(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の転写ユニットおよび第二の転写ユニットを含む発現カセットであり、
（ａ）前記第一の転写ユニットが、第一のアルファウイルスの糖タンパク質またはカプシドタンパク質の両方ではないいずれかをコードする第一のコード配列に操作可能に連結された第一のアルファウイルスのサブゲノムプロモータを含み、
（ｂ）前記第二の転写ユニットが、第二のアルファウイルスの非構造タンパク質１−４をコードする第二のコード配列に操作可能に連結された第二のアルファウイルスのサブゲノムプロモータを含む、
発現カセット。
【請求項２】
前記第一の転写ユニットが、前記第二の転写ユニットに対して５’である、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項３】
前記第一の転写ユニットが、前記第二の転写ユニットに対して３’である、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項４】
前記第一のコード配列が糖タンパク質をコードする、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項５】
前記第一のコード配列がカプシドタンパク質をコードする、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項６】
前記第一のコード配列がハイブリッドカプシドタンパク質をコードする、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項７】
前記第一のコード配列が、前記カプシドタンパク質の自己タンパク分解活性を減じる変異を含むカプシドタンパク質をコードする、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項８】
前記変異が、配列番号１により番号づけされる、Ｈｉｓ１４１Ａｌａ、Ａｓｐ１４７Ａｌａ、Ａｓｐ１６３Ａ、Ｓｅｒ２１５Ａｌａ、ΔＨｉｓ１４１、ΔＡｓｐ１４７、ΔＡｓｐ１６３、ΔＳｅｒ２１５、およびΔＴｒｐ２６４ならびにその組み合わせからなる群より選択される、請求項７に記載の発現カセット。
【請求項９】
前記第一のアルファウイルスおよび前記第二のアルファウイルスの少なくとも一つがシンドビスウイルスである、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項１０】
前記第一アルファウイルスおよび前記第二のアルファウイルスの少なくとも一つがベネズエラ馬脳炎（ＶＥＥ）ウイルスである、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項１１】
前記第一のサブゲノムプロモータおよび前記第二のサブゲノムプロモータの少なくとも一つが、ＶＥＥサブゲノムプロモータ、シンドビスウイルスサブゲノムプロモータ、東部馬脳炎（ＥＥＥ）サブゲノムプロモータ、またはセムリキ森林ウイルスサブゲノムプロモータである、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項１２】
選択可能マーカをさらに含む、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項１３】
内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含む、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項１４】
前記第二のコード配列が配列番号２を含む、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項１５】
前記第二の転写ユニットが、配列番号９により番号づけされるＮｓｐ４におけるＲ３３１またはＲ３３２の少なくとも一つに変異を含む、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項１６】
第一の発現カセットを含む宿主細胞であり、前記第一の発現カセットが、
（ａ）第一のアルファウイルスの糖タンパク質またはカプシドタンパク質の両方ではないいずれかをコードする第一のコード配列に操作可能に連結された第一のアルファウイルスのサブゲノムプロモータを含む第一の転写ユニットと；
（ｂ）第二のアルファウイルスの非構造タンパク質１−４をコードする第二のコード配列に操作可能に連結される第二のアルファウイルスのサブゲノムプロモータを含む第二の転写ユニット
を含む、宿主細胞。
【請求項１７】
第二の発現カセットをさらに含み、前記第二の発現カセットが、
（ｃ）第三のアルファウイルスの糖タンパク質をコードする第三のコード配列に操作可能に連結された第三のアルファウイルスのサブゲノムプロモータを含む第三の転写ユニットと；
（ｄ）第四のアルファウイルスの非構造タンパク質１−４をコードする第四のコード配列に操作可能に連結された第四のアルファウイルスのサブゲノムプロモータを含む第四の転写ユニットと
を含み、前記第一のコード配列がカプシドタンパク質をコードする、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
前記第一のアルファウイルスおよび前記第二のアルファウイルスの少なくとも一つがＶＥＥウイルス、シンドビスウイルス、またはセムリキ森林ウイルスである、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
パッケージングシグナルを含み、目的のタンパク質をコードするレプリコンをさらに含む、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
組換えアルファウイルス粒子を産生するためのパッケージング細胞を作製する方法であって、以下：
（ａ）第一の発現カセットを適切な宿主細胞にトランスフェクションする工程であり、
前記第一の発現カセットが、
（ｉ）第一のアルファウイルスの糖タンパク質をコードする第一のコード配列に操作可能に連結された第一のアルファウイルスのサブゲノムプロモータを含む第一の転写ユニットと；
（ｉｉ）第二のアルファウイルスの非構造タンパク質１−４をコードする第二のコード配列に操作可能に連結された第二のアルファウイルスのサブゲノムプロモータを含む第二の転写ユニットと；
を含む、
工程と、
（ｂ）第二の発現カセットを前記適切な宿主細胞にトランスフェクションする工程であり、前記第二の発現カセットが、
（ｉ）第三のアルファウイルスのカプシドタンパク質をコードする第三のコード配列に操作可能に連結された第三のアルファウイルスのサブゲノムプロモータを含む第三の転写ユニットと；
（ｉｉ）第四のアルファウイルスの非構造タンパク質１−４をコードする第四のコード配列に操作可能に連結された第四のアルファウイルスのサブゲノムプロモータを含む第四の転写ユニットと
を含む、
工程、
を含む、方法。
【請求項２１】
組換えアルファウイルス粒子を産生する方法であって、パッケージングシグナルを含み、目的のタンパク質をコードするレプリコンを、宿主細胞に導入する工程を含み、前記宿主細胞が二つの発現カセットを含み、ここで、
（ａ）第一の発現カセットが、
（ｉ）第一のアルファウイルスの糖タンパク質をコードする第一のコード配列に操作可能に連結された第一のアルファウイルスのサブゲノムプロモータを含む第一の転写ユニットと；
（ｉｉ）第二のアルファウイルスの非構造タンパク質１−４をコードする第二のコード配列に操作可能に連結された第二のアルファウイルスのサブゲノムプロモータを含む第二の転写ユニットと；
を含み、
（ｂ）第二の発現カセットが、
（ｉ）第三のアルファウイルスのカプシドタンパク質をコードする第三のコード配列に操作可能に連結された第三のアルファウイルスのサブゲノムプロモータを含む第三の転写ユニットと；
（ｉｉ）第四のアルファウイルスの非構造タンパク質１−４をコードする第四のコード配列に操作可能に連結された第四のアルファウイルスのサブゲノムプロモータを含む第四の転写ユニットと
を含む、方法。
【請求項２２】
三つの転写ユニットを含む発現カセットであって、ここで、
