif 000043
（式中、ｍおよびｎは、各々０または１であり、但しｍ＋ｎ＝１である）によって表される。（先により詳細に記載された）レポーター部分「ＲＰ」は固定された電荷を含むか、あるいは質量分析計においてイオン化可能であり、ここで、該レポーター部分は結合Ｘの断片化に際して質量分析計においてサインイオンを生成することができ、また、各レポーター部分、およびその対応するサインイオンの総質量は、該組のいずれの標識試薬を用いて試料を標識したかに依って、各異なる試料について異なる。（先により詳細に記載した）コードされていない検出可能な標識「ＤＬ」は、該組の各異なる標識試薬について異なり、各異なるコードされていない検出可能な標識は該組における他のものから独立して検出可能であり、および、各異なるコードされていない検出可能な標識は、該組の他の標識試薬の他のコードされていない検出可能な標識と同一総質量および同一の正味の電荷を有する。（先により詳細に記載した）リンカー部分「ＬＫ」は直鎖または分岐状であり得、ここで、ＬＫは分析物をレポーター部分およびコードされていない検出可能な標識の双方に（直接的または間接的に）連結させ、該組の各異なる標識試薬の連結部位の質量は、レポーター部分およびリンカー部分の組合せの凝集体総質量が該組の各標識試薬について同一であるように、該組の異なる標識試薬についてのレポーター部分の間の総質量の差を補正する。（先により詳細に記載された）Ｘは、レポーター部分をリンカー部分へ、またはコードされていない検出可能な標識へ連結させる共有結合であって、Ｘは質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能である。（先により詳細に記載された）Ｙは、分析物をリンカー部分に連結させる共有結合または連結基であって、Ｙは、必要に応じて、質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能であり、但し、Ｙが連結基であるとき、総質量は該組の各標識試薬について同一である。（先により詳細に記載された）Ｗは、コードされていない検出可能な標識をリンカー部分に連結する共有結合または連結基であって、Ｗは、必要に応じて、光、熱および／または化学試薬によって切断可能であり、および／または質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能であり、但し、Ｗが連結基であるとき、その総質量は該組の各標識試薬について同一である。標識された分析物ＩＡのある種の断片化特性を図３ａに示す。
【０２１９】
例えば、混合物は式ＩＩＡまたはＩＩＩＡ：
【０２２０】
【化２１】
0005422382.tif 000044
【０２２１】
【化２２】
0005422382.tif 000045
によって表される少なくとも１つの標識された分析物を含むことができる。
【０２２２】
標識された分析物ＩＩＡおよびＩＩＩＡのエレメントおよびある種の断片化特性を図３ｂに示す。
【０２２３】
いくつかの実施形態において、混合物は、支持体結合された標識試薬を用いることによって調製され、標識された分析物は支持体から切断されて、それにより、混合物を形成する。かくして、いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも２つの差次的に標識された分析物を含む混合物に関し、ここで、該混合物は、各試料が同位体的にコードされた異性体および／または同重体標識試薬の組からの異なる標識試薬で標識された少なくとも２つの異なる試料の標識反応の産物を混合することによって形成され、ここで、混合物の各差次的に標識された分析物が、塩形態および／または水和物形態を含めた、式ＩＳＳＡｘ：
【０２２４】
【化２３】
0005422382.tif 000046
