(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における心血管疾患の重篤度のインビトロにおける判定方法であって、
（ａ）ｈＢＮＰの量を定量化するためのイムノアッセイに従って試験サンプル中のｈＢＮＰの量を測定する段階と；
（ｂ）前記サンプル中のヒトプロＢＮＰの量を測定する段階と；
（ｃ）前記サンプルにおけるｈＢＮＰの量に対するヒトプロＢＮＰの量のモル比又は重量比を求める段階と；
（ｄ）モル比又は重量比を対象における心血管疾患の重篤度と相関させる段階と
を含み、前記比が所定レベルよりも低い場合には対象は心血管疾患の重篤度が高いと判定し、前記比が所定レベルよりも高い場合には対象は心血管疾患の重篤度が低いと判定し、
ｈＢＮＰの量を測定するための前記イムノアッセイは、試験サンプル中に存在するヒトプロＢＮＰに交差反応性が低く、前記イムノアッセイは、
（Ｉ）ｈＢＮＰと結合し、固相に固定化して固定化抗体とした少なくとも１種のキャプチャー抗体を前記試験サンプルと接触させ、少なくとも１種のキャプチャー抗体−ｈＢＮＰの複合体を含む第１の混合物を形成する段階と、ここで、前記キャプチャー抗体は約３．０×１０−７〜約１．０×１０−１３Ｍの平衡解離定数（ＫＤ）をもつ１種以上の抗体を含む；
（ＩＩ）ｈＢＮＰと結合し、検出可能なラベルで標識した少なくとも１種の検出抗体と、少なくとも１種のキャプチャー抗体−ｈＢＮＰの複合体を含む前記第１の混合物を接触させ、少なくとも１種のキャプチャー抗体−ｈＢＮＰ−少なくとも１種の検出抗体の複合体を含む第２の混合物を形成する段階と、ここで、前記検出抗体は約３．０×１０−７〜約１．０×１０−１３Ｍの平衡解離定数（ＫＤ）をもつ１種以上の抗体を含む；
（ＩＩＩ）試験サンプル中に含まれるｈＢＮＰの量の尺度として検出可能なラベルを検出することにより、段階（ＩＩ）で形成された少なくとも１種のキャプチャー抗体−ｈＢＮＰ−少なくとも１種の検出抗体の複合体の量を測定する段階と
を含み、
少なくとも１種のキャプチャー抗体と少なくとも１種の検出抗体が、併用時に試験サンプル中に存在するヒトプロＢＮＰに対して約２０％未満の交差反応性を示す、方法。
【請求項２】
心血管疾患が冠動脈疾患、末梢血管疾患、高血圧、心筋梗塞及び心不全からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対象における心血管疾患の進行のインビトロにおける監視方法であって、
（ａ）ｈＢＮＰの量を定量化するためのイムノアッセイに従って試験サンプル中のｈＢＮＰの量を測定する段階と；
（ｂ）前記サンプル中のヒトプロＢＮＰの量を測定する段階と；
（ｃ）前記サンプルにおけるｈＢＮＰの量に対するヒトプロＢＮＰの量のモル比又は重量比を求める段階と；
（ｄ）モル比又は重量比を対象における疾患の進行と相関させる段階と
を含み、前記比は進行している対象では初期試験サンプル中の比に比較して低下し、前記比は心血管疾患が進行していない対象又は改善した対象では初期試験サンプル中の比に比較して変化しないか又は上昇し、
ｈＢＮＰの量を測定するための前記イムノアッセイは、試験サンプル中に存在するヒトプロＢＮＰに交差反応性が低く、前記イムノアッセイは、
（Ｉ）ｈＢＮＰと結合し、固相に固定化して固定化抗体とした少なくとも１種のキャプチャー抗体を前記試験サンプルと接触させ、少なくとも１種のキャプチャー抗体−ｈＢＮＰの複合体を含む第１の混合物を形成する段階と、ここで、前記キャプチャー抗体は約３．０×１０−７〜約１．０×１０−１３Ｍの平衡解離定数（ＫＤ）をもつ１種以上の抗体を含む；
（ＩＩ）ｈＢＮＰと結合し、検出可能なラベルで標識した少なくとも１種の検出抗体と、少なくとも１種のキャプチャー抗体−ｈＢＮＰの複合体を含む前記第１の混合物を接触させ、少なくとも１種のキャプチャー抗体−ｈＢＮＰ−少なくとも１種の検出抗体の複合体を含む第２の混合物を形成する段階と、ここで、前記検出抗体は約３．０×１０−７〜約１．０×１０−１３Ｍの平衡解離定数（ＫＤ）をもつ１種以上の抗体を含む；
（ＩＩＩ）試験サンプル中に含まれるｈＢＮＰの量の尺度として検出可能なラベルを検出することにより、段階（ＩＩ）で形成された少なくとも１種のキャプチャー抗体−ｈＢＮＰ−少なくとも１種の検出抗体の複合体の量を測定する段階と
を含み、
少なくとも１種のキャプチャー抗体と少なくとも１種の検出抗体が、併用時に試験サンプル中に存在するヒトプロＢＮＰに対して約２０％未満の交差反応性を示す、方法。
【請求項４】
心血管疾患の治療後に前記監視を実施する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
心血管疾患のナトリウム利尿ペプチド誘導体治療が有効であった対象のインビトロにおける同定方法であって、
（ａ）ｈＢＮＰの量を定量化するためのイムノアッセイによって、心血管疾患に関連する１種以上の臨床徴候を示す対象から得られた試験サンプル中のｈＢＮＰの量を測定する段階と；
（ｂ）前記サンプル中のヒトプロＢＮＰの量を測定する段階と；
（ｃ）前記サンプルにおけるｈＢＮＰの量に対するヒトプロＢＮＰの量のモル比又は重量比を求める段階と；
（ｄ）段階（ｃ）で求めたモル比又は重量比が所定レベルよりも高いか又は低いかを判定する段階と；
（ｅ）段階（ｄ）の判定に基づいてナトリウム利尿ペプチド誘導体治療が対象に有効であったか否かを判断する段階と
を含み、比が所定レベルよりも低い場合には、ナトリウム利尿ペプチド誘導体治療が対象に有効でなかったと判断し、前記比が所定レベルよりも高い場合には、ナトリウム利尿ペプチド誘導体治療が対象に有効であったと判断し、
ヒトＢＮＰの量を測定するための前記イムノアッセイは、試験サンプル中に存在するヒトプロＢＮＰに交差反応性が低く、前記イムノアッセイは、
（Ｉ）ｈＢＮＰと結合し、固相に固定化して固定化抗体とした少なくとも１種のキャプチャー抗体を前記試験サンプルと接触させ、少なくとも１種のキャプチャー抗体−ｈＢＮＰの複合体を含む第１の混合物を形成する段階と、ここで、前記キャプチャー抗体は約３．０×１０−７〜約１．０×１０−１３Ｍの平衡解離定数（ＫＤ）をもつ１種以上の抗体を含む；
（ＩＩ）ｈＢＮＰと結合し、検出可能なラベルで標識した少なくとも１種の検出抗体と、少なくとも１種のキャプチャー抗体−ｈＢＮＰの複合体を含む前記第１の混合物を接触させ、少なくとも１種のキャプチャー抗体−ｈＢＮＰ−少なくとも１種の検出抗体の複合体を含む第２の混合物を形成する段階と、ここで、前記検出抗体は約３．０×１０−７〜約１．０×１０−１３Ｍの平衡解離定数（ＫＤ）をもつ１種以上の抗体を含む；
（ＩＩＩ）試験サンプル中に含まれるｈＢＮＰの量の尺度として検出可能なラベルを検出することにより、段階（ＩＩ）で形成された少なくとも１種のキャプチャー抗体−ｈＢＮＰ−少なくとも１種の検出抗体の複合体の量を測定する段階と
を含み、
少なくとも１種のキャプチャー抗体と少なくとも１種の検出抗体が、併用時に試験サンプル中に存在するヒトプロＢＮＰに対して約２０％未満の交差反応性を示す、方法。
【請求項６】
ナトリウム利尿ペプチド誘導体がネシリチドである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
対象が１種以上の医薬組成物を前記対象に投与した結果として心血管合併症を発症しているか否かを判定するインビトロにおける方法であって、
（ａ）対象に１種以上の医薬組成物を投与する前に、試験サンプル中に存在するｈＢＮＰの量を定量するためのイムノアッセイによって、対象から得られた試験サンプル中のヒトＢＮＰの量を測定する段階と；
（ｂ）前記サンプル中のヒトプロＢＮＰの量を測定する段階と；
（ｃ）前記サンプルにおけるｈＢＮＰの量に対するヒトプロＢＮＰの量のモル比又は重量比を求める段階と；
（ｄ）対象に１種以上の医薬組成物を投与した後に、前記イムノアッセイによって、対象から得られた第２の試験サンプル中のヒトＢＮＰの量を測定する段階と；
（ｅ）前記第２の試験サンプル中のヒトプロＢＮＰの量を測定する段階と；
（ｆ）前記第２の試験サンプルにおけるｈＢＮＰの量に対するヒトプロＢＮＰの量のモル比又は重量比を求める段階と；
（ｇ）段階（ｃ）で求めたモル比又は重量比を段階（ｆ）のモル比又は重量比と比較する段階と
を含み、段階（ｃ）で求めたモル比又は重量比が段階（ｆ）で求めたモル比又は重量比に比較して変化していない場合には、対象が１種以上の医薬組成物の投与の結果として心血管合併症を発症していないと判定し、段階（ｃ）で求めたモル比又は重量比が段階（ｆ）で求めたモル比又は重量比に比較して変化している場合には、対象が１種以上の医薬組成物の投与の結果として心血管合併症を発症していると判定し、
ｈＢＮＰの量を測定するための前記イムノアッセイは、試験サンプル中に存在するヒトプロＢＮＰに交差反応性が低く、前記イムノアッセイは、
（Ｉ）ｈＢＮＰと結合し、固相に固定化して固定化抗体とした少なくとも１種のキャプチャー抗体を前記試験サンプルと接触させ、少なくとも１種のキャプチャー抗体−ｈＢＮＰの複合体を含む第１の混合物を形成する段階と、ここで、前記キャプチャー抗体は約３．０×１０−７〜約１．０×１０−１３Ｍの平衡解離定数（ＫＤ）をもつ１種以上の抗体を含む；
（ＩＩ）ｈＢＮＰと結合し、検出可能なラベルで標識した少なくとも１種の検出抗体と、少なくとも１種のキャプチャー抗体−ｈＢＮＰの複合体を含む前記第１の混合物を接触させ、少なくとも１種のキャプチャー抗体−ｈＢＮＰ−少なくとも１種の検出抗体の複合体を含む第２の混合物を形成する段階と、ここで、前記検出抗体は約３．０×１０−７〜約１．０×１０−１３Ｍの平衡解離定数（ＫＤ）をもつ１種以上の抗体を含む；
（ＩＩＩ）試験サンプル中に含まれるｈＢＮＰの量の尺度として検出可能なラベルを検出することにより、段階（ＩＩ）で形成された少なくとも１種のキャプチャー抗体−ｈＢＮＰ−少なくとも１種の検出抗体の複合体の量を測定する段階と
を含み、
少なくとも１種のキャプチャー抗体と少なくとも１種の検出抗体が、併用時に試験サンプル中に存在するヒトプロＢＮＰに対して約２０％未満の交差反応性を示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は試験サンプル中のヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドの量の検出及び／又は定量用アッセイに関する。詳細には、本発明のアッセイは試験サンプル中に存在する又は含有されるヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチドに対して約２０％未満の交差反応性を示す。
【背景技術】
【０００２】
心房性ナトリウム利尿ペプチド（以下、「ＡＮＰ」と言う）、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（以下、「ＢＮＰ」と言う）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（以下、「ＣＮＰ」と言う）及びマンバ（Ｄｅｎｄｒｏａｓｐｉｓ）ナトリウム利尿ペプチド（以下、「ＤＮＰ」と言う）は各々「ナトリウム利尿ペプチド」と呼ばれるホルモンファミリーのメンバーである。ＡＮＰとＢＮＰは共通の広範な生物学的性質をもち、心臓由来ナトリウム利尿系に属する。ＡＮＰとＢＮＰはいずれも心筋細胞に由来し、ＣＮＰは内皮細胞に由来する。ＤＮＰはグリーンマンバヘビの毒から単離され、ＡＮＰ、ＢＮＰ及びＣＮＰと構造的類似性をもつ。
【０００３】
ＡＮＰは心臓により心房で分泌される。ＡＮＰは２個のシステイン残基間のジスルフィド結合により閉環した１７アミノ酸環をもつ。環の１７個のアミノ酸のうちの１１個はＡＮＰ、ＢＮＰ、ＣＮＰ及びＤＮＰ間で保存されている。１７アミノ酸環構造に加え、ＡＮＰは６アミノ酸のアミノ末端尾部と、５アミノ酸のカルボキシ末端尾部をもつ。ＡＮＰはＡＮＰの主要保存形態である１２６アミノ酸プロＡＮＰとして産生される。アミノ酸９８及び９９間の蛋白分解開裂後、冠動脈洞血漿中には成熟２８アミノ酸ペプチドＡＮＰが検出される（Ｙａｎｄｌｅ，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄ．，２３５：５６１−５７６（１９９４）参照）。
【０００４】
ＢＮＰはブタの脳から最初に単離されたことから命名され、従って、当初は「ＢＮＰ」は「脳性ナトリウム利尿ペプチド」の意味であった。しかし、ＢＮＰは心臓由来ナトリウム利尿系に属することが分かったため、「脳（ｂｒａｉｎ）」という単語は「Ｂ型」に変更された。従って、「ＢＮＰ」は現在では「Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド」意味する。ヒトにおいて、ＢＮＰは心臓により冠動脈洞を通って主に心室から分泌される。ヒトＢＮＰのプレプロペプチド前駆体（以下、「ヒトプレプロＢＮＰ」と言う）は１３４アミノ酸長（配列番号１）であり、酵素により開裂されて１０８アミノ酸長（配列番号２）のＢＮＰのヒトプロペプチド（以下、「ヒトプロＢＮＰ」と言う）を遊離する短いシグナルペプチドを含む。ヒトプロＢＮＰは更に開裂され、７６アミノ酸長（配列番号３）のヒトＢＮＰのＮ末端プロペプチド（以下、「ヒトＮＴ−プロＢＮＰ」と言う）と、３２アミノ酸長（配列番号４）の活性ホルモンヒトＢＮＰ（以下、「ｈＢＮＰ」又は「ｈＢＮＰ−３２」と言う）となる。ヒトＮＴ−プロＢＮＰ、ｈＢＮＰ−３２及びヒトプロＢＮＰは各々ヒト血漿中を循環することが示唆されている（Ｔａｔｅｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８５：７６０−７（１９９２）；Ｈｕｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１４：１１７５−８３（１９９５）参照）。
【０００５】
ＣＮＰは最初に脳で検出されたが、その大半は内皮細胞と腎細胞に由来する。脈管構造、脳、骨及び内皮に広く分布している。ＣＮＰは心臓には存在するとしても僅かである。プロＣＮＰは１０３アミノ酸ペプチドであり、プロセシングされると、活性ペプチドであるＣＮＰ−５３（アミノ酸５１〜１０３）又はＣＮＰ−２２（アミノ酸８２〜１０３）となる。ＡＮＰと同様に、ＣＮＰはシステイン残基間のジスルフィド結合により閉環した１７アミノ酸環をもつ。この１７アミノ酸環構造に加え、ＣＮＰ−２２は５アミノ酸のアミノ末端尾部をもち、カルボキシ末端尾部は含まない。ＣＮＰ−５３はアミノ末端の３１アミノ酸延長部を除いてＣＮＰ−２２と同一である。
【０００６】
上記のように、ＤＮＰはグリーンマンバヘビの毒から単離された。ＤＮＰの成熟形は３８アミノ酸から構成される。ヒト血漿中でＤＮＰ様免疫反応性（ＤＮＰ−ＬＩ）が報告されており、鬱血性心不全患者ではＤＮＰ−ＬＩの血漿濃度が上昇していることが分かっている（Ｃａｔａｌｉｏｔｔｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ，７６：１１１−１１１９（２００１）参照）。更に、合成ＤＮＰの注入の結果、血漿及び尿中の環状グアノシン一リン酸の増加と共に顕著なナトリウム利尿及び利尿を生じることも知られている。同上参照。
【０００７】
ヒトでは、心疾患がＡＮＰ及びＢＮＰの分泌を刺激する場合がある。実際に、ヒトにおけるＡＮＰ及びＢＮＰの分泌は一般に心機能の変化を反映する。具体的には、ＡＮＰの分泌は一般に心房に負荷がかかっているときに加速され、ＢＮＰの生合成と分泌は心室に負荷がかかっているときに刺激される。従って、ＡＮＰとＢＮＰはいずれも心疾患の診断における指標として有用である。しかし、徐々にＢＮＰはＡＮＰよりも心疾患の診断における有用な指標として認められるようになっている。例えば、ＢＮＰの血中濃度は正常対象ではＡＮＰの１／６に過ぎないが、心不全患者ではＡＮＰよりも高くなる。更に、心不全患者ではＢＮＰの血中濃度はＡＮＰと同様に増加し、ＢＮＰの血漿濃度はＡＮＰを上回ることが多いため、心機能不全の重篤度をより正確に反映する。更に、心不全患者のＢＮＰ濃度は場合により健常対象の数十倍から数百倍まで増加する。
【０００８】
