(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のアミノ酸配列：
【化１】
0005519702.tif 000015
からなるペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドをコードする核酸。
【請求項３】
前記核酸配列が、以下の：
【化２】
0005519702.tif 000016
であり、ここで、Aがアデノシンであり、Cがシチジンであり、Gがグアノシンであり、Tがチミジンであり、かつ、HがA又はC又はTであり、MがA又はCであり、NがA又はC又はG又はTであり、RがA又はGであり、SがC又はGであり、WがA又はTであり、そしてYがC又はTである、請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
請求項２に記載の核酸を含む、プラスミド及び／又は発現ベクターを含む、発現系。
【請求項５】
T型カルシウムチャンネルの拮抗薬としての、請求項１に記載のペプチドのインビトロでの使用であって、該チャンネルが、Cav3.2チャンネル及びCav3.1チャンネルを含む群から選ばれるチャンネルである、使用。
【請求項６】
請求項１に記載のペプチドを含む、T型カルシウムチャンネルの拮抗薬である医薬であって、該チャンネルが、Cav3.2チャンネル及びCav3.1チャンネルを含む群から選ばれるチャンネルである、医薬。
【請求項７】
請求項１に記載のペプチドを含む医薬。
【請求項８】
疼痛の治療のための、請求項７に記載の医薬。
【請求項９】
鎮痛剤である、請求項７又は８に記載の医薬。
【請求項１０】
固体基板上での化学合成のステップ又は遺伝子組み換えによる合成のステップを含むことを特徴とする、請求項１に記載のペプチドの合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、T型カルシウムチャンネル拮抗薬である毒素に関する。具体的には、それは、ペプチドを作るペプチド、該ペプチドをコードする核酸、及びT型カルシウムチャンネルの拮抗薬及び／又は逆作動薬としての該ペプチドの使用に関する。本発明はまた、医薬品を製造するためのこのペプチドの使用にも関する。
【０００２】
それは、特に疼痛の治療において、心臓血管系疾患において、勃起障害の治療において、そして、可能性として癌の治療において適用される。
【０００３】
以下の説明において、「Ref.」を付して示される引用文献は、実施例の後に示される引用文献のリストを意味する。
【背景技術】
【０００４】
従来技術
疼痛の管理と治療は、生活の質にとって必須である。疼痛は、多くの人に影響を及ぼす。ヨーロッパでは、６０００万人の人が毎年疼痛に侵され、これは、その治療のための医薬に毎年かかる費用が１０億ドルであることを表す。鎮痛薬に対する毎年の支出は、約２５０億ドルと評価され、そして２０１０年には４２０億ドルにのぼると予想される。疼痛は、以下の２つのカテゴリー：急性疼痛及び慢性疼痛、に分けられる。痛覚過敏などを伴いうる持続的な疼痛である慢性疼痛とは対照的に、急性疼痛は、持続時間の限られた急速な短時間の疼痛に相当する。
【０００５】
疼痛が伝達されるメカニズムを同定するために、多くの研究が実施されてきた。神経系による疼痛シグナルの伝達は、痛みの刺激を電気的シグナルに変換する神経受容体を含む。そして、電気的シグナルは特定の分子受容体を含む神経によって中枢神経系に伝達される。
【０００６】
多様な感覚ニューロンの中で、われわれは、痛み刺激に特異的に反応する、侵害受容ニューロンに言及する。
【０００７】
それらの特異性によって、侵害受容ニューロンは、細胞の興奮性に関与し、かつ、薬物標的の主要クラスを表す、独自のイオンチャンネルレパートリーを有する。したがって、イオンチャンネルは、新しい鎮痛薬の発見のための多くの標的を表す、侵害受容ニューロン中で特異的に発現される。
【０００８】
疼痛を抑制する分子又は鎮痛薬は、非常に長い間知られている。われわれは、疼痛シグナルの情報伝達に作用し、そして疼痛を抑制する神経経路を刺激する、アヘン剤のクラスに言及することができる。他の分子は、慢性疼痛を治療するために使用される。これらは、例えば、バドフェン、ジアゼパム、チザニジン及びダントロレンなどのGABA受容体に採用する分子である。
【０００９】
現在使用されている鎮痛物質は、いくつかの欠点を有する。オピオイド誘導体が幻覚及び心肺機能低下を起しうることはよく知られている。それらはまた、モルヒネ、メタドンなどに対する依存などの依存症の原因でもある。最後に、アヘン剤による治療は、重度の便秘などの望ましくない効果を伴う。
【００１０】
これらの医薬品に対する耐性を発生する場合もあり、すなわち、持続的な効果を得るために必要な用量が増加されなければならない。この耐性は、時間の経過とともに増大し、そしてしたがって、用量を増加することが必要であり、そして、薬物を効果のないものとしうる。実際、必要量は該薬物の毒性用量よりも高くなりうる。
【００１１】
例えば、糖尿病、癌、化学療法、慢性の炎症性疼痛において発生しうる神経因性疼痛の場合、過敏性腸症候群などの場合、既知の鎮痛剤による疼痛の治療は耐性現象、したがって、疼痛の治療における問題をしばしば誘発する。
【００１２】
したがって、コストを低下させ、そして疼痛の治療及び患者の心地よさを改善するために、従来技術のこれらの欠陥、欠点及び障害を軽減する新規な鎮痛物質を発見することが真に必要である。
【発明の概要】
【００１３】
発明者らは、侵害受容器中に存在するT型カルシウムチャンネルCav3.2をコードするCacna1h遺伝子の発現を阻害する実験において、該チャンネルが疼痛知覚に関与することを示した。
【００１４】
Cav3.2チャンネルは、「低閾値」又は「T型」カルシウムチャンネルのファミリーの一部をなし、そして、侵害受容ニューロン中で発現される。
【００１５】
Bourinet, E., et al., "Silencing of the CaV3.2 T-type calcium channel gene in sensory neurons demostrates its major role in nociception" Embo J, 2005. 24(2): p.315-24（Ref 1）に記載された、ラットにおけるアンチセンスDNAの髄腔内注射による遺伝子抑制のアプローチを用いることによって、発明者らは、健康な動物又はニューロパチーの状態における侵害受容ニューロン中のCav3.2カルシウムチャンネルの枯渇が、非常に効果的な鎮痛をもたらすことを実証した。したがって、T型カルシウムチャンネルは、疼痛の治療への新しい治療的アプローチの開発のための可能性のある標的である。
【００１６】
