(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンテロコッカス・フェカリス菌の細胞壁から単離され、下記式：
→−ｖ）−Ｄ−Ｇａｌｆ−（１→−ｚ）−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→−、
→−ｖ）−Ｄ−Ｇａｌｆ−（１→−ｚ）−Ｄ−Ｇｌｃｆ−（１→−、
→−ｖ）−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→−ｚ）−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→−または
→−ｖ）−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→−ｚ）−Ｄ−Ｇｌｃｆ−（１→−、
（式中、ｖおよびｚは、それぞれ１、２、３、４、５または６である）より選ばれる構造を有するピラノース／フラノース型ガラクトースおよびピラノース／フラノース型グルコースからなる二糖構造を有し、前記二糖構造が、
下記の一般式で示される構成単位の構造を有することを特徴とするエンテロコッカス・フェカリス菌抗原。
【化１】
0005386361.tif 000005
｛式中、Ｒ１は、それぞれ独立して、ＯＨ、ＯＡｃ、ＯＣｎＨｍおよびＯＦｏより選ばれ
［式中、Ｆｏはホルミル基を表し、ｍ＝２ｎ＋１およびｎは、自然数１〜１０より選ばれる。］、
Ｘは、Ｏであり、
Ｙは、Ｏであり、
ＣＡは、それぞれ独立してＣ１−Ｃ６アシルエーテル基、およびヒドロキシアシル基からなる群より選ばれる。｝
【請求項２】
Ｒ１がＯＨ、ＸがＯ、ＹがＯ、およびＣＡがラクチル基であることを特徴とする請求項１に記載の抗原。
【請求項３】
下記式で示される構成単位を有することを特徴とする請求項１または２に記載の抗原。
【化２】
0005386361.tif 000006
【請求項４】
分子量が、１，０００〜２００，０００Ｄａの間であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の抗原。
【請求項５】
１抗原当たり前記構成単位が、少なくとも５回繰り返されている構造であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の抗原。
【請求項６】
担体に結合していることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の抗原。
【請求項７】
前記担体への結合が共有結合であることを特徴とする請求項６に記載の抗原。
【請求項８】
前記担体が免疫担体であることを特徴とする請求項６または７に記載の抗原。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の抗原を含む組成物。
【請求項１０】
薬学的に許容される基剤を含む請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれかに記載の抗原に対する特異的抗体。
【請求項１２】
請求項１１に記載の抗体を含む組成物。
【請求項１３】
薬学的に許容される基剤を含む請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
エンテロコッカス・フェカリス菌に対するワクチンであることを特徴とする請求項９、１０、１２または１３に記載の組成物。
【請求項１５】
医薬組成物であることを特徴とする請求項９、１０、１２または１３に記載の組成物。
【請求項１６】
エンテロコッカス・フェカリス菌に対する抗体の検出方法であって、
−エンテロコッカス・フェカリス菌に対する抗体の有無を調べる試料と、請求項１〜８のいずれかに記載の抗原とを接触させる工程、および
−抗体−抗原複合体または抗体−複合抗原複合体を検出する工程を含み、
該複合体が検出されることによって、試料中にエンテロコッカス・フェカリス菌に対する抗体の存在が示されることを特徴とする検出方法。
【請求項１７】
エンテロコッカス・フェカリス菌抗原の検出方法であって、
−担体に固定されていてもよい請求項１１に記載の抗体と、エンテロコッカス・フェカリス菌抗原の有無を調べる試料とを接触させる工程、および
−抗原−抗体複合体または複合抗体−抗原複合体を検出する工程を含み、
該複合体が検出されることによって、試料中にエンテロコッカス・フェカリス菌抗原の存在が示されることを特徴とする検出方法。
【請求項１８】
前記抗原または抗体が、担体に固定されていることを特徴とする請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗原または抗体が、マーカーで標識されていることを特徴とする請求項１６〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記マーカーが、放射性マーカー、色素マーカー、酵素マーカーおよび磁気マーカーからなる群より選ばれることを特徴とする請求項１９の方法。
【請求項２１】
抗体に結合した後に、前記マーカーが特性変化を示すことを特徴とする請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜８のいずれかに記載の抗原を含む、試料中のエンテロコッカス・フェカリス菌に対する抗体を検出するためのキット。
【請求項２３】
担体に結合していてもよい請求項１１に記載の抗体を含む、試料中のエンテロコッカス・フェカリス菌抗原を検出するためのキット。
【請求項２４】
前記抗原または抗体が、マーカーで標識されていることを特徴とする請求項２２または２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記マーカーが、放射性マーカー、色素マーカー、酵素マーカーまたは磁気マーカーであることを特徴とする請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記抗原または抗体が、担体に結合していることを特徴とする請求項２２〜２５のいずれかに記載のキット。
【請求項２７】
エンテロコッカス・フェカリス菌に対する抗体および／または抗体フラグメントを検出または産生するための請求項１〜８のいずれかに記載の抗原の使用（但し、ヒトの体内で前記抗体および／または抗体フラグメントを産生するための使用を除く）。
【請求項２８】
前記抗体または抗体フラグメントの産生方法であって、前記抗体または抗体フラグメントの産生に十分な量の請求項１〜８のいずれかに記載の抗原を、動物（但し、ヒトを除く）に投与することを含む方法。
【請求項２９】
請求項１１に記載の抗体と構造的に同等である組換え抗体、またはその組換えフラグメントであって、請求項１〜８のいずれかに記載の抗原に特異的に結合する組換え抗体、またはその組換えフラグメント。
【請求項３０】
請求項１１に記載の抗体、またはそのフラグメントを遺伝子組換えで産生するインビトロの方法であって、前記フラグメントは、請求項１〜８のいずれかに記載の抗原に特異的に結合するものであり、前記抗体またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列を発現ベクターへクローニングした後、このコンストラクトを用いて細胞を形質転換して組換え抗体またはそのフラグメントを発現させることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、エンテロコッカス・フェカリス菌および／またはエンテロコッカス・フェシウム菌が原因菌である感染症を発見および予防する分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
