(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性成分としての、下記式を有するポリマーＧ−ＣＳＦ結合体と、
【化１】
0005570988.tif 000010
（式中、ＡＡはＧ−ＣＳＦのトレオニン１３３（Ｎ末端メチオニンが存在する場合トレオニン１３４）であり、ｆは１〜２５００から選択された整数である）
界面活性剤としてのポリソルベート２０およびポリソルベート８０の少なくとも一方と、
張性改変剤としてのソルビトールおよびマンニトールの少なくとも一方と、
緩衝剤としての酢酸塩と、ナトリウムとを含み、他の賦形剤を含まず、
４．５〜５．５の範囲のｐＨを有する水性製剤。
【請求項２】
前記界面活性剤は、０．０００１％（ｗ／ｖ）〜０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する請求項１に記載の水性製剤。
【請求項３】
ｐＨは４．７〜５．３の範囲にある請求項１または２に記載の水性製剤。
【請求項４】
ｐＨは４．９〜５．１の範囲にある請求項１〜３のいずれか一項に記載の水性製剤。
【請求項５】
前記緩衝剤が２〜５０ｍｍｏｌ／ｌの濃度で存在する請求項１〜４のいずれか一項に記載の水性製剤。
【請求項６】
前記張性改変剤は１〜１０％の濃度で存在する請求項１〜５のいずれか一項に記載の水性製剤。
【請求項７】
ｐＨがＮａＯＨを使用して調節される請求項１〜６のいずれか一項に記載の水性製剤。
【請求項８】
ポリマーＧ−ＣＳＦ結合体が１〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する請求項１〜７のいずれか一項に記載の水性製剤。
【請求項９】
ポリマーＧ−ＣＳＦ結合体が８〜１２ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する請求項１〜８のいずれか一項に記載の水性製剤。
【請求項１０】
水性製剤を１：２〜１：８に希釈した、請求項１〜９のいずれか一項に記載の水性製剤から得られる希釈水性製剤。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の水性製剤を備えた医薬容器。
【請求項１２】
注射器、ガラス瓶、輸液ボトル、アンプルまたはカルプルである請求項１１に記載の医薬容器。
【請求項１３】
針保護システムを備えた注射器である請求項１１または１２に記載の医薬容器。
【請求項１４】
注入ペン内のカルプルである請求項１１または１２に記載の医薬容器。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の水性製剤を製造する方法であって、
活性薬剤としてのポリマーＧ−ＣＳＦ結合体を、４．５〜５．５の範囲のｐＨを有するとともに、界面活性剤としてのポリソルベート２０およびポリソルベート８０の少なくとも一方と、張性改変剤としてのソルビトールおよびマンニトールの少なくとも一方と、緩衝剤としての酢酸塩と、ナトリウムとを含み、他の賦形剤を含まない水性製剤へと調合することを含む方法。
【請求項１６】
好中球減少症の治療または予防に使用するための請求項１〜１０のいずれか一項に記載の水性製剤。
【請求項１７】
神経障害の治療または予防に使用するための請求項１〜１０のいずれか一項に記載の水性製剤。
【請求項１８】
骨髄移植に使用するための請求項１〜１０のいずれか一項に記載の水性製剤。
【請求項１９】
幹細胞動員のための請求項１〜１０のいずれか一項に記載の水性製剤。
【請求項２０】
小児への投与のための請求項１０に記載の水性製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリマーと結合された顆粒球コロニー刺激因子ポリペプチドを含み、４．５〜５．５の範囲のｐＨ値を有する液体の医薬組成物に関する。組成物はさらに、界面活性剤と、任意選択で１または複数の他の医薬として許容される賦形剤とを含む。さらに、本発明の組成物は、緩衝液として酒石酸またはその塩を含まなければコハク酸およびその塩も含まず、安定剤としてのアミノ酸も含まない。組成物は良好な貯蔵安定性を示し、顆粒球コロニー刺激因子製剤が有用な治療と考えられる疾患および医学的適応の予防および治療に特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は、造血前駆細胞の増殖ならびに分化および成熟した好中球の活性化を刺激する造血増殖因子である。Ｇ−ＣＳＦは、インビトロおよびインビボにおける好中球の増殖を支援することができる。Ｇ−ＣＳＦのヒト型は、１９８６年に日本とアメリカの基によりクローニングされた（非特許文献１）。天然ヒト糖タンパク質は、２つの形式で存在し、一方は１７４個のアミノ酸を有し、他方は１７７個のアミノ酸を有する。存在量が多く、より活性の強い１７４アミノ酸型が組換えＤＮＡ技術により医薬の開発に使用されてきた。
【０００３】
大量の組換えＧ−ＣＳＦが、組換え大腸菌（Escherichia coli）で生産され、化学療法で誘発される好中球減少症に苦しむ癌患者を治療するために臨床の用途でうまく使用されている。大腸菌によって生産されたＧ−ＣＳＦは、Ｎ末端に余分なメチオニンを１つ含む１７５個のアミノ酸からなるポリペプチド鎖である。このタンパク質は、大腸菌中でＧ−ＣＳＦ遺伝子を発現させ、そのタンパク質産物を精製することにより生産されている。かかるタンパク質産物は、５つのシステイン残基を有し、そのうち４つがジスルフィド結合に関与する疎水性タンパク質である。自由な１つのシステイン残基は通常、溶液の保存時のより高分子量の凝集体の形成に関与する。タンパク質の凝集体は、タンパク質の主要な配列中の内部メチオニン残基の酸化によって生じるタンパク質の酸化型からも形成され得る。４つのメチオニン残基のうち、一つはＮ末端に位置し、他の３つは内部に位置する。１２２の位置に酸化メチオニンを含むタンパク質の酸化型は、１２７または１３８の位置に酸化メチオニンを含む型および天然タンパク質から、標準の逆相ＨＰＬＣ分離法により分離することが可能である（かかる位置は１７５アミノ酸からなるメチオニル−Ｇ−ＣＳＦに対して計算）。
【０００４】
大腸菌発現系で合成された組換えヒトＧ−ＣＳＦは、フィルグラスチム（国際一般名称、ＩＮＮ）と呼ばれる。フィルグラスチムの構造は天然糖タンパク質とわずかに異なる。組換えヒトＧ−ＣＳＦの別の型はレノグラスチム（ＩＮＮ）と呼ばれ、これはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で合成される。フィルグラスチムとレノグラスチムは欧州ではそれぞれ商標名Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）およびＧｒａｎｏｃｙｔｅで取引されている。
【０００５】
しかしながら、上記の組換えヒトＧ−ＣＳＦの市販型は、薬効が短く、白血球減少症状態の間は一日に二回以上投与しなければならないことが多い。循環半減期が長い分子であれば、白血球減少症を緩和するのに必要な投与回数を減少させ、かつ結果として伝染病を予防するだろう。現在利用可能な組換えヒトＧ−ＣＳＦ製品に関する別の問題は、用量依存的な骨痛の発生である。骨痛は組換えヒトＧ−ＣＳＦによる治療の重大な副作用として患者に経験されるため、このような作用が本質的にないか、または骨痛を引き起こさないかまたは少なくとも減少させるのに十分少ない用量で有効な、組換えヒトＧ−ＣＳＦ製品
を提供することは望ましい。したがって、改良型組み換えＧ−ＣＳＦ分子およびＧ−ＣＳＦ分子を安定した使用する準備ができた調製物として含む製剤が明らかに必要とされている。
【０００６】
Ｇ−ＣＳＦ変異型におけるヒトＧ−ＣＳＦのタンパク質工学変異型が、例えば特許文献１〜１１に報告されている。
未変性ポリペプチドと比較してヒトＧ−ＣＳＦおよび他のポリペプチドに、少なくとも１つの追加の炭水化物鎖を導入する修飾も報告されている（特許文献１２）。さらに、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）基の取り付けを含む未変性ヒトＧ−ＣＳＦのポリマー修飾が報告され、研究されている（特許文献１３〜１７）。
