(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ヘパリンにＮＨＳ−基を導入してＮＨＳ−ヘパリンを形成する段階と、
ｂ）前記ＮＨＳ−ヘパリンとフィブリノーゲンを直接結合して、ヘパリンが結合したフィブリノーゲンを製造する段階と、
ｃ）自由フィブリノーゲンと前記段階ｂ）で製造されたヘパリンが結合したフィブリノーゲンを１．５：１〜５：１の重量比にて混合して、混合フィブリノーゲンを製造する段階と、
ｄ）前記段階ｃ）で製造された混合フィブリノーゲンにトロンビンを混合する段階と、
を備える、ヘパリンが結合したフィブリンゲルの製造方法。
【請求項２】
前記フィブリンゲルは注射可能なゲルであることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記フィブリノーゲンは哺乳類から由来したフィブリノーゲンであることを特徴とする請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記哺乳類はヒトであることを特徴とする請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記ヘパリンの分子量は１０００〜２００００であることを特徴とする請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項６】
前記段階ａ）の前記ＮＨＳ−ヘパリンは、ヘパリンとカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシ琥珀イミドとの反応によって製造されることを特徴とする請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項７】
前記段階ｂ）のヘパリンが結合したフィブリノーゲンの製造段階は、活性化したヘパリンのカルボキシ基とフィブリノーゲンの蛋白質に存在するアミノ基との反応によって達成されることを特徴とする請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項８】
ヘパリンが結合したフィブリノーゲンと、
ヘパリンが結合しなかった自由フィブリノーゲンと、
トロンビンと、
を備え、前記ヘパリンが結合したフィブリノーゲンは、ＮＨＳ−ヘパリンとフィブリノーゲンを直接結合したフィブリノーゲンであり、そして前記自由フィブリノーゲンと前記ヘパリンが結合したフィブリノーゲンとを１．５：１〜５：１の重量比で含むことを特徴とするヘパリン−結合フィブリンゲル製造用キット。
【請求項９】
ヘパリンに結合する成長因子蛋白質をさらに備えることを特徴とする請求項８に記載のヘパリン−結合フィブリンゲル製造用キット。
【請求項１０】
前記成長因子蛋白質は骨形成蛋白質(ｂｏｎｅ
ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＢＭＰ)、血管内皮成長因子(ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ)、変形成長因子(ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β、ＴＧＦ−β)、血小板誘導成長因子(ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＰＤＧＦ)および繊維芽細胞成長因子(ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ
ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ)で構成された群から選択される一つ以上の成長因子蛋白質であることを特徴とする請求項８または９に記載のヘパリン−結合フィブリンゲル製造用キット。
【請求項１１】
