(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、懸濁液中にｈＥＳ−由来の細胞集合体を発生させる方法；
（ａ）  未分化の接着性のｈＥＳ細胞培養物を提供すること；
（ｂ）  （ａ）の接着性のｈＥＳ細胞培養物をｈＥＳ単独細胞の懸濁液内に解離すること；
（ｃ）  ｈＥＳ細胞の未分化成長を支持する定義された培地中にｈＥＳ単独細胞懸濁液をシードし、それによりｈＥＳ単独細胞懸濁液培養物を形成すること；
（ｄ）  ｈＥＳ単独細胞懸濁液培養物を低せん断応力で撹拌し、該懸濁液中のｈＥＳ単独細胞に実質的に均一なｈＥＳ細胞集合体を形成させること；
（ｅ）  懸濁液中のｈＥＳ細胞集合体を分化培養条件に接触させ、懸濁液中のｈＥＳ細胞集合体に、懸濁液中のｈＥＳ−由来の細胞集合体を形成させる；
それにより、懸濁液中のｈＥＳ−由来の細胞集合体を発生させること。
【請求項２】
前記ｈＥＳ単独細胞懸濁培養物が少なくとも３０分間撹拌される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ｈＥＳ単独細胞懸濁培養物が８０ｒｐｍから１６０ｒｐｍで、ｈＥＳ単独細胞懸濁培養物のオービタルローテーションにより撹拌される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記ｈＥＳ単独細胞懸濁培養物が１００ｒｐｍから１４０ｒｐｍで、ｈＥＳ単独細胞懸濁培養物のオービタルローテーションにより撹拌される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
複数のｈＥＳ−由来の細胞集合体が懸濁培養で製造され、懸濁液中のｈＥＳ−由来の細胞集合体のサイズと形状が本質的に一定である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記分化培養条件と接触させる工程に引き続いて、１種以上の選択性マーカまたは薬剤の使用により希望のｈＥＳ−由来の細胞集合体を選択するかまたは精製する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記選択性マーカまたは薬剤が、ＣＤ３０、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５５、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１４２、ＣＤ１６５、ＣＤ２００、ＣＤ３１８、ＣＤ３３４、およびＣＤ３４０から成る群から選ばれる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記希望のｈＥＳ−由来の細胞集合体の選択または精製がセルソ−ティングの使用により行われる、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記ｈＥＳ単独細胞懸濁培養物に、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５２Ｐ、およびインスリン／鉄結合性グロブリン／セレニウム（ＩＴＳ）を含む混合物から成る群から選ばれる、細胞生存を促進できる薬剤を追加することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記未分化の接着性のｈＥＳ細胞の培養物が、細胞外マトリクス、細胞外基質蛋白質およびヒトまたはマウスフィーダー層から成る群から選択される基体またはマトリツクスを欠いている、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記未分化の接着性のｈＥＳ細胞の培養物が、異物性がなく、無マトリツクス、およびフィーダなしである、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府によって後援された研究または発育に関する声明
本発明の完成のための研究の一部は、米国政府資金のアメリカ国立衛生研究所グラントＮｏ．５Ｒ２４  ＲＲ０２１３１３−０５を利用して為された。従って、米国政府は本発明に対してある種の権利を有する。  
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
発明の分野  
本発明は事実上血清およびフィーダーを含まない懸濁細胞集合体組成物、および細胞集合体懸濁液の分化方法に関する。
これまで、真核性のほ乳動物細胞のための大規模製造過程（「スケールアップ」）を提供する効率的システムは全くなく、特に、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞などの哺乳動物多能性細胞については全くなかった。生体外で未分化状態でｈＥＳ細胞を維持するために、ｈＥＳ細胞は典型的にはマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダーの上で維持され、手動の機械的な解離（例えば、微細手術）を経て、個々のコロニーへ継代された。これらの方法は未分化型ｈＥＳ細胞または分化型ｈＥＳ細胞の大量産生を必要としない調査研究、遺伝子ターゲッティング、薬物送達、試験管内毒性研究には十分である。酵素継代を含むｈＥＳ細胞の安定した大規模なエキスパンジョンのための、将来的な臨床適用は改良された方法を要求する。
【０００３】
ｈＥＳ細胞の酵素のエキスパンションは実行できるが、これらの方法は、ｈＥＳ細胞が生存のためのパラ−およびオートクライン信号と同様に細胞間相互作用に依存するので、技術的な欠陥がある。したがって、単独細胞として存在する場合と比べて、ｈＥＳ細胞は細胞内微小環境を好む。また、ｈＥＳ細胞の酵素解離が異常核型に導き、遺伝的および後成的変化の結果につながることがあるという報告がある。その結果、高度に支持的な培養環境であって、同時に長い培養の期間、多分化能、多能性または遺伝的安定性において妥協せずに、未分化型ｈＥＳまたは分化型ｈＥＳ細胞の確固とした大規模なエキスパンジョン（すなわち、製造プロセス）を考慮することが本質的である。
【０００４】
人間の多能性細胞は人間発達の初期段階を調査して、糖尿病やパーキンソン病のようないくつかの病状での治療関与のめったにないチャンスを提供する。例えば、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣｓ）から得られたインスリンを作り出すβ細胞の使用は、提供者膵からの細胞を利用する現在の細胞治療手順に大きな改良を提供するだろう。現在の、提供者膵からの細胞を利用する糖尿病に関する細胞治療は、移植に必要である高品質の小島細胞への不足によって制限される。Ｉ型糖尿病患者のための細胞治療は、約８×１０８のすい臓島細胞の移植を必要とする（Ｓｈａｐｉｒｏら，２０００，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４３：２３０−２３８；Ｓｈａｐｉｒｏら，２００１ａ，Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  １５：２４１−２６４；Ｓｈａｐｉｒｏら，２００１，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３２２：８６１）
そのため、少なくとも２つの健常ドナー臓器が、成功する臓器移植のための十分な小島細胞を得るのに必要である。
【０００５】
その結果、胚性幹（ＥＳ）細胞は早期胚中で多能性細胞生物学と分化の基礎となる機構の研究の強力なモデル系を示す。また、哺乳動物の遺伝操作の機会を与え、結果の商業的、医学的、農業的用途の機会を与える。さらに、胚性幹細胞の潜在的な増殖および分化は、細胞損傷または機能不全から生じる疾病の治療のための移殖に適合する細胞の無制限なソースを作るのに使用される。国際特許出願ＷＯ９９／５３０２１に記載された早期原始外胚葉（ＥＰＬ）細胞、生体内または生体外の派生したＩＣＭ／胚盤葉上層、生体内または生体外の派生した原始外胚葉、始原生殖細胞（ＥＧ細胞）、奇形しゅ細胞（ＥＣ細胞）、および脱分化または核移植で誘導された多能性細胞をはじめとする、他の多能性細胞および細胞ラインが、これらの特性と用途のいくつかまたはすべてを共有するだろう。国際特許出願ＷＯ９７／３２０３３と米国特許番号５，４５３，３５７は、齧歯動物以外の種からの細胞を含む多能性細胞を記述する。人間の胚性幹細胞は国際特許出願ＷＯ００／２７９９５および米国特許番号６，２００，８０６に記載されている。そしてヒトＥＧ細胞は国際特許出願ＷＯ９８／４３６７９に記載されている。
【０００６】
胚性幹細胞多分化能と分化を規制する生化学的機構は、非常に不十分にしか理解されていない。しかしながら、利用可能な限られた実験によって得られるデータ（多くの事例証拠）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養条件下での多分化能胚性幹細胞の連続的維持は、細胞外環境に存在するシトキンと生育因子の存在に依存していることを示唆する。
【０００７】
人間のＥＳＣｓが人間細胞療法のためにかなりの量の高品質の分化細胞を開発する出発物質のソースを提供する一方、臨床の安全と有効度を決定する期待される規定のガイドラインと等価な条件で、これらの細胞を得、および／または、培養しなければならない。
そのようなガイドラインは化学的に定義された培地の使用を必要とするだろう。
そのような化学的に定義された／ＧＭＰ標準状態の開発が、治療目的でｈＥＳＣｓから得られた細胞とｈＥＳＣｓの人体での使用を容易にするために必要である。
【０００８】
さらに、ｈＥＳＣベースの細胞置換療法の最終の用途は、大量培養を可能にする方法と規定ガイドラインに対応する分化条件の開発を必要とするだろう。いくつかのグループがｈＥＳＣｓのための簡易型の生育条件を報告したが、これらの研究にはかなりの制限がある。しかしながら、一般に、これまで、多能性細胞の成功した単離、長期のクローン維持、遺伝操作、および生殖細胞系列移行(germ line transmission)は難しかった。
【０００９】
幹細胞のための細胞培養条件の大部分は、培地内に血清代用品（ＫＳＲ）を含んでいる。（Ｘｕら，２００５  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２３：３１５−３２３；Ｘｕら，２００５  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２：１８５−１８９；Ｂｅａｔｔｉｅら，２００５  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２３：４８９−４９５；Ａｍｉｔら，２００４  Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，７０：８３７−８４５；Ｊａｍｅｓら，２００５  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３２：１２７９−１２８２）ＫＳＲは非常に浄化されたソースではなく、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の粗精製物を含んでいる。他のものは短期試験を実行するだけであり、したがって、それらの条件が長期間の間、多分化能の維持を可能にするかどうかは、明確でない。（Ｓａｔｏら，（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，１０：５５−６３；米国特許公開２００６／００３００４２および２００５／０２３３４４６）。他のものはＦＧＦ２、アクチビンＡ、およびインスリンで化学的に定義された培地における、多分化能の長期の維持を示したが、細胞はヒト血清でコーティングされたプレートであって、細胞のプレーティングの前に「洗い落とされた」ものの上で育てられた。（Ｖａｌｕｅｒら，２００５  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，１１８（Ｐｔ  １９）：４４９５−５０９）ＦＧＦ２はこれらのすべての培地の成分であるが、それが絶対必要であるかどうかは明確でない；特にいくつかの配合物では、高濃度でそれを使用することが必要である（最大１００ｎｇ／ｍＬ、Ｘｕら，２００５  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２：１８５−１８９）。
【００１０】
さらに、これらのグループのすべてが、それらの培地にマイクロｇ／ｍＬのレベルでインスリンを含んでいるか、またはＫＳＲの使用により存在するインスリンを含む。
インスリンがインスリン受容器と結合することを通して、グルコース代謝と「細胞生存」シグナリングにおいて機能すると通常考えられている。
生理学的濃度を超えたレベルでは、しかしながら、インスリンは、低い効率でＩＧＦｌ受容体と結合して、ＰＩ３  キナーゼ／ＡＫＴ系路を通して古典的な増殖因子活性を与えることができる。ＫＳＲまたは他の培地におけるそのような高水準（マイクロｇ／ｍＬのレベル）でのインスリンの存在／必要は、ｈＥＳＣｓによって発現されるＩＧＦｌ受容体に結合されることを介して主な活性が顕在化されることを示唆している（Ｓｐｅｒｇｅｒら，２００３  ＰＮＡＳ，１００（２３）：１３３５０−１３３５５）。ＩＧＦｌＲの完全な補体とｈＥＳＣｓでの細胞内信号系路メンバーの発現は、この系路の機能的活性を意味しそうである（Ｍｉｕｒａら，２００４  Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ，３：３３３−３４３）。インスリンまたはＩＧＦｌがｈＥＳＣｓの自己再生に必要である主要な信号を顕在化させることができる。これは、ｈＥＳＣの培養のために開発された全ての条件は、インスリン、ＫＳＲにより提供されたインスリン、または血清により提供されたＩＧＦｌを含むという事実により示唆される。この概念を支持するものとして、ＰＩ３  キナーゼがｈＥＳＣ培養で禁止されると、細胞が分化することが示されている（Ｄ’Ａｍｏｕｒら，２００５  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２３（１２）：１５３４−４１；ＭｃＬｅａｎら，２００７  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２５：２９−３８）。
【００１１】
最近の刊行物は、ｈＥＳＣｓについてのヒト化された、定義された培地について概説する（Ｌｕｄｗｉｇら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  Ｊａｎｕａｒｙ  １，２００６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔｌ  １７７）。しかしながら、この最近の配合物は、ＦＧＦ２、ＴＧＦβ、ＬｉＣｌ、γ−アミノ酪酸およびピペコリン酸のような、ｈＥＳＣｓの増殖に影響を及ぼすことが示唆されるいくつかの要素を含んでいる。また、この最近定義された細胞培地はインスリンを含むことに留意すべきである。
【００１２】
ＥＧＦ増殖因子ファミリーには、少なくとも１４のメンバーが含まれ、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、ヘパリン結合ＥＧＦ（ｈｂ−ＥＧＦ）、ニューレグリン−β（また、ヘレグリン−β（ＨＲＧ−β）、膠細胞生育因子などとも呼ばれる）、ＨＲＧ−α、アンフィレグリン、ベタセルリン、およびエピレグリンがあげられるが、これらに限定されるものではない。これらのすべての増殖因子が、ＥＧＦドメインを含み、最初に、メタロプロテイナーゼ（具体的にはアダム：ＡＤＡＭ）タンパク質によって処理される、可溶性のエクトドメイン増殖因子を発生させる膜横断たんぱく質として発現される。または、ＥＧＦファミリーのメンバーは、異なる親和性を有するＥｒｂＢｌ、２、３、および４細胞表面受容体のホモ−またはヘテロ−二量体と相互作用する（Ｊｏｎｅｓら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，１９９９，４４７：２２７−２３１）。ＥＧＦ、ＴＧＦα、およびｈｂＥＧＦは、ＥｒｂＢｌ／１（ＥＧＦＲ）ホモダイマと高い親和性（１−１００ｎＭの範囲）で結合するが、ＨＲＧ−βはＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４と非常に高い親和性（＜１ｎＭの範囲）で結合する。活性ＥｒｂＢ受容体はＰＩ３  キナーゼ／ＡＫＴ系路とＭＡＰＫ系路に信号を発する。ｈＥＳＣｓで最も発現する増殖因子受容体としてＥｒｂＢ２とＥｒｂＢ３がある（Ｓｐｅｒｇｅｒ他、２００３ＰＮＡＳ、１００（２３）：１３３５０−１３３５５）。ＨＲＧ−βは、先に、マウス始原生殖細胞のエキスパンションをサポートすることが示された（Ｔｏｙｏｄａ−Ｏｈｎｏら，１９９９  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２１５（２）：３９９−４０６）。さらに、ＥｒｂＢ２の過剰発現と引き続く不適当な活性化が腫よう発生過程に関連している（Ｎｅｖｅら，２００１  Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１２  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ９−１３；Ｚｈｏｕ  ＆  Ｈｕｎｇ，２００３  Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，３０（５  Ｓｕｐｐｌ  １６）：３８−４８；Ｙａｒｄｅｎ，２００１  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，６１  Ｓｕｐｐｌ  ２：１−１３）。ヒトＥｒｂＢ２（染色体１７ｑ）、およびＥｒｂＢ３（染色体１２ｑ）は、いくつかのｈＥＳＣｓの三染色体性として蓄積するのが観測された染色体上に存在している（Ｄｒａｐｅｒら，２００４  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２２（ｌ）：５３−４；Ｃｏｗａｎら，２００４  Ｎ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３５０（１３）：１３５３−６；Ｂｒｉｍｂｌｅら，２００４  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．，１３（６）：５８５−９７；Ｍａｉｔｒａら，２００５  Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３７（１０）：１０９９−１０３；Ｍｉｔａｌｉｐｏｖａら，２００５  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１）：１９−２０；Ｄｒａｐｅｒら，２００４  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．，１３（４）：３２５−３６；Ｌｕｄｗｉｇら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  Ｊａｎｕａｒｙ  １，２００６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔｌ  １７７）。
【００１３】
ＥｒｂＢ２とＥｒｂＢ３はマウス胚盤胞内で発現された（Ｂｒｏｗｎら，２００４  Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，７１：２００３−２０１１；Ｓａｌａｓ−Ｖｉｄａｌ  ＆  Ｌｏｍｅｌｉ，２００４，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．，２６５：７５−８９）。しかし、明確に内細胞塊（ＩＣＭ）には制限されず、ＥｒｂＢｌ、ＥＧＦ、およびＴＧＦβが人間の胚盤胞で発現された（Ｃｈｉａら，１９９５  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２２１（２）：２９９−３０７）。ＨＢ  ＥＧＦはヒトＩＶＦ胚盤胞培養で増殖促進効果を有する（Ｍａｒｔｉｎら，１９９８  Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．，１３（６）：１６４５−５２；Ｓａｒｇｅｎｔら，１９９８  Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．１３  Ｓｕｐｐｌ  ４：２３９−４８）。そして１５％の血清内でのマウス胚性幹細胞に対して追加の効果を有する（Ｈｅｏら，２００５，Ａｍ．  Ｊ．Ｐｈｙ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）。移植前または移植直後の現象は、ＥｒｂＢ２−／−，ＥｒｂＢ３−／−，ニューレグリン（Ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ）ｌ−／−（Ｂｒｉｔｓｃｈら，１９９８  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１２：１８２５−３６）、ＡＤＡＭ１７／−（Ｐｅｓｃｈｏｎ，ら，１９９８  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２：１２８１−１２８４）、およびＡＤＡＭ１９−／−、（Ｈｏｒｉｕｃｈｉ，２００５  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２８３（２）：４５９−７１）ヌル胚で影響を受けるように見えない。したがって、ｈＥＳＣｓのＥｒｂＢ受容体ファミリーを通してシグナルする重要さはこれまで不明瞭である。
【００１４】
ニューレグリン−１（ＮＲＧｌ）は、多重スプライシングとタンパク質プロセシング異形を示す大きい遺伝子である。これは多くのタンパク質アイソフォームを発生させる。（タンパク質アイソフォームは本明細書においては集合的にニューレグリンと呼ばれる）。ニューレグリンは細胞表面膜横断たんぱく質として支配的に発現される。細胞外領域は免疫グロブリン様ドメイン、炭水化物改質領域、およびＥＧＦドメインを含んでいる。ＮＲＧｌ発現アイソフォームは以前に、検討された（Ｆａｌｌｓ，２００３  Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２８４：１４−３０）。細胞膜メタロプロテアーゼＡＤＡＭ１７とＡＤＡＭ１９は、ニューレグリン−１の膜貫通型を処理して可溶性のニューレグリン／ヘレグリンにすることが示された。ＨＲＧ−αと−βは、ＥＧＦと他のドメインを含むニューレグリンの開裂されたエクトドメインである。ＥＧＦドメインがＥｒｂＢ受容体の結合および活性化の原因となるので、このドメインだけを含む組み換え分子は、本質的にはこのタンパク質の可溶性成長要因効果のすべてを示すことができる（Ｊｏｎｅｓら，１９９９  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４４７：２２７−２３１）。また、ＥｒｂＢ受容体とＥＧＦドメインとの相互作用を通して、隣接している細胞にはジャクスタクリンシグナリング（juxtacrine signaling）の引き金となると思われるニューレグリンの処理加工膜横断アイソフォームが存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際特許出願ＷＯ９９／５３０２１
【特許文献２】国際特許出願ＷＯ９７／３２０３３
【特許文献３】米国特許番号５，４５３，３５７
【特許文献４】国際特許出願ＷＯ００／２７９９５
【特許文献５】米国特許番号６，２００，８０６
【特許文献６】国際特許出願ＷＯ９８／４３６７９
【特許文献７】米国特許公開２００６／００３００４２
【特許文献８】米国特許公開２００５／０２３３４４６
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｓｈａｐｉｒｏら，２０００，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４３：２３０−２３８
【非特許文献２】Ｓｈａｐｉｒｏら，２００１ａ，Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  １５：２４１−２６４
【非特許文献３】Ｓｈａｐｉｒｏら，２００１，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３２２：８６１
【非特許文献４】Ｘｕら，２００５  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２３：３１５−３２３
【非特許文献５】Ｘｕら，２００５  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２：１８５−１８９
【非特許文献６】Ｂｅａｔｔｉｅら，２００５  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２３：４８９−４９５
【非特許文献７】Ａｍｉｔら，２００４  Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，７０：８３７−８４５
【非特許文献８】Ｊａｍｅｓら，２００５  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３２：１２７９−１２８
【非特許文献９】Ｓａｔｏら，（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，１０：５５−６３２
【非特許文献１０】Ｖａｌｕｅｒら，２００５  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，１１８（Ｐｔ  １９）：４４９５−５０９
【非特許文献１１】Ｓｐｅｒｇｅｒら，２００３  ＰＮＡＳ，１００（２３）：１３３５０−１３３５５
【非特許文献１２】Ｍｉｕｒａら，２００４  Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ，３：３３３−３４３
【非特許文献１３】Ｄ’Ａｍｏｕｒら，２００５  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２３（１２）：１５３４−４１
【非特許文献１４】ＭｃＬｅａｎら，２００７  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２５：２９−３８
【非特許文献１５】Ｌｕｄｗｉｇら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  Ｊａｎｕａｒｙ  １，２００６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔｌ  １７７
【非特許文献１６】Ｊｏｎｅｓら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，１９９９，４４７：２２７−２３１
【非特許文献１７】Ｔｏｙｏｄａ−Ｏｈｎｏら，１９９９  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２１５（２）：３９９−４０６
【非特許文献１８】Ｎｅｖｅら，２００１  Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１２  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ９−１３
【非特許文献１９】Ｚｈｏｕ  ＆  Ｈｕｎｇ，２００３  Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，３０（５  Ｓｕｐｐｌ  １６）：３８−４８
【非特許文献２０】Ｙａｒｄｅｎ，２００１  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，６１  Ｓｕｐｐｌ  ２：１−１３
【非特許文献２１】Ｄｒａｐｅｒら，２００４  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２２（ｌ）：５３−４
【非特許文献２２】Ｃｏｗａｎら，２００４  Ｎ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３５０（１３）：１３５３−６
【非特許文献２３】Ｂｒｉｍｂｌｅら，２００４  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．，１３（６）：５８５−９７
【非特許文献２４】Ｍａｉｔｒａら，２００５  Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３７（１０）：１０９９−１０３
【非特許文献２５】Ｍｉｔａｌｉｐｏｖａら，２００５  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１）：１９−２０
【非特許文献２６】Ｄｒａｐｅｒら，２００４  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．，１３（４）：３２５−３６
【非特許文献２７】Ｌｕｄｗｉｇら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  Ｊａｎｕａｒｙ  １，２００６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔｌ  １７７
【非特許文献２８】Ｂｒｏｗｎら，２００４  Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，７１：２００３−２０１１
【非特許文献２９】Ｓａｌａｓ−Ｖｉｄａｌ  ＆  Ｌｏｍｅｌｉ，２００４，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．，２６５：７５−８９
【非特許文献３０】Ｃｈｉａら，１９９５  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２２１（２）：２９９−３０７
【非特許文献３１】Ｍａｒｔｉｎら，１９９８  Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．，１３（６）：１６４５−５２
【非特許文献３２】Ｓａｒｇｅｎｔら，１９９８  Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．１３  Ｓｕｐｐｌ  ４：２３９−４８
【非特許文献３３】Ｈｅｏら，２００５，Ａｍ．  Ｊ．Ｐｈｙ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，ｉｎ  ｐｒｅｓｓ
【非特許文献３４】Ｂｒｉｔｓｃｈら，１９９８  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１２：１８２５−３６
【非特許文献３５】Ｐｅｓｃｈｏｎ，ら，１９９８  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２：１２８１−１２８４
【非特許文献３６】Ｈｏｒｉｕｃｈｉ，２００５  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２８３（２）：４５９−７１
【非特許文献３７】Ｆａｌｌｓ，２００３  Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２８４：１４−３０
【非特許文献３８】Ｊｏｎｅｓら，１９９９  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４４７：２２７−２３１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
それでも、培養で多分化能を維持することへのｈＥＳＣ研究の進行における重要な開発は、臨床の安全と有効度を決定する期待される規定のガイドラインと互換性がある培地と細胞培養条件の解明になるだろう。最も良い結果はｈＥＳＣｓのための化学的に定義された培地の有用性であるだろうが、それらがＧＭＰ規格に沿って製造されるなら、化学的に定義されないコンポーネンツは、許容できる。したがって、治療目的で使用できる多分化能性幹細胞の集団の培養と安定化のための方法と組成物であって、培養組成物が定義され、および／またはＧＭＰ規格に沿って製造されるものを特定することに対する必要がある。
本発明は基本栄養塩溶液(basal salt nutrient solution)とＥｒｂＢ３配位子を含む組成物に関し、該組成物には血清が本質的に含まれない。
【００１８】
また、本発明は基本栄養塩溶液と、分化可能な細胞におけるＥｒｂＢ２−由来チロシンキナーゼ活性を刺激するための手段を含む組成物に関する。
本発明は分化可能な細胞を培養する方法に関する。この方法は細胞培養表面に分化可能な細胞をプレーティング(plating)し、分化可能な細胞に基本栄養塩溶液を提供して、ＥｒｂＢ３と特異的に結合するリガンドを提供する。
【００１９】
本発明は分化可能な細胞を培養する方法に関する。この方法では、細胞培養表面で分化可能な細胞をプレーティングして、分化可能な細胞に基本栄養塩溶液と、分化可能な細胞中のＥｒｂＢ２−由来チロシンキナーゼ活性を刺激する手段を提供する。
【００２０】
また、本発明は分化可能な細胞を培養する方法であって、消化の前に培地チャンバー中に含まれている分化可能な細胞の層に消化液を提供し、消化が細胞の層を単独細胞にすることを含む方法に関する。消化の後に、単独細胞は分化可能な細胞培養液とともに新しい組織培養チャンバー内に置かれる。そこでは、分化可能な細胞培養液は基本栄養塩溶液とＥｒｂＢ３リガンドを含む。いったん培養されると、単独の分化可能な細胞は単独細胞の成長と分裂を可能にする条件に置かれる。
【００２１】
本発明は多分化能ｈＥＳの接着培地からｈＥＳ細胞集合体を懸濁液中に発生させるための方法に関する。この方法では未分化状態でエキスパンションを許容する接着成長培養条件でｈＥＳ細胞を培養し；
接着したｈＥＳ培養細胞を単独細胞懸濁液培養(single cell suspension culture)に分離し(diassociating)；
単独の細胞懸濁培養液を、単独細胞懸濁培養液が懸濁液中にｈＥＳ−由来細胞集合体を形成するまで撹拌することにより、懸濁液中のｈＥＳ−由来細胞集合体(hES-derived cell aggregates)を形成することを許容する第一の分化可能培養条件と接触させ、
懸濁液中のｈＥＳ−由来細胞集合体を発生させる。
好ましい実施態様では、単独細胞懸濁培養の撹はんは約８０ｒｐｍから１６０ｒｐｍで実行される。
【００２２】
また、本発明はｈＥＳ−由来単独細胞懸濁液から、ｈＥＳ−由来細胞集合体の懸濁液を発生させるための方法に関する。この方法は、未分化状態でエキスパンションを許容する接着性の成長培養条件でｈＥＳ細胞を培養すること；
ｈＥＳ細胞を分化するのに好適な第一の分化培養条件に未分化ｈＥＳ細胞を接触させ、接着したｈＥＳ−由来細胞を得ること；
接着したｈＥＳ−由来細胞を単独細胞懸濁培養物に分離すること；
単独細胞懸濁培養物を、単独細胞懸濁培養液が、懸濁液中にｈＥＳ−由来細胞集合体を形成するまで撹拌することにより、単独の細胞懸濁培養液を、懸濁液中のｈＥＳ−由来細胞集合体を形成することを許容する第二の分化培養条件と接触させ、懸濁液中のｈＥＳ−由来細胞集合体を発生させる。好適な実施態様では、単独細胞懸濁培養の撹はんは約８０ｒｐｍから１６０ｒｐｍで実行される。
【００２３】
また、本発明は多能性細胞培養の細胞濃度を最適化するか、または様々な増殖因子、たとえばＦＧＦ１０、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ノギン(noggin)およびレチノイン酸、アポプトーシス阻害剤、Ｒｈｏ−キナーゼ阻害薬、および同様のものの濃度を変えることにより、得られた細胞培養物の組成を富化または変化させる方法、および／またはｈＥＳ−由来細胞集合体懸濁液のポピュレーションを変化させる方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は規定された条件（８ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ２、１００ｎｇ／ｍＬ  ＬＲ−ＩＧＦｌ、１ｎｇ／ｍＬ  アクチビンＡ(Activin A)における、ＢＧ０１ｖ中の、ＡＤＡＭ１９、ニューレグリン１、およびＥｒｂＢｌ−３のリアルタイムのＲＴ  ＰＣＲ発現解析について示す。ＧＡＰＤＨとＯＣＴ４コントロール反応を示す。
【００２５】
【図２】図２は、ＡＧ８７９を使用した、ＢＧ０１ｖ細胞の増殖抑制について示す。ＢＧ０１ｖ細胞は、６−ウエルのトレー中にプレーティングされて、プレーティング後、ＤＭＳＯ（Ａ）、５０ｎＭ−２０マイクロＭ  ＡＧｌ４７８（Ｂ）、または１００ｍＭ−２０マイクロＭ  ＡＧ８７９（Ｃ）に２４時間暴露された。培養５日後に、培養物は、アルカリホスファターゼ活性のために固定され、染色された。ＡＧｌ４７８は、これらの濃度（Ｂに示された２０マイクロＭ）では増殖に影響するように見えなかったが、ＡＧ８７９は５マイクロＭ（Ｃ）で実質的に細胞成育を遅くした。
【００２６】
【図３】図３は１０ｎｇ／ｍＬ  ＨＲＧ−β、１０ｎｇ／ｍＬ  アクチビン  Ａ、２００ｎｇ／ｍＬ  ＬＲ−ＩＧＦｌ、および８ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ２を含む定義された培養液であるＤＣ−ＨＡＩＦ中で培養されたＢＧ０１ｖ細胞のモルホロジー（ＡおよびＢ）について示す。また１０ｎｇ／ｍＬ  ＨＲＧ−β、１０ｎｇ／ｍＬ  アクチビン  Ａ、および２００ｎｇ／ｍＬ  ＬＲ−ＩＧＦｌを含む定義された培養液で培養されたＢＧ０１ｖ細胞のモルホロジー（ＣおよびＤ）について示す。
【００２７】
【図４】図４はマウス胚性幹細胞（Ａ）とＭＥＦｓ（Ｂ）中のＲＴ  ＰＣＲによるＡＤＡＭ１９、ニューレグリン  ｌ、およびＥｒｂＢｌ−４の発現について示す。
【００２８】