【０００７】
これらのタンパク質がポリマー分子に結合されたときにタンパク質の安定性を改善され、かつこれらのタンパク質に対する免疫応答が減少することが一般に受け入れられている。特許文献１８は、ＰＥＧで修飾された生理活性タンパク質で免疫原性と抗原性が現象し、血流中での循環が非結合タンパク質よりもかなり長くなる、つまりクリアランス速度が減少することを示している。
【０００８】
糖タンパク質治療薬の薬物動態特性を改良するためのペプチドバックボーンへの合成ポリマーの取り付けは当該技術分野では周知である。ペプチドに結合される代表的なポリマーはＰＥＧである。ペプチド治療薬を誘導体化するためのＰＥＧの使用は、ペプチドの免疫原性を減少させることが実証された。例えば、特許文献１９は、ＰＥＧまたはポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）に結合された酵素とペプチドホルモン等の非免疫原性ポリペプチドを開示している。免疫原性の減少に加えて、問題のポリペプチドのＰＥＧ結合体の大きさが増加するため血液循環中のクリアランス時間が延長される。
【０００９】
ペグフィルフィルグラスチム（ＩＮＮ）は、組換えメチオニルヒトＧ−ＣＳＦ（フィルグラスチム）と、一つの２０ｋＤａモノメトキシ−ＰＥＧ分子とのの共有結合による結合体である。モノメトキシ−ＰＥＧ分子はフィルグラスチムのＮ末端のメチオニル残基に共有結合で結合される。ペグフィルグラスチムは欧州では商標名Ｎｅｕｌａｓｔａで取引されている。
【００１０】
ペプチドへのＰＥＧおよびその誘導体の取り付けの基本的形式は、ペプチドのアミノ酸残基を介した非特異的結合である（例えば特許文献２０〜２４を参照されたい）。ペプチドへのＰＥＧの取り付けの別の形式は、糖タンパク質のグリコシル基の非特異的酸化による（例えば特許文献２５を参照されたい）。
【００１１】
これらの非特異的方法では、ＰＥＧはペプチドバックボーン上の反応性残基に対してランダムな非特異性的方法で加えられる。ＰＥＧ分子のランダムな付加には、最終産物が均質性を欠く、ペプチドの生物活性または酵素活性が減少する可能性があるといったことを含む欠点がある。ここ数年の間に、ペプチドに合成ポリマーまたは他の標識を取り付けるためのより部位特異的な方法が開発され、酵素の作用によって特異的に結合された均質なペプチド治療材がインビトロで生産できることが判明している。これらの酵素に基づく結合体は、位置選択性および立体選択性の利点を有する。結合ペプチドの合成に使用される酵素の主な２つのクラスは、グリコシルトランスフェラーゼ（例えばシアリルトランスフェラーゼ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）およびグリコシダーゼである。これらの酵素は、治療剤部分を有するように後で修飾可能な糖の特異的取り付けのために使用することができる。代わりに、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾グリコシダーゼを使用して、直接修飾糖をペプチドバックボーンに変換してもよい（例えば特許文献２６〜３１を参照されたい）。化学的合成成分と酵素的合成成分を組み合わせる方法も知られている（例えば特許文献２９を参照され
たい）。
【００１２】
Ｇ−ＣＳＦのようなポリペプチド、ＰＥＧのようなポリマー部分と結合させる様々な方法が周知であり、先行技術に広範囲に記載されている。糖ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ製剤が、例えば特許文献１０に記載されている。Ｇ−ＣＳＦとＰＥＧ部分間の結合体の調製に関する別の特許出願は、特許文献１１である。この方法では、結合体がその間に介在するインタクトなグリコシル連結基で連結され、Ｇ−ＣＳＦポリペプチドおよび修飾基に共有結合で取り付けられる。結合体は、グリコシル化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドと、グリコシルトランスフェラーゼの作用により非グリコシル化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドとのいずれもから形成される。グリコシルトランスフェラーゼは、ポリペプチド上のアミノ酸またはグリコシル残基上に修飾糖部分をライゲートする。特許文献１０および特許文献１１の開示は、本発明に関連して明示的に引用される。
【００１３】
ＰＥＧに加えて、他のポリマー部分も、Ｇ−ＣＳＦおよび他の治療剤タンパク質との有用な結合体として記載されている。特許文献３２は、特に、生体適合性ポリマー誘導体との生物学的に活性なタンパク質の結合により生産された生体適合性タンパク質高分子化合物を示す。使用される生体適合性ポリマーは反応性が非常に高い分岐ポリマーであり、得られる結合体はポリマー誘導体およびタンパク質間に長いリンカーを備えている。特許文献３２によると、生体適合性ポリマーの例にはＰＥＧ、ＰＰＧ、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）、ポリトリメチレンエチレングリコール、ポリ乳酸およびその誘導体、ポリアクリル酸エステルおよびその誘導体、ポリアミノ酸、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリ（Ｌ−リジン）、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、多糖等の水溶性ポリマー、デキストラン、ならびにポリビニルアルコールおよびポリアクリルアミド等の免疫原のポリマーが含まれる。
【００１４】
特許文献３３は、特定の種類の化学結合を介して薬学的に純粋な合成親水性ポリマーに生物学的に不活性なポリマーまたはポリマー誘導体を共有結合で結合させることにより形成される生体適合性ポリマー結合体を開示している。天然高分子およびその誘導体として、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、Ｂ、およびＣのようなプロテオグリカン、キチン、ヘパリン、ヘパリン硫酸塩、シクロデキストラン等のデキストラン、ヒドロキシエチルセルロース、セルロースエーテルおよびスターチ、トリグリセリド等の脂質、およびリン脂質が開示される。
【００１５】
特許文献１５は、Ｎ末端化学修飾タンパク質化合物およびその製造方法について記載している。詳細には、Ｇ−ＣＳＦのＮ末端に水溶性ポリマーを結合させることにより生じたＧ−ＣＳＦ組成物について記載している。特許文献１５に列挙された水溶性ポリマーの例は、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれでもよい）、ポリ（ｎ−
ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ＰＰＧホモポリマー、ポリ酸化プロピレン／エチレンオキシドコポリマー、またはポリオキシエチレン化ポリオールである。
【００１６】
特許文献３４は、２つ以上のポリペプチド分子が結合されたポリマー担体分子を含む、アレルゲン性が減少されたポリペプチド結合体について記載している。これらの結合体は、ポリマー担体分子を活性化させ、２つ以上のポリペプチド分子を活性化されたポリマー担体分子と反応させ、かつ結合体上の残りの活性基をブロックすることにより生産される。特許文献３４は、少なくとも２つの異なる取り付け基を含むポリオール、ポリアミン、ポリカルボン酸およびヘテロポリマー等の天然または合成のホモポリマーを含む様々なポリマー担体分子を列挙している。例を挙げると、星状体ＰＥＧ、分岐ＰＥＧ、ポリビニル
アルコール、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドンおよびポリ−Ｄ，Ｌ−アミノ酸がある。特許文献３４の結合体は、カルボキシメチルデキストラン等のデキストラン、ヒドロキシエチルセルロースまたはヒドロキシプロピルセルロース等のセルロース、キトサンの水和溶解物、ヒドロキシエチルスターチまたはヒドロキシプロピルスターチ、グリコーゲン、アガロース、グアガム、イヌリン、プルラン、キサンタンガム、カラゲーニン、ペクチン、アルギン酸等も含む。
