(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物を捕集したメンブレンフィルタを微生物の捕集面が対面する状態で平面板に光透過性を有する固着剤で固着させ、前記固着剤を溶解させずに前記メンブレンフィルタのみを溶解剤で溶解させる平坦化工程を具備し、
前記平面板上から前記微生物を検出することを特徴とする微生物検出方法。
【請求項２】
前記メンブレンフィルタは、ポリカーボネート製であることを特徴とする請求項１に記載の微生物検出方法。
【請求項３】
前記メンブレンフィルタが下を向く状態で前記平面板ごと前記溶解剤に浸すことを特徴とする請求項１または２に記載の微生物検出方法。
【請求項４】
前記溶解剤は、クロロホルムであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の微生物検出方法。
【請求項５】
前記固着剤は、寒天であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の微生物検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＦＩＳＨ法（fluorescence in situ hybridization）とは、蛍光標識したプローブを、標的微生物のみに反応させることで、標的微生物のみを蛍光染色する手法であり、自然界の微生物研究の多くに活用されている。しかし、ＦＩＳＨ法において標的微生物の捕集に用いられるメンブレンフィルタ、特にポリカーボネートフィルタは、非常に薄く、波打ちやすい。そのため、メンブレンフィルタは、標本の調整中に平坦性が失われてしまうことがある。そして、ステージの移動が自動化された顕微鏡では、メンブレンフィルタの平坦性が失われると、視野の移動ごとにメンブレンフィルタの起伏に応じてフォーカスを合わせなければならないので、観察に余分な時間がかかる。
そのため、このような課題を解決する発明として、下記特許文献１には、平坦な標本を作製することができる微生物検出方法が開示されている。この微生物検出方法は、平坦な基材上に粘着層が積層された捕集シートで微生物を捕集し、当該捕集シート上の微生物を観察する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２００４／０２２７７４号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところで、上記特許文献１では、平坦な基材上に粘着層が積層された捕集シートで標的微生物を捕集し、顕微鏡で捕集シート上の微生物を観察する。しかしながら、上記特許文献１では、試料中の微生物をもれなく採取するには、試料中の全ての微生物を粘着層に付着させなければならないが、全ての微生物を粘着層に付着させることは極めて困難である。そして、上記特許文献１では、微生物をもれなく捕集することが困難であるので、試料中に含まれる微生物を定量することがむずかしい。
【０００５】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであり、微生物をもれなく採取するとともに微生物が含まれる標本を平坦化することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明では、微生物検出方法に係る第１の解決手段として、ろ過によりメンブレンフィルタ上に試料中の微生物を捕集し、当該メンブレンフィルタから微生物を検出する微生物検出方法であって、微生物を捕集したメンブレンフィルタを微生物の捕集面が対面する状態で平面板に固着剤で固着させ、前記固着剤を溶解させずに前記メンブレンフィルタのみを溶解剤で溶解させる平坦化工程を具備するという手段を採用する。
【０００７】
本発明では、微生物検出方法に係る第２の解決手段として、上記第１の解決手段において、前記メンブレンフィルタは、ポリカーボネート製であるという手段を採用する。
【０００８】
本発明では、微生物検出方法に係る第３の解決手段として、上記第１または第２の解決手段において、前記メンブレンフィルタが下を向く状態で前記平面板ごと前記溶解剤に浸すという手段を採用する。
【０００９】
