(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドの少なくとも1種を含有する象牙質再生剤。
SESDNNSSSRGDASYNSDES (1-1)
ANSESDNNSSSRGDA (2-1)
SRGDASYNSDESKD (3-1)
【請求項２】
多孔質ハイドロキシアパタイトまたはI型コラーゲンのリコンビナント体をさらに含む請求項1に記載の象牙質再生剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規RGD含有ペプチドおよび象牙質再生剤、骨再生剤、歯周組織再生剤に関する。本発明は、さらに詳しくは、象牙質フォスフォフォリン由来する新規なRGD含有ペプチドと、それを利用した象牙質再生剤、骨再生剤、歯周組織再生剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでの歯科治療は、ただ単に虫歯や神経を取りこぼすことなく完璧なまでに除去し、その部分にレジンや金属等の材料を詰めるという作業が中心であった。しかし近年、高齢化社会を迎えて国民の健康に対する関心は益々高くなり、それと同時に歯科においても、患者の痛みを除きさらに切削部分を材料に置換するという治療から、インプラントや審美歯科のような高度なQuality of Lifeを求める医療へと変化しつつある。さらには患者自身の細胞を操作して、歯や歯周組織を自在に再生させる技術は、これまで治療が不可能とされてきた多くの諸問題を解決に導くことができると考えられる。このような背景のもと、本発明者らは、生体親和性を示し短期間で強力に骨再生を誘導する組織誘導材料および技術を開発することを目標としている。
【０００３】
象牙質フォスフォフォリンは、象牙質の非コラーゲン性タンパク質の50%を占める酸性タンパク質である。象牙質フォスフォフォリンに関しては、ウシ象牙質フォスフォフォリン・コラーゲン複合体の高い石灰化誘導活性および骨および歯周組織誘導活性についての報告がある。まず第一に、フォスフォフォリン・コラーゲン複合体の石灰化誘導活性を石灰化誘導時の基質・結晶間の界面張力を用いて定量化して、その高さを実証したこと(T.Saito et al., Bone 21(4),305-311,1997.（非特許文献１）)、脱リン酸化により石灰化誘導能を失うことからリン酸基がフォスフォフォリンによる石灰化に必須であること(T.Saito et al., J Bone Miner. Res.,13(2),265-270,1998. (非特許文献2)、T.Saito et al. J. Bone Miner. Res., 15, 1615-1619, 2000. (非特許文献3))、次に、フォスフォフォリン・コラーゲン複合体を動物の大腿骨欠損部(D.Iejima, T.Saito, T.Uemura, J.Biomater. Sci. Polymer Ed., 14, 1097-1103, 2003. (非特許文献4))、歯周病モデルとしての歯槽骨欠損部(T.Fujii, Y.Terada, F.Kobayashi, T.Koike, T.Saito, T.Uemura, Bone 36, S103, 2005. (非特許文献5))に移植してそれらの組織再生に対する高い誘導活性を示したことが報告されている。特に、歯槽骨再生実験においては、歯槽骨のみならずセメント質再生、さらに再生された歯槽骨とセメント質の間には、歯周病治療のキーポイントとなる歯根膜再生が認められたことが報告されている。
【０００４】
さらに、ブタフォスフォフォリン・コラーゲン複合体をラット、イヌの人工露髄面に移植した覆髄実験においては、早期に細管構造を有する緻密な修復象牙質の形成誘導が認められ、歯髄に炎症がほとんど認められず、強力な修復象牙質形成誘導活性と生体親和性を兼ね備えた覆髄材料であることが明らかになった（特開２００３−２３５９５３号公報(特許文献1)、WO2005/079728(特許文献2)）。
【０００５】
フォスフォフォリンそのものの細胞分化促進作用を使って骨及び象牙質に応用することも提案されている(WO2005/016368(特許文献3))。
【０００６】
ペプチドを用いた歯科用を含む骨疾患の治療に関する報告もある。例えば、基質細胞外リン糖タンパク質のRGD配列、グリコサミノグリカン結合モチーフおよびカルシウム結合モチーフを有するペプチドを歯磨き粉や洗口液に加え、良好な骨や歯の成長を促進させることが提案されている（特表２００４−５０６６５４号公報(特許文献4)）。さらに、この骨成長促進ペプチドを含む練り歯磨き、口内洗浄剤、およびデンタルフロスなどの歯科用製品(特表２００４−５０６００２号公報(特許文献5)、特開２００６−８３１７６号公報(特許文献6))も提案されている。
【非特許文献１】T.Saito et al., Bone 21(4),305-311,1997.
