(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の核酸配列のコード領域である、ヒト卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のβ鎖をコードする核酸配列を有する核酸分子。
【請求項２】
宿主細胞において活性なプロモータに制御される請求項１に記載の第１の核酸配列を有する組換え核酸分子。
【請求項３】
配列番号２の核酸配列のコード領域および配列番号２の核酸配列のコード領域に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸配列から成る群から選択された、配列番号５で示されるヒト卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のα鎖をコードする第２の核酸配列をさらに有する請求項２に記載の組換え核酸分子。
【請求項４】
配列番号３で示された核酸配列のコード領域、および配列番号３で示された核酸配列のコード領域と少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列から成る群から選択された、配列番号５で示されるヒト卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のα鎖をコードする第２の核酸配列をさらに含む請求項２に記載の組換え核酸分子。
【請求項５】
第２の核酸配列が別のプロモータに制御される請求項３または４に記載の組換え核酸分子。
【請求項６】
第１の核酸配列および第２の核酸配列のうちの少なくとも一方がウイルスプロモータに制御される請求項３〜５のいずれか一項に記載の組換え核酸分子。
【請求項７】
第１の核酸配列がＳＶ４０プロモータに制御されるか、または第２の核酸配列がＣＭＶプロモータに制御される請求項６に記載の組換え核酸分子。
【請求項８】
配列番号７の核酸配列を有する請求項７に記載の組換え核酸分子。
【請求項９】
請求項３〜８のいずれか一項に記載の組換え核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項１０】
哺乳動物細胞である請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である請求項９または１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８３３を有する請求項９〜１１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
請求項２に記載の第１の組換え核酸分子と、
配列番号２の核酸配列のコード領域、配列番号２の核酸配列のコード領域に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸配列、および配列番号３に示される核酸配列から成る群から選択された、配列番号５で表されるヒト卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のα鎖をコードする核酸配列を含む第２の組換え核酸分子と、を有する宿主細胞。
【請求項１４】
適切な培地中の、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の宿主細胞を含む細胞培養物。
【請求項１５】
組換えヒトＦＳＨを生産する方法であって、
適切な培地中で、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養する工程；
細胞培養上清を採取する工程からなる方法。
【請求項１６】
細胞培養上清から組換えヒトＦＳＨを精製する工程をさらに含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項３〜８のいずれか一項に記載の組換え核酸分子によって、無血清条件下で懸濁培養中の細胞をトランスフェクトする工程を含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の宿主細胞を生産する方法。
【請求項１８】
請求項１３に記載の宿主細胞を生産する方法であって、
請求項２に記載の第１の組換え核酸分子と、配列番号２の核酸配列のコード領域、配列番号２の核酸配列のコード領域に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸配列、および配列番号３に示される核酸配列から成る群から選択された、配列番号５で表されるヒト卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のα鎖をコードする核酸配列を含む第２の組換え核酸分子とにより、無血清条件下で懸濁培養中の細胞をトランスフェクトさせる工程を含む方法。
【請求項１９】
