(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＢＡＦＦ(B cell activating factor belonging to the TNF family)タンパク質の１３４〜１４６番目のアミノ酸配列である、ＡＶＱＧＰＥＥＴＶＴ  ＱＤＣ（アミノ酸１文字表記によるアミノ酸配列）からなるペプチドに対する特異的なモノクローナル抗体であって、抗ＣＤ３抗体で刺激した末梢血リンパ球におけるＩｇＧ、ＩＦＮ−γ、及びＴＮＦ−αの産生誘導を抑制する活性を有するものである、モノクローナル抗体。
【請求項２】
請求項１に記載のモノクローナル抗体を製造する方法であって、ＡＶＱＧＰＥＥＴＶＴ  ＱＤＣ（アミノ酸１文字表記によるアミノ酸配列）からなるペプチドをハプテンとして用いて、ヒトを除く動物を感作する工程、及び前記ペプチドに対する特異的抗体を産生する抗体産生細胞を選抜する工程を含む、方法。
【請求項３】
動物が、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ニワトリ又はウサギである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１に記載の抗体、及び製薬上許容される担体とからなる、自己免疫疾患を予防及び／又は治療するための医薬組成物。
【請求項５】
自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、シェーグレン症候群（ＳＳ）、自己免疫性糖尿病、ＡＩＤＳ、又はＢ細胞の活性化を伴う自己免疫疾患である請求項４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な抗ヒトＢＡＦＦ抗体、好ましくは抗ヒトＢＡＦＦモノクローナル抗体、及びその製造方法に関する。また、本発明は、当該抗体、好ましくは当該モノクローナル抗体を用いた、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、慢性関節リウマチ(ＲＡ)、シェーグレン症候群(ＳＳ)、自己免疫性糖尿病、ＡＩＤＳ又はＢ細胞の活性化を伴う自己免疫疾患等の自己免疫疾患の予防・治療のための医薬組成物、それを含有してなる診断剤及び診断方法、並びに当該抗体の有効量を投与することからなる自己免疫疾患の予防・治療方法に関する。さらに本発明は、当該抗体、好ましくは当該モノクローナル抗体を用いた、ＢＡＦＦの定量方法、及びＢＡＦＦに対する阻害作用又は活性化作用を有する物質をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＢＡＦＦ(B cell activating factor belonging to the TNF family)は、Ｔ細胞、単球／マクロファージ、樹状細胞等から産生・分泌され、Ｂ細胞上の３種の受容体を介してＢ細胞の分化、活性化、生存等を制御することが知られている（Mooreら Science(1999)285,260-263）。【０００３】
ヒトＢＡＦＦは、２８５個アミノ酸からなる膜貫通型の蛋白質である。そのアミノ酸配列中には、４６アミノ酸の細胞質ドメインと２１８アミノ酸の細胞外ドメインが存在し、また、Ｎグリコシル化部位が２ヶ所有り、３量体を形成するといった構造的な特徴を有する。さらにＣ末端から１５２アミノ酸の細胞外ドメインは、Furinファミリーのプロテアーゼによって切断され、可溶型として遊離されると考えられている。ヒトＢＡＦＦのアミノ酸配列は当初、Neutrokineαとの名称で、国際特許出願公開ＷＯ９８／１８９２１号公報中の配列番号１又は２として開示された。この他別名称として、Ｋａｙ、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、Ｂｌｙｓ、ＴＡＬＬ−１、ＴＨＡＮＫ、ｚＴＮＦ４等も知られている。【０００４】
ＢＡＦＦの受容体としては、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＴＡＣＩ(transmembrane activator and calcium modulator and cyclophilin ligand interactor)、及びＢＣＭＡ(B cell maturation antigen)が知られている。ＢＡＦＦ−Ｒ及びＢＣＭＡは主にＢ細胞に発現しており、ＴＡＣＩはＢ細胞と活性化Ｔ細胞に発現している。【０００５】
