(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
21ヌクレオチドの二本鎖を形成するセンス領域およびアンチセンス領域を含み、
該センス領域が、配列番号5のヌクレオチド配列からなり、該アンチセンス領域が、配列番号6のヌクレオチド配列からなる、
抗アポトーシスタンパク質Bcl-XLをインビボで抑制的調節することが可能である、Bcl-XL転写産物に特異的な二本鎖の短い干渉核酸分子。
【請求項２】
一方の断片が短い干渉核酸分子のセンス領域を含み、かつ第2の断片が短い干渉核酸分子のアンチセンス領域を含む、二つの別々のオリゴヌクレオチド断片から組み立てられる、請求項１に記載の二本鎖の短い干渉核酸分子。
【請求項３】
リンカー分子を介して、センス領域がアンチセンス領域に連結される、請求項１または２に記載の二本鎖の短い干渉核酸分子。
【請求項４】
1つまたはそれより多い改変ピリミジンおよび／またはプリンヌクレオチドを含む、請求項１〜３のいずれか1項に記載の二本鎖の短い干渉核酸分子。
【請求項５】
センス領域を含む鎖が5'および／または3'末端に末端キャップ部分を含む、請求項１〜４のいずれか1項に記載の二本鎖の短い干渉核酸分子。
【請求項６】
前記アンチセンス領域を含む鎖が5'末端にリン酸基を含む、請求項１〜５のいずれか1項に記載の二本鎖の短い干渉核酸分子。
【請求項７】
少なくとも1つの改変ヌクレオチド間リンケージを含む、請求項１〜６のいずれか1項に記載の二本鎖の短い干渉核酸分子。
【請求項８】
転写開始領域、転写終止領域、および請求項１〜３のいずれか1項に記載の少なくとも1つの短い干渉核酸分子をコードする核酸配列を含み、
前記核酸配列が、該短い干渉核酸分子の発現および／または送達を可能にする様式で、前記開始領域に実施可能に連結する、転写ユニット。
【請求項９】
請求項８に記載の転写ユニットを含む、発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターにより改変された、細胞。
【請求項１１】
許容できる担体の中に、請求項１〜７のいずれか1項に記載の短い干渉核酸分子または請求項９に記載の発現ベクターを少なくとも含む、医薬組成物。
【請求項１２】
少なくとも2つの異なる短い干渉核酸分子の組み合わせを含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
Mcl-1転写産物を標的にする短い干渉核酸分子を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
Mcl-1転写産物を標的にする短い干渉核酸分子が、それぞれ配列番号7、19、21の配列のセンス鎖と、配列番号8、20、22の配列のアンチセンス鎖とからなる、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
短い干渉核酸分子またはベクターが、少なくとも1つの抗癌剤と組み合わされた、請求項１１〜１４のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１６】
抗癌剤が、細胞毒性薬剤、抗血管新生因子、チロシンキナーゼ阻害剤およびBH3模擬物からなる群より選択される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
薬剤としての、請求項１〜７のいずれか1項に記載の短い干渉核酸分子または請求項９に記載のベクター。
【請求項１８】
癌治療のための医薬品の製造のための、請求項１〜７のいずれか1項に記載の短い干渉核酸分子または請求項９に記載のベクターの使用。
【請求項１９】
癌治療のための細胞毒性医薬品の製造のための、請求項１〜７のいずれか1項に記載の短い干渉核酸分子または請求項９に記載のベクターと、請求項１３または１４で定義した短い干渉核酸分子との組み合わせの使用。
【請求項２０】
前記癌が、卵巣、鼻咽頭、胸部、前立腺および結腸の癌腫、神経膠腫、中皮腫ならびに黒色腫からなる群から選択される、請求項１８または１９に記載の使用。
【請求項２１】
抗癌治療における同時の、別々のまたは連続した使用のための組み合わせ製剤としての、請求項１〜７のいずれか1項に記載の短い干渉核酸分子または請求項９に記載の発現ベクターと、抗癌剤とを少なくとも含む製品。
【請求項２２】
前記短い干渉核酸分子が抗癌剤よりも先に使用するためのものである、請求項２１に記載の製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、RNA干渉によってBcl-XLタンパク質の発現を抑制的に調節し、かつインビボで腫瘍細胞の増殖を阻害する、Bcl-XLのmRNAに特異的な短い核酸分子および癌治療のためのそれらの使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシスは、プロアポトーシスBax、Bcl-XS、Bak、Bad、Bid、Bik、Bimと、抗アポトーシス Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、A1およびBcl-Wとを含む、Bcl-2タンパク質ファミリーによって部分的に調節されている。様々な刺激、例えば細胞毒性のある薬剤、血清飢餓および放射線により誘導されるアポトーシスに対する細胞の感受性は、細胞内局在およびプロアポトーシスタンパク質と抗アポトーシスタンパク質（それらのタンパク質はヘテロ二量体を形成し、相互の機能を滴定できる）との間の相対的な比率により、少なくとも部分的に決定されるようである（White, E., Genes Dev., 1996, 10, 1-15; Korsmeyer, S.J., Cancer Res., 1999, 59, 1693s-1700s; Cory, S.およびAdams, J.M., Nat. Rev. Cancer, 2002, 2, 647-656）。
【０００３】
Bcl-2ファミリーの抗アポトーシスメンバーの高い発現レベルは、多くの腫瘍において見出され、Bcl-2とBcl-XLの亢進的な調節は、悪性度と薬剤耐性の鍵となる要素であることが示されている（Reed, J.C., Semin. Hematol., 1997, 34, 9-19; Konoplevaら, Br. J. Haematol., 2002, 118, 521-534; Lebedevaら, Cancer Res., 2000, 60, 6052-6060; Liuら, Gynecol. Oncol., 1998, 70, 398-403; Simonianら, Blood, 1997, 90, 1208-1206）。
【０００４】
特に、Bcl-2および/またはBcl-XLは、卵巣、鼻咽頭、胸部、前立腺および結腸の癌腫、神経膠腫、中皮腫および黒色腫において頻繁に過剰発現している（Heら, Chin. J. Cancer, 2003, 22, 11-15; Minら, Chin. J. Oncol., 2004, 26, 14-16; Krishnaら, J. Neurosurg., 1995, 83, 1017-1022; Krajewskiら, Am. J. Pathol., 1997, 150, 805-814; Caoら, Am. J. Respir. Cell. Biol., 2001, 25, 562-568; Soiniら, Clin. Cancer Res., 1999, 5, 3508-3515; Kojimaら, J. Biol. Chem., 1998, 273, 16647-16650; Olopadeら, Cancer J. Sci. Am., 1997, 3, 230-237; Zapataら, Breast Cancer Res. Treat., 1998, 47, 129-140; Simonianら, Blood, 1997, 90, 1208-1216; Leiterら, Arch. Dermatol. Res., 2000, 292, 225-232; Nicholsonら, Nature, 2000, 407, 810-816; Krajewskaら, Cancer Res., 1996, 56, 2422-2427; Maurerら, Dig. Dis. Sci., 1998, 43, 2641-2648; Mercatanteら, J. Biol. Chem., 2002, 277, 49374-49382; Ferrandinaら, Cancer Lett., 2000, 155, 19-27; Liuら, Gynecol. Oncol., 1998, 70, 498-503; Marone ら, Clin. Cancer Res., 1998, 4, 517-524; フランス特許出願第0108864号）。
【０００５】
しかしながら、Bcl-XLは、細胞毒性のある薬剤および放射線により誘導されるアポトーシスの抑制について、Bcl-2よりもさらに効率がよいと一般的に考えられている（Simonianら,前記引用; Gottschalkら, P.N.A.S., 1994, 91, 7350-7354）。それゆえ、Bcl-XLは、癌治療、特に従来の抗癌剤に抵抗性のある癌の治療の良い標的である。
【０００６】
BCL2L1遺伝子（BCL2様1、BCL2L、BCLX、Bcl-X、bcl-xまたは BCL-X遺伝子）の転写は、3つのアイソフォーム：長い抗アポトーシスアイソフォーム（Bcl-XL）、短いプロアポトーシスアイソフォーム（Bcl-XS）およびBcl-X（ベータアイソフォーム）をコードする、選択的スプライシングされた変異型を産生する。
【０００７】
Bcl-XLは、BCL2L1遺伝子のエクソン1、エクソン2およびエクソン3を含む長い変異型転写産物（変異型転写産物1）によってコードされる、233アミノ酸のタンパク質である。ヒトBcl-XL mRNAおよびタンパク質は、それぞれNCBIアクセッション番号NP_612815 （配列番号3）および NM_138578 （配列番号2）に一致する。
【０００８】
