(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖の一方の鎖が、５’から３’の方向に、
第一のニッキングエンドヌクレアーゼの切断部位、
外来ＤＮＡ断片の挿入領域、
第二のニッキングエンドヌクレアーゼの切断部位、
スペーサー領域を挟んでなる逆方向反復配列、及び
第一の制限酵素の切断部位
を含む核酸
を発現可能な状態で含有する、組換えベクターであって、
第一のニッキングエンドヌクレアーゼ及び第二のニッキングエンドヌクレアーゼが互いに異なり、
核酸における外来ＤＮＡ断片の挿入領域に外来ＤＮＡ断片を挿入し、外来ＤＮＡ断片由来の逆方向反復配列を含む組換えベクターを作製するためのものである、組換えベクター。
【請求項２】
外来ＤＮＡ断片の挿入領域が第二の制限酵素の切断部位、又は第二の制限酵素の切断部位及び第三の制限酵素の切断部位を含む、請求項１に記載の組換えベクター。
【請求項３】
スペーサー領域が少なくとも５０塩基の長さである、請求項１又は２に記載の組換えベクター。
【請求項４】
第一のニッキングエンドヌクレアーゼ及び第二のニッキングエンドヌクレアーゼが、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、及びＮｔ．ＣｖｉＰＩＩからなる群から選ばれる酵素である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換えベクター。
【請求項５】
第一の制限酵素が、認識部位が６塩基以上である制限酵素からなる群から選ばれる酵素である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えベクター。
【請求項６】
第二の制限酵素及び第三の制限酵素が、互いに異なり、かつ第一の制限酵素と異なって、認識部位が６塩基以上である制限酵素からなる群から選ばれる酵素である、請求項２〜５のいずれか１項に記載の組換えベクター。
【請求項７】
外来ＤＮＡ断片の挿入領域に、任意の外来ＤＮＡ断片が挿入されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換えベクター。
【請求項８】
外来ＤＮＡ断片の長さが少なくとも１００塩基の長さである、請求項７に記載の組換えベクター。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の組換えベクターを含有する形質転換体。
【請求項１０】
形質転換体が、微生物、植物又は昆虫である請求項９に記載の形質転換体。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換えベクターを準備する工程；
逆方向反復配列の鋳型となる外来ＤＮＡ断片を、前記組換えベクター内に挿入された核酸における外来ＤＮＡ断片の挿入領域に挿入して、外来ＤＮＡ断片を含む組換えベクターを得る工程；
前記外来ＤＮＡ断片を含む組換えベクターを、第二のニッキングエンドヌクレアーゼ及び第一の制限酵素で処理して、ニック入り切断組換えベクターを得る工程；
前記ニック入り切断組換えベクター内に挿入された核酸におけるスペーサー領域を挟んでなる逆方向反復配列においてステムループ構造を形成させて、第一のステムループ構造を含むニック入り切断組換えベクターを得る工程；
前記第一のステムループ構造を含むニック入り切断組換えベクターを、リガーゼで処理して、ステムループ構造を含む切断組換えベクターを得る工程；
前記ステムループ構造を含む切断組換えベクターを、第一のニッキングエンドヌクレアーゼ及び第一の制限酵素で処理して、第二のステムループ構造を含むニック入り切断組換えベクターを得る工程；
前記第二のステムループ構造を含むニック入り切断組換えベクターを鎖置換型ＤＮＡ合成酵素で処理して、外来ＤＮＡ断片由来の逆方向反復配列を含む切断組換えベクターを得る工程；
前記外来ＤＮＡ断片由来の逆方向反復配列を含む切断組換えベクターをエキソヌクレアーゼで処理して、切断面が平滑末端である組換えベクターを得る工程；及び
前記切断面が平滑末端である組換えベクターをリガーゼで処理して、外来ＤＮＡ断片由来の逆方向反復配列を含む組換えベクターを得る工程
を含む、外来ＤＮＡ断片由来の逆方向反復配列を含む組換えベクターを作製する方法。
【請求項１２】
外来ＤＮＡ断片の長さが少なくとも１００塩基である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
鎖置換型ＤＮＡ合成酵素がＰｈｉ２９ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ、Ｂｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、及びＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅからなる群から選ばれる酵素である、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
複数の外来ＤＮＡ断片及び複数の発現ベクターを用いて、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法により、前記外来ＤＮＡ断片由来の逆方向反復配列を含む複数の組換えベクターを作製して、ＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリー得る工程
を含む、ＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーを作製する方法。
【請求項１５】
同一作製条件下で前記外来ＤＮＡ断片由来の逆方向反復配列を含む複数の組換えベクターを作製することを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
複数の外来ＤＮＡ断片がＲＮＡｉの標的遺伝子の塩基配列を含む核酸をランダムに切断して得られた二本鎖ＤＮＡ断片である、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
外来ＤＮＡ断片由来の逆方向反復配列を含む組換えベクターを、ＲＮＡｉの標的となる遺伝子を発現する宿主細胞に導入して形質転換体を得る工程；
形質転換体を培養して、形質転換体培養物を得る工程；
前記形質転換体培養物における標的遺伝子の発現量を測定する工程；及び
未形質転換の宿主細胞と比べて、標的遺伝子の発現量に影響を与えている形質転換体に導入された前記逆方向反復配列を、ＲＮＡｉ効果を有する逆方向反復配列と判定する工程
を含む、ＲＮＡｉ効果を有する逆方向反復配列の判定方法であって、
外来ＤＮＡ断片由来の逆方向反復配列を含む組換えベクターが、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法により作製された組換えベクターであるか、又は
外来ＤＮＡ断片由来の逆方向反復配列を含む組換えベクターが、請求項１４又は１５に記載の方法により作製されたＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーから選ばれる組換えベクターである、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法により、ＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーからＲＮＡｉ効果を有する逆方向反復配列を選抜する工程
を含む、ＲＮＡｉ効果を有する逆方向反復配列のスクリーニング方法であって、
ＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーが請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法により作製されたＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーである、方法。
【請求項１９】
標的遺伝子が昆虫免疫関与遺伝子の転写制御に関わる遺伝子又は昆虫ＤＮＡウイルスの侵入に関わる遺伝子である、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外来ＤＮＡ断片由来の逆方向反復配列を含む組換えベクター及びその作製方法に関する。さらに本発明は、上記組換えベクターを作製する方法を利用したＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーを作製する方法及びこのライブラリーを利用した標的遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有する逆方向反復配列を判定及びスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；ＲＮＡ干渉）ライブラリーを用いて機能的かつ網羅的に免疫反応などの生物の生命現象に関わる因子のスクリーニングが実施されている。ＲＮＡｉライブラリーを作製する方法としては、これまでに直接合成型ＲＮＡｉライブラリー作製法とＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリー作製法の二つのアプローチが試みられてきた。
【０００３】
直接合成型ＲＮＡｉライブラリー作製法は、ＲＮＡｉの標的遺伝子の塩基配列情報に基づいて、ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーなどを利用して二本鎖ＲＮＡを合成することにより、ＲＮＡｉライブラリーを構築する方法である。本法によれば、種々の長さを持つ二本鎖ＲＮＡからなるＲＮＡｉライブラリーを作製することができる。しかし、本法は、ゲノム配列が明らかになった一部の生物にしか利用できず、かつ作業性及び経済性の面から大規模なライブラリーを作製することが困難であるなどの問題点がある。
【０００４】
ＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーは、標的遺伝子の逆方向反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ）を一本鎖上に含む核酸を含有する組換えベクターから構成される。ＤＮＡ型ＲＮＡｉが標的遺伝子を発現する宿主細胞に導入されると、上記逆方向反復配列の情報に基づいて細胞内にステムループＲＮＡが産生され、このＲＮＡによるＲＮＡｉ効果により標的遺伝子はノックダウンされる。
【０００５】
ＤＮＡ型ＲＮＡｉを簡便に作製する方法として、Ｇａｔｅｗａｙ法が知られている（非特許文献１）。Ｇａｔｅｗａｙ法を利用すれば、ある特定の核酸の塩基配列に基づいて特定の逆方向反復配列を持つ核酸を作製することができる。しかし、種々の核酸の塩基配列から同一作製条件下（例えば、一つの試験管内）で１回又は数回で逆方向反復配列を持つ核酸を作製することはできない。したがって、Ｇａｔｅｗａｙ法を用いてＲＮＡｉライブラリーを作製することは非常に困難とされている。
【０００６】
そこで、Ｇａｔｅｗａｙ法を用いない、ＤＮＡ型ＲＮＡｉを作製する方法として種々の方法がこれまでに試みられてきた（特許文献１及び２、非特許文献２）。
【０００７】
特許文献１に記載の方法は、一本鎖にするとステムループ構造をとり、かつステム部分に制限酵素部位を持つ核酸が組み込まれているプラスミドを用いる方法である。特許文献１に記載の方法の概略は次の通りである。まず、プラスミドＤＮＡを一本鎖にする。次いで、ステム部分を制限酵素で切断することによりループ部分とレプリコン部分に分離する。次いで、外来ＤＮＡ断片をループ部分とレプリコン部分の間に挿入する。次いで、ＤＮＡ複製反応により二本鎖プラスミドに戻して、外来ＤＮＡ断片の逆方向反復配列を含むプラスミド、すなわちＤＮＡ型ＲＮＡｉを得る。
【０００８】
特許文献２及び非特許文献２に記載の方法は、ヘアピン型のアダプターＤＮＡを利用することによりＤＮＡ型ＲＮＡｉを得る方法である。その概略は以下の通りである。まず、ＭｍｅＩの認識部位を持つヘアピン型の第一のアダプターを外来ＤＮＡ断片の一端に連結させる。次いで、ＭｍｅＩで処理した後、標的核酸断片の他端に第二のアダプターを連結させる。次いで、第二のアダプターに相補的なプライマーを用いてＤＮＡ合成することにより、ＤＮＡ型ＲＮＡｉを作製することができる。
【特許文献１】特表２００５−５０２３８３号公報
【特許文献２】ＷＯ２００５／０６９３８
【非特許文献１】Genes Genet.Syst. 81, 129-134, 2006
【非特許文献２】Nat. Genet. 36, 190-196, 2004
