(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガラス繊維膜上に細胞を捕捉すること、
細胞を、緩衝液で洗浄し、洗浄物を真空、正圧、又は遠心分離により除去すること、
前記細胞を、細胞膜を溶解するが核を溶解しない低刺激性洗浄剤と接触させ、細胞膜の透過性を高めること、
細胞質を、真空、正圧、又は遠心分離により細胞から放出すること、
前記ガラス繊維膜をリン酸緩衝生理食塩水で２又は３回洗浄することにより、残余の細胞質分画を洗い落として細胞質ｍＲＮＡを除去すること、
前記細胞質分画を洗い落としたガラス繊維膜を、核膜を溶解する溶解緩衝液と、核を溶解するのに十分な時間接触させること、
前記核膜を溶解する溶解緩衝液に溶解した核膜及び核内容物を、真空、正圧、又は遠心分離によりガラス繊維膜から放出して核溶液を得ること、
を含み、前記細胞の洗浄工程は、前記膜上で実行される、核内ＲＮＡの抽出方法。
【請求項２】
前記細胞の洗浄工程は、真空濾過により実行される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】［発明の分野］
核ｍＲＮＡの単離方法を開示する。特に本方法は、フィルターまたは膜上に細胞を捕捉すること、細胞を透過可能にすること、核を単離することを含む。次に核を溶解し、抽出物を回収する。
【０００２】［発明の背景］
ｍＲＮＡを単離する従来の方法は、細胞から全ｍＲＮＡを単離する。この方法で単離されたｍＲＮＡは、サイトゾルｍＲＮＡおよび核ｍＲＮＡを含む。発現の定量化および分析のためには、細胞質中で分解されつつあるｍＲＮＡでない、新規合成ｍＲＮＡだけを単離することが重要である。本発明の方法では、遺伝子の発現レベルまたは遺伝子の発現における変化の「真の」読み取りができる。
【０００３】  遺伝子発現分析は、機能的ゲノム学の分野において大きな関心事である。目下、ヒトゲノムがシーケンシングされており、疾患に関与する遺伝子および突然変異を特定することが大いに必要とされている。これらは、上方制御または下方制御される遺伝子か、あるいは多型性を有する遺伝子であり得る。これらの遺伝子を分析するために用いられる方法の多くが、ｍＲＮＡの単離を含む。例えばＤＮＡマイクロアレイチップは、数千の異なる遺伝子の発現プロフィールを同時に分析することができる。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、個々の遺伝子の発現を定量化するために用いられる非常に高感度の方法であり、より多くの労働集約型ノーザンブロット分析に代わって急速に用いられている。高感度遺伝子検出に利用可能な、多数のその他の非ＰＣＲ技法、例えば核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）および分枝鎖ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）増幅が挙げられる。
【０００４】  これらの、およびその他の検出技法の多くが開発され、商業化されてきたが、出発物質は常に、細胞試料または組織試料からの全ＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋ＲＮＡである。細胞全体からの全ＲＮＡまたはｍＲＮＡが用いられる場合、得られるものは、転写産物の混合物ならびにサイトゾルからの分解産物の混合物である。このために、ｍＲＮＡの消化が進行中である条件下で、新規のｍＲＮＡの発現を検出するのは困難である。さらに、大量のｍＲＮＡがすでに存在する場合、ｍＲＮＡの量のわずかな変化を検出することは困難なため、これらの検出技法の感度は低い。
【０００５】  未熟ｍＲＮＡの転写は核内で起こり、そこではポリ（Ａ）テールが付着され、必要に応じてスプライシングが起こる。この後、成熟ｍＲＮＡ分子は細胞質に移動し、翻訳され、分解される。核中のｍＲＮＡの量がｍＲＮＡの転写（分解でない）量に直接関連するため、核分画中の特定のｍＲＮＡ（または核ＲＮＡ）の量を測定するべく、核分画を精製する試みがなされてきた。核分画を特異的に分析するための従来の試みとしては、特定遺伝子の転写のレベルを測定する核ラン−オンアッセイが挙げられる。しかしながら、このアッセイの使用に対する主要な障害は、必要とされる時間、リボヌクレアーゼの混入を裂けるために非常に注意深く取り扱う必要があること、ならびに放射性廃棄物の発生である。核分画の精製のためのその他の技法は、長時間の超遠心分離、または労働集約型マイクロインジェクションを用いて、核ｍＲＮＡの精製および分析を実施する。これらの方法は、ハイスループットでなく、精確な定量化に適していない。さらに、例えば超遠心分離をしている間、核ｍＲＮＡが保存されるか否かは明らかでない。
【０００６】  したがって、ｍＲＮＡの核分画を単離および分析するための迅速な、高感度の、信頼できる、かつハイスループット方法が必要とされている。この方法は、遺伝子の「真の」転写レベルの分析を可能にする。
【０００７】［発明の概要］
上記を考慮して、本発明の一態様において、細胞からのＲＮＡの単離方法が提供される。本方法は、（ａ）フィルターまたは膜上に細胞を捕捉すること、（ｂ）細胞を透過可能にして、核を単離すること、および（ｃ）核膜を溶解して、核ＲＮＡを、通常は核ｍＲＮＡを回収することを含む。上記においては、少なくとも以下の実施形態が含まれうる：フィルターまたは膜がガラス繊維膜であり得る；低刺激性洗浄剤を適用することにより、透過可能にしてもよい；透過可能にした細胞膜を洗い落とすことにより、核が単離され得る；洗浄が、真空濾過による洗浄であり得る；溶解緩衝液により核膜を溶解してもよい；溶解緩衝液が強力洗浄剤を含み得る；さらに、ｍＲＮＡの回収は、下流ＲＮＡ調製のための容器、フィルターまたはカラムに、透過可能にした核の内容物を移すことによるものであり得る。本発明は、上記実施形態を、単独あるいはそれらを組合せて採用することができる。
【０００８】  本発明の上記の態様によれば、新規合成（転写）ｍＲＮＡの発現は、ｍＲＮＡの消化が進行中である条件下においても検出することができる。本発明は非常にシンプルであり、従来の単離方法と比較して２〜３分余分な時間を要するだけであるが、多くの検体を処理することができる。この方法は、自動化遺伝子発現システムに容易に組み入れることができる。
【０００９】  本発明の別の態様では、特定遺伝子の転写体を同定および／または定量化するための方法が提供される。本方法は、（ａ）上記の単離方法を用いて単離ｍＲＮＡを得ること、（ｂ）上記のプレート、フィルターまたは膜上でｍＲＮＡを逆転写すること、および（ｃ）当該遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを実施することを含む。
【００１０】  別の実施形態では、ＤＮＡ修復過程に関与する遺伝子を同定または定量化する方法が提供される。本方法は、（ａ）ＤＮＡ損傷剤で細胞を処理すること、（ｂ）上記の単離方法により単離ＲＮＡを得ること、（ｃ）ｍＲＮＡを逆転写すること、および（ｄ）ＤＮＡ損傷により、転写が上方制御された、または活性化された遺伝子を同定することを含む。上記において、一実施形態では、同定はＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、ＲＡＰ  ＰＣＲ、ｄｄＰＣＲ、サブトラクションおよびアレイまたは遺伝子チップ分析からなる群から選択される方法による同定であり得る。
【００１１】  本発明は、以下の方法に有効に適用することができる：
細胞中での遺伝子発現を検出するための方法は、（ａ）フィルターまたは膜上に細胞を捕捉すること、（ｂ）細胞を細胞膜透過溶液と接触させ、細胞膜の透過性を増大させること、（ｃ）細胞質を洗浄すること、（ｄ）細胞質を洗浄した細胞を細胞溶解溶液と接触させ、核を溶解して核溶液を得ること、（ｅ）核溶液からｍＲＮＡを回収すること、および（ｆ）回収ｍＲＮＡの量に基づいて、細胞中の遺伝子発現を確認することを含む。この態様によれば、ｍＲＮＡの消化が進行中である条件下においてさえ、高精度の遺伝子発現を伴う大規模なプロセシングが実現され得る。
