(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の膵臓におけるβ細胞集団を定量化する方法であって：
（ａ）有効量の小胞モノアミントランスポーター２型（vesicular monoamine transporter type 2：ＶＭＡＴ２）−特異的放射性リガンドを投与された対象の膵臓の少なくとも一部について取得された少なくとも１のコンピュータ化画像を用意する工程；及び、
（ｂ）前記コンピュータ化画像を定量分析し、前記対象の膵臓におけるβ細胞集団の定量的な測定値を取得する工程を含み、
前記放射性リガンドが［１１Ｃ］ＤＴＢＺである方法。
【請求項２】
前記コンピュータ化画像が陽電子放出断層撮影（positron emission tomography：ＰＥＴ）を用いて取得される、請求項１の方法。
【請求項３】
前記対象が哺乳類である、請求項１の方法。
【請求項４】
前記対象がヒトである、請求項１の方法。
【請求項５】
対象における代謝障害の存在を決定する方法であって：
（ａ）有効量の小胞モノアミントランスポーター２型（ＶＭＡＴ２）−特異的放射性リガンドを投与された対象の膵臓の少なくとも一部について取得された少なくとも１のコンピュータ化画像を用意する工程；
（ｂ）前記コンピュータ化画像を定量分析し、前記対象の膵臓におけるβ細胞集団の定量的な測定値を取得する工程；及び
（ｃ）前記β細胞集団の定量的な測定値をβ細胞集団の基準測定値と比較し、β細胞集団の定量的な測定値が前記基準測定値に対して有意に減少又は増加している場合に、代謝障害が存在すると決定する工程を含み、
前記放射性リガンドが［１１Ｃ］ＤＴＢＺである方法。
【請求項６】
前記コンピュータ化画像が陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）を用いて得られる、請求項５の方法。
【請求項７】
前記対象が哺乳類である、請求項５の方法。
【請求項８】
前記対象がヒトである、請求項５の方法。
【請求項９】
前記障害が膵臓β細胞関連障害である、請求項５の方法。
【請求項１０】
前記障害がインスリノーマである、請求項９の方法。
【請求項１１】
前記障害が糖尿病である、請求項９の方法。
【請求項１２】
前記障害が１型糖尿病である、請求項１１の方法。
【請求項１３】
前記障害が２型糖尿病である、請求項１１の方法。
【請求項１４】
前記障害が前臨床１型糖尿病である、請求項５の方法。
【請求項１５】
対象が糖尿病を発症するおそれを決定する方法であって、周期的な工程として：
（ａ）有効量の小胞モノアミントランスポーター２型（ＶＭＡＴ２）−特異的放射性リガンドを投与された対象の膵臓の少なくとも一部について取得された少なくとも１のコンピュータ化画像を用意する工程；
（ｂ）前記コンピュータ化画像を定量分析し、前記対象の膵臓におけるβ細胞集団の定量的な測定値を取得する工程；及び
（ｃ）前記周期的に決定されるβ細胞集団の定量的な測定値をβ細胞集団の基準測定値と比較し、β細胞集団の定量的な測定値が前記基準測定値に対して有意に減少している場合に、前臨床糖尿病から糖尿病に進行するおそれがあると決定する工程を含み、
前記放射性リガンドが［１１Ｃ］ＤＴＢＺである方法。
【請求項１６】
前記コンピュータ化画像が陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）を用いて得られる、請求項１５の方法。
【請求項１７】
前記対象が哺乳類である、請求項１５の方法。
【請求項１８】
前記対象がヒトである、請求項１５の方法。
【請求項１９】
代謝障害を処置又は予防するための治療の成否を決定する方法であって、周期的な工程として：
（ａ）有効量の小胞モノアミントランスポーター２型（ＶＭＡＴ２）−特異的放射性リガンドを投与された対象の膵臓の少なくとも一部について取得された少なくとも１のコンピュータ化画像を用意する工程；
（ｂ）前記コンピュータ化画像を定量分析し、前記対象の膵臓におけるβ細胞集団の定量的な測定値を取得する工程；及び
（ｃ）前記周期的に決定されるβ細胞集団の定量的な測定値をβ細胞集団の基準測定値と比較し、β細胞集団の定量的な測定値が前記基準測定値に概ね一致している場合に、前記代謝障害を処置又は予防する治療に成功していると決定する工程を含み、
前記放射性リガンドが［１１Ｃ］ＤＴＢＺである方法。
【請求項２０】
前記コンピュータ化画像が陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）を用いて得られる、請求項１９の方法。
【請求項２１】
前記対象が哺乳類である、請求項１９の方法。
【請求項２２】
前記対象がヒトである、請求項１９の方法。
【請求項２３】
前記障害が膵臓β細胞関連障害である、請求項１９の方法。
【請求項２４】
前記障害がインスリノーマである、請求項１９の方法。
【請求項２５】
前記障害が糖尿病である、請求項１９の方法。
【請求項２６】
前記障害が１型糖尿病である、請求項２５の方法。
【請求項２７】
前記障害が前臨床１型糖尿病である、請求項１９の方法。
【請求項２８】
糖尿病を処置又は予防するための更なる治療の必要性を決定する方法であって、周期的な工程として：
（ａ）有効量の小胞モノアミントランスポーター２型（ＶＭＡＴ２）−特異的放射性リガンドを投与された対象の膵臓の少なくとも一部について取得された少なくとも１のコンピュータ化画像を用意する工程；
（ｂ）前記コンピュータ化画像を定量分析し、前記対象の膵臓におけるβ細胞集団の定量的な測定値を取得する工程；及び
（ｃ）前記周期的に決定されるβ細胞集団の定量的な測定値をβ細胞集団の基準測定値と比較し、β細胞集団の定量的な測定値が前記基準測定値に対して有意に減少している場合に、糖尿病を処置又は予防するための更なる治療が必要であると決定する工程を含み、
前記放射性リガンドが［１１Ｃ］ＤＴＢＺである方法。
【請求項２９】
前記コンピュータ化画像が陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）を用いて得られる、請求項２８の方法。
【請求項３０】
前記対象が哺乳類である、請求項２８の方法。
【請求項３１】
前記対象がヒトである、請求項２８の方法。
【請求項３２】
前記糖尿病が１型糖尿病である、請求項２８の方法。
【請求項３３】
対象の膵臓におけるβ細胞集団を決定するために使用されるキットであって、有効量の小胞モノアミントランスポーター２型（ＶＭＡＴ２）−特異的放射性リガンドと、医薬的に許容し得る担体と、任意によりＰＥＴスキャナーとを含み、前記放射性リガンドが［１１Ｃ］ＤＴＢＺであるキット。
【請求項３４】
前記対象が哺乳類である、請求項３３のキット。
【請求項３５】
前記対象がヒトである、請求項３３のキット。
【請求項３６】
対象における神経内分泌障害の存在を決定する方法であって：
（ａ）有効量の小胞モノアミントランスポーター２型（ＶＭＡＴ２）−特異的放射性リガンドを投与された対象の関心領域の少なくとも一部について取得された少なくとも１のコンピュータ化画像を用意する工程；
（ｂ）前記コンピュータ化画像を定量分析し、前記対象の膵臓におけるβ細胞集団の定量的な測定値を取得する工程；及び
（ｃ）前記β細胞集団の定量的な測定値をβ細胞集団の基準測定値と比較し、β細胞集団の定量的な測定値が前記基準測定値に対して有意に減少又は増加している場合に、神経内分泌障害が存在すると決定する工程を含み、前記放射性リガンドが［１１Ｃ］ＤＴＢＺである方法。
【請求項３７】
前記神経内分泌障害が神経内分泌ガンである、請求項３６の方法。
【請求項３８】
神経内分泌腫瘍を撮像する方法であって、有効量の小胞モノアミントランスポーター２型（ＶＭＡＴ２）−特異的放射性リガンドを投与された対象の関心領域の少なくとも一部について、少なくとも１のコンピュータ化画像を取得する工程を含み、前記放射性リガンドが［１１Ｃ］ＤＴＢＺである方法。
【請求項３９】
前記腫瘍が前立腺腫瘍である、請求項３８の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＮＩＨ認可番号ＲＯ１ ＤＫ ６３５６７−０２に基づく政府支援下でなされたものである。従って米国政府は本発明につき一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、対象におけるβ細胞集団を定量的に測定するための非侵襲的な方法であって、糖尿病等の代謝障害の管理に有用な方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
１型糖尿病（Type 1 Diabetes：Ｔ１Ｄ）は、膵臓の内分泌部位であるランゲルハンス島のインシュリン産生β細胞が、自己免疫により破壊される結果生じる（Weir, et al, 1990, Islet mass and function in diabetes and transplantation, Diabetes 39:401-405）。本疾患は尿崩症として発症し、認識されるまでに数年を要する場合もある。一般的には、β細胞集団の大部分が糖尿病の発症時に破壊されると考えられているが、近年の幾つかの研究によれば、診断時に相当なインシュリン分泌能力が残存している可能性も示唆されている（Steele, et al, 2004, Insulin secretion in type 1 diabetes, Diabetes 53:426-433）。更に、長い前臨床期間中、ランゲルハンス島は免疫による攻撃を受けており、臨界的な量のβ細胞が失われてインシュリンの要求が高まった場合に、初めて高血糖を発症するものと考えられている。