（ａ）第一の転写ユニットが、アルファウイルスの非構造タンパク質１−３をコードするコード配列に操作可能に連結されたプロモータを含み、
（ｂ）第二の転写ユニットが、アルファウイルスの糖タンパク質またはカプシドタンパク質の両方ではないいずれかをコードするコード配列に操作可能に連結された第一のアルファウイルスのサブゲノムプロモータを含み、
（ｃ）第三の転写ユニットが、アルファウイルスの非構造タンパク質４をコードするコード配列に操作可能に連結された第二のアルファウイルスのサブゲノムプロモータを含む、
発現カセット。
【請求項２３】
前記第二の転写ユニットが糖タンパク質をコードする配列を含む、請求項２２に記載の発現カセット。
【請求項２４】
前記第二の転写ユニットがカプシドタンパク質をコードする配列を含む、請求項２２に記載の発現カセット。
【請求項２５】
前記第二の転写ユニットがハイブリッドカプシドタンパク質をコードする配列を含む、請求項２２に記載の発現カセット。
【請求項２６】
前記第二の転写ユニットが、カプシドタンパク質の自己タンパク分解活性を減じる変異を含むカプシドタンパク質をコードする配列を含む、請求項２２に記載の発現カセット。
【請求項２７】
前記変異が、配列番号１により番号づけされる、Ｈｉｓ１４１Ａｌａ、Ａｓｐ１４７Ａｌａ、Ａｓｐ１６３Ａ、Ｓｅｒ２１５Ａｌａ、ΔＨｉｓ１４１、ΔＡｓｐ１４７、ΔＡｓｐ１６３、ΔＳｅｒ２１５、およびΔＴｒｐ２６４ならびにその組み合わせからなる群より選択される、請求項２６に記載の発現カセット。
【請求項２８】
請求項２２に記載の第一の発現カセットを含む、宿主細胞。
【請求項２９】
請求項２２に記載の第二の発現カセットをさらに含み、ここで、前記第一の発現カセットがアルファウイルスの糖タンパク質をコードし、前記第二の発現カセットがアルファウイルスのカプシドタンパク質をコードする、請求項２８に記載の宿主細胞。
【請求項３０】
パッケージングシグナルを含み、目的のタンパク質をコードするレプリコンをさらに含む、請求項２９に記載の宿主細胞。
【請求項３１】
組換えアルファウイルス粒子を産生するためのパッケージング細胞を作製する方法であって、
（ａ）アルファウイルスの糖タンパク質をコードする、請求項２２に記載の第一の発現カセットを、適切な宿主細胞にトランスフェクションする工程と、
（ｂ）アルファウイルスのカプシドタンパク質をコードする、請求項２２に記載の第二の発現カセットを、前記宿主細胞にトランスフェクションする工程と
を含む、方法。
【請求項３２】
組換えアルファウイルス粒子を産生する方法であって、請求項２９に記載の宿主細胞に、パッケージングシグナルを含み、目的のタンパク質をコードするレプリコンを導入するステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００７年１１月２６日に出願された米国特許出願番号第６０／９９０，０８８号の権利を主張し、かつ参照として援用する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、組換えアルファウイルス粒子の調製に関する。
【０００３】
本発明は、米国国立衛生研究所よりＣｏｎｔｒａｃｔ  Ｎｏ．ＨＨＳＮ２６６２００５００００７Ｃにより補助をうけた。米国政府は、本発明に一定の権利を有しうる。
【背景技術】
【０００４】
組換えアルファウイルス粒子（アルファウイルスレプリコン粒子）は、タンパク質生産、抗原送達、および様々な治療的応用における使用に関して、大きな可能性を有する。アルファウイルスパッケージング細胞株（ＰＣＬ）は、アルファウイルスレプリコン粒子を生成する最も効率的で費用効果的な手段である。しかし、アルファウイルスパッケージング細胞株の開発における一つの障害は、粒子の収量が少ないことである。他方で、多数の組換えアルファウイルス粒子を生成する際には、ＲＣＶ（複製可能ウイルス粒子）の生成が潜在的問題である。欠損ヘルパーを二つの別々のカセットに分割することにより、組換えの可能性を大きく減じることができる。なぜなら、感染性ＲＮＡを産生するために複数のスイッチが必要となるためである。しかし、大規模生産でＲＣＶが生成される可能性がまだある。したがって、ＰＣＬの生産性を高め、組換えアルファウイルス粒子の大規模生産の間中複製可能ウイルスが生成されうる可能性を減じる方法が、当技術分野で必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
分割されたヘルパーシステムにおいては、各構造タンパク質が、複製に必要な５’および３’シスエレメントを含む別々の欠損ヘルパー（ＤＨ）カセットにコードされる（例えば、米国特許出願公開第２００６／０２９２１７５号参照）。コードされた構造タンパク質の発現は、レプリコンから翻訳されるレプリカーゼ複合体によるＤＨカセットの良好な複製およびそれに続くサブゲノムＲＮＡの転写による。レプリカーゼ複合体は単一のポリペプチド鎖として翻訳された後、連続的な自己切断事象を経て、それぞれの切断複合体が独自の複製機能を果たす。ＤＨ複製のごく最初のステップに必要な機能的レプリカーゼ複合体、特にマイナス鎖レプリカーゼは、限られた時間および位置で利用可能である。
【０００６】
本発明は、有効なレプリカーゼ複合体の量および利用可能性を高め、これによりＤＨ転写産物の複製効率およびＰＣＬの生産性を高めるために用いうる戦略を提供する。本発明は、複製可能ウイルス粒子（ＲＣＶ）の生成を最小限にするための戦略も提供する。本発明のコンセプトおよび方法は、アルファウイルスベースのパッケージング細胞系統システムと関連して以下に記載されるが、他のタンパク質発現システムまたはウイルスパッケージング細胞系統システムに容易に適用して、商業的に実行可能な収量を得ることができる。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
第一の転写ユニットおよび第二の転写ユニットを含む発現カセットであり、
（ａ）上記第一の転写ユニットが、第一のアルファウイルスの構造タンパク質をコードする第一のコード配列に操作可能に連結された第一のアルファウイルスのサブゲノムプロモータを含み、
（ｂ）上記第二の転写ユニットが、第二のアルファウイルスの非構造タンパク質１−４をコードする第二のコード配列に操作可能に連結された第二のアルファウイルスのサブゲノムプロモータを含む、
発現カセット。
（項目２）
上記第一の転写ユニットが、上記第二の転写ユニットに対して５’である、項目１に記載の発現カセット。
（項目３）
上記第一の転写ユニットが、上記第二の転写ユニットに対して３’である、項目１に記載の発現カセット。
（項目４）
上記構造タンパク質が糖タンパク質である、項目１に記載の発現カセット。
（項目５）
上記構造タンパク質がカプシドタンパク質である、項目１に記載の発現カセット。
（項目６）
上記構造タンパク質がハイブリッドカプシドタンパク質である、項目１に記載の発現カセット。
（項目７）
上記構造タンパク質が、上記カプシドタンパク質の自己タンパク分解活性を減じる変異を含むカプシドタンパク質である、項目１に記載の発現カセット。
（項目８）
上記変異が、配列番号１により番号づけされる、Ｈｉｓ１４１Ａｌａ、Ａｓｐ１４７Ａｌａ、Ａｓｐ１６３Ａ、Ｓｅｒ２１５Ａｌａ、ΔＨｉｓ１４１、ΔＡｓｐ１４７、ΔＡｓｐ１６３、ΔＳｅｒ２１５、およびΔＴｒｐ２６４ならびにその組み合わせからなる群より選択される、項目７に記載の発現カセット。
（項目９）
上記第一のアルファウイルスおよび上記第二のアルファウイルスの少なくとも一つがシンドビスウイルスである、項目１に記載の発現カセット。
（項目１０）
上記第一アルファウイルスおよび上記第二のアルファウイルスの少なくとも一つがベネズエラ馬脳炎（ＶＥＥ）ウイルスである、項目１に記載の発現カセット。
（項目１１）
上記第一のサブゲノムプロモータおよび上記第二のサブゲノムプロモータの少なくとも一つが、ＶＥＥサブゲノムプロモータ、シンドビスウイルスサブゲノムプロモータ、東部馬脳炎（ＥＥＥ）サブゲノムプロモータ、またはセムリキ森林ウイルスサブゲノムプロモータである、項目１に記載の発現カセット。
（項目１２）
選択可能マーカをさらに含む、項目１に記載の発現カセット。
（項目１３）
内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含む、項目１に記載の発現カセット。
