(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細菌由来の第一の精製タンパク質およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ細菌由来の第二の精製タンパク質を含む、免疫原性組成物であって、ここで、
ｉ）該第１の精製タンパク質が配列番号３５１６または配列番号３５１６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列であり、かつ、該第２の精製タンパク質が、配列番号１〜３５１５および３５１７〜４００２から選択される偶数の配列番号のうちの１つ以上またはそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列であるか；
ｉｉ）該第１の精製タンパク質が配列番号３５１８または配列番号３５１８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列であり、かつ、該第２の精製タンパク質が、配列番号１〜３５１７および３５１９〜４００２から選択される偶数の配列番号のうちの１つ以上またはそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列であるか；あるいは
ｉｉｉ）該第１の精製タンパク質が配列番号３５２０または配列番号３５２０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列であり、かつ、該第２の精製タンパク質が、配列番号１〜３５１９および３５２１〜４００２から選択される偶数の配列番号のうちの１つ以上またはそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列である、
組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の免疫原性組成物であって、ここで、
ｉ）前記第１の精製タンパク質が配列番号３５１６であり、かつ、前記第２の精製タンパク質が、配列番号１〜３５１５および３５１７〜４００２から選択される偶数の配列番号のうちの１つ以上であるか；
ｉｉ）前記第１の精製タンパク質が配列番号３５１８であり、かつ、前記第２の精製タンパク質が、配列番号１〜３５１７および３５１９〜４００２から選択される偶数の配列番号のうちの１つ以上であるか；あるいは
ｉｉｉ）前記第１の精製タンパク質が配列番号３５２０であり、かつ、前記第２の精製タンパク質が、配列番号１〜３５１９および３５２１〜４００２から選択される偶数の配列番号のうちの１つ以上である、
組成物。
【請求項３】
配列番号１〜４００２より選択される２以上の精製タンパク質を含む、請求項１または２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
医薬としての使用のための、請求項１、２または３に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
請求項４に記載の免疫原性組成物であって、以下：
（ｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細菌による感染を処置または予防するための医薬；
（ｉｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細菌、もしくは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細菌に対して惹起された抗体の存在を検出するための診断試薬；および／あるいは
（ｉｉｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細菌に対して抗体を惹起し得る試薬
として使用される、組成物。
【請求項６】
以下：
（ｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細菌による感染を処置または予防するための医薬；
（ｉｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細菌、もしくは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細菌に対して惹起された抗体の存在を検出するための診断試薬；および／あるいは
（ｉｉｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細菌に対して抗体を惹起し得る試薬
の製造における、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】  本明細書中に引用される全ての文書は、それらの全てが参考として援用される。
【０００２】  （発明の分野）
本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ（ナイセリア）細菌、特にＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の生物学的分子の組合せを含む組成物に関する。
【０００３】  （背景技術）
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅは、非運動性であり、ヒトにおいて病原性であるグラム陰性の双球菌である。
【０００４】  生物体の被嚢多糖に基づいて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの１２の血清型が同定された。Ａ群は、サハラ以南のアフリカにおける流行病に最も頻繁に関係した病原体である。血清型ＢおよびＣは、米国およびほとんどの先進国における症例の大多数の原因である。血清型Ｗ１３５およびＹは、米国および先進国における症例の残りの原因である。
【０００５】  現在使用される髄膜炎菌のワクチンは、血清型Ａ、Ｃ、ＹおよびＷ１３５から構成される四価の多糖ワクチンである。しかし、髄膜炎菌Ｂは問題を残す。多糖アプローチは使用され得ない。なぜなら、ｍｅｎＢ被嚢多糖は、哺乳動物組織にもまた存在するα（２−８）連結Ｎ−アセチルノイラミン酸のポリマーであるからである。ｍｅｎＢワクチンに対する１つのアプローチは、外膜タンパク質（ＯＭＰ）の混合物を使用する。抗原性の可変性を克服するために、９までの異なるポーリンを含む多価ワクチンが構築された（例えば、Ｐｏｏｌｍａｎ  ＪＴ（１９９２）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｄｉｓ．４：１３−２８）。外膜ワクチンに使用されるべきさらなるタンパク質は、ｏｐａタンパク質およびｏｐｃタンパク質であるが、これらのアプローチのいずれもが抗原性の可変性を克服し得なかった（例えば、Ａｌａ  ＡｌｄｅｅｎおよびＢｏｒｒｉｅｌｌｏ（１９９６）  Ｔｈｅ  ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １  ａｎｄ  ２  ａｒｅ  ｂｏｔｈ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｘｐｏｓｅｄ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｔｒａｉｎｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ  １４（１）：４９−５３）。
【０００６】  集団の中で優勢な菌株において頻発する経時的な変化とともに、非流行期間の髄膜炎菌病が、複数の菌株または菌株改変体によって引き起こされる傾向があることを考慮すると（Ｒｕｓｓｅｌら（１９９８）Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  １１ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ．２８１頁）、汎用髄膜炎菌Ｂワクチンは１より多い抗原性種が要求されるようである。
【０００７】  （発明の説明）
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａタンパク質およびヌクレオチドの配列は、以下の文書に開示される：
・ＷＯ９９/２４５７８
・ＷＯ９９/３６５４４
・ＷＯ９９/５７２８０
・ＷＯ９７/２８２７３
・ＷＯ９６/２９４１２
・ＷＯ９５/０３４１３
・Ｔｅｔｔｅｌｉｎら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：１８０９−１８１５。
