(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）乃至（４）から選択される少なくとも一種以上の結合物質と試験物質を混合し、
前記結合物質とマクロファージ遊走阻止因子の結合処理を行い、
前記結合物質と前記マクロファージ遊走阻止因子の結合状態を確認することで、
チオレドキシンファミリーのポリペプチドとマクロファージ遊走阻止因子の結合を増強する試験物質を選び出すことを特徴とするスクリーニング方法。
（１）活性中心に−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−、または−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−を有するチオレドキシンファミリーに属するポリペプチド
（２）前記（１）のチオレドキシンファミリーに属するポリペプチドのアミノ酸配列のうち、１若しくは数個のアミノ酸が欠失，置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つ前記（１）のチオレドキシンファミリーのポリペプチドと同等の活性を有するタンパク質
（３）（１）をコードする遺伝子
（４）（２）をコードする遺伝子
【請求項２】
前記結合物質と前記マクロファージ遊走因子の結合状態の確認を分子間相互作用解析で行うことを特徴とする請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
ニトロソグルタチオン、プロスタグランジンＩ２から選ばれる一種以上を含有する、チオレドキシンファミリーのポリペプチドとマクロファージ遊走阻止因子の結合を増強する組成物。
【請求項４】
下記（１）乃至（４）から選択される少なくとも一種以上を含み、マクロファージ遊走阻止因子と直接結合する結合物質。
（１）活性中心に−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−、または−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−を有するチオレドキシンファミリーに属するポリペプチド
（２）前記（１）のチオレドキシンファミリーに属するポリペプチドのアミノ酸配列のうち、１若しくは数個のアミノ酸が欠失，置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つ前記（１）のチオレドキシンファミリーのポリペプチドと同等の活性を有するタンパク質
（３）（１）をコードする遺伝子
（４）（２）をコードする遺伝子
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チオレドキシンファミリーのポリペプチド（以下「ＴＲＸｓ」と略記する）とマクロファージ遊走阻止因子（Macrophage migration inhibitory factor：以下「ＭＩＦ」と略記する）の結合を増強する試験物質を選び出すためのスクリーニング方法、該スクリーニング方法で選ばれた物質を含有する組成物、結合物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）は、炎症部位中にマクロファージがランダムに遊走するのを阻止する炎症性サイトカインで、全身／局所の炎症と免疫応答に重要な役割を果たす（非特許文献１、２）。
ＭＩＦは、（リンパ球、マクロファージ等の）免疫担当細胞や、脳下垂体などから生体侵襲（例えば、酸化ストレスを引き起こすエンドトキシン、活性酸素、紫外線などの刺激）に即応して産生され、炎症性サイトカインカスケードの上流に位置し、（ＭＩＦが他の炎症性サイトカインの発現を誘導することによって）炎症反応を制御することが報告されている（非特許文献３、４）。
他にも、（ＭＩＦが）グルココルチコイドの抗炎症作用を抑制し、炎症反応促進させること、Ｔリンパ球の活性化促進因子であること、さらにはｐ５３の機能を抑制することや、脂肪細胞・癌細胞等の増殖・分化に関与すること等、様々な生体反応に重要な役割を果たしていることなどが報告されている（非特許文献２、５、６）。【０００３】
しかしながら、ＭＩＦは炎症作用を有する為、その過剰な産生が過度の炎症反応を引き起こし、（炎症を伴う）各種障害の原因となる。
ＭＩＦによって引き起こされる障害（疾病）は多岐に渡り、代表的なものとして、慢性リウマチ様関節炎等の遅延型アレルギー（IV型：細胞免疫性反応）が挙げられるが、近年、その関連疾患は拡大を見せ、動脈硬化、子宮内膜症などへの寄与も明らかにされている。他にも、急性呼吸急迫症候群（ＡＲＤＳ）の肺胞洗浄液、腎臓移植を受けた患者の拒絶反応時における尿、及び急性心筋梗塞、糖尿病、全身性エリテマトーデス、クローン病、アトピー性皮膚炎患者で、血清中のＭＩＦ濃度が健常人と比べて顕著に上昇していることを示した報告などが挙げられる。
加えて、腎炎、肝炎、肺炎、関節炎、エンドトキシンショック等の動物病態モデルでは、抗ＭＩＦ中和抗体の投与群で明らかな改善効果が認められた（非特許文献７）。
このことはＭＩＦの炎症作用がこれら病態の悪化に関与することを示す。【０００４】
ＭＩＦと各種疾患との関係について、詳しく報告された公知文献として、非特許文献８〜１６を例示することができる。
１）非特許文献８
肺障害モデルラットにリポポリサッカライド（ＬＰＳ：lipopolysaccharide）刺激を与えることによって、ＭＩＦのｍＲＮＡが上昇し、好中球や単球の肺胞への浸潤や気管支肺胞洗浄液中への誘導がみられるが、ＬＰＳ投与前に抗ＭＩＦ抗体を投与するとこれらの浸潤や誘導は減少し、肺出血も抑制されたことが確認されている。
このことはＭＩＦ活性の阻害が肺障害の予防乃至治療に有効であることを示す。
