(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を備えた自己抗体の検出方法。
（ａ）抗原タンパク質と、該抗原タンパク質のＮ末端又はＣ末端に融合した蛍光タンパク質、及び蛍光タンパク質を融合した反対の末端に融合したシステインタグとを含む複合タンパク質を調製する工程；
（ｂ）工程（ａ）で調製した複合タンパク質のシステインタグと、アミノ基を介してマレイミド基を導入した基板表面のマレイミド基とを反応させ、共有結合により基板表面に複合タンパク質を固定して抗原タンパクチップを調製する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で調製した抗原タンパクチップを、タンパク質の変性剤及び還元剤の存在下に加熱処理する工程；
（ｄ）加熱処理後の抗原タンパクチップに、血清と抗蛍光タンパク質非ヒト抗体とを作用させる工程；
（ｅ）蛍光物質［Ｉ］で標識された抗ヒトＩｇ抗体と、蛍光物質［Ｉ］と異なる蛍光物質［II］で標識された抗非ヒトＩｇ抗体とを順次２段階で反応させる工程；
（ｆ）蛍光物質［Ｉ］／蛍光物質［II］の蛍光強度の比を算出する工程；
【請求項２】
蛍光タンパク質として緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を用いることを特徴とする請求項１記載の自己抗体の検出方法。
【請求項３】
複合タンパク質が、抗原タンパク質のＮ末端に融合した蛍光タンパク質及びＣ末端に融合したシステインタグを含むことを特徴とする請求項１又は２記載の自己抗体の検出方法。
【請求項４】
複合タンパク質が、ＧＦＰのＮ末端にヒスチジンタグがさらに融合されていることを特徴とする請求項２又は３記載の自己抗体の検出方法。
【請求項５】
工程（ｃ）と工程（ｄ）の間に、ＢＳＡブロッキング処理を行うことを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の自己抗体の検出方法。
【請求項６】
タンパク質の変性剤としてＳＤＳ、還元剤として２−メルカプトエタノールを用いることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の自己抗体の検出方法。
【請求項７】
蛍光物質としてＣｙ３とＣｙ５を用いることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の自己抗体の検出方法。
【請求項８】
基板として、ダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）がコーティングされているＤＬＣチップを用いることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の自己抗体の検出方法。
【請求項９】
抗原タンパク質が、ＨＳＰ７０、ＳＯＤ２、又はＰＲＤＸ６であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の自己抗体の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己抗体の検出方法、より詳しくは、自己抗原タンパク質を調製し基板に結合させて調製した抗原チップを用いて自己抗体の発現量を測定する自己抗体の検出方法に関する。本発明の自己抗体の検出方法は、例えば、血清中に存在する自己抗体の発現量の増減を指標として、癌を発症するリスクを判定する際に有用である。
【背景技術】
【０００２】
わが国においてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染者は１５０万〜２００万人いると推測され、その多くは輸血などの医療行為に対策がとられる以前の感染によるものであり、現在新たな感染者の増加率は低くなっている。しかし一度感染が成立すると感染は持続的で、ＨＣＶ感染者は慢性的な肝炎(Ｃ型肝炎）を引き起こし、２０〜３０年を経て肝硬変の後に、もしくはＣ型肝炎から直接に肝細胞癌を発症する。従ってＨＣＶ感染者においては、出来る限り早期にこれらの疾患発症を検出し、早期に治療を開始して、肝疾患を克服することが、現在の重要な医学的課題である。原発性肝細胞癌発症の診断マーカーとして血清中のＡＦＰ（α-fetoprotein)、ＰＩＶＫＡ−II（protein induced by vitamin-K absence-II）等が報告されているが、初期段階での検出感度が低いため、前癌状態における診断に用いることは困難であった。そのため、新しい肝癌検出用マーカーの開発が急務である。本発明者のグループは、肝細胞癌患者には特異的な３つの自己抗体が存在することを報告してきた（非特許文献１参照）。その自己抗体抗原タンパク質は、ＨＳＰ７０(heat shock 70kDa protein 1)、ＳＯＤ２ (manganese superoxide dismutase)、ＰＲＤＸ６(peroxiredoxin)である。こうした自己抗体は診断マーカーとして活用できる可能性がある。