【０００４】
Ｔ１Ｄが自然経過を辿って進行すると、最終的にはインシュリン分泌能力を完全に消失してしまい、外来のインシュリンに頼らないと生存できなくなる。しかしながら、糖尿病患者が有するβ細胞集団（ＢＣＭ）を正確に決定することはこれまで不可能であったため、自然経過に関する判断も、その後の介入が本経過に対して及ぼす効果に関する判断も、間接証拠に基づいて行なわれてきた。同様に、２型糖尿病（Type 2 Diabetes：Ｔ２Ｄ）の患者についても、膵臓のインシュリン産生能力に数々の異常が生じることが報告されてきた（Bernard-Kargar, et al, 2001, Endocrine pancreas plasticity under physiological and pathological conditions, Diabetes 50 Suppl 1 :530-35）が、この型の疾患についても、インシュリン分泌における機能上の欠陥と解剖学的な欠陥とを弁別可能なＢＣＭの測定手段は存在しない。
【０００５】
Ｔ１Ｄを処置するために、免疫治療、幹細胞治療、島移植など、様々な実験的処置が開発されてきた。Ｔ２Ｄに対する処置は、本疾患の根底にある作用機序についての知識が不足しているため、経験に頼るところが大きかった。糖尿病の様々な相を通じてβ細胞集団がどのように変化するかの知識が得られれば、研究者が新たな治療法を開発する上で、何れの型の糖尿病についても重要な情報になるものと思われる。
【０００６】
膵臓内分泌部の疾患を撮像する技術の進展は、数々の研究により報告されてきた。Clark等は、フッ素−１８ ４−フルオロベンジルトロザミコール（fluorine-18 4-fluorobenzyltrozamicol：ＦＢＴ）を用いて膵臓本体を撮像できることを実証した（Clark, et al, 2003, Neurofunctional imaging of the pancreas utilizing the cholinergic PET radioligand [(18)F]4-fluorobenzyltrozamicol, EurJ Nucl Med Mol Imaging）。ＦＢＴは、膵臓を神経支配するニューロンのシナプス前小胞に存在する特異的神経受容体である、小胞アセチルコリントランスポーターに結合する放射性リガンドである。同様に、膵腺房細胞により発現される重炭酸及び／又は有機アニオントランスポーターを利用して、［１１Ｃ］酢酸塩を用いた膵臓外分泌腺の可視化が行なわれてきた（Shreve, et al, 1997, Imaging of the pancreas and related disease with PET carbon-11-acetate, J Nucl Med 38:1305-1310、及び、Seltzer, et al, 2004, Radiation dose estimates in humans for (ll)C-acetate whole-body PET, J Nucl Med 45: 1233-1236）。Markmann等の近年の報告によれば、屍体の島を移植することにより、移植から１４ヶ月後に島周囲の細胞集団の脂肪沈着が誘発されることが、化学シフト勾配−エコー磁気共鳴映像法（magnetic resonance imaging：ＭＲＩ）による可視化によって示された（Markmann, et al, 2003, Magnetic resonance-defined periportal steatosis following intraportal islet transplantation: a functional footprint of islet graft survival? Diabetes 52:1591-1594）。本アプローチに伴い考えられる課題は、島の同種移植の拒絶後に島周囲の脂肪症が（少なくとも数日間）持続する可能性がある点と、本方法は島を原位置で撮像するには適さないという点である。
【０００７】
β細胞及びＴ１Ｄに関連する病理を撮像するための、他の従来の試みとしては、the studies by Moore等による研究が挙げられる（Moore, et al, 2001, Noninvasive in vivo measurement of beta-cell mass in mouse model of diabetes, Diabetes 50:22312236、Moore, et al, 2004, Tracking the recruitment of diabetogenic CD8+ T-cells to the pancreas in real time, Diabetes 53:1459-1466、及び、Moore, et al, 2002, MRI of insulitis in autoimmune diabetes, Magn Reson Med 47:751-758）。放射性同位体キレート剤で修飾したβ細胞特異的な抗ＩＣ２ ｍＡｂを用いることにより、健常なげっ歯類及び糖尿病のげっ歯類の膵臓を生体外で撮像した。放射免疫シンチグラフィーにより、健常なげっ歯類と糖尿病のげっ歯類との間には、ｍＡｂの膵臓取り込みに大きな違いがあることを示した（Moore, et al, 2001, Noninvasive in vivo measurement of beta-cell mass in mouse model of diabetes, Diabetes 50:22312236）が、本方法が生体内撮像に適しているかどうかは不明である。ましてや、抗ガングリオシドｍＡｂを用いた放射免疫シンチグラフィーは期待できない（Ladriere, et al, 2001, Pancreatic fate of a (125)I-labelled mouse monoclonal antibody directed against pancreatic B-cell surface ganglioside(s) in control and diabetic rats, Cell Biochem Funct 19:107-115）。
【０００８】
他の実験として、健常なラットとストレプトゾトシン注入したラットとの間で、膵臓による６−デオキシ−６−［１２５１］ヨード−Ｄ−グルコース取り込みの比較も行なわれた。島及び腺房組織による放射性リガンド取り込みには違いがあり、β細胞欠失膵臓では取り込みが減少することが示されたものの、放射性リガンドの結合の特異性が広く、肝臓による取り込みが高いことから、本アプローチの臨床的な有用性は不明である（Malaisse, et al, 2001, Pancreatic uptake of [2-(14)C] alloxan, IntJ Mol Med 7:311-315）。トレーサーである［２−（１４）Ｃ］アロキサンの膵臓による取り込みを、健常なげっ歯類及びストレプトゾトシンで処置したげっ歯類について調べる研究も行なわれた。健常な膵臓では、糖尿病の膵臓に対して、放射性トレーサーが優先的に取り込まれることが実証された。しかしながら、アロキサンはそれ自体が糖尿病誘発剤としてよく知られているため、このアプローチの臨床的な有用性も明らかにはなっていない（Malaisse, et al, 2001, Pancreatic uptake of [2-(14)C]alloxan, Int J Mol Med 7:311-315）。ジチゾン及びスルホニル尿素受容体リガンド［例えば、３Ｈ−グリベンクラミド等］も造影剤として検討されてきたが、取り込み組織分布が広範であり、その実現可能性を否定する結果が得られている（Garnuszek, et al, 2000, Identification of transplanted pancreatic islet cells by radioactive dithizone-[1311]-histamine conjugate. Preliminary report, Nucl Med Rev Cent East Eur 3:61-63. Ladriere, et al, 2000, Uptake of tritiated glibenclamide by endocrine and exocrine pancreas, Endocrine 13:133-136, and Sweet, et al, 2004, Systematic screening of potential beta-cell imaging agents, Biochem Biophys Res Commun 314:976-983）。
【０００９】
実験的膵島炎による磁気共鳴映像法の使用も検討されている。Moore等は（ＣＬＩＯ−ＴＡＴペプチド又はＭＨＣ四量体ペプチド複合体を介した）超常磁性粒子標識Ｔ細胞を用いて、β細胞破壊の進展時における浸潤性Ｔ細胞の存在を明確に示すことに成功した（Moore, et al, 2004, Tracking the recruitment of diabetogenic CD8+ T-cells to the pancreas in real time, Diabetes 53:1459-1466、及びMoore, et al, 2002, MRI of insulitis in autoimmune diabetes, Magn Resort Med 47:751-758）。また、磁気共鳴映像法を用いて、膵島炎による島周囲の血管漏洩を超常磁性ナノビーズにより可視化した報告もある（Denis, et al, 2004, Imaging inflammation of the pancreatic islets in type 1 diabetes, Proc Natl Acad Sd USA 101 : 12634-12639）。
