(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種類の酵素活性を含む有効に機能する代謝経路を有する微生物において、当該経路がケイヒ酸からピノシルビンを生産することを特徴とするピノシルビンを生産する酵母、細菌又は糸状菌である微生物の使用であって、
該微生物における該代謝経路において、
前記微生物に固有ではない前記酵素をコードする核酸から前記微生物に発現したＬ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）によりＬ−フェニルアラニンからケイヒ酸が生産され、
前記微生物中の遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに有効に機能可能に連結している４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ又はシンナメート−ＣｏＡリガーゼをコードする前記遺伝子配列の少なくとも１つのコピーによって、該微生物に発現した４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）又はシンナモイル−ＣｏＡリガーゼにより触媒される反応で、前記ケイヒ酸からシンナモイル−ＣｏＡが形成され、
前記微生物中において、前記微生物に固有ではない前記酵素をコードする核酸から発現したスチルベンシンターゼによりシンナモイル−ＣｏＡからピノシルビンが生産されることを特徴とする微生物の使用。
【請求項２】
前記ＰＡＬが、基質としてチロシンも受容し、且つ、そこからクマル酸を形成する場合、前記ＰＡＬに対するＫｍ（フェニルアラニン）／Ｋｍ（チロシン）の比の値は、１／１未満となるように、前記ＰＡＬが、基質としてフェニルアラニンを受容し、且つ、そこからケイヒ酸を生産することを特徴とする請求項１に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
【請求項３】
前記微生物が、シンナメート−４−ヒドロキシラーゼ酵素（Ｃ４Ｈ）を生産する場合、Ｋｃａｔ（ＰＡＬ（Ｌ−フェニルアラニンからケイヒ酸へ））／Ｋｃａｔ（Ｃ４Ｈ（ケイヒ酸からクマル酸へ））の比の値は、少なくとも２／１であることを特徴とする請求項２に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
【請求項４】
前記微生物が、サッカロミセス属、クリベロミセス属、カンジダ属、ピチア属、デバロミセス属、ハンゼヌラ属、ヤロウイア属、ザイゴサッカロミセス属、又はシゾサッカロミセス属に属する酵母菌であることを特徴とする請求項１に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
【請求項５】
ピノシルビンの生産条件下で、酵母、細菌又は糸状菌である微生物を培養する工程を含むピノシルビンを生産する方法であって、
前記微生物が少なくとも１種類の酵素活性を含む有効に機能する代謝経路を有し、
前記経路がケイヒ酸からピノシルビンを生産し、
該微生物における該代謝経路において、
前記微生物に固有ではない前記酵素をコードする核酸から前記微生物に発現したＬ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）によりＬ−フェニルアラニンからケイヒ酸が生産され、
前記微生物中の遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに有効に機能可能に連結している４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ又はシンナメート−ＣｏＡリガーゼをコードする前記遺伝子配列の少なくとも１つのコピーによって、該微生物に発現した４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）又はシンナモイル−ＣｏＡリガーゼにより触媒される反応で、前記ケイヒ酸からシンナモイル−ＣｏＡが形成され、
前記微生物中において、前記微生物に固有ではない前記酵素をコードする核酸から発現したスチルベンシンターゼによりシンナモイル−ＣｏＡからピノシルビンが生産され、
前記ＰＡＬが、基質としてチロシンも受容し、且つ、そこからクマル酸を形成する場合、前記ＰＡＬに対するＫｍ（フェニルアラニン）／Ｋｍ（チロシン）の比の値は、１／１未満であり、且つ、
前記微生物が、シンナメート−４−ヒドロキシラーゼ酵素（Ｃ４Ｈ）を生産する場合、Ｋｃａｔ（ＰＡＬ（Ｌ−フェニルアラニンからケイヒ酸へ））／Ｋｃａｔ（Ｃ４Ｈ（ケイヒ酸からクマル酸へ））の比の値は、少なくとも２／１であることを特徴とするピノシルビンを生産する方法。
【請求項６】
シンナモイル−ＣｏＡを生産し、且つ、そこからピノシルビンを生産する有効に機能する代謝経路を有する酵母、細菌又は糸状菌である微生物であって、
前記経路が少なくとも１種類の酵素活性を含み、
前記経路がケイヒ酸からピノシルビンを生産し、
該微生物における該代謝経路において、
前記微生物に固有ではない前記酵素をコードする核酸から前記微生物に発現したＬ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）によりＬ−フェニルアラニンからケイヒ酸が生産され、
前記微生物中の遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに有効に機能可能に連結している４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ又はシンナメート−ＣｏＡリガーゼをコードする前記遺伝子配列の少なくとも１つのコピーによって、該微生物に発現した４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）又はシンナモイル−ＣｏＡリガーゼにより触媒される反応で、前記ケイヒ酸からシンナモイル−ＣｏＡが形成され、
前記微生物中において、前記微生物に固有ではない前記酵素をコードする核酸から発現したスチルベンシンターゼによりシンナモイル−ＣｏＡからピノシルビンが生産され、
スチルベンゼンシンターゼが、基質とする４−クマロイル−ＣｏＡとの代謝回転率よりも、基質とするシンナモイル−ＣｏＡとより高い代謝回転率を有することを特徴とする微生物。
【請求項７】
シンナモイル−ＣｏＡを生産し、且つ、そこからピノシルビンを生産する有効に機能する代謝経路を有する酵母、細菌又は糸状菌である微生物であって、
前記経路が少なくとも１種類の酵素活性を含み、
前記経路がケイヒ酸からピノシルビンを生産し、
該微生物における該代謝経路において、
前記微生物に固有ではない前記酵素をコードする核酸から前記微生物に発現したＬ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）によりＬ−フェニルアラニンからケイヒ酸が生産され、
前記微生物中の遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに有効に機能可能に連結している４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ又はシンナメート−ＣｏＡリガーゼをコードする前記遺伝子配列の少なくとも１つのコピーによって、該微生物に発現した４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）又はシンナモイル−ＣｏＡリガーゼにより触媒される反応で、前記ケイヒ酸からシンナモイル−ＣｏＡが形成され、
前記微生物中において、前記微生物に固有ではない前記酵素をコードする核酸から発現したスチルベンシンターゼによりシンナモイル−ＣｏＡからピノシルビンが生産され、
前記Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）が、基質としてチロシンも受容し、且つ、そこからクマル酸を形成する場合、前記ＰＡＬに対するＫｍ（フェニルアラニン）／Ｋｍ（チロシン）の比の値は、１／１未満となるように、前記Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）が、基質としてフェニルアラニンを受容し、且つ、そこからケイヒ酸を生産することを特徴とする微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、ポリフェノールピノシルビンの生産に関する。さらに、本発明は、ピノシルビンを作る天然微生物又は組換え微生物の、食物、餌、及び飲料の生産のための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬品の微生物からの生産は、バイオテクノロジーの重要な応用となっている。典型的には、そのようなバイオ生産法の開発の工程として、１）適当な微生物宿主の選択、２）副産物を導く代謝経路の排除、３）酵素活性レベルと転写レベルの両方で望ましい経路の調節解除、及び４）望ましい経路での適当な酵素の過剰発現が挙げられるだろう。好ましい態様において、本発明は、ピノシルビンの望ましい生合成のために必要な前駆体を供給する植物のフェニルプロパノイド経路の酵素により、フェニルアラニンからの炭素の流れを再指示する上記工程の組合せを使用している。
【０００３】
ピノシルビン（すなわち、ピノシルビン、又は３，５―ジヒドロキシ―トランス―スチルベン）は、感染又は他のストレスに関連する現象に応答して植物中に活動的な防御機構を構成する低分子量の二次的代謝産物であるスチルベンフィトアレキシン類の群に属するフィトフェノールである。スチルベンフィトアレキシン類はスチルベン骨格（トランス−１，２−ジフェニルエチレン）をそれらの共通する基本構造として含み、この構造は他の基の付加により補われてもよい（ハート及びシュリンプトン（Ｈａｒｔ  ａｎｄ  Ｓｈｒｉｍｐｔｏｎ）、１９７９年、ハート（Ｈａｒｔ）、１９８１年）。スチルベン類は一定の木（被子植物、裸子植物）に発見されてきたが、一部の多年草（フトモモ科、ブドウ科及びマメ科の種）にも発見されている。該化合物は、有害生物、特に菌類、細菌及び昆虫への毒性がある。ほんのわずかな植物がスチルベン類を合成する能力があるか、又は有害生物に対して十分な耐性を植物に与える量でスチルベン類を生産する能力を有する。
【０００４】