ヘパリンが結合したフィブリンゲルおよび一つ以上の成長因子蛋白質を含む成長因子蛋白質伝達体であって、前記ヘパリンが結合したフィブリンゲルは、ヘパリンが結合したフィブリノーゲンと、ヘパリンが結合しなかった自由フィブリノーゲンと、トロンビンとを含む混合物から製造され、前記ヘパリンが結合したフィブリノーゲンは、ＮＨＳ−ヘパリンとフィブリノーゲンを直接結合したフィブリノーゲンであり、そして前記自由フィブリノーゲンと前記ヘパリンが結合したフィブリノーゲンとを１．５：１〜５：１の重量比で含むことを特徴とする前記成長因子蛋白質伝達体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００８年４月２８日に出願した韓国特許出願第２００８−３９３２２および２００９年４月２４日に出願した第２００９−３５７７９の利益を請求し、その各開示の全体を参照のために本明細書に編入する。
【０００２】
本発明は損傷した組織および臓器の復元に焦点を合わせた生体組織工学分野、特に成長因子蛋白質の伝達に係る生体組織再生分野に関する。
【０００３】
より具体的には、本発明は成長因子蛋白質を含む注射可能な(ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ)ヘパリンが結合したフィブリンゲルの製造方法に関し、本発明では活性化したヘパリンをフィブリノーゲンと結合させてこれを自由(ｆｒｅｅ)フィブリノーゲンと混合して溶解させた後、これにトロンビンを混合させることによって注射可能なヘパリンが結合したフィブリンゲルの製造方法を開示する。
【０００４】
一方、本発明の方法によって製造されたヘパリンが結合したフィブリンゲルをヘパリンと親和性がある成長因子蛋白質と物理的に結合させた後、人体に注射して、長期間成長因子蛋白質を持続放出させることによって、骨、皮膚、血管、軟骨などの組織再生を促進する治療剤として使用できる。
【背景技術】
【０００５】
生体組織工学は、疾病または事故によって生体組織や臓器が損傷された場合において、損傷した組織および臓器の復元に焦点を合わせている研究分野である。これに係り、生体組織再生用支持体として注射可能なゲルを利用する方法が広く研究されているが、このように注射可能なゲルを利用する方法は、外科的手術なしに必要な部位に容易に注入することができるため、患者の回復期間、痛み、費用などを減少させることができる長所がある。前記注射可能なゲルとして現在までコラーゲンゲル、フィブリンゲル、アルギン酸ゲルなどが使用されて来た。特に、フィブリンゲルは患者自身の血液から得らえるため、免疫誘発などの問題が生じないことから、自家治療(ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ)用生体組織工学用支持体として大きく注目されている。
【０００６】
フィブリンは硬蛋白質の一種あり、血漿中のフィブリノーゲンに酵素トロンビンが作用してできる不溶性蛋白質である。即ち、フィブリンは常温でトロンビンの存在するフィブリノーゲンの酵素的重合反応によって、ゲル(ｇｅｌ)を形成する。このように形成されたフィブリンゲルは損傷した組織および臓器の復元に焦点を合わせた組織工学分野における重要な意義があり、特に成長因子蛋白質の伝達が容易であって、骨、皮膚血管、軟骨などの生体組織再生分野においてフィブリンゲルに係る多くの研究が進められている。
【０００７】
グリコサミノグリカンの一種のヘパリンは、硫酸基を多量含んで、高度に負電荷を帯びる性質のために特定種のヘパリン−結合性蛋白質と結合する親和性リガンドとして使用されうる。このような性質は主に蛋白質分離においてクロマトグラフィーに利用されることもあるが、最近、蛋白質製剤の運搬体に固定化されて、ヘパリン−結合性蛋白質を特異的に体内特定部位に運搬することにその応用可能性が注目されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、含有薬物の持続放出性が優秀な、ヘパリンが直接結合したフィブリンゲルの簡便な製造方法を提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、含有薬物の持続放出性が優秀な、ヘパリンが直接結合したフィブリンゲルを含む蛋白質伝達体およびそのようなフィブリンゲルの製造用キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
そこで、本発明者らはペプチドを使用せずに多量の成長因子蛋白質を含有できるフィブリンゲル組成物に対する研究を重ねた結果、ヘパリンを活性化させた後、これを直接フィブリノーゲンに結合させることによってヘパリンが直接結合したフィブリノーゲンを製造した。
