(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリーブの果実の水性、エタノール又は水−エタノール抽出物とリン脂質のアルコール溶液との乾燥混合物からなる複合体であって、リン脂質のオリーブ果実抽出物に対する比が、１０〜１w/wの範囲にある、複合体。
【請求項２】
リン脂質が、ダイズリン脂質である、請求項１記載の複合体。
【請求項３】
リン脂質のオリーブ果実抽出物に対する比が、５〜１w/wの範囲にある、請求項１又は２記載の複合体。
【請求項４】
リン脂質のアルコール溶液が、エタノール溶液である、請求項１〜３のいずれか一項記載の複合体。
【請求項５】
オリーブの果実の水性、エタノール又は水−エタノール抽出物を、アルコール性溶媒中でリン脂質と反応させ、次にこの複合体を、濃縮及び乾燥により単離する、請求項１〜４のいずれか一項記載の複合体の製造方法。
【請求項６】
アルコール性溶媒が、エタノールである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
適切な医薬担体と混合した、請求項１〜４のいずれか一項記載の複合体を活性成分として含む、医薬組成物。
【請求項８】
化学予防作用、酸化防止作用及び心血管疾患予防作用を有する医薬の製造のための、請求項１〜４のいずれか一項記載の複合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改善されたバイオアベイラビリティを有するオリーブの果実又は葉の抽出物の新規なリン脂質複合体に関する。
【０００２】
技術的背景
オリーブ（Olea europea）の活性成分に関する研究は、数十年にわたり実施されており、それらの性質は、最近になって実験及び臨床研究において確認された（１）。
【０００３】
葉で検出できる主要な成分であるオレウロペイン（oleuropein）が、血圧低下作用、冠状血管拡張作用及び抗不整脈作用を担う化合物であることが報告された。ある研究（２）では、オリーブ葉から単離されたトリテルペノイドの抗高血圧効果、利尿効果、抗動脈硬化症効果、酸化防止効果及び血糖低下効果が、食塩感受性遺伝性高血圧ラットモデルで確認された。オリーブ葉の抽出物はまた、ルチン及びヘスペリジンを含む他の相乗的植物化学物質を含む。これらは、毛細管（血管）の強度を増大させ、かつその透過性を調節するその能力に不可欠である。
【０００４】
オリーブ油に関する限り、幾つかの研究が、そこに含まれるフェノール性化合物の重要な役割を証明している。主要成分である、チロソール、ベルバスコシド（verbascoside）及びヒドロキシチロソールは、インビボでＬＤＬ酸化の強力なインヒビターであるが（３−４）、この酸化は、冠動脈性心疾患の発生の一因であることが仮定されている、アテローム動脈硬化性プラークの形成に結びついている。ヒドロキシチロソールは、単独で、冠動脈性心疾患及びアテローム動脈硬化のリスクを軽減する（５−６）ことが報告されており、インビトロではＬＤＬの硫酸銅誘導性酸化の強力で用量依存性のインヒビターである。これらの結果はまた、動物モデルにおいても得られた（７）。ベルバスコシドは、スーパーオキシドアニオン及びヒドロキシルラジカルに及ぼす強力なスカベンジング作用を持つこと（８−９）、また、マウス肝ミクロソーム、ラット肝ミトコンドリアの過酸化反応、及びラジカルにより誘導される赤血球の溶血を阻害するための酸化防止剤としても作用することが証明されており、その酸化防止能力は、多くの他の実験モデルにおいて明らかになっている。
【０００５】
