(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨欠損の修復のための生体適合性インプラントであって、
（ａ）囲まれた空所を作り出すために、前記骨欠損の周囲に取り付けられる内側及び外側表面を有する生体適合性材料を含む可撓性の膜、及び
（ｂ）前記膜によって作られる空所内に含まれる多血小板血漿ゲル組成物を含み、
前記膜は、管状の針を通して前記多血小板血漿ゲル組成物を前記空所内に注入可能に形成されている
生体適合性インプラント。
【請求項２】
前記多血小板血漿ゲル組成物がさらに、１つの型の自家細胞、又は少なくとも２つの型を混合した自家細胞を含む、請求項１の生体適合性インプラント。
【請求項３】
前記自家細胞の総量が、多血小板血漿ゲル組成物１ｍＬ当たり３００，０００〜６，０００，０００細胞である、請求項２の生体適合性インプラント。
【請求項４】
前記多血小板血漿ゲル組成物がさらに、ヒドロキシアパタイト、サンゴ藻ヒドロキシアパタイト、炭酸ヒドロキシアパタイト、生体活性ガラス及びセラミック、リン酸カルシウムセラミック、焼成骨、リン酸三カルシウム、及び類似の材料からなる群から選択されるナノ粒子無機物を含む、好ましくはヒドロキシアパタイトを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の生体適合性インプラント。
【請求項５】
前記ナノ粒子無機物が、１ｎｍ〜５μｍの平均粒径を有する、請求項４の生体適合性インプラント。
【請求項６】
前記ナノ粒子無機物が、前記多血小板血漿ゲル組成物の体積の０．０１％〜６０％を構成する、請求項４の生体適合性インプラント。
【請求項７】
前記多血小板血漿ゲル組成物がさらに、カルシウム塩、トロンビン、バトロキソビン、コラーゲン、ＡＤＰ及びセロトニン等の活性化剤を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の生体適合性インプラント。
【請求項８】
前記活性化剤が、前記多血小板血漿ゲル組成物の体積の５〜５０％を構成する、請求項６の生体適合性インプラント。
【請求項９】
前記多血小板血漿ゲル組成物が支持構造物内に包含される、請求項１〜８のいずれかの生体適合性インプラント。
【請求項１０】
前記多血小板血漿ゲル組成物が、前記支持構造物が前記骨欠損内に配置される前又は後に供給される、請求項９の生体適合性インプラント。
【請求項１１】
前記支持構造物が多孔質である、請求項９の生体適合性インプラント。
【請求項１２】
前記支持構造物が吸収可能及び／又は生分解性である、請求項９の生体適合性インプラント。
【請求項１３】
前記支持構造物が、スポンジ、泡、ゲル又は繊維網の形状である、請求項９の生体適合性インプラント。
【請求項１４】
前記支持構造物が、骨欠損の形に形成されるか、又は骨欠損内に圧入される（ｐｒｅｓｓ−ｆｉｔｔｅｄ）、請求項９の生体適合性インプラント。
【請求項１５】
前記生体適合性材料が生分解性である、請求項１〜１４のいずれかに記載の生体適合性インプラント。
【請求項１６】
前記生体適合性材料の分解速度が４〜３６ヶ月である、請求項１〜１５のいずれかに記載の生体適合性インプラント。
【請求項１７】
前記生体適合性材料が、コラーゲン、ヒアルロン酸、セルロース等のポリマー、ポリ乳酸及びポリグリコール酸等の分解可能なポリエステル、ポリ（３−ヒドロキシブタノアート）、ポリ（３−ヒドロキシバレラート）、ポリ（４−ヒドロキシブタノアート）；ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（バレロラクトン）、ポリオルトエステル、ポリカルボキシレート、ポリカーボネート、ポリアンヒドリド、ポリウレタン、｛ポリテトラフルオロエチレン、フッ素化エチレンプロピレン等のパーフルオロポリマー；ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、シリコーン、ポリサルフォン、ポリアクリル酸、ポリヒドロキシメタクリレート、ポリメチルメタクリレート、ポリアミド｝及びこれらの共重合体、ブロック共重合体及び混合物から選択される、請求項１〜１６のいずれかに記載の生体適合性インプラント。
【請求項１８】
前記膜が、任意に、片面又は両面に、全骨髄、細胞、多血小板血漿ゲル組成物、及びセラミック粒子から選択される１以上を播種される、請求項１〜１７のいずれかに記載の生体適合性インプラント。
【請求項１９】
前記膜が、５μｍ〜１０００μｍのミクロ細孔（ｍｉｃｒｏｐｏｒｏｓｉｔｙ）、及び１００ｎｍ〜５μｍの任意のナノ細孔（ｎａｎｏｐｏｒｏｓｉｔｙ）を有する、請求項１〜１８のいずれかに記載の生体適合性インプラント。
【請求項２０】
前記膜が、０．０５ｍｍ〜５ｍｍの厚み、１０ｃｍ〜２５ｃｍの長さ、１０ｃｍ〜２５ｃｍの高さを有する、請求項１〜１９のいずれかに記載の生体適合性インプラント。
【請求項２１】
被験者内の骨成長、及びインプラントの新しい血管新生を誘導するための、前記請求項１〜２０に記載の生体適合性インプラント。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の生体適合性インプラントを製造するための部品を収容するコンパートメントを有する部品キットであって、
前記多血小板血漿ゲル組成物を収容するコンパートメント、前記膜を収容するコンパートメント、及び前記膜を通して前記多血小板血漿ゲル組成物を前記空所内に注入するための注射器及び注射針を収容するコンパートメントを含む部品キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨修復用の生体適合性インプラント、特に骨欠損の周囲に取り付けられる可撓性の膜、及び、この膜によって作られる空所（ｖｏｉｄ  ｓｐａｃｅ）内に包含される多血小板血漿ゲル組成物を含む生体適合性インプラントと、その利用及びそれの部品キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
骨組織は、再生しそれによって損傷や他の欠損を修復するという優れた能力を持つ。このような修復は、同化作用（骨形成）プロセスと異化作用（骨吸収）プロセスとの平衡、つまり骨芽細胞として知られる骨形成細胞と破骨細胞として知られる骨吸収細胞との相互作用に依存し、それにより骨は連続的に破壊（吸収）及び再建される。従って、骨形成の強化が必要な状況、例えば骨組織が骨折等の損傷を被っている場合には、通常、骨芽細胞の前駆細胞が急速に増殖し、成熟骨芽細胞へと分化し骨を再生する。しかしながら、骨芽細胞が効果的に活性化され得ない多くの状況がある。例えば、重度の負傷により生じる複雑骨折又は損傷、変形、疾患、又は外科的処置中、場合によっては骨髄炎を伴う場合、又は多くの疾患の直接的な結果として骨吸収及び骨形成の間の繊細に調整されたバランスがかき乱された場合等である。
【０００３】
このような骨欠損の治療は、通常骨移植に基づいてきた。自家移植技術は１００年以上にわたって知られており、皮質骨及び海面骨を移植材料として用いる。自家移植片の使用は病気の感染のリスクが低いため好ましいが、入手可能なドナー材料の量が限られること、付加的な外科的処置が必要なこと、及び骨のサイズや形が制限されること等のいくつかの重大な欠点も存在する。一方、同種移植には、患者の手術部位が２つになることを避けるという利点はあるだろうが、病気の感染や免疫原性移植片拒絶のリスクが高かった。従って、過去１０年間、骨折治癒機転を促進し、新しい骨が成長するための強く生物学的に適合した骨組みを提供するために、移植骨の代わりに使用できる骨移植片代替品を得ることに焦点を合わせて研究がなされた。
【０００４】
このような代替手段には、例えば、脱塩骨基質（ＤＢＭ）（例えば、特許文献１）、コラーゲン、β−リン酸三カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２）（β−ＴＣＰ）、α−リン酸三カルシウム（α−ＴＣＰ）及びヒドロキシアパタイト（ＨＡ）（例えば、特許文献２）等の各種リン酸カルシウム、及びこれらの合成物、つまり、例えば、特定の骨成長及び骨分化因子、骨形成タンパク質（例えば、特許文献３〜６）、骨髄細胞（ＢＭＣ）等のさらなる骨誘導材料と組み合わせた合成物をベースにした組成物、及びより最近では、多血小板血漿（ＰＲＰ）をベースにした組成物等がある。