【００１７】
特許文献３５は、スターチ由来の修飾多糖にタンパク質を結合する方法に関する。タンパク質と多糖（すなわちヒドロキシアルキルスターチ）との間の結合作用は、ヒドロキシアルキルスターチ分子の末端アルデヒド基の化学修飾によって生じる末端アルデヒド基と、タンパク質の官能基との間で形成される共有結合による連結である。タンパク質の反応基として、アミノ基、チオ基およびカルボキシ基が開示される。
【００１８】
特許文献３６は、ヒドロキシアルキルスターチ（ＨＡＳ）とＧ−ＣＳＦタンパク質の結合体の調製物であって、ポリマーまたはその誘導体の少なくとも１つの官能基がタンパク質の少なくとも１つの官能基と反応し、それによって共有結合による連結を形成している結合体の製剤について記載している。ポリペプチドのＨＡＳ化、好ましくはＨＥＳ化についての他の先行技術文書は特許文献３７〜４１である。
【００１９】
Ｇ−ＣＳＦ等の治療剤ポリペプチドのクリアランス時間を延長し、かつ免疫原性を減少させるために、ポリマー部分でかかる治療剤ポリペプチドを修飾するいくつかのアプローチが先行技術に記載されているが、そのようポリマー−Ｇ−ＣＳＦ結合体の有利な製剤の開発についてはほとんど研究が行われていないようである。
【００２０】
上述のＮｅｕｌａｓｔａ（登録商標）製品は、皮下注射用の液体組成物である。その製剤は、ペグフィルグラスチム、酢酸ナトリウム、ソルビトール、ポリソルベート２０および注射用の水を含み、４．０のｐＨを有する（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｕｌａｓｔａ．ｃｏｍおよびＲＯＴＥ  ＬＩＳＴＥ  ２００７を参照）。Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標）とＮｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）製品（いずれもＡｍｇｅｎにより販売）は、緩衝液、賦形剤および溶液のｐＨ値に関してほぼ同一である。Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）は、フィルグラスチム（ペグフィルグラスチムの代わり）、酢酸ナトリウム、ソルビトール、ポリソルベート８０および注射用の水を含み、４．０のｐＨを有する（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｕｐｏｇｅｎ．ｃｏｍおよびＲＯＴＥ  ＬＩＳＴＥ  ２００７を参照）。
【００２１】
本発明は、ポリマーＧ−ＣＳＦ結合体の特性を考慮するように特に開発されたポリマーＧ−ＣＳＦ結合体を含む液体医薬組成物に関する。非結合Ｇ−ＣＳＦを含む製剤に関する先行技術ではいくつかのアプローチが報告されているが、ポリマーＧ−ＣＳＦ結合体の有用な製剤についてはほとんど知られていない。
【００２２】
非結合Ｇ−ＣＳＦに対して開発された医薬組成物がいくつか特許文献で提示されており、それは非結合Ｇ−ＣＳＦがＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ結合体と置換された製剤を包含するように報告されているが、非Ｇ−ＣＳＦのみに対して準備し、試験しているのは明白である。
【００２３】
例えば、特許文献４２は、組成物が４．０を超えるｐＨ値を有し、さらに酸を含むが界面活性剤を含まない、Ｇ−ＣＳＦを含む安定した医薬組成物について記載している。特許文献４２に記載された医薬組成物は、明らかに非結合Ｇ−ＣＳＦに対して開発されており、明細書には同じまたは改良された生物学的活性を示すＰＥＧ等で化学修飾されたＧ−ＣＳＦを含むことが述べられている。
【００２４】
別の例は、特許文献４３であり、これもＧ−ＣＳＦを含む安定した水性組成物に関する
。組成物は、緩衝液としてのコハク酸または酒石酸もしくはその塩を含み、４．０〜５．８の範囲の好ましいｐＨを有する。明細書によれば、Ｇ−ＣＳＦタンパク質は、例えば酵素グリコシル化または化学的ＰＥＧ化により、合成的に修飾してもよい。
【００２５】
特許文献４４は、安定剤としてトリプトファンを含む安定したタンパク質調合を開示している。タンパク質のリストは、Ｇ−ＣＳＦと、ＰＥＧまたはその同等物で化学修飾したＧ−ＣＳＦとを包含している。Ｇ−ＣＳＦ調製物は好ましくは５−７のｐＨ、より好ましくは６．０−６．７のｐＨを有する。
【００２６】
別の実施例は特許文献４５であり、これは活性成分として生理活性タンパク質と、平滑剤として少なくとも１つの糖とを含み、６．５−７．４のｐＨを有する注射可能な医薬調製物について記載している。この場合でも、ＰＥＧまたはその同等物で化学修飾されたＧ−ＣＳＦも含まれている。
【００２７】
特許文献４６は、少なくとも１つのアミノ酸またはその塩、好ましくはメチオニンを安定剤として含むＧ−ＣＳＦ溶液製剤について記載している。Ｇ−ＣＳＦ溶液製剤は、好ましくは５−７のｐＨを有し、より好ましくは５．５−６．８のｐＨを有する。ここでも、ＰＥＧまたはその同等物で化学修飾されたＧ−ＣＳＦも含まれている。
【００２８】
しかしながら、先行技術に開示された調製物はいずれも特異的なポリマーＧ−ＣＳＦ結合体の調製物ではない。それどころか、特許文献に記載された溶液は単に非Ｇ−ＣＳＦについてのみ開発され、試験されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２９】
【特許文献１】国際公開第０１／８７９２５号
【特許文献２】欧州特許出願公開第０  ４５６  ２００Ａ号
【特許文献３】米国特許第６，１６６，１８３号
【特許文献４】米国特許第６，００４，５４８号
【特許文献５】米国特許第５，５８０，７５５号
【特許文献６】米国特許第５，５８２，８２３号
【特許文献７】米国特許第５，６７５，９４１号
【特許文献８】米国特許第５，４１６，１９５号
【特許文献９】米国特許第５，３９９，３４５号
【特許文献１０】国際公開第２００５／０５５９４６号
【特許文献１１】国際公開第２００６／０７４４６７号
【特許文献１２】米国特許第５，２１８，０９２号
【特許文献１３】米国特許第５，８２４，７７８号
【特許文献１４】米国特許第５，８２４，７８４号
【特許文献１５】国際公開第９６／１１９５３号
【特許文献１６】国際公開第９５／２１６２９号
【特許文献１７】国際公開第９４／２００６９号
【特許文献１８】国際公開第９４／２８０２４号
【特許文献１９】米国特許第４，１７９，３３７号
【特許文献２０】米国特許第４，０８８，５３８号
【特許文献２１】米国特許第４，４９６，６８９号
【特許文献２２】米国特許第４，４１４，１４７号
【特許文献２３】米国特許第４，０５５，６３５号
【特許文献２４】国際公開第８７／０００５６号
【特許文献２５】国際公開第９４／０５３３２号
【特許文献２６】米国特許第６，３９９，３３６号
【特許文献２７】米国特許出願公開第２００３／００４００３７号
【特許文献２８】米国特許出願公開第２００４／０１３２６４０号
【特許文献２９】米国特許出願公開第２００４／０１３７５５７号
【特許文献３０】米国特許出願公開第２００４／０１２６８３８号
【特許文献３１】米国特許出願公開第２００４／０１４２８５６号
【特許文献３２】国際公開第０２／０９７６６号
【特許文献３３】国際公開第９４／０１４８３号
【特許文献３４】国際公開第９７／３０１４８号
【特許文献３５】国際公開第０３／０７４０８７号
【特許文献３６】国際公開第２００５／０１４０５０号
【特許文献３７】国際公開第２００５／０１４６５５号
【特許文献３８】国際公開第２００５／０９２３９０号
【特許文献３９】国際公開第２００７／０３１２６６号
【特許文献４０】国際公開第２００５／０９２９２８号
【特許文献４１】国際公開第２００５／０９２３９１号
【特許文献４２】国際公開第２００５／０４２０２４号
【特許文献４３】国際公開第２００５／０３９６２０号
【特許文献４４】欧州特許出願公開第１  ２６０  ２３０  Ａ１号
【特許文献４５】欧州特許出願公開第１  ３３６  ４１０  Ａｌ号