【図５】図５はマウス胚性幹細胞中でのＥｒｂＢｌとＥｒｂＢ２シグナリングの抑制について示す。２×ｌ０５  Ｍｏｕｓｅ  ＲｌＥＳ細胞が、１０％のＦＢＳ中１：１０００のＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）、１０％のＫＳＲと１０００Ｕ／ｍＬマウスＬＩＦ（ＥＳＧＲＯ）上にプレーティングされた。翌日、ＤＭＳＯ（対照キャリア）、１−５０マイクロＭのＡＧ１４７８、または１−５０マイクロＭのＡＧ８７９が新鮮な培地と共に加えられた。培地は、８日目に固定されて、アルカリホスファターゼ活性のために染色された。ＤＭＳＯ（Ａ）および１−５０  マイクロＭのＡＧｌ４７８（ＢおよびＣ）は増殖を明白に抑制しなかった。ＡＧ８７９は５０マイクロＭのときに実質的に細胞成育を禁止して（ＤおよびＦの比較）、２０マイクロＭ（Ｅ）で増殖を遅くしたかもしれない。
【００２９】
【図６】図６はコンディショニングされた培地（ＣＭ）中で育てられたＢＧ０２細胞の増殖抑制について示す。（Ａ）５０マイクロＭのＡＧ８２５は、ＣＭ中で育てられたＢＧ０２  ｈＥＳＣｓの増殖を禁止した。（Ｂ）ＡＧ８２５はｈＥＳＣｓ中のＥｒｂＢ２  Ｙ１２４８リン酸化を抑制する。（Ｃ）増殖因子の異なった併用におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣｓの連続継代のコロニー計数。（Ｄ）ＢＧ０２細胞を使用するｈＥＳＣ増殖におけるＩＧＦｌおよびＨＲＧの役割の細胞計数分析（左）。（Ｅ）繰返し実験のＯＣＴ４／ＤＡＰＩ免疫染色は、ＡｃｔＡ／ＦＧＦ２条件と比べて、ＩＧＦｌとＨＲＧがＯＣＴ４＋細胞の割合をかなり増加させたことを示した。（Ｆ）一夜増殖因子のない飢餓状態で、次いで１５分、ＤＣ−ＨＡＩＦでパルスされたＢＧ０１  ＤＣ−ＨＡＩＦ  ｈＥＳＣｓのＲＴＫブロッティング分析。または、定常状態培養物が示される（左）。規格化された相対強度の平均と範囲がプロットされた（右）。
【００３０】
【図７】図７は異なった増殖因子の組み合わせに従って規定された条件で育てられたマウスＥＳ細胞について示す。（Ａ）２×ｌ０５細胞が８日間異なった増殖因子の組み合わせで育てられた後の、ＡＰ＋コロニーのスコアを示している。（Ｂ−Ｇ）異なった増殖因子の組み合わせで育てられたＡＰ＋コロニーの４倍イメージを示す。
【００３１】
【図８】図８はＤＣ−ＨＡＩＦ培地中で維持されるヒト胚性幹細胞のキャラクタリゼーションについて示す。（Ａ）ＢＧ０２  ＤＣ−ＨＡＩＦ  ｐ２５細胞からの奇形腫の分析は外胚葉、中胚葉および内胚葉への多分化能分化能を示した。（Ｂ）分化した１５％ＦＣＳ／５％ＫＳＲ中で培養されたＢＧ０２細胞の免疫染色。（Ｃ）ＣＭ中（６４継代）またはＤＣ−ＨＡＩＦ（規定された培地内で１０または３２継代）で維持されたＢＧ０２細胞中の４７，２９６の転写プローブを含む高密度イルミナ  セントリックス  ヒューマン−６  エクスプレッション  ビードチップス(Illumina Sentrix Human-6 Expression Beadchips)を使用して調査された転写の分配のベン図。（Ｄ）ＢＧ０２  ＤＣ−ＨＡＩＦ  ｐ３２細胞の転写プロフィールが、ＣＭ中で維持されたＢＧ０２細胞のものと非常に類似し（上部）、ＤＣ−ＨＡＩＦでの初期および終期の継代培養と実質的に変化されなかった（下部）ことを示すスキャッタープロット分析。（Ｅ）ビードスタジオ(Beadstudio)ソフトウェアを使用することで作られた異なったポピュレーションにおける相対遺伝子表現の階層的な菌株群形成樹状図。
【００３２】
【図９】図９はＤＣ−ＨＡＩＦ媒地の存在下で、ヒト化細胞外マトリックス（ＥＣＭｓ）上で培養された細胞のモルホロジーについて示す。（Ａ）増殖因子の減少されたＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（１：２００に希釈）上で成長されたＣｙＴ４９細胞（１：２００に希釈）。ＣｙＴ４９細胞はまた、（Ｂ）全ヒト血清、（Ｃ）ヒトフィブロネクチン、および（Ｄ）ＶＩＴＲＯＧＲＯ（登録商標）でコーティングされた組織培養皿で成長された。
【００３３】
【図１０】図１０はヒト胚性幹細胞の単独細胞継代について示す。（Ａ−Ｄ）ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）での継代および６０ｍｍの培養ざら中のおよそ５×１０５の細胞のプレーティングの後の、ステージごとのＢＧ０２細胞のイメージ。（Ａ）初期の平板培養の１．５時間後、生存細胞が皿に接着していることを示す。（Ｂ）平板培養後２０時間では、細胞の大多数は集合し、小さいコロニーを形成した。これらのコロニーは、平板培養後４日まで、増殖して拡大し（Ｃ）、５−６日間の経過で皿全体を覆いながら上皮のような単分子層を形成する（Ｄ）。（Ｅ）ＤＣ−ＨＡＩＦ中でＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）とともに１９回継代したＢＧ０２培養で示された正常な男性核型。
【００３４】
【図１１】図１１は、（Ａ）ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）、（Ｂ）０．２５％トリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ）／ＥＤＴＡ、（Ｃ）ＴｒｙｐＬＥ、または（Ｄ）バーシーン（Ｖｅｒｓｅｎｅ）を使用したヒト胚性幹細胞の単独細胞継代の後の細胞モルホロジーを示す。
【００３５】
【図１２】図１２はＤＣ−ＨＡＩＦ中で培養されたヒト胚性幹細胞の大規模な成長について示す。（Ａ）＞１０１０の細胞へのエキスパンションの後のＢＧ０２細胞のフローサイトメトリー解析。＞  ８５％の細胞はＯＣＴ４、ＣＤ９、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−８１を発現した。（Ｂ）ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＲＥＸｌ、ＳＯＸ２、ＵＴＦｌ、ＣＲＩＰＴＯ、ＦＯＸＤ３、ＴＥＲＴ、およびＤＰＰＡ５の多分化能マーカーの発現のＲＴ  ＰＣＲ分析。分化型リネッジ(differentiated lineages)のマーカー、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＭＳＸｌ、およびＨＡＮＤｌは検出されなかった。（Ｃ）ヒト染色体特異性反復配列(human chromosome-specific repeats)を使用する蛍光  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）が、ｈＣｈｒ１２、１７、ＸおよびＹの標準のコピー数の維持を示した。
【００３６】
【図１３】図１３は、７代または２カ月より長い期間、ＦＧＦ２の非存在下で、ＨＲＧ−βとＩＧＦｌを含む規定された培地中で成長されたｈＥＳＣ  ＢＧ０２細胞のモルホロジー（Ａ）と正常核型（Ｂ）について示す。
【００３７】
【図１４】図１４は、ＤＣ−ＨＡＩＦ（３２代）またはＤＣ−ＨＡＩ（１０代）中で維持されたｈＥＳＣｓ（ＢＧ０２）からの転写のスキャッタープロット分析について示す。大部分の転写の発現が両方のサンプルで検出された。そして、転写性は、外因のＦＧＦ２が非存在下でのｈＥＳＣｓの培養によっては、実質的に変化されなかった。相関係数（Ｒ２）が、＞０（すべてのドット）の発現水準でのすべての検出された転写を使用することで、または＞０．９９の検出信頼度を示す転写で求められた（Ｒ２  ｓｅｌｅｃｔ、点線の楕円形により示される）。斜線は、平均および２フォールドディファレンス(2-fold difference)の限界を示す。
【００３８】
【図１５】図１５はＤＣ−ＨＡＩＦで維持された初期および晩期の継代ＢＧ０２細胞の異なったポピュレーションにおける相対遺伝子発現の階層的な菌株群形成樹状図を示す。細胞は、密接（約０．００７５）に群生し、コンディショニングされた培地（ＣＭ）でＢＧ０２およびＢＧ０３細胞が同様に維持された（約０．０３７）。また、ＤＣ−ＨＡＩ中で維持されたＢＧ０２細胞は、他の評価されるｈＥＳＣポピュレーションと密接して群生される。説明として、図１５では、ＣＭはコンディショニングされた媒体である。ＤＣは、上で定義されるように、定義された培養液ＤＣ−ＨＡＩＦである。ａｐはＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）単独細胞継代である。ＤＣ−ＨＡＩは、ＦＧＦ２を含まないことを除いて、本明細書に定義されるような、ＤＣ−ＨＡＩＦと同じである。
【００３９】
【図１６】図１６は９６−ウエルおよび３８４−ウエルのＤＣ−ＨＡＩＦ中で培養されたＢＧ０２細胞のモルホロジーとアルカリ性ホスファターゼ染色について示す。９６−ウエルプレートの１つのウエルで成長したＢＧ０２細胞（１０４細胞／ウエル）の相コントラストイメージング（Ａ）および（Ｂ）アルカリ性ホスファターゼ染色。３８４−ウエルプレートの１つのウエルで成長したＢＧ０２細胞（１０３細胞／ウエル）の相コントラストイメージング（Ｃ）および（Ｄ）アルカリ性ホスファターゼ染色。
【００４０】
【図１７】図１７はＤＣ−ＨＡＩＦで懸濁培養で育てられたＢＧ０２の暗視野イメージについて示す。２日目と６日目の培養物について示す。４倍率を使用することでイメージを得た。
【００４１】
【図１８】図１８はＤＣ−ＨＡＩＦの接着および懸濁培養での成長速度について示す。接着および懸濁培養で平行なウエルで１×１０６細胞のＢＧ０２がプレーティングされた。細胞数は１−６日で数えられた。
【００４２】
【図１９】図１９は懸濁および接着ｈＥＳＣｓのｑＰＣＲ分析について表現する。懸濁液で成長するＢＧ０２細胞（Ｓ．ｈＥＳＣｓ）と接着培地で成長するもの（ｈＥＳＣｓ）は同等なレベルのＯＣＴ４発現およびＳＯＸ１７発現の欠如を示した。最終的な内胚葉（ＤＥ）に分化した接着細胞、および懸濁液中で最終的な内胚葉（Ｓ．ＤＥ  ｄ３）に分化した懸濁ｈＥＳＣｓは、ともに期待された顕著なＯＣＴ４の少ない発現とＳＯＸｌ７の多い発現を示した。
【００４３】
【図２０】図２０は懸濁培養におけるＹ２７６３２の存在下でのｈＥＳＣ集合の増大について示す。３ｍＬのＤＣ−ＨＡＩＦまたはＤＣ−ＨＡＩＦ  ＋  Ｙ２７６３２中に、２×１０６のＢＧ０２細胞をシードし、６−ウエルのトレイ中で、１００ｒｐｍの回転台上でインキュベータ内においた。１日目と３日目に集合体のイメージを得た。
【００４４】
【図２１】図２１はＹ２７６３２の存在下での懸濁集合体のＲＴ  ＰＣＲ分析について示す。ＲＴ−ＰＣＲは、多分化能のマーカーの発現を評価するために増殖した培養物に実行された。ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＲＥＸｌ、ＳＯＸ２、ＵＴＦｌ、ＣＲＩＰＴＯ、ＦＯＸＤ３、ＴＥＲＴ  ＡＮＤ  ＤＰＰＡ５は検出された。分化型リネッジのマーカーであるＡＦＰ、ＭＳＸｌ、およびＨＡＮＤｌは検出されなかった。
【００４５】
【図２２】図２２Ａ−Ｎはマーカー遺伝子ＯＣＴ４（パネルＡ）、ＢＲＡＣＨ（パネルＢ）、ＳＯＸｌ７（パネルＣ）、ＦＯＸＡ２またはＨＮＦ３ｂｅｔａ（パネルＤ）、ＨＮＦｌｂｅｔａ（パネルＥ）、ＰＤＸｌ（パネルＦ）ＮＫＸ６．１（パネルＧ）、ＮＫＸ２．２（パネルＨ）、ＩＮＳ（パネルＩ）、ＧＣＧ（パネルＪ）、ＳＳＴ（パネルＫ）、ＳＯＸ７（パネルＬ）、ＺＩＣｌ（パネルＭ）、ＡＦＰ（パネルＮ）、ＨＮＦ４Ａ（パネルＯ）、およびＰＴＦｌＡ（パネルＰ）の発現様式を示す棒グラフである。これは完全なリストではないが、多分化能ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞（ステージ０、ｄ０）、最終的な内はい葉細胞（ステージｌ；ｄ２）、ＰＤＸｌ−陰性の前腸内はい葉細胞（ステージ２；ｄ５）、ＰＤＸｌ−陽性内はい葉細胞（ステージ３、ｄ８）、膵性内はい葉細胞（ステージ４；ｄ１１）、膵性内分泌性先駆、および／またはホルモン分泌細胞（ステージ５；ｄ１５）を同定するために使用できる。
【００４６】
【図２３】図２３は、培養物における培地の全容積（ｍＬ）と相関した懸濁液の細胞集合体の直径（ミクロン）の範囲を示すグラフである。
【００４７】
【図２４】図２４Ａ−Ｄは、ｈＥＳ−由来細胞中のＰＤＸｌ（パネルＡ）、ＮＫＸ６．１（パネルＢ）、ＮＧＮ３（パネルＣ）、およびＮＫＸ２．２（パネルＤ）の、それらが由来するｈＥＳ細胞培養の細胞濃度との相関での、マーカー遺伝子の発現パターンを示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
発明の詳細な説明
ポリマーの足場、マトリクス、および／または、ゲル内に個別細胞をシードすることに基づいている再生医療の従来知られている方法と対照して、本明細書に記載された方法は、組織形成の構成用ブロックとして多分化能ｈＥＳ単独細胞懸濁液またはｈＥＳ−由来（分化された）単独細胞懸濁液から形成された細胞集合体懸濁液を使用する。細胞集合体はしばしば数百ないし数千もの個別細胞により構成され、接着結合部と細胞外マトリックスを介して連結され、全体として最終的な分化された生成物に貢献する。この点で、より伝統的な設計された組織に対して多くの有用な特性を提供する組織のタイプとして細胞集合体を定義できる。
【００４９】
本発明の１つの実施態様では、多分化能性幹細胞培養物またはｈＥＳ−由来細胞培養物の単独細胞懸濁液からｈＥＳ細胞集合体懸濁液を製造する方法が提供される。多分化能性幹細胞は、初めは、線維芽細胞フィーダーの上で培養されるか、またはそれらはフィーダなしで培養されることができる。ｈＥＳＣの単離方法およびヒトフィーダー細胞上での培養は、ヒトフィーダー細胞上でのヒトＥＳ細胞の培養方法（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＣＵＬＴＵＲＥ  ＯＦ  ＨＵＭＡＮ  ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ  ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬＳ  ＯＮ  ＨＵＭＡＮ  ＦＥＥＤＥＲ  ＣＥＬＬＳ）の名称の、米国特許第７，４３２，１４０号に記載され、その全体が本明細書の一部として参照される。フィーダーの上に培養されたｈＥＳＣｓから直接作られているか、またはそれから開始された多分化能ＥＳ細胞集合体懸濁培養は、例えば、接着培養におけるようなｈＥＳＣ単分子層作成の必要性を避ける。これらの方法は実施例１７および１８に詳細に記載される。
【００５０】
本発明の他の実施態様は、分化培地、例えば、ＴＧＦβファミリーまたは受容体を活性化することのできる分化培地試薬、望ましくはＴＧＦβファミリーメンバー内に、直接細胞集合体懸濁液を製造する方法を提供する。そのような試薬としては、アクチビン  Ａ、アクチビン  Ｂ、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１１、およびＮｏｄａｌがあげられるが、これらには限定されない。分化培地内に細胞集合体懸濁液を製造する方法は他の方法と区別され、多分化能性幹細胞培地、例えばＳｔｅｍＰｒｏ内に細胞集合体懸濁液培養物の生産を提供する。
【００５１】
本発明のさらなる他の実施態様は、たとえば上掲のｄ’Ａｍｏｕｒ２００５と２００６年に記載されたようなステージ１、２、３、４からの細胞である、分化型ｈＥＳ細胞培養物（ｈＥＳ−由来細胞培養物」または「ｈＥＳ−由来細胞」とも呼ばれる）から形成された細胞集合体懸濁液を製造する方法を提供する。したがって、本明細書に記載される細胞集合体を形成するための方法は、ｈＥＳまたはｈＥＳ−由来細胞多分化能または多分化能ステージのいずれかに制限されないで、むしろ使用方法と細胞タイプ最適化の必要性が、どの方法が好ましいかを決めるだろう。これらの方法は実施例１９−２２で詳細に記載される。
【００５２】
本発明の別の実施態様では、得られる細胞組成物の制御、例えば膵性内はい葉細胞、膵臓内分泌細胞、および／または、ＰＤＸｌ内はい葉細胞の割合の制御を、異なった増殖因子の濃度を変えることによって行う。これらの方法は実施例２１に詳細に記載される。
【００５３】
別途記載されない限り、本明細書で使用する用語は、関連技術における当業者の慣例的用法によると理解されるべきである。また、以下に提供された用語の定義に加えて、分子生物学上の一般的な定義は以下の文献に見いだされる；Ｒｉｅｇｅｒら，１９９１  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ：ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｂｅｒｌｉｎ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９８  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）。単数形の表記が明細書と特許請求の範囲において使用される場合、それが使用されている文脈に基づいて、１つまたはそれ以上の意味であることが理解されるべきである。たとえば、「細胞」は少なくとも１つの細胞を意味する。
【００５４】
また明細書および特許請求の範囲において、特記の無い限り、成分の量、物質の割合または比率、反応条件および他の数値については、すべての場合に“約”という用語によって修飾されるものとして理解される。反する記述のない限り、明細書および特許請求の範囲において記載される数値パラメータは近似値であり、本発明により得られることが求められるものに応じて変化することができる。少なくとも、特許請求の範囲について均等論の適用を制限するものではなく、それぞれの数値パラメータは少なくとも有効数字として報告されており、通常の丸めの技術によっている。
【００５５】
本発明はｈＥＳ−由来単独細胞懸濁液から、ｈＥＳ−由来細胞集合体の生産のための方法を提供する。種々の機械的および非生物学的要素は、培養における細胞の動きと集合、最適の細胞集合体の生育性と特性に相関する流体機械的なミクロ環境、並びにスケールアップに使用できる規格化された変数に影響を与えるので、様々な培養容器、皿、バイオリアクタなどにおける細胞の増殖および分化の動きおよび効果、および存在する場合には細胞に関する様々な培地条件を特徴付けることが必要である。それらの要因としては、これらに限定するものではないが、せん断速度、せん断応力、細胞濃度、および細胞媒体中の種々の増殖因子があげられる。
【００５６】
せん断速度とせん断応力は、システム中の流体せん断を定義する力学特性である。せん断速度は、特定の距離における流体速度と定義されて、秒−１の単位で表される。せん断速度は、せん断応力に比例し、せん断速度（γ）＝せん断応力（ｔ）／粘度（マイクロ）である。せん断応力は、細胞表面のタンジェント方向に作用する流体せん断力と定義されて、単位面積あたりの力（ダイン／ｃｍ２またはＮ／ｍ２）として表される。せん断応力は静置されていた細胞を含む流体を撹拌することにより、静置した液体を通して細胞を撹拌することにより、または撹拌された動的な液体環境の中を細胞を動かすことにより発生されることができる。流体粘度は典型的にはポイズで測定され、１ポイズ＝１ダイン  秒／ｃｍ２＝１００センチポイズ（ｃｐ）である。知られている最少の粘性流体の１つである水の粘度は０．０１ｃｐである。培地における、真核細胞の典型的な懸濁液の粘度は、２５℃の温度で１．０から１．１ｃｐの間である。密度と温度の両方が液体粘度に影響する。
【００５７】
また、流体速度は、流れが層流であるか、または乱流であるかを決める。層流は、粘性力が支配的である場合に生じ、低速での平滑で均一な流線によって特徴付けられる。対照的に、乱流においては高速度と慣性力が支配的であり、渦巻(eddies)と渦(vortices)の発生、および空間と時間にまたがる無秩序な流れにより特徴付けられる。レイノルズ数（Ｒｅ）として知られる無次元の数値は、層流または乱流の流れの存在を定量化するのに通常使用される。レイノルズ数は、慣性対粘性力の比率であり、（密度×速度×長さスケール）／（粘度）として定量化される。層流はＲｅ＜２３００の時に支配的であり、Ｒｅ＞４０００の時には乱流が支配的である。流体速度とのこの相関に基づいて、レイノルズ数とその結果、すなわち流体流が層流であるかまたは乱流であるかの程度は、懸濁液中の細胞が経験するせん断速度とせん断応力に直接正比例する。しかしながら、高速せん断応力条件は層流の、そして乱流の両方の液体環境で発生しうる。初めは、液体が動きに抵抗する傾向がある。引力を受ける固体表面の最も近くの流体には、境界層または流れがない範囲がすぐ表面に隣接して発生する。これは表面から流体流れの中心まで流体速度の傾きを形成する。流体速度の傾きは、境界層から最も高い流体速度の領域までの距離と、流体の速度の関数である。容器を通る、または容器の周りの液体流れが加速するのに従って、流れの速度は液体の粘度に打ち勝ち、そして、平滑で、層状から成る傾きは破壊され、乱流が形成される。トーマス他は、乱流条件の下の細胞分解が、局所的に高速せん断応力と高エネルギー放散速度の領域で最も頻繁に起こることを示した。トーマス他、（１９９４）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：３２９−３３５を参照。これらの領域はランダムに発生するが、速度勾配が最も高い境界層でしばしば見つけられる。流体速度におけるこれらのランダムな変動は、細胞培養の製造システムのスケールアップで決定的なマイナスの影響を与える場合がある、非常に高いせん断応力の領域を発生させる場合がある。したがって、ほ乳類細胞培養製造スケールアップシステムにおいて、そのようなシステムのせん断力の主な供給源を制御することによる、細胞密度と生育性を維持できる方法の必要性が存在している。
【００５８】
Ｈｅｎｚｌｅｒ（Ｈｅｎｚｌｅｒ、２０００、バイオリアクター中での粒子応力(Particle stress in bioreactors)、Ｉｎ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｃｈｅｐｅｒ、Ｔ．  Ｅｄ．  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ）およびＣｏｌｏｍｅｒ他（Ｃｏｌｏｍｅｒ、Ｊ．ら  ２００５．  低せん断流れにおける粒子凝集の実験的分析(Experimental analysis of coagulation of particles under low-shear flow)、Ｗａｔｅｒ  Ｒｅｓ．  ３９：２９９４）により与えられた方法により、回転する６−ウエルの皿中のバルク流体の流体機械的特性が計算された。無次元の応力は、乱流定数×（集合体直径／コルモゴロフ  マイクロスケール）Λ乱流指数と等しい。せん断応力は無次元応力×流体密度×（動粘度×力のインプット）０．５と等しい。せん断速度はせん断応力／動粘度と等しい。力のインプットとコルモゴロフのマイクロスケールの計算において、レイノルズ数は、各回転速度について必要であり、（回転速度×フラスコ直径）Λ２／粘度と等しい。力のインプットとコルモゴロフのマイクロスケールの両方がレイノルズ数の関数なので、すべてのせん断応力およびせん断速度の計算値は回転速度に従って変化する。
【００５９】
そのうえ、せん断応力とせん断速度は、形成される集合体の直径に依存する無次元応力の関数であり、その結果、集合体によって経験されるせん断応力および速度は回転の時間と共に増加すると予想される。計算の例が、１００−２００ミクロンの集合体直径と、６０−１４０ｒｐｍの間の回転速度について、実施例１７に示されている。これらの方法は、経時的なバルク流体の平均したせん断に関する見積りを提供するために使用された。しかしながら、容器の壁におけるせん断応力は、境界効果のために最も高くなると予想される。壁面せん断応力を予測するために、Ｌｅｙ他が、６−ウエルの皿の壁面せん断応力が回転半径×（密度×動粘度）（２×ｐｉ×回転速度）３）０．５に等しいとの提案をした。このアプローチを使用して、壁面せん断応力は、６０ｒｐｍから１４０ｒｐｍまでの回転速度について計算されて、実施例１８に示されている。バルク流体中で集合体によって経験される時間平均されたせん断応力と異なり、壁で起こるせん断応力は集合直径に非依存性であることに注意すべきである。
【００６０】
培養細胞濃度は、また、組織機能の重要な要素であり、２次元である伝統的な組織（例えば、接着して構成されたもの）で達成および／または最適化するのは難しい。細胞濃度の分化に対する効果はさらに詳細に実施例２０で説明される。より正確に生体内の細胞密度と立体配座を反映する３次元（３Ｄ）の構造を仮定することによって、細胞集合体はこの限界を克服できる。その結果、細胞がそれらの意図している構造を達成する期間をかなり減少し、および／または、より一貫していて効率的にすることができる。そのうえ、３Ｄ集合形式の細胞は分化することができ、より最適に機能することができる。この構造が、接着培養よりもより正常な生理学的現象に類似しているからである。製造工程における機械的な困難は、たとえば接着培養における機械的な困難と比較して、懸濁培養において浮動している細胞集合体にほとんどダメージを与えない。
【００６１】
また、典型的な製造規模の懸濁培養は細胞濃度を最大にしている間、細胞生存率を維持するための方法として培地の連続かん流(continuous perfusion)を利用する。このような関係においては、培地交換は接着細胞と懸濁集合体に異なった影響の流体せん断を与える。培地流れが細胞表面を横切って流れるとき、不動化された接着細胞は流体せん断応力を受けることがある。対照的に、懸濁集合体は集合体表面を横切るせん断応力をほとんど受けない。集合体が適用されたせん断力に対応して自由に崩れることができるからである。長期間のせん断応力が接着胚性幹細胞に有害であり、懸濁している集合体の形式が最適な生存および機能のために好しいことが予想される。多分化能性幹細胞から由来される多分化能性幹細胞、および／または、多分化能前駆細胞(multipotent progenitor cells)の生産のための効率的な製造プロセスと、せん断速度とせん断応力に関連する上記の観測された機構の必要性に基づく必要性が存在している。本発明は、初めて多分化能性幹細胞から懸濁形式、特には細胞集合体懸濁液形式で得られた多分化能性幹細胞、および／または、多分化能前駆細胞の生産のための製造方法を提供する。
【００６２】
本明細書において使用される時、「単独細胞懸濁液(single cell suspension)」またはその同等な表現は、すべての機械的または化学意味において、ｈＥＳ細胞単独細胞懸濁液またはｈＥＳ−由来(hES-derived)単独細胞懸濁液を意味する。細胞集塊を解離して、第１次組織、培養物中の接着細胞および集合体から、単独細胞懸濁液を形成するためにはいくつかの方法が存在し、例えば、物理的力（細胞スクレーパ、狭口径ピペット、細針吸引、渦離解、および細かいナイロンまたはステンレスメッシュを通した強制濾過などによる摩砕などの機械的な解離）、酵素（トリプシン、コラゲナーゼ、アキュターゼ(Acutase)などによる酵素的な解離）、または両者の併用があげられる。さらに、ｈＥＳ細胞の単独細胞への解離を支持するために役立つ方法および培養培地条件は、エキスパンション、細胞選別、マルチウェルプレート検定のためのシーディングの定義のために有用であり、培養手順とクローンエキスパンジョンの自動化を可能にする。したがって、本発明の１つの実施態様は、長期の維持と未分化の多分化能ｈＥＳ細胞または分化型ｈＥＳ細胞の効率的なエキスパンションをサポートすることができる、単独細胞の安定した酵素学的解離ｈＥＳ細胞またはｈＥＳ−由来細胞培養系を発生させるための方法を提供する。
【００６３】
本明細書において使用される時、「接触」という用語（すなわち、細胞、例えば、分化可能な細胞と、化合物との接触）は、化合物と細胞を一緒に生体外（例えば、培養物中で化合物を細胞に追加する）でインキュベートすることを含んでいることを意図する。
「接触」という用語は、被検者中で自然に起こることがある、ＥｒｂＢ３リガンド、および任意にＴＧＦ−βファミリーのメンバーを含む定義された細胞媒地への細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ暴露（すなわち、天然の生理学的過程の結果、起こることがある暴露）を含めないことを意図する。ＥｒｂＢ３リガンド、および任意にＴＧＦ−βファミリーのメンバーを含む定義された細胞培地と細胞が接触するステップは、任意の好適な方法で行うことができる。例えば、接着培養、または懸濁培養で細胞を処理できる。細胞を安定させるか、または細胞を分化するために、定義された培地と接触された細胞は、さらに細胞分化環境で処理できることが理解される。
【００６４】
本明細書において使用される時、「分化」という用語は、それが由来する細胞タイプよりも、より分化された型である細胞タイプの生産について言及する。したがって、用語は部分的にまたは最終的に分化された細胞形を包含する。一般に、ｈＥＳ細胞から得られた分化細胞とは、ｈＥＳ−由来細胞、ｈＥＳ−由来細胞集合体培養物、ｈＥＳ−由来単独細胞懸濁液、またはｈＥＳ−由来細胞接着培養物、および同様のものをいう。
【００６５】
本明細書において使用される時、「実質的に」の用語は、大きい範囲又は程度をいい、たとえば方法において「実質的に同様」の用語が使用される場合には、大きい範囲又は程度において類似し、他の方法とは異なる方法をいう。本明細書に使用される場合、例えば「実質的に含まない」、たとえば「実質的に汚染物を含まない」、「実質的に血清を含まない」、「インスリンまたはインスリン様増殖因子を実質的に含まない」、またはそれの同等表現は、溶液、培地、サプリメントおよび賦形剤なとが少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％において、または少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％、血清、汚染物または同等物を含まないことを意味する。１つの実施態様では、血清を含まない、１００％血清を含まない、または実質的に血清を含まない定義された培地が提供される。逆に、組成物、プロセス、方法、溶液、培地、サプリメント、賦形剤、および同様のものが、「実質的に同様である」またはそれと同等の表現が記載された場合には、プロセス、方法、溶液等が、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％が、本明細書で先に記載された方法と、また全体として本明細書に組み込まれた方法と類似することをいう。
【００６６】
本発明のある実施態様では、「富化された」という用語は、希望の細胞リネッジを約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％以上で含む細胞培養物をいう。
【００６７】
本明細書において使用される時、化合物の「有効な量」という用語またはそれと同等の表現は、フィーダー細胞がないときまたは血清もしくは血清代替物がないときに、１カ月以上、培養物における分化可能な細胞の安定化に作用するように、定義された培地の残余の成分中に存在する化合物の十分な濃度をいう。この量は、当業者であれば容易に決定することができる。  
【００６８】
本明細書において使用される時、「発現」という用語は、ポリヌクレオチドの転写または細胞の中のポリペプチドの翻訳についていい、分子のレベルは分子を発現する細胞では分子を発現しない細胞よりも測定可能に高くされることをいう。分子の発現を測定する方法は、当業者にとって周知であり、ノーザンブロット法、ＲＴ  ＰＣＲ、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション、ウェスタンブロット法、および免疫染色があげられるが、これらに限定されるものではない。
【００６９】
本明細書において使用される時、細胞、細胞ライン、細胞培養または細胞のポピュレーションについて述べる時、「単離された(isolated)」という用語は、細胞の天然源から実質的に分離され、細胞、細胞ライン、細胞培養、または細胞ポピュレーションが生体外で培養できるようにされることをいう。さらに、「単離」という用語は、二個以上の細胞のグループからの１種以上の細胞の物理的選択についていい、細胞は細胞のモルホロジーおよび／または様々なマーカーの発現に基づいて選択される。
【００７０】
本発明は、以下の本発明の好ましい実施態様の詳細な説明ならびにそこに含まれる実施例を参照することでさらによく理解され得る。しかしながら、本発明にかかる組成物と方法について説明する前に、本発明は特定の核酸、特定のポリペプチド、特定の細胞型、特定の宿主細胞、特定の条件、または特定の方法などに限定されないことが理解されるべきである。当業者には当然、種々の改良と変更が明らかである。
【００７１】
ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどを含む、クローン化、ＤＮＡ単離、増幅、および精製のための標準的方法、酵素反応のための標準的方法、および様々な分離技法は当業者により知られていて、一般的に採用されているものである。
多くの標準的方法がＳａｍｂｒｏｏｋら，１９８９  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８２  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｗｕ（Ｅｄ．）１９９３  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１８，Ｐａｒｔ  Ｉ；Ｗｕ（Ｅｄ．）１９７９  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８；Ｗｕら，（Ｅｄｓ．）１９８３  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １００  ａｎｄ  １０１；Ｇｒｏｓｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｍｏｌｄａｖｅ（Ｅｄｓ．）  １９８０  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５；Ｍｉｌｌｅｒ（ｅｄ．）１９７２  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｏｌｄ  ａｎｄ  Ｐｒｉｍｒｏｓｅ，１９８１  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ；Ｓｃｈｌｅｉｆ  ａｎｄ  Ｗｅｎｓｉｎｋ，１９８２  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｇｌｏｖｅｒ  Ｅｄ．）１９８５  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｏｌ．Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ；Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（Ｅｄｓ．）１９８５  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ；および  Ｓｅｔｌｏｗ  ａｎｄ  Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ  １９７９  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ＶｏＩｓ．１−４，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；に記載されている。使用される略語と用語体系は、この分野で標準であると考えられて、本明細書に引用されたものなどの専門雑誌で一般的に使用される。
【００７２】
本発明は基本栄養塩溶液、ＥｒｂＢ３リガンドの有効な量を含む組成物と方法に関し、本発明の組成物は実質的に血清を含まない。本発明の組成物および方法は、細胞、特には分化可能な細胞の培養に有用である。分化可能な細胞を培養する間の異なったポイントで、様々な成分を細胞培養に追加できることが理解される。培地は本明細書に記載されたもの以外の成分を含むことができる。しかしながら、培地の調製の間、または分化可能な細胞の培養の間の１つのポイントで、定義された培地は基本栄養塩溶液とＥｒｂＢ２−由来チロシンキナーゼの活性化手段を含むことが企図される。
【００７３】
本明細書に記載される基本栄養塩溶液は、ｈＥＳの細胞成育と生育性を維持するのに使われるが、本発明の他の実施態様においては、多分化能または多能性細胞の分化を維持するために、代替の幹細胞培養液も実質的に同様に作用し、たとえばＫＳＲ(Invitrogen)、無異物性のＫＳＲ(xeno-free KSR)(Invitrogen)、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）（Invitrogen)、ｍＴｅＳＲ（登録商標）ｌ(StemCell Technologies)、ＨＥＳｃＧＲＯ（ミリポア）、ＤＭＥＭベース培地などがあげられるが、これらに制限されるものではない。
【００７４】
別の実施態様では、ｈＥＳ細胞は、細胞外マトリックス蛋白質（ＥＣＭ）、たとえばＭＡＴＲＩＧＥＬの存在下および／または非存在下で、本明細書に記載された定義された培地で培養される。ＥＣＭの非存在下で培養されたヒト胚性幹細胞は、約０．５〜１０％ヒト血清（ｈＳ）を含んでいるか、または３００Ｋおよび／または１００Ｋカットオフスピンカラム(Microcon)からのｈＳ濃縮画分を含む。直接ｈＳまたはｈＳ濃縮画分を含む培地でｈＥＳ細胞を直接インキュベートすることによって、ｈＥＳ細胞集合体懸濁液を製造できる。ｈＳまたはｈＳ濃縮画分と培地容器を約３０分、１時間、２時間、３時間、４、何時間、５時間、６時間、１２時間、および２４時間、３７℃でインキュベートした後に、ｈＥＳ細胞集合体懸濁液を製造できる。ｈＳまたはｈＳ濃縮画分含有培地におけるｈＥＳ細胞のためのコロニー形成率は、ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６２７５５に記載されている、ＤＣ−ＨＡＩＦで培養されたｈＥＳ細胞、またはＥＣＭとしてＭＡＴＲＩＧＥＬを使用してＤＣ−ＨＡＩＦ培地で培養されたｈＥＳ細胞、または他の類似する培地で培養されたｈＥＳ細胞において観察されたものと匹敵していた。実質的に血清を含まない定義された培地でｈＥＳ細胞を培養することが、２００７年１０月１９日に出願された、米国出願番号１１／８８７５、０５７の、ヒト幹を含む多能性幹細胞培地のフィダーのための方法と組成物(METHODS AND COMPOSITIONS FOR FEEDER PLURIPOTENT STEM CELL MEDIA CONTAINING HUMAN SERUM)に記載され、これは本明細書の一部として組み込まれる。
【００７５】