【０００５】
ＰＲＰは、血小板９５％、赤血球４％、白血球１％を含む、濃縮された血小板を含む混合物である。血小板を血液全体から分離して、少量の血漿中に再懸濁したものである。トロンビン又は塩化カルシウム等の活性化剤と組み合わせると、血小板は活性化されてその内容物、サイトカインや他の成長因子等を放出する。ＰＲＰは、医学、主として骨移植術及び歯科インプラント利用において使用されてきた。例えば、特許文献７は、頭蓋顔面及び関節の再建、歯科インプラント及び骨欠損や骨折のための、ＰＲＰ及びコラーゲン（活性化のため）を含む、自家移植用のトロンビンを含まない血小板ゲルを開示する。インビトロ生成で、ゲル化して下顎の空隙に挿入することが記載されている。特許文献８には、インプラントを歯槽骨又は顎骨に固定するために、ヒドロキシアパタイトセラミックスからなり、任意にその中にＰＲＰを導入したチューブを使用することが記載されている。特許文献９は、骨の形成を誘導するため、少なくともリン脂質、及び、マトリックス中に分散させた有効量のカルシウムを含む化合物を存在させて、トロンボプラスチンを備えたＰＲＰの凝固マトリックスを含む骨再生製品を開示する。
【０００６】
医学の他の領域における利用では、例えば、創傷治療（特許文献１０）及び組織修復（特許文献１１）のため、組織シーラント（特許文献１２）として、又は動脈及び静脈を一時的に閉塞するために生体高分子と組み合わせた使用のため（特許文献１３）に、組成物の一部としてＰＲＰを含んでいる。
【０００７】
これまで、骨修復でのＰＲＰの使用は、後天性及び先天性頭蓋顔面及び他の骨格又は歯異常等の小さめの骨欠損を治療するため（例えば、非特許文献１参照）、顎骨中等の失われた骨の置換又は骨増生が求められる歯及び歯周の再建を行うため、及び歯周病によって生じる歯槽骨損失を補って歯を失うのを遅らせる又は防ぐため（例えば、非特許文献２）に計画されてきた。しかしながら、このような修復は、例えば負傷、又は、骨腫瘍又は骨嚢胞の除去等の疾患に起因する、偽関節（ｎｏｎ−ｕｎｉｏｎ）骨折、部分隙間又は骨空隙を塞ぐために要求される骨形成の誘導とはかなり異なっているように思われる。このような場合には、骨成長代替物として機能するように、異なる型のマトリックス又は足場を用いる骨移植術又は新しい骨成長の誘導が必要とされる。
【０００８】
このような使用のために、組成物は、例えばシート、パテのような流動性を有しない塊の形で、又は生体高分子と組み合わせて開発され、及び／又は、例えばグルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド又は他の化学的架橋剤と架橋させて、又は、骨欠損に塗布する前にゲル化して予め足場を作り、それにより組成物の流動性を減らして骨欠損場所で確実に保持されるようにされた。しかしながら、これにより、組成物の前処理が非常に長くなり、生体内での副作用を持つかもしれない異物が付加される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＵＳＰ  ５４８１６０１
【特許文献２】ＵＳＰ  ４６２３５５３
【特許文献３】ＵＳＰ  ７１７２６２９
【特許文献４】ＵＳＰ  ４３９４３７０
【特許文献５】ＵＳＰ  ４４７２８４０
【特許文献６】ＵＳＰ  ４６２０３２７
【特許文献７】ＵＳＰ  ６３２２７８５
【特許文献８】ＥＰ１５０８３１１
【特許文献９】ＥＰ１２３９８９４  Ｂ１
【特許文献１０】ＵＳＰ  ５５９９５５８
【特許文献１１】ＵＳＰ  ６８１１７７７
【特許文献１２】ＵＳＰ  ５５８５００７
【特許文献１３】ＵＳＰ  ５６１４２０４
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｇｌｏｗａｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  １：９５９（１９８１）
【非特許文献２】Ｓｉｇｕｒｄｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ，６６：５１１（１９９５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
明らかに、汎用使用において最適だと認められている骨形成組成物は未だなく、一見明確に定義された組成物をもってさえも、臨床結果はばらつきが大きい。一貫して強力な骨誘導及び骨伝導性であり、生体内で副作用をもたらさず、入手しやすく、外科的処置での取り扱いが簡単であり、骨発達の早い段階での新しい骨の形成に対し強さと安定性を提供し、（小さい欠損から大きい隙間まで）全てのサイズの骨欠損に適応可能な改良された骨形成インプラント材料に対するニーズは依然として存在する。好ましくは、このような組成物は、骨形成プロセスの終わりまでに骨にほぼ完全に取り込まれ再構築されるため、さらなる外科的処置を必要としない。本発明はこのようなニーズに向けられたものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
出願人は、骨欠損内での骨成長を誘導促進するために、任意に自家造骨因子、ナノ粒子無機物等で補完したＰＲＰゲル組成物を含む生体適合性インプラントシステムを、骨欠損内部にＰＲＰゲル組成物を保持するための可撓性の生体適合性膜と組み合わせて用いることにより、上記欠点を克服できることを見出した。
【００１３】
注入可能なＰＲＰゲル組成物を適切な膜と組み合わせて使用することにより、多数の操作の必要のない、容易で素早い適用が可能となる。さらに、ＰＲＰゲル組成物（及び／又は膜）を補完する自家材料を使用することにより、異物によって起こる副作用を減らし又は取り除く。注入可能なＰＲＰゲル組成物は、通常、スカフォールドフリー（ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｆｒｅｅ）であるが、当業者は、骨欠損の性質及び場所に応じて、つまり、付加的な安定性が望まれる場合には、生分解性の支持構造物で補うこともできる。
【００１４】
このように、新規の生体適合性インプラントは非常に柔軟で、任意の種類及び任意のサイズの骨欠損の内部で骨成長を誘導促進することができる。
【００１５】
本発明は、第1の態様として、ＰＲＰゲル組成物と可撓性の生体適合性膜を含む、骨欠損の修復のための改良された骨形成生体適合性インプラントを提供し、前記膜を骨欠損場所の周囲に掛けて（ｓｐａｎｎｅｄ）空所（ｖｏｉｄ  ｓｐａｃｅ）を作り、この空所にＰＲＰゲル組成物を注入する（図１）。
【００１６】
具体的な実施形態において、ＰＲＰゲル組成物は、同じ又は異なる性質の自家細胞を含む。
【００１７】
さらなる具体的な実施形態において、ＰＲＰゲル組成物は、自己の性質（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｎａｔｕｒｅ）を有し、外科的処置の前に原位置で（ｉｎ  ｓｉｔｕ）作られるか、あるいは作製した状態で（ｕｐｏｎ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）さらなる使用まで−２０℃にて保存される。
【００１８】
さらに別の具体的な実施形態において、ＰＲＰゲル組成物は、ヒドロキシアパタイト、サンゴ藻ヒドロキシアパタイト、炭酸ヒドロキシアパタイト、生体活性ガラスセラミック、生体活性セラミック、リン酸カルシウムセラミック、焼成骨、リン酸三カルシウム、及び類似の材料からなる群から選択される少なくとも1つのナノ粒子無機物を含み、好ましくはヒドロキシアパタイトを含む。
【００１９】
さらなる具体的な実施形態において、ＰＲＰゲル組成物は、カルシウム塩又はトロンビン等の活性化剤を含んでもよい。
【００２０】
さらなる具体的な実施形態において、ＰＲＰゲル組成物は、外科的処置で直ぐ使用する前に原位置で作られるか、あるいは作製した状態でさらなる使用まで−２０℃にて保存される。
【００２１】
さらなる具体的な実施形態において、ＰＲＰゲル組成物は、さらに、支持構造物内に包含されてもよい。
【００２２】