（項目１４）
上記第二のコード配列が配列番号２を含む、項目１に記載の発現カセット。
（項目１５）
上記第二の転写ユニットが、配列番号９により番号づけされるＮｓｐ４におけるＲ３３１またはＲ３３２の少なくとも一つに変異を含む、項目１に記載の発現カセット。
（項目１６）
第一の発現カセットを含む宿主細胞であり、上記第一の発現カセットが、
（ａ）第一のアルファウイルスの構造タンパク質をコードする第一のコード配列に操作可能に連結された第一のアルファウイルスのサブゲノムプロモータを含む第一の転写ユニットと；
（ｂ）第二のアルファウイルスの非構造タンパク質１−４をコードする第二のコード配列に操作可能に連結される第二のアルファウイルスのサブゲノムプロモータを含む第二の転写ユニット
を含む、宿主細胞。
（項目１７）
第二の発現カセットをさらに含み、上記第二の発現カセットが、
（ｃ）第三のアルファウイルスの第二の構造タンパク質をコードする第三のコード配列に操作可能に連結された第三のアルファウイルスのサブゲノムプロモータを含む第三の転写ユニットと；
（ｄ）第四のアルファウイルスの非構造タンパク質１−４をコードする第四のコード配列に操作可能に連結された第四のアルファウイルスのサブゲノムプロモータを含む第四の転写ユニットと
を含み、上記第一の構造タンパク質がカプシドタンパク質であり、上記第二の構造タンパク質が糖タンパク質である、項目１６に記載の宿主細胞。
（項目１８）
上記第一のアルファウイルスおよび上記第二のアルファウイルスの少なくとも一つがＶＥＥウイルス、シンドビスウイルス、またはセムリキ森林ウイルスである、項目１６に記載の宿主細胞。
（項目１９）
パッケージングシグナルを含み、目的のタンパク質をコードするレプリコンをさらに含む、項目１６に記載の宿主細胞。
（項目２０）
組換えアルファウイルス粒子を産生するためのパッケージング細胞を作製する方法であって、以下：
（ａ）第一の発現カセットを適切な宿主細胞にトランスフェクションする工程であり、上記第一の発現カセットが、
（ｉ）第一のアルファウイルスの構造タンパク質をコードする第一のコード配列に操作可能に連結された第一のアルファウイルスのサブゲノムプロモータを含む第一の転写ユニットと；
（ｉｉ）第二のアルファウイルスの非構造タンパク質１−４をコードする第二のコード配列に操作可能に連結された第二のアルファウイルスのサブゲノムプロモータを含む第二の転写ユニットと；
を含む、
工程と、
（ｂ）第二の発現カセットを上記適切な宿主細胞にトランスフェクションする工程であり、上記第二の発現カセットが、
（ｉ）第三のアルファウイルスの第二の構造タンパク質をコードする第三のコード配列に操作可能に連結された第三のアルファウイルスのサブゲノムプロモータを含む第三の転写ユニットと；
（ｉｉ）第四のアルファウイルスの非構造タンパク質１−４をコードする第四のコード配列に操作可能に連結された第四のアルファウイルスのサブゲノムプロモータを含む第四の転写ユニットと
を含む、
工程、
を含む、方法。
（項目２１）
組換えアルファウイルス粒子を産生する方法であって、パッケージングシグナルを含み、目的のタンパク質をコードするレプリコンを、宿主細胞に導入する工程を含み、上記宿主細胞が二つの発現カセットを含み、ここで、
（ａ）第一の発現カセットが、
（ｉ）第一のアルファウイルスの構造タンパク質をコードする第一のコード配列に操作可能に連結された第一のアルファウイルスのサブゲノムプロモータを含む第一の転写ユニットと；
（ｉｉ）第二のアルファウイルスの非構造タンパク質１−４をコードする第二のコード配列に操作可能に連結された第二のアルファウイルスのサブゲノムプロモータを含む第二の転写ユニットと；
を含み、
（ｂ）第二の発現カセットが、
（ｉ）第三のアルファウイルスの第二の構造タンパク質をコードする第三のコード配列に操作可能に連結された第三のアルファウイルスのサブゲノムプロモータを含む第三の転写ユニットと；
（ｉｉ）第四のアルファウイルスの非構造タンパク質１−４をコードする第四のコード配列に操作可能に連結された第四のアルファウイルスのサブゲノムプロモータを含む第四の転写ユニットと
を含む、方法。
（項目２２）
三つの転写ユニットを含む発現カセットであって、ここで、
（ａ）第一の転写ユニットが、アルファウイルスの構造タンパク質１−３をコードするコード配列に操作可能に連結されたプロモータを含み、
（ｂ）第二の転写ユニットが、アルファウイルスの構造タンパク質をコードするコード配列に操作可能に連結された第一のアルファウイルスのサブゲノムプロモータを含み、
（ｃ）第三の転写ユニットが、アルファウイルスの非構造タンパク質４をコードするコード配列に操作可能に連結された第二のアルファウイルスのサブゲノムプロモータを含む、
発現カセット。
（項目２３）
上記構造タンパク質が糖タンパク質である、項目２２に記載の発現カセット。
（項目２４）
上記構造タンパク質がカプシドタンパク質である、項目２２に記載の発現カセット。
（項目２５）
上記構造タンパク質がハイブリッドカプシドタンパク質である、項目２２に記載の発現カセット。
（項目２６）
上記構造タンパク質が、カプシドタンパク質の自己タンパク分解活性を減じる変異を含むカプシドタンパク質である、項目２２に記載の発現カセット。
（項目２７）
上記変異が、配列番号１により番号づけされる、Ｈｉｓ１４１Ａｌａ、Ａｓｐ１４７Ａｌａ、Ａｓｐ１６３Ａ、Ｓｅｒ２１５Ａｌａ、ΔＨｉｓ１４１、ΔＡｓｐ１４７、ΔＡｓｐ１６３、ΔＳｅｒ２１５、およびΔＴｒｐ２６４ならびにその組み合わせからなる群より選択される、項目２６に記載の発現カセット。
（項目２８）
項目２２に記載の第一の発現カセットを含む、宿主細胞。
（項目２９）
項目２２に記載の第二の発現カセットをさらに含み、ここで、上記第一の発現カセットがアルファウイルスの糖タンパク質をコードし、上記第二の発現カセットがアルファウイルスのカプシドタンパク質をコードする、項目２８に記載の宿主細胞。
（項目３０）
パッケージングシグナルを含み、目的のタンパク質をコードするレプリコンをさらに含む、項目２９に記載の宿主細胞。
（項目３１）
組換えアルファウイルス粒子を産生するためのパッケージング細胞を作製する方法であって、
（ａ）アルファウイルスの糖タンパク質をコードする、項目２２に記載の第一の発現カセットを、適切な宿主細胞にトランスフェクションする工程と、
（ｂ）アルファウイルスのカプシドタンパク質をコードする、項目２２に記載の第二の発現カセットを、上記宿主細胞にトランスフェクションする工程と
を含む、方法。
（項目３２）
組換えアルファウイルス粒子を産生する方法であって、項目２９に記載の宿主細胞に、パッケージングシグナルを含み、目的のタンパク質をコードするレプリコンを導入するステップを含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】いくつかの二重サブゲノムプロモータヘルパーカセットの構造である。「ＣＭＶ」、サイトメガロウイルスプロモータ；「５’」、５’非翻訳領域および複製に必要なＮｓｐ１コード領域のＮ末端からの配列；「ＪＲ」、サブゲノムプロモータと隣接配列（結合領域）；「Ｃａｐ／Ｇｌｙ」、カプシドまたは糖タンパク質；「Ｎｓｐ」、非構造タンパク質１−４；「Ａ４０」、４０−マーのポリＡテール；「３’」、３’非翻訳領域；「Ｐｓｖ４０」、ネオマイシン耐性遺伝子（「ｎｅｏ」）の転写を制御するＳＶ４０プロモータ；「ＩＲＥＳ」、内部リボソーム侵入部位。
【図２】図２Ａ〜Ｄは、様々なタイプのアルファウイルスの非構造タンパク質における切断部位を示すＢＬＡＳＴアライメントである。図２Ａ、ＳＦＶ  Ｎｓｐ２、配列番号１４；Ｎｓｐ２  ＶＣＲ−Ｃｈｉｍ、配列番号１５；シンドビスＮｓｐ２、配列番号１６；ＥＥＥ  Ｎｓｐ２、配列番号１７；コンセンサス、配列番号１８。図２Ｂ、ＳＦＶ  Ｎｓｐ２、配列番号２１；Ｎｓｐ２  ＶＣＲ−Ｃｈｉｍ、配列番号２２；シンドビスＮｓｐ２、配列番号２３；ＥＥＥ  Ｎｓｐ２、配列番号２４；コンセンサス、配列番号２５。図２Ｃ、ＳＦＶ  Ｎｓｐ２、配列番号２６；Ｎｓｐ２  ＶＣＲ−Ｃｈｉｍ、配列番号２７；シンドビスＮｓｐ２、配列番号２８；ＥＥＥ  Ｎｓｐ２、配列番号２９；コンセンサス、配列番号３０。図２Ｄ、ＳＦＶ  Ｎｓｐ２、配列番号３１；Ｎｓｐ２  ＶＣＲ−Ｃｈｉｍ、配列番号３２；シンドビスＮｓｐ２、配列番号３３；ＥＥＥ  Ｎｓｐ２、配列番号３４；コンセンサス、配列番号３５。配列表において配列番号１８、２５、３０、および３５として提供される図２Ａ〜Ｄのコンセンサス配列において、「Ｘａａ」は、任意のアミノ酸であればよく、あるいは、示される位置で欠失していればよい。「Ｘａａ」を伴う配列番号１８、２５、３０、および３５に示される位置のアミノ酸は、図２Ａ〜Ｄ中の位置に示されるアミノ酸より選択されるのが好ましい。