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＲＮＡｉ反応は配列依存性が高いので逆方向反復配列が長いほどＲＮＡｉ効果の高い配列を含む確率が高まる。特に、植物や昆虫等では長鎖のＲＮＡｉを利用することができるので、効率よく標的遺伝子をノックダウンすることができる。したがって、例えば、昆虫の特定の遺伝子をノックダウンさせる際に、逆方向反復配列部分が１００塩基対以上の長鎖ＤＮＡ型ＲＮＡｉが有効に利用され得る。
【００１０】
特許文献１に記載の方法は、組換えベクターに挿入した１００塩基対以上の外来ＤＮＡ断片の塩基配列を逆方向反復配列に変換できる。しかし、本法は、プラスミドＤＮＡを一本鎖に調製しなければならず、さらにループ部分、外来ＤＮＡ断片及びレプリコン部分の間でライゲーション反応をしなければならない。プラスミドＤＮＡの一本鎖は不安定であり、容易に高次構造をとり得る。異なる三つの断片のライゲーション反応は、各断片の末端部の接近効率が悪いことから、反応効率の低い反応である。これらの理由によって、本願発明者らは、本法を利用してＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーを作製することは技術的に困難であると考えた。
【００１１】
特許文献２及び非特許文献２に記載の方法は、逆方向反復配列部分が２０塩基対程度の、短鎖ＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーを構築する際に用いられる手法である。そこでまず、本発明者らは、本方法を改良することにより、長鎖ＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーを作製することができると考えた。しかし、本願発明者らは、種々検討した結果、短鎖の逆方向反復配列をもつＤＮＡと比べて、長鎖の逆方向反復配列をもつＤＮＡを発現ベクターに組み込ませることは困難なことであり、長鎖ＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーを作製することができなかった。
【００１２】
そこで本発明は、大規模な長鎖ＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーを、同一作製条件下で一回又は数回で作製することができる方法を提供することを解決すべき課題とした。さらに、本発明は、上記長鎖ＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーを作製する際に用いられる、核酸、組換えベクター、形質転換体などの部品を提供することを解決すべき課題とした。さらに、本発明は、上記長鎖ＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーから標的遺伝子の発現量を低下させるＤＮＡ型ＲＮＡｉを評価・選抜する方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するために、外来ＤＮＡ断片を発現ベクターに組み込み、制限酵素処理した後、ステムループ構造を持つ外来ＤＮＡリンカーを制限酵素切断部位に結合させ、片鎖をニッキングエンドヌクレアーゼによりニックを入れ、ＤＮＡポリメラーゼ及びリガーゼにより二本鎖を再合成する方法を創作した。しかし、この方法では外来ＤＮＡ断片の逆方向反復配列を持つ組換えベクターを得ることができなかった。この理由について検討した結果、外来ＤＮＡリンカーのライゲーション反応効率に問題があることを見出した。そこで、本願発明者らは、外来ＤＮＡリンカーを用いずに長鎖外来ＤＮＡ断片の逆方向反復配列を持つ組換えベクターを作製することに成功した。さらに、この作製法によれば、複数の長鎖外来ＤＮＡ断片から同一作製条件下で１回又は数回で長鎖外来ＤＮＡ断片の逆方向反復配列を持つ複数の組換えベクターを作製することができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成された発明である。
【００１４】
本発明の外来ＤＮＡ断片の逆方向反復配列を含む組換えベクターを作製する方法は、第一の制限酵素とニッキングエンドヌクレアーゼ処理後に、熱処理とその後のアニーリング反応によってベクターＤＮＡの末端がループ構造になり、さらにこのループ構造で生じているニックの部分をうめることができるという点及び、この中間体の挿入された外来ＤＮＡ断片の末端の逆側にニックを入れるとそこから鎖置換伸長反応によって、外来ＤＮＡ断片が逆方向反復配列に変換されるという点を特徴とする方法である。
【００１５】
すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］二本鎖の一方の鎖が、５’から３’の方向に、
第一のニッキングエンドヌクレアーゼの切断部位、
外来ＤＮＡ断片の挿入領域、
第二のニッキングエンドヌクレアーゼの切断部位、
スペーサー領域を挟んでなる逆方向反復配列、及び
第一の制限酵素の切断部位
を含む核酸。
［２］外来ＤＮＡ断片の挿入領域が第二の制限酵素の切断部位、又は第二の制限酵素の切断部位及び第三の制限酵素の切断部位を含む、上記［１］に記載の核酸。
［３］スペーサー領域が少なくとも５０塩基の長さである、上記［１］又は［２］に記載の核酸。
［４］第一のニッキングエンドヌクレアーゼ及び第二のニッキングエンドヌクレアーゼが、互いに異なり、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、及びＮｔ．ＣｖｉＰＩＩからなる群から選ばれる酵素である、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の核酸。
［５］第一の制限酵素が、認識部位が６塩基以上である制限酵素からなる群から選ばれる酵素である、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の核酸。
［６］第二の制限酵素及び第三の制限酵素が、互いに異なり、かつ第一の制限酵素と異なって、認識部位が６塩基以上である制限酵素からなる群から選ばれる酵素である、上記［２］〜［５］のいずれかに記載の核酸。
［７］外来ＤＮＡ断片の挿入領域に、任意の外来ＤＮＡ断片が挿入されている、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の核酸。
［８］外来ＤＮＡ断片の長さが少なくとも１００塩基の長さである、上記［７］に記載の核酸。
［９］上記［１］〜［８］のいずれかに記載の核酸を発現可能な状態で含有する組換えベクター。
［１０］上記［９］に記載の組換えベクターを含有する形質転換体。
［１１］形質転換体が、微生物、植物又は昆虫である上記［１０］に記載の形質転換体。
［１２］上記［１］〜［６］のいずれかに記載の核酸を、発現可能な状態で発現ベクターに挿入して、組換えベクターを得る工程；
逆方向反復配列の鋳型となる外来ＤＮＡ断片を、前記組換えベクター内に挿入された核酸における外来ＤＮＡ断片の挿入領域に挿入して、外来ＤＮＡ断片を含む組換えベクターを得る工程；
前記外来ＤＮＡ断片を含む組換えベクターを、第二のニッキングエンドヌクレアーゼ及び第一の制限酵素で処理して、ニック入り切断組換えベクターを得る工程；
前記ニック入り切断組換えベクター内に挿入された核酸におけるスペーサー領域を挟んでなる逆方向反復配列においてステムループ構造を形成させて、第一のステムループ構造を含むニック入り切断組換えベクターを得る工程；
前記第一のステムループ構造を含むニック入り切断組換えベクターを、リガーゼで処理して、ステムループ構造を含む切断組換えベクターを得る工程；
前記ステムループ構造を含む切断組換えベクターを、第一のニッキングエンドヌクレアーゼ及び第一の制限酵素で処理して、第二のステムループ構造を含むニック入り切断組換えベクターを得る工程；
前記第二のステムループ構造を含むニック入り切断組換えベクターを鎖置換型ＤＮＡ合成酵素で処理して、外来ＤＮＡ断片由来の逆方向反復配列を含む切断組換えベクターを得る工程；
前記外来ＤＮＡ断片由来の逆方向反復配列を含む切断組換えベクターをエキソヌクレアーゼで処理して、切断面が平滑末端である組換えベクターを得る工程；及び
前記切断面が平滑末端である組換えベクターをリガーゼで処理して、外来ＤＮＡ断片由来の逆方向反復配列を含む組換えベクターを得る工程
を含む、外来ＤＮＡ断片由来の逆方向反復配列を含む組換えベクターを作製する方法。
［１３］外来ＤＮＡ断片の長さが少なくとも１００塩基である、上記［１２］に記載の方法。
［１４］鎖置換型ＤＮＡ合成酵素がＰｈｉ２９  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ、Ｂｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、及びＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅからなる群から選ばれる酵素である、上記［１２］又は［１３］に記載の方法。
［１５］複数の外来ＤＮＡ断片及び複数の発現ベクターを用いて、上記［１２］〜［１４］のいずれかに記載の方法により、前記外来ＤＮＡ断片由来の逆方向反復配列を含む複数の組換えベクターを作製して、ＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリー得る工程
を含む、ＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーを作製する方法。
［１６］同一作製条件下で前記外来ＤＮＡ断片由来の逆方向反復配列を含む複数の組換えベクターを作製することを特徴とする、上記［１５］に記載の方法。
［１７］複数の外来ＤＮＡ断片がＲＮＡｉの標的遺伝子の塩基配列を含む核酸をランダムに切断して得られた二本鎖ＤＮＡ断片である、上記［１５］又は［１６］に記載の方法。
［１８］外来ＤＮＡ断片由来の逆方向反復配列を含む組換えベクターを、ＲＮＡｉの標的となる遺伝子を発現する宿主細胞に導入して形質転換体を得る工程；
形質転換体を培養して、形質転換体培養物を得る工程；
前記形質転換体培養物における標的遺伝子の発現量を測定する工程；及び
未形質転換の宿主細胞と比べて、標的遺伝子の発現量に影響を与えている形質転換体に導入された前記逆方向反復配列を、ＲＮＡｉ効果を有する逆方向反復配列と判定する工程
を含む、ＲＮＡｉ効果を有する逆方向反復配列の判定方法。
［１９］外来ＤＮＡ断片由来の逆方向反復配列を含む組換えベクターが、上記［１２］〜［１４］のいずれかに記載の方法により作製された組換えベクターである、上記［１８］に記載の方法。
［２０］外来ＤＮＡ断片由来の逆方向反復配列を含む組換えベクターが、上記［１５］又は［１６］に記載の方法により作製されたＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーから選ばれる組換えベクターである上記［１８］に記載の方法。
［２１］上記［１８］〜［２０］のいずれかに記載の方法により、ＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーからＲＮＡｉ効果を有する逆方向反復配列を選抜する工程
を含む、ＲＮＡｉ効果を有する逆方向反復配列のスクリーニング方法。
［２２］ＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーが上記［１５］〜［１７］のいずれかに記載の方法により作製されたＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーである、上記［２１］に記載の方法。
［２３］標的遺伝子が昆虫免疫関与遺伝子の転写制御に関わる遺伝子又は昆虫ＤＮＡウイルスの侵入に関わる遺伝子である、上記［１７］〜［２２］のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、異なる長鎖ｃＤＮＡがそれぞれ挿入された複数のプラスミドを一つのチューブ内に入れた場合、それぞれ挿入されたｃＤＮＡを一気に逆方向反復配列にすることができる。本発明によれば、発現プラスミドに挿入されたｃＤＮＡを簡便に逆方向反復配列構造に変換でき、これを直接培養細胞でのＲＮＡｉによる目的遺伝子のノックダウン実験に用いることができる。さらに、本発明によれば、ｃＤＮＡ発現プラスミドライブラリーから長鎖ＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーの構築ができる。
【００１７】
