(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
臍帯血、循環血または造血骨髄由来の前駆細胞を試験管内分化によって得られる血管内皮前駆体細胞（ＥＰＣｓ）と、臍帯血、末梢血または造血骨髄由来の前駆細胞を試験管内分化によって得られる平滑筋前駆体細胞（ＳＭＣｓ）とを具備する血管再生促進薬剤であって、前記血管内皮前駆体細胞（ＥＰＣｓ）が、前記血管内皮前駆体細胞を活性化するためのタンパク性物質を受容できるとともに、チロシンキナーゼ活性を有する特異的Ｅｐｈ受容体を発現し、ならびに、前記タンパク性物質が、前記特異的Ｅｐｈ受容体の特異的リガンドとしてエフリンリガンドを含み、前記リガンドが結合ポリペプチドと結合していることを特徴とする血管再生促進薬剤。
【請求項２】
前記特異的Ｅｐｈ受容体が、ＥｐｈＢ型の受容体であることを特徴とする請求項１に記載の血管再生促進薬剤。
【請求項３】
前記特異的Ｅｐｈ受容体が、ＥｐｈＢ４型の受容体であることを特徴とする請求項２に記載の血管再生促進薬剤。
【請求項４】
前記特異的リガンドが、エフリンＢリガンドであることを特徴とする請求項１に記載の血管再生促進薬剤。
【請求項５】
前記特異的リガンドが、エフリンＢ２リガンドであることを特徴とする請求項１に記載の血管再生促進薬剤。
【請求項６】
前記結合ポリペプチドが、Ｆｃイムノグロブリン断片であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の血管再生促進薬剤。
【請求項７】
前記平滑筋前駆体細胞（SMCs）は、臍帯血または末梢血に由来する前駆体の試験管内分化によって得られたもの、又は、造血骨髄に由来する前駆体の試験管内分化によって得られたものであることを特徴とする請求項１〜６いずれか１項に記載の血管再生促進薬剤。
【請求項８】
前記平滑筋前駆体細胞（SMCs）は、筋肉のバイオプシーによって得られたものであることを特徴とする請求項１〜７いずれか１項に記載の血管再生促進薬剤。
【請求項９】
虚血組織の血管再生を促進させるための医薬の調製を目的とした請求項１〜８いずれか１項に記載の血管再生促進薬剤の使用。
【請求項１０】
化学療法において投与した薬剤を腫瘍の内部へ拡散させるための腫瘍の血管形成を正常化させるための医薬の調製を目的とした請求項１〜９いずれか１項に記載の血管再生促進薬剤の使用。
【請求項１１】
治癒相にある傷害を受けた組織の血管再生を促進させるための医薬の調製を目的とした請求項１〜１０いずれか１項に記載の血管再生促進薬剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は血管再生を促進するための薬剤としての細胞調製物、および細胞調製物の使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
多数の疾患がここでは対象となるが、それらの疾患は概して血管系の変性あるいは破壊へ至らしめる疾患である。そのような状況は特に動脈血の組織あるいは器官への供給が減少ないし停止する時におきる。
【０００３】
細胞治療とはそもそも、その組織が何であれ、試験管内で、ないしはその他の方法で培養され、次いで退化した組織に移植される特異的な細胞に基づいて退化した組織を再生させることである。これら細胞治療は既に様々な疾患の治療において優位性を発揮してきている。
【０００４】
（細胞治療の）一般原理は本質的にはある種の細胞はそれらの発生のある時期において増殖し、移植された組織の形態および特殊な機能を獲得するような特殊化された細胞を生み出すようにと分化するという能力に依存している。胚性幹細胞は受精後の初期のステージにあり、未分化で体の全ての組織の形成へと導くことが出来るであろう。これに反して、成人の幹細胞は既に特殊化された組織のプログラムに組み込まれているのでそれらははっきり決まった組織の形成あるいは再生へと導くことが出来るのみである；これらは多能性と呼ばれ、一方、胚性幹細胞は全能性である。
【０００５】