【非特許文献２】T.Saito et al., J Bone Miner. Res.,13(2),265-270,1998.
【非特許文献３】T.Saito et al. J. Bone Miner. Res., 15, 1615-1619, 2000.
【非特許文献４】D.Iejima, T.Saito, T.Uemura, J.Biomater. Sci. Polymer Ed., 14, 1097-1103, 2003.
【非特許文献５】T.Fujii, Y.Terada, F.Kobayashi, T.Koike, T.Saito, T.Uemura, Bone 36, S103, 2005.
【特許文献１】特開２００３−２３５９５３号公報
【特許文献２】WO2005/079728
【特許文献３】WO2005/016368
【特許文献４】特表２００４−５０６６５４号公報
【特許文献５】特表２００４−５０６００２号公報
【特許文献６】特開２００６−８３１７６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし数年前からのBSE問題の浮上により、非特許文献1〜5、特許文献1、2に記載の生体由来のタンパク質の使用は、安全性についての懸念があり、より安全な組織再生材料の開発が重要課題となっている。特許文献3に記載のフォスフォフォリンそのものを用いる場合も同様の安全性についての懸念がある。
【０００８】
また、特許文献3〜5に記載の骨成長促進ペプチドは、骨格成長や象牙芽細胞の数を増加させる作用があり、われわれのペプチドは骨芽細胞や象牙芽細胞への分化を促進させ得るものと考えられる。しかし、その骨成長促進効果は、十分満足できるものではなく、骨再生効果を有する新たな材料の提供が望まれていた。
【０００９】
そこで、本発明の目的は、BSE等の生体由来の材料に内在する安全性についての懸念がない、人工的に合成が可能なペプチドであって、骨再生効果を有する新たなペプチドを提供することにある。さらに本発明は、この新たなペプチドを用いた骨再生剤、象牙質再生剤、歯周組織再生剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は以下のとおりである。
［1］
以下のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチド。
SESDNNSSSRGDASYNSDES  (1-1)
ESDNNSSSRGDASYNSDES  (1-2)
SDNNSSSRGDASYNSDES  (1-3)
SESDNNSSSRGDASYNSDE  (1-4)
SESDNNSSSRGDASYNSD  (1-5)
SESDNNSSSRGDASYNS  (1-6)
SESDNNSSSRGDASYN  (1-7)
ANSESDNNSSSRGDA  (2-1)
NSESDNNSSSRGDA  (2-2)
SRGDASYNSDESKD  (3-1)
SRGDASYNSDESK  (3-2)
DNNSSSRGDASYNSD  (4)
［2］
［1］に記載のペプチドの少なくとも1種を含有する象牙質再生剤。
［3］
多孔質ハイドロキシアパタイトまたはI型コラーゲンのリコンビナント体をさらに含む［2］の象牙質再生剤。
［4］
［1］に記載のペプチドの少なくとも1種を含有する骨再生剤。
［5］
多孔質ハイドロキシアパタイトまたはI型コラーゲンのリコンビナント体をさらに含む［4］に記載の骨再生剤。
［6］
［1］に記載のペプチドの少なくとも1種を含有する歯周組織再生剤。
［7］
多孔質ハイドロキシアパタイトまたはI型コラーゲンのリコンビナント体をさらに含む［6］に記載の歯周組織再生剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、硬組織誘導活性を保持したフォスフォフォリンのRGD配列を含む合成ペプチドが提供され、このペプチドは、高品質で安全性の高い新しい骨再生材料として利用できる。さらに、担体として生体親和性を有するI型コラーゲンのリコンビナント体を使用することにより、より骨再生能力がより改善された骨再生剤、象牙質再生剤、歯周組織再生剤が提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、以下のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドに関する。