（式中、ｍおよびｎは、各々０または１であり、但し、ｍ＋ｎ＝１である）によって表される。（先により詳細に記載された）レポーター部分「ＲＰ」は固定された電荷を含むか、あるいは質量分析計においてイオン化可能であって、該レポーター部分は、結合Ｘの断片化に際して質量分析計においてサインイオンを生成することができ、ここで、各レポーター部分、およびその対応するサインイオンの総質量は、該組のいずれの標識試薬を用いて試料を標識したかに依って、各異なる試料について異なる。（先により詳細に記載された）コードされていない検出可能な標識「ＤＬ」は、該組の各異なる標識試薬について異なり、ここで、各異なるコードされていない検出可能な標識は該組における他のものから独立して検出可能であって、各異なるコードされていない検出可能な標識は、該組の他の標識試薬の他のコードされていない検出可能な標識と同一の総質量および同一の正味の電荷を有する。（先により詳細に記載された）リンカー部分「ＬＫ」は直鎖または分岐状であり得、ここで、ＬＫは分析物をレポーター部分およびコードされていない検出可能な標識の双方に（直接的または間接的に）連結させ、また、該組の各異なる標識試薬のリンカー部分の質量は、レポーター部分およびリンカー部分の組合せの凝集体総質量が該組の各標識試薬について同一であるように、該組の異なる標識試薬についてのレポーター部分の間の総質量の差を補正する。（先により詳細に記載された）Ｘは、レポーター部分をリンカー部分へ、またはコードされていない検出可能な標識へ連結させる共有結合であって、結合Ｘは質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能である。（先により詳細に記載された）Ｙは、分析物をリンカー部分に連結させる共有結合または連結基であって、Ｙは、必要に応じて、質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能であり、但し、Ｙが連結基であるとき、その総質量は該組の各標識試薬について同一である。（先により詳細に記載された）Ｗは、コードされていない検出可能な標識をリンカー部分へ連結させる共有結合または連結基であって、Ｗは、必要に応じて、光、熱、化学試薬の適用によって切断可能であり、および／または質量分析計において解離エネルギーの適用によって断片化可能であり、但し、Ｗが連結基であるとき、その総質量は該組の各標識試薬について同一である。Ｑ’は固体支持体からの差次的に標識された分析物の切断によって形成された官能基である。例えば、Ｑ’はアルキルアミン基、アルキルヒドロキシル基またはアルキルチオール基であり得る。
【０２２５】
例えば、混合物は、式ＩＩｓｓＡｘまたはＩＩＩｓｓＡｘ：
【０２２６】
【化２４】
0005422382.tif 000047
【０２２７】
【化２５】
0005422382.tif 000048
（式中、Ｑ’は固体支持体からの差次的に標識された分析物の切断によって形成された官能基である）によって表される少なくとも１つの標識された分析物を含むことができる。標識された分析物ＩＩｓｓＡｘおよびＩＩＩｓｓＡｘの要素およびある種の断片化特性は図３ｄに示される。
【０２２８】
Ｖ．キット
いくつかの実施形態において、本発明はキットに関する。該キットは本明細書に記載された１以上の標識試薬、ならびに１以上の他の試薬、容器、酵素、緩衝液および／または指示書を含むことができる。例えば、キットの試薬は、２以上の異なる試料中の１以上の分析物を定量するためのアッセイを行うように選択され得る。キットは２以上の標識試薬、および１以上の他の試薬、容器、酵素、緩衝液および／または指示書の組を含むことができる。キットの２以上の標識試薬は異性体および／または同重体であり得る。標識試薬は同位体的にコードされ得る。
【０２２９】
キットの標識試薬は本明細書に記載された任意の標識試薬であり得る。例えば、キットの１以上の標識試薬は、その同位体的にコードされたバージョンを含めた、先に本明細書で開示された式：Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｉｓｓ、ＩＩｓｓおよび／またはＩＩＩｓｓの（化合物の組を含めた）化合物であり得る。
【０２３０】
いくつかの実施形態において、キットは、その同位体的にコードされたバージョンを含めた、先に本明細書に開示された式：ＩＡ、ＩＩＡ、ＩＩＩＡ、ＩｓｓＡｘ、ＩＩｓｓＡｘおよび／またはＩＩＩｓｓＡｘの標識された分析物を含むことができる。キットの標識試薬の他の特性は開示されている。いくつかの実施形態において、キットの少なくとも１つのさらなる試薬は、レポーター部分を含む標識された較正標準であり得る。いくつかの実施形態において、レポーターはキット中の化合物のいずれか（すなわち、標識試薬）と比較して固有の質量を有することができる。キットは、例えば、同一試料中の、または２以上の異なる試料中の１以上の分析物の多重分析で有用であり得る。
【実施例】
【０２３１】