【０００８】  参照を容易にすると、これらの文書に開示される配列は、以下の表に従って本願中に参照される：
【０００９】
【表１】
0005622344.tif 000002
本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細菌由来の第一の生物学的分子およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ細菌由来の第二の生物学的分子を含む組成物を提供する。用語「生物学的分子」は、タンパク質および核酸を含む。
【００１０】  組成物はまた、さらなる生物学的分子、好ましくはまたＮｅｉｓｓｅｒｉａ由来の生物学的分子を含み得る。すなわち、組成物は、２以上の生物学的分子（例えば、３、４、５、６、７、８など）（このうち少なくとも２つ（例えば、３、４、５、６、７、８など）は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細菌由来）を含み得る。このような組成物は、（ｉ）２以上の異なるＮｅｉｓｓｅｒｉａタンパク質、（ｉｉ）２以上の異なるＮｅｉｓｓｅｒｉａ核酸、または（ｉｉｉ）１以上のＮｅｉｓｓｅｒｉａタンパク質および１以上のＮｅｉｓｓｅｒｉａ核酸を含む組成物を含む。
【００１１】  １つの好ましい実施形態において、第一および第二の生物学的分子は、異なるＮｅｉｓｓｅｒｉａ種由来である（例えば、１つはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来で、１つはＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来である）。しかし、第一および第二の生物学的分子は、同一種からであり得る。組成物中の生物学的分子は、同一種の異なる血清型または菌株であり得る。
【００１２】  第一の生物学的分子は、好ましくは配列番号１〜８３７６からなる群より選択される。より好ましくは、第一の生物学的分子は、配列番号１〜４００２および／または配列番号４０５７〜８３７６からなる群より選択される。好ましくは、第一の生物学的分子は、精製されるかまたは単離された生物学的分子である。
【００１３】  第二の生物学的分子は、好ましくは配列番号１〜８３７６からなる群より選択される。より好ましくは、第二の生物学的分子は、配列番号１〜４００２および／または配列番号４０５７〜８３７６からなる群より選択される。好ましくは、第二の生物学的分子は、精製されるかまたは単離された生物学的分子である。
【００１４】  第一および第二の生物学的分子の一方または両方は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａの生物学的分子であり得、本明細書中に詳細には開示されない。そして、本特許出願が出願される前は、同定も、発見も、公衆に利用可能にされも、精製もされ得ない。
【００１５】  特に、本発明は、以下の第一および第二の生物学的分子（配列番号によって列挙される）の対の１つ以上を含む組成物を提供する。
【００１６】  Ｆｉｒｓｔ：第一；Ｓｅｃｏｎｄ：第二
【００１７】
【表２】
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したがって、本発明は、配列番号１〜８３７６の３５０７４５００個の可能な対の各々（１および２、１および３、１および４、１および５、・・・  １および８３７５、１および８３７６、２および３、２および４、２および５、…  ２および８３７５、２および８３７６、３および４、・・・  １０００および１００１、１０００および１００２、・・・  １０００および８３７６、・・・  ８３７４および８３７５、８３７４および８３７６、８３７５および８３７６）を包含するが、スペースの都合で、その全てをここに列挙していない。
【００１８】  配列番号１〜４０５６をなす分子がいかに生成されそして使用され得るかの詳細は、関連する国際出願から見出され得、これらの詳細は、ここで繰り返される必要はない。同様の原理が配列番号４０５７〜８３７６に当てはまる。
【００１９】  本発明の組成物における配列番号１〜８３７６は、配列番号１〜８３７６に相同な配列（すなわち、配列同一性を有する）を含む分子により補充または置換され得る。特定の配列に依存して、同一性の程度は、好ましくは、５０％よりも大きく（例えば、６５％、８０％、９０％、またはそれ以上）、そして変異体および対立遺伝子改変体を含む。タンパク質間の配列同一性は、好ましくは、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に装備されたＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって、アフィンギャップ検索をギャップオープンペナルティ（ｇａｐ  ｏｐｅｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝１２およびギャップ伸長ペナルティ（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝１で使用して決定される。
【００２０】  本発明の組成物における配列番号１〜８３７６は、配列番号１〜８３７６のフラグメントを含む分子によって補充または置換され得る。このようなフラグメントは、その分子由来の少なくともｎ個の連続するモノマーを含むべきであり、そして特定の配列に依存して、ｎは、（ｉ）タンパク質分子については、好ましくは、そのフラグメントがその配列からのエピトープを含むように７またはそれ以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、またはそれ以上）であり、または（ｉｉ）核酸分子については、１０またはそれ以上である（例えば、１２、１４、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０またはそれ以上）のいずれかである。
【００２１】  その組成物が、異なる新生形態または成熟形態で存在するタンパク質を含む場合、成熟形態のタンパク質が好ましくは使用される。例えば、シグナルペプチドを欠失するＮｓｐＡタンパク質の成熟形態（配列番号４００８〜４０３３；ＷＯ９６／２９４１２；図２９）が使用され得る。
【００２２】  タンパク質分子の場合、本発明の組成物における配列番号１〜８３７６は、そのタンパク質に結合する抗体によって補充または置換され得る。この抗体は、モノクローナル抗体かまたはポリクローナル抗体であり得る。
【００２３】  核酸分子の場合、本発明の組成物における配列番号１〜８３７６は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａの核酸に、好ましくは、「高いストリンジェンシー」条件下で（例えば、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ溶液において、６５℃）、ハイブリダイズし得る核酸によって補充または置換され得る。
【００２４】  組成物中の任意の核酸が種々の形態（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プローブなど）をとり得ることは明らかである。さらに、用語「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、そしてまた、それらのアナログ（例えば、改変された骨格を含むもの）、およびまたペプチド核酸（ＰＮＡ）などを含む。
【００２５】  特定の実施形態において、その組成物は、異なるＮｅｉｓｓｅｒｉａ種（例えば、１つ以上のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ分子および１つ以上のＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ分子）由来の分子を包含する。いくつかの実施形態において、その組成物は、同じ種の異なる血清型および／または菌株由来の分子（例えば、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＡ株およびＢ株）を含み得る。さらなる実施形態は、異なる菌株由来の１つ以上のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ分子、およびまた１つ以上のＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ分子の混合物を含む。
