(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性が増強し、かつ、グルコースホスホトランスフェラーゼ活性が低下するように改変された有機酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌又は該細菌の処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオン、または二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させることによって、有機酸を生成させ、該有機酸を採取することを特徴とする有機酸の製造法であり、かつ該細菌がエンテロバクター属の細菌である方法。
【請求項２】
前記細菌が、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードするｐｃｋＡ遺伝子のコピー数を高めること、及び／または、該遺伝子の発現調節配列を改変することにより、該遺伝子の発現が増強するように改変された細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｐｃｋＡ遺伝子が下記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡである請求項２に記載の方法。
（ａ）配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、又は１８の塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、又は１８の塩基配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
前記ｐｃｋＡ遺伝子が、配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、又は２４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、または配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、又は２４において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記細菌が、ptsG、crr、ptsH、及びptsIからなる群より選択されるグルコースホスホ
トランスフェラーゼ系をコードする遺伝子または該遺伝子の発現調節領域の配列を改変することにより、グルコースホスホトランスフェラーゼ活性が低下するように改変された細菌である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌が、グルコースホスホトランスフェラーゼ系（PTS）をコードする遺伝子が、ptsG遺伝子または該遺伝子の発現調節領域の配列を改変することにより、グルコースホス
ホトランスフェラーゼ活性が低下されるように改変された細菌である、請求項１〜５のいずれかに一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細菌が、エンテロバクター・アエロゲネスである請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記有機酸がコハク酸である請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法によりコハク酸を製造する工程、及び得られたコハク酸を重合させる工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌を用いたコハク酸等の有機酸の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
コハク酸などの非アミノ有機酸を発酵により生産する場合、通常、アンアエロバイオスピリルム（Anaerobiospirillum）属、アクチノバチルス（Actinobacillus）属等の嫌気性細菌が用いられている（特許文献１、特許文献２、及び非特許文献１）。嫌気性細菌を用いる場合は、生産物の収率が高いが、その一方では、増殖する為の栄養素を多く要求するため、培地中に多量のＣＳＬ（コーンスティープリカー）などの有機窒素源を添加する必要がある。これらの有機窒素源を多量に添加することは培地コストの上昇をもたらすだけでなく、生産物を取り出す際の精製コストの上昇にもつながり経済的でない。【０００３】
また、コリネ型細菌のような好気性細菌を好気性条件下で一度培養し、菌体を増殖させた後、集菌、洗浄し、静止菌体として酸素を通気せずに非アミノ有機酸を生産する方法も知られている（特許文献３及び特許文献４）。この場合、菌体を増殖させるに当たっては、有機窒素の添加量が少なくてよく、簡単な培地で十分増殖できるため経済的ではあるが、目的とする有機酸の生成量、生成濃度、及び菌体当たりの生産速度の向上、製造プロセスの簡略化等、改善の余地があった。【０００４】
一方、通性嫌気性グラム陰性細菌であるエシェリヒア・コリでは、コリネ型細菌同様、好気性条件下で一度培養し、菌体を増殖させた後、静止菌体として酸素を通気せずに嫌気的に非アミノ有機酸を生産する方法（非特許文献２）と、好気的に非アミノ有機酸を生産する方法（特許文献５）が知られているが、グラム陰性細菌であるため浸透圧に弱く、菌体当たりの生産性などに改善の余地があった。また、エンテロバクター属細菌によるコハク酸の生産も試みられている（特許文献６、特許文献７）。【０００５】
これまでに、上記細菌群の育種について、アナプレロティック経路に関しては、エシェリヒア・コリやコリネ型細菌などで、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPC)やピルビン酸カルボキシラーゼ(PYC)の活性を増強させた株を用いた非アミノ有機酸の発酵生産なども報告されている（例えば、特許文献４及び、特許文献８、非特許文献３）。【０００６】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（PEPCK）に関しては、同酵素はオキサロ酢酸から脱炭酸反応でホスホエノールピルビン酸を生成する酵素であり、主に糖新生方向に代謝が進むと考えられてきた（非特許文献３及び、非特許文献４）。一方、PEPCKには、前記と逆反応、すなわちホスホエノールピルビン酸から炭酸固定によりオキサロ酢酸を生成する反応に平衡が傾いている酵素があることも知られている。このタイプのPEPCKは、二酸化炭素高濃度下でコハク酸生成能を有する一部の細菌群、マンヘイミア・サクシニシプロデューセンス（Mannheimia succiniciproducens）、アクチノバチルス・サクシノゲネス（Actinobacillus succinogenes）、アンアエロバイオスピリルム・サクシニシプロデューセンス（Anaerobiospirillum succiniciproducens）、セレノモナス・ルミナンティウム（Selenomonas ruminantium）において存在が確認されている（非特許文献５、非特許文献６、及び非特許文献７、非特許文献８）。これらの細菌由来PEPCKの活性を増強させた株を用いた非アミノ有機酸の製造方法としては、例えばアクチノバチルス・サクシノゲネス由来PEPCKの活性を、エシュリヒア・コリで増強することにより、コハク酸蓄積に効果的であることが知られている（非特許文献７）。一方で、この効果はPEPC欠損株においてのみ確認されており、非欠損株ではコハク酸蓄積に効果が無いことも報告されている(非特許文献７)。【０００７】
また、グルコースホスホトランスフェラーゼ系（PTS）の膜結合サブユニットIICB（Glc）をコードするptsG遺伝子に変異を導入、もしくは欠損をさせた株を用いた非アミノ有機酸の発酵生産なども報告されている（例えば、特許文献９、及び非特許文献９、非特許文献１０）。しかし、ptsG遺伝子を不活化し、更にPEPCKの活性を増強させる事で、コハク酸発酵に顕著な効果がある事は報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，１４２，８３４号
【特許文献２】米国特許第５，５０４，００４号
【特許文献３】特開平１１−１１３５８８号
【特許文献４】特開平１１−１９６８８８号
【特許文献５】米国特許出願公開２００５−０１７０４８２号
【特許文献６】WO2008/133131
【特許文献７】WO2008/133161
【特許文献８】特開平１１−１９６８８７号
【特許文献９】特表２００７−５３５９２６号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】International Journal of Systematic Bacteriology (1999), 49, 207-216
【非特許文献２】Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology (2002), 28(6) 325-332
【非特許文献３】Applied and Environmental Microbiology (1996), 62, p.1808-1810
【非特許文献４】Applied and Environmental Microbiology (1993), 59, p.4261-4265
【非特許文献５】Applied and Environmental Microbiology (2006), 72, p.1939-1948
【非特許文献６】Applied and Environmental Microbiology (1997), 63, p.2273-2280
【非特許文献７】Applied and Environmental Microbiology (2004), 70, p.1238-1241
【非特許文献８】Microbiology (2001),147, p.681-690
【非特許文献９】Applied and Environmental Microbiology (200１), 67, p.148-154
【非特許文献１０】Biotechnology Letters （2006）,28,p.89-93
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、より生産効率の高い、細菌を用いた有機酸の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性が増強し、かつ、グルコースホスホトランスフェラーゼ活性が低下するように改変された腸内細菌科に属する細菌であって、エシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、エルビニア属、クレブシエラ属、及びラウルテラ属から選択される細菌又はその処理物を用いることにより、有機酸の生成、又は収率が顕著に高まることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１２】
すなわち本発明は以下のとおりである。
（１）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性が増強し、かつ、グルコースホスホトランスフェラーゼ活性が低下するように改変された有機酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌又は該細菌の処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオン、または二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させることによって、有機酸を生成させ、該有機酸を採取することを特徴とする有機酸の製造法であり、かつ該細菌がエシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、エルビニア属、クレブシエラ属、及びラウルテラ属から選択される細菌である方法。