SESDNNSSSRGDASYNSDES  (1-1)(配列番号1)
ESDNNSSSRGDASYNSDES  (1-2) (配列番号2)
SDNNSSSRGDASYNSDES  (1-3) (配列番号3)
SESDNNSSSRGDASYNSDE  (1-4) (配列番号4)
SESDNNSSSRGDASYNSD  (1-5) (配列番号5)
SESDNNSSSRGDASYNS  (1-6) (配列番号6)
SESDNNSSSRGDASYN  (1-7) (配列番号7)
ANSESDNNSSSRGDA  (2-1) (配列番号8)
NSESDNNSSSRGDA  (2-2) (配列番号9)
SRGDASYNSDESKD  (3-1) (配列番号10)
SRGDASYNSDESK  (3-2) (配列番号11)
DNNSSSRGDASYNSD  (4) (配列番号12)
【００１３】
本発明のペプチドは象牙質フォスフォフォリンのRGD配列とその前後のアミノ酸を含むものである。RGDのみのペプチド配列では骨芽細胞への分化促進作用や石灰化促進作用は全く認められない。(1-1)のアミノ酸配列を有するペプチドがもっとも活性が高く、RGDとそのN末端側およびC末端側の両方に少なくとも1つ以上のアミノ酸を有するものが、高い活性を有する。RGDとそのN末端側のみのペプチドやRGDとそのC末端側のみのペプチドでは同様の作用を認めるもののその活性はかなり減少する。本発明のペプチドにおいては、RGD以外にその前後のアミノ酸も重要な役割を果たしていると考えられる。これらのペプチドは常法によるペプチド合成により容易に得ることができる。
【００１４】
本発明は、上記ペプチドの少なくとも1種を含有する象牙質再生剤、骨再生剤、または歯周組織再生剤に関する。本発明の象牙質再生剤、骨再生剤または歯周組織再生剤は、上記ペプチドの1種または2種以上を含有するものであり、さらに担体として多孔質ハイドロキシアパタイトまたはI型コラーゲンのリコンビナント体をさらに含むことが好ましい。多孔質ハイドロキシアパタイトまたはI型コラーゲンのリコンビナント体は、ペプチドの質量100に対して100〜200の範囲の質量比で用いることができる。
【００１５】
本発明の象牙質再生剤、骨再生剤または歯周組織再生剤は、細胞に直接触れて作用するものであり、例えば、直接覆髄材や歯周炎に罹患した患者の骨再生へ適用して、象牙質および骨の再生を可能にし、歯周組織の再生にも有効である。
【００１６】
本発明の象牙質再生剤、骨再生剤または歯周組織再生剤は、覆髄材の担体として、徐放系となり細胞分化の足場として有効である多孔質ハイドロキシアパタイトまたはＩ型コラーゲンを使用することが好ましい。例えば、担体25mgをシリンジ内に入れ、生理食塩水にて5μg/30μlに調整したペプチドを滴下含浸することにより複合体を作製することができる。覆髄材は、窩洞形成中の髄角部露出のように、ごく小範囲の非感染性状態の露出歯髄を生じた時に、修復象牙質形成を促進させるための材料として使われる。
【００１７】
特許文献4〜6に記載のペプチドは、基質細胞外リンタンパク質のRGDとグリコサミノグリカン結合部位の２つのモチーフをもつペプチドのみが骨格成長や象牙芽細胞数の増加を促進するとされている。RGDの前後数アミノ酸を含むペプチドでは同様の作用を認めていません。つまりペプチドにはこの２つのモチーフが必要で、それ以外の前後のアミノ酸はほとんど重要ではない。
【００１８】
一方、本発明のペプチドは、象牙質フォスフォフォリンのRGD配列に加えてその前後のアミノ酸も活性の発現に関与する。RGDのみのペプチド配列では全く骨芽細胞への分化促進作用や石灰化促進作用は認められない。従って、同じRGD配列を含むペプチドであるが、本発明のペプチドと特許文献4〜6に記載のペプチドとでは、作用機序に大きな違いがあるものと推察される。
【実施例】
【００１９】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
【００２０】
