(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を包含することを特徴とする、部位特異的変異導入方法；
（１）鋳型となる環状ＤＮＡ、前記鋳型ＤＮＡにアニールし、５’末端側が互いに相補的な領域を有する少なくとも１組の変異導入用プライマー対、並びに５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有さないＤＮＡポリメラーゼからなる混合液を調製する工程、ここで、変異を導入する部位は前記のプライマー対の互いに相補的な領域に対となって存在し、かつ、プライマー対が５’末端側の互いに相補的な領域の長さが１２〜２１塩基、変異導入部位から３’末端の鋳型ＤＮＡに相補的な配列の長さが１５〜２１塩基であるプライマーからなる変異導入用プライマー対であり；
（２）工程（１）で調製した混合物をＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）に供し、５’突出末端を有するＤＮＡ断片を含むＰＣＲ産物として増幅する工程；
（３）工程（２）で得られたＰＣＲ産物を直接宿主と混合して、宿主を形質転換する工程。
【請求項２】
宿主が相同組換え能欠損株である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
請求項１記載の部位特異的変異導入方法のためのキットであって、以下の構成品を含むキット；
（１）鋳型となる環状ＤＮＡ；
（２）（１）の鋳型ＤＮＡにアニールし、５’末端側が互いに相補的な領域を有する少なくとも１組のプライマー対、ここで、変異を導入する部位はプライマー対の互いに相補的な領域に対となって存在し、かつ、プライマー対が５’末端側の互いに相補的な領域の長さが１２〜２１塩基、変異導入部位から３’末端の鋳型ＤＮＡに相補的な配列の長さが１５〜２１塩基であるプライマーからなる変異導入用プライマー対である；および
（３）５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有さないＤＮＡポリメラーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分子生物学の分野、さらに特定的に言うと部位特異的変異導入方法および当該方法に使用するキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
部位特異的変異導入法には、古典的なＫｕｎｋｅｌ法（例えば、非特許文献１）、ＯＤＡ（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｕａｌ  Ａｍｂｅｒ）法（例えば、非特許文献２）、ＬＡ−ＰＣＲ法と制限酵素部位を組み合わせた変異導入方法（例えば、非特許文献３）、ＬＡ−ＰＣＲ法とＯＤＡ法を組み合わせた変異導入方法（例えば、非特許文献４）、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法と相同組換を利用した変異導入方法（例えば、特許文献１）、鋳型プラスミドＤＮＡのメチル化とＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法およびメチル化ＤＮＡ特異的ヌクレアーゼを有する宿主を用いた変異導入方法（インビトロジェン社）、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法とリガーゼ並びにキナーゼを利用した変異導入方法（例えば、非特許文献５）とＩｎｖｅｒｓｅ  非ＰＣＲ法とエンドヌクレアーゼを組み合わせた変異導入方法（例えば、特許文献３）等がある。
【非特許文献１】Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（１９８５）Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２，４８８．
【非特許文献２】Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ  １５２，２７１．
【非特許文献３】ＬＡ−ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製、製品コード：ＲＲ０１６）取扱説明書
【非特許文献４】Ｍｕｔａｎ（登録商標）−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ（タカラバイオ社製、製品コード：ＲＲ０２２）取扱説明書
【非特許文献５】ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（東洋紡株式会社製、製品コード：ＳＭＫ−１０１）取扱説明書
【特許文献１】米国特許第５２８６６３２号公報
【特許文献２】特開２００５−３４８７４１号公報
【０００３】
これらの変異導入方法は、各種変異導入キットとして製品化されているがその方法の能力は、完成されたものではない。例えば、古典的なＫｕｎｋｅｌ法やＯＤＡ法では、複雑な操作が必要であり、かつ変異導入効率は高くない。また、ＰＣＲ法を利用した変異導入方法においては、変異導入効率を上げるためにはＰＣＲ後、変異導入前の鋳型プラスミドＤＮＡを除去する操作を行わなければならない。さらに、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ産物をキナーゼとリガーゼで連結する方法においては上記に加えて変異導入用プライマーの合成不良による連結部分の不適切な変異導入が危惧される。また、Ｉｎｖｅｒｓｅ  非ＰＣＲ法とエンドヌクレアーゼを組み合わせた変異導入方法についても、変異導入前の鋳型プラスミドＤＮＡを除去する操作が必要であり、長い塩基の挿入、置換および欠失の際には変異導入プライマーが十分に鋳型ＤＮＡにアニールしないことによる変異導入効率低下のおそれがある。
以上のように、操作が簡便で、変異導入効率に優れ、さらに目的以外の変異が入らない変異導入方法という観点からするとまだまだ不十分な方法であるのが現状である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、操作が簡便で、変異導入効率に優れ、さらに目的以外の変異の導入が極めて少ない変異導入方法を提供することにある。さらには、当該方法のために使用するキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本法は宿主を形質転換するには十分でない少量の鋳型プラスミドＤＮＡより、ＰＣＲ反応の過程で目的の変異を含む、形質転換可能なＰＣＲ産物を効率よく産生するプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを使用した変異導入方法および当該方法に使用するキットを提供する。
【０００６】
本発明の第１の発明は、下記工程を包含することを特徴とする、部位特異的変異導入方法に関する。
（１）鋳型となる環状ＤＮＡ、前記鋳型ＤＮＡにアニールし、５’末端側が互いに相補的な領域を有する少なくとも１組の変異導入用プライマー対、並びにＤＮＡポリメラーゼからなる混合液を調製する工程、ここで、変異を導入する部位は前記のプライマー対の互いに相補的な領域に対となって存在し；
（２）工程（１）で調製した混合物をＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）に供し、５’突出末端を有するＤＮＡ断片を含むＰＣＲ産物として増幅する工程；
（３）工程（２）で得られたＰＣＲ産物を用いて、宿主を形質転換する工程。
本発明の第１の発明において、プライマー対が５’末端側の互いに相補的な領域の長さが９〜３０塩基、変異導入部位から３’末端の長さが１２〜３０塩基であるプライマーからなる変異導入用プライマー対であってもよく、宿主が相同組換え能欠損株であってもよく、コンピテントセルであってもよい。
【０００７】
本発明の第２の発明は、本発明の第１の発明のためのキットであって、以下の構成品を含むキットに関する。
（１）鋳型となる環状ＤＮＡ；
（２）（１）の鋳型ＤＮＡにアニールし、５’末端側が互いに相補的な領域を有する少なくとも１組のプライマー対、ここで、変異を導入する部位はプライマー対の互いに相補的な領域に対となって存在する；および
（３）ＤＮＡポリメラーゼ。
本発明の第２の発明において、プライマー対が５’末端側の互いに相補的な領域の長さが９〜３０塩基、変異導入部位から３’末端の長さが１２〜３０塩基であるプライマーからなる変異導入用プライマー対であってもよい。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、操作が簡便で、変異導入効率に優れ、さらに目的以外の変異が入らない変異導入方法が提供される。当該方法は、プラスミドＤＮＡの修飾を必要とせず、ベクター、宿主を選ばず、制限酵素切断部位の導入などを必要としないため、あらゆる目的に幅広く利用できる。ＰＣＲ産物で宿主（例えば大腸菌）を形質転換するというきわめて簡便な操作で確実に変異導入体を取得できるためハイスループットの変異体取得に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の方法は、標的となる核酸配列上の変異の導入が望まれる少なくとも１対の変異部位を含むように設計された変異導入用プライマー対と、校正活性に優れたα様ＤＮＡポリメラーゼを用いることを特徴とする。変異導入用プライマー対を構成する変異導入用プライマーは互いに部分的に相補的な領域（オーバーラップ領域）を有するように設計される。ここで導入される変異に相当する塩基配列である変異導入部位は、両方の変異導入プライマーの、前記の相補的な領域の中に配置されている。
