(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３のアミノ酸配列を含んだポリペプチドに金属イオンが結合した構造を有することを特徴とする人工酸化還元酵素。
【請求項４】
前記ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列で表されるポリペプチドである、請求項１に記載の人工酸化還元酵素。
【請求項５】
前記人工酸化還元酵素は、カタラーゼ様反応を触媒する酵素又は過酸化水素依存性のスーパーオキシド生成反応を触媒する酵素である、請求項１又は４に記載の人工酸化還元酵素。
【請求項６】
前記金属イオンは遷移金属イオンである、請求項１，４，５のいずれか一項に記載の人工酸化還元酵素。
【請求項７】
前記人工酸化還元酵素は、タンパク質、ペプチド、多糖類、合成樹脂、金属及びガラスから選ばれる少なくとも一つに結合して構成されている、請求項１，４〜６のいずれか一項に記載の人工酸化還元酵素。
【請求項８】
前記多糖類、合成樹脂、金属及びガラスは、繊維状、顆粒状、板状、棒状又は球状の形態を有する、請求項７に記載の人工酸化還元酵素。
【請求項９】
請求項１，４〜８のいずれか一項に記載の人工酸化還元酵素の使用方法であって、
人工酸化還元酵素の触媒による反応産物との反応により発光、蛍光、着色、及び色素沈着から選ばれる少なくとも一つを生じるプローブ化合物を利用して人工酸化還元酵素の触媒活性を検出することを含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記プローブ化合物は、ルミノール、ジアミノベンジジン、及びウミホタルルシフェリンアナログから選ばれる少なくとも一つである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１，４〜８のいずれか一項に記載の人工酸化還元酵素の使用方法であって、
人工酸化還元酵素を構成する前記ポリペプチド中のチロシン残基をリン酸化又は脱リン酸化することにより、人工酸化還元酵素の触媒活性を調節することを含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定のポリペプチドからなる人工酸化還元酵素及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、生物が生産する天然の触媒である酵素はアミノ酸が連なることで形成されるタンパク質（ポリペプチド）からなることが知られている。遺伝子工学に基づくアプローチにより既知の酵素のアミノ酸配列にランダムにアミノ酸配列を付加・延長させる人為的な「分子進化」によって有用な触媒機能を持つタンパク質を創出・選抜する手法（random elongation mutagenesis）の有用性が現在までに確認されている。例えば、非特許文献１には、カタラーゼ活性を主として有するタンパク質を、酸化還元酵素活性を主として有するタンパク質へと改変（進化）させる方法が開示されている。また、非特許文献２には、ランダムなアミノ酸配列からＤＮＡ結合能を持つタンパク質を選抜する方法が開示されている。【０００３】
現在、世界では、多くの研究者が、分子生物学の知見と技術を駆使してペプチド配列をデザインすることで新規の触媒活性を付与したタンパク質を創出することに取り組んでいる。しかしながら既に機能することが知られる酵素中のアミノ酸配列ですら、実際の反応において果たす役割についての理解は、全く十分ではない。そのため、人為的に「酵素」を創出する試みは必ずしも成功しているとは言えない。【０００４】
酸化還元酵素の例としては、例えば、ＡＨ２＋Ｈ２Ｏ２→Ａ＋２Ｈ２Ｏで表される基質の脱水素反応を触媒するペルオキシダーゼ、及び２Ｈ２Ｏ２→Ｏ２＋２Ｈ２Ｏで表される過酸化水素の分解反応を触媒するカタラーゼが知られている。酸化還元酵素は、分子生物学および生化学の基礎研究だけでなく医療・保健・食品・環境分野でも利用可能であるために、人工的な合成に成功すれば工業的な応用が最も容易な酵素群の一つである。しかしながら、酸化還元酵素の多くは現在、生体による産生に依存しており、そのため、収量と品質がバッチやメーカーによって大きく異なる。したがって、高純度で高活性の酵素の調達にかかるコストを無視することができない。【０００５】