【００２６】  多くのタンパク質は、異なる種、血清群、およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの菌株（例えば、配列番号５２、５４、５８）間で比較的保存されている。ＰＣＴ／ＩＢ００／００６４２は、これらのタンパク質における保存された領域のより多くの詳細な実験分析を含む。最大の菌株間認識および反応性を確実にするために、異なるＮｅｉｓｓｅｒｉａ種、血清型、および菌株間で保存されているタンパク質の領域が、本発明の組成物において使用され得る。したがって、本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａの大部分にわたって、特に、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに共有されているアミノ酸配列のストレッチを含むタンパク質を提供する。したがって、好ましくは、その組成物は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａタンパク質のフラグメントを含むタンパク質（好ましくは、配列番号１〜８３７６のタンパク質、またはより好ましくは、配列番号１〜４００２のタンパク質）を含む。ここで、そのフラグメントは、ｎ個の連続する保存されたアミノ酸からなる。特定のタンパク質に依存して、ｎは７またはそれ以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、またはそれ以上）からなる。そのフラグメントは、好ましくは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａタンパク質の抗原性または免疫原性領域を含む。「保存された」アミノ酸は、少なくともｘ％のＮｅｉｓｓｅｒｉａ（または好ましくは少なくともｘ％の、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌株の組み合わせ）の特定のＮｅｉｓｓｅｒｉａタンパク質に存在する１つである。ｘの値は、５０％以上、例えば、６６％、７５％、８０％、９０％、９５％またはさらに１００％（すなわち、アミノ酸が全てのＮｅｉｓｓｅｒｉａにおける問題のタンパク質に見出される）であり得る。アミノ酸が特定のＮｅｉｓｓｅｒｉａタンパク質において「保存されている」か否かを決定するために、複数の異なるＮｅｉｓｓｅｒｉａ（「参照集団」）由来の問題のタンパク質の配列中のアミノ酸残基を比較することが必要である。「参照集団」の適切な定義は、ＰＣＴ／ＩＢ００／００６４２に見出され得る。異なるＮｅｉｓｓｉｅｒｉａｅのアミノ酸配列は、容易に、コンピュータを使用して比較され得る。これは、代表的には、ＣＬＵＳＴＡＬ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２２：４６７３−４６８０；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  （１９９８）２３：４０３−４０５）または好ましくは、ＰＩＬＥＵＰ（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージの一部、好ましくは、バージョン９．０）のようなアルゴリズムを使用して、多数の配列のアラインメントを包含する。保存されたアミノ酸は、複数の配列アラインメント−整列された配列の大部分が特定のアミノ酸を含む問題のアミノ酸位置−において容易に明らかである。保存されたアミノ酸は、ＢＯＸＳＨＡＤＥ（例えば、ＮＩＨからオンラインで入手可能）、ＰＲＥＴＴＹＢＯＸ（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｖｅｒｓｉｏｎ１０）、またはＪＡＬＶＩＥＷ（ＥＢＩからオンラインで入手可能）のようなプログラムを使用して、より視覚的に明らかである。
【００２７】  したがって、本発明に従う特定の組成物は、以下のものを含む：
・配列番号１〜４００２から選択される２つ以上の生物学的分子；
・配列番号１〜４００２から選択される１つ以上の生物学的分子と配列番号４００３〜８３７６から選択される１つ以上の生物学的分子の組み合わせ；
・配列番号１〜４００２から選択される１つ以上の生物学的分子とＮｓｐＡタンパク質（ＷＯ９６／２９４１２に開示されるもの；本願明細書の図２９もまた参照のこと）（好ましくは、成熟形態）との組み合わせ；
・配列番号１〜８３７６（好ましくは、配列番号１〜４００２）から選択される１つ以上の生物学的分子とトランスフェリン結合タンパク質Ａ（ＴｂｐＡ）および／またはＢ（ＴｂｐＢ）（例えば、ＷＯ００／２５８１１に開示されるＴｂｐＡおよびＴｂｐＢ（またはそれらの免疫原性フラグメント））との組み合わせ；
・配列番号１〜４００２から選択されるタンパク質の１つ以上のフラグメントと好ましくは、保存されたアミノ酸のストレッチを含むフラグメントとの組み合わせ；
・異なるタンパク質の組み合わせであって、ここで、その組み合わせは、全体として、参照集団において各菌株によって認識される１つ以上のタンパク質を含むが、その組み合わせ中の各個々のタンパク質は、それ自体、参照集団において各菌株によって認識されないかもしれない、すなわち、参照集団の各メンバーは、少なくとも１つのタンパク質をその組み合わせにおいて認識する。
【００２８】  本発明はまた、医薬としての使用のため（例えば、免疫原性組成物またはワクチン）または診断試薬としての本発明の組成物を提供する。本発明はまた、（ｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細菌による感染を処置または予防するための医薬；（ｉｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細菌またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ細菌に対する抗体の存在を検出するための診断試薬；および／または（ｉｉｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細菌に対して抗体を惹起し得る試薬の製造における組成物の使用を提供する。
【００２９】  本発明はまた、患者を処置するための方法を提供する。この方法は、その患者に治療有効量の本発明の組成物を提供する工程を包含する。
【００３０】  本発明はさらに、本発明に従う組成物を産生するためのプロセスを提供する。このプロセスは、１つ以上の配列番号１〜８３７６を、１つ以上の配列番号１〜８３７６と組み合わせる工程を包含する。
【００３１】  （実施例）
（実施例１−発現および精製実験）
ＷＯ９９／２４５７８に開示された、ＯＲＦ６、７、１３、６５−１、７２、７３−１、１０５−１、１３７−１、１４３−１および１４７−１を、以下の表に示されるように、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そして精製した。
【００３２】
【表３】
0005622344.tif 000053
注意：ＯＲＦ７３−１は、フラグメント（アミノ酸４１〜１６１）として発現された。
【００３３】  これらの１０個のＯＲＦを発現させるために使用されたプロトコールは、本質的にＷＯ９９／２４５７８に記載されたプロトコールと同じであり、ｐＧＥＸおよびｐＥＴベクターを使用した。ＯＲＦを増幅するために使用したＰＣＲプライマーの例は、以下の表の通りである。
【００３４】
【表４】
0005622344.tif 000054
発現された１０個のＯＲＦについてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を、図１に示す。
【００３５】  ＯＲＦ７−Ｈｉｓ融合物を使用して、マウスに免疫した。本質的にＷＯ９９／２４５７８に記載されるように、この血清がＥＬＩＳＡアッセイにおいて使用され、そして陽性結果を与えた。
【００３６】  以下のタンパク質もまた、発現および精製された（結果は示さず）。
【００３７】
【表５】
0005622344.tif 000055
以下のＰＣＲプライマーを使用して、これらのＯＲＦを増幅した。
【００３８】
【表６】
0005622344.tif 000056
これらの各ＯＲＦを、１以上の配列番号１〜８３７６と組合せ得る。
【００３９】  （実施例２−ＯＲＦ９の発現および精製）
ＷＯ９９／２４５７８に開示されたＯＲＦ９を、ｐＥＴベクター中にクローン化し、そしてＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。精製されたＯＲＦ−Ｈｉｓ融合タンパク質を、図２Ａに示されるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。精製されたＯＲＦ９−Ｈｉｓを用いて、マウスに免疫し、そしてウェスタンブロット分析（図２Ｂ）、ＦＡＣＳ分析（図２Ｃ）、およびＥＬＩＳＡアッセイのために血清を使用した。使用されたプロトコールは、ＷＯ９９／２４５７８に示されたプロトコールと本質的に同じである。
