(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ヒトにおいてｈｕＴＮＦＲ１−リガンドの免疫原性応答を低減させることができる１つまたは複数のヒト由来アミノ酸配列と、
（ｉｉ）ｈｕＴＮＦＲ１と選択的に結合することができる１つまたは複数の非ヒト由来アミノ酸配列と
を有するタンパク質構築物を含むｈｕＴＮＦＲ１−リガンドであって、
前記タンパク質構築物が、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号７に記載のアミノ酸配列および軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むか、又はヒト化抗体の断片であって、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖである断片を含む、ｈｕＴＮＦＲ１−リガンド。
【請求項２】
生物学的に許容される化合物との特異的相互作用を可能にするさらなるタグを含む、請求項１に記載のｈｕＴＮＦＲ１−リガンド。
【請求項３】
タンパク質構築物が、翻訳後化学結合または組換え遺伝子技術によってそれと非共有結合したまたはそれと共有結合した、生物学的に許容される化合物をさらに含む、請求項１または２に記載のｈｕＴＮＦＲ１−リガンド。
【請求項４】
生物学的に許容される化合物が、血清タンパク質からなる群から選択される、請求項３に記載のｈｕＴＮＦＲ１−リガンド。
【請求項５】
生物学的に許容される化合物がアルブミンである、請求項３または４に記載のｈｕＴＮＦＲ１−リガンド。
【請求項６】
タンパク質構築物が、配列番号１０に記載のヒト血清アルブミンとの融合タンパク質を含む、請求項３から５のいずれかに記載のｈｕＴＮＦＲ１−リガンド。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載のｈｕＴＮＦＲ１−リガンドをコードしている核酸。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項９】
請求項７に記載の核酸または請求項８に記載のベクターを含む単離宿主細胞。
【請求項１０】
治療上有効な量の請求項１から６のいずれかに記載のｈｕＴＮＦＲ１−リガンドと、必要に応じて、製薬上許容される担体、製薬上許容される塩、補助剤、安定化剤、希釈剤および溶媒、またはその任意の組合せからなる群から選択される１つまたは複数の追加の成分とを含む医薬組成物。
【請求項１１】
関節リウマチ、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎ならびに他の慢性炎症性および／または自己免疫疾患、急性の劇症のウイルスまたは細菌感染症、代謝性疾患、急性神経変性疾患、好ましくは多発性硬化症、パーキンソン病およびアルツハイマー病から選択される慢性神経変性疾患、好ましくは周期熱症候群およびケルビム症から選択される、ＴＮＦ／ＴＮＦＲ１が原因の病理媒介物質である遺伝性疾患、ならびに癌を治療するための、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
関節リウマチ、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎ならびに他の慢性炎症性および／または自己免疫疾患、急性の劇症のウイルスまたは細菌感染症、代謝性疾患、急性神経変性疾患、好ましくは多発性硬化症、パーキンソン病およびアルツハイマー病から選択される慢性神経変性疾患、好ましくは周期熱症候群およびケルビム症から選択される、ＴＮＦ／ＴＮＦＲ１が原因の病理媒介物質である遺伝性疾患、ならびに癌から選択される疾患に罹患している患者を治療するための医薬品の調製のための請求項１から６のいずれかに記載のｈｕＴＮＦＲ１−リガンドの使用。
【請求項１３】
人間に投与した場合に免疫原性応答が低減するｈｕＴＮＦＲ１−リガンドを産生する方法であって、
（ａ）請求項１から６のいずれか一項に記載のタンパク質構築物を提供するステップと、
（ｂ）タンパク質構築物のアミノ酸配列のうちの１つまたは複数をマトリックスとして使用した誘導選択によって、ｈｕＴＮＦＲ１と選択的に結合することができる１つまたは複数のヒト由来アミノ酸配列を同定するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で同定したアミノ酸配列のうちの少なくとも１つまたは複数を含むリガンドを構築するステップと
を含む方法。
【請求項１４】
ヒト由来アミノ酸配列のみを含む別の低免疫原性ｈｕＴＮＦＲ１−リガンドの同定および構築における誘導選択のマトリックスとしての、請求項１から６のいずれか一項に記載のタンパク質構築物を含むｈｕＴＮＦＲ１−リガンドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト腫瘍壊死因子１型受容体（ｈｕＴＮＦＲ１）と特異的に結合するリガンドであって、人間においてリガンドの免疫原性応答を低減させることができる１つまたは複数のヒト由来アミノ酸配列と、ｈｕＴＮＦＲ１と選択的に結合することができる１つまたは複数のアミノ酸配列とを含むリガンドに関する。本発明はさらに、前記リガンドをコードしている核酸、およびｈｕＴＮＦＲ１に関係する障害を治療するための医薬組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＮＦは、炎症およびアポトーシスを調節する主要なサイトカインである。細胞種および環境状況に応じて、ＴＮＦは、相反する効果、すなわち免疫刺激または免疫抑制を有することができ、また、ＴＮＦはアポトーシスおよびアポトーシス耐性を媒介することができる（Ｌｏｃｋｓｌｅｙ他、Ｃｅｌｌ、２００１年、第１０４号、４８７〜５０１頁；Ａｇｇａｒｗａｌ  Ｂ．Ｂ．、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００３年、第３号、７４５〜７５６頁）。ヒトにおいて、ＴＮＦは自然免疫系および炎症反応の機能を全体的に調節する重要なサイトカインであるが、いくつかの慢性および急性疾患の中心的な病原性媒介物質としても認識されている。具体的には、関節リウマチ（ＲＡ）、クローン病および潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患、乾癬、ならびにそれぞれＴＮＦおよびＴＮＦＲ１の過剰発現に関連するケルビム症および周期熱症候群などのいくつかの稀な遺伝性疾患（Ｃｈａｔｚａｎｔｏｎｉ  Ｋ、Ｍｏｕｚａｋｉ  Ａ．、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２００６年、第６号、１７０７〜１７１４頁；Ｕｅｋｉ他、Ｃｅｌｌ、２００７年、第１２８号、７１〜８３頁；Ｓｉｍｏｎ  Ａ．、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｅｒ  Ｊ．Ｗ．、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｇｕｌ．Ｉｎｔｅｇｒ．Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００７年、第２９２号、Ｒ８６〜Ｒ９８頁）では、ＴＮＦ系は病理学的に関連性のある媒介物質として同定されている。いわゆるサイトカイン症候群をもたらす劇症のウイルスまたは細菌感染症ではＴＮＦが決定的に関連していることが知られており、敗血症性ショックおよび多臓器不全の媒介物質としてのその重大な役割は十分に記載されている。ＴＮＦはまた、いくつかの他の疾患、特に肥満症および２型糖尿病を含めた代謝性疾患（Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ  Ｇ．Ｓ．、Ｎａｔｕｒｅ、２００６年、第４４４号、８６０〜８６７頁；Ｓｔｏｒｚ他、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、１９９８年、第４４０号、４１〜４５頁）ならびにいくつかの形態の肝炎（Ｋｕｓｔｅｒｓ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７年、第２７号、２８７０〜２８７５頁）にも関連づけられている。さらに、ＴＮＦは、特定の癌の局所的治療においてその治療活性が知られているにもかかわらず、他の悪性疾患において、恐らくはＮＦ−κＢ媒介性のアポトーシス耐性および他の生存経路を介する腫瘍促進因子とみなされている（Ｌｕｏ他、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２００４年、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｗｏｔａ、１３５〜１５９頁）。したがって、臨床治験では、特定の血液悪性疾患（例えばＡＭＬ）の治療レジメンとしての抗ＴＮＦ戦略も現在開発中である。機構的観点からは、ＴＮＦＲノックアウトマウスを含めた数々のモデルにおいて、ＴＮＦＲ１がＴＮＦの病理学的表現型の主要な媒介物質であることが実証されている（Ｌｏｃｋｓｌｅｙ他、Ｃｅｌｌ、２００１年、第１０４号、４８７〜５０１頁；Ａｇｇａｒｗａｌ他、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００３年、第３号、７４５〜７５６頁）。
【０００３】
いくつかの慢性炎症性疾患では、ＴＮＦ中和試薬、具体的には抗ＴＮＦ抗体および可溶性ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質が臨床的に幅広く適用されている。ＴＮＦ作用と干渉する３つの薬物が認可されている：Ｒｅｍｉｃａｄｅ（ＶｉｌｃｅｋおよびＦｅｌｄｍａｎｎ、２００４年）（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ／Ｔａｎａｂｅ）、Ｅｎｂｒｅｌ（Ｉｍｍｕｎｅｘ／Ｗｙｅｔｈ）およびＨｕｍｉｒａ（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ／Ａｂｂｏｔｔ）。これらの薬物はすべて、ＴＮＦ自体を標的とする。薬物は、関節リウマチ（ＲＡ）、若年性ＲＡ、乾癬性関節炎、クローン病および強直性脊椎炎の治療に認可されている。ＴＮＦを標的とする薬物はＲＡに対して大きな成功を示しているが、治療効果は限定された期間のみであり、一部の患者は抗ＴＮＦ抗体の治療に対して先天的に不応性であるか、または耐性を発生する。さらに、例えばクローン病におけるヒト化ＴＮＦ特異的モノクローナル抗体であるＣＤＰ５７１を用いた臨床治験の結果は、予想よりも有望性が確実に低く、ＴＮＦ／ＴＮＦＲ系を標的とする新しい概念および試薬の開発が要求されている。
【０００４】
