(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
産生物を含む溶出液において濁度と不純物を減少させる方法であって、前記方法は、
（ａ）産生物および一つまたはそれ以上の不純物を含む添加流体を提供すること、ここで、前記産生物はＦｃを含むモノクローナル抗体であり、
（ｂ）前記添加流体を媒体と接触させることであって、ここで前記媒体はＰｒｏｔｅｉｎＡクロマトグラフィーカラムであり、前記媒体は前記産生物と結合するのに適した条件下において前記産生物と結合することが可能であり、それにより結合された媒体を提供すること、
（ｃ）前記結合された媒体を一つまたはそれ以上の洗浄溶液と接触させることであって、ここで、少なくとも一つの最初の洗浄溶液は、０．５Ｍから１．０Ｍの濃度のアルギニンを含み、その洗浄溶液のｐＨが５．０以上８．０未満であり、それにより洗浄された媒体を提供すること、
（ｄ）前記結合された媒体を２番目の洗浄溶液と接触させること、
（ｅ）前記産生物を溶離するのに適した条件下において、前記洗浄された媒体を溶離液と接触させること、ここで前記溶離液はアルギニン誘導体、グリシン、ＨＥＰＥＳおよび酢酸の少なくとも一つを含み、および
（ｆ）前記産生物を含む溶出液を収集すること、ここで、ステップ（ｃ）の洗浄溶液中にいかなる検出可能量のアルギニンを用いない類似の方法で回収される溶出液と比較して、前記溶出液中の前記産生物の宿主細胞タンパク質に対する比率が増加し、濁度が減少する、
を含む方法。
【請求項２】
前記抗体はＧＤＦ−８に対して特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体はＩＬ−１３に対して特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体はＩＬ−２２に対して特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体はＲＡＧＥに対して特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体はＡβに対して特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記最初の洗浄溶液における前記アルギニンの濃度は約０．５Ｍから約１．０Ｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記最初の洗浄溶液のｐＨは約７．５である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
一つまたはそれ以上の前記不純物は、宿主細胞タンパク質、核酸、産生物の変異体またはエンドトキシンである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
一つまたはそれ以上の前記不純物はウイルスまたはそのフラグメントである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
アルギニン誘導体は、アセチルアルギニン、アグマチン、アルギニン酸、Ｎ−α‐ブチロイル‐Ｌ‐アルギニン、またはＮ−α‐ピバロイルアルギニンである請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記溶離液は約２と約４の間のｐＨを有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ａ）では、少なくとも一つの不純物が前記産生物に結合しており、ステップ（ｃ）では、一つまたはそれ以上の洗浄溶液を前記結合された媒体と接触させ、前記産生物に結合した少なくとも一つの不純物を除去する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法が上流側の陰イオン性吸着ろ過を含まない、請求項１の方法。
【請求項１５】
前記２番目の洗浄溶液がアルギニンを含まない、請求項１の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願への相互参照
本願は、２００６年９月８日に出願された米国特許出願第６０／８４３，０８４号に対して米国特許法のもとに優先権の利益を主張する。米国特許出願第６０／８４３，０８４号は、その全体が参照として本明細書中に援用される。
【０００２】
本出願は、タンパク質の精製に関する。特に、本出願は、媒体と結合したタンパク質を、媒体を通してアルギニンまたはアルギニン誘導体を含む少なくとも一つの洗浄溶液を通過させ、精製されたタンパク質を収集することにより精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
組み換えタンパク質技術の到来により、目的とするタンパク質を、該タンパク質が発現するように操作された真核または原核宿主細胞の培養株を用いて産生することができる。所望の組み換えタンパク質を薬学的応用に供するためには、適正レベルのタンパク質を宿主細胞タンパク質、タンパク質変異体、および培地からの化合物のような不純物から確実に回収できることが一般的に条件となる。
【０００４】
従来のタンパク質精製方法は、目的とするタンパク質をサイズ、電荷、溶解度、および疎水性の違いに基づいて不純物から分離するように設計されている。かかる方法は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー、およびハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー法を含む。これらの方法は、目的とするタンパク質または不純物のいずれかが選択的に付着するように設計することが可能な分離媒体をしばしば用いる。結合‐溶離（ｂｉｎｄ‐ｅｌｕｔｅ）モードでは、所望のタンパク質が分離媒体に選択的に結合し、異なる溶剤により該媒体から特異的に溶離される。素通り（ｆｌｏｗ−ｔｈｏｕｇｈ）モードでは、不純物が特異的に分離媒体に結合するのに対して、目的とするタンパク質は結合せず、従って「素通り」した所望のタンパク質を回収することが可能となる。
【０００５】
抗体のようなタンパク質を精製するための現行手法は、二つまたはそれ以上のクロマトグラフィー処理を含む。例えば、タンパク質精製のプロトコールにおける第１処理として、目的とするタンパク質と固定化されたキャプチャー試薬との間の特異的な相互作用を利用するアフィニティークロマトグラフィー処理を含むことができる。Ｆｃ領域を含む抗体のようなタンパク質のアフィニティーキャプチャーには、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ吸着剤が特に役立つ。しかし、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａクロマトグラフィーをタンパク質精製に利用するためには、多くの欠点がある。いくつかの事例では、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａキャプチャー試薬の漏洩は溶離したタンパク質産生物の汚染をもたらし、一方で他の事例では、アフィニティーキャプチャーにおいてタンパク質の凝集体のようなタンパク質変異体は目的とするタンパク質から分離されない。加えて、さまざまなレベルの濁度および／または沈殿物が、ｐＨ中和後のＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ溶出プールに形成されることがある。このような濁度および／または沈殿物は、中和されたＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ溶出プールにおいて著しい産生物の損失を招く可能性がある。従って、産生物の損失を低減し、かつ溶出プールにおける産生物の純度を向上させる精製方法が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、一部分において、産生物が結合した媒体を通して添加流体を通過させること、それに続いて該媒体を通してアルギニンまたはアルギニン誘導体を含む少なくとも一つの洗浄溶液を通過させること、および溶離液を用いて産生物を収集することにより、抗体のような産生物および一つまたはそれ以上の不純物を含む添加流体から産生物を単離する方法に関する。
【０００７】
一様態においては、産生物を単離する方法が提供される。本方法は、産生物および一つまたはそれ以上の不純物を含む添加流体を提供すること、該添加流体を該産生物と結合するのに適した条件下において該産生物と結合することができる媒体と接触させること、それにより結合された媒体を得ることを含む。本方法は、該結合された媒体をアルギニンまたはアルギニン誘導体を含む一つまたはそれ以上の洗浄溶液と接触させること、それにより洗浄された媒体を得ることをさらに含む。本方法は、該産生物を溶離するのに適した条件下において、該洗浄された媒体を溶離液と接触させることをさらに含む。該産生物を含む溶出液は、次に収集されてもよい。該産生物は、治療上の使用のためにさらに精製および／または製剤されてもよい。
【０００８】
本様態のいくつかの実施形態において、産生物はタンパク質、例えば治療用タンパク質である。ある実施形態では、産生物は抗体である。特定の実施形態では、抗体は、次の通り、増殖分化因子‐８（ＧＤＦ‐８：Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ−８）、インターロイキン１３（ＩＬ‐１３）、インターロイキン２２（ＩＬ‐２２）、アミロイドβ、終末糖化産物に対するレセプター（ＲＡＧＥ：Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  Ｅｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔ）、および５Ｔ４、のうちの一つに対して或いは向けて産生される。いくつかの実施形態では、産生物は抗原結合性フラグメントである。いくつかの実施形態において、産生物は融合タンパク質である。特定の実施形態では、産生物はＩｇ融合タンパク質である。ある実施形態では、産生物はＦｃタンパク質、免疫複合体、サイトカイン、インターロイキン、ホルモン、または治療用酵素である。
【０００９】
本様態のいくつかの実施形態において、媒体はマトリックス、樹脂、またはクロマトグラフィーカラムである。特定の実施形態では、媒体はＰｒｏｔｅｉｎ  Ａクロマトグラフィーカラム、例えば組み換えＰｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム、またはＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇクロマトグラフィーカラム、例えば組み換えＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラムである。
【００１０】
本様態のいくつかの実施形態において、洗浄溶液におけるアルギニンまたはアルギニン誘導体の濃度は、約０．１Ｍから約２．０Ｍである。ある実施形態では、洗浄溶液におけるアルギニンまたはアルギニン誘導体の濃度は、約０．１Ｍから約０．９Ｍである。一実施形態では、洗浄溶液におけるアルギニンまたはアルギニン誘導体の濃度は、約１Ｍである。ある他の実施形態では、洗浄溶液におけるアルギニンまたはアルギニン誘導体の濃度は、約１．１Ｍから約２．０Ｍである。さらに他の実施形態では、洗浄溶液におけるアルギニンまたはアルギニン誘導体の濃度は、約０．５Ｍから約１．０Ｍである。さらに他の実施形態では、洗浄溶液におけるアルギニンまたはアルギニン誘導体の濃度は、約０．５Ｍより大きく、約２．０Ｍより小さい。また別の実施形態では、洗浄溶液におけるアルギニンまたはアルギニン誘導体の濃度は、約０．５Ｍより大きく、約１．０Ｍより小さい。特定の実施形態では、アルギニン誘導体は、アセチルアルギニン、アグマチン、アルギニン酸、Ｎ−α‐ブチロイル‐Ｌ‐アルギニン、またはＮ−α‐ピバロイルアルギニンである。
【００１１】
本様態のいくつかの実施形態において、洗浄溶液のｐＨは約４．５から約８．０である。ある実施形態では、洗浄溶液のｐＨは約４．５より大きく、約８．０より小さい。いくつかの実施形態において、洗浄溶液のｐＨは約７．５である。
【００１２】
本様態のいくつかの実施形態において、溶離液は、塩化ナトリウム、アルギニンまたはアルギニン誘導体、グリシン、ＨＥＰＥＳ、および酢酸のうちの一つを含む。ある実施形態では、溶離バッファは約２．０から約４．０のｐＨを有する。特定の実施形態では、溶離バッファは約３．０のｐＨを有する。
【００１３】
本様態のある実施形態では、不純物の一つまたはそれ以上は、宿主細胞タンパク質、核酸、産生物の変異体、エンドトキシン、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ、ウイルスまたはそのフラグメント、細胞培地からの成分、または産生物の変異体、例えば、ジスルフィド以下で結合した産生物、低分子量の産生物、高分子量の産生物、切り詰められた産生物および／またはミスフォールドされた産生物である。少なくとも一つの不純物が産生物に結合したいくつかの実施形態では、一つまたはそれ以上の洗浄溶液が結合された媒体を通して結合された媒体に接触し、それにより産生物に結合した少なくとも一つの不純物が除去される。