さらに、Cav3.2カルシウムチャンネルが細胞増殖（Taylor, J.T., Zeng, X.B., Pottle, J.E., Lee, K., Wang, A.R., Yi, S.G., Scruggs, J.A., Sikka, S.S. and Li, M. (2008) Calcium signaling and T-type calcium channels in cancer cell cycling. World J Gastroenterol, 14, 4984-4991(Ref 8））及び血圧の調節（Chen, C.C., Lamping, K.G., Nuno, D.W., Barresi, R., Prouty, S.J., Lavoie, J.L., Cribbs, L.L., England, S.K., Sigmund, C.D., Weiss, R.M., Williamson, R.A., Hill, J.A. and Campbell, K.P. (2003) Abnormal coronary function in mice deficient in alpha1H T-type Ca2+ channels. Science, 302, 1416-1418.（Ref 9））に関与することが実証されている。T型カルシウムチャンネルは、高血圧及び癌、例えば制御されない癌細胞の増殖を伴う癌、の治療への新しい治療的アプローチを開発するための可能性のある標的を示す。
【００１７】
それは、以下のようなさまざまな器官の癌であることができる：
−前立腺癌（Gackiere F, Bidaux G, Delcourt P, Van Coppenolle F, Katsogiannou M, Dewailly E, Bavencoffe A, Van Chuoi-Mariot MT, Mauroy B, Prevarskaya N, Mariot P. (2008) CaV3.2 T-type calcium channels are involved in calcium-dependent secretion of neuroendocrine prostate cancer cells. J Biol Chem, 283 (15): 10162-73 （Ref 16）を参照のこと）、
−神経膠腫（Panner A, Cribbs LL, Zainelli GM, Origitano TC, Singh S, Wurster RD. (2005) Variation of T-type calcium channel protein expression affects cell division of cultured tumor cells. Cell Calcium, 37(2)： 105-19 (Ref 11）を参照のこと）、
−食道癌（Lu F, Chen H, Zhou C, Liu S, Guo M, Chen P, Zhuang H, Xie D, Wu S. (2008) T-type Ca2+ channel expression in human esophageal carcinomas: a functional role in proliferation Cell Calcium. 43(1): 49-58 （Ref 12）を参照のこと）、
−乳癌（Taylor JT, Huang L, Pottle JE, Liu K, Yang Y, Zeng X, Keyser BM, Agrawal KC, Hansen JB, Li M (2008) Selective blockade of T-type Ca2+ channels suppresses human breast cancer cell proliferation. Cancer Lett, 18; 267(1): 116-24（Ref 13）を参照のこと）。
【００１８】
特に、Cav3.2 T型チャンネルの選択的拮抗薬を用いる薬理学的アプローチは、本発明の目的である。
【００１９】
したがって、本発明は、特に疼痛シグナルを阻害することのできる新規分子、より具体的には、このシグナルに関与する受容体を阻害することのできる分子を提供することによって、新しい鎮痛物質を発見するという必要性を満たす。この分子は、以下の配列：
【化１】
0005519702.tif 000002
を有する分子又はその誘導体である。
【００２０】
「誘導体」は、これらの「断片」又は「誘導体」が本発明のペプチドの性質を保存するようなものを意味する。誘導体又は断片は、本発明のペプチドのアナログと考えることもできる。
【００２１】
例えば、誘導体は、アミノ酸のうちの少なくとも１つに修飾がある配列番号：１の配列を有するペプチドであることができる。修飾は、例えば以下のものである：
−少なくとも１つのアミノ酸の、同じファミリー（芳香族、疎水性、塩基性など）の他のものによる置換、
−天然のアミノ酸（Lアミノ酸）の、D形態の同じアミノ酸による置換、
−２つのアミノ酸間のペプチド結合の、擬似ペプチド結合による置換、
−ペプチドのN-及びC-末端に無関係の修飾。
【００２２】
これらの誘導体が天然のアミノ酸、セレノシステインなどの修飾アミノ酸、非天然のアミノ酸、及び／又は環化などのペプチドの構造的修飾を含むことも可能であろう。
【００２３】
誘導体は、例えば、ビオチン、蛍光発色団又は放射性同位体などの剤による標識の目的のために修飾されたペプチドを含むこともできる。
【００２４】
N-又はC-末端の修飾は、例えば、イソプレニル化、グリピエーション（glypiation）、ミリストイル化、又はパルミトイル化であることもできる。C末端は、C-末端におけるアミド官能基の形成に導くアミド化などによって修飾されることもできる。ペプチド中で起こる翻訳後修飾の例は、Han KK, Martinage A (1992) Post-translational chemical modification(s) of proteins. Int J Biochem. 24(1): 19-28.; Walsh G, Jefferis R (2006) Post-translational modifications in context of therapeutic proteins Nature Biotechnology-24, 1241-1252 （Ref 17）中に示されている。これらの修飾は、昆虫毒において遭遇しうる修飾である（例えば、Escoubas P. (2006) Molecular diversification in spider venoms: a web of combinatorial peptide libraries. Mol Divers. 10(4): 545-54（Ref 18）を参照のこと）。
【００２５】
以下の記載において、配列番号：１のペプチドは、配列番号：１又はそれに由来する配列を有するペプチドを意味する。
【００２６】
本発明はまた、とりわけ血圧を低下させることのできる新規な分子を提供することによって、新しい降圧剤を発見するという必要性も満たす。
【００２７】
本発明は、とりわけ細胞増殖を阻害することのできる新規な分子を提供することによって、癌治療のための新しい分子を発見するという必要性も満たす。
【００２８】