さらなる具体的な実施形態において、前記膜は、骨欠損を囲み又は覆うために使用する前に、その表面の片側又は両側に、細胞、例えば内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、ＭＳＣ及びこれらの混合物、及び／又はＰＲＰ組成物、及び／又はナノ粒子材料、例えばリン酸カルシウム粒子を播種される（図２）。
【００２３】
さらなる具体的な実施形態において、膜は、骨欠損の場所の周囲に掛ける又は取り付けるのに十分な柔軟性を持ち、安定した形状を保って、骨欠損の場所の内部にＰＲＰゲルを保持できるに十分な機械的強度を有する。
【００２４】
好ましくは、膜は生分解性であり、付加的な外科的処置によって取り除く必要がない。好ましい材料としては、ポリ乳酸及びポリグリコール酸等の加水分解性ポリエステル、及びポリ（エステル−ウレタン）、ポリ（エーテル−ウレタン）、ポリ（ウレタン−尿素）、ポリ（エステル−ウレタン−尿素）及びポリ（エステル−チオウレタン）を含むポリウレタン、及び上記材料の共重合体、ブロック共重合体及び混合物が挙げられる。
【００２５】
本発明はまた、このような生体適合性インプラントの製造方法、及び、骨成長を誘導し、骨形成が望まれるあらゆるところで、外傷、病気及び他の異常による骨欠損を修復するためのその利用を提供する。
【００２６】
本発明のこれら及び他の目的、特徴及び利点は、以下の説明から容易に分かるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、本発明の骨欠損の修復のための生体適合性インプラントの概略図である。
【図２】図２は、膜の表面の自家ＥＰＣ播種の概略図である。
【図３】図３は、吸収性膜の概略図である（長さＬ、高さＨ、厚みＴ、孔径Ｄ、２つの隣接する孔の間の短い方の空間Ｓ）。
【図４】図４は、ＰＲＰ活性化法での成長因子放出を示す。
【図５】図５は、１日及び７日間ＰＲＰゲルで培養した後のＥＰＣ、ＭＳＣ（骨髄源：ＢＭＳＣ）及びヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の生存能力を示す。
【図６】図６は、ヒドロキシアパタイト粒子（ＨＡＰ）及びトロンビンの濃度を変えたＰＲＰゲルのＦａｘｉｔｒｏｎ  Ｘ線画像を示す。
【図７】図７は、ＨＵＶＥＣ、ＢＭＳＣ又は２つの細胞型の５０／５０％混合物を含むＰＲＰ／ＨＡＰゲル（２，６又は１０ｕｇ／ゲル＝６，２０，３３ｕｇ／ｍＬ）のＦａｘｉｔｒｏｎ画像を示す。
【図８】図８は、ヘマトキシリン・エオシン染色及びＬＤＨ活性によるＰＲＰ／ＨＡＰ内のＥＰＣ、ＢＭＳＣ又はＥＰＣ／ＢＭＳＣの細胞分布及び生存能力を示す。
【図９】図９は、レーザー焼結ポリウレタン膜のＳＥＭ顕微鏡写真（左）及び蒸着法によって作られたポリ（Ｌ／ＤＬ−ラクチド）膜のＳＥＭ顕微鏡写真（右）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本明細書で用いる「骨欠損」とは、空隙、空洞、立体構造の不連続部、割れ目、又は、損傷、骨切り術、外科手術、骨折、奇形回復、偽関節（ｎｏｎ−ｕｎｉｏｎ）骨折、骨格奇形、老化又は疾患により引き起こされる任意の構造的変化（ただしこれらに限定されない）を含む、任意の骨の異常をいう。
【００２９】
本明細書で用いる「骨誘導の」とは、材料の、前駆細胞、特に間充織幹細胞から骨芽細胞の生産を誘導する能力をいう。骨誘導材料は、前駆細胞と相互作用して骨芽細胞分化を誘導する成長因子として直接作用してもよいし、又は骨誘導性成長因子の生産を誘導することによって間接的に作用してもよい。この誘導はまた、シグナリング分子、調節分子及び形質転換分子を必要とする。骨誘導はさらに、前記骨芽細胞の骨細胞、つまり骨の成熟細胞への分化を含む。
【００３０】
本明細書で用いる「骨形成の」とは、新しい骨を形成するプロセスをいう。この形成は、シグナリング分子、調節分子及び形質転換分子を必要とする。
【００３１】
本明細書で用いる「骨伝導の」とは、周囲の組織からの骨形成細胞の内部成長及び配向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）にとって好ましい環境を提供する材料を指す。このような材料は大抵多孔質材料であり、すなわち海綿骨に似た格子構造を提供する。
【００３２】
本明細書で用いる「自家の」とは、それらが得られた同じ個体に再移植される細胞、組織又はタンパク質をいう。
【００３３】
本明細書で用いる「血管新生の」とは、新しい血管の形成のことをいう。
【００３４】
本明細書で用いる「生体適合性」とは、本発明により使用される場合、毒性が低く、生体での異物反応が許容できる範囲であり、生体組織と親和性のある材料のことをいう。
【００３５】
本明細書で用いる「吸収可能な」とは、材料の、生体内に吸収される能力を指す。「十分な」とは有意な細胞外断片が残っていないことを意味する。「生分解性の」とは、通常、体液、酵素又は細胞の活動によって起こる、最初の（ｏｒｉｇｉｎａｌ）インプラント材料の吸収のことをいう。「生体内分解性の」とは、通常、バルク又は表面分解による吸収プロセスのことをいう。生体内吸収には、様々なプロセスの組み合わせを含んでよい。
【００３６】
本明細書で用いる「被験者」とは、動物又はヒト等の哺乳類のことである。
【００３７】
第１の態様において、本発明は、囲まれた空所を作り出すために、骨欠損の周囲に取り付ける又は掛ける内側及び外側表面を有する生体適合性材料を含む可撓性の膜、及びこの膜によって作られる空所内に包含されるＰＲＰゲル組成物を含む、骨欠損の修復のための生体適合性インプラント（以下、本発明の生体適合性インプラントとも呼ぶ）に関する。
【００３８】
本発明の生体適合性インプラントの１つの実施形態を図１に概略的に示す。それによると、骨の隙間等の骨欠損（１）を、まず、管状の本発明の膜によって包み（ｗｒａｐｐｅｄ）、空所（２）を作る。続いて、本発明のＰＲＰ組成物を注射器（３）を用いて膜を通し前記空間に注入し、本発明の最終的な生体適合性インプラント（４）を得る。
【００３９】
本発明の生体適合性インプラントの、他の実施形態においては、空洞等の骨欠損を本発明の膜で覆って空所を作り、続いて本発明のＰＲＰ組成物を注射器を用いて膜を通し注入し、本発明の最終的な生体適合性インプラントを得る。
【００４０】
骨欠損の性質及び場所に応じて、ＰＲＰゲル組成物を、以下に記載する支持構造物で補ってもよい。
【００４１】
具体的な実施形態では、空隙に供給されるＰＲＰは、骨修復の必要のある患者の血漿から作られ、及び／又は患者と組織適合する血漿から作られ、好ましくは、骨修復の必要のある患者の血漿から作られる。これは、不適合による合併症を除外するだけでなく、取り扱いの容易さ及びそれに続く移植のための膜とＰＲＰゲル組成物の作製での遅れを無くすことを保証する。
【００４２】
本明細書で用いる「ＰＲＰ」は、通常の意味で解釈してよく、血漿溶液に懸濁させた、末梢血濃度より大きな血小板濃縮物のことであり、通常、立方ミリメートル当たり５００，０００〜２，０００，０００の範囲の血小板濃度を有する。
【００４３】
ＰＲＰは、当該技術分野で周知の標準的な手順に従って得られ（例えば、Ｍａｒｘ，  Ｒ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｒａｌ  Ｓｕｒｇ．  Ｏｒａｌ  Ｍｅｄ．  Ｏｒａｌ  Ｐａｔｈｏｌ．  Ｏｒａｌ  Ｒｄｉｏｌ．  Ｅｎｄｏｄ．，  Ｖｏｌ．  ８５，  ６３８−６４６，（１９９８）；  ＵＳＰ  ６３９８９７２参照）、実施例の項に記載した。手短に言えば、それは、血液全体から血小板を濃縮して形成され、血小板及び／又は血漿の自家源、同種源又はプール源、好ましくは自家源を用いて得ることができる。このようにして得たＰＲＰを、生体内利用（又はＰＲＰ活性化効率の試験管内評価）のために活性化工程直後に使用したか、又はさらなる利用まで−２０℃にて保存した。利用前に、以下に記載する補完物を加えてもよい。ＰＲＰの活性化は、凍結融解サイクル等の標準的な手順によって達成された。例えば、−２０℃で保存したＰＲＰを、３７℃の水槽で３０〜６０分間培養して解凍した。
【００４４】
