(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＣＩＭＢアクセション番号４１４５４または４１４４１の下に寄託された種子から生長させた植物が有する特性である傷誘導性表面変色の軽減を示すか、または該変色を示さないレタス植物であって、
ＮＣＩＭＢアクセション番号４１４５４または４１４４１の下に寄託された種子から生長させた植物を同じ種の別の植物と交雑し、交雑から得られた植物または植物部分を、
ａ）水性環境中で、作りだされた損傷表面を有する植物または植物部分、および、淡紅変、褐変、およびＬ−ＤＯＰＡのメラニンへの転換という変色反応のうち１つまたは複数を示し、その反応をＬ−システインまたはケイ皮アルデヒドにより抑制できる対照の植物または植物部分をインキュベートして、表面内部または表面上に変色を起こさせること、
ｂ）植物または植物部分の内部または表面の損傷表面変色を観察すること、
ｃ）植物または植物部分の内部または表面で観察される損傷表面変色を、対照の植物または植物部分の表面または内部で観察される該変色と比較して、植物または植物部分が、変色を示さないか、または対照の植物または植物部分に比べ変色の程度が軽減しているか否かを評価すること
を含むスクリーニングする方法に付して試験することにより得られるレタス植物またはＮＣＩＭＢアクセション番号４１４５４または４１４４１の下に寄託された種子から生長させたレタス植物。
【請求項２】
スクリーニングされる植物部分が、葉、結球、芽、根、塊茎、茎、花、種子またはその断片および細胞から選択される、請求項１に記載のレタス植物。
【請求項３】
スクリーニングされる植物部分が、円形葉片である、請求項１または２に記載のレタス植物。
【請求項４】
スクリーニングされる植物部分が、中央脈組織から得た円形片である、請求項１または２に記載のレタス植物。
【請求項５】
水性環境が、ぬれたろ紙を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のレタス植物。
【請求項６】
水性環境が、水または溶液を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のレタス植物。
【請求項７】
水性環境が、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、クロロゲン酸、イソクロロゲン酸、Ｌ−チロシンおよびカテコールから選択される化合物を含有する、請求項５または６に記載のレタス植物。
【請求項８】
対照植物が、その円形葉片を２枚のぬれたろ紙の間で７日間５℃でインキュベートすると、縁周囲に淡紅変を示す植物である、請求項１から７のいずれか一項に記載のレタス植物。
【請求項９】
軽減した傷誘導性表面変色を示し、負の多面発現効果を示さない、請求項１から８のいずれか一項に記載のレタス植物。
【請求項１０】
親植物において見られるのと同様に、傷誘導性表面変色を示さないか、または該変色の軽減を示す、請求項１から９のいずれか一項に記載の親植物の後代。
【請求項１１】
傷誘導性表面変色の軽減を示すか、または傷誘導性表面変色の軽減を示す植物に生長させることができる、請求項１から１０のいずれか一項に記載の植物の部分。
【請求項１２】
葉、結球、芽、根、塊茎、茎、花、種子またはその断片および細胞から選択される、請求項１１に記載の植物の部分。
【請求項１３】
親において見られるのと同様に、傷誘導性表面変色を示さないか、または該変色の軽減を示す、請求項１２に記載の植物部分から再生された植物。
【請求項１４】
生長した植物が、傷誘導性表面変色の軽減を示す、請求項１から１０のいずれか一項に記載の植物の種子。
【請求項１５】
親において見られるのと同様に、傷誘導性表面変色を示さないか、または該変色の軽減を示す、請求項１４に記載の種子の後代。
【請求項１６】
請求項１から１０のいずれか一項に記載のレタス植物またはその部分を含む、野菜製品。
【請求項１７】
製品が、傷誘導性表面変色を示さないか、または限られた該変色を示す加工レタスである、請求項１６に記載の野菜製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の集団または植物部分を、対照植物に比べ軽減した傷誘導性表面変色を示す個体のその中での存在についてスクリーニングする方法に関する。また本発明は、この方法により得られる、傷誘導性表面変色を示さないか、または軽減した該変色を示す植物およびその植物由来の部分、ならびにその部分および後代に関する。
【背景技術】
【０００２】
需要の増加により、生鮮農産物、詳細にはレタスの加工は、近年顕著に拡大している。レタスの収穫および加工は、強い損傷応答を誘導する、広範にわたる葉のカットを含んでいる。この損傷応答は、加工製品の急速な劣化をもたらす。この劣化は、損傷表面部およびその周囲での酵素的褐変または淡紅変が原因の変色、呼吸、ならびに蒸散が原因の乾燥によって生じる。とりわけ酵素的褐変または淡紅変は重要性がきわめて高く、パッケージに入った生鮮カットレタスの総合品質を直接的または間接的に決定していると考えられている。
【０００３】
さらに、劣化の結果として微生物の数が著しく増える可能性があり、食品安全性が損なわれかねない。加工レタスが有する非常に傷みやすい性質は、色劣化、におい劣化および質感劣化を消費者に強く感じさせる結果をまねき、そのことが、いわゆる便利食品市場の、今以上の急速な成長を妨げている。
【０００４】
劣化の過程を阻害する目的で多くの化学的または物理的な収穫後処理が開発されており、このような処理は、加工レタスの劣化を遅らせるために適用できる。
【０００５】
その中でも酵素的褐変を阻害するのは、調整気相下での生鮮カットレタスの包装、可食性コーティングの施用、熱ショック処理および化学薬品添加である。酸素を減らした低温の雰囲気下で生鮮カットレタスを包装すると、酵素的褐変を相当軽減できる。しかし、このような調整された低酸素の環境は嫌気性呼吸を引き起こし、これにより、非常に魅力が乏しいと感じさせる、製品の風味劣化およびにおい劣化が生じる。
【０００６】
可食性コーティングは、物理的な遮蔽バリアとして作用し、蒸発および褐変など様々な種類の劣化から農産物を効果的に保護する物質の薄層である。このコーティングは、例えば樹脂、多糖類またはタンパク質で作製できる。
【０００７】
さらに、生鮮カットレタスの褐変は、加工後直ちに４５℃で９０秒の短時間の熱ショックを与えることにより防止できることが実証されている。おそらく熱ショックはタンパク質生合成を、変色に関与する酵素から酵素的褐変能を低下させる熱ショックタンパク質へと変える。あるいは、熱ショック処理が褐変に及ぼす影響は、変色経路に関与する酵素の熱感受性によって説明しうる。
【０００８】
施用可能な化学薬品は、例えば、ビタミンＣなどの還元剤、ＥＤＴＡなどのキレート剤、シクロデキストリンなどの錯化剤、およびＬ−システインなどの酵素阻害剤とすることができる。生鮮食品への化学薬品の施用は明らかに食品安全性の問題にかかわることであり、規制当局の認可が必要である。上述の収穫後技術の併用は考慮可能であり、最終的には、適用される手順は、技術的効力、コストおよび食品安全性の間のバランスで決まる。
【０００９】
適用される技術にかかわらず、加工レタスの収穫後品質の向上にはコストがかかることになるため、当技術分野においては、物理的または化学的な収穫後技術を適用する必要を排除または軽減する代替技術を提供する明白な必要性が存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、酵素的褐変または淡紅変などの収穫後の加工障害に耐性のある植物およびその植物由来の後代を提供するために、低下した傷誘導性変色応答を示す植物を選抜するためのスクリーニング方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、損傷時に顕著に軽減した淡紅変または褐変を示す植物を提供することである。損傷時の変色は、茎、種子、果実、葉、花、塊茎、芽など、植物の部分においても視認できることがある。したがって、本発明のさらなる目的は、この植物部分において低下した傷誘導性変色応答を示す植物を選抜するためのスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって、本発明は、植物の集団または植物部分を、対照の植物または植物部分に比べ軽減した傷誘導性表面変色を示す個体のその中での存在についてスクリーニングする方法を提供し、この方法は、