ＢＡＦＦの生理的作用は、上述のようにＢ細胞の分化、活性化、生存等の制御であるが、近年、病態との関わりも次第に明らかとなった。即ち、ＢＡＦＦを過剰に発現するマウスでは、末梢血Ｂ細胞の増多、リンパ節や脾臓の肥大、血清中ＩｇＧ濃度上昇、抗核抗体産生、腎内に免疫複合体の沈着、蛋白尿、腎炎等の、ＳＬＥ様の症状を示すことが報告されている（Mackayら J.Exp.Med.,(1999)190,1697-1710、及びKhareら Proc.Natl.Acad.Sci.USA  (2000)97,3370-3375）。さらにこのマウスは、加齢と共に唾液腺炎、唾液腺破壊等の、ＳＳ様の症状を示すことも判明した（Groomら J.Clin.Invest.(2002)109,59-68）。またＳＬＥ、ＲＡ、ＳＳの患者において、血清中ＢＡＦＦ濃度が増加していることも報告されており（Groomら J.Clin.Invest.(2002)109,59-68、Zhangら J.Immunol.(2001)166,6-10、及びCheemaら Arthritis Rheum.(2001)44,1313-1319）、さらにはＲＡ患者の滑液中ＢＡＦＦレベルは血清中に比べて高いこと（Cheemaら Arthritis Rheum.(2001)44,1313-1319）や、ＳＳ患者の唾液腺浸潤白血球におけるＢＡＦＦの発現（Groomら J.Clin.Invest.(2002)109,59-68）、ＳＬＥ患者における血清ＢＡＦＦレベルとイムノグロブリンや抗ｄｓＤＮＡ抗体との相関性（Zhangら J.Immunol.(2001)166,6-10）、ＲＡ患者におけるＢＡＦＦとリウマトイド因子との相関性（Cheemaら Arthritis Rheum.(2001)44,1313-1319）等、数多くの報告がある。【０００６】
これらの事実から、ＳＬＥ、ＲＡ、ＳＳ等の自己免疫疾患の患者はもとより、その発症前においても、血清中あるいは組織中（例えば、ＲＡ患者の滑液など）のＢＡＦＦを測定することは、病態の進展の把握、即ち診断に役立つということができる。また、ＢＡＦＦの機能を阻害することにより、ＳＬＥ、ＲＡ、ＳＳ等の自己免疫疾患の予防・治療も可能となる。【０００７】
ＢＡＦＦのような蛋白質の測定には、その蛋白質を認識できる抗体を用いる方法が一般的である。実際、ＢＡＦＦに対する抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体併せていくつかの市販品（例えば、R&D Systems社の抗ヒトモノクローナル抗体(Catalog Number:MAB124)や、Santa Cruz Biotech社のヤギ抗ヒトＢＡＦＦポリクローナル抗体(Catalog Number:SC-5743)、ALEXIS社のマウス抗ヒトＢＡＦＦモノクローナル抗体(Catalog Number:ALX-804-128-C100)など）が存在するが、これらの抗体は、ＢＡＦＦの全長又はＣ末端側のアミノ酸配列を抗原として作製されたものであり、ウェスタンブロット法においてヒトリコンビナントＢＡＦＦに対する高い特異性を示さず、また、ＥＬＩＳＡにおける検出限界の面においても充分とはいえず、高感度の診断に耐えうるほど満足できるものは知られていない。【０００８】
また、ＳＬＥ、ＲＡ、ＳＳ等の自己免疫疾患の予防・治療としてＢＡＦＦの機能を阻害する方法としては、ＢＡＦＦ遺伝子発現抑制等のＢＡＦＦ産生を抑制又は阻害する方法、ＢＡＦＦ受容体拮抗薬等によるＢＡＦＦ受容体を阻害する方法、及び、抗ＢＡＦＦ抗体等によるＢＡＦＦの機能自体を阻害する方法等が考えられる。例えば、Human Genome Sciences社による抗ヒトＢＡＦＦ(ＢＬｙＳＴＭ)モノクローナル抗体（開発名：LymphoStat-BＴＭ）の、ＳＬＥ、ＲＡ患者に対する臨床試験が、米国で第２相の臨床試験まで進められていることが知られているが、その治療薬としての可能性は必ずしも充分とはいえず、予防薬あるいは治療薬としてさらに有効な作用効果を有する抗体の開発が求められている。
【発明の開示】
【０００９】
本発明の目的は、自己免疫疾患の診断に使用しうるより高感度の抗ヒトＢＡＦＦ抗体を提供することにある。また、そのような抗ヒトＢＡＦＦ抗体を用いることにより、多くの自己免疫疾患をより効率的に予防・治療することが可能となり、本発明はこのような医薬組成物、それを用いた予防・治療方法を提供する。さらに、そのような抗ヒトＢＡＦＦ抗体を用いることにより、ヒトＢＡＦＦの阻害薬又は活性化薬のスクリーニング方法をも提供できることになる。
【００１０】
そこで本発明者らは鋭意検討した結果、ヒトＢＡＦＦのアミノ酸配列中、細胞外ドメインの膜近傍に相当する１３アミノ酸（配列番号１）をハプテンとして、ＫＬＨ(Keyhole limpet hemocyanin)を結合させたものを抗原として作製した新規なモノクローナル抗体(以下４Ｈ４と表記する)が、ヒトＢＡＦＦを検出するＥＬＩＳＡにおいてこれを検出抗体として用いる場合には、０．５ｎｇ／ｍＬの検出限界が得られるという驚くべき高感度での検出が可能となることを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、ヒトＢＡＦＦ(B cell activating factor belonging to the TNF family)タンパク質の１３４〜１４６番目の、ＡＶＱＧＰＥＥＴＶＴ  ＱＤＣ（アミノ酸１文字表記によるアミノ酸配列）からなるアミノ酸配列を有するペプチドに対する抗体、好ましくは当該モノクローナル抗体に関する。