【００１１】
また、このように製造されたヘパリンが直接結合されたフィブリノーゲンのみで重合架橋反応を行うと、ゲル状のフィブリンを簡単に得られないが、一方ヘパリンが結合されない自由(ｆｒｅｅ)フィブリノーゲンを前記ヘパリンが直接結合したフィブリノーゲンと混合して、重合架橋反応を行と含有薬物の持続放出性能が優れて取り扱い(ｈａｎｄｌｉｎｇ)が容易なフィブリンゲルを得ることができると言う知見を発見して、本発明の完成に至った。
【００１２】
従って、本発明は、ａ)ヘパリンを活性化させる段階と、ｂ)活性化したヘパリンとフィブリノーゲンを結合して、ヘパリンが結合したフィブリノーゲンを製造する段階と、ｃ)自由フィブリノーゲンと前記段階ｂ)で製造されたヘパリンが結合したフィブリノーゲンを混合して、混合フィブリノーゲンを製造する段階と、ｄ)前記段階ｃ)で製造された混合フィブリノーゲンにトロンビンを混合する段階とを備える、ヘパリンが結合したフィブリンゲルの製造方法を提供する。
【００１３】
さらに、本発明はヘパリンが結合したフィブリノーゲン、ヘパリンが結合しなかった自由フィブリノーゲン、およびトロンビンを含むヘパリン−結合フィブリンゲル製造用キットおよびヘパリンが直接結合したフィブリノーゲンを含むフィブリンゲルおよび成長因子蛋白質を含む成長因子蛋白質伝達体を提供する。
【００１４】
本発明のヘパリンが結合したフィブリンゲルの製造方法によると、成長因子蛋白質などの薬品に結合親和性があるヘパリンが結合したフィブリンゲルを低費用で簡便に製造できるだけでなく、その方法によって製造された本発明のフィブリンゲルは人体に注射されて、局所的に長期間に亘って、成長因子蛋白質などの薬品を持続放出することによって、骨、皮膚、血管、軟骨などの組織再生に優れた効果を示す治療剤として使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
本発明のこれらおよび／またはその他の目的、側面ならびに利点は、添付の図面と結び付けた以下の実施態様の記載から明確かつ容易に理解される。
【００１６】
【図１】活性化したヘパリンがフィブリノーゲンに結合したか否かを確認するために行ったＮＭＲ分析のデータを示したグラフである。
【００１７】
【図２】活性化したヘパリンがフィブリノーゲンに結合したか否かを確認するために行ったＦＴＩＲ分析のデータを示したグラフである。
【００１８】
【図３】注射可能なヘパリンが結合したフィブリンゲル組成物における骨形成蛋白質−２(ＢＭＰ−２)の放出挙動を示したグラフである。
【００１９】
【図４】ヘパリンが結合しなかったフィブリノーゲンのみを、またはヘパリンが結合したフィブリノーゲンのみを各々使用して、トロンビン溶液を混合して、重合架橋反応を行った場合、ゲル形成有無を示した写真である。
【００２０】
【図５】ヘパリンが結合しなかったフィブリノーゲンの含有量の増加に伴って形成されるゲルを撮影した写真である。
【００２１】
【図６】注射可能なヘパリンが結合したＰＲＰフィブリンゲル組成物における血小板誘導成長因子(ＰＤＧＦ)の放出挙動を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、具体例に基づいて、本発明をさらに詳細に説明する。
【００２３】
本発明においては、ａ)ヘパリンを活性化させる段階、ｂ)活性化したヘパリンとフィブリノーゲンを結合して、ヘパリンが結合したフィブリノーゲンを製造する段階、ｃ)自由フィブリノーゲンと前記段階ｂ)で製造されたヘパリンが結合したフィブリノーゲンを混合して、混合フィブリノーゲンを製造する段階、およびｄ)前記段階ｃ)で製造された混合フィブリノーゲンにトロンビンを混合する段階を含む、ヘパリンが結合したフィブリンゲルの製造方法を提供する。本発明によって製造されたフィブリンゲルは注射可能なフィブリンゲルである。
【００２４】
本発明に係るヘパリンが結合したフィブリンゲルの製造方法において、前記フィブリノーゲンは任意の哺乳類から由来したフィブリノーゲンを使用できる。好ましくは、前記フィブリノーゲンはヒト血漿由来のものが好ましい。
