(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３に記載のアミノ酸配列からなる、単離または精製されたペプチド。
【請求項２】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３に記載のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列よりなる単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリヌクレオチドからなる形質転換細胞。
【請求項４】
請求項２に記載のポリヌクレオチドからなるように遺伝子工学によって作成されたウイルス性宿主。
【請求項５】
請求項２に記載のポリヌクレオチドからなるとともに、適当な宿主内において該ポリヌクレオチドの発現を制御する調節配列に作用的に連結される発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の発現ベクターからなる宿主細胞。
【請求項７】
虚血・再潅流障害、内毒素血症誘導急性呼吸困難症候群、免疫複合体型糸球体腎炎、細菌性肺炎および乳腺炎からなるグループから選んだＣＸＣケモカイン受容体媒介病状の治療のための薬剤の製造方法であって、請求項１に記載のペプチドを利用した薬剤製造方法。
【請求項８】
静脈配送、皮内配送あるいは皮下配送のために薬剤を配合する請求項７に記載の薬剤製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＣＸＣケモカイン受容体アンタゴニストの分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
受容体信号グルタミン酸−ロイシン−アルギニン（ＥＬＲ）モチーフ（例えばＣＸＣＬ１／ＧＲＯα、ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８；Ｍ・バジョリニ（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ）、１９９８年、ネイチャー３９２号５６５〜５６８頁）を所有するＣＸＣケモカインは、多くの固化における病状の多くを媒介する炎症性細胞の流入において重要であり、該病状は虚血・再潅流障害（Ｎ・セキドウ他、１９９３年、ネイチャー３６５号６５４〜６５７頁；Ｊ・ヴィラード（Ｖｉｌｌａｒｄ）他、１９９５年、アメリカン・ジャーナル・オブ・リスペレトリー・アンド・クリティカル・ケア・メディスン１５２号１５４９〜１５５４頁）、内毒素血症誘導急性呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ；Ｎ・ムカイダ他、１９９８年、インフレメーション・リサーチ４７号別冊３：Ｓ１５１〜１５７頁）、関節炎、および免疫複合体型糸球体腎炎（Ａ・ハラダ他、１９９６年、インフレメーション・リサーチ２号４８２〜４８９頁）を含む。例えば、活性化された好中球からの不適当に放出された加水分解酵素および反応性酸素種は、病的処理を開始および／あるいは永続させる。一方、大半の細菌感染において、このケモカイン反応は防御の限界第一線を示す。しかし、ＥＬＲ＋ＣＸＣケモカイン反応は、そのＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２受容体を示す炎症細胞の活性化能力により、病状を悪化させる。例えば、実験の盲腸穿刺および結紮セプシスにおいて、ＭＩＰ−２の中和によってマウスの死亡率が８５％から３８％へ減少した（Ｋ・Ｒ・ウォリー（Ｗａｌｌｅｙ）他、１９９７年、インフェクション・アンド・イミュニティー誌６５号３８４７〜３８５１頁）。また、循環する好中球を除去する実験的処理によって、肺性マンハイミオシス（ｍａｎｎｈｅｉｍｉｏｓｉｓ）の病状が改善される（Ｒ・スローカム（Ｓｌｏｃｏｍｂｅ）他、１９８５年、アメリカン・ジャーナル・オブ・ヴェテリナリー・リサーチ誌４６号２２５３頁）。気道でのＣＸＣＬ８の発現は好中球の走化性誘導に不定に影響する（Ｊ・Ｌ・カズウェル（Ｃａｓｗｅｌｌ）他、１９９７年、ヴェテリナリー・パソロジー誌３５号１２４〜１３１頁；Ｊ・Ｌ・カズウェル他、２００１年、カナディアン・ジャーナル・オブ・ヴェテリナリー・リサーチ誌６５号２２９〜２３２頁）。多くの固化におけるケモカイン反応の重大な重要性にもかかわらず、不都合な炎症細胞反応は損傷を与え、ＥＬＲ＋ケモカインを阻止可能な治療用具の発展が研究の優先度を有するようになっている（Ｍ・バジョリニおよびＢ・モーザー（Ｍｏｓｅｒ）、１９９７年、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン誌１８６号１１８９〜１１９１頁）。
【０００３】
'ＥＬＲ'ケモカインはそのＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２受容体によって、炎症細胞を走化性誘導および活性化する（バジョリニ、１９９８年；Ｓ・Ｋ・アフジャ（Ａｈｕｊａ）およびＰ・Ｍ・マーフィー、１９９６年、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー誌２７１号２０５４５〜２０５５０頁）。大半の哺乳類はＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２受容体および'ＥＬＲ'ケモカインのオーソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）（共通の先祖遺伝子から種分化した異なる種の遺伝子）を発現する。これらのホモローグ（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）（遺伝子的または機能的に関連する）遺伝子の間の配列類似性は高く、保存されたアミノ酸置換を考慮してもより高い。マウスとラットは、ＣＸＣＲ１遺伝子を持たずＣＸＣＬ８等価物が他の哺乳類より高度に発散しており、例外である。インターロイキン８（ＣＸＣＬ８）は種特異ではなく、ある種由来のＣＸＣＬ８タンパク質は他の種においても機能する（ロート（Ｒｏｔ）、１９９１年、サイトカイン３：２１〜２７頁）。
【０００４】
ＣＸＣＲ１はＣＸＣＬ８およびＣＸＣＬ６／果粒球走化性タンパク質−２（ＧＣＰ−２）に対し特異的である。ＣＸＣＲ２は高い親和性でＣＸＣＬ８に結合するが、それよりやや低い親和性でマクロファージ炎症性タンパク質−２（ＭＩＰ−２）、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ５／ＥＮＡ−７８およびＣＸＣＬ６にも結合する（例えばバジョリニおよびモーザー、１９９７年を参照）。ヒトＣＸＣＲ１またはＣＸＣＲ２を移入された細胞系におけるＣＸＣＬ８シグナリングは、等力の走化性反応を誘導する（Ａ・ワイツ（Ｗｕｙｔｓ）他、１９９８年、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー誌２５５号６７〜７３頁；Ｒ・リチャードソン他、１９９８年、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー誌２７３号２３８３０〜２３８３６頁）。好中球サイトゾル自由Ｃａ＋＋変化およびＣＸＣＬ８に応じた細胞脱顆粒もまたこれらの受容体に媒介され、ホスホリパーゼＤの呼吸性突発および活性化は排他的にＣＸＣＲ１に依存するともされている（Ｓ・Ａ・ジョーンズ他、１９９６年、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ誌９３号６６８２〜６６８６頁）。一方、ＣＸＣＲ１のアンタゴニストではないＣＸＣＲ２の非ペプチドアンタゴニストが、ＣＸＣＬ８媒介の好中球走化性を相殺するが細胞活性化にはしないことが報告されている（Ｊ・Ｒ・ホワイト他、１９９８年、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー誌２７３号１００９５〜１００９８頁）。最後に、炎症反応においてケモカインがもっとも頻繁に過剰に発現するという豊富な証拠が存在する（例えばカズウェル他、１９９７年参照）。しかし当該領域における活性調査にもかかわらず、いずれかのＥＬＲ−ＣＸＣケモカイン受容体に誘導される反炎症細胞活性の抑制に効果的な先行技術において、ＣＸＣケモカインアンタゴニストは知られていない。
【非特許文献１】Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ，  Ｍ．  １９９８．  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｔｒａｆｆｉｃ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ３９２：５６５−５６８．
【非特許文献２】Ｓｅｋｉｄｏ，  Ｎ．，  Ｎ．  Ｍｕｋａｉｄａ，  Ａ．  Ｈａｒａｄａ，  Ｉ．  Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，  Ｙ．  Ｗａｔａｎａｂｅ，  ａｎｄ  Ｋ．  Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ．  １９９３．  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔｓ  ｂｙ  ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８．  Ｎａｔｕｒｅ．  ３６５：６５４−６５７．
【非特許文献３】Ｖｉｌｌａｒｄ，  Ｊ．，  Ｆ．  Ｄａｙｅｒ  Ｐａｓｔｏｒｅ，  Ｊ．  Ｈａｍａｃｈｅｒ，  Ｊ．  Ｄ．  Ａｕｂｅｒｔ，  Ｓ．  Ｓｃｈｌｅｇｅｌ  Ｈａｕｅｔｅｒ，  ａｎｄ  Ｌ  Ｐ．  Ｎｉｃｏｄ．  １９９５．  ＧＲＯ  ａｌｐｈａｒｍａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８  ｉｎ  Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ  ｏｒ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  ａｎｄ  ａｄｕｌｔ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｔｒｅｓｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．  Ａｍ．  Ｊ，  Ｒｅｓｐｉｒ．  Ｃｒｉｔ．  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．  １５２：１５４９−１５５４．
【非特許文献４】Ｍｕｋａｉｄａ，  Ｎ．，  Ｔ．  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，  Ｋ  Ｙｏｋｏｉ，  Ａ．  Ｈａｒａｄａ，  ａｎｄ  Ｋ．  Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ．  １９９８．  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｃｕｔｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｂｙ  ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８  （ＩＬ−８）．  Ｉｎｆｌａｍｍ．  Ｒｅｓ．  ４７  （ｓｕｐｐｌ．  ３）：Ｓ１５１−１５７．
【非特許文献５】Ｈａｒａｄａ，  Ａ．，  Ｎ．  Ｍｕｋａｉｄａ，  ａｎｄ  Ｋ．  Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ．  １９９６．  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ８  ａｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．  Ｉｎｆｌａｍｍ．  Ｒｅｓ．  ２：４８２−４８９．
【非特許文献６】Ｗａｌｌｅｙ，  Ｋ．  Ｒ．，  Ｎ．  Ｗ．  Ｌｕｋａｃｓ，  Ｔ．  Ｉ．  Ｓｔａｎｄｉｆｏｒｄ，  Ｒ．  Ｍ．  Ｓｔｒｉｃｔｅｒ，  ａｎｄ  Ｓ．  Ｌ．  Ｋｕｎｋｅｌ．  １９９７．  Ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２  ｉｎ  ｓｅｖｅｒｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｐｅｒｉｔｏｎｉｔｉｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ．  Ｉｎｆｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ６５：３８４７−３８５１．
【非特許文献７】Ｓｌｏｃｏｍｂｅ，  Ｒ．，  Ｊ．  Ｍａｌａｒｋ，  Ｒ．  Ｉｎｇｅｒｓｏｌｌ，  Ｆ．  Ｄｅｒｋｓｅｎ，  ａｎｄ  Ｎ．  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ．  １９８５．  Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｐｎｅｕｍｏｎｉｃ  ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌｏｓｉｓ  ｉｎ  ｃａｌｖｅｓ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｒｅｓ．  ４６：２２５３．
【非特許文献８】Ｃａｓｗｅｌｌ，  Ｊ．  Ｌ，  Ｄ．  Ｍ．  Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，  Ｓ．  Ｄ．  Ｓｏｒｄｅｎ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｒ．  Ｇｏｒｄｏｎ．  １９９７．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｐｎｅｕｍｏｎｉｃ  ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌｏｓｉｓ．  Ｖｅｔ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ３５：１２４−１３１．
【非特許文献９】Ｃａｓｗｅｌｌ，  Ｊ．  Ｌ．，  Ｄ．  Ｍ．  Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｒ．  Ｇｏｒｄｏｎ．  ２００１．  Ｔｈｅ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８  ａｓ  ａ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｕｎｇｓ  ｏｆ  ｃａｔｔｌｅ  ｗｉｔｈ  ｐｎｅｕｍｏｎｉｃ  ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌｏｓｉｓ．  Ｃａｎａｄ．  Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｒｅｓ．  ６５：２２９−２３２．
【非特許文献１０】Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｂ．  Ｍｏｓｅｒ．  １９９７．  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８６：１１８９−１１９１．
【非特許文献１１】Ａｈｕｊａ，  Ｓ．  Ｋ．，  ａｎｄ  Ｐ．  Ｍ．  Ｍｕｒｐｈｙ．  １９９６．  Ｔｈｅ  ＣＸＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  ｇｒｏｗｔｈ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  （ＧＲＯ）  ａｌｐｈａ，  ＧＲＯｂｅｔａ，  ＧＲＯｇａｍｍａ，  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ−２，  ａｎｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ−７８  ａｒｅ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｇｏｎｉｓｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｙｐｅ  Ｂ，  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｔｈｅ  ｔｙｐｅ  Ａ，  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１  ：２０５４５−２０５５０．
【非特許文献１２】Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ，  Ｐ．，  Ｍ．  Ｓｅｉｔｚ，  Ｉ．  Ｃｌａｒｋ  Ｌｅｗｉｓ，  Ｍ．  Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ，  ａｎｄ  Ｂ．  Ｍｏｓｅｒ．  １９９４．  Ｂｏｔｈ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ．  Ｊｕｒｋａｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＩＬ−８Ｒ１  ｏｒ  ＩＬ−８Ｒ２  ｍｉｇｒａｔｅ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＩＬ−８，  ＧＲＯ  ａｌｐｈａｒｍａｎｄ  ＮＡＰ１．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ３４１：１８７−１９２．
【非特許文献１３】Ｗｕｙｔｓ，  Ａ．，  Ｐ．  Ｐｒｏｏｓｔ，  Ｉ．  Ｐ．  Ｌｅｎａｅｒｔｓ，  Ａ．  Ｂｅｎ  Ｂａｒｕｃｈ，  Ｊ．  Ｖａｎ  Ｄａｍｍｅ，  ａｎｄ  ＪＭ．  Ｗａｎｇ．  １９９８．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｕｓａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＸＣ  ｃｈｅｍｏｋｈｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  １  ａｎｄ  ２  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８，  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２  ａｎｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ａｔｔｒａｃｔａｎｔ−７８．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２５５：６７−７３．