ヒト組換えＦＳＨの生産のためのインビトロでの核酸分子の使用であって、配列番号１の核酸配列からなる核酸分子の使用、または配列番号１および配列番号２の両方の核酸配列からなる核酸分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、野生型ヒトＦＳＨ核酸配列と比べてＣＨＯ細胞のコドン使用頻度が改変された、ヒト卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のα鎖およびβ鎖をコードする核酸配列を有する核酸分子に関する。
【０００２】
本発明はさらに、上記核酸配列を有する組み換え分子、かかる組換え核酸分子を含む宿主細胞、および組換えヒトＦＳＨの生産におけるそれらの使用方法にも関する。
最後に、本発明はさらに、無血清条件下で懸濁培養中の細胞を本発明の組換え核酸分子によりトランスフェクトすることにより、ヒト卵胞刺激ホルモンを発現する宿主細胞を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）は、下垂体前葉の生腺刺激細胞により生産され、血液循環へ放出される。ＦＳＨは、女性における卵母細胞成熟および男性における精子形成の制御において、黄体形成ホルモン（ＬＨ）と共に作用する。ＦＳＨおよびＬＨはいずれも、別の遺伝子によってコードされる２つの非共有結合したαおよびβ鎖から成るヘテロ二量体糖タンパク質のファミリーに属している。ＦＳＨとＬＨはα鎖のアミノ酸配列が同一であるが、両タンパク質ではβ鎖のアミノ酸配列が異なる。α鎖およびβ鎖はいずれも糖鎖形成している。ＦＳＨのα鎖は５２および７８位に２つのアスパラギン結合糖鎖形成部位を有し、ＦＳＨのβ鎖は、７および２４位に２つのアスパラギン結合糖鎖形成部位を有する（非特許文献１）。
【０００４】
ヒトＦＳＨは、無排卵の女性の治療のために、多卵胞発達（排卵過度）の刺激のために、およびＩＶＦ（体外受精）、ＧＩＦＴ（配偶子卵管内移植）またはＺＩＦＴ（接合子卵管内移植）等の受胎支援の準備のために使用されている。さらに、ヒトＦＳＨは、ＦＳＨ生産が低いか欠如している女性での卵胞の成熟を刺激したり、先天的または獲得性低ゴナドトロピン性機能不全の男性での精子形成を刺激したりするために使用されている。
【０００５】
もともと医薬用途のＦＳＨは、ヒトの閉経後の尿から精製された。しかしながら、この精製ＦＳＨは、ＬＨや、他のヒト由来の夾雑タンパク質を含むという欠点を有している。さらに、そのような天然由来の物の使用は、製品の利用可能性および一貫性に制限があることを意味している。
【０００６】
組換えＤＮＡ技術の出現により、α鎖およびβ鎖をコードする核酸配列でトランスフェクトした細胞培養物でヒトＦＳＨを生産することが可能になった。α鎖およびβ鎖をコードするＤＮＡ配列および組換えヒトＦＳＨを生産するため方法が、例えば特許文献１〜３に開示されている。
【０００７】
現在、ドイツの市場には２つの市販の組み換えヒトＦＳＨ製品（すなわちＧＯＮＡＬ−Ｆ（登録商標）およびＰＵＲＥＧＯＮ（登録商標））があり、これはいずれもＣＨＯ細胞でα鎖およびβ鎖をコードする野生型ＤＮＡを発現させることにより生産されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第８８／１０２７０号
【特許文献２】国際公開第８６／０４５８９号
【特許文献３】欧州特許出願出願公開第０  ７３５  １３９号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Olijve et al. (1996) Mol. Hum. Reprod. 2(5): 371-382)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、所定数の細胞を得るために、ＦＳＨの収量および発現率を改善すべくＦＳＨ鎖の発現を最適化する必要がいまだ存在する。したがって、本願における課題は、組換えヒトＦＳＨを真核細胞中で多量に生産可能な核酸配列および組換え核酸分子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明によれば、上記およびさらなる課題は、独立請求項の特徴により解決される。
有利な実施形態が従属請求項に定義される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ヒトＦＳＨのα鎖およびβ鎖をコードする非改変核酸配列および改変核酸配列  ａ）ヒトＦＳＨのα鎖をコードする改変核酸配列と非改変核酸配列の配列比較ｐＸＭ１７ｓｓ＃６：ヒトＦＳＨのα鎖をコードする改変核酸配列（配列番号２）を含むプラスミドの一部ｗｔαＦＳＨ：ヒトＦＳＨのα鎖をコードする非改変核酸配列（配列番号３）。開始コドンおよび終止コドンを太字で示す。  ｂ）ヒトＦＳＨのβ鎖をコードする改変核酸配列と非改変核酸配列の配列比較Ｑｕｅｒｙ：ヒトＦＳＨのβ鎖をコードする非改変核酸配列（配列番号４）Ｓｕｂｊｅｃｔ：ヒトＦＳＨのβ鎖をコードする改変核酸配列（配列番号１）開始コドンおよび終止コドンを太字で示す。
【図２】ヒトＦＳＨのα鎖をコードする改変核酸配列およびヒトＦＳＨのβ鎖をコードする改変核酸配列の両方を有する組換え核酸分子のマップ。