ヒトプロＢＮＰ、ヒトＮＴ−プロＢＮＰ及びｈＢＮＰは循環でき、心血管疾患、特に心不全の患者の試験サンプル中で検出できることが知られている。ｈＢＮＰとヒトＮＴ−プロＢＮＰはいずれも心不全を検出し、患者におけるその危険を推定するためのマーカーとして多用されている。しかし、循環する個々の型のＢＮＰ（即ちヒトプロＢＮＰ、ヒトＮＴ−プロＢＮＰ及びヒトＢＮＰ）の各々の実際の量はこれらの各種型の現行市販アッセイの交差反応性により不明である（Ｌｉａｎｇ  Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，４９（１０）：１０７１−１０７８（２００７）参照）。
【０００９】
更に、ヒトプロＢＮＰとヒトＮＴ−プロＢＮＰは糖鎖付加される場合があることが知られており（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，４５１：１６０−１６６（２００６）参照）、これらの糖鎖付加体はヒトサンプルから単離されている（Ｈａｍｍｅｒｅｒ−Ｌｅｒｃｈｅｒ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５４（５）：８５８−８６５（２００８）及びＳｅｆｅｒｉａｎ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５４（５）：８６６−８７３（２００８）参照）。ペプチドのＮ末端部分内の３６アミノ酸領域（アミノ酸３６〜７１）に限られた７個の可能な糖鎖付加部位が存在する。この領域に対して作製された抗体は１）抗体を作製するために使用する免疫原；及び２）検体の糖鎖付加の有無に応じて、検体ヒトプロＢＮＰ又はＮＴ−プロＢＮＰを含有するサンプルと結合する場合と結合しない場合がある。ヒトプロＢＮＰ及びＮＴ−プロＢＮＰのオプションのアッセイはこれらの領域を避ける抗体を使用すべきである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｙａｎｄｌｅ，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄ．，２３５：５６１−５７６（１９９４）
【非特許文献２】Ｔａｔｅｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８５：７６０−７（１９９２）
【非特許文献３】Ｈｕｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１４：１１７５−８３（１９９５）
【非特許文献４】Ｃａｔａｌｉｏｔｔｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ，７６：１１１−１１１９（２００１）
【非特許文献５】Ｌｉａｎｇ  Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，４９（１０）：１０７１−１０７８（２００７）
【非特許文献６】Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，４５１：１６０−１６６（２００６）
【非特許文献７】Ｈａｍｍｅｒｅｒ−Ｌｅｒｃｈｅｒ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５４（５）：８５８−８６５（２００８）
【非特許文献８】Ｓｅｆｅｒｉａｎ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５４（５）：８６６−８７３（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記に鑑み、特に（例えば他の型に対する）それらの個々の循環濃度の変動の臨床的重要性が理解されるようになるにつれて、ヒトＢＮＰの量を定量するための新規アッセイ、特に前記ペプチドの他の型に対する交差反応性の低いアッセイが当分野で必要とされている。本発明は新規アッセイ及び方法を提供することを目的とする。本発明は更にこのようなアッセイ及び方法で使用するためのキットを提供することも目的とする。前記方法及びキットは心血管疾患の重篤度を推定するため、心血管疾患の進行を監視するため、又は心血管疾患の進行の危険を推定するために実施されるアッセイを含むヒトＢＮＰの定性的又は定量的アッセイで使用することができる。これら及び他の目的及び利点と、その他の特徴は本明細書の詳細な記載から理解されよう。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
１側面において、本発明はｈＢＮＰについて試験する試験サンプル又はｈＢＮＰを含有している疑いのある試験サンプル中に存在するｈＢＮＰの量の定量方法に関し、前記方法は試験サンプル中に存在するヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチド（「ヒトプロＢＮＰ」）に対する交差反応性が低い。前記方法は、
（ａ）ｈＢＮＰと結合し、固相に固定化して固定化抗体とした少なくとも１種のキャプチャー抗体を前記試験サンプルと接触させ、少なくとも１種のキャプチャー抗体−ｈＢＮＰの複合体を含む第１の混合物を形成する段階（なお、前記キャプチャー抗体は約３．０×１０−７〜約１．０×１０−１３Ｍの平衡解離定数（ＫＤ）をもつ１種以上の抗体を含む）と；
（ｂ）ｈＢＮＰと結合し、検出可能なラベルで標識した少なくとも１種の検出抗体と、少なくとも１種のキャプチャー抗体−ｈＢＮＰの複合体を含む前記第１の混合物を接触させ、少なくとも１種のキャプチャー抗体−ｈＢＮＰ−少なくとも１種の検出抗体の複合体を含む第２の混合物を形成する段階（なお、前記検出抗体は約３．０×１０−７〜約１．０×１０−１３Ｍの平衡解離定数（ＫＤ）をもつ１種以上の抗体を含む）と；
（ｃ）試験サンプル中に含まれるｈＢＮＰの量の尺度として検出可能なラベルを検出することにより、段階（ｂ）で形成された少なくとも１種のキャプチャー抗体−ｈＢＮＰ−少なくとも１種の検出抗体の複合体の量を測定する段階を含み、
少なくとも１種のキャプチャー抗体と少なくとも１種の検出抗体は併用時に試験サンプル中に存在するヒトプロＢＮＰに対して約２０％未満の交差反応性を示す。前記方法は更に、場合により段階（ａ）、段階（ｂ）、又は段階（ａ）及び段階（ｂ）後に洗浄段階を含む。
【００１３】
より厳密には、上記イムノアッセイにおいて、少なくとも１種のキャプチャー抗体と少なくとも１種の検出抗体は併用時に試験サンプル中に存在するヒトプロＢＮＰに対して約１５％未満の交差反応性を示す。更により厳密には、上記イムノアッセイにおいて、少なくとも１種のキャプチャー抗体と少なくとも１種の検出抗体は併用時に試験サンプル中に存在するヒトプロＢＮＰに対して約１０％未満の交差反応性を示す。
【００１４】
更に、本発明のイムノアッセイで使用するキャプチャー抗体（例えば第１のキャプチャー抗体）と検出抗体は約２．５×１０−７〜約５．０×１０−１３Ｍ、又は約２．０×１０−７〜約１．０×１０−１２Ｍの平衡解離定数をもつことができる。キャプチャー抗体（例えば第１のキャプチャー抗体）と検出抗体はモノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、完全ヒト化抗体、部分ヒト化抗体、動物抗体、組換え抗体、キメラ抗体、１本鎖Ｆｖ、１本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ、抗イディオタイプ抗体又はその機能的に活性なエピトープ結合フラグメントとすることができる。第１のキャプチャー抗体として使用することができる抗体の例としては限定されないが、１０６．３、ＢＣ２０３、Ｍ１、クローン３（３−６３１−４３６）、ＡＭ１、ＡＭ５、ＡＭ８、８．１及び２０１．３が挙げられる。第１の検出抗体として使用することができる抗体の例としては限定されないが、１０６．３、ＢＣ２０３、Ｍ１、クローン３（３−６３１−４３６）、ＡＭ１、ＡＭ５、ＡＭ８、８．１及び２０１．３が挙げられる。キャプチャー抗体はクローン３（３−６３１−４３６）が好ましい。検出抗体はＡＭ１又は８．１が好ましい。
【００１５】
別の側面において、本発明はｈＢＮＰについて試験する試験サンプル又はｈＢＮＰを含有している疑いのある試験サンプル中に存在するｈＢＮＰの量の定量方法に関し、前記方法は試験サンプル中に存在するヒトプロＢＮＰに対する交差反応性が低い。前記方法は、
（ａ）ｈＢＮＰと結合し、検出可能なラベルで標識した少なくとも１種の検出抗体と前記試験サンプルを接触させ、少なくとも１種のｈＢＮＰ−検出抗体の複合体を含む第１の混合物を形成する段階（なお、前記検出抗体は約３．０×１０−７〜約１．０×１０−１３Ｍの平衡解離定数（ＫＤ）をもつ１種以上の抗体を含む）と；
（ｂ）ｈＢＮＰと結合し、固相に固定化して固定化抗体とした少なくとも１種のキャプチャー抗体と、前記少なくとも１種のｈＢＮＰ−検出抗体の複合体を含む前記第１の混合物を接触させ、少なくとも１種のキャプチャー抗体−ｈＢＮＰ−少なくとも１種の検出抗体の複合体を含む第２の混合物を形成する段階（なお、前記少なくとも１種のキャプチャー抗体は約３．０×１０−７〜約１．０×１０−１３Ｍの平衡解離定数（ＫＤ）をもつ１種以上の抗体を含む）と；
（ｃ）試験サンプル中に含まれるｈＢＮＰの量の尺度として検出可能なラベルを検出することにより、段階（ｂ）で形成された少なくとも１種の検出抗体−ｈＢＮＰ−少なくとも１種のキャプチャー抗体の複合体の量を測定する段階を含み、
少なくとも１種の検出抗体と少なくとも１種のキャプチャー抗体は併用時に試験サンプル中に存在するヒトプロＢＮＰに対して約２０％未満の交差反応性を示す。前記方法は更に、場合により段階（ｂ）後に洗浄段階を含む。
【００１６】
より厳密には、上記イムノアッセイにおいて、少なくとも１種の検出抗体と少なくとも１種のキャプチャー抗体は併用時に試験サンプル中に存在するヒトプロＢＮＰに対して約１５％未満の交差反応性を示す。更により厳密には、上記イムノアッセイにおいて、少なくとも１種の検出抗体と少なくとも１種のキャプチャー抗体は併用時に試験サンプル中に存在するヒトプロＢＮＰに対して約１０％未満の交差反応性を示す。
【００１７】
更に、本発明のイムノアッセイで使用する検出抗体とキャプチャー抗体は各々約２．５×１０−７〜約５．０×１０−１３Ｍ、又は約２．０×１０−７〜約１．０×１０−１２Ｍの平衡解離定数をもつことができる。検出抗体とキャプチャー抗体はモノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、完全ヒト化抗体、部分ヒト化抗体、動物抗体、組換え抗体、キメラ抗体、１本鎖Ｆｖ、１本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ、抗イディオタイプ抗体又はその機能的に活性なエピトープ結合フラグメントとすることができる。第１のキャプチャー抗体として使用することができる抗体の例としては限定されないが、１０６．３、ＢＣ２０３、Ｍ１、クローン３（３−６３１−４３６）、ＡＭ１、ＡＭ５、ＡＭ８、８．１及び２０１．３が挙げられる。第１の検出抗体として使用することができる抗体の例としては限定されないが、１０６．３、ＢＣ２０３、Ｍ１、クローン３（３−６３１−４３６）、ＡＭ１、ＡＭ５、ＡＭ８、８．１及び２０１．３が挙げられる。
【００１８】
別の側面において、本発明はｈＢＮＰについて試験する試験サンプル又はｈＢＮＰを含有している疑いのある試験サンプル中に存在するｈＢＮＰの量の定量方法に関し、前記方法は試験サンプル中に存在するヒトプロＢＮＰに対する交差反応性が低い。前記方法は、
（ａ）ｈＢＮＰと結合し、固相に固定化して固定化抗体とした少なくとも１種のキャプチャー抗体と、ｈＢＮＰと結合し、検出可能なラベルで標識した少なくとも１種の検出抗体とに試験サンプルを接触させ、少なくとも１種のキャプチャー抗体−ｈＢＮＰ−少なくとも１種の検出抗体の複合体を形成する段階（なお、少なくとも１種のキャプチャー抗体と少なくとも１種の検出抗体は各々約３．０×１０−７〜約１．０×１０−１３Ｍの平衡解離定数（ＫＤ）をもつ１種以上の抗体である）と；
（ｂ）試験サンプル中に含まれるｈＢＮＰの量の尺度として検出可能なラベルを検出することにより、段階（ａ）で形成された少なくとも１種のキャプチャー抗体−ｈＢＮＰ−少なくとも１種の検出抗体の複合体の量を測定する段階を含み、
少なくとも１種のキャプチャー抗体と検出可能なラベルで標識した少なくとも１種の検出抗体は併用時に試験サンプル中に存在するヒトプロＢＮＰに対して約２０％未満の交差反応性を示す。前記方法は更に、場合により段階（ａ）後に洗浄段階を含む。
【００１９】
より厳密には、上記イムノアッセイにおいて、少なくとも１種のキャプチャー抗体と少なくとも１種の検出抗体は併用時に試験サンプル中に存在するヒトプロＢＮＰに対して約１５％未満の交差反応性を示す。更により厳密には、上記イムノアッセイにおいて、少なくとも１種のキャプチャー抗体と少なくとも１種の検出抗体は併用時に試験サンプル中に存在するヒトプロＢＮＰに対して約１０％未満の交差反応性を示す。
【００２０】
更に、本発明のイムノアッセイで使用するキャプチャー抗体と検出抗体は各々約２．５×１０−７〜約５．０×１０−１３Ｍ、又は約２．０×１０−７〜約１．０×１０−１２Ｍの平衡解離定数をもつことができる。キャプチャー抗体と検出抗体は１種以上の抗体とすることができる。キャプチャー抗体と検出抗体はモノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、完全ヒト化抗体、部分ヒト化抗体、動物抗体、組換え抗体、キメラ抗体、１本鎖Ｆｖ、１本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ、抗イディオタイプ抗体又はその機能的に活性なエピトープ結合フラグメントとすることができる。第１のキャプチャー抗体として使用することができる抗体の例としては限定されないが、１０６．３、ＢＣ２０３、Ｍ１、クローン３（３−６３１−４３６）、ＡＭ１、ＡＭ５、ＡＭ８、８．１及び２０１．３が挙げられる。第１の検出抗体として使用することができる抗体の例としては限定されないが、１０６．３、ＢＣ２０３、Ｍ１、クローン３（３−６３１−４３６）、ＡＭ１、ＡＭ５、ＡＭ８、８．１及び２０１．３が挙げられる。
【００２１】
別の側面において、本発明はｈＢＮＰについて試験する試験サンプル又はｈＢＮＰを含有している疑いのある試験サンプル中に存在するｈＢＮＰの量の定量方法に関し、前記方法は試験サンプル中に存在するヒトプロＢＮＰ又はヒトＮＴ−プロＢＮＰに対する交差反応性が低い。前記方法は、
（ａ）ｈＢＮＰと結合し、固相に固定化して固定化抗体とした少なくとも１種のキャプチャー抗体を前記試験サンプルと接触させ、少なくとも１種のキャプチャー抗体−ｈＢＮＰの複合体を含む第１の混合物を形成する段階（なお、前記キャプチャー抗体は約３．０×１０−７〜約１．０×１０−１３Ｍの平衡解離定数（ＫＤ）をもつ１種以上の抗体を含む）と；
（ｂ）ｈＢＮＰと結合し、検出可能なラベルで標識した少なくとも１種の検出抗体と、少なくとも１種のキャプチャー抗体−ｈＢＮＰの複合体を含む前記第１の混合物を接触させ、少なくとも１種のキャプチャー抗体−ｈＢＮＰ−少なくとも１種の検出抗体の複合体を含む第２の混合物を形成する段階（なお、検出抗体は約３．０×１０−７〜約１．０×１０−１３Ｍの平衡解離定数（ＫＤ）をもつ１種以上の抗体を含む）と；
（ｃ）試験サンプル中に含まれるｈＢＮＰの量の尺度として検出可能なラベルを検出することにより、段階（ｂ）で形成された少なくとも１種のキャプチャー抗体−ｈＢＮＰ−少なくとも１種の検出抗体の複合体の量を測定する段階を含み、
少なくとも１種のキャプチャー抗体と少なくとも１種の検出抗体は併用時に試験サンプル中に存在するヒトプロＢＮＰ又はヒトＮＴ−プロＢＮＰに対して約２０％未満の交差反応性を示す。前記方法は更に、場合により段階（ａ）、段階（ｂ）、又は段階（ａ）及び段階（ｂ）後に洗浄段階を含む。
【００２２】
より厳密には、上記イムノアッセイにおいて、少なくとも１種のキャプチャー抗体と少なくとも１種の検出抗体は併用時に試験サンプル中に存在するヒトプロＢＮＰ又はヒトＮＴ−プロＢＮＰに対して約１５％未満の交差反応性を示す。更により厳密には、上記イムノアッセイにおいて、少なくとも１種のキャプチャー抗体と少なくとも１種の検出抗体は併用時に試験サンプル中に存在するヒトプロＢＮＰ又はヒトＮＴ−プロＢＮＰに対して約１０％未満の交差反応性を示す。
