(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）に属する乳酸菌ＭＳＣ００３株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１０２６）。
【請求項２】
請求項１に記載の乳酸菌株の培養物。
【請求項３】
請求項２に記載の培養物を炭素数１〜３のアルコールを用いて抽出する工程を経て得られる抽出組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の乳酸菌株を用いて発酵する工程を用いて製造された食品組成物。
【請求項５】
請求項２に記載の培養物及び／又は請求項３に記載の抽出組成物を有効成分として含有することを特徴とする、抗菌剤。
【請求項６】
食品、動物飼料、化粧品、医薬品及び洗浄剤よりなる群より選ばれる少なくとも１つの製品の保存剤として用いられる、請求項５に記載の抗菌剤。
【請求項７】
ｐＨ５以下に調整されてなる、請求項５又は６に記載の抗菌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規乳酸菌に関し、より詳細には、グラム陽性菌のみならずグラム陰性菌に対しても有効な抗菌性物質を産生する新規乳酸菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌は、ヨーグルトの製造に用いられる等、これまで多くのものが知られている（例えば、特許文献１参照。）。
特許文献１に記載のように、「乳酸菌は様々な機能を有していることが知られており、その中でも抗菌作用は近年注目されてきている。乳酸菌が生産する抗菌性物質として、乳酸や酢酸などの有機酸、過酸化水素、ジアセチル、ロイテリン、バクテリオシンなどがある。その中でバクテリオシンは、一般に近縁のグラム陽性菌に対して抗菌作用を示すタンパク質性もしくはペプチド性の物質である。乳酸菌のバクテリオシンは、人間の消化酵素で分解消化されること、乳酸菌が古くから広く食品に利用されていて安全性が高いことなどから、精力的にその探索が実施されてきている。」（特許文献１、発明の詳細な説明中の段落番号０００２〜０００３）。
また、乳酸菌が生産するバクテリオシンとしては、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）４８１株が産生するヘルベティシンＪ（Helveticin J）が知られている（非特許文献１参照）。このヘルベティシンＪはグラム陽性菌に対して抗菌作用を示すタンパク質性もしくはペプチド性の物質である。
【０００３】
また、本発明者は、以前から乳酸菌の研究に携わり、既に乳酸菌に関連する特許出願も行ってきた（例えば、特許文献２、特許文献３等）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４３０２４７６号公報
【特許文献２】特開２００７−２３６２２７号公報
【特許文献３】特開２００６−７６９６１号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Melissa C.Joerger and Todd R.Klaenhammer. 1986. J. Bacteriol. 167:439-446
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述の特許文献１及び非特許文献１の如く、乳酸菌が産生する物質は、その多くがグラム陽性菌に対して有効であるものの、大腸菌等のようなグラム陰性菌に対して有効なものはほとんど知られていなかった。
そこで、本発明では、グラム陰性菌に対しても有効な抗菌性物質を産生する新規な乳酸菌を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の本発明者らは、グラム陰性菌に対しても有効な抗菌性物質を産生する新規な乳酸菌の探索を行なった結果、自然界や発酵食品に広く分布しているラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）に属する新規な乳酸菌ＭＳＣ００３株が、大腸菌をはじめ多くのグラム陰性菌に対して抗菌性を示す物質を産生することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