さらなる実施形態において、ＰＲＰは自家細胞で補われる。ＥＰＣ又は他の間充織幹細胞（ＭＳＣ）、（骨）髄間質細胞（（Ｂ）ＭＳＣ）、平滑筋細胞、前駆細胞（例えば、骨髄、脂肪又は末梢血からの）などを含む、様々な異なる自家細胞型を幅広く使用することができ、好ましくは、ＥＰＣ、ＭＳＣ、及びこれらの混合物、例えばＭＳＣ／内皮細胞、ＭＳＣ／ＥＰＣ等を使用することができる。従って、本発明はまた、前記多血小板血漿ゲル組成物がさらに自家細胞を含む上記の生体適合性インプラントを企図する。
【００４５】
具体的な実施形態では、好適な（ｏｆ  ｃｈｏｉｃｅ）細胞は１つの細胞型又は少なくとも二つの細胞型を様々な割合で混合したものであり、例えば、様々な量（１００％：０％、５％：９５％、１０％：９０％、２５％：７５％、５０％：５０％、７５％：２５％、０％：１００％）のＥＰＣ：ＢＭＳＣを通常トリプシン処理し、選んだ数の細胞を集めてＰＲＰとともに混合する。総細胞数は、最終体積３００μＬの試料当たり、１０，０００〜２，０００，０００と様々であってよく、より好ましくは最終体積３００μＬの試料当たり１００，０００〜１，０００，０００である。これらの量はより大きな体積試料に対してはそれ相応に適合されるべきである。
【００４６】
以上に示したように、ＰＲＰはある濃度（被験者ごとに異なってよい）に濃縮された成長因子を含む天然の自家混合物を表す。従って、さらなる実施形態において、ＰＲＰは、必要であれば、さらに、１以上の以下の（既に存在する）物質を様々な比率で（例えば１以上の特定の成長因子を強化するために）補われてもよい：血小板由来成長因子ＡＢ（ＰＤＧＦ−ＡＢ）、血小板由来成長因子ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ）、血小板由来成長因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ−ｐ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、上皮細胞増殖因子ＥＣＧＦ及び線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）。
【００４７】
さらなる実施形態において、ＰＲＰはまた、任意に、血管新生因子及び／又は骨形成因子で補うこともできる。好適な血管新生因子は、小分子薬剤、活性化合物、遺伝子産物及び遺伝子治療剤、及び、サイトカイン又は一時的なマトリクスタンパク質又はその両方などの、新しい血管の成長を促進する治療に有用な任意の物質を含んでもよい。より具体的には、１以上の以下の物質を含むことができる：生物活性炭水化物、組み替え生物薬剤、転写調節による遺伝子活性の調整、細胞ｍＲＮＡの反転、又は特定のｍＲＮＡがそのタンパク産物に翻訳される効率に影響を及ぼす酸化窒素剤、つまりアンチセンス薬剤等の血管生理学の調節に関与する（ａｃｔｉｖｅ）化学物質。他の活性化合物には、ホルモン、受容体リガンド、ペプチド（合成及び天然とも）、ペプチド模倣化合物、特異的及び非特異的プロテアーゼ阻害剤、プロスタグランジン、プロスタグランジン合成酵素の阻害剤及び／又はプロスタグランジン合成の調節に関与する他の酵素、酸性及び塩基性ＦＧＦ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、アンギオジェニン、ＴＧＦアルファ及びＴＧＦベータ等の血管系に作用する成長因子が含まれる。
【００４８】
さらなる実施形態では、ＰＲＰはまた、少なくとも1つのナノ粒子材料で補われる。好適な無機物は、以下の物質を１以上含む：ベータリン酸トリカルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２）（ベータ−ＴＣＰ）、アルファリン酸トリカルシウム（アルファ−ＴＣＰ）、及び例えばＷＯ２００７／０４５９７７（これを参照することにより全体として本明細書に援用する）に記載のヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）等のリン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、炭酸カルシウム、又は、必ずしもではないが、主にＳｉＯ２、Ｎａ２Ｏ、ＣａＯ及びＰ２Ｏ５から成る生体活性ガラス及びセラミックスであり、好ましくはＨＡＰ、生体活性ガラス又はセラミックスである。
【００４９】
従って、本発明はまた、前記多血小板血漿ゲル組成物がさらに、上で定義したナノ粒子材料を少なくとも１つ含む（及び任意に、上に定義した自家細胞を含む）上述の生体適合性インプラントを企図する。
【００５０】
好ましくは、微粒子無機物は、平均粒径が約１ｎｍ〜約５μｍ、好ましくは１ｎｍ〜１μｍ、より好ましくは１０ｎｍ〜約０．５μｍである。
【００５１】
好ましくは、少なくとも１つのナノ粒子無機物が、ＰＲＰゲル組成物の体積の、約０．０１％〜約６０％、好ましくは０．０１％〜１０％を構成する。
【００５２】
ＰＲＰのゼリー化は、少なくとも１つの好適な活性化剤又はゼリー化剤を加えることにより開始され、活性化剤又はゼリー化剤は、本発明の目的のために血小板成長因子の放出及びフィブリノゲンのフィブリンへの変換を活性化できる化合物として定義される。従って、さらなる実施形態では、ＰＲＰは活性化剤で補われる。活性化剤は天然の、合成の及び／又は無機の活性化剤が可能である。好適な活性化剤は、自家ＰＲＰゲル組成物のゼリー化又は凝固をもたらすために他の成分と適合性がある。例としては、カルシウム塩（例えば、塩化カルシウム又はグルコン酸カルシウム）、トロンビン（ヒト又はウシ）、バトロキソビン、又は他の活性剤（例えば、ＵＳＰ  ６３２２７８５に記載のコラーゲン、ＡＤＰ及びセロトニン）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい活性化剤にはトロンビン及び塩化カルシウムが含まれる。
【００５３】
従って、本発明はまた、前記多血小板血漿ゲル組成物がさらに上に定義した少なくとも１つの活性化剤又はゼリー化剤を含む（及び任意に自家細胞及び／又は少なくとも１つの上に定義したナノ粒子材料を含む）上述の生体適合性インプラントを企図する。
【００５４】
要求されるゲルの特性に応じて（例えばゼリー化時間、ゲルの剛性）、考慮されるゼリー化剤の濃度を変えて加えることができる。
【００５５】
好ましくは、前記活性化剤又はゼリー化剤は、毒性を低く保つために、付加的な有機化合物及び特にイオノフォアを含まない。
【００５６】
ＰＲＰゲル組成物は、生体内又は生体外で活性化することができる。
【００５７】
１つの実施形態において、ＰＲＰゲル組成物は生体外で活性化される。血小板又はＰＲＰの生体外活性化は、ウシトロンビンの付加、超音波処理、又はイオノフォアの付加を含み、化学的又は物理的に行うことができる。
【００５８】
より好ましい実施形態において、ＰＲＰゲル組成物は、繰り返し凍結融解サイクルを用いて活性化される。活性化効率は他の方法に匹敵する（例えば超音波処理）。
【００５９】
さらなる実施形態では、ＰＲＰゲル組成物は、好ましくは、生理的ｐＨと実質的に等しいｐＨを有し、例えば、３７℃で測定したｐＨが６．５〜８、好ましくは約７〜７．５の間に含まれる。通常、保存中又は使用のための準備時にｐＨを変える必要はない。
【００６０】
当業者であれば、骨修復での利用に使用されるＰＲＰゲル組成物の量又は体積は、修復される骨欠損の大きさに依存することがわかるだろう。好ましくは、ＰＲＰゲル組成物の総体積は１ｃｍ３から２０ｃｍ３まで変化する。１つの実施形態では、ＰＲＰゲル組成物は、ゼリー化が起こるまで（ゲル体積に応じて、１分から２時間、好ましくは３０分）、３７℃の細胞培養器で予め培養され、その後、骨欠損に置き、骨欠損を、本発明によるバイオ人工骨膜を周囲に取り付けることにより実質的に囲む。
【００６１】
他の実施形態では、バイオ人工骨膜で骨欠損の周囲を包んで隙間を作り、完全にゼリー化する前にＰＲＰゲル組成物を骨の空隙に直接注入し、バイオ人工骨膜によってその中に包含させる。その後ゼリー化が骨の空隙内で起こる。
【００６２】