【非特許文献１４】Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  Ｒ．，  Ｂ．  Ｐｒｉｄｇｅｎ，  Ｂ．  Ｈ−ａｒｉｂａｂｕ，  Ｈ．  Ａｌｉ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｓｎｙｄｅ  ａｎ．  １９９８．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｃｒｏｓｓ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ＣＸＣＲ１  ａｎｄ  ＣＸＣＲ２．  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｉｍｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｉｇｎａｌ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３：２３８３０−２３８３６．
【非特許文献１５】ＭｃＣｏｌｌ，  Ｓ．  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｉ．  Ｃｌａｒｋ  Ｌｅｗｉｓ．  １９９９．  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆｍｕｒｉｎｅ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｙ  ＣＸＣ  ｃｈｅｍｏｋｈｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６３：２８２９−２８３５．
【非特許文献１６】Ｊｏｎｅｓ，  Ｓ．  Ａ．，  Ｍ．  Ｗｏｌｆ，  Ｓ．  Ｑｉｎ，  Ｃ．  Ｒ．  Ｍａｃｋａｙ，  ａｎｄ  Ｍ．  Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ．  １９９６．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ８  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  （ＩＬ−８Ｒ）  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ：  ＮＡＤＰＨ  ｏｘｉｄａｓｅ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｄ  ａｒｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＩＬ−８Ｒ１  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ＩＬ−８Ｒ２．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９３：６６８２−６６８６．
【非特許文献１７】Ｗｈｉｔｅ，  Ｊ．  Ｒ．，  Ｊ．  Ｍ．  Ｌｅｅ，  Ｐ．  Ｒ．  Ｙｏｕｎｇ，  Ｒ．  Ｐ．  Ｈｅｒｔｚｂｅｒｇ，  Ａ．  Ｊ．  Ｊｕｒｅｗｉｃｚ，  Ｍ．  Ａ．  Ｃｈａｉｋｉｎ，  Ｋ．  Ｗｉｄｄｏｗｓｏｎ，  Ｊ．  Ｊ．  Ｆｏｌｅｙ，  Ｌ．  Ｄ．  Ｍａｒｔｉｎ，  Ｄ．  Ｅ．  Ｇｒｉｓｗｏｌｄ，  ａｎｄ  Ｈ．  Ｍ．  Ｓａｒａｕ．  １９９８．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ，  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｎｏｎ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ＣＸＣＲ２  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｔｈａｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３：１００９５−１００９８．
【非特許文献１８】Ｔａｔｅｄａ，  Ｋ．，  Ｔ．  Ａ．  Ｍｏｏｒｅ，  Ｍ．  Ｗ．  Ｎｅｗｓｔｅａｄ，  Ｗ．  Ｃ．  Ｔｓａｉ，  Ｘ．  Ｚｅｎｇ，  Ｊ．  Ｃ．  Ｄｅｎｇ，  Ｇ．  Ｃｈｅｎ，  Ｒ．  Ｒｅｄｄｙ，  Ｋ．  Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，  ａｎｄ  Ｔ．  Ｊ．  Ｓｔａｎｄｉｆｏｒｄ．  ２００１．  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ：  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ａｓ  ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌｓ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ６９：２０１７−２０２４．
【非特許文献１９】Ｔｓａｉ，  Ｗ．  Ｃ．，  Ｒ．  Ｍ．  Ｓｔｒｉｃｔｅｒ，  Ｂ．  Ｍｅｈｒａｄ，  Ｍ．  Ｗ．  Ｎｅｗｓｔｅａｄ，  Ｘ．  Ｚｅｎｇ，  ａｎｄ  Ｔ．  Ｊ．  Ｓｔａｎｄｉｆｏｒｄ．  ２０００．  ＣＸＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＣＸＣＲ２  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｎａｔｅ  ｈｏｓｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ６８：４２８９４２９６．
【非特許文献２０】Ｇｏｏｄｍａｎ，  Ｒ．  Ｂ．，  Ｒ．  Ｍ．  Ｓｔｒｉｅｔｅｒ，  Ｃ．  Ｗ．  Ｆｒｅｖｅｒｔ，  Ｃ．  Ｊ．  Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，  Ｐ．  Ｔｅｋａｍｐ  Ｏｌｓｏｎ，  Ｓ．  Ｌ．  Ｋｕｎｋｅｌ，  Ａ．  Ｗａｌｌ，  ａｎｄ  Ｔ．  Ｒ．  Ｍａｒｔｉｎ．  １９９８．  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｃ−Ｘ−Ｃ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｌＳｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ａｌｖｅｏｌａｒ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２７５：Ｌ８７−９５．
【非特許文献２１】Ｎｕｆｅｒ，  Ｏ．，  Ｍ．  Ｃｏｒｂｅｔｔ，  ａｎｄ  Ａ．  Ｗａｌｌ．  １９９９．  Ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ＥＮＡ−７８  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３８：６３６−６４２．
【非特許文献２２】Ｗｕｙｔｓ，  Ａ．，  Ａ．  Ｄ’Ｈａｅｓｅ，  Ｖ．  Ｃｒｅｍｅｒｓ，  Ｐ．  Ｍｅｎｔｅｎ，  Ｊ．  Ｐ．  Ｌｅｎａｅｒｔｓ，  Ａ．  Ｄｅ  Ｌｏｏｆ，  Ｈ．  ＨｅｒｅｎｌａｎＳ，  Ｐ．  Ｐｒｏｏｓｔ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｖａｎ  Ｄａｍｍｅ．  １９９９．  ＮＨ２−  ａｎｄ  ＣＯＯＨ−  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２  ａｕｇｍｅｎｔ  ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｃｙ．  Ｊ．  Ｌｅｕｋｏｃ．  Ｂｉｏｌ．  １６３：６１５５−６１６３．
【非特許文献２３】Ｃｌａｒｋ  Ｌｅｗｉｓ，  Ｉ．，  Ｂ．  Ｄｅｗａｌｄ，  Ｍ．  Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ，  Ｂ．  Ｍｏｓｅｒ，  ａｎｄ  Ｍ．  Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ．  １９９４．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａｎａｌｏｇｓ  ａｎｄ  ＣＸＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｈｙｂｒｉｄｓ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９：１６０７５−１６０８１．
【非特許文献２４】Ｌｉ，  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｒ．  Ｇｏｒｄｏｎ．  ２００１．  ＩＬ−８．ｓｕｂ．（３−７４）Ｋ１１Ｒ  ｉｓ  ａ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｇｏｎｉｓｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ＣＸＣＲ１  ａｎｄ  ＣＸＣＲ２．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  ２８６：５９５−６００．
【非特許文献２５】Ｍｏｓｅｒ，  Ｂ．，  Ｂ．  Ｄｅｗａｌｄ，  Ｌ  Ｂａｒｅｌｌａ，  Ｃ  Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，  Ｍ，  Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ，  ａｎｄ  Ｉ．  Ｃｌａｒｋ  Ｌｅｗｉｓ．  １９９３．  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６８：７１２５−７１２８．
【非特許文献２６】Ｃａｓｗｅｌｌ，  Ｊ．  Ｌ．，  Ｄ．  Ｍ．  Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｒ．  Ｇｏｒｄｏｎ．  １９９８．  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂｏｖｉｎｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８  ａｓ  ａ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｖｅｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．  ６７：３２７−３４０．
【非特許文献２７】Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ｊ．，  Ａ．  Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，  Ｄ．  Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，  Ｅ．  Ｓｈｅｖａｃｈ，  ａｎｄ  Ｗ．  Ｓｔｒｏｂｅｒ．  １９９４．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．
【非特許文献２８】Ｗａｌｌｅｒ，  Ｋ．  Ｐ．  １９９７．  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｏｖｉｎｅ  ｔｅａｔ  ｕｓｉｎｇ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ／ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｔｏ  ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅｓ，  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １  ｂｅｔａ．  Ｖｅｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．  ５７：２３９−２５１．
【非特許文献２９】Ｃａｉｒｎｓ，  Ｃ．  Ｍ．，  Ｊ．  Ｒ．  Ｇｏｒｄｏｎ，  Ｆ．  Ｌｉ，  Ｍ．  Ｅ．  Ｂａｃａ−Ｅｓｔｒａｄａ，  Ｔ．  Ｎ．  Ｍｏｙａｎａ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｘｉａｎｇ．  ２００１．  Ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｄｒｉｖｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｍｅｄｉａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＣＤ４＋  ａｎｄ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ＸＣＲ１  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６７：５７−６５．
【非特許文献３０】Ｇｏｒｄｏｎ，  Ｊ．  Ｒ．  ２０００．  ＴＧＦｂ  ａｎｄ  ＴＮＦａ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌｓ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ＦｃｅＲｌ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１．  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１：４２−４９．
【非特許文献３１】Ｇｏｒｄｏｎ，  Ｊ．  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｓ．  Ｊ．  Ｇａｌｌｉ．  １９９４．  Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌｓ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ＦｃｅＲＩ．  Ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏ  ｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８０：２０２７−２０３７．
【非特許文献３２】Ｇｏｒｄｏｎ，  Ｊ．  Ｒ．  ２０００−  Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１  （ＭＣＰ−１）  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｉｓ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  ｌａｒｇｅｌｙ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ．  Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １０６：  １１０−１１６．
【非特許文献３３】Ｃａｓｗｅｌｌ，  Ｊ．  Ｌ．  １９９８．  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８  ａｓ  ａ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｉｎ  ｂｏｖｉｎｅ  ｂｒｏｎｃｈｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ．  Ｐｈ．Ｄ．  ｔｈｅｓｉｓ，  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓａｓｋａｔｃｈｅｗａｎ．  ２４１  ｐｇ，
【非特許文献３４】Ｈｏｃｈｒｅｉｔｅｒ，  Ｗ．  Ｗ．，  Ｒ．  Ｂ．  Ｎａｄｌｅｒ，  Ａ．  Ｅ．  Ｋｏｃｈ，  Ｐ．  Ｌ．  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，  Ｍ．  Ｌｕｄｗｉｇ，  Ｗ．  Ｗｅｉｄｎｅｒ，  ａｎｄ  Ａ．  Ｊ．  Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ．  ２０００．  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８  ａｎｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ−７８  ａｓ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓ．  Ｕｒｏｌｏｇｙ．  ５６：  １０２５−１０２９．
【非特許文献３５】Ｐｅｒｓｓｏｎ，  Ｋ．，  Ｉ．  Ｌａｒｓｓｏｎ，  ａｎｄ  Ｃ．  Ｈａｌｌｅｎ  Ｓａｎｄｇｒｅｎ．  １９９３．  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｅｒｔａｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｏｎ  ｂｏｖｉｎｅ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｖｅｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．  ３７：９９−１１２．
【非特許文献３６】Ｇｒａｙ，  Ｇ．  Ｄ．，  Ｋ．  Ａ．  Ｋｎｉｇｈｔ，  Ｒ．  Ｄ．  Ｎｅｌｓｏｎ，  ａｎｄ  Ｍ．  Ｈｅｒｒｏｎ，  Ｊ．  １９８２．  Ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｒｅｓ．  ４３：７５７−７５９．
【非特許文献３７】Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，  Ｈ．  Ｎ．，  Ｐ．  Ｍ．  Ｉｉｅｎｓｏｎ，  Ａ．  Ｏｔａｎｉ，  ａｎｄ  Ｔ．  Ｅ．  Ｈｕｇｌｉ．  １９７８．  Ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  Ｃ３ａ  ａｎｄ  Ｃ５ａ  ａｎａｐｈｙｌａｔｏｘｉｎｓ．  Ｉ．  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃ３ａ  ａｎｄ  Ｃ５ａ  ｌｅｕｋｏｔａｘｉｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｕｎｄｅｒ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２０：  １０９−１１５．