より具体的には、本発明は、請求項１に記載の抗原、請求項１４および３３に記載の抗体、請求項１０および１５に記載の組成物、請求項１９、２０、３２および３４に記載の方法、請求項２５および２６に記載のキット、ならびに請求項３０に記載の使用に関する。
【０００３】
院内感染（病院感染）は、入院に伴って起こる微生物が原因の感染である。
【０００４】
アメリカでは、院内感染の発生数が１９７５〜１９９５年で３６％増加し、１９９５年は１０００人の患者のうちおよそ１０人が院内感染の被害を受けた。
【０００５】
このような状況で、現在アメリカにおける院内感染単独の死者数は、年間４４，０００〜９８，０００人に上っている。
【０００６】
病院内で発症する合併症の多くは、院内感染が原因である。このような院内感染を予防することが、患者に対する医療および看護の質を維持する上で不可欠である。
【０００７】
入院治療において、質を重視した医療行為を行う上で、その至上目的は、もちろん患者を健康な状態にすることである。このため、院内感染は病院にとって重大問題である。
【０００８】
院内感染は、さらなる苦痛となって患者自身に負担を与えるだけでなく、通常、入院期間の延長（平均で約４日）にもつながる。したがって、病院および医療制度にとっても重い負担となる。院内感染は、アメリカで年間１７０〜２９０億米ドルのコスト負担となっている。
【０００９】
医療は確実に進歩しているにもかかわらず、院内感染の発生率は、今後むしろ増加することが予想される。
【００１０】
このような状況には、とりわけ下記要因が関与している：
−高齢の患者数が増加すること、
−内因感染に対する防御力が弱い患者を病院で治療する機会が増えること、
−外科技術の進歩により、以前より複雑かつ困難な手術が実施されること、
−複雑な装置を用いた感染リスクの高い侵襲性の処置を行う可能性がますます高まっていること、
−防御力が低下するような治療的処置を行う機会が増加すること、および
−抗生物質、特に広域スペクトルを持った抗生物質の使用頻度が増すことで、多剤耐性微生物が増加すること。
【００１１】
これに関連した最近の研究（Ａｍ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．，３２：４７０−４８５，２００４）より、病院内で単離されたエンテロコッカス・フェシウム菌のうち、最大で２５％がグリコペプチド抗生物質耐性であることがわかった。
【００１２】
グリコペプチド系抗生物質は、菌体の細胞壁に作用してその構造内へ直接進入する。それにより細胞壁に穴が開いて、菌体内へ水が進入する。グリコペプチド系抗生物質としては、バンコマイシンが挙げられる。
【００１３】
近年、ＤｉａｚＧｒａｎａｄｏｓ、Ｃ．Ａ．らは、免疫系機能が弱まった患者においては特に、バンコマイシン耐性エンテロコッカス菌による疾病率および死亡率が極めて高くなることを示した（Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，４１：３２７−３３３，２００５）。
【００１４】
したがって、このような院内感染を予防または少なくとも抑制する効果のある免疫療法の手法を開発することに、引き続き関心が集まっている。
【００１５】
ワクチンの開発における糖鎖抗原の利用は、原理上、先行技術（Ａｄａ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．，９：７９−８５，２００３）において公知であるが、エンテロコッカス・フェカリス菌の細胞壁に関連した莢膜多糖体については、これまでほとんど知られていない。
【００１６】
これまでに４つの糖鎖抗原について報告があるが（Ｈａｎｃｏｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９９：１５７４−１５７９，２００２；Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６：６２，２００６；Ｐａｚｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４８：２７９−２８４，１９７３；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３１６：１５５−１６０，１９９９；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６５：４２０７−４２１５，１９９７；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６：４３１３−４３２３，１９９８；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６８：８１５−８２３，２０００）、このうち完全な構造解析が行われたのは、１つのみである。また、エンテロコッカス・フェカリス菌株ＦＡ２−２の菌体表面に露出した、グルコース、ガラクトースおよびグリセリンリン酸から構成される糖鎖抗原についても報告されている。
【００１７】
エンテロコッカス・フェカリス菌および近縁のエンテロコッカス・フェシウム菌における多剤耐性菌株の出現により生じた問題を解決するために、エンテロコッカス・フェカリス菌および／またはエンテロコッカス・フェシウム菌の菌体表面に露出した抗原の特性を明らかにし、このような抗原を用いて上記の問題を克服することが、先行技術において強く求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
したがって、本発明の目的は、エンテロコッカス・フェカリス菌および／またはエンテロコッカス・フェシウム菌における未知の抗原を提供することである。
【００１９】
本発明の別の目的は、前記エンテロコッカス・フェカリス菌および／またはエンテロコッカス・フェシウム菌における未知の抗原に対する抗体を提供することである。
【００２０】
本発明の別の目的は、エンテロコッカス・フェカリス菌および／またはエンテロコッカス・フェシウム菌の少なくとも１種の抗原、またはその抗体を含む組成物を提供することである。この組成物は、エンテロコッカス・フェカリス菌および／またはエンテロコッカス・フェシウム菌感染を防ぐための能動免疫または受動免疫に適していることが好ましい。
【００２１】
本発明の別の目的は、試料中に含まれる前記未知の抗原を検出する方法を提供することである。
【００２２】
本発明の別の目的は、試料中に含まれる前記未知の抗原に対する抗体を検出する方法を提供することである。
【００２３】
本発明の別の目的は、前記未知の抗原またはその抗体を検出するキットを提供することである。
【００２４】