昆虫や植物などは逆方向反復配列部分が１００ｂｐ以上の長鎖型のものを用いても細胞障害は起こらず、かつ効果の高い配列を含む確率が上がる長鎖型を用いることによりＲＮＡｉ効果が上昇することから、本発明で作製された長鎖ＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーを用いれば、微生物、昆虫及び植物等において簡便で効率よく生命現象に関わる因子の機能的探索及び同定が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の核酸は、二本鎖の一方の鎖が、５’から３’の方向に、第一のニッキングエンドヌクレアーゼの切断部位、外来ＤＮＡ断片の挿入領域、第二のニッキングエンドヌクレアーゼの切断部位、スペーサー領域を挟んでなる逆方向反復配列、及び第一の制限酵素の切断部位を含む核酸である。
【００１９】
一般的に、逆方向反復配列とは、第一の塩基配列及び該塩基配列と相補的な塩基配列の逆方向の塩基配列を同一鎖上に含む配列を意味する。例えば、上記第一の塩基配列が５’から３’の方向にＡＴＣＧＣＧという配列であるならば、逆方向反復配列は、５’から３’の方向にＡＴＣＧＣＧ−（Ｎ）n−ＣＧＣＧＡＴという配列をとる。ここで、（Ｎ）ｎは逆方向反復配列の間に含みうる塩基を意味する。例えば、ＮはＡ、Ｔ、Ｃ及又はＧの任意の塩基を、ｎは塩基の０又は１以上の任意の数を表す。（Ｎ）ｎは、例えば、ＡＴＣＧなどを具体例として挙げることができる。
【００２０】
第一のニッキングエンドヌクレアーゼ及び第二のニッキングエンドヌクレアーゼは、二本鎖核酸の特定の塩基配列を認識して、二本鎖核酸の片方の鎖を切断してニックを入れる酵素であって、互いに異なる認識部位及び切断部位を持つ酵素であれば特に制限されないが、例えば、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩなどを挙げることができる。
【００２１】
本明細書にいう「切断部位」とは、制限酵素やニッキングエンドヌクレアーゼなどにより切断される部位を意味する。切断部位は、これらの酵素の認識部位の内部に存在しない場合もあり得るが、好ましくは認識部位の内部に存在することが好ましい。
【００２２】
本発明の核酸における第一のニッキングエンドヌクレアーゼの切断部位と第二のニッキングエンドヌクレアーゼの切断部位とは、互いに同じ鎖上にあっても、互いに異なる鎖上にあってもよいが、互いに異なる鎖上にあることが好ましい。
【００２３】
制限酵素は、二本鎖核酸の特定の塩基配列を認識して、二本鎖核酸の両方の鎖を切断する酵素であれば特に制限されない。第一の制限酵素、第二の制限酵素及び第三の制限酵素は、互いに異なる認識部位及び切断部位を持つ制限酵素であれば特に制限されず、例えば、ＳｔｙＩ、ＥｃｏＲＩ、ＭｌｕＩ、ＮｃｏＩ、ＡｐａＩ、ＡｐａＬＩ、ＳｐｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＳｐｅＩ、ＮｈｅＩ、ＳｐｈＩ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩ、ＮｄｅＩ、ＰｖｕＩＩ、ＰｓｔＩ、ＤｒａＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＫｐｎＩなどを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。さらに、第一の制限酵素、第二の制限酵素及び第三の制限酵素は、本発明の核酸を挿入する予定の発現ベクターの中にないものが好ましく、かつ認識部位が４塩基以上、好ましくは認識部位が６塩基以上のものが好ましい。
【００２４】
外来DNA断片は、本発明の核酸に組み込むことができるＤＮＡ断片であれば特に制限されず、その種類や長さは制限なく任意に設定することができる。外来DNA断片の長さは、例えば、３０〜１００００塩基、好ましくは５０〜１０００塩基、より好ましくは１００〜５００塩基、なおさらに好ましくは２００〜４００塩基である。外来DNA断片の塩基配列は、既知及び未知の塩基配列のいずれも用いることができ、例えば、ノックダウンさせるべき遺伝子（標的遺伝子）の塩基配列を知ることができるのであれば、その標的遺伝子に基づいて設計したものを用いることができる。
【００２５】
本発明の核酸における外来ＤＮＡ断片の挿入領域は、外来ＤＮＡ断片を挿入することができる領域であれば特に制限されないが、例えば、第一のニッキングエンドヌクレアーゼ及び第二のニッキングエンドヌクレアーゼと同一の認識部位を持つ制限酵素の切断部位を含む領域や１種又は２種の制限酵素の切断部位を含む領域などを挙げることができる。ニッキングエンドヌクレアーゼと同一の認識部位を持つ制限酵素としては、例えば、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩと同一の認識部位を持つＢｂｖＣＩが挙げられる。二つの制限酵素の切断部位を含む領域としては、例えば、ＸｈｏＩとＫｐｎＩの認識部位を含む領域を挙げることができる。具体的には、ＸｈｏＩ認識部位を含むプライマー及びＫｐｎＩ認識部位を含むプライマーを用いて標的遺伝子の塩基配列を含む核酸を増幅することによりＸｈｏＩ及びＫｐｎＩの認識部位を含む外来ＤＮＡ断片とし、これをＸｈｏＩ及びＫｐｎＩを用いて本発明の核酸の外来ＤＮＡ断片の挿入領域に挿入することができる。本発明の核酸の別の態様として、上記外来ＤＮＡ断片の挿入領域に外来ＤＮＡ断片が挿入されている核酸も含めることができる。
【００２６】
スペーサー領域を挟んでなる逆方向反復配列は、第一の塩基配列とスペーサー領域と第一の塩基配列に対して少なくとも一部が逆方向の配列を含む配列である。スペーサー領域を挟んでなる逆方向反復配列は、本発明の核酸を一本鎖にした後に、第一の塩基配列と第一の塩基配列に対して少なくとも一部が逆方向の配列の間で少なくとも一部で二本鎖を形成し、かつスペーサー領域がループ構造を形成することにより、ステムループ構造を形成する。逆方向反復配列である、第一の塩基配列と第一の塩基配列に対して少なくとも一部が逆方向の配列は、本発明の核酸を一本鎖にした後に互いに少なくとも一部で二本鎖を形成することができれば特に制限されることはないが、好ましくはそれぞれの長さが５〜３５塩基、より好ましくは１０〜３０塩基、さらに好ましくは１５〜２５塩基、より好ましくは２０塩基である。さらに、逆方向反復配列は、本発明の核酸を含有する組換えベクターを導入する宿主細胞中には存在せず、かつオフターゲット（非特異ＲＮＡｉ効果）を引き起こすＣＡＮリピート構造（例えば、（ＣＡＡ）n、（ＣＡＧ）n、（ＣＡＣ）n及び（ＣＡＴ）nであり、ｎが６以上のトリプレットリピート構造）をとっていないことが好ましい。スペーサー領域は、ループ形成時にＤＮＡの二次構造をとりうる配列でなければ特に制限されるものではないが、好ましくはその長さは２０塩基以上、より好ましくは３０塩基以上、さらに好ましくは４０塩基以上、なおさらに好ましいのは５０塩基以上である。スペーサー領域は、ＳａｃＩなどの制限酵素認識・切断部位が存在することが好ましい。逆方向反復配列が二次構造を形成することなどの理由により、逆方向反復配列をシークエンシングしようとした場合、シークエンス反応効率が低下する傾向にある。スペーサー領域内の一部を切断することができれば、組換えベクターをｌｉｎｅａｒにすることができ、上記反応効率の低下を回避することができる。すなわち、逆方向反復配列を確認するために、スペーサー領域内に制限酵素認識部位を入れることが好ましい。スペーサー領域が短すぎると、本発明の核酸を含有する組換えベクターを宿主細胞に導入した際に、ベクターの変異や欠失等を引き起こす可能性が高くなる。
【００２７】
本発明の核酸は、５’末端と３’末端に発現ベクターに挿入される部位を含めることができる。例えば、５’末端と３’末端のそれぞれに第一、第二及び第三の制限酵素と異なる制限酵素の認識部位を含めることができる。したがって、本発明の核酸は、５’末端と３’末端を介して発現ベクターに挿入することができる。
【００２８】
本発明の核酸は、上記した切断部位、挿入領域、５’末端部と３’末端部以外にも、これらの部位や領域を認識・切断する酵素以外の任意の酵素に認識・切断される部位やその他の塩基配列が挿入してあってもよい。例えば、本発明の核酸は、逆方向反復配列中にＣｓｐＣＩで認識される部位（ＣＡＡ（Ｎ）5ＧＴＧＧを認識）を設けることができる。ＣｓｐＣＩは上記部位を認識して、認識部位から５’側に１０−１１塩基の部位と３’側の１２−１３塩基の部位を切断する。これにより、ステムループ構造を形成させた際に、ステムに相当する配列（逆方向反復配列）の片方を取り除くことができ、ループ配列を長くすることができる。
【００２９】
本発明の核酸は、上記した構成をとることができれば、その作製方法は特に制限されず、ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーなどの装置や常法に従い作製することができる。本発明の核酸は、例えば、外来ＤＮＡ断片由来の逆方向反復配列を作製する際に用いられ得る。例えば、本発明の核酸は、本発明の外来ＤＮＡ断片の逆方向反復配列を含む組換えベクターを作製する方法や本発明のＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーを作製する方法に用いることができる。
【００３０】
本発明の核酸の具体例は、実施例に記載の式（Ｉ）の核酸を挙げることができるが、これに限定されるものではない。
【００３１】
本発明の別の側面によれば、本発明の核酸を発現可能な状態で含有する組換えベクターが提供される。本発明の組換えベクターは、例えば、本発明の核酸の５’末端及び３’末端を発現ベクターのマルチクローニングサイトに挿入して作製することができる。本発明の核酸を発現可能な状態とするために、宿主として大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）や枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの細菌を使用する場合は、例えば、プロモーター、オペレーター領域（プロモーター、オペレーター及びリボゾーム結合領域（ＳＤ領域）を含む）、開始コドン、終止コドン、ターミネーター領域、及びプラスミド複製可能単位などを有する。また、酵母等の真菌細胞または動物細胞を宿主細胞として用いる場合は、一般に、プロモーター、開始コドン、及び終止コドンなどを有する。また、本発明の組換えベクターは、必要に応じて、エンハンサーなどのシスエレメント、非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、複製可能単位、相同領域、選択マーカーなどを含むことができる。これらのエレメントは、本発明の組換えベクターが導入されるべき宿主に対応したものであれば、特に制限されず、技術常識に基づいて選択することができる。
【００３２】
なお、選択マーカーとしては、特に制限されず、例えば遺伝子発現に使用される宿主が細菌の場合は、薬剤抵抗性遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、シクロヘキシミド耐性遺伝子、テトラマイシン耐性遺伝子など）、宿主が細菌以外の例えば酵母などの場合は、栄養要求性遺伝子（例えば、ＨＩＳ４、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＡＲＧ４など）などを始めとする公知の各種選択マーカーを利用することもできる。
【００３３】
本発明の組換えベクターは、本発明の核酸が発現可能な状態であるために、例えば、本発明の核酸の上流にはプロモーター領域などの転写開始及び調節領域があり、その下流にはターミネーター領域などの転写終結領域がある。本発明の組換えベクターの構築は、ＤＮＡ組換えの一般的な方法、例えばMolecular Cloning (1989) (Cold Spring Harbor Lab.)に記載される方法に従って行うことができる。
【００３４】
発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、シャトルベクター、ファージベクター、レトロトランスポゾン、ウイルスベクターなどを制限なく挙げることができる。発現ベクターとしては、例えば、宿主細胞が昆虫細胞である場合、ｐＩＥｘ−１、ｐＩＥｘ−２、ｐＩＥｘ−４（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＩＺ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが使用でき；宿主細胞が植物細胞である場合、ｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）、ｐＭＬＨ７１３３などが使用でき；宿主細胞が酵母である場合は、ｐＮＭＴ１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、Ｙｃｐ５Ｏ（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５などを使用できるが、これらに限定されるものではない。これらの発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類によって適宜選択して用いられ得る。本発明の組換えベクターは、例えば、外来ＤＮＡ断片の逆方向反復配列を作製するために用いることができ、より具体的には、本発明の外来ＤＮＡ断片の逆方向反復配列を含む組換えベクターを作製する方法や本発明のＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーを作製する方法に用いることができる。