Bcl-XSは、Bcl-XLタンパク質のN末端配列（1位〜125位）およびC末端配列（189位〜233位）を有するが、Bcl-XLタンパク質の126位から188位までの 63アミノ酸の配列を欠く、170アミノ酸のタンパク質である。Bcl-XSは、エクソン1、エクソン2の5’配列およびエクソン3を含む短い変異型転写産物（変異型転写産物2）によってコードされる。Bcl-XS mRNAは、エクソン2の3’末端に位置する、Bcl-XLの転写産物に特異的な189ヌクレオチドの配列を欠く。Bcl-XLタンパク質の対応する63アミノ酸の配列もまた、Bcl-XSタンパク質には存在せず、Bcl-XLタンパク質に特異的である。ヒトBcl-XS mRNAとタンパク質は、それぞれNCBIアクセッション番号NP_001182およびNM_001191に一致する。
【０００９】
Bcl-X（ベータ）は、Bcl-XLのN末端配列（BCL2遺伝子のエクソン1およびエクソン2によってコードされる、Bcl-XLタンパク質の1位〜188位）およびBCL2遺伝子のイントロン2にコードされる39アミノ酸のC末端配列を有する、227アミノ酸のタンパク質である。
【００１０】
Bcl-XLは、ミトコンドリア外膜に局在し、ミトコンドリアの膜からのカスパーゼアクチベーターおよびシトクロムcの放出を阻害することによって細胞死を調節しているようである（Desagher S.およびMartinou, J.C., Trends Cell. Biol., 2000, 10, 369-377; Hengartner, M.O., Nature, 2000, 407, 770-776; Kroemer, G., Nat. Med., 1997, 3, 614-620; Kroemerら, Immunol. Today, 1997, 18, 44-51; Marchettiら, J. Exp. Med., 1996, 184, 1155-1160; Minnら, Nature, 1997, 385, 353-357; Susinら, J. Exp. Med., 1996, 184, 1331-1341）。
【００１１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドによるBcl-XL発現の抑制的調節は、アポトーシスを誘導し、かつ、癌細胞に対する化学療法の細胞毒性効果を増強することが示された（米国特許出願第2003/0191300号; 米国特許第5,776, 905号および第6,143,291号; PCT国際出願第WO 00/01393号, 第WO 00/66724号; Lebedevaら, 前記引用 ; Yangら, The J. Biochem., 2003, 278, 25872-25878; Sonnemannら, Cncer Letters, 2004, 209, 177-185; Sonnemannら, Int. J. Oncol., 2004, 25, 1171-1181; Ozvaranら, Mol. Cancer Therapeutics, 2004, 3, 545-550; Smytheら, The J. Thoracic and Cardiovascular Surgery, 2002, 123, 1191-1198; Simoesら, Int. J. Cancer, 2000, 87, 582-590, Hopkins-Donaldsonら, Int. J. Cancer, 2003, 106, 160-166; Heeresら, Int. J. Cancer, 2002, 99, 29-34; Taylorら, Oncogene, 1999, 18, 4495-4504; Wacheckら, British Journal of Cancer, 2003, 89, 1352-1357; Taylorら, Nature Biotechnology, 1999, 17, 1097-1100; Mercatanteら, precited; Frankeら, Cancer Research, 2001, 61, 4837-4841; Royら, Oncogene, 2000, 19, 141-150）。しかしながら、アンチセンスオリゴヌクレオチド技術は、低い吸収率、非特異的阻害効果、多量の有効投与量および毒性を含む、多くの問題に直面している。
【００１２】
特異的標的の発現を阻害する、小型干渉RNA（small interfering RNAs）（siRNAs）技術の使用の成功は、癌の新しい治療の発展にとって大いに有望である。
【００１３】
RNAi干渉は、二本鎖RNAの細胞への導入が、配列依存的に遺伝子発現を阻害する方法である（Shueyら, Drug Discovery Today, 2002, 7, 1040-1046に論評される）。RNAiは、哺乳類、ショウジョウバエ、線虫、真菌および植物のような多くの生物について観察され、ウィルスに対する防御、トランスポゾン活性の調節および遺伝子発現の調節に関係すると考えられている。RNAiは、細胞質においてdsRNAが相同メッセンジャーRNAの分解を引き起こすという、転写後遺伝子サイレンシング機構として、通常は記載される。標的の認識は、かなり配列特異的である。なぜなら、siRNAと標的遺伝子との間の１つまたは２つの塩基対のミスマッチにより、サイレンシング効果が著しく減少するからである。RNA干渉の媒介物は、21および23ヌクレオチドの小型干渉RNA（siRNA）である。2番目のステップにおいて、siRNAは、小型dsRNAをその相同mRNA標的へと導く、RNA誘導性サイレンシング複合体（RNA-induced silencing complex）（RISC）と呼ばれるリボヌクレアーゼ複合体に結合する。その結果、RISCは、アンチセンスdiRNAと対になった領域のおよそ中間の位置で該mRNAを切断し、その後、このmRNAはさらに分解される。
【００１４】
マウスへのsiRNAの投与は、様々な器官（肝臓、脳、眼、肺、腎臓）および異種移植片にある標的の発現を効率よく阻害することが示された（Braaschら, Biochemistry, 2003, 42, 7967-7975; Duxburyら, Biochem. Biophys., Res. Comm.., 2003, 311, 786-792; Giladiら, Mol. Ther., 2003, 8, 769-776; Lewisら, Nat. Genet., 2002, 32, 107-108; Makimuraら, BMC Neurosci., 2002, 3, 18-; Reichら, Mol. Vis., 2003, 9, 210-216; Songら, Nat. Med., 2003, 9, 347-351; Zenderら, P.N.A.S., 2003, 100, 7797-7802）。
【００１５】
アンチセンス技術と比較すると、RNAiは、有効な遺伝子特異的技術であり、長期安定性、可逆性および簡単な手順の利点を有する。
【００１６】
Bcl-XLを標的にするRNAiは、インビトロで、細胞生存と化学療法への抵抗性におけるBcl-XLの役割を研究するために用いられてきた。RNAiによるBcl-XL発現の抑制的調節は、アポトーシスを誘導し、癌細胞への化学療法の細胞毒性効果を増強することがインビトロで示された（Taniaiら, Cancer Res., 2004, 64, 3517-3524; Zhangら, Haematologica, 2004, 89, 1199-1206; Zenderら, Hepatology, 2005, 41, 280-288; Shimizuら, Nature Cell Biology, 2004, 6, 1221-1228; Honら, J. Immunol., 2004, 173, 4425-4432; Dodierら, Gynecologic Oncology, Epub, 2005, Sep 26; Heら, Chinese J. Cancer, 2005, 24, 646-652; Liuら, Acta Pharmacol., Sin., 2005, 26, 228-234; Leiら, Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 2005, 37, 555-560; Pizziら, Cell Death and Differenciation, 2005, 12, 761-772; Rorhbachら, J. Mol. Cell. Cardio., 2005, 38, 485-493; Tranら, The J. Biol., Chem., 2005, 280, 3483-3492; Zhuら, Cancer Biology and Therapy, 2005, 4, 393-397; Zhuら, Molecular Cancer Therapeutics, 2005, 4, 451-456; 米国特許出願第2005/0176025号）。
【００１７】
しかしながら、ほとんどのRNAiは、Bcl-XLに特異的ではない（Zenderら; Honら; Dodierら; Heら, Liuら, Tranら, Zhuら, Cancer Biology and Therapy, 前記引用）。さらに、いくつかのBcl-XL特異的なsiRNAiは、非特異的siRNAiと組み合わせて試しただけであり（Dodierら,前記引用）、Bcl-XL特異的なsiRNAiがインビボで抗腫瘍効果を有することを示したものはない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、抗アポトーシスタンパク質Bcl-XLの発現を、効率的に抑制的調節することが可能なBcl-XL特異的siRNAを作製した。化学療法抵抗性のヒトの腫瘍細胞を移植したマウスにBcl-XL特異的siRNAを低用量で注射することにより、顕著に該マウスの生存を増加させ、腫瘍細胞の移植から少なくとも5ヶ月間、定着する前の腫瘍の完全な退縮を促した。
【００１９】
このsiRNAは、癌の治療、特に従来の抗癌剤に抵抗性のある腫瘍の治療に役立つ。
【００２０】
それゆえ、本発明は、センス領域とアンチセンス領域を含む、Bcl-XL転写産物に特異的な二本鎖の短い干渉核酸（double-stranded short interfering nucleic acid）（siNA）分子に関し、ここで該センス領域は、配列番号1のヌクレオチド配列または該配列と少なくとも70％の同一性、好ましくは少なくとも80％の同一性、より好ましくは少なくとも90％の同一性のある配列を含み、該アンチセンス領域は、該センス領域と相補的であるヌクレオチド配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、トランスフェクション後72時間におけるSKOV3細胞のBcl-XL mRNAおよびタンパク質発現に対するsiXL1の効果を示す。[A]： RT-PCR；[B]：定量的RT-PCRおよび[C]ウェスタンブロット。T：未処理細胞。