また、本発明は、前記本発明の抗体の製造方法を提供するものであり、本発明は、少なくともＡＶＱＧＰＥＥＴＶＴ  ＱＤＣ（アミノ酸１文字表記によるアミノ酸配列）からなるアミノ酸配列を有するペプチドを含有する抗原を用いて、動物、好ましくはヒト以外の動物を感作し、当該動物の免疫産生細胞から前記ペプチドに対する抗体を製造する方法に関する。
【００１１】
本発明は、前記した本発明の抗体の各種の用途又は使用を提供するものである。
即ち、本発明は、前記本発明の抗体、及び製薬上許容される担体とからなる医薬組成物、好ましくは自己免疫疾患を予防・治療するための医薬組成物に関する。また、本発明は、自己免疫疾患の患者又は自己免疫疾患の可能性が有る患者に、前記本発明の抗体の有効量を投与することからなる自己免疫疾患の予防又は治療方法に関する。さらに本発明は、自己免疫疾患の予防・治療用の医薬組成物、又は自己免疫疾患の診断用の組成物を製造するための前記本発明の抗体の使用に関する。
【００１２】
また、本発明は、前記本発明の抗体を含有してなる自己免疫疾患の診断剤、及びそれを用いた診断方法に関する。
【００１３】
さらに、本発明は、検体中に前記本発明の抗体を添加して、当該抗体と結合したＢＡＦＦを測定することからなる検体中のＢＡＦＦを検出又は定量する方法に関する。
【００１４】
また、本発明は、ＢＡＦＦを含有する試料中に試験物質を添加し、試験物質の添加によるＢＡＦＦの量の変化を前記本発明の抗体を用いて測定することからなる、試験物質が有するＢＡＦＦの阻害作用又は活性化作用をスクリーニングする方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明の抗ヒトＢＡＦＦモノクローナル抗体(４Ｈ４)及び対照としてChemicon製ウサギ抗ヒトＢＡＦＦポリクローナル抗体(Chem)を用い、常法のウエスタンブロッティング法にてリコンビナントのヒトＢＡＦＦ(Chemicon製)を検出した図である。
【図２】図２は、４Ｈ４を用いて確立したＥＬＩＳＡによる、リコンビナントのヒトＢＡＦＦ(Chemicon製)を用いて作成した標準曲線である。
【図３】図３は、健常人由来又はＳＬＥ患者由来のＰＢＬに対し抗ＣＤ３抗体刺激により誘導されたＩｇＧの産生に対する４Ｈ４の効果を示す図である。
【図４】図４は、健常人由来又はＳＬＥ患者由来のＰＢＬに対し抗ＣＤ３抗体刺激により誘導されたＩＦＮγの産生に対する４Ｈ４の効果を示す図である。
【図５】図５は、健常人由来又はＳＬＥ患者由来のＰＢＬに対し抗ＣＤ３抗体刺激により誘導されたＴＮＦαの産生に対する４Ｈ４の効果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の抗体は、２８５個のアミノ酸からなるヒトＢＡＦＦのアミノ酸配列中における細胞外ドメインの膜近傍に相当する１３４〜１４６番目の次に示す、
ＡＶＱＧＰＥＥＴＶＴ  ＱＤＣ
のアミノ酸配列（配列番号１参照）からなるペプチドを含有する抗原を用いて製造されたものであることを特徴とするものである。
通常の抗体は、タンパク質のＮ末端側やＣ末端側のアミノ酸配列を抗原として使用して製造される。タンパク質の中央部付近のアミノ酸配列は、立体的にタンパク質の内部に来る場合があり、抗原として不適切である場合が多々あるからである。タンパク質のＮ末端側やＣ末端側は、多くの場合立体的に露出した構造となり、このようにして製造された抗体が充分な感度を有することが多いこともよく知られていることである。このようなことから、抗ヒトＢＡＦＦ抗体も従来はＮ末端側やＣ末端側のアミノ酸配列に基づいて製造されていた。しかし、本発明者らは、このようにして製造された抗ヒトＢＡＦＦ抗体が必ずしも充分な感度を有するものではないことを見出した。その理由の詳細については明確ではないが、ヒトＢＡＦＦのＮ末端側又はＣ末端側が、通常のタンパク質とは異なり充分に露出した構造になっていないことが予想される。即ちヒトＢＡＦＦの特異的な３次元構造のためと考えられるが、その詳細は明らかでない。今後、ヒトＢＡＦＦの３次元構造が解明されることにより明確になると予想される。【００１７】
本発明の抗体は、ヒトＢＡＦＦのほぼ中央部のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として使用することを特徴とするものであり、このような中央部のアミノ酸配列が抗原として適切であることは驚くべきことであり、ヒトＢＡＦＦタンパク質の特異的な３次元構造によるものと予測される。【００１８】
本発明の抗体は、前記ペプチドを抗原として使用することを特徴とするものであり、抗体としては、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、特異性の観点からはモノクローナル抗体であることが好ましい。【００１９】