【００３５】
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを含有する形質転換体である。組換えベクターの宿主細胞への導入（形質転換）方法は、特に制限されず、トランスフォーメーション法、トランスフェクション法、コンピテント細胞法、エレクトロポレーションなど、導入する宿主細胞の種類や組換えベクターの形態に応じて、適宜選択することができる。宿主細胞としては、本発明の組換えベクターに合わせて適宜調整され、外来ＤＮＡ断片の宿主または発現媒体として作用する能力を有する細胞であり、例えば、微生物、植物又は昆虫が挙げられる。なお、組換えベクターの宿主細胞内での存在様式は特に制限されず、染色体中に挿入されても、あるいは置換されて組み込まれてもよいし、またプラスミド状態で存在していてもよい。
【００３６】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えば、本発明の組換えベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ステムループＲＮＡを発現させることができる。
【００３７】
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。また、昆虫細胞としては、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ(インビトロジェン社製)等を用いることができる。組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換えベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法またはリポフェクション法等を挙げることができる。
【００３８】
本発明の形質転換体の培養に用いる栄養培地としては、炭素源、窒素源、無機物、ウシ胎児血清および必要に応じ使用菌株の必要とする微量栄養素を程よく含有するものであれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【００３９】
本発明の形質転換体の培養に用いる栄養培地の炭素源としては、該形質転換体が資化しうる物であればよく、例えば、グルコース、マルトース、フラクトース、マンノース、トレハロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、デンプン、デキストリン、糖蜜などの糖質、またはクエン酸、コハク酸などの有機酸、またはグリセリンなどの脂肪酸も使用することができる。
【００４０】
本発明の形質転換体の培養に用いる栄養培地の窒素源としては、各種有機および無機の窒素化合物、さらに培地は各種の無機塩を含むことができる。たとえば、コーンスチープリカー、大豆粕、あるいは各種ペプトン類等の有機窒素源、そして塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、リン酸アンモニウム等の無機窒素源などの化合物が使用可能である。また、グルタミン酸などのアミノ酸および尿素などの有機窒素源が炭素源にもなることはいうまでもない。さらに、ペプトン、ポリペプトン、バクトペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、大豆粉、大豆粕、乾燥酵母、カザミノ酸、ソリュブルベジタブルプロテイン等の窒素含有天然物も窒素源として使用できる。
【００４１】
本発明の形質転換体の培養に用いる栄養培地の無機物としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などが適宜用いられる。具体的には、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等が用いられる。さらに、必要に応じて、アミノ酸ならびにビオチンおよびチアミンなどの微量栄養素ビタミンなども適宜用いられる。
【００４２】
本発明の形質転換体の培養法としては、特に制限されず、固体培養法でも液体培養法（振とう培養法もしくは通気攪拌培養法）でもいずれを用いてもよい。培養温度とｐＨは、使用する形質転換体の増殖に適した条件を選べばよい。たとえば、形質転換体が昆虫細胞の場合の培養は、通常、温度２０〜３５℃、好ましくは２０〜３０℃、より好ましくは２５℃であり、ｐＨ５〜９、好ましくは６〜８から選ばれる条件で行われる。培養時間は細胞が増殖し始める時間以上の時間であればよく、好ましくは８〜１２０時間である。細胞の増殖を確認する方法は特に制限はないが、たとえば、培養物を採取して顕微鏡で観察してもよいし、吸光度で観察してもよい。
【００４３】
本発明の形質転換体の培養において、組換えベクターに選択マーカーを含有させている場合などでは、選択マーカーに対応した抗生物質を栄養培地とともに加える。たとえば、選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子およびクロラムフェニコール耐性遺伝子を含有する場合は、適当な濃度に調製したアンピシリン溶液およびクロラムフェニコール溶液をそれぞれ加える。また、必要であれば、発現誘導剤を培養開始時または培養開始から形質転換体の増殖を確認した後に加えることができる。具体的には、発現誘導剤としては、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を挙げることができる。
【００４４】
例えば、宿主細胞がカイコ胚由来培養細胞ＮＩＡＳ−Ｂｍ−Ｏｙａｎａｇｉ  ２である場合は、ウシ胎児血清及びＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×）（ＧＩＢＣＯ）を含むＩＰＬ−４１（ＧＩＢＣＯ）で約８０−９０％コンフルエントとなるまで培養することができる。その際の培養温度は２０〜３５℃、好ましくは２５℃であり、培養時間は１２〜７２時間、好ましくは２４〜４８時間に設定することができる。トランスフェクションには、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いることができる。
【００４５】
本発明の形質転換体を得る方法及び本発明の形質転換体を培養する方法は、上記した方法に制限されず、適宜常法に従い又は常法を応用して行うことができる。
【００４６】
本発明の外来ＤＮＡ断片由来の逆方向反復配列を含む組換えベクターを作製する方法（例えば、図５の工程１〜９を含む方法）は、本発明の核酸を、発現可能な状態で発現ベクターに挿入して、組換えベクターを得る工程（例えば、図５の工程１）、逆方向反復配列の鋳型となる外来ＤＮＡ断片を、前記組換えベクター内に挿入された核酸における外来ＤＮＡ断片の挿入領域に挿入して、外来ＤＮＡ断片を含む組換えベクターを得る工程（例えば、図５の工程２）、前記外来ＤＮＡ断片を含む組換えベクターを、第二のニッキングエンドヌクレアーゼ及び第一の制限酵素で処理して、ニック入り切断組換えベクターを得る工程（例えば、図５の工程３）、前記ニック入り切断組換えベクター内に挿入された核酸におけるスペーサー領域を挟んでなる逆方向反復配列においてステムループ構造を形成させて、第一のステムループ構造を含むニック入り切断組換えベクターを得る工程（例えば、図５の工程４）、前記第一のステムループ構造を含むニック入り切断組換えベクターを、リガーゼで処理して、ステムループ構造を含む切断組換えベクターを得る工程（例えば、図５の工程５）、前記ステムループ構造を含む切断組換えベクターを、第一のニッキングエンドヌクレアーゼ及び第一の制限酵素で処理して、第二のステムループ構造を含むニック入り切断組換えベクターを得る工程（例えば、図５の工程６）、前記第二のステムループ構造を含むニック入り切断組換えベクターを鎖置換型ＤＮＡ合成酵素で処理して、外来ＤＮＡ断片由来の逆方向反復配列を含む切断組換えベクターを得る工程（例えば、図５の工程７）、前記外来ＤＮＡ断片由来の逆方向反復配列を含む切断組換えベクターをエキソヌクレアーゼで処理して、切断面が平滑末端である組換えベクターを得る工程（例えば、図５の工程８）、及び前記切断面が平滑末端である組換えベクターをリガーゼで処理して、外来ＤＮＡ断片由来の逆方向反復配列を含む組換えベクターを得る工程（例えば、図５の工程９）を含む方法である。
【００４７】
本発明の外来ＤＮＡ断片由来の逆方向反復配列を含む組換えベクターを作製する方法は、上記工程を含む方法であれば特に制限されず、例えば、他の工程を適宜含むこともできる。本発明の外来ＤＮＡ断片由来の逆方向反復配列を含む組換えベクターを作製する方法は、例えば、実施例に記載の式（Ｉ）の核酸を用いた方法を挙げることができ、その概略は図５により表される。
【００４８】
外来ＤＮＡ断片を含む組換えベクターを、第二のニッキングエンドヌクレアーゼ及び第一の制限酵素で処理して、ニック入り切断組換えベクターを得る工程（例えば、図５の工程３）において、外来ＤＮＡ断片を含む組換えベクターを、第二のニッキングエンドヌクレアーゼ及び第一の制限酵素のいずれか一方の酵素で処理した後に他方の酵素で処理することもできるし、それらを組み合わせて同時に処理することもできる。すなわち、上記工程は、外来ＤＮＡ断片を含む組換えベクターを、第二のニッキングエンドヌクレアーゼ及び第一の制限酵素で処理して、ニック入り切断組換えベクター（例えば、図５の工程３及び４の間の組換えベクター）を得ることができれば特に制限されるものではない。
【００４９】
ニック入り切断組換えベクター内に挿入された核酸におけるスペーサー領域を挟んでなる逆方向反復配列においてステムループ構造を形成させて、第一のステムループ構造を含むニック入り切断組換えベクターを得る工程（例えば、図５の工程４）において、スペーサー領域を挟んでなる逆方向反復配列におけるステムループ構造の形成は、ニック入り切断組換えベクターの二本鎖が変性する温度下に置き、次いで上記逆方向反復配列がアニーリングしてステムループ構造を形成する温度に置くことにより達成できる。例えば、ステムループ構造の形成は、ニック入り切断組換えベクターを７５〜１００℃程度、好ましくは８５〜９５℃程度に加熱し、次いで５０〜１０℃程度、好ましくは４０〜２０℃程度にまで徐々に冷却することにより達成することができる。ただし、上記工程は、ニック入り切断組換えベクター内に挿入された核酸におけるスペーサー領域を挟んでなる逆方向反復配列においてステムループ構造を形成させて、第一のステムループ構造を含むニック入り切断組換えベクター（例えば、図５の工程４及び５の間の組換えベクター）を得ることができれば、上記加熱・冷却方法により制限されない。
【００５０】
ステムループ構造を含む切断組換えベクターを、第一のニッキングエンドヌクレアーゼ及び第一の制限酵素で処理して、第二のステムループ構造を含むニック入り切断組換えベクターを得る工程（例えば、図５の工程６）において、ステムループ構造を含む切断組換えベクターを、第一のニッキングエンドヌクレアーゼ及び第一の制限酵素のいずれか一方の酵素で処理した後に他方の酵素で処理することもできるし、それらを組み合わせて同時に処理することもできる。すなわち、上記工程は、ステムループ構造を含む切断組換えベクターを、第一のニッキングエンドヌクレアーゼ及び第一の制限酵素で処理して、第二のステムループ構造を含むニック入り切断組換えベクター（例えば、図５の工程６及び７の間の組換えベクター）を得ることができれば特に制限されるものではない。
【００５１】
本発明の方法におけるニッキングエンドヌクレアーゼ、制限酵素、リガーゼ、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、エキソヌクレアーゼは、常法に従い用いることができる。例えば、これらの酵素は実施例に記載の方法により使用することができる。
【００５２】
