(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のプロテアーゼ酵素の存在を検出する酵素検出製品であって、
サンプルを受け取るための反応ゾーン（反応領域）と、
酵素の活性の検出に応じてシグナルを提示するための明視化ゾーン（明視化領域）と、
該反応ゾーン（反応領域）と該明視化ゾーン（明視化領域）の間に挿入できる膜であって、閾値サイズより大きいサイズを有する成分の、前記反応ゾーン（反応領域）から前記明視化ゾーン（明視化領域）への通過を妨げる膜と
を備え、
前記反応ゾーン（反応領域）には、前記酵素と反応して前記閾値サイズより小さいサイズを有する反応生成物を生成するための、前記酵素によって分割することができるペプチドを含む第一の反応体を含んでおり、
前記明視化ゾーン（明視化領域）に、前記シグナルを生成するために、前記反応生成物と反応することができる第二の反応体を含む、
酵素検出製品。
【請求項２】
前記膜が不透明である請求項１に記載の酵素検出製品。
【請求項３】
前記反応ゾーン（反応領域）および／または明視化ゾーン（明視化領域）が、水和するが水の存在下で溶解しない吸収材料で製造されたフィルムを含む請求項１または２に記載の酵素検出製品。
【請求項４】
前記フィルムが、ポリビニルアルコール、ペクチン、アクリルアミド、アガロース、プルランまたはカラゲナンから製造される請求項３に記載の酵素検出製品。
【請求項５】
前記明視化ゾーン（明視化領域）が、光学的に透明で固有の色を有せず、均一に顕色することができる材料から製造される請求項１乃至４のいずれか１項に記載の酵素検出製品。
【請求項６】
前記反応ゾーン（反応領域）および明視化ゾーン（明視化領域）が、互いに蝶番式に接続され、ならびに該蝶番の周りで曲げることにより互いを接触させることができる請求項１乃至５のいずれか１項に記載の酵素検出製品。
【請求項７】
前記明視化ゾーン（反応領域）がリーフ上に設けられ、該リーフには該明視化ゾーン（明視化領域）を見るための開口部が設けられている請求項１乃至６のいずれか１項に記載の酵素検出製品。
【請求項８】
前記反応ゾーン（反応領域）が、それに隣接して位置する吸収材料から製造された液だめを有する請求項１乃至７のいずれか１項に記載の酵素検出製品。
【請求項９】
前記酵素がプロテアーゼであり、前記第一の反応体がＮａ−ベンゾイル−ｄｌ−Ａｒｇ  β−ナフチルアミドの合成ペプチドであり、前記第二の反応体がジメチルアミドシンナムアルデヒドである請求項１乃至８のいずれか１項に記載の酵素検出製品。
【請求項１０】
サンプルの横方向の動きを助長し、前記反応ゾーン（反応領域）の表面を破壊し、その中に流路を形成し、それを通してサンプルを導く繊維材料のサンプル分散手段をさらに含む請求項１乃至９のいずれか１項に記載の酵素検出製品。
【請求項１１】
前記明視化ゾーン（明視化領域）が、酵素活性なしに存在するサンプルに応じて第二のシグナルを呈示することができる請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の酵素検出製品。
【請求項１２】
サンプル中のプロテアーゼ酵素の存在を検出する検出方法であって、
ｉ）酵素が存在する場合に反応生成物を生成する第一の反応体とサンプルとを接触させる段階と、
ｉｉ）前記反応生成物が前記閾値サイズより小さい場合に、選択された膜を使って、前記反応生成物を含む混合物中の閾値サイズより小さい成分の少なくとも一部を明視化ゾーン（明視化領域）へと分離する段階と、
ｉｉｉ）前記明視化ゾーン（明視化領域）において、前記反応生成物の存在を検出する段階と、を有し、
前記検出する段階が、前記反応生成物と反応し、第二の反応体によってシグナルを生成することによって、前記明視化ゾーン（明視化領域）に存在する前記反応生成物の存在を検出する、
プロテアーゼ酵素の検出方法。
【請求項１３】
前記分離する段階が、選択膜を使用して前記混合物中の成分を分離することを含む請求項１２に記載の検出方法。
【請求項１４】
前記分離する段階が、前記反応生成物または前記反応生成物によって放出されるシグナルを観察することを含む請求項１２または１３に記載の検出方法。
【請求項１５】
前記接触させる段階が、反応支持層上で行われ、前記検出する段階が、明視化支持層上で行われる請求項１２乃至１４のいずれか１項に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素検出製品およびまた酵素の存在を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な状況下での酵素の存在の検出は、当該技術分野において公知である。検査室手法に加えて、専門家用機器なしに特定の酵素または酵素のタイプを検出することができるキットが提供されている。
【０００３】