さらに他の実施形態では、ＰＲＰゲル組成物を、適切な生体適合性支持構造物で補う又はこれに包含させる。多血小板血漿ゲル組成物を、前記骨欠損に支持構造物が配置される前あるいは後に供給する。従って、１つの実施形態では、最初にＰＲＰゲル組成物を生体適合性支持構造物に供給し、続いてこの生体適合性構造物を骨欠損に配置し、その後、この骨欠損を本発明による膜をその周囲に取り付けることによって囲む。あるいは、最初に適切な生体適合性支持構造物を骨欠損に配置し、その後完全にゼリー化する前にＰＲＰゲル組成物を前記支持構造物に供給し、骨欠損を本発明の膜をその周囲に取り付けることによって囲む。多血小板血漿ゲル組成物の供給は、通常、注射によってなされる。
【００６３】
意図する使用に好適な支持構造物を設計する当業者であれば、修復すべき骨欠損の性質及び場所に応じて、例えば細孔径、形状、相互連結、分解時間等の異なる特徴を持つ支持構造物が適することがわかるだろう。
【００６４】
具体的な実施形態では、支持構造物は、吸収可能及び／又は生分解可能である。好ましくは、支持構造物は、吸収可能及び／又は生分解可能なポリマー、セラミックス又は吸収可能なポリマー−セラミック複合材料である。
【００６５】
吸収可能なポリマーの例としては、コラーゲン、ヒアルロン酸、セルロース等が含まれるが、これらに限定されない。分解可能なポリマーの他の例としては、これらに限定されないが、ポリ乳酸及びポリグリコール酸、ポリ（３−ヒドロキシブタノアート）、ポリ（３−ヒドロキシバレラート）、ポリ（４−ヒドロキシブタノアート）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（バレロラクトン）、ポリオルトエステル、ポリアンヒドリド、ポリウレタン、ポリアクリル酸、ポリヒドロキシメタクリレート、ポリメチルメタクリレート、ポリアミド、及び上記材料の共重合体、ブロック共重合体及び混合物が挙げられ、より好ましくは、ポリアクリル酸及びポリウレタン、最も好ましくはポリウレタン（ポリ（エステル−ウレタン）、ポリ（エーテル−ウレタン）、ポリ（ウレタン−尿素）、ポリ（エステル−ウレタン−尿素）及びポリ（エステル−チオウレタン）を含む）である。吸収可能なセラミックの例としては、これらに限定されないが、ヒドロキシアパタイト、サンゴ藻ヒドロキシアパタイト、炭酸ヒドロキシアパタイト、生体活性ガラスセラミック、生体活性セラミック、リン酸カルシウムセラミック、焼成骨、リン酸三カルシウム、又は類似の材料又は上述のセラミックスの混合物を含む。吸収可能なポリマー−セラミックス複合材料の例としては、これらに限定されないが、上述のポリマー及びセラミックスのいずれかの混合物又は合成物が挙げられ、最も好ましくはポリウレタンとヒドロキシアパタイトの複合材料である。
【００６６】
本発明の好適な支持構造物は、生体内で１ヶ月から３年、好ましくは２ヶ月から１２ヶ月の速度で吸収されるであろう。このような吸収速度は、ポリマー分子量、ポリマーの鎖配向や結晶化度、物理的構造、化学的組成、空隙の存在及び程度、添加物等を変えるなど、当業者に公知の方法を用いて調節することができる。
【００６７】
他の具体的な実施形態では、支持構造物は多孔質であり、好ましくは、３０％〜９９％の範囲の、より好ましくは６０％〜９５％の空隙率を有する。好ましくは、細孔径の範囲が、５〜２０００μｍ、より好ましくは５０μｍ〜１０００μｍである。
【００６８】
さらに他の具体的な実施形態では、支持構造物は、骨欠損の形に形成されるか、又は骨欠損内に圧入される（ｐｒｅｓｓ−ｆｉｔｔｅｄ）。従って、１つの実施形態では、支持構造物は、スポンジ、泡、ゲル又は線維網又は類似のものの形をしている。
【００６９】
他の具体的な実施形態では、上述の生体適合性インプラントの可撓性の膜として用いるための移植可能な生体適合性材料は、無毒、非炎症性、非免疫原性でなければならず、移植部位で他の好ましくない反応があってはいけない。さらに、骨欠損の周囲に掛けるのに十分な可撓性を有するべきであり、これにより、移植前あるいは外科的処置自身の間、膜を正確な形にする必要なく、任意の大きさ又は形状の骨欠損に適合できる。
【００７０】
本発明で用いる「周囲に取り付けて」「周囲を包んで」又は「周囲に掛けて」とは、空所をつくるように欠損を覆い又は囲むことを意味する。従って、骨の隙間の場合、このような膜は「実質的に管状」（この用語には骨の隙間の周りを膜で包んで骨の端部の間の隙間を囲み、空所を形成する際に得られる任意の形状を含む）に、隙間の「周囲に取り付けられる」（例えば図１参照）。例えば頭蓋顎顔面利用で見られるような骨空洞の場合、このような膜を、裏張り又は覆いの形で空洞の「周囲に取り付け」、空洞を囲んで空所を形成する。
【００７１】
さらに、移植可能な生体適合性材料は、安定した三次元構造を維持するに十分な機械的強度を持たなければならず、それにより骨欠損の場所の内部にＰＲＰゲル組成物を保持し、歪み、移動、又は、骨化が確立される前にインプラントの場所からＰＲＰゲル組成物が流れ出すことをなくす。さらに、好ましくは、生体適合性材料は、付加的な外科的処置によって取り除く必要がなく、このような骨化時に吸収されるよう設計されなければならない。さらに、生体適合性材料は、内皮細胞が相互連結した孔全体に付着し広がって新しい血管新生が可能なように、少なくともその内側表面に、適切な支持体を提供しなければならない。
【００７２】
好適な材料は、好ましくは、多孔質マトリクスを含み、生体分子の循環を可能にする。好適な（ｏｆ  ｃｈｏｉｃｅ）材料は、当業者に公知の任意の技術により多孔質にすることができ、骨欠損に掛けた膜によって形成される空所への細胞及び血管の通り抜け成長（ｔｈｒｏｕｇｈ−ｇｒｏｗｔｈ）を可能にする装置となるであろう。このような技術としては、これらに限定されないが、気泡の大きさを注意深く制御して焼結する；異なる分解速度を持つ材料を混ぜ合わせ、１つの材料を先ず再吸収させて（生体内又は生体外）、部分的に再吸収された多孔質構造を残す；繊維同士を織って又は編んで織物様の材料を形成する；加工中に発泡剤を使用し、材料が硬化するときに気泡を発生させ孔を残す；溶媒／溶液相分離；レーザーエッチング；イオンビームエッチング；及び、塩又はゼラチン等の粒子を材料構造物に組み込み、粒子を溶出して多孔質空隙を残す粒子リーチングが含まれる。
【００７３】
意図する用途に合わせて吸収性膜を設計する当業者であれば、例えば骨前駆細胞の移動、骨形成原細胞の付着、及び栄養素、副産物等の拡散、及び骨や組織の成長をさらに後押しするための血管新生を可能にするように多孔性の程度を選択する方法を知っているであろう。
【００７４】
この多孔性の範囲は、ミクロ及びナノ細孔（ｐｏｒｏｓｉｔｙ）によって表すことができる。本発明の範囲内で、ミクロ細孔とは、１０００μｍ未満、５μｍ以上の孔径を有すると定義され、ナノ細孔とは、５μｍ未満、好ましくは１００ｎｍから５μｍの間の孔径を有すると定義される。
【００７５】
モノ多孔性又は様々な細孔径範囲を有する二峰性の多孔性、つまり、ナノ細孔及びミクロ細孔の両方を含む膜は、膜の所望する特性、例えば浸透性、細胞付着性及び拡散性、脈管化などに応じて、どちらかを使用できる。さらに、多孔質マトリクスはまた、活性成分の放出、例えば移植部位で時間をかけてのゆっくりとした持続した活性成分の放出を提供し、その結果骨成長の速度を促進できる。
【００７６】
従って、さらなる実施形態では、ＥＰＣ、ＭＳＣ及びこれらの混合物等の細胞（好ましくは自家細胞）、及び、例えばリン酸カルシウム、ヒドロキシアパタイトなどのセラミック等の全骨髄骨伝導材料、及び／又は例えば骨形成タンパク質（ＢＭＰ）などの成長因子等の骨伝導材料、及び／又は薬、脂肪酸、抗生物質等の他の生物活性化合物を、マトリックスに組み込む又は表面の片側又は両側に（好ましくは骨欠損に向かって内側に面する表面に）播種して、骨形成を後押しし促進することもできる。
【００７７】
好ましい実施形態では、全骨髄、及び／又はＥＰＣ、ＭＳＣ及びこれらの混合物（例えばＥＰＣ／ＭＳＣが全細胞数の１０％：９０％）等の細胞、及び／又は本発明のＰＲＰゲル組成物、及び／又は、セラミック粒子が例えば１％〜２０％、好ましくは１％〜１０％、最も好ましくは５％重量／体積で、本発明の膜の片面、好ましくは内側、又は両面に播種される。
【００７８】
膜として使用される材料は、天然又は合成源であってよく、好ましくは生分解性である。