【０００３】
近年、多種類のタンパク質を小さな基板上に固定化するタンパク質チップ技術の進展が著しい。タンパク質チップは、先行しているＤＮＡチップ技術を発展させながらも、ＤＮＡより多様な立体構造をもち直接生命機能を担うタンパク質独自の特徴の少なくとも一部を基板上で再現する必要があり、こうした問題を解決しながら現在発展途上にある。
【０００４】
バイオマーカーとなる自己抗体としては、肝臓癌患者の体液または組織抽出液中に存在しかつ肝臓癌で発生量が増加する抗ヒトＧＡＤＩＩ自己抗体をヒトＧＡＤＩＩタンパク質と反応させることにより検出する方法等（特許文献１参照）や血中のホルモンレセプターに対する自己抗体の測定による癌の検出方法（特許文献２参照）が報告されている。また、バイオチップ上に固定化された肝臓疾患用バイオマーカーを用いて、試料中の自己抗体を同定する肝臓疾患用の検出キット等（特許文献３参照）が報告されている。
【０００５】
また、本発明者らは、基板上にアミノ基を介してマレイミド基を導入した固体支持体を用い、オリゴシステイン配列が導入されたポリペプチドをマレイミド基と結合させることにより、ポリペプチドを固定化する方法（特許文献４参照）等や、ポリペプチドが固定化された担体を凍結乾燥することを含む担体の保存方法（特許文献５参照）について報告し、また、スタスミンと、スタスミンに結合した検出用の蛍光タンパク質と、Ｃ末端側に結合したシステインタグと、Ｎ末端側に結合したヒスチジンタグを含むポリペプチドで構成される、スタスミンを有効成分とする、タンパク質検出用チップ（特許文献６参照）等について報告している。これらのチップでは、タンパク質は基板から１方向に並んで裸出しているため、基板を浸した溶液中の物質との反応性に富むことが予測される。
【０００６】
そしてまた、本発明者らは、ヒスチジンタグと、システイン残基が５つ連なった５ｘＣｙｓ（システイン）タグを付加したＧＦＰタンパク質を大腸菌内で発現させ、ニッケルカラムで精製後、マレイミド基を導入したダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）基板に対する、上記タンパク質の結合、及び結合効率について調べた。タンパク質発現、精製、及びマレイミド基への結合までのトータルな効率を考えると、ターゲットタンパク質のＮ末端側にヒスチジンタグを、Ｃ末端側にシステインタグを付加させるとよいことを報告している（非特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平１１−３８００８号公報
【特許文献２】特開平１１−９４８３１号公報
【特許文献３】特開２００５−１８１３４２号公報
【特許文献４】特開２００５−３１２４２５号公報
【特許文献５】特開２００８−１０５９７３号公報
【特許文献６】特開２００７−２８２５９１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Proteomics 6：3894-3900、2006
【非特許文献２】Journal of Proteome Research 5: 2144-2151、2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＨＣＶ感染者はＣ型肝炎を発症し、その後、長期間を経て肝細胞癌を発症するリスクが高い。肝細胞癌患者血清にはいくつかの特異的な自己抗体が認められる。したがってＨＣＶ感染者からこれらの自己抗体を検出すれば、ごく初期の段階の癌の存在を明らかにし、早い時期に治療を開始できると考えられる。本発明の課題は、ＨＣＶ感染者の血清からＨＣＣ患者特異的自己抗体等の血清中の自己抗体を、高感度・特異的に検出する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
抗原チップ法は、複数の抗体の存在を同時に高感度、ハイスループット（スループット：単位時間当たりの処理能力）で検出できる点が新しく、一つひとつの抗原を検査する従来の酵素抗体法に比べ、複数抗体を同時検出するため情報量が多い。１チップから検出した自己抗体情報を組み合わせることが出来るので、原理的に検出特異性と感度を高められると期待されている。ごく少量の血清（５倍希釈して用いるとき必要な血清原液量は１０μｌ）から検出できる点で、従来のウエスタンブロット（ＷＢ）解析（１００倍希釈して用いるとして血清原液５００μｌは必要）よりも優れている。本研究では、基板に固定化された抗原タンパク質１２８ｆｍｏｌに結合する血清自己抗体は、蛍光にて可視化しており、検出感度は、化学発光法と組み合わせ増感して検出するＷＢ解析と同程度か、それ以上である。このチップを用いれば、多数の血清試料を９６ウェルプレートにて同時に反応させることが可能で、ＷＢ解析に比べはるかにスループットに優れている。