【特許文献４６】欧州特許出願公開第１  ３２９  ２２４  Ａｌ号
【非特許文献】
【００３０】
【非特許文献１】Nagata et al. (1986) Nature 319: 415 - 418
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３１】
本発明の根底にある課題は、結合体に適合され、かつ高温（通常２〜８℃の冷蔵庫よりも高い温度）で安定なポリマーＧ−ＣＳＦを提供することにある。さらに、本発明の目的は、調製のいかなる段階でも再構成を必要とせず、かつ患者に投与されたときにできるだけ炎症を引き起こさない医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００３２】
これらの問題は、ポリマーＧ−ＣＳＦ結合体を含み、４．５〜５．５の範囲のｐＨを有する医薬水性組成物の提供により、本発明に従って解決される。本発明の水性調製物は、界面活性剤と、任意選択で１または複数の他の医薬として許容される賦形剤とを含む。好ましい実施形態では、組成物は安定剤として、アミノ酸またはその誘導体もしくは塩を含まず、緩衝液として酒石酸またはその塩も、コハク酸またはその塩も含まない。
【００３３】
５．０に４．５〜５．５の範囲のｐＨ値、好ましくは５．０のｐＨを有するポリマーＧ−ＣＳＦ結合体の組成物の調合は、結合体の結合の酸加水分解を防ぐという驚くべきことが判明した。このｐＨ範囲は、冷蔵庫の温度（２〜  ８℃）よりも高い、特に室温（つまり２５℃未満）、さらにはより高温（例えば４０℃）における溶液の安定性を改善する。これは、延長された期間の間、活性を有意に損なわず、また品質を有意に低下させずに組成物を貯蔵できることを意味する。
【００３４】
さらに、貯蔵安定性とは別に、本発明の組成物は、４．０のｐＨを有する比較組成物に対して利点を有する。というのも、酸性が少ない組成物は患者に投与した場合に引き起こす炎症が少ないためである。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
別段の定めがない限り、以下の定義を本明細書において発明を説明するために使用される種々の用語の意味および範囲を例証および説明するために、以下の定義を示す。
用語「ポリマーＧ−ＣＳＦ」は、ポリマーの官能基とポリペプチドの官能基との間の共有結合による連結により結合体が形成される、Ｇ−ＣＳＦポリペプチドとポリマーとの間の結合体を指す。結合体は１または複数のポリマー部分を含んでよい。
【００３６】
用語「Ｇ−ＣＳＦ」（またはＧ−ＣＳＦポリペプチドまたはＧ−ＣＳＦタンパク質またはＧ−ＣＳＦペプチド）は、天然ヒトＧ−ＣＳＦ（つまり造血前駆細胞の分化および増殖を刺激できるタンパク質）のインビボ生物活性を有するタンパク質を指す。Ｇ−ＣＳＦは、Stute, N., et al. "Pharmacokinetics of subcutaneous recombinant human granulocyte colony- stimulating factor in children" (1992) Blood 79 (11), pages 2849-2854.に記載されたアッセイによってＧ−ＣＳＦであると明白に確認することができる。
【００３７】
例証的実施形態では、Ｇ−ＣＳＦは配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を有し、配列番号１は、大腸菌で生産されるヒトメチオニル−Ｇ−ＣＳＦの野生型アミノ酸配列を示し、配列番号２は、哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞）で生産されるヒトＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列を示す。配列番号１は第１のアミノ酸がメチオニンで、Ｔｈｒ  １３４にトレオニン残基を有する１７５アミノ酸の変異型である。配列番号２は、先端のメチオニンがないという点を除いて該１７５アミノ酸変異型と同じ配列を有する１７４のアミノ酸変異型であるため、配列はＴから始まり、１３３位置にトレオニン残基を有する。
【００３８】
配列番号１
ＭＴＰＬＧＰＡＳＳＬＰＱＳＦＬＬＫＣＬＥＱＶＲＫＩＱＧＤＧＡＡＬＱＥＫＬＣＡＴＹＫＬＣＨＰＥＥＬＶＬＬＧＨＳＬＧＩＰＷＡＰＬＳＳＣＰＳＱＡＬＱＬＡＧＣＬＳＱＬＨＳＧＬＦＬＹＱＧＬＬＱＡＬＥＧＩＳＰＥＬＧＰＴＬＤＴＬＱＬＤＶＡＤＦＡＴＴＩＷＱＱＭＥＥＬＧＭＡＰＡＬＱＰＴＱＧＡＭＰＡＦＡＳＡＦＱ  ＲＲＡＧＧＶＬＶＡＳＨＬＱＳＦＬＥＶＳＹＲＶＬＲＨＬＡＱＰ（１７５個のアミノ酸）
配列番号２
ＴＰＬＧＰＡＳＳＬＰＱＳＦＬＬＫＣＬＥＱＶＲＫＩＱＧＤＧＡＡＬＱＥＫＬＣＡＴＹＫＬＣＨＰＥＥＬＶＬＬＧＨＳＬＧＩＰＷＡＰＬＳＳＣＰＳＱＡＬＱＬＡＧＣＬＳＱＬＨＳＧＬＦＬＹＱＧＬＬＱＡＬＥＧＩＳＰＥＬＧＰＴＬＤＴＬＱＬＤＶＡＤＦＡＴＴＩＷＱＱＭＥＥＬＧＭＡＰＡＬＱＰＴＱＧＡＭＰＡＦＡＳＡＦＱＲＲＡＧＧＶＬＶＡＳＨＬＱＳＦＬＥＶＳＹＲＶＬＲＨＬＡＱＰ（１７４個のアミノ酸）
当業者は、本発明はここに示した配列に限定されず、Ｇ−ＣＳＦの変異型を含むことを容易に理解するだろう。そのような変異型は当該技術分野に周知であり、それらは天然Ｇ−ＣＳＦの生物活性を維持しつつ、上記に示したアミノ酸配列に対して１または複数のアミノ酸の削除、置換または付加を含み得る。例として、だが全く、Ｇ−ＣＳＦ変異型は、国際公開第０１／８７９２５号、欧州出願公開第０  ４５６  ２００  Ａ号、米国特許６，１６６，１８３号、米国特許６，００４，５４８号、米国特許５，５８０，７５５号、米国特許５，５８２，８２３号、米国特許５，６７５，９４１号、米国特許５，４１６，１９５号、米国特許５，３９９，３４５号、国際公開第２００５／０５５９４６号および国際公開第２００６／０７４４６７号に記載されているが、これは本願をそのように限定するものではない。
【００３９】
Ｇ−ＣＳＦポリペプチドはグリコシル化されていてもよいし、グリコシル化されていなくてもよい。好ましい実施形態では、Ｇ−ＣＳＦポリペプチドは大腸菌で生産された組換えヒトＧ−ＣＳＦである、つまり、配列番号１の上記に示されたアミノ酸配列またはその変異型を有する組換えヒトＧ−ＣＳＦである。
【００４０】
ポリマーは、Ｇ−ＣＳＦポリペプチドに共有結合で連結でき、Ｇ−ＣＳＦポリペプチドに共有結合で連結されると治療上有用なポリマーＧ−ＣＳＦ結合体が生じるポリマーであれば、いかなるポリマーであってもよい。いくつかの適切なポリマーは、導入部分で既に言及したが、これにはＰＥＧおよびＰＰＧ等のポリ（アルキレンエチレングリコール）、ヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）等のヒドロキシアルキルスターチ、およびポリマーポリマーポリペプチドに関する国際公開第０２／０９７６６、国際公開第９６／１１９５３、国際公開第９７／３０１４８に記載されたポリマーを含む。好ましい実施形態では、ポリマーはＰＥＧである。
【００４１】
結合体に関して以下に使用されるｍｇ／ｍｌの濃度の詳細は、すべてＧ−ＣＳＦ部分のみに関する。定義上、ＰＥＧ部分は質量濃度を考慮しない。
フィルグラスチムは約１８〜１９ｋＤの分子量を有しているが、ペグフィルグラスチムはそのモノメトキシ−ＰＥＧ部分のためそれよりはるかに大きく、約３９ｋＤの分子量を有する。本発明のポリマーＧ−ＣＳＦ結合体は、２０〜６０ｋＤの範囲、好ましくは３５〜４５ｋＤの範囲の分子量を有してよい。
【００４２】
適切なＰＥＧは、先行技術、例えば国際公開第２００５／０５５９４６号、国際公開第２００６／０７４４６７号および国際公開第０１／８７３２９号に開示されている。ＰＥＧ部分は直線であっても分岐であってもよく、５〜４０ｋＤのサイズを有してよい。好ましくはＰＥＧ部分は１５〜２５ｋＤの分子量、最も好ましくは約２０ｋＤの分子量を有する。
【００４３】
ポリマーＧ−ＣＳＦ結合体の生産方法も、先行技術に記載されている。ポリペプチドとポリマー部分との間の結合体の調製に関する上記に言及した文書が援用される。本願ではこれらの文書の開示、すなわち本明細書で説明する結合体およびその製造方法について援用する。
