(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物に由来し、アルカリ性環境下および酸性環境下において、互いに蛍光ピーク波長の異なる蛍光活性をそれぞれ有し、配列番号１、３、４、５または６で示されるアミノ酸配列を含む蛍光タンパク質。
【請求項２】
アルカリ性環境下における前記蛍光活性が、蛍光ピーク波長が５０６ｎｍ付近且つｐＫａ＝６．５であり、酸性環境下における前記蛍光活性が、蛍光ピーク波長が４５８ｎｍ付近且つｐＫａ＝６．０である、請求項１に記載の蛍光タンパク質。
【請求項３】
請求項１または２に記載の蛍光タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸。
【請求項４】
請求項１または２に記載の蛍光タンパク質を培養された細胞に導入し、前記蛍光タンパク質が発する蛍光に基づいて前記対象内部のｐＨを測定する方法。
【請求項５】
請求項１または２に記載の蛍光タンパク質と前記蛍光タンパク質とは異なるタンパク質とから成る融合タンパク質を培養された細胞に導入し、前記蛍光タンパク質が発する蛍光に基づいて前記対象内部のｐＨを測定する方法。
【請求項６】
前記細胞が、固定した細胞または生きた細胞である請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記測定が、５０６ｎｍ付近の蛍光強度と４５８ｎｍ付近の蛍光強度との比に基づいて行われる、請求項４から６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
波長の異なる２つの励起光を前記蛍光タンパク質に照射し、前記蛍光タンパク質から発生する蛍光に基づいて前記細胞内部のｐＨを測定する請求項４から７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
単一の波長の励起光を前記蛍光タンパク質に照射し、前記蛍光タンパク質から発生する蛍光に基づいて前記細胞内部のｐＨを測定する請求項４から７の何れか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属する生物、特にウミサボテンから遺伝子クローニングによって得られた蛍光タンパク質およびその変異体、ならびに、それらを用いた細胞機能の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）から、緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする遺伝子がクローニングされ、そのリコンビナントＧＦＰが大腸菌や哺乳細胞で発現することが確認された。その結果、このようなリコンビナントＧＦＰは、ＧＦＰの蛍光発色団形成に特別なコファクターが不要であり、あらゆる種の細胞にて利用できると認識され、タンパク質の局在や遺伝子の発現をｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ、ｉｎ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅでモニタリングするための画期的なツールとして用いられるようになった。更に、個体レベルでも用いられ、非侵襲的に生かした状態で観察することが可能となっている。
【０００３】
オワンクラゲ由来のＧＦＰは、自ら発色団を形成して蛍光を発する、２３８アミノ酸からなる２７ｋＤのタンパク質である。野生型ＧＦＰ（ｗｔＧＦＰ）は、紫外光３９５ｎｍに励起極大波長（４７０ｎｍにマイナーピーク）をもち、５０９ｎｍの緑色蛍光を発するタンパク質である。発色団は、アミノ酸配列中の６４〜６９番目の配列（特に６５〜６７番目の配列）によって形成されている。
【０００４】
また、ＧＦＰタンパク質の変異体も作製され、中でも６５番目のセリンをスレオニンに置換したＳ６５Ｔ変異体は、励起極大波長が４９０ｎｍと長波長側にシフトしており、ｗｔＧＦＰよりも数倍強い蛍光を発する。その後も様々なＧＦＰタンパク質の改変が行われ、現在までに、より明るい蛍光やタンパク質の安定性、溶解度を高める工夫などが加えられた数多くの変異体が作製されている。
【０００５】
クロンテック社のＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）は、発色団のアミノ酸置換（Ｐ６４Ｌ、Ｓ６５Ｔ等）に加え、晴乳類細胞や植物での翻訳効率を高める目的でヒトのコドン使用頻度に合わせて塩基配列が最適化されており、塩基配列としては１９０箇所以上の変異が導入されている。さらに、蛍光色の変異体ＥＢＦＰ（Ｂｌｕｅ）（Ｙ６６Ｈのアミノ酸置換等）、ＥＣＦＰ（Ｃｙａｎ）（Ｙ６６Ｗのアミノ酸置換等）およびＥＹＦＰ（Ｙｅｌｌｏｗ）（Ｔ２０３Ｙのアミノ酸置換等）は、ヒトのコドン使用頻度に合わせた塩基配列の最適化も行われた上で、ＥＧＦＰとは異なる蛍光色にて観察できる変異体として同社から入手可能である。
【０００６】
また、近年、ＧＦＰ様の蛍光タンパク質を有する生物種が、オワンクラゲ以外にも発見されており、そのような生物種から、それまでに作製されたＧＦＰ変異体のどれよりも長波長側にシフトした蛍光（赤い蛍光色）を発する蛍光タンパク質の遺伝子がクローニングされ、利用されるようになった。ＤｓＲｅｄは、ディスコソーマ・ストリアタ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｔｒｉａｔａ）に由来し、２２５アミノ酸から成る２６ｋＤのタンパク質であり、オワンクラゲＧＦＰと同様に自ら蛍光を発するタンパク質である。ＤｓＲｅｄの取得により、オワンクラゲＧＦＰの誘導体では得られなかった、赤色の蛍光（励起極大波長５５８ｎｍ、蛍光波長５８３ｎｍ）を使用することが可能となった。
【０００７】
蛍光タンパク質の特性の１つはｐＨ感受性（ｐＫａ）である。ｐＫａは、蛍光強度が最大値の５０％の値を示すときのｐＨの値に等しい。ほとんどのＧＰＦはｐＨ（プロトン）に対して感受性を示し、酸性条件では蛍光強度が急速に低下する。野生型のＧＦＰではｐＨ５．５〜１２の範囲で蛍光を観察できるが、ｐＨ５．５以下では急速に蛍光を失う。酸性側での蛍光活性の失活は、プロトンによる吸光度（モル吸光係数）の低下と、量子収率の低下が考えられるが、ＧＦＰに人為的なアミノ酸の変異を施すことによって様々なｐＨ感受性をもつ改変型が開発されてきた。
【０００８】
中性付近でイメージングを行う場合、細胞内ｐＨの変化による蛍光量の変化の影響を防ぐため、一般にｐＫａが６以下のＧＦＰが用いられる。ゴルジ体や分泌小胞などの酸性オルガネラのイメージングを行う場合には、ｐＫａが更に低い改変ＧＦＰを使わないと定量的な測定ができない。ｐＫａの低いｐＨ非感受性のＧＦＰとしては、ＧＦＰｕｖやＥＣＦＰ（クロンテック社）が用いられることが多い。
【０００９】
一方、ｐＨ感受性によって、ＧＦＰをｐＨセンサーとして利用することができる。ＧＦＰは、タンパク質であるため、低分子有機化合物から成るｐＨ指示薬（ＢＣＥＣＦ、ＳＮＡＲＦ等）とは異なり、移行シグナルペプチド等と融合させることができ、細胞内のオルガネラに局在させることが可能である。そのため、細胞質や核以外にも、ゴルジ体、小胞体、ミトコンドリア等の細胞内小器官でのｐＨ動態が、様々なｐＫａを示す改変ＧＦＰを用いて調べられている。
【００１０】
例えば、非特許文献１では、ｐＨ依存的にアルカリ性側に蛍光活性を持つＥＧＦＰおよびＥＹＦＰのそれぞれに、ミトコンドリア移行シグナル（ｃｏｘＩＶ；  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ＩＶ）またはゴルジ体移行シグナル（ＧＴ；ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を融合させたベクターをＨｅＬａ細胞に導入し、融合タンパク質を発現させて、ミトコンドリアまたはゴルジ体に局在したＥＧＦＰおよびＥＹＦＰの蛍光強度の変化を、各種刺激に応答したｐＨの変化として捉えている。また、ＧＴ−ＥＹＦＰ、および、ｐＨによる蛍光強度変化の少ないＥＣＦＰにＧＴを融合させたＧＴ−ＣＦＰを用い、ゴルジ体におけるｐＨの変化をＧＴ−ＥＹＦＰおよびＧＴ−ＥＣＦＰの蛍光強度の比によっても計測している。
【００１１】
また、非特許文献２では、オワンクラゲ由来のＧＦＰを改変することで、ｐＨ依存的に励起スペクトルが変化するＧＦＰを作製し、２波長励起による１波長の蛍光強度を測定し、それぞれの波長で励起したときの蛍光強度の比から細胞内のｐＨを測定している。しかしながら、当該ＧＦＰは、ｐＨによって蛍光スペクトルが変化するものではない。
【００１２】
このような従来の蛍光タンパク質では、ｐＨ感受性を利用して、細胞内および細胞内小器官のｐＨ変化を測定しようとする場合、１波長で励起し１波長の蛍光強度をモニターする。この方法では、ｐＨの変化を蛍光強度の変化として捉えるため、異なった実験系での数値データを互いに比較することは困難である。
【００１３】
また、ｐＨ感受性を持つ従来の蛍光タンパク質は、アルカリ性側に蛍光活性を有し、酸性側での蛍光強度は極めて低い。そのため、酸性側からアルカリ性側まで広範囲にカバーすることは難しく、特に酸性側で精度よく測定するには問題がある。
【００１４】
さらに、非特許文献１で行われているように、ｐＨ感受性の異なる２種類の蛍光タンパク質を用い、それぞれの蛍光強度の比からｐＨを求めることも可能であるが、両者とも酸性側での蛍光強度が低いため、比をとることによって酸性側での精度が著しく向上するわけではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Llopis et al (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 6803-6808.