【００１４】
本様態のある実施形態では、溶出液は単離された産生物を備え、該単離された産生物の純度は、洗浄溶液中に約０．１Ｍより少ないアルギニンまたはアルギニン誘導体を用いる類似の方法と比較して向上する。いくつかの実施形態では、溶出液は単離された産生物を備え、該産生物の少なくとも一つの不純物に対する比率は、洗浄溶液中にいかなる検出可能量のアルギニンもアルギニン誘導体も用いない類似の方法と比較して増加する。ある実施形態では、溶出液は産生物を備え、該産生物の宿主細胞タンパク質に対する比率は、洗浄溶液中に約０．１Ｍより少ないアルギニンまたはアルギニン誘導体を用いる類似の方法と比較して増加する。さらなる実施形態では、溶出液は産生物を備え、該産生物の宿主細胞タンパク質に対する比率は、洗浄溶液中にいかなる検出可能量のアルギニンもアルギニン誘導体も用いない類似の方法と比較して増加する。
【００１５】
本様態のまた別の実施形態では、溶出液の濁度は、洗浄溶液中に約０．１Ｍより少ないアルギニンまたはアルギニン誘導体を用いる類似の方法と比較して低減される。いくつかの実施形態では、溶出液の濁度は、洗浄溶液中にいかなる検出可能量のアルギニンもアルギニン誘導体も用いない類似の方法と比較して低減される。
【００１６】
また別の様態において、抗体を単離する方法が提供される。本方法は、抗体および一つまたはそれ以上の不純物を含む添加流体を提供すること、および該添加流体をＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ媒体またはＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ媒体と接触させることであって、該媒体は該抗体と結合するのに適した条件下において該抗体と結合することができ、それにより結合された媒体が結果として生じることを含む。本方法は、結合された媒体を一つまたはそれ以上の洗浄溶液と接触させることであって、少なくとも一つの洗浄溶液は、０．５Ｍより高く約１．０Ｍより低い濃度でアルギニンまたはアルギニン誘導体を備え、それにより洗浄された媒体を提供することをさらに含む。本方法は、抗体を溶離するのに適した条件下において洗浄された媒体を溶離液と接触させること、および該抗体を含む溶出液を収集することをさらに含む。本方法を実施した結果においては、洗浄溶液中にいかなる検出可能量のアルギニンも用いない類似の方法で回収される溶出液と比較して、溶出液における抗体の宿主細胞タンパク質に対する比率は増加し、溶出液は低減された濁度を有する。
【００１７】
本様態のいくつかの実施形態において、洗浄溶液のｐＨは約５．０より大きく、約８．０より小さい。
【００１８】
また別の様態では、産生物を含む溶出液における濁度を低減する方法が提供される。本方法は、産生物および一つまたはそれ以上の不純物を含む添加流体を提供すること、該添加流体を溶媒と接触させることであって、該媒体は該産生物と結合するのに適した条件下において該産生物と結合することができ、それにより結合された媒体を提供することを含む。本方法は、該結合された媒体を一つまたはそれ以上の洗浄溶液と接触させることであって、少なくとも一つの洗浄溶液はアルギニンまたはアルギニン誘導体を備え、それにより洗浄された媒体を提供することをさらに含む。本方法は、該産生物を溶離するのに適した条件下において、該洗浄された媒体を溶離液と接触させ、それにより産生物を含む溶出液を生成すること、および該溶出液のｐＨを中和させることをさらに含む。本方法は、洗浄溶液中にいかなる検出可能量のアルギニンもアルギニン誘導体も用いない類似の方法と比較して、濁度が低減された溶出液を提供する。
【００１９】
本様態のいくつかの実施形態において、中和された溶出液のｐＨは、約６．５および約８．２の間にある。ある実施形態では、洗浄溶液は、濃度が約０．５Ｍより高く約１．０Ｍより低いアルギニンまたはアルギニン誘導体を含む。いくつかの実施形態において、洗浄溶液のｐＨは約５．０より高く、約８．０より低い。本様態のいくつかの実施形態において、本方法は、上流側の陰イオン性吸着ろ過を備えない。ある実施形態では、溶出液における産生物は、治療上の使用のためにさらに精製および／または製剤される。
【００２０】
また別の様態では、産生物を含む溶出液における濁度および不純物を低減するための方法が提供される。本方法は、産生物および一つまたはそれ以上の不純物を含む添加流体を提供すること、該添加流体を媒体と接触させることであって、該媒体は該産生物と結合するのに適した条件下において該産生物と結合することができ、それにより結合された媒体を提供することを含む。本方法は、該結合された媒体を一つまたはそれ以上の洗浄溶液と接触させることであって、少なくとも一つの洗浄溶液はアルギニンまたはアルギニン誘導体を備え、それにより洗浄された媒体を提供することをさらに含む。本方法は、産生物を溶離するのに適した条件下において、該洗浄された媒体を溶離液と接触させ、それにより該産生物を含む溶出液を生成すること、および該を中和させることをさらに含む。本方法は、洗浄溶液中にいかなる検出可能なアルギニンもアルギニン誘導体も用いない類似の方法と比較して、溶出液における産生物の少なくとも一つの不純物に対する比率は増加し、低減された濁度を有する溶出液を提供する。
【００２１】
本様態のいくつかの実施形態において、中和された溶出液のｐＨは約６．５および約８．２の間にある。ある実施形態では、洗浄溶液は、０．５Ｍより高く、１．０Ｍより低い濃度のアルギニンまたはアルギニン誘導体を含む。いくつかの実施形態において、洗浄溶液のｐＨは５．０より高く、約８．０Ｍより低い。本様態のいくつかの実施形態において、本方法は、上流側の陰イオン性吸着ろ過を備えない。ある実施形態では、溶出液における産生物は、治療用の使用のためにさらに精製および／または製剤される。本発明は、本明細書に添付される請求項に列挙されるように、様々な方法および製品にも関わる。
【００２２】
別に定義しない限り、本明細書に用いるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味をもつ。本発明を実施または試験するためにここに記載されるのと同様または等価な方法および材料を用いることができるが、適切な方法および材料は以下に記載する通りである。本明細書に挙げるすべての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照によりここに組み込まれる。加えて、これらの材料、方法、および例は、単に説明のためであり限定する意図はもたない。
【００２３】
本発明の他の特徴および利益は、詳細な説明、図面から、さらに請求項から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムステップ後におけるＧＤＦ‐８  ｍＡｂ‐１の回収率（％）、濁度、ＨＣＰ（“ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ”）およびＬＲＶ（“ｌｏｇ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｖａｌｕｅ”）を評価した実験の結果を示す棒グラフである。
【図２】Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムステップ後におけるＧＤＦ‐８  ｍＡｂ‐２の回収率（％）、濁度、ＨＣＰおよびＬＲＶを評価した実験の結果を示す棒グラフである。
【図３】Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムステップ後におけるＩＬ‐１３  ｍＡｂ‐１の回収率（％）、濁度、ＨＣＰおよびＬＲＶを評価した実験の結果を示す棒グラフである。
【図４】Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムステップ後におけるＩＬ‐２２  ｍＡｂの回収率（％）、濁度、ＨＣＰおよびＬＲＶを評価した実験の結果を示す棒グラフである。
【図５】Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムステップ後におけるＲＡＧＥ  ｍＡｂの回収率（％）、濁度、ＨＣＰおよびＬＲＶを評価した実験の結果を示す棒グラフである。
【図６】Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムステップ後における濁度ＩＬ‐１３  ｍＡｂ‐２を評価した実験の結果を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、アルギニン洗浄またはアルギニン誘導体による洗浄を含む手順を用いて、一つまたはそれ以上の不純物を含む添加流体から産生物を精製および回収するための方法を提供する。本発明は、治療および／または診断を目的としたタンパク質を大量に調整するために適用することができる。
Ａ．定義
本発明をより容易に理解するために、本明細書で用いるいくつかの用語を定義する。付加的な定義は、詳細な説明の至るところに示される。
【００２６】
用語「産生物」は、ヒトまたは自然過程により産生される分子に適用される。「産生物」は、限定なしに、タンパク質、例えば、Ｆｃ含有タンパク質を含むＩｇ融合タンパク質を含めて、治療用タンパク質を含むことができる。他のタンパク質は、免疫複合体、サイトカイン、インターロイキン、ホルモン、治療用酵素、ウイルス、治療用血清、毒素、抗毒素、ワクチン、血液成分または誘導体、ないし任意の類似の産生物を含む。タンパク質は、分泌タンパク質であってもよい。タンパク質は、たとえば、抗体、抗体の抗原結合フラグメント、可溶性レセプター、レセプター融合タンパク質、サイトカイン、増殖因子、酵素、または凝固因子であってもよい。本明細書では、用語「産生物」および「目的とするタンパク質」は置換可能に用いられる。
【００２７】
ここで用いる用語「タンパク質」は、ユニットとして機能することができる一つまたはそれ以上のポリペプチドに適用される。ここで用いる用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して連結されたアミノ酸の連鎖に適用される。
【００２８】
治療用タンパク質は、たとえば、分泌タンパク質であってもよい。治療用タンパク質は、抗体、抗体の抗原結合フラグメント、可溶性レセプター、レセプター融合タンパク質、サイトカイン、増殖因子、酵素、または凝固因子であってもよく、それらのいくつかは以下により詳細に記載される。タンパク質の上記リストは、事実上単に例を示すもので、限定的な列挙を意図したものではない。当業者は、本発明に従って任意のタンパクを用いてもよいことを理解し、かつ必要に応じて産生すべき特定のタンパク質を選択することができるであろう。ここで用いる用語「馴化培地」は、目的とする所望の組み換えポリぺプチド（類）を分泌することができる宿主細胞に対して暴露された細胞培地から、遠心分離および／または精密ろ過のような分離法により、細胞および細胞残屑を除去してつくり出された上清に適用される。馴化培地は、例えば、分泌された組み換えポリペプチド、または目的とする産生物、選択された栄養源（例えば、ビタミン、アミノ酸、補因子、およびミネラル）；付加的な増殖因子および／またはインスリンを含む補給剤、および付加的な外生的、または宿主細胞タンパク質および不純物を含むことができる。馴化培地という用語は、浄化された馴化培地、ろ過された馴化培地、および馴化された細胞培地を含む。
【００２９】
用語「添加流体」は、単離されるべき産生物および一つまたはそれ以上の不純物を含む液体に適用される。添加流体は、以下に記載される発明の操作条件下において媒体と接触する（例えば、媒体に通す）。
【００３０】
用語「不純物」は、添加流体のような溶液中に存在する任意の外的または望ましくない分子に適用される。不純物は、精製される目的タンパク質の試料中に同様に存在する、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または精製される目的タンパク質以外のタンパク質のような生物学的巨大分子であってもよい。不純物は、例えば、凝集したタンパク質、ミスフォールドしたタンパク質、ジスルフィド以下で結合したタンパク質、高分子量種、低分子量種およびフラグメント、並びに脱アミド化種のような、望ましくないタンパク質変異体；精製されるタンパク質を分泌する宿主細胞からの他のタンパク質、宿主細胞のＤＮＡ、細胞培地からの成分、先行する精製処理の間に試料中ににじみ出るアフィニティークロマトグラフィー用吸収剤の一部の分子、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ；エンドトキシン；核酸；ウイルス、または前述したいずれかのフラグメントを含む。
【００３１】