本発明の新規な分子はペプチドである。このペプチドは、Paraphysa属（Psp3）（クモ目オオツチグモ科（Araneae: Theraphosidae））のクモの毒から発明者らにより最初に単離された。
【００２９】
さらに、本発明は以下の配列：
【化２】
0005519702.tif 000003
を有するペプチドをコードする任意の核酸配列にも関する。
【００３０】
本発明の核酸は遺伝コードの縮重を考慮した、配列番号：１の配列を有するペプチドをコードする任意の配列であることができる。例えば、それは、以下の配列：
【化３】
0005519702.tif 000004
【化４】
0005519702.tif 000005
を有する核酸であることができ、ここで、Aはアデノシン、Cはシチジン、Gはグアノシン、Tはチミジン、そしてHはA又はC又はT、MはA又はC、NはA又はC又はG又はT、RはA又はG、SはC又はG、WはA又はT、そして、YはC又はTである。
【００３１】
本発明は、配列番号：１の配列を有するペプチドをコードする、プラスミド及び／又は発現ベクターを含む発現系にも関する。
【００３２】
本発明においては、発現系は、以下の配列：
【化５】
0005519702.tif 000006
を有するペプチドをコードする核酸配列を少なくとも１つ含むことができる。
【００３３】
「発現ベクター」は、本発明において、我々が宿主中で発現させることを望む核酸の１つ以上の断片をそこへ挿入することができる核酸配列を意味する。発現ベクターは、核酸配列の宿主中での発現を可能とする要素を含むことができる。例えば、ベクターは、プロモーター配列、ペプチドシグナルをコードする配列を含むことができる。ベクターは、当業者に知られた任意のベクターであることができる。
【００３４】
例えば、発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、細菌ベクター、酵母人工染色体（YAC）及び細菌人工染色体（BAC）から選ばれることができる。発現ベクターは、GSTなどの可溶性タンパク質に融合した又はしない組み換えタンパク質、チオレドキシン、又は当業者に知られた任意の他の融合タンパク質を過剰発現するベクターであることもできる。
【００３５】
例えば、本発明において有用なベクターは、とりわけ、プラスミドpT7-7（配列番号：４、図５）、例えば、Pharmacia社により販売されているpGEXシリーズのプラスミド（配列番号：５、図６）、又は例えば、Novagen社により販売されているpET32シリーズのプラスミド（配列番号：６、図７）を含む群から選ばれることができる。
【００３６】
本発明は、以下の配列：
【化６】
0005519702.tif 000007
を有するペプチドの発現ベクターを含む宿主にも関する。
【００３７】
本発明においては、「宿主」は、本発明のペプチドを産生するために発現ベクターで形質転換されることのできる任意の細胞又は遺伝子組み換えされた任意の細胞を意味する。
【００３８】
上記「宿主」の形質転換は、例えば、エレクトロポーレーション又は当業者に知られた任意の他の方法によって実施されることができる。形質転換の間に使用される、配列番号：１の配列を有するペプチドをコードする配列は、上記のベクターのうちの１つに取り込まれているか又は遊離形態であることができる。導入後、上記核酸配列は、遺伝子組み換えによって宿主のゲノム中に取り込まれるか、宿主中で遊離形態のままであるか、及び／又はベクター中にとどまることができ、その後、上記核酸配列は、宿主のタンパク質及び／又は酵素によって認識され、そしてそれによって発現される。
【００３９】
宿主は、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）などの細菌、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などの酵母、ショウジョウバエ（Drosophila）又はヨトウ（Spodoptera）の細胞などの昆虫細胞、哺乳動物細胞及び発現ベクターからペプチド及び／又はタンパク質が産生されることを可能とする、当業者に知られた任意の他の細胞などの、真核細胞または原核細胞を含む群から選ばれることができる。
【００４０】
好ましくは、原核細胞又は真核細胞は、ベクターによってコードされたペプチドの過剰発現を可能とすることができる。したがって、エシェリキア・コリなどの、本発明のペプチドのための発現ベクターを発現することのできる任意の宿主細胞が使用可能である。
【００４１】
好ましくは、選ばれた真核細胞又は原核細胞は、本発明のペプチドの過剰発現を可能とするものである。例えば、それらは、ヨトウのSf9細胞、ショウジョウバエのS2細胞、ピキア・パストリスタイプの酵母又はエシェリキア・コリ細菌である。
【００４２】
発明者らは、以下に示す実施例において、配列番号：１の配列を有するペプチドがT型チャンネルの拮抗薬及び／又は部分拮抗薬であることを示す。
【００４３】
さらに、本発明は、以下の配列：
【化７】
0005519702.tif 000008
を有するペプチドの、T型カルシウムチャンネルの拮抗薬としての使用にも関する。
【００４４】
「拮抗薬」は、上記チャンネル上の受容体部位と相互作用し、そして上記チャンネルが機能することを防ぐ、化学分子、タンパク質、ペプチドなどの作用物質を意味する。
【００４５】
拮抗薬は、作動薬の薬理学的効果を低下させることもでき、その場合、それは「部分拮抗薬」である。
【００４６】
本発明は、配列番号：１の配列を有するペプチドの、T型チャンネルの逆作動薬としての使用にも関する。「逆作動薬」は、同じ受容体と、この受容体の作動薬として相互作用するが、反対の薬理学的効果を生じる、化学分子、タンパク質などの作用物質を意味する。
【００４７】
言い換えれば、拮抗薬、部分拮抗薬、又は逆作動薬は、同じ細胞受容体に、参照物質と同じ又は異なる部位で結合し、後者がその通常の効果のすべて又は一部をもたらすことを防ぐか、又は反対の効果をもたらす。
【００４８】
本発明においては、「T型カルシウムチャンネル」は、低い活性化閾値を有する、すなわち、−８０〜−２０mＶ、好ましくは−７０〜−５０mＶの活性化電位を有する、カルシウムチャンネルを意味する。
【００４９】
例えば、T型カルシウムチャンネルは、それらの調節サブユニットと組み合わされた又はされない、サブユニットCav3.1、Cav3.2、Cav3.3及びそれらのすべてのスプライシング変異体によって生成されたカルシウムチャンネルであることができる。
【００５０】
好ましくは、ペプチドは、T型カルシウムチャンネルの拮抗薬及び／又は逆作動薬として使用される。
【００５１】
より好ましくは、ペプチドは、Cav3.2カルシウムチャンネル及び／又はCav3.1及び／又はCav3.3カルシウムチャンネルの拮抗薬及び／又は逆作動薬として使用される。
【００５２】
本発明は、以下の配列：
【化８】
0005519702.tif 000009
を有するペプチド及び／又は以下の配列：
【化９】