【図３】ＣＨＯ細胞での一過性発現後のα鎖およびβ鎖の種々の組み合わせの発現分析  野生型α鎖およびβ鎖の組み合わせを発現している細胞に関する相対的ＦＳＨ発現が示されている。ｗ／ｗ：非改変α鎖と非改変β鎖  ｓ／ｗ：改変α鎖と非改変β鎖  ｗ／ｓ：改変β鎖と非改変α鎖  ｓ／ｓ：改変α鎖と改変β鎖
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明によれば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のコドン使用頻度に適合されたヒトＦＳＨ鎖のα鎖およびβ鎖をコードする改変核酸配列を有する核酸分子が、ＣＨＯ細胞をトランスフェクトするために使用され、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞におけるＦＳＨ生産を有意に増加させる。
【００１４】
本発明に関連して、用語「ＦＳＨ生産の増加」は、宿主細胞中で改変核酸配列を発現させると、同じアミノ酸配列を有するＦＳＨをコードする非改変核酸配列が同様な条件下（例えば同等なトランスフェクション法、同等な発現ベクター等）で同じ種類の宿主中で発現された状況に比べて、より多量のＦＳＨが宿主中で生産されることを指す。
【００１５】
例えば２０個のアミノ酸が６１個の三つ組コドンによって指定されているように、遺伝子コードは冗長である。したがって、２０個のタンパク質を生成するアミノ酸のほとんどは、いくつかの基本トリプレット（コドン）によりコードされている。特定のアミノ酸を指定する複数のコドンは、特定の生物中では同じ頻度では使用されず、高い頻度で使用される好ましいコドンと、低い頻度で使用される稀なコドンとがある。コドン使用頻度のこのような相違は選択的進化の圧力、特には翻訳効率がその原因であると考えられている。稀にしか生じないコドンの翻訳効率がより低い１つの理由は、対応するアミノアシル−ｔＲＮＡプールが枯渇し、したがってタンパク質合成にもはや利用可能でないからである可
能性がある。
【００１６】
さらに、異なる生物体は異なるコドンを好む。したがって、例えば哺乳動物細胞由来の組換えＤＮＡの発現は、大腸菌細胞では準最適にしか進まない場合が多い。したがって、稀にしか使用されないコドンを、頻繁に使用されるコドンにより置換すれば、場合によっては発現が高まり得る。
【００１７】
多くの生物体の場合、多数の遺伝子のＤＮＡ配列が知られており、それぞれの生物体中の特定コドンの使用頻度が得られる表も存在する。そのような表の使用により、タンパク質配列を、タンパク質の種々のアミノ酸に対する、それぞれの生物体に好ましいコドンを含むＤＮＡ配列を形成するよう比較的正確に逆翻訳することができる。コドン使用頻度の表は、特に以下のインターネットアドレスに見出せる：
http://www.kazusa.or.jp/codon/index.htmlまたは
http://www.entelechon.com/index.php?id=tools/index。
【００１８】
縮重ＤＮＡ配列を形成するための、例えばヒトＦＳＨのα鎖またはβ鎖のタンパク質配列のようなタンパク質配列の逆翻訳に利用可能なプログラムもまた利用可能であり、例えば：
httpV/www.entelechon.com/eng/backtranslation.html
に記載されている。
【００１９】
本発明の目的では、用語「核酸配列」は、ペプチド、タンパク質等のポリペプチドをコードする任意の核酸分子に関する。かかる核酸分子はＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの類似体から形成されてもよい。しかしながら、ＤＮＡから形成された核酸分子が好ましい。
【００２０】
当業者には、開始ヌクレオチド配列の改変が、コドン使用頻度に関する最適化プロセスを記述していることが明白に認識される。
例えば、外来野生型酵素のコード配列がＣＨＯ細胞のコドン使用頻度に調節される場合、導入された変更は、改変配列と開始配列との比較により容易に識別することができる（図１ａおよび１ｂを参照）。さらに、いずれの配列も同じアミノ酸配列をコードする。ヒトＦＳＨのα鎖のアミノ酸配列が配列番号５で描かれ、ヒトＦＳＨのβ鎖のアミノ酸配列が配列番号６で描かれる。これらのアミノ酸配列は、ＥＭＢＬデータベースに受入番号Ｊ
００１５２およびＮＣＢＩデータベースに受入番号ＮＭ ０００５１０でそれぞれ寄託された、ヒトＦＳＨのα鎖およびβ鎖の野生型アミノ酸配列に相当する。
【００２１】
ヒトＦＳＨのα鎖の場合、開始核酸配列は配列番号３であり、ヒトＦＳＨのβ鎖の場合、開始核酸配列は配列番号４である。
本発明によれば、ヒトＦＳＨのα鎖をコードする核酸配列は、ＣＨＯ細胞におけるコドン使用頻度に関して、開始配列と比較して、少なくとも３０個の位置で、好ましくは少なくとも４０個の位置で、特に好ましくは少なくとも５０個の位置で、さらに特に好ましくは少なくとも６０または７０個の位置で、最も好ましくは７５個の位置で改変される。