【００２３】
更に、本発明のイムノアッセイで使用するキャプチャー抗体（例えば第１のキャプチャー抗体）と検出抗体は約２．５×１０−７〜約５．０×１０−１３Ｍ、又は約２．０×１０−７〜約１．０×１０−１２Ｍの平衡解離定数をもつことができる。キャプチャー抗体（例えば第１のキャプチャー抗体）と検出抗体はモノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、完全ヒト化抗体、部分ヒト化抗体、動物抗体、組換え抗体、キメラ抗体、１本鎖Ｆｖ、１本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ、抗イディオタイプ抗体又はその機能的に活性なエピトープ結合フラグメントとすることができる。第１のキャプチャー抗体として使用することができる抗体の例としては限定されないが、１０６．３、ＢＣ２０３、Ｍ１、クローン３（３−６３１−４３６）、ＡＭ１、ＡＭ５、ＡＭ８、８．１及び２０１．３が挙げられる。第１の検出抗体として使用することができる抗体の例としては限定されないが、１０６．３、ＢＣ２０３、Ｍ１、クローン３（３−６３１−４３６）、ＡＭ１、ＡＭ５、ＡＭ８、８．１及び２０１．３が挙げられる。キャプチャー抗体はクローン３（３−６３１−４３６）が好ましい。検出抗体はＡＭ１又は８．１が好ましい。
【００２４】
別の側面において、本発明はｈＢＮＰについて試験する試験サンプル又はｈＢＮＰを含有している疑いのある試験サンプル中に存在するｈＢＮＰの量の定量方法に関し、前記方法は試験サンプル中に存在するヒトプロＢＮＰ又はヒトＮＴ−プロＢＮＰに対する交差反応性が低い。前記方法は、
（ａ）ｈＢＮＰと結合し、検出可能なラベルで標識した少なくとも１種の検出抗体と試験サンプル（例えばｈＢＮＰについて試験する試験サンプル又はｈＢＮＰを含有している疑いのある試験サンプル）を接触させ、少なくとも１種のｈＢＮＰ−検出抗体の複合体を含む第１の混合物を形成する段階（なお、少なくとも１種の検出抗体は約３．０×１０−７〜約１．０×１０−１３Ｍの平衡解離定数をもつ１種以上の抗体を含む）と；
（ｂ）ｈＢＮＰと結合し、固相に固定化して固定化抗体とした少なくとも１種のキャプチャー抗体と、前記ｈＢＮＰ−少なくとも１種の検出抗体の複合体を含む第１の混合物を接触させ、少なくとも１種のキャプチャー抗体−ｈＢＮＰ−少なくとも１種の検出抗体の複合体を含む第２の混合物を形成する段階（なお、前記少なくとも１種のキャプチャー抗体は約３．０×１０−７〜約１．０×１０−１３Ｍの平衡解離定数をもつ１種以上の抗体を含む）と；
（ｃ）試験サンプル中に含まれるｈＢＮＰの量の尺度として検出可能なラベルを検出することにより、段階（ｂ）で形成された少なくとも１種のキャプチャー抗体−ｈＢＮＰ−少なくとも１種の検出抗体の複合体の量を測定する段階を含み、
検出抗体とキャプチャー抗体は併用時に試験サンプル中に存在するヒトプロＢＮＰ又はヒトＮＴ−プロＢＮＰに対して約２０％未満の交差反応性を示す。前記方法は更に、場合により段階（ｂ）後に洗浄段階を含む。
【００２５】
より厳密には、上記イムノアッセイにおいて、少なくとも１種のキャプチャー抗体と少なくとも１種の検出抗体は併用時に試験サンプル中に存在するヒトプロＢＮＰ又はヒトＮＴ−プロＢＮＰに対して約１５％未満の交差反応性を示す。更により厳密には、上記イムノアッセイにおいて、少なくとも１種のキャプチャー抗体と少なくとも１種の検出抗体は併用時に試験サンプル中に存在するヒトプロＢＮＰ又はヒトＮＴ−プロＢＮＰに対して約１０％未満の交差反応性を示す。
【００２６】
更に、本発明のイムノアッセイで使用する検出抗体とキャプチャー抗体は各々約２．５×１０−７〜約５．０×１０−１３Ｍ、又は約２．０×１０−７〜約１．０×１０−１２Ｍの平衡解離定数をもつことができる。検出抗体とキャプチャー抗体はモノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、完全ヒト化抗体、部分ヒト化抗体、動物抗体、組換え抗体、キメラ抗体、１本鎖Ｆｖ、１本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ、抗イディオタイプ抗体又はその機能的に活性なエピトープ結合フラグメントとすることができる。検出抗体及びキャプチャー抗体として使用することができる抗体の例としては限定されないが、１０６．３、ＢＣ２０３、Ｍ１、クローン３、ＡＭ１、ＡＭ５、ＡＭ８、８．１及び２０１．３が挙げられる。
【００２７】
更に別の側面において、本発明はｈＢＮＰについて試験する試験サンプル又はｈＢＮＰを含有している疑いのある試験サンプル中に存在するｈＢＮＰの量の定量方法に関し、前記方法は試験サンプル中に存在するヒトプロＢＮＰ又はヒトＮＴ−プロＢＮＰに対する交差反応性が低い。前記方法は、
（ａ）ｈＢＮＰと結合し、固相に固定化して固定化抗体とした少なくとも１種のキャプチャー抗体と、ｈＢＮＰと結合し、検出可能なラベルで標識した少なくとも１種の検出抗体とに試験サンプル（例えばｈＢＮＰを含有している疑いのあるサンプル）を接触させ、少なくとも１種のキャプチャー抗体−ｈＢＮＰ−少なくとも１種の検出抗体の複合体を形成する段階（なお、少なくとも１種のキャプチャー抗体と少なくとも１種の検出抗体は各々約３．０×１０−７〜約１．０×１０−１３Ｍの平衡解離定数をもつ１種以上の抗体である）と；
（ｂ）試験サンプル中に含まれるｈＢＮＰの量の尺度として検出可能なラベルを検出することにより、段階（ａ）で形成された少なくとも１種のキャプチャー抗体−ｈＢＮＰ−少なくとも１種の検出抗体の複合体の量を測定する段階を含み、
キャプチャー抗体と検出抗体は併用時に試験サンプル中に存在するヒトプロＢＮＰ又はヒトＮＴ−プロＢＮＰに対して約２０％未満の交差反応性を示す。前記方法は更に、場合により段階（ａ）後に洗浄段階を含む。
【００２８】
より厳密には、上記イムノアッセイにおいて、少なくとも１種のキャプチャー抗体と少なくとも１種の検出抗体は併用時に試験サンプル中に存在するヒトプロＢＮＰ又はヒトＮＴ−プロＢＮＰに対して約１５％未満の交差反応性を示す。更により厳密には、上記イムノアッセイにおいて、少なくとも１種のキャプチャー抗体と少なくとも１種の検出抗体は併用時に試験サンプル中に存在するヒトプロＢＮＰ又はヒトＮＴ−プロＢＮＰに対して約１０％未満の交差反応性を示す。
【００２９】
更に、本発明の方法で使用するキャプチャー抗体と検出抗体は各々約２．５×１０−７〜約５．０×１０−１３Ｍ、又は約２．０×１０−７〜約１．０×１０−１２Ｍの平衡解離定数をもつことができる。キャプチャー抗体と検出抗体は１種以上の抗体とすることができる。キャプチャー抗体と検出抗体はモノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、完全ヒト化抗体、部分ヒト化抗体、動物抗体、組換え抗体、キメラ抗体、１本鎖Ｆｖ、１本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ、抗イディオタイプ抗体又はその機能的に活性なエピトープ結合フラグメントとすることができる。キャプチャー抗体及び検出抗体として使用することができる抗体の例としては限定されないが、１０６．３、ＢＣ２０３、Ｍ１、クローン３、ＡＭ１、ＡＭ５、ＡＭ８、８．１及び２０１．３が挙げられる。
【００３０】
本発明の更に別の態様では、試験サンプル中のヒトプロＢＮＰとヒトＢＮＰ又はヒトＢＮＰとヒトプロＢＮＰのモル比又は重量比の測定方法を提供する。前記方法は、
（ａ）（例えば本発明のイムノアッセイに従って）適切な方法により試験サンプル中のｈＢＮＰの量を測定する段階と；
（ｂ）任意の適切な方法（例えば実施例２に記載の方法）により前記サンプル中のヒトプロＢＮＰの量を測定する段階と；
（ｃ）前記サンプル中のヒトプロＢＮＰとヒトＢＮＰ又はヒトＢＮＰとヒトプロＢＮＰのモル比又は重量比を求める段階を含む。場合により、このような方法において、ヒトプロＢＮＰ／ｈＢＮＰのモル比は約１．０〜約５０．０、特に約１．２０〜約４５．０である。更に、このような方法において、ヒトプロＢＮＰ／ｈＢＮＰの重量比は約２．０〜約１５０．０、特に約４．０〜約１４５．０である。場合により、このような方法において、ヒトＢＮＰ／ヒトプロＢＮＰのモル比は約０．０２〜約０．７２である。更に、このような方法において、ヒトＢＮＰ／ヒトプロＢＮＰの重量比は約０．００７〜約０．２１である。
【００３１】
本発明の更に別の態様では、対象における心血管疾患の重篤度の判定方法を提供する。前記方法は、
（ａ）対象からの試験サンプルを準備する段階と；
（ｂ）（例えば本発明のイムノアッセイに従って）適切な方法により試験サンプル中のｈＢＮＰの量を測定する段階と；
（ｃ）任意の適切な方法（例えば実施例２に記載の方法）により前記サンプル中のヒトプロＢＮＰの量を測定する段階と；
（ｄ）前記サンプル中のヒトプロＢＮＰの量とｈＢＮＰの量のモル比又は重量比を求める段階と；
（ｅ）モル比又は重量比を対象における心血管疾患の重篤度と相関させる段階を含むことができ、比が所定レベルよりも低い場合には対象は心血管疾患の重篤度が高いと判定し、比が所定レベルよりも高い場合には対象は心血管疾患の重篤度が低いと判定する。
【００３２】
上記方法において、心血管疾患は特に冠動脈疾患、末梢血管疾患、高血圧、心筋梗塞又は心不全とすることができる。
【００３３】
本発明の更に別の態様では、対象における心血管疾患の進行の監視方法を提供し、前記方法は、
（ａ）対象からの試験サンプルを準備する段階と；
（ｂ）（例えば本発明のイムノアッセイに従って）適切な方法により試験サンプル中のｈＢＮＰの量を測定する段階と；
（ｃ）任意の適切な方法（例えば実施例２に記載の方法）により前記サンプル中のヒトプロＢＮＰの量を測定する段階と；
（ｄ）前記サンプル中のヒトプロＢＮＰの量とｈＢＮＰの量のモル比又は重量比を求める段階と；
（ｅ）モル比又は重量比を対象における疾患の進行と相関させる段階を含み、前記比は進行している対象では初期試験サンプル中の比に比較して低下し、前記比は心血管疾患が進行していない対象又は改善した対象では初期試験サンプル中の比に比較して変化しないか又は上昇する。
【００３４】
上記方法では、場合により心血管疾患の治療後又は治療前（例えば治療の開始時等に治療決定を補助するために監視を実施する場合）に監視を実施する。
【００３５】
心血管疾患に関連する１種以上の臨床徴候を示す対象の１例はそのｃｏｒｉｎ又はｆｕｒｉｎ遺伝子に突然変異をもつ対象である。
【００３６】
更に別の側面において、本発明は心血管疾患のナトリウム利尿ペプチド誘導体治療が有効であった対象の同定方法に関する。前記方法は、
（ａ）心血管疾患に関連する１種以上の臨床徴候を示す対象から試験サンプルを採取する段階と；
（ｂ）（例えば本発明のイムノアッセイに従って）適切な方法により試験サンプル中のｈＢＮＰの量を測定する段階と；
（ｃ）任意の適切な方法（例えば実施例２に記載の方法）により前記サンプル中のヒトプロＢＮＰの量を測定する段階と；
（ｄ）前記サンプル中のヒトプロＢＮＰの量とｈＢＮＰの量のモル比又は重量比を求める段階と；
（ｅ）段階（ｄ）で求めたモル比又は重量比が所定レベルよりも高いか又は低いかを判定する段階と；
（ｆ）段階（ｅ）の判定に基づいてナトリウム利尿ペプチド誘導体治療が対象に有効であったか否かを判断する段階を含む。具体的には、段階（ｄ）で求めた比が所定レベルよりも低い場合には、ナトリウム利尿ペプチド誘導体治療が対象に有効でなかったと判断する。他方、段階（ｄ）で求めた比が所定レベルよりも高い場合には、ナトリウム利尿ペプチド誘導体治療が対象に有効であったと判断する。対象を治療するために使用することができるヒトナトリウム利尿ペプチド誘導体の１例はネシリチドである。
【００３７】
本発明の更に別の態様では、対象が１種以上の医薬組成物を前記対象に投与した結果として心血管合併症を発症しているか否かを判定する方法を提供する。このような方法は、
（ａ）対象に１種以上の医薬組成物を投与する前に対象から第１の試験サンプルを採取する段階と；
（ｂ）（例えば本発明のイムノアッセイに従って）適切な方法により試験サンプル中のｈＢＮＰの量を測定する段階と；
（ｃ）任意の適切な方法（例えば実施例２に記載の方法）により前記サンプル中のヒトプロＢＮＰの量を測定する段階と；
（ｄ）前記サンプル中のヒトプロＢＮＰの量とｈＢＮＰの量のモル比又は重量比を求める段階と；
（ｅ）対象に１種以上の医薬組成物を投与した後に対象から第２の試験サンプルを採取する段階と；
（ｆ）（例えば本発明のイムノアッセイに従って）適切な方法により第２の試験サンプル中のｈＢＮＰの量を測定する段階と；
（ｇ）任意の適切な方法（例えば実施例２に記載の方法）により前記第２の試験サンプル中のヒトプロＢＮＰの量を測定する段階と；
（ｈ）前記第２の試験サンプル中のヒトプロＢＮＰの量とｈＢＮＰの量のモル比又は重量比を求める段階と；
（ｉ）段階（ｄ）で求めたモル比又は重量比を段階（ｈ）のモル比又は重量比と比較する段階を含むことができる。具体的には、段階（ｄ）で求めたモル比又は重量比が段階（ｈ）で求めたモル比又は重量比に比較して変化していない場合には、対象が１種以上の医薬組成物の投与の結果として心血管合併症を発症していないと判定する。段階（ｄ）で求めたモル比又は重量比が段階（ｈ）で求めたモル比又は重量比に比較して変化（上昇又は低下）している場合には、対象が１種以上の医薬組成物の投与の結果として心血管合併症を発症していると判定する。
【００３８】
更に別の側面において、本発明は試験サンプル中のヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチド（「ｈＢＮＰ」）の存在の検出方法の改善に関する。前記方法は、
（ａ）ｈＢＮＰ／抗体の複合体の形成を可能にする時間と条件下で、ｈＢＮＰを含有している疑いのある試験サンプルを前記ｈＢＮＰに特異的な少なくとも１種のキャプチャー抗体と接触させる段階と；
（ｂ）前記ｈＢＮＰの存在を示すものとして少なくとも１種の検出抗体を使用して形成されたｈＢＮＰ／抗体の複合体を検出する段階を含み、
前記改善は併用時にヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチド（「ヒトプロＢＮＰ」）に対して約２０％未満の交差反応性を示す抗体を前記少なくとも１種のキャプチャー抗体及び前記少なくとも１種の検出抗体として利用する段階を含む。
【００３９】
更に別の側面において、本発明は免疫診断試薬に関する。本発明はヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチド（「ｈＢＮＰ」）に対して特異的であり、併用時にヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチド（「ヒトプロＢＮＰ」）に対して約２０％未満の交差反応性を示す少なくとも１種のキャプチャー抗体と少なくとも１種の検出抗体を含む。キャプチャー抗体と検出抗体は約２．５×１０−７〜約５．０×１０−１３Ｍ、又は約２．０×１０−７〜約１．０×１０−１２Ｍの平衡解離定数（ＫＤ）をもつことができる。好ましくは、キャプチャー抗体は３−６３１−４３６であり、検出抗体はＡＭ１又は８．１である。
【００４０】
更に別の側面において、本発明は試験サンプル中のヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチド（「ｈＢＮＰ」）の検出用キットに関する。前記キットは、
（ａ）試験サンプルのアッセイを実施するための説明書と；