例えば、リガーゼとしてはＴ４  ＤＮＡリガーゼなどを制限なく挙げることができる。エキソヌクレアーゼとしては３’突出末端を平滑化するエキソヌクレアーゼであれば特に制限されず、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｕｎｇ  ｂｅａｎヌクレアーゼ、ＳＩヌクレアーゼなどを挙げることができる。例えば、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素としては、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ニューイングランドバイオラブス社）、Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（タカラなど）、Ｂｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ニューイングランドバイオラブス社）、ＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラ）などを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００５３】
第二のステムループ構造を含むニック入り切断組換えベクターにおいて、ニックは、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素により、外来ＤＮＡ断片の一本鎖、ステムループ構造及び外来ＤＮＡ断片の他方の一本鎖を含む領域を鋳型としてＤＮＡ合成反応が行われるために挿入される。
【００５４】
本発明の方法により作製された外来ＤＮＡ断片由来の逆方向反復配列を含む組換えベクターにおいて、該逆方向反復配列が形成されているか否かは、例えば、該逆方向反復配列を含む領域をＰＣＲなどによって増幅すること、ゲル電気泳動法により該逆方向反復配列を含む領域のバンドを検出すること、逆方向反復配列を含む領域を解読（シークエンシング）することなどにより確認することができる。シークエンシングにより確認する場合、例えば、予め上記組換えベクターのスペーサー領域を制限酵素で切断するなどした後でシークエンシングすることが好ましい。ＰＣＲ増幅によって確認する場合、逆方向反復配列を挟むプライマーセットでＰＣＲを行うと逆方向反復配列を含む領域は増幅されない傾向にある。したがって、例えば、上記プライマーセットでＰＣＲにより増幅されなかったものを、外来ＤＮＡ断片由来の逆方向反復配列を含む組換えベクターと判定することができる。
【００５５】
本発明の別の側面によれば、本発明の外来ＤＮＡ断片の逆方向反復配列を含む組換えベクターを作製する方法により、複数の外来ＤＮＡ断片及び複数の発現ベクターを用いて、前記外来ＤＮＡ断片由来の逆方向反復配列を含む複数の組換えベクターを作製して、ＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーを得る工程を含む、ＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーを作製する方法を提供することができる。
【００５６】
複数の外来ＤＮＡ断片及び複数の発現ベクターにおける「複数」は、それぞれが２以上であれば、それぞれ異なる数でも同じ数でもいずれでもよい。
【００５７】
本発明のＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーを作製する方法は、同一作製条件下で複数の外来ＤＮＡ断片及び複数の発現ベクターを用いて、前記外来ＤＮＡ断片由来の逆方向反復配列を含む複数の組換えベクターを作製することができる。したがって、本発明のＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーを作製する方法によれば、一度又は数回（例えば、２〜１０回）程度の操作で大規模なＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーを構築することができる。
【００５８】
外来ＤＮＡ断片は、例えば、ＲＮＡｉの標的遺伝子の塩基配列を含む核酸をランダムに切断して得られた二本鎖ＤＮＡ断片を挙げることができるがこれに限定されるものではない。
【００５９】
本発明の方法により作製された外来ＤＮＡ断片由来の逆方向反復配列を含む組換えベクター又はＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーは、外来ＤＮＡ断片由来の逆方向反復配列を含む組換えベクターを、ＲＮＡｉの標的となる遺伝子を発現する宿主細胞に導入して形質転換体を得る工程、形質転換体を培養して、形質転換体培養物を得る工程、前記形質転換体培養物における標的遺伝子の発現量を測定する工程、及び未形質転換の宿主細胞と比べて、標的遺伝子の発現量に影響を与えている形質転換体に導入された前記逆方向反復配列を、ＲＮＡｉ効果を有する逆方向反復配列と判定する工程を含む、ＲＮＡｉ効果を有する逆方向反復配列と判定することにより、ＲＮＡｉ効果を有する逆方向反復配列と判定することができる。すなわち、本発明の別の側面によれば、上記工程を含む、ＲＮＡｉ効果を有する逆方向反復配列を判定する方法が提供される。
【００６０】
さらに、本発明の別の側面によれば、本発明のＲＮＡｉ効果を有する逆方向反復配列を判定する方法により、ＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーからＲＮＡｉ効果を有する逆方向反復配列を選抜する工程を含む、ＲＮＡｉ効果を有する逆方向反復配列のスクリーニング方法が提供される。
【００６１】
標的遺伝子の発現量は、形質転換体培養物から常法に従い得られた、標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量、該ｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡの量及び該ｍＲＮＡによって翻訳されたタンパク質の量などによって測定することができる。
【００６２】
標的遺伝子の発現量に与える影響とは、標的遺伝子の発現量の増加又は減少を意味し、好ましくは減少である。
【００６３】
標的遺伝子としては、例えば、昆虫免疫関与遺伝子の転写制御に関わる遺伝子又は昆虫ＤＮＡウイルスの侵入に関わる遺伝子を挙げることができるが、これらに制限されるものではない。
【００６４】
本発明の方法のいずれも、各工程を単独で行うこともできるが、２以上の工程を同時に行うこともできる。
【００６５】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００６６】
昆虫細胞におけるＲＮＡｉによるルシフェラーゼ遺伝子のノックダウン
１．発現ベクター
発現ベクターとして、ｐＩＥｘ−４（Ｎｏｖａｇｅｎ社；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｓｍｏｂｉｏ．ｃｏ．ｊｐ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ＿ＮＶＧ＿２００６０３０８＿０３．ａｓｐ）を用いた。ｐＩＥｘ−４のプロモーターは昆虫細胞で非常に強力に働くバキュロウイルス由来のＩＥ１プロモーターである。ｐＩＥｘ−４には、さらにプロモーター活性を強力にするために  ｈｒ５エンハンサーが付加されている。これらのプラスミドマップ及び塩基配列を図１に示した。なお、発現ベクターは宿主細胞によって適宜調整することができる。
【００６７】
２．逆方向反復配列を作製するための核酸
ｃＤＮＡを挿入する前に、下記式（Ｉ）の核酸（配列表の配列番号１）を昆虫細胞用発現ベクターｐＩＥｘ−４に挿入させた、組換えｐＩＥｘ−４を作製した。具体的には、ｐＩＥｘ−４のｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅ（ＭＣＳ）を制限酵素ＮｃｏＩ及びＤｒａＩＩＩで切断して除去し（１０８２−１２８４の範囲の除去）、その切断箇所に下記式（Ｉ）の核酸を挿入した。
【化１】
0005422804.tif 000002
【００６８】
なお、ｐＩＥｘ−４に上記式（Ｉ）の核酸を挿入させる前に、ｐＩＥｘ−４内にある２２８７番目のＡと２４６９番目のＴをそれぞれＣに置換することにより、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩによる不作為の切断を防止した。
【００６９】
上記式（Ｉ）の核酸の特徴は、下記の通りである。
ｃＤＮＡは制限酵素部位であるＸｈｏＩとＫｐｎＩを介して挿入される。ＸｈｏＩ認識部位とＫｐｎＩ認識部位の両側に、認識部位の二本鎖ＤＮＡの片方のみを切断する酵素であるニッキングエンドヌクレアーゼのＮｂ．ＢｂｖＣＩとＮｂ．ＢｓｒＤＩに認識される部位が挿入されている。上記ニッキングエンドヌクレアーゼは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂｊ．ｊｐ／ｊｐ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）によって市販されている。Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ認識部位のターミネーター側に一本鎖になるとステムループ構造を形成する逆方向反復（ＩＲ）型のＤＮＡが挿入されている。このステム部分に相当するステム配列は、長さが２０ｂｐで、この配列がカイコゲノム中には存在せず、かつオフターゲット（非特異ＲＮＡｉ効果）を引き起こすＣＡＮリピート構造をとっていない。一方、ループ部分に相当するループ配列の長さは５０ｂｐである。ＤＮＡの二次構造をとるような配列ではない。なお、ループ配列の長さが最低５０ｂｐないと、プラスミドは大腸菌内で変異、欠失等を引き起こす可能性が高くなる。ＩＲ型ＤＮＡの下流に、ＰｓｔＩによって認識される制限酵素部位がある。
【００７０】
ｐＩＥｘ−４には上記した制限酵素及びニッキングエンドヌクレアーゼによって認識される部位はない。上記した通り、ｐＩＥｘ−４中の二箇所のＮｂ．ＢｓｒＤＩ部位は、塩基配列を置換することによりＮｂ．ＢｓｒＤＩによって認識させなくしている。
【００７１】
上記式（Ｉ）の核酸において、以下に示す通り、５’側のステム配列の中にＣｓｐＣＩ部位（ＣＡＡ（Ｎ）5ＧＴＧＧを認識）が一カ所存在する。
【化２】
0005422804.tif 000003
【００７２】
ＣｓｐＣＩはこの部位を認識するとそれらの５’側の１０から１１塩基離れた所と、３’側の１２から１３塩基離れた所を切断するのでＩＲ構造に変換させたＤＮＡの間に存在するステムループ部分（２０ｍｅｒのステムと５０ｍｅｒのループ）のステムに相当する配列の片方を取り除くことができ、さらにループ配列を長くすることができる。ループ配列が長くなると、大腸菌でのＩＲ構造の安定性がよくなる。
【００７３】
３  発現ベクターへのｃＤＮＡの挿入
ホタルルシフェラーゼ（ルシフェラーゼ又はｌｕｃと呼ぶ）ｃＤＮＡを用いた。ｌｕｃは１００ｂｐ、２００ｂｐ、及び３００ｂｐの長さのものを用いた。両端にＸｈｏＩとＫｐｎＩ部位を持つｃＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅後、ＸｈｏＩ及びＫｐｎＩで消化した。この断片を回収後、組換えｐＩＥｘ−４のＸｈｏＩ認識部位及びＫｐｎＩ認識部位に挿入した。
【００７４】
より具体的には、下記の方法によりルシフェラーゼｃＤＮＡを得た。
発現ベクターであるｐｓｉＣＨＥＣＫ−２（Ｐｒｏｍｅｇａ社；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ｃａｔａｌｏｇ／ｃａｔａｌｏｇｐｒｏｄｕｃｔｓ．ａｓｐｘ？ｃａｔｅｇｏｒｙｎａｍｅ＝ｐｒｏｄｕｃｔｌｅａｆ＿１６０２）には、下記に示す通りにルシフェラーゼｃＤＮＡとウミシイタケルシフェラーゼｃＤＮＡが挿入されている。
【化３】
0005422804.tif 000004
【００７５】
このｐｓｉＣＨＥＣＫ−２をテンプレートとして、Ｐｗｏ  Ｓｕｐｅｒ  Ｙｉｅｌｄ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いたＰＣＲによりルシフェラーゼｃＤＮＡ（ｌｕｃ）断片を増幅した。使用した試薬及びＰＣＲ条件は以下の通りである。
【００７６】
DDW・・・39.5 μl
1 ng/μl psiCHECK-2・・・1 μl
10 pmol/μl lucCommonF-XhoI primer・・・1.5 μl
10 pmol/μl luc100, 200 or 300R-KpnI primer・・・1.5 μl
10 mM dNTP・・・1 μl
10× Pwo Super Yield PCR buffer・・・5 μl
5 U/μl Pwo Super Yield DNA Polymerase・・・0.5 μl
ＰＣＲは初期変性：９５℃・２分、連鎖反応：９５℃・２０秒→５５℃・３０秒→７２℃・２０秒×３５サイクル、最終伸長：１分で行った。
【００７７】