0005519702.tif 000010
を有するペプチドをコードする核酸の、薬物の製造のための使用にも関する。この薬物は、ヒトのため又は獣医学的用途のために使用されることができる。
【００５３】
本発明においては、ペプチドは、例えば、溶液中でのそのバイオアベイラビリティー、その溶解度、その安定性を改善するため、及び／又は薬物の製造のために、任意の薬理学的に許容可能な担体と併合されることができる。
【００５４】
本発明においては、「薬学的に許容可能な担体」は、当業者に知られた、医薬品中での使用のための任意の化合物を意味する。それは、例えば、Pharmacie galenique of A. LEHIR （Publ. Masson, 1992 (第６版)（Ref 7）中で言及された化合物であることができる。
【００５５】
本発明においては、「結合」は、担体及び本発明のペプチドが溶液中に存在しており、イオン相互作用によって結合している、担体との共有結合を意味する。
【００５６】
配列番号：１の配列を有するペプチドを含む医薬品は、患者又は動物へのその投与を可能とする任意の形態に製剤されることができる。それは、例えば、経口、静脈内、硬膜外、皮膚又は経皮経路による投与を可能とする製剤であることができる。
【００５７】
本発明においては、「製剤」は、（Octaplex（登録商標）又はSynergon（登録商標）などの）注射用製剤、シロップなどの経口製剤、（Octaplex（登録商標）などの）散剤、顆粒、（Estima（登録商標）などの）錠剤、（Provames（登録商標）などの）被覆錠剤、カプセル、スプレー、（Trophicreme（登録商標）クリームなどの）クリーム、ローション、ジェル、などの局所用製剤、洗眼液などの眼科用製剤、静脈内注射用の製剤、インスリンペンタイプの自動注入器による注射用の製剤、経皮パッチ、経口で利用可能な錠剤、舌下摂取用製剤、又は硬膜外注射用の製剤を意味する。
【００５８】
例えば、それは、Pharmacie galenique of A. LEHIR （Publ. Masson, 1992 (第６版)）（Ref 7）に記載された、さまざまな医薬製剤であることもできる。
【００５９】
薬物は、例えば、カプセル、錠剤、パッチ、注射用溶液、座剤及び／又は散剤の形態で投与されることができる。
【００６０】
薬物及び／又は動物用医薬品中の本発明のペプチドの濃度は、薬学的見地から有効であり、かつ、治療される患者又は動物によって許容可能な任意の濃度、例えば、１nM〜１０００nMであることができる。
【００６１】
本発明のペプチドを含む薬物は、生物学的効果を可能とする静脈内濃度を得るために投与されることが好ましい。この有効な血漿濃度は、哺乳動物への静脈内注射によるその投与後の本発明のペプチドの半減期をモニタリングすること、そして、マススペクトロメトリーによるその濃度の測定などによって決定されることもできる。半減期は、上記医薬品の濃度が最初の濃度の半分に等しくなるのに必要とされる時間に相当する。
【００６２】
配列番号：１の配列を有するペプチドを含む薬物及び／又は動物用医薬品は、一日１回、一日２回、一日３回、一日おき、三日おき、週に１回の投与のために包装されることができる。
【００６３】
投与方法及び投与量は、各個人のために調節されることができ、そして、とりわけ治療される個人の生理学的特徴に関して、医師によって決定されることができる。
【００６４】
本発明においては、薬物は、疼痛、偏頭痛、てんかん、パーキンソン病、視床律動異常、睡眠障害及び不眠症、二極性障害、心臓血管障害（心臓肥大、高血圧）、アルドステロン放出に伴う病変、勃起障害及び癌性病変を治療するための製品であることができる。
【００６５】
本発明の薬物は、疼痛の治療のための製品、例えば、鎮痛剤、抗アロジニア剤であることが好ましい。
【００６６】
本発明の医薬品及び／又は動物用医薬品は、鎮痛剤であることが好ましい。
【００６７】
本発明は、以下の配列：
【化１０】
0005519702.tif 000011
を有するペプチドの合成方法にも関する。
【００６８】
本発明における合成方法は、固体基板上の化学合成又は遺伝子組み換えによる合成方法であることができる。
【００６９】
遺伝子組み換えによる合成方法は、上記で定義した発現系又はベクターを使用することができる。
【００７０】
遺伝子組み換えによる本発明のペプチドの合成方法は、とりわけ、以下のステップ：
−本発明のペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、
−上記形質転換された宿主細胞を、それが上記発現ベクターから本発明のペプチドを産生する培養条件下で、培養し、そして、
−上記宿主細胞によって産生された上記ペプチドを回収すること、
を含むことができる。
【００７１】
形質転換、培養及びペプチドの単離のステップは、Sambrook, Fritsch and Maniatis, "Molecular cloning, A laboratory manual", second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989（Ref 3）中に記載された技術などの、遺伝子組み換えの通常の技術によって実施されることができる。
【００７２】
例えば、配列番号：１の配列を有するペプチドは、固体基板上のFmocペプチド合成の方法（"Fmoc solid phase peptide synthesis, a practical approach", by W.C. Chan and P.D. White, Oxford University Press, 2000 （Ref 4））などにしたがって、固相化学合成の古典的技術により調製されることができる。
【００７３】
本発明の他の特徴及び利益は、添付された図面を参照し、以下の説明を読むことによって明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１は、Psp3の毒素の高速液体クロマトグラフィー（HPLC）の、時間の関数としてのmAUで表したプロフィールを示すダイアグラムである（逆相カラム）（一番上の部分）。一番下のダイアグラムは、一番上のダイアグラムの灰色の網掛け部分によって示された画分のHPLCクロマトグラフィー（イオン交換カラム）のプロフィールを示す。下のHPLCプロフィール上の灰色の網掛け部分は、Psp3T×１毒素を含む、純粋なピークに相当する。
【図２】図２は、Cav3.2 チャンネルによって生成された電流をナノアンペア（nA）で、時間の関数として示す、ダイアグラムである。曲線は、図１に示す、HPLCによって精製されたPsp3T×１の一部の適用の、ツメガエル（Xenopus）の卵母細胞中で発現されたCav3.2チャンネルの活性に対する効果を示す。電流は、電荷担体としての５mMバリウムを含む溶液中で記録され、それは、−１００mVの静止電位から始まり、−３０mVにおける脱分極によって生成される。