本発明者らは、抗原チップを用いた自己抗体検出方法の改良プロトコル（図４参照）を見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、（１）（ａ）抗原タンパク質と、該抗原タンパク質のＮ末端又はＣ末端に融合した蛍光タンパク質、及び蛍光タンパク質を融合した反対の末端に融合したシステインタグとを含む複合タンパク質を調製する工程；（ｂ）工程（ａ）で調製した複合タンパク質のシステインタグと、アミノ基を介してマレイミド基を導入した基板表面のマレイミド基とを反応させ、共有結合により基板表面に複合タンパク質を固定して抗原タンパクチップを調製する工程；（ｃ）工程（ｂ）で調製した抗原タンパクチップを、タンパク質の変性剤及び還元剤の存在下に加熱処理する工程；（ｄ）加熱処理後の抗原タンパクチップに、血清と抗蛍光タンパク質非ヒト抗体とを作用させる工程；（ｅ）蛍光物質［Ｉ］で標識された抗ヒトＩｇ抗体と、蛍光物質［Ｉ］と異なる蛍光物質［II］で標識された抗非ヒトＩｇ抗体とを順次２段階で反応させる工程；（ｆ）蛍光物質［Ｉ］／蛍光物質［II］の蛍光強度の比を算出する工程；を備えた自己抗体の検出方法や、（２）蛍光タンパク質として緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を用いることを特徴とする上記（１）記載の自己抗体の検出方法や、（３）複合タンパク質が、抗原タンパク質のＮ末端に融合した蛍光タンパク質及びＣ末端に融合したシステインタグを含むことを特徴とする上記（１）又は（２）記載の自己抗体の検出方法や、（４）複合タンパク質が、ＧＦＰのＮ末端にヒスチジンタグがさらに融合されていることを特徴とする上記（２）又は（３）記載の自己抗体の検出方法に関する。
【００１２】
また本発明は、（５）工程（ｃ）と工程（ｄ）の間に、ＢＳＡブロッキング処理を行うことを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載の自己抗体の検出方法や、（６）タンパク質の変性剤としてＳＤＳ、還元剤として２−メルカプトエタノールを用いることを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれか記載の自己抗体の検出方法や、（７）蛍光物質としてＣｙ３とＣｙ５を用いることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれか記載の自己抗体の検出方法や、（８）基板として、ダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）がコーティングされているＤＬＣチップを用いることを特徴とする上記（１）〜（７）のいずれか記載の自己抗体の検出方法や、（９）抗原タンパク質が、ＨＳＰ７０、ＳＯＤ２、又はＰＲＤＸ６であることを特徴とする上記（１）〜（８）のいずれか記載の自己抗体の検出方法に関する。
【発明の効果】
【００１３】
抗原チップを用いる本発明の自己抗体の検出方法を用いた検証テストで、ＨＣＶ陰性者（ＨＣＶ陰性他疾患患者及び健常者）血清１４試料が全て肝細胞癌発症は陰性とするような発症示唆基準を設定したが、この発症示唆基準によると、ＨＣＶ陽性肝細胞癌患者血清１３試料中７試料で陽性検出が得られ、さらに興味深いことにはＨＣＶ陽性他疾患患者血清４試料中２試料で陽性検出が認められた。多くの血清を用いてさらに検討する必要があるが、この抗原チップを用いることで、ＨＣＶ陽性者の中から肝細胞癌発症を早期に予測しうる可能性がある。また、自己抗体の組み合わせを用いた病態の超早期診断という新しい検診方法を提案できる可能性も期待できる。  
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】（ａ）ＧＦＰ融合抗原タンパク質の構成を示す図である。（ｂ）基板上に（ａ）に示されたＧＦＰ融合抗原タンパク質が固定化された、肝細胞癌に特異的な自己抗体を検出するための抗原チップを示す図である。
【図２】自己抗体検出の原理を示す図である。
【図３】固定化タンパク量の検出の問題点を示す図である。上左図が比較的むらなく検出できた例を示し、下左図が検出にむらが認められた例である。
【図４】抗原チップを用いた自己抗体検出方法の改良プロトコルを示す図である。
【図５】抗原チップの熱処理の効果を示す抗原チップの蛍光顕微鏡による解析を行った結果を示す図である。基板上のタンパク質は横１列に同じタンパク質が固定化されており、ＧはＧＦＰのみ、ＨＣはＧＦＰ融合ＨＳＰ７０Ｃ末端ドメイン（Ｃ）、ＨＮはＧＦＰ融合ＨＳＰ７０Ｎ末端ドメイン（Ｎ）、ＳはＧＦＰ融合ＳＯＤ２、ＰはＧＦＰ融合ＰＲＤＸ６が固定化されている。