さらに、幹細胞の分裂によって生じる前駆細胞はそれらの発生中に既にある程度の特殊化を獲得しており生理学的には機能性を有している。
【０００６】
かくして、骨格筋由来の組織に基づく多能性の幹細胞の集団を調製するというアイデアは既に提出されている。とくに文献WO03/027281に言及することが出来るが、それには骨格筋細胞や他の多くの細胞、特に平滑筋細胞、心筋細胞、血液細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞など等へと分化できるそういった多能性幹細胞の調製過程が記載されている。
【０００７】
この過程は多くのタイプの組織の再生が目的で多分化能の幹細胞集団を調製することを可能としているが、反面、実施するとなると比較的複雑となる。
【０００８】
さらに、心筋層の組織は再生するための心筋細胞を欠損しているので、その中で優勢を占めるのが筋芽細胞である比較的均一な細胞集団を調製し、これらの細胞集団を直接筋組織に注入するかまたは間接的に動脈の流れに注入すると言うアイデアが提出されている。文献WO01/94555に言及することもまた出来る。そこにはそのような過程が記載されている。
【０００９】
また、様々な細胞集団をソートする（分別する）には特殊な細胞マーカーの観察が必要である。さらに、得られた細胞集団は心筋の再生に特異的に適している。
【００１０】
かくして、上記に分析された最初の文献は得られた多能性幹細胞集団の比較的広範囲の使用スペクトラムを示しているが、前―血管形成活性に関する説得力のある結果を得ることを可能とはしていない、一方、二番目の文献は筋芽細胞の特性を現す特殊な細胞集団を開示しているが、その結果、より限定された用途を持つこととなる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開公報ＷＯ０３／０２７２８１明細書
【特許文献２】国際公開公報ＷＯ０１／９４５５５明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
生じていている一つの問題、そして本発明が解決しようともくろんでいる課題は、投与すれば傷ついた哺乳類の、とくに人の組織の血管系を再構成することを可能とする、血管再生を促進する試薬としての用途のための細胞調製物を提供することである。さらにはそのような調製物を比較的容易に得られることが必要である。
【００１３】
この課題を解決するために、本発明は血管再生促進試薬としての用途のために、血管内皮細胞の前駆細胞（EPCs；血管内皮前駆細胞）および平滑筋細胞（SMCs；平滑筋細胞）の前駆細胞を含む細胞調製物を、同時に、または別々に、あるいは時差的に投与するための組み合わせ製品として提供する。
【課題を解決するための手段及び発明の効果】
【００１４】
よって、本発明の一つの特徴は二つのタイプの細胞を使用することにある。そして血管内皮前駆細胞も平滑筋の前駆細胞もともに元々存在する血管を基にして毛細血管の形成および発達を促進すべく相互作用する。それ故、血流が減少あるいは停止しているどのような細胞組織であれ、梗塞している組織へ血管内皮前駆細胞および平滑筋細胞の前駆細胞を注入すると、もちろん血流が正常に再び見られる条件下で毛細血管の再生が誘導される。
【００１５】
前述の血管内皮前駆細胞(EPCs)は、望むらくは臍帯血あるいは造血骨髄あるいは末梢循環血あるいは全く別の何らかの組織に由来する前駆細胞を試験管内で分化させることで得られる。後により詳細に説明するように、単核細胞が、例えば臍帯血から得られる。次いでそれらの試験管内での分化が誘導され、それらを回収し、平滑筋前駆細胞と組み合わせるために。
【００１６】
とくに好都合には、前述の血管内皮前駆細胞(EPCs)は前述の血管内皮前駆細胞(EPCs)を活性化させるためのタンパク性物質を受容することの出来る特殊な受容体を発現している。かくして、血管内皮前駆細胞の活性化はこれら前駆細胞と平滑筋前駆細胞との補完的な相乗効果を誘導する。その相乗効果は活性化されていない前駆細胞単独あるいは平滑筋前駆細胞単独よりもより大きな血管再生あるいは前―血管形成活性を導く。
【００１７】
