(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般構造
(Ｍ-Ｌ-Ｏ-Ｎ=ＣＨ)ｎ-Ｐ-(ＣＨ=Ｎ-Ｏ-Ｌ'-Ｍ')ｍ      (式Ｉ)
[上式中、Ｍ及び存在する場合はＭ'は、独立して、修飾された糖タンパク質の分子量を増加させるためのポリマー部分であり、Ｌ及びＬ'は、独立して二価リンカーを表し、Ｐは糖タンパク質の一又は複数の酸化グルカン末端を有する糖タンパク質を表し、Ｏ、Ｎ、Ｃ及びＨは、それぞれ酸素、窒素、炭素及び水素原子を表し、ｎは１−１０であり、ｍは０−５０である]
を有する修飾された糖タンパク質を調製する方法であって、
ａ）糖タンパク質Ｐ＊に存在する少なくとも一のグリカン末端を過ヨウ素酸イオンで酸化させ、ここでＰ＊は一又は複数のアルデヒド基を含む糖タンパク質Ｐ-(ＣＨＯ)ｎ＋ｍを得るための複数のグリコフォームを表し、
ｂ）Ｐ-(ＣＨＯ)ｎ＋ｍをＭ-Ｌ-Ｏ-ＮＨ２と反応させて構造(Ｍ-Ｌ-Ｏ-Ｎ=ＣＨ)ｎ-Ｐ-(ＣＨＯ)ｍの修飾された糖タンパク質を得、
ｃ）構造(Ｍ-Ｌ-Ｏ-Ｎ=ＣＨ)ｎ-Ｐ-(ＣＨＯ)ｍを有する糖タンパク質中の任意の未反応アルデヒド基をＭ'-Ｌ'-Ｏ-ＮＨ２と反応させて構造(Ｍ-Ｌ-Ｏ-Ｎ=ＣＨ)ｎ-Ｐ-(ＣＨ=Ｎ-Ｏ-Ｌ'-Ｍ')ｍの修飾された糖タンパク質を得る
工程を含み、ここで、該過ヨウ素酸イオンは、糖タンパク質に存在する非還元グリカン末端の数に対して０．１−５当量の量で存在しており、該修飾された糖タンパク質は、出発糖タンパク質Ｐ＊と比較して改善された薬理学的性質を有し、その機能活性は維持されており、ＰはＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ及びＦＩＸから選択される方法。
【請求項２】
Ｍ及び／又はＭ'が、一又は複数のカルボン酸、アミン、スルホン酸、ホスホン酸、又はその組合せを含みうる低分子量の有機荷電基；低分子量の中性親水性分子；低分子量の疎水性分子；２−４０ｋＤａの平均分子量を有するポリエチレングリコール；詳細が明らかな精密ポリマー；実質的に非免疫原性のポリペプチド；及び高分子量の有機ポリマーからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｍ及び／又はＭ'が、シクロデキストリン、又は分枝ポリエチレン鎖；脂肪酸又はコール酸又はその誘導体；７００Ｄａ〜２０ｋＤａの範囲の正確な分子量のデンドリマー；及びアルブミン、抗体又はＦｃドメインを含んでいる抗体の一部からなる群から選択される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｍ及び／又はＭ'が、デンドリマー、ポリアルキレングリコール(ＰＡＧ)を含むポリアルキレンオキシド(ＰＡＯ)、ポリビニルアルコール(ＰＶＡ)、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン・無水マレイン酸コポリマー、ポリスチレン・無水マレイン酸コポリマー、デキストラン、カルボキシメチル-デキストラン、ＨＥＳ、ＭＰＣ、及びＰＨＦからなる群から選択される請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
Ｍ及び／又はＭ'が、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリプロピレングリコール(ＰＰＧ)、及び分枝状ＰＥＧからなる群から選択される請求項４に記載の方法。
【請求項６】
糖タンパク質が第ＶＩＩ因子ポリペプチドである請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
修飾された糖タンパク質が、未修飾の糖タンパク質の生物学的利用能の少なくとも１１０％の生物学的利用能を示す請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
修飾された糖タンパク質が、未修飾の糖タンパク質の生物学的利用能の少なくとも１２０％の生物学的利用能を示す請求項７に記載の方法。
【請求項９】
修飾された糖タンパク質が、未修飾の糖タンパク質の生物学的利用能の少なくとも１３０％の生物学的利用能を示す請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
修飾された糖タンパク質が、未修飾の糖タンパク質の生物学的利用能の少なくとも１４０％の生物学的利用能を示す請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記過ヨウ素酸イオンが、糖タンパク質に存在する非還元グリカン末端の数に対して、０．１−１当量の量で存在する請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改善された薬剤の調製、特に改善された薬力学的及び薬物動態学的特性を有する修飾された糖タンパク質の調製に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体由来のタンパク質は、高度な効能とその天然リガンドに対する高度な選択性を有していることが多いために治療剤としての期待が高い。生物は明確な排出メカニズムとその排出のための代謝経路を既に有しているために、生体由来であることは、それらが無毒性であり、一般的な低分子薬剤よりも使用が安全である蓋然性が増すことになる。このことを、現在タンパク質は様々な異なる発現系中において組換えＤＮＡ技術により生産でき、大規模生産が可能であるという事実と併せると、タンパク質は理想的な薬剤候補になる。しかしながら、治療的に関心のあるタンパク質、例えばホルモン、可溶性レセプター、サイトカイン、酵素等は、体内での循環半減期が短いことが多く、これが一般的にその治療的有用性を低下させる。
【０００３】
治療用タンパク質は多くの経路で循環から排除される。いくつかの薬理活性タンパク質では、循環からの排除を媒介する特異的レセプターが存在している。グリコシル化されるタンパク質は、肝臓において、その分子の糖鎖に対してのみ特異性を示すレクチン様レセプターにより除去されうる。約５０ｋＤａ以下のタンパク質及びペプチド(特に非グリコシル化タンパク質及びペプチド)の腎臓による非特異的クリアランスについても文献化されている。アシアロ糖タンパク質が、天然糖タンパク質又はグリコシル化を欠くタンパク質よりも、肝臓によってより素早く除去されることが記載されている(Bocci (1990) Advanced Drug Delivery Reviews 4: 149)。また治療用タンパク質は、アミノ酸配列又は３次元構造における小さな変化でさえ治療用タンパク質を免疫原性にしうるので、それらが自己タンパク質と完全には同一ではない場合に、免疫系によって循環から排除される。さらに治療用タンパク質により誘導される免疫応答は、循環からの除去促進とは別に、様々な所望されない効果を有するおそれがある：抗体は、治療用タンパク質の結合部位への接近を立体的に阻害することによって治療効果を妨害するか又はブロックし、誘導された抗体が自己タンパク質と交差反応し得、それによって自己免疫反応を生じるおそれがある。また、治療用タンパク質を、ある種の細胞、器官又は組織を標的にするように修飾することにも関心が寄せられている。特殊化細胞又は組織中に存在する分子に対して高い親和性を有するリガンド分子へのタンパク質のコンジュゲート又は融合は、この効果を達成する既知の一方法である。
【０００４】
よって、長時間にわたる血清半減期及び／又は低減した免疫原性及び／又は改善された薬理学的性質を示す修飾された(治療用)タンパク質の調製方法の提供に対して一般的必要性がある。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、可溶性糖タンパク質誘導体の循環半減期の延長をもたらし、よって治療又は予防のための循環糖タンパク質の治療的有効レベルの維持に必要な注入頻度及び注射物質の量を減少させる。ある種の治療的に活性な糖タンパク質ではインビボ血漿半減期が短いことは、治療又は予防に必要とされるであろう可溶性タンパク質の量及び頻度のために望ましいことではない。本発明は、糖タンパク質構造に対する有効な変化を有し、生物活性が実質的に維持された糖タンパク質の循環半減期を延長させる手段を提供する。
【０００６】
本発明は、ポリマー部分のオキシムが糖タンパク質のグリコシル基に導入され、該修飾された糖タンパク質が、出発糖タンパク質と比較して改善された薬理学的性質を有する糖タンパク質誘導体を調製する簡便な方法を提供する。
【０００７】
よって、本発明は、一般構造
(Ｍ-Ｌ-Ｏ-Ｎ=ＣＨ)ｎ-Ｐ-(ＣＨ=Ｎ-Ｏ-Ｌ'-Ｍ')ｍ      (式Ｉ)
[上式中、Ｍ及び場合によってはＭ'は、独立して、修飾された糖タンパク質の分子量を増加させるためのポリマー部分であり、Ｌ及びＬ'は、独立して二価リンカーを表し、Ｐは該糖タンパク質の一又は複数の酸化グルカン末端を有する糖タンパク質を表し、Ｏ、Ｎ、Ｃ及びＨは、それぞれ酸素、窒素、炭素及び水素原子を表し、ｎは１−１０であり、ｍは０−５０である]
を有する修飾された糖タンパク質の調製方法に関し、該方法は、
ａ）糖タンパク質Ｐ＊に存在する少なくとも一のグリカン末端を過ヨウ素酸イオンで酸化させ、ここでＰ＊は、一又は複数のアルデヒド基を含む糖タンパク質Ｐ-(ＣＨＯ)ｎ＋ｍを得るための複数のグリコフォームを表し、
ｂ）Ｐ-(ＣＨＯ)ｎ＋ｍをＭ-Ｌ-Ｏ-ＮＨ２と反応させて、構造(Ｍ-Ｌ-Ｏ-Ｎ=ＣＨ)ｎ-Ｐ-(ＣＨＯ)ｍの修飾糖タンパク質を得、
ｃ）場合によっては、構造(Ｍ-Ｌ-Ｏ-Ｎ=ＣＨ)ｎ-Ｐ-(ＣＨＯ)ｍの糖タンパク質中の任意の未反応アルデヒド基をＭ'-Ｌ'-Ｏ-ＮＨ２と反応させて、構造(Ｍ-Ｌ-Ｏ-Ｎ=ＣＨ)ｎ-Ｐ-(ＣＨ=Ｎ-Ｏ-Ｌ'=Ｍ')ｍの修飾糖タンパク質を得る；
工程を含み、ここで前記過ヨウ素酸イオンは、糖タンパク質に存在する非還元グリカン末端の数に対して、５０当量未満の量で存在しており、該修飾糖タンパク質は、出発糖タンパク質Ｐ＊と比較して改善された薬理学的性質を有し、その機能活性は維持している。
【０００８】
Ｐ-(ＣＨＯ)ｎ＋ｍ中のアルデヒド基又はアルデヒド基群は、そのジェミナルなジオール型として、又はヘミアセタール(類)として一過的に存在し得ることが理解される。
また、Ｐ-及び-Ｐ-とは、糖タンパク質が、前記糖タンパク質の一又は複数の酸化グルカン末端を有し、化学結合が該一又は複数のグルカン末端でなされていることが理解される。
【０００９】
さらに本発明は、本発明の方法により得ることができる修飾された糖タンパク質に関する。
よって、本発明は、一般構造
(Ｍ-Ｌ-Ｏ-Ｎ=ＣＨ)ｎ-Ｐ-(ＣＨ=Ｎ-Ｏ-Ｌ'-Ｍ')ｍ      (式Ｉ)
[上式中、Ｍ及び場合によってはＭ'は、独立して、修飾された糖タンパク質の分子量を増加させるためのポリマー部分であり、Ｌ及びＬ'は、独立して二価リンカーを表し、Ｐは該糖タンパク質の一又は複数の酸化グルカン末端を有する糖タンパク質を表し、Ｏ、Ｎ、Ｃ及びＨは、それぞれ酸素、窒素、炭素及び水素原子を表し、ｎは１−１０であり、ｍは０−５０である]
を有する修飾された糖タンパク質に関し、該修飾された糖タンパク質は、出発糖タンパク質Ｐ＊と比較して改善された薬理学的性質を有し、その機能活性は維持されている。
また本発明は、一般構造
(Ｍ-Ｌ-Ｏ-Ｎ=ＣＨ)ｎ-Ｐ-(ＣＨ=Ｎ-Ｏ-Ｌ'-Ｍ')ｍ      (式Ｉ)
[上式中、Ｍ及び場合によってはＭ'は、独立して、修飾された糖タンパク質の分子量を増加させるためのポリマー部分であり、Ｌ及びＬ'は、独立して二価のリンカーを表し、Ｐは該糖タンパク質の一又は複数の酸化グルカン末端を有する糖タンパク質を表し、Ｏ、Ｎ、Ｃ及びＨは、それぞれ酸素、窒素、炭素及び水素原子を表し、ｎは１−１０であり、ｍは０−５０である]
を有する複数の修飾された糖タンパク質を含む調製物に関し、該修飾された糖タンパク質は、出発糖タンパク質Ｐ＊と比較して改善された薬理学的性質を有し、その機能活性は維持されている。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
「複数の修飾された糖タンパク質」とは、調製物内の個々の修飾された糖タンパク質分子が、厳密に同一の化学構造を有しておらず、個々の糖タンパク質分子内でかなり多様であることと理解される。出発糖タンパク質Ｐ＊は、典型的には異なるグリコフォームで存在する。「グリコフォーム」とは、翻訳後修飾又は共翻訳修飾のいずれかにより、それらに異なった多糖類が結合した同一タンパク質のタンパク質アイソフォームを意味する。調製に伴ういくつかの分子は、全く修飾されていなくてもよく、またいくつかの分子は、一以上のポリマー部分で修飾されていてもよく、これがまた各個々の糖タンパク質の異なるグリカン末端で修飾されてもよい。よって、Ｐ＊は複数のタンパク質Ｐグリコフォームであると考えられる。
【００１１】
「非還元グリカン末端」又は「非還元グリカン末端群」なる用語は、フェーリング液又はトレンス試薬等を使用して、これらの試薬で酸化されるオリゴ糖の還元末端と対照的に、還元されないオリゴ糖の末端又は末端群を意味する。糖タンパク質では、オリゴ糖は、通常はグリコシド-又はグリコサミノ結合を介してその還元末端にてタンパク質に結合している。オリゴ糖の非還元末端には、例示であって限定するものではないが、複合Ｎ-及びＯ-グリカン上の末端シアル酸残基；ハイブリッドＮ-グリカン上の末端シアル酸残基；高マンノースＮ-グリカン上の末端マンノース残基；複合Ｎ-及びＯ-グリカン上の末端ガラクトース残基；ハイブリッドＮ-グリカン上の末端ガラクトース残基；複合Ｎ-及びＯ-グリカン上の末端Ｎ-アセチルガラクトース残基；ハイブリッドＮ-グリカン上の末端Ｎ-アセチルガラクトース残基；複合Ｎ-及びＯ-グリカン上の末端Ｎ-アセチルグルコサミン残基；ハイブリッドＮ-グリカン上の末端Ｎ-アセチルグルコサミン残基；完全又は部分的に露出したトリマンノースコア残基上の末端マンノース残基；コアフコース残基を含む末端フコース残基；末端グルコース及びキシロース残基が含まれる。
【００１２】
出発糖タンパク質Ｐ＊は、特定の末端グリカン部分が過ヨウ素酸反応に対して好ましいものであるならば、場合によってはシアリダーゼ、ガラクトシダーゼ、Ｎ-アセチルグルコサミンダーゼ、マンノシダーゼ又はフコシダーゼでトリミングされてもよい。また、グリカン部分は、シアリルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、Ｎ-アセチルグルコサミノシルトランスフェラーゼ；Ｎ-アセチルガラクトサミノシルトランスフェラーゼ；マンノシルトランスフェラーゼ、及びそれぞれの糖供与体、例えばＣＭＰ-Ｓｉａ；ＵＤＰ-Ｇａｌ；ＧＤＰ-Ｆｕｃ等を使用し、リモデリングされてもよい。
【００１３】
糖タンパク質のグリカン末端を酸化するための過ヨウ素酸塩の使用はよく文献化されており、タンパク質コンジュゲートを調製する一般的な方法として使用されている。公開番号WO 06/071801の国際特許出願には、フォン・ヴィレブランド因子のグリカン末端の酸化、及びタンパク質のペグ化型を調製するためのその応用について記載されている。公開番号WO 00/23114を有する国際特許出願には、インターフェロン-β-１ａのペグ化型を調製するための方法が記載されており、公開番号WO 92/16555を有する国際特許出願には、タンパク質にＰＥＧ部分をコンジュゲートするためのいくつかの方法が記載されており、そこには、過ヨウ素酸塩を使用するグリカン末端上でのアルデヒド官能基の形成が記載されている。
【００１４】
糖部分におけるジオールの開裂の他に、過ヨウ素酸塩は、メチオニン等のアミノ酸側鎖を酸化させ、セリン及びスレオニン等のアミノアルコール部分を含むＮ末端アミノ酸を開裂させることが知られている。ある場合には、メチオニンの側鎖の酸化により、タンパク質の生物学的プロファイルの変化が、特に生物活性の変化がもたらされうる。Kornfelt, T; Persson, E.及びPalm, L.; Archives of Biochemistry and Biophysics Vol. 363 , No. 1 pp. 43-54 (1999)に述べられているように、組換え第ＦＶＩＩ凝固因子(例えば、 ＦＶＩＩａ)の活性化型は、メチオニン酸化に対して非常に感受性であることが証明されている。過酸化水素を用いてメチオニン２９８及び３０６を酸化させた後では、解離定数が３倍に増加していることに見られるように、可溶型組織因子(ＴＦ)へのＦＶＩＩａの結合はさらに弱化している。また、可溶型ＴＦとの複合体におけるメチオニン酸化ＦＶＩＩａのアミド分解活性は、天然のＦＶＩＩａ-ＴＦ複合体のものと比較して８０％しかない。
【００１５】
驚くことではないが、これらの知見と一致して、我々は、文献に一般的に記載されており、上述された過ヨウ素酸塩媒介コンジュゲート法を使用する場合、既知のペプチド基質を開裂させる能力により測定されるＦＶＩＩａのペプチド分解活性の有意で、ある場合には完全な消失が観察されることを見出した。よって、ＰＥＧ部分等の過ヨウ素酸塩媒介性コンジュゲーションのための既知の方法は、酸化に対して高度に敏感な糖タンパク質で作業をする場合に、その使用が非常に制限される。この発明は、この問題を解消する一般的な方法を記載しており、よって、保持された機能活性を有するオキシムコンジュゲート糖タンパク質の調製を可能にする初めての方法を開示している。
【００１６】
当量に関し、低濃度を適用する場合−糖タンパク質に存在する非還元グリカン末端の数に対する過ヨウ素酸塩の化学量論量が近い場合、生物活性は保存可能である。驚くべきことに、化学量論量の過ヨウ素酸イオンを用いた酸化、続くコンジュゲート化学は、許容されるタイムフレーム内で続行され、中程度から良好な収率で、高純度の生物学的機能を有するタンパク質コンジュゲートが提供される。
【００１７】
一実施態様では、本発明は、修飾された糖タンパク質を調製する方法に関し、ここで該糖タンパク質は、Ｎ-グリコシル化及び／又はＯ-グリコシル化されており、及び／又はシアル酸部分を含む。
【００１８】
さらなる実施態様では、本発明は、修飾された糖タンパク質を調製する方法に関し、ここで該方法は、修飾された糖タンパク質が出発糖タンパク質と比較して改善された薬理学的性質を有していることを確認するさらなる工程を含む。
【００１９】
一実施態様では、改善された薬理学的性質は、生物学的利用能の増加、機能的インビボ半減期の増加、インビボ血漿半減期の増加、免疫原性の低下、プロテアーゼ耐性の増加、アルブミンに対する親和性の増加、レセプターに対する親和性の改善、保存安定性の増加、機能的インビボ半減期の低減、インビボ血漿半減期の低減からなる群から選択される。
【００２０】
一実施態様では、半減期の増加は、Ｍ及び／又はＭ'を、腎クリアランスが低減され又は消失されるように分子量を増加させる基にするか、及び／又はＭ及び／又はＭ'を肝臓レセプターに対する結合パートナーをマスクする基にすることにより得られる。
一実施態様では、免疫原性の低下は、Ｍ及び／又はＭ'を免疫原性部位に結合する抗体をブロックする基にすることにより得られる。