予想される全身的な免疫抑制の他に、認可された抗ＴＮＦ薬は、抗ｄｓＤＮＡ抗体の産生、ループスおよび神経炎症性疾患などの副作用もさらに示す。全身的なＴＮＦ遮断下にある患者の免疫抑制状態は、共生生物を含めた感染症の危険性の増加に関連している。「Ｌｅｎｅｒｃｅｒｐｔ  ｓｔｕｄｙ」（１９９９年）では、疾患状態が改善ではなく悪化したため、ＭＳを治療するための抗ＴＮＦ剤の臨床治験を中止しなければならなかった。当時は予想外の有害応答であったこのことの機構的背景は、現在ではより明確になっており、ＴＮＦＲ１シグナルが神経細胞死を伝播し、ＴＮＦＲ２シグナルがミエリンシートの再生を活性化するという、この疾患におけるＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２の異なる役割に関連している。全体的に、以下に概要を示すように、ＴＮＦ作用の受容体選択的標的化を目的とする新しい治療戦略が、多くの場合にＴＮＦシグナル伝達の全身的な遮断よりも優位であるべきだという証拠が増えている。例えば、以下に詳述する一部の動物疾患モデルでは、ＴＮＦ作用の矛盾する効果は、明確に異なる受容体、ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２の異なる機能によって説明される。受容体レベルにおけるＴＮＦの作用の機構に関して得られた知識は、現在実際に、受容体の一方の薬理学的遮断を目的とする新しい治療戦略を開き、したがって、より特異的な効果を潜在的にもたらす。
【０００５】
例えば、網膜虚血は、網膜ニューロンがＴＮＦ誘発性のアポトーシスを受けて盲目を引き起こす糖尿病の合併症である。ＴＮＦＲ２ノックアウトマウスの網膜はアポトーシスの増加を示したが、ＴＮＦＲ１ノックアウトマウスの網膜は野生型と比較して低下したアポトーシスを示した（Ｆｏｎｔａｉｎｅ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２００２年、第２２号、ＲＣ２１６）。
【０００６】
同様に、ＥＡＥは多発性硬化症（ＭＳ）の動物モデルである。これは、ミエリンに対する初期の自己免疫炎症によって特徴づけられている。ミエリン特異的反応は後に鎮静するが、他のエピトープが自己免疫抗原として引き継がれる。ＴＮＦノックアウトマウスが示すミエリンに対する初期の炎症性反応はより弱いが、ミエリン特異的免疫反応は鎮静しない。ＴＮＦＲ１ノックアウトマウスでは、初期の炎症性反応は同等に低下しているが、その後鎮静し、このことは、ＴＮＦＲ２がＴＮＦの長期的免疫抑制性機能を媒介するために十分である一方で、炎症性反応はＴＮＦＲ１によって媒介されることを示している（Ｋａｓｓｉｏｔｉｓ  Ｇ．、Ｋｏｌｌｉａｓ  Ｇ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２００１年、第１９３号、４２７〜４３４頁；Ｋｏｌｌｉａｓ他、Ｃｕｒｒ．Ｄｉｒ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．、２００２年、第５号、３０〜５０頁；Ｏｗｅｎｓ他、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、２００１年、第７号、１６１〜１６６頁）。
【０００７】
同様に、多発性硬化症（ＭＳ）の脱髄／再生期に似ている毒素（クプリゾン）誘発性の可逆的ＣＮＳ脱髄のマウスモデルでは、毒素を取り除いた際の再ミエリン化プロセスがＴＮＦ依存性であり、オリゴデンドロサイト前駆体の増殖および成熟ミエリンシートへと分化してオリゴデンドロサイトを形成することを始動するＴＮＦＲ２シグナル伝達が選択的に必要であるという、説得力のある証拠が存在する（Ａｒｎｅｔｔ他、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２００１年、第４号、１１１６〜１１２２頁）。オリゴデンドロサイト再生のＴＮＦ依存性に関するこれらの発見は、ＭＳに罹患しているヒトにおける状況を反映している。ＴＮＦＲ１−Ｆｃ融合タンパク質を用いてＭＳにおける完全なＴＮＦ遮断を目的とする臨床治験では、ＴＮＦの遮断は、治療上の利点ではなく疾患の悪化に関連しており、これは上述の動物モデルの結果と一致している。
【０００８】
さらに、例えばマウスの皮質ニューロンは、神経伝達物質グルタミン酸によってＮＭＤＡ受容体を明白に始動させた際に、興奮毒性死で死滅した。グルタミン酸は、脳卒中で起こるものなどの虚血状態（酸素欠乏）の際に、死滅する組織から放出される。ニューロンの初代培養は、Ｐ１３Ｋ−ＡＫＴ−ＮＦ−κＢ経路に関与するＴＮＦＲ２依存性の様式で、興奮毒性死に対して完全に耐性であるように作製することができる。対照的に、ＴＮＦＲ１シグナルはグルタミン酸誘発性の細胞死を増大し（Ｍａｒｃｈｅｔｔｉ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００４年、第２７９号、３２８６９〜３２８８１頁）、これは、ＣＮＳにおけるＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２の異なる役割を示している。
【０００９】
したがって、急性および慢性両方の神経変性、網膜虚血、脳卒中モデルならびに多発性硬化症の様々なモデルにおいて、ＴＮＦの完全な遮断は明らかな治療効果は有さず、むしろ直接的に有害であるか、または患部組織の再生能力を低下させる。したがって、炎症性ＴＮＦＲであるＴＮＦＲ１の特異的遮断およびＴＮＦＲ２機能の維持が、これらの疾患の有望な治療手法を表す。
【００１０】
同様に、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、ならびにそれぞれＴＮＦおよびＴＮＦＲ１の過剰発現に関連するケルビム症および周期熱症候群などのより稀な遺伝性疾患のいずれにおいても、ＴＮＦＲ１は、病理学的に関連性のある受容体としてみなされているか、または明白にそのように同定されている。ＴＮＦＲ１および２の異なる役割は、患者の一部分のみが抗ＴＮＦ治療学に応答するクローン病およびＳＬＥ（Ｋｏｍａｔａ他、Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ、１９９９年、第５３号、５２７〜５３３頁）においても明らかとなり、それぞれ治療に対する耐性および疾患罹患率が、どちらもＴＮＦＲ２の突然変異（複数可）に関連している。
【００１１】
したがって、ＴＮＦＲ１を標的とするために受容体選択的抗体を使用することが、これらの慢性炎症性疾患における確立された抗ＴＮＦ戦略の代替方法を表す。これは、治療サイクルを繰り返した際に抗ＴＮＦ試薬に対して不応性となる患者において、特に関連度が高いと考えられる。さらに、全体的かつ継続的なＴＮＦの遮断が自然免疫および獲得免疫の応答の機能不全に関連しているため、感染症による合併症の危険性はこれらの患者において相当に増加している。ＴＮＦＲ１との選択的干渉がＴＮＦＲ２を介したＴＮＦ応答を維持し、このことは、患者の全体的な免疫能にとって利点となるであろう。
【００１２】
強力な治療レジメンとしての選択的ＴＮＦＲ１遮断の裏付けは、ヒトＴＮＦＲ１に特異的な拮抗性マウスモノクローナル抗体（ｍａｂ）Ｈ３９８のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ機能の、本発明者らの以前の研究による（Ｔｈｏｍａ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９０年、第１７２号、１０１９〜１０２３頁；Ｇｒｅｌｌ他、Ｃｅｌｌ、１９９５年、第８３号、７９３〜８０２頁；Ｍｏｏｓｍａｙｅｒ他、Ｔｈｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９５年、第２号、３１〜４０頁）。このマウス抗体およびその組換えマウスｓｃＦｖ誘導体は、ＴＮＦとヒトＴＮＦＲ１との結合の競合的阻害によって、広範囲のＴＮＦ活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで中和することができる。ｍａｂは、ヒヒにおける細菌誘導性致死的ショック症候群の予防に有効であることが示され、Ｈ３９８がこの種のＴＮＦＲ１と交差反応性を示す。ＴＮＦ依存性の慢性疾患における抗体Ｈ３９８の治療上の有効性は、抗体がマウス由来であり、治療サイクルを繰り返した際にマウス抗体に対する急性の有害反応および／または免疫応答の急速な発生の危険性があるため、臨床治験で評価することができない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｌｏｃｋｓｌｅｙ他、Ｃｅｌｌ、２００１年、第１０４号、４８７〜５０１頁
【非特許文献２】Ａｇｇａｒｗａｌ  Ｂ．Ｂ．、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００３年、第３号、７４５〜７５６頁
【非特許文献３】Ｃｈａｔｚａｎｔｏｎｉ  Ｋ、Ｍｏｕｚａｋｉ  Ａ．、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２００６年、第６号、１７０７〜１７１４頁
【非特許文献４】Ｕｅｋｉ他、Ｃｅｌｌ、２００７年、第１２８号、７１〜８３頁
【非特許文献５】Ｓｉｍｏｎ  Ａ．、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｅｒ  Ｊ．Ｗ．、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｇｕｌ．Ｉｎｔｅｇｒ．Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００７年、第２９２号、Ｒ８６〜Ｒ９８頁
【非特許文献６】Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ  Ｇ．Ｓ．、Ｎａｔｕｒｅ、２００６年、第４４４号、８６０〜８６７頁
【非特許文献７】Ｓｔｏｒｚ他、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、１９９８年、第４４０号、４１〜４５頁
【非特許文献８】Ｋｕｓｔｅｒｓ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７年、第２７号、２８７０〜２８７５頁
【非特許文献９】Ｌｕｏ他、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２００４年、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｗｏｔａ、１３５〜１５９頁
【非特許文献１０】ＶｉｌｃｅｋおよびＦｅｌｄｍａｎｎ、２００４年
【非特許文献１１】「Ｌｅｎｅｒｃｅｒｐｔ  ｓｔｕｄｙ」（１９９９年）
【非特許文献１２】Ｆｏｎｔａｉｎｅ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２００２年、第２２号、ＲＣ２１６
