(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
αＶβ３とαＶβ５インテグリンリガンドペプチド、結合ペプチド及び腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドからなる腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の融合タンパク質であり、前記結合ペプチドは２〜２０のアミノ酸残基であり、前記インテグリンリガンドペプチドは、ＡＣＤＣＲＧＤＣＦＣであることを特徴とする腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体。
【請求項２】
請求項１に記載の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の製造方法であって、人工合成又は遺伝子のクローンにより腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体のコーディング遺伝子を構築し、従来の遺伝子工学的手法を用いて当該コーディング遺伝子の遺伝子工学的発現及び分離・精製を達成する、ことを特徴とする腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の製造方法。
【請求項３】
大腸菌において、請求項１に記載の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の可溶性発現の方法であって、前記腫瘍組織標的性の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の組み換え大腸菌の発現菌株を低温で培養及び誘発を行い、最終的に発現生成物が封入体を形成することを有効に回避し、その際の低温とは３５℃〜１０℃である、ことを特徴とする大腸菌における腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の可溶性発現の方法。
【請求項４】
前記腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体を、腫瘍治療薬物を製造するために用いることを特徴とする請求項１に記載の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の用途。
【請求項５】
ハンドル状構造を有し且つＲＧＤ配列を含有するペプチド、結合ペプチド及び腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドからなる腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の融合タンパク質であり、前記結合ペプチドは２〜２０のアミノ酸残基であり、前記ハンドル状構造を有し且つＲＧＤ配列を含有するペプチドは、ＡＣＤＣＲＧＤＣＦＣであることを特徴とする腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体。
【請求項６】
請求項５に記載の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の製造方法であって、前記人工合成又は遺伝子のクローンにより腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体のコーディング遺伝子を構築し、従来の遺伝子工学的手法を用いて当該コーディング遺伝子の遺伝子工学的発現及び分離・精製を達成することを特徴とする腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の製造方法。
【請求項７】
大腸菌において、請求項５に記載の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の可溶性発現の方法であって、前記腫瘍組織標的性の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の組み換え大腸菌の発現菌株を低温で培養及び誘発を行い、最終的に発現生成物が封入体を形成することを有効に回避し、その際の低温とは３５℃〜１０℃であることを特徴とする請求項６に記載の大腸菌における腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の可溶性発現の方法。
【請求項８】
請求項５に記載の前記腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体を、腫瘍治療薬物を製造するために用いる請求項５に記載の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドとインテグリンリガンドからなる融合タンパク質及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL)は、腫瘍壊死因子スーパーファミリーのメンバーである。腫瘍壊死因子スーパーファミリーのその他のメンバーと類似し、可溶性形状の腫瘍壊死因子関連リガンドは、三量体形状で標的細胞表面の三量体化のアダプター分子と結合することにより生物学的機能を果たす。腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドのアポトーシス誘導作用は腫瘍細胞上の死受容体４と死受容体５との相互作用で死亡信号を送達することにより達成する。腫瘍壊死因子スーパーファミリーのその他のメンバーは、全身性毒副作用を有することにより、応用が制限されているが、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドは、比較的安全で、腫瘍選択性を有する抗腫瘍物質である。腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドは、体外で複数の腫瘍細胞及び癌細胞のアポトーシスを誘導することができ、かつハツカネズミに異種腫瘍を移植し、結腸癌、乳腺癌、多様性骨髄腫、神経膠腫、前立腺癌などを含める複数のモデルでは、良好な抗腫瘍活性を有する。特に、ハツカネズミ及び非ヒトの霊長類の動物に全身投薬するとき、TRAILは僅かな毒性又は無毒性を呈する。以上の理由に鑑み、組み換え腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドについては、既に腫瘍治療の臨床研究を行った。
【０００３】
しかし、最近の報告によれば、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドは、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導すること以外に、先天免疫及び適応免疫に関し、自己免疫疾患に関与する。例えば、最近の研究報告によれば、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドは、胸腺の発育過程において、負の方向性選択を調節し、又は胸腺細胞のアポトーシスを誘導し、かつ自己免疫疾患、例えばI型糖尿病を誘発することに大きく関与する。また、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの受容体は、全身に広範に発現され、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドが肝細胞死及び肝炎に関与する。従って、臨床で高投与量の外因性の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドタンパク質を重複、全身的に使用することによって、予測できない免疫結果となる。これらの報告から科学者は腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドが臨床で重複して、または持続して使用されるときに生じる潜在的な副作用を心配する。腫瘍治療のとき、如何に腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドのその他の組織に対する毒副作用を回避するかということは、TRAILを潜在的な臨床応用に使用する時直面する難しい課題である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