又、血小板減少が抑制されたことから、ＭＩＦ活性の阻害が感染症による敗血症治療にも有効であることが示されている。
２）非特許文献９
ＢＣＧ（bacilli Calmette Guerin）−ＬＰＳ誘導急性肝炎モデルマウスにおいて、抗ＭＩＦ抗体を投与することにより、生存率の改善やＴＮＦ−αの増加抑制が確認されている。このことはＭＩＦ活性の阻害が急性肝炎の予防乃至治療に有効であることを示す。
３）非特許文献１０及び１１
typeII collagen関節炎や、adjuvant関節炎モデル動物実験において、抗ＭＩＦ抗体による炎症反応の軽減が見られたことから、ＭＩＦ活性の阻害が関節リウマチの予防乃至治療に有効であることが報告されている。
４）非特許文献１２
急性呼吸急迫症候群（ＡＲＤＳ）患者に対し、抗ＭＩＦ抗体を投与することにより、炎症性サイトカインの上昇が抑制されていることが確認されている。
即ち、ＭＩＦ活性の阻害が急性呼吸急迫症候群（ＡＲＤＳ）の予防乃至治療に有効であることが示されている。
５）非特許文献１３
マウス気管支喘息モデルにおいて、抗ＭＩＦ抗体が病態改善に有効であったことから、ＭＩＦ活性の阻害が気管支喘息の予防乃至治療に有効であることが示されている。
６）非特許文献１４及び１５
急速進行性糸球体腎炎モデルにおいて、抗ＭＩＦ抗体が病態改善に有効であったことから、ＭＩＦ活性の阻害が急速進行性糸球体腎炎の予防乃至治療に有効であることが示されている。
７）非特許文献１６
ＩｇＡ腎症モデルにおいて、抗ＭＩＦ抗体が病態改善に有効であったことから、ＭＩＦ活性の阻害がＩｇＡ腎症の予防乃至治療に有効であることが示されている。【０００５】
このように、ＭＩＦは多くの疾患と深く関わっており、これらの疾患の症状を緩和するために、ＭＩＦの活性を阻害する物質を探索することが望まれている。【０００６】
一方、チオレドキシン（Thioredoxin）は、その活性部位配列：−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−：の２つのシステイン残基間でのジスルフィド／ジチオール交換反応による酸化還元（レドックス）活性を有する１２ｋＤａの多機能ポリペプチドである（非特許文献１７）。チオレドキシンは、リボヌクレオチドリダクターゼに対する水素イオン供与体、デオキシリボヌクレオチドの合成に重要な酵素として大腸菌から単離されて以来、多くの原核生物、真核生物から単離同定されてきた。
成人Ｔ細胞白血病誘導因子（ＡＤＦ）は、本発明者らがＨＴＬＶ−１に感染したＴリンパ球によって産生されるＩＬ−２受容体誘導因子として最初に同定したもので、ヒトチオレドキシンである。
細胞内チオレドキシンはラジカル消去や、activator protein‐1（ＡＰ−１）、nuclear factor‐kappa Ｂ（ＮＦ−κＢ）などのレドックスに関する転写因子の制御に重要な役割を果たしている（非特許文献１８）。
ヒトチオレドキシンは、p38 mitogen activating protein kinase（ＭＡＰＫ）やapoptosis signal regulating kinase−1（ＡＳＫ−１）のシグナル伝達を制御する。
チオレドキシンが細胞外に放出され、サイトカインまたはケモカイン作用を示すこと（非特許文献１９）、更には細胞外ＴＲＸが細胞内へ移行すること（非特許文献２０）が本発明者らによって報告されてきた。
しかしながら、ＭＩＦとチオレドキシンとの関係や、ＭＩＦと関連する物質をスクリーニングする方法については、現在に至るまで、報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
非特許文献１：Nishihira J., J Interferon Cytokine Res,(2000)20:751-762
非特許文献２：Bucala R., FASEB J (1996) 7:19-24）
非特許文献３：Annual Reports in Medicinal Chemistry,第33巻,24頁,1998年
非特許文献４：Advances in Immunology,第66巻,197頁,1997年
非特許文献５：Bernhagen J, et al Nature 365: 756-759,1993
非特許文献６：Calandra T, et al Nature 377: 68-71,1995
非特許文献７：International Journal of Molecular Medicine, 第2巻,17頁,1998年
非特許文献８：Makita H, et al Am J Respir Crit Care Med 158:573-579,1998
非特許文献９：Kobayashi S, et al Hepatology 29:1752-1759,1999
非特許文献１０：Mikulowaska A, et al J Immunol 158:5514-5517,1997
非特許文献１１：Ichiyama H, et al Cytokine 26:187-194,2004
非特許文献１２：Donnelly SC, et al Nat Med 3:320-323,1997
非特許文献１３：Mizue Y, et al Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:14410-14415,2005
非特許文献１４：Yang N, et al Mol Med 4:413-424,1998
非特許文献１５：Lan HY, et al J Exp Med 185:1455-1465,1997
非特許文献１６：Leung JC, et al Nephrol Dial Transplant 19:36-45,2003
非特許文献１７：Redox regulation of cellular activation Ann.Rev.Immunol.1997;15:351-369