本発明の別の目的は、前記未知の抗原に対する抗体もしくは抗体フラグメントを検出または産生するための該抗原の使用、およびその使用方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明におけるこれらの目的は、請求項１に記載の抗原、請求項１４および３３に記載の抗体、請求項１０および１５に記載の組成物、請求項１９、２０、３２および３４に記載の方法、請求項２５および２６に記載のキット、ならびに請求項３０に記載の使用により達成される。
【００２６】
より具体的には、本発明は、下記の一般式で示される構成単位を少なくとも１つ含むことを特徴とするエンテロコッカス・フェカリス菌抗原および／またはエンテロコッカス・フェシウム菌の抗原を提供する。
【００２７】
【化１】
0005386361.tif 000002
【００２８】
｛式中、Ｒ１は、それぞれ独立してＨ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＡｃ、ＯＣｎＨｍ、ＯＦｏ、ＯＡｃｙｌ、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＳＣｎＨｍ、ＳＦｏ、ＳＡｃ、ＳＡｃｙｌ、ＮＨ２、ＮＨＣＨ３、ＮＨＣｎＨｍ、ＮＨＦｏ、ＮＨＡｃ、ＮＨＡｃｙｌ、ＰＯ２（ＯＲ２）２、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群より選ばれ
［式中、Ｆｏはホルミル基を表し、Ｒ２は、それぞれ独立してＨ、ＣｎＨｍ、ＣｎＨｍ−１ＮＨＲ３およびＣｎＨｍ−１Ｎ（ＣＨ３）３からなる群より選ばれる（式中、Ｒ３は、それぞれ独立してＨ、Ｆｏ、Ａｃおよびアシル基からなる群より選ばれる）］、
Ｘは、それぞれ独立してＯ、Ｓ、ＣＨ２、ＮＨおよびＰＯＯＲ４からなる群より選ばれ
［式中、Ｒ４は、Ｈ、ＣｎＨｍ、ＣｎＨｍ−１ＮＨＲ３またはＣｎＨｍ−１Ｎ（ＣＨ３）３を表す］、
Ｙは、それぞれ独立してＯ、Ｓ、ＣＨ２およびＨＰＯ４からなる群より選ばれ、
ＣＡは、それぞれ独立してＣ１−Ｃ６アシル基、特にヒドロキシアシル基、好ましくはラクチル基、ならびにＨ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＡｃ、ＯＣｎＨｍ、ＯＦｏ、ＯＡｃｙｌ、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＳＣｎＨｍ、ＳＦｏ、ＳＡｃ、ＳＡｃｙｌ、ＮＨ２、ＮＨＣＨ３、ＮＨＣｎＨｍ、ＮＨＦｏ、ＮＨＡｃ、ＮＨＡｃｙｌ、ＰＯ２ＯＲ２、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群より選ばれ
［式中、Ｆｏはホルミル基を表し、Ｒ２は、それぞれ独立してＨ、ＯＣｎＨｍ、ＯＣｎＨｍ−１ＮＨＲ３およびＯＣｎＨｍ−１Ｎ（ＣＨ３）３からなる群より選ばれる（式中、Ｒ３は、それぞれ独立してＨ、Ｆｏ、Ａｃおよびアシル基からなる群より選ばれる）］、
ｍ＝２ｎ＋１およびｎは、自然数１〜１０より選ばれる。｝
【００２９】
この構成単位の２つの糖は、Ｄ体であることが好ましい。
【００３０】
本発明の抗原は、フラノース型ガラクトースおよびピラノース型グルコースからなる二糖類が、下記式より選ばれる構造を有することを特徴とする抗原であることが特に好ましい。
→−ｖ）−Ｄ−Ｇａｌｆ−（１→−ｚ）−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→−、
→−ｖ）−Ｄ−Ｇａｌｆ−（１→−ｚ）−Ｄ−Ｇｌｃｆ−（１→−、
→−ｖ）−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→−ｚ）−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→−または
→−ｖ）−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→−ｚ）−Ｄ−Ｇｌｃｆ−（１→−
【００３１】
（式中、ｖおよびｚは、それぞれ１、２、３、４、５または６である。）
【００３２】
本発明に用いられる抗原としては、下記式で示される構成単位を含むことが特に好ましい。
【００３３】
【化２】
0005386361.tif 000003
【００３４】
Ｒ１がＯＨ、ＸがＯ、ＹがＯ、およびＣＡがラクチル基であることがさらに好ましい。
【００３５】
理論的には、本発明の抗原の分子量は重要でないため、分子量に関してこれ以上限定されることはない。しかし、一般に本発明の抗原の分子量は、約１，０００〜２００，０００Ｄａ、より好ましくは約５０，０００〜１５０，０００Ｄａ、特に好ましくは約１００，０００Ｄａである。抗原の分子量が小さすぎると分子内相互作用が十分に働かないため、構造上安定したエピトープを形成できない可能性がある。一方、抗原の分子量が大きすぎると、往々にして合成されにくく、抗原の寿命も短くなる。
【００３６】
理論的には、本発明の抗原は、請求項１に記載の構成単位が少なくとも１回繰り返された構造を持っていれば十分である。しかし、１抗原当たり上記構成単位が少なくとも５回、好ましくは少なくとも１０回、より好ましくは少なくとも１００回、特に好ましくは少なくとも１，０００回繰り返された構造をとることによって、本発明の抗原の抗原性を高めることができる。本発明の抗原を様々な分析に応用するために、上記抗原を固定することがさらに好ましい。このようにして、抗原が局所的に存在するよう制限してもよい。その結果、種々の試料を、例えばアレイ状に配置することにより、これらの試料を同時にかつ個別に抗体と接触させ、分析することができる。また、固相化抗原は、親和性を利用した、抗体などの精製方法にも有用である。
【００３７】
したがって、本発明の好ましい実施形態において、抗原を担体に、好ましくは免疫担体に結合する。
【００３８】
抗原の固相化は、理論的にはいずれの種類の相互作用を用いてもよい。例えば、ファンデルワールス力、イオン相互作用、双極子相互作用、水素結合または疎水的相互作用などを用いることができる。しかし、抗原を共有結合で担体に結合することが好ましい。
【００３９】
本発明の抗原が、組成物の形態で提供されることが好ましい。好ましい実施形態において、このような組成物は少なくとも１種の薬学的に許容される基剤を含む。ここで、「基剤」は、抗原を付加できる、かつ／または抗原が物理的に結合できる物質であればよい。このようにして例えば、通常投与するのに困難が伴う量の抗原を、容易に投与できる量の基剤に結合することができる。このような基剤として、デンプンおよびマルトデキストリンが挙げられる。ここで、「薬学的に許容される」とは、本発明で用いる基剤が無毒で、抗原の作用を妨げないことを意味する。
【００４０】
エンテロコッカス・フェカリス菌および／またはエンテロコッカス・フェシウム菌が原因菌である感染症に対する予防対策として、能動的に免疫を獲得するワクチン接種の形態で、本発明の抗原を患者に投与してもよい。このようなワクチン接種の目的は、本来備わっている免疫系自体を賦活して特異的抗体を産生させ、それによりエンテロコッカス・フェカリス菌および／またはエンテロコッカス・フェシウム菌に対する特異的な免疫を形成することである。したがって、患者は、免疫系を持つ生物であればよい。しかし、例えばヒト、ヒト以外の霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギおよびヒツジなどの哺乳動物、ならびに例えばニワトリ、アヒル、ガチョウ、七面鳥およびダチョウなどの鳥類が、特に重要である。