【非特許文献１３】Ｋａｓｓｉｏｔｉｓ  Ｇ．、Ｋｏｌｌｉａｓ  Ｇ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２００１年、第１９３号、４２７〜４３４頁
【非特許文献１４】Ｋｏｌｌｉａｓ他、Ｃｕｒｒ．Ｄｉｒ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．、２００２年、第５号、３０〜５０頁
【非特許文献１５】Ｏｗｅｎｓ他、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、２００１年、第７号、１６１〜１６６頁
【非特許文献１６】Ａｒｎｅｔｔ他、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２００１年、第４号、１１１６〜１１２２頁
【非特許文献１７】Ｍａｒｃｈｅｔｔｉ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００４年、第２７９号、３２８６９〜３２８８１頁
【非特許文献１８】Ｋｏｍａｔａ他、Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ、１９９９年、第５３号、５２７〜５３３頁
【非特許文献１９】Ｔｈｏｍａ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９０年、第１７２号、１０１９〜１０２３頁
【非特許文献２０】Ｇｒｅｌｌ他、Ｃｅｌｌ、１９９５年、第８３号、７９３〜８０２頁
【非特許文献２１】Ｍｏｏｓｍａｙｅｒ他、Ｔｈｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９５年、第２号、３１〜４０頁
【非特許文献２２】Ｊｏｎｅｓ他、１９８６年、Ｎａｔｕｒｅ、３２１、５２２〜５２５頁
【非特許文献２３】Ｋａｓｈｍｉｒｉ他、２００５年、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６、２５〜３４頁
【非特許文献２４】Ｒｏｇｕｓｋａ他、１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１、９６９〜９７３頁
【非特許文献２５】Ｈｗａｎｇ他、２００５年、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６、３５〜４２頁
【非特許文献２６】Ｈｅｌｌｅｎｄｏｒｎ他、２００４年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、４（補遺Ｉ）、２０頁
【非特許文献２７】Ｂｏａｄｏ他、２００７年、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．、印刷前の電子出版
【非特許文献２８】Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９年
【非特許文献２９】Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ他、１９９７年
【非特許文献３０】Ｕｒｌａｕｂ他、１９８３年
【非特許文献３１】Ｊｅｓｐｅｒｓ他、１９９４年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
【非特許文献３２】ＷｈｉｔｅｌｅｇｇおよびＲｅｅｓ、２０００年、ＷＡＭ−ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｗｅｂ．Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１３、８１９〜８２４頁
【非特許文献３３】ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／
【非特許文献３４】Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  Ｓ．、Ｊｏｎｅｓ  Ｔ．、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ａ  ｌａｂ  ｍａｎｕａｌ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、２００１年、５６７〜５９０頁
【非特許文献３５】Ｌｏ  Ｂ．Ｋ．Ｃ．、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２００４年、１３５〜１５９頁
【非特許文献３６】Ｍａｒｔｉｎ  Ａ．Ｃ．Ｒ．、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ａ  ｌａｂ  ｍａｎｕａｌ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、２００１年、４２２〜４３９頁
【非特許文献３７】Ｍａｒｔｉｎ  Ａ．Ｃ．Ｒ．、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ａ  ｌａｂ  ｍａｎｕａｌ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、２００１年、５６７〜５９０頁
【非特許文献３８】Ｇｒｅｌｌ他、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１９９９年、第１８号、３０３４〜３０４３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、患者においてＴＮＦ拮抗剤としてヒトＴＮＦＲ１（ｈｕＴＮＦＲ１）と有効かつ特異的に相互作用し、人間に投与した際に免疫原性応答が低減する（すなわち耐性になる）新規物質の必要性が存在する。
【００１５】
したがって、本発明の根底にある技術的問題は、様々なＴＮＦ媒介性障害を治療するための治療剤として人間における適用に適したＴＮＦ作用の拮抗剤としての新規の低免疫原性ｈｕＴＮＦＲ１−リガンドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明によれば、上述の問題は、（ｉ）ヒトにおいて前記ｈｕＴＮＦＲ１−リガンドの免疫原性応答を低減させることができる１つまたは複数のヒト由来アミノ酸配列と、（ｉｉ）ｈｕＴＮＦＲ１と選択的に結合することができる１つまたは複数の非ヒト由来アミノ酸配列とを有するタンパク質構築物を含むｈｕＴＮＦＲ１−リガンドを提供することによって解決される。
【００１７】
本明細書中では、用語「ｈｕＴＮＦＲ１−リガンド」とは、ヒトＴＮＦ１型受容体（ｈｕＴＮＦＲ１）と選択的に結合することができ、同時に、人間に投与した場合に低減された免疫原性応答を示す、任意の分子または分子群を意味する。ｈｕＴＮＦＲ１と結合することによって、前記ｈｕＴＮＦＲ１−リガンドは、ＴＮＦおよびとりわけＴＮＦＲ１の天然リガンドであるリンフォトキシンα（ＬＴα）に対する拮抗剤として作用する。
【００１８】
本明細書中で使用する用語「ｈｕＴＮＦＲ１」は、ヒトＴＮＦ１型受容体自体に関連するだけでなく、ｈｕＴＮＦＲ１に構造的および／または機能的に関連する、その任意の一部分または任意の他の受容体も含まれる。
【００１９】
表現「低減された免疫原性応答」とは、もっぱら非ヒト由来アミノ酸配列だけを含むｈｕＴＮＦＲ１−リガンドの免疫原性応答と比較して低減された免疫原性応答を意味する。もっぱら非ヒト由来アミノ酸配列だけを含むｈｕＴＮＦＲ１−リガンドの例には、げっ歯類由来などの非ヒト哺乳動物由来のペプチド、タンパク質および核酸、例えばマウス抗体が含まれる。
【００２０】
本明細書中で使用する表現「タンパク質構築物」は、特に限定されず、１つまたは複数のペプチド結合、好ましくはペプチド配列を含み、ｈｕＴＮＦＲ１と結合する一方で、人間において低減された免疫原性応答を示す、任意の分子または分子群を意味する。本発明によるタンパク質構築物は、核酸ならびに糖または脂肪酸などの有機および無機化合物をさらに含み得る。さらに、タンパク質構築物は、融合タンパク質などの、共有または非共有結合によって独立して会合している分子群を含み得る。本発明の別の実施形態によれば、タンパク質構築物は、さらなる分子、例えば、ポリエチレングリコールまたはメトキシポリエチレングリコールとさらにカップリングしていてもよく、すなわち、ＰＥＧ化されていてもよい。
【００２１】
本発明によるｈｕＴＮＦＲ１−リガンドおよび／またはタンパク質構築物は、例えば、適切なプラスミドまたはベクターの構築および微生物もしくは任意の高等生物中での発現を含む組換え方法、または固相ペプチド合成などの自動ペプチド合成などの、当業者に知られている任意の適切な方法によって産生し得る。
【００２２】
本明細書中で使用する表現「ヒト由来アミノ酸配列」とは、人体内で見つけることができるアミノ酸配列を意味する。しかし、この表現は、厳密に人体内で見つけることができるアミノ酸配列だけには限定されず、ヒトアミノ酸配列と５０％以上の類似度を有するアミノ酸配列も含まれる。ヒト由来アミノ酸配列の具体的な例は、ヒト抗体に含まれるアミノ酸配列またはその断片である。
【００２３】
さらに、本明細書中で使用する表現「非ヒト由来アミノ酸配列」とは、非ヒト哺乳動物などの非ヒト動物中で見つけることができる任意のアミノ酸配列を意味する。例えば、非ヒト由来アミノ酸配列は、非ヒト抗体、例えばマウス抗体の配列であり得る。
【００２４】
本発明のタンパク質構築物では、例えば患者における免疫原性の危険性を低下させるヒト由来アミノ酸配列の利点を、例えばマウス抗体Ｈ３９８で見つかるものなどの、非ヒト由来アミノ酸配列のｈｕＴＮＦＲ１に対する選択性と組み合わせる。
【００２５】
上記に定義したｈｕＴＮＦＲ１−リガンドの別の実施形態によれば、タンパク質構築物は、ヒト化抗体または少なくとも１つのその断片を含む。
【００２６】
本明細書中で使用する用語「抗体」とは、抗体を、人間に対する免疫原性応答が低減した状態で人間に投与することができる限りは、天然抗体、突然変異抗体および（半）合成抗体を含めた、抗原と結合することができる任意の種類の抗体を意味する。好ましい実施形態では、抗体またはその断片は、例えば組換え核酸技術によって得ることができるヒト化抗体（「ヒト化組換え抗体」）もしくは少なくとも１つのその断片または抗体様組換えタンパク質である。例として、それだけには限定されないが、断片は、ダイアボディ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質、およびｓｃＦｖ−ＣＨ３融合タンパク質などの抗体様組換えタンパク質中に含まれていてもよい。
【００２７】