異なる実施態様では、ｈＥＳ細胞集合体懸濁液は実質的に血清を含まない培地で、外因的に付加された繊維芽細胞生長因子（ＦＧＦ）の非存在下で培養された。これはトムソンらの米国特許番号７，００５，２５２の、血清を含まない培地であるが、ＦＧＦをはじめとする外因的に付加された増殖因子を含む培地でｈＥＳ細胞を培養することを必要とする発明と区別される。
【００７６】
細胞制御は細胞の中で生化学経路を調節することに至る、膜を横切る細胞外シグナルの形質導入を通して作用できる。蛋白質燐酸化は最終的に細胞応答をもたらす、細胞内信号が分子から分子へ伝播される１つの経過を表す。これらの情報伝達カスケードは非常に規制され、ホスファターゼおよび多くのプロテインキナーゼの存在により証明されるように、しばしば重なる。プロテインチロシンキナーゼが人間では、糖尿病、癌腫を含む多くの病状の発展における重要な役割を有することが知られて、また、さまざまな先天性症候群に関係すると報告された。セリントレオニンキナーゼ（例えば、Ｒｈｏ−キナーゼ）は酵素類のクラスであり、阻害されたならば、糖尿病、癌腫、さまざまな炎症性の心臓血管疾患、およびＡＩＤＳをはじめとする、人間のかかる病気の治療に関連性を持つことができる。これまで特定されたか、または設計された阻害剤の大部分が、ＡＴＰ結合部位で作用する。そのようなＡＴＰ拮抗阻害剤は、ＡＴＰ結合部位の、より不十分に保存された領域を狙う選択能を示した。
【００７７】
小さいＧＴＰ結合蛋白質のＲｈｏ−キナーゼファミリーはＲｈｏ  Ａ−ＥとＧ、Ｒａｃ１および２、Ｃｄｃ４２、およびＴＣ１０を含む少なくとも１０のメンバーを含む。
阻害物はしばしばＲＯＫまたはＲＯＣＫ阻害剤と呼ばれる、そして、それらは本明細書において互換性を持って使用される。ＲｈｏＡ、ＲｈｏＢ、およびＲｈｏＣのエフェクタドメインは、同じアミノ酸配列を持って、同様の細胞内標的を持っているように見える。Ｒｈｏ−キナーゼはＲｈＯの原発性川下媒体(primary downstream mediator)として操作して、２つのアイソフォームα（ＲＯＣＫ２）とβ（ＲＯＣＫｌ）として存在している。Ｒｈｏ−キナーゼファミリー蛋白質は、Ｎ末端ドメインに触媒作用（キナーゼ）ドメイン、中間部分にコイルドコイル領域、およびＣ末端領域に推定プレックストリン相同性（putative pleckstrin-homology)(ＰＨ）ドメインがある。ＲＯＣＫのＲｈｏ−結合ドメインは、コイルドコイル領域のＣ末端部分に局所化されて、ＲｈｏのＧＴＰ結合形式はキナーゼ活性の増進をもたらす。Ｒｈｏ／Ｒｈｏキナーゼ仲介経路は、アンジオテンシンＩＩ、セロトニン、トロンビン、エンドセリン−１、ノルエピネフリン、血小板由来増殖因子、ＡＴＰ／ＡＤＰ、および細胞外ヌクレオチド、およびウロテンシンＩＩをはじめとする多くのアゴニストにより開始される情報伝達で重要な役割を果たす。目標作動因子／基体の調節で、Ｒｈｏ−キナーゼは、平滑筋収縮、アクチン細胞骨格組織、細胞接着、自動運動性、および遺伝子発現を含む様々な細胞機能で重要な役割を果たす。また、動脈硬化の病因に関連していると知覚されている多くの細胞機能を調停することにおけるＲｈｏ−キナーゼタンパク質の果たす役割により、このキナーゼの阻害剤は、アテローム性動脈硬化を進行すると思われる内皮の収縮と内皮透過性の増大に伴った様々な動脈硬化性心血管病の治療または予防の役に立つかもしれない。したがって、本発明の他の実施態様では、細胞生存を促進する、および／または、サポートする薬剤が、種々の細胞培養培地、例えば、Ｒｈｏ−キナーゼ阻害剤Ｙ−２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ、およびＨ−１１５２ＰおよびＩＴＳ（インスリン／鉄結合性グロブリン／セレニウム；Ｇｉｂｃｏ）に加えられる。これらの細胞生存促進薬は、たとえば前腸内胚葉、膵性内胚葉、膵性上皮、膵性幹細胞集団、および同様のもの、特には分離された膵性内胚葉および膵性幹細胞集団のような、部分的に分離したｈＥＳ細胞またはｈＥＳによって由来された培養物の再会合を促進することにより機能する。ｈＥＳまたはｈＥＳ−由来の細胞の生存の増大は、細胞が懸濁された細胞集合体で生産されたか、または接着性の平板培養から製造されたかどうかの如何にかかわらず、細胞外マトリックスの有無、血清の有無、フィーダーの有無にかかわらず達成された。これらの細胞集団の生存の増大は、セルソータを使用した精製システムを容易にして、改良する。したがって、細胞の回収を改良した。Ｙ２７６３２などのＲｈｏ−キナーゼ阻害剤の使用は、連続継代で分離した単独細胞、または極低温の保存からの生存を促進することによって、ｈＥＳ−由来の細胞タイプのエキスパンションを許容する。Ｙ２７６３２などのＲｈｏ−キナーゼ阻害剤は、ｈＥＳおよびｈＥＳ由来細胞培養物でテストされ、Ｒｈｏ−キナーゼ阻害剤は他の細胞形に適用でき、たとえば一般に上皮性細胞、たとえば肺、胸腺、腎臓、神経性の細胞タイプ、たとえば網膜色素上皮細胞などに適用できる。
【００７８】
本明細書において使用される時、「分化可能な細胞」という用語は、少なくとも部分的に成熟した細胞に分化できる細胞または細胞集合、または細胞の分化、たとえば他の細胞との融合、または少なくとも部分的に成熟した細胞への分化に参加できるものを記載するために使用される。本明細書において使用される時，「部分的に成熟している細胞(partially mature cells)」、「前駆細胞(progenitor cells)」、「未熟細胞(immature cells)」、「前駆体細胞(precusor cells)」、「多能性細胞(multipotent cells)」、およびそれらと同等の用語は、例えば、最終的な内はい葉細胞、ＰＤＸｌ陰性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸｌ陽性プレ膵性内はい葉細胞を含むＰＤＸｌ陽性の膵性内はい葉細胞、ＰＤＸｌ陽性膵性内胚葉端細胞のような、末端分化細胞を含む。すべてが、同じ臓器または組織からの成熟細胞の、たとえばモルホロジーまたは蛋白質発現などの遺伝表現型の少なくとも１つの特徴を示すが、さらに他の少なくとも１つの細胞タイプに分化できる。例えば、正常の、成熟したヘパトサイトは、アルブミン、線維素原、α−１−アンチトリプシン、プロトロンビン凝固因子、鉄結合性グロブリン、およびシトクロムＰ−４５０などの解毒酵素のようなタンパク質を通常発現する。したがって、本発明において「部分的に成熟しているヘパトサイト」は、アルブミンまたは別の１種以上のタンパク質を発現することができるか、または正常で、成熟したヘパトサイトの外観または機能を持ち始めることができる。
【００７９】
サイズと形の両方で異なることがある以前に知られている方法で製造された細胞集合体と対照的に、本明細書に記載された細胞集合体と方法は、狭いサイズと形状の分布を有する。すなわち、細胞集合体はサイズおよび／または形が実質的に均一である。分化性能と培養均質性に、細胞集合体の大きさの均一性は重要である。透過性が等しいと仮定すると、基本的な質量輸送分析を集合体に適用した場合には、より小さい集合体への拡散と比べて、大きい集合体の中心への酸素および栄養物の拡散は遅くなると予想される。膵性リネッジ細胞への集合した胚性幹細胞の分化が特異的増殖因子の一時的適用に依存しているので、異なった直径の集合体の混合物を有する培養物は、均一（大きさ形状）な細胞集合体と比べて、同期していない培養物である傾向がある。細胞集合体のこの混合物は不均一をもたらして、低い分化性能をもたらして、結局製造、スケールアップ、および生産にそれ自体を適合させることができない。本明細書に使用された細胞集合体は、様々な形のものであることができる、例えば、球、シリンダ（望ましくは、等しい高さと直径を有する）、または棒状などであることができる。本発明の１つの実施態様で他の形状の集合体を使用できるが、一般に、細胞集合体が球体、または筒状であることが望ましい。別の実施態様では、細胞集合体は、球体であって大きさ形状が実質的に一定である。例えば、細胞集合体がサイズにおいて異なるか、または均一でないなら、細胞の大規模なスケールアッププロセスを信頼性良く製造して、実行するのは難しいだろう。したがって、本明細書に使用される場合、「実質的に一定」の、または「大きさ形状が実質的に一定」の句またはそれの同等表現は、集合体の均一性における広がりについて言及して、それは約２０％以下である。別の実施態様では、集合体の均一性における広がりは、約１５％以下、１０％以下または５％以下である。
【００８０】
１つの集合あたりの細胞の正確な数は重要でないが、それぞれの集合のサイズ（その結果、１集合あたりの細胞数）が酸素および栄養物が中心細胞に拡散する能力によって制限され、またこの数は細胞タイプとこの細胞タイプの栄養需要量に応じて変化することが当業者によって認められるだろう。細胞集合体は、１集合あたりの細胞の最少数（例えば、２または３つの細胞）を含むことができるか、または１集合あたり数百または数千もの細胞を含むことができる。通常、細胞集合体は１集合あたり数百から数千の細胞を含む。本発明の目的のために、細胞集合体は典型的には約５０ミクロンから約６００ミクロンのサイズを有するが、細胞のタイプにより変化し、サイズはこの範囲内よりさらに少ないか、または大きいことができる。１つの実施態様では、細胞集合体のサイズは、約５０ミクロンから約２５０ミクロン、または約７５〜２００ミクロン、望ましくは約１００〜１５０ミクロンである。対照的に、懸濁液で得られることができる筒状の、または非球状細胞の集合体では、マイナー、およびメジャーな軸（例えば、Ｘ、Ｙ、およびＺ軸）に基づいた直径が等しくない。これらの非球状細胞集合体は、サイズが大きく、直径および高さが約５００ミクロンから６００ミクロンである傾向がある。しかしながら、それらが分化していなかった場合、本明細書に記載された方法で分化がいったん開始されると、これらの非球状ｈＥＳ細胞集合体は球体になる。非球状細胞集団は、筒状の、そして立方体様の細胞集合体を含み、これらに制限されないが、サイズと形状は依然として一定である。
【００８１】
本明細書に記載された細胞集合体を形成するのに多くの細胞タイプを使用できる。一般に、設計される（例えば、膵臓、肝臓、肺、腎臓、心、膀胱、血管、および同様のものを含む様々な臓器構造）三次元構造に応じて、細胞タイプの選択は異なるだろう。例えば、三次元構造が膵臓であれば、細胞集合体は膵臓で通常見られる１つまたは複数の細胞タイプ（例えば、インスリン、グルカゴン、グレリン、などの内分泌細胞ソマトスタチンタイプ細胞、内皮細胞、平滑筋細胞など）を有利に含むだろう。当業者は、立体的な組織または臓器のタイプに基づいて望ましいように細胞集合体のための適切な細胞形を選ぶことができる。適当な細胞タイプとしての非限定的な例としては、細胞（例えば、成人のおよび胚性）、収縮性または筋肉細胞（例えば、横紋筋細胞と平滑筋細胞）、神経系細胞（例えば、膠細胞、樹枝状、およびニューロン）、結合組織（骨、軟骨、骨形成細胞および軟骨形成細胞に分化する細胞、およびリンパ組織）、実質細胞、上皮系細胞（腔、脈管またはチャンネルでライニングを形成する内皮細胞）、外分泌上皮細胞、上皮系吸収細胞、角化上皮系細胞（例えば、角質細胞と角膜上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌細胞、粘膜上皮細胞、腎臓上皮細胞、肺上皮細胞、乳房上皮細胞、および同様のもの、および未分化細胞（たとえば胚細胞、幹細胞、他の前駆細胞など）があげられる。
【００８２】
本明細書に記載された細胞集合体は、ホモ細胞集合体またはヘテロ細胞の集合体である場合がある。本明細書において使用される時、「ホモ細胞」、「単細胞」の細胞集合体またはそれの同等の表現は懸濁液中の複数の細胞集合体を示す。ここで各細胞集合体は実質的に単独細胞の複数の生細胞を含む。たとえば本明細書の方法で製造されるｈＥＳ細胞集合体は、実質的にホモ細胞であることができ、多分化能ｈＥＳ細胞から実質的に成ることができ、最終的な内はい葉細胞から実質的に成ることができ、前腸内はい葉細胞から実質的に成ることができ、膵性内はい葉細胞から実質的に成ることができ、さらにＰＤＸｌ−陽性のプレ膵性内はい葉細胞、ＰＤＸｌ−陽性の膵性内はい葉細胞、ＰＤＸｌ−陽性の膵性内胚葉、膵性の内分泌性前駆細胞、膵臓内分泌細胞、および同様のものであることができる。
【００８３】
本明細書において使用される時、「実質的に」または「本質的に」との用語は、「デ  ミニマム(de minimus)」または少量の成分または細胞が細胞集合体懸濁液タイプ内に存在することを意味し、たとえば本明細書に記載された懸濁液における細胞集合体は「本質的にまたは実質的に均質」であり、「本質的にまたは実質的にホモ細胞」であり、「本質的にｈＥＳ細胞」であり、「本質的にまたは実質的に最終的な内はい葉細胞」であり、「本質的にまたは実質的に前腸内はい葉細胞」であり、「本質的にまたは実質的にＰＤＸｌ−陰性の前腸内はい葉細胞」であり、「本質的にまたは実質的にＰＤＸｌ−陽性のプレ膵性内はい葉細胞」であり、「本質的にまたは実質的にＰＤＸｌ−陽性の膵性内胚葉または前駆細胞」であり、「本質的にまたは実質的にＰＤＸｌ−陽性の膵性内胚葉端細胞」であり、「本質的にまたは実質的に膵性内分泌腺の前駆細胞」であり、「本質的にまたは実質的に膵性内分泌腺の細胞」、および同様のものである。
【００８４】
実質的にホモ−細胞の細胞集合体懸濁液培養液は、たとえば約５０％未満のｈＥＳＣｓ、約４５％未満のｈＥＳＣｓ、約４０％未満のｈＥＳＣｓ、約３５％未満のｈＥＳＣｓ、約３０％未満のｈＥＳＣｓ、約２５％未満のｈＥＳＣｓ、約２０％未満のｈＥＳＣｓ、約１５％未満のｈＥＳＣｓ、約１０％未満のｈＥＳＣｓ、約５％未満のｈＥＳＣｓ、約４％未満のｈＥＳＣｓ、約３％未満のｈＥＳＣｓ、約２％未満のｈＥＳＣｓまたは約１％未満のｈＥＳＣｓを、培養物におけるｈＥＳ−由来の細胞合計に基づいて含む、ｈＥＳ−由来細胞集合体懸濁液培養物である。別の表現をすれば、ｈＥＳ−由来細胞集合体懸濁液培養物、たとえばＰＤＸｌ−陰性の前腸内胚葉、ＰＤＸ−陽性のプレ膵性内はい葉細胞、ＰＤＸｌ−陽性の膵性内胚葉または前駆細胞、ＰＤＸｌ−陽性の膵性端細胞、膵性内分泌前駆細胞、および膵臓内分泌細胞を少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％で含む。
【００８５】
本明細書において使用される時、「ヘテロ細胞の(hetero-cellular)」および「多細胞の(multi-cellular)」またはそれらと同等な表現は、細胞集合体であって、それぞれの細胞集合体は少なくとも２、３、４、５、６以上の細胞タイプの複数の細胞を含む細胞集合体、または少なくとも１の細胞タイプと非細胞成分、例えば細胞外マトリックス（ＥＣＭ）物質（例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、および／または、プロテオグリカン）を含む細胞集合体をいう。そのようなＥＣＭコンポーネンツは細胞により自然に分泌できるか、または細胞はＥＣＭ物質および／または、細胞接着分子、たとえばレクチン、インテグリン、免疫グロブリン、またはカドヘリンなどの発現水準を変えることが当該技術分野で知られている任意の適切な方法で遺伝子操作されることができる。別の実施態様では、集合体生成の間、天然のＥＣＭ物質またはＥＣＭ物質を模倣する任意の合成物質のいずれかを集合体に組み入れることができる。例えば、膵性上皮または膵性内胚葉細胞集合体（またはステージ４細胞集合体）などのｈＥＳ−由来細胞集合体の本明細書に記載された生産方法は、膵性上皮または内はい葉細胞から実質的に成るが、小細胞数の他の非膵性上皮性タイプ細胞、または内胚葉前駆細胞、および膵性内分泌性細胞（例えば、インスリン分泌細胞）からなることもできる。
【００８６】
本明細書に記載された懸濁方法により生産されたホモ−、またはヘテロ−細胞集合体は、当該技術分野において記載された細胞集合体とは異なり、胚様体（ＥＢｓ）と呼ばれた細胞集合体と同じではない。ＥＢｓは、ＥＳ細胞が単層培養中で過成長した時、または未定義の培地で内の懸濁培養で維持されるか、または多発性胚葉組織に向けた非由来性のプロトコール（すなわち、ランダムな分化）を介して分化された時に現れる分化したおよび未分化の細胞の細胞集合体であるので、胚様体は本明細書に記載された細胞集合体と明確に区別される。対照的に、実施例１７と２０で詳細に議論される本発明は、接着性の平板培養で酵素的にｈＥＳ細胞を分離し、単独細胞懸濁液を形成し、ついで複数の細胞を一緒にして細胞集合体を形成し、上記のｄ’Ａｍｏｕｒ２００５および２００６に実質的に記載されているように、これらの細胞集合体懸濁培養を分化のために使用する。以下でさらにＥＢｓと本発明の細胞集合体の他の相違点について議論する。
【００８７】
さらに、胚様体（ＥＢｓ）を形成する他の方法を説明する。本明細書において使用される時、「胚様体(embryoid bodies)」、「集合体(aggregate bodies)」との用語またはそれと同等の表現は、ＥＳ細胞が単層培養中で過成長した時、または未定義の培地で内の懸濁培養で維持されるか、または多発性胚葉組織に向けた非由来性のプロトコール（すなわち、ランダムな分化）を介して分化された時に現れる分化したおよび未分化の細胞の細胞集合体をいう。すなわち、ＥＢｓは、本明細書に記載されるような、多分化能性幹細胞の単独細胞懸濁液から形成されない。また、ＥＢｓはｈＥＳ−由来の多能性細胞の接着培養から形成されない。これらの特徴のみによっても、胚様体と本発明は明確に区別される。
【００８８】
胚様体はモルホロジー的な評価基準により識別可能な通常、数個の胚葉である異なる細胞タイプの混合物である。胚様体とはそれの大部分が非由来分化、すなわち、たとえば未分化細胞が定義された増殖因子が存在していない血清の高濃縮に露出されたような、胚性幹（ＥＳ）細胞から得られる細胞の集団から構成される形態学的構造について通常言及する。ＥＢ形成（例えば、マウス胚性幹細胞のためのＬｅｕｋｅｍｉａの抑制要素、または他の、同様のブロック因子の除去）に適した培養条件の下では、胚性幹細胞は増殖し、小塊の細胞を形成して分化し始める。最初に、ヒト胚性幹細胞のための約１−４日の分化に対応して、細胞の小塊は内胚葉細胞の層を外側の層の上に形成する。これは「単純性胚様体」であると考えられている。第二に、ヒト胚性幹細胞のための約３−２０日の後分化に対応して、「複雑な胚様体」が形成される。これは外胚葉性および中胚葉細胞および誘導体組織の大規模な分化で特徴付けられる。本明細書において使用される時、文脈により異なるものと考えられない限り、ＥＢｓは単純性のものと複雑なＥＢｓの両者を含んでいる。
ＥＳ細胞の培養で胚様体を形成した時に関する決定は、当技術分野の当業者によって例えば、モルホロジーの目視検査により、ルーチン的に行われる。培養条件に依存して、約２０以上の細胞の浮いた塊はＥＢｓであると考えられている。たとえばＳｃｈｍｉｔｔら、（１９９１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５，７２８−７４０；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら（１９８５）Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．８７、２７−４５を参照。また、用語は胚性生殖腺領域から抽出された初期の細胞である、始原生殖細胞から得られたものと等価の構造をも意味する。例えば、Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ，ら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５，１３７２６を参照。また当技術分野で時々ＥＧ細胞または胚芽細胞と呼ばれる始原生殖細胞は、適切な因子群で処理されると、胚様体を誘導することができる多分化能胚性幹細胞を形成できる。例えば、米国特許番号５，６７０，３７２、および上記のＳｈａｍｂｌｏｔｔらを参照。
【００８９】
ＥＢｓを作るための様々な方法が存在している、例えば（２００８）ネイチャープロトコル３（５）：４６８−７７６に記載されたスピン胚様体(spin embryoid bodies)、上記のＢａｕｗｅｎｓ他（２００８）に記載されているような、マイクロパターンド細胞外マトリックスアイランド上にプレーティングされた単独細胞懸濁液からＥＢｓが形成される。しかしながら、これらの方法はｈＥＳ細胞およびｈＥＳによって由来された細胞の大規模な生産（製造）には、費用的に採算が合わず、それほど効率的でない。スケールアップ生産が実際に始まるまでに、あまりに多くの工程を必要とするからである。たとえば、Ｂａｕｗｅｎｓ他の方法では、細胞が懸濁培養を始めるために選択される前に、最初に低減した増殖因子ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）にｈＥＳ細胞をシードしなければならない。この方法の時間と費用は、カスタム設計されたマイクロ−パターンド組織培養プレートが必要であるので、厄介である。さらに、Ｎｇらの方法は、ｈＥＳ細胞とｈＥＳ−由来の細胞の大規模な製造には、より均一なＥＢを作成するために遠心分離機の使用が必要であり、費用効率的でない。最後に、これらのすべての方法論では、本発明のようには、細胞集合体は多分化能性幹細胞の単独細胞懸濁液から作られない。
【００９０】
胚様体は本発明で記載される細胞集合体とは異なり、３つの胚葉からの多数の細胞タイプで作られた細胞集合体であり、典型的には未分化型胚性幹細胞の集合体を非有向性分化シグナル(non-directed differentiation signals)、たとえば２０％のウシ胎仔血清などに暴露することによって作成される細胞集合体である。この非有向性方法論の結果は、生体外で通常の胎児成長をまねることを意図する細胞タイプの混合物である。このアプローチは基礎研究レベルで胎児成長を調べることの役に立つが、それは細胞収率、集団のアイデンティティ、集団の純粋さ、バッチの一貫性、安全性、細胞機能、および商品原価が主要な関心であるところのすべての大規模な細胞治療製造プロセスには適用できない。そのうえ、胚様体から所定の細胞タイプを精製するのに使われた任意の富化作用戦略にかかわらず、分化プロトコールは単独細胞タイプの大集団を発生させる直接的なアプローチを提供しない。それに続いて、汚染物集団がいつも支配的であり、特定集団を精製するどんな試みも妨げるだろう。胚性幹細胞の集合体を作成して、分化することへのすべての先行研究は、それらの方法論において以下のコンポーネンツの一個以上を有する：
１）    ヒト胚性幹細胞ではなくマウスの使用
２）    通常の細胞接着過程ではなく、細胞を集合させるために遠心沈殿に依存する強制集合プロトコール
３）    静的条件における、細胞塊の集合
４）    非単独細胞解離または表面の細胞をこすり落とすことによる集合体の形成
５）    すべての胚様体と胚葉の細胞タイプの形成をもたらす、１５−２０％の胎児ウシ血清を使用する細胞集合体の非直接分化。
我々の知識によれば、胚様体を分化するのに１５−２０％のＦＣＳを利用しない唯一の研究が、細胞集合体が強制的な集合で形成されて、次に集合体がすぐに中胚葉に、適切な培地を使用して分化されるプロトコールについて説明する（Ｎｇら、Ｂｌｏｏｄ．２００５  １０６（５）：１６０１）。しかしながら、この仕事では、１０−１２日間静的に集合された後、研究者が非集合の接着培養に胚様体を移しているので、本発明とは無関係である。従来の仕事と対照的に、本発明は
１）  ヒト胚性幹細胞を単独細胞に分離し、集合直径および細胞生存のコントロールを改良するために最適化されたせん断速度で回転培養(rotational culture)することによる集合体の形成、
２）    次に直接、最終的な内胚葉へＥＳ細胞集合体を分化させ、前腸内胚葉に分化させ、プレ膵性前腸内胚葉へ分化させ、次いで膵性内胚葉および最終的に膵臓内分泌細胞へ分化させる。
この分化プロトコールは高能率と最小量の汚染物集団で、最終的な内胚葉および膵性リネッジ集団を発生させる。そのうえ、他のすべての公開された研究と対照的に、胚性幹細胞集合と分化へのこのアプローチは胚様体を作成しない。
【００９１】
分化型および未分化細胞の混合物であり、典型的には数個の胚葉からの細胞から成り、ランダムな分化を行う胚様体と対照的に、本明細書に記載された細胞集合体は、本質的にまたは実質的にホモ−セルであり、多分化能、バイポーテント(bipotent)、またはユニポーテント(unipotent)タイプの細胞の集団として存在し、たとえば胚細胞、最終的な内胚葉、前腸内胚葉、ＰＤＸｌ−陽性の膵性内胚葉、膵臓内分泌細胞、および同様のものとして存在する。
【００９２】
本発明は、再現可能に、容易に大規模製造に適用できるプロセスを使用し、実質的に大きさおよび形状が一定の細胞集合体を製造できる経済効率的な製造プロセスまたは方法を提供することによって、上記の課題を解決する。１つの特定の実施態様では、分化可能な細胞は本発明の細胞培地を使用して、懸濁培養中でエキスパンドする。別の特定の実施態様では、分化可能な細胞が懸濁液内に保持されエキスパンドされる。すなわち、それらは、未分化型のままで残っているか、またはさらに分化するのが阻まれる。当該技術分野において、細胞増殖に関連して「エキスパンド(expand)」の用語が使用される時、細胞増殖および細胞数の増加、好ましくは生菌細胞数の増加をいう。具体的な実施態様では、細胞は、培養懸濁液中で、約１日、すなわち約２４時間以上の間培養することによって、エキスパンドする。より具体的な実施態様では、細胞は懸濁培養中で少なくとも１、２、３、４、５、６、７日間、または少なくとも２、３、４、５、６、７、８週間培養することによりエキスパンドする。
【００９３】
本明細書に記載された分化培養条件とｈＥＳ−由来の細胞タイプは、実質的にｄ’Ａｍｏｕｒ他、２００６、上掲、で記載されていたものと同様である。ｄ’Ａｍｏｕｒ他、２００６、は５ステップ分化プロトコールについて説明する：
ステージ１（実質的に最終的な内胚葉生産）
ステージ２（実質的にＰＤＸｌ−陰性の前腸内胚葉生産）
ステージ３（実質的にＰＤＸｌ−陽性の前腸内胚葉生産）
ステージ４（実質的に、膵性内胚葉、または上皮または膵性内分泌性前駆体生産）、および
ステージ５（実質的に、ホルモン発現性内分泌細胞生産）。
重要なことには、初めて、本明細書に記載された懸濁法でこれらのすべての細胞形を製造できる。
【００９４】
本明細書において使用される時、「最終的な内胚葉（ＤＥ）」は、腸管または腸管に由来する臓器細胞に分化できる多分化能内胚葉リネッジ細胞を示す。ある実施態様によると、最終的な内はい葉細胞はほ乳動物細胞である。そして、好適な実施態様では、最終的な内はい葉細胞はヒト細胞である。本発明のいくつかの実施態様では、最終的な内はい葉細胞は、発現するか、またはあるマーカーを有意に発現しない。いくつかの実施態様では、ＳＯＸｌ７、ＣＸＣＲ４、ＭＸＬｌ、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３ｂｅｔａ、ＧＳＣ、ＦＧＦｌ７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱｌ、ＣＭＫＯＲｌ、ＣＲＩＰｌ、およびＣＥＲから選ばれた１種以上のマーカーは、最終的な内はい葉細胞の中で発現される。他の実施態様では、ＯＣＴ４、α−フェトタンパク（ＡＦＰ）、スロムボムデュリン(Thrombomodulin（登録商標））、ＳＰＡＲＣ、ＳＯＸ７、およびＨＮＦ４ａｌｐｈａから選ばれた１種以上のマーカーは、最終的な内はい葉細胞の中で有意に発現されない。最終的な内胚葉細胞集合体とそれの生産方法は、２００４年１２月２３日に出願された、名称が最終的内胚葉（DEFINITIVE ENDODERM)の、米国特許出願第１１／０２１，６１８に記載されており、この出願は全体が本明細書に組み込まれる。
【００９５】
本発明のさらに異なる実施態様は、「ＰＤＸｌ−陰性の前腸内はい葉細胞」および「前腸内はい葉細胞」、およびそれらの同等物の細胞培養と細胞集合体に関する。ＰＤＸｌ−陰性の前腸内はい葉細胞は、また多分化能であり、様々な細胞と、胸腺、甲状腺、副甲状腺、肺／気管支、肝臓、咽頭部、鰓嚢、十二指腸の一部およびエウスターキオ管を含む組織をもたらすことができる。いくつかの実施態様では、前腸内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７、ＨＮＦｌＢ、ＨＮＦｌα、ＦＯＸＡｌを非前腸内胚葉細胞、たとえばこれらのマーカーを有意に発現しない最終的な内胚葉またはＰＤＸ陽性の内胚葉と比べて、増加するレベルで発現する。ＰＤＸｌ−陰性の前腸内はい葉細胞は、ＰＤＸｌ、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、およびＳＯＸｌを低レベルで発現するかまたは全く発現しない。ＰＤＸｌ−陰性の前腸内胚葉細胞集合体とその生産方法は、２００６年１０月２７日に出願された、ＰＤＸＩ発現性の背側および腹側の前腸内はい葉細胞(PDXl-expressing dorsal and ventral foregut endoderm)のタイトルの米国特許出願第１１／５８８，６９３に記載され、この出願は全体が本明細書に組み込まれる。
【００９６】
本発明の他の実施態様は「ＰＤＸｌ−陽性の膵性前腸内胚葉細胞」、および「ＰＤＸｌ−陽性のプレ膵性内胚葉」、またはそれの同等物の細胞培養に関する。ＰＤＸｌ−陽性のプレ膵性内はい葉細胞は、多分化能であり、様々な細胞および／または、胃、腸および膵臓をはじめとする組織をもたらすことができる。いくつかの実施態様では、これらのマーカーを多量には発現しない非プレ膵性内はい葉細胞と比べて、ＰＤＸｌ−陽性のプレ膵性内はい葉細胞は、ＰＤＸｌ、ＨＮＦ６、ＳＯＸ９、およびＰＲＯＸｌを増大したレベルで発現する。また、ＰＤＸｌ−陽性のプレ膵性内はい葉細胞は、ＮＫＸ６．１、ＰＴＦｌＡ、ＣＰＡ、およびｃＭＹＣを低レベルで発現するかまたは全く発現しない。
【００９７】
本発明の他の実施態様は、「ＰＤＸｌ−陽性の膵性内はい葉細胞(PDXI-positive pancreatic endoderm cells)」、「ＰＤＸｌ陽性の膵性前駆(PDXI-positive pancreatic progenitor)」、「膵性上皮(pancreatic epithelium)」、「ＰＥ」またはそれらの同等物の細胞培養に関する。ＰＤＸｌ−陽性の膵性前駆細胞は、多分化能であり、腺房、管および内分泌細胞を含む膵の中の様々な細胞をもたらすことができる。いくつかの実施態様では、ＰＤＸｌ−陽性の膵性前駆細胞は、ＰＤＸｌとＮＫＸ６．１を、これらのマーカーを多量には発現しない非プレ膵性内はい葉細胞と比べて、増大したレベルで発現させる。また、ＰＤＸｌ−陽性の膵性前駆細胞は、ＰＴＦｌＡ、ＣＰＡ、ｃＭＹＣ、ＮＧＮ３、ＰＡＸ４、ＡＲＸ、ＮＫＸ２．２、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、およびＰＰを低レベルで発現するかまたは全く発現しない。
【００９８】
あるいはまた、本発明の他の実施態様は「ＰＤＸｌ−陽性の膵性内胚葉端細胞(PDXI-positive pancreatic endoderm tip cells)」、またはそれの同等物の細胞培養に関する。いくつかの実施態様では、ＰＤＸｌ−陽性の膵性内胚葉端細胞はＰＤＸｌ−陽性の膵性前駆細胞と同様、増加したレベルのＰＤＸｌおよびＮＫＸ６．１を発現するが、ＰＤＸｌ陽性の膵性前駆細胞と異なり、ＰＤＸｌ−陽性の膵性内胚葉端細胞はさらに、ＰＴＦｌＡ、ＣＰＡおよびｃＭＹＣを増加したレベルで発現する。ＰＤＸｌ−陽性の膵性内胚葉端細胞は、ＮＧＮ３、ＰＡＸ４、ＡＲＸおよびＮＫＸ２．２、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、およびＰＰを低レベルで発現するかまたは全く発現しない。
【００９９】
本発明の他の実施態様は「膵性内分泌性前駆細胞」、「膵性内分泌前駆細胞」またはそれの同等物の細胞培養に関する。膵性内分泌前駆細胞は、多分化能であり、アルファ、ベータ、デルタおよびＰＰ細胞を含む成熟している内分泌細胞をもたらす。いくつかの実施態様では、他の非内分泌性前駆細胞タイプと比べて、膵性内分泌前駆細胞はＮＧＮ３、ＰＡＸ４、ＡＲＸ、およびＮＫＸ２．２を増加したレベルで発現する。また、膵性前駆細胞はＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、およびＰＰを低レベルで発現するかまたは全く発現しない。
【０１００】
本発明のさらなる実施態様は、「膵臓内分泌細胞」、「膵臓ホルモン分泌細胞」、「膵性の小島ホルモン発現細胞」、またはそれの同等物の細胞培養に関し、多能性細胞から生体外で得られた細胞、例えば、アルファ、ベータ、デルタおよび／またはＰＰ細胞またはそれらの組み合わせに関する。内分泌細胞はポリ−ホルモン性またはシングル−ホルモン性であることができ、たとえば、インスリン、グルカゴン、グレリン、ソマトスタチン、および膵臓ポリペプチドまたはそれらの組み合わせであることができる。したがって、内分泌細胞は１種以上の膵臓ホルモンを発現することができる。これは少なくともヒトすい島細胞の機能のいくつかを有する。膵島ホルモン発現細胞は、成熟または未熟であることができる。ある種のマーカーの示差的発現に基づいてか、または生体外または生体内での機能的な能力、例えば、グルコース反応性に基づいて、成熟している膵性小島ホルモン発現細胞と未熟な膵性小島ホルモン発現細胞を区別できる。また、膵臓内分泌細胞はＮＧＮ３、ＰＡＸ４、ＡＲＸ、およびＮＫＸ２．２を低レベルで発現するかまたは全く発現しない。
【０１０１】
間葉の最終的な内はい葉細胞と比べて、上記の細胞形の大部分は上皮化される。いくつかの実施態様において、膵性内はい葉細胞は、２００６年１０月２７日に出願された、ＰＤＸＩ発現性の背側および腹側の前腸内はい葉細胞(PDXl EXPRESSING DOSAL AND VENTRAL FOREGUT ENDODERM)の名称の米国特許出願１１／５８８，６９３に記載された表３から選択される１つ以上のマーカー、および／または表４から選択される１つ以上のマーカー、および２００５年４月２６日に出願されたＰＤＸＩ発現性の内はい葉細胞(PDXl-expressing endoderm)の名称の米国特許出願１１／１１５，８６８の１種以上のマーカーを発現する。これらは本明細書中に参考として全体が援用される。
【０１０２】
本発明は、それらのソースまたはそれらの形成性(plasticity)にかかわらず、分化可能な細胞に有用な組成物と方法を企図する。本明細書においては、当該技術分野においてそうであるように、細胞の「形成性」は概略的な意味で使用される。すなわち、細胞の形成性は、胎児、胎児または成長した有機体からの組織または臓器で見い出される特定の細胞タイプに分化する細胞の能力について言及する。細胞が「より形成性」であればあるほど、細胞が分化できるかもしれない組織はより多くなる。「多分化能細胞」は、細胞とそれらの子孫(progeny)を含んでいる。それらは多分化能(pluripotent)、マルチ分化能（multipotent)、オリゴポテント(oligopotent)、および単能性(unipotent)細胞に分化するか、それらをもたらすか、および／または、全部でない場合には数個の、胎児、胎児または成長した有機体からの臓器で見い出される成熟したまたは部分的に成熟した細胞タイプとなる。「マルチ分化能細胞」は細胞とそれらの子孫を含んでいる。それらはマルチ分化能、オリゴポテント、および単能性細胞に分化するか、それらをもたらすか、および／または、成熟したまたは部分的に成熟した細胞タイプが特定の組織、臓器または臓器システムに限定される場合を除き、１以上の成熟したまたは部分的に成熟した細胞タイプとなる。例えば、マルチ分化能造血剤前駆細胞、および／またはその子孫は、１種以上のタイプの骨髄性前駆細胞やリンパ前駆細胞細胞などのオリゴポテント細胞に分化するか、またはそれらをもたらす能力を有し、また、通常、血液の中で見つけられる他の成熟した細胞組成をもたらす。「オリゴポテント細胞」は、成熟した、または部分的に成熟した細胞に分化する能力が多能性細胞より制限されている細胞およびそれらの子孫を含む。しかしながら、オリゴポテント細胞は、オリゴポテントおよび単能性細胞、および／または、１種以上の成熟した、または部分的に成熟した細胞タイプの特定の組織、臓器または臓器系に分化するような能力をまだ持つことができる。オリゴポテント細胞の１つの例は、骨髄性の前駆細胞である。これは成熟した、または部分的に成熟した、赤血球、血小板、好塩基球、好酸球、好中性および単核細胞をもたらすことができる。「単能性細胞」は、他の単能性細胞、および／または、１つのタイプの成熟した、または部分的に成熟した細胞タイプに分化するか、それらをもたらす能力を持っている細胞とそれらの子孫を含む。
【０１０３】
本明細書に使用される分化可能な細胞は多分化能、マルチポテント、オリゴポテント、または、ユニポテントであることができる。本発明のある実施態様では、分化可能な細胞は多分化能の分化可能な細胞である。より特異的な実施態様では、多分化能の分化可能な細胞は、はい幹細胞、ＩＣＭ／胚盤葉上層細胞、原始外胚葉細胞、始原生殖細胞、および奇形癌細胞から成る群から選択される。１つの特定の実施例では、分化可能な細胞は哺乳動物はい幹細胞である。より特定の実施態様では、分化可能な細胞はヒト胚性幹細胞である。
【０１０４】
本発明は、細胞が本明細書に定義されるような分化可能であるならば、動物の中の任意のソースからの分化可能な細胞をも企図する。例えば、分化可能な細胞は、胎児、またはその内部の任意の始原生殖層、胎盤またはじゅう毛膜組織、または成人の幹細胞などの、より成熟している組織から得ることができ、たとえば脂質、骨髄、神経組織、乳房組織、肝臓組織、膵臓組織、上皮性組織、呼吸器組織、生殖腺および筋肉組織から得ることができるが、これらに制限されるものではない。具体的な実施態様では、分化可能な細胞ははい幹細胞である。他の具体的な実施態様では、分化可能な細胞は成人の幹細胞である。
さらに、他の具体的な実施態様では、幹細胞は胎盤の、または、絨毛膜に由来する幹細胞である。
【０１０５】
本発明は、もちろん分化可能な細胞を発生させることができるすべての動物からの分化可能な細胞も使用することを企図する。分化可能な細胞が得られる動物は、脊椎動物、無脊椎動物、哺乳動物、非哺乳動物、人間、または非人間であることができる。動物ソースの例としては、霊長動物、齧歯動物、犬科、ネコ科、ウマ科、うし科、およびブタ科の動物を含むが、これらに限定されない。
【０１０６】