例えば、患者の歯肉溝液をプロテアーゼ酵素の存在について分析するために歯科医が使用するためのキットの提供が開示されている。歯肉溝液のサンプルを患者から採取し、濾紙、すなわち、第一反応体、すなわちＢＡＮＡ（Ｎａ−ベンゾイル−ｄｌ−Ａｒｇ  β−ナフチルアミド）として知られている合成ペプチド、を付加した濾紙、の上に置く。図１に示すように、プロテアーゼが存在する場合、ＢＡＮＡペプチドからナフチルアミン部分が切断される。その濾紙の別の部分には、第二反応体ＤＭＡＣ（ジメチルアミノシンナムアルデヒド）が付加される。切断されたナフチルアミン部分およびＨＣＬの存在に応じて、ＤＭＡＣは色を変える（無色からピンク／赤へ）。使用の際、その濾紙を折り重ね、それによって、ＤＭＡＣが付加された領域をＢＡＮＡおよびサンプルが付加された領域と接触させて、それらを混合させ、あらゆる変色を観察する。変色が生じた場合、これは、その患者のサンプル中にプロテアーゼが存在するというしるしである。
【０００４】
こうした先行技術検出システムは、十分満足できる程度に働くが、より広い適用可能性の点で幾つかの問題を有する。１つの問題は、歯肉溝液は一般に透明であるが、他のサンプルは透明でないこともあり、それ故、発生しているかもしれない変色の観察がより難しいという問題である。例えば、サンプルが血液である、または血液で汚染されている場合、それは、反応中に呈示される色をわかりにくくし得る固有の強いバックグラウンドカラーを有する。
【０００５】
こうした先行技術システムでのもう１つの問題は、サンプル、それ自体が、第二の反応体と反応して変色または他のシグナルを生じさせる成分を含有することがあるため、間違った陽性結果をもたらし易いという問題である。幾つかの色素生産システムでは、アミノ酸または短いペプチド（例えば、ニンヒドリン）との反応によって色を生じさせることがある。例えば、上の例について引き続いて述べると、歯肉溝液サンプルは、プロテーゼが存在せず、ＢＡＮＡペプチドが切断されなかったときでさえ、ＤＭＡＣと反応して変色を生じさせることができる、遊離第一芳香族アミン基またはその類似体を含有し得る。
【０００６】
本発明は、上の問題の１つ以上を解決しようとするものである。
【発明の開示】
【０００７】
本発明の１つの態様によれば、
サンプルを受け取るための反応ゾーンと、
酵素の活性の検出に応答してシグナルを提示するための明視化ゾーン
を含む、サンプル中の酵素の存在を検出するための酵素検出製品を提供し、この場合、反応ゾーンは、酵素と反応して反応生成物を生成することができる反応体を含む。
【０００８】
前記反応ゾーンは前記反応体で前処理される。
【０００９】
好ましくは、前記製品は、前記反応ゾーンと前記明視化ゾーンの間に挿入できる膜（この膜は、閾値サイズより大きいサイズを有する成分の該反応ゾーンから該明視化ゾーンへの通過を妨げる）をさらに含み、ならびにその反応生成物は、該閾値サイズより小さいサイズを有する。
【００１０】
前記膜は分子量閾値を有する。これは、好ましくは、１００ｋＤａ、５０ｋＤａ、１０ｋＤａ、５ｋＤａ、１ｋＤａまたは５００Ｄａより小さい。
【００１１】
前記膜が不透明であると好都合である。
【００１２】
好ましくは、前記反応ゾーンおよび／または前記明視化ゾーンは、水和するが水の存在下で溶解しない吸収材料で製造されたフィルムを含む。
【００１３】
前記フィルムは、ＰＶＡ、ペクチン、アクリルアミド、アガロース、プルランまたはカラゲナンから製造されるのが有利である。
【００１４】
前記明視化ゾーンは、均一に顕色することができる材料から製造されるのが好都合である。
【００１５】
好ましくは、前記反応ゾーンおよび前記明視化ゾーンは、互いに蝶番式に接続され、その蝶番の周りで曲げることにより互いを接触させることができる。
【００１６】
前記反応ゾーンおよび明視化ゾーンの少なくとも一方は、その反応ゾーンをその明視化ゾーンと密封式に接触させるための、その外周の周囲に広がる接着領域を有するのが有利である。
【００１７】
前記明視化ゾーンは、リーフ上に据え付けられ、このリーフにはその明視化ゾーンを見るための開口部が設けられるのが好都合である。
【００１８】
好ましくは、前記開口部は透明窓によって覆われる。
【００１９】
前記反応ゾーンは、それに隣接して位置する、吸収材料から製造された液だめを有するのが有利である。
【００２０】
好ましくは、前記反応ゾーンと前記液だめの間に接着層などの層がある。この層は、その反応ゾーンの外側に横方向に広がっていることが好ましい。例えば、反応ゾーンおよび層が円形である場合には、その層は、その反応ゾーンより大きい直径を有する。
【００２１】
前記反応ゾーンおよび明視化ゾーンの少なくとも一方は、脱着可能な保護フィルムによって覆われるのが好都合である。
【００２２】
好ましくは、前記明視化ゾーンは、前記反応生成物と反応してシグナルを生じさせることができる第二反応体を含む。
【００２３】
前記酵素は、プロテアーゼであり、前記第一反応体は、ＢＡＮＡペプチドであり、前記第二反応体は、Ｄ−ＭＡＣであるのが有利である。
【００２４】
前記サンプル検出製品は、サンプルの横方向の動きを助長し、前記反応ゾーンの表面を破壊し、その中に流路を形成してそれを通してサンプルを導くサンプル分散手段をさらに含むのが好都合である。
【００２５】