一実施態様では、アルブミンに対する親和性の改善は、Ｍ及び／又はＭ'をアルブミンに対して高い親和性を有する基にすることにより得られる。
一実施態様では、レセプターに対する親和性の改善は、Ｍ及び／又はＭ'を標的細胞における表面レセプターに特異的に結合する基にすることにより得られる。
【００２１】
さらなる実施態様では、本発明は、一般構造
(Ｍ-Ｌ-Ｏ-Ｎ=ＣＨ)ｎ-Ｐ-(ＣＨ=Ｎ-Ｏ-Ｌ'-Ｍ')ｍ      (式Ｉ)
[上式中、Ｍ及び／又はＭ'は、一又は複数のカルボン酸、アミン類、スルホン酸、ホスホン酸又はその組合せを含有してよい低分子量の有機荷電基；低分子量の中性親水性分子、例えばシクロデキストリン、又は場合によっては分枝状のポリエチレン鎖；低分子量の疎水性分子、例えば脂肪酸又はコール酸又はその誘導体；２−４０ｋＤａの平均分子量を有するポリエチレングリコール；十分に定義された精密ポリマー、例えば７００Ｄａ〜２０ｋＤａの範囲の正確な分子量を有するデンドリマー；実質的に非免疫原性のポリペプチド、例えばアルブミン、抗体又はＦｃドメインを含んでいてもよい抗体の一部；及び高分子量の有機ポリマーからなる群から選択される]
を有する修飾された糖タンパク質を調製する方法に関する。
【００２２】
さらなる実施態様では、本発明は、一般構造
(Ｍ-Ｌ-Ｏ-Ｎ=ＣＨ)ｎ-Ｐ-(ＣＨ=Ｎ-Ｏ-Ｌ'-Ｍ')ｍ      (式Ｉ)
[上式中、Ｍ及び／又はＭ'は、デンドリマー、ポリアルキレングリコール(ＰＡＧ)を含むポリアルキレンオキシド(ＰＡＯ)、例えばポリエチレングリコール(ＰＥＧ)及びポリプロピレングリコール(ＰＰＧ)、分枝状ＰＥＧ、ポリビニルアルコール(ＰＶＡ)、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン・無水マレイン酸コポリマー、ポリスチレン・無水マレイン酸コポリマー、デキストラン、カルボキシメチル-デキストランからなる群から選択される]
を有する修飾された糖タンパク質を調製する方法に関する。
【００２３】
さらなる実施態様では、Ｍ及び／又はＭ'は、ヒドロキシアルキルデンプン(ＨＡＳ)及びヒドロキシエチルデンプン(ＨＥＳ)、例えば Clin Pharmacokinet 2005; 44 (7): 681-699に記載され、WO2006094810A2に開示されている化合物から選択される；ＨＥＳの適切に活性化された形態は、出典明示によりここに導入されるWO2005092369A2に開示されている。
さらなる実施態様では、Ｍ及び／又はＭ'は、ポリ(１-ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール)(ＰＨＦ)又は類似の分解デキストラン類、例えば出典明示によりここに含まれるWO2006094810A2に記載されているものであり、そこでは、ポリマーの適切に活性化された形態が開示されている。
さらなる実施態様では、Ｍ及び／又はＭ'は、双性イオン性ポリマー、例えば出典明示によりここに含まれるWO03062290A1に開示されているものから選択される。特定の実施態様では、ポリマーは２-メタクリロイルオキシ-２'-エチルトリメチルアンモニウムホスフェート内塩(ＭＰＣ)である。
【００２４】
さらなる実施態様では、本発明は、一般構造
(Ｍ-Ｌ-Ｏ-Ｎ=ＣＨ)ｎ-Ｐ-(ＣＨ=Ｎ-Ｏ-Ｌ'-Ｍ')ｍ      (式Ｉ)
[上式中、Ｍ及び／又はＭ'は、血清タンパク質結合リガンド、及び生理学条件下にて帯電特性を変化させる部分を有する小有機分子、グリカンのレセプターへの結合を阻害する構造、及びグリカン特異的認識を防止する中性置換基からなる群から選択される]
を有する修飾された糖タンパク質を調製する方法に関する。
【００２５】
さらなる実施態様では、本発明は、一般構造
(Ｍ-Ｌ-Ｏ-Ｎ=ＣＨ)ｎ-Ｐ-(ＣＨ=Ｎ-Ｏ-Ｌ'-Ｍ')ｍ      (式Ｉ)
[上式中、Ｐは、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＩＩ、ＦＶ、プロテインＣ、プロテインＳ、ｔＰＡ、ＰＡＩ-１、組織因子、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、ＦＸＩＩＩ、並びにその配列変異体；免疫グロブリン、サイトカイン、例えばインターロイキン、α-、β-、及びγ-インターフェロン、コロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、ホスホリパーゼ活性化タンパク質(ＰＵＰ)、インスリン、植物タンパク質、例えばレクチン及びリシン、腫瘍壊死因子及び関連する対立遺伝子、腫瘍壊死因子レセプターの可溶型、インターロイキンレセプター及びインターロイキンレセプターの可溶型、増殖因子、例えば組織増殖因子、例えばＴＧＦａ’ｓ又はＴＧＦｐｓ、及び表皮増殖因子、ホルモン、ソマトメジン、エリスロポエチン、色素性ホルモン、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン類、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノーゲンアクチベータ、及び免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、及びＩｇＤ、及びその断片、又は上述のタンパク質又はその断片の任意のものを含む任意の融合タンパク質から選択される]
を有する修飾された糖タンパク質を調製する方法に関する。
【００２６】
さらなる実施態様では、本発明は、一般構造
(Ｍ-Ｌ-Ｏ-Ｎ=ＣＨ)ｎ-Ｐ-(ＣＨ=Ｎ-Ｏ-Ｌ'-Ｍ')ｍ      (式Ｉ)
[上式中、糖タンパク質は第ＶＩＩ因子ポリペプチドである]
を有する修飾された糖タンパク質を調製する方法に関する。
さらなる実施態様では、本発明は、一般構造
(Ｍ-Ｌ-Ｏ-Ｎ=ＣＨ)ｎ-Ｐ-(ＣＨ=Ｎ-Ｏ-Ｌ'-Ｍ')ｍ      (式Ｉ)
[上式中、糖タンパク質は野生型ヒト第ＶＩＩ因子のアミノ酸配列を有する]
を有する修飾された糖タンパク質を調製する方法に関する。
さらなる実施態様では、本発明は、一般構造
(Ｍ-Ｌ-Ｏ-Ｎ=ＣＨ)ｎ-Ｐ-(ＣＨ=Ｎ-Ｏ-Ｌ'-Ｍ')ｍ      (式Ｉ)
[上式中、糖タンパク質は第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドである]
を有する修飾された糖タンパク質を調製する方法に関する。
ここで使用される場合、「第ＶＩＩＩ因子」又は「ＦＶＩＩＩポリペプチド」には、ＦＶＩＩＩ：ＦＶＩＩＩのＣ、Ｂ-ドメイン欠失型、アミノ酸変異体及びその組合せが含まれる。
【００２７】
さらなる実施態様では、本発明は、一般構造
(Ｍ-Ｌ-Ｏ-Ｎ=ＣＨ)ｎ-Ｐ-(ＣＨ=Ｎ-Ｏ-Ｌ'-Ｍ')ｍ      (式Ｉ)
を有する修飾された糖タンパク質を調製する方法に関し、ここで修飾された糖タンパク質は、本明細書に記載されるような凝固アッセイ、タンパク質分解アッセイ、又はＴＦ結合アッセイの一又は複数で試験された場合、未修飾の第ＶＩＩ因子ポリペプチドの特定の活性の、少なくとも約１０％、例えば少なくとも約２０％、例えば少なくとも約４０％、例えば少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、例えば少なくとも約１００％を示す。
【００２８】
さらなる実施態様では、本発明は、一般構造
(Ｍ-Ｌ-Ｏ-Ｎ=ＣＨ)ｎ-Ｐ-(ＣＨ=Ｎ-Ｏ-Ｌ'-Ｍ')ｍ      (式Ｉ)
を有する修飾された糖タンパク質を調製する方法に関し、ここで修飾された糖タンパク質は、未修飾の糖タンパク質の生物学的利用能の少なくとも約１１０％、例えば少なくとも約１２０％、約１３０％、又は未修飾の糖タンパク質の生物学的利用能の少なくとも約１４０％の生物学的利用能を示す。
【００２９】
さらなる実施態様では、本発明は、一般構造
(Ｍ-Ｌ-Ｏ-Ｎ=ＣＨ)ｎ-Ｐ-(ＣＨ=Ｎ-Ｏ-Ｌ'-Ｍ')ｍ      (式Ｉ)
を有する修飾された糖タンパク質を調製する方法に関し、ここで修飾された糖タンパク質は、未修飾の糖タンパク質の半減期の少なくとも約１２５％、例えば約１５０％、約２００％、又は未修飾の糖タンパク質の半減期の少なくとも約２５０％の血清半減期を示す。
【００３０】
さらなる実施態様では、本発明は、一般構造
(Ｍ-Ｌ-Ｏ-Ｎ=ＣＨ)ｎ-Ｐ-(ＣＨ=Ｎ-Ｏ-Ｌ'-Ｍ')ｍ      (式Ｉ)
を有する修飾された糖タンパク質を調製する方法に関し、ここで過ヨウ素酸イオンは、糖タンパク質に存在する非還元グリカン末端の数に対して、２０当量未満、例えば１０当量未満、例えば５当量未満、例えば１当量未満、例えば糖タンパク質に存在する非還元グリカン末端の数に対して、０．１−２０当量の範囲、例えば０．１−１０当量の範囲、例えば０．１-５当量の範囲、例えば０．１−１当量の範囲の量で存在している。
【００３１】
よって、一実施態様では、過ヨウ素酸イオンの数は、糖タンパク質に存在する非還元グリカン末端の数に対して、１０−２０当量の量で存在している。他の実施態様では、過ヨウ素酸イオンの数は、糖タンパク質に存在する非還元グリカン末端の数に対して、５−１０当量の量で存在している。他の実施態様では、過ヨウ素酸イオンの数は、糖タンパク質に存在する非還元グリカン末端の数に対して、２−５当量の量で存在している。他の実施態様では、過ヨウ素酸イオンの数は、糖タンパク質に存在する非還元グリカン末端の数と実質的に等しい当量の量で存在している。他の実施態様では、過ヨウ素酸イオンの数は、糖タンパク質に存在する非還元グリカン末端の数に対して、０．１−０．９当量の量で存在している。
【００３２】
他の実施態様では、準化学量論的な量の過ヨウ素酸塩が、糖タンパク質に存在する非還元グリカン末端の数に対して使用される。
本明細書及び特許請求の範囲において、「ポリペプチド」なる用語は、ペプチド結合アミノ酸残基からなる直鎖状の単鎖分子である。よって、本用語は、ペプチド(２−１０のアミノ酸残基)、オリゴペプチド(１１−１００のアミノ酸残基)及び本来のポリペプチド(１００を越えるアミノ酸残基)を包含する。よって、ポリペプチドは、生物学的に活性な構造単位であるが、機能を欠いている場合もある。本明細書において「タンパク質」は、少なくとも一のポリペプチドを含む機能的又は非機能的分子又は複合体であり、モノマーとは別に、該用語には、ポリマー分子、例えばホモ-及びヘテロ多量体が含まれる。タンパク質は補欠分子族(接合団)を含んでいてよく、様々なグリコシル化及び脂質化パターンを含みうる。ここで使用される「糖タンパク質」とは、何らかの方法でグリコシル化されたタンパク質のことである。本発明のいくつかの実施態様では、糖タンパク質は、Ｎ-グリコシル化及び／又はＯ-グリコシル化され、及び／又はシアル酸部分で修飾される。
【００３３】
他の実施態様では、修飾されたグリコシル化分子を生産する方法は、修飾された糖タンパク質が、グリコシル化出発分子と比較して改善された薬理学的性質を有していることを確認するさらなる工程を含む。
典型的には、改善された薬理学的性質は、生物学的利用能の増加、機能的インビボ半減期の増加、インビボ血漿半減期の増加、免疫原性の低下、プロテアーゼ耐性の増加、アルブミンに対する親和性の増加、レセプターに対する親和性の改善、保存安定性の増加からなる群から選択される。
【００３４】
「機能的インビボ半減期」なる用語は、その通常の意味で使用される。すなわち、修飾された糖タンパク質又は参照分子の生物学的活性の５０％が体／標的器官になお存在している時間、又は修飾された糖タンパク質又は参照分子の活性がそのピーク値の５０％まで低下するのにかかる時間である。機能的インビボ半減期を測定するための代替として、「インビボ血漿半減期」、すなわち、排除される前に、修飾された糖タンパク質又は参照分子の５０％が、血漿又は血流を循環している時間を測定してもよい。血漿半減期の測定は、多くの場合、機能的半減期を測定するよりも簡単で、血漿半減期の大きさは、通常、機能的インビボ半減期の大きさの良好な目安となる。血漿半減期の代替用語には、血清半減期、循環半減期(circulating half-life)、循環性半減期(circulatory half-life)、血清クリアランス、血漿クリアランス、及びクリアランス半減期が含まれる。保持される機能は、通常、凝血原、タンパク質分解、共因子(co-factor)結合、レセプター結合活性、又は特定のタンパク質に関連した他のタイプの生物学的活性から選択される。
【００３５】
機能的インビボ半減期又は血漿半減期に関連して使用される「増加」なる用語は、修飾された糖タンパク質の関連半減期が、本発明の方法を受けていない他の同一の糖タンパク質等の参照分子のものと比較して統計的に有意に増加していることを示す。よって、半減期は比較できる条件下で測定される。例えば関連半減期は、少なくとも約２５％、例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約１００％、１５０％、２００％、２５０％、又は５００％増加していてもよい。いくつかの実施態様では、本発明の修飾された糖タンパク質は、未修飾の糖タンパク質の半減期に対し、少なくとも約０．２５時間、好ましくは少なくとも約０．５時間、より好ましくは少なくとも約１時間、最も好ましくは少なくとも約２時間の半減期の増加を示す。
【００３６】
生物学的インビボ半減期の測定は、文献に記載されている多くの方法により実施することができる。ｒＦＶＩＩａ及びその変異体のインビボ半減期を測定するためのアッセイに修飾されたＦＶＩＩａ(第ＶＩＩａ凝固因子)を使用する例は、ＦＤＡ参照番号９６-０５９７に記載されている。簡単に述べると、ＦＶＩＩａ凝固活性は、修飾された糖タンパク質の投与前、及び投与後２４時間の間に採取された血漿において測定される。定常状態での分布のメジアン見かけ体積を測定し、メジアンクリアランスを測定する。
【００３７】
「生物学的利用能」とは、投与後の予め決められた時間に血漿中で検出可能な複合糖質の投与量の割合を意味する。典型的には、生物学的利用能は、約２５−２５０μｇ／ｋｇの用量の調製物を投与し；投与後の予め決められた時間に血漿サンプルを得；適切なバイオアッセイ、又は免疫アッセイ、又は等価なアッセイを使用して、試料中の糖タンパク質の含有量を測定することにより、試験動物で測定される。データは、典型的には[糖タンパク質]対時間としてグラフに示され、生物学的利用能は、曲線下の面積(ＡＵＣ)として表される。試験調製物の相対的生物学的利用能は、試験調製物のＡＵＣと未修飾の糖タンパク質のＡＵＣとの間の比率を意味する。
【００３８】
いくつかの実施態様では、本発明の調製物は、対応する未修飾の糖タンパク質の生物学的利用能の少なくとも約１１０％、好ましくは少なくとも約１２０％、より好ましくは少なくとも約１３０％、最も好ましくは少なくとも約１４０％の相対的生物学的利用能を示す。生物学的利用能は、任意の哺乳動物種、好ましくはイヌで測定することができ、ＡＵＣを算出するために使用される予め決められた時間は、１０分−８時間の異なる増分を含みうる。例えば、生物学的利用能は、次のようにして、イヌモデルにおいて測定されうる：４グループに分けた１２匹のビーグル犬で四肢交差研究として実験を実施する。全ての動物には、塩化ナトリウム(２．９２ｍｇ／ｍｌ)、塩化カルシウム二水和物(１．４７ｍｇ／ｍｌ)、マンニトール(３０ｍｇ／ｍｌ)、及びポリソルベート８０を含むグリシルグリシン(ｐＨ５．５)等の適切なバッファーに入った約９０μｇ／ｋｇの用量の試験調製物Ａと参照調製物Ｂを投与する。最初の投与から１０、３０、及び６０分、２、３、４、６及び８時間後に血液試料を採血する。試料から血漿を得、ＥＬＩＳＡにより糖タンパク質を定量する。
【００３９】
調製物の「免疫原性」なる用語は、ヒトに投与された場合、体液性、細胞性又はその双方であってもなくても、有害な免疫応答を誘発する調製物の能力を意味する。任意のヒト亜母集団においては、特定の投与されたタンパク質に対して感受性を示す個体が存在し得る。免疫原性は、当該分野で知られている一般的な方法を使用して、感受性の個体における糖タンパク質反応性Ｔ細胞及び／又は抗糖タンパク質抗体の存在を定量することにより測定することができる。ある実施態様では、本発明の修飾された糖タンパク質は、感受性の個体における免疫原性を、未修飾の糖タンパク質の個体に対する免疫原性に対して、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約４０％、最も好ましくは少なくとも約５０％の低下を示す。
【００４０】
薬剤に対する免疫原性は、タンパク質様剤が非感受性の被験者において免疫原性になり得るという事実に関連しており、薬剤の繰り返し投与は、薬剤に対する免疫応答の連続ブーストに至ることを意味する。これは、免疫応答が薬剤の活性を阻害するため、ほとんどの場合所望されず、よって、治療効果をもたらすためには、経時的に増加した用量の薬剤を投与することが必要となる。ある実施態様では、本発明の修飾された糖タンパク質は、個々の未修飾の糖タンパク質の免疫原性に対して、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約４０％、最も好ましくは少なくとも約５０％の非感受性の被験者における免疫原性低下を示す。
【００４１】
糖タンパク質に対してここで使用される「プロテアーゼ保護」なる用語は、血漿ペプチダーゼ又はプロテアーゼに対する耐性を該化合物に付与するために化学的に修飾された糖タンパク質を意味する。血漿中のプロテアーゼは、いくつかのペプチドホルモンの分解に関与し、より大きなタンパク質の分解における役割も担っていることが知られている。
【００４２】
例えばジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶ(ＤＰＰＩＶ)による分解に対する糖タンパク質の耐性は、次の分解アッセイにより測定される：０．１Ｍのトリエチルアミン-ＨＣｌバッファー１００μＬ、ｐＨ７．４中の５ｍＵ酵素活性に相当する１μＬの精製ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶと共に糖タンパク質のアリコート(５ｎｍｏｌ)を３７℃で１０−１８０分インキュベートする。１０％のトリフルオロ酢酸５μＬを添加することにより酵素反応を終結させ、ペプチド分解産物を分離し、ＨＰＬＣ分析を使用して定量する。この分析を実施するための一方法は次の通りである：混合物をＶｙｄａｃ Ｃ１８ワイドポア(widepore)(３０ｎｍの孔、５μｍの粒子)２５０×４．６ｍｍのカラムに適用し、Siegelら,  Regul. Pept. 1999；79；93-103及びMentleinら, Eur. J. Biochem. 1993；214：829-35に従い、０．１％のトリフルオロ酢酸に線形の段階的勾配をつけてアセトニトリルが入ったもの(３分間は０％のアセトニトリル、１７分間は０-２４％のアセトニトリル、１分間は２４-４８％のアセトニトリル)を、１ｍｌ／分の流量で溶出させる。ペプチドとその分解生成物を、２２０ｎｍ(ペプチド結合)又は２８０ｎｍ(芳香族アミノ酸)の吸光度をモニターし、標準に対するそれらのピーク面積を積分することにより定量される。ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶによるペプチドの加水分解速度は、１０％未満のペプチドが加水分解されるインキュベート時間で概算される。