【図３】図３は、Psp3T×１（Psp3T×１）の適用の前（対照）及び適用の間のいくつかの電位におけるCaV3.2サブユニットによって生成された、T型の時間の関数としてのナノ−アンペアで表された電流のいくつかの記録を示すダイアグラムである。
【図４】図４は、図３に示す記録についての電流−電圧の関係を示すダイアグラムである。横座標は、ミリボルト（mV）で表した電圧の関数としての、ナノアンペアで表した電流を表す。
【図５】図５は、pＴ7-7プラスミドの配列である（配列番号：４）。
【図６−１】図６−１は、pGEXシリーズのプラスミドの配列である（配列番号：５）。
【図６−２】図６−２は、pGEXシリーズのプラスミドの配列である（配列番号：５）。
【図７−１】図７−１は、pET32シリーズのプラスミドの配列である（配列番号：６）。
【図７−２】図７−２は、pET32シリーズのプラスミドの配列である（配列番号：６）。
【図７−３】図７−３は、pET32シリーズのプラスミドの配列である（配列番号：６）。
【図８】図８は、毒素の濃度の関数としての、Cav3.2チャンネルにより生成された電流の阻害パーセンテージを示すダイアグラムである。縦座標は、Cav3.2チャンネルにより生成された電流の阻害パーセンテージを示し、横座標は、毒素のモル濃度の１０進法対数値を示す。黒丸による曲線は、毒素Psp3T×１による阻害曲線、白丸による曲線は、合成毒素による阻害曲線に相当する。
【実施例】
【００７５】
実施例１：本発明のペプチドの特徴づけ
PARAPHYSA SP3毒素を、パッチクランプ分析のために使用される細胞外液で１０００倍に希釈した。この溶液は、以下の組成（mMで表す）：NaCl １３５、TEACI ２０、HEPES １０、CaCl2 ２、MgCl2 １を有する（TEAOHによりpH７．３とする）。
【００７６】
（Q-biogen社により供給された）jetPEI（商標）試薬を用いて、ヒトカルシウムチャンネルCav3.2の相補的DNA及びレポーター遺伝子（CD８）を含むpcDNA3発現プラスミドでHEK293細胞をトランスフェクトした。４８時間の発現の後、トランスフェクトされた細胞をトリプシンの助けにより分散させ、そして低密度でパッチクランプ分析のための培養皿に播種した。
【００７７】
陽性にトランスフェクトされた細胞を、抗−CD8抗体（Dynal）で被覆した磁性ビーズによって、先にJimenez, C., Bourinet, E., Leuranguer, V., Richard, S., Snutch, T.P. and Nargeot, J. (2000) "Determinants of voltage-dependent inactivation affect Mibefradil block of calcium channels." Neuropharmacology, 39, 1-10（Ref２）に記載されたとおりに同定した。電気生理学的記録を、「パッチクランプ」技術により「ホールセル」構成において、Digidataインターフェース及びpClamp9ソフトウエア（Molecular Devices）により制御されたAxopatch200B増幅器によって行った。２mMカルシウムを含む細胞外記録液は上述した。記録は、１．５〜２．５mΩの抵抗を有するように延伸したホウケイ酸塩ピペット（Sutter Instruments）を用いて行った。記録に使用したピペット内液は、以下の組成：CsCl １３０mM、HEPES １０mM、EGTA １０mM、CaCl2 2mM、MgCl2 1mM、MgATP ４mM、TrisGTP ０．３mM（NaOHでpH７．３とする）を有する。結果を、Clampfit（登録商標）、Excel（登録商標）及びGraphPad Prism（登録商標）ソフトウエアを用いて分析した。
【００７８】
この実施例において電気生理学的記録に用いた機器は、Axopatch200B Amplifier（Molecular Devices）、Digidata 1300（Molecular Devices）、pClamp9ソフトウエア（Molecular Devices）、GeneClamp500増幅器（Molecular Devices）、Olympus IX70倒立顕微鏡（Olympus France）、Sutter極微操作装置（Sutter Instruments）である。使用した化合物、試薬及び細胞については、化学物質はSigma-Aldrich France社から、使用した細胞はHEK293細胞（ATCC）、ビーズDynal anti-CD8はInvitrogen France社から、試薬jetPEI（登録商標）はQ-biogen France社から、微生物アフリカツメガエル(Xenopus laevis）は（CRBM-CNRS Montpellier France）から入手した。
【００７９】
トランスフェクトされた細胞中で発現された組み換えCav3.2チャンネルによって生成されたT型カルシウム電流を可視化するために、以下の刺激プロトコールを使用した：−１００mVの静止電位から開始し、−３０mVの電位において１００msの脱分極を１０秒ごとに適用する。この刺激によって生成された電流の振幅を、対照条件において、次いでPARAPHYSA SP3毒素の適用中に測定した。このために、PARAPHYSA SP3毒素を記録ピペットと同じピペット中に吸引する。毒素の入ったこのピペットを、１〜２マイクロリッターの毒素が記録されている細胞付近に加えられるように空圧システムに連結する。
【００８０】
PARAPHYSA SP3毒素の画分の特徴づけを異なる発現系において実施する。Altier, C., Dubel, S.J., Barrere, C., Jarvis, S.E., Stotz, S.C., Spaetgens, R.L., Scott, J.D., Cornet, V., De Waard, M., Zamponi, G.W., Nargeot, J. and Bourinet, E. (2002) "Trafficking of L-type calcium channels mediated by postsynaptic scaffolding protein AKAP79." J. Biol. Chem., 277, 33598-33603（Ref 5）及びDubel, S.J., Altier, C., Chaumont, S., Lory, P., Bourinet, E. and Nargeot, J. (2004)"Plasma Membrane Expression of T-type Calcium Channel ｛alpha｝1 Subunits Is Modulated by High Voltage-activated Auxiliary Subunits." J Biol Chem, 279, 29263-29269（Ref 6）に記載されたように、ヒトCav3.2をコードするcDNAをアフリカツメガエルの卵母細胞中に注入する。pClamp9ソフトウエア（登録商標）により制御されたGenClamp500増幅器（登録商標）（Molecular Devices（登録商標））を用いて二連微小電極から電圧を印加する技術によって、電流を記録する。毒素から得られたさまざまなクロマトグラフィー画分を、以下の：５ BaOH2、２５ TEAOH、２５ NaOH、２ CsOH、３０ NMDG、５ HEPES（単位はmM）を含む細胞外液（メタンスルホン酸によりpHを７．３に調節する）中に溶解する。１５μｌのマイクロセル中で記録を行う。記録される卵母細胞に直接、ピペットを用いて画分（１０μl）を手動で加える。
