(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列が配列番号１で示される、ヘパトポイエチンＰＣｎ（ＨＰＰＣｎ）タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のＨＰＰＣｎタンパク質をコードしている、核酸分子。
【請求項３】
請求項１に記載のＨＰＰＣｎタンパク質又は請求項２に記載の核酸分子を含む、医薬組成物。
【請求項４】
肝細胞増殖及び肝再生を促進し、様々な原因による肝臓損傷を治療し、又は肝線維症を治療するのに使われる薬剤を調製するための、請求項１に記載のＨＰＰＣｎタンパク質又は請求項２に記載の核酸分子の使用。
【請求項５】
前記薬剤が急性又は慢性肝臓損傷を治療するのに使われる、請求項４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的製剤及びタンパク薬物の分野に、具体的には外因性肝再生因子、ヘパトポイエチン（Ｈｅｐａｔｏｐｏｉｅｔｉｎ）ＰＣｎ（ＨＰＰＣｎ）に関する。このタンパク質は、肝細胞増殖及び肝再生を促進でき、細胞に存在するときに腫瘍細胞の増殖を阻害して、腫瘍細胞のアポトーシスを促進できるので、臨床応用の潜在的価値を有する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓は、生体の強力な再生能力を有する臓器である。肝臓の調節機構は、１００年以上に亘って調べられている。しかし、現在、例えば、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、形質転換因子−α（ＴＧＦ−α）などとして知られる、肝再生に関連する増殖因子の作用は、肝臓特異性が十分ではないので、肝再生の臓器特異的な調節機構を説明することが困難である。それ故に、この分野の研究は、肝再生の新規な調節因子の探求に集中している。１９５０年代には、哺乳類の肝臓に、その増殖を制御できる幾つかの物質があることが分かった（非特許文献１）。１９７５年に、ＬａＢｒｅｃｑｕｅらは、ラットの再生された肝組織に、明確に肝細胞増殖を促進することができる、熱安定性混合物があることを初めて報告したので（非特許文献２）、この混合物は、肝臓刺激物質（ＨＳＳ）と呼ばれている。１９８０年代半ばには、同種の因子が、発明者達によってヒトの胎児の肝組織から発見され、そして対応する生物活性、物理化学的性質、タンパク質の精製及び臨床応用が全身的に研究された。この種類の因子が、厳しい肝臓損傷の臨床治療において良好な治療効果を示したことによって、それらは大きな注目を集め、関連米国特許が１９９５年に得られた（特許文献１）。しかし、その中の成分は、タンパク質を精製して識別する技術の制限のために、さらに識別されることはなく、技術の制限は、そのような物質のさらなる開発及び応用を制限する。その一方で、この種類の因子の分子クローニングが、世界的に多くの研究室で研究されている。１９９５年には、Ｈａｇｉｙａら（非特許文献３）が、ラットの再生された肝組織から肝再生の増強因子を分離して、そのクローニング及び発現を行ない、そして肝再生の組換え型増強因子は、部分肝切除ラットの肝再生を促進できるが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは初代培養肝細胞及び肝臓細胞株を刺激する活性を有していないことが分かった（特許文献２）。
【０００３】
近年、発明者達が、幾つかの分離法を用いて、新生児の仔ウシの肝臓から新しい肝細胞増殖因子を分離し、そしてこの肝細胞増殖因子が、肝細胞のＤＮＡ合成を促進することができて、急性又は慢性肝臓損傷に対して保護作用を有し得ることが発見された。この肝細胞増殖因子はＨＰＰＣｎと表される。その配列分析は、それが、ロイシンの豊富な酸性核タンパク質（ＬＡＮＰ）類に属することを示した。ＬＡＮＰは多機能性の酸性核タンパク質であり、それは、シグナル伝達、タンパク質分解、細胞骨格の動態、及び形態形成などの各種の生物学的過程に必要とされる（非特許文献４〜１１）。しかし、増殖因子としてのＬＡＮＰが、肝細胞増殖又は肝再生を促進できるとは報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】Ｗｕ  Ｃｔ、Ｔｕ  Ｑ、Ｈｅ  ＦＣらの「Hepatokine and methods for its use」、米国特許、１９９５年、第５４４００２２号