【００２２】
さらに本発明によれば、ヒトＦＳＨのβ鎖をコードする核酸配列は、ＣＨＯ細胞のコドン使用頻度に関して、開始配列と比較して、少なくとも２５個の位置で、好ましくは少なくとも３０個の位置で、より好ましくは少なくとも４０個の位置で、特に好ましくは５０個の位置で、さらに特に好ましくは６０個の位置で、最も好ましくは少なくとも６５個の位置で改変される。
【００２３】
最も好ましくは、ヒトＦＳＨのβ鎖をコードする改変核酸配列は、配列番号１で与えられる核酸配列のコード領域であるか、またはコード領域全体にわたって配列番号１で与え
られる核酸配列のコード領域と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％または９４％、特に好ましくは少なくとも９６％または９８％、最も好ましくは少なくとも９９％だけ同一の核酸配列である。配列番号１では、コード領域は５６位のヌクレオチドから開始し、４４２位のヌクレオチドまで延びる。
【００２４】
最も好ましくは、ヒトＦＳＨのα鎖をコードする最適化核酸配列は、配列番号２で与えられた核酸配列のコード領域であるか、またはコード領域全体にわたって配列番号２で与えられる核酸配列のコード領域と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８７％または９０％、特に好ましくは少なくとも９２％または９４％、最も好ましくは少なくとも９６％、９８％、または９９％だけ核酸のコード領域と同一の核酸配列である。配列番号２では、コード領域は１９位のヌクレオチドから開始し、３６６位のヌクレオチドまで延びる。
【００２５】
本発明の目的では、用語「非改変核酸配列」、「野生型核酸配列」または「開始核酸配列」は、宿主細胞での（過剰）発現のために使用されるように意図されたものであって、宿主細胞中のコドン使用頻度に適合されない、タンパク質をコードする実際の野生型核酸配列である核酸配列に関する。
本発明の目的では、用語「改変核酸配列」または「最適化核酸配列」は、非改変または開始核酸配列を宿主細胞のコドン使用頻度へ適合させることにより宿主細胞での発現用に改変された配列に関する。改変または最適化核酸配列は、非改変配列によりコードされたタンパク質と同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。
【００２６】
配列同一性は、種々のアルゴリズムに基づいて多くのプログラムにより決定される。本明細書では、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズムまたはＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムが、特に信頼できる結果を達成する。配列比較には、ＰｉＩｅＵｐプログラム（Feng and Doolittle (1987) J. MoI. Evolution 25: 351 - 360; Higgins et al. (1989) CABIOS 5: 151 - 153）またはＧａｐおよびＢｅｓｔ  Ｆｉｔプログラム（Needleman and Wunsch (1970) J. MoI. Biol. 48: 443 - 453 およびSmith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482 - 489）が使用され、これらはＧＣＧ
ソフトウェアパッケージ（Genetics Computer Group, 575 Science Drive, アメリカ合衆国ウィスコンシン州Madison）に含まれる。
【００２７】
本明細書でパーセントで与えられる配列同一性の値は、以下の設定で配列領域全体に関するプログラムギャップで決定された：ギャップ重量：５０、長さ重量：３、平均マッチ：１０，０００、および平均ミスマッチ：０．０００。特段の指定がない場合、かかる設定を配列比較のための標準設定として使用した。
【００２８】
仮説によって束縛されるわけではないが、コドンが最適化されたＤＮＡ配列ではより効率的な翻訳が可能となり、それによって形成されたｍＲＮＡは細胞内でより長い半減期を有し、それゆえ翻訳により頻繁に利用可能となると仮定される。
【００２９】
当業者は、元の開始核酸配列を、同一アミノ酸であるが異なるコドン使用頻度のポリペプチドをコードする改変核酸配列へ変更させる技術に精通している。例えばこれは、ポリメラーゼ連鎖反応に基づく変異技術、周知のクローニング技術、および化学合成等により達成される。
【００３０】
本発明の目的はさらに、改変核酸配列が配列番号１のヌクレオチド配列のコード領域および配列番号１のヌクレオチド配列のコード領域に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列から成る群から選択され、かつ改変核酸配列が宿主細胞中で活性なプロモータの制御下にある、ヒトＦＳＨのβ鎖をコードするかかる改変核酸配列を有