本発明のもう１つの態様によれば、サンプル中の酵素の存在を検出する方法が提供され、この方法は、
ｉ）サンプルを第一反応体と接触させる段階（この反応体は、酵素が存在する場合、反応生成物を生成する）と、
ｉｉ）混合物中の閾値サイズより小さい成分の少なくとも一部を明視化ゾーンへと分離する段階（前記反応生成物は、その閾値サイズより小さい）と、
ｉｉｉ）明視化ゾーンにおいて前記反応生成物の存在を検出する段階
とを含む。
【００２６】
段階ｉｉ）は、選択膜を使用して前記混合物中の成分を分離することを含むのが好都合である。
【００２７】
好ましくは、段階ｉｉ）は、前記反応生成物または前記反応生成物によって放出されるシグナルを観察することを含む。
【００２８】
段階ｉ）は反応支持層上で行われ、段階ｉｉｉ）は、明視化支持層上で行われるのが有利である。
【００２９】
本方法は、段階ｉ）の後、前記反応支持層を前記明視化支持層と接触させる段階をさらに含むのが好都合である。
【００３０】
好ましくは、段階ｉｉｉ）は、前記反応生成物と反応してシグナルを生じさせる第二反応体を供給することを含む。
【００３１】
本方法は本発明の酵素検出製品を使用するのに有利である。
【００３２】
本発明をより容易に説明することができるように、且つ本発明のさらなる特徴を理解できるように、今度は例として添付の図面を参照しながら本発明の実施形態を説明しよう。
【００３３】
図２を参照すると、酵素検出製品１は、背５で接続された同じ形およびサイズの第一および第二リーフ３、４を有する紙またはボール紙のブック２から成る。従って、背５は、第一リーフ３と第二リーフ４の間の蝶番としての働きをする。
【００３４】
第一リーフ３の中央には、ブック２における第一の開口部６が設けられている。第一リーフ３の上には、その開口部６を覆って、明視化パッド７が設けられており、これは、使用前は保護フィルムによって覆われている（図示されていない）。
【００３５】
図３Ａを参照して、明視化パッド７をもっと詳細に説明しよう。第一リーフ３の内側の面は第一接着フィルム８を有し、これには、第一開口部６に位置を合わせた、しかし第一開口部６より大きい開口部９がある。第一接着フィルム８の上には、水和するが水の存在下で溶解しない、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）製の明視化フィルム１０が設けられている。この明視化フィルム１０は、その構造内にＤＭＡＣおよびＨＣＬを含有する。明視化フィルム１０は、開口部６を中心にして配置されるが、第一接着フィルム８より小さい。明視化フィルム１０は光学的に透明であり、固有の色を有さず、均一に顕色することができるが、使用前は無孔質である。
【００３６】
明視化フィルム１０の上には膜１１が設けられており、この膜１１はそのフィルム１０より大きく、従って、明視化フィルム１０より一部外にはみ出しており、その端で第一接着フィルム８に接続している。それにもかかわらず、膜１１は、第一接着フィルム８より小さいので、第一接着フィルム８の端１２は、膜１１から外側に延びている。膜１１は不透明であり、好ましくは白色である。それは多数の細孔を含む（図示されていない）。これらの細孔によって、この膜はそれを通過できる分子について選択的になる。より具体的には、５００ダルトンの閾値サイズより上の分子量を有する分子は膜１１を通過できないが、５００ダルトンより小さい分子量を有する分子はこの膜を通過することができる。代替実施形態において、前記閾値サイズは５００Ｄａより大きく、例えば、１ｋＤａまたは５ｋＤａであり得る。
【００３７】
第二リーフ４はその中央に反応パッド１３を有する。この反応パッド１３は、第一リーフ３の明視化パッド７と向かい合う第二リーフ４上の位置にある。反応ゾーン１３は、脱着可能なホイルラップ（図示されていない）で覆われている。次に図３Ｂを参照して反応パッド１３をさらに詳細に説明しよう。
【００３８】
反応パッド１３は、第二リーフ４に取り付けられた第二接着フィルム１４を含む。この接着フィルム１４の上に吸収性液だめ１５（接着フィルム１４より小さいサイズのものだが）が設けられている。その吸収パッド１５上には、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）製で、その中に合成ペプチドＢＡＮＡおよびサンプル分散材料が含浸された反応フィルム１６が設けられている。このサンプル分散材料は、反応フィルム１６の表面を破壊し、その中にサンプルを伝達することができる流路を形成することによって、その反応フィルム１６上でのサンプルの横方向の動きを助長する布である。反応フィルム１６は、明視化フィルム１０と同じサイズであり、吸収性液だめ１５より小さいので、第二接着フィルム１４の端１７は反応フィルム１６の外側に延びている。
【００３９】