【非特許文献２】Miesenbock et al (1998) Nature 394: 192-195.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の目的は、アルカリ性側だけでなく酸性側においても十分な蛍光活性を示す蛍光タンパク質、および、当該蛍光タンパク質を利用した精度の高い細胞機能の測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の実施態様によれば、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物に由来し、アルカリ性環境下および酸性環境下において、互いに蛍光ピーク波長の異なる蛍光活性をそれぞれ有する蛍光タンパク質が提供される。
【００１８】
また、そのような蛍光タンパク質を対象に導入し、前記蛍光タンパク質が発する蛍光に基づいて前記対象内部のｐＨを測定する方法が提供される。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、１種類の蛍光タンパク質の中に２種類の蛍光特性、すなわち、アルカリ性側にｐＨ依存性を示す蛍光特性と酸性側にｐＨ依存性を示す蛍光特性とを持ち合わせた刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物（例えば、ウミサボテン）由来の蛍光タンパク質が提供され、さらに、このような蛍光タンパク質を用いた、細胞内および細胞内小器官等の精度の高いｐＨ測定方法が提供される。ここにおいて、これらの２種類の蛍光特性は、それぞれ異なった蛍光波長を有している。
【００２０】
この互いに反対のｐＨ特性をもつ蛍光タンパク質を用いることによって、２波長励起２波長蛍光または１波長励起２波長蛍光の測定が可能となり、さらに、ｐＨの変化を相対的な蛍光強度の比として計測することが可能となる。そのため、異なった実験条件下における蛍光強度の絶対的な差異をキャンセルでき、種々のデータを互いに比較することができる。また、アルカリ性側および酸性側の両方に蛍光活性を持つことにより、広範囲にｐＨを測定でき、さらに、酸性側での測定精度も確保できる。
【００２１】
また、このような性質を持つウミサボテン由来の蛍光タンパク質は、野生型の状態では多量体を形成するが、人為的にアミノ酸置換を施して単量体化することで、細胞内での凝集および細胞内移動における制限が抑制された変異体が提供される。
【００２２】
さらに、野生型のウミサボテン由来蛍光タンパク質は、蛍光発色団の形成が２５℃付近で最も高いが、人為的にアミノ酸置換を施すことで、哺乳細胞の培養等に適した温度（例えば３７℃付近）において蛍光発色団の形成の最適化され、強い蛍光を発する変異体が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】遺伝子クローニングによって得られたウミサボテン蛍光タンパク質のアミノ酸配列および塩基配列。
【図２ａ】３８８ｎｍで励起した場合のｐＨ５、７および９環境下でのウミサボテン蛍光タンパク質の蛍光スペクトル（横軸：波長（ｎｍ）、縦軸：蛍光強度（任意単位））。
【図２ｂ】４５０ｎｍで励起した場合のｐＨ５、７および９環境下でのウミサボテン蛍光タンパク質の蛍光スペクトル（横軸：波長（ｎｍ）、縦軸：蛍光強度（任意単位））。
【図３】ｐＨ５、７および９環境下でのウミサボテン蛍光タンパク質の吸収スペクトル（横軸：波長（ｎｍ）、縦軸：吸光度（任意単位））。
【図４】ウミサボテン蛍光タンパク質の４５８ｎｍピークの蛍光（３８８ｎｍ励起）および５０７ｎｍピークの蛍光（４５０ｎｍ励起）におけるｐＨ感受性（横軸：ｐＨ、縦軸：蛍光強度（任意単位））。
【図５】ウミサボテン蛍光タンパク質の３８８ｎｍピークおよび４５０ｎｍピークの吸収におけるｐＨ感受性（横軸：ｐＨ、縦軸：吸光度）。
【図６】各ｐＨにおけるウミサボテン蛍光タンパク質の４５８ｎｍ蛍光（３８８ｎｍ励起）と５０７ｎｍ蛍光（４５０ｎｍ励起）との蛍光強度比（横軸：ｐＨ、縦軸：蛍光強度比）。
【図７】各ｐＨにおけるウミサボテン蛍光タンパク質の４５８ｎｍ蛍光と５０７ｎｍ蛍光と（ともに３８８ｎｍ励起）の蛍光強度比（横軸：ｐＨ、縦軸：蛍光強度比）。
【図８】野生型蛍光タンパク質および変異体蛍光タンパク質（１５４番目システインをセリンに置換）の会合状態をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより比較した図。
【図９】変異体蛍光タンパク質（３７℃で安定化）を大腸菌で発現させたときの蛍光を示す図。
【図１０】野生型蛍光タンパク質および変異体蛍光タンパク質（３７℃で安定化）の会合状態のゲルろ過法による分析結果。
【図１１】ウミサボテン蛍光タンパク質を発現させたＵ２ＯＳ細胞の明視野像（ａ）、ｐＨ＝７における蛍光像（ｂ）およびｐＨ＝４における蛍光像（ｃ）、ならびに、ｂおよびｃの蛍光スペクトル（ｄ）。
【図１２】ウミサボテン蛍光タンパク質を発現させた大腸菌がＲＡＷ細胞に貪食される状態を示す蛍光像。
【図１３】ＲＡＷ細胞に貪食される前後のウミサボテン蛍光タンパク質の蛍光スペクトルおよび蛍光強度比を示す表。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
＜蛍光タンパク質＞
本発明は、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物に由来し、アルカリ性環境下および酸性環境下において、互いに蛍光ピーク波長の異なる蛍光活性をそれぞれ有する蛍光タンパク質に関する。
【００２５】
すなわち、本発明の蛍光タンパク質は、ｐＨ＞７のいずれかのｐＨの環境下で蛍光を発し、さらに、ｐＨ＜７のいずれかのｐＨの環境下においても前記蛍光の波長とは異なる波長の蛍光を発することができる。このため、本発明の蛍光タンパク質は、環境中のｐＨの指標として利用することができる。特に、本発明の蛍光タンパク質は、酸性環境下においても十分な強度の蛍光を発生することができるため、従来の蛍光タンパク質と比較して精度の高いｐＨの指標となる。
【００２６】
また、本発明の蛍光タンパク質は、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物に由来する。例えば、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属すカベルヌラリア・オベサ（Ｃａｖｅｒｎｕｌａｒｉａ  ｏｂｅｓａ）（和名：ウミサボテン）に由来する。したがって、未だ分類されていない生物または未発見の生物であっても、それが後に刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属すとされ、且つ、それから得られる蛍光タンパク質が上述のような二峰性の蛍光活性を持てば、本発明に含まれる。なお、ここにいう「由来する」とは、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物が有する野生型の蛍光タンパク質に加えて、その変異体をも含むことを意味する。
【００２７】
本発明の蛍光タンパク質の好ましい例は、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む蛍光タンパク質である。また、本発明の蛍光タンパク質の好ましい例は、これらの配列番号で示されるアミノ酸配列に変異を含むアミノ酸配列を含む蛍光タンパク質である。
【００２８】
＜野生型＞
図１には、このような蛍光タンパク質の一例のアミノ酸配列（配列番号１）および塩基配列（配列番号２）が示される。この蛍光タンパク質の遺伝子は、カベルヌラリア・オベサからクローニングされた。また、当該蛍光タンパク質は、通常、細胞内において二量体を形成する。
【００２９】
図２ａおよび図２ｂには、図１にアミノ酸配列を示した蛍光タンパク質の蛍光スペクトルが示される。図２ａは、当該蛍光タンパク質を、ｐＨ５、７および９の環境下において、３８８ｎｍの波長の光によって励起したときの蛍光スペクトルである。この場合、ｐＨを９から５へとシフトするほど、４５８ｎｍ付近のピークが大きくなる。特にｐＨ５では、５０６ｎｍ付近のピークも残っているものの、それよりも強い強度で４５８ｎｍのピークが生じている。一方、図２ｂは、当該蛍光タンパク質を、ｐＨ５、７および９の環境下において、４５０ｎｍの波長の光によって励起したときの蛍光スペクトルである。この場合、ｐＨを５から９へとシフトするほど、５０６ｎｍ付近のピークが大きくなる。特に、ｐＨ９では、５０６ｎｍ付近に単一のピークが生じる。これらのことから、当該蛍光タンパク質は、酸性側において４５８ｎｍ付近に最大のピークを持つ蛍光を発し、アルカリ性側において５０６ｎｍ付近にピークを持つ蛍光を発することがわかる。
【００３０】
図３には、図１にアミノ酸配列を示した蛍光タンパク質の、ｐＨ５、７および９の環境下における吸収スペクトルが示される。この図から、当該蛍光タンパク質は、ｐＨ７および９では４９８ｎｍ付近に主な吸収ピークを持ち、ｐＨ５では、３８８ｎｍ付近に最大の吸収ピークを持ち、４９８ｎｍ付近にも吸収ピークを持つことがわかる。
【００３１】
図４および図５には、図１にアミノ酸配列を示した蛍光タンパク質の蛍光および吸収のｐＨ感受性が示される。
【００３２】
図４は、横軸をｐＨ、縦軸を蛍光強度として、ｐＨの変化と４５８ｎｍ付近または５０７ｎｍ付近の蛍光強度の変化との関係を示している。なお、４５８ｎｍ付近の蛍光強度は３８８ｎｍ付近の励起光を用いて測定し、５０７ｎｍ付近の蛍光強度は４５０ｎｍ付近の蛍光強度を用いて測定した。この図から、５０７ｎｍ付近の蛍光ピークはアルカリ性側に活性を持ち、４５８ｎｍ付近の蛍光ピークは酸性側に活性を持つことがわかる。このとき、５０７ｎｍ付近の蛍光ピークにおけるｐＫａ（すなわち、蛍光強度が、最大値の５０％となるｐＨ）は６．５であり、４５８ｎｍ付近の蛍光ピークにおけるｐＫａは６．０である。すなわち、５０７ｎｍ付近の蛍光は、ｐＨ６．５よりもアルカリ性側において最大値の５０％を超える蛍光強度を示し、一方、４５８ｎｍ付近の蛍光は、ｐＨ６．０よりも酸性側において最大値の５０％を超える蛍光強度を示す。このことから、これらの蛍光強度のピークは適度に分離していることがわかる。
【００３３】
図５は、横軸をｐＨ、縦軸を吸光度として、ｐＨの変化と３８８ｎｍ付近または４９８ｎｍ付近の励起光の吸収の変化との関係を示している。この図から、４９８ｎｍ付近の励起光はアルカリ性側で吸収され、３８８ｎｍ付近の励起光は酸性側で吸収されることがわかる。
【００３４】