する組換え核酸分子である。
【００３１】
用語「宿主細胞中で活性なプロモータ」とは、組換え核酸分子内のプロモータが、核酸配列の発現が望まれる宿主細胞中での核酸配列の発現を許容することを意味する。プロモータの活性は、プロモータに結合し、転写を活性化することが可能な転写因子の存在により通常決定される。
【００３２】
哺乳動物細胞での核酸配列の発現に適したプロモータが当業者には周知であり、それにはＣＭＶ、ＳＶ（シミアンウイルス）４０、ＨＴＬＶまたはアデノウイルス主要後期プロモータ等のウイルスプロモータおよびＥＦｌαプロモータまたはＵｂＣプロモータ等の他のプロモータが含まれる。
【００３３】
用語「宿主細胞」は、本発明の目的では、発現（つまり例えばポリペプチドの生産のための核酸配列の転写および翻訳）のために一般に使用される任意の細胞を指す。特に、用語「宿主細胞」または「生物体」は、原核生物、下等な真核生物、植物、昆虫細胞または哺乳動物細胞培養系に関する。好ましくは、宿主細胞は哺乳動物細胞であり、より好ましくは宿主細胞はげっ歯動物細胞であり、さらにより好ましくは、宿主細胞はＣＨＯ細胞と同様のコドン使用頻度を有するげっ歯動物細胞であり、最も好ましくは宿主細胞はＣＨＯ細胞である。
【００３４】
改変配列の発現のためおよび組換えヒトＦＳＨの生産のために使用される宿主ＣＨＯ細胞株は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞株の派生物であり、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）活性が欠如している。細胞株はＤＳＭＺ（ドイツ微生物培養細胞収集有限会社、カタログ番号ＡＣＣ１２６）から得られ、懸濁および無血清培養条件に適合される。
【００３５】
ヒトＦＳＨβ鎖をコードする第１の最適化核酸配列と、ヒトＦＳＨのα鎖をコードする第２の最適化核酸配列とを有する組換え核酸分子を含むＣＨＯ細胞株を、寄託番号ＤＳＭ
ＡＣＣ２８３３の下、ブラウンシュヴァイク（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）のＤＳＭＺに２００７年３月２８日に寄託した。
【００３６】
用語「組換え核酸分子」は、本発明の意味では、宿主細胞へ導入されることが可能であって、組換え核酸分子内に含まれる核酸配列の発現を達成する、任意の種類の核酸分子を含む。用語「ベクター」は特に、プラスミドベクター、アデノウイルス、レンチウイルス、およびレトロウイルスベクター等のウイルスベクターを含み、プラスミドベクターが好ましい。
【００３７】
哺乳動物細胞でタンパク質を発現するために使用可能な適切なプラスミドベクターの例は周知であり、それには例えばｐＣＩベクターシリーズ、ｐＳＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、ｐｃＤＮＡ（登録商標）ベクター、ｐＣＥＰ４、ｐＲＥＰ４、ｐＳＨＯＯＴＥＲ（商標）、ｐＺｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）、ｐＢｌａｓｔ、ｐＭｏｎｏ、ｐＳＥＬＥＣＴ、ｐＶＩＴＲＯおよびｐＶＩＶＯ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ社）が挙げられる。プロモータおよび発現される核酸配列に加えて、組換え核酸分子は通常、ポリアデニル化配列、正しく形質転換された原核生物および／または真核細胞の識別を可能にする原核生物および／または真核生物の選択遺伝子、および複製開始点のような、他の機能的要素も含む。専門家は、特定の目的にはどの要素を選択しなければならないか、また特定の宿主細胞中での特定の核酸配列の発現にはどのプラスミドベクターが適切かが分かっている。
【００３８】
本発明の核酸配列を有する組換え核酸分子は、文献、例えばSambrook and Russell (2001) Molecular cloning - a laboratory manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY, USA.に記載された標準的な分子生物学的方
法により得ることが可能である。
【００３９】
好ましくは、本発明の組換え核酸分子は、ヒトＦＳＨのβ鎖をコードする改変核酸配列と、ＦＳＨのα鎖をコードする核酸配列との両方を含む。
ヒトＦＳＨのα鎖をコードする核酸配列は、配列番号２の核酸配列のコード領域、配列番号２で示された核酸配列のコード領域と少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸配列、配列番号３で示された非改変核酸配列のコード領域、および配列番号３で示された核酸配列のコード領域と少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸から成る群から選択されたヒトＦＳＨのα鎖をコードする最適化核酸配列から選択される。
【００４０】