【００４０】  この結果によって、ＯＲＦ９が表面に露出されるタンパク質であることが確認された。ＯＲＦ９は、１つ以上の他の配列番号１〜８３７６と組合せるために適切であり得る。
【００４１】  （実施例３−さらなる発現実験）
さらなる発現および精製実験を、以下の表に示されるように、ＷＯ９９／２４５７８に開示されたＯＲＦ２−１、５−１、２２−１、および１３２−１について、Ｅ．ｃｏｌｉ中で実施した。
【００４２】
【表７】
0005622344.tif 000057
これらの４つのＯＲＦを発現させるために使用されたプロトコールは、本質的にＷＯ９９／２４５７８に記載されたプロトコールと同じであり、ｐＧＥＸおよびｐＥＴベクターを使用した。ＯＲＦを増幅するために使用したＰＣＲプライマーの例は、以下の表の通りである。
【００４３】
【表８】
0005622344.tif 000058
発現された４個のＯＲＦについてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を、図３に示す。
【００４４】  これらの各ＯＲＦを、１以上の配列番号１〜８３７６と組合せ得る。
【００４５】  （実施例４−ＯＲＦ４リポタンパク質の発現および精製）
ＯＲＦ４は、リポペプチドシグナル配列（ＬＰＳＳ）を含むとして、ＷＯ９９／２４５７８に開示されている。全長ＯＲＦを、以下のＰＣＲプライマーを使用して増幅した。
ｏｒｆ４−Ｌ（順方向）
ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＣＣＴＴＣＴＴＣＡＡＡＡＣＣ
ｏｒｆ４−Ｌ（順方向）
ＣＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＴＴＧＧＣＴＧＣＧＣＣＴＴＣ。
【００４６】  増幅されたＤＮＡフラグメントを、Ｃ末端Ｈｉｓタグ化融合物として、発現のためにベクターｐＥＴ２１ｂ＋中にクローン化した。ｐＥＴ２１ｂ＋ｏｒｆ４−ＬＰＳＳを含むＥ．ｃｏｌｉの対数期培養物を、１．０ｍＭのＩＰＴＧを用いて、３時間３０℃にて誘導し、８０００ｇで１０分間遠心分離することによって収集し、そしてＰＢＳ中に再懸濁した。懸濁物を、氷上で音波破砕し、そしてＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４を、最終濃度０．６％（ｖ／ｖ）まで添加した。この物質を、氷上で２０分間インキュベートし、ついで、相分離（高い程度の曇りによって示される）が生じるまで、３７℃で加温した。２０℃で１０，０００ｇでの１０分間の遠心分離後、上の水相を捨て、そして細菌のペレットを破壊することなく、下の界面活性剤相を収集した。この界面活性剤相に対して、１３容量の２０ｍＭヒスチジン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、３０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ５．８）を添加した。これを、４℃で１０分間遠心分離し、そしてこの上清を、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して、４℃で３０分間、バッチ式（ｂａｔｃｈｗｉｓｅ）で合わせた。この混合物を遠心分離し、この上清を保持させ、そしてこの樹脂を、２０ｍＭヒスチジン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、３０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ５．８）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．３％（ｖ／ｖ）で洗浄し、そして同じ緩衝液中において１Ｍ  ＮａＣｌで溶出した。Ｏｒｆ４リポタンパク質の大部分が、結合後に得られた上清において見出された。最終的な精製を、Ｈｉ−ＴｒａｐＴＭ  Ｑ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でのクロマトフラフィーによって達成した。結合上清を、０．１Ｍ  ＨＣｌの添加によってｐＨ７．０に調整し、そして５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化したＨｉ−ＴｒａｐＴＭ  Ｑカラムに適用した。このカラムを、５．０ｍｌの平衡緩衝液で洗浄し、そして１０ｍＭから１ＭまでのＮａＣｌ勾配を適用した。電気泳動的に異なる２つの形態のタンパク質が溶出された。一方は、洗浄液中であり、そして他方は、１５０ｍＭ  ＮａＣｌと３００ｍＭ  ＮａＣｌとの間のＮａＣｌ勾配中である。洗浄液中に得られたタンパク質を、マウスの免疫のために使用した。この形態のタンパク質はおそらく、完全にプロセスされた脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）分子を表す。
【００４７】  ３１ｋＤａの精製リポタンパク質が、図３において見出され得る。ＯＲＦ４は、１以上の他の配列番号１〜８３７６と組合せるのに適切であり得る。
【００４８】  （実施例５−コンピューター予測）
ＯＲＦ２、５、６ａ、７、９、１３ａ、１５、２２、２３、２７、２８、３２、６５、７２、７３、７６、７９、８９、１０５、１０６−１、１３２、１３７、１３８、１４３、および１４７（ＷＯ９９／２４５７８において開示される）のコンピューター分析を実施した。図４〜２８は、これらの各ＯＲＦに関する、親水性プロット（上段）、抗原性指数プロット（中段）、およびＡＭＰＨＩ分析（下段）を示す。ＡＭＰＨＩプログラムを使用して、Ｔ細胞エピトープを推定した［Ｇａｏら（１９８９）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３００７；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９６）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒ  １２：５９３；Ｑｕａｋｙｉら（１９９２）Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、補遺１１：９］。ＡＭＰＨＩプログラムは、ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（１２２８  Ｓｏｕｔｈ  Ｐａｒｋ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５３７１５  ＵＳＡ）のＰｒｏｔｅａｎソフトウェアパッケージで利用可能である。
【００４９】  これらの各ＯＲＦを、１以上の他の配列番号１〜８３７６と組合せ得る。
【００５０】  （実施例６−四価混合物）
タンパク質９１９（ＷＯ９９／５７２８０）、２２５（ＷＯ９９／５７２８０）、ＯＲＦ４（ＷＯ９９／２４５７８、実施例２６）、およびＯＲＦ４０（ＷＯ９９／３６５４４、実施例１）の混合物を生成し、そしてＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳによってアッセイした。１３試験菌株に対するＥＬＩＳＡ力価は、以下の通りであった。
【００５１】
【表９】
0005622344.tif 000059
ＦＡＣＳの結果を、図３３に示す。この四価混合物が、使用された特定のｍｅｍＢ菌株とは無関係に、優れた結果を与えることは明らかである。さらに、菌株２９９６中で、この混合物に対して惹起された抗血清は、希釈率１：２０４８まで殺菌性である。
【００５２】  （実施例７−五価混合物）
タンパク質ＯＲＦ４−Ｌ（脂質化タンパク質、上記実施例４を参照のこと）、ＯＲＦ３７（ＷＯ９９／２４５７８、実施例１）、ＯＲＦ４０（ＷＯ９９／３６５４４、実施例１）、５０２（ＷＯ９９／５７２８０、６８７〜６９０頁）、および８（ＷＯ９９／５７２８０、１６５〜１６７頁）の混合物を生成した。１３試験菌株に対するＥＬＩＳＡ力価は、以下の通りであった。
【００５３】
【表１０】
0005622344.tif 000060
ＦＡＣＳの結果を、図３４に示す。この五価混合物が、使用された特定のｍｅｍＢ菌株とは無関係に、優れた結果を与えることは明らかである。さらに、菌株２９９６中で、この混合物に対して惹起された抗血清は、静菌性である。
【００５４】  （実施例８−三価混合物）