調査された大部分の種の中でも小さい遺伝子ファミリーからなるスチルベンシンターゼによる基本的なスチルベン骨格の合成が探究されている（Ｋｏｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００２年）。スチルベンシンターゼは、カルコンシンターゼから進化したと思われて、６５％を超えるアミノ酸相同を共有するｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＰＫＳ）スーパーファミリーに属する。細菌のＰＫＳｓとは違って、スチルベンシンターゼと、カルコンシンターゼは共に、比較的小さいホモダイマー（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｓ）を形成し、１つの活性部位でユニモジュラーのＰＫＳｓとして機能する（Ｔｒｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．１９９５年）。スチルベンシンターゼ、及びカルコンシンターゼは、共有の基質、すなわち、３つのマロニル−ＣｏＡと、１つのシンナモイル−ＣｏＡ／ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ−ＣｏＡを使用し、これらの生成物を類似する反応メカニズムで形成する（Ｋｉｎｄｌ，１９８５年）。スチルベンシンターゼは、リスベラトロールシンターゼ（ＥＣ  ２．３．１．９５）などの基質として４−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ−ＣｏＡに最も高い活性を有する４−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ−ＣｏＡ−の特別なタイプであるか、ピノシルニンシンターゼ（ＥＣ  ２．３．１．１４６）などの基質としてシンナモイル−ＣｏＡに最も高い活性を有するシンナモイル−ＣｏＡ−の特別なタイプのどちらかに分類される。リスベラトロールシンターゼをコードする遺伝子は、ｐｅａｎｕｔ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）（Ｓｃｈｏｐｐｎｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｎｄｌｅ，１９８４年；Ｓｃｈｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８８年）、及びｇｒａｐｅｖｉｎｅ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）（Ｍｅｌｃｈｉｏｒ  ａｎｄ  Ｋｉｎｄｌ，１９９１年；Ｗｉｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９４年）の初期に記述されている。これに対して、ピノシルビンシンターゼをコードする遺伝子は、ｐｉｎｅ（Ｐｉｎｕｓ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ  ａｎｄ−ｓｔｒｏｂｕｓ）（Ｓｃｈａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．１９９２年；Ｒａｉｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９５年；Ｋｏｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００２年；Ｈｅｍｉｎｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．１９７７年）に大部分が記述されている。
【０００５】
ピノシルビンは、Ｐｉｎｕｓ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｐｉｎｕｓ．ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａ、Ｐｉｎｕｓ．ｔａｅｄａ、Ｐｉｎｕｓ．ｓｔｒｏｂｅｓ等のユーカリノキ、トウヒ、松の木の木材中に存在する。松の木の種において、構成要素のピノシルビンは、心材中に単独に存在する（Ｋｉｎｄｌ、１９８５年）。しかしながら、その化合物は、傷カビの攻撃、或いは、ＵＶ放射、オゾン汚染などの環境ストレスへの応答として辺材、師部、針葉中で誘発される（Ｈａｒｔ、１９８１年；Ｋｉｎｄｌ、１９８５年；Ｒｉｃｈｔｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｌｄ、１９９２年；Ｌｉｅｕｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９６年；Ｒｏｓｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１年）。その化合物は、糸状菌の幅広い種類に対して強力なアンチ真菌性の活性を所有する（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；，Ｐａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【０００６】
ピノシルビン（図１：トランス形）は２個の密に結合したフェノール環からなるのでポリフェノール類に属する。多くの他のピノシルビンとは違って、ピノシルビンは、環Ｂ（図１）においてヒドロキシル基が不足し、マロニル−ＣｏＡの３分子を有する非置換されたシンナモイル−ＣｏＡの縮合に由来する。とは言うものの、ピノシルビンは、赤ワイン中で発見されるトリ−ヒドロキシスチルベンリスベラトロールに構造的に類似する（Ａｇｇａｒｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．２００４年）。多くのデータから、リスベラトロールの健康便益が明らかになってきた。例えば、多くの癌細胞株に渡ってリスベラトロールの強力な制癌活性が明らかになってきた（Ａｇｇａｒｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．２００４年）。リスベラトロールと構造の点で類似するため、ピノシルビンは、強力な健康便益をも所有することが期待されている。実際に、結腸直腸癌、肝臓癌を含む様々な癌におけるピノシルビンの効用が研究され、ピノシルビンの効用は、化学療法予防活性、及び制白血病性活性であることが指摘されてきた（Ｓｋｉｎｎｉｄｅｒ  ａｎｄ  Ｓｔｏｅｓｓｌ，１９８６年；Ｍｅｌｌａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６年；Ｒｏｕｐｅ  ｅｔ  ａｌ．２００５年と２００６年）。さらに、ピノシルビンは、例えリスベラトロールよりも、より少ない量であっても、制酸化体としての能力も有する（Ｓｔｏｊａｎｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．２００１年）。
【０００７】
現在、ピノシルビンは、松の木の樹皮から発現する様々なフラボノイドの混合物中から大部分が得られる。前記抽出物は、低い収率で労働集約的な過程である。好ましい態様において、本発明は、いままでになく、より効率的で、生成物の高い収率を提供する。
【０００８】
植物において、フェニルプロパノイド経路は、リグニン、サリチル酸塩、クマリン、ヒドロキシ、ケイヒアミド、顔料、フラボノイド、及びフィトアレキシンを含む多種多様な第二の代謝化合物の合成に関与する。実際に植物中のスチルベンの形成は、フェニルプロパノイド経路を通じて進行する。アミノ酸Ｌ−フェニルアラニンは、Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）による非酸化脱アミノ反応を経由して、トランス−ケイヒ酸に変換される（図２）。トランス−ケイヒ酸からの経路は、リスベラトロールを形成するルート、或いは、ピノシルビンを形成するルートに分岐させることができる。前者のルートにおいて、トランス−ケイヒ酸は、シンナメート−４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）、すなわち、チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ酵素によってＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０還元酵素（ＣＰＲ）と結合してパラ位で４−ケイヒ酸（４−ヒドロキシケイヒ酸）にヒドロキシル基が導入される。続いて、４−クマル酸は、４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）の反応によって４−クマロイル−ＣｏＡへ活性化される。リスベラトロールシンターゼ（ＶＳＴ１）は、マロニルＣｏＡをもつ４−クマレート−ＣｏＡのフェニルプロパン単位の凝縮を触媒することができ、リスベラトロールの形成体が得られる。
後者のルートにおいて、トランス−ケイヒ酸は、ピノシルビンシンターゼ（ＰＳＴ）は、続いて、マロニルＣｏＡを有するシンナモイル−ＣｏＡのフェニルプロパン単位の凝縮を触媒する４ＣＬの反応によって、直接的にシンナモイル−ＣｏＡへ活性化させることができる。
【０００９】
スチルベンシンターゼは、さまざまな生理的で、且つ、非生理的な基質を受容することができる特異性の広い酵素である。例えば、さまざまなフェニルプロパノイドＣｏＡ始動エステルの添加によって、生体外で、さまざまな生成物が形成される（Ｉｋｕｒｏ  ｅｔ  ａｌ．２００４年；Ｍｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．２００１年）。同様に、シンナモイル−ＣｏＡが、クマロイル−ＣｏＡの代わりに基質として使用された場合、ダイオウ（ｒｈｕｂａｒｂ）（Ｒｈｅｕｍ  ｔａｒｔａｒｉｃｕｍ）由来のリスベラトロールシンターゼが、少量のピノシルビンを確かに合成することがわかってきた。（Ｓａｍａｐｐｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．２００３年）。
【００１０】
同様に、クマロイル−ＣｏＡリガーゼは、ケイヒ酸の触媒効率（Ｋｍ／Ｋｃａｔ）はクマル酸と比較して１００倍劣るが、基質としてクマル酸とケイヒ酸の両方とも受容することができる（Ａｌｌｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．１９９８；Ｅｈｌｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）。標準的なリスベラトロールシンターゼとして指定される場合でも、４ＣＬとスチルベンシンターゼからなる経路においてピノシルビンを生成することができるであろうことを我々は、上記のことから推定した。
【００１１】
近年、酵母菌において、ブドウマスト中に少量発見されるクマル酸からリスベラトロールを生産することができるということが公開された（Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００３，ＺＡ２００４０８１９４）。Ｓ．セレヴィシエの実験用菌株において、外因性の４−クマル酸と付随するリスベラトロール由来の４−クマロイル−ＣｏＡの生産は、ブドウのつるのリスベラトロールシンターゼ遺伝子（ＶＳＴ１）と共に、雑種ポプラから、非相同のコエンザイム−Ａリガーゼ遺伝子を再発現させることによって達成された。リスベラトロールシンターゼの他の基質であるマロニル−ＣｏＡは、酵母菌中にすでに内生的に生成され、新たな脂肪酸生合成に取り込まれる。研究は、Ｓ．セレヴィシエの細胞が、４−クマル酸で補われた合成媒体において培養されるとき、自由形成か、あるいはグルコース結合による形成かどちらかで、わずかな量のリスベラトロールを生成することができることを示した。
【００１２】
さまざまなリスベラトロールシンターゼが与えられると、ケイヒ酸の実質的な量が与えられるとき、前記酵母菌もピノシルビンを生産することができるだろう。しかしながら、そのような酵母菌の商業的応用は、可能なピノシルビンの生産量が少ないことによって、産業媒体において豊富には存在しないケイヒ酸を追加する必要性によって阻まれている。したがって、調合薬と栄養補助食品の両方としてピノシルビンの使用を促進し、広めるため、ケイヒ酸、又はシンナモイル−ＣｏＡなどのあらゆる下流のケイヒ酸誘導体を追加せず、グルコースから直接ピノシルビンを生産することができる酵母菌、或いは他の微生物を提供することが非常に求められる。
【００１３】