【図２】図２は、種々の卵巣癌腫の細胞株[A]および種々の起源の腫瘍細胞[B]においてウェスタンブロットにより検討した、トランスフェクション後72時間におけるBcl-XLタンパク質発現に対するsiXL1の効果を示す。
【図３】図３は、トランスフェクション後72時間におけるSKOV3細胞のBcl-XLタンパク質発現に対するsiXL1 [A]または対照siRNA [B]の様々な濃度での効果を示す。
【図４】図４は、トランスフェクション後の様々な時間における、SKOV3細胞のBcl-XLタンパク質発現に対する25 nM [A]または100 nM [B]のsiXL1の効果を示す。
【図５】図５は、トランスフェクション後72時間における、siXL1によるSKOV3細胞のアポトーシス誘導を示す。A．細胞の形態学的観察（左パネル）およびDAPI染色後の核（右パネル）。B．カスパーゼ3活性およびPARP切断をウェスタンブロットにより検討する。T：未処理細胞。
【図６】図6は、トランスフェクション後144時間、すなわち、シスプラチン曝露の開始後96時間における、細胞形態とアポトーシス誘導に対する、siXL1または対照siRNAとシスプラチン曝露との組み合わせの効果を示す。トランスフェクションしていない細胞を対照として用いた。siXL1（MからR）または対照siRNA（GからL）をトランスフェクションされた細胞、またはトランスフェクションしていない細胞（AからE）を、未処理（対照：A、D、G、J、MおよびP）または5μg/ml（B、E、H、K、NおよびR）もしくは20μg/ml（C、F、I、L、OおよびR）のシスプラチンで処理した。細胞の形態学的観察：A、B、C、G、H、I、M、NおよびO。DAPI染色後の細胞核の形態学的観察（D、E、F、J、K、L、P、QおよびR）。
【図７】図７は、トランスフェクション後144時間、すなわち、シスプラチン曝露の開始後96時間における、細胞の生存能力に対する、siXL1または対照siRNAとシスプラチン曝露との組み合わせの効果を示す。A．5μg/mlのシスプラチンへの曝露。C5：5μg/mlのシスプラチン単独への曝露。siRNA対照／C5：対照siRNAと5μg/mlのシスプラチンとの組み合わせへの曝露。siXL1／C5：siXL1と5μg/mlのシスプラチンとの組み合わせへの曝露。  B．20μg/mlのシスプラチンへの曝露。C20：20μg/mlのシスプラチン単独への曝露。siRNA対照／C20：対照siRNAと20μg/mlのシスプラチンとの組み合わせへの曝露。siXL1／C20：siXL1と20μg/mlのシスプラチンとの組み合わせへの曝露。
【図８】図８は、SKOV3の細胞周期に対する、siXL1または対照siRNAとシスプラチン曝露との組み合わせの効果を示す。トランスフェクションしていない細胞を対照として用いた。siXL1（150 nM）または対照siRNA（150 nM）をトランスフェクションされた細胞、またはトランスフェクションしていない細胞を、未処理（対照）または5μg/mlもしくは20μg/mlのシスプラチン（CDDP）で処理した。シスプラチン曝露の開始後24時間（A）または96時間（B）において細胞周期を解析した。
【図９】図９は、Bxl-xL発現およびカスパーゼ3活性またはPARP切断に対する、siXL1または対照siRNAとシスプラチン曝露との組み合わせの効果を示す。トランスフェクションしていない細胞を対照として用いた。siXL1（150 nM）または対照siRNA（150 nM）をトランスフェクションされた細胞、またはトランスフェクションしていない細胞（AからE）を、未処理（0）または5μg/ml（5）または20μg/ml（20）のシスプラチンで処理した。シスプラチン曝露の開始後24時間（A）または96時間（B）においてBxl-xL発現およびカスパーゼ3活性またはPARP切断を解析した。
【図１０】図１０は、シスプラチン曝露と組み合わせるか、または組み合わせていないsiXL1トランスフェクション後のSKOV3の細胞増殖を示す。siXL1トランスフェクション後48時間において、該細胞を5μg/mlのCDDP（C5）で2時間処理し、または処理せず、そして処理後の異なる時間において、トリパンブルー排除試験により細胞生存を評価した。トランスフェクションしていない細胞を対照として用いた。結果を25 cm2フラスコにおける生存細胞数として表わし、かつ2回の独立した計数の平均を示した。△：トランスフェクションせず、かつ未処理の細胞。○：トランスフェクションせず、かつ5μg/mlのCDDP単独で処理した細胞。□：siXL1をトランスフェクションし、かつ未処理の細胞。X：siXL1をトランスフェクションし、かつ5μg/mlのCDDPで処理した細胞。
【図１１】図１１は、対照siRNA（siGFP）トランスフェクション後72時間におけるSKOV3細胞のMcl-1 mRNAおよびタンパク質発現に対するsiRNA-Mcl-1（またはsiMcl-1）の効果を示す。[A]： RT-PCR；[B]：ウェスタンブロット。Unt：未処理細胞。
【図１２】図１２は、Mcl-1 mRNAに指向されたsiRNAとsiXL1との組み合わせの細胞毒性効果を示す。細胞にsiXL1単独（100 nM）、siRNA-Mcl-1単独（100 nM）またはsiXL1（50 nM）とsiRNA-Mcl-1（50 nM）との組み合わせをトランスフェクションした。トランスフェクションしていない細胞を対照として用いた。細胞の形態学的観察（左パネル）。DAPI染色後の細胞核の形態学的観察（右パネル）。
【図１３】図１３は、Mcl-1 mRNAに指向されたsiRNAとsiXL1との組み合わせの細胞毒性効果を示す。細胞にsiXL1、siRNA-Mcl-1または対照siRNAを、単独（150 nM）またはそれぞれのうちの１つ（75 nM）と他の2つのsiRNAのうちの1つ（75 nM）との組み合わせをトランスフェクションした。トランスフェクションしていない細胞を対照として用いた。細胞（左パネル）および核（中央パネル）の形態観察ならびにDNA含量のFACs解析（右パネル）により、トランスフェクション後72時間における細胞の応答を解析した。
【図１４】図１４は、SKOV3の細胞生存に対する、BclxLおよびMcl-1 mRNAそれぞれを標的にするsiRNAの組み合わせの効果を示す。SKOV3に対照siRNA、Mcl-1 mRNAを標的とするsiRNA（siMcl-1）およびBclxL mRNAを標的とするsiRNA（siXL1）を、単独（150 nM）またはそれぞれのうちの１つ（75 nM）と他の2つのsiRNAのうちの1つ（75 nM）との組み合わせをトランスフェクションした。細胞の生存をトリパンブルー排除アッセイにより解析した。
【図１５】図１５は、シスプラチンと組み合わせるか、または組み合わせていない、siXL1または対照siRNAで処理あるいは未処理の後の、腹腔内にSKOV3腫瘍を移植したマウスの生存を示す。A．siXL1で処理：マウスを未処理（左および右パネル）、CDDP単独（4 mg/kg）（左および右パネル）、siXL1単独（左および右パネル）、またはsiXL1およびCDDPの組み合わせ（右パネル）で処理し、生存するマウスのパーセンテージを、処理後190日間に渡って測定した。B．対照siRNAで処理：マウスを未処理（左および右パネル）、CDDP単独（4 mg/kg）（左および右パネル）、対照siRNA単独（左および右パネル）、または対照siRNAおよびCDDPの組み合わせ（右パネル）で処理し、生存するマウスのパーセンテージを、処理後190日間に渡って測定した。
【図１６】図１６は、腫瘍の増殖に対する、裸の、またはL-PEIにより輸送されるsiXL1の効果を示す。20 x 106 個のSKOV3ヒト卵巣癌腫細胞をヌードマウスに皮下移植し、かつ腫瘍の大きさが10x10 mm（8日後）に達するまで増殖させた。L-PEIと複合したsiXL1（▲）または複合していないsiXL1（■）を、SKOV3腫瘍を移植したマウスに毎週、腹腔注射し、かつ腫瘍移植後、異なる時間において腫瘍体積を測定した。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
定義
「短い核酸分子」とは、長さが100ヌクレオチド以下の核酸分子、好ましくは長さが80ヌクレオチド以下、最も好ましくは長さが50ヌクレオチド以下を指す。siNAは通常、長さが15〜50ヌクレオチドであり、好ましくは15〜40ヌクレオチド、より好ましくは長さが15〜30ヌクレオチドである。
【００２３】
「干渉核酸分子」とは、RNA干渉を媒介できる核酸分子を指す。
【００２４】
「RNA干渉」（RNAi）とは、合成された短い二本鎖核酸分子、例えばElbashirらによるNature 2001, 411, 494-とPCT国際出願第WO 01/75164号に初めて記載されたような21ヌクレオチドの二本鎖RNAを細胞内に導入することにより誘導される、配列特異的転写後遺伝子サイレンシングの方法を指す。
【００２５】
「ヌクレオチド」とは、天然塩基（アデニン、シトシン、グアニン、チミンまたはウラシル）を含む、一般的なリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドならびに糖、リン酸および／または塩基部分で改変されたヌクレオチドを指す。
【００２６】
「同一性」とは、2つの核酸分子の間の配列の同一性を指す。同一性は、比較の目的のために整列させうる、各配列中の位置を比較することによって決定できる。比較する配列中の位置が同じ塩基によって占められている場合、両分子はその位置において同一である。核酸配列またはアミノ酸配列同士の類似性または同一性の程度は、核酸配列によって共有される位置における、同一または同等（matching）のヌクレオチドの数の関数である。2つの配列の間の同一性を計算するために、GCG配列解析パッケージ（University of Wisconsin, Madison, Wis.）の一部として利用でき、かつ、例えば標準設定で使用できるFASTAまたはBLASTを含む、様々な整列アルゴリズムおよび／またはプログラムを使用できる。本発明においては、配列番号1との配列の同一性を、配列全体（N≧15の塩基数N）のうち、配列番号1の塩基と同一である塩基の数（n）を計算することによって測定する。パーセント同一性（p）は、100n/Nである。
