(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：３２、３３及び３４に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号：３５、３６及び３７に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでなる抗体。
【請求項２】
配列番号：３８、３９及び４０に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号：４１、４２及び４３に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでなる抗体。
【請求項３】
配列番号：２に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号：３に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでなる抗体。
【請求項４】
配列番号：４に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号：５に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでなる抗体。
【請求項５】
定常領域を更に含む請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
定常領域のＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
定常領域がＩｇＧ抗体由来である請求項５に記載の抗体。
【請求項８】
ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、又はＩｇＧ４抗体である請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
配列番号：２、４、３２から３４、及び３８から４０に示すアミノ酸配列の一又は複数をコードする核酸。
【請求項１０】
請求項９に記載の一又は複数の核酸を含むベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１２】
軽鎖定常領域及び／又は重鎖定常領域を更に含む、請求項１から４の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１３】
抗体が単鎖Ｆｖである請求項１から４の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１４】
標識を更に含む請求項１から４の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１５】
Ｎｏｔｃｈ３（配列番号１）のＬＩＮ１２ドメインのアミノ酸残基１３９５−１３９６、１４０２−１４０４及び１４２０−１４２２と、Ｎｏｔｃｈ３（配列番号１）の二量体形成ドメインのアミノ酸残基１５７６−１５７８及び１６２６−１６２８とを含むＮｏｔｃｈ３立体構造エピトープに結合する抗体。
【請求項１６】
試料中におけるＮｏｔｃｈ３関連疾病の存在の検出を補助するための方法であって、請求項１４に記載の抗体を用いて試料中におけるＮｏｔｃｈ３の発現レベルを測定することを含み、このとき発現のレベルが、該試料を入手した被検体におけるＮｏｔｃｈ３関連疾病の存在を示す、方法。
【請求項１７】
抗体の生成に適した条件下で請求項１１に記載の細胞を培養し、生成された抗体を単離する、抗体生成方法。
【請求項１８】
抗体がその抗原結合部位を含む抗体断片である、請求項１から８、１２から１４及び１７の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１９】
Ｎｏｔｃｈ３関連疾病又は疾患の治療のための医薬であって、請求項１から８、１２から１４及び１７の何れか一項に記載の抗体を含有してなる医薬。
【請求項２０】
疾病が、Ｔ細胞性急性リンパ性白血病、リンパ腫、異常血管新生を伴う肝臓疾患、糖尿病、卵巣癌、血管細胞運命を伴う疾患、関節リウマチ、膵臓癌、非小細胞肺癌、形質細胞腫瘍(例えば多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、及び髄外性形質細胞腫)、並びに神経芽細胞腫である、請求項１９に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その開示を出典明示によりここに援用する２００６年１２月１８日出願の米国仮特許出願第６０／８７５５９７号及び２００７年１月６日出願の米国仮特許出願第６０／８７９２１８号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明はアンタゴニスト抗Ｎｏｔｃｈ３抗体と、Ｎｏｔｃｈ３関連疾患又は障害の寛解、治療、又は予防におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｎｏｔｃｈ遺伝子はミバエ(キイロショウジョウバエ)の系統がＮｏｔｃｈのある羽ブレードを有していることが分かった１９１７年に最初に開示された(Morgan, Am Nat 51:513 (1917))。その遺伝子はほぼ７０年後にクローニングされ、ショウジョウバエにおいて多くの異なった細胞型及び組織の発生に重要な役割を果たしている細胞表面レセプターであることが分かった(Wharton等, Cell 43:567 (1985))。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路はまもなく細胞間接着によって媒介されるシグナル伝達機構であることが見出され、ショウジョウバエからヒトへ進化的に保存されている。Ｎｏｔｃｈレセプターは、多くの細胞プロセス、例えば分化、細胞運命決定、幹細胞の維持、細胞運動性、増殖、発生及び組織ホメオスタシスの間における様々な細胞型でのアポトーシスに関与していることが見出された(Artavanis-Tsakonas等, Science 268:225 (1995)参照)。
【０００４】
哺乳類は４つのＮｏｔｃｈレセプタータンパク質(Ｎｏｔｃｈ１からＮｏｔｃｈ４と命名されている)と５つの対応するリガンド(Ｄｅｌｔａ−１(ＤＬＬ−１)、 Ｄｅｌｔａ−３(ＤＬＬ−３)、Ｄｅｌｔａ−４(ＤＬＬ−４)、Ｊａｇｇｅｄ−１及びＪａｇｇｅｄ−２と命名されている)を持っている。哺乳類のＮｏｔｃｈレセプター遺伝子は、細胞表面へのその輸送の間に切断されヘテロ二量体として存在する〜３００ｋＤのタンパク質をコードしている。Ｎｏｔｃｈレセプターの細胞外部分は３４の上皮増殖因子(ＥＧＦ)様リピートと３つのシステインリッチのＮｏｔｃｈ／ＬＩＮ１２リピートを有している。２つの切断されたサブユニットの結合は切断部位のＮ末端及びＣ末端の直ぐ近くにある配列によって媒介され、これらの２つのサブユニットはＮｏｔｃｈヘテロ二量体化(ＨＤ)ドメインを構成している(Wharton等, Cell 43:567 (1985)；Kidd等, Mol Cell Biol 6:3431 (1986)；Kopczynski等, Genes Dev 2:1723 (1988)；Yochem等, Nature 335:547 (1988))。
【０００５】
現在でも、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達が異なったレセプターによってどのようにして調節されるのか、又は５つのリガンドはそのシグナル伝達又は調節においてどのように異なっているのかは、未だ明らかではない。シグナル伝達及び／又は調節の差は異なった組織中におけるその発現パターンによって、あるいは異なった環境要因によって制御されうる。Ｊａｇｇｅｄ／Ｓｅｒｒａｔｅ及びＤｅｌｔａ／Ｄｅｌｔａ様を含むＮｏｔｃｈリガンドタンパク質はＥＧＦリピート領域に特異的に結合し、レセプター媒介Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を誘導する(Bray, Nature Rev Mol Cell Biol. 7:678 (2006)及びKadesch, Exp Cell Res. 260:1 (2000)により概説されている)。ＥＧＦリピートのなかで、１０回から１２回のリピートはＮｏｔｃｈレセプターへのリガンド結合に必要とされ、他のＥＧＦリピートはレセプター−リガンド相互作用を亢進しうる(Xu等, J Biol Chem. 280:30158 (2005)；Shimizu等, Biochem Biophys Res Comm. 276:385 (2000))。ＬＩＮ１２リピートと二量体形成ドメインは、リガンド結合に直接的には関与していないが、それらはヘテロ二量体タンパク質複合体の維持に重要な役割を果たしており、リガンド独立性のプロテアーゼ切断及びレセプター活性化を防止している(Sanche-Irizarry等, Mol Cell Biol. 24:9265 (2004)；Vardar等, Biochem. 42:7061 (2003))。
【０００６】
ツメガエルの胚の発達におけるＮｏｔｃｈレセプターの変異形態の発現は、正常な発達を大きく妨害する(Coffmanら、Cell 73: 659 (1993))。Ｎｏｔｃｈ１ノックアウトはマウスにおいて胎性致死であることが分かっている(Swiatekら、Genes & Dev 8:707 (1994))。ヒトにおいては、癌を含め、様々なＮｏｔｃｈレセプター変異に関連する複数の遺伝的疾病が存在する(Artavanis-Tsakonasら、Science 284:770 (1999))。例えば、転座により引き起こされるＮｏｔｃｈ１レセプターの異常な活性化はＴ細胞性リンパ性白血病を引き起こす可能性がある(Ellisenら、Cell 66:649 (1991))。Ｎｏｔｃｈ１レセプターのＨＤドメインにおける特定の変異は、リガンド結合を生じずにシグナル伝達を亢進し(Maleckiら、Mol Cell Biol 26:4642 (2006))、更にはＮｏｔｃｈレセプター活性化に関与していると考えられる。リガンド結合によって誘発されるシグナルは、レセプターの２つのタンパク質切断と、それに続く細胞内ドメインの核転座を伴うプロセスによって核に伝達される(Ｎｏｔｃｈ−ＩＣ)。ＬＩＮ１２リピート及びＨＤドメインは、リガンドの不在下でシグナル伝達を防ぐと考えられていたが、リガンド結合がどのようにしてタンパク質切断イベントを促進するかについては未だ不明である。
【０００７】
Ｎｏｔｃｈレセプターは、正常細胞又は非悪性細胞と比較した場合の、様々なヒトの疾病組織及び細胞株におけるＮｏｔｃｈレセプターの過剰発現の報告によって実証されるように、癌、神経障害、及び免疫疾患を含む広範な種類の疾病に関連付けられている(Joutel, et al.. Cell & Dev Biol 9:619 (1998); Namら、Curr Opin Chem Biol 6:501 (2002))。Ｎｏｔｃｈ３レセプターは、非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)及び卵巣癌を含め、様々な固形腫瘍に過剰発現されるもので(Harukiら、Cancer Res 65:3555 (2005); Parkら、Cancer Res 66:6312 (2006); Luら、Clin Cancer Res 10:3291 (2004))、これは固形腫瘍におけるＮｏｔｃｈ３レセプターの発現の重要性を示唆している。更に、Ｎｏｔｃｈ３レセプターの発現は、多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、及び髄外性形質細胞腫を含む形質細胞腫瘍(Hedvatら、Br J Haematol 122:728 (2003))、膵臓癌(Buchlerら、Ann Surg 242:791 (2005))、及びＴ細胞性急性リンパ性白血病(Ｔ−ＡＬＬ)(Bellaviaら、Proc Natl Acad Sci USA 99:3788 (2002); Screpantiら、Trends Mol Med 9:30 (2003))において上方制御される。Ｎｏｔｃｈ３レセプターはまた、神経芽細胞腫細胞株のサブセットにおいて発現され、ホメオボックス遺伝子Ｐｈｏｘ２Ｂにおける体質性変異又は腫瘍特異性変異を有するこの種の腫瘍のマーカーとして機能する(van Limptら、Cancer Lett 228:59 (2005))。Ｎｏｔｃｈ３レセプターの発現に関連している他の指標及び疾病には、神経障害(Joutelら、Nature 383:707 (1996))、糖尿病(Anastasiら、J Immunol 171:4504 (2003))、関節リウマチ(Yabeら、J Orthop Sci 10:589 (2005))、血管に関連する疾病(Sweeneyら、FASEB J 18:1421 (2004))、及びアラジール症候群(Flynnら、J Pathol 204:55 (2004))が含まれる。
【０００８】
Ｎｏｔｃｈ３レセプターの過剰発現(遺伝子増幅を含む)は様々な癌において観察されるが、活性化変異はまだ報告されていない。腫瘍におけるＮｏｔｃｈ３レポーターのレベルの上昇は、間質細胞又は腫瘍細胞中の異なるリガンドにより活性化され、Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達の増強を導くと考えられる。特に、Ｎｏｔｃｈリガンドは、発達及び腫瘍形成の間のいずれにおいても血管内皮に局在化しており(Mailhosら、Differentiation 69:135 (2001); Taichmanら、Dev Dyn 225: 166 (2002))、これは内皮細胞が腫瘍においてＮｏｔｃｈ３レセプターを活性化させるリガンドを供給しうることを示唆する。Ｎｏｔｃｈリガンド及びレセプターによって媒介される類似の腫瘍−間質クロストークが、異なる種類の癌において実証されている(Houdeら、Blood 104: 3697 (2004); Jundtら、Blood 103: 3511 (2004); Zengら、Cancer Cell 8: 13 (2005))。細胞内Ｎｏｔｃｈ３(Ｎｏｔｃｈ３−ＩＣ)の過剰発現により引き起こされるＮｏｔｃｈ３シグナル伝達の増大は、Ｔ−ＡＬＬにおける腫瘍形成及び乳癌の動物モデルを導きうる(Vaccaら、The EMBO J 25: 1000 (2006); Huら、Am J Pathol 168: 973 (2006))。
【０００９】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達と細胞の自己複製におけるその役割は、腫瘍中において少数の、腫瘍形成を開始させることができる癌幹細胞に関連付けられている(Reyaら、Nature 414:105 (2001))。腸及び神経の幹細胞を含め、多数の組織に由来する正常な幹細胞は、自己複製及び運命決定のＮｏｔｃｈシグナル伝達に依存している(Freら、Nature, 435: 964 (2005); van Esら、Nature, 435:959 (2005); Androutsellis-Theotokisら、Nature, 442: 823 (2006))。同様の仕組みは癌幹細胞にも存在すると思われ、γセクレターゼインヒビターによるＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害は、胚性脳腫瘍において癌幹細胞を枯渇させ、生着を遮断することが示された(Fanら、Cancer Res 66:7445 (2006))。
【００１０】
γセクレターゼインヒビターによるＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害は、インビトロ及び異種移植モデルにおいてＮｏｔｃｈを発現する形質転換細胞に目覚しい抗悪性腫瘍効果を有する(Weijzenら、Nat Medicine 8: 879 (2002); Bocchettaら、Oncogene 22:81 (2003); Wengら、Science, 306:269 (2004))。最近、γセクレターゼインヒビターが、Ａｐｃ(ｍｉｎ＋)マウスにおいて結腸腺腫を効果的に死滅させることが示されたが(van Esら、Nature, 435: 959 (2005))、正常幹細胞に対するその効果及び複数のＮｏｔｃｈ経路の阻害により、治療上の窓口は未だ開けていない。Ｎｏｔｃｈ１とは異なり、マウスにおけるＮｏｔｃｈ３遺伝子ノックアウトは胚性致死ではなく幾つかの異常を有しており(Domengaら、Genes & Dev 18: 2730 (2004))、これによりＮｏｔｃｈ３がＮｏｔｃｈ１より優れた治療上の標的であることが示された。
【００１１】
Tournier-Lasserveら(米国特許出願公開第２００３／０１８６２９０号)は、Ｎｏｔｃｈ３レセプターとＣＡＤＡＳＩＬの関連性を教示している。この出願は、Ｎｏｔｃｈ３遺伝子の様々な変異と、それらと疾病ＣＡＤＡＳＩＬとの関連の可能性とを開示している。この出願は、このような変異の検出における診断用抗体の使用を提案している。この出願はまた、ＣＡＤＡＳＩＬの治療に治療用抗体、つまりアゴニスト抗体を使用することを提案しているが、特定の抗体は開示されておらず、またそのような抗体の作製方法も開示されていない。
【００１２】
多数のヒト疾病がＮｏｔｃｈ３シグナル伝達経路に関連しているという見地から、これらの疾病を予防及び治療する新規方法を同定することは重要である。本発明は、この未だ対処されていない医療上の必要性に有用な、新規の抗Ｎｏｔｃｈ３抗体を提供する。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、ＬＩＮ１２ドメイン及びヘテロ二量体形成ドメインを含むエピトープであるヒトＮｏｔｃｈ３レセプターの立体構造のエピトープに特異的に結合する新規な抗体とその断片を提供する。本発明の他の態様は、本発明の抗体と同じ該エピトープに結合するエピトープ結合部位及び抗体を含む。本発明の抗体はＮｏｔｃｈ３レセプターを介したリガンド誘発性シグナル伝達を活性化する。
【００１４】
本発明は抗体の可変重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列とその対応する核酸配列を含む。本発明の他の実施態様はこれらの抗体のＣＤＲ配列を含む。他の実施態様はこれらの抗体のヒト化形態を含む。
【００１５】
本発明の他の実施態様は本発明の抗体配列を内部に持つ細胞株及びベクターを含む。
【００１６】
本発明はまた本発明のアンタゴニスト抗体によって認識される立体構造エピトープを含む。本発明はまたこの立体構造エピトープに結合する抗体を含む。該実施態様は、配列番号９と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有するＬＩＮ１２ドメインと、配列番号１８と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有する二量体形成ドメイン２とを含むＮｏｔｃｈ３立体構造エピトープを含む。より詳細には、Ｎｏｔｃｈ３立体構造エピトープは、Ｌ１  ＬＩＮ１２ドメインのアミノ酸残基１３９５−１３９６、１４０２−１４０４、及び１４２０−１４２２と、Ｄ２二量体形成ドメインのアミノ酸残基１５７６−１５７８及び１６２６−１６２８とを含む。本発明はこの立体構造エピトープに結合する抗体を含む。
【００１７】
本発明の他の実施態様は、Ｎｏｔｃｈ３レセプター活性化に関連した疾病及び障害の治療のための医薬又は組成物の調製のためのこれら抗体のいずれかの使用である。
【００１８】
本発明の他の実施態様は、Ｎｏｔｃｈ３の活性化に関連した障害の治療におけるこれらの抗体のいずれかの使用であり、例えばＮｏｔｃｈ３のシグナル伝達を阻害することによるＮｏｔｃｈ３の活性の阻害、又はリガンド結合を遮断することによるレセプターの中和を含む。Ｎｏｔｃｈ３関連障害には、限定されないが、T細胞急性リンパ性白血病、リンパ腫、異常な血管新生を含む肝臓疾患、糖尿病、卵巣癌、血管性の細胞運命に関連する疾病、関節リウマチ、膵臓癌、非小細胞肺癌、形質細胞腫瘍(例えば多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、及び髄外性形質細胞腫)、及び神経芽細胞腫が含まれうる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１はＮｏｔｃｈ３のアミノ酸配列を示す。ＥＧＦリピート領域はアミノ酸残基４３から１３８３まで伸長している；ＬＩＮ１２ドメインはアミノ酸残基１３８４から１５０３まで伸長している；二量体形成ドメインはアミノ酸残基１５０４から１６４０まで伸長している。
【図２Ａ】ヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、及びＮｏｔｃｈ４間のアミノ酸配列比較を示す。
【図２Ｂ】ヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、及びＮｏｔｃｈ４間のアミノ酸配列比較を示す。
【図２Ｃ】ヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、及びＮｏｔｃｈ４間のアミノ酸配列比較を示す。
【図２Ｄ】ヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、及びＮｏｔｃｈ４間のアミノ酸配列比較を示す。
【図２Ｅ】ヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、及びＮｏｔｃｈ４間のアミノ酸配列比較を示す。
【図２Ｆ】ヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、及びＮｏｔｃｈ４間のアミノ酸配列比較を示す。
【図２Ｇ】ヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、及びＮｏｔｃｈ４間のアミノ酸配列比較を示す。
【図２Ｈ】ヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、及びＮｏｔｃｈ４間のアミノ酸配列比較を示す。
【図３】Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、及びＮｏｔｃｈ４のパーセント同一性を示す。
【図４Ａ】抗Ｎｏｔｃｈ３モノクローナル抗体ＭＡｂ２５６Ａ−４(配列番号２)の重鎖可変領域を示し、ＣＤＲ領域には下線を付す。
【図４Ｂ】抗Ｎｏｔｃｈ３モノクローナル抗体ＭＡｂ２５６Ａ−４(配列番号２)の軽鎖可変領域を示し、ＣＤＲ領域には下線を付す。
【図５Ａ】抗Ｎｏｔｃｈ３モノクローナル抗体ＭＡｂ２５６Ａ−８(配列番号４)の重鎖可変領域を示し、ＣＤＲ領域には下線を付す。
【図５Ｂ】抗Ｎｏｔｃｈ３モノクローナル抗体ＭＡｂ２５６Ａ−８(配列番号２)の軽鎖可変領域を示し、ＣＤＲ領域には下線を付す。
【図６】Ｎｏｔｃｈ３リガンドであるＪａｇｇｅｄ１に対する抗Ｎｏｔｃｈ３ＭＡｂによる阻害効果を示す実施例５のルシフェラーゼレポーターアッセイを示す。
【図７】Ｎｏｔｃｈ３リガンドであるＪａｇｇｅｄ２に対する抗Ｎｏｔｃｈ３ＭＡｂによる阻害効果を示すルシフェラーゼレポーターアッセイを示す。
【図８】Ｎｏｔｃｈ３リガンドであるＤＬＬ４に対する抗Ｎｏｔｃｈ３ＭＡｂによる阻害効果を示すルシフェラーゼレポーターアッセイを示す。
【図９Ａ】卵巣癌細胞の天然Ｎｏｔｃｈ３に対する抗Ｎｏｔｃｈ３ＭＡｂによる阻害効果を示すルシフェラーゼレポーターアッセイを示す。ヒト卵巣癌細胞株、ＯＶ／ＣＡＲ３が示されている。
【図９Ｂ】卵巣癌細胞の天然Ｎｏｔｃｈ３に対する抗Ｎｏｔｃｈ３ＭＡｂによる阻害効果を示すルシフェラーゼレポーターアッセイを示す。ヒト卵巣癌細胞株、Ａ２７８０が示されている。
【図１０】Ｊａｇｇｅｄ１により誘導される細胞生存効果が抗Ｎｏｔｃｈ３ＭＡｂによって阻害されたことを示す実施例６のアポトーシスアッセイを示す。
【図１１Ａ】実施例７の細胞遊走に対する抗Ｎｏｔｃｈ３ＭＡｂの阻害効果を示す。
【図１１Ｂ】実施例７の細胞浸潤に対する抗Ｎｏｔｃｈ３ＭＡｂの阻害効果を示す。
【図１２】Ｃ末端に結合したヒトＩｇＧ／Ｆｃとの融合タンパク質として発現されたＮｏｔｃｈ１−Ｎｏｔｃｈ３ドメインｓｗａｐの模式図である。
【図１３Ａ】検出抗体として抗ヒトＦｃコントロール抗体を用いたＥＬＩＳＡを示し、図１２のタンパク質が条件培地に発現されたことを示す。
【図１３Ｂ】検出抗体として２５６Ａ−４を用いたＥＬＩＳＡを示す。
【図１３Ｃ】検出抗体として２５６Ａ−８を用いたＥＬＩＳＡを示す。
【図１３Ｄ】検出抗体としてポジティブコントロール抗体２５６Ａ−１３を用いたＥＬＩＳＡを示す。
【図１４】天然Ｎｏｔｃｈ３リーダーペプチドコード配列(ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００４３５)に対する遺伝子操作Ｎｏｔｃｈ３リーダーペプチドコード配列の比較を示し、ヌクレオチドの変化を示し(１４Ａ)、また遺伝子操作Ｎｏｔｃｈリーダーペプチド配列の翻訳されたアミノ酸配列を示す(１４Ｂ)。
【図１５】ＰＣＲ−ＳＯＥ法によるドメインｓｗａｐコンストラクトの生成を示す。矢印バーはＰＣＲプライマーを表す。白抜きバーはＮｏｔｃｈ３配列を表す。塗り潰しバーはＮｏｔｃｈ１配列である。
【図１６】ＭＡｂ２５６Ａ−４及びＭＡｂ２５６Ａ−８のＮｏｔｃｈ３ＬＩＮ１２ドメインエピトープマッピングに使用されたアミノ酸配列を示す。
【図１７】ＭＡｂ２５６Ａ−４及びＭＡｂ２５６Ａ−８のＮｏｔｃｈ３二量体形成ドメインエピトープマッピングに使用されたアミノ酸配列を示す。
【図１８】ＭＡｂ２５６Ａ−４及びＭＡｂ２５６Ａ−８のエピトープ結合部位の略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、ここに記載された特定の方法、プロトコル、細胞株、ベクター、又は試薬には、それらは変わりうるので、限定されない。更に、ここで使用される用語法は特定の実施態様だけを記述する目的のものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。明細書及び添付の特許請求の範囲に使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は文脈が明らかに他の意味になっていない限り、複数形を含む。例えば、「宿主細胞(a host cell)」は複数のかかる宿主細胞を含む。別の意味に定義されていない限り、ここで使用される全ての技術的及び科学的用語及び任意の頭字語は本発明の分野で当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有している。ここに記載されたものと同様な又は等価な任意の方法及び材料を本発明の実施に使用することができるが、例示的な方法、装置、及び材料をここに記載する。
【００２１】
ここで述べられる全ての特許及び刊行物は、本発明で使用されるかもしれないそこで報告されたタンパク質、酵素、ベクター、宿主細胞、及び方法論を記述し開示する目的のために、法律によって許容される範囲で、出典明示によりここに援用される。しかしながら、ここでの何も本発明にはそのような開示に先行する権利が与えられていないということを自認するものと解釈してはならない。
【００２２】
定義
この出願を通して使用される用語は、当業者にとって通常の典型的な意味を持つものと解されるものである。しかしながら、本出願人は、次の用語には、以下に記載される特定の定義が与えられることを所望する。
【００２３】
抗体鎖ポリペプチド配列に関する「実質的に同一」なる語句は、参照ポリペプチド配列に対して少なくとも７０％、又は８０％、又は９０％、又は９５％の配列同一性を示す抗体鎖と解することができる。核酸配列に関する該用語は、参照核酸配列に対して少なくとも約８５％、又は９０％、又は９５％、又は９７％の配列同一性を示すヌクレオチドの配列と解することができる。
【００２４】