即ち、本発明の乳酸菌株（以下、「本菌株」という。）は、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）に属する新規な乳酸菌ＭＳＣ００３株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１０２６）である。
本菌株（乳酸菌ＭＳＣ００３株、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１０２６）は、後述の如く、大腸菌をはじめ多くのグラム陰性菌に対する抗菌性物質を産生する。
【０００９】
本発明は、本菌株の培養物（以下、「本培養物」という。）も提供する。
本発明は、本培養物（本菌株の培養物）を炭素数１〜３のアルコールを用いて抽出する工程を経て得られる抽出組成物（以下、「本抽出組成物」という。）も提供する。
本発明は、本菌株を用いて発酵する工程を用いて製造された食品組成物（以下、「本食品組成物」という。）も提供する。
本発明は、本培養物及び／又は本抽出組成物を有効成分として含有することを特徴とする抗菌剤（以下、「本抗菌剤」という。）も提供する。本抗菌剤は、食品、動物飼料、化粧品、医薬品及び洗浄剤よりなる群より選ばれる少なくとも１つの製品の保存剤として好適に使用できる。また、本抗菌剤は、ｐＨ５以下に調整されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】抗菌活性測定用の試験液の調製方法を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の新規な乳酸菌株（本菌株）は、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）に属する新規な乳酸菌ＭＳＣ００３株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１０２６）である。
本菌株であるラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）に属する乳酸菌ＭＳＣ００３株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１０２６）は、自然界や発酵食品に広く分布しているラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）に属する乳酸菌から分離されたものである。
本菌株は、以下に示す菌学的性質を有する。これらの菌学的性質は、乳酸菌の科学と技術（学会出版センター、１９９６年）及びBergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Second Edition（２００９年）に記載の方法に準拠し検査した。
【表１】
0005622110.tif 000002
【００１２】
以上の特徴をBergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Second Edition（２００９年）を参照して近縁菌種を検索した結果、本菌株はラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）の特徴を示した。しかし、アピ５０ＣＨ（シスメックス・ビオメリュー社製）を用いた糖類資化性試験においてＤ−セロビオース及びＤ−スクロースの結果が基準株とは異なる非典型的性質を示した。
また、表１には示していないが、通常のラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）とは異なり、１０％還元脱脂乳培地では乳酸の生成が遅く、酵母エキスを０．５％添加することで改善されるという特徴的な性質を示した。
遺伝学的性質は以下の如くである。本菌株について１６ＳｒＤＮＡの塩基配列１５００ベースペア（ｂｐ）を解読し、アポロンＤＢ-ＢＡ５．０データベースで近縁菌種の相同性検索を行った結果、登録されているラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）ＪＣＭ１１２０株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列と９９．３％の相同率を示した。また、国際塩基配列データベースではラクトバチルス・ヘルベティカスＬＨ株、ラクトバチルス・ヘルベティカスＬＨ５株およびラクトバチルス・ヘルベティカスＩＭＡＵ５０００１株と１００．０％の相同率を示した。
従って、本菌株をラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）と同定した。