タンパク質ＯＲＦ１（例えば、ＷＯ９９／２４５７８の実施例７７；ＷＯ９９／５５８７３もまたを参照のこと）、「２８７」（例えば、ＷＯ９９／５７２８０の図２１；その中の配列番号３１０３〜３１０８もまたを参照のこと）、および「９１９」（例えば、ＷＯ９９／５７２８０の図２３およびその中の配列番号３０６９〜３０７４）を組合せ、そしてＡｌ（ＯＨ）3でアジュバント処理（ａｄｊｕｖａｎｔ）した。このタンパク質は、ＭｅｍＢの菌株２９９６由来である。
【００５５】  この混合物をまた、ＭｅｎＣ多糖結合抗原［例えば、Ｃｏｓｔａｎｔｉｎら（１９９２）Ｖａｃｃｉｎｅ  １０：６９１−６９８］と組合せた。ＯＭＶをコントロールとして使用した。
【００５６】  この混合物を、相同な菌株に対する殺菌アッセイに使用し、そしてまた異種ＭｅｍＢ菌株に対する殺菌アッセイにも使用した。力価は、以下の通りであった。
【００５７】
【表１１】
0005622344.tif 000061
（実施例９−タンパク質２８７、９１９、および９５３）
タンパク質２８７、９１９、および９５３は、ＷＯ９９／５７２８０に開示される。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂの菌株２９９６由来のこれらのタンパク質を発現させ、そして単独または組合せにおいて、菌株２９９６に対する殺菌アッセイにおいて試験した。２９９６由来のＯＭＶを、陽性コントロールとして使用した。
【００５８】
【表１２】
0005622344.tif 000062
図３５は、個々の抗原および４つの組合せに対するＦＡＣＳデータを示す。
【００５９】  抗原混合物が、単離物における抗原よりも有効であること、そして特に、９１９＋９５３の組合せが、驚くべき程優れた結果を与えることが明らかである。
【００６０】  ２９９６由来の個々の抗原および組合せをまた、異なる血清型Ａ、ＢおよびＣの菌株に対して試験した（すなわち、異種チャレンジ）。殺菌力価は、以下の通りであった。
【００６１】
【表１３】
0005622344.tif 000063
抗原混合物が、交差菌株活性を付与する際に有用であることが明らかである。
【００６２】  第２の実験のセットでは、個々の抗原についての力価は以下の通りであった。
【００６３】
【表１４】
0005622344.tif 000064
本実施例において使用された３つのタンパク質を、以下の形態で発現させ、そして使用した：
（１）タンパク質２８７を、ＧＳＴ融合物としてＥ．ｃｏｌｉ中で発現させた；
（２）タンパク質９１９を、そのリーダーペプチドを伴なわず、その成熟Ｎ末端システインを伴なわず、そしていかなる融合パートナー（「９１９−ｕｎｔａｇ」）をも伴なわずに、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させた；および
（３）タンパク質９５３を、ヒスチジンタグを使用して発現させた。
【００６４】  これらの免疫を、フロイントアジュバントと共に投与した−最初にＣＦＡを含み、そして最後の２つはＩＦＡを含んだ。
【００６５】  （実施例１０−さらなる多価の組合せ）
さらなる抗原の組合せを、ＣＤ１マウスにおいて試験した。
【００６６】
【表１５】
0005622344.tif 000065
*：「ｈｉｓ」は、ヒスチジンタグ化タンパク質での発現および免疫を示す；
「ＯＲＦ４−Ｌ」は、ＯＲＦ４の脂質化形態である；
「ＧＳＴ」は、ＧＳＴ融合タンパク質での発現および免疫を示す；
「９１９−ｕｎｔａｇ」は、実施例９に規定される通りである；
「ＭｅｎＣ  ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ」は、実施例８に記載される、ＭｅｎＣ複合糖質である。
【００６７】  さらなる抗原の組合せを、モルモットで試験した。
【００６８】
【表１６】
0005622344.tif 000066
明らかに、組合せは、優れた免疫学的結果を与える。
【００６９】  （実施例１１−ＮｓｐＡ組み合わせ）
ＮｓｐＡタンパク質は、ＷＯ９６／２９４１２において開示され、そして本明細書中に配列番号４００８〜４０３３として表される。このタンパク質の学術文献の開示［Ｍａｒｔｉｎら（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５  １１７３−１１８３］は、このタンパク質が、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ菌株間で高度に保存されること（２５０の髄膜炎菌Ａ、Ｂ、およびＣ菌株と抗ＮｓｐＡ抗体との交差反応性は９９％である）、そしてまた生細菌での致死的なチャレンジに対する効率的な防御を報告した。ミョウバン上に吸着されたＮｓｐＡは、ウサギおよびサルにおいて血清髄膜炎殺菌抗体応答を惹起するとの報告もある［Ｍａｒｔｉｎら（１９９８）Ａｂｓｔｒａｃｔ  ｏｆ  １１ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ．ｐａｇｅ  １９８］。これらのデータに基づいて、ｒＮｓｐＡ（組換えＮｓｐＡ）は、全血清群により引き起こされる髄膜炎菌疾患の予防のためのワクチンとして開発されつつある。
【００７０】  しかし、配列保存に関わらず、驚くべきことに、ｒＮｓｐＡ細胞表面エピトープが、以下で試験した血清群Ｂ菌株の６５％でしか検出されないこと、および抗ＮｓｐＡ殺菌活性に対する感受性もまた、Ｍａｒｔｉｎらにより報告されたより低いことが発見された。これらの結果は、Ｍａｒｔｉｎらと対照的であり、そしてｒＮｓｐＡに基づく髄膜炎菌Ｂワクチンが、有効であるために、さらなる抗原で補充される必要があることを示唆する。
【００７１】  本実施例で試験したＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌株を、３０年を超える期間にわたって異国に居住している患者から単離した（７２頁の表［表１８］を参照のこと）。これらの菌株を、多遺伝子座イソ酵素型決定（ｔｙｐｉｎｇ）［Ｓｅｉｌｅｒら（１９９６）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９：８４１−８５６］および／または多遺伝子座配列決定（ｔｙｐｉｎｇ）［Ｍａｉｄｅｎら（１９９８）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９５：３１４０−４５］により定義されるように、広範に分岐する「クローン」群の代表であるように選択した。菌株Ｍ７（菌株ＮＭＢより誘導される）は、被嚢多糖生合成をブロックするトランスポゾン挿入を含む［Ｓｔｅｐｈｅｎｓら（１９９１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：４０９７−４１０２］が、しかし他の菌株は、全て、被嚢を有する。
【００７２】  Ｍａｒｔｉｎら（１９９７）におけるヌクレオチド配列に基づいて、ＰＣＲプライマーを設計し、そして菌株８０４７由来のＮｓｐＡ遺伝子を増幅した。プロモーター領域を含む配列をｐＳＫ＋プラスミドにクローニングした（ｒＮｓｐＡ）。シグナル配列の一部がポリヒスチジンタグと置換されているタンパク質をコードするプラスミドｐＴｒｃ．ＮｓｐＡ．１もまた使用した。両方のプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させ、そしてタンパク質を精製した。Ｅ．ｃｏｌｉでは、ｒＮｓｐＡは、外膜と結合しているよりもむしろ、分泌されている。このタンパク質を、５５％ｗ／ｖ硫酸アンモニウムでの沈降により培養培地から部分的に精製し、そしてウェスタンブロットにより確認された１８．６ｋＤａの見かけ分子量を有した。
【００７３】  ２つの形態のＮｓｐＡ（ｒＮｓｐＡおよび変性ＨｉｓタグＮｓｐＡ）を、６週齢雌ＣＤ−１マウスに注入し、抗血清を惹起させた。これらがＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌株Ｂの表面に結合する能力を、間接的蛍光アッセイのフローサイトメトリー検出を用いて決定した［Ｇｒａｎｏｆｆら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：５０２８−３６］。菌株ＮＭＢおよび菌株Ｍ７（ＮＭＢの無被嚢変異体）についての結果を図３０に示す。予期されるように、抗群Ｂ多糖ｍＡｂ  ＳＥＡＭ−３［Ｇｒａｎｏｆｆら］は、有被嚢菌株にのみ結合するが、一方、陽性抗Ｐ１．２（ＰｏｒＡ）コントロールｍＡｂは、両方の菌株に結合する。ｒＮｓｐＡに対して惹起された抗血清は、両方の菌株に結合し得る。しかし、ＨｉｓタグＮｓｐＡに対する抗血清は、陰性結果を与えた。これらの抗血清はまた、菌株８０４７、菌株ＣＵ３８５および菌株Ｍ９８６についても陰性であった（図３１Ａ）が、しかしウェスタンブロットにより、これらの抗血清は、陽性結果を与えた。