天然の酸化還元酵素は主に、ヘムポケット内のヘムと周辺アミノ酸残基を活性中心とするヘムタンパク質である。酸化還元酵素活性の改変の為の試みとしては、変性による構造変化を利用することが知られている。例えばヘモグロビンのメト化により得られるメトヘモグロビンは、活性は低いが酸化還元酵素様活性（シュード酸化還元酵素活性）を示す。メトヘモグロビンはまた、植物酸化還元酵素と同様にモノアミン類を基質として酸化し、スーパーオキシドの生成の触媒もする。一方、本来酸化還元酵素ではないタンパク質骨格にヘムを取り込ませて酸化還元酵素活性を付与する試みが知られている。例えば、アミロイドβペプチドにヘムを結合させると、酸化還元酵素活性が発現する。（非特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Matsuura, T. et al., Nature Biotechnol. 17, 58-61 (1999)
【非特許文献２】Nakashima, T. et al., J. Biosci. Bioeng. 103(2), 155-160 (2007)
【非特許文献３】Atamna, H. and Boyle, K., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103(9), 3381-6 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、発明者らの鋭意研究の結果、これまでに酵素としての機能が全く知られていないアミノ酸配列を有する人為的に合成したペプチド短鎖について、酸化還元酵素活性を有することを発見したことに基づくものである。【０００８】
本発明の目的とするところは、容易に且つ簡便に利用することができる人工酸化還元酵素及びその使用方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明の第１の態様では、配列番号３のアミノ酸配列を含んだポリペブチドに金属イオンが結合した構造を有する人工酸化還元酵素を提供する。【００１０】
好ましくは、前記ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列で表されるポリペプチドである。【００１１】
好ましくは、前記人工酸化還元酵素は、カタラーゼ様反応を触媒する酵素又は過酸化水素依存性のスーパーオキシド生成反応を触媒する酵素である。
好ましくは、前記金属イオンは遷移金属イオンである。【００１２】
好ましくは、前記人工酸化還元酵素は、タンパク質、ペプチド、多糖類、合成樹脂、金属及びガラスから選ばれる少なくとも一つに結合して構成される。
好ましくは、前記多糖類、合成樹脂、金属及びガラスは、繊維状、顆粒状、板状、棒状又は球状の形態を有する。【００１３】
本発明の第２の態様では、前記第１の態様の人工酸化還元酵素を使用する方法を提供する。その方法は、人工酸化還元酵素の触媒による反応産物との反応により発光、蛍光、着色、及び色素沈着から選ばれる少なくとも一つを生じるプローブ化合物を利用して人工酸化還元酵素の触媒活性を検出することを含む。【００１４】
好ましくは、前記プローブ化合物は、ルミノール、ジアミノベンジジン、及びウミホタルルシフェリンアナログから選ばれる少なくとも一つである。