また、図６および図７には、各ｐＨにおける、４５８ｎｍ付近の蛍光強度と５０７ｎｍ付近の蛍光強度との比が示される。図６は、２つの励起光を用いた場合、すなわち、３８８ｎｍ付近の励起光を用いて４５８ｎｍ付近の蛍光を検出し、４５０ｎｍ付近の励起光を用いて５０７ｎｍ付近の蛍光を検出した場合である。一方、図７は、１つの励起光を用いた場合、すなわち、３８８ｎｍ付近の励起光を用いて４５８ｎｍ付近および５０７ｎｍ付近の蛍光を検出した場合である。２励起光を用いる場合（図６）、ｐＨ６付近を境に、アルカリ性側で５０７ｎｍ／４５８ｎｍの比が高くなり、酸性側で４５８ｎｍ／５０７ｎｍの比が高くなることがわかる。一方、１励起光を用いる場合（図７）、ｐＨ５．５付近を境に、アルカリ性側で５０６ｎｍ／４５８ｎｍの比が高くなり、酸性側で４５８ｎｍ／５０６ｎｍの比が高くなることがわかる。
【００３５】
なお、一般に、独立した実験系で蛍光タンパク質の蛍光活性を測定する場合、測定条件を極力同一にしたとしても、検出される蛍光強度の値は変動する可能性がある。例えば、使用する励起光源の状態等により、検出される蛍光強度の絶対値は変動する。また、測定する細胞の状態や培養液の状態などによって、バッググラウンドが上昇または下降することがある。このような場合、それらの実験系から得られる蛍光強度の値同士を直接比較することは適当ではない。これに対し、単一の実験系にて２つの蛍光強度を取得し、その比をもとめれば、蛍光強度の値の変動をキャンセルすることができ、同一条件の下で得られた比は、実験系間でほぼ一定となると考えられる。この点で、図６および７に示されるグラフは、蛍光強度比の検量線として使用することができる。
【００３６】
＜変異体＞
また、本発明の蛍光タンパク質は、野生型のウミサボテン蛍光タンパク質の様々な変異体であってもよい。当該変異体は、アルカリ性環境下および酸性環境下において、互いに蛍光ピーク波長の異なる蛍光活性をそれぞれ有するという特徴を維持する限りにおいて、どのような変異体であってもよい。ここにおいて、変異体とは、野生型蛍光タンパク質のアミノ酸配列に変異（例えば、アミノ酸の置換、欠失および／または付加等）が生じた蛍光タンパク質を指す。この変異とは、野生型蛍光タンパク質のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸の変異であり、好ましくは、野生型蛍光タンパク質のアミノ酸配列の１から２０のアミノ酸の変異、１から１５のアミノ酸の変異、１から１０のアミノ酸の変異または１から５のアミノ酸の変異である。好ましくは、当該変異体のアミノ酸配列は、野生型蛍光タンパク質のアミノ酸配列との間で７５％以上、８０％以上、８５%以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の相同性を有する。
【００３７】
また、本発明の蛍光タンパク質は、上述のような二峰性の蛍光活性以外の特徴を変化させた変異体を含む。特に、そのような変異は、蛍光タンパク質としての操作性を向上させる変異であることが好ましい。
【００３８】
例えば、本発明の蛍光タンパク質には、野生型よりも強度の高い蛍光を発することができる変異体が含まれる。この変異体は、感度の低い測定システムを使用する場合や、タンパク質の発現が弱い細胞にて測定する場合においても、十分な蛍光強度を提供することができる。このような変異体は、当該分野の従来の方法を使用して取得することができ、例えば、野生型の蛍光タンパク質をコードする核酸にランダムに変異を導入した後、それを大腸菌等に発現させ、励起光を照射し、野生型蛍光タンパク質を発現する株よりも強い蛍光を発する株を選択することで取得できる。このような変異体の例は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質である。この蛍光タンパク質は、図１に示されるアミノ酸配列の１５４座位のシステインがアルギニンに置換されたものである。この蛍光タンパク質は、二量体を形成する性質は維持されているが、野生型と比較して蛍光強度が向上している。
【００３９】
また、本発明の蛍光タンパク質として、細胞内で単量体として存在できる変異体が含まれる。蛍光タンパク質が二量体を形成する場合、細胞内で凝集を生じたり、細胞内の移動が阻害されたりすることがある。単量体化することによって、そのような問題を回避することができる。特に、蛍光タンパク質に別のタンパク質を融合させる場合、この別のタンパク質の本来の機能に対する影響を最小化することができる。このような単量体化された変異体は、野生型蛍光タンパク質の遺伝子にランダムに変異を導入した後、そのような候補変異体を含むライブラリーから、単量体化され且つ蛍光活性を失っていないものをスクリーニングすることで取得することができる。あるいは、蛍光タンパク質の二量体形成に寄与する可能性が高いアミノ酸に変異を入れた後、単量体化され且つ蛍光活性を失っていないことを確認することで取得することができる。このような単量体化された変異体の例は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質である。当該蛍光タンパク質は、図１に示されるアミノ酸配列の１５４座位のシステインがセリンに置換されたものである。この蛍光タンパク質は、図８に示されるように二量体を形成せず単量体で存在する（右レーンが当該変異体、２量体のバンドが消失している）。
【００４０】
また、本発明の蛍光タンパク質として、特定の条件の下で安定性の高い変異体が含まれる。そのようなタンパク質には、例えば、測定対象となる細胞の培養に適した温度の下で蛍光発色団の形成効率が高い変異体が含まれる。野生型の蛍光タンパク質はウミサボテン科の生物に由来するため、蛍光タンパク質は当該生物の生活環境において最も安定的である可能性が高い。その生活環境における温度等の条件が実験条件と大きく異なる場合、蛍光タンパク質の安定性が損なわれる可能性がある。したがって、特に実験で使用する条件の下で安定性の高い蛍光タンパク質の変異体を取得することは精度の高い測定を行う上で利点がある。このような変異体は、図１にアミノ酸配列が示される野生型に対して、または、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する単量体化した変異体に対してランダムに変異を入れた後、それらを大腸菌等に発現させ、特定の条件下で所望の安定性を示す変異体を選択することで取得できる。
【００４１】
このような変異体のより具体的な例は、哺乳細胞の培養に適した温度（例えば３７℃付近）において野生型の蛍光タンパク質と比較して蛍光強度の強い変異体である。この一例は、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質である。当該蛍光タンパク質は、図１に示されるアミノ酸配列の１２６座位のアスパラギンがチロシンに置換され、１５４座位のシステインがセリンに置換され、および１６６座位のチロシンがフェニルアラニンに置換されたものである。また別の例は、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質である。当該蛍光タンパク質は、図１に示されるアミノ酸配列の１２９座位のセリンがグリシンに置換され、１５４座位のシステインがセリンに置換され、１５６座位のアスパラギン酸がグリシンに置換され、２０４座位のリジンがイソロイシンに置換され、および、２０９座位のアスパラギンがチロシンに置換されたものである。これら２つの変異体は、上述の単量体化された変異体と同様に１５４座位のシステインがセリンに置換された変異を含むため単量体で存在する。
【００４２】
＜核酸＞
本発明は、さらに、上述したような野生型蛍光タンパク質または変異体蛍光タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸に関する。このような塩基配列は、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物に由来する塩基配列であってよい。ここにおける「由来する」とは、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物が本来有する野生型の塩基配列に加えて、そこに変異が生じた塩基配列をも含むことを意味する。ここにおける変異とは、塩基配列中の特定の塩基の置換、欠失および／または付加等を指す。塩基配列の変異には、コードされるアミノ酸配列に変化を生じさせない変異をも含む。また、核酸とは、特に、ＤＮＡまたはＲＮＡを指す。
【００４３】
本発明の核酸の好ましい例は、ウミサボテン由来の野生型蛍光タンパク質をコードする配列番号２の塩基配列を含む核酸、当該野生型タンパク質よりも蛍光強度が増大した変異体（Ｃ１５４Ｒ）をコードする配列番号７の塩基配列を含む核酸、当該野生型蛍光タンパク質を単量体化（Ｃ１５４Ｓ）した変異体をコードする配列番号８の塩基配列を含む核酸、当該野生型蛍光タンパク質を単量体化し、且つ、哺乳細胞の培養に適した温度での安定性を増大させた変異体（Ｎ１２６Ｙ、Ｃ１５４Ｓ、Ｙ１６６Ｆ）（Ｓ１２９Ｇ、Ｃ１５４Ｓ、Ｄ１５６Ｇ、Ｋ２０４Ｉ、Ｎ２０９Ｙ）をコードする配列番号９または配列番号１０の塩基配列を含む核酸を含む。
【００４４】
また、本発明は、これらの核酸を含むベクターを含む。当該ベクターには、蛍光タンパク質をコードする核酸以外に、発現を調節するための配列またはマーカー遺伝子の配列を含む核酸等を含んでよい。
【００４５】
＜ｐＨ測定方法＞
また本発明は、本発明に係る蛍光タンパク質を対象に導入し、前記蛍光タンパク質が発する蛍光に基づいて前記対象内部のｐＨを測定する方法に関する。
【００４６】
すなわち、本発明の方法では、対象の内部に蛍光タンパク質を導入した後、励起光を照射して蛍光タンパク質が発する蛍光を検出し、当該蛍光の波長に基づいてｐＨを特定する。
【００４７】
ここにおいて、対象は、バクテリアの細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞または哺乳細胞といった細胞であってよい。さらに、対象は、組織または個体であってよい。細胞は、固定したものであってよいし、生きた状態のものであってよい。固定は、ホルマリン、メタノール等による一般的な方法で行うことができる。また、対象としての個体は、ヒトを除く個体であってよい。さらに、対象は、生物学実験で一般的に用いられる溶液であってよい。対象とする細胞、組織および個体に特に限定はなく、従来の取得方法によって得られるものを使用することができる。
【００４８】
対象に蛍光タンパク質を導入するために、細胞等へタンパク質を導入するための当該分野で一般的ないずれの方法を使用してもよい。例えば、対象が細胞である場合、マイクロインジェクション法によって蛍光タンパク質を直接細胞内へ注入してもよい。あるいは、蛍光タンパク質の遺伝子を含む発現ベクターを細胞に導入し、適切に発現させることで導入してもよい。
【００４９】