【００２７】
「相同的」とは、RNAi活性を導くほど十分なもう1つの分子との同一性、より具体的には70％の同一性、好ましくは80％の同一性、より好ましくは90％の同一性を有する核酸分子を指す。
【００２８】
「相補的」とは、従来のワトソン−クリック型の塩基対形成または従来にないタイプの塩基対形成による、核酸の水素結合を形成する能力を指す。本発明の核酸分子に関しては、核酸分子とその相補的な配列の結合自由エネルギーは、核酸の関連した機能、例えばRNAi活性を生じさせうるのに十分である。核酸分子の結合自由エネルギーの測定は、よく知られた技術である（例えば、Turnerら, 1987, CSH Symp. Quant. Biol., 1987, LII, pp 123-133, Frier ら, P.N.A.S., 1986, 83, 9373-9377; Turnerら, J. Am. Chem. Soc., 1987, 109, 3783-3785を参照）。パーセント相補性とは、第2の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン−クリック型の塩基対）を形成できる核酸分子における、連続する残基のパーセンテージを示す（例えば、第１のヌクレオチドの合計10ヌクレオチドのうち、5、6、7、8、9または10ヌクレオチドが、10ヌクレオチドの第2の核酸配列と塩基対を形成することは、それぞれ50％、60％、70％、80％、90％および100％の相補性であることを示す）。「完全に相補的」とは、核酸配列の全ての連続する残基が、第２の核酸配列中の同数の連続する残基と水素結合することを意味する。
【００２９】
「標的遺伝子」とは、その発現が抑制的調節されるべき遺伝子を指す。
【００３０】
「標的配列」とは、siNA分子のアンチセンス領域と相補的な、mRNAの一部分を指す。
【００３１】
「ベクター」とは、連結された別の核酸分子を輸送できる核酸分子を指す。
【００３２】
「抗癌剤」、「抗癌治療」とは、細胞毒性のある薬剤を用いる化学療法と放射線治療との両方を指す。
【００３３】
本発明による短い干渉核酸（siNA）分子は、Bcl-XL転写産物（mRNA）に特異的であり、かつ、NCBIアクセッション番号NM_138578（添付の配列表中の配列番号2）を参照することにより、849位から867位までに相当する19の連続するヌクレオチドを標的とする。本発明によるsiNA分子の標的は、BCL2L1遺伝子のエクソン2の3'末端の189ヌクレオチド配列（配列番号2の742位から930位）に含まれる。この標的は、Bcl-XL転写産物には存在しない。さらに、該標的は、Bcl-2転写産物と相同性のある領域（配列番号2の741位から843位および907位から947位）の外側にある、Bcl-XL転写産物の領域に存在する。
【００３４】
本発明によるsiNA分子は、Bcl-XL mRNAおよびタンパク質の発現を特異的に阻害する。該siNAは、プロアポトーシスBcl-XSタンパク質またはBcl-2およびMcl-1のような他のBcl-2ファミリーメンバーの発現には影響を及ぼさない。
【００３５】
Bcl-XL発現の阻害は、RNAまたはタンパク質のよく知られた解析技術（ノーザンブロット、ウェスタンブロット、定量的RT-PCR）のいずれによっても評価しうる。
【００３６】
本発明におけるsiNA分子はさらに、インビボで抗腫瘍活性を有し、これは当業者に知られた適切な動物モデルにおいてアッセイが可能である。
【００３７】
本発明は、いかなる生物からのBcl-XL mRNAおよびタンパク質の発現も阻害する、合成、半合成または組み換え型siNAを含む。配列番号1は、ヒトの標的配列、すなわち、siNA分子のアンチセンス領域と相補的なヒトmRNAの一部分である。ヒトmRNA配列中の標的の位置に鑑みて、当業者は、NCBIデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）のようなデータベースでアクセス可能な他の生物（真核生物、例えば、哺乳類）の相同的な配列中に、相当する位置を容易に見つけられるだろう。そのような相同的な配列は、当該技術で知られるように、例えば、配列アライメントを用いることによって確認できる。さらに、本発明におけるsiNA分子は、標的遺伝子の変異型、例えばハプロタイプ多型から得られる多型変異型の発現を阻害しうる。
【００３８】
siNA分子は、例えば、完全に相補的な配列の使用、または非標準的な塩基対、例えば、反転ミスマッチ（flipped mismatches）、単独水素結合ミスマッチ、トランス型ミスマッチ、3塩基相互作用および4塩基相互作用を含む、付加的な標的配列を提供しうるミスマッチおよび／またはウォッブル塩基対を組み込むことによって、そのような相同的な配列を標的とするように設計されうる。例えば、siNA分子は、RNA活性を媒介するために、siNA分子が必要とする高度な特異性の結果、特定の標的遺伝子のmRNA配列に独特な配列（単独の対立遺伝子または単独のヌクレオチドの多型（SNP））を標的とするように設計されうる。あるいは、ミスマッチが確認された場合、非標準的な塩基対（例えば、ミスマッチおよび／またはウォッブル塩基）を、1つより多い配列を標的とするsiNA分子を作製するために用いることができる。非制限的な例において、uuおよびcc塩基対のような非標準的な塩基対を、相同的な標的mRNA配列を標的することが可能なsiNA分子の作製に用いる。このアプローチにおいて、種々のmRNAを標的とするために、1つより多いsiNA分子を用いる代わりに、単独のsiNAを、1つより多いmRNAの発現を阻害するために用いることができる。
【００３９】
ある実施形態において、本発明は、各鎖が15〜約30（例えば、約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30）ヌクレオチドを含むか、またはそれらからなり、かつ、各鎖が、他の鎖のヌクレオチドと相補的な、少なくとも15〜約30（例えば、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30ヌクレオチド）ヌクレオチドを含むsiNA分子を特徴とする。例えば、本発明のsiNA分子は、19〜21ヌクレオチドの二本鎖（19〜21塩基対）を含むか、またはそれらからなる。
【００４０】
本発明の別の実施形態において、siNA分子は、リボヌクレオチド（2'-OHヌクレオチド）を含み、またはそれからなる。
【００４１】
別の実施形態において、本発明は、センス領域が配列番号1の配列を含むか、またはそれからなり、かつ、アンチセンス領域が配列番号4の配列を含むか、またはそれからなるsiNA分子を特徴とする。このsiNA分子はヒト遺伝子を標的とする（表I）。
【００４２】
【表１】
0005406024.tif 000002
【００４３】
本発明の別の実施形態において、siNA分子は、一方または両方の末端に突出ヌクレオチド、好ましくは、1〜約3（例えば、約1、2または3）の突出ヌクレオチドを含む。突出ヌクレオチドは、各鎖の3'末端にあることが有利で、好ましくは2'-デオキシヌクレオチド、好ましくは2'-デオキシチミジンのような2'-デオキシピリミジンである。例えば、本発明のsiNA分子は、19塩基対と3'末端のtt突出を有する21ヌクレオチドの二本鎖である。特に、センス鎖が配列番号5の配列のものであり、アンチセンス鎖が配列番号６の配列のものである、siXL1とよばれるこのsiNAは、3'末端に付加されたtt突出を有する配列番号1（センス鎖）および配列番号4（アンチセンス鎖）に相当する。
【００４４】
本発明の別の実施形態において、siNA分子は、両末端が平滑、または、一方の末端が平滑である、平滑末端を含む。例えば、本発明のsiNA分子は、19〜21塩基対と平滑末端を有する、19〜21ヌクレオチドの二本鎖である。
【００４５】
本発明の別の実施形態において、siNA分子は、2つの別々のオリゴヌクレオチド断片または鎖から組み立てられ、一方の断片（センス鎖）は、該siNA分子のセンス領域を含み、第２の断片（アンチセンス鎖）は、該siNA分子のアンチセンス領域を含む。
【００４６】
別の実施形態において、本発明は、ヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーのようなリンカー分子を介して、センス領域がアンチセンス領域に連結されるsiNA分子を特徴とする。ヌクレオチドリンカーは、少なくとも長さが2ヌクレオチド、例えば、長さが約3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチドのリンカーでありえる。そのようなsiNA分子の例は、小型ヘアピン状核酸（small hairpin nucleic acid）（shNA）分子を含む。
【００４７】
非ヌクレオチドリンカーは、無塩基のヌクレオチド、アプタマー、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリハイドロカーボン、または他の高分子化合物を含む。
【００４８】
本発明の別の実施形態において、siNA分子は、siNA分子の活性を調節してRNA干渉を媒介するための、ミスマッチ、バルジ、ループまたはウォッブル塩基対を含む。
【００４９】
さらに、siNA分子は、インビボでのヌクレアーゼによる分解への抵抗性を増し、かつ／または細胞への取り込みを改善する、1つまたはそれより多い改変を含みうる。該siNA分子は、糖、ホスフェートおよび／または塩基部分で改変されたヌクレオチド、および／または5'または3'末端の改変、またはヌクレオチド間のリンケージを含みうる。
【００５０】
