(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸のカルボキシル基の一部が、
（ヒアルロン酸のカルボキシル基から水酸基を除いた残基）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ−Ｙ−Ｚ
（ここで、Ｙは両末端に酸素原子を有する繰り返し単位数が５〜４０のポリエチレンオキシドから導かれる２価の基であり、Ｚは炭素数１８の直鎖状炭化水素基、ステアロイル基、またはオレオイル基である。）
の形式で置換されており、置換基−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ−Ｙ−Ｚの置換度が０．０５〜０．４０である、ヒアルロン酸誘導体。
【請求項２】
水１００重量部に対し、請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体を０．１〜２．０重量部含むハイドロゲル。
【請求項３】
温度応答性を有することを特徴とする請求項２に記載のハイドロゲル。
【請求項４】
請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体を含有する医療用材料。
【請求項５】
請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体を含有する癒着防止材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルボキシ多糖のカルボキシル基が特定の置換基で置換された多糖類誘導体およびそのハイドロゲルに関する。本発明の多糖類誘導体は、水中でハイドロゲルを形成する。かかるハイドロゲルは粘弾性に優れ、かつ注射器などの注入器で所定の場所に注入することができる不定形のインジェクタブルゲルを形成でき、医療用ゲルや癒着防止材として好ましく利用できる。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸やアルギン酸に代表されるカルボキシ多糖類は、その優れた水への溶解性、適度な粘性、粘着性、保湿性や生体適合性を示すことから、食品添加剤、医療材料、化粧品や日用品の添加剤、とりわけ増粘材として幅広く用いられている。
これらカルボキシ多糖類の中で、一般に広く利用されている化合物としてヒアルロン酸があるが、ヒアルロン酸は水溶性のポリマーであり、分散性や保水性がよいことから、食品や化粧品、医薬品など様々な分野で利用されている。また、ヒアルロン酸は安全性が高いため、医療分野においては関節潤滑剤、癒着防止材の原料などに利用されている。
ヒアルロン酸のカルボキシル基を修飾し、不溶性の誘導体を形成した例は知られており、例えば特許文献１にはヒアルロン酸を含むポリアニオン性多糖、求核剤、および活性化剤を水性混合液中で混合することからなるポリアニオン性多糖の非水溶性誘導体およびその製造方法が記載されている。
また、特許文献２には、ヒアルロン酸アミドおよびそれらの誘導体、ならびにそれらの製造方法について記載がなされている。しかしながら、本発明のような高い粘弾性を有するインジェクタブルゲルを与えることについては記載されていない。
さらに、特許文献３には、多糖類高分子および１つの多糖高分子に付着した脂肪酸鎖を有する、ゲル状態から溶液状態に、可逆的に状態変化するようにした天然の傷治療製品が開示されている。
しかしながら、これらの文献で開示されている多糖類は、水溶液中での粘弾性に乏しく、注射針のような細い管を経由して体内に注入可能なハイドロゲルとして用いることは困難である。
また、特許文献４には、カルボキシメチルセルロースの側鎖をホスファチジルエタノールアミンで修飾したものが癒着防止剤として使用できることが、特許文献５には、ヒアルロン酸の側鎖をホスファチジルエタノールアミンで修飾したものが癒着防止剤として使用できることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ０１／０４６２６５号明細書
【特許文献２】国際公開ＷＯ００／０１７３３号明細書
【特許文献３】特開２０００−０５１３４３号公報
【特許文献４】国際公開ＷＯ０７／０１５５７９号明細書