本発明では、微生物検出方法に係る第４の解決手段として、上記第１〜３のいずれかの解決手段において、前記溶解剤は、クロロホルムであるという手段を採用する。
【００１０】
本発明では、微生物検出方法に係る第５の解決手段として、上記第１〜４のいずれかの解決手段において、前記固着剤は、寒天であるという手段を採用する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、メンブレンフィルタを微生物の捕集面が対面する状態で平面板に固着剤で固着させる。そして、その後に固着剤を溶解させずにメンブレンフィルタのみを溶解剤で溶解させる。これにより、波打ちやすいメンブレンフィルタではなく、平面基板上に標本が付着するので、標本を平坦化することができる。この結果として、蛍光顕微鏡の視野の移動毎に、フォーカスを合わせる必要がないので、観察時に生じる余分な時間を低減することができる。また、本発明は、ろ過により微生物をメンブレンフィルタ上に捕集するので微生物を漏れなく採取することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の実施形態に係るレジオネラ菌検出方法の工程を示すフローチャートである。
【図２】本発明の実施形態に係るレジオネラ菌検出方法の第８の工程及び第９の工程を示す模式図である。
【図３】本発明の実施形態に係るレジオネラ菌検出方法の第９の工程の効果を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、図面を参照して、本発明の実施形態について説明する。
本実施形態に係るレジオネラ菌検出方法（微生物検出方法）は、ＦＩＳＨ法を用いて試料からレジオネラ菌を検出する方法であり、以下に説明するように第１〜第１１の工程を有するものである。また、これら第１〜第１１の工程のうち、第８の工程及び第９の工程は、本実施形態における平坦化工程を構成する。
【００１４】
レジオネラ菌検出方法について、図１を参照して、説明する。
〔第１の工程〕
まず、第１の工程において、レジオネラ菌を含む液体試料に、終濃度が４質量％になるようにパラホルムアルデヒド溶液を添加し、当該液体試料を４℃の温度の下で一晩保存することでレジオネラ菌の固定標本を作製する（ステップＳ１）。
〔第２の工程〕
上記第１の工程が終了すると、次に第２の工程において、上記液体試料をろ過装置によってろ過することで、レジオネラ菌の固定標本をメンブレンフィルタ上に捕集する（ステップＳ２）。なお、上記メンブレンフィルタは、直径が２５ｍｍの円形であり、孔径が０．２２μｍであるポリカーボネート製のフィルタである。また、このメンブレンフィルタの中心部の直径１６ｍｍの円形領域が固定標本の捕集に使用される。
〔第３の工程〕
上記第２の工程が終了すると、次に第３の工程において、上記メンブレンフィルタを９９．５質量％のエタノールに１分間入れることで脱水し、その後に常温の空気中で乾燥させる（ステップＳ３）。
【００１５】
〔第４の工程〕                          
上記第３の工程が終了すると、次に第４の工程において、上記メンブレンフィルタの全面にハイブリダイゼーションバッファを塗布する（ステップＳ４）。なお、上記ハイブリダイゼーションバッファの構成は、ＮａＣｌが０．９質量％、Ｔｒｉｓ‐Ｃｌが２０ｍＭ、formamideが３５質量％、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔが２質量％、ＳＤＳ（Sodium Dodecyl sulphate：界面活性剤）が０．０２質量％である。
【００１６】
〔第５の工程〕                          
上記第４の工程が終了すると、次に第５の工程において、上記メンブレンフィルタ上のレジオネラ菌にプローブを結合させる（ステップＳ５）。第５の工程を具体的に説明すると、まずレジオネラ菌用プローブ溶液の入った平坦な容器に上記メンブレンフィルタを入れる。そして、振とう機を使って平坦な容器を４６℃の温度下で、約２時間振とうさせる。これにより、レジオネラ菌に対するプローブの結合が促進され、時間の経過とともにレジオネラ菌とプローブとが結合する。なお、プローブとは、標的微生物であるレジオネラ菌の核酸（多くの場合においてリボソームＲＮＡ（ribosome Ribonucleic acid））に対して相補的なポリヌクレオチドに蛍光色素を共有結合したものである。