「同一性」又は「相同性」なる用語は、配列をアラインメントさせ、全配列に対して最大の配列同一性を達成するために必要ならばギャップを導入し、配列同一性の一部として保存的置換を考慮しない、比較される対応する配列の残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の百分率を意味するものと解釈される。Ｎ末端又はＣ末端伸長又は挿入の何れも同一性又は相同性を減少させると解されない。アラインメントの方法及びコンピュータプログラムは当該分野でよく知られている。配列同一性は配列解析ソフトウェアを使用して測定することができる。
【００２５】
「抗体」なる用語は最も広い意味で使用され、特にモノクローナル抗体(完全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、及び多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及び所望する生物活性を示す限りは抗体断片を包含する。抗体(Ａｂ)及び免疫グロブリン(Ｉｇ)は同じ構造的特性を有する糖タンパク質である。抗体は特定の標的に対する結合特異性を示すが、免疫グロブリンは標的特異性を欠く抗体と他の抗体様分子の双方を含む。 本発明の抗体は任意のタイプ  (例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ)、クラス(例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２)又はサブクラスでありうる。天然抗体及び免疫グロブリンは、通常は、２つの同一の軽(Ｌ)鎖よ２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各重鎖は多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)を一端に有する。各軽鎖は一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、その他端に定常ドメインを有する。
【００２６】
ここで使用される場合、「抗Ｎｏｔｃｈ３抗体」は、Ｎｏｔｃｈ３のそのリガンドに対する結合を阻害又はほぼ阻害するか、或いはＮｏｔｃｈ３シグナル伝達を阻害するような形でヒトＮｏｔｃｈ３に特異的に結合する抗体を意味する。
【００２７】
抗体の可変ドメインの文脈における「可変」なる用語は、可変ドメインのある部分が、抗体間で配列が広く異なり、その特定の標的に対する各特定の抗体の結合及び特異性に使用されるという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインに均一には分散していない。軽鎖及び重鎖可変ドメインの双方において高頻度可変領域としても知られている相補性決定領域(ＣＤＲｓ；つまりＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３)と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインの更に高度に保存されている部分はフレームワーク(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、大体においてβシート構造をとる４つのＦＲ領域を有し、該ＦＲ領域は、ある場合には該βシート構造の一部を形成しながら該βシート構造を連結するループを形成する３つのＣＤＲにより連結される。各鎖中のＣＤＲはＦＲ領域によって近接して保持され、他方の鎖からのＣＤＲとともに抗体の標的結合部位の形成に寄与する(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1987))。本明細書において、免疫グロブリンアミノ酸残基の番号付けは、特に明記しない限り、Kabat等の免疫グロブリンアミノ酸残基番号付けにしたがって行われる。
【００２８】
「抗体断片」なる用語は、全長抗体の部分、通常は標的結合又は可変領域を指す。抗体断片の例は、Ｆ(ａｂ)、Ｆ(ａｂ’)、Ｆ(ａｂ’)２、及びＦｖ断片を含む。抗体の「機能的断片又はアナログ」なる語句は、全長抗体と同様に定性的生物活性を有する化合物である。例えば、抗Ｎｏｔｃｈ３抗体の機能的断片又はアナログは、レセプターがそのリガンドに結合する又はシグナル伝達を開始する能力を抑制するか又は実質的に低減するようにＮｏｔｃｈ３レセプターに結合できるものである。ここで使用する、抗体に関する「機能的断片」はＦｖ、Ｆ(ａｂ)、及びＦ(ａｂ’)２断片を指す。「Ｆｖ」断片は、一つの重鎖可変ドメインと一つの軽鎖可変ドメインとが緊密に非共有会合した二量体(ＶＨ−ＶＬ二量体)からなる。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を定めるのはこのような立体配置においてである。集合的に、６つのＣＤＲが該抗体に標的結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン(又は標的に特異的な３つのＣＤＲのみを有するＦｖの半分)であっても、完全な結合部位に比べると低い親和性においてではあるが標的を認識及び結合する能力を有する。
【００２９】
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインはポリペプチド単鎖中に存在している。一般に、Ｆｖポリペプチドは、標的結合のための所望の構造をｓＦｖが形成することを可能にするポリペプチドリンカーをＶＨ及びＶＬドメイン間に更に含む。
【００３０】
「ダイアボディ」なる用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、該断片は同じポリペプチド鎖中に軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に結合された重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を含む。同一鎖上で２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを用いることによって、これらのドメインは別の相補ドメインと対をなし、そして２つの抗原結合部位を生成する。
【００３１】
Ｆ(ａｂ)断片は、軽鎖定常ドメインと重鎖第一定常ドメイン(ＣＨ１)を含む。Ｆ(ａｂ’)断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に数個の残基が加わっている点でＦ(ａｂ)断片と異なる。Ｆ(ａｂ’)断片は、Ｆ(ａｂ’)２ペプシン消化産物のヒンジシステインのジスルフィド結合を切断することにより生産される。抗体断片の更なる化学結合は当業者に周知である。
【００３２】
ここで使用する「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均質な抗体の集団、すなわち該集団を構成する個々の抗体が最小量で存在しうる天然発生する可能性のある突然変異以外は同一であるもの、から得られた抗体を指す。本明細書においてモノクローナル抗体は特に、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種由来の抗体、又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一か又は相同であり、残りの鎖が、特定の種由来の抗体、又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一か又は相同である「キメラ」抗体(免疫グロブリン)を含み、並びに所望の生物活性を示す限りにおいてそういった抗体の断片を含む(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc Natl Acad Sci USA 81:6851 (1984))。モノクローナル抗体は、単一の標的部位に対して向けられており、高度に特異的である。更に、異なる決定基(エピトープ)に向けられた異なる抗体を典型的に含む通常の(ポリクローナル)抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は標的上の単一の決定基に向けられている。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は他の免疫グロブリンが混入することのないハイブリドーマ培養により合成されうる点で有利である。修飾語句「モノクローナル」は、抗体の実質的に相同な集団から得られたという抗体の性質を示し、何らかの特定の方法で抗体を生産する必要があると解釈されるものではない。例えば、本発明で使用するモノクローナル抗体は、周知の技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離されうる。本発明に従って使用される親モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature 256:495 (1975)に最初に記載されたハイブリドーマ法で作製でき、又は組換え法により作製できる。
【００３３】
「ヒト化」形態の非ヒト(例えばマウス)抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する配列を最小で含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片(Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、又は抗体の他の標的結合性のサブ配列など)である。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン鋳型配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体はまた、典型的には選択されたヒト免疫グロブリン鋳型のものである免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部を含みうる。
【００３４】
「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養」なる用語は子孫を含む。全ての子孫は、故意の、或いは故意ではない変異によりＤＮＡ含量が厳密に同一でなくてもよいことも理解されたい。独自に形質転換された細胞においてスクリーニングされた同一の機能又は生物学的特性を有する変異子孫も含まれる。本発明で使用される「宿主細胞」は、概して原核生物又は真核生物宿主である。
【００３５】
ＤＮＡによる細胞生物、細胞、又は細胞株の「形質転換」は、染色体外要素としてか又は染色体への組込みによって、ＤＮＡが複製可能であるようにＤＮＡを標的細胞に導入することを意味する。ＤＮＡによる細胞又は生物の「形質移入(トランスフェクション)」は、いかなるコード配列が実際に発現されるかに関わらず、細胞又は生物によるＤＮＡ、例えば発現ベクターの引受けを指す。「形質移入された宿主細胞」及び「形質転換された」なる用語は、ＤＮＡが導入された細胞を指す。該細胞は「宿主細胞」と称され、原核生物又は真核生物のものでありうる。典型的な原核生物宿主細胞は、様々な大腸菌株を含む。典型的な真核生物宿主細胞は、哺乳類のもの、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞、又はヒト起源の細胞である。導入されたＤＮＡ配列は、宿主細胞と同じ種のものであっても、宿主細胞と異なる種のものであってもよく、或いは何らかの外来ＤＮＡ及び何らかの相同ＤＮＡを含むハイブリッドＤＮＡ配列であってよい。
【００３６】
「ベクター」なる用語は、適切な宿主でＤＮＡの発現をもたらすことができる適切な制御配列に作用可能に連結されたＤＮＡ配列を含むＤＮＡコンストラクトを意味する。こういった制御配列は、転写をもたらすプロモーター、そういった転写を制御する任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び翻訳の終止を制御する配列を含む。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、又は単に潜在的ゲノム挿入でありうる。適切な宿主に形質転換されると、ベクターは複製し宿主ゲノムと独立して機能しうるか又は、いくつかの例においてはゲノムそのものに組込まれうる。本明細書では、プラスミドが最も広く使用されているベクターの形態であるので、「プラスミド」と「ベクター」を相互交換可能に使用する場合がある。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たす、当該分野で周知の又は周知となる他の形態のベクターを含むことを意図する。
【００３７】
治療を目的とした「哺乳動物(類)」は、ヒト、家畜、非ヒト霊長類、及び動物園、運動競技、又はペット用動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ等を含む、哺乳類として類別されるいかなる動物も指す。
【００３８】
ここで使用する「標識」なる語は、例えば抗体といった、分子又はタンパク質に直接又は間接的にコンジュゲートできる検出可能な化合物又は組成物を指す。標識は、それ自体が検出可能(例えば放射性同位元素標識、又は蛍光標識)か又は、酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変化を触媒しうる。
【００３９】
ここで使用する「固相」は、本発明の抗体が接着する非水性マトリックスを意味する。ここで網羅する固相の例は、ガラス(例えば孔制御ガラス)、多糖類(例えばアガロース)、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、及びシリコンから部分的又は完全になるものを含む。特定の実施態様において、状況次第で、固相はアッセイプレートのウェルを含み、他の実施態様では精製カラム(アフィニティクロマトグラフィカラム)である。
【００４０】
ここで使用する「Ｎｏｔｃｈ３介在障害」なる用語は、Ｎｏｔｃｈ３レセプターの過剰発現及び／又は過敏症を特徴とする状態又は疾患を意味する。特に、該用語は、非小細胞肺癌、卵巣癌、及びＴ細胞急性リンパ性白血病といった癌に関連する状態を含むと解釈されるものである。膵臓癌、前立腺癌、形質細胞腫瘍(例えば多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、及び髄外性形質細胞腫)、神経芽細胞腫、及び髄外性形質細胞腫を含む他の癌も、この用語の範囲に含まれる。他の種類の疾病には、リンパ腫、アラジール症候群、異常血管新生を伴う肝臓疾患、神経性疾患、糖尿病、血管性細胞運命を伴う疾病、及び関節リウマチが含まれる。
【００４１】
抗体を生産するためのＮｏｔｃｈ３レセプター免疫原
可溶型標的又はその断片は抗体の生産のための免疫原として使用することができる。抗体は対象の標的に対してつくられる。好ましくは、標的は生物学的に重要なポリペプチドであり、疾患又は障害を被っている哺乳類への投与がその哺乳類において治療的効果を生じうる。全細胞を、抗体を作製するための免役原として使用することができる。免役原は組換え的に生産され又は合成法を使用して作製されうる。免役原は天然源から単離することもまたできる。
【００４２】
レセプターのような膜貫通分子の場合、これらの断片(例えばレセプターの細胞外ドメイン)を免役原として使用することができる。別法として、膜貫通分子を発現する細胞を免役原として使用することができる。かかる細胞は天然源(例えば癌細胞株)から誘導することができ、又は膜貫通分子を過剰発現させる組換え技術によって形質転換されている細胞でありうる。抗体調製のために有用な免役原の他の形態は当業者には明らかであろう。
【００４３】
別法として、ヒトＮｏｔｃｈ３レセプターをコードする遺伝子又はｃＤＮＡをプラスミド又は他の発現ベクター中にクローニングし、当業者によく知られている方法に従って多くの発現系の何れかにおいて発現させることができる。Ｎｏｔｃｈ３レセプター及びヒトＮｏｔｃｈ３レセプターに対する核酸配列をクローニングし発現させる方法は知られている(例えば米国特許第５８２１３３２号及び同第５７５９５４６号を参照)。遺伝コードが縮重しているので、Ｎｏｔｃｈ３レセプタータンパク質又はポリペプチドをコードする多数のヌクレオチド配列を使用できる。可能なコドン選択に基づき組合せを選択することによってヌクレオチド配列を変更できる。これらの組合せは、天然発生Ｎｏｔｃｈ３レセプターをコードするヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレット遺伝コードに従ってなされ、全てのそのような変形が考慮されうる。これらのポリペプチドの何れか一つが、ヒトＮｏｔｃｈ３レセプターに結合する抗体を生産するために動物の免疫化で使用されうる。
【００４４】
他の種からの組換えＮｏｔｃｈ３タンパク質もまた、Ｎｏｔｃｈ３のアミノ酸配列の保存性の高さにより、抗体生産のための免疫原として使用できる。ヒトとマウスのＮｏｔｃｈ３の比較では、２つの種の間で９０％を超えるアミノ酸配列同一性が示された。
【００４５】
免疫原Ｎｏｔｃｈ３レセプターは、有益な場合、融合セグメントに付着したＮｏｔｃｈ３レセプターを有する融合タンパク質として発現されうる。融合セグメントはしばしば、例えば融合タンパク質の単離及びアフィニティクロマトグラフィによる精製を可能にすることによるタンパク質精製に役立つが、免疫原性の増進にも使用できる。融合タンパク質は、タンパク質のカルボキシル及び／又はアミノ末端の何れかに付着した融合セグメントを含むタンパク質をコードする融合核酸配列で形質転換した組換え細胞を培養することで生産することができる。融合セグメントとしては、免疫グロブリンＦｃ領域、グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、二価金属イオンに結合可能なポリ-ヒスチジンセグメント、及びマルトース結合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
実施例１に記載の組換えＮｏｔｃｈ３レセプタータンパク質を使用してマウスを免疫化し、本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを生産した。例示的なポリペプチドは、配列番号１の全て又は一部、又はその変異形を含む。
【００４７】
抗体生産
本発明の抗体は、当該分野で周知のいかなる適切な方法により生産してもよい。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体を含みうる。ポリクローナル抗体の調製方法は、当業者に周知である(出典明示によりここに援用するHarlow等, Antibodies: a Laboratory Manual, Cold spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988))。
【００４８】
例えば、実施例１に記載の免疫原を様々な宿主動物、限定するものではないが例えばウサギ、マウス、ラット等に投与して、抗原に特異的なポリクローナル抗体を含む血清の生産を誘発してよい。免疫原の投与には、免疫剤、及び所望であればアジュバントの一又は複数の注入が伴いうる。宿主の種に応じて、免疫応答を増大するために様々なアジュバントが使用でき、限定するものではないが、フロイントアジュバント(完全及び不完全)、無機物ゲル、例えば水酸化アルミニウム、界面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、及び潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばＢＣＧ(カルメット・ゲラン桿菌)及びコリネバクテリウムパルバムを含む。使用されうるアジュバントの更なる例としては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコレート)が挙げられる。免疫化プロトコルは当該分野で周知であり、選択された動物宿主において免疫応答を引き起こすいかなる方法によっても実行できる。アジュバントもまた当該分野で周知である。
【００４９】
典型的に、免疫原(アジュバントあり又はなし)は、頻回皮下又は腹腔内注射、又は筋肉又は静脈注射により哺乳類に注入される。免疫原は、Ｎｏｔｃｈ３ポリペプチド、融合タンパク質、又はその変異体を含みうる。ポリペプチドの性質(つまり、疎水性パーセント、親水性パーセント、安定性、正味荷電、等電点等)に応じて、免疫化されている哺乳類において免疫原性であることが知られているタンパク質に免疫原をコンジュゲートすることが有用でありうる。かかるコンジュゲートは、共有結合が形成されるようにコンジュゲートすべき免疫原性タンパク質と免疫原の両方に活性化学官能基を誘導体化することによるか又は誘導タンパク質に基づいた手順を介した化学的コンジュゲート、又は当業者に周知の他の方法を含む。かかる免疫原性タンパク質の例としては、限定するものではないが、キーホールリンペットヘモシアニン、オボアルブミン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、ダイズトリプシンインヒビター、及び乱交雑Ｔヘルパーペプチドが挙げられる。上述したように、免疫応答を増大するために様々なアジュバントが使用されうる。
【００５０】
本発明の抗体は、モノクローナル抗体を含む。モノクローナル抗体は、単一抗原部位を認識する抗体である。それらの均一な特異性により、モノクローナル抗体は、通常多様な異なる抗原部位を認識する抗体を含むポリクローナル抗体よりはるかに有用である。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、例えばKohler等, Nature 256:495 (1975)；米国特許番号第４３７６１１０号； Harlow等, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988)及びHammerling等, Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier (1981)に記載のもの、組換えＤＮＡ法、又は当業者に周知の他の方法を用いて調製できる。モノクローナル抗体の生産に使用されうる他の方法の例としては、限定するものではないが、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kosbor等, Immunology Today 4:72 (1983)； Cole等, Proc Natl Acad Sci USA 80:2026 (1983))、及びＥＢＶハイブリドーマ技術(Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 77-96ページ, Alan R. Liss (1985))が挙げられる。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤを含む任意の免疫グロブリンクラス、及びそのサブクラスのものであってよい。本発明のＭＡｂを生産するハイブリドーマは、インビトロ又はインビボで培養されうる。
【００５１】
ハイブリドーマモデルにおいて、宿主、例えばマウス、ヒト化マウス、ヒト免疫系を有するマウス、ハムスター、ウサギ、ラクダ、又は任意の他の適切な宿主動物は免疫化され、免疫化に使用されたタンパク質に特異的に結合するであろう抗体を生産するか又は生産可能なリンパ球を誘導する。別法として、リンパ球はインビトロで免疫化されうる。リンパ球は次いで、ポリエチレングリコールといった適切な融合剤を用いて骨髄腫細胞に融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 59-103ページ (1986))。
【００５２】
通常、抗体生産ハイブリドーマの作製において、ヒト由来の細胞が所望される場合は末梢血リンパ球(ＰＢＬ)が使用され、又は非ヒト哺乳類源が所望される場合は脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。リンパ球は次いで、ポリエチレングリコールといった適切な融合剤を用いて不死化細胞株に融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 59-103ページ (1986))。不死化細胞株は通常、形質転換された哺乳類細胞、特にげっ歯類、ウシ又はヒト由来の骨髄腫細胞である。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは未融合の不死化細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地において培養されうる。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失している場合、ハイブリドーマ培地は典型的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防ぐ物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む(「ＨＡＴ培地」)。
【００５３】
好適な不死化細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体生産細胞による安定した高レベルの抗体生産を支援し、且つＨＡＴ培地といった培地に感受性があるものである。これらの骨髄腫細胞株としては、マウス骨髄腫株、例えばthe Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif.から入手可能なＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及びAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USAから入手可能なＳＰ２／０又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞由来のものがある。ヒト骨髄腫及びマウス-ヒトヘテロ骨髄腫細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の生産のために記載されている(Kozbor, J Immunol 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc, 51-63ページ (1987))。マウス骨髄腫細胞株ＮＳＯもまた使用されうる(European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wilshire, UK)。
【００５４】
ハイブリドーマ細胞が増殖する培地が、Ｎｏｔｃｈ３に対するモノクローナル抗体の生産のためにアッセイされる。ハイブリドーマ細胞により生産されたモノクローナル抗体の結合特性は、免疫沈降又はインビトロ結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)によって決定されうる。かかる技術は、当該分野及び当業者には周知である。Ｎｏｔｃｈ３に対するモノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析により決定できる(Munson等, Anal Biochem 107:220 (1980))。
【００５５】
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を生産するハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンは、限界希釈法によりサブクローニングされ、標準的な方法により増殖されうる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 59-103ページ (1986))。この目的に適切な培地としては例えば、ダルベッコ改変イーグル培地(Ｄ-ＭＥＭ)又はＲＰＭＩ-１６４０培地が挙げられる。また、ハイブリドーマ細胞は、動物の腹水腫瘍としてインビボで増殖してもよい。