【非特許文献３８】Ｒｉｏｌｌｅｔ，  Ｃ．，  Ｐ．  Ｒａｉｎａｒｄ，  ａｎｄ  Ｂ．  Ｐｏｕｔｒｅｌ．  ２０００．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｃ５ａ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｔｒａｍａｍｍａｒｙ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ．  Ｃｌｉｎ．  Ｄｉａｇｎ．  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ７：１６１−１６７．
【非特許文献３９】Ｓｈｕｓｔｅｒ，  Ｄ．  Ｅ．，  Ｍ．  Ｅ．  Ｋｅｈｒｌｉ，  Ｊｒ．，  Ｐ．  Ｒａｉｎａｒｄ，  ａｎｄ  Ｍ．  Ｐａａｐｅ．  １９９７．  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｃ５ａ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｔｒａｍａｍｍａｒｙ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ６５：３２８６−３２９２．
【非特許文献４０】Ｂｌｅｓｓ，  Ｎ．  Ｍ．，  Ｒ．  Ｌ  Ｗａｒｍｅｒ，  Ｖ．  Ａ．  Ｐａｄｇａｏｎｋａｒ，  Ａ．  Ｂ．  Ｌｅｎｔｓｃｈ，  Ｂ．  Ｊ．  Ｃｚｅｍａｋ，  Ｈ．  Ｓｃｈｍａｌ，  Ｈ．  Ｐ．  Ｆｒｉｅｄｌ，  ａｎｄ  Ｐ．  Ａ．  Ｗａｒｄ．  １９９９．  Ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｃ−Ｘ−Ｃ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｃ５ａ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｆｔｅｒ  ｈｉｎｄｌｉｍｂ  ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２７６：Ｌ５７−６３．
【非特許文献４１】Ｅｍｂｅｒ，  Ｊ．  Ａ．，  Ｓ．  Ｄ．  Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｔ．  Ｅ．  Ｈｕｇｌｉ，  ａｎｄ  Ｅ．  Ｌ．  Ｍｏｒｇａｎ．  １９９４．  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  Ｃ５ａ  ａｎａｐｈｙｌａｔｏｘｉｎ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １４４：３９３−４０３．
【非特許文献４２】Ｆｉｓｈｅｒ，  Ｃ．，  Ｇ．  Ｓｌｏｔｍａｎ，  Ｓ．  Ｏｐａｌ，  Ｊ．  Ｐｒｉｂｂｌｅ，  Ｒ．  Ｂｏｎｅ，  Ｇ．  Ｅｍｍａｎｕｅｌ，  Ｄ．  Ｎｇ，  Ｄ．  Ｂｌｏｅｄｏｗ，  ａｎｄ  Ｍ．  Ｃａｔａｌａｎｏ．  １９９４．  Ｉｎｉｔｉａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｅｐｓｉｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：  ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，  ｏｐｅｎ−ｌａｂｅｌ，  ｐｌａｃｅｂｏｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  ｔｒｉａｌ．  Ｔｈｅ  ＩＬ−１ＲＡ  Ｓｅｐｓｉｓ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ．  Ｃｒｉｔ．  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．  ２２：１１−２１．
【非特許文献４３】Ｖｅｒｂｏｎ，  Ａ．，  Ｐ．  Ｅ．  Ｄｅｋｋｅｒｓ，  Ｔ．  ｔｅｎ  Ｈｏｖｅ，  Ｃ．  Ｅ．  Ｈａｃｋ，  Ｉ．  Ｐｒｉｂｂｌｅ，  Ｔ．  Ｔｕｒｎｅｒ，  Ｓ．  Ｓｏｕｚａ，  Ｔ．  Ａｘｔｅｌｌｅ，  Ｆ，  Ｈｏｃｋ，  −Ｓ．  −Ｊ．  ｖａｎ  Ｄｅｖｅｎｔｅｒ，  ａｎｄ  Ｔ．  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｌｌ．  ２００１．  ＩＣ１４，  ａｎ  ａｎｔｉ−ＣＤ  １４  ａｎｔｉｂｏｄｙ，  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｙｍｐｔｏｍｓ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６６：３５９９−３６０５．
【非特許文献４４】Ｃｌａｒｋ  Ｌｅｗｉｓ，  Ｉ．，  Ｋ．  Ｓ．  Ｋｉｍ，  Ｋ．  Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍ，  Ｊ．  Ｈ．  Ｇｏｎｇ，  Ｂ．  Ｄｅｗａｌｄ，  Ｂ．  Ｍｏｓｅｒ，  Ｍ．  Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ，  ａｎｄ  Ｂ．  Ｄ．  Ｓｙｋｅｓ．  １９９５．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ．  Ｊ．  Ｌｅｕｋｏｃ．  Ｂｉｏｌ．  ５７：７０３−７１１．
【非特許文献４５】Ｊｏｎｅｓ，  Ｓ．  Ａ．，  Ｂ．  Ｄｅｗａｌｄ，  Ｉ．  Ｃｌａｒｋ  Ｌｅｗｉｓ，  ａｎｄ  Ｍ．  Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ．  １９９７．  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｔｈａｔ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｂｌｏｃｋｅｒｓ  ｏｆ  ＣＸＣＲ２．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２：１６１６６−１６１６９．
【非特許文献４６】Ｈａｎｇ，  Ｌ  Ｂ．  Ｆｒｅｎｄｅｕｓ，  Ｇ．  Ｇｏｄａｌｙ，  ａｎｄ  Ｃ．  Ｓｖａｎｂｏｒｇ．  ２０００．  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｉｃｅ  ｈａｖｅ  ｓｕｂｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｒｅｎａｌ  ｓｃａｒｒｉｎｇ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ａｃｕｔｅ  ｐｙｅｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ．  Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  １８２：  １７３８−１７４８．
【非特許文献４７】Ｓａｕｒｅｒ，  Ｌ．，  Ｐ．  ＲｅｂｅｒＪ．  Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ，  Ｍ．  Ｗ．  Ｂｕｃｈｌｅｒ，  Ｃ．  Ｂｕｒｉ，  Ａ．  Ｋａｐｐｅｌｅｒ，  Ａ．  Ｗａｌｌ，  Ｈ．  Ｆｒｉｅｓｓ，  ａｎｄ  Ｃ．  Ｍｕｅｌｌｅｒ．  ２０００．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．  １１８：３５６−３６７．
【非特許文献４８】Ｓｚｅｋａｎｅｃｚ，  Ｚ．，  Ｒ．  Ｍ．  Ｓｔｒｉｅｔｅｒ，  Ｓ．  Ｌ．  Ｋｕｎｋｅｌ，  ａｎｄ  Ａ．  Ｅ．  Ｋｏｃｈ．  １９９８．  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．  ２０：１１５−１３２．
【非特許文献４９】ＭａｃＤｅｒｍｏｔｔ，  Ｒ．  Ｐ．  １９９９．  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９：２６６−２７２．
【非特許文献５０】Ｄａｍａｓ，  Ｊ．  Ｋ．，  Ｌ．  Ｇｕｌｌｅｓｔａｄ，  Ｔ．  Ｕｅｌａｎｄ，  Ｎ．  Ｏ．  Ｓｏｌｕｍ，  Ｓ．  Ｓｉｍｏｎｓｅｎ，  Ｓ．  Ｓ．  Ｆｒｏｌａｎｄ，  ａｎｄ  Ｐ．  Ａｕｋｒｕｓｔ．  ２０００．  ＣＸＣ−ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ，  ａ  ｎｅｗ  ｇｒｏｕｐ  ｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ−−ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．  Ｒｅｓ．  ４５  ：４２８−４３６，
【非特許文献５１】Ｍｏｒｓｅｙ，  Ｍ．，  Ｙ．  Ｐｏｐｏｗｙｃｈ，  Ｉ．  Ｋｏｗａｌｓｋｉ，  Ｇ．  Ｇｅｒｌａｃｈ，  Ｄ．  Ｇｏｄｓｏｎ，  Ｍ．  Ｃａｍｐｏｓ，  ａｎｄ  Ｌ  Ｂａｂｉｕｋ．  １９９６．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８．  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ．  ２０：２０３−２１２．
【非特許文献５２】Ｂｅｎｓｏｎ，  Ｍ．，  Ｉ．  Ｌ  Ｓｔｒａｎｎｅｇａｒｄ，  Ｇ．  Ｗｅｎｎｅｒｇｒｅｎ，  ａｎｄ  Ｏ．  Ｓｔｒａｎｎｅｇａｒｄ．  １９９９．  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−５  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ  ａｎｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ｉｎ  ｎａｓａｌ  ｆｌｕｉｄｓ  ｆｒｏｍ  ｓｃｈｏｏｌ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ｓｅａｓｏｎａｌ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｒｈｉｎｉｔｉｓ．  Ｐｅｄｉａｔｒ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １０：１７８１８５．
【非特許文献５３】Ｈａｕｓｅｒ，  Ｕ．，  Ｍ．  Ｗａｇｅｎｍａｎｎ，  Ｃ．  Ｒｕｄａｃｋ，  ａｎｄ  Ｃ．  Ｂａｃｈｅｒｔ．  １９９７．  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ＩＬ−８−ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｎａｓａｌ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓ：  Ａ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｅｘｐｌａｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．  ＡＩｌｅｒｇｏｌ．  ２０：  １８４−１９１．
【非特許文献５４】Ｓｅｈｍｉ，  Ｒ．，  Ｏ．  Ｃｒｏｍｗｅｌｌ，  Ａ．  Ｊ．  Ｗａｒｄｌａｗ，  Ｒ．  ＭｏｑｂｅＩ，  ａｎｄＡ．  Ｂ．  Ｋａｙ．  １９９３．  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８  ｉｓ  ａ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｆｏｒ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｆｒｏｍ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｂｌｏｏｄ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉａ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｆｒｏｍ  ｎｏｒｍａｌ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  ２３：１０２７−１０３６．
【非特許文献５５】Ｕｌｆｉｎａｎ，  Ｌ．  Ｈ．，  Ｄ．  Ｐ．  Ｊｏｏｓｔｅｎ，  Ｊ．  Ａ．  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｉｎｄｅｎ，  Ｊ．  Ｗ．  Ｌａｍｍｅｒｓ，  Ｊ．  Ｊ．  Ｚｗａｇｉｎｇａ，  ａｎｄ  Ｌ．  Ｋｏｅｎｄｅｒｍａｎ，  ２００１．  ＩＬ−８  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ａｒｒｅｓｔ  ｏｆ  ｒｏｌｌｉｎｇ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６６：５８８−５９５．
【発明の開示】
【０００５】
本発明の構成は、哺乳類細胞のＣＸＣＲ１またはＣＸＣＲ２受容体に結合可能な新たなＥＬＲ−ＣＸＣケモカインアゴニストおよびアンタゴニストタンパク質を含む。これらは高親和性結合が可能なアゴニストおよびアンタゴニストを含み、ここで"高親和性"とは、アゴニストまたはアンタゴニストの受容体に対する親和性であって、生理的適性濃度において野生型ケモカインアゴニストを阻害するのに充分である親和性を示す。新たなアンタゴニストタンパク質はまた、野生型ウシおよび／またはヒトＣＸＣＬ８タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１および２のアミノ酸配列で示される）に略等しいものを含む（すなわち、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２結合機能を削除しないアミノ酸置換、付加および欠失を含む）とともに、Ｌｙｓ１１のＡｒｇ置換およびＧｌｙ３１のＰｒｏ置換を有するクマ改良アミノ末端基アミノ酸残余を含む。このウシＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐの相似物、すなわちＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐ／Ｐ３２Ｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）およびＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｔ１２Ｓ／Ｈ１３Ｆ／Ｇ３１Ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）も含まれる。
【０００６】
本発明の他の構成は、これらのタンパク質に関連する新たなポリヌクレオチドおよびポリペプチドである。他の実施形態において、前記アミノ酸配列に由来するヌクレオチド配列が提供される。さらに本発明は、新たなポリヌクレオチドからなるベクター、および新たなポリヌクレオチドの調節配列制御発現と効果的に組み合わされた該ポリヌクレオチドからなる発現ベクターを含む。同様に、親和性把持および新たなポリヌクレオチドからなる遺伝子融合、およびこのような遺伝子融合を含む合成ベクターおよび発現ベクターが本発明に含まれる。
【０００７】
本発明はまた、新たなポリヌクレオチドを含むように遺伝子設計された宿主、および調節配列と効果的に組み合わされた、新たなポリヌクレオチドすなわち調節配列が新たなポリヌクレオチドの発現を制御するような調節配列と効果的に組み合わされた、新たなポリヌクレオチドを含むように遺伝子設計された宿主を含む。調節配列が遺伝子融合の発現を制御するような調節配列と組み合わされたか、あるいはそのような調節配列が存在しない、遺伝子融合を含む宿主も含まれる。これらの宿主はウイルスまたは細胞でありうる。この細胞には制限なしでバクテリア、酵母菌、原生動物、茸、藻、植物細胞、動物細胞およびそれらに由来する高位の有機体が含まれる。
【０００８】
本発明はさらに、哺乳類のＣＸＣＲ１またはＣＸＣＲ２受容体を含むＣＸＣケモカイン媒介病状の治療における新たなポリヌクレオチドの利用からなる。同様に、ＣＸＣＲ１またはＣＸＣＲ２受容体を含むＥＬＲ−ＣＸＣケモカイン受容体媒介病状の治療方法であって、罹患した哺乳類への有効量の新たなポリヌクレオチドの１つの投薬を含む方法を、本発明は含む。生物活性量の新たなポリヌクレオチドの１つからなる薬品組成も含まれる。
【０００９】
新たなポリヌクレオチドの生産と精製の方法もまた本発明に含まれる。
【００１０】
本発明の１つの側面において、以下の配列を有する、または該配列からなる、精製または単離されたペプチドが提供される。ここでＸは任意のアミノ酸である。
【００１１】
ＸＥＬＲＣＸＣＩＲＸ  ＸＳＸＰＦＸＰＫＸＩ  ＸＥＸＸＸＩＸＳＰＰ  ＨＣＸＮＸＥＩＩＶＫ  ＬＸＸＧＸＥＸＣＬＸ  ＰＸＸＸＷＶＱＸＸＶ  ＸＸＦＸＫＸＸＥＸＸ  ＸＸ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３）
本発明の別の実施形態においては、以下の配列からなる、精製または単離されたペプチドが提供される。ここでＸ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は独立した０〜１０のアミノ酸残基であり、Ｘは任意のアミノ酸である。
【００１２】
Ｘ１ＥＬＲＣＸＣＩＲＸ  ＸＳＸＰＦＸＰＫＸＩ  ＸＥＸＸＸＩＸＳＰＰ  ＨＣＸＮＸＥＩＩＶＫ  ＬＸＸＧＸＥＸＣＬＸ  ＰＸＸＸＷＶＱＸＸＶ  ＸＸＦＸＫＸＸＥＸＸ２Ｘ３Ｘ４
本発明の別の実施形態においては、以下の配列からなる、精製または単離されたペプチドが提供される。
Ｘ１ＥＬＲＣＸ６ＣＩＲＸ１０  Ｘ１１ＳＸ１３ＰＦＸ１６ＰＫＸ１９Ｉ  Ｘ２１ＥＸ２３Ｘ２４Ｘ２５ＩＸ２７ＳＰＰ
ＨＣＸ３３ＮＸ３５ＥＩＩＶＫ  Ｌ  Ｘ４２Ｘ４３ＧＸ４５ＥＸ４７ＣＬＸ５０  ＰＸ５２Ｘ５３Ｘ５４ＷＶＱＸ５８Ｘ５９Ｖ
Ｘ６１Ｘ６２ＦＸ６４ＫＸ６６Ｘ６７ＥＸ６９Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．  ４）
ここで、
Ｘ１は０〜１０のアミノ酸；
Ｘ６はＱ、ＥまたはＬ；
Ｘ１０はＴまたはＩ；
Ｘ１１はＨまたはＹ；
Ｘ１３はＴまたはＫ；
Ｘ１６はＨまたはＮ；
Ｘ１９はＦまたはＹまたはＬ；
Ｘ２１はＫまたはＲ；
Ｘ２３はＬまたはＭ；
Ｘ２４はＲまたはＴ；
Ｘ２５はＶまたはＡ；
Ｘ２７はＤまたはＥ；