本発明の第３の態様では、前記第１の態様の人工酸化還元酵素を使用する別の方法を提供する。その方法は、人工酸化還元酵素を構成する前記ポリペプチド中のチロシン残基をリン酸化又は脱リン酸化することにより、人工酸化還元酵素の触媒活性を調節することを含む。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、容易に且つ簡便に利用することができる人工酸化還元酵素及びその使用方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】試験例１のペプチドＣ〜Ｆの触媒作用による過酸化水素依存性スーパーオキシド生成に基づいて測定される最大発光強度を示したグラフ。
【図２】試験例１のペプチドＣ〜Ｆの触媒作用による過酸化水素依存性スーパーオキシド生成に基づいて測定される発光強度の時間変化を示したグラフ。
【図３】試験例２の８種類のペプチドの触媒作用による過酸化水素依存性スーパーオキシド生成に基づいて測定される発光強度の時間変化を示したグラフ。
【図４】試験例２の８種類のペプチドの触媒作用による過酸化水素依存性スーパーオキシド生成に基づいて測定される最大発光強度を示したグラフ。
【図５】試験例３の２種類のペプチドの触媒作用によるカタラーゼ様反応で生じる酸素の濃度の時間変化を、ペプチドなしの場合に同様の測定を行ったときの結果と併せて示したグラフ。
【図６】試験例４の３種類のペプチドの触媒作用による過酸化水素依存性スーパーオキシド生成に基づいて測定される発光強度の時間変化を、ペプチドなしの場合及びＣｕＳＯ４なしの場合に同様の測定を行ったときの結果と併せて示したグラフ。
【図７】試験例４の３種類のペプチドの触媒作用による過酸化水素依存性スーパーオキシド生成に基づいて測定される最大発光強度を、ペプチドなしの場合及びＣｕＳＯ４なしの場合に同様の測定を行ったときの結果と併せて示したグラフ。
【図８】試験例５のペプチドの触媒作用による過酸化水素の分解に基づいて測定される波長２４０ｎｍにおける吸光度の時間変化を示したグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
本実施形態の人工酸化還元酵素は、アミノ酸の数が６〜１３個のポリペプチドに金属イオンが結合した構造を有している。前記ポリペプチドは、構成アミノ酸としてチロシン及びヒスチジンを含む。前記ポリペプチドのチロシン残基は電子供与基として働く。前記ポリペプチドのヒスチジン残基は、前記ポリペプチドのＮ末端以外の位置に存在し、金属イオン結合領域を構成する。
【００１８】
チロシン及びヒスチジン以外の人工酸化還元酵素の構成アミノ酸はいずれのアミノ酸であってもよい。チロシン残基は、前記ポリペプチド内のいずれの位置に存在してもよい。ヒスチジン残基は、前記ポリペプチドのＮ末端以外の位置であればいずれの位置に存在してもよいが、人工酸化還元酵素の触媒活性をより向上させるためには前記ポリペプチドのＣ末端に位置するか、あるいはＣ末端の近くに位置することが望ましい。
【００１９】
前記ポリペプチドは、人工酸化還元酵素の触媒活性をより向上させる観点からは、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（ＧＨ）及びＰｒｏ−Ｈｉｓ（ＰＨ）から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸配列を含むことが好ましく、より好ましくは配列番号３，４，６〜９，１２，１３から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸配列を含み、さらに好ましくは配列番号３，４，６〜９，１２，１３から選ばれる一つのアミノ酸配列で表されるポリペプチドである。
【００２０】
人工酸化還元酵素は、タンパク質、ペプチド、多糖類、合成樹脂、金属及びガラスから選ばれる少なくとも一つに結合して構成されてもよい。人工酸化還元酵素が結合する多糖類、合成樹脂、金属及びガラスの形状は特に限定されないが、例えば、繊維状、顆粒状、板状、棒状及び球状が挙げられる。また、人工酸化還元酵素は、例えば生化学試験用キットとして用いられる合成樹脂製の容器の壁面にコーティングして用いてもよい。
【００２１】
人工酸化還元酵素は、以下の理化学的性質を有する。