好都合には、前述の特殊な受容体とは、チロシンキナーゼ活性を持つEphであり、例えばEphB型、より正確にはEphB4である。さらにタンパク性物質は望むらくは前述マーカーの特殊なリガンドを含み、そのリガンドは結合ポリペプチドと結合している。さらに提出された実施例によると、特殊なリガンドとはエフリンリガンド、例えばエフリンBあるいはより正確にはエフリンB2あるいはエフリンB１である。結合ポリペプチドに関しては、これは望むらくはFcイムノグロブリン断片である。
【００１８】
このように、特殊な受容体を発現していて、その受容体はリガンドおよび結合ポリペプチドより構成されるタンパク性物質と結合する、そういった血管内皮細胞が得られる：そのような血管内皮前駆細胞は次いで活性化を受ける。
【００１９】
平滑筋細胞(SMCs)の前駆細胞に関しては、これらは望ましくは臍帯血あるいは造血骨髄あるいは末梢循環血あるいは全く別の何らかの組織に由来する前駆細胞を試験管内で分化させることで得られる。血管内皮前駆細胞と全く同様に単核細胞が最初に分離される。例えば臍帯血から得られ次いでそれらが平滑筋細胞の前駆細胞へと分化誘導される。それらは次いで回収され、投与のために血管内皮前駆細胞と組み合わせられる。
【００２０】
本発明の別の実施例に拠れば、前述の平滑筋細胞の前駆細胞(SMCs)は筋肉組織のバイオプシーから得られる。その組織は人の骨格筋から得られ、平滑筋細胞の前駆細胞のみを同定し回収するために細胞培養に付される。これらの平滑筋細胞の前駆細胞は、実際、特殊な細胞マーカーによって明らかに同定できる。
【００２１】
別の局面によれば、本発明は、哺乳類、特に人の虚血性の組織の血管再生および血管形成を促進することを意図した細胞組成の調製のための血管内皮前駆細胞と平滑筋細胞の前駆細胞を組み合わせる細胞調製物の用途を提供している。さらに、腫瘍の血管再生を正常化させることを意図した医薬の調製を目的とした血管内皮前駆細胞と平滑筋細胞の前駆細胞との組み合わせも考えられる。
【００２２】
より広くいえば、治癒相にある損傷を受けた組織の血管再生を促進させることを意図した医薬の調製を目的とした血管内皮前駆細胞と平滑筋細胞の前駆細胞とを組み合わせた細胞調製物の使用が考えられる。それ故、以下のような病理学的状態の治療が本発明による細胞の調製物の助けによってなされることが考えられる：放射線あるいは放射線後の皮膚炎、やけど、あるいは外傷または何らかの他の原因による皮膚の障害。
【００２３】
さらに、血管内皮前駆細胞と平滑筋細胞の前駆細胞とを組み合わせた細胞調製物は、化学療法あるいは放射線療法の抗がん治療に先立ってあるいは同時投与によるがんの予防または治療処置を意図した治療用の組成物の調製物としてふさわしい。それはまた、血管の奇形、特に血管腫にも適している。
【００２４】
より一般的にいえば、前―血管形成活性のある成分としての本発明のようなタイプの細胞調製物の用途としては、生理学的に受容できるような賦形剤と組み合わせて、血管不全の処置、特に心臓、大脳、あるいは末梢の虚血性の組織の血管再生における治療的な用途のための成分の調製を目的とした使用が考えられる。
【００２５】
本発明のその他の特徴および優位性は、以下の記載、つまり情報として与えられ、それに限定されないが、本発明の特異的な実施例、唯一付加したこのような図に関して読めば明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の主題である細胞調製物の前―血管形成活性の効果の比較を表しているヒストグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
〔第一の実施例〕
本発明の第一の実施例に拠れば、血管内皮前駆細胞(EPCs)と平滑筋前駆細胞(SMCs)は共通して人の臍帯血から得られる。
【００２８】