ａ）植物の集団またはその集団の植物の部分を用意すること、
ｂ）スクリーニング対象の植物または植物部分および対照の植物または植物部分に損傷表面を作り出すこと、
ｃ）損傷表面をインキュベートして、表面内部または表面上に変色を起こさせること、
ｄ）植物または植物部分の内部または表面の損傷表面変色を観察すること、
ｅ）スクリーニング対象の植物または植物部分の内部または表面で観察される損傷表面変色を、対照の植物または植物部分の表面または内部で観察される変色と比較して、変色を示さないか、または対照の植物または植物部分に比べ軽減している変色を示す植物または植物部分を同定すること
を含む。
【００１２】
本発明の方法は、変色を起こしやすいと考えられる任意の植物に対して使用できるが、農産物、特に野菜もしくは果物、または花に対して特に有用である。この方法は、レタスなどの葉菜類、ジャガイモもしくはサツマイモなどの塊茎、根セロリなどの根菜、ウィットルーフなどの芽、またはマッシュルームに対して特に適している。さらにこの方法は、リンゴ、バナナ、アボカド、モモ、洋ナシ、アンズ、マンゴー、ナスなどの果物、およびガーベラの茎、キクの花、アーティチョークの根部などの花または花茎などに対しても使用できる。
【００１３】
本発明のスクリーニング法は、軽減した傷誘導性表面変色を１つまたは複数の部分または組織中に有する植物を同定することを意図している。したがって、スクリーニングに際しては、変色しがちな部分または組織を使用することが非常に実際的である。レタスの場合、これは葉またはパンチ片などの葉の一部であってよく、バナナの場合は皮を剥いた果肉の薄片が適切に使用でき、また、花の場合は茎の薄片が非常に実際的な試験ビヒクルである。
【００１４】
特定の実施形態では、この方法は、傷誘導性表面変色を示さないか、または該変色の軽減を示す、キク科に属する植物、詳細にはラクチュカ属の植物、さらに詳細にはラクチュカ・サティバ（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）種に属する植物、または、チコリ属、詳細にはチコリウム・インティブス（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ  ｉｎｔｙｂｕｓ）種およびチコリウム・エンディヴィア（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ  ｅｎｄｉｖｉａ）種に属する植物の選抜に対して特に有用である。
【００１５】
本発明の方法を用いてスクリーニングされる植物集団は任意の植物集団であってよいが、好ましくは、軽減した傷誘導性変色を示す植物を見い出す機会を増やすため、多くの異なる構成種を有する変異植物集団である。そのような変異集団は、例えば化学薬品および／または照射法を使用した突然変異誘発処理により作製できるため、本明細書中では突然変異体植物集団と呼ぶ。代替的な集団は生殖質収集物であり、これは、自然な変形形態を示す植物の収集物である。また、トランスジェニック植物の集団を使用することもできる。
【００１６】
本発明の方法は、適切には損傷表面を有する植物部分を用いて実施する。非常に有用な試験試料は、葉から打ち抜いた円形片、いわゆる円形葉片である。あるいは、葉脈のある葉菜類の中央脈組織を使用することもできる。適切には、円形片はそのような葉脈から切り取る。
【００１７】
適切には、インキュベーションは水性環境で行われる。本発明の方法は、ぬれたろ紙の上または間でインキュベートされる円形葉片で非常に良好に実施できる。こうすると、変色応答が、紙上の、傷の縁周囲で非常によく視認できる。ラクチュカ属およびチコリ属の植物の場合、この変色は淡紅変応答である。
【００１８】
あるいは、水性環境は水または溶液を含む。以下で詳細に例示する特定の実施形態では、溶液はＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンを含有する。この化合物は、酵素のポリフェノールオキシダーゼにより黒色色素のメラニンという生成物に転換される。この点で使用できる代替的な化合物としては、クロロゲン酸、イソクロロゲン酸、Ｌ−チロシンおよびカテコールが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
さらに本発明は、軽減した傷誘導性表面変色を示す植物に関し、この植物は、植物の集団を本発明のスクリーニング法に供し、スクリーニングにおいて表面変色を示さないか、またはスクリーニングにおいて対照植物に比べ軽減している表面変色を示す集団から植物を選抜することにより入手できる。
【００２０】
適切には、この植物は葉菜類植物、より具体的には、ラクチュカ属、詳細にはラクチュカ・サティバ種に属する植物、またはチコリ属、詳細にはチコリウム・インティブス種およびチコリウム・エンディヴィア種に属する植物である。
【００２１】
好ましくは、本発明の植物は、スクリーニングで同定してから、傷誘導性表面変色が軽減しているか、または変色していないものとして選抜するが、引き続き試験を行って、正常な習性を有するかどうか確認する。より詳細にはこの植物は、好ましくは負の多面発現効果を示すべきではない。
【００２２】
本発明に従い、傷誘導性表面変色を示さないか、または顕著に軽減した該変色を示す植物を同定および選抜した。これらの植物の種子の後代をＮＣＩＭＢに寄託し、表１に掲載のとおりアクセション番号が与えられた。寄託植物の種子子孫に関する詳細は、実施例４および実施例６に示してある。これらの寄託植物は、傷誘導性変色を示さないか、または該変色が顕著に軽減しているという単一の特性を有することから作製されている。これらの寄託植物は、品種登録のためのＤＵＳ基準、すなわち、全ての登録特性における区別性、均一性、安定性については試験しておらず、これらの基準を満たすことは全く期待していない。
【００２３】
【表１】
0005386175.tif 000002
【００２４】
さらに本発明は、傷誘導性表面変色が軽減しているか、または該変色を示さない植物で、本発明の植物を同じ種の別の植物と交雑することにより得られる植物に関する。したがって、「傷誘導性表面変色が軽減しているか、または該変色を示さない」という特徴は、本来その特徴を有していない他の植物に導入できる。そのような交雑の結果得られる植物が実際に本発明の植物であるかどうかは、これらの植物を本発明のスクリーニング法に供することにより試験できる。好ましくは、本発明の植物として選抜する植物は、その後、正常な習性を有することについても試験する。
【００２５】
さらに本発明は、本発明の親植物において見られるのと同様の、傷誘導性葉変色を示さないか、または該変色の軽減を示すという特徴を保持している、該親植物の後代に関する。このような後代は、親から何世代も離れていることがありうる。「傷誘導性表面変色が軽減しているか、または該変色を示さない」という特徴が保持されている限り、その植物は本発明の植物である。
【００２６】
さらに本発明は、本発明の植物の部分に関する。レタスまたはエンダイブの結球または葉などの植物部分は、通常、変色しやすいと思われるカット表面を有する部分である。
【００２７】
本発明の植物部分は、組織培養用の組織が誘導される元の植物において見られるのと同様の、傷誘導性葉変色を示さないか、または該変色の軽減を示すという特徴を保持している植物を再生するために、組織培養において使用できる。このような再生植物も本発明の一部である。
【００２８】
さらに本発明は、本発明の植物の種子に関する。この種子からは、同様に「傷誘導性表面変色が軽減しているか、または該変色を示さない」という特徴を有する植物を栽培できる。種子およびそのようにしてその種子から栽培される植物がこの特徴を保持しているかどうかは、本発明のスクリーニング法で試験できる。また本発明は、元の種子において見られるのと同様の、傷誘導性葉変色を示さないか、または該変色の軽減を示すという特徴を保持しているさらに先の世代の種子に関する。
【００２９】