【００４３】
哺乳動物種の循環血液中に最も豊富なタンパク質成分は血清アルブミンであり、全血１００ミリリットル当たり約３から４．５グラムの濃度で通常存在している。血清アルブミンは約７００００ダルトンの血液タンパク質であり、循環系においていくつかの重要な機能をもたらす。例えば、それは、血液中に見出される多様な有機分子のトランスポーターとして、種々の代謝産物、例えば脂肪酸やビリルビンの血液を介する主要なトランスポーターとして、また多量にあるために、循環血液の浸透圧調節物質として機能する。血清アルブミンは１週間以上の半減期を有しており、ペプチドの血漿半減期を増加させるための一アプローチは、血清アルブミンに結合する化学実体でペプチドを誘導体化することである。「アルブミンバインダー」なる用語は、アルブミン等の血漿タンパク質に結合することが知られているこのような化学実体のことを指す。アルブミン結合特性は、出典明示によりここに導入されるJ.Med.Chem, 43, 2000, 1986-1992に記載されているようにして測定されうる。アルブミン結合部分には、脂肪酸誘導体、有機スルファテート化されたポリアロメート、例えばチバクロン、並びに４０未満のアミノ酸残基を有するペプチド、例えば出典明示によりここに援用されるJ. Biol Chem. 277, 38 (2002) 35035-35043に開示されている部分が含まれる。
【００４４】
本発明に従って調製される糖タンパク質は、未修飾の糖タンパク質と比較して改善された機能特性を示す。改善された機能特性には、限定されるものではないが、ａ）物理的特性、例えば保存安定性の改善；ｂ）薬物動態学的特性の改善、例えば生物学的利用能及び半減期の増加；及びｃ）ヒトにおける免疫原性の低下が含まれる。
糖タンパク質の保存安定性は、(ａ)乾燥粉末として２５℃で保存した場合、調製物の生物学的利用能の２０％が崩壊するのに必要な時間、及び／又は(ｂ)調製物において、凝集物等、予め決められた分解産物の割合が倍になるのに必要な時間を測定することにより評価されうる。
【００４５】
ある実施態様では、本発明の修飾された糖タンパク質は、該糖タンパク質を含有する調製物を乾燥粉末として２５℃で保存した場合、未修飾の糖タンパク質に対して必要とされる時間に対し、生物学的利用能の２０％が崩壊するのに必要な時間が、少なくとも約３０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも１００％増加することが示される。
【００４６】
生物活性の測定は、特定のタンパク質に関連したある種の生物活性に準じて行われる；例えば凝固因子の場合では、生物活性は、凝固アッセイ、タンパク質分解アッセイ、ＴＦ結合アッセイ、又はＴＦ独立性トロンビン生成アッセイの任意のものを使用して測定されうる。
【００４７】
ある実施態様では、本発明の調製物は、参照調製物と比較すると、双方の調製物を乾燥粉末として２５℃で保存した場合、凝集体等、予め決められた分解産物が倍になるのに必要な時間が、少なくとも約３０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約１００％の増加を示す。凝集体の量は、例えばゲル浸透ＨＰＬＣ、また他のタイプのよく知られているクロマトグラフィー法により測定されうる。凝固因子の場合、凝集体は、次のように、プロテイン・パック３００ＳＷカラム(７．５×３００ｍｍ)(Waters, 80013)でのゲル浸透ＨＰＬＣにより測定されうる。カラムは溶離剤Ａ(０．２Ｍの硫酸アンモニウム、５％のイソプロパノール、リン酸でｐＨ２．５に調節、その後、トリエチルアミンでｐＨ７．０に調節)で平衡にされた後、２５μｇの試料がカラムに充填される。溶出は、３０分、０．５ｍｌ／分の流量の溶離剤Ａを用いてなされ、検出は２１５ｎｍでの吸光度を測定することにより達成される。凝集体の量は、凝固因子凝集体のピーク面積／凝固因子のピークの全面積(モノマー及び凝集体)として算出される。
【００４８】
二価リンカーＬ及びＬ'：
Ｌ及びＬ'は同一でも異なっていてもよい二価の化学的リンカーを表す。
一実施態様では、Ｌ及びＬ'は独立して結合又は次のものを表す。
0005570809.tif 000002
【００４９】
(置換基Ｍ及びＭ')
以下において、置換基Ｍ及びＭ'を考察する。
本発明の一実施態様では、半減期の増加は、Ｍ及び／又はＭ'を、腎クリアランスが低減され又は消失されるように分子量を増加させる基にするか、及び／又はＭ及び／又はＭ'を肝臓レセプターに対する結合パートナーをマスクする基にすることにより得られる。他の実施態様では、免疫原性の低下は、Ｍ及び／又はＭ'を免疫原性部位に結合する抗体をブロックする基にすることにより得られる。さらに他の実施態様では、アルブミンに対する親和性の改善は、Ｍ及び／又はＭ'をアルブミンに対して高い親和性を有する基にすることにより得られる。さらに他の実施態様では、レセプターに対する親和性の改善は、Ｍ及び／又はＭ'を標的細胞における表面レセプターに特異的に結合する基にすることにより得られる。
置換基Ｍ及び／又はＭ'は、任意の官能性改善基、例えば「延長(プロトラクター(protractor))基」とすることができる。ここで使用される場合、これは、未修飾のタンパク質又はペプチドと比較した場合、タンパク質又はペプチドにコンジュゲートした際に、該タンパク質又はペプチドの循環半減期を増加させる基を意味する。延長効果の背後にある特定の原理は、サイズの増加、ペプチダーゼ又は抗体により認識可能なペプチド配列の保護、例えば肝臓又はマクロファージ中に存在するグリカン特異性レセプターにより認識されない形でのグリカンのマスキング、クリアランスの防止又は低減に起因している。また延長基の延長効果は、例えば、アルブミン等の血中成分への結合、又は血管組織への特異的又は非特異的結合に起因する場合もある。コンジュゲートした糖タンパク質は、未修飾の糖タンパク質の生物学的活性を実質的に維持しているべきである。
【００５０】
他の可能性には、例えば、糖タンパク質が非常に高い局所的濃度でその効果を発揮しなければならないならば興味深いように、Ｍ及び／又はＭ'が、修飾された糖タンパク質を、所定のタイプの細胞又は組織に標的化する基である場合が含まれる。またさらなる可能性には、Ｍ及び／又はＭ'が、それだけで有効活性成分、例えば放射性核種又は毒性物質であるものが含まれ−これは、例えば、未修飾の糖タンパク質が悪性組織におけるレセプターに対して高い親和性を有しており、よって修飾された分子における標的化部分として機能する場合に都合がよい。
【００５１】
本発明の一実施態様では、Ｍ及び／又はＭ'は、
−  一又は複数のカルボン酸、アミン、スルホン酸、ホスホン酸、又はその組合せを含みうる低分子量の有機荷電基(１５−１０００Ｄａ)、
−  低分子量(１５−１０００Ｄａ)の中性親水性分子、例えばシクロデキストリン、又は場合によっては分枝していてもよいポリエチレン鎖、
−  低分子量(１５−１０００Ｄａ)の疎水性分子、例えば脂肪酸又はコール酸又はその誘導体、
−  ２−４０ｋＤａの平均分子量のポリエチレングリコール、
−  十分に定義された精密ポリマー、例えば７００Ｄａ〜２００００Ｄａ、より好ましくは７００−１００００Ｄａの範囲の正確な分子量を有するデンドリマー、
−  実質的に非免疫原性の糖タンパク質、例えばアルブミン、又は抗体もしくは場合によってはＦｃドメインを含んでいてもよい抗体の一部、及び
−  高分子量の有機ポリマー、例えばデキストラン、
からなる群から選択される。
【００５２】
本発明の一実施態様では、ポリマー分子は、デンドリマー(例えば、７００−１００００Ｄａの範囲の分子量を有するもの、又は国際特許出願WO200514049に開示されているデンドリマー)、ポリアルキレングリコール(ＰＡＧ)を含むポリアルキレンオキシド(ＰＡＯ)、例えばポリエチレングリコール(ＰＥＧ)及びポリプロピレングリコール(ＰＰＧ)、分枝状ＰＥＧ、ポリビニルアルコール(ＰＶＡ)、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン・無水マレイン酸コポリマー、ポリスチレン・無水マレイン酸コポリマー、デキストラン、例えばカルボキシメチル-デキストラン、ＨＥＳ、ＰＨＦ又はＭＰＣからなる群から選択される。本発明の一実施態様では、ポリマー分子はＰＥＧ基である。本発明の一実施態様では、ポリマー分子はデンドリマーである。
【００５３】
本発明の一実施態様では、Ｍ及び／又はＭ'は、血清タンパク質結合リガンド、例えばアルブミンに結合する化合物、例えば脂肪酸、Ｃ５-Ｃ２４脂肪酸、脂肪族の二酸(例えばＣ５-Ｃ２４)、グリカンのレセプター(例えばアシアロ糖タンパク質レセプター及びマンノースレセプター)への結合を阻害する構造(例えば、シアル酸誘導体又は模倣剤)、生理学的条件下で帯電特性を変化させる部分を有する小有機分子、例えばカルボン酸又はアミン類、又はグリカン特異性認識を防止する中性置換基、例えばより小さいアルキル置換基(例えば、Ｃ１-Ｃ５アルキル)、一又は複数のカルボン酸、アミン類、スルホン酸、ホスホン酸、又はその組合せを含みうる低分子量の有機荷電基(例えば、Ｃ１-Ｃ２５)；低分子量の中性親水性分子(例えば、Ｃ１-Ｃ２５)、例えばシクロデキストリン、又は場合によっては分枝していてもよいポリエチレン鎖；２−４０ｋＤａの平均分子量を有するポリエチレングリコール；十分に定義された精密ポリマー、例えば７００Ｄａ〜２００００Ｄａ、より好ましくは７００−１００００Ｄａの範囲の正確な分子量を有するデンドリマー；実質的に非免疫原性の糖タンパク質、例えばアルブミン、抗体又は場合によってはＦｃドメインを含んでいてもよい抗体の一部からなる群から選択される延長基である。
【００５４】
一実施態様では、Ｍ及び／又はＭ'は独立して以下のものから選択される：
0005570809.tif 000003
0005570809.tif 000004
【００５５】
一実施態様では、Ｍ及び／又はＭ'は独立して以下のものから選択される：
0005570809.tif 000005
上表中、Ｑは、１０−２０、１０−３０、１０−４０、２０−３０、２０−４０、３０−４０、例えば１０、２０又は３０の整数を表す。
0005570809.tif 000006
【００５６】
一実施態様では、 Ｍ-Ｌ-ＯＮＨ２及び／又はＭ'-Ｌ'-ＯＮＨ２は以下のものである：
0005570809.tif 000007
0005570809.tif 000008
【００５７】
一実施態様では、 Ｍ-Ｌ-ＯＮＨ２及び／又はＭ'-Ｌ'-ＯＮＨ２は独立して、以下のものから選択される：
0005570809.tif 000009
0005570809.tif 000010
【００５８】
一実施態様では、 Ｍ-Ｌ-ＯＮＨ２及び／又はＭ'-Ｌ'-ＯＮＨ２は独立して、以下のものから選択される：
0005570809.tif 000011
0005570809.tif 000012
【００５９】
一実施態様では、 Ｍ-Ｌ-ＯＮＨ２及び／又はＭ'-Ｌ'-ＯＮＨ２は独立して、以下のものから選択される：
0005570809.tif 000013
0005570809.tif 000014
【００６０】
Ｍ及び／又はＭ'は、以下の群：
−  直鎖状、分枝状及び／又は環状のＣ１-３０アルキル、Ｃ２-３０アルケニル、Ｃ２-３０アルキニル、Ｃ１-３０ヘテロアルキル、Ｃ２-３０ヘテロアルケニル、Ｃ２-３０ヘテロアルキニルで、一又は複数の同素環芳香族化合物のビラジカル、又は複素環化合物のビラジカルが挿入されていてもよく、該Ｃ１-３０又はＣ２-３０基は、-ＣＯ２Ｈ、-ＳＯ３Ｈ、-ＰＯ２ＯＨ、-ＳＯ２ＮＨ２、-ＮＨ２、-ＯＨ、-ＳＨ、ハロゲン、又はアリールから選択される一又は複数の置換基で置換されていてもよく、該アリールは-ＣＯ２Ｈ、-ＳＯ３Ｈ、-ＰＯ２ＯＨ、-ＳＯ２ＮＨ２、-ＮＨ２、-ＯＨ、-ＳＨ、又はハロゲンで置換されていてもよいもの；ステロイド基；脂質基；
−  多糖類基、例えばデキストラン類；α-、β-、又はγ-シクロデキストリン、ポリアミド基、例えばポリアミノ酸基；ＰＶＰ基；ＰＶＡ基；ポリ(１-３-ジオキサラン）；ポリ(１,３,６-トリオキサン）；エチレン／無水マレイン酸ポリマー；
−  チバクロン染料、例えばチバクロンブルー３ＧＡ、及び出典明示によりここに援用されるWO 00/12587に開示されている特定長さのポリアミド鎖；
−  実質的に非免疫原性のタンパク質残基、例えばアルブミニル誘導体のような血液成分、又は抗体又はそのドメイン、例えばヒト正常ＩｇＧ１由来のＦｃドメインで、Kan, SKら, The Journal of Immunology 2001, 166(2), 1320-1326、又はStevenson, GT, The Journal of Immunology 1997, 158, 2242-2250に記載されているようなもの；
−  ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)又はメトキシポリエチレングリコール(ｍＰＥＧ)基、及びそのアミノ誘導体で、平均分子量が５００〜１０００００Ｄａ、例えば５００〜６００００Ｄａ、例えば１０００〜４００００Ｄａ、例えば５０００〜４００００Ｄａであってよいもの；
−  アルブミン等の血漿タンパク質に結合することが知られている部分で、アルブミン結合特性が、出典明示によりここに援用されるJ.Med.Chem, 43, 2000, 1986-1992に記載されているようにして測定されてよいもの、又はアルブミン結合部分、例えば４０未満のアミノ酸残基を有するペプチド、例えば出典明示によりここに援用されるJ. Biol Chem. 277, 38(2002)35035-35043に開示されている部分；
の一つから選択される有機基でありうる。
【００６１】
他の実施態様では、Ｍ及び／又はＭ'はＣ１-Ｃ２０-アルキル、例えばＣ１-Ｃ１８-アルキルである。特に、特定の荷電基、極性基、及び／又はハロゲンで置換されていてもよいＣ１４-、Ｃ１６-及びＣ１８-アルキルを挙げることができる。このような置換基の例には、-ＣＯ２Ｈ、テトラゾール及びハロゲンが含まれる。特定の実施態様では、Ｃ１-Ｃ２０-アルキルにおける全ての水素は、フルオロで置換されて、ペルフルオロアルキルを形成する。
特定の実施態様では、Ｍ'はＭとは異なる。特定の実施態様では、Ｍ'は、Ｍよりも実質的に低い分子量を有する。特定の一実施態様では、Ｍ'はメトキシルアミン(ＭｅＯＮＨ２)である。
【００６２】
出発分子Ｐ＊
以下、置換基Ｐ＊を考察する。
糖タンパク質Ｐ＊は、過ヨウ素酸塩により酸化反応する、グリカン末端を有する。
よって、Ｐ＊の反応性基は、炭水化物の一部であるか、又はグリコシル化された糖タンパク質のＮ-又はＯ-グリカン類に見出されるもの等の、炭水化物残基から誘導される。また糖タンパク質Ｐ＊の反応性基は、シアル酸残基であってもよい。
【００６３】
一実施態様では、Ｐ＊は、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＩＩ、ＦＶ、プロテインＣ、プロテインＳ、ｔＰＡ、ＰＡＩ-１、組織因子、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、ＦＸＩＩＩ、並びにその配列変異体；免疫グロブリン、サイトカイン類、例えばインターロイキン、α-、β-、及びγ-インターフェロン、コロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、ホスホリパーゼ活性化タンパク質(ＰＵＰ)から選択される。またＰ＊は、一般的に生物学的及び治療的に関心のある任意の他のタンパク質及びペプチドとすることもでき、インスリン、植物タンパク質、例えばレクチン類及びリシン類、腫瘍壊死因子及び関連する対立遺伝子、腫瘍壊死因子レセプターの可溶型、インターロイキンレセプター及びインターロイキンレセプターの可溶型、増殖因子、例えば組織増殖因子、例えばＴＧＦａ’ｓ又はＴＧＦｐｓ、及び表皮増殖因子、ホルモン、ソマトメジン、エリスロポエチン、色素性ホルモン類、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノーゲンアクチベータ、及び免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、及びＩｇＤを含む。
【００６４】
グリカン末端を含まないペプチド及びタンパク質は、グリコシルトランスフェラーゼを使用し、Li Shaoら Glycobiology 12(11)76２-770(2002)に記載されているようにして、酵素的にグリコシル化されるか、又は例えば標準的なペプチド化学及びグリコシル化アミノ酸成分、例えばＮ-ガラクトシル化アスパラギンを使用し、化学的に合成することもできる。
【００６５】
また、グリコシル化部位は、インビボでは通常はその非グリコシル化形態で生成されるタンパク質又はペプチドに操作されうる。例えば、ＥＧＦ反復にコンセンサス配列Ｃｙｓ-ＸＸＸ-Ｓｅｒ-ＸＸＸ−Ｐｒｏ-Ｃｙｓを挿入すると、ＵＤＰ-グルコース及びグリコシルトランスフェラーゼを使用するセリンの選択的Ｏ-グリコシル化が可能になる(Li Shaoら Glycobiology 12(11)762-770(2002))が、コンセンサス配列Ａｓｎ-ＸＸＸ-Ｓｅｒ／Ｔｈｒを挿入するとＮ-グリコシル化が可能となる(R.A. Dwek, Chem. Rev. 1996, 96, 683-720)。また、スレオニン又はセリンを含むペプチド配列は、配列依存的な形で、ＵＤＰ-ＧａｌＮＡｃ：ポリペプチドＮ-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ及ＵＤＰ-ＧａｌＮＡｃの存在下でグリコシル化を受ける(例えば、B.C. O'Connell, F.K.Hagen及びL.A. Tabak, J. Biol. Chem. 267(35), 25010-25018(1992)を参照)。また、システイン変異を導入する部位特異的突然変異誘発は、D.P. Gamblinら Angew. Chem.Int. Ed., 43, 828(2004)に記載されているようにして、混合ジスルフィド形成を介して、ガラクトース、又はガラクトース含有糖構造の導入に使用することができる。さらに、ガラクトース又はＮ-アセチルガラクトサミン含有ペプチド及びタンパク質は、例えばP.G. Schultz, J.Am.Chem.Soc, 125, 1702(2003)により記載されている方法等、非生体ハンドルを含むタンパク質又はペプチドにコンジュゲートさせることにより、又はトリクロロアセトアミジルガラクトシド等、グリコシル供与体基質を使用し、ペプチドを直接グリコシル化することにより非特異的に、作製することができる。発酵培養物へグリコシターゼインヒビターを添加し、US4925796A/US5272066A1に記載されているような、切断型グリカン構造を有する糖タンパク質を製造することにより、ガラクトース又はＮ-アセチルガラクトサミン含有タンパク質の入手、並びにＴＧａｓｅを使用するグルタミン残基の酵素的修飾が可能となる(例えば、M. Satoら Angew. Chem. Int. Ed. 43, 1516-1520,(2004)を参照)。