（２）前記細菌が、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードするｐｃｋＡ遺伝子のコピー数を高めること、及び／または、該遺伝子の発現調節配列を改変することにより、該遺伝子の発現が増強するように改変された細菌である、前記方法。
（３）前記ｐｃｋＡ遺伝子が下記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡである前記方法。
（ａ）配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、又は１８の塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、又は１８の塩基配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（４）前記ｐｃｋＡ遺伝子が、配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、又は２４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、または配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、又は２４において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、前記方法。
（５）前記細菌が、ptsG、crr、ptsH、及びptsIからなる群より選択されるグルコースホスホトランスフェラーゼ系をコードする遺伝子または該遺伝子の発現調節領域の配列を改変することにより、グルコースホスホトランスフェラーゼ活性が低下するように改変された細菌である、前記方法。
（６）前記細菌が、グルコースホスホトランスフェラーゼ系をコードするptsG遺伝子または該遺伝子の発現調節領域の配列を改変することにより、グルコースホスホトランスフェラーゼ活性が低下するように改変された細菌である、前記方法。
（７）前記細菌が、エンテロバクター・アエロゲネスである、前記方法。
（８）前記有機酸がコハク酸である前記方法。
（９）前記の方法によりコハク酸を製造する工程、及び得られたコハク酸を重合させる工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ヘルパープラスミドRSF-Red-TERの構造を示す図。
【図２】ヘルパープラスミドRSF-Red-TERの構築を示す図。
【図３】各種PEPCKのアミノ酸配列のアラインメントと共通配列を示す図。
【図４】各種PEPCKのアミノ酸配列のアラインメントと共通配列を示す図（続き）。
【図５】各種PEPCKのアミノ酸配列のアラインメントと共通配列を示す図（続き）。
【図６】各種PEPCKのアミノ酸配列のアラインメントと共通配列を示す図（続き）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明の細菌
本発明の方法に用いられる細菌は、有機酸生産能を有し、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（以下、「PEPCK」と略す）活性が増強し、かつ、グルコースホスホトランスフェラーゼ活性が低下するように改変された細菌である。ここで、有機酸生産能とは、本発明の細菌を培地で培養したときに、培地中に有機酸を生成し、回収できる程度に蓄積する能力をいう。例えば、目的とする有機酸を培地中に好ましくは0.5g/L以上、より好ましくは1.0g/L以上、蓄積させることができる細菌をいう。このような細菌は、有機酸生産能を有する親株を、PEPCK活性が増強し、かつグルコースホスホトランスフェラーゼ活性が低下するように改変することにより得ることができる。また、親株が有機酸生産能を有していない場合、有機酸の生産能を付与し、さらに、PEPCK活性が増強し、かつグルコースホスホトランスフェラーゼ活性が低下するように改変することによって得ることができる。また、PEPCK活性が増強し、かつグルコースホスホトランスフェラーゼ活性が低下するように改変された細菌に、有機酸の生産能を付与してもよい。有機酸の生産能を有する細菌は、本来的に有機酸の生産能を有するものであってもよいが、下記のような細菌を、変異法や組換えDNA技術を利用して、有機酸の生産能を有するように改変したものであってもよい。
【００１５】
有機酸とは、TCA回路の代謝中間体の有機酸をいい、例えば、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、クエン酸、イソクエン酸、シス−アコニット酸などが挙げられるが、この中でもコハク酸、リンゴ酸、フマル酸が好ましく、コハク酸がより好ましい。
また、本発明において有機酸とは、フリー体の有機酸及び／またはその塩、例えば硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等を含む。
【００１６】
本発明に使用できる細菌の親株は、腸内細菌科に属し、かつエシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、エルビニア属、クレブシエラ属、及びラウルテラ属から選択される細菌である。
【００１７】
エシェリヒア属、パントエア属細菌、エルビニア属細菌、エンテロバクター属細菌、クレブシエラ属細菌、及びラウルテラ属細菌は、γ−プロテオバクテリアに分類される細菌であり、分類学的に非常に近縁である（J. Gen. Appl. Microbiol. 1997, 43: 355-361; Int. J. Syst. Bacteriol. 1997 47: 1061-1067）。近年、DNA-DNAハイブリダイゼーション実験等により、エンテロバクター属に属する細菌には、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・ディスパーサ(Pantoea dispersa)等に再分類されているものがある(Int. J. Syst. Bacteriol. 1989, 39: 337-345)。また、エルビニア属に属する細菌にはパントエア・アナナス（Pantoea ananas）、パントエア・スチューアルティに再分類されているものがある（Int. J. Syst. Bacteriol. 1993, 43: 162-173 参照）。
【００１８】
本発明において使用することができるエシェリヒア属に属する細菌は、特に制限されないが、例えば、ナイトハルトらの著書（Neidhardt, F. C. Ed. 1996. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology/Second Edition pp. 2477-2483. Table 1. American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.）に記述されている系統のものが含まれる。具体的には、プロトタイプの野生株K12株由来のエシェリヒア・コリ W3110 （ATCC 27325）、エシェリヒア・コリ MG1655 (ATCC 47076)等が挙げられる。
これらの菌株は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所  10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。以下に記載する他のATCCの登録番号が付与された菌株も同様である。
【００１９】
エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）等が挙げられる。具体的には、欧州特許出願公開0952221号に例示された菌株を使用することが出来る。エンテロバクター属の代表的な株として、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株やエンテロバクター・アエロゲネスATCC13048株、エンテロバクター・アエロゲネスNBRC 12010株（Biotechnol Bioeng. 2007 Mar 27;98(2):340-348）、エンテロバクター・アエロゲネス AJ 110637 (FERM BP-10955)株等が挙げられる。
【００２０】
エンテロバクター・アエロゲネス AJ110637株は、平成19年8月22日付で独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に受託番号FERM P-21348として寄託され、2008年3月13日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-10955の受領番号が付与されている。
【００２１】
パントエア属細菌の代表的な菌株として、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）パントエア・アグロメランス、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられる。
【００２２】
パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）(欧州特許出願公開0952221号)
パントエア・アナナティスAJ13356株（FERM BP-6615）(欧州特許出願公開0952221号)
尚、これらの菌株は、欧州特許出願公開0952221号にはエンテロバクター・アグロメランスとして記載されているが、現在では、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
【００２３】
エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）、エルビニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora）が挙げられ、クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、クレブシエラ・プランティコーラ（Klebsiella planticola）が挙げられ、ラウルテラ属細菌としては、ラウルテラ・テリゲナ（Raoultella terrigena）、ラウルテラ・プランティコーラ（Raoultella planticola）が挙げられる。
具体的には、下記の菌株が挙げられる。
【００２４】
エルビニア・アミロボーラ  ATCC15580株
エルビニア・カロトボーラ  ATCC15713株
クレブシエラ・プランティコーラAJ13399株（FERM BP-6600）(欧州特許出願公開0955368号)
クレブシエラ・プランティコーラAJ13410株（FERM BP-6617）(欧州特許出願公開0955368号)
ラウルテラ・プランティコーラ  ATCC33531株
尚、AJ13399株及びAJ13410株は、寄託当時はクレブシエラ・プランティコーラとして分類されていたが、現在ではクレブシエラ・プランティコーラはラウルテラ・プランティコーラに分類されている（Int J Syst Evol Microbiol. 2001 May;51(Pt 3):925-32）。
【００２５】
＜１−１＞有機酸生産能の付与
以下、細菌に有機酸生産能を付与する方法、またはこれらの細菌の有機酸生産能を増強する方法について述べる。
【００２６】