【００７４】  これらのデータは、ＨｉｓタグＮｓｐＡを用いて調製された抗体は、インビボで細胞表面上で見出されるように、変性ＮｓｐＡに存在するエピトープを認識するが、しかしネイティブなＮｓｐＡは認識しないことを示唆する。対照的に、ｒＮｓｐＡに対して調製された抗体は、コンフォメーショナルなＮｓｐＡエピトープを認識するようである。
【００７５】  フローサイトメトリーアッセイを、７２頁の表［表１８］に示される菌株に適用した。図３１Ａは、ｒＮｓｐＡに対して惹起されたマウス抗体が菌株８０４７（ｎｓｐＡ遺伝子がクローニングされた菌株）および菌株ＣＵ３８５の表面に結合するが、Ｍ９８６には結合しないことを示す。図３１Ｂは、菌株ＢＺ２３２、ＭＣ５８、ＮＧ３／８８およびＮＧＰ１６５について同様の陰性結果を示す。しかし、これらの陰性の場合の全てにおいて、抗被嚢ｍＡｂコントロールは陽性であった。
【００７６】  ７２頁の表［表１８］は、フローサイトメトリーの結果を要約する。ＮｓｐＡは、試験した全てのインタクトなＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌株の表面に到達可能であると報告されている［Ｍａｒｔｉｎら（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １８５  １１７３−１１８３；Ｐｌａｎｔｅら（１９９９）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：２８５５−６１］が、１７の試験した菌株のうち１１（６５％）のみが抗ｒＮｓｐＡ血清と反応した。所定の菌株における細胞表面発現および分類（血清型、サブタイプ、または電気泳動タイプによる）の間、またはこれらと単離の年もしくは国との間に明らかな関係はなかった。
【００７７】  抗ｒＮｓｐＡ血清との反応性の差異を説明しようとして、６つの陰性菌株の５つ（ＢＸ２３２、ＮＧ３／８８、ＮＧＰ１６５、Ｍ１３６、およびＭ９８６）および陽性菌株の３っ（８０４７、ＣＵ３８５、およびＮＧ６／８８）由来のｎｓｐＡ遺伝子を配列決定した。６番目の陰性菌株（ＭＣ５８）の配列は、全ゲノム配列から既に入手可能であった。
【００７８】  全１０菌株のｎｓｐＡ配列は高度に保存され、Ｍａｒｔｉｎらのプロトタイプ配列からせいぜい５ヌクレオチドの変動であった。最も変動していたタンパク質は、３アミノ酸のみの差異であった（図２９を参照のこと）。１つの例外があるが、アミノ酸改変体の全てが、このタンパク質の個々のセグメントに同じそれぞれの残基を含んだ。これらは、Ｃ末端の５０残基中に、成熟タンパク質に存在しないシグナルペプチド、および２つの短いセグメントを含む。これらの差異は、陽性であった菌株および陰性であった菌株において同一の改変体配列の例があるので、抗血清結果を説明しない（Ｍ１３６および８０４７；ＮＧＰ１６５およびＮＧ６／８８；ＭＣ５８およびＣＵ３８５を比較する）。
【００７９】  遺伝子の欠失も多型も抗血清の結果を説明しなかったので、５つの菌株（８０４７、ＣＵ３８５およびＮＧ６／８８−全て抗ｒＮｓｐＡについて陽性である；Ｍ９８６およびＭ１３６−ともに陰性である）の外膜中のＮｓｐＡタンパク質の量を試験した。細菌細胞ペレットをサルコシン酸ラウリルで抽出し、そして不溶性外膜画分を分析した。１８．６ｋＤａバンドが５つの菌株全部について見られ、そしてこれは、ウェスタンブロットにより抗ＨｉｓタグＮｓｐＡと交差反応性であった。従って、ｎｓｐＡ発現における菌株の差異もまた、結果を説明することができなかった。
【００８０】  抗ｒＮｓｐＡが細菌細胞表面に結合する能力は、存在する多糖被嚢の量によって影響され得た。従って、１７試験菌株により生成された被嚢多糖の量をインヒビションＥＬＩＳＡによって評価した。
【００８１】  被嚢多糖の抽出物を、Ｃｏｒｎら［Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（１９９３）１６７：３５６−６４］により記載の方法に基づいて調製した。個々の細菌クローンを、７ｍｌのＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス中でＯＤ620が０．５〜０．７になるまで増殖させた。細菌を５０００ｇで１５分間の遠心分離によって採集し、０．６ｍｌの１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８．０中で洗浄し、次いで１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．６ｍｌの同じ緩衝液中で再懸濁し、そして３７℃で１時間インキュベートした。細胞を１０，０００ｇで１分間ペレット化し、そして上清中に放出された髄膜炎菌Ｂ多糖抗原の相対量を、Ａｚｍｉら［Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９５）６３：１９０６−１３］により記載のように行ったインヒビションＥＬＩＳＡによって決定した。ＥＬＩＳＡ中の固相抗原は、アビジンコーティングマイクロタイタープレートに吸着された髄膜炎菌Ｂ多糖−ＡＤＨ−ビオチン［Ｇｒａｎｏｆｆら］であった。髄膜炎菌Ｂ多糖反応性ヒトパラプロチンＬＩＰ［Ａｚｍｉら］を、一次抗体として使用した（０．２μｇ／ｍｌ）。インヒビターの非存在下で、この抗体濃度は、基質と３０分インキュベートした後に約０．７〜１．０のＯＤを与えるのに十分であった［Ａｚｍｉら］。上清に放出された多糖の力価を、抗体結合５０％阻害を生じた上清の希釈を決定することにより測定した。本アッセイ中のコントロールは、菌株Ｍ７（これはいかなる被嚢多糖も生成しない）から調製したＥＤＴＡ抽出物、および精製された髄膜炎菌Ｂ多糖を含んだ。被嚢多糖のすべてがＥＤＴＡ処理によって放出されたことを確実にするために、同じインヒビションＥＬＩＳＡを、被嚢抽出物と同じ緩衝液および容積に再懸濁した細胞ペレットを用いて実施した。細胞ペレットからの観察可能な阻害活性は、被嚢抽出物で見られる活性の０％と１０％との間であった。後の方の高い方の百分率は、最も多い量の被嚢を生成する菌株の細胞ペレットから生じた。
【００８２】  各菌株についての結果を７２頁の表［表１８］に示す。平均して、６つの陰性抗ｒＮｓｐＡ菌株が、１１の陽性菌株よりも３倍多い被嚢多糖を生じた（それぞれの相互幾何平均希釈は６７６対２２４、ｐ＜０．０５）。これは、抗血清を用いて得られた結果を説明し得る−おそらく、より多い量の被嚢の存在は、抗ｒＮｓｐＡ抗体がＮｓｐＡエピトープ（より低い量の被嚢を有する菌株では、到達可能である）に結合する能力を妨害し得た。
【００８３】  抗ｒＮｓｐＡ抗血清の補体依存性殺菌活性を、Ｍａｎｄｒｅｌｌら［Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（１９９５）１７２：１２７９−８９］により記載のアッセイと同様のアッセイを用いて試験した。補体供給源は、Ｂ群多糖に対する検出可能な抗被嚢抗体がなく、そして試験菌株に対する固有の殺菌活性がない、健常な成人由来のヒト血清であった。血清殺菌力価を、０時間でのコントロールＣＦＵ／ｍｌに比較して、反応混合物中の細菌の６０分インキュベーション後にＣＦＵ／ｍｌの５０％減少を生じる血清希釈として定義した。
【００８４】  代表的には、陰性コントロール抗体とインキュベートした細菌は、６０分のインキュベーションの間にＣＦＵ／ｍｌの１５０〜２００％増加を示した。陽性コントロール抗体［抗被嚢ＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ  ＳＥＡＭ１２、Ｇｒａｎｏｆｆら］は、全１７菌株に対して補体媒介殺菌活性を示した。対照的に、フローアッセイにより抗ｒＮｓｐＡ抗血清結合について陰性であった６つの菌株は、抵抗性であり、殺菌効果も静菌効果も示さなかった。他の１１の陽性菌株のうち１０は、補体および抗血清により殺傷された（ＳＷＺ１０７、Ｊ３５１、ＣＵ３８５、ＮＧ６／８８、ＢＺ１９８、Ｈ４４／７６、ＮＭＢ，および８０４７）か、または阻害された（Ｈ３５５およびＳ３４４６）；しかし、菌株１０００は影響を受けなかった。