蛍光の検出は、特定の波長の蛍光を測定することが可能な、従来の方法または装置を使用して行うことができる。例えば、蛍光タンパク質を導入した細胞を蛍光顕微鏡下で観察することで行われる。そのような方法の１例において、蛍光の検出は、３８８ｎｍ励起−４５８ｎｍ蛍光および４９８ｎｍ励起−５０６ｎｍ蛍光に対応したフィルターセットの蛍光キューブを具備した倒立型蛍光顕微鏡において、４５８ｎｍおよび５０６ｎｍピークの試料の蛍光画像をＣＣＤカメラによって撮像する。撮像した画像内のｐＨ測定対象領域の蛍光強度を数値化しｐＨを求めることができる。このとき、細胞を種々の条件で刺激し、その後一定時間ごとに撮像することで、系時的に蛍光画像を取得することもできる。さらに、蛍光の測定は、４５８ｎｍ付近および５０６ｎｍ付近の波長のみでなく、蛍光スペクトルを測定することもできる。この場合、具体的には、顕微鏡のカメラポートに光ファイバーを接続し分光光度計にて測定対象領域の蛍光スペクトルを測定することで行うことができる。
【００５０】
また、ｐＨの算出は、各ｐＨに対する４５８ｎｍおよび５０６ｎｍの蛍光強度並びにそれらの比の値から作成した検量線をもとに行うことができる。検量線は、予め、各ｐＨについて４５８ｎｍの蛍光強度および５０６ｎｍの蛍光強度を測定し、それらの比を求めて図６または図７のようにグラフにプロットすることで作成できる。その後、測定したい対象において４５８ｎｍおよび５０６ｎｍの蛍光強度を測定し、その比を検量線に当てはめて、対象中のｐＨを特定することができる。ｐＨの特定を、蛍光強度の絶対値によらず、蛍光強度比によって行うことで、独立した実験から得られた蛍光強度値の間の変動をキャンセルすることが可能となり、測定のたびに検量線を作成する必要がなくなり、また、独立した実験から得られた結果同士を比較することが可能となる。
【００５１】
本発明の方法は、蛍光タンパク質を単独で対象に導入する場合に限定されず、蛍光タンパク質と、その蛍光タンパク質とは異なるタンパク質とから成る融合タンパク質を対象に導入する方法も含む。例えば、この「異なるタンパク質」を、対象とする細胞が本来発現しているタンパク質とする場合、そのタンパク質が本来局在している細胞内の部位に、本発明の融合タンパク質も局在することが予想される。その状態で、蛍光タンパク質の蛍光を検出することで、「異なるタンパク質」に応じた特定部位のｐＨを測定することが可能となる。「異なるタンパク質」は、測定したい部位や、実験の目的に応じて選択することが可能であり、例えば、ミトコンドリア移行シグナル（ｃｏｘＩＶ）、ゴルジ体移行シグナル（ＧＴ）を使用できる。
【００５２】
本発明のｐＨ測定方法では、蛍光タンパク質の励起を、波長の異なる２つの励起光を照射することで行うことができる。本発明のｐＨ測定方法は、波長の異なる２つの蛍光を測定することを含むが、その２つの蛍光にそれぞれ対応した、波長の異なる２つの励起光を使用することができる。例えば、図１の蛍光タンパク質を使用する場合、４５８ｎｍ付近および５０６ｎｍ付近の蛍光を発生させるために、３８８ｎｍ付近および４５０ｎｍ付近の励起光が使用することができる（図２ａおよび図２ｂ）。また、本発明のｐＨ測定方法では、蛍光タンパク質の励起を、単一波長の励起光を照射して行うことができる。例えば、図１の蛍光タンパク質を使用する場合、４５８ｎｍ付近および５０６ｎｍ付近の蛍光を発生させるために３８８ｎｍ付近の励起光を使用することができる（図２ａ）。単一の励起光を使用することにより、測定のための装置を単純化することが可能となる。
【実施例】
【００５３】
［実施例１：ウミサボテン蛍光タンパク遺伝子のクローニング］
ウミサボテン（Ｃａｖｅｒｎｕｌａｒｉａ  ｏｂｅｓａ）から蛍光タンパク質を抽出および精製し、その部分的なアミノ酸配列を読み取った後、当該配列をもとに遺伝子配列を決定することで蛍光タンパク質遺伝子のクローニングを行った。
【００５４】
蛍光タンパク質の抽出精製およびアミノ酸配列分析
島根近海で採取したウミサボテン１５個体（約２００ｇ）を５００ｍｌのＳＤＳ−グリシンバッファー中ですり潰し、蛍光活性を持つタンパクを含む可溶性タンパクを抽出した。遠心機を用いて残渣を取り除き、蛍光活性を持つタンパクを含む溶液を抽出した。この抽出溶液に、最終濃度が８０％になるように硫酸アンモニウムを加えて硫安沈殿を行った。具体的には、抽出溶液５００ｍｌに２６２ｇの硫酸アンモニウムを加えた。得られた沈殿を、５０ｍｌのトリスバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ  ＮａＣｌ）に再溶解させた。これに２倍量のエタノールを加え、タンパク質を再度沈殿させた。さらに、この沈殿にトリスバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ  ＮａＣｌ）を加えて再溶解させた。この溶液５０ｍｌを、十分量のトリスバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ  ＮａＣｌ）および透析膜２７／３２（三光純薬株式会社）を用いて透析した。透析後の溶液を、ＤＥＡＥ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を装着したクロマトグラフィーシステムＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いてイオン交換分離精製した。このイオン交換は、低塩濃度トリスバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ  ＮａＣｌ）で十分に平衡化した後、サンプルを添加し、高塩濃度トリスバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１Ｍ  ＮａＣｌ）でＮａＣｌ濃度を０．４Ｍまで上昇させることで行い、その結果、蛍光活性のあるフラクションを分取した。蛍光活性を持つタンパクを含むフラクションの選択は、ＵＶ／ＢＬＵＥ  ＣＯＮＶＥＲＴＥＲ  ＰＬＡＴＥ（ＵＶＰ）を用いて行った。得られたフラクションを、十分量のトリスバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ  ＮａＣｌ）および透析膜２７／３２（三光純薬株式会社）を用いて透析した。透析後の溶液を、限外ろ過アミコンウルトラ：分画分子量３０ｋＤａ（日本ミリポア株式会社）を用いて濃縮した。次に、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００  Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）およびトリスバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ  ＮａＣｌ）を用いてゲルろ過を行った。ゲルろ過後、得られた蛍光活性のあるフラクションをｍｏｎｏＱ  ５／５０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）によってイオン交換分離した。このイオン交換は、低塩濃度トリスバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ  ＮａＣｌ）で十分に平衡化した後、サンプルを添加し、高塩濃度トリスバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１Ｍ  ＮａＣｌ）でＮａＣｌ濃度を０．４Ｍまで上昇させることで行い、その結果、蛍光活性のあるフラクションを得た。この活性のあるフラクションを限外ろ過アミコンウルトラ：分画分子量３０ｋＤａ（日本ミリポア株式会社）を用いて濃縮し、その後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）およびトリスバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ  ＮａＣｌ）を用いてゲルろ過分離を行い、蛍光活性のあるフラクションを得た。このサンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離してアミノ酸配列を分析した。分析の結果、２２残基のアミノ酸配列（ＩＰＤ  ＹＦＶ  ＱＳＦ  ＰＥＧ  ＦＴＦ  ＥＲＴ  ＬＳＦ  Ｅ：配列番号１１）を決定することができた。
【００５５】
蛍光タンパク質遺伝子のクローニング
蛍光タンパク質遺伝子全長のクローニングのために、３’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲを下記のとおり実施した。Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄ法（以下、ＲＡＣＥと略す）により、蛍光タンパク質遺伝子をクローニングするための混合プライマーを作成した。アミノ酸配列解析によって得られたアミノ酸配列ＩＰＤ  ＹＦＶ  ＱＳＦ  ＰＥＧ  ＦＴＦ  ＥＲＴ  ＬＳＦ  Ｅ（配列番号１１）のうち、コドンの塩基組み合わせが少ないＩＰＤＹＦＶおよびＥＧＦＴＦＥＲのアミノ酸領域に注目した。これらのアミノ酸領域をコードする塩基配列を予測し、３’末端ＲＡＣＥ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下ＰＣＲと略す）に用いる蛍光タンパク質特異的混合プライマー（合計１２種類）を以下のように作成した。ＩＰＤＹＦＶアミノ酸領域に結合するプライマーとして、ＣＯＧＦＰ−ＴＴＴ（５’−ＡＴＨ  ＣＣＮ  ＧＡＴ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＧＴ−３’）（配列番号１２）、ＣＯＧＦＰ−ＴＴＣ（５’−ＡＴＨ  ＣＣＮ  ＧＡＴ  ＴＡＴ  ＴＴＣ  ＧＴ−３’）（配列番号１３）、ＣＯＧＦＰ−ＴＣＴ（５’−ＡＴＨ  ＣＣＮ  ＧＡＴ  ＴＡＣ  ＴＴＴ  ＧＴ−３’）（配列番号１４）、ＣＯＧＦＰ−ＴＣＣ（５’−ＡＴＨ  ＣＣＮ  ＧＡＴ  ＴＡＣ  ＴＴＣ  ＧＴ−３’）（配列番号１５）、ＣＯＧＦＰ−ＣＴＴ（５’−ＡＴＨ  ＣＣＮ  ＧＡＣ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＧＴ−３’）（配列番号１６）、ＣＯＧＦＰ−ＣＴＣ（５’−ＡＴＨ  ＣＣＮ  ＧＡＣ  ＴＡＴ  ＴＴＣ  ＧＴ−３’）（配列番号１７）、ＣＯＧＦＰ−ＣＣＴ（５’−ＡＴＨ  ＣＣＮ  ＧＡＣ  ＴＡＣ  ＴＴＴ  ＧＴ−３’）（配列番号１８）およびＣＯＧＦＰ−ＣＣＣ（５’−ＡＴＨ  ＣＣＮ  ＧＡＣ  ＴＡＣ  ＴＴＣ  ＧＴ−３’）（配列番号１９）を作成し、ならびに、ＥＧＦＴＦＥＲアミノ酸領域に結合するプライマーとして、ＣＯＧＦＰ−ＡＴＴＡＡ（５’−ＧＡＡ  ＧＧＮ  ＴＴＴ  ＡＣＮ  ＴＴＴ  ＧＡＡ  ＡＧ−３’）（配列番号２０）、ＣＯＧＦＰ−ＡＣＣＡＡ（５’−ＧＡＡ  ＧＧＮ  ＴＴＣ  ＡＣＮ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＡＧ−３’）（配列番号２１）、ＣＯＧＦＰ−ＡＴＴＧＡ（５’−ＧＡＧ  ＧＧＮ  ＴＴＴ  ＡＣＮ  ＴＴＴ  ＧＡＧ  ＡＧ−３’）（配列番号２２）およびＣＯＧＦＰ−ＡＣＣＧＡ（５’−ＧＡＧ  ＧＧＮ  ＴＴＣ  ＡＣＮ  ＴＴＣ  ＧＡＧ  ＡＧ−３’）（配列番号２３）を作成した。プライマー中のＴ、ＨおよびＮは、混合塩基を示す。