【特許文献２】Ｆｒａｎｃａｖｉｌｌａ  Ａ、Ｈａｇｉｙａ  Ｍ、Ｓｔａｒｚｌ  Ｅ、「Mamalian ALR: human and rat」米国特許、１９９６年、１９９６年８月２７日：第５５５００３７号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂｌｏｍｑｕｉｓｔ  Ｋらの「Growth stimulation in the liver and tumour development following intraperitoneal injections of liver homogenates in the rat」  Ａｃｔａ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｓｃａｎｄ  １９５７年；１２１（増補）：３７５−３８２
【非特許文献２】ＬａＢｒｅｃｑｕｅ  ＤＲ、Ｐｅｓｃｈ  ＬＡ．  「Preparation and partial characterization of hepatic regeneration stimulator substance from rat liver」  Ｊ  ｐｈｙｓｉｏｌ、  １９７５年、２４８（３）：２７３−２８４
【非特許文献３】Ｈａｇｉｙａ  Ｍ、Ｆｒａｎｃａｖｉｌｌａ  Ａ、Ｐｏｌｉｍｅｎｏ  Ｌらの「Cloning and sequence analysis of the rat augmentor of liver regeneration (ALR) gene: expression of biologically active recombinant ALR and demonstration of tissue distribution」  ＰＮＡＳ、１９９５年、９２（７）：３０７６−３０８０
【非特許文献４】Ｍａｔｓｕｏｋａ  Ｋ、Ｔａｏｋａ  Ｍ、Ｓａｔｏｚａｗａ  Ｎらの「A nuclear factor containing the leucine-rich repeats expressed in murine cerebellar neuron」  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  米国、１９９４年；９１（２１）：９６７０−９６７４
【非特許文献５】Ｍａｌｅｋ  ＳＮ、Ｋａｔｕｍｕｌｕｗａ  ＡＩ、及びＰａｓｔｅｒｎａｃｋ  ＧＲの「Identification and preliminary characterization of two related proliferation-associated nuclear phosphoproteins」  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ  １９９０年；２６５（２２）：１３４００−１３４０９
【非特許文献６】Ｂｒｏｄｙ  ＪＲ、Ｋａｄｋｏｌ  ＳＳ、Ｍａｈｍｏｕｄ  ＭＡらの「Identification of sequences required for inhibition of oncogene-mediated transformation by pp32」  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９９年；２７４（２９）：２００５３−２００５５
【非特許文献７】Ｃｈｅｎ  ＴＨ、Ｂｒｏｄｙ  ＪＲ、Ｒｏｍａｎｔｓｅｖ  ＦＥらの「Structure of pp32, an acidic nuclear protein which inhibits oncogene-induced formation of transformed foci」  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １９９６年；７（１２）：２０４５−２０５６
【非特許文献８】Ｌｉ  Ｍ、Ｍａｋｋｉｎｊｅ  Ａ、Ｄａｍｕｎｉ  Ｚの「Molecular identification of I1PP2A, a novel potent heat-stable inhibitor protein of protein phosphatase 2A」  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９６年；３５（２２）：６９９８−７００２
【非特許文献９】Ｂｒｅｎｎａｎ  ＣＭ、Ｇａｌｌｏｕｚｉ  ＩＥ、Ｓｔｅｉｔｚ  ＪＡの「Protein ligands to HuR modulate its interaction with target mRNAs in vivo」  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０００年；１５１（１）：１−１４