本発明は、加工野菜市場にとって、商業的に非常に興味深い。上に説明したように、変色した製品は消費者に拒絶されることから、農産物、詳細には生鮮果物および野菜の変色は望ましくないと考えられる。そのため、カットしたレタス、エンダイブもしくはウィットルーフまたはその組合せなどの加工野菜製品において見られる「傷誘導性表面変色が軽減しているか、または該変色を示さない」という本発明の特徴は、好都合である。本発明の方法を用いてスクリーニングすると、本発明の加工野菜は傷誘導性葉変色を示さないか、または限られた該変色を示す。このスクリーニングに適合する全ての加工野菜、詳細には、加工したレタス、エンダイブおよびウィットルーフは、ＰＡＬおよび／またはＰＰＯ依存性の代謝フラックス低下につながる改変を有することが実証されているため、本発明の一部である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
レタスが収穫されカットによる加工が行われると多くの葉表面損傷が生じ、これにより植物または植物部分の顕著な応答が起こり、損傷表面部またはその近接部で褐変または淡紅変が生じる。淡紅変は、根元と同様に、葉の中央脈部の損傷表面から離れた箇所でも観察できる。収穫直前の段階で、作物の非生物的ストレスまたは過成熟によると考えられる淡紅変が観察できることもある。
【００３１】
様々な種類の変色は酵素活性によりもたらされるが、この酵素活性は損傷の結果として強力に高まり、数種のポリフェノールおよびポリフェノール由来の反応生成物を生じさせる。
【００３２】
褐変反応に関与している重要な酵素活性は、ＰＰＯである。酵素的褐変に関連するＰＰＯ活性はレタスに限定されず、リンゴ、バナナおよびジャガイモなどにおける収穫後劣化に関与していることが、他の多くの植物種について説明されている。事実、ＰＰＯは、多くの加工生鮮果物および野菜の収穫後劣化に関与しているもっとも重要な酵素の１つであると広く認識されている。
【００３３】
この理由により、ＰＰＯは、食品の収穫後品質を向上させるためにその活性の低下または抑制を目的とする多くの技術の標的となっている。ＰＰＯは、植物組織中に存在しているポリフェノールが酸化されｏ−キノンの形成を生じさせる反応を触媒する。続いて酵素的反応および非酵素的反応により、褐色または黒色の色素が形成される。
【００３４】
多くの植物種において、ＰＰＯは小規模な遺伝子ファミリーによってコードされており、その個々の構成遺伝子は機能的相違を示す様々な時間的および空間的発現パターンを有している可能性がある。例えば、レタスは葉の光合成組織および維管束組織中に様々なＰＰＯアイソフォームを含有していることが示されている。
【００３５】
異なる種間では、ＰＰＯの天然基質が異なることがある。レタスの場合、クロロゲン酸およびイソクロロゲン酸などのカフェー酸誘導体がＰＰＯ基質として主に作用する。
【００３６】
ＰＰＯ酵素のレベルは、植物組織の損傷時に特異的に誘導されるのではなく、葉緑体中に不活性な状態で存在している。損傷時には、液胞中に存在しているフェノール性基質が組織破壊によりＰＰＯと接触するという事実によって顕在化したＰＰＯが活性化される。
【００３７】
レタスの場合、損傷時に、ＰＰＯの基質であるポリフェノールの生成が誘導される。したがって、レタス組織の褐変能は、葉組織中のＰＰＯの量によって制限されるのではなく、むしろ損傷時のポリフェノール生合成の速度によって制限されると思われる。
【００３８】
この点については、作物間で状況が異なる可能性がある。例えば、リンゴの場合は、ポリフェノールの量は損傷後１時間以内に果実の褐変応答を引き起こすのに十分であるのに対し、レタスの場合、レタスにおいては貯留されるポリフェノールは大部分が損傷時に新規に合成される必要があるという事実により、褐変反応が起きるには数日かかることがある。
【００３９】
ポリフェノールの合成は、フェニルプロパノイド経路と呼ばれるかなり特徴的な生化学経路を経由して起きる。この経路の始動反応は、酵素のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ、Ｈａｈｌｂｒｏｃｋ，ＫおよびＳｃｈｅｅｌ，Ｄ（１９８９）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０，３４７〜３６９）により触媒される。ＰＡＬは、シキミ酸経路を経由して合成されるアミノ酸のフェニルアラニンをケイ皮酸に転換する。
【００４０】
レタスの場合、葉の損傷はＰＡＬ遺伝子発現およびＰＡＬ活性の強力な誘導につながる。ポリフェノールの形成はこの酵素活性と相関があり、このことは、レタスの損傷によって誘導されるＰＡＬ活性が、褐変の原因となる重要な因子であることを示唆している（Ｃａｍｐｏｓ，Ｒ．ら（２００４）Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ  １２１，４２９〜４３８および同稿中の参考文献）。しかしながら、他のどの因子が傷誘導性変色反応の最終的な結果を決定するのか、現時点では明らかではない。例えば、変色の最終的な程度が定まる際にペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の活性も同様に重要であることが示唆されている（Ｆｕｋｕｍｏｔｏ，Ｌ．Ｒ．ら（２００２）Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．５４０，４５０３〜４５１１；Ｍａｒｔｉｎ−Ｄｉａｎａ  Ａ．ら（２００５）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６９，１６７７〜１６８５）。
【００４１】
酵素活性は体内の過酸化水素の可用性に依存しているため、変色に対するＰＯＤの寄与は制限される可能性がある。
【００４２】
さらに、損傷は何らかの形で植物により認知され、それに続いてあるカスケードを経て信号が発生するということは明白であるが、レタスについては現時点でこのカスケードはあまり明確になっていない。これらの活性は本来、傷の治癒および病原体に対する防御を目的としたものであろうということは明らかだと思われる。したがって、損傷を受けたレタス組織の変色応答の増加には多くの遺伝的因子が関与しており、それらの各因子は、傷誘導性変色を軽減し、または消滅させる遺伝的改変のための潜在的標的であると考えられる。
【００４３】
このような遺伝的因子の大半は現時点で未知であり、また、関与することが知られている遺伝的因子であっても、これらの因子が変色反応において特定の役割をどの程度果たしているのか、あるいはまた植物の傷生理に関し、より全般的な機能をどの程度有しているのかについては明らかになっていない。
【００４４】
例えば、傷誘導性ＰＡＬ活性はレタスの褐変の程度を決定していると考えられるが、フェニルプロパノイド経路の生成物は、とりわけ細胞壁生合成または防御応答にも関与していることが知られている。したがって、褐変能を低下させるために傷誘導性ＰＡＬ活性を低下させると、傷誘導性褐変以外の他の機能をも損なう可能性があり、そのことは、レタス栽培の他の点に関してあまり望ましくないと考えられる。
【００４５】
同様に、ＰＰＯ活性は防御応答に関与していることが示唆されており、そのため、ＰＰＯ濃度を低下させることにより褐変能を低下させると、病原体に対する感受性が高まる可能性がある（Ｔｈｉｐｙａｐｏｎｇ，Ｐ．ら（２００４）Ｐｌａｎｔａ  ２２０，１０５〜１１７）。そのため発明者は、よりバイアスのかかっていない手順の方がこの点について上首尾であろうと判断した。このような手順は、以下の工程を含む。
１．植物の変異体集団、詳細には突然変異体集団の作出。このような突然変異体集団は、種子または植物組織をエチルメタンスルホン酸（ｅｍｓ）などの突然変異原またはＸ線で処理することにより作出できる。
２．スクリーニングにおける選抜が、植物、詳細には葉菜類、より詳細にはレタス、エンダイブまたはウィットルーフの、ＰＡＬおよび／またはＰＰＯにより導かれる損傷応答誘導性変色に基づく、効率的な表現型スクリーニングのセットアップ。
３．収穫後の変色能に関して、また、植物、詳細には葉菜類、より詳細にはレタス、エンダイブまたはウィットルーフの栽培および加工に悪影響を及ぼす、改変の多面発現効果がないことに関して、その損傷応答が改変された突然変異体の、一般的な方法に従った特徴づけ。
【００４６】
したがって一実施形態では、本発明は、傷誘導性変色および酵素的褐変または淡紅変など収穫後の加工障害の軽減を示す植物を同定、選抜および入手するためのバイアスのかかっていないスクリーニング法に関する。