【００１０】
膵臓内分泌部のβ細胞とニューロンとは、発生学上の起源が異なるにもかかわらず、共通の遺伝子産物を多数発現しており、機能的にも多くの類似点がある。過去の研究によれば、この機能的な類似の根底にある生理化学的な基礎が、タンパク質及び核酸の双方のレベルにおいて示されている（Atouf, et al, 1997, Expression of neuronal traits in pancreatic beta cells. Implication of neuron-restrictive silencing factor/repressor element silencing transcription factor, a neuron-restrictive silencer, J Biol Chem 272:1929-1934、Bernal-Mizrachi, et al, 2003, Gene expression profiling in islet biology and diabetes research, Diabetes Metab Res Rev 19:32-42、及び、Scharfmann, et al, 1996, Differentiation and growth of pancreatic beta cells, Diabetes Metab 22:223-228）。本発明者等は、遺伝子発現マッピング研究により、こうした共通の遺伝子産物の１つであるＶＭＡＴ２（小胞モノアミントランスポーター２型：vesicular monoamine transporter type 2）に着目するに至った。ＶＭＡＴ２はβ細胞により発現されるが、膵臓外分泌腺や他の種々の腹部器官には存在しない（Maffei, et al, 2004, Identification of tissue-restricted transcripts in human islets, Endocrinology 145:4513-4521）。ＶＭＡＴ２の特異的リガンドであるジヒドロテトラベンアジン（dihydrotetrabenazine：ＤＴＢＺ）は、中枢神経系障害の陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）用として、既に臨床的に使用されている（Vander Borght, et al, 1995, In vivo imaging of the brain vesicular monoamine transporter, JNucl Med 36:2252-2260）。本発明者等は、精製したヒトの島及び精製した膵臓外分泌腺組織から調製された総膜画分（total membrane fraction）に対する［３Ｈ］ＤＴＢＺの結合を研究したところ、［３Ｈ］ＤＴＢＺが島の膜には特異的に結合するが、膵臓外分泌腺由来の膜には特異的に結合しないことを見出した。更に、免疫組織化学によって、抗ＶＭＡＴ２とインシュリン免疫反応性が、ともに島β細胞に局在していることを示した（Weihe, et al, 2000, Chemical neuroanatomy of the vesicular amine transporters, Faseb J 14:2435-2449、Weihe, et al, 1994, Localization of vesicular monoamine transporter isoforms (VMAT1 and VMAT2) to endocrine cells and neurons in rat, J Mol Neurosci 5:149-164、Anlauf, et al, 2003, Expression of the two isoforms of the vesicular monoamine transporter (VMAT1 and VMAT2) in the endocrine pancreas and pancreatic endocrine tumors, J Histochem Cytochem 51 :1027-1040、及び、Mei, et al, 2002, Early, selective and marked loss of sympathetic nerves from the islets of BioBreeder diabetic rats, Diabetes 51:2997-3002）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
以上の背景から、β細胞集団（ＢＣＭ）を非侵略的に決定するための新たな方法であって、例えば糖尿病の治療、島の再生及び移植のための定量的な終点の提供に使用可能な方法を探し出す必要がある。本発明者等は本出願において、β細胞におけるＶＭＡＴ２発現を［１１Ｃ］ＤＴＢＺ及びＰＥＴを用いて定量化することにより、こうした非侵襲的なＢＣＭの測定法が提供されることを報告する。より具体的に、本発明者等は、［１１Ｃ］ＤＴＢＺを用いれば膵臓内分泌部を生体内で撮像できること、及び、この放射性リガンドを用いたＰＥＴ撮像によって、自然発症の糖尿病又はストレプトゾトシン（ＳＴＺ）により誘発された糖尿病のラットから、正常血糖のラットを識別することに成功したことを報告する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、陽電子放出断層撮影（positron emission tomography：ＰＥＴ）を用いて、膵臓内分泌部のβ細胞集団を容易に且つ非侵略的に可視化し、定量的に測定することができるという知見、また、この方法が、糖尿病等のβ細胞関連障害の新たな実験的治療、並びに監視及び管理の支えとなるという知見に基づくものである。重要なのは、この方法が、新生糖尿病のおそれがある人の診断検査を可能とする点である。
【００１３】
即ち、一態様によれば、本発明は、対象の膵臓におけるβ細胞集団を決定する方法であって：有効量の小胞モノアミントランスポーター２型（vesicular monoamine transporter type 2：ＶＭＡＴ２）−特異的放射性リガンドを前記対象に投与する工程；前記対象の膵臓の少なくとも一部について１又は２以上のコンピュータ化画像を取得する工程；及び、前記対象の膵臓におけるβ細胞集団を決定するべく、前記コンピュータ化画像を定量分析する工程を含んでなる方法を提供する。本発明の一実施形態によれば、前記ＶＭＡＴ２−特異的放射性リガンドは［１１Ｃ］ジヒドロテトラベンアジン（［１１Ｃ］ＤＴＢＺ）である。本発明の別の実施形態によれば、前記コンピュータ化画像は陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）を用いて得られる。本発明の方法は、任意の哺乳類を対象とするβ細胞集団の決定に使用できるが、前記対象はヒトであることが好ましい。
【００１４】
また、本発明は、対象における代謝障害又は神経内分泌障害を診断する方法であって：有効量の小胞モノアミントランスポーター２型（ＶＭＡＴ２）−特異的放射性リガンドを前記対象に投与する工程；前記対象の膵臓の少なくとも一部について、１又は２以上のコンピュータ化画像を取得する工程；前記対象の膵臓におけるβ細胞集団を決定するべく、前記コンピュータ化画像を定量分析する工程；及び、前記β細胞集団をβ細胞集団の基準測定値と比較し、前記基準測定値に対するβ細胞集団の減少又はβ細胞集団の増加を、代謝障害又は神経内分泌障害の存在と関連付ける工程を含んでなる方法を提供する。本発明の一実施形態によれば、前記放射性リガンドは［１１Ｃ］ＤＴＢＺであり、前記コンピュータ化画像はＰＥＴを用いて得られる。本発明の別の実施形態によれば、前記代謝障害はβ細胞関連障害であり、例としては、必ずしもこれに制限されるものではないが、インスリノーマや他の神経内分泌腫瘍が挙げられる。別の実施形態によれば、前記β細胞関連障害は糖尿病である。本発明の特定の実施形態によれば、前記代謝障害は１型糖尿病である。別の実施形態によれば、前記代謝障害は２型糖尿病である。更なる実施形態によれば、前記代謝障害は前臨床１型糖尿病である。
【００１５】
更に本発明は、糖尿病を発症するおそれのある対象の予後を評価する方法であって、周期的な工程として：有効量の小胞モノアミントランスポーター２型（ＶＭＡＴ２）−特異的放射性リガンドを前記対象に投与する工程；前記対象の膵臓の少なくとも一部について、１又は２以上のコンピュータ化画像を取得する工程；前記対象の膵臓におけるβ細胞集団を決定するべく、前記コンピュータ化画像を定量分析する工程；及び、前記周期的に決定されるβ細胞集団をβ細胞集団の基準測定値と比較し、前記基準測定値に対するβ細胞集団の減少を、前糖尿病状態から糖尿病状態への進行と関連付ける工程を含んでなる方法を提供する。本発明の一実施形態によれば、前記放射性リガンドは［１１Ｃ］ＤＴＢＺであり、前記コンピュータ化画像はＰＥＴを用いて得られる。本発明の別の実施形態によれば、前記対象は１型又は２型糖尿病を発症するおそれのある対象である。
【００１６】