野生型腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドが腫瘍治療面で直面する欠陥を克服するために、本発明の目的は、腫瘍組織標的性の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体を発現し、それを腫瘍組織に標的導入させ、これによって腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの治療効果を向上し、その毒副作用を低減することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記の目的を達成するために、本発明の技術的解決手段は、遺伝子工学的手法によって、αVβ３とαVβ５インテグリンリガンド、結合ペプチド及び腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドからなる腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の融合タンパク質を構築し、即ち、従来の遺伝子工学的手法を用いて人工合成又は遺伝子のクローンにより腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体のコーディング遺伝子を構築し、可溶性的組み換え発現及び簡易的分離・精製を達成する。
【０００６】
さらに、αVβ３とαVβ５インテグリンリガンドは、RGD配列を含有するポリペプチドであることができる。
【０００７】
さらに、αVβ３とαVβ５インテグリンリガンドは、ハンドル状構造を有する、RGD配列を含有するポリペプチド、例えばペプチドACDCRGDCFCであることができる。
さらに、αVβ３とαVβ５インテグリンリガンドと、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドとを結合ペプチドにより結合させ、結合ペプチドは２〜２０のアミノ酸残基である。
【０００８】
さらに、αVβ３とαVβ５インテグリンリガンドと、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドからなる腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体は腫瘍治療に応用する。
【０００９】
さらに、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体と、既存の化学治療、放射治療、漢方薬治療及び生物治療などの方法を腫瘍治療に併用する。
さらに、大腸菌における高含有量の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体及びその変異体の重合体を可溶性発現し、及び簡易的分離・精製する方法である。現在腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドは、大腸菌において多くの生物活性を有しない封入体生成物を発現されるにかかわらず、本発明中の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の分子構造及び分子量は、野生型腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドよりより複雑である。従って、大腸菌において発現されたとき、その封入体の形成はより難しくなり、精製はより複雑となる。本発明は、低温下で腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体を培養及び誘発する発現方法を用いて、発現生成物の封入体の形成を有効に回避した。本発明は、同時に腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドが金属イオンをキレートする生物機能を利用し、金属親和クロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーとを結合することにより腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体を有効的な精製をしており、高純度のタンパク質生成物を得ており、かつ精製生成物が高割合の重合体形状を有する。従って、非常に良い生物活性を有する。その低温は３５℃〜１０℃である。
【００１０】
インテグリンαVβ３とαVβ５は、休眠期細胞及び正常血管細胞での発現量が極めて低く、そして複数の腫瘍細胞（例えば黒色腫、結腸癌、乳腺癌、子宮癌）及び腫瘍血管内皮細胞の発現量が顕著に向上する。上記αVβ３とαVβ５インテグリンリガンド、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドからなる腫瘍組織標的性の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体は、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドが腫瘍組織における分布を大幅に向上し、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの腫瘍組織における標的導入を達成し、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの抗腫瘍効果を大幅に向上すると同時に、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの用量を顕著に低減する。
【００１１】
既存の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体と比較して、本発明は以下の明らかな特徴及び創意工夫がある。
【００１２】
（１）より良い腫瘍組織標的性：既存の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの腫瘍組織に対する相対の選択性的作用は、主に腫瘍組織で発現した死受容体４及び死受容体５を利用することにより表示して達成するが、本発明の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体は、腫瘍組織で発現した死受容体４及び死受容体５を利用すること以外に、腫瘍組織が高発現されたαVβ３とαVβ５インテグリンの特徴を利用し、さらに腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドが腫瘍組織における標的導入を有効に達成した。
【００１３】
（２）より効果的な抗腫瘍効果：腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドが腫瘍組織における標的供給を達成したことによって、本発明の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体と、同じ投与量の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドと比較して、単独に使用しても、既存の化学治療、放射治療、漢方薬治療及び生物治療などの方法と併用しても、すべてより良い抗腫瘍効果を有することを示している。
【００１４】