有機酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、アナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、有機酸生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、発酵による物質生産菌の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵（株）学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第77-100ページ参照）。ここで有機酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、2種又は3種以上であってもよい。また発現が増強される有機酸生合成系酵素も単独であっても、2種または3種以上であってもよい。さらに栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
【００２７】
有機酸生産能を有する栄養要求性変異株、有機酸のアナログ耐性株、又は代謝制御変異株を取得するには、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつ有機酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。
以下、具体的に細菌に有機酸生産能を付与する方法と有機酸生産菌について例示する。
【００２８】
＜コハク酸生産菌＞
コハク酸生産菌としては、酢酸、乳酸、エタノール、2,3-ブタンジオール及び蟻酸の形成能を欠損した株を使用することが出来る。
【００２９】
酢酸、乳酸、エタノール、2,3-ブタンジオール及び蟻酸の形成能を欠損した株は、最小培地で酢酸、及び乳酸を資化できない株を取得すること、または、以下の乳酸の生合成系遺伝子、及び酢酸の生合成系酵素の活性を低下することによって取得することが可能である（WO2005/052135）。
【００３０】
また、上記のような株は、モノフルオロ酢酸耐性を付与することによっても取得することができる（米国特許第5,521,075号）。
【００３１】
その他にコハク酸生成能が向上した株を取得する方法として、蟻酸と乳酸の両方の形成能を欠損した株を用いて嫌気条件化でグルコース資化能を付与する方法が挙げられる（WO1997/16528）。
【００３２】
コハク酸生産能は、以下のコハク酸生合成系に関与する遺伝子の増幅や欠損によっても取得することが可能である。
【００３３】
コハク酸生産能は、乳酸の生合成系酵素である、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH、以下カッコ内は酵素名）の酵素活性が低下するように改変することによっても付与することができる（WO2005/052135、WO2005/116227、米国特許5,770,435号、米国特許出願公開2007/0054387号、WO99/53035号、Alam, K. Y., Clark, D. P. 1989. J. Bacteriol. 171: 6213-6217）。細菌によってはＬ型の乳酸デヒドロゲナーゼとＤ型の乳酸デヒドロゲナーゼを有するものがあるが、いずれか一方を低下させるように改変すればよいが、両方とも低下させることが好ましい。
【００３４】
また、コハク酸生産能は、ギ酸の生合成系酵素である、ピルビン酸−ギ酸リアーゼ(PFL)の酵素活性が低下するように改変することによっても付与することができる（米国特許出願公開2007/0054387号、WO2005/116227、WO2005/52135、Donnelly, M.I., Millard, C.S., Clark, D.P., Chen, M.J., Rathke, J.W. 1998. Appl. Biochem. Biotechnol. 70-72, 187-198）。
【００３５】
コハク酸生産能は、酢酸の生合成系酵素である、燐酸アセチルトランスフェラーゼ（PTA）、酢酸キナーゼ（ACK）、ピルビン酸オキシダーゼ (POXB) 、アセチルCoA合成酵素（ACS）、アセチルCoAハイドロラーゼ（ACH）の酵素活性が低下するように改変することによっても付与することが出来る（米国特許出願公開2007/0054387号、WO2005/052135、WO99/53035、WO2006/031424、WO2005/113745、WO2005/113744）。
【００３６】
また、コハク酸生産能は、エタノールの生合成系酵素である、アルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）の酵素活性が低下するように改変することによっても高めることができる（WO2006/031424）。
【００３７】
また、コハク酸生産能は、2,3-ブタンジオールの生合成系酵素である、α−アセト乳酸デカルボキシラーゼの酵素活性が低下した株を取得する事によってもコハク酸生産能を高めることができる(J Biosci Bioeng. 2004;97(4):227-32)。
【００３８】
また、ピルビン酸キナーゼ、ArcAタンパク質、IclRタンパク質（iclR）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（gdh）及び/又はグルタミンシンセターゼ（glnA）、グルタミン酸シンターゼ（gltBD）活性を低下することによっても、コハク酸生産能を高めることが出来る（WO2007/007933、特開2005-168401号）。酵素名の後のカッコ内は、遺伝子名である。
【００３９】
コハク酸生産能は、コハク酸生産に関与する生合成系酵素の増強によっても付与することが出来る。
コハク酸生産能は、ピルビン酸カルボキシラーゼ、マリックエンザイム、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、フマラーゼ、フマル酸リダクターゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を増強することによっても高めることが出来る（特開平11-196888号、WO99/53035、2001. Biotechnol. Bioeng. 74: 89-95、Millard, C. S., Chao, Y. P., Liao, J. C., Donnelly, M. I. 1996. Appl. Environ. Microbiol. 62: 1808-1810、WO2005/021770、特開2006-320208号、Pil Kim, Maris Laivenieks, Claire Vieille, and J.Gregory Zeikus. 2004. Appl. Environ. Microbiol. 70: 1238-1241）。これらの目的酵素の酵素活性増強は、後述するpckA遺伝子の発現の増強方法を参照にして行うことが出来る。
【００４０】
具体的には、腸内細菌科に属するコハク酸生産菌として以下の菌株が挙げられる。
エンテロバクター・アエロゲネス AJ 110637 (FERM BP-10955)株
エンテロバクター・アエロゲネス VP-1株  (J Biosci Bioeng. 2004;97(4):227-32)
【００４１】
＜１−２＞ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼの増強
本発明の細菌は、上述したような有機酸生産能を有する細菌より、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（PEPCK）活性を増強し、かつ、グルコースホスホトランスフェラーゼ活性を低下するように改変することによって得ることができる。ただし、PEPCK活性を増強し、かつ、グルコースホスホトランスフェラーゼ活性を低下するように改変を行った後に、有機酸生産能を付与してもよい。
【００４２】
本発明においてホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（PEPCK）は、ホスホエノールピルビン酸（PEP）から炭酸固定によりオキサロ酢酸（OAA）を生成する反応を可逆的に触媒する酵素である。本発明においてPEPCK活性とは、このPEPからOAAを生成する反応を触媒する活性をいう。本発明に利用するPEPCKは、平衡がPEPからOAAを生産する方向に傾いているものが好ましい。酵素活性は、例えば、Pil Kim等の方法に従い、Sigma Diagnostics ATP Kitを用いて37℃におけるATP生成量を測定する方法で決定できる（Pil, Kim., Maris, Laivenieks., Claire, Vieille., Gregory, Zeikus., Applied And Enviromental Microbiology, Feb. 2004, p.1238-1241）。
【００４３】
PEPCKの活性が親株、例えば野生株や非改変株と比べて増大していることの確認は、上記の方法で酵素活性を測定すること、または、PEPCKをコードする遺伝子のmRNAの量を野生型、あるいは非改変株と比較することによって確認出来る。発現量の確認方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、Reverse-Transcriptase PCR（RT-PCR）が挙げられる（Sambrook, J., and Russell, D.W. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)）。酵素活性の増大については、野生株あるいは非改変株と比較して、増大していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上増大していることが望ましい。また、酵素活性の増大は、PEPCKタンパク質量が非改変株、野生株と比較して増大していることによって確認することができ、例えば抗体を用いてウェスタンブロットによって検出することが出来る（Sambrook, J., and Russell,D.W. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)）。
【００４４】
本発明に使用できるPEPCKをコードする遺伝子としては、アクチノバチルス・サクシノゲネス由来のpckA遺伝子（GenBank Accession No. YP_001343536.1：配列番号６）、またはこのpckA遺伝子のホモログが挙げられる。pckA遺伝子ホモログとは、他の微生物に由来し、上記アクチノバチルス・サクシノゲネスのpckA遺伝子と高い相同性を示し、PEPCK活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をいう。例えば、Haemophilus influenzae（ハエモフィルス・インフルエンザ）のpckA遺伝子（GenBank Accession No. YP_248516.1：配列番号８）、Pasteurella multocida（パスツレラ・マルトシダ）のpckA遺伝子（GenBank Accession No. NP_246481.1：配列番号10）、マンヘイミア・サクシニシプロデューセンスのpckA遺伝子（GenBank Accession No. YP_089485.1：配列番号12）、Yersinia pseudotuberculosis（エルシニア・シュードツベルクローシス）のpckA遺伝子（GenBank Accession No. YP_072243 配列番号14）、Vibrio cholerae（ビブリオ・コレラ）のpckA遺伝子（GenBank Accession No. ZP_01981004.1：配列番号16）、Selenomonas ruminantium (セレノモナス・ルミナンティウム)(GenBank Accession No. AB016600：配列番号18)のpckA遺伝子が挙げられる。