当業者に知られている任意の方法を使用することで本発明の分化可能な細胞を誘導できる。例えば、脱分化および核移植方法を使用することでヒト多能性細胞を製造できる。さらに、本発明に使用されるヒトＩＣＭ／胚盤葉上層細胞または原始外胚葉細胞は生体内または生体外で誘導できる。原始外胚葉細胞はＷＯ９９／５３０２１に記載されているように、接着培養または懸濁培養における細胞集合体として生産できる。さらに、ヒト多能性細胞は当業者に知られている任意の方法により継代することが可能で、手動の継代方法や、酵素的、または非酵素的継代方法などのバルク継代方法を使用することができる。
【０１０７】
ある実施態様では胚性幹細胞が利用される場合、はい幹細胞は正常核型を持っているが、他の実施態様では、はい幹細胞が異常核型を持っている。１つの実施態様では、はい幹細胞の大部分が正常核型を持っている。調べられた有糸分裂の中期の５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上が正常核型を示すことが企図される。
【０１０８】
別の実施態様では、はい幹細胞の大部分が異常核型を持っている。調べられた有糸分裂の中期の５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上が異常核型を示すことが企図される。ある実施態様では、細胞が５以上、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または２０以上の継代培養された後には、異常核型が明白である。１つの具体的な実施態様では、異常核型は常染色体が染色体１、７、８、１２、１４および１７から成る群から選択される少なくとも１つの常染色体の三染色体を含む。別の実施態様では、異常核型は少なくとも１よりも多い常染色体の１つが染色体１、７、８、１２、１４および１７から成る群から選択される１よりも多い常染色体の三染色体を含む。１つの実施態様では、常染色体は、第１２染色体または１７染色体である。別の実施態様では、異常核型は性染色体をさらに含む。１つの実施態様では、核型は２個のＸ染色体と１個のＹ染色体を含む。また、染色体の転座が起こることがあると想定されて、そのような転座は「異常核型」という用語中に包含される。また、上記の染色体異常と他の染色体異常の組み合わせは本発明に包含される。
【０１０９】
本発明の組成物と方法は基本栄養塩溶液を含む。本明細書において使用される時、基本栄養塩溶液とは、通常の細胞代謝のために本質的なある種のバルクな無機イオン類と水を細胞に提供する塩の混合物であり、細胞内と細胞外の浸透バランスを維持して、エネルギー源として炭水化物を提供して、生理的ｐＨ範囲内の中に媒体を維持するための緩衝化システムを提供する塩の混合物をいう。基本栄養塩溶液の例としては、ダルベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地(Minimal Essential Medium)(MEM)、基本イーグル培地(Basal Medium Eagle)(BME)、ＲＰＭｌ１６４０、ハムズＦ−１０(Ham's F-10)、ハムズＦ−１２(Ham's F-12)、アルファ−最小必須培地(α-Minimal Essential Medium)(αMEM)、グラスゴー最小必須培地(Glasgow's Minimal Essential Medium)(G-MEM)、およびイスコブの改良ダルベッコ培地(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)、およびそれらの混合物があげられるが、これらに限定されるものではない。１つの具体的な実施例では、基本栄養塩溶液はＤＭＥＭとハムズＦ１２の約５０：５０混合物である。
【０１１０】
組成物がさらに微量元素を含むことが企図される。商業的に微量元素を購入でき、例えば、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈから購入できる。微量元素の非限定的な例としては、アルミニウム、塩素、硫酸、鉄、カドミウム、コバルト、クロム、ゲルマニウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、ホスフェートおよびマグネシウムがあげられるが、これらに制限されるものではない。微量元素を含む化合物の具体的な例としては、ＡｌＣｌ３、硝酸銀、Ｂａ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２、ＣｄＣｌ２、ＣｄＳＯ４、ＣｏＣｌ２、ＣｒＣｌ３、Ｃｒ２（ＳＯ４）３、ＣｕＳＯ４、クエン酸第二鉄、ＧｅＯ２、ＫＩ、ＫＢｒ、ＬＩ、モリブデン酸、ＭｎＳＯ４、ＭｎＣｌ２、ＮａＦ、Ｎａ２ＳｉＯ３、ＮａＶＯ３、ＮＨ４ＶＯ３、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４、ＮｉＳＯ４、ＲｂＣｌ、セレニウム、Ｎａ２ＳｅＯ３、Ｈ２ＳｅＯ３、亜セレン酸塩−２Ｎａ、セレノメチオノン、ＳｎＣｌ２、ＺｎＳＯ４、ＺｒＯＣｌ２、それらの混合物、およびそれの塩があげられるが、これらに制限されるものではない。セレニウム、亜セレン酸塩またはセレノメチオノンが存在している場合には、約０．００２〜約０．０２ｍｇ／Ｌの濃度で存在する。また、さらに、ヒドロキシルアパタイトも存在することができる。
【０１１１】
定義された培地にアミノ酸類を加えることができると企図される。そのようなアミノ酸類の非限定的な例としては、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン／グルタマックス、Ｌ−塩酸アルギニン、Ｌ−アスパラギン−Ｈ２Ｏ、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン  ヒドロクロライド  Ｈ２Ｏ、Ｌ−シスチン２ＨＣｌ、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩−Ｈ２Ｏ、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−塩酸リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン二ナトリウム塩二水和物、およびＬ−バリンがあげられる。ある実施態様では、アミノ酸は、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−バリン、およびそれらの混合物質である。
【０１１２】
また、定義された培地はアスコルビン酸を含むことができると企図される。望ましくは、アスコルビン酸は約１ｍｇ／Ｌから約１０００ｍｇ／Ｌ、または２ｍｇ／Ｌから約５００ｍｇ／Ｌ、または約５ｍｇ／Ｌから約１００ｍｇ／Ｌ、または約１０ｍｇ／Ｌから約１００ｍｇ／Ｌ、または約５０ｍｇ／Ｌの初期濃度において存在している。
【０１１３】
さらに、本発明の組成物と方法は他の成分を含むことができ、たとえば血清アルブミン、鉄結合性グロブリン、Ｌ−グルタミン、リピド、抗生物質、βメルカプトエタノール、ビタミン、鉱物、ＡＴＰ、および類似物が存在することができる。存在することができるビタミン類の例としてはビタミンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ９、Ｂ１２、Ｃ、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、Ｅ、トコトリエノール、Ｋ１およびＫ２を含むが、これらに限定されない。当業者はミネラル、ビタミン、ＡＴＰ、リピド、必須脂肪酸などの、特定の培養における使用のための最適濃度を決定できる。例えば、サプリメントの濃度は約０．００１マイクロＭから約１ｍＭまたはそれ以上であることができる。サプリメントが提供されることができる濃度の具体的な例は、約０．００５マイクロＭ、０．０１マイクロＭ、０．０５マイクロＭ、０．１マイクロＭ、０．５マイクロＭ、１．０マイクロＭ、２．０マイクロＭ、２．５マイクロＭ、３．０マイクロＭ、４．０マイクロＭ、５．０マイクロＭ、１０マイクロＭ、２０マイクロＭ、１００マイクロＭなどがあげられるが、これらに限定されない。１つの具体的な実施態様では、本発明の組成物と方法はビタミンＢ６とグルタミンを含む。別の具体的な的実施態様では、本発明の組成物と方法はビタミンＣと鉄分サプリメントを含む。別の具体的な実施態様では、本発明の組成物および方法は、ビタミンＫ１とビタミンＡを含む。別の具体的な実施態様では、本発明の組成物および方法は、ビタミンＤ３とＡＴＰを含む。別の具体的な実施態様では、本発明の組成物と方法はビタミンＢ１２および鉄結合性グロブリンを含む。別の具体的な実施態様では、本発明の組成物と方法はトコトリエノールとβメルカプトエタノールを含む。別の具体的な実施態様では、本発明の組成物と方法はグルタミンとＡＴＰを含む。別の具体的な実施態様では、本発明の組成物と方法はオメガ３−脂肪酸とグルタミンを含む。別の具体的な実施態様では、本発明の組成物と方法はオメガ６−脂肪酸とビタミンＢ１を含む。別の具体的な実施態様では、本発明の組成物と方法は、α−リノレン酸、およびＢ２を含む。
【０１１４】
本発明の組成物は事実上血清を含まない。本明細書において使用される時、「事実上血清を含まない」とは、本発明の溶液における、血清の非存在を示す。血清は、本発明の組成物と方法における必須成分ではない。したがって、すべての組成物における血清の存在は単に不純物とされ、たとえば細胞初代培養からの残留結成であるか、または出発物質からのものである。例えば、事実上血清を含まない培地または環境は、１０％未満、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％未満の血清を含むことができ、媒体または環境の改良された生物活性維持能力が依然として観測される。本発明の具体的な実施態様では、事実上血清を含まない組成物は、血清または血清代替物を含んでいないか、または定義された培地に加えられる血清または血清代替物の成分の単離からの血清または血清代替物の痕跡量を含むだけである。
【０１１５】
本発明の組成物および方法においては、分化可能な細胞の中にＥｒｂＢ２チロシンキナーゼ活性を刺激する手段を含む。本発明の具体的な実施態様では、本発明の組成物および方法は、少なくとも１つのＥｒｂＢ３リガンドの存在を含む。典型的には、ＥｒｂＢ３リガンドは、ＥｒｂＢ３受容体と結合して、ＥｒｂＢ２受容体と二量化する。ＥｒｂＢ２受容体は、次いで分化可能な細胞の中で細胞内のチロシンキナーゼ活性に応答性となる。
【０１１６】
本明細書において使用される時、「ＥｒｂＢ３リガンド」はＥｒｂＢ３に結合するリガンドであって、ついでＥｒｂＢ２と二量化し、その結果、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロ二量体受容体のＥｒｂＢ２部分のチロシンキナーゼ活性を活性化するものをいう。ＥｒｂＢ３リガンドの非限定的な例としてはニューレグリン−１；ＨＲＧ−β、ＨＲＧ−α、ニュー分化因子(Neu Differentiation Factor:NDF)を含むニューレグリン−１のスプライス変異体とアイソフォーム、アセチルコリン受容体由来作用（ＡＲＩＡ）、膠細胞増殖因子２（ＧＧＦ２）、および知覚性および運動性ニューロン−由来要素(Sensory And Motor Neuron-Derived Factor:SMDF)、ニューレグリン−２；ＮＲＧ２−βを含むがこれに限定されないニューレグリン−２のスプライス変異体(splice variants)とアイソフォーム；エピレグリン；ビレグリン(Biregulin)があげられる。
【０１１７】
１つの実施態様では、ＥｒｂＢ２−由来チロシンキナーゼ活性を刺激する手段は、ニューレグリン−１、ヘレグリン−β（Ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ−β：ＨＲＧ−β）、ヘレグリン−α（ＨＲＧ−α）、ニュー分化因子（ＮＤＦ）、アセチルコリンの受容体由来活性体（ＡＲＩＡ）、膠細胞増殖因子２（ＧＧＦ２）、運動ニューロン由来要素(motor-neuron derived factor:SMDF)、ニューレグリン−２、ニューレグリン−２β（ＮＲＧ２−β）、エピレグリン(Epiregulin)、ビレグリン、およびそれらの変異体、機能的な断片(functional fragments)からなる群から選択された少なくとも１つのＥｒｂＢ３リガンドを含む。別の具体的な実施態様では、本発明の組成物および方法は、たとえば二個以上ＥｒｂＢ３リガンドを使用することであるがこれらに限定されない、ＥｒｂＢ２−由来チロシンキナーゼ活性を刺激する１より多い手段を含む。
【０１１８】
さらなる具体的な実施態様では、本発明の組成物と方法は、ＥｒｂＢ３リガンドは、ＨＲＧ−β、またはそれらの変異体、機能的な断片である。１つの実施態様では、培地添加タンパク質、ポリペプチド、それらの変異体または由来体の機能的な断片は、培養される細胞種と同じである。例えば、マウス胚性幹細胞が培養されている場合、培養における添加物としてハツカネズミ(mus musculs)  ＨＲＧ−β配列と同じアミノ酸配列を有するＨＲＧ−βを使用でき、「同じ種」であると考えられる。他の実施態様では、生物学的添加物から誘導された種は、培養される細胞と異なっていると考えられる。例えば、マウス胚性幹細胞が培養されている場合、ヒトＨＲＧ−β配列と同じアミノ酸配列を有するＨＲＧ−βを使用でき、「異なる種」であると考えられる。
【０１１９】
本明細書において使用される時、「機能的な断片」は、完全な長さのポリペプチドとして同様の生理的または細胞の効果を生む完全な長さのポリペプチドの断片またはスプライス変異体をいう。機能的な断片の生物学的な効果は、同様の生理的または細胞の効果が見られる限り、完全な長さのポリペプチドと同じ範囲または強度である必要はない。例えば、ＨＲＧ−βの機能的な断片は検出可能にＥｒｂＢ２−由来チロシンキナーゼを刺激できる。
【０１２０】
本明細書において使用される時、「変異体」という用語はキメラまたは融合ポリペプチド、同族体、類似物と、オーソログ、またはパラログを含む。さらに、参照される蛋白質またはポリペプチドの変異体は、アミノ酸配列が参照される蛋白質またはポリペプチドと少なくとも約８０％同じであるタンパク質またはポリペプチドである。具体的な実施態様では、変異体は比較蛋白質またはポリペプチドと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同じである。本明細書において配列アラインメントに関連して用語「対応する」が使用される時には、参照される蛋白質またはポリペプチド内の記載された位置を意味することを意図している。たとえば野生型ヒトまたはマウスのニューレグリン−１と、変成された蛋白質またはポリペプチドにおける参照される蛋白質またはポリペプチドにおける位置をいう。したがって、対象のタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列が、参照される蛋白質またはポリペプチド配列のアミノ酸配列と並べられた時、参照される蛋白質またはポリペプチドのアミノ酸配列のある記載された位置に対応する配列は、参照される配列の位置と並ぶ配列であり、参照配列と正確な数字の同じ位置にある必要があるわけではない。以下で配列間で対応するアミノ酸を決定するための配列を整列する方法を説明する。
【０１２１】
たとえばＴＧＦ−βである参照されるアミノ酸配列コードとたとえば少なくとも約９５％「同じ」アミノ酸配列を有するポリペプチドは、ポリペプチドのアミノ酸配列が参照されるＴＧＦ−βをコード化する参照アミノ酸配列の１００アミノ酸あたり最大およそ５つの変成を含むことができるのを除いて、ポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列と同じであることを意味することが理解される。言い換えれば、参照アミノ酸配列と約９５％同じアミノ酸配列を持っているペプチドを得るためには、参照配列のアミノ酸残基の約５％までを削除するか、または他のアミノ酸で置換でき、または参照配列に、総アミノ酸類の約５％までのアミノ酸を挿入できる。参照配列のこれらの修飾は参照アミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端位置において、またはそれらの端末の位置の間のどこでも起こることができ、参照配列のアミノ酸の間に個別に存在するか、または参照配列中に１種以上の隣接するグループとして存在することができる。
【０１２２】
本明細書において使用される時、「同一性」の用語は、参照されるヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比べた、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度である。一般に、配列は最も高い順番の一致が得られるように並べられる。「同一性」自体は、当該技術分野で認識された意味を持ち、公知の技術により計算できる。（参照：、例えば、コンピュータによる分子生物学(Computational Molecular Biology)、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：インフォーマティクスおよびゲノムプロジェクト(Informatics And Genome Projects)，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；配列データのコンピュータ分析  パート(Computer Analysis of Sequence Data,Part I)，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）；ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ，分子生物学における配列分析(Sequence Analysis In Molecular Biology)，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；および  配列分析プライマー（Sequence Analysis Primer)，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１））。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の間の同一性を測定するいくつかの方法が存在しているが、「同一性」という用語は当業者には公知である（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．＆Ｌｉｐｔｏｎ，Ｄ．，Ｓｉａｍ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ  ４８：１０７３（１９８８））。２つの配列の間の同一性または類似性を決定するのに一般的に使われる方法は、これに限定されるものではないが、大規模コンピュータのガイド(Guide to Huge Computers)，Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９４）ａｎｄ  Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．＆  Ｌｉｐｔｏｎ，Ｄ．，Ｓｉａｍ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ  ４８：１０７３（１９８８）に開示されている。コンピュータプログラムは同一性と類似性について計算する方法とアルゴリズムを含むことができる。２つの配列の間の同一性と類似性を決定するコンピュータプログラム方法の例は、これに限定されるものではないが、ＧＣＧ  プログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（ｉ）：３８７（１９８４）），ＢＬＡＳＴＰ，ＥｘＰＡＳｙ５  ＢＬＡＳＴＮ，  ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ら，Ｊ  Ｍｏｌｅｃ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３（１９９０））および  ＦＡＳＴＤＢに示される。同一性と類似性を決定する方法の例は、Ｍｉｃｈａｅｌｓ，Ｇ．ａｎｄ  Ｇａｒｉａｎ，Ｒ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＶｏＩ  １，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２０００）に記載され、これは参照され、本明細書に組み込まれる。本発明の１つの実施態様では、二つ以上のポリペプチドの間の同一性を決定するために使用されるアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴＰである。
【０１２３】
本発明の別の実施態様では、二つ以上のポリペプチドの間の同一性を決定するために使用されるアルゴリズムは、ＦＡＳＴＤＢである。これはＢｒｕｔｌａｇらのアルゴリズムによる（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））。これは参照され、本明細書に組み込まれる。ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントでは、対照とされる配列はアミノ配列である。得られる配列アラインメントの同一性はパーセントで示される。同一性のパーセントを計算するためにアミノ酸配列のＦＡＳＴＤＢアラインメントに使用されるパラメータ類は、これらに限定されないが、以下の通りである。マトリックス＝ＰＡＭ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、ミスマッチペナルティ＝１、ジョイニングペナルティ＝２０、ランダマイゼイショングループ長さ＝０、カットオフスコア＝１、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ  ０．０５、ウインドーサイズ＝５００、または対象とされるアミノ配列の長さの、どちらか短い方。
【０１２４】
対象の配列がＮ末端またはＣ終点の付加または染色体欠失のために対象とされる配列よりも短いかまたは長い場合、内部の付加または染色体欠失のためであるかに関わらず、手作業で矯正をすることができる。なぜなら、パーセントの同一性について計算するとき、ＦＡＳＴＤＢプログラムが対象の配列のＮ末端とＣ末端のトランケーションまたは付加を計算しないからである。対象とされている配列に関し、５’または３’末端においてトランケーションされている配列について、同一性のパーセントは、マッチング／アラインしていない対象配列に対する、Ｎ−末端およびＣ末端である対象配列の塩基の数について計算することによって、対象配列の全塩基のパーセントとして修正される。ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果が、マッチング／アラインメントを決定する。アラインメントの割合は、具体的なパラメータ類を使用して上記のＦＡＳＴＤＢプログラムで計算された同一性パーセントから引き算され、最終パーセント同一性スコアが得られる。アラインメントがどのようにお互いに「対応するか」を決定する目的に、同一性パーセントと同様に、この修正されたスコアを使用できる。手動で同一性パーセントスコアを調整する目的のために、参照または対象の配列のＮまたはＣ末端を超えて伸びる質問（対象）の配列の残基を考慮することができる。すなわち、比較配列のＮまたはＣ末端にマッチ／アラインされていない残基は、手動でパーセント同一性スコアまたはアラインメントナンバリングを調整するときに計算できる。
【０１２５】
例えば、９０アミノ酸残基被検配列は、パーセントの同一性を決定するために１００残基参照配列と並べられる。染色体欠失は対象の配列のＮ末端で起こる。したがって、ＦＡＳＴＤＢ配列はＮ末端で最初の１０残基のマッチ／アラインメントを示さない。１０の不対残基が配列の１０％を示す時（ＮとＣ末端における残基数が被検配列における残基の総数と合っていない時）、ＦＡＳＴＤＢプログラムで計算されたパーセント同一性スコアから１０％が引かれる。残っている９０の残基が完全に合わせられているなら、最終的な同一性パーセントは９０％である。別の例では、９０残基の対象配列は１００の対象配列と比較される。このとき、染色体欠失は、対象の配列のＮまたはＣ末端には残基が全くない、対象とマッチしないかまたはアラインされていない内部欠損である。
この場合、ＦＡＳＴＤＢによって計算されたパーセントの同一性は、手動で修正されない。
【０１２６】
また、本発明はキメラまたは融合ポリペプチド(chimeric or fusion polypeptides)を提供する。本明細書において使用される時、「キメラポリペプチド」または「融合ポリペプチド」は、少なくとも第二の異なったポリペプチドに有効にリンクされた参照ポリペプチドのメンバーの一部を含む。第二のポリペプチドは、実質的に参照ポリペプチドと同じでないポリペプチドに対応するアミノ酸配列を有し、該ポリペプチドは同じかまたは異なった有機体から誘導される。融合ポリペプチドに関して、「有効にリンクする」という用語は、参照ポリペプチドと第二のポリペプチドがお互いに融合し、両方の配列が使用される配列に生ずる期待される機能を実現させるようにされることを意図する。参照ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に第二のポリペプチドを融合できる。例えば、ある実施態様では、融合ポリペプチドは、ＩＧＦ−１配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合されたＧＳＴ−ＩＧＦ−１融合ポリペプチドである。そのような融合ポリペプチドは組換ポリペプチドの精製を容易にすることができる。別の実施態様では、融合ポリペプチドはＮ末端におけるヘテロロガスシグナル配列を含むことができる。ある宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）の中では、ポリペプチドの発現および／または分泌はヘテロロガスシグナル配列の使用で増加できる。
【０１２７】
断片および融合ポリペプチドに加えて、本発明は天然存在ポリペプチドの同族体と類似物を含んでいる。「同族体」は本明細書において類似又は同一のヌクレオチドまたはアミノ酸配列を持つ２つの核酸またはポリペプチドと定義される。同族体は、以下に定義されるような、対立遺伝子多型、オーソログ、パラログ、アゴニスト、およびきっ抗体を含んでいる。「同族体」という用語はさらに遺伝コードの縮退のため参照ヌクレオチド配列と異なっていて、その結果参照ヌクレオチド配列によってコード化されたものと同じポリペプチドをコード化する核酸分子を包含する。本明細書において使用される時、「天然存在」は天然に発生する核酸またはアミノ酸配列を示す。
【０１２８】
ポリペプチドのアゴニストは実質的にポリペプチドの生物活動と同じ、またはサブセットを保持できる。ポリペプチドの拮抗物質はポリペプチドから天然に発生する活性の一以上を禁止できる。
【０１２９】
本発明の組成物および方法のより具体的な実施態様では、ＥｒｂＢ３リガンドは、ＨＲＧ−β、その変異体または機能的な断片である。さらに、ＥｒｂＢ３リガンドの非限定的な例は以下に開示される。米国特許Ｎｏ．６，１３６，５５８、６，３８７，６３８、および７，０６３，９６１。これらは参考として本明細書に援用される。
【０１３０】
一般に、ヘレグリンは２つの主要な型式に分類され、Ｃ末端部分で異なる２つの変異体のＥＧＦ−様ドメイン(EGF-like domains)に基づいて、アルファおよびベータとされる。しかしながら、これらのＥＧＦ−様ドメインは、そこに含まれる６つのシステイン残基のスペーシングが同じである。アミノ酸配列比較に基づいて、ホームズ他は、ＥＧＦ−様ドメインの１番目から６番目のシステインの間において、ＨＲＧｓがヘパリン結合ＥＧＦ−様増殖因子（ＨＢ  ＥＧＦ）と４５％類似し、アンフィレグリン（ＡＲ）と３５％同一で、ＴＧＦ−αと３２％同一で、ＥＧＦと２７％同一であることを見いだした。
【０１３１】
４４ＫＤａ  ニュー分化因子（ＮＤＦ）はヒトＨＲＧのラット同等物である。ＨＲＧポリペプチドのように、ＮＤＦはＥＧＦ−様ドメインが免疫グロブリン（Ｉｇ）相同ドメインの(immunoglobulin (Ig) homology domain)あとに続き、Ｎ末端シグナルペプチドを欠いている。現在、ＥＧＦ−様ドメインの配列に基づく、アルファまたはベータポリペプチドのどちらかとして分類された少なくとも６の異なった線維芽細胞  ｐｒｏ−ＮＤＦｓがある。アイソフォーム１から４はＥＧＦ−様ドメインと膜貫通領域の間の変化するストレッチに基づいて特徴付けられる。したがって、異なったＮＤＦアイソフォームは、スプライシングの変化により発生して、異なった組織特異的機能を実行できるように見える。ＥＰ  ５０５１４８；ＷＯ９３／２２４２４；および  ＷＯ９４／２８１３３を参照。これらは本明細書に援用される。
【０１３２】
本発明の１つの実施態様では、本発明の組成物と方法は外因のインスリンとインスリン代用物を含まない。「外因のインスリンまたはインスリン代用物」を含まないという句は、インスリンまたはインスリン代用物を故意に本発明の組成物または方法に追加されないということを示すのに本明細書に使用される。本発明のある実施態様では、本発明の方法と組成物は、したがって、故意に供給されるインスリンまたはインスリン代用物を含まない。しかしながら、本発明の組成物または方法が必ずしも内因性インスリンを踏むことができないというわけではない。本明細書において使用される時、「内因性インスリン」は、本発明の方法により培養された時に、培養細胞が自らの作用としてインスリンを製造できることを示す。細胞初代培養からの不純物、または出発物質からの残留不純物を示すものとして内因性インスリンが使用されることもある。具体的例では、本発明の組成物および方法は、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１マイクロｇ／ｍＬ以下のインスリンを含んでいる。
【０１３３】
本明細書において使用される時、「インスリン」という用語は、正常な生理学的濃度でインスリン受容体と結合し、インスリン受容体を通してシグナルを引き起こすことができる、タンパク質、変異体またはその断片を示す。「インスリン」という用語は、すべての自然なヒトインスリン、他の哺乳動物インスリン、これらの配列の同族体やまたは変異体のポリペプチド配列を有するタンパク質を包含する。さらに、用語インスリンはインスリン受容体と結合し、インスリン受容体を通してシグナルを引き起こすことができる、ポリペプチド断片を包含する。「インスリン代用物」という用語はインスリンとして実質的に同様の結果を与えるためにインスリンに代わって使用されるすべての亜鉛含有化合物をも包含する。インスリン代用物の例としては、塩化亜鉛、硝酸亜鉛、臭化亜鉛、および硫酸亜鉛を含むが、これらに限定されない。
【０１３４】
はっきり言えば、インスリン様増殖因子は、本発明で企図されるインスリン代用物でなく、またインスリンの同族体でもない。従って、別の具体的実施態様では、本発明の組成物および方法は少なくとも１回のインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、変異体またはそれの機能的な断片の使用を含む。別の実施態様では、本発明の組成物および方法はすべての外因のインスリン様増殖因子（ＩＧＦｓ）も含まない。具体的実施態様では、本発明の組成物および方法は２００、１５０、１００、７５、５０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｎｇ／ｍＬ以下のＩＧＦ−１を含んでいる。
【０１３５】
本明細書において使用される時、「ＩＧＦ−１Ｒのアクチベータ」という用語は調整された細胞増殖、分化、およびアポプトーシスにおいて極めて重要な役割を果たす有糸分裂促進因子をいう。ＩＧＦ−１Ｒのアクチベータの効果は、他の受容体を通して媒介されることもできるが、ＩＧＦ−１Ｒを通して通常媒介される。また、ＩＧＦ−１Ｒは腫瘍ウイルス蛋白質と癌遺伝子産物によって引き起こされた細胞形質転換を含み、相互作用は特異的結合蛋白質（ＩＧＦＢＰｓ）のグループによって規制される。さらに、ＩＧＦＢＰプロテアーゼの大きいグループはＩＧＦＢＰｓを加水分解し、ＩＧＦｓ結合を解離し、ＩＧＦ−１Ｒと相互作用する能力を再開する。本発明の目的のために、リガンド、受容体、結合蛋白質、およびプロテアーゼはすべてＩＧＦ−１Ｒのアクチベータであると考えられている。ある実施態様では、ＩＧＦ−１Ｒのアクチベータは、ＩＧＦ−１、またはＩＧＦ−２である。更なる実施態様では、ＩＧＦ−１ＲのアクチベータはＩＧＦ−１類似物である。ＩＧＦ−１類似物の非限定的な例は、ＬｏｎｇＲ３−ＩＧＦｌ，Ｄｅｓ（ｌ−３）ＩＧＦ−１，［Ａｒｇ３］ＩＧＦ−ｌ，［Ａｌａ３１］ＩＦＧ−１，Ｄｅｓ（２，３）［Ａｌａ３１］ＩＧＦ−１，［ＬｅＵ２４］ＩＧＦ−ｌ，Ｄｅｓ（２，３）［Ｌｅｕ２４］ＩＧＦ−ｌ，［Ｌｅｕ６０］ＩＧＦ−ｌ，［Ａｌａ３１］［Ｌｅｕ６０］ＩＧＦ−ｌ，［Ｌｅｕ２４］［Ａｌａ３１］ＩＧＦ−ｌ，およびそれらの組み合わせである。更なる実施態様では、ＩＦＧ−１類似物はＬｏｎｇＲ３−ＩＧＦｌである。ＬｏｎｇＲ３−ＩＧＦｌはヒトインスリン増殖因子−１の組換え型の類似物である。ＬｏｎｇＲ３−ＩＧＦｌは、約１ｎｇ／ｍＬから約１０００ｎｇ／ｍｌ、より望ましくは約５ｎｇ／ｍｌから約５００ｎｇ／ｍＬ、より望ましくは約５０ｎｇ／ｍｌから約５００ｎｇ／ｍＬ、より望ましくは約１００ｎｇ／ｍｌから約３００ｎｇ／ｍＬ、または約１００ｎｇ／ｍｌの濃度において初期的に存在していると想定される。
【０１３６】
ある実施態様では、本発明の組成物および方法は、形質転換増殖因子ベータ（transforming growth factor beta:ＴＧＦ−β）、またはＴＧＦ−βファミリー、変異体またはそれの機能的な断片を含む。本明細書において使用される時、「ＴＧＦ−βファミリーのメンバー」という用語または増殖因子に関連して使用される同様の語は、ＴＧＦ−βファミリーに関連する当業者に使用される一般的なもの、またはＴＧＦ−βファミリーのメンバーに知られた相同性により、またはＴＧＦ−βファミリーのメンバーに知られた機能の類似性により特徴付けられる。本発明の具体的な実施対態様では、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーが存在する場合には、ＴＧＦ−βファミリーのメンバー、変異体またはそれの機能的な断片がＳＭＡＤ２または３を活性化する。ある実施態様では、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーは、ノーダル（Ｎｏｄａｌ）、アクチビン  Ａ、アクチビン  Ｂ、ＴＧＦ−β、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ２）、および骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ４）から成るグループから選ばれる。１つの実施態様では、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーはアクチビン  Ａである。
【０１３７】
ノーダル(Nodal)が存在している場合には、約０．１ｎｇ／ｍＬから約２０００ｎｇ／ｍｌ、より望ましくは約１ｎｇ／ｍｌから約１０００ｎｇ／ｍＬ、より望ましくは約１０ｎｇ／ｍｌから約７５０ｎｇ／ｍＬ、より望ましくは約２５ｎｇ／ｍｌから約５００ｎｇ／ｍＬの初期濃度で存在していることが企図される。使用される場合には、アクチビン  Ａは約０．０１ｎｇ／ｍＬから約１０００ｎｇ／ｍｌ、より望ましくは約０．１ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍＬ、より望ましくは約０．１ｎｇ／ｍｌから約２５ｎｇ／ｍＬ、または望ましくは約１０ｎｇ／ｍｌの初期濃度において存在していることが企図される。存在する場合には、ＴＧＦ−βは約０．０１ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍＬ、より望ましくは約０．１ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍＬ、より望ましくは約０．１ｎｇ／ｍｌから約２０ｎｇ／ｍＬの初期濃度において存在していることが企図される。
【０１３８】
本発明の追加の実施態様では、本発明の組成物および方法はＦＧＦ受容体のアクチベータを含まない。現在、繊維芽細胞生長因子のファミリーの少なくとも２２の公知のメンバーがあり、これらの因子は４つのＦＧＦ受容体の少なくとも１つに結合する。本明細書において使用される時、「ＦＧＦ受容体のアクチベータ」という用語は、一般に、ＦＧＦ−βファミリーに関連する当業者に使用される一般的なもの、またはＦＧＦ−βファミリーのメンバーに知られた相同性により、またはＦＧＦ−βファミリーのメンバーに知られた機能の類似性により特徴付けられる増殖因子をいう。ある実施態様では、ＦＧＦ受容体のアクチベータはＦＧＦであり、たとえばαＦＧＦおよびＦＧＦ２であるが、これらに限定されない。具体的な実施態様では、組成物および方法には外因のＦＧＦ２を含まない。「外因のＦＧＦ２」を含まないとの用語は、故意に本発明の組成物または方法に線維芽細胞増殖因子２、すなわち塩基性ＦＧＦが追加されないことを示すものとして本明細書に使用される。したがって、本発明のある実施態様では、本発明の方法と組成物は故意に供給されたＦＧＦ２を含まない。しかしながら、本発明の組成物または方法が必ずしも内因性のＦＧＦ２を含むことができないというわけではない。本明細書において使用される時、「内因性のＦＧＦ２」は、本発明の方法により培養された時に、培養細胞それ自身がＦＧＦ２を製造できることを示す。細胞初代培養からの不純物、または出発物質からの残留不純物を示すものとして内因性ＦＧＦ２が使用されることもある。具体例としては、本発明の組成物または方法は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１ｎｇ／ｍＬ以下のＦＧＦ２を含んでいる。
【０１３９】