【００５６】
完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（インビトロジェン）を用いて作成したウミサボテン完全長ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、蛍光タンパク質のアミノ酸配列から予測して作成した１２種類の特異的混合プライマーおよび３’末端特異的プライマーであるＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＡＡＣ  ＧＡＴ  ＡＣＧ  ＣＴＡ  ＣＧＴ  ＡＡＣ  Ｇ−３’）（配列番号２４）およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＧＣ  ＴＡＣ  ＧＴＡ  ＡＣＧ  ＧＣＡ  ＴＧＡ  ＣＡＧ  ＴＧ−３’）（配列番号２５）を用いて３’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲを行った。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  ＰｒｉｍｅｒおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒは、完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（インビトロジェン社）に含まれており、これを使用した。３’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲによって効果的に蛍光タンパク質遺伝子を増幅させるため、一度ＰＣＲによって増幅した遺伝子を鋳型とし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ポリメラーゼＥｘ−Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。
【００５７】
一度目のＰＣＲは、ＩＰＤＹＦＶアミノ酸領域で作成した８種類プライマー（ＣＯＧＦＰ−ＴＴＴ、ＣＯＧＦＰ−ＴＴＣ、ＣＯＧＦＰ−ＴＣＴ、ＣＯＧＦＰ−ＴＣＣ、ＣＯＧＦＰ−ＣＴＴ、ＣＯＧＦＰ−ＣＴＣ、ＣＯＧＦＰ−ＣＣＴ、ＣＯＧＦＰ−ＣＣＣ）のいずれかとＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  Ｐｒｉｍｅｒとの計８つのプライマー対で蛍光タンパク質遺伝子の増幅を行った。１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｍｇ２＋添加）を最終濃度等倍、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）を最終濃度各０．２ｍＭ、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を最終濃度０．０５Ｕ／μｌ、８種類のプライマーのうちの１つを最終濃度０．４μＭおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’Ｐｒｉｍｅｒを最終濃度０．４μＭとして２０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、ウミサボテン完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液を０．２μｌ加えた。ＰＣＲ反応条件として、最初に９４℃１分間の熱変性を行い、次に、９４℃３０秒、４５℃３０秒および７２℃２分のサイクルを３０回行い、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応溶液２μｌを１％トリス酢酸緩衝液（以下、ＴＡＥと略す）アガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。８つの反応溶液でわずかに遺伝子増幅が認められたため、このＰＣＲ反応溶液を鋳型としてｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ反応を実施した。
【００５８】
ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲは、ＥＧＦＴＦＥＲアミノ酸領域で作成した４種類プライマー（ＣＯＧＦＰ−ＡＴＴＡＡ、ＣＯＧＦＰ−ＡＣＣＡＡ、ＣＯＧＦＰ−ＡＴＴＧＡ、ＣＯＧＦＰ−ＡＣＣＧＡ）の何れかとＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒとの計４つのプライマー対で蛍光タンパク質遺伝子の増幅を行った。１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｍｇ２＋添加）を最終濃度等倍、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）を最終濃度各０．２ｍＭ、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を最終濃度０．０５Ｕ／μｌ、４種類のプライマーのうちの１つを最終濃度０．４μＭおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒを最終濃度０．４μＭとして１０μｌのｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ反応溶液を作製し、１度目のＰＣＲ反応溶液を鋳型として０．２μｌを加えた。ＰＣＲ反応条件として、最初に９４℃１分間の熱変性を行い、次に、９４℃３０秒、４５℃３０秒および７２℃２分のサイクルを３０回行い、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応溶液２μｌを１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。
【００５９】
その結果、１度目のＰＣＲ反応として、ＣＯＧＦＰ−ＴＴＣとＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて実施し、ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ反応として、得られたＰＣＲ反応溶液を鋳型としてＣＯＧＦＰ−ＡＣＣＡＡとＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて実施した場合に、顕著な遺伝子増幅を確認できた。この増幅した遺伝子の塩基配列を決定し、ウミサボテン蛍光タンパク質遺伝子のウミサボテン３’末端側の塩基配列（配列番号２６）とした。
【００６０】
蛍光タンパク質の５’末端クローニングのための５’−ＲＡＣＥを下記の通り行った。一連の３’−ＲＡＣＥ解析によって得られたウミサボテン蛍光タンパク質遺伝子の３’末端側の塩基配列をもとに、５’末端クローニングのための５’−ＲＡＣＥに用いるプライマーを作成した。作成した５’末端クローニング用のプライマーは、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ１（５’−ＧＣＴ  ＡＴＡ  ＧＣＣ  ＧＴＣ  ＴＣＡ  ＴＧＴ  ＴＧＣ  ＴＣＧ  Ｔ−３’）（配列番号２７）、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ２（５’−ＡＧＣ  ＣＧＴ  ＣＴＣ  ＡＴＧ  ＴＴＧ  ＣＴＣ  ＧＴＡ  ＧＴＡ  Ｇ−３’）（配列番号２８）およびＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ３（５’−ＡＴＧ  ＴＴＧ  ＣＴＣ  ＧＴＡ  ＧＴＡ  ＧＴＴ  ＧＣＣ  ＴＴＣ  ＣＴＣ  ＧＡＣ−３’）（配列番号２９）の３種類である。ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ１、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ２、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ３の順で５’末端に近い位置に結合し、順次ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ反応のプライマーとして用いる。
【００６１】
完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒを用いて作成したウミサボテン完全長ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、３種類の５’末端クローニング用のプライマーならびに５’末端特異的プライマーであるＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’  Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＧＡ  ＣＴＧ  ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＧＡＧ  ＧＡＣ  ＡＣＴ  ＧＡ−３’）（配列番号３０）およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’  Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＡ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＧＡＧ  ＴＡ−３’）（配列番号３１）を用いて、５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲを行った。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’  ＰｒｉｍｅｒおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’  Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒは完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（インビトロジェン社）に含まれており、これを使用した。５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲによって効果的に蛍光タンパク質遺伝子を増幅させるため、一度ＰＣＲによって増幅した遺伝子を鋳型にし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。ＰＣＲにはポリメラーゼＥｘ−Ｔａｑを用いて、マニュアルに従って実施した。