【００８１】
精製毒素の添加に続いて、Cav3.2チャンネルの電流が３０秒後に強く阻害される（図２）。毒素の効果の洗い流しの間、最初の電流の振幅が数分後に回復する。
【００８２】
さらに、図４に示すように、抽出物の添加は、電流電圧関係を正電圧に向かって約２０mVシフトさせる。このシフトは、イオンチャンネルの「電圧センサー」を阻害する毒素の特徴である。クモ毒のこの古典的効果は、Winterfield JR, Swartz KJ, (2000）A hot spot for the interaction of gating modifier toxins with voltage-dependent ion channels. J Gen Physiol, 116(5):637-44（Ref 10）に記載されている。これは、ポテンシャルの変化を検出するチャンネルの一部（「電圧センサー」）のブロッキングである。その結果、チャンネルの開口がより困難となり、かつ、より大きな脱分極を必要とする。したがって、電流電圧関係がより正のポテンシャルに向かってずれる。
【００８３】
したがって、該抽出物がT型チャンネルの拮抗薬を含むことは明らかである。したがって、この分子は、疼痛シグナルの阻害を可能とする新規分子である。
【００８４】
実施例２：本発明のペプチドの単離及び配列決定
先の実施例において示された、カルシウムチャンネル活性を阻害する毒素の画分を単離し、この阻害に関与する成分の調査を、分別ステップと組み合わせた活性テストの一連のステップにより実施した。
【００８５】
PARAPHYSA SP毒素をメス成体の鋏角の電気刺激によって得た。毒素をマイクロチューブ中に集め、そして凍結乾燥した。
【００８６】
活性の分析のため及びクロマトグラフィーによる分離のための毒素の調製は、凍結乾燥物を超純水に最初の毒素体積の１０倍希釈で溶解し、遠心分離し（１分あたり１４０００回転、２０分）、そして０．４５μmのメンブレン（SJHVL04NS Millipore（登録商標））でろ過することからなる。
【００８７】
クロマトグラフィーによる毒素の活性成分の精製：最初のステップにおいて、１００μlの毒素希釈液のアリコート（原毒素の１０μlに等価）をC8分取用カラム（5C8MS、10×250mm、Waters）上の逆相高速クロマトグラフィー（RP-HPLC）によって分画する。使用する勾配は、水＋０．１％トリフルオロ酢酸（A）／アセトニトリル＋０．１％トリフルオロ酢酸（B）からなる。勾配は、以下のようにプログラムされる：０％のBを５分間、０〜６０％のBを６０分、６０〜９０％のBを１０分間、流速２mL／分。カラム出口で画分を手動で集め、２１５nmにおけるUV吸収の変動をモニタリングする。これらの画分を凍結乾燥し、そしてそれらの活性をT型カルシウムチャンネルにおいて上記のように試験する。
【００８８】
RP-HPLCからの活性画分について第二の精製ステップを以下のように実施する：陽イオン交換クロマトグラフィーの第二のステップにおいて、Tosoh SP5PWカラム（登録商標）（４．６×７０mm）（Tosoh）上、水中酢酸アンモニウムの直線的勾配（５０分間で、２０mM〜１M）、０．５mL／分の流速で、これらの画分を分析する。集めた画分を凍結乾燥し、次いで、それらの活性をT型カルシウムチャンネルにおいて上記のとおり試験する。
【００８９】
活性画分を同定後、活性画分を構成するペプチドの純度及び分子量をMALDI-TOF（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight）マススペクトロメトリーによって測定する。
【００９０】
マススペクトロメトリー測定を、MALDI-TOFマススペクトロメトリーにより、Voyager DE-Pro（登録商標）マススペクトロメーター（Applied Biosystems（登録商標））において反射モードで実施する。ペプチドをα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸マトリックス（５０：５０：０．１の水：アセトニトリル：TFA中、５mg/mLのα−CHCA、Sigma（登録商標））と混合して、分析した。マススペクトルを内部標準で較正し、そして、Data Explorerソフトウエア（登録商標）を用いて分析した。
【００９１】
エドマン分解により、気相シーケンサー（Applied Biosystems Procise）を用いる自動配列決定によって、精製されたペプチドの配列を決定する。
【００９２】
分析の前に、当業者に知られたプロトコール（John M. Walker. The Protein Protocols Handbook, Humana Press 1996 (ISBN 0-89603-339-2)（Ref 14）を参照のこと）に従い、精製されたペプチドのジスイルフィド架橋をDTTにより還元し（ジチオスレイトール １０mM、５５℃、４５分）、IAAでアルキル化する（ヨード酢酸、５０mM、２０℃において、３０分間）。還元／アルキル化されたペプチドを、Merk Chromolith Speed-Rod（登録商標）カラム（０．４６×５０mm）上のRP-HPLC C18クロマトグラフィーによる脱塩に供する。次に、Applied Biosystems 477A（登録商標）モデルのペプチドシーケンサー（Applied Biosystems（登録商標））による自動化気相N-末端配列決定により、還元／アルキル化されたペプチドの配列を決定する。
【００９３】
得られたペプチド配列は、以下の：
【化１１】
0005519702.tif 000012
である。
【００９４】
したがって、この実施例は、T型チャンネル拮抗薬分子が配列番号：１の配列を有するペプチドであることを明確に実証している。
【００９５】
したがって、このペプチドは疼痛シグナルを阻害する新規分子を表す。
【００９６】
実施例３：配列番号：１の配列を有するペプチドの化学合成
Altergen（登録商標）社は、以下のプロトコール：Merifield technique, Fmoc strategyによる固相合成、にしたがって本発明のペプチドを化学合成する。
【００９７】
実施例２で同定したペプチドの阻害活性を、さまざまなT型カルシウムチャンネルにおいてインビトロで試験した（結果は提供されていない）。
【００９８】
実施例４：配列番号：１の配列を有するペプチドの化学合成