また、本発明の変異導入方法は、置換のみならず、欠失、挿入変異のいずれにおいても好適に使用できる。
【００１０】
本明細書において「５’末端側が相補的なプライマー対」とは、それぞれのプライマーの５’末端を含む領域が、互いに相補的な配列を有するプライマー対を意味する。以下、その相補的な領域をオーバーラップ領域と呼ぶこともある。「５’末端側」および「３’末端側」とは、ヌクレオチドの中央より、それぞれ５’末端を含む領域の一部分、および３’末端を含む領域の一部分を示す。
【００１１】
本明細書において「環状ＤＮＡ」とは、環状構造をとるＤＮＡである。二本鎖の環状ＤＮＡとして、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡが例示される。二本鎖の環状ＤＮＡのうち、鎖の一部にニックを有するＤＮＡ、および鎖の一部が一本鎖になっているＤＮＡも、環状構造をとることができれば二本鎖の環状ＤＮＡに含まれ、本明細書において「部分的環状二本鎖ＤＮＡ」と称する場合がある。
【００１２】
本明細書において「直ちに、宿主を形質転換する」とは、ＰＣＲ産物を直接、そのまま宿主と混合することを示し、エンドヌクレアーゼを初めとするＤＮＡポリメラーゼ以外の酵素により処理する工程やＰＣＲ産物を精製する工程を要しないことを意味する。
【００１３】
（１）本発明の変異導入方法
本発明の変異導入方法は、変異導入が望まれる核酸断片を含むプラスミドＤＮＡを鋳型にして、それぞれの５’末端側が相補的なプライマー対と５’−３’エキソヌクレアーゼ活性および鋳型置換活性を有しないα様ＤＮＡポリメラーゼを用いることにより、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって上記プライマーの互いに相補的な部分（オーバーラップ領域）が５’突出となった二本鎖ＤＮＡを作製することを特徴とする。当該二本鎖ＤＮＡは、宿主の形質転換が可能な環状構造（部分的環状構造）をとることができる。
【００１４】
本発明の方法に用いる変異導入用プライマーは、その５’末端側に、オーバーラップ領域、すなわち変異導入用プライマー対を構成する他方の変異導入用プライマーとの間で互いに相補的な配列を有する。導入が望まれる変異は、当該オーバーラップ領域に含まれ、オーバーラップ領域の５’末端側、中央部分、３’末端側のいずれにあってもよい。置換あるいは挿入変異の場合、導入される変異に相当する塩基配列である変異導入部位は鋳型ＤＮＡと相補的な配列とならないが、変異導入部位以外のオーバーラップ領域が鋳型ＤＮＡに相補的であってもよく、オーバーラップ領域のすべてが変異導入部位であってもよい。欠失変異の場合、変異導入用プライマーが鋳型ＤＮＡの欠失させたい部分の外側の領域に相補的であればよい。すなわち、プライマーのオーバーラップ領域の変異導入部位より５’末端側に、鋳型ＤＮＡにアニールするための相補的な配列を有する。また、オーバーラップ領域の鎖長は、９〜３０塩基、好ましくは、１２〜２１塩基、特に好ましくは１５塩基である。
さらに、変異導入用プライマーは、オーバーラップ領域に接してその３’末端側に、鋳型ＤＮＡに相補的な配列を有する。この鋳型ＤＮＡに相補的な配列は、前記変異導入部位から３’末端側に１２〜３０塩基、特に好ましくは、１５〜２１塩基の領域があればよい。
本発明の方法において、上記変異導入用プライマーの設計は、置換、欠失、挿入変異のいずれの場合も同様にして行えばよく、普遍的にプライマーの設計が行える利点を有する。本発明の方法において、特に限定はされないが例えば、置換および挿入の場合は１〜３０塩基の範囲、特に好ましくは、１〜２１塩基の範囲で変異導入を効果的に行うことができる。特に欠失の場合は、欠失させる鎖長に制限はない。
【００１５】
本発明の変異導入用プライマーは、オリゴヌクレオチドプライマーである。当該オリゴヌクレオチドはＤＮＡのみならず、その類似体も好適に使用できる。このような類似体は、塩基類似体及び／又はバックボーン類似体、例えばホスホロチオエート、ホスフォン酸塩などであってよい。例えばホスホロアミダイト法によるオリゴヌクレオチドの合成のための技術は、当業者にとっては周知のものである。例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（オリゴヌクレオチドと類似体：実践的アプローチ）、ｅｄ．  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９２）の中で記述されている。本発明の方法の中で使用されるオリゴヌクレオチドは、オリゴデオキシリボヌクレオチドが好適である。
【００１６】
本発明の方法に用いることができるＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ法に用いることができる酵素である。また、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのような５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有さないＤＮＡポリメラーゼが本発明に好ましい。さらに、鎖置換活性を有さないＤＮＡポリメラーゼが本発明に好ましい。また、ＰＣＲ法を利用した変異導入方法においては、使用するＤＮＡポリメラーゼのＦｉｄｅｌｉｔｙ（信頼性）に起因して変異導入断片に目的以外の変異が入る可能性があるため、校正活性に優れるＤＮＡポリメラーゼ、即ちα様ＤＮＡポリメラーゼが本発明に特に好適である。
本発明の方法に用いるα様ＤＮＡポリメラーゼには、特に限定はないが例えば、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン）、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）等が好適に使用できる。
本発明で使用するＤＮＡポリメラーゼは、上記特性を有する限り、野生型でもよく、変異体あるいは融合体であっても良い。特に限定はないが例えば、Ｐｆｘ５０  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（インビトロジェン社）、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（フィンザイム社）、ｉＰｒｏｏｆ  ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン）等が本発明に好適に使用できる。
【００１７】
また、本発明の方法においては、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性及び鎖置換活性を促進しない限りにおいて、ＰＣＲの際に補助因子を共存させてもよい。特に限定はされないが、ＤＮＡポリメラーゼ活性促進作用を有するタンパク質、あるいは酸性高分子物質、ＤＮＡに適度に親和性を有する物質等が本発明に使用できる。
前記の補助因子を含有するＤＮＡポリメラーゼとして、特に限定はないが例えば、ＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＴｕｒｂｏ  Ｃｘ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＵｌｔｒａＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン）、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（タカラバイオ）等が好適に使用できる。
【００１８】
本発明の方法について、想定されうる一態様を図１および以下に示す。しかしながら、本発明の方法は、下記態様に限定されるものではない。
【００１９】
本発明の方法において、第１と第２の変異導入用プライマーを用いる。第１と第２の変異導入用プライマーの組み合わせを「変異導入用プライマー対」と呼ぶ。当該プライマーは、お互いに相補的な配列をそれぞれの５’末端側に有している。例えば、第１と第２の変異導入用プライマーの当該相補的な部分が環状の鋳型ＤＮＡに十分にアニールしている場合、第１と第２の変異導入用プライマーからの伸長鎖は、環状鋳型ＤＮＡに沿って一回りして当該プライマーの自身の５’末端に到達して伸長停止する。その結果、第１の変異導入用プライマーから生じる伸長鎖は、３’末端に第２の変異導入用プライマーの鋳型ＤＮＡに相補的な配列を、また５’末端側には第２の変異導入用プライマーのオーバーラップ領域に相補的な配列を有している。