ヒトＦＳＨのα鎖をコードする核酸配列は、例えば配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）による等、β鎖をコードする核酸配列と同じプロモータに制御されてもよく、または別のプロモータに制御されてもよい。好ましくは、ヒトＦＳＨのα鎖をコードする核酸配列は、別のプロモータに制御される。より好ましくは、ヒトＦＳＨの最適化β鎖をコードする核酸配列はＳＶ４０プロモータに制御され、ヒトＦＳＨのα鎖をコードする核酸配列はＣＭＶプロモータに制御される。最も好ましくは、本発明の組換え核酸分子は配列番号７で示される核酸配列を有する。
【００４１】
さらに本発明は、ヒトＦＳＨのβ鎖をコードする最適化核酸配列と、さらには配列番号２の核酸配列のコード領域、配列番号２で示された核酸配列のコード領域と少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸配列、配列番号３で示された非改変核酸配列のコード領域、および配列番号３で示された核酸配列のコード領域と少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸から成る群から選択された改変核酸配列から選択されたヒトＦＳＨのα鎖をコードする核酸配列とを有する組換え核酸分子を含む宿主細胞に関する。
【００４２】
ヒトＦＳＨのα鎖をコードする核酸配列は、ヒトＦＳＨのβ鎖をコードする最適化核酸配列と同じ組換え核酸分子中に存在してもよいし、または、ヒトＦＳＨのα鎖をコードする核酸配列は別の組換え核酸分子上で宿主細胞へ導入されてもよい。好ましくは、ヒトＦＳＨのα鎖をコードする核酸配列は、ヒトＦＳＨのβ鎖をコードする最適化核酸配列と同じ組換え核酸分子中に存在する。
【００４３】
宿主細胞は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＢＨＫ細胞およびＨｅＬａ細胞等の哺乳動物細胞培養系から選択可能である。好ましくは宿主細胞はげっ歯動物細胞であり、より好ましくは宿主細胞はＣＨＯ細胞と同様なコドン使用頻度を有するげっ歯動物細胞であり、最も好ましくは宿主細胞はＣＨＯ細胞である。
【００４４】
また、本発明の目的は、ヒトＦＳＨのβ鎖をコードする改変核酸配列と、ヒトＦＳＨのα鎖をコードする核酸配列とを有する組換え核酸分子を供えた宿主細胞を含む細胞培養物であり、ヒトＦＳＨのα鎖をコードする核酸配列は、適切な培地中で、上記に定義した非改変核酸配列および改変核酸配列から成る群から選択可能である。
【００４５】
細胞培養物は、宿主細胞の成長を支援する条件下で適切な培地中で宿主細胞を培養することにより得られる。
用語「細胞を培養する」とは、細胞の増殖、正常な代謝、および組換えタンパク質の形成を許容する条件下で細胞をインビボに維持することを意味する。これは、細胞がすべての必要な栄養素だけでなく酸素も供給され、適切なｐＨおよび適切な浸透圧に維持されることを意味する。細胞は任意の適切な方法で培養されてよい。好ましくは細胞は、例えばフラスコ中または回転フラスコ中で、懸濁培養として培養される。用語「培養」は、バッチ培養、流加培養（フェッドバッチ培養）、ならびに灌流培養および他の適切な培養方法
を含む。
【００４６】
「懸濁状態での培養（懸濁培養）」とは、細胞が表面に付着せず、培養液中に分配されることを意味する。
本発明の意味での「バッチ培養」は、培養培地が培養中に加えることも除去することもしない培養方法である。
【００４７】
本発明の意味での「流加培養（フェッドバッチ法）」は、培養培地が培養中に加えられるが、除去されない培養方法である。
本発明の範囲での「潅流方法」は、培地が除去され、新たな培養培地が培養中に加えられる培養方法である。
【００４８】
培養培地は、好ましくは血清含有量が低く、例えば１％（ｖ／ｖ）であり、好ましくは培地は無血清である。適切な培地の例は、ＲＰＭＩ  １６４０、ＤＭＥＭ、Ｆ１２、ＰｒｏＣＨＯ５またはｅＲＤＦのような基本培地であり、これらを混合し、細胞の必要に応じて補足成分を混合してもよい。グルコースとアミノ酸に加えて、培地は、オーリントリカルボン酸（ＡＴＡ）等のキレート化剤、リン酸塩のような無機類、ポリアミン、プトレシン等のそれらの前駆物質、インシュリン等のホルモン、アスコルビン酸およびビタミン混合物等の酸化防止剤、エタノールアミン等の脂質前駆物質、およびプルロニックＦ６８等の細胞保護物質を含み得る。専門家には、特定の細胞種の培養のためにどの培養培地を使用すべきかが理解される。好ましくは、培養培地はＰｒｏＣＨＯ５である。
【００４９】
さらに本発明の目的は、本発明の宿主細胞が一定期間の間適当な培養培地でまず培養され、次に細胞培養上清が採取される方法である。