Genepep（登録商標）社は、以下のプロトコール：Merifield technique, Fmoc strategy（Ref 4）による固相合成、にしたがって本発明のペプチドを化学合成した。
【００９９】
Synprosis（登録商標）社は、Genepep社により製造された線状ペプチドを以下のプロトコールにしたがってフォールディングした：１mMの還元グルタチオン（GSH）、１mMの酸化グルタチオン（GSSG）、１００mMのトリスヒドロキシメチルアミノメタン（TRIS）pH９、２５％グリセロールを含むバッファー中での１０μMの線状ペプチドPsp3-Tx1のインキュベーション。室温で穏やかに振とうしながら２４時間、インキュベーションを実施した。RP-C18 Chromolith（登録商標）カラム上の逆相HPLCクロマトグラフィーにより、０．１％トリフルオロアセテート（TFA）中、１０〜５０％のアセトニトリル（ACN）の勾配を用いて、合成毒素Psp3-Tx1を精製した。
【０１００】
フォールディングされた合成ペプチドの質量をマススペクトロメトリーにより確認し、６つのシステイン間の３つのジスルフィド架橋の形成と一致して、３３９８．０ダルトン（Da）を得た。
【０１０１】
実施例５：実施例４において製造された本発明の合成ペプチドの特徴づけ
実施例４からの合成ペプチドのCav3.2チャンネルに対する阻害活性をインビトロで試験した。天然のペプチド（Psp3-Tx1）による阻害を同じ条件で比較した。合成ペプチド及び天然のペプチド（天然の毒素）を、蒸留水で１０-3モルの原液濃度まで希釈した。この原液濃度から始めて、パッチクランプ分析に用いる細胞外液に相当する溶液でペプチドを希釈した。この溶液は、以下の組成（mMで表す）を有する：NaCl １３５、TEACI ２０、HEPES １０、CaCl2 2、MgCl2 １（TEAOHでpH７．３とする）。試験した濃度は、以下のとおりである：合成ペプチドについては、１０-8、１０-7、及び１０-6モル；天然のペプチドについては、１０-9、１０-8、３．１０-8、１０-7、３．１０-7及び１０-6モル。
【０１０２】
ヒトCav3.2カルシウムチャンネルの相補的DNA配列を安定的に発現するHEK293細胞（ATCC）を使用した。細胞株の各継代において、「パッチクランプ」分析（分子電気生理学）のための培養皿に低密度で細胞を播種した。
【０１０３】
陽性にトランスフェクトされた細胞を、抗−CD8抗体（Dynal）で被覆した磁性ビーズによって、Jimenez, C., Bourinet, E., Leuranguer, V., Richard, S., Snutch, T.P. and Nargeot, J. (2000) "Determinants of voltage-dependent inactivation affect Mibefradil block of calcium channels." Neuropharmacology, 39, 1-10（Ref 2）に先に記載されたとおりに同定した。
【０１０４】
Digidataインターフェース及びpClamp10ソフトウエア（Molecular Devices）により制御されたAxopatch200B増幅器を用いて、「ホールセル」構成で「パッチクランプ」技術により電気生理学的記録を行った。２mMのカルシウムを含む細胞外記録液は上記した。
【０１０５】
１．５〜２．５mΩの抵抗を有するように延伸したホウケイ酸塩ピペット（Sutter Instruments）を用いて記録を行った。
【０１０６】
記録に用いるピペット内液は、以下の組成を有する：CsCl １３０mM、HEPES １０mM、EGTA １０mM、CaCl2 ２mM、MgCl2 1mM、MgATP ４mM、TrisGTP ０．３mM（NaOHでpH７．３とする）。Clampfit（登録商標）、Excel（登録商標）及びGraphPad Prism（登録商標）ソフトウエアを用いて結果を分析した。
【０１０７】
電気生理学的記録のためにこの実施例において使用した機器は、Axopatch200B Amplifier（Molecular Devices）、Digidata1440（Molecular Devices）、pClamp１０ソフトウエア（Molecular Devices）、GeneClamp500増幅器（Molecular Devices）、Olympus IX70倒立顕微鏡（Olympus France）、Sutter極微操作装置（Sutter Instruments）である。使用した化合物、試薬及び細胞については、化学薬品はSigma-Aldrich France社から入手し、使用した細胞はHEK293細胞（ATCC）であり、ビーズは、Invitrogen France社からのDynal 抗−CD8抗体であり、jetPEI試薬（登録商標）はQ-biogen Franceから入手した。
【０１０８】
トランスフェクトされた細胞中で発現されたCav3.2組み換えチャンネルにより生成されたT型カルシウム電流を可視化するために、以下の刺激のプロトコールを用いる：−１００mVの静止電位で開始して、−３０mVの電位において１００msの脱分極を１０秒ごとに適用する。
【０１０９】
この刺激により生成される電流の振幅を、対照条件おいて、そして次いで実施例４からの合成ペプチドを濃度を増加しながら加える間に、又は天然の毒素Psp3-Tx1を濃度を増加しながら加える間に測定する。このために、異なる濃度の合成ペプチド又は毒素Psp3-Tx1を含む溶液をインフュージョンチューブに分配し、これらのチューブはさまざまな上記溶液を記録される細胞付近に加えるためのコレクターに接続されている。
【０１１０】
したがって、各濃度の合成ペプチド又は天然の毒素の阻害活性を、記録される細胞のCaV3.2電流の振幅をその効果のプラトーで測定することによって決定する。
【０１１１】
合成ペプチド及び天然のペプチドの阻害効果を、図８に示す「用量−効果」曲線を構築するための各濃度におけるブロッキングのパーセンテージの形態で表した。これらの「用量−効果」曲線を、電流の５０％を阻害する用量（EC50）並びに対応する曲線の勾配又はHill数を計算するための、シグマ分析機能「ログ（拮抗薬）対 応答−可変勾配」を有するGraphPad Prism（登録商標）ソフトウエアにより分析した。
【０１１２】
図８は、天然のペプチド（Psp3T×１）（黒丸による曲線）及び合成ペプチド（白丸による曲線）についての用量応答曲線を示す。
【０１１３】
したがって、図８においては、天然の毒素についてのEC50は１．１μMで、Hill数が０．８７（分析した細胞の数は６）、そして合成ペプチドについてのEC50は２．０１μMで、Hill数が０．８９（分析した細胞の数は２０）である。
【０１１４】
したがって、結果は、合成ペプチドと天然のペプチドが、Cav3.2チャンネルの電流を阻害することを示す。結果は、約１に等しいHill係数とともに記載され、チャンネルとペプチドの間の１：１相互作用を暗示する。
【０１１５】