【００４１】
この点において、好ましい実施形態における本発明の抗原は、エンテロコッカス・フェカリス菌および／またはエンテロコッカス・フェシウム菌に対するワクチンである。
【００４２】
本発明はまた、前記抗原の抗体に関する。
【００４３】
この抗体はモノクローナル抗体とポリクローナル抗体のいずれであってもよい。
【００４４】
抗体は、２つの同一の重鎖（Ｈ）および２つの同一の軽鎖（Ｌ）から構成され、それぞれの鎖は共有結合の一つであるジスルフィド結合によって結合し、Ｙ字形の構造をしている。生物の分類上のサブクラスおよび免疫グロブリンのサブクラスによって異なるが、２つの軽鎖はカッパ鎖とラムダ鎖のいずれかであり、重鎖のうちヒンジ領域の上流に位置する領域と共に、抗原結合性フラグメント（Ｆａｂ）を形成している。このフラグメントは、酵素により下流の結晶化可能フラグメント（Ｆｃ）と分離することができる。
【００４５】
生物は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えにより抗体結合部位（相補性決定領域（ＣＤＲ））の著しい可変性を享受している。
【００４６】
２つの軽鎖は、それぞれ１つの可変領域と１つの定常領域から構成される。それぞれ、ＶＬとＣＬと称する。一方、２つの重鎖は、１つの可変領域と３つの定常領域をそれぞれ有する。同様にそれぞれ、ＶＨおよびＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３と称する。
【００４７】
本発明で用いる抗体は、全長抗体またはそのフラグメントであり、フラグメントとしては、例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖが挙げられる。ただし、後者は、少なくとも限定的に抗原に結合することができる場合に限る。
【００４８】
本発明はまた、ヒト化抗体およびキメラ抗体を含む。
【００４９】
この種の抗体および／または本発明の抗原は、例えば下記において使用することができる。
−酵素標識抗体を用いて、例えば血清や細胞培養上清などに含まれる抗原または抗体を定量するＥＬＩＳＡ法、
−酵素標識抗体を用いて、形質細胞などの抗体産生細胞または抗原産生細胞を検出するＥＬＩＳＰＯＴ法、
−細胞表面、細胞質内、または核内の抗原に結合する蛍光標識抗体を用いて、細胞を定量するＦＡＣＳ法、
−ウェスタンブロット、
−スーパーゲルシフトアッセイ（ＥＭＳＡも含む）、
−ファージディスプレイ、
−ドラッグワイプ（ｄｒｕｇｗｉｐｅ）分析、
−アブザイム法、または
−適切なアフィニティー法による本発明の抗原または抗体の精製方法。
【００５０】
本発明の抗体は、本発明の抗原と同様に、組成物の形態、好ましくは薬学的に許容される基剤を含む組成物の形態で提供されることが好ましい。
【００５１】
本発明の特に好ましい実施形態において、本発明の抗体をエンテロコッカス・フェカリス菌および／またはエンテロコッカス・フェシウム菌に対して受動的に免疫を獲得するワクチン接種に使用する。したがって、この場合、本発明の抗体は、エンテロコッカス・フェカリス菌および／またはエンテロコッカス・フェシウム菌に対するワクチンである。
【００５２】
受動的に免疫を獲得するワクチン接種は、エンテロコッカス・フェカリス菌および／またはエンテロコッカス・フェシウム菌に対する本発明の特異的抗体を含有する、好ましくは本発明の特異的抗体を高濃度に含有するワクチン血清を用いて行う。
【００５３】
本発明の組成物は、原則として医薬組成物であることが好ましい。本発明の医薬組成物は、治療または予防のための投与に適している点で優れている。
【００５４】
本発明は、さらにエンテロコッカス・フェカリス菌および／またはエンテロコッカス・フェシウム菌に対する抗体を検出する方法に関する。該方法は、下記の工程を含む。
−エンテロコッカス・フェカリス菌および／またはエンテロコッカス・フェシウム菌に対する抗体の有無を調べる試料と、本発明の抗原とを接触させる工程。
−抗体−抗原複合体または抗体−複合抗原複合体を検出する工程。
このような複合体が検出されることにより、試料中にエンテロコッカス・フェカリス菌および／またはエンテロコッカス・フェシウム菌に対する抗体の存在が示される。
【００５５】
本発明はまた、エンテロコッカス・フェカリス菌抗原および／またはエンテロコッカス・フェシウム菌抗原を検出する方法を含む。該方法は、少なくとも下記の工程を含む。
−エンテロコッカス・フェカリス菌抗原および／またはエンテロコッカス・フェシウム菌抗原の有無を調べる試料と、本発明の抗体とを接触させる工程。このとき、本発明の抗体は担体に固定されていてもよい。
−抗原−抗体複合体または複合抗体−抗原複合体を検出する工程。
このような複合体が検出されることにより、試料中にエンテロコッカス・フェカリス菌抗原および／またはエンテロコッカス・フェシウム菌抗原の存在が示される。
【００５６】
上記の２つの方法において、抗原または抗体が、担体に、特に固相担体に、好ましくはマイクロタイタープレートに固定されていることが好ましい。
【００５７】
あるいは、検査試料を担体に固定することも考えられる。
【００５８】
いずれの場合も、形成された抗原抗体複合体を極めて容易に検出できる。これは、複合体を検出する前に、例えば洗浄操作を行うことで担体から未結合の試料成分を除去することも可能であり、その結果、ノイズが減り、測定精度が向上するからである。また、固相担体を使用することによって、機器による試料の取り扱いが容易になるため、本発明の方法は、例えばハイスループットスクリーニングのような自動化システムにとりわけ優れた適性を示す。
【００５９】
本発明の抗原または抗体を検出可能なマーカーで標識することにより、抗原抗体複合体をさらに容易に検出できる。
【００６０】
例えば抗エンテロコッカス・フェカリス菌抗体および／または抗エンテロコッカス・フェシウム菌抗体を含む可能性がある検査試料を担体に固定し、次いで、この固相化試料を本発明の標識抗原と接触させると、抗原の標識マーカーが放つシグナルによって、洗浄操作が終了した時点で抗エンテロコッカス・フェカリス菌抗体および／または抗エンテロコッカス・フェシウム菌抗体を含む試料を確認できる。
【００６１】
マーカーとして使用できる好適な化合物は、抗原と抗体の相互作用を妨げることなく本発明の抗体または抗原と接触できればよく、必要ならば適宜基質を活性化または導入した後、種類は問わず検出可能なシグナルを直接的または間接的に生成するものであればいかなる化合物であってもよい。
【００６２】
本発明で用いるマーカーとしては、放射性マーカー、色素マーカー、酵素マーカーおよび磁気マーカーが好ましい。
【００６３】
抗体または抗原に結合した後に、マーカーが特性変化を示す場合、本発明の検出方法はさらに容易なものになる。これは、例えば洗浄操作を行わなくても、未結合の標識抗原や標識抗体と、結合したものとを識別できるからである。
【００６４】
本発明はまた、エンテロコッカス・フェカリス菌および／またはエンテロコッカス・フェシウム菌に対する抗体を検出するためのキット、および／またはエンテロコッカス・フェカリス菌抗原および／またはエンテロコッカス・フェシウム菌抗原を検出するためのキットを提供する。該キットは、上記の実施形態のいずれかにおける本発明の抗体および／または抗原を含むものである。