図１にヒト象牙質フォスフォフォリンの一次構造とペプチドのアミノ酸配列を示す。ヒト象牙質フォスフォフォリン由来のペプチドをInvitrogen社に合成依頼した。RGD-1, RGD-2, RGD-3, RGD-4, RGD-5はRGD配列とそれに隣接するN末端およびC末端の数個のアミノ酸を含むペプチドであり、SGXG-1とSGXG-2はグリコサミノグリカン結合部位を含むペプチドである。さらに、RGD配列の役割を明確にするためにコントロールとしてRGDとRADペプチド(Biomol社)を実験に使用した。さらにRGD-1とRGD配列をRAD配列に変えたRAD-1も対比のためにInvitrogen社に合成依頼した。
【００２１】
実験1
ヒト間葉系幹細胞の石灰化能に及ぼすペプチドの影響を調べた。結果を図２に示す。方法は以下のとおりである。
ヒト間葉系幹細胞(BioWhittaker, Walkersville, MD)を、10% FBSを添加したヒト間葉系幹細胞培地(BioWhittaker)を用いて37℃・5% CO2条件下で培養した。24穴プレートに細胞を1x105個播種し、24時間後無血清培地に交換しさらに24時間培養した後、細胞を10％ FBS、50μg/mlアスコルビン酸、10mMβ−グリセロリン酸、100nMデキサメタゾンおよび50μM各種ペプチドを含む石灰化誘導培地にて28日間培養した。70％エタノールにて１時間細胞固定し、PBSにて2回洗浄後、40mMアリザリンレッド染色液(pH 4.2, Sigma)で10分間染色し、蒸留水およびPBSにてそれぞれ3回洗浄した。石灰化結節は光学顕微鏡にて観察した。RGD-1はヒト間葉系幹細胞の石灰化を最も促進した。RGD-2、RGD-3も石灰化を促進したが、RGD-1に比べて効果は低かった。SGXG-1、-2は石灰化に影響を及ぼさなかった。
【００２２】
実験2
ヒト間葉系幹細胞の増殖能に及ぼすペプチドの影響を調べた。結果を図３に示す。方法は以下のとおりである。
ヒト間葉系幹細胞の増殖はCell Counting Kit-8(Dojindo)を用いて測定した。96穴プレートに細胞を1x103個播種し、24時間後無血清培地に交換しさらに24時間培養した後、細胞を1％ FBSおよび50μM各種ペプチドを含む培地にて培養した。48時間後、新規テトラゾリウム塩WST-8を各ウェルに10μl添加し30分間培養後、細胞内脱水素酵素によってWST-8が還元されて生成する水溶性ホルマザンの450nmにおける吸光度をMicroplate Reader Model 680(Bio-Rad)で測定した。すべてのペプチドはヒト間葉系幹細胞の増殖に影響を与えなかった。
【００２３】
実験3
ヒト間葉系幹細胞のアルカリホスファターゼ活性に及ぼすペプチドの影響を調べた。結果を図４−１および４−２に示す。方法は以下のとおりである。
24穴プレートに細胞を1x105個播種し、24時間後無血清培地に交換しさらに24時間培養した後、細胞を10％ FBS、50μg/mlアスコルビン酸、10mMβ−グリセロリン酸、100nMデキサメタゾンおよび5, 50μM各種ペプチドを含む石灰化誘導培地にて7日間培養し、細胞抽出液中のアルカリフォスファターゼ(ALP)活性をALP-Labアッセイキット(WAKO)を用いて測定した。なおALP活性(International Unit:IU)は、Bio-Rad Protein Assay(Bio-Rad)で測定した各ウェルの総タンパク質量(mg)当たりの活性(IU/mg)として算出した。図４−１に示すように、RGD-1はコントロールに比べて有意にALP活性を促進し、濃度依存性も認められた。RGD-2とRGD-3もALP活性を有意に促進したが、濃度による差異はほとんどみられなかった。他のSGXGやRGDコントロールペプチドにはALP活性値にほとんど影響を与えなかった。図４−２に示すように、RGD-4はコントロールに比べて有意にALP活性を促進し、濃度依存性も認められた。RGD-5とRAD-1もALP活性を促進したが、コントロールとの間に有意な差はみられなかった。
【００２４】
実験4
ヒト間葉系幹細胞のアルカリホスファターゼ活性に及ぼすペプチドの相乗効果を調べた。結果を図５−１および５−２に示す。方法は以下のとおりである。