【００１７】
〔第６の工程〕
上記第５の工程が終了すると、次に第６の工程において、上記メンブレンフィルタをウォッシングバッファに浸し、メンブレンフィルタ上の未反応のプローブを洗浄する。（ステップＳ６）。
〔第７の工程〕
上記第６の工程が終了すると、次に第７の工程において、上記メンブレンフィルタを９９．５質量％のエタノールに１分間入れることでメンブレンフィルタを脱水し、その後に常温の空気中で乾燥させる（ステップＳ７）。
【００１８】
〔第８の工程（平坦化工程）〕
上記第７の工程が終了すると、次に第８の工程において、上記メンブレンフィルタをレジオネラ菌の捕集面が対面した状態で平行平面基板（平面板）上に寒天（固着剤）で固着させる（ステップＳ８）。第８の工程を図２の（ａ）を参照して具体的に説明すると、まず、レジオネラ菌の固定標本が付着したメンブレンフィルタＦｌを約４０℃の０．０５質量％の寒天溶液に浸し、その後に図２の（ａ）に示すように、当該メンブレンフィルタＦｌをレジオネラ菌の捕集面Ｃｓが平行平面基板Ｆｂの上平面と対面する状態で気泡の入らないように平行平面基板Ｆｂ上に貼り付ける。すなわち、レジオネラ菌の固定標本がメンブレンフィルタＦｌと平行平面基板Ｆｂの上平面とによって挟まれる状態となるように、メンブレンフィルタＦｌを平行平面基板Ｆｂ上に貼り付ける。そして、その後に常温の空気中で水平状態で乾燥させることで、メンブレンフィルタＦｌ及びレジオネラ菌の固定標本を平行平面基板Ｆｂに固着させる。
【００１９】
〔第９の工程（平坦化工程）〕
上記第８の工程が終了すると、次に第９の工程において、寒天を溶解させずにメンブレンフィルタＦｌのみをクロロホルム（溶解剤）で溶解させる（ステップＳ９）。第９の工程を図２の（ｂ）及び（ｃ）を参照して具体的に説明すると、まず、図２の（ｂ）に示すようなクロロホルム溶液Ｃｌの入った容器Ｖｌを準備し、メンブレンフィルタＦｌが下を向く状態で平行平面基板Ｆｂごとクロロホルム溶液Ｃｌに浸す。この際、クロロホルム溶液Ｃｌは揮発性が高いので、容器Ｖｌにはゴム栓Ｇｍをする。平行平面基板Ｆｂは、ゴム栓Ｇｍを貫通する針金Ｗｒで吊るされて、クロロホルム溶液Ｃｌに浸される。
【００２０】
そして、一定時間が経過すると、メンブレンフィルタＦｌは溶解するが、寒天は溶解しないので、捕集面Ｃｓに付着したレジオネラ菌の固定標本が寒天に覆われた状態で平行平面基板Ｆｂの表面に残る。ここで、寒天は繊維構造を有するので、クロロホルム溶液Ｃｌが繊維の隙間から内部に浸入し、クロロホルムの作用によってメンブレンフィルタＦｌのみが選択的に溶け出す。この結果として、平行平面基板Ｆｂの表面には、レジオネラ菌の固定標本が寒天とともに付着した状態となる。
このようにしてメンブレンフィルタＦｌがクロロホルム溶液Ｃｌ中に完全に溶解すると、レジオネラ菌の固定標本及び寒天が表面に付着した平行平面基板Ｆｂをクロロホルム溶液Ｃｌから取り出し、図２の（ｃ）に示すように常温の空気中で乾燥させる。
【００２１】
そして、図３の（ａ）に示すように、平行平面基板Ｆｂ上のレジオネラ菌ｌｇの固定標本Ｓｍは、寒天Ａｇにより平行平面基板Ｆｂの表面に押し付けられた状態で平行平面基板Ｆｂ上に薄く密着する。すなわち、レジオネラ菌ｌｇの固定標本Ｓｍは、波打ちやすいメンブレンフィルタＦｌ上ではなく、当該メンブレンフィルタＦｌよりも剛性が高い平行平面基板Ｆｂ上に平坦化された状態で付着する。
これに対して、図３の（ｂ）に示すように、従来のようにメンブレンフィルタＦｌ上にレジオネラ菌ｌｇを捕集しただけでは、レジオネラ菌ｌｇの固定標本Ｓｍは平坦化されない。また、メンブレンフィルタＦｌが波打つことによって、レジオネラ菌ｌｇの固定標本Ｓｍの平坦性がさらに悪化する。
【００２２】
〔第１０の工程〕
上記第９の工程が終了すると、次に第１０の工程において、平行平面基板Ｆｂ上の寒天Ａｇに覆われたレジオネラ菌ｌｇの固定標本Ｓｍにベクターシールドを滴下し、その上に気泡がはいらないようカバーガラスを載せて、密着させる（ステップＳ１０）。
【００２３】
〔第１１の工程〕