【００４５】
また、pckA遺伝子ホモログとしては、配列番号７、９、１１、１３、１５、１７又は１９のアミノ酸配列に対して、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％、特に好ましくは９９％以上の相同性を有し、かつ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードするものが挙げられる。アミノ酸配列および塩基配列の相同性は、例えばKarlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST（Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)）やFASTA（Methods Enzymol., 183, 63 (1990)）を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている (http://www.ncbi.nlm.nih.govbi.nlm.nih.gov参照)。
【００４６】
配列番号７、９、１１、１３、１５、１７又は１９のアミノ酸配列のアラインメントを図３〜６に示す。また、これらのコンセンサス（共通）配列を配列番号２４に示す。前記pckA遺伝子ホモログには、配列番号２４のアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び配列番号２４のアミノ酸配列に対して、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％、特に好ましくは９９％以上の相同性を有し、かつ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする遺伝子も含まれる。
【００４７】
pckA遺伝子は、上記のとおり、既にいくつかの配列が明らかにされているので、それらの塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いて得ることができる。例えば、配列番号４及び５に示すプライマーを用いて、アクチノバチルス・サクシノゲネスの染色体DNAを鋳型とするPCR法（PCR：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)参照）によって、アクチノバチルス・サクシノゲネスのpckAのコード領域と、その制御領域を含む隣接領域を取得することができる。アクチノバチルス・サクシノゲネスの具体例としては、130Z（ATCC55618）株が挙げられる。同株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110, United States of America）から入手することができる。他の微生物のpckAのホモログも、同様にして取得され得る。
【００４８】
腸内細菌科に属する細菌の種や菌株によってpckA遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、本発明の方法に用いる細菌を得るために使用するpckA遺伝子は、配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、又は２４のアミノ酸配列をコードする遺伝子に限られず、細菌内でその発現を増強することにより細菌のコハク酸生産能を向上させることができる限り、配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、又は２４のアミノ酸配列において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする変異体又は人為的な改変体であってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、特に好ましくは１から５個である。また、このようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、pckA遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００４９】
上記変異は機能的に変化しない中性変異である保存的変異が好ましい。保存的変異としては保存的置換が挙げられる。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、phe,trp,tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、leu,ile,val間で、極性アミノ酸である場合には、gln,asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、lys,arg,his間で、酸性アミノ酸である場合には、asp,glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、ser,thr間でお互いに置換する変異である。より具体的には、保存的置換としては、alaからser又はthrへの置換、argからgln、his又はlysへの置換、asnからglu、gln、lys、his又はaspへの置換、aspからasn、glu又はglnへの置換、cysからser又はalaへの置換、glnからasn、glu、lys、his、asp又はargへの置換、gluからgly、asn、gln、lys又はaspへの置換、glyからproへの置換、hisからasn、lys、gln、arg又はtyrへの置換、ileからleu、met、val又はpheへの置換、leuからile、met、val又はpheへの置換、lysからasn、glu、gln、his又はargへの置換、metからile、leu、val又はpheへの置換、pheからtrp、tyr、met、ile又はleuへの置換、serからthr又はalaへの置換、thrからser又はalaへの置換、trpからphe又はtyrへの置換、tyrからhis、phe又はtrpへの置換、及び、valからmet、ile又はleuへの置換が挙げられる。
【００５０】
さらに、pckA遺伝子は、配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、又は２４のアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有するタンパク質をコードし、かつ、発現を増強することにより細菌の有機酸生産能を向上させることが出来るタンパク質をコードする配列を用いることも出来る。また、それぞれ導入する宿主により、遺伝子の縮重性が異なるので、それぞれpckAが導入される宿主で使用しやすいコドンに置換したものでもよい。同様にpckA遺伝子は、発現を増強することにより細菌のコハク酸生産能を向上させる機能を有する限り、Ｎ末端側、C末端側が延長したタンパク質、あるいは削られているタンパク質をコードする遺伝子でもよい。例えば延長・削除する長さは、アミノ酸残基で50以下、好ましくは20以下、より好ましくは10以下、特に好ましくは5以下である。より具体的には、もとのアミノ酸配列のＮ末端側50アミノ酸から5アミノ酸、又はＣ末端側50アミノ酸から5アミノ酸が延長又は削除されたタンパク質をコードする遺伝子でもよい。
【００５１】
このようなpckA遺伝子と相同な遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、又は２４のアミノ酸配列をコードする遺伝子を改変することによって取得することができる。また、以下のような従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、pckA遺伝子をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および該遺伝子を保持する微生物、例えばアクチノバチルス・サクシノゲネスを、紫外線またはN-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)もしくはエチルメタンスルフォネート（EMS）等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法、エラープローンPCR(Cadwell,R.C. PCR Meth. Appl. 2, 28(1992))、DNA shuffling(Stemmer,W.P. Nature 370, 389(1994))、StEP-PCR(Zhao,H. Nature Biotechnol. 16, 258(1998))によって、遺伝子組換えにより人工的にpckA遺伝子に変異を導入して活性の高いPEPCKをコードする遺伝子を取得することが出来る。
【００５２】
これらのpckA相同遺伝子が発現を増強することにより有機酸生産能を向上させるタンパク質をコードしているか否かは、例えば、これらの遺伝子をエンテロバクター・アエロゲネスAJ 110637 (FERM BP-10955)株等に導入し、有機酸の生産能が向上するかどうかを調べることにより、確かめることができる。
【００５３】
また、pckA遺伝子は、配列番号6、8、10、12、14、16、又は18に相補的な塩基配列又はこれらの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつPEPCK活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、特に好ましくは97％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼ−ションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳさらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００５４】
プローブとして、配列番号6、8、10、12、14、16、又は18に相補的な塩基配列の一部の配列を用いることもできる。そのようなプローブは、これらの塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。例えば、プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。
上記遺伝子ホモログ及び保存的変異に関する記載は、本明細書に記載された他の酵素遺伝子、例えば後述のグルコースホスホトランスフェラーゼ系をコードする遺伝子についても同様に適用される。
【００５５】
上記のようなpckA遺伝子について、その発現が増強するように細菌を改変することによって、PEPCK活性を増強することができる。
ここで、「pckA遺伝子の発現が増強するように改変された」とは、非改変株、例えば親株又は野生株に対して細胞当たりのPEPCK分子の数が増加した場合や、PEPCK分子当たりの活性が上昇した場合などが該当する。なお、比較対象となる野生株としては、例えばエンテロバクター・アエロゲネスではエンテロバクター・アエロゲネスATCC13048などが挙げられる。
【００５６】
pckA遺伝子の発現の増強は、pckA遺伝子のコピー数を高めることによって達成される。例えば、pckA遺伝子を含む断片を、目的の細菌内で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを上述のような有機酸生産能を有する細菌に導入して形質転換すればよい。また、野生型の細菌に上記組換えDNAを導入して形質転換株を得、その後当該形質転換株に有機酸生産能を付与してもよい。また、コピー数の上昇は、pckA遺伝子をコードする遺伝子を染色体上に１コピーあるいは複数コピー転移させることによっても達成される。染色体上にpckA遺伝子が転移したことの確認は、pckA遺伝子の一部をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認出来る。