酵素検出製品１を使用するためには、ブック２を開いて第一リーフ３と第二リーフ４を離し、明視化パッド７および反応パッド１３を覆う保護フィルム（図示されていない）を取り外す。試験すべきサンプル（例えば、血液）を反応フィルム１６の上に乗せる。サンプルからの溢れ液は液だめ１５によって吸収する。適切な反応時間（例えば、６０秒）の後、第一接着フィルム８の端１２が第二接着フィルム１４の端１７と接するように、ブック２の第一リーフ３と第二リーフ４とを互いに押し付け、第一リーフ３と第二リーフ４とが接着するようにする。第一リーフ３と第二リーフ４との接着により、サンプルはブック２の中に密封されるので、サンプルは衛生的に収容される。
【００４０】
リーフ３とリーフ４を一体にする前でも、サンプルを反応フィルム１６上に置くやいなや、そのサンプル中のいずれかのプロテアーゼ酵素活性が、ＢＡＮＡペプチドの加水分解およびナフチルアミン部分の放出を開始させることに留意しなければならない。ナフチルアミン部分は、膜１１を通って明視化フィルム１０に達するほど十分小さい。５００ダルトンの閾値サイズより大きい分子量を有するサンプルの他の成分は、膜１１を通過することができない。
【００４１】
ナフチルアミン部分が明視化フィルム１０に到達すると、ＤＭＡＣおよびナフチルアミンは濃縮され、赤／ピンクへと変色する（図１参照）。明視化フィルム１０は、第一リーフ３の第１開口部６および第一接着フィルム８の第２開口部９を通して見えるので、観察者は発生した変色を見ることができる。膜１１は、好ましくは、白色不透明であり、明視化フィルム１０に対するバックグラウンドとなるため、観察者が、サンプルに由来する干渉色にかかわらず偏りなく変色を評定する助けとなる。変色は、サンプル中のプロテアーゼ酵素の存在を示す。変色度（色相、彩度および吸光度）および変色速度（必ずしも両方ではないが）は、サンプル中の酵素濃度および反応時間に依存する。
【００４２】
プロテアーゼ活性を有さないサンプルでは、ナフチルアミン部分は、反応フィルム１６から放出されず、そのため、ブック１の２つのリーフ３、４を接触させると、ＤＭＡＣ化合物は、その液体サンプルの存在下、明視化フィルム１０の中に存在するＨＣＬと反応して、黄色い色をした生成物を生成する。
【００４３】
本発明の別の実施形態では、第一リーフ３の第一接着フィルム８とは反対側に、第一リーフ３に透明スライドまたは窓を取り付けて、第一開口部６を覆う。この透明スライドは、明視化フィルム１０の目視を可能にするが、不純物の進入およびサンプルの退出を許さない。
【００４４】
また別の実施形態においては、反応フィルム１６および明視化フィルム１０は、水和するが水に溶解しない他の材料、例えばアクリルアミド、アガロース、プルランまたはカラゲナンから製造される。
【００４５】
反応フィルム１６にＢＡＮＡペプチドを含浸させ、明視化フィルム１０にＤＭＡＣを含浸させる実施形態に本発明が限定されないことは、理解されるはずである。代わりに、反応フィルム１６および明視化フィルム１０上に反応体の異なるセットをそれぞれ設けててもよい。
【００４６】
例えば、ＤＭＡＣの代わりにＦａｓｔＧａｒｎｅｔ（亜鉛安定化ジアゾニウム塩）またはＦａｓｔ  Ｂｌａｃｋを使用することもできる。
【００４７】
あるいは、特定のプロテアーゼの検出を可能にするために選択される任意のアミノ酸配列に、ＢＡＮＡのナフチルアミド基を付けることができる。例えば、酵素好中球エラスターゼの存在について試験するために、ＢＡＮＡの代わりにＨ−ＤＬ−Ａｌａ−ｂＮＡ（Ｂａｃｈｅｍ）を使用する。
【００４８】
ナフチルアミドまたはナフチルアミドエステル標識を使用して、特定のプロテアーゼ酵素の活性の存在を検出するために、反応体を設計および合成することができる。
【００４９】
別の実施形態では、反応体カゼインをＢＡＮＡの代わりに反応フィルム上に供給し、反応体ニンヒドリンをＤＭＡＣの代わりに明視化フィルム上に供給する。
【００５０】
実際、いずれの反応体を明視化フィルム１０上に供給することも本発明にとって本質的なことではない。例えば、図４を参照してもう１つの実施形態を概略的に示す。図４において、同様の成分は前の実施形態と同じ番号を有する。従って、この実施形態において、第一および第二リーフ３、４は、選択膜１１によってそれぞれ覆われた明視化フィルム１０と反応フィルム１６をそれぞれ有する。明視化フィルム１０の上の第一リーフ３には開口部６が設けられている。反応フィルム１６には切断可能なペプチド１８が含浸されており、このペプチド１８は、その一方の末端２０に共有結合で付いている蛍光体基１９と、そのペプチドの他方の末端２２に付いているクエンチャー基２１とを有する。ペプチド１８は、プロテアーゼ酵素に対して感受性がある。すなわち、プロテアーゼ酵素は、ペプチド１８を切断し、蛍光体基１９がコンジュゲートしている第一末端２０とクエンチャー基２１がコンジュゲートしている探索末端２２とを分離する。切断された第一末端２０は、残りのペプチド１８上にあるクエンチャー２３から離れて、膜１１を通過し、明視化フィルム１０（ここで、入射光２３のもと、可視光２４の蛍光発生を観察することができる）へと進むのに十分小さい。しかし、サンプル中にプロテアーゼが不在である場合、ペプチドは切断されず、その未切断ペプチド１８は、大きすぎて膜１１を通過できない。従って、この実施形態では、明視化フィルム１０は、いずれかの他の成分と反応する成分を含有せず、その代わり、反応生成物（すなわち、第一末端２０に結合した蛍光体基２１）のための容器および目視領域としての機能を果す。