【００４４】
本発明において有用な他のポリマーＧ−ＣＳＦ結合体が、国際公開第９６／１１９５３号、欧州特許出願公開第８２２  １９９Ａ号、国際公開第０１／５１５１０号、国際公開第２００６／０１２８４６０号、欧州特許出願公開第欧州９２１  １３１号  Ａおよび欧州特許出願公開第７４４  ４０９号に記載されている。本願ではこれらの文書の開示、すなわち本明細書で説明する結合体およびその製造方法を明示的に参照する。
【００４５】
当業者は、ＰＥＧまたはＨＥＳ等のポリマーがタンパク質のアミノ酸残基に直接結合される結合体のみならず、ポリマー部分とＧ−ＣＳＦポリペプチドがリンカーによって互いに連結された結合体も包含することを容易に理解するだろう。例えば、ポリペプチドとＰＥＧ部分との間に挟まれたグリコシル基は、本発明の結合体内の有用なリンカーである。国際公開第２００６／０７４４６７号は、Ｇ−ＣＳＦポリペプチドとポリマー部分がグリコシルリンカーまたは非グリコシルリンカー（例えば置換または非置換のアルキルまたは置換または非置換のヘテロアルキル）を介して連結されたポリマーＧ−ＣＳＦ結合体について説明している。国際公開第２００６／０７４４６７の開示は本明細書に援用する。
【００４６】
用語「ＰＥＧＧ−ＣＳＦ」（ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ）は、以下に説明するように１または複数のポリエチレングリコール部分と共有結合で結合されたＧ−ＣＳＦタンパク質を指す。ＰＥＧ基とＧ−ＣＳＦタンパク質は、互いに直接結合してもよいし、またはリンカー（例えばグリコシルリンカー）を介して結合されてもよい。
【００４７】
本発明の１実施形態では、ポリマーＧ−ＣＳＦペプチド結合体は、国際公開第２００６／０７４４６７号に記載された方法によって調製される。好ましい実施形態では、ポリマーＧ−ＣＳＦペプチドは、ＰＥＧ修飾部分とＧ−ＣＳＦポリペプチドとの間にグリコシル
連結基を有するＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ結合体である。そのような結合体は「糖ＰＥＧ化」Ｇ−ＣＳＦと呼ばれる。
【００４８】
例証的実施形態では、本発明の「糖ＰＥＧ化」Ｇ−ＣＳＦ分子は、グリコシル化してもグリコシル化しなくてもよいＧ−ＣＳＦペプチドと、その構造内にポリ（エチレングリコール）部分を有する酵素で転位可能なサッカリル部分との間の結合体の酵素媒介性の形成により生産される。ＰＥＧ部分は、サッカリル部分に直接取り付けられてもよいし（すなわち２つの反応基の反応により一つの基が形成されることにより）、リンカー部分を介して取り付けられても良い（例えば置換または非置換のアルキル、置換または非置換のヘテロアルキル等）グリコシル連結基はＰＥＧで誘導体化されるシアル酸部分であってもよい。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態では、グリコシルリンカーは、Ｏ−グリコシル化を介して、好ましくはＧ−ＣＳＦタンパク質のトレオニン残基の位置でのＯ−グリコシル化を介して、Ｇ−ＣＳＦタンパク質に結合される。
【００５０】
グリコシルリンカーは好ましくは単糖、二糖、またはオリゴ糖を含み、より好ましくはグリコシルリンカーはシアル酸およびＮ−アセチルガラクトサミンを含む。
本発明の１実施形態では、ポリマーＧ−ＣＳＦペプチド結合体は以下の部分を含む：
【００５１】
【化１】
0005570988.tif 000002
式中、Ｒ1は直鎖または分岐のポリ（エチレングリコール）残基を含む部分であり、Ｌ
は結合、置換または非置換のアルキル、および置換または非置換のヘテロアルキルから選択されたメンバーであるリンカーであり、ペプチドはグリコシル基でグリコシル化され、前記部分がグリコシル基に共有結合で結合される。グリコシル基は好ましくはＮ−アセチルガラクトサミンである。好ましい実施形態では、Ｇ−ＣＳＦペプチドは、トレオニン残基で、好ましくは１３４の位置（Ｎ末端基メチオニンと合計１７５のアミノ酸を有するメチオニル−Ｇ−ＣＳＦポリペプチドについて計算）のトレオニン残基でグリコシル化される。好ましい実施形態では、トレオニン残基では直鎖ポリ（エチレングリコール）基であり、Ｌはヘテロアルキルである。
【００５２】
上述のＧ−ＣＳＦペプチド結合体は、
（ａ）基質Ｇ−ＣＳＦペプチドを、以下の式を有するＰＥＧシアル酸ドナーと接触させること
を含む方法によって生産することが可能である。
【００５３】
【化２】
0005570988.tif 000003
式中、Ｒ1およびＬは上に定義した通りであり、ＰＥＧシアル酸部分をドナーから基質
Ｇ−ＣＳＦペプチドのグリコシル基上に転送できる酵素である。好ましい実施形態では、酵素はシアリルトランスフェラーゼであり、例えば国際公開第２００５／０５５９４６に記載されるＳＴβＧａｌＮＡｃＩである。
【００５４】
上述のＧ−ＣＳＦペプチド結合体は、
（ａ）非グリコシル化基質Ｇ−ＣＳＦペプチドを、グリコシルドナーおよびグリコシル基部分をドナーから基質Ｇ−ＣＳＦペプチド上に転送できる酵素と接触させること、および（ｂ）グリコシル化したＧ−ＣＳＦペプチドを、以下の式を有するＰＥＧシアル酸ドナーと接触させること
を含む方法によって生産することが可能である。
【００５５】
【化３】
0005570988.tif 000004
式中、Ｒ1およびＬは上に定義した通りであり、ＰＥＧシアル酸部分をドナーから基質
Ｇ−ＣＳＦペプチドのグリコシル基上に転送できる酵素である。工程（ａ）と（ｂ）は逐次反応でも同時反応でもよい。好ましい実施形態では、グリコシルドナーはＵＤＰＮ−アセチルガラクトサミンである。好ましい実施形態では、工程（ａ）の酵素はＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼであり、工程（ｂ）の酵素はシアリルトランスフェラーゼであり、例えば工程（ａ）ではＧａｌＮＡｃＴ２、工程（ｂ）ではＳＴβＧａｌＮＡｃＩである。
【００５６】
Ｇ−ＣＳＦは、化学合成法で生産してもよいし、任意のヒトまたは別の哺乳動物供給源からのものであってもよいし、精製によりヒト胎盤、ヒト血液またはヒト尿等の天然供給
源から得てもよい。さらに、多くの上皮癌、急性脊髄性白血病細胞および様々な腫瘍細胞系列がこの因子を発現できる。
【００５７】
好ましくは、Ｇ−ＣＳＦは遺伝子組み換えで生産される。これは、ゲノムもしくはｃＤＮＡのクローニングにより、またはＤＮＡ合成によって得られた外因性ＤＮＡ配列の真核生物または原核生物宿主での発現を含む。適切な原核生物宿主は、好ましい宿主である大腸菌を始めとする種々の細菌を包含する。適切な真核生物宿主は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等の酵母およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞ならびにサル細胞等の哺乳動物細胞を含む。
【００５８】
Ｇ−ＣＳＦのようなタンパク質の組換え生産法は当該技術分野で周知である。一般に、これは、宿主細胞の適切な発現ベクトルでのトランスフェクション、タンパク質の生産を可能にする条件下での宿主細胞の培養、および宿主細胞からのタンパク質の精製を含む。詳細な情報のためには、例えばSouza, L.M. et al. 1986, Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor: effects on normal and leukemic myeloid cells, Science (1986) 232: 61-65; Nagata, S. et al. 1986, Molecular cloning and expression of cDNA for human granulocyte colony- stimulating factor, Nature (1986) 319: 415-418; Komatsu, Y. et al. 1987, Cloning of granulocyte colony-stimulating factor cDNA from human macrophages and its expression in Escherichia coli, Jpn. J. Cancer Res. (1987) 78: 1179-1181.参照されたい。