Ｘ３３はＶまたはＡまたはＥ；
Ｘ３５はＴまたはＳ；
Ｘ４２はＳまたはＶまたはＴまたはＦ；
Ｘ４３はＤまたはＮ；
Ｘ４５はＲまたはＡまたはＮまたはＫまたはＤ；
Ｘ４７はＬまたはＶ：
Ｘ５０はＤまたはＮ；
Ｘ５２はＫまたはＨ；
Ｘ５３はＥまたはＱまたはＴ；
Ｘ５４はＰまたはＮまたはＫ；
Ｘ５８はＲまたはＫまたはＩ；
Ｘ５９はＶまたはＩ；
Ｘ６１はＥまたはＱ；
Ｘ６２はＫまたはＩまたはＶまたはＡ；
Ｘ６４はＬまたはＶ；
Ｘ６６はＲまたはＫ；
Ｘ６７はＡまたはＴ；
Ｘ６９はＳまたはＮまたはＫまたはＧ；
Ｘ７０はＱまたはＳまたはＫであるかあるいは削除；
Ｘ７１はＮまたはＤであるかあるいは削除；
Ｘ７２はＰまたはＡまたはＳであるかあるいは削除である。
【００１３】
本発明の別の実施形態においては、実質的に以下の配列１乃至２に示すアミノ酸配列のいずれかからなる、精製または単離されたペプチドが提供される。
【００１４】
［配列１］    
【化１】
0005462623.tif 000002
【００１５】
［配列２］    
【化２】
0005462623.tif 000003
【００１６】
本発明のさらなる側面により、以下のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列からなる、単離されたポリヌクレオチド配列が提供される。ここでＸ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は独立した０〜１０のアミノ酸残基であり、Ｘは任意のアミノ酸である。
Ｘ１ＥＬＲＣＸＣＩＲＸ  ＸＳＸＰＦＸＰＫＸＩ  ＸＥＸＸＸＩＸＳＰＰ  ＨＣＸＮＸＥＩＩＶＫ  ＬＸＸＧＸＥＸＣＬＸ  ＰＸＸＸＷＶＱＸＸＶ  ＸＸＦＸＫＸＸＥＸＸ２Ｘ３Ｘ４
本発明のさらなる側面により、以下のアミノ酸配列をエンコードする、単離されたポリヌクレオチド配列が提供される。
Ｘ１ＥＬＲＣＸ６ＣＩＲＸ１０  Ｘ１１ＳＸ１３ＰＦＸ１６ＰＫＸ１９Ｉ  Ｘ２１ＥＸ２３Ｘ２４Ｘ２５ＩＸ２７ＳＰＰ
ＨＣＸ３３ＮＸ３５ＥＩＩＶＫ  Ｌ  Ｘ４２Ｘ４３ＧＸ４５ＥＸ４７ＣＬＸ５０  ＰＸ５２Ｘ５３Ｘ５４ＷＶＱＸ５８Ｘ５９Ｖ
Ｘ６１Ｘ６２ＦＸ６４ＫＸ６６Ｘ６７ＥＸ６９Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）
ここで、
Ｘ１は０〜１０のアミノ酸；
Ｘ６はＱ、ＥまたはＬ；
Ｘ１０はＴまたはＩ；
Ｘ１１はＨまたはＹ；
Ｘ１３はＴまたはＫ；
Ｘ１６はＨまたはＮ；
Ｘ１９はＦまたはＹまたはＬ；
Ｘ２１はＫまたはＲ；
Ｘ２３はＬまたはＭ；
Ｘ２４はＲまたはＴ；
Ｘ２５はＶまたはＡ；
Ｘ２７はＤまたはＥ；
Ｘ３３はＶまたはＡまたはＥ；
Ｘ３５はＴまたはＳ；
Ｘ４２はＳまたはＶまたはＴまたはＦ；
Ｘ４３はＤまたはＮ；
Ｘ４５はＲまたはＡまたはＮまたはＫまたはＤ；
Ｘ４７はＬまたはＶ：
Ｘ５０はＤまたはＮ；
Ｘ５２はＫまたはＨ；
Ｘ５３はＥまたはＱまたはＴ；
Ｘ５４はＰまたはＮまたはＫ；
Ｘ５８はＲまたはＫまたはＩ；
Ｘ５９はＶまたはＩ；
Ｘ６１はＥまたはＱ；
Ｘ６２はＫまたはＩまたはＶまたはＡ；
Ｘ６４はＬまたはＶ；
Ｘ６６はＲまたはＫ；
Ｘ６７はＡまたはＴ；
Ｘ６９はＳまたはＮまたはＫまたはＧ；
Ｘ７０はＱまたはＳまたはＫであるかあるいは削除；
Ｘ７１はＮまたはＤであるかあるいは削除；
Ｘ７２はＰまたはＡまたはＳであるかあるいは削除である。
【００１７】
本発明のさらなる側面により、実質的にＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０〜４１のいずれかのアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列からなる、単離されたポリヌクレオチド配列が提供される。
【００１８】
本発明の他の側面においては、前記のポリヌクレオチドからなる形質転換細胞が提供される。該ポリヌクレオチドは非天然でありうる。
【００１９】
本発明の他の側面においては、遺伝子工学によって前記のポリヌクレオチドからなるように作成されたウイルス性宿主が提供される。
【００２０】
本発明のさらなる側面においては、前記のポリヌクレオチドからなる発現ベクターが提供される。該発現ベクターは適当な宿主内において該ポリヌクレオチドの発現を制御する調節配列に作用的に連結される。
【００２１】
本発明のさらなる側面においては、前記の発現ベクターからなる宿主細胞が提供される。
【００２２】
本発明の別の側面においては、ＥＬＲ−ＣＸＣケモカイン受容体媒介病状の治療のための薬剤の製造における前記のペプチドの利用が提供される。
【００２３】
本発明の別の側面においては、治療を要する個体への有効量の前記ペプチドの投薬からなるＥＬＲ−ＣＸＣケモカイン受容体媒介病状の治療方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下の略称を開示で用いる：ＡＲＤＳ（急性呼吸困難症候群）；ＢＡＬＦ（気管支肺胞洗浄液）；ＢＨＲ（ボルトン−ハンター試薬）；ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＬ８受容体Ａ、Ｂそれぞれ；ＥＬＲ（グルタミン酸−ロイシン−アルギニンモチーフ）；ＣＸＣＬ１（生育依存腫瘍遺伝子アルファ）；ＣＸＣＬ４（血小板第４因子）；ＣＸＣＬ５（上皮移送好中球アクティベーター−７８）；ＣＸＣＬ６（果粒球走化性タンパク質−２）；ＣＸＣＬ８（インターロイキン−８）；ｆＭＬＰ（フォルミルメチオニル−ロイシルプロリン細菌性トリペプチド）；ＩＰＴＧ（イソプロピル−チオ−Ｄ−ガラクトピロノシド）；ＭＩＰ−２（マクロファージ炎症タンパク質−２）；ＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）；ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）。
【００２５】
ここで用いる'アゴニスト'は細胞を活性化する作用物質を指す。
【００２６】
ここで用いる'アンタゴニスト'は、アゴニストの存在または非存在下において細胞の活性化を防止する作用物質を指す。
【００２７】
ここで用いる用語'精製'は絶対的な純度を要求しないが、相対的な定義を意図する。例えば、出発原料または天然原料の、少なくとも１桁、好ましくは２または３桁への精製は、'精製'の定義内にあるものと明白に熟慮する
ここで用いる用語'単離'は、原料がその元の環境から除去されることを要する。
【００２８】
ここで用いる用語'処置'は、疾患状態、疾患進行、疾患による他の異常の有害な効果を防止、養生、反転、希釈、軽減、最小化、抑制または停止することを指す。
【００２９】
ここで用いる'有効量'は、所望の結果を得るのに充分な量である。当業者には認識されるように、そのような量はもちろん、処置される個体の年齢、体重および状態に依存する。
【００３０】
ウシＣＸＣＬ８のアミノ末端切断をアミノ酸１１におけるリジンのアルギニン置換（すなわちＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ）に組み合わせる場合、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２受容体親和性の劇的な増加が明白であり、ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒは、多重配位子の双方の受容体への結合を競争的に阻害する（Ｆ・リーおよびＪ・Ｒ・ゴードン、２００１年、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ誌２８６号５９５〜６００頁、非特許文献に含まれる）。いくつかの受容体シグナリングＣＸＣケモカインのＥＬＲモチーフ（例えばヒトＣＸＣＬ８のアミノ酸４〜６）へのさらなる切断によって、それらを緩い（ＣＸＣＬ８（６−７２））、並みの（ＣＸＣＬ１（８−７３））受容体アンタゴニストへと変形することができる（マッコールおよびクラーク・ルイス、１９９９年、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー誌２６８号７１２５〜７１２８頁）。ここで開示するように、グリシン３１のプロリン残基への二次アミノ酸置換のウシＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒへの導入（すなわちＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐ）により、このＣＸＣＬ８相似物はウシおよびヒトＥＬＲ−ＣＸＣケモカイン反応の非常に親和性の高いアンタゴニストとなる。これは、細菌性またはエンドトキシン誘導の炎症病巣内で発現するヒトＥＬＲ−ＣＸＣケモカインの配列全体を充分にアンタゴナイズするとともに、生体内エンドトキシン誘導炎症を遮断する。
【００３１】
以下の考察の一部においては主にウシ好中球を扱うが、他の哺乳類（ヒトを含む）の炎症細胞もＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２受容体を示し（例えば、Ｍ・ベンソン他、ピディアトリック・アレルギー・アンド・イミュノロジー誌１０号１７８〜１８５頁を参照）、そのためＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐによる阻害を受けることができる。よって、本発明は哺乳類ＥＬＲ−ＣＸＣケモカイン媒介病状に広く適用することができる。
【００３２】
当業者には理解されるように、ここで用いる命名、'３−７４'は、天然ＣＸＣＬ８ペプチドの長さは７４のアミノ酸であり（'７４'）、最初の２つのアミノ酸を切断し、ペプチド配列が天然配列でのアミノ酸＃３から始まることを指している。命名の一貫性のため、アミノ酸は野生型配列に基づく数によって示し、'Ｇ３１Ｐ'は野生型配列のアミノ酸＃３１のグリシンのプロリンへの置換を指す。当業者には認識されるように、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１に関して、最初の２つのアミノ酸の除去によりプロリンは実際には２９番目のアミノ酸である。
【００３３】
本発明の別実施例においては、哺乳類炎症細胞においてＣＸＣＲ１またはＣＸＣＲ２受容体に結合可能なヒトＥＬＲ−ＣＸＣケモカインアンタゴニストタンパク質が提供される。好ましい実施例において、これらのペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の配列を有するペプチドと略同等である。これは、当業者には認識されるように、これらのペプチドは、少なくとも６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％が野生型ＣＸＣＬ８タンパク質（ここではＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２のアミノ酸配列として示す）と一致するアミノ酸配列を有するとともに、最初の２つのアミノ酸の切断残基およびＬｙｓ１１のＡｒｇ置換とＧｌｙ３１のＰｒｏ置換を有する、ということと略等しい意味である。当業者には認識されるように、多くの実施例において、以下で述べるようにこれらのペプチドの長さはおよそ６９、７０または７２のアミノ酸である。しかし、別の実施例においては、上で述べたペプチドは１、２、３、４、５、６またはそれ以上のアミノ酸の除去および／または挿入を含みうる。当業者には認識されるように、挿入または除去が許容されるペプチドの領域を、ペプチドの三次元構造から、または関連する生体の配列の比較によって予測することができる。
【００３４】
例えば、ウシ、ヒト、アカゲザル、ヒツジ、イヌおよびブタを含む複数の種からの野生型ＣＸＣＬ８配列のペプチド整列を示す表１に関して、ブタ配列の１つは、野生型ウシ配列のアミノ酸６０および６１に対応する部分の間に挿入された追加のアミノ酸を含み、これによってこれは他の種の１つ以上のアミノ酸の挿入が許容されるらしいサイトであることが示される。同様に、ヒトおよびブタ配列において、２および３のアミノ酸が、ウシ配列に関連するＣ末端において除去され、これによって、少なくとも２〜３のアミノ酸のＣ末端からの除去は他の種でも同様に許容されるらしいことが示唆される。当業者には認識されるように、これはまた、これらのペプチドのＣ末端でのアミノ酸の追加または置換が許容されるらしい、すなわちペプチドの所望の生物学的活性に有意な負の効果を持たない、ということを示す。
【００３５】
ポリペプチドの構造においてペプチドの生物学的機能を実質的に変えることなくいくつかの変異および変化を加え、生物学的に同等のポリペプチドを得ることが可能であることが、当該技術において既知であることは注目すべきである。本発明の一つの側面において、前記のペプチドは、保存的アミノ酸置換による異なるペプチドを含みうる。本発明のペプチドはまた、保存的アミノ酸置換によって異なっている生物学的に同等のペプチドに拡張することができる。ここで用いる語"保存されるアミノ酸置換"は、１つのアミノ酸のペプチドにおける他の所定の位置との置換であって、関連する機能、この場合においてはエピトープの折り畳みの実質的な減少なしに可能な置換を指す。このような変化を為すにおいて、類似のアミノ酸残基の置換は、側鎖置換基の相対的類似、例えばその大きさ、電荷、疎水性、親水性等に基づいて可能であり、このような置換は、ペプチドの機能における該置換の効果について定期試験によって分析されうる。この実施例においては、機能とはＣＸＣＬ８ケモカインアンタゴニスト活性を指す。
【００３６】
いくつかの実施例においては、保存されるアミノ酸置換として、アミノ酸残基を近い親水値（例えば±２．０以内の値）を有する別のアミノ酸と置換することが可能であり、約−１．６のハイドロパシック（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ）インデックスを有するアミノ酸、Ｔｙｒ（−１．３）やＰｒｏ（−１．６）等を以下のアミノ酸残基に割り当てうる（非特許文献に含まれる米国特許４５５４１０１号に詳述される）：Ａｒｇ（＋３．０）；Ｌｙｓ（＋３．０）；Ａｓｐ（＋３．０）；Ｇｌｕ（＋３．０）；Ｓｅｒ（＋０．３）；Ａｓｎ（＋０．２）；Ｇｌｎ（＋０．２）；Ｇｌｙ（０）；Ｐｒｏ（−０．５）；Ｔｈｒ（−０．４）；Ａｌａ（−０．５）；Ｈｉｓ（−０．５）；Ｃｙｓ（−１．０）；Ｍｅｔ（−１．３）；Ｖａｌ（−１．５）；Ｌｅｕ（−１．８）；Ｉｌｅ（−１．８）；Ｔｙｒ（２．３）；Ｐｈｅ（−２．５）；ａｎｄＴｒｐ（−３．４）。
【００３７】
別の実施例においては、保存されるアミノ酸置換として、アミノ酸残基を近いハイドロパシックインデックス（例えば±２．０以内の値）を有する別のアミノ酸と置換することが可能である。このような実施例においては、以下のそれぞれのアミノ酸残基をその疎水性および電荷の特性に基づいて、ハイドロパシックインデックスに割り当てうる：Ｉｌｅ（＋４．５）；Ｖａｌ（＋４．２）；Ｌｅｎ（＋３．８）；Ｐｈｅ（＋２．８）；Ｃｙｓ（＋２．５）；Ｍｅｔ（＋１．９）；Ａｌａ（＋１．８）；Ｇｌｙ（−０．４）；Ｔｈｒ（−０．７）；Ｓｅｒ（−０．８）；Ｔｒｐ（−０．９）；Ｔｙｒ（−１．３）；Ｐｒｏ（−１．６）；Ｈｉｓ（−３．２）；Ｇｌｕ（−３．５）；Ｇｌｎ（−３．５）；Ａｓｐ（３．５）；Ａｓｎ（−３．５）；Ｌｙｓ（−３．９）；ａｎｄＡｒｇ（−４．５）。
【００３８】
別の実施例においては、保存されるアミノ酸置換として、アミノ酸残基を同じクラスの別のアミノ酸と置換することが可能である。該アミノ酸は以下のように無極性、酸性、塩基性および中性に分けられる：無極性：  ＡＩａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｐｈｅ，Ｔｒｐ，Ｐｒｏ，Ｍｅｔ；酸性：Ａｓｐ，Ｇｌｕ；塩基性：Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｈｉｓ；中性：Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｃｙｓ，Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ｔｙｒ。
【００３９】
他の実施例においては、既知の任意のアミノ酸を所定の位置において置き換える置換がなされうる。いくつかの実施例においては、進化的な非保存または弱い保存のアミノ酸を、例えばサイズが近く疎水性の異なるアミノ酸または電荷が近くサイズが異なるアミノ酸と置換しうる。また、当業者に理解される他の類似の置換も可能である。
【００４０】
よって、ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１ＲＧ３１Ｐの相似物を構成することが可能であり、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６で示される配列の挿入、除去および置換によって所望の生物学的機能が保持される。ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７〜４１において典型的な相似物が示されることも注目すべきである。
【００４１】
好ましい実子例においては、ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｇ３１Ｐの略等しい相似物を、例えば表１に示される複数の種の関連する配列の比較を用いて調製する。当業者には認識されるように、高度に可変なアミノ酸位置の置換は、高度に保存されるアミノ酸よりも許容されうる。
【００４２】
例えば、２つのＮ末端アミノ酸の消去、グリシン３１のプロリンとの置換およびリジン１１のアルギニンとの置換の後の、表１に示される配列の比較により、以下の配列が提供される。
ＸＥＬＲＣＸＣＩＲＸ  ＸＳＸＰＦＸＰＫＸＩ  ＸＥＸＸＸＩＸＳＰＰ  ＨＣＸＮＸＥＩＩＶＫ  ＬＸＸＧＸＥＸＣＬＸ  ＰＸＸＸＷＶＱＸＸＶ  ＸＸＦＸＫＸＸＥＸＸ  ＸＸ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３）
ここでＸは任意のアミノ酸である。いくつかの実子例においては、Ｘは天然アミノ酸である。
【００４３】
本発明の別実子例においては、以下のアミノ酸配列を含む単離または精製されたペプチドが提供される。
Ｘ１ＥＬＲＣＸＣＩＲＸ  ＸＳＸＰＦＸＰＫＸＩ  ＸＥＸＸＸＩＸＳＰＰ  ＨＣＸＮＸＥＩＩＶＫ  ＬＸＸＧＸＥＸＣＬＸ  ＰＸＸＸＷＶＱＸＸＶ  ＸＸＦＸＫＸＸＥＸＸ２Ｘ３Ｘ４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．  ４２）
ここでＸ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は独立な０〜１０アミノ酸残基であり、Ｘは任意のアミノ酸である。すなわち、Ｘ１は例えばランダムな６アミノ酸の長さであり、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は全て０アミノ酸の長さ、つまり消去でありうる。別の実子例においては、Ｘ１は変性の２アミノ酸、すなわちＭＳ（ウシ）およびＳＡ（ヒト）以外の任意の２アミノ酸であり、Ｘ２はＳまたはＱ、Ｘ３およびＸ４は消去でありうる。
【００４４】
あるいは、Ｘ１は０〜９アミノ酸、０〜８アミノ酸、０〜７アミノ酸、０〜６アミノ酸、０〜５アミノ酸、０〜４アミノ酸、０〜３アミノ酸、または０〜２アミノ酸であるか、もしくはＸ１はＧＳＫ、ＧＳＴ、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｋ、ＧＳＭＧＧＳＫ、およびＧＳＭＧＧＳＴからなるグループのいずれかであるか、またはＸ１は消去でありうる。