抗体もしくは少なくとも１つのその断片、または抗体様組換えタンパク質は、ｈｕＴＮＦＲ１との相互作用に負の効果を与えない限りは、付加、欠失または置換されたアミノ酸または核酸などの１つまたは複数の突然変異または変異を含み得る。さらに、抗体もしくは少なくとも１つのその断片、または抗体様組換えタンパク質は、ｈｕＴＮＦＲ１の相互作用に正の効果を与え、前記分子の拮抗活性を向上させる、付加、欠失または置換されたアミノ酸または核酸などの１つまたは複数の突然変異または変異を含み得る。具体的には、そのような突然変異した変異体は、より良好な親和性および／またはより良好な阻害活性を有する。
【００２８】
本発明によれば、用語「断片」とは、１つ（一価）または２つ（二価）の抗原（ｈｕＴＮＦＲ１）結合部位を介して所望の抗原と結合する能力を有する限りは、上記に定義した抗体の任意の一部分を意味する。さらに、本発明の断片は、前記抗体からのいくつかの異なる部分を含み得る。タンパク質分解または組換えによって産生した抗体の一価断片の例には、抗原結合断片（Ｆａｂ）、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、可変断片（Ｆｖ）、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、免疫グロブリン重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）、免疫グロブリン軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）、およびその組合せが含まれる。タンパク質分解処理したまたは組換えの本発明の二価断片の例には、Ｆ（ａｂ）２、ダイアボディ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質、およびｓｃＦｖ−ＣＨ３融合タンパク質が含まれる。
【００２９】
例えば、抗体または少なくとも１つのその断片は、マウス抗体Ｈ３９８に由来するヒト化抗体または少なくとも１つのその断片であり得る。
【００３０】
抗体が所望の抗原と結合する限りは、抗体のヒト化の技術に制限はない。ヒト化の例には、それだけには限定されないが、相補性決定領域移植（ＣＤＲ移植）（Ｊｏｎｅｓ他、１９８６年、Ｎａｔｕｒｅ、３２１、５２２〜５２５頁）、特異性決定残基移植（ＳＤＲ移植）（Ｋａｓｈｍｉｒｉ他、２００５年、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６、２５〜３４頁）、可変ドメインの再表面化（Ｒｏｇｕｓｋａ他、１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１、９６９〜９７３頁）、構造に基づく選択およびＣＤＲ移植によるヒト化（Ｈｗａｎｇ他、２００５年、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６、３５〜４２頁）、ならびに脱免疫化戦略（Ｈｅｌｌｅｎｄｏｒｎ他、２００４年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、４（補遺Ｉ）、２０頁）が含まれる。
【００３１】
本明細書中で使用する表現「ヒト化抗体」とは、タンパク質工学を用いて、例えば、げっ歯類抗体の定常領域および／または可変ドメインフレームワークまたはフレームワーク残基をヒト抗体中で見つかる配列と交換することによって、外来（「非ヒト」）タンパク質配列の量を減らした任意の抗体を意味する。
【００３２】
本発明の具体的な実施形態では、上記に定義したｈｕＴＮＦＲ１−リガンドのタンパク質構築物は、ヒト由来および非ヒト、例えばげっ歯類由来のアミノ酸配列を含むヒト化抗体であり得る。
【００３３】
本明細書中で使用する用語「ｓｃＦｖ」とは、例えば、セリン、グリシン、または任意の他の天然もしくは非天然のアミノ酸からなるペプチドなどのリンカーで一緒に連結された、任意の免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域の融合体を意味する。
【００３４】
上記に定義したｈｕＴＮＦＲ１−リガンドのさらなる実施形態では、少なくとも１つの断片は、Ｆａｂ領域、ｓｃＦｖ、前記断片の遺伝子操作または翻訳後プロセシングされた組換え誘導体、および前記断片の化学修飾された誘導体からなる群から選択される。
【００３５】
上記に定義したｈｕＴＮＦＲ１−リガンドの具体的な実施形態によれば、少なくとも１つの断片は、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖである。
【００３６】
上記に定義したｈｕＴＮＦＲ１−リガンドのさらなる実施形態では、タンパク質構築物は、ｈｕＴＮＦＲ１との結合をもたらす、配列番号１〜６からなる群から選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの１つもしくは複数、またはその一部分を含み、前記ＣＤＲは、上記のタンパク質構築物の（ｉｉ）に概要を示すように、好ましくはｈｕＴＮＦＲ１と選択的に結合することができる１つまたは複数の非ヒト由来アミノ酸配列内に含まれる。
【００３７】
配列番号１〜６のものなどの、上記に定義したｈｕＴＮＦＲ１−リガンドのＣＤＲは、任意の組合せで存在してもよく、例えば前記ＣＤＲのうちの２つ、３つ、４つ、５つまたは６つが存在し得る。さらに、リガンドがヒトＴＮＦＲ１に対して十分な親和性を示し、人間に投与した場合に低減された免疫原性応答を可能にする限りは、ＣＤＲのうちの任意のものの複数コピーまたは遺伝的変異体が本発明のｈｕＴＮＦＲ１−リガンド中に存在し得る。
【００３８】
ｈｕＴＮＦＲ１−リガンドの具体的な実施形態によれば、タンパク質構築物は、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号７に記載のアミノ酸配列および軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む。
【００３９】
本発明のさらに別の実施形態では、上記に定義したｈｕＴＮＦＲ１−リガンドは、生物学的に許容される化合物との特異的相互作用を可能にするさらなるタグを含む。ｈｕＴＮＦＲ１−リガンドとｈｕＴＮＦＲ１との結合または人間に投与した場合の免疫原性応答に対する負の効果が存在しないか、または許容できるものである限りは、本発明で使用可能なタグに関して明確な制限はない。適切なタグの例には、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、カルモジュリンタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、およびＳタグが含まれる。
【００４０】
上記に定義したｈｕＴＮＦＲ１−リガンドの別の実施形態では、タンパク質構築物は、翻訳後化学結合または組換え遺伝子技術によってそれと非共有結合したまたはそれと共有結合した、生物学的に許容される化合物をさらに含む。
【００４１】
本明細書中で使用する表現「生物学的に許容される化合物」は、特に限定されず、生きた生物などの生物学的環境で使用可能な任意の化合物を意味し、前記生物学的に許容される化合物の製薬上の許容も含まれる。本発明の生物学的に許容される化合物の例は、それだけには限定されないが、ペプチド、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、ならびに他の有機および無機化合物である。生物学的に許容される化合物は、好ましくは、さらなる正の効果、例えば、溶解度の増強、安定性の延長、拮抗活性の向上、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の増加、組織浸透の増加、血液脳関門の通過および毒性の低下などの薬物動態学的特性の向上等の、生化学的／生物物理学的特性の向上を発揮する。
【００４２】
上記に定義したｈｕＴＮＦＲ１−リガンドの薬物動態学的特性の向上を目的とする具体的な一実施形態によれば、生物学的に許容される化合物は、血清タンパク質からなる群から選択される。
【００４３】
上記に定義したｈｕＴＮＦＲ１−リガンドの別の実施形態では、生物学的に許容される化合物はアルブミンである。具体的な実施形態によれば、生物学的に許容される化合物はヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。
【００４４】
上記に定義したｈｕＴＮＦＲ１−リガンドのさらなる実施形態では、生物学的に許容される化合物は、アルブミン結合ドメイン（例えば細菌由来）、天然もしくは非天然のアミノ酸からなるアルブミン結合ペプチド、アルブミン結合活性を有する１つもしくは複数のアシル鎖、ポリエチレングリコールまたはメトキシポリエチレングリコールを含む。上記に定義したｈｕＴＮＦＲ１−リガンドのさらなる実施形態では、生物学的に許容される化合物は、血清成分（例えばアルブミン）と結合する、血清タンパク質成分または天然もしくは合成のリガンドに特異的な別の抗体またはその断片を含む。
【００４５】
上記に定義したｈｕＴＮＦＲ１−リガンドの薬物動態学的特性の向上を目的とするさらなる具体的な実施形態では、生物学的に許容される化合物は、細胞表面分子または細胞外マトリクス成分を標的とする別の抗体を含む。例として、抗ＨＩＲ（ヒトインスリン受容体）または抗ＴＲ（トランスフェリン受容体）抗体が、血液脳関門を介した能動輸送および化合物の脳内への送達に使用されている（Ｂｏａｄｏ他、２００７年、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．、印刷前の電子出版）。
【００４６】
上記に定義したｈｕＴＮＦＲ１−リガンドの機能的活性の向上を目的とするさらなる具体的な実施形態では、生物学的に許容される化合物は、上記に定義したｈｕＴＮＦＲ１リガンドによって認識されるものとは明確に異なるＴＮＦＲ１の別のエピトープと結合することで、全体的な結合（結合力）およびこの二重特異性試薬の選択性を増加させる抗体を含む。
【００４７】
上記に定義したｈｕＴＮＦＲ１−リガンドの別の具体的な実施形態によれば、タンパク質構築物は配列番号１０に記載の融合タンパク質を含む。
【００４８】
本出願のさらなる態様は、上記に定義したｈｕＴＮＦＲ１−リガンドをコードしている核酸に関する。
【００４９】
本発明による核酸は、特に限定されず、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。核酸は、例えば蛍光標識またはＨｉｓタグなどの、検出または単離手順で使用する配列をさらに含み得る。核酸は、人工のＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡ構成単位などの人工の構成単位をさらに含み得る。さらに、本発明による核酸は、組換えまたは固相合成などの化学合成等の任意の適切な方法で産生し得る。
【００５０】
本発明の別の態様は、上記に定義した核酸配列を含むベクターに関する。本発明のベクターは、適切な宿主細胞の形質移入に使用することができ、異種遺伝子発現に適している限りは、特に限定されない。
【００５１】