【特許文献５】特開２００６−２９６９１６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明が解決しようとする課題は、高粘弾性を有し、注射器などの注入器で所定の場所に注入できるインジェクタブルゲルとして有用な生体内消化性の多糖類誘導体を提供することにある。これまで開示された技術では、高い粘弾性を有するゲルを得ようとして置換基の導入割合（置換度）を高めようとすると凝集や沈殿が起こり、粘弾性の高いゲルが得られなかった。しかし、高粘弾性のゲルが得られれば、体内の特定の箇所に一定期間、任意に留らせることができるため、傷口の保護や、臓器間の物理的な隔離バリアー形成に有用である。また、かかるゲルに薬物を含浸させることで、局所的なドラッグデリバリーシステムを実現できる。さらに、生体内に注入するといずれは分解または吸収されてしまう特性があれば、外科手術時に用いる注入用ゲル材や再生医療の足場材料などに好ましく利用できる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明者らは、生体内に用いることができて安全性に優れ、取り扱い性に優れたインジェクタブルゲルを見出すことを目的に鋭意研究した結果、カルボキシ多糖類のカルボキシル基を特定の官能基で化学修飾することによって、高い粘弾性を有しながら取り扱い性にも優れたインジェクタブルゲルが得られることを見出し、さらに研究を続けて本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、カルボキシ多糖類のカルボキシル基の一部が、
−ＮＨ−Ｘ−ＣＯ−Ｙ−Ｚ        （ａ）
（ここで、Ｘは炭素数１〜１０の２価の炭化水素基であり、Ｙは両末端に酸素原子を有するポリアルキレンオキシドから導かれる２価の基であり、Ｚは炭素数１から２４の炭化水素基または−ＣＯ−Ｒ２であり、Ｒ２は炭素数１〜２３の炭化水素基である。）
で置換されている、カルボキシ多糖類の誘導体である。
ここで、「カルボキシル基の一部」とは、カルボキシ多糖類が有する複数のカルボキシル基のうちの一部のカルボキシル基が、という意味であり、カルボキシル基が「置換されている」とは、当該カルボキシル基中のカルボニル基が上記式（ａ）で表される置換アミノ基と結合してアミドとなっていることを意味する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のインジェクタブルゲルは、高い粘弾性を有し、取り扱い性に優れたゲルであり、傷口や創傷部位をカバーするシーラント、癒着防止ゲルなどの医療材料にとって好ましく用いられる。また、細胞やたんぱく質と混合することができるので、体外で培養した細胞を体内に入れるための足場材料や、ＤＤＳ担体などにも有用である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明における「カルボキシ多糖類」とは、側鎖にカルボキシル基を有する多糖類をいう。具体的には、ヒアルロン酸、アルギン酸、ペクチン、ポリガラクチュロン酸などの天然多糖類、カルボキシメチルプルラン、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルキトサン、カルボキシメチルマンナン、カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルデキストランなどのカルボキシアルキル多糖類、酸化セルロースや酸化でんぷんなどの酸化多糖類などを挙げることができる。
カルボキシ多糖類としてはヒアルロン酸が好ましく、その場合は、下記式で表される化学構造を繰り返し単位とするヒアルロン酸誘導体を例示することができる。
0005406281.tif 000002
ここでＲは、下記（ａ）または（ｂ）で表される基であり、少なくとも一部は（ａ）で表される基である。
−ＮＨ−Ｘ−ＣＯ−Ｙ−Ｚ        （ａ）
−ＯＭ                          （ｂ）
Ｍは、水素原子、アルカリ金属、またはアルカリ土類金属である。
アルカリ金属としては、ナトリウム、カリウム、リチウムなどが挙げられ、アルカリ土類金属としては、マグネシウム、カルシウムなどが挙げられる。好ましくはナトリウムである。
式（ａ）中のＸは、炭素数１〜１０の２価の炭化水素基である。具体的には、メチレン基、エチレン基、ｎ−プロピレン基、イソプロピレン基、ｎ−ブチレン基、イソブチレン基などが挙げられる。好ましくはメチレン基である。