（ｂ）ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチド（「ｈＢＮＰ」）に対して特異的であり、併用時にヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチド（「ヒトプロＢＮＰ」）に対して約２０％未満の交差反応性を示す少なくとも１種のキャプチャー抗体と少なくとも１種の検出抗体を含有する免疫診断試薬を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ｈＢＮＰペプチド系較正物質と、実施例１に従って実施したイムノアッセイによる４種類の選択ＢＮＰアッセイを使用して作成した典型的な較正曲線を示す。この図１中、−■−は３−６３１−４３６微粒子／１０６．３ＡＭ１コンジュゲートを表し、−▲−は１０６．３ＡＭ１微粒子／８．１コンジュゲートを表し、−◆−は３−６３１−４３６微粒子／８．１コンジュゲートを表し、＊は１０６．３ＡＭ１微粒子／Ｍ１コンジュゲートを表す。
【図２】実施例１に従って実施したイムノアッセイによるスパイク添加ヒトプロＢＮＰペプチドの平均回収率％を示す。この図２中、黒棒線は３−６３１−４３６微粒子／１０６．３ＡＭ１コンジュゲートを表し、格子状棒線は１０６．３ＡＭ１微粒子／８．１コンジュゲートを表し、点状棒線は３−６３１−４３６微粒子／８．１コンジュゲートを表し、斜線棒線は１０６．３ＡＭ１微粒子／Ｍ１コンジュゲートを表す。
【図３】実施例２に従って実施したイムノアッセイによりヒトプロＢＮＰペプチド系較正物質を使用して作成した典型的な較正曲線を示す。この図３中、−◆−は１０６．３ＡＭ１微粒子／１８  Ｈ５コンジュゲートを表す。
【図４】実施例４に従って実施したヒトプロＢＮＰに対するｈＢＮＰの濃度のプロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明はｈＢＮＰについて試験する試験サンプル又はｈＢＮＰを含有している疑いのある試験サンプル中に存在するヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチド（「ｈＢＮＰ」）の量の定量用イムノアッセイに関する。詳細には、本発明のイムノアッセイはヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチド（「ヒトプロＢＮＰ」）に対する交差反応性が低い。別の態様において、本発明は試験サンプル中のｈＢＮＰの量の定量用イムノアッセイに関し、前記イムノアッセイはヒトプロＢＮＰ又はヒトＮ末端プロＢ型ナトリウム利尿ペプチド（「ヒトＮＴ−プロＢＮＰ」）に対する交差反応性が低い。更に別の態様において、本発明は試験サンプル中のヒトプロＢＮＰとｈＢＮＰの量の比の測定方法に関する。更に別の態様において、本発明は対象における疾患の重篤度又は進行の判定方法に関する。更に別の側面において、本発明はその治療を必要とする対象における心血管疾患の治療薬の同定方法に関する。
【００４３】
Ａ．定義
本明細書で使用する単数形はそうでないことが内容から明白である場合を除き、複数形も含む。本明細書で数値範囲を記載する場合には、同一精度でその範囲内の各数値を明確に想定する。例えば、６〜９の範囲では、６と９に加えて数値７及び８を想定し、６．０〜７．０の範囲では、数値６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９及び７．０を明確に想定する。
【００４４】
ａ）抗体
本明細書で使用する単数及び複数の「抗体」なる用語はモノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体（完全又は部分ヒト化）、動物抗体（１側面では、トリ（例えばアヒル又はガチョウ）、別の側面ではサメ又はクジラ、更に別の側面では、非霊長類（例えばウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウス等）及び非ヒト霊長類（例えばカニクイザル、チンパンジー等のサル）を含む哺乳動物）、組換え抗体、キメラ抗体、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、１本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ”フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、並びに上記のいずれかの機能的に活性なエピトープ結合フラグメントを意味する。特に、抗体としては免疫グロブリン分子と免疫グロブリン分子の免疫活性フラグメント、即ち抗原結合部位を含む分子が挙げられる。免疫グロブリン分子は任意種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスとすることができる。
【００４５】
ｂ）８．１
本明細書で使用する「８．１」とは１９９６年２月２１日付けでＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．）に寄託され、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＨＢ−１２０５６を付与されたハイブリドーマ細胞株８．１により産生されるモノクローナル抗体と又はその誘導体を意味する。８．１と８．１の作製方法は米国特許第６，１６２，９０２号に記載されている。８．１はｈＢＮＰ上のアミノ酸残基２６−３２を含むエピトープと結合する。
【００４６】
ｃ）１０６．３
本明細書で使用する「１０６．３」とは１９９６年２月１４日付けでＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．に寄託され、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＨＢ−１２０４４を付与されたハイブリドーマ細胞株１０６．３により産生されるモノクローナル抗体又はその誘導体を意味する。１０６．３と１０６．３の作製方法は米国特許第６，１６２，９０２号に記載されている。１０６．３はｈＢＮＰ上のアミノ酸残基５−１３を含むエピトープと結合する。１０６．３には２つの異なる平衡解離定数（ＫＤ）、即ち約０．３２×１０−９Ｍの平衡解離定数と約１．０×１０−９Ｍの平衡解離定数が報告されている。
【００４７】
ｄ）２０１．３
本明細書で使用する「２０１．３」とは１９９６年２月１４日付けでＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．に寄託され、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＨＢ−１２０４５を付与されたハイブリドーマ細胞株２０１．３により産生されるモノクローナル抗体又はその誘導体を意味する。２０１．３と２０１．３の作製方法は米国特許第６，１６２，９０２号に記載されている。２０１．３はｈＢＮＰ上のアミノ酸残基１−１０を含むエピトープと結合する。
【００４８】
ｅ）ＡＭ１
本明細書で使用する「ＡＭ１」又は「１０６．３ＡＭ１」、「ＡＭ１  １０６．３」又は「１０６．３  Ｌ１  Ｂ２４／Ｈ２  ２８８」とは２００５年９月２０日付けでＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．に寄託され、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＰＴＡ−６９８７を付与されたハイブリドーマ細胞株１０６．３  Ｌ１  Ｂ２４／Ｈ２  ２８８により産生されるモノクローナル抗体又はその誘導体を意味する。ＡＭ１とＡＭ１の作製方法は２００６年１１月９日付け米国特許出願第１１／５９５，６２５号に記載されている。ＡＭ１はｈＢＮＰ上のアミノ酸残基５−１３を含むエピトープと結合する。ＡＭ１には２つの異なる平衡解離定数（ＫＤ）、即ち約０．１４×１０−９Ｍの平衡解離定数と約１．９×１０−１２Ｍの平衡解離定数が報告されている。
【００４９】
ｆ）ＡＭ５
本明細書で使用する「ＡＭ５」とは２００７年４月２４日付けでＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．に寄託され、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＰＴＡ−８３６９を付与されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株ＡＭ５（別称ＢＮＰ３−６３１−４３６ＡＭ５ＣＨＯ８９３−２１４）により産生される抗体又はその誘導体を意味する。ＡＭ５とＡＭ５の作製方法は２００７年５月８日付け米国特許出願第１１／７４５，９６３号に記載されている。ＡＭ５の平衡解離定数は約１．４×１０−１０Ｍである。ＡＭ５はｈＢＮＰ上のアミノ酸残基１３−１８を含むエピトープと結合する。
【００５０】
ｇ）ＡＭ８
本明細書で使用する「ＡＭ８」とは２００７年４月２４日付けでＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．に寄託され、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＰＴＡ−８３６８を付与されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株ＡＭ８（別称ＢＮＰ３−６３１−４３６ＡＭ８ＣＨＯ９７４−２１１）により産生される抗体又はその誘導体を意味する。ＡＭ８とＡＭ８の作製方法は２００７年５月８日付け米国特許出願第１１／７４５，９６３号に記載されている。ＡＭ８の平衡解離定数は約１．０×１０−１０Ｍである。ＡＭ８はｈＢＮＰ上のアミノ酸残基１３−１８を含むエピトープと結合する。
【００５１】
ｈ）ＢＣ２０３
本明細書で使用する「ＢＣ２０３」とは１９９１年８月２０日付けで茨城県、つくば市、東１丁目、１−３に所在の微生物工業技術研究所に寄託され、微工研条寄第ＦＥＲＭ  ＢＰ−３５１５号を付与されたハイブリドーマ細胞株ＢＣ２０３により産生されるモノクローナル抗体又はその誘導体を意味する。ＢＣ２０３とＢＣ２０３の作製方法は米国特許第６，６７７，１２４号に記載されている。ＢＣ２０３はｈＢＮＰ上のアミノ酸残基２６−３２を含むエピトープと結合する。ＢＣ２０３には２つの異なる平衡解離定数（ＫＤ）、即ち約３．１×１０−８Ｍの平衡解離定数と約１．３×１０−９Ｍの平衡解離定数が報告されている。
【００５２】
ｉ）クローン３又はＢＮＰ３−６３１−４３６
本明細書で同義に使用する「クローン３」、「ＢＮＰ３−６３１−４３６ｍｓ」、「３−６３１−４３６」又は「抗体３−６３１−４３６」とは各々２００４年１２月２１日付けでＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．に寄託され、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＰＴＡ−６４７６を付与されたハイブリドーマ細胞株３−６３１−４３６により産生されるモノクローナル抗体又はその誘導体を意味する。クローン３とクローン３の作製方法は２００６年８月１７日付け米国特許公開第２００６／０１８３１５４号に記載されている。クローン３はｈＢＮＰ上のアミノ酸残基１３−１８を含むエピトープと結合する。クローン３の平衡解離定数は約３．７×１０−１０Ｍである。
【００５３】
ｊ）Ｍ１
本明細書で使用する「Ｍ１」とはＳｔｒａｔｅｇｉｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｎｅｗａｒｋ，Ｄｅｌａｗａｒｅ（カタログ番号Ｂ９１０ＳＭＤ０１−Ｄ０）から市販されているハイブリドーマ細胞株Ｍ１により産生されるモノクローナル抗体を意味する。Ｍ１はｈＢＮＰ上のカルボキシ（Ｃ）末端と結合する。Ｍ１の平衡解離定数は約１．７×１０−７Ｍである。
【００５４】
ｋ）会合速度
本明細書で同義に使用する「会合速度」、「ｋｏｎ」又は「ｋａ」なる用語は抗体とその標的抗原の結合強度（程度）又は下式：
抗体（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）→Ａｂ−Ａｇ
により示されるようなｍＡｂと抗原の間の複合体形成速度を示す数値を意味する。
【００５５】
会合定数（ｋａ）の測定方法は当分野で周知である。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）（生体分子間相互作用解析）アッセイを使用することができる（例えばスウェーデン，Ｕｐｐｓａｌａに所在のＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社であるＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢから市販されている機器）。更に、Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄａｈｏ）から市販されているＫｉｎＥｘＡ（登録商標）（結合平衡除外法）アッセイも使用することができる。
【００５６】
ｌ）心血管合併症
本明細書で同義に使用する「心血管合併症」又は「心血管合併症を発症」なる用語は任意心血管疾患又はイベントを意味する。心血管疾患又はイベントが二次的合併症（例えば肺鬱血又は鬱血肺）を誘発する場合には、このような二次的合併症も「心血管合併症」なる用語に含むものとみなす。心血管合併症は「代償性」（例えば代償性とは対象の身体の通常酸素要求量を満足できていることを意味する）でも「非代償性」（例えば非代償性とは対象の身体の通常酸素要求量を現時点で満足していないことを意味する）でもよい。更に、「心血管合併症」又は「心血管合併症を発症」なる用語は既存心血管合併症の悪化も意味する。
【００５７】
ｍ）心血管疾患
本明細書で使用する「心血管疾患」なる用語は心臓、血管又は循環に関する各種臨床疾患、障害又は病態を意味する。これらの疾患、障害又は病態は冠動脈、脳動脈又は末梢動脈のアテローム硬化性障害に起因すると考えられる。心血管疾患としては限定されないが、冠動脈疾患、末梢血管疾患、高血圧、心筋梗塞、心不全等が挙げられる。例えば、心不全では、心血管疾患の「重篤度上昇」とは例えばクラスＩＩＩ又はクラスＩＶまでのＮＹＨＡ分類の上昇により示されるような疾患の悪化を意味し、心血管疾患の「重篤度低下」とは例えばクラスＩＩＩ又はＩＶからクラスＩＩ又はＩへのＮＹＨＡ分類の低下により示されるような疾患の改善を意味する。
【００５８】
ｎ）臨床徴候
本明細書で使用する「臨床徴候」なる用語は心血管疾患の指標となるアッセイ、試験法（例えば撮像法）、標準（例えばニューヨーク心臓協会（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）（ＮＹＨＡ）分類）、生物理学的尺度（例えばＬＤＬ濃度、ＨＤＬ濃度、トリグリセリド濃度、血圧、ボディマス指数、胴囲、心拍数、空腹時インスリン濃度、空腹時グルコース濃度、糖尿病状態）及び他のバイオメトリックパラメーター（限定されないが、例えば人種、性別、年齢、喫煙状態、心血管疾患歴、心血管疾患の家族歴、高血圧薬の使用等）を意味する。
【００５９】
ｏ）解離速度
本明細書で同義に使用する「解離速度」、「ｋｏｆｆ」又は「ｋｄ」なる用語はその標的抗原からの抗体の解離強度（程度）又は下式：
抗体（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）←Ａｂ−Ａｇ
により示されるようなＡｂ−Ａｇ複合体から遊離ｍＡｂ及び抗原への経時的分離を示す数値を意味する。
【００６０】
解離定数（ｋｄ）の測定方法は当分野で周知である。例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）（スウェーデン）アッセイを使用することができる。更に、Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄａｈｏ）から市販されているＫｉｎＥｘＡ（登録商標）（結合平衡除外法）アッセイも使用することができる。
【００６１】
ｐ）平衡解離定数
本明細書で同義に使用する「平衡解離定数」又は「ＫＤ」なる用語は解離速度（ｋｏｆｆ）を会合速度（ｋｏｎ）で割ることにより得られる数値を意味する。会合速度、解離速度及び平衡解離定数は抗原に対する抗体の結合親和性を表すために使用する。
【００６２】
ｑ）エピトープ