非特許文献１８：AP-1 transcriptional activity is regulated by a direct association between thioredoxin and Ref-1 PNAS.1997;94:3633-3638
非特許文献１９：Circulating thioredoxin suppresses lipopolysaccharide-induced neutrophil chemotaxis PNAS.2001; 98: 15143-15148
非特許文献２０：Redox-sensing release of thioredoxin from T lymphocytes with negative feedback loops J.Immunol.2004;172:442-448
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、チオレドキシンとＭＩＦが結合することを明らかとし、チオレドキシンとＭＩＦの結合を増強する物質を選び出すスクリーニング方法、該スクリーニング方法で選ばれた物質を含有する組成物、結合物質を提供することを解決課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究の結果、チオレドキシンファミリーのポリペプチド（ＴＲＸｓ）が、ＭＩＦに直接結合することを見出し、ＴＲＸｓを用いることによりＴＲＸｓとＭＩＦの結合に影響を与える物質をスクリーニングすることができるとの結論に達し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明のある実施形態は、下記（１）乃至（４）から選択される少なくとも一種以上の結合物質と試験物質を混合し、前記結合物質とマクロファージ遊走阻止因子の結合処理を行い、前記結合物質と前記マクロファージ遊走阻止因子の結合状態を確認することで、チオレドキシンファミリーのポリペプチドとマクロファージ遊走阻止因子の結合を増強する試験物質を選び出すことを特徴とするスクリーニング方法に関する。
（１）活性中心に−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−、または−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−を有するチオレドキシンファミリーに属するポリペプチド
（２）前記（１）のチオレドキシンファミリーに属するポリペプチドのアミノ酸配列のうち、１若しくは数個のアミノ酸が欠失，置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つ前記（１）のチオレドキシンファミリーのポリペプチドと同等の活性を有するタンパク質
（３）（１）をコードする遺伝子
（４）（２）をコードする遺伝子
本発明の他の実施形態は、前記結合物質と前記マクロファージ遊走因子の結合状態の確認を分子間相互作用解析で行うことを特徴とするスクリーニング方法に関する。
本発明の他の実施形態は、ニトロソグルタチオン、プロスタグランジンＩ２から選ばれる一種以上を含有する、チオレドキシンファミリーのポリペプチドとマクロファージ遊走阻止因子の結合を増強する組成物に関する。
本発明の他の実施形態は、下記（１）乃至（４）から選択される少なくとも一種以上を含み、マクロファージ遊走阻止因子と直接結合する結合物質に関する。
（１）活性中心に−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−、または−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−を有するチオレドキシンファミリーに属するポリペプチド
（２）前記（１）のチオレドキシンファミリーに属するポリペプチドのアミノ酸配列のうち、１若しくは数個のアミノ酸が欠失，置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つ前記（１）のチオレドキシンファミリーのポリペプチドと同等の活性を有するタンパク質
（３）（１）をコードする遺伝子
（４）（２）をコードする遺伝子
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、チオレドキシンとマクロファージ遊走阻止因子の結合を増強する試験物質を選び出すことにより、結合物質（チオレドキシンファミリーのポリペプチド等）が有するマクロファージ遊走阻止因子の活性の阻害をより強めることができる。
また、分子間相互作用解析を用いることにより、リアルタイムで分子間の結合状態を確認することができる。
また、ニトロソグルタチオンやプロスタグランジンＩ２は、チオレドキシンファミリーのポリペプチドとマクロファージ遊走阻止因子の結合を確実に増強させることができる。
また、活性中心に−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−のいずれかを有することにより、チオレドキシンファミリーのポリペプチドがマクロファージ遊走阻止因子と確実に結合する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】細胞内におけるＴＲＸとＭＩＦの結合を確認した結果である。
【図２】細胞外におけるＴＲＸとＭＩＦの結合を確認した結果である。
【図３】ＴＲＸによるＭＩＦの細胞内への取り込み抑制を確認した結果である。
【図４】ＴＲＸによるＭＩＦの活性阻害をＴＮＦ−ａｌｐｈａ（α）の濃度（ｐｇ／ｍＬ）で確認した結果である。
【図５】ＴＲＸとＭＩＦの結合を分子間相互作用解析によって確認した結果である。