ベクターを構築するために使用する方法は当業者に周知であり、様々な出版物に記載されている。具体的には、プロモーター、エンハンサー、終結およびポリアデニル化シグナル、選択マーカー、複製起点、スプライシングシグナル、およびリーダー配列などの機能的構成要素の説明を含めた、適切なベクターを構築するための技術は、（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９年）およびそれ中に引用される参考文献にかなり詳細に総説されている。ベクターには、それだけには限定されないが、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工／ミニ染色体（例えばＡＣＥ）、ＭＡＲベクター、またはバキュロウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レトロウイルス、バクテリオファージなどのウイルスベクターが含まれ得る。原核発現に適したベクターの例にはｐＡＢ１が含まれる（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ他、１９９７年）。真核発現ベクターはまた、典型的には、細菌内での選択のための複製起点および抗生物質耐性遺伝子などの、細菌内でのベクターの増殖を促進する原核配列も含み得る。１つまたは複数のポリヌクレオチドをその内に作動可能に連結させることができるクローニング部位を含む様々な真核発現ベクターが当分野で周知であり、その一部は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、Ｃａｒｌｓｂａｄ；Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州、Ｍａｄｉｓｏｎ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ；Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ＰＬＣ、英国、Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ州、Ｓｌｏｕｇｈなどの企業から市販されている。真核ベクターの例は、ｐＣＤＮＡ３、ｐＳｅｃＴａｇ、およびｐＥＥ６．４である。
【００５２】
好ましい実施形態では、発現ベクターは、目的のペプチド／ポリペプチド／タンパク質をコードしているヌクレオチド配列の転写および翻訳に必要な調節配列である少なくとも１つの核酸配列を含む。
【００５３】
本発明のさらなる態様は、上記に定義した核酸または上記に定義したベクターを含む宿主細胞に関する。本発明の宿主細胞は、特に限定されず、ｈｕＴＮＦＲ１−リガンドおよび／またはタンパク質構築物もしくはその一部分の産生に使用可能なすべての細胞が含まれる。本発明に適した宿主細胞の例には、様々な種由来の酵母、植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞などの真核細胞および原核細胞、ならびにトランスジェニック生物全体（トランスジェニック植物、トランスジェニック動物）が含まれる。原核細胞の例には、大腸菌、ＴＧ１、およびシュードモナス種が含まれる。動物細胞の例には、ハムスター細胞、好ましくは、ＢＨＫ２１、ＢＨＫ  ＴＫ−、ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ  Ｂ１、およびＣＨＯＤＧ４４細胞またはそのような細胞系の任意のものの誘導体／子孫が含まれる。本発明のさらなる実施形態では、宿主細胞は、ネズミ骨髄腫細胞、好ましくは、ＮＳ０およびＳｐ２／０細胞またはそのような細胞系の任意のものの誘導体／子孫である。本発明によるｈｕＴＮＦＲ１リガンドの発現に使用できる哺乳動物細胞の例を表１に要約する。
【００５４】
【表１】
0005534819.tif 000002
【００５５】
宿主細胞は、樹立させ、適応させ、無血清条件下、必要に応じてすべての動物由来のタンパク質／ペプチドを含まない培地中で完全に培養した場合が最も好ましい。ハムＦ１２（Ｓｉｇｍａ、ドイツ、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（ＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ）、イスコブ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；Ｓｉｇｍａ）、ＣＤ−ＣＨＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、Ｃａｒｌｓｂａｄ）、ＣＨＯ−Ｓ−Ｉｎｖｔｉｒｏｇｅｎ）、無血清ＣＨＯ培地（Ｓｉｇｍａ）、およびタンパク質を含まないＣＨＯ培地（Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地が、例示的な適切な栄養液である。どの培地にも、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、表皮成長因子、インスリン様成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、リン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオシド（アデノシン、チミジンなど）、グルタミン、グルコースまたは他の同等のエネルギー源、抗生物質ならびに微量元素を例とした、様々な化合物を添加し得る。任意の他の必要な添加物も、当業者に知られている適切な濃度で含め得る。本発明では、無血清培地の使用が好ましいが、適切な量の血清を添加した培地も宿主細胞の培養に使用することができる。選択可能な遺伝子を発現する遺伝子改変した細胞の増殖および選択には、適切な選択剤を培地に加える。
【００５６】
さらに、治療上有効な量の上記に定義したｈｕＴＮＦＲ１−リガンドと、必要に応じて、製薬上許容される担体、製薬上許容される塩、補助剤、安定化剤、希釈剤および溶媒、またはその任意の組合せからなる群から選択される１つまたは複数の追加の成分とを含む、医薬組成物を提供する。
【００５７】
別の実施形態によれば、上記に定義した医薬組成物は、関節リウマチ、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎ならびに他の慢性炎症性および／または自己免疫疾患、急性の劇症のウイルスまたは細菌感染症、代謝性疾患、急性神経変性疾患、好ましくは多発性硬化症、パーキンソン病およびアルツハイマー病から選択される慢性神経変性疾患、好ましくは周期熱症候群およびケルビム症から選択される、ＴＮＦ／ＴＮＦＲ１が原因の病理媒介物質である遺伝性疾患、ならびに癌の治療に使用可能である。
【００５８】
本発明のｈｕＴＮＦＲ１−リガンドは、上述したものなどの任意のＴＮＦ関連障害を治療するための医薬品の調製にさらに使用し得る。
【００５９】
さらに、関節リウマチ、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎ならびに他の慢性炎症性および／または自己免疫疾患、急性の劇症のウイルスまたは細菌感染症、代謝性疾患、急性神経変性疾患、好ましくは多発性硬化症、パーキンソン病およびアルツハイマー病から選択される慢性神経変性疾患、好ましくは周期熱症候群およびケルビム症から選択される、ＴＮＦ／ＴＮＦＲ１が原因の病理媒介物質である遺伝性疾患、ならびに癌から選択される疾患に罹患している患者を治療する方法であって、治療上有効な量の上記に定義したｈｕＴＮＦＲ１−リガンドを、それを必要としている患者に投与するステップを含む方法を提供する。
【００６０】
本発明によれば、上記に定義したｈｕＴＮＦＲ１−リガンドは、機能的に等価なｈｕＴＮＦＲ１特異的抗体をヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリから単離することで前記試薬の潜在的な免疫原性をさらに最小限にするための、現況技術（Ｊｅｓｐｅｒｓ他、１９９４年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に従った誘導選択手順に使用し得る。
【００６１】
したがって、本発明の別の態様によれば、上記に定義したタンパク質構築物を鋳型として使用した誘導選択によって得ることができる、（ｉ）ヒトにおいてｈｕＴＮＦＲ１−リガンドの免疫原性応答を低減させることができる１つまたは複数のヒト由来アミノ酸配列と、（ｉｉ）ｈｕＴＮＦＲ１と選択的に結合することができる１つまたは複数のアミノ酸配列とを有するタンパク質構築物を含むｈｕＴＮＦＲ１−リガンドを提供する。
【００６２】
さらに、人間に投与した場合に低減した免疫原性応答を有するｈｕＴＮＦＲ１−リガンドを産生する方法であって、（ａ）上記に定義したタンパク質構築物を提供するステップと、（ｂ）前記タンパク質構築物のアミノ酸配列、特に非ヒト由来アミノ酸配列のうちの１つまたは複数を鋳型として使用した誘導選択によって、ｈｕＴＮＦＲ１と選択的に結合することができる１つまたは複数のヒト由来アミノ酸配列を同定するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）で同定したアミノ酸配列のうちの少なくとも１つまたは複数を含む前記リガンドを構築するステップとを含む方法を提供する。
【００６３】
本発明の別の態様は、本質的にヒト由来またはヒト由来のみであるアミノ酸配列を含む別の低免疫原性ｈｕＴＮＦＲ１−リガンドの同定および構築における誘導選択の鋳型としての、（ｉ）ヒトにおいて前記ｈｕＴＮＦＲ１−リガンドの免疫原性応答を低減させることができる１つまたは複数のヒト由来アミノ酸配列と、（ｉｉ）ｈｕＴＮＦＲ１と選択的に結合することができる１つまたは複数の非ヒト由来アミノ酸配列とを有するタンパク質構築物を含むｈｕＴＮＦＲ１−リガンドの使用に関する。
【００６４】
図は、以下を示す。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】ＶＨ（ＶＨ１−６９＝１−ｅ＝ＤＰ−８８）およびＶＬ（Ａ３＝ＤＰＫ１５）の最も近いヒト生殖系列配列であるマウスモノクローナル抗体Ｈ３９８のＶＨおよびＶＬ配列、ならびにＣＤＲ移植によって作製したヒト化ＶＨおよびＶＬ配列（ＩＺＩ−０６．１  ＶＨ、ＩＺＩ−０６．１  ＶＬ）のアラインメントを示す図である。Ｈ３９８とヒト生殖系列配列との間で異なるアミノ酸にアスタリスクで印を付けた。フレームワーク領域（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）を示す。
【図２】コドン最適化したＩＺＩ−０６．１  ＶＨおよびＩＺＩ−０６．１  ＶＬ（上列）ならびに対応するアミノ酸（下列）のＤＮＡ配列を示す図である。それぞれのアミノ酸配列の最初と終わりの斜体の文字は、ＩＺＩ−０６．１  ＶＨおよびＩＺＩ−０６．１  ＶＬに属さず、クローニング／プロセシングに使用されるアミノ酸配列に関連し、特定の制限酵素の切断部位を含む。