RGDとSGXG配列を含むDentonin(Acologix社)が細胞分化を促進する効果があることが報告されていることから、RGDとSGXGの混合ペプチドの効果を検討した。さらに、Dentonin(Acologix社)についても比較試験を行った。しかし、RGD-1とSGXGペプチドのコンビネーションによるALP活性促進効果は認められなかった。RGD-1とDentoninはともに5μMでコントロールに比べてALP活性を有意に促進し、RGD-1はDentoninとほぼ同等の活性促進があることがわかった。
【００２５】
実験5
ヒト間葉系幹細胞のアルカリホスファターゼ活性に及ぼすRGDコントロールペプチドおよびインテグリン抗体の影響を調べた。結果を図６に示す。方法は以下のとおりである。
24穴プレートに細胞を1x105個播種し、24時間後無血清培地に交換しさらに24時間培養した後、細胞を10％ FBS、50μg/mlアスコルビン酸、10mMβ−グリセロリン酸、100nMデキサメタゾンおよび50μMRGDもしくはRADペプチド、25μg/ml αｖβ3インテグリン抗体(Santacruz社)を含む石灰化誘導培地にて培養した。１時間後、50μM RGD-1を添加してさらに７日間培養し、細胞抽出液中のALP活性を測定した。RADの前処理ではほとんどALP活性に影響を与えなかったが、RGDやインテグリン抗体の前処理によりRGD-1のALP活性促進効果は有意に抑制された。この結果から、RGD-1の細胞分化促進作用は、そのRGD配列のインテグリンへの結合によることが明らかとなった。
【００２６】
実験6
ヒト間葉系幹細胞のオステオカルシン産生に与えるペプチドの影響を調べた。結果を図７に示す。方法は以下のとおりである。
24穴プレートに細胞を1x105個播種し、24時間後無血清培地に交換しさらに24時間培養した後、細胞を10％ FBS、50μg/mlアスコルビン酸、10mMβ−グリセロリン酸、100nMデキサメタゾンおよび50μMRGDを含む石灰化誘導培地にて７日間培養した。50μg/mlアスコルビン酸、10mMβ−グリセロリン酸、100nMデキサメタゾンおよび50μMRGDを含む無血清培地(500μl)に交換し、２日間培養した後培養液をすべて回収し、ヒトオステオカルシンELISA kit(Biomedical technologies社)を用いて培地中のオステオカルシン量を測定した。RGD-1処理によりオステオカルシン量はコントロールに比べて約３倍と有意に増加した。また、RGD-2, RGD-3処理でも約２倍に増加した。しかし、SGXGペプチドでは、コントロールとほとんど違いは認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明は、歯科医療の分野に有用な材料を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１にヒト象牙質フォスフォフォリンの一次構造とペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図２】ヒト間葉系幹細胞の石灰化能に及ぼすペプチドの影響を調べた結果を示す。
【図３】ヒト間葉系幹細胞の増殖能に及ぼすペプチドの影響を調べた結果を示す。
【図４−１】ヒト間葉系幹細胞のアルカリホスファターゼ活性に及ぼすペプチドの影響を調べた結果を示す。
【図４−２】ヒト間葉系幹細胞のアルカリホスファターゼ活性に及ぼすペプチドの影響を調べた結果を示す。
【図５−１】ヒト間葉系幹細胞のアルカリホスファターゼ活性に及ぼすペプチドの相乗効果を調べた結果を示す。
【図５−２】ヒト間葉系幹細胞のアルカリホスファターゼ活性に及ぼすDentonin(Acologix社)の効果を調べた結果を示す。
【図６】ヒト間葉系幹細胞のアルカリホスファターゼ活性に及ぼすRGDコントロールペプチドおよびインテグリン抗体の影響を調べた結果を示す。
【図７】ヒト間葉系幹細胞のオステオカルシン産生に与えるペプチドの影響を調べた結果を示す。
【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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