【００１２】  上記においては、少なくとも以下の実施形態を含み得る：フィルターまたは膜はガラス繊維膜であり得る；細胞膜透過溶液は、細胞膜を溶解するが、核を溶解しない低刺激性洗浄剤であり得る；洗浄工程はフィルターまたは膜上で実行され得る；洗浄工程は真空濾過により実行され得る；細胞溶解溶液は、核膜を溶解する溶解緩衝液であり得る；溶解緩衝液は強力洗浄剤を含み得る；ｍＲＮＡ回収工程は、オリゴｄＴ固定化固体支持体に、透過可能にした核の内容物を移すことにより実行され得る；固体支持体はプレート、フィルターまたはカラムであり得る；プレート、フィルターまたはカラムは、フィルターまたは膜が適合するような形状を有し得る；さらに、ｍＲＮＡ回収工程は、ｍＲＮＡと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド固定化固体支持体に、透過可能にした核の内容物を移すことにより実行され得る。本発明は、上記実施形態を単独、あるいは２つまたはそれ以上を組合せて採用することができる。
【００１３】  本発明のさらに別の実施形態では、細胞中での遺伝子発現を確定するための方法が提供される。本方法は、（ｉ）第１の生物学的試料から細胞を収集すること、（ｉｉ）フィルターまたは膜上に細胞を捕捉すること、（ｉｉｉ）細胞を細胞膜透過溶液と接触させ、細胞膜の透過性を増大させること、（ｉｖ）細胞質を洗浄すること、（ｖ）細胞質を洗浄した細胞を細胞溶解溶液と接触させ、核を溶解して核溶液を得ること、（ｖｉ）核溶液からｍＲＮＡを回収すること、（ｖｉｉ）第２の生物学的試料からの細胞を用いて工程（ｉ）〜（ｖｉ）を反復すること、および（ｖｉｉｉ）工程（ｖｉ）および（ｖｉｉ）においてそれぞれ回収された特定種のｍＲＮＡの量の変化に基づいて、細胞中の遺伝子発現を確定することを含む。上記において、一実施形態では、指定された処理は、第１の試料でなく、第２の試料に適用され得た。この方法は、指定された目的のための候補化学物質の効力の確定のために有効に用いることができる。
【００１４】  本発明、および従来技術を超えて達成された利点を要約するために、本発明の特定の目的および利点を説明してきた。もちろん、このような目的または利点のすべてが、必ずしも本発明の任意の特定の実施形態にしたがって達成され得るというわけではないことを理解されるべきである。したがって、例えば、本発明は、本明細書中で教示されたような１の利点または利点群を達成するかまたは最適化する方法で具体化または実行され得るが、本明細書中で教示されまたは示唆され得るような他の目的または利点を達成する必要はないことを当業者は認識するであろう。
【００１５】  本発明のさらなる態様、特徴および利点は、以下の好ましい実施形態の詳細な説明から明らかになるであろう。
【００１６】  本発明のこれらの特性または他の特徴を好ましい実施形態の図面を参照して説明するが、これらは本発明を例示するものであって、限定することを意図しない。
【００１７】［好ましい実施形態の詳細な説明］
核ｍＲＮＡを単離するための迅速、簡単な方法であって、固体支持体上に細胞を捕捉すること、細胞を透過可能にすること、および核を単離することを含む方法が開示される。核が溶解され、核ｍＲＮＡを含む抽出物が回収される。本方法は、ハイスループット精製、および遺伝子の「真の」発現レベルの分析を可能にする。本方法は、分解産物の妨害を受けることなく、遺伝子発現におけるわずかな変化を同定することも可能にする。
【００１８】  図１を参照すると、本手順における第１の溶解は、核（新規合成ｍＲＮＡを含有する）を無傷のまま残しつつ、細胞膜および細胞質（ミトコンドリアおよびｍＲＮＡ分解産物、ｔＲＮＡならびにｒＲＮＡを含む）の除去を可能にする、低刺激性溶解である。細胞は溶解するが、核は溶解しないように、低刺激性洗浄剤が用いられ得る。用いられ得る洗浄剤の例としては、ＮＰ−４０、トリトン−Ｘ１００およびサポニンが挙げられるが、これらに限定されない。低刺激性洗浄剤は、激しく混合せずに細胞を透過可能にするのに十分な時間、細胞上に残留させる。短時間の低刺激性洗浄剤の使用は、核膜を溶解または透過可能にすることなく、細胞を透過可能にさせ、実際、核に対する損傷はほとんどまたは全く認められない。さらに本方法は、すべての細胞に溶液を曝露することを可能にして、これがｍＲＮＡのより良好な収率をもたらし、リボヌクレアーゼの不活性化が必要とされない。
【００１９】  次の工程は、通常は、核を溶解するのに十分な時間、強力洗浄剤を用いて核を溶解することを含む。穏やかに混合することにより、すべての核を溶解溶液に曝露し、リボヌクレアーゼを不活性化することができるが、しかしながらこの手順は必要であるとは考えられず、有益でもなく、実際、その手順を行うことにより収率が低減することがある。
【００２０】  その結果得られたｍＲＮＡは、ｍＲＮＡを必要とする任意の方法に用いることができるが、しかしながら本開示方法は、遺伝子の発現を分析するために特に有益である。これは、分析対象であるｍＲＮＡが、核内で新規に合成されるｍＲＮＡであるためである。通常は、ｍＲＮＡの精製方法は、細胞質中に見出される任意の分解産物を含む全ｍＲＮＡを用いる。したがって本発明の方法は、異なる細胞条件下で遺伝子により産生される転写体を分析するために特に有益である。転写体のサイズ、ならびにレベルを、より精確に同定することができる。
【００２１】  好ましい実施形態の方法により生産されるｍＲＮＡを使用することは、ｍＲＮＡ発現を分析するための任意の方法を含む。これらの例としては、ＰＣＲ、ｃＤＮＡライブラリー生成および分析、遺伝子チップおよびマイクロアレイの分析、ｄｄＰＣＲ（および相当するその他の技法）、ならびに定量的ＰＣＲが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】  溶解手順を実施する前に、細胞は固体支持体に適用される。固体支持体は、電荷により、共有結合的にまたは疎水的に細胞の付着を可能にするか、あるいは単に細胞に対する支持を提供し得る。固体支持体の例としては、膜、フィルター、ガラスプレート、紙、プラスチック、ビーズ、繊維性ポリエステルおよびカラムが挙げられる。使用する固体支持体の選択は、ｍＲＮＡに関する目的に依存する。例えばｍＲＮＡを、蛍光標識し、蛍光顕微鏡により分析しようとする場合、ガラススライドが用いられ得る。ｍＲＮＡを定量的ＰＣＲのために用いようとする場合、フィルターを有するマイクロウェルプレート、あるいはチップまたはアレイが用いられ得る。
【００２３】  初期細胞溶解
初期細胞溶解においては、細胞質膜を透過可能にするかまたは除去するが、核を溶解しない任意の物質、試薬または緩衝液を用いることができる。溶解を実施している間、細胞質が核と接触したままであって、核を保護することは、有益であり得る。溶解のために用いることができる緩衝液の例としては、低刺激性洗浄剤、ＰＢＳまたはハンクス平衡塩溶液を含有する緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。通常は、第１の溶解が低刺激性であるために、混合はほとんどまたは全く行わない。細胞は、細胞膜のほかに細胞壁を有し、細胞膜を除去する前にまたは同時に細胞壁を除去するための付加的工程が必要であることがある。原核生物細胞に関しては、核溶解は必要でなく、初期溶解は、細胞壁の除去を行っても、行わなくても十分である。
【００２４】  細胞壁除去