【図３】Ｈ３９８  Ｆｖ（薄い灰色）およびＩＺＩ−０６．１  Ｆｖ（濃い灰色）の主鎖の重ね合わせモデル構造を示す図である。ａ）２つのモデル構造の側面図。ｂ）ＣＤＲ領域Ｈ１〜Ｈ３およびＬ１〜Ｌ３の上面図。モデルはＷＡＭ（ＷｈｉｔｅｌｅｇｇおよびＲｅｅｓ、２０００年）ＷＡＭ−ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｗｅｂ．Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１３、８１９〜８２４頁）で作成した。構造はＰｙｍｏｌ（ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ）で可視化した。
【図４】Ｆａｂ断片を発現させる細菌ベクターを作製するためのクローニング戦略を示す図である。
【図５ａ】ＩＭＡＣ（１）調製後に非還元１２％ゲルを用いたＳＤＳ  ＰＡＧＥ後の、ニトロセルロース上のウエスタンブロットを示す図である。抗ヒトＦａｂ−ＡＰによる検出、標準手順に従ったＡＰ染色、１５μＬ試料をゲルに適用した。略記：ＰＰ＝ペリプラズム抽出物、ＤＬ＝ＩＭＡＣのフロースルー、Ｗ＝洗浄画分、Ｆ＝画分。
【図５ｂ】１２％ゲル上でのＳＤＳ  ＰＡＧＥ後の、ＩＭＡＣ（１）精製のクマシー染色を示す図である。マーカーの左側は非還元ゲルを表し、右側は還元条件下のゲルを表す。試料体積は１５μＬであった。
【図６】受容体陽性細胞と結合するＩＺＩ−０６．１−Ｆａｂの飽和結合曲線および誘導したスキャッチャードプロットを示す図である。非特異的結合は差し引いた。生じたデータにより、ＩＺＩ−０６．１−ＦａｂとＴＮＦＲ１−Ｆａｓとの結合は飽和性かつ特異的であり、見かけの親和性がＫＤ＝０．７７８ｎＭであることが示される。
【図７】ＴＮＦＲ１の細胞外ドメイン（ＥＤ）および細胞死受容体Ｆａｓの細胞質ドメインからなるキメラ受容体、ＴＮＦＲ１−Ｆａｓ（Ａ）、またはＴＮＦＲ２−ＥＤおよびＦａｓからなるキメラ受容体（ＴＮＦＲ２−Ｆａｓ）（Ｂ）、またはＴＮＦＲ１のシステインに富んだドメイン（ＣＲＤ）１が欠失したキメラ受容体、ΔＣＲＤ１−ＴＮＦＲ１−Ｆａｓ（ＣおよびＤ）、またはＴＮＦＲ２のＣＲＤ１を含むＴＮＦＲ１−Ｆａｓ分子からなるＣＲＤ１交換突然変異体、ＣＲＤ１ＴＮＦＲ２−ＴＮＦＲ１−Ｆａｓ（ＥおよびＦ）を安定して発現するマウス胚性線維芽細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。これらの形質移入体を、氷上で２時間、２．５μｇ／ｍｌのＩＺＩ−０６．１−Ｆａｂ（Ａ〜Ｃ、Ｅ、白いヒストグラム）、ＴＮＦＲ１に特異的な抗体ｍＡｂ２２５（ＤおよびＦ、白いヒストグラム）、ＴＮＦＲ２に特異的な抗体８０Ｍ２（Ｂ、白＋太字のヒストグラム）と共にインキュベーションしたか、または対照として二次抗体のみで処理した（灰色のヒストグラム）。インキュベーション緩衝液はＰＢＡ（ＰＢＳ＋０．０５％のウシ血清アルブミン＋０．０２％のＮａＮ３）であった。細胞をＦＩＴＣで標識した二次抗体（８０Ｍ２およびｍＡｂ２２５：ヤギ抗ネズミＩｇＧ；ＩＺＩ−０６．１  Ｆａｂ：ヤギ抗ＨＩＳタグ）と共にインキュベーションし、細胞をフローサイトメトリーによって分析した。生細胞について細胞にゲートをかけ、合計蛍光強度（ＭｎＸ）をそれぞれの抗体について示す。（Ｃｏｎ＝対照値）。
【図８】ＩＺＩ−０６．１によるＴＮＦＲ１阻害に関連する図を示す。処理の前日にＫｙｍ  Ｉ細胞を９６ウェルプレートに播種した（１０，０００個の細胞／ウェル、ＲＰＭＩ１６４０＋５％のＦＣＳ中）。翌日、細胞を３倍希釈ステップで１００ｎｇ／ｍｌのｈｕＴＮＦを用いて処理した。対照はＰＢＳの滴定であった。１６時間後、細胞をクリスタルバイオレットアッセイによって分析した。ＯＤ吸光度を５５０ｎｍで測定した。結果は対照（ＰＢＳで処理した細胞）の％として示す。上パネル：１．２５ｎｇ／ｍｌのｈｕＴＮＦが最大毒性を誘発するために十分な用量であると推定された。下パネル：すべて３倍ステップで希釈した２５μｇ／ｍｌのＨ３９８、Ｈ３９８−Ｆａｂまたはヒト化Ｈ３９８−Ｆａｂと共に６０分間プレインキュベーションした後、一定量の１．２５ｎｇ／ｍｌのｈｕＴＮＦ−を適用した。１６時間後、細胞をクリスタルバイオレットアッセイによって分析した。ＯＤ吸光度を５５０ｎｍで測定した。結果は対照の％として示す。
【図９】ＶＨ−ＶＬ（ａ）およびＶＬ−ＶＨ（ｂ）構成ならびにｓｃＦｖ−アルブミン融合タンパク質（ｃ）におけるｓｃＦｖ  ＩＺＩ−０６．１の組成を示す図である。すべての構築物は可溶性発現のためのＮ末端リーダー配列およびヘキサヒスチジルタグ（Ｈｉｓ６）を含み、ｓｃＦｖ分子の場合はｍｙｃタグも含む。リンカー配列は黒いバーとして示す。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
本発明によるｈｕＴＮＦＲ１−リガンドは高い特異性でヒトＴＮＦＲ１と結合し、この受容体のＣＲＤ１と相互作用する。予想外に、ｈｕＴＮＦＲ１−リガンドは非常に高い親和性でＴＮＦＲ１と結合し、マウス抗体Ｈ３９８の親和性を有利に上回る。したがって、上述のヒトＴＮＦＲ１リガンドは、天然に存在するリガンドのＴＮＦＲ１、ＴＮＦおよびＬＴαに対する作用および生物活性を非常に効率的に妨げ、従来技術に記載のネズミＨ３９８抗体に対するその拮抗活性がより優れている。ヒト由来アミノ酸配列（複数可）の含有率により、このリガンドの免疫原性は有利に低い。したがって、本発明のｈｕＴＮＦＲ１−リガンドは、リガンドに対する急性の有害反応および／または免疫応答の急速な発生の危険性がない一方で、同時にｈｕＴＮＦＲ１に対する非ヒト由来アミノ酸配列の高い選択性および遮断効率から利点を得る、ＴＮＦＲ１に関係する障害に罹患している患者の治療を可能にする。
【００６７】
本発明を以下の実施例でさらに例示するが、それだけには限定されない。
【実施例】
【００６８】
[実施例１]
マウスモノクローナル抗体Ｈ３９８配列およびヒト生殖系列ＩｇＶ遺伝子配列に基づいた抗ＴＮＦ受容体１拮抗剤のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ作製
Ｈ３９８重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のアミノ酸配列（Ｍｏｏｓｍａｙｅｒ他、Ｔｈｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９５年、第２号、３１〜４０頁）を用いて、Ｖベースデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）およびＩｇＢｌａｓｔを使用して類似のヒト生殖系列Ｖセグメントを検索した。この検索により、６１．２〜６２．２％の全体的な類似度を有するいくつかのＶＨ生殖系列配列（ＤＰ７５、ＤＰ８、ＤＰ８８）および８０．０〜８１．０％の類似度を有するいくつかのＶＬ生殖系列配列（ＤＰＫ１５、ＤＰＫ１３、ＤＰＫ２７、ＤＰＫ２８）が同定された。同定された配列をＨ３９８のＶＨおよびＶＬとアラインメントし、ＣＤＲのコンホメーションに重大なアミノ酸、ＶＨ／ＶＬ界面および微調整（Ｖｅｒｎｉｅｒ）領域を記載されているように同定した（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  Ｓ．、Ｊｏｎｅｓ  Ｔ．、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ａ  ｌａｂ  ｍａｎｕａｌ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、２００１年、５６７〜５９０頁；Ｌｏ  Ｂ．Ｋ．Ｃ．、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２００４年、１３５〜１５９頁）。カバット、コチア、ＡｂＭおよびコンタクトの定義を使用してＣＤＲ領域を割り当てた（Ｍａｒｔｉｎ  Ａ．Ｃ．Ｒ．、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ａ  ｌａｂ  ｍａｎｕａｌ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、２００１年、４２２〜４３９頁）。さらに、Ｌ１〜Ｌ３およびＨ１〜Ｈ２のカノニカルクラスは以下のように決定された：Ｌ１−４、Ｌ２−１、Ｌ３−１、Ｈ１−１、Ｈ２−３（Ｍａｒｔｉｎ  Ａ．Ｃ．Ｒ．、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ａ  ｌａｂ  ｍａｎｕａｌ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、２００１年、５６７〜５９０頁）。ＣＤＲ置換には、ＣＤＲは以下のように定義された：アミノ酸Ｌ２４〜Ｌ３４（ＣＤＲＬ１）、Ｌ４６〜Ｌ５６（ＣＤＲＬ２）、Ｌ８９〜Ｌ９７（ＣＤＲＬ３）、Ｈ２６〜Ｈ３５（ＣＤＲＨ１）、Ｈ４７〜Ｈ６５（ＣＤＲＨ３）、およびＨ９５〜Ｈ１０２（ＣＤＲＨ３３）。ヒトアクセプター配列として、本発明者らはＶＨ生殖系列セグメントＶＨ１−６９（１−ｅ、ＤＰ８８）およびＶＬ生殖系列セグメントＡ３（ＤＰＫ１５）を選択した。６つのＣＤＲのすべてを、これらのヒト可変生殖系列セグメント内に挿入した（図１）。生じた独特の配列を、それぞれＩＺＩ−０６．１  ＶＨ（配列番号７）およびＩＺＩ−０６．１  ＶＬ（配列番号８）と命名した。
【００６９】
[実施例２]
ＩＺＩ−０６．１  ＶＨおよびＩＺＩ−０６．１  ＶＬのＤＮＡ配列の合成
２つのヒト化可変ドメイン（ＩＺＩ−０６．１  ＶＨ（配列番号７）、ＩＺＩ−０６．１  ＶＬ（配列番号８））をコードしているコドン最適化したＤＮＡを、ＧｅｎｅＡｒｔ（ドイツ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ）によって、適切なクローニング部位を付加して合成した（図２）。
【００７０】
[実施例３]
Ｈ３９８およびＩＺＩ−０６．１  Ｆｖ断片のモデル構造
ウェブ抗体モデリングサーバ（ＷＡＭ）を使用して、Ｈ３９８およびＩＺＩ−０６．１  Ｆｖのモデル構造を作成した（Ｗｈｉｔｅｌｅｇｇ  Ｎ．Ｒ．Ｊ．、Ｒｅｅｓ  Ａ．Ｒ．、Ｗｅｂ．Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．、２０００年、第１３号、８１９〜８２４頁）。２つのモデル構造のアラインメントにより、わずかな歪みを示すＣＤＲＨ３を例外として、ＣＤＲを含めたタンパク質の主鎖および側鎖のコンホメーションの高い一致が明らかとなった（図３）。したがって、Ｈ３９８モデルおよびＩＺＩ−０６．１モデルのＣＤＲＨ３の先端のＡｓｐ９６は、抗原結合ポケットから外に約０．３８ｎｍ移動している。
【００７１】
[実施例４]
ＩＺＩ−０６．１のクローニングおよび一価Ｉｇ断片（Ｆａｂフォーマット）の構築