本発明の別の実施形態において、siNA分子は、1つまたはそれより多い改変されたピリミジンおよび／またはプリンヌクレオチドを、好ましくは二本鎖siNAの各鎖に含む。より好ましくは、前記改変されたヌクレオチドが、2'-O-メチルヌクレオチド、2'-O-メトキシエチルヌクレオチド、2'-デオキシヌクレオチドおよび2'-デオキシ2'-フルオロヌクレオチドのようなデオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基のヌクレオチド、非環式ヌクレオチドおよび5-C-メチルヌクレオチドからなる群より選択される。本発明のsiNA分子は、約5 ％〜約100 ％改変されたヌクレオチド（例えば、約5 %、10 %、15 %、20 %、25 %、30 %、35 %、40 %、45 %、50%、55 %、60 %、65 %、70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %または100 %改変されたヌクレオチド）を一般的に含みうる。与えられたsiNA分子中に存在する改変されたヌクレオチドの実際のパーセンテージは、siNA分子中に存在するヌクレオチドの総数に依存する。改変率は、センス鎖、アンチセンス鎖またはセンス鎖とアンチセンス鎖の両方に存在するヌクレオチドの総数に基づきうる。
【００５１】
別の実施形態において、本発明は、センス領域を含む鎖（センス鎖）が、該鎖の5'末端、3'末端、または5'および3'末端の両方に末端キャップ部分を、好ましくは無塩基のデオキシ部分またはグリセリル部分を含むsiNA分子を特徴とする。
【００５２】
別の実施形態において、本発明は、前記アンチセンス領域を含む鎖（アンチセンス鎖）が5'末端にリン酸基を含むsiNA分子を特徴とする。
【００５３】
本発明の別の実施形態において、siNA分子は、ホスホロチオエートリンケージのような、少なくとも1つの改変されたヌクレオチド間のリンケージを含む。
【００５４】
本発明によるsiNA分子は、5'末端のジメトキシトリチルおよび3'末端のホスホルアミダイトのような一般の核酸の保護基およびカップリング基を用いる、公知のオリゴヌクレオチド合成法を用いる化学合成によって作製されうる。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性基、例えば、2'-アミノ、2'-C-アリル、2'-フルオロ、2'-O-メチル、2'-Hを用いる修飾によって安定性を増すように改変されうる（UsmanおよびCedergren, TIBS, 1992, 17, 34 およびUsmanら, Nucleic Acids Symp. Ser., 1994, 31, 163を参照）。そのような修飾されたオリゴヌクレオチドの例は、制限せずに：2' F-CTP、2' F-UTP、2' NH2-CTP、2' NH2-UTP、2' N3-CTP、2-チオCTP、2-チオUTP、4-チオUTP、5-ヨードCTP、5-ヨードUTP、5-ブロモUTP、2-クロロATP、アデノシン 5'-(1-チオトリフォスフェート)、シチジン5'-(1-チオトリフォスフェート)、グアノシン-5'-(1-チオトリフォスフェート)、ウリジン-5'-(1-チオトリフォスフェート)、擬似UTP、5-(3-アミノアリル)-UTPおよび5-(3-アミノアリル)-dUTPを含む。siNA構築物は、一般的な方法を用いるゲル電気泳動または高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）によって精製して、水に再懸濁できる。
【００５５】
本発明による化学的に合成されたsiNA分子は、別々に合成された二つの別個のオリゴヌクレオチドから組み立てることができる。あるいは、該siNA分子の両鎖は、切断可能なリンカー、例えばスクシニルベースのリンカーを用いて、一列に合成できる。
【００５６】
あるいは、本発明のsiNA分子は、当業者に知られ、かつ、市販のDNAまたはRNAベクターに挿入された転写ユニットから（インビトロまたはインビボにおいて）発現させることができる。
【００５７】
本発明はまた、転写開始領域、転写終止領域および少なくとも1つの本発明によるsiNA分子をコードする核酸配列を含み、前記核酸配列が、該siNA分子の発現および／または輸送を可能にする様式で、前記開始領域に機能的に連結する転写ユニットに関連する。
【００５８】
核酸配列は、siNA分子の一方もしくは両方の鎖、または自己がハイブリダイズして二本鎖siNAとなる自己相補的な単一の鎖をコードしうる。
【００５９】
転写開始領域は、真核生物のRNAポリメラーゼI、IIまたはIII（pol I、IIまたはIII）のプロモーターからでありえる。Pol IIまたはpol IIプロモーターからの転写物は、全ての細胞において高レベルに発現される。あるいは、適切な細胞において原核生物のRNAポリメラーゼ酵素が発現されるのであれば、原核生物のRNAポリメラーゼプロモーターを使用しうる。U6小型核酸転移RNAおよびアデノウィルスVA RNAをコードする遺伝子に由来する転写ユニットは、細胞において所望のsiNAを高濃度にすることに役立つ。
【００６０】
本発明はまた、本発明のsiNA分子を少なくとも1つコードする核酸を含む発現ベクターに関連する。該発現ベクターは、該siNA分子の一方もしくは両方の鎖、または自己がハイブリダイズして二本鎖siNAとなる自己相補的な単一の鎖をコードしうる。本発明のsiNA分子をコードする核酸は、上記で定義した転写ユニットに挿入されることが好ましい。
【００６１】
siNA分子発現に適するDNAまたはRNAベクターの多くは、当業者に知られ、かつ市販される。組み換え型ベクターは、DNAプラスミドまたはウィルスベクターでありえる。siNA発現ウィルスベクターは、アデノ随伴ウィルス、レトロウィルス、アデノウィルスまたはアルファウィルスに基づいて構築されうるが、これらに限られない。siNA分子を発現可能な組み換え型ベクターは、インビボで運ばれ、かつ標的細胞内に残存できる。あるいは、ウィルスベクターを、siNA分子の一過的な発現を供給するために用いることができる。
【００６２】
本発明はまた、上記で定義されたベクターにより改変された、真核生物または原核生物の細胞に関連する。
【００６３】
本発明はまた、許容できる担体、例えば、安定化剤、緩衝液などの中に、上記で定義されたsiNA分子または発現ベクターを少なくとも含む医薬組成物に関連する。
【００６４】
医薬組成物または製剤は、投与、例えば、細胞または例えばヒトを含む対象への、全身または局所の投与に適する形態のことである。適する形態は、部分的には、使用法または侵入経路（例えば、経口、吸入または注射による）に依存する。これらの医薬組成物または製剤は、医薬組成物の製造の技術分野で知られた、いかなる方法によっても調製される。
【００６５】
ある実施形態において、本発明は、siNAまたはベクターが、癌細胞および／または内皮細胞へsiNA／ベクターを送達することを可能にする、化合物と会合している組成物を特徴とする。該化合物は、膜ペプチド、トランスポーター、脂質、カチオン性ポリマー、PEIでありえる。該siNAと該化合物は、マイクロスフェア、ナノ粒子またはリポソームに処方されることが好ましい。さらには、該siNA分子と該ベクターは、具体的には細胞表面の抗原または受容体のリガンド、例えば、RGDペプチドのようなペプチド、糖、葉酸または前記抗原／受容体に特異的な抗体のような、腫瘍および／または内皮細胞を特異的に標的にすることを可能にする化合物と会合しうる。
【００６６】
別の実施形態において、本発明は、少なくとも2つの異なるsiNA分子の組み合わせを含む組成物を特徴とする。
【００６７】
特に、該組成物は、上記で定義されたsiNA分子と、抗腫瘍効果を有するほかのsiNA分子とを含む。
【００６８】
抗腫瘍効果を有するsiNA分子は、限定することなく、Mcl-1転写産物を標的にするsiNAを含む。配列番号7、19または20の配列のセンス鎖と、配列番号8、21および22の配列のアンチセンス鎖とからなるsiNAは、Mcl-1特異的なsiRNAの例である。
【００６９】
別の実施例において、本発明は、siNA分子又はベクターが、少なくとも1つの抗癌剤と組み合わされた組成物を特徴とする。
【００７０】
本発明はまた、医薬品としての、上記で定義されたsiNA分子又はベクターに関連する。
【００７１】
本発明はまた、癌治療のための医薬品を製造するための、上記で定義されたsiNA分子又はベクターの使用に関連する。
【００７２】
本発明はさらに、癌治療のための細胞毒性医薬品を製造するための、上記で定義されたBcl-Xl転写産物に特異的な短い干渉核酸分子（siNAまたは前記siNAを含む発現ベクター）と、Mcl-1転写産物を標的にする短い干渉核酸分子との組み合わせの使用に関連する。
【００７３】
癌は、いかなるタイプもありえる。癌は、固形腫瘍、例えば、卵巣、鼻咽頭、胸部、前立腺もしくは結腸の癌腫、神経膠腫、中皮腫または黒色腫であることが好ましい。
【００７４】
前記使用のある実施形態において、該siNA分子又はベクターは、抗癌剤と組み合わされる。
【００７５】
本発明はまた、抗癌治療における同時の、別々のまたは連続した使用のための組み合わせ製剤としての、上記で定義されたsiNA分子又はベクターと、抗癌剤とを少なくとも含有する製品に関連する。
【００７６】
本発明によるsiNA分子又はベクターと組み合わせて用いられる抗癌剤は、化学療法において一般に使用され、アルキル化剤、細胞分裂抑制剤および代謝抑制剤のような細胞毒性薬剤、抗血管新生因子、チロシンキナーゼ阻害剤、およびBH3ドメイン模擬物（BH3-domain mimetics）を含む。
【００７７】
BH3模擬物は、BakのBH3ペプチドに類似した機能を有し、Bcl-2およびBcl-XLのようなBcl-2ファミリーの抗アポトーシスタンパク質の疎水性ポケットに結合する化合物である。BH3模擬物の例は、BH3I-2' （3-ヨード-5-クロロ-N-[2-クロロ-5-((4-クロロフェニル)スルホニル)フェニル]-2-ヒドロキシベンザミド）、HA14-1 （エチル 2-アミノ6ブロモ-4-(1-シアノ-2-エトキシ-2エトキシ-2オキソエチル)-4H-クロメン-3-カルボキシレート）、YC137（2-メトキシカルボニルアミノ-4-メチルスルファニル-ブチル酸、4-(4,9-ジオキソ-4,9-ジヒドロナフト[2,3-d]チアゾール-2イルアミノ)-フェニルエステル）およびABT737である。
【００７８】
好ましい抗癌剤は、シスプラチン（シスジアミンジクロロプラチナ、CDDPまたはDDP）、カルボプラチン、ドキソルビシン、ペメトレクスド（Alimta（登録商標））、パクリタキセル（Taxol（登録商標））およびBH3模擬物である。
【００７９】