必要な場合には、細胞壁は、最初の溶解の前に、または同時に除去される。動物細胞、昆虫細胞および原生動物は、通常は細胞壁を有しない。したがってそれらは、細胞壁または細胞壁型構造を除去するための前処理を必要としない。しかしながら、ほとんどの細菌は、ペプチドグリカンを含む細胞壁を有する。真菌はセルロースまたはキチンを含む細胞壁を有し、植物はセルロース、リグニン、ペクチンおよび／またはケラチンを含む細胞壁を有する。しかしながら細胞膜を無傷のまま残しつつ、細胞壁を除去する方法は既知であり、数十年間用いられてきた。これらの方法は、スフェロプラスト、プロトプラストまたはＬ形態と称されることがある変異体を産生する。本方法の概略を以下に記載する。しかしながらこのような方法は、当業者により特定され得る。
【００２５】  細菌によって種々の型の細胞壁が存在し、それらは細胞壁がないもの（マイコプラズマ）から、内生胞子と称される破壊するのが困難な非常に強力な保護構造を有するものまでさまざまである。真正細菌の細胞壁はしばしば、グラム陽性またはグラム陰性と呼ばれ、種々の菌株による処理に対する細胞の反応に関連する。グラム陽性菌は、ペプチドグリカン層および細胞膜のみを有し、一方、グラム陰性菌は、外膜、ペプチドグリカンを含む細胞壁および内膜を有する。抗酸菌、例えばマイコバクテリア属は、通常は細胞壁に脂質構成成分を含む。各細胞壁を除去するためには、それぞれわずかに異なる処理が必要である。しかしながら、すべての種類の細胞壁を除去するためのそれぞれの方法が存在する。
【００２６】  Ｌ形態、スフェロプラスト、およびプロトプラストを生産する細菌から細胞壁を除去する方法は、長年既知であった。その方法は、通常は、細胞壁構成成分を分解する酵素の使用、およびその結果得られる、細胞壁を有さない細胞の浸透圧を安定化する緩衝系の使用を含む。あるいは細菌を、細胞壁を分解する抗生物質を含む培地中で増殖し、その結果生じるＬ−形態、スフェロプラストまたはプロトプラストの浸透圧を安定化する培地を用いる。用いられてきた酵素としてはリゾチームが挙げられるが、これに限定されない。用いられてきた抗生物質としては、ペニシリン、例えばアンピシリン（１０Ｘ  ＭＩＣ（Hornsten, EG, et al. Diagn. Microbiol Infect Dis 1989 Mar-Apr; 12(2):171-5））およびグロボマイシン（Globomycin）（Inukai M., et al. J. Antibiot (Tokyo) 1978 May; 31(5): 410-20）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】  細菌が付加的に莢膜を有する場合、莢膜の除去の方法が当該技術分野で既知であり、その例としては、種々の温度での１時間のインキュベーションにおいて、水およびＰＢＳを使用することが挙げられる（Gentry, et al. Am J. Vet. Res. 1982 Nov; 43(11):2070-3）。グラム陰性菌、例えばグルコノバクター属（Gluconobacter）、アセトバクター属（Acetobacter）、エルウィニア属（Erwinia）、シュードモナス属（Pseudomonas）、およびコリネバクテリウム属（Corynebacterium）からのスフェロプラストの産生のための標準技法は、トリス−スクロース−ＥＤＴＡ−リゾチームの使用を含む（Verma, V. et al. Biotechniques 1989 May; 7(5):449-52）。グラム陽性菌、例えばバシラス属（Bacillus）およびクロストリジア属（Clostridia）は、プロトプラストを産生するために多少強い処置を要する（Jacobson, ED, et al. J. Bacteriol. 1975 Oct; 124(1): 445-8; およびDurban E. et al. Can J. Microbiol 1974 Mar; 20(3): 353-8）。塩化リチウムの使用により、ペスト菌（エルジニア属（Yersinia））に関してもスフェロプラストが産生され得る（Gramotina LI., et al. Antibiotiki 1977 Jul; 22(7):634-9）。グラム陰性菌、例えばＥ．ｃｏｌｉに関する他の方法は、リゾチームおよびＥＤＴＡを用いる（Birdsell D.C., et al. J. Bacteriol 1967 Jan; 93(1):427-37）。アグロバクテリウム属（Agrobacterium）は若干異なる方法を要し（Beardsley, et al. Cancer Res. 1966 Aug; 26(8):1606-10）、ストレプトミセス属（Streptmyces）は、リゾチームおよびペニシリンを補充した液体培地中でスフェロプラストを生産する（Innes C.M., et al. J. Appl. Microbiol. 2001 Mar;90(3):301-8）。
【００２８】  真菌は、キチンおよび／またはセルロースを含む細胞壁を有する。通常は、酵素を用いて細胞壁を除去し、その過程は、浸透圧安定性を可能にする培地または緩衝液中で実行される。細胞壁を除去するために用いられる酵素としては、セルロースおよびキチナーゼ（Masuda, S. et al. Biosci Biotechnol Biochem 2001 Aug; 65(8):1883-5）が挙げられるが、これらに限定されない。酵母は、変異体型の細胞壁を有する型の真菌である。酵母細胞は、還元剤、ならびに担子菌類（Basidiomycete）から単離される１，３β−グルカナーゼまたはそれに匹敵する酵素の混合物を用いて、スフェロプラストを生産し得る（Havelkova, M. Arch Mikrobiol 1973 Mar 2; 90(1): 77-88）。この方法は、子嚢菌類(Ascomycetes)およびいくつかの不完全真菌に関して用いられ得る。その他の真菌は、二次酵素である１，４−α−グルカナーゼの添加を要した。
【００２９】  原生動物、例えばアメーバは、細胞壁を有しない。ゾウリムシ、プラスモジウム、ジアルジア、およびその他の原生動物は、外皮を有する。アカパンカビ属（Neurospora）のような原生動物は、外皮を有しているにもかかわらず、スフェロプラストを生産する（Scarborough GA., et al. Anal Biochem 1974 Oct; 61(2):441-7）。
【００３０】  植物細胞は、１つまたは複数の以下の物質：ペクチン、リグニン、およびケラチンを含み得る強力な細胞壁を有する。したがって、スフェロプラストを生産するためには、細胞壁構成成分を分解し得る酵素が培地中で用いられて、このことが浸透圧を安定化する。用いられる通常の酵素としては、リグニナーゼ、ペクチナーゼおよびケラチナーゼが挙げられるが、これらに限定されない（Levit, M.N., et al. Bioorg Khim 1992 Mar; 18(3): 309-45）。
【００３１】  組織からの単一細胞の単離
本明細書中に開示された方法に関しては、通常は単一細胞を用いる。したがって、組織生検または器官からの細胞が用いられる場合、最初の溶解を膜に適用する前に、通常は、細胞外マトリックスが除去され、細胞が分離される。細胞外マトリックスの除去および各細胞の単離をするための技術は既知であり、組織培養の工程で用いられる。それは、ＥＤＴＡおよびトリプシンの使用を含む。あるいは組織および細胞間マトリックスの解離を引き起こす任意の酵素または緩衝液が用いられ、その例としてはコラゲナーゼが挙げられるが、これに限定されない。
【００３２】  最終的な核溶解
核溶解工程は、元の固体支持体上で実施してもよく、あるいは核を第２の支持体、例えばｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはそれらの任意の混合物を特異的に結合する膜に移してもよい。しかしながら、前記核は無傷であるが脆弱であり、それらの移動工程を実施すると、ｍＲＮＡの収率を低減することがあるため、通常は、核は移動されない。