本教示の態様は、本教示の範囲を限定するものと断じて解釈されるべきではない以下の実施例に徴してさらに理解することができる。
【０２３２】
（実施例１）標識試薬への提案された合成経路
図９ａおよび９ｂを参照し、例示的な標識試薬ＩＩＩに対する提案された合成経路が提示される。同一方法を用いて、適当な蛍光染料の単純な置換によって例示的な標識試薬ＩＩを調製することができるのは理解されるべきである。また、組成物は、適切にコードされた出発物質の置換によって同位体濃縮された部位にて調製することができるのも理解されるべきである。
【０２３３】
図９ａを参照し、水素化ナトリウム（ＮａＨ）の存在下で化合物１０を化合物１１と反応させて、それにより、生成物化合物１２を生じさせる。化合物１２を無水酢酸（Ａｃ２Ｏ）と反応させて、それにより、化合物１３を形成する。化合物１３を、化合物１４（適切にはその同位体的にコードされたバージョンを含む；例えば、以下の実施例２参照）で処理して、それにより、化合物１５を生じさせる。
【０２３４】
図９ｂを参照し、次いで、化合物１５をメタノール（ＭｅＯＨ）およびジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）で処理して、それにより、化合物１６を生じさせる。次いで、ジオキサン中で化合物１６を塩酸（ＨＣｌ）で処理して、それにより、化合物１７を生成する。次いで、トリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）等の非求核性塩基、および化合物１８等の、活性化された（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル））コードされていない検出可能な標識によって塩基性条件下で処理して、それにより、化合物１９を生成する。化合物１８は１つの可能なコードされていない検出可能な標識であり、この標識は本明細書に示した式ＩＩＩの化合物において表される。式ＩＩの化合物において表されるもの等の、コードされていない検出可能な標識の活性化された形態を用いて、異性体および／または同重体標識試薬の組のコンパニオン標識を形成することもできよう。次いで、化合物１９を、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）等の強塩基で処理して、メチルエステルをケン化し、得られたカルボン酸を、カルボン酸基をＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルへ変換するのに適していることが通常知られた試薬であるＮ−ヒドロキシスクシンイミジル−トリフルオロアセテート（ＮＨＳ−ＴＦＡ）での処理によってＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルに変換して（図７参照）、それにより、標識試薬２０を生成する。
【０２３５】
（実施例２）コードされたレポーター分子への提案された合成経路：
（ｉ）ＢｏｃＮＨ１３ＣＨ２１３ＣＨ２ＯＨ（３１）の合成
図１０ａを参照し、ＢｏｃＮＨ１３ＣＨ２１３ＣＯＯＨ（３０，Ｐ／Ｎ：Ａｌｄｒｉｃｈ６０４９９２；１０ｇ，５６．４４ミリモル）を、セプタム、磁気撹拌棒およびアルゴン入口ラインを備えた５００ｍＬ二首丸底フラスコに移した。該系を窒素でフラッシングした後、乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ，Ｐ／Ｎ：Ａｌｓｒｉｃｈ，１８６５６２；１００ｍＬ）を、圧力差を用いてカニューレを介して移し、清澄な溶液が得られるまで、室温で撹拌した。次いで、反応混合物を０℃まで冷却し、ボラン−ＴＨＦ錯体の溶液（ＢＨ３／ＴＨＦ，Ｐ／Ｎ：Ａｌｄｒｉｃｈ１７６１９２，１Ｍ，１９７ｍＬ）を１０分間にわたってカニューレを介して反応混合物に加えた。次いで、反応を０℃にてさらに９０分間継続した。
【０２３６】
反応混合物の小さなアリコットをメタノール（ＭｅＯＨ）でクエンチし、薄層クロマトフラフィ（ＴＬＣ）によって分析し、これは、出発物質３０の完全な消費および生成物３１の形成を示した（Ｒｆ３０＝０．００，Ｒｆ３１＝０．２０；１：１へキサン−酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）；ＴＬＣはエタノール（ＥｔＯＨ）中で３％（ｗ／ｖ）ニンヒドリン溶液と共に加熱することによって発色した）。