【００８５】  抗ｒＮｓｐＡ抗血清が髄膜炎菌Ｂ菌血に対する受動防御を与える能力を、Ｓａｕｋｋｏｎｅｎ［Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（１９８８）１５８：２０９−２１］から採用した方法を用いて乳児ラットにおいて試験した。簡潔には、６〜７日齢のラットを無作為に養母に分配した。５〜６匹の動物の群を１００μｌのおよそ５０００ＣＦＵのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｂ群細菌で腹腔内（ＩＰ）でチャレンジした。ＮｓｐＡ表面エピトープについて陰性である１つの菌株（Ｍ９８６）および陽性菌株（８０４７）を試験した。これらはそれぞれ、乳児ラットにおいて３回継代している。投与の直前に、細菌懸濁液を、試験またはコントロール抗体の異なる希釈物と混合した（陽性コントロール：抗被嚢ｍＡｂ；陰性コントロール：抗Ｅ．ｃｏｌｉ）。チャレンジの１８時間後、血液標本を心臓から得た。アリコートをチョコレート寒天上にプレートし、そしてＣＦＵ／ｍｌを５％ＣＯ2中の３７℃での一晩のインキュベーション後に決定した。
【００８６】  種々の同時投与した抗体の防御活性は、以下のとおりであった：
【００８７】
【表１７】
0005622344.tif 000067
観察され得るように、ラットあたり２μｇ用量の陽性抗被嚢コントロールは、両菌株に対して防御的であった。１：５または１：２５希釈の抗ｒＮｓｐＡ抗血清は、菌株８０４７によって引き起こされた菌血症に対して防御した。しかし、いずれの希釈度も、Ｍ９８６菌血症の防御において効果的でなかった。
【００８８】  従って、Ｍａｒｔｉｎらの肯定的結論にもかかわらず、ＮｓｐＡは、髄膜炎菌Ｂ感染の防御において効果的でないようである。約１／３の菌株が、インビトロで増殖させた場合にＮｓｐＡエピトープの細胞表面発現を減少し、抗ＮｓｐＡ誘導性の補体媒介性の溶菌に耐性であり、そして受動抗血清免疫に耐性である。これらの菌株は、大量の被嚢多糖を産生し、従って、最も高いビルレンスを有することが予測された。従って、ＮｓｐＡのみを含有するワクチンが髄膜炎菌Ｂに対する広範な防御免疫を付与する能力は疑われるべきである。
【００８９】  従って、ＮｓｐＡ［配列番号４００８〜４０３３；図２９］を含む組成物は、有利には、さらなる抗原を含む。従って、本発明の好ましい局面は、ＮｓｐＡタンパク質の１以上のさらなるＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原との組み合わせである。
【００９０】  （実施例１２−ＮｓｐＡフラグメント）
ＮｓｐＡの二次構造のモデルを図３２に示す。これは、８つの膜貫通β鎖および４つの表面露出連結ループを含む。これは、多くのβバレルポーリンに特徴的な、ＮｓｐＡの疎水性アミノ酸および親水性アミノ酸が交互するパターンにあてはまる［Ｗｅｉｓｓら（１９９０）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｓ  ２６７：２６８−２７２］。
【００９１】  このモデルの灰色の影を付けた領域は、非縮重性ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳのＢＬＡＳＴ検索において同定されたＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎ．ｆｌａｖｉｕｓ、Ｎ．ｓｉｃｃａおよびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来の混濁（ｏｐａｃｉｔｙ）タンパク質（Ｏｐａ）のコードアミノ酸配列に対して＞４０％の同一性および＞７０％の類似性であるセグメントを示す。この交互する配列は予測された両親媒性β鎖であり；縦方向のセグメントは膜貫通セグメントに対応し；図の上部は、ループ１〜４と標識した、表面露出セグメントに対応する。
【００９２】  Ｍａｒｔｉｎらに従って、ＮｓｐＡの推定アミノ酸配列と他のタンパク質の推定アミノ酸配列との間の唯一の有意な相同性は、このタンパク質のＣ末端近辺の２つの小さいセグメント（約２０アミノ酸）における、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ混濁タンパク質（Ｏｐａ）ファミリーとの弱い相同性である。しかし、ＧｅｎＢａｎｋでのＮｓｐＡのＮ末端およびＣ末端の別々の比較は、ＮｓｐＡとＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎ．ｆｌａｖｉｕｓ、Ｎ．ｓｉｃｃａおよびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のＯｐａタンパク質との間の、高い程度の相同性（＞４０％の同一性および＞７０％の類似性）を明らかにする。これらのＯｐａタンパク質は、８つの膜貫通セグメントおよびポーリンのβバレル形態に類似する膜中のβバレル形態を有する、内在型の膜タンパク質と考えられる［Ｍｅｒｋｅｒら（１９９７）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２３：２８１−２９３］。界面活性剤不溶性の膜調製物中のＮｓｐＡの存在は、ＮｓｐＡが、外側の膜に位置することを示し、これは、このモデルに示されたＯｐａ様膜形態と一致する。さらに、Ｏｐａタンパク質のセグメントに最も相同性のＮｓｐＡセグメントは、図３２の影を付けた領域に示される推定膜貫通セグメントである。
【００９３】  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａの混濁タンパク質は、特定の条件下で、防御抗体を誘発する。しかし、被嚢性細菌中の混濁タンパク質の抗体接近性の制限、露出ループセグメントにおけるアミノ酸配列の可変性、および臨床感染の間のタンパク質発現の時期的変動の問題は、一貫して防御抗体を誘発するＯｐａの能力を制限する［Ｍａｌｏｍｙら（１９９８）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７２：１２７９−８９］。対照的に、図３２におけるＮｓｐＡの表面に露出されたループにおいて、ほとんどまたは全くアミノ酸の変動はないようである。しかし、たとえＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの２つの種におけるそれぞれのアミノ酸配列が９２％同一であるにもかかわらず、試験した全ての髄膜炎菌株と反応した抗Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  ＮｓｐＡモノクローナル抗体のパネルは、限定された数のＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌株としか反応しないことが、近年報告された。髄膜炎菌株および淋菌株のそれぞれのＮｓｐＡ配列を比較する場合（図２９）、それぞれのアミノ酸の差異の全てが、疎水性または電荷に変化を生じ、そしてこれらは、推定される表面に露出される連結ループに位置される（図３２）。この知見は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに高度に保存されている、ＮｓｐＡにおける連結ループが、ネイティブＮｓｐＡに結合する抗体の重要なエピトープであり得ることを示唆する。従って、この分子のこれらのセグメントは、防御抗体との相互作用二間して最も関心深いものであるようである。しかし、ＮｓｐＡの推定表面ループは、例えば、ＰｏｒＡおよびＯｐｃの高度に免疫原性の外部ループ（２４〜４５アミノ酸）と比較して、比較的小さい（１０〜１４アミノ酸）。これらのより短いループの長さは、特に、豊富な被嚢多糖の存在下で、血清抗体との結合相互作用のためのＮｓｐＡ表面エピトープの接近性を制限し得る。
【００９４】  従って、本発明は、図３２における細胞表面上に露出されているＮｓｐＡのフラグメント、すなわち、ＳＳＳＬＧＳＡＫＧ、ＮＹＫＡＰＳＴＤＦＫＬＹ、ＮＲＡＳＶＤＬＧＧＳＤＳＦＳＱＴおよびＮＹＩＧＫＶＮＴＶＫＮＶＲＳＧを提供し、そしてＮｓｐＡの対立遺伝子改変体由来の対応するフラグメントもまた提供する。さらに、本発明は、これらのフラグメントの部分配列を提供し、これらの部分配列は、これらのフラグメント由来の７以上連続するアミノ酸を含む。本発明はさらに、これらのフラグメントを含むタンパク質を提供する。これらのフラグメントをコードする核酸もまた、提供される。
【００９５】  これらのＮｓｐＡフラグメント、これらのフラグメントを含むタンパク質、および核酸は、本発明の組成物において、特に、全長ＮｓｐＡの代用物として使用され得る。さらなる局面において、これらのフラグメント、タンパク質および核酸は、単離された産物として使用され得、つまり、これらは、必ずしも他の生物学的分子と組み合わせて使用される必要はない。
【００９６】  本発明は、実施例のみによって記載され、そして本発明の範囲および精神内に存在する限り改変が成され得ることが理解される。
【００９７】