（ａ）ポリペプチド中に存在するチロシン残基が電子供与基として機能する。
（ｂ）過酸化水素や有機過酸化物などのペルオキシ構造（−Ｏ−Ｏ−）を有する過酸化物が電子受容体としての基質となる。
【００２２】
（ｃ）上記（ｂ）に記載の過酸化物の分解産物である酸素、水及び活性酸素種、及び／又は反応中間体である有機ラジカル種と反応系に共存する分子酸素との二次反応の産物として生じるスーパーオキシド及び該スーパーオキシドから派生する活性酸素種を反応産物として生じる。
【００２３】
人工酸化還元酵素の触媒活性の検出は、人工酸化還元酵素の触媒作用による反応産物、例えば一次反応産物又は二次反応産物との反応により発光、蛍光、着色、及び色素沈着から選ばれる少なくとも一つを生じるプローブ化合物を利用して行うことができる。このようなプローブ化合物は疑似基質として用いられてもよい。使用可能なプローブ化合物の例としては、ルミノール及びジアミノベンジジンのほか、スーパーオキシドと特異的に反応して発光するウミホタルルシフェリンアナログを挙げることができる。こうして触媒活性を検出することにより、人工酸化還元酵素の定量及び定性を行うことができる。
【００２４】
人工酸化還元酵素は、人工酸化還元酵素の直接的な基質とはならない物質が人工酸化還元酵素の触媒作用による反応産物又は反応中間体、例えば活性酸素種や有機ラジカル種と反応することにより２次的に進行する反応の触媒としても利用することができる。そのような基質の例としてはポルフィリン類を挙げることができる。ポルフィリン類は、人工酸化還元酵素の直接的な基質となる過酸化水素と共存することで初めて人工酸化還元酵素の触媒作用により酸化的に開環する。
【００２５】
人工酸化還元酵素の前記ポリペプチドは、公知の化学合成法又は遺伝子工学的手法によって製造することができる。例えば、既知のアミノ酸配列からなるポリペプチドを各種の特異的プロテアーゼで処理することにより製造してもよい。遺伝子工学的手法による前記ポリペプチドの製造は、公知のインビトロ（in vitro）タンパク合成系を利用して行うことができる。具体的には、前記ポリペプチドをコードする塩基配列を有する遺伝子を公知の任意のベクターに組み込み、該ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞などの宿主内に導入して形質転換体を作製し、該形質転換体を培養することによって行うことができる。
【００２６】
前記ポリペプチドに結合する金属イオンの例としては、ニッケル（Ｎｉ）、銅（Ｃｕ）、コバルト（Ｃｏ）、鉄（Ｆｅ）、マンガン（Ｍｎ）、クロム（Ｃｒ）、及びチタン（Ｔｉ）などの遷移金属のイオン、セリウム（Ｃｅ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、及びテルビウム（Ｔｂ）などの希土類金属のイオン、マグネシウム（Ｍｇ）、カルシウム（Ｃａ）、及びストロンチウム（Ｓｒ）などのアルカリ土類金属のイオン、リチウム（Ｌｉ）、ナトリウム（Ｎａ）、及びカリウム（Ｋ）などのアルカリ金属のイオンが挙げられる。これらの金属イオンは補因子としての役割を果たす。中でも好ましいのは、銅イオン、ニッケルイオン、コバルトイオン、鉄イオン、マグネシウムイオンであり、特に好ましいのは銅イオンである。
【００２７】
前記ポリペプチドの金属イオン結合領域に金属イオンが結合することによって、人工酸化還元酵素の触媒活性、すなわち酸化還元酵素様活性が発現する。人工酸化還元酵素は、例えば、過酸化水素を分解するカタラーゼ様反応を触媒したり、過酸化水素依存性のスーパーオキシド生成反応を触媒する。カタラーゼは、２Ｈ２Ｏ２→Ｏ２＋２Ｈ２Ｏで表される過酸化水素の分解反応を触媒する酵素として知られている。人工酸化還元酵素もまた、過酸化水素の分解反応を触媒する。
【００２８】