用語「媒体」は、巨大分子の分離プロセスにおいて単離されるべき産生物との間にリガンド‐生体巨大分子相互作用が働くアフィニティーマトリックスまたは樹脂に適用される。媒体は、限定なしに、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＡクロマトグラフィーカラムまたはＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇクロマトグラフィーカラムとすることができる。
【００３２】
用語「結合された媒体」は、単離されるべき産生物が結合し、さらに一つまたはそれ以上の不純物も結合した媒体に適用される。結合された媒体は、産生物と結合するのに適した条件下において、媒体に添加流体を通過させることによりつくり出すことができる。
【００３３】
用語「洗浄された媒体」は、一つまたはそれ以上の洗浄溶液により洗浄された、結合された媒体に適用され、少なくとも一つの洗浄溶液は、アルギニンまたはアルギニン誘導体を含む。洗浄された媒体は、結合された媒体を一つまたはそれ以上の洗浄溶液と接触させることによりつくり出すことができ、少なくとも一つの洗浄溶液は、アルギニンまたはアルギニン誘導体を含む。洗浄された媒体において、単離されるべき産生物の純度は、結合された媒体における添加流体と比較して一般的に向上する（すなわち、産生物の一つまたはそれ以上の不純物に対する比率は増加する）。
【００３４】
用語「結合‐溶離モード」は、添加流体に含まれる少なくとも一つの産生物が媒体（例えば、クロマトグラフィー樹脂）と結合する、産生物の調整技術に適用される。
【００３５】
用語「抗体」は、任意の免疫グロブリンまたはそのフラグメントに適用され、抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを包含する。本用語は、多クローン性、単クローン性、単一特異性、多特異性、非特異性、ヒト化、ヒト、一本鎖、キメラ、合成、組み換え、ハイブリッド、変異、移植、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成された抗体を含むが、これらには限定されない。抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂを含み、これらは抗原結合機能を維持することができる。通常は、かかるフラグメントは抗原を結合させるドメインを含む。
【００３６】
用語「ＩＬ‐１３」は、ＩＬ‐１３の完全長で未処理の前駆体型、並びに翻訳後切断から生じる成熟型を含む、インターロイキン１３に適用される。インターロイキン１３（ＩＬ‐１３）は、Ｔリンパ球およびマスト細胞により分泌される、以前に特性解析されたサイトカインである（ＭｃＫｅｎｚｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  ＵＳＡ  ９０：３７３５‐３９；  Ｂｏｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８７：６６３‐４１）。本用語は、修飾された配列を含めて、成熟型ＩＬ‐１３に関係する少なくともいくつかの生物学的活性を保持するＩＬ‐１３の任意のフラグメントおよび変異体にも適用される。用語「ＩＬ‐１３」は、ヒトＩＬ‐１３、並びに脊椎動物種に由来する他のＩＬ‐１３を含む。いくつかの継続中の出願、例えば米国特許出願公開第２００６／００６３２２８Ａ号および第２００６／００７３１４８号は、ここに記載される方法で用いることができるヒトおよびサルのＩＬ‐１３、ＩＬ‐１３ペプチド、それらを産生するベクターおよび宿主細胞を開示している。これらのすべての刊行物の内容は、その全体が参照によりここに組み込まれる。
【００３７】
ＩＬ‐１３は、ＩＬ‐４といくつかの生物学的活性を共有する。例えば、ＩＬ‐４またはＩＬ‐１３は、Ｂ細胞においてＩｇＥのアイソタイプスイッチを引き起こすことができる（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：５７９２‐５８００）。加えて、ぜんそく患者において細胞表面のＣＤ２３および血清のＣＤ２３（ｓＣＤ２３）のレベルが増加することが報告されている（Ｓａｎｃｈｅｚ‐Ｇｕｅｒｅｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａｌｌｅｒｇｙ  ４９：５８７−９２；  ＤｉＬｏｒｅｎｚｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｐｒｏｃ．２０：１１９−２５）。加えて、ＩＬ‐４またはＩＬ‐１３のいずれも、ＭＨＣクラスＩＩおよび低親和性ＩｇＥレセプター（ＣＤ２３）がＢ細胞および単球上で発現するのを亢進することができ、結果として抗原提示の増加およびマクロファージ機能の調節がもたらされる（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．上記参照）。これらの観測結果は、ＩＬ‐１３が気道内好酸球増多症および気道過敏性（ＡＨＲ：ａｉｒｗａｙ  ｈｙｐｅｒｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ）の発症に重要な役割を果たすことを示唆する（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．上記参照；Ｗｉｌｌｓ‐Ｋａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：２２５８‐６１）。従って、ＩＬ‐１３の抑制は、呼吸器疾患、例えば、喘息；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ：ｃｈｒｏｎｉｃ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）；気道炎症、好酸球増多症、線維症および過剰粘液産生を含む他の病気、例えば、嚢胞性線維症および肺線維症；アトピー性疾患、例えば、アトピー性皮膚炎、じんま疹、湿疹、アレルギー性鼻炎；皮膚（例えば、アトピー性皮膚炎）、胃腸器官（例えば、潰瘍性大腸炎および／またはクローン病のような炎症性腸疾患（ＩＢＤ：ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ））、肝臓（例えば、肝硬変、肝細胞ガン）の炎症性および／または自己免疫状態；強皮症；白血病、膠芽腫、およびリンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫のような腫瘍またはガン（例えば、軟部または充実性腫瘍）；（例えば、ＨＴＬＶ‐Ｉからの）ウイルス感染；他器官の線維症、例えば、肝臓の線維症、（例えば、Ｂ型および／またはＣ型肝炎ウイルスによって引き起こされる線維症）を含むが、それらには限定されない、いくつかの炎症および／またはアレルギー状態の病状を改善するのに役立つ可能性がある。
【００３８】
用語「ＧＤＦ‐８」は、増殖分化因子‐８および、構造的または機能的にＧＤＦ‐８と関連する因子、例えば、ＢＭＰ‐１１およびＴＧＦ‐８スーパーファミリーに属する他の因子に適用される。本用語は、ＧＤＦ‐８の完全長で未処理の前駆体型、並びに翻訳後切断から生じる成熟およびポリペプチド型に適用される。本用語は、修飾された配列を含めて、成熟型ＧＤＦ‐８に係る少なくともいくつかの生物学的活性を保持するＧＤＦ‐８の任意のフラグメントおよび変異体にも適用される。ヒトＧＤＦ‐８、並びに（マウス、ヒヒ、ウシ、およびニワトリを含む）他の脊椎動物種のＧＤＦ‐８のアミノ酸配列が、例えば、米国特許出願公開第２００４‐０１４２３８２号、米国特許出願公開第２００２‐０１５７１２５号、およびＭｃＰｈｅｒｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９４：１２４５７−１２４６１に開示されており、これらのすべての内容は、その全体が参照によりここに組み込まれる。ＧＤＦ‐８に対する中和抗体の例は、例えば、米国特許出願公開第２００４‐０１４２３８２号に開示されており、筋組織または骨密度の増加が望ましい状態を治療または阻止するために用いることができる。例となる疾患および障害は、（デュシェーヌ型筋ジストロフィーを含む）筋ジストロフィー；筋萎縮性側索硬化症；筋萎縮；器官萎縮；虚弱；手根管足根管等症候群；うっ血性閉塞性肺疾患；筋肉減少症；悪液質；および他の筋肉消耗症候群；脂肪組織疾患（例えば、肥満）、２型糖尿病、耐糖能異常；メタボリック・シンドローム（例えば、ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｘ）；やけどまたは窒素インバランスのようなトラウマにより誘発されるインスリン抵抗性；および骨変性疾患（例えば、変形性関節症および骨粗しょう症）を含む。
【００３９】
ＧＤＦ‐８は、ミオスタチンとしても知られる分泌タンパク質であり、構造的に関連する増殖因子のトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ‐β：ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ‐ｂｅｔａ）スーパーファミリーに属し、これらのすべてが生理学的に重要な増殖調整および形態形成特性を有する（Ｋｉｎｇｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，８：１３３‐１４６）；Ｈｏｏｄｌｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２２８：２３５‐２７２）。ＴＧＦ‐βと同様に、ヒトＧＤＦ‐８は３７５アミノ酸残基の前駆タンパク質として合成される。前駆ＧＤＦ‐８タンパク質はホモ二量体を形成する。プロセシングの間にアミノ末端プロペプチドがＡｒｇ‐２６６で切断される。“ｌａｔｅｎｃｙ‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ（潜在性関連ペプチド）”（ＬＡＰ）として知られる切断されたプロペプチドは、ホモ二量体に非共有結合的に結合した状態に留まり、それにより複合体は不活化される（Ｍｉｙａｚｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：６４０７‐６４１５；Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：７６４６‐７６５４；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，３：３５‐４３；およびＴｈｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，１８：２５１‐２５９）。成熟型ＧＤＦ‐８のプロペプチドとの複合体は、一般に“ｓｍａｌｌ  ｌａｔｅｎｔ  ｃｏｍｐｌｅｘ（潜在型小複合体）”と呼ばれる（Ｇｅｎｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９：６８５１‐６８５７；Ｏｅｘｙｎｃｋ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ，３１６：７０１‐７０５；およびＭａｓｓａｇｕｅ（１９９０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１２：５９７‐６４１）。他のタンパク質も成熟型ＧＤＦ‐８に結合し、その生物学的活性を阻害することが知られている。かかる阻害タンパク質は、フォリスタチンおよびフォリスタチン関連タンパク質を含む（Ｇａｍｅｒ  ｅａ  ａｌ．（１９９９）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ，２０８：２２２‐２３２）。
【００４０】
用語「ＲＡＧＥ」は、終末糖化産物に対するレセプターに適用される。ＲＡＧＥは、免疫グロブリンのスーパーファミリーにおけるマルチリガンドの細胞表面メンバーである。ＲＡＧＥは、細胞外領域、単一膜貫通領域および細胞質部から構成される。レセプターの細胞外領域は、一つのＶ字型免疫グロブリン領域とそれに続くＣ字型免疫グロブリン領域からなる。ＲＡＧＥは可溶型でも存在する（ｓＲＡＧＥ）。ＲＡＧＥは、サイトカインの分泌、細胞酸化ストレスの増加、神経突起の伸長および細胞の移動を含む様々な細胞応答をもたらすいくつかの異なる分類の内因性タンパク質と結合する、パターン認識レセプターである。ＲＡＧＥのリガンドには、長期にわたる高血糖状態で形成される終末糖化産物（ＡＧＥ：ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）が含まれる。ＡＧＥに加えて、ＲＡＧＥについて知られるリガンドには、Ｓ１００／ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ（例えば、Ｓ１００Ａ１２、Ｓ１００Ｂ、Ｓ１００Ａ８‐Ａ９）、血清アミロイド（ＳＡＡ）（小線維型）、βアミロイドタンパク質（Ａβ）、およびｈｉｇｈ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ  ｂｏｘ‐１染色体タンパク質１（ＨＭＧＢ１、ａｍｐｈｏｔｅｒｉｎとしても知られる）を含む、アミロイド沈着および炎症反応を促進するメディエーターの特徴を示すβシート小線維を有するタンパク質が含まれる。ＲＡＧＥは、例えば、内皮および平滑筋細胞、マクロファージおよびリンパ球、並びに肺、心臓、腎臓、骨格筋、および脳を含む多くの異なる組織における、多くの細胞タイプにより発現される。発現は、リウマチ性関節炎および糖尿病性腎症のような慢性炎症状態で増加する。その生理学的機能は明らかでないが、ＲＡＧＥは炎症反応に関与し、筋芽細胞分化および神経発生を含む、多様な発生過程で役割を果たす可能性がある。多くの重要なヒト疾患は、ＲＡＧＥに対するリガンドの産生増加およびＲＡＧＥそのものの産生増加に関連づけられる。それらの疾患は、例えば、リウマチ、乾癬性関節炎および腸疾患、ガン、糖尿病および糖尿病性腎症、アミロイドーシス、心血管疾患および敗血症を含めて、多くの慢性炎症性疾患を含む。例えば、ＲＡＧＥに対するリガンドの一つであるＨＭＧＢ‐１は、マウスの敗血症の二つのモデルにおいて、致死性後期メディエーターであることが示されており、ＲＡＧＥとＨＭＧＢ‐１のようなリガンド間の相互作用は、敗血症および他の炎症性疾患の発症に重要な役割を果たすと信じられている。