【００２５】
本発明において使われる用語「ヘパリンが結合したフィブリノーゲン」は、本明細書において説明に従うヘパリンの活性化反応を利用して製造されたヘパリンが結合しているフィブリノーゲンを意味し、これと比較して、本発明において使われる用語「自由フィブリノーゲン」または単独で使われる用語「フィブリノーゲン」は他の化合物と結合しないフィブリノーゲン、特にヘパリンが結合していないフィブリノーゲンを意味する。
【００２６】
また、本発明の方法においてヘパリンは低分子量のものであって、具体的には分子量１０００〜２００００であることが好ましい。
【００２７】
また、本発明のフィブリンゲル製造方法中、段階ａ)のヘパリンの活性化段階は、ヘパリンにＮＨＳ−基を導入する段階であり、これを達成するためいかなる手段を使用しても差し支えない。これはヘパリンにカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシ琥珀イミドを反応させることによって、ヘパリンをＮＨＳ−ヘパリンに活性化させる方法によって達成されるが、これに限定されない。
【００２８】
また、本発明のフィブリンゲル製造方法中、段階ｂ)のヘパリンが結合したフィブリノーゲンの製造段階は、ＮＨＳ−ヘパリンとフィブリノーゲンの結合反応によって達成され、より具体的にはＮＨＳ−ヘパリンのカルボキシ基とフィブリノーゲンの蛋白質に存在するアミノ基との作用によって達成される。一方、前記反応によって製造されるヘパリンが結合したフィブリノーゲンは、直ちに使われて次の段階で移行することもできるが、必要に応じて液体および乾燥粉などの形態で保管した後使用してもよい。好ましくは、保管の容易性などの側面から凍結乾燥形態として保管される。
【００２９】
また、本発明のフィブリンゲル製造方法中、段階ｃ)の混合フィブリノーゲン(ヘパリンが結合したフィブリノーゲンと自由フィブリノーゲンの混合物)の製造時、自由フィブリノーゲンとヘパリンが結合したフィブリノーゲンの比は１：１〜５：１であることが好ましい。前記比を維持することによってフィブリンゲルの凝塊を調節することができる。その比が１：１未満の場合、ゲルの機械的物性が弱くフィブリンゲルがさほど形成されない(図５参照)。ゲルが形成されないと、本発明の目的である徐放性が得られないため、機械的物性が弱いゲルが形成されて、体内に注射されても注射後初期放出量が多くて、長期間持続放出という究極的効果が得られない。また、その比が５：１を過ぎると、ゲル形成はよく行われるが、結果としてフィブリンゲルにおいてフィブリノーゲンと混合されたヘパリンの相対的量が減るようになって、これに結合する成長因子蛋白質の量が減る。究極的には治療有効量の蛋白質薬品を含むために使わなければならないフィブリンゲルの量が増えて、蛋白質薬品の効果的持続放出という長所が損なう。
【００３０】
本発明の一具体例においては、ヘパリンが結合したフィブリノーゲンと、ヘパリンが結合しなかった自由フィブリノーゲンと、トロンビンとを備えるヘパリン−結合フィブリンゲル製造用キットを提供する。好ましくは、前記キットでヘパリンが結合したフィブリノーゲンとヘパリンが結合しなかった自由フィブリノーゲンの比は１：１〜５：１である。好ましくは、ヘパリンが結合したフィブリノーゲン、ヘパリンが結合しなかった自由フィブリノーゲン、およびトロンビンの各々は分離して、凍結乾燥状態で保管してフィブリンゲル形成直前に各々を緩衝溶液に溶解した後、混合して、本発明の製造方法に従ってゲルを形成させる。より好ましくは、緩衝溶液に各々溶解した各成分が使用直前混合できるツーウェイ(ｔｗｏ−ｗａｙ)注射器のようなツールを使って簡便に混合してフィブリンゲルを製造することができる。
【００３１】
本発明の他の具体例においては、ヘパリンが結合したフィブリノーゲン、ヘパリンが結合しなかった自由フィブリノーゲン、およびトロンビンに加えて、ヘパリンに結合する成長因子蛋白質をさらに備えるヘパリン−結合フィブリンゲル製造用キットを提供する。好ましくは、成長因子蛋白質は骨形成蛋白質(ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＢＭＰ)、血管内皮成長因子(ｖａｓｃｕｌａｒ
ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ)、変形成長因子(ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β、ＴＧＦ−β)、血小板誘導成長因子(ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ
ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＰＤＧＦ)および繊維芽細胞成長因子(ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ
ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ)で構成された群から選択されるが、これに限定されない。本発明において成長因子蛋白質は、一つ以上含まれ、例えば、多血小板血漿(ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ
ｐｌａｓｍａ：ＰＲＰ)のように多種の成長因子が混合された混合物状として提供できる。
【００３２】
一方、本発明のフィブリン形成のための追加的な成分や反応条件の調節は当業者に周知のことである。 例えば、前記混合フィブリノーゲンの溶解のためには、アプロチニン溶液を使用してもよい。アプロチニンは、フィブリノーゲンがトロンビンによって架橋重合してフィブリンを形成する際に、フィブリンの自然な酵素分解作用を遅延させる役割を果たす。また、本発明の方法において、トロンビンは塩化カルシウムが溶解した溶液に溶かして使うことが好ましい。フィブリノーゲンおよびトロンビン溶液の濃度により凝塊形成時間、凝塊強度などの調節が可能である。この時、溶解したトロンビンの量は、混合フィブリノーゲンと同量を使うのが好ましい。
【００３３】
本発明のさらに他の具体例は、ヘパリンが直接結合したフィブリノーゲンを含むフィブリンゲルおよび一つ以上の成長因子蛋白質を含む成長因子蛋白質伝達体を提供する。本発明の方法によって製造されたフィブリンゲルは、前記例示した成長因子などと結合した後、フィブリンゲル組成物の形態として人体に注射されて、局所的に長期間成長因子蛋白質を放出させることによって、骨、皮膚、血管、軟骨などの組織再生を促進させる治療剤として使用される。より具体的には、本発明の方法によって製造されたフィブリンゲル組成物は、人体に注射する簡単な施術で、骨欠損、火傷、糖尿病性または虚血性足部潰瘍、虚血性心疾患、下肢虚血、退行性軟骨疾患などの治療に広く利用できる。
【実施例】
【００３４】
［実施例１］ヘパリンの活性化
【００３５】
低分子量のヘパリン１００ｍｇ(０．００００２モル)(４０００−６０００、Ｓｉｇｍａ)をＭＥＳ緩衝溶液([２−(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸]バッファー、０．０５Ｍ、ｐＨ６．０) １ｍｌに完全溶解させた後、０．００４６ｇのＮ−ヒドロキシ琥珀酸イミド(ＮＨＳ、０．００００８Ｍ)と０．０１５３３６ｇのＮ−(３−ジメチルアミノプロピル)−Ｎ−エチルカルボジイミドハイドロクロライド(ＥＤＣ、０．００４Ｍ)を添加した後、４℃で１２時間反応させて、ＮＨＳ−ヘパリン溶液を製造した。前記製造されたＮＨＳ−ヘパリン溶液を無水アセトンで沈殿および抽出して、２４時間凍結乾燥させた。
【００３６】
【００３７】
［実施例１−１］活性化したヘパリンとフィブリノーゲンの結合
【００３８】
前記実施例１で製造した凍結乾燥されたＮＨＳ−ヘパリン(６０ｍｇ)とヒト血漿由来フィブリノーゲン(１００ｍｇ)を２０ｍｌ燐酸緩衝溶液(Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ７．４)に完全溶解させた後、４℃ で３時間反応させた。この時、フィブリノーゲンを溶解させる際に、泡が生じないように徐々に溶解させた。前記反応が終わった後の溶液を再び無水アセトンで沈殿させて沈殿物を遮光して、凍結乾燥させ、ヘパリンが結合したフィブリノーゲンを製造した。活性化したヘパリンがフィブリノーゲンに結合したことをＮＭＲおよびＦＴＩＲ分析により確認したし、その結果を各々図１および図２に示した。一方、前記製造されたヘパリンが結合したフィブリノーゲンを２０ｍｌ燐酸緩衝溶液に溶解させて、透析膜(ｄｉａｌｙｓｉｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＭＷＣＯ：１２−１４０００)を利用して、４℃で２４時間３回以上蒸溜水を交換しながら、未反応ヘパリンを湧出させた。これを通じて得られたヘパリンが結合したフィブリノーゲンを遮光して、４８時間以上凍結乾燥させることによって、白色粉のヘパリンが結合したフィブリノーゲンが得られた。