ＰＣＲで使用したプライマーセットは、ｌｕｃＣｏｍｍｏｎＦ−ＸｈｏＩ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号２）とｌｕｃ１００Ｒ−ＫｐｎＩ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号３）、ｌｕｃ２００Ｒ−ＫｐｎＩ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号４）若しくはｌｕｃ３００Ｒ−ＫｐｎＩ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号５）だった。
【００７８】
ｌｕｃＣｏｍｍｏｎＦ−ＸｈｏＩ  ｐｒｉｍｅｒ及びｌｕｃ１００Ｒ−ＫｐｎＩ  ｐｒｉｍｅｒの第一のプライマーセットを用いたＰＣＲにより、配列番号６のｌｕｃ配列を増幅させた。ｌｕｃＣｏｍｍｏｎＦ−ＸｈｏＩ  ｐｒｉｍｅｒ及びｌｕｃ２００Ｒ−ＫｐｎＩ  ｐｒｉｍｅｒの第二のプライマーセットを用いたＰＣＲにより、配列番号７のｌｕｃ配列を増幅させた。ｌｕｃＣｏｍｍｏｎＦ−ＸｈｏＩ  ｐｒｉｍｅｒ及びｌｕｃ３００Ｒ−ＫｐｎＩ  ｐｒｉｍｅｒの第三のプライマーセットを用いたＰＣＲにより、配列番号８のｌｕｃ配列を増幅させた。
【００７９】
各ＰＣＲ産物はＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製した。各精製ＰＣＲ産物と組換えｐＩＥｘ−４を以下の条件で制限酵素処理した。
DDW・・・42 μl
0.2 pmol/μl 各精製PCR産物・・・1 μl
0.02 pmol/μl 組換えpIEx-4・・・1 μl
10× L Buffer(NIPPON GENE)・・・5 μl 
10 mg/ml BSA・・・0.5 μl
20 U/μl KpnI(NIPPON GENE)・・・0.5 μl
37℃・1時間
【００８０】
制限酵素処理後、２．６３μｌの１Ｍ  ＮａＣｌ、０．５μｌの２０Ｕ／μｌ  ＸｈｏＩ（ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ）を加えてさらに３７℃・１時間反応させた。反応終了後、フェノール・クロロホルム処理、クロロホルム処理、イソプロパノール沈殿（共沈剤として０．５μｌのＥｔｈａｃｈｉｎｍａｔｅ（ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ）を使用）してＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡを２μｌの１／２×ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞（ＴＡＫＡＲＡ  ＢＩＯ）で溶解し、１６℃・１時間ライゲーションした。これらをＥ．ｃｏｌｉ（ＪＭ１０９）へ導入し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢプレートにスプレッドして３７℃・一晩培養した。
【００８１】
上記第一から第三の各プライマーセットを用いたコロニーＰＣＲで、生育したコロニーの中からインサートが確認されたプラスミドを含有する大腸菌を１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＱｕｉｃｋＰｕｒｅ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）を用いてプラスミドを抽出及び精製した。これらのプラスミドを、組換えｐＩＥｘ−４−ｌｕｃ１００、組換えｐＩＥｘ−４−ｌｕｃ２００、及び組換えｐＩＥｘ−４−ｌｕｃ３００（ｌｕｃ１００−３００は１００−３００ｂｐのｌｕｃ断片を意味する）と呼ぶ。
【００８２】
４  鎖置換反応による組換えｐＩＥｘ−４−ｌｕｃ１００、２００、３００のｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ形成
まず、ルシフェラーゼｃＤＮＡを挿入した組換えｐＩＥｘ−４をＰｓｔＩとＮｂ．ＢｓｒＤＩで消化した。ＰｓｔＩ部位は完全消化されるが、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ部位は片方の鎖のみが切断された。次に、熱処理（８５℃）をした後に、温度をゆっくりと下げた。ＤＮＡは熱処理により、一本鎖状態になった（解離）が、この後温度をさげることにより再び、相補的な部分が会合し二本鎖状態となった。ここで、ニックを生じた側のＩＲ部分（２０ｂｐ−５０ｂｐ−２０ｂｐ）は、熱処理により一本鎖になり解離したが、温度をさげて再会合する際に、ヘアピン構造をとった。これは、相補的な二本鎖が会合するよりも、一本鎖中のＩＲ部分が会合しやすいためと考えられる。その後、ニックの部分をＬｉｇａｓｅで連結した。ここで、Ｌｉｇａｓｅ処理をせずに、ヘアピン構造をとるアダプターやリンカーを直接付着することが考えられた。しかし、ヘアピン構造をとるアダプター等を結合した場合、最終的に目的とするｃＤＮＡのＩＲを有する組換えベクターを得ることができなかった。
【００８３】
上記Ｌｉｇａｔｉｏｎ反応後、ＰｓｔＩで消化したもう一方の末端部に同じ末端部が結合し得たので、これを切断するためにもう一度ＰｓｔＩで消化するとともに、ニッキングエンドヌクレアーゼであるＮｂ．ＢｂｖＣＩで消化した。挿入したｃＤＮＡの下流にあるＮｂ．ＢｂｖＣＩ部位の片方にニックが入った。その後、鎖置換反応を触媒できるＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅのＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで反応させると、ニックの部分から鎖置換反応がおこり、最終的に挿入したＤＮＡがＩＲ構造に変換された。ＰｓｔＩ切断で生じた３’突出末端をＴ４  ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ処理で平滑末端にした後、Ｌｉｇａｓｅで末端同士を付着させた。上記工程を経ることにより、目的のｃＤＮＡがｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ構造に変換された組換えプラスミドを産生することができた。
【００８４】
具体的は実験方法は以下の通りである。
組換えｐＩＥｘ−４−ｌｕｃ１００−３００を以下のように処理した。
DDW・・・33.5 μl
0.02 pmol/μl組換えpIEx-4-lucxxx・・・10 μl
10× M Buffer(NIPPON GENE)・・・5 μl
10 mg/ml BSA・・・0.5 μl
10 U/μl Nb.BsrDI(New England Biolabs)・・・1 μl
65℃・1時間
【００８５】
反応終了後、２．６３μｌの１Ｍ  ＮａＣｌ、０．５μｌの１５Ｕ／μｌ  ＰｓｔＩ（ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ）を加えてさらに３７℃・１時間反応させた。その後８５℃・１分間加熱の後緩冷してループを形成させ、フェノール・クロロホルム処理、クロロホルム処理、イソプロパノール沈殿（共沈剤として０．５μｌのＥｔｈａｃｈｉｎｍａｔｅを使用）してプラスミドを回収した。これらを１０μｌの１／２×ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞で溶解して１６℃・１時間反応させてニックを修復した。反応終了後、フェノール・クロロホルム処理、クロロホルム処理、イソプロパノール沈殿してプラスミドを回収した。これらを４３．５μｌのＤＤＷで溶解し、以下のように処理した。
組換えｐＩＥｘ−４−ｌｕｃｘｘｘ反応産物・・・４３．５  μｌ
10× M Buffer・・・5 μl
10 mg/ml BSA・・・0.5 μl
10 U/μl Nb.BbvCI(New England Biolabs)・・・1 μl
37℃・1時間
【００８６】
上記処理後、２．６３μｌの１  Ｍ  ＮａＣｌ、０．５μｌの１５Ｕ／μｌ  ＰｓｔＩを加えてさらに３７℃・１時間反応させた。その後フェノール・クロロホルム処理、クロロホルム処理、イソプロパノール沈殿してプラスミドを回収した。これらを以後「組換えｐＩＥｘ−４−ｌｕｃｘｘｘ最終反応産物」（ｘｘｘは塩基の長さに対応して１００、２００又は３００）と呼んだ。
【００８７】
回収した各プラスミドを以下のようにＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ  ＢＩＯ）を用いて鎖置換反応し、ｌｕｃ断片のＩｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ（ＩＲ）を形成した。
DDW・・・16.1 μl
0.01 pmol/μl組換えpIEx-4-lucxxx最終反応産物・・・1 μl
10× Buffer・・・2 μl
10 mM dNTP・・・0.4 μl
2 U/μl BcaBEST DNA polymerase・・・0.5 μl
65℃・1時間
【００８８】
反応終了後、０．４μｌの５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１  μｌの０．３  Ｕ／μｌ  Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を加えてさらに１６℃・１０分間反応させてプラスミドの末端を平滑化した。その後フェノール・クロロホルム処理、クロロホルム処理、イソプロパノール沈殿（共沈剤として０．５  μｌのＥｔｈａｃｈｉｎｍａｔｅを使用）してプラスミドを回収した。これらを２μｌの１／２×ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞で溶解して１６℃・１時間ライゲーションしてＥ．ｃｏｌｉ（ＳＵＲＥ２  ｆｒｏｍ  ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）へ導入し、１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含むＬＢプレートにまいて３７℃・一晩培養した。
【００８９】
ＩＲの外側の配列に対して相補的となるようにデザインされたｐＩＥｘＦ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号９）及びｐＩＥｘＲ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１０）を用いたコロニーＰＣＲでは増幅が見られなかったクローン（ＩＲが形成されると高次構造をとるため、鎖置換反応活性のないＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなどでは著しく増幅効率が悪くなることを利用したスクリーニング法）を１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＱｕｉｃｋＰｕｒｅを用いてプラスミドを抽出・精製した。
【００９０】
これらのプラスミドをループ配列部分に存在するＳａｃＩで切断した後、その塩基配列をＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて決定し、正しい配列をもつプラスミドであることを確認した。なお、これらのプラスミドの塩基配列を直接シークエンスしようとしても、高次構造を形成するのでシークエンシングできなかった。そこで、上記の通りに、制限酵素ＳａｃＩで切断した。これらのプラスミドを以後「組換えｐＩＥｘ−４−ｌｕｃｘｘｘＩＲ」（ｘｘｘは塩基長に対応して１００、２００又は３００）と呼んだ。その後、組換えｐＩＥｘ−４−ｌｕｃｘｘｘＩＲをＧｅｎｏｐｕｒｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて抽出・精製した。
【００９１】
５  ＲＮＡｉ効果の評価
上記手法で作製した組換えｐＩＥｘ−４−ｌｕｃ１００ＩＲ、ｐＩＥｘ−４−ｌｕｃ２００ＩＲ、ｐＩＥｘ−４−ｌｕｃ３００ＩＲをカイコ培養細胞に導入したときにＲＮＡｉ効果を示すことを下記スキームにより確認した。
【化４】
0005422804.tif 000005
【００９２】
ここでは、胚由来のカイコ培養細胞であるＢｍ−ＮＩＡＳ−Ｏｙａｎａｇｉ２を用い、この細胞に上記組換えプラスミドと、カイコ用に改変したルシフェラーゼ遺伝子のチェックベクター（組換えｐｓｉＣＨＥＣＫ−２）を一緒にトランシフェクションし、４８時間培養した。培養後、細胞抽出液を調製した後、この抽出液中のルシフェラーゼ（ｌｕｃ）活性を測定することでＲＮＡｉ効果を評価した。なお、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）活性も同時に測定し、Ｒｌｕｃ活性でｌｕｃ活性を補正した。ルシフェラーゼ活性がコントロールと比較し減少すれば、ＲＮＡｉ効果が得られたと評価した。