【００６５】
具体的には、本発明の抗原および／または本発明の抗体を、担体に、好ましくは固相担体に結合してもよく、かつ／またはマーカー、好ましくは放射性マーカー、色素マーカー、酵素マーカーまたは磁気マーカーで標識してもよい。
【００６６】
さらに本発明は、エンテロコッカス・フェカリス菌および／またはエンテロコッカス・フェシウム菌に対する抗体および／または抗体フラグメント、具体的にはＦａｂまたはｓｃＦｖを検出または産生するための、請求項１〜１０に記載の本発明の抗原の使用を含む。
【００６７】
こうして産生されるエンテロコッカス・フェカリス菌および／またはエンテロコッカス・フェシウム菌に対する抗体および／または抗体フラグメントは、特にエンテロコッカス菌抗原に対する受動的免疫療法または感染予防に使用することを目的としている。
【００６８】
本発明の抗体または抗体フラグメント、具体的にはＦａｂまたはｓｃＦｖは、例えば抗体または抗体フラグメントの産生に十分な量の本発明の抗原を、動物、特に哺乳動物に投与することを含む方法によって調製できる。
【００６９】
本発明のポリクローナル抗体を調製するには、まず目的の抗体にあった本発明の抗原を選択して産生する。これは種々の方法によって実施できる。例えばエンテロコッカス・フェカリス菌および／またはエンテロコッカス・フェシウム菌より抗原を単離するか、該抗原をｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成するか、または遺伝子組換えを用いて例えば微生物で産生するなどの方法が挙げられる。次いで、得られた抗原を動物に投与すると、動物の体内で免疫系が働き、この抗原に対する抗体が産生される。抗体産生に好適な動物は、特にマウス、ラットおよびウサギであるが、またヤギ、ヒツジおよびウマを用いることも可能である。免疫を数回繰り返して行うことが好ましい。数週間後、抗体産生に用いた動物の血液または血清からポリクローナル抗体を回収する。
【００７０】
モノクローナル抗体は、上述したポリクローナル抗体と同様の方法で産生することができる。具体的には、まず、動物、好ましくはマウスおよび／またはラットを免疫した後、脾臓またはリンパ節から形質細胞を得る。この形質細胞を腫瘍細胞株と融合して、「ハイブリドーマ細胞株」を作製することができる。このハイブリドーマ細胞株は、理論的には、不死の細胞で１種類のモノクローナル抗体を産生する。この細胞の培養上清から、モノクローナル抗体を単離することができる。
【００７１】
本発明の別の実施形態は、本発明の抗体またはそのフラグメント、具体的にはＦａｂまたはｓｃＦｖを遺伝子組換えで産生する方法である。該方法は、前記抗体またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列を発現ベクターへクローニングした後、このコンストラクトを用いて細胞、具体的には大腸菌、酵母菌または真核細胞（例えばＣＨＯ細胞）を形質転換して組換え抗体または組換え抗体フラグメントを発現させることを含む。
【００７２】
このような方法で得られる組換え抗体は、本発明の抗体と構造的に同等であることを特徴とする。同様に、本発明の組換え抗体フラグメント、具体的にはＦａｂまたはｓｃＦｖは、精製して得られる天然の本発明の抗体フラグメントと同等である。
【００７３】
本発明の組換え抗体および組換え抗体フラグメントは、複雑な技術や抗体産生用の動物を用いなくても大量に産生できるという点が特に好都合である。また、極めて高純度な抗体を調製することが可能であるとともに、血液との直接接触やそれに関連した感染のリスクを回避できる。
【００７４】
本発明で開示された範囲を逸脱せずに、本明細書に例を用いて記載された本発明の実施形態を適宜組み合わせることが可能であることは当業者にとって自明である。
【００７５】
さらに、本明細書に記載の全ての引用文献の内容は、すべて参考として本明細書において援用する。
【００７６】
各々の例示的な実施形態に関する記述および図面より、上記以外の本発明の利点および実施形態は自明である。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】Ｅ．フェカリス菌５型株の莢膜多糖体のプロトン核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ  ＮＭＲスペクトル）を示す。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、６００ＭＨｚ、２７℃で測定した。文字は、図３に示す糖残基を表す。アラビア数字は、糖残基に存在するプロトンの番号を表す。ＬＡは乳酸を表す。
【図２】Ｅ．フェカリス菌５型株の莢膜多糖体のＲＯＥＳＹスペクトルのセクションを示す。ＲＯＥＳＹスペクトルは、６００ＭＨｚ、２７℃で測定した。文字は、図３に示す糖残基を表す。アラビア数字は、糖残基に存在するプロトンの番号を表す。糖残基間のＮＯＥ相関を下線とイタリック体で示す。
【図３】Ｅ．フェカリス菌５型株の莢膜多糖体の繰り返し単位の化学構造を示す。ＬＡは乳酸を表す。Ｇａｌｆ基はＤ体とする。
【図４】Ｅ．フェカリス菌５型株の菌体とウサギ抗血清との結合実験結果を示す。使用した抗原を凡例に示す。図中の数値はそれぞれ、少なくとも２回の測定の平均値を示す。
【図５】ウサギ抗血清のＥ．フェカリス菌５型株菌体に対するオプソニン作用における阻害実験結果を示す。抗血清はすべて、１：２００に希釈して使用した。使用した阻害剤を凡例に示す。図中のデータは、少なくとも４回の測定値の平均値を示し、エラーバーはＳＥＭを示す。阻害剤非存在下では、すべての抗血清のオプソニン活性は７０％を上回った。
【図６】Ｅ．フェカリス菌２型株および５型株の莢膜多糖体に対するウサギ抗体と、それぞれに対応する精製抗原との結合実験結果を示す。
【図７】精製抗血清のＥ．フェカリス菌２型株に対するオプソニン化貪食作用による殺菌率を示す。図中の数値より、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、ウサギで産生された防御抗体の作用によって、最終的に菌が殺滅することが明確に示された。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００７８】
オプソニン化貪食作用によるエンテロコッカス・フェカリス菌（以下、Ｅ．フェカリス菌と略記することもある）の排除は、特に細胞壁および細菌莢膜の糖鎖抗原に対する抗体を介して行われる。最近、リポテイコ酸（ＬＴＡ）が、Ｅ．フェカリス菌株１２０３０に対するオプソニン抗体の標的抗原として同定された。しかし、精製ＬＴＡに対して作製された抗血清は、血清型ＣＰＳ−ＣおよびＣＰＳ−Ｄの菌株に対する殺菌力はない。
【００７９】
本発明の実施例は、菌体の細胞壁を酵素で分解し、ゲル浸透クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーを行うことにより、ＣＰＳ−Ｄ型株であるＥ．フェカリス菌５型株から新規莢膜多糖体を単離することを含む。
【００８０】
次いで、単離した多糖体を、糖分析や、１Ｈや１３Ｃを観測する、同種核または異種核の一次元または二次元ＮＭＲ測定により分析する。
【００８１】
そして、繰り返し単位に、通常とは異なる、→６）−３−Ｏ−［１−カルボキシエチル］−β−Ｇａｌｆ−（１→、という単位を含有する新規Ｅ．フェカリス菌莢膜多糖体を同定する。