しかしながら、本発明の組成物および方法は、ＦＧＦポリペプチド、その機能的な断片またはその変異体を包含するＦＧＦ受容体の少なくとも１つのアクチベータを含むことができると企図される。ＦＧＦ２が存在する場合には、約０．１ｎｇ／ｍＬから約１００ｎｇ／ｍｌ、より望ましくは約０．５ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍＬ、より望ましくは約１ｎｇ／ｍｌから約２５ｎｇ／ｍＬ、より望ましくは約１ｎｇ／ｍｌから約１２ｎｇ／ｍＬ、また最も望ましくは約８ｎｇ／ｍｌの初期濃度において存在することが企図される。別の具体的実施態様では、本発明の組成物および方法は、ＦＧＦ２以外のＦＧＦ受容体の少なくとも１つのアクチベータを含むことができる。例えば、本発明の組成物および方法は、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ−２２、それらの変異体またはそれらの機能的な断片の少なくとも１つを含むことができる。具体的実施態様では、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０とＦＧＦ−２２、それらの変異体またはそれらの機能的な断片の少なくとも２つが存在している。別の実施態様では、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−２２、それらの変異体またはそれらの機能的な断片の３つのすべてが存在している。ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−２２、それらの変異体またはそれらの機能的な断片のいずれかが存在する場合には、それぞれが約０．１ｎｇ／ｍＬから約１００ｎｇ／ｍｌ、より望ましくは約０．５ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍＬ、より望ましくは約１ｎｇ／ｍｌから約２５ｎｇ／ｍＬ、より望ましくは約１ｎｇ／ｍｌから約１２ｎｇ／ｍＬ、また最も望ましくは約８ｎｇ／ｍｌの初期濃度において存在することが企図される。  
【０１４０】
さらなる実施態様では、本発明の組成物および方法は、血清アルブミン（ＳＡ）を含む。
具体的実施態様では、ＳＡはウシのＳＡ（ＢＳＡ）またはヒトのＳＡ（ＨＡＳ）のどちらかである。具体的実施態様では、ＳＡの濃度は容積（ｖ／ｖ）で約０．２％以上であるが、約１０％ｖ／ｖ以下である。さらなる具体的な実施態様では、ＳＡの濃度は、約０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、  ０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．２％、１．４％、１．６％、１．８％、２．０％、２．２％、２．４％、２．６％、２．８％、３．０％、３．２％、３．４％、３．６％、３．８％、４．０％、４．２％、４．４％、４．６％、４．８％、５．０％、５．２％、５．４％、５．６％、５．８％、６．０％、６．２％、６．４％、６．６％、６．８％、７．０％、７．２％、７．４％、７．６％、７．８％、８．０％、８．２％、８．４％、８．６％、８．８％、９．０％、９．２％、９．４％、９．６％  および  ９．８％（ｖ／ｖ）よりも高い。
【０１４１】
追加の実施態様では、本発明の組成物と方法は少なくとも１つの不溶性基質を含む。例えば、これらに制限されるものではないが、ポリスチレン、ポリプロピレンのような化合物を含む細胞培養表面に分化細胞を置くことができる、次いで不溶性基質で表面をコーティングできる。具体的実施態様では、不溶性基質はコラーゲン、フィブロネクチン、それらの断片またはそれらの変異体から成る群から選択される。不溶性基質の他の例はフィブリン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、およびニドゲンを含むが、これらに限定されない。
【０１４２】
従って本発明の細胞培養環境および方法は接着培養に細胞をプレーティングすることを含む。本明細書において使用される時、「プレートされる」、および「プレーティング」という用語は、細胞が接着培養中で成長することを許容する任意のプロセスをいう。本明細書において使用される時、「接着培養」という用語は、細胞が個体表面で培養される培養システムであって、該個体表面は不溶性基体でコーティングされ、ついで以下に例示されるような基体の他の表面被覆でコーティングされるか、または細胞が増殖するか安定することを許容する任意の他の化学物質または生物物質などでコーティングされるものをいう。細胞はしっかりと固体表面、または基体に接着することができるし、またそうでないこともできる。接着培養のための基体は、ポリオルニチン(polyornithine)、ラミニン、ポリリシン、精製コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、テネイシン、ビトロネクチン、エンタクチン、ヘパリン硫酸塩プロテオグリカン、多糖分解酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、およびポリ乳酸グリコール酸（ＰＬＧＡ）の一つ又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。さらに、接着培養のための基体はフィーダー層または多分化能ヒト細胞または細胞培養物を含むマトリックスを含むことができる。本明細書において使用される時、「細胞外マトリックス」という用語は、上で説明した固体基体（ただしこれらに限定されない）を包含し、並びにフィーダー層または多分化能ヒト細胞または細胞培養物を含むマトリックスを包含する。１つの実施態様では、細胞はＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）でコーティングされたプレート上にプレーティングされる。別の実施態様では、細胞はフィブロネクチンコーティングされたプレート上にプレーティングされる。ある実施態様では、細胞がフィブロネクチン上にプレーティングされる場合、プレートは１０マイクロｇ／ｍＬのヒト血漿フィブロネクチン（インビトロゲン、＃３３０１６−０１５）のコーティングで調製され、組織グレード水で希釈され、室温で２〜３時間保持される。
別の実施態様では、細胞がプラスチック上にプレーティングされるのを許容するため、２４時間までの間、血清を媒体中に置くことができる。細胞の接着を促進するために血清を使用する場合には、次に、培地が移されて、事実上血清を含まない組成物をプレーティングされた細胞に加える。
【０１４３】
本発明の組成物および方法は、分化可能な細胞が本質的にはフィーダー細胞またはフィーダー層を含まない条件下で培養されることを企図する。本明細書において使用される時、「フィーダー細胞」は生体外で成長する細胞である。すなわち、標的細胞と共同培養され、分化の段階において標的細胞を安定させる細胞をいう。本明細書において使用される時、「フィーダー細胞」という用語と「フィーダ細胞層」とは互換性を持って使用できる。本明細書において使用される時、「フィーダー細胞を本質的に含まない」との用語は、フィーダー細胞を含まないか、または「デ  ミニマス(de minimus)」の数のフィーダー細胞を含む組織培養条件を示す。「デ  ミニマス」の用語は、分化された細胞がフィーダー細胞上で培養されていた先の培養条件から現在の培養条件へ持ち越された、フィーダー細胞の数を意味する。上記の方法の１つの実施態様では、分化の現状における標的細胞を安定させるフィーダー細胞から、コンディショニングされた培地を得る。別の実施態様では、定義された培地はコンディショニングされていない培地であり、これはフィーダー細胞から得られない培地である。
【０１４４】
本明細書において使用される時、細胞または細胞培養物の細胞の分化状態に関連して使用される時に「安定」という用語は、細胞が複数の代にわたり培地中で増殖を続け、好ましくは培地中で増殖を続け、全部ではなくてもほとんどの培地中の細胞が同じ分化状態にあることを意味する。さらに安定した細胞が分裂するとき、分裂は同じ細胞タイプの細胞または同じ分化状態の細胞を通常もたらす。一般に、安定した細胞または細胞集団は、培養条件が変更されない場合には、さらなる分化又は再分化せず、細胞は継代され続け、過成長しない。１つの実施態様では、安定している細胞は、無期限に、または少なくとも２代以上にわたり、安定状態で増殖ができる。より具体的な実施態様では、細胞は３代以上、４代以上、５代以上、６代以上、７代以上、８代以上、９代以上、１０代以上、１５代以上、２０代以上、２５代以上、３０代以上にわたり、細胞は安定している。１つの実施態様では、細胞は約１カ月以上、２カ月以上、３カ月以上、４カ月以上、５カ月以上、６カ月以上、７カ月以上、８カ月以上、９カ月以上、１０カ月、または１１カ月の連続した継代において安定である。別の実施態様では、約１年間以上の連続した継代において、細胞は安定している。１つの実施態様では、それらが分化されるのが望ましくなるまで、幹細胞は多分化能状態で定義された培地において通常の継代で維持される。本明細書において使用される時、「増殖」という用語は細胞培養における細胞の数の増大について言う。
【０１４５】
ある実施態様では、本発明の組成物と方法はＢＭＰシグナリングのイナクチベータを含む。本明細書において使用される時、「ＢＭＰシグナリングのイナクチベータ」とは、１種以上のＢＭＰタンパク質の活性、またはそれらの上流または下流シグナルコンポーネンツのいずれかと、可能なシグナリング経路のいずれかを介して拮抗する薬剤をいう。ＢＭＰシグナリングのイナクチベートに使用される１つまたは複数の化合物は、当技術分野で知られているもの、または今後発見される任意の化合物であることができる。ＢＭＰシグナリングのイナクチベータの非限定的な例としては、ドミナント−陰性  トランケイティド  (dominant-negative, truncated)ＢＭＰ受容体、可溶性のＢＭＰ受容体、ＢＭＰ受容体−Ｆｃキメラ、ノギン(noggin)、ホリスタチン(follistatin)、神経由来因子(chordin)、グレムリン(gremlin)、セルベラス／ＤＡＮファミリー蛋白質(cerberus/DAN family proteins)、ベントロピン（ventropin)、高ドーズアクチビン（high dose activin)、およびアムニオンレス（amnionless)があげられる。
【０１４６】
ある実施態様では、本発明の組成物と方法は少なくとも１つのホルモン、シトキン、アディポカイン、成長ホルモン、それらの変異体またはそれらの機能的な断片を含むことができる。ある実施態様では、定義された培地に存在している成長ホルモンは、定義された培地で培養される分化可能な細胞と同じ種のものであると想定される。したがって、例えば、人間細胞が培養されているなら、成長ホルモンは人成長ホルモンである。また、培養細胞と異なった種から来ている成長ホルモンの使用も想定される。望ましくは、ホルモン、シトキン、アディポカイン、および／または成長ホルモンは、約０．００１ｎｇ／ｍｌから約１０００ｎｇ／ｍＬ、より望ましくは約０．００１ｎｇ／ｍｌから約２５０ｎｇ／ｍＬ、または、より望ましくは約０．０１ｎｇ／ｍｌから約１５０ｎｇ／ｍｌの初期濃度で存在する。
【０１４７】
本発明の組成物と方法に含むことができるシトキンとアディポカインの例としては、シトキン類の４αヘリックスバンドルファミリー、シトキン類のインターロイキン−１（ＩＬ−Ｉ）ファミリー、シトキン類のＩＬ−１７ファミリー、およびシトキン類のケモカインファミリーを含むが、これらに限定されない。もちろん、本発明はシトキン類のこれらのファミリーのそれぞれのメンバーとサブクラスを企図し、たとえば、ＣＣケモカイン類、ＣＸＣケモカイン類、Ｃケモカイン類およびＣＸ３Ｃケモカイン類、インターフェロン類、インターロイキン類、リンホトキシン類、ｃ‐ｋｉｔリガンド、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子(Granulocyte/Macrophage-Colony Stimulating Factor:GM-CSF)、単球−マクロファージコロニー刺激因子(monocyte-macrophage colony-stimulating factor M-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、レプチン、アディポネクチン、レジスチン、プラスミノゲンアクチベータインヒビター−１（ＰＡＩ−１）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦβ）、白血病阻止因子、ビスファチン、レチノール結合蛋白４（ＲＢＰ４）、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、スロンボポエチン（ＴＨＰＯ）があげられるが、これらに限定されるものではない。もちろん、当業者は本発明が上に記載された要素の変異体または機能的な断片を企図していることを理解するだろう。
【０１４８】
本発明は分化可能な細胞を培養する方法に関し、この方法は、細胞培養表面に分化可能な細胞をプレーティングすることを含み、基本栄養塩溶液を細胞に提供して、細胞にＥｒｂＢ２−由来チロシンキナーゼ活性を刺激する手段を提供することを含む。
【０１４９】
１つの実施態様では、血清または血清代替物の非存在下、およびフィーダー細胞層の非存在下で、少なくとも１つの本発明の組成物と分化可能な細胞が接触し、細胞が少なくとも１カ月、未分化状態で維持されるようにされる。多分化能は表面マーカ−、転写性マーカー、核型、３つの胚葉層の細胞に分化する能力に関する細胞のキャラクタリゼーションを介して決定できる。当業者にとって、これらのキャラクタリゼーションは周知である。
【０１５０】
本明細書に記載された細胞集合体は、任意の生理的に許容できる媒体中に懸濁でき、典型的には含まれる細胞タイプに従って選ばれる。組織培養液は例えば、糖類およびアミノ酸類のような基本的栄養、増殖因子類、抗生物質類（汚染を最小にするため）、および同様のものなどを含むことができる。別の実施態様では、分化可能な細胞は本明細書に記載された細胞培地を使用して懸濁液中で培養される。「懸濁」との用語が細胞培養の文脈で使用される場合、当技術分野で用いられる意味で使用される。すなわち、細胞培養懸濁液は、細胞または細胞集合体が表面に接着しない細胞培養環境である。当業者は懸濁培養技術に詳しく、たとえば、これらに限定されるものではないが、フローフード類(flow hoods)、インキュベータ、および／または、細胞を一定の動きに維持するために使用される装置、例えば、撹拌機プラットホーム、シェーカーなどを必要に応じて備えることができる。本明細書において使用される時、細胞が動いている場合、またはそれらの間の環境が細胞に対して動いている場合には、細胞には「動き」がある。細胞が「動き」の状態に維持されると、１つの実施態様では、動きは細胞をせん断力に暴露することを避けるか、または防ぐように設計されている「優しい動き」または「優しい撹はん」となるだろう。
【０１５１】
細胞集合体を作るさまざまな方法が当該技術分野において公知であり、例えば「ハンギングドロップ(hanging drpo)」法が知られ、この方法では組織培養液の逆さの滴の中で細胞が滴の底部に沈み、集まり、実験フラスコ中で細胞懸濁液を震動させる。これらのテクニックの種々の変法も使用できる。例えば、Ｎ．Ｅ．Ｔｉｍｍｉｎｓら，（２００４）Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ７，９７−１０３；Ｗ．Ｄａｉら，（１９９６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ５０，３４９−３５６；Ｒ．Ａ．Ｆｏｔｙら，（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２２，１６１１−１６２０；Ｇ．Ｆｏｒｇａｃｓら，（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．７４，２２２７−２２３４（１９９８）；Ｋ．Ｓ．Ｆｕｍｋａｗａら，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １０，４４１−４４５；Ｒ．Ｇｌｉｃｋｌｉｓら，（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ８６，６７２−６８０；Ｃａｒｐｅｎｅｄｏら，（２００７）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２５，２２２４−２２３４；およびＴ．Ｋｏｒｆｆら，（２００１）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１５，４４７−４５７を参照。これらの全体は本明細書に参照され組み込まれる。より最近では、細胞集合体はマイクロパターン化されたコロニーを懸濁液内にこすり落とし、マイクロタイタープレートのコロニーを遠心分離で取り出し懸濁液にするか、またはピペットを使用してパターンドマイクロウェルで成長されたコロニーを取り出し懸濁させる（Ｕｎｇｒｉｎ他、（２００８）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ３（２）、１−１２；Ｂａｕｗｅｎｓ他、（２００８）、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  Ｊｕｎｅ  ２６，２００８）。本明細書に記載された細胞集合体を製造するのにそのような方法を使用できるが、本明細書に製造された細胞集合体は、同期した有向分化（synchronous directed-differentiation)のために上記のｄ’Ａｍｏｕｒ他２００６に記載されているようにして、最適化される。これらの他の方法と異なって、本明細書に記載された懸濁液中における細胞集合体を製造するための方法は大規模製造に影響を受けやすい。
【０１５２】
一般に、本発明の細胞培地組成は、少なくとも１日に１度リフレッシュされるが、よりしばしばまたは、より少なく懸濁培養物の具体的必要性と事情によって媒体を変えることができる。生体外で、細胞は、通常バッチ・モードにより培養液で育てられて、様々な培地条件に暴露される。本明細書に記載されたように、細胞は接着培養として、または懸濁中における細胞集合体として皿培地中に存在して、取り囲む培地に接触し；および定期的に廃棄物培地が取り替えられる。一般に、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、または２４時間毎、またはそれの任意の時間で培養液をリフレッシュできる。追加例では、１．１日、１．２日、１．３日、１．４日、１．５日、１．６日、１．７日、１．８日、１．９日または２日またはそれ以上ごとに、またはそれらの間の任意の期間で培地はリフレッシュされることができるが、これらに限定されるものではない。
【０１５３】
しかし、本発明の別の実施態様では、増殖因子および頻繁に取り替えられなければならない他の薬剤の分解を防止するために環流方法(perfusion method)が採用され、または一定期間の間に培地からの廃棄物を減耗する手段として環流方法が採用された。例えば、米国特許第５，３２０，９６３号は、懸濁細胞の潅流培養のためのバイオリアクタについて説明する。米国特許第５，６０５，８２２号は、環流による培養でのＨＳＣ細胞の成長のために、増殖因子を提供するのにストロマ細胞を使うバイオリアクタシステムについて説明する。米国特許第５，６４６，０４３号は、ＨＳＣ細胞の成長のための培地組成物を含む連続した周期的環流でのＨＳＣ細胞の成長について説明する。米国特許第５，１５５，０３５号は、流体培地回転による細胞の懸濁培養のためのバイオリアクタについて説明する。これらは参照され本明細書にそれらの全体が取り入れられる。
【０１５４】
一般に、本発明の培地組成物中で懸濁培養される細胞は、ほぼ毎週、「スプリット(split)」または「継代(passage)」されるが、細胞は具体的な必要性および懸濁培養の環境に応じて、より頻繁にまたはより少ない頻度で継代されることができる。例えば、細胞は１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日間、またはそれらの間の任意のタイムフレームで継代されることができる。本明細書において使用される時、それが細胞培養の文脈で使用される場合、「スプリット」または「継代」という用語は、当該技術分野における使用されている意味で使用される。すなわち、細胞培養スプリットまたは継代は、前の培養からの細胞の収集と、新しい細胞培養容器への、より少ない数の収集された（収穫された）細胞の移転である。一般に、継代細胞は、健康な細胞培養環境で成長し続けることができる。当業者は細胞培養継代のプロセスおよび方法になじみ深く、これは必ずではないがそれらの成長エキスパンションの間に一緒に集合している細胞を分けるために使用できる酵素的または非酵素的方法の使用を含む。
【０１５５】
ある場合に、ある程度の細胞死が、継代直後の（懸濁または接着培養の）細胞で起こることがある。１つの実施態様では、分化可能な細胞は、２４時間以上細胞媒体のリフレッシュを遅らせることによって継代から「回復できる」。その後、より頻繁に細胞媒体を変えることができる。別の実施態様では、細胞培地は、さらに細胞死の防止剤を含むことができる。例えば最近Ｗａｎｔａｎａｂｅ他は、解離の後にヒト胚性幹細胞を保護するためにＲｈｏ−関連キナーゼ阻害薬(Rho-associated kinase inhibitor)、Ｙ２７６３２の使用を開示する。Ｗａｎｔａｎａｂｅ，Ｋ．，ら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２５（６）：６８１−６８６（２００７）を参照されたい。これは参照され、本明細書に援用される。
追加の実施態様では、細胞培地は、継代直後の細胞死を防ぐか、または減衰させるようにカスパーゼ阻害剤、増殖因子または他の栄養素を含むことができる。使用できる物の具体的例としては、ＨＡ１０７７、ジヒドロクロライド(Dihydrochloride)、ヒドロキシファスジル(Hydroxyfasudil)、Ｒｈｏ  キナーゼ  阻害剤、Ｒｈｏ−キナーゼ  阻害剤  ＩＩ、Ｒｈｏ  キナーゼ  阻害剤  ＩＩＩ、キナーゼ  阻害剤  ＩＶ、およびＹ２７６３２があげられるが、これらに限定されるわけではない。なお、上記の物質はすべて商業的に利用可能である。さらに別の実施態様では、細胞継代直後またはその間の細胞死を防ぐかまたは減衰させるために使用される物質または要素は、細胞が継代のプロセスから回復した後に、細胞培地から取り除くことができる。追加の実施態様では、未分化型胚性幹細胞は、標準のベース培地中で有効に集合することができ、解離と集合の間、生育性を維持するためにＹ２７６３２または他の関与を必要としない。
【０１５６】
また、追加の実施態様では、本発明の組成物および方法は界面活性化合物の存在または使用を含むことができる。１つの特定の実施例では、本発明の組成物と方法は懸濁培養において少なくとも１つの表面活性剤を含む。界面活性化合物は、当技術分野で周知であり、一般的には両親媒性である。具体的実施態様では、本発明はアニオン系、カチオン性、ノニオン性または双性である少なくとも１つの表面活性剤の使用を含む。本発明の組成物および方法に使用される表面活性剤の濃度の決定は、ルーチン的な検査と最適化の問題である。たとえばオーエン他は、ヒーラ細胞とヒト羊膜細胞の細胞培養法における界面活性化合物の使用を報告する。Ｏｗｅｎら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃ，３２：３６３−３７６（１９７８）を参照。これは参照して本明細書に組み込まれる。使用できる界面活性化合物の例としては、これらに限定されるわけではないが、以下の物質があげられる；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、アンモニウムラウリル硫酸、および他のアルキル硫酸塩；ナトリウムラウレススルフェート（ＳＬＥＳ）、アルキルベンゼンスルホン酸エステル、石鹸、または脂肪酸塩、セチルトリメチルアンモニウム臭素（ＣＴＡＢ）（ヘキサデシルトリメチル臭化アンモニウム）、および他のアルキルトリメチルアンモニウム塩、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、ポリエトキシル化獣脂アミン（ＰＯＥＡ）、ベンズアルコニウム塩化物（ＢＡＣ）、ベンズエトニウム塩化物（ＢＺＴ）、ドデシルベタイン、ドデシルジメチルアミン酸化物、コカミドプロピルベタイン、ヤシアンフォグリシナート、アルキルポリ（エチレンオキシド）、ポリエチレンオキシドとポリプロピレン・オキシドコポリマー、たとえばプルロニック(Pluronic)Ｆ６８、アルキルポリグリコシド、たとえば、オクチルグルコシド、デシルマルトシド、脂肪アルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、コカミド  ＭＥＡ、コカミドＤＥＡおよびコカミドＴＥＡ、および／または、ポリオキシエチレン−ソルビタン  モノラウレート（トゥイーン）があげられるが、これらに制限されるものではない。
【０１５７】
本明細書に記載された実施態様は、低せん断環境を維持することにより、システムの細胞濃度を維持して、流体せん断応力を最小にし、ｈＥＳ細胞を増殖させ、および／または分化させる大規模製造のための方法を提供する。特に、本発明は６０ｍｍの皿、６ウェルのプレート、回転するボトル、バイオリアクタ（例えば、スピナーフラスコ）、および容器などで細胞懸濁液を培養することによる、真核細胞製造スケールアップシステムにおける低せん断環境を維持するための方法を提供する。あるいはまた、細胞を培養する連続かん流システムは、細胞の懸濁、酸化、および新鮮な栄養物の提供のため、すなわち成長および／または分化のために、バイオリアクタまたは容器内における撹拌または動きを必要とする。細胞懸濁液を得るために、バイオリアクタ容器は典型的にはせん断応力の可能なソースである１種以上の可動な機械的撹はん装置を使用する。
【０１５８】
細胞成育と生育性を維持するのに、一定の、そして、最適化された攪拌せん断速度を確立して、維持することは重要である。例えば増加したせん断速度は、以下の点で有害である：
（１）；  過度のせん断はエネルギー消費量を上げる。
（２）；  過度のせん断は細胞膜表面での拡散を干渉する。
（３）；  過度のせん断はある化合物から生理活性を奪うことがある。
（４）；  過度のせん断は、融解(cell lysis)に通じる破壊の閾値張力を超えて細胞膜を変形する。
したがって、細胞集合体の直径、単独細胞解離およびせん断に対する特定の細胞ラインの感度に依存して、５〜５００秒−１の範囲内の中のせん断を維持することが望ましい。本発明の方法で有用な構成におけるせん断速度の例は、６ウェルの皿において、６０−１４０ｒｐｍの間の回転速度で、１００−２００ミクロンの直径の集合直径について、実施例１７に示されている。これらの値は、回転の間にバルク流体に起こる時間平均のせん断応力を見積もっている。しかしながら、容器の壁におけるせん断応力は、境界効果のためより高くなると予想される。上記のＬｅｙ他の方法を使用して、壁面せん断応力は、６０ｒｐｍから１４０ｒｐｍまでの回転速度のために計算されて、実施例１７−１９に示されている。
【０１５９】
そっと撹拌されている細胞懸濁液を発生させるための手段または装置の他の例も存在していて、当業者にとって周知である。例としては、プロペラのようなインペラー、または他の機械的手段、たとえばブラダー(bladders)、流体または気体の流れに基づく手段、超音波定在波発生器、前後にゆれるかまたは回転するプラットホーム、または細胞懸濁液を製造するそれらの組み合わせなどがあげられる。本発明の方法では、回転するプラットホームは、６ウェルのプレート内に細胞を分散させる例示的な手段であり、４００秒−１未満のせん断速度を発生させる。撹拌された流体懸濁液を発生するための撹拌機タイプまたは機構にかかわらず、バルク流体内の見積もられた時間平均されたせん断速度とせん断応力は、すべての流体混合装置が関係づけられる規格化要素を提供する。装置の中の流れの状態はそれらのプロフィルおよび層流または乱流の流れの程度により異なることができ、せん断の計算は、異なった機構による混合により発生される装置内の流れを等しくする基礎を提供する。例えば、４ｃｍのインペラー直径、６．４ｃｍの容器幅、９０度のインペラー角度、および０．１ｃｍのインペラー幅を有する１２５ｍＬスピナーフラスコでは、ｌ００ｒｐｍで回転している５ｍＬ培地を有する６ウェルの皿で、直径ｌ００μｍの集団について、バルク流体で同じ時間平均せん断速度とせん断応力を発生する。
【０１６０】
また、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日間、４０日間以上、５０日間以上にわたり、スケールアップ製造システムの低せん断環境を維持するのに本発明の方法を使用できる。例示的な稼働時間は少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日間、４０日間以上、５０日間以上である。
【０１６１】
分化可能な細胞は、酵素学的または非酵素学的方法を使用して、または、本発明の規定培地との接触の前および接触の後の手動の解離方法により、継代することができる。酵素的な解離方法の非限定的な例としては、トリプシン、コラゲナーゼ、ジスパーゼ、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）などのプロテーアーゼの使用を含む。１つの実施態様では、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）は接触された細胞の継代に使用される。酵素的継代方法が使用されるとき、得られた培養物は、シングレット(singlet)、ダブレット(doublet)、トリプレット(triplet)および細胞のクランプ(clumps)を含むことができ、これらは使用された酵素の種類に応じてサイズが異なる。非酵素学的解離方法の非限定的な例は細胞分散バッファ(cell dispersal buffer)である。当技術分野において手動の継代技術についてはよく説明されており、たとえばＳｃｈｕｌｚら，２００４  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２２（７）：１２１８−３８に記載されている。存在する場合には、細胞外マトリックスの選択により継代方法の選択は影響を及ぼされるが、当業者によって容易に決定されることができる。
【０１６２】
１つの具体的実施態様では、分化可能な細胞を培養する方法は、解離が単独細胞に細胞層を壊す解離の前に、培養チャンバーに含まれている分化可能な細胞の層の解離溶液を提供することを含む。解離の後に、単独細胞は幹細胞培養液と新しい組織培養チャンバーに置かれる；そこでは、幹細胞培養液は基本栄養塩溶液とＥｒｂＢ３リガンドを含む。いったん培養されると、単独幹細胞は単独細胞の成長と分裂を可能にする条件に置かれる。別の具体的実施態様では、分化可能な細胞を培養する方法は、先の培養チャンバーに含まれている分化可能な細胞集合へ解離溶液(dissociation solution)を提供することを含む、そこでは、解離により単独細胞または、より小さい集団に細胞の集団を壊す。
【０１６３】
本発明の方法で使用される離解溶液(disaggregation solution)は、大規模な急性毒性を細胞に引き起こさずに、単独細胞に細胞をばらばらにするか、または離解することができる離解溶液であることができる。離解溶液の例は、トリプシン、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）、０．２５％のトリプシン／ＥＤＴＡ、ＴｒｙｐＬＥ、またはＶＥＲＳＥＮＥ（登録商標）（ＥＤＴＡ）とトリプシンを含むが、これらに限定されない。本発明の方法は、少なくともいくつかの単独細胞が離解され再培養できることを条件として、集密層または懸濁液中のあらゆる細胞が単独細胞に離解されることを必要とするわけではない。
【０１６４】
培養の始め、または継代の後に、どんな密度でも分化可能な細胞をシードでき、培養チャンバーにひとつの細胞でもよい。さまざまな要素によって、シードされる細胞の細胞濃度を調整できる。たとえば接着培養、懸濁培養の使用、使用される培養細胞培養液の具体的処方、生育条件、および培養される細胞の想定された使用を含む。細胞培養密度の例としては以下があげられる；０．０１×１０５細胞／ｍｌ，０．０５×１０５細胞／ｍｌ，０．１×１０５細胞／ｍｌ，０．５×１０５細胞／ｍｌ，１．０×１０５細胞／ｍｌ，１．２×１０５細胞／ｍｌ，１．４×１０５細胞／ｍｌ，１．６×１０５細胞／ｍｌ，１．８×１０５細胞／ｍｌ，２．０×１０５細胞／ｍｌ，３．０×１０５細胞／ｍｌ，４．０×１０５細胞／ｍｌ，５．０×１０５細胞／ｍｌ，６．０×１０５細胞／ｍｌ，７．０×１０５細胞／ｍｌ，８．０×１０５細胞／ｍｌ，９．０×１０５細胞／ｍｌ，または１０．０×１０５細胞／ｍｌ、またはそれ以上、たとえば５×１０７細胞／ｍＬまでが、良好な細胞の生存を示して培養される。これらの値の間の任意の値も採用できる。
【０１６５】
上記に加えて、本明細書に使用される時には、「細胞濃度操作」という用語、「操作された細胞濃度」またはそれの等価な表現は、製造プロセスまたはシステムでの細胞密度が操作され、増殖性または分化性のｈＥＳ細胞培養物を生産することをいう。そのような細胞濃度は、システムに供給されるビタミン、ミネラル、アミノ酸、代謝物などの栄養物、または酸素分圧などの環境条件が、細胞生育力を維持するために十分である下でのものをいう。あるいはまた、そのような細胞濃度は、細胞生育力を維持できるような速度でシステムから廃棄物を取り除くことができる下でのものをいう。当業者は容易にそのような細胞濃度を決定できる。
【０１６６】
維持できる作動細胞濃度は、少なくとも約０．５×１０６細胞／ｍＬからである。典型的なスケールアップシステム作動式細胞濃度は、約０．５×１０６細胞／ｍＬから約２５×１０６細胞／ｍＬの間である。例示的な濃度は、約２．５×１０６細胞／ｍｌ、２２×１０６細胞／ｍＬから、最大５×１０７細胞／ｍＬの間である。本発明の方法では、細胞生存率は少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、および約１００％までである。他のスケールアップシステム作動細胞濃度と許容細胞生存率レベルは、当業者によって認められ、当業者にとって周知のテクニックにより決定できる。例えば、バッチ、フェドバッチ(fed-batch)および連続供給される構成では、約０．５×１０６細胞／ｍＬから１５×１０６細胞／ｍＬの間の細胞濃度であってもよい。
【０１６７】
また、それらの形成性または他の特性に影響を及ぼす分子類または要素について、分化可能な細胞をスクリーンに利用できる。例えば、アポプトーシス、分化または、増殖または分化可能な細胞から発生した分化されたリネッジを引き起こす薬剤を特定するのに分化可能な細胞を使用できる。
【０１６８】
本発明の組成物および方法が単独細胞継代を許容するので、分化可能な細胞は大量処理設定、これらに制限されるものではないが、たとえば９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレートで成功裏に培養された。図１６は、本発明の方法を使用して、９６ウェルプレートおよび３８４ウェルプレートの両方でＤＣ−ＨＡＩＦ内で培養されたＢＧ０２細胞のモルホロジーとアルカリ性ホスファターゼ染色を示している。簡潔には、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）を使用して継代され、９６ウェルプレートおよび３８４ウェルプレートでプレーティングされたｈＥＳＣｓ細胞は、他の培養ざらを使用して観測されたものと同様のコロニー形成率を示した。さらに、細胞はコロニーを形成して、より小さい環境で５日間成功裏にエキスパンドした。これらのより小さい培養物はモルホロジー的に未分化型のままで残り、未分化細胞のマーカーであるアルカリホスファターゼにより均一に陽性に染色された。さらに、ＡＣＥＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（ｗｗｗ．ａｃｅａｂｉｏ．ｃｏｍ）からのＲＴ−ＣＥＳ（登録商標）法を使用することで、細胞増殖と生育性を測定することができる、インピーダンスのリアルタイム測定値を提供する９６ウェルの培養装置（図示せず）でｈＥＳＣｓを育てることができた。そのようなアプローチは分化可能な細胞における微妙であるか即座の効果のラベルを使用しない識別と定量化を可能にするだろう。また、増殖、アポプトーシスおよびモルホロジー変化のリアルタイム測定も可能にするだろう。
【０１６９】
本発明の組成物および方法は、上記または本明細書のほかの場所に記載された線分の任意の組み合わせを実際には含むことができる。ただし、本発明の組成物と方法は基本栄養塩溶液と、ＥｒｂＢ２−由来チロシンキナーゼ活性を刺激する手段を含む。プロトコールのデザインにより、本発明の組成物および方法の成分が異なることは当業者には理解されるであろう。従って、本発明の１つの実施態様は、９６ウェルプレートおよび／または３８４ウェルのプレートで分化可能な細胞を培養することに関する。本発明の組成物および方法を使用して、細胞培養チャンバー、すなわち培養ざらは特定の大きさに制限されない。したがって、本明細書に記載された方法は、具体的な培養チャンバー寸法、および／または、細胞集合体を発生させる手段と装置によっては決して制限されない。
【０１７０】
本明細書に記載された組成物と方法は、いくつかの有用な特徴を持っている。例えば、本明細書に記載された組成物と方法は、人間の発達の初期をモデル化することの役に立つ。さらに、本明細書に記載された組成物と方法は、疾病の治療介入に有用であり、たとえば神経変性の障害、糖尿病または腎不全症などのように、純粋な組織または細胞タイプの発達によるものに有用である。
【０１７１】
分化可能な細胞から分化する細胞タイプは、これらに制限されるものではないが、薬物発見、薬物開発および試験、毒性学、治療目的および基礎科学研究のための細胞の生産を含む研究開発の多くの分野で用途を持っている。これらの細胞タイプはさまざまな研究分野で対象となる分子類を発現する。これらは標準参照テキストに記載される様々な細胞タイプの機能に必要であることが知られている分子類を含んでいる。これらの分子類としてはサイトカイン類、増殖因子、サイトカイン受容体、細胞外マトリックス、転写因子、分泌されたポリペプチド類および他の分子、および増殖因子受容体を含むが、これらに限定されない。
【０１７２】
本発明の分化可能な細胞が、細胞分化環境との接触を介して分化できることが企図される。本明細書において使用される時、「細胞分化環境」という用語は、分化可能な細胞の分化が誘導されるか、または分化細胞の中でヒト細胞培養が富化されるように誘導される細胞培養条件を示す。望ましくは、増殖因子によって引き起こされた分化型細胞リネッジは、均質になるだろう。「均一性」の用語は、約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の希望の細胞リネッジを含む集団を示す。