【００５９】
好ましい実施形態では、Ｇ−ＣＳＦは、ヒト成熟Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸配列を有し（Nagata, S. et al. (1986)、前掲を参照）、その網の末端にメチオニンをさらに含んでもよく、その結果、１７５のアミノ酸からなるタンパク質となる（上述の配列番号１を参照）。さらに、メチオニンの代わりにＧ−ＣＳＦはセリンまたはトレオニン残基を含んでもよい。
【００６０】
その後、タンパク質は従来の下流の処理プロトコルに従って精製される。Ｇ−ＣＳＦに適した精製方法が、例えば、国際公開第８７／０１１３２号、欧州特許出願公開第０  ７１９  ８６０Ａ号、欧州特許出願公開第１  ４５８  ７５７  Ａ号、欧州特許出願公開第１  ５２７  １８８Ａ号、国際公開第０３／０５１９２２号、国際公開第０１／０４１５４号、および国際公開第２００６／０９７９４４号の先行技術に記載されている。
【００６１】
本発明の１実施形態では、本明細書で与える実施例１に記載されるようにポリマーＧ−ＣＳＦペプチド結合体が調製される。この結合体は、Ｇ−ＣＳＦポリペプチドとＰＥＧ部分がＮ−アセチルガラクトサミニル（ＧａＩＮＡｃ）基とシアル酸（ＳＡ）基を介して結合されるよう特徴付けられる。結合体は以下のＧ−ＣＳＦ−ＧａＩＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧの構造を有している。
【００６２】
【化４】
0005570988.tif 000005
式中、Ｒ1およびＬは上に定義した通りであり、ＡＡはＧ−ＣＳＦのアミノ酸残基である
。
【００６３】
例証的実施形態では、Ｒ1は、シアル酸基とＧａＩＮＡｃ基を介してＧ−ＣＳＦポリペ
プチドに結合される、以下に示すような線形のＰＥＧ部分である。
【００６４】
【化５】
0005570988.tif 000006
式中、Ｌは上に定義した通りであり、ＡＡはＧ−ＣＳＦのアミノ酸残基であり、ｆは１〜２５００から選択された整数である。
【００６５】
ある実施形態では、ポリマーＧ−ＣＳＦ結合体は以下の式を有する：
【００６６】
【化６】
0005570988.tif 000007
式中、ＡＡはＧ−ＣＳＦのトレオニン１３３（Ｎ末端メチオニンが存在する場合トレオニン１３４）であり、ｆは１〜２５００から選択された整数である。
【００６７】
本発明の調製物は液体組成物（例えば水溶液）である。注入目的では、溶媒として純水の使用が好ましい。しかしながら、医薬製剤に適した従来の他の溶媒も使用することができる。本発明の好ましい実施形態では、医薬組成物は等張溶液である。
【００６８】
さらに、本発明の液体溶液製剤の調製のいかなる段階でも、再構成の必要はない。溶液は使用の準備ができている製剤である。
本発明の医薬組成物は４．５〜５．５の範囲のｐＨを有している。好ましい実施形態では、ｐＨ値が４．７〜５．３の間、より好ましくは４．８〜５．２の間、最も好ましくは４．９と５．１の間にある。
【００６９】
所望のｐＨ範囲を達成するために調整が必要な場合、ｐＨ値は適切な溶液により調整される；ｐＨ値の減少が示された場合は酸性溶液、ｐＨ値の増加が示された場合はアルカリ性溶液で。適切な酸性溶液は、例えば塩酸、リン酸、クエン酸および、リン酸水素ナトリウムおよびリン酸水素カリウム。適切なアルカリ性溶液は、アルカリおよびアルカリ土類金属の水酸化物、アルカリ炭酸塩、アルカリ酢酸塩、アルカリクエン酸塩、およびジアル
カリ水素リン酸塩（例えば水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、二ナトリウム、リン酸カリウム、アンモニア）である。
【００７０】
好ましくは、溶液のｐＨは水酸化ナトリウムを使用して調整される。結果として、本発明の製剤はナトリウムイオンを含んでよい。ナトリウムは、１０ｍｍｏｌ／ｌ未満、通常は６ｍｍｏｌ／ｌ未満の濃度で存在する。
【００７１】
本発明の製剤は、１または複数の界面活性剤を含む。界面活性剤の典型的な例には以下のものが含まれる：非イオン性界面活性剤、例えばモノカプリル酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、およびモノパルミチン酸ソルビタン等のソルビタン脂肪酸エステル；モノカプリル酸グリセリン、モノミリスチル酸グリセリン、およびモノステアリン酸グリセリン等のグリセリン脂肪酸エステル；モノステアリン酸デカグリセリル、ジステアリン酸デカグリセリル、およびモノリノール酸デカグリセリル等のポリグリセリン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンモノラウリン酸ソルビタン、ポリオキシエチレンモノオレイン酸ソルビタン、ポリオキシエチレンモノステアリン酸ソルビタン、ポリオキシエチレンモノパルミチン酸ソルビタン、ポリオキシエチレントリオレイン酸ソルビタン、およびポリオキシエチレントリステアリン酸ソルビタン等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンテトラステアリン酸ソルビトールおよびポリオキシエチレンテトラオレイン酸ソルビトール等ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンモノステアリン酸グリセリン等のポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル；ポリエチレンジステアリン酸グリコール等のポリエチレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンラウリルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、およびポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル等のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル；ポリオキシエチレンひまし油、ポリオキシエチレン硬化ひまし油（ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油）等のポリオキシエチレン硬化ひまし油；ポリオキシエチレンソルビトールワックス等のポリオキシエチレンワックス誘導体；ポリオキシエチレンラノリン等のポリオキシエチレンラノリン誘導体；６−１８のＨＬＢ値を有するポリオキシエチレンステアリン酸アミド等のポリオキシエチレン脂肪酸アミド；陰イオン界面活性剤、例えばセチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびオレイル硫酸ナトリウム等のＣ１０〜１８アルキルを有する硫酸アルキル；ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム等の、２−４の平均ＥＯモル数とＣ１０〜１８アルキルを有するポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；ラウリルスルホスクシン酸ナトリウム等のＣ８〜１８アルキルを有するアルキルスルホスクシン酸エステル塩；および天然界面活性剤、例えばレシチン；グリセロリン脂質；スフィンゴミエリン等のスフィンゴリン脂質；Ｃ１２〜１８脂肪酸のショ糖脂肪酸エステル。これらの界面活性剤の１つまたは複数を、本発明の製剤と組み合わせて加えることが可能である。
【００７２】
好ましい界面活性剤はポリオキシエチレンソルビタンのアルキルエステルであり、好ましくは、ポリソルベート２０、２１、４０、６０、６５、８０、８１、８５、最も好ましくはポリソルベート２０および８０である。
【００７３】