【０２３７】
ＭｅＯＨ（１００ｍＬ，２０分間にわたって加えた）をゆっくりと加えることによって、反応を（０℃にて）クエンチした。揮発物を減圧下で除去した。そのように得られた油をさらなるＭｅＯＨ（５０ｍＬ）から蒸発させ、カラムクロマトグラフィ（２回の実行；１２０ｇＳｉＯ２カラムＩｓｃｏ．；８５ｍＬ／分、０〜１０分のヘキサン中の４０％ＥｔＯＡｃ、０〜１０分のヘキサン中の９０％ＥｔＯＡｃ、収集された１８ｍＬ−画分；画分３９〜５５は純粋な生成物を有した）によって精製して、ＢｏｃＮＨ１３ＣＨ２１３ＣＨ２ＯＨ（３１）を無色油（７．４０ｇ，８１％）として得た。
【０２３８】
（ｉｉ）ＢｏｃＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＭｓ（３２）の合成
図１０ｂを参照し、ジクロロメタン（ＤＣＭ，１００ｍＬ）中の３１（１．１５ｇ，７．１３ミリモル）、Ｅｒ３Ｎ（２．５ｍＬ，１７．８２ミリモル）の氷冷溶液に、撹拌しつつ、１分間にわたって塩化メタンスルホニル（ＭｓＣｌ，Ｐ／Ｎ：Ｆｌｕｋａ６４２６０、０．６６４ｍＬ、８．５５ミリモル）を加えた。０℃にてさらに１５分後、反応混合物をＴＬＣによって分析し、新しい生成物の形成を示した（Ｒｆ３１＝０．２０、Ｒｆ３２＝０．４２；１：１へキサン−ＥｔＯＡｃ；ＴＣＬは、ＥｔＯＨ中の３％（ｗ／ｖ）ニンヒドリン溶液と共に加熱することによって発色した。
【０２３９】
ＤＣＭを蒸発させ、黄色固体をＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）に溶解させた。ＥｔＯＡｃ層をＨＣｌ（１Ｍ，１００ｍＬ）、続いてブライン（５０ｍＬ×２）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して黄色油が得られ、これを精製することなく次の反応で用いた。
【０２４０】
（ｉｉｉ）ＢｏｃＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨＭｅ（３３）の合成
図１０ｃを参照し、６０ｍＬのメチルアミン（ＭｅＮＨ２、Ｐ／Ｎ：Ａｌｄｒｉｃｈ３９５０５６、ＴＨＦ中２．０Ｍ、１２０ミリモル）溶液を加えた最小量のＴＨＦを用い、ＢｏｃＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＭｓ（３２）（１．４２ｇ、５．９４ミリモル）をＣｈｅｍ−Ｇｌａｓｓ圧力容器に移し、蓋をし、４０〜４５℃にて３時間、次いで、室温にて一晩（安全シールドを使用）（撹拌しつつ）加熱した。ＴＬＣ分析（１：１ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）は３２の完全な消費、および新しい生成物（Ｒｆ３３＝０．３８；１：１へキサン−ＤＣＭ−ＭｅＯＨ＋１％（ｖ／ｖ）Ｅｔ３Ｎ；ＴＬＦプレートをまず５分間加熱して、Ｅｔ３Ｎを除去し、次いで、ＥｔＯＨ中の３％（ｗ／ｖ）ニンヒドリン溶液と共に加熱することによって発色させた）の形成を示した。次いで、反応混合物を油まで濃縮し、カラムクロマトグラフィ（４０ｇカラムＩｓｃｏ．；ＳｉＯ２；４０ｍＬ／分、ＥｔＯＡｃで平衡化したカラム、１：１ＭｅＯＨ−ＤＣＭ＋１％Ｅｔ３Ｎ（ｖ／ｖ）で溶出、収集された１８ｍＬ−画分；画分１３〜１９は純粋な生成物を有した）によって精製して、ＢｏｃＮＨ１３ＣＨ２１３ＣＨ２ＮＨＭｅ３３を無色油（０．７９ｇ、７６％）として得た。ＥＳ−ＭＳ（ＭｅＯＨ中にて直接的に注入）計算値ＭＨ＋［１３Ｃ２Ｃ６Ｈ１８Ｎ２Ｏ２＋Ｈ］＋ＭＨ＋＝１７７．１４、観測値ＭＨ＋＝１７７．１４。
【０２４１】
（ｉｖ）ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（Ｍｅ）Ｆｍｏｃ（３４）の合成
