(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴｒｐーＨｉｓで示されるジペプチド又はその塩を有効成分とする、カルシウム拮抗薬が忌避される心臓疾患を有する患者用である、アテローム性動脈硬化症の予防または改善剤。
【請求項２】
１日当たりの投与量が体重１ｋｇ当り５〜１００ｍｇである、請求項１に記載のアテローム性動脈硬化症の予防または改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔｒｐ−Ｈｉｓで示されるジペプチド又はその塩を有効成分とし、カルシウム拮抗薬が忌避される心臓疾患を併発していても使用可能な、アテローム性動脈硬化症を予防またはその進展を抑制する作用を有する、健康食品、機能性食品、医薬品等の組成物に関する。  
【背景技術】
【０００２】
カルシウムチャンネルブロッカーは血管弛緩作用ないし血管拡張作用を有する薬剤であるが、そのアテローム性動脈硬化症への効果について記載された文献もある。たとえば非特許文献１には、代表的なカルシウムチャンネルブロッカーであるアゼルニジピンに関し、その抗アテローム性動脈硬化作用についての記載がある。ここで示されている、効果が認められる最小有効作用量は、３ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙであり、これは血管拡張作用に必要な作用量である８〜１６ｍｇ／ｄａｙ（体重６０ｋｇ患者）よりも格段に大きい値である。   アゼルニジピンに関する資料（「カルブロック（アゼルニジピン）及びカルブロック錠8mg・16mgに関する資料」宇部興産株式会社、三共株式会社（http://www.info.pmda.go.jp/shinyaku/g030102/  インターネットにより２００９年２月２３日入手））によると、ラットへの投与実験において、１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの投与により心臓重量の増加をはじめとする副作用が確認されている。【０００３】
カルシウムチャンネルブロッカーはその作用機序により、心臓への影響が懸念される薬剤である。カルシウムチャンネルブロッカーを血管拡張剤として使用する際には、その有効作用量と、心臓重量の増加という副作用が起こる量の間に一定の開きがあり、問題となることは少ないようであるが、カルシウムチャンネルブロッカーを抗アテローム性動脈硬化剤として使用する場合は、上記の通り、抗アテローム性動脈硬化剤としての有効作用量と、心臓重量の増加という副作用が起こる量の間に、３．３倍程度の開きしかなく、カルシウムチャンネルブロッカーを抗アテローム性動脈硬化剤として使用する上での懸念となっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  １９６（２００８）１７２−１７９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、比較的容易に入手可能な素材で、心臓への影響が少ない、抗アテローム性動脈硬化作用を有する物質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記の課題に対して鋭意研究を重ねた。そして、カルシウムブロッカーとしての血管拡張作用が知られていたジペプチドＴｒｐ−Ｈｉｓが、カルシウムブロッカーであれば当然起こると考えられていた心臓への有意な影響を起こすことなく、抗アテローム性動脈硬化作用を示すことを見出し、本発明の完成に至った。【０００７】
即ち、本発明は
（１）Ｔｒｐ−Ｈｉｓで示されるジペプチド又はその塩を有効成分とする、有効作用量に対して過剰量の投与を行っても心臓への副作用を起こさないアテローム性動脈硬化症の予防または改善剤。
（２）Ｔｒｐ−Ｈｉｓで示されるジペプチド又はその塩を有効成分とする、カルシウム拮抗薬が忌避される心臓疾患を有する患者用である、アテローム性動脈硬化症の予防または改善剤。
（３）１日当たりの投与量が体重１ｋｇ当り５〜１００ｍｇである、（１）〜（２）いずれか１つに記載のアテローム性動脈硬化症の予防または改善剤。