【００４１】
用語「Ａβ」は、脳内のアミロイド斑の主成分に適用される。Ａβペプチドは、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ：ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と命名された、より大きい膜貫通型糖タンパク質の３９〜４３アミノ酸残基からなる４ｋＤａの内部フラグメントである。Ａβには、ＡＰＰが異なるセクレターゼ酵素によりタンパク質分解処理される結果として、主として短い４０アミノ酸残基長の形態および長い４２〜４３アミノ酸残基長の形態が見られる。ＡＰＰの疎水性の膜透過領域の部分がＡβのカルボキシル末端に見られ、Ａβが特に長い形態の場合に斑に凝集する能力は、このことで説明できるかもしれない。脳におけるアミロイド斑の蓄積は、最終的に神経細胞死をもたらす。このタイプの神経機能障害に関わる身体症状がアルツハイマー病（ＡＤ）を特徴づける。脳内のアミロイド斑の蓄積は、ダウン症候群および他の認知障害にも関係する。
【００４２】
ＡＰＰタンパク質内のいくつかの変異がＡＤの存在と関連付けられてきた（例えば、Ｇｏａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：７０４，１９９１（バリン７１７からイソロイシン）；Ｃｈａｒｔｉｅｒ  Ｈａｒｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３５３：８４４，１９９１（バリン７１７からグリシン）；Ｍｕｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：９７，１９９１（バリン７１７からフェニルアラニン）；Ｍｕｌｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１：３４５，１９９２（リシン５９５‐メチオニン５９６からアスパラギン５９５‐ロイシン５９６への二重変異）を参照。これらの各々は、その全体が参照によりここに組み込まれる）。かかる変異は、ＡＰＰのＡβへのプロセシングが増加または変化することにより、特に、ＡＰＰのプロセシングにより長い形態のＡβ（すなわち、Ａβ‐４２およびＡβ‐４３）が増加することにより、ＡＤを引き起こすと考えられる。プレセニリン遺伝子、ＰＳ１およびＰＳ２、のような他の遺伝子の変異が、ＡＰＰのプロセシングが長い形態のＡβを増加させることに間接的に影響を及ぼすと考えられている（Ｈａｒｄｙ，ＴＩＮＳ  ２０：１５４，１９９７．その全体が参照によりここに組み込まれる。）ある実施形態では、抗Ａβ抗体が本発明に従って精製される。
【００４３】
ここで用いる用語「ＩＬ‐２２」は、ＩＬ‐２２の完全長で未処理の前駆体型、並びに翻訳後切断により生じる成熟型を含む、インターロイキン２２に適用される。本用語は、修飾された配列を含めて、成熟型ＩＬ‐２２に係る少なくともいくつかの生物学的活性を保持するＩＬ‐２２の任意のフラグメントおよび変異体にも適用される。用語「ＩＬ‐２２」は、ヒトＩＬ‐２２、並びに他の脊椎動物種を含む。ヒトおよび齧歯類のＩＬ‐２２、並びにＩＬ‐２２に対する抗体のアミノ酸およびヌクレオチド配列は、例えば、米国特許出願公開第２００３‐０１５７１０６号、第２００５‐０１５３４０号、第２００５‐００４２２２０号および第２００５‐０１５８７６０号、並びに米国特許第６９３９５４５号に開示されている。これらのすべての出版物の内容は、その全体が参照によりここに組み込むまれる。
【００４４】
インターロイキン２２（ＩＬ‐２２）は、ＩＬ‐１０に対して配列相同性を示す、以前に特性解析されたクラスＩＩのサイトカインである。その発現は、ＩＬ‐９またはコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）によりＴ細胞で亢進される（Ｄｕｍｏｕｔｉｅｒ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７（１８）：１０１４４‐９）。研究によれば、リポ多糖（ＬＰＳ）の投与に応じてＩＬ‐２２  ｍＲＮＡの発現がｉｎ  ｖｉｖｏに誘発されること、ＩＬ‐２２は急性相反応を示すパラメータを変化させること（Ｄｕｍｏｕｔｉｅｒ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）上記参照；Ｐｉｔｔｍａｎ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２：１７２）、および抗ＩＬ‐２２中和抗体を用いてＩＬ‐２２活性を低めると、マウスのコラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ：ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）モデルにおける炎症性症状が改善することが示されている。それ故に、ＩＬ‐２２抑制因子、例えば、抗ＩＬ‐２２中和抗体およびそのフラグメントを、例えば、自己免疫疾患（例えば、リウマチ性関節炎のような関節疾患）；呼吸器疾患（例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））；例えば、皮膚（例えば、乾癬）、心臓血管系（例えば、アテローム性動脈硬化症）、神経系（例えば、アルツハイマー病）、腎臓（例えば、腎炎）、肝臓（例えば、肝炎）および膵臓（例えば、膵炎）を治療することを目的として、生体内に免疫抑制を誘発するために用いることができる。
【００４５】
用語「宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ：ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、細胞培養または発酵の間に宿主細胞がつくり出す非産生物のタンパク質に適用される。従って、いくつかの実施形態において、産生物を含む溶出液には、１００万分の１００（１００ｐｐｍ）より少ない（例えば、約５０ｐｐｍより少ない、または約２０ｐｐｍより少ない）ＨＣＰが存在する。ＨＣＰの組成は、極めて不均一でありタンパク質産生物および用いる精製手順に依存する。生物学的産生物を治療に供するための任意の販売認可に先立って、ＩＣＨ（免疫組織化学検査）およびＦＤＡ（米国食品医薬品局）のガイドラインに従い、産生物における（ＨＣＰのような）混入タンパク質レベルを定量的に測定しなければならない。
【００４６】
用語「カラム流出液」は、添加サイクルの間または添加物が加えられている期間中に、媒体またはカラムから流出する流体に適用される。
Ｂ．  発明の詳細な説明
本発明は、結合された媒体をアリギニンまたはアルギニン誘導体で洗浄することを含む手順を用いて、一つまたはそれ以上の不純物を含む添加流体から、産生物を精製および回収するための方法を提供する。好ましい実施形態では、媒体はＰｒｏｔｅｉｎ  Ａクロマトグラフィーカラムである。
【００４７】
一実施形態において、産生物は、タンパク質、例えば、ペプチド抗体を含む治療用タンパク質である。他の実施形態では、産生物は、分泌タンパク質；融合タンパク質、Ｆｃ融合タンパク質を含むレセプター融合タンパク質またはＩｇ融合タンパク質；可溶性レセプター；増殖因子；酵素；凝固因子；Ｆｃ含有タンパク質；免疫複合体、サイトカイン、インターロイキン、ホルモン、または治療用酵素である。
【００４８】
本発明のさらなる実施形態において、産生物は、タンパク質、例えば、ＣＨ２／ＣＨ３領域を有し、従ってＰｒｏｔｅｉｎ  Ａクロマトグラフィーによる精製に適した抗体である。用語「ＣＨ２／ＣＨ３領域」は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａと相互作用する、免疫グロブリン分子のＦｃ領域におけるアミノ酸残基に適用される。いくつかの実施形態において、ＣＨ２／ＣＨ３領域は、完全ＣＨ２領域およびそれに続く完全ＣＨ３領域を含む。他の実施形態では、ＣＨ２／ＣＨ３領域は、免疫グロブリンのＦｃ領域を含む。ＣＨ２／ＣＨ３領域を含むタンパク質の例には、抗体、イムノアドヘシン、およびＣＨ２／ＣＨ３領域に融合または接合した目的とするタンパク質を含む融合タンパク質が含まれる。
【００４９】
ある実施形態では、添加流体が媒体に添加されたときに少なくとも一つの不純物が媒体および／または産生物に付着し、媒体および／または産生物に付着した不純物を除去するためにアルギニンまたはアルギニン誘導体を含む少なくとも一つの洗浄溶液が用いられる。
【００５０】
タンパク質は、分泌タンパク質であってもよい。タンパク質は、抗体、抗体の抗原結合フラグメント、可溶性レセプター、レセプター融合タンパク質、サイトカイン、増殖因子、酵素、または凝固因子であってもよい。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明の方法を用いて精製されるタンパク質は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。ここで用いるように、用語「抗体」は、少なくとも一つの、典型的には二つの、ＶＨドメインないしその部分、および／または少なくとも一つの、典型的には二つの、ＶＬドメインないしその部分を含むタンパク質を含む。ある実施形態では、抗体は、二つの重い免疫グロブリン鎖および二つの軽い免疫グロブリン鎖からなる四量体であって、重いおよび軽い免疫グロブリン鎖は、例えば、ジスルフィド結合により相互に接続されている。抗体またはその一部分は、限定なしに、齧歯類、霊長類（例えば、ヒトおよびヒト以外の霊長類）、ラクダ科動物、サメを含む任意の起源から得てもよく、並びに、例えば、当業者によく知られた方法により、組み換え産生、例えば、キメラ、ヒト化、および／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成されてもよい。
【００５２】
抗体の用語「抗原結合フラグメント」に包含される結合フラグメントの例は、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインから構成される一価のフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された二つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインから構成されるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインから構成されるＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインから構成される、ｄＡｂフラグメント；（ｖｉ）ラクダまたはラクダ化した可変ドメイン、例えば、ＶＨＨドメイン；（ｖｉｉ）単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）；（ｖｉｉｉ）二重特異性抗体；および（ｉｘ）Ｆｃ領域に融合した免疫グロブリンの一つまたはそれ以上の抗体結合フラグメント、を含む。さらに、Ｆｖフラグメントの二つのドメイン、ＶＬおよびＶＨ、は別個の遺伝子によりコードされるが、それらは、組み換え法を用いて、ＶＬおよびＶＨ領域の１対が一価分子となった単一分子鎖を形成することを可能にする合成リンカーにより、連結されることができる（単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３‐２６；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８５：５８７９‐８３．を参照）。抗体の用語「抗原結合フラグメント」が、かかる単一鎖の抗体を包含することも意図している。これらの抗体フラグメントは、当業者に知られた従来技術を用いて得られ、これらのフラグメントは完全抗体と同様の仕方で機能が評価される。