Ｙは、両末端に酸素原子を有する、ポリアルキレンオキシドから導かれる２価の基である。ポリアルキレンオキシドとは、具体的にはポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコールなどで例示されるポリアルキレンエーテル類をいう。ポリアルキレンオキシド中のアルキレン部分は、炭素数が２−４であることが好ましい。両末端に酸素原子を有するとは、ポリアルキレンオキシドの両末端の水酸基から水素原子を除去したものが隣接する基との結合に関与している構造をいう。具体的には、−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−）ｐ−Ｏ−で表される１，２−ポリプロピレングリコール類、−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）ｐ−Ｏ−で表される１，３−ポリプロピレングリコール類、−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−）ｐ−Ｏ−で表されるポリエチレングリコール類などから導かれる基が挙げられる。また、上記ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体、例えばＰＥＯ−ＰＰＯなどで表される共重合体から導かれる基であってもよい。ここでｐは繰り返し単位数を表す。かかる繰り返し単位数ｐは、好ましくは２〜１００であり、さらに好ましくは３〜７０である。
Ｚは、炭素数１から２４の炭化水素基または、−ＣＯ−Ｒ２であり、Ｒ２は炭素数１〜２３の炭化水素基である。
Ｚの炭素数１から２４の炭化水素基としては、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ノニル基、ラウリル基、ステアリル基などの直鎖状アルキル基、シクロヘキシル基、シクロペンチル基、シクロヘキシルノニル基、コレステリル基などの環状構造を有するアルキル基、オレイル基などの不飽和アルキル基、フェニル基、ナフチル基、ベンジル基などの芳香族炭化水素基が例示できる。これらの中ではステアリル基、オレイル基などが好ましい。
Ｒ２は、炭素数１〜２３の炭化水素基である。Ｒ２の具体例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ノニル基、ヘプタデカニル基、ヘプタデセニル基、ラウリル基、ステアリル基などの直鎖状アルキル基、シクロヘキシル基、シクロペンチル基、シクロヘキシルノニル基、コレステリル基などの環状構造を有するアルキル基、オレイル基などの不飽和アルキル基、フェニル基、ナフチル基、ベンジル基などの芳香族炭化水素基が例示できる。これらの中ではヘプタデカニル基、ヘプタデセニル基などが好ましい。
Ｒ２が脂肪族アルキル基の場合、Ｚの−ＣＯ−Ｒ２は、脂肪酸に由来するアシル基となる。かかるアシル基の好ましい具体例としては、ラウロイル基、パルミトイル基、ステアロイル基、オレオイル基が挙げられる。一方、Ｒ２が芳香族基のときは、Ｚの−ＣＯ−Ｒ２は、芳香族脂肪酸に由来するアシル基となる。その好ましい具体例としては、ベンゾイル基、ナフトイル基を例示することができる。これらの中では、ステアロイル基、オレオイル基が好ましく用いられる。
本発明における置換度は、置換基（ａ）、置換基（ｂ）の当量の合計を１とした場合の、置換基（ａ）の当量をいう。置換基（ａ）の置換度は、好ましくは０．０１〜０．８０であり、より好ましくは０．０３〜０．６０であり、さらに好ましくは０．０５〜０．４０である。
置換基（ａ）の置換度をこの範囲に制御することにより、粘弾性に優れ、注射器などの細管を有する器具を用いて注入可能なゲルを得ることができる。置換基（ａ）の置換度は元素分析による炭素含量と窒素含量の比から求めることができる。
また、多糖類誘導体の重量平均分子量は５×１０３〜５×１０６であり、好ましくは５×１０４〜５×１０６、より好ましくは５×１０４〜１×１０６である。多糖類誘導体の重量平均分子量は、導入される置換基（ａ）の導入による分子量の変化が起こり、置換基（ａ）を導入する前のカルボキシ多糖類よりも分子量が増えることとなる。原料となるカルボキシ多糖類の分子量を適切に選択することによって目的の分子量を有する多糖類誘導体を得ることができる。
原料となる多糖類は、動物由来でも植物由来でも発酵法により製造された多糖類でもよく、これらを化学修飾することによってカルボキシル基を導入する場合は、その合成方法に特に制限はない。
本発明のカルボキシ多糖の誘導体は、（ｉ）カルボキシ多糖またはその金属塩と、（ｉｉ）下記式（２）で表される成分Ｐの縮合反応により得ることができる。
ここで成分Ｐとは、下記式（２）で表される、片末端にアミノ基を有する化合物である。
Ｈ２Ｎ−Ｘ−ＣＯ−Ｙ−Ｚ        （２）
ここで、Ｘ、Ｙ、およびＺの定義は、前記式（ａ）における定義と同一である。
かかるアミノ基は、適切な酸類と塩を形成しても遊離のアミノ基であってもよく、特に制限はない。式（２）で表される化合物は、好ましくは以下の反応により製造することができる。Ａはアミノ基の保護基を表す。
反応１）：
Ａ−ＮＨ−Ｘ−ＣＯＯＨ  ＋  Ｈ−Ｙ−Ｚ  →  Ａ−ＮＨ−Ｘ−ＣＯ−Ｙ−Ｚ
反応２）：
Ａ−ＮＨ−Ｘ−ＣＯ−Ｙ−Ｚ  →  Ｈ２Ｎ−Ｘ−ＣＯ−Ｙ−Ｚ