抗体ＩＺＩ−０６．１の可変重鎖および軽鎖ドメイン（ＶＨ、ＶＬ）をコードしている遺伝子をＧｅｎｅＡｒｔによって合成し、適切なクローニング部位を含むベクターｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ−ＩＺＩ−０６．１−ＶＨ、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ−ＩＺＩ−０６．１−ＶＬ）内に提供する。Ｆｄ断片（ＶＨ−ＣＨ１）（＝構築物ｐＡＢ１−ＩＺＩ−０６．１−Ｆｄ）のクローニングでは、プラスミドｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ−ＩＺＩ−０６．１−ＶＨを制限酵素ＳｆｉＩおよびＸｈｏＩで消化し、生じた断片を、同じ酵素で消化したベクターｐＡＢ１−ＣＨ１（ヒト免疫グロブリンγ１重鎖のＣＨ１ドメインの遺伝子を含む）内にクローニングする。軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）（＝構築物ｐＡＢ１−ＩＺＩ−０６．１−Ｌ）のクローニングには、プラスミドｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ−ＩＺＩ−０６．１−ＶＬを制限酵素ＳｆｉＩおよびＡｓｃＩで消化し、生じた断片を、同じ酵素で消化したベクターｐＡＢ１−ＣＨ１（ヒトＣ？ドメインの遺伝子を含む）内にクローニングする。ベクターにコードされているリボソーム結合部位（ＲＢＳ）およびｐｅｌＢリーダー配列が含まれる軽鎖遺伝子を、プラスミドｐＡＢ１−ＩＺＩ−０６．１−Ｌから、プライマーＡ（５’−ＧＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＴ  ＴＡＣ  ＧＣＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＴＣＣ  ＡＣＧ  ＧＣＡ  ＴＧＣ  ＡＡＡ  ＴＴＣ−３’）（配列番号１１）およびＢ（５’−ＡＣＧ  ＡＣＧ  ＧＣＣ  ＡＧＴ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＴＴＡ  ＡＣＡ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＣＣＴ  ＧＴＴ  ＧＡＡ−３’）（配列番号１２）を用いて、ＰＣＲによって増幅する。このステップで、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ部位をそれぞれ５’および３’末端に導入する。ＰＣＲ産物を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで消化し、同じ酵素で消化したプラスミドｐＡＢ１−ＩＺＩ−０６．１−Ｆｄ内にクローニングする。これにより、Ｆｄ断片のＣ末端にヘキサヒスチジルタグが含まれる抗体ＩＺＩ−０６．１のＦａｂ断片をコードしている、最終的な細菌発現プラスミドｐＡＢ１−ＩＺＩ−０６．１−Ｆａｂがもたらされる。
【００７２】
[実施例５]
発現系
ベクター：ｐＡＢ１（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ他、１９９７年）
細胞：大腸菌ＴＧ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）
基本原理：ＩＺＩ−０６．１  Ｆａｂの発現はＰＬａｃの制御下にあり、標準手順に従ってＩＰＴＧによって誘導する。選択はアンピシリン（ｂｌａ−Ｇｅｎ）を添加することによって達成する。
【００７３】
Ｎ末端ｐｅＬＢリーダー配列により標的遺伝子産物のペリプラズム発現が可能となり、前者はペリプラズム内でのタンパク質分解性プロセシングによって標的タンパク質から除去される。標的タンパク質（ＩＺＩ−０６．１）は、ＥＤＴＡおよびリゾチームを用いて細菌細胞壁を不安定化した際に可溶性タンパク質として単離される。残りの細菌細胞を、細胞溶解を回避するためにサッカロース／ＭｇＳＯ４緩衝液を用いてスフェロブラストとして浸透圧的に安定化させ、細胞を遠心分離によって分離する。
【００７４】
発現：
手順：バッチの振盪フラスコ培養。
【００７５】
前培養：５０ｍＬのＬＢ培地＋１００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび１％のグルコース、単一の大腸菌コロニーを接種。３０℃、揺動プラットフォーム上（１２５ｒｐｍ）で終夜インキュベーション。
【００７６】
主培養：１ＬのＬＢ培地＋１００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび０．１％のグルコース、５％（Ｖ／Ｖ）の前培養物を接種。３０℃、揺動プラットフォーム上（１２５ｒｐｍ）でインキュベーション。ＯＤ６００（約３時間のインキュベーション時間）で、ＩＰＴＧ（１ｍＭの最終濃度）の添加によってタンパク質発現の誘導。発現時間は２５℃で３．５時間であった。
【００７７】
抽出：培養物を１０分間、４０００ｇで遠心。ペレットを５０ｍＬのペリプラズマ可溶化緩衝液ＰＰＡ（ＰＰＡ：３０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２０％のサッカロース）に再懸濁。５０μｇ／ｍＬのリゾチームを加え、懸濁液を氷上で３０分間インキュベーション。その後、１８，０００ｇで遠心分離することによってスフェロブラストを除去した。上清（ペリプラズマ抽出物）を２００倍体積のＰＢＳで終夜透析。
【００７８】
この発現／抽出プロトコルの典型的な収量は、約１〜２ｍｇのＦａｂ  ＩＺＩ−０６．１／１Ｌの培養物である。
【００７９】
[実施例６]
精製
基本原理：２回の連続的なＩＭＡＣの実行、続いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による、３ステップの精製プロトコル。ＩＺＩ−０６．１はＣ末端のｍｙｃ−Ｈｉｓタグを保有する（ｐＡＢ１、クローニング戦略参照）。第１および第２の精製ステップはＩＭＡＣ（固定金属イオンアフィニティークロマトグラフィー）である。Ｈｉｓタグ内のヒスチジン残基は、セファロースマトリックス上のリガンドとキレート化したＮｉイオンと、特異的に結合する。第２のＩＭＡＣステップは生成物を濃縮するためのものである。ＳＥＣは、ＦＰＬＣ（ドイツ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて半調製様式で行う。このステップは、見かけ上の分子量に応じて分離し、標的タンパク質のより高分子の凝集体の分離、ならびにより高分子やより低分子のタンパク質および非タンパク質汚染物質の分離を可能にする。具体的には、折り畳みが誤ったおよび／またはプロセシングされていない標的タンパク質ＩＺＩ−０６．１は、ＳＥＣでより高い見かけの分子量を示し、正しく折り畳まれた生物活性のある生成物から分離することができる。
【００８０】
ＩＭＡＣ（１）：
カラム：ＨｉＴｒａｐ  ５ｍＬ（Ｎｉイオンキレート化）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。
【００８１】
適用：４×５０ｍＬのペリプラズム抽出物（透析）。
【００８２】
流速：０．５〜１．０ｍＬ／分
洗浄画分：２５ｍＭのナトリウム−リン酸−緩衝液、ｐＨ８．０；０．５ＭのＮａＣｌ；２５ｍＭのイミダゾール、５倍体積（カラム）
溶出：２５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０；０．５ＭのＮａＣｌ；５００ｍＭのイミダゾール
画分：８×３．５ｍＬ
ＩＺＩ−０６．１は主に画分２および３で溶出される（図５ａ、５ｂ）。画分２〜４をプールし、５００倍体積のＰＢＳに対して透析した。生じた透析物を第２のＩＭＡＣステップ（ＩＭＡＣ２）によって濃縮する。
【００８３】
ＩＭＡＣ（２）：
カラム：ＨｉｓＴｒａｐ  １ｍＬ（Ｎｉイオンキレート化）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。
【００８４】
適用：２×３ｍＬのＩＭＡＣ（１）の透析した画分（２回の実行）。
【００８５】
流速：０．５〜１．０ｍＬ／分
洗浄画分：２５ｍＭのナトリウム−リン酸−緩衝液、ｐＨ８．０；０．５ＭのＮａＣｌ；２５ｍＭのイミダゾール、５倍体積（カラム）
溶出：２５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０；０．５ＭのＮａＣｌ；５００ｍＭのイミダゾール
画分：８×１．０ｍＬ
ＳＥＣ／ＦＰＬＣ：
カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
溶出液：ＰＢＳ（滅菌濾過）
適用：２００μＬのＩＭＡＣ（２）の画分２または３
流速：０．２５ｍＬ／分
画分：Ｎｒ．１〜５：１ｍＬ、Ｎｒ．５〜３５：０．５ｍＬ
ＩＺＩ−０６．１  Ｆａｂは、主に画分２４／２５（バイオアッセイによる活性なＦａｂ）、小量で画分２０／２１（活性のより低いＦａｂ、恐らくは主に折り畳みが誤ったタンパク質）中に存在する。
【００８６】
[実施例７]
ＩＺＩ−０６．１  Ｆａｂの機能的活性
平衡結合研究による結合特徴、結合親和性の決定：
ＴＮＦＲ１に対する親和性を決定するために、放射標識したＩＺＩ−０６．１  Ｆａｂを用いた飽和結合研究を４℃で行う。クロラミンＴ法を用いて、抗体を１２５ヨウ素で標識する。手短に述べると、１０μｇの精製したタンパク質を、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中、室温で、３．７×１０７ベクレルのＮａ１２５ＩおよびクロラミンＴと共にインキュベーションする。反応を二亜硫酸Ｎａで停止させ、過剰のＮａＩおよび標識されたタンパク質を、ＰＤ１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いたゲル濾過によって分離する。１ｍｌ画分が収集される。タンパク質は画分２および３に溶出され、遊離１２５Ｉは画分７〜９で検出される。生じたタンパク質濃度は２．７μｇ／ｍｌであり、放射活性は１２０，０００ｃｐｍ／ｎｇである。生物活性物質は、一定量の標識したＩＺＩ−０６．１  Ｆａｂを漸増する数のＴＮＦＲ１−Ｆａｓを発現するマウス線維芽細胞と共にインキュベーションすることによって決定する。生じた双曲線を用いて、直線回帰によって１部位結合方程式を当てはめ、外挿された最大結合値（Ｂｍａｘ）は生物活性物質の％を表す（約１０％）。この分析からのデータを用いて、以下の実験で適用された抗体の濃度を計算する。
【００８７】