【００４７】
別の実施形態では、本発明は、ＰＰＯにより色素に転換される基質を用いた、よりバイアスのかかった方法に関する。このアッセイでは、スクリーニングは明確にＰＰＯ突然変異体を狙いとしている。適切な基質は、黒色色素のメラニンに転換されるＬ−ＤＯＰＡである。
【００４８】
本発明は、本明細書中ではレタスなどの葉菜類を引き合いに出して例示するが、同様に、上述のような他の植物でも実施できる。
【００４９】
本発明の方法で使用するための突然変異体植物集団は、例えば以下のように調製できる。
ａ）突然変異原で改変する植物種のＭ０種子を処理してＭ１種子を得る、
ｂ）このようにして得たＭ１種子から植物を生長させてＭ１植物を得る、
ｃ）所望により、工程ｂ）およびｃ）をｎ回繰り返して、Ｍ１＋ｎ種子を得る、
ｄ）このようにして得たＭ１＋ｎ種子を発芽させて、この種子から植物を生長させる。
【００５０】
本発明に従い、続いてこれらの植物を傷誘導性変色応答についてアッセイする。損傷に対し変色応答を示さないか、または低下した変色応答を示す植物を選抜する。次に、選抜した植物の後代を栽培し、傷誘導性変色応答を評価する。
【００５１】
遺伝的可変性を創出するためには、突然変異誘発を用いることができる。レタスなどの植物種において遺伝的突然変異を誘導するために使用できるいくつかの化学薬品または物理的処理は当業者に公知である。例えば、様々な濃度のｅｍｓなどの突然変異原を含有している溶液中でレタスの種子を処理できる。ｅｍｓは主にＤＮＡ鎖のＧ残基をアルキル化し、この結果、ＤＮＡ複製中にＣの代わりにＴとの対合が生じる。その結果、ＧＣ塩基対は、ｅｍｓの有効量と植物のミスマッチ修復系の活性とにより決定される頻度で、ＡＴ塩基対に入れ替わる。
【００５２】
ｅｍｓの有効量は、使用する濃度、種子の大きさおよび他の物性、ならびにｅｍｓ溶液中での種子のインキュベーション時間に依存する。ｅｍｓで処理した種子を、一般にＭ１種子と呼ぶ。処理の結果として、Ｍ１種子の組織はその細胞のゲノム中にランダムな点突然変異を有し、生殖細胞系組織を形成することになる細胞（生殖細胞）の亜集団中に存在するそのような変異は、Ｍ２と呼ばれる次世代に伝わることになる。不稔性の原因となるハプロ不全である突然変異もしくは胚死を誘導する突然変異またはその組合せは、Ｍ２世代に伝わらないと考えられる。
【００５３】
ｅｍｓの使用について上述したような同様の手順は、他の突然変異原にも適用される。適切な突然変異原は、当技術分野では周知である。特に有用なのは、ジエチル硫酸（ｄｅｓ）、エチレンイミン（ｅｉ）、プロパンスルトン、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソウレタン（ｍｎｕ）、Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチルウレア（ＮＭＵ）、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（ｅｎｕ）、アジ化ナトリウムなどのアルキル化突然変異原である。
【００５４】
あるいは突然変異は、例えばＸ線、高速中性子、紫外線の照射から選択される照射法により誘導する。
【００５５】
本発明の別の実施形態では、突然変異は、キメラオリゴヌクレオチドの使用、相同組換え、遺伝子ターゲッティング、体内生成物と競合する改変された標的遺伝子の導入、ＲＮＡ干渉による下方制御などを用いた遺伝子工学により誘導する。
【００５６】
突然変異誘発処理のＭ２集団は、ＰＡＬおよびＰＰＯにより導かれる損傷応答を対象としたスクリーニング手順において使用できる。遺伝的変形形態を有している任意の植物集団をこのような表現型スクリーニングのための出発材料として採用できることは、当業者には自明である。
【００５７】
好ましくは、さらに本発明は、傷誘導性変色応答低下の原因となる対立遺伝子を積み上げることに関する。
【００５８】
Ｍ１およびＭ１＋ｎ種子の作出は、自家受粉により適切に達成される。
【００５９】
さらに本発明は、遺伝子型の変化した植物または植物部分を入手することに関し、この植物または植物部分は、酵素的褐変または淡紅変など収穫後の生理的な加工障害に対する感受性低下を示す。本発明は、酵素的褐変または淡紅変など収穫後の加工障害に対する感受性低下の原因であってレタス植物のゲノム中で見られる遺伝情報をゲノム中に有する植物または植物部分に関する。
【００６０】
特許請求しているように、この植物の後代も本発明の一部である。本明細書中で使用する「後代」は、本明細書中に記載の元の植物、および、自家受精もしくは同属の別の植物との他家受精などの有性生殖、または挿し木、組織培養、一倍体培養、プロトプラスト培養、プロトプラスト融合などの栄養生殖、または他の手順によるなど、何らかの方法による元の植物由来の植物と同一または同様の低下した感受性を、収穫後の加工障害、詳細には酵素的褐変または淡紅変に対して有する全ての植物を網羅することを意図している。このような後代とは、こうした手順の１つまたは複数により得られる第１世代の植物だけでなく、得られた植物の感受性が低下している場合には、こうした手順の１つまたは複数により得られる、以降の各世代の植物のことでもある。
【００６１】
酵素的変色反応は損傷時に誘導されるので、本発明の表現型スクリーニングを実施するためには損傷表面を生じさせる必要がある。損傷は、カット、打ち抜き、薄切り、擦過、押しつぶし、破壊、剥離、破砕、圧迫、切り裂き、粉砕、液体注入、浸透圧ショック、切り取り、刈り取り、細断、摩擦および引き裂きなどの方法により、自然植物、組織および／または細胞構造を不可逆的に乱すことである。
【００６２】
続いて、組織変色に至る経路についての指標であり突然変異体集団のスクリーニングにおいて非常に効率的に使用できる表現型特性を生じさせる必要がある。
【００６３】
驚くべきことに、このような表現型特性は、レタス植物の葉部分を採取し、様々な形態の損傷表面変色の発生を促進する非常に特異な条件下でこれをインキュベートすることにより得られることを見い出した。続いて、このようなアッセイを、傷誘導性変色応答の低下を示すそのような植物を選抜するために数多くの突然変異体植物に適用できる。
【００６４】
本発明の一実施形態は、葉、詳細にはレタス葉から円形片を採取し、ぬれたろ紙の間で５℃でインキュベートすると、およそ４日後、円形葉片の縁で淡紅色色素の形成が明らかになる、という驚くべき発見に基づいている。適切なろ紙は、Ｓｃｈｌｅｉｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＧｍｂＨ、Ｄａｓｓｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ製の１４５０ＣＶ、照会番号１０３１３２８１の種類のろ紙である。さらにインキュベーションすると、信号は強まり、およそ１週間後に最大強度に達した。淡紅色色素の形成は、損傷表面で特異的に生じる。
【００６５】
変色は、褐変または淡紅変がないことを意味する０から、標準的なレタス品種（Ｌ．サティバ）のような褐変および淡紅変を意味する１０までの視覚尺度上でのスコアリングにより測定できる。本実施例では、Ｌ．サティバ品種「トルバドール（Ｔｒｏｕｂａｄｏｕｒ）」を１０の基準として使用する。所望により、０と１０の間の中間クラスのスコアとの比較のために写真を使用してもよい。また、淡紅色色素のついたろ紙のデジタル画像を作製してから、円形葉片の箇所ごとに、濃い淡紅色の画素の数を数えてもよい。これらの測定法の１つを使用し、当業者には周知のｔ検定などの単純統計分析を実施して、植物または植物群が栽培品種「トルバドール」などの標準より淡紅変が有意に少ないかどうかを確認できる。片側検定の、適用する有意水準は０．００１である。
【００６６】
突然変異体については、もっとも入手しやすい標準である元の品種の淡紅変スコアと、個々の突然変異体および／またはその子孫の淡紅変スコアとの間で統計的比較を実施できる。
【００６７】
既存の植物において本発明の形質を見い出すには、品種の代表試料、育種系統および／または遺伝子バンク受託植物を使用できる。その後、調査中の個々の受託植物の淡紅変スコアとそれ以外の集団との間で統計的比較を実施できる。有意に少ない淡紅変について個体を統計的に検定するときは、適切な全体の有意水準を維持するために、例えば１つの基準を用いたダネットの多重比較検定（Ｄｕｎｎｅｔｔ  ＣＷ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｓｔａｔｉｓｔ．Ａｓｓｏｃ．５０：１０９６〜１１２１（１９５５））などの多重比較検定が必要と思われる。