【図６】ＴＲＸとＭＩＦの結合を分子間相互作用解析によって確認した結果である。
【図７】三種類の試験物質夫々とＴＲＸを混合したものをアナライトとして用いた場合の分子間相互作用解析の結果である。
【図８】試験物質としてＮ−アセチルグルコサミンを用いた場合の分子間相互作用解析の結果である。
【図９】試験物質としてニトロソグルタチオンを用いた場合の分子間相互作用解析の結果である。
【図１０】試験物質としてプロスタグランジンＩ２を用いた場合の分子間相互作用解析の結果である。
【図１１】試験物質としてプロスタグランジンＩ２を用いた場合の分子間相互作用解析の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明者らは、鋭意研究の結果、チオレドキシンファミリーのポリペプチド（ＴＲＸｓ）の新たな機能として、炎症作用を有するマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）に直接結合することを解明した。
このことから、ＴＲＸｓを用いることで、ＭＩＦとＴＲＸｓの結合に影響を与える物質を選び出すことができるとの結論に達し、本発明を完成するに至った。
以下、本発明に係るスクリーニング方法の実施形態について詳説する。
【００１３】
本実施形態に係るスクリーニング方法は、試験物質の中から、ＴＲＸｓとＭＩＦの結合を増強するものを選び出すための方法である。
具体的には、下記（ａ）〜（ｃ）の工程を経ることにより行うことができる。
（ａ）ＴＲＸｓ等の結合物質（詳細は後述する）と試験物質を混合する
（ｂ）試験物質と混合した結合物質をＭＩＦに結合させる結合処理を行う
（ｃ）試験物質と混合した結合物質とＭＩＦの結合状態を確認し、試験物質を混合しない場合の結合物質とＭＩＦの結合状態と比較する
【００１４】
解析の結果、試験物質と混合した結合物質とＭＩＦの結合が、試験物質と混合しない結合物質とＭＩＦの結合に比して強い場合、試験物質は結合物質とＭＩＦの結合を増強している物質であるといえる。
結合物質（ＴＲＸｓ等）はＭＩＦに結合し、ＭＩＦの活性を阻害するＭＩＦ阻害剤としての役割を有するが、結合物質とＭＩＦの結合を増強する物質を選び出すことにより、結合物質のＭＩＦ阻害剤としての効果をより顕著にすることができる。
【００１５】
試験物質としては各種ペプチド、リピッド、糖鎖等を挙げることができる。
また、ニトロソグルタチオンやプロスタグランジンＩ２は、本発明のスクリーニング方法により、ＴＲＸｓとＭＩＦの結合を増強することが確認できた。そのため、ニトロソグルタチオン、プロスタグランジンＩ２から選ばれる一種以上を含有する組成物はＴＲＸｓとＭＩＦの結合を増強するのに好適に利用することができる。
さらに、プロスタグランジンJ2（PGJ2）ファミリー、ヒアルロン酸、S_Nitrosylation、Glutathionylation等も挙げることができる。
【００１６】
結合物質とＭＩＦの結合状態の確認方法としては、表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance：SPR）現象を利用した分子間相互作用解析（Biacore）を挙げることができる。当該解析は、標識を使わずに分子間の相互作用をリアルタイムにモニタリングすることができる。
分子間相互作用解析を用いる場合、センサーチップにリガンドとしてＭＩＦを固定化し、アナライトとして結合物質（ＴＲＸｓ等）と試験物質の混合物を用い、試験物質と混合した結合物質とＭＩＦの結合状態（相互作用）を解析する。そして、当該解析結果を、試験物質を混合しない場合の結合物質とＭＩＦの結合状態と比較することで、試験物質のスクリーニングを行う。
【００１７】
［ＴＲＸｓ］
以下、本発明の結合物質について説明する。
本発明の結合物質は、下記（１）乃至（４）をいい、単独の他、これらの組み合わせ等が挙げられる。
（１）チオレドキシンファミリーのポリペプチド（ＴＲＸｓ）
（２）ＴＲＸｓのアミノ酸配列のうち、１若しくは数個のアミノ酸が欠失，置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つＴＲＸｓと同等の活性を有するポリペプチド
（３）（１）をコードする遺伝子
（４）（２）をコードする遺伝子
【００１８】
チオレドキシンファミリーに属するポリペプチド（ＴＲＸｓ）と同等の活性とは、ＭＩＦに直接結合し得たるものをいう。
【００１９】
ＴＲＸｓとは、ジチオール結合やジスルフィド結合の酸化還元活性を有するポリペプチド類であって、もともと、生物細胞中に存在するポリペプチドである（特開２００２−１７９５８８等参照）。
【００２０】
本発明のＴＲＸｓには、天然のヒトを含む動物，植物，大腸菌，酵母からの抽出ポリペプチド類以外に、遺伝子組み換えにより酵母や大腸菌等から抽出されるポリペプチド類，化学合成で作成されるポリペプチド類等も含まれる。但し、ヒト由来のもの，及びそれを大腸菌，酵母において遺伝子組み換えで作成したもの，及びそれらと同一又は類似の配列からなる合成ペプチドが、生体に与える影響がより少ないと考えられるため好ましい。
【００２１】
ＴＲＸｓは、システイン残基を含む活性部位(−Ｃｙｓ−Ｘ１−Ｘ２−Ｃｙｓ−：Ｘ１，Ｘ２は、任意のアミノ酸残基を表し、同一であっても異なるものでも良い)を有し、類似の３次元構造を持つ分子群である。従って、本発明のＴＲＸｓには、上記の他、ジチオール結合やジスルフィド結合の酸化還元活性を損なわない範囲で、一部のアミノ酸が欠失又は置換されたものや、他のアミノ酸，ペプチドが融合されたものであってもよい。
【００２２】
活性部位の具体例としては、−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−等が挙げられるが、中でも、−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−が種を超えて保存されている配列であるため、マウスモデルによる実験結果の人間への応用がより確実であるという理由で好ましい。