本発明の抗体は、抗体製造方法の常法にしたがって抗原を非ヒト哺乳動物に免疫することにより得られる天然型抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得る組換えキメラモノクローナル抗体及び組換えヒト型モノクローナル抗体（CDR-grafted抗体）、並びにヒト抗体産生トランスジェニック動物等を用いて製造され得るヒト抗体を包含する。またモノクローナル抗体の場合には、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有するモノクローナル抗体をも包含する。好ましくは、ＩｇＧ又はＩｇＭが挙げられる。【００２０】
より具体的には、例えば、本発明の抗ヒトＢＡＦＦモノクローナル抗体は、既存の一般的な製造方法に従って、本発明の特徴であるヒトＢＡＦＦのアミノ酸配列中における細胞外ドメインの膜近傍に相当する１３アミノ酸（配列番号１）をハプテンとして、ＫＬＨを結合させたものを抗原として、必要に応じてフロイントアジュバント（Freund's Adjuvant）と共に、哺乳動物、好ましくは、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウマあるいはウシ、より好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモット又はウサギに免疫することにより得られる当該抗体産生細胞（脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓のＢ細胞）と抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）からハイブリドーマを調製し、該ハイブリドーマをクローン化し、哺乳動物の免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを免疫学的測定法（ＥＬＩＳＡなど）により選択することによって製造される。【００２１】
さらに具体的には、次のようにして本発明のモノクローナル抗体を製造することができる。即ち、本発明の、ヒトＢＡＦＦのアミノ酸配列中における細胞外ドメインの膜近傍に相当する１３アミノ酸（配列番号１）をハプテンとして、ＫＬＨ(Keyhole limpet hemocyanin)を結合させたものを抗原として、必要に応じてフロイントアジュバント（Freund's Adjuvant）と共に、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ニワトリあるいはウサギ、好ましくはマウス、ラットあるいはハムスター（ヒト抗体産生トランスジェニックマウスのような他の動物由来の抗体を産生するように作出されたトランスジェニック動物を含む）の皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に１乃至数回注射するかあるいは移植することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１乃至１４日毎に１乃至４回免疫を行って、最終免疫より約１乃至５日後に免疫感作された該哺乳動物から抗体産生細胞を取得し、上述の方法に従ってモノクローナル抗体を産生するクローンを得ることができる。【００２２】
好ましくは、次のようにして本発明のモノクローナル抗体を製造することができる。即ち、１００μＬの１ｍｇ／ｍＬ上記抗原ペプチド生理食塩水溶液を、フロイント完全アジュバントを超音波処理によってエマルジョン化し、マウス（Ｂａｌｂ／ｃ，６週齢）腹腔内に免疫する。初回免疫２週間後に１００μＬの１ｍｇ／ｍＬ抗原ペプチド生理食塩水溶液、フロイント完全アジュバントを超音波処理によってエマルジョン化したものを追加免疫し、以降２週間毎に追加免疫を２回行い、その後は上述の方法に従ってモノクローナル抗体を産生するクローンを得ることができる。【００２３】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの調製は、ケーラー及びミルシュタインらの方法（Nature (1975)256, 495-497）及びそれに準じる修飾方法に従って行うことができる。即ち、前述の如く免疫感作された哺乳動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ又はヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラット又はヒト由来の自己抗体産生能のないミエローマ細胞との細胞融合させることにより調製される。【００２４】