【００３３】
核は、ｍＲＮＡを損傷することなく、核の透過処理および溶解を可能にする任意の方法により溶解することができる。通常は、洗浄剤を激しく混合しながら用いることにより、す
べての核の完全溶解を達成する。本方法に使用可能な洗浄剤としては、ＳＤＳが挙げられるが、これに限定されない。用いられ得るその他の緩衝液または試薬としては、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＦａｓｔ ｔｒａｃｋ ｋｉｔの溶解緩衝液が挙げられる。あるいは以下の基礎構成成分またはその等価物を含有する緩衝液：ｐＨを維持するための緩衝液、オリゴ−ｄＴおよびポリＡテール間のハイブリダイゼーションストリンジェンシーを維持するための塩、膜を溶解するための洗浄剤、デオキシリボヌクレアーゼおよび／またはリボヌクレアーゼ阻害剤、例えばプロテイナーゼＫ、グアニジン、ＲＮアシンが用いられ得る。
【００３４】  次に核抽出物または核質が除去され、ｍＲＮＡ分画が種々の方法で単離され得る。分画はｍＲＮＡ特異性膜、カラム、またはビーズに適用され得る。例えばオリゴ−（ｄＴ）膜、カラム、またはフィルターは、核質からｍＲＮＡを精製
することを可能にする。あるいはデオキシリボヌクレアーゼ、およびフェノールまたはその等価物を用いて、タンパク質およびＤＮＡを除去し得る。
【００３５】  好ましい実施形態では、９６ウェルＧＦ／Ｃガラス繊維フィルタープレート（例えばリボキャップ（RiboCap（登録商標））フィルタープレート、RNAture, CA）が、本方法に用いられる。細胞を捕捉し、低刺激性洗浄剤で細胞を処理した後に、核を支持することができる任意のフィルタープレートが用いられ得る。フィルタープレートは第一に、細胞の固体支持体として用いられるガラス繊維フィルター膜を含む。細胞質および細胞膜または細胞壁構成成分は、真空濾過の使用により洗い落とされる。この方法により、核ｍＲＮＡの損失を最小限にしつつ、洗浄を実施することができる。これは、非常にシンプルなハイスループット方法も実現する。
【００３６】  さらに好ましい実施形態では、オリゴ−（ｄＴ）プレート（例えばジーンプレート（GenePlate（登録商標）），  RNAture, CA）を用いて、ｍＲＮＡを捕捉することができる。ジーンプレート（GenePlate（登録商標））は、オリゴ−（ｄＴ）配列が共有結合的に固定化されているマイクロタイタープレートである。それは、蛍光指示色素（Ｙｏｙｏ−１）を添加することにより、定量化の実施を容易にする。装置および定量化方法は、米国特許出願第０８／７７２，１５０号（１９９６年１２月２０日出願）（この記載内容は、参照により本明細書中に援用される）に記載されている。特定の配列がマイクロタイタープレート上に固定化されると、その配列と相補的な配列を有するｍＲＮＡが捕捉され得る。上記において、フィルタープレートはマイクロタイタープレートに適合し、両者が同数のウェルを有し、濾過および捕捉を連続的に実行することができることが好ましい。
【００３７】  従来の方法と比較した場合の本明細書中に記載した方法の分析を、表１に示す。この分析から、本方法はハイスループット技法、さらに自動化技術にも容易に変換することができるが、従来の方法はこのような適用のためには面倒で且つ時間がかかりすぎることが明らかである。
【００３８】
【表１】
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【００３９】  本方法の適用
本方法は、遺伝子チップおよびマイクロアレイの分析、ＰＣＲによる診断分析、ｃＤＮＡライブラリーの生成、ノーザンブロット、ならびに示差的表示またはサブトラクションライブラリー技法に適用することができる。遺伝子を同定する、または遺伝子の代替的転写体を単離する場合に、ｍＲＮＡの分解産物が誤った結果、例えば分解産物としてのみ存在するより小型の転写体を提供することがあるため、特に有益である。
【００４０】  以下の実施例において、本方法を実施し、その結果得られるｍＲＮＡを、ミトコンドリアＲＮＡ（細胞質構成成分）の混入に関して試験する。その結果得られる核ｍＲＮＡの量を、−アクチンのＰＣＲにより試験する。最後に、その結果得られる核ｍＲＮＡの質を、細胞をＵＶ光で照射する実験を実施することにより試験し、２つの既知の遺伝子産物ｐ２１およびｊｕｎＢのレベルを調査する。
【００４１】  実施例
以下の実施例に用いられる方法、および分析される方法は、ガラス繊維ＧＦ／Ｃ膜上に細胞を捕捉すること、緩衝液で洗浄すること、および真空、正圧、または遠心分離などのような方法で洗浄物を除去することを含む。一実施形態では、細胞を第１の溶解緩衝液でインキュベートし、サイトゾル分画を真空、正圧、または遠心分離により放出して、サイトゾル分画をＰＢＳで２〜３回洗い落として、サイトゾルｍＲＮＡを除去した。第２の溶解緩衝液を適用し、核を溶解するのに十分な時間インキュベートした。第２の溶解緩衝液を真空、正圧、または遠心分離により放出して、核分画を明らかにした。
【００４２】  本方法は、RNAtureからのリボキャップ（RiboCap（登録商標））フィルタープレートおよびジーンプレート（GenePlate（登録商標））を有利に適合させて用いることにより、ハイスループット化することができ、かつ自動化することができる。したがって以下の実施例は、RNAtureからのリボキャップ（RiboCap（登録商標））フィルタープレートおよびジーンプレート（GenePlate（登録商標））の適合を概説し、精製レベルを分析した。用いた細胞、装置および緩衝液は以下の通りであった：ヒト組織球細胞株Ｕ９３７、ヒト赤白血病細胞株Ｋ５６２、ｊｕｎ−Ｂプラスミド（ATCC, Manassas, VA, USA）、リボキャップ（RiboCap（登録商標））、ジーンプレート（GenePlate）（商標）、ウォッシュバッファー（WASH BUFFER）、ライシスバッファー（LYSIS BUFFER）（RNAture, Irvine, CA）。
【００４３】  実施例１
リボキャップ（RiboCap（登録商標））フィルタープレートを用いた核の単離
細胞を捕捉するために、リボキャップ（RiboCap（登録商標））フィルタープレートを用いた（RNAture, Irvine, CA）。リボキャップ（RiboCap）は．ガラス繊維フィルター膜を底に取付けられている９６ウェルプレートである。細胞をリボキャップ（RiboCap（登録商標））に適用し、真空濾過により膜上に捕捉した。低刺激性洗浄剤ＮＰ−４０をリボキャップ（RiboCap（登録商標））に添加して、細胞を透過可能にした。高濃度のＮＰ−４０に核膜が直接曝露されるのを避けるために、攪拌またはボルテックスせずに、リボキャップ（RiboCap（登録商標））フィルター膜上で細胞をＮＰ−４０に曝露させた。サイトゾル構成成分は、ＮＰ−４０で処理した後も細胞中に存在し、考え得る損傷から核を保護しうる。フロースルー分画を顕微鏡下で時々検査したが、無傷細胞はこの分画中に見出せなかった。さらに、洗浄溶液ＰＢＳにＮＰ−４０が含まれなかったために、核は保護されたが、細胞質構成成分は洗浄により除去された。リボキャップ（RiboCap（登録商標））と組合せたこの低刺激性溶解手法は、再現性の高いデータを提供した。
【００４４】  次に核を溶解し、実施例２に示すように、ジーンプレート（GenePlate）上でｍＲＮＡを捕捉した。
【００４５】  実施例２
ポリｄＴフィルタープレート（ジーンプレート）を用いた核からのｍＲＮＡの単離
リボキャップ（RiboCap）フィルタープレート上に適合するよう、ジーンプレート（GenePlate）（RNAture）を適宜に製造した。そこで、リボキャップ（RiboCap）プレートで核を溶解した後、ジーンプレート（GenePlate）上にリボキャップ（RiboCap）プレートを設置することにより、ｍＲＮＡをジーンプレート（GenePlate）で収集し、真空圧を用いて、ｍＲＮＡを含む核質を移した。ｍＲＮＡおよび核内容物をジーンプレート（GenePlate）上に収集した後、以下のようにｍＲＮＡを結合させて、洗浄を実施して、核内容物を除去した。