最近の研究（ロー及びダグラス（Ｒｏ  ａｎｄ  Ｄｏｕｇｌａｓ）、２００４年）には、ポプラに由来するＰＡＬ、Ｃ４Ｈ及びＣＰＲを導入することによる、Ｓ．セレヴィシエにおけるフェニルプロパノイド経路のエントリポイントの再構成が記載されている。この目的は、ＰＡＬとＣ４Ｈを含む多酵素複合体（ＭＥＣ）が、フェニルプロパノイド代謝へのエントリポイントにおいて機能的に重要かどうかを評価することにあった。組換え酵母に［３Ｈ］−フェニルアラニンを供給することにより、代謝された［３Ｈ］−フェニルアラニンの大多数が４−［３Ｈ］−クマル酸に取り込まれること、及びフェニルアラニン代謝はＣ４Ｈ活性を阻害することにより非常に減少することがわかった。さらに、ＰＬＡのみのエクスプレッサーが微小のフェニルアラニンをケイヒ酸に代謝した。［３Ｈ］−フェニルアラニンと［１４Ｃ］−トランス−ケイヒ酸を同時にトリプルエクスプレッサーに供給した場合、内因的に合成された［３Ｈ］−トランス−ケイヒ酸の４−クマル酸へのチャネリングについていかなる証拠も見られなかった。したがって、ＰＡＬとＣＨ４により触媒される反応によりフェニルアラニンから４−クマル酸への効率的な炭素の流れは酵母におけるＭＥＣによるチャネリングを必要とするようには思えず、ＰＡＬとＣ４Ｈの真の生化学的カップリングが炭素の流れをフェニルプロパノイド経路に引き込むのに十分であるように思える。さらに別の研究（Ｈｗａｎｇら、２００３年）において、大腸菌による植物特異的なフラバノン類の生産は多様な異種起源のフェニルプロパノイド経路の３遺伝子（酵母Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｒｕｂｒａに由来するＰＡＬ、放線菌ストレプトミセス  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒに由来する４ＣＬ及び甘草植物Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ  ｅｃｈｉｎａｔａに由来するカルコンシンターゼ（ＣＨＳ））を含む人工的な遺伝子クラスターの発現により達成された。細菌の４ＣＬ酵素はコエンザイムＡをトランス−ケイヒ酸と４−クマル酸の両方に連結させたので、これらの経路はＣ４Ｈをバイパスした。さらに、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｒｕｂｒａ由来のＰＡＬはフェニルアラニンとチロシンの両方を基質として利用する。したがって、該遺伝子クラスターを含有し、かつグルコースで増殖した大腸菌細胞は、少量の２種類のフラバノン（フェニルアラニンからピノセムブリン（０．２９ｇ／ｌ）及びチロシンからナリンゲニン（０．１７ｇ／ｌ））を産生した。さらに、大量のそれらの前駆体である４−クマル酸とトランス−ケイヒ酸（それぞれ０．４７及び１．２３ｍｇ／リットル）が蓄積された。さらに、これらの化合物の収率はフェニルアラニンとチロシンの添加により増加させることができた。
【００１４】
また、ピノシルビンシンターゼの酵素特性は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｉｌ）に、先ず遺伝子をクローニングすることによって研究されてきたことが記載されている。例えば、Ｒａｉｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９５は、大腸菌中に相同発現後、調査されたマツ属（Ｐｉｎｕｓ  ｓｔｒｏｂｕｓ）（Ｅａｓｔｅｒｎ  ｗｈｉｔｅ  ｐｉｎｅ）由来のスチルベンについて報告している。このＰ．ｓｔｒｏｂｕｓについて、Ｐ．ｓｔｒｏｂｕｓｃＤＮＡライブラリーをＰｉｎｕｓ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ由来のスチルベンシンターゼ（ＳＴＳ）プローブで選別した。ＳＴＳ遺伝子、ＳＴＳ１、ＳＴＳ２に密接に関連する２つの単離されたｃＤＮＡｓは、タンパク質の点で相違する５つのアミノ酸が探し出された。遺伝子は、プラスミドについてクローン化され、大腸菌に発現され、細胞抽出物に酵素アッセイを行った。両方のタンパク質が、基質としてシンナモイル−ＣｏＡを受容するようにみえ、ピノシルビンシンターゼとして考察されたが、大きな違いが明らかになった。ＳＴＳＩは、ＳＴＳ２の活性の３〜５％だけ有し、ｐＨ最適条件は、より低い値にシフトされ（ｐＨ６）、それから、２番目の未知の生成物であるシンナモイル−ＣｏＡと合成した。部位を指示する突然変異生成は、ＳＴＳ１中の単一Ａｒｇ−ｔｏ−Ｈｉｓ交換が全ての差異に関与したことを明らかにした。その他の研究において、Ｐｉｎｕｓ  ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａ由来の３つのＳＴＳ  ｃＤＮＡｓ（ＰＤＳＴＳ１、ＰＤＳＴＳ２、及びＰＤＳＴＳ３）は、単離され、ｃＤＮＡは、酵素の特性を特徴づけるために、大腸菌中に非相同的に発現された（Ｋｏｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。ＰＤＳＴＳ３は、テストされたＳＴＳｓの中でも、最も高いピノシルビンを形成する活性を示すようにみえた。さらに、ＰＣＳＴＳ３は、ＰＣＳＴＳ１、及びＰＣＳＴＳ２とは違って、生産物阻害に対して無反応であった。
ＰＤＳＴＳ３の独特な特徴は、フレームシフトによる突然変異によってもたらされたスチルベンシンターゼに通常共通するＣ−ターミナル伸長の欠如とみなすことができる。さらに、別の研究では、遺伝子のＤＮＡライブラリーは、プローブとしてピノシルビンシンターゼｃＤＮＡ  ｐＳＰ−５４と選別された（Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）。サブ・クローニング後、４つの異なるメンバーは、配列によって特徴づけられた。遺伝子ＰＳＴ−１、ＰＳＴ−２、ＰＳＴ−３、及びＰＳＴ−５に由来すると推定されるアミノ酸配列は、概して９５％を超えて一致した。
【００１５】
プロモーター強度における違いは、タバコ原形質体（ｔｏｂａｃｃｏ  ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ）における一時的な発現によって分析された。使用された構築は、マツ属の遺伝子ＰＳＴ−１、ＰＳＴ−２、及びＰＳＴ−３のプロモーターの制御下で、細菌−グルクロニダーゼを含有した。ＵＶ光、又は真菌エリシターを使った処理で、ＰＳＴ−１のプロモーターは、最も高い反応性を示し、且つ、維管束において組織特異性の発現を導いた。
そのデータは、マツにおいて、ＰＳＴ−１の遺伝子生産物は、苗木中のストレス反応と、心材中のピノシルビン形成体の両方に関与することを指し示す。
【００１６】
さらなる研究により、Ｓｃｏｔｓ  ｐｉｎｅ  （Ｐｉｎｕｓ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）由来のクローン化されたスチルベンシンターゼは、ジハイドロピノシルビンシンターゼとして、初期発育不全に割り当てられたが、ピノシルビンシンターゼになることが示されることを明らかにした。
先の誤解は、基質選択における細菌因子の影響によって、及び大腸菌で発現された植物特有のタンパク質の活性によってもたらされた。発現システムの改良後、次の速度論分析は、フェニルプロピオニル−ＣｏＡよりもむしろシンナモイル−ＣｏＡの方が、クローン化されたスチルベンシンターゼの好ましい基質であることを明らかにした。さらに、Ｐ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ由来の抽出物は、基質選択に選択的に影響を与えた。例えば、活性はフェニルプロピオニル−ＣｏＡで低下したが、シンナモイルＣｏＡでは低下しなかった。このことは、植物抽出物と、大腸菌で発現したクローン化された酵素との明らかな違い、自然界に起因する警告を説明し、新しいホストは、クローン化された配列の機能的同定を複雑にさせるだろう。
【００１７】
さらに、ベクター（ｖｅｃｔｏｒｓ）には、微生物の形質転換、及びペストや損傷に対して改良された抵抗を与える植物について、リスベラトロールシンターゼ、及びピノシルビンシンターゼを記したものであるスチルベンシンターゼ遺伝子について開示されている（ＥＰ０３０９８６２、及びＥＰ０４６４４６１）。
【００１８】
また、さらに、ベクター（ｖｅｃｔｏｒｓ）には、マツ属（Ｐｉｎｕｓ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）のピノシルビンシンターゼを水素化物化するＤＮＡ配列が記述され（ＵＳ５３９１７２４）、また、前記ベクター（ｖｅｃｔｏｒｓ）には、植物中の発現に使用されることについて記述されている（ＵＳ５９７３２３０）。しかしながら、微生物中のピノシルビンの生成のために、スチルベンシンターゼと共に、ＰＡＬと４ＣＬを組み込むことは、記述されていない。微生物を生産するピノシブリンについてはどんなものにも記述されていない。
【００１９】
最近、糸状菌の麹菌（コウジカビ）が、植物中のナリンゲニン等のフラボノイド類の生合成に通常関与するカルコンシンターゼ（ＣＨＳ）酵素を含むとの証拠が示された（Ｊｕｖｖａｄｉら、２００５年；Ｓｅｓｈｉｍｅら、２００５年）。実際、麹菌がフェニルプロパノイド−フラボノイド代謝に関与する主要な一組の遺伝子（すなわち、ＰＡＬ、Ｃ４Ｈ及び４ＣＬ）を含むことも示した。しかし、麹菌がリスベラトロールシンターゼ等のスチルベンシンターゼを含むとの証拠はない。
【００２０】
我々の継続中の国際公開ＷＯ２００６／０８９８９８号には、微生物、特に酵母菌を生産するリスベラトロールについて記述されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明は、ケイヒ酸からピノシルビンを生産する少なくとも１種類の酵素活性を含む有効に機能する代謝経路を有する微生物を提供する。好ましい微生物において、前記経路は、ケイヒ酸を生産し、そこからピノシルビンを生産する。特に、本発明は、ピノシルビンを生産する際のそのような微生物の使用を提供するものである。そのような微生物は自然に存在してよく、縮重ＰＣＲ（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ＰＣＲ）、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ、及びｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｓｅａｒｃｈｅｓ等の適切なスクリーニング手順により単離してもよく、さらに好ましくは遺伝子組み換えされている。
【００２２】
本発明は、そのような微生物からピノシルビンを生産し、随意に単離し或いは生産されたピノシルビンを精製する方法を含む。培養は、ケイヒ酸の外部源の実質的な非存在下で好ましく行われる。このことは、シンナモイル−ＣｏＡ等のフェニルプロパノイド経路において、そこから形成されるケイヒ酸の誘導体の外部源の実質的な非存在を含む。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
好ましくは、該ピノシルビン又は誘導体は、内在性のマロニル−ＣｏＡが基質である酵素により触媒される反応で作られ、好ましくは、該ピノシルビンはシンナモイル−ＣｏＡから生成される。
【００２４】
前記ピノシルビン又は誘導体は、シンナモイル−ＣｏＡから好ましく生成され、好ましくは、前記微生物中において、前記微生物に固有ではない前記酵素をコードする核酸から発現されるスチルベンシンターゼによって生成される。
【００２５】
ここでは一般的に、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、ピノシルビンへの言及は、そのオリゴマー誘導体かグリコシド結合誘導体への言及を含む。