【００５７】
また、pckA遺伝子の発現の増強は、pckA遺伝子の発現調節領域を改変することによっても達成出来る。例えば、pckAのプロモーターの配列をより強いプロモーターに置換すること、プロモーター配列をコンセンサスに近づけることによって達成出来る（ＷＯ００／１８９３５）。
【００５８】
以下、有機酸生産能を有し、pckA遺伝子の発現量が上昇するように改変した細菌の構築方法を示す。これらの方法は、Molecular cloning（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor(USA), 2001）等のマニュアルに従って実施出来る。
【００５９】
pckA遺伝子の発現の増強は、pckA遺伝子のコピー数を高めることによって達成でき、コピー数を高めることは、以下のようにプラスミドでpckA遺伝子を増幅することによって達成出来る。まずpckA遺伝子を、アクチノバチルス・サクシノゲネスなどの染色体からクローニングする。染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。PCRに用いるオリゴヌクレオチドは上記の公知情報に基づいて合成でき、例えば配列番号４、５に記載の合成オリゴヌクレオチドを用いpckA遺伝子を増幅することが出来る。
【００６０】
PCR法により増幅されたpckA遺伝子を含む遺伝子断片は、増幅する細菌で自律複製可能な複製起点を有するベクターに組み込み、該ベクターで細菌を形質転換することによって増幅することが好ましい。腸内細菌科に導入する場合は、ベクターとしては、pUC19、pUC18、pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pACYC184, pMW219等が挙げられる。
【００６１】
pckA遺伝子と、同遺伝子を増幅する細菌で機能するベクターを連結して組換えDNAを調製するには、pckA遺伝子の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。この制限酵素サイトはあらかじめpckA遺伝子の増幅に用いる合成オリゴヌクレオチドに導入されていてもよい。連結はT4 DNAリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。
【００６２】
上記のように調製した組換えプラスミドを細菌に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリ  Ｋ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法(Chang,S.andChoen,S.N.,Mol.Gen.Genet.,168,111(1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.andHopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929（1978）)も応用できる。また、電気パルス法（特開平2-207791号）や、接合伝達法（Biotechnology (N Y). 1991 Jan;9(1):84-7）によっても、細菌の形質転換を行うことができる。
【００６３】
pckA遺伝子のコピー数を高めることは、pckA遺伝子を細菌の染色体DNA上に複数コピー存在させることによっても達成できる。細菌の染色体DNA上にpckA遺伝子を複数コピー導入するには、染色体DNA上に複数コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号に開示されているように、pckA遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。（特開平2-109985号、特開平７−１０７９７６号、Mol.Gen.Genet.,245, 397-405 (1994)、Plasmid. 2000 Nov;44(3):285-91）。
【００６４】
また、pckA遺伝子の発現量を増加させる手段として染色体DNA上またはプラスミド上のpckA遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換すること、pckAの発現調節に関与する因子、例えばオペレーターやリプレッサーを改変すること、強力なターミネーターを連結することによっても達成される(Hamilton et al, Journal of Bacterology, 171:4617-4622、WO98/004715)。 例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター、λ-phage由来のPRプロモーター、lacUVプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128）等に記載されている。また、WO00/18935に開示されているように、目的遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、よりコンセンサスに近づける配列に置換し、強力なものに改変することも可能である。例えば、−３５領域をTTGACA、TTGCCA配列に、−１０領域をTATAAT、TATAAC配列に置換することが考えられる。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がｍＲＮＡの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可能である。
【００６５】
また、発現量の上昇は、m-RNAの生存時間を延長させることや、酵素タンパク質の細胞内での分解を防ぐことによっても達成可能である。pckA遺伝子上流のプロモーター等の発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやGENETYX等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することも出来る。これらのプロモーター置換または改変によりpckA遺伝子の発現が強化される。
なお、発現調節配列の改変は、pckA遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
【００６６】
＜１−３＞グルコースホスホトランスフェラーゼの弱化
多種の細菌においては、グルコースはグルコースホスホトランスフェラーゼ系（PTS; PEP-dependent phosphotransferase system）により、リン酸化とカップルして細胞内に取り込まれ、解糖系により代謝される。特に、腸内細菌におけるグルコース代謝に関し、グルコースホスホトランスフェラーゼ系は、IICBGlc（ptsG遺伝子産物）、IIAGlc（crr遺伝子産物）、HPr（ptsH遺伝子産物）、及びEnzyme I（ptsI遺伝子産物）より構成されている事が知られている（FEBS Letters, 504, (2001),1 04-111）。
【００６７】
本発明においては、pckA遺伝子の発現上昇に加えて、グルコースホスホトランスフェラーゼ活性が低下するように改変された細菌株を用いる。ここで、「グルコースホスホトランスフェラーゼ活性が低下するように改変された」とは、グルコースホスホトランスフェラーゼ非改変株、例えば親株又は野生株と比較してグルコースホスホトランスフェラーゼ活性が低下していることをいう。グルコースホスホトランスフェラーゼ活性は、グルコースホスホトランスフェラーゼ非改変株と比較して、菌体当たり１０％以下に低下されていることが好ましい。また、グルコースホスホトランスフェラーゼ活性は完全に欠損していてもよい。グルコースホスホトランスフェラーゼ活性が低下されたことは、公知の方法（Kornberg, H. L., and R. E. Reeves, Biochem.J. 128 p.1339-1344, (1972)）によりグルコースホスホトランスフェラーゼ活性を測定することによって確認することができる。腸内細菌のグルコースホスホトランスフェラーゼ活性の低下した変異株の具体的な製造方法としてはApplied and Environmental Microbiology (200１), 67, p.148-154に記載されている方法等が挙げられる。比較対照となる野生株としては、例えばエンテロバクター・アエロゲネスではエンテロバクター・アエロゲネスATCC13048などが挙げられる。
【００６８】
グルコースホスホトランスフェラーゼ活性を低下または欠損させるには、通常の変異処理法によって、染色体上のグルコースホスホトランスフェラーゼ系をコードする遺伝子、例えばptsG、crr、ptsH、及びptsI遺伝子のいずれかまたはその発現調節領域に、細胞中のグルコースホスホトランスフェラーゼ活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。例えば、遺伝子組換えによって、染色体上の上記遺伝子のいずれかを欠損させたり、プロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。また、染色体上のグルコースホスホトランスフェラーゼをコードする領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入すること、遺伝子の一部分あるいは全領域を欠失させることによっても達成出来る（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617（1997）。また、遺伝子破壊、例えばコード領域の少なくとも一部が欠失したような変異型グルコースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子（破壊型遺伝子）を構築し、相同組換えなどによって、染色体上の正常型遺伝子を破壊型遺伝子で置換すること、又は、トランスポゾン、IS因子を染色体上の正常型遺伝子に挿入することによってもグルコースホスホトランスフェラーゼ活性を低下または欠損させることができる。
【００６９】
例えば、グルコースホスホトランスフェラーゼ活性を低下または欠損させるような変異を遺伝子組換えにより導入する為には、以下のような方法が用いられる。上記遺伝子のいずれかの部分配列を改変し、正常に機能する酵素を産生しないようにした変異型ptsG、crｒ、ptsH、もしくはptsI遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで形質転換し、変異型遺伝子と染色体上の遺伝子で組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を変異型に置換することが出来る。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入は既に確立しており、DatsenkoとWannerによって開発された「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645）や、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組合わせた方法（WO2005/010175）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、又は特開平05-007491号、WO2005/010175）。また、上述のような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入は、宿主中で複製能力を持たないプラスミドを用いても行うことが出来る。