【００６６】
Ｎ-グリコシル化タンパク質の生産は、哺乳動物宿主細胞、例えばＣＨＯ又はＢＨＫ細胞を使用することに限定されず、昆虫細胞、酵母、又はM. Wackerら Science, 298, 1790-1793(2002)に記載されているようにして、細菌細胞を使用して、実施することもできる。本発明の一実施態様では、ペプチドはアプロチニン、組織因子経路インヒビター、又は他のプロテアーゼインヒビター、インスリン又はインスリン前駆体、ヒト又はウシの成長ホルモン、インターロイキン、グルカゴン、オキシントモジュリン、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-２、ＩＧＦ-Ｉ、ＩＧＦ-ＩＩ、組織プラスミノーゲンアクチベータ、形質転換増殖因子γ又はβ、血小板由来増殖因子、ＧＲＦ(成長ホルモン放出因子)、ヒト成長因子、免疫グロブリン、ＥＰＯ、ＴＰＡ、プロテインＣ、血液凝固因子、例えばＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＩＩ、ＦＶ、プロテインＣ、プロテインＳ、ＰＡＩ-１、組織因子、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、及びＦＸＩＩＩ、エキセンディン-３、エキセンディン-４、及び酵素又はその機能的アナログである。本明細書において「機能的アナログ」なる用語は、天然タンパク質と同様な機能を有するタンパク質を示すことを意味する。タンパク質は天然タンパク質と構造的に類似していてもよく、天然タンパク質のＣ及びＮ末端の一方又は双方に、一又は複数のアミノ酸が付加され、天然アミノ酸配列の一つ又は多くの異なる部位で一又は複数のアミノ酸が置換され、天然タンパク質の一端又は両端、もしくはアミノ酸配列内の一つ又はいくつかの部位が欠失され、又は天然アミノ酸配列の一又は複数の部位に、一又は複数のアミノ酸が挿入されることにより、天然タンパク質から誘導されうる。さらに、タンパク質は、一又は複数の位置でアシル化され得、例えばWO 98/08871には、ＧＬＰ-１及びそのアナログのアシル化が開示されており、WO 98/08872には、ＧＬＰ-２及びそのアナログのアシル化が開示されている。アシル化ＧＬＰ-１誘導体の例は、Ｌｙｓ２６(Ｎε-テトラデカノイル)-ＧＬＰ-１(７−３７)であり、ここでＧＬＰ−１(７−３７)は、２６位のＬｙｓ残基のεアミノ基がテトラデカノイル化されているものである。
【００６７】
タンパク質又はその部分は、当業者に公知の技術、例えば組織培養、動物源からの抽出、又は組換えＤＮＡ法を使用し、調製し又は単離することができる。タンパク質、ペプチド、アミノ酸配列等のトランスジェニック源もまた考えられる。このような物質はトランスジェニック動物、すなわちマウス、ブタ、ウシ等から得られ、タンパク質は、ミルク、血液又は組織で発現する。また、トランスジェニック昆虫及びバキュロウイルス発現系もまた供給源として考慮される。さらに、タンパク質の変異型、例えば変異ＴＮＦ及び／又は変異インターフェロンも本発明の範疇に入る。関心ある他のタンパク質は、アレルゲンタンパク質、例えばブタクサ、抗原Ｅ、ミツバチ毒、ダニアレルゲン等である。
【００６８】
以上は、本発明の延長基とのコンジュゲートに適した生物学的に活性なペプチドの例である。特に記載しないが適切なペプチドを有しているそれらの生物学的に活性な物質もまた意図しており、本発明の範疇に入ることが理解される。
一実施態様では、糖タンパク質はＦＶＩＩポリペプチドである。一実施態様では、ポリペプチドは野生型第ＶＩＩａ因子である。
【００６９】
ここで使用される場合、「第ＶＩＩ因子ポリペプチド」又は「ＦＶＩＩポリペプチド」なる用語は、野生型ヒト第ＶＩＩａ因子(すなわち、米国特許第4,784,950号に開示されているアミノ酸配列を有するポリペプチド)、並びにその変異体のアミノ酸配列１−４０６を含む任意のタンパク質を意味する。
「第ＶＩＩ因子」なる用語は、それらの未切断(チモーゲン)型の第ＶＩＩ因子ポリペプチド、並びにタンパク分解的にプロセシングされて第ＶＩＩａ因子と命名されうるそれぞれの生物活性型を生じるものを含むものである。典型的には、第ＶＩＩ因子は残基１５２と１５３の間が切断されて第ＶＩＩａ因子を生じる。第ＶＩＩ因子のこのような変異体は、安定性、リン脂質結合性、特定の活性の改変等を含む、ヒト第ＶＩＩ因子とは異なる特性を示しうる。
ここで使用される場合、「野生型ヒトＦＶＩＩａ」とは、米国特許第4,784,950号に開示されているアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００７０】
第ＶＩＩ因子変異体の非限定的例には、Ｓ５２Ａ-ＦＶＩＩａ、Ｓ６０Ａ-ＦＶＩＩａ( Linoら, Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998); 米国特許第5,580,560号に開示されているような増加したタンパク分解安定性を示すＦＶＩＩａ；残基２９０と２９１の間、又は残基３１５と３１６の間が、タンパク分解的に切断された第ＶＩＩａ因子(Mollerupら, Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995)；第ＶＩＩａ因子の酸化型(Kornfeltら, Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999)；PCT/DK02/00189(WO 02/077218に相当)に開示されているＦＶＩＩ変異体；WO 02/38162に開示されているような増加したタンパク分解安定性を示すＦＶＩＩ変異体(Scripps Research Institute)；WO 99/20767、US特許US 6017882 及びUS 6747003、US特許出願20030100506(ミネソタ大学)及びWO 00/66753、US特許出願US 20010018414、US 2004220106、及びUS 200131005、US特許US 6762286及びUS 6693075(ミネソタ大学)に開示されたような、高められた膜結合性を示し、修飾されたＧｌａ-ドメインを有するＦＶＩＩ変異体；及びWO 01/58935、US特許US 6806063、US特許出願20030096338(Maxygen ApS)、WO 03/93465(Maxygen ApS)、WO 04/029091(Maxygen ApS)、WO 04/083361(Maxygen ApS)、及びWO 04/111242(Maxygen ApS)、並びにWO 04/108763(Canadian Blood Services)に開示されているようなＦＶＩＩ変異体が含まれる。
【００７１】
野生型ＦＶＩＩａと比較して増加した生物活性を有するＦＶＩＩ変異体の非限定的例には、WO 01/83725、WO 02/22776、WO 02/077218、PCT/DK02/00635(WO 03/027147に相当)、デンマーク特許出願PA 2002 01423(WO 04/029090に相当)、デンマーク特許出願PA 2001 01627(WO 03/027147に相当); WO 02/38162(Scripps Research Institute)に開示されているようなＦＶＩＩ変異体；及びJP2001061479(Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.)に開示されているような高められた活性を有するＦＶＩＩａ変異体が含まれる。
【００７２】
第ＶＩＩ因子の変異体の例は、限定されるものではないが、Ｌ３０５Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｍ３０６Ｄ／Ｄ３０９Ｓ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｉ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｐ-ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ１５７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｋ-ＦＶＩＩ、及びＳ３３６Ｇ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３１６Ｈ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３１６Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９���Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶ
ＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｓ５２Ａ-ＶＩＩ因子、Ｓ６０Ａ-ＶＩＩ因子；Ｒ１５２Ｅ-ＶＩＩ因子、Ｓ３４４Ａ-ＶＩＩ因子、Ｔ１０６Ｎ-ＦＶＩＩ、Ｋ１４３Ｎ／Ｎ１４５Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｖ２５３Ｎ-ＦＶＩＩ、Ｒ２９０Ｎ／Ａ２９２Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｇ２９１Ｎ-ＦＶＩＩ、Ｒ３１５Ｎ／Ｖ３１７Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｋ１４３Ｎ／Ｎ１４５Ｔ／Ｒ３１５Ｎ／Ｖ３１７Ｔ-ＦＶＩＩ；及び２３３Ｔｈｒから２４０Ａｓｎのアミノ酸配列に、置換、付加又は欠失を有するＦＶＩＩ；３０４Ａｒｇから３２９Ｃｙｓのアミノ酸配列に、置換、付加又は欠失を有するＦＶＩＩ；１５３Ｉｌｅから２２３Ａｒｇのアミノ酸配列に、置換、付加又は欠失を有するＦＶＩＩが含まれる。
一実施態様では、糖タンパク質はＦＶＩＩＩポリペプチドである。一実施態様では、糖タンパク質はＦＩＸポリペプチドである。
【００７３】
発明の他の態様
また本発明は、一般構造
(Ｍ-Ｌ-Ｏ-Ｎ=ＣＨ)ｎ-Ｐ-(ＣＨ=Ｎ-Ｏ-Ｌ'-Ｍ')ｍ      (式Ｉ)
[上式中、Ｍ及び場合によってはＭ'は独立して、修飾された糖タンパク質の分子量を増加させるためのポリマー部分であり、Ｌ及びＬ'は、独立して二価のリンカーを表し、Ｐは糖タンパク質の一又は複数の酸化グルカン末端を有する糖タンパク質を表し、Ｏ、Ｎ、Ｃ及びＨは、それぞれ酸素、窒素、炭素及び水素原子を表し、ｎは１−１０であり、ｍは０−５０である]
を有する新規の修飾された糖タンパク質に関し、該修飾された糖タンパク質は、出発糖タンパク質Ｐ＊と比較して改善された薬理学的性質を有し、その機能活性は維持されている。
【００７４】
本発明のある実施態様では、このような修飾された糖タンパク質は、修飾されたＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＩＩ、ＦＶ、プロテインＣ、プロテインＳ、ｔＰＡ、ＰＡＩ-１、組織因子、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、ＦＸＩＩＩ、並びにその配列変異体；免疫グロブリン、サイトカイン類、例えばインターロイキン、α-、β-、及びγ-インターフェロン、コロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、及びホスホリパーゼ活性化タンパク質(ＰＵＰ)から選択される。
【００７５】
他の修飾された糖タンパク質は、一般的に生物学的及び治療的に関心のある修飾タンパク質及びペプチドであり、例えばインスリン、植物タンパク質、例えばレクチン類及びリシン類、腫瘍壊死因子及び関連する対立遺伝子、腫瘍壊死因子レセプターの可溶型、インターロイキンレセプター及びインターロイキンレセプターの可溶型、増殖因子、例えば組織増殖因子、例えばＴＧＦａ’ｓ又はＴＧＦｐｓ、及び表皮増殖因子、ホルモン、ソマトメジン、エリスロポエチン、色素性ホルモン、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノーゲンアクチベータ、及び免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、及びＩｇＤ、及びその断片を含む。
本発明の一実施態様では、修飾された糖タンパク質はＮ-グリコシル化及び／又はＯ-グリコシル化されており、及び／又はシアル酸部分を含む。
【００７６】
本発明の一実施態様では、修飾された糖タンパク質は、生物学的利用能の増加、機能的インビボ半減期の増加、インビボ血漿半減期の増加、免疫原性の低下、プロテアーゼ耐性の増加、アルブミンに対する親和性の増加、レセプターに対する親和性の改善、保存安定性の増加、機能的インビボ半減期の低減、インビボ血漿半減期の低減からなる群から選択される改善された薬理学的性質を有する。一実施態様では、半減期の増加は、Ｍを、腎クリアランスが低減され又は消失されるように分子量を増加させる基にするか、及び／又はＭを肝臓レセプターに対する結合パートナーをマスクする基にすることにより得られる。一実施態様では、免疫原性の低下は、Ｍを免疫原性部位に結合する抗体をブロックする基にすることにより得られる。一実施態様では、アルブミンに対する親和性の改善は、Ｍをアルブミンに対して高い親和性を有する基にすることにより得られる。一実施態様では、レセプターに対する親和性の改善は、Ｍを標的細胞における表面レセプターに特異的に結合する基にすることにより得られる。
【００７７】
本発明の一実施態様では、修飾された糖タンパク質は、Ｍが、一又は複数のカルボン酸、アミン類、スルホン酸、ホスホン酸、又はその組合せを含有してよい低分子量の有機荷電基；低分子量の中性親水性分子、例えばシクロデキストリン、又は場合によっては分枝状のポリエチレン鎖；低分子量の疎水性分子、例えば脂肪酸又はコール酸又はその誘導体；２−４０ｋＤａの平均分子量を有するポリエチレングリコール；十分に定義された精密ポリマー、例えば７００Ｄａ〜２０ｋＤａの範囲の正確な分子量を有するデンドリマー；実質的な非免疫原性ポリペプチド、例えばアルブミン、抗体又は場合によってはＦｃドメインを含んでいてもよい抗体の一部；及び高分子量の有機ポリマーからなる群から選択されるものである。
【００７８】
本発明の一実施態様では、修飾された糖タンパク質は、Ｍが、デンドリマー、ポリアルキレングリコール(ＰＡＧ)を含むポリアルキレンオキシド(ＰＡＯ)、例えばポリエチレングリコール(ＰＥＧ)及びポリプロピレングリコール(ＰＰＧ)、分枝状ＰＥＧ、ポリビニルアルコール(ＰＶＡ)、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン・無水マレイン酸コポリマー、ポリスチレン・無水マレイン酸コポリマー、デキストラン、カルボキシメチル-デキストラン、ＨＥＳ、ＭＰＣ又はＰＨＦからなる群から選択されるものである。
【００７９】
本発明の一実施態様では、修飾された糖タンパク質は、Ｍが、血清タンパク質結合リガンド、生理学的条件下で帯電特性を変化させる部分を有する小有機分子、グリカンのレセプターへの結合を阻害する構造、及びグリカン特異性認識を防止する中性置換基からなる群から選択されるものである。
【００８０】
一実施態様では、本発明の修飾された糖タンパク質は、Ｐが、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＩＩ、ＦＶ、プロテインＣ、プロテインＳ、ｔＰＡ、ＰＡＩ-１、組織因子、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、ＦＸＩＩＩ、並びにその配列変異体；免疫グロブリン、サイトカイン類、例えばインターロイキン、α-、β-、及びγ-インターフェロン、コロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、ホスホリパーゼ活性化タンパク質(ＰＵＰ)、インスリン、植物タンパク質、例えばレクチン及びリシン、腫瘍壊死因子及び関連する対立遺伝子、腫瘍壊死因子レセプターの可溶型、インターロイキンレセプター及びインターロイキンレセプターの可溶型、増殖因子、例えば組織増殖因子、例えばＴＧＦａ’ｓ又はＴＧＦｐｓ、及び表皮増殖因子、ホルモン類、ソマトメジン類、エリスロポエチン、色素性ホルモン、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノーゲンアクチベータ、及び免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、及びＩｇＤ、及びその断片、又は上述のタンパク質又はその断片の任意のものを含有する任意の融合タンパク質から選択されるものである。
【００８１】
一実施態様では、本発明の修飾された糖タンパク質は、糖タンパク質が第ＶＩＩ因子ポリペプチドであるものである。
一実施態様では、本発明の修飾された糖タンパク質は、糖タンパク質が、野生型ヒト第ＶＩＩ因子のアミノ酸配列を有しているものである。
【００８２】
一実施態様では、本発明の修飾された糖タンパク質は、該修飾された糖タンパク質が、本明細書に記載される凝固アッセイ、タンパク質分解アッセイ、又はＴＦ結合アッセイの一又は複数で試験された場合、未修飾の第ＶＩＩ因子ポリペプチドの特定の活性の、少なくとも約１０％、例えば少なくとも約２０％、例えば少なくとも約４０％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約１００％を示すものである。
【００８３】
一実施態様では、本発明の修飾された糖タンパク質は、該修飾された糖タンパク質が、未修飾の糖タンパク質の生物学的利用能の少なくとも約１１０％、例えば少なくとも約１２０％、約１３０％、又は未修飾の糖タンパク質の生物学的利用能の少なくとも約１４０％の生物学的利用能を示すものである。
【００８４】
一実施態様では、本発明の修飾された糖タンパク質は、該修飾された糖タンパク質は、未修飾の糖タンパク質の半減期の少なくとも約１２５％、例えば約１５０％、約２００％、又は未修飾の糖タンパク質の半減期の少なくとも約２５０％の血清半減期を示すものである。
一実施態様では、修飾されたグリコシル化分子を生成する方法は、医薬組成物として、該グリコシル化分子を処方するさらなる工程を含む。
【００８５】
本発明の一実施態様では、一般構造(Ｍ-Ｌ-Ｏ-Ｎ=ＣＨ)ｎ-Ｐ-(ＣＨ=Ｎ-Ｏ-Ｌ'-Ｍ')ｍを有する修飾された糖タンパク質におけるｍは、０−５０、例えば０−２０、例えば０−１０、例えば０−５、例えば０−３の範囲にある。