【００８２】
熱失活したＥ．フェカリス菌５型株菌体を用いてウサギに免疫を行ったところ、得られたウサギ抗血清は、該菌株の新規莢膜多糖体に対する特異的な抗体、および同菌株のＬＴＡに対する抗体をいずれも含んでいた。
【００８３】
しかし、この抗血清のＥ．フェカリス菌５型株に対するオプソニン作用は、ＬＴＡでは阻害されず、精製した上述の多糖体によってのみ阻害された。
【００８４】
以上より、本実施例は、Ｅ．フェカリス菌５型株の新規莢膜多糖体を、免疫原性を有するオプソニン抗体の標的抗原として同定する方法の可能性を示す。
【００８５】
さらに本実施例は、Ｅ．フェカリス菌由来抗原の免疫原性の有無を調べる方法を示す。
【実施例２】
【００８６】
２ａ）  菌株およびその培養
ＣＰＳ−Ｄ型株であるＥ．フェカリス菌５型株（Ｍａｅｋａｗａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３６：６７１−６８１，１９９２）から、最近報告された血清型分類法（Ｈｕｆｎａｇｅｌ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：２５４８−２５５７，２００４）を用いて莢膜多糖体を単離した。菌体は、スタータカルチャーを１％グルコース含有コロンビア培養液（Ｃｏｌｕｍｂｉａ  ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ，ＵＳＡ）で３７℃、２時間撹拌せずに培養することにより得られた。
【００８７】
２ｂ）  抗血清
Ｅ．フェカリス菌５型株の完全な菌体に対する抗血清については過去に記載がある（Ｈｕｆｎａｇｅｌ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：２５４８−２５５７，２００４）。菌株１２０３０から精製したＬＴＡを用いて、過去の報告（Ｔｈｅｉｌａｃｋｅｒ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７４，２００６）の記載通りにＬＴＡに対する抗血清を作製した。まず、雌性ニュージーランド白ウサギに、１００μｇのＬＴＡを完全フロイントアジュバントで懸濁した液を皮下注射して免疫を行った。次いで７日後、同量のＬＴＡを不完全フロイントアジュバントで懸濁した液で同様に免疫を行い、さらに翌週、３日ごとに１０μｇの追加免疫を行った。
【００８８】
２ｃ）  莢膜多糖体の調製およびその特性
Ｅ．フェカリス菌のＬＴＡを、過去の報告（Ｈｕｅｂｎｅｒ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：１２１３−１２１９，１９９９；Ｔｈｅｉｌａｃｋｅｒ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７４，２００６）の記載通りに単離した。本明細書に記載の抗原を以下の通り調製した。簡単に述べると、遠心分離によって菌体を回収し、これにムタノリジンおよびリゾチーム（それぞれ１００ｐｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、それぞれ５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２および０．０５％  ＮａＮ３含有ＰＢＳに溶解）を加えて３７℃で１８時間反応させ、菌体を消化した。遠心分離によって不溶性物質を除去し、上清をヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅＩおよびＲＮａｓｅＡ、１００ｐｇ／ｍｌ）で３７℃、４時間処理した。続いて、プロテナーゼＫ（１００ｐｇ／ｍｌ）を加えて５６℃で１８時間処理した（試薬はいずれもＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製である）。上清にエタノール（最終容量８０％）を加え、得られた沈殿を遠心分離によって回収した。透析外液に脱イオン化水を使用して透析した後、得られた物質を凍結乾燥した。ゲル浸透クロマトグラフィー用に、上記物質を０．０１Ｍ炭酸水素アンモニウム緩衝液に溶解し、これをＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００カラム（１．６×９０ｃｍ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）にロードした。Ｋａｖ値が約０．４５の溶出画分をまとめて透析し、凍結乾燥した。得られた物質を２０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．４）で再懸濁し、陰イオン交換カラム（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｑ  ＦＦ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。ＮａＣｌの直線濃度勾配をかけて、カラムに結合している抗原を溶出した。多糖体を含む画分を、Ｄｕｂｏｉｓアッセイ（Ｄｕｂｏｉｓ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２８：３５０−３５６，１９５６．）および５型株に対するウサギ免疫血清を用いたイムノブロッティング法により同定した。４５０ｍＭ  ＮａＣｌで溶出され免疫反応を示した物質をまとめて透析し、凍結乾燥した。最終精製工程として、１．５×７５ｃｍのＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−４０（Ｔｏｓｏｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）カラムを用いてゲル浸透クロマトグラフィーを行った。次いで、泳動バッファーとしてＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、１０％ビス−トリスゲルを用いてＳＤＳ  ＰＡＧＥを行った後、付属の製品マニュアルに従ってクマシー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）染色およびＰＡＳ（Ｓｉｇｍａ）染色を行うことにより、単離した物質の純度を求めた。
【００８９】
さらに、ＳＤＳ  ＰＡＧＥで分離した物質に対して、５型株に対するウサギ抗血清を用いてウェスタンブロット染色を行った。
【００９０】
２ｄ）莢膜多糖体の精製結果
Ｅ．フェカリス菌５型株のペプチドグリカンを酵素で消化して、菌体から莢膜多糖体を分離した。目的の抽出物は、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００ゲル浸透クロマトグラフィーによって、糖鎖を含む２つの画分として溶出された。第１の画分は、ボイド容量で溶出した画分で、１Ｈ  ＮＭＲ分析（データ示さず）によってＬＴＡを含むことがわかった。容量の大きい第２の画分は、Ｋａｖ値が約０．４５の溶出画分で、これをさらにＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。４５０ｍＭ  ＮａＣｌの時点で、免疫反応を示す少量の物質が溶出した。この物質は、グルコースとガラクトースのみを含んでおり、これをＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−４０Ｓを用いたゲル浸透クロマトグラフィーに供した。その後、さらに分析を行った。この精製物質に対してＳＤＳ  ＰＡＧＥを行ったところ、１００ｋＤａの位置に１つのブロードなバンドが検出された。このバンドは、ＰＡＳで染色されたが、クマシーでは染色されなかった。同様に、５型株に対する抗血清で染色したウェスタンブロットにおいても、１００ｋＤａの位置に１つのブロードなバンドが検出され、それ以外のバンドは存在しなかった（データ示さず）。