【００１３】
一方、上述した非特許文献１に記載されたラクトバチルス・ヘルベティカス４８１株が産生するバクテリオシンのヘルベティシンＪ（Helveticin J）の性質と、本菌株乳酸菌ＭＳＣ００３株が産生する抗菌物質の性質と、は大きく異なる。即ち、（ａ）ヘルベティシンＪは近縁種であるラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・ブルガリカス（Lactobacillus bulgaricus）及びラクトバチルス・ラクティス（Lactobacillus lactis）の限られた菌株に対してのみ抗菌活性を示し、抗菌スペクトルが狭いこと（本菌株乳酸菌ＭＳＣ００３株が産生する抗菌物質は抗菌スペクトルが広い）。（ｂ）トリプシンやペプシンなどのプロテアーゼ（タンパク分解酵素）により失活すること（本菌株乳酸菌ＭＳＣ００３株が産生する抗菌物質はプロテアーゼにより失活しない）。（ｃ）１００℃、３０分間の加熱処理により失活すること（本菌株乳酸菌ＭＳＣ００３株が産生する抗菌物質は該加熱処理により失活しない）。これら（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）等のヘルベティシンＪの性質が、本菌株乳酸菌ＭＳＣ００３株が産生する抗菌物質とは大きく異なる。
したがって、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）のこれまで知られている菌株とは明確に異なる菌株であると認められ、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）ＭＳＣ００３株と命名した。
このラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）ＭＳＣ００３株は、千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８に住所を有する独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に平成２３年１月６日（寄託日）付で上記名称（識別の表示：Lactobacillus helveticus  ＭＳＣ００３）で寄託されており、受託番号はＮＩＴＥ  Ｐ−１０２６である。
【００１４】
本菌株乳酸菌ＭＳＣ００３株は、上述したように、天然に存する乳酸菌から分離されたものであり、本菌株乳酸菌ＭＳＣ００３株それ自身及びその培養物についてもヒトを含む動物に対する毒性はなく、ヒトを含む動物に対して経口摂取や皮膚への塗布を安全に行うことができる。
【００１５】
本菌株乳酸菌ＭＳＣ００３株は、大腸菌をはじめ多くのグラム陰性菌に対する抗菌性物質を産生する。該抗菌性物質は、後に詳述する表２（ＭＳＣ００３の抗菌スペクトル）に示す通り、サルモネラ血清型エンテリティディス、サルモネラ血清型ティフィムリウム、大腸菌、大腸菌Ｏ−１５７、コレラ菌及びシュードモナス・フラギ（なお、表２中では、記載を容易にするため、サルモネラ血清型エンテリティディス及びサルモネラ血清型ティフィムリウムの「血清型」を省略している。）等のようなグラム陰性菌に対して抗菌性を示すと共に、ボツリヌス菌Ａ型、ボツリヌス菌Ｂ型、ボツリヌス菌Ｆ型、スポロゲネス菌、黄色ブドウ球菌、メチシリン耐性ブドウ球菌、セレウス菌及びリステリア・モノサイトゲネス菌等のようなグラム陽性菌に対しても抗菌性を示す。
加えて、本菌株乳酸菌ＭＳＣ００３株は、ｐＨ４．５、１２１℃で１５分間の処理条件下で熱安定性を示す。
そして、本菌株乳酸菌ＭＳＣ００３株が産生する抗菌性物質は、上述したグラム陰性菌に対して有効であると共に次のような特徴を有する。
（イ）プロテアーゼで消化されない。
（ロ）ｐＨ５以下（例えば、ｐＨ２〜５）で安定性を示す。
【００１６】
本菌株乳酸菌ＭＳＣ００３株の分離菌株の保存は、ＭＲＳブイヨンで培養した培養菌液を１０％還元脱脂乳培地に０．５％量程度添加し、そのまま−２０℃から−８０℃で冷凍することで保存できる。
そして、使用にあたっては、菌株を含む保存物をＭＲＳブイヨンに１％量程度添加し、３７℃で２４時間保つことで培養することができる。
本菌株乳酸菌ＭＳＣ００３株の培養に使用することのできる培地としては、本菌株が増殖し得るものであれば任意のものでよい。例えば、使用可能な培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類、ビタミン、アミノ酸等を含む通常用いられる培地（液体培地、固体培地など）であるが、乳酸菌の培養に適する培地を用いてもよい。乳酸菌の培養に適する培地としては、例えば、ＭＲＳブイヨン、ＭＲＳ寒天培地、ＢＣＰ加プレートカウント培地、酵母エキスを０．５％量加えた１０％還元脱脂乳培地等が挙げられる。