に関するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、合成などにより比較的容易に調製できるＴｒｐ−Ｈｉｓで示されるジペプチド及びその塩により、心臓に有意な影響を与えない抗アテローム性動脈硬化作用を有する薬剤等の組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】「βコングリシニン  α‘サブユニット」の配列
【図２】比較例１(Ｃｏｎｔｒｏｌ），実施例１(Ｔｒｐ−Ｈｉｓ投与量１０ｍｇ／ｋｇ／日）、実施例２（Ｔｒｐ−Ｈｉｓ投与量１００ｍｇ／ｋｇ／日）における、９週間飼育後の大動脈（ａｏｒｔｉｃ  ｔｒｅｅ）のアテローム性動脈硬化病変（白い部分）。比較例１（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べ、実施例１、２の病変は小さいことが確認できる。
【図３】図２病変領域の数値解析データ。実施例１（Ｔｒｐ−Ｈｉｓ投与量１０ｍｇ／ｋｇ／日），実施例２(Ｔｒｐ−Ｈｉｓ投与量１００ｍｇ／ｋｇ／日）は比較例１（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べ、病変領域が小さい。
【図４】比較例１(Control)，実施例１(Ｔｒｐ−Ｈｉｓ投与量１０ｍｇ／ｋｇ／日）、実施例２（Ｔｒｐ−Ｈｉｓ投与量１００ｍｇ／ｋｇ／日）における、９週間飼育後の大動脈洞におけるアテローム性動脈硬化病変。比較例１、実施例１、実施例２間で大きな差は見られない。
【図５】図４病変領域の数値解析データ。比較例１、実施例１（Ｔｒｐ−Ｈｉｓ投与量１０ｍｇ／ｋｇ／日），実施例２(Ｔｒｐ−Ｈｉｓ投与量１００ｍｇ／ｋｇ／日）間で有意な差は見られない。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明で言う「抗アテローム性動脈硬化作用」とは、アテローム性動脈硬化症の発症を抑制したり、一旦発症したアテローム性動脈硬化症の進展を抑制することを指す。
本発明でいう「有効作用量」とは、抗アテローム性動脈硬化作用を示す投与量のことである。そして、「有効作用量に対して過剰量の投与」とは、有効と考えられる作用量のうちできるだけ少ない量に対し、１０倍量程度の投与をいう。
また、「心臓への副作用を起こさない」とは、カルシウムブロッカーと呼ばれる薬剤が、その作用機序から心臓疾患を併発した患者への使用が忌避されている現状に鑑み、カルシウムブロッカーが忌避されるような心臓疾患を併発した患者においても使用可能な程度に、心臓への影響が少ないことを指す。より具体的には、本発明実施例２のように、目的とする効果が認められた投与量である１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙに対し、その１０倍量に相当する１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙを投与しても、心臓重量に有意な影響を与えない場合は、本発明で言う「心臓への副作用を起こさない」と判断する。本発明は「心臓への副作用を起こさない」ことが特徴の一つであり、心臓疾患を併発した患者用、またカルシウムブロッカーが忌避される患者用として特に好ましい。なお、カルシウムブロッカーが忌避される心臓疾患としては、房室ブロック、心原性ショックなどがあげられる。
【００１１】
動脈は心臓より発し、ヒトでは左心室にある大動脈口より起始し、上行したのちに胸骨角または第2肋軟骨の高さで大動脈弓に移行する。上行大動脈の起始部における血管径は末梢側よりも大きいので大動脈球(bulb of aorta)と呼ばれ、その内腔を大動脈洞(sinus of aorta)またはバルサルバ洞(sinus of Valsalva)と呼ばれる。本発明においては、大動脈洞に対しては効果が確認されていない。
本発明が効果を及ぼす動脈を大動脈（ａｏｒｔｉｃ  ｔｒｅｅ）と標記する。ここで言う大動脈（ａｏｒｔｉｃ  ｔｒｅｅ）には大動脈洞は含まない。