また、本発明は、代謝又は障害の治療の効率を決定する方法であって、周期的な工程として：有効量の小胞モノアミントランスポーター２型（ＶＭＡＴ２）−特異的放射性リガンドを前記対象に投与する工程；前記対象の膵臓の少なくとも一部について、１又は２以上のコンピュータ化画像を取得する工程；前記対象の膵臓におけるβ細胞集団を決定するべく、前記コンピュータ化画像を定量分析する工程；及び、前記周期的に決定されるβ細胞集団をβ細胞集団の基準測定値と比較し、β細胞集団が前記基準測定値に概ね一致していることを、前記代謝障害の治療に成功していることの指標とする工程を含んでなる方法を提供する。本発明の一実施形態によれば、前記放射性リガンドは［１１Ｃ］ＤＴＢＺであり、前記コンピュータ化画像はＰＥＴを用いて得られる。本発明の更なる実施形態によれば、前記代謝障害は膵臓β細胞関連障害である。特定の実施形態によれば、前記β細胞障害はインスリノーマ又は神経内分泌腫瘍である。更に別の特定の実施形態によれば、前記β細胞障害は糖尿病である。更に他の本発明の実施形態によれば、前記β細胞障害は１型糖尿病、２型糖尿病、又は前臨床１型糖尿病である。
【００１７】
また、本発明は、糖尿病の処置又は予防を管理する方法であって、周期的な工程として：有効量の小胞モノアミントランスポーター２型（ＶＭＡＴ２）−特異的放射性リガンドを前記対象に投与する工程；前記対象の膵臓の少なくとも一部について、１又は２以上のコンピュータ化画像を取得する工程；前記対象の膵臓におけるβ細胞集団を決定するべく、前記コンピュータ化画像を定量分析する工程；及び、前記周期的に決定されるβ細胞集団をβ細胞集団の基準測定値と比較し、前記基準測定値に対するβ細胞集団の減少を、更なる治療の必要性と関連付ける工程を含んでなる方法を提供する。本発明の一実施形態によれば、前記放射性リガンドは［１１Ｃ］ＤＴＢＺであり、前記コンピュータ化画像はＰＥＴを用いて得られる。一実施形態によれば、前記糖尿病は２型糖尿病である。好ましい実施形態によれば、前記糖尿病は１型糖尿病である。
【００１８】
また、本発明は、対象の膵臓におけるβ細胞集団を決定するために使用されるキットであって、有効量の小胞モノアミントランスポーター２型（ＶＭＡＴ２）−特異的放射性リガンドと、医薬的に許容し得る担体と、任意によりＰＥＴスキャナーとを含んでなるキットを提供する。一実施形態によれば、前記放射性リガンドは［１１Ｃ］ＤＴＢＺである。本発明の別の実施形態によれば、前記糖尿病は１型糖尿病又は２型糖尿病である。
【００１９】
更に、本発明は、対象における神経内分泌障害を診断する方法であって：有効量の小胞モノアミントランスポーター２型（ＶＭＡＴ２）−特異的放射性リガンドを前記対象に投与する工程；前記対象の関心領域の少なくとも一部について、１又は２以上のコンピュータ化画像を取得する工程；前記対象の関心領域におけるβ細胞集団を決定するべく、前記コンピュータ化画像を定量分析する工程；及び、前記β細胞集団をβ細胞集団の基準測定値と比較し、前記基準測定値に対するβ細胞集団の減少又はβ細胞集団の増加を、神経内分泌障害の存在と関連付ける工程を含んでなる方法を提供する。本発明の一実施形態によれば、前記神経内分泌障害は神経内分泌ガン、例えば前立腺ガンである。
【００２０】
また、本発明は、神経内分泌腫瘍を撮像する方法であって：有効量の小胞モノアミントランスポーター２型（ＶＭＡＴ２）−特異的放射性リガンドを前記対象に投与する工程；及び、前記対象の関心領域の少なくとも一部について、１又は２以上のコンピュータ化画像を取得する工程を含んでなる方法を提供する。一実施形態によれば、前記腫瘍は前立腺腫瘍である。
【００２１】
本発明のその他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明により明らかになるであろう。但し、詳細な説明及び具体的な実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものであるが、例示のためだけに与えられるものであると解すべきである。以下の詳細な説明によれば、本発明の趣旨及び範囲を超えない様々な変更及び修正が、当業者には明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本明細書に記載の通り、本発明者等は、膵臓内分泌部のβ細胞集団を、ＰＥＴを用いて容易に可視化し、測定するための非侵襲的な方法を見出した。更に、本発明者等はこの方法が、新生糖尿病のおそれがある人の診断検査に使用できるとともに、代謝及び神経内分泌障害の治療にも役立つことを見出した。
【００２３】
従って本発明は、対象におけるβ細胞集団を決定する方法を提供する。本明細書で使用される「対象」とは哺乳類を指し、その例としては、限定されるものではないが、ウシ、イヌ、マウス、ブタ、ラット、サル、又はヒトが挙げられる。中でも、対象はヒトであることが好ましい。
【００２４】
本発明は、対象の膵臓におけるβ細胞集団を決定する方法であって：有効量のＶＭＡＴ２−特異的放射性リガンドを前記対象に投与する工程；前記対象の膵臓の少なくとも一部について、１又は２以上のコンピュータ化画像を取得する工程；及び、前記対象の膵臓におけるβ細胞集団を決定するべく、前記コンピュータ化画像を定量分析する工程を含んでなる方法を提供する。本発明の一実施形態によれば、ＶＭＡＴ２−特異的放射性リガンドは［１１Ｃ］ＤＴＢＺである。本発明の別の実施形態によれば、コンピュータ化画像は陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）を用いて得られる。本明細書で使用される「有効量」とは、コンピュータ断層撮影を用いて関心領域の画像を得るのに有効な放射性リガンドの量を指す。画像を得るのに有効な放射性リガンドの量は、各事例に固有の因子に応じて異なる場合がある。こうした因子の例としては、放射性リガンドの種類、対象の種別、対象の体重、及び投与の方法が挙げられる。これらの量は当業者であれば容易に決定することが可能である。
【００２５】
本発明の方法によれば、本明細書に記載された放射性リガンドは、対象となるヒト又は動物に対して、公知の手法により投与することができる。こうした手法としては、限定されるものではないが、非経口投与（例えば、血管内、静脈内、動脈内、又は実質内投与）が挙げられる。好ましい投与方法の一例は、静脈又は動脈注射による非経口投与である。
【００２６】
非経口投与の場合には、放射性リガンドを滅菌水溶液と混合してもよい。滅菌水溶液は対象の血液と等張であることが好ましい。このような製剤を調製するには、例えば、生理学的に適合性のある物質（例えば塩化ナトリウム、グリシン等）を含有し、生理学的条件に適合するよう緩衝化されたｐＨを有する水に、固体活性成分を溶解させて水溶液とし、得られた溶液を滅菌とすればよい。本製剤は密閉アンプル又はバイアル等、単位用量又は複数回用量の容器に入れて供することができる。また、本製剤は上述した方法を含む、任意の注射方法で送達することができる。
【００２７】
また、本発明の放射性リガンドは、浸透圧ミニポンプやその他の持続放出器具を用いて放出又は送達することも可能である。基本的な浸透圧ミニポンプによる放出速度は、放出オリフィス内に配置された微小多孔質の高速応答ゲルによって調節することができる。浸透圧ミニポンプは、選択された放射性リガンドの制御放出や標的送達に有用である。
【００２８】
また、本発明は、対象における代謝障害又は神経内分泌障害を診断する方法であって：有効量のＶＭＡＴ２−特異的放射性リガンドを前記対象に投与する工程；前記対象の膵臓の少なくとも一部について、１又は２以上のコンピュータ化画像を取得する工程；前記対象の膵臓におけるβ細胞集団を決定するべく、前記コンピュータ化画像を定量分析する工程；及び、前記β細胞集団をβ細胞集団の基準測定値と比較し、前記基準測定値に対するβ細胞集団の減少又はβ細胞集団の増加を、代謝障害又は神経内分泌障害の存在と関連付ける工程を含んでなる方法を提供する。本発明の一実施形態によれば、放射性リガンドは［１１Ｃ］ＤＴＢＺであり、前記コンピュータ化画像はＰＥＴを用いて得られる。本発明の更なる実施形態によれば、代謝障害はβ細胞関連障害であり、その例としては、必ずしもこれに制限されるものではないが、インスリノーマや他の神経内分泌ガンが挙げられる。別の実施形態によれば、β細胞関連障害は糖尿病である。本発明の特定の実施形態によれば、代謝障害は１型糖尿病又は２型糖尿病である。別の実施形態によれば、代謝障害は前臨床糖尿病である。
【００２９】
本明細書で使用される「代謝障害」という語は、代謝恒常性の欠失を引き起こす体内の任意の問題を指す。「β細胞関連障害」という語は、β細胞の集団又は機能の変化を特徴とする任意の障害又は疾患を指す。例としては、これに制限されるものではないが、糖尿病、前臨床糖尿病、及び、インスリノーマ等の低血糖障害が挙げられる。本明細書で使用される「糖尿病」という語は、高血糖に繋がる任意のグルコース代謝の障害を指し、１型及び２型の両糖尿病が挙げられる。
【００３０】
本明細書で使用される「神経内分泌障害」という語は、神経系と細胞ホルモン放出との間の相互作用を伴う、或いはそれに関連する、任意の障害又は疾患を指す。例としてはクローン病及び神経内分泌ガン（neuroendocrine cancers：ＮＥＣ）が挙げられる。
【００３１】
本明細書で使用されるＢＣＭの「基準測定値（baseline measure）」という語は、対象のＢＣＭの定量的な測定値と比較される、ＢＣＭの測定値を指す。例として、ＢＣＭの基準測定値としては、コントロール対象のＢＣＭを用いることができる。本明細書で使用される「コントロール対象」とは、代謝障害を有していない哺乳類（例えば、これらに制限されるものではないが、ウシ、イヌ、マウス、ブタ、ラット、サル、又はヒト等）を指す。本発明の好ましい実施形態によれば、コントロール対象はヒトである。別の例として、ＢＣＭの基準測定値としては、以前に測定された対象のＢＣＭを用いてもよい。
【００３２】