【図６】熱処理と２次抗体の２段階処理による検出の向上を示す図である。Scan Array (Perkin Elmer社)にて検出した。表示された縦軸にはＣｙ５による蛍光レベル（自己抗体量）、横軸にはＣｙ３による蛍光レベル（ＧＦＰタンパク量）が示されている。
【図７】健常者及びＨＣＶ陰性他疾患患者（ＨＣＶ−／肝細胞癌−他疾患患者）血清からの検出例を示す図である。ProScan Array (Perkin Elmer社) autoadjust-modeにて表示した。基板上のタンパク質は横１列に同じタンパク質が固定化されており、ＧはＧＦＰのみ、ＨＣはＧＦＰ融合ＨＳＰ７０のＣ末端ドメイン、ＨＮはＧＦＰ融合ＨＳＰ７０のＮ末端ドメイン、ＳはＧＦＰ融合ＳＯＤ２、ＰはＧＦＰ融合ＰＲＤＸ６が固定化されている。
【図８】ＨＣＶ陽性肝細胞癌患者（ＨＣＶ＋／肝細胞癌＋患者）からの陽性検出例を示す図である。基板上のタンパク質は横1列に同じタンパク質が固定化されており、ＧはＧＦＰのみ、ＨＣはＧＦＰ融合ＨＳＰ７０のＣ末端ドメイン、ＨＮはＧＦＰ融合ＨＳＰ７０のＮ末端ドメイン、ＳはＧＦＰ融合ＳＯＤ２、ＰはＧＦＰ融合ＰＲＤＸ６が固定化されている。
【図９】抗原チップによる自己抗体検出の数値化したデータを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の自己抗体の検出方法における上記工程（ａ）としては、抗原タンパク質と、該抗原タンパク質のＮ末端又はＣ末端に融合した蛍光タンパク質、及び蛍光タンパク質を融合した反対の末端に融合したシステインタグとを含む複合タンパク質を調製する工程であれば特に制限されないが、上記複合タンパク質としては、抗原タンパク質のＮ末端に融合した蛍光タンパク質及びＣ末端に融合したシステインタグを含むものが好ましい。
【００１６】
上記抗原タンパク質としては、癌、自己免疫疾患、感染症等の患者血清中の自己抗体により認識され、自己抗体と結合する抗原タンパク質であれば特に制限されず、例えば、腫瘍抗原タンパク質としてＭＡＧＥ、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１、ＨＳＰ７０、ＳＯＤ２、ＰＲＤＸ６、チロシナーゼ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＥＡ、ＰＳＡ、ＳＡＲＴ−１等を、ウイルスの抗原タンパク質としてＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＰＶ、ＨＴＬＶ、ＥＢＶ等のウイルス由来の抗原タンパク質を、細菌の抗原タンパク質として梅毒トレポネーマ、ヘリコバクター・ピロリ、マイコプラズマ、淋菌、結核菌等の抗原タンパク質を挙げることができるが、肝細胞癌患者に特異的な３つの自己抗体が認識する腫瘍抗原タンパク質であるＨＳＰ７０、ＳＯＤ２、ＰＲＤＸ６を特に好適に例示することができる。以上の抗原タンパク質は、全長のみならず、その部分ポリペプチドや改変体であっても、自己抗体により認識され、自己抗体と結合するものであればよい。
【００１７】
上記蛍光タンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescence Protein；ＧＦＰ）、ＧＦＰ変異体（シアン蛍光タンパク質[Cyan Fluorescence Protein；ＣＦＰ]、青色蛍光タンパク質[Blue Fluorescence Protein；ＢＦＰ]、黄色蛍光タンパク質[Yellow Fluorescence Protein；ＹＦＰ]、赤色蛍光タンパク質[Red Fluorescence Protein；ＲＦＰ]）、ルシフェラーゼ（luciferase）等を例示することができるが、ＧＦＰ又はＧＦＰ変異体を検出するＧＦＰ抗体はSanta Cruz社、Roche社、又はＭＢＬ社などから市販されていることから入手が容易であり、かつ該ＧＦＰ抗体は良質な抗体として知られているため、ＧＦＰ又はＧＦＰ変異体を用いることが好ましい。
【００１８】
また、上記蛍光タンパク質には、亜鉛、ニッケル又はコバルトイオンのような金属イオンと特異的に相互作用するヒスチジンタグ、亜鉛若しくは銅と特異的に相互作用する、少なくとも約４個のリシンを含むリシンタグ若しくは９個のアルギニン残基を含むポリアルギニンタグなどの複合タンパク質精製用のタグがさらに融合されていてもよい。
【００１９】
上記システインタグとしては、システイン残基が３個以上、好ましくは３〜１０個、より好ましくは４〜６個、特に５個連なったものを好適に例示することができる。
【００２０】