また、活性部位が−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−、または−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−であるものを用いることができる。
【００２３】
ＴＲＸｓには、具体的には、例えば、活性部位が−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−であるチオレドキシン（ＴＲＸ），グルタレドキシン等が挙げられる。
【００２４】
チオレドキシン（ＴＲＸ）には、ヒト，大腸菌，酵母由来のものがあり、グルタレドキシンには、ヒト，大腸菌由来のものがある。
ここで、ヒト由来のヒトチオレドキシン（ｈＴＲＸ）は、配列番号１に示される１０５個のアミノ酸からなるポリペプチドである。ｈＴＲＸの塩基配列は、配列番号２に示される。
【００２５】
ヒト細胞からＴＲＸｓを抽出する具体的な方法としては、以下の方法が例示される。
（Ａ）ヒト由来の細胞株から抽出する方法（特開平１−８５０９７号公報等参照）。
（Ｂ）遺伝子組み換え法を用いる方法（特開平１−８５０９７号公報等参照）。
（Ｃ）ペプチド合成法を用いる方法（特開平５−１３９９９２号公報等参照）。
【００２６】
また、ＭＩＦに直接結合し得るものであれば、配列番号１のヒトチオレドキシンをもとにして公知の遺伝子工学的手法により作製されたＴＲＸ改変体であってもよい。
該改変体としては、配列番号１の３２位と３５位以外、好ましくは３２位〜３５位以外のアミノ酸の１又は複数個が置換、欠失、付加、挿入されているものが挙げられる。
【００２７】
また、上記のチオレドキシンファミリーに属するポリペプチド（ＴＲＸｓ）を、単独又は２種以上を組み合わせて使用することもできる。
【００２８】
さらに、（３），（４）に記載のコードする遺伝子を用いる場合、細胞内で（１）（２）に記載のポリペプチドを産出させて用いればよい。
【００２９】
［マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）］
次いで、本発明のスクリーニング方法に用いられるＭＩＦについて説明する。
ＭＩＦは、ヒトをはじめ様々な動物種に存在し、配列番号３で示される１１５個のアミノ酸残基からなる分子量１２．３ｋＤａタンパク質で、分子内にレドックス活性領域であるＣｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓモチーフ（Ｘは任意のアミノ酸）を有することから、チオレドキシンファミリーに属する。
ＭＩＦは、リンパ球のみならず、脳や腎臓など種々の臓器で発現し、特に腎臓では尿細管上皮細胞、皮膚や角膜では細胞増殖の盛んな基底膜細胞等で発現が強い。
ＭＩＦを発現する細胞・組織としては、Ｔ細胞、単球・マクロファージ、樹状細胞、メサンギウム細胞、尿細管上皮細胞、角膜上皮細胞、肝細胞、卵細胞、セルトリ細胞、ケラチノサイト、骨芽細胞、滑膜細胞、脂肪細胞、アストロサイト、癌細胞、粘膜、脳下垂体などを例示することができる。
【００３０】
本発明の限定的解釈を望むものではないが、結合物質（ＴＲＸｓ等）は炎症作用を有するＭＩＦに直接結合することにより、ＭＩＦの活性を低減させ、ＭＩＦによる炎症（並びに炎症による繊維化）を抑えることができる。詳細には、結合物質（ＴＲＸｓ等）がＭＩＦのレドックス活性領域に直接結合することによって、ＭＩＦの活性を阻害するものと考えられる。
また、結合物質（ＴＲＸｓ等）はＭＩＦの細胞内への取り込みを抑制することにより、ＭＩＦによる炎症（並びに炎症による繊維化）を抑えることができる。
本発明のスクリーニング方法では、結合物質（ＴＲＸｓ等）とＭＩＦの結合を増強する物質を選び出すことができる。そのため、本発明のスクリーニング方法を用いることにより、結合物質（ＴＲＸｓ等）が有するＭＩＦに対する効果をさらに強化することのできる物質を探索することが可能である。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
（実施例１）【００３２】
〔細胞内におけるＴＲＸとＭＩＦの結合確認実験〕
ＡＴＬ２細胞及びＨＬ６０細胞内におけるＴＲＸとＭＩＦの結合を（後述の如く）免疫沈降法によって確認した。【００３３】
〔実験材料〕
ＡＴＬ２細胞  ：ヒト成人型Ｔ白血病細胞株
公開特許公報  昭62-19532、Tagaya, Y., Y. Maeda, A. Mitsui, N. Kondo, H. Matsui, J. Hamuro, N. Brown, K. Arai, T. Yokota, H. Wakasugi, et al 1989. EMBO J. 8:75  参照
ＨＬ６０細胞  ：ヒト急性前骨髄性白血病細胞株
京都大学ウイルス研究所  淀井淳司教授譲渡分
Protein G Sepharose 4 Fast Flow：（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）
抗ＴＲＸ抗体（ＡＤＦ１１抗体）：（レドックスバイオサイエンス社製）
抗ＭＩＦ抗体：（サンタクルズ社製）
抗Ｒａｂｂｉｔ抗体：（ｕｐｓｔａｔｅ社製）【００３４】
〔実験方法〕
細胞は１７５ｃｍ２フラスコ内で、１０％ ＦＣＳ，１００Ｕ／ｍｌ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ １６４０（シグマ社製）培地を用い培養した。