【図３】カプシドタンパク質の３’末端（Ｔｒｐ）での、または糖タンパク質の５’末端のセリン残基（Ｍｅｔ−Ｓｅｒ）での、カプシド切断部位である。シンドビスカプシド（Ｓｃａｐ）の３’末端、配列番号１１；シンドビス糖タンパク質（Ｓｇｌｙ）の５’末端、配列番号１２；ＲＣＶ（複製可能ウイルス粒子）、配列番号１３。
【図４】カプシドタンパク質配列：配列番号１（シンドビス）、配列番号２（ＳＦＶ）、配列番号３（ＥＥＥ）、および配列番号４（ＶＥＥ）のＢＬＡＳＴアライメントである。コンセンサス配列：配列番号５。
【図５Ａ】最適化されたコード配列を含むＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４コード配列のＢＬＡＳＴアライメント。ＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４（コドン最適化）、配列番号１０；ＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４、配列番号１９；コンセンサス、配列番号２０。
【図５Ｂ】最適化されたコード配列を含むＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４コード配列のＢＬＡＳＴアライメント。ＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４（コドン最適化）、配列番号１０；ＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４、配列番号１９；コンセンサス、配列番号２０。
【図５Ｃ】最適化されたコード配列を含むＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４コード配列のＢＬＡＳＴアライメント。ＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４（コドン最適化）、配列番号１０；ＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４、配列番号１９；コンセンサス、配列番号２０。
【図５Ｄ】最適化されたコード配列を含むＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４コード配列のＢＬＡＳＴアライメント。ＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４（コドン最適化）、配列番号１０；ＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４、配列番号１９；コンセンサス、配列番号２０。
【図５Ｅ】最適化されたコード配列を含むＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４コード配列のＢＬＡＳＴアライメント。ＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４（コドン最適化）、配列番号１０；ＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４、配列番号１９；コンセンサス、配列番号２０。
【図５Ｆ】最適化されたコード配列を含むＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４コード配列のＢＬＡＳＴアライメント。ＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４（コドン最適化）、配列番号１０；ＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４、配列番号１９；コンセンサス、配列番号２０。
【図５Ｇ】最適化されたコード配列を含むＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４コード配列のＢＬＡＳＴアライメント。ＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４（コドン最適化）、配列番号１０；ＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４、配列番号１９；コンセンサス、配列番号２０。
【図５Ｈ】最適化されたコード配列を含むＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４コード配列のＢＬＡＳＴアライメント。ＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４（コドン最適化）、配列番号１０；ＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４、配列番号１９；コンセンサス、配列番号２０。
【図５Ｉ】最適化されたコード配列を含むＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４コード配列のＢＬＡＳＴアライメント。ＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４（コドン最適化）、配列番号１０；ＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４、配列番号１９；コンセンサス、配列番号２０。
【図５Ｊ】最適化されたコード配列を含むＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４コード配列のＢＬＡＳＴアライメント。ＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４（コドン最適化）、配列番号１０；ＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４、配列番号１９；コンセンサス、配列番号２０。
【図５Ｋ】最適化されたコード配列を含むＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４コード配列のＢＬＡＳＴアライメント。ＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４（コドン最適化）、配列番号１０；ＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４、配列番号１９；コンセンサス、配列番号２０。
【図５Ｌ】最適化されたコード配列を含むＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４コード配列のＢＬＡＳＴアライメント。ＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４（コドン最適化）、配列番号１０；ＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４、配列番号１９；コンセンサス、配列番号２０。
【図６】二重サブゲノムプロモータカセットの構造である。「ＣＭＶ」、サイトメガロウイルスプロモータ；「５’」、５’非翻訳領域および複製に必要なＮｓｐ１コード領域のＮ末端からの配列；「ＪＲ」、サブゲノムプロモータと隣接配列（結合領域）；「ＣａｐまたはＧｌｙ」、カプシドまたは糖タンパク質；「Ｎｓｐ１−３」、非構造タンパク質１−３；「Ｎｓｐ４」、非構造タンパク質４；「３’」、３’非翻訳領域；「δＲ」、リボザイム切断部位。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