本菌株乳酸菌ＭＳＣ００３株の培養は、とくに嫌気的条件下で行う必要はなく、通常の好気的条件下で培養することができる。培養条件は特に限定はないが、温度は３０〜４０℃、ｐＨは６．０〜７．０、培養時間は２４〜７２時間の範囲とされてもよい。
【００１７】
本培養物は、本菌株ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）に属する乳酸菌ＭＳＣ００３株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１０２６）の培養物である。
本菌株乳酸菌ＭＳＣ００３株の培養は、上述したような条件下にて行うことができ、その培養物（本培養物）は本菌株乳酸菌ＭＳＣ００３株が産生する前記の抗菌性物質を含有する。従って、本培養物自身も、それが含有する該抗菌性物質に基づくグラム陽性菌及びグラム陰性菌に対する抗菌性を有する。
また、本培養物としては、本菌株を液状または固形培地で培養した培養物全体を用いることもできるが、必要に応じて培養物の一部を分取した分取物としてもよい。分取物としては、培養液（菌体含有）、コロニー、培養上清（菌体不含）等を例示できる。そして、本培養物として培養上清を用いる場合には、培養液から菌体を遠心分離等によって分離し、培養上清液のｐＨを炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等によりｐＨを５以下に調整（例えば、ｐＨ２〜５程度）して、本抗菌剤として利用することもできる。更に、培養上清液の粗精製物を本抗菌剤として用いることもでき、この粗精製物は、例えば、培養上清液をイオン交換、限外濾過、逆浸透、ゲル濾過等の方法で抗菌活性を有する画分を取得することで調製することもできる。
【００１８】
本抽出組成物は、本培養物（本菌株の培養物）を炭素数１〜３のアルコールを用いて抽出する工程を経て得られる抽出組成物である。
本培養物に含まれる前記抗菌性物質は、本培養物と炭素数１〜３のアルコールとを接触させると、アルコール層に抽出されるので、本培養物からアルコール層に抽出される抽出画分を含む本抽出組成物は前記抗菌性物質を含有する。
従って、本抽出組成物も、それが含有する前記抗菌性物質に基づくグラム陽性菌及びグラム陰性菌に対する抗菌性を有する。
ここに用いる炭素数１〜３のアルコールとしては、メチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコールを例示できるが、本抽出組成物に残留する場合の低毒性を考慮すれば、エチルアルコールが好ましい。
また、炭素数１〜３のアルコールを接触させ抽出する本培養物としては、本乳酸菌株を培養した培養物そのものでもよいが、本培養物に含まれる前記抗菌性物質は本培養物を遠心分離や静置分離した際に得られる上清に含まれるので、本培養物を遠心分離や静置分離して生じる上清を該アルコール層と接触させるようにしてもよい。
【００１９】
本抽出組成物は、本培養物を炭素数１〜３のアルコールを用いて抽出する工程を経て得られるものであり、本培養物から抽出された前記抗菌性物質を含有するアルコール層は、本抽出組成物中にアルコールが含まれてもよい場合には、アルコールを留去せず、そのままアルコールを含んだ状態の本抽出組成物としてもよい。そして、本培養物から抽出された前記抗菌性物質を含有するアルコール層は、それが含有するアルコールの一部又は全部を留去したり、及び／又は、それが含有する水分の一部又は全部を留去して本抽出組成物としてもよい。さらに、本培養物から抽出された前記抗菌性物質を含有するアルコール層は、乾燥固化して本抽出組成物としてもよい。
また、本抽出組成物は、水に安定して溶解するので、水溶液としておくこともできる。本抽出組成物に含まれる前記抗菌性物質はｐＨ５以下で安定した抗菌性を発揮するのでｐＨ５以下（例えば、ｐＨ＝２〜５）の水溶液としてもよい。
【００２０】
本抽出組成物は、上述の通り、本培養物を炭素数１〜３のアルコールを用いて抽出する工程を経て得られるものであればよく何ら限定されるものではないが、例えば、本培養物にエチルアルコールを接触させる接触ステップと、接触ステップにより培養物と接触したエチルアルコール層を回収する回収ステップと、回収ステップにより回収されたエチルアルコール層のエチルアルコールを留去し抽出組成物とする留去ステップと、を含んでなる製造方法により製造されうる。