【００６２】
一度目の５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲとして、３’−ＲＡＣＥで増幅した遺伝子の塩基配列をもとに作成したＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ１とＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて、蛍光タンパク質遺伝子を増幅した。１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｍｇ２＋添加）を最終濃度等倍とし、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）を最終濃度各０．２ｍＭとし、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を最終濃度０．０５Ｕ／μｌとし、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ１を最終濃度０．４μＭとし、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’  Ｐｒｉｍｅｒを最終濃度０．４μＭとして、１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、ウミサボテン完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液を０．２μｌを加えた。ＰＣＲ反応条件として、最初に９４℃１分間の熱変性を行い、次に、９４℃３０秒、４５℃３０秒および７２℃２分のサイクルを３０回行い、最後に、７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応溶液２μｌを、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。この５’−ＲＡＣＥでわずかに遺伝子増幅が認められたため、このＰＣＲ反応溶液を鋳型としてｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ反応を実施した。
【００６３】
ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲとして、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ２とＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’  Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて蛍光タンパク質ＧＦＰ遺伝子を増幅した。１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｍｇ２＋添加）を最終濃度等倍とし、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）を最終濃度各０．２ｍＭとし、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を最終濃度０．０５Ｕ／μｌとし、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ２を最終濃度０．４μＭとし、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’  Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒを最終濃度０．４μＭとして、１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、１度目のＰＣＲ反応溶液を鋳型として０．２μｌを加えた。ＰＣＲ反応条件として、最初に９４℃１分間の熱変性を行い、次に、９４℃３０秒、４５℃３０秒および７２℃２分のサイクルを３０回行い、最後に、７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応溶液２μｌを、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。
【００６４】
その結果、１度目のＰＣＲ反応として、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ１とＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’  Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて実施し、ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ反応として、得られたＰＣＲ反応溶液を鋳型としてＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ２とＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’  Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて実施した場合に、顕著な遺伝子増幅を確認できた。しかし、非特異的な複数の遺伝子の増幅が認められたため、このＰＣＲ反応溶液を鋳型として、異なるプライマー対を用いて再度ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ反応を実施した。
【００６５】
二度目のｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲとして、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ３とＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’  Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて、ＧＦＰ遺伝子を増幅した。１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｍｇ２＋添加）を最終濃度等倍とし、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）を最終濃度各０．２ｍＭとし、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を最終濃度０．０５Ｕ／μｌとし、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ３を最終濃度０．４μＭとし、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’  Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒを最終濃度０．４μＭとして、２０μｌのｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ反応溶液を作製し、１度目のｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ反応溶液を鋳型として０．４μｌを加えた。ＰＣＲ反応条件として、最初に９４℃１分間の熱変性を行い、次に、９４℃３０秒、４５℃３０秒および７２℃２分のサイクルを３０回行い、最後に、７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応溶液２μｌを、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。その結果、一連のｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ反応で顕著な遺伝子増幅を確認できた。この増幅した遺伝子の塩基配列を決定し、ウミサボテン蛍光タンパク質遺伝子の５’末端側の塩基配列（配列番号３２）とした。
【００６６】
次に、蛍光タンパク質遺伝子の完全長の増幅を下記のとおりに行った。上述した３’−ＲＡＣＥおよび５’−ＲＡＣＥ解析によって得られたウミサボテン由来の蛍光タンパク質遺伝子の５’末端側の塩基配列をもとに、完全長蛍光タンパク質遺伝子クローニングのための３’−ＲＡＣＥに用いるプライマーを作成した。作成した完全長ＧＦＰ遺伝子クローニング用のプライマーは、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ３（５’−ＡＴＴ  ＴＡＧ  ＧＴＧ  ＧＣＴ  ＧＣＧ  ＴＡＣ  ＡＧ−３’）（配列番号３３）、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ４（５’−ＡＴＴ  ＴＡＧ  ＧＴＧ  ＧＣＴ  ＧＣＧ  ＴＡＣ  ＡＧＴ  ＴＡＡ  ＣＡＣ−３’）（配列番号３４）の２種類である。ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ３、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ４の順で３’末端に近い位置に結合する。ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ４をｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ反応のプライマーとして用いる。
【００６７】