【００２６】
ある好ましい実施態様において、前記スチルベンシンターゼは、ラッカセイ属（Ａｒａｃｈｉｓ）に属する植物、例えば、Ａ．ｇｌａｂａｔｒａ、Ａ．ｈｙｐｏｇａｅａ、ダイオウ属（Ｒｈｅｕｍ）に属する植物、例えば、Ｒ．ｔａｔａｒｉｃｕｍ、ヴィートス属（Ｖｉｔｕｓ）に属する植物、例えば、Ｖ．ｌａｂｒｕｓｃａ、Ｖ．ｒｉｐａｒａｉａ、Ｖ．ｖｉｎｉｆｅｒａ、又は、マツ属（Ｐｉｎｕｓ）、トウヒ属（Ｐｉｃｅａ）、ユリ属（Ｌｉｌｉｕｍ）、ユーカリノキ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）、ツタ属（Ｐａｒｔｈｅｎｏｃｉｓｓｕｓ）、シッサス属（Ｃｉｓｓｕｓ）、カロコルタス属（Ｃａｌｏｃｈｏｒｔｕｓ）、タデ属（Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ）、グネツム属（Ｇｎｅｔｕｍ）、パンノキ属（Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ）、ナンキョクブナ属（Ｎｏｔｈｏｆａｇｕｓ）、ナツメヤシ属（Ｐｈｏｅｎｉｘ）、ウシノケグサ属（Ｆｅｓｔｕｃａ）、スゲ属（Ｃａｒｅｘ）、シュロソウ属（Ｖｅｒａｔｒｕｍ）、ハカマカズラ属（Ｂａｕｈｉｎｉａ）、又はＰｔｅｒｏｌｏｂｉｕｍ属のいずれか１種類に属する植物に由来するリスベラトロールシンターゼ（ＥＣ  ２．３．１．９５）である。
【００２７】
スチルベンシンターゼは、基質とする４−クマロイル−ＣｏＡとの代謝回転率よりも、基質とするシンナモイル−ＣｏＡとより高い代謝回転率を有するものであってもよく、例えば、少なくとも１．５のファクター、又は少なくとも２のファクターを有するものであってもよい。さらに、好ましい実施態様として、前記スチルベンシンターゼは、ピノシルビンシンターゼであって、好適には、マツ属（Ｐｉｎｕｓ）、ユーカリノキ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）、トウヒ属（Ｐｉｃｅａ）又はマクルラ属（Ｍａｃｌｕｒａ）の木の種属等に由来する。特に、スチルベンシンターゼは、Ｐ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｐ．ｓｔｒｏｂｅｓ、Ｐ．ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａ、Ｐ．ｔａｅｄａを含むマツ属（Ｐｉｎｕｓ）に属する植物、トウヒ属（Ｐｉｃｅａ）に属する植物、又はユーカリノキ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）のいずれか１種類に属する植物に由来するピノシルビンシンターゼ（ＥＣ  ２．３．１．１４６）であってもよい。
【００２８】
好ましくは、前記ケイヒ酸は、アンモニアが生成される酵素触媒反応でＬ−フェニルアラニンから作られ、好適には、該ケイヒ酸は、フェニルアラニンアンモニアによりＬ−フェニルアラニンから形成される。
【００２９】
ある好ましい実施態様において、該Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼは、植物又は微生物に由来するＬ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＥＣ４．３．１．５）である。植物は、シロイヌナズナ属に属する植物、例えば、シロイヌナズナ、Ｂｒａｓｓｉｃａ属に属する植物、例えば、Ｂ．ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｒａｐａ、シトラス属に属する植物、例えば、Ｃ．ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ、Ｃ．ｃｌｅｍｅｎｔｉｎｕｓ、Ｃ．リモン、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ属に属する植物、例えば、Ｐ．ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ、Ｐ．ヴァリガリス、パイナス属に属する植物、例えば、Ｐ．ｂａｎｋｓｉａｎａ、Ｐ．ｍｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｐ．パイナスター、Ｐ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｐ．ｔａｅｄａ、Ｐｏｐｕｌｕｓ属に属する植物、例えば、Ｐ．ｂａｌｓａｍｉｆｅｒａ、Ｐ．ｄｅｌｔｏｉｄｅｓ、Ｐ．Ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｋｉｔａｋａｍｉｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ、ナス属に属する植物、例えば、Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ、プラナス属に属する植物、例えば、Ｐ．ａｖｉｕｍ、Ｐ．ｐｅｒｓｉｃａ、ヴィティス属に属する植物、例えば、ヴィティス  ヴィニヘラ、ズィー属に属する植物、例えば、Ｚ．メイス又は他の植物属、例えば、Ａｇａｓｔａｃｈｅ属、Ａｎａｎａｓ属、Ａｓｐａｒａｇｕｓ属、Ｂｒｏｍｈｅａｄｉａ属、Ｂａｍｂｕｓａ属、Ｂｅｔａ属、Ｂｅｔｕｌａ属、Ｃｕｃｕｍｉｓ属、カメリア属、Ｃａｐｓｉｃｕｍ属、Ｃａｓｓｉａ属、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ属、Ｃｉｃｅｒ属、Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ属、Ｃｏｆｆｅａ属、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ属、Ｃｙｎｏｄｏｎ属、Ｄａｕｃｕｓ属、Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ属、Ｄｉａｎｔｈｕｓ属、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ属、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ属、ユーカリ属、Ｇａｌｌｕｓ属、Ｇｉｎｋｇｏ属、グリシン属、Ｈｏｒｄｅｕｍ属、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属、Ｉｐｏｍｏｅａ属、Ｌａｃｔｕｃａ属、リソスパーマム・オフィシナーレ属、ハス属、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ属、Ｍｅｄｉｃａｇｏ属、マリュス属、Ｍａｎｉｈｏｔ属、Ｍｅｄｉｃａｇｏ属、マツバギク属、タバコ属、Ｏｌｅａ属、オリザ属、Ｐｉｓｕｍ属、Ｐｅｒｓｅａ属、ペトロセリウム属、Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ属、Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ属、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ属、Ｐｉｃｅａ属、Ｐｙｒｕｓ属、Ｑｕｅｒｃｕｓ属、Ｒａｐｈａｎｕｓ属、Ｒｅｈｍａｎｎｉａ属、キイチゴ属、Ｓｏｒｇｈｕｍ属、Ｓｐｈｅｎｏｓｔｙｌｉｓ属、Ｓｔｅｌｌａｒｉａ属、Ｓｔｙｌｏｓａｎｔｈｅｓ属、コムギ属、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ属、コムギ属、Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ属、Ｖｉｇｎａ属、Ｚｉｎｎｉａ属に属してよい。微生物は、Ａｇａｒｉｃｕｓ属に属する真菌類、例えば、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ、アスペルギルス属に属する真菌類、例えば、麹菌、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａ．フミガーツス、Ｕｓｔｉｌａｇｏ属に属する真菌類、例えば、Ｕ．ｍａｙｄｉｓ、ロドバクテリア属に属する細菌、例えば、Ｒ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する細菌、例えば、Ｓ．ｍａｒｉｔｉｍｕｓ、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ属に属する細菌、例えば、Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａに属する酵母菌、例えば、Ｒ．ｒｕｂｒａであってよい。
【００３０】
上述したように、ピノシルビンの生産について我々は、基質の特異性の広いＰＡＬによるチロシン由来のクマル酸の生成か、Ｃ４Ｈ酵素によるケイヒ酸の変換によるチロシン由来のクマル酸の生成よりはむしろ、ＰＡＬ酵素によるケイヒ酸の生成、及びピノシルビンへの変換を要求するので、本発明で利用する微生物は、好ましくは基質としてチロシン（クマル酸を生成する）以上にフェニルアラニン（ケイヒ酸を生成する）に有利に働くＰＡＬを有する。好ましくは、ＰＡＬに対するＫｍ（フェニルアラニン）／Ｋｍ（チロシン）の比の値は、１／１よりも少なく、好ましくは１／５よりも少なく、例えば１／１０よりも少ない。通常、Ｋｍは、生成形成物の最大速度の半分を生産する基質（フェニルアラニン、又はチロシン）のモル濃度である。
【００３１】
Ｃ４Ｈの存在は、ピノシルビンの生産に役立たないが、クマル酸を経てリスベラトロールの形成に関してピノシルビンの生産から離れてケイヒ酸の転換が過度でなければＣ４Ｈは禁止されるものではない。それゆえ、好ましくはＣ４Ｈ生産が、非存在であるか、或いは、Ｋｃａｔ（ＰＡＬ）／Ｋｃａｔ（Ｃ４Ｈ）は、２よりも大きく、好ましくは４よりも大きくなるようにするかどちらかである。従来通り、それぞれのケースで、ＫｃａｔはＶｍａｘ／［酵素］である。ここで、［酵素］は、関連のある酵素の濃度である。
【００３２】
図解を通じて、シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）に対する標準的なＫｍ値であるフェニルアラニンアンモニアリアーゼＰＡＬ２とその相同体ＰＡＬ１は、基質としてフェニルアラニンを使う場合には約６０μＭのであり（Ｃｏｃｈｒａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２００４）、基質としてチロシンを使う場合には１０００μＭ以上である（Ｗａｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＰＡＬ２に対する触媒の代謝回転速度は、フェニルアラニンをケイヒ酸に変換する場合、１９２ｍｏｌケイヒ酸／ｍｏｌ酵素ＰＡＬ２であるが（Ｃｏｃｈｒａｎｅ  ｅｔ  ａｌ，  ２００４）、Ｋｃａｔは、チロシンのクマル酸への変換に対する分である。上記力学的特性をもつＰＡＬは、基質としてフェニルアラニンに対して特有であり、フェニルアラニン由来のケイヒ酸の形成を単独的に与え、検出できないレベルのチロシン由来のクマル酸を与える。
【００３３】