【００４６】  核の核構成成分を、１％の２−メルカプトエタノールを含有する５０μＬのLYSIS BUFFER（RNAture）を用いて放出させ、これをリボキャップ（RiboCap（登録商標））のウェルに適用して、室温で１５分間インキュベートした。次に、４℃で５分間、３，２００ｘｇでの遠心分離により、さらに、場合によっては、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで２回抽出し、エタノール沈殿させて（図２Ｃおよび２Ｄ）、溶解物をリボキャップ（RiboCap（登録商標））からポリ−（ｄＴ）を含有するマイクロプレートに移した。図２Ａおよび図２Ｂでは、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール抽出およびエタノール沈殿は実施しなかった。
【００４７】  実施例３および４において、本方法を立証した。
【００４８】  実施例３
光学顕微鏡およびＳＥＭによる細胞溶解の立証
細胞および核溶解を立証するために、本方法を以下のように実施した：Ｕ９３７細胞をリボキャップ（RiboCap（登録商標））フィルタープレートに適用して、４インチＨｇの真空圧により、ガラス繊維膜（ジーンプレート（GenePlate））上に捕捉した。サイトゾル構成成分を除去するために、１００μＬの０．１％ＮＰ−４０をウェルに適用し、室温で０、５、１５、３０および６０秒間インキュベートした。次にリボキャップ（RiboCap（登録商標））フィルタープレートを１００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。核から核内容物を放出するために、１％の２−メルカプトエタノールを含む５０μＬのLYSIS BUFFER（RNAture）をリボキャップ（RiboCap（登録商標））フィルタープレートのウェルに適用し、室温で１５分間インキュベートした。次に、４℃で５分間、３，２００ｘｇでの遠心分離により、さらに、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで２回抽出し、エタノール沈殿させて、溶解物をリボキャップ（RiboCap（登録商標））フィルタープレートからマイクロプレートに移した。
【００４９】  Ｕ９３７細胞に関して実施した光学顕微鏡検査は、細胞が依然として無傷であることを示した。図２Ａにおける結果は、以下のものを含む：陰性対照（未処理Ｕ９３７細胞、Ａ１）、０．１％ＮＰ−４０に１分間曝露した後にトリパンブルーで染色した同一細胞（Ａ２）、およびLYSIS BUFFERに曝露した後の同一細胞（Ａ３）。図２Ａ１〜２に示したように、ＮＰ−４０誘発性細胞透過を、トリパンブルー染色により確証した。興味深いことに、細胞形状は、ＮＰ−４０へ１５分間曝露した後でも、ほとんど無傷であった（図２Ａ２）。
【００５０】  細胞膜に対する損傷を可視化するために、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）により細胞表面特性を分析した。従来のＳＥＭは強真空圧を要するため、細胞表面の天然状態を可視化するのは困難である。したがって、最新モデルの弱真空圧ＳＥＭ（Hitachi S3000N）を用いた。走査ＥＭ検査は、以下のように実施した：細胞（Ｕ９３７およびＫ５６２）をｐＨ７．４の１０ｍＭのトリス中に再懸濁して、ガラススライド上に広げて、６０〜７０Ｐａの真空圧および５ＫＶの加速電圧で、Hitachi S3000N（Nissei Sangyo America, Pleasanton, CA, USA）ＳＥＭに挿入した。写真記録するために、サブシグナルＢＳＥ２イメージを用いた。図２Ｂは、未処理（×５，０００  Ｂ１）の、ならびに０．１％ＮＰ−４０に３０秒間曝露して処理したＫ５６２細胞のＳＥＭ（走査電子顕微鏡）を示す。加速電圧は５ＫＶ、真空圧は６０（Ｂ３）または７０（Ｂ１〜２）ｐａであった。
【００５１】  弱真空圧条件でも塩の結晶が観察されたが、いくつかの細胞は無塩領域に存在して、細胞表面は明らかに曝露されていた（図２Ｂ１〜３）。亀裂（図２Ｂ２）および孔（図２Ｂ３）が、ＮＰ−４０処理細胞の細胞膜上に観察された（矢印参照）。この損傷は軽度で、細胞内の核は無傷のままであったが、細胞膜は貫通していた。
【００５２】  実施例４では、核を溶解し、その溶解を立証する。
【００５３】  実施例４
核溶解の立証
実施例３の場合と同様に細胞を溶解した後、フィルタープレートをＰＢＳで３回洗浄して、サイトゾル構成成分を除去した。顕微鏡でフロースルー分画を観察したが、この分画に核は観察されず、このことは、核が依然としてリボキャップ（RiboCap（登録商標））フィルタープレートのガラス繊維膜上に捕捉されていたことを示唆する。次にLYSIS BUFFERをリボキャップ（RiboCap（登録商標））フィルタープレートに適用して、核膜を破壊した。光学顕微鏡により、細胞の完全溶解を確認した。次に、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールによる２回の抽出により核溶解物を処理し、その後、エタノール沈殿させた。
【００５４】  実施例５〜１０では、アガロースゲルおよびＰＣＲにより核酸を分析した。
【００５５】  実施例５
アガロースゲル電気泳動による精製核酸の分析
サイトゾル構成成分が除去されたことを確証するために、アガロースゲル電気泳動により精製核酸物質を分析した。本方法は以下のように実施した：Ｕ９３７細胞（５．０×１０5細胞／ウェル）をリボキャップ（RiboCap（登録商標））フィルタープレート（RNAture）に適用し、４インチＨｇの真空圧により、ガラス繊維膜上に捕捉した。サイトゾル構成成分を除去するために、１００μＬの０．１％ＮＰ−４０（Sigma, St Louis, MO, USA）をウェルに適用し、室温で５〜６０秒間インキュベートした。次にリボキャップ（RiboCap（登録商標））フィルタープレートを１００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。核から核内容物を放出するために、１％の２−メルカプトエタノール（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）を含む５０μＬのLYSIS BUFFER（RNAture）をリボキャップ（RiboCap（登録商標））フィルタープレートのウェルに適用し、室温で１５分間インキュベートした。次に、４℃で５分間、３，２００ｘｇでの遠心分離により、その後、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで２回抽出し、エタノール沈殿させて、溶解物をリボキャップ（RiboCap（登録商標））からマイクロプレートに移した。
【００５６】  電気泳動するために、精製核酸物質を、３．７％ホルムアルデヒドで変性させ、１．２５％アガロースゲル電気泳動により分析して、ＳＹＢＲＧＯＬＤ（Molecular Probes, Eugene, OR, USA）で染色し、蛍光スキャナー（FM-BIO-II, Hitachi Genetic System, Alameda, CA, USA）により記録した。図２Ｃに示したように、１８ｓ−および２８ｓ−ｒＲＮＡバンド（下方２つの矢印で示す）は、ＮＰ−４０処理により低減されたが、ＤＮＡ（上矢印）は不変であった（ＭＫ：分子量マーカー）。
【００５７】  その結果得られた核酸物質も、ＰＣＲにより分析した。
【００５８】  実施例６
ミトコンドリアＤＮＡのＰＣＲ