完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒを用いて作成したウミサボテン完全長ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、２種類の完全長蛍光タンパク質遺伝子クローニング用のプライマーならびに３’末端特異的プライマーであるＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＡＡＣ  ＧＡＴ  ＡＣＧ  ＣＴＡ  ＣＧＴ  ＡＡＣ  Ｇ−３’）（配列番号２４）およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＧＣ  ＴＡＣ  ＧＴＡ  ＡＣＧ  ＧＣＡ  ＴＧＡ  ＣＡＧ  ＴＧ−３’）（配列番号２５）を用いて、３’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲを行った。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  ＰｒｉｍｅｒおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒは、完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（インビトロジェン社）に含まれているので、これを使用した。３’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲによって効果的に完全長蛍光タンパク質遺伝子を増幅させるため、一度ＰＣＲによって増幅した遺伝子を鋳型にし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。ＰＣＲにはポリメラーゼＥｘ−Ｔａｑを用いてマニュアルに従って実施した。
【００６８】
一度目のＰＣＲとして、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ３とＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて蛍光タンパク質遺伝子を増幅した。１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｍｇ２＋添加）を最終濃度等倍とし、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）を最終濃度各０．２ｍＭとし、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を最終濃度０．０５Ｕ／μｌとし、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ３を最終濃度０．４μＭとし、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  Ｐｒｉｍｅｒを最終濃度０．４μＭとして、１０μｌのｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ反応溶液を作製し、ウミサボテン完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液を０．２μｌを加えた。ＰＣＲ反応条件として、最初に９４℃１分間の熱変性を行い、次に、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃１分のサイクルを３０回行い、最後に、７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応溶液２μｌを１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。一度目の５’−ＲＡＣＥでわずかに遺伝子増幅が認められたため、このＰＣＲ反応溶液を鋳型としてｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ反応を実施した。
【００６９】
ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲとしてＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ４とＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’  Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて、蛍光タンパク質遺伝子を増幅した。１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｍｇ２＋添加）を最終濃度等倍とし、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）を最終濃度各０．２ｍＭとし、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を最終濃度０．０５Ｕ／μｌとし、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ４を最終濃度０．４μＭとし、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’  Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒを最終濃度０．４μＭとして、１０μｌのｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ反応溶液を作製し、１度目のＰＣＲ反応溶液を鋳型として０．２μｌを加えた。ＰＣＲ反応条件として、最初に９４℃１分間の熱変性を行い、次に、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃１分のサイクルを３０回行い、最後に、７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応溶液２μｌを１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。その結果、顕著な遺伝子増幅を確認できた。この増幅した遺伝子の塩基配列を決定して、完全長ウミサボテン蛍光タンパク質遺伝子の５’末端側の塩基配列（配列番号３５）とした。
【００７０】
得られた完全長ウミサボテン蛍光タンパク質の塩基配列から、配列情報解析ソフトウェアＤＮＡＳＩＳ  Ｐｒｏを用いてウミサボテンＧＦＰ遺伝子のオープンリーディングフレームの塩基配列を予想した（配列番号２）。さらに、このオープンリーディングフレームを翻訳してウミサボテン蛍光タンパク質のアミノ酸配列を得た（配列番号１）。このアミノ酸配列は、ウミサボテンから精製し、アミノ酸分析によって得られた２２残基の配列（配列番号１１）を完全一致の状態で含むことから、ウミサボテンに由来する蛍光タンパク質遺伝子であると決定した。この遺伝子をｐＲＳＥＴベクター（インビトロジェン）に組み込み、大腸菌にトランスフォーメーションし、ＵＶ／ＢＬＵＥ  ＣＯＮＶＥＲＴＥＲ  ＰＬＡＴＥ（ＵＶＰ）を用いて観察したところ顕著な蛍光活性が示された。
【００７１】
［実施例２：ウミサボテン蛍光タンパク質の蛍光強度の増強］
野生型ウミサボテン蛍光タンパク質の遺伝子にランダムに変異を導入し、それらを大腸菌に発現させて、野生型よりも強い蛍光強度を示す変異体をスクリーニングした。
【００７２】
変異の導入には、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  ＩＩ  ＥＺＣｌｏｎｅ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いた。ｐＲＳＥＴ−Ａ（インビトロジェン社）に野生型のウミサボテン蛍光タンパク質遺伝子がクローニングされたプラスミドを鋳型とし、Ｐｉｒｍｅｒ１（ＡＴＧＡＧＴＡＴＴＣＣＡＧＡＧＡＡＴＴＣＧＧＧＣＴＴＡＡＣＡＧ）（配列番号３８）およびＰｒｉｍｅｒ２（ＴＣＡＴＧＧＴＴＴＡＧＣＴＡＴＧＧＣＣＧＴＣＴＣＡＴＧ）（配列番号３９）を加えて、キットに添付されているマニュアルに準じてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応後、１％アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、目的とするＰＣＲ産物を、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて精製した。精製後、マニュアルに準じてＰＣＲ反応を行い、３７℃にてＤｐｎＩで処理した後に、エタノール沈殿を行った。沈殿後、少量の蒸留水にＤＮＡを溶かして、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ社）を用いてエレクトロポレーション法にてＪＭ１０９（ＤＥ３）にトランスフォームした。トランスフォーム後の大腸菌を、２５ｃｍ四方のＬＢ（５０ｎｇ／ｍｌのアンピシリンを添加済み）プレートに播種して、３７℃で培養してコロニーを形成させた。コロニー形成後、ＵＶ／ＢＬＵＥ  ＣＯＮＶＥＲＴＥＲ  ＰＬＡＴＥ（ＵＶＰ）を使用して、野生型蛍光タンパク質を発現するコロニーと比べて、強い蛍光を発するコロニーを選択し、再度培養した。その後、それが保持するプラスミドの塩基配列を決定した（配列番号７）。
【００７３】
さらに、この塩基配列をアミノ酸配列に変換し（配列番号３）、野生型のアミノ酸配列と比較した結果、１５４番目のシステインがアルギニンに置換されていることがわかった。
【００７４】
［実施例３：ウミサボテン蛍光タンパク質の単量体化］
以下の方法によって、野生型蛍光タンパク質のアミノ酸配列の１５４番目のシステインをセリンに置換した。変異の導入には、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いた。ｐＲＳＥＴ−Ａ（インビトロジェン社）にウミサボテン蛍光タンパク質遺伝子をクローニングしたプラスミドを鋳型とし、Ｐｉｒｍｅｒ１（ＣＡＡＴＧＴＡＴＧＴＡＴＣＧＧＡＣＧＡＣＡＣＴＴＴＧＧ）（配列番号３６）およびＰｒｉｍｅｒ２（ＣＣＡＡＡＧＴＧＴＣＧＴＣＣＧＡＴＡＣＡＴＡＣＡＴＴＧ）（配列番号３７）を使用して、キットに添付されているマニュアルに準じてＰＣＲ反応を行った。反応後、３７度にてＤｐｎＩで処理し、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株にトランスフォームした。
【００７５】
トランスフォームされた菌を培養してベクターを取り出し、蛍光タンパク質遺伝子の塩基配列をシーケンサーによって読み取った。その結果、配列番号８の配列が得られ、狙い通りに変異が導入できたことが確認できた。この遺伝子から、１５４番目がセリンに置換された蛍光タンパク質（配列番号４）が発現する。
【００７６】