【００６８】
さらに、傷誘導性変色応答は異なる発育段階の葉の多種多様な組織を使用して得られることが示された。例えば、中央脈組織を、損傷時にこの応答を示すように誘導することもできる。バターヘッド、アイスバーグ、コス、バタビアまたはオークリーフなど異なる種類のレタスに適用した際には、調査対象の集団以外の集団より有意に少ない淡紅変を示す個体アクセションは見られなかった。
【００６９】
さらに、本発明に従い、ＰＰＯの特異的阻害剤のＬ−システインは、この反応中に施用されると、淡紅色色素の形成を強力に抑制することが実証された。加えて、淡紅色色素の形成は、ＰＡＬ活性および生鮮カットレタスの褐変の阻害剤であるケイ皮アルデヒドにより抑制されることも見い出された（Ｆｕｊｉｔａ，Ｎ．ら（２００６）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０，６７２〜６７６）。これらの発見は、レタスの淡紅変応答がＰＡＬおよびＰＰＯ依存性であることを示している。
【００７０】
生鮮カットレタスの酵素的褐変は、短時間の熱ショックを与えることにより非常に効果的に防止されることが知られている。観察される効果は、フェニルプロパノイド経路から、ポリフェノールの形成に向けられる代謝フラックスを減少させる熱ショックタンパク質へと、タンパク質生合成の経路が切り替わると仮定することにより説明できる。
【００７１】
あるいは、この効果は、ＰＰＯおよびＰＯＤなどのポリフェノール酸化に関与する酵素が熱ショック処理により失活すると仮定することにより説明しうる。淡紅変応答について続いてアッセイを行うレタスに熱ショックを与えると、酵素的褐変などのこうした応答が効果的に抑制されることが示された。このことは、本発明の一部であるレタスの淡紅変応答が周知の酵素的褐変応答と生理学的に非常によく似ていることを実証している。
【００７２】
この発見は、還元剤としてＬ−システインを施用することにより、さらに実証された。Ｌ−システインは、ＰＰＯの阻害剤である他、有色のｏ−キノンと反応し、化学的還元反応においてこれを無色のジフェノールに戻すことも知られている。レタスの円形葉片により形成された淡紅色色素をＬ−システインで処理すると、淡紅色の化合物が無色の化合物に転換されることが実証された。したがって、淡紅色色素はＰＰＯにより形成されたｏ−キノンであると考えられる。
【００７３】
このことは、アスコルビン酸またはグルタチオンなどの還元剤もまた、淡紅色色素を無色の化合物に転換するという発見により裏づけられた。
【００７４】
加えて、屋外から採取すると淡紅変を示す植物をＬ−システインで処理すると、淡紅変は同様に除去される。このことは、円形葉片の淡紅変応答は、屋外条件下で生育している植物においても見られることのある自然発生的な淡紅変現象を表しているということを実証している。
【００７５】
本発明のさらなる実施形態は、以下の実験に基づいている。レタスの結球の葉部分をカットにより作製し、空気下、１６℃でインキュベートする。応答として、損傷表面はおよそ４日後に褐色に変わる。特に中央脈の損傷表面で、褐変が明瞭に観察できる。さらに、褐変反応は、カットまたは擦過により葉に損傷を与えた際に、植物の全体レベルでも観察できる。
【００７６】
これら全ての褐変反応は、ＰＰＯの阻害剤であるＬ−システインにより完全に抑制でき、このことは、これらの表現型はＰＰＯ活性により生じること、したがってレタスの加工および包装中に観察されるような収穫後の褐変の指標と判断できるということを実証している。
【００７７】
このような傷誘導性褐変反応は、傷誘導性褐変能が低下している突然変異体植物を同定するための表現型スクリーニング手順で利用可能な効率的な方法で発生させることができる。
【００７８】
本発明のさらなる実施形態は、フェノール酸化酵素により有色の化合物に転換させることができる基質を施用することにより誘導される、レタス組織の損傷表面での変色に基づいている。
【００７９】
例えば、レタスの円形葉片をＰＰＯの基質であるＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）でインキュベートすると、損傷表面で暗褐色ないし黒色の変色が観察されるが、これは、ＰＰＯによるメラニン形成の現れである。同時にＬ−システインを施用すると、黒変は完全に抑制されたが、このことは、この変色がＰＰＯ媒介性であるという仮定を裏づける。
【００８０】
Ｌ−ＤＯＰＡは、レタスのＰＰＯの天然基質だとは考えられていないが、軽減した傷誘導性変色を示す突然変異体の同定を目的としたアッセイにおいて有用でありうる。
【００８１】
Ｌ−ＤＯＰＡについて記載したのと同様の方法で、変色応答を起こさせるために他の基質を施用してもよい。このような基質としてはクロロゲン酸、イソクロロゲン酸、Ｌ−チロシン、およびカテコールが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
まとめると、植物において発生させた損傷表面での様々な色素の形成により、ＰＡＬおよびＰＰＯにより導かれ変色をもたらす損傷信号の誘導によって開始する経路の変更がモニターされる。上述のとおり、このような傷誘導性変色反応は、非常に効率的な突然変異体スクリーニング手順を可能にする視覚的検査により容易に評価できる。本発明により説明する方法の基礎となる論拠を図１に示す。
【００８３】
このように、本発明に従い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの円形葉片の傷誘導性変色経路は、工業規模で加工されたレタスの傷誘導性変色と大部分重なっており、そのためこの過程の指標と判断できるということが見い出された。このことは、ＰＡＬまたはＰＰＯの阻害剤が、実際の工業的条件下で加工および包装されたレタスの酵素的褐変を抑制するという認識により裏づけられる。重要なことに、この手順は誘導工程、すなわち、損傷およびＰＰＯにより媒介される最終的な代謝的変換の１つを含んでいるため、この手順によって、この生理学的過程に直接的または間接的に関与している全ての遺伝的因子を把握することが可能になる。さらに、この応答は異なる発育段階の葉の全範囲の葉組織を使用して発生させることができるため、突然変異体スクリーニングは、関連性があると考えられる場合、これらの異なる段階の組織に狙いをつけることができる。
【００８４】
損傷を受けてから上述の表現型アッセイの１つまたは複数に基づくＰＡＬおよびＰＰＯ依存性の変色に至る生理過程に関して改変されていると同定された突然変異体植物を、さらに特徴づけることができる。そのような特徴づけは、例えば分子、生化学、生理学および表現型レベルなど様々なレベルで行うことができる。
【００８５】
元の集団における変色形質に影響を与える、異なる突然変異体遺伝子座、または、対立遺伝子の形態が異なる同一の遺伝子座のいずれかの存在を反映していると考えられる様々な程度の変色が観察されうることは、当業者には自明である。
【００８６】
劣性突然変異の場合は、これら２つの可能性は、２つの突然変異体植物を交雑すること、およびその交雑種の表現型を決定することを含む対立性検定を実施することにより、容易に区別できる。突然変異の対立性の場合、変色形質の低下はＦ１において明らかであると考えられるのに対し、突然変異体における表現型が、異なる劣性遺伝子座により決定されている場合には、そのようにはならないと思われる。
【００８７】
開始集団を作出するためにランダムな突然変異誘発を施したため、遺伝的背景の突然変異が実験条件下の表現型の変形形態にも寄与している可能性がある。強さが異なる単一突然変異と遺伝的背景における突然変異の複合効果とを区別するために、戻し交雑を実施して、軽減した変色の異なる事象についての均一な遺伝的背景を作り出すべきである。
【００８８】
さらに、このような手順は、傷誘導性変色に関与している特定の遺伝子座での突然変異が多面発現効果を示しているかどうかを確認するのに適切である。
【００８９】
低下した変色応答に基づいてこのように選抜したＭ２植物は、Ｍ３種子を育てるために使用する。続いて、軽減した変色の事象に由来している近交系を、低下した損傷応答について再評価する。加えて、異なる遺伝的背景において、また、作物栽培および加工の異なる条件下において、軽減した褐変または淡紅変を評価することができる。