先に述べたとおり、前記ポリペプチドのチロシン残基は電子供与基として働く。したがって、このチロシン残基を公知の方法を用いて修飾することにより、人工酸化還元酵素の触媒活性を調節することが可能である。チロシン残基の修飾方法としては、例えばリン酸化及び脱リン酸化が挙げられる。チロシン残基のリン酸化又は脱リン酸化によれば、オンオフ制御を含む人工酸化還元酵素の触媒活性の調節を容易に行うことができる。
【００２９】
人工酸化還元酵素は、例えば試薬、医薬品及び飲食品等の分野において使用することができる。また、人工酸化還元酵素は、タンパク質、ペプチド、多糖類、合成樹脂、金属、ガラスなどの基材に結合させて使用してもよいし、基材に結合させることなくそのままで使用してもよい。
【００３０】
人工酸化還元酵素は、例えば分子生物学及び生化学の基礎研究だけでなく医療、保健、食品、環境、工業、及び研究用試薬分野においても用いることができる。具体的には、カタラーゼの代替酵素として、あるいは過酸化水素を対象としたバイオセンサ用酵素として人工酸化還元酵素は用いられうる。環境・工業分野では、例えば、繊維・紙・パルプの漂白、電子機器部品の漂白、配管内スライムの除去、食品容器の殺菌、浴場のレジオネラ菌の殺菌などの用途で使用される過酸化水素の残留分を除去する目的で人工酸化還元酵素を使用することができる。研究用試薬としては、人工酸化還元酵素を例えば酸素発生試薬として利用することが考えられる。生化学分野においては、人工酸化還元酵素を例えばリン酸化研究用試薬として利用することが考えられる。また、バイオ燃料電池用の酸素電極資材としての利用も考えられる。
【００３１】
人工酸化還元酵素は、医薬品又は試薬の分野において、酵素等のタンパク質又はペプチドに標識として結合させて使用してもよい。また、人工酸化還元酵素は、合成樹脂又はガラスに担持させてからカラム等に充填して使用してもよい。合成樹脂へのペプチドの担持は、例えばグラフト重合法で行うことができる。ガラス表面へのペプチドの固定は、例えばアレイ作成技術を利用して行うことができる。
【００３２】
本実施形態の利点を以下に記載する。
本実施形態の人工酸化還元酵素は、従来の酸化還元酵素と少なくとも同じ程度に、容易に且つ簡便に利用することができる。
【００３３】
人工酸化還元酵素は、従来の酸化還元酵素と比較して低分子である。このことは、安定性の向上及び酵素力価の向上を可能にする。
人工酸化還元酵素のポリペプチドがＧｌｙ−Ｈｉｓ（ＧＨ）及びＰｒｏ−Ｈｉｓ（ＰＨ）から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸配列を含むか、あるいは配列番号３，４，６〜９，１２，１３から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸配列を含むか、あるいは配列番号３，４，６〜９，１２，１３から選ばれる一つのアミノ酸配列で表されるポリペプチドである場合、人工酸化還元酵素の触媒活性はより向上する。
【００３４】
酸化還元酵素であるペルオキシダーゼが触媒活性を発揮するためには一般に、フェノール類のような電子供与体の添加が必要である。しかしながら、本実施形態の人工酸化還元酵素は、電子供与体の別途の添加を必要とすることなく触媒活性を発揮し、例えば、過酸化水素の分解反応又はスーパーオキシドの生成反応を触媒する。よって、人工酸化還元酵素は、ペルオキシダーゼよりも利用が容易且つ簡便であり、また用途の範囲も広い。
【００３５】
人工酸化還元酵素をタンパク質、ペプチド、多糖類、合成樹脂及びガラスから選ばれる少なくとも一つに結合して構成した場合、工業、試薬、医薬品、飲食品等の分野において各種の用途で使用することができる。
【００３６】
人工酸化還元酵素の主体であるポリペプチドは、例えば公知の化学合成法又は遺伝子工学的手法によって製造することができる。したがって、天然の生体由来の酵素による産生に比べ、収量及び品質が時期や製造者によって大きく異なることがない。また、生体からの精製のような手間を必要としないために、人工酸化還元酵素の製造は安価で且つ短時間である。
【００３７】