二重サブゲノムプロモータ発現カセット
いくつかの実施形態においては、アルファウイルス非構造タンパク質１−４（ｎｓｐ１−４）のコード配列は、構造タンパク質と同じ発現カセットにおいて第二のサブゲノムプロモータの制御下に置かれる。いったんレプリコンにより誘導されるとこれらの「二重サブゲノムプロモータ発現コンストラクト」は、自立した複製の特性を有するが、誘導なしでは実質的には発現を有しない。
【０００９】
本発明の発現カセットは、二つの転写ユニット、ならびに発現のために必要なプロモータおよび制御エレメントを含む。典型的な制御エレメントには、転写プロモータ、転写エンハンサエレメント、クロマチンインスレータ、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列（翻訳終止コドンに対して３’に配置）、翻訳の開始の最適化のための配列（コード配列に対して５’に配置）、翻訳終結配列、非構造タンパク質媒介性増幅に必要な５’配列、および非構造タンパク質媒介性増幅に必要な３’配列が含まれるがこれに限定されない。
【００１０】
本発明の発現カセットにおいて使用されるプロモータは、誘導可能または構成的でありうる。有用なプロモータには、プロモータには、ＣＭＶプロモータ、ＭＭＴＶプロモータ、ＭｏＭＬＶプロモータ、アデノウイルスＶＡ１ＲＮＡプロモータ、およびＰｏｌＩプロモータを含むプロモータが含まれる。
【００１１】
いくつかの実施形態においては、第一の転写ユニットは、第二の転写ユニットに対して５’である。他の実施形態においては、第一の転写ユニットは、第二の転写ユニットに対して３’である。いずれの場合においても、第一の転写ユニットには、アルファウイルス構造タンパク質をコードする第一のコード配列に操作可能に連結されたアルファウイルスサブゲノムプロモータが含まれる。第二の転写ユニットには、アルファウイルス非構造タンパク質１−４をコードする第二コード配列に操作可能に連結された別のアルファウイルスサブゲノムプロモータが含まれる。転写ユニットのエレメントは、その通常の機能を実行するように構成される場合、すなわち、構造タンパク質および非構造タンパク質の発現が、サブゲノムプロモータの制御下にある場合に、「操作可能に連結される」。
【００１２】
アルファウイルスサブゲノムプロモータ（「結合領域プロモータ」またはＪＲとも呼ばれる）は一般に、非構造タンパク質のオープンリーディングフレームと構造タンパク質のオープンリーディングフレームとの間の領域に由来する。典型的に、アルファウイルスサブゲノムプロモータは、プロモータ関連活性のほとんどを提供するコア配列、ならびにプロモータ関連活性をさらに増強するフランキング領域を含む。例えば、ＨＲ株シンドビスウイルスサブゲノム結合領域プロモータは、典型的にほぼヌクレオチド７５７９番から始まり、少なくともヌクレオチド７６１２番（およびおそらくそれ以降）まで続く。最低でも、ヌクレオチド７５７９〜７６０２が、サブゲノムフラグメントの転写に必要なコア配列として働くと考えられている。
【００１３】
本発明の発現カセットにおける二つのサブゲノムプロモータは、同じであるのが好ましいが、異なるアルファウイルスに由来してもよい。例えば、第一のサブゲノムプロモータおよび第二のサブゲノムプロモータの少なくとも一つは、ベネズエラ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）サブゲノムプロモータ、シンドビスウイルスサブゲノムプロモータ、東部馬脳炎ウイルス（ＥＥＥ）サブゲノムプロモータ、またはセムリキ森林ウイルスサブゲノムプロモータである。好ましい実施形態においては、両方のサブゲノムプロモータが、シンドビスプロモータ、ＶＥＥプロモータ、ＳＦＶプロモータ、またはＥＥＥプロモータである。
【００１４】
「アルファウイルス構造タンパク質」とは、カプシドタンパク質または糖タンパク質（Ｅ１ならびにＥ２、および適切なＥ３を含む）のいずれかをいう。カプシドおよび糖タンパク質は、同じタイプのアルファウイルス、例えばシンドビスウイルス、ＳＦＶ、ＶＥＥ、またはＥＥＥに由来しうるが、その必要はない。したがって、いくつかの発現カセットでは、第一および第二のアルファウイルスの少なくとも一つが、シンドビスウイルスである。他の発現カセットにおいては、第一および第二のアルファウイルスの少なくとも一つが、ＶＥＥウイルスである。
【００１５】
カプシドタンパク質配列の例は、配列番号１（シンドビス）、配列番号２（ＳＦＶ）、配列番号３（ＥＥＥ）、および配列番号４（ＶＥＥ）に提供される。構造ポリタンパク質配列の例は、配列番号３６（シンドビス；カプシド、アミノ酸１〜２６４；Ｅ３、アミノ酸２６５〜３２８；Ｅ２、アミノ酸３２９〜７５１；６Ｋ、アミノ酸７５２〜８０６；Ｅ１、アミノ酸８０７〜１２４５）、配列番号３７（ＳＦＶ；カプシド、アミノ酸１〜２６７；Ｅ３、アミノ酸２６８〜３３３；Ｅ２、アミノ酸３３４〜７５５；６Ｋ、アミノ酸７５６〜８１５；Ｅ１、アミノ酸８１６〜１２５３）、配列番号３８（ＶＥＥ；カプシド、アミノ酸１〜２７５；Ｅ３、アミノ酸２７６〜３３４；Ｅ２、アミノ酸３３５〜７５６；６Ｋ、アミノ酸７５７〜８１２；Ｅ１、アミノ酸８１３〜１２５４）、および配列番号３９（ＥＥＥ；カプシド、アミノ酸１〜２６０；Ｅ３、アミノ酸２６１〜３２３；Ｅ２、アミノ酸３２４〜７４３；６Ｋ、アミノ酸７４４〜８００；Ｅ１、アミノ酸８０１〜１２４１）に提供される。
【００１６】
以下にさらに詳述されるいくつかの実施形態では、カプシドタンパク質には、カプシドタンパク質の自己タンパク分解活性を減じる一つ以上の変異を含むカプシドタンパク質が含まれる（例えば、配列番号１にしたがって番号付けされる、Ｈｉｓ１４１Ａｌａ、Ａｓｐ１４７Ａｌａ、Ａｓｐ１６３Ａ、Ｓｅｒ２１５Ａｌａ、およびその組み合わせ）。
【００１７】
いくつかの実施形態においては、カプシドタンパク質および／または糖タンパク質は、「ハイブリッド」タンパク質である。ハイブリッドタンパク質は第一のアルファウイルスに由来する少なくとも一つの機能的ドメインを含む一方、そのタンパク質の残りの部分は、一つ以上の別のアルファウイルスに由来する。例えば、ハイブリッドカプシドタンパク質は、第一のアルファウイルスからのＲＮＡ結合ドメイン、および第二のアルファウイルスからのエンベロープ相互作用ドメインを含みうる。ハイブリッドカプシドタンパク質および糖タンパク質は、米国特許出願公開第２００６／０２９２１７５号にさらに詳述される。
【００１８】
当技術分野で公知のように、非構造タンパク質には、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４が含まれる。非構造タンパク質配列の例は、配列番号６〜９としてそれぞれ提供される。最適化されたコドンを用いたＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４をコードするＤＮＡ配列が、配列番号１０に提供される。当業者には当然のことながら、本明細書に開示されるものに加えて、アルファウイルス非構造タンパク質をコードする様々な配列が、本発明において使用でき、したがって「アルファウイルス非構造タンパク質」というフレーズの範囲内であるとみなされる。例えば、本発明の一実施形態の範囲内においては、遺伝コードの縮重により、一つを超えるコドンが所与のアミノ酸をコードしうる。したがって、アルファウイルス非構造タンパク質をコードする様々な核酸配列が生成されうる。本発明の他の実施形態の範囲内では、例えばその最終結果がアルファウイルス非構造タンパク質の生物活性を変更しない様々な置換、挿入、または欠失を含む、様々な他の非構造タンパク質誘導体が作られうる。本発明の文脈の範囲内においては、アルファウイルス非構造タンパク質は、それらがベクターコンストラクトの自己複製またはトランス複製を促進すれば、全体として生物学的に活性であるとみなされる。ウイルスベクター核酸の複製をさす自己複製またはトランス複製は、時間の経過とともに実行される代謝標識またはＲＮアーゼ保護アッセイにより容易に決定されうる。
【００１９】