図１０ｄを参照し、アセトン（１２５ｍＬ）中のＢｏｃＮＨ１３ＣＨ２１３ＣＨ２ＮＨＭｅ（３３、１．７８ｇ、１０．２ミリモル）のよく撹拌された溶液に、Ｆｍｏｃ−ＯＳｕの溶液（Ｐ／Ｎ：Ａｄｖａｎｃｅ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ  ＲＣ８０１５、３．４６ｇ、１２５ｍＬアセトン中１０．２ミリモル）を加える。混合物を雰囲気温度にて２０分間撹拌する。この時点で、ＮａＨＣＯ３（飽和，２５ｍＬ）溶液を反応混合物に加え、ｐＨを８〜９に調節し、さらに３０分間激しく撹拌する（二相反応）。アセトンの蒸発後、生成物をＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）および薄（ａｑ）塩酸（ＨＣｌ、３０ｍＬ、１Ｍ）＋３０ｍＬブラインの間に分配する。次いで、ＥｔＯＡｃ層を薄ＨＣｌ（３０ｍＬ、１Ｍ）＋３０ｍＬブライン、続いて、ＮａＨＣＯ３（１０ｍＬ）＋ブライン（６０ｍＬ）の混合物、およびブライン（５０ｍＬ×２）でさらに洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して、濃厚な無色油を得る。
【０２４２】
次いで、該油をＤＣＭ（５０ｍＬ）に溶解させ、ジオキサン中のＨＣｌ溶液（４Ｍ、５０ｍＬ）を加え、反応混合物を雰囲気温度にて３０分間撹拌する。揮発物を減圧下で除去して、白色乾燥固体が得られ、これを７：３のＥｔＯＡｃ−ヘキサンで洗浄して、ＮＨ２１３ＣＨ２１３ＣＨ２Ｎ（Ｆｍｏｃ）Ｍｅ３４を固体として得る。
【０２４３】
（ｖ）部分的にコードレポーター／リンカー部分（３５）の合成
図１１を参照し、ＤＣＭ中の３４（３当量）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、６当量）の溶液に、トリチル−Ｃｌ樹脂（Ａｄｖａｎｃｅ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ，Ｐ／ＮＳＣ５０２８、１当量）を固体として加え、３０分間混合する。次いで、樹脂を濾過し、ＤＭＦで洗浄する。次いで、樹脂をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のピペリジンの２０％溶液で５分間処理し、ＤＭＦで洗浄する。
【０２４４】
Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）中のＮ−メチルピペラジン酢酸（Ｃｈｅｓｓ  ＧｍｂＨ、Ｐ／Ｎ２０２２、３当量）およびＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートＨＡＴＵ（３当量）の溶液に、ＤＩＥＡ（９当量）を加える。これを１分間混合し、樹脂に加える。３０分間のカップリングの後、樹脂をＮＭＰ、続いてアセトニトリルで洗浄する。
【０２４５】
生成物（３５）をＤＣＭ中の１５％ＴＦＡを用いて樹脂から切断して、化合物をＴＦＡ塩として得る。
【０２４６】
コードされたＮ−メチルピペラジン酢酸（例えば、コードされたＮ−メチルピペラジン酢酸の例示的な合成については米国公開特許出願ＵＳ２００５−０１４８７７４Ａ１およびＵＳ２００５−０１４４８７７３Ａ１参照）およびコードされていないＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（Ｆｍｏｃ）Ｍｅ３４’（図１２）は反応合成において置換されて、それにより、（図１２においては３５’として確認される）化合物３５の対応するバージョンを生じさせることは理解されるべきであり、ここで、レポーターは同位体濃縮された部位を含む（例えば、図１２に示された代替合成参照）。出発物質の注意深い選択によって、示された方法を用い、化合物３５の実質的に任意の所望のコードバージョンを調製することができる。
【０２４７】
いくつかの実施形態において、コードされたＮ−メチルピペラジン酢酸部分は、式：
【０２４８】
【化２６】
0005422382.tif 000049
（式中、＊は１２Ｃに代えての１３Ｃでの置換を示す）によって表される化合物３６または３７から選択することができる。
【０２４９】
（実施例３）標識試薬への提案された代替合成経路：
図１３および１４を参照し、標識試薬への代替合成経路が示され、ここで、コードされていない検出可能な標識を標識試薬の残りに切断可能に連結するリンカーを、前記実施例１における記載と比較して反対にする。図１３ａを参照し、蛍光染料４０（本明細書に開示された式ＩＩの化合物をもたらす蛍光染料を選択できるのは理解されるべきである）を、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）の存在下で化合物４１と反応させて、それにより、化合物４２を生成する。次いで、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）での処理によって、化合物４２のｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−ｂｏｃまたはＢｏｃ）基を除去して、それにより、化合物４３をそのＴＦＡ塩として生成する。図１３ａを参照し、図１４に示したように用いる化合物４３’としての簡単な形態で化合物４３も示す。