エンテロバクター・アエロゲネスのptsG遺伝子として、エンテロバクター・アエロゲネスAJ 110637 (FERM BP-10955)株のptsG遺伝子の塩基配列を配列番号２０に、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号２１に示す。
【００７０】
＜２＞本発明の有機酸の製造法
本発明では、上記のような、有機酸生産能を有し、pckA遺伝子の発現が増強し、かつ、グルコースホスホトランスフェラーゼ活性が低下するように改変された細菌を用いて有機酸の製造を行う。具体的には、本発明の細菌又は該細菌の処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオン、または二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させることによって、有機酸を生成させ、該有機酸を採取することによって、有機酸を製造することができる。
【００７１】
第一の形態では、炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガス、および有機原料を含む培地で細菌を培養することにより、細菌の増殖と有機酸の生成が同時に行なわれる。この形態では、培地が前記反応液に相当する。尚、細菌の増殖と有機酸の生成が並行して行われてもよく、また、主として細菌が増殖する培養期と、主として有機酸が生成する培養期があってもよい。
【００７２】
また、第二の形態では、培地で培養して増殖させた菌体を、炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガス、および有機原料を含む反応液と共存させ、該反応液中で細菌を有機原料に作用させることによって有機酸を生成させる。この形態では、細菌の菌体の処理物を使用することもできる。菌体の処理物としては、例えば、菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体、菌体を破砕した破砕物、その遠心分離上清、又はその上清を硫安処理等で部分精製した画分等が挙げられる。
培養に用いる細菌は、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものであっても良いが、予め液体培地で培養（種培養）したものが好ましい。
【００７３】
培養に用いる培地は、通常細菌の培養に用いられる培地を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウム、燐酸カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩からなる組成に、肉エキス、酵母エキス、ペプトン等の天然栄養源を添加した一般的な培地を用いることができる。
前記第一の形態では、培地に添加する炭素源は、有機酸生成のための有機原料でもある。
前記第二の形態では、培養後の菌体は、遠心分離、膜分離等によって回収され、反応に用いられる。
【００７４】
本発明の方法に用いる有機原料としては、本細菌が資化してコハク酸を生成させうる炭素源であれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、グリセロール、シュークロース、サッカロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセリン、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、フルクトース、グリセロールが好ましく、特にグルコースが好ましい。また、有機酸がコハク酸の場合、特開平５−６８５７６のように効率よくコハク酸を製造するためにフマル酸などを添加してもよく、フマル酸の代わりにリンゴ酸を添加してもよい。
【００７５】
また、上記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜なども使用される。これらの発酵性糖質は、単独でも組み合わせても使用できる。上記有機原料の使用濃度は特に限定されないが、有機酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利であり、通常、前記第一の形態では、有機原料の培地中の濃度は５〜３０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは１０〜２０％（Ｗ／Ｖ）の範囲内である。また、前記第二の形態では、反応液中の有機原料の濃度は５〜３０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは１０〜２０％（Ｗ／Ｖ）の範囲内である。また、反応の進行に伴う上記有機原料の減少にあわせ、有機原料の追加添加を行っても良い。
【００７６】
上記炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガス、および有機原料を含む反応液としては特に限定されず、例えば、細菌を培養するための培地であってもよいし、燐酸緩衝液等の緩衝液であってもよい。反応液は、窒素源や無機塩などを含む水溶液であることが好ましい。ここで、窒素源としては、本細菌が資化して有機酸を生成させうる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種燐酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、反応時の発泡を抑えるために、培養液には市販の消泡剤を適量添加しておくことが望ましい。
【００７７】
反応液のｐＨは、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化マグネシウム等を添加することによって調整することができる。本反応におけるｐＨは、通常、ｐＨ5〜10、好ましくはｐＨ6〜9.5であることが好ましいので、反応中も必要に応じて反応液のｐＨはアルカリ性物質、炭酸塩、尿素などによって上記範囲内に調節する。
【００７８】
本発明で用いる反応液としては、水、緩衝液、培地等が用いられるが、培地が最も好ましい。培地には、例えば上記した有機原料と炭酸イオン、重炭酸イオン又は炭酸ガスを含有させ、嫌気的条件で反応させることができる。炭酸イオン又は重炭酸イオンは、中和剤としても用いることのできる炭酸マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸カルシウム、重炭酸カルシウムから供給されるが、必要に応じて、炭酸若しくは重炭酸又はこれらの塩或いは炭酸ガスから供給することもできる。炭酸又は重炭酸の塩の具体例としては、例えば炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、炭酸カルシウム、重炭酸カルシウム等が挙げられる。そして、炭酸イオン、重炭酸イオンは、０．００１〜５Ｍ、好ましくは０．１〜３Ｍ、さらに好ましくは１〜２Ｍの濃度で添加する。炭酸ガスを含有させる場合は、溶液１Ｌ当たり５０ｍｇ〜２５ｇ、好ましくは１００ｍｇ〜１５ｇ、さらに好ましくは１５０ｍｇ〜１０ｇの炭酸ガスを含有させる。
【００７９】
本反応に用いる細菌の生育至適温度は、通常、２５℃〜４０℃である。反応時の温度は、通常、２５℃〜４０℃、好ましくは３０℃〜３７℃である。反応液中の菌体の量は、特に規定されないが、１〜７００ｇ／Ｌ、好ましくは１０〜５００ｇ／Ｌ、さらに好ましくは２０〜４００ｇ／Ｌが用いられる。反応時間は１時間〜１６８時間が好ましく、３時間〜７２時間がより好ましい。また、反応は、バッチ式でもよく、カラム式でもよい。
【００８０】
細菌の培養は、好気条件で行うことが好ましい。一方、有機酸の生成反応は、好気条件で行ってもよいが、微好気条件または嫌気条件化で行ってもよい。微好気条件または嫌気条件化での反応には、例えば反応容器を密閉して無通気で反応させる、窒素ガス等の不活性ガスを反応液に供給して反応させる、炭酸ガス含有の不活性ガスを反応液に通気する等の方法を用いることができる。
【００８１】
反応液（培養液）中に蓄積した有機酸は、常法に従って、反応液より分離・精製することができる。具体的には、遠心分離、ろ過等により菌体等の固形物を除去した後、イオン交換樹脂等で脱塩し、その溶液から結晶化あるいはカラムクロマトグラフィーにより有機酸を分離・精製することができる。
本発明において採取される有機酸は、目的とする有機酸以外に微生物菌体、培地成分、水分、及び微生物の代謝副産物を含んでいてもよい。採取された有機酸の純度は、50％以上、好ましくは85％以上、特に好ましくは95%以上である。
【００８２】
さらに本発明において目的とする有機酸がコハク酸である場合には、上記した本発明の方法によりコハク酸を製造した後に、得られたコハク酸を原料として重合反応を行うことによりコハク酸含有ポリマーを製造することができる。近年、環境に配慮した工業製品が数を増す中、植物由来の原料を用いたポリマーに注目が集まってきており、本発明において製造されるコハク酸は、ポリエステルやポリアミドといったポリマーに加工されて用いる事が出来る（特開平4-189822）。コハク酸含有ポリマーとして具体的には、ブタンジオールやエチレングリコールなどのジオールとコハク酸を重合させて得られるコハク酸ポリエステル、ヘキサメチレンジアミンなどのジアミンとコハク酸を重合させて得られるコハク酸ポリアミドなどが挙げられる。また、本発明の製造法により得られるコハク酸もしくはコハク酸含有ポリマー、又はこれらを含有する組成物は食品添加物や医薬品、化粧品などに用いることができる。
【実施例】
【００８３】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。【００８４】
〔実施例１〕
＜１−１＞エシェリヒア・コリ MG1655株のスレオニンオペロンプロモーター断片の取得
エシェリヒア・コリ(エシェリヒア・コリK-12株)のゲノムの全塩基配列（GenBank Accession No. U00096）は既に明らかにされている（Science, 277, 1453-1474 (1997)）。本配列を基にスレオニンオペロン（thrLABC）のプロモーター領域のPCR増幅を行った。5'側プライマーとしてSalIサイトを有した配列番号１に示す合成オリゴヌクレオチド、3'側プライマーとして配列番号２に示す合成オリゴヌクレオチドを用いて、エシェリヒア・コリ MG1655株（ATCC47076, ATCC700926）のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、スレオニンオペロンプロモーター断片（A）（配列番号３）を得た。【００８５】
＜１−２＞アクチノバチルス・サクシノゲネス130Z（ATCC55618）株のホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子断片の取得
アクチノバチルス・サクシノゲネス130Z株のゲノムの全塩基配列（GenBank Accession No. CP000746）も既に公開されており、PEPCKをコードする遺伝子（遺伝子名pckA）の塩基配列を基にプライマーを設計し、PCR増幅を行った。5'側プライマーとして配列番号４に示す合成オリゴヌクレオチド、3'側プライマーとしてSalIサイトを有した配列番号５に示す合成オリゴヌクレオチドを用いて、アクチノバチルス・サクシノゲネス130Z株のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、pckA遺伝子断片（B）（配列番号６）を得た。【００８６】