【００２１】
接触ステップでは、本培養物にエチルアルコールを接触させる。
接触ステップにおける本培養物（体積）に対するエチルアルコール（体積）の比率（エチルアルコール（体積）／本培養物（体積））は、あまり小さいと前記抗菌性物質がエチルアルコール層に十分抽出されず、逆にあまり多いとエチルアルコール層が多すぎて回収ステップや留去ステップを実施することが大変になるため、これらを両立する範囲とされてもよく、特に限定されるものではないが、通常、１〜１０とされてもよい。また、接触ステップにおける本培養物及びエチルアルコールの温度は、あまり低いと凍結により前記抗菌性物質がエチルアルコール層に十分抽出されない恐れがあり、逆にあまり高いと前記抗菌性物質が変性を起こす恐れが生じるので、これらを両立する範囲とされてもよく、特に限定されるものではないが、通常、１℃〜１５℃とされてもよい。そして、接触ステップにおける本培養物及びエチルアルコールの接触時間は、あまり短いと前記抗菌性物質がエチルアルコール層に十分抽出されず、逆にあまり長いと時間がかかりすぎるので、これらを両立する範囲とされてもよく、特に限定されるものではないが、通常、４時間〜２４時間とされてもよい。
また、接触ステップにおいてエチルアルコール層と接触させる本培養物としては、本乳酸菌株を培養した培養物そのものでもよいが、本培養物に含まれる前記抗菌性物質は本培養物を遠心分離や静置分離した際に得られる上清に含まれるので、本培養物を遠心分離や静置分離して生じる上清を接触ステップにおいてエチルアルコール層と接触させるようにしてもよい。
【００２２】
回収ステップでは、接触ステップにより培養物と接触したエチルアルコール層を回収する。
接触ステップにおいて培養物と接触したエチルアルコール層は、培養物層とは液−液分離するので比重差を利用して遠心分離や静置分離の後に、分液することでエチルアルコール層を回収できる（上層に透明なエチルアルコール層、下層に白色の培養物層が形成される）。かかるエチルアルコール層には、本菌株が産生する前記の抗菌性物質が含まれている。
【００２３】
留去ステップでは、回収ステップにより回収されたエチルアルコール層のエチルアルコールを留去し本抽出組成物とする。
回収ステップで回収されたエチルアルコール層からエチルアルコールを留去するには、エチルアルコールを蒸発させ除去すればよく、常圧下又は減圧下でエチルアルコールを蒸発除去してもよい（前記抗菌性物質を含む本抽出組成物が高温により劣化することを防止又は減少させることからは減圧下で行うようにしてもよい。）。
また、本抽出組成物中にエチルアルコールが含まれてもよい場合には、エチルアルコールを完全に留去せず、エチルアルコールを含んだ状態の本抽出組成物としてもよい。
本抽出組成物は、水に安定して溶解するので、水溶液としておくこともできる。本抽出組成物に含まれる前記抗菌性物質はｐＨ５以下で安定した抗菌性を発揮するのでｐＨ５以下（例えば、ｐＨ＝２〜５）の水溶液としてもよい。
【００２４】
本食品組成物は、本菌株を用いて発酵する工程を用いて製造された食品組成物である。
本菌株乳酸菌ＭＳＣ００３株は、本菌株が属する乳酸菌株及び前記抗菌性物質の特徴に基づき、特に食品分野へ好適に用いることが可能である。即ち、本菌株は、本菌株を用いて発酵原料を発酵する工程を用いて発酵食品を製造するために使用することができる。なお、本菌株は、他の食品用微生物と組み合わせて発酵させることができる。
発酵原料としては、例えば、野菜、果物、乳等の発酵原料があげられ、これらを本菌株を用いて発酵させることで、本食品組成物である漬物、味噌、醤油、乳製品、ヨーグルト等を得ることができる。例えば、野菜、果物、乳等の発酵原料に本菌株を添加する場合には、原料１グラムあたり１０４個〜１０７個（１万個〜１千万個）の割合で本菌株を添加し、３０〜４０℃で発酵させるようにしてもよい。
【００２５】
本抗菌剤は、本培養物及び／又は本抽出組成物を有効成分として含有することを特徴とする抗菌剤である。
本培養物及び本抽出組成物に含まれる前記抗菌性物質に基づく抗菌性が本抗菌剤において発揮され、本抗菌剤が含む前記抗菌性物質の動物（ヒトを含む）に対する安全性から本抗菌剤は食品、動物飼料、化粧品、医薬品及び洗浄剤よりなる群より選ばれる少なくとも１つの製品の保存剤として好適に用いられる。なお、ここにいう化粧品、医薬品及び洗浄剤としては口腔等のような体腔に適用されるものを含み、そして洗浄剤には、身体用洗浄剤、手洗い用洗浄剤、衣類用洗浄剤、住居用洗浄剤及び医療機器用洗浄剤等が含まれる。