【実施例３】
【００９１】
ＬＴＡの調製
過去の報告（Ｔｈｅｉｌａｃｋｅｒ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７４，２００６）の記載通りに、ブタノール抽出と疎水性相互作用クロマトグラフィーによってＬＴＡを調製した。調製したＬＴＡの純度は、完全な菌体に対するＬＴＡの抗血清（上記参照）を用いて、ＳＤＳ  ＰＡＧＥとウェスタンブロット分析によって評価した。
また、最近の報告（Ｔｈｅｉｌａｃｋｅｒ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７４，２００６）の記載通りにＮＭＲ測定を行い、ＬＴＡと構造が一致することを確認した。
【００９２】
一般分析手法
２Ｍトリフルオロ酢酸を用いて、１２０℃で３時間加水分解を行った。次いで、単糖をアルジトール酢酸に変換し、ＳＰＢ−５カラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５ｐｍ，Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を装着したＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ５８９０クロマトグラフを用いてＧＣ分析を行った。１５０℃を３分保持した後、毎分３℃の速度で３００℃まで昇温させる温度プログラムを使用した。
また、過去の報告（Ｈａｓｅｌｅｙ，Ｓ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４４：７６１−７６６，１９９７；Ｌｅｏｎｔｅｉｎ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂ．Ｒｅｓ．６２：３５９−３６２，１９７８）の記載通りに、糖残基の絶対配置を決定した。
【００９３】
ＮＭＲ測定
試料を９９．０％の２Ｈ２Ｏで３回置換した後凍結乾燥し、９９．９％の２Ｈ２Ｏに再度分散した。一次元および二次元のスペクトルはすべて、Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ  Ａｖａｎｃｅ  ６００ＭＨｚスペクトロメータ（動作周波数：１Ｈ  ＮＭＲでは６００．３１ＭＨｚ、１３Ｃ  ＮＭＲでは１５０．９６ＭＨｚ）と慣用のＢｒｕｋｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｒｕｋｅｒ，Ｒｈｅｉｎｓｔｅｔｔｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２７℃で測定したものである。化学シフト値は、アセトン（δＨ  ２．２２５；δＣ  ３１．４５）を基準としたものである。相関分光法（ＣＯＳＹ）、全相関分光法（ＴＯＣＳＹ）、およびＲＯＥＳＹは、４０９６×５１２データポイントを含むデータシート（ｔ１×ｔ２）を用い、３２回スキャンして測定した。
【００９４】
ＴＯＣＳＹおよびＲＯＥＳＹの測定は、Ｓｔａｔｅｓらの方法に従って位相検波法を用いて行った。ＴＯＣＳＹは、混合時間１００ｍｓで行った（Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．４８：２８６−２９２，１９８２）。１Ｈと１３Ｃの相関は、多量子コヒーレンス（ＨＭＱＣ）による１Ｈ検出モードで測定して求めた。１３Ｃのドメイン中のプロトンをデカップルし、２０４８×２５６データポイントを含むデータシートを用いて、ｔ１の各値に対して１２８回スキャンを行い測定した（Ｂａｘ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：２０９３−２０９４，１９８６；Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０８：４２８５−４２９４，１９８６）。
【００９５】
化学分析およびＮＭＲ測定
精製多糖体の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（図１）では、低磁場領域において、２つのアノメリックシグナルがδ５．３１５（Ａ基、［３ＪＨ１，Ｈ２＜２Ｈｚ］）とδ４．５４２（Ｂ基、［３ＪＨ１，Ｈ２＝７．８Ｈｚ］）に観測された。これらのシグナルは、β−Ｇａｌｆとβ−Ｄ−Ｇｌｃｐに帰属すると同定された。さらに、δ１．３６１のダブレットは、乳酸基（ＬＡ）のメチル基に帰属すると同定された（Ｋｎｉｒｅｌ，Ｙ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２５９，１９９４；Ｋｎｉｒｅｌ，Ｙ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２３５：Ｃ１９−２３，１９９２）。Ｄ−Ｇｌｃｐ基の存在は、化学分析、絶対配置決定法、およびＮＭＲ測定データによって確認された。３位の炭素が乳酸で置換されたＧａｌｆ基は、ＮＭＲデータのみから同定された（Ｂｅｙｎｏｎ，Ｌ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５０：１６３−１６７，１９９７；Ｋｎｉｒｅｌ，Ｙ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２５９，１９９４；Ｋｎｉｒｅｌ，Ｙ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２３５：Ｃ１９−２３，１９９２）。Ｅ．フェカリス菌５型株の莢膜多糖体の１Ｈと１３Ｃの化学シフト値（表１）はすべて、１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹおよびＴＯＣＳＹスペクトル、ならびに１Ｈ−１３Ｃ  ＨＭＱＣスペクトルから求めた。
【００９６】
【表１】
0005386361.tif 000004
【００９７】
炭素原子のシグナルが低磁場にシフトしていることから、β−Ｇａｌｆの６位と３位の炭素（Ａ基、δ７１．９０とδ８４．９６）およびβ−Ｄ−Ｇｌｃｐの３位の炭素（Ｂ基、δ８２．４４）に置換基があることがわかった。繰り返し単位内の２つの糖残基の配列順序は、ＲＯＥＳＹの測定結果により決定した。２つの糖残基間で、プロトンＡ１（δ５．３１５）とＢ３（δ３．６６３）との間、およびプロトンＢ１（δ４．５４２）とＡ６ａ（δ３．７６８）との間に強力なＮＯＥ相関が観測された（図２）。以上より、単離した多糖体の繰り返し単位は、図３に示す構造であることが判明した。
【実施例４】
【００９８】
ＥＬＩＳＡ実験