【００２０】
従って、第１の変異導入用プライマーからの伸長鎖の５’末端側と３’末端側にまたがって、第２の変異導入用プライマーがアニールし、前記伸長鎖を鋳型として伸長することにより部分的環状二本鎖ＤＮＡが生成する。また、第１と第２の変異導入用プライマーそれぞれの伸長鎖同士がアニールした分子は、両端に５’突出のある二本鎖ＤＮＡとなる。突出した配列はオーバーラップ領域となるので、互いに相補的であることから、前記二本鎖ＤＮＡの一部は分子内で突出部同士がアニールして環状構造になる。前記二本鎖ＤＮＡの一部は、突出部分の相補鎖が合成されて突出部のない二本鎖ＤＮＡとなるが、そのうちの第１変異導入用プライマーからの伸長鎖は、その５’末端側と３’末端側に第２変異導入用プライマーの５’末端側の塩基配列に相補的な同一配列（オーバーラップ領域の配列）を有している。当該伸長鎖の３’末端側に第２変異導入用プライマーがアニールして開始されるＤＮＡの伸長は、鋳型となっている伸長鎖の５’末端側にアニールしている別の第２変異導入用プライマーの５’末端でストップする。同様の反応が第２変異導入用プライマーからの伸長鎖と第１変異導入用プライマーとの間で起こる結果、上記同様に分子内で二本鎖環状構造を形成するのに好適な突出末端を有する伸長産物が形成される。本発明では、オーバーラップ領域をプライマーのアニールに十分な鎖長に設定する結果、ＰＣＲ中に以上のような反応が起こると考えられる。
【００２１】
一方、第１と第２の変異導入用プライマーのそれぞれのオーバーラップ領域は、鋳型ＤＮＡに必ずしもアニールする必要はない。前記のような形態のプライマーを使用する場合、それぞれのプライマーの３’末端側の鋳型ＤＮＡにアニールする配列を、当該配列単独でプライマーとして機能しうる鎖長に設定してＰＣＲを実施することにより、第１変異導入用プライマーからの伸長鎖は、その５’末端側と３’末端側にまたがって第２の変異導入用プライマーがアニールしうるＤＮＡ、第２変異導入用プライマーからの伸長鎖は、その５’末端側と３’末端側にまたがって第２の変異導入用プライマーがアニールしうるＤＮＡ、となる。これらの分子からは、上記同様ＰＣＲの過程で二本鎖環状構造を形成するための伸長鎖が形成される。
【００２２】
本発明の方法においては、ＰＣＲ増幅産物が作製できれば、当該増幅断片により直接宿主を形質転換することにより目的の変異導入体を取得する事ができる。特に限定はされないが例えば、ＰＣＲの効率が低下しない範囲で、第１と第２の変異導入用プライマーのオーバーラップ領域を長くすることにより、当該プライマーのオーバーラップ領域は別のプライマーからの伸張鎖とアニーリングしやすくなる。また、当該プライマーのオーバーラップ領域以外の３’末端側の鋳型ＤＮＡに相補的な配列を短くすることにより、目的の変異導入体の形質転換体の取得率を向上させることができる。特に限定されないが、１塩基置換の目的の変異を導入する場合、第１と第２の変異導入用プライマーのそれぞれの５’末端側の相補的な塩基配列を、変異導入部位を中心に１５塩基とし、その変異導入部位の３’末端側より１８塩基の鋳型ＤＮＡに相補的な塩基を配したプライマー構造、すなわち、プライマーの５’末端から順に、プライマー対で相補的な７塩基、変異導入塩基、プライマー対で相補的な７塩基、鋳型ＤＮＡにのみ相補的な１１塩基となるプライマーが概ね好適に使用できる。
【００２３】
本発明の方法では、宿主の相同的組換えを利用した方法（特許文献１）とは、宿主の形質転換が可能な部分的環状構造をとることができる、５’突出となった二本鎖ＤＮＡを積極的に生成させる点において相違する。
【００２４】
本発明の方法において作成される部分的環状ＤＮＡは、少量の鋳型プラスミドＤＮＡからＰＣＲ法を用いて効率よく作製することができる。また、こうして得られる部分的環状ＤＮＡは自体は使用される変異導入プライマーに相補的な配列を一部欠いているため、ＰＣＲの各サイクルで鋳型として使用される頻度が低く、トータルの合成回数は実際のＰＣＲサイクル数より少ないという特徴を有する。これによりＤＮＡポリメラーゼによる合成エラーを減じることができる。
【００２５】
本発明の方法で得られた部分的環状ＤＮＡを含むＰＣＲ溶液は、宿主細胞の形質転換に直接使用することができる。宿主細胞の形質転換に先立ってＤＮＡの連結反応を行なう必要もない。連結反応不要としたことにより、従来の部位特異的変異導入方法に比べて本発明の方法を実施するのに必要とされる時間と費用を削減することができる。本発明の方法において用いる宿主（細胞）は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。相同組換え能欠損株（例えば、ｒｅｃＡ）も宿主として効率よく形質転換体を取得することができる。
【００２６】
好ましくは、宿主細胞は原核細胞であり、より好ましくはＥ．ｃｏｌｉのコンピテントセルである。コンピテント単細胞微生物を調製し、形質転換するための技術は、当業者にとっては周知のものであり、例えば、２００１年、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー  クローニング：ア  ラボラトリー  マニュアル第３版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄ．）、Ｈａｒｗｏｏｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．３１，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（１９９４）などに記載されている。また、本発明の方法では調製後に凍結保存されたコンピテントセル、例えば市販のコンピテントセルを形質転換することもできる。
【００２７】
本発明の方法を用いることにより、鋳型環状ＤＮＡとしてプラスミドｐＵＣ１１８（３．２ｋｂ）を使用して、大腸菌を形質転換可能な目的の変異を含む分子を得るのに要する時間は、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡポリメラーゼを利用した場合、僅か１時間である。また、目的部位以外への変異の導入は僅か９００００塩基に１個の割合である。
【００２８】
本発明の方法は、高い効率でＤＮＡに変異を導入することができる。本発明の方法により目的の変異を有する細胞が得られる効率、すなわち変異導入効率は、全形質転換細胞に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上である。
【００２９】
（２）本発明の変異導入方法のためのキット
本発明のもう１つの形態は、本発明の部位特異的変異導入方法を実施するためのキットである。本発明のキットは、当該方法を実施する上で使用するための単数又は複数の酵素又はその他の試薬を含む。本発明のキットには、当該方法を実施するときに精度と正確さの両方を確保するよう、予め測定された量の試薬が含まれていてもよい。また、本発明のキットには、本発明の方法を実施方法が記載された指示書が含まれていてよい。本発明のキットは、最低限、以下のものを含む：α様ＤＮＡポリメラーゼ、対照鋳型核酸、対照用変異導入プライマー対。
【００３０】
本発明のキットには、個々のヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰの等モル混合物を含む）、ヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）混合物、第１及び第２の変異導入用プライマー、凍結コンピテントセル、ＰＣＲ緩衝液などを含んでいてもよい。
【００３１】
本発明のキットに含まれる対照鋳型核酸ならびに対照用変異導入プライマー対は、それぞれ、本発明の方法により容易に検出可能な部位特異的変異導入を提供するように選択される、環状二本鎖ＤＮＡ分子及び変異導入用プライマー対のことを指す。例えば、対照鋳型核酸を変異が導入された結果、その産物の活性が失われた遺伝子を含むものとした場合、対照用変異導入プライマーは、前記変異を復帰するような変異を導入するべく設計され得る。対照において、本発明のキットが所望の機能を果たすことは、変異が復帰した遺伝子から生成する遺伝子産物の活性発現により、確認することができる。
【実施例】
【００３２】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
また、本明細書に記載の操作のうち、基本的な操作については、２００１年、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー  クローニング：ア  ラボラトリー  マニュアル第３版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄ．）に記載の方法によった。
【００３３】
実施例１
本発明の方法を用いた、プラスミドＤＮＡｐＵＣ１１８（全長：３．２ｋｂｐ）への部位特異的な変異誘導効率について検討した。本実施例では、プラスミドＤＮＡｐＵＣ１１８と大腸菌ＪＭ１０９のＬａｃＺ表現系を利用し、このｐＵＣ１１８を鋳型に表現型が変化する変異導入をＰＣＲにて行い、その産物で直接大腸菌を形質転換して、選択培地上で培養し生じたコロニーの表現型より変異導入効率を評価することにした。