【００５６】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えばプロテインＡセファロース、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィ、ゲル排除クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティクロマトグラフィにより、培地、腹水、又は血清から適切に分離又は単離される。
【００５７】
モノクローナル抗体の生産のための様々な方法が当該分野に存在し、よって、本発明はハイブリドーマでの生産のみに限定されるものではない。例えば、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第４８１６５６７号に記載のものによって作製されてよい。この文脈で「モノクローナル抗体」なる用語は、単一の真核生物、ファージ又は原核生物クローン由来の抗体を指す。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて(例えばマウス抗体、又はヒト、ヒト化又は他の起源からの重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブによって)(Innis等, In PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic (1990)；Sanger等, Proc Natl Acad Sci 74:5463 (1977))、容易に単離及び配列決定される。ハイブリドーマ細胞はかかるＤＮＡの源として役立つ。一旦単離されると、ＤＮＡは発現ベクター内に挿入され、該ベクターは次いで宿主細胞、例えば大腸菌細胞、ＮＳ０細胞、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又はそうでなければ免疫グロブリンタンパク質を生産しない骨髄腫細胞にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得る。ＤＮＡはまた、例えば相同なマウス配列を、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインをコードする配列に置換することによって(米国特許第４８１６５６７号；Morrison等, Proc Natl Acad Sci USA 81:6851 (1984))、或いは非免疫グロブリンポリペプチドをコードする配列の全て又は一部を、免疫グロブリンコード配列に共有結合することによって、修飾されうる。かかる非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインと置換可能か、又は本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインと置換可能で、キメラ二価抗体を作製できる。
【００５８】
抗体は一価抗体であってよい。一価抗体の調製方法は当該分野で周知である。例えば、ある方法は、免疫グロブリンの軽鎖及び修飾重鎖の組換え発現を伴う。重鎖は通常、重鎖の架橋を防ぐためにＦｃ領域の任意の点で切断される。或いは、重鎖の架橋を防ぐために、関連するシステイン残基が別のアミノ酸残基に置換されるか又は削除される。
【００５９】
特異的エピトープを認識する抗体断片は周知の技術によって生成されうる。伝統的には、これらの断片はインタクトな抗体のタンパク分解を介して誘導された(例えばMorimoto等, J Biochem Biophys Methods 24:107 (1992)；Brennan等, Science 229:81 (1985)を参照)。例えば本発明のＦａｂ及びＦ(ａｂ’)２断片は、酵素、例えば(Ｆａｂ断片の生産のために)パパイン、又は(Ｆ(ａｂ’)２断片の生産のために)ペプシンを用いて、免疫グロブリン分子のタンパク分解的切断により生産されうる。Ｆ(ａｂ’)２断片は、可変領域、軽鎖定常領域、及び重鎖のＣＨ１ドメインを含む。しかしながら、これらの断片は現在、組換え宿主細胞により直接生産できる。例えば、抗体断片は、抗体ファージライブラリから単離できる。或いは、Ｆ(ａｂ’)２-ＳＨ断片が、大腸菌から直接回収され、Ｆ(ａｂ’)２断片を形成するために化学的に結合できる(Carter等, Bio/Technology 10:163 (1992))。別法によると、Ｆ(ａｂ’)２断片は、組換え宿主細胞培養から直接単離できる。他の抗体断片生産技術は、当業者には明らかであろう。他の実施態様において、最適な抗体は単鎖Ｆｖ断片(Ｆｖ)である(国際公報第９３／１６１８５号)。
【００６０】
ヒトにおける抗体のインビボでの使用及びインビトロ検出アッセイを含む、いくつかの使用では、キメラ、ヒト化、又はヒト抗体の使用が好ましい。キメラ抗体は、抗体の複数の異なる部分が異なる動物種由来である分子、例えばマウスモノクローナル抗体由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを有する抗体である。キメラ抗体の生産方法は当該分野で周知である。例えば、出典明示によりここに援用するMorrison, Science 229:1202 (1985)；Oi等, BioTechniques 4:214 (1986)；Gillies等, J Immunol Methods 125:191 (1989)；米国特許第５８０７７１５号；同第４８１６５６７号；及び同第４８１６３９７号を参照。
【００６１】
ヒト化抗体は、動物由来のモノクローナル抗体よりもヒト免疫グロブリンに高い相同性を持つように設計される。ヒト化は、実質的に一以下のインタクトなヒト可変ドメインが非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体の作製技術である。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の一又は複数の相補性決定領域(ＣＤＲ)を有する所望の抗原と、ヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク(ＦＲ)領域とを結合する非ヒト種で生成される抗体分子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域のフレームワーク残基は、抗原結合を改変、好ましくは改良するためにＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基で置換される。これらのフレームワーク置換は、当該分野で周知の方法、例えば抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用のモデリング、及び特定の位置における異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較により、同定される。例えば、出典明示によりここに援用する米国特許第５５８５０８９号；Riechmann等, Nature 332:323 (1988)を参照。抗体は、例えばＣＤＲグラフト技術(欧州特許第２３９４００号；国際公報第９１／０９９６７号；米国特許第５２２５５３９号；同第５５３０１０１号；及び同第５，５８５０８９号)、ベニアリング(veneering)又はリサーフェシング(resurfacing)(欧州特許第５９２１０６号；欧州特許第５１９５９６号；Padlan, Molecular Immunology 28:489 (1991)；Studnicka等, Protein Engineering 7:805 (1994)；Roguska等, Proc Natl Acad Sci USA 91:969 (1994))、及び鎖シャフリング(chain shuffling)(米国特許第５５６５３３２号)を含む当該分野で周知の様々な技術を用いてヒト化可能である。
【００６２】
通常、ヒト化抗体は、非ヒト源から導入された一又は複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列をＣＤＲ配列に置換することにより、Winter及び共同研究者等の方法に従って基本的に実行可能である(Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536(1988))。よって、かかる「ヒト化」抗体は、実質的に一以下のインタクトなヒト可変ドメインが非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体である(米国特許第４８１６５６７号)。実際には、ヒト化抗体は典型的には、いくつかのＣＤＲ残基及び場合によってはいくらかのＦＲ残基がげっ歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
【００６３】
抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが更に重要である。この目標を達成するべく、好適な方法では、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における特定の残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。直接的かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼすのはＣＤＲ残基であるが、このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった望ましい抗体特性が最大化されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。
【００６４】
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を作製する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。例示的な一方法、いわゆる「ベストフィット法」では、非ヒト抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に非ヒト親抗体のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトＦＲとして受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。別の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導された特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを複数の異なるヒト化抗体に使用できる(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J. Immunol., 151:2623 (1993))。
【００６５】
ヒト患者の治療には完全なヒト抗体が特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリを用いて上述したファージディスプレイ法を含む当該分野で周知の様々な方法によって作製できる。米国特許第４４４４８８７号及び同第４７１６１１１号；及び国際公報第９８／４６６４５号、同第９８／５０４３３、同第９８／２４８９３、同第９８／１６６５４、同第９６／３４０９６、同第９６／３３７３５、及び同第９１／１０７４１も参照のこと。これらは出典明示によりここに援用する。Cole等及びBoerder等の技術もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である(Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Riss (1985)；及びBoerner等, J Immunol 147:86 (1991))。
【００６６】
ヒト抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンを発現できないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現できるトランスジェニックマウスを用いて生産することができる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体が、ランダムに又は相同的組換えにより、マウスＥＳ細胞に導入されうる。或いは、ヒト可変領域、定常領域、及び多様性領域が、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子に加えてマウスＥＳ細胞へ導入されてもよい。マウス重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同的組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入と別個に又は同時に非機能性を付与されうる。特に、ＪＨ領域のホモ接合体欠失は内因性抗体生産を防止する。改変ＥＳ細胞は、キメラマウスを生産するために伸長され胚盤胞に微量注入される。キメラマウスは次いで、ヒト抗体を発現するホモ接合型の子孫を生産するために交配される。例えばJakobovitis等, Proc Natl Acad Sci USA 90:2551 (1993)；Jakobovitis等, Nature 362:255 (1993)；Bruggermann等, Year in Immunol 7:33 (1993)；Duchosal等, Nature 355:258 (1992)を参照。トランスジェニックマウスは、選択された抗原、例えば本発明のポリペプチドの全て又は一部を用いて通常の手順で免疫化される。抗原に対するモノクローナル抗体が、従来のハイブリドーマ技術を用いて免疫化されたトランスジェニックマウスから得られる。トランスジェニックマウスに宿ったヒト免疫グロブリントランス遺伝子は、Ｂ細胞の分化中に再配列し、続いてクラススイッチと体細胞変異を遂げる。このように、かかる技術を用いて、治療的に有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、及びＩｇＥ抗体を生産することができる。ヒト抗体を生産するための当該技術の概要については、Lonberg等, Int Rev Immunol 13:65-93 (1995)を参照のこと。ヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体を生産するための当該技術及びかかる抗体を生産するためのプロトコルの詳細な考察については、例えば国際公報第９８／２４８９３号；同第９２／０１０４７号；同第９６／３４０９６号；同第９６／３３７３５号；欧州特許第０５９８８７７号；米国特許第５４１３９２３号；同第５６２５１２６号；同第５６３３４２５号；同第５５６９８２５号；同第５６６１０１６号；同第５５４５８０６号；同第５８１４３１８号；同第５８８５７９３号；同第５９１６７７１号；及び同第５９３９５９８号を参照のこと。これらは出典明示によりここに援用する。加えて、Abgenix, Inc. (Freemont, Calif.)、Genpharm (San Jose, Calif.)、及びMedarex, Inc. (Princeton, N.J.)といった企業が、上述したものと類似の技術を用いて、選択された抗原に対するヒト抗体を提供することに取り組みうる。
【００６７】
また、ヒトＭＡｂは、ヒト末梢血白血球、脾細胞、又は骨髄を移植されたマウスを免疫化することによって作製されうる(Trioma techniques of XTL)。選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「ガイド選択(guided selection)」と称される技術を用いて生産できる。このアプローチでは、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体を用いて、同一のエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択をガイドする(Jespers等, Bio/technology 12:899 (1988))。
【００６８】
更に、本発明のポリペプチドに対する抗体を使用して、次に、当業者に周知の技術を用いて本発明のポリペプチドを「模倣」する抗イディオタイプ抗体を生産することができる(例えばGreenspan等, FASEB J 7:437 (1989)；Nissinoff, J Immunol 147:2429 (1991)を参照)。例えば、リガンドに結合し、そしてポリペプチドのマルチマー化及び／又は本発明のポリペプチドのリガンドへの結合を競合的に阻害する抗体を使用して、ポリペプチドのマルチマー化及び／又はドメイン結合を「模倣」し、その結果ポリペプチド及び／又はそのリガンドに結合し不活性化する抗イディオタイプを生産できる。かかる不活性化抗イディオタイプ、又はかかるイディオタイプのＦａｂ断片は、ポリペプチドリガンドを不活性化する治療法で使用することができる。例えば、かかる抗イディオタイプ抗体を使用して、本発明のポリペプチドを結合及び／又はそのリガンド／レセプターを結合し、それによりその生物活性を遮断することができる。
【００６９】
本発明の抗体は二重特異性抗体であってよい。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に結合特異性を有するモノクローナル、好ましくはヒト又はヒト化抗体である。本発明では、結合特異性の一つはＮｏｔｃｈ３に対するものであり、もう一つは他の何らかの抗原に対するもの、好ましくは細胞表面タンパク質、レセプター、レセプターサブユニット、組織特異的抗原、ウィルス由来のタンパク質、ウィルスによりコードされた外膜タンパク質、バクテリア由来のタンパク質、又は細菌表面タンパク質等に対するものであってよい。
【００７０】
二重特異性抗体の作製方法は周知である。伝統的に、二重特異性抗体の組換え生産は、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖の対の共発現に基づき、ここで２つの重鎖は異なる特異性を有する(Milstein等, Nature 305:537 (1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダムな組合せのために、これらのハイブリドーマ(クアドローマ)は、１０の異なる抗体分子の潜在的な混合物を生産し、該分子の一つだけが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は通常、アフィニティクロマトグラフィ工程によりなされる。同様の手順が国際公報第９３／０８８２９号、及びTraunecker等, EMBO J 10:3655 (1991)に開示されている。
【００７１】
所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗体-抗原結合部位)を、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合することができる。ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合が好ましい。それは、融合の少なくとも一つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含む第一重鎖定常領域(ＣＨ１)を有しうる。免疫グロブリン重鎖融合、及び所望であれば免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡが、別個の発現ベクターに挿入され、適切な宿主生物に同時形質転換される。二重特異性抗体の生産の更なる詳細については、例えばSuresh等, Meth In Enzym 121:210 (1986)を参照。
【００７２】
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明で考えられる。ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。かかる抗体は例えば、免疫系細胞を不要な細胞に標的化するために提案されてきた(米国特許第４６７６９８０号)。該抗体は、架橋剤を伴うものを含む、合成タンパク質化学の周知の方法を用いたインビトロでの調製が考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を用いて又はチオエスエル結合を形成して、免疫毒素が構築されてよい。この目的のための適切な試薬の例としては、イミノチオレート、及びメチル-４-メルカプトブチルイミダート、及び例えば米国特許第４６７６９８０号に開示のものが挙げられる。
【００７３】
また、Ｎｏｔｃｈ３に対する単一ドメイン抗体を生産することができる。この技術の例は、ラクダ重鎖Ｉｇ由来の抗体に関する国際公報第９４／２５５９１号、並びにファージライブラリからの単一ドメイン完全ヒト抗体の単離を記載した米国特許公報第２００３／０１３０４９６号に記載されている。
【００７４】
重鎖及び軽鎖Ｆｖ領域が結合されているペプチド単鎖結合分子を生成することもできる。単鎖抗体(「ｓｃＦｖ」)及びそれらの構築方法は、米国特許第４９４６７７８号に記載されている。或いは、同様の手段によってＦａｂを構築及び発現することができる。全ての完全及び部分的ヒト抗体が、完全マウスＭＡｂよりも免疫原性が低く、断片及び単鎖抗体もまた免疫原性が低い。
【００７５】
抗体又は抗体断片は、McCafferty等, Nature 348:552 (1990)に記載の技術を用いて生成された抗体ファージライブラリから単離できる。Clarkson等, Nature 352:624 (1991)、及びMarks等, J Mol Biol 222:581 (1991)は、ファージライブラリを用いた、それぞれマウス抗体とヒト抗体の単離を記載している。続いて公開された文献は、鎖シャフリングによる高親和性(ｎＭ範囲)ヒト抗体の生産(Marks等, Bio/Technology 10:779 (1992))、並びに非常に大きなファージライブラリの構築方策としての組合せ感染(combinatorial infection)及びインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc Acids Res 21:2265 (1993))を記載している。よって、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術の実行可能な別法である。
【００７６】
ＤＮＡはまた、例えば相同なマウス配列を、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインをコードする配列に置換することによって修飾されうる(米国特許第４８１６５６７号；Morrison等, Proc Natl Acad Sci USA 81:6851 (1984))。
【００７７】
更なる別法は、化学融合ではなく電気融合を用いてハイブリドーマを形成することである。この技術は定着している。融合の代わりに、例えばエプスタイン・バー・ウィルス又は形質転換遺伝子を用いて、Ｂ細胞を形質転換し、それを不死化することもできる。例えば、“Continuously Proliferating Human Cell Lines Synthesizing Antibody of Predetermined Specificity,” Zurawaki, 等, in Monoclonal Antibodies, Kennett等編, Plenum Press, 19-33ページ (1980)を参照。抗Ｎｏｔｃｈ３ＭＡｂは、真核細胞系か原核細胞系の何れかにより発現されたＮｏｔｃｈ３タンパク質、融合タンパク質、又はその断片でげっ歯類(例えばマウス、ラット、ハムスター及びモルモット)を免疫化することによって作製できる。他の動物、例えば非ヒト霊長類、イムノグロブリンを発現するトランスジェニックマウス、及びヒトＢリンパ球を移植された重症複合免疫不全(ＳＣＩＤ)マウスを、免疫化に用いることができる。ハイブリドーマは、上述したように(Koehler等, Nature 256:495 (1975))免疫化動物からのＢリンパ球を骨髄腫細胞(例えばＳｐ２／０及びＮＳＯ)と融合することによって従来の手順で生成できる。更に、抗Ｎｏｔｃｈ３抗体は、ファージディスプレイ系におけるヒトＢリンパ球からの組換え単鎖Ｆｖ又はＦａｂライブラリのスクリーニングによって生成できる。Ｎｏｔｃｈ３に対するＭＡｂの特異性は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタン免疫ブロット法、又は他の免疫化学的技術によって試験できる。補体活性化に対する抗体の阻害活性は、古典的補体経路について感作されたチキン又はヒツジＲＢＣを用いて溶血アッセイにより評価できる。陽性ウェルのハイブリドーマは限界希釈法によりクローニングされる。抗体は、上述のアッセイにより、ヒトＮｏｔｃｈ３に対する特異性についての特徴付けのために精製される。
【００７８】
抗Ｎｏｔｃｈ３抗体の同定
本発明は、Ｎｏｔｃｈ３の作用を阻害及び中和するアンタゴニストモノクローナル抗体を提供する。特に、本発明の抗体は、Ｎｏｔｃｈ３に結合し、その活性を阻害する。本発明の抗体は、ここに開示される、２５６Ａ−４及び２５６Ａ−８と命名する抗体を含む。本発明はまた、これら抗体の一つと同じエピトープに結合する抗体を含む。
【００７９】
候補抗Ｎｏｔｃｈ３抗体を、酵素免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)、ウェスタン免疫ブロット法、又は他の免疫化学的技術によって試験した。個々の抗体を特徴付けるために実行したアッセイは実施例に記載する。
【００８０】
本発明の抗体は、限定するものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、一価、二重特異性、ヘテロコンジュゲート、多重特異性、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ(ａｂ’)断片、Ｆａｂ発現ライブラリにより生産された断片、抗イディオタイプ(抗Ｉｄ)抗体(例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む)、及び上述の何れかのエピトープ結合断片を含む。
【００８１】
抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体断片であってよく、限定するものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ(ａｂ’)２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ(ｓｄＦｖ)、及びＶＬ又はＶＨドメインの何れかを含む単一ドメイン抗体を含む。単鎖抗体などの抗原結合抗体断片は、単独の、或いはヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインの全体又は一部と結合した可変領域を含みうる。また本発明には、可変領域と、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとの何らかの結合を含む抗原結合断片も含まれる。本発明の抗体は、トリ及び哺乳類など動物由来のものであってよい、好適には、抗体は、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類(例えばマウス及びラット)、ゴリラ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、又はニワトリ由来のものである。
【００８２】
ここで使用する「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、そして、以下及びKucherlapati等による米国特許第５９３９５９８号に記載のように、内因性免疫グロブリンを発現しない一又は複数のヒト免疫グロブリントランスジェニック動物からか又は、ヒト免疫グロブリンライブラリから単離された抗体を含む。
【００８３】