【００１２】
本発明の有効成分であるジペプチドＴｒｐ−Ｈｉｓは大豆蛋白質中にもある配列であり、大豆たん白質を適切な酵素で分解し、これを分画して所望のペプチドを含む画分を精製することによって得ることができるし、またペプチド鎖長が２と短いので通常のペプチド合成の方法によっても得ることができる。なおＴｒｐ−Ｈｉｓの配列は大豆蛋白質βコングリシニンのα’サブユニット一次構造中、１２５−１２６番目に存在している。該当する大豆蛋白質のアミノ酸配列を図１に示す。大豆蛋白などから酵素等による分解により調製したＴｒｐ−Ｈｉｓであれば、過去に食経験のある素材に由来するものであることから、サプリメントや、健康補助食品、特定保健用食品などのポイントとなる素材として、有用である。
【００１３】
合成法によって本発明のジペプチドを得る場合には、通常のペプチド合成に用いられる化学合成法（固相法、液相法）、酵素合成法およびDNA組換え法を用いた生物学的合成方法が知られているが、いずれの方法を用いてもよい。酵素法に関して、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）の逆反応を利用した方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，７０７−７２０（１９３７））耐熱性アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素を利用する方法［特開昭５９−１０６２９８号公報参照］ などが既に知られているが、最近では、エシェリヒア属やバチルス属に属する微生物を用いた製造方法（国際公開番号ＷＯ２００４/０５８９６０）が開示されている。
【００１４】
また、合成によって得られた本発明のペプチドは逆相高速液体クロマトグラフィー、イオン交換樹脂やハイポーラスポリマー樹脂を用いたクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を用いた通常の精製法で精製することができる。なお、アミノ酸はＬ型であることが望ましい。
本発明の医薬組成物の投与経路、剤形は、当業者であれば適宜設計することができる。投与経路の例としては、経口、口腔、注射（ 皮内、皮下、筋肉、静脈） 、気道呼吸器、体孔部（粘膜） があり、剤形の例としては、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、吸入剤、スプレー剤、エアゾール剤、坐剤等がある。製剤化の際には、医薬として許容可能な種々の担体、例えば、賦形剤、結合剤、外皮（コーティング） 、崩壊剤、滑沢剤、懸濁化剤、界面活性剤、矯味（香）剤、着色剤、保存剤、安定化剤等の製剤成分を用いることができる。この医薬組成物は、経口投与が可能であり、かつ有効である。
また、食品の形態による投与も可能であり、想定される様態としては飲料、錠菓、焼成菓子、アイスクリーム、チョコレートなどがあげられる。
【００１５】
なお、Ｔｒｐ−Ｈｉｓで示されるジペプチド又はその塩が所定量含有されていれば、それ以外のペプチドおよび他成分が混在していても、本発明の効果等に悪影響を与えない限り問題はない。また、「ジペプチド又はその塩」との表現は、ジペプチドとその塩が混在した状態をも指す。
抗アテローム性動脈硬化作用を得るために必要なＴｒｐ−Ｈｉｓの量は体重１ｋｇ当り５〜１００ｍｇ／日が望ましく、より望ましくは７〜１００ｍｇ／日であり、さらに望ましくは１０〜１００ｍｇ／日である。Ｔｒｐ−Ｈｉｓの量が少なすぎる場合は、抗アテローム性動脈硬化作用が乏しく、好ましくない場合が多い。また１００ｍｇ／ｋｇ／日を超える投与量については、心臓への影響について２００９年２月２３日の段階においては検証されていない。
【００１６】
以下に実施例を記載する。特に示さない限り％は重量％を示す。
【実施例】
【００１７】
実験１（実施例１〜２、比較例１）
「ジペプチドＴｒｐ−Ｈｉｓの抗アテローム性動脈硬化作用」
ペプチド、試薬の入手
Ｔｒｐ−ＨｉｓはＦｍｏｃ固相合成法（国産化学社製）により合成した。その他の試薬は試薬グレードのものを使用した。