【００３４】
（１）変異導入用プライマーの作製
ｐＵＣ１１８の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｅ１４３０４）をもとに部分特異的変異を含むｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｆプライマー（配列番号１）とｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｒプライマー（配列番号２）、ｐＵＣ−ｄｅｌ３Ｆプライマー（配列番号３）とｐＵＣ−ｄｅｌ３Ｒプライマー（配列番号４）およびｐＵＣ−ｉｎｓ６Ｆプライマー（配列番号５）とｐＵＣ−ｉｎｓ６Ｒプライマー（配列番号６）の３種類のプライマー対を合成した。
【００３５】
置換変異導入用プライマーのｐＵＣ−ｓｕｂ３ＦプライマーとｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｒプライマーは、いずれもその５’末端より１５塩基が当該プライマー間で相補的であり、双方のプライマーの５’末端から７〜９番目の塩基が鋳型ＤＮＡと相補的でない。また、ｐＵＣ−ｓｕｂ３ＦプライマーおよびｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｒプライマーは全長２７塩基中２４塩基が鋳型ＤＮＡに相補的である。
【００３６】
欠失変異導入用プライマーのｐＵＣ−ｄｅｌ３ＦプライマーとｐＵＣ−ｄｅｌ３Ｒプライマーは、いずれもその５’末端より１５塩基が当該プライマー間で相補的であり、ｐＵＣ−ｄｅｌ３Ｆプライマーは、その５’末端から７番目と８番目の塩基の間で鋳型ＤＮＡに相補的な３塩基が欠失している。さらにｐＵＣ−ｄｅｌ３Ｒプライマーは、その５’末端から８番目と９番目の塩基の間で鋳型ＤＮＡに相補的な３塩基が欠失している。つまり全長２５塩基のｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｆプライマーと全長２６塩基のｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｒプライマーは３塩基対欠失した鋳型ＤＮＡに相補的である。
【００３７】
挿入変異導入用プライマーのｐＵＣ−ｉｎｓ６ＦプライマーとｐＵＣ−ｉｎｓ６Ｒプライマーは、いずれもその５’末端より１５塩基が当該プライマー間で相補的であり、ｐＵＣ−ｉｎｓ６Ｆプライマーの５’末端から４番目と５番目の塩基の間に鋳型ＤＮＡにない６塩基が挿入されている。一方、ｐＵＣ−ｉｎｓ６Ｒプライマーの５’末端から５番目と６番目の塩基の間に鋳型ＤＮＡにない６塩基が挿入されている。ｐＵＣ−ｉｎｓ６Ｆプライマーは全長２８塩基中２２塩基が鋳型ＤＮＡに相補的であり、ｐＵＣ−ｉｎｓ６Ｒプライマーは全長２９塩基中２３塩基が鋳型ＤＮＡに相補的である。
【００３８】
（２）変異導入およびその効率
変異導入効率は、以下のようにして測定した。すなわちｐＵＣ１１８ＤＮＡ  １０ｐｇを鋳型に、上記（１）で作製した各１０ｐｍｏｌの変異導入用プライマーとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（２×）（タカラバイオ社製）２５μｌを用いて反応容量５０μｌのＰＣＲを行なった。反応条件は９８℃  １０秒、５５℃  １５秒、７２℃  ２０秒を１サイクルとする３０サイクル反応で行なった。反応終了後、増幅産物の２μｌをそのままＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９コンピテントセル（タカラバイオ社製）１００μｌに添加し、０℃  ３０分、４２℃  ４５秒の処理後、ＳＯＣ培地１ｍｌを加えて３７℃で１時間振とう培養した。そのうち１００μｌを選択プレート（ＬＢ＋Ａｍｐ、ＩＰＴＧ，Ｘ−ｇａｌ）上で培養し、白コロニー（変異体）と青コロニー（バックグラウンド）の数をカウントした。
その結果を表１に示す。
【００３９】
【表１】
0005390076.tif 000002
【００４０】
表１に示したように本発明の変異導入方法で、ｐＵＣ１１８ＤＮＡ  １０ｐｇを鋳型にした場合、３種類の、置換、欠失あるいは挿入変異導入体がいずれも９９％以上の驚くべき高い効率で多数取得できた。
【００４１】
（３）本発明の変異導入方法の正確性
上記変異導入体（挿入）白コロニーより１１７個を任意に選択し培養後、プラスミドＤＮＡを取得しそれぞれの全塩基配列を決定し解析した。その結果、１１７クローンすべてにおいて目的の変異導入が確認された。さらに驚くべきことに、目的部位以外の変異は全塩基数３７０，６５６塩基中わずか４塩基のみであった。市販されているＫＯＤ−ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキットでは、８０％を越える変異導入効率で、４８，０００塩基に１塩基であることと比較しても、本発明の方法の変異導入効率は驚くほど高いうえに、変異導入部位以外の正確性も非常に高いものであることを確認した。
【００４２】
（４）８．５ｋｂの欠失変異体の作製
本発明の方法を用いて長鎖のＤＮＡ断片の変異導入ができるかどうかを確認した。まず、ｐＵＣ１１８ＤＮＡのＨｉｎｃ  ＩＩサイトに８．５ｋｂのＤＮＡ断片（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＴ  ００９２３７記載の塩基配列の核酸番号４０３４２２４〜４０４２７３１の範囲のＤＮＡ断片）を挿入したプラスミドＤＮＡを作製し、このプラスミドＤＮＡより８．５ｋｂを欠失させるための変異導入用プライマー、ｐＵＣ−ｄｅｌ８ＫＦ（配列番号７）とｐＵＣ−ｄｅｌ８ＫＲ（配列番号８）を合成した。ｐＵＣ−ｄｅｌ８ＫＦプライマーとｐＵＣ−ｄｅｌ８ＫＲプライマーは、いずれもその５’末端より１５塩基が当該プライマー間で相補的であり、ｐＵＣ−ｄｅｌ３Ｆプライマーの５’末端から７番目と８番目の塩基の間で鋳型ＤＮＡに相補的な８．５ｋｂが欠失している。一方、ｐＵＣ−ｄｅｌ８Ｒプライマーは、その５’末端から８番目と９番目の塩基の間で鋳型ＤＮＡに相補的な８．５ｋｂが欠失している。つまり、全長２５塩基のｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｆプライマーと全長２６塩基のｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｒプライマーは、８５０８塩基対欠失した鋳型ＤＮＡに相補的である。前記構成において、欠失変異が導入された形質転換体は、プラスミドＤＮＡがｐＵＣ１１８に復帰し青コロニーを形成し、欠失変異が導入されない形質転換体は白コロニーを形成する。
【００４３】
次に、上記プラスミドＤＮＡ１００ｐｇを鋳型として上記プライマー各１０ｐｍｏｌとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（２×）２５μｌを用いて反応容量５０μｌのＰＣＲを行なった。反応条件は上記（２）記載の条件と同じで行った。反応終了後、増幅産物２μｌをそのままＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９コンピテントセル１００μｌに添加し、０℃  ３０分、４２℃  ４５秒の処理後、ＳＯＣ培地１ｍｌを加えて３７℃で１時間振とう培養した。そのうち１００μｌを選択プレート（ＬＢ＋Ａｍｐ、ＩＰＴＧ、Ｘ−ｇａｌ）上で培養し、青コロニーと白コロニー（バックグラウンド）の数をカウントした。さらに、得られた青コロニー１０個よりそれぞれプラスミドを調製し、プラスミドＤＮＡサイズおよび制限酵素のＨｉｎｃ  ＩＩサイトが回復していることを確認することにした。
【００４４】
その結果、プラスミドＤＮＡ１００ｐｇを鋳型とした場合、変異導入体（青コロニー）１５８個に対しバックグラウンド（白コロニー）は３個で、９８％の確率で変異体を取得できた。
また、変異導入体（青コロニー）１０個より取得したプラスミドＤＮＡについて電気泳動によりそのサイズを確認した。その結果を図２に示す。図２において、レーン１は変異導入前、レーン２〜１１は変異導入後のＤＮＡを示す。レーンＭはλ／ＨｉｎｄＩＩＩマーカーを示す。
【００４５】
図２に示したように、すべてのプラスミドＤＮＡが８ｋｂのＤＮＡ断片が欠失したサイズのプラスミドＤＮＡであることを確認した。さらにＨｉｎｃ  ＩＩで１箇所切断され３．２ｂｐのＤＮＡ断片が得られたことからも、正しく変異導入（欠失）できていることが確認できた。
すなわち、Ｉｎｖｅｒｓｅ  非ＰＣＲ法とエンドヌクレアーゼを組み合わせた変異導入方法（特許文献３）では変異導入用プライマーの５’末端側および３’末端側の配列双方が効率よく鋳型にアニールしないために不可能であった長鎖ＤＮＡ断片の欠失も、本発明の変異導入方法において、簡便、高効率に取得できることが確認できた。
【００４６】
実施例２  プライマーの構造と変異体取得効率の検討