【０１７３】
部分的に、末端に、または可逆的に本発明の分化可能な細胞を分化するのに細胞分化媒体または環境を利用できる。本発明によると、細胞分化環境の培地は、さまざまな成分、たとえば、ＫＯＤＭＥＭ培地(Knockout Dulbecco's Modified Eagle's Medium)、ＤＭＥＭ、ＨａｍのＦ１２培地、ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、ＦＧＦ２（線維芽細胞増殖因子２）、ＫＳＲまたはｈＬＩＦ（ヒト白血病阻止因子）を含むことができる。また、細胞分化環境は、たとえばＬ−グルタミン、ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）、Ｐ／Ｓ（ペニシリン／ストレプトマイシン）、Ｎ２、Ｂ２７およびβメルカプトエタノール（βＭＥ）のようなサプリメントを含むことができる。以下のような追加要素を細胞分化環境に加えることができると企図される；フィブロネクチン、ラミニン、ヘパリン、ヘパリン硫酸塩、レチノイン酸、表皮細胞増殖因子ファミリー（ＥＧＦｓ）のメンバー；ＦＧＦ２、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、および／またはＦＧＦ１０を含む線維芽細胞増殖因子ファミリー（ＦＧＦｓ）のメンバー、血小板由来増殖因子ファミリー（ＰＤＧＦｓ）のメンバー；転換増殖因子（ＴＧＦ）／骨形成たん白質の（ＢＭＰ）／成長および分化因子（ＧＤＦ）ファミリーのアンタゴニスト、これらに限定されるものではないがたとえば、ノギン、ホリスタチン、コルジン、グレムリン、セルベラス／ＤＡＮファミリー蛋白質、ベントピン、高ドーズアクチビン、およびアムニオンレス(amnionless)；変異体またはそれらの機能的な断片。ＴＧＦ／ＢＭＰ／ＧＤＦアンタゴニストも、ＴＧＦ／ＢＭＰ／ＧＤＦ受容体−Ｆｃキメラの形で加えることができる。加えることができる他の要素としては、Ｎｏｔｃｈ受容体ファミリー（Notch receptor family)を介してシグナリングを活性化または不活性化できる分子類、これらに制限されるものではないが、たとえば、デルタ−様(Delta-like)およびジャグド(Jagged)ファミリーのタンパク質、並びにノッチ(Notch)プロセッシング、または解裂の阻害剤、またはそれらの変異体および機能的な断片を含んでいる。他の増殖因子としては、インスリンの様の増殖因子ファミリー(insulin like growth factor family:IGF)、インスリン、ウイングレスリレイテッド（ＷＮＴ）因子ファミリー(wingless related (WNT) factor family)、ヘッジホッグ因子ファミリー(hedgehog factor family)、それらの変異体または機能的な断片があげられる。内胚葉系中胚葉幹／前駆細胞、内胚葉幹／前駆細胞、中胚葉幹／前駆細胞、または最終的な内胚葉幹／前駆細胞の増殖と生存を促進するため、並びにこれらの前駆細胞の由来体の生存や分化を促進するために、追加要素を加えることができる。
【０１７４】
本明細書に記載された組成物は、試験化合物をスクリーニングして、試験化合物が分化可能な細胞の多分化能、増殖、および／または分化を調節するかどうか決定するために有用である。当業者は容易に分化可能な細胞の多分化能、増殖、および／または、分化を確かめることができる。非限定的な方法としては、細胞形態、様々なマーカーの発現、奇形腫形成、細胞数、およびインピーダンスの測定を含んでいる。
【０１７５】
希望の細胞リネッジへの分化可能な細胞の進行、または未分化状態での維持は、希望の細胞リネッジのマーカー遺伝子特性の発現、並びに分化可能な細胞タイプのマーカー遺伝子特性の欠損を定量化することによって、モニターできる。そのようなマーカー遺伝子の遺伝子表現を定量化する１つの方法が定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）の使用である。Ｑ−ＰＣＲを実行する方法は当技術分野で周知である。また、当技術分野で知られている他の方法もマーカー遺伝子発現を定量化するために使用できる。対象となる標識遺伝子に特異的な抗体を使用することによって、マーカー遺伝子発現を検出できる。
【０１７６】
ある実施態様では、スクリーニング法は分化可能な細胞の多分化能、増殖および／または分化を調節できる化合物を特定する、以下を含む方法を包含する；
（ａ）；  分化可能な細胞を提供すること；
（ｂ）；  基本栄養塩溶液とＥｒｂＢ３リガンドを含み、事実上血清を含まない組成物中で細胞を培養すること；
（ｃ）；  テスト化合物と細胞を接触させること；および
多分化能、増殖、および／または、分化の増大または減少が、化合物と接触された細胞で起こるかどうか決定すること。
ここで前記の増大が起こっていれば、化合物が多分化能、増殖、および／または、分化を調節することを示す。ある実施態様では、ＥｒｂＢ３リガンドはＨＲＧ−βである。他の実施態様では、テスト化合物でＥｒｂＢ３リガンドを置換して、テスト化合物の効果を決定できる。例えば、テスト化合物で起こる多分化能、増殖、および／または分化への効果は、ＥｒｂＢ３リガンドで起こる多分化能、増殖、および／または分化への効果と比較され、分化可能な細胞へのテスト化合物の効果を決定することができる。本発明のスクリーニング法に、本明細書に記載されたすべての組成物を使用できると想定される。
【０１７７】
さらに別の実施態様では、ＥｒｂＢ３リガンド（ＥｒｂＢ２−由来チロシンキナーゼ(tyrosine kinase)活性）の、非存在下で培養され、ＥｒｂＢ３リガンド（ＥｒｂＢ２−由来チロシンキナーゼ活性）の欠損の際の細胞への効果を決定できる。
【０１７８】
本明細書に記載された方法を使用して、希望の細胞リネッジを含む、他の細胞タイプを実質的に含まない組成物を製造できる。あるいはまた、分化可能な細胞と希望の細胞リネッジの混合物質を含む組成物を製造できる。
【０１７９】
本発明のいくつかの実施態様では、そのような細胞に特異的なアフィニティータグを使用することによって、希望の細胞リネッジの細胞を分離できる。標的細胞に特異的なアフィニティータグの１つの例は、本明細書に記載された方法で生産された細胞培養において見い出される標的細胞の細胞表面に存在しているが、他の細胞タイプには実質的に存在していないマーカーポリペプチドに特異的である抗体である。
【０１８０】
また、本発明はキットに関し、該キットはＥｒｂＢ２−由来チロシンキナーゼ活性を刺激することができる少なくとも１つの化合物と、基本栄養塩溶液を含む。１つの実施態様では、キットは本明細書に記載されるような少なくとも１つのＥｒｂＢ３リガンドを含む。別の実施態様では、キットは１より多いＥｒｂＢ３リガンドを含む。別の実施態様では、キットは、本明細書に記載されるように、少なくとも１つのＴＧＦ−β、ＴＧＦ−βファミリー、それらの変異体または機能的な断片を含む。さらに別の実施態様では、キットは１より多いＴＧＦ−β、ＴＧＦ−βファミリー、それらの変異体または機能的な断片を含む。さらに別の実施態様では、キットは少なくとも１つの繊維芽細胞生長因子、それらの変異体または機能的な断片を含む。別の実施態様では、キットは２以上の繊維芽細胞生長因子、それらの変異体または機能的な断片を含む。具体的実施態様では、キットは少なくとも１つのＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−２２、それらの変異体または機能的な断片の１つを含む。別の実施態様では、キットは血清アルブミンを含む。
さらに別の実施態様では、キットは血清、本明細書に記載される少なくとも１つの不溶性基体、および／または、少なくとも１つの離解溶液を含む。
【０１８１】
本発明のキットは上記の、または本明細書に任意の場所に記載された成分のすべての組み合わせも含むことができる。当業者が認めるように、本発明のキットに供給された成分は、キットのための用途により異なるだろう。したがって、この出願に記載された様々な機能を実行するようにキットを設計できる、そして、そのようなキットの成分は従って、異なるだろう。
【０１８２】
本出願を通じて、種々の文献が参照されている。これらの刊行物の開示内容は、本発明の技術分野における技術水準をより完全に記載するために、その全体が本願に参考として援用される。
【０１８３】
実施例
ヒト胚性幹細胞ラインＢＧ０１ｖ（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ｉｎｃ．、アセインズ、ジョージア州）は本明細書に記載された実験のいくつかに使用された。ＢＧ０１ｖ  ｈＥＳＣラインは核型変異体細胞ラインである。その細胞ラインは特異的三染色体（核型：４９，ＸＸＹ，＋１２，＋１７）を含む安定した核型を示す。親培養は先に説明したように維持された（Ｓｃｈｕｌｚら，２００３，ＢＭＣ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，４：２７；Ｓｃｈｕｌｚら，２００４，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２２（７）：１２１８−３８；Ｒｏｓｉｅら，２００４，Ｄｅｖ．Ｄｙｎａｍｉｃｓ，２２９：２５９−２７４；Ｂｒｉｍｂｌｅら，２００４  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．，１３：５８５−５９６）。簡潔にいえば、細胞はＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）またはフィブロネクチンでコーティングされた皿で、ＤＭＥＭ：Ｆ１２と２０％のＫＳＲ、８ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ２、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｘ  非必須アミノ酸、０．５Ｕ／ｍＬペニシリン、０．５Ｕ／ｍＬストレプトマイシン、０．１ｍＭのβメルカプトエタノールを含むマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦｓ）（ＭＥＦ−ＣＭ）からのコンディショニングされた培地（シグマ、セントルイス、ミズーリ州、米国）で、コラゲナーゼ継代で成長された。
【０１８４】
本明細書でテストされた定義された培養（ＤＣ）培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、２ｍＭ  グルタマックス(Glutamax)、Ｉｘ  非必須アミノ酸、０．５Ｕ／ｍＬペニシリン、０．５Ｕ／ｍＬストレプトマイシン、１０マイクロｇ／ｍＬの鉄結合性グロブリン（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州、米国から）、０．１ｍＭ  βメルカプトエタノール（シグマ）、０．２％脂肪酸非含有のコーンズ 画分(Cohn's fractions)Ｖ  ＢＳＡ(Serologicals)、１ｘ  トレースエレメントミックシィズ(Trace Element mixes)  Ａ、Ｂ、およびＣ(Cellgro)、並びに５０マイクロｇ／ｍＬ  アスコルビン酸（シグマ）で構成される。可変レベルの組換え型の増殖因子が使用された。該因子としては、ＦＧＦ２（シグマ）、ＬｏｎｇＲ３−ＩＧＦｌ(JRH Biosciences)，ヘレグリン(Heregulin)−β  ＥＧＦ  ドメイン(HRGβ,Peprotech)，ＴＧＦβ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ），ノダル(nodal)(R&D systems)，ＬＩＦ(R&D systems)，ＥＧＦ(R&D systems)，ＴＧＦα(R&D systems)，ＨＲＧα(R&D systems），ＢＭＰ４(R&D systems)，およびアクチビン  Ａ(R&D Systems)があげられる。ＬｏｎｇＲ３−ＩＧＦｌは、ＩＧＦｌ結合蛋白質への親和性を減少させたＩＧＦｌの改質バージョンである。その或るものはｈＥＳＣｓで発現される。ＤＣ−ＨＡＩＦは１０ｎｇ／ｍＬ  ＨＲＧ−β、１０ｎｇ／ｍＬ  アクチビン  Ａ、２００ｎｇ／ｍＬ  ＬＲ−ＩＧＦｌ、および８ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ２を含む、先のように定義された培養液である。ＤＣ−ＨＡＩは、１０ｎｇ／ｍＬ  ＨＲＧ−β、１０ｎｇ／ｍＬ  アクチビン  Ａ、および２００ｎｇ／ｍＬ  ＬＲ−ＩＧＦｌを含む、先に定義された培養液である。ＤＣ−ＨＡＩＦとＤＣ−ＨＡＩ、ＬＲ−ＩＧＦｌ成分は、もちろんＩＦＧｌで置き換えられる。
【０１８５】
ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）が塗布された皿は、増殖因子低減(Growth Factor Reduced)ＢＤ  ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）マトリツクス(BD Biosciences,Franklin Lakes、ニュージャージー、米国）を冷ＤＭＥＭ／Ｆ−１２中の約１：３０から約１：１０００への最終濃度範囲へ希釈することにより調製される。１つの実施態様では、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）の濃度は約１：２００である。１ｍｌ／３５ｍｍの皿は、室温で１〜２時間、または４℃で少なくとも一夜、皿をコーティングするのに使用された。最大１週間、４℃で、培養物は貯蔵された。使用の直前ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）溶液を取り除いた。テストされた条件に関しては、親培養は複数の条件の比較のために６ウェルの皿にプレーティングされた。培養物は、典型的には直接試験条件でプレーティングされた。培養物は、プレーティングの４〜５日後から毎日評価されて、形態学的な評価基準に基づいて等級付けされた。１〜５の評価尺度は、全体の培養を調べて、未分化型コロニーの総合的な比率、それらの相対的大きさ、明白な分化を示しているコロニー比率またはコルニーの部分を算定することによった。グレード５は大きい未分化型コロニーと無視できる分化で「理想的な」培養を示す。グレード４は非常に良い培養を示すが、幾分かの明白な分化を示す。グレード３は許容できる培養を示すが、コロニーのおよそ半分が明白な分化を示している。グレード２は、主として分化しており、時々の推定的な未分化細胞が存在する。グレード１の培養物は、分化したコロニーを含むか、または培養物は、接着しなかったか、生き残らなかった。未分化細胞の良いエキスパンションを示した培養物は、これらの条件での、より長い期間培養を評価するために継代された。
【０１８６】
実施例１−ＢＧ０１ｖ細胞におけるＥｒｂＢｌ−３、Ｎｒｇｌ、およびＡＤＡＭ１９の発現
【０１８７】
リアルタイムのＲＴ  ＰＣＲは、ＢＧ０１ｖ細胞中でのＥｒｂＢｌ−３、ニューレグリン、およびＡＤＡＭ−１９の発現を示すのに使用された（図１）。１００ｎｇ／ｍＬ  ＬｏｎｇＲ３−ＩＧＦｌ（ＬＲ−ＩＧＦｌ）、８ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ２、１ｎｇ／ｍＬ  アクチビン  Ａを含む、上で説明したようなＤＣ培地で培養されたＢＧ０１ｖ細胞が収穫され、ＲＮＡがメーカーの取扱説明書にしたがって、ＲＮ  イージーミニキット(RN easy mini kit)(Qiagen)を使用して調製された。最初のストランドｃＤＮＡは、ｉＳｃｒｉｐｔキット(Biorad)を使用することで調製された。そして、リアルタイムＰＣＲが、ＭＪ  リサーチ  オプティコン  ターミナルサイクラー(MJ Research Opticon thermal cycler)を使用して行われた。
【０１８８】
ＡＤＡＭ１９（Ｈｓ００２２４９６０＿ミリリットル）、ＥＧＦＲ（Ｈｓ００ｌ９３３０６＿ミリリットル）、ＥｒｂＢ２（Ｈｓ００１７０４３３＿ミリリットル）、ＥｒｂＢ３（Ｈｓ００１７６５３８＿ミリリットル）、ＮＲＧｌ（Ｈｓ００２４７６２０＿ミリリットル）、ＯＣＴ４（Ｈｓ００７４２８９６＿ｓｌ）についてのタクマン(TaqMan)検定方法（アプライドバイオシステム）、およびコントロールＧＡＰＤＨが、タクマン  ユニバーサル  ＰＣＲ(TaqMan universal PCR)（アプライドバイオシステム）で使用された。未分化型ＢＧ０１ｖ細胞でのこれらの転写の発現を示す、リアルタイムの増幅プロットが図１に示される。
【０１８９】
実施例２−ＥｒｂＢ２の抑制はＢＧ０１ｖ  細胞の増殖を遅くすること
【０１９０】
リガンドのＥＧＦドメインファミリーは受容体チロシンキナーゼのＥｒｂＢファミリーに結合する。ｈＥＳＣｓ中のＥｒｂＢチロシンキナーゼの公知の阻害効果を調べるために、ＢＧ０１ｖ細胞は１０００：１に希釈されたＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）の上の６ウエルトレーで、１００ｎｇ／ｍＬ  ＬｏｎｇＲ３−ＩＧＦｌ、８ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ２、および１ｎｇ／ｍＬ  アクチビン  Ａを含む定義された培養液（ＤＣ）中にプレーティングされた。翌日、ＤＭＳＯ（キャリアコントロール）、５０ｎＭ−２０マイクロＭ  ＡＧ１４７８（ＥｒｂＢｌ阻害剤）、または１００ｎＭ−２０マイクロＭ  ＡＧ８７９（ＥｒｂＢ２  阻害剤）が新鮮培地と共に加えられた。細胞は５日間、毎日培地を交換しつつ培養された。培養物は、アルカリホスファターゼ活性について固定され、染色された。
【０１９１】
ＡＰ＋ＢＧ０１ｖ細胞のサブコンフリューエント(subconfluent)コロニーが、コントロールとＡＧ１４７８培養細胞の中で観察された（図２Ａおよび２Ｂ）。ＤＭＳＯもＡＧｌ４７８（５０ｎＭ−２０マイクロＭ）も細胞増殖に明白な影響を及ぼさないことが示された。ＡＧ８７９はしかしながら、５マイクロＭで実質的に細胞成育を禁止して（図２Ｃ）、２０マイクロＭで細胞死を引き起こした（図示せず）。ＡＧ８７９で育てられた培養物は、分化を見せず、多分化能形態学とアルカリホスファターゼ活性を維持するように見えた。これはＡＧ８７９が、分化を起こさずに増殖を抑制することを示し、細胞生存において、ＢＧ０１ｖ細胞がＥｒｂＢ２シグナリングに頼っていることを示唆している。逆に、上記と同様の条件で育てられたＢＧ０１ｖ細胞は、増殖においてＥｒｂＢｌ信号に頼っているように見えない。
【０１９２】
実施例３−ＢＧ０１ｖ細胞はヘレグリンを含む定義された培地中で維持される
【０１９３】
ＥｒｂＢ２とＥｒｂＢ３の発現とＡＧ８７９での増殖抑制は、ＢＧ０１ｖ細胞が内因性のＥｒｂＢシグナリングに活性であり、またそれらが外因性のＨＲＧ−βに反応することができることを示唆した。ＢＧ０１ｖ細胞は１：１０００に希釈されたＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）上で、１０ｎｇ／ｍＬ  ＨＲＧ−β、２００ｎｇ／ｍＬ  ＬｏｎｇＲ３−ＩＧＦｌ、８ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ２、および１０ｎｇ／ｍＬ  アクチビン  Ａを含むＤＣ媒体中で成長された（図３ＡおよびＢ）。細胞は４代または２０日より長く成長され、未分化型モルホロジーを示し、高い突発性分化を示さなかった。
【０１９４】
さらに、ＢＧ０１ｖ細胞は２代、または１３日より長い間にわたり、１０ｎｇ／ｍＬ  ＨＲＧβ、２００ｎｇ／ｍＬ  ＬｏｎｇＲ３−ＩＧＦｌ、および１０ｎｇ／ｍＬ  アクチビン  Ａを含むＤＣ媒体内で維持された。これらの培養物は通常通り増殖し、非常に低い突発性分化を示した。これはＦＧＦ２の非存在下で、ＨＲＧβの存在下で、定義された条件下でＢＧ０１ｖ細胞を維持できたことを示している。
【０１９５】
実施例４−ＥＳ細胞中のＥｒｂＢ２−由来チロシンキナーゼの役割
【０１９６】
ＲＴ−ＰＣＲは、ｍＥＳＣｓがＡＤＡＭ１９、ニューレグリンｌ（Ｎｒｇｌ）、およびＥｒｂＢｌ−４を発現することを示した（図４Ａ）。ｍＥＳＣｓでは、ＥｒｂＢ２と３はＥｒｂＢ１よりも高いレベルで発現したことが示され、ＥｒｂＢ４の低レベルが検出された。これらのデータは、内因性のＨＲＧ−βがｍＥＳＣ自己再生の推進にかかわることができたことを示唆する。
【０１９７】
また、マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦｓ）中のＥｒｂＢ受容体転写物の発現も調べられた（図４Ｂ）。ＭＥＦｓは、マウスおよびヒトＥＣ細胞と胚性幹細胞を維持するのに歴史的に使用されてきたＥ１２．５−１３．５の内臓から得られた細胞の不均一集団である。この集団におけるＮｒｇｌとＡｄａｍ１９の発現は、ＨＲＧ−βエクトドメインが、ＭＥＦ馴化培地内にも存在していて、多分化能に有意な効果を示すことができることを示唆する。
【０１９８】
ＡＧ１４７８とＡＧ８７９は、マウス胚性幹細胞でのＨＲＧ／ＥｒｂＢシグナリングの役割を調べるのに使用された。ＲｌマウスＥＳ細胞はＤＭＥＭの標準状態、１０％ＦＢＳ、１０％ＫＳＲ、０．５Ｕ／ｍＬペニシリン、０．５Ｕ／ｍＬストレプトマイシン、ＩｘＮＥＡＡ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０００Ｕ／ｍＬ  ＬＩＦ（ＥＳＧＲＯ）、０．１ｍＭ  βＭＥで維持されて、０．５％トリプシン／ＥＤＴＡで継代された。２×ｌ０５細胞／ウェルは１：１０００に希釈されたＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）上で６ウエルトレー中にプレーティングされた。プレーティングの翌日、ＤＭＳＯ（キャリアコントロール）、１−５０マイクロＭ  ＡＧ１４７８、または１−５０マイクロＭ  ＡＧ８７９が新鮮培地と共に加えられた。細胞は毎日培地を交換しつつ、さらに８日間培養された。培養物は、ついで固定されたアルカリホスファターゼ活性について、染色された。
【０１９９】
ＤＭＳＯと１−５０  マイクロＭ  ＡＧｌ４７８は細胞増殖に明白な影響を有していなかった。アルカリホスファターゼポジティブのｍＥＳＣｓの「サブ−コンフルエント」コロニーが観察された（図５Ａ−Ｃ）。しかしながら、ＡＧ８７９は５０マイクロＭで実質的に細胞成育を禁止して（図５Ｄおよび５Ｆの比較）、２０マイクロＭで増殖を遅くしたかもしれない（図５Ｅ）。ＡＧ８７９で育てられたｍＥＳＣｓは、分化を示さず、多分化能モルホロジーと、アルカリホスファターゼ活性を維持した。
【０２００】
結果は、ＡＧ８７９が増殖を抑制し、ｍＥＳＣｓの分化を示さず、ｍＥＳＣｓが増殖のためにＥｒｂＢ２シグナリングを必要とすることを示唆した。逆に、ｍＥＳＣｓは、増殖のためのＥｒｂＢｌシグナリングに頼っていないように見える。増殖を抑制するために必要とされるＡＧ８７９の濃度は、ｍＥＳＣｓについて、定義された条件で育てられたＢＧ０１ｖ細胞のためのそれより約１０倍高かった。ｍＥＳＣ条件で使用した血清が薬の活性を妨げたか、ＡＧ８７９はマウスＥｒｂＢ２チロシンキナーゼについてヒトＥｒｂＢ２チロシンキナーゼより低い親和性を有するか、またはＥｒｂＢ２が胚性幹細胞の異なった種でわずかに異なった役割を果たすことができるかを示している。
【０２０１】
ＥｒｂＢ２チロシンキナーゼの別の高選択的阻害剤、チルホスチンＡＧ８２５（Ｍｕｒｉｌｌｏ，ら  ２００１  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６１，７４０８−７４１２）が、ヒトＥＳＣｓでのＥｒｂＢ２の役割を調査するのに使用された。ＡＧ８２５は、条件培地（ＣＭ）で成長するｈＥＳＣｓの増殖を顕著に禁止した（図６Ａ）。ＡＧ８２５は広範囲の細胞死を起こさずに増殖を抑制し、５日間より長くｈＥＳＣｓの生存が維持できた（図示せず）。ウェスタンブロット法は、ＡＧ８２５が、ＤＣ−ＨＡＩＦで成長する飢餓／ヘレグリン（ＨＲＧ）パルストｈＥＳＣｓ(starved/heregulin(HRG) pulsed hESCs)内で、チロシン−１２４８でＥｒｂＢ２の自動りん酸化を禁止したことを示した（図６Ｂ）。したがって、ＥｒｂＢ２の分裂のシグナリングはｈＥＳＣ増殖を厳しく抑制した。定義された生育条件でｈＥＳＣｓを確立するために、培養は、直接ＣＭ条件からＤＣ−ＨＡＩＦに継代され、最小の突発性分化を示した（図６Ｃ）。コロニーと細胞計量検定方法は、ＬｏｎｇＲ３−ＩＧＦｌとＨＲＧが、本発明の実施態様の１つの文脈における自己再生および増殖における主要な役割を演ずることを確認した（図６Ｄおよび６Ｅ）。ＩＧＦｌＲ、ＩＲ、ＦＧＦ２α、ＥｒｂＢ２、およびＥｒｂＢ３のリン酸化は、定常状態ＤＣ−ＨＡＩＦ培養、およびＤＣ−ＨＡＩＦパルスト飢餓培地(starved cultures that were pulsed with DC-HAIF)の両者で観測された（図６Ｆ）。
【０２０２】
実施例５、定義された条件における、マウスＥＳ細胞の培養
【０２０３】
さらにマウス胚性幹細胞でのＨＲＧ／ＥｒｂＢ２シグナリングの役割を調べるために、Ｒｌ  ＥＳ細胞の増殖が増殖因子の組み合わせを使用して、ＤＣ培地で調べられた。１×１０５細胞／ウェルが６ウェルのトレーの中にプレーティングされ、０．２％のゼラチンで被覆され、１０ｎｇ／ｍＬ  ＨＲＧ−β、１００ｎｇ／ｍＬ  ＬｏｎｇＲ３−ＩＧＦｌ、１ｎｇ／ｍＬ  アクチビン  Ａ、１０００Ｕ／ｍＬマウスＬＩＦまたは１０ｎｇ／ｍＬ  ＢＭＰ４の組み合わせを含むＤＣ中で培養された（以下の表１）。増殖は８日間観測された。
【０２０４】
生存可能なコロニーは、少なくともＬＩＦ／ＨＲＧ−βまたはＬＩＦ／ＢＭＰ４を含む条件でのみ成長した（表１）。ＬｏｎｇＲ３−ＩＧＦｌまたはアクチビンがこれらの組み合わせに加えられたときには、明確な追加の利益は観測されなかった。通常の増殖はコントロール親培養で観測された。そして、生存可能なコロニーは増殖因子なしの定義された培地では観測されなかった。表１参照。
【０２０５】
【表１】
0005390624.tif 000002
【０２０６】
定量的測定法は６ウェルのトレー中の１：１０００のＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）と、１０または５０ｎｇ／ｍＬのＨＲＧ−ベータ、ＥＧＦ、１０００Ｕ／ｍＬ  ＬＩＦまたは１０ｎｇ／ｍＬ  ＢＭＰ４の選択された組み合わせに２×ｌ０５細胞／ウエルをプレーティングして行った。培養物は、８日間成長され、固定された。そして、アルカリ性ホスファターゼコロニーの数が数えられた（図７Ａ）。定義された条件で増殖因子なしではコロニーは全く観測されなかった。そして、４５よりも少ないコロニーがＨＲＧ−β、ＨＲＧ−β／ＥＧＦ、およびＨＲＧ−β／ＢＭＰの組み合わせで観測された。１３５８のコロニーがＬＩＦのみで観測されたが、４１１４および３７３４コロニーが１０ｎｇ／ｍＬ  ＨＲＧ−β／ＬＩＦと５０ｎｇ／ｍＬ  ＨＲＧ−β／ＬＩＦの組み合わせでそれぞれ観測された。これは、定義された条件では、ＬＩＦだけが実質的な多分化能信号を提供したことを示した。そして、ＨＲＧ−βはＬＩＦと大きい相乗効果を示し、この分析評価において、増殖性ｍＥＳＣコロニーの数を倍以上にした。また、この分析評価の低倍率イメージはこの相乗的な増殖促進効果を示す（図７Ｂ−Ｇ）。
【０２０７】
実施例６−ＤＣ−ＨＡＩＦ中で維持されたヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣｓ）の多分化能のキャラクタリゼーション
複数のアプローチが、ＤＣ−ＨＡＩＦ内のｈＥＳＣｓの形成性の維持を確認するのに使用された。６カ月（２５代）ＤＣ−ＨＡＩＦ内で培養されたＢＧ０２細胞は、複雑な奇形腫を形成する可能性を維持（図８Ａ）し、生体外の３個の胚葉層の代表種であった。転写分析は、ＣＭおよびＤＣ−ＨＡＩＦ内で維持されたｈＥＳＣｓ細胞（Ｌｉｕら、２００６，ＢＭＣ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ６，２０）でグローバルな発現を比較するのに使用された。１１，６００より多くの転写がＤＣ−ＨＡＩＦ中で育てられた１０から３２継代のＢＧ０２細胞で、およびＣＭ中で６４継代で育てられたＢＧ０２細胞で検出された。ＣＤ９、ＤＮＭＴ３、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＴＥＲＴおよびＵＴＦｌ（図示せず）などの知られているｈＥＳＣマーカーをはじめとするすべての集団では約１０３６４の転写が一般にあった（図８Ｃ）。高い相関係数が、ＣＭとＤＣ−ＨＡＩＦ培養の比較（Ｒ２ｓｅｌｅｃｔ＝０．９２８）と、早い段階および遅い段階での継代細胞（Ｒ２ｓｅｌｅｃｔ＝０．９５９）で観測された（図８Ｄ）。階層的なクラスター分析は、ＤＣ−ＨＡＩＦ中で維持されたＢＧ０２細胞は、しっかりと保持され、ＣＭ中で維持されたＢＧ０２とＢＧ０３細胞に近い類似性を有していた（図８Ｅ）。これらのデータは前の分析と一致し、未分化型ｈＥＳＣｓは、胚様体または線維芽細胞（Ｌｉｕら、２００６，ＢＭＣ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ６，２０）と比べて、しっかりとクラスターされていることを示している。したがって、本発明の組成物で維持された細胞は、多分化能のキーマーカーを維持できる。従って、分化可能な細胞の自己再生を支持するための簡単な培地として本発明の組成物を使用できる。
【０２０８】
実施例７−ＤＣ−ＨＡＩＦ中のヒト化細胞外マトリックス（ＥＣＭｓ）におけるヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣｓ）の維持
【０２０９】
ＥｒｂＢ２シグナリングの役割を調査して、ｈＥＳＣｓのための定義された培地を開発するために、ＤＣ−ＨＡＩＦ培養物を増殖因子の減少されたｌ：３０のＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）でコーティングされた培養皿上に初期的に広げた。１：２００、または１：１０００で希釈された基体上に長期的に成功裏に維持できた（図９Ａ）。また、ヒト血清（図９Ｂ）；ヒトフィブロネクチン（図９Ｃ）；またはプロプライアタリイ  ヒューマナイズド  ＥＣＭ(proprietary humanized ECM)であるＶＩＴＲＯＧＲＯ（登録商標）（図９Ｄ）でコーティングされた組織培養皿上で、ＢＧ０２とＣｙＴ４９  ｈＥＳＣｓを５継代より長く維持できた。
【０２１０】
実施例８−ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣｓ）の単独細胞継代
【０２１１】
複数の研究グループは、ある種の三倍体性、著しくはｈＣｈｒｌ２と１７は、ｈＥＳＣｓに、ある部分的な最適培養条件の下で蓄積されることを示した（Ｂａｋｅｒら，２００７  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（２）：２０７−２１５）。三倍体性の外観は、培養物が継代時に単独細胞に分離される時に、最も直接的に不十分な細胞生存に関連するように思え、これらの異数性の細胞ハーバリング(harboring)のために推定される強い選択成長の利点が細胞に提供される。逆に、本発明の１つの実施態様でＤＣ−ＨＡＩＦで成長するｈＥＳＣｓが、単独細胞に分離された後のプレーティングで、高い生育性を維持した（図１０Ａ−Ｄ）。ＢＧ０ｌとＢＧ０２細胞は、ACCUTASE：登録商標でそれぞれ＞１８および１９の継代の後、正常核型に維持された（図１０Ｅ）。細胞における正常核型の維持は、単独細胞へのｈＥＳＣ培養物の離解が本来ＤＣ−ＨＡＩＦで維持されたｈＥＳＣｓのこれらの三染色体性の蓄積につながらなかったことを示した。ＢＧ０ｌとＢＧ０２培養物も、複数の継代試薬を使用した単独細胞への離解により継代される（図１１）。培地は、５継代のために、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）、０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ、ＴｒｙｐＬＥ、またはバーシーン(VERSENE：登録商標）でスプリットされ、カリオタイプされた(karyotyped)。データは、本発明の組成物でのｈＥＳＣｓの培養および継代は、さまざまな細胞解離試薬を使用して、正常核型が少なくとも２のヒト胚性細胞ラインで維持されたことを示す。
【０２１２】
また、本発明の組成物を使用して、未分化型ｈＥＳＣｓの大規模なエキスパンションも可能である。６０ｍｍのプレート内のＢＧ０２細胞の最初のコンフルーエントな培地(confluent culture)は、ＤＣ−ＨＡＩＦ内で２０日間の１つの実験で、１．１２×ｌ０１０より多くの細胞に４継代で増殖された。培養は未分化型のままで残り、流動細胞計測法によれば、バッチ内の細胞の８５％より多くがＯＣＴ４、ＣＤ９、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−８１などの多分化能のマーカーの発現を維持した（図１２Ａ）。また、多分化能の他のマーカーの発現もＲＴ  ＰＣＲ分析で観測された。一方分化型リネッジのα−フェトプロテイン、ＭＳＸｌ、およびＨＡＮＤｌのマーカーは検出されなかった（図１２Ｂ）。蛍光  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション分析は、ＤＣ−ＨＡＩＦ内で培養され継代された細胞は、ｈＣｈｒｌ２（９８％  ２−コピー）、ｈＣｈｒｌ７（９８％、２−コピー）、ｈＣｈｒＸ（９５％、１−コピー）およびｈＣｈｒＹ（９８％、１−コピー）について、期待されたコピー数を維持した（図１２Ｃ）。また、核型分析は、正常な倍数性染色体内容とバンディングプロフィール(banding profile)がこれらの細胞で維持されたことを示した。
【０２１３】
実施例９−生理学的濃度で適用される際の、インスリン、およびＩＧＦｌのｈＥＳＣｓへの異なる効果
【０２１４】
本質的にはこれまでのｈＥＳＣｓについての既報告培養条件のすべてが、ＩＲとＩＧＦｌＲの両方を刺激できるインスリンを生理学的に過剰な量で含んでいる。ＩＧＦｌと比べて、インスリンおよびインスリン代用物が及ぼす活性を区別するために、ｈＥＳＣｓがこれらの増殖因子の生理的濃度の定義された培地条件で培養される。インスリンとＩＧＦｌの濃度は約０．２〜約２００ｎｇ／ｍＬまでとされ、細胞増殖は、５日後に細胞を数えることによってモニターされる。成功裏に広がる培地は、連続的に５回継代される。インスリンの生理的濃度はｈＥＳＣ培養のエキスパンションをサポートしないが、ＩＧＦｌの生理的濃度はｈＥＳＣ培養のエキスパンションをサポートする。これはインスリンまたはインスリン代用物の活性がＩＧＦｌを置き換えることができないことを示し、ＩＧＦｌとインスリン（またはインスリン代用物）はｈＥＳＣｓへの作用に関して別々のクラスの生物的活性を及ぼす。
【０２１５】
実施例１０−サプリメントの効果をスクリーニングする方法
【０２１６】
中間密度で成長するｈＥＳＣｓの成長または分化に対するビタミンＢ１２とＢ６の効果を初期的に評価するために、ＢＧ０２細胞は、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）を使用して、１×１０５細胞／ウエルで、６ウェルトレー中で定義された培養（ＤＣ）培地でプレーティングされ、分裂された。ＤＣ培地は１０ｎｇ／ｍＬ  ＨＲＧ−β、２００ｎｇ／ｍＬ  ＬｏｎｇＲ３−ＩＧＦｌ、および１０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ１０を含んでいる。ビタミンＢ６（０．５マイクロＭ）、および／または、ビタミンＢ１２（０．５マイクロＭ）は試験ウエルに加えられる。各条件での細胞数は７日後に数えられる。両方の実験用および対照ウェルでの細胞数およびコロニー数は、ビタミンＢ１２とＢ６の細胞成長に与える効果の見通しを与える。
【０２１７】
さらに、ＯＣＴ４などの分化マーカーについて試験ウエル内で評価して、添加剤およびサプリメントの分化可能な細胞の分化状態への効果を決定できる。
【０２１８】
実施例１１−ＦＧＦ２の非存在下でのｈＥＳＣｓの培地
【０２１９】
ＢＧ０２細胞は長い期間（２０継代）、ＤＣ−ＨＡＩ内で維持された（図１３Ａ）。ＢＧ０ｌ細胞も、連続的にＤＣ−ＨＡＩ内で継代された。ともにＦＧＦ２の非存在下であった。培養は、悪化もしなかったし、明白な分化を示しもしないで、培養時期の全期間にわたり未分化型コロニーの通常のエキスパンションを示した。ＢＧ０２培養における、正常男性核型の維持は、ＤＣ−ＨＡＩ内での６継代の後に示された（図１３Ｂ、２０／２０の正常な有糸分裂の中期の広がり）。
【０２２０】