本明細書で使用する単数又は複数の「エピトープ」なる用語は対象において抗原又は免疫原活性をもつポリペプチド又は蛋白質の部位又はフラグメントを意味する。免疫原活性をもつエピトープは動物に抗体応答を誘発するポリペプチド又は蛋白質の部位又はフラグメントである。抗原活性をもつエピトープは当業者に周知の任意方法、例えばイムノアッセイにより判定した場合に抗体が免疫特異的に結合するポリペプチド又は蛋白質の部位又はフラグメントである。
【００６３】
ｒ）心不全
本明細書で使用する「心不全」なる用語は心臓が身体の他の部分に血液を効率的に拍出できない病態を意味する。心不全は梗塞、心筋症（一次性又は二次性）、高血圧、冠動脈疾患、弁疾患、先天性欠損症又は感染に起因する心臓損傷又は動脈狭窄が原因であると考えられる。心不全は更に慢性、鬱血性、急性、非代償性、収縮期又は拡張期に分類することができる。ニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）分類は患者の機能に基づいて疾患の重篤度を分類しており、ＮＹＨＡクラスは治療又は治療応答の欠如に基づいて進行及び／又は後退することができる。
【００６４】
ｓ）ヒト脳性ナトリウム利尿ペプチド
本明細書で同義に使用する「ヒト脳性ナトリウム利尿ペプチド」、「ヒトＢＮＰ」、「ｈＢＮＰ」、「ｈＢＮＰ−３２」、「ｈＢＮＰペプチド」、「ｈＢＮＰポリペプチド」又は「Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド」なる用語は配列番号４に示すアミノ酸配列をもつ３２アミノ酸分子を意味する。配列番号４に示すアミノ酸配列はヒトプロＢＮＰの１０８アミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸７７−１０８により表される。
【００６５】
ｔ）ｈＢＮＰフラグメント
本明細書で同義に使用する「ｈＢＮＰフラグメント」、「ｈＢＮＰ−３２フラグメント」、「ｈＢＮＰペプチドフラグメント」又は「ヒトＢＮＰフラグメント」なる用語は配列番号４の少なくとも６個の連続するアミノ酸を含むポリペプチドを意味する。１側面において、ｈＢＮＰフラグメント又はｈＢＮＰペプチドフラグメントとは配列番号４の少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基、配列番号４の少なくとも１５個の連続するアミノ酸残基、配列番号４の少なくとも２０個の連続するアミノ酸残基、配列番号４の少なくとも２５個の連続するアミノ酸残基、又は配列番号４の少なくとも３０個の連続するアミノ酸残基を含むペプチドを意味する。ｈＢＮＰフラグメント又はｈＢＮＰペプチドフラグメントの例としては限定されないが、配列番号４のアミノ酸残基１−３１、１−３０、１−２９、１−２８、１−２７、１−２６、１−２５、１−２４、１−２３、１−２２、１−２１、１−２０、１−１９、１−１８、１−１７、１−１６、１−１５、２−３２、２−３１、２−３０、２−２９、２−２８、２−２７、２−２６、２−２５、２−２４、２−２３、２−２２、２−２１、２−２０、２−１９、２−１８、２−１７、２−１６、２−１５、２−１４、２−１３、２−１２、２−１１、２−１０、２−９、２−８、２−７、３−３２、３−３１、３−３０、３−２９、３−２８、３−２７、３−２６、３−２５、３−２４、３−２３、３−３２、３−２１、３−２０、３−１９、３−１８、３−１７、３−１６、３−１５、３−１４、３−１３、３−１２、３−１１、３−１０、３−９、３−８、４−３２、４−３１、４−３０、４−２９、４−２８、４−２７、４−２６、４−２５、４−２４、４−２３、４−２２、４−２１、４−２０、４−１９、４−１８、４−１７、４−１６、４−１５、４−１４、４−１３、４−１２、４−１１、４−１０、４−９、５−３２、５−３１、５−３０、５−２９、５−２８、５−２７、５−２６、５−２５、５−２４、５−２３、５−２２、５−２１、５−２０、５−１９、５−１８、５−１７、５−１６、５−１５、５−１４、５−１３、５−１２、５−１１、５−１０、６−３２、６−３１、６−３０、６−２９、６−２８、６−２７、６−２６、６−２５、６−２４、６−２３、６−２２、６−２１、６−２０、６−１９、６−１８、６−１７、６−１６、６−１５、６−１４、６−１３、６−１２、６−１１、７−３２、７−３１、７−３０、７−２９、７−２８、７−２７、７−２６、７−２５、７−２４、７−２３、７−２２、７−２１、７−２０、７−１９、７−１８、７−１７、７−１６、７−１５、７−１４、７−１３、７−１２、８−３２、８−３１、８−３０、８−２９、８−２８、８−２７、８−２６、８−２５、８−２４、８−２３、８−２２、８−２１、８−２０、８−１９、８−１８、８−１７、８−１６、８−１５、８−１４、８−１３、９−３２、９−３１、９−３０、９−２９、９−２８、９−２７、９−２６、９−２５、９−２４、９−２３、９−２２、９−２１、９−２０、９−１９、９−１８、９−１７、９−１６、９−１５、９−１４、１０−３２、１０−３１、１０−３０、１０−２９、１０−２８、１０−２７、１０−２６、１０−２５、１０−２４、１０−２３、１０−２２、１０−２１、１０−２０、１０−１９、１０−１８、１０−１７、１０−１６、１０−１５、１１−３２、１１−３１、１１−３０、１１−２９、１１−２８、１１−２７、１１−２６、１１−２５、１１−２４、１１−２３、１１−２２、１１−２１、１１−２０、１１−１９、１１−１８、１１−１７又は１１−１６を含むアミノ酸配列が挙げられる。
【００６６】
ｕ）ヒトナトリウム利尿ペプチドアナログ
本明細書で使用する「ヒトナトリウム利尿ペプチドアナログ」なる用語はヒトナトリウム利尿ペプチド（例えばヒトＢＮＰ）の生物学的に活性な類似体を意味する。例えば、生物学的に活性なヒトナトリウム利尿ペプチドアナログとしては、元の化合物の生物学的活性を失わないように短縮、欠失、挿入、置換、代替、側鎖延長を加えたヒトナトリウム利尿ペプチド、及び融合蛋白質、又はその組合せが挙げられる。ヒトナトリウム利尿ペプチドアナログは各種手段により得ることができる。例えば、相互結合能を失わせずに天然ナトリウム利尿ペプチド構造の所定アミノ酸を他のアミノ酸に置換することができる。ヒトナトリウム利尿ペプチドアナログの例とこのようなアナログの作製方法は米国特許出願第２００６／０１７２９３３号に記載されている。
【００６７】
ｖ）ヒトナトリウム利尿ペプチドコンジュゲート
本明細書で使用する「ヒトナトリウム利尿ペプチドコンジュゲート」なる用語は少なくとも１個の修飾部分又は少なくとも１個の反応性部分を付加したヒトナトリウム利尿ペプチド又はヒトナトリウム利尿ペプチドフラグメントを意味する。修飾部分はヒトナトリウム利尿ペプチド又はヒトナトリウム利尿ペプチドフラグメント（例えばｈＢＮＰ又はｈＢＮＰフラグメント）を修飾する部分である。修飾部分の例としては限定されないが、安定性、溶解度及び／又は生物学的活性に作用する部分（例えば親水性ポリマー又はオリゴマー、両親媒性ポリマー又はオリゴマー、及び親油性ポリマー又はオリゴマー）、親水性部分、ポリエチレングリコール部分、生体適合性水溶性部分、ポリカチオン性部分、両親媒性部分、ポリエチレングリコール／アルキル修飾部分等が挙げられる（各々米国特許出願第２００６／０１７２９３３号に記載されている）。
【００６８】
ヒトナトリウム利尿ペプチド又はヒトナトリウム利尿ペプチドフラグメントは米国特許出願第２００４／０２６６６７３号に記載されているように反応性部分とカップリングすることにより（共有結合により）化学的に修飾することができる。反応性部分は血液成分、好ましくは血液蛋白質と共有結合を形成することが可能である。共有結合は一般に反応性部分と血液成分のアミノ基、ヒドロキシル基又はチオール基の間に形成される。アミノ基はカルボキシ、ホスホリル又はアシル等の反応性部分と共有結合を形成することができ、ヒドロキシル基は好ましくは活性エステル等の反応性部分と共有結合を形成し、チオール基は好ましくはエステルや混合酸無水物等の反応性部分と共有結合を形成する。好ましい血液成分は血清アルブミン、免疫グロブリン又はその組合せ等の流動性血液成分であり、好ましい反応性部分はマレイミド又はマレイミド含有基等の酸無水物を含む。
【００６９】
修飾部分をヒトナトリウム利尿ペプチド（例えばヒトＢＮＰ）等の塩基分子と結合するための方法は当分野で周知である。例えば、修飾部分をヒトナトリウム利尿ペプチドと結合するためのストラテジーは米国特許出願第２００６／０１７２９３３号に開示されている。ヒトナトリウム利尿ペプチドを反応性部分で化学的に修飾するための方法は米国特許出願第２００４／０２６６６７３号に記載されている。
【００７０】
ｗ）ヒトナトリウム利尿ペプチド誘導体
本明細書で使用する「ヒトナトリウム利尿ペプチド誘導体」なる用語はヒトナトリウム利尿ペプチドアナログ、ヒトナトリウム利尿ペプチドコンジュゲート又はヒトナトリウム利尿ペプチドの組換え体（例えばヒトＢＮＰ（配列番号４）の組換え体（例えばネシリチド））を意味する。
【００７１】
ｘ）免疫診断試薬
本明細書で使用する「免疫診断試薬」なる用語はｈＢＮＰの１領域と特異的に結合する１種以上の抗体を意味する。
【００７２】
ｙ）医薬組成物
本明細書で使用する「医薬組成物」なる用語は治療を必要とする疾患又は病態の患者を使用するために使用することができる任意の物質又は薬剤を意味し、小分子（例えば活性剤を含有する薬剤）でも生物製剤でもよい。医薬組成物の例としては限定されないが、抗腫瘍薬（化学療法薬）、抗鬱薬（例えば三環系抗鬱薬）、多発性硬化症治療薬、麻酔薬、インターフェロン、ホルモン、ＨＩＶ抗ウイルス薬等とその任意組合せが挙げられる。一般に、医薬組成物は心血管系に作用することが知られているもの又は予想されるものでもよいし、予想外又は意外にも心血管系に作用するものでもよい。
【００７３】
ｚ）ヒトＢＮＰのプレプロペプチド前駆体
本明細書で使用する「ヒトＢＮＰのプレプロペプチド前駆体」又は「ヒトプレプロＢＮＰ」なる用語は配列番号１に示すアミノ酸配列をもつ１３４アミノ酸分子を意味する。
【００７４】
ａａ）ヒトＢＮＰのプロペプチド
本明細書で使用する「ヒトＢＮＰのプロペプチド」又は「ヒトプロＢＮＰ」なる用語は配列番号２に示すアミノ酸配列をもつ１０８アミノ酸分子を意味する。ヒトプロＢＮＰはヒトプレプロＢＮＰから誘導される。
【００７５】
ｂｂ）ヒトＢＮＰのＮ末端プロペプチド
本明細書で使用する「ヒトＢＮＰのＮ末端プロペプチド」、「ヒトＮＴ−プロＢ型ナトリウム利尿ペプチド」又は「ヒトＮＴ−プロＢＮＰ」なる用語は配列番号３に示すアミノ酸配列をもつ７６アミノ酸分子を意味する。ヒトＮＴ−プロＢＮＰはヒトプロＢＮＰ（配列番号２）から誘導される。
【００７６】
ｃｃ）対象
本明細書では「対象」及び「患者」なる用語を同義に使用するが、本発明の対象は必ずしもイムノアッセイ時に医療治療を受けているか又は受けたことがある必要はない。本明細書で使用する単数及び複数の「対象」なる用語は動物を意味し、１側面ではトリ（例えばアヒル又はガチョウ）、別の側面ではサメ又はクジラ、又は別の側面では、非霊長類（例えばウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット及びマウス）及び霊長類（例えばカニクイザル、チンパンジー等のサル及びヒト）を含む哺乳動物を意味する。対象はヒトが好ましい。
【００７７】
ｄｄ）試験サンプル
本明細書で使用する「試験サンプル」なる用語はｈＢＮＰについて試験する対象及び／又はｈＢＮＰを含有している疑いのある対象の組織、血清、血漿、全血、リンパ液、ＣＮＳ液、尿又は他の体液に由来する生体サンプルを意味する。試験サンプルは当業者に公知の日常的技術を使用して作製することができる。
【００７８】
ｅｅ）読取値
「読取値」なる用語は較正曲線（例えばＢＮＰ較正曲線）から読取られた所定検体（例えばプロＢＮＰ）の濃度を意味する。検体が較正物質（と一致しない場合例えば検体プロＢＮＰと較正物質ＢＮＰ）には、分子量の差について読取値を補正すると最適である。
【００７９】
ｆｆ）交差反応性の低下
本明細書で使用する「交差反応性の低下」なる用語は当業者に知られているような他の（例えば少なくとも１種、場合により少なくとも２種の）ヒトＢＮＰアッセイ及び／又はヒトＢＮＰスパイク添加試験に比較して、併用時に試験サンプルに含まれるプロＢＮＰ又はＮＴ−プロＢＮＰとの結合の低下を示す１種以上の抗体を利用する試験サンプル中のヒトＢＮＰのイムノアッセイを意味する。低下は約０．１％〜約２０％、場合により約１％〜約２０％、約０．１％〜約１５％、約１％〜約１５％、約０．１％〜約１０％又は約１％〜約１０％とすることができる。
【００８０】
ｇｇ）所定レベル
本明細書で使用する「所定レベル」なる用語は一般にアッセイ結果を所定レベルに比較することにより診断結果を判定するために使用されるアッセイカットオフ値を意味し、所定レベルは予め各種臨床パラメーター（例えば疾患の重篤度、進行／非進行／改善等）と関係又は関連付けられている。本発明は典型的な所定レベルを提示し、本明細書に記載するような典型的イムノアッセイに関してこのようなレベルと臨床パラメーターの初期関係又は関連について記載する。しかし、カットオフ値がイムノアッセイの種類（例えば利用する抗体等）により変動する場合があることは周知である。更に、この記載に基づいて他のイムノアッセイのイムノアッセイ特異的カットオフ値を得るように本発明を他のイムノアッセイに適応させることは当業者が十分に可能である。所定レベル（カットオフ）の厳密な値はアッセイ間で変動する場合があるが、本明細書に記載するような相関は一般に適用可能であると思われる。
【００８１】
Ｂ．イムノアッセイ
本明細書に要約するように、本発明は試験サンプル中のｈＢＮＰ又はｈＢＮＰフラグメントの定性的検出及び／又は定量に使用することができるイムノアッセイに関する。本明細書に記載するイムノアッセイは試験サンプル中に含まれている可能性のあるヒトプロＢＮＰ又はヒトＮＴ−プロＢＮＰに対する交差反応性が低い。
【００８２】
本発明のイムノアッセイは当分野で公知の任意フォーマットを使用して実施することができ、限定されないが、サンドイッチフォーマットが挙げられる。
【００８３】
本発明の所定態様では、試験サンプル中のｈＢＮＰ又はｈＢＮＰフラグメントを分離及び定量するために少なくとも２種類の抗体を使用する。より詳細には、少なくとも２種類の抗体はｈＢＮＰ又はｈＢＮＰフラグメントの所定のエピトープと結合し、「サンドイッチ」と呼ばれる免疫複合体を形成する。一般に、イムノアッセイでは、試験サンプル中のｈＢＮＰ又はｈＢＮＰフラグメントを捕捉するために１種類以上の抗体を使用することができ（これらの抗体は「キャプチャー」抗体と通称される）、検出可能（即ち定量可能）なラベルをサンドイッチに結合するために１種類以上の抗体を使用することができる（これらの抗体は「検出抗体」又は「コンジュゲート」と通称される）。
【００８４】
本発明者らはキャプチャー抗体及び検出抗体として抗体の所定の組合せを使用して優れたイムノアッセイ、特にサンドイッチアッセイを実施できることを発見した。より詳細には、本発明の特定態様でキャプチャー抗体及び検出抗体として使用される抗体は各々約３．０×１０−７〜約１．０×１０−１３Ｍ、約２．５×１０−７〜約５．０×１０−１３Ｍ、又は約２．０×１０−７〜約１．０×１０−１２Ｍの平衡解離定数（ＫＤ）をもつ。上記範囲内の平衡解離定数（ＫＤ）をもち、本発明のイムノアッセイでキャプチャー抗体及び検出抗体として使用することができる抗体の例としては限定されないが、１０６．３、ＢＣ２０３、クローン３、Ｍ１、ＡＭ１、ＡＭ５、２０１．３、ＡＭ８又は８．１が挙げられる。
【００８５】
所定のキャプチャー抗体とコンジュゲート抗体の組合せは同一又は重複するエピトープを共有するため、本明細書に記載するようなサンドイッチアッセイで併用するには好ましくない。同一又は重複するエピトープをもつ抗体群を下表Ａに示す。
【００８６】
【表１】
0005570415.tif 000002
【００８７】
一般に、異なる群（例えば任意に指定した「Ａ」、「Ｂ」又は「Ｃ」）の抗体は相互に対になる。例えば、一般にＡ群からの抗体はＢ群からの抗体と対になる。しかし、所定の場合及びアッセイフォーマットでは、重複又は連続するエピトープをもつ２種類の抗体をサンドイッチ形成に使用することが可能である。換言するならば、表Ａは例示に過ぎず、抗体対組合せに関して限定するものではない。
【００８８】