【非特許文献１０】Ｓｅｏ  ＳＢ、ＭｃＮａｍａｒａ  Ｐ、Ｈｅｏ  Ｓらの「Regulation of histone acetylation and transcription by INHAT, a human cellular complex containing the set oncoprotein」  Ｃｅｌｌ  ２００１年；１０４（１）：１１９−１３０
【非特許文献１１】Ｏｐａｌ  Ｐ、Ｇａｒｃｉａ  ＪＪ、ＭｃＣａｌｌ  ＡＥらの「Generation and Characterization of LANP/pp32 Null Mice」  Ｍｏｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ；２４（８）：３１４０−９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
中国では、１億２０００万人を超える患者がウィルス性肝炎、肝硬変及び／又は肝臓癌に苦しんでいる。したがって、肝細胞増殖及び肝再生を特異的に促進できる活性因子の開発は、様々な原因による肝臓損傷の治療に重要である。
【０００７】
さらに、肝臓癌などの、悪性腫瘍は、ヒトの健康にとって主要な有害物の１つになり、それ故に、腫瘍細胞の増殖又は腫瘍形成を阻害することは社会的にとても重要である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明では、ヘパトポイエチンＰＣｎ（ＨＰＰＣｎ）が新規な肝細胞増殖因子であり、新生児の仔ウシの肝臓から分離されることが発見された。対応するヒトヌクレオチド配列がヒトｃＤＮＡライブラリーから得られ、組換え型ヒトＨＰＰＣｎタンパク質を得るために大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）内で発現させられた。ＨＰＰＣｎの本質的特性は次の通りである：（１）それは、ロイシンの豊富な酸性核タンパク質（ＬＡＮＰ）類の１種であり、約３０ＫＤの分子量を有し、プロテアーゼに感受性があり、熱安定性である；（２）それは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのラットの初代培養肝細胞及び肝臓細胞株のＤＮＡ合成を促進することができる；（３）それは、ｉｎ  ｖｉｖｏの部分肝切除マウスの肝臓内のＤＮＡ合成を促進することができる；（４）それは、急性肝臓損傷及び肝線維症から肝臓を保護できる；（５）腫瘍細胞内でのその過剰発現が、腫瘍細胞の増殖を阻害できる。
【０００９】
次の図は、本発明を説明するために使われるにすぎず、本発明を制限するためのものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＨＰＰＣｎのアミノ酸配列（配列番号：１）を示す図である。
【図２】大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＢＬ２１内のＨＰＰＣｎの発現及びその精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す図であり、上パネルは、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＢＬ２１内のＨＰＰＣｎの誘導性発現を示し（１：陰性の対照物；  ２：封入体タンパク質；  ３：可溶性タンパク質）、下パネルは、ＨＰＰＣｎの精製を示す（１：封入体タンパク質；  ２：浸透液；  ３：溶離液を用いることにより溶離した物；  ４：低分子量マーカー）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
したがって、本発明の第一態様は、配列番号：１で示されたアミノ酸配列を含むＨＰＰＣｎに関する。好ましくは、本発明のＨＰＰＣｎの配列は、配列番号：１で示される。本発明は、ＨＰＰＣｎの相同体にも関係し、それは、本発明のＨＰＰＣｎと少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、９０％又は９５％の、相同性を有し、本発明のＨＰＰＣｎの活性を保持する。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、ＨＰＰＣｎ又はその相同体をコードしている核酸分子に関する。
【００１３】