【００９０】
遺伝的改変によりもたらされる、経路に関連する問題に対処するには、生化学試験を実施することができる。ＰＡＬ、ＰＰＯまたはペルオキシダーゼをコードしている遺伝子のように酵素的褐変または淡紅変応答に関与していると推定される候補遺伝子が改変されているかどうかを確認するには、分子試験を実施することができる。候補遺伝子において見られる改変が表現型の変化に関し原因となっているかどうかを実証するには、続いて遺伝分析を実施することになろう。
【００９１】
誘導された突然変異誘発は本発明で使用するのに好ましい方法であるが、植物のゲノム中に存在している遺伝子ターゲットを特定の方法で改変できる技術が存在することは、当業者には公知である。例えば、キメラオリゴヌクレオチドは、特定の作用機序を有する効果的な突然変異原であることが実証されている。
【００９２】
別の手順は、相同組換えまたは遺伝子ターゲッティングにより遺伝子ターゲットを改変することである。このような手順を用いると、遺伝子の断片は、所望の改変を有している導入済みのＤＮＡ断片と交換される。また、体内生成物と競合する改変された標的遺伝子が導入されているトランスジェニック手順も実施可能である。これは優性の負の効果をまねきうる。さらに、遺伝子発現の特定の下方制御は、ＲＮＡ干渉により実施可能である。
【００９３】
突然変異原性オリゴヌクレオチドの場合は、傷誘導性変色応答に関与している遺伝的因子を改変するために遺伝子ターゲッティングまたはトランスジェニック手順を使用するが、当然、関連遺伝子の一次構造が知られている必要がある。
【００９４】
本発明のさらなる一部分は、レタスの円形葉片の傷誘導性淡紅変に基づいて同定されたレタスの突然変異体および該変異体由来の後代に関する。この紅変アッセイを、ランダムなｅｍｓ誘導性突然変異を有するＭ２集団の植物に適用すると、ｅｍｓ誘導性突然変異を有さない対照植物に比べ淡紅変応答の顕著な低下を示すいくつかの突然変異体が同定される結果となった。
【００９５】
このような突然変異体の大部分は、矮化しかつ多くの場合黄化した表現型を示した。しかし驚くべきことに、淡紅変応答が低下している突然変異体の中には、正常な成長習性、すなわち対照植物と非常によく似た大きさ、形状、成長および色を示すものがあることが見い出された。
【００９６】
自家受精により得られた種子から栽培したこの特定の突然変異体の後代植物を淡紅変についてアッセイすると、最初に同定した突然変異体について見られたのと同様の軽減が観察される。このことは、低下した淡紅変応答は遺伝性である可能性があり、ゲノムの改変により生じさせられることを実証している。
【００９７】
さらなる驚くべき発見は、後代植物を栽培し成熟させ、損傷した中央脈組織の酵素的褐変について試験すると、この応答も強力に抑制されているという事実であった。
【００９８】
このことは、本発明の一部である円形葉片淡紅変アッセイがレタスにおける酵素的褐変に原因として関連していること、また、この淡紅変アッセイは成熟したレタス植物の酵素的褐変の程度を予測するために使用できることを示している。
【００９９】
したがって、この円形葉片淡紅変アッセイは、酵素的褐変能が低下したレタス植物を同定するための選抜ツールとして使用できる。このようなツールは、当該集団中に存在している遺伝的変形形態の原因に関係なく、任意の種類の植物集団から酵素的褐変能が低下したレタス植物を同定するために使用できる。例えば、ｅｍｓ集団の他、自然アクセションまたは育種集団を使用することもできる。
【０１００】
本発明が提供するスクリーニング法の１つまたは複数を、収穫後の加工品質を向上させる必要がある任意の葉菜類種に適用することができる。したがって、本発明は、栽培種のレタスの他、ラクチュカ属の野生種など、キク科に属する他の植物種にも適用できる。さらに、本発明は詳細には、エンダイブ（チコリウム・エンディヴィア）、チコリおよびウィットルーフチコリ（チコリウム・インティブス）などの種が属するチコリ属の植物に属する植物種に適用できる。
【０１０１】
本発明は、本明細書中に開示してあるスクリーニング法の１つを実施することにより植物中で検出できる表現型特徴に関する。本発明の植物は、対照植物と比較して、傷誘導性表面変色を示さないか、または該変色の軽減を示す植物である。この特徴の存在は、３つの変色試験、すなわち淡紅変もしくは褐変の発生または基質のＬ−ＤＯＰＡをメラニンに転換する能力の試験の１つまたは複数により確認する。本発明の植物は、これらの試験の少なくとも１つにおいて、対照に比べ少なくとも軽減している変色を示す植物である。
【０１０２】
本明細書中で使用する場合の「対照」は、淡紅変、褐変、およびＬ−ＤＯＰＡのメラニンへの転換という変色反応のうち１つまたは複数を示し、その反応をＬ−システインまたはケイ皮アルデヒドにより抑制できることが知られている任意の植物である。適切には、ぬれたろ紙の間で円形葉片を５℃で７日間インキュベートした際に、円形葉片の縁周囲に淡紅変を示す植物を使用する。
【０１０３】
本発明を以下の実施例でさらに例示するが、本実施例は決して、本発明を制限することを意図したものではない。本実施例はレタスを引き合いに出しているが、レタスの代わりに他の農産植物またはその部分、詳細には生鮮果物および野菜を使用できる。本実施例においては、追って記載の図面を参照する。
【実施例】
【０１０４】
（実施例１）
ｅｍｓを使用したレタスの遺伝的改変
レタス品種トルバドールＴｒｏｕｂａｄｏｕｒ，Ａｐａｃｈｅ，Ｙｏｒｖｉｋ  ａｎｄ  Ｒｏｄｅｒｉｃｋの種子およそ２０００個を、０．０５％（ｗ／ｖ）ｅｍｓまたは０．０７％（ｗ／ｖ）ｅｍｓのいずれかの通気溶液中で、２４時間室温でインキュベートした。ｅｍｓ処理の後、Ｍ１種子を水ですすぎ、２０℃で１６時間明期／８時間暗期の管理方式で温室に植え、成熟した植物を栽培し、Ｍ２種子を作出するために薹立ちさせ花が咲くように誘導した。成熟後、Ｍ２種子を収穫し、まとめて、後日使用するまで保存した。突然変異頻度は、クロロフィル生合成が阻害される白化した表現型を有する個々の植物の相対数に基づいて推定した。
【０１０５】
（実施例２）
淡紅色色素形成に基づくレタスの傷誘導性変色についての表現型スクリーニング指標の開発
損傷により誘導されたレタスの葉変色を容易に評価できる表現型アッセイを開発した。この手順は、変色についての幼若植物スクリーニングを可能にする。直径５ｍｍの円形葉片を幼若植物または成熟植物から採取し、トレーに入れたぬれたろ紙の間に置いた。この系を５℃で７日間インキュベートした。インキュベーション期間中、円形葉片の損傷箇所で淡紅色色素が発色し、この色素は、ろ紙上で、印刷された円のように明瞭に視認できるようになった（図２）。
【０１０６】
淡紅色色素の生成には活性化したフェニルプロパノイド経路が必要であることを実証するために、ＰＡＬの阻害剤（ケイ皮アルデヒド、図３）およびＰＰＯの阻害剤（Ｌ−システイン、図４）の作用をこのアッセイで試験した。ケイ皮アルデヒドをアッセイ中に施用すると、０．０１％以上の濃度で、淡紅変は完全に抑制された。
【０１０７】
Ｌ−システインを０．００１％以上の濃度で使用すると同様の結果が得られたが、これに対し、Ｌ−ロイシンまたはＬ−アラニンなどの他のアミノ酸は作用を全く示さなかった。このことは、Ｌ−システインはレタスの円形葉片の淡紅変応答を抑制できること、また、Ｌ−システインの阻害剤作用は特異的であることを実証している。
【０１０８】
Ｌ−システインが事実この系におけるＰＰＯ活性の阻害剤として作用していることを実証するために、レタスの円形葉片をＰＰＯ基質のＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）でインキュベートした。Ｌ−ＤＯＰＡはレタスのＰＰＯの天然基質であるとは考えられないが、ＰＰＯによるメラニン形成の現れである暗褐色ないし黒色の変色が損傷表面で観察された。１ｍＭ以上の濃度のＬ−システインを同時に施用すると、図５に示すように、この変色は完全に抑制された。
【０１０９】
損傷応答を誘導する前に熱ショックを与えることにより、レタスの円形葉片淡紅変応答をさらに特徴づけた。切り取った葉を９０秒間２１、４０、５０および６０℃でインキュベートした。この処理の後、円形葉片を取り出し、淡紅変についてアッセイを行った。５０℃以上の温度で熱ショックを実施すると、淡紅変応答は完全に抑制された。この結果を図６に示す。