工程（ａ）において、蛍光タンパク質、好ましくは精製用のタグがさらに融合された蛍光タンパク質と、抗原タンパク質と、システインタグとが融合している複合タンパク質を調製するには、通常の遺伝子組換え技術を用いることができる。例えば、あらかじめヒスチジンタグとＧＦＰとシステインタグとをコードする領域をもつプラスミドベクターを構築し、後で制限酵素部位等を利用して標的抗原タンパク質をコードするＤＮＡを導入して、得られた組み換えベクターで宿主細胞を形質転換し、当該形質転換体において融合ポリペプチドを発現させることにより、複合タンパク質を調製することができる。あるいは、複合タンパク質をコードするＤＮＡを、宿主細胞中で複製可能な複製起点、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有するプラスミドベクターに導入して、得られた組み換えベクターで宿主細胞を形質転換し、当該形質転換体において融合ポリペプチドを発現させることにより、複合タンパク質を調製することができる。複合タンパク質の精製には、例えばヒスチジンタグを利用して、ニッケルカラムを用いるなどの通常の方法で精製することができる。
【００２１】
本発明の自己抗体の検出方法における上記工程（ｂ）としては、上記工程（ａ）で調製した複合タンパク質のシステインタグと、アミノ基を介してマレイミド基を導入した基板表面のマレイミド基とを反応させ、共有結合により基板表面に複合タンパク質を固定して抗原タンパクチップを調製する工程であれば特に制限されず、システインタグが融合されている上記複合タンパク質をスポッティグ用バッファーに溶解し、アミノ基を介してマレイミド基を導入した基板表面にスポッティングすることにより、システインタグのＳＨ基がマレイミド基と反応して共有結合を形成し、複合タンパク質が強固に固定された抗原タンパクチップを調製することができる。
【００２２】
システインタグを導入した複合タンパク質を、濃度が通常０．０１〜１００μＭ、好ましくは５〜５０μＭとなるようにスポッティング用バッファーに溶解し、スポッティング用溶液を調製する。スポッティング用バッファーとしては、２０〜５０％のＰＥＧ（ポリエチレングリコール）溶液、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）、２０〜５０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、３×ＳＳＣ（saline sodium citrate）、純水等を使用することができる。マレイミド基は加水分解されやすく、ｐＨ７付近で反応効率が最も良い。スポッティング後、複合タンパク質が基板表面に結合する反応を進行させるため、インキュベーションを行うことが好ましい。また、反応後に純水等で洗浄することが好ましい。
【００２３】
上記基板の材料としては、シリコン、ガラス、繊維、木材、紙、セラミックス、プラスチックを挙げることができ、かかる基板上にカーボン層、特にダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）層を形成することが好ましい。ＤＬＣ層を形成することにより、高密度に複合タンパク質を固定化でき、高いＳ／Ｎ比が得られるため、感度の高い検出が可能になる。また、繰り返し使用することも可能である。基板にアミノ基を導入するには、例えばＤＬＣ層を施した基板を、アンモニア雰囲気下でイオン化したガスでバイアスを印加するプラズマ法に付すことにより実施することができる。
【００２４】
本発明の自己抗体の検出方法における上記工程（ｃ）としては、上記工程（ｂ）で調製した抗原タンパクチップを、タンパク質の変性剤及び還元剤の存在下に加熱処理する工程であれば特に制限されず、上記タンパク質の変性剤としてはラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、グアニジン塩酸塩、尿素等を挙げることができるがＳＤＳが好ましい。また、上記タンパク質の還元剤としては２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）やジチオトレイトール（ＤＴＴ）を挙げることができるが２−ＭＥが好ましい。加熱条件としては９０〜９８℃で１０〜１分、好ましくは９５℃で５分を挙げることができる。工程（ｃ）におけるタンパク質の変性剤及び還元剤の存在下に加熱処理することにより、タンパク質の立体構造がくずれ、次工程（ｄ）における抗体の反応性を高めることができると共に、蛍光タンパク質の自家蛍光を消失することができる。
【００２５】
本発明の自己抗体の検出方法における上記工程（ｄ）としては、加熱処理後の抗原タンパクチップに、血清と抗蛍光タンパク質非ヒト抗体とを作用させる工程であれば特に制限されず、上記血清としては癌、自己免疫疾患、感染症等の患者の血清を好適に例示することができる。工程（ｄ）においては、抗原チップに固定されている複合タンパク質の蛍光タンパク質部分に抗蛍光タンパク質非ヒト抗体が結合し、複合タンパク質の抗原タンパク質部分に血清中の自己抗体が結合する。
【００２６】
上記工程（ｃ）と工程（ｄ）との間には、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）による抗原チップのブロッキング処理を１時間程度行うことが好ましい。ＢＳＡブロッキング処理によりタンパクスポットの検出時にむらができにくい傾向が認められる。