（３）より少ない使用量：腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体は、同じ投与量の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドよりより良い抗腫瘍効果を有するので、使用時に同じ抗腫瘍の治療効果を保証する場合、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体のタンパク質の用量を大幅に低減する。腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体のタンパク質の投薬量の低減により腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの腫瘍治療における副作用を克服することができると同時に、低減できるという手段は大きな応用前途を有し、腫瘍患者の治療費を低減することができ、効果的、低毒副作用で、低コストである腫瘍治療効果を達成する。
【００１５】
（４）発現及び製造に便利：腫瘍細胞特異抗体及び抗体の断片の標的腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの融合タンパク質と異なるのは、本発明が腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドをαVβ３とαVβ５インテグリンのペプチドリガンドと融合させ、分子量をあまり増加ぜず、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の遺伝子のクローン、発現及び製造に更に有利になり、生産量がより高くなる。
【００１６】
（５）可溶性発現及び簡易的分離精製：現在腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドは、大腸菌において発現されたとき、生物活性を有しない封入体生成物を形成するかどうかにかかわらず、本発明の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド組み換えの分子構造及び分子量は野生型腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドよりより複雑である。従って、大腸菌において発現されたとき、その封入体の形成はより難しくなり、精製はより複雑となる。本発明は、低温下で腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体を培養及び誘発する発現方法を用いて、発現生成物の封入体の形成を有効に回避した。本発明は、同時に腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドが金属イオンをキレートする生物機能を利用し、金属親和クロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーとを結合させることによって、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体を有効的な精製をしており、高純度のタンパク質生成物を得ており、かつ精製生成物が高割合の重合体形状を有する。従って、非常に良い生物活性を有する。本発明は、重合体の含有量を有効的発現、及び効果的に獲得する腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体の発現方法及び精製プロセスを提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】精製した組み換え腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及び変異体１A．SDS-PAGEの分析結果：  １．分子量の基準。２．ヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド。３．ヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体。１B．非還元、非変性PAGE分析結果：  １．ヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド。２．ヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体。
【図２】腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体は、ヒトの包皮毛細血管内皮細胞の接着及び付着を促進する実験（拡大２００）２A．ヒトの包皮毛細血管内皮細胞を６．４μg/mlのヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体がコーティングされた培養オリフィスに接着及び付着する。２B．ヒトの包皮毛細血管内皮細胞を６．４μg/mlのヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドがコーティングされた培養オリフィスに接着及び付着する。
【図３】フローサイトメトリーにて緑色蛍光色素標識のヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体が腫瘍動物モデル体内に腫瘍細胞との結合を分析。腫瘍動物モデル：COLO-205腫瘍細胞のBALB/c  nu/nuを接種したヌードマウス。ヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体RGD-L-TRAIL-FITC（黒灰色線、スペクトログラム中空ピーク）、ヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（黒色線、スペクトログラム中空ピーク）、比較タンパク質BAS-FITC（薄灰色線、スペクトログラム中空ピーク）をそれぞれ担癌のハツカネズミの尾静脈に注射する。３０分後、腫瘍組織を剥離し、細胞懸濁液を製成してフローサイトメトリーにて分析する。陰性比較（黒色線、スペクトログラム中実ピーク）いかなるタンパク質の注射していない腫瘍動物から取られる。
【図４】アネキシン（Annexin V）及びヨウ化ピリジン（PI）二重染色法にてヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体（2.43ng/ml）がCOLO-205細胞アポトーシスを誘導する能力を測定する。１．比較。２．ヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド。３．ヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体。
【図５】ヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体の用量と、各種の腫瘍細胞アポトーシスを誘導する効果との関係を分析。５A：COLO-205細胞。５B：Jurkat細胞。５C：MDA-MB-231細胞。
【図６】ヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体の、COLO-205腫瘍モデルにおける単独治療、及びCPTとの併用治療の抗腫瘍効果。６A：ヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体の単独治療。６B：ヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体とCPT-11との併用治療。データ統計解析の結果を平均値で表示。差異は標準誤差。星印＊はｐ＜０．０５を表示。二つの星印＊＊はｐ＜０．０１を表示。