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、又はそれ以上の多重特異性であってよい。多重特異性抗体は、Ｎｏｔｃｈ３の異なるエピトープに特異的であってよく、又はＮｏｔｃｈ３と異種エピトープ、例えば異種ポリペプチド又は固体担体物質の両方に特異的であってよい。例えば、国際公報第９３／１７７１５号；同第９２／０８８０２号；同第９１／００３６０号；同第９２／０５７９３号；Tutt等, J Immunol 147:60 (1991)；米国特許第４４７４８９３号；同第４７１４６８１号；同第４９２５６４８号；同第５５７３９２０号；同第５６０１８１９号；Kostelny等, J Immunol 148:1547 (1992)を参照のこと。
【００８４】
本発明の抗体は、それらが認識又は特異的に結合するＮｏｔｃｈ３のエピトープ又は部分に関して説明又は特定されうる。エピトープ又はポリペプチド部分は、本明細書に記載のように、例えばＮ末端及びＣ末端位置によって、隣接アミノ酸残基のサイズによって、又は表及び図面に掲載されたように、特定されうる。
【００８５】
本発明の抗体はまた、交差反応性に関して説明又は特定されうる。Ｎｏｔｃｈ３と少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、及び少なくとも５０%の同一性(当該分野で周知の方法を用いて計算され、及び本明細書に記載されたとおり)を有するＮｏｔｃｈ３ポリペプチドに結合する抗体もまた、本発明に含まれる。抗Ｎｏｔｃｈ３抗体はまた、約１０−７Ｍ以下、約１０−６Ｍ以下、約１０−５Ｍ以下のＫＤで他のタンパク質、例えば抗Ｎｏｔｃｈ３抗体が対象とするもの以外の種由来の抗Ｎｏｔｃｈ抗体と結合しうる。
【００８６】
特定の実施態様において、本発明の抗体は、ヒトＮｏｔｃｈ３のサル相同体、及び対応するそのエピトープと交差反応する。特定の実施態様において、上述の交差反応性は、何らかの単一特異的抗原性又は免疫原性ポリペプチド、又はここに開示した特異的抗原性及び／又は免疫原性ポリペプチドの組合せに関する。
【００８７】
更に、ストリンジェントなハイブリダイズ条件下でＮｏｔｃｈ３をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドを結合する抗体も本発明に含まれる。本発明の抗体はまた、本発明のポリペプチドに対するそれらの結合親和性に関して説明又は特定されうる。好適な結合親和性は、１０−８から１０−１５Ｍ、１０−８から１０−１２Ｍ、１０−８から１０−１０Ｍ、又は１０−１０から１０−１２ＭのＫＤ又は平衡解離定数を有するものを含む。本発明はまた、競合的結合を決定するための当該分野で周知の任意の方法、例えばここに記載のイムノアッセイによって決定されるような、本発明のエピトープに対する抗体の結合を競合的に阻害する抗体を提供する。好適な実施態様では、抗体は、エピトープに対する結合を少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、又は少なくとも５０%、競合的に阻害する。
【００８８】
ベクター及び宿主細胞
別の態様において、本発明は、ここに開示の抗体をコードする単離された核酸配列、本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列を含むベクターコンストラクト、かかるベクターを含む宿主細胞、及び抗体を生産するための組換え技術を提供する。
【００８９】
抗体の組換え生産のために、それをコードする核酸が単離され、更なるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製ベクターに挿入される。抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順で(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いて)容易に単離及び配列決定される。クローニング及び形質転換のための標準的な技術が、本発明の抗体を発現する細胞株の調製に使用されうる。
【００９０】
ベクター
多くのベクターが利用できる。ベクター成分は通常、限定するものではないが、以下のもの：シグナル配列、複製起点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列の一又は複数を含む：。本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターは、周知の技術を用いて調製できる。発現ベクターは、適切な転写又は翻訳制御ヌクレオチド配列、例えば哺乳類、微生物、ウィルス、又は昆虫遺伝子由来のものに作用可能に連結されたヌクレオチド配列を含む。制御配列の例としては、転写プロモーター、オペレーター、エンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、及び／又は転写及び翻訳の開始及び終結を制御する他の適切な配列が挙げられる。ヌクレオチド配列は、制御配列が適切なポリペプチドのヌクレオチド配列と機能的に関連するとき「作用可能に連結」する。このように、プロモーターヌクレオチド配列は、該配列が適切なヌクレオチド配列の転写を制御する場合、例えば抗体重鎖配列と作用可能に連結する。
【００９１】
また、抗体重鎖及び／軽鎖配列を天然には伴わない適切なシグナルペプチドをコードする配列を、発現ベクターに組込むことができる。例えば、抗体がペリプラズム空間又は培地に分泌されるように、シグナルペプチド(分泌リーダー)のヌクレオチド配列をインフレームでポリペプチド配列に融合してよい。意図した宿主細胞において機能的なシグナルペプチドが、適切な抗体の細胞外分泌を増進する。シグナルペプチドは、細胞からの抗体の分泌時にポリペプチドから切断されうる。かかる分泌シグナルの例は周知で、例えば米国特許第５６９８４３５；同第５６９８４１７号；及び同第６２０４０２３号を含む。
【００９２】
ベクターは、プラスミドベクター、一本鎖又は二本鎖ファージベクター、又は一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡウィルスベクターであってよい。かかるベクターは、ＤＮＡ及びＲＮＡを細胞に導入する周知の技術によって、ポリヌクレオチドとして細胞に導入されうる。ファージ及びウィルスベクターの場合、ベクターはまた、周知の感染及び形質導入技術によって、パッケージ化又はカプセル化されたウィルスとして細胞に導入されうる。ウィルスベクターは、複製可能又は複製欠損であってよい。後者の場合、ウィルス増殖は通常、相補宿主細胞でのみ起こる。また、無細胞翻訳系を利用して、本ＤＮＡコンストラクト由来のＲＮＡを用いてタンパク質を生産してもよい。かかるベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含んでよく(国際公報第８６／０５８０７及び同第８９／０１０３６号；及び米国特許第５１２２４６４号)、抗体の可変ドメインが、完全重鎖又は軽鎖の発現のためにかかるベクターにクローニングされうる。
【００９３】
宿主細胞
本発明の抗体は、任意の適切な宿主細胞から発現できる。本発明で有用な宿主細胞の例としては、原核、酵母、又は高等真核細胞が挙げられ、及び、限定するものではないが、抗体コード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換されたバクテリア(例えば大腸菌、枯草菌)といった微生物；抗体コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母(例えばサッカロミセス、ピチア)；抗体コード配列を含む組換えウィルス発現ベクター(例えばバキュロウィルス)で感染させた昆虫細胞系；組換えウィルス発現ベクター(例えばカリフラワーモザイクウィルス，ＣａＭＶ；タバコモザイクウィルス，ＴＭＶ)で感染させた、又は抗体コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター(例えばＴｉプラスミド)で形質転換した植物細胞系；又は哺乳類細胞のゲノム由来のプロモーター(例えばメタロチオネインプロモーター)又は哺乳類ウィルス由来のプロモーター(例えばアデノウィルス遅発性プロモーター；ワクシニアウィルス７．５Ｋプロモーター)を含む組換え発現コンストラクトを内部に持つ哺乳類細胞系(例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞)が含まれる。
【００９４】
本発明の宿主細胞として有用な原核生物は、グラム陰性又はグラム陽性の生物、例えば大腸菌、枯草菌、エンテロバクター、エルウィニア、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、セラチア、赤痢菌、並びにバシラス、シュードモナス、及びストレプトマイセスを含む。一つの好適な大腸菌クローニング宿主は、大腸菌２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)であるが、他の株、例えば大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１５３７)、及び大腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７３２５)も適切である。これらの例は、限定するものではなく例示的なものである。
【００９５】
原核宿主細胞で使用する発現ベクターは通常、一又は複数の表現型選択可能マーカー遺伝子を含む。表現型選択可能マーカー遺伝子は例えば、抗生物質耐性を付与するか又は独立栄養要件を満たすタンパク質をコードする遺伝子である。原核宿主細胞のための有用な発現ベクターの例としては、市販のプラスミド由来のベクター、例えばｐＫＫ２２３−３(Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden)、ｐＧＥＭ１(Promega Biotec, Madison, Wisconsin., USA)及びｐＥＴ(Novagen, Madison, Wisconsin, USA)、及びｐＲＳＥＴ(Invitrogen, Carlsbad, CA)シリーズのベクター(Studier, J Mol Biol 219:37 (1991)；Schoepfer, Gene 124:83 (1993))が挙げられる。組換え原核宿主細胞発現ベクターに一般的に使用されるプロモーター配列は、Ｔ７(Rosenberg等, Gene 56:125 (1987))、βラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)、ラクトースプロモーター系(Chang等, Nature 275:615 (1978)；Goeddel等, Nature 281:544 (1979))トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系(Goeddel等, Nucl Acids Res 8:4057 (1980))、及びｔａｃプロモーター(Sambrook等, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1990))を含む。
【００９６】
本発明で有用な酵母又は糸状菌としては、サッカロミセス、ピチア、放線菌類、クルイベロミセス、シゾサッカロミセス、カンジダ、トリコデルマ、アカパンカビ、及び糸状菌、例えばアカパンカビ、ペニシリウム、トリポクラディウム、及びアスペルギルス由来のものが挙げられる。酵母ベクターは多くの場合、２μ酵母プラスミドからの複製起点配列、自己複製配列(ＡＲＳ)、プロモーター領域、ポリアデニル化配列、転写終結配列、選択可能マーカー遺伝子を含む。酵母ベクターの適切なプロモーター配列は、特に、メタロチオネイン、３-ホスホグリセリン酸キナーゼ(Hitzeman,等, J Biol Chem 255:2073 (1980))、又は他の糖分解酵素(Holland等, Biochem 17:4900 (1978))、例えばエノラーゼ、グリセロアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、及びグルコキナーゼのプロモーターを含む。酵母発現での使用に適切な他のベクター及びプロモーターは更に、Fleer等, Gene 107:285 (1991)に記載されている。酵母及び酵母形質転換プロトコルのための他の適切なベクター及びプロモーターは当該分野で周知である。酵母形質転換プロトコルは周知である。かかるプロトコルの一つは、Hinnen等, Proc Natl Acad Sci 75:1929 (1978)に記載されている。Ｈｉｎｎｅｎプロトコルは、選択培地におけるＴｒｐ＋形質転換体について選択する。
【００９７】
また、哺乳類又は昆虫宿主細胞培養系を利用して、組換え抗体を発現してもよい。原則的に、脊椎動物細胞由来でも又は非脊椎動物細胞由来でも、いかなる高等真核細胞培養も有効である。非脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞(Luckow等, Bio/Technology 6:47 (1988)；Miller等, Genetics Engineering, Setlow等編. Vol. 8, 277-9ページ, Plenam Publishing (1986)；Mseda等, Nature 315:592 (1985))が挙げられる。例えば、異種タンパク質の生産のためにバキュロウィルス系が使用されうる。昆虫系では、-オートグラファカリフォルニカ(Autographa californica)核多角体病ウィルス(ＡｃＮＰＶ)が、外来遺伝子の発現のためのベクターとして使用されうる。該ウィルスは、スポドプテラフルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞で増殖する。抗体コード配列は、ウィルスの非必須領域(例えばポリヘドリン遺伝子)に個々にクローニングされ、ＡｃＮＰＶプロモーター(例えばポリヘドリンプロモーター)の制御下に置かれうる。同定された他の宿主は、ネッタイシマカ、キイロショウジョウバエ、及びカイコを含む。トランスフェクションのための様々なウィルス株が、例えばＡｃＮＰＶのＬ-１変異体、及びカイコＮＰＶのＢｍ-５株など公的に入手可能で、かかるウィルスは、特にスポドプテラフルギペルダ細胞のトランスフェクションのために本発明に従ってここでのウィルスとして使用できる。更に、綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコの植物細胞培養もまた宿主として利用される。
【００９８】
培養(組織培養)における脊椎動物細胞、及び脊椎動物細胞の増殖は常法となっている。Tissue Culture, Kruse等編, Academic Press (1973)を参照。有用な哺乳類宿主細胞株の例は、サル腎臓；ヒト胚腎臓株；ベビーハムスター腎細胞；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))；マウスセルトリ細胞；ヒト子宮頸癌細胞(ＨＥＬＡ)；イヌ腎細胞；ヒト肺細胞；ヒト肝細胞；マウス乳房腫瘍；及びＮＳ０細胞である。
【００９９】
宿主細胞は、抗体生産のために上述のベクターで形質転換され、プロモーターの導入、転写及び翻訳制御配列、形質転換細胞の選択、又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適当に改変された従来の栄養培地で培養される。通常使用されるプロモーター配列及びハンハンサー配列は、ポリオーマウィルス、アデノウィルス２、シミアンウィルス４０(ＳＶ４０)、及びヒトサイトメガロウィルス(ＣＭＶ)由来である。例えばＳＶ４０由来の早期及び後期プロモーター、エンハンサー、スプライス、及びポリアデニル化部位といったＳＶ４０ウィルスゲノム由来のＤＮＡ配列を用いて、哺乳類宿主細胞における構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝要素が提供されうる。ウィルス早期及び後期プロモーターは、何れもウィルス複製起点も含みうる断片としてウィルスゲノムから容易に得られるため、特に有用である。哺乳類宿主細胞で使用するための例示的な発現ベクターは、市販されている。
【０１００】
本発明の抗体の生産に使用される宿主細胞は、様々な培地で培養されうる。ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(Sigma, St Louis, MO)、最小必須培地(MEM, Sigma, St Louis, MO)、ＲＰＭＩ-１６４０(Sigma, St Louis, MO)及びダルベッコの改良イーグル培地(DMEM, Sigma, St Louis, MO)といった市販の培地が宿主細胞の培養に適している。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979)、Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980)、及び米国特許第４７６７７０４号；同第４６５７８６６号；同第４５６０６５５号；又は同第５１２２４６９号；５７１２１６３号；同第６０４８７２８号に記載された何れの培地も宿主細胞のための培地として使用できる。これらの培地には何れも、ホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン又は表皮成長因子)、塩類(例えばＸ塩化物、ここでＸはナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩である)バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えばＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)、及びグルコース又は等価なエネルギー源を、必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた、当業者であればわかる適当な濃度で含まれてよい。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【０１０１】
抗体をコードするポリヌクレオチド
本発明は更に、本発明の抗体及びその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド又は核酸、例えばＤＮＡを提供する。例示的なポリヌクレオチドとしては、ここに記載の一又は複数のアミノ酸配列を含む抗体鎖をコードするものが挙げられる。本発明はまた、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドにストリンジェントな又はより低いストリンジェンシーのハイブリダイズ条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドも包含する。
【０１０２】
当該分野で周知の任意の方法によって、ポリヌクレオチドが得られ、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定されうる。例えば、抗体のヌクレオチド配列は周知で、抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学合成されたオリゴヌクレオチドからアセンブルされ(例えばKutmeier等, Bio/Techniques 17:242 (1994)に記載のように)、これにはつまり、抗体をコードする配列の部分を含む重複オリゴヌクレオチドの合成、これらのオリゴヌクレオチドのアニール及びライゲート、及びそれに続くライゲートされたオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅が伴う。
【０１０３】
或いは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な源からの核酸から生成されうる。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンが入手できないが、その抗体分子の配列がわかっている場合、配列の３’及び５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを用いたＰＣＲ増幅によって、又は抗体をコードするｃＤＮＡライブラリから例えばｃＤＮＡクローンを同定するために特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いてクローニングすることによって、免疫グロブリンをコードする核酸を、適切な源(例えば、本発明の抗体を発現するために選択されたハイブリドーマ細胞など抗体を発現する任意の細胞又は組織から生成されたｃＤＮＡライブラリ又は抗体ｃＤＮＡライブラリ、又はそれから単離された核酸、好適にはポリＡ＋ＲＮＡ)から得るか又は化学合成することができる。
【０１０４】
抗体のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列が決定されると、抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作に関して当該分野で周知の方法、例えば組換えＤＮＡ技術、部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲなど(例えば、出典明示によりここに援用するSambrook等, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1990)；Ausubel等編, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1998)を参照)を用いて、例えばアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を生成するため、異なるアミノ酸配列を有する抗体を生産するために操作されうる。
【０１０５】
特定の実施態様において、周知の方法、例えばわかっている重鎖及び軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と比較して配列超可変領域を決定することによって、重鎖及び／又は軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を調べてＣＤＲの配列を同定することができる。常法の組換えＤＮＡ技術を用いて、上述したように、一又は複数のＣＤＲを、フレームワーク領域内で、ヒトフレームワーク領域に挿入し非ヒト抗体をヒト化できる。フレームワーク領域は、天然に発生したものか、コンセンサスフレームワーク領域であってよく、好ましくはヒトフレームワーク領域である(ヒトフレームワーク領域の一覧については例えばChothia等, J Mol Biol 278: 457 (1998)を参照)。好適には、フレームワーク領域とＣＤＲの組合せにより生成されたポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体をコードする。好適には、上述したように、一又は複数のアミノ酸置換がフレームワーク領域内でなされ、好ましくは、アミノ酸置換は抗体の抗原への結合を向上する。また、かかる方法を用いて、内鎖ジスルフィド結合に関与する一又は複数の可変領域システイン残基のアミノ酸置換又は欠失を行い、一又は複数の内鎖ジスルフィド結合を欠いた抗体分子を生成することもできる。ポリヌクレオチドへの他の改変も本発明及び当該分野の範囲内である。
【０１０６】
また、適切な抗原特異性を持つマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物活性を持つヒト抗体分子由来の遺伝子とともにスプライスすることによる「キメラ抗体」の生産のために開発された技術(Morrison等, Proc Natl Acad Sci 81:851 (1984)；Neuberger等, Nature 312:604 (1984)； Takeda等, Nature 314:452 (1985))を用いることができる。上述したように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種由来である分子、例えばマウスＭＡｂ由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを有するもの、例えばヒト化抗体である。
【０１０７】
或いは、単鎖抗体の生産について記載された技術(米国特許第４９４６７７８号；Bird, Science 242:423 (1988)；Huston等, Proc Natl Acad Sci USA 85:5879 (1988)；及びWard等, Nature 334:544 (1989))を、単鎖抗体の生産に適応することができる。単鎖抗体は、アミノ酸を介してＦｖ領域の重鎖及び軽鎖断片を結合することによって形成され、単鎖ポリペプチドがもたらされる。大腸菌における機能的Ｆｖ断片のアセンブリ技術もまた使用されうる(Skerra等, Science 242:1038 (1988))。
【０１０８】
抗Ｎｏｔｃｈ３抗体の生産方法
本発明の抗体は、抗体合成のための当該分野で周知の任意の方法によって、特に化学合成によって、又は好ましくは組換え発現技術によって生産できる。
【０１０９】
本発明の抗体、その断片、誘導体、又はアナログ(例えば本発明の抗体又は本発明の単鎖抗体の重鎖又は軽鎖)の組換え発現は、抗体又は抗体断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築を必要とする。抗体分子をコードするポリヌクレオチドが一旦得られると、抗体生産のためのベクターが組換えＤＮＡ技術によって生産されうる。抗体コード配列及び適切な転写及び翻訳制御シグナルを含む発現ベクターが構築される。これらの方法には、例えばインビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びインビボ遺伝子組換えが含まれる。
【０１１０】
発現ベクターは従来技術により宿主細胞に伝達され、トランスフェクトされた細胞は次いで、本発明の抗体を生産するために従来技術により培養される。本発明の一態様において、重鎖及び軽鎖の両方をコードするベクターは、以下に詳述するように、完全な免疫グロブリン分子の発現のために宿主細胞で共発現されうる。
【０１１１】
様々な宿主発現ベクター系が、上述したような本発明の抗体分子を発現するために利用されうる。かかる宿主発現系は、対象のコード配列を生成し続いて精製しうる担体を表すが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換又はトランスフェクトされるとインシチュで本発明の抗体分子を発現しうる細胞も表す。細菌性細胞、例えば大腸菌、及び真核細胞が、組換え抗体分子の発現、特に完全組換え抗体分子の発現のために一般にしようされる。例えば、ヒトサイトメガロウィルスからの主要中間体初期遺伝子プロモーター要素といったベクターと併用される、ＣＨＯなどの哺乳類細胞が、抗体の効果的な発現系である(Foecking等, Gene 45:101 (1986)；Cockett等, Bio/Technology 8:2 (1990))。
【０１１２】
また、挿入された配列の発現を調節するか、又は所望の特定の形態に遺伝子産物を修飾及びプロセシングする宿主細胞株が選ばれてよい。タンパク質産物のかかる調節(例えばグリコシル化)及びプロセシング(例えば切断)は、タンパク質の機能にとって重要でありうる。様々な宿主細胞が、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシング及び修飾のための特徴的及び特異的メカニズムを持つ。適切な細胞株又は宿主系を選んで、発現された異種タンパク質の正しい修飾及びプロセシングを確認することができる。このために、遺伝子産物のリン酸化、グリコシル化、及び一次転写産物の適正なプロセシングのための細胞機構を有する真核生物宿主細胞が用いられうる。かかる哺乳類宿主細胞は、限定するものではないが、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、３Ｔ３、又は骨髄腫細胞を含む。