同様に、上述されるカプシドおよび糖タンパク質のタンパク質は、本明細書に開示される厳密な配列を有するポリペプチドに限られない。アルファウイルスゲノムは絶え間ない変化があることが多く、種間および単離されたゲノム間で比較的高い程度の変異性（ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）を有する複数の可変ドメインを含む。「カプシド」、「糖タンパク質」、および「非構造タンパク質（単数または複数）」という用語は、任意の同定されたアルファウイルスからのそのようなタンパク質、ならびに新たに同定された分離株、およびこれらの分離株のサブタイプを含む。さらに、アミノ酸配列は、特に高い配列相同性を呈する領域のものは、修飾されうる。
【００２０】
様々なヌクレオチド配列を用いて、構造タンパク質および非構造タンパク質をコードしうる。後述のように、任意に、ｎｓｐ１−４をコードする配列を最適化して、組換え粒子への同時パッケージングの可能性を減じ、複製可能ウイルス（ＲＣＶ）を生成しうる組換えを防止しうる。
【００２１】
いくつかの実施形態においては、本発明の発現カセットは、Ｎｅｏ、ＳＶ２  Ｎｅｏ、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、フレオマイシン、ヒスチジノール、またはＤＨＦＲ等の選択可能マーカを含み、これは転写ユニットの機能が妨げられない限りにおいて発現カセットの様々なポイントに位置しうる。
【００２２】
本発明のいくつかの発現カセットは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む。ＩＲＥＳは、５’シス−複製エレメントとサブゲノムプロモータの間、二つのサブゲノムプロモータの間、またはサブゲノムコード領域と３’シス−複製エレメントの間に配置されうる。
【００２３】
本発明の別の実施形態においては、四つの全ての非構造タンパク質が一つの発現カセットから産出され、これには、より効率的な複製複合体の構築、ならびにカプシドおよび糖タンパク質の発現増加という利点がある。Ｖｏｋｏｖａ等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３４４巻，３１５−２７頁，２００６年；および米国特許第７，３３２，３２２号を参照されたい。本発明のいくつかの実施形態においては、ｎｓｐ１−３の転写は上述のように誘導可能プロモータまたは構成プロモータの制御下にあり、カプシドまたは糖タンパク質の転写は第一のサブゲノムプロモータの制御下にあり、ｎｓｐ４の転写は第二のサブゲノムプロモータの制御下にある。任意に、Ｎｓｐ１−４配列は、コドン最適化される（例えば、配列番号１０参照）。いくつかの実施形態においては、カプシドカセットはピューロマイシンマーカを有し、糖タンパク質カセットはマーカを有しない。
【００２４】
本発明による発現カセットの例が、図１および図６に示される。
【００２５】
宿主細胞およびパッケージング細胞系統
本発明の発現カセットは、宿主細胞に導入されうる。いくつかの場合には、宿主細胞は第一の発現カセットを含み、これには、（ａ）第一のアルファウイルスの構造タンパク質をコードする第一のコード配列に操作可能に連結された第一のアルファウイルスサブゲノムプロモータを含む第一の転写ユニットと；（ｂ）第二のアルファウイルスの非構造タンパク質１−４をコードする第二のコード配列に操作可能に連結された第二のアルファウイルスサブゲノムプロモータを含む第二の転写ユニットが含まれる。いくつかの宿主細胞は、二つのそのような発現カセットを含み、これらの実施形態では、第一の発現カセットがカプシドタンパク質をコードし、第二の発現カセットが糖タンパク質をコードする。このような宿主細胞を、組換えアルファウイルス粒子を作製するために用いうるパッケージング細胞として用いることができる。
【００２６】
宿主細胞は、組換えタンパク質産生に適切な任意の真核生物細胞でありうる。これらには、鳥類細胞、昆虫細胞（例えばＣ６／３６、ＳＦ９）、脊椎動物細胞、および哺乳類細胞が含まれる。有用な哺乳類細胞系統の例には、Ｖｅｒｏ、ＭＤＢＫ、ＭＤＣＫ、ＭＲＣ、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＢＨＫ、ＰＥＲＣ．６（登録商標）（Ｃｒｕｃｅｌｌから入手可能；国際公開第０１／３８３６２号および国際公開第０２／４０６６５号を参照）、ＥＢ細胞系統、およびＨＥＫ２９３細胞が含まれる。鳥類細胞のソースには、ＥＢＸ（登録商標）細胞（Ｖｉｖａｌｉｓ、ＦＲ）等の胚幹細胞、胚線維芽細胞、および胚生殖細胞が含まれるがこれに限られない。有用な鳥類細胞には、アヒル細胞系統ＡＧＥ１．ＣＲ（ＰｒｏＢｉｏＧｅｎ）が含まれる。他の鳥類細胞系統は、例えば、米国特許第５，３４０，７４０号；米国特許第５，６５６，４７９号；米国特許第５，８３０，５１０号；米国特許第６，１１４，１６８号；米国特許第６，５００，６６８号；米国特許第６，８７２，５６１号；欧州特許第０７８７１８０Ｂ号；欧州特許第０３２９１８１３．８号；国際公開第０３／０４３４１５号；および国際公開第０３／０７６６０１号に開示される。
【００２７】
本発明の発現カセットは、マイクロインジェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、およびリン酸カルシウム沈殿を含むがこれに限られない当該技術分野で周知の方法を用いて宿主細胞に導入されうる。あるいは、本発明の発現コンストラクトが、プラスミドまたはウイルスベースのベクター等のポリヌクレオチド送達媒体に組み込まれうる。
【００２８】
組換え宿主細胞または「パッケージング細胞」がいったん構築されたら、これを用いて、アルファウイルスパッケージングシグナルを含み目的のタンパク質をコードするレプリコンの導入により組換えアルファウイルス粒子を作製できる。目的のタンパク質は、典型的には抗原である。抗原は、いくつかの既知のウイルス、細菌、寄生虫および真菌類のいずれか、ならびに様々な腫瘍抗原のいずれかまたは免疫反応が所望される他の任意の抗原から得ることができる。さらに、本発明の目的に関し、「抗原」とは、タンパク質が免疫応答を誘発する能力を維持する限りにおいて、天然の配列に対する（一般的には本質的に保存的な）欠失、付加および置換等の修飾を含むタンパク質をさす。これらの修飾は、部位特異的変異誘発によるように意図的でも、抗原を産出する宿主の突然変異によるなどの偶発的でもよい。米国特許出願公開第２００６／０２９２１７５号を参照されたい。
【００２９】
抗原が由来しうる細菌病原体の非限定的な例には、ジフテリア、ブドウ球菌、コレラ、結核、破傷風、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、百日咳、髄膜炎、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉｓ、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、およびＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓが含まれる。
【００３０】
ウイルス病原体の非限定的な例には、髄膜炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ライノウイルス、呼吸器系合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、ピコルナウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、レトロウイルス、および肝炎ウイルスが含まれる。
【００３１】
腫瘍抗原には、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１および２、β−カテニン、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ−４、カスパーゼ−８、ＫＩＡ０２０５、ＨＬＡ−Ａ２−Ｒ１７０１；ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−１２、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、アルファ−フェトプロテイン、テロメラーゼ触媒タンパク質、Ｇ−２５０、ＭＵＣ−１、癌胎児性抗原、ｐ５３、Ｈｅｒ−２−ｎｅｕ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ＣＤＣ−２７、およびＬＤＬＲ−ＦＵＴ）が含まれるがこれに限らない。国際公開第９１／０２０６２号、米国特許第６，０１５，５６７号、国際公開第０１／０８６３６号、国際公開第９６／３０５１４号、米国特許第５，８４６，５３８号および米国特許第５，８６９，４４５号も参照されたい。