Ｃ４Ｈによって触媒されるヒドロキシラーゼ反応に対するチロシンの代謝回転速度は、固有の酵母菌ＣＰＲ活性がその反応を支持する場合、２５ｍｏｌｅｓクマル酸生産物／ｍｏｌｅ酵素／分である（Ｕｒｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９４）。Ｃ４Ｈの活性は、ＮＡＤＰＨ効能によって制限され、また、Ｃ４Ｈの活性は、酵素チトクロームＰ４５０ヒドロキシラーゼ（ＣＰＲ）が過剰に発現される場合には増大するだろう。該ＣＰＲが文献中で例示されているように、５〜２０倍過剰発現する場合（Ｍｉｚｕｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９８、Ｕｒｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９４）、ケイヒ酸をクマル酸に変換するＣ４Ｈ反応に対する代謝回転速度は、それぞれ１２５ｍｏｌｅクマル酸生産物／ｍｏｌｅ酵素／分、及び５３０ｍｏｌｅクマル酸生産物／ｍｏｌｅ酵素／分に増大する。
【００３４】
合併型反応ＰＡＬ−Ｃ４Ｈ−ＣＰＲの結果は、触媒のナンバーや各酵素の存在に依存するだろう。特に、Ｃ４Ｈに対する電子供給、ＮＡＤＰＨを支持するＣＰＲの量に依存するだろう。効率の良いＰＡＬは、約１９２ｍｏｌｅｓケイヒ酸／ｍｏｌｅ  ＰＡＬ／分を与え、また、配列に続いてＣ４Ｈ酵素は、このケイヒ酸／ｍｏｌｅ  Ｃ４Ｈ／分の約２５ｍｏｌｅｓを、固有のＣＰＲ活性をもつクマル酸に変換するだろう。それゆえ、合併型反応ＰＡＬ−Ｃ４Ｈ−ＣＰＲ由来の主要な生成物は、ケイヒ酸になるだろう（１６７ｍｏｌｅｓケイヒ酸／ｍｏｌｅ  ＰＡＬ  酵素／分と、固有のＣＰＲ活性を有する２５ｍｏｌｅｓクマル酸／ｍｏｌｅ酵素固有のＣＰＲ活性を有するＣ４Ｈ／分）。
より高いＣＰＲ活性は、高いレベルで過剰発現した場合、Ｃ４Ｈ酵素のｍｏｌｅあたりのより多くのＣ４Ｈに導き、最終的に純粋なクマル酸に導くだろう。ミズタニの論文（Ｍｉｚｕｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）で５倍だけ過剰発現したＣＰＲは、１２５ｍｏｌｅｓクマル酸／ｍｏｌｅＣ４Ｈ／分をもたらし、唯一の６７ｍｏｌｅｓケイヒ酸は、１分あたりＰＡＬからもたらされるだろう。それゆえ、ＣＰＲは、純粋なクマル酸に対して約８倍（望ましくない）少なくとも過剰発現するに違いない。
【００３５】
さまざまなＰＡＬｓ／ＴＡＬｓ、及びＣ４Ｈをもつ組換え或いは天然の微生物の場合、１つは細胞抽出物を準備することができ、見掛け上の触媒の代謝回転速度、及び見掛け上の酵素ＰＡＬ、ＴＡＬ、又はＣ４Ｈの合計（あるいは凝集された酵素）としてＫｍ値を測定することができる。これらの評価された合計から、微生物は主にクマル酸あるいはケイヒ酸を生産する場合、特性を決定することができ、４ＣＬとＶＳＴが、この微生物中で発現すると、リスベラトロール又はピノシルビンを生産する結果となるだろう。代謝回転速度は、純粋酵素ｍｏｌｅｓ生産物／（ｍｏｌｅ純粋酵素／時間）を使う場合に代わって、ｍｏｌｅｓ生産物／（ｍｏｌｅ  ｔｏｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ／時間）と表わすことができる。従って、１：１未満のＰＡＬに対する好ましい比Ｋｍ（フェニルアラニン）／Ｋｍ（チロシン）は、１種より多いＰＡＬが存在する総計のＰＡＬ活性に適用することができ、２よりも大きいＫｃａｔ（ＰＡＬ）／Ｋｃａｔ（Ｃ４Ｈ）の好ましい比は、１より多いＰＡＬ及び／又はＣ４Ｈ活性が存在する場合は、ＰＡＬ及び／又はＣ４Ｈ活性（ＣＰＲによって調節）の凝集体に適用することができる。
【００３６】
好ましくは、微生物は、外因性Ｃ４Ｈを有さず、例えば、遺伝的に修正されず、結果的にＣ４Ｈ酵素の発現を提供する。あらゆるＣ４Ｈの生産物は、該微生物に固有のものであってよい。随意に、外因性のＣ４Ｈのない微生物は、外因性のＣ４Ｈが欠けていてもよい。外因性のＣ４Ｈの欠如は、酵素はその代謝を必要としないので、遺伝子技術、或いは、遺伝子を封じる方法によって取り除かれた固有のＣ４Ｈの能力に起因するもの、又は、微生物は、通常Ｃ４Ｈ遺伝子を欠くであろう。
【００３７】
また、上述したように、ＣＰＲの存在は、ピノシルビンの生産やその過剰発現に役立たないが、禁止しないのは一般的に好ましくない。従って、微生物は、好ましくは、内因性のＣＰＲを有さず、外因性のＣＰＲを有さず、固有のＰＣＲの過剰発現を有さず、或いは、固有のＣＰＲの発現を減少させてもよい。
【００３８】
好適には、前記Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼは、微生物に固有ではない前記酵素をコードする核酸に由来する前記微生物中に発現される。
【００３９】
好ましくは、シンナモイル−ＣｏＡは、ＡＴＰとＣｏＡが基質であり、且つ、ＡＤＰが生成物である酵素によって触媒される反応で形成され、好適にはシンナモイル−ＣｏＡが４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（なお、４−クマロイル−ＣｏＡリガーゼともいう。）によって触媒される反応で形成される。公知の４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ酵素は、基質として４−クマル酸かケイヒ酸のどちらかを受容し、対応するＣｏＡ誘導体を生成する。一般に、そのような酵素は、酵素が基質とする４−クマル酸とより高い活性を示すか、或いは、基質とするケイヒ酸とより高い活性を示すにしても、４−クマレート−ＣｏＡリガーゼとして知られている。
しかしながら、我々は、ここで、選好する基質を有する酵素を、シンナメート−ＣｏＡリガーゼ’酵素（あるいは、シンナモイル−ＣｏＡリガーゼ）とよぶ。そのような酵素の１つは、例えばＡｎｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ．２００３に記述されている。
【００４０】
前記４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ、又はシンナメート−ＣｏＡリガーゼは、植物、微生物、又は線虫に由来する４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ／シンナメート−ＣｏＡリガーゼ（ＥＣ  ６．２．１．１２）であってもよい。植物は、モミ属（Ａｂｉｅｓ）、例えばＡ．ｂｅｓｈａｎｚｕｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｆｉｒｍａ、Ｂ．ｈｏｌｏｐｈｙｌｌａ、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）に属する植物、例えばＡ．ｔｈａｌｉａｎａ、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）に属する植物、例えば、Ｂ．ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｒａｐａ、Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ、ミカン属（Ｃｉｔｒｕｓ）に属する植物、例えばＣ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ、カラマツ属（Ｌａｒｉｘ）に属する植物，例えば、Ｌ．ｄｅｃｉｄｕａ、Ｌ．ｇｍｅｌｉｎｉｉ、Ｌ．ｇｒｉｆｆｉｔｈｉａｎａ、Ｌ．ｈｉｍａｌａｉｃａ、Ｌ．ｋａｅｍｐｆｅｒｉ、Ｌ．ｌａｒｉｃｉｎａ、Ｌ．ｍａｓｔｅｒｓｉａｎａ、Ｌ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｌ．ｐｏｔａｎｉｎｉｉ、Ｌ．ｓｉｂｉｒｉｃａ、Ｌ．ｓｐｅｃｉｏｓａ、インゲンマメ属（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）に属する植物、例えば、Ｐ．ａｃｕｔｉｆｏｌｉｕｓ、Ｐ．ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ、マツ属（Ｐｉｎｕｓ）に属する植物、例えばＰ．ａｒｍａｎｄｉｉ、Ｐ．ｂａｎｋｓｉａｎａ、Ｐ．ｐｉｎａｓｔｅｒ、ハコヤナギ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）に属する植物、例えばＰ．ｂａｌｓａｍｉｆｅｒａ、Ｐ．ｔｏｍｅｎｔｏｓａ、Ｐ．ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）に属する植物、例えばＳ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ、ヴィートス属（Ｖｉｔｕｓ）、例えばＶｉｔｕｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ、トウモロコシ属（Ｚｅａ）に属する植物、例えばＺ．ｍａｙｓ、或いは、アガスタケ属（Ａｇａｓｔａｃｈｅ）、アンフォラ属（Ａｍｏｒｐｈａ）、カタヤ属（Ｃａｔｈａｙａ）、ヒマラヤスギ属（Ｃｅｄｒｕｓ）、クロッカス属（Ｃｒｏｃｕｓ）、ウシノケグサ属（Ｆｅｓｔｕｃａ）、ダイズ属（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、クルミ属（Ｊｕｇｌａｎｓ）、シマモミ属（Ｋｅｔｅｌｅｅｒｉａ）、リソスペルマム属（Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍ）、ロリウム属（Ｌｏｌｉｕｍ）、ハス属（Ｌｏｔｕｓ）、トマト属（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、リンゴ属（Ｍａｌｕｓ）、ウマゴヤシ属（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）、メセンブリアンテマム属（Ｍｅｓｅｍｂｒｙａｎｔｈｅｍｕｍ）、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、ノトツガ属（Ｎｏｔｈｏｔｓｕｇａ）、オリザ属（Ｏｒｙｚａ）、テンジクアオイ属（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ）、ペトロセリヌム属（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ）、センタイ属（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ）、トウヒ属（Ｐｉｃｅａ）、サクラ属（Ｐｒｕｎｕｓ）、モミ属（Ｐｓｅｕｄｏｌａｒｉｘ）、トガサワラ属（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ）、ローザ属（Ｒｏｓａ）、キイチゴ属（Ｒｕｂｕｓ）、Ｒｙｚａ属、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）、マツナ属（Ｓｕａｅｄａ）、テルンギエラ属（Ｔｈｅｌｌｕｎｇｉｅｌｌａ）、コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、又はツガ属（Ｔｓｕｇａ）のいずれか１種類に属する植物であってもよい。