ＩＺＩ−０６．１  Ｆａｂの親和性（ＫＤ値）を決定するために、２００，０００個のＴＮＦＲ１−Ｆａｓ陽性細胞を氷上で３時間、漸増濃度の標識したＩＺＩ−０６．１（全体積１５０μｌ中に２．５〜５０ｎｇ）と共にインキュベーションする。結合緩衝液としては、リン酸緩衝生理食塩水＋２％のウシ胎児血清＋０．０２％のＮａＮ３を使用する。非特異的結合は、細胞を１８０倍の相対濃度の標識していないＩＺＩ−０６．１と共に同時インキュベーションすることによって決定する。結合した１２５Ｉ−Ｆａｂをγ線計数器で測定し、生じたデータを用いて、飽和結合定数ＫＤを含む１部位結合双曲線に当てはめた：
結合＝（Ｂｍａｘ×［ＩＺＩＦａｂ］）／（［ＩＺＩＦａｂ］＋ＫＤ）
データの適合度は、スキャッチャードプロットとしても知られる線形化変換を行うことによって評価する。生じたデータにより、ＩＺＩ−０６．１とＴＮＦＲ１との結合は飽和性かつ特異的であり、見かけの親和性がＫＤ＝０．７７８ｎＭであることが示される。
【００８８】
受容体ドメインの交換／欠失およびＦＡＣＳ分析による結合特徴、ＴＮＦＲ１の選択性およびエピトープマッピング：
Ｈｉｓタグの陽性ＩＺＩ−０６．１−Ｆａｂを用いて、ＴＮＦＲ１結合またはＴＮＦＲ１−Ｆａｓ結合のそれぞれの特異性、および抗体誘導体によって認識されるエピトープの特徴づけを決定する。図７Ａは、間接免疫蛍光フローサイトメトリー分析を示す。ＩＺＩ−０６．１−Ｆａｂは、陰性対照と比較して、ＴＮＦＲ１−Ｆａｓキメラを発現する細胞を陽性に染色する（検出試薬：ＦＩＴＣで標識したＨｉｓに特異的な抗体。ＴＮＦＲ１特異的ｍａｂ２２５を用いた間接ＩＦと比較した、比較的低い染色強度（図７Ｄ）は、主に使用した二次検出試薬が異なること（Ｈｉｓタグ特異的検出抗体対抗マウス−Ｉｇ検出抗体）によることが知られている。陰性対照と比較してＴＮＦＲ２−Ｆａｓを発現する細胞上で特異的結合は起こらず、ＴＮＦＲ２に特異的な抗体８０Ｍ２が陽性対照として役割を果たした（図７Ｂ）。膜遠位のシステインに富んだドメイン（ＣＲＤ）１が除去されている、ＴＮＦＲ１−Ｆａｓ構築物に対して陽性の細胞で特異的な染色は起こらなかった（図７Ｃ）。しかし、この構築物は、別のＴＮＦＲ１に特異的なｍａｂであるｍａｂ２２５によって容易に検出される（図７Ｄ）。さらに、膜遠位のＣＲＤ１がＴＮＦＲ２のそれによって置き換えられている、機能的（シグナルコンピテント）ＴＮＦＲ１−Ｆａｓ構築物を発現する細胞上で特異的な染色は起こらなかった（図７Ｅ）。ここでも、この受容体キメラは、ＴＮＦＲ１とＣＲＤ１外で結合することが知られているｍａｂ２２５によって容易に検出される。したがって、図７Ｃ〜Ｆに示すデータから、ＩＺＩ−０６．１はＴＮＦＲ１のＣＲＤ１を認識すると結論することができる。本発明者らは、ＣＲＤ１が、ＣＲＤ２のコンホメーションに影響を与えることによってＴＮＦ結合に決定的に関与しており、後者がＣＲＤ３と一緒になって直接リガンド接触部位のうちの１つを提供することを知っている（本発明者らの未発表データ）。
【００８９】
ＴＮＦ作用の阻害：
精製したＩＺＩ−０６．１  Ｆａｂを、ＴＮＦ感受性が高く（１００ｐｇ／ｍＬ  ｓＴＮＦ未満のＬＤ５０、タンパク質合成の阻害は必要ない）、ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２の両方を介して応答する（後者のシグナル経路は、ＮＦ−κＢのシグナル伝達によって内在性ＴＮＦ発現を誘発し、続いてＴＮＦＲ１によって膜発現ＴＮＦのアポトーシスの自己向性シグナル伝達（ａｕｔｏｔｒｏｐｉｃ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を誘発することが、以前に示されている（Ｇｒｅｌｌ他、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１９９９年、第１８号、３０３４〜３０４３頁））Ｋｙｍ−１ヒト横紋筋肉腫細胞系モデルにおいて、拮抗活性について試験する。ＩＺＩ−０６．１  Ｆａｂの拮抗活性を、マウスｍａｂ  Ｈ３９８およびＨ３９８から酵素的に調製したＦａｂと比較する。図８は、Ｈ３９８  Ｆａｂと比較して２〜４倍低い濃度での、ＩＺＩ−０６．１  ＦａｂによるＫｙｍ−１細胞に対するＴＮＦに媒介される細胞毒性作用の効率的かつ完全な遮断を示す。以前の結果から予想されるように、完全長ｍａｂは、一価Ｆａｂと比較してより低い濃度でより高い中和活性を示し、これは恐らく、二価試薬の解離速度（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）がより低い（結合力がより高い）ことが原因である。重要なことに、ｍａｂ  Ｈ３９８は、高濃度で拮抗剤から部分アゴニストへと変換されるため、この高感度なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＴＮＦ活性の完全な遮断に達しない。このことは、ＴＮＦＲの架橋結合が用量依存的に増加し、リガンドに依存しない機能的なＴＮＦＲシグナル伝達複合体が潜在的に形成されることによって説明される（Ｍｏｏｓｍａｙｅｒ他、Ｔｈｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９５年、第２号、３１〜３０頁も参照）
要約すると、本発明によれば、驚くべきかつ予想外の主要な特長の１つは、ＴＮＦＲ１特異的拮抗剤ＩＺＩ−０６．１  Ｆａｂが同じ特異性の既存のマウスＦａｂと比較して、より優れたＴＮＦＲ１遮断活性を示し、また、受容体架橋結合能力を完全に欠くために完全長ｍａｂよりも優れている、すなわち、ＩＺＩ−０６．１  Ｆａｂはすべての内在性のシグナル伝達潜在性を欠き、したがってＴＮＦＲ１の真の拮抗剤であることである。
【００９０】
[実施例８]
単鎖Ｆｖ  ＩＺＩ−０６．１およびその誘導体
ｓｃＦｖ  ＩＺＩ−０６．１（ＶＨ−ＶＬ）のクローニングおよび発現：
ｓｃＦｖ  ＩＺＩ−０６．１（ＶＨ−ＶＬ）は、２ステップでファージミドベクターｐＨＥＮ２内にクローニングして、ベクターにコードされている１５残基のリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＳＡＱ）（配列番号１３）、Ｎ末端のｐｅｌＢリーダー配列ならびにＣ末端のｍｙｃタグおよびヘキサヒスチジルタグ（Ｈｉｓ６）を導入することによって作製する。可溶性発現には、ｓｃＦｖのコード配列は、ｐＨＥＮ２−ｓｃＦｖ  ＩＺＩ−０６．１（ＶＨ−ＶＬ）プラスミドＤＮＡを制限酵素ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩで消化し、生じた断片を同じ酵素で消化した発現ベクターｐＡＢ１内にクローニングすることによって得られる。発現および精製は以下のように行う。２Ｌの２×ＴＹ、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、０．１％のグルコースに、形質転換させたＴＧ１の２０ｍｌの終夜培養物を接種し、対数期（ＯＤ６００＝０．８）まで３７℃で増殖させた。１ｍＭのＩＰＴＧを添加することによってタンパク質発現を誘導し、細菌をさらに３時間、室温で増殖させた。細胞を遠心分離によって収集し、１００ｍｌの３０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ、２０％のスクロースに再懸濁させた。５ｍｇのリゾチームを加えた後、細胞を氷上で１５〜３０分間インキュベーションする。１０ｍＭのＭｇ２ＳＯ４を加えた後、細胞を１０，０００ｇで３０分間、４℃で遠心分離する。上清をＰＢＳに対して透析し、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾールで平衡化したＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ、Ｈｉｌｄｅｎ）上に添加する。洗浄ステップ（５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、３５ｍＭのイミダゾール）の後、Ｈｉｓタグ付けされた組換え抗体断片を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのイミダゾールで溶出させる。タンパク質画分をプールし、ＰＢＳに対して透析する。タンパク質濃度を分光光度計によって決定し、それぞれのタンパク質で計算されたｅ値を用いて計算する。
【００９１】
ｓｃＦｖ  ＩＺＩ−０６．１−アルブミン融合タンパク質のクローニングおよび発現：
ｓｃＦｖ  ＩＺＩ−０６．１（ＶＨ−ＶＬ）ヒトアルブミン融合タンパク質（配列番号１０）は、プラスミドｐＡＢ１からのｓｃＦｖ  ＩＺＩ−０６．１（ＶＨ−ＶＬ）をコードしているＤＮＡを、ＳｆｉＩ−ＮｏｔＩ断片として、ヒトアルブミンをコードしているｃＤＮＡを含むプラスミドｐＳｅｃＴａｇＡ−ＨＳＡ内にクローニングすることによって作製する。プラスミドＤＮＡを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ドイツ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）を用いてＨＥＫ２９３細胞内に形質移入した。安定な形質移入体は、ゼオシン（３００μｇ／ｍＬ）で選択することによって作製される。細胞を、ＲＰＭＩ、５％のＦＣＳ中で、９０％コンフルエントになるまで拡大増殖させる。タンパク質産生には、細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ドイツ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）中で培養し、培地を３日毎に３〜４回交換する。上清をプールし、タンパク質を硫安塩析（６０％飽和）によって濃縮した後、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ、Ｈｉｌｄｅｎ）上に添加する。ＩＭＡＣによる精製を上述のように行う。
【配列表フリーテキスト】
【００９２】
配列番号７：ＩＺＩ−０６．１ＶＨ−ヒト化抗体断片
配列番号８：ＩＺＩ−０６．１ＶＬ−ヒト化抗体断片
配列番号９：ｓｃＦｖ  ＩＺＩ−０６．１  ＶＨ−ＶＬ−ヒト化抗体断片
配列番号１０：ｓｃＦｖ  ＩＺＩ−０６．１ヒト血清アルブミン融合タンパク質
配列番号１１：プライマーＡ
配列番号１２：プライマーＢ
配列番号１３：リンカー
配列番号１４：ＩＺＩ−０６．１ＶＨ−ヒト化抗体断片ＶＨ
配列番号１５：ＩＺＩ−０６．１ＶＬ−ヒト化抗体断片
配列番号１６：ｓｃＦｖ  ＩＺＩ−０６．１−ヒト化抗体断片
配列番号１７：ｓｃＦｖ  ＩＺＩ−０６．１ヒト血清アルブミン融合タンパク質
【図１】
0005534819.tif 000003
【図２】
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【図３】
0005534819.tif 000005
【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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