【００３２】
変異レプリカーゼ複合体を伴うＤＨカセットの連続増幅
他の実施形態は、ＤＨカセットの連続増幅を伴う。これらの実施形態は、ＶＥＥの非構造タンパク質、およびサブゲノム転写に特異的欠損を有するがＤＨ／レプリコン複製には有さない様々なアルファウイルスの非構造タンパク質変異体を構成的に発現する細胞系統を利用する。したがって、これらの変異体の非構造タンパク質レプリカーゼ複合体は、ＤＨを増幅するように構成的に発現されうるが、アルファウイルスの構造タンパク質をコードするサブゲノム転写産物を産生しない。レプリコンの誘導後、増幅されたＤＨ  ＲＮＡが、レプリコンからの野生型ｎｓｐによりさらに増幅される。野生型レプリカーゼ複合体は、サブゲノム転写産物も産出し、構造タンパク質の発現をもたらす。これらの（ｔｈｅｓｅｓ）変異体のいくつかは、野生型非構造タンパク質と比較してサブゲノムＲＮＡ転写または粒子産生において何百倍以上の減少を示し、強力な誘導型のシステムを提供する。
【００３３】
一つの有用な変異体は、ｎｓＰ２切断変異体である。アルファウイルスのマイナス鎖複製は、非切断Ｐ１２３と正しく切断されたｎｓＰ４を必要とし、感染から約４時間後に止められる（ＫａａｒｉａｉｎｅｎおよびＡｈｏｌａ，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７１巻，１８７−２２２頁，２００２年）。したがって、よく保存されたアルファウイルスｎｓｐ切断部位における変異は切断されず、変異体レプリカーゼは野生型レプリカーゼと比較して長時間利用可能なはずである。さらに、シンドビスおよびＳＦＶでは、このような変異体は、非常に低いレベルのサブゲノムＲＮＡ転写を有する（Ｌｅｍｍ等、ＥＭＢＯ  Ｊ．１３巻（１２号），２９２５−３４頁，１９９４年，Ｓｈｉｒａｋｏ  ＆  Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６８巻（３号），１８７４−８５頁，１９９４年，Ｋｉｍ等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３２３巻（１号），１５３−６３頁，２００４年）。これらの切断部位はＶＥＥウイルスにおいてよく保存され（図２）、いくつかの異なる変異体（ｎｓＰ１／ｎｓＰ２切断部位およびｎｓＰ２／ｎｓＰ３切断部位での変異等）が作られうる。
【００３４】
他の変異には、シンドビスＮｓｐ４タンパク質におけるＲ３３１ＡおよびＲ３３２Ａ変異（Ｌｉ  ＆  Ｓｔｏｌｌａｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１巻，９４２９−３４頁，２００４年）が含まれ、これは、レプリカーゼ複合体のサブゲノムプロモータ結合／転写能力を失わせるが、ウイルス／ＤＨゲノムを増幅する能力を維持する。これらの変異は、異なるアルファウイルスファミリー間で高度に保存される。あるいは、Ｒ３３１、Ｒ３３２（配列番号９により番号付けされる）におけるかまたはその両方での欠失または他の置換が用いられうる。これらの変異体Ｎｓｐ１−４レプリカーゼ複合体は、同一のＤＨ転写産物（例えばＩＲＥＳ配列に連結される）から発現することもできるし、あるいは別々の転写物カセットから細胞基質（ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）に発現することもできる。適切な置換には、
Ｒ３３１で：グルタミン、ロイシン、セリン、アスパラギン、グルタミン酸、リシン、スレオニン、グリシン、メチオニン、トリプトファン、アスパラギン酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、システイン、イソロイシン、プロリン、アラニン、またはバリン；または
Ｒ３３２で：グルタミン、ロイシン、セリン、グルタミン酸、リシン、スレオニン、グリシン、メチオニン、トリプトファン、アスパラギン酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、システイン、イソロイシン、プロリン、アラニン、またはバリン
が含まれる。
【００３５】
いくつかのシンドビスおよびＳＦＶの温度感受性変異体は、サブゲノムＲＮＡ合成において特異的欠損を示す（Ｌｕｌｌａ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８０巻（６号），３１０８−１１頁，２００６年；Ｌａｓｔａｒｚａ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８巻（９号），５７８１−９１頁，１９９４年）。このような変異体も、シンドビス−、ＶＥＥ−、およびＳＦＶ−をベースとするＰＣＬを作製するために有用である。
【００３６】
任意に、アルファウイルス変異体のｎｓｐ１−４コドンを最適化して、組換え粒子への同時パッケージングの可能性を減じ、複製可能ウイルス（ＲＣＶ）を生成しうる組換えを防止しうる。最適化したコドンを用いたＶＥＥ  Ｎｓｐ１−４をコードするＤＮＡ配列が、配列番号１３に示される。
【００３７】
上記の戦略の各々が、下記の戦略の一つ以上とともに用いられうる。
【００３８】
カプシド自己タンパク分解変異体を用いたＲＣＶ生成リスクの最小化
ＲＣＶ（複製可能ウイルス粒子）の生成は、アルファウイルスベースのレプリコン粒子の適用にとって潜在的な問題である。欠損ヘルパーを二つの別々のカセットに分割することにより組換えの可能性が大きく減じられる。なぜなら、感染性ＲＮＡを産生するために複数のスイッチが必要となるためである。しかし、大規模生産の間にＲＣＶが生成されうることが考えられる。本発明は、ＲＣＶの生成可能性をさらに減らすために使用できるカプシド自己タンパク分解変異体を提供し、アルファウイルスにもとづくレプリコン粒子の産生に対し追加的な保護を提供する。この戦略を用いると野生型ＲＣＶを生成することは、実質的に不可能となる。
【００３９】
アルファウイルスの構造タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏで２６ＳサブゲノムＲＮＡから翻訳と同じときおよび翻訳後の両方でプロセシングされるポリタンパク質として翻訳される。カプシドは、自己タンパク分解により新生ポリタンパク質のＮ末端から自らを切り離すセリンプロテアーゼであると想定される。いくつかのシンドビスウイルス自己タンパク分解変異体が同定されており（例えばＨｉｓ１４１、Ａｓｐ１４７、およびＳｅｒ２１５）、いずれもウイルスにとって致命的だった（Ｈａｈｎ  ＆  Ｓｔｒａｕｓｓ，１９９０，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４巻，３０６９−７３頁，１９９０年）。二重ヘルパーシステムにおいては、カプシドが構造ポリタンパク質から人為的に分離され、自己タンパク分解機能はアルファウイルス粒子産生におそらく重要でない。したがって、カプシド自己プロテアーゼ変異を用いて、ＲＣＶを生成するリスクを最小限にできる。これらの変異には、配列番号１にしたがって番号付けされる、Ｈｉｓ１４１（例えばＨｉｓ１４１Ａｌａ）、Ａｓｐ１４７（例えばＡｓｐ１４７Ａｌａ）、Ａｓｐ１６３（例えばＡｓｐ１６３Ａｌａ）、Ｓｅｒ２１５（例えばＳｅｒ２１５Ａｌａ）での変更、およびその組み合わせが含まれる。他の置換には、
Ｈｉｓ１４１で：グルタミン、ロイシン、セリン、アルギニン、グルタミン酸、リシン、スレオニン、グリシン、メチオニン、トリプトファン、アスパラギン酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、システイン、イソロイシン、プロリン、またはバリン；