一般構造(Ｍ-Ｌ-Ｏ-Ｎ=ＣＨ)ｎ-Ｐ-(ＣＨ=Ｎ-Ｏ-Ｌ'-Ｍ')ｍを有する修飾された糖タンパク質において、ｎは、特定の糖タンパク質の非還元グリカン末端の数により制限される。よって、本発明の一実施態様では、一般構造(Ｍ-Ｌ-Ｏ-Ｎ=ＣＨ)ｎ-Ｐ-(ＣＨ=Ｎ-Ｏ-Ｌ'-Ｍ')ｍを有する修飾された糖タンパク質におけるｎは、糖タンパク質に存在する非還元グリカン末端の数に等しい。本発明の他の実施態様では、一般構造(Ｍ-Ｌ-Ｏ-Ｎ=ＣＨ)ｎ-Ｐ-(ＣＨ=Ｎ-Ｏ-Ｌ'-Ｍ')ｍを有する修飾された糖タンパク質におけるｎは、１−１０、例えば１−５、例えば１−３、例えば１−２、例えば１、例えば２、例えば３の範囲にある。
【００８６】
一実施態様では、一般構造(Ｍ-Ｌ-Ｏ-Ｎ=ＣＨ)ｎ-Ｐ-(ＣＨ=Ｎ-Ｏ-Ｌ'-Ｍ')ｍ(式Ｉ)を有する修飾された糖タンパク質は、次のものからなるリストから選択される。
0005570809.tif 000015
【００８７】
医薬組成物
本発明の他の目的は、１０−１２ｍｇ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌ、例えば１０−１０ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する修飾された糖タンパク質を含有する医薬組成物を提供することであり、ここで、該組成物は２．０〜１０．０のｐＨを有する。該組成物はバッファー系、保存料、等張化剤、キレート剤、安定剤及び界面活性剤をさらに含有しうる。本発明の一実施態様では、医薬組成物は水性組成物、すなわち水を含有する組成物である。このような組成物は、典型的には溶液又は懸濁液である。本発明のさらなる実施態様では、医薬組成物は水溶液である。「水性組成物」なる用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水分を含有する組成物と定義される。同様に「水溶液」なる用語も、少なくとも５０％ｗ／ｗの水分を含有する溶液と定義され、「水性懸濁液」なる用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水分を含有する懸濁液と定義される。
【００８８】
他の実施態様では、医薬組成物は凍結乾燥された組成物であり、医師又は患者は、使用前に溶媒及び／又は希釈剤を添加する。他の実施態様では、医薬組成物は事前の溶解の必要がない使用準備が整った乾燥組成物（例えば凍結乾燥又はスプレードライ）である。
【００８９】
さらなる態様において、本発明は、修飾された糖タンパク質とバッファーの水溶液を含有する医薬組成物に関し、ここで該修飾された糖タンパク質は０．１−１００ｍｇ／ｍｌ又はそれ以上の濃度で存在しており、該組成物は約２．０〜１０．０のｐＨを有する。
【００９０】
本発明の他の実施態様では、組成物のｐＨは、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、及び１０．０からなる列挙から選択される。
【００９１】
本発明のさらなる実施態様では、バッファーは、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、コハク酸塩、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸又はそれらの混合物からなる群から選択される。これらの特定のバッファーの各一が本発明の別の実施態様を構成する。
【００９２】
本発明のさらなる実施態様では、組成物は薬学的に許容可能な保存料をさらに含有する。本発明のさらなる実施態様では、保存料は、フェノール、ｏ-クレゾール、ｍ-クレゾール、ｐ-クレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ-ヒドロキシ安息香酸プロピル、２-フェノキシエタノール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸ブチル、２-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、チメロサール、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロロヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウム、クロロフェネシン（３ｐ-クロルフェノキシプロパン-１,２-ジオール）又はそれらの混合物からなる群から選択される。本発明の更なる実施態様では、保存料は、０．１ｍｇ／ｍｌから２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。本発明の更なる実施態様では、保存料は、０．１ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。本発明の更なる実施態様では、保存料は、５ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。本発明の更なる実施態様では、保存料は、１０ｍｇ／ｍｌから２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。これら特定の保存料の各一が本発明の別の実施態様を構成する。薬学的組成物中における保存料の使用は当業者によく知られている。簡便には、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20版, 2000が参照される。
【００９３】
本発明の更なる実施態様では、組成物は等張剤を更に含有する。本発明の更なる実施態様では、等張剤は、塩（例えば塩化ナトリウム）、糖又は糖アルコール、アミノ酸（例えばＬ-グリシン、Ｌ-ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン）、アルジトール（例えばグリセロール（グリセリン）、１,２-プロパンジオール（プロピレングリコール）、１,３-プロパンジオール、１,３-ブタンジオール）、ポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ４００）、又はそれらの混合物からなる群から選択されうる。例えばフルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンブン、ヒドロキシエチルデンプン、カルボキシメチルセルロース-Ｎａを含む単糖類、二糖類、又は多糖類、又は水溶性グルカン類のような任意の糖を使用することができる。一実施態様では、糖添加剤はスクロースである。糖アルコールは少なくとも一つの-ＯＨ基を有するＣ４−Ｃ８炭化水素として定義され、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトール、アラビトールを含む。一実施態様では、糖アルコール添加剤はマンニトールである。上述の糖類又は糖アルコールは個々に又は組み合わせて使用することができる。糖又は糖アルコールが液体調製物中で可溶性であり、本発明の方法を使用して達成される安定化効果に悪影響を及ぼさない限り、使用される量に決まった制限はない。一実施態様では、糖又は糖アルコール濃度は約１ｍｇ／ｍｌと約１５０ｍｇ／ｍｌの間である。本発明の更なる実施態様では、等張剤は１ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。本発明の更なる実施態様では、等張剤は１ｍｇ／ｍｌから７ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。本発明の更なる実施態様では、等張剤は８ｍｇ／ｍｌから２４ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。本発明の更なる実施態様では、等張剤は２５ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。これらの特定の等張剤の各一は本発明の別の実施態様を構成する。薬学的組成物中における等張剤の使用は当業者によく知られている。簡便には、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20版, 2000が参照される。
【００９４】
本発明の更なる実施態様では、組成物はキレート剤を更に含有する。本発明の更なる実施態様では、キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸、及びアスパラギン酸の塩、及びそれらの混合物から選択されうる。本発明の更なる実施態様では、キレート剤は０．１ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。本発明の更なる実施態様では、キレート剤は０．１ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。本発明の更なる実施態様では、キレート剤は２ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。これらの特定のキレート剤の各一は本発明の別の実施態様を構成する。薬学的組成物中におけるキレート剤の使用は当業者によく知られている。簡便には、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20版, 2000が参照される。
【００９５】
本発明のさらなる実施態様では、組成物は安定剤をさらに含有する。医薬組成物における安定剤の使用は当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第20版, 2000が参照される。
【００９６】
より詳細には、本発明の組成物は、液体薬学的製剤として貯蔵中に凝集体形成を示すおそれのあるタンパク質がその治療的に活性な成分に含まれる安定化された液体医薬組成物である。「凝集体形成」とは、可溶性のままでありうるオリゴマーか、溶液から沈殿する大きな目視できる凝集体の形成を生じるポリペプチド分子間の物理的相互作用のことである。「貯蔵中」とは、ひとたび調製された液体医薬組成物又は組成物が直ぐには患者に投与されないことを意図する。むしろ調製後に、液体形態、凍結状態、又は液体形態もしくは患者への投与に適した他の形態へ後で再構成するための乾燥形態の何れかで貯蔵のために包装される。「乾燥形態」とは、液体医薬組成物又は組成物が、フリーズドライ（つまり凍結乾燥；例えばWilliams及びPolli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38:48-59）、スプレードライ（Masters (1991), Spray-Drying Handbook (5版; Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), pp.491-676；Broadhead等 (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206；及びMumenthaler等 (1994) Pharm. Res. 11:12-20を参照）又はエアードライ（Carpenter及びCrowe (1988) Cryobiology 25:459-470；及びRoser (1991) Biopharm. 4:47-53）の何れかによって乾燥されていることを意図する。液体医薬組成物の貯蔵中におけるタンパク質による凝集体形成はそのタンパク質の生物学的活性に悪影響を及ぼし得、医薬組成物の治療効果を損なわしめる。更に、凝集体形成は、そのタンパク質含有薬学的組成物を、注入系を使用して投与する場合、チューブ、膜、又はポンプの詰まりのような他の問題を生じうる。
【００９７】
本発明の医薬組成物は組成物の貯蔵の間におけるタンパク質の凝集体形成を減少させるのに十分な量のアミノ酸塩基を更に含みうる。「アミノ酸塩基」とは、アミノ酸又はアミノ酸の組合せのことであり、任意の与えられたアミノ酸はその遊離塩基形態又はその塩形態で存在する。アミノ酸の組合せが使用される場合、アミノ酸の全てがその遊離塩基形態で存在し得、全てはその塩形態で存在し得、あるいは幾つかがその遊離塩基形態で存在し得る一方、他のものはその塩形態で存在する。一実施態様では、本発明の組成物を調製する際に使用するアミノ酸は、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸のような荷電側鎖を担持しているものである。特定のアミノ酸（例えばメチオニン、ヒスチジン、イミダゾール、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン及びそれらの混合物）の任意の立体異性体（つまりＬ、Ｄ、又はその混合体）又はこれら立体異性体の組み合わせは、特定のアミノ酸がその遊離塩基形態又はその塩形態の何れかで存在している限り、本発明の医薬組成物中に存在しうる。一実施態様では、アミノ酸のＬ立体異性体が使用される。一実施態様では、Ｄ立体異性体が使用される。本発明の組成物はまたこれらのアミノ酸のアナログと共に製剤化されうる。「アミノ酸アナログ」とは、本発明の液体医薬組成物の貯蔵中にタンパク質による凝集体形成を減少させるという所望の効果をもたらす天然に生じるアミノ酸の誘導体のことである。適切なアルギニンアナログには、例えばアミノグアニジン、オルニチン及びＮ-モノエチルＬ-アルギニンが含まれ、適切なメチオニンアナログには、エチオニン及びブチオニンが含まれ、適切なシステインアナログにはＳ-メチル-Ｌシステインが含まれる。他のアミノ酸の場合と同様に、アミノ酸アナログはその遊離の塩基形態又はその塩形態で組成物中に導入される。本発明の更なる実施態様では、アミノ酸又はアミノ酸アナログは、タンパク質の凝集を防止又は遅延させるのに十分な濃度で使用される。
【００９８】
本発明の更なる実施態様では、治療剤として作用するタンパク質が酸化を受けやすい少なくとも一のメチオニン残基を含むタンパク質である場合、メチオニン（又は他の含硫アミノ酸又はアミノ酸アナログ）を添加してメチオニン残基がメチオニンスルホキシドへ酸化するのを阻害することができる。「阻害する」とは、メチオニンが酸化された種の経時的な蓄積の最小化のことである。メチオニンの酸化を阻害することはポリペプチドをその正しい分子形態に、より維持することとなる。メチオニンの任意の立体異性体（Ｌ又はＤ異性体）又はその組み合わせを使用することができる。添加される量は、メチオニンスルホキシドの量が規制機関に受け入れられるようにメチオニン残基の酸化を阻害するのに十分な量でなければならない。典型的には、これは、組成物が約１０％以下から約３０％以下のメチオニンスルホキシドしか含まないことを意味する。一般に、これは、メチオニン残基に加えられるメチオニンの比が約１：１から約１０００：１、例えば１０：１から約１００：１の範囲であるようにメチオニンを添加することによって達成することができる。
【００９９】
本発明の更なる実施態様では、組成物は高分子量ポリマー又は低分子化合物の群から選択される安定剤を更に含有する。本発明の更なる実施態様では、安定剤はポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ３３５０）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、カルボキシ／ヒドロキシセルロース又はその誘導体（例えばＨＰＣ、ＨＰＣ-ＳＬ、ＨＰＣ-Ｌ、ＨＰＭＣ）、シクロデキストリン、モノチオグリセロール、チオグリコール酸及び２-メチルチオエタノールのような硫黄含有物質、及び異なった塩（例えば塩化ナトリウム）から選択される。これらの特定の安定剤の各一が本発明の他の実施態様を構成する。
【０１００】
医薬組成物はまたその中の治療的に活性なポリペプチドの安定性を更に向上させる更なる安定剤を含有しうる。本発明にとって特に興味がある安定剤には、限定するものではないが、メチオニンの酸化からポリペプチドを保護するメチオニン及びＥＤＴＡと、凍結融解又は機械的せん断に伴う凝集からポリペプチドを保護する非イオン性界面活性剤が含まれる。
【０１０１】
本発明の更なる実施態様では、組成物は界面活性剤を更に含有する。本発明の更なる実施態様では、界面活性剤は、洗浄剤、エトキシル化ヒマシ油、ポリグリコール化グリセリド、アセチル化モノグリセリド、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシプロピレン・ポリオキシエチレンブロックポリマー（例えばプルロニック(登録商標)Ｆ６８、ポロキサマー１８８及び４０７、トリトンＸ-１００のようなポロキサマー類）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン及びポリエチレン誘導体、例えばアルキル化及びアルコキシル化誘導体（トゥイーン類、例えばＴｗｅｅｎ-２０、Ｔｗｅｅｎ-４０、Ｔｗｅｅｎ-８０及びＢｒｉｊ-３５）、そのモノグリセリド又はそのエトキシル化誘導体、ジグリセリド又はそのポリオキシエチレン誘導体、アルコール、グリセロール、レクチン及びリン脂質（例えばホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ジホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン）、リン脂質誘導体（例えばジパルミトイルホスファチジン酸）及びリゾリン脂質誘導体（例えばパルミトイルリゾホスファチジル-Ｌ-セリン及びエタノールアミン、コリン、セリンもしくはスレオニンの１-アシル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスフェートエステル）並びにリゾホスファチジル及びホスファチジルコリンのアルキル、アルコキシル（アルキルエステル）、アルコキシ（アルキルエーテル）誘導体、例えばリゾホスファチジルコリンのラウロイル及びミリストイル誘導体、ジパルミトイルホスファチジルコリン、及び極性頭部基、つまり、コリン、エタノールアミン、ホスファチジン酸、セリン、スレオニン、グリセロール、イノシトール、正荷電ＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＭＡ、ＤＣＰ、ＢＩＳＨＯＰ、リゾホスファチジルセリン及びリゾホスファチジルスレオニンの修飾体、及びグリセロリン脂質（例えばケファリン）、グリセロ糖脂質（例えばガラクトピラノシド）、スフィンゴ糖脂質（例えばセラミド、ガングリオシド）、ドデシルホスホコリン、ニワトリ卵白リゾレシチン、フシジン酸誘導体（例えばタウロ-ジヒドロフシジン酸ナトリウム等々）、長鎖脂肪酸及びその塩Ｃ６-Ｃ１２（例えばオレイン酸及びカプリル酸）、アシルカルニチン及び誘導体、リジン、アルギニン又はヒスチジンのＮα-アシル化誘導体、又はリジンもしくはアルギニンの側鎖アシル化誘導体、リジン、アルギニン又はヒスチジンと中性又は酸性アミノ酸の任意の組合せを含むジペプチドのＮα-アシル化誘導体、中性アミノ酸と二つの荷電アミノ酸の任意の組合せを含むトリペプチドのＮα-アシル化誘導体、ＤＳＳ（ドキュセート・ナトリウム、ＣＡＳ登録番号［５７７-１１-７］）、ドキュセート・カルシウム、ＣＡＳ登録番号［１２８-４９-４］、ドキュセート・カリウム、ＣＡＳ登録番号［７４９１-０９-０］、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム又はラウリル硫酸ナトリウム）、カプリル酸ナトリウム、コール酸又はその誘導体、胆汁酸及びその塩及びグリシンもしくはタウリンコンジュゲート、ウルソデオキシコール酸、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、Ｎ-ヘキサデシル-Ｎ,Ｎ-ジメチル-３-アンモニオ-１-プロパンスルホネート、アニオン性（アルキル-アリール-スルホネート）一価界面活性剤、両性イオン性界面活性剤（例えばＮ-アルキル-Ｎ,Ｎ-ジメチルアンモニオ-１-プロパンスルホネート類、３-コールアミド-１-プロピルジメチルアンモニオ-１-プロパンスルホネート、カチオン性界面活性剤（第４級アンモニウム塩基）（例えば臭化セチル-トリメチルアンモニウム、塩化セチルピリジニウム）、非イオン性界面活性剤（例えばドデシルβ-Ｄ-グルコピラノシド）、エチレンジアミンへプロピレンオキシド及びエチレンオキシドを連続添加して誘導される四官能性ブロックコポリマーであるポロキサミン（例えばテトロニックス(Tetronic's)）から選択することができ、あるいは該界面活性剤はイミダゾリン誘導体又はその混合物の群から選択されうる。これらの特定の界面活性剤の各一は本発明の別の実施態様を構成する。