本抗菌剤の該製品への配合量は該製品の種類などにより適宜設定すればよいが、例えば、本培養物及び／又は本抽出組成物の量に換算して、１〜１００重量％の割合とされてもよい。
そして、本抗菌剤に含まれる前記抗菌性物質はｐＨ５以下で安定した抗菌性を発揮するので本抗菌剤はｐＨ５以下（例えば、ｐＨ＝２〜５）に調整されてもよい。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。なお、実施例において使用する「ＭＳＣ００３株」は、上述の如く、自然界や発酵食品に広く分布しているラクトバチルス・ヘルベティカスから分離されたものであり、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）に属する乳酸菌ＭＳＣ００３株として２０１１年１月６日（寄託日）付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１０２６として寄託されている。
【００２７】
実験例１：ＭＳＣ００３株の抗菌スペクトル
（試験対象菌の培養）
試験の対象菌を準備し、各々の対象菌を液体培地で培養する。対象菌としては、表２に示す通り、グラム陽性菌として、ボツリヌス菌Ａ型、ボツリヌス菌Ｂ型、ボツリヌス菌Ｆ型、スポロゲネス菌、黄色ブドウ球菌、メチシリン耐性ブドウ球菌、セレウス菌及びリステリア・モノサイトゲネス菌を用い、グラム陰性菌として、サルモネラ血清型エンテリティディス、サルモネラ血清型ティフィムリウム、大腸菌、大腸菌Ｏ−１５７、コレラ菌及びシュードモナス・フラギを用いた（なお、表２中では、記載を容易にするため、サルモネラ血清型エンテリティディス及びサルモネラ血清型ティフィムリウムの「血清型」を省略している。）。
これらの対象菌のうちボツリヌス菌Ａ型、ボツリヌス菌Ｂ型及びボツリヌス菌Ｆ型の培養には、ＴＰＧＹ（Trypticase-Peptone-Glucose-Yeast extract）ブイヨンを用い、その他のスポロゲネス菌、黄色ブドウ球菌、メチシリン耐性ブドウ球菌、セレウス菌及びリステリア・モノサイトゲネス菌、サルモネラ血清型エンテリティディス、サルモネラ血清型ティフィムリウム、大腸菌、大腸菌Ｏ−１５７、コレラ菌及びシュードモナス・フラギの培養には、普通ブイヨンを用い、いずれも３５℃で２４時間培養した。
【００２８】
（試験液の調製）
阻止円を評価するための試験液の調製方法を図１を参照して説明する。
予め、ＭＳＣ００３株をＭＲＳブイヨン（乳酸菌用の液体培地）を用いて３７℃で２４時間の３回培養し（前培養）、前培養液を得た。
そして、市販の還元脱脂粉乳と酵母エキスを蒸留水に溶解し、０．５％酵母エキスを含む１０％還元脱脂乳培地を調製した。
調製した０．５％酵母エキスを含む１０％還元脱脂乳培地１００ｍｌにＭＳＣ００３株の前培養液１ｍｌを接種した。ＭＳＣ００３株の前培養液を接種した０．５％酵母エキスを含む１０％還元脱脂乳培地を３７℃で７２時間培養した。
培養した培養液を２０分間遠心分離（３０００Ｇ）した。
遠心分離した上清を分取した。
分取した上清５０ｍｌ（約１０℃）に５００ｍｌのエチルアルコール（約１０℃）を徐々に加えながら混合し、その後、その混合物を１０℃のまま１晩静置した。
１晩静置した該混合物を２０分間遠心分離（３０００Ｇ）した。
遠心分離した該混合物からエチルアルコール層を分液し回収した。
分液したエチルアルコール層をロータリエバポレーターにかけ、減圧下（約４５℃）にてエチルアルコールを留去した。
エチルアルコールを留去し残留した画分約１ｍｌに蒸留水を加え溶解させ１０ｍｌとした。これに１０Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液を添加してｐＨ４．５に調整し、試験液とした。
【００２９】
（抗菌活性測定用寒天培地の調製）
対象菌それぞれの培養液を、約５０℃に保たれた活性測定用寒天培地（予め加熱殺菌し溶解させ調製した）に１％接種し混合して抗菌活性測定用寒天培地を調製した。なお、活性測定用寒天培地として、対象菌のうちボツリヌス菌Ａ型、ボツリヌス菌Ｂ型及びボツリヌス菌Ｆ型には、ＴＰＧＹ（Trypticase-Peptone-Glucose-Yeast extract）培地を用い、その他のスポロゲネス菌、黄色ブドウ球菌、メチシリン耐性ブドウ球菌、セレウス菌及びリステリア・モノサイトゲネス菌、サルモネラ血清型エンテリティディス、サルモネラ血清型ティフィムリウム、大腸菌、大腸菌Ｏ−１５７、コレラ菌及びシュードモナス・フラギには、普通寒天（nutrient agar）を用いた。