【００２７】
本発明の自己抗体の検出方法における上記工程（ｅ）としては、蛍光物質［Ｉ］で標識された抗ヒトＩｇ抗体と、蛍光物質［Ｉ］と異なる蛍光物質［II］で標識された抗非ヒトＩｇ抗体とを順次２段階で反応させる工程であれば特に制限されず、上記蛍光物質としては、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ２、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ローダミン、テキサスレッド、Alexa−４８８、Alexa−５４６、Alexa−５９４等を挙げることができるが、蛍光タンパク質としてＧＦＰを用いる場合、熱処理後のＧＦＰの自家蛍光の残存によるバックグランドがあるため、緑色発光以外の蛍光物質を用いるのが好ましく、その中でも、Ｃｙ３とＣｙ５は輝度と光安定性が高く、他の蛍光物質よりもバックグランドが低い点から、Ｃｙ３とＣｙ５を用いるのが好ましい。工程（ｅ）において、抗ヒトＩｇ抗体と抗非ヒトＩｇ抗体とを順次２段階で反応させることにより、抗ヒトＩｇ抗体と抗非ヒトＩｇ抗体とを同時に用いる場合に比べて、複合タンパク質の抗原タンパク質部分に結合した自己抗体に対する抗ヒトＩｇ抗体の結合反応性を高めることができる。
【００２８】
抗原タンパクチップに固定化された抗原タンパク質量は、抗原タンパク質の種類やスポッティング条件で異なる可能性があるが、本発明の自己抗体の検出方法において固定化抗原タンパク質量を正確に把握することは重要である。例えば、抗原タンパクチップに複数種類の異なる抗原タンパク質を固定化する場合、抗原タンパク質を同じ濃度にそろえて固定化処理を行っても、必ずしも同じ量が固定化されない可能性があることから、自己抗体量を相対的に評価するには補正を行う必要がある。研究当初は、抗原タンパク質に融合した蛍光タンパク質の蛍光強度を指標として固定化抗原タンパク質量を簡便かつ正確に測定しうるのではないかと考えられた。しかし、融合されている抗原タンパク質の種類によっては蛍光タンパク質の構造に変化が生じ、蛍光タンパク質の蛍光強度を指標としても、固定化抗原タンパク質量を正確に把握することが困難であることがわかった。そこで本発明においては、工程（ｄ）における抗蛍光タンパク質非ヒト抗体の使用と、工程（ｅ）における蛍光物質［II］で標識された抗非ヒトＩｇ抗体の使用とを組み合わせる方法で、固定化抗原タンパク質量を正確に把握することとしている。工程（ｆ）では、この方法で測定した蛍光物質［II］の蛍光強度を利用して、自己抗体量を相対的に評価するため、蛍光物質［Ｉ］／蛍光物質［II］の蛍光強度の比を算出する。工程（ｆ）により、抗原チップによる自己抗体検出の相対評価と数値化が可能となる。
【００２９】
以下実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はかかる実施例により制限されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
［肝細胞癌患者特異的自己抗体検出用抗原タンパク質チップ（抗原チップ）］
自己抗体抗原タンパク質としてＨＳＰ７０、ＳＯＤ２及びＰＲＤＸ６を用いた。抗原タンパク質はいずれも、Ｎ末端側に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とタンパク質精製用のヒスチジンタグを融合させ、Ｃ末端にシステインタグを結合させたリコンビナントタンパク質として大腸菌内で発現させた。７０ｋＤａと比較的大きなタンパク質であるＨＳＰ７０は、２つのドメインに分けて発現させた。すなわち、ＨＳＰ７０のＣ末端ドメイン（ＨＳＰ７０Ｃ）、ＨＳＰ７０のＮ末端ドメイン（ＨＳＰ７０Ｎ）、ＳＯＤ２、又はＰＲＤＸ６の４種類の抗原タンパク質の各Ｎ末端側に、ＧＦＰ及びヒスチジンタグを順次付加させ、各Ｃ末端側にシステインタグを付加させた４種類の融合タンパク質（ＧＦＰ−ＨＳＰ７０Ｃ；ＧＦＰ−ＨＳＰ７０Ｎ；ＧＦＰ−ＳＯＤ２；ＧＦＰ−ＰＲＤＸ６）を大腸菌内で発現させ、リコンビナント融合タンパク質を作製した。なお、コントロールとしてＧＦＰ、ヒスチジンタグ及びシステインタグが融合したタンパク質（ＧＦＰとのみ記載）を用いた（図１ａ）。
【００３１】
リコンビナント融合タンパク質を大腸菌から抽出し、融合タンパク質のヒスチジンタグを利用して、ニッケルカラムを用いてこれら５種類の融合タンパク質を精製後、３ｍｍ×３ｍｍのＤＬＣ表面加工シリカガラスにマレイミド基を導入した基板上に、１２８ｆｍｏｌ／１０ｎｌの５種類の前記融合タンパク質を直径２００μｍ中に横一列に５〜６スポットし、システインとマレイミド基の共有結合を利用して、前記融合タンパク質を前記基板に結合させ、抗原チップを調製した。蛍光顕微鏡を用いて抗原チップ上のＧＦＰの蛍光を検出したところ、５種類すべての融合タンパク質についてＧＦＰの蛍光が検出され、スポットによる蛍光強度に差はほとんど見られなかった（図１ｂ）。このことは、５種類の融合タンパク質は基板へ結合していること、及びスポットによる操作の手ブレがほとんどないことを確認できる。