【００５１】
適する蛍光体基の例は、Ｍｃａ（７−メトキシクマリン−４−アセチル）であり、適するクエンチャーは、Ｄｐａ（２，４−ジニトロフェニル）である。Ｍｃａは、Ｄｐａに近接していない場合、３９２ｎｍ（励起３２５ｎｍ）で蛍光計により検出することができる。
【００５２】
別の実施形態において、反応フィルム１６中の反応体は、カルボキシ末端がアミド結合によってｐ−ニトロアニリン基に連結されているペプチドである。このペプチドがプロテアーゼ酵素によって切断されると、ｐ−ニトロアニリン基を放出し、それが膜１１を通過し、それは黄色であるように見える。
【００５３】
もう１つの実施形態では、ＢＡＮＡを反応フィルム１６上に供給するが、ＤＭＡＣは明視化フィルム１０に供給しない。プロテアーゼ酵素が存在する場合、ナフチルアミンが放出され、ＵＶ線のもとでは明視化フィルムにおいてそれが見える。さらなる実施形態において、反応フィルム１６上に供給される反応体は、ＤＬアルギニンアミノメチルＬクマリンであり、これも、プロテアーゼ酵素が存在する場合、蛍光性切断生成物を放出する。
【００５４】
本発明がプロテアーゼ酵素の検出用の製品に限定されないことも理解されるはずである。他の実施形態において、サンプル中の他の酵素に応答する反応体が、反応フィルム１６上に、場合によっては明視化フィルム１０上にも供給される。例えば、１つの実施形態では、反応フィルム１６中のアミロースからのグルコースの放出によって、アミラーゼを検出する。この実施形態において、明視化フィルム１０は、当業者には公知のタイプのグルコースオキシダーゼおよび適切な色原体を含有する。
実施例
【実施例１】
【００５５】
ブックレット形式のエラスターゼ基質
材料（フィルム作製）
Ｈ−Ａｌａ−β−ナフチルアミド（Ｈ−Ａｌａ−βＮＡ）
５０ｍＭ  トリス緩衝液ｐＨ８
脱イオン水中の１０％  Ｂｒｉｊ  ３５
脱イオン水中の５％  ＰＶＡ
ジメチルアミノシンナムアルデヒド（ＤＭＡＣ）  
綿ガーゼ
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）
３Ｍ  ＨＣＬ
メタノール（ＭＥＯＨ）
ペトリ皿  ２０ｃｍ
脱イオン水
材料（装置組み立ておよび酵素アッセイ）
厚手画用紙
両面接着テープ
ＤＭＡＣフィルム
Ｈ−Ａｌａ−βＮＡフィルム
ブタ膵臓エラスターゼ
ＰＣに接続される小さな測色計（図６）
方法（フィルム作製）
Ｈ−Ａｌａ−βＮＡフィルムは次のように作製した：ガーゼを円盤状に切り取って、標準的な１８ｃｍ微生物学用ペトリ皿の底の内側に取り付けた。さらに、２０ｍｇのＨ−Ａｌａ−βＮＡを量り取り、１ｍＬのＤＭＳＯが入っている汎用ボトルに添加して溶解した。その溶解した基質に次の試薬を添加した：１．５ｍＬのトリス緩衝液、１００μＬのＢｒｉｊ３５および７．５ｍＬの５％ＰＶＡ。そのチューブを穏やかに反転させて、成分の混合を助長し、その後、その懸濁液をペトリ皿にそのガーゼにかぶせるように注入した。空けたままの皿をドラフトの中に置いて、約２０時間、周囲温度で乾燥させた。
【００５６】
ＤＭＡＣフィルムは次のように作製した：１５ｍｇのＤＭＡＣを量り取り、１．５ｍＬのＭｅＯＨが入っている汎用容器に添加して溶解した。３．７５ｍＬのＨＣＬを添加し、その後２．２５ｍＬの脱イオン水および７．５ｍＬの５％  ＰＶＡを添加した。そのチューブを反転させることによってそれらの成分を混合し、その後清浄な空のペトリ皿に注入した。そのフィルムをドラフトの中で約２０時間、周囲温度で乾燥させた。
【００５７】
方法（装置組み立て）
厚手画用紙を約１０×５ｃｍの長方形に切り、これらを半分に折り畳み、表表紙の中心点に鉛筆で印をつけた。丸パンチを使用して、それらのブックレットの表表紙に直径約１２ｍｍの開口部を切り取った。その後、その穴を用いて、この構成の反対側のリーフの内側の中心位置に印をつけた。
【００５８】
数片の両面テープを内方左および右手側に貼った。（上で説明した）フィルムを丸パンチで切り取った；Ｈ−Ａｌａ−βＮＡを直径１２ｍｍのパンチで切り取り、その内方右手側の粘着テープに貼り付けて、サンプル適用領域を得た。ＤＭＡＣフィルムは、直径約１５ｍｍのわずかに大きいパンチで切り取り、開口部を覆うように内方左手側の両面テープで固定した。
【００５９】
酵素アッセイ
ブタ膵臓エラスターゼ（Ｓｉｇｍａ）を、トリス緩衝液ｐＨ８中、約２０ｍｇ／ｍＬになるように調製した。
【００６０】
２つの装置を動作させ、酵素陰性サンプルは装置１に適用し、エラスターゼ陽性サンプルは第二装置に適用した。４０μＬのサンプルを基質パッド（Ｈ−Ａｌａ−βＮＡ）に適用し、室温で１０分間インキュベートすることによって、これらの装置を継続的に動作させた。インキュベーション期間の後、ＤＭＡＣフィルムが基質パッドに接触するようにその装置を閉じ、両面テープによって閉じた状態を維持した。
【００６１】