【図７】ヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体の、HT-29結腸癌の腫瘍モデルにおける単独治療、及びCPT-11との併用治療の抗腫瘍効果。データ統計解析の結果を平均値で表示。差異は標準誤差。星印＊はｐ＜０．０５を表示。二つの星印＊＊はｐ＜０．０１を表示。
【図８】ヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体の、COLO-205腫瘍動物モデルにおける腫瘍組織の標的を高める効果を比較分析。COLO-205の担癌のヌードマウスの尾静脈にそれぞれ１００μl/５μCi125I-標識のヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体タンパク質を注射する。注射した５、３０、６０、１２０及び２４０分後、腫瘍組織をそれぞれ剥離して計量する。シンチレーションカウンターにて腫瘍組織同位体の放射量を測定し、腫瘍組織の放射量単位は、各グラム組織の測定した放射量と注射した放射量とのパーセント（％ID/ｇ）である。全ての結果は三回の独立実験の平均値である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
【実施例】
【００１９】
（１）腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の遺伝子のクローン、発現及び精製
野生型腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの遺伝子は、ヒト胎盤から得られた信号によりRNAを逆転写させて獲得したものである。ACDCRGDCFCペプチドを融合した腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体遺伝子のPCRプライマーは以下である。即ち、プライマー1：5’-TGCAGATCATATGGCATGCGACTGCCGTGGTGACTGCTTCTGCGGTGGTGGTGGTGGTGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAG-3’。プライマー２：5’ATGGATCCTTAGCCAACTAAAAAGGCCC-3’。PCR反応によりACDCRGDCFCペプチド、及び五つのアミノ酢酸からなる結合ペプチドをコーディングした腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体（RGD-L-TRAIL）遺伝子が得られた。腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体（RGD-L-TRAIL）の遺伝子クローンは、Novagen会社のｐET-23a発現担体にある。得られる組み換え発現型プラスミドは、大腸菌BL21（DE3）中にて発現する。腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体RGD-L-TRAILの可溶性発現を得るために、発現条件は以下の通りである。即ち、一夜で増殖した組み換え発現型菌をLB培養基に１００倍稀釈させ、３７℃で２.５時間培養した。そして、再び２４℃で１〜２時間培養し、２４℃下でIPTGを０.６mMまで加える。そして、２４℃下で細菌を一夜誘発する。細菌を遠心した後、溶解液（燐酸ナトリウム５０mM、塩化ナトリウム０.５M、ジチオスレイトール１mM、ｐH７.６）に浮遊し、超音波により破壊する。組み換え腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体RGD-L-TRAILタンパク質は、Ni-NTAアガロース・ゲル媒質（Qiagen会社）により分離・精製し、グリオキサリン６０mMを収集してピークを溶出する。そして、SP-Sepharose陽イオン樹脂にてさらに精製する。実験中で使用した水は全て内毒素を除去した超純水であり、タンパク質の定量は南京建成生物工程研究所より提供されたBCAタンパク質実験キットにて測定する。腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体の純度及び分子量は、SDS-PAG電気泳動銀染色法を用いて測定し、分子量はマススペクトルにより分析鑑定する（Applied  Biosystems  4700  Proteomics  Analyzer）。
【００２０】
（２）ヒトの包皮毛細血管内皮細胞の接着試験
腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体タンパク質をポリ塩化ビニル９６オリフィス板上に４℃で一夜コーティングする。コーティングされた９６オリフィス板を０.９％の生理塩水で洗浄し、再び子牛血清アルブミンを２％含有する１６４０培養基に室温で１時間密閉し、そして、再び洗浄する。ヒトの包皮毛細血管内皮細胞が消化した後、リン酸緩衝液を用いて三回洗浄した後に完全なRPMI1640培養基に再浮遊させる。そして、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体がコーティングされた９６オリフィス板中（各孔に４万細胞）に加える。細胞を二酸化炭素が５％含有の培養箱に３７℃で１.５時間培養させた後、生理塩水で三回水洗し、付着しない細胞を洗い流し、付着した細胞をホルマリン４％と蔗糖２％を含有するリン酸緩衝液（ｐH７.３）を用いて室温で３０分固定させる。そして、クリスタル・バイオレット０.５％で染色する。固定された染色された細胞を数回洗浄する。そして、１００μlのジメチル・スルホキシドで溶解させ、５４０nmの吸光度を測定する。全ての実験を少なくとも三回独立に繰り返す。
【００２１】
（３）腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体と、内皮細胞とを結合する実験
腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体にそれぞれ蛍光色素（Sigma会社）にて標識を行い、標識されたタンパク質はSephadex-G25分子篩により遊離する蛍光色素を除去する。ヒトの包皮毛細血管内皮細胞がトリプシンにより消化した後、ウシ胎盤血清を２％含有する冷たいリン酸緩衝液で二回洗浄する。そして、再浮遊させ、１μgの標識タンパク質を加え、４℃で氷状態の培養を１時間行う。実験は蛍光色素にて標識した子牛血清アルブミンと比較する。染色された細胞を三回洗浄した後、フローサイトメトリー（Becton  Dickinson会社）にて結合能力を分析する。
【００２２】
（４）インテグリンの発現分析
細胞表面のインテグリン発現量は間接標識法を用いてフローサイトメトリーにて分析測定する。消化された細胞はウシ胎盤血清を２％含有する冷たいリン酸緩衝液で二回洗浄し、細胞を再浮遊させた後、氷上でそれぞれ下記のモノクローナル抗体を１時間コーティングする。抗ヒトαVβ３インテグリン抗体MAB  23C6（eBioscience会社）又は抗ヒトαVβ５インテグリン抗体MAB  1961（Chemicon  International会社）である。陰性比較は精製した同型ネズミ免疫グロブリンG（eBiosience会社）を用いる。一次抗体がコーティングされた細胞を二回洗浄した後、緑色蛍光色素カップリングのヤギ抗マウス免疫グロブリンG1（γ）（Caltag  Laboratories会社）を加え、二次抗体に光を避けた状態で３０分標識させる。そして、三回洗浄し、ホルマリンを４％含有するリン酸緩衝液を用いて固定させ、最後にフローサイトメトリーにてインテグリン発現量を測定・分析する。全ての実験を少なくとも三回独立に繰り返す。
【００２３】
（５）アネキシン（Annexin V）及びヨウ化ピリジン（PI）二重染色法にて細胞アポトーシスを測定
腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体により処理された細胞をトリプシンによって消化した後、培養板上から吸出し、リン酸緩衝液で二回洗浄し、３００g遠心力の下で５分遠心させ、上清を取り除く。そして、１００μlの結合緩衝液を用いて再浮遊させ、最終濃度が２μg/mlであるAnnexin  V-FITC（BD  Pharmgen会社）を加え、室温で培養を行い、１０分後、４００μlの結合緩衝液を補充し、細胞をフロー分析管内に移し、各フロー分析管にヨウ化ピリジン（Sigma会社）を１μg加える。細胞を３０分内にフローサイトメトリーにて分析を行う。各細胞系は実験を少なくとも三回繰り返す。
【００２４】
（６）Caspase-8及びCaspase-3酵素活性の測定
Caspase-8及びCaspase-3酵素活性の測定は、蛍光実験キットにて測定する（Oncogene会社）。実験方法はメーカーが提供された方法に従う。蛍光はマイクロプレートリーダーにて測定する。蛍光のパラメーターは励起波長が４００nm、発光波長が５０５nmである。
【００２５】
（７）腫瘍動物モデルの抗腫瘍治療効果の実験
５〜６週齢のメスヌードマウスは上海実験動物センターより購入する。まず、ヌードマウスの尾静脈に１００μgの閉鎖型ナチュラルキラー細胞の特異抗体が精製されたAsialo  GM-１抗体（日本Wako  Chemicals会社）を注射する。２４時間後、ヌードマウスの背中の右上側に１０万個のCOLO-205又はHT-29結腸癌細胞を皮下注射する。腫瘍が７０mm３を達成したとき、ランダムにクループ分けを行い、治療を始める。組み換え腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体タンパク質は、腹腔から投薬し、一日一回で、１０〜１４日継続する。水溶性のカンプトセシンCPT-11（11-ヒドロキシル・ラジカル-カンプトセシン。商品名：カプト。Pharmacia/Upjohn会社の製品）を週一回静脈に投薬し、合計二回投薬する。組み換えタンパク質及びカンプトセシンは、全てリン酸緩衝液にて稀釈する。腫瘍の大きさはノギスにて測定を行い、計算式は、（長さ×幅）２/２である。
【００２６】
（８）組み換えタンパク質は腫瘍組織における薬物分布の実験
組み換え腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及び腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体タンパク質は、それぞれ放射性同位体ヨウ素125標識キット（Pierce会社）にて標識を行う。標識の結果は、125I-腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの比活性度は、７.８６μCi/μgタンパク質であり、125I-腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の比活性度は、７.４９μCi/μgタンパク質である。ヌードマウスに結腸癌COLO-205を接種した後、腫瘍の大きさが４００〜５００mm３に達成した後にランダムにクループ分けを行い、野生型クループ及び変異体クループに分け、各グループに５、３０、６０、１２０、２４０分の五つの時間を設定し、各時間に三体の動物に実験を行う。各担癌のヌードマウスに５μCi/１００μlの標識タンパク質を注射する。各時間帯にハツカネズミを殺し、手術にて腫瘍を剥離して計量する。シンチレーションカウンターにて放射量を測定する。腫瘍組織の分布は、各グラム組織に含有された放射量のパーセント（もと注射した放射量のパーセントに対する）で表示する（％ID/ｇ）。
【００２７】
（９）体内における組み換えタンパク質と腫瘍組織との結合実験
腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体と、子牛血清アルブミンとを緑色蛍光色素で標識する。標識されたタンパク質はゲル分子篩Sephadex-G25により遊離する蛍光色素を除去する。腫瘍が４００〜５００mm３の大きさに増殖した担癌のネズミの尾静脈に５００μgの蛍光色素にて標識したタンパク質を注射し、注射した３０分後にハツカネズミを殺し、腫瘍を剥離し、腫瘍細胞の単細胞懸濁液を作製し、生理塩水にて数回水洗を行い、６万個細胞を取ってフローサイトメトリーにて測定し、組み換えタンパク質が腫瘍細胞表面における結合状態を分析する。
【００２８】
（１０）統計解析
データ統計は社会科学データパケットソフトウェアにて統計解析を行う。全ての実験を少なくとも三回繰り返す。細胞のアポトーシス及び接着実験の結果は平均標準偏差にて表示し、腫瘍の大きさは標準誤差にて表示する。P値＜０．０５の場合、顕著性の差異となり、P値＜０．０１の場合、極めて顕著な差異となり、それぞれ一つ又は二つの星印を用いる。
【００２９】
従来の報告では、野生型腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドが大腸菌において発現されたとき、常に生物活性を有しない封入体生成物として存在する。本発明の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体は、四つのシステイン（即ち二つのジスルフィド結合を増加）を増加させ、当該変異体は、大腸菌において発現されたとき、野生型腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドより生物活性を有しない封入体生成物をより容易に形成し、精製がより困難になる。本発明は、発現条件及び分離精製過程を最適化にすることによって、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体とも可溶性形状にて発現することをうまく実現し、かつニッケル親和カラム及び陽イオン樹脂の精製によって、生物活性を有する高純度の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体タンパク質が得られ、収率は６０mg/lである。１５％変性還元の条件の下でポリアクリルアミドゲルの電気泳動銀染色法にによる分析及びマススペクトル配列分析ともに発現生成物の正確性を証明する（図１A）。かつ、本発明の発現条件及び精製プロセスの下で、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体の重合体が非常に高い割合で形成された。これは腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの発現及び精製における同様な作業ではめったに見られない。
【００３０】
腫瘍壊死因子スーパーファミリータンパク質は、全てモノマー、二量体及び三量体を形成する特徴を有し、かつそれらの生物学的活性は二量体及び三量体形状に依存し、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドも例外でない。ACDCRCFC構造ドメインを融合した後、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体重合体の形成能力に対して影響を及ぼすか否かを検出するためである。非変性非還元のポリアクリルアミドゲルの電気泳動分析によれば、組み換え腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体タンパク質は、重合体形成の能力を有する。結果によれば、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体タンパク質とも分子量が約２０，０００、４０，０００及び６０，０００ダルトンの三つのバンドを有し、この三つの分子量のバンドはモノマー、二量体及び三量体に対応する（図１B）。さらに、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体タンパク質のモノマー、二量体及び三量体の組成パーセントは殆ど同じである。これは、本発明が発現、精製された腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体タンパク質が正確な空間構造を確実に有し、従来報告された大腸菌にて発現したTRAILよりより良い生物活性を有する。