【００５３】
いくつかの実施形態において、用語「抗原結合フラグメント」は単一ドメインの抗体を包含する。単一ドメインの抗体は、その相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部分である抗体を含んでもよい。例として、重鎖抗体、天然の軽鎖のない抗体、従来の４本鎖抗体から得られる単一ドメイン抗体、抗体から得られる以外の操作された抗体および単一ドメインのスカフォールドを含まれるが、これらには限定されない。単一領域の抗体は、任意の現状技術、または任意の次世代の単一領域の抗体であってもよい。単一ドメインの抗体は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギ、ウシおよびサメを含むが、これらには限定されない、任意の種から得ることができる。本発明の一様態によれば、ここで用いるような単一ドメインの抗体は、軽鎖のない重鎖抗体として知られる、自然発生的な単一ドメインの自然抗体である。かかる単一のドメイン抗体は、例えば国際特許出願第ＷＯ９４０４６７８号に開示されている。明確化のために、天然の軽鎖のない重鎖抗体から得られるこの可変ドメインは、４本鎖の免疫グロブリンの標準的なＶＨから区別するために、ここではＶＨＨまたはナノ体と称する。かかるＶＨＨ分子は、ラクダ科の種、例えば、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカおよびグアナコで採取される抗体から得ることができる。ラクダ科以外の他の種が天然の軽鎖のない重鎖抗体を産生することもあり、かかるＶＨＨも本発明の範囲内である。
【００５４】
抗原結合フラグメントは、例えば、安定性、エフェクター細胞機能または補体結合のうちの一つまたはそれ以上を向上させる部分を、随意的に、さらに含むことができる。例えば、抗原結合フラグメントは、ＰＥＧ化部分、アルブミン、または重および／または軽鎖の定常領域をさらに含むことができる。
【００５５】
加えて、本発明の方法は、ｓｍａｌｌ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ（ＳＭＩＰ（商標））薬（Ｔｒｕｂｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、シアトル、ワシントン州）を精製するために用いることができる。ＳＭＰは、抗原、カウンターレセプターまたは類似物、システイン残基を一つもつかまたはもたないヒンジ領域のポリペプチド、および免疫グロブリンのＣＨ２およびＣＨ３ドメインのような類似構造に対する結合ドメインからなる単一鎖ポリぺプシドである（ｗｗｗ．ｔｒｕｂｉｏｎ．ｃｏｍも参照）。ＳＭＩＰとその使用および応用は、例えば、米国特許出願公開第２００３／０１１８５９２号明細書、第２００３／０１３３９３９号明細書、第２００４／００５８４４５号明細書、第２００５／０１３６０４９号明細書、第２００５／０１７５６１４号明細書、第２００５／０１８０９７０号明細書、第２００５／０１８６２１６号明細書、第２００５／０２０２０１２号明細書、第２００５／０２０２０２３号明細書、第２００５／０２０２０２８号明細書、第２００５／０２０２５３４号明細書、および第２００５／０２３８６４６号明細書、および、関連する特許ファミリーの特許に開示されており、これらのすべては、その全体が参照により本明細書に組み込むまれる。
【００５６】
「二重特異的」または「二重機能」抗体以外は、抗体は、その各々が等価な結合部位を有すると解釈される。「二重特異的」または「二重機能抗体」は、二つの異なる重鎖および／または軽鎖のペア、および二つの異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である。二重特異的抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの連結を含む様々な方法により産生することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ＆Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５‐３２１（１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，１５４７‐１５５３（１９９２）。
【００５７】
タンパク質が抗体またはそのフラグメントである実施形態において、それは、少なくとも一つ、または二つの完全長の重鎖、および少なくとも一つ、または二つの軽鎖、を含むことができる。代わりに、抗体またはそのフラグメントは、抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖまたは単一鎖のＦｖフラグメント）のみを含むこともできる。抗体またはそのフラグメントは、単クローン性または単一特異的抗体であってもよい。抗体またはそのフラグメントは、ヒト、ヒト化、キメラ、ＣＤＲ‐移植、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成された抗体であってもよい。さらに他の実施形態では、抗体は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４から選択された、重鎖の定常領域を有してもよい。また別の実施形態では、抗体は、例えば、κまたはλから選択された軽鎖を有してもよい。一実施形態では、定常領域は、抗体の特性を修正するために（例えば、Ｆｃレセプターの結合、抗体のグリコシル化、システイン残基数、エッフェクター細胞機能、または補体機能のうちの一つまたはそれ以上を向上または低減するために）、改変、例えば、変異される。典型的には、抗体またはそのフラグメントは、所定の抗原、例えば、疾患、例えば神経変性、メタボリック、炎症性、自己免疫および／または悪性疾患、に関係する抗原に特異的に結合する。本発明の方法により分離することができる抗体の例は、ＲＡＧＥ、Ａβペプチド、インターロイキン１３（ＩＬ‐１３）、インターロイキン２２（ＩＬ‐２２）、５Ｔ４、および増殖分化因子８（ＧＤＦ‐８）に対する抗体を含むが、これらには限定されない。
【００５８】
ここに記載される方法で用いられる抗体は、免疫性を付与した動物の血清、腹水、ハイブリドーマまたは骨髄腫の上清、抗体分子を発現する組み換え細胞株の培養から、または抗体産生細胞の細胞抽出物から得られた馴化培地、を含む多くのソースから調製することができるが、これらには限定されない。本発明の一実施形態において、産生物は、抗体を産生する組み換え細胞株の馴化培地からの抗体である。細胞株間および様々の抗体産生物間でいくらかの変動はあり得るが、本明細書の開示に基づいて、ここに記載される発明を抗体タンパク質および産生細胞株の特定の組み合わせに適応させることは、十分に当業者の範囲内にある。
【００５９】
ある実施形態では、添加流体が媒体に添加されるとき、少なくとも一つの不純物が媒体および／または産生物と結合し、アルギニンまたはアルギニン誘導体を含む少なくとも一つの洗浄溶液が媒体および／または産生物と結合した不純物を除去するために用いられる。本発明の一実施形態では、精製された産生物は、６０％より少ない不純物（例えば、宿主細胞タンパク質）を含み、一実施形態では、４０％の不純物、一実施形態では、２０％の不純物、一実施形態では、１０％の不純物、一実施形態では、５％の不純物、一実施形態では、３％より少ない不純物、また別の実施形態では、１％より少ない不純物、を含む。不純物は、凝集したタンパク質、高分子量種、低分子量種、およびフラグメントのような望ましくないタンパク質変異体；精製されるタンパク質を分泌する宿主細胞からの他のタンパク質；宿主細胞のＤＮＡ；細胞培地からの成分、先に行う精製処理の間に試料中ににじみ出るアフィニティークロマトグラフィーに用いられる吸収剤の一部である分子、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＡおよびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ；エンドトキシン；核酸；ウイルス、または前記したものの任意のフラグメント、を含むが、これらには限定されない。
【００６０】
ここに記載される方法で用いられる媒体は、例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーカラム、サイズ排除クロマトグラフィーカラム、透析および膜分離（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、限外ろ過、ウイルス除去ろ過、および／またはイオン交換クロマトグラフィーカラム、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＡクロマトグラフィーカラムまたはＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇクロマトグラフィーカラムである。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａクロマトグラフィーカラムは、例えば、ＰＲＯＳＥＰ‐Ａ（商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，英国）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＡＳＴ  ＦＬＯＷ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ピスカタウェイ，ニュージャージー州）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）６５０Ｍ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ（ＴｏｓｏＨａｓｓ  Ｃｏ．，フィラデルフィア，ペンシルべニア州）、またはＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ピスカタウェイ，ニュージャージー州）であってもよい。
【００６１】
媒体を添加流体と接触させる前に、ｐＨ、イオン強度、および温度、並びにある場合には異なる種類の物質の添加のようなパラメータの調整が必要となることがある。従って、これは、媒体を溶液（例えば、ｐＨ、イオン強度などを調整するため、または洗浄剤を導入するための緩衝液）で洗浄することにより平衡化を行い、産生物の結合および精製に必要な特性をもたらす随意的な処理である。
本発明の一実施形態では、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムは平衡化され、さらにアルギニンまたはアルギニン誘導体を含む洗浄溶液で洗浄され、それにより産生物を精製するために必要な特性がもたらされる。本発明の一実施形態では、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムは、塩、例えば、約１００ｍＭから約１５０ｍＭのＮａＰＯ４、約１００ｍＭから約１５０ｍＭの酢酸ナトリウム、および約１００ｍＭから約１５０ｍＭのＮａＣｌ、を含む溶液を用いて平衡化することができる。平衡化バッファのｐＨは約６．０から約８．０の範囲とすることができる。一実施形態では、平衡化バッファのｐＨは約７．５である。平衡化バッファは、約１０ｍＭから約５０ｍＭのＴｒｉｓを含むことができる。また別の実施形態では、平衡化バッファは、約２０ｍＭのＴｒｉｓを含むことができる。媒体（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム）を添加流体と接触させた後、結合された媒体は洗浄される。本発明によれば、ここに記載される方法で用いられる洗浄溶液は、アルギニンまたはアルギニン誘導体を含む。アルギニン誘導体は、アセチルアルギニン、アグマチン、アルギニン酸、Ｎ−α‐ブチロイル‐Ｌ‐アルギニン、またはＮ−α‐ピバロイルアルギニンとすることができるが、これらには限定されない。
【００６２】