基本測色計の上にその装置の覗き窓を配置することによって、顕色をモニターした。合計５分の間、２秒に１回、読み取りを行った。得られたデータを、次の等式を用いることによって色相（Ｈ）および彩度（Ｓ）について比較した：１／Ｈ  ×  Ｓ。データは、図５で見ることができる。陽性サンプルで処理した装置から生じた色が強いほど（青線）、Ｈの数値は低く、多くの場合、彩度、すなわちＳ値は大きい。従って、陰性サンプルは、陽性サンプルより低く平坦な傾向を有する（ピンク線）。
【００６２】
その測色計を図６に示す。これは、白色ＬＥＤ光源および色探知チップ、例えば周囲光を除去するために黒いプラスチックケースに入った検出器から成る。この測色計の構成要素は次のとおりである：白色ＬＥＤで装置を読み取るための開口部３０；電源３１；コンピュータへの接続３２；オン／オフスイッチ３３；および適所に装置を保持するためのゴムバンド。埋め込み型ソフトウェアによって生データを変換して、色相（Ｈ）、彩度（Ｓ）および強度（Ｖ）値ならびに赤（Ｒ）、緑（Ｇ）および青（Ｂ）を端末エミュレーターアプリケーションに与える。この装置からの読取値は、カラーホイール原理に基づく。
【実施例２】
【００６３】
基質の酵素的切断後の蛍光標識検出
Ａ．蛍光体としてのβＮＡの検出
材料
脱イオン水中の５％ＰＶＡ
綿ガーゼ
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）
ペトリ皿  ２０ｃｍ
脱イオン水
２５０ｍＭ  ホスフェート  ２５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．２
ベンゾイルアルギニンβナフチルアミド・ＨＣＬ（ＢＡＮＡ）
ペトリ皿
厚手画用紙
両面粘着テープ
方法
ＢＡＮＡフィルムを、微妙な違いはあるが、前記Ｈ−Ａｌａ−βＮＡフィルムどおりに作製した。綿ガーゼを円盤状に切り取って、標準的な１８ｃｍ  微生物学用ペトリ皿の内側に取り付けた。２０ｍｇのＢＡＮＡを汎用容器に添加し、１ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。次の試薬を添加した：１ｍＬのホスフェート／ＥＤＴＡ緩衝液、０．５ｍＬの脱イオン水および７．５ｍＬの５％  ＰＶＡ。その懸濁液を穏やかに混合し、その後、そのガーゼの上に注ぎ、ドラフトの中に置いて、約２０時間、周囲温度で乾燥させた。
【００６４】
試験
５つの小さな穴（直径約５ｍｍ）を有する厚手画用紙片  約１２×５ｃｍを用意した。それらの穴をそれぞれ小さな正方形の両面テープで覆った。ＢＡＮＡフィルムを切り取って、穴の上のテープに合わせ、貼り付けた。０．０１％システインを伴う脱イオン水、希釈剤、中、７００、３５０、７０および７μｇｍＬで、パパイン酵素標準物質を調製した。希釈剤のみの陰性対照も使用した。それらの酵素および対照サンプルをＢＡＮＡフィルム１つにつき２０μＬで適用し、室温でインキュベートした。蛍光発現の進行を、ＵＶ線ボックスで、約５分間隔でチェックした。約１４分後の結果を図７に与え、表１に作表する。
【００６５】
【表１】
0005570729.tif 000002
３５０および７００μｇｍＬのパパインと共にインキュベートしたフィルムにおいてバックグラウンドより高い蛍光が検出された。
【００６６】
Ｂ．切断されたＢｚ−ＤＬ−Ａｒｇ−アミノメチルクマリン・ＨＣＬの検出
材料
Ｂｚ−ＤＬ−Ａｒｇ＿ＡＭＣ・ＨＣＬ（Ｂａｃｈｅｍ  １−１０７６）
脱イオン水中の５％  ＰＶＡ
綿ガーゼ
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）
ペトリ皿  ２０ｃｍ
脱イオン水
２５０ｍＭ  ホスフェート  ２５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．２
ペトリ皿
厚手画用紙
両面粘着テープ
方法
次のことを除き、「Ａ」において説明したとおりフィルムを作製した：１０ｍｇのＢｚ−ＤＬ−Ａｒｇ＿ＡＭＣ・ＨＣＬをＢＡＮＡの代わりにＤＭＳＯに添加した。
【００６７】
試験
次のことを除き、前に「Ａ」において説明したとおり試験装置のセットアップをした：４片のフィルムの３つの列を５片の１列の代わりに覗き窓の上に取り付けた。
【００６８】
新たなパパイン標準物質を次の濃度で適用した、１００００、１０００、１００μｇｍＬおよび０。前のとおりシグナル生成をモニターした。結果を図８に示し、表２に作表する。
【００６９】
【表２】
0005570729.tif 000003
試験した酵素のすべてのレベルで蛍光が検出された。
【実施例３】
【００７０】
記憶データを使用するＢＡＮＡ／ＤＭＡＣプロテアーゼアッセイの例示
ＢＡＮＡおよびＤＭＡＣフィルムの作製
標準的手順は次のとおりである：
材料
目の詰まった綿ガーゼ
脱イオン水中の５％ＰＶＡ
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）
ペトリ皿  ２０ｃｍ
脱イオン水
２５０ｍＭ  ホスフェート  ２５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．２