【実施例２】
【００３２】
［抗原チップ固定化タンパク質の検出］
事前に蛍光顕微鏡でＧＦＰ蛍光を確認した、４種類の抗原タンパク質及びコントロールが結合した基板（抗原チップ）をＴＢＳ−Ｔ溶液（１０ｍＭ  Trizma Base、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Tween 20（登録商標）、ｐＨ７．５）中で１０分間洗浄後、還元剤溶液（６４０ｍＭ  ２−ＭＥ／ＴＢＳ−Ｔ）中で３０分間振盪し、５％ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ溶液中で１時間ブロッキング処理を行った。次に1次抗体として５倍希釈の患者血清液中で１時間３０分間振盪した後（図２（１））、５００倍希釈の抗ＧＦＰマウス抗体（Santa Cruz社製）溶液中で３０分間振盪することで１次抗体反応を行った（図２（２））。ＴＢＳ−Ｔ溶液で洗浄後、Alexa６３３標識抗ヒトＩｇＧ抗体（図２（３））及びAlexa５５５標識抗マウスＩｇＧ抗体（図２（４））の混合液中で１時間、ＴＢＳ−Ｔ溶液で洗浄した。洗浄は２４ウェルプレート、１次抗体液処理は９６ウェルプレート、２次抗体液処理は４８ウェルプレートにて行った。Ｃｙ３蛍光（抗ＧＦＰ抗体検出）でチップ固定化タンパク量を、Ｃｙ５蛍光（抗ヒトＩｇＧ抗体検出）で自己抗体量を画像化した（図２（５））。各タンパクスポットの詳細な観察は蛍光顕微鏡にて、蛍光量測定はイメージスキャナーScan Array（Perkin Elmer社製）にて行った。Ｃｙ３（Laser power９０％、ＰＭＴ gain９５％）、Ｃｙ５（Laser power９５％、ＰＭＴ gain９５％）にて検出した。さらに、患者血清３１試料について、検出器を、ProScan Array（Perkin Elmer社製）に変え、Ｃｙ３（Laser power９０％、ＰＭＴ gain５０％）、Ｃｙ５（Laser power９０％、ＰＭＴ gain９０％）にて検出を行い、検出値をＣｙ５／Ｃｙ３（自己抗体量／固定化タンパク量）で補正し（図２（６））、基板上５〜６スポットの平均値を各血清の判定値とした。結果を図３に示す。
【００３３】
同じ方法を用いても、ＧＦＰ抗体の検出が低下していることがあった。特に、作製直後の抗原チップはＧＦＰ抗体の検出が比較的安定していたが（図３（１）上段）、抗原チップ作製後１ヶ月以上４℃で保存しておいたチップではＧＦＰ抗体の検出にむらが認められる傾向があった（図３（１）下段）。そのような抗原チップの検出操作後タンパクスポットを蛍光観察したところ、タンパクスポットの中でＧＦＰ蛍光が残っている部分にはＧＦＰ抗体が結合していなかった（図３（３））。他方、自己抗体の検出にはむらは認められなかった（図３（２）上段と下段を比較）。従ってＧＦＰの立体構造の変化により抗ＧＦＰ抗体の結合が阻害されたのではないかと考えられた。
【実施例３】
【００３４】
［抗原チップ熱処理の効果］
上記のように、同じ方法を用いてもＧＦＰ抗体の検出が低下していることがあったことから、あらかじめＷＢ解析で自己抗体の検出が高いと確認された患者血清Ｎｏ．１５０、Ｎｏ．１９３の２検体を用いて、検出方法の再検討を行った。種々の検討を行った中で、タンパク質の立体構造を崩し抗原エピトープを裸出させる目的で、タンパク質の変性剤ＳＤＳ及び還元剤２−ＭＥを含む変性・還元剤溶液（２％  ＳＤＳ／６４０ｍＭ  ２−ＭＥ／５０ｍＭ  Tris-HCl（ｐＨ  ６．８）／１０％  glycerol）中で９５℃、５分間の熱処理を行うように変更し（図４、改良点１）、熱処理前、熱処理後、及び検出操作後に抗原チップを蛍光顕微鏡にて撮影して比較した（図５）ところ、熱処理なしの抗原チップは検出操作後でもＧＦＰ蛍光が検出されたが、熱処理した抗原チップは熱処理直後にＧＦＰ蛍光が検出されなくなり、この蛍光消失は検出操作終了後まで持続した。ＧＦＰの蛍光消失は立体構造が崩れていることを示していると考えられた。他方、タンパク質の変性剤（ＳＤＳ）及び還元剤（２−ＭＥ）の存在下に熱処理を行うと、各スポットの抗体で検出されるＧＦＰのシグナル（Ｃｙ３による蛍光）はより強くより均一になった（図５、右から２番目の下段図を上段図と比較参照）。一方で自己抗体検出には大きな変化は認められなかった（図５、右端の下段図を上段図と比較参照）。従って、抗原チップをあらかじめタンパク質の変性剤及び還元剤の存在下に熱処理することにより、基板上に固定化されている抗原タンパク質の量はＧＦＰ抗体を用いてＣｙ３検出として定量できると考えられた。
【実施例４】