最初の調製法に拠れば又、それぞれ30から50mlの人の臍帯血のサンプルはまず集められたら、抗凝固剤であるヘパリンナトリウムの溶液を含む滅菌されたチューブに移される。次いで、単核細胞が臍帯血から、Percoll（1.077g/ml,Dominique Dutscher S.A.,Brumath,Franceの製品）による密度勾配遠心によって分離される。分離された単核細胞は次に、24時間37℃でプラスチックの容器で培養され、容器に付着した細胞を除かれる。分離され、付着細胞が除かれた単核細胞の混合物は回収され、規定された基質でコートされた6ウェルのプレートに移される。規定された基質には、フィブロネクチン、ラミニン、ヘパリン硫酸ナトリウム、I型およびIV型コラーゲン(これらは全てSigma-Aldrichにより供給された)、および成長因子hVEGF(R&D  Systems,Oxford UK)が含まれている。
【００２９】
このようにして、15日間培養すると、扁平上皮型細胞のコロニーと紡錘体型細胞のコロニーとがはっきり識別できるようになる。これらのコロニーはそれぞれお互いに独立に区別できるように再び回収され、これら2つのタイプの細胞を大量に得るために増殖させる。
【００３０】
扁平上皮型細胞は実際、血管内皮前駆細胞である。なんとなれば、この型の細胞の根本的なマーカーである、Von Willebrand Factor,CD31 ,eNOS, VE-カドへリン、VEGF-R1あるいはVEGF-R2を発現しているからである。一方、紡錘体型細胞は平滑筋前駆細胞である。なんとなればマーカーとして、αSMA、カルポニン、SM22αおよびSM-MHCを発現しているからである。
【００３１】
こうして血管内皮前駆細胞と平滑筋前駆細胞とを同時に含む最初の細胞の調製物が、以下に規定した最初のプロトコールに従って、雄のヌードマウスの群を用いてテストされる。
【００３２】
前述の調製物の効力は細胞のコロニーを含まない中立の調製物であるPBS（バッファー：137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.84mM KH2PO4）のみとの比較だけではなく、血管内皮前駆細胞のみを含む細胞調製物および平滑筋前駆細胞のみを含む細胞調製物とも比較されるであろう。それ故、各々6匹の動物の4つの群が準備され、４つの調製物が4つの群の動物にそれぞれ投与される。
【００３３】
まず最初に、時間t=0において、虚血を促進させるために、7週齢の全てのマウスの右大腿動脈の結紮が行われる。5時間後に、血管内皮前駆細胞と平滑筋前駆細胞との最初の細胞の調製物を最初の群の各マウスに、それぞれのタイプの細胞を同時に約250,000個の細胞を後方眼窩洞の位置の静脈内に注入する。そして他の調製物も3つの動物群にそれぞれ注入される。テストされる他の細胞調製物は約500,000個の細胞を含んでいる。
【００３４】
結紮の12日後にマウスは殺され、虚血された脚および非虚血の脚の腓腹筋が取り出される。それから3つのパラメーターが測定される。血管造影（アンギオグラフィー）スコアー、毛細管密度、皮膚の血流。
【００３５】
血管造影スコアーは血管の密度を測定する。それはマイクロアンギオグラフィーで測られる（作業方法はSilvestre J.S et al., Cir.Res.,2001;89:259-264の文献を参照）。この特殊な場合においては、血管の密度は各々のマウスの虚血された脚および非虚血の脚について測定され、得られた結果は虚血された脚の値を非虚血の脚の値で割った比の形で表される。
【００３６】
毛細血管密度は、平方ミリメーター当たりの毛細管の数で表される。それは前に記載した血管内皮細胞の特異的なマーカーであるCD31に対する抗体で腓腹筋の切片を標識することによって、そして非虚血の脚からの同じ筋肉の切片と比較することによって測定される。その結果はしたがって、虚血された脚の値を非虚血の脚の値で割った比の形で表される。
【００３７】
皮膚の血流に関しては、これは虚血された脚で測定された血流と非虚血の脚で測定された血流との比によって定量的に評価される。これは血管の数の変化が機能的な適応に、それ故、虚血された脚の血流の循環の変化に対応することをチェックしている。
【００３８】
前述の3つのパラメーターの測定値が各6つの個体の4つの群について次の表に表されている。測定値は6匹の動物から得られた平均値である。