１×１０７〜８／ｃｅｌｌの細胞を回収し、１０００ｒｐｍ，４℃，１５分間で遠心後、得られた沈殿をｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒで可溶化し３０分間氷上で静置した。
溶液を１０００ｒｐｍ，４℃，１５分間遠心し、得られた上清を免疫沈降実験に使用した。タンパク質の濃度測定は、ＤＣプロテインアッセイキット（ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を用いた。
マイクロチューブに２０μｌのProtein G Sepharose、５００μｇの細胞溶液を加え、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒで１ｍｌに調整し、小型回転培養機で４℃,３時間反応させた。細胞溶液を１５０００ｒｐｍ、４℃、２分間遠心し、得られた上精を新しいマイクロチューブに加え、さらに２０μｌのProtein G Sepharose、４μｇ／ｍｌの抗ＭＩＦ抗体を添加した。
また、コントロールには抗ＭＩＦ抗体の代わりに抗Ｒａｂｂｉｔ抗体を加えた。
反応は小型回転培養機を用い、４℃で一晩行った。反応溶液を１５０００ｒｐｍ、４℃、２分間遠心し、沈殿を洗浄ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ ＮＰ４０）で洗浄した。
沈殿にＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加え、１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに供した。泳動後、ウエスタンブロッティングを行い抗ＴＲＸ抗体（ＡＤＦ１１抗体）で確認した（図１）。【００３５】
図１より、ＡＴＬ２細胞及びＨＬ６０細胞内のいずれにおいても、ＴＲＸがＭＩＦに直接結合することが示された。
（実施例２）【００３６】
〔細胞外におけるＴＲＸとＭＩＦの結合実験〕
ＡＴＬ２細胞外でのＴＲＸとＭＩＦの結合を免疫沈降法によって確認した。【００３７】
〔実験材料〕
ＡＴＬ２細胞  ：ヒト成人型Ｔ白血病細胞株
公開特許公報（特開昭62-19532）、Tagaya, Y., Y. Maeda, A. Mitsui, N. Kondo, H. Matsui, J. Hamuro, N. Brown, K. Arai, T. Yokota, H. Wakasugi, et al 1989. EMBO J. 8:75  参照
Protein G Sepharose 4 Fast Flow：（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）
抗ＴＲＸ抗体（ＡＤＦ１１抗体）：（レドックスバイオサイエンス社製）
抗ＭＩＦ抗体：（サンタクルズ社製）
抗Ｒａｂｂｉｔ抗体：（ｕｐｓｔａｔｅ社製）
amicon ultra-4 (ミリポア社製)【００３８】
〔実験方法〕
１×１０５／ｃｅｌｌのＡＴＬ２細胞を１７５ｃｍ２フラスコで、１００Ｕ／ｍｌ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ １６４０（シグマ社製）培地で３日間培養した。そして、培地を回収し、１００００ｒｐｍ，４℃，１５分間で遠心後、得られた上清を最終濃度が１０％になるようにFCSを加え、amicon ultra-4で濃縮し、得られた濃縮液を免疫沈降実験に使用した。マイクロチューブに２０μｌのProtein G Sepharose、３０μｌの培養上清を加え、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒで１ｍｌに調整し、小型回転培養機で４℃,３時間反応させた。細胞溶液を１５，０００ｒｐｍ、４℃、２分間遠心し、得られた上精を新しいマイクロチューブに加え、さらに２０μｌのProtein G Sepharose、４μｇ／ｍｌの抗ＭＩＦ抗体を添加した。
また、コントロールには抗ＭＩＦ抗体の代わりに抗Ｒａｂｂｉｔ抗体を加えた。
反応は小型回転培養機を用い、４℃で一晩行った。反応溶液を１５０００ｒｐｍ、４℃、２分間遠心し、沈殿を洗浄ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ ＮＰ４０）で洗浄した。
沈殿にＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加え、１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに供した。泳動後、ウエスタンブロッティングを行い抗ＴＲＸ抗体（ＡＤＦ１１抗体）で確認した（図２）。【００３９】
図２より、ＡＴＬ２細胞外でＴＲＸがＭＩＦに直接結合することが示された。【００４０】
（実施例３）
〔ＴＲＸによるＭＩＦの細胞内への取り込み抑制確認実験〕
ＭＩＦはオートクライン、パラクライン作用により細胞内に取り込まれ、炎症性サイトカインＴＮＦ−ａｌｐｈａ（α）やＩＬ−１の産生を誘導する。そこでＴＲＸによるＭＩＦの細胞内取り込みに対する影響を調べ、炎症応答制御メカニズムの解明を試みた。【００４１】
〔実験材料〕
ＡＴＬ２細胞  ：ヒト成人型Ｔ白血病細胞株、
組換え型ＭＩＦ（ｒＭＩＦ）：発現ベクターpQE30（キアゲン社）を用いてHis tag付き組換え型ＭＩＦを大腸菌内で発現し、MagneHisTM Protein Purification System（プロメガ社製）によるカラム精製した。
組換え型ＴＲＸ（ｒＴＲＸ）：（味の素株式会社製）
抗His tag抗体：（プロメガ社製）【００４２】
〔実験方法〕
ＡＴＬ２細胞は、７５ｃｍ２フラスコで１０％ＦＣＳ，１００Ｕ／ｍｌ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ  １６４０培地で培養した。