アガロースゲル電気泳動は定量的でないため、ＰＣＲによりミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）のレベルを測定した。ミトコンドリアはサイトゾル中にのみ存在するため、これは依然として存在するサイトゾル構成成分の測定を提供する。実施例３から得られた核酸を用いて、ＰＣＲによりミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を増幅した。２０μＬの予混合ＰＣＲ緩衝液（０．２５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、１×ＰＣＲ緩衝液、２．５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ2、１００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ、１単位のＴａｑポリメラーゼ）および１滴の鉱油（Sigma）を各ウェルに添加し、サーモサイクラー（UNO II, Biometra（商標）, Horsham, PA, USA）中で、「９４℃で１分間の変性、５６℃で１分間のアニーリング、その後の７２℃で１分間の伸張」を２０サイクル実施して増幅させた。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル電気泳動により分析し、臭化エチジウム（Sigma）で染色して、写真検出により記録した（Alphalmager 2200, Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA）。ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）のプライマーは、５’−ＴＣＣＡＣＡＣＴＡＧＣＡＧＡＧＡＣＣＡＡＣＣＧ−３’（配列番号１）であって、非特異的ハイブリダイゼーションを排除するために、GenBank UniGeneデータベースに対するハイブリダイゼーション刺激を用いてコンピュータープログラム（HYBsimulato（登録商標））（RNAture）により、５’−ＡＧＡＡＣＡＧＧＧＡＧＧＴＴＡＧＡＡＧＴＡＧＧＧＴ−３’（配列番号２）を設計した。
【００５９】  図２Ｄに示したように、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を全細胞抽出物中で増幅した後、ＮＰ−４０で処理したが、ＮＰ−４０への曝露時間が１５秒を越えると、ｍｔＤＮＡ  ＰＣＲ産物の量は実質的に低減した（図２Ｄ）。これは、サイトゾル構成成分が、ＮＰ−４０処理をしている間に、およびその後の洗浄手法中に低減したことを示す。ＮＰ−４０処理の前後におけるｍｔＤＮＡのＰＣＲ産物の量を定量化することにより、核分画の純度を算定した。
【００６０】  実施例８
核ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ
核溶解物（実施例３からの）を、リボキャップ（RiboCap（登録商標））フィルタープレートからジーンプレート（GenePlate（商標））に直接移して、ハイブリダイゼーションのために室温で１時間インキュベートした。次にジーンプレート（GenePlate（商標））を５０μＬのLYSIS BUFFERで２回洗浄し、その後５０μＬのWASH BUFFER（RNAture）で２回洗浄した。２０μＬの予混合ｃＤＮＡ緩衝液（１×ＲＴ緩衝液、５００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ、１００単位のＭＭＬＶ逆転写酵素）を添加することにより、プライマーとして固定化オリゴ（ｄＴ）を用いて、ジーンプレート（GenePlate（商標））中でｃＤＮＡを合成した。
【００６１】  実施例９
−アクチンのＰＣＲ
アガロースゲル電気泳動およびｍｔＤＮＡ  ＰＣＲは、ＮＰ−４０処理およびその後の洗浄手順中における、核の無傷性に関するいかなる定量的データも提供しない。そこで、未熟ｍＲＮＡは主に核中に存在するために、ＲＴ−ＰＣＲにより、プレスプライシング未熟β−アクチンｍＲＮＡの量を測定した。粗製核溶解物を、遠心分離により、リボキャップ（RiboCap（登録商標））フィルタープレートからオリゴ（ｄＴ）−固定化ＰＣＲマイクロプレートに直接移した。LYSIS BUFFERはオリゴ（ｄＴ）とｍＲＮＡのポリ（Ａ）テールとの間のハイブリダイゼーションに関する最適化ストリンジェンシーを有し、リボヌクレアーゼ活性を不活性化するための強力洗浄剤を含むため、１時間の室温でのインキュベーション中に、ジーンプレート（GenePlate（商標））はｍＲＮＡを捕捉し得る。WASH BUFFERで各ウェルを洗浄して非ハイブリダイズ化物質を除去した後、プライマーとして固定化オリゴ（ｄＴ）を用いて、同一プレート中でｃＤＮＡを合成した。
【００６２】  ジーンプレート（GenePlate（商標））はＤＮＡではなく、ｍＲＮＡを選択的に捕捉するが、ＰＣＲ産物がｍＲＮＡに由来するかまたは混入した核ＤＮＡに由来するかは明らかでなかった。ハイブリダイゼーション後の広範な洗浄により、非特異的結合ＤＮＡを除去することができる。しかしながらこの方法は、多少のｍＲＮＡも分離してしまうため、感度および再現性が低下する。そこで、ｃＤＮＡは固定化オリゴ（ｄＴ）を介してジーンプレート（GenePlate（商標））に共有結合的に固定化するので、ｃＤＮＡが合成された後、各ウェルを広範に洗浄した。各ウェルをｐＨ７．４の１０ｍＭトリスで５回洗浄後、ＰＣＲを実行した。ＲＴ−ＰＣＲを実施例５と同様に実行し、ＰＣＲを実行して、β−アクチンのイントロン部分を以下のように増幅した：ＰＣＲを、ＭＭＬＶ逆転写酵素（GIBCO/BRL, Rockville, MD, USA）、ＰＣＲ試薬（Promega, Madison, WI, USA）、およびｄＮＴＰ（Yamasa, Tokyo, Japan）を用いて、２０〜５０サイクル実行した。
【００６３】  非特異的ハイブリダイゼーションを排除するために、GenBank UniGeneデータベースに対するハイブリダイゼーション刺激を用いてコンピュータープログラムＨＹＢｓｉｍｕｌａｔｏｒ（登録商標）（RNAture）により、β−アクチン５’−ＴＧＧＣＡＣＣＡＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＡＡ−３’（配列番号３）および５’−ＣＡＴＣＴＣＴＴＧＣＴＣＧＡＡＧＴＣＣＡ−３’（配列番号４）、ならびにβ−アクチンイントロン（５’−ＧＴＧＣＴＧＴＧＧＡＡＧＣＴＡＡＧＴＣＣＴＧＣ−３’）（配列番号５）、および５’−ＣＡＣＣＣＡＣＣＴＴＧＡＴＣＴＴＣＡＴＴＧＴＧＣＴ−３’（配列番号６）のプライマーを設計した。
【００６４】  次に、ｃＤＮＡ合成を用いた場合と、用いない場合とで、ＰＣＲを比較した。図２Ｅに示したように、β−アクチンイントロンはｃＤＮＡ合成を用いなかった場合には増幅されなかった（ＲＴ−）が、ｃＤＮＡ合成を用いた場合には首尾よく増幅された（ＲＴ＋）。さらに、図２Ｅに示したように、β−アクチンイントロンＰＣＲ産物のバンド強度は、ＮＰ−４０処理によって変化しなかった。別の実験において、図２Ｅのバンド強度は飽和状態でなく、定量化のダイナミックレンジで存在するということを確証した。これは、β−アクチンイントロンの量が、ＮＰ−４０処理中、十分に保たれていることを示唆する。
【００６５】  遺伝子の上方制御および下方制御を分析するための手法を試験するために、ｊｕｎ−Ｂの発現に及ぼすＵＶ照射の影響を分析した。
【００６６】  実施例１０
Ｊｕｎ−Ｂおよびｐ２１発現ならびにＵＶＣによる誘導の分析