【００３５】
［熱処理と２次抗体の２段階処理による検出の向上]
さらに、先に抗原チップに固定された複合タンパク質のＧＦＰ部分に結合した抗マウスＧＦＰ抗体や抗原タンパク質部分に結合した自己抗体が、抗体自体がもつ立体構造により近傍の別の場所の抗体結合を阻害して、最終的な検出を低下させている可能性も考えられた。そこで、混合して使用していた２種の蛍光標識２次抗体１時間振盪のうち、最初の３０分を５００倍希釈抗ヒトＩｇＧ抗体のみで振盪させ、残り３０分で５００倍希釈抗マウスＩｇＧ抗体を追加して振盪するという２段階に改変した（図４、改良点２）。患者血清Ｎｏ．１９３とＮｏ．１５０を用いた蛍光検出結果をグラフ化し（図６ａ−ｄ）、改良前（□；熱処理なし、２次抗体混合）、改良点１の後（△；熱処理あり、２次抗体混合）と改良点１及び２の後（○；熱処理あり、２次抗体２段階）を比較した。ＨＳＰ７０Ｃ検出においては、改良前では検出結果にばらつきがみられたが、改良１及び２の後ではばらつきが少なくなり、直線性が得られるようになった（図６ａ、ｃ）。また、Ｎｏ．１９３血清のＰＲＤＸ６においては、改良前では自己抗体の検出が低かったが、改良１及び２の後には高くなった（図６ｂ）。Ｎｏ．１５０血清のＰＲＤＸ６においては、改良後でもＣｙ３蛍光の比較的強いスポットにおいてもＣｙ５検出は低く、ＰＲＤＸ６自己抗体は検出限界以下と思われた（図６ｄ）。したがって、基板の熱処理と２次抗体２段階処理という２つの改良には顕著な検出改善効果が認められた。
【実施例５】
【００３６】
［抗原チップによる自己抗体検出の数値化］
抗原チップを熱処理し、その後の２次抗体反応を２段階で操作するという上記実施例４の方法（改良点１及び２）が血清中に存在する自己抗体を検出するうえで有効な手段であることがわかったので、ＨＣＶ陽性肝細胞癌（ＨＣＶ＋／ＨＣＣ＋）患者、ＨＣＶ陽性他疾患（ＨＣＶ＋／ＨＣＣ−他疾患）患者、ＨＣＶ陰性他疾患（ＨＣＶ−／ＨＣＣ−他疾患）患者及び健常者の４グループから３１検体の血清を採取し、それら血清中に存在する自己抗体量を上記実施例４の方法（改良点１及び２）を用いて検出した。結果を図７及び８に示す。図７には、ProScan Array (Perkin Elmer社製) autoadjust-modeにて表示された健常者及びＨＣＶ陰性他疾患（ＨＣＶ−／ＨＣＣ−他疾患）患者の血清からの検出例が示されているが、いずれの場合においてもＣｙ３蛍光検出（抗ＧＦＰ抗体検出）は良好であるのに対し、Ｃｙ５蛍光検出（抗ヒトＩｇＧ抗体検出）はバックグランド以下の検出しか得られなかった。そのため、こうした健常者及びＨＣＶ陰性他疾患（ＨＣＶ−／ＨＣＣ−他疾患）患者の血清を陰性と判定した。図８では、ＨＣＶ陽性肝細胞癌患者（ＨＣＶ＋／ＨＣＣ＋）患者からの検出例が示されているが、Ｃｙ３蛍光検出（抗ＧＦＰ抗体検出）は良好であり、またＣｙ５蛍光検出（抗ヒトＩｇＧ抗体検出）は特定の抗原タンパク列にのみ認められた。こうしたＨＣＶ陽性肝細胞癌患者（ＨＣＶ＋／ＨＣＣ＋）患者の血清を陽性と判定した。
【００３７】
そこで、健常者６検体、ＨＣＶ陰性他疾患（ＨＣＶ−／ＨＣＣ−他疾患）患者８検体、ＨＣＶ陽性肝細胞癌（ＨＣＶ＋／ＨＣＣ＋）患者１３検体、及びＨＣＶ陽性他疾患（ＨＣＶ＋／ＨＣＣ−）患者４検体の計３１検体について、蛍光強度の比（Ｃｙ５／Ｃｙ３＝自己抗体量／固定化タンパク量）を算出し、その値をグラフ化して図９に示した。その結果、ＨＣＶ陽性者（ＨＣＶ陽性肝細胞癌患者及びＨＣＶ陽性他疾患患者）の血清は、ＨＣＶ陰性者（ＨＣＶ陰性他疾患患者及び健常者）の血清と比べ、全体として自己抗体検出レベルが高かった。
【００３８】
このグラフを基に、ＨＣＶ陰性患者血清試料が全てＨＣＣ発症示唆陰性となる基準値（Ｃｙ５／Ｃｙ３＝自己抗体量／固定化タンパク量）を求めた。すなわちＨＣＶ陰性他疾患患者８検体と健常者６検体の合計１４検体すべてを陰性とする条件を設定すると、４種類の自己抗体（ＨＳＰ７０Ｃ、ＨＳＰ７０Ｎ、ＳＯＤ２、及びＰＲＤＸ６）のうち少なくとも１種類におけるＨＣＣ発症示唆基準値は０．８となり、４種類の自己抗体のうち少なくとも１種類において０．８以上の値を示す血清をＨＣＣ発症示唆陽性と判定することとした。このＨＣＣ発症示唆基準値０．８に基づき判定すると、ＨＣＶ陽性肝細胞癌患者では１３検体中７検体がＨＣＣ発症示唆陽性であった。また、ＨＣＶ陽性の他疾患患者４検体中でも２検体がＨＣＣ発症示唆陽性であり、ＨＣＶ陽性肝細胞癌患者のＨＣＣ発症示唆陽性検出率と同程度であった。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明の自己抗体の検出方法は、癌、自己免疫疾患、感染症等の各種疾患の診断に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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