＜１−３＞pckA遺伝子増幅用プラスミドの構築
上記、断片（A）と（B）を鋳型にし、SalIサイトを有した配列番号１と配列番号５のプライマーを用いてPCR反応を行い、断片（A）と（B）が結合された遺伝子断片（C）を得た。この遺伝子断片（C）を制限酵素SalIにて処理、精製した産物を、制限酵素SalIで消化したプラスミドベクターpSTV28（宝バイオ社製）に結合して、pckA増幅用プラスミドpSTV28::Pthr::pckAを構築した。【００８７】
＜１−４＞エンテロバクター・アエロゲネスAJ110637 (FERM BP-10955)のpckA増幅株の作製
上記で得られたpSTV28::Pthr::pckAおよびpSTV28を用いて、エンテロバクター・アエロゲネスAJ110637 (FERM BP-10955)株（参考例１参照）を電気パルス法により形質転換し、クロラムフェニコール40μg/mlを含むLB寒天培地に塗布し、37℃で約18時間培養した。出現したコロニーを純化し、定法によりプラスミドを抽出し、目的のプラスミドが導入されていることを確認した。得られた株をそれぞれエンテロバクター・アエロゲネス AJ110637+pSTV28::Pthr::pckA、エンテロバクター・アエロゲネス AJ110637+pSTV28と名づけた。【００８８】
〔実施例２〕
＜２−１＞エンテロバクター・アエロゲネス AJ110637におけるptsG欠損株の構築
エンテロバクター・アエロゲネス AJ110637のグルコースホスホトランスフェラーゼをコードするptsG遺伝子の欠損を実施した。【００８９】
ptsG欠損用遺伝子断片は、後述の参考例３に記載のプラスミドpMW118-(λattL-Kmr-λattR)を鋳型として、配列番号２２と配列番号２３のオリゴヌクレオチドを用いてPCRにより調製した。pMW118-(λattL-Kmr-λattR)は、pMW118(宝バイオ社製)にλファージのアタッチメントサイトであるattL及びattR遺伝子と抗生物質耐性遺伝子であるKm遺伝子を挿入したプラスミドであり、λattL-Kmr-λattRの順で挿入されている（参考例３参照）。前記PCRにより、カナマイシン耐性遺伝子の両端にそれぞれλphageのattL及びattRの配列、更にその外側にそれぞれptsG遺伝子の上流60bp、下流59bpの配列を付加した遺伝子断片を増幅した。この断片をWizard PCR Prep DNA Purification System（Promega社製）を用いて精製した。【００９０】
次にエンテロバクター・アエロゲネス AJ110637をRSF-Red-TER（図１、参考例２参照）で形質転換し、エンテロバクター・アエロゲネス AJ110637/RSF-Red-TER株を得た。同株を40μg/mlクロラムフェニコールを含有するLB培地で終夜培養を行い、この培養液を40μg/ml クロラムフェニコールと0.4mM イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノサイドを含有するL培地50mLに1/100量接種し、4時間31℃で培養を行った。菌体を集菌し、氷冷した10%グリセロールで３回洗菌した後、最終的に0.5mLの10%グリセロールに懸濁したものをコンピテントセルとし、上項で調製したPCR断片500ngを、GENE PULSER II（BioRad社製）を用いて、電場強度20kV/cm、コンデンサー容量25μF、抵抗値200Ωの条件で導入した。細胞懸濁液に、氷冷しておいたSOC培地（バクトトリプトン20g/L、イーストエキストラクト5g/L、NaCl 0.5g/L、グルコース10g/L）を添加し、31℃で2時間振盪培養を行った後、LB培地に50μg/mlのカナマイシンを加えた培地に塗布した。出現したコロニーを同培地で純化した後、PCRによりptsG遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子と置換していることを確認した。【００９１】
次に、前記のようにして得られた各組換え株からRSF-Red-TERプラスミドを脱落させるため、これらの株を10%シュークロース及び1mM IPTGを含むLB培地に塗布し、37℃で一晩培養した。出現したコロニーの中から、クロラムフェニコール耐性を欠失した株を、AJ110637ΔptsGとして選択した。【００９２】
＜２−２＞エンテロバクター・アエロゲネス AJ110637ΔptsG＋pckA増幅株の構築
上記で得られたエンテロバクター・アエロゲネス AJ110637ΔptsGを、pckA増幅用プラスミドpSTV28::Pthr::pckAおよび空のベクターpSTV28でそれぞれ形質転換し、クロラムフェニコール40μg/ml 及び、50μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天培地に塗布し、37℃で約18時間培養した。出現したコロニーを純化し、定法によりプラスミドを抽出し、目的のプラスミドが導入されていることを確認した。得られた株をそれぞれエンテロバクター・アエロゲネス AJ110637ΔptsG+pSTV28、エンテロバクター・アエロゲネス AJ110637ΔptsG+pSTV28::Pthr::pckAと名づけた。【００９３】
〔実施例３〕エンテロバクター属細菌コハク酸生産株でのΔptsG+pckA増幅の効果
エンテロバクター・アエロゲネス AJ110637+pSTV28、エンテロバクター・アエロゲネス AJ110637ΔptsG+pSTV28、エンテロバクター・アエロゲネス AJ110637+pSTV28::Pthr::pckA、エンテロバクター・アエロゲネス AJ110637ΔptsG+pSTV28::Pthr::pckAを40mg/Lのクロラムフェニコールを含むLBプレートに均一に塗布し、37℃にて16時間培養した。その後、該プレートをアネロパック（三菱ガス化学株式会社製  嫌気性菌簡易培養用  品番A-04）に入れ、嫌気条件下、37℃で16時間培養を行った。得られたプレートの菌体を、0.8%の食塩水で洗浄後、250倍希釈でOD=1.0（600nm）になる様に調製した。この菌体懸濁液100μlと予め炭酸ガスにて置換した生産培地1.3mlを1.5ml容のマイクロチューブに分注し、マイクロチューブシェイカーを用いて31.5℃において72時間培養した。以下に生産培地の組成を示す。【００９４】
（エンテロバクター属細菌有機酸生産培地組成）
〔Ａ区〕
グルコース                       20 g/L（最終濃度）
硫酸マグネシウム・七水和物        0.5 g/L
〔Ｂ区〕
硫酸アンモニウム                  0.5 g/L
燐酸二水素カリウム                0.5 g/L
硫酸マンガン・五水和物            5 mg/L
硫酸鉄・七水和物                  5 mg/L
Yeast Extract                     2 g/L
ビオチン                          0.5 mg/L
(KOHにてpH=5.5に調製)
〔Ｃ区〕
炭酸カルシウム（日本薬局方） 50 g/L
Ａ区、Ｂ区をそれぞれ115℃、10分オートクレーブ滅菌、Ｃ区を180℃ 3時間乾熱滅菌した後、放冷し、混合する。【００９５】
培養後、培地中に蓄積した有機酸量を液体クロマトグラフィーにより分析した。カラムはShim-pack SCR-102H（Shimadzu）を二本直列接続したものを用い、サンプルは5mM p-トルエンスルホン酸を用いて50℃で溶出した。溶出液を5mM p-トルエンスルホン酸および100μM EDTAを含む20mM Bis-Tris水溶液を用いて中和し、CDD-10AD(Shimadzu)にて電気伝導度を測定することにより有機酸を測定した。72時間目のコハク酸蓄積、及び対消費糖収率を表１に示す。【００９６】
【表１】
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pckA遺伝子の増幅のみでも、対照のエンテロバクター・アエロゲネス AJ110637+pSTV28と比べて、コハク酸の蓄積、消費糖あたりの収率は向上した。一方、ptsG遺伝子の欠損のみでも対消費糖収率は向上したが、コハク酸蓄積は低下した。それに対し、pckA遺伝子を増幅し、かつ、ptsG遺伝子を欠損したエンテロバクター・アエロゲネス AJ110637ΔptsG+pSTV28::Pthr::pckAにおいては、コハク酸の蓄積、及び消費糖あたりの収率のいずれにおいても向上効果は顕著であった。
【００９７】
〔参考例１〕エンテロバクター属に属するコハク酸生産菌の取得
エンテロバクター・アエロゲネスAJ110637は、2006年3月に神奈川県牧之原市須々木海岸側の土壌から、グリセリンを炭素源とした液体集積培養にて取得した。その後16ＳｒＤＮＡの全長配列を決定したところ、エンテロバクター・アエロゲネスNCTC10006株と99.9％の相同率を示した。また、ＡＰＩキットによる生理学的試験結果においてもエンテロバクター・アエロゲネスの基準種と同じ結果を得た事により、単離取得株はエンテロバクター・アエロゲネスと同定した。【００９８】
〔参考例２〕ヘルパープラスミドRSF-Red-TERの構築
ヘルパープラスミドRSF-Red-TERの構築スキームを図２に示す。
構築の最初の工程として、RSFsacBPlacMCSベクターをデザインした。そのために、pACYC184プラスミドのcat遺伝子、及びバチルス・サブチリスのsacB遺伝子の構造部分を含むＤＮＡ断片を、それぞれ配列番号２５、２６、２７、２８のオリゴヌクレオチドを用いて、PCRにより増幅した。これらのオリゴヌクレオチドは各々、さらなるクローニングに必要な、都合のよいBglII、SacI、XbaI、及びBamHI制限酵素部位を5'末端に含んでいる。得られた1.5kbのsacB断片を、先に得たpMW119-PlaclacIベクターのXbaI-BamHI部位にクローニングした。このベクターは、pMW118-PlaclacIベクターについての記載（Skorokhodova,A.Yu et al, Biotekhnologiya (Rus), 5, 3-21 (2004)）と同様にして構築した。但し、同ベクターは、pMW218プラスミドの代わりにpMW219からのポリリンカー部位を含んでいる。【００９９】
次に、前記の1.0kbのcat断片をBglII及びSacIで処理し、先の工程で得たRSF-PlaclacIsacBプラスミドのBamHI-SacI部位にクローニングした。得られたプラスミドpMW-PlaclacIsacBcatは、PlacUV5-lacI-sacB-cat断片を含んでいる。この断片をRSF1010ベクターにサブクローンするために、pMW-PlaclacIsacBcatをBglIIで消化し、DNAポリメラーゼＩクレノーフラグメントで処理して平滑末端化し、続いてSacIで切断した。pMWPlaclacIsacBcatプラスミドの3.8kbのBglII-SacI断片を1%アガロースゲルから溶出させ、PstI、及びSacIで処理したRSF1010ベクターに連結した。ライゲーション混合液でエシェリヒア・コリTG1を形質転換し、クロラムフェニコール（50mg/L）を含むLB培地にプレートした。生育したクローンから単離したプラスミドの制限酵素解析を行い、RSFsacBプラスミドを得た。RSFsacBPlacMCSベクターを構築するために、配列番号２９及び３０のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、pMW119-PlaclacIプラスミドを鋳型として用いて、PlacUV5プロモーターを含むDNA断片をPCRにより増幅した。得られた146bpの断片をSacI及びNotIで消化し、RSFsacBプラスミドのSacI-NotI大断片と連結した。その後、配列番号３１及び３２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、pKD46プラスミド（Datsenko, K.A., Wanner, B.L., Proc.Nat1.Acad.Sci.USA, 97, 6640-6645, (2000)）を鋳型とし用いたPCRにより、λRedαβγ遺伝子、及び転写ターミネーターtL3を含む2.3kbのDNA断片を増幅した。得られた断片をRSFsacBPlacMCSベクターのPvuI-NotI部位にクローニングした。こうして、RSFRedプラスミドをデザインした。【０１００】