最近の研究では、ヒドロキシチロソール並びにそのセコイリドイド誘導体及び代謝物のような、バージンオリーブ油フェノール性成分、即ち、オルト−ジフェノール構造を持つ化合物が、強力な酸化防止効果、更には他の生体関連効果を発揮することが証明されている（１０−１１）。これらの結果の大部分は、インビトロ系で得られているが（１２−１３）、インビボのオリーブ油フェノール類の生物学的活性の証拠もまた蓄積している（１４−１５）。ヒドロキシチロソール（ＨＴ）は、恐らく最も活性なオリーブフェノール類であり、その処方により程度の差はあっても、ヒトに用量依存的に吸収されることが証明されている。一例として、これをヨーグルトに混ぜ込むと、抽出物トラバージンオリーブ油の天然成分としての投与後に比較して、そのバイオアベイラビリティは低下する（１６）。
【０００６】
したがって、バイオアベイラビリティが改善した新規なオリーブの果実又は葉の抽出物誘導体を見い出すことは非常に望ましいことである。
【０００７】
天然、合成又は半合成リン脂質との、植物抽出物又はその精製成分の複合体化合物は、例えば、EP 209,038、EP 275,005、EP 283,713、EP 1,035,859及びEP 1,140,115に開示されている。上述の複合体は、その親油性のために、抽出物又は精製成分の血漿中のバイオアベイラビリティを改善している。EP 275,005は、複合体の形成が、非プロトン性溶媒中で行われると述べている。EP 1,140,115は、上述の複合体の調製に使用することができる種々の溶媒の中でエタノールについて一般的に言及しているが、溶媒としてエタノールを利用する調製例を提供していない。更には、開示される複合体は、プロアントシアニジンＡ２のリン脂質複合体であるが、これは、本発明のオリーブの果実又は葉の抽出物のリン脂質複合体とは化学構造が全く異なっている。
【０００８】
発明の開示
本発明は、オリーブの果実又は葉の抽出物のリン脂質複合体に関する。
【０００９】
本発明のリン脂質複合体は、処方されていないオリーブの果実又は葉のエタノール抽出物よりも高い、親物質の全身レベルを与えることが見い出された。
【００１０】
したがって、本発明は、バイオアベイラビリティが改善したオリーブの果実又は葉の抽出物の新規なリン脂質複合体に関する。第１の実施態様において、本発明は、オリーブの果実又は葉の水性抽出物のリン脂質複合体に関する。第２の実施態様において、本発明は、オリーブの果実又は葉のエタノール又は水−エタノール抽出物のリン脂質複合体に関する。
【００１１】
本発明では、植物又は合成由来のリン脂質を使用することができ、特に好ましいのは、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミンのような、ダイズリン脂質である。
【００１２】
本発明では、本複合体は、プロトン性溶媒に溶解したオリーブの果実又は葉の抽出物にリン脂質を加えること、更に具体的には、還流下で撹拌しながら、オリーブの果実又は葉の抽出物のエタノール溶液にリン脂質を加えることにより調製する。生じる懸濁液は、減圧下で濃縮することにより残渣が得られるが、これを次に乾燥する。リン脂質のオリーブの果実又は葉の抽出物に対する比は、１０〜１w/wの範囲であり、更に好ましいモル比は５：１w/wである。
【００１３】
本発明はまた、適切な医薬担体と混合した、本発明のオリーブの果実又は葉の抽出物のリン脂質複合体の１つを活性成分として含む、医薬組成物に関する。
【００１４】
本発明は更に、化学予防作用、酸化防止作用及び心血管疾患予防作用を有する医薬の製造のための、本発明のオリーブの果実又は葉の抽出物のリン脂質複合体の使用に関する。
【００１５】
以下の実施例により本発明を更に説明する。
【００１６】
実施例
オリーブの果実又は葉の抽出物の調製