本発明のさらなる態様は、本発明のＨＰＰＣｎタンパク質若しくはその相同体又はそれらをコードしている核酸分子を含む医薬組成物に関する。医薬組成物は、所望により、医薬的に許容できる担体又は他の標準的な助剤をさらに含んでよい。これらの担体及び助剤は、当業者の技能の範囲内である。
【００１４】
本発明のさらなる態様は、肝細胞増殖及び肝再生を促進し、様々な原因による肝臓損傷を治療し、肝線維症を治療し、細胞に存在するときに腫瘍細胞の増殖を阻害し、又は様々な腫瘍を治療するのに使われる薬剤を調製するための、ＨＰＰＣｎタンパク質若しくはその相同体又はそれらをコードしている核酸分子の使用に関する。
【００１５】
好ましくは、本発明の薬剤は、肝線維症又は急性若しくは慢性肝臓損傷を治療するのに使われる。
【００１６】
本発明によれば、用語「肝細胞増殖（hepatocyte proliferation）」とは、肝臓、標準的な肝臓細胞株及び肝臓癌細胞株に由来する初代培養実質細胞の細胞分裂能力の増加をいい、細胞の増殖能力は、ＤＮＡ合成を検出することにより、主に測定される。
【００１７】
本発明によれば、用語「肝再生（liver regeneration）」とは、哺乳類の肝臓が損傷後に自然に回復する能力をいう。
【００１８】
本発明によれば、本発明のＨＰＰＣｎは、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ），酵母（Ｐｉｃｈｉａ），サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）又は動物細胞内で発現し得る。
【実施例】
【００１９】
次の実施例は、本発明を説明するために使われるが、それらは本発明を制限するためのものではない。
【００２０】
実施例１：ＨＰＰＣｎの製造
ＤＥＡＥセルロース、ソース（Ｓｏｕｒｃｅ）１５Ｑなどのクロマトグラフィー；ＳＤＳ−ＰＡＧＥリカバリー；並びにＭＡＬＤＹ−ＴＯＦ及びＱ−ＴＯＦ質量分析により、タンパク因子であるヘパトポイエチンＰＣｎ（ＨＰＰＣｎ）を新生児の仔ウシの肝臓から精製して識別した。ヒト胎児肝臓ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより、ヒトＨＰＰＣｎのｃＤＮＡ配列を得た。ＢａｍＨ  Ｉ及びＸｈｏ１  Ｉ制限酵素認識部位を遺伝子配列の両端に付けて、次に配列を原核生物発現ベクターＰＥＴ−２４ａ中に組込み、プラスミドＰＥＴ−２４ａ−ＨＰＰＣｎを得た。ＩＰＴＧ誘導によって、プラスミドを大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）に変えて、発現させた。イオン交換及びゲルろ過により、９５％を超える純度を有する組換え型タンパク質を得た。タンパク質のアミノ酸配列を図１に示し、タンパク質の電気泳動図を図２に示す。
【００２１】
実施例２：肝細胞増殖を促進する組換え型タンパク質ＨＰＰＣｎの活性の識別
肝細胞増殖を促進するＨＰＰＣｎの活性を3Ｈ−ＴｄＲ  ＤＮＡ組込み試験によって検出した。ラットの初代培養肝細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生物活性の検出における対象細胞として使用した。１００μＬの細胞懸濁液（５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を９６ウェルのプレート上に添加して、６時間培養した。次に様々な濃度のＨＰＰＣｎを加え、さらに２４時間培養した。１．８５×１０4Ｂｑの3Ｈ−ＴｄＲを各ウェルに加え、３時間後に、液体シンチレーション計測を行なった。結果は、ＨＰＰＣｎが、肝細胞のＤＮＡ合成を著しく用量依存的な態様で促進できることを示した（表１）。肝再生（ＡＬＲ）の他の増強因子は、ＨＰＰＣｎのこの特性を有しない。
【００２２】
【表１】
0005390397.tif 000002
【００２３】
実施例３：急性肝臓損傷に対する組換え型タンパク質ＨＰＰＣｎの保護作用
組換え型タンパク質ＨＰＰＣｎが３４％肝切除マウスの肝臓のＤＮＡ合成に及ぼす影響を検出することによって、組換え型タンパク質ＨＰＰＣｎが部分肝切除マウスに及ぼす保護作用を決定した。良好な健康状態のオスのＣ５７マウスに、肝臓の中葉の外科的切除を受けさせた。２．５ｍｇＨＰＰＣｎ／ｋｇ体重又は等体積の生理食塩水を異なる時点で肝切除マウスの尾静脈中に注射した。１８時間の治療後、２０μＣｉ3Ｈ−ＴｄＲを腹腔内に注射した。２時間の組込み後、動物を犠牲にして、肝臓のゲノムＤＮＡを抽出した。液体シンチレーション計測で3Ｈ−ＴｄＲの組込み量を決定した。結果は、治療群の3Ｈ−ＴｄＲの組込み量が、各時点で生理食塩水対照群のものより高いことを示し（表２）、ＨＰＰＣｎが、切除された肝臓の再生能力を強化できることを示唆した。