【００４５】
いくつかの実施例においては、前記ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６、７、８または９のアミノ酸配列を持たないことが条件となることは注目すべきである。
【００４６】
本発明の別実子例においては、以下のアミノ酸配列を含む単離または精製されたペプチドが提供される。
【００４７】
Ｘ１ＥＬＲＣ  Ｘ６ＣＩＲＸ１０  Ｘ１１ＳＸ１３ＰＦＸ１６ＰＫＸ１９Ｉ  Ｘ２１ＥＸ２３Ｘ２４Ｘ２５ＩＸ２７ＳＰＰ
ＨＣＸ３３ＮＸ３５ＥＩＩＶＫ  Ｌ  Ｘ４２Ｘ４３ＧＸ４５ＥＸ４７ＣＬＸ５０  ＰＸ５２Ｘ５３Ｘ５４ＷＶＱＸ５８Ｘ５９Ｖ
Ｘ６１Ｘ６２ＦＸ６４ＫＸ６６Ｘ６７ＥＸ６９Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４３）
ここで、Ｘ１、Ｘ７０、Ｘ７１およびＸ７２は独立の０〜１０アミノ酸である。Ｘ６、Ｘ１０  Ｘ１１、Ｘ１３  Ｘ１６  Ｘ１９  Ｘ２１  Ｘ２３  Ｘ２４  Ｘ２５  Ｘ２７  Ｘ３３  Ｘ３５  Ｘ４２  Ｘ４３  Ｘ４５  Ｘ４７  Ｘ５０  Ｘ５２  Ｘ５３  Ｘ５４  Ｘ５８  Ｘ５９  Ｘ６１  Ｘ６２  Ｘ６４  Ｘ６６  Ｘ６７  Ｘ６９は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＹからなるグループからそれぞれ独立に選ばれる。
【００４８】
あるいは、Ｘ１、Ｘ７０、Ｘ７１およびＸ７２は独立の０〜９アミノ酸、０〜８アミノ酸、０〜７アミノ酸、０〜６アミノ酸、０〜５アミノ酸、０〜４アミノ酸、０〜３アミノ酸、または０〜２アミノ酸であるか、もしくはＸ１はＧＳＫ、ＧＳＴ、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｋ、ＧＳＭＧＧＳＫ、およびＧＳＭＧＧＳＴからなるグループのいずれかであるか、またはＸ１は消去でありうる。
【００４９】
別の実子例においては、Ｘ１は変性の２アミノ酸、すなわちＭＳ（ウシ）およびＳＡ（ヒト）以外の任意の２アミノ酸であり、Ｘ７０はＳまたはＱ、Ｘ７１およびＸ７２は消去でありうる。
【００５０】
いくつかの実施例においては、前記ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６、７、８または９のアミノ酸配列を持たないことが条件となることは注目すべきである。
【００５１】
本発明の別実子例においては、以下のアミノ酸配列を含む単離または精製されたペプチドが提供される。
Ｘ１ＥＬＲＣＸ６ＣＩＲＸ１０  Ｘ１１ＳＸ１３ＰＦＸ１６ＰＫＸ１９Ｉ  Ｘ２１ＥＸ２３Ｘ２４Ｘ２５ＩＸ２７ＳＰＰ
ＨＣＸ３３ＮＸ３５ＥＩＩＶＫ  Ｌ  Ｘ４２Ｘ４３ＧＸ４５ＥＸ４７ＣＬＸ５０  ＰＸ５２Ｘ５３Ｘ５４ＷＶＱＸ５８Ｘ５９Ｖ
Ｘ６１Ｘ６２ＦＸ６４ＫＸ６６Ｘ６７ＥＸ６９Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）
ここで、
Ｘ１は０〜１０のアミノ酸；
Ｘ６はＱ、ＥまたはＬ；
Ｘ１０はＴまたはＩ；
Ｘ１１はＨまたはＹ；
Ｘ１３はＴまたはＫ；
Ｘ１６はＨまたはＮ；
Ｘ１９はＦまたはＹまたはＬ；
Ｘ２１はＫまたはＲ；
Ｘ２３はＬまたはＭ；
Ｘ２４はＲまたはＴ；
Ｘ２５はＶまたはＡ；
Ｘ２７はＤまたはＥ；
Ｘ３３はＶまたはＡまたはＥ；
Ｘ３５はＴまたはＳ；
Ｘ４２はＳまたはＶまたはＴまたはＦ；
Ｘ４３はＤまたはＮ；
Ｘ４５はＲまたはＡまたはＮまたはＫまたはＤ；
Ｘ４７はＬまたはＶ：
Ｘ５０はＤまたはＮ；
Ｘ５２はＫまたはＨ；
Ｘ５３はＥまたはＱまたはＴ；
Ｘ５４はＰまたはＮまたはＫ；
Ｘ５８はＲまたはＫまたはＩ；
Ｘ５９はＶまたはＩ；
Ｘ６１はＥまたはＱ；
Ｘ６２はＫまたはＩまたはＶまたはＡ；
Ｘ６４はＬまたはＶ；
Ｘ６６はＲまたはＫ；
Ｘ６７はＡまたはＴ；
Ｘ６９はＳまたはＮまたはＫまたはＧ；
Ｘ７０はＱまたはＳまたはＫであるかあるいは削除；
Ｘ７１はＮまたはＤであるかあるいは削除；
Ｘ７２はＰまたはＡまたはＳであるかあるいは削除である。
【００５２】
あるいは、Ｘ１は０〜９アミノ酸、０〜８アミノ酸、０〜７アミノ酸、０〜６アミノ酸、０〜５アミノ酸、０〜４アミノ酸、０〜３アミノ酸、または０〜２アミノ酸であるか、もしくはＸ１はＧＳＫ、ＧＳＴ、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｋ、ＧＳＭＧＧＳＫ、およびＧＳＭＧＧＳＴからなるグループのいずれかであるか、またはＸ１は消去でありうる。
【００５３】
いくつかの実施例においては、前記ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６、７、８または９のアミノ酸配列を持たないことが条件となることに注目すべきである。
【００５４】
本発明の別実子例においては、以下のアミノ酸配列を含む単離または精製されたペプチドが提供される。
【００５５】
Ｘ１ＥＬＲＣ  Ｘ６ＣＩＲＸ１０  Ｘ１１ＳＸ１３ＰＦＸ１６ＰＫＸ１９Ｉ  Ｘ２１ＥＸ２３Ｘ２４Ｘ２５ＩＸ２７ＳＰＰ
ＨＣＸ３３ＮＸ３５ＥＩＩＶＫ  Ｌ  Ｘ４２Ｘ４３ＧＸ４５ＥＸ４７ＣＬＸ５０  ＰＸ５２Ｘ５３Ｘ５４ＷＶＱＸ５８Ｘ５９Ｖ
Ｘ６１Ｘ６２ＦＸ６４ＫＸ６６Ｘ６７ＥＸ６９Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４３）
ここで、
Ｘ１はＧＳＫ、ＧＳＴ、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｋ、ＧＳＭＧＧＳＫ、ＧＳＭＧＧＳＴ、あるいは削除；
Ｘ１１はＨまたはＹ；
Ｘ１３はＴまたはＫ；
Ｘ３３はＡまたはＥ；
Ｘ３５はＴまたはＳ；
Ｘ４２はＳまたはＴ；
Ｘ４３はＤまたはＮ；
Ｘ４５はＲまたはＮまたはＤ：
Ｘ４７はＬまたはＶ；
Ｘ５０はＤまたはＮ；
Ｘ５４はＮまたはＫ；
Ｘ５８はＲまたはＫ；
Ｘ６１はＥまたはＱ；
Ｘ６２はＫまたはＶ；
Ｘ６４はＬまたはＶ；
Ｘ６９はＮまたはＫ；
Ｘ７０はＱまたはＳまたは消去；
Ｘ７１はＤまたは消去；
Ｘ７２はＰまたは消去である。
【００５６】
いくつかの実施例においては、前記ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６、７、８または９のアミノ酸配列を持たないことが条件となることは注目すべきである。
【００５７】
別実子例においては、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６〜４１またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０〜４１（）前記配列１乃至２参照）のアミノ酸配列を実質的に含むかあるいは含む、単離または精製されたペプチドが提供される。
【００５８】
当業者には認識されるように、上で定義したペプチドにおける'実質的に含む'とは、該ペプチドが例えばＮ末端および／またはＣ末端の除去であって、ペプチドの活性、すなわちＥＬＲ−ＣＸＣケモカインアゴニストまたはアンタゴニスト活性に著しく影響しない除去を含みうるということを指す。
【００５９】
好ましい実施例においては、前記単離または精製されたペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３（ｈＧ３１Ｐ＋２）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４（ｈＧ３１Ｐ＋６）に示されるものである。図１２、１９および２０に示すとともに以下に述べるように、これらのペプチドはｈＧ３１Ｐ＋０およびｈＧ３１Ｐ−１と比較してより大きい反応活性を示すものである。
【００６０】
前記のペプチドをエンコードするポリヌクレオチドは本発明の視野の範囲内であるとともに、当該技術分野において既知の手法を用いて構成しうる。当業者には認識されるように、このようなポリヌクレオチドからなるか、あるいは形質転換または移入された形質転換細胞または細胞系もまた、以下で述べるように本発明の視野の範囲内である。
【００６１】
例えば、当該技術分野において既知の手法を用いて、ポリヌクレオチドまたは前記のポリヌクレオチドからなる発現ベクターからなるとともに、該ポリヌクレオチドの発現を制御する調節配列と効果的に連結されるウイルス性宿主を遺伝子工学によって構成しうる。
【００６２】
さらに前記のペプチドを、ＣＸＣケモカイン媒介病状の処置に用いる薬剤の製造に用いることもできる。いくつかの実施例においては、該薬剤はＥＬＲ−ＣＸＣケモカイン媒介病状の処置に用いるものである。該ＣＸＣケモカイン媒介病状は、虚血・再潅流障害、内毒素血症誘導急性呼吸困難症候群、免疫複合体型糸球体腎炎、細菌性肺炎および乳腺炎からなるグループのいずれかでありうる。
【００６３】
当業者には認識されるように、効果量の前記ペプチドのいずれかからなるこのような薬剤は、このような処置を必要とする個人の助けとなりうる。
【００６４】
本発明の別実子例においては、結合サイトにおいて同じ三次元構造を有する化合物をアンタゴニストとして用いうると構想される。化学的構造の三次元解析を用いて、ケモカインとの結合サイトを含む活性サイトの構造を測定する。高処理量スクリーニングによる化学的誘導を用いてＣＸＣＲ２の選択的アンタゴニストを生成するとともに化学的に最適化することがなされている（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー誌１９９８年２７３号１００９５頁、非特許文献に含まれる）。同様の取り組みはＣＣＲ３アンタゴニストの生成にも用いられていた（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー誌２０００年２７５号３６６２６頁、非特許文献に含まれる）。
【００６５】
ウェルズ他（ジャーナル・オブ・ロイコサイト・バイオロジー誌１９９６年５９号５３頁、非特許文献に含まれる）において、核磁気共鳴分光（ＮＭＲ）を用いてＥＬＲおよび非ＥＬＲのＣＸＣケモカインの双方を含むＣＸＣＲの配位子の三次元構造を詳述している。そのＮＭＲ情報により、ウェルズ他は多重ケモカインの受容体結合サイト内での多重置換を行い、実質的に配位子の受容体特性を変更することができた。
［原料と方法］
［試薬と補給］
以下の試薬を購入した。グルタチオンセファロース、発現ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ、セファデックスＧ−２５（アマシャム・ファーマシア・バイオテック、ケベック州ベーダーフィー）ボルトン−ハンター試薬、タンパク質ビオチン化キット（ピアース・サイエンティフィック、イリノイ州ロックフォード）、シーケンシングベクターｐブルースクリプトＩＩＫＳ、Ｐｆｕターボ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ストラトジーン、カリフォルニア州ラホーア）サイト指向突然変異誘発キット（クイックチェンジ（登録商標）、ベーリンガー・マンハイム、カナダ  ケベック州ラヴァル）、アプロチニン、ベンゼン、カルシウムイオン透過担体Ａ２３１８７、クロラミンＴ、サイトカラシンＢ、ジメチルホルムアミド、エンドトキシン（大腸菌リポ多糖類、血清型０１２７Ｂ８）、イソプロピル−チオ−Ｄ−ガラクトピロノシド（ＩＰＴＧ）、ロイペプチン、ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−グルクロニド、鉱油、シリコンオイル、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、ホルボール−１２，１３−ミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ）、トライトンＸ−１００（シグマ・ケミカル、オンタリオ州ミシソーガ）ディフ−クイック染色キット（アメリカン・サイエンティフィック・プロダクツ、イリノイ州マグロー）、ヒトＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ５およびＣＸＣＬ８（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネソタ州ミネアポリス）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）共役抗ウサギ免疫グロブリン（ザイメッド、カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）、ＤＭＥＭ、ＨＢＳＳ（ギブコ、ニューヨーク州グランドアイランド）、ＨＲＰ−ストレプトアビジン（ベクター・ラボ、カリフォルニア州バーリンゲーム）、ＡＢＴＳ酵素基質（キアケゴー＆ペリー・ラボ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、リンパ球分離薬剤（ＩＣＮファーマスーティカルズ、イリノイ州オーロラ）。
［ＣＸＣＬ８．ｓｕｂ．（３−７４）Ｋ１１Ｒ相似物の生成］
高親和性ＣＸＣＲ１／ＣＸＣＲ２配位子ＣＸＣＬ８．ｓｕｂ．（３−７４）Ｋ１１ＲおよびそのＴ１２Ｓ／Ｈ１３Ｆ相似物を、リーおよびゴードン（２００１年、前記）の方法に従って生成した。これらのタンパク質のＧｌｙ３１Ｐｒｏ（Ｇ３１Ｐ）、Ｐｒｏ３２Ｇｌｙ（Ｐ３２Ｇ）およびＧ３１Ｐ／Ｐ３２Ｇ相似物を、適当な前方および後方オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲによるサイト指向突然変異誘発で生成した（表１）。それぞれの反応の産物をＤｐｎＩにより消化し、ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ内へ連結し、ＨＢ１０１細胞へ移入し、それらの配列を商業的に確認した（プラント・バイオテクノロジー・インスティテュート、サスカトゥーン）。簡単には、プロテアーゼ阻害剤カクテル（２ｍＭ  ＰＭＳＦ、２μｇ／ｍｌアプロチニンおよび２μｇ／ｍｌロイペプチン）存在下で組換体細菌を溶解し、上澄み内の組換体融合タンパク質を、カズウェル他の方法（Ｊ・Ｌ・カズウェル、Ｄ・Ｍ・ミドルトンおよびＪ・Ｒ・ゴードン、１９９８年、ヴェテリナリー・イミュノロジー・アンド・イミュノパソロジー誌６７号３２７〜３４０頁）に従って、グルタチオン−セファロースビーズを用いた親和クロマトグラフィーにより精製した。ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ相似物をＧＳＴ融合タンパク質からトロンビン消化によって開裂し、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）に対し透析し、市販エンドトキシン除去カラムを通過させ、それからポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）およびヤギ抗ウシＣＸＣＬ８抗体（Ｍ・モーセ（Ｍｏｒｓｅｙ）博士により提供された）を用いたウエスタンブロッティングによって特性を決定した。それぞれの精製された相似物は８ｋＤａの分子量を持ち、ウエスタンブロッティングにおいて抗ＣＸＣＬ８抗体に特異的に認識され、ＰＡＧＥゲルの濃度計解析による相対的純度は９６％であった。
［組換体タンパク質の標識］
後の相対的受容体親和性の分析のための、相似物の好中球および１２５Ｉ−ＣＸＣＬ８への結合の初期測量に、ｂｉｏｔＣＸＣＬ８を用いた。ＣＸＣＬ８をビオチン化し、リーおよびゴードン（２００１年、前記）に記載の市販キットを用いてビオチン置換のレベルを定量した。ｂｉｏｔＣＸＣＬ８を、１モルのＣＸＣＬ８あたり２．１５モルのビオチンで置換した。リーおよびゴードン（２００１年、前記）に詳述されるようにして、ＣＸＣＬ８を１２５Ｉによりボルトン−ハンター試薬（ＢＨＲ）方法を用いて放射性同位元素で標識した。リーおよびゴードン（２００１年、前記）に記載されるようにして、標識されたタンパク質を合体された１２５Ｉ−ＢＨＲからセファデックスＧ５０上のクロマトグラフィーによって分離し、標識されたＣＸＣＬ８の特性を、その好中球への相対的親和性および結合平衡を得るのに必要な時間について決定した。
［ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ相似物結合検定］
カズウェルの方法（Ｊ・Ｌ・カズウェル他、１９９８年、ヴェテリナリー・イミュノロジー・アンド・イミュノパソロジー誌６７号３２７〜３４０頁）に従って、細胞（８５〜９３％好中球）を蓄牛の血液から精製した。予備実験において、トリパンブルー色素排除により、我々のいずれの相似物も好中球の生存に影響しないことを測定した。幅広い相似物測量のため、ＨＢＳＳ／０．５％ＢＳＡ内の好中球を相似物とともに４℃で２時間インキュベートし、冷ＤＭＥＭ中で洗浄し、それからｂｉｏｔＣＸＣＬ８（１０００ｎｇ／ｍｌ）とともに４℃で２時間インキュベートした。洗浄した細胞をアルカリ性ホスファターゼ結合ストレプトアビジン（１：７００希釈）とインキュベートしてからＡＢＴＳ酵素基質とインキュベートすることで、細胞会合ビオチンを検出した。ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて試料のＯＤ４０５を定量した。薬剤で処置した好中球は充分な．ｓｕｐ．ｂｉｏｔＣＸＣＬ８と慣例的に結合し、０．５〜０．６のＯＤ４０５を生成した。
【００６６】
ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐの深さ方向の研究のため、１２５Ｉ−ＣＸＣＬ８を非標識ＣＸＣＬ８またはＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐとの結合抑制検定に用いた。予備実験において、好中球の１２５Ｉ−ＣＸＣＬ８への結合平衡時間が４５分であるとともに、２０ｐＭの１２５Ｉ−ＣＸＣＬ８がちょうど細胞の高親和性受容体を飽和させることを測定した。細胞をそれからシリコンオイル内の６％鉱油によって沈殿させ、細胞会合放射配位子のレベルをカウンターを用いて定量した。それぞれの検定において、試料のセット内での非標識配位子の２００倍モル過多により、１２５Ｉ−ＣＸＣＬ８の細胞への非特異的結合を評定した。この値を用いて特異的結合のパーセントを算出した（Ｊ・コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）、Ａ・クルースベーク（Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ）、Ｄ・マルグリース（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ）、Ｅ・シェバス（Ｓｈｅｖａｃｈ）およびＷ・ストロバー（Ｓｔｒｏｂｅｒ）、１９９４年、カレント・プロトコルス・イン・イミュノロジー、ジョン・ワイリー＆サンズ、ニューヨーク）。
［好中球−グルクロニダーゼ放出検定］
好中球−グルクロニダーゼ検定は詳細に報告されている（リーおよびゴードン、２００１年）。簡単には、サイトカラシンＢで処置した好中球をＣＸＣＬ８相似物とともに３０分間インキュベートし、それからその分泌産物を酵素について熱量測定検定した。−グルクロニダーゼ放出は、０．２％（ｖ／ｖ）トライトンＸ−１００で処置した細胞の溶解によって定量した全体細胞内容の存在として示された。ポジティブコントロール刺激薬ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＡ２３１８７（１μｇ／ｍｌ）による好中球免疫試験により、全体細胞−グルクロニダーゼ貯蔵の４２＋／−６％の放出が誘導された。