【表１】
0005390394.tif 000002
【００３９】
このように、PBSのみを注入したコントロール群に比べて血管内皮前駆細胞(EPCs)あるいは平滑筋前駆細胞(SMCs)の注入によって血管の密度はそれぞれ、およそ60％および35%とわずかに上昇している（あるいはそれぞれ1.60および1.35と倍加している）。予想しなかったことには、血管内皮前駆細胞と平滑筋前駆細胞とを同時に注入すると、血管の密度はコントロール群の動物の値に比べて本質的に2.4倍も増加した。
【００４０】
毛細血管の密度については、血管内皮前駆細胞と平滑筋前駆細胞とを同時に投与した動物では、血管内皮前駆細胞のみ、あるいは平滑筋前駆細胞のみを投与した動物よりも本質的に50%の多さを示した。
【００４１】
4つの動物群の皮膚の血流の測定に関しては、血管内皮前駆細胞と平滑筋前駆細胞とを同時に投与した動物の皮膚の血流は、血管内皮前駆細胞のみ、あるいは平滑筋細胞の前駆細胞のみを投与した動物の皮膚の血流よりもおよそ50%大きかったので、この結果は、上記の結果を裏付けている。
【００４２】
このように、測定した3つのパラメーター、アンギオグラフィースコアー、毛細血管密度、皮膚の血流―これらは血管形成活性または血管再生の指標を表す―の結果は一致し、さらに同等の割合であるように思われる。
【００４３】
したがって、前もって虚血された組織における血管内皮前駆細胞と平滑筋前駆細胞との組み合わせ作用は血管および毛細血管の再生を誘導するように思われる。よって、虚血された組織内での増強効果による血管内皮前駆細胞と平滑筋前駆細胞との相乗効果はこの血管の再生を誘導する。
【００４４】
かくして、血管内皮前駆細胞と平滑筋前駆細胞とを組み込んだ本発明に係る細胞調製物は、特に血管の不全の治療のために、特に虚血性の心臓、脳、末梢組織の血管再生において医薬としてとして投与できる。さらに、そのような調製物は腫瘍の血管形成を正常化させるのにもまた必要であり、そうして化学療法で投与された薬剤を腫瘍の組織によりよく拡散させることが可能となる。事実、腫瘍の血管形成は健康な組織の正常な血管形成とあまり似ていない、特に止血剤、化合物障害を伴う場合は。かくして投与された薬剤は腫瘍の中心部に到達しにくくなり同様な理由でそれらの活性および効力が減少する。今や、前述の細胞の調製物は腫瘍の血管形成を正常へと回復させ、血中を循環する薬剤を腫瘍が正常に受容できるようになる。
【００４５】
本発明による細胞の調製物は血管内皮前駆細胞と平滑筋前駆細胞とを同時に含んだ単位用量の形で、あるいは別々に梱包することが出来る。別々の場合、２つの細胞組成は同時に、あるいは別々に、あるいはまた時間をずらして投与される。
【００４６】
さらに、血管内皮前駆細胞と平滑筋細胞の前駆細胞は独立に凍結し、マイナス80℃で保存することが出来る。したがって、必要な時には、融解し、同時、あるいは別々投与のために約一週間培養される。
【００４７】
この細胞調製物は特に、動脈炎、冠状血管あるいは心臓の不全、脳血管不全の治療を意図した構成物の調製にとって適している。前述の動物モデルにおいて、下肢のいわゆる危機的な虚血の治療によい結果を示し、よって、類似の状況で、人で治癒を得ることが出来、外科的切断を避けられるという大きな希望がある。
【００４８】
本発明による細胞構成物は哺乳類、特に人に本質的に既知の手法で投与できる。たとえば、細胞構成物は血管の障害部位かその近くの血中に注入するか、あるいは直接に障害の部位に適当なベクターによって導入される。変法としては、一方では血管内皮前駆細胞を投与し、他方、別々に注入できるルートで平滑筋前駆細胞を投与することが可能である。
【００４９】
ヒト成人にあっては、本発明によれば、105から109の間の細胞数よりなる細胞調製物が注入によって投与できる。
【００５０】
〔第二の実施例〕
本発明の第二の実施例に拠れば、活性化された血管内皮前駆細胞EPCsと平滑筋前駆細胞SMCsとは合体される。
【００５１】