洗浄溶液中のアルギニンまたはアルギニン誘導体の濃度は、約０．１Ｍおよび約２．０Ｍの間（例えば、０．１Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、１．０Ｍ、１．５Ｍ、または２．０Ｍ）であり、または約０．５Ｍおよび約１．０Ｍの間（例えば、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、または１．０Ｍ）である。ある実施形態では、洗浄溶液中のアルギニンまたはアルギニン誘導体の濃度は、約０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、または０．９Ｍである。ある実施形態では、洗浄溶液中のアルギニンまたはアルギニン誘導体の濃度は、約１．１Ｍ、１．２Ｍ、１．３Ｍ、１．４Ｍ、１．５Ｍ、１．６Ｍ、１．７Ｍ、１．８Ｍ、１．９Ｍ、または２．０Ｍである。ある実施形態では、洗浄溶液中のアルギニンまたはアルギニン誘導体の濃度は、約０．５Ｍより高く、約２．０Ｍより低い（例えば、０．５５Ｍ、０．７５Ｍ、１．０Ｍ、１．２５Ｍ、１．５Ｍ、または１．７５Ｍ、ないし２．０Ｍ）、或いは約０．５Ｍより高く、約１．０Ｍより低い（例えば、０．５５Ｍ、０．７５Ｍ、または１．０Ｍ）。一実施形態では、アルギニンの濃度は、１Ｍではない。いくつかの実施形態では、洗浄溶液におけるアルギニンまたはアルギニン誘導体の濃度は、１Ｍより高い。いくつかの実施形態では、洗浄溶液におけるアルギニンまたはアルギニン誘導体の濃度は、１Ｍより低い。さらなる実施形態では、洗浄溶液は、約０．１Ｍから約０．９Ｍのアルギニンまたはアルギニン誘導体を含むことができる。ある実施形態では、アルギニンまたはアルギニン誘導体の濃度は、約０．２Ｍから約０．８Ｍ、約０．３Ｍから約０．７Ｍ、または約０．４Ｍから約０．６Ｍとすることができる。さらなる実施形態では、洗浄溶液は、約１．１Ｍから約３．０Ｍ、または約１．１Ｍから約２．０Ｍのアルギニンまたはアルギニン誘導体を含んでもよい。ある実施形態では、アルギニンまたはアルギニン誘導体の濃度は、約１．２Ｍから約２．８Ｍ、約１．３Ｍから約２．６Ｍ、約１．４Ｍから約２．４Ｍ、約１．５Ｍから約２．２Ｍ、約１．６Ｍから約２．０Ｍ、または約１．８Ｍから約２．０Ｍである。ある実施形態では、アルギニンまたはアルギニン誘導体の濃度は、約１．２Ｍから約１．９Ｍ、約１．３Ｍから約１．８Ｍ、約１．４Ｍから約１．７Ｍ、または約１．５Ｍから約１．６Ｍである。
【００６３】
洗浄溶液のｐＨは、一般的に約４．５および約８．０の間、例えば、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５および８．０である。同じ場合には、洗浄溶液のｐＨは、５．０より大きく、約８．０より小さい、例えば、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、７および８．０である。洗浄溶液は、２０ｍＭから５０ｍＭのＴｒｉｓ（例えば、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭまたは５０ｍＭ）を含むことができる。一実施形態では、結合された媒体は、５カラム容積の洗浄溶液で洗浄され、次に溶離処理が続く。
【００６４】
本発明のある実施形態では、産生物は、洗浄された媒体、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム、から溶離することができる。産生物をＰｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムから溶離するために、洗浄された媒体を溶離バッファと接触させる。いくつかの実施形態において、溶離バッファは、約１５ｍＭから約５０ｍＭのＮａＣｌを含む。他の実施形態では、溶離バッファは、約５０ｍＭから約１５０ｍＭのアルギニンまたはアルギニン誘導体を含んでもよい。さらなる実施形態では、溶離バッファは、約５０ｍＭから約１５０ｍＭのグリシンを含んでもよい。溶離バッファは、約２０ｍＭから約３０ｍＭのＨＥＰＥＳを含むこともできる。溶離バッファは、約２５ｍＭから約５０ｍＭの酢酸を含んでよい。溶離バッファのｐＨは、約２．０から約４．０の範囲とすることができる。一実施形態では、溶離バッファのｐＨは、約３．０である。
【００６５】
媒体は、抗体の溶離後に、随意的に清浄化、すなわち、剥離および再生することができる。この手順は、固相の表面上に不純物が蓄積することを最小限にとどめ、および／または産生物が微生物で汚染されるのを防ぐことを目的として充填剤を滅菌するために通常は定期的に行われる。
【００６６】
バッファ成分は、当業者の知識に従って調整することができる。実例となるバッファ組成の範囲は、以下の例に提示される。すべてのバッファまたは処理が必要なわけではないが、しかし説明だけのために提示される。例に示されるような、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムクロマトグラフィーのバッファ条件を効率的に最適化するために、高スループットスクリーニングを利用することができる。
【００６７】
本方法の一実施形態では、溶出液は単離された産生物を含み、単離された産生物の純度は、洗浄溶液中に約０．１Ｍより少ないアルギニンまたはアルギニン誘導体を用いる類似の方法と比較して増加する。
【００６８】
また別の実施形態では、溶出液は単離された産生物を含み、産生物の少なくとも一つの不純物に対する比率は、洗浄溶液中にいかなる検出可能量のアルギニンもアルギニン誘導体も用いない類似の方法と比較して増加する。
【００６９】
いくつかの事例において、溶出液は産生物を含み、産生物の宿主細胞タンパク質に対する比率は、洗浄溶液中に約０．１Ｍより少ないアルギニンまたはアルギニン誘導体を用いる類似の方法と比較して増加する。
【００７０】
溶出液は、産生物を含むことができ、産生物の宿主細胞タンパク質に対する比率は、洗浄溶液中にいかなる検出可能量のアルギニンもアルギニン誘導体も用いない類似の方法と比較して増加する。
【００７１】
濁度は、不溶性の産生物、不溶性の不純物、および産生物および不純物からなる不溶性の複合体に関する尺度を提供する。濁度は、細胞内粒子および細胞片が原因となることがある。一般的に、溶出液の濁度がより低いことは、産生物の品質がより望ましいことと関連する。濁度は、当分野で知られた方法を用いて評価することができる。例えば、比濁法（Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２  Ａｐｒｉｌ；２０（４）：１４９‐５６）または光学濃度を用いることができる。光学濃度は、一般的に約３２０ｎｍから約６５０ｎｍの範囲の吸光度の測定により評価することができる。
【００７２】
いくつかの事例において、ある溶出液の濁度は、洗浄溶液中に約０．１Ｍより少ないアルギニンまたはアルギニン誘導体を用いる類似の方法における溶出液の濁度と比較して低減される。ある方法では、ある溶出液の濁度は、洗浄溶液中にいかなる検出可能量のアルギニンもアルギニン誘導体も用いない類似の方法と比較して低減される。
【００７３】
ある実施形態では、本発明の方法は、産生物を含む溶出液における濁度の低減をもたらす。他の実施形態では、本方法は、洗浄溶液中にいかなる検出可能量のアルギニンもアルギニン誘導体も用いない類似の方法と比較して、産生物を含む溶出液における濁度の低減、並びに不純物の低減をもたらす。ある実施形態では、本方法は、いかなる付加的な上流側のろ過、例えば、付加的な上流側の陰イオン性吸着ろ過も含まない。
【００７４】
本発明の精製方法は単独で用いることもできるが、他の精製技術と組み合わせて用いてもよい。一実施形態では、例えば、ここに記載される方法を使用する一方で、汚染物質または不純物に関する添加の課題を低減することを目的として添加流体を調製するために、一つまたはそれ以上のプロセスを用いることができる。いくつかの事例には、例えば、溶出液中に存在する汚染物質または不純物を除去することを目的として溶出液を処理するために、一つまたはそれ以上のプロセスが用いられる。
【００７５】
本発明は、ここに記載される方法に従って調製される産生物にも関する。一般的に、本発明に従って単離される産生物は、さらに単離および／または精製され、標準の方法に従って治療上の使用のために製剤されることが典型的には望ましいであろう。タンパク質に関しては、例えば、参照によりここに組み込まれる、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ２ｎｄ  Ｅｄｕｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ‐Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．（ｅｄｓ）、およびＤｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．，Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．，Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．（ｅｄｓ），Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌ  １８２），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７、を参照。当業者は、用いるべき的確な技術が産生物の個性に依存して変わることを認識するであろう。薬理活性を有する本発明の産生物は、医薬の調製に役立てることができる。これらは、患者に投与されてもよく、または、限定なしに、非経口（例えば、静脈）、皮内、皮下、経口、経鼻、気管支、眼、経皮（局所性）、経粘膜、直腸、および膣を含む任意の利用可能な経路により送達するために予め製剤されてもよい。
【００７６】
産生物の医薬組成物は、当分野で知られた方法に従って、投与を意図する経路に適合するように製剤される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ”，１９ｔｈ  ｅｄ．，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，（１９９５）、および“Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ”  ，５２ｎｄ  ｅｄ．，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，  Ｍｏｎｔｖａｌｅ，  ＮＪ．（１９９８）．参照。いくつかの実施形態において、産生物は、滅菌水（例えば、ＳＷＦＩ）、緩衝食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）、またはそれらの適切な混合物を用いて製剤される。
【００７７】
ここに記載される方法を用いて回収することができる産生物の非限定的な例は、タンパク質またはペプチド、例えば、抗体、抗体フラグメント、組み換えタンパク質、自然界の分泌タンパク質、分泌するように操作されたタンパク質またはペプチド、細胞で産生される非タンパク質産生物、または前述の産生物の組み合わせを含む。
【実施例】
【００７８】
本発明は、以下の例によりさらに説明される。これらの例は、単に説明目的のために提示される。これらは、決して本発明の範囲または内容を限定すると解釈されるべきではない。
【００７９】
細胞のバクテリアまたは組織により産生される産生物の単離のために役立つ方法を特定するために、単離プロセスの一部としてアフィニティー媒体を用いるプロトコールで実験が行われた。これらの実験において、産生物を結合させるためにＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムが用いられた。
【００８０】
（実施例１）
ＧＤＦ‐８  ｍＡｂ−１：ＨＣＰおよび濁度の低減、並びに産生物の回収に関するＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ洗浄バッファの比較
高スループットスクリーニング（ＨＴＳ：ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）法を用いて、様々な洗浄溶液の評価を最初に行った。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムに、チャイニーズハムスター卵巣（“ＣＨＯ”：Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ）細胞培養プロセスからの馴化培地を最初に添加した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）樹脂を次にスラリーにして、樹脂スラリーの１００μＬを９６穴マイクロタイタープレートの各穴に分配した。マイクロタイタープレートの各穴を、次に評価段階にある試験溶液で洗浄し、その後に低ｐＨバッファで溶離した。各穴からの溶出プールは、ピーク濁度についてＡ３２０により、および産生物の回収についてＡ２８０により評価した。ＨＴＳ実験からの結果に基づいて、小規模のカラム・スカウティングランを用いたさらなる試験のために、最も高い回収および最も低い濁度をもたらした試験溶液を選択した。カラム・スカウティングランにおいて、ＭｅｂＳｅｌｅｃｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５を含むバッファにより平衡化し、ＧＤＦ‐８  ｍＡｂ‐１を含むＣＨＯ馴化培地を添加した。本カラムを次に５カラム容積（ＣＶ）の平衡化バッファでフラッシュし、その後に５ＣＶの評価段階にある試験溶液で洗浄した。結合した産生物は、その後に低ｐＨバッファ中で溶離した。中和後のピーク濁度はＡ３２０によりまたは濁度計により測定し、産生物の回収はＡ２８０により測定し、さらにＨＣＰレベルはＥＬＩＳＡにより測定した。最初の評価に用いたカラムのサイズは、直径が０．５ｃｍまたは１．１ｃｍでベッド高さが８から２５ｃｍであった。表１に、実施例１に記載されたすべての実験に関するカラム操作条件をまとめる。