また、対象が何らかの疾患や障害の症候を示していない時点で対象を評価することにより、期待又は正常ＢＣＭを決定してもよい。或いは、同様の種別、年齢、及び性別の非罹病対象を評価することにより、期待又は正常ＢＣＭを決定することもできる。例えば、２５歳から４０歳までの正常且つ健全な男性少なくとも３０人からＢＣＭの測定値を取得し、成人男性の正常ＢＣＭを決定すればよい。女性の正常ＢＣＭも同様の手順で決定することができる。また、対象を評価することにより、期待又は正常ＢＣＭを求めてもよい。
【００３３】
本発明を限定するものではないが、定量的な診断評価法の場合、代謝障害の存在を示す典型的な陽性の結果としては、ＢＣＭの基準測定値と比較した場合に、対象のＢＣＭが統計的に有意な増加又は減少を示すことが挙げられる。非限定的な例として、コントロール対象に対するＢＣＭの統計的に有意な上昇を、インスリノーマ、又は他の神経内分泌ガン、又は早期２型糖尿病の存在と関連付けることができる。同様に、前記基準測定値に対するＢＣＭの統計的に有意な減少を、糖尿病の存在と関連付けることができる。
【００３４】
加えて、本発明は、１型又は２型の糖尿病を発症するおそれのある対象の予後を評価する方法であって、周期的な工程として：有効量のＶＭＡＴ２−特異的放射性リガンドを前記対象に投与する工程；前記対象の膵臓の少なくとも一部について、１又は２以上のコンピュータ化画像を取得する工程；前記対象の膵臓におけるβ細胞集団を決定するべく、前記コンピュータ化画像を定量分析する工程；及び、前記周期的に決定されるβ細胞集団を、β細胞集団の基準測定値と比較し、前記基準測定値に対するβ細胞集団の減少を、前臨床糖尿病から糖尿病への進行と関連付ける工程を含んでなる方法を提供する。本発明の一実施形態によれば、前記放射性リガンドは［１１Ｃ］ＤＴＢＺであり、前記コンピュータ化画像はＰＥＴを用いて得られる。対象としては、１型糖尿病又は２型糖尿病のおそれのある患者が挙げられる。
【００３５】
非限定的な例として、本発明の方法を用いて１型又は２型糖尿病のおそれがある対象の予後を監視及び評価するには、対象のＢＣＭを継続的に（例えば毎月１回ずつ６ヶ月間）測定し、測定値を得るたびに以前のＢＣＭ測定値（基準測定値）又は同一対象の測定値と比較すればよい。以前の（基準）測定値と比べてＢＣＭの減少が見られた対象は、更に１型又は２型糖尿病を発症するおそれがあると考えられる。
【００３６】
また、本発明は、代謝障害を処置又は予防するための治療の効率を決定する方法であって、周期的な工程として：有効量のＶＭＡＴ２−特異的放射性リガンドを前記対象に投与する工程；前記対象の膵臓の少なくとも一部について、１又は２以上のコンピュータ化画像を取得する工程；前記対象の膵臓におけるβ細胞集団を決定するべく、前記コンピュータ化画像を定量分析する工程；及び、前記周期的に決定されるβ細胞集団をβ細胞集団の基準測定値と比較し、β細胞集団が前記基準測定値に概ね一致することを、前記代謝障害を処置又は予防する治療に成功していることの指標とする工程を含んでなる方法を提供する。
【００３７】
本明細書で使用される「コントロール対象のＢＣＭに概ね一致する」とは、基準測定値との間に有意な差異が無いことを意味する。例えば、あるＢＣＭとある基準測定値との間に有意な差が無いことが、周知の統計的方法によって決定された場合、そのＢＣＭはコントロール対象のＢＣＭに概ね一致するということができる。本発明の一実施形態によれば、放射性リガンドは［１１Ｃ］ＤＴＢＺであり、コンピュータ化画像はＰＥＴを用いて得られる。本発明の更なる実施形態によれば、代謝障害は膵臓β細胞関連障害である。特定の実施形態によれば、β細胞障害はインスリノーマ又は他の神経内分泌腫瘍である。更に別の特定の実施形態によれば、β細胞障害は糖尿病である。更に他の本発明の実施形態によれば、β細胞障害は１型糖尿病、２型糖尿病、又は前臨床１型糖尿病である。
【００３８】
また、本発明は、糖尿病の処置又は予防を管理する方法であって、周期的な工程として：有効量のＶＭＡＴ２−特異的放射性リガンドを前記対象に投与する工程；前記対象の膵臓の少なくとも一部について、１又は２以上のコンピュータ化画像を取得する工程；前記対象の膵臓におけるβ細胞集団を決定するべく、前記コンピュータ化画像を定量分析する工程；及び、前記周期的に決定されるβ細胞集団をβ細胞集団の基準測定値と比較し、前記基準測定値に対するβ細胞集団の減少を、更なる治療の必要性と関連付ける工程を含んでなる方法を提供する。本発明の一実施形態によれば、放射性リガンドは［１１Ｃ］ＤＴＢＺであり、コンピュータ化画像はＰＥＴを用いて得られる。一実施形態によれば、糖尿病は２型糖尿病である。別の実施形態によれば、糖尿病は１型糖尿病である。
【００３９】
本発明の方法によれば、対象又は患者のＢＣＭの決定は、糖尿病を処置又は予防する治療の開始後であれば、任意のときに行なうことができる。例えば、対象又は患者がまだ糖尿病のための処置を受けている間に、ＢＣＭを決定してもよい。
【００４０】
対象又は患者のＢＣＭが正常値よりも低い値で留まり続ける場合、医師は、対象又は患者が受ける糖尿病のための処置を継続する旨を選択すればよい。同様に、継続的な評価を通じて、対象又は患者のＢＣＭに目立った上昇がなく、一定値のまま留まり続けてもいない場合、糖尿病のための処置による効果が得られておらず、処置の用量を増量するか、或いは処置を変更すべきであることを示す指標とすればよい。
【００４１】
一方、継続的な評価を通じて、対象又は患者のＢＣＭが一定値のまま留まり続けるか、或いは上昇して、正常又は基準ＢＣＭに近付いている場合、糖尿病のための処置による効果が得られており、処置量を減少させるか、更には処置を停止してもよいことを示す指標とすればよい。
【００４２】
対象又は患者の糖尿病が再発したか否かを決定するべく、対象又は患者の受ける糖尿病のための処置の終了後にＢＣＭを評価することも、本発明の範囲内である。即ち、ＢＣＭの決定によって、糖尿病の診断を受けた患者の経過観察を行なうのに利便性の高い方法が提供される。更に、対象又は患者における糖尿病の程度を決定するための手段として、並びに、適切な処置又は予防の選択肢を確認するための手段として、対象又は患者のＢＣＭを決定することも、本発明の範囲内である。
【００４３】
［１１Ｃ］ＢＴＢＮＺ及びＰＥＴを用いてＢＣＭを定量的に決定することができるという知見は、糖尿病を有する患者を特定する手段を提供するとともに、糖尿病状態の診断用試験の形態で商業化できる可能性を示すものである。こうした試験の開発によって、一般的なスクリーニング手法が提供される。こうした手法によって、糖尿病の早期の検出及び診断を支援するとともに、正常値を下回るＢＣＭが検出された患者の経過観察のための方法を提供することができる。同様に、この試験によって、インスリノーマや他の神経内分泌障害等のβ細胞関連障害を有する患者の早期の検出及び診断を支援するとともに、正常値を上回るＢＣＭが検出された患者の経過観察のための方法を提供することができる。
【００４４】
従って、本発明は更に、対象の膵臓におけるβ細胞集団を決定するために用いられる、或いは対象における糖尿病等の代謝障害又は神経内分泌障害を診断するためのキットであって、有効量のＶＭＡＴ２−特異的放射性リガンドと、医薬的に許容し得る担体と、任意によりＰＥＴスキャナーとを含んでなるキットを提供する。一実施形態によれば、放射性リガンドは［１１Ｃ］ＤＴＢＺである。但し、本発明では、ＶＭＡＴ２に特異的に結合する放射性リガンドを任意に利用することができ、ＤＴＢＺのＶＭＡＴ２−特異的類似体には限定されない。ＶＭＡＴ２−特異的放射性リガンド及びＤＴＢＺ類似体は、当業者に周知の種々の方法により合成することが可能である。
【００４５】
本発明の一実施形態によれば、前記障害はインスリノーマ、他の神経内分泌ガン、又は糖尿病である。好ましい一実施形態によれば、糖尿病は１型又は２型糖尿病である。
【００４６】
ＶＭＡＴ２−特異的放射性リガンドを含有する製剤を、更に医薬的に許容し得る担体に混合することにより、医薬組成物を含有させることも本発明の範囲内である。従って、本発明は更に、ＶＭＡＴ２−特異的放射性リガンドと、医薬的に許容し得る担体とを含んでなる医薬組成物を提供する。医薬的に許容し得る担体とは、組成物の他の成分に適合するとともに、その受容物に対して有害ではないという意味で「許容し得る」ものでなければならない。許容し得る医薬担体の例としては、特に、カルボキシメチルセルロース、結晶性セルロース、グリセリン、アラビアゴム、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、粉末、食塩水、アルギン酸ナトリウム、スクロース、デンプン、タルク、及び、中でも水が挙げられる。医薬組成物の製剤は便宜上、単位用量にて提供することが好ましい。
【００４７】
本発明の医薬製剤は、製薬分野で周知の方法により調製することができる。例えば、放射性リガンドを担体又は希釈剤と混合して、懸濁液又は溶液とする。任意により、１又は２以上の副成分（例えば緩衝剤、香味剤、界面活性剤等）を加えてもよい。担体の選択は投与経路によって様々である。この医薬組成物は本発明の放射性リガンドを対象に投与するのに有用である。放射性リガンドは、前記対象の関心領域について１又は２以上の画像を得るのに有効な量で提供すればよい。上述のように、この量は当業者であれば容易に決定することができる。
【００４８】
更に、本発明は、対象における神経内分泌障害を診断する方法であって：有効量の小胞モノアミントランスポーター２型（ＶＭＡＴ２）−特異的放射性リガンドを前記対象に投与する工程； 前記対象の関心領域の少なくとも一部について、少なくとも１のコンピュータ化画像を取得する工程； 前記対象の関心領域におけるβ細胞集団を決定するべく、前記コンピュータ化画像を定量分析する工程；及び、前記β細胞集団をβ細胞集団の基準測定値と比較して、前記基準測定値に対するβ細胞集団の減少又はβ細胞集団の増加を、神経内分泌障害の存在と関連付ける工程を含んでなる方法を提供する。本発明の一実施形態によれば、神経内分泌障害は神経内分泌ガン、例えば前立腺ガンである。