【００３１】
ACDCRGDCFCは二つのジスルフィド結合を形成でき、環状構造を有し、RGD配列を含有するαVβ３とαVβ５インテグリンリガンドであり、単純のRGD配列よりより良いインテグリンαVβ３とαVβ５の親和性及び選択性を有する。本発明の結果によれば、ヒトの包皮毛細血管内皮細胞はTRAILをコーティングした培養オリフィス板に接着及び付着しないが、αVβ３とαVβ５インテグリンリガンドを融合したTRAILの変異体は、ヒトの包皮毛細血管内皮細胞をTRAILがコーティングされた培養オリフィス板に接着及び付着することを表現し、かつ投与量に依頼性を呈する（図２）。TRAIL変異体中のαVβ３とαVβ５インテグリンリガンドペプチドはTRAILに内皮細胞を接着及び付着する能力を賦与することが表明された。
【００３２】
上記腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体タンパク質がコーティングされた培養オリフィス板に遊離のRGD-L-TRAIL、RGD-L-TRAIL（C230G）（TRAIL活性中心が突然変異を生じ、TRAIL生物活性を有しない、αVβ３とαVβ５インテグリンリガンドを融合したTRAILの変異体である）及びTRAILが含有されるタンパク質を加え、競合試験を行う。実験の結果によれば、RGD-L-TRAIL又はRGD-L-TRAIL （C230G）タンパク質は、ヒトの包皮毛細血管内皮細胞がRGD-L-TRAILをコーティングしたマイクロオリフィス板に接着及び付着する数量を顕著に減少させるが、TRAILはこの能力を有しない。
【００３３】
本発明は、インテグリンαVβ３とαVβ５受容体について標的を設計し、まず、内皮細胞及び腫瘍細胞表面のαVβ３とαVβ５インテグリンの発現状況を分析する。フローサイトメトリーの分析結果によれば、ヒトの包皮毛細血管内皮細胞表面にインテグリンαVβ３とαVβ５の発現レベルは最も高い。そのほかに以下のことに注意を払わなければない。複数の腫瘍細胞は異なる程度のインテグリンαVβ３とαVβ５の発現を有し、その中Tリンパ腫細胞Jurkatが中等量のインテグリンαVβ３とαVβ５を発現する。結腸癌細胞COLO-205インテグリンαVβ３の発現量が弱いが、インテグリンαVβ５の発現レベルは相対的に高い。乳腺癌細胞MDA-231はインテグリンαVβ３を発現せず、かつインテグリンαVβ５の発現レベルも低い。
【００３４】
われわれは蛍光色素標識の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体とヒトの包皮毛細血管内皮細胞との直接結合能力をさらに評価する。フローサイトメトリーの測定結果によれば、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体がヒトの包皮毛細血管内皮細胞における結合は、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドより遥かに高い。これらの結果によれば、インテグリンαVβ３とαVβ５リガンドペプチドは、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体と、血管内皮細胞との特異的な結合能力を顕著に向上した。
【００３５】
同時に、われわれは担癌のヌードマウスの体内におけるそれぞれ腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体の、癌細胞との結合の状況を評価する。蛍光色素標識の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体、陰性比較の子牛血清アルブミンを、それぞれCOLO-205腫瘍細胞を接種した担癌のハツカネズミの尾静脈に注射し、３０分後、ハツカネズミを殺し、腫瘍を剥離し、腫瘍細胞が蛍光色素標識の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体と結合する能力を分析する（図３）。結果によれば、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体は、野生型腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドよりより強い腫瘍細胞と結合する能力を有する。これらの結果によれば、インテグリンαVβ３とαVβ５リガンドペプチドは、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドと腫瘍組織との結合の特性を賦与し、かつその標的腫瘍の能力を向上した。
【００３６】
われわれはCOLO-205、Jurkat及びMDA-MB-231腫瘍細胞を用いて腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の腫瘍細胞アポトーシスを誘導する抗腫瘍活性を評価した。腫瘍細胞は一連の濃度勾配のTRAIL変異体又はTRAILにより誘導処理した後、Annexin  V-FITC及びPI二重染色法を用いて、フローサイトメトリーにて測定分析する。結果によれば、TRAILと比較して、COLO-205結腸癌細胞及びJurkat  Tリンパ腫細胞において、TRAIL変異体はより強い細胞アポトーシスを誘導する能力を有するが、乳腺癌細胞MDA-MB-231において、TRAIL変異体が細胞アポトーシスを誘導する能力は野生型TRAILより若干強い。例えば、COLO-205細胞に対して、２.４３μg/mlのTRAIL誘導腫瘍細胞アポトーシス量は４３.７％であるが、TRAIL変異体は同じ投与量の下で、８７.５％の細胞アポトーシス量を達成する（図４）。TRAILはCOLO-205、Jurkat及びMDA-MB-231細胞の半致死量はそれぞれ３.５、６.７及び２.３μg/mlであるが、TRAIL変異体が相応する半致死量はそれぞれ０.３７、０.４１及び１.２μg/mlに低減した。COLO-205、Jurkat及びMDA-MB-231の三種の細胞に対して、TRAIL変異体の投与量はそれぞれ９.５、１６.３４、１.９倍に低減した（図５）。TRAIL変異体は、より良い腫瘍細胞アポトーシスを誘導する能力を有する。
αVβ３とαVβ５インテグリン陽性発現の腫瘍細胞に対して、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体は、腫瘍細胞それ自体及び腫瘍血管細胞表面に標的導入することができる。本発明は、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体が腫瘍標的細胞のアポトーシスを顕著に向上することを発現した。COLO-205及びJurkat腫瘍細胞において、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体は、野生型腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド又はRGE-L-TRAIL突然変異体より腫瘍細胞アポトーシス活性を８〜１０倍向上する（図５）。この活性向上は、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体のαVβ３とαVβ５インテグリンリガンド構造ドメインがインテグリン受容体に選択的に結合するので、標的細胞表面腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の局所濃度を高め、変異体分子中の壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド部分をより容易、より頻繁及びより有効にTRAIL受容体に接近させ、細胞アポトーシス経路を活性化する信号を増強した。