持続的放出特性を有する好適な膜となり得る、多くの合成生分解性ポリマーがある。これらのポリマーの説明は、例えば、Ｌｉｃｈｕｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｖｅｈｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｏｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  −Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ”、Ｐａｒｋ  ａｎｄ  Ｍｕｓｎｙ  ｅｄｓ．、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＤＣ  （２０００）、Ｇｕｎａｔｉｌｌａｋｅ  Ｐ．Ａ．  ａｎｄ  Ａｄｈｉｋａｒｉ  Ｒ．，  Ｅｕｒｏｐ．  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，  ５，  １−１６，  ２００３；  Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｔ．Ａ．  ａｎｄ  Ｍｉｋｏｓ  Ａ．Ｇ．，  Ａｄｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｅｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １０２，  １６１−８５，  ２００６；  Ｎａｉｒ  Ｌ．Ｓ．  ａｎｄ  Ｌａｕｒｅｎｃｉｎ  Ｃ．Ｔ．，  Ａｄｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｅｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １０２，  ４７−９０，  ２００６に見つけることができ、これらを全体として参照することにより本明細書に援用する。
これらのポリマーの例としては、これらに限定されないが、コラーゲン、ヒアルロン酸、セルロース等の生分解性及び非生分解性ポリマー、ポリ乳酸及びポリグリコール酸等の分解可能なポリエステル、ポリ（３−ヒドロキシブタノアート）、ポリ（３−ヒドロキシバレラート）、ポリ（４−ヒドロキシブタノアート）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（バレロラクトン）、ポリオルトエステル、ポリカルボキシレート、ポリカーボネート、ポリアンヒドリド、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン、フッ素化エチレンプロピレン等のパーフルオロポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、シリコーン、ポリサルフォン、ポリアクリル酸、ポリヒドロキシメタクリレート、ポリメチルメタクリレート、ポリアミド、及び上記物質の共重合体、ブロック共重合体及び混合物が挙げられ、好ましくは、コラーゲン、ヒアルロン酸、等の生分解性ポリマー、ポリ乳酸及びポリグリコール酸等の加水分解性ポリエステル、ポリオルトエステル、ポリカルボキシレート、ポリカーボネート、ポリカプロラクトン、ポリアンヒドリド、ポリウレタン（ポリ（エステル−ウレタン）、ポリ（エーテル−ウレタン）、ポリ（ウレタン−尿素）、ポリ（エステル−ウレタン−尿素）、ポリ（エステル−チオウレタン）を含む）、好ましくは、加水分解性ポリエステル及びポリウレタン、より好ましくはポリ乳酸及びポリウレタン、最も好ましくはポリウレタンである。
【００７９】
ポリウレタンは、例えばＷＯ２００６／０１０２７８（これを全体として参照することにより本明細書に援用する）に記載されているように、生分解性、生体適合性材料として使用されることが、当該技術分野では周知である。ポリウレタンは、単独又は他のポリマーと組み合わせて使用して、適当な可撓性、機械的強度（厚みを含む）、空隙率及び分解速度等の所望する特徴を得ることができる。これらの特徴は、ポリマーの分子量の変化、膜の形成、及び可能な割合で１以上のポリマーを付加することによって、当業者が調節できる。ポリウレタンの特性は、また、反応物（例えばポリオール、鎖延長剤、イソシアネート）の性質及びそれら個々の濃度を変えることにより調節できる。
【００８０】
従って、ポリ（エステル−ウレタン）等の好ましいポリウレタンは、例えば、ＷＯ２００６／０１０２７８  Ａ１（これを全体として参照することにより本明細書に援用する）に記載のように、ポリ（ε−カプロラクトン）セグメント、１，６−ヘキサメチレンジイソシアネート、及び、イソソルビド、ポリ（エチレングリコール）等の鎖延長剤を含んでもよい。
【００８１】
好ましいポリウレタンは、記載されている標準的な手順に従って作製することができる（例えばＷＯ２００６／０１０２７８；  Ｇｏｒｎａ  Ｋ．ａｎｄ  Ｇｏｇｏｌｅｗｓｋｉ  Ｓ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．７９Ａ，  １２８−１３８，  ２００６（両文献を全体として参照することにより本明細書に援用する）を参照）。例えば、ヘキサメチレン−１，６−ジイソシアネート等のジイソシアネートを、ポリオール（例えばポリ（ε−カプロラクトン）ジオール）及び鎖延長剤（例えば１，４，３，６−ジアンヒドロ−Ｄ−ソルビトール又はイソソルビド）と、触媒（例えばジブチル錫ジラウレート）の存在下、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で、昇温（例えば８０℃）にて、数時間（例えば２４時間）反応させる。ポリウレタンは、エタノール中で沈殿し、真空下で一定重量で乾燥される。通常の平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーで測定して２５００００ｇ・ｍｏｌ−１である。ポリオール基及び鎖延長剤に対するジイソシアネートのモル比は１：１に保たれ、ポリオールに対する鎖延長剤の理論上のモル比は、０．１：１〜１０：１まで変化できるが、好ましくは０．５：１である。
【００８２】
意図する用途に合わせて吸収性膜を設計する当業者であれば、修復される骨欠損の性質に応じて、好適な分解時間は異なることを知っているだろう。より大きな欠損に適するポリウレタン膜は、骨形成が十分に成長するまでゲル組成物が十分に滞留するように、より長い分解時間を示す必要があるが、より小さい欠損には、より短い分解時間が適当である。好適な分解時間は、４〜３６ヶ月、好ましくは１２〜３６ヶ月である。
【００８３】
本発明での使用に対して、好適な（ｏｆ  ｃｈｏｉｃｅ）ポリマー膜の細孔（ｐｏｒｏｓｉｔｙ）は、５μｍ〜１０００μｍ、より好ましくは５０μｍ〜５００μｍの範囲であってよい。本発明での使用に対し好適な（ｏｆ  ｃｈｏｉｃｅ）ポリマー膜の厚みは、０．０５ｍｍ〜５ｍｍ、好ましくは０．１ｍｍ〜２ｍｍの範囲であってよい。当業者であれば、好適な膜の大きさは、治療される骨欠損の大きさに依存し、好ましくは、損なわれていない骨に膜を固定できるように骨欠損に重なることがわかっているだろう。例えば、長さは５ｃｍ〜３５ｃｍ、好ましくは１０ｃｍ〜２５ｃｍ、高さは５ｃｍ〜３５ｃｍ、好ましくは１０〜２５ｃｍの膜が好適である。
【００８４】
さらなる態様では、本発明は、骨欠損の修復における本発明による生体適合性インプラントの使用、又は被験者の骨成長を誘導する方法に関する。
【００８５】
本発明での使用に対し、可撓性膜として使用するために好適な（ｏｆ  ｃｈｏｉｃｅ）ポリマーは、所望の形状に形作られなければならず、上で定義したような厚み及び多孔性を有する所望の大きさの膜である。１つの実施形態では、膜は、移植前に所望の形状に形作ることができ、設置される（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ）空間（すなわち隙間、空洞等）の所望の形状を、空間内に生きた骨を実質的に作り出すために必要な期間、実質的に保持するような機械的特性を備えるように構成され得る。他の実施形態では、膜は、移植中に形作ることが可能なように構成され得る。