本明細書に記載するように実施するイムノアッセイは各々約３．０×１０−７〜約１．０×１０−１３Ｍ、約２．５×１０−７〜約５．０×１０−１３Ｍ、又は約２．０×１０−７〜約１．０×１０−１２Ｍの平衡解離定数（ＫＤ）をもつ抗体を少なくとも１種のキャプチャー抗体及び少なくとも１種の検出抗体として利用し、前記少なくとも１種のキャプチャー抗体と少なくとも１種の検出抗体の併用時に試験サンプル中に存在する可能性のあるヒトプロＢＮＰに対して交差反応性の低下を示す。好ましくは、イムノアッセイは試験サンプル中に存在する可能性のあるヒトプロＢＮＰに対して約２０％未満の交差反応性を示す。より好ましくは、イムノアッセイは試験サンプル中に存在する可能性のあるヒトプロＢＮＰに対して約１９％未満、約１８％未満、約１７％未満、約１６％未満、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満又は約１％未満（例えば約０．１％）の交差反応性を示す。
【００８９】
本発明の別の態様では、本明細書に記載するように実施するイムノアッセイは各々約３．０×１０−７〜約１．０×１０−１３Ｍ、約２．５×１０−７〜約５．０×１０−１３Ｍ、又は約２．０×１０−７〜約１．０×１０−１２Ｍの平衡解離定数（ＫＤ）をもつ抗体を少なくとも１種のキャプチャー抗体及び少なくとも１種の検出抗体として利用し、試験サンプル中に存在する可能性のあるヒトプロＢＮＰ又はヒトＮＴ−プロＢＮＰに対して交差反応性の低下を示す。好ましくは、イムノアッセイは試験サンプル中に存在する可能性のあるヒトプロＢＮＰ又はヒトＮＴ−プロＢＮＰに対して約２０％未満の交差反応性を示す。より好ましくは、イムノアッセイは試験サンプル中に存在する可能性のあるヒトプロＢＮＰ又はヒトＮＴ−プロＢＮＰに対して約１９％未満、約１８％未満、約１７％未満、約１６％未満、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満又は約１％未満の交差反応性を示す。
【００９０】
ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰフラグメントについて試験する試験サンプル（例えば含有している疑いのある試験サンプル）を少なくとも１種のキャプチャー抗体と少なくとも１種の検出抗体とに同時又は順次に任意順序で接触させることができる。例えば、試験サンプルを先ず少なくとも１種のキャプチャー抗体と接触させた後に（順次）少なくとも１種の検出抗体と接触させることができる。あるいは、試験サンプルを先ず少なくとも１種の検出抗体と接触させた後に（順次）少なくとも１種のキャプチャー抗体と接触させることができる。更に別法では、試験サンプルをキャプチャー抗体と検出抗体とに同時に接触させることができる。
【００９１】
サンドイッチアッセイフォーマットでは、第１の抗体−ｈＢＮＰの複合体の形成を可能にする条件下で、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰフラグメントを含有している疑いのある試験サンプルを先ず、約３．０×１０−７〜約１．０×１０−１３Ｍ、約２．５×１０−７〜約５．０×１０−１３Ｍ、又は約２．０×１０−７〜約１．０×１０−１２Ｍの平衡解離定数をもつ少なくとも１種の第１のキャプチャー抗体と接触させる。２種類以上のキャプチャー抗体を使用する場合には、第１の多重キャプチャー抗体−ｈＢＮＰの複合体が形成される。サンドイッチアッセイでは、試験サンプル中に予想されるｈＢＮＰ又はｈＢＮＰフラグメントの最大量よりも過剰の抗体、好ましくは少なくとも１種のキャプチャー抗体を使用する。例えば、緩衝液（例えば微粒子コーティング用緩衝液）１ｍＬ当たり約５μｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬの抗体を使用することができる。
【００９２】
場合により、試験サンプルを少なくとも１種のキャプチャー抗体（例えば第１のキャプチャー抗体）と接触させる前に、第１の抗体−ｈＢＮＰの複合体を試験サンプルから分離し易い固体支持体に少なくとも１種のキャプチャー抗体を固定することができる。当分野で公知の任意固体支持体を使用することができ、限定されないが、ウェル、チューブ又はビーズ形態のポリマー材料からなる固体支持体が挙げられる。ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰフラグメントと結合する抗体の能力を妨げないという条件で、吸着、化学カップリング剤を使用する共有結合又は当分野で公知の他の手段により抗体を固体支持体に固定することができる。あるいは、（例えば、Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａから市販されているＰｏｗｅｒ−Ｂｉｎｄ（登録商標）−ＳＡ−ＭＰストレプトアビジンコート微粒子を使用して）予めストレプトアビジンをコーティングしておいた微粒子に抗体を固定することができる。あるいは、抗種特異的モノクローナル抗体を予めコーティングしておいた微粒子を使用して抗体を固定することもできる。更に、必要に応じて抗体の各種官能基と反応できるように固体支持体を誘導体化することもできる。このような誘導体化には所定のカップリング剤の使用が必要であり、限定されないが、無水マレイン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドが挙げられる。
【００９３】
ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰフラグメントについて試験する試験サンプル及び／又は含有する疑いのある試験サンプルを少なくとも１種のキャプチャー抗体（例えば第１のキャプチャー抗体）と接触させた後、第１の抗体（又は多重抗体）−ｈＢＮＰの複合体の形成を可能にするように混合物をインキュベートする。インキュベーションは約４．５〜約１０．０のｐＨ、約２℃〜約４５℃の温度で少なくとも約１分間〜約１８時間、好ましくは約１〜２０分間、最も好ましくは約２〜４分間実施することができる。本明細書に記載するイムノアッセイは１段階（即ち、試験サンプルと少なくとも１種のキャプチャー抗体と少なくとも１種の検出抗体の全てを反応容器に順次又は同時に加える）で実施してもよいし、２段階以上、例えば２段階、３段階等で実施してもよい。
【００９４】
（第１／多重）キャプチャー抗体−ｈＢＮＰの複合体の形成後、（（第１／多重）キャプチャー抗体−ｈＢＮＰ−第２の検出抗体の複合体の形成を可能にする条件下で）複合体を少なくとも１種の検出抗体と接触させる。少なくとも１種の検出抗体はイムノアッセイで使用する第２、第３、第４等の抗体とすることができる。キャプチャー抗体−ｈＢＮＰの複合体を２種類以上の検出抗体と接触させるならば、（第１／多重）キャプチャー抗体−ｈＢＮＰ−（多重）検出抗体の複合体が形成される。キャプチャー抗体（例えば第１のキャプチャー抗体）と同様に、少なくとも第２（以下）の検出抗体をキャプチャー抗体−ｈＢＮＰの複合体と接触させる場合には、（第１／多重）キャプチャー抗体−ｈＢＮＰ−（第２／多重）検出抗体の複合体の形成には上記と同様の条件下のインキュベーション時間が必要である。少なくとも１種の検出抗体は検出可能なラベルを含むことが好ましい。（第１／多重）キャプチャー抗体−ｈＢＮＰ−（第２／多重）検出抗体の複合体の形成よりも前、同時又はその後に検出可能なラベルを少なくとも１種の検出抗体（例えば第２の検出抗体）に固定することができる。当分野で公知の任意の検出可能なラベルを使用することができる。例えば、検出可能なラベルは放射性ラベル（例えば３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ）、酵素ラベル（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ等）、化学発光ラベル（例えばアクリジニウムエステル、ルミノール、イソルミノール、チオエステル、スルホンアミド、フェナントリジニウムエステル等）、蛍光ラベル（例えばフルオレセイン（５−フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、３’６−カルボキシフルオレセイン、５（６）−カルボキシフルオレセイン、６−ヘキサクロロフルオレセイン、６−テトラクロロフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート等）、ローダミン、フィコビリプロテイン、Ｒ−フィコエリスリン、量子ドット（硫化亜鉛をコートしたセレン化カドミウム））、温度ラベル又は免疫ポリメラーゼ連鎖反応ラベルとすることができる。ラベル、標識法及びラベル検出の概要はＰｏｌａｋ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｎｏｏｒｄｅｎ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９９７）と、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎから発行されたハンドブック兼カタログであるＨａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（１９９６）に記載されている。更に、２種類以上のラベルを使用することもできる。例えば、各々異なるラベルを含む二重コンジュゲートを使用することができる。例えば、一方のコンジュゲート抗体にはビオチンを付加し、第２のコンジュゲートはアクリジニウムで標識した抗ビオチン抗体とすることができる。他の変形も当業者に容易に認識されよう。
【００９５】
検出可能なラベルは抗体に直接固定してもよいし、カップリング剤により固定してもよい。使用可能なカップリング剤の１例はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから市販されているＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）である。使用可能な他のカップリング剤は当分野で公知である。検出可能なラベルを抗体に固定する方法は当分野で公知である。更に、検出可能なラベルを抗体にカップリングし易くする末端基を予め付加した多数の検出可能なラベルを購入又は合成することができ、例えばＮ１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−（３−カルボキシプロピル）アクリジニウム−９−カルボキサミド活性エステル（別称ＣＰＳＰ−アクリジニウムエステル）又はＮ１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−（３−スルホプロピル）アクリジニウム−９−カルボキサミド活性エステル（別称ＳＰＳＰ−アクリジニウムエステル）が挙げられる。
【００９６】
（第１／多重）キャプチャー抗体−ｈＢＮＰ−（第２／多重）検出抗体の複合体は必ずしもそうしなくてもよいが、ラベルの定量前に試験サンプルの残余から分離することができる。例えば、少なくとも１種のキャプチャー抗体（例えば第１のキャプチャー抗体）をウェルやビーズ等の固体支持体に固定している場合には、（試験サンプルの）液体を固体支持体から引き離すことにより分離を行うことができる。あるいは、少なくとも１種の第１のキャプチャー抗体を固体支持体に固定している場合には、ｈＢＮＰ含有サンプルと少なくとも１種の第２の検出抗体とに同時に接触させ、第１の（多重）抗体−ｈＢＮＰ−第２の（多重）抗体の複合体を形成した後に、液体（試験サンプル）を固体支持体から引き離すことができる。少なくとも１種の第１のキャプチャー抗体を固体支持体に固定していない場合には、ラベルの量を定量するために（第１／多重）キャプチャー抗体−ｈＢＮＰ−（第２／多重）検出抗体の複合体を試験サンプルから除去する必要はない。
【００９７】
標識キャプチャー抗体−ｈＢＮＰ−検出抗体の複合体（例えば第１のキャプチャー抗体−ｈＢＮＰ−第２の検出抗体の複合体）の形成後、当分野で公知の技術を使用して複合体中のラベルの量を定量する。例えば、酵素ラベルを使用する場合には、発色等の定量可能な反応を生じるラベルの基質と標識複合体を反応させる。ラベルが放射性ラベルの場合にはには、シンチレーションカウンターを使用してラベルを定量する。ラベルが蛍光ラベルの場合には、ある色（「励起波長」と言う）の光でラベルを刺激し、刺激に応答してラベルにより発光される別の色（「発光波長」と言う）を検出することによりラベルを定量する。ラベルが化学発光ラベルの場合には、目視又はルミノメーター、Ｘ線フィルム、高速写真フィルム、ＣＣＤカメラ等を使用して発光を検出することによりラベルを定量する。複合体中のラベルの量を定量したら、既知濃度のｈＢＮＰ又はｈＢＮＰフラグメントの希釈系列を使用して作成しておいた標準曲線を利用して試験サンプル中のｈＢＮＰ又はｈＢＮＰフラグメントの濃度を測定する。ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰフラグメントの希釈系列の使用以外に、重量測定、質量分析法及び当分野で公知の他の技術により標準曲線を作成することもできる。
【００９８】
Ｃ．試験サンプル中の所定比の測定方法
別の態様において、本発明は（ａ）試験サンプル中のｈＢＮＰの量とヒトプロＢＮＰの量又は（ｂ）試験サンプル中のヒトプロＢＮＰとｈＢＮＰの量のモル比又は重量比の測定方法に関する。詳細には、本発明の方法は試験サンプル中のｈＢＮＰの量を測定する段階を含む。試験サンプル中のｈＢＮＰの量を測定又は定量するのに適した任意方法を使用することができる。このような方法は当分野で周知である。例えば、このような方法は本明細書（例えば上記セクションＢ）に記載するイムノアッセイ等のイムノアッセイとすることができる。更に、本発明の方法は試験サンプル中のヒトプロＢＮＰの量を測定又は適切する段階を含む。試験サンプル中のヒトプロＢＮＰの量を測定又は定量するのに適した任意方法を使用することができる。このような方法は当分野で周知である。例えば、このような方法は本明細書（例えば上記セクションＢ）に記載するイムノアッセイ等のイムノアッセイとすることができる。あるいは、実施例２に記載する方法等の方法を使用することができる。試験サンプル中のｈＢＮＰ又はヒトプロＢＮＰの量を測定又は定量する順序は特に重要ではない。測定することができるモル比又は重量比は（ｉ）前記サンプル中のｈＢＮＰの量とヒトプロＢＮＰの量；又は（ｉｉ）前記サンプル中のヒトプロＢＮＰの量とｈＢＮＰの量の比とすることができる。測定するモル比又は重量比は試験サンプル中のヒトプロＢＮＰの量とｈＢＮＰの量の比が好ましい。
【００９９】
上記方法に従って測定したヒトプロＢＮＰ／ｈＢＮＰのモル比は約１．０〜約５０．０とすることができる。この範囲は約１．２０〜約４５．０が好ましい。上記方法に従って測定したヒトプロＢＮＰ／ｈＢＮＰの重量比は約２．０〜約１５０．０とすることができる。好ましくは、この範囲は約４．０〜約１４５．０である。上記方法に従って測定したｈＢＮＰ／ヒトプロＢＮＰのモル比は約０．０２〜約０．７２とすることができる。上記方法に従って測定したｈＢＮＰ／ヒトプロＢＮＰの重量比は約０．００７〜約０．２１とすることができる。
【０１００】
本明細書に記載する方法を使用して測定したモル比又は重量比は対象の臨床状態（即ち疾患の重篤度又は進行）の指標を提供するために利用することができる。例えば、本発明の方法を使用して測定したモル比又は重量比は対象が心不全等の疾患を発症しているか否かを判定するために使用することができる。あるいは、本明細書に記載するモル比又は重量比は心不全を発症している対象をニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）分類Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩもしくはＩＶのいずれかに分類すべきであるか又は所定のニューヨーク心臓協会分類に分類された対象が別のニューヨーク心臓協会分類まで進行している（例えば対象は当初にニューヨーク心臓協会分類ＩＩに分類された後に、対象はニューヨーク心臓協会分類ＩＩＩまで進行している）かを判定するために使用することができる。具体的には、