医薬組成物中における界面活性剤の使用は当業者によく知られている。簡便には、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20版, 2000が参照される。
【０１０２】
その他の成分が本発明の医薬組成物中に存在することもありうる。そのような更なる成分には、湿潤剤、乳化剤、抗酸化剤、充填剤、張度調節剤、キレート剤、金属イオン、油性媒体、タンパク質（例えばヒト血清アルブミン、ゼラチン又はタンパク質）及び双性イオン（例えばベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リジン、ヒスチジンのようなアミノ酸）が含まれる。そのような更なる成分は、当然ながら、本発明の医薬組成物の全体の安定性に悪影響を及ぼしてはならない。
【０１０３】
本発明の修飾された糖タンパク質を含む医薬組成物は、そのような治療を必要とする患者のいくつかの部位に投与され得、例えば局所的部位、例えば皮膚及び粘膜部位、吸収をバイパスする部位、例えば動脈、静脈、心臓への投与、及び吸収を含む部位、例えば皮膚、皮下、筋肉又は腹部への投与である。
【０１０４】
本発明の医薬組成物の投与は、いくつかの投与経路、例えば舌、舌下、頬、口、経口、胃及び腸、鼻、肺を介して、例えば細気管支及び肺胞及び／又はそれらを組合せたもの、表皮、真皮、経皮、膣、直腸、眼を介して、例えば結膜、尿管、及び非経口を介して、そのような治療を必要としている患者に投与されうる。
【０１０５】
本発明の組成物は、いくつかの投薬形態、例えば溶液、懸濁液、エマルション、マイクロエマルション、多相エマルション、フォーム、膏薬、ペースト、プラスター、軟膏、錠剤、コート錠剤、リンス、カプセル、例えば硬質ゼラチンカプセル及び軟質ゼラチンカプセル、坐薬、直腸用カプセル、ドロップ、ゲル、スプレー、パウダー、エアゾール、吸入剤、点眼剤、眼軟膏、眼用リンス、膣用ペッサリー、膣用リング、膣用軟膏、注射液、インサイツ形質転換溶液、例えばインサイツゲル化、インサイツ硬化、インサイツ沈殿、インサイツ結晶化のもの、輸液、及び移植片として投与されうる。
【０１０６】
本発明の組成物は、修飾された糖タンパク質の安定性をさらに高め、生物学的利用能を増加させ、溶解度を高め、副作用を低減させ、当業者によく知られている時間療法を達成し、また患者のコンプライアンスを高め、又はそれらの任意の組合せのために、例えば共有的、疎水的及び静電気的相互作用を介して、薬剤担体、薬剤デリバリー系及び先端薬剤デリバリー系にさらに配合され、又は結合されうる。担体、薬剤デリバリー系及び先進薬剤デリバリー系の例には、限定されるものではないが、ポリマー、例えばセルロース及び誘導体、多糖類、例えばデキストラン及び誘導体、デンプン及び誘導体、ポリ(ビニルアルコール)、アクリレート及びメタクリレートポリマー、ポリ乳酸及びポリグリコール酸及びそれらのブロックコポリマー、ポリエチレングリコール、担体タンパク質、例えばアルブミン、ゲル、例えばサーモゲル化系、例えば当業者によく知られているブロックコポリマー系、ミセル、リポソーム、ミクロスフィア、ナノ粒子、液晶及びそれらの分散液、脂質-水系における相挙動の当業者によく知られているＬ２相とそのディスパージョン、ポリマーミセル、多相エマルション、自己乳化、自己-マイクロ乳化、シクロデキストリン及びその誘導体、及びデンドリマーが含まれる。
【０１０７】
本発明の組成物は、全ての装置が当業者によく知られたものである例えば定量吸入器、乾燥パウダー吸入器及びネブライザーを使用し、修飾された糖タンパク質を肺に投与するための固形物、半固形物、パウダー及び溶液の組成物に有用である。
【０１０８】
本発明の組成物は、制御された徐放性、持続性、遅延及び持続放出薬物デリバリー系の組成物に特に有用である。より詳細には、限定されるものではないが、組成物は、当業者によく知られている非経口用の制御放出及び徐放系（双方の系は、投与数を何倍も低下させる)組成物に有用である。さらにより好ましくは、皮下投与される制御放出及び徐放系である。本発明の範囲を限定するものではないが、有用な制御放出系及び組成物の有用な例は、ヒドロゲル、油性ゲル、液晶、ポリマーミセル、ミクロスフィア、ナノ粒子である。
【０１０９】
本発明の組成物に有用な徐放系の製造方法は、限定されるものではないが、結晶化、凝縮、共結晶化、沈殿、共沈殿、乳化、分散、高圧ホモジナイズ、カプセル化、噴霧乾燥、マイクロカプセル化、コアセルベーション、相分離、ミクロスフィアを製造するための溶媒蒸発、押出及び超臨界プロセスを含む。一般的には、Handbook of Pharmaceutical Controlled Release(Wise, D.L.編 Marcel Dekker, New York, 2000)及びDrug and the Pharmaceutical Sciences vol.99：Protein Composition and Delivery(MacNally, E.J.編 Marcel Dekker, New York, 2000)を参照。
非経口投与は、シリンジ、場合によってはペン状シリンジによる皮下、筋肉内、腹膜内又は静脈内注射によって実施することができる。あるいは、非経口投与は輸液ポンプにより実施することができる。さらなる選択肢は、鼻用又は肺用スプレーの形態で修飾された糖タンパク質を投与するための溶液又は懸濁液であってもよい組成物にある。さらなる選択肢としては、本発明の修飾された糖タンパク質を含む医薬組成物を、例えば針のない注射、又はイオン導入パッチであってよいパッチによる経皮投与、又は頬等の経粘膜投与用に適合させることもできる。
【０１１０】
「安定化された組成物」なる用語は、物理的な安定性が増し、化学的な安定性が増し、又は物理的及び化学的安定性が増した組成物を意味する。
ここで使用されるタンパク質組成物の「物理的安定性」という用語は、熱機械的ストレスへのタンパク質の暴露及び／又は疎水性表面及び界面のような不安定化している界面及び表面との相互作用の結果としてのタンパク質の生物学的に不活性な及び／又は不溶性の凝集体を形成するタンパク質の傾向を意味する。タンパク質水性組成物の物理的安定性は、適切な容器（例えばカートリッジ又はバイアル）中に満たした組成物を機械的／物理的ストレス（例えば攪拌）に様々な時間の間、異なった温度で暴露した後に視覚検査及び／又は濁度測定によって評価される。組成物の視覚検査は暗い背景中において鋭く集光された光下で実施される。組成物の濁りは例えば濁度を０から３の尺度（濁りを示さない組成物が視覚スコア０に相当し、昼光で可視できる濁りを示す組成物は視覚スコア３に相当する）でランク付けすることにより特徴付けされる。組成物は、昼光下で可視できる濁りを示す場合にタンパク質凝集に対して物理的に不安定であると分類される。あるいは、組成物の濁りは当業者によく知られている簡単な濁度測定によって評価することができる。タンパク質水性組成物の物理的安定性はタンパク質の立体構造状態の分光学的薬剤又はプローブを使用してまた評価することができる。プローブは好ましくはタンパク質の非天然配座異性体に優先的に結合する小分子である。タンパク質構造の小分子分光学的プローブの一例はチオフラビンＴである。チオフラビンＴはアミロイド線維の検出に広く使用されている蛍光染料である。線維と、おそらくは他のタンパク質立体配置もまた存在すると、チオフラビンＴが約４５０ｎｍで新たな励起極大を引き起こし、線維タンパク質形態に結合したとき約４８２ｎｍで増強した発光を生じる。未結合のチオフラビンＴは本質的にはその波長で非蛍光である。
【０１１１】
天然から非天然状態までのタンパク質構造における変化のプローブとして、他の小分子を使用することができる。例えば、タンパク質の露出した疎水性パッチに優先的に結合する「疎水性パッチ」プローブである。疎水性パッチは、一般には、その天然状態のタンパク質の３次構造内に埋められているが、タンパク質がアンフォールドされ又は変性が始まると、露出するようになる。これらの小分子の分光学的プローブは、芳香族の疎水性染料、例えばアントラセン、アクリジン、フェナントロリン等である。他の分光学的プローブは金属-アミノ酸錯体、例えば疎水性アミノ酸、例えばフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、及びバリン等のコバルト金属錯体である。
【０１１２】
ここで使用されるタンパク質組成物の「化学的安定性」なる用語は、天然タンパク質構造と比較して潜在的に少ない生物学的効力及び／又は潜在的に増加した免疫原性を持つ化学的変性産物の形成に至るタンパク質構造中の化学共有結合変化を意味する。天然タンパク質のタイプと性質及びタンパク質がさらされる環境に応じて、様々な化学的変性産物が形成されうる。最も可能性が高いことは化学的変性は完全には避けることができないことであり、当業者にはよく知られているように、化学的変性産物の量の増加がタンパク質組成物の貯蔵や使用中にしばしば見られる。殆どのタンパク質は、脱アミド化を受ける傾向があり、これはグルタミニル又はアスパラギニル残基の側鎖アミド基が加水分解されて遊離のカルボン酸を形成するプロセスである。他の変性経路は、アミド基転移及び／又はジスルフィド相互作用を通して二以上のタンパク質分子が互いに共有結合し、共有結合した二量体、オリゴマー及び多量体変性産物の形成に至る高分子量転換産物の形成を含む（Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T. J. & Manning M. C., Plenum Press, New York 1992）。(例えばメチオニン残基の)酸化は化学的変性の他の変形例として挙げることができる。タンパク質組成物の化学的安定性は、異なった環境条件への暴露後に様々な時点において化学的変性産物の量を測定することによって評価することができる（変性産物の形成は例えば温度上昇によってしばしば加速され得る）。それぞれ個々の変性産物の量は、様々なクロマトグラフィー法（例えばＳＥＣ-ＨＰＬＣ及び／又はＲＰ-ＨＰＬＣ)を使用して分子サイズ及び／又は電荷に応じて変性産物を分離することにより決定されることが多い。
【０１１３】
よって、上に概説したように、「安定化された組成物」とは増加した物理的安定性、増加した化学的安定性、又は増加した物理的及び化学的安定性を有する組成物を意味する。一般に、組成物は、有効期限に達するまで（推奨された使用及び貯蔵条件に応じて）使用及び貯蔵中に安定でなければならない。
本発明の一実施態様では、修飾された糖タンパク質を含有する医薬組成物は、６週間を越える使用の間、また３年を越える貯蔵の間、安定している。
本発明の他の実施態様では、修飾された糖タンパク質を含有する医薬組成物は、４週間を越える使用の間、また３年を越える貯蔵の間、安定している。
本発明のさらなる実施態様では、修飾された糖タンパク質を含有する医薬組成物は、４週間を越える使用の間、また２年を越える貯蔵の間、安定している。
本発明のさらなる実施態様では、修飾された糖タンパク質を含有する医薬組成物は、２週間を越える使用の間、また２年を越える貯蔵の間、安定している。
【０１１４】
ここに引用された刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての文献は、本明細書の他の箇所で特定の文献が別個に援用されているかどうかにかかわらず、あたかも各文献が個々にかつ特に出典明示により援用され、その全体がここに記載されているかの如く、ここに出典明示によりその全体が同じ程度に援用される(法律により許容される最大範囲)。
本発明で記述する場合における「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び類似の指示対象の使用は、ここに特段の定義が示されたり、明瞭に内容に矛盾が生じていない限り、単数形と複数形の双方をカバーしていると解釈される。
【０１１５】
特段の定義が示されない限り、ここで提供される全ての正確な値は、対応する近似値を代表する(例えば、特定の因子又は測定に対して提供される全ての正確な例示値は、適切な場合には「約」により修飾される、対応する近似測定値をまた提供すると考えることができる)。
要素又は要素群に関して「含有する」、「持つ」、「有する」、又は「含む」のような用語を使用する任意の態様又は本発明の態様のここに記載した説明は、特段の定義が示されないか又は明瞭に内容が矛盾しない限り、その特定の要素又は要素群「からなる」、「から本質的になる」、「含む」又は「含める」態様又は本発明の態様に対して裏付けを提供するものである（例えば、特定の成分を含有するここに記載の組成物は、特段の定義が示されないか又は明瞭に内容が矛盾しない限り、その成分からなる組成物を記述するものと理解されなければならない)。
【０１１６】
全ての表題及び副題は便宜のためのみにここで使用され、決して本発明を限定するものと解釈してはいけない。
本明細書における任意のかつ全ての例、又は例を示す表現（例えば「等」）の使用は、発明をより良好に例証するためだけのものであり、特段示されていない限り、本発明の範囲に対する限定をもたらすものではない。明細書中の如何なる表現も、請求項に記載していない要素が発明の実施に必須であることを示していると解釈してはいけない。
ここでの特許文献の引用及び援用は便宜のためにのみなすもので、そのような特許文献の有効性、特許性及び／又は権利行使可能性についての見解を何ら反映するものではない。
【実施例】
【０１１７】
略語：
ＳＤＳ-ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＦＶＩＩａ：第ＶＩＩａ因子
ＦＶＩＩＩ：第ＶＩＩＩ因子
ＦＩＸ：第ＩＸ因子
【０１１８】
材料、装置及び方法
精製：
イオン交換カラム(HiTrap Q HP, Amersham Bioscience)又はサイズ排除カラム(XK26/60 HiLoad Superdex 200, Amersham Bioscience)でのタンパク質精製を、FC-950フラクション収集器を具備するAkta FPLCを使用して実施した。溶出用バッファー、カラム及びフラクション収集器を５℃で温度調節した。
ＳＤＳ-ＰＡＧＥ：
Invitrogenの標準的なプロトコルに従い、プレキャストされた４−１２％のビス-トリスゲル、NuPAGE MES SDSランニングバッファー、 Mark 12 標準体、及びNUPAGE LDSサンプルバッファーと共にInvitrogenＴＭのXcell SurelockＴＭMinI-Cellシステムを使用して、ＳＤＳ-ＰＡＧＥを実施した。Invitrogenの標準的なプロトコルに従い、ゲルをSimpleBlueＴＭで染色した。
バッファー溶液
ＧｌｙＧｌｙバッファー：２５ｍＭのＧｌｙ-Ｇｌｙ、５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ６．０
ＣａＣｌ２フリーのＧｌｙＧｌｙバッファー：２５ｍＭのＧｌｙ-Ｇｌｙ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０
Ｈｅｐｅｓバッファー：５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０，０１％のトゥイーン８０、ｐＨ＝７．４
【０１１９】
実施例
ＦＶＩＩａのＮａＩＯ４処理及びＳ２２８８活性
ＮａＩＯ４と残留ペプチド分解(peptiodlytical activity)活性との相関研究→非自明な関係
【０１２０】
アッセイＩ
ＦＶＩＩａに対するペプチド分解活性の測定：
ペプチド分解活性を、Chromogenix, Molndal, Swedenからの発色基質Ｓ-２２８８(Ｈ-Ｄ-Ｉｌｅ-Ｐｒｏ-Ａｒｇ-Ｐ-ニトロアニリン)を使用して測定した。次のプロトコルを適用した：Ｈｅｐｅｓバッファーに入った１０ｍＭのＳ２２８８保存液を調製した。同様に、Ｈｅｐｅｓバッファーに入った２００ｎＭの組織因子保存液を調製した。試験体と参照化合物(例えば野生型ＦＶＩＩａ)の２００ｎＭ保存液を、Ｈｅｐｅｓバッファーにて調製した。化合物を、ＥＬＩＳＡウェルで３回試験した。典型的な実験では、１０ｕｌの２００ｎＭ試験体溶液、５０ｕｌの２００ｎＭ組織因子保存液、及び１３５μｌのＨｅｐｅｓバッファーを、ウェルに添加した。５ｕｌの２００ｎＭ Ｓ２２８８保存液を添加することにより、反応を開始させた。室温で１５分間、ＥＬＩＳＡ-リーダー(４０５ｎｍでの吸光度)でウェルを連続的に分析した。開始速度から相対的活性を算出し、野生型ＦＶＩＩａの速度と比較した。修飾されたＦＶＩＩａアナログに対する活性を、野生型ＦＶＩＩａの活性のパーセントとして報告した。
【実施例１】
【０１２１】