【０１１３】
組換えタンパク質の長期の高収率生産のためには、安定した発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定して発現する細胞株が作出されうる。ウィルス複製起点を含む発現ベクターを用いる以外に、宿主細胞を、選択可能マーカー、及び適切な発現制御因子(例えばプロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等)で制御されたＤＮＡで形質転換できる。外来ＤＮＡの導入後、作出された細胞は強化培地で一日から２日間増殖され、次いで選択的培地に移される。組換えプラスミドの選択可能マーカーにより、選択に耐性が付与され、そして細胞は、安定にプラスミドをそれらの染色体に組込むことができ、且つクローニングされ及び細胞株に拡充されうる増殖巣を形成するために増殖することができる。当該方法は、抗体分子を発現する細胞株を作出するために有利に使用されうる。このように作出された細胞株は、抗体分子と直接又は非直接的に相関する化合物のスクリーニング及び評価に特に有用でありうる。
【０１１４】
多くの選択系が使用されてよく、限定するものではないが、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ(Wigler等, Cell 11:223 (1977))、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska等, Proc Natl Acad Sci USA 48:202 (1992))、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy等, Cell 22:817 (1980))遺伝子がそれぞれ、ｔｋ、ｈｇｐｒｔ又はａｐｒｔ細胞で使用されうる。また、代謝拮抗物質耐性が、以下の遺伝子：メトトレキセートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ(Wigler等, Proc Natl Acad Sci USA 77:357 (1980)；O'Hare等, Proc Natl Acad Sci USA 78:1527 (1981))；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ(Mulligan等, Proc Natl Acad Sci USA 78:2072 (1981))；アミノグリコシドＧ４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ(Wu等, Biotherapy 3:87 (1991))；及びハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ(Santerre等, Gene 30:147 (1984))についての選択基準として利用できる。組換えＤＮＡ技術の当該分野で一般に知られた方法が、所望の組換えクローンの選択に常套的に適用され、かかる方法は例えば、出典明示によりここに援用するAusubel等編, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1993)；Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press (1990)；及びChapters 12及び13, Dracopoli等編, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons (1994)；Colberre-Garapin等, J Mol Biol 150:1 (1981)に記載されている。
【０１１５】
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅(概説については、Bebbington等, "The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells," DNA Cloning, Vol.3. Academic Press (1987)を参照)により上昇できる。抗体を発現するベクター系のマーカーが増幅可能な場合、宿主細胞の培養に存在するインヒビターのレベル上昇は、マーカー遺伝子のコピー数を増加させることになる。増幅された領域は抗体遺伝子と関連するので、抗体の生産もまた増加する(Crouse等, Mol Cell Biol 3:257 (1983))。
【０１１６】
宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクター、重鎖由来ポリペプチドをコードする第一のベクター及び軽鎖由来ポリペプチドをコードする第二のベクターをコトランスフェクトされうる。２つのベクターは、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの均一な発現を可能にする同一の選択可能マーカーを含みうる。或いは、重鎖及び軽鎖ポリペプチドをコードし且つそれを発現することができる単一のベクターを用いてもよい。かかる状況において、軽鎖は、過剰な毒性自由重鎖を回避するために重鎖の前に配置すべきである(Proudfoot, Nature 322:52 (1986)；Kohler, Proc Natl Acad Sci USA 77:2197 (1980))。重鎖及び軽鎖のコード配列はｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを含みうる。
【０１１７】
本発明の抗体分子は、一旦動物により生産されるか、化学合成されるか、又は組換え技術により発現されると、免疫グロブリン分子精製のための当該分野で周知の任意の方法によって、例えばクロマトグラフィ(例えば、イオン交換、アフィニティ、プロテインＡ後の特定の抗原についてのアフィニティ、及びサイズ排除クロマトグラフィ)、遠心分離、分別溶解、又は任意の他の標準的なタンパク質精製技術によって、精製されうる。また、本発明の抗体又はその断片は、精製を容易にするために、ここに記載しているか又は当該分野で知られた異種ポリペプチド配列に融合できる。
【０１１８】
本発明は、ポリペプチドに組換え技術により融合されたか又は化学的にコンジュゲート(共有及び非共有コンジュゲートの両方を含む)された抗体を包含する。本発明の融合又はコンジュゲート抗体は、精製を用意にするために使用されうる。例えば、出典明示によりここに援用する、国際公報第９３／２１２３２；欧州特許第４３９０９５号；Naramura等, Immunol Lett 39:91 (1994)；米国特許第５４７４９８１号；Gillies等, Proc Natl Acad Sci USA 89:1428 (1992)；Fell等, J Immunol 146:2446 (1991)を参照のこと。
【０１１９】
更に、本発明の抗体又はその断片は、精製を容易にするためにマーカー配列、例えばペプチドに融合できる。好適な実施態様において、マーカーアミノ酸配列はヘキサヒスチジンペプチド、例えば多くが市販されているもののなかでも特にｐＱＥベクター(QIAGEN, Inc., Valencia, CA)において供給されるタグである。Gentz等, Proc Natl Acad Sci USA 86:821 (1989)に記載のように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製に役立つ。精製に有用な他のペプチドタグとしては、限定するものではないが、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応する「ＨＡ」タグ(Wilson等, Cell 37:767 (1984))及び「ｆｌａｇ」タグが挙げられる。
【０１２０】
抗体精製
組換え技術を利用する場合、抗体は、細胞内のペリプラズム空間に生産するか、又は培地に直接分泌することができる。抗体が細胞内で生産される場合、第一工程として、微粒子状破片、宿主細胞か溶解断片のいずれか、が例えば遠心分離又は限外ろ過によって除去されうる。Carter等, Bio/Technology 10:163 (1992)に、大腸菌のペリプラズム空間に分泌される抗体を単離する手順が記載されている。簡潔には、細胞ペーストが酢酸ナトリウム(ｐＨ３．５)、ＥＤＴＡ、及びフッ化フェニルメチルスルホニル(ＰＭＳＦ)の存在下で約３０分以上溶解される。細胞破片は遠心分離により除去できる。抗体が培地に分泌されると、通常、かかる発現系からの上清が、市販のタンパク質収集フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過ユニットを用いてまず収集される。ＰＭＳＦといったプロテアーゼインヒビターが、タンパク質分解を阻害するために前述の工程のいずれかに含まれてよく、そして抗生物質が、外来性汚染物質の増殖を防止するために含まれてよい。
【０１２１】
細胞から調製された抗体組成物は、例えばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティクロマトグラフィを用いて精製することができ、アフィニティクロマトグラフィが好適な精製技術である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体に存在する何らかの免疫グロブリンＦｃドメインのアイソタイプ及び種に依存する。プロテインＡは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる(Lindmark等, J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983))。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトＩｇＧ３に推奨されている(Guss等, EMBO J. 5: 15671575 (1986))。アフィニティリガンドが結合されるマトリックスはアガロースであることが最も多いが、他のマトリックスも使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸＴＭ樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)が精製に有用である。イオン交換カラムによる分画化、エタノール沈降、逆相ＨＰＬＣ、シリカによるクロマトグラフィ、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭによるクロマトグラフィ、アニオン-又はカチオン-交換樹脂(ポリアスパラギン酸カラム等)によるクロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈降といった他のタンパク質精製技術もまた、回収すべき抗体に応じて利用可能である。
【０１２２】
任意の予備精製工程に続いて、対象とする抗体と汚染物質とを含む混合物に、約２．５−４．５のｐＨでの溶出バッファーを用いて、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィを施してもよく、これは好ましくは低い塩濃度(例えば約０−０．２５Ｍ塩)で実施される。
【０１２３】
医薬製剤
ポリペプチド又は抗体の治療製剤は、所定の純度を持つポリペプチドを、当該分野で典型的に用いられる任意の「製薬的に許容される」担体、賦形剤又は安定化剤、つまり緩衝剤、安定化剤、保存料、等張化剤、非イオン性洗浄剤、酸化防止剤及び他の添加剤と混合することにより凍結乾燥製剤又は水溶液として調製され保存されうる。Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Osol編, (1980)を参照。このような添加剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性でなければならない。
【０１２４】
緩衝剤は、ｐＨを生理学的条件近傍に維持するのを助ける。それらは、約２ｍＭから約５０ｍＭの範囲の濃度で存在する。本発明での使用に適した緩衝剤は、有機及び無機酸の両方及びその塩、例えば、クエン酸塩バッファー(例えば、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物など)、コハク酸塩バッファー(例えば、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物など)、酒石酸塩バッファー(例えば、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物など)、フマル酸塩バッファー(例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物など)、グルコン酸塩バッファー(例えば、グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物など)、シュウ酸塩バッファー(例えば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物など)、乳酸塩バッファー(例えば、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物など)、及び酢酸塩バッファー(例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物など)を含む。更に、リン酸バッファー、ヒスチジンバッファー、及びトリス等のトリメチルアミン塩が挙げられる。
【０１２５】
保存料は、微生物増殖を抑制するために添加されてよく、０．２％−１％(ｗ／ｖ)の範囲の量で添加されてよい。本発明での使用に適した保存料は、フェノール、ベンジルアルコール、メタ-クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ハロゲン化ベンザルコニウム(例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物)、塩化ヘキサメトニウム、及びアルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、及び３-ペンタノールを含む。
【０１２６】
等張化剤は「安定化剤」としても知られ、本発明の液体組成物の等張性を確保するために存在し、多価糖アルコール、好ましくは三価又はそれ以上の糖アルコール、例えばグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトールを含む。
【０１２７】
安定化剤は、機能が充填剤から、治療薬を可溶化するか又は変性又は容器壁面への付着の防止を助ける添加剤までに及ぶ、大きな部類の賦形剤を指す。典型的な安定化剤は、多価糖アルコール(上で列挙した)；アミノ酸、例えばアルギニン、リシン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ-ロイシン、２-フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンら、有機糖又は糖アルコール、例えばラクトース、トレハロース、スタキオース(stachyose)、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール、ガラクチトール、グリセロールら、イノシトール等のシクリトールを含む；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；イオウ含有還元剤、例えば尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸、チオグリセロール、α-モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウム；低分子量ポリペプチド(＜約１０残基)；ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース等の単糖類；ラクトース、マルトース、スクロース等の二糖類；ラフィノース等の三糖類；及びデキストラン等の多糖類とすることができる。安定化剤は、活性タンパク質重量部当たり０．１から１０，０００重量の範囲で存在しうる。
【０１２８】
非イオン性界面活性剤又は洗浄剤(「湿潤剤」としても知られる)は、治療薬の可溶化を助けるため、並びに撹拌に誘発される凝集に抗して治療用タンパク質を保護するために添加されてよく、これはまた、製剤をタンパク質変性することなく応力のかかった剪断表面に暴露するのを可能にする。適切な非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート(２０、８０等)、ポロキサマー(１８４、１８８等)、プルロニック(Pluronic)(登録商標)ポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル(Ｔｗｅｅｎ-２０(登録商標)、Ｔｗｅｅｎ-８０(登録商標)等)を含む。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍｌから約１．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０７ｍｇ／ｍｌから約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲で存在しうる。
【０１２９】
更なる種々の賦形剤は、充填剤(例えばデンプン)、キレート化剤(例えばＥＤＴＡ)、酸化防止剤(例えばアスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ)及び共溶媒を含む。ここで製剤は、治療すべき特定の症状の必要に応じて一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものを含有してもよい。例えば、免疫抑制剤を更に提供するのが望ましい場合がある。このような分子は、意図する目的に有効な量で組み合わせて適切に存在させる。また活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれコロイド状薬物送達システム(例えば、リポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルションの、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセルに封入されていてもよい。これらの技術はRemington's Pharmaceutical Sciences, 16版, Osal編 (1980)に開示されている。
【０１３０】
インビボ投与に用いられる製剤は無菌でなければならない。これは、例えば除菌膜を介したろ過によって容易に達成される。持続放出製剤を調製することもできる。持続放出製剤の適切な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、当該マトリックスは造形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール)、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号)、Ｌ-グルタミン酸とエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-ビニル酢酸塩、非分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴＴＭ(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能なミクロスフィア)、及びポリ-Ｄ-(−)-３-ヒドロキシブチル酸が含まれる。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸等のポリマーは、１００日を越えて分子を放出することを可能にするが、ある種のヒドロゲルはより短期間しかタンパク質を放出しない。カプセル化抗体が体内に長時間滞在すると、それらは３７℃の水分に暴露された結果、変性又は凝集して生物活性の喪失、及び場合によっては免疫原性の変化を起こすことがある。関連するメカニズムに応じて、安定化のために合理的な方策が考えられる。例えば、凝集メカニズムがチオ‐ジスルフィド交換を通した細胞間Ｓ--Ｓ結合形成であることが見出された場合、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分の制御、適当な添加剤の使用、及び特定のポリマーマトリックス組成の開発によって安定化が達成されうる。
【０１３１】
特定の疾患又は状態の治療において有効な治療用ポリペプチド、抗体又はその断片の量は、疾患又は状態の性質に依存し、標準的な臨床技術により決定できる。可能ならば、最初にインビトロで、次いでヒトにおける試験の前に有用な動物モデル系で本発明の製薬組成物についての用量−応答曲線を決定することが望ましい。
【０１３２】
好ましい実施態様では、治療用ポリペプチド、抗体又はその断片の水溶液が皮下注射によって投与される。各用量は体重１ｋｇ当たりに約０．５μｇから約５０μｇ、より好ましくは体重１ｋｇ当たりに約３μｇから約３０μｇの範囲であってよい。
【０１３３】
皮下投与の投薬スケジュールは、疾患の種類、疾患の重篤さ、及び治療薬に対する患者の感受性を含む複数の臨床学的因子に応じて、月に１回から毎日変更されうる。
【０１３４】
抗Ｎｏｔｃｈ３抗体の治療への使用
本発明の抗体は哺乳類を治療するために用いてもよいと考えられる。一実施態様において、抗体は、例えば、臨床前データを得るためにヒト以外の哺乳類に投与される。治療されるヒト以外の哺乳類の例には、ヒト以外の霊長類、イヌ、ネコ、齧歯動物と他の哺乳類が含まれ、それらについて臨床前研究が実施される。このような哺乳類は、抗体で治療される疾患のために確立された動物モデルであってもよく、又は、興味の抗体の毒性を研究するために用いられてもよい。これら実施態様の各々において、用量漸増研究が哺乳動物において実施されうる。
【０１３５】
抗体は、それにコンジュゲートされた治療成分と共に、又はそのような成分無しで、単独で、又は治療剤として使用できる細胞毒性因子(類)と組合せて投与された。本発明はＮｏｔｃｈ３介在性疾患、障害又は病状を治療するために動物、哺乳類、又はヒトに本発明の抗体を投与することを含む抗体ベースの治療に関する。動物又は患者は、特定の治療を必要とする哺乳類、例えば特定の障害(例えば、Ｎｏｔｃｈ３に関連するもの)を有すると診断されている哺乳類であってもよい。Ｎｏｔｃｈ３に対する抗体は、ウシ、ブタ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、非ヒト霊長類その他を非限定的に含む哺乳類とヒトにおいて、癌と、神経障害、糖尿病、関節リウマチ、血管関連疾患及びアラジール症候群を含む他のＮｏｔｃｈ３関連性疾患とに対し有効である。例えば、本発明の抗Ｎｏｔｃｈ３抗体又は複数の抗体又は本発明の抗体の混合物又は異なる起源の他の抗体と組合わせの治療的に許容可能な用量を投与することによって、治療された哺乳類、特にヒトにおいて疾患症は改善又は予防されうる。    
【０１３６】
本発明の治療的化合物は、抗体(本願明細書に記載のとおり、それらの断片、類似体及び誘導体を含む)及び後述するように本発明の抗体をコードする核酸(本願明細書に記載のとおり、それらの断片、類似体及び誘導体、及び抗イディオタイプ抗体を含む)を含むが、これらに限定されるものではない。本発明の抗体は、本願明細書に記載されている疾患、障害、又は病状を非限定的に含む、Ｎｏｔｃｈ３の異常な発現及び／又は活性と関連する疾患、障害又は病状を治療、抑制、又は予防するために用いることができる。Ｎｏｔｃｈ３の異常な発現及び／又は活性と関連する疾患、障害又は病状の治療及び／又は予防は、それらの疾患、障害又は病状に伴う少なくとも一つの症状を緩和することを含むが、これに限定されるものではない。従来技術で知られているように、又は本願明細書に記載されているように、本発明の抗体は薬学的に許容可能な組成物の状態で提供されうる。
【０１３７】
本発明の抗Ｎｏｔｃｈ３抗体は、種々の疾患において治療的に用いられうる。本発明は、哺乳類のＮｏｔｃｈ３介在性疾患を予防又は治療する方法を提供する。方法は、哺乳類に抗Ｎｏｔｃｈ３抗体の疾患予防量又は疾患治療量を投与することを含む。抗Ｎｏｔｃｈ３抗体は、Ｎｏｔｃｈ３に結合してその機能をアンタゴナイズする。Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達は、種々の癌(Harukiら、Cancer Res 65:3555 (2005); Parkら、Cancer Res 66:6312 (2006); Luら、Clin Cancer Res 10:3291 (2004); Hedvatら、Br J Haematol 122:728 (2003); Buchlerら、Ann Surg 242:791 (2005); Bellaviaら、Proc Natl Acad Sci USA 99:3788 (2002); Screpantiら、Trends Mol Med 9:30 (2003); van Limpら、Cancer Lett 228:59 (2005))、神経障害(Joutelら、Nature 383:707 (1996))、糖尿病(Anastasiら、J Immunol 171:4504 (2003))、関節リウマチ(Yabeら、J Orthop Sci 10:589 (2005))、血管関連疾患(Sweeneyら、FASEB J 18:1421 (2004))、及びアラジール症候群(Flynn等, J Pathol 204:55 (2004))のようなさまざまな疾患と関連づけられている。また、抗Ｎｏｔｃｈ３抗体は上述した疾患の予防に効果的であると推察される。
【０１３８】
Ｎｏｔｃｈ３の異常な発現及び／又は活性に伴う疾患又は障害の治療、抑制及び予防に効果的な抗体の用量は、標準の臨床技術によって決定されてもよい。投与量は、治療される疾患の種類、疾患の重症度及びコース、抗体が予防目的あるいは治療目的で投与されるか、以前の治療、患者の病歴及び抗体への応答性、及び主治医の裁量に依存する。抗体は、例えば、病態を改善するための１〜数日にわたる単回又は数回の投与及び疾患の進行を阻害し疾患の再発を妨げるための長期間にわたる定期的投与のような治療計画によって投与されてもよい。加えて、インビトロアッセイは、最適用量範囲の特定を助けるために、任意に使用することができる。また、製剤に使用される正確な用量は、投与経路、疾患又は障害の重症度に依存するものであり、施術者の判断と各患者の状況に従って決定されなければならない。有効量は、インビトロ又は動物モデル試験システムから導いた用量反応曲線から推定されてもよい。
【０１３９】
抗体に関して、患者に投与される用量は、典型的に、患者の体重につき０．１ｍｇ／ｋｇ〜１５０ｍｇ／ｋｇである。好ましくは、患者に投与される用量は、患者の体重につき０．１ｍｇ／ｋｇと２０ｍｇ／ｋｇとの間であり、より好ましくは、患者の体重につき１ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇとの間である。通常、ヒト抗体は人体の中で他種からの抗体より長い半減期を有するが、これは異種ポリペプチドに対する免疫反応のためである。したがって、ヒト抗体ではより低い投与量及びより低い頻度の投与が大抵は可能である。更に、本発明の抗体の投与量及び投与の頻度は、例えば脂質化のような修飾によって、(例えば、脳内への)抗体の取込み及び組織透過性を増強することによって減少されてもよい。少なくとも数日にわたって繰り返される投与について、状況に応じて、治療は疾患症状の所望の抑制が生じるまで継続される。しかしながら、他の投与計画が有効な場合がある。この治療の進行度は、従来技術及びアッセイにより容易にモニターされる。
【０１４０】