このためには細胞の外膜の表面に特異的なマーカーを発現している血管内皮前駆細胞が準備される。Ephからなるグループから選択された前述の細胞マーカー、特にEphB4あるいはEphB1、および構造がL-Kの蛋白性の物質がその上に組み合わされる。蛋白性の物質は前述のマーカーの特異的なリガンド（L）および結合ペプチド（K）,特にFcイムノグロブリンあるいは抗体の断片より成る。全体として、EPC-Eph-L-Kの構造をもつ細胞集団あるいは細胞性物質を提供できるシステムである。特許文献FR 05 08029に言及できる。それにはそのような細胞性物質の利用について記載されている。
【００５２】
かくして、血管形成を促進させるために、Ephマーカーを含むEPC細胞はエフリンファミリーに属する特異的なリガンド（L）によって活性化される。リガンド（L）は、またエフリンたとえば、エフリンB2のペプチド断片であってもよい。それは同様の生物学的活性を持つ。
【００５３】
その場合、前もって虚血にした組織の血管再生あるいは血管形成促進するために平滑筋前駆細胞と組み合わせて投与されるのはこれら活性化した血管内皮前駆細胞である。
【００５４】
望ましくは、この第二の発明の実施例に拠れば、血管内皮前駆細胞はエフリンB2リガンドが結合している細胞マーカーのEphB4によって活性化されている。リガンド自身はFc抗体断片と結合している。こうして、活性化血管内皮前駆細胞の形：EPC-EphB4-エフリンB2-Fcが得られる。
【００５５】
まず第一に、マーカーEphB4を発現している 血管内皮前駆細胞を主に含む細胞集団を得ることが必要である。
【００５６】
最初の獲得方法によれば、前述の最初の調製方法にしたがって得られた細胞の調製物に由来する扁平上皮型の細胞コロニーが回収される。この細胞の調製物はとりわけマーカーBphB4を備えた血管内皮前駆細胞を含んでいる。これらの細胞のコロニーは37℃、30分間、３μg/mlのエフリンB2-Fcの融合タンパクで処理される。各々結合していない融合タンパクはPBSですすぐことによって除かれる（少なくとも2回のすすぎが必要である）。こうして：EPC-EphB4-エフリンB2-Fcの構造を持った血管内皮前駆細胞の構成物が得られる。
【００５７】
次いで、この細胞構成物を本発明によるところの第二の細胞調製物を作るために平滑筋前駆細胞と組み合わせる必要がある。最初の調製法によって得られた前述の細胞調製物は紡錘形によって識別できる平滑筋前駆細胞を含んでいる。それ故これらの平滑筋前駆細胞はそのような調製で選択されるであろう。そしてそれらはEPC-EphB4-エフリンB2-Fcの構造を持つ血管内皮前駆細胞と組み合わされるであろう。
【００５８】
第二の獲得方法によれば、細胞構成物は発明の第一の実施例で前述した最初の調製法の最初の部分の終わりで回収される。かくして、臍帯血からの単核細胞は遠心によって分離され24時間37℃、プラスチックの容器で培養し、付着細胞から分離される。こうしてマーカーEphB4を発現している単核細胞と前記マーカーを発現していない単核細胞の細胞混合物が得られる。
【００５９】
次に、標準的なイムノ磁気分離法、特に抗―CD34モノクローナル抗体を含む“CD34  分離キット”（MILTENYI BIOTECH, Paris Franceで販売されている）によって、非付着細胞からCD34+標識細胞が分離され、純化される。このようにして得られた細胞は、フローサイトメトリーおよびFITC結合抗―CD34モノクローナル抗体（出来れば、前者とは異なる方が良い）による解析で、75%(±5.6%)がCD34マーカーを持っていることを示している。
【００６０】
1.5×106ないし3.5×106個のCD34+細胞を含んだ、このようにして得られた細胞混合物は、基質でコートされた6ウェルのプレートのウェルに移される。基質には、フィブロネクチン、ラミニン、ヘパリン硫酸ナトリウム、I型およびIV型コラーゲン(前記Sigma-Aldrichにより市販されている製品)が含まれ、培養液には、ｈVEGF,ｂFGF,およびIGF1（R&D SYSTEMS INC.,Oxford,United Kingdom と呼ばれている会社によって市販されている製品）が含まれている。15日間の培養の後、EPC-EpｈB4が増加している細胞混合物が回収される。