（ａ）対象からの試験サンプルを準備する段階と；
（ｂ）本明細書（例えば上記セクションＢ）に記載するイムノアッセイのいずれかに従って試験サンプル中のｈＢＮＰの量を測定する段階と；
（ｃ）前記サンプル中のヒトプロＢＮＰの量を測定する段階と；
（ｄ）前記サンプル中のヒトプロＢＮＰの量とｈＢＮＰの量のモル比又は重量比を求める段階と；
（ｅ）モル比又は重量比を対象における疾患の重篤度又は進行と相関させる段階を含む方法により、対象における心血管疾患等の疾患の重篤度又は進行を判定することができる。具体的には、モル比又は重量比を対象における心血管疾患の重篤度と相関させる場合には、重篤度が高いときに比は所定レベルよりも低く、重篤度が低いときに比は所定レベルよりも高い。モル比又は重量比を対象における疾患の進行と相関させる場合には、比は進行している対象では初期試験サンプルの比に比較して低下し、比は心血管疾患が進行していない対象又は改善した対象では初期試験サンプル中の比に比較して変化しないか又は上昇する。対象における治療の開始前又は対象における治療の開始後に心血管疾患等の疾患の進行を監視することができる。
【０１０１】
更に、本明細書に記載する方法を使用して測定したモル比又は重量比を使用し、対象のｃｏｒｉｎ又はｆｕｒｉｎ遺伝子が突然変異しているか否かを判定又は判断することができる。ｃｏｒｉｎとｆｕｒｉｎはナトリウム利尿性ペプチドのプロ体（例えばｃｏｒｉｎはプロＡＮＰとプロＢＮＰの両者を開裂し、ｆｕｒｉｎはプロＣＮＰとプロＢＮＰを開裂する）をその活性形（ＡＮＰ，ＢＮＰ，ＣＮＰ）とそのＮ末端不活性ペプチドに開裂することが知られているセリンプロテアーゼである。これらの遺伝子の突然変異の結果、これらの遺伝子を必要とするプロホルモンのプロセシングが不完全になり、活性ペプチドの循環量が低下する可能性がある。従って、ｃｏｒｉｎ又はｆｕｒｉｎが突然変異した対象は突然変異していない対象又は野生型対立遺伝子をもつ対象よりもヒトプロＢＮＰとｈＢＮＰの比が高くなると予想される。このことを利用して心血管疾患の治療が有効であった対象を同定することができ、特に心血管疾患のナトリウム利尿ペプチド誘導体治療が有効であった対象を判定又は同定することができる。例えば、このような方法は、
（ａ）心血管疾患に関連する１種以上の臨床徴候を示す対象（例えばそのｃｏｒｉｎ又はｆｕｒｉｎ遺伝子が突然変異した対象）から試験サンプルを採取する段階と；
（ｂ）本明細書（例えば上記セクションＢ）に記載するイムノアッセイのいずれかに従って試験サンプル中のヒトＢＮＰの量を測定する段階と；
（ｃ）前記サンプル中のヒトプロＢＮＰの量を測定する段階と；
（ｄ）前記サンプル中のヒトプロＢＮＰの量とｈＢＮＰの量のモル比又は重量比を求める段階と；
（ｅ）段階（ｄ）で求めたモル比又は重量比が所定レベルよりも高いか又は低いかを判定する段階と；
（ｆ）段階（ｅ）の判定に基づいてナトリウム利尿ペプチド誘導体治療が対象に有効であったか否かを判断する段階を含むことができる。具体的には、段階（ｄ）で求めた比が所定レベルよりも低い場合には、ナトリウム利尿ペプチド誘導体治療が対象に有効でなかったと判断する。他方、段階（ｄ）で求めた比が所定レベルよりも高い場合には、ナトリウム利尿ペプチド誘導体治療が対象に有効であったと判断する。対象を治療するために使用することができるヒトナトリウム利尿ペプチド誘導体の１例はネシリチドである。このような対象の治療の種類と量は日常的技術を使用して当業者が容易に決定することができる。
【０１０２】
更に、本明細書に記載する方法を使用して測定したモル比又は重量比を使用し、対象が１種以上の医薬組成物を前記対象に投与した結果として心血管合併症を発症しているか否かを判定することができる。例えば、このような方法は、
（ａ）対象に１種以上の医薬組成物を投与する前に対象から第１の試験サンプルを採取する段階と；
（ｂ）本明細書（例えば上記セクションＢ）に記載するイムノアッセイのいずれかに従って試験サンプル中のヒトＢＮＰの量を測定する段階と；
（ｃ）前記サンプル中のヒトプロＢＮＰの量を測定する段階と；
（ｄ）前記サンプル中のヒトプロＢＮＰの量とｈＢＮＰの量のモル比又は重量比を求める段階と；
（ｅ）対象に１種以上の医薬組成物を投与した後に対象から第２の試験サンプルを採取する段階と；
（ｆ）本明細書（例えば上記セクションＢ）に記載するイムノアッセイのいずれかに従って第２の試験サンプル中のヒトＢＮＰの量を測定する段階と；
（ｇ）前記第２の試験サンプル中のヒトプロＢＮＰの量を測定する段階と；
（ｈ）前記第２の試験サンプル中のヒトプロＢＮＰの量とｈＢＮＰの量のモル比又は重量比を求める段階と；
（ｉ）段階（ｄ）で求めたモル比又は重量比を段階（ｈ）のモル比又は重量比と比較する段階を含むことができる。具体的には、段階（ｄ）で求めたモル比又は重量比が段階（ｈ）で求めたモル比又は重量比に比較して変化していない場合には、対象が１種以上の医薬組成物の投与の結果として心血管合併症を発症していないと判定する。段階（ｄ）で求めたモル比又は重量比が段階（ｈ）で求めたモル比又は重量比に比較して変化（上昇又は低下）している場合には、対象が１種以上の医薬組成物の投与の結果として心血管合併症を発症していると判定する。
【０１０３】
Ｄ．方法の応用
本発明は更に、例えば米国特許第５，０８９，４２４号及び５，００６，３０９号に記載され、例えばＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）から市販されているような各種自動及び半自動システム（固相が微粒子からなるものを含む）で使用するように応用することもでき、このようなシステムとしては限定されないが、Ａｂｂｏｔｔ社のＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）、ＡｘＳＹＭ（登録商標）、ＩＭｘ（登録商標）、ＰＲＩＳＭ（登録商標）及びＱｕａｎｔｕｍ（登録商標）ＩＩ機器と、他のプラットフォームが挙げられる。更に、本発明は場合によりサンドイッチイムノアッセイを実施するためのＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社の市販ポイントオブケア（ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標））電気化学イムノアッセイシステムにも応用可能である。免疫センサーとその製造方法及び使い捨て装置における操作方法は例えば米国特許第５，０６３，０８１号、米国特許出願第２００３／０１７０８８１号、米国特許出願第２００４／００１８５７７号、米国特許出願第２００５／００５４０７８号、及び米国特許出願第２００６／０１６０１６４号に記載されている。
【０１０４】
Ｅ．典型的キット
本発明は更に自動及び半自動システム及びプラットフォーム用の各種キットで使用するように応用することもでき、例えばＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）から市販されているものとして、限定されないが、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社のＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）、ＡｘＳＹＭ（登録商標）、ＩＭｘ（登録商標）、ＰＲＩＳＭ（登録商標）及びＱｕａｎｔｕｍ（登録商標）ＩＩ機器）、サンドイッチイムノアッセイを実施するためのＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社の市販ポイントオブケア（ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標））電気化学イムノアッセイシステム、並びに他のプラットフォームが挙げられる。
【０１０５】
このようなキットは本明細書に記載する免疫診断試薬（例えば抗体）の１種以上を含むことができる。より詳細には、キットがイムノアッセイを実施するためのキットである場合には、キットは場合により（１）ｈＢＮＰと結合し、併用時にヒトプロＢＮＰ及びヒトＮＴ−プロＢＮＰに対して低い交差反応性を示す少なくとも１種のキャプチャー抗体及び検出抗体と；（２）イムノアッセイを実施するための１種以上の説明書を含むことができる。キャプチャー抗体として、検出抗体として、又はキャプチャー抗体と検出抗体の両者として本発明の免疫診断試薬をこのような試験キットに含むことができる。例えば、抗体クローン３をキャプチャー抗体としてキットに含むことができ、抗体ＡＭ１を検出抗体としてキットに含むことができる。あるいは、抗体クローン３をキャプチャー抗体としてキットに含むことができ、抗体８．１を検出抗体としてキットに含むことができる。場合により、キットは更に少なくとも１種の較正物質又は対照を含むことができる。任意較正物質又は対照をキットに含むことができる。しかし、較正物質又は対照はｈＢＮＰが好ましく、特に上記配列番号４である。従って、キットは少なくとも１種の較正物質、又は少なくとも１種の対照、又は少なくとも１種の較正物質と少なくとも１種の対照の組合せを含むことができる。
【０１０６】
場合により、キットは更に品質管理用試薬（例えば感受性パネル、較正物質及び陽性対照）を含むことができる。品質管理用試薬の作製は当分野で周知であり、例えば各種免疫診断剤添付シートに記載されている。場合により、例えば既知量のｈＢＮＰ抗原を適切なアッセイバッファー（例えばリン酸緩衝液）にスパイク添加することにより、例えば「低」から「高」までの既知量のｈＢＮＰ抗原を含有する各種量のヒトＢＮＰ感受性パネルメンバーを作製することができる。これらの感受性パネルメンバーは場合によりアッセイ性能特性を確認するために使用され、更に、場合によりイムノアッセイキット試薬の完全性とアッセイ標準化の有用な指標である。ｈＢＮＰ抗原も較正物質として使用することができる。
【０１０７】
キットで提供する抗体はフルオロフォア、放射性部分、酵素、ビオチン／アビジンラベル、クロモフォア、化学発光ラベル等の検出可能なラベルを付加することができ、あるいはキットは抗体の標識用試薬又は抗体（例えば検出抗体）の検出用及び／又は抗原の標識用試薬又は抗原の検出用試薬を含むことができる。抗体、較正物質及び／又は対照は別々の容器で提供してもよいし、適切なアッセイフォーマット、例えばマイクロタイタープレートに予め分配してもよい。
【０１０８】
更に別の態様において、キットは１０６．３、ＢＣ２０３、クローン３、Ｍ１、ＡＭ１、ＡＭ５、２０１．３、ＡＭ８及び８．１から構成される群から選択される１種以上の抗体を含有する免疫診断剤を単独、説明書と共に、又はキット及びキット成分の他の側面と共に含むことができる。
【０１０９】
キットは場合により診断アッセイを実施するため又は品質管理評価を助長するために必要な他の試薬（例えば緩衝液、塩、酵素、酵素補因子、基質、検出試薬等）を含むことができる。試験サンプルの単離及び／又は処理用緩衝液及び溶液（例えば前処理用試薬）等の他の成分もキットに加えてもよい。更に１種以上の他の対照をキットに加えてもよい。キットの成分の１種以上を凍結乾燥し、凍結乾燥成分の再構成に適した試薬をキットに更に加えてもよい。
【０１１０】
キットの各種成分は場合により適切な容器に入れて提供される。上記のように、容器の１種以上はマイクロタイタープレートとすることができる。キットは更にサンプルの保持又は保存用容器（例えば血液又は尿サンプル用容器又はカートリッジ）を含むことができる。必要に応じて、キットは更に場合により反応容器、混合容器及び試薬又は試験サンプルの作製を助長する他の成分を含むことができる。キットは更に試験サンプルの採取補助用の１種以上の機器（例えばシリンジ、ピペット、ピンセット、計量スプーン等）を含むことができる。
【０１１１】
キットは更に場合により使用説明書を含むことができ、紙形態でもよいし、ディスク、ＣＤ、ＤＶＤ等のコンピュータ読取り可能な形態でもよい。
【０１１２】
以下、非限定的な例示として本発明の実施例を記載する。
【実施例１】
【０１１３】
ヒトプロＢＮＰに対する交差反応性が＜１０％のヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ｈＢＮＰ）サンドイッチアッセイ
ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）−ｈＢＮＰ特異的アッセイ（以下、「Ａｒｃ−ｈＢＮＰ」と言う）に備え、常磁性粒子にモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）３−６３１−４３６をコーティングした。このｍＡｂはｈＢＮＰペプチド上のアミノ酸１３−１８を含むアミノ酸配列と結合する。ハイブリドーマ細胞株３−６３１−４３６により産生されるモノクローナル抗体を本明細書では「モノクローナル抗体３−６３１−４３６」又は「クローン３」及び「ＢＮＰ３−６３１−４３６ｍｓ」と言う場合もある。更に、マウスハイブリドーマ細胞株３−６３１−４３６は２００４年１２月２１日付けでＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．に寄託され、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＰＴＡ−６４７６を付与されている。米国特許第６，１６２，９０２号に記載の技術を使用してＢＮＰ３−６３１−４３６ｍｓ  ｍＡｂを常磁性粒子（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｍｈｅｒｓｔ，ＭＡ）にコーティングした。具体的には、ＥＤＡＣカップリングを使用した。ＥＤＡＣは一般に第１級アミンとのアミド結合用カルボキシル活性化剤として使用されている。更に、リン酸基と反応する。また、ペプチド合成、蛋白質と核酸の架橋及び免疫コンジュゲートの作製に使用されている。ＥＤＡＣの化学名は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩である。ＥＤＡＣはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから市販されている。粒子を洗浄し、ＢＳＡをオーバーコートした。これらの粒子を検体の存在下の１回目のインキュベーション中のアッセイでキャプチャー試薬として使用する。
【０１１４】
モノクローナル抗体１０６．３  Ｌ１  Ｂ２４／Ｈ２  ２８８をＮ１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−（３−カルボキシプロピル）アクリジニウム−９−カルボキサミド活性エステル（別称ＣＰＳＰ−アクリジニウムエステル）（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）で標識した。このｍＡｂはｈＢＮＰペプチド上のアミノ酸５−１３を含むアミノ酸配列と結合する。ハイブリドーマ細胞株１０６．３  Ｌ１  Ｂ２４／Ｈ２  ２８８により産生されるモノクローナル抗体を本明細書では「モノクローナル抗体１０６．３  Ｌ１  Ｂ２４／Ｈ２  ２８８」、「１０６．３ＡＭ１」及び「ＡＭ１」と言う場合もある。更に、マウスハイブリドーマ細胞株１０６．３  Ｌ１  Ｂ２４／Ｈ２  ２８８は２００５年９月２０日付けでＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．に寄託され、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＰＴＡ−６９８７を付与されている。アクリジニウムで標識した抗体１０６．３ＡＭ１を２回目のインキュベーション中のアッセイで使用し、粒子と結合したｈＢＮＰペプチドを検出する。標識は抗体１０６．３ＡＭ１と活性化アクリジニウムカルボキサミドエステルの反応により生じた。
【０１１５】