【０１１０】
Ｌ−システインは、ＰＰＯの生成物であるｏ−キノンと反応し、これを無色のジフェノールに戻すことが知られているため、レタスの円形葉片に由来する淡紅色色素に対するＬ−システインの効果を確認した。平行して、Ｌ−ＤＯＰＡでのインキュベーション時のメラニン形成に対するＬ−システインの効果を確認した。
【０１１１】
上述の手順に従って、円形葉片を採取しインキュベートした。損傷応答が完了した後、一連の濃度のＬ−システインを円形葉片に加え、色の変化をモニターした。結果を図７に示す。この実験により、Ｌ−システインは淡紅色色素を無色の化合物に戻していたのに対し、Ｌ−ＤＯＰＡアッセイで形成された黒色メラニンはＬ−システインにより影響されないことが明確に実証された。このことは、淡紅色色素がレタスのポリフェノール酸化系により形成されるｏ−キノンに非常によく似ていることを実証している。
【０１１２】
観察されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ応答が生理的に関係した応答を反映していることを実証するために、Ｌ−システインに基づく脱色を、屋外栽培の植物材料に施した。これは、葉脈に沿って激しい淡紅変症状を示した屋外栽培のレタス植物から葉を収穫することにより実施した。この症状は、植物が、例えば過酷な湛水条件によりストレスを与えられた際に典型的に観察される。葉を使用して円形葉片を調製し、円形葉片は直ちに１ｍＭ  Ｌ−システインでインキュベートした。およそ３０分の室温でのインキュベーションの後、図８に示すように淡紅変は消滅した。
【０１１３】
まとめると、これらの実験データは、損傷を与えることによって、ＰＡＬおよびＰＰＯ依存性の淡紅変を生じるようにレタスの円形葉片を誘導できることを示している。この表現型により、ＰＡＬ、ＰＰＯまたはその両方によって導かれる変色が誘導される、改変された損傷応答を有するレタスの突然変異体の、効率的で効果的なスクリーニング手順が可能になる。
【０１１４】
（実施例３）
軽減した傷誘導性変色を示す突然変異体のスクリーニング
傷誘導性の酵素的褐変能または淡紅変能が低いレタスの突然変異体を同定するために、実施例２に記載の円形葉片アッセイを、レタスの突然変異体集団の植物に適用した。
【０１１５】
１２０００個体の植物を温室内で栽培し（所在地：オランダ国Ｄｅ  Ｌｉｅｒ、播種：３月２８日、植付け：４月１８日、普通のレタス栽培者の条件下で栽培）、各個体植物から円形葉片１枚を採取し（試料採取：５月１５日以降）、ぬれたろ紙の間で（平均）２５試料のプールとして５℃で７日間インキュベートした。淡紅変の強度に応じて各円形葉片に視覚的スコアをつけた。この評価に基づき、円形葉片が損傷表面変色を示さないか、または比較的低度の該変色を示した植物を選抜した。変色跡がほとんど視認できない植物に０６Ｄ．２１０２０２と番号をつけた。
【０１１６】
１２０００個体の植物のうち、ほとんど視認できない変色跡のみを示した１個体の植物、および比較的低度の変色を示した１１個体の植物を最終的に選抜した。これらのアッセイのうち１つの結果を図９に示す。
【０１１７】
最初に選抜した１２個体について変色アッセイを繰り返すと、ほとんどの個体事例について、元の結果が確認された。確認された個体のみを、さらなる分析および種子作出用に選抜した。
【０１１８】
（実施例４）
軽減した傷誘導性変色を示す突然変異体のスクリーニング
傷誘導性の酵素的褐変能が低いレタスの突然変異体を同定するために、実施例２に記載の円形葉片アッセイをレタスの突然変異体集団の植物に適用した。８５００個体の植物を３週齢（６〜８葉段階）まで温室内で栽培し、各個体植物から円形葉片を採取し、ぬれたろ紙の間で５℃で７日間インキュベートした。
【０１１９】
淡紅変の強度に応じて各円形葉片に視覚的スコアをつけた。この評価に基づき、円形葉片が損傷表面変色を示さないか、または比較的低度の該変色を示した植物を選抜した。８５００個体の植物のうち、視認できる変色を全く示さなかった８個体の植物、および比較的低度の変色を示した１０個体の植物を選抜した。最初に選抜した１８個体について変色アッセイを繰り返すと、ほとんどの個体事例について、元の結果が確認された。１２個体を図１０に示す。確認された個体のみを、さらなる分析および種子作出用に選抜した。多面発現的な副次的効果（例えば白化、矮小化）のない１つの突然変異体植物に０５Ｄ．２０２５３９と番号をつけた。この植物の自殖により作出した種子に０５Ｄ．８１０５９６と番号をつけた。０５Ｄ．８１０５９６の種子から栽培した３植物の自殖により作出した種子に０７Ｇ．９９７９と番号をつけ、ＮＣＩＭＢに寄託した。ＮＣＩＭＢ番号は４１４４１である（２００６年１０月１０日に寄託）。
【０１２０】
（実施例５）
軽減した傷誘導性変色を示している選抜された突然変異体の表現型分析
実施例３に示したスクリーニングから選抜された１２個体の突然変異体のうち６個体が、低下した強い成長表現型および白化を示した。他の突然変異体は、正常に、すなわち、突然変異誘発実験の開始集団の型に従って発育した。
【０１２１】
矮小化および白化した突然変異体は、おそらく葉緑体機能が阻害されていると考えられる。ＰＰＯはこの細胞小器官中に存在しているため、このことは円形葉片アッセイにおける比較的低い応答を説明しうる。このような多面発現的な突然変異は望ましいものではないため、これらの突然変異体はあまり適切ではないと判断した。
【０１２２】
円形葉片変色のもっとも大幅な軽減を示した突然変異体植物０６Ｄ．２１０２０２は正常な表現型を示したため、この突然変異は変色に特異的で、強い多面発現効果はないと判断される。
【０１２３】
（実施例６）
子孫において変色表現型がほとんどないことの確認
実施例３および５の植物０６Ｄ．２１０２０２のようなレタスの突然変異体の軽減した変色が、本明細書中に記載の突然変異誘発処理により引き起こされた遺伝的影響によるものであることを実証するために、自殖により種子を作出した。植物０６Ｄ．２１０２０２の自殖により作出した種子に、０６Ｄ．８１９７８４と番号をつけた。この種子を土中で発芽させ、円形葉片淡紅変アッセイを用いて変色について植物を試験した。
【０１２４】
全ての後代植物が同様の表現型、すなわち、種子を作出するために使用した突然変異体のような淡紅変の大幅な軽減を示したため、この実験は、変化した表現型には遺伝的根拠があることを明確に示した。この結果を図１１に示す。
【０１２５】
０６Ｄ．８１９７８４の種子から栽培した３植物の自殖により作出した種子に０６Ｄ．８６３Ｂ２と番号をつけ、ＮＣＩＭＢに寄託した。ＮＣＩＭＢ番号は４１４５４である（２００７年１月３日に寄託）。
【０１２６】
（実施例７）
褐色色素形成に基づく、レタスの傷誘導性変色についての表現型スクリーニング指標の開発
レタス植物を栽培して成熟させ、中央脈組織から円形片を切り取ることにより外葉の部分を採取した。この円形片をぬれたろ紙上で１６℃でインキュベートした。およそ７２時間後、損傷表面は褐色に変化した。１０ｍＭ  Ｌ−システイン存在下では褐変応答は抑制され、このことは、観察された変色がＰＰＯ媒介性であることを示している。このような実験の代表的な結果を図１２に示す。
【０１２７】
図１２に示したような応答はＰＰＯ媒介性の褐変応答であるため、本実施例に記載のようなスクリーニング手順は、レタスの加工中に生じる褐変の軽減を示している突然変異体をスクリーニングするために効果的でバイアスがかかっていないと判断できる。
【０１２８】
（実施例８）
メラニンと呼ばれる黒色色素へのＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）の転換に基づく、レタスの傷誘導性変色の表現型スクリーニング指標の開発
広い意味での傷誘導性変色を扱うアッセイに加え、本発明に従えば、この方法により、ＰＰＯ活性が低下した突然変異体について、より特定的な方法でスクリーニングすることも可能になる。１．５ｍＭ  Ｌ−ＤＯＰＡの存在下でインキュベートした円形葉片を使用することにより、ＰＰＯ活性の指標となる表現型アッセイを開発した。黒変が明瞭になったので、Ｌ−ＤＯＰＡはレタス葉の損傷表面で、ポリフェノール酸化系によりメラニンと呼ばれる黒色色素に容易に転換される可能性がある、と結論づけることができる。Ｌ−ＤＯＰＡは、ドパクロムおよびインドールキノンを経由して黒色メラニンへと非酵素的に転換される反応性のＬ−ＤＯＰＡキノンへ、ＰＰＯにより転換される。