（１）変異導入用プライマーの合成
プライマー構造が変異体取得効率に及ぼす影響を明らかにするために以下の４対のプライマーを合成した。
【００４７】
ｐＵＣ−ｉｎｓＸｈｏＩＦ＋３（配列番号９）プライマーとｐＵＣ−ｉｎｓＸｈｏＩＲ＋３（配列番号１０）プライマーは、その５’末端より１５塩基が当該プライマー間で相補的であり、ｐＵＣ−ｉｎｓＸｈｏＩＦ＋３プライマーは、その５’末端から４番目と５番目の塩基の間に鋳型ＤＮＡにない６塩基が挿入されている。一方、ｐＵＣ−ｉｎｓＸｈｏＩＲ＋３プライマーは、その５’末端から５番目と６番目の塩基の間に鋳型ＤＮＡにない６塩基が挿入されている。それぞれのプライマーは全長２８塩基中２２塩基が鋳型ＤＮＡに相補的である。さらに、ｐＵＣ−ｉｎｓＸｈｏＦ＋３プライマーでは挿入変異部位から３’末端側１８塩基が鋳型ＤＮＡに相補的であり、ｐＵＣ−ｉｎｓＸｈｏＩＲ＋３プライマーでは挿入変異部位から３’末端側１７塩基が鋳型ＤＮＡに相補的である。
【００４８】
ｐＵＣ−ｉｎｓＸｈｏＩＣ６，７Ｆ（配列番号１１）プライマーとｐＵＣ−ｉｎｓＸｈｏＩＣ６Ｒ（配列番号１２）プライマーは、その５’末端より６塩基が当該プライマー間で相補的であり、いずれのプライマーもその５’末端には鋳型ＤＮＡにない６塩基が挿入されている。それぞれのプライマーは全長２５塩基中１９塩基が鋳型ＤＮＡに相補的である。さらに、ｐＵＣ−ｉｎｓＸｈｏＩＣ６，７ＦおよびｐＵＣ−ｉｎｓＸｈｏＩＣ６Ｒプライマーにおいて、挿入変異部位から３’末端側１９塩基が鋳型ＤＮＡに相補的である。
【００４９】
ｐＵＣ−ｉｎｓＸｈｏＩＣ６，７ＦプライマーとｐＵＣ−ｉｎｓＸｈｏＩＣ７，８Ｒ（配列番号１３）プライマーは、その５’末端より７塩基が当該プライマー間で相補的である。また、ｐＵＣ−ｉｎｓＸｈｏＩＣ６，７Ｆプライマーでは、その５’末端に鋳型ＤＮＡにない６塩基が挿入されている。一方、ｐＵＣ−ｉｎｓＸｈｏＩＣ７，８Ｒプライマーでは、その５’末端から１番目と２番目の塩基の間に鋳型ＤＮＡにない６塩基が挿入されている。ｐＵＣ−ｉｎｓＸｈｏＩＣ６，７Ｆプライマーは、全長２５塩基中１９塩基が鋳型ＤＮＡに相補的であり、ｐＵＣ−ｉｎｓＸｈｏＩＣ７，８Ｒプライマーは、全長２５塩基中１８塩基が鋳型ＤＮＡに相補的である。さらに、ｐＵＣ−ｉｎｓＸｈｏＩＣ６，７Ｆプライマーでは挿入変異部位から３’末端側１９塩基が鋳型ＤＮＡに相補的であり、ｐＵＣ−ｉｎｓＸｈｏＩＣ７，８Ｒプライマーでは挿入変異部位から３’末端側１８塩基が鋳型ＤＮＡに相補的である。
【００５０】
ｐＵＣ−ｉｎｓＸｈｏＩＣ８Ｆ（配列番号１４）プライマーとｐＵＣ−ｉｎｓＸｈｏＩＣ７，８Ｒプライマーは、その５’末端より８塩基が当該プライマー間で相補的であり、いずれのプライマーもその５’末端から１番目と２番目の塩基の間に鋳型ＤＮＡにない６塩基が挿入されている。また、ｐＵＣ−ｉｎｓＸｈｏＩＣ８Ｆプライマーは全長２５塩基中１７塩基が鋳型ＤＮＡに相補的であり、ｐＵＣ−ｉｎｓＸｈｏＩＣ７，８Ｒプライマーは全長２５塩基中１８塩基が鋳型ＤＮＡに相補的である。さらに、ｐＵＣ−ｉｎｓＸｈｏＩＣ８Ｆプライマーでは挿入変異部位から３’末端側１７塩基が鋳型ＤＮＡに相補的であり、ｐＵＣ−ｉｎｓＸｈｏＩＣ７，８Ｒプライマーでは挿入変異部位から３’末端側１８塩基が鋳型ＤＮＡに相補的である。
【００５１】
（２）変異導入およびその効率
ｐＵＣ１１８ＤＮＡ  １０ｐｇを鋳型に、前記の各１０ｐｍｏｌの変異導入用プライマー対とＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（２×）２５μｌを用いて反応容量５０μｌのＰＣＲを行なった。反応条件は、９８℃  １０秒、５５℃  １５秒、７２℃  ２０秒を１サイクルとする３５サイクル反応で行なった。反応終了後、増幅産物２μｌをそのままＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９コンピテントセル１００μｌに添加し、０℃  ３０分、４２℃  ４５秒の処理後、ＳＯＣ培地１ｍｌを加えて３７℃で１時間振とう培養した。そのうち１００μｌを選択プレート（ＬＢ＋Ａｍｐ、ＩＰＴＧ、Ｘ−ｇａｌ）上で培養し、白コロニー（変異体）数をカウントした。
【００５２】
その結果、プライマーの３’末端側の鋳型ＤＮＡに相補的な配列が１７−１９塩基で、５’末端側の当該プライマー間で相補的な配列を６、７、８、１５塩基と伸ばした場合、変異体取得数はそれぞれ１、２、２０、１３５個と増加した。
【００５３】
実施例３  ＰＣＲに使用する酵素と変異体取得率との関係
（１）変異導入およびその効率
ｐＵＣ１１８  １０ｐｇを鋳型にそれぞれ１０ｐｍｏｌの前記変異導入用プライマーｐＵＣ−ｉｎｓ６Ｆ（配列番号５）とｐＵＣ−ｉｎｓ６Ｒプライマー（配列番号６）を用いて５０μｌの反応系でＰＣＲを行った。ＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、ｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を使用し、反応組成は各製品添付の取り扱い説明書に従った。ＰＣＲ条件は、ＰＣＲ増幅産物量および増幅の特異性をそろえるために、以下のように設定した。
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ；
９８℃  １０秒、５５℃  １５秒、７２℃  ４分を１サイクルとする３０サイクル反応
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ；
９８℃  １０秒、５５℃  ３０秒、７２℃  ４分を１サイクルとする３０サイクル反応
Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ；
９８℃  １０秒、６８℃  ４分を１サイクルとする３０サイクル反応
ｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ；
９８℃  １０秒、５５℃  ３０秒、７２℃  ４分を１サイクルとする４０サイクル反応
【００５４】
反応終了後、増幅産物２μｌをそのままＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９コンピテントセル１００μｌに添加し、０℃  ３０分、４２℃  ４５秒の処理後、ＳＯＣ培地１ｍｌを加えて３７℃で１時間振とう培養した。そのうち１００μｌを選択プレート（ＬＢ＋Ａｍｐ、ＩＰＴＧ、Ｘ−ｇａｌ）上で培養し、白コロニー（変異体）数をカウントした。
【００５５】
その結果、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼおよびｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した各ＰＣＲ増幅量は同等であったが、目的の変異体数はそれぞれ６０２、４７８、４７４および７５であった。このことから、ＰＣＲにα様（α−ｌｉｋｅ）ＤＮＡポリメラーゼを使用することにより、ＰｏｌＩ型のＤＮＡポリメラーゼであるｒＴａｑの６倍以上の変異体を取得することができた。
【００５６】
実施例４  プライマーの５’末端側領域の検討
プライマーの５’末端側領域の鋳型ＤＮＡへのアニーリングと形質転換効率について検討した。１００ｐｇのｐＵＣ１１８と１００ｐｇのｐＵＣ１１８ＤＮＡのＨｉｎｃ  ＩＩサイトに８．５ｋｂのＤＮＡ断片を挿入したプラスミドＤＮＡを鋳型に、前述のｐＵＣ−ｄｅｌ８ＫＦ（配列番号７）とｐＵＣ−ｄｅｌ８ＫＲプライマー（配列番号８）各１０ｐｍｏｌとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（２×）２５μｌを用いて反応容量５０μｌでＰＣＲを行なった。反応条件は、９８℃  １０秒、５５℃  １５秒、７２℃  ２０秒を１サイクルとする３０サイクル反応で行なった。反応終了後、増幅産物２μｌをそのままＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９コンピテントセル１００μｌに添加し、０℃  ３０分、４２℃  ４５秒の処理後、ＳＯＣ培地１ｍｌを加えて３７℃で１時間振とう培養した。そのうち１００μｌを選択プレート（ＬＢ＋Ａｍｐ、ＩＰＴＧ、Ｘ−ｇａｌ）上で培養し、青コロニー（変異体）数をカウントした。なお、本実施例においては、ｐＵＣ１１８ＤＮＡのＨｉｎｃ  ＩＩサイトに８．５ｋｂのＤＮＡ断片を挿入したプラスミドＤＮＡは、当該８．５ｋｂのＤＮＡ断片の欠失変異が起こるため、選択プレート上では白コロニーから青コロニーになる。
【００５７】
ｐＵＣ１１８を鋳型にした場合とｐＵＣ１１８ＤＮＡのＨｉｎｃ  ＩＩサイトに８ｋｂのＤＮＡ断片を挿入したプラスミドＤＮＡを鋳型にした場合のＰＣＲ増幅産物は同一でありＰＣＲ増幅産物量は同等であった。にもかかわらず、それぞれから得られる形質転換体の数は１５３個と６５個と差が生じた。このことは本発明の方法が相同的組換えによるものではないことを示している。