ＥＬＩＳＡ実験を過去の報告（Ｔｈｅｉｌａｃｋｅｒ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７４，２００６）の記載通りに慣用的な方法を用いて行った。簡単に述べると、マイクロタイタープレートをＥ．フェカリス菌由来の種々の糖鎖抗原（１０ｐｇ／ｍｌ、０．０４Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解）でコーティングし、４℃で１８時間静置した。プレートの洗浄は、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０含有ＰＢＳで行った。これらのプレートを、０．０２％アジ化ナトリウム含有ＰＢＳで調製した３％スキムミルクで、３７℃、２時間ブロッキングした。二次抗体としては、ヤギ抗ウサギＩｇＧアルカリホスファターゼ複合体（Ｓｉｇｍａ）を１：１０００に希釈して用い、基質としては、パラニトロフェニルリン酸（Ｓｉｇｍａ）を用いた。３７℃で６０分インキューベーションした後、４０５ｎｍで吸光度を測定した。
【実施例５】
【００９９】
オプソニン活性測定
オプソニン活性測定を過去の報告（Ｔｈｅｉｌａｃｋｅｒ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７４，２００６）の記載通りに行った。補体供給源として、標的菌株で吸着した子ウサギ血清（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｏｒｎｂｙ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を用いた。免疫血清のオプソニン活性を、正常ウサギ血清を含むコントロールと比較した。免疫血清は、使用前に５６℃で３０分間熱失活させた。ネガティブコントロールの試験管は、多形核白血球、補体および血清のいずれも含まなかった。免疫血清のオプソニン活性を以下の通りに算出した。
［１−（免疫血清による９０分後のＣＦＵ／免疫前血清による９０分後のＣＦＵ）］×１００
オプソニン化貪食作用の阻害実験においては、まず１：２００に希釈した抗血清を、０．０８〜１００μｇ／ｍｌの阻害剤とともに４℃で６０分間インキュベートした。インキューベーション後に、吸着済みの血清を加えて、上記と同様にオプソニン活性測定を行った。阻害剤非存在下では、いずれの免疫血清においても、接種原に対するオプソニン活性の最小値は７０％を上回った。
【実施例６】
【０１００】
免疫化学的特性
Ｅ．フェカリス菌５型株（Ｍａｅｋａｗａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：６７１−６８１，１９９２）の菌体に対する抗血清は、上述の精製多糖体に反応した（図４）。またこの抗血清は、Ｅ．フェカリス菌のＬＴＡに対する高濃度のＩｇＧ抗体を含んでいた（図４）。抗ＬＴＡ抗体は、Ｅ．フェカリス菌株１２０３０のオプソニン化貪食作用を媒介するので、Ｅ．フェカリス菌５型株に対するオプソニン抗体の特異性を調べた。精製ＬＴＡは、５型株に対する抗血清のオプソニン活性を阻害しなかった（図５）。これは、Ｅ．フェカリス菌５型株およびＥ．フェカリス菌株１２０３０のそれぞれのオプソニン抗体が交差反応を示さないという所見（Ｈｕｆｎａｇｅｌ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：２５４８−２５５７，２００４）に合致している。一方、上述の精製莢膜多糖体は、５型株に対するオプソニン抗体の作用を強力に阻害した（図５）。また、精製ＬＴＡに対するウサギ抗血清は、オプソニン活性測定において、菌株１２０３０に対するオプソニン化貪食作用を促進するが、５型株に対してはオプソニン作用を示さなかった。これは、我々が行った阻害実験結果（データ示さず）を裏付けるものである。
【実施例７】
【０１０１】
ウサギを用いて、２型株および５型株のそれぞれの多糖体に対する抗体を産生した。雌性ニュージーランド白ウサギに、１００μｇの２型株または５型株の多糖体を完全フロイントアジュバントで懸濁した液を皮下注射して免疫を行った。次いで７日後、同量の上記多糖体を不完全フロイントアジュバントで懸濁した液で同様に免疫を行い、さらに翌週、３日ごとに１０μｇの追加免疫を行った。上記で用いた多糖体は、２ｄ）に記載の方法によって得た。いずれの場合も、２匹のウサギで免疫を行い、抗血清を得た。ウサギから得られた抗血清をＥＬＩＳＡ実験に供した。ＥＬＩＳＡ実験用に、２型株の多糖体および５型株の多糖体をそれぞれマイクロタイタープレートに固定した。その結果、驚いたことに、５型株の精製多糖体と２型株の多糖体のいずれに対しても抗体が産生されていることがわかった。この事実により、この抗原が免疫原性を有することが示されたが、この抗原が「Ｔ細胞非依存性」抗原であるという事実を考慮しても、このような結果が必ずしも予想されたわけではない。図６に上記抗体の結合実験結果を示す。
【実施例８】
【０１０２】
オプソニン活性測定
このインビトロアッセイは、顆粒細胞、抗血清および菌体を組み合わせて、産生された抗体がエンテロコッカス・フェカリス菌を殺滅可能かどうか調べるものである。このアッセイ混合物について、以下に正確に述べる。健康なドナーから採取した新鮮な全血を、ヘパリンデキストラン緩衝液と混合した。次いで、白血球を精製し、所定の細胞数（５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）に調整した。アッセイに用いる菌体は、対数増殖中期に、培養液から遠心分離により回収し、分光光度法により白血球と同様に５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整した。補体供給源として、凍結乾燥した子ウサギ血清を細胞培養液で１：１５に希釈し、これを標的菌株に吸着させて、使用するエンテロコッカス菌株に対する既存抗体を除去したものを用いた。同様にウサギ血清を、実験の慣例に合った細胞培養液で希釈した。実験の実施にあたり、それぞれ、１００μｌの菌体懸濁液、１００μｌの白血球（菌体：白血球比率は１：１）、１００μｌの補体供給源および上記菌体に対応する１００μｌの希釈抗体液を混合した。このアッセイ混合液を希釈してプレート上に植菌し、最初の菌体数を求め、次いで、アッセイ混合液を転倒型回転器で３７℃、９０分間インキュベートした。実験が終了したところで、先と同様に、アッセイ混合液を再び希釈してプレート上に植菌し、翌日コロニー数を数えた。接種原混合時と実験終了時とを比べた際の菌体数の減少率をパーセントで示し、オプソニン作用を介した殺菌率とした。この値は、感染力を有する病原性細菌に対して防御的な免疫反応を示すかどうかを調べる上で、最良の間接的なマーカーである。
【０１０３】
図７に実験結果を示す。実験結果によると、１：５０〜１：２００に希釈した血清は、約８０％の顕著な殺菌率を示したが、さらに血清を希釈するとこのような作用が失われることがわかった。このことは、このような抗原に対する抗体の力価が高ければ、Ｅ．フェカリス菌による感染から生物を防御できることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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