補完として他のキャプチャー試薬（１０６．３ＡＭ１、ＢＣ２０３、２０１．３、８．１、Ｍ１）を作製した。これらの粒子を検体の存在下の１回目のインキュベーション中のアッセイでキャプチャー試薬として使用する。上記の補完として他の検出試薬（８．１、Ｍ１、２０１．３、ＢＣ２０３及びＢＮＰ３−６３１−４３６ｍｓコンジュゲート）を作製した。活性化アクリジニウムカルボキサミドエステルを使用して抗体−アクリジニウムコンジュゲートを作製した。抗体−アクリジニウムコンジュゲートを２回目のインキュベーション中のアッセイで使用し、粒子と結合したｈＢＮＰペプチドを検出する。
【０１１６】
ｈＢＮＰの全イムノアッセイはＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）機器で実施した（この機器は米国特許第５，４６８，６４６号に記載されている）。
【０１１７】
Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）から入手した材料を（米国特許公開第２００５／００１４２８７号に記載されている）ｈＢＮＰ較正物質希釈剤で希釈することにより全長ｈＢＮＰ較正物質（アミノ酸残基１−３２）を作製した。ＨｙＴｅｓｔ  Ｌｔｄ．（Ｔｕｒｋｕ，フィンランド）から入手した全長ヒトプロＢＮＰをｈＢＮＰ較正物質希釈剤で希釈することによりヒトプロＢＮＰ溶液（アミノ酸残基１−１０８）を調製した。回収率％実験で使用した全ヒトプロＢＮＰスパイク添加溶液はｈＢＮＰ較正物質モル濃度に等しい濃度とした。
【０１１８】
キャプチャー抗体をＴｒｉｓ／ＢＳＡ希釈剤で希釈してコーティングした微粒子をサンプリングセンターでサンプリングプローブにより個々の反応容器に注入した。微粒子を入れた各反応容器にｈＢＮＰ較正物質又はヒトプロＢＮＰスパイク添加溶液を含むアリコートを分配し、反応混合物を形成した。反応混合物を約４分間約３７℃の温度でインキュベートした。インキュベーション後に反応混合物をＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）系希釈剤で洗浄し、捕捉されなかったｈＢＮＰ又はヒトプロＢＮＰペプチドを除去した。ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）系希釈剤はＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓから市販されている。
【０１１９】
次にＭＥＳ希釈剤で１５０ｎｇ／ｍＬまで希釈した抗体−アクリジニウムコンジュゲートを反応容器に分配し、得られた混合物を約４分間約３７℃の温度でインキュベートした。インキュベーション後に反応容器をＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）系希釈剤で洗浄し、未結合材料を除去した。
【０１２０】
反応容器に過酸化水素溶液、次いで水酸化ナトリウムを加え、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）機器の化学発光微粒子イムノアッセイ（ＣＭＩＡ）光学アセンブリにより化学発光シグナルを測定した。
【０１２１】
ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）システムはアクリジニウムシグナルを一般に相対発光量（以下、「ｒｌｕ」と言う）として測定する。２回ずつ測定した。下表１ａ〜１ｆと図１に示す結果はｈＢＮＰ較正物質の２回の測定値の平均と典型的較正曲線を示す。
【０１２２】
【表２】
0005570415.tif 000003
【０１２３】
【表３】
0005570415.tif 000004
【０１２４】
【表４】
0005570415.tif 000005
【０１２５】
【表５】
0005570415.tif 000006
【０１２６】
【表６】
0005570415.tif 000007
【０１２７】
【表７】
0005570415.tif 000008
【０１２８】
較正物質曲線が得られたら、スパイク添加試験を実施し、ヒトプロＢＮＰに対する交差反応性を測定した。ＢＮＰ較正物質範囲にわたって等モル濃度でプロＢＮＰのスパイク添加を実施した。図２は選択した抗体組合せのスパイク添加ヒトプロＢＮＰペプチドの平均回収率％を示す。表２ａ〜２ｆはヒトプロＢＮＰの平均読取値濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。
【０１２９】
【表８】
0005570415.tif 000009
【０１３０】
【表９】
0005570415.tif 000010
【０１３１】
【表１０】
0005570415.tif 000011
【０１３２】
【表１１】
0005570415.tif 000012
【０１３３】
【表１２】
0005570415.tif 000013
【０１３４】
【表１３】
0005570415.tif 000014
【０１３５】
これらのデータからプロＢＮＰに対する交差反応性が約２０％又は約１５％及び／又は約１０％未満であり、ヒトＢＮＰに特異的なアッセイ構成であることが確認される。例えば、ＢＮＰ３−６３１−４３６ｍｓ／１０６．３ＡＭ１及びＢＮＰ３−６３１−４３６ｍｓ／８．１の２種類のアッセイ構成はプロＢＮＰに対して１０％未満の交差反応性を示し、従って、ＢＮＰに特異的なアッセイである。
【実施例２】
【０１３６】
ｈＢＮＰに対する交差反応性のないヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ヒトプロＢＮＰ）サンドイッチアッセイ
ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）−ヒトプロＢＮＰ特異的アッセイ（以下、「Ａｒｃ−ヒトプロＢＮＰ」と言う）に備え、上記のように常磁性粒子にｍＡｂ  １０６．３ＡＭ１をコーティングした。米国特許第６，１６２，９０２号に記載の技術を使用して上記のように１０６．３ＡＭ１  ｍＡｂを常磁性粒子（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｍｈｅｒｓｔ，ＭＡ）にコーティングした。これらの粒子を検体の存在下１回目のインキュベーション中のアッセイでキャプチャー試薬として使用する。
【０１３７】
モノクローナル抗体１８Ｈ５をアクリジニウム（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）で標識した。このｍＡｂはヒトプロＢＮＰペプチド上のアミノ酸１３−２７を含むアミノ酸配列と結合し、従って、可能な糖鎖付加領域の外側と結合する。モノクローナル抗体１８Ｈ５はＨｙＴｅｓｔ  Ｌｔｄ．（Ｔｕｒｋｕ，フィンランド）から市販されている。アクリジニウムで標識した抗体１８Ｈ５を２回目のインキュベーション中のアッセイで使用し、粒子と結合したヒトプロＢＮＰペプチドを検出する。標識は抗体１８Ｈ５と活性化アクリジニウムカルボキサミドエステルの反応により生じた。
【０１３８】
ヒトプロＢＮＰの全イムノアッセイはＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）機器で実施した。ＨｙＴｅｓｔ  Ｌｔｄ．（Ｔｕｒｋｕ，フィンランド）から入手した材料をｈＢＮＰ較正物質希釈剤で希釈することによりヒトプロＢＮＰ較正物質（アミノ酸残基１−１０８）を作製した。実施例１からのｈＢＮＰ較正物質溶液をｈＢＮＰスパイク添加溶液として使用した。利用した全ｈＢＮＰ及びヒトプロＢＮＰ溶液は等モル濃度とした。
【０１３９】
１０６．３ＡＭ１キャプチャー抗体をＴｒｉｓ／ＢＳＡ希釈剤で希釈してコーティングした微粒子をサンプリングセンターでサンプリングプローブにより個々の反応容器に注入した。微粒子を入れた各反応容器にヒトプロＢＮＰ較正物質又はｈＢＮＰスパイク添加溶液を含むアリコートを分配し、反応混合物を形成した。反応混合物を約４分間約３７℃の温度でインキュベートした。インキュベーション後に反応混合物をＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）系希釈剤で洗浄し、捕捉されなかったヒトプロＢＮＰ又はｈＢＮＰペプチドを除去した。
【０１４０】
次にＭＥＳ希釈剤で１５０ｎｇ／ｍＬまで希釈した１８Ｈ５抗体−アクリジニウムコンジュゲートを反応容器に分配し、得られた混合物を約４分間約３７℃の温度でインキュベートした。インキュベーション後に反応容器をＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）系希釈剤で洗浄し、未結合材料を除去した。
【０１４１】
反応容器に過酸化水素溶液、次いで水酸化ナトリウムを加え、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）機器の化学発光微粒子イムノアッセイ（ＣＭＩＡ）光学アセンブリにより化学発光シグナルを測定した。
【０１４２】
３回ずつ測定した。下表３と図３に示す結果はヒトプロＢＮＰ較正物質の３回の測定値の平均と典型的較正曲線を示す。
【０１４３】
【表１４】
0005570415.tif 000015
【０１４４】
具体的には、表４の結果はｈＢＮＰの平均読取値濃度（ｐｇ／ｍＬ）とスパイク添加ｈＢＮＰペプチドの回収率％を示す。
【０１４５】
【表１５】
0005570415.tif 000016
【０１４６】
従って、以上から明らかなように、１０６．３ＡＭ１と１８  Ｈ５によるアッセイはｈＢＮＰに対する交差反応性がなく、ヒトプロＢＮＰのみを検出する。
【実施例３】
【０１４７】
臨床サンプル中のヒトプロＢＮＰ／ｈＢＮＰ比の測定
２０個のＥＤＴＡ血漿検体をＡＲＵＰ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ，ＵＴ）から入手した。サンプルはドライアイスで梱包して輸送し、使用時まで−７０℃で保存した。サンプルは医師がＢＮＰ試験用に依頼した各種年齢の男女対象から採取した。
【０１４８】
ＢＮＰ３−６３１−４３６ｍｓ微粒子／１０６．３ＡＭ１アクリジニウムコンジュゲート組合せを使用して上記のようにＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）−ｈＢＮＰ特異的測定を実施した。１０６．３ＡＭ１微粒子／１８Ｈ５アクリジニウムコンジュゲート組合せを使用して上記のようにＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）−ヒトプロＢＮＰ特異的測定を実施した。ｈＢＮＰ及びヒトプロＢＮＰの全イムノアッセイは上記のように作製したＢＮＰ較正物質（アミノ酸残基１−３２）とヒトプロＢＮＰ較正物質（アミノ酸残基１−１０８）を使用してＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）機器で実施した。
【０１４９】
全ｈＢＮＰ及びヒトプロＢＮＰ較正物質は検体特異的キットを使用して２回ずつ測定し、２点間データ減少法を使用してフィットさせ、各検体の較正曲線を作成した。夫々の較正曲線から読取った単一測定値から各患者検体におけるｈＢＮＰとプロＢＮＰの濃度を求めた。各患者検体におけるｈＢＮＰ及びヒトプロＢＮＰ濃度の読取値を下表５に示す。具体的には、表５の結果は患者検体におけるｈＢＮＰ又はヒトプロＢＮＰをｐｇ／ｍＬ又はピコモル（ｐＭ）で表す。
【０１５０】
【表１６】
0005570415.tif 000017
【０１５１】
ヒトプロＢＮＰとＢＮＰ又はｈＢＮＰとヒトプロＢＮＰのモル比と重量比も測定した。プロＢＮＰ／ＢＮＰのモル比（上記表５参照）は１．３９〜５．７４であった。ＢＮＰ／プロＢＮＰのモル比は０．１７〜０．７２であった。比の概算４倍範囲を示した。プロＢＮＰ／ＢＮＰの重量比は４．７９〜１９．７２であり、ＢＮＰ／プロＢＮＰの重量比は０．０５１〜０．２０９であった。この場合も、比の概算４倍範囲を示した。
【実施例４】
【０１５２】
臨床サンプル中のヒトプロＢＮＰ／ｈＢＮＰモル比及び重量比の測定
ニューヨーク心臓協会分類Ｉ−ＩＶに分類した７３個のＨＦ血漿検体をＰｒｏＭｅｄＤｘ，ＬＬＣ（Ｎｏｒｔｏｎ，ＭＡ）から入手した。サンプルはドライアイスで梱包して輸送し、使用時まで−７０℃で保存した。
【０１５３】
クローン３微粒子／１０６．３ＡＭ１アクリジニウムコンジュゲート組合せを使用して上記のようにＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）−ｈＢＮＰ特異的測定を実施した。１０６．３ＡＭ１微粒子／１８Ｈ５アクリジニウムコンジュゲート組合せを使用して上記のようにＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）−ヒトプロＢＮＰ特異的測定を実施した。ｈＢＮＰ及びヒトプロＢＮＰの全イムノアッセイは上記のように作製したＢＮＰ較正物質（アミノ酸残基１−３２）とヒトプロＢＮＰ較正物質（アミノ酸残基１−１０８）を使用してＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）機器で実施した。
【０１５４】
全ｈＢＮＰ及びヒトプロＢＮＰ較正物質は検体特異的キットを使用して２回ずつ測定し、２点間データ減少法を使用してフィットさせ、各検体の較正曲線を作成した。夫々の較正曲線から読取った単一測定値から各患者検体におけるｈＢＮＰとヒトプロＢＮＰの濃度を求めた。各患者検体におけるｈＢＮＰ及びヒトプロＢＮＰ濃度の読取値を下表６Ａ及びＢに示す。ヒトプロＢＮＰ／ｈＢＮＰ及びｈＢＮＰ／ヒトプロＢＮＰのモル比と重量比も表６Ａ及びＢに示す。図４は測定したヒトプロＢＮＰに対するｈＢＮＰの濃度のプロットを示し、数値間の一般相関を示す。具体的には、図４の結果は患者検体におけるｈＢＮＰ又はヒトプロＢＮＰをｐＭで表す。各ＮＹＨＡ分類のヒトプロＢＮＰ／ｈＢＮＰモル比及び重量比の平均値を表７Ａ及びＢに示す。疾患の重篤度と試験したＮＹＨＡ  ＩＶサンプル数が少ない（ｎ＝３）ことから、ＮＹＨＡクラスＩＩＩ及びＩＶの患者は同一分類とする。
【０１５５】
【表１７】
0005570415.tif 000018
【０１５６】
【表１８】
0005570415.tif 000019
【０１５７】
【表１９】
0005570415.tif 000020
【０１５８】
【表２０】
0005570415.tif 000021
【０１５９】
ニューヨーク心臓協会分類Ｉ−ＩＶにより心不全に分類される対象ではヒトプロＢＮＰとｈＢＮＰの比に相関が認められ、即ち臨床徴候により測定した疾患重篤度の上昇（即ちＮＹＨＡクラスの上昇）に伴ってヒトプロＢＮＰ／ｈＢＮＰ比（モル又は重量）の低下が認められた。
【０１６０】
当業者に容易に理解されるように、本発明は目的を実施し、記載した結果と利点を得ると共に、それらに内在する結果と利点を得るために好適である。本明細書に記載する分子複合体と方法、手順、処理、分子、特定化合物は好ましい態様の現在の代表例であり、例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。当業者に容易に理解されるように、発明の範囲と精神から逸脱せずに本発明に種々の置換及び変更を加えることができる。
【０１６１】
本明細書に引用した全特許及び刊行物は本発明が属する分野の当業者の技術水準を示すものである。
【０１６２】
本明細書に具体的に記載する発明は本明細書に具体的に開示しない要素、限定の不在下で適切に実施することができる。従って、例えば、本明細書の各箇所で「〜を含む」、「〜から本質的に構成される」及び「〜から構成される」なる用語はいずれも相互に置き換えることができる。利用した用語及び表現は説明として使用するものであり、限定ではなく、このような用語及び表現の使用において表示及び記載する特徴又はその部分の等価物を排除する意図はなく、請求する発明の範囲内で種々の変更が可能であるとみなされる。従って、好ましい態様と非必須の特徴により本発明を具体的に開示したが、当然のことながら、当業者は本明細書に開示する概念の変更及び変形も採用することができ、このような変更及び変形も特許請求の範囲に定義するような本発明の範囲に含むものとみなす。
【図１】
0005570415.tif 000022
【図２】
0005570415.tif 000023
【図３】
0005570415.tif 000024
【図４】
0005570415.tif 000025
【配列表】
0005570415000001.app