「細胞培養上清」は、細胞と一定期間接触し、その後細胞から分離された細胞培地である。細胞培養上清は、細胞によって生産された組換えタンパク質を含む。細胞は、濾過および遠心分離等の従来の分離方式によって上清から分けることが可能である。長期培養では、本発明による宿主細胞の上清は、少なくとも５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも１０００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも１５００ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは２０００ｎｇ／ｍｌのＦＳＨ濃度を含む。
【００５０】
組換えヒトＦＳＨは、１または複数の精製工程により細胞培養上清から精製可能である。適切な精製工程が専門家には知られており、それにはイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィーおよびゲルろ過が含まれる。組換えヒトＦＳＨを精製する方法は例えば、国際公開第００／６３２４８号、国際公開第２００６／０５１０７０号、および国際公開第２００５／０６３８１１号に開示されている。
【００５１】
薬剤として投与する場合、患者に投与可能な製剤を得るために、精製組換えヒトＦＳＨが、１または複数の賦形剤と混合される。組換えヒトＦＳＨに適した製剤は、欧州特許出願出願公開０  ８５３  ９４５号、欧州特許出願出願公開１  ２８５  ６６５号、欧州特許出願出願公開０  ９７４  ３５９号、欧州特許出願出願公開１  １８８  ４４４号および欧州特許出願出願公開１  １６９  ３４９号に特に開示されている。
【００５２】
本発明の宿主細胞は、ヒトＦＳＨのβ鎖をコードする改変核酸配列のみ、またはヒトＦＳＨのα鎖をコードする核酸配列をさらに含む本発明の組換え核酸分子で細胞をトランスフェクトさせることにより生産される。代わりに、β鎖をコードする核酸配列およびα鎖をコードするヌクレオチド配列は、宿主細胞へ同時にまたは連続的に導入された別の組換え核酸分子上に存在していてもよい。
【００５３】
適切なトランスフェクション方法が当業者に知られており、それには例えばリン酸カルシウム沈降、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、およびリポフェクションが含まれる。ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ、ＰｏｌｙＦｅｃｔ、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ社）、ＴｒａｎｓＦａｓｔ（商標）、ＰｒｏＦｅｃｔｉｏｎ（登録商標）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、およびＴｒａｎｓＰａｓｓ（商標）（ＮＥＢ）等のトランスフェクション用の市販のキットを使用してもよい。好ましくは、細胞は懸濁状態の間に、無血清条件下でトランスフェクトされる。
【００５４】
商用規模で組換えヒトＦＳＨを生産する場合、細胞は通常安定にトランスフェクトされるが、これは、うまくトランスフェクトされた細胞はトランスフェクト後に死滅させる選択試薬によって選択され、耐性遺伝子を含むトランスフェクト細胞は成長し続けることを意味する。適切な選択試薬には、ゼオシン、ネオマイシンおよびプロマイシン等の抗生物質、ならびにメトトレキサートのような他の薬が含まれる。
【００５５】
本発明を、限定として理解されるべきではない以下の実施例により説明する。
実施例
１．  ヒトＦＳＨのα鎖およびβ鎖をコードする最適化核酸配列を有する組換え核酸分子のクローニング
既にＳＶ４０ポリアデニル化部位、スプライス部位、およびＲＳＶプロモータ、マウスジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ならびにＳＶ４０ポリアデニル化部位およびスプライス部位から成るｄｈｆｒ遺伝子カセットを含む、ｐＵＣ１８ベクターバクボーンを使用した。ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子は、正しくトランスフェクトした細胞の選択およびメトトレキサート薬によるトランスフェクト遺伝子の増幅を可能にする。
【００５６】
ヒトＦＳＨのα鎖およびβ鎖の非改変配列は、Fiddes and Goodman (1979) Nature 281
: 351-356 およびJameson et al. (1988) MoI. Endocrinol. 2(9): 806-815,からそれぞれ得た。これらの配列を、頻繁に使用されているＣＨＯ遺伝子中のコドン使用頻度にコード領域が適合されるように最適化した。
【００５７】
さらに、追加の終止コドンを、翻訳の効率的な終了を保証するために導入した。β鎖およびα鎖のための最適化ヌクレオチド配列を、配列番号１および２にそれぞれ示し、野生型および改変核酸配列の比較を図１ａおよび１ｂに示す。配列比較により、ヒトＦＳＨのα鎖をコードする改変核酸配列と非改変核酸配列は８０％同一であるが、ヒトＦＳＨのβ鎖をコードする改変核酸配列と非改変核酸配列―の鎖は８５％同一であることが分かる。
【００５８】