【００６１】
この細胞混合物は次に、最初の獲得方法と同じ方法で、3μg/mlのエフリンＢ２−Fc融合タンパクで処理される。そうして、主として、EPC-EpｈB4-エフリンＢ２−Fcの構造を持った血管内皮前駆細胞からなる細胞組成物が得られる。
【００６２】
次に、最初の獲得方法と同様にして最初の調製法に従った細胞調製物の中から選択された平滑筋前駆細胞が上の細胞組成物と組み合わされる。かくして本発明による第三の細胞調製物が得られる。
【００６３】
平滑筋前駆細胞は前述の第2の獲得方法によっても得られることも注目されるであろう。
【００６４】
EPC-EphB4-エフリンB2-Fcの構造の血管内皮前駆細胞と平滑筋前駆細胞を同時に含むこの第二の細胞調製物は、基本的には上記第一のプロトコールと同じ第二のプロトコールに従って雄のヌードマウス群でテストされる。前述第三の細胞調製物は第二の調製物と同じ結果をもたらすことは注目される。
【００６５】
第二の細胞調製物の効力はコントロールの調製物（PBS）と比較され、またEPC-EphB4-エフリンB2-Fcの構造の血管内皮前駆細胞のみを含む調製物とも比較される。各々6匹のマウスの3群が準備され、3つの調製物が3群の動物にそれぞれ投与されるであろう。
【００６６】
この第2のプロトコールにしたがって、第1のプロトコールと同様に、時間t=0において、虚血を促進させるために、7週令の全てのマウスの右大腿動脈の結紮が行われる。5時間後に、第2のの細胞の調製物を最初の群の各マウスに、２つのタイプの細胞を各250,000個、そして比較のための前述の調製物もそれぞれ2つの他の群の動物へ、後方眼窩洞の位置の静脈ルートで同時に注入される。
【００６７】
次に、結紮の12日後にマウスは殺され、虚血された脚および非虚血の脚の腓腹筋が取り出される。それから既に以前出てきた3つのパラメーター、血管造影スコアー、毛細管密度、皮膚の血流が測定される。
【００６８】
前述の3つのパラメーターの測定値が次の表に6個体の3群に関して並べられている。測定値は6匹の動物で観察された結果の平均値である。
【表２】
0005390394.tif 000003
【００６９】
かくして、きわめて驚くべきことには、血管内皮前駆細胞はそれらのエフリンＢ２および抗体断片のFcを結合したEphB4マーカーによって活性化され、平滑筋前駆細胞と組み合わさって、血管密度を、細胞を含まないコントロール組成物に比べて3.5倍もの増加を誘導する。
【００７０】
さらには、血管上皮細胞のみを含む細胞組成物であってもリガンドエフリンB2およびFc抗体断片を結合したEphB4マーカーによって活性化されコントロール組成物に比べて2倍もの血管密度の増加を誘発する。
【００７１】
かくして、本発明の第二の細胞調製物は活性化した血管内皮前駆細胞を組み込み、および平滑筋前駆細胞の組み合わせにより、血管不全の治療のためにも、特に心臓、脳、あるいは抹消の虚血組織の治療に、医薬として投与することが出来る。ちょうど第一の細胞調製物と同様、この第二の細胞調製物はガン組織の血管の正常化のための医薬の創製にも適している。
【００７２】
次に、図1に言及すれば、そこには本発明に従ってテストされた細胞調製物のアンギオグラフィースコアーが、ヒストグラムの形で再現されている。
【００７３】
かくして、もし、血管内皮細胞の前駆体および平滑筋細胞の前駆細胞が独立に前ー血管形成作用を生み出すことに注目するならば、これら2つのタイプの細胞の組み合わさった作用が著しい前ー血管形成作用を有することは特筆すべきである。血管の密度は実際、コントロール組成物の血管密度に比べて2.4倍である。
【００７４】
さらには、平滑筋前駆細胞とEphB4受容体を介して活性化された血管内皮前駆細胞の組み合わせが、血管密度を、コントロール組成物によって得られた血管密度に比べて3.5倍増加させていることも同様特筆に価する。
【図１】
0005390394.tif 000004