【００８６】
移植時、膜は、被験者の生きた組織と、骨欠損を取り囲む膜によって作られる設置される空所との間に、多孔質で浸透性の境界を提供する。従って、膜は、例えば、骨隙間の場合は実質的に管形状、又は空洞（上に定義したような）の場合は（平らな）覆いとなる。
【００８７】
膜は、空間の全境界又は空間の一部だけを画定（ｄｅｌｉｎｅａｔｅ）してよく、境界の残りの部分は被験者の組織によって画定される。好ましくは、膜は、空間の全境界を画定することができる。具体的な実施形態では、膜の端部は、骨の端部と、好ましくは０．０１〜５ｃｍ、より好ましくは０．５ｃｍ〜３ｃｍ重なっている。
【００８８】
被験者の体内に所望の設置される空間を設立及び保持するのに、膜とともに補強手段の利用が必要であってもよい。従って、これらの重なる端部を、ステープル、ネジ、縫合及び支柱、ワイヤ又はメッシュ等の、当該技術分野で公知の適切な手段によって、骨端部に取り付けることができる。
【００８９】
骨欠損の周囲を膜で包むことによって設置される空間の構造（大きさ及び形状）は、骨の全機能を再び得るために要求される生きた骨の構造とほぼ同等である。従って、好ましくは、生きた骨の生成は、骨欠損の周囲を包む膜によって設置される空間の実質的に外側では起こらない。
【００９０】
上述のように、設置される空間を実質的に保持するのに必要な期間は、骨欠損の場所、生成される生きた骨の体積及び寸法、使用されるＰＲＰゲル組成物の性質（すなわち、自家細胞及び骨形成因子等による補充の量、及び／又は支持構造物の存在）、及び骨修復が必要な被験者の構造に応じて異なっていてよい。設置される空間を実質的に保持するのに必要な機械的特徴は、分解可能な材料が装置の構造物又は補強部材に使用される場合、特に重要である。これらの分解可能な材料は、所望の設置される空間を保持する能力を、早く失いすぎてはいけない。
【００９１】
従って１つの実施形態では、骨欠損上又は骨欠損の周囲に膜を配置する時又は配置した後直ぐ、設置された空所は本発明のＰＲＰゲル組成物で満たされる。注入可能な本発明のＰＲＰゲル組成物を用いることによって、注射器又はカテーテルの使用を含む従来の手段により空所に簡単に供給できる。ゼリー化剤が存在していれば、本発明のＰＲＰゲル組成物を空所に注入すると直ぐにゼリー化が始まる。時間が経つと、自然な生物学的プロセス（細胞分化及び成長、続いてマトリクス合成、血管新生）は、骨新生形成及び本発明の生体適合性インプラントの吸収に至るであろう。従って、１つの実施形態において、本発明は、被験者内の骨成長を誘導する方法に関し、（ａ）内側及び外側表面を有する生体適合性材料を含む可撓性の膜を骨欠損に掛けて、及び任意に膜の端部を固定して、空所を作り、この空所に多血小板血漿ゲル組成物を注入して骨成長が起こるようにすることを含む。
【００９２】
他の実施形態において、まず、支持構造物によって補われたＰＲＰゲル組成物を、骨隙間（図１のような）又は空洞（図示せず）等の骨欠損に塗布し、次に本発明の膜で隙間の周囲を管状に包み、又は囲むように空洞の上に置いて、本発明の最終的な生体適合性インプラントを得る。１つの特定の実施形態では、まず、ＰＲＰゲル組成物を支持構造物に注入し、その後支持構造物を骨欠損内に配置する。他の特定の実施形態では、好適な（ｏｆ  ｃｈｏｉｃｅ）支持構造物をまず骨欠損内に配置し、骨欠損内に支持構造物を配置した後、ＰＲＰゲル組成物を供給する。
【００９３】
従って、他の実施形態では、本発明は、被験者内の骨成長を誘導する方法に関し、（ａ）骨欠損内に生体適合性支持構造物を配置し、（ｂ）前記生体適合性支持構造物内にＰＲＰゲル組成物を供給し、及び（ｃ）前記骨欠損に可撓性の膜を掛けて前記支持構造物を囲み、骨欠損内に支持構造物を保持して、骨成長が起こるようにすることを含む。
【００９４】
あるいは、本発明は、被験者内の骨成長を誘導する方法に関し、（ａ）生体適合性支持構造物内にＲＰＲゲル組成物を供給し、（ｂ）ＰＲＰゲル組成物を含む前記生体適合性支持構造物を骨欠損内に配置し、及び（ｃ）前記骨欠損に可撓性の膜を掛けて前記支持構造物を囲み、骨欠損内に支持構造物を保持して、骨成長が起こるようにすることを含む。
【００９５】
さらなる態様では、本発明は、本発明の生体適合性インプラントの製造のための部品キットに関する。特に、この部品キットには、ＰＲＰゲル組成物を原位置（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で作製する（骨修復の必要な被験者からＰＲＰを採取すること、得られたＰＲＰの精製、ＰＲＰと任意の補完物との混合を含む）ための１以上の即用性（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）のコンパートメント、可撓性の滅菌膜を含むさらなるコンパートメント、任意の補完物を備えた少なくとも１つのさらなるコンパートメントが含まれる。
【００９６】
任意に、この部品キットはまた、原位置で作製されるＰＲＰゲル組成物の注入のための注射器及び注射針（例えば１８ゲージ）を備えたコンパートメントを含む。
【００９７】
従って、１つの特定の実施形態では、部品キットが、骨修復が必要な被験者の血液採取のための１以上の容器（例えばＭｏｎｏｖｅｔｔｅｓ（登録商標）その他）を備える第１のコンパートメント、血小板分離のための１以上の殺菌分析チューブ（例えばＦａｌｃｏｎその他）を備える第２のコンパートメント、ＰＲＰゲル組成物の第２の製造段階（つまり血漿からの血小板分離）を行うための１以上の殺菌分析チューブ（例えばＦａｌｃｏｎその他）を備える第３のコンパートメント、適切な大きさ（例えば、２０ｃｍ×１５ｃｍ、必要ならば本発明の使用に先だって特定の大きさにカットできる）の可撓性滅菌膜を含む第４のコンパートメント、原位置で作製されるＰＲＰゲル組成物の注入のための注射器及び注射針（例えば１８ゲージ）を備える第５のコンパートメント、生体活性セラミック微粒子（例えばＨＡＰ、ＣａＰその他）等の任意の補完物を備える少なくとも１つのさらなるコンパートメント、適切な支持構造物を備える任意のさらなるコンパートメント、及び、任意の補完物（例えば微粒子、細胞等）とＰＲＰゲル組成物を混合するための最後のコンパートメントを含む。
【００９８】
本発明を、特に、その好ましい実施形態を参照して示し説明したが、当業者であれば、添付の請求項により包含される本発明の範囲から逸脱することなく、構造及び詳細を様々に変えることが可能であると理解されるであろう。
【実施例】
【００９９】
材料及び方法
画像化：
Ｆａｘｉｔｒｏｎ  Ｘ−ｒａｙ社のキャビネット型（４３８５５Ａ型）及びＳｔｒｕｃｔｕｒｉｘ  ＡＧＦＡ  フィルムを用いて、コンタクトラジオグラフィーで撮像した。
【０１００】
細胞：
内皮細胞を、例えば伏在静脈を取り除き内皮細胞を培養することによって、最終的な移植者から採取した。好ましくは前駆細胞を用い、前駆細胞は骨髄生検から得る又は循環血液から単離して、体外で培養することができる。ＭＳＣは、移植者の骨髄サンプルからのもので、必要な細胞数に達するまで（通常２〜４週間）、体外で増幅させた。
【０１０１】
培養方法：
培養方法は、再移植の目的で、ヒト細胞の培養に対し特別な用心をもっての、標準的な培養技術であった。
【０１０２】
ＰＲＰの作製：
治療を必要とする被験者から得た血液吸引物を、ＣＰＤＡキュベット（キットに装備）から、１５ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブ（キットに装備）に移して、室温で３０分間、２００ｇにて遠心分離機にかけた。結果として生じた血漿上澄みを貯めて、新しい１５ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに移し、室温で５分間、２，０００ｇにて遠心分離機にかけ、血小板沈殿物を得た。そこから、残っている血漿上澄みに得られた沈殿物を再懸濁させることによって、ＰＲＰを作製した（最初の血液量の１０分の１）。ＰＲＰは、ＰＲＰ活性化効率の試験管内評価のために又は生体内で（補完物を任意に付加する際）直ぐに用いるか、あるいは利用まで−２０℃で保存した。
【０１０３】
ＰＲＰ活性化：