反応１）は、Ａ−ＮＨ−Ｘ−ＣＯＯ−で表されるアミノ基が保護されたアミノ酸誘導体と、Ｈ−Ｙ−Ｚの構造を有する片末端が水酸基の化合物とのカップリング反応である。反応にはエステル結合を形成させる縮合剤を用いることが好ましく、カルボジイミド類などの縮合剤が好ましく用いられる。好ましい具体例として、ジシクロヘキシルカルボジイミドを挙げることができる。
アミノ基の保護基Ａとしては、具体的にはベンジル基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）などの公知の保護基を用いることができる。これらの中でもＢｏｃ基が好ましい。
反応１）により得られる、Ａ−ＮＨ−Ｘ−ＣＯ−Ｙ−Ｚは、上記カップリング反応（反応１））に限定されず、公知のあらゆる合成方法を利用できる。例えば、アミノ基が保護されカルボキシル基が活性エステルになっているアミノ酸誘導体と、Ｈ−Ｙ−Ｚの構造を有する片末端が水酸基の化合物とのエステル交換反応で合成してもよい。
反応２）はアミノ基の脱保護反応であり、通常のペプチド合成で用いられる公知の反応であれば、いずれの反応も用いることができる。ＡがＢｏｃ基の場合は、酸を用いた脱保護反応がよく、トリフルオロ酢酸などの酸が好ましく利用される。反応物の精製方法も特に限定されないが、所望に応じてクロマトグラフィーによる分離精製を行ってもよい。
上記反応１）と２）は、液相合成でも固相合成でもよく、反応方法や精製方法は特に制限されない。
上記反応で得られた化合物であるＨ２Ｎ−Ｘ−ＣＯ−Ｙ−Ｚの片末端アミノ基と、カルボキシ多糖類のカルボキシル基とのカップリング反応により、本発明の多糖類誘導体が得られる。
Ｈ２Ｎ−Ｘ−ＣＯ−Ｙ−Ｚは、出発物質たるカルボキシ多糖類のカルボキシル基のモル当量に対して、０．０１〜０．８当量となるように反応系に導入される。このとき反応効率を考慮して、Ｈ２Ｎ−Ｘ−ＣＯ−Ｙ−Ｚの仕込み量を過剰に用いてもよい。
カップリング反応は、カルボキシ多糖類の特性から、水を含む溶液で反応させることが好ましい。この場合、反応溶媒を水だけとしても、水と相溶する有機溶媒を混合してもよく、水と相溶しない有機溶媒を用いた２層系の反応で行ってもよい。水と相溶する有機溶媒としては、メタノール、エタノールなどのアルコール類やテトラヒドロフラン、ジオキサンなどの環状エーテル類、ポリエチレンオキシド化合物などのエーテル類、ジメチルホルムアミドやジメチルアセトアミドなどのアミド類、ピリジンやピペリジンなどの有機塩基類、ジメチルスルホキシドなどのジアルキルスルホン類、アセトンなどのケトン類を挙げることができる。好ましくは、水および水と相溶する有機溶媒を混合した均一な反応系で、カルボキシ多糖類とＨ２Ｎ−Ｘ−ＣＯ−Ｙ−Ｚとの反応を行うことが好ましく、水と相溶する有機溶媒としてはテトラヒドロフランが好ましい。
カップリングに用いる触媒は、公知のいずれの化合物を使ってもよく、カルボキシル活性化剤や縮合剤が好ましく用いられる。カルボキシル活性化剤として、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシピペリジン、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド、２，４，５−トリクロロフェノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンなどが挙げられる。縮合剤としては、１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドやその塩酸塩、ジイソプロピルカルボジイミド、ジシクロヘキシルカルボジイミドやＮ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドなどが挙げられる。
これらの中でも、カルボキシ活性化剤としてＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールを、縮合剤として１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドの塩酸塩を用いるのが好ましい。
反応温度は、好ましくは０〜６０℃である。副生成物を抑えるためには、反応を０〜１０℃に行うのがより好ましい。反応環境は弱酸性下が好ましく、さらに好ましくはｐＨ６〜７である。
本発明のハイドロゲルは、本発明のカルボキシ多糖類誘導体が水を含むことにより形成されるハイドロゲルであり、水１００重量部に対し、カルボキシ多糖類誘導体を０．０５〜３．０重量部、好ましくは０．１〜２．０重量部、さらに好ましくは０．３〜１．０重量部含む。