製剤中の界面活性剤の濃度は、溶液製剤の全量に対し、通常０．０００５％（ｗ／ｖ）から０．０５％（ｗ／ｖ）までの範囲、より好ましくは０．００１％（ｗ／ｖ）から０．０１％（ｗ／ｖ）までの範囲、さらに好ましくは０．００２％（ｗ／ｖ）から０．００６％（ｗ／ｖ）までの範囲、最も好ましくは０．００３％（ｗ／ｖ）から０．００４％（ｗ／ｖ）までの範囲である。
【００７４】
通常、本発明の製剤は、０．００３％（ｗ／ｖ）、０．００３３％（ｗ／ｖ）または０．００４％（ｗ／ｖ）の濃度の界面活性剤ポリソルベート２０または８０を含み、ポリソルベート２０が好ましい。
【００７５】
本発明の製剤は生理学的に許容される緩衝液を含む。適切な緩衝液が溶液製剤の分野では周知であり、例えば（好ましくはリン酸一水素ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム系）リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、乳酸緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液、ＢｉｓＴｒｉｓ、ＭＥＳ、およびグリシン−ＨＣｌ）が挙げられる。酢酸緩衝液の使用、すなわち酸性の酸とその塩（例えばアルカリまたはアンモニウム塩）の使用が好ましい。
【００７６】
緩衝液は、通常、１〜１００ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは２〜５０ｍｍｏｌ／ｌ、最も好ましくは５〜２０ｍｍｏｌ／ｌの濃度で製剤中に存在する。好ましい実施形態では、緩衝液は、１０ｍｍｏｌ／ｌで存在し、最も好ましくは１０ｍｍｏｌ／ｌで存在する酢酸塩である。
【００７７】
緩衝液（例えば酢酸塩）の濃度は、十分な緩衝能のみならずｐＨ安定化作用が提供されるように選択される。しかしながら、同時に、イオン濃度、従って溶液の導電率は凝集体の形成を回避するためにできるだけ低くする。
【００７８】
本発明の実施形態では、最終的な溶液製剤の導電率は１．０ｍＳ／ｃｍ未満で、好ましくは０．８ｍＳ／ｃｍ未満、より好ましくは０．５未満ｍＳ／ｃｍである。
さらに、製剤は酒石酸およびコハク酸ならびにその塩を含まないことが好ましい。溶液がＨＥＰＥＳ、ＴＥＳおよびトリシンを含まないこともまた好ましい。
【００７９】
本発明の製剤が硫酸イオンを含まないことも好ましい。
さらに、好ましい実施形態では、製剤は防腐剤を含まない。ここで防腐剤とは、貯蔵安定性を増大させるための防腐剤として慣例的に使用され、標準濃度では殺菌作用を有する物質のことを意味する。特に、製剤は、塩化エチル、ベンジルアルコール、ｐ−クロロ−ｍ−クレゾールおよびピロカルボン酸ジアルキルエステルおよび塩化ベンザルコニウム等の防腐剤を含まない。
【００８０】
本発明の実施形態では、製剤はさらに好ましくはポリオール、好ましくは糖アルコール、最も好ましくはマンニトールまたはソルビトールを、張性改変剤として含む。ソルビトールは特に好ましい。ソルビトールまたはマンニトール等の糖の量は、溶液の総量に対して通常１０．０％（ｗ／ｖ）以下である。好ましくは、糖の濃度は８．０％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは６．０％（ｗ／ｖ）以下、最も好ましくは５．０％（ｗ／ｖ）以下である。好ましい実施形態では、ソルビトールは５．０％（ｗ／ｖ）の量で存在する。
【００８１】
さらに、本発明の溶液製剤は、アミノ酸、その誘導体および塩、ポリマー安定化剤およびタンパク質安定化剤から選択された安定化剤を含まないことが好ましい。
ポリマーＧ−ＣＳＦ結合体を含む本発明の製剤は、注射（皮下、静脈内または筋肉注射）または経皮、粘膜、鼻、または肺投与等の非経口経路で通常投与されるが、経口投与であってもよい。
【００８２】
ポリマーＧ−ＣＳＦ結合体は、通常、１．０〜３０．０ｍｇ／ｍｌの濃度、好ましくは５．０〜２０．０ｍｇ／ｍｌの濃度、最も好ましくは８．０〜１２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤中に存在する。好ましい実施形態では、ポリマーＧ−ＣＳＦ結合体は、１０．０ｍｇ／ｍｌの量で存在するＰＥＧ−ＳＡ−ＧａｌＮＡｃ−Ｇ−ＣＳＦである。
【００８３】
好ましい実施形態では、製剤は、活性成分としてのポリマーＧ−ＣＳＦと、界面活性剤
と、緩衝液と、張性改変剤と、ナトリウムイオンと、水とを含み、他の成分は含まない。最も好ましくは、本発明の水性製剤は、活性薬剤としての糖ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦと、界面活性剤としてのポリソルベート２０およびポリソルベート８０のうちの少なくとも一方と、張性改変剤としてのソルビトールおよびマンニトールのうちの少なくとも一方と、緩衝液としての酢酸塩と、ナトリウムとを含み、他の賦形剤を含まない。
【００８４】
本発明の別の態様では、上述した本発明の水性製剤は、小児への使用に適しした稀釈水性製剤を得るために希釈される。子供の治療に適した稀釈液は、上記の本発明の溶液を１：２〜１：８に希釈することにより得られる。
【００８５】
本発明はさらに、本発明の水性製剤または該水性製剤から希釈によって得られる希釈溶液を備えた医薬容器に関する。適切な医薬容器は先行技術から理解される。容器は、例えば、注射器、ガラス瓶、輸液ボトル、アンプルまたはカルプルであってよい。好ましい実施形態では、容器が注射器である場合、注射器は針保護システムを備えている。先行技術から周知のそのような針保護システムは、損傷の危険性を減らすよう支援する。別の実施形態では、容器は注入ペン内のカルプルである。
【００８６】
本発明はさらに、本発明の水性製剤を製造する方法であって、活性薬剤としてのポリマーＧ−ＣＳＦ結合体を、４．５〜５．５の範囲のｐＨを有し界面活性剤とさらには医薬賦形剤とを含む水性製剤へと調合することを含む方法に関する。
【００８７】
別の態様では、本発明は、好中球減少症の治療または予防における本発明の水性製剤の使用に関する。さらに、本発明の水性製剤は、有利には、神経障害の治療または予防に、または骨髄移植に関して使用することが可能である。一般に、本発明の医薬溶液は幹細胞の動員に有用である。
【００８８】
本発明の医薬液体の製剤は、非常に良好な貯蔵安定性を示すことが判明した。本発明の範囲内では、用語「貯蔵安定性」とは、活性なポリマーＧ−ＣＳＦの含量が２５℃で製剤を３ヶ月貯蔵した後でも最初の濃度の８０％以上にいまだ達することを意味する。好ましくは、２５℃で３ヶ月貯蔵した後に、Ｇ−ＣＳＦ活性の残りの含量は最初の活性の少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％に達する。
【００８９】
ポリマーＧ−ＣＳＦ結合体の活性は、Ｇ−ＣＳＦに関する先行技術に記載されているため、従来の活性試験によって決定することが可能である。例えば、Draft Monographie "Filgrastim Concentrated Solution" PharmEur. Vol.19, No.l, Jan. 2007, or Stute, N., et al. "Pharmacokinetics of subcutaneous recombinant human granulocyte colony-
stimulating factor in children 1" (1992) Blood 79 (11), pages 2849-2854参照されたい。
【００９０】
インビトロにおけるＧ−ＣＳＦ活性の測定は、Shirafuji, N. et al. 1989, A new bioassay for human granulocyte colony-stimulating factor (hG- CSF) using murine myeloblasts NFS-60 cells as targets and estimation of its levels in sera from normal healthy persons and patients with infectious and hematological disorders, Exp.