人工酸化還元酵素は、比較的低分子であることから、高い安定性を有する。そのため、基質となる物質をモニターするのに用いられる化学センサー（例えば固定酵素センサーや屋外用酵素センサー）に適用した場合には、野外等の過酷な気象条件で長期間に亘って使用することが可能になると期待される。
【００３８】
人工酸化還元酵素を構成するポリペプチド中のチロシン残基を修飾することにより、人工酸化還元酵素の触媒活性は調節される。チロシン残基のリン酸化又は脱リン酸化によれば、オンオフ制御を含む人工酸化還元酵素の触媒活性の調節を容易に行うことができる。またこの場合、人工酸化還元酵素をリン酸化研究用試薬として利用することができる。
【００３９】
前記実施形態は以下のように変更してもよい。
前記実施形態の人工酸化還元酵素は、緩衝液等の溶液中に保存してもよいし、あるいは結晶状又は粉末状の形態で保存してもよい。
【００４０】
前記実施形態の人工酸化還元酵素のポリペプチドを一つ以上の同じポリペプチドと公知の方法で連結したものを主体として人工酸化還元酵素を構成してもよい。かかる構成の人工酸化還元酵素も本発明の人工酸化還元酵素と同様の作用効果が期待される。
【００４１】
人工酸化還元酵素のポリペプチドが遊離のオリゴペプチドである場合は、アミノ基末端をアセチル化してもよい。この場合、ポリペプチドの環状化を防ぐことができる点で有利である。
【００４２】
次に、実施例を挙げて前記実施形態を更に具体的に説明する。
＜試験例１：ＭＡＰキナーゼと人工ペルオキシダーゼのキメラによる新規人工酵素の作成＞
以下のＡ〜Ｆの６種類のペプチドを人工的に合成した。
【００４３】
ペプチドＡ：ペルオキシダーゼ様活性を有する配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプチド（以下、「Ｇ５Ｈ」とも表記する）、
ペプチドＢ：ＭＡＰキナーゼ（Mitogen activated protein kinase、Ｅｒｋ１）のリン酸化領域（ＭＥＫ基質）に相当する配列番号２のアミノ酸配列で表されるチロシン残基含有ペプチド（以下、「Ｅｒｋ」とも表記する）、
ペプチドＣ：Ｃ末端側にペプチドＡ（Ｇ５Ｈ）のアミノ酸配列を有し、Ｎ末端側にペプチドＢ（Ｅｒｋ）のアミノ酸配列を有する配列番号３のアミノ酸配列で表されるキメラペプチド（以下、「ＥｒｋＧ５Ｈ」とも表記する）、
ペプチドＤ：配列番号３のアミノ酸配列におけるチロシン残基がリン酸化されたペプチド（以下、「ＹｐＥｒｋＧ５Ｈ」とも表記する）、
ペプチドＥ：配列番号３のアミノ酸配列におけるスレオニン残基がリン酸化されたペプチド（以下、「ＴｐＥｒｋＧ５Ｈ」とも表記する）、
ペプチドＦ：配列番号３のアミノ酸配列におけるチロシン残基及びスレオニン残基がリン酸化されたペプチド（以下、「ＴｐＹｐＥｒｋＧ５Ｈ」とも表記する）。
【００４４】
スーパーオキシドアニオンと反応して発光する２−メチル−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾール[１，２−ａ]ピラジン−３−オン（東京化成工業社製のCypridina luciferin analog（ＣＬＡ））を使用してペプチドＡ〜Ｆの過酸化水素依存性スーパーオキシド生成活性を評価した。より具体的には、ｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸緩衝液に５μＭのＣＬＡ、０．１５ｍＭのペプチドＡ〜Ｆのいずれか、補因子として０．５ｍＭのＣｕＳＯ４を順に添加し、最後に０．５ｍＭの過酸化水素を添加した。このとき、ルミノメーター（アトー株式会社製のルミネッセンサーＡＢ−２２００）を使用して、ＣＬＡによる発光を測定した。発光の測定は、過酸化水素を添加する６０秒前から開始した。ペプチドＣ〜Ｆについて同じ試験を４度行った結果を図１及び図２に示す。
【００４５】