したがって、この実施例は、実施例１に示されるようにクモ毒素から抽出された及び／又は化学合成された、配列番号：１の配列を有するペプチドが、Cav3.2チャンネルの電流を阻害することを明確に実証した。
【０１１６】
実施例６：本発明のペプチドの鎮痛効果
熱刺激により誘導された疼痛に関して、本発明のペプチドの鎮痛効果を観察するためにマウスを使用する。
【０１１７】
マウスは、C57BL/6J野生型マウス及びC57BL/6J Cav3.2−／−マウスである。マウスの総数は、１０匹の野生型及び１０匹のCaV3.2−／−である。
【０１１８】
２つの群のマウス（C57BL/6J）を用い、1つの群には髄腔内に本発明のペプチドを１０及び１００nMの濃度で含む生理溶液を注射し、第２の群（対照群）は生理溶液のみの髄腔内注射を受容した。そして、マウスを４６℃の水浴中に尾を浸す試験に供した。この実験の目的は、痛みをもたらす熱にマウスが反応するまでの時間を測定し、そして、熱の知覚に関連する疼痛シグナルの出現の閾値を示すことである。同じ実験を、CaV3.2サブユニットによりコードされるT型カルシウムチャンネルをコードする遺伝子を欠損するC57BL/6Jマウスの２つの他の群において並行して行う。この実験の目的は、本発明のペプチドの選択性を示すことである。
【０１１９】
結果は、ペプチドを注射された群のマウスと対照群のマウスの間の、熱に対する反応時間に顕著な相違があることを示す。熱に対する反応時間は、配列番号：１の配列を有するペプチドを受容するマウスにおいて顕著に長い。
【０１２０】
機械的刺激に関して、本発明のペプチドの鎮痛効果を観察するためにマウスを使用する。
【０１２１】
マウスは、C57BL/6J野生型マウス及びC57BL/6J CaV3.2−／−マウスである。マウスの総数は、１０匹の野生型及び１０匹のCaV3.2−／−である。
【０１２２】
２群のマウス（C57BL/6J）を用い、１つの群には、本発明のペプチドを１０及び１００nMの濃度で含む生理溶液を髄腔内に注射し、第２の群（対照群）は生理溶液のみの髄腔内注射を受容する。そして、マウスをフォン・フレイ・ブリストル（von Fray bristles）による機械的刺激試験に供する。この実験の目的は、肢のアーチに与えるだんだんに強くなる機械的刺激に対する反応の閾値を決定することである。動物の反応閾値は、機械的圧力の知覚に連結した疼痛シグナルの出現に相関する。同じ実験を、CaV3.2サブユニットによりコードされるT型カルシウムチャンネルをコードする遺伝子を欠損するC57BL/6Jマウスの２つの他の群において並行して行う。この実験の目的は、本発明のペプチドの選択性を示すことである。
【０１２３】
結果は、ペプチドを注射したマウスの群とマウスの対照群の間の、機械的圧力の知覚の閾値における顕著な相違を示す。圧力閾値は、配列番号：１の配列を有するペプチドを受容するマウスにおいて顕著に高い。
【０１２４】
したがって、本発明のペプチドは、熱及び機械的な疼痛刺激に関して、予想された鎮痛効果を有する。
【０１２５】
したがって、この実施例は、実施例２において同定された配列番号：１の配列を有するペプチドが疼痛の治療のための新規分子であることを実証する。
【０１２６】
実施例７：本発明のペプチドと参照鎮痛剤の鎮痛効果の比較
本実施例において使用するマウスと実験プロトコールは、実施例４に記載されたものと同一である。
【０１２７】
2つの追加の群のマウスを試験した。
−１つの用量（１μg/kg）のモルヒネを髄腔内に注射した群、及び
−配列番号：１の配列を有するペプチドが（１０nM）である群。
【０１２８】
実施例８：本発明のペプチドの降圧効果
本実施例において使用するマウスは、実施例４に記載されたものと同一である。
【０１２９】
本発明のペプチドの降圧効果を観察するためにマウスを使用する。２つの群のマウス（C57BL/6J）を使用し、１群には、１０及び１００nMの濃度で本発明のペプチドを含む生理溶液を静脈内注射し、第２の群（対照群）は、生理溶液のみの静脈内注射を受容する。仙尾鞘法（caudal sleeve method）（Plehm, R., Barbosa, M.E. and Bader, M. (2006) Animal models for hypertension/blood pressure recording. Methods Mol Med, 129, （Ref 15））の原理によって血圧を測定する。
【０１３０】
実施例９：本発明のペプチドの抗増殖効果
本発明のペプチドの抗増殖効果を観察するために、LNCAP前立腺癌細胞を使用する。使用する培養培地は、Gackiere F, Bidaux G, Delcourt P, Van Coppenolle F, Katsogiannou M, Dewailly E, Bavencoffe A, Van Chuoi-Mariot MT, Mauroy B, Prevarskaya N, Mariot P. (2008) CaV3.2 T-type calcium channels are involved in calcium-dependent secretion of neuroendocrine prostate cancer cells. J Biol Chem, 283(15):10162-73. (Ref 16)の文献に記述されたとおり、５mMのL-グルタミン(Sigma-Aldrich, L'lsle d'Abeau, France)および１０％のFBS（Applera France SA, Courtaboeuf, France）を補充したRPMI 1640培地（BioWhittaker SA, Verviers, Belgium）である。
【０１３１】
細胞の２つの条件を使用する：
−細胞が１０、３０、１００、３００、１０００nMの濃度の本発明のペプチドの存在下での異なるアッセイにおいて培養される、１つの条件、及び
−ペプチドを含まない第２の条件（対照）。
【０１３２】
CFSE蛍光トレーサーの培養細胞による取り込みに基づくCellTrace法（登録商標）CFSE（Invitrogen（登録商標））及びフローサイロメーターを用いる標識細胞の測定によって、細胞増殖を測定する。
【０１３３】
【表１】
0005519702.tif 000013
【０１３４】
【表２】
0005519702.tif 000014
【図１】
0005519702.tif 000017
【図２】
0005519702.tif 000018
【図３】
0005519702.tif 000019
【図４】
0005519702.tif 000020
【図５】
0005519702.tif 000021
【図６−１】
0005519702.tif 000022
【図６−２】
0005519702.tif 000023
【図７−１】
0005519702.tif 000024
【図７−２】
0005519702.tif 000025
【図７−３】
0005519702.tif 000026
【図８】
0005519702.tif 000027
【配列表】
0005519702000001.app