【００９３】
具体的な実験方法は下記の通りである。
カイコ胚由来培養細胞ＮＩＡＳ−Ｂｍ−Ｏｙａｎａｇｉ  ２を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清・１％（ｖ／ｖ）Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×）（ＧＩＢＣＯ）を含むＩＰＬ−４１（ＧＩＢＣＯ）で約８０−９０％コンフルエントとなるまで培養した。この細胞をセルスクレーパーで剥がして同上の培地で懸濁し、２×１０5個／ｗｅｌｌとなるように２４穴プレートの各ウェルに分注し、２５℃・２４時間培養した。その後培地を除去し、１００μｌの同じ組成の培地に交換した。
【００９４】
０．０６ｐｍｏｌの組換えｐｓｉＣＨＥＣＫ−２に対して０．１８ｐｍｏｌの組換えｐＩＥｘ−４−ｌｕｃｘｘｘＩＲもしくは組換えｐＩＥｘ−４（ネガティブコントロール）を混合し、ＩＰＬ−４１で１００μｌとした。ここに０．２  μｇＤＮＡ／μｌの割合となるようにＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）を加え、２０分間室温でインキュベートした。これらを細胞の入った各ウェルに加えて、２５℃・４時間インキュベートした後で培地を除去し、５００μｌの１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清・１％（ｖ／ｖ）Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×）を含むＩＰＬ−４１に交換した。その後２５℃・４８時間インキュベートした。
【００９５】
インキュベート後、細胞抽出液を調製し、各組換えｐＩＥｘ−４−ｌｕｃｘｘｘＩＲのＲＮＡｉ効果をルシフェラーゼ活性として評価した。なお、ルシフェラーゼ活性及びウミシイタケルシフェラーゼ活性（補正用）は、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。方法はこのキットの説明書に従った。
【００９６】
組換えｐｓｉＣＨＥＣＫ−２のみを用いた場合の相対的ルシフェラーゼ活性を１００として、各々の相対的ルシフェラーゼ活性を求めた。その結果、組換えｐＩＥｘ−４−ｌｕｃ１００ＩＲ、ｐＩＥｘ−４−ｌｕｃ２００ＩＲ、ｐＩＥｘ−４−ｌｕｃ３００ＩＲのいずれによって形質転換した場合でも、相対的ルシフェラーゼ活性が大きく低下し、効率よくＲＮＡｉ効果を示すことが明らかになった（図２）。しかも、ｐＩＥｘ−４−ｌｕｃ２００ＩＲ、ｐＩＥｘ−４−ｌｕｃ３００ＩＲの場合、ポジティブコントロールとなるプラスミド（ｐＩＥｘ−４−５００ｌｕｃ−Ａ３ＩＲ；ルシフェラーゼｃＤＮＡ由来の配列を有する５００ｂｐのＤＮＡが１００ｂｐのカイコアクチンＡ３遺伝子イントロン由来の配列１００ｂｐを挟んでｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ構造になっているものをｐＩＥｘ−４のＮｃｏＩとＤｒａＩＩＩ  部位に挿入したもの）を用いた場合とほぼ同様のＲＮＡｉ効果を示した。これらのことから、この手法で作製したコンストラクトはＲＮＡｉ効果を生じることが明らかとなった。なお、この手法で作製すると、ＩＲ構造に変換した際に、その間に２０ｂｐ−５０ｂｐ−２０ｂｐの短いＩＲ構造をしたＤＮＡが生じる。当初はこのＩＲ  ＤＮＡを排除するために、ＣｓｐＣＩ部位で切断し、その後セルフライゲーションさせたものを用いる予定であったが、こうした短いＩＲ構造が含まれていてもＲＮＡｉ効果に問題はなかった。従って以後はＣｓｐＣＩ認識部位を切断せずに用いた。
【００９７】
上記式（Ｉ）の核酸を含有する組換えベクターを用いた長鎖ＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーの作製法
下記に示すとおり、上記式（Ｉ）の核酸を含有する組換えベクターを用いて、複数のｃＤＮＡから長鎖ＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーを作製することができると考え、次の通りに計画した。
【化５】
0005422804.tif 000006
【００９８】
まず、昆虫の適当な組織あるいは培養細胞からｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡからｃＤＮＡを調製する。このとき、ｃＤＮＡを一度適当なベクターに入れてライブラリー化することもできる。その場合、その後のステップに移る際に、ベクター由来のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、ｃＤＮＡ断片をとりだす。例えば、二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素であるＤｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＥＶＲＯＧＥＮ）でｃＤＮＡをランダムに消化した後、２００から５００ｂｐのＤＮＡ断片を回収する。その後、ＴａｑＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅでＤＮＡの３’末端にモノアデニンを付加させ、ＴＡクローニングベクターであるｐＴＡＣ−１（ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｃ．； ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｄｙｎａｍｉｃｓ．ｃｏ．ｊｐ／ｐｒｄ＿ｄｓ１２０．ｈｔｍに塩基配列の情報がある）にクローニングし、ｃＤＮＡプラスミドライブラリーを作製する。ｐＴａｃ−１のクローニング部位の両脇の配列にそれぞれＫｐｎＩ認識部位及びＸｈｏＩ認識部位を５’側に付加した配列をプライマーとしてＰＣＲを行い、これらの部位を含む両脇の配列をそれぞれプライマーとしてＰＣＲを行い、増幅ＤＮＡを回収後、ＫｐｎＩとＸｈｏＩで消化し、組換えｐＩＥｘ−４に挿入する。次いで、実施例１に記載の方法により、長鎖ＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーを得ることができる。
【００９９】
具体的には、Ｒｌｕｃ  ｃＤＮＡを出発材料として長鎖ＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーを作製した。
【０１００】
１  ウミシイタケルシフェラーゼｃＤＮＡ断片のサブクローニング
ｐｓｉＣＨＥＣＫ−２をテンプレートとしたＰＣＲで、ウミシイタケルシフェラーゼｃＤＮＡ（Ｒｌｕｃ）を下記の通りに増幅した。
DDW・・・39.5 μl
1 ng/μl psiCHECK-2・・・1 μl
10 pmol/μl Rluc Full-F primer・・・1.5 μl
10 pmol/μl Rluc Full-R primer・・・1.5 μl
10 mM dNTP・・・1 μl
10× Pwo Super Yield PCR buffer・・・5 μl
5 U/μl Pwo Super Yield DNA Polymerase・・・0.5 μl
ＰＣＲは初期変性：９５℃・２分、連鎖反応：９５℃・２０秒→５５℃・３０秒→７２℃・１分×３５サイクル、最終伸長：１分で行った。
【０１０１】
使用したプライマーセットは、Ｒｌｕｃ  Ｆｕｌｌ−Ｆ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１１）及びＲｌｕｃ  Ｆｕｌｌ−Ｒ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１２）であった。このプライマーセットを用いたＰＣＲによって完全長のＲｌｕｃ（ｐｓｉＣＨＥＣＫ−２の６９４−１６２９番目の塩基に相当する領域）が増幅された（配列番号１３）。
【０１０２】
各ＰＣＲ産物はＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて精製した。その後、以下の条件で完全長ＲｌｕｃをＤｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｓｅで消化した。
200 ng/μl完全長Rluc・・・6.2 μl
10× DSN master buffer・・・0.8 μl
0.01 U/μl Duplex-specific nuclease・・・1 μl
60℃・40分
【０１０３】
反応終了後、電気泳動でＤＮＡを分離し、２００−５００ｂｐの範囲を切り出した。ゲル中のＤＮＡをＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍで精製（５０μｌのＤＤＷで溶出）し、これを以下の条件で処理して平滑化した。
Duplex-specific nuclease消化産物・・・43 μl
10× Ex Taq Buffer(TAKARA BIO)・・・5 μl
10 mM dNTP・・・1 μl
10 mg/ml BSA・・・0.5 μl
3 U/μl T4 DNA polymerase・・・0.5 μl
16℃・10分
【０１０４】
反応終了後、１μｌの５Ｕ／μｌ  ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ  ＢＩＯ）を加えて、７２℃・１時間反応させ、３’末端にモノアデニンを付加した。反応終了後、フェノール・クロロホルム処理、クロロホルム処理、イソプロパノール沈殿（共沈剤として０．５μｌのＥｔｈａｃｈｉｎｍａｔｅを使用）でＤＮＡを回収した。これを１μｌの５０ｎｇ／μｌ  ｐＴＡＣ−１（ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１μｌのＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞で溶解して１６℃・１時間ライゲーションした。これをＥ．ｃｏｌｉ（ＪＭ１０９）へ導入し、１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含むＬＢプレートにスプレッドして３７℃・一晩培養した。培養終了後、プレートに２ｍｌの１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含むＬＢ培地を流し込んで、１分ほど揺することで組換え大腸菌を浮かび上がらせ、培地を回収した。これを２時間程度培養した後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＱｕｉｃｋＰｕｒｅを用いてプラスミドを抽出・精製した。このプラスミドを「ｐＴＡＣ−１−Ｒｌｕｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔ」と名付けた。
【０１０５】
２  組換えｐＩＥｘ−４へのウミシイタケルシフェラーゼｃＤＮＡ断片の挿入
ｐＴＡＣ−１−Ｒｌｕｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔをテンプレートとして、以下のようにＰＣＲを行った。
DDW・・・39.5 μl
1 ng/μl pTAC-1-Rluc fragment・・・1 μl
10 pmol/μl pTAC-1-cDNA-F primer・・・1.5 μl
10 pmol/μl pTAC-1-cDNA-R primer・・・1.5 μl
10 mM dNTP・・・1 μl
10× Pwo Super Yield PCR buffer・・・5 μl
5 U/μl Pwo Super Yield DNA Polymerase・・・0.5 μl
ＰＣＲは初期変性：９５℃・２分、連鎖反応：９５℃・２０秒→５５℃・３０秒→７２℃・３０秒×３５サイクル、最終伸長：１分で行った。プライマーセットとしてｐＴＡＣ−１−ｃＤＮＡＦ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１４）及びｐＴＡＣ−１−ｃＤＮＡＲ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１５）を用いた。
【０１０６】
ＰＣＲ産物はＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて精製した。精製ＰＣＲ産物と組換えｐＩＥｘ−４を以下の条件で制限酵素処理した。
DDW・・・42 μl
0.2 pmol/μl 精製PCR産物・・・1 μl
0.02 pmol/μl 組換えpIEx-4・・・1 μl