【００４９】
また、本発明は、神経内分泌腫瘍を撮像する方法であって：有効量の小胞モノアミントランスポーター２型（ＶＭＡＴ２）−特異的放射性リガンドを前記対象に投与する工程；及び、前記対象の関心領域の少なくとも一部について、少なくとも１のコンピュータ化画像を取得する工程を含んでなる方法を提供する。一実施形態によれば、腫瘍は前立腺腫瘍である。
【００５０】
以下の実施例により本発明を説明するが、これらの実施例は本発明の理解のために記載するものであり、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の範囲を、如何なる意味でも限定するものと解釈してはならない。
【実施例】
【００５１】
実施例１
方法
【００５２】
放射性リガンド
［１１Ｃ］ＤＴＢＺの前駆体である、立体化学的に分離された（＋）−９−Ｏ−デスメチル−ａ−ジヒドロテトラベンアジンは、ABX Advanced Biochemical Compounds（Radeberg, Germany）から入手した。（＋）−α−［１１Ｃ］ＤＴＢＺは、適切な前駆体を［１１Ｃ］メチル化し、生成物をＨＰＬＣで精製することにより合成した（Jewett, et al, 1997, A simple synthesis of [11C]dihydrotetrabenazine (DTBZ), Nucl Med Biol 24:197-199、及び、Kilbourn, et al, 1995, Binding of alpha-dihydrotetrabenazine to the vesicular monoamine transporter is stereospecific, Eur J Pharmacol 278:249-252）。［１１Ｃ］−ＤＴＢＺ調製物における所望の（＋）−産物の純度は、９８．５から９９．９％までの範囲であった。炭素−１１標識放射性トレーサーの比活性は、注射の時点で＞２０００ｍＣｉ／μｍｏｌであった。
【００５３】
ＳＴＺ誘発性糖尿病 
動物実験は何れもコロンビア大学医学部において、動物管理使用委員会（Institutional Animal Care and Use Committee：ＩＵＣＡＣ）による審査及び承認の下で行なった。何れの実験もＩＵＣＡＣ承認の手順に沿って実施した。糖尿病の誘発は、２５０〜３５０ｇのルイス（Lewis）ラットに、ストレプトゾトシン（Sigma Aldrich, St. Louis, Mo）を単回腹腔内注射（５０ｍｇ／ｋｇ）することにより行なった。ＳＴＺ処置による効果を高めるため、ラットは注射前に４時間絶食させた。ＳＴＺを０.１Ｍクエン酸塩緩衝剤（ｐＨ５.５）に溶解させ、最終的に滅菌濾過することにより、新鮮なＳＴＺ溶液を調製した。同様の年齢及び体重の対照ラットには、クエン酸塩緩衝剤のみを注射した。
【００５４】
血中グルコース及び腹腔内グルコース負荷試験測定
ラットの尾の静脈から血液サンプルを採取した。Accu-Check 血中グルコース監視システム（Roche Diagnostics, Somerville, NJ）を用いて、ラットの血中グルコース（ＢＧ）レベルを毎日監視した。腹腔内グルコース負荷試験（intraperitoneal glucose tolerance tests：ＩＰＧＴＴ）は、絶食動物を用いて無麻酔下、前述した手法により行なった（Weksler-Zangen, et al, 2001, The newly inbred cohen diabetic rat: a non obese normolipidemic genetic model of diet-induced type 2 diabetes expressing sex differences, Diabetes 50:2521-2529）。基準ＢＧの測定後、動物に体重１ｋｇ当たり１ｇのグルコースを腹腔内注射してから、その５、１０、１５、３０、６０、及び１２０分後に、ＢＧ濃度を再び測定した。ＢＧ値が４回連続して３００ｍｇ／ｄＬを上回り、異常なＩＰＧＴＴ応答を示した場合、その動物は糖尿病であると判断した。正常血糖の対照動物と、上記の基準を満たした糖尿病ラットとを、撮像実験に使用した。一部の実験では、対照ラットを撮像してからＳＴＺで処置し、糖尿病であると判定してから再度撮像した。
【００５５】
ラットの膵臓を切断し、４％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳで固定し、パラフィンに包埋した。得られた１０μｍ厚切片を脱パラフィンし、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。また、切片をモルモット（guinea pig）抗ウシインシュリン抗体又はＶＭＡＴ２（Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo）で染色し、標準的な間接免疫組織化学法で展開した。この切片を、写真用デジタルカメラを備えたLeica DME光学顕微鏡（Heidelberg, Germany）で観察した。
【００５６】
ＰＥＴスキャン試験プロトコル
４頭の健常な成体ラット及び３頭の糖尿病の成体ラットを対象として、ＰＥＴスキャンを実施した。撮像前に、動物にケタミン及びキシラジンを腹腔内注射して麻酔した。全身透過スキャン（放射データの減衰補正に使用する）の取得後、媒体である滅菌食塩水に放射性リガンドを取り、２００〜３００μＣｉの［１１Ｃ］ＤＴＢＺをボーラス注射により、陰茎静脈から投与した。Concorde microPET-R4（CTI Molecular Imaging, Knoxville, TN, USA）を用い、注射後６０分まで動物のＰＥＴスキャンを動的に取得した。本スキャナーの視野は１００×８０ｍｍであり、視野中央４０ｍｍの再構成解像度は２．２５ｍｍである。透過スキャンで得られた減衰補正マトリックスを用いてＰＥＴデータを処理し、フーリエリビニングを用いて画像を再構成した後、二次元フィルター逆投影を行なった。
【００５７】
データ分析及び解釈
関心領域の分析及び画像再構成はAsiPro（Concorde Microsystems, Knoxville, TN）で行なった。視覚分析は、ＰＥＴ解釈の熟練者２人が、冠状断、横断及び矢状断再構成を用いて行なった。スライス厚５ｍｍの再構成冠状ＰＥＴ画像を用いて、着目する各ソース器官の活性の同定及び測定を行なった。像平面に手動で関心領域（ＲＯＩ）を画定し、時間活性曲線の決定に供した。健常ラットの膵臓中のＲＯＩを手描きするために、本発明者等は肝臓及び胃を目印とし、ランゲルハンス島β細胞におけるＤＴＢＺの高アビディティー摂取を用いて決定した。ＳＴＺ誘発性糖尿病ラットの関心領域は、肝臓及び胃を目印とし、ＳＴＺ処置前の動物の膵臓において観察されたＤＴＢＺアビディティーパターンに基づいて決定した。全視野及びＲＯＩにおける［１１Ｃ］ＤＴＢＺの活性を算出した。
【００５８】
結果及び考察
過去の研究で、ＤＴＢＺがＶＭＡＴ２を特異的に標的化することが示されている（Scherman, D. 1986, Dihydrotetrabenazine binding and monoamine uptake in mouse brain regions, J Neurochem 47:331-339、Scherman, et al, 1980, Effect of drugs on the ATP-induced and pH-gradient-driven monoamine transport by bovine chromaffin granules, Biochem Pharmacol 29:1883-1890、Scherman, et al, 1983, The catecholamine carrier of bovine chromaffin granules. Form of the bound amine, Mol Pharmacol 23:431-436、及び、Scherman, et al, 1983, Characterization of the monoamine carrier of chromaffin granule membrane by binding of [23H]dihydrotetrabenazine, Proc Natl Acad Sci USA 80:584-588）。インサイチュハイブリダイゼーション、免疫組織化学、及び共焦点顕微鏡法（Anlauf, et al. , 2003 , Expression of the two isoforms of the vesicular monoamine transporter (VMAT 1 and VMAT2) in the endocrine pancreas and pancreatic endocrine tumors, JHistochem Cytochem 51:1027-1040）、並びにその他（Maffei, etal, 2004, Identification of tissue-restricted transcripts in human islets, Endocrinology 145:4513-4521, and Weihe, et al, 1994, Localization of vesicular monoamine transporter isoforms (VMATl and VMAT2) to endocrine cells and neurons in rat, JMoI Neurosci 5: 149-164）を用いた研究で、ＶＭＡＴ２免疫反応性がインシュリンと同じ部位に局在化し、或いは他のβ−細胞マーカーによって発現されており、抗グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドで染色されたヒトの島細胞には存在しないことが示されている。