細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、例えばマウス由来ミエローマＰ３／Ｘ６３−ＡＧ８．６５３(６５３；ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１５８０)、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１(ＮＳ−１)、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１(Ｐ３Ｕ１)、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４(Ｓｐ２／０，Ｓｐ２)、ＰＡＩ、ＦＯあるいはＢＷ５１４７、ラット由来ミエローマ２１０ＲＣＹ３−Ａｇ．２．３、ヒト由来ミエローマＵ−２６６ＡＲ１、ＧＭ１５００−６ＴＧ−Ａ１−２、ＵＣ７２９−６、ＣＥＭ−ＡＧＲ、Ｄ１Ｒ１１あるいはＣＥＭ−Ｔ１５を使用することができる。【００２５】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の前述のマウス免疫感作で用いた免疫抗原に対する反応性を、例えばＲＩＡやＥＬＩＳＡ等の酵素免疫測定法によって測定することにより行うことができる。ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、ハイブリドーマをインビトロ、又はマウス、ラット、モルモット、ハムスター又はウサギ等、好ましくはマウス又はラット、より好ましくはマウスの腹水中等でのインビボで行い、得られた培養上清、又は哺乳動物の腹水から単離することにより行うことができる。インビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地あるいは既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。【００２６】
基本培地としては、例えば、Ｈａｍ’ｓＦ１２培地、ＭＣＤＢ１５３培地あるいは低カルシウムＭＥＭ培地等の低カルシウム培地及びＭＣＤＢ１０４培地、ＭＥＭ培地、Ｄ−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＡＳＦ１０４培地あるいはＲＤ培地等の高カルシウム培地等が挙げられ、該基本培地は、目的に応じて、例えば血清、ホルモン、サイトカイン及び／又は種々の無機あるいは有機物質等を含有することができる。モノクローナル抗体の単離、精製は、上述の培養上清あるいは腹水を、飽和硫酸アンモニウム、ユーグロブリン沈澱法、カプロイン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ又はＤＥ５２等）、抗イムノグロブリンカラムあるいはプロテインＡカラム等のアフィニティカラムクロマトグラフィーに供すること等により行うことができる。また、当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体をコードする遺伝子をクローニングし、トランスジェニック動物作製技術を用いて当該抗体コーディング遺伝子が内在性遺伝子に組み込まれたトランスジェニックなウサギ、ヤギ、ヒツジ又はブタを作製し、当該トランスジェニック動物のミルク中から当該抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である（日経サイエンス、1997年４月号、第７８頁乃至８４頁）。【００２７】
以上のごとく得られる本発明の抗ヒトＢＡＦＦモノクローナル抗体は、後記実施例に示すように０．５ｎｇ／ｍＬの検出限界が得られるという驚くべき特徴を有するので、感度の良い自己免疫疾患の診断方法はもとより、自己免疫疾患の予防・治療方法、さらにはヒトＢＡＦＦの阻害薬又は活性化薬のスクリーニング方法を実現することができる。なお実施において本発明の抗ヒトＢＡＦＦモノクローナル抗体は、抗体、その抗体の断片及びそれらの誘導体として利用することができる。また、本発明の抗ヒトＢＡＦＦモノクローナル抗体は、細胞又は血液由来のＢＡＦＦの精製に利用することもできる。さらに本発明の抗ヒトＢＡＦＦモノクローナル抗体を利用し精製されたヒトＢＡＦＦ蛋白質及びその誘導体は、Ｂ細胞の活性化薬などの試薬あるいは医薬品としても利用されうる。またさらに、本発明の抗ヒトＢＡＦＦモノクローナル抗体、その抗体の断片及びそれらの誘導体を利用し、免疫染色など当該分野で公知な技術によりＢＡＦＦ蛋白質の画像化を行うことができる。【００２８】
本発明の医薬組成物における製薬上許容される担体としては、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。そのような担体の一つ以上を用いることにより、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、注射剤、液剤、カプセル剤、トローチ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。本発明の医薬組成物は、非経口的に投与することができる。非経口投与のための形態としては、本発明の抗体を含有し、常法により処方される注射剤、腸溶内投与のための坐剤及びペッサリーの他、点眼剤、点鼻剤などが含まれる。【００２９】