上記第１０の工程が終了すると、次に第１１の工程において、蛍光顕微鏡で平行平面基板Ｆｂ上のレジオネラ菌ｌｇの固定標本Ｓｍを検出する（ステップＳ１１）。つまり、蛍光顕微鏡に平行平面基板Ｆｂを取り付け、対物レンズをカバーガラスに接するように配置する。そして、蛍光顕微鏡が波長４９５ｎｍの青色の励起光を寒天Ａｇに覆われたレジオネラ菌ｌｇの固定標本Ｓｍに照射すると、レジオネラ菌ｌｇに結合したプローブが波長５２０ｎｍの緑色の蛍光を発するので、その蛍光を基にレジオネラ菌ｌｇを検出する。
ここで、平行平面基板Ｆｂ上のレジオネラ菌ｌｇの固定標本Ｓｍが従来よりも平坦なので、蛍光顕微鏡の視野が移動しても、オートフォーカスによる焦点の再調整をほとんど行う必要がない。実際に蛍光顕微鏡によってレジオネラ菌ｌｇの固定標本Ｓｍの画像を撮影したところ、従来方法では画像全体にフォーカスの合う画像は１０枚に１枚程度であったが、本実施形態に係る微生物検出方法では、１０枚中９枚程度の画像において良好なフォーカス状態が得られた。
【００２４】
以上のように、本実施形態では、メンブレンフィルタＦｌをレジオネラ菌ｌｇの捕集面Ｃｓが対面する状態で平行平面基板Ｆｂ上に寒天Ａｇで固着させる第８、第９の工程（平坦化工程）を有するので、平行平面基板Ｆｂ上のレジオネラ菌ｌｇの固定標本Ｓｍは、従来よりも平坦化されて平行平面基板Ｆｂ上に付着する。すなわち、従来のように波打ちやすいメンブレンフィルタＦｌ上にレジオネラ菌ｌｇの固定標本Ｓｍを付着させるのではなく、メンブレンフィルタＦｌよりも剛性が高い平行平面基板Ｆｂ上にレジオネラ菌ｌｇの固定標本Ｓｍを付着させるので、レジオネラ菌ｌｇの固定標本Ｓｍを従来よりも大幅に平坦化させることができる。この結果として蛍光顕微鏡の視野の移動毎に、フォーカスを合わせる必要がないので、観察時に生じる余分な時間を低減することができる。
【００２５】
以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されることなく、例えば以下のような変形が考えられる。
（１）上記実施形態では、ＦＩＳＨ法を用いてレジオネラ菌ｌｇを検出する際の標本を平坦化したが、本発明はこれに限定されない。
例えば、ＤＡＰＩ（4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride）染色法やアクリジンオレンジ染色法などのＦＩＳＨ法以外の蛍光染色法、また蛍光染色法以外の微生物検出方法であっても、ろ過によりポリカーボネート製のメンブレンフィルタＦｌ上に試料中の微生物を捕集し、当該メンブレンフィルタＦｌから微生物を検出する方法であれば、本発明を適用することができる。
【００２６】
（２）上記実施形態では、平面板として平行平面基板Ｆｂを用いたが、本発明はこれに限定されない。
例えば、平行平面基板Ｆｂの代わりに、スライドガラスを用いてもよい。しかし、より平面度を増すためには平行平面基板Ｆｂなど平面度の高い物を用いた方がよい。また、ＦＩＳＨ法などの蛍光染色法では、標本を載せる平面板が透明である必要がないので、上面と下面が平行なシリコンウェハーを用いてもよい。
【００２７】
（３）上記実施形態では、標本を平行平面基板Ｆｂに固着する固着剤として寒天Ａｇを用いたが、本発明はこれに限定されない。
例えば、寒天Ａｇ以外のゼラチンまたはでんぷんのり等を固着剤として用いてもよい。
【００２８】
（４）上記実施形態では、固着剤を溶解せずにメンブレンフィルタＦｌのみを溶解する溶解剤としてクロロホルムを用いたが、本発明はこれに限定されない。
例えば、クロロホルム以外であっても、固着剤を溶解せずにメンブレンフィルタＦｌのみを溶解するものであれば、溶解剤として用いてもよい。
【符号の説明】
【００２９】
Ｆｌ…メンブレンフィルタ、Ｃｓ…捕集面、Ｆｂ…平行平面基板、Ｃｌ…クロロホルム溶液、Ｖｌ…容器、Ｇｍ…ゴム栓、Ｗｒ…針金、Ｓｍ…固定標本、ｌｇ…レジオネラ菌、Ａｇ…寒天
【図１】
0005609126.tif 000002
【図２】
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【図３】
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