かつこの腫瘍細胞アポトーシス活性の増強の程度は、腫瘍細胞表面αVβ３とαVβ５インテグリン発現量によって決定し、量の高い場合、活性が増強する程度も高く、逆もまた然りである。例えば、MDA-MB-231細胞において、インテグリン発現量は相対的に低く、活性が２倍しか向上しない（図５）。これだけでなく、COLO-205結腸癌細胞に対して、予めACDCRGDCFC構造ドメイン完備であるが、TRAIL活性中心と突然変異を生じた競合阻害タンパク質RGD-L-TRAIL（C230G）を孵化させ、再びRGD-L-TRAILを用いて誘導処理を行い、結果としてRGD-L-TRAILのアポトーシスを誘導する活性は大幅に低下した。以上の結果によれば、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体RGD-L-TRAIL活性の向上は、ACDCRGDCFCの標的性によって得られた。蛍光色素にて標識した腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体を用いて毛細血管内皮細胞との結合を追跡する実験も、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体RGD-L-TRAILと毛細血管内皮細胞との親和力が非常に高いことを証明したが、蛍光色素にて標識したTRAILの毛細血管内皮細胞との結合を追跡して非常に弱い。さらに体内蛍光素標識と同位体標識の試験結果によれば、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体が腫瘍組織に存在し、特異的に高めている。
【００３７】
腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体中のACDCRGDCFCの構造ドメインをACDCRGECFC（RGE-L-TRAIL変異体）に突然変異させ、RGE-L- TRAIL変異体は、αVβ３及びαVβ５インテグリンとの結合能力を喪失した。実験結果によれば、RGE-L-TRAILとTRAILの活性とはほぼ同じであり、RGD- L-TRAIL活性との差が非常に大きい。
腫瘍細胞と異なり、正常なヒトの包皮毛細血管内皮細胞、293T腎細胞と初代肝細胞を３００μg/mlのTRAIL変異体又はTRAILにて２４時間処理しても、明らかな細胞毒性は見られない。これはTRAIL変異体が正常細胞と腫瘍細胞を区別することができ、腫瘍細胞アポトーシスを誘導することができるが、正常細胞に対して比較的に安全であることを表明した。
【００３８】
蛍光法を用いてTRAIL及びTRAIL変異体にて処理したJurkat細胞中のCaspase-8とCaspase-3の活性を測定した。処理した２時間後、同じ投与量の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドと比較して、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体はcaspase-8及びcaspase-3の活性をより高くし、それは野生型腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの２.５倍である。FADD-/- 及びCaspase-8-/- が突然異変したJurkat細胞では、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体とも細胞アポトーシスを誘導することを測定することができない。これはTRAIL変異体がTRAILと同じように受容――FADD-Caspase-8により細胞アポトーシスを誘導する役割を果たしているものである。
【００３９】
無胸腺ヌードマウスにCOLO-205及びHT-29の二種の結腸癌モデルにてTRAIL組変え体の抗腫瘍活性を測定する。COLO-205結腸細胞はTRAILに敏感であるので、まず、このモデルでTRAIL組変え体及びTRAILを単独に使用する治療効果を評価する。ヌードマウスが腫瘍を接種した八日目から尾静脈に投薬する。次の四組に分けて、十日間連続で投薬する。それぞれ１００μgTRAIL変異体組、２０μgTRAIL変異体組、１００μg野生型TRAIL組及びPBS比較組である。データを統計分析した結果によれば、PBS比較組と比較すると、１００μg野生型TRAILが腫瘍をわずかに縮小させ、３７日目の腫瘍抑制率は３７％（P＝０.０８）である。但し、１００μgTRAIL変異体組は腫瘍の増殖を顕著に抑制し、特に治療期間において効果がさらに明らかになり、１９日目の腫瘍抑制率は７０.４％（P＝０.００２）、３７日目の腫瘍抑制率は５６.８％（P＝０.０１６）である。これだけでなく、TRAIL変異体は腫瘍の増殖を抑制することが投与量の依存性を呈する。２０μgTRAIL変異体組は３７.１％（３７日目、P＝０.０４５）の腫瘍抑制率になり、５倍投与（１００μg）の野生型TRAIL変異体組より少し良い。
【００４０】
本発明は、TRAIL変異体と化学療法薬CPT-11との併用による抗腫瘍効果を検討した。毎日に一回TRAIL変異体又はTRAILを腹腔注射し、合計二週間注射する。二日間ごとに一回でCPT-11を静脈注射し、合計７回注射する。併用投薬組では、TRAILに敏感であるCOLO-205腫瘍モデルにおいて、比較的低い投与量のCPT-11（６.２５mg/kg毎/回毎）を選択し、異なる投与量のRGD-L-TRAIL（１００μg /毎日/各ネズミ又は３０μg /毎日/各ネズミ）又はTRAIL（２７０μg/毎日/各ネズミ又は９０μg/毎日/各ネズミ）と併用する。TRAILに抵抗性があるHT-29結腸癌モデルにおいて、比較的に高い投与量のCPT（２５mg/kg毎/回毎）を選択し、RGD-L-TRAIL（２００μg /毎日/各ネズミ）又はTRAIL（４００μg/毎日/各ネズミ）と併用する。図に示すように、COLO-205腫瘍モデルでは、PBS比較組と比較して、低投与量のCPT-11を単独に注射しても腫瘍の増殖を抑制する効果はわずかではっきりしない。但し、この投与量のCPT-11をRGD-L-TRAIL１００μgと併用すると腫瘍の増殖を抑制する効果は極めて顕著であり（９６.２％、P＝０.０００１、３６日目）、さらに高投与量のTRAILとCPT-11との併用治療組（２７０μg /毎日/各ネズミ）より効果は良い（８９％、P＝０.０００１、３６日目）。同様に、投与量（３０μg /毎日/各ネズミ）のRGD-L-TRAIL組の腫瘍抑制率（７７.１％、P＝０.００５、３６日目）は、投与量（９０μg /毎日/各ネズミ）のTRAIL組の腫瘍抑制率（６７.８％、P＝０.０１２、３６日目）よりより高い。記述するに値するのは、投与量（１００μg /毎日/各ネズミ）のRGD-L-TRAILとCPT-11との併用治療組では、３６日目後十匹の投薬ハツカネズミ中、八匹のハツカネズミの腫瘍が消滅した。投与量（２７０μg /毎日/各ネズミ）のTRAILとCPT-11との併用治療組では、十匹のハツカネズミ中、六匹のハツカネズミの腫瘍が消滅した。投与量（１００μg /毎日/各ネズミ）のRGD-L-TRAILとCPT-11との併用治療組の治療効果は、投与量（２７０μg /毎日/各ネズミ）のTRAILとCPT-11との併用治療組より明らかに良い。
【００４１】