実施例３及び４に使用されるオリーブの果実の抽出物は、以下のとおり調製した。新鮮なOlea europaea L.果実（オリーブ）を破砕し、混練して遠心分離することにより、油及びベジテーション水（vegetation water）の一部を除去した。生じた物質（オリーブ搾りかす）を次に水性エタノール（エタノール：水  ６：４）で６０℃で抽出して、涸渇した搾りかすを排出した。この抽出物を濾過し、プールして濃縮することにより、エタノールを除去して、水不溶性不純物を遠心分離により除去した。この清澄化溶液から減圧下で溶媒を留去することにより、乾燥オリーブ果実精製抽出物を得た（フォリン・シオカルトー（Folin-Ciocalteau）測定法による総フェノール含量：９．５％w/w）。
【００１７】
この抽出物は、吸着樹脂で更に精製することにより、３０％w/wの総フェノール含量（フォリン・シオカルトー測定法）が得られ、そしてこれを実施例１及び２に使用した。
【００１８】
実施例５で使用される抽出物の調製は、実施例３及び４で使用される抽出物の調製と同様であるが、唯一の違いは、オリーブ搾りかすを精製水で抽出したことである。
【００１９】
実施例６及び７で使用される葉抽出物は、代わりにOlea europaea L.葉を水性エタノール（エタノール：水  ９：１）で７０℃で抽出することにより調製した。この抽出物を濾過し、プールして濃縮することにより、エタノールを除去して、水不溶性不純物を遠心分離により除去して、廃棄した。この清澄化溶液を減圧下で乾燥することにより、乾燥オリーブ葉精製抽出物（ＨＰＬＣ測定法によるポリフェノール含量：２０．８％w/w）を得たが、これを実施例６に使用した。この抽出物は、吸着樹脂で更に精製することにより、４１．６％w/wの総フェノール含量（ＨＰＬＣ測定法）を得ることができ、そしてこれを実施例７に使用した。
【００２０】
実施例１：  オリーブ果実精製エタノール抽出物のリン脂質複合体の調製
機械的撹拌下で還流エタノール（１．６ｌ）にダイズリン脂質（１５０ｇ）をゆっくり加えた。この懸濁液を撹拌しながら１時間還流し、次に６０℃に保持した水性アルコール（エタノール−水  ７．５：２．５）１００ml中のオリーブ果実精製抽出物（フォリン・シオカルトー測定法による総フェノール：３０％w/w；ＨＰＬＣ測定法：ベルバスコシド７．３８％w/w）５０ｇの溶液を加えた。添加終了後、この混合物を撹拌しながら１時間還流し、次いで濾過した。生じた溶液を蒸留により７０％w/w乾燥残渣になるまで濃縮し、次に真空下で４０℃で６８時間乾燥した。
【００２１】
フォリン・シオカルトー測定法による総フェノール含量８．８６％w/w及びＨＰＬＣ測定法によるベルバスコシド含量２．２４％w/wを有する生成物１５８ｇを得た。
【００２２】
有機溶媒中の生成物の溶解度は、出発抽出物とは著しく異なる。実際に、出発精製抽出物は、塩化メチレン、クロロホルム及びアセトンに不溶性であり、そしてエタノールに部分的にのみ可溶性であるが、複合体化抽出物は、塩化メチレン及びクロロホルムに可溶性であり、そしてアセトン及びエタノールに不溶性である。
【００２３】
１Ｈ、１３Ｃ及び３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルは、複合体形成を裏付けた。３１Ｐ−ＮＭＲ分析からの最も顕著なデータは、表１に報告した。表１のエントリー１及び３について示したように、複合体化されていないリン脂質は、ＣＤＣｌ３ ３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルにおいてδ０．３に鋭いシグナルを有する。複合体化リン脂質は、対照的に、同じ表のエントリー２について示したように、δ０．７にはるかに広いシグナルを有する（Δ値を参照のこと）。１Ｈ及び１３Ｃ核は、ＣＤＣｌ３中の３１Ｐと同じ挙動をとる。プロトン及び炭素スペクトルは、別表に示した。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