対象菌の培養液を接種した抗菌活性測定用寒天培地それぞれ２０ｍｌを、直径９ｃｍのシャーレに注入し、抗菌活性測定用寒天培地を固化させた。
各シャーレ内で固化した抗菌活性測定用寒天培地に直径約６ｍｍの穴（ほぼ直円柱状）をあけた（ピペット等を用いて該穴を形成した）。
【００３０】
（抗菌活性の評価）
抗菌活性測定用寒天培地の穴（ウエル）に５０μｌの試験液を注入した。
その後、穴（ウエル）に５０μｌの試験液を注入したシャーレそれぞれを４℃で２時間静置した後、３５℃で２４時間又は４８時間培養した。なお、対象菌のうちボツリヌス菌Ａ型、ボツリヌス菌Ｂ型及びボツリヌス菌Ｆ型は、アネロパック（登録商標）を用い嫌気ジャーにて培養し、他の対象菌は、恒温器内にて通常通り培養した。
培養後、穴（ウエル）の周囲に形成された透明な阻止円の直径（ｍｍ）を測定した。阻止円の直径は、抗菌活性測定用寒天培地の穴（ウエル）が直径６ｍｍであるので、６ｍｍを超えれば抗菌性を示している。
【００３１】
測定した阻止円の直径（ｍｍ）を表２に表す。
表２に示すように、ボツリヌス菌Ａ型、ボツリヌス菌Ｂ型、ボツリヌス菌Ｆ型、スポロゲネス菌、黄色ブドウ球菌、メチシリン耐性ブドウ球菌、セレウス菌及びリステリア・モノサイトゲネス菌のいずれのグラム陽性菌に対しても、そしてサルモネラ血清型エンテリティディス、サルモネラ血清型ティフィムリウム、大腸菌、大腸菌Ｏ−１５７、コレラ菌及びシュードモナス・フラギのいずれのグラム陰性菌に対しても、ＭＳＣ００３株の培養物からエチルアルコールにて抽出した成分は十分な抗菌性を示した。
【表２】
0005622110.tif 000003
【００３２】
（抗菌性のｐＨによる変化測定）
上述の試験液の調整において、エチルアルコールを留去し残留した画分約１ｍｌに蒸留水を加え溶解させ１０ｍｌとした。これに１０Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液の添加量を変えてｐＨを４．０〜７．０の間で段階的に変化（ｐＨを０．５刻みで変化）させたものを試験液として、対象菌を大腸菌（グラム陰性菌）及びリステリア・モノサイトゲネス菌（グラム陽性菌）として上と同様に試験した。結果を表３に示す。
表３から明らかなように、ＭＳＣ００３株の培養物からエチルアルコールにて抽出した成分は、ｐＨ４〜５の範囲にて大腸菌（グラム陰性菌）及びリステリア・モノサイトゲネス菌（グラム陽性菌）のいずれにも抗菌性を示すが、ｐＨ５．５以上においては、大腸菌（グラム陰性菌）及びリステリア・モノサイトゲネス菌（グラム陽性菌）のいずれにも抗菌性を示さなかった。
なお、ｐＨ４以下の試験液においては乳酸に由来する抗菌作用により阻止円が形成され、本試験法ではＭＳＣ００３株の産生する抗菌性物質による抗菌作用と区別できないため、表３にはｐＨ４以下の試験結果を示していない。
【表３】
0005622110.tif 000004
【００３３】
（抗菌性の酵素処理による影響測定）
上述の試験液の調整において、エチルアルコールを留去し残留した画分約１ｍｌに蒸留水を加え溶解させ１０ｍｌとした。これに２Ｎ−塩酸水溶液又は１０Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液を添加して、表４に示す各種プロテアーゼの至適ｐＨに調整した。各種プロテアーゼを５ｍｇ／ｍｌの濃度で加え、表４に示す温度で１時間反応させた後、８５℃で３０分間加熱して酵素を失活させた。２Ｎ−塩酸水溶液又は１０Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液を用いて、再度、ｐＨ４．５に調整したものを試験液とした。大腸菌を対象として上と同様に試験した。
なお、プロテアーゼとしては、表４に示すとおり、ペプシン、プロナーゼＥ、トリプシン、プロティナーゼＫ、プロテアーゼ、α−キモトリプシンを用いた。また、プロテアーゼの代わりに蒸留水を添加したものをコントロール（対照）とし、抗菌性を示す物質が過酸化水素に基づくか否かを確認するためにカタラーゼを５ｍｇ／ｍｌ添加して実験を行った。