図１及び図２にはデータを示していないが、ペプチドＡ（Ｇ５Ｈ）又はペプチドＢ（Ｅｒｋ）を用いた場合には、過酸化水素依存性スーパーオキシド生成は認められなかった。一方、図１及び図２に示されるように、ペプチドＡとペプチドＢのキメラであるペプチドＣ（ＥｒｋＧ５Ｈ）を用いた場合には、顕著な過酸化水素依存性スーパーオキシド生成が認められた。興味深いことに、このペプチドＣのチロシン残基をリン酸化することにより、過酸化水素依存性スーパーオキシド生成は大きく阻害された（図１及び図２中のペプチドＤ（ＹｐＥｒｋＧ５Ｈ）の結果を参照）。これに対し、ペプチドＣのスレオニン残基をリン酸化した場合には、チロシン残基をリン酸化した場合ほどには過酸化水素依存性スーパーオキシド生成は阻害されなかった（図１及び図２中のペプチドＥ（ＴｐＥｒｋＧ５Ｈ）の結果を参照）。ペプチドＣのチロシン残基及びスレオニン残基をリン酸化した場合には、過酸化水素依存性スーパーオキシド生成は最も大きく阻害された（図１及び図２中のペプチドＦ（ＴｐＹｐＥｒｋＧ５Ｈ）の結果を参照）。以上のことは、ペプチドＣの触媒活性におけるチロシン残基の重要性を示している。
【００４６】
この結果から、人工ペルオキシダーゼであるペプチドＡに、チロシン残基を含んだペプチドを付加することにより、過酸化水素依存性の活性酸素生成を触媒することのできる人工酵素を作成できることが確認された。また、この人工酵素の触媒活性がリン酸化により制御可能であることが確認された。
【００４７】
＜試験例２：ニワトリプリオン由来のアミノ酸配列を有する人工的に合成したペプチドによる過酸化水素依存性スーパーオキシド生成反応の触媒活性試験＞
先に述べたとおり、ペルオキシダーゼが触媒活性を発揮するためには一般に、フェノール類のような電子供与体の添加が必要である。発明者らは、人工ペルオキシダーゼである配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプチドＡが触媒活性を発揮するのにも、チロシンなどのフェノール類の添加が必要であることを既に確認している。ニワトリプリオンの銅結合領域（ヘキサリピート領域）のアミノ酸配列にはチロシン残基が含まれている。そこで、このニワトリプリオン由来のアミノ酸配列を利用して新規の人工酵素の開発を検討した。具体的にはまず、以下の８種類のペプチド（オリゴペプチド）を合成した。
【００４８】
Ｈｅｘ１：配列番号４のアミノ酸配列で表されるペプチド、
Ｈｅｘ２：配列番号５のアミノ酸配列で表されるペプチド、
Ｈｅｘ３：配列番号６のアミノ酸配列で表されるペプチド、
Ｈｅｘ４：配列番号７のアミノ酸配列で表されるペプチド、
Ｈｅｘ５：配列番号８のアミノ酸配列で表されるペプチド、
Ｈｅｘ６：配列番号９のアミノ酸配列で表されるペプチド、
Ｈｅｘ３Ｆ：配列番号１０のアミノ酸配列で表されるペプチド、
Ｈｅｘ６Ｆ：配列番号１１のアミノ酸配列で表されるペプチド。
【００４９】
Ｈｅｘ１〜Ｈｅｘ６はそれぞれ、ニワトリプリオンの銅結合領域において繰り返される６つのアミノ酸残基からなるリピート単位に相当するヘキサペプチドである。Ｈｅｘ３Ｆは、Ｈｅｘ３のチロシン残基をフェニルアラニン残基で置き換えたヘキサペプチドである。Ｈｅｘ６Ｆは、Ｈｅｘ６のチロシン残基をフェニルアラニン残基で置き換えたヘキサペプチドである。これら８種類のペプチドの過酸化水素依存性スーパーオキシド生成活性を評価するべく、試験例１と同様にして行った試験の結果を図３及び図４に示す。なお、試験例１では過酸化水素を添加する６０秒前から発光の測定を開始したが、試験例２では過酸化水素を添加する１００秒前から発光の測定を開始した（図３参照）。
【００５０】
図３及び図４に示されるように、Ｈｅｘ３を用いた場合に最も高い過酸化水素依存性スーパーオキシド生成が認められた。一方、ヒスチジン残基がＮ末端に位置するＨｅｘ２や、チロシン残基を含まないＨｅｘ３Ｆ及びＨｅｘ６Ｆを用いた場合には、過酸化水素依存性スーパーオキシド生成が弱くしか認められないか、あるいはほとんど認められなかった。
【００５１】
＜試験例３：ニワトリプリオン由来のアミノ酸配列を有する人工的に合成したペプチドによるカタラーゼ様反応の触媒活性試験＞
ｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液に、配列番号４のアミノ酸配列で表されるペプチドであるＨｅｘ１及び配列番号８のアミノ酸配列で表されるペプチドであるＨｅｘ５のいずれか０．１５ｍＭ、０．５ｍＭのＣｕＳＯ４及び１０ｍＭの過酸化水素を添加した。このとき、過酸化水素の分解により生じる酸素の濃度の時間変化を、酸素電極を用いて測定温度２５℃で測定した結果を図５に示す。図５には、対照試験として、ペプチドなしの場合に同様の測定を行ったときの結果も示している。
【００５２】
図５に示される結果からは、Ｈｅｘ１及びＨｅｘ５のいずれを用いた場合も、過酸化水素を分解するカタラーゼ様反応が触媒されることが分かった。
＜試験例４：植物由来のアミノ酸配列を有する人工的に合成したペプチドによる過酸化水素依存性スーパーオキシド生成反応の触媒活性試験＞
アカザ科のAtriplex canescensへのオゾン暴露実験により、植物体内においてオゾンにより誘導されるペプチドがこれまでに単離されている。このペプチドは、水分欠乏やＳＯ２への暴露によっても植物体内で誘導されることが知られている。このペプチドは、配列番号１３で表されるアミノ酸配列が繰り返されるリピート構造を有し、２価の銅イオンの結合を受けることが知られている。したがって、このペプチドは銅イオンをキレートすることができ、これにより酸化ストレスを防御する働きをするとの報告もある。配列番号１３で表されるアミノ酸配列は、試験例１〜３で酸化還元反応に対する触媒活性を示したペプチドと類似した構造を有している。そのため、ニワトリプリオン由来のアミノ酸配列と同様、過酸化水素依存性スーパーオキシド生成反応に対する触媒活性を有していることが期待される。
【００５３】
そこで、配列番号１２のアミノ酸配列で表されるペプチド、配列番号１３のアミノ酸配列で表されるペプチド、及び配列番号１４のアミノ酸配列で表されるペプチドを人工的に合成した。これらのペプチドの過酸化水素依存性スーパーオキシド生成活性を評価するべく、試験例１と同様にして行った試験の結果を図６及び図７に示す。なお、試験例１では過酸化水素を添加する６０秒前から発光の測定を開始したが、この試験例４では過酸化水素を添加する１００秒前から発光の測定を開始した（図６参照）。また、図６及び図７には、対照試験として、ペプチドなしの場合に同様の試験を行ったときの結果、また配列番号１２のアミノ酸配列で表されるペプチドを用いたがＣｕＳＯ４（補因子）の添加を行わなかった場合に同様の試験を行ったときの結果も示している。
【００５４】
図６及び図７に示されるように、配列番号１２のペプチド及び配列番号１３のペプチドを用いた場合、高い過酸化水素依存性スーパーオキシド生成が認められた。これら２つのペプチドを比較すると、ヒスチジン残基の位置がＣ末端により近い配列番号１２のペプチドを用いた場合において、より高い過酸化水素依存性スーパーオキシド生成が認められた。ヒスチジン残基がＮ末端に位置する配列番号１４のペプチドを用いた場合には、過酸化水素依存性スーパーオキシド生成がほとんど認められなかった。以上の結果からは、配列番号１２のペプチド及び配列番号１３のペプチドが過酸化水素依存性スーパーオキシド生成反応に対する触媒活性を発揮するためには遊離のチロシンの添加の必要がないことが分かった。
【００５５】
＜試験例５：植物由来のアミノ酸配列を有する人工的に合成したペプチドによる過酸化水素分解反応の触媒活性試験＞
配列番号１２のペプチドを含んだ溶液中に銅イオン及び過酸化水素を添加したときの波長２４０ｎｍにおける吸光度の時間変化を測定した結果を図８に示す。この試験により、図８に示されるように、過酸化水素が経時的に減少することが確認されたことから、配列番号１２のペプチドが過酸化水素の分解を触媒することが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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