転写分析は、ＤＣ−ＨＡＩＦとＤＣ−ＨＡＩで維持されたｈＥＳＣｓ細胞でグローバルな発現(global expression)を比較するのに使用された。総セルＲＮＡは、ｈＥＳＣｓからＴｒｉｚｏｌ(Invitrogen)を使用して分離されて、メーカーの示唆された実験計画書によりＤＮａｓｅ  Ｉ(Invitrogen)で処理された。サンプル増幅は、全ＲＮＡの１００ｎｇで、イルミナ  ＲＮＡ  増幅(Illumina RNA Amplification)キットを使用して実行された。そして、ラベリングはラベルされていないＵＴＰと１：１の比率でビオチン(biotin)−１６−ＵＴＰ(Perkin Elmer Life and Analytical Sciences)を加えることによって達成された。ラベルされた増幅物（１アレイあたりの７００ｎｇ）は、メーカーの指示(Illumina,Inc.)により、４７，２９６の転写プローブを含むイルミナ  セントリックス  ヒューマン−６  エクスプレッション  ビードチップス(Illumina Sentrix Human-6 Expression Beadchips)とハイブリダイズされた。アレイはイルミナ  ビード  アレイ  リーダー(Illumina Bead Array Reader)共焦点スキャナでスキャンされ、１次データ処理、バックグランド除去、およびデータ分析が、メーカーの指示によりイルミナ  ビードスタジオ(Illumina BeadStudio)ソフトウェアを使用することで実行された。０．９９（計算されたカットオフが、目標配列シグナルがネガティブコントロールから識別可能であったことを示した）の最小の検出信頼スコアが、転写産物の存在または欠如を区別するために使用された。データ分析は、他のｈＥＳＣのサンプルのために説明した並列アプローチを使用することで実行された（Ｌｉｕら  ２００６，ＢＭＣ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ６：２０）。階層的なクラスター形成は、先に（Ｌｉｕら、２００５，ＢＭＣ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ６：２０）説明したように実行されて、ＡＮＯＶＡによって特定された分化発現遺伝子(differentially expressed genes)を使用する類似性測定基準として平均連結とユークリッド距離に基づいた（ｐ＜０．０５）。アレイ製造に使用される感度および品質管理試験の詳細、およびビードスタジオソフトウェアで使用されるアルゴリズムの詳細な説明はＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ（サンディエゴ（カリフォルニア））から利用可能である。検出された転写の大部分がＤＣ−ＨＡＩＦとＤＣ−ＨＡＩ  ＢＧ０２培養の両方で発現され、ＣＤ９、ＤＮＭＴ３、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＴＥＲＴおよびＵＴＦｌなどの公知のｈＥＳＣマーカーを含んでいた（図示せず）。高い相関係数が、ＤＣ−ＨＡＩＦとＤＣ−ＨＡＩ培養の比較で観測された（Ｒ２ｓｅｌｅｃｔ＝０．９６１）（図１４）。階層的なクラスター形成分析は、ＤＣ−ＨＡＩ内で維持されたＢＧ０２細胞はしっかりとグループ化され(grouped tightly)、複数の培養形式のＢＧ０２や他のｈＥＳＣラインと同様にＤＣ−ＨＡＩＦ内で維持された細胞に近い類似性を保有した（図１５）。これらのデータは、胚様体または線維芽細胞と比べて、未分化型ｈＥＳＣｓが群生した(clustered tightly)ことを示している前の分析と一致している。（Ｌｉｕら、２００６，ＢＭＣ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ６：２０）
【０２２１】
さらに、ＤＣ−ＨＡＩ内で維持されたＢＧ０２細胞は、ＳＣＩＤベージュのネズミで形成された複雑な奇形腫における内胚葉、外胚葉および中胚葉の代表種に分化し（図示せず）、外因のＦＧＦ２の非存在下で育てられた培養における、多分化能の維持を示した。
【０２２２】
外因のＦＧＦ２が単独細胞継代で必要であったかどうかを調べるために、ＢＧ０ｌ細胞はＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）で継代され、１０ｎｇ／ｍＬ  ＨＲＧ−βおよび２００ｎｇ／ｍＬ  ＬｏｎｇＲ３−ＩＧＦｌ（ＤＣ−ＨＩ）のみを含む定義された条件で成長された。これらのＤＣ−ＨＩ培養物は、１０継代維持されて、明白な分化または増殖の減速を示さなかった。
【０２２３】
これらの研究は、ｈＥＳＣｓ最小含有ヘレグリンとＩＧＦｌを含む定義された培地内で維持されるとき、外因のＦＧＦ２は必要でないことを明確に示した。さらに、ＦＧＦ２のない培養液は中胚葉、内胚葉、および外胚葉への生体内での分化と転写プロフィールをはじめとする、多分化能の基本性質を保有した。
【０２２４】
実施例１２−懸濁培養
【０２２５】
ＢＧ０２細胞の出発時の培地は、本明細書に記載されたように、１：２００ｍａｔｒｉｇｅｌによってコーティングされた皿の上のＤＣ−ＨＡＩＦ培地で維持されて、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）で継代され分割された。懸濁培養を開始するために、ＢＧ０２細胞はＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）でばらばらにされ、ＤＣ−ＨＡＩＦ培地中、１．６、３、または６×ｌ０５細胞／ｍＬ（３ｍＬ体積中、０．５、１、または２×ｌ０６細胞）の密度でローアタッチメント６ウエルトレイに置いた。トレーは５％のＣＯ２の加湿されたインキュベータ内に、８０−１００ｒｐｍで回転プラットホーム上に置かれた。これらの条件下で、ｈＥＳＣｓは２４時間以内に形態学的に小球の生存細胞に融合した。
【０２２６】
２日目、およびその後の毎日、ウェルの培地を変えた。懸濁集団は増殖し続け、時間とともに分化の明白な徴候なしで大きくなった（図１７）。球のいくつかが、培養の過程の上で集合体であり続けたが、いくつかの集団が大部分よりはるかに大きくなった。さらに、培養の最初の数日の間に、合体過程において非球状集合体が観測できた。この連続的な集合に限れば、３８マイクロｇ／ｍＬ  ＤＮａｓｅＩが最初の２４時間の懸濁培養中に含まれていた。しかし、より少ない集団がＤＮａｓｅＩの存在下で形成されるので、このアプローチは比較的大きい初期の集合に役に立つように見えた。しかしながら、ＤＮａｓｅＩ処理が引き続く球の合体を減少させて、ＤＮａｓｅＩへの暴露が一貫してこれらの集団をより堅くし、分離の際に破壊されるかどうかは明確でない。
【０２２７】
懸濁培養はＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）で約７日毎に離解され、新しい球が作られた。密度は実験により異なったが、この範囲内の密度（１．６−６×ｌ０５細胞／ミリリットル）で作られた球は１２継代より長い間、または８０日より長い間、分化の形態学的な徴候なしで培地中で維持できた。連続的に継代された懸濁ｈＥＳＣｓのＦＩＳＨ分析が、一般的な異数性の染色体数を算定するために実行された。６継代の間懸濁液中で育てられたＢＧ０２細胞は、ｈＣｈｒ１２（９６％、２−コピー、ｎ＝７８８）、ｈＣｈｒ１７（９７％、２−コピー、ｎ＝５８７）、ｈＣｈｒ  Ｘ（９７％、１コピー、ｎ＝７２４）、およびｈＣｈｒ  Ｙ（９８％、１コピー、ｎ＝６８９）について通常のカウントを示した。
【０２２８】
実施例１３−懸濁培養における、分化可能な細胞のエキスパンション
【０２２９】
血清または分化誘導剤の存在下での胚様体培養と異なり、ＤＣ−ＨＡＩＦ中のｈＥＳＣｓの懸濁集団は分化するように見えなかった。明白な臓器の内胚葉は観測されないで、また原腸腔(proamniotic cavities)類似構造の形成も、胚様体分化に関する古典的な徴候もなかった。より密接に分化の欠如を調べるために、培養物は１：２００に希釈されたＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）上の接着条件にプレーティングして戻され、ＤＣ−ＨＡＩＦ中で培養された。これらの培養物は、本来未分化であり、より大きくて平らにされた細胞、または構造領域の存在などの増加する分化の明白なモルホロジー的な徴候を示さなかった。
【０２３０】
細胞計数は、接着培養と比べて、懸濁培養中における細胞の相対成長率を評価するのに使用された。この実験では、ＢＧ０２細胞の接着培養はＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）で継代され、約１×１０６の細胞が懸濁培養または接着培養ウェルに置かれた。個々のウェルは、１−６日の間、計数され、対数スケールでプロットされた（図１８）。接着培養中では、２４時間後でのｈＥＳＣｓのより高い初期割合（約９０％対約１４％）を示したが、成長率はその後、同等であった。これは、ｈＥＳＣｓが伝統的な接着培養と懸濁培養で、ほぼ同じくらい急速に増殖できることを示した。継代の間に行われた細胞の計数は、この単純懸濁系で可能なエキスパンションの量を測ることを許容する。いくつかの培養では、５×１０５の細胞の播種で、７日後には約１０７以上の細胞が発生した。懸濁培養における７日後のエキスパンションは、約２０倍またはそれ以上のエキスパンションに等しく、観察された最大のエキスパンションは約２４倍であった。
【０２３１】
実施例１４−懸濁培養でエキスパンドされた分化可能な細胞の特性
【０２３２】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、ＤＣ−ＨＡＩＦ中での懸濁培養および接着培養で育てられたｈＥＳＣｓの遺伝子発現を比較するのに使用された。多能性細胞のマーカーであるＯＣＴ４の同程度が、両方の培養形式で観測され、懸濁培養で維持された培養が、本来未分化であったことが確認された。最終的な内胚葉のマーカーであるＳＯＸ１７は、ｈＥＳＣｓのどちらの集団でも発現されなかった。また、ｑＰＣＲ分析は懸濁培養ｈＥＳＣｓが、懸濁における集団として最終的な内胚葉に分化する可能性を調べた。接着および懸濁ｈＥＳＣｓは、同じ条件を使用して分化された。２％のＢＳＡ、１００ｎｇ／ｍＬ  アクチビン  Ａ、８ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ２、および２５ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ３Ａを含むＲＰＭＩでｈＥＳＣ培養物が２４時間処理され、次いで、Ｗｎｔ３Ａを含まずに同じ培地で２日間処理した。未分化型ｈＥＳＣｓと比べて、両方の最終的な内胚葉のサンプルでＯＣＴ４の発現は減少され、ＳＯＸｌ７の発現は増大された。この分化分析は、ＤＣ−ＨＡＩＦでの懸濁培養で培養されたｈＥＳＣｓが、最終的な内胚葉の同様な形成で証明されるように、それらの分化能を維持したことが確認された。
【０２３３】
実施例１５−懸濁培養におけるアポトーシス阻害剤の付加
【０２３４】
懸濁中における初期の継代の後に細胞の損失を減衰させるために、アポプトーシスの阻害剤が媒体に追加された。細胞は実施例１２のように継代された。ただし、Ｙ−２７６３２ではなく、ｐｌ６０−Ｒｈｏ会合  コイルドコイルキナーゼ(pl60-Rho-associated coiled-coil kinase:ROCK)が培地に追加された。
【０２３５】
ＢＧ０２細胞の懸濁集団は、３ｍＬ  ＤＣ−ＨＡＩＦ培地中、６ウェル皿に２×ｌ０６の単独細胞を播種し、インキュベーター内の１００ｒｐｍの回転プラットホームに置くことにより形成された（表２、実験  Ａ）。１０μＭのＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤は、実験計画にしたがって試験ウエルに加えられ、毎日観測され、２４時間（１日目）後と４日または５日後に数えられた。図２０に示されるように、Ｙ２７６３２の添加は懸濁培養の初期の集合フェーズで絶大な効果があった。阻害剤のない培地で集合された細胞と比べて、はるかに大きい集団がＹ２７６３２の存在下で形成された（図２０）。細胞計数は、より生存可能な細胞が阻害剤があるときに存在すると確認した（表２、実験  Ａ）。細胞数におけるこの相違は、培養時期の経過中にわたり持続した。また、阻害剤のない培養と比べてより多くの細胞が４日目に観察された。先の懸濁培養の実験と同様、Ｙ２７６３２に暴露された細胞は連続的に継代されることができ、未分化状態で維持されることができた（図示せず）。再度分割される際、Ｙ２７６３２で処理されたもののほぼ２倍の細胞が観察された（表２の実験  Ａ）。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、Ｙ２７６３２の存在下で、懸濁培養で育てられたＢＧ０２細胞は、未分化型のままで残っていたことを示した（図２１）。
【０２３６】
前の実験で、懸濁培養および接着培養における細胞の成長率が初期の２４時間後に同様であったのを示したように、Ｙ２７６３２がこの当初期間の後に除去された実験が行われた（表２、実験  Ｂ）。前の観察と一致して、Ｙ２７６３２は初期の生存、最初の継代の後のｈＥＳＣｓの集合を増大させたが、２４時間後に阻害剤を除去すると、５日目に分析された細胞の数と生育性カウントには否定的な影響は与えられなかった。未処置の培養における３．９×１０６の細胞と比べて、阻害剤が存在していたとき、１．４×ｌ０７（＋Ｙ２７６３２）と１．８×ｌ０７（＋／−Ｙ２７６３２）の生存細胞が発生した。この分析は、懸濁ｈＥＳＣ培養の最初の２４時間の間、Ｙ２７６３２は最も大きい影響力があったことを確認した。
【０２３７】
Ｙ２７６３２の存在下で観測された向上された生存と集合のため、懸濁培養をシードするのに使用される細胞数を減少させることが可能かどうか調べるために実験が行われた（表２、実験  Ｃ）。前の実験では、３ｍＬ  ＤＣ−ＨＡＩＦあたりおよそ５×１０５以下の細胞の低密度での胚性幹細胞の播種では良好に作用しないことが示された。ＲＯＣＫ阻害物の添加は低い密度での細胞播種を許容するかどうかを確認するために、ある範囲の細胞濃度（２×１０６細胞から約１×１０５の細胞）が、３ｍＬ  ＤＣ−ＨＡＩＦで６ウェルトレー細胞で懸濁培養をシードするのに使用された。１０マイクロＭのＹ２７６３２がすべての条件で加えられ、細胞数と生育性が５日目に評価された。成功裏の集合とエキスパンションが低い播種密度でさえ観測された。１×１０５の細胞でシードされただけである培地であっても、ほぼ１３倍の生存細胞のエキスパンションが観察された。したがって、Ｙ２７６３２によるＲＯＣＫの抑制は、この懸濁培養システムでは、より低い密度でｈＥＳＣｓの初期生存を容易にした。
【０２３８】
【表２】
0005390624.tif 000003
【０２３９】
Ｅｘｐｔ．：実験
ｐ０は継代０、ｐ１は継代１
Ｎ／Ａは未測定
細胞数と割合はそれぞれ少数第０または１位で四捨五入される。
【０２４０】
実施例１６−様々な培地における懸濁培養
ＦＧＦ２および／またはアクチビン  Ａの非存在下で胚性幹細胞の懸濁培養が可能かどうかを決定するために、これらの要素の有無により胚性幹細胞がさまざまな培地で培養された。表３は懸濁培養の細胞計数結果を示し、懸濁培養は外因のＦＧＦ２が存在しない場合（ＨＡＩ条件）、または外因のＦＧＦ２またはアクチビン  Ａが存在しない場合（ＨＩ条件）にも、成功裏にエキスパンジョンさせることができたことを示す。Ｙ２７６３２の添加は、すべての条件下で、５日で細胞収率を増大させた。さらに、各培地における細胞は分化のモルホロジー的な徴候を示さず、成功裏に継代された。
【０２４１】
【表３】
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【０２４２】
実施例１７−懸濁細胞集合体の増加する生存、一様な密度、およびサイズにおける最適化されたせん断速度
本明細書に開示されたシステム、方法および装置によれば、懸濁細胞の中で維持できるすべての細胞ラインが利益を受け、利用できると企図される。細胞としては、ヒト細胞ラインＣｙＴ４９、ＣｙＴ２０３、Ｃｙｔ２Ｓ、ＢＧ０ｌ、ＢＧ０２、マウス、犬、非人間霊長類幹細胞ラインをはじめとするほ乳動物細胞、および他のものを含むが、これらに限定されない。    
【０２４３】
本明細書に提供された結果は、反応装置に関する操作パラメータ、特に培養物の流れ速度およびせん断力に応じて、細胞増殖と分化を制御されたレベルで維持するか、または減衰させることができることを示す。細胞培養物に加えられたせん断力は、細胞増殖に有意な効果を持つことができる。本明細書で使われた回転プラットホームなどの対称的システムは、均一な、主として層流のせん断応力を容器の周囲に提供し、撹はん槽バイオリアクタのような非対称システムとその取り付けは、局所性な高速せん断応力によって特徴付けられる乱流の領域を有する。バイオリアクタまたは細胞培養装置が対称的システムでなければ、培養物流れの方向は回転から生じるせん断応力の性質と程度の両方に影響する。
【０２４４】
もちろん、最適の回転数は具体的な培地に依存し、培地中の細胞数、培養液の粘度、培地のタイプ、懸濁液における特定の細胞の丈夫さ（いくらかの細胞は他のものより大きなせん断力に耐えることができる）などに依存する。最適の回転数は特定の条件の組に応じて容易に決定できる。本明細書に説明され、想定された回転数は、層流条件を維持するために特に、役に立つ。本明細書に記載された実験は以下の条件で行われた：
１）細胞増殖と分化は制御されたレベルまたは制御されたレベルの近くに維持された。
および
２）細胞が増殖し分化する条件は減衰された。
以下は、ｈＥＳ細胞集合体培養物または分化型ｈＥＳ細胞集合体培養物を良好に維持することができる一般法である。当業者は本明細書に提供された説明に基づき細胞集合体の大きさおよび形状を最適化できる。
【０２４５】
下記の表４は、細胞集合体の直径（μｍ）に関連する、せん断速度および応力を示す。
人間の胚性幹細胞はオービタルローテーター（Ｂａｍｓｔｅａｄ  ＬａｂＬｉｎｅ  Ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ  Ｒｏｔａｔｏｒ）を使用して様々な回転速度で、１、２、３および／または４日の間集合された：６０ｒｐｍ、８０ｒｐｍ、１００ｒｐｍ、１２０ｒｐｍ、１３０ｒｐｍ、１４０ｒｐｍ、１５０ｒｐｍ、および１６０ｒｐｍ。また、表４は、細胞集合体の直径に依存する、細胞集合体により経験された効果的なせん断速度を示す。
【０２４６】
【表４】
0005390624.tif 000005
【０２４７】
回転速度がどのように、ＥＳ集合体の直径をコントロールするかを決定するために、１００ｒｐｍ、１２０ｒｐｍまたは１４０ｒｐｍで回転させてＥＳ集合体を発生させた。集合体の直径は２日後に回転培養物から得られた、５倍フェーズコントラスト画像から定量化された。ｌ００ｒｐｍ培養において、平均直径＋／−ＳＤは１９８μｍ＋／−２１μｍであった。１２０ｒｐｍの培養において、平均直径＋／−ＳＤは２２５μｍ＋／−２８μｍであった。１４０ｒｐｍの培養において、平均直径＋／−ＳＤは８５μｍ＋／−１５μｍであった。それぞれの直径分布は、ＡＮＯＶＡおよびターキー  マルチプルコンパリゾン(Tukey Multiple Comparison)のポストテストを使用して統計的に有意である（ｐ＜．００１）。表４に示されるように、せん断速度は６０ｒｐｍから１４０ｒｐｍへ指数関数的に増える。例えば、１００μｍの直径集合体のための１００ｒｐｍではせん断速度はほぼ３０秒−１であるのに対し、１４０ｒｐｍではほぼ８０秒−１であり、３倍に増大にする。典型的には、１４０ｒｐｍより高い回転速度はより大きく、均一度の低いｈＥＳ細胞集合体をもたらした。細胞集合体培養物は、初めは減少した回転速度、例えば、約１日間、６０ｒｐｍから８０ｒｐｍで培養して、その後より高い回転速度（例えば、１００ｒｐｍ−１４０ｒｐｍ、又はそれ以上）で、細胞集合体のサイズおよび形への悪影響を及ぼすことなく培養することができる。
【０２４８】
細胞集合体の直径はせん断速度に従って変化するが、様々な条件、すなわち異なる回転速度、および／または細胞集合体の異なるサイズおよび形状において遺伝子発現には甚大な効果は全くないことに留意することは重要である。すなわち、多分化能ｈＥＳ細胞またはｈＥＳ細胞−由来細胞タイプ（例えば、最終的な内胚葉、前腸内胚葉、ＰＤＸｌ内胚葉、膵性内胚葉、および内分泌細胞）のために観察された署名マーカーが、上記の本明細書に参照され組み込まれているｄ’Ａｍｏｕｒ他の出願およびそれらの関連出願で説明されたことと一致していた。
【０２４９】
細胞生存または細胞生存率に対する回転速度、せん断速度、およびせん断応力の効果を決定するために、生存が減少速度（例えば、６０ｒｐｍから８０ｒｐｍ）での１日により改良されたことが示された。例えば、細胞生存は、６０ｒｐｍから１４０ｒｐｍの間の回転速度において少なくとも６０％以上に及んだ。また、より高い回転速度（例えば、ｌ００ｒｐｍ以上）と比べて、減少した回転速度培養であるｄ１、ｄ２、およびｄ３では、細胞集合体の数もより多かった。また、細胞集合体が、より高い回転速度（例えば、１４０ｒｐｍ以上）で培養されたとき、顕著な分裂および離解があった。しかしながら、同時にこれらのデータは、細胞集合体が最初に少なくとも１日間減少した回転速度で培養されたとき、細胞生存が増加されることを示して、回転速度がｌ００ｒｐｍに１４０ｒｐｍまで増加したとき、細胞生存には大幅ダウンが全くなかったことを示す。
もっとも、１４０ｒｐｍ未満の回転速度での分化は好ましい。
【０２５０】
また、培養体積は上で議論したように、せん断速度およびせん断応力に影響を及ぼし、これは細胞集合体の大きさおよび形状の均一性に影響する。たとえば単独細胞懸濁培養が開始され、６ｍＬで細胞集合体が形成された場合、４ｍＬで開始されたものと比べて、より均一な大きさと形状の細胞集合体が得られる。図２３を参照する。４ｍＬで培養されると、細胞集合体の直径は５０ミクロン未満から２５０ミクロン以上まで変化するが、６ｍＬで培養されると、直径はより狭い範囲となり、細胞集合体の直径は５０ミクロン以上から２００ミクロン以下になった。説明した細胞集合体は接着性のｈＥＳ細胞培養からつくられた単独細胞懸濁培養から開始されたが、ｈＥＳ−由来接着性プレーティングから開始された細胞集合体懸濁培養も同様な挙動を取ることが期待される。したがって、培地の容積は、細胞集合体懸濁液培養が開始されるステージからほぼ独立している。
【０２５１】
さらに、さまざまな異なった培地条件でｈＥＳ細胞集合体を培養できる。例えば、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）含有培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２含有培地；２０％のＫｎｏｃｋｏｕｔ血清代替物含有(KSR、Invitrogen)ＤＭＥＭ／Ｆ１２含有培地；２０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ(R&D Systems)と２０ｎｇ／ｍＬ  アクチビン  Ａ(R&D Systems)をさらに含むＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）およびＤＭＥＭ／Ｆ１２培地；１０ｎｇ／ｍＬ  ヘレグリン(Heregulin)Ｂをさらに含むＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）およびＤＭＥＭ／Ｆ１２培地；中でｈＥＳ細胞集合体培養を維持できる。あるいはまた、無異物性のＫＳＲ(Invitrogen)が補われた状態で、本明細書に参照された培地と市販の培地のいずれも使用できる。最後に、細胞集合体は、上記の培地であってさらに外因のＦＧＦを含んでいない培地でも、培養され製造された。
【０２５２】
実施例１８−懸濁培養におけるｈＥＳ細胞集合体は内胚葉リネッジタイプ細胞に分化できる
上記のｄ’Ａｍｏｕｒ他（２００６）および米国特許出願番号２００５／０２６６５５４、２００５／０１５８８５３、２００６／０００３３１３、２００６／０１４８０８１、２００７／０１２２９０５と２００７／０２５９４２１で記載されているように、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞は、生体外で維持され、最終的な内胚葉（ステージ１）、前腸内胚葉、およびＰＤＸｌ内胚葉に分化する。上記の文献は参照され、その全体が本明細書の一部として組み込まれる。
【０２５３】
簡潔にいえば、未分化型多分化能ｈＥＳ接着（プレート）細胞は、マウス胚線維芽細胞フィーダー層（ミリポア、先のＣｈｅｍｉｃｏｎまたはＳｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｍｅｄｉａ）の上、または、２０％のＫｎｏｃｋＯｕｔ血清代替物(Invitrogen/Gibco)、１ｍＭ非必須アミノ酸(Invitrogen/Gibco)、グルタマックス(Glutamax)(Invitrogen/Gibco)、ペニシリン／ストレプトマイシン(Invitrogen/Gibco)、０．５５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール(Invitrogen/Gibco)、および４ｎｇ／ｍＬから２０ｎｇ／ｍＬの組替えヒトＦＧＦ２(R&D Systems)が補われたＤＭＥＭ／Ｆ１２(Mediatech)内のヒト血清で被覆された６０ｍｍのプレート（０．１〜２０％の最終濃度；Valley Biomedical）の上で維持された。あるいはまた、上記の培地は無異物性のＫＳＲ(Xeno-free KSR)(Gibco)とヒト血清を補うことができる。また、ｈＥＳ細胞がコーティングを施していない培養プレート上にシードされた後に、ヒト血清が培養に追加された。アクチビン  Ａの少用量は（２−２５ｎｇ／ｍｌ、R&D Systems）、未分化増殖を維持するのを助けるために成長培地に追加された。０日目（ｄ０）の接着性の多分化能ｈＥＳ細胞は、高水準の多分化能蛋白質マーカー、ＯＣＴ４を発現する。図１、パネルＡ、ｄ０のプレートコントロールを参照。
【０２５４】
細胞は手動または酵素的に、実質的に上記のｄ’Ａｍｏｕｒ他らに記載されているように、再度継代された。懸濁培養物は、分離されて、円錐管に移されて、約５分間１０００ｒｐｍで遠心分離された。上澄を取り除き、バイセル  セルアナライザー（ＶｉＣｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）を使用して標準の細胞計数を実行した。６０ｍｍのプレートからの典型的な細胞数は３×ｌ０６から１２×１０６の範囲で変化し、継代の前の培地中での日数および細胞ラインに依存する。一次細胞懸濁液中における細胞数がいったん測定されると、懸濁液はさらにＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）または無異物性のＫＳＲを含む培地で上記のように希釈され、１×１０６細胞／ｍＬの最終的な容積に希釈された。この容積は、＞４×１０６細胞／ｍＬに増加できるが、より頻繁なフィーディングを必要とする。ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２(Axxora)は細胞懸濁液に約１−１５マイクロＭ、典型的には１０マイクロＭの最終濃度まで加えられた。そして、チューブは優しい反転によって混ぜられた。いくつかの場合、Ｙ２７６３２は、集合体生成の速度を制御するために懸濁に加えられなかった。再懸濁された細胞は、次にローバインディング６ウェル皿（１ウェルあたりの細胞懸濁液約５ｍＬ）の各ウェルに等しく分配されて、分化の前に約１−４日間、１００ｒｐｍから１４０ｒｐｍで回転プラットホーム上に置かれた。
【０２５５】
この培養の間、ｈＥＳ細胞集合体が形成され、少なくとも毎日１−２回、Ｙ２７６３２を新鮮なＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）培地からＹ２７６３２を除いたものの４ｍＬで、４ｍＬの培地を取り替えることによって、培養物に毎日フィーデングするか、または前記のいずれかの培地に無異物性のＫＳＲを補った。培地交換（「フィーデング」）は、集合体の分裂を回避し、回転の間に集合体を浮かせておける表面張力を破ることがあるために、できるだけ速く実行されるべきである。また、細胞集合体の成長を最適化し、集合体の大きさと形状の均一性を最適化するために、長期間、回転プラットホームまたは装置から細胞集合体を取り除くべきでない。かくして、当技術分野で確立しているｈＥＳ細胞接着培養からｈＥＳ細胞集合体を製造できる。
【０２５６】
現在ｈＥＳ細胞集合体は、上記のＤ’Ａｍｏｕｒ他（２００６）に記載されているように、懸濁液中の集合体として直接分化できる。簡潔にいえば、ウェルからＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）（マイナスＹ２７６３２）培地または無異物性のＫＳＲが補われた前記の任意の培地を取り除き（例えば、吸引される）、そして５ｍＬの、ｈＥＳ細胞集合体は血清を含まないＲＭＰＩ（Ｃａｔ．１５−０４０−ＣＶ；Ｍｅｄｉａｔｅｄ．）の５ｍＬ、ペニシリン／ストレプトマイシン(Invitrogen)、およびグルタマックス（また、ＲＭＰＩ、ペン／ストレプ（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）、およびグルタマックス培地とも呼ばれる）、０％  ＦＢＳ、１％  ペン／ストレプ、１％  グルタマックスで洗浄された。そして、洗浄培地を取り除く１−２分前に、回転プラットホーム上に６ウェル皿を戻した。これは少なくとも二度またはインスリンおよび／または、ＩＧＦ−１が十分取り除かれるまで繰り返された。多分化能の維持とＥＳ自己再生に必要であるが、同じ要素が制御された、シンクロした、リネッジ−由来された分化に有害だからである。
様々な外因性マイトジェンの添加および除去により、すべての内胚葉リネッジへの分化は、ｄ’Ａｍｏｕｒ他（２００６）で説明したように、１００ｒｐｍで実質的に実行された。さらに詳細に以下で説明する。
【０２５７】
最終的な内胚葉（ステージＩ）への分化
ヒトＥＳ細胞集合体は初日はＲＰＭＩ、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡおよび可変濃度のＦＢＳ（US Defined FBS、HyClone、カタログＮｏ．ＳＨ３００７０．０３）、および２５ｎｇ／ｍＬ−７５ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ３ａ、２日目と３日目（ｄ０からｄ２）は、さらに１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡおよび可変濃度のＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）を含むＲＭＰＩ、ペン／ストレプ、およびグルタマックス培地において分化された。３日のステージ１実験計画が使用されるか、または望ましい場合には、ほとんどの分化実験ＦＢＳ濃度は、最初の２４時間（ｄ１）では０％、第２の２４時間（ｄ２）については０．２％（ｄ２）、および第３の２４時間（ｄ３）については０．２％（ｄ３）である。望ましくは、２日のステージ１実験計画が実行される。
【０２５８】
２日のステージ１実験計画の終わりの懸濁培養における、ｈＥＳ−由来細胞集合体のＱＰＣＲ分析は、接着プレート対照と比べて、ｈＥＳ集合体の最終的な内胚葉へ向けての高能率的な有向分化を示す。細胞集合体は１００ｒｐｍ、１２０ｒｐｍ、および１４０ｒｐｍで形成された。いくつかの実験では、ｈＥＳ−由来集合体が、分化の前にバイオリアクタ（スピナーフラスコ）に移された。最終的な内はい葉細胞に分化したｈＥＳ細胞培養と、接着ｈＥＳ細胞培養物がコントロールとして使用された。未分化型ｈＥＳ細胞集合体と接着性のプレートコントロールと比べて、ＳＯＸ１７とＦＯＸＡ２の増加した発現レベルが懸濁培養と接着培養の細胞集合体で観測された。図２２、パネルＣ（ＳＯＸｌ７）、およびＤ（ＦＯＸＡ２）のステージ１（ｄ２）を参照。さらに、内胚葉の最終的な接着プレートコントロールと比較して、ＳＯＸ７、胚体外および臓器の内胚葉を汚染と関連する遺伝子の発現水準は、最終的な内胚葉細胞集合体内でかなり減少した。図２２、パネルＬのステージ１（ｄ２）を参照。
【０２５９】
ＣＸＣＲ４とＨＮＦ３ｂｅｔａ（ＦｏｘＡ２）タンパク質を使用するフローサイトメトリー分析は、ＥＳ細胞−由来集合体の有向分化は、少なくとも９７％ＣＸＣＲ４−陽性、少なくとも９７％ＨＮＦ３ｂｅｔａ−陽性、および少なくとも９５％ＣＸＣＲ４／ＨＮＦ３ｂｅｔａ  コ−陽性の集団をもたらすことを示した。
【０２６０】
さらにｈＥＳ細胞集合体分化の効率を評価するために、ＥＳ−由来細胞集合体の凍結切片が、ＳＯＸｌ７およびＨＮＦ３ｂｅｔａ発現について、免疫細胞学および共焦点顕微鏡を使用することで調べられた。染色された凍結切片の像解析は、ステージ１（最終的な内はい葉細胞）の終期のすべての細胞のほぼ９０％以上が、ＨＮＦ３ｂｅｔａおよび／または、ＳＯＸｌ７を発現したことを示した。
【０２６１】
これらのデータはすべて、細胞集合体としての胚性幹細胞の高能率的な分化が達成でき、識別領域の最終的な内胚葉マーカー(signature definitive endoderm marker)の発現水準に基づいて、接着平板培養の分化と比べて、本明細書に記載されるように、最終的な内胚葉を製造するための方法は、より効率的であることを示す。
【０２６２】
ＰＤＸＩ−陰性の前腸内はい葉細胞への分化（ステージ２）
【０２６３】
ステージ１からのヒト最終内はい葉細胞(Human definitive endoderm cell)の集合体は、ＰＢＳ＋／＋で簡単に洗浄され、ついでＲＭＰＩ、ペン／ストレプおよびグルタマックス培地で更に２％ＦＢＳ、２５ｎｇ−５０ｎｇ／ｍＬ  ＫＧＦ(R&D Systems)を含むものの中でさらに２ないし３日分化された。いくつかの実験では、ステージ２の初日の間、５マイクロＭのＳＢ４３１５４２（シグマオルドリッチＩｎｃ．）または２．５マイクロＭのＴＧＦ−ｂｅｔａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＶ(Calbiochem)が加えられた。あるいはまた、ＲＭＰＩ、ペン／ストレプ、およびグルタマックス培地／０．２％ＦＢＳ／ＩＴＳ（インスリン／鉄結合性グロブリン／セレニウム）が使用された。
【０２６４】
ＱＰＣＲ分析は、実質的に上で議論したようにして実行された。接着性の平板培養のコントロールと比較して、ＨＮＦｌβとＨＮＦ４ａｌｐｈａの増加した発現レベルが細胞集合体培養で観測された。図２２、パネルＥ（ＨＮＦｌＢ）、およびパネルＯ（ＨＮＦ４ａｌｐｈａ）のステージ２（ｄ５）を参照。具体的ステージ０、１、２、および５ｈＥＳまたはｈＥＳ−由来細胞集合体（または、分化型集団についての「ｄＡｇｇｓ」）を製造する方法はパネルＯでわずかに変更された。この文脈では、分化された細胞集合体は、対応するステージの、それらが由来する接着平板対照培養から開始された、分化されたｈＥＳまたはｈＥＳ−由来細胞集合体をいう。例えば、ステージ１では、分化細胞集合体（「ｄＡｇｇｓ」）懸濁培養は、ステージ０の接着性プレートから開始され、ｌ００ｒｐｍから１４０ｒｐｍの回転プラットホーム上で約２４時間、本明細書に記載された培地のいずれでインキュベートされる。これらの分化型細胞集合体は、対応する接着性のプレート対照でステージ１の最終的な内はい葉細胞にさらに分化された。図２２、パネルＯは、ステージの１つの分化細胞の集合体または接着性のプレート対照のどちらかにも、顕著なＨＮＦ４ａｌｐｈａ（ＨＮＦ４Ａ）発現がないことを示している。対照的に、同様の方法がステージ２のサンプルのために行われて、ＨＮＦ４Ａを発現量の増加したレベルで製造した。ステージ５のサンプルでは、ＨＮＦ４Ａの発現も確固としている。
【０２６５】
さらに、平板培養コントロールと比較して、胚体外の内胚葉（ＳＯＸ７）に関連する遺伝子の発現水準は、ｈＥＳ−由来細胞集合体培養でかなり減少した。図２２、パネルＬ、ステージ２（ｄ５）を参照。その結果、懸濁培養における細胞集合体によるＰＤＸｌ−陰性の前腸内はい葉細胞の有向分化が胚体外の内胚葉汚染物を取り除くことを示す。
【０２６６】
これらのデータはすべて、ｈＥＳ細胞集合体の有向分化が高能率的であることを示し、識別領域のＰＤＸｌ−陰性の前腸内胚葉マーカーの発現水準に基づき、前腸内はい葉細胞を製造するための方法は、接着性の平板培養での分化と比較して改善されたことを示す。
【０２６７】
ＰＤＸｌ−陽性の前腸内はい葉細胞への分化（ステージ３）
【０２６８】
ステージ２からの前腸内胚葉細胞は１〜３日間、無血清ＲＭＰＩで、グルタマックス(Invitrogen)、ペニシリン／ストレプトマイシン(Invitrogen)、０．５Ｘ  Ｂ２７−サプリメント(Invitrogen/Gibco)、さらに１マイクロＭないし２マイクロＭのレチノイン酸(RA、Sigma)と０．２５ｎＭ  ＫＡＡＤ−シクロパミン(cyclopamine)(Toronto Research Chemicals)；または１マイクロＭないし２マイクロＭのレチノイン酸、０．２５ｎＭ  ＫＡＡＤ−シクロパミン、および５０ｎｇ／ｍＬ  ノギン(R&D systems)を加えて分化させた。あるいはまた、０．２マイクロＭないし０．５マイクロＭのＲＡと、０．２５ｎＭ  ＫＡＡＤ−シクロパミンが１日間、培地に加えられた。さらに、いくつかの実験では、ＲＡまたはＫＡＡＤ−シクロパミンが、細胞集合体培養物に追加されなかった。他の実施態様では、０．１−０．２％の有効濃度のＢＳＡが加えられた。
【０２６９】
接着性の平板培養コントロールと比べて、ＰＤＸｌの増大した発現レベルが、ｈＥＳ−由来細胞集合体で観測された。図２２、パネルＦ（ＰＤＸｌ）、ステージ３（ｄ８）を参照。さらに、平板培養コントロールと比べて、胚体外内胚葉（ＳＯＸ７）に関連する遺伝子と臓器の内胚葉（ＡＦＰ）の発現水準は、ｈＥＳ−由来細胞集合体培養で顕著に減少した。図２２、パネルＬ（ＳＯＸ７）、およびパネルＮ（ＡＦＰ）、ステージ３（ｄ８）を参照。したがって、懸濁培養における細胞集合体によるＰＤＸｌ−陽性の前腸内はい葉細胞を製造する有向分化が、胚体外の内胚葉汚染物を取り除くことが示された。
【０２７０】
これらのデータは、ｈＥＳ細胞集合体の有向分化が高能率的であることを示し、識別領域のＰＤＸｌ−陽性の前腸内胚葉マーカーの発現水準に基づき、ＰＤＸＩ−陽性の内はい葉細胞を製造するための方法は、対照の接着性の平板培養での分化と比較して改善されることを示す。
【０２７１】
膵性内胚葉または膵性内分泌前駆細胞への分化（ステージ４）
【０２７２】
ステージ４では、ステージ３培養からＲＡが取り出され、ＤＭＥＭプラスＢ２７（１：１００Ｇｉｂｃｏ）で培地を一度洗浄した。ついで洗浄液を、４−８日間、ＤＭＥＭ＋１ＸＢ２７サプリメント単独、または以下の要素のいずれかまたはすべてとの組み合わせに取り替える：ノギン（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＫＧＦ（２５−５０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（２５−５０ｎｇ／ｍｌ）、１−５％ＦＢＳ。ＲＡが加えられない場合では、１−９日間、３０−１００ｎｇ／ｍＬ(R&D systems)でノギンが培地に加えられた。さらに、いくつかの実験では、２５ｎｇ／ｍＬでＦＧＦ１０が加えられた。
【０２７３】
ＮＫＸ６．１およびＰＤＸ−ＩおよびＰＴＦｌＡの増大した発現レベルが、ＥＳ細胞−由来集合体と対応する接着性の平板培養コントロールで観測された。図２２、パネルＦ（ＰＤＸｌ）、パネルＧ（ＮＫＸ６．１）、およびパネルＰ（ＰＴＦＡｌ）、ステージ４（ｄ１１）を参照。図２２、パネルＰでは、懸濁培養におけるｈＥＳ、および／または、ｈＥＳ−由来集合体が、それらが由来する接着性の平板培養内の細胞数に影響を受けるか否かを決定するために、棒グラフが方法からの結果を表現する。パネル  Ｐのみが１×１０７細胞の結果を示すが、細胞集合体懸濁液培養は様々な種子カウント（例えば、１×１０６から２×１０７細胞）から始められた。すべてが、実質的に同様であり、良い生育性とほとんどない細胞死を有する細胞集合培養を製造した。たとえばステージ４では、分化された細胞集合体懸濁培養細胞（「ｄＡｇｇｓ」）は、ｄ５（ステージ２）の接着性の平板培養から始められて、再び本明細書に記載された培地のいずれかにより、２４時間、１００ｒｐｍから１４０ｒｐｍの回転プラットホーム上でインキュベートされた。これらの分化型細胞集合体はさらに、ＰＴＦｌＡを発現するステージ４膵性内胚葉タイプ細胞に分化された（パネルＰ）。対応するステージ４の接着性の平板培養コントロールと比べて、ＰＴＦｌＡの発現増加がみられる。