１００ｍｌ／Ｌのウシ胎児血清、５００，０００単位／Ｌのペニシリンおよび５００ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン（リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、細胞培地、抗生物質、およびウシ胎児血清（GIBCO/BRL, Rockville, MD, USAから購入））を含有するＲＰＭＩ−１６４０中で、Ｕ９３７細胞を増殖させた。トリパンブルーの排除により細胞生育能力を評価したが、これは常に９５％を上回っていた。フェノールレッドを含有しない上記培地に細胞を再懸濁して、１０4細胞／μＬの濃度として、１００μＬの細胞懸濁液を９６ウェル培養プレートのウェルに適用した。次にプレートをSTRATALINKER 1800（Stratagene, La Jolla, CA, USA）中に入れて、１００、３００、および５００ｍＪ／ｃｍ2の線量のＵＶＣ（２５４ｎｍ）に曝露した。遠心分離によりリボキャップ（RiboCap（登録商標））フィルタープレートのガラス繊維膜上に、細胞を捕捉した。全細胞アッセイ（以下、「Ｗ」で表すことがある）のために、LYSIS BUFFERをリボキャップ（RiboCap（登録商標））フィルタープレートに適用し、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを捕捉するために、溶解物をジーンプレート（GenePlate（商標））に移した。核アッセイ（以下、「Ｎ」で表すことがある）のために、リボキャップ（RiboCap（登録商標））フィルタープレートを０．１％ＮＰ−４０で６０秒間処理し、直ちにＰＢＳで洗浄した。次にLYSIS BUFFERを適用し、全細胞アッセイに用いたのと同一のプロトコールを用いた。ジーンプレート（GenePlate（商標））によりｍＲＮＡを捕捉した後、ｃＤＮＡを合成し、その後、ｊｕｎ−Ｂ（３０サイクル）、β−アクチン（３５サイクル）およびｐ２１（Ｗに関して３０サイクル、Ｎに関して４４サイクル）を増幅するためのＰＣＲを行った。非特異的ハイブリダイゼーションを排除するために、GenBank UniGeneデータベースに対するハイブリダイゼーション刺激を用いてコンピュータープログラムＨＹＢｓｉｍｕｌａｔｏr（登録商標）（RNAture）により、ｊｕｎ−Ｂのプライマー（５’−ＡＧＧＡＣＡＡＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＣＴＣＡＡＧＧ−３’）（配列番号７）および（５’−ＧＣＡＧＧＧＧＡＣＧＴＴＣＡＧＡＡＧＧＣ−３’）（配列番号８）、ならびにｐ２１のプライマー（５’−ＣＣＧＣＴＣＴＡＣＡＴＣＴＴＣＴＧＣＣＴＴＡＧＴ−３’）（配列番号９）および（５’−ＣＡＧＣＡＣＴＣＴＴＡＧＧＡＡＣＣＴＣＴＣＡＴＴＣＡＡＣ−３’）（配列番号１０）を設計した。−アクチンプライマーに関しては実施例９を参照。
【００６７】  本方法は、まず、紫外線（ＵＶＣ）誘導性のｊｕｎ−Ｂ発現を確証するために用いた。この実験に用いたＵＶＣの線量（１００、３００、および５００ｍＪ／ｃｍ2）は、他の報告と比較して非常に高かった。しかしながら、９６ウェルプレート中の１００μＬのＰＢＳ中で細胞をＵＶＣに曝露したため、生育可能性は、照射後２４時間でさえ、常に９５％より高かったことがトリパンブルー実験により示された。図２Ａに示したように、ｊｕｎ−Ｂの高バックグラウンド発現が全細胞（Ｗ）で観察されたが、これは、ＵＶＣ誘導性のｊｕｎ−Ｂ発現増大をわからなくした。ＮＰ−４０処理によりサイトゾル分画を除去すると、バックグラウンドｊｕｎ−Ｂ発現が実質的に低減され、ＵＶＣ誘導性のｊｕｎ−Ｂ発現が核分画（Ｎ）中で明らかになった。興味深いことに、ｊｕｎ−ＢはＵＶＣ刺激前にも核分画中で弱く発現され、Ｕ９３７細胞中でのＪｕｎ−Ｂの代謝レベルを表わしている可能性がある。全細胞抽出物および核分画の両方を同一条件下で同時に分析したため、バンド強度の差は、サイトゾルＪｕｎ−ＢｍＲＮＡの量を示し得る。対照β−アクチンも全細胞抽出物から増幅したが、ＵＶＣ刺激の前および後に変化は検出されなかった（図２Ａ）。興味深いことに、β−アクチンは、ＵＶＣ刺激後でさえ、核分画中で検出されず、このことは、この細胞株においてはｊｕｎ−Ｂの代謝レベルよりもβ−アクチンｍＲＮＡの代謝レベルのほうが低いことを示唆する。
【００６８】  ＵＶＣ刺激によるｊｕｎ−Ｂの上方制御および下方制御という、多少意外な結果が得られたので、ｐ２１遺伝子発現を、Ｕ９３７細胞の全細胞抽出物で分析した。ｐ２１のレベル（図２Ｂ）は、３００ｍＪ／ｃｍ2より高いＵＶに曝露した後には、低下した。しかしながら、サイトゾル分画が一旦除去されると、ｐ２１発現は、核分画中でＵＶＣ曝露後に有意に増大した（図３Ｂ）。これらの結果は、Ｕ９３７細胞をＵＶに曝露すると、それらのｐ２１転写だけでなく、分解も増大し得ることを示唆する。
【００６９】  実施例１１
ＰＣＲによる診断分析に本方法を使用すること
単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、通常は、ハイブリダイゼーションを用いてまたは用いずに、ＲＴＰＣＲにより患者試料中で同定される。したがって、患者からの血液細胞を用いて、実施例１〜４の場合と同様に、核ｍＲＮＡを単離する。ＳＮＰ特異的プライマーを用いてｍＲＮＡを逆転写して、ＳＮＰを同定する。
【００７０】  このようにして、２Ｂ型ヴォンヴィルブランド病に関連したＳＮＰを、症状を示す患者において同定する。患者から白血球を単離して、それを用いて、実施例１〜４の場合と同様に核ｍＲＮＡを単離する。ｖＷＦ遺伝子エキソン２８のアミノ酸５１０〜６００間のプライマーを用いて、このｍＲＮＡのＲＴＰＣＲを行った（Wood, N. et al. Thrombosis and Haemostasis, 1996, 75(2)363-7）。
【００７１】  用いたプライマーは、２Ｂ型ヴォンヴィレブランド病に関連した以下のＳＮＰを同定し得る（コドン５４４および５５１／５５２における２箇所の３塩基欠失、ならびにコドン５７４／５７５および５７７／５７８における２箇所の２塩基置換）。患者は、アミノ酸５４４における３塩基欠失を有することが判明した。
【００７２】  実施例１２
マイクロアレイ分析に本方法を使用すること
遺伝子チップおよびマイクロアレイは、研究者の遺伝子発現についての考え方を急速に変えつつある。一時期に１つの遺伝子を研究する代わりに、実験により、数千の遺伝子の遺伝子発現プロフィールを同時に解明することができる。マイクロアレイは、通常は、標識ｃＤＮＡまたは標識ｃＲＮＡをスポッティング(spotting)することにより作製される。次に、疾患組織からの標識ｃＤＮＡとハイブリダイズし、正常組織と比較することにより、分析することができる。しかしながら、ｃＤＮＡが、細胞または組織からの全ＲＮＡまたはｍＲＮＡから生成される場合、不精確である結果、または間違っている結果となることさえある。したがって、本明細書中の方法により単離したｍＲＮＡからのｃＤＮＡまたはｃＲＮＡを用いて、癌遺伝子、癌原遺伝子、およびサプレッサー遺伝子のマイクロアレイを作製する。
【００７３】  正常乳房細胞、ならびに乳癌細胞から、０．４〜１ｍｇの核ポリ（Ａ）ＲＮＡを単離する。ＦＡＩＲＰＬＡＹ  ＭＩＲＯＡＲＲＡＹ  ＬＡＢＥＬＩＮＧ  ＫＩＴ（Stratagene, La Jolla, CA）を用いて、蛍光標識ｃＤＮＡを作製する。標識ｃＤＮＡを上記のマイクロアレイとハイブリダイズして、示差的発現遺伝子を同定する。
【００７４】  実施例１３
ｃＤＮＡライブラリーを作製するために本方法を使用すること