ＰＲＰを、凍結融解サイクルを経て活性化した。ＰＲＰを、利用まで−２０℃で最低３０分間凍結した。その後、サンプルを３７℃の水浴で３０〜６０分間培養することによって融解させた。異なるパーセンテージのトロンビン（１０〜３０％  ｖｏｌ／ｖｏｌの５０Ｕ／ｍＬ貯蔵液）をＰＲＰに加えて、必要なゲル組織及びゼリー化の遅延を達成した。
【０１０４】
活性化時のタンパク質放出：
上述の方法の血小板活性化効率を評価するために、ＰＤＧＦ−ＡＢ、−ＢＢ及びＶＥＧＦの放出を、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。サンプルを１８，０００ｇで２分間遠心分離し、残屑（ｄｅｂｒｉｓ）を沈殿させた（ｐｅｌｌｅｔ）。生じた上澄みを、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳに１：５０で薄め、ヒトＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＢ及び−ＢＢタンパク質含有量を、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｂｉｏ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｄｅｒ  ＨＴＳ  ７０００に、Ｒ＆ＤシステムのＤｕｏｓｅｔ  ＥＬＩＳＡ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＤＧＦ−ＡＢ：ＤＹ２２２、ＰＤＧＦ−ＢＢ：ＤＹ２２０、ＶＥＧＦ：ＤＹ２９３Ｂ）を用いて測定した。図４から、異なる活性化モードが同じ成長因子の放出効率を示すことがわかる。
【０１０５】
実施例１：ＰＲＰゲルへの細胞カプセル化
総細胞数は、サンプル当たり１００，０００〜２，０００，０００と様々であった。ＰＲＰゼリー化は、トロンビン付加によって開始された。必要なゲル特性（例えばゼリー化時間、ゲル剛性）を得るために、様々なパーセンテージ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の５０Ｕ／ｍＬトロンビン溶液を加えた（１０〜３０％）。
【０１０６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイのために、３００μＬの調合液をモールド（ＬａｂＴｅｃｋ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｓｌｉｄｅｓ，Ｎｕｎｃ）内に移し、ゼリー化が完了するまで２０分間３７℃で置いた。サンプルをその後モールドから取り出し、細胞培養地を含む２４ウェル培養プレートに置き、さらに３７℃、５％ＣＯ２、湿気のある培養器内で培養した。
【０１０７】
ＥＰＣ及びＢＭＳＣは、７日後もまだ培養中のＰＲＰゲル内で生存しているのが観察されたが、ＨＵＶＥＣは生存率がより低かった（図５）。
【０１０８】
実施例２：ＰＲＰゲルへのヒドロキシアパタイトナノ粒子（ＨＡＰ）カプセル化
上述のように、ＰＲＰを作製し活性化させた。様々な量の無機ナノ粒子をＰＲＰ／細胞調合液と混合させた。異なるＰＲＰ／トロンビン比率についてテストし、ゲル生成並びにゲル組織の最適な条件を決定した：１０，１５，２０，２５及び３０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）トロンビン（５０Ｕ／ｍＬ貯蔵液）をＰＲＰ（この実験では総体積３００μＬ）に混ぜた。最も適切なトロンビンのパーセンテージは、１５〜２０％の間であった。
【０１０９】
異なる量のＨＡＰをＰＲＰゲルに加え、異なるトロンビンのパーセンテージについてテストした。図６に示したＦａｘｉｔｒｏｎ  Ｘ線像から、ゲル構造物中のＨＡＰの存在／再分配がわかる。ＨＡＰ粒子の均質な再分配は、全ての場合で得ることができた。１５％トロンビンを用いて得られたゲル組織が、簡単なサンプル操作に好適であった。
【０１１０】
実施例３：ＰＲＰゲルＨＡＰへの細胞カプセル化
上述のように、１５％トロンビン及び２，６又は１０ｍｇ／ｇｅｌ（６，２０，３３ｍｇ／ｍＬ）いずれかのＨＡＰナノ粒子を用いて、ＰＲＰ／ＨＡＰゲルを作製した。細胞をトリプシン処理して、選んだ数の細胞を収集しＰＲＰ／ＨＡＰとともに混ぜた。細胞型は、単独でＰＲＰ／ＨＡＰに混合させる、すなわち１細胞型単独か、あるいは他の細胞型とともに混合させる、つまり２以上の細胞型の混合物（例えばＭＳＣ／内皮細胞、ＭＳＣ／ＥＰＣ）であった。後者の場合、異なる細胞型を異なる割合で用いた。総細胞数は、サンプル当たり１００，０００〜２，０００，０００と様々であった。ＰＲＰゼリー化はトロンビンを付加すると直ぐに始まった。異なるパーセンテージ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の５０Ｕ／ｍＬトロンビン溶液を加えた（１０〜３０％）。図７は、１５％トロンビンを調合液に加えたときの、ＨＵＶＥＣ、ＢＭＳＣ、又はＨＵＶＥＣ及びＢＭＳＣ両細胞型の５０／５０％混合物のいずれかを含むＰＲＰ／ＨＡＰゲル（２，６又は１０ｍｇ／ｇｅｌ＝６，２０，３３ｍｇ／ｍＬ）の、ＦａｘｉｔｒｏｎＸ線像を示す。図７は、細胞の存在下でさえ、満足できる均一なゲル内ナノ粒子再配合に達することが可能なことを示す。
【０１１１】
ＰＲＰ／ＨＡＰゲル内の、ＥＰＣ、ＢＭＳＣ、又はＥＰＣ及びＢＭＳＣ両細胞型の５０／５０％混合物のいずれかの分配及び生存率を、それぞれ、ヘマトキシリン・エオシン染色及びＬＤＨ活性によってもテストした（図８参照）。全ての場合でゲル内の均一な細胞分配が得られ、ＬＤＨ活性染色は、両細胞型（いずれか又は混合物）が６日後でさえ培養液中にまだ生存していたことを示す（図８）。
【０１１２】
実施例４：多孔質ポリウレタン膜の作製
生体吸収性ポリウレタン膜（Ｄ  １００μｍ、Ｓ  ５０μｍ、Ｔ  ０．０５ｍｍ、Ｌ  １５ｃｍ、Ｈ  ２０ｃｍ）を、１，６−ヘキサメチレンジイソシアネート、ポリ（ε−カプロラクトン）ジオール（ＭＷ  ５３０ｇ／ｍｏｌ）、イソソルビド（ポリオールに対する鎖延長剤のモル比＝０．５：１）から構成されるポリウレタンから作製した。ポリウレタン１０ｇ（ＭＷ  ２５０，０００ｇ／ｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２００ｍｌに溶かし、２０×３５ｃｍのトレイに注いだ。室温にて５日間溶媒をゆっくりと蒸発させた後、透明な膜（５０ミクロン厚）を得、エタノールで洗浄し、さらに真空下で２４時間４０℃にて乾燥させた。続いて、３０Ｗ空冷、コンピュータ制御のＣＯ２レーザーカッター（ＦＢ４００シリーズ、ＣａｄＣａｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．、ノッティンガム、イギリス；  レーザービーム分解能：２５μｍ）を用いて、１００μｍサイズのミクロ細孔を膜に作った。レーザーの位置制御、ラスター／ベクトル速度及び出力は、所有権を主張できるソフトウェア（ＡｐＳ−Ｅｔｈｏｓ）を用いて達成した（図９）。
【０１１３】
実施例５：多孔質ポリ（Ｌ／ＤＬ−ラクチド）膜の作製
ポリ（Ｌ／ＤＬ−ラクチド）８０／２０ｗｔ％（Ｍｎ  ３０００００ｇ／ｍｏｌ）をＰＵＲＡＣから購入した。５．１５ｇのポリ（Ｌ／ＤＬ−ラクチド）８０／２０を２６６ｍＬのテトラヒドロフランに解かした。その後、アセトン２７ｍｌ及び水４ｍｌをゆっくりと加えて透明で均一な溶液を得た。最後に、ジメチルスルホキシド５０ｍｌにクエン酸３９ｇを溶かした溶液４ｍｌを滴下して加えた。この溶液２２６ｍｌを大きなガラストレイ（２０×３５ｃｍ）に注ぎ、多孔質ポリエチレンシートで覆って、溶媒の蒸発を制御した。室温２３〜２５℃、湿度４５％〜５５％で６日間、溶液をゆっくり蒸発させた。得られたミクロ及びナノ多孔質膜（Ｄ  ２〜４０μｍ、Ｓ  ２００〜２０μｍ、Ｔ  ０．３ｍｍ、Ｌ  １５ｃｍ、Ｈ  ２０ｃｍ）を、エタノールを用いてプレートから引き上げ、４０℃にて２４時間乾燥させた（図９）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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