２４穴プレートにＡＴＬ２細胞を１×１０６／ｃｅｌｌ加え、終濃度０〜２５０μｇ／ｍｌのｒＴＲＸと２５μｇ／ｍｌのｒＭＩＦを加え３７℃、０．５%ＣＯ２条件下で２４時間培養した。
培養後細胞を回収し、沈殿にＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加え、１５%ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動後、ウエスタンブロッティングを行い抗His tag抗体で細胞内に取り込まれたＭＩＦを検出した。ウエスタンブロッティングによるバンドの変化をデンシトメーターで解析した。測定結果を図３に示す。【００４３】
図３より、ＴＲＸは濃度依存的にＡＴＬ２細胞へのＭＩＦの取り込みを抑制した。
このことから、ＴＲＸはＭＩＦの細胞内取り込みを抑制することにより、炎症応答を抑制することが示唆された。
（実施例４）【００４４】
〔ＴＲＸによるＭＩＦ活性阻害確認実験〕
ＴＲＸによるＭＩＦの活性阻害実験を（後述の如く）炎症性サイトカインＴＮＦ−αの濃度を測定することによって確認した。【００４５】
〔実験材料〕
ＲＡＷ  ２６４．７細胞：マウス由来マクロファージ細胞株、
現理化学研究所免疫・アレルギー科学総合研究センター  石井保之博士譲渡分
組換え型ＭＩＦ（ｒＭＩＦ）：（ＡＴＧＥＮ社製）
組換え型ＴＲＸ（ｒＴＲＸ）：（味の素株式会社製）
ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ）:（ＳＩＧＭＡ社製）
ＴＮＦ−α  ＥＬＩＳＡキット：（R&D systems社製）【００４６】
〔実験方法〕
ＲＡＷ  ２６４．７細胞は、７５ｃｍ２フラスコで１０％ ＦＣＳ，１００Ｕ／ｍｌ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ  １６４０培地で培養した。２４穴プレートにＲＡＷ  ２６４．７細胞を１×１０６／ｃｅｌｌになるように加え、終濃度１０ｎｇ／ｍｌＭＩＦを加え、０〜５００ｎｇ／ｍｌのＴＲＸを添加し、３７℃，５％ＣＯ２条件下で４時間静置した。
さらに、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを加え（ＬＰＳ（＋）と表記）、３７℃，５％ＣＯ２条件下で４時間静置した後、培養液を回収した。
産生するＴＮＦ−ａｌｐｈａ（α）の量はＤｕｏ Ｓｅｔ ＥＬＩＳＡ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ ｍｏｕｓｅ ＴＮＦ−αキットにより測定した。
測定方法はキットに添付のプロトコールに従った。測定結果を図４に示す。【００４７】
図４より、ｒＴＲＸは、濃度依存的にｒＭＩＦの活性を阻害し、炎症性サイトカインであるＭＩＦ由来のＴＮＦ−ａｌｐｈａの産生を抑制することが確認された。【００４８】
上記実施例１〜３の結果から、ＴＲＸはＭＩＦに直接結合することで、ＭＩＦの細胞内への移行を抑制することが確認された。
また、上記実施例４の結果から、チオレドキシンファミリーのポリペプチドがＭＩＦの細胞内への移行を抑制することでＴＮＦ−ａｌｐｈａの産生を抑制し、炎症応答を抑制することが確認された。
従って、ＴＲＸが、ＭＩＦによって引き起こされる障害に、広く有効であると考えられる。
（実施例５）【００４９】
〔ＴＲＸとＭＩＦの結合確認実験１〕
ＴＲＸとＭＩＦの結合を表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance：SPR）現象を利用した分子間相互作用解析（Biacore）（以下、単に分子間相互作用解析と称す）によって確認した。【００５０】
〔実験材料〕
組換え型ＭＩＦ（ｒＭＩＦ）：発現ベクターpQE30（キアゲン社）を用いてHis tag付きｒＭＩＦを大腸菌内で発現し、MagneHisTM Protein Purification System（プロメガ社製）によるカラム精製した。
組換え型ＴＲＸ（ｒＴＲＸ）：発現ベクターpQE80L（キアゲン社）を用いてHis tag付きｒＴＲＸを大腸菌内で発現し、MagneHisTM Protein Purification System（プロメガ社製）によるカラム精製した。
抗His tag抗体：（プロメガ社製）
ＢＩＡｃｏｒｅ２０００（ＣＭ５センサーチップ使用）(ビアコア社製)【００５１】
〔実験方法〕
ＣＭ５センサーチップにリガンドとしてｒＭＩＦを固定化した。リガンドは、Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０を用い、ＭＩＦを２００ｎＭ以下となるように調整した。
そして、アナライトとして、ｒＴＲＸを用い、ｒＴＲＸとｒＭＩＦの相互作用を解析した。また、ｒＴＲＸの濃度については、２μＭ，４μＭ，６μＭ，８μＭ，１０μＭ，１２μＭと変化させて解析を行った。【００５２】
図５は実施例５の分子間相互作用解析の結果を示す図である。
図５に示すように、ｒＴＲＸの濃度に依存して表面プラズモン共鳴が増加しているので、ｒＴＲＸとｒＭＩＦの結合は濃度依存性を有するといえる。
また、センサーチップＮＴＡ（Ni-Histag）を用いて同様の実験を行った場合も同様の結果が得られた。
（実施例６）【００５３】
〔ＴＲＸとＭＩＦの結合確認実験２〕
ＴＲＸとＭＩＦの結合において、ＴＲＸの活性部位である３２位と３５位のシステイン残基が関与しているのかを、分子間相互作用解析によって確認した。【００５４】
〔実験材料〕
ｒＷＴ ＴＲＸ（実施例５のｒＴＲＸと同じ）
ｒＤＭ ＴＲＸ（実施例５のｒＴＲＸの３２位と３５位のシステイン残基をセリンに変換させたもの）
ｒＣ３５Ｓ ＴＲＸ（実施例５のｒＴＲＸの３５位のシステイン残基をセリンに変換させたもの）