実施例２：  オリーブ果実精製エタノール抽出物のホスファチジルコリン複合体の調製
ホスファチジルコリン１００ｇをエタノール１．６ｌに溶解した。この混合物を機械的撹拌下で還流し、次にオリーブ果実精製抽出物（フォリン・シオカルトー測定法による総フェノール：３０％w/w；ＨＰＬＣ測定法：ベルバスコシド７．３８％w/w）５０ｇを６０℃に保持した水性アルコール（エタノール−水  ７．５：２．５）１００mlに溶解して得られる溶液に滴下により加えた。添加終了後、この混合物を撹拌しながら１時間還流し、次に７０％w/w乾燥残渣になるまで濃縮し、最後に真空下で４０℃で６８時間乾燥した。
【００２６】
フォリン・シオカルトーＵＶ測定法による総フェノール含量１０％w/w及びＨＰＬＣ測定法によるベルバスコシド含量２．４６％w/wを有する生成物１５０ｇを得た。生成物のＮＭＲスペクトルは、実施例１で得られたものと類似していた。
【００２７】
実施例３：  オリーブ果実エタノール全抽出物のリン脂質複合体の調製
機械的撹拌下で還流エタノール１．６ｌにリン脂質１５０ｇをゆっくり加えた。添加終了後、この懸濁液を撹拌しながら１時間還流した。６０℃に保持した水性アルコール（エタノール−水  ７．５：２．５）１００ml中のオリーブ果実精製抽出物（フォリン・シオカルトー測定法による総フェノール含量：９．５％w/w）５０ｇの溶液を滴下により加えた。添加終了後、この混合物を撹拌しながら１時間還流し、次いで濾過した。生じた溶液を７０％w/w乾燥残渣になるまで濃縮し、次に真空下で４０℃で６８時間乾燥した。
【００２８】
フォリン・シオカルトーＵＶ測定法による総フェノール含量２．７％w/wを有するオリーブ果実全抽出物のダイズリン脂質複合体１６７ｇを得た。生成物のＮＭＲスペクトルは、実施例１で得られたものと類似していた。
【００２９】
実施例４：  オリーブ果実エタノール全抽出物のホスファチジルコリン複合体の調製
ホスファチジルコリン１００ｇをエタノール７００mlに溶解し、この混合物を機械的撹拌下で還流した。６０℃に保持した水性アルコール（エタノール−水  ７．５：２．５）１００ml中のオリーブ果実精製抽出物（フォリン・シオカルトー測定法による総フェノール含量：９．５％w/w）５０ｇの溶液を滴下により加えた。添加終了後、この混合物を撹拌しながら１時間還流し、次に７０％w/w乾燥残渣になるまで大気圧下の蒸留により濃縮し、次いで真空下で４０℃で６８時間乾燥した。
【００３０】
フォリン・シオカルトーＵＶ測定法による総フェノール含量４．１％w/wを有する生成物１７５ｇを得た。生成物のＮＭＲスペクトルは、実施例１で得られたものと類似していた。
【００３１】
実施例５：  オリーブ果実水性全抽出物のリン脂質複合体の調製
リン脂質１００ｇをエタノール（１２５０ml）に溶解し、機械的に撹拌しながら還流した。オリーブ果実水性全抽出物（フォリン・シオカルトー測定法による総フェノール含量：６．８％w/w）５０ｇをこの混合物にゆっくり加えた。添加終了後、この混合物を撹拌しながら１時間還流し、次に濾過した。生じた溶液を７０％w/w乾燥残渣になるまで濃縮し、次いで真空下で４０℃で６８時間乾燥した。
【００３２】
フォリン・シオカルトーＵＶ測定法による総フェノール含量２．３％w/wを有する生成物１３９ｇを得た。生成物のＮＭＲスペクトルは、実施例１で得られたものと類似していた。
【００３３】
実施例６：  オリーブ葉エタノール全抽出物のホスファチジルコリン複合体の調製