本発明の医薬組成物の有効成分の投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間などにより異なるが、通常成人一人あたり、一回につき１μｇから１０００ｍｇ、好ましくは１０μｇから５００ｍｇの範囲で投与することができる。しかしながら、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量より少ない量で充分な場合もあり、また上記の範囲を越える投与量が必要な場合もある。例えば、注射剤の場合には、生理食塩水あるいは注射用蒸留水等の非毒性の製薬上許容される担体中に０．１μｇ抗体／ｍＬ担体〜１０ｍｇ抗体／ｍＬ担体の濃度となるように溶解又は懸濁することにより製造することができる。【００３０】
このようにして製造された注射剤は、処置を必要とするヒト患者に対し、１回の投与において１ｋｇ体重あたり、１μｇ〜１００ｍｇの割合で、好ましくは５０μｇ〜５０ｍｇの割合で、１日あたり１回〜数回投与することができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射のような医療上適当な投与形態が例示できる。好ましくは静脈内注射である。また、注射剤は、場合により、非水性の希釈剤（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。そのような注射剤の無菌化は、バクテリア保留フィルターを通す濾過滅菌、殺菌剤の配合又は照射により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水又は他の溶媒に溶解して使用することができる。【００３１】
本発明の医薬組成物は、自己免疫疾患、例えば、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、慢性関節リウマチ(ＲＡ)、シェーグレン症候群(ＳＳ)、自己免疫性糖尿病、ＡＩＤＳ、又はＢ細胞の活性化を伴う自己免疫疾患等の自己免疫疾患の予防及び／又は治療に有用である。【００３２】
また、本発明の診断剤は、本発明の抗体を含有するものであり、検体中のＢＡＦＦタンパク質に特異的にかつ高感度で結合し、形成された複合体を測定可能にする各種の試薬を含有するものである。本発明の診断用の組成物は、前記した本発明の診断剤又は当該診断剤及び診断用の担体からなるものである。また、本発明の抗体自体を測定可能にするために標識化することもできる。このような標識化としては、放射性元素や蛍光物質などによる通常の方法を採用することができる。【００３３】
本発明における自己免疫疾患の診断方法としては、例えば、本発明の抗ヒトＢＡＦＦモノクローナル抗体を用いて後記する実施例に記載のごとくＥＬＩＳＡ系を構築し、このＥＬＩＳＡ系にて自己免疫疾患の患者等の被験者から採取された血清中あるいは組織中のＢＡＦＦ濃度を測定することにより、自己免疫疾患の進行度合いを調べることができる。さらにまた、治療の効果を知るためのモニタリングや予後の予測にも利用できる。【００３４】
本発明のＢＡＦＦを検出又は定量する方法としては、検体中に本発明の抗体を添加して、当該抗体と結合したＢＡＦＦを測定することにより行うことができる。本発明の抗体と結合したＢＡＦＦを測定する方法としては、公知の各種の抗原−抗体反応による検出又は定量化の手法を使用することができ、例えば、ＥＬＩＳＡ法などを使用することができる。
本発明の診断方法や検出又は定量化方法におけるＢＡＦＦとしては、ヒトＢＡＦＦが好ましい。
本発明における自己免疫疾患の予防・治療方法の場合、本発明の抗ヒトＢＡＦＦモノクローナル抗体を薬学的に許容される担体と共に、自己免疫疾患の予防・治療が必要な患者に投与することにより、その予防・治療が実現できる。【００３５】
本発明におけるヒトＢＡＦＦの阻害薬又は活性化薬のスクリーニング方法の場合、本発明の抗ヒトＢＡＦＦモノクローナル抗体を用いて後記実施例に記載のごとくＥＬＩＳＡ系を構築し、このＥＬＩＳＡ系にてＢＡＦＦ受容体を発現している細胞もしくはＢＡＦＦ受容体蛋白質又はその断片及びそれらの誘導体と被験物質のＢＡＦＦ結合活性を測定することにより実現することができる。また、ヒトＢＡＦＦを産生する細胞に被験物質を接触させ、細胞より産生されるＢＡＦＦの測定をＥＬＩＳＡ等、当該分野において公知慣用である免疫学的技術にて行うことにより、ヒトＢＡＦＦの産生阻害薬又は促進薬のスクリーニングを行うことができる。【００３６】