［炎症病変からの試料］
実験的エンドトキシン誘導乳腺炎の畜牛（ｎ＝４）の乳槽（Ｋ・Ｐ・ウォラー、１９９７年、ヴェテリナリー・イミュノロジー・アンド・イミュノパソロジー誌５７号２３９〜２５１頁）と同様に、診断された臨床線維素膿性肺性マンハイミオシス（カズウェル他、１９９７年）によって蓄牛の肺（ｎ＝４）から気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を得た。用量−反応先行試験において、５μｇのエンドトキシンが強い（最大７０〜８０％）乳房好中球反応を誘導することが測定された。よって、報告される実験においては、５μｇのエンドトキシンまたは分散媒のみ（食塩水；体積３ｍｌ）の、非泌乳ホルスタイン乳牛の乳槽への注入によって、乳腺炎が誘導されるとともに、１５時間後、３０ｍｌ  ＨＢＳＳを加えた洗浄液により該槽の浸潤が回復された。ＢＡＬＦおよび乳槽洗浄液からの細胞を延伸分離によって沈殿させ、鑑別計数を行った。未処置およびＣＸＣＬ８を削減した（下側）洗浄液を、そのケモカイン含有量についてＥＬＩＳＡ（ＣＸＣＬ８のみ）および走化性検定によって評定した。
［好中球走化性検定］
既知の方法（カズウェル他、１９９８年；Ｃ・Ｍ・ケアンズ他、２００１年、ジャーナル・オブ・イミュノロジー誌１６７号５７〜６５頁）に従って、複製改良ボイデン顕微走化性室において、ポリビニルピロリドンを含まない５μｍ孔径ポリカーボネートフィルターを用いて、顕微走化性検定を行った。それぞれの試料について、２０〜３０分で膜に移入された細胞の数を、４０倍対物視野での少なくとも９回の直接計数によって計数し、その結果を細胞／４０倍視野（＋／−ＳＥＭ）の平均値として示した。化学誘引物質は、ウシまたはヒトＣＸＣＬ８、ヒトＣＸＣＬ５およびＣＸＣＬ１、肺性マンハイミオシスＢＡＬＦおよび乳腺炎洗浄液（ＨＢＳＳ中で１：１０〜１：８０に希釈）を含み、アンタゴニストはマウス抗ヒツジＣＸＣＬ８抗体８Ｍ６（Ｐ・ウッド博士、オーストラリアＣＳＩＲＯによって寛大にも提供された）またはＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ相似物からなる。いくつかの分析において、試料を抗体（５μｇ／ｍｌ）とともに氷上で６０分間あらかじめインキュベートした（Ｊ・Ｒ・ゴードン、２０００年、セルラー・イミュノロジー誌２０１号４２〜４９頁）。他の分析においては、８Ｍ６抗体およびタンパク質−Ａ−セファロースビーズによってＣＸＣＬ８特異的免疫親和性マトリクスを生成し、これらを試料の過剰吸収に用いた（カズウェル他、１９９７年；Ｊ・Ｒ・ゴードンおよびＳ・Ｊ・ガリ（Ｇａｌｌｉ）、１９９４年、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン誌１８０号２０２７〜２０３７頁）ＣＸＣＬ８削減の範囲を処置された試料のＥＬＩＳＡによって確認した。組換体アンタゴニストの分析のために、阻害剤を試験の直前に試料と直接混合した。
［ＣＸＣＬ８  ＥＬＩＳＡ］
ＥＬＩＳＡのために、カズウェル他（１９９７年）に記載のように、ＭＡｂ  ８Ｍ６を捕捉抗体として用い、ウサギ抗ヒツジＣＸＣＬ８抗血清（これもＰ・ウッド博士、ＣＳＩＲＯより）を二次抗体として用いるとともに、ＨＲＰ共役抗ウサギＩｇおよびＴＭＢを検出システムとして用いた。それぞれの試料の連続希釈を三重反復で分析し、それぞれの分析は組換体ウシＣＸＣＬ８標準曲線を含んでいた。
［生体内でのＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐのエンドトキシン反応の遮断］
一連の１５時間の皮膚試験を用い、ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐが生体内でエンドトキシン炎症誘導反応を遮断する能力を試験した。それぞれの試験において、２週齢の健康なホルスタイン乳牛を皮内について１００μｌ食塩水中の１μｇエンドトキシンによって免疫試験し、それから１５時間後に局所麻酔（リドカイン）を用いて６ｍｍのせん孔による生検材料を採取し、組織病理学的に処置した（ゴードンおよびガリ、１９９４年）。第一の（内部ポジティブコントロール）試験の後で、それぞれの動物の皮下、筋肉内、あるいは静脈に食塩水内のＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐ（７５μｇ／ｋｇ）を注入し、それからそれらを再び上記のようにエンドトキシンに対し免疫試験した。該動物を合計４回エンドトキシンによって免疫試験し、１５時間反応サイト生検材料を処置後０、１６、４８および７２時間後に採取した。該生検材料を通常の方法で処置し６ｍｍパラフィン切片とし、ギエムザ溶液で染色し、４００倍で盲目的方法において検査した（ゴードンおよびガリ、１９９４年；Ｊ・Ｒ・ゴードン、２０００年、ジャーナル・オブ・アレルギー・アンド・クリニカル・イミュノロジー誌１０６号１１０〜１１６頁）。４０倍対物顕微鏡視野あたりの好中球の平均数を皮膚内の３つの異なる深度、乳頭（表面）、中間および網状（深い）真皮において定量した。
［統計的解析］
多群データをＡＮＯＶＡおよび事後のフィッシャー最小有意差法（ＰＬＳＤ）試験により解析し、２群比較はスチューデントｔ検定（両側）を用いて行った。結果を平均＋／−ＳＥＭとして示した。
［結果］
［１．  ウシＧ３１Ｐ］
ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１ＰはＣＸＣＬ８の好中球への結合を競争的に阻害する。それぞれのＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ相似物の好中球上のＣＸＣＬ８受容体への結合能力を測量し、その結果、配位子としてＣＸＣＬ８と競争する。我々の初期測量において、ｂｉｏｔＣＸＣＬ８結合阻害分析を行い、細胞を相似物（１０ｎｇ／ｍＩ）とともに４℃で２時間インキュベートしてからｂｉｏｔＣＸＣＬ８（１μｇ／ｍＩ）へ暴露した。このレベルのＣＸＣＬ８は、実験的肺性マンハイミオシスのヒツジの肺組織において発見されたものと近似している（Ｊ・Ｌ・カズウェル他、１９９８年。ウシの気管支肺炎においてインターロイキン８は好中球化学誘引物質の役割を果たす。サスカチェワン大学獣医病理学部博士号論文）。ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐはこの分析（図１）におけるＣＸＣＬ８結合の有効なアンタゴニストであり、１０ｎｇ／ｍｌのＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐによって続いてのｂｉｏｔＣＸＣＬ８の細胞への結合の９５％が遮断された。この用量での試験の際、ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｐ３２ＧはＣＸＣＬ８の結合の４８％しか遮断できず、未標識ＣＸＣＬ８自体はｂｉｏｔＣＸＣＬ８の結合の３０％を競争的に遮断した。ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１ＰまたはＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｐ３２Ｇへの、Ｔｈｒ１２およびＨｉｓ１３における追加のアミノ酸置換の導入は、相似物のアンタゴニスト活性を実質的に低下させる（図１）。このデータは、好中球をＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐとともに前もってインキュベートすることによって、それに続くＣＸＣＬ８結合が強く減少調節されることを明確に示唆している。
【００６７】
ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１ＰのＣＸＣＬ８結合阻害能力をより微細にマッピングするために、次の実験群において、１２５ＩＣＸＣＬ８および変動用量のＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐまたは未標識ＣＸＣＬ８へと、細胞を同時に暴露した。２０ｐＭの１２５Ｉ−ＣＸＣＬ８の細胞への結合の阻害において、ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐは野生型ＣＸＣＬ８に対し約２桁大きく効果的であった（図１）。標識された配位子の結合の５０％を阻害する濃度（ＩＣ５０）は、未標識ＣＸＣＬ８では１２０ｐＭであり、ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐでは４ｐＭであった。このデータによって、ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１ＰはＣＸＣＬ８の好中球への結合の非常に有効な競争的阻害剤であることが示唆される。
【００６８】
ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐは好中球アゴニスト活性を示さない。ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐは確かに好中球ＣＸＣＬ８受容体の高親和性配位子であるが、アゴニストまたはアンタゴニストとしても同等に作用するであろう。よって、我々の次の実験において、我々が生成したＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ相似物の潜在的アゴニスト活性を、それらの細胞に対する化学誘引能力、または生体外での好中球顆粒加水分解酵素、グルクロニダーゼの放出誘導能力によって測定した（図２）。１００ｎｇ／ｍｌにおいて、ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐの化学誘引は弱く、１または１００ｎｇ／ｍｌのＣＸＣＬ８（ｐ＜０．００１）によってそれぞれ１３．９＋／−４％または５．４＋／−２％の反応を誘導した。１００ｎｇ／ｍｌにおいて、ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｐ３２Ｇ相似物は明確に実質的な（ＣＸＣＬ８反応の３８．３＋／−２％）反応を誘導したが、複合ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐ／Ｐ３２Ｇ相似物は有効な化学誘引を示さなかった。グルクロニダーゼ放出の誘導能力の評定の際に、メディエータ放出を誘導するのにＣＸＣＬ８と同等に効果的なＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ相似物は無かった。実際に、これらのいずれも１０ｎｇ／ｍｌにおいては表面に出ない放出しか見られず、１００ｎｇ／ｍｌにおいてはＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐ／Ｐ３２Ｇのみが有意な好中球反応を誘導した（図２）。ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐに注意を集中したことで、複合ＣＸＣＬ８競争的阻害および好中球アゴニストデータが得られた。
【００６９】
ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１ＰはＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２配位子の両方への好中球走化性反応を遮断する。不適当なＥＬＲ＋ケモカイン発現の最も病原となる効果は、炎症細胞の組織への誘引である。よって、次に大用量ＣＸＣＬ８への好中球の走化性反応に対するＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐの衝撃を評定した（図３）。我々のヒツジおよび畜牛での生体内観測（３３）から予測されるように、１μｇ／ｍｌ（１２９ｎＭ）のＣＸＣＬ８は非常に強い走化性誘導を示すが、非常に少ない用量のＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐによってこの反応は改善された。１２．９ｐＭのＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐの追加によって、細胞の走化性反応は３３％減少した。この条件のＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１ＰにおいてＩＣ５０は０．１１ｎＭであり、１０ｎＭのＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１ＰによってＣＸＣＬ８反応は完全に遮断された。
【００７０】
より微妙なウシＣＸＣＬ８免疫試験の反応の遮断におけるＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐの効力の試験の際に、研究を拡張してＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐの、ヒトＣＸＣＬ８およびヒトＣＸＣＲ２特異配位子ＣＸＣＬ１およびＣＸＣＬ５への好中球反応の遮断能力を評定した。これらのそれぞれは、膵臓炎（Ｗ・Ｗ・ホシェーター（Ｈｏｃｈｒｅｉｔｅｒ）他、２０００年、ユーロロジー誌５６号１０２５〜１０２９頁）またはＡＲＤＳ（ヴィラード他、１９９５年）に罹患した組織において１〜１０ｎｇ／ｍｌで発現した。ウシ好中球は１ｎｇ／ｍｌのｈＣＸＣＬ１またはｈＣＸＣＬ５に反応するとともに、１０ｎｇ／ｍｌのｈＣＸＣＬ８にも同様に反応した（図３）。よって、これらの用量を、これらの配位子の好中球反応へのＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐの効果の試験に用いた。ｈＣＸＣＬ１およびｈＣＸＣＬ５への好中球反応はそれぞれ０．２６および０．０６ｎＭのＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐによって５０％減少し、これらのｈＣＸＣＬ８への反応は０．０４ｎＭのＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐによって５０％減少した（図３）。このデータにより、ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１ＰによってケモカインのＥＬＲ−ＣＸＣ亜科の多くの動作をアンタゴナイズできることが示される。
【００７１】
ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐは、細菌性肺炎または乳腺炎病変において発現する好中球ケモカインの効果的な生体外アンタゴニストである。生体内の複合炎症環境において発現する好中球化学誘引物質の配列を我々のアンタゴニストによって遮断可能な範囲を試験しようとした。よって、ケモカインによる好中球活性化が病状の進行に重要に寄与する２つの疾患、乳腺炎および肺性マンハイミオシスを選択した。乳腺炎のエンドトキシンモデル（Ｋ・ペーション（Ｐｅｒｓｓｏｎ）他、１９９３年、ヴェテリナリー・イミュノロジー・アンド・イミュノパソロジー誌３７号９９〜１１２頁）を用い、乳槽毎に５μｇのエンドトキシンを注入し１５時間後にそれぞれの槽を洗浄した。好中球はエンドトキシンおよびコントロール槽からのそれぞれ８２および６％の細胞からなり、細胞の残りはマクロファージからなっていた。希釈された（１：１０）洗浄液は生体外での好中球走化性反応を強く誘導し、試料への抗ＣＸＣＬ８抗体の追加によってそれは薬剤コントロールに対し最大７３＋／−８％減少した（図４Ａ）。一方、１ｎｇ／ｍｌのＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐの試料への追加により、それらの走化性活性は９７＋／−３％減少した。
【００７２】
好中球はまた、進行した肺性マンハイミオシスの蓄牛のＢＡＬＦから回収した細胞の９３＋／−１２％からなっていた。生体外での試験において、これらの試料もまた好中球への走化性が強く、抗ＣＸＣＬ８抗体の追加によってその好中球走化性活性は最大７３＋／−５％減少した（図４Ａ）。これらのＢＡＬＦ試料を１または１０ｎｇ／ｍｌのＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐで処置することによって、好中球反応は薬剤コントロールに対しそれぞれ７５＋／−９または９３＋／−９％減少した。このデータにより、ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１ＰによってＣＸＣＬ８および非ＣＸＣＬ８化学誘引物質の動作を遮断できることが示される。
【００７３】
別の戦略を用いてこれらの観測を確認するために、次に免疫親和性マトリクスを用いて細菌性肺炎ＢＡＬＦ試料のＣＸＣＬ８を削減し、それから試料の残余好中球走化性活性の遮断におけるＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐの効力を評定した（図４Ｂ）。未処置の残余ＢＡＬＦ試料は３，２１５＋／−２７５ｐｇ／ｍｌのＣＸＣＬ８を含み、免疫親和性で吸収されたＢＡＬＦは２４＋／−１７ｐｇ／ｍｌのＣＸＣＬ８を含んでいた。この一連の実験において、ＣＸＣＬ８削減ＢＡＬＦ試料への好中球反応は、未吸収サンプルへの反応の６５．４＋／−４％だった。ＣＸＣＬ８は、臨床の配列から得られた肺性マンハイミオシスのＢＡＬＦにおける好中球走化性活性に、１５％程度寄与できることが知られる（カズウェル他、２００１年）。よって、ＣＸＣＬ８削減処置はＣＸＣＬ８の除去において９９％効果的であり、これらの試料内には実質的な量の走化性活性が残っていたとともに、１ｎｇ／ｍｌのＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐの追加によってその蓄積効果は充分に排除された（図４Ｂ）。このデータによって、ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐはこれらの試料において発現する非ＩＬ−８化学誘引物質をもアンタゴナイズすることが明確に確認された。
【００７４】
ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐは、生体内でのエンドトキシン誘導好中球炎症の遮断に高度に効果的である。我々の最後の実験において、ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐの蓄牛の皮膚におけるエンドトキシン誘導炎症反応の遮断能力、およびそれが効果的だった時間枠を評定した。動物を皮内において１μｇの細菌性エンドトキシンを加えて１５時間前から免疫試験し（内部ポジティブコントロール反応）、あるいは異なる３種の時間の後で、静脈内、皮下または筋内にＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐを注入した（７５μｇ／ｋｇ）。１５時間のエンドトキシン反応サイトのパンチ生検を処置の１５分前およびアンタゴニストのそれぞれの動物への注入の１６、４８および７２時間後に採取し、浸潤した好中球の数をそれぞれの生検材料の乳頭（皮相）、中間および網状真皮において盲目的方法で定量した。アンタゴニスト処理の前に、強い好中球炎症反応がそれぞれの動物のエンドトキシン免疫試験サイトに存在した（図５）。生検材料内において、乳頭真皮での反応は全ての動物において穏やかであるとともに（データは図示しない）皮膚の深度が増すにつれて徐々に顕著となり、最大の炎症（好中球浸潤）は網状真皮の血管の周囲において観測された（図５Ａ）。ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐ処置の後で、それぞれの処置前の反応に対し、１６時間の生検材料内において観測された炎症反応は８８〜９３％抑制され、４８時間の生検材料内では５７％（静脈内）から９７％（皮内）抑制された。７２時間の処置後、静脈内に投薬されたアンタゴニストの効果は消えたが、皮内および皮下を処置された蓄牛のエンドトキシン反応はまだ６０％抑制されていた。このデータによって、ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐは生体内でのエンドトキシン誘導炎症反応の高度に効果的なアンタゴニストであり、その効果は２〜３日持続するとともに、配送経路はこの新たなアンタゴニストの薬物動力学に著しく影響するということが明確に示される。
【００７５】
Ｇ３１Ｐはまた、ヒト好中球上のヒトＥＬＲ−ＣＸＣケモカインＣＸＣＬ８／ＩＬ−８およびＣＸＣＬ５／ＥＮＡ−７８の走化性効果をアンタゴナイズすることを発見した。０．１〜５００ｎｇ／ｍｌのＣＸＣＬ８（図６、左側のパネル）またはＣＸＣＬ５／ＥＮＡ−７８（図６、右側のパネル）の走化性活性は、１０ｎｇ／ｍｌの我々のアンタゴニストの走化性分析への追加によって実質的には完全に遮断された。同様に、Ｇ３１ＰはＣＸＣＬ８のＣＸＣＲ１／ＣＸＣＲ２陽性好酸球への走化性効果を遮断した。我々および他者によって、アトピーまたはぜん息の被験者からの好酸球はＥＬＲ−ＣＸＣケモカイン受容体を発現するとともに、ＣＸＣＬ８に反応することが発見されている（図７、左側のパネル）。穏やかなアトピーであるとともにぜん息ではないドナーの精製された末梢血液好酸球（純度９９％）への１００ｎｇ／ｍｌのＣＸＣＬ８の走化性効果は、１０ｎｇ／ｍｌのＧ３１Ｐの走化性分析への追加によって完全に排除されたが、ＣＣＲ３配位子ＣＣＬ１１／エオタキシンではそうではなかった（図７、中央のパネル）。好酸球増多症患者からの精製した好酸球に対する試験において（図７、右側のパネル）、Ｇ３１Ｐはこれらの細胞のＣＸＣＬ８／ＩＬ−８またはＣＸＣＬ５／ＥＮＡ−７８への反応を中和した。
【００７６】
このデータによって以下のことが明確に示される。ウシＧ３１Ｐは、エンドトキシン免疫試験に反応して生体内で発現するウシＥＬＲ−ＣＸＣケモカインの効果的なアンタゴニストであるとともに、好中球および好酸球のＥＬＲ−ＣＸＣケモカイン受容体の、ＣＸＣＲ１／ＣＸＣＲ２の既知の配位子であるＣＸＣＬ８およびＣＸＣＬ５への反応を充分にアンタゴナイズするものである。
［２．  ヒト化ウシＧ３１Ｐ］
ウシＧ３１Ｐのアミノ末端部分およびヒトＣＸＣＬ８のカルボキシル末端部分からなるウシ−ヒトキメラタンパク質（ｂｈＧ３１Ｐ）（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０）を生成するとともに、これが生体内および生体外での強い好中球アンタゴニスト活性を有することを発見した。実際に、ｂｈＧ３１ＰはｂＧ３１Ｐまたはヒト形態のＧ３１Ｐよりも強い活性を有しうる。また、残存ウシアミノ酸をヒトアミノ酸と置換したｂｈＧ３１Ｐの５つの別の形態（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６〜３０）を生成し特性を決定した。これらは相似物のアンタゴニスト活性を増加させることはなく、いくつかの証拠からこれらはアンタゴニスト活性を減少させうることが示唆される。
【００７７】
ヒトの薬剤の生成の１つの取り組みにおいて、我々はｂＧ３１Ｐのヒト化を企てた。さらに、ＣＸＣＬ８の生物学的活性について、ＣＸＣＬ８のアミノ末端'半分'はカルボキシル末端よりも重要である。ＣＸＣＬ８のカルボキシル末端'半分'は１０の分子の１５のウシ−ヒト相違アミノ酸からなるため、最初に、ｈＣＸＣＬ８のカルボキシル末端（すなわち、エンコードアミノ酸４５〜７２）のｂＧ３１Ｐのアミノ半分（すなわち、エンコードアミノ酸３〜４４）への大規模なライゲーションがその活性に影響するかどうかを検査した。本質的に、ＣＸＣＬ８のアミノ半分は不可欠な受容体認識およびモチーフとその連合足場構造のシグナリングを行うと知られている。
【００７８】
前記のようにして、キメラウシ−ヒトＧ３１Ｐタンパク質、ｂＣＸＣＬ８（３−４４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐ−ｈＣＸＣＬ８（４５−７２）（ｂｈＧ３１Ｐ）（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０）を生成し、それからこのタンパク質のｃＤＮＡを残存ウシ−ヒト相違アミノ酸残基１つずつの置換のテンプレートとして用いた。
【００７９】
エンテロキナーゼ（ｂｈＧ３１Ｐ＋０およびｂｈＧ３１Ｐ−１アイソフォームのみ）またはトロンビン（他の全ての相似物）開裂のＳＯＰを用い、それぞれの構造を発現および生成し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングによってこれらの特性を決定した（図８）。それぞれのアイソフォームは大きさが８ｋＤであり、ｂｈＧ３１Ｐ／Ｔ１５Ｋ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２８）およびｂｈＧ３１Ｐ／Ｓ３７Ｔ  （ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３０）アイソフォーム溶液は、あるいは試料内のタンパク質の高濃度、または二量化に関連するこれらのＧ３１Ｐ相似物のこの部分の摂動の結果として形成された、低いレベルの相似物二量体として解釈可能であるものを含むと見られた。この領域の複数のアミノ酸はヒトＣＸＣＬ８の二量化に大きく影響することが既に報告されている。
【００８０】
ｂｈＧ３１Ｐ（すなわち、ｂＣＸＣＬ８（３−４４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐ−ｈＣＸＣＬ８（４５−７２））はｂＧ３１ＰのＥＬＲ−ＣＸＣケモカインアンタゴニスト活性を保持し、ヒト好中球のヒトＣＸＣＬ８への走化性または活性酸素（ＲＯＩ）放出反応を遮断した（図９）。
【００８１】
このウシ−ヒトキメラタンパク質を、追加のヒト同等アミノ酸を相違残基（すなわち、Ｔ３Ｋ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６）、Ｈ１３Ｙ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２７）、Ｔ１５Ｋ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２８）、Ｅ３５Ａ  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２９）およびＳ３７Ｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３０））の代わりに導入することによってさらにヒト化した際に、これらの変更が５０：５０ウシ−ヒトキメラの活性に有意に影響しないことが発見された。走化性分析において評定されるように相似物のいずれをも好中球のアゴニストとせず、あるいは走化性阻害または活性酸素放出の阻害において評定されるようにアンタゴニスト活性の有意に減少しなかった（図１０Ｂ）。
【００８２】
アミノ末端配列を変更したｂｈＧ３１Ｐ（すなわち、ｂｈＧ３１Ｐ＋６、ｂｈＧ３１Ｐ＋２、ｂｈＧ３１Ｐ＋０、ｂｈＧ３１Ｐ−１）（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏｓ．１４、１３、１１および１２）の活性の衝撃を評定し、それぞれの走化性阻害および活性酸素阻害分析を測定した（図１１）。Ｌｙｓ３の除去はｂｈＧ３１Ｐの活性を減少させる傾向があるが、他の相似物のアンタゴニスト活性はおおよそ同等であった（図１１）。当業者には認識されるように、このデータは、Ｇ３１Ｐ活性を有意に妨害することなく可変長および可変アミノ酸組成のＮ末端追加が許容されうることを示すものである。Ｎ末端追加は０〜９のランダムアミノ酸、０〜８のランダムアミノ酸、０〜７のランダムアミノ酸、０〜６のランダムアミノ酸、０〜５のランダムアミノ酸、０〜４のランダムアミノ酸、０〜３のランダムアミノ酸、あるいは０〜２のランダムアミノ酸である。
【００８３】
また、このデータは、Ｇ３１Ｐの多重ウシ−ヒトキメラ形態は有用な好中球アンタゴニストであることを示唆するものである。しかし、およそこれらのキメラの特性の決定を完了した際に、ＣＸＣＬ８誘導好中球反応の遮断においてＣＸＣＬ８（３−７２）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐのヒト形態はｂＧ３１Ｐと同等に効果的であるとともに、ｈＧ３１Ｐは生体内での細菌性エンドトキシン誘導好中球炎症および病状の高度に効果的なアンタゴニストであると測定されたことは注目すべきである。
［３．  ヒトＧ３１Ｐ（ｈＧ３１Ｐ）］
我々は宝生物工程（中国、大連）と契約し、全長のヒトＣＸＣＬ８のｃＤＮＡを合成し、適合性の５’（ＢａｍＨ１）および３’（ＥｃｏＲ１）末端を用いてｐＧＥＸ−２Ｔへとクローニングした。このｐＧＥＸ−ｈＣＸＣＬ８のｃＤＮＡをサイト指向突然変異誘発のテンプレートとして用い、ｐＧＥＸ−ｈＣＸＣＬ８（３−７２）Ｋ１１Ｒ（ｈＫ１１Ｒ）およびｐＧＥＸ−ｈＣＸＣＬ８（３−７２）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐ（ｈＧ３１Ｐ）を生成した。これらはＧＳＴ融合タンパク質として発現され、標準的操作手順によるトロンビン開裂を用いて精製された。ｂｈＧ３１Ｐ（前記）とともに、組換体Ｇ３１Ｐ関連分子の、６（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）または２（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）の外来アミノ酸が先行しそれぞれｈＧ３１Ｐ＋６（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４）またはｈＧ３１Ｐ＋２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３）と称される２つの族、外来アミノ酸を持たない構成の族（Ｇ３１Ｐ＋０）（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１）、さらにアミノ末端を除去した族（すなわちＧ３１Ｐ−１、Ｇ３１Ｐ−３またはＧ３１Ｐ−５）を生成した。ウシ同等アミノ酸をｈＧ３１Ｐ＋６のアミノ酸位置３５（ＳＥＱ  ＴＤ  Ｎｏ．３６）、３７（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３７）、４４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３８）、４７（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３９）および４９（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４０）へ導入した。それぞれのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングで発現、精製し特性を決定した。予測されたように、これらのそれぞれが抗ＣＸＣＬ８抗体に反応する〜８ｋＤのシングルバンドからなった。
［生物学的特性決定］
精製ヒト好中球による走化性分析を用いて、それぞれの構造のアゴニストおよびＣＸＣＬ８アンタゴニスト活性を評定した（図１２）。
［  ｈＣＸＣＬ８（３−７２）Ｋ１１Ｒ（ｈＫ１１Ｒ）］
ｈＫ１１ＲはＣＸＣＬ８よりも有意に高い特異的活性を有し（好中球走化性分析）、天然ヒトケモカインよりはるかに強い好中球アゴニストを示す。よって、ｈＫ１１Ｒは漸増好中球漸増／活性化を要する臨床状況において利用されうる。
［ｈＣＸＣＬ８（３−７２）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐ（ｈＧ３１Ｐ）］
ｈＫ１１Ｒ＋６でのＧ３１Ｐ置換によってこの分子のアゴニスト活性は実質的に消去され、ｈＧ３１Ｐ＋６はＣＸＣＬ８誘導好中球走化性のアンタゴニストとして、少なくともｂＧ３１Ｐ＋６と同等に効果的である。
【００８４】
ｈＧ３１Ｐの様々なＮ末端構造は相似物の生物学的活性に影響した。ｈＧ３１Ｐ＋６およびｈＧ３１Ｐ＋２はＣＸＣＬ８走化性の優れたアンタゴニストであり、ｈＧ３１Ｐ＋０およびｈＧ３１Ｐ＋２はｂＧ３１Ｐ＋６に比して有意に低い走化性アンタゴニスト活性を有していた。興味深いことに、ヒト好中球からのＣＸＣＬ８誘導ＲＯＩ放出の抑制能力を比較すると、相似物のアンタゴニスト活性への様々なＮ末端配列の影響は非常に低く、それぞれの相似物は大いに有意なＲＯＩ放出アンタゴニスト活性を示した。ＲＯＩ放出は好中球内のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性に依存し、ＮＡＤＰＨオキシダーゼはＣＸＣＲ１ではなくＣＸＣＲ２に制御されることが報告されている。
【００８５】
様々なＮ末端置換相似物の異なる有効性の原理は、あるいは立体障害によって、ｈＧ３１Ｐ＋２またはｈＧ３１Ｐ＋６の余分の２または６の残基がＥＬＲモチーフ（すなわちＧ３１Ｐ上の）のＣＸＣＲ１／ＣＸＣＲ２との相互作用の潜在性をさらに減少させることでありうる。
【００８６】
ＣＸＣＲ２の機能をアンタゴナイズするｈＧ３１Ｐの能力のさらなる記録のため、そのＣＸＣＬ５（ＥＮＡ−７８）依存好中球走化性の抑制能力を評定した。ＣＸＣＬ５はＣＸＣＲ１ではなくＣＸＣＲ２に特異的な配位子である。用量依存方式においてｈＧ３１Ｐ＋６はその走化性活性をアンタゴナイズした（図１４）。
【００８７】
ｈＧ３１Ｐの様々なＮ末端相似物が有意なアゴニスト活性を有するかどうかを、ＰＢＳのみに関連して好中球走化性分析において評定した。好中球の部分において他のＮ末端相似物への有意な反応は発見されなかった。
【００８８】
次に、ヒト−ウシ相違アミノ酸のｈＧ３１Ｐ＋６でのさらなる置換がｈＧ３１Ｐのアンタゴニスト活性を増加させるかどうかを評定した。ｈＧ３１Ｐ／Ａ３５Ｅ、ｈＧ３１ＰＡ４９Ｖ、ｈＧ３１ＰＲ４７Ｄ、ｈＧ３１Ｐ／Ｓ４４ＴおよびｈＧ３１Ｐ／Ｔ３７Ｓを生成および試験し、これらは全て無効なアゴニストであることを発見した。ウシ同等アミノ酸の位置３５、３７、４４、４７または４９への導入はそれぞれこれらの相似物のアンタゴニスト活性を低下させた。Ｒ４７ＤおよびＳ４４Ｔ相似物はＣＸＣＬ８の活性を抑制というより増加させているように見られ、Ａ３５Ｅ、Ｌ４９ＶおよびＴ３７Ｓ相似物は有意な走化性抑制活性を示さなかった。
【００８９】
細菌性の肺炎増悪を受けている嚢胞性繊維症（ＣＦ）患者の痰における好中球走化性活性をｂＧ３１Ｐによってアンタゴナイズできることを既に示した。よって、穏やか（ｎ＝１）、中程度（ｎ＝２）、激しい（ｎ＝２）または進行した（ｎ＝）ＣＦの患者、および未分類（ｎ＝２、細菌性）、中程度（ｎ＝２）または激しい（ｎ＝２）気管支拡張症の患者からの痰における好中球走化性活性の、ｈＧ３１Ｐによる遮断能力を試験した。ぜん息、ＣＯＰＤまたは一般的な静脈洞炎／気管支炎と診断された患者からの痰も、ｈＧ３１Ｐ＋６の存在下または非存在下で試験した。コントロールのぜん息患者を除き、他の全ては様々な細菌種（例えばヘモフィルス属、シュードモナス属、ブドウ球菌属）の培養が陽性であった。それぞれの試料を先行試験において滴定し、走化性分析の最適な希釈度を決定した。Ｇ３１Ｐは、進展したＣＦ患者からの試料を除く全ての試料における好中球走化性活性の遮断に際立って効果的であった。これによって、進展したＣＦ患者に見られる病状には別の病因が存在しうることが示唆される。
［ｈＧ３１Ｐは生体内の好中球炎症をアンタゴナイズする］
エンドトキシン誘導皮膚好中球性炎症および気道内毒素血症病状に対するｂＧ３１Ｐの遮断能力を既に示した。よって、次に気道内毒素血症のモデルにおけるｈＧ３１Ｐの活性を評定した。
［気道内毒素血症のマウスモデル］
マウスは小さい動物であり要するＧ３１Ｐが実質的にモルモット（我々の標準モデル）より少ないため、最初にマウスでの好中球性炎症におけるｈＧ３１Ｐ＋６の保護効果を試験した。先行試験において、１．５ｍｇ／ｋｇのＬＰＳ用量によってＢＡＬＢ／ｃマウスの適当な免疫試験用量が提供されることを決定し、これは５μｇ／ｋｇのＬＰＳによって強い気道好中球増加症、発熱および肺胸膜出血性反応を誘導するモルモットとの明確な対比となる。単一マウス実験（ｎ＝５／グループ）において、マウスに食塩水あるいは１００、２５０または５００μｇ／ｋｇのｈＧ３１Ｐ＋６  ｓ．ｃ．を投与し、それから１時間後にそれらを軽度イソフルランガス麻酔下でＬＰＳ（１／５ｍｇ／ｋｇ）により鼻腔内で免疫試験した。１６時間後、これらの動物をＣＯ２を用いて安楽死させ、血液、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液および肺組織を分析のために採取した。先の試験において１５０μｇ／ｋｇのｂＧ３１ＰのＬＰＳ腹膜炎モデルへの効果は小さかったが、ｈＧ３１Ｐ＋６は、気道全体白血球および好中球浸潤、肺柔組織好中球増加症、およびより小さく可変の範囲における気道での赤血球の出現の減少に非常に効果的であった（図１７）。
［気道内毒素血症のモルモットモデル］
３つの実験において気道内毒素血症のモルモットモデルを用いた。その１つにおいて、その動物に最適用量のエンドトキシン（５０μｇ／ｋｇ）を投与し、２番目および３番目では標準ＬＰＳ用量の５μｇ／ｋｇで、レベルを変動して配送されるＧ３１Ｐを用いて免疫試験した。それぞれの実験において、該動物をＧ３１Ｐと同時にＬＰＳおよび処置したｓ．ｃ．により鼻腔内で免疫試験した。１５時間後にこれらの動物を犠牲にし、末梢血液（ＷＢＣ較差）および肺反応（ＢＡＬ  ＷＢＣ数、較差および好中球脱顆粒産物レベル、および組織好中球増加症）を前記のように評定した。
［高（病的）用量ＬＰＳ免疫試験実験］
５０μｇ／ｋｇ以下の用量において、ＬＰＳはモルモットにおいて、気道への激しい出血を含む複数の肺損傷を引き起こすが、この用量において肺の好中球浸潤は＋／−５μｇ／ｋｇ  ＬＰＳにおいて観測されるそれに比して鈍い。５０μｇ／ｋｇ  ＬＰＳ免疫試験であってもｈＧ３１Ｐ＋６は気道での赤血球（ＲＢＣ）の出現の減少において非常に効果的であることを発見した（図１８）。Ｇ３１処置によってＢＡＬ中の好中球平均数も減少した。
［気道内毒素血症病状におけるｈＧ３１ＰおよびｈｂＧ３１Ｐの効力］