本発明のハイドロゲルのうち、ゲルの入った容器を傾けても流れ落ちない程度の粘弾性を有するものが好ましく、スパテルなどの金属へらで触ると容易に変形することが可能で、患部に塗布することが容易な状態であり、また注射器など細管を有する器具で注入することが可能なものが好ましい。本発明のハイドロゲルの粘弾性は、本発明のヒアルロン酸誘導体の水に対する含量を変えることにより調整できるので、使用目的に合わせて最適化できる。
また、本発明のハイドロゲルは無色透明であり、製造の過程でごみなどの異物が混入した場合、これを検知することが可能であり、工業生産する上でのメリットを有する。
また、本発明のハイドロゲルを水で希釈しても水を吸収し、ゲルの体積は水が増えた分大きくなる。さらに水で希釈していくと、いずれは水に可溶化し、ゲルの性状を失い、水溶液となる特徴を有する。
本発明のハイドロゲル中に含まれる水以外の他の成分としては、触媒として用いた縮合剤類、縮合剤が所定の化学反応を経由することで生成するウレアなどの副産物類、カルボキシル活性化剤、未反応のアミン類、反応の各段階で混入する可能性のある異物、ｐＨの調整に用いたイオン類などが含まれるが、これらの成分はいずれも、生体内に入れたときに異物反応として認識されない程度の含有量以下の低いレベルに抑えてあることが好ましい。
本発明のカルボキシ多糖誘導体より得られるハイドロゲルの好ましい複素弾性率としては、水中におけるポリマー濃度が０．５重量％、温度３７℃の条件で、動的粘弾性測定装置（レオメーター）で角速度１０ｒａｄ／ｓｅｃにて測定したときに、５０〜９００Ｎ／ｍ２であるものが好ましく、より好ましくは１００〜７００Ｎ／ｍ２のものである。ここで、複素弾性率とは弾性体の応力とひずみの比を表す定数のことである。
本発明のカルボキシ多糖類は、適切に化学種を選択することにより、温度応答性を示す。温度応答性とは、カルボキシ多糖類誘導体のハイドロゲルに温度変化を与えた際に、特定の温度を境にゲルの粘度が上昇または下降する特性のことをいう。とりわけ体温付近の３０℃あたりを境にして温度が上昇するハイドロゲルが、体内へ注入する際のインジェクタブルゲルとして好ましく用いることができる。本発明の温度応答性を有する多糖類誘導体の好適例として、多糖類がヒアルロン酸であり、上記式（ａ）のＹがポリエチレンオキシドであり、その繰り返し単位数ｐが、５から４０のものを挙げることができる。
本発明の多糖類誘導体の温度応答性は、多糖類の種類、置換度、側鎖の種類やその長さなどにより影響を受けるが、温度応答性をもつ多糖類誘導体調製のために検討すべき因子を理解した当業者であれば、簡単な試行により容易に上記ヒアルロン酸誘導体以外の温度応答性をもつカルボキシル多糖類も取得することができる。
本発明のカルボキシ多糖類誘導体およびそのハイドロゲルの用途としては、医用材料を含めた医療用途、ヘアケア製品や肌の保湿剤なとの日用品用途、化粧品用途などへの使用が可能である。その中でも、本発明のハイドロゲルは注射器を通して注入可能であることから低侵襲医療用途に用いることが可能であり、特に再生医療のための細胞の担体、成長因子などの液性因子を保持・徐放する担体、医薬品として利用できる低分子化合物を保持・徐放する担体、癒着防止材やシーラントなどの医用材料として好ましく利用できる。さらには、細胞培養担体、微生物の培養担体、歯科用のインプラント材料などに好ましく用いられる。細胞を培養させた成型品と細胞との複合体は、セルチップなどのセンシングや診断などの用途にも好ましく用いることができる。
本発明のカルボキシ多糖類誘導体およびそのハイドロゲルは、公知のあらゆる滅菌方法で滅菌処理することができる。好ましく用いられる滅菌方法は、電子線照射やエチレンオキシドによるガス滅菌、高圧蒸気滅菌などである。
【実施例】
【０００８】
［実施例１］
Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−ＣＯ−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）７−Ｏ−Ｃ１８Ｈ３５の合成
オレイルアルコールポリエチレングリコールエーテル（Ｈ−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）７−Ｏ−Ｃ１８Ｈ３５、和光純薬（株）製）１ミリモルに対し、Ｎ−ブチルオキシカルボニルグリシン（Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、和光純薬（株）製）１ミリモルをジクロロメタンに溶解し、縮合剤として、ジシクロヘキシルカルボジイミド（和光純薬（株）製）１ミリモルを含むジクロロメタン溶液を室温で滴下した。反応液をろ過して副生成物であるジシクロヘキシルウレアを取り除き、濃縮、乾燥させ、アミノ基が保護された中間体（Ｂｏｃ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）７−Ｏ−Ｃ１８Ｈ３５）を得た。