１０Ｋ ＰＥＧ-ＯＮＨ２：１０Ｋ-ＳＭＢ-ＰＥＧ(１．００ｇ；０．１ｍｍｏｌ；Nektar Inc)を、ＤＣＭ(１０ｍｌ)に溶解させた。４-(Ｎ-Ｔ-ブトキシカルボニルアミノオキシ)ブチルアミン(０．２０ｇ、１ｍｍｏｌ、WO 2005014049 A2に記載されたようにして調製)を添加し、混合物を室温で１６時間攪拌した。ジエチルエーテル(９０ｍｌ)を添加し、白色沈殿物を濾過した。ＤＣＭ(１０ｍｌ)に沈殿物を再溶解させ、ジエチルエーテル(９０ｍｌ)を添加することにより、該プロセスを繰り返した。ついで、沈殿した物質をＤＣＭ(６ｍｌ)に再溶解させ、Amberlyst 15イオン交換樹脂(２．０ｇ；予めＤＣＭ及びＤＣＭに１０％のＥｔＯＨが入ったもので洗浄)を添加した。混合物を室温で３０分攪拌し、ついで樹脂を濾過し、ＤＣＭで広範囲に洗浄した。組合せたＤＣＭ溶液を、ロータリーエバポレータにて最小容量になるまで濃縮し、ついでジエチルエチル(９０ｍｌ)を添加し、生成物を沈殿させた。生成物をＤＣＭ(６ｍｌ)に溶解させ、ＴＦＡ(６ｍｌ)を添加した。混合物を室温で０．５時間攪拌した。生成物をジエチルエーテル(１００ｍｌ)で沈殿させ、濾過した。生成物をＤＣＭ(５ｍｌ)に再溶解させ、トリエチルアミン(１ｍｌ)を添加した。混合物を５分攪拌し、ついで、生成物をジエチルエーテル(１００ｍｌ)で再度沈殿させた。沈殿物を濾過し、ジエチルエーテルで２回洗浄し、真空オーブンで一晩乾燥させた。収量：４７５ｍｇ(４６％)。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３；選択ピーク)：δ１．２５ｐｐｍ(ｄ,３Ｈ)；１．５０−１．７５(ｍ,６Ｈ)；１．８２(ｍ,１Ｈ)；３．３８(ｓ,３Ｈ)；３，４５−３，９０(ｍ,ｃａ．９００Ｈ)。
【実施例２】
【０１２２】
モノ １０Ｋ-ＰＥＧ-ＦＶＩＩａ(０１２８-００００-１０１８-１Ａ)：
１０ｍｌの２５ｍＭ Ｇｌｙ-Ｇｌｙ、５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ６．０(ＧｌｙＧｌｙバッファー)に溶解させた第ＶＩＩａ因子(１４ｍｇ、０．２８ｕｍｏｌ)を、ＣａＣｌ２フリーのＧｌｙＧｌｙバッファーに２０ｍＭのＮａＩＯ４を溶解させた１００ｕｌの溶液及びＧｌｙＧｌｙバッファーに１０Ｋ-ＰＥＧ-ＯＮＨ２(実施例１、４２ｍｇ；４．２ｕｍｏｌ；第ＶＩＩａ因子に対して１５当量)を溶解させた１０００ｕｌの溶液に添加した。時折振揺させつつ、混合物を２時間氷上に配した。ついで、ＧｌｙＧｌｙバッファーにＭｅＯＮＨ２・ＨＣｌ(１７ｍｇ；０．２１ｍｍｏｌ)を溶解させた溶液５００ｕｌ(１ＭのＮａＯＨでｐＨを６．０に調節)を反応混合物に添加した。氷上にさらに１０分混合物を放置した。ついで、反応混合物を、ｐＨ９．０以下に維持しつつ、１００ｍＭの二塩基ＥＤＴＡ(４．５ｍｌ)の冷溶液に添加した。ついで、１ＮのＨＣｌ水１００ｕｌでｐＨを８．０に調節した。
【０１２３】
イオン交換クロマトグラフィー：
過剰のＰＥＧ-ＯＮＨ２をイオン交換クロマトグラフィーにより除去した。冷却した反応混合物を、２５ｍＭのＧｌｙＧｌｙ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０で予め平衡にした５ｍｌのHiTrap Qイオン交換カラム(Amersham Bioscience)に充填した。一定の流量(１ｍｌ／分)及び温度(５℃)にて、２５ｍＭのＧｌｙＧｌｙ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０(バッファーＡ)、１０ｃｖで、ついで２５ｍＭのＧｌｙＧｌｙ、５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ８．０(バッファーＢ)、１５ｃｖで、カラムを溶出させた。２８０ｎｍの吸光度により溶出物をモニターした。
【０１２４】
サイズ排除クロマトグラフィー：
５℃で操作されるFrac-950を具備するAKTA FPLC(Amersham Bioscience)を使用し、Superdex 200でのサイズ排除クロマトグラフィーにより、HiTrap Qからプール化フラクションとして回収されたグリコペグ化ＦＶＩＩａ変異体から非ペグ化ＦＶＩＩａを除去した。XK26/60 HiLoad Superdex 200カラム(３２０ｍｌ ｃｖ)を予め平衡にしておき(１０ｃｖ)、充填後、２５ｍＭのＧｌｙＧｌｙ、５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ６．０を用い、流量２．５ｍｌ／分で溶出させた。２８０ｎｍの吸光度により溶出物をモニターした。１０ｍｌのフラクションを収集した。Invitrogenにより記載されたようにし、Simple Blueで染色されたＳＤＳ-ＰＡＧＥ(４-１２％のビス-トリスNuPAGEゲル)でフラクションを分析した。純粋なモノペグ化ＦＶＩＩａを含むフラクションをプール化し、４０００ｒｐｍ、１０℃で、１３．５分、Amicon ＵltraＴＭ-15(10K MWCO)遠心分離フィルターを介して濾過することにより濃縮して、最終容量４．１ｍｌが得られた。
【０１２５】
タンパク質濃度はＵＶ測定(Ｅ２８０ｎｍ＝１．３２ｍｌ／ｍｇ／ｃｍを使用)で０．２９ｍｇ／ｍｌであると決定され、これは０．３５ｍｇ／ｍｌのＦＶＩＩＡ-１０Ｋ ＰＥＧと等しい。ペプチド分解活性(Ｓ２２８８アッセイ)は野生型ＦＶＩＩａに対して７９％であった。
【実施例３】
【０１２６】
高置換(ＨＳ)及び低置換(ＬＳ)１０Ｋ-ＰＥＧ-ＦＶＩＩａの調製
１０ｍｌの２５ｍＭ Ｇｌｙ-Ｇｌｙ、５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ６．０(ＧｌｙＧｌｙバッファー)に溶解させた第ＶＩＩａ因子(１４ｍｇ、０．２８ｕｍｏｌ)を、ＣａＣｌ２フリーのＧｌｙＧｌｙバッファーに２０ｍＭのＮａＩＯ４を溶解させた１００ｕｌの溶液、及びＧｌｙＧｌｙバッファーに１０Ｋ-ＰＥＧ-ＯＮＨ２(実施例１、４２ｍｇ；４．２ｕｍｏｌ；第ＶＩＩａ因子に対して１５当量)を溶解させた１０００ｕｌの溶液に添加した。時折振揺させつつ、混合物を２４時間４℃に配した。ついで、ＧｌｙＧｌｙバッファーにＭｅＯＮＨ２．ＨＣｌ(１７ｍｇ；０．２１ｍｍｏｌ)を溶解させた溶液５００ｕｌ(１ＭのＮａＯＨでｐＨを６．０に調節)を反応混合物に添加した。氷上にさらに１０分混合物を放置した。ついで、反応混合物をｐＨ９．０以下に維持しつつ、１００ｍＭの二塩基ＥＤＴＡ(４．５ｍｌ)の冷溶液に添加した。ついで、１ＮのＨＣｌ水６０ｕｌでｐＨを８．０に調節した。
【０１２７】
イオン交換クロマトグラフィー：
過剰のＰＥＧ-ＯＮＨ２をイオン交換クロマトグラフィーにより除去した。冷却した反応混合物を、２５ｍＭのＧｌｙＧｌｙ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０で予め平衡にされた５ｍｌのHiTrap Qイオン交換カラム(Amersham Bioscience)に充填した。一定の流量(１ｍｌ／分)及び温度(５℃)にて、２５ｍＭのＧｌｙＧｌｙ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０(バッファーＡ)、１０ｃｖで、ついで２５ｍＭのＧｌｙＧｌｙ、５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ８．０(バッファーＢ)、１５ｃｖで、カラムを溶出させた。２８０ｎｍの吸光度により溶出物をモニターした。
【０１２８】
サイズ排除クロマトグラフィー：
５℃で操作されるFrac-950を具備するAKTA FPLC(Amersham Bioscience)を使用し、Superdex 200でのサイズ排除クロマトグラフィーにより、HiTrap Qからプール化フラクションとして回収されたグリコペグ化ＦＶＩＩａ変異体から非ペグ化ＦＶＩＩａを除去した。XK26/60 HiLoad Superdex 200カラム(３２０ｍｌ ｃｖ)を予め平衡にしておき(１０ｃｖ)、充填後、２５ｍＭのＧｌｙＧｌｙ、５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ６．０を用い、流量２．５ｍｌ／分で溶出させた。２８０ｎｍの吸光度により溶出物をモニターした。１０ｍｌのフラクションを収集した。Invitrogenにより記載されたようにし、Simple Blueで染色されたＳＤＳ-ＰＡＧＥ(４-１２％のビス-トリスNuPAGEゲル)でフラクションを分析した。ＰＥＧ置換レベルに従ってフラクションをプール化し、４０００ｒｐｍ、１０℃、Amicon ＵltraＴＭ-15(10K MWCO)遠心分離フィルターを介して濾過することにより濃縮した。
ＨＳ(トリ／テトラ１０Ｋ ＰＥＧ)ＦＶＩＩａ：０．９２ｍｇのタンパク質(ＵＶ２８０ｎｍ)／ｍｌ、全量＝１．６ｍｌ。
ＨＳ(ジ／トリ１０Ｋ ＰＥＧ)ＦＶＩＩａ：０．６３ｍｇのタンパク質(ＵＶ２８０ｎｍ)／ｍｌ、全量＝１．４ｍｌ。
ＬＳ(モノ／ジ１０Ｋ ＰＥＧ)ＦＶＩＩａ：１．２ｍｇのタンパク質(ＵＶ２８０ｎｍ)／ｍｌ、全量＝１．４ｍｌ。
モノ１０Ｋ ＰＥＧ ＦＶＩＩａ：０．７ｍｇのタンパク質(ＵＶ２８０ｎｍ)／ｍｌ、全量＝２．３ｍｌ。
【実施例４】
【０１２９】
高置換(ＨＳ)及び低置換(ＬＳ)４０Ｋ-ＰＥＧ-ＦＶＩＩａの調製
１５ｍｌの２５ｍＭ Ｇｌｙ-Ｇｌｙ、５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ６．０(ＧｌｙＧｌｙバッファー)に溶解させた第ＶＩＩａ因子(１４ｍｇ、０．２８ｕｍｏｌ)を、ＣａＣｌ２フリーのＧｌｙＧｌｙバッファーに２０ｍＭのＮａＩＯ４を溶解させた溶液５０ｕｌ、及びＧｌｙＧｌｙバッファーに４０Ｋ-ＰＥＧ-ＯＮＨ２((２０Ｋ ＰＥＧ)ＯＣＨ２(２０Ｋ ＰＥＧ)ＯＣＨＣＨ２ＯＣ(=Ｏ)Ｏ-ＣＨ２ＣＨ２ＯＮＨ２；WO 2006042847、１１２ｍｇ；２．８ｕｍｏｌ；第ＶＩＩａ因子に対して１０当量)を溶解させた溶液１５００ｕｌに添加した。時折振揺させつつ、混合物を４８時間４℃に配した。ついで、ＧｌｙＧｌｙバッファーにＭｅＯＮＨ２．ＨＣｌ(１７ｍｇ；０．２１ｍｍｏｌ)を溶解させた５００ｕｌの溶液を反応混合物に添加し、続いて１ＮのＮａＯＨを用い、ｐＨを６．０に調節した。氷上に１０分混合物を放置した。ついで、反応混合物を、ｐＨ９．０以下に維持しつつ、１００ｍＭの二塩基ＥＤＴＡ(４．５ｍｌ)の冷溶液に添加した。ついで、１ＮのＨＣｌ水６０ｕｌでｐＨを８．０に調節した。
【０１３０】
イオン交換クロマトグラフィー：
過剰のＰＥＧ-ＯＮＨ２をイオン交換クロマトグラフィーにより除去した。冷却した反応混合物を、２５ｍＭのＧｌｙＧｌｙ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０で予め平衡にされた、５ｍｌのHiTrap Qイオン交換カラム(Amersham Bioscience)に充填した。一定の流量(１ｍｌ／分)及び温度(５℃)にて、２５ｍＭのＧｌｙＧｌｙ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０(バッファーＡ)、１０ｃｖで、ついで２５ｍＭのＧｌｙＧｌｙ、５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ８．０(バッファーＢ)、１５ｃｖで、カラムを溶出させた。２８０ｎｍの吸光度により溶出物をモニターした。フラクションをプール化し、１ＮのＨＣｌでｐＨを６．０に調節した。
【０１３１】
サイズ排除クロマトグラフィー：
５℃で操作されるFrac-950を具備するAKTA FPLC(Amersham Bioscience)を使用し、Superdex 200でのサイズ排除クロマトグラフィーにより、HiTrap Qからプール化フラクションとして回収されたグリコペグ化ＦＶＩＩａ変異体から非ペグ化ＦＶＩＩａを除去した。XK26/60 HiLoad Superdex 200カラム(３２０ｍｌ ｃｖ)を予め平衡にしておき(１０ｃｖ)、充填後、２５ｍＭのＧｌｙＧｌｙ、５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ６．０を用い、流量２．５ｍｌ／分で溶出させた。２８０ｎｍの吸光度により溶出物をモニターした。１０ｍｌのフラクションを収集した。Invitrogenにより記載されたようにし、Simple Blueで染色されたＳＤＳ-ＰＡＧＥ(４-１２％のビス-トリスNuPAGEゲル)で、ＵＶ活性(２８０ｎｍ)を含むフラクションを分析した。ＰＥＧ置換レベルに従ってフラクションをプール化し、４０００ｒｐｍ、１０℃、Amicon ＵltraＴＭ-15(10K MWCO)遠心分離フィルターを介して濾過することにより濃縮した。
ＨＳ(ジ／トリ４０Ｋ ＰＥＧ)ＦＶＩＩａ：０．４６ｍｇのタンパク質(ＵＶ２８０ｎｍ)／ｍｌ、全量＝３．０ｍｌ。
ＬＳ(モノ／ジ４０Ｋ ＰＥＧ)ＦＶＩＩａ：０．７５ｍｇのタンパク質(ＵＶ２８０ｎｍ)／ｍｌ、全量＝３．７ｍｌ。
モノ４０Ｋ ＰＥＧ ＦＶＩＩａ：０．５３ｍｇのタンパク質(ＵＶ２８０ｎｍ)／ｍｌ、全量＝４．５ｍｌ。
【実施例５】
【０１３２】
高置換(ＨＳ)及び低置換(ＬＳ)５Ｋ-ＰＥＧ-ＦＶＩＩａの調製
−過ヨウ素酸塩濃度及び最終の化合物のペプチド分解活性に対する影響
次の保存液を調製した：
２．８ｍＭのＰＥＧ保存液：５Ｋ-ＰＥＧ-ＯＮＨ２(４．０３ｍｇ；０．８ｕｍｏｌ、実施例１に記載したようにして、５Ｋ-ＰＥＧ-ＮＨＳエステルから調製)を、ＣａＣｌ２フリーのＧｌｙＧｌｙバッファー(２５ｍＭのＧｌｙ-Ｇｌｙ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０)２８１ｕｌに溶解。２０ｍＭのＮａＩＯ４保存液：ＮａＩＯ４(４２６ｍｇ；２ｍｍｏｌ)を、ＣａＣｌ２フリーのＧｌｙＧｌｙバッファー(２５ｍＭのＧｌｙ-Ｇｌｙ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０)１００ｍｌに入れたもの。１００ｍＭのＥＤＴＡ溶液：１０ｍｌの水にＥＤＴＡ-二ナトリウム塩(２９２ｍｇ)を入れたもの。１ＭのＣａＣｌ２溶液：１０ｍｌの水にＣａＣｌ２(１．１２ｇ)を入れたもの(０．４５ｕｍのフィルターで濾過)。１２．８ｕＭの第ＶＩＩａ因子溶液：１．０ｍｌの２５ｍＭ Ｇｌｙ-Ｇｌｙ、５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ６．０(ＧｌｙＧｌｙバッファー)に(１．４ｍｇ、０．０２８ｕｍｏｌ)を溶解させたものを、１００ｍＭのＥＤＴＡ溶液９５ｕｌ、続いてＣａＣｌ２フリーのＧｌｙＧｌｙバッファー１．０９５ｍｌに添加したもの(最終的なＦＶＩＩａ濃度＝０．６４ｍｇ／ｍｌ)。保存液を以下のスキームに従い混合した。
0005570809.tif 000016
【０１３３】
全ての反応混合物を、室温で２時間、ゆっくりと振揺した。ついで、各バイアルに、２５ｕｌの１Ｍ ＣａＣｌ２溶液を添加した。ついで、アッセイのセクションに記載されたようにして、ペプチド分解活性についてサンプルを分析した。
0005570809.tif 000017
＊ＦＶＩＩａにおけるシアル酸の平均数は、以下の実施例８に記載するノイラミニダーゼ-ガラクトースオキシダーゼアッセイにより測定して、４．５に等しい。
全ての場合において、Invitrogenにより記載されたようにして、SilverQuestで染色されたＳＤＳ-ＰＡＧＥ(４-１２％のビス-トリスNuPAGEゲル)で分析して、モノ-、ジ-及びトリペグ化産物の同一混合物が得られた。
【実施例６】
【０１３４】
高置換(ＨＳ)及び低置換(ＬＳ)１０Ｋ-ＰＥＧ-ＦＩＸの調製
これらの物質は、実施例３に記載したプロトコルを使用して調製する。
【実施例７】
【０１３５】
高置換(ＨＳ)及び低置換(ＬＳ)４０Ｋ-ＰＥＧ-ＦＩＸの調製
第ＩＸ因子(BeneFix)を、次の手順に従って賦形剤から精製した：凍結乾燥した材料(１０００ＩＵ)を、滅菌水(４ｍｌ)で再構築させ、ＥＤＴＡ(２００ｕｌ、０．２５Ｍの水溶液、ｐＨ６)に添加した。５℃で１０分後、サンプルを、２５ｍＭのＧｌｙＧｌｙ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０で予め平衡にされた１ｍｌのResource Qカラム(Amersham Bioscience)に充填した。カラムを１ｍｌ／分の流量で操作した。一定の流量(１ｍｌ／分)及び温度(５℃)にて、２５ｍＭのＧｌｙＧｌｙ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０(バッファーＡ)、３０ｃｖで、ついで２５ｍＭのＧｌｙＧｌｙ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ６．０(バッファーＢ)、１５ｃｖで、カラムを溶出させた。２８０ｎｍの吸光度により溶出物をモニターした。４．２ｍｌのフラクションを収集し、タンパク質濃度を吸光度により測定し(１．３２／ｍｇ／ｍｌ)、０．５２ｍｇ／ｍｌであった。
【０１３６】
ペグ化反応：
２５ｍＭのＧｌｙＧｌｙ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０(２ｍｌ；１．０４ｍｇ；１８．５４ｍｍｏｌ)に精製したBenefixが入ったものを、８０ｕｌ(１ｍＭのＮａＩＯ４、８０ｎｍｏｌ、BeneFixにおけるシアル酸含有量に対して１当量)添加した。室温で２時間、混合物を攪拌し、ついで、２５ｍＭのＧｌｙＧｌｙ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０に４０Ｋ-ＰＥＧ-ＯＮＨ２((２０Ｋ ＰＥＧ)ＯＣＨ２(２０Ｋ ＰＥＧ)ＯＣＨＣＨ２ＯＣ(=Ｏ)Ｏ-ＣＨ２ＣＨ２ＯＮＨ２； WO 2006042847；９２６ｕｌ；５００ｕＭ；２５×)が溶解した溶液を添加した。混合物を、室温で４８時間放置した。メチオニン(１００ｕｌ、２５ｍＭのＧｌｙＧｌｙ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０に５ｍＭ)、続いてＭｅＯＮＨ２(１００ｕｌ、２５ｍＭのＧｌｙＧｌｙ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０に５ｍＭ)を添加した。混合物を室温で３０分放置し、ついで、さらに精製するまで、−８０℃で凍結した。
【０１３７】
イオン交換クロマトグラフィー：
過剰のＰＥＧ-ＯＮＨ２試薬と非ペグ化ＦＩＸを、Frac-950を具備するAKTA FPLCにおいて操作される１ｍｌのResource Qカラム(全てAmersham Bioscience)を使用するイオン交換クロマトグラフィーにより、グリコペグ化ＦＩＸから除去した。２８０ｎｍの吸光度により溶出物をモニターした。１０００ｕｌのフラクションを収集し、プロセス中、流量を１ｍｌ／分に維持した。凍結された反応混合物をゆっくりと解凍し、ＥＤＴＡ(４００ｕｌ、０．２５Ｍの水溶液、ｐＨ６)に添加した。水を添加することにより、混合物の伝導率を９．３ｍＳに調節した。ついで、混合物を、２０ｃｖの１０ｍＭ ヒスチジン、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％のトゥイーン８０、ｐＨ６．０で予め平衡にされたResource Qカラムに適用した。カラムを、１５ｃｖの１０ｍＭ ヒスチジン、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％のトゥイーン８０、ｐＨ６．０、続いて１５ｃｖの１０ｍＭ ヒスチジン、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のトゥイーン８０、ｐＨ６．０(バッファーＡ)で洗浄した。ついで、１０ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０１％のトゥイーン８０、ｐＨ６．０(バッファーＢ)、１５ｃｖで、続いて１００％のバッファーＢで２０ｃｖで増加する勾配(０-８０％)を用いて、カラムを溶出させた。Invitrogenにより記載されたようにして、Simple Blueで染色されたＳＤＳ-ＰＡＧＥ(４-１２％のビス-トリスNuPAGEゲル)でフラクションを分析した。ＰＥＧ置換レベルに従ってフラクションをプール化した。