Hematol. (1989) 17, 116-119に記載されている。インビボにおけるＧ−ＣＳＦ活性の測定については、例えばTanaka, H. et al. 1991, Pharmacokinetics of recombinant human granulocyte colony- stimulating factor conjugated to polyethylene glycol in rats, Cancer Research (1991) 51,3710- 3714に記載されている。Ｇ−ＣＳＦ活性の測定に関する試験が記載されたさらなる刊行物には米国特許第６，５５５，６６０号および Nohynek, G.J. et al.1997, Comparison of the potency of glycosylated and nonglycosyl
ated recombinant human granulocyte colony- stimulating factors in neutropenic and non-neutropenic CD rats, Cancer Chemother. Pharmacol. (1997) 39, 259-266がある。
【００９１】
製剤に使用されるポリマーＧ−ＣＳＦ結合体の純度は、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９９％、最も９９％よりも高い。純度の程度はＨＰＬＣ分析により決定できる。そのような分析を行なうのに適した材料およびプロトコルは、ＶｙｄａｃまたはＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（http ://www. tosohbioscp.de）等の商用供給業者から得ることができる。
【００９２】
本発明の溶液を調合するための成分は、従来の供給業者から、例えばＳｉｇｍａまたはＭｅｒｃｋ等の会社から得ることができる。
本発明の製剤の生産は従来の方法により行なうことができる。製剤の成分は、水性緩衝液に溶解させることが可能である。代わりに、結合体を、精製プロセスの結果としての水性緩衝液の形で得てもよい。
【００９３】
最後に、完成した液体製剤は適切な医薬容器へ充填され、投与されるまで保存される。
以下の実施例は、本発明の範囲を限定せずに本発明を例証するものである。  実施例
実施例１．Ｇ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧの調製
以下の実施例では、酵素の同時の相加を使用して、（ａ）次の工程で使用される前に各中間生成物が精製される２つの連続工程からなる方法、および（ｂ）１つの工程からなる方法、におけるＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧの調製を説明する。
【００９４】
ａ．二つの工程からなる方法
ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２を用いたＧ−ＣＳＦおよびＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃからのＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ（ｐＨ６．２）の調製
Ｇ−ＣＳＦ（９６０μｇ）のパッケージされた３．２ｍＬの緩衝液を限外濾過フィルタ（ＭＷＣＯ５Ｋ）を使用して濃縮し、次に、１ｍＬの２５ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．２、０．００５％ＮａＮ3）で再構成した。その後、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（６ｍｇ、９
．２４ｍＭ）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（４０μＬ、０．０４Ｕ）、および１００ｍＭ  ＭｎＣｌ2（４０μＬ、４ｍＭ））を加え、生じた溶液を室温でインキュベートした。
【００９５】
２４時間後、ＭＡＬＤＩにより反応が完了したことが示された。反応混合物を、ＳＥＣ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５およびＳｕｐｅｒｄｅｘ２００）とＰＢＳ（リン酸緩衝液、ｐＨ４．９および０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０）を含む溶出緩衝液を使用してＨＰＬＣ精製に直接かけた。Ｇ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃの採集ピークを、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ５ＫＤａ
ＭＷＣＯフィルタを使用して約１５０μＬに濃縮し、ＰＢＳ（リン酸緩衝液（ｐＨ４．９および０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０）を用いて１ｍｌに体積を調節した。最終タンパク質濃度は１ｍｇ／ｍＬ（Ａ280）、収率は１００％であった。サンプルを４℃で保存した
。
【００９６】
精製したＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０ＫＤａ）およびマウスＳＴＯＧａｌＮ  Ａｃ−ＴＩ（ｐＨ６．２）を用いたＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧの精製
１ｍｇのタンパク質を含むＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ溶液を、２５ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．２、０．００５％ＮａＮ3）へ緩衝液を交換し、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０
ＫＤａ）（５ｍｇ、０．２５μｍｏｌ）を加えた。溶解後、ＭｎＣｌ2（１００μＬ、１
００ｍＭ溶液）およびＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉ（１００μＬ（マウス酵素）を加え、反応混合物を３２℃で３日間ゆっくり振動させた。反応混合物を、限外濾過（ＭＷＣＯ５Ｋ）で濃縮し、２５のｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．９）で１回緩衝液を交換し、次に、全量１
ｍＬに濃縮した。その後、生成物を、保持時間１３〜１８分のＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａ：２５ｍＭ  ＮａＯＡｃ＋０．００５％トゥイーン−８０  ｐＨ４．５、Ｂ：２５ｍＭ  ＮａＯＡｃ＋０．００５％トゥイーン−８０  ｐＨ４．５＋２Ｍ  ＮａＣｌ）と、保持時間８．６分（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５、流量１ｍｌ／分）のＳＥＣ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５；ＰＢＳ−ｐＨ７．２、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ８０）を使用して精製した。所望の分画を採集し、０．５ｍＬに濃縮し、４℃で保存した。
【００９７】
ｂ．一つの工程からなる方法
マウスＳＴｏＧａｌＮＡｃ−Ｉ（ｐＨ６．０）を用いたワンポットプロセス
Ｇ−ＣＳＦ（９６０μｇのタンパク質、３．２ｍＬの生成物調合緩衝液に溶解）を、限外濾過（ＭＷＣＯ５Ｋ）で０．５ｍｌまで濃縮し、２５ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０、０．００５％  ＮａＮ3）で全量約１ｍＬまたはタンパク質濃度１ｍｇ／ｍＬに再構築
した。その後、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（６ｍｇ、９．２１μｍｏｌ）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（８０μＬ、８０ｍＵ）、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０ＫＤａ）（６ｍｇ、０、３μｍｏｌ）およびマウス酵素ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉ（１２０μＬ）および１００ｍＭ  ＭｎＣｌ2（５０μＬ）を加えた。溶液を３２℃で４８時間振動させ、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅで標準クロマトグラフィ条件を使用して精製した。全量で０．５ｍｌのタンパク質（Ａ280）または約５０％の全収率が得られた。生成物の構造をＭＡＬＤＩおよびＳＤＳ−
ＰＡＧＥの両方を用いた分析により確認した。
【００９８】
ニワトリＳＴｏＧａｌＮＡｃ−Ｉ（ｐＨ６．０）を用いたワンポットプロセス
１４．４ｍｇのＧ−ＣＳＦを最終量３ｍLに濃縮し、２５ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６
．０、０．０５％  ＮａＮ3、０．００４％ Ｔｗｅｅｎ８０）で緩衝液を交換し、体積を１３ｍＬに調節した。その後、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（９０ｍｇ、１５０μモル）、ＧａｌＮＡｃＴ２（０．５９Ｕ）、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０ＫＤａ（９０ｍｇ）、ニワトリＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉ（０．４４Ｕ）および１００ｍＭ  ＭｎＣｌ2（６００μＬ）
を加えた。得られた混合物を室温で６０時間静置した。その後、反応混合物を限外濾過（ＭＷＣＯ５Ｋ）と遠心分離を使用して濃縮した。残留物（約２ｍＬ）を２５ｍＭ  ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解し、再び５ｍＬの最終体積に濃縮した。このサンプルを、保持時間約１０〜２３分のＳＰセファロース、ＳＥＣ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５、１７分、流量０．５ｍｌ／分）および追加のＳＥＣ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００、２３分、流量０．５ｍｌ／分）を使用して精製し、３．６ｍｇ（２５％の全収率）のＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０ＫＤａ（Ａ280およびＢＣＡ法）を得た。
【００９９】
実施例２．液体ポリマー−Ｇ−ＣＳＦ結合体（ＰＥＧ−ＳＡ−ＧａｌＮＡｃ−Ｇ−ＣＳＦ）製剤
糖ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ（ＰＥＧ−ＳＡ−ＧａｌＮＡｃ−Ｇ−ＣＳＦの構造を有する結合体）を含む液体製剤を、以下の成分を酢酸緩衝液中で調合することにより調製した。
【０１００】
【表１】
0005570988.tif 000008
組成物のｐＨ値はＮａＯＨの添加により調整した。成分はすべて欧州薬局方（Ｐｈ．Ｅｕｒ．）に従った品質である。
【０１０１】
さらに、ｐＨ４．５またはｐＨ５．５のいずれかを有し、それに比例してより少ないまたは多いナトリウムをそれぞれ有する同じ組成物を調製した。ｐＨ４．０（Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標）製剤のように）を有する比較製剤も調合した。
【０１０２】
実施例３．本発明による製剤の安定性試験
ｐＨ４．５、５．０および５．５の組成物を、５００μｌ／ガラス瓶に等分割し、２〜８℃および２５℃で保存した。１、２、３、４．５、６、８、１２および１５か月後に、サンプルを以下の表に与える試験パラメータに関して試験した。
【０１０３】
ｐＨ５．０を有する組成物に対する予測の仕様は以下の通りであった：
【０１０４】
【表２】
0005570988.tif 000009
Ｔ＝０ヶ月、１か月、２か月、３か月、４．５か月、６か月、８か月、１２か月、および１５か月に試験したサンプルはすべて、予測された仕様を満たしていた。このことは、糖ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦを含み、かつ４．５、５．０または５．５のｐＨを有するすべての組成物で判明した。
【０１０５】
本発明の組成物を、２つの比較製剤：Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標）（ｐＨ４．０）および４．０のｐＨを有する糖ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ（ＰＥＧ−ＳＡ−ＧａｌＮＡｃ−Ｇ−ＣＳＦ）の組成物：と比較した。その結果、糖ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦを含み４．０ｐＨを有する比較溶液と比較して、４．５、５．０のおよび５．５のより高いｐＨ値を有する製剤はより良好な貯蔵安定性を示すことが判明している。これらの収集データによって、ｐＨ値がより高いと糖ＰＥＧ結合の酸加水分解が予防されると結論することが可能である。
【０１０６】
さらに、本発明の製剤が、Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標）として知られるＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ結合体の安定性に匹敵する安定性を有することが観察された。
【配列表】
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