抗体組成物は、適正な医療行為に合致する方法で、処方、服用及び投与される。ここで考慮する要因には、治療される特定の疾患、治療される特定の哺乳類、個々の患者の臨床症状、疾患の原因、作用剤の送達の部位、投与の方法、投与のスケジュール、及び医師が知りうる他の要因が含まれる。投与される抗体の「治療上の有効量」は、このような考慮によって調整されて、疾患又は障害を予防、改善、又は治療するために必要な最小限の用量である。必要ではないが場合によっては、問題の疾患を予防又は治療するために現在用いられる一つ以上の作用剤と抗体とを処方する。そのような他の作用剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、疾患又は治療の種類、及び上述の他の因子に依存する。一般的に、前の使用と同じ用量及び投与経路で、又はこれまでに用いた用量の１〜９９％で用いる。
【０１４１】
本発明の抗体は、単独で、或いは、従来的な化学療法剤(パクリタキセル、カルボプラチン、シスプラチン、及びドキソルビシン)、抗ＥＧＦＲ剤(ゲフィチニブ、エルロチニブ及びセツキシマブ)、抗血管新生剤(ベバシズマブ及びスニチニブ)、並びにインターフェロンα及びサリドマイド等の免疫調整剤といった他のタイプの癌治療と組み合わせて投与されてもよい。
【０１４２】
好適な態様において、抗体は、十分に精製される(例えば、その効果を制限するか又は望まれていない副作用を生じる物質を実質的に存在しない)。  
【０１４３】
注入、例えばリポソーム、微小粒子又はマイクロカプセルへの被包、化合物を発現できる組換え細胞、受容体依存性エンドサイトーシス(例えば，Wu等, J Biol Chem 262:4429(1987)を参照)、レトロウイルス又は他のベクターの一部としての核酸の構造を含む  さまざまなデリバリー系が知られており、本発明の抗体を投与するために用いることができる。
【０１４４】
抗Ｎｏｔｃｈ３抗体は、任意の許容可能な方法で哺乳類に投与することができる。導入の方法は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、鼻腔内、硬膜外、吸入、及び経口の経路を含むがこれに限定されるものではなく、免疫抑制治療が望ましいならば、病巣内投与である。非経口的注入は、筋肉内、皮内、静脈内か、動脈内、腹膜内投与を含む。抗体又は組成物は、任意の便利な経路、例えば、注入又はボーラス注射によって、上皮又は皮膚粘膜ライニング(例えば、口腔粘膜、直腸及び腸管の粘膜など)による吸収によって投与されてもよく、他の生物学的に活性な薬剤とともに投与されてもよい。投与は、全身又は局所的でもよい。加えて、脳室内及びクモ膜下注射を含む任意の適切な経路によって、本発明の治療的抗体又は組成物を中枢神経系に導入することが望ましい場合がある；脳室内注入は、例えばオマヤ漕のようなリザーバーに取り付けられた脳室内カテーテルによって促進されてもよい。加えて、抗体は、特に抗体の用量の減少を伴うパルス注入によって最適に投与される。投与は、投与が短期か又は長期間にわたるかどうかにある程度依存して、好ましくは注射、最も好ましくは静脈内又は皮下注射によって与えられる。
【０１４５】
また、肺投与は、例えば、吸入器又はネブライザーの使用、及びエアロゾル化剤による製剤によって行うことができる。また、抗体は乾燥粉末組成物の形態で、患者の肺に投与されてもよい(例えば米国特許第６５１４４９６号を参照)。
【０１４６】
特定の実施態様において、治療を必要とする範囲に局所的に本発明の治療的抗体又は組成物を投与することが望ましい場合がある；これは、例えば、限定的な意味でなく、局所注入、局所適用、注射によって、カテーテルによって、坐薬によって、又はインプラントによって達成されてもよく、該インプラントは、シラスティック膜又は繊維のような膜を含む多孔性、非多孔性、ゼリー状の物質である。好ましくは、本発明の抗体を投与するときに、タンパク質を吸収しない物質の使用に配慮しなければならない。
【０１４７】
別の実施態様において、抗体はビヒクルで送達することができる(Langer, Science 249:1527(1990)；Treat等，Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein等編，353-365頁(１９８９)；Lopez-Berestein, 同書, pp.317-27；同書の全般を参照)。  
【０１４８】
さらに別の実施形態では、抗体は制御放出系で送達することができる。ある実施形態において、ポンプが使用されてもよい(Langer,Science249:1527(1990)；Sefton,CRC Crit Ref Biomed Eng 14:201(1987)；Buchwald等,Surgery 88:507 (1980)；Saudek等,N Engl J Med 321:574(1989)参照)。別の実施形態において、ポリマー材料を使用することができる(Medical Applications of Controlled Release, Langer等編, CRC Press(1974)；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance,Smolen等編,Wiley(1984)；Ranger等,J Macromol Sci Rev Macromol Chem 23:61(1983)；Levy等,Science 228:190(1985)；During等,Ann Neurol 25:351(1989)；Howard等,J Neurosurg 71:105(1989)参照)。さらに別の実施形態では、制御放出系は治療標的の近傍に配置することができる。
【０１４９】
また、本発明は医薬組成物を提供する。このような組成物は、抗体の治療的有効量及び生理学的に許容可能な担体を含む。特定の実施態様では、「生理学的に許容可能」という用語は、動物、より詳細にはヒトへの使用について、連邦又は州政府の規制機関によって承認されるか、アメリカ合衆国薬局方又は他の一般的に認められた薬局方に掲載されることを意味する。「担体」という用語はそれと共に治療剤が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを意味する。このような生理学的担体は滅菌液、例えば石油、動物、野菜又は合成由来のもの、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含む油と水でもよい。医薬品組成物が静注で投与されるときに、水は好適な担体である。また、生理食塩水及び水性デキストロース及びグリセロール溶液は液体担体、特に注射可能な溶液として使用することができる。好適な医薬賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等々が含まれる。組成物は、所望されるならば、少量の湿潤又は乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含みうる。これらの組成物は溶液懸濁液、エマルション、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、徐放製剤等々の形態をとりうる。組成物は、伝統的なバインダーとトリグリセリドのような担体を用いて座薬として処方できる。経口製剤は、標準的な担体、例えば医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等々を含みうる。適切な医薬担体の例は、E.W.Martinの「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。そのような組成物は、好ましくは精製形態の治療的有効量の治療剤を、患者への適切な投与のための形態となるように好適な量の担体と共に含む。製剤は投与態様に適応しなければならない。
【０１５０】
ある実施態様において、組成物は、ヒトへの静脈内投与に適応する医薬品組成物として、常法に従って製剤化される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、無菌等張性水性バッファー溶液である。また、必要な場合には、可溶化剤及び注入部位の痛みを緩和するリグノカインのような局所麻酔薬を含んでもよい。通常、成分は、密封容器(例えば活性薬剤の量を示しているアンプル又はサッシェ (sachette))に密閉された凍結乾燥粉末又は水非含有濃縮物として、別々に供給されるか、あるいは単位剤形中に一緒に混合されて供給される。組成物を点滴により投与する場合は、無菌の製薬グレードの水又は生理食塩水を含有する点滴ボトルにより送出することができる。組成物が注射により投与される場合には、無菌注入用水又は生理食塩水のアンプルを、成分が投与前に混合されるように提供することができる。
【０１５１】
本発明はまた本発明の医薬組成物の一又は複数の成分が満たされた一又は複数の容器を具備する医薬パック又はキットを提供する。場合によってそのような容器に付随させることができるものは、医薬又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって指示された形態の注意書きで、ヒトへの投与のために製造し、使用し、又は販売することに対する機関の承認を反映する注意書きである。
【０１５２】
加えて、本発明の抗体は、異種ポリペプチド、試薬、ラジオヌクレオチド、又は毒素といった様々なエフェクター分子にコンジュゲートすることができる。例えば、国際公開第９２／０８４９５号、同第９１／１４４３８号、同第８９／１２６２４号、米国特許第５３１４９９５号及び欧州特許第３９６３８７号を参照されたい。抗体又はその断片は、細胞毒(例えば、細胞分裂阻害剤又は細胞破壊剤)、治療剤、又は放射性金属イオン(例えば、２１３Ｂｉのようなα放射体)といった治療成分にコンジュゲートすることができる。細胞毒又は細胞障害性剤は、細胞に有害なあらゆる薬剤を含む。例えば、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド(etoposide)、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン(dehydrotestosterone)、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン、並びにそれらの類似体又は相同体が挙げられる。治療剤は、代謝拮抗薬(例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン)、アルキル化剤(例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(ＢＳＮＵ)及びロムスチン(ＣＣＮＵ)、シクロトスファミド(cyclothosphamide)、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシスジクロロジアミン白金(ＩＩ)(ＤＤＰ)シスプラチン)、アントラサイクリン(例えば、ダウノルビシン(旧ダウノマイシン)及びドキソルビシン)、抗生物質(例えば、ダクチノマイシン(旧アクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン(ＡＭＣ))、並びに有糸分裂阻害薬(例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン)を含むが、これらに限定されない。
【０１５３】
抗体に対してこのような治療成分をコンジュゲートさせる技術が周知である。例えば、Arnonら、"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeldら、(編)、243-56頁 Alan R. Liss (1985); Hellstromら、"Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery, 第２版, Robinsonら編、623-53頁, Marcel Dekker (1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pincheraら、編、475-506頁(1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, Baldwinら編、303-16頁, Academic Press (1985);並びにThorpeら、Immunol Rev 62:119 (1982)を参照されたい。或いは、抗体を第２の抗体にコンジュゲートさせて一の抗体へテロコンジュゲートを形成することができる。例えば、米国特許第４６７６９８０号参照。
【０１５４】
本発明のコンジュゲートは、所定の生物学的応答の調節に使用することができる。治療剤又は薬剤成分は、伝統的な化学的治療剤に限定されるものではない。例えば、薬剤成分は、所望の生物学的活性をプロセシングするタンパク質又はポリペプチドであってもよい。そのようなタンパク質には、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、又はジフテリア毒素、腫瘍壊死因子、αインターフェロン、βインターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲナクチベーター、アポトーシス剤、例えばＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ  Ｉ(国際公開第９７／３３８９９号参照)、ＡＩＭ  ＩＩ(国際公開第９７／３４９１１号参照)、Ｆａｓリガンド(Takahashiら、Int Immunol, 6:1567 (1994))、ＶＥＧＩ(国際公開第９９／２３１０５号参照)、血栓薬、抗血管新生薬、例えば、アンジオスタチン又はエンドスタチン、或いは、例えばリンホカイン、インターロイキン−1(「ＩＬ−１」)、インターロイキン２(「ＩＬ−２」)、インターロイキン６(「ＩＬ−６」)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(「ＧＭ−ＣＳＦ」)、顆粒球コロニー刺激因子(「Ｇ−ＣＳＦ」)、又はその他増殖因子といった生物学的応答モディファイヤーが含まれる。
【０１５５】
製造品
本発明の他の実施態様では、前述した疾患の治療に有用な物質を含有する製造品が提供される。製造品は容器及び説明書を含んでなる。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、シリンジ、及び試験管が含まれる。容器はガラス又はプラスチックのような様々な材料で形成することができる。容器は病状の治療に有効な組成物を収容しており、滅菌した出入口を有している(例えば、容器は皮下注射針により貫通可能なストッパーを具備する静脈溶液用のバック又はバイアルであってよい)。容器上の又は容器に付随する説明書には、組成物が、選択された病状の治療に使用されることが示されている。さらに製造品は、製薬的に許容可能なバッファー、例えばリン酸緩衝生理食塩水、リンガル液及びブドウ糖液を収容する第２の容器をさらに具備しうる。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用指示書を含む、市販及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでいてもよい。
【０１５６】
抗体ベースの遺伝子療法
本発明の別の態様において、抗体又はその機能的な誘導体をコードする配列の核酸は、遺伝子療法として、Ｎｏｔｃｈ３の異常な発現及び／又は活性に伴う疾患又は障害を治療、抑制又は予防するために投与される。遺伝子療法とは発現した又は発現可能な核酸を、患者に投与することによって実施される治療法を意味する。本発明の実施態様において、核酸はそれらがコードする、治療効果をもたらタンパク質を産生する。利用可能な遺伝子療法の任意の方法が、本発明によって使用できる。以下に、典型的な方法について説明する。
【０１５７】
遺伝子療法の方法の一般的な総説については、Goldspiel等, Clinical Pharmacy 12:488(1993)；Wu等, Biotherapy 3:87(1991)；Tolstoshev,Ann Rev Pharmacol Toxicol 32:573(1993)；Mulligan,  Science  260:926(1993)；Morgan等,Ann Rev Biochem 62:191(1993)；May,TIBTECH 11:155(1993)を参照できる。
【０１５８】
一態様において、化合物は、抗体をコードする核酸配列を含み、該核酸配列は適切な宿主において抗体又はそれらの断片又は重鎖又は軽鎖を発現する発現ベクターの一部である。特に、このような核酸配列は、抗体コード領域に作用可能に連結したプロモーターを有し、該プロモーターは誘導的又は構成的、場合によっては組織特異的である。
【０１５９】
別の特定の実施態様において、抗体コード配列及び任意の他の所望の配列の横に、ゲノム中の所望の部位における相同組換えを促進する領域が配置された核酸分子が使用され、したがって抗体をコードする核酸の染色体内発現を提供する(Koller等，Proc Natl Acad Sci USA 86:8932(1989)；Zijlstra等,Nature 342:435(1989))。特定の実施態様において、発現する抗体分子は、一本鎖抗体である；あるいは、核酸配列は、抗体の重鎖及び軽鎖の両方又はその断片をコードする配列を含む。
【０１６０】
患者への核酸の送達は、直接的(この場合、患者が核酸又は核酸を担持するベクターに直接的に曝される)であるか、あるいは間接的(この場合、はじめに細胞が核酸によってインビボで形質転換され、次に患者に移植される)であってもよい。これらの２つのアプローチは、それぞれインビボ又はエクスビボ遺伝子療法として知られている。
【０１６１】
特定の実施態様において、核酸配列はインビボに直接投与され、そこで発現し、コードする産物を産生する。これは、従来技術で知られている多数の方法の何れかによって、例えば、適切な核酸発現ベクターの一部としてそれらを構築し、投与して、細胞内のものとすることによって、例えば、不完全又は弱毒化レトロウイルス又は他のウイルスベクターを使用した感染によって(米国特許第４，９８０，２８６号を参照)、又は裸のＤＮＡの直接の注射によって、又は微小粒子照射(例えば、遺伝子銃；Biolistic、Dupont)、又は脂質又は細胞表面レセプター又は形質移入化剤による被膜、リポソーム、微小粒子又はマイクロカプセルへの被包を用いて、又は核に入ることが知られているペプチドに結合させて投与することによって、受容体依存性エンドサイトーシスに対するリガンドと結合させて投与すること(例えば、Wu等,J Biol Chem 262:4429(1987)を参照)(受容体を特に発現する標的細胞タイプに使用することができる)等によって達成できる。別の実施態様において、リガンドがエンドソームを崩壊させる融合ウイルスペプチドを含み、核酸のリソソーム劣化を回避することを可能にする核酸−リガンド複合体を形成させることができる。さらに別の実施形態において、核酸は、特異的な受容体を標的とすることによって、細胞特異的な取り込みと発現のためのインビボにおける標的とすることができる(例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ９２／０６１８０；ＷＯ９２／２２６３５；ＷＯ９２／２０３１６；ＷＯ９３／１４１８８，ＷＯ９３／２０２２１を参照)。あるいは、相同組換えによって、核酸を細胞内に導入し、発現のための宿主細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる(Koller等,Proc Natl Acad Sci USA 86:8932(1989)；Zijlstra等,Nature 342:435(1989))。
【０１６２】
特定の実施態様において、本発明の抗体をコードする核酸配列を含むウイルスベクターを使用する。例えば、レトロウイルスベクターを使用できる(Miller等, Meth Enzymol 217:581(1993)参照)。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスのゲノムの正しいパッケージング及び宿主細胞ＤＮＡへの組込みのために必要な構成要素を含む。遺伝子療法で使用される抗体をコードする核酸配列は一つ以上のベクターにクローン化され、それは患者への遺伝子の送達を容易にする。レトロウイルスベクターについてはBoesen等, Biotherapy 6:291(1994)に詳細があり、それは幹細胞を化学療法に対してより耐性があるようにするためにｍｄｒｌ遺伝子を造血幹細胞に送達するためのレトロウイルスベクターの使用を記載する。遺伝子療法におけるレトロウイルスベクターの使用を例示する他の参考文献は、以下の通りである：Clowes等,J Clin Invest 93:644(1994)；Kiem等,Blood 83:1467(1994)；Salmons等,Human Gene Therapy 4:129(1993)；及びGrossman等, Curr Opin Gen and Dev 3:110(1993)。
【０１６３】
また、本発明においてアデノウイルスが使用されてもよい。特に、アデノウイルスは抗体を呼吸上皮に送達するための本発明の魅力的なビヒクルである。アデノウイルスは、自然に呼吸上皮に感染する。アデノウイルスベースの送達系の他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞及び筋肉である。アデノウイルスは非分裂細胞に感染できるという利点がある。Kozarsky等(Curr Opin Gen Dev 3:499(1993))はアデノウイルスベースの遺伝子療法の総説である。Bout等(Human Gene Therapy 5:3(1994))はアデノウイルスの使用によりアカゲザルの呼吸上皮に遺伝子が運ばれることを証明した。遺伝子療法におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Rosenfeld等,Science 252:431(1991)；Rosenfeld等, Cell68:143(1992)；Mastrangeli等,J Clin Invest 91:225(1993)；ＰＣＴ公報ＷＯ９４／１２６４９；Wang等,Gene Therapy 2:775(1995)に記載されている。また、アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)の遺伝子療法への使用が提案されている(Walsh等,Proc Soc Exp Biol Med 204:289(1993)；米国出願番号第５４３６１４６号；第６６３２６７０号；及び第６６４２０５１号)。
【０１６４】
遺伝子療法の他のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム介在形質移入又はウイルス感染症のような方法によって、遺伝子を組織培養の細胞に導入することを含む。通常、導入の方法は、選別可能なマーカーを細胞に導入することを含む。それから、細胞は、導入された遺伝子を取り込み発現する細胞を分離するために、選択の下に置かれる。次に、それらの細胞は患者に送達される。
【０１６５】
本実施態様において、核酸は、結果として生じる組換え細胞のインビボ投与前に、細胞に導入される。このような導入は、限定されるものではないが、形質移入、エレクトロポレーション、顕微注射、核酸配列を含むウイルスベクター又はバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体介在性遺伝子導入、ミクロセル介在性遺伝子導入、スフェロプラスト融合等を含む公知技術の任意の方法によって実施することができる。細胞への異種遺伝子の導入について、多数の技術が公知技術となっており(例えば、Loeffler等, Meth Enzymol 217:599(1993)；Cohen等, Meth Enzymol 217:618(1993)；Cline, Pharmac Ther 29:69(1985)参照)、受容細胞の必須の発生学的と生理学的機能を崩壊させないならば、本発明によって使用されてもよい。核酸は細胞によって発現可能であり、好ましくは遺伝性であり、その細胞後代によって発現可能であるために、技術は細胞への核酸の安定した導入を提供しなければならない。
【０１６６】
結果として生じる組換え細胞は、公知技術の様々な方法によって患者に送達することができる。組換え血液細胞(例えば造血幹又は前駆細胞)は、好ましくは静脈内投与される。使用に想定される細胞の量は、所望の効果、患者の状態等に依存し、当業者により決定されうる。
【０１６７】
核酸が遺伝子療法の目的で導入することができる細胞は、任意の所望の利用可能な細胞型を包含し、限定されるものではないが上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞；血液細胞、例えばＴリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、骨髄巨核球、顆粒白血球；様々な幹細胞又は前駆細胞、特に造血幹又は前駆細胞、例えば骨髄、さい帯血、末しょう血液、胎児の肝臓等から得られるものを含む。
【０１６８】
一実施態様において、遺伝子療法に使用される細胞は患者において自己由来である。本発明の抗体をコードする核酸配列は、細胞又はそれらの後代によって発現可能である細胞に導入され、次に組換え細胞は治療的効果の目的でインビボに投与される。特定の実施態様において、幹細胞又は前駆細胞が使用される。分離しインビボで保持することができる任意の幹細胞及び／又は前駆細胞は、本発明のこの実施態様によって使用することができる可能性がある(例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ９４／０８５９８；Stemple等, Cell 71:973(1992)；Rheinwald, Meth Cell Bio 21A:229(1980)；Pittelkow等, Mayo Clinic Proc 61:771(1986))。
【実施例】
【０１６９】
実施例１：免疫原の生産：Ｎｏｔｃｈ３細胞外ドメイン-Ｆｃ融合タンパク質
ヒトＮｏｔｃｈ３のＬＩＮ１２／二量体形成ドメイン(以降「ＬＤ」)に特異的に結合する抗Ｎｏｔｃｈ３モノクローナル抗体を、組換えＮｏｔｃｈ３-Ｆｃ融合タンパク質を、カルボキシ末端においてγ１Ｆｃ領域に融合したＮｏｔｃｈ３ＬＤを含む免疫原として用いて生産した。特に、免疫原は、Ｎｏｔｃｈ３ＬＤのアミノ酸残基１３７８から１６４０(図１参照)とヒトγ１Ｆｃ融合タンパク質とを含んだ。アミノ酸残基４３から１３７７由来のＮｏｔｃｈ３ＥＧＦリピート領域を含むコントロール抗体を生成した(２５５Ａ−７９と呼ぶ)。
【０１７０】
Ｎｏｔｃｈ３タンパク質配列を、インターネットベースの調査ソフトウェア及びサービス(Motif Search, http://motif.genome.jp/)を利用して分析した。ヒト肝臓及び脾臓ＲＮＡ(Ambion, Inc. Austin, TX)を鋳型として用いて、標準的な市販のｃＤＮＡ合成キットで第一のｃＤＮＡ鎖を合成した。Ｎｏｔｃｈ３ＬＤ及びＥＧＦリピート領域をコードするｃＤＮＡを、ベタイン(１−２Ｍ)及びＤＭＳＯ(５％)の存在下でＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ合成されたＮｏｔｃｈ３ＬＤ  ＤＮＡ断片(〜０．８ｋｂ)及びＮｏｔｃｈ３-ＥＧＦリピートＤＮＡ断片(〜４ｋｂ)を、それぞれ異なる抗生物質マーカーを有する市販のベクターｐＳｅｃ又は市販のベクターｐＣＤ３．１中にＨｉｓ-γ１Ｆｃを含む発現ベクターにクローニングした。このクローニングの結果、２つの発現プラスミド、一つはＮｏｔｃｈ３-ＬＤ／Ｆｃを発現するもの、及びもう一つはＮｏｔｃｈ３-ＥＧＦ／Ｆｃ融合タンパク質を発現するもの、が生じた。
【０１７１】