TRAIL耐性のHT-29結腸癌モデルでは、RGD-L-TRAILを単独に使用するとき、毎日４００μg/各ネズミの高投与量を腹腔注射してもわずかな抗腫瘍効果しか見られない。但し、RGD-L-TRAILとCPT-11との併用治療のとき、腫瘍の増殖を顕著に抑制することができ、かつTRAILとCPT-11との併用治療より効果がより良い。RGD-TRAIL２００μgとCPT-11２５mg/kg毎との併用治療組は、RGD-TRAIL４００μgより抗腫瘍効果がより良いことを示す。これは同じ治療効果を達成するため、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の必要な投与量は、野生型腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドよりはるかに低いことを表している。従って、結果によれば、αVβ３とαVβ５インテグリンのペプチドリガンドACDCRGDCFCペプチドを、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドと融合させた後、その体内の抗腫瘍活性を顕著に高めた。
【００４２】
体内の動物モデルは、さらに腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体が野生型腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドよりより良い治療効果を有することを証明した。COLO-205腫瘍モデルでは、同じ投与量のタンパク質腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体は、野生型腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドより抗腫瘍効果を顕著に向上させ、さらに腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の投与量は、野生型腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの投与量の１/５の条件下で、その腫瘍抑制率が相匹敵する。これは腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドを腫瘍標的ペプチドと融合させた後、動物腫瘍モデル体内のレベルにおいてその抗腫瘍生物活性を確実に向上することができる。同様に、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体は、単独に使用するときに治療効果を向上するだけでなく、化学療法薬CPT-11と併用するとき、明らかな相乗効果を有し、治療効果は更に顕著である。腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体をCP-11と併用治療するとき、各自の使用量を低減することだけでなく、潜在的な全身性毒性を最小限にし、かつ元々腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドに敏感でなかった腫瘍の治療への応用にできる。TRAILに敏感であるCOLO-205モデルでは、低投与量の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体（１００μg /毎日/各ネズミ）を低投与量のCPT-11（６.２５mg /体重kg毎）と併用して、腫瘍の増殖を極めて顕著に抑制し、腫瘍を退縮させ、さらに一部的腫瘍を完全に消滅させる。併用治療法を使用して、同じ治療効果を達成するために、COLO-205モデルでは、野生型腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの必要な投与量が腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の３〜９倍である。TRAILに敏感でなかったHT-29モデルでは、野生型腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの必要な投与量は少なくとも腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体より２倍高くなる。体内動物実験により腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の治療効果は腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドより優れていることを十分に証明した。
【００４３】
腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体は、動物モデルにおける抗腫瘍活性の増強が腫瘍組織に標的を高めることができるためであることを実証するために、われわれはヨウ素１２５同位体にて標識した腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体RGD-TRAILが腫瘍組織における分布を測定した。同じ放射量のヨウ素１２５同位体にて標識した腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体をそれぞれCOLO-205の担癌のヌードマウスに注射し、注射した５、３０、６０、１２０及び２４０分後、ハツカネズミを殺し、腫瘍組織を剥離して計量し、それぞれシンチレーションカウンターにて同位体の放射量を測定する。結果によれば、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドTRAILは、αVβ３とαVβ５インテグリンのペプチドリガンドACDCRGDCFCペプチドを融合した後、TRAILタンパク質をCOLO-205腫瘍組織ドメインに標的を高める能力を明らかに増強した。注射した初期、125I-RGD-L-TRAILが腫瘍組織における分布は約125I-TRAILの２倍である。RGD-L-TRAILが腫瘍組織に対する親和力の増強、腫瘍組織における分布の増加により、RGD-L-TRAILが循環血液における除去速度を大幅に低減したので、腫瘍組織における分布を延長した。注射した２４０分後、TRAILが腫瘍組織における分布は基本的に既に検出し難くなるが、また相当多いRGD-L-TRAILが腫瘍部位に持続的に分布している。従って、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体が動物体内の腫瘍組織ドメインにおける分布の増加、及び動物モデル上で観察されたその抗腫瘍活性の増強という二つの事実とも、本発明に係る腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体が腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドより良い腫瘍標的性を賦与し、かつ投薬量を低減すると同時に、最終的に抗腫瘍効果を向上することを十分に証明した。
【００４４】
本発明は、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドにて腫瘍を治療する効果を向上する方法に関し、即ち腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドをαVβ３とαVβ５インテグリンリガンドと融合させ、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドを腫瘍部位へ直接導入する目的を達成し、抗腫瘍効果を顕著に増強したと同時に、治療効果が得られるのに必要なタンパク質投薬量を低減し、その生物の利用率を向上し、治療コストを低減し、最終的に腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの全身性毒副作用を低減及び克服し、腫瘍治療において良好な応用前途を有する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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