表４中の抗菌活性（％）は、（コントロールの阻止円の直径（ｍｍ）−６ｍｍ）に対する（各実験例（ペプシン、プロナーゼＥ、トリプシン、プロティナーゼＫ、プロテアーゼ、α−キモトリプシン、カタラーゼ）の阻止円の直径（ｍｍ）−６ｍｍ）の割合（％）として示した。（コントロールの阻止円の直径（ｍｍ）−６ｍｍ）及び（各実験例（ペプシン、プロナーゼＥ、トリプシン、プロティナーゼＫ、プロテアーゼ、α−キモトリプシン、カタラーゼ）の阻止円の直径（ｍｍ）−６ｍｍ）における２つの「６ｍｍ」は抗菌活性測定用寒天培地の穴（ウエル）の直径６ｍｍを意味しているので、阻止円の直径（ｍｍ）から６ｍｍを減じた数値は抗菌性の強さを示す。即ち、上記のような抗菌活性（％）によって、各実験例（ペプシン、プロナーゼＥ、トリプシン、プロティナーゼＫ、プロテアーゼ、α−キモトリプシン、カタラーゼ）における処理によって、これらの処理がされていないコントロール（対照）に対して抗菌作用がどの程度影響を受けているかを見ることができる。
表４に示す実験結果から明らかなように、ＭＳＣ００３株の培養物に含まれる抗菌性物質は、ペプシン、プロナーゼＥ、トリプシン、プロティナーゼＫ、プロテアーゼ、α−キモトリプシンのプロテアーゼにより消化されず（抗菌活性（％）は全て１００％であり、酵素の処理により抗菌作用は影響を受けていない。）、過酸化水素に基づくものでもないことが明らかになった（カタラーゼを添加しても抗菌活性（％）は１００％であり影響を受けていない。）。
【表４】
0005622110.tif 000005
【００３４】
（本抗菌剤の保存剤としての使用例）
以下、本抗菌剤を食品、動物飼料、化粧品、医薬品及び洗浄剤の製品の保存剤として用いる場合の処方例を示す。
なお、これら処方例における本抗菌剤は、上述したｐＨ４．５に調整された試験液と同様に調製したものを用いた。
【００３５】
（処方例１）本抗菌剤を白菜の漬物（食品）の保存剤として用いる処方例
白菜                    １０ｋｇ
食塩                  ０．３ｋｇ
赤唐辛子                １０本
昆布                    ５０ｃｍ
柚子                      ２個
本抗菌剤              ０．５ｋｇ
【００３６】
（処方例２）本抗菌剤を豚用飼料（動物飼料）の保存剤として用いる処方例
とうもろこし            ６０ｋｇ
ライ麦                  １０ｋｇ
大豆粕                  ２２ｋｇ
米ぬか粕              １．５ｋｇ
炭酸カルシウム        ０．５ｋｇ
リン酸カルシウム      ０．５ｋｇ
食塩                  ０．５ｋｇ
本抗菌剤                  ５ｋｇ
【００３７】
（処方例３）本抗菌剤を皮膚用軟膏（医薬品）の保存剤として用いる処方例
ワセリン                            ２０ｋｇ
ステアリルアルコール                １０ｋｇ
モノステアリン酸グリセリル            １ｋｇ
硬化ヒマシ油                          ２ｋｇ
グリセリン                            ５ｋｇ
１，３−ブチレングリコール            ５ｋｇ
カルボキシビニルポリマー              １ｋｇ
香料                                  １ｋｇ
本抗菌剤                            １０ｋｇ
精製水                              ４５ｋｇ
【００３８】
（処方例４）本抗菌剤を洗口剤（洗浄剤）の保存剤として用いる処方例
エチルアルコール          １０ｋｇ
グリセリン                １０ｋｇ
サッカリンナトリウム      ２０ｇ
クエン酸                ０．２ｋｇ
ハッカ                  ０．５ｋｇ
香料                    ０．３ｋｇ
本抗菌剤                  １０ｋｇ
精製水                    ４９ｋｇ
【００３９】
（処方例５）本抗菌剤を除菌剤（洗浄剤）の保存剤として用いる処方例
エチルアルコール          ２０ｋｇ
本抗菌剤                  ２０ｋｇ
クエン酸                ０．５ｋｇ
香料                    ０．５ｋｇ
精製水                    ５９ｋｇ
【受託番号】
【００４０】
ＮＩＴＥ  Ｐ−１０２６
【図１】
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