【００３９】
【００４０】
［実施例１−２］ヘパリンが結合したフィブリノーゲンのヘパリン定量
【００４１】
実施例１−１で製造したヘパリンが結合したフィブリノーゲン中のヘパリン量をトルイジンブルー(ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ
ｂｌｕｅ)分析法によって定量した。要約すると、試験管に２ｍｌの０．０２％ ＮａＣｌ水溶液を入れて前記製造されたヘパリンが結合したフィブリノーゲンを添加した後、０．００１Ｎ ＨＣｌ中の０．００５％トルイジンブルー溶液を５００μｌ加えた。弱く攪拌しながら、３０分インキュベーションした後、ｎ−ヘキサンを３ｍｌ加えて、１０〜１５秒強く攪拌した後、静置して層を安定化させた。気泡が除去されたのが確認され、上層であるヘキサン層と下層である水溶液層が明白に区分されると、水溶液層である下層から約２００μｌのサンプルを取ってＥＬＩＳＡを行い、ＵＶ分光計を使用して６３０ｎｍで測定した。ヘパリン含有量は４２．７３ｍｇ／ｇとして測定された。
【００４２】
【００４３】
［実施例２］骨形成蛋白質が含まれたフィブリンゲルの製造
【００４４】
骨形成蛋白質を蛋白質分解酵素阻害剤として使用されるアプロチニン溶液に溶解させた。前記実施例１−１で製造したヘパリンが結合したフィブリノーゲン(３３ｍｇ)と市販中のヒト血漿由来フィブリノーゲン(６６ｍｇ)を１：２で混合して製造した混合フィブリノーゲンを骨形成蛋白質が混合されたアプロチニン溶液(１０００μｌ)に溶解して、フィブリノーゲン溶液を製造した。一方、同量のヒト血漿由来トロンビン(１０ｍｇ)を塩化カルシウムが溶解した溶液(１０００μｌ)に溶かした後、これを前記混合フィブリノーゲン溶液と混合して、最終的に骨形成蛋白質(５００ｎｇ)が結合したフィブリンゲル(１００μｌ)蛋白質伝達体を収得した。
【００４５】
【００４６】
［実施例２−１］フィブリンゲルでの骨形成蛋白質の放出挙動
【００４７】
既に市販中のヘパリンが含まれていないフィブリンゲルに骨形成蛋白質を人為的に混合して、対照群１として使用し、追加的に既に市販中のフィブリンゲルとヘパリン、骨形成蛋白質を人為的に混合して、対照群２として使用した。即ち、対照群１および２において骨形成蛋白質はフィブリンゲルおよび／またはヘパリンと結合しない状態である。
【００４８】
一方、前記実施例２で製造された骨形成蛋白質が結合したフィブリンゲル組成物を実験群として使用し、３７℃でゆっくり攪拌しながら、２８日間骨形成蛋白質の放出挙動を調べた。骨形成蛋白質の放出挙動を図３にグラフで示した。図３に示されたように、骨形成蛋白質が対照群１および２のフィブリンゲル組成物においては３日目に８０％以上が放出されたが、骨形成蛋白質がヘパリンに結合した形態の実験群(本発明の実施例２)のフィブリンゲル組成物においては８０％以上が１３日間放出される傾向にあることを確認することができた。
【００４９】
【００５０】
［実施例３］フィブリンゲル形成におけるヘパリン量と自由フィブリノーゲンの影響評価
【００５１】
ヘパリンが結合したフィブリノーゲンが単独でトロンビンの作用によってフィブリンゲルを形成できるか否かを観察した。
【００５２】
フィブリンヘパリンが結合しなかったフィブリノーゲンは混合せずに実施例１によってヘパリンが結合したフィブリノーゲンを製造し、トロンビンなどフィブリン形成条件を適用して、ゲル形成程度を観察した。ヘパリンを結合しないフィブリノーゲンのみを使用して、アプロチニン緩衝液中のフィブリノーゲンとトロンビン溶液を混合して、重合架橋反応が起きる場合にはゲル形成が良好であったが、ヘパリンが結合したフィブリノーゲンで重合架橋反応が起きる場合にはゲルが形成されなかった(図４参照)。図４の写真はゲル形成反応後、形成板を傾けた時に、ヘパリンを結合しないフィブリノーゲン反応物はゲルを形成させて流れ落ちないが、ヘパリンが結合したフィブリノーゲンのみを使用した反応物はゲルを形成させることができなく流れ落ちる様子を撮影したものである。