オリーブ葉全水性アルコール抽出物（ＨＰＬＣ測定法によるポリフェノール含量：２０．８％w/w）１００ｇをエタノール２５７０ml中のホスファチジルコリン１２８ｇの溶液に溶解した。生じた溶液を１時間還流し、次に減圧下で７０％w/v乾燥残渣を有する懸濁液になるまで濃縮した。この生成物を最後に４０℃で真空下で２４時間乾燥することにより、明褐色の生成物（ＨＰＬＣ測定法によるポリフェノール：９．３％w/w）２１８ｇを得た。生成物のＮＭＲスペクトルは、実施例１で得られたものと類似していた。
【００３４】
実施例７：  オリーブ葉精製エタノール抽出物のホスファチジルコリン複合体の調製
オリーブ葉精製水性アルコール抽出物（ＨＰＬＣ測定法によるポリフェノール：４１．６％w/w）１００ｇをエタノール２５７０ml中のホスファチジルコリン１１５ｇの溶液に溶解した。生じた溶液を１時間還流し、次に減圧下で７０％w/v乾燥残渣を有する懸濁液になるまで濃縮した。この生成物を最後に４０℃で真空下で２４時間乾燥することにより、明褐色の生成物（ＨＰＬＣ測定法によるポリフェノール：１８．８％w/w）１９６ｇを得た。生成物のＮＭＲスペクトルは、実施例１で得られたものと類似していた。
【００３５】
実験セクション
本発明のリン脂質複合体のバイオアベイラビリティと複合体化されていないオリーブの果実又は葉のエタノール抽出物のそれとを比較するために試験を行った。
【００３６】
経時的フェノール類のバイオアベイラビリティ及び用量範囲は、複合体化されていない形とリン脂質と複合体化された形の両方の高度に標準化されたオリーブの果実の抽出物のボランティアへの投与後、総ＨＴとして、及びその最も代表的代謝物、即ち、ホモバニリルアルコール（ＨＶＡｌｃ）としての両方の、２４時間にわたる尿中排泄の評価によって判断した。
【００３７】
更に、高度不飽和脂肪酸であるアラキドン酸の非酵素的酸化により形成される、全身の脂質過酸化反応の容認されたマーカーである、尿中イソプロスタン類の排泄に及ぼす処置の効果を評価した。
【００３８】
６名の健常男性ボランティアを、それぞれ３名の２群に割り当てた。第１群には、本発明の複合体（以降オレアセレクト（OLEASELECT）（商標）フィトソーム（Phytosome）（登録商標）と呼ぶ）を投与した。第２群には、高度に標準化されたオリーブの果実の抽出物の複合体化されていない形（以降オレアセレクト（商標）と呼ぶ）を投与した。
【００３９】
全ての被験者には、３日間オリーブ油を含まない食餌を摂らせ（洗い出し期間）、次にそれぞれオレアセレクト（商標）フィトソーム（登録商標）、又はオレアセレクト（商標）のいずれかを、１回目に１カプセル、２回目に２カプセル、そして３回目に４カプセルを各投与の間を１週間として投与した。２４時間の尿を処置の前日及び後日に収集した。尿容量を測定して、アリコートを−８０℃で貯蔵した。
【００４０】
ＨＴ及びその代謝物のホモバニリルアルコール（ＨＶＡｌｃ）の尿中濃度を処置の前後に評価した。試料を抽出して、グルクロニダーゼと共にインキュベートし、質量分析に直結したＨＰＬＣにより分析した（８）。Ｆ２−イソプロスタン類の尿中濃度は、免疫測定法により測定した（９）。各値は、クレアチニンの濃度（メトラ（Metra）・クレアチニンアッセイキット、クィデル（Quidel））に対して標準化してpg/mｇクレアチニンとして表した。結果は、対データのための両側スチューデントｔ検定により統計的有意性について解析した。
【００４１】
オレアセレクト（商標）フィトソーム（登録商標）で処置した群は、５．２〜７．９の範囲のＨＴ及びＨＶＡｌｃのパーセンテージを示した。この結果は、経口のバイオアベイラビリティの激しい増加を証明した。イソプロスタン類の用量依存性の減少も観測した。
【００４２】
オレアセレクト（商標）単独で処置した群は、１〜２．３の範囲のＨＴ及びＨＶＡｌｃのパーセンテージ、即ち、はるかに低い経口のバイオアベイラビリティを示した。
【００４３】
【表２】
0005528799.tif 000003