ｒＭＩＦ（実施例５のｒＭＩＦと同じ）
ＢＩＡｃｏｒｅ２０００（ＣＭ５センサーチップ）【００５５】
〔実験方法〕
ＣＭ５センサーチップにリガンドとして２００ｎＭ以下の濃度に調整したｒＭＩＦを固定化した。
そして、アナライトとして、ｒＷＴ ＴＲＸ、ｒＤＭ ＴＲＸ、ｒＣ３５Ｓ ＴＲＸを用い、これらのｒＴＲＸとｒＭＩＦの相互作用を、酸化状態と還元状態の夫々について解析した。
なお、酸化状態では、Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０を用いリガンドの調整を行い、還元状態ではＲｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０に加えて、１Ｍ ＤＴＴを添加してリガンドの調整を行った。
図６は実施例６の分子間相互作用解析の結果を示す図である。
また、表１，２は図６から算出した解離定数値（ＫＤ値）を示したものであり、表１は酸化状態でのｒＴＲＸとｒＭＩＦのＫＤ値を示した表であり、表２は還元状態でのｒＴＲＸとｒＭＩＦのＫＤ値を示した表である。【００５６】
【表１】
0005528351.tif 000002
【００５７】
【表２】
0005528351.tif 000003
【００５８】
図６、表１，２に示すように、ｒＷＴ ＴＲＸ、ｒＤＭ ＴＲＸ、ｒＣ３５Ｓ ＴＲＸのいずれにおいても、ｒＭＩＦと直接的に結合していることが確認された。
特に、ｒＭＩＦとｒＣ３５Ｓ ＴＲＸの結合は、ｒＷＴ ＴＲＸ又はｒＤＭ ＴＲＸとＭＩＦの結合より強いことが確認された。
また、ｒＷＴ ＴＲＸ、ｒＤＭ ＴＲＸは酸化状態でも還元状態でも解離定数値に殆ど変化がなく、ｒＣ３５Ｓ ＴＲＸは酸化状態でｒＭＩＦとの結合が強いことが確認された。
つまり、ＴＲＸ活性部位であるＣｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（３２位〜３５位）に、酸化還元依存性を有する部分と酸化還元依存性を有さない部分が存在するといえる。【００５９】
〔ＴＲＸとＭＩＦの結合に影響を与える分子のスクリーニング実験〕
いくつかの試験物質において、ＴＲＸとＭＩＦの結合を増強するものであるかを分子間相互作用解析により確認した。【００６０】
〔実験材料〕
ｒＴＲＸ（実施例５のｒＴＲＸと同じ）
ｒＭＩＦ（実施例５のｒＭＩＦと同じ）
ＢＩＡｃｏｒｅ２０００（ＣＭ５センサーチップ）
（試験物質）
Ｎ−アセチルグルコサミン（N-acetyl glucosamine）
ニトロソグルタチオン（Nitrosoglutathione）
プロスタグランジンＩ２（Prostaglandin I2）【００６１】
〔実験方法〕
ＣＭ５センサーチップにリガンドとしてｒＭＩＦを固定化した。リガンドは、Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０を用い、ｒＭＩＦの濃度が２００ｎＭ以下となるように調整した。
そして、Ｎ−アセチルグルコサミン、ニトロソグルタチオン、プロスタグランジンＩ２の夫々をｒＴＲＸと混合し、三種類のアナライトを作成した。
夫々のアナライトにおいて、ｒＴＲＸの濃度は５μＭ、試験物質の濃度は５００μＭとした。なお、プロスタグランジンＩ２については、アナライトにおける濃度を５μＭとしたものも解析した。【００６２】
図７は三種類の試験物質夫々をｒＴＲＸと混合したものをアナライトとして用いた場合の分子間相互作用解析の結果を示した図であり、ｒＴＲＸ（５μＭ）のみの分子間相互作用解析の結果も示している。
図８は試験物質としてＮ−アセチルグルコサミンを用いた場合の分子間相互作用解析の結果を示し、ｒＴＲＸ（５μＭ）のみの分子間相互作用解析の結果、Ｎ−アセチルグリコサミン（５００μＭ）のみの分子間相互作用解析の結果も示している。
図９は試験物質としてニトロソグルタチオンを用いた場合の分子間相互作用解析の結果を示し、ｒＴＲＸ（５μＭ）のみの分子間相互作用解析の結果、ニトロソグルタチオン（５００μＭ）のみの分子間相互作用解析の結果も示している。
図１０は試験物質としてプロスタグランジンＩ２を用いた場合の分子間相互作用解析の結果を示し、ｒＴＲＸ（５μＭ）のみの分子間相互作用解析の結果、プロスタグランジンＩ２（５００μＭ）のみの分子間相互作用解析の結果も示している。
図１１は試験物質として、ｒＴＲＸとプロスタグランジンＩ２を混合したアナライトにおいて、プロスタグランジンＩ２の濃度を５μＭ、５００μＭとしたアナライトを用い、分子間相互作用解析をした結果である。【００６３】
図７〜１１で示すように、ニトロソグルタチオン、プロスタグランジンＩ２をｒＴＲＸに混合することにより、ｒＴＲＸとｒＭＩＦの結合が著しく増強されることが確認できた。
つまり、ニトロソグルタチオン、プロスタグランジンＩ２は、ＴＲＸｓとＭＩＦの結合を増強する物質であるということがわかった。【００６４】
このように、本発明のスクリーニング方法は、ＴＲＸｓとＭＩＦの結合を増強させる物質をスクリーニングすることができる。
【図１】
0005528351.tif 000004
【図２】
0005528351.tif 000005
【図３】
0005528351.tif 000006
【図４】
0005528351.tif 000007
【図５】
0005528351.tif 000008
【図６】
0005528351.tif 000009
【図７】
0005528351.tif 000010
【図８】
0005528351.tif 000011
【図９】
0005528351.tif 000012
【図１０】
0005528351.tif 000013
【図１１】
0005528351.tif 000014
【配列表】
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