この中間体に、１〜２ｍｌ程度のトリフルオロ酢酸（和光純薬（株）製）を加え、酸処理による脱Ｂｏｃ反応を室温で２時間行った。反応の進行はＴＬＣで確認した。反応液を減圧濃縮し、過剰のトリフルオロ酢酸を取り除き、目的物であるアミン化合物のトリフルオロ酢酸塩を得た。生成物は、１Ｈ−ＮＭＲで確認した。
［実施例２］
ヒアルロン酸（ＨＡ−Ｎａ）と、Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−ＣＯ−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）７−Ｏ−Ｃ１８Ｈ３５とのカップリング
ＨＡ−Ｎａ（紀文フードケミファ（株）製、ＦＣＨ１２０）２００ｍｇを水４０ｍｌに溶解し、さらにテトラヒドロフラン４０ｍｌを加えて混合し、均一な溶液を得た。この溶液に、実施例１で合成したＨ２Ｎ−ＣＨ２−ＣＯ−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）７−Ｏ−Ｃ１８Ｈ３５のトリフルオロ塩酸塩を、ＨＡ−Ｎａのカルボキシル基１当量に対して０．２当量を加え、混合した。
ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミド・ＨＣｌ、和光純薬工業（株）製）、およびＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール・１水和物、和光純薬工業（株）製）をそれぞれＨ２Ｎ−ＣＨ２−ＣＯ−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）７−Ｏ−Ｃ１８Ｈ３５に対して１．１当量、１０ｍｌのテトラヒドロフラン／水＝１／１に溶解し、反応系に添加した後、終夜攪拌した。攪拌後、反応液をロータリーエバポレーターで濃縮することによりテトラヒドロフランを除去し、水を蒸発させ、全体量を約１／３にまで濃縮したところでエタノール中に反応溶液を加え、沈殿を形成させた。沈殿をろ別し、その沈殿物をエタノール中に懸濁させて２４時間攪拌し、沈殿物を回収して真空乾燥することでヒアルロン酸誘導体１３６ｍｇを得た。得られたヒアルロン酸誘導体の元素分析を行い、炭素と窒素の比率から置換度を算出した。その結果、置換度は０．０９であった。
［実施例３］
ハイドロゲルの調製
実施例２で得られたヒアルロン酸誘導体１０ｍｇをイオン交換水９９０ｍｇに溶解し、濃度１．０重量％のハイドロゲルを調製した。得られたハイドロゲルは無色透明で、容器を傾けても流動することはなく、スパテルなどの金属へらを簡単に挿入することができ、２５Ｇの注射針を通して容易に押し出すことができた。
また、得られたハイドロゲルの複素弾性率を測定したところ、３６５Ｎ／ｍ２であった。ハイドロゲルの複素弾性率は、動的粘弾性測定装置であるＲｈｅｏｍｅｔｅｒ  ＲＦＩＩＩ（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を使用し、２５ｍｍΦのコーンプレート型の測定器具を用い、３７℃、角速度１０ｒａｄ／ｓｅｃで測定した。
［実施例４］
ハイドロゲルの温度応答性
実施例２で得られたハイドロゲルを、実施例３の動的粘弾性測定装置にセットし、角速度１０ｒａｄ／ｓｅｃで動的粘弾性を測定しながらサンプルの温度を２０℃から上昇させた。その結果、３０℃から５５℃にかけて複素弾性率が２８１Ｎ／ｍ２から９０９Ｎ／ｍ２にまで上昇したことから、このゲルは温度応答性を示し、温度の上昇とともに複素弾性率が上昇することが確認された。
このように、このハイドロゲルは温度応答性を示して体温付近で複素弾性率の上昇が起こるため、体内の特定の箇所に留まらせるのに好ましく用いることができる。
【産業上の利用可能性】
【０００９】
本発明のカルボキシ多糖類誘導体は、高い粘弾性を有するハイドロゲルを形成することで、体内の特定の箇所に留まらせることが可能となるため、傷口の保護や、臓器間の物理的な隔離バリアー形成のために用いられる。
また、本発明のハイドロゲルに薬物を含浸させることで、局所的なドラッグデリバリーシステムを実現できる。
また、本発明のハイドロゲルは生体内に注入すると、いずれは分解または吸収されてしまう特性があり、外科手術時に用いる注入用ゲル材や再生医療の足場材料などに好ましく利用できる。
その他の用途としては、ヘアケア製品や肌の保湿剤などの日用品、化粧品などへの使用が可能である。さらに、細胞培養担体、微生物の培養担体、歯科用のインプラント材料などにも用いられる。さらに、細胞を培養させた成型品と細胞との複合体は、セルチップなどのセンシングや診断などの用途にも用いられる。