ＬＳ(モノ／ジ４０Ｋ ＰＥＧ)ＦＩＸ：３４．３ｕｇのタンパク質(ＵＶ２８０ｎｍ)／ｍｌ、全量＝３ｍｌ。
モノ４０Ｋ-ＰＥＧ-ＦＩＸ：７０．７ｕｇのタンパク質(ＵＶ２８０ｎｍ)／ｍｌ、全量＝３ｍｌ。
【実施例８】
【０１３８】
ＦＶＩＩａのシアル酸含有量の定量
WO 2005014035 A2に記載されたようにして、Molecular Probes Inc.(29851 Willow Creek Road, Eugene, OR 97402)からのAmplex Red Neuraminidase(Sialidase)アッセイキット(A-22178)を使用し、シアル酸含有量を測定した。
【実施例９】
【０１３９】
過ヨウ素酸塩媒介性ＦＶＩＩＩの４０Ｋペグ化
ＮａＣｌ(３６ｍｇ／ｍｌ)；サッカロース(１２ｍｇ／ｍｌ)；Ｌ-ヒスチジン(６ｍｇ／ｍｌ)；ＫＣｌ(１ｍｇ／ｍｌ)；ポリソルベート８０(０．４ｍｇ／ｍｌ)を含有する１ｍｌの分散バッファーに、第ＶＩＩＩ因子(Refacto; WyetH、2000 IE)を溶解させた。ついで、４００ＩＥ(２００ｕｌの構成バッファー中)を、Amiconultra 15,10K MWCOを使用するスピンフィルター(３ｘ１２分、１３．０００ｒｐｍ)により、２０ｍＭのＧｌｙＧｌｙ、０．１５ＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのＣａＣｌ２；０．０２％のトゥイーン８０、ｐＨ７．３においてバッファー交換した。このＦＶＩＩＩ溶液が３０ｕｌになるまで、２０ｍＭのＧｌｙＧｌｙ、０．１５ＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのＣａＣｌ２；０．０２％のトゥイーン８０、ｐＨ７．３に５００ｕＭの４０Ｋ-ＰＥＧ-ＯＮＨ２(SunBrightgL2-400CA；２０ｍｇ／ｍｌ)が入ったものを１０ｕｌ、続いて３ｕｌの１００ｕＭ ＮａＩＯ４水、及び１２ｕｌの２０ｍＭ ＧｌｙＧｌｙ、０．１５ＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのＣａＣｌ２；０．０２％のトゥイーン８０、ｐＨ７．３溶液を添加した。反応物を４℃で１６時間インキュベートし、ついでＳＤＳ-ゲル(７％のトリスアセタートゲル１５０Ｖ／７０分)で分析し、Invitrogenに記載されたようにして、SilverQuestで銀染色した。
【０１４０】
(発明の例示的な実施態様及び特徴)
ここに記載された本発明をよりよく例証するために、本発明の例示的な実施態様及び特徴のいくつかの非限定的列挙をここに提供する：
１．一般構造
(Ｍ-Ｌ-Ｏ-Ｎ=ＣＨ)ｎ-Ｐ-(ＣＨ=Ｎ-Ｏ-Ｌ'-Ｍ')ｍ      (式Ｉ)
[上式中、Ｍ及び場合によってはＭ'は、独立して修飾された糖タンパク質の分子量を増加させるためのポリマー部分であり、Ｌ及びＬ'は、独立して二価リンカーを表し、Ｐは糖タンパク質の一又は複数の酸化グルカン末端を有する糖タンパク質を表し、Ｏ、Ｎ、Ｃ及びＨは、それぞれ酸素、窒素、炭素及び水素原子を表し、ｎは１−１０であり、ｍは０−５０である]
を有する修飾された糖タンパク質を調製する方法であって、
ａ）糖タンパク質Ｐ＊に存在する少なくとも一のグリカン末端を過ヨウ素酸イオンで酸化させ、ここで、Ｐ＊は一又は複数のアルデヒド基を含む糖タンパク質Ｐ-(ＣＨＯ)ｎ＋ｍを得るための複数のグリコフォームを表し、
ｂ）Ｐ-(ＣＨＯ)ｎ＋ｍをＭ-Ｌ-Ｏ-ＮＨ２と反応させて構造(Ｍ-Ｌ-Ｏ-Ｎ=ＣＨ)ｎ-Ｐ-(ＣＨＯ)ｍの修飾された糖タンパク質を得、
ｃ）場合によっては、構造(Ｍ-Ｌ-Ｏ-Ｎ=ＣＨ)ｎ-Ｐ-(ＣＨＯ)ｍの糖タンパク質中の任意の未反応アルデヒド基をＭ'-Ｌ'-Ｏ-ＮＨ２と反応させて構造(Ｍ-Ｌ-Ｏ-Ｎ=ＣＨ)ｎ-Ｐ-(ＣＨ=Ｎ-Ｏ-Ｌ'=Ｍ')ｍの修飾された糖タンパク質を得る
工程を含み、ここで、該過ヨウ素酸イオンは、糖タンパク質に存在する非還元グリカン末端の数に対して５０当量未満の量で存在しており、該修飾された糖タンパク質は、出発糖タンパク質Ｐ＊と比較して改善された薬理学的性質を有し、その機能活性は維持されている方法。
【０１４１】
２．前記糖タンパク質が、Ｎ-グリコシル化及び／又はＯ-グリコシル化されており、及び／又はシアル酸部分を含む、実施態様１の方法。
３．修飾された糖タンパク質が出発糖タンパク質と比較して改善された薬理学的性質を有していることを確認するさらなる工程を含む先の実施態様のいずれか一つの方法。
４．改善された薬理学的性質が、生物学的利用能の増加、機能的インビボ半減期の増加、インビボ血漿半減期の増加、免疫原性の低下、プロテアーゼ耐性の増加、アルブミンに対する親和性の増加、レセプターに対する親和性の改善、保存安定性の増加、機能的インビボ半減期の低減、インビボ血漿半減期の低減からなる群から選択される、先の実施態様のいずれか一つの方法。
【０１４２】
５．半減期の増加が、Ｍ及び／又はＭ'を、腎クリアランスが低減され又は消失されるように分子量を増加させる基にするか、及び／又はＭを肝臓レセプターに対する結合パートナーをマスクする基にすることにより得られる実施態様４の方法。
６．免疫原性の低下が、Ｍ及び／又はＭ'を免疫原性部位に結合する抗体をブロックする基にすることにより得られる実施態様４の方法。
７．アルブミンに対する親和性の改善が、Ｍ及び／又はＭ'をアルブミンに対して高い親和性を有する基にすることにより得られる実施態様４の方法。
８．レセプターに対する親和性の改善が、Ｍ及び／又はＭ'を標的細胞上の表面レセプターに特異的に結合する基にすることにより得られる実施態様４の方法。
【０１４３】
９．Ｍ及び／又はＭ'が、一又は複数のカルボン酸、アミン類、スルホン酸、ホスホン酸、又はその組合せを含みうる低分子量の有機荷電基；低分子量の中性親水性分子、例えばシクロデキストリン、又は分枝していてもよいポリエチレン鎖；低分子量の疎水性分子、例えば脂肪酸又はコール酸又はその誘導体；２−４０ｋＤａの平均分子量を有するポリエチレングリコール；十分に定義された精密ポリマー、例えば７００Ｄａ〜２０ｋＤａの範囲の正確な分子量を有するデンドリマー；実質的に非免疫原性のポリペプチド、例えばアルブミン、抗体又は場合によってはＦｃドメインを含む抗体の一部；及び高分子量の有機ポリマーからなる群から選択される先の実施態様のいずれか一つの方法。
【０１４４】
１０．Ｍ及び／又はＭ'が、デンドリマー、ポリアルキレングリコール(ＰＡＧ)を含むポリアルキレンオキシド(ＰＡＯ)、例えばポリエチレングリコール(ＰＥＧ)及びポリプロピレングリコール(ＰＰＧ)、分枝状ＰＥＧ、ポリビニルアルコール(ＰＶＡ)、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン-コ-無水マレイン酸、ポリスチレン-コ-無水マレイン酸、デキストラン、カルボキシメチル-デキストラン、ＨＥＳ、ＭＰＣ及びＰＨＦからなる群から選択される先の実施態様のいずれか一つの方法。
１１．Ｍ及び／又はＭ'が、血清タンパク質結合リガンド、生理的条件下で荷電特性を変化させる部分を含む低有機分子、グリカンのレセプターへの結合を阻害する構造、及びグリカン特異的認識を防止する中性置換基からなる群から選択される先の実施態様のいずれか一つの方法。
【０１４５】
１２．Ｐが、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＩＩ、ＦＶ、プロテインＣ、プロテインＳ、ｔＰＡ、ＰＡＩ-１、組織因子、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、ＦＸＩＩＩ、並びにその配列変異体；免疫グロブリン、サイトカイン類、例えばインターロイキン、α-、β-、及びγ-インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子を含むコロニー刺激因子、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、ホスホリパーゼ活性化タンパク質(ＰＵＰ)、インスリン、植物タンパク質、例えばレクチン及びリシン、腫瘍壊死因子及び関連する対立遺伝子、腫瘍壊死因子レセプターの可溶型、インターロイキンレセプター及びインターロイキンレセプターの可溶型、増殖因子、例えば組織増殖因子、例えばＴＧＦａ’ｓ又はＴＧＦｐｓ、及び表皮増殖因子、ホルモン、ソマトメジン、エリスロポエチン、色素性ホルモン、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノーゲンアクチベータ、及び免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、及びＩｇＤ、及びその断片、又は上述のタンパク質又はその断片の任意のものを含む任意の融合タンパク質から選択される先の実施態様のいずれか一つの方法。
【０１４６】
１３．糖タンパク質が第ＶＩＩ因子ポリペプチドである実施態様１−１２のいずれか一つの方法。
１４．糖タンパク質が、野生型ヒト第ＶＩＩ因子のアミノ酸配列を有している実施態様１−１２のいずれか一つの方法。
【０１４７】
１５．修飾された糖タンパク質が、本明細書に記載されるような凝固アッセイ、タンパク質分解アッセイ、又はＴＦ結合アッセイの一又は複数で試験した場合、未修飾の第ＶＩＩ因子ポリペプチドの特定の活性の、少なくとも約１０％、例えば少なくとも約２０％、例えば少なくとも約４０％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約１００％を示す実施態様１３−１４のいずれか一つの方法。
１６．修飾された糖タンパク質が、未修飾の糖タンパク質の生物学的利用能の少なくとも約１１０％、例えば少なくとも約１２０％、約１３０％、又は未修飾の糖タンパク質の生物学的利用能の少なくとも約１４０％の生物学的利用能を示す実施態様１−１５のいずれか一つの方法。
１７．修飾された糖タンパク質が、未修飾の糖タンパク質の半減期の少なくとも約１２５％、例えば約１５０％、約２００％、又は未修飾の糖タンパク質の半減期の少なくとも約２５０％の血清半減期を示す実施態様１−１５のいずれか一つの方法。
【０１４８】
１８．過ヨウ素酸イオンが、糖タンパク質に存在する非還元グリカン末端の数に対して、２０当量未満、例えば１０当量未満、例えば５当量未満、例えば１当量未満、例えば糖タンパク質に存在する非還元グリカン末端の数に対して、０．１−２０当量の範囲、例えば０．１−１０当量の範囲、例えば０．１−５当量の範囲、例えば０．１−１当量の範囲の量で存在している実施態様１−１７のいずれか一つの方法。
【０１４９】
１９．一般構造
(Ｍ-Ｌ-Ｏ-Ｎ=ＣＨ)ｎ-Ｐ-(ＣＨ=Ｎ-Ｏ-Ｌ'-Ｍ')ｍ      (式Ｉ)
[上式中、Ｍ及び場合によってはＭ'は、独立して、修飾された糖タンパク質の分子量を増加させるためのポリマー部分であり、Ｌ及びＬ'は、独立して二価リンカーを表し、Ｐは糖タンパク質の一又は複数の酸化グルカン末端を有する糖タンパク質を表し、Ｏ、Ｎ、Ｃ及びＨは、それぞれ酸素、窒素、炭素及び水素原子を表し、ｎは１−１０であり、ｍは０−５０である]
を有する修飾された糖タンパク質であって、出発糖タンパク質Ｐ＊と比較して改善された薬理学的性質を有し、その機能活性が維持されている修飾された糖タンパク質。
【０１５０】
２０．前記糖タンパク質が、Ｎ-グリコシル化及び／又はＯ-グリコシル化されており、及び／又はシアル酸部分を含む実施態様１９の修飾された糖タンパク質。
２１．改善された薬理学的性質が、生物学的利用能の増加、機能的インビボ半減期の増加、インビボ血漿半減期の増加、免疫原性の低下、プロテアーゼ耐性の増加、アルブミンに対する親和性の増加、レセプターに対する親和性の改善、保存安定性の増加、機能的インビボ半減期の低減、インビボ血漿半減期の低減からなる群から選択される、実施態様１９−２０のいずれか一つの修飾された糖タンパク質。
【０１５１】
２２．半減期の増加が、Ｍ及び／又はＭ'を、腎クリアランスが低減され又は消失されるように分子量を増加させる基にするか、及び／又はＭ'を肝臓レセプターに対する結合パートナーをマスクする基にすることにより得られる実施態様２１の修飾された糖タンパク質。
２３．免疫原性の低下が、Ｍ及び／又はＭ'を免疫原性部位に結合する抗体をブロックする基にすることにより得られる実施態様２１の修飾された糖タンパク質。
２４．アルブミンに対する親和性の改善が、Ｍ及び／又はＭ'をアルブミンに対して高い親和性を有する基にすることにより得られる実施態様２１の修飾された糖タンパク質。
２５．レセプターに対する親和性の改善が、Ｍ及び／又はＭ'を標的細胞における表面レセプターに特異的に結合する基にすることにより得られる実施態様２１の修飾された糖タンパク質。
【０１５２】
２６．Ｍ及び／又はＭ'が、一又は複数のカルボン酸、アミン、スルホン酸、ホスホン酸、又はその組合せを含みうる低分子量の有機荷電基；低分子量の中性親水性分子、例えばシクロデキストリン、又は分枝していてもよいポリエチレン鎖；低分子量の疎水性分子、例えば脂肪酸又はコール酸又はその誘導体；２−４０ｋＤａの平均分子量を有するポリエチレングリコール；十分に定義された精密ポリマー、例えば７００Ｄａ〜２０ｋＤａの範囲の正確な分子量を有するデンドリマー；実質的に非免疫原性のポリペプチド、例えばアルブミン、抗体又は場合によってはＦｃドメインを含む抗体の一部；及び高分子量の有機ポリマーからなる群から選択される実施態様１９−２５のいずれか一つの修飾された糖タンパク質。
【０１５３】
２７．Ｍ及び／又はＭ'が、デンドリマー、ポリアルキレングリコール(ＰＡＧ)を含むポリアルキレンオキシド(ＰＡＯ)、例えばポリエチレングリコール(ＰＥＧ)及びポリプロピレングリコール(ＰＰＧ)、分枝状ＰＥＧ、ポリビニルアルコール(ＰＶＡ)、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン・無水マレイン酸コポリマー、ポリスチレン・無水マレイン酸コポリマー、デキストラン、カルボキシメチル-デキストラン、ＨＥＳ、ＭＰＣ及びＰＨＦからなる群から選択される実施態様１９−２６のいずれか一つの修飾された糖タンパク質。
２８．Ｍ及び／又はＭ'が、血清タンパク質結合リガンド、生理条件下で帯電特性を変化させる部分を有する低有機分子、グリカンのレセプターへの結合を阻害する構造、及びグリカン特異性認識を防止する中性置換基からなる群から選択される実施態様１９−２６のいずれか一つの修飾された糖タンパク質。
【０１５４】
２９．Ｐが、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＩＩ、ＦＶ、プロテインＣ、プロテインＳ、ｔＰＡ、ＰＡＩ-１、組織因子、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、ＦＸＩＩＩ、並びにその配列変異体；免疫グロブリン、サイトカイン、例えばインターロイキン、α-、β-、及びγ-インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子を含むコロニー刺激因子、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、ホスホリパーゼ活性化タンパク質(ＰＵＰ)、インスリン、植物タンパク質、例えばレクチン類及びリシン類、腫瘍壊死因子及び関連する対立遺伝子、腫瘍壊死因子レセプターの可溶型、インターロイキンレセプター及びインターロイキンレセプターの可溶型、増殖因子、例えば組織増殖因子、例えばＴＧＦａ’ｓ又はＴＧＦｐｓ、及び表皮増殖因子、ホルモン、ソマトメジン、エリスロポエチン、色素性ホルモン、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノーゲンアクチベータ、及び免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、及びＩｇＤ、及びその断片、又は上述のタンパク質又はその断片の任意のものを含む任意の融合タンパク質から選択される実施態様１９−２８のいずれか一つの修飾された糖タンパク質。
【０１５５】
３０．糖タンパク質が第ＶＩＩ因子ポリペプチドである実施態様１９−２９のいずれか一つの修飾された糖タンパク質。
３１．糖タンパク質が、野生型ヒト第ＶＩＩ因子のアミノ酸配列を有している実施態様１９−２９のいずれか一つの修飾された糖タンパク質。
【０１５６】
３２．修飾された糖タンパク質が、本明細書に記載された凝固アッセイ、タンパク質分解アッセイ、又はＴＦ結合アッセイの一又は複数で試験した場合、未修飾の第ＶＩＩ因子ポリペプチドの特定の活性の、少なくとも約１０％、例えば少なくとも約２０％、例えば少なくとも約４０％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約１００％を示す実施態様３０−３１のいずれか一つの修飾された糖タンパク質。
３３．修飾された糖タンパク質が、未修飾の糖タンパク質の生物学的利用能の少なくとも約１１０％、例えば少なくとも約１２０％、約１３０％、又は未修飾の糖タンパク質の生物学的利用能の少なくとも約１４０％の生物学的利用能を示す実施態様１９−３２のいずれか一つの修飾された糖タンパク質。
３４．修飾された糖タンパク質が、未修飾の糖タンパク質の半減期の少なくとも約１２５％、例えば約１５０％、約２００％、又は未修飾の糖タンパク質の半減期の少なくとも約２５０％の血清半減期を示す実施態様１９−３３のいずれか一つの方法。
【０１５７】
３５．一般構造
(Ｍ-Ｌ-Ｏ-Ｎ=ＣＨ)ｎ-Ｐ-(ＣＨ=Ｎ-Ｏ-Ｌ'-Ｍ')ｍ      (式Ｉ)
[上式中、Ｍ及び場合によってはＭ'は、独立して、修飾された糖タンパク質の分子量を増加させるためのポリマー部分であり、Ｌ及びＬ'は、独立して二価のリンカーを表し、Ｐは糖タンパク質の一又は複数の酸化グルカン末端を有する糖タンパク質を表し、Ｏ、Ｎ、Ｃ及びＨは、それぞれ酸素、窒素、炭素及び水素原子を表し、ｎは１−１０であり、ｍは０−５０である]
を有する修飾された糖タンパク質であって、出発糖タンパク質Ｐ＊と比較して改善された薬理学的性質を有し、その機能活性が維持され、実施態様１−１２のいずれか一つの方法で得られる修飾された糖タンパク質。
【０１５８】
３６．実施態様１９−３５のいずれか一つの修飾された糖タンパク質を複数含有する調製物。
３７．製薬的に許容可能な担体、希釈剤、ビヒクル又は賦形剤と混合して、実施態様１９−３６のいずれか一つの修飾された糖タンパク質を含有する医薬組成物。
３８．治療における使用のための実施態様１９−３６のいずれか一つの修飾された糖タンパク質。