【０２５０】
図１３ｂを参照し、化合物４４（これは、Ｆａｄｅｅｖ，Ｅｖｇｅｎｙ  Ａ．；Ｌｕｏ，Ｍｉｎｋｕｉ；Ｇｒｏｖｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｔ．Ｔ；Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ  ｓｉｄｅｏｐｈｏｒｅ  ｒｈｉｚｏｂａｃｔｉｎ−１０２１  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｎａｌｏｇｓ．Ｂｉｏｉｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００５），１５（１６），３７７１−３７７４に従って調製することができる）を、トリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）またはＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）等の非求核性有機塩基の存在下で、化合物３５（所望の試薬に依って、化合物３５の種々のコードされたバージョンまたはコードされていないバージョンを用いることができるのは理解されるべきである）と反応させて、それにより、化合物４５を生成する。無機塩基である炭酸セシウム（ＣｓＣＯ３）の存在下で、化合物４５を臭化ベンジル（ＢｎＢｒ）と反応させて、それにより、化合物４６を形成させる。次いで、ＴＦＡでの処理によって化合物４６のｔ−ｂｏｃ基を除去して、それにより、化合物４７を生成する。次いで、ＤＩＥＡ等の非求核有機塩基の存在下で、化合物４７をＨＡＴＵで処理し、次いで、化合物４３’と反応させて、それにより、化合物４８を生成する。次いで、化合物４８を水素（Ｈ２）およびパラジウム（Ｐｄ）触媒で処理して、それにより、ベンジルエステルをカルボン酸基に変換し、これをＮ−ヒドロキシスクシンイミジル−トリフルオロアセテート（ＮＨＳ−ＴＦＡ、化合物５０）と反応させて、それにより、標識試薬４９のＮＨＳ−エステルを形成させる。
【０２５１】
（実施例４）コードされていない検出可能な標識への提案された合成経路：
コードされていない検出可能な標識として用いられる蛍光染料は利用可能な染料および／または商業的に入手可能な染料から修飾された染料であり得る。例えば、図１４を参照し、一般式ＩＩＩを有する本明細書に開示された組成物はＴＡＭＲＡ部分を含み、ここで、ＴＡＭＲＡは種々の源から商業的に入手可能な染料である。
【０２５２】
ＴＡＭＲＡと同一の質量および電荷を含む蛍光染料を調製するために、図１４は、一般式ＩＩを有する化合物に関して用いた染料への提案された合成経路を示す。提案された合成はよく知られた合成経路に従い、そこで、フェノール性化合物のＮ−エチルバージョンをそのＮ−メチル誘導体６０で置換して、それにより、望まれる染料６５をそのビス−ＴＦＡ塩として生じさせる。
【０２５３】
図１４を参照し、化合物６０および６１の混合物を高温下で長時間の間、ポリリン酸で処理することによって染料６５を調製することができる。蛍光染料製造の分野における当業者であれば、この混合をどのようにして行うかを認識するであろう。反応により化合物６２および６３を生成し、ここで、化合物６３を単離して、塩形態６４に変換する。次いで、化合物６４をトリフルオロ酢酸／トリエチルアミンで処理して、それにより、ビス−トリフルオロアセテート６５を生成することができる。
【０２５４】
本教示を種々の実施形態と組み合わせて記載してきたが、本教示はそのような実施形態に制限されることを意図しない。反対に、当業者によって認識されるように、本教示は種々の別法、修飾物および同等物を含む。
【図１ａ】
0005422382.tif 000066
【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１４】
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