鋳型となる核酸がｐＵＣ１１８の場合には、プライマーの５’末端側の１５塩基が鋳型ＤＮＡに連続して相補的であるのでそれぞれのプライマーからの伸長鎖は鋳型を一周して自己の５’末端でストップし、効率よく部分的環状二本鎖ＤＮＡを産生するためのプライマー伸長産物ができるのに対し、鋳型ＤＮＡがｐＵＣ１１８  ＤＮＡのＨｉｎｃ  ＩＩサイトに８．５ｋｂのＤＮＡ断片を挿入したプラスミドＤＮＡの場合、プライマーの５’末端側の１５塩基に相補的な配列が８．５ｋｂのインサートで７塩基と８塩基に分断されているために、プライマーの５’末端側の８塩基が鋳型にアニールしにくく、自己の５’末端でストップしたプライマー伸長産物ができにくい。このことにより部分的環状二本鎖ＤＮＡができる効率に差が生じ、形質転換体取得効率に差が生じたと考えられる。以上のことから、本発明の方法は、ＰＣＲ過程で生じる部分的環状二本鎖構造が生成することにより、従来の相同的組み換え型の変異導入方法よりも変導導入効率を大幅に改善することができることを確認した。
【００５８】
実施例５  プライマーの構造と変異体取得効率の検討
（１）変異導入用プライマーの合成
プライマー構造の変異体取得効率に及ぼす影響を明らかにするために以下の３対のプライマーを合成した。
プライマー対１：ｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｆ−２１−９（配列番号１５）プライマーとｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｒ−２１−９（配列番号１６）プライマーは、いずれもその５’末端より２１塩基が当該プライマー間で相補的であり、双方のプライマーの５’末端から１０〜１２番目の塩基が鋳型ＤＮＡと相補的でない。また、ｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｆ−２１−９プライマーおよびｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｒ−２１−９プライマーは全長３０塩基中２７塩基が鋳型ＤＮＡに相補的である。
【００５９】
プライマー対２：ｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｆ（配列番号１）プライマーとｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｒ（配列番号２）プライマーは、いずれもその５’末端より１５塩基が当該プライマー間で相補的であり、双方のプライマーの５’末端から７〜９番目の塩基が鋳型ＤＮＡと相補的でない。また、ｐＵＣ−ｓｕｂ３ＦプライマーおよびｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｒプライマーは全長２７塩基中２４塩基が鋳型ＤＮＡに相補的である。
【００６０】
プライマー対３：ｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｆ−９−１２（配列番号１７）プライマーとｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｒ−９−１２（配列番号１８）プライマーは、いずれもその５’末端より９塩基が当該プライマー間で相補的であり、双方のプライマーの５’末端から４〜６番目の塩基が鋳型ＤＮＡと相補的でない。また、ｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｆ−９−１２プライマーおよびｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｒ−９−１２プライマーは全長２１塩基中１８塩基が鋳型ＤＮＡに相補的である。
【００６１】
プライマー対１、プライマー対２およびプライマー対３の３塩基の変異配列とそれに続く３’末端側の鋳型ＤＮＡに相補的な１８塩基は同一であり、それぞれのプライマー対の５’末端側の相補的な配列の長さが２１塩基、１５塩基、９塩基と異なる。
【００６２】
（２）変異導入およびその効率
ｐＵＣ１１８ＤＮＡ  １００ｐｇを鋳型に、前記の各１０ｐｍｏｌの変異導入用プライマー対とＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（２×）２５μｌを用いて、反応容量５０μｌのＰＣＲを行なった。反応条件は、９８℃  １０秒、５５℃  １５秒、７２℃  １５秒を１サイクルとする３０サイクル反応で行なった。反応終了後、増幅産物２μｌをそのままＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９コンピテントセル１００μｌに添加し、０℃  ３０分、４２℃  ４５秒の処理後、ＳＯＣ培地１ｍｌを加えて３７℃で１時間振とう培養した。そのうち１００μｌを選択プレート（ＬＢ＋Ａｍｐ、ＩＰＴＧ、Ｘ−ｇａｌ）上で培養し、白コロニー（変異体）の数をカウントした。
【００６３】
その結果、プライマー対１、プライマー対２およびプライマー対３のＰＣＲにおける増幅効率は同等で、白コロニー（変異体）数はそれぞれ２８２個、２９２個および７個であった。このことから、いずれの場合も部位特異的に変異導入が可能であることが確認できた。実施例１とのコロニー数の違いはコンピテントセルのロットによる形質転換効率の違いによる。
【００６４】
実施例６  プライマーの構造と変異体取得効率の検討
（１）変異導入用プライマーの合成
プライマー構造の変異体取得効率に及ぼす影響を明らかにするために以下の４対のプライマーを合成した。
プライマー対１：ｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｆ−２１−１５（配列番号１９）プライマーとｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｒ−２１−１５（配列番号２０）プライマーは、いずれもその５’末端より２１塩基が当該プライマー間で相補的であり、双方のプライマーの５’末端から１０〜１２番目の塩基が鋳型ＤＮＡと相補的でない。また、ｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｆ−２１−１５プライマーおよびｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｒ−２１−１５プライマーは全長３６塩基中３３塩基が鋳型ＤＮＡに相補的である。
【００６５】
プライマー対２：ｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｆ−２１−１２（配列番号２１）プライマーとｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｒ−２１−１２（配列番号２２）プライマーは、いずれもその５’末端より２１塩基が当該プライマー間で相補的であり、双方のプライマーの５’末端から１０〜１２番目の塩基が鋳型ＤＮＡと相補的でない。また、ｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｆ−２１−１２プライマーおよびｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｒ−２１−１２プライマーは全長３３塩基中３０塩基が鋳型ＤＮＡに相補的である。
【００６６】
プライマー対３：ｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｆ−２１−９プライマーとｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｒ−２１−９プライマーは、いずれもその５’末端より２１塩基が当該プライマー間で相補的であり、双方のプライマーの５’末端から１０〜１２番目の塩基が鋳型ＤＮＡと相補的でない。また、ｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｆ−２１−９プライマーおよびｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｒ−２１−９プライマーは全長３０塩基中２７塩基が鋳型ＤＮＡに相補的である。
【００６７】
プライマー対４：ｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｆ−２１−６（配列番号２３）プライマーとｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｒ−２１−６（配列番号２４）プライマーは、いずれもその５’末端より２１塩基が当該プライマー間で相補的であり、双方のプライマーの５’末端から１０〜１２番目の塩基が鋳型ＤＮＡと相補的でない。また、ｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｆ−２１−６プライマーおよびｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｒ−２１−６プライマーは全長２７塩基中２４塩基が鋳型ＤＮＡに相補的である。
【００６８】