Red遺伝子のリードスルー転写を排除するために、エシェリヒア・コリのrrnBオペロンのρ−依存性転写ターミネーターを、cat遺伝子とPlacUV5プロモーターとの間に挿入した。そのために、配列番号３３及び３４のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、エシェリヒア・コリBW3350の染色体を鋳型として用いたPCRにより、PlacUV5プロモーターとTrrnBターミネーターを含むDNA断片を増幅した。得られたこれらの断片をKpnIで処理して、連結した。その後、配列番号３５及び３６のオリゴヌクレオチドをプライマーとするオリゴヌクレオチドを用いたPCRにより、PlacUV5及びTrrnBの両方を含む0.5kb断片を、増幅した。得られたDNA断片をEcoRIで消化し、DNAポリメラーゼＩクレノーフラグメントで処理して平滑末端化し、BamHIで切断し、RSFsacBPlacMCSベクターのEcl136II-BamHI大断片と連結した。得られたプラスミドをRSF-Red-TER（図１）と命名した。【０１０１】
〔参考例３〕pMW118-(λattL-Kmr-λattR)プラスミドの構築
pMW118-(λattL-Kmr-λattR)プラスミドは、pMW118-attL-Tc-attRプラスミドから、テトラサイクリン耐性マーカー遺伝子をpUC4Kプラスミドのカナマイシン耐性遺伝子で置換することによって構築した。そのために、pMW118-attL-Tc-attRプラスミドのEcoRI-HindIII大断片を、カナマイシン耐性遺伝子を持つpUC4KプラスミドのHindIII-PstI(676bp)及びEcoRI-HindIII(585bp)の２つの断片に連結した。基本となるpMW118-attL-Tc-attRは、以下の４つの断片を連結することによって得た（WO2005/010175参照）。【０１０２】
pMW118-attL-Tc-attRプラスミドの構築
１）エシェリヒア・コリW3350（λプロファージを含む）の染色体のattLに相当する領域から、プライマーP1（配列番号３５）及びP2（配列番号３６）を用いたPCR増幅により得たattL（配列番号３７）を持つBglII-EcoRI断片(114bp)。これらのプライマーは、BglII及びEcoRIのための副次的な認識部位を含んでいる。【０１０３】
２）エシェリヒア・コリW3350（λプロファージを含む）の染色体のattRに相当する領域から、プライマーP3（配列番号３８）及びP2（配列番号３９）を用いたPCR増幅により得たattR（配列番号４０）を持つPstI-HindIII断片(182bp)。これらのプライマーは、PstI及びHindIIIのための副次的な認識部位を含んでいる。【０１０４】
３）pMW118-ter_rrnBのBglII-HindIII大断片(3916 bp)。プラスミドpMW118-ter_rrnBは、次の３つのDNA断片を連結することによって得た。
・pMW118のAatII-EcoRI断片を持つ大断片(2359 bp)。この断片は、pMW118をEcoRIで消化し、DNAポリメラーゼＩクレノーフラグメントで処理し、次いでAatIIで消化することによって得た。
・アンピシリン耐性（ApＲ）の遺伝子blaを持つpUC19のAatII-BglII小断片(1194 bp)。この断片は、pUC19プラスミドの相当する領域をプライマーP5及びP6（配列番号４１及び４２）を用いてPCR増幅することにより得た。これらのプライマーは、PstI及びAatII及びBglIIのための副次的な認識部位を含んでいる。
・転写ターミネーターter_rrnBのBglII-PstI小断片(363bp)。この断片は、エシェリヒア・コリMG1655染色体の相当する領域をプライマーP7及びP8（配列番号４３及び４４）を用いてPCR増幅することにより得た。これらのプライマーは、PstI及びBglII及びPstIのための副次的な認識部位を含んでいる。【０１０５】
４）テトラサイクリン耐性遺伝子及びter_thrL転写ターミネーターを持つpML-Tc-ter_thrLのEcoRI-PstI小断片(1388bp)（配列番号４５）。pML-Tc-ter_thrLプラスミドは、次の２工程で得た。
・pML-MCSプラスミド(Mashko, S.V. et al., Biotekhnologiya (in Russian), 2001, no.5, 3-20)をXbaI及びBamHIで消化し、次いで大断片(3342bp)を、ter_thrLターミネーターを含むXbaI-BamHI断片(68bp)と連結した。このter_thrLターミネーターを含む断片は、エシェリヒア・コリMG1655染色体の相当する領域を、プライマーP9及びP10（配列番号４６及び４７）を用いたPCRにより得た。こうしてpML-ter_thrLプラスミドを得た。これらのプライマーは、PstI及びXbaI及びBamHIのための副次的な認識部位を含んでいる。
・pML-ter_thrLプラスミドをKpnI及びXbaIで消化し、次いでDNAポリメラーゼＩクレノーフラグメントで処理し、テトラサイクリン耐性遺伝子を持つpBR322のEcoRI-Van91I小断片(1317bp)と連結して、pML-Tc-ter_thrLプラスミドを得た。尚、pBR322は、EcoRI及びVan91Iで消化し、次いでDNAポリメラーゼＩクレノーフラグメントで処理した。【０１０６】
〔配列表の説明〕
配列番号１：スレオニンプロモーター増幅用プライマー
配列番号２：スレオニンプロモーター増幅用プライマー
配列番号３：スレオニンプロモーター遺伝子断片
配列番号４：Actinobacillus succinogenes pckA遺伝子増幅用プライマー
配列番号５：Actinobacillus succinogenes pckA遺伝子増幅用プライマー
配列番号６：Actinobacillus succinogenes ATCC55618株pckA遺伝子配列
配列番号７：Actinobacillus succinogenes ATCC55618株pckAアミノ酸配列
配列番号８：Haemophilus influenzae 86-028NP株pckA遺伝子配列
配列番号９：Haemophilus influenzae 86-028NP株pckAアミノ酸配列
配列番号10：Pasteurella multocida subsp. multocida str. PM70株pckA遺伝子
配列番号11：Pasteurella multocida subsp. multocida str. PM70株pckAアミノ酸
配列番号12：Mannheimia succiniciproducens MBEL55E株pckA遺伝子配列
配列番号13：Mannheimia succiniciproducens MBEL55E株pckAアミノ酸配列
配列番号14：Yersinia pseudotuberculosis IP 32953株pckA遺伝子配列
配列番号15：Yersinia pseudotuberculosis IP 32953株pckAアミノ酸配列
配列番号16：Vibrio cholerae 623-39 pckA遺伝子配列
配列番号17：Vibrio cholerae 623-39 pckAアミノ酸配列
配列番号18：Selenomonas ruminantium subsp. lactilytica TH1 pckA遺伝子配列
配列番号19：Selenomonas ruminantium subsp. lactilytica TH1 pckAアミノ酸配列
配列番号20：Enterobacter aerogenes AJ110637 ptsG遺伝子配列
配列番号21：Enterobacter aerogenes AJ110637 ptsGアミノ酸配列
配列番号22：ptsG欠損用プライマー
配列番号23：ptsG欠損用プライマー
配列番号24：PEPCKコンセンサス（共通）配列
配列番号25：cat遺伝子増幅用プライマー
配列番号26：cat遺伝子増幅用プライマー
配列番号27：sacB遺伝子増幅用プライマー
配列番号28：sacB遺伝子増幅用プライマー
配列番号29：PlacUV5プロモーターを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号30：PlacUV5プロモーターを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号31：λRedαβγ遺伝子及びtL3を含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号32：λRedαβγ遺伝子及びtL3を含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号33：PlacUV5プロモーターおよびTrrnBを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号34：PlacUV5プロモーターおよびTrrnBを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号35：attL増幅用プライマー
配列番号36：attL増幅用プライマー
配列番号37：attLの塩基配列
配列番号38：attR増幅用プライマー
配列番号39：attR増幅用プライマー
配列番号40：attRの塩基配列
配列番号41：bla遺伝子を含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号42：bla遺伝子を含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号43：ter_rrnBを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号44：ter_rrnBを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号45：ter_thrLターミネーターを含むDNA断片の塩基配列
配列番号46：ter_thrLターミネーターを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号47：ter_thrLターミネーターを含むDNA断片増幅用プライマー
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明の方法によれば、迅速かつ高効率で有機酸を製造することができる。また有機酸がコハク酸の場合、得られたコハク酸は食品添加物や医薬品、化粧品等に用いることができる。また、得られたコハク酸を原料として重合反応を行うことによりコハク酸含有ポリマーを製造することもできる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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