動物検体はＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡ）より購入し、九州大学医学部動物実験ラボラトリーにて飼育したアポＥ欠損マウス（オス  ８〜１８週齢）を使用した。これを３つの集団に分け、９週間にわたり表１に示す餌を与え飼育した。各集団間でのマウスの週齢には有意差はなかった。(比較例１  １５．０±０．８，実施例１  １４．３±１．２、実施例２  １４．６±１．３）。
表１  餌の配合
0005627568.tif 000002
【００１８】
Ｔｒｐ−Ｈｉｓの投与は、各マウスの体重に対し１０ないし１００ｍｇ／ｋｇのＴｒｐ−Ｈｉｓを１ｍｌの脱イオン水に溶解し、経口挿管し、１日１回投与した。コントロールのマウスへは、同様の方法で脱イオン水を投与した。なお、Ｔｒｐ−Ｈｉｓ投与量１０ｍｇ／ｋｇ／日を実施例１、投与量１００ｍｇ／ｋｇ／日を実施例２、脱イオン水のみを投与したものを比較例１とした。マウスは室温２２℃、１２時間毎の明暗の繰り返しにより飼育した。また、表１の餌と脱イオン水は自由摂取可能とした。
９週間飼育後、６時間絶食させた後、心臓より採血した。また肝臓、後腹膜の白色脂肪組織、腸間膜、皮下部、精巣上体部を摘出し、液体窒素で冷却した。同様に、大動脈と心臓を摘出し、ホルマリンにて固定した。【００１９】
血漿中のトリアシルグリセロール、総コレステロール、ＨＤＬ-コレステロールは酵素法測定キット（Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  Ｅ  ｔｅｓｔ  ｆｒｏｍ  Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｔ−ＣＨＯ  ｋａｉｎｏｓ  ｆｒｏｍ  Ｋａｉｎｏｓ）により行った。血漿ＭＣＰ−１（ヒト単球走化活性因子）濃度の測定はＥＬＩＳＡキット（Ｍｏｕｓｅ  ＭＣＰ−１  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ  ｆｒｏｍ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）により行った。肝臓の脂質はＣＨＣｌ３−ＣＨ３ＯＨ混合液により抽出し、「Ｂｒ  Ｊ  Ｎｕｔｒ．９４，８９６−９０１（２００５）」記載の方法により測定した。
アテローム性動脈硬化症病変の定量分析は「Ｊ  Ｎｕｒｔ１２８、１８８４−１８８９（１９９８）」に記載した方法により行った。結果は平均値および平均値の標準誤差（ＳＥＭ）で表した。また  Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒの多重比較に従い一元配置分散分析を用い評価した。Ｐ（ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）＜０．０５を有意と判断した。解析はソフトウエア（Ｓｔａｔ  Ｖｉｅｗ  Ｊ５．０（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｒｙ，ＮＣ、ＵＳＡ））にて行った。【００２０】
結果
体重と給餌効率
９週間の飼育の後、体重、臓器重量、餌摂取量、給餌効率は３つのグループで差は認められなかった（表２）。体脂肪量（比較例１  Ｃｏｎｔｒｏｌ：平均８．９（ＳＥＭ１．２）％、ｎ８；実施例１  １０ｍｇ／ｋｇ  Ｔｒｐ−Ｈｉｓ：平均７．１（ＳＥＭ０．７）％、ｎ７；実施例２  １００ｍｇ／ｋｇ  Ｔｒｐ−Ｈｉｓ：平均７．５（ＳＥＭ０．６）％，ｎ８）は腸間膜、精巣、下皮の脂肪量と同様、グループ間で差は認められなかった。
表２  ９週間飼育後の状態
0005627568.tif 000003
【００２１】
血中脂質
血液の分析では、総コレステロール、ＨＤＬ-コレステロール、ＭＣＰ−１の量において、３つのグループに差は認められなかった(表３)。血漿コレステロール量は比較的高い（＞１０００ｍｇ／日）が、これは高コレステロール食によるものと思われる。
表３  ９週間飼育後のコレステロール量等