本発明によるsiNA分子は、腫瘍の外科的切除に続くアジュバント療法として一般的に使用される。さらに、本発明によるsiNA分子は、放射線療法および免疫療法を含む、他の従来の抗癌療法と組み合わせて使用されうる。
【００８０】
医薬有効量は、疾患または病状の発生を予防し、阻止し、または治療（ある程度の症状を、好ましくは全ての症状を緩和）するために必要な用量である。該siNAの医薬有効量は、医療技術の当業者が認識する、癌の種類、用いられる組成、投与経路、治療される哺乳動物の種類、想定される特定の哺乳動物の身体的特徴、併用薬物、およびその他の要因に依存する。一般的に、体重当たりの有効成分の一日量は、1μg/kgと100 mg/kgの間、好ましくは5μg/kgと100μg/kgの間の量が投与される。
【００８１】
本発明のsiNA分子を、腫瘍内、例えば、脳内（クモ膜下腔内、脳室内）、経皮、皮下、静脈内、筋内、腹腔内、脊椎内(intrarachian)、経口、舌下、または吸入から選択される単一または複数の経路から投与しうる。
【００８２】
siNA分子またはベクターを、化学療法または放射線療法と組み合わせて用いる場合、抗癌剤よりも先に、より好ましくは、抗癌剤投与の少なくとも48時間前に投与することが好ましい。
【００８３】
上記の特徴に加えて、本発明はさらに、本発明によるsiNA分子およびその使用を説明する実施例、および添付図面を参照する上記から明らかになる他の特徴を含む。
【００８４】
以下の実施例は、本発明を説明するが、決して限定するものではない。
【実施例】
【００８５】
実施例１：腫瘍細胞に対するsiXL1の効果
1）材料と方法
a）細胞株
SKOV3、OAW42、OAW42-R10、IGROV1およびIGROV1-R10ヒト卵巣腺癌細胞株、GL15グリア芽腫細胞株ならびにNCI-H28中皮腫細胞株は、ECACC またはATCCから入手した。OAW42、OAW42-R10細胞は、10％牛胎仔血清（GIBCO-BRL）、2 mM Glutamax（商標）（GIBCO-BRL）、1 mM ピルビン酸ナトリウム（GIBCO-BRL）、20 UI/L ヒト組換え型インスリン（LILLY）、33 mM 重炭酸ナトリウムおよび20mM HEPES を補ったDMEM（GIBCO-BRL）中で増殖させた。他の全ての細胞株は、10％牛胎仔血清（GIBCO-BRL）、2 mM Glutamax（商標）（GIBCO-BRL）、33 mM 重炭酸ナトリウムおよび20mM HEPES を補ったRPMI 1640培地（GIBCO-BRL）中で増殖させた。細胞は、37 °C、5 % CO2の加湿雰囲気中で維持し、週に2度、トリプシン処理により継代した。
【００８６】
b）化学物質
シスプラチン（CDDP、シスジアミノジクロロプラチナII）は、MERCKからシスプラチン市販品として入手した。Oligofectamine試薬は、INVITROGENから入手した。これは液体状で提供され、そして4℃で保管した。直鎖型ポリエチレンイミン（L-PEI）は、エンドトキシンを含まない水の100 mM溶液としてPOLYPLUS-TRANSFECTIONから入手し、そして使用前は−80℃で保存した。
【００８７】
c）インビトロでのシスプラチンへの曝露
指数関数的に増殖する細胞を、血清を含まない培地中にて37℃で2時間、CDDPに曝露した。該薬剤に曝露後、該細胞層をすすぎ、完全増殖培地中でインキュベートした。
【００８８】
d）siRNA設計とトランスフェクション
標的mRNAに相同的な、特異的な二本鎖の19ヌクレオチドのRNA配列を、Bcl-XLおよびMcl-1発現をサイレンシングするために用いた。siXL1と呼ばれる、Bcl-XL発現を妨げるために用いる二本鎖RNAの配列は：
・センス：5'auuggugagucggaucgcatt-3'（配列番号5）
・アンチセンス：5'ugcgauccgacucaccaautt-3' （配列番号6）
である。
Mcl-1特異的なsiRNAの配列は：
・センス：5' gugccuuuguggcuaaacatt -3'（配列番号7）
・アンチセンス：5' uguuuagccacaaaggcacct -3' （配列番号8）
である。
対照siRNAの配列は：
・センス：5' gacgugggacugaaggggutt -3'（配列番号9）
・アンチセンス：5' accccuucagucccacguctt -3' （配列番号10）
である。
【００８９】
該対照siRNAは、関連するヒト遺伝子のいずれにも相同性を有しない（(Duxburyら, 2003, 前記引用）。siXL1はBcl-XL mRNAを選択的に標的にするが、Bcl-XS mRNAを標的にしない。siRNA Mcl-1は、Mcl-1 mRNAの長いアイソフォームを選択的に標的にする。siRNAは、合成され、HPLC精製され、かつEurogentecによりアニーリングされる。
【００９０】
該siRNAの二本鎖は、Oligofectamine試薬およびOpti-MEM培地（INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES）を用いて、推奨される手順によりトランスフェクションされた。25 cm2フラスコにおいて、異なった濃度のsiXL1、siRNA Mcl-1または対照siRNAを30〜40％コンフルエントの細胞にトランスフェクションし、そして37℃、5 % CO2で4時間インキュベートした。次いで、25 cm2フラスコにおいて、最終濃度が10％牛胎仔血清になるまで20％牛胎仔血清を加えた。
【００９１】
e）RT-PCR
RNAeasyキット（QIAGEN）で抽出した全RNAのうち1μgを、製造者が推奨する一本鎖反応の条件下において200ユニットのOmniscript 逆転写酵素（QIAGEN）で逆転写した。標的となるcDNAを下記のプライマー対、Bcl-XL/Sフォワード 5'- ttggacaatggactggttga -3'（配列番号11）およびBcl-XL/Sリバース5'- gtagagtggatggtcagtg -3'（配列番号12；Bargouら, Int. J. Cancer, 1995, 16, 854-859）を用いて増幅し、かつ下記のサイクル条件：プレインキュベーションを94°Cで5分間、そして94 °Cで40秒間、58 °Cで60秒間および72 °Cで40秒間を30サイクル、ポストインキュベーションを72 °Cで 3分間の下で、Mastercycleur Gradient（EPPENDORF）内で増幅した。これらのプライマーの使用により、Bcl-XSおよびBcl-XLのPCR産物をそれぞれ576および765 bpの2つの明確なバンドとして泳動できる。
【００９２】
f）リアルタイムRT-PCR
RNAeasy キット（QIAGEN）で抽出した全RNAのうち1μgを、製造者が推奨する一本鎖反応の条件下において200ユニットのOmniscript逆転写酵素（QIAGEN）で逆転写した。Bcl-XL発現を標準化するために、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（GAPDH）を用いた。Primer Express Applications-Based Primer Design Software （PERKIN-ELMER APPLIED BIOSYSTEMS）を用いて選択されるプライマーとTaqman-MGBプローブを用いて、Bcl-XLおよびGAPDH cDNAを増幅した。
【００９３】
Bcl-XLのために、以下のプライマー：5'-tgcgtggaaagcgtagacaa-3'（配列番号13）および5'-aggtaagtggccatccaagct-3'（配列番号14）を、以下の配列で表されるTaqman-MGBプローブ：5′-FAM-agatgcaggtattggtg-TAMRA-3′（配列番号15）と共に用いた。
【００９４】
GAPDHのために、配列5'-gcaccgtcaaggctgagaac-3'（配列番号16）および5'-tctcgctcctggaagatggt-3'（配列番号17）のプライマーを、以下の配列で表されるTaqman-MGBプローブ：5′-VIC-catcaatggaaatccca-TAMRA-3′（配列番号18）と共に用いた。National Centre for Biotechnology Information（NCBI）データベースのBasic Local Alignment Search Tool（BLAST）サーチにより、該プライマーと該プローブの配列が、他のいずれのヒトの既知遺伝子とも相同性がないことが明らかとなった。キャリブレーターとして選択された未処理の対照サンプルに対して、データを示した。
【００９５】
Bcl-XL mRNAおよびGAPDH mRNA発現を、TaqMan法（ABI PRISM 7000、PE APPLIED BIOSYSTEMS）を用いるリアルタイム定量的RT-PCRにより別々に測定した。各PCRのために、dNTP、Hot Goldstar DNAポリメラーゼ、5 mM MgCl2、UNGおよびROXを含む2X反応緩衝液（qPCR Mastermix、EUROGENTEC）でマスターミックスを調製した。Bcl-XLのための400 nMの各プライマー、GAPDHのための800 nMの各プライマーおよび100 nMの適切なプローブでPCRを行った。5μlの希釈した各DNAを20μlのマスターミックスに加えた。熱サイクリング条件は、始めのUNGインキュベーションを50℃で2分間、Hot Goldstar DNAポリメラーゼの活性化を95℃で10分間、変性を95℃で15秒間およびアニーリング／伸長を60℃で1分間を50サイクル含む。各実施は、GAPDHおよびBcl-XLのための較正曲線の5点、キャリブレーターサンプル、実験サンプル、ならびに鋳型を含まない対照を全て3重に含む。
【００９６】
Bcl-XLを発現するJurkat細胞のcDNAの5倍の系列希釈を用いて、Bcl-XLおよびGAPDHのための標準曲線を確立した。閾値サイクル（CT）は、Bcl-XLおよびGAPDH mRNAの量（Q）を測定するために用いられた。Bcl-XLの相対的な発現は、以下のように計算した：Bcl-XL発現 = (Q Bcl-XL / Q GAPDH)サンプル / (Q Bcl-XL / Q GAPDH)キャリブレーター。結果は、APPLIED BIOSYSTEMSのSDS 2.0ソフトウェアを用いて解析した。