プライマー対１、プライマー対２、プライマー対３およびプライマー対４のそれぞれのプライマー対の５’末端側の相補的な配列２１塩基は共通で、３塩基の変異配列に続く３’末端側の鋳型ＤＮＡに相補的な配列の長さが２４塩基、２１塩基、１８塩基、１５塩基と異なる。
【００６９】
（２）変異導入およびその効率
ｐＵＣ１１８ＤＮＡ  １００ｐｇを鋳型に、前記の各１０ｐｍｏｌの変異導入用プライマー対とＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（２×）２５μｌを用いて、反応容量５０μｌのＰＣＲを行なった。反応条件は、９８℃  １０秒、５５℃  １５秒、７２℃  ２０秒を１サイクルとする３０サイクル反応で行なった。反応終了後、増幅産物２μｌをそのままＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９コンピテントセル１００μｌに添加し、０℃  ３０分、４２℃  ４５秒の処理後、ＳＯＣ培地１ｍｌを加えて３７℃で１時間振とう培養した。そのうち１００μｌを選択プレート（ＬＢ＋Ａｍｐ、ＩＰＴＧ、Ｘ−ｇａｌ）上で培養し、白コロニー（変異体）の数をカウントした。
【００７０】
その結果、プライマー対１、プライマー対２、プライマー対３およびプライマー対４のＰＣＲにおける増幅効率は同等で、白コロニー（変異体）数はそれぞれ１４０個、２１０個、２８２個および２０９個であった。このことから、いずれの場合も部位特異的に変異導入が可能であることが確認できた。
【００７１】
実施例７  プライマーの構造と変異体取得効率の検討
（１）変異導入用プライマーの合成
プライマー構造の変異体取得効率に及ぼす影響を明らかにするために、以下の５対のプライマーを合成した。
プライマー対１：ｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｆ−１５−１８（配列番号２５）プライマーとｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｒ−１５−１８（配列番号２６）プライマーは、いずれもその５’末端より１５塩基が当該プライマー間で相補的であり、双方のプライマーの５’末端から７〜９番目の塩基が鋳型ＤＮＡと相補的でない。また、ｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｆ−１５−１８プライマーおよびｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｒ−１５−１８プライマーは全長３３塩基中３０塩基が鋳型ＤＮＡに相補的である。
【００７２】
プライマー対２：ｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｆ−１５−１５（配列番号２７）プライマーとｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｒ−１５−１５（配列番号２８）プライマーは、いずれもその５’末端より１５塩基が当該プライマー間で相補的であり、双方のプライマーの５’末端から７〜９番目の塩基が鋳型ＤＮＡと相補的でない。また、ｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｆ−１５−１５プライマーおよびｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｒ−１５−１５プライマーは全長３０塩基中２７塩基が鋳型ＤＮＡに相補的である。
【００７３】
プライマー対３：ｐＵＣ−ｓｕｂ３ＦプライマーとｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｒは、いずれもその５’末端より１５塩基が当該プライマー間で相補的であり、双方のプライマーの５’末端から７〜９番目の塩基が鋳型ＤＮＡと相補的でない。また、ｐＵＣ−ｓｕｂ３ＦプライマーおよびｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｒプライマーは全長２７塩基中２４塩基が鋳型ＤＮＡに相補的である。
【００７４】
プライマー対４：ｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｆ−１５−９（配列番号２９）プライマーとｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｒ−１５−９（配列番号３０）プライマーは、いずれもその５’末端より１５塩基が当該プライマー間で相補的であり、双方のプライマーの５’末端から７〜９番目の塩基が鋳型ＤＮＡと相補的でない。また、ｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｆ−１５−９プライマーおよびｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｒ−１５−９プライマーは全長２４塩基中２１塩基が鋳型ＤＮＡに相補的である。
【００７５】
プライマー対５：ｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｆ−１５−６（配列番号３１）プライマーとｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｒ−１５−６（配列番号３２）プライマーは、いずれもその５’末端より１５塩基が当該プライマー間で相補的であり、双方のプライマーの５’末端から７〜９番目の塩基が鋳型ＤＮＡと相補的でない。また、ｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｆ−１５−６プライマーおよびｐＵＣ−ｓｕｂ３Ｒ−１５−６プライマーは全長２１塩基中１８塩基が鋳型ＤＮＡに相補的である。
【００７６】
プライマー対１、プライマー対２、プライマー対３、プライマー対４およびプライマー対５のそれぞれのプライマー対の５’末端側の相補的な配列１５塩基は共通で、３塩基の変異配列に続く３’末端側の鋳型ＤＮＡに相補的な配列の長さが２４塩基、２１塩基、１８塩基、１５塩基、１２塩基と異なる。
【００７７】
（２）変異導入およびその効率
ｐＵＣ１１８ＤＮＡ  １００ｐｇを鋳型に、前記の各１０ｐｍｏｌの変異導入用プライマー対とＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（２×）２５μｌを用いて、反応容量５０μｌのＰＣＲを行なった。反応条件は、９８℃  １０秒、５５℃  １５秒、７２℃  ２０秒を１サイクルとする３０サイクル反応で行なった。反応終了後、増幅産物２μｌをそのままＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９コンピテントセル１００μｌに添加し、０℃  ３０分、４２℃  ４５秒の処理後、ＳＯＣ培地１ｍｌを加えて３７℃で１時間振とう培養した。そのうち１００μｌを選択プレート（ＬＢ＋Ａｍｐ、ＩＰＴＧ、Ｘ−ｇａｌ）上で培養し、白コロニー（変異体）の数をカウントした。
【００７８】
その結果、プライマー対１、プライマー対２、プライマー対３、プライマー対４およびプライマー対５の白コロニー（変異体）数はそれぞれ１２６個、１３６個、２９２個、２３９個および１７３個であった。このことから、いずれの場合も部位特異的に変異導入が可能であることが確認できた。
実施例８  プライマーの構造と変異体取得効率の検討
（１）変異導入用プライマーの合成
プライマー構造の変異体取得効率に及ぼす影響を明らかにするために以下の７対のプライマーを合成した。
プライマー対１：ｐＵＣ−ＦＣ９−１８（配列番号３３）プライマーとｐＵＣ−ＲＣ９−１８（配列番号３４）プライマーは、いずれもその５’末端より９塩基が当該プライマー間で相補的であり、双方のプライマーの５’末端から１〜９番目の塩基が鋳型ＤＮＡと相補的でない。また、ｐＵＣ−ＦＣ９−１８プライマーおよびｐＵＣ−ＲＣ９−１８プライマーは全長２７塩基中１８塩基が鋳型ＤＮＡに相補的である。
【００７９】
プライマー対２：ｐＵＣ−ＦＣ１２−１８（配列番号３５）プライマーとｐＵＣ−ＲＣ１２−１８（配列番号３６）プライマーは、いずれもその５’末端より１２塩基が当該プライマー間で相補的であり、双方のプライマーの５’末端から１〜１２番目の塩基が鋳型ＤＮＡと相補的でない。また、ｐＵＣ−ＦＣ１２−１８プライマーおよびｐＵＣ−ＲＣ１２−１８プライマーは全長３０塩基中１８塩基が鋳型ＤＮＡに相補的である。
【００８０】
プライマー対３：ｐＵＣ−ＦＣ１５−１８（配列番号３７）プライマーとｐＵＣ−ＲＣ１５−１８（配列番号３８）プライマーは、いずれもその５’末端より１５塩基が当該プライマー間で相補的であり、双方のプライマーの５’末端から１〜１５番目の塩基が鋳型ＤＮＡと相補的でない。また、ｐＵＣ−ＦＣ１５−１８プライマーおよびｐＵＣ−ＲＣ１５−１８プライマーは全長３３塩基中１８塩基が鋳型ＤＮＡに相補的である。
【００８１】