0005627568.tif 000004
【００２２】
ジペプチドＴｒｐ−Ｈｉｓを９週間投与後、大動脈（ａｏｒｔｉｃ  ｔｒｅｅ）においては、コントロールグループ(比較例１)よりもＴｒｐ−Ｈｉｓ投与グループ（投与量１０ｍｇ／ｋｇ(実施例１)，１００ｍｇ／ｋｇ(実施例２)とも）の方が、アテローム性動脈硬化病変が小さかった（図２）。数値的には図３の通り、Ｔｒｐ−Ｈｉｓ投与グループの病変領域の割合（１０ｍｇ／ｋｇ：平均９．５（ＳＥＭ  １．３）％，ｎ７，  １００ｍｇ／ｋｇ：平均８．１（ＳＥＭ１．６）％，ｎ８，Ｐ＜０．０５）はコントロールグループ（平均１３．０（ＳＥＭ  １．０）％，ｎ８）よりも明らかに小さかった。これはジペプチドＴｒｐ−Ｈｉｓが動脈硬化病変の進展を阻害していることを示していた。Ｔｒｐ−Ｈｉｓ投与グループ間では、投与量に依存する有意な差は見られなかった。これは、Ｔｒｐ−Ｈｉｓの投与量は１０ｍｇ／ｋｇ／日あれば、効果を引き出す上で十分であることを示している。【００２３】
大動脈洞におけるアテローム性動脈硬化病変(図４)と病変領域の数値解析データ(図５)は、３つのグループで違いは見られなかった（Ｐ＞０．０５）。【００２４】
考察
上記結果の通り、ジペプチドＴｒｐ−Ｈｉｓを９週間投与したアポＥ欠損マウスにおいて、大動脈（ａｏｒｔｉｃ  ｔｒｅｅ）のアテローム性動脈硬化症の病変領域は、ジペプチドを投与しなかったものに比べ小さかった。これはジペプチドＴｒｐ−Ｈｉｓに、大動脈（ａｏｒｔｉｃ  ｔｒｅｅ）のアテローム性動脈硬化症の発展を抑制する働きがあることを示している。そして大動脈（ａｏｒｔｉｃ  ｔｒｅｅ）と基本的構造が類似する他の血管、特に動脈に対しては同様の効果があることが考えられた。そして、Ｔｒｐ−Ｈｉｓの体重あたりの投与量の違いで効果に有意な差が見られなかったことから、５〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の投与量において、効果が見出されると考えられた。【００２５】
また、今回の実験において、十分な効果の認められた投与量１０ｍｇ／ｋｇ／日に対して、その１０倍量に当たる１００ｍｇ／ｋｇ／日の投与量においても、心臓重量に有意な変化は見られなかった。このようなことは従来は全く知られていないことであり、本発明のジペプチドＴｒｐ−Ｈｉｓは、従来知られているようなカルシウムブロック作用以外の作用機序により、抗アテローム性動脈硬化作用を示していると推定される。【００２６】
本発明では、大動脈洞においては、ジペプチドＴｒｐ−Ｈｉｓによる抗アテローム性動脈硬化作用は確認されなかった。これも従来考えられていた作用機序からするときわめて異例である。すなわち、従来知られたカルシウム拮抗作用のみにより抗アテローム性動脈硬化作用を示しているのであれば、大動脈洞に対してもそれ以外の動脈と同様、抗アテローム性動脈硬化作用を示すはずであり、カルシウム拮抗作用以外の作用機序の存在を傍証している。そして、大動脈洞が心臓近傍に存在することからも、ジペプチドＴｐｒ−Ｈｉｓが心臓に対し、従来知られていない特異的な働きをしている可能性を示唆している。【００２７】
なお、Ｔｒｐ−Ｈｉｓにより上記の通り効果が見出されているため、その塩においても同様の効果が見出されることは、当業者であれば十分に推測できることである。また本実験はマウスに対するものであるが、哺乳類一般に対し同様の効果が期待できることは、当業者であれば十分に推測できることである。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明により、心疾患を併発したアテローム性動脈硬化症患者に対し、従来は心臓への影響を懸念し、カルシウム拮抗薬を服用できなかった患者に対しても、服用が可能な抗アテローム性動脈硬化剤を供給することができる。
【図１】
0005627568.tif 000005
【図２】
0005627568.tif 000006
【図３】
0005627568.tif 000007
【図４】
0005627568.tif 000008
【図５】
0005627568.tif 000009