【００９７】
g）ウェスタンブロット法
細胞を氷冷したPBSですすぎ、そして150 mM NaCl、50 mM Tris-HCl pH 8、1 % Triton X100、4 mM PMSF、2 mM アプロチニン、5 mM EDTA、10 mM NaF、10 mM NaPPi、1mM Na3VO4中に30分間、氷上で溶解した。4℃で10分間、10000gの遠心分離で溶解物を清澄にし、そしてBradfordアッセイ（BIO-RAD）を用いて、タンパク質濃度を測定した。等量の全細胞タンパク質（20μg）を、ビス-トリス-HCL（pH 6.4）で緩衝した4〜12 %ポリアクリルアミドゲル（NuPAGE（登録商標）Novex（登録商標）4〜12 % ビス-トリスゲル、INVITROGEN) 中に、200V、35分間で分離し、そしてPVDF膜（MILLIPORE）上に、30V、75分間で電気泳動的に転写した。該膜を、脱脂粉乳を5％添加したT-TBS (132 mM NaCl、20 mM Tris-HCl pH 7.6、0.05 % Tween 20)中に室温で1時間ブロッキングした。該膜を、以下の一次抗体を添加したT-TBS-ミルク中に室温で1時間インキュベートした：抗Bcl-XL/S抗体（1：500、S18 SANTA-CRUZ BIOTECHNOLOGY）、抗PARP抗体（1：1000、CELL-SIGNALING TECHNOLOGY）、抗カスパーゼ-3抗体（1：1000、BD BIOSCIENCES PHARMINGEN）抗断片化カスパーゼ-3抗体（1：1000、CELL-SIGNALING TECHNOLOGY）、抗アルファ‐チューブリン抗体（1：3000、SIGMA）および抗Mcl-1抗体（1：750、S19 SANTA-CRUZ BIOTECHNOLOGY）。T-TBSでの3回の洗浄の後、該膜を、適切なペルオキシダーゼをコンジュゲートさせた二次抗体（抗ウサギIgG、CELL-SIGNALING TECHNOLOGY、および抗マウスIgG、AMERSHAM）を添加したT-TBS-ミルク中に室温で1時間インキュベートした。T-TBSで3回およびTBSで1回の洗浄の後、免疫反応性を、高感度化学ルミネセンス（ECLキット、AMERSHAM）により検出した。
【００９８】
h）ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）での核染色によるアポトーシス細胞の形態学的特徴付け
処理後、浮遊細胞を別々に回収し、そして接着細胞をトリプシン／EDTAによって剥離した。そして、接着および浮遊細胞を集めて、1500x gで5分間遠心分離した後に70％エタノールで固定した。それから、該細胞を細胞遠心分離によりポリリジンコートしたガラススライドに回収した後に、1μg/ml DAPI水溶液（BOEHRINGER MANNHEIM）中に室温で30分間インキュベーションした。その後、スライドを蒸留水でよく洗浄し、Mowiol（CALBIO-CHEM）をのせた。
【００９９】
i）DNA細胞内容物のフローサイトメトリ解析
細胞の調製
処理後、浮遊細胞を別々に回収した。そして、接着細胞をトリプシン／EDTA剥離によって採集した。それから、接着および浮遊細胞を集めてPBSで洗浄した後に、70％エタノールで固定し、−20℃で保存した。フローサイトメトリ解析の前に、該細胞をPBSで洗浄し、アポトーシス細胞に特徴的な低分子量（m.w.）DNAの放出を可能にするためにPBS中に室温で30分間インキュベートした。4000gで10分間の遠心分離の後、該細胞沈殿を再懸濁し、1 ml当たり細胞106個の終濃度でDNA Prep Coulter Reagent キット（BECKMAN-COULTER）を用いてプロピジウムアイオダイド（PI）で染色した。
【０１００】
機械の設定
サンプルを、15 mWのアルゴンレーザを搭載したEPICS XLフローサイトメータ（BECKMAN COULTER）を用いて解析した。PI染色した細胞を、488 nmの励起で解析した。620 nmのバンドパスフィルタをPIの赤色蛍光に用いた。コンピュータ化されたゲーティングを、微小のデブリスを排除するために側方および前方のスキャッタに、かつ凝集物を除去するためにパルス幅および赤色蛍光の積算ピークに使用した。全てのサンプルを、1秒当たり100イベント未満の流速かつシース圧30 psiで解析した。
【０１０１】
データ解析
EXPO 32 Acquisition Software（Beckman Coulter）をデータの取得に用いた。
【０１０２】
2）結果
a）Bcl-XL発現、細胞増殖率およびアポトーシス誘導に対するsiXL1の効果
Bcl-XS mRNA ではなくBcl-XL mRNAを選択的に標的にするsiXL1の効果を、種々の腫瘍細胞株について試験した。siXL1で処理したSKOV3細胞では、RT-PCR解析（図１A）で示したように、Bcl-XL mRNAレベルが顕著に減少する。定量的RT-PCR解析では、Bcl-XL mRNAレベルが60％〜70％減少することを明らかにした（図１B）。Bcl-XLタンパク質発現は、siXL1トランスフェクション後24時間で減少し、かつ72時間後に完全に消失した（図１C）。Bcl-XLタンパク質発現の消失は、試験した種々の腫瘍細胞株において観察された：卵巣癌腫細胞、グリア芽腫細胞または中皮腫細胞（図２AおよびB）。siXL1によるBcl-XLタンパク質発現の消失は、用量依存的である（図３A）。対照siRNAで処理した細胞では、Bcl-XL発現に対する効果は検出されなかった（図３B）。Bcl-XLタンパク質発現の消失の動態（kinetic）は、100 nM siXL1処理の72時間後に最大の減少を（図４）、かつ144時間以降からBcl-XLタンパク質の再発現を示す。低用量のsiXL1（25 nM）で処理した細胞において、該効果は顕著に減少し、かつ遅延した（図４）。細胞および核の形態（図５A）、およびウェスタンブロットによるカスパーゼ3切断の検出（図５B）で示したように、siXL1はSKOV3細胞において穏やかなアポトーシスを誘導する。Bcl-XLタンパク質発現が減少するほど、該切断が増加する。
【０１０３】
b）インビトロにおけるSKOV3細胞に対するsiXL1／シスプラチンの組み合わせの効果
シスプラチンとsiXL1との組み合わせへの曝露は、シスプラチン単独では細胞周期の進行の一過的な停止を誘導するだけの条件（5および20μg/ml）において、数日後に高レベルの細胞死を誘導する。わずかな効果が24時間後に検出可能であるが、siXL1とシスプラチンとの組み合わせへの4日間の曝露後に、細胞の大量死が観察される；未処理細胞と比較して、生存細胞は10％未満である（図6、7および８）。
【０１０４】
遺伝子発現解析（図９）は、シスプラチンは、用いた濃度（5および20μg/ml）においてBcl-XLタンパク質発現に対して効果を有さないが、siXL1との組み合わせは、シスプラチンへの曝露後24時間（siRNAトランスフェクション後72時間）においてBcl-XL発現がほとんど完全に消失したことを示す。Bcl-XL発現は、シスプラチンへの曝露後96時間（トランスフェクション後144時間）において再び現れるので、この発現の改変は一過的である。それにもかかわらず、該発現は、siXL1と高用量のシスプラチン（20 μg/ml）との組み合わせにより、顕著に抑制され、最長時間後でさえもBcl-XLタンパク質発現は検出できない。
【０１０５】
カスパーゼ3活性化とPARP切断の検出で示したように、アポトーシス誘導は、siXL1とシスプラチンとの組み合わせにより顕著に増幅される。シスプラチン単独への曝露の24時間後、用いた濃度のいずれでもアポトーシスの兆候は検出できない。これとは対照的に、siXL1に曝露した細胞では、カスパーゼ3活性とPARP切断を検出でき、この切断は、20 μg/mlのシスプラチンおよびsiXL1で共処理された細胞において増幅される。シスプラチンへの曝露の96時間後、この差異は明確に検出でき、シスプラチンをsiXL1と組み合わせる場合、カスパーゼ3活性とPARP切断は最大に達する。
【０１０６】
これらの結果は、シスプラチン単独では用いた濃度（S期およびG2期での一過的な停止による、細胞増殖抑制効果のみ観察される）のいずれでも、低レベルの細胞死を誘導するか、または誘導しないが、siXL1単独ではアポトーシスによる穏やかな細胞死を誘導することを示すことにより、形態学的観察（図６および７）および細胞周期のFACS解析（図８）を確かなものにする。しかしながら、siXL1とシスプラチンとの組み合わせは、時間とより少ない程度でシスプラチン用量とに依存する細胞の大量死を誘導する。siXL1／シスプラチンの組み合わせの細胞毒性効果は、最も低い用量のシスプラチン（5μg/ml）でも非常に強く、20μg/mlでは、処理の開始後1週間で腫瘍群がほとんど完全に破壊される。
対照siRNAはシスプラチンの効果に変化を誘導しないので、該効果は特異的である。さらに、図10は、siXL1と低用量のシスプラチン（5μg/ml）との組み合わせが、SKOV3細胞に多くの細胞死を誘導し、かつインビトロにおいて腫瘍の再発を強く遅延したことを示す。
【０１０７】
これらの結果は、選択されたsiRNA配列、siXL1が、非常に効果的にBcl-XL mRNAおよびタンパク質発現を阻害し、かつ非常に活動的でシスプラチンへの抵抗性の高い卵巣腫瘍細胞株に対するシスプラチンの細胞毒性活性を強く増強することを示す。siXL1の効果は特異的で、96時間持続し、かつsiXL1の最適濃度は150 nMである。
【０１０８】
c）インビトロにおけるSKOV3細胞のMcl-1発現に対するsiMcl-1の効果
RT-PCR解析（図１１A）で示されるように、siMcl-1で処理したSKOV3細胞では、Mcl-1 mRNA発現がほとんど完全に減少される。Mcl-1タンパク質発現は、72時間後に完全に消失した（図１１B）。siXL1によるMcl-1タンパク質発現の消失は、用量依存的である（図１１B）。siGFP対照siRNAで処理した細胞において、Mcl-1発現に対する効果は検出されなかった（図１１Aおよび１１B）。
【０１０９】
d）インビトロにおけるSKOV3細胞に対するsiXL1／siRNA Mcl-1の組み合わせの効果