微生物は、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）に属する糸状菌、例えばＡ．ｆｌａｖｕｓ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、アカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）に属する糸状菌、例えばＮ．ｃｒａｓｓａ、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）に属する真菌、例えばＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ属に属する真菌、例えばＭ．ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属する細菌、例えばＭ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）に属する細菌、例えばＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属する細菌、例えばＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）に属する細菌、例えばＲ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、アンシロストーマ属（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ）に属する線虫、例えばＡ．ｃｅｙｌａｎｉｃｕｍ、カエノルハブディティス属（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ）に属する線虫、例えばＣ．ｅｌｅｇａｎｓ、ヘモンクス属（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ）に属する線虫、例えばＨ．ｃｏｎｔｏｒｕｓ、Ｌｕｍｂｒｉｃｕｓ属に属する線虫、例えばＬ．ｒｕｂｅｌｌｕｓ、Ｍｅｉｌｏｄｏｇｙｎｅ属に属する線虫、例えばＭ．ｈａｐｌａ、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｕｓ属に属する線虫、例えばＳ．ｒａｔｔｉｉ、Ｓ．ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ、Ｐｒｉｓｔｉｏｎｃｈｕｓ属に属する線虫、例えばＰ．ｐａｃｉｆｉｃｕｓであってもよい。
【００４１】
微生物は、天然に発生すると同時に、好ましくは前記代謝経路においてそれぞれの酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、組み換え的に前記微生物に導入された。
【００４２】
前記酵素をコードするコード配列を導入することに加えて又は代わりに、前記微生物において、前記コード配列と固有的ではなく関連するプロモーター配列などの１つ以上の発現シグナルを提供することができる。従って、随意に、Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする遺伝子配列の少なくとも１つのコピーは、前記微生物において前記遺伝子配列と固有的に関連しない発現シグナルに随意に連結される。
【００４３】
発現シグナルは、転写、ＲＮＡ処理、安定性、関連したコード配列の翻訳に影響を与えるコード配列の上流（５’ｎｏｎ−コード配列）、中流、下流（３’ｎｏｎ−コード配列）に位置するヌクレオチド配列を含む。そのような配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、及びポリアデニル化認識を含む。
【００４４】
任意に、４−クマレートＣｏＡリガーゼ、又はシンナメート−ＣｏＡリガーゼをコードする遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、天然かどうかにかかわらず、該生物において該遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに有効に機能可能に連結される。
【００４５】
任意に、スチルベンゼンシンターゼをコードする遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、天然かどうかにかかわらず、該生物において該遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに有効に機能可能に連結される。
【００４６】
任意に、ピノシルビンシンターゼをコードする遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、天然かどうかにかかわらず、該生物において該遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに有効に機能可能に連結される。
【００４７】
ある態様において、本発明は、第１酵素により触媒され、かつその反応工程がアンモニアを作る反応により第１代謝産物が第２代謝産物に変換され、ＡＴＰ及びＣｏＡが基質であり、ＡＤＰが生成物である第２酵素により触媒される反応で該第２代謝産物が第３代謝物に変換され、内在性マロニル−ＣｏＡが基質である第３酵素により触媒される反応で第３代謝産物が第４代謝産物に変換される有効に機能する代謝経路を有するさまざまに記述された代謝改変微生物を提供する。
【００４８】
上記微生物として、発現シグナルに有効に機能可能に連結されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに有効に機能可能に連結された４−クマレートＣｏＡリガーゼ、又はシンナメート−ＣｏＡリガーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに有効に機能可能に連結されたリスベラトロールシンターゼになるであろうスチルベンシンターゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有する微生物が挙げられる。
【００４９】
また、上述した微生物としては、発現シグナルに有効に機能可能に連結されたチロシンアンモニアリアーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに有効に機能可能に連結された４−クマレートＣｏＡリガーゼ、又はシンナメート−ＣｏＡリガーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに有効に機能可能に連結されたピノシルビンシンターゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有する微生物も挙げられる。
【００５０】
現在の文脈において、「微生物」は、細菌等の微生物、酵母等の微細菌に関する。
【００５１】
さらに具体的には、微生物は真菌であってよく、さらに具体的には、アスペルギルス属に属する糸状菌、例えば、黒色アスペルギルス、Ａ．ａｗａｍｏｒｉ、麹菌、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に属する酵母、例えば、Ｓ．セレヴィシエ、Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ、Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ、Ｓ．ｓｅｖａｚｚｉ、Ｓ．ｕｖａｒｕｍ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属に属する酵母、例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ  ｖａｒ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、カンジダ属に属する酵母、例えば、Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ、ピチア属に属する酵母、例えば、Ｐ．ｓｔｉｐｉｄｉｓ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｓｏｒｂｉｔｏｐｈｉｌａ、又は他の酵母属、例えば、クリプトコッカス属、Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、ピチア属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属又はシゾサッカロミセス属であってよい。他の微生物に関して、ペニシリウム属、クモノスカビ属、フサリウム属、Ｆｕｓｉｄｉｕｍ属、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ属、ケカビ属、モルティエラ属、トリコデルマ属に属する種等の好適な糸状菌の非網羅的なリストが提供される。
【００５２】
細菌に関して、好適な細菌の非網羅的なリストは以下の通り与えられる：バシラス属に属する種、エシェリキア属に属する種、乳酸菌属に属する種、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する種、コリネバクテリア属に属する種、アセトバクター属に属する種、アシネトバクター属に属する種、シュードモナス属に属する種等。
【００５３】
本発明の好ましい微生物は、Ｓ．セレヴィシエ、黒色アスペルギルス、麹菌、大腸菌、乳酸連鎖球菌又は枯草菌であってよい。
【００５４】
構築され、改変された微生物は、ケモスタット培養、バッチ培養、流加バッチ培養等の一般に知られている方法を用いて培養することができる。
【００５５】
例えば、本発明は、微生物細胞を炭素基質にケイヒ酸の外部源の実質的な非存在下で接触させる工程を含むピノシルビンの製造方法であって、該細胞が該条件下でピノシルビンを作る能力を有し、該微生物が真菌及び細菌、特に酵母からなる群より選択することができる。
【００５６】
このようにして製造されたピノシルビンは、随意に単離、または精製されてもよく、最適な方法としては、ｎ−ヘキサンを使った溶媒抽出後、１００％エーテル、アセトン、メタノール、及び水を用いて順次抽出を徐々に行う方法、並びに、ｎ−ヘキサン／エチルアセテート（２／１）システムを使ったシリカゲルカラムでのクロマトグラフィー精製が挙げられる（Ｓｕｇａ  ｅｔ  ａｌ．１９９３）。
【００５７】
前記炭素基質は、単糖類、小糖類及び多糖類、例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、マンノース、スクロース、ラクトース、エリトロース、スレオース及び／又はリボースからなる発酵性炭素基質の群より任意に選択される。該炭素基質は、さらに又は代わりに、エタノール、アセテート、グリセロール及び／又はラクテート等の非発酵性炭素基質からなる群より選択してもよい。該非発酵性炭素基質は、さらに又は代わりに、アミノ酸からなる群より選択してよく、フェニルアラニンであってよい。
【００５８】
別の態様において、本発明は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、４−クマレート−ＣｏＡ−リガーゼ及びリスベラトロールシンターゼをコードするヌクレオチド配列の異種発現によるピノシルビンの製造方法、さらにフェニルアラニンアンモニアリアーゼ、４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ及びピノシルビンシンターゼをコードするヌクレオチド配列の異種発現によるピノシルビンの製造方法を含む。
【００５９】
そのように製造されるピノシルビンを含むピノシルビンは、例えば、乳製品又はビール等の飲料などの食品中の栄養補助食品として使用することができる。従って、本発明としては、微生物が生産したピノシルビンを含む食品も含む。
【００６０】