【表１８】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ＯＲＦ６、７、１３、６５−１、７２、７３−１、１０５−１、１３７−１、１４３−１、および１４７−１の発現のためのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。左側のレーンは、分子量マーカーを示す（セットＭ１）。
【図２】  図２は、（Ａ）ＯＲＦ９についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果、（Ｂ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜粒子調製物に対するウエスタンブロットにおけるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ免疫反応性バンドの位置、（ｃ）ＦＡＣＳ分析を示す。
【図３】  図３は、ＯＲＦ２−１、５−１、２２−１、１３２−１、および４の発現についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。左側のレーンは、分子量マーカーを示す（セットＭ１）。
【図４】  図４は、ＯＲＦ２についての親水性プロット（上段）、抗原性指数（中段）、およびＡＭＰＨＩ領域（下段）を示す。
【図５】  図５は、ＯＲＦ５についての親水性プロット（上段）、抗原性指数（中段）、およびＡＭＰＨＩ領域（下段）を示す。
【図６】  図６は、ＯＲＦ６についての親水性プロット（上段）、抗原性指数（中段）、およびＡＭＰＨＩ領域（下段）を示す。
【図７】  図７は、ＯＲＦ７についての親水性プロット（上段）、抗原性指数（中段）、およびＡＭＰＨＩ領域（下段）を示す。
【図８】  図８は、ＯＲＦ９についての親水性プロット（上段）、抗原性指数（中段）、およびＡＭＰＨＩ領域（卞段）を示す。
【図９】  図９は、ＯＲＦ１３ａについての親水性プロット（上段）、抗原性指数（中段）、およびＡＭＰＨＩ領域（下段）を示す。
【図１０】  図１０は、ＯＲＦ１５についての親水性プロット（上段）、抗原性指数（中段）、およびＡＭＰＨＩ領域（下段）を示す。
【図１１】  図１１は、ＯＲＦ２２についての親水性プロット（上段）、抗原性指数（中段）、およびＡＭＰＨＩ領域（下段）を示す。
【図１２】  図１２は、ＯＲＦ２３についての親水性プロット（上段）、抗原性指数（中段）、およびＡＭＰＨＩ領域（下段）を示す。
【図１３】  図１３は、ＯＲＦ２７についての親水性プロット（上段）、抗原性指数（中段）、およびＡＭＰＨＩ領域（下段）を示す。
【図１４】  図１４は、ＯＲＦ２８についての親水性プロット（上段）、抗原性指数（中段）、およびＡＭＰＨＩ領域（下段）を示す。
【図１５】  図１５は、ＯＲＦ３２についての親水性プロット（上段）、抗原性指数（中段）、およびＡＭＰＨＩ領域（下段）を示す。
【図１６】  図１６は、ＯＲＦ６５についての親水性プロット（上段）、抗原性指数（中段）、およびＡＭＰＨＩ領域（下段）を示す。
【図１７】  図１７は、ＯＲＦ７２についての親水性プロット（上段）、抗原性指数（中段）、およびＡＭＰＨＩ領域（下段）を示す。
【図１８】  図１８は、ＯＲＦ７３についての親水性プロット（上段）、抗原性指数（中段）、およびＡＭＰＨＩ領域（下段）を示す。
【図１９】  図１９は、ＯＲＦ７６についての親水性プロット（上段）、抗原性指数（中段）、およびＡＭＰＨＩ領域（下段）を示す。
【図２０】  図２０は、ＯＲＦ７９についての親水性プロット（上段）、抗原性指数（中段）、およびＡＭＰＨＩ領域（下段）を示す。
【図２１】  図２１は、ＯＲＦ８９についての親水性プロット（上段）、抗原性指数（中段）、およびＡＭＰＨＩ領域（下段）を示す。
【図２２】  図２２は、ＯＲＦ１０５についての親水性プロット（上段）、抗原性指数（中段）、およびＡＭＰＨＩ領域（下段）を示す。
【図２３】  図２３は、ＯＲＦ１０６−１についての親水性プロット（上段）、抗原性指数（中段）、およびＡＭＰＨＩ領域（下段）を示す。
【図２４】  図２４は、ＯＲＦ１３２についての親水性プロット（上段）、抗原性指数（中段）、およびＡＭＰＨＩ領域（下段）を示す。
【図２５】  図２５は、ＯＲＦ１３７についての親水性プロット（上段）、抗原性指数（中段）、およびＡＭＰＨＩ領域（下段）を示す。
【図２６】  図２６は、ＯＲＦ１３８についての親水性プロット（上段）、抗原性指数（中段）、およびＡＭＰＨＩ領域（下段）を示す。
【図２７】  図２７は、ＯＲＦ１４３についての親水性プロット（上段）、抗原性指数（中段）、およびＡＭＰＨＩ領域（下段）を示す。
【図２８】  図２８は、ＯＲＦ１４７についての親水性プロット（上段）、抗原性指数（中段）、およびＡＭＰＨＩ領域（下段）を示す。
【図２９】  図２９は、髄膜炎菌Ｂの種々の菌株からのＮｓｐＡの配列可変性を示す。これらの配列は、ＷＯ９６／２９４１２のＮｓｐＡに対する代替として使用され得る（配列番号４００８−４０３３）。
【図３０】  図３０は、間接的蛍光フローサイトメトリーによるポリクローナル抗ｒＮｓｐＡの被嚢化ｍｅｎＢ菌株および非被嚢化ｍｅｎＢ菌株への結合を示す。
【図３１Ａ】  図３１は、被嚢化された菌株８０４７、ＣＵ３８５およびＭ９８６（３１Ａ）、ならびに非被嚢化菌株ＢＺ２３２、ＭＣ５８、ＮＧ３／８８およびＮＧＢ１６５（３１Ｂ）についての同様のデータを示す。
【図３１Ｂ】  図３１は、被嚢化された菌株８０４７、ＣＵ３８５およびＭ９８６（３１Ａ）、ならびに非被嚢化菌株ＢＺ２３２、ＭＣ５８、ＮＧ３／８８およびＮＧＢ１６５（３１Ｂ）についての同様のデータを示す。
【図３２】  図３２は、ＮｓｐＡの二次構造のモデルを示す。
【図３３Ａ】  図３３は、４価の混合物を使用する非被嚢化菌株Ｍ７（３７Ａ）およびエタノール処置（カプセルを破壊するため）菌株２９９６、Ｎ４４７７６、ＭＣ５８、１０００、ＢＺ２３２、ＢＺ１３３、ＮＧ６／８８、ＢＺ１９８、ＮＧ３／８８、２９７−０、ＢＺ１４７、およびＢＺ１６９（３７Ｂ）のＦＡＣＳ分析を示す。
【図３３Ｂ】  図３３は、４価の混合物を使用する非被嚢化菌株Ｍ７（３７Ａ）およびエタノール処置（カプセルを破壊するため）菌株２９９６、Ｎ４４７７６、ＭＣ５８、１０００、ＢＺ２３２、ＢＺ１３３、ＮＧ６／８８、ＢＺ１９８、ＮＧ３／８８、２９７−０、ＢＺ１４７、およびＢＺ１６９（３７Ｂ）のＦＡＣＳ分析を示す。
【図３４】  図３４は、１：４００（３４Ａ）、１：２００（３４Ｂ）、および１：１００（３４Ｃ）希釈で、５価の混合物を使用してのＭ７菌株のＦＡＣＳ分析を示す。
【図３５】  図３５は、個々の抗原および４つの組合せに対するＦＡＣＳデータを示す。
【図１】
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【図１−１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図３０】
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【図３０−１】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ａ−１】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｂ−１】
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【図３１Ｂ−２】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｂ−１】
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【図３３Ｂ−２】
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【図３３Ｂ−３】
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【図３３Ｂ−４】
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【図３３Ｂ−５】
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【図３３Ｂ−６】
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【図３３Ｂ−７】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３５−１】
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