Ａｓｐ１４７で：グルタミン、ロイシン、セリン、アルギニン、グルタミン酸、リシン、スレオニン、グリシン、メチオニン、トリプトファン、アスパラギン酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、システイン、イソロイシン、プロリン、またはバリン；
Ａｓｐ１６３で：グルタミン、ロイシン、セリン、アルギニン、グルタミン酸、リシン、スレオニン、グリシン、メチオニン、トリプトファン、アスパラギン酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、システイン、イソロイシン、プロリン、またはバリン；または
Ｓｅｒ２１５で：グルタミン、ロイシン、セリン、アルギニン、グルタミン酸、リシン、スレオニン、グリシン、メチオニン、トリプトファン、アスパラギン酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、システイン、イソロイシン、プロリン、またはバリン
が含まれる。
【００４０】
変更には欠失（例えば、ΔＨｉｓ１４１、ΔＡｓｐ１４７、ΔＡｓｐ１６３、ΔＳｅｒ２１５、およびΔＴｒｐ２６４および挿入も含まれる。本発明に用いられるカプシドタンパク質は、一つ、二つ、三つまたはそれを超えるこのような変異を含みうる。
【００４１】
いくつかの実施形態においては、カプシドタンパク質の３’末端（Ｔｒｐ）または糖タンパク質セリン残基の５’末端（Ｍｅｔ−Ｓｅｒ）のいずれかまたは組み合わせの、カプシド切断部位に変異が導入される（図３を参照されたい）。主要な残基（例えばカプシドＷ２６４およびＧｌｙ  Ｓｅｒ２）を欠失させてもよい。カプシド自己触媒部位が異なる株間で保存されるため、様々なアルファウイルスベースのシステムにこの戦略を用いうる（例えばシンドビス、ＳＦＶ、およびＶＥＥ；図４を参照されたい）。
【００４２】
本開示に引用される全ての特許、特許出願、および参考文献は、参照により特に本明細書に組み込まれる。上記の開示は、一般に本発明を説明する。説明のみを目的として提供され、本発明の範囲を制限することを意図しない以下の具体的実施例を参照することで、より完全な理解を得ることができる。
【実施例】
【００４３】
実施例１
二つのサブゲノムプロモータを含むＤＨカセットの制御下の異種タンパク質発現の改善
サブゲノムプロモータ下でアルファウイルスｎｓＰ１−４をコードするＤＨ発現カセットは、レプリコンによりいったん誘導されると自立複製の特性を有する。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をリポータシステムとして用いた予備的結果は、そのようなコンストラクトがＧＦＰ陽性細胞の割合において３〜４倍の増加および平均蛍光強度における類似の倍率の増加を提供することを示した（表１を参照されたい）。
【００４４】
【表１】
0005627464.tif 000002
実施例２
カプシド変異体
部位特異的変異誘発を用いて、以下のカプシド変異体：Ｈｉｓ１４１Ａｌａ、Ａｓｐ１４７Ａｌａ、Ｓｅｒ２１５Ａｌａ、Ｔｒｐ２６４Ａｌａ、および様々な複合変異体（ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｍｕｔａｎｔ）を生成した。配列決定により変異誘発を確認した。それらが組換えアルファウイルス粒子産生を干渉するかをテストするために、二つの分割されたカセットＲＮＡ（ＶＣＲ−ＤＨ−Ｓｃａｐ、ＶＣＲ−ＤＨ−Ｓｇｌｙ）に変異が組み込まれた。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｓｐ６−転写ＲＮＡ（野生型または変異カプシドＲＮＡ、糖タンパク質ＲＮＡ、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レプリコンＲＮＡ）を、ＢＨＫ−ｖ細胞にエレクトロポレーションした。２０時間後に上清を採取し、ナイーブＢＨＫ細胞を感染させるために用いた。１８時間後に、ＦＡＣＳ分析を行って、レプリコンＧＦＰ粒子の力価を決定した。結果が、表２および３に示される。
【００４５】
【表２】
0005627464.tif 000003
結果は、Ｈ１４１Ａ、Ｄ１４７Ａ、およびＳ２１５Ａ変異がレプリコン粒子力価に影響せず、様々な複合変異体が野生型と比較して類似のレベルの粒子産生を有することを示す。
【００４６】
実施例３
シングルおよびダブルサブゲノムプロモータ発現コンストラクトの比較
本実施例は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を目的のタンパク質として用いて、本発明のダブルサブゲノムプロモータ発現コンストラクトが、サブゲノムプロモータを一つだけ用いるコンストラクトよりも多くの目的タンパク質を産出することを実証する。
【００４７】
ＢＨＫ−ｖ細胞を６−ウェルプレートに成長させ、１０％ガンマ線−照射ウシ胎仔血清、１％抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）、および１％ピルビン酸ナトリウム（Ｃｅｌｌｇｒｏ）を補充したダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｃｅｌｌｇｒｏ，Ｖｅｒｍｏｎｔ，ＶＡ）で維持した。ＶＥＥ欠損ヘルパープラスミドＤＮＡ（シングルサブゲノムＧＦＰ転写産物をコードするＶＣＰ−ｎｆ３．１−ＧＦＰ、およびダブルサブゲノム転写産物ＧＦＰおよびＮｓｐ１−４をコードするＶＣＰ−ＰｓｕｂＧＦＰ−ＰｓｕｂＮｓｐ１−４）を、ウェルあたり２μｇのＬＴ１トランスフェクション薬剤（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ）用いてＢＨＫ−ｖ細胞にトランスフェクションした。細胞をトランスフェクション後４８時間増殖させ、安定した組換えＢＨＫ−ｖ細胞系統の選択および維持のために、ジェネテシン（Ｇ４１８硫酸塩、硫酸ネオマイシンアナログ；Ｃｅｌｌｇｒｏ）を増殖培地中６００μｇ／ｍｌで加えた。両方の形質移入物からプールを集め、６−ウェルプレートに成長させた。ＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２．１−ｇｐ１２０レプリコン粒子を用いて、ＭＯＩ５でプールを感染させ、感染の２４時間後に細胞を回収した。ＦＡＣＳ分析を行って、ＧＦＰ陽性の比率を決定した。各コンストラクトにつき二通り（または四通り）の実験の結果が、表３に示される。
【００４８】
表３に列挙されるコンストラクト「ＶＣＰ−ｎｆ３．１−ＧＦＰ」は、サブゲノムプロモータを一つだけ含む。コンストラクト「ＶＣＰ−Ｐｇｆｐ−Ｐｎｓｐ−ＩＲＥＳｎｅｏ」は、図１の真ん中のコンストラクトである。「ＶＣＰ」は、ＶＥＥ  ＣＭＶプロモータプラスミドを表し；「Ｐｇｆｐ」は、ＧＦＰコード領域を伴うサブゲノムプロモータを表し；「Ｐｎｓｐ」は、Ｎｓｐ１−４コード領域を伴うサブゲノムプロモータを表し；「ＩＲＥＳ」は、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳにより駆動されるネオマイシンを表す。
【００４９】
【表３】
0005627464.tif 000004
【図１】
0005627464.tif 000005
【図２】
0005627464.tif 000006
【図３】
0005627464.tif 000007
【図４】
0005627464.tif 000008
【図５Ａ】
0005627464.tif 000009
【図５Ｂ】
0005627464.tif 000010
【図５Ｃ】
0005627464.tif 000011
【図５Ｄ】
0005627464.tif 000012
【図５Ｅ】
0005627464.tif 000013
【図５Ｆ】
0005627464.tif 000014
【図５Ｇ】
0005627464.tif 000015
【図５Ｈ】
0005627464.tif 000016
【図５Ｉ】
0005627464.tif 000017
【図５Ｊ】
0005627464.tif 000018
【図５Ｋ】
0005627464.tif 000019
【図５Ｌ】
0005627464.tif 000020
【図６】
0005627464.tif 000021
【配列表】
0005627464000001.app
0005627464000002.xml