本発明は、さらに、微生物細胞からなる微生物組成物を含み、且つ、少なくとも乾燥重量基準で１．５ｍｇ／ｇのピノシルビンを含む。例えば、ピノシルビンを含有する、酵母菌、酵母菌含有物、酵母菌由来製剤、生成されたピノシルビンは、例えば、乾燥した状態で、人間や動物の消費物に用いてもよく、好適には、酵母菌を例えば少なくとも０．５ｇ例えば１〜３ｇ含む錠剤あるいはカプセルなどの経口投薬形態として用いてもよい。
【００６１】
ここで記述したあらゆる天然型酵素は、突然変異型によって置換することができる。天然型の必須の酵素活性を維持しながら、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の命名された天然型酵素に関連するアミノ酸相同を有する突然変異型が好適である。これは、天然型のあらゆる基質の選択を維持することを含む。例えば、チロシンよりフェニルアラニンへ、クマル酸よりケイヒ酸へ、クマロイル−ＣｏＡよりシンナモイル−ＣｏＡが挙げられる。ここで記述した酵素をコードするあらゆる天然型のコード配列は、同じ酵素であるがコドンの使用量が調節された酵素のコード配列と置換してもよい。これは、ここで記述した天然型酵素と、上記で議論された突然変異型の両方を表す。天然型酵素の突然変異型をコードするヌクレオチド配列は、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の程度で対応する天然型酵素の野生型ヌクレオチド配列と相同であることが好ましい。
【００６２】
酵素の突然変異型は、天然型酵素のそれから大きく変化しないレベルの酵素活性を有し、或いは、より高いレベルの活性を有するように選択してもよい。天然型酵素のアミノ酸の同類置換は、公知の慣行に従って行うことができる。改良された活性を有する酵素は、技術的に知られている指向進化技術によって発展してもよく、Ｅ．ｃｏｌｉ、又はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等の適したテスト組織中の酵素をコードする際に、ランダムに遺伝的変化を導入した後、所望の特性をスクリーニングすることによって改良された変異型を発現と選択する方法、又は改良された活性を発現する微生物の下で自己選択条件を与える方法によって生成される酵素にランダムな変化は、生存上優位となるであろう。
【００６３】
例えば、ケイヒ酸等の基質の供給の不在、或いは実質的な不在、或いは欠如についての言及は、基質に代謝されるか、又は基質のさらなる代謝の直接的な生成物である例えばシンナモイル−ＣｏＡなどのケイヒ酸エステル（チオエステルも含む）など誘導体の実質的な不在を含む。特に、ケイヒ酸の欠如は、シンナモイル−ＣｏＡの欠如を示唆するものである。
【００６４】
本発明に従って製造されるピノシルビンとしては、シス−ピノシルビン、又はトランス−ピノシルビンが挙げられ、それらは、それぞれシス−ケイヒ酸、及びトランス−ケイヒ酸から形成されることが期待される。もう１つの方法として、シス−ピノシルビンは、異性化を含むプロセスによってトランス−ピノシルビンから形成することができる。しかし、トランス−型が通常優位を占めることが期待される。
本発明の上記説明の容易な理解を助けるために、添付の図面を参照されたい。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１は、ピノシルビンの化学構造を示す。
【図２】図２は、クマロイル−ＣｏＡに作用し、リスベラトロールに導くリスベラトロールシンターゼを利用するフェニルプロパノイド経路を示す。
【図３】図３は、シンナモイル−ＣｏＡに作用し、ピノシルビンに導くピノシルビンシンターゼ、又はリスベラトロールシンターゼを利用するフェニルプロパノイド経路を示す。
【図４】図４は、１００ｇ／ｌのガラクトースで成長させたＳ．セレヴィシエ菌株であるＦＳＳＣ−ＰＡＬ４ＣＬＶＳＴ１の浮遊物及び細胞抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。６０ナノグラムの純粋なピノシルビンのクロマトグラムが含まれる。
【図５】図５は、１００ｇ／ｌのガラクトースで成長させたＳ．セレヴィシエ菌株であるＦＳＳＣ−ＰＡＬ４ＣＬＲＥＳの細胞抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。６０ナノグラムの純粋なピノシルビンのクロマトグラムが含まれる。
【図６Ａ】図６Ａは、純粋なピノシルビンのＬＣ−ＭＳデータ、及び１００ｇ／ｌのガラクトースで成長させたＳ．セレヴィシエ菌株であるＦＳＳＣ−ＰＡＬ４ＣＬＶＳＴ１により生産されたピノシルビンのＬＣ−ＭＳデータを示す。ＭＺ２１１．０７５９Ｄａ／ｅにおけるベースピーククロマトグラムとネガティブイオントレースが示されている。
【図６Ｂ】図６Ｂは、純粋なピノシルビンのＬＣ−ＭＳデータ、及び１００ｇ／ｌのガラクトースで成長させたＳ．セレヴィシエ菌株であるＦＳＳＣ−ＰＡＬ４ＣＬＶＳＴ１により生産されたピノシルビンのＬＣ−ＭＳデータを示す。ＭＺ２１１．０７５９Ｄａ／ｅにおけるベースピーククロマトグラムとネガティブイオントレースが示されている。
【図６Ｃ】図６Ｃは、純粋なピノシルビンのＬＣ−ＭＳデータ、及び１００ｇ／ｌのガラクトースで成長させたＳ．セレヴィシエ菌株であるＦＳＳＣ−ＰＡＬ４ＣＬＶＳＴ１により生産されたピノシルビンのＬＣ−ＭＳデータを示す。ＭＺ２１１．０７５９Ｄａ／ｅにおけるベースピーククロマトグラムとネガティブイオントレースが示されている。
【図６Ｄ】図６Ｄは、純粋なピノシルビンのＬＣ−ＭＳデータ、及び１００ｇ／ｌのガラクトースで成長させたＳ．セレヴィシエ菌株であるＦＳＳＣ−ＰＡＬ４ＣＬＶＳＴ１により生産されたピノシルビンのＬＣ−ＭＳデータを示す。ＭＺ２１１．０７５９Ｄａ／ｅにおけるベースピーククロマトグラムとネガティブイオントレースが示されている。
【図７】図７は、実施例１６で得られたＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図８】図８は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の菌株（上段）、及び対照菌株（下段）を生産するピノシルビンの発酵に由来する抽出生成物のＨＰＬＣの分析結果を示す。
【実施例】
【００６６】
以下の限定されない実施例により本発明をさらに説明し、例示する。
（実施例１）
ＰＡＬ、４ＣＬ、ＲＥＳ、及びＶＳＴ１をコードする遺伝子の単離
フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ２）（コクレンら（Ｃｏｃｈｒａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．）、２００４年；配列番号１、配列番号２）、４−クマレート：コエンザイムＡリガーゼ（４ＣＬ１）（ハンバーガー及びハルブロック（（Ｈａｍｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｈｌｂｒｏｃｋ）、２００４年；エルチングら（Ｅｈｌｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９９年；配列番号３、配列番号４）を、ＰＣＲにより、表１のプライマーを用いて、シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）のｃＤＮＡ（バイオキャット社（ＢｉｏＣａｔ）、ハイデルベルグ、ドイツ）から単離した。
ケイヒ酸とシンナモイル−ＣｏＡのそれぞれに対する好ましい速度パラメーターのために、幾つかのシロイヌナズナ相同体（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ）のうち、ＰＡＬ２と４ＣＬ１を選択した（コクレンら（Ｃｏｃｈｒａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．）、２００４年；ハンバーガー及びハルブロック（（Ｈａｍｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｈｌｂｒｏｃｋ）、２００４年；エルチングら（Ｅｈｌｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．），１９９９年）。
【００６７】
Ｒｈｕｂａｒｂ，Ｒｈｅｕｍ  ｔａｔａｒｉｃｕｍに由来するリスベラトロールシンターゼ（ＲＥＳ）のコード配列（サマピトら（Ｓａｍａｐｐｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．）、２００３年；配列番号５、配列番号６）は、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での発現のために、ｗｗｗ．ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ．ｃｏｍのオンラインサービスバックトランスレーションツールを用いて、コドン最適化を行って、配列番号７と配列番号８を得た。
合成遺伝子組立てのためのオリゴ（Ｏｌｉｇｏｓ）は、ＭＷＧバイオテック社（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で構築され、合成遺伝子は、以下に述べるマーチンら（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）（２００３年）の若干改良された方法プロトコールを用いて、ＰＣＲにより組み立てられた。
【００６８】
【表１】
0005528108.tif 000002
【００６９】
合成遺伝子の組立てのためにＭＷＧ社のプライマーをミリＱ水に溶解させて１００ｐｍｏｌｅ／μｌの濃度とした。各プライマーの５μｌのアリコートをトータルミックス中で一緒にし、次にミリＱ水で１０倍希釈した。遺伝子は、融合ＤＮＡポリメラーゼ（フィンザイム社（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ））のために５０μｌあたり鋳型として５μｌの希釈トータルミックスを用いたＰＣＲにより組み立てた。
ＰＣＲプログラムは以下の通りである。
最初に９８℃で３０秒間、次に、１０００塩基対あたり、９８℃で１０秒間、４０℃で１分間及び７２℃で１分間の３０サイクル、及び最後に７２℃で５分間とした。得られたＰＣＲ反応物から、２０μｌを１％アガロースゲルで精製した。その結果はＰＣＲスメアであり、欲する大きさの周囲の領域をアガロースゲルから切り取り、ＱｉａＱｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて精製した。
表１の外側のプライマーによる最終的なＰＣＲは、要求されたＲＥＳ遺伝子を与えた。Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発ＩＩキット（ストラタジン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ラホーヤ、カリフォルニア州）を用いて点突然変異を補正した。
【００７０】
Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ（ｇｒａｐｅｖｉｎｅ）をコードするＶＳＴ１遺伝子