【００８１】
【表１】
0005386354.tif 000002
各々のランに対して、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムを５カラム容積の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．５で平衡化し、その後におよそ３５ｍｇ産生物／ｍＬ樹脂まで添加した。次に、カラムを次に１コラム容積の平衡化バッファ、および５カラム容積（ＣＶ）の評価段階にある試験洗浄液（表２参照）でフラッシュした。洗浄フェーズの次に１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．５の５ＣＶのフラッシュが続いた。結合した産生物は、次に１００ｍＭ  Ｌ‐アルギニン、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ３．０でカラムから溶離した。産生物のプールを、その後に２Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０でｐＨ  ７．５に中和した。カラムを２ＣＶの６Ｍ  グアニジン  ＨＣｌで剥離した。グアニジンは、１６％  エタノール（４ＣＶ）中に保存する前に、４ＣＶの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．５でカラムから除去した。すべてのカラム操作は室温で行った。
【００８２】
ＨＣＰおよびプール濁度のピーク値の低減に関して評価した様々な洗浄溶液を表２にリストする。比較参照用の１Ｍ  ＮａＣｌ洗浄溶液を用いたとき、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａの溶出プールに著しい沈澱および産生物の損失が観測された（図１）。加えて、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムステップを通したＨＣＰのクリアランスは、１ｌｏｇ１０より小さかった。１０％  イソプロパノール（ＩＰＡ）、０．５Ｍ  グアニジン‐ＨＣｌ（ＧｕＨＣｌ）、または２Ｍ  Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌのような代替洗浄溶液と比較して、アルギニン洗浄溶液は良好な産生物の回収を維持する一方で、ＨＣＰおよび溶出プールの濁度を低減するのにより有効であった（図１）。
【００８３】
【表２】
0005386354.tif 000003
（実施例２）
ＧＤＦ−８  ｍＡｂ‐２：ＨＣＰおよび濁度の低減、並びに産生物の回収に関するＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ洗浄バッファの比較
ＧＤＦ−８  ｍＡｂ‐２を含むＣＨＯ細胞培養プロセスからの馴化培地をＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムを用いて小規模に精製した。最初の評価に用いたカラムサイズは、直径が０．５ｃｍまたは１．１ｃｍでベッド高さが８ｃｍから２５ｃｍであった。ＧＤＦ−８  ｍＡｂ‐２の精製のために用いたＰｒｏｔｅｉｎ  Ａの操作条件、並びにＨＣＰおよびプール濁度のピーク値の低減について評価するための洗浄溶液は、実施例１で用いたものと同じであった（評価された試験溶液については表２参照）。
【００８４】
比較参照用の１Ｍ  ＮａＣｌ洗浄溶液を用いたとき、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａの溶出プールにおいて著しい沈澱および産生物の損失が観測された（図２）。加えて、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムステップを通したＨＣＰのクリアランスは、１ｌｏｇ１０より小さかった。１０％  イソプロパノール、０．５Ｍ  グアニジン‐ＨＣｌ（ＧｕＨＣｌ）、または２Ｍ  Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌのような代替洗浄溶液と比較して、アルギニン洗浄液は、＞７５％の産生物の回収を維持する一方で、ＨＣＰを除去し、溶出プールの濁度を低減するのにより有効であった（図２）。
【００８５】
（実施例３）
ＩＬ‐１３  ｍＡｂ‐１：ＨＣＰおよび濁度の低減、並びに産生物の回収に関するＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ洗浄バッファの比較
高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）法を用いて、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムステップを通した濁度およびＨＣＰの低減についていくつかの洗浄溶液の評価を最初に行った。２５ｍＬのカラムにＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）樹脂を充填し、樹脂１ｍＬ当たりＩＬ‐１３  ｍＡｂ‐１  ２５ｍｇの最終添加目標までＣＨＯ細胞の馴化培地を添加した。樹脂を次にスラリーにして、樹脂スラリーの１００μＬを９６穴マイクロタイタープレートの各穴に分配した。マイクロタイタープレートの各穴を次に評価段階にある試験溶液で洗浄し、結合した産生物を５０ｍＭ  グリシン、３５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ３．０で溶離した。表３に、この検討で評価したすべての洗浄溶液のリストを示す。各穴からの溶出プールは、ピーク濁度についてＡ３２０および産生物の回収についてＡ２８０により測定した。
【００８６】
【表３Ａ】
0005386354.tif 000004
【００８７】
【表３Ｂ】
0005386354.tif 000005
評価段階にある洗浄溶液の有効性を、中和された溶出プールに関するノーマライズされたＡ３２０値を比較することにより評価した。５つの試験溶液、アルギニン、ＣａＣｌ２，グアニジン  ＨＣｌ、ＩＰＡおよびＴｒｉｓは、１Ｍ  ＮａＣｌの比較参照用洗浄液に比べて、中和後のプール濁度のピーク値を低減するのにより有効であった。小規模カラムのスカウティングランを用いて、アルギニン、ＣａＣｌ２，ＴｒｉｓおよびＩＰＡをさらに試験した。１．１ｃｍ（直径）×８ｃｍ（ベッド高さ）のカラムをこれらの評価に用いた。単クローン性抗体を含むＣＨＯ細胞培養からの馴化培地を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムを室温で操作して精製した。添加目標は、これらのランに対して３０ｍｇ／ｍＬ樹脂に固定した。スカウティングランに用いた操作条件を表４にまとめる。端的には、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムを平衡化し、ＩＬ‐１３  ｍＡｂ‐１を含むＣＨＯ細胞の馴化培地を添加した。カラムを次に５カラム容量の高塩濃度バッファで、続いて５カラム容量の評価段階にある洗浄溶液で洗浄した。カラムを次に溶離処理に備えて、一連の低塩濃度溶液で洗浄した。結合した産生物は、次に５０ｍＭ  グリシン、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ３．０で溶離した。中和後のピーク濁度は濁度計により測定し、産生物の回収はＡ２８０により測定し、さらにＨＣＰレベルはＥＬＩＳＡにより測定した。これらの実験からの結果を図３にまとめる。
【００８８】
【表４Ａ】
0005386354.tif 000006
【００８９】
【表４Ｂ】
0005386354.tif 000007
１Ｍ  ＮａＣｌの比較参照用洗浄溶液を用いたときの中和後のプールのピーク濁度値は約２０ＮＴＵであり、実施例１および２で報告された値より著しく低い。アルギニン、ＣａＣｌ２，およびＴｒｉｓは、１Ｍ  ＮａＣｌの比較参照液と比較して、中和後のプールのピーク濁度値を低減するのにより有効であった。しかし、中和後のプールのピーク濁度値を低減するために有効であった３つの洗浄溶液のうちでも、アルギニンは、産生物の回収に影響することなく、ＨＣＰを低減するためにより有効であった。０．４Ｍ  アルギニンによるＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ処理を通したＨＣＰの低減は、１Ｍ  ＮａＣｌの比較参照用洗浄液による対応する値より３．５倍高かった（図３）。
【００９０】
（実施例４）
ＩＬ‐２２  ｍＡｂ：ＨＣＰおよび濁度の低減、並びに産生物の回収に関するＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ洗浄バッファの比較
ＨＴＳ法を用いて、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムステップを通した濁度およびＨＣＰの低減についていくつかの洗浄溶液の評価を最初に行った。２５ｍＬのカラムにＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）樹脂を充填し、樹脂１ｍＬ当たりＩＬ‐２２  ｍＡｂ  ２５ｍｇの最終添加目標までＣＨＯ細胞の馴化培地を添加した。樹脂を次にスラリーにして、樹脂スラリーの１００μＬを９６穴マイクロタイタープレートの各穴に分配した。マイクロタイタープレートの各穴を次に評価段階にある試験溶液で洗浄し、結合した産生物を低ｐＨバッファで溶離した。溶出プールを次に高ｐＨバッファで中和し、ピーク濁度についてＡ３２０によりおよび産生物の回収についてＡ２８０により評価した。小規模カラムのスカウティングランを用いてさらに試験するために、ＨＴＳ実験からの結果に基づいて、最も高い回収および最も低い濁度をもたらした試験溶液を選択した。その条件を表５にまとめる。
【００９１】
【表５】
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各ランに対して、０．５ｃｍ（ｄ）×２０ｃｍ（ｈ）のＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムを５カラム容量（ＣＶ）の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５で平衡化し、その後におよそ３５ｍｇ産生物／ｍＬ樹脂まで添加した。カラムを次に５ＣＶの試験溶液で洗浄した。洗浄フェーズの次に、５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２０〜３０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．５の３ＣＶの溶離前フラッシュが続いた。結合した産生物は、次に低ｐＨバッファでカラムから溶離し、試験溶液でｐＨ７．５に中和した。カラムを５ＣＶの５０ｍＭ  ＮａＯＨ，５００ｍＭ  硫酸ナトリウムで剥離し、５ＣＶの１６％（ｖ／ｖ）エタノール、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５中に保存した。すべてのカラム操作は室温で行い、これらを表６にまとめる。
【００９２】
【表６】
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図４に示されるように、すべての試験溶液は同程度の産生物の回収をもたらした。ラン２に用いたアルギニン洗浄液およびラン５に用いたＴｒｉｓ洗浄液は、ＨＣＰを最もよく低減した。しかし、ラン２に用いたアルギニン洗浄液は、ラン５に用いたＴｒｉｓ洗浄液に比べてほぼ２倍濁度レベルが低かった。
【００９３】
（実施例５）
ＲＡＧＥ  ｍＡｂ：ＨＣＰおよび濁度の低減、並びに産生物の回収に関するＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ洗浄バッファの比較
ＨＴＳ法を用いて、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムステップを通した濁度およびＨＣＰの低減に関するいくつかの洗浄溶液の評価を最初に行った。２５ｍＬのカラムにＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）樹脂を充填し、樹脂１ｍＬ当たりＲＡＧＥ  ｍＡｂ  ２５ｍｇの最終添加目標までＣＨＯ細胞の馴化培地を添加した。樹脂を次にスラリーにして、樹脂スラリーの１００μＬを９６穴マイクロタイタープレートの各穴中に分配した。マイクロタイタープレートの各穴を次に評価段階にある試験溶液で洗浄し、結合した産生物を低ｐＨバッファで溶離した。溶出プールを次に高ｐＨバッファで中和し、ピーク濁度についてＡ３２０によりおよび産生物の回収についてＡ２８０により評価した。ＨＴＳ実験において、試験した過半数の溶液について許容できる回収および濁度が得られた。これらの結果およびこれまでの経験に基づいて、この産生物に対する洗浄条件としてアルギニンを評価して選択した。