改変配列を、それらを制限酵素ＳａｃＩＩおよびＮｃｏＩで切断し、その後ライゲーションを行うことにより、ｐＵＣ１８バックボーンの２つのコピーに別々に挿入した。
ＣＭＶプロモータおよびシミアンウイルス４０プロモータを、以下のプライマーで適切なテンプレートＤＮＡから増幅し、同時にＡｓｃＩおよびＰａｃＩ制限部位（以下のプライマーでは下線を引いている）を同時に導入した：
Ａｓｃ−ＣＭＶＦプライマー
５’−ＧＧＣ  ＧＣＧ  ＣＣＴ  ＴＴＴ  ＧＣＴ  ＣＡＣ  ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＣＧ−３’（配列番号８）
Ｐａｃ−ＣＭＶ−Ｒプライマー
５’−ＣＣＴ  ＴＡＡ  ＴＴＡ  ＡＧＡ  ＧＣＴ  ＧＴＡ  ＡＴＴ  ＧＡＡ  ＣＴＧ  ＧＧＡ  ＧＴＧ−３’（配列番号９）
Ａｓｃ−ＳＶ４０−Ｆ  プライマー
５’−ＧＧＣ  ＧＣＧ  ＣＣＧ  ＣＡＴ  ＡＣＧ  ＣＧＧ  ＡＴＣ  ＴＧ−３’（配列番号１０）
Ｐａｃ−ＳＶ４０−Ｒ  プライマー
５’ −ＣＣＴ  ＴＡＡ  ＴＴＡ  ＡＧＴ  ＴＣＧ  ＡＧＡ  ＣＴＧ  ＴＴＧ、ＴＧＴ
ＣＡＧ  ＡＡＧ  Ａ−３’（配列番号１１）
ＣＭＶプロモータを、プラスミドを制限酵素ＡｓｃＩおよびＰａｃＩで切断してライゲーションを行うことによりヒトＦＳＨのα鎖を含むプラスミドへ導入し、ＳＶ４０プロモータを、プラスミドを制限酵素ＡｓｃＩおよびＰａｃＩで切断してライゲーションを行うことによりヒトＦＳＨのβ鎖を含むプラスミドへ導入した。
【００５９】
最後に、ＳＶ４０プロモータ、β鎖をコードする核酸配列、およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含むヒトＦＳＨのβ鎖に対する発現カセットを、以下のプライマーを用いて増幅し、同時に増幅物の５’端および３’ 端の両方にＮｏｔＩ制限部位（以下のプラ
イマーでは下線を引いている）を導入した。
β−ＮｏｔＩ−Ｆ  プライマー
５’−ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＡ  ＴＡＣ  ＧＣＧ  ＧＡＴ  ＣＴＧ  Ｃ）  ３’（配列番号１２）
β−ＮｏｔＩ−Ｒ  プライマー
５’−ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＣＡＣ  ＴＣＡ  ＴＴＡ  ＧＧＣ  ＡＣＣ、ＣＣＡ  ＧＧ）−３’（配列番号１３）
その後、増幅物を、ヒトＦＳＨのα鎖を含むＮｏｔＩで切断されたプラスミドに挿入した。α鎖をコードする最適化核酸配列とβ鎖をコードする最適化核酸配列の両方を含む得られたプラスミドを図２に示す。両方の最適化核酸配列を備えたプラスミドの配列を、配列番号７で示す。
２．ヒトＦＳＨのα鎖およびβ鎖の異なる組み合わせを含む組換え核酸分子によるＣＨＯ細胞の一過性トランスフェクション
α鎖をコードする最適化核酸配列またはβ鎖をコードする最適化核酸配列を、対応の野生型のβ鎖またはα鎖と組み合わせて含むか、もしくは両方の最適化配列を含むプラスミドを、上記１）に記載された通りに生産した。ＤＮＡを、全量が２００μｌとなるようＨＴなしで８ｍＭグルタミンを含む培地ＰｒｏＣＨＯ５（Ｌｏｎｚａ社）と混合された。その後、２０μｌのＳｕｐｅｒＦｅｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ社）をＤＮＡ溶液に加え、混合した。その後、この混合物を室温で５−１０分間インキュベートした。
【００６０】
１．６８×１０6ＣＨＯ細胞を含むありコートを遠心し（５分、８００ｒｐｍ、１８−
２５℃）、上清を除去し、細胞をＨＴなしで８ｍＭグルタミンを含む１．１ｍｌの培地ＰｒｏＣＨＯ５に再懸濁した。その後、懸濁物をＤＮＡ混合物に移し、ＤＮＡ混合物を５−１０分間インキュベートし、混合し、６ウェルプレートのウェルに移した。細胞を３７℃で３時間インキュベートし、このインキュベートにより細胞を接着させた。上清を除去し、細胞を１ｍＬＰＢＳで３回洗浄し、次にＨＴなしで８ｍＭグルタミンを含む２ｍｌ  ＰｒｏＣＨＯ5）を追加した。３７℃で２日間インキュベートした後、上清を除去し、遠心
した。上清を濃縮し（濃縮係数１６．６７）、ＦＳＨ濃度をＥＬＩＳＡリーダー（Ａｎｏｇｅｎ社）で決定した。この測定結果を図３に示す。
【００６１】
結果、改変α鎖と野生型β鎖との組み合わせの導入は、２つの野生型鎖の組み合わせに対してほぼ５０％の発現の減少につながることが示されている。対照的に、改変βは、野生型α鎖および改変α鎖のいずれと組み合わせても、野生型α鎖および野生型β鎖の組み合わせに比較して、１．５〜３倍だけ一過性ＦＳＨ発現が増大する。したがって、とくに、改変α鎖は積極的にＦＳＨ生産に影響を及ぼさないが、改変β鎖の使用は一過性トランスフェクション後のＦＳＨ発現の有意の増大につながる。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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