プローブを用いて遺伝子の相同体、または完全長クローンを単離するために、ｃＤＮＡライブラリーを用いる。相同体の単離をする間に、単一遺伝子から発現される種々のサイズの転写体の同定がなされる。ライブラリーを作製するために用いられるｍＲＮＡに、ｍＲＮＡ分解産物が含まれている場合、ライブラリーは完全長クローンを提供するとは考えにくく、当該遺伝子に対する代替的転写体についての間違った情報を与えかねない。したがって、疾病双極性障害に関するｃＤＮＡライブラリーを作製するために、以下のプロトコールに従う：双極性障害患者からの脳脊髄液（ＣＳＦ）を単離し、細胞構成成分を用いて、実施例１〜４の場合と同様に、核ｍＲＮＡを単離する。ライブラリーを作製するためのＬＡＭＢＤＡ  ＺＡＰ−ｃＤＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ＫＩＴ中の使用説明書に従って、かつＬＡＭＢＤＡ  ＺＡＰ  ＩＩベクター(Stratagene, La Jolla, CA)を用いて、ｃＤＮＡライブラリーを作製するべく、ｍＲＮＡを用いる。
【００７５】  実施例１４
キャスタウェイ（CASTAWAY）系を用いた示差的発現遺伝子産物を同定するために本方法を使用すること
示差的発現遺伝子産物を同定するために利用可能な、広範な方法およびキットが存在する。これらの方法に関する一般的問題の１つは、分析のために、全細胞または組織からの全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを使用することである。これは、不精確な、時としては正しくない結果をもたらす。本明細書中に記載した方法は、これらの系のいずれかに用いることができるが、ＲＡＰ−ＰＣＲ系をプロトタイプとして選択し、Stratageneキャスタウェイ（CASTAWAY）予備成形ゲル（Stratagene Cloning Systems, Inc., La Jolla, CA）を、結果を迅速に分析するために選択した。
【００７６】  ヒト骨髄性単球細胞系（ＨＬ６０）をホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）で４時間刺激する。実施例１〜４で単離したのと同様にして、核ＲＮＡからの第１鎖合成のために、任意のプライマーを用いた。逆転写核ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅を実行する。Stratageneマニュアルに略記されているように、ＰＣＲ産物をキャスタウェイ（CASTAWAY）系で走査させる。ＰＣＲバンドのパターンを、非刺激対照のパターンと比較する。多数の独特のバンドを同定し、ゲルから単離して、さらに分析するためにＰＣＲにより再増幅する。刺激細胞および非刺激細胞の核分画からのｍＲＮＡを用いてノーザンブロットを実行して、結果を立証する。
【００７７】  実施例１５
ＤＮＡ修復機能の定量化方法およびその用途
本方法は、ＤＮＡ損傷剤で細胞を刺激すること、核ＲＮＡまたは核ｍＲＮＡを調製すること、および新規発現遺伝子のレベルを定量化することを含む。本明細書中に開示した核ｍＲＮＡ方法論を用いない場合、従来の方法では、サイトゾルにおける分解が高まるために、特定遺伝子発現の増大を確認することができない。したがって、本方法は、本明細書中に開示したｍＲＮＡ単離方法を用いる（実施例１および２参照）。
【００７８】  刺激は、組織培養または試験管中ではｉｎ  ｖｉｔｒｏでもよく、全身刺激を用いることによりｉｎ  ｖｉｖｏでもよい。任意の種類の細胞を本方法に用いることができるが、しかしながら通常の細胞としては、全血液、白血球、生検検体、外科的除去検体、毛包、胃洗浄物、滲出液、全身等が挙げられる。
【００７９】  ＤＮＡ損傷作因、例えば放射能、紫外線照射、Ｘ線、化学物質、超音波、食物、化粧品、環境作因、ストレス、化学的突然変異原、毒素等（これらに限定されない）により、細胞は損傷を受ける。
【００８０】  ＤＮＡ損傷作因で細胞を損傷した後、実施例１〜４に略記した方法により、核ｍＲＮＡを用意する。ノーザンブロット、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ、遺伝子増幅（ＰＣＲ、「実時間」ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ｓＤＮＡ、ｂＤＮＡ、インベーダー等）により遺伝子発現を定量化する。リアルタイム(real time)ＰＣＲとしては、ＴＡＱＭＡＮ、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＥＡＣＯＮ、ＡＭＰＬＩＦＬＵＯＲ、ＳＣＯＲＰＩＯＮ、ＳＹＢＲ−ＤＹＥ、ＰＯＬＩＣＥＭＡＮ等が挙げられる。通常は、ある種の作因により損傷を受けた細胞を、損傷を受けていない細胞と比較する。
【００８１】  このようにして、ＤＮＡを損傷したことにより、活性化された、または上方制御された遺伝子を同定する。新規発現遺伝子としては、ＤＮＡ修復メカニズムに関与する遺伝子、アポトーシスに関与する遺伝子、および未知の機能を有する遺伝子が挙げられる。
【００８２】  ＤＮＡ修復メカニズムに応答性であることが知られている遺伝子としては、ｐ５３、ｐ２１、ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。アポトーシスに応答性であることが知られている遺伝子としては、カスパーゼ、ＢＡＸ、ｂｃｌ−２等が挙げられる。これらを対照として用いて、本方法が機能していることを確証することができる。しかしながら特に興味深いのは、これまで、これらの工程に関与すると確認されていなかった遺伝子である。
【００８３】  未知の機能を有する遺伝子としては、ＤＮＡマイクロアレイチップ、サブトラクションハイブリダイゼーション、示差的表示等により発見される遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子をデータベースにより分析して、相同体および活性部位を見出し得る。しかしながら、この機能をｉｎ  ｖｉｔｒｏ法により同定するのが最良である。
【００８４】  同定された遺伝子の用途としては、以下のものが挙げられる：癌の危険性が高い個体のスクリーニング、癌予防化合物（即ち、薬剤、薬草、食物等）に関する薬剤スクリーニング、加齢の評価、健康および疾患のモニタリング、非癌誘発物質（食物、化粧品、薬剤、香料等）の同定。スクリーニングは、遺伝子チップまたはアレイ技法により実施し得る。
【００８５】  したがって、本明細書中に記載した方法は、「真の」遺伝子発現を分析するために非常に迅速かつ高感度であり、本方法は、分解産物を伴わない転写を表わす。さらに本方法は、市販の計器を用いたハイスループット自動システムに適合することができる。核遺伝子発現分析は、将来、遺伝子発現分析の標準的方法になると思われる。
【００８６】  本発明の精神を逸脱しない限り、多数のならびに種々の修正がなされ得ると当業者には理解されよう。したがって、本発明の形態は例示的なものであるに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではないと明らかに理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の好ましい実施形態の概要を示す図である。
【図２】  本発明の好ましい実施形態において抽出されたｍＲＮＡは、核ｍＲＮＡである、という根拠を示す。Ａは光学顕微鏡写真を示し、Ｂは走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真を示し、Ｃはアガロースゲル電気泳動写真を示す。ＣおよびＤでは、Ｃに示した精製核物質を用いて、ミトコンドリアＤＮＡを２０サイクルのＰＣＲにより増幅した（Ｄ）。
【図３】  全細胞抽出のｍＲＮＡとｍＲＮＡの核分画との間の遺伝子発現分析の比較である。Ａは、ＵＶ暴露後のｊｕｎＢおよびβ−アクチンの増幅を示す。Ｂは、細胞のＵＶ暴露後のｐ２１の増幅を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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