ＤＴＢＺを用いたＰＥＴスキャンに関連して、ＶＭＡＴ２の発現は（げっ歯類組織における免疫組織化学により、及び、定量リアルタイムＰＣＲを用いた本発明者等独自の研究により決定されたところでは）ＣＮＳの特定の領域に限定されており、腸管神経系、腸管クロム親和性細胞、副腎髄質のクロム親和性細胞、及び膵臓内分泌部のβ細胞が限局的に染色される（Weihe, et al, 2000, Chemical neuroanatomy of the vesicular amine transporters, Faseb J 14:2435-2449）。ＶＭＡＴ２の神経薬理学及び神経機能解剖が詳細に検討されてきた（Weihe, et al, 2000, Chemical neuroanatomy of the vesicular amine transporters, Faseb J 14:2435-2449, and Henry, et al, 1998, The vesicular monoamine transporter: from chromaffin granule to brain, Neurochem Int 32:227246）。
【００５９】
ヒトＴ１ Ｄのモデルとして、ＳＴＺ処置ルイス（Lewis）ラットモデルを選択した。ＳＴＺは、げっ歯類において実験的に糖尿病を誘発するのに広く用いられている（Wilson, et al, 1990, Streptozotocin interactions with pancreatic beta cells and the induction of insulin-dependent diabetes, Curr Top Microbiol Immunol 156:27-54）。過去の研究では、ＳＴＺがグルコーストランスポーター２を通じてβ細胞に侵入し、フリーラジカルの形成や酸化窒素の放出等、一連の細胞内変化を誘発することにより、結果としてβ−細胞が壊死することが示されている（Szkudelski, T.2001, The mechanism of alloxan and streptozotocin action in B cells of the rat pancreas, Physiol Res 50:537-546）。ＳＴＺ処置の後、これらの実験で用いたルイス（Lewis）ラットは、安定した高血糖状態となった。
【００６０】
次に本発明者等は、膵臓内分泌部のβ細胞によって発現されているＶＭＡＴ２を、ＰＥＴスキャンに適した放射性リガンドである［１１Ｃ］ＤＴＢＺで標的化した。［１１Ｃ］ＤＴＢＺ取り込みを定量測定することにより、本発明者等は膵臓により占有される解剖学的空間内のＶＭＡＴ２密度を間接的に算出した。ＶＭＡＴ２は膵臓内分泌部のβ細胞のみで発現されることから、これによりβ細胞集団の測定値を得た。健常ラットの膵臓のＰＥＴ撮像によって、ＤＴＢＺ取り込みは中心管部の周辺に集中し、膵臓の胃側及び脾臓側領域の方が、器官頭部と比べて取り込み量が多いことが明らかになった（図２、パネルＡ、Ｃ）。健常ラットの膵臓が示すＤＴＢＺアビディティー領域の分布パターンは、過去に報告されたラットの外分泌腺実質内における島の分布と、そのサイズ及び密度が類似していた（Elayat, et al, 1995, An immunocytochemical and morphometric study of the rat pancreatic islets, JAnat 186 (Pt 3):629-637、及び、Bertelli, et al, 2001, Association between islets of Langerhans and pancreatic ductal system in adult rat. Where endocrine and exocrine meet together?, Diabetologia 44:575-584）。膵臓ＤＴＢＺ取り込みは、６０分間の撮像期間のうち、注射後１分から約５０分までの間、単調増加していた。
【００６１】
ＳＴＺ誘発性糖尿病ラット腹部のＰＥＴ撮像によれば、非糖尿病の対照げっ歯類と比較した場合、膵臓領域におけるＤＴＢＺ取り込みのパターン及び密度の両方に差異があることが分かった（図２、パネルＢ、Ｄ）。［１１Ｃ］ＤＴＢＺのＰＥＴスキャンから再構成された画像の定量分析によれば、ＳＴＺ処置により糖尿病を誘発した動物の膵臓のＶＭＡＴ２密度は、処置前のレベルや他の対照動物と比べて低下したものの、完全に消失したわけでは無いことが示された。
【００６２】
ＳＴＺ誘発性糖尿病ラットの膵臓における［１１Ｃ］ＤＴＢＺ取り込みの減少は、ＳＴＺの糖尿病誘発作用、その異常なＩＰＧＴＴ、更には、［１１Ｃ］ＤＴＢＺを用いた撮像後のげっ歯類から得られた膵臓切片の分析により得られた微細解剖学的知見にも一致している。ＳＴＺ誘発性糖尿病ラット由来の膵臓切片の免疫組織化学及びＨ＆Ｅ染色によれば、対照げっ歯類由来の切片と比較して、島の面積及び頻度が減少していることが示された（図２、パネルＡ〜Ｄ）。抗インシュリン及び抗ＶＭＡＴ２免疫反応性を有する島内の細胞頻度も、ＳＴＺ誘発性糖尿病ラット由来の膵臓では、対照と比較して減少していた（図２、パネルＥ〜Ｈ）。
【００６３】
実施例２
自然発症糖尿病ラットモデルにおけるβ細胞集団変化の定量分析
方法
【００６４】
放射性リガンド
［１１Ｃ］ＤＴＢＺの前駆体である、立体化学的に分離された（＋）−９−Ｏ−デスメチル−ａ−ジヒドロテトラベンアジンは、ABX Advanced Biochemical Compounds（Radeberg, Germany）から取得した。（＋）−α−［１１Ｃ］ＤＴＢＺの合成は、適切な前駆体を［１１Ｃ］メチル化し、生成物をＨＰＬＣで精製することにより行なった。［１１Ｃ］−ＤＴＢＺ調製物の純度は、所望の（＋）−生成物が９８．５から９９．９％までの範囲であった。注射時における炭素１１標識放射性トレーサーの比活性は、＞２０００ｍＣｉ／μｍｏｌであった。
【００６５】
自然発症ラット糖尿病モデル
動物実験は何れもコロンビア大学医学部において、動物管理使用委員会（Institutional Animal Care and Use Committee：ＩＵＣＡＣ）による審査及び承認の下で行なった。何れの実験もＩＵＣＡＣ承認の手順に沿って実施した。ＢＢ ＤｐラットはマサチューセッツのBiomedical Research Modelsから取得した。ＢＢ−Ｄｐラットは、生後５０から１２０日の間で（平均８０日）糖尿病を自然発症する（約８０％）。
【００６６】
血中グルコース及び腹腔内グルコース負荷試験測定
血液サンプルをラットの尾静脈から採取した。Accu-Check血中グルコース監視システム（Roche Diagnostics, Somerville, NJ）を用いて、ラットの血中グルコース（ＢＧ）レベルを毎日監視した。腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）は、既述の手順に従い、無麻酔下の動物を絶食させて行なった（Weksler-Zangen, et al, 2001, The newly inbred cohen diabetic rat: a non obese normolipidemic genetic model of diet-induced type 2 diabetes expressing sex differences, Diabetes 50:2521-2529）。基線ＢＧの測定後、動物に体重１ｋｇ当たり１ｇのグルコースを腹腔内注射した。５、１０、１５、３０、６０、及び１２０日後に、ＢＧ濃度を再び測定した。ＢＧ値が四回連続して３００ｍｇ／ｄＬを上回り、異常なＩＰＧＴＴ応答がみられた場合、その動物は糖尿病であると判断した。４５日目、糖尿病の発症前に、基準状態における動物の撮像を行なった。基準スキャンの後、異常グルコース負荷試験の明確な徴候が現れるまで、動物を約二週間の間隔で撮像した。
【００６７】
膵臓組織学
ラット膵臓を切断し、４％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳで固定し、パラフィンに包埋した。得られた１０μｍ厚切片を脱パラフィンし、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。また、切片をモルモット抗ウシインシュリン抗体又はＶＭＡＴ２（Sigma−Aldrich, St.Louis, Mo）で染色し、標準的な間接免疫組織化学法で展開した。写真用デジタルカメラを備えたLeica DME光学顕微鏡（Heidelberg, Germany）で切片を観察した。
【００６８】
ＰＥＴスキャン試験プロトコル