【０１２９】
さらに、この反応は、反応中に１ｍＭ  Ｌ−システインを加えることにより抑制できることが示された（図５）。したがって、このアッセイにより、葉の損傷表面でＰＰＯ活性を高める能力が改変されている突然変異体の同定が可能になる。Ｌ−ＤＯＰＡの存在に対するレタスの円形葉片の応答は、溶液中ならびに図１３に示すようにぬれたろ紙の間のいずれにおいても観察できる。
【０１３０】
（実施例９）
中央脈円形片褐変アッセイを用いた、変色がほとんどないことを示している突然変異体の子孫の褐変応答低下についての評価
円形葉片の損傷表面の淡紅変が顕著に軽減している、実施例３、５および６で得た植物番号０６Ｄ．２１０２０２のようなレタスの突然変異体の軽減した変色が、傷誘導性褐変応答においても効果的に軽減していることを実証するために、いくつかの後代植物を栽培し成熟させた。
【０１３１】
この発育段階で、いくつかの後代植物の外葉から３片の中央脈円形片を採取する。実施例７に記載の手順に従い、この中央脈円形片をインキュベートする。傷誘導性淡紅変が大きく軽減していることがより早い段階で示された突然変異体の後代植物は、傷誘導性中央脈褐変も大きく軽減していることが示されている。この実験の結果を図１４に示す。
【０１３２】
（実施例１０）
プラスチック袋に詰めた生鮮カットレタスの結球を使用した、変色がほとんどないことを示している突然変異体の子孫の褐変応答低下についての評価
円形葉片の損傷表面の淡紅変が顕著に軽減している、実施例６で得た番号０６Ｄ．８１９７８４の種子から栽培したレタス植物の成熟結球を、ナイフを使用して細かく刻み、周囲大気の入ったプラスチック袋内に詰めた。通常の円形葉片淡紅変応答を示す対照植物を同一方法で処理した。この袋を４℃で６日間保存した後、葉材料を褐変応答について評価した。
【０１３３】
この実験により、傷誘導性淡紅変が大きく軽減していることがより早い段階で示された突然変異体の後代植物は、加工してから自然大気を用いてプラスチック袋中で保存した際に傷誘導性中央脈褐変も大きく軽減していることが示されている。この実験の結果を図１５に示す。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】収穫後の酵素的変色の軽減を目的としたレタス集団の突然変異体スクリーニング手順の設計の背後にある論拠の概略図である。スクリーニングの入力信号は葉組織の損傷であり、この信号は植物により感知され、老化、呼吸および組織変色などのいくつかの生理過程に至る様々な情報伝達応答を発生させる。この入力信号は、ＰＰＯ基質としてのフェノール性化合物の施用と組み合わせることができる。  スクリーニングの出力信号は、適用される条件に依存する、収穫後の褐変および淡紅変についての損傷表面指標である褐変または淡紅変である。このことは、それぞれＰＡＬおよびＰＰＯの特異的阻害剤であるケイ皮アルデヒドおよびＬ−システインにより出力信号が完全に阻害されるという事実から推論されている。
【図２】円形葉片の淡紅変に基づくスクリーニングの出力表現型の代表的な画像である。レタス植物の円形葉片（植物当り１片）をぬれたろ紙の間に並べ、５℃で７日間インキュベートする。各円形葉片の周囲の損傷表面で淡紅変が明瞭に観察できる。
【図３】異なる濃度のＰＡＬ阻害剤のケイ皮アルデヒドの存在下で実施した円形葉片の淡紅変アッセイの画像である（皿当り４片）。各皿の上の番号は、使用したケイ皮アルデヒドの濃度（％）を示す。
【図４】ぬれたろ紙の間でインキュベートしたレタスの円形葉片（皿当り４片）の淡紅変に対する、ＰＰＯ阻害剤Ｌ−システインの阻害作用を示す画像である。各皿の上の番号は、使用したＬ−システインの濃度（％）を示す。
【図５】１．５ｍＭ  Ｌ−ＤＯＰＡ存在下でぬれたろ紙の間でインキュベートしたレタスの円形葉片（皿当り４片）の黒変に対する、ＰＰＯ阻害剤Ｌ−システインの阻害作用を示す画像である。各皿の上の番号は、使用したＬ−システインのｍＭ濃度を示す。
【図６】レタスの円形葉片の淡紅変に対する、熱ショック前処理の効果を示す画像である。各皿の上に示す温度で９０秒間、無傷の葉に対して熱ショックを与えた。
【図７】レタスの損傷応答により形成された淡紅色色素の、無色の化合物へのＬ−システインによる転換を示す画像である。皿の上列がＬ−ＤＯＰＡアッセイを示すのに対し、皿の下列は淡紅変アッセイを示す。各皿内の下側の２片の円形片は、損傷応答が完了した後、Ｌ−システインで処理した。使用したＬ−システインの濃度は０、０．００１、０．０１、０．１、１および１０ｍＭであり、上に示してある。
【図８】Ｌ−システインによる、屋外栽培レタスにおける淡紅変の軽減を示す画像である。上のパネルは、湛水により極度にストレスを与えられた植物から採取したレタス葉の典型的な淡紅変症状を示している。中央脈は、淡紅色色素の存在を示している。右下のパネルは、１ｍＭ  Ｌ−システインで３０分間、室温での処理後に淡紅変症状を示している葉から採取した円形片を示す。左下のパネルは、水で３０分間、室温での処理後の同様の円形葉片を示している。
【図９】パネルＡ：本発明により説明する方法に従う、円形葉片の変色についての、個々のレタスのＭ２植物（プール中でグループ化）の表現型分析の画像である。このパネルには１２０００試料のうち合計１３８試料を示してあるが、そのうち矢印で示した１試料は、大きく軽減した淡紅変を示した。パネルＢ：明らかな変色応答を示す対照試料に比べ淡紅変の形成がほとんどない（中央の位置にある試料）ことが確認され、パネルＡに示した選抜済個体の再試験の画像。
【図１０】Ｍ２レタス植物の表現型の画像である。本発明に従ってアッセイを用いると、１、２、４、５、７、１０および１２のラベルをつけた植物は、軽減した円形葉片淡紅変を示す。３、６、８、９、および１１の植物は、野生型の対照に匹敵する程度の円形葉片の淡紅変を示した植物である。植物１は、淡紅変の大幅な軽減および正常な成長習性を示す突然変異体の唯一の例である。植物２、４、５、７、１０および１２は、淡紅変の軽減および矮小化し白化した表現型を示している。
【図１１】軽減した変色を示している、レタスの突然変異体の後代の試験の画像である。左側には、通常の傷誘導性変色応答を示す２５個の対照試料を示してある。右側には、傷誘導性変色応答が大幅に低下している単一の突然変異体由来の一連の後代植物３５個体から採取されている試料の一群を示してある。
【図１２】成熟したレタス植物から採取した葉の中央脈部分の褐変に基づくスクリーニングの出力表現型の代表的な画像である。この写真は、３日間１６℃でのインキュベーション後の、レタスの外葉の中央脈組織の円形片を示している。損傷表面で、典型的な褐変が明瞭に観察できる。各皿には、中央脈の異なる箇所で採取した３片の円形片（緑色、薄緑色および白色）が入っている。皿の上の数字は、ろ紙に加えたＬ−システインのｍＭ濃度を示している。
【図１３】レタスの葉表面でのＬ−ＤＯＰＡのメラニンへの転換を示す画像である。パネルＡは、１．５ｍＭ  Ｌ−ＤＯＰＡ溶液中でのアッセイを示している。上の試験管は陰性対照であり、他の３本の試験管は同一である。パネルＢは、１．５ｍＭ  Ｌ−ＤＯＰＡを含有するぬれたろ紙の間での円形葉片のインキュベーションの結果を示している。
【図１４】中央脈褐変において、軽減した傷誘導性淡紅変を示しているレタスの突然変異体の後代試験の画像である。パネルＡは、淡紅変の軽減した突然変異体の後代植物８個体の中央脈円形片（植物当り３片）を示しており、１〜８の番号をつけてある。パネルＢは、通常の褐変応答を示す対照植物８個体の中央脈円形片（植物当り３片）を示しており、９〜１６の番号をつけてある。
【図１５】周囲大気下でのカットおよび包装後に、傷誘導性淡紅変応答または褐変応答の低下を示している、レタスの突然変異体の評価を示す画像である。対照植物の結球の葉断片を左側に示し、変色が軽減した突然変異体の葉断片を右側に示してある。生鮮カット葉材料を６日間４℃で保存した。褐変は、対照試料で明瞭に観察できるのに対し、突然変異体試料は変化のないままである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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