また、トランスフォーム後の大腸菌を、２８度にて培養した後、溶菌してライセートを作製した。これにＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを加え、熱を加えずにサンプルを調製して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果を図８に示す。図８から、野生型蛍光タンパク質（左レーン）では出現する２量体のバンドが、変異体蛍光タンパク質（右レーン）において消失していることがわかる。このことから、蛍光タンパク質が単量体化されたことが確認された。
【００７７】
［実施例４：ウミサボテン蛍光タンパク質の発色団形成温度の改変］
実施例３で得られた単量体化した変異体蛍光タンパク質に対してランダムに変異を導入し、３７℃において発色団形成が安定化する変異体をスクリーニングした。
【００７８】
変異の導入は、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  ＩＩ  ＥＺＣｌｏｎｅ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いた。ｐＲＳＥＴ−Ａ（インビトロジェン社）に単量体化変異体（１５４番目のシステインがセリンに置換）の遺伝子がクローニングされたプラスミドを鋳型とし、Ｐｉｒｍｅｒ１（ＡＴＧＡＧＴＡＴＴＣＣＡＧＡＧＡＡＴＴＣＧＧＧＣＴＴＡＡＣＡＧ）（配列番号３８）およびＰｒｉｍｅｒ２（ＴＣＡＴＧＧＴＴＴＡＧＣＴＡＴＧＧＣＣＧＴＣＴＣＡＴＧ）（配列番号３９）を加えて、キットに添付されているマニュアルに準じてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応後、１％アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、目的とするＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて精製した。精製後、マニュアルに準じてＰＣＲ反応を行い、３７℃にてＤｐｎＩで処理した後に、エタノール沈殿を行った。沈殿後、少量の蒸留水にＤＮＡを溶かして、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ社）を用いてエレクトロポレーション法にてＪＭ１０９（ＤＥ３）にトランスフォームした。トランスフォーム後の大腸菌を、２５ｃｍ四方のＬＢ（５０ｎｇ／ｍｌのアンピシリンを添加済み）プレートに播種して、３７℃で培養してコロニーを形成させた。コロニー形成後、ＵＶ／ＢＬＵＥ  ＣＯＮＶＥＲＴＥＲ  ＰＬＡＴＥ（ＵＶＰ）を使用して、野生型蛍光タンパク質を発現するコロニーと比べて、強い蛍光を発するコロニー（それぞれ変異体１および変異体２と名付ける）を２つ選択し、再度培養した。その後、それらが保持するプラスミドの塩基配列を決定した。それぞれの配列は配列番号９および配列番号１０に示される。
【００７９】
さらに、これらの塩基配列をアミノ酸配列に変換し（変異体１は配列番号５、変異体２は配列番号６）、野生型のアミノ酸配列と比較した。変異体１は、１２６番目のアスパラギンがチロシンに置換され、１５４番目のシステインがセリンに置換され、１６６番目のチロシンがフェニルアラニンに置換されていることがわかった。変異体２は、１２９番目のセリンがグリシンに置換され、１５４番目のシステインがセリンに置換され、１５６番目のアスパラギン酸がグリシンに置換され、２０４番目のリジンがイソロイシンに置換され、２０９番目のアスパラギンがチロシンに置換されていることがわかった。
【００８０】
また、変異体１および２の３７℃における発色団形成の安定性を、野生型蛍光タンパク質および単量体化蛍光タンパク質と比較した。ｐＲＳＥＴ−Ａ（インビトロジェン社）に、野生型遺伝子、実施例３で作製した単量体化変異体の遺伝子、変異体１の遺伝子および変異体２の遺伝子をそれぞれクローニングし、それぞれＪＭ１０９（ＤＥ３）株にトランスフォームした。これらの株をプレートに塗布し、３７℃で培養して蛍光タンパク質を発現させた。その状態をＵＶ／ＢＬＵＥ  ＣＯＮＶＥＲＴＥＲ  ＰＬＡＴＥ（ＵＶＰ）で観察して、画像を撮影した。図９は、それをモノクロで表した画像である。蛍光は、実際の画像では緑色の光として観察されたが、図９では白色で示され、白色が濃いほど、蛍光強度が高い。野生型および単量体化変異体と比較して、変異体１および２は非常に強い蛍光を発していることがわかる。特に、変異体１に比べて、変異体２のほうが強い蛍光を発していることがわかる。
【００８１】
次に、ゲルろ過クロマトグラフィーにて、蛍光タンパク質の会合状態を調べた。野生型蛍光タンパク質を発現する大腸菌および変異体２を発現する大腸菌から、それぞれ蛍光タンパク質を精製し解析した。その結果を図１０に示す。野生型では６６ｋＤａｌ付近にピークが得られ、一方、変異体２では３７ｋＤａｌ付近でピークが得られた。これらの結果は、野生型蛍光タンパク質が２量体を形成しているのに対し、変異体２の蛍光タンパク質が単量体を形成していることを示唆する。
【００８２】
［実施例５：固定細胞での細胞内ｐＨの測定］
固定細胞内において、野生型ウミサボテン蛍光タンパク質の蛍光を測定した。
【００８３】
哺乳細胞発現ベクターｐＣＤＡ３．１（インビトロジェン社）に、野生型ウミサボテン蛍光タンパク質のｃＤＮＡを組み込んだ。作製されたプラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロジェン社）を用いてＵ２ＯＳ細胞に導入した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００は取扱説明書に従って使用した。
【００８４】
そのＵ２ＯＳ細胞を一昼夜培養した後、３％中性ホルマリン固定法によって固定し、蛍光顕微鏡（オリンパス社製ＩＸ７０）にて明視野像を撮影した（図１１ａ）。その後、細胞をリン酸緩衝液（ｐＨ＝７）で洗浄し、ＩＢ励起用の蛍光キューブＮＩＢＡ（オリンパス社製：励起フィルター４７０−４９０ｎｍ、ダイクロイックミラー５０５ｎｍ、蛍光フィルター５１０−５５０ｎｍ）を使用して蛍光像を撮影した。図１１ｂは、それをモノクロで表した画像である。実際の画像において緑色で観察された蛍光は、図１１ｂでは白色で示される。次に、細胞を酢酸緩衝液（ｐＨ＝４）で洗浄し、Ｕ励起用蛍光キューブＷＵ（オリンパス社製：励起フィルター３３０−３８５ｎｍ、ダイクロイックミラー４００ｎｍ、蛍光フィルター４２０ｎｍロングパス）を使用して蛍光像を撮影した。図１１ｃは、それをモノクロで表した画像である。実際の画像において青色で観察された蛍光は、図１１ｃでは白色で示される。これらの画像から、本発明のウミサボテン蛍光タンパク質が、ホルマリン固定された細胞内においても蛍光を発生することができ、さらに、ｐＨに応じてその波長を変化させることが示された。
【００８５】
さらに、各ｐＨにおける蛍光スペクトルを計測した（図１１ｄ）。計測には浜松ホトニクス社製のマルチチャンネル検出器ＰＭＡ−１１を用いた。その結果、ｐＨ４では４７２ｎｍに、ｐＨ７では５０９ｎｍに最大波長を示すスペクトルが得られた。
【００８６】
［実施例６：貪食細胞におけるｐＨの測定］
生細胞内における野生型ウミサボテン蛍光タンパク質の蛍光を測定して細胞内のｐＨを推定した。
【００８７】
大腸菌発現ベクターｐＲＳＥＴ（インビトロジェン社）に野生型ウミサボテン蛍光タンパク質のｃＤＮＡを組み込んだ。作製されたプラスミドを大腸菌にトランスフォーメーションし、２５℃で培養して、野生型ウミサボテン蛍光タンパク質を大腸菌内で発現させた。この大腸菌を、マウス由来マクロファージＲＡＷ２６４．７細胞株の培養容器内に加えて、一昼夜培養した。なお、大腸菌はＲＡＷ細胞によって貪食された後、ＲＡＷ細胞内の酸性環境下にある細胞小器官リソソームで消化されることが一般に知られている。
【００８８】
蛍光顕微鏡観察を行う前に、培養液をリン酸緩衝液（ｐＨ＝７）で置換した。その後、大腸菌を貪食中のＲＡＷ細胞をＩＢ励起用の蛍光キューブＮＩＢＡ（オリンパス社製：励起フィルター４７０−４９０ｎｍ、ダイクロイックミラー５０５ｎｍ、蛍光フィルター５１０−５５０ｎｍ）を用いて撮影した。図１２の（ａ）は、それをモノクロで表した画像である。蛍光キューブＮＩＢＡを使用すると、主に緑色の蛍光のみを検出することができるが、図１２ａ中では、緑色の蛍光は白色で表される。さらに、Ｕ励起用の蛍光キューブＷＵ（オリンパス社製：励起フィルター３３０−３８５ｎｍ、ダイクロイックミラー４００ｎｍ、蛍光フィルター４２０ｎｍロングパス）を用いて撮影した。図１２の（ｂ）は、それをモノクロで表した画像である。蛍光キューブＷＵを使用すると、緑色および青色を含む４２０ｎｍ以上の蛍光を検出できるが、図１２ｂ中では、緑色および青色の蛍光は、ともに白色で表される。
【００８９】
図１２ａによれば、点在する光を観察することができるが、ＲＡＷ細胞の形を認識することはできない。観察されたこの光は、明視野像（図示せず）との比較から、ＲＡＷ細胞に貪食される前の培養液中に存在する大腸菌に由来する光であることがわかる。このことから、中性の培養液中に存在する大腸菌内の蛍光タンパク質は、緑色の蛍光を発していることがわかった。
【００９０】
図１２ｂに示すように、点在する光に加え、多数の光が集ってＲＡＷ細胞の形を形成している様子も観察された。点在する光は、図１２ａと同様に、貪食前の培養液中の大腸菌に由来する光である。一方、ＲＡＷ細胞の形を形成する光は、貪食されＲＡＷ細胞内のリソソームに取り込まれた大腸菌に由来する光である。ここで、実際の画像によれば、点在する光は緑色に、ＲＡＷ細胞の形を形成する光は青色に観察された。これらのことから、ウミサボテン蛍光タンパク質は、中性の培養液では緑色の蛍光を発するが、酸性のリソソーム内に移されることにより、青色の蛍光を発するようになることがわかった。
【００９１】
さらに、図１２ｂにおけるＲＡＷ細胞による貪食の前後における蛍光タンパク質の蛍光スペクトルを図１３に示す。この蛍光スペクトルから得られた４５８ｎｍおよび５０６ｎｍの蛍光強度に基づいて比を求め、それを図７に示される検量線に当てはめて培養液中およびリソソーム内のｐＨを推定した（図１３下表）。推定されたｐＨは、培養液中のｐＨおよびリソソーム内のｐＨをほぼ反映している。
【００９２】
以上の結果から、ウミサボテン蛍光タンパク質は、生きた異種細胞内においても中性環境下から酸性環境下へと移されることで、それが発する蛍光の波長を変化させることができることが示された。さらに、そのときの蛍光強度に基づいてウミサボテン蛍光タンパク質の存在する環境中のｐＨを良好に求めることができることが示された。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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