10× L Buffer・・・5 μl 
10 mg/ml BSA・・・0.5 μl
20 U/μl KpnI・・・0.5 μl
37℃・1時間
【０１０７】
ここで、精製ＰＣＲ産物のモル濃度は、ＤＮＡの鎖長３５０ｂｐとして計算した。反応終了後、２．６３μｌの１Ｍ  ＮａＣｌ、０．５μｌの２０  Ｕ／μｌ  ＸｈｏＩを加えてさらに３７℃・１時間反応させた。反応終了後、フェノール・クロロホルム処理、クロロホルム処理、イソプロパノール沈殿（共沈剤として０．５μｌのＥｔｈａｃｈｉｎｍａｔｅを使用）してＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡを２μｌの１／２×ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞で溶解し、１６℃・１時間ライゲーションした。これらをＥ．ｃｏｌｉ（ＪＭ１０９）へ導入し、１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含むＬＢプレートにスプレッドして３７℃・一晩培養した。培養終了後、プレートに２ｍｌの１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含むＬＢ培地を流し込んで、１分ほど揺することで組換え大腸菌を浮かび上がらせ、培地を回収した。これを６時間程度培養した後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＱｕｉｃｋＰｕｒｅを用いてプラスミドを抽出・精製した。このプラスミドをテンプレートとし、ｐＴＡＣ−１−ｃＤＮＡＦ  ｐｒｉｍｅｒ・ｐＴＡＣ−１−ｃＤＮＡＲ  ｐｒｉｍｅｒを用いたＰＣＲで、２００−５００ｂｐのＤＮＡの増幅が見られることを確認した。このプラスミドを「組換えｐＩＥｘ−４−Ｒｌｕｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔ」と名付けた。
【０１０８】
３  鎖置換反応による組換えｐＩＥｘ−４−Ｒｌｕｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  のＲｌｕｃのＩＲ構造への変換
組換えｐＩＥｘ−４−Ｒｌｕｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔのＲｌｕｃＤＮＡを図５に示した方法でＩＲ構造に変換させ、これらをＥ．ｃｏｌｉ（ＳＵＲＥ）に形質転換し、１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含むＬＢプレートにスプレッドして３７℃・一晩培養した。生じたコロニー５個を１組として１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、Ｇｅｎｏｐｕｒｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔを用いてプラスミドを抽出・精製した。このプラスミドを「組換えｐＩＥｘ−４−Ｒｌｕｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔＩＲＬｉｂ」と名付けた。
【０１０９】
４  長鎖ＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーのＲＮＡｉ効果の評価（図２）
実施例１と同様の方法により、長鎖ＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーのＲＮＡｉ効果を確認した。ライブラリーの評価に際して、ライブラリー中の５クローンを１プールとして、組換えｐｓｉＣＨＥＣＫ−２と共にカイコ培養細胞（Ｂｍ−ＮＩＡＳ−Ｏｙａｎａｇｉ２）にトランスフェクションさせ、４８時間培養した。培養後、細胞抽出液を調製した後、この抽出液中のウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）活性を測定することでＲＮＡｉ効果を評価した。なお、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）活性も同時に測定し、ｌｕｃ活性でＲｌｕｃ活性を補正した。ウミシイタケルシフェラーゼ活性がコントロールと比較し減少すれば、ＲＮＡｉ効果が得られたといえる。図３に４つの異なるプールを用いて行った結果を示した。その結果ＲＮＡｉ効果は図２で得られた結果と比較すると低いが、プールによっては十分効果を示すことが分かった。効果が低い理由として、これら調製したプラスミドの中には不完全な形のもの（例えば、外来ＤＮＡ断片由来の逆方向反復配列が１００ｂｐ以下）が多く含まれているからと考えられる。上記評価結果から、長鎖ＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーの５クローンを１プールとして培養細胞にトランスフェクションさせ、そのノックダウン効果をｐｈｅｎｏｔｙｐｅにより解析し、ノックダウン効果の大きいクローンをスクリーニングできることが明らかになった。
【０１１０】
（参考例１）
ＥＰＲＩＬ法など既に報告されている短鎖ＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーの構築法を応用した方法（以下、改法１とよぶ）を下記の通りに創作した。
【化６】
0005422804.tif 000007
【０１１１】
なお、改法１は、複数の異なったＤＮＡを一斉にＩＲ型に変換できる反応を目的として創作した。改法１はプラスミドに挿入されたｃＤＮＡプラスミドライブラリーを出発材料にすることを想定したものである。改法１の概要は次の通りである。
【０１１２】
まず、ＤＮＡをＰＣＲで増幅した（ステップ１）。その際に、ＰＣＲに用いたプライマーの片方には平滑末端が生成される制限酵素部位Ｘ（ＨｉｎｃＩＩ）が付加されている。次いでＩＲリンカー（ステムループ構造をとっているもの）をＤＮＡ断片の両側にｌｉｇａｓｅで付着させた（ステップ２）。次いで制限酵素Ｘで切断した（ステップ３）。そうするとＤＮＡ断片の片側が平滑末端にもう片側がループ構造をとった。その後、ＮｏｔＩ部位を含むアダプターを平滑末端に付着させ（ステップ４）、アダプターの配列と相補的な配列を有するプライマーと鎖置換反応を触媒するＢｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ）で伸長反応を行わせた。得られたＩＲ型ＤＮＡを発現プラスミドにいれた。
【０１１３】
下記に示す３種類のＩＲリンカーを用いて、改法１を評価した。
【化７】
0005422804.tif 000008
【０１１４】
その結果、上記のＤＮＡ産物１〜４が作製されていることを確認した（図４）。また、上記のＤＮＡ産物５も、図４に記載のＤＮＡ産物４と比較すると長さが倍になっているバンドが確認されたことから、ＩＲ型への変換も適切に行われていると判断した。そこで、ＤＮＡ産物５を回収し、平滑化及びＮｏｔＩ消化した後、発現ベクターに挿入し、大腸菌に形質導入した。形質転換体を培養後、無作為にピックアップした大腸菌からプラスミドＤＮＡを調製したところ、プラスミドＤＮＡが挿入されたものはいずれも欠失などによって逆方向反復配列を正しくとっているものがなかった。大腸菌の中ではＩＲ構造をとるＤＮＡが挿入されているプラスミドはＩＲの間のループの長さが５０ｂｐ以上あるとＩＲ構造を保持したことから、ループ部分を５０ｂｐ以上にしたものを用いてさらに実験を行った。その結果、ＩＲ構造に変換できるものの、これらのプラスミドへの挿入は正確に行われなかった。
【０１１５】
その後の実験で、下記に示す通り、ＩＲ構造を有するＤＮＡのプラスミドへの挿入はその挿入するステップが重要であることが分かった。
【化８】
0005422804.tif 000009
【０１１６】
つまり、ＩＲ構造をしたＤＮＡが挿入されたプラスミドを得るには、まず、ループ構造に相当するＤＮＡを入れたプラスミドに目的のＤＮＡを入れ、次いでループ構造に相当するＤＮＡを挟んで、逆向きに目的のＤＮＡを入れなければならないことがわかった。したがって、外来ＤＮＡをＩＲ構造に変換してからプラスミドに入れるという方法では結果としてＤＮＡ型ＲＮＡｉを得ることができなかった。ただし、ＥＰＲＩＬ法でも示されているように、ステム及びループ部分に相当する外来ＤＮＡの長さがそれぞれ２０ｂｐ、１０ｂｐ程度の短いものであればＩＲ構造になっているものを直接挿入することができるのかもしれない。
【０１１７】
（参考例２）
以上の改法２の失敗を踏まえて、まずＤＮＡを発現ベクターに入れ、それをＩＲ構造に変換する手法（以下、改法２とよぶ）を下記の通りに創作した。
【化９】
0005422804.tif 000010
【０１１８】
改法２の概略は次の通りである。発現プラスミドのプロモーター部位とターミネーター部位の間にＮｃｏＩ、ＳｔｕＩ、ＢｂｖＣＩ及びＤｒａＩＩＩ認識部位を設け、ＳｔｕＩとＢｂｖＣＩ部位とニッキングエンドヌクレアーゼであるＮｂ．ＢｂｖＣＩ部位を５’から３’の方向に挿入した改良発現プラスミドを作製した（ＳｔｕＩは平滑末端を、ＮｃｏＩは５’突出末端を生み出す制限酵素であり、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩは二本鎖ＤＮＡの片方のみを切断する、つまりニックを入れる制限酵素である）。次いでこの発現プラスミドのＳｔｕＩ部位とＢｂｖＣＩ部位の間に目的のＤＮＡを挿入し、これを出発材料とした。ＮｃｏＩで消化後、５’末端を脱リン酸化処理し、ＳｔｕＩ消化した。次に、これにＩＲリンカーを付着させ、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ消化し、その後、鎖置換反応を触媒するＢｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで伸長反応を行わせた。この産物をセルフライゲーションさせてＩＲ型に変換されたＤＮＡが作製できた。
【０１１９】
しかしながら、改法２を実際に行っても、大腸菌に形質転換されたプラスミドＤＮＡでＩＲ型に変換されたものは全く取得できなかった。こうしたプラスミドＤＮＡの塩基配列をみてみると、始めに挿入したＤＮＡとＩＲリンカーＤＮＡの境界部分でＤＮＡの伸長反応が止まったらしきものが多く見受けられた。そこで、外来ＤＮＡがＩＲ型に変換されたプラスミドを取得できなかった理由として、ＩＲリンカーのライゲーションに問題があると考えた。この考えの下に、ライゲーション操作をさらに入念に行ってみたが、いずれも改善できなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１２０】
本発明の核酸、組換えベクター及び形質転換体を用い、本発明の外来ＤＮＡ断片の逆方向反復配列を含む組換えベクターを作製する方法及びＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーを作製する方法によれば、長鎖ＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーを作製することができる。長鎖ＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリーを用いれば、免疫関与因子などの、昆虫や植物などの生命現象に関わる因子を網羅的かつ機能的に探索することができ、このような因子の発見が害虫防除開発を可能とする。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】図１は、ｐＩＥｘ−４の制限酵素地図及びＭＣＳを示す。
【図２】図２は、組換えｐｓｉＣＨＥＣＫ−２のみを用いた場合の相対的ルシフェラーゼ活性を１００として、組換えｐＩＥｘ−４−ｌｕｃ１００ＩＲ、ｐＩＥｘ−４−ｌｕｃ２００ＩＲ、及びｐＩＥｘ−４−ｌｕｃ３００ＩＲの相対的ルシフェラーゼ活性を測定した結果を示す。
【図３】図３は、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）活性により補正した後のウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）活性の測定結果を示す。
【図４】図４は、改法１の各ステップにおけるＤＮＡ産物１〜５の電気泳動結果を示す。
【図５】図５は、長鎖ＤＮＡ型ＲＮＡｉライブラリー作製法の工程スキームを示す。
【図１】
0005422804.tif 000011
【図２】
0005422804.tif 000012
【図３】
0005422804.tif 000013
【図４】
0005422804.tif 000014
【図５】
0005422804.tif 000015
【配列表】
0005422804000001.app