ｈＧ３１Ｐ＋０、ｈＧ３１Ｐ−１、ｈＧ３１Ｐ＋２、ｈＧ３１Ｐ＋６、および生体外においてヒトＣＸＣＬ８依存好中球漸増に対し非常に効果的であることを示したウシ−ヒトキメラｂｈＧ３１Ｐ＋６の相対的治療効力を比較した。再び、２５０μｇ／ｋｇのそれぞれのＧ３１Ｐアイソフォームをモルモットのグループに配送し（ｓ．ｃ．；  ｎ＝５）、それらを気道で５μｇ／ｋｇ大腸菌ＬＰＳにより免疫試験し、それから１５時間後にその動物を安楽死させ、その末梢血液好中球増加症、および気道好中球と赤血球のレベル、および２つの好中性顆粒マーカーであるラクトフェリン（好中球１０顆粒特異マーカー）およびミエロペルオキシダーゼ（好中球２０顆粒特異マーカー）のレベルを評定した。この２５０μｇ／ｋｇの用量において、試験されたＧ３１Ｐアイソフォームのそれぞれは好中球の気道への浸潤（ＢＡＬ好中球）を実質的に除去したとともに、ＢＡＬ内でのＲＢＣ、ラクトフェリンおよびミエロペルオキシダーゼの発生を有意に減少させた（図１９）。ｈＧ３１Ｐ＋２が他より大きい保護を与えたかのように見られたが、全てのパラメータを考慮に入れる場合は有意ではない。
［毒理学試験］
ｂＧ３１Ｐ毒性の予備試験を行った。免疫増感を最適化するように設計された時間枠での３匹のモルモットへのｂＧ３１Ｐの配送（２５０μｇ／ｋｇ）（すなわち、分子が免疫原だった場合）では、肝臓および腎臓酵素のパネルの血清レベルの通常からの観測可能な変動は生じなかった。動物の行動あるいは総合的な健康の変化は観測されなかった。さらに、これらの動物からの心臓、腎臓、肺、肝臓および胃の予備組織学的評定は、炎症浸潤、局所的細胞アポプトシスまたは増殖、あるいは組織病理学的異常の徴候を示さなかった。我々は、解剖病理学者がこれらの組織を独立に評定できるように準備をしている。用いた分析は特別な感受性を持たないが、これらの動物の血清において識別できるレベルの抗ｂＧ３１Ｐ抗体反応性を検出することができなかった。
【００９０】
原核細胞（すなわち細菌）発現システムを用いるｈＧ３１ＰまたはｂＧ３１Ｐの生成に注目し、標品が細菌エンドトキシンによって有意に汚染されていることを発見した。商用エンドトキシン除去カラムを除外し薬剤のエンドトキシン負担を減少させた際に、エンドトキシン除去カラムの利用によってＧ３１Ｐの容認できない高損失が生じることを発見した。生体内において、Ｇ３１Ｐの治療用量において発見されるレベルのエンドトキシンによるモルモットの処置は、Ｇ３１Ｐの治療活性を擬態しなかった。
［効力研究］
１つの実験において、ｈＧ３１Ｐ＋６を５０μｇ／ｋｇ（すなわち、ｂＧ３１Ｐの最適な用量の２０％）において用いた。５μｇ／ｋｇのＬＰＳでモルモットを免疫試験し、この低用量ｈＧ３１Ｐで処置した。ｈＧ３１Ｐ＋２およびｈＧ３１Ｐ＋６は好中球炎症の減少において大きくない効力を保持するのみであったが、気道への赤血球移行の減少には効果的であることを発見した（この発見の意味は完全に明白ではないが、この薬剤がはたらく機構のさらなる複雑度の可能性を示唆するものである）。
【００９１】
気道内毒素血症モデルを用いた生体内での別の取り組みにおいて、モルモットを、激しい肺出血を誘導することが知られているＬＰＳの用量で免疫試験し、それらを２５０μｇ／ｋｇのｈＧ３１Ｐで処置した。この高められたＬＰＳの用量において好中球は脈管構造から気道へと少ししか漸増しないことを、先の研究から我々は知っていた。
【００９２】
１つの実験において、ｈＧ３１Ｐ＋６を５０μｇ／ｋｇ（すなわち、ｂＧ３１Ｐの最適な用量の２０％）において用いた。５μｇ／ｋｇのＬＰＳでモルモットを免疫試験し、この低用量ｈＧ３１Ｐで処置した。ｈＧ３１Ｐ＋２およびｈＧ３１Ｐ＋６は好中球炎症の減少において大きくない効力を保持するのみであったが、気道への赤血球移行の減少には効果的であることを発見した（この発見の意味は完全に明白ではないが、この薬剤がはたらく機構のさらなる複雑度の可能性を示唆するものである）。
【００９３】
気道内毒素血症モデルを用いた生体内での別の取り組みにおいて、モルモットを激しい肺出血を誘導することが知られている用量である５０μｇ／ｋｇのＬＰＳで免疫試験し、それらを２５０μｇ／ｋｇのｈＧ３１Ｐで処置した（図１８参照）。この高められたＬＰＳの用量において好中球は脈管構造から気道へと少ししか漸増しないことを、先の研究から我々は知っていた。しかしｈＧ３１Ｐは、食塩水で処置され高用量ＬＰＳで免疫試験した動物で観測されるように、ＲＢＣの気道への高いレベルの溢血の減少に有意な効果を有していたとともに（図１８）、この免疫試験に関連して気道好中球反応および末梢血液好中球可動化を減少させる傾向があった（図１８）。
［考察］
ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐは多数のＥＬＲ−ＣＸＣケモカインの高親和性アンタゴニストであることを、ここで我々は説明した。生体外においてこのアンタゴニストは、２つの粘膜区画（肺、乳腺）における穏やかなものから極度なものまでの炎症病変において発現する、全ての好中球走化性活性を効果的に遮断したとともに、生体内においてエンドトキシン誘導炎症反応の９７％までを遮断した。我々はＣＸＣＬ８を肺炎および乳腺炎の試料における主要な化学誘引物質とみなしたが、細菌性肺炎試料の活性の３５％が、同様にＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐによって効果的にアンタゴナイズされるＣＸＣＬ８ではない化学誘引物質によるものであることもまた説明した。げっ歯類（タテダ他、２００１年；ツァイ他、２０００年）、蓄牛（カズウェル他、１９９７年）およびヒト（ヴィラード他、１９９５年）における炎症反応の研究に基づき、これらの試料が、ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐのアンタゴニスト効果を受ける多数のＥＬＲ＋ＣＸＣケモカイン（例えばＣＸＣＬ５およびＣＸＣＬ８）を含みうることは明らかである。
【００９４】
【表１】
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【００９５】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１ＲのＧ３１Ｐ相似物は、末梢血液好中球へのＣＸＣＬ８結合の効力のある阻害剤である。ウシ末梢血液好中球（純度８７〜９３％）を（上側のパネル）ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ相似物（１０ｎｇ／ｍｌ）または媒質（ｍｅｄ）のみに４℃で２時間暴露し、それから洗浄しビオチン化ＣＸＣＬ８（ｂｉｏｔＣＸＣＬ８；１０００ｎｇ／ｍｌまたは１２９ｎＭ）と共に同様にインキュベートした。ＣＸＣＬ８のこれらのレベルは、肺パスツレラ症の動物の肺組織でのそれに近似する（非特許文献８、９）。細胞に結合するｂｉｏｔＣＸＣＬ８のレベルはＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫収着検定）技術を用いて定量される。ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ内で描写されるアミノ酸にはＧ３１Ｐ、Ｐ３２Ｇ、Ｔ１２Ｓ／Ｈ１３Ｐ／Ｇ３１ＰおよびＴ１２Ｓ／Ｈ１３Ｐ／Ｇ３１Ｐ／Ｐ３２Ｇが含まれていた。Ｐ３２Ｇ相似物ではないＧ３１Ｐ相似物は、細胞に結合するＣＸＣＬ８の高度に効果的なアンタゴニストであった。Ｇ３１ＰおよびＰ３２Ｇの相似物とともに、Ｔ１２ＳおよびＨ１３Ｐの追加の基質はそれらのアンタゴニスト活性を低下させた（下側のパネル）。変動濃度のＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐまたは未標識ＣＸＣＬ８および２０ｐＭの１２５ＩＣＸＣＬ８へ、好中球を同時に４℃で４５分暴露した。１２５Ｉ−ＣＸＣＬ８のレベルは細胞の高親和性ＣＸＣＬ８受容体をほぼ飽和させるように選択された（データは図示しない）。細胞関連１２５Ｉ−ＣＸＣＬ８のレベルはカウンターを用いて評定された。ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１ＰがＣＸＣＬ８より略高い好中球への親和性を有することが、データによって明瞭に示された。
【図２】ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐは、好中球走化性誘導応答または−グルクロニダーゼ放出のアゴニストではない。ＣＸＣＬ８およびＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１ＰのＧ３１Ｐ、Ｐ３２Ｇ、または組み合わされたＧ３１Ｐ／Ｐ３２Ｇ相似物について、その好中球アゴニスト活性を、新鮮に精製したウシ末梢血液好中球を用いて試験した。（上側のパネル）それぞれのタンパク質への走化性誘導反応を３０分の顕微走化性検定によって試験し、その結果を平均（＋／−ＳＥＭ）細胞数／４０倍対物顕微鏡視野で、手法の節で概略を述べるようにして示した。Ｇ３１ＰおよびＧ３１Ｐ／Ｐ３２Ｇの相似物はいずれもわずかに識別可能な走化性活性を示したが、Ｐ３２Ｇ相似物は１００ｎｇ／ｍｌにおいて実質的な反応を誘導した。（下側のパネル）用量が変動されるそれぞれの相似物へ好中球を３０分間暴露し、それから手法の節で概略を述べるようにして、色素産生基質ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−グルクロニドを用いて細胞分泌物を−グルクロニダーゼについて検定する。−グルクロニダーゼの全細胞貯蔵量を、トライトンＸ−１００により溶解させた細胞の部分標本から定量する。個々の処理での酵素放出を、全細胞貯蔵量に対するパーセントで示す。全ての相似物は実質的なアゴニスト活性を持たないが、ＣＸＣＬ８自体が有意な酵素放出を誘導する。ホルボール−１２、１３−ミリスチン酸アセテートおよびカルシウムイオノフォアＡ２３１８７によるポジティブコントロールにより、４２＋／−６％の酵素放出が誘導された。
【図３】ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ−Ｇ３１ＰはＥＬＲ−ＣＸＣケモカイン媒介好中球走化性誘導の高度に効果的なアンタゴニストである。ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐの、いくつかのＥＬＲ−ＣＸＣケモカインへのウシ好中球の走化性誘導反応を遮断する能力を、２０分の顕微走化性検定を用いて測定した。（左側のパネル）細胞を同時にＣＸＣＬ８（１ｕｇ／ｍｌ）および濃度が変動される相似物へ暴露した。図２のように、ＣＸＣＬ８に反応した細胞の数を、走化性検定膜の直接計数によって評定した。ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ−Ｇ３１Ｐは、ＣＸＣＬ８への細胞の反応に対する高度に効果的な競争的阻害剤である。（中央のパネル）ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ５またはＣＸＣＬ８によるウシ好中球の走化性誘導の用量−反応曲線である。それぞれのケモカインは１〜１０ｎｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌにおいて最大の二相活性パターンを示した。（右側のパネル）ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐの、１ｎｇ／ｍｌのヒトＣＸＣＬ５またはＣＸＣＬ１または１０ｎｇ／ｍｌのヒトＣＸＣＬ８への細胞の反応を遮断する能力を、前記のようにして評定した。ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１ＰはそれぞれのＥＬＲ−ＣＸＣケモカインを効果的にアンタゴナイズし、完全な阻害は３〜２０ｎＭのＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐによって得られた。
【図４】ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ−Ｇ３１Ｐは、肺気道またはエンドトキシン誘導乳腺炎において発現するＣＸＣＬ８および非ＣＸＣＬ８化学誘引物質の活性を遮断する。好中球反応でのモノクローナル抗ＩＬ８抗体８Ｂ６またはＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ−Ｇ３１Ｐの、肺パスツレラ症の動物の肺またはエンドトキシン誘導乳腺炎の畜牛の乳槽において発現する化学誘引物質への効果を図３のように評定した。（Ａ）希釈した（１：１０）肺炎の畜牛の肺葉の気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）（ＰＮＥＵＭＯＮＩＡ）または乳腺炎の畜牛の乳槽洗浄液（ＭＡＳＴＩＴＩＳ）を、そのまま（ｎｏｎｅ）、あるいは抗ＣＸＣＬ８  ＭＡｂ  ８Ｂ６（５μｇ／ｍｌ）またはＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐ（Ｇ３１Ｐ；１または１０ｎｇ／ｍｌ）での処理後に試験し、その走化性活性を溶媒のみと比較した。双方のサンプルにおいて、ＭＡｂ  ８Ｂ６抗体の独力でサンプルの走化性活性の７４％を中和し、ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐによって反応が９３〜９７％減少した。（Ｂ）別の戦略を用いてこれらの結果を確認するために、次に病変ＢＡＬ液を、その内容のＣＸＣＬ８の９９％より多くを除去したモノクローナル抗体８Ｂ６−免疫親和性マトリクスによって吸収し、それから残余走化性活性およびＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐの残余非ＣＸＣＬ８走化性活性のアンタゴナイズ能力を試験した。試料において全体および残余走化性活性の用量依存阻害が存在し、ＣＸＣＬ８および非ＣＸＣＬ８化学誘引物質がこれらの病変において発現していることが示される。
【図５】ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ−Ｇ３１Ｐは、エンドトキシン誘導炎症反応を生体内において除去することができる。２週齢のホルスタイン仔牛において、その好中球性炎症反応を皮内エンドトキシン（１μｇ／ｓｉｔｅ）免疫試験に対し、静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎ．）、あるいは筋内（ｉ．ｍ．）へのＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ−Ｇ３１Ｐ注入の前および様々な期間の後に試験した。１５時間のエンドトキシン反応サイト生検を処理の０、１６、４８および７２時間後に採取し、好中球性反応の組織病状評定のために処理し、区画あたりの９つの４０倍対物顕微鏡視野での好中球を計数して決定した。（左側のパネル）組織の顕微鏡写真は、処理前および処理後４８時間の網状真皮の血管周囲のエンドトキシン免疫試験に対応する。処理後ではなく処理前の組織において、網状真皮の血管周囲に多数の好中球が蓄積された。（Ｂ）それぞれの経路によるＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ−Ｇ３１Ｐ配送の前（０ｈ）および後（１６、４８、７２ｈ）でのエンドトキシン免疫試験への好中球反応の画像提示である。それぞれ＊＊または＊＊＝ｐ  ０．０１または０．００１であり、内部制御処理前反応に関連する。
【図６】アトピー性でぜん息のドナーまたはアトピー性でぜん息ではないドナー（左側のパネル）あるいは過好酸球増加症の対象（右側のパネル）の血液から精製された好酸球を、その組換型ヒトＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ５またはＣＸＣＬ１１への反応について、示される用量の組換型ウシＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐ（Ｇ３１Ｐ）の存在下または非存在下において評定した。低用量のＧ３１Ｐにより、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２配位子へのこれらの細胞の反応を遮断することができたが、ＣＣＲ３配位子ＣＣＬ１１／イオタキシンへの好酸球の反応には効果が無かった。
【図７】健康なドナーの末梢血液からの好中球を、その組換型ヒトＣＸＣＬ８またはＣＸＣＬ５への反応について、ウシＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐ（Ｇ３１Ｐ；１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下において試験した。Ｇ３１Ｐは双方の配位子への好中球の反応を遮断した。
【図８】ｈｂＧ３１Ｐアイソフォームの物理的特性決定。
【図９】ｂＧ３１ＰとｈｂＧ３１Ｐとの比較（ＣＸＣＬ８アンタゴニズム）。
【図１０】（Ａ）ｈｂＧ３１Ｐ相似物は好中球アゴニストではない。（Ｂ）ｈｂＧ３１Ｐアンタゴニスト活性。
【図１１】ｈｂＧ３１Ｐのアンタゴニスト活性におけるカルボキシル末端配列の効果。
【図１２】アゴニストおよびＣＸＣＬ８相似物−構成の活性。
【図１３】ｂＧ３１ＰとｈＧ３１Ｐ＋６とのアンタゴニスト活性の比較
【図１４】ｈＧ３１Ｐは、ＣＸＣＲ２特異配位子であるＥＮＡ７８をアンタゴナイズする。
【図１５】ｈＧ３１Ｐは、ＣＸＣＬ８誘導ＲＯＩ放出をアンタゴナイズする。
【図１６】ｈＧ３１Ｐは、気管支拡張症および膵臓繊維症の患者の痰の好中球走化性をアンタゴナイズする。
【図１７】ｈＧ３１Ｐは、内毒素血症マウスにおける肺の炎症を減少させる。
【図１８】モルモットの病的気道内毒素血症におけるｈＧ３１Ｐの効果。
【図１９】モルモットの病的気道内毒素血症における様々なｈＧ３１Ｐアイソフォーム（およびｈｂＧ３１Ｐ）の効果。
【図２０】モルモットの病的気道内毒素血症における様々なｈＧ３１Ｐアイソフォーム（およびｈｂＧ３１Ｐ）の効果。
【図２１】ｈｂＧ３１Ｐ変異体は、ヒトＩＬ−８およびＧＲＯαに対し、ヒト好中球（ＰＭＮ）細胞内Ｃａ流入反応を遮断する。ヒトＩＬ−８およびＧＲＯαに刺激されるｈｂＧ３１Ｐおよびその変異体のヒト好中球（ＰＭＮ）細胞内Ｃａ流入の遮断活性［Ｃａ］ｉを評定した。１００ｎｇ／ｍｌのｂＧ３１Ｐ、ｈｂＧ３１ＰおよびｈｂＧ３１Ｐ変異体を、２ｘ１０５ＰＭＮで染色した２μＭフッ化４ＡＭと共にインキュベートし、それから１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−８またはＧＲＯαで刺激した。それから蛍光計で試料の蛍光を読んだ。データを［Ｃａ］ｉ測定の面積として示した。概して、ｈｂＧ３１ＰおよびｂＧ３１Ｐと同様にｈｂＧ３１Ｐ変異体は、ＩＬ−８およびＧＲＯαに刺激されたＰＭＮ［Ｃａ］ｉにおいて有効なアゴニスト活性を示した。
【図２２】ｈｂＧ３１Ｐ変異体はＬＰＳに刺激された皮膚試験の炎症サイトへのＰＭＮ移行の遮断に異なる効果を示した。ｈｂＧ３１Ｐおよびその変異体の、ＬＰＳ刺激炎症サイトへのＰＭＮ移行の遮断におけるアンタゴニスト活性を評定した。顕微鏡の４０倍視野における、０．５μｇのＬＰＳおよび２５０μｇ／ｍｌのｂＧ３１Ｐ、ｈｂＧ３１Ｐまたはその変異体で処理した皮下および皮内組織のＰＭＮの遮断数の、炎症サイトを処理したのみのＬＰＳでのＰＭＮの数に対するパーセンテージとして、データを示した。ｈｂＧ３１ＰがｂＧ３１Ｐと等しい遮断能力を有することをデータは明瞭に示した。Ｈ１３ＹはＴ３Ｋ、Ｅ３５Ａよりはるかに良いアンタゴニスト活性を示した。Ｔ１５Ｋはわずかな遮断効果を示した。一方、Ｓ３７Ｔはアンタゴニスト活性を示さなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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