ベンゾイルアルギニンβナフチルアミド・ＨＣＬ（ＢＡＮＡ）
ペトリ皿
３Ｍ  ＨＣＬ
メタノール（ＭＥＯＨ）
ＤＭＡＣ
ＢＡＮＡ／ＰＶＡ／ガーゼフィルム
１）綿ガーゼを円盤状に切り取って、２０ｃｍ  ペトリ皿の内側に取り付けた。
【００７１】
２）２０ｍｇのＢＡＮＡを清浄な汎用容器に添加し、１ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。
【００７２】
３）（２）において調製したＢＡＮＡ原液に次のものを添加した：１ｍＬのホスフェート／ＥＤＴＡ緩衝液、０．５ｍＬの脱イオン水および７．５ｍＬの５％  ＰＶＡ。
【００７３】
４）その溶液を穏やかに混合し、その後、そのガーゼの上に注ぎ、ドラフトの中に置いて、約２０時間、周囲温度で乾燥させた。
【００７４】
ＤＭＡＣ／ＰＶＡフィルム
１）１５ｍｇのＤＭＡＣを量り取り、１．５ｍＬのＭｅＯＨが入っている清浄な汎用容器に添加して溶解した。
【００７５】
２）（１）において調製したＤＭＡＣ原液に次のものを添加した：３．７５ｍＬのＨＣＬを添加し、その後、２．２５ｍＬの脱イオン水および７．５ｍＬの５％  ＰＶＡを添加した。
【００７６】
３）チューブを反転させることによってそれらの成分を混合し、その後、清浄な空のペトリ皿に注入した。そのフィルムを、ドラフトの中で、約２０時間、乾燥させた。
【００７７】
パパイン標準物質の調製
１）必要とする各日に原液を新たに調製して、０．１％システインを伴う脱イオン水中１０ｍｇｍＬの酵素を得る。その後、この原液は、脱イオン水でさらに希釈することにより作業濃度の標準物質を調製するために使用する。
【００７８】
ブックレット装置の作製
１）約５×５ｃｍのブックレットが得られるように厚手画用紙を折り畳むことによって、ブックレットを作製した。
【００７９】
２）表表紙の中央に、直径１２ｃｍの穴（覗き窓６）をあけた。
【００８０】
３）約２５ｍｍの正方形の２片の両面テープを、接着フィルム８および１４として、そのブックレットの両方のリーフ内側の中央に配置した。
【００８１】
４）直径１２ｍｍの円盤状のＢＡＮＡ／ＰＶＡ／ガーゼフィルム１６を、サンプル適用領域となる接着フィルム１４の中央に配置する。
【００８２】
５）直径１５ｍｍの円盤状のＤＭＡＣ／ＰＶＡフィルム１０を接着フィルム８の中央に配置して、覗き窓６を覆う。
【００８３】
酵素アッセイ
上で説明して本発明者らの標準的な方法論に従って、装置材料を作製し、組み立てる。第０日（材料を乾燥させ、装置組み立ての用意が整った日と定義する）に、装置を動作させて、保管材料と比較することができる第０日の結果を得た。５００および５μｇｍＬの濃度でパパインを含有する溶液および希釈剤のみの陰性対照（試験１回につき５０μＬの量）を、１０分間のインキュベーション時間のために装置に適用した。ブックレットを閉じ、以下のパラメータを１秒間隔で測定するＭｏｌｏｇｉｃブックレット装置測色計を使用して顕色をモニターした：色相（Ｈ）、彩度（Ｓ）、明度（Ｖ）、赤色（Ｒ）、緑色（Ｇ）および青色（Ｂ）。
【００８４】
装置を乾燥させずに４℃で保管し、その後２８日間にわたってアッセイした。第０日および第２８日のデータを下に列挙する。
【００８５】
データ操作
次の等式を用いて、色相および彩度についての測色計出力測定データを操作した：１／Ｈ  ×  Ｓ。これらのデータを図９および１０に示す。図９は、第０日装置で試験したパパイン標準物質についての重複測定データを示すグラフを示している。図１０は、第２８日に試験したパパイン標準物質についての重複測定データを示すグラフを示している。
【００８６】
【表３】
0005570729.tif 000004
これらのデータは、第２８日陽性サンプルにおける低減されたシグナル発生率を例証するものである。しかし、平均データの比較は、最終シグナル値にほとんど有意な変化がなく、陽性サンプルの場合、これは、わずかに長い時間枠内に達成されることを示す。
【実施例４】
【００８７】
ブックレットアッセイへの選択膜の評価
標準的ＢＡＮＡ／ＤＭＡＣ形式ブックレット（実施例３において説明したとおり）を使用して、図３Ａに従って以下の「選択」膜をその装置に組み込んだが、但し、基質インキュベーション中の蒸発を最小にするために明視化窓６を接着フィルム８で完全に密封したので開口部９はここにない。
【００８８】
下に列挙するような０．２２μｍ細孔径フィルターからＭＷＣＯ  ３５００Ｄａ透析膜に及ぶ広範な膜を、プロテアーゼブックレットにおいて評価した。
Millipore Isopore膜  −  ０．１μｍ、２５μｍ厚  ＶＣＴＰ
Millipore ＭＦ膜  −  ０．２μｍ、１５０μｍ厚  ＧＳＰＷ
Millipore Durapore膜  −  ０．２２μｍ、１５０μｍ厚ＧＶ
Whatman ナイロン膜  −  ０．２μｍ細孔、１５０μｍ厚
Degussa セラミック複合膜  −  タイプＳ２４０  Ｐ２５  −  ２５μｍ厚
透析膜  −  Pierce Snakeskin prod  ＃  ６８０３５、ＭＷＣＯ  ３，５００、および