【０２７４】
さらに、接着性の平板培養コントロールと比べて、ＡＦＰの発現水準はｈＥＳ−由来細胞集合体でかなり減少した。図２２、パネルＮ、ステージ４（ｄ１１）を参照。したがって、懸濁培養における細胞集合体によるＰＤＸｌ−陽性の膵性内はい葉細胞を製造する有向分化は、臓器の内胚葉汚染物を取り除く。
【０２７５】
ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ３ｂｅｔａおよびクロモグラニン(Chromogranin)（ＣＨＧ）タンパク質を使用したフローサイトメトリー分析は、ｈＥＳ−由来細胞集合体の有効分化が少なくとも５３％のＣＨＧ−陽性、少なくとも４０％のＮＫＸ６．１とＣＨＧコ−陽性、および少量のＨＮＦ３ｂｅｔａと他のタイプの細胞である細胞集合体を与えたことを示した。
【０２７６】
ｈＥＳ−由来の集団の低温断面が、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸｌおよびＮＫＸ２．２の発現について、免疫細胞化学および共焦点顕微鏡を使用して、ステージ４の最後で調べられた。像解析は膵性内胚葉（または、ＰＤＸｌ−陽性の膵性内胚葉）への集合体細胞の高能率的な分化を示した。ほぼすべての細胞がＰＤＸｌを発現し、細胞の大集団がＮＫＸ６．１（約４０％の細胞）および／またはＮＫＸ２．２（約４０％の細胞）を発現した。
【０２７７】
ホルモン発現性内分泌細胞への分化（ステージ５）
【０２７８】
ステージ５分化において、ステージ４の分化細胞集合体が、ＣＭＲＬ(Invitrogen/Gibco)またはＲＭＰＩ、ペン／ストレプ、およびグルタマックス培地および０．５Ｘ  Ｂ２７−サプリメントのどちらかで続けられていた。いくつかの実験では、培地はステージ５の間、０．２−５％の範囲のヒト血清(Valley Biomedical)または牛胎児血清で補われた。
【０２７９】
再び、ステージ２−４からの細胞タイプと同様に、接着性の平板培養コントロールと比較して、特定の細胞型に関連する遺伝子の発現の増加が観測された。例えば、増加した発現レベルのホルモンインスリン（ＩＮＳ）、グルカゴン（ＧＣＧ）、およびソマトスタチン（ＳＳＴ）が観察された。図２２、パネルＩ（ＩＮＳ）、パネルＪ（ＧＣＧ）、およびパネルＫ（ＳＳＴ）のステージ５（ｄｌ５）を参照。さらに、接着性の平板培養コントロールと比較して、ＡＦＰとＺＩＣｌ、外胚葉に関連している遺伝子の発現水準はｈＥＳ−由来の細胞集合体でかなり減少した。図２２、パネルＭ（ＺＩＣｌ）、およびパネルＮ（ＡＦＰ）のステージ５（ｄｌ５）を参照。したがって、懸濁培養における細胞集合体を通して膵臓内分泌細胞を製造する有向分化は、外はい葉のおよび臓器の内胚葉の汚染要因物を取り除く。
【０２８０】
内分泌性集団細胞を発現するｈＥＳ−由来のホルモンの生産は、説明したプロトコールでの２３日目におけるフローサイトメトリー分析で確認された。集団は、初めは、５ｍＬ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２で１４０ｒｐｍで形成され、別法としてノックアウト血清代替物（KSR;Gibco/Invitrogen、一貫性のため００６３と比較）または無異物性のＫＳＲ(Invitrogen)を含み、次に、ｌ００ｒｐｍで分化された。ＮＫＸ６．１、クロモグラニン  Ａ、インスリン、グルカゴン、およびソマトスタチン蛋白質発現の分析は、ＥＳ細胞−由来の集団は約２０％のＮＫＸ６．１＋／クロモグラニンＡ−膵性上皮、および約７４％のクロモグラニン  Ａ＋内分泌組織を含むことを示す。さらに、細胞の１１％はインスリンを、１４％はグルカゴンを、および１１％はソマトスタチンを発現する。これらでは、インスリン＋細胞の６８％はシングル−陽性(single positive)であり、グルカゴン＋細胞の７０％はシングル−陽性であり、ソマトスタチン陽性細胞の５２％はシングル−陽性である。シングルホルモンの陽性の程度は、ほとんどポリホルモーナル(polyhormonal)細胞であった接着培養で説明された値を超えている。
【０２８１】
さらにホルモン発現性内分泌細胞への集合体の分化の効率を評価するために、ＥＳ−由来の集団の低温断面が、グルカゴン、インスリンおよびソマトスタチン発現について、ステージ５の間、免疫細胞化学および共焦点顕微鏡を使用して調べられた。２０倍の低温断面の像解析は集合体細胞のホルモン−陽性への高能率な分化を示し、ほとんどすべての細胞がグルカゴン、ソマトスタチンまたはインスリンを発現した。また、先の接着培養実験と対照して、集合体における細胞の大部分が、発達の間生体内で起こるように、シングルホルモン(single hormone)を発現するように見える。
【０２８２】
実施例１９−様々なステージからの接着培養は、細胞集合体を形成し、膵性内胚葉タイプ細胞に分化できる
【０２８３】
以下は、ｈＥＳ−由来の細胞集合体の生産は多分化能ｈＥＳ細胞から開始できるだけではなく、細胞集合体は分化培地（０日目の細胞集合体）内に直接開始され、また分化されたかまたはｈＥＳ−由来の細胞から開始でき、たとえば、ステージ１、２、４および５またはｈＥＳ−由来の細胞から細胞集合体を製造できることを示す。
【０２８４】
０日目の細胞集合体
【０２８５】
ステージ１の初日（ｄ０）で製造された細胞集合体：
接着性の多分化能ｈＥＳ細胞は成長され、手動または酵素的に継代され、分離され、数えられ、ペレットにされ、該ペレットはＲＭＰＩ、ペン／ストレプおよびグルタマックス培地を含み、さらに１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ、２５ｎｇ／ｍＬ−７５ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ３ａ、０．２％のＦＢＳ(HyClone)を含む分化培地中で１ｘ１０６細胞／ｍＬから約１×１０６細胞／ｍＬの最終的な容積に再懸濁された。この容積は、＞４×１０６細胞／ｍＬに増加できるが、より頻繁なフィーディングを必要とする。時々ＤＮａｓｅが１０−５０ｎｇ／ｍＬの濃度で含まれる。ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２(Axxora)は細胞懸濁液に約１−１５マイクロＭ、典型的には１０マイクロＭの最終濃度まで加えられた。他のケースでは、約１：２０００から１：５０００のＩＴＳ（インスリン／鉄結合性グロブリン／セレニウム、Ｇｉｂｃｏ）が培地に追加された。Ｒｈｏ−キナーゼ阻害剤とＩＴＳの両方が、細胞生存をサポートするために加えられた。再懸濁された細胞は、実質的に上で説明された、ローバインディング６ウェルの皿の各ウェルに等しく分配され、一晩１００ｒｐｍから１４０ｒｐｍで回転プラットホーム上に置かれた。この培養の期間、均一サイズと形の細胞集合体が形成された。その結果、高い密度の培養物は、ＰＤＸｌ−陽性の膵性内胚葉またはＰＤＸ−陽性の膵性前駆細胞について、効果的に又は実質的に豊化した。実施例２１に詳細を提供する。
【０２８６】
ステージ１のｄ０に製造された細胞集合体は、次に、ＲＭＰＩ、ペン／ストレプ、およびグルタマックス培地を含む分化培地で１−２Ｘで毎日フィードされ、次の２−３日間はさらに１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡと０．２％のＦＢＳ(HyClone)を含むものがフィードされた。プロトコールの引き続くステップ（ステージ２−５）は、ＥＳ集団のために上で説明したものと実質的に同じである。
【０２８７】
ステージ１−２日目と３日目
【０２８８】
ステージ１のｄ２−ｄ３に製造された細胞集合体：
接着性のｈＥＳ細胞は、実質的に上で説明されたようにして発育され、継代され、次に、実質的にｄ’Ａｍｏｕｒ他（２００６）（上掲）で記載されているように、ステージ１に分化された。
【０２８９】
ステージ１（分化プロトコールへの約ｄ２またはｄ３；
最終的な内胚葉タイプ細胞）の終期で、接着培養はＰＢＳ＋／−で１度洗浄され、１ｍＬまたは５ｍＬピペットを使用して３７℃にあらかじめ暖かくされたアキュターゼ(Accutase)の２ｍＬで、約２−５分、単独細胞に分離された。次に、ＲＭＰＩ、ペン／ストレプ、およびグルタマックス培地中の１０％ＦＢＳの４ｍＬが加えられ、単独細胞懸濁液は４０ミクロンの青色フィルター(BD Biosciences)を通して濾過され、５０ｍＬ円錐管に入れられた。細胞は、実質的に上で説明したように、数えられて、ペレットにされた（遠心分離された）。
【０２９０】
次に、細胞ペレットはＲＭＰＩ、ペン／ストレプ  およびグルタマックス培地、さらに２％のＦＢＳ、プラスＤＮａｓｅ（５０−１００  マイクロｇ／ｍｌ、ロシュ・ダイアグノスティックス）、および１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡを含む培地中に再懸濁された。あるいはまた、細胞ペレットはＲＭＰＩ、ペン／ストレプ、グルタマックス、および２％のＦＢＳ、およびＤＮａｓｅ（５０−１００  マイクロｇ／ｍＬ）、２５ｎｇ−５０ｎｇ／ｍＬ  ＫＧＦ(R&D Systems)を含む培地中に再懸濁された。いくつかの実験では、５マイクロＭのＳＢ４３１５４２（シグマオルドリッチＩｎｃ．）または２．５マイクロＭのＴＧＦ−ｂｅｔａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＶ(Calbiochem)がＫＧＦとともに含まれていた。いくつかの実験では、Ｙ２７３３２（ｌ０マイクロＭ）が含まれた。再懸濁された細胞は、上記のようにローバインディング６ウェルの皿の各ウェルに等しく分配され、１００ｒｐｍから１４０ｒｐｍの回転プラットホーム上に一晩おかれ、均一サイズと形の細胞集合体が形成された。
【０２９１】
そして、ステージ１の最後に製造された細胞集合体は、さらに分化された。プロトコールの引き続くステップ（ステージ２−５）は、実施例１７および１８におけるＥＳ集合体と、実質的に同じである。
【０２９２】
ステージ２、５日目から６日目
【０２９３】
ステージ２でｄ５−ｄ６に製造された細胞集合体：
接着性のｈＥＳ細胞は、実質的に上で説明されたようにして発育され、継代され、次に、実質的にｄ’Ａｍｏｕｒ他（２００６）（上掲）で記載されているように、ステージ２に分化された。ステージ１からの接着細胞集合体は、ステージ２のためにＰＢＳ＋／＋で簡単に洗浄され、さらに２％ＦＢＳ、グルタマックス、ペニシリン／ストレプトマイシン、および２５ｎｇ−５０ｎｇ／ｍＬ  ＫＧＦ(R&D Systems)が追加されたＲＰＭＩ中で３日分化された。いくつかの実験では、５マイクロＭ  ＳＢ４３１５４２（シグマオルドリッチＩｎｃ．）または２．５マイクロＭ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＶ(Calbiochem)がステージ２の初日の間、加えられた。
【０２９４】
ステージ２（分化プロトコールの約ｄ５またはｄ６；前腸タイプ細胞）の終期の接着細胞は、実質的に上記のように単独細胞に分離され、計数され、ペレットにされた。次に、細胞ペレットはＤＭＥＭ、ペン／ストレプおよびグルタマックス培地、さらにＩＸ  Ｂ２７−サプリメントおよびＤＮａｓｅ（５０−１００  マイクロｇ／ｍｌ、ロシュ・ダイアグノスティックス）を含み、ＦＢＳを含まないかもしくは１−２％のＦＢＳ、または０．５％から１０％のヒト血清（ｈＳ）、並びに；１マイクロＭのレチノイン酸（ＲＡ、Ｓｉｇｍａ）および０．２５ｎＭ  ＫＡＡＤ−シクロパミン(Toronto Research Chemicals)；または１マイクロＭないし２マイクロＭのレチノイン酸、０．２５ｎＭ  ＫＡＡＤ−シクロパミン、および５０ｎｇ／ｍＬノギン(R&D systems)；または０．２５ｎＭ  ＫＡＡＤ−シクロパミンと１００ｎｇ／ｍＬノギン；または１００ｎｇ／ｍＬノギン；または０．２μＭないし０．５μＭのＲＡと０．２５ｎＭ  ＫＡＡＤ−シクロパミン；または０．２マイクロＭないし０．５マイクロＭのＲＡ、０．２５ｎＭ  ＫＡＡＤ−シクロパミンと５０ｎｇ／ｍＬノギン；のいずれかを含む分化培地中で再懸濁された。いくつかの実験では、Ｙ２７３３２（ｌ０マイクロＭ）が含まれていた。
【０２９５】
再懸濁された細胞は、等しく各ウェルに分配されて、回転プラットホーム上で１００ｒｐｍから１４０ｒｐｍで一晩回転され、均一なサイズと形の細胞集合体がそれらの間に形成された。
【０２９６】
ステージ２の終わりに製造された細胞集合体は、回転プラットホームでさらに分化されて、１−２Ｘ、毎日フィードされ、さらに０−２日は、ＤＭＥＭ、ペン／ストレプとグルタマックス培地、更にＩＸ  Ｂ２７−サプリメント、１マイクロＭから２マイクロＭのレチノイン酸(RA、Sigma)、および；０．２５ｎＭ  ＫＡＡＤ−シクロパミン(Toronto Research Chemicals)；１マイクロＭから２マイクロＭのレチノイン酸、０．２５ｎＭ  ＫＡＡＤ−シクロパミンおよび５０ｎｇ／ｍＬノギン(R&D systems)；または０．２５ｎＭ  ＫＡＡＤ−シクロパミンと１００ｎｇ／ｍＬノギン；または１００ｎｇ／ｍＬノギン；または０．２マイクロＭから０．５μＭのＲＡと０．２５ｎＭ  ＫＡＡＤ−シクロパミン；または０．２μＭから０．５マイクロＭのＲＡ、０．２５ｎＭ  ＫＡＡＤ−シクロパミン、および５０ｎｇ／ｍＬノギンのいずれかを含むものがフィードされた。
【０２９７】
そして、ステージ２の終わりに製造された細胞集合体は、上で説明したように、さらにステージ３、４と５に分化された。
【０２９８】
ステージ４および５−１０日目から３０日目
【０２９９】
ステージ４でｄ１０−ｄｌ４で細胞集合体が製造された：
再度、接着性のｈＥＳ細胞は実質的に上で説明したように成長され継代され、ついでＤ’Ａｍｏｕｒ他（２００６）（上掲）に記載されているように、ステージ２に分化された。
【０３００】
ステージ３に関しては、ステージ２からの接着細胞は１〜３日間、ＤＭＥＭ、ペン／ストレプ、グルタマックス培地であって、更にＩＸ  Ｂ２７−サプリメント、および１マイクロＭから２マイクロＭのＲＡと０．２５ｎＭ  ＫＡＡＤ−シクロパミンを含む培地中でさらに分化された。他の場合では、５０ｎｇ／ｍＬノギンがＲＡとＫＡＡＤ−シクロパミンと共に加えられた。あるいはまた、０．２マイクロＭから０．５マイクロＭのＲＡと、ＫＡＡＤ−シクロパミンの０．２５ｎＭが、ちょうど１日間、培地に加えられた。他の実験では、ＲＡもＫＡＡＤ−シクロパミンも加えられなかった。ステージ４では、１−２Ｘ、毎日、グルタマックスが補われたＤＭＥＭ、ペニシリン／ストレプトマイシン、およびＩＸ  Ｂ２７−サプリメントを細胞に与えた。実施例１７と１８で既に記載されているように、さらにステージ４細胞をステージ５細胞に分化できる。
【０３０１】
ステージ４（分化プロトコールの約ｄｌ０−ｄ１４；膵性上皮および内分泌性タイプ細胞）またはステージ５（分化プロトコールの約１６日目から３０日目；内分泌性先駆および内分泌細胞）の接着培養物は、同様に単独細胞に分離されて、計数され、ペレットにされた。そして、細胞ペレットはＤＭＥＭ  ＣＭＲＬによって補われたペン／ストレプおよびグルタマックス、およびＩＸ  Ｂ２７−サプリメント、ＤＮａｓｅ（５０−１００  マイクロｇ／ｍｌ、ロシュ・ダイアグノスティックス）、および０−２％のＦＢＳ中で再懸濁された。いくつかの実験では、Ｙ２７３３２（ｌ０マイクロＭ）が含まれ、細胞生存をサポートした。細胞は、上で説明したように、等しく６ウェルのプレートに分配されて、４時間ないし一晩、１００ｒｐｍから１４０ｒｐｍの回転プラットホーム上に置かれた。
【０３０２】
さらに、実施例１７−１９のように、ステージ２およびステージ５で製造された細胞集合体は、それらが由来する接着性の平板培養と比べて膵性細胞タイプが富化された。例えば、１つの典型的な実験では、ステージ２で製造されて、ステージ４でフローサイトメトリーで分析された細胞集合体は、少なくとも９８％の膵性細胞タイプ（７３％のクロモグラニン(Chromogranin)Ａ  陽性  内分泌細胞、２５％のＮｋｘ６．ｌ  陽性  膵性内胚葉（ＰＥ））、および２％の非すい臓細胞がタイプからなる。細胞集合体が由来する接着性の平板培養は約７３％の膵性細胞タイプ（３３％のクロモグラニン  Ａ  陽性  内分泌細胞、および４０％のＮｋｘ６．１  陽性  ＰＥ）、および２７％の非すい臓細胞タイプからなる。したがって、ステージ２における集合体は、膵性細胞タイプをもたらす前駆細胞を富化し、非すい臓細胞タイプを減少できる。同様に、典型的な実験では、ステージ５で製造されて、フローサイトメトリーで分析された細胞集合体は、少なくとも７５％のクロモグラニン  Ａ  陽性  内分泌性細胞タイプから成ったが、細胞集合体が由来する接着性の平板培養は約２５％のクロモグラニン  Ａ  陽性  内分泌性細胞タイプから成る。したがって、ステージ５での集合体は膵臓内分泌細胞を効果的に富化できる。
【０３０３】
したがって本明細書に記載された方法は、細胞集合体懸濁液でｈＥＳ細胞の有向分化の効率を向上するだけでなく、汚染物集団（例えば、外はい葉、栄養外胚葉、臓器の内胚葉、および胚体外の内胚葉）を有するｈＥＳ−由来の膵性細胞タイプ（または、集団）を減少すると同時に膵性細胞タイプ（例えば、膵性内胚葉および内分泌細胞）を富化する方法を提供する。
【０３０４】
実施例２０−細胞密度のｈＥＳ分化結果への効果
【０３０５】
以下は、細胞密度の変化が特定の培地と増殖因子条件の中で分化結果に作用することを示す。細胞密度における調節から得られる分化効率は、内因的に製造された伝達分子の濃度の変化を反映し、細胞分化への影響を及ぼすこれらの分子の濃度依存性を反映する。
【０３０６】
直接分化培地で生産されたｄ０細胞集合体を含むヒトＥＳ細胞集合体とｈＥＳ−由来の細胞集合体は、実質的に上記のように発生された。ステージ１と２を経た分化の５日後、分化した細胞集合体はプールされて、異なる播種密度、例えば、前腸内胚葉の２８ｍＬの懸濁液で個々のウェルにリアリコートされ(re-aliquoted)、ステージ細胞集合体は、４、６、８または１０ｍＬ／ウエルで（２．５倍の範囲内の細胞密度）播種されたか、またはリアリコートされた。この細胞分配が２回行われ、１組のウエルにステージ３培地（ＤＭＥＭ／ＰｅｎＳｔｒｅｐ／グルタマックス＋１％  Ｂ２７サプリメント（ｖｏｌ／ｖｏｌ）＋０．２５マイクロＭ  ＫＡＡＤ−シクロパミン＋３マイクロＭ  ＴＴＮＰＢ）で５０ｎｇ／ｍＬのノギンを含む培地が供給され、他のウエルの組は２５ｎｇ／ｍＬのノギンを含んでいた。ステージ３は３日間、毎日培地交換して続けられた。細胞試料は、リアルタイムＱＰＣＲ分析のためにステージ３の最後の３日間（または約８日目）に２個取られ、また再びステージの４の後（または約１４日目）に再度取られた。
【０３０７】
ステージ３の間に使用される細胞密度とノギンの濃度は、膵性内胚葉前駆細胞、および／または、内分泌性前駆細胞または前駆体を示すそれらの遺伝子類の発現に異なった影響を与えた。簡潔にいえば、細胞密度の増大と膵性前駆細胞細胞タイプ（例えば、膵性内胚葉、膵性上皮、ＰＤＸｌ−陽性の膵性内胚葉）の対応する増大の間には、直線関係がある。例えば、ステージ３（または、８日目）の後に、細胞密度の増大は、ＰＤＸｌとＮＫＸ６−１の高められた遺伝子発現で示したように、膵性前駆細胞の細胞数の増大に対応する。図２４Ａおよび２４Ｂを参照。対照的に、ステージ４（または、１４日目）の後の、細胞密度の増大と内分泌性前駆細胞細胞タイプにおける減少の間には逆相関性がにあった。
例えば、細胞密度が減少するにつれて、ステージ３（または、８日目）の後に、少なくともＮＧＮ３とＮＫＸ２−２の減少した発現がみられた。図２４Ｃおよび２４Ｄを参照。
【０３０８】
しかし、与えられる任意の密度でのノギンの低い濃度（例えば、２５ｎｇ／ｍＬ）は、ＮＧＮ３とＮＫＸ２−２の減少した発現で示されるように、内分泌性前駆細胞タイプを減少させた。図２４Ｃおよび２４Ｄを参照。細胞培養における、ノギンの細胞密度非依存性作用は、細胞から内因的に生成されたＢＭＰシグナルが外因的に加えられたノギンによって拮抗されることを示唆する。内因的に生成された信号の分化結果への影響は、ＢＭＰのみに制限されるのではなく、他の増殖因子、および／または、細胞によって培地中に分泌された薬剤が、単独または外因の増殖因子、および／または、薬剤と組み合わされて類似的または対照的な作用を持つことができる。
【０３０９】
実施例２１−膵性内胚葉または内分泌性細胞タイプが富化されて発生される細胞集合体懸濁液培養の最適化
【０３１０】
ｈＥＳ−由来の細胞集合体集団の細胞組成は、様々な増殖因子、および／または、薬剤の濃縮を制御することによって、ある細胞タイプのために最適化される。本明細書に記載された膵性細胞組成物は、ｈＥＳ細胞接着培養、ｄ０細胞集合体（細胞集合体はｈＥＳ接着培養から開始されたか、多分化幹細胞培地ではなく、直接分化培地に置かれた）、または前の例に記載されているように、分化の様々なステージのｈＥＳ−由来の細胞集合体懸濁液から開始された、単独細胞懸濁培養から生成された。ステージ４の間、細胞集合体はＮＯＧＧＩＮ（Ｎ）、ＫＧＦ（Ｋ），ＦＧＦ１０（Ｆ），およびＥＧＦ（Ｅ）の因子群の異なった濃度に暴露された。分化ｈＥＳ細胞集合体の細胞組成は、ＣＨＧＡ、ＮＫＸ６．１、およびＰＤＸｌを含むマーカーのパネルを使用しながら、フローサイトメトリー分析で評価された。任意の集合体中の、内分泌細胞、膵性内はい葉細胞、ＰＤＸ１＋内はい葉細胞、および非−膵性細胞の合計パーセントが表４に示される。
【０３１１】
表４のデータは、ある増殖因子の濃度と比率を制御することによって、得られた組成物をある種の細胞タイプのために最適化できることを示す。例えば、ＫＧＦおよびＥＧＦ（例えば、Ｋ（２５）Ｅ（１０）の７１％対２２．１％）の濃度を下げることによって、内分泌性タイプ細胞と比べて、膵性内胚葉タイプ細胞の割合は増加した。対照的に、ＫＧＦおよびＥＧＦの高い濃度と、ノギンおよびＦＧＦ１０（例えば、Ｎ（５０）Ｆ（５０）Ｋ（５０）Ｅ（５０））の包含は、膵性内胚葉タイプ細胞の数を減少させ、総数が内分泌性タイプ細胞（例えば、３９．６％対４０．１％）と匹敵した。より高い濃度におけるノギンおよびＫＧＦ（例えば、Ｎ（５０）Ｋ（５０））、または増殖因子を加えない時には、得られる集合体内で、膵性内胚葉細胞タイプと比べて、内分泌性タイプ細胞の集団を増加させた。また、非すい臓細胞タイプ（すなわち非ＰＤＸｌ−陽性タイプ細胞）の割合は、ＫＧＦおよびＥＧＦの量を減らす（例えば、Ｋ（２５）Ｅ（１０）；１．５１％）ことにより、または増殖因子を加えない（１．５３％）ことによって、顕著に低下できる。
【０３１２】
したがって、表４は、分化のあるステージ（例えば、ステージ４）で培養培地における、異なった増殖因子の濃度を少なくとも変えると、膵性内胚葉、内分泌性、ＰＤＸｌ−陽性  内胚葉または非膵性細胞タイプのある集団がかなり増加および／または、減少することを明確に示す。
【０３１３】
【表５】
0005390624.tif 000006
【０３１４】
さらに、特定のｈＥＳ−由来の細胞タイプを富化するかまたは精製する他の方法が存在している。これは２００８年４月８日に出願された、米国特許出願第１２／１０７，０２０，特発性好酸球増加症候群細胞から得られた内胚葉ＡＮＤ膵性内はい葉細胞を精製するための方法（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＰＵＲＩＦＹＩＮＧ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ  ＡＮＤ  ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ  ＣＥＬＬＳ  ＤＥＲＩＶＥＤ  ＦＲＯＭ  ＨＥＳ  ＣＥＬＬＳ）に記載され、この特許は本明細書で参照され、組み込まれる。この出願は上掲のｄ’Ａｍｏｕｒら２００５の２００６年に説明されるように、ステージ１、２、３、４と５のそれぞれのステージをもたらすすべての細胞タイプを含む様々なｈＥＳ−細胞タイプを富化するための方法を説明する。この出願は、ＣＤ３０、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５５、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１４２、ＣＤ１６５、ＣＤ２００、ＣＤ３１８、ＣＤ３３４およびＣＤ３４０を含む（ただしこれらに限定されない）様々な抗体類を使用する。
【０３１５】
ｈＥＳ−由来の細胞または細胞集合体を富化するための方法は、抗体親和性手段を使う方法に制限されず、ある細胞タイプの富化を許容する、当業者にとって周知の利用可能な、または将来利用可能なすべての方法を含むことができる。１つの細胞タイプを減少するかまたは、別の細胞タイプまたは培養物から分離することにより富化を行うことができる。
【０３１６】
実施例２２−生体内の成熟膵性内胚葉であってインスリン応答性の細胞集合体懸濁液
本明細書に記載される細胞集合体懸濁液を生成する方法は、生体内で機能する膵性前駆細胞を提供することを示すために、実施例１７−２１の、上記のｈＥＳ−由来の細胞集合体（例えば、ＰＤＸｌ−陽性の内胚葉、膵性内胚葉、膵性上皮、内分泌性先駆、内分泌細胞、および同様のもの）が動物に移植された。正常、および糖尿病が誘発された動物への移殖の方法、動物の生体内のグルコース応答性の決定、および移植された成熟した細胞の生体内でのインスリン生産が実質的に、Ｋｒｏｏｎら（２００８）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６（４）：４４３−４５２、および２００７年７月５日に出願された、米国特許出願第１１／７７３，９４４，膵性ホルモンの生成方法（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＰＲＯＤＵＣＩＮＧ  ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ  ＨＯＲＭＯＮＥＳ）に記載された方法で実行された。これらは本明細書で参照され、組み込まれる。実質的に、同じ水準のヒトＣ−ペプチドはＫｒｏｏｎ他の米国特許出願第１１／７７３，９４４（上掲）にみられるものと同様の期間で、これらの動物の血清で観測された。
【０３１７】
本明細書に記載された、方法、組成物、および装置は、好適な実施態様を代表するが、例示であり、本発明の範囲を制限することは意図されない。そこでの変化および他の用途は当業者によって考えられるであろうが、それらは本発明の精神の範囲内に包含され、請求の範囲によって定義される。本明細書中で開示された発明に対する種々の置換および変更が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく行われうることは、当業者に容易に理解されるであろう。
【０３１８】
本発明に関する一定の態様においては、異なる実施態様として記載されていても、実施態様の組み合わせが提供されることができることが理解される。例えば、ｈＥＳ−由来の細胞集合体を懸濁培養中で作るための方法は、任意の内胚葉リネッジ細胞タイプ、たとえば膵性リネッジタイプ細胞、肝臓リネッジタイプ細胞、上皮性リネッジタイプ細胞、甲状腺リネッジ細胞、および胸腺リネッジ細胞を生成するために作られ、最適化できる。したがって本明細書に具体的に説明されたｈＥＳ−由来の細胞タイプには制限されない。また逆に、本発明の様々な態様は、簡潔さのために単一の実施態様として記載されているが、それらを別々に行うこともできるし、また任意の適当なサブコンビネーションとしても提供できる。例えば、当業者には、ｈＥＳ細胞およびｈＥＳ−由来の細胞集合体を接着性の平板培養または懸濁培養から、未分化型接着性の平板培養または懸濁培養から、分化型接着性の平板培養または懸濁培養から生成するための記載された方法は、例示に過ぎず、これらの方法の組み合わせも使用できることは、明らかである。
【０３１９】
この明細書で参照されたすべての刊行物および特許は、本明細書に参考としてそれらの全体が援用される。
【０３２０】
以下の特許請求の範囲および明細書で使用される「本質的に〜からなる」との用語は、この句に関連して列記された要素を含むことを意味し、列記された要素について開示された活性または作用を妨害し、またはこれに寄与しない他の要素に制限される。すなわち、「本質的に〜からなる」との用語は、列記された要素が必要とされ、義務的であることを示すが、列記された要素の活性および作用に影響を与えるか否かにより、他の要素も任意に存在することができ、または存在することができないことを意味する。
本発明はその実施態様として以下のものを含む。
第１項：  以下を含む、ｈＥＳ単独細胞懸濁液からの懸濁液中にｈＥＳ−由来の細胞集合体を発生させる方法；
（ａ）  未分化状態でのエキスパンションを許容する接着性の成長培養条件でｈＥＳ細胞を培養すること；
（ｂ）  （ａ）の接着性のｈＥＳ細胞培養物をｈＥＳ単独細胞の懸濁培地内に解離すること；および
（ｄ）  ｈＥＳ単独細胞懸濁培地を、単独細胞懸濁培地がｈＥＳ−由来の細胞集合体を懸濁液中で形成するまでの期間撹拌した際に、懸濁液中にｈＥＳ−由来の細胞集合体を形成することを許容する分化培地条件と接触させ、懸濁液中のｈＥＳ−由来の細胞集合体を発生させること。
第２項：  前記ｈＥＳ単独細胞懸濁培地が少なくとも３０分間撹拌される、第１項記載の方法。
第３項：  前記ｈＥＳ単独細胞懸濁培地が８０ｒｐｍから１６０ｒｐｍで、ｈＥＳ単独細胞懸濁培養物のオービタルローテーションにより撹拌される、第１項記載の方法。
第４項：  前記ｈＥＳ単独細胞懸濁培地が１００ｒｐｍから１４０ｒｐｍで、ｈＥＳ単独細胞懸濁培養物のオービタルローテーションにより撹拌される、第１項記載の方法。
第５項：  複数のｈＥＳ−由来の細胞集合体が懸濁培養で製造され、懸濁液中のｈＥＳ−由来の細胞集合体のサイズと形状が本質的に一定である、第１項記載の方法。
第６項：  ｈＥＳ−由来の細胞集合体が内胚葉リネッジ特異性細胞集合体である、第１項記載の方法。
第７項：  前記内胚葉リネッジ特異性細胞集合体が、膵性リネッジタイプ細胞集合体、肝臓リネッジタイプ細胞集合体、上皮性リネッジタイプ細胞集合体、甲状腺リネッジ細胞集合体、および胸腺リネッジ細胞集合体から成る群から選択される、第６項記載の方法。
第８項：  前記内胚葉リネッジ特異性細胞集合体が膵性リネッジタイプ細胞集合体である、第６項記載の方法。
第９項：  前記ｈＥＳ−由来の細胞集合体は、多分化能膵性前駆細胞集合体または内分泌性細胞集合体である、第１項記載の方法。
第１０項：  前記分化培養条件と接触させる工程に引き続いて、１種以上の選択性マーカまたは薬剤の使用により希望のｈＥＳ−由来の細胞集合体を選択するかまたは精製する工程をさらに含む、第１項記載の方法。
第１１項：  前記選択性マーカまたは薬剤が、ＣＤ３０、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５５、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１４２、ＣＤ１６５、ＣＤ２００、ＣＤ３１８、ＣＤ３３４、およびＣＤ３４０から成る群から選ばれる、第１０項記載の方法。
第１２項：  前記希望のｈＥＳ−由来の細胞集合体の選択または精製がセルソ−ティングの使用により行われる、第１０項記載の方法。
第１３項：  前記分化培養条件と接触させる工程に引き続いて、ＦＧＦ１０、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ノギン、およびレチノイン酸から成る群から選択される増殖因子の低濃度と接触させることにより膵性内胚葉細胞を富化する工程をさらに含む、第１項記載の方法。
第１４項：  前記分化培養条件と接触させる工程に引き続いて、ＦＧＦ１０、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ノギン、およびレチノイン酸から成る群から選択される増殖因子の高濃度と接触させることにより膵性内分泌細胞を富化することを許容する工程をさらに含む、第１項記載の方法。
第１５項：  前記ｈＥＳ単独細胞懸濁培地に、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５２Ｐ、およびインスリン／鉄結合性グロブリン／セレニウム（ＩＴＳ）を含む混合物から成る群から選ばれる、細胞生存を促進できる薬剤を追加することをさらに含む、第１項の方法。
第１６項：  前記接着培養条件が、細胞外マトリクス、細胞外基質蛋白質およびヒトまたはマウスフィーダー層から成る群から選択される基体またはマトリツクスを欠いている、第１項記載の方法。
第１７項：  前記接着性の成長培養条件は、異物性がなく、無マトリツクス、およびフィーダなしである、第１項記載の方法。
第１８項：  前記第一の分化培養条件が、ＴＧＦｂｅｔａファミリーメンバー受容体を活性化するＴＧＦｂｅｔａファミリーメンバーを含み、該ＴＧＦｂｅｔａファミリーメンバーがアクチビン  Ａ、アクチビン  Ｂ、ノーダル、ＧＤＦ−８、およびＧＤＦ−１１から成る群から選ばれる、第１項記載の方法。
第１９項：  以下を含む、ｈＥＳ−由来単独細胞懸濁液から、懸濁液中にｈＥＳ−由来の細胞集合体を発生させる方法；
（ａ）  未分化状態でのエキスパンションを許容する接着性の成長培養条件でｈＥＳ細胞を培養すること；
（ｂ）  ｈＥＳ細胞を分化するのに好適な第一の培養条件に未分化のｈＥＳ細胞を接触させ、接着性のｈＥＳ−由来の細胞を与えること；
（ｃ）  接着性のｈＥＳ−由来の細胞を単独細胞懸濁培養物に解離すること；
および
（ｄ）  単独細胞懸濁培養物を、単独細胞懸濁培地がｈＥＳ−由来の細胞集合体を懸濁液中で形成するまでの期間撹拌した際に、懸濁液中にｈＥＳ−由来の細胞集合体を形成することを許容する第二の分化培地条件と接触させ、それにより懸濁液中にｈＥＳ−由来の細胞集合体を発生させること。
第２０項：  前記第二の分化培養条件が、ＦＧＦ１０、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ノギンおよびレチノイン酸から成る群から選ばれた非ＴＧＦｂｅｔａファミリーメンバーを含む、第１９項記載の方法。
第２１項：  ＦＧＦ１０、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ノギン、およびレチノイン酸から成る群から選択された増殖因子の低濃度を使用することを含む膵性前駆細胞を富化する方法。
第２２項：  ＦＧＦ１０、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ノギン、およびレチノイン酸から成る群から選択された増殖因子の高濃度を使用することを含む内分泌前駆細胞を富化するための方法。
第２３項：  ｈＥＳ細胞培地から膵性前駆細胞を富化する方法であって、膵性前駆細胞が由来するｈＥＳ細胞培地密度を大きくすることを含む、方法。
第２４項：  ｈＥＳ細胞培地から内分泌前駆細胞を富化する方法であって、膵性前駆細胞が由来するｈＥＳ細胞培地密度を小さくすることを含む、方法。
【図１】
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【図２Ａ】
0005390624.tif 000008
【図２Ｂ】
0005390624.tif 000009
【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
0005390624.tif 000011
【図３Ｂ】
0005390624.tif 000012
【図３Ｃ】
0005390624.tif 000013
【図３Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
0005390624.tif 000018
【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
0005390624.tif 000020
【図６】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｅ−１】
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【図８Ｅ−２】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
0005390624.tif 000043
【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１Ａ−１１Ｂ】
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【図１１Ｃ−１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２２Ｆ】
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【図２２Ｇ】
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【図２２Ｈ】
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【図２２Ｉ】
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【図２２Ｊ】
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【図２２Ｋ】
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【図２２Ｌ】
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【図２２Ｍ】
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【図２２Ｎ】
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【図２２Ｏ】
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【図２２Ｐ】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図４】
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