プライマー対４：ｐＵＣ−ＦＣ１８−１８（配列番号３９）プライマーとｐＵＣ−ＲＣ１８−１８（配列番号４０）プライマーは、いずれもその５’末端より１８塩基が当該プライマー間で相補的であり、双方のプライマーの５’末端から１〜１８番目の塩基が鋳型ＤＮＡと相補的でない。また、ｐＵＣ−ＦＣ１８−１８プライマーおよびｐＵＣ−ＲＣ１８−１８プライマーは全長３６塩基中１８塩基が鋳型ＤＮＡに相補的である。
【００８２】
プライマー対５：ｐＵＣ−ＦＣ２１−１８（配列番号４１）プライマーとｐＵＣ−ＲＣ２１−１８（配列番号４２）プライマーは、いずれもその５’末端より２１塩基が当該プライマー間で相補的であり、双方のプライマーの５’末端から１〜２１番目の塩基が鋳型ＤＮＡと相補的でない。また、ｐＵＣ−ＦＣ２１−１８プライマーおよびｐＵＣ−ＲＣ２１−１８プライマーは全長３９塩基中１８塩基が鋳型ＤＮＡに相補的である。
【００８３】
プライマー対６：ｐＵＣ−ＦＣ２４−１８（配列番号４３）プライマーとｐＵＣ−ＲＣ２４−１８（配列番号４４）プライマーは、いずれもその５’末端より２４塩基が当該プライマー間で相補的であり、双方のプライマーの５’末端から１〜２４番目の塩基が鋳型ＤＮＡと相補的でない。また、ｐＵＣ−ＦＣ２４−１８プライマーおよびｐＵＣ−ＲＣ２４−１８プライマーは全長４２塩基中１８塩基が鋳型ＤＮＡに相補的である。
【００８４】
プライマー対７：ｐＵＣ−ＦＣ２７−１８（配列番号４５）プライマーとｐＵＣ−ＲＣ２７−１８（配列番号４６）プライマーは、いずれもその５’末端より２７塩基が当該プライマー間で相補的であり、双方のプライマーの５’末端から１〜２７番目の塩基が鋳型ＤＮＡと相補的でない。また、ｐＵＣ−ＦＣ２７−１８プライマーおよびｐＵＣ−ＲＣ２７−１８プライマーは全長４５塩基中１８塩基が鋳型ＤＮＡに相補的である。
【００８５】
プライマー対１、プライマー対２、プライマー対３、プライマー対４、プライマー対５、プライマー対６およびプライマー対７のそれぞれのプライマーの３’末端側の鋳型に相補的な配列１８塩基は共通で、それぞれのプライマー対の５’末端側の相補的な配列の長さが９塩基、１２塩基、１５塩基、１８塩基、２１塩基、２４塩基、２７塩基と異なる。
【００８６】
（２）変異導入およびその効率
ｐＵＣ１１８ＤＮＡのＨｉｎｃ  ＩＩサイトに４ｋｂのＤＮＡ断片（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＣ１０４３８９  記載の塩基配列の核酸番号２０３５９〜２４４０８の範囲のＤＮＡ断片）を挿入したプラスミドＤＮＡ  １００ｐｇを鋳型に、前記の各１０ｐｍｏｌの変異導入用プライマー対とＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（２×）２５μｌを用いて、反応容量５０μｌのＰＣＲを行なった。反応条件は、９８℃  １０秒、５５℃  １５秒、７２℃  ２０秒を１サイクルとする３０サイクル反応で行なった。反応終了後、増幅産物２μｌをそのままＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９コンピテントセル１００μｌに添加し、０℃  ３０分、４２℃  ４５秒の処理後、ＳＯＣ培地１ｍｌを加えて３７℃で１時間振とう培養した。そのうち１００μｌを選択プレート（ＬＢ＋Ａｍｐ、ＩＰＴＧ、Ｘ−ｇａｌ）上で培養し、白コロニー（変異体）の数をカウントした。
【００８７】
その結果、プライマー対１、プライマー対２、プライマー対３、プライマー対４、プライマー対５、プライマー対６およびプライマー対７の白コロニー（変異体）数はそれぞれ１６個、１８０個、２６４個、２３７個、１９４個、２４８個および２５２個であった。このことから、いずれの場合も部位特異的に変異導入が可能であることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明により、操作が簡便で、変異導入効率に優れ、さらに目的以外の変異が入らない変異導入方法が提供される。さらには、当該方法のためのキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】本発明の部位特異的変異導入方法を示す図である。
【図２】本発明の方法により得られたＤＮＡを示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００９０】
SEQ ID NO:1: Synthetic primer pUC-sub3F
SEQ ID NO:2: Synthetic primer pUC-sub3R
SEQ ID NO:3: Synthetic primer pUC-del3F
SEQ ID NO:4: Synthetic primer pUC-del3R
SEQ ID NO:5: Synthetic primer pUC-ins6F
SEQ ID NO:6: Synthetic primer pUC-ins6R
SEQ ID NO:7: Synthetic primer pUC-del8KF
SEQ ID NO:8: Synthetic primer pUC-del8KR
SEQ ID NO:9: Synthetic primer pUC-insXhoIF+3
SEQ ID NO:10: Synthetic primer pUC-insXhoIR+3
SEQ ID NO:11: Synthetic primer pUC-insXhoIC6,7F
SEQ ID NO:12: Synthetic primer pUC-insXhoIC6R
SEQ ID NO:13: Synthetic primer pUC-insXhoIC7,8R
SEQ ID NO:14: Synthetic primer pUC-insXhoIC8F
SEQ ID NO:15: Synthetic primer pUC-sub3F-21-9
SEQ ID NO:16: Synthetic primer pUC-sub3R-21-9
SEQ ID NO:17: Synthetic primer pUC-sub3F-9-12
SEQ ID NO:18: Synthetic primer pUC-sub3R-9-12
SEQ ID NO:19: Synthetic primer pUC-sub3F-21-15
SEQ ID NO:20: Synthetic primer pUC-sub3R-21-15
SEQ ID NO:21: Synthetic primer pUC-sub3F-21-12
SEQ ID NO:22: Synthetic primer pUC-sub3R-21-12
SEQ ID NO:23: Synthetic primer pUC-sub3F-21-6
SEQ ID NO:24: Synthetic primer pUC-sub3R-21-6
SEQ ID NO:25: Synthetic primer pUC-sub3F-15-18
SEQ ID NO:26: Synthetic primer pUC-sub3R-15-18
SEQ ID NO:27: Synthetic primer pUC-sub3F-15-15
SEQ ID NO:28: Synthetic primer pUC-sub3R-15-15
SEQ ID NO:29: Synthetic primer pUC-sub3F-15-9
SEQ ID NO:30: Synthetic primer pUC-sub3R-15-9
SEQ ID NO:31: Synthetic primer pUC-sub3F-15-6
SEQ ID NO:32: Synthetic primer pUC-sub3R-15-6
SEQ ID NO:33: Synthetic primer pUC-FC9-18
SEQ ID NO:34: Synthetic primer pUC-RC9-18
SEQ ID NO:35: Synthetic primer pUC-FC12-18
SEQ ID NO:36: Synthetic primer pUC-RC12-18
SEQ ID NO:37: Synthetic primer pUC-FC15-18
SEQ ID NO:38: Synthetic primer pUC-RC15-18
SEQ ID NO:39: Synthetic primer pUC-FC18-18
SEQ ID NO:40: Synthetic primer pUC-RC18-18
SEQ ID NO:41: Synthetic primer pUC-FC21-18
SEQ ID NO:42: Synthetic primer pUC-RC21-18
SEQ ID NO:43: Synthetic primer pUC-FC24-18
SEQ ID NO:44: Synthetic primer pUC-RC24-18
SEQ ID NO:45: Synthetic primer pUC-FC27-18
SEQ ID NO:46: Synthetic primer pUC-RC27-18
【図１】
0005390076.tif 000003
【図２】
0005390076.tif 000004
【配列表】
0005390076000001.app