【００２４】
【表２】
0005390397.tif 000003
【００２５】
１ｍＬのＣＣｌ4／ｋｇ体重の注射後、良好な健康状態の３０匹のＢａｌｂｃマウスをランダムに３つの群に分けた：群Ｉ，１ｍｇＨＰＰＣｎ／ｋｇ体重の静脈注射；群ＩＩ，２．５ｍｇＨＰＰＣｎ／ｋｇ体重の静脈注射；群ＩＩＩ，５ｍｇＨＰＰＣｎ／ｋｇ体重の静脈注射；群ＩＶ，生理食塩水対照群である。マウスには１２時間に１回注射した。４８時間後、血中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の変化を検出し、マウスに病理学検査を受けさせた。対照群のマウスではＡＳＴ及びＡＬＴの血中濃度が著しく増加し、肝臓の大部分の組織球が壊死し、細胞核の消失を示し、そして空胞化を示したのに対して；ＡＳＴ及びＡＬＴの濃度がＨＰＰＣｎ治療群のマウスではある程度まで回復し（表３）、壊死肝細胞の数及び肝臓損傷の程度が著しく減少したことが、結果から分かった。これは、組換え型タンパク質には、ＣＣｌ4による急性肝臓損傷に対する保護作用があることを示唆する。
【００２６】
【表３】
0005390397.tif 000004
【００２７】
実施例４：肝線維症に対する組換え型タンパク質ＨＰＰＣｎの保護作用
４０匹のウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）系ラットでは、エタノール及びＣＣｌ4を用いる合成法により肝線維症モデルを製造した。４週間後、ラットをランダムに４つの群に分けた：対照群、高用量群、中用量群、及び低用量群である。腹腔内投与を毎日行なった。８週間で、動物を犠牲にした。血液サンプルを採取し、血中のＡＬＴ、ＡＳＴなどの生化学的指標の濃度を決定した。肝臓を取り出し、肝臓の外観の変化を観測し、ヒドロキシプロリン及びマロンアルデヒドの含有量を決定し、組織病理学検査を行なった。対照群と比較したときに、治療群は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の濃度が減少し、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）の含有量が著しく減少することを示す一方で、マロンアルデヒド（ＭＤＡ）の含有量には目立った変化がないことが、結果から分かった（表４）。対照群のラットの肝臓は、灰黄色を示し、顆粒状の非平滑面を有したが、治療群のラットの肝臓は比較的赤かった。肝組織のＨＥ染色及びマッソン・トリクローム（Masson’s trichrome）染色の結果は、対照群のラットの肝臓では、細胞壊死及び脂質沈着が起きて、線維性組織が増殖し、偽小葉が形成されたが；治療群では、特に中用量群では、線維性組織の増殖が著しく減少し、肝細胞壊死が減少したことを示す。これは、組換え型タンパク質ＨＰＰＣｎの投与が、慢性肝臓損傷による肝線維症を軽減できることを示唆する。
【００２８】
【表４】
0005390397.tif 000005
【００２９】
実施例５：細胞に存在するときのＨＰＰＣｎによる腫瘍細胞の増殖の阻害
ＨＰＰＣｎを真核性発現ベクター、プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１中に組込み、それを使用してヒト肝臓癌ＳＭＭＣ７７２１細胞株にトランスフェクトした。３６時間の培養後、４％パラホルムアルデヒド及び７０％エタノールで、それぞれに、細胞を固定化した。ＰＩ染色後、細胞周期の変化をＦＡＣＳにより検出した。結果は、トランスフェクトされた肝臓癌細胞には明白なＧ０／Ｇ１期の停止があり、トランスフェクトされた肝臓癌細胞の中でもＧ２／Ｍ期の細胞の比率が、何も組み込まれていないプラスミドをトランスフェクトされた群（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１をトランスフェクトされた群）のものより著しく低いことを示した（表５）。これは、細胞内のＨＰＰＣｎの過剰発現が、肝臓癌細胞の増殖を著しく阻害できることを示唆する。
【００３０】
【表５】
0005390397.tif 000006
【図１】
0005390397.tif 000007
【図２】
0005390397.tif 000008
【配列表】
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