本発明の抗ヒトＢＡＦＦモノクローナル抗体は、後記実施例に示すように０．５ｎｇ／ｍＬの検出限界が得られるという驚くべき特徴を有するので、極めて実用性に優れたものである。また、膜タンパク質の中央付近のアミノ酸配列からなるペプチドから得られる抗体が、特異性及び親和性において極めて優れた抗体となるということも、ＢＡＦＦ特有の予想外のことである。【００３７】
本発明の抗体は、抗原とされる部位が特徴的であるだけでなく、特異性及び親和性（感度）において極めて優れており、実用的な自己免疫疾患の診断方法はもとより、自己免疫疾患の予防・治療方法、さらにはヒトＢＡＦＦの阻害薬又は活性化薬のスクリーニング方法を実現することができる。
また、本発明の抗体を用いることにより、自己免疫疾患に対する優れた医薬組成物、及び診断剤を提供することができる。【００３８】
実施例
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３９】
抗ヒトＢＡＦＦ抗体の作製
配列表の配列番号２に示したＢＡＦＦの２８５個のアミノ酸から細胞外ドメインの膜近傍に該当する１３アミノ酸を選択し、ＭＢＳ法を用いてＫＬＨとコンジュゲートし、抗原とした。１００μＬの１ｍｇ／ｍＬ抗原ペプチド生理食塩水溶液、フロイント完全アジュバントを超音波処理によってエマルジョン化し、マウス（Ｂａｌｂ／ｃ，６週齢）腹腔内に免疫した。２週間後に１００μＬの１ｍｇ／ｍＬ抗原ペプチド生理食塩水溶液、フロイント完全アジュバントを超音波処理によってエマルジョン化したものを追加免疫し、以降２週間毎に追加免疫を２回行った。初回免疫後２ヶ月目に脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ １６４０培地(ペニシリン，ストレプトマイシン入り)中でリンパ球を分離した。分離したリンパ球をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法によりマウス骨髄腫由来のミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１株と融合させ、ハイブリドーマ細胞を作製した。ハイブリドーマ細胞をフィーダー細胞入りのＨＡＴ培地に懸濁し９６穴プレート（Greiner）に分注し１５日間培養した。ハイブリドーマ細胞を培養したウェルから培養上清を回収し，ＥＬＩＳＡ法（enzyme-linked immunosorbent assay）によって抗原ペプチドと反応がある抗体産生細胞を選択した。即ち、まず９６穴プレートに５０μＬの１０μｇ／ｍＬ抗原ペプチドをしき、４℃、一晩底面に吸着させた後、１００μＬの２％ＢＳＡ／ＰＢＳで３７℃、２時間ブロッキングさせた。ハイブリドーマ細胞の上清１００μＬを４℃、１晩反応させた後、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧを１０００倍希釈して３７℃、１時間反応させ、オルトフェニレンジアミンを基質に用いて発色させた。５０μＬの２Ｎ硫酸で反応を停止させた後、４９２ｎｍの吸光度を測定して１．０以上の値が得られたハイブリドーマを選択し，限界希釈法によるクローニングを行った。【００４０】
７日前、３日前にそれぞれ０．５ｍＬのプリスタンを腹腔内投与したマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）に、選択したハイブリドーマ細胞を腹腔内注射し、約１０日後に腹水を採取した。採取した腹水は室温で３０分おいた後、４℃で一晩静置し、１５Ｋｒｐｍ、１０分間遠心して上清を回収し、マウスＩｇＧ画分をプロテインＡ-Sepharoseカラムにて分離精製した。
以上の方法にて、抗ヒトＢＡＦＦ抗体(４Ｈ４、アイソタイプはＩｇＧ１)を産生するハイブリドーマ細胞株、並びに該抗体(４Ｈ４)を得た。得られた４Ｈ４、及び対照としてChemicon製ウサギ抗ヒトＢＡＦＦポリクローナル抗体(ＡＢ１６５３０：図中、Chemと表記)を、常法のウエスタンブロッティング法にてリコンビナントのヒトＢＡＦＦ(Chemicon製)の検出に用いた結果、図１に示すように可溶性ヒトＢＡＦＦに該当する１７ＫＤａのバンドが確認された。
【実施例２】
【００４１】
ＥＬＩＳＡの確立
１次抗体としてウサギ抗ヒトＢＡＦＦポリクローナル抗体（ＡＢ１６５３０、Chemicon製）を用い、９６穴プレートに１μｇ／ｗｅｌｌで４℃一晩コーティングした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄後ＢｌｏｃｋＡｃｅ(大日本製薬製)を１５０μＬ／ｗｅｌｌ加え、３７℃、２時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄後検体５０μＬ及びビオチン標識した４Ｈ４を５０μＬ(８ｎｇ／ｍＬ)加え、室温にて２時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで１０００倍に希釈したストレプトアビジン標識ＨＲＰ（Horse radish peroxidase）を５０μＬ添加し、室温にて３０分反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで５回洗浄後ＴＭＢ One Solution(Clonetech製）を５０μＬ加え、５分間室温にて反応させた後、１Ｎ ＨＣｌ ５０μＬを添加後プレートリーダー(PerkinElmer製)で４５０ｎｍの吸光度を測定した。標準物質としてリコンビナントのヒトＢＡＦＦ（Chemicon製）を用い、標準曲線を作成した。【００４２】