【００９４】
５ｃｍ（ｄ）×２３ｃｍ（ｈ）のＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムを５カラム容量（ＣＶ）の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５で平衡化し、その後に約３５ｍｇ産生物／ｍＬ樹脂まで添加した。カラムを次に５ＣＶの０．５Ｍ  アルギニン、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５で洗浄した。洗浄フェーズの次に、３９ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ７．５の３ＣＶの溶離前フラッシュが続いた。結合した産生物は、次に２２ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  グリシン、ｐＨ  ３．０で溶離し、２．０Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ８．２でｐＨ７．５に中和した。カラムを５ＣＶの５０ｍＭ  ＮａＯＨ、５００ｍＭの硫酸ナトリウムで剥離し、５ＣＶの１６％（ｖ／ｖ）エタノール、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ７．５中に保存した。すべてのカラム操作は室温で行い、これらを表７にまとめる。
【００９５】
【表７Ａ】
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【００９６】
【表７Ｂ】
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図５に示されるように、アルギニン洗浄液は産生物の許容可能な回収をもたらし、一方でＨＣＰ除去および中和後のピーク濁度の低減に所望のレベルが得られた。
【００９７】
（実施例６）
Ａβ  ｍＡｂ：ＨＣＰおよび濁度の低減、並びに産生物の回収に関するＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ洗浄バッファの比較
高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）法を用いて、様々な洗浄溶液の評価を最初に行った。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養プロセスからの馴化培地を最初に添加した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ樹脂を次にスラリーにして、樹脂スラリーの１００μＬを９６穴マイクロタイタープレートの各穴に分配した。マイクロタイタープレートの各穴を次に評価段階にある試験溶液（表８参照）で洗浄し、その後に低ｐＨバッファにより溶離した。各穴からの溶出プールをピーク濁度についてＡ３２０により、および産生物の回収についてＡ２８０により評価した。小規模カラムのランを用いたさらなる試験のために、ＨＴＳ実験からの結果に基づいて、最も高い回収および最も高いＨＣＰ除去をもたらした試験溶液を選択した。これらの洗浄溶液はアルギニンおよびＣａＣｌ２であった。
【００９８】
【表８】
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カラムのランでは、これらの評価のために１．６ｃｍ（直径）×１５ｃｍ（ベッド高さ）のカラムを用いた。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５を含むバッファで平衡化し、Ａβ  ｍＡｂを含むＣＨＯ細胞の馴化培地を４０ｍｇ／ｍＬまで添加した。カラムを次に２カラム容量（ＣＶ）の平衡化バッファでフラッシュし、その後に５ＣＶのアルギニンまたはＣａＣｌ２のいずれかで洗浄した。カラムを次に溶離処理に備えて１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５カラムを洗浄した。結合した産生物は、その後に５０ｍＭ  グリシン、１０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ  ３．０で溶離した。中和後のピーク濁度はＡ３２０によりまたは濁度計により測定し、産生物の回収はＡ２８０により測定し、ＨＣＰレベルはＥＬＩＳＡにより測定した。表９に、この実施例に記載されたすべての実験に関するカラム操作条件をまとめる。
【００９９】
【表９】
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【０１００】
【表１０Ａ】
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【０１０１】
【表１０Ｂ】
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表１０は、Ａβ  ｍＡｂに関するのための洗浄実験に関する回収およびＨＣＰ値の結果を示す。アルギニンおよびＣａＣｌ２は、宿主細胞およびプール濁度の最終ピーク値の低減の点で同程度の洗浄溶液であった。洗浄の間に産生物の損失がより少ないことに基づいて、０．５Ｍ  アルギニンをＡβ  ｍＡｂプロセスのための洗浄溶液として選択した。
【０１０２】
（実施例７）
ＩＬ‐１３  ｍＡｂ‐２：ＨＣＰおよび濁度の低減、並びに産生物の回収に関するＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ洗浄バッファの比較
高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）法を用いて、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムステップを通した濁度の低減についていくつかの洗浄溶液の評価を最初に行った。２５ｍＬのカラムにＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）樹脂を充填し、樹脂１ｍＬ当りＩＬ‐１３  ｍＡｂ‐２  ５０ｍｇの最終添加目標までＣＨＯの馴化培地を添加した。樹脂を次にスラリーにして、樹脂スラリーの１００μＬを９６穴マイクロタイタープレートの各穴に分配した。マイクロタイタープレートの各穴を次に評価段階にある試験溶液で洗浄し、結合した産生物を溶離し、さらに酸性の溶出プールを中和した。
【０１０３】
ＨＴＳに対して、様々な添加剤の洗浄液、溶離バッファおよび滴定剤を組みあわせにより、および様々な濃度で活用した。ＨＴＳで活用した添加剤の洗浄液は、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、Ｔｒｉｓ、およびアルギニンであった。ＨＴＳで活用した溶離バッファは、異なる濃度のＮａＣｌとともにグリシン、ＨＥＰＥＳ、および酢酸であった。ＨＴＳで活用した滴定剤は、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳおよびイミダゾールであった。
【０１０４】
Ａ３２０を沈澱の代わり用いて、中和された溶出プールに関する正規化したＡ３２０の値と比較することにより、洗浄溶液の有効性を評価した。溶離されたピークのＡ３２０示度を低減するのにはアルギニンが最も有効なことが分かった。小規模カラムのスカウティングランを用いたさらなる試験のために、ＨＴＳ実験からの結果に基づいて、最も高い回収および最も低い濁度をもたらした試験溶液を選択した。これは、塩化カルシウム、アルギニン、および塩化ナトリウム（比較参照用）を小規模カラムの試行における洗浄バッファとして用いるさらなる試験につながる。
【０１０５】
ＩＬ‐１３  ｍＡｂ‐２を含むＣＨＯ培養プロセスからの馴化培地を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムを室温で操作して小規模に精製した。最初の評価に用いたカラムのサイズは、直径が１．１ｃｍでベッド高さが２０ｃｍから２５ｃｍであった。添加目標はこれらのランに対して３５ｍｇ／ｍＬ樹脂に固定した。スカウティングランに用いた条件を表１１にまとめる。
【０１０６】
【表１１】
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【０１０７】
【表１２Ａ】
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【０１０８】
【表１２Ｂ】
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【０１０９】
【表１３】
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端的には、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムを平衡化し、ＩＬ‐１３  ｍＡｂ‐２を含むＣＨＯの馴化培地を添加した。カラムを次に５ＣＶの中塩濃度バッファで、続いて５ＣＶの評価段階にある洗浄溶液で洗浄した。溶離処理に備えて、カラムを次に３ＣＶの低塩濃度溶液で洗浄した。結合した産生物を、次にバッファ種としてグリシンまたは酢酸のいずれかを含むｐＨ３．１の溶液で溶離した。このピークプールを次に３つの異なる滴定剤で独立に中和した。中和後のピーク濁度は濁度計で測定し、産生物の回収はＡ２８０により測定し、ＨＣＰレベルはＥＬＩＳＡにより定量化した。この実験からの結果を図６にまとめる。
【０１１０】
試行したすべての濃度および様々な溶離バッファ（表１３参照）に関して、アルギニンが、塩化カルシウムまたは塩化ナトリウムと比べて酸性および中和されたプールのピーク濁度を低減するのにより有効であることがわかった。酸性のプールがＴｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、またはイミダゾールの滴定剤で中和されたかどうかを問わず、この所見には一貫性があった（表１３参照）。
【０１１１】
加えて、アルギニン洗浄液の効果は、中和されたプールの最終的かつ個別のｐＨには限定されない。７．５〜８．２のｐＨ範囲（例えば、７．５，７．７，７．９，８．０，８．１および８．２）にわたって、中和後のピーク濁度値は、ｐＨが増加するにつれて減少する。しかし、この同じ範囲にわたって、アルギニン洗浄液の採用により、常に塩化カルシウムを用いた場合と比べて低いＮＴＵとなった。
【０１１２】
添加した産生物の回収は、試行した各々の添加剤に対して＞９５％であった。ＨＴＳデータは、＞１．５Ｍの塩化カルシウムを用いた洗浄では回収が測定可能なほど減少するであろうことを示唆した。従って、この濃度は試行しなかった。
【０１１３】
試験した洗浄液種は、ピークプールにおけるＨＣＰ、ＨＭＷ，およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ａの最終的な濃度に基づいて区別することはできなかった。しかし、１．０Ｍ  アルギニン洗浄溶液で溶離した洗浄フラクションの分析では、ＨＣＰは一貫して有意なレベルを示した。この洗浄フラクションのＨＣＰレベルは約４９０００ｐｐｍであり、一方でピークでは約２２０００ｐｐｍに過ぎなかった。このことはアルギニン洗浄液が選択的にＨＣＰを除去することの証拠である。
【０１１４】
本明細書に引用されるすべての参考文献は、個々の出版物または特許ないし特許出願についていかなる目的に対してもその全体が参照により組み込まれることを具体的かつ個別的に示したように、いかなる目的に対してもその全体が参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれる出版物および特許または特許出願が本明細書に含まれる開示と矛盾する範囲内において、本明細書は、任意のかかる矛盾する資料に代わるおよび／または優先することを意図するものである。
【０１１５】
本明細書および請求項に用いられる原料、反応条件などの量を示すすべての数は、すべての事例において用語「約」により修正がなされると理解されるべきである。従って、逆が指示されない限り、明細書および添付の請求項に示される数値パラメータは、本発明により獲得が目指される所望の特性に依存して変化してもよい。少なくとも、しかも請求の範囲に均等論を適用することを制限する試みとしてではなく、各々の数値パラメータは、有効数字および通常の四捨五入扱いの観点から解釈されるべきである。
【０１１６】
本発明の改良および変更は、当業者には明らかであろうように、その精神および範囲から逸脱することなく為されることができる。本明細書に記載される具体的な実施例は、例示の手段としてのみ提示されるものであり、いかなる意味においても限定的となることは意図していない。本明細書および実施例は単に例を示すものであり、本発明の真の範囲および精神は請求項により示されることを意図するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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