【００５３】
次に、反応開始前にヘパリンが結合しなかったフィブリノーゲン(自由フィブリノーゲン)をヘパリンが結合したフィブリノーゲンに対する比として、各々１：１、１．５：１および２：１の割合で混合して、それぞれの造成でフィブリンゲルを製造した。図５ではヘパリンが結合しなかったフィブリノーゲンの含有量の増加に伴って形成されるゲルを撮影した写真を示す。ヘパリンが結合しなかったフィブリノーゲンの含有量が増加するにつれてゲルの形成がさらに良好であった。
【００５４】
【００５５】
［実施例４］フィブリンゲルにおける血小板誘導生長因子の放出挙動
多血小板血漿(ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ：ＰＲＰ)１ｍｌを前記実施例１−１で製造したヘパリンが結合したフィブリノーゲンと市販中のヒト血漿由来フィブリノーゲンを１：２で混合して製造した混合フィブリノーゲン１００ ｍｇと混合して、ヒト血漿由来トロンビン(１０ｍｇ)を塩化カルシウムが溶解した溶液(１０００μｌ)に溶かした後、これを前記混合フィブリノーゲン溶液と混合して、最終的にＰＲＰが結合したフィブリンゲル(１００μｌ)蛋白質伝達体を収得した。
【００５６】
【００５７】
既に市販中のヘパリンが含まれていないフィブリンゲルを使用したことを除いては、同様に製造したフィブリンゲル蛋白質伝達体を対照群として使用した。
【００５８】
製造されたＰＲＰ−トロンビンフィブリンゲルおよびＰＲＰ−ＨＣＦ(Ｈｅｐａｒｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ
ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ：ヘパリン−フィブリノーゲン)−トロンビンフィブリンゲルを実験群として使用して、３７℃でゆっくり攪拌しながら、１０日間血小板誘導生長因子(ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＰＤＧＦ)蛋白質の放出挙動を調べた。血小板誘導生長因子の放出挙動を図６にグラフで示した。図６に示されたように、血小板誘導生長因子は対照群のフィブリンゲルにおいては１日目乃至６日目に殆どが放出されたが、血小板誘導生長因子がヘパリンに結合した形態の実験群のフィブリンゲル組成物においては１０日目にも１日目より高い水準の持続放出を維持することを確認することができた。
【００５９】
【００６０】
本発明のヘパリンが結合したフィブリンゲルの製造方法によると、成長因子蛋白質などの薬品に結合親和性を有するヘパリンが結合したフィブリンゲルを低費用で簡便に製造することができる。
【００６１】
また、本発明の方法によって製造されたヘパリンと結合したフィブリンゲルは、ヘパリンと親和性がある成長因子蛋白質を結合させることによって、成長因子蛋白質を含有するフィブリンゲル組成物として製造できる。このような本発明の方法によって製造されたフィブリンゲル組成物は、成長因子蛋白質を効果的に伝達して、人体に注射する簡単な施術で人体に注射されて、局所的に長期間に亘って、成長因子蛋白質などの薬品を持続放出することによって骨欠損、火傷、糖尿病性または虚血性足部潰瘍、虚血性心疾患、下肢虚血、退行性軟骨疾患などの疾患を効果的に治療できる低費用高効率の治療剤として開発できる。
【００６２】
本発明の実施態様を示して説明してきたが、、特許請求の範囲およびその均等物により規定される発明の精神および範囲から逸脱することなく、説明した実施態様に対してさまざまな変更をなし得ることが当業者に理解される。
【図１】
0005390595.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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