siXL1とMcl-1 mRNAに指向したsiRNAとの組み合わせへの曝露は、各siRNAが細胞毒性効果を示さない濃度（50 nM；図１２）またはわずかな細胞毒性効果のみを示す濃度（図１３および１４）において、（シスプラチン曝露なしで）SKOV3細胞に対する細胞毒性効果を示す。
【０１１０】
細胞と核の形態観察、および細胞周期解析（図１３）は、トランスフェクションしていないSKOV3細胞と、siMcl-1または対照siRNAを単独（各150 nM）または組み合わせ（各75 nM）でトランスフェクションしたSKOV3細胞との間に差異がないことを明らかにした。増殖率のわずかな減少（20％〜40％）を観察した。
【０１１１】
同じ条件において、siXL1単独（各150 nM）または対照siRNAとの組み合わせ（各75 nM）をトランスフェクションしたSKOV3細胞では、核の断片化および凝縮が示すような穏やかなアポトーシス、ならびに生存細胞の減少を示す（図１３および１４）。
【０１１２】
それに比べ、siXL1とsiMcl-1の組み合わせ（各75 nM）は、細胞の形態、アポトーシスによる細胞死の多数の核の特徴および重要な前G1ピック（pic）の存在が示すように、大量の細胞の剥離および細胞死を誘導する（図１３および１４）。
【０１１３】
実施例２：卵巣腫瘍に対するsiXL1の効果
1）材料と方法
a）ヌードマウス
4週齢のメスのスイス／ヌードマウスをCHARLES-RIVER LABORATORIESから得て、病原体のない環境で維持した。該マウスに標準的な実験用の餌および水道水を任意に与え、かつ23±1℃、12時間ごとの昼夜サイクルで飼育した。本研究での動物実験は、欧州実験動物科学協会連盟のガイドラインに従って行われた。
【０１１４】
b）PEI／siRNA複合体形成および投与
PEI／siRNA複合体を、5％グルコース溶液中にL-PEI窒素とsiRNAホスフェートとの比が5：1で調製した。様々な量のsiRNA（125、625、または2500 ng）およびL-PEIを別々に希釈し、そしてPEIを該siRNAに加えた。この溶液を迅速にホモジナイズし、そして室温にて15分放置した。これをマウスの腹腔内に0.5 mlの5 %グルコース溶液として注射した。
【０１１５】
c）マウスへの腫瘍細胞の腹腔内移植およびsiRNAの注射
6〜8週齢のマウスの腹腔内に、卵巣腺癌SKOV3細胞2 x 107個を移植した。以前に記載されたように、このモデルは、進行性の卵巣癌のi.pでの増殖パターンを反映する。（Louisら, Cancer Gene Therapy, 2006, 13, 367-374）。
【０１１６】
c1）マウス生存の解析
腫瘍移植の21日後、マウスを、表IIにまとめた8つの処置グループ（1グループ当たり10匹）の1つに配分する：
‐グループ1は、未処理動物を含めた。
‐グループ2は、0.9 % NaCl 1 ml中の4 μg/kgシスプラチンの腹腔内注射を受けた。
‐グループ3は、0.9 % NaCl 1 ml中の25 μg/kg対照siRNAの腹腔内注射を受けた。
‐グループ4は、0.9 % NaCl 1 ml中の25 μg/kg Bcl-XL siRNAの腹腔内注射を受けた。
‐グループ5は、0.9 % NaCl 1 ml中の25 μg/kg 対照siRNA、および翌日に0.9 % NaCl 1 ml中の4 μg/kgシスプラチンの腹腔内注射を受けた。
‐グループ6は、0.9 % NaCl 1 ml中の4 μg/kgシスプラチン、および翌日に0.9 % NaCl 1 ml中の25 μg/kg 対照siRNAの腹腔内注射を受けた。
‐グループ7は、0.9 % NaCl 1 ml中の25 μg/kg Bcl-XL siRNA、および翌日に0.9 % NaCl 1 ml中の4 μg/kgシスプラチンの腹腔内注射を受けた。
‐グループ8は、0.9 % NaCl 1 ml中の4 μg/kgシスプラチン、および翌日に0.9 % NaCl溶液1 ml中の25 μg/kg Bcl-XL siRNAの腹腔内注射を受けた。
【０１１７】
同じ処理を１ヵ月後に繰り返した。マウスを瀕死とみなした場合、殺して解剖した。臓器および腫瘍を、組織学的試験のためにホルマリン固定し、かつパラフィン包埋した。実験の終点において、全ての生存動物を犠牲にし、そして残存する腫瘍結節を検出するために組織学的試験を行った。
【０１１８】
【表２】
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【０１１９】
c1）SKOV3腫瘍結節中のBcl-XL発現に対するsiRNA送達の効果
腹腔の癌腫症の進展後、動物の腹腔内に裸の、またはPEIと複合したsiXL1を5、25または100 μg/kg注射した。トランスフェクションの3日後にマウスを殺し、各臓器（腎臓、肝臓、脾臓、膵臓、卵巣、腹膜、横隔膜、肺、心臓および骨格筋）を生理食塩水で洗浄した。各臓器の部分を、RT-PCRおよびウェスタンブロット解析のために液体窒素で凍結して、-80℃で保存し、あるいは組織学的試験および免疫組織化学的解析のためにホルマリン固定およびパラフィン包埋した。
【０１２０】
d）マウスへの腫瘍細胞の皮下移植およびsiRNAの注射
SKOV3細胞（2 x 107/500 μL）をヌードマウスの右わき腹に皮下移植し、そして触知できる腫瘍の定着を測定した。腫瘍体積は、v = L x l2 x π/6（式中、Lおよびlは、デジタル測径器で週に2度測定した、腫瘍の長径および短径を示す）のように計算した。腫瘍の平均体積が、約100 mm3に達した場合（10日目において）、以下の3つの実験グループ（1グループ当たり3匹）を試験した：（a）未処理、（b）裸のsiXL1（25μg/kg）、および（c）siXL1-PEI（25μg/kg）。サンプルを0.5 mlの0.9 % NaCl溶液（裸のsiRNA）または0.5 ml 5 %グルコース溶液（siRNA-PEI）で希釈し、腹腔内に注射した。この過程を週に1度繰り返した。
【０１２１】
e）免疫組織化学
免疫組織化学的染色を、パラフィン包埋した材料に対して行った。免疫染色を行うために、厚さ4μmの切片からパラフィンを除き、再水和し、そして0.1M pH6クエン酸緩衝液中で、高温加熱抗原回復法により30分間処理して、エピトープを露出させた。切片を、Santa Cruz（TEBU-BIO）から入手し、1：50に希釈したポリクローナル抗体の抗Bcl-XL/S抗体（S18）とともに室温にて1時間インキュベートした。洗浄後、スライドを、製造者の使用説明書に従ってウサギIgG Vectastain ABCキット（VECTOR、ABCYS）とともにインキュベートした。染色をDAB chromogen システム（DAKO）で明らかにし、切片をヘマトキシリンで対比染色した。
【０１２２】
2）結果
インビボでのsiXL1の効果を、ヒト卵巣癌のマウスのモデルで試験した。このモデルにおいて、腹腔のヒト卵巣腺癌は、SKOV3ヒト卵巣腫瘍細胞をヌードマウスの腹腔内へ注射することにより誘発される。
【０１２３】
a）裸のsiRNAの注射
siXL1は顕著にマウスの生存数を増加させる（未処理のマウスでは10 ％が生存するのに対し、siXL1で処理したグループでは130日目において60％が生存する）が、シスプラチン処理は生存数を改善しないという結果を示す（図１５）。しかしながら、インビトロでの結果とは反対に、siXL1とシスプラチンとの組み合わせは、siXL1単独の効果と同様のインビボでの効果をもたらす；siXL1とシスプラチンとの組み合わせは、siXL1単独に比べて、マウスの生存数を改善しない。このsiRNA用量および注射回数（28日間隔で2回の注射）が、他の研究で用いられるもの（高用量のsiRNAを毎日、または週に何度も）に比べて、かなり低いことは注目する価値がある。対照siRNAはマウスの生存数を増加させないので、この効果は特異的である。
【０１２４】
siXL1で処理したグループでは、マウスは、150日後のマウスの解剖で示されるように、対照マウスと同じ間隔で死ぬか（マウスの50 %）、または治癒され、このことはマウスの50 %において残存腫瘍が見られないことを示す。カーブの前半は、異なるグループにおいて同じであり、おそらく血管の内皮細胞に対するsiXL1の直接の効果のため、siRNAの効果が最小の腫瘍小結節に限定されうることを示唆する。対照的に、siXL1注射の時により大きな腫瘍を有するマウスは、これらの条件（裸のsiRNA投与）ではsiXL1処理に感受性がより乏しく、かつそれらの生存率は未処理のグループと同様である。未処理のグループにおいて、最初のマウスの死と最後のマウスの死との間に1ヶ月の遅延があるので、このモデルにおけるマウス間の腫瘍進展の不均一性によって、これらの結果を説明できた。
【０１２５】
標的に対するsiRNAの分子効果は、腹腔のSKOV3腫瘍結節中のBcl-XLタンパク質の免疫組織化学的解析により示された。未処理マウスの腫瘍では、相対的な個体内および個体間のばらつきにもかかわらず、高いBcl-XL発現を示した。様々な量の裸のsiXL1（5、25または100 μg/ml）で処理したマウスは、ある結節では高いBcl-XL発現レベルを示す一方で、他の結節では減少したBcl-XL発現レベルを示し、相対的な個体内および個体間のばらつきを明らかにする。それにもかかわらず、siXL1の用量が増加すると、標識強度は減少し、該siRNAの用量効果を示唆する。
【０１２６】
b）siRNA/PEI複合体の注射
裸の、またはL-PEIと複合したsiXL1で処理したマウスにおける腹腔のSKOV3腫瘍結節中のBcl-XLタンパク質の免疫組織化学的解析により、siXL1/L-PEI複合体で処理したマウスにおける全体のBcl-XLタンパク質発現レベルが、裸のsiXL1で処理したマウスに比べて低いことが示される。これらの結果は、ベクター（L-PEI：直鎖ポリエチレンイミン）によるsiXL1送達が、インビボでその活性を増加させることを示唆する。
【０１２７】
これは、腫瘍増殖が未処理マウスのそれとほぼ同様であるので、PEIとともに送達され、かつ腹腔内に注射された裸のsiXL1が少なくとも45日間、腫瘍増殖を阻害するが、同じ条件で注射されたsiXL1はほとんど効果を有さないことを示す、皮下腫瘍増殖解析により確認された（図１６）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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