プラスミドの構築を容易にし、且つ様々なＮｏｔｃｈ３組換えタンパク質の発現を増進するために、Ｎｏｔｃｈ３核酸コード配列の第一の１３５塩基対を含むリーダーペプチド配列に相当するオリゴヌクレオチドを生成した。これらのオリゴヌクレオチドは、ＧＣ含量を低減するためにウォブルコード位置に複数の変化を含んだ。ヌクレオチド配列の変化は全てサイレントで、つまりアミノ酸配列の変化はなかった(図１４Ａ)。オリゴヌクレオチドを共にアニールした後、作出されたリーダーペプチドコード配列を、ＰＣＲ-ＳＯＥにより残りのコード配列に連結した(Ho等, Gene 77:51 (1989)；Horton等, BioTechniques 8:528 (1990))(図１５参照)。このリーダーペプチドコード配列を、Ｎｏｔｃｈ３-ＬＤ／Ｆｃ及びＮｏｔｃｈ３発現コンストラクトで使用した。従って、両方のＦｃ融合タンパク質が、Ｎ末端に連結したシグナルペプチドと、Ｃ末端に融合したヒトγ１Ｆｃ配列とを含む。リーダーペプチドを含むＮｏｔｃｈ３-ＬＤのアミノ酸配列を、図１４及び配列番号６に示す。
【０１７２】
Ｎｏｔｃｈ３-ＥＧＦ／Ｆｃ及びＮｏｔｃｈ３-ＬＤ／Ｆｃ融合タンパク質の発現を、Ｎｏｔｃｈ３発現プラスミドの、それぞれ２９３Ｔ(ＡＴＣＣ番号  ＣＲＬ‐１１２６８, Manassas, VA)及びＣＨＯ細胞(Invitrogen, Carlsbad, CA)への一過性トランスフェクションにより確認した。トランスフェクションに先立ち、細胞を、１０％ウシ胎仔血清(ＦＣＳ)、２ｍＭのグルタミン、及び１×必須アミノ酸溶液を含有するＤＭＥＭ(Invitrogen, Carlsbad, CA)増殖培地で培養し、続いてウェル当たり約３−５×１０５細胞を６ウェルプレートに播種し、そしておよそ２４時間増殖させた。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００トランスフェクション系(Invitrogen, Carlsbad, CA)を製造業者のプロトコルに従って使用して、それぞれ３マイクログラムのＮｏｔｃｈ３融合タンパク質発現プラスミドを各ウェルの細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの後、細胞を、新鮮な増殖培地で培養し、Ｎｏｔｃｈ３融合タンパク質発現分析を行う前に約４０−４８時間、ＣＯ２インキュベーターで培養した。或いは、トランスフェクションの後、細胞を、３−４時間、増殖培地で培養し、その後２％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ培地に移し、分泌されたタンパク質の分析のためのならし培地を注ぐ前におよそ６０−６６時間、培養する。
【０１７３】
適切な細胞株を、Ｎｏｔｃｈ３-ＥＧＦ／Ｆｃ(Ｈｉｓ-Ｆｃγ／ｐＳｅｃベクター)及びＮｏｔｃｈ３-ＬＤ／Ｆｃ(Ｈｉｓ-Ｆｃγ/ｐＳｅｃベクター)の両方のために生成した。各プラスミドをＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの後、細胞を一晩、ＤＭＥＭ増殖培地で培養し、次いで８００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを有する増殖培地に移し、Ｎｏｔｃｈ３発現プラスミドを持たない細胞が抗生物質により除去されるまで、少なくとも２週間培養した。安定な細胞株からのならし培地を、ウェスタンブロット分析にかけた。
【０１７４】
安定な又は一過性の形質移入細胞についてＮｏｔｃｈ３−ＬＤ／Ｆｃ又はＮｏｔｃｈ３−ＥＧＦ／Ｆｃ融合タンパク質の発現及び分泌をアッセイした。培養皿から集めた形質移入細胞をリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)で一回洗浄し、脱イオン水中に再懸濁させ、等容量の２×タンパク質試料負荷バッファー(BioRad, Hercules, CA) と混合し、ついで約１００℃で１０分間加熱した。分泌されたタンパク質を等容量の２×タンパク質試料負荷バッファーと混合し１００℃で１０分間加熱した条件培地を使用して分析した。試料を４−１５％の勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分離した。タンパク質を、タンパク質を移す少なくとも１時間前にＰＢＳＴ(０．０５％のＴＷＥＥＮ-２０(登録商標)を含むＰＢＳ)中に５％の脱脂粉乳でブロックしたＰＶＤＦ膜(BioRad, Hercules, CA)にゲルから移した。
【０１７５】
Ｎｏｔｃｈ３−ＥＧＦ／Ｆｃ及びＮｏｔｃｈ３−ＬＤ／Ｆｃ融合タンパク質を、ブロッキングバッファー中のγＦｃ特異的なＨＲＰ結合抗体(Sigma, St Louis, MO)と共にインキュベートすることによって検出した。その膜をＰＢＳＴ中で３回洗浄し、化学発光基質を用いて発現させた。
【０１７６】
Ｎｏｔｃｈ３ドメイン／Ｆｃ融合タンパク質の精製では、上に記載したＣＨＯ安定細胞株を、２％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で５日間まで培養した。１リットルの条件培地を集め、アフィニティー結合のためのプロテインＡビーズ充填カラムにかけた。カラムをＰＢＳで洗浄し、結合したタンパク質を５０ｍＭのクエン酸塩バッファー(ｐＨ２．８)で溶出させ、１Ｍのトリス−ＨＣｌバッファー(ｐＨ８)を添加してｐＨを中性にした。タンパク質の純度を、４−１５％の勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用するタンパク質ゲル分析によって評価した。タンパク質の濃度は製造者のプロトコル(Pierce, Rockford, IL)に従ってクーマシーブルー試薬を使用してアッセイした。この手順を通して、ミリグラム量のＮｏｔｃｈ３−ＬＤ／Ｆｃ及びＮｏｔｃｈ３−ＥＧＦ／Ｆｃタンパク質を免疫及びＥＬＩＳＡ結合アッセイのために精製した。
【０１７７】
実施例２：抗Ｎｏｔｃｈ３ ＭＡｂの生成
８−１２週齢の雄Ａ／Ｊマウス(Harlan, Houston, TX)に、２００μｌのＰＢＳ中のフロイント完全アジュバント(Difco Laboratories, Detroit, MI)中の２５μｇのＮｏｔｃｈ３−ＥＧＦ／Ｆｃ又はＮｏｔｃｈ３−ＬＤ／Ｆｃを皮下的に注射した。注射の２週間後で屠殺の３日前に、マウスにまたＰＢＳ中の同じ抗原２５μｇを腹腔内注射した。各融合体について、単一の細胞懸濁液を免疫化細胞の脾臓から調製し、Ｓｐ２／０ミエローマ細胞との融合に使用した；５×１０８のＳｐ２／０及び５×１０８の脾臓細胞を、５０％のポリエチレングリコール(分子量１４５０) (Kodak, Rochester, NY)及び５％のジメチルスルホキシド(Sigma, St. Louis, MO)を含む培地中で融合させた。ついで、細胞を、１０％のウシ胎仔血清、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．１μＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、及び１６μＭのチミジンを補填したＩｓｃｏｖｅ培地(Invitrogen, Carlsbad, CA)中において２００μｌの懸濁液中１．５×１０５脾臓細胞の濃度まで調整した。２００マイクロリットルの細胞懸濁液を約９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。約１０日後、培養上清を、ＥＬＩＳＡを使用するその抗原結合活性についてのスクリーニングのために取り出した。
【０１７８】
９６ウェル平底Ｉｍｍｕｌｏｎ ＩＩマイクロテストプレート(Dynatech, Laboratories, Chantilly, VA)を、１×フェノールレッド及び３−４滴のｐＨｉｘ／リットル(Pierce, Rockford, IL)を含む(ＰＢＳ)中の１００μｌのＮｏｔｃｈ３−ＥＧＦ／Ｆｃ又はＮｏｔｃｈ３−ＬＤ／Ｆｃ(０．１μｇ／ｍｌ)を使用してコートし、室温で一晩インキュベートした。コーティング溶液を、プレートをはじいて除去した後、０．１％のメルチオレートを含むＰＢＳＴ中に２％のＢＳＡを含む２００μｌのブロッキングバッファーを、非特異的結合をブロックするために各ウェルに１時間加えた。ついで、そのウェルをＰＢＳＴで洗浄した。各融合体ウェルから５０マイクロリットルの培養上清を集め、５０μｌのブロッキングバッファーと混合し、ついでマイクロプレートの個々のウェルに添加した。１時間のインキュベーション後、ウェルをＰＢＳＴで洗浄した。ついで、結合したマウス抗体を、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)結合Ｆｃ特異的ヤギ抗マウスＩｇＧ(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)との反応によって検出した。０．１％の３，３，５，５−テトラメチルベンジジン及び０．０００３％の過酸化水素を含むＨＲＰ基質溶液を、３０分間、発色のためにウェルに添加した。５０ｍｌの２ＭのＨ２ＳＯ４／ウェルを添加して反応を終了させた。４５０ｎｍでのＯＤをＥＬＩＳＡプレートリーダー(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)で読み取った。
【０１７９】
単離し分析した１８５のハイブリドーマのうち、Ｎｏｔｃｈ３−ＬＤ／Ｆｃで免疫したマウス由来の２つのハイブリドーマクローンがＮｏｔｃｈ３をアンタゴナイズする抗体を生産した。これについては後述で更に特徴付けする。ＭＡｂ２５６Ａ−４及び２５６Ａ−８を生産する２つのハイブリドーマクローンの上清を使用したＥＬＩＳＡにより、それが産生された精製Ｎｏｔｃｈ３ＬＤ／ＦＣ融合タンパク質に対する強い結合活性が示されたが、ヒトＮｏｔｃｈ１−ＬＤ／Ｆｃ(カルボキシル末端でＦｃ領域に融合したＬＩＮ／二量体形成ドメイン)又はコントロールヒトＦｃタンパク質には結合しなかった(データは示さず)(表１)。機能アッセイを用いたその後の研究により、ＭＡｂ２５６Ａ−４及び２５６Ａ−８が、Ｎｏｔｃｈ１及びＮｏｔｃｈ２と比較してＮｏｔｃｈ３を特異的にアンタゴナイズすることが更に実証された(データは示さず)。
【０１８０】
表１．ハイブリドーマ上清を使用する抗Ｎｏｔｃｈ３ＭａｂのＥＬＩＳＡのＯＤ読み値
0005386364.tif 000002
【０１８１】
この一次ＥＬＩＳＡスクリーニングからの陽性ハイブリドーマクローンを、単一コロニーピッキングによって更に単離し、上に記載した第二ＥＬＩＳＡアッセイを実施して、選択された免疫原に対する特異的結合を証明した。確認されたハイブリドーマクローンを、より大きなスケールの培養で増量させた。モノクローナル抗体(ＭＡｂ)をプロテインＡアフィニティーカラムを使用してこれら大きなスケールの培養の培地から精製した。ついで、抗Ｎｏｔｃｈ３ＭＡｂを、細胞ベースアッセイ、顕微鏡、ウェスタンブロット、及びＦＡＣＳ分析を使用して特徴付けした。
【０１８２】
実施例３：抗Ｎｏｔｃｈ３ＭＡｂに対する細胞ベース結合アッセイ
抗Ｎｏｔｃｈ３ＭＡｂを特徴付けるために使用する細胞ベース結合アッセイには、ベクター、この場合にはｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ(Invitrogen, Carlsbad, CA)中へのヒトＮｏｔｃｈ３オープンリーディングフレームの完全長のクローニングが必要であった。Ｎｏｔｃｈ３コーディング領域は、鋳型としてヒト肝臓腫瘍ＲＮＡ (Ambion, Inc., Austin, TX) を使用してＲＴ−ＰＣＲによって合成した。最終のプラスミドコンストラクトＮｏｔｃｈ３／Ｈｙｇｒｏは、図１に示されるように完全長Ｎｏｔｃｈ３タンパク質を発現した。Ｎｏｔｃｈ３を発現する安定な細胞株は、実施例１に記載されたものと同じ手順に従ってリポフェクタミン２０００キットを使用して、Ｎｏｔｃｈ３／Ｈｙｇｒｏプラスミドコンストラクトを２９３Ｔ細胞(ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１１２６８)中に形質移入させることによって生産した。形質移入後、細胞をＤＭＥＭ増殖培地で一晩培養し、ついで２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含む増殖培地に再播種し、１２−１４日間培養した。良好に単離された単一コロニーを取り上げ、別個のウェルで、十分なコロニー細胞が増幅されるまで増殖させた。ハイグロマイシン選択に耐性があり高レベルのＮｏｔｃｈ３タンパク質を発現した安定な２９３Ｔクローンを、ウェスタンブロット分析と、ポリクローナル抗Ｎｏｔｃｈ３抗体を使用する蛍光電子顕微鏡観察(R&D Systems, Minneapolis, MN)によって同定した。
【０１８３】
Ｎｏｔｃｈ ＬＩＮ１２／二量体化(ＬＤ)ドメイン及び膜貫通(ＴＭ)ドメインだけを含む部分的Ｎｏｔｃｈ３発現プラスミドをまたＰＣＲによって構築し、ｐｃＤＮＡ３．１．(Invitrogen, Carlsbad, CA)中にサブクローニングした。このプラスミドコンストラクトも、そのＣ末端にＶ５タグを含み、Ｎｏｔｃｈ３−ＬＤＴＭ／Ｖ５と呼ばれる。実施例１に記載の手順に従って、このプラスミドを発現する安定な細胞株であるＮｏｔｃｈ３−ＬＤＴＭ／Ｖ５を産生した。
【０１８４】
天然にＮｏｔｃｈ３を発現するヒトＳｕｐ−Ｔ１細胞株(ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１９４２)をまたウェスタンブロットによって確認した。Ｓｕｐ−Ｔ１細胞を、１０％のウシ胎仔血清、２ｍＭのグルタミン及び１×の必須アミノ酸溶液を含むＲＰＭＩ１６４０培地で増殖させた。
【０１８５】
細胞ベースの抗体結合は、製造者によって提供されたプロトコルに従ってＦＭＡＴ(登録商標)(蛍光マクロ共焦点高ハイスループットスクリーニング)８１００ＨＴＳシステム(Applied Biosystems, Foster City, CA)を使用して評価した。Ｎｏｔｃｈ３を天然に発現するかＮｏｔｃｈ３発現コンストラクトが安定に形質移入された細胞株を９６ウェルプレートに播種した。別法として、一過性に形質移入した２９３Ｔ又はＣＨＯ細胞を９６ウェルプレートに播種した。細胞は１ウェル当たり３００００−５００００細胞の密度で播種した。２０−２４時間後、抗Ｎｏｔｃｈ３ＭＡｂ及び１×ＰＢＳ反応バッファーをウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。一次抗体の除去後、Ｃｙ−５結合抗マウスＩｇＧ抗体をウェルに添加した。
【０１８６】
細胞ベースの抗体結合はまた、内部的に生産した２９３Ｔ／Ｎｏｔｃｈ３安定細胞株と双方ともＮｏｔｃｈ３を天然に発現する(データは示さず)２つの癌細胞株であるヒトＳｕｐ−Ｔ１及びＡ２７８０細胞株(ＵＫ  ＥＣＡＣＣ番号カタログ番号９３１１２５１９)を使用して、蛍光標示式細胞分取器(ＦＡＣＳ)によっても評価した。細胞は最初に１×ＰＢＳ中で抗ＮｏｔｃｈＭＡｂと共にインキュベートした。３回の洗浄後、細胞を蛍光分子結合二次抗体と共にインキュベートした。細胞を再懸濁し、０．１％のパラホルムアルデヒドを含む１×ＰＢＳ中で固定し、ＦＡＣＳ(BD Sciences, Palo Alto, CA)で分析した。その結果は、両方のＭＡｂが、培養された細胞中で組換えプラスミドコンストラクトから又は天然タンパク質として発現されたＮｏｔｃｈ３レセプターに結合することを示している(表２)。しかしながら、ウェスタンブロット法では、Ｎｏｔｃｈ３レセプター又はＮｏｔｃｈ３−ＬＤ／Ｆｃ融合タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて変性してナイロンブロット膜に移動すると、抗Ｎｏｔｃｈ３ＭＡｂはもはや結合しないことが示され、これは立体構造エピトープであることを示唆する。また、Ｎｏｔｃｈ３／Ｈｙｇｒｏプラスミドを含む一過性に形質移入した２９３Ｔ細胞を上に記載のように免疫蛍光で染色し、蛍光顕微鏡によって観察した。
【０１８７】
表２．平均蛍光強度として示した細胞ベースＦＡＣＳ分析における抗Ｎｏｔｃｈ３ＭＡｂの結合活性
0005386364.tif 000003
【０１８８】
細胞ベースのＦＭＡＴ及びＦＡＣＳ分析では、培養された細胞中で組換えプラスミドコンストラクトから又は天然タンパク質として発現されるＮｏｔｃｈ３レセプターにＭＡｂ２５６Ａ−４及び２５６Ａ−８の両方が確かに結合する(表２及び表３)ことが確認された。
【０１８９】
表３．細胞ベースＦＭＡＴにおける抗Ｎｏｔｃｈ３ＭＡｂ結合活性のまとめ
0005386364.tif 000004
【０１９０】
Ｇ３はネガティブコントロールヒトＩｇＧ１  Ｍａｂである。陽性の結合シグナルを、Ｇ３及び他の陰性ハイブリドーマクローンのものよりも有意に高い(ｐ＞０．０１)ＦＭＡＴシグナルの読み取りに基づいて決定した。Ｇ３ＦＭＡＴ結合の陰性のシグナルの読み取りはバックグラウンドと考えた。Ｎｏｔｃｈ３／Ｈｙｇｒｏプラスミドが一過性に形質移入された２９３Ｔ細胞をまた上に記載のように免疫蛍光で染色し、蛍光顕微鏡によって観察した。
【０１９１】
実施例４：抗Ｎｏｔｃｈ３ＭＡｂ結合活性のウェスタンブロット解析
変性条件下でのＮｏｔｃｈ３に対する抗Ｎｏｔｃｈ３ＭＡｂの結合活性、並びにヒト細胞株中でのＮｏｔｃｈ３及び他のＮｏｔｃｈ関連タンパク質の発現レベルを評価するためにウェスタンブロットを実施した。精製したＮｏｔｃｈ３−ＬＤ／Ｆｃ融合タンパク質をタンパク質負荷バッファーと組み合わせた。タンパク質試料をまた実施例１に記載された一過性に又は安定に形質移入された細胞から調製し、これを培養皿から収集し、ＰＢＳで一回洗浄し、全細胞性タンパク質抽出物バッファー(Pierce, Rockford, IL)に再懸濁させ、等容量の２×タンパク質試料負荷バッファーの添加後に１００℃で加熱した。全試料を４−１５％勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥでの電気泳動によって分離した。タンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜に移し、抗Ｎｏｔｃｈ３ＭＡｂを一次検出抗体としてウェスタンブロット膜に適用した。ＨＲＰ結合二次抗体を検出に使用し、上述のように化学発光基質を使用してシグナルを生成した。ヒトＦｃ、Ｖ５タグ、Ｎｏｔｃｈ３及びＮｏｔｃｈ１に対して陽性のコントロール抗体は(Invitrogen, R&D Systems, Santa Cruz Biotechnologies, 及びOrbigen)から購入した。
【０１９２】
ウェスタンブロット分析は、ＭＡｂ２５６Ａ−４及び２５６Ａ−８が変性条件下でＮｏｔｃｈ３−ＬＤ／Ｆｃに結合しないことを示した。このことは、Ｎｏｔｃｈ３ＬＩＮ１２／ヘテロ二量体形成ドメインが天然分子の立体構造中に維持されるＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ分析とは完全に対照的であった。従って、ＭＡｂ２５６Ａ−４及び２５６Ａ−８が、それらの天然立体構造中に維持されなければならないＮｏｔｃｈ３−ＬＤ中の複数のエピトープに結合すると結論付けられる。この結論は、後述の実施例８において説明するエピトープマッピングの結果によっても確認された。
【０１９３】
実施例５：ルシフェラーゼレポーターアッセイによる抗Ｎｏｔｃｈ３  ＭＡｂの機能の評価
Ａ．プラスミドコンストラクト
上の実施例３に記載された完全長Ｎｏｔｃｈ３発現コンストラクトを配列決定により確認したところ、図１に示された発表されている配列と一致していた。ヒトＪａｇｇｅｄ１プラスミドをＯｒｉＧｅｎｅ(Rockville, MD)から入手し、配列決定によりＮＭ＿０００２１４(ＮＣＢＩ／Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号)と同一であることを証明した。ＯｒｉＧｅｎｅのＪａｇｇｅｄ１プラスミドは抗菌性の選択マーカーを有さないので、Ｊａｇｇｅｄ１コード化配列を含むＮｏｔ  Ｉ断片をｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロマイシンに形質移入した。ヒトＪａｇｇｅｄ２  ｃＤＮＡの３．７Ｋｂのサブクローンを、ヒトＴ細胞白血病細胞株であるＨＨ(ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２１０５)からの第１鎖ｃＤＮＡ合成及びＰＣＲ増幅により生成した。次いでＪａｇｇｅｄ２  ｃＤＮＡをサブクローニングした。Ｎｏｔｃｈ３、Ｊａｇｇｅｄ１、及びＪａｇｇｅｄ２の発現は、実施例４に記載されたように一過性トランスフェクションとウェスタンブロットによって確証した。
【０１９４】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のためのルシフェラーゼレポータープラスミドを生成するために、ＣＢＦ１結合モチーフのタンデムリピートを含み次の配列を有する２つの相補的オリゴヌクレオチドプライマーを合成した：
５’ＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣＧＴＧＧＧＡＡＡＡＴＡＣＣＧＴＧＧＧＡＡＡＡＴＧＡＡＣＣＧＴＧＧＧＡＡＡＡＴＣＴＣＧＴＧＧ (配列番号７)
５’ＧＣＴＣＧＡＧＡＴＴＴＴＣＣＣＡＣＧＡＧＡＴＴＴＴＣＣＣＡＣＧＧＴＴＣ (配列番号８)
【０１９５】
これら２つのオリゴプライマーを、４ｍＭの濃度の各オリゴを有する１００ｍＭのＮａＣｌ中で６５℃にてアニールした。互いにアニールした後、プライマーをＰＣＲによって伸長させた。ＰＣＲ産物を市販のベクター中にクローニングした。挿入物を配列決定によって証明したところ、ＣＢＦ１結合モチーフの４つのタンデムリピートと２つの隣接Ｘｈｏ Ｉ部位を含んでいた。Ｘｈｏ Ｉを使用して挿入物を切除し、ホタルルシフェラーゼレポーターコード配列の下流にライゲーションした。ルシフェラーゼレポーターアッセイ及び配列決定解析後に、ＣＢＦ１結合モチーフの８つのリピートを持つプラスミドクローンを選択し、ＣＢＦ１−Ｌｕｃと標記した。
【０１９６】
Ｂ．安定な細胞株の生産
２つの安定な細胞株を、ヒト胚性腎細胞株 (ＨＥＫ２９３)を使用して機能的アッセイのために生産した。一つの細胞株は核ゲノム中に組み込まれたＮｏｔｃｈ３発現プラスミド及びＣＢＦ１−Ｌｕｃレポータープラスミドを含んでいた。この細胞株は、製造者のプロトコルに従ってリポフェクタミン２０００を使用して２９３Ｔ細胞中にＮｏｔｃｈ３／ハイグロマイシン及びＣＢＦ１−Ｌｕｃプラスミドを同時形質移入することによって生産した。安定な形質移入細胞クローンを、ＤＭＥＭ増殖培地において２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンに対して選択し、ルシフェラーゼレポーターアッセイ及びウェスタンブロットによってスクリーニングした。比較的高いレベルのＮｏｔｃｈ３発現(ウェスタンブロットに基づく)及びルシフェラーゼ活性を有する細胞株を機能アッセイに使用するために選択し、ＮＣ８５と標示した。
【０１９７】
第２の安定な細胞株は、Ｊａｇｇｅｄ１又はＪａｇｇｅｄ２といったＮｏｔｃｈリガンド発現コンストラクト、或いはネガティブコントロールとしてのｐｃＤＮＡ３．１を含んでいた。ヒトＪａｇｇｅｄ１を発現するか又はｐｃＤＮＡ３．１を有する安定な細胞株は、上述のように、２９３Ｔ細胞中への形質移入及びハイグロマイシンに対する選択により生成された。Ｊａｇｇｅｄ２は、サブクローニングされ、２９３Ｔ細胞株に形質移入されたもので、ゲノム内の特定の座位に統合されていると思われた。ハイグロマイシンに耐性を有する細胞を上述のようにして選択した。
【０１９８】
Ｃ．培養条件下でのルシフェラーゼレポーターアッセイ
ＮＣ８５細胞を混合し、ヒトのＪａｇｇｅｄ１(Ｊａｇｇｅｄ１／２９３Ｔ)、Ｊａｇｇｅｄ２／２９３Ｆ、又は、ｐｃＤＮＡ３.１／２９３Ｔをそれぞれ安定して発現する他の２９３Ｔ細胞株と共に２４〜４８時間培養した。共培養終了後、培地を吸引によって除去し、細胞を１×Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ(E1501, Promega, Madison, WI)に溶解し、ルシフェラーゼ活性をＴＤ−２０／２０ルミノメーター(Turner Designs Instrument, Sunnyvale, CA)において製造業者のプロトコール(E1501, Promega, Madison, WI)に従ってルシフェラーゼアッセイシステムを用いてアッセイした。図６及び図７に示すように、ＮＣ８５細胞をＪａｇｇｅｄ１／２９３Ｔ又はＪａｇｇｅｄ２／２９３Ｆと共に培養すると、ルシフェラーゼ活性がｐｃＤＮＡ３.１／２９３Ｔ細胞と共に培養したものと比較して２〜４倍増加した。抗Ｎｏｔｃｈ３ ＭＡｂの阻害作用を評価するために、共培養した細胞の播種及び混合の始めの細胞培養物に抗体を添加した。(２５６−Ａ、２５６Ａ−８及びＥＧＦ−リピートドメインコントロール２５５Ａ−７９)。
【０１９９】
Ｄ.Ｎｏｔｃｈリガンドコートプレート上で細胞を培養することによるルシフェラーゼレポーターアッセイ
Becton Dickinson Labware (#18779, Palo Alto, CA)の通常の９６ウェル組織培養プレートを、ラットＪａｇｇｅｄ１／Ｆｃ、ヒトＤＬＬ−４(R&D Systems, Minneapolis, MN)又はヒトＦｃ(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)、ウシ血清アルブミン(Sigma, St Louis, MO)にてコートした。各タンパク質(３μｇ／ｍｌＰＢＳ)を１００μｌづつウェルに分注し、使用前のコート溶液を除去するまで少なくとも８時間、室温又は４℃で維持した。ＮＣ８５細胞又は癌細胞を、１ウェル当たり３〜５×１０４細胞で播き、２８〜４８時間生育させた。ルシフェラーゼレポーターアッセイ及び抗体阻害アッセイは、上のセクションＣにて説明したように、実施した。ルシフェラーゼレポーターアッセイは、ＬＩＮ１２／二量体化ドメインに対する２５６Ａ−４及び２５６Ａ−８の２つのＭＡｂの結合は、Ｊａｇｇｅｄ１及びＪａｇｇｅｄ２の誘導性ルシフェラーゼレポーター活性をほぼ完全に遮断したことを示す(図６及び７)。対照的に、コントロールとしてのＮｏｔｃｈ３−ＥＧＦドメイン(２５５Ａ−７９)に対するＭＡｂ特異的結合は、Ｊａｇｇｅｄ１誘導性ルシフェラーゼレポーター活性のみを阻害するが(およそ６０％阻害、図６)、Ｊａｇｇｅｄ２誘導性ルシフェラーゼレポーター活性を阻害しない(図７)。ＤＬＬ−４−誘導性ルシフェラーゼレポーター活性を遮断するＭＡｂ ２５６Ａ−４及び２５６Ａ−８の能力は、図８に示す。
【０２００】
更なる機能アッセイは、ＭＡｂ ２５６Ａ−４及び２５６Ａ−８はＮｏｔｃｈ標的遺伝子のリガンド誘導性上方制御を阻害したことを示した。組換えＮｏｔｃｈ３を発現する２９３Ｔ細胞をＪａｇｇｅｄ−１コートプレート上で培養した。ＭＡｂ ２５６Ａ−４及び２５６Ａ−８の存在下では、定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定されるように、２つのＮｏｔｃｈ標的遺伝子であるＨＥＳ５及びＨＥＹ２の上方制御が阻害された(データは示さない)。
抗Ｎｏｔｃｈ３ ＭＡｂがヒト癌細胞に発現される天然のＮｏｔｃｈ３に結合し、レセプターシグナル伝達を遮断するか否かを確認するために、ＯＶ／ＣＡＲ３及びＡ２７８０の２つの卵巣癌細胞株を用いてレポーターアッセイを行った。２５６Ａ−４及び２５６Ａ−８は、ＯＶ／ＣＡＲ３細胞において天然のＮｏｔｃｈ３に媒介されるＪａｇｇｅｄ１誘導性Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を有意に遮断した(図９a)。同様に、両ＭＡｂは、プレート上にコートしたＤｌｌ４によって誘導されるおよそ５０％のルシフェラーゼ活性を阻害した(図９ｂ)。後の結果は、Ｎｏｔｃｈ１及びＮｏｔｃｈ３がＡ２７８０細胞において発現されるという事実と一致している。これらの結果は、抗Ｎｏｔｃｈ３ ＭＡｂが癌細胞における天然Ｎｏｔｃｈ３媒介性シグナル伝達を阻害しうることを示唆する。
【０２０１】
実施例６：アポトーシスアッセイ