Spectra/Por cat ＃  １３２７２３、ＭＷＣＯ  ３，５００
Amicon ＮＭＷＬ膜  −  ｃａｔ  ＃  ＰＢＣＣ  ０４３１０、ＮＭＷＬ  ５，０００
上で説明したとおりのそれぞれの膜を用いてブックレットを作製し、その後、すべてのブックレット成分を湿潤させるために十分な液体が確実に装置に添加されるように対照装置については４０μＬおよび膜を内蔵している装置については８０μＬのサンプル量を用いて、０、５０および２５０μｇ／ｍＬ  パパイン標準物質で試験した。標準物質をＢＡＮＡフィルムに添加し、１０分間、インキュベートした。その後、それらのブックレットを閉じ、３０分間にわたってデジタル画像を取り込むことによって顕色を記録した。
【００８９】
図１１は、１５分インキュベートした後の、選択膜を有さないブックレット（対照ブックレット）およびＭＷＣＯ  ３，５００透析膜を有するブックレットのデジタル画像を示すものである。結果を表４に作表する。
【００９０】
【表４】
0005570729.tif 000005
【実施例５】
【００９１】
ブックレットにおけるシンクの評価
様々なシンク形式をブックレットタイププロテーゼで試験し、ここではすべての場合、シンクは、ＢＡＮＡフィルムより大きく、ＢＡＮＡフィルムの真下に位置した（両面テープを使用して、そのシンクの上にＢＡＮＡフィルムを保持した）。２つの材料、Fisherbrand  ＱＬ  １００濾紙およびBibby Sterilin Bench
Guard、を試験し、二番目の材料のほうが、はるかに大きい吸収度および気孔率を有した。
【００９２】
両面テープが、ＢＡＮＡフィルムと同じ直径またはそれより小さいもの（直径１２ｍｍ以下）である場合、−例えば、図３Ｂの場合−、には、「サンプル」は、サンプルパッドから、ガーゼ繊維によってまたは直接ＰＶＡフィルムによってシンクへと運ばれるので、ＢＡＮＡフィルムは、最初のサンプルインキュベーション後、ほぼ乾燥していることとなり、それが一様でない劣ったシグナル生成をもたらすことがわかった。図１２は、４０および７０μＬサンプル量を用いる、シンクを有するおよび有さない図３Ｂのブックレットのデジタル画像であり、サンプルパッドからの液体除去の影響および減少したシグナルを示している。結果を表５に作表する。
【００９３】
【表５】
0005570729.tif 000006
両面テープが、ＢＡＮＡフィルム全体の周囲に最低１ｍｍの余分があるように、ＢＡＮＡフィルムより大きいとき（下に示すとおり）、装置は、サンプルの４０から２００μＬというサンプル量にうまく対処し、シンクによってぬぐわれない過剰量がないことが判明した。こうした実施形態の図を図１３に示す。図１３の構成要素は次のとおりである：ＤＭＡＣ／ＰＶＡフィルム３５；両面テープ３６；ＢＡＮＡ／ＰＶＡ／ガーゼフィルム３７；およびシンク／液だめ３８。１５０μＬサンプル量を用いて試験した、シンクを有するおよび有さないブックレットのデジタル画像を図１４に示す。結果を表６に作表する。
【００９４】
【表６】
0005570729.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】プロテアーゼ酵素、ＢＡＮＡとＤＭＡＣの反応の概略図である。
【図２】本発明の１つの実施形態の酵素検出製品の斜視図である。
【図３Ａ】図２に示す酵素検出製品の線Ａ−Ａに沿った断面図である。
【図３Ｂ】図２に示す酵素検出製品の線Ｂ−Ｂに沿った断面図である。
【図４】別の実施形態の酵素検出製品の概略断面図である。
【図５】１つの実施形態の酵素検出製品の顕色を示すグラフである。
【図６】結果を図５に示す試験において使用した測色計の平面図である。
【図７】使用後の、もう１つの実施形態の酵素検出製品の画像である。
【図８】使用後の、もう１つの実施形態の酵素検出製品の画像である。
【図９】もう１つの実施形態の酵素検出製品の顕色を示すグラフである。
【図１０】もう１つの実施形態の酵素検出製品の顕色を示すグラフである。
【図１１】使用後の、もう１つの実施形態の酵素検出製品の画像である。
【図１２】使用後の、もう１つの実施形態の酵素検出製品の画像である。
【図１３】さらなる実施形態の酵素検出製品の断面図である。
【図１４】使用後の、もう１つの実施形態の酵素検出製品の画像である。
【図１】
0005570729.tif 000008
【図２】
0005570729.tif 000009
【図３Ａ】
0005570729.tif 000010
【図３Ｂ】
0005570729.tif 000011
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0005570729.tif 000016
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
0005570729.tif 000021
【図１４】
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