試験対象に対するＰＥＴスキャンは約５０日目に実施し、その後は約２週間おきに、動物が定常的に糖尿病を発症するまで連続して行なった。撮像前にケタミン及びキシラジンを腹腔内注射して動物を麻酔した。全身透過スキャン（放射データの減衰補正に使用する）の取得後、媒体である滅菌食塩水に放射性リガンドを取り、２００〜３００μＣｉの［１１Ｃ］ＤＴＢＺをボーラス注射により、陰茎静脈から投与した。Concorde microPET-R4（CTI Molecular Imaging, Knoxville, TN, USA）を用い、注射後６０分まで動物のＰＥＴスキャンを動的に取得した。本スキャナーの視野は１００×８０ｍｍであり、視野中央４０ｍｍの再構成解像度は２．２５ｍｍである。透過スキャンで得られた減衰補正マトリックスを用いてＰＥＴデータを処理し、フーリエリビニングを用いて画像を再構成した後、二次元フィルター逆投影を行なった。
【００６９】
データ分析及び解釈
関心領域の分析及び画像再構成はAsiPro（Concorde Microsystems, Knoxville, TN）で行なった。視覚分析は、ＰＥＴ解釈の熟練者２人が、冠状断、横断及び矢状断再構成を用いて行なった。スライス厚５ｍｍの再構成冠状ＰＥＴ画像を用いて、着目する各ソース器官の活性の同定及び測定を行なった。像平面に手動で関心領域（ＲＯＩ）を画定し、時間活性曲線の決定に供した。健常ラットの膵臓中のＲＯＩを手描きするために、本発明者等は肝臓及び胃を目印とし、ランゲルハンス島β細胞におけるＤＴＢＺの高アビディティー摂取を用いて決定した。糖尿病ラットの関心領域は、肝臓及び胃を目印とし、基準状態の動物の膵臓において観察されたＤＴＢＺアビディティーパターンに基づいて決定した。ＲＯＩにおける［１１Ｃ］ＤＴＢＺ取り込みの時間対活性曲線を、ASIProソフトウェアを用いて算出した（図１６〜２５）。
【００７０】
結果及び考察
ＢＢ−Ｄｐラットモデルにおける［１１Ｃ］ＤＴＢＺのＰＥＴスキャンと、腹腔内グルコース負荷試験による膵臓内分泌部での［１１Ｃ］ＤＴＢＺ取り込みに関する定量データの比較結果から、取り込みの変化と同時に、或いはその後に、通常はグルコース耐性の変化が生じることが明らかになった。１０頭のＢＢ−Ｄｐラットを用いた一連の試験から、本発明者等は、［１１Ｃ］ＤＴＢＺ取り込みが約５０％減少すると、グルコース不耐及び高血糖の徴候が現れることを見出した（図１６〜２５）。
【００７１】
実施例３
ヒト対象放射性リガンドにおけるβ細胞集団の変化の決定
【００７２】
［１１Ｃ］ＤＴＢＺの前駆体である、立体化学的に分離された（＋）−９−Ｏ−デスメチル−ａ−ジヒドロテトラベンアジンは、ABX Advanced Biochemical Compounds（Radeberg, Germany）から取得する。（＋）−α−［１１Ｃ］ＤＴＢＺは、適切な前駆体を［１１Ｃ］メチル化し、生成物をＨＰＬＣで精製することにより合成する。［１１Ｃ］−ＤＴＢＺ調製物の純度は、所望の（＋）−生成物の純度が９８．５から９９．９％の範囲である。注射時における炭素１１標識放射性トレーサーの比活性は＞２０００ｍＣｉ／μｍｏｌである。
【００７３】
ＰＥＴスキャン試験プロトコル
全身透過スキャン（放射データの減衰補正に使用する）の取得後、媒体である滅菌食塩水に放射性リガンドを取り、２００〜３００μＣｉの［１１Ｃ］ＤＴＢＺを静脈投与する。注射後１２０分までの対象のＰＥＴスキャンを、ＧＥ ＰＥＴスキャナーを用いて動的に取得する。透過スキャンで得られた減衰補正マトリックスを用いてＰＥＴデータを処理し、フーリエリビニングを用いて画像を再構成した後、二次元フィルター逆投影を行なう。
【００７４】
データ分析及び解釈
関心領域の分析及び画像再構成はAsiPro（Concorde Microsystems, Knoxville, TN）で行なう。視覚分析は、ＰＥＴ解釈の熟練者２人が、冠状断、横断及び矢状断再構成を用いて行なう。スライス厚５ｍｍの再構成冠状ＰＥＴ画像を用いて、着目する各ソース器官の活性の同定及び測定を行なう。像平面に手動で関心領域（ＲＯＩ）を画定し、時間活性曲線の決定に供する。健常ラットの膵臓中のＲＯＩを手描きするために、肝臓及び胃を目印とし、ランゲルハンス島β細胞におけるＤＴＢＺの高アビディティー摂取を用いて決定する。
【００７５】
上記手順を約２８日毎に３ヶ月間に亘って繰り返し、ＢＣＭの経時変化を記録した。
【００７６】
本明細書に引用した刊行物、参照文献、特許及び特許出願は何れも、その全体が援用によって組み込まれる。その程度は、各々の出願、特許及び特許出願が具体的且つ個別に、その全体が援用によって組み込まれる旨を表示しているのと同様である。
【００７７】
明確化及び理解のために、上では本発明をある程度詳しく説明したが、本出願の開示に接した当業者には明らかなように、添付の特許請求の範囲によって定まる本発明の真の範囲を逸脱しない限り、その形式及び詳細に様々な変更を加えることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１は、健常ラット（パネル１Ａ及び１Ｃ）及びＳＴＺ誘発性糖尿病ラット（パネル１Ｂ及び１Ｄ）の腹部の、［１１Ｃ］ＤＴＢＺを用いて得られたＰＥＴ画像の冠状面の代表例である。膵臓内分泌部本体を大矢印で示している。また、肝臓左葉（小矢印）及び胃腔（中矢印）も示している。撮像には約３００μＣｉの（＋）−α−［１１Ｃ］ＤＴＢＺを使用した。健常ルイス（Lewis）ラットの撮像後、糖尿病を誘発してから、２度目の撮像を行なった。パネルＡ及びＣに画像を示す動物の血中グルコース濃度は８０から１２０ｍｇ／ｄｌの範囲であり、パネルＢ及びＤに画像を示す動物の血中グルコース濃度は３００ｍｇ／ｄｌを上回っていた。掲載したデータはスキャン期間を合計したイメージである。パネルＡ及びＣに画像を示す動物は撮像６時間前から絶食させたのに対し、パネルＢ及びＤに画像を示す動物の摂食は無制限とした。関心領域（パネル２Ａ〜Ｄ）内の活性を定量したところ、ＳＴＺ処置後の［１１Ｃ］ＤＴＢＺ取り込みには、視野の総活性と比較して減少が見られた（約２０〜４０％）。各視野のグレイスケール密度積分値が、パネル２Ａ〜Ｄの左下端に示されている。図中上方は吻側である。
【図２】図２は、撮像後の正常血糖の対照（左側のパネル）及びＳＴＺ誘発性糖尿病（右側のパネル）のルイス（Lewis）ラットの膵臓の免疫組織化学である。対照及びＳＴＺ処置ラット膵臓のパラフィン包埋切片をＨ＆Ｅで染色し（パネルＡ〜Ｄ）、或いは、抗インシュリン抗体（パネルＥ及びＦ）又はＶＭＡＴ２に対する抗体（パネルＧ及びＨ）を用いて免疫組織化学用に処理した。右側のパネルの切片は糖尿病ラットの膵臓本体から取られたものであるが、本ラットにはＤＴＢＺ結合の消失が観察された。スライドの間接染色は、西洋ワサビペルオキシダーゼを複合化した抗ヤギ又はモルモットＩｇを用いて行ない、ＤＡＢで展開した。パネルＡ及びＢは倍率１００倍の写真であり、他のパネルは何れも倍率４００倍で撮られた写真である。
【図３】図３は、健常ラットにおける初回スキャン（ラセミＤＴＢＺ）の時間活性曲線（time activity curves：ＴＡＣ）である。
【図４】図４は、Bob 19（健常ルイス（Lewis）ラット）のＰＥＴスキャンを最初の４分間について合計したフレームである。
【図５】図５は、関心領域（ＲＯＩ）の画定に使用したBob 19の肝臓及び膵臓の画像である。（Ａ）５０分におけるフレーム２６。（Ｂ）０〜４分及び５０〜５２分の登録フレーム。
【図６】図６（Ａ）は時間活性曲線であり、（Ｂ）はBob 19のＲＯＩ画像である。
【図７】図７は、ＳＴＺ処置糖尿病Bob 19の（Ａ）ＴＡＣ及び（Ｂ）ＲＯＩ画像である（全１９フレームの合計）。
【図８】図８はそれぞれ（Ａ）フレーム１０／１１及び（Ｂ）フレーム１／１１を用いて画定したBill 17のＲＯＩである。
【図９】図９は、（Ａ）ＳＴＺ前及び（Ｂ）ＳＴＺ処置後における、Bill 17のＴＡＣである。
【図１０】図１０は、ＳＴＺ Bill 17のＴＡＣである。
【図１１】図１１は、Stu 16のスキャンで得られた異なるフレーム（時間）における、吻側から尾側への移動横断切片上に画定したＲＯＩである。
【図１２】図１２は、ＳＴＺ処置糖尿病Stu 16のＲＯＩである。
【図１３】図１３は、（Ａ）ＳＴＺ処置前及び（Ｂ）処置後における、Stu 16のＴＡＣである。
【図１４】図１４は、（Ａ）ＳＴＺ処置前及び（Ｂ）処置後における、Ted 13のＴＡＣである。
【図１５】図１５は、ラセミＤＴＢＺで撮像したＳＴＺ処置ラットのＲＯＩ及びＴＡＣである。
【図１６】図１６は、（Ａ）試験開始時及び（Ｂ）〜（Ｃ）試験終了時における、ＢＢラットＡの膵臓である。
【図１７】図１７は、２００５年４月４日に連続撮像された、自然発症糖尿病ＢＢラットＡのＲＯＩ及びＴＡＣである。
【図１８】図１８は、２００５年４月１１日に連続撮像された、ＢＢラットＡのＲＯＩである。
【図１９】図１９は、２００５年５月５日におけるＢＢラットＡのＴＡＣである。
【図２０】図２０は、２００５年５月１７日におけるＢＢラットＡのＴＡＣである。
【図２１】図２１は、２００５年４月４日におけるＢＢラットＡの（Ａ）標準取り込み対（Ｂ）腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）の結果である。
【図２２】図２２は、２００５年４月１１日におけるＢＢラットＡの（Ａ）標準取り込み対（Ｂ）ＩＰＧＴＴの結果である。
【図２３】図２３は、２００５年４月２０日におけるＢＢラットＡの（Ａ）標準取り込み対（Ｂ）ＩＰＧＴＴの結果である。
【図２４】図２４は、２００５年５月５日におけるＢＢラットＡの（Ａ）標準取り込み対（Ｂ）ＩＰＧＴＴの結果である。
【図２５】図２５は、２００５年５月１７日におけるＢＢラットＡの（Ａ）標準取り込み対（Ｂ）ＩＰＧＴＴの結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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