その結果図２に示すように、ＢＡＦＦ濃度が２５ｎｇ／ｍＬから０．２ｎｇ／ｍＬまで、良好な直線関係を示すＥＬＩＳＡ系の確立が確認された。特に２ｎｇ／ｍＬから０．５ｎｇ／ｍＬの範囲は、従来の抗ヒトＢＡＦＦ抗体では検出できない濃度であるため、この濃度まで信頼性良く検出できるということは、本発明の抗ヒトＢＡＦＦモノクローナル抗体を用いた自己免疫性疾患の診断、あるいはＢＡＦＦの阻害薬又は活性化薬のスクリーニングに極めて有用であることを表す。
【実施例３】
【００４３】
ヒトＰＢＬに対する作用
健常人又はＳＬＥと診断された患者より血液を採取し、Ficollを用いた比重遠心法によりリンパ球層を分離採取し、ヒト末梢血リンパ球（Peripheral Blood Lymphocytes : ＰＢＬ）とした。ＰＢＬを１０％ＦＢＳ(Fetal bovine serum)を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、ＰＢＳにより１０μｇ／ｍＬに希釈した抗ＣＤ３抗体を２４ウェル培養プレートにしき、４℃一晩で底面吸着させた後、５×１０５cells/wellとなるようにＰＢＬを播種した。これと同時に４Ｈ４を最終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように添加し、４日間あるいは７日間３７℃、７％ＣＯ２にてＣＯ２インキュベータを用いて培養した。培養上清を回収し、培養上清中のＩｇＧ、ＩＦＮγ、ＴＮＦαをそれぞれに特異的に反応するモノクローナル抗体（ＩｇＧ：１次抗体：BDPharmingen製  Cat. No. 555784、２次抗体（ビオチン標識）BDPharmingen製  Cat. No.555785、ＩＦＮγ：１次抗体：BDPharmingen製  Cat. No. 554698、２次抗体（ビオチン標識）BDPharmingen製  Cat. No.554550、ＴＮＦα：１次抗体：BDPharmingen製  Cat. No. 551220、２次抗体（ビオチン標識）BDPharmingen製  Cat. No.554511）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法にて測定した。【００４４】
結果を図３〜５に示す。健常人由来及びＳＬＥ患者由来のＰＢＬ共に、抗ＣＤ３抗体刺激により誘導されたＩｇＧ（図３）、ＩＦＮγ（図４）及びＴＮＦα（図５）の産生（全て、図中の左（オープン）カラム）が、４Ｈ４の添加（全て、図中の右（ソリッド）カラム）により抑制された。特に患者ＰＢＬにおいては抗ＣＤ３抗体によるＩｇＧ、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αの産生誘導が健常人と比較して増強しており、４Ｈ４によるこれらの産生抑制率も高いことが明らかとなった。特に本抗体のＴＮＦα産生に関しては有意に抑制することが明らかとなった（ｔ検定）。これらの産生促進は病態形成に深く関与していると考えられ、その産生を抑制することはＳＬＥなどの自己免疫疾患の治療への新しい試みとなると考えられる。従って、本発明の抗ヒトＢＡＦＦモノクローナル抗体が、自己免疫疾患の治療薬開発にむけて極めて有用であることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明は、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、慢性関節リウマチ(ＲＡ)、シェーグレン症候群(ＳＳ)、自己免疫性糖尿病、ＡＩＤＳ又はＢ細胞の活性化を伴う自己免疫疾患等の自己免疫疾患との関係が明らかにされてきているＢＡＦＦ、特にヒトＢＡＦＦに対する極めて特異的でかつ高感度の抗体を提供するものであり、自己免疫疾患の治療、予防、診断に有用なだけでなく、自己免疫疾患の治療や予防に有効な新しい物質をスクリーニングするための手法を提供するものであり、産業上の利用可能性がある。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１】
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【配列表】
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