アネキシンＶは細胞表面上の早期アポトーシスのマーカーであり、アポトーシスの細胞群は蛍光体標識した抗アネキシンＶ抗体によって印付けされ、ＦＡＣＳ分析によって定量化されうる。上記のように、ＮＣ８５細胞をＦｃ−又はＪａｇｇｅｄ１／Ｆｃ−コート９６ウェルプレートの１ウェルにつき５〜６×１０４細胞で播き、無血清ＤＭＥＭ培地に２４時間維持した。アポトーシス細胞は、ＦＩＴＣ−標識抗アネキシンＶ抗体(BD Biosciences, Palo Alto, CA)によって染色し、ＦＡＣＳによって分析した。Ｊａｇｇｅｄ１／Ｆｃコート表面上で培養した細胞は、Ｆｃコートプレート上で培養したものと比較して有意にアポトーシス細胞群が低かった(図１０)。抗体の機能効果を調べるために、抗Ｎｏｔｃｈ３ ＭＡｂを、研究の始めの細胞培養物に加えた。図１０に示すように、抗Ｎｏｔｃｈ３ ＭＡｂ ２５６Ａ−４及び２５６Ａ−８はＪａｇｇｅｄ１によって誘導される細胞生存作用のおよそ５０〜６５％を遮断した。
【０２０２】
実施例７：細胞遊走アッセイ、浸潤アッセイ及び形態アッセイ
インビトロ細胞遊走及び浸潤アッセイは、癌細胞の転移能力を評価するために多用される。これらのアッセイは、腫瘍原性の２９３Ｔ／Ｎｏｔｃｈ３−安定性細胞株(ＮＣ８５)に対する抗Ｎｏｔｃｈ３ ＭＡｂによって発揮される阻害効果をアッセイするために実施した。浸潤アッセイは、Ｃｏｓｔａｒ４８-ウェルインサートプレート(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)を使用して実施した。インサートは、インサートの底にある多孔性メンブラン(孔直径＝８μｍ)によって分離される上下のチャンバに、ウェルを分ける。上記のセクションで記述したように、Ｎｏｔｃｈリガンド、Ｊａｇｇｅｄ１／Ｆｃ、ＤＬＬ−４又はヒトＦｃをメンブラン表層に固定した。ＮＣ８５細胞は、１ウェルにつき１０００００細胞で播き、上部チャンバの無血清ＤＭＥＭ中、及び下部チャンバの１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ中に維持した。１０〜２４時間後に、インサートメンブランの上表面に残った細胞を取り除き、インサートメンブランの底に付着しているメンブランを通過した細胞を０．０５％結晶ビロードを含むＰＢＳにて染色した。３０％酢酸により細胞から色素を抽出し、５９０ｎｍで読み取られる吸収を記録した。抗Ｎｏｔｃｈ３ ＭＡｂを細胞培養物に添加して２４時間後にＣｏｓｔａｒアッセイプレートにＮＣ８５細胞を播き、すべてのＭＡｂを細胞培養物に添加して２４時間後にＣｏｓｔａｒアッセイプレートにＮＣ８５細胞を播いた。新鮮なＭＡｂを加えて、遊走アッセイプレート中で同じ濃度を維持した。実験結果を図１１Ａに示す。
【０２０３】
浸潤アッセイは、Ｂｅｃｔｏｎディキンソン４８-ウェルマトリゲルプレート(BD Labware, Palo Alto, CA)を用いて行った。細胞培養ウェルは、インサートウェルの底にある多孔性メンブラン(孔直径＝８μｍ)によって分離される、上下のチャンバに、インサートウェルによって分けた。製造業者によって、メンブラン上表面に最適な密度のマトリゲルがコートされており、メンブラン底表面にフィブロネクチンがコートされていた。図１１Ｂに示すように、ＮＣ８５、Ｊａｇｇｅｄ１／２９３Ｔ、及びｐｃＤＮＡ３.１／２９３Ｔ細胞を、対にして混合した。合計６〜１０×１０４細胞を、４８-ウェルマトリゲルプレートの各々のウェルに播き、増殖培地中で２４時間培養した。上部チャンバのインサートメンブランの上に残った細胞を取り除き、インサートメンブランの底に付着しているメンブランを通過した細胞を０．０５％結晶ビロードを含むＰＢＳにて染色した。色素を抽出し、吸収測定値は前セクションにて記載した通りである。ＭＡｂは、混合した細胞培養物の初めに加えた。結果を図１１Ｂに示す。
【０２０４】
細胞遊走アッセイ結果は、ＮＣ８５細胞をＪａｇｇｅｄ１コートメンブレン上で培養した場合、Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達の活性化により有意に細胞遊走が増加し、ＭＡｂ ２５６Ａ−４及び２５６Ａ−８は明らかに遊走を阻害したことを示す(図１１Ａ)。浸潤実験は同様な傾向を示した(図１１Ｂ)。
更に、細胞「球体」のＪａｇｇｅｄ−１−誘導性の形成に対するＭＡｂ ２５６Ａ−４及び２５６Ａ−８の効果を調べた。Ｎｏｔｃｈ３を過剰に発現する２９３Ｔ細胞をＪａｇｇｅｄ１コートプレート上で培養した場合に、形成された細胞は「細胞ボール」又は「球体」を軽く接着した。しかしながら、ＭＡｂ ２５６Ａ−４及び２５６Ａ−８の存在下では、これら細胞球体の形成は阻害された(データは示さない)。
【０２０５】
実施例８：抗-ＮＯＴＣＨ３ ＭＡｂの結合エピトープのマッピング
Ａ．ドメインＳｗａｐ策略と原理
第一に、アンタゴニストＮｏｔｃｈ３ ＭＡｂは、Ｎｏｔｃｈ３ ＬＩＮ１２／二量体化ドメイン(ＬＤ)と結合するが、相同なヒトＮｏｔｃｈ１ ＬＩＮ１２／二量体化ドメインには結合しない(図１２及び１３を参照)。第二に、実施例４で述べられるように、抗Ｎｏｔｃｈ３ ＭＡｂはウエスタンブロットにおいて変性Ｎｏｔｃｈ３タンパク質に結合しないことから、ＭＡｂは立体配座的エピトープに結合することが示される。第三に、Ｎｏｔｃｈ３及びＮｏｔｃｈ１はＬＩＮ１２／二量体化ドメインのおよそ５５％のアミノ酸配列相同性を共有するので、この領域内のＮｏｔｃｈ３とＮｏｔｃｈ１間のドメインｓｗａｐはタンパク質立体配座を壊さないと結論づけられた。
【０２０６】
Ｂ．ドメインＳｗａｐ融合タンパク質コンストラクト
配列分析は、Ｎｏｔｃｈ３が３つのＬＩＮ１２リピートを有し、その二量体化ドメインは２つのセグメントに分かれることを示す。したがって、５つのドメインｓｗａｐタンパク質コンストラクトは、Ｎｏｔｃｈ１の対応するドメインによって置換される２つの二量体化セグメントと３つのＬＩＮ１２リピートのそれぞれによって生成される。図１２に図示したように、ドメインｓｗａｐコンストラクトは、ＰＣＲ−ＳＯＥ を用いて生成した(Ho, et al., Gene 77:51 (1989)；Horton, et al., BioTechniques 8:528 (1990))。ＰＣＲ及びＰＣＲ−ＳＯＥ反応は、反応に添加した１Ｍベタインと５％ＤＭＳＯによるＰＣＲを用いて行った。ＰＣＲサーモサイクルは、各々のＰＣＲサイクルのアニーリング工程がＰＣＲ−ＳＯＥでは１分の伸展としたことを除いては、ＰＣＲ及びＰＣＲ−ＳＯＥとほぼ同じとした。最終ＰＣＲ−ＳＯＥ生成物をサブクローニングして、配列決定によって確認した。正しいインサート配列を有するプラスミドクローンを、ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩにより切断して、インサートを切り出し、ゲル精製してサブクローニングした。５つのＮｏｔｃｈ３／Ｎｏｔｃｈ１ドメインｓｗａｐコンストラクトを図１２に例示する。エピトープマッピングを容易にするために、ヒトＩｇＧκ鎖シグナル伝達ペプチドを、ドメインｓｗａｐコンストラクトのリーダーペプチドとして用いた。アミノ酸配列を図１６及び１７に示す。
前セクションに記載の方法及びＰＣＲを用いて、Ｎｏｔｃｈ１-ＬＤ ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅した。ＰＡ−１細胞総ＲＮＡ(ＡＴＣＣ番号 ＣＲＬ−１５７２)から第一鎖ｃＤＮＡテンプレートを合成した。ヒトＩｇＧκ鎖リーダーペプチドコード配列を、ＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ−ＳＯＥによりＮｏｔｃｈ１-ＬＤの５'に結合させるためにリーダーペプチドとして用い、Ｈｉｓ-γ１Ｆｃ／ｐＳｅｃにサブクローニングした。
ＥＬＩＳＡ分析結果に基づいて、標的ドメインＬＩ、Ｄ１及びＤ２をサブドメインにさらに分けた。サブドメイン発現コンストラクトを用いたＥＬＩＳＡ結合分析は、Ｌ１及びＤ２だけがＮｏｔｃｈ３ ＭＡｂ結合に必要であることを示した。Ｄ１ドメインは必要でなかった。したがって、Ｌ１及びＤ２のドメインは、特定の結合部位の更なる分析のためにアミノ酸突然変異の複数のクラスターに分けた。図１６及び図１７に示すアミノ酸突然変異のクラスター又はＬ１及びＤ２サブドメインｓｗａｐを含むコンストラクトを生成した。
【０２０７】
Ｃ．Ｎｏｔｃｈ３／Ｎｏｔｃｈ１ドメインＳｗａｐ融合タンパク質の発現
Ｎｏｔｃｈ３／Ｎｏｔｃｈ１−ＬＤドメインｓｗａｐプラスミドを、リポフェクタミン２０００を用いてＣＨＯ細胞に過渡的に形質移入した。ＣＨＯ細胞を、６ウェルプレートの１ウェル当たり０．８〜１×１０６細胞で、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ成長培地に播き、形質移入の前終夜にわたってＣＯ２インキュベーターに維持した。およそ３時間成長培地中で形質移入した後細胞を回収し、次いで２％ＦＣＳを有するＤＭＥＭに切り換え、３日間培養した。条件培地を回収して、３５００回転数／分で１０分間遠心分離した。ＣＨＯから分泌されるＮｏｔｃｈ３−ＬＤドメインｓｗａｐタンパク質を含む上清を集め、ウエスタンブロット及びＥＬＩＳＡ結合分析のために調製した。ＥＬＩＳＡは、すべてのドメイン−ｓｗａｐ融合タンパク質が発現され、培養上清中に分泌されたことを示し(表４)、これはウエスタンブロット分析によって更に確認された(データは示さない)。
ＥＬＩＳＡ読み値は、すべてのタンパク質が培地上清に発現されていることを示す検出抗体として抗ヒトＦｃ抗体を用いた。ヒトＩｇＧ／Ｆｃをコントロールとして用いた。各ウェルにコートされるヒトＩｇＧ／Ｆｃの開始点は１００ｎｇである。
【０２０８】
表４：ＥＬＩＳＡ読み値
0005386364.tif 000005
表４のＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいて使用するタンパク質の略記号は以下の通りである。Ｎ１−ＬＤ、Ｎｏｔｃｈ１−ＬＤ／Ｆｃ。Ｎ３−ＬＤ、Ｎｏｔｃｈ３−ＬＤ／Ｆｃ。Ｌ１−ｓｗａｐ：第一ＬＩＮ１２ドメインｓｗａｐ。Ｌ２−ｓｗａｐ：第二ＬＩＮ１２ドメインｓｗａｐ。Ｌ３−ｓｗａｐ：第三ＬＩＮ１２ドメインｓｗａｐ。Ｄ１−ｓｗａｐ：第一二量体化ドメインｓｗａｐ。Ｄ２−ｓｗａｐ：第二二量体化ドメインｓｗａｐ。ｈＩｇＧ−Ｆｃ、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ。
【０２０９】
Ｄ．ＥＬＩＳＡを使用するエピトープ結合アッセイ
９６ウェル平底Ｉｍｍｕｌｏｎ ＩＩマイクロテストプレート(Dynatech, Laboratories, Chantilly, VA)を、１×フェノールレッド及び３−４滴のｐＨｉｘ／リットル(Pierce, Rockford, IL)を含むリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)中の１００μｌの抗体(０．１μｇ／ｍｌ)を添加することによって抗ヒトＦｃ抗体(Jackson ImmunoResearch)でコートし、室温で一晩インキュベートした。コーティング溶液を、プレートをはじいて除去した後、０．１％のメルチオレート及びＰＢＳＴ中に２％のＢＳＡを含む２００μｌのブロッキングバッファーを、非特異的結合をブロックするために各ウェルに１時間加えた。ついで、そのウェルをＰＢＳＴで洗浄した。Ｎｏｔｃｈ３／Ｎｏｔｃｈ１ドメインｓｗａｐコンストラクトの各形質移入体から５０マイクロリットルの上の条件培地を集め、５０μｌのブロッキングバッファーと混合し、マイクロプレートの個々のウェルに添加した。１時間のインキュベーション後、Ｎｏｔｃｈ３／Ｎｏｔｃｈ１−ＬＤドメインｓｗａｐタンパク質をコートした抗Ｆｃ抗体によって捕捉し、ウェルをＰＢＳＴで洗浄した。抗Ｎｏｔｃｈ３ＭＡｂ及びアイソタイプ一致コントロールＭＡｂを上のようにブロッキングバッファーで連続希釈し、５０μｌの希釈したＭＡｂを各ウェルに添加して、結合Ｎｏｔｃｈ３／Ｎｏｔｃｈ１ドメインｓｗａｐタンパク質への結合を評価した。セイヨウワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)結合Ｆｃ特異的ヤギ抗マウスＩｇＧを検出に使用した。０．１％の３，３，５，５−テトラメチルベンジジン及び０．０００３％の過酸化水素を含むＨＲＰ基質溶液を、３０分間、発色のためにウェルに添加した。５０ｍｌの２ＭのＨ２ＳＯ４／ウェルを添加して反応を終了させた。４５０ｎｍでのＯＤをＥＬＩＳＡリーダーで読み取った。サブドメインｓｗａｐコンストラクト及び変異のクラスターを上のＥＬＩＳＡ分析によって同様にして検査した。
【０２１０】
ドメイン-ｓｗａｐタンパク質に対するＭＡｂ ２５６Ａ−４及び２５６Ａ−８を用いたＥＬＩＳＡ結合実験は、第一ＬＩＮ１２ドメイン(Ｌ１)及び第二二量体化ドメイン(Ｄ２)のｓｗａｐが３つすべてのＭＡｂ結合を完全に無効にするのに対して、第一二量体化ドメイン(Ｄ1)のｓｗａｐはＭＡｂ ２５６Ａ−４及び２５６Ａ−８の結合を無効にしたことを示す(図１３Ｂ及びＣ)。第三ＬＩＮ１２ドメイン(Ｌ３)のｓｗａｐは有意に結合を弱めた。しかし、両ＭＡｂは、融合タンパク質と結合することが依然として可能であった。第二ＬＩＮ１２ドメインのｓｗａｐは、ＭＡｂの結合を干渉しなかった(図１３Ｂ及びＣ)。第一ＬＩＮ１２ドメインに結合することが既にマップされているポジティブクローン抗体は、Ｌ１以外のすべてのドメインｓｗａｐ融合タンパク質に結合した(図１３Ｄ)。対照的に、アイソタイプコントロールネガティブ抗体であるＧ３は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいていずれのドメインｓｗａｐ融合タンパク質にも結合しない(データは示さない)。上記の実験から、第一ＬＩＮ１２ドメイン及び第二二量体化ドメインがＭＡｂ ２５６Ａ−４及び２５６Ａ−８結合に必要であると結論づけられた。
【０２１１】
抗Ｎｏｔｃｈ３ ＭＡｂが結合する第一ＬＩＮ１２ドメイン(Ｌ１)のエピトープをさらにマッピングするために、Ｌ1ドメインを、更にＬ１−ｓｕｂ１、Ｌ１−ｓｕｂ２及びＬ１−ｓｕｂ３の３つのサブドメインに分け、Ｎｏｔｃｈ１の対応する配列と交換(swap)した(図１６)。ＥＬＩＳＡ結合実験は、Ｌ１−ｓｕｂ１ｓｗａｐが結合活性に対する阻害作用を有しないこと、及び、Ｌ１−ｓｕｂ２及びＬ１−ｓｕｂ３ｓｗａｐは結合を無効にしたことを示した(図１６)。Ｌ１−ｓｕｂ２及びＬ１−ｓｕｂ３領域では、Ｎｏｔｃｈ３及びＮｏｔｃｈ１の間で異なるアミノ酸残基のクラスターが５つある。したがって、ｓｗａｐ融合タンパク質コンストラクトは、アミノ酸のこれら５つのクラスター内に生成された(図１６)。ＥＬＩＳＡ分析は、Ｌ１−クラスター４ｓｗａｐが３つすべてのＭＡｂ結合に対して阻害を示さなかったことを示した。ｓｗａｐの残り４つのクラスターは、抗Ｎｏｔｃｈ ＭＡｂ結合を部分的又は完全に無効にした。ゆえに、アミノ酸残基のこれら４つのクラスターは、ＭＡｂが結合する４つの異なるエピトープを表した。Ｌ１−クラスター３(アミノ酸：ＤＲＥ)及びＬ１−クラスター５(アミノ酸：ＳＶＧ)は必要とされる。Ｌ１−クラスター１(アミノ酸：ＡＫＲ)及びクラスター２(アミノ酸：ＤＱＲ)は、抗Ｎｏｔｃｈ３ ＭＡｂ結合にも役割があり、この突然変異は有意にＭＡｂ結合を弱めた。
【０２１２】
抗Ｎｏｔｃｈ３ ＭＡｂが結合するＮｏｔｃｈ３の第二二量体化(Ｄ２)ドメインのエピトープをマッピングするために、Ｄ２ドメインを、Ｄ２−ｓｕｂ１、Ｄ２−ｓｕｂ２、Ｄ２−ｓｕｂ３、Ｄ２−ｓｕｂ４及びＤ２−ｓｕｂ５の更に５つのサブドメインに分けた。これらサブドメインの配列は、Ｎｏｔｃｈ１の対応する配列と交換した(図１７)。ＥＬＩＳＡ結合実験は、ＭＡｂ  ２５６Ａ−４及び２５６Ａ−８はＤ１−ｓｕｂ２及びＤ２−ｓｕｂ３ｓｗａｐに強く結合するが、Ｄ２−ｓｕｂ１及びＤ２−ｓｕｂ４ｓｗａｐには結合しないことが示された。両ＭＡｂは、Ｄ２−ｓｕｂ５に弱い結合を示した(図１７)。したがって、データから、Ｄ２−ｓｕｂ１及びＤ２−ｓｕｂ４は抗Ｎｏｔｃｈ３ ＭＡｂ結合に必要であり、Ｄ２−ｓｕｂ５は結合活性を促しうることが示唆された。
ＭＡｂ ２５６Ａ−４及び２５６Ａ−８はＬ１及びＤ２を含む立体配置的エピトープに結合するアンタゴニスト抗体であるのに対して、Ｌ１のみに結合する他の抗体２５６Ａ−１３はアゴニスト性である(２００７年１０月１８日に出願の同時係属米国特許出願番号第１１／８７４６８２号を参照)。さらに、アゴニスト２５６Ａ−１３はＬ１内のエピトープについてアンタゴニスト２５６Ａ−４と競合し、エピトープマッピング研究により、これらはＬ１上のオーバーラップするエピトープに結合することが示唆される。主な相違は、アンタゴニスト抗体もＤ２に結合するのに対して、アゴニスト抗体は結合しないことである。Ｌ１及びＤ２への同時結合が拮抗性活性の原因であるという仮説を試験するために、２５６Ａ−４と類似のＤ２のエピトープに結合する２５６Ａ−２を分析した。ＭＡｂ ２５６Ａ−２はアンタゴニストでもアゴニストでもない(データは示さない)。試験は、２５６Ａ−２が２５６Ａ−１３と競合せず、同時にＮｏｔｃｈ３に結合しうることを示した。さらに、２５６Ａ−２及び２５６Ａ−１３はそれぞれ２５６Ａ−４と一部競合しているが、これら２つの抗体が組み合わさるとＮｏｔｃｈ３に対する２５６Ａ−４の結合を完全に遮断する(データは示さない)。また、試験から、Ｌ１及びＤ２のエピトープに対して２つの抗体が別々に結合してもリガンド依存性Ｎｏｔｃｈ３活性化は阻害されないことを示した。このことから、アンタゴニスト抗体は、おそらくＬ１及びＤ２相互作用を固定して安定化し、リガンドが誘導する立体配位的変化を阻害する、ブリッジを形成することが示唆される。(図１８を参照) 。
【０２１３】
実施例９：抗Ｎｏｔｃｈ３ＭＡＢの配列決定
抗体結合特性は重鎖と軽鎖の双方の可変領域に依存するので、２５６Ａ−４及び２５６Ａ−８の可変配列をサブタイプ化し、配列決定した。抗体ＩｇＧサブタイプを、Isostripマウスモノクローナル抗体キット(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)を使用して決定した。その結果は、２５６A−４及び２５６Ａ−８の量ＭＡｂがＩｇＧ１重鎖とカッパ軽鎖を有していることを示した。
重鎖及び軽鎖の可変領域配列をＲＴ−ＰＣＲ及びｃＤＮＡクローニングを通して解読した。ハイブリドーマクローン２５６Ａ−１３からの全ＲＮＡを、製造者のプロトコルに従って ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット(Qiagen, Valencia, CA)を使用して単離した。第一ストランドｃＤＮＡを、ＲＮＡ鋳型とSuperscriptaseIIIキットを使用して合成した。軽鎖及び重鎖ｃＤＮＡｓの可変領域を、マウスカッパ鎖コード領域の ５’-末端をカバーする変性順方向プライマーと可変領域の３’-末端との接合部で定常領域に対応する逆方向プライマーを使用して、又はマウス重鎖コード領域の５’-末端をカバーする変性順方向プライマーとマウス重鎖の定常領域逆方向プライマーを使用して、第一ストランドｃＤＮＡからＰＣＲ増幅させた。ＰＣＲ産物を市販のベクター中にクローニングし、Lone Star Lab(Houston, TX)によって配列決定した。ヌクレオチド配列を、コンピュータソフトウェアプログラムＤＮＡＳｔａｒ(DNASTAR, Inc., Madison, WI)を利用して解析した。各抗Ｎｏｔｃｈ３ ＭＡｂ配列を、同じハイブリドーマクローンから誘導した複数のＰＣＲクローンからの配列によって決定した。
ＭＡｂ ２５６Ａ−４は、重鎖及び軽鎖の可変領域にそれぞれ１２３及び１１６アミノ酸残基を含む(図４Ａ及び４Ｂ)。ＭＡｂ ２５６Ａ−８は、それぞれ重鎖及び軽鎖の可変領域の１２２及び１２３のアミノ酸残基からなる(図５Ａ及び５Ｂ)。
【０２１４】
実施例１０：Ｎｏｔｃｈ３のメタロプロテアーゼ切断に対するＮｏｔｃｈ３アンタゴニスト抗体の影響
Ｎｏｔｃｈレセプター活性化は膜近傍部位(Ｓ２)でのリガンド誘導メタロプロテアーゼ切断を含み、細胞外サブユニットを生じる。この切断は、活性化されたＮｏｔｃｈ細胞内領域を放出するためのＳ３切断に対する必須の条件である。２５６Ａ−４及び２５６Ａ−８は共に、その結合にＮｏｔｃｈ３のＬ１及びＤ２ドメインの少なくとも一部の存在を必要とすることが判明した。これら２つのドメインは、線形配列内に近接して位置せずに、２つの別々のポリペプチドに位置しており、これら抗体が、不活性の自己抑制されたＮｏｔｃｈ構造を安定させることができることを示唆している。アンタゴニスト抗体が、２つのタンパク分解性切断を含むリガンド独立性の逐次Ｎｏｔｃｈ活性化事象を阻害しうるかどうかを試験するために、組換えＮｏｔｃｈ３レセプターを安定に発現する２９３Ｔ細胞(ＮＣ８５細胞)を、固定した組換えＪａｇｇｅｄ−１で処理するか又はＪａｇｇｅｄ−１を発現する２９３Ｔ細胞と共培養した。培養培地においてタンパク分解性切断によって生成された可溶型細胞外サブユニットを、Ｎｏｔｃｈ３切断産物を認識する固体表面に結合した抗体を使用してＥＬＩＳＡアッセイによって検出した。Ｎｏｔｃｈ３アンタゴニストＭＡｂは、条件培地において可溶型Ｎｏｔｃｈ３細胞外サブユニットの生成を減少させると思われ、一方非機能的Ｎｏｔｃｈ３結合抗体は減少させないと思われた。
Ｓ２切断断片を直接検出するために、Ｎｏｔｃｈ３ Ｃ末端抗体を用いて７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動及びウェスタンブロットを行った。Ｓ２断片は５７のアミノ酸残基であり、切断していないＮｏｔｃｈ３小サブユニット(膜貫通サブユニット)よりも小さく、わずかに速く遊走する。
Ｎｏｔｃｈ３アンタゴニストＭＡｂがＳ２でＮｏｔｃｈ３のリガンド誘導性のメタロプロテアーゼ切断を阻害するか否かを調べるために、組換えＮｏｔｃｈ３を発現する２９３Ｔ細胞を、γセクレターゼインヒビター化合物Ｅ(１μＭ)にて４時間処理し、部位Ｓ２での切断の生成物を安定化し、蓄積させた。ＭＡｂ ２５６Ａ−４及び２５６Ａ−８の存在下では、Ｓ２でのＮｏｔｃｈ３のＪａｇｇｅｄ−１誘導性メタロプロテアーゼ切断は阻害された(データは示さない)。
【０２１５】
実施例１１：異種移植マウスにおけるヒト癌モデルを用いた有効研究
Ａ．ヒト癌細胞及び腫瘍形成細胞
ＨＣＣ２４２９、ＨＣＣ９５等のＮｏｔｃｈ３発現を有するヒト癌細胞株は、Academic Institutesから、又はＡＴＣＣから得られうる。２９３Ｔ／ｐｃＤＮＡ３.１、及び２９３Ｔ／Ｎｏｔｃｈ３(ＮＣ８５)は、前セクションに記載したように、関連した遺伝子を２９３Ｔに形質移入し、ハイグロマイシンにて選別することによって生成する。すべての細胞は、１０％ウシ胎児血清、ナトリウムピルベート、非必須アミノ酸、Ｌ-グルタミン、ビタミン溶液及びペニシリン−ストレプトマイシンを有するＲＰＭＩ１６４０培地又はＤＭＥＭ培地中で培養する(Flow Laboratories, Rockville, MD)。細胞株は、インキュベーター中で、５％ＣＯ２及び９５％の空気の混合下、３７℃でインキュベートする。培養物は、凍結貯蔵物から回復させてから３週間未満の間維持される。９０％の生存度を有する対数的に増殖する単細胞懸濁液細胞を、ＰＢＳにて洗浄した後に、腫瘍細胞注入のために用いる。
【０２１６】
Ｂ．動物
例えば、マウスは、フレデリック癌技術研究所, Frederick, MDの国立癌研究所の動物産生部門から得られる。動物は目的繁殖させ、研究の始めには実験的にナイーブである。研究に用いるために選択するマウスは、できるだけ年齢と体重が均一になるように選択する。６〜８週齢であり、開始時の体重はおよそ１８〜２５グラムとする。この研究で使用する動物の生年月日の記録は研究生データに取り置き、グループ帰属時の体重範囲を報告書に明記する。各動物は、番号を付した耳タグによって識別する。動物は、ＮＩＨガイドラインを満たすないしは上回る、セルロースベッドを含むポリスチレン使い捨て靴箱ケージに、処理群ごとにグループ化する(４マウス／ケージ)。研究の経過の間、動物室の環境条件をモニターし、１８〜２６℃の温度範囲内に維持し、相対的な湿度を毎日記録する。１２時間の明／暗照明周期を研究期間中維持する。動物には放射線照射した食物を与える。この研究の結果を妨げうるレベルの汚染物質が食物中に存在することは明らかとなっていない。加圧滅菌水をウォーターボトルにより各動物に与える。この研究の結果を妨げうるレベルの汚染物質が水に存在することは明らかとなっていない。研究を行う前に、すべての研究動物は、投薬の初日前の少なくとも７日間の間、所定の住居に慣れさせる。
【０２１７】
Ｃ．腫瘍モデル及び有効性研究
マウスは、ナトリウムペントバルビタール(５０ｍｇ／ｋｇ体重)を用いて麻酔し、右側側臥位に置く。非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)細胞株であるＨＣＣ２４２９(Haruki, et al. Cancer Res. 65: 3555 (2005))、ＨＣＣ９５(John Mina博士より)、及びＨ２１２２(ＡＴＣＣ番号  ＣＲＬ５９８５)等の癌細胞を含む、１０％マトリゲル含有の５０μｌハンクを脚の左葉に注射する。腫瘍細胞の注射後、マウスを左側臥位に向け、十分に回復するまで４５〜６０分間観察する。腫瘍細胞注射の記録は、生の研究データに書きおく。
すべての動物は、研究生データに記録される研究及び臨床所見の間、少なくとも１日１回ケージ内で観察される。顕著な有害効果を示す動物は研究から除外することが必要であろう。体重は処置の間週に１回測定する。可能であれば、各マウスからの癌組織を回収し、将来可能性のある生物学的特徴付けのために保存する。
【０２１８】
実施例１２：ＮＯＴＣＨ３関連疾患についてのアッセイ
他のＮｏｔｃｈ３関連疾患を同定するために、患者試料のＮｏｔｃｈ３遺伝子を配列決定し、患者細胞を用いてＦＩＳＨ(蛍光インサイツハイブリダイゼーション)及びＣＧＨ(比較ゲノムハイブリダイゼーション)分析を行って遺伝子増幅や転座を探すか、又は患者組織ないしは腫瘍切片を用いて免疫組織化学を行ってＮｏｔｃｈ３レセプターの過剰発現を調べることができる。さらに、Ｎｏｔｃｈ３関連疾患を有すると思われる患者からの細胞を単離・培養して、細胞移動、浸潤、生存及び増殖に対する本発明のアンタゴニスト抗体の影響を調べることができる。細胞移動及び浸潤アッセイのためのプロトコールは実施例７に記述しており、アポトーシスアッセイのためのプロトコールは実施例６に記述している。細胞増殖アッセイのために、患者試料から培養した細胞を、Ｎｏｔｃｈリガンドにてコートした９６ウェルプレートとコートしていない９６ウェルプレートに播く。アンタゴニスト抗体は培養開始時に添加する。細胞数は、トリパンブルー染色を用いて所定の時間点で計数する。Ｎｏｔｃｈ３ ＦＩＳＨ及びＣＧＨ分析は、Park, et al.(Cancer Res, 66: 12 (2006))の公開されたプロトコールを使用して実行してもよい。
【０２１９】
当業者であればここに記載された発明の特定の実施態様に対する多くの均等物を、認識するか、又はただの常套的な実験を使用して確認することができる。かかる均等物は次の特許請求の範囲によって包含されるものである。
【図１】
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【図２Ａ】
0005386364.tif 000007
【図２Ｂ】
0005386364.tif 000008
【図２Ｃ】
0005386364.tif 000009
【図２Ｄ】
0005386364.tif 000010
【図２Ｅ】
0005386364.tif 000011
【図２Ｆ】
0005386364.tif 000012
【図２Ｇ】
0005386364.tif 000013
【図２Ｈ】
0005386364.tif 000014
【図３】
0005386364.tif 000015
【図４Ａ】
0005386364.tif 000016
【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
0005386364.tif 000021
【図８】
0005386364.tif 000022
【図９Ａ】
0005386364.tif 000023
【図９Ｂ】
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【図１０】
0005386364.tif 000025
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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