リスベラトロールシンターゼ（Ｈａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）を，ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）により合成した。アミノ酸配列（配列番号１０）を、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（配列番号９）での発現のために最適化された合成遺伝子コドンを産出するために鋳型として用いた。合成ＶＳＴ１遺伝子を、ＢａｍＨ１とＸｈｏ１の制限部位によって側面に位置する大腸菌ｐＵＣ５７を供給し、挿入した。合成遺伝子を、ＢａｍＨ１／Ｘｈｏ１制限によるｐＵＣ５７ベクターで精製し、且つ、ＱｉａＱｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ））を用いてアガロースゲルで精製した。
【００７１】
（実施例２）
ＰＡＬ２発現用の酵母ベクターの構築
実施例１に記載のように単離されたＰＡＬ２をコードする遺伝子を、ＥｃｏＲ１とＳｐｅ１の制限部位（表１）を含む５'突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いるＰＣＲにより再増幅した。増幅されたＰＡＬ２  ＰＣＲ産物をＥｃｏＲ１／Ｓｐｅ１により消化し、消化されたｐＥＳＣ−ＵＲＡベクター（ストラタジン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））をＥｃｏＲ１／Ｓｐｅ１に連結して、ベクターｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＰＡＬ２を得た。
遺伝子の配列は、２つの異なるクローンの配列決定により検証した。
【００７２】
（実施例３）
４ＣＬ１発現用酵母ベクターの構築
４ＣＬ１をコードする遺伝子を実施例１に記載のように単離した。増幅された４ＣＬ１  ＰＣＲ産物をＸｂａ１／ＢａｍＨ１により消化し、Ｓｐｅ１／ＢｇｌＩＩで消化されたｐＥＳＣ−ＴＲＰベクター（ストラタジン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））に連結して、ベクターｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ１を得た。ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ１の２つの異なるクローンの配列を決定して、クローニングされた遺伝子の配列を検証した。
【００７３】
（実施例４）
４ＣＬ１及びＲＥＳ発現用の酵母ベクターの構築
ＲＥＳをコードする遺伝子を実施例１に記載のように単離した。増幅された合成ＲＥＳ遺伝子をＢａｍＨ１／Ｘｈｏ１により消化し、ＢａｍＨ１／Ｘｈｏ１で消化されたｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ１（実施例３）に連結した。
得られたプラスミドｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ１−ＲＥＳは、分岐ＧＡＬ１／ＧＡＬ１０プロモーターの制御下に４ＣＬ１とＲＥＳをコードする遺伝子を含んでいた。ＶＳＴ１をコードする遺伝子の配列はｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ１−ＶＳＴ１の２つの異なるクローンの配列決定により検証した。
【００７４】
（実施例５）
４ＣＬ１及びＶＳＴ１発現用の酵母ベクターの構築
ＶＳＴ１をコードする遺伝子を実施例１に記載のように単離した。精製され且つ消化されたＶＳＴ１遺伝子を、ＢａｍＨ１／Ｘｈｏ１で消化されたｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ（実施例４）に連結した。得られたプラスミドｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ１−ＶＳＴ１は、分岐ＧＡＬ１／ＧＡＬ１０プロモーターの制御下に４ＣＬ１とＶＳＴ１をコードする遺伝子を含んでいた。ＶＳＴ１をコードする遺伝子の配列はｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ１−ＶＳＴ１の２つの異なるクローンの配列決定により検証した。
【００７５】
（実施例６）
酵母Ｓ．セレヴィシエにおいてＰＡＬ２、４ＣＬ１、及びＲＥＳを用いてリスベラトロールを導く経路の発現
適当な遺伝子マーカーを含む酵母菌株を実施例２、実施例３、及び実施例４で記載したベクターにより別々に、又は組合せて形質転換した。酵母細胞の形質転換は、当分野で公知の方法にしたがって、コンピテント細胞、又はその代わりになるものとして例えば電気穿孔法を用いて実施した（例えば、サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８９年を参照）。形質転換体は、ウラシル及び／又はトリプトファンを欠如する培地上で選択し、画線を同培地上で精製した。
Ｓ．セレヴィシエ菌株ＦＳ０１２６７（ＭＡＴａ  ｔｒｐ１  ｕｒａ３）を、ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＰＡＬ２（実施例２）、及びｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ１−ＲＥＳ（実施例４）により同時形質転換し、形質転換された菌株をＦＳＳＣ−ＰＡＬ２４ＣＬ１ＲＥＳと命名した。
【００７６】
（実施例７）
酵母Ｓ．セレヴィシエにおいてＰＡＬ２、４ＣＬ１、及びＶＳＴ１を用いてピノシルビンを導く経路の発現
適当な遺伝子マーカーを含む酵母菌株を実施例２、実施例３、及び実施例５で記載したベクターにより別々に、又は組合せて形質転換した。酵母細胞の形質転換は、当分野で公知の方法にしたがって、例えば、コンピテント細胞又は電気穿孔法を用いて実施した（例えば、サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８９年を参照）。形質転換体は、ウラシル及び／又はトリプトファンを欠如する培地上で選択し、画線を同培地上で精製した。
Ｓ．セレヴィシエ菌株ＦＳ０１２６７（ＭＡＴａ  ｔｒｐ１  ｕｒａ３）を、ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＰＡＬ２（実施例２）、及びｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ１−ＶＳＴ１（実施例５）により同時形質転換し、形質転換された菌株をＦＳＳＣ−ＰＡＬ２４ＣＬ１ＶＳＴ１と命名した。
【００７７】
（実施例８）
振盪フラスコによる組換え酵母菌株による発酵
前記組換え酵母菌株を、滅菌した接種用ループにより寒天プレートに接種し、ビタミン類、微量元素、５ｇ／ｌのグルコース及び９５ｇ／ｌを含有する１００ｍｌの合成無機培地（ベルダインら（Ｖｅｒｄｕｙｎ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９２年）で増殖させた。５００ｍｌのコック付き振盪フラスコを３日間、３０℃、１６０ｒｐｍでインキュベートした。
【００７８】
（実施例９）
ａ）ピノシルビンの抽出
５分間の遠心により５０００ｇの細胞を回収した。５０ｍｌの上清アリコートを２０ｍｌの酢酸エチルで一回抽出した。この酢酸エチルを凍結乾燥し、乾燥生成物を０．７ｍｌのメタノールで再溶解し、ろ過してＨＰＬＣバイアルに入れた。
１００ｍｌ培地から得られた細胞ペレットを２ｍｌの水に溶解し、３本の迅速調製チューブに分割し、ガラス玉で砕いた。これらの３チューブからの粗製抽出物を、５０ｍｌの縫工チューブ中の１０ｍｌの１００％メタノール中にプールし、４℃の冷暗部屋でロータリーチャンバーにより４８時間抽出した。４８時間後、細胞デブリスを遠心により５分間、５０００ｇで除去し、該メタノールを一晩の凍結乾燥により除去した。乾燥残留物を０．７ｍｌのメタノールに再溶解し、ろ過してＨＰＬＣバイアルに入れた。
【００７９】
ｂ）ピノシルビンの分析
（ＨＰＬＣ）
ケイヒ酸、クマル酸及びリスベラトロールの定量的分析のために、試料を、λ＝３０６ｎｍのＵＶダイオードアレイ検出前に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）シリーズ１１００システム（ヒューレットパッカード社（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）製）による分離に供した。
フェノメネックス社（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）（トランス、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）製Ｌｕｎａ３マイクロメートルＣ１８（１００×２．００ｍｍ）カラムを４０℃で用いた。移動相として、アセトニトリルとミリＱ水（両方とも５０ｐｐｍのトリフルオロ酢酸を含む）のグラジエントを０．４ｍｌ／分の流速で用いた。グラジエントのプロフィールは２０分間にわたる１５％アセトニトリルから１００％アセトニトリルの間、リニアであった。溶出時間はトランス−ピノシルビンで約８．８〜８．９分であった。純粋ピノシルビンスタンダード（＞９５％純粋）は、アルボノバ社（ＡｒｂｏＮｏｖａ）（トゥルク、フィンランド）から購入した。
【００８０】
（ＬＣ−ＭＳ）
サンプルと標準を、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステム（アジレントテクノロジーズ社（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ワルブロン、ドイツ）に連結したＬｏｃｋｓｐｒａｙ（商品名）基準プルーブを具備したＷａｔｅｒｓ（マイクロマス社（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）、マンチェスター、イギリス）ＬＣＴ（商品名）飛行時間質量分析計で、ネガティブ電気スプレイによって分析した。分離は、０．３ｍｌ／分で水−アセトニトリドのグラジエントを用いて、４ｍｍ×２ｍｍ  ＩＤ  ＳｅｃｕｒｉｔｙＧｕａｒｄ（商品名）プレ−カラム（フェノメネックス社（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）、アメリカ）に取り付けられた５０ｍｍ×２ｍｍ  ＩＤ  Ｌｕｎａ  Ｃ−１８（ＩＩ）カラム（フェノメネックス社（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、アメリカ）で行った。２つの溶離液は共に、２０ｍＭのギ酸を含有していた。溶媒の組成を、２０分間で、注入時１５％のアセトニトリルから１００％のアセトニトリルへ変化させ、それをグラジエントを始動条件に戻す前に５分間維持した。３μｌサンプルを、すべてのケースに注入し、カラムを４０℃に維持した。すべての化学物質は、ＨＰＬＣ勾配で、ＭｉＬＬｉ−Ｑ（商品名）水に溶解した。ＵＶスペクトルは、４ｎｍの分解能を有する２スペクトル／秒で２００〜７００ｎｍから収集した。質量分析計を、ロイシン  ｅｎｋｐｈａｌｉｎｅ（０．５％ギ酸を使って５０％アセトニトリル中で０．５μｇ／ｍｌ）の溶液に５５００ＦＷＨよりも良好な分解能になるようにネガティブ電気スプレイモードで最大感度にして調節した。前記溶液を、１５μｌ／分のネガティブＥＳＩのＬｏｃｋｓｐｒａｙ（商品名）で質量基準として使用した。機器を、５０％アセトニトリルのカルボキシル化したＰＥＧ混合液においてネガティブＥＳＩで較正した。両方の場合の較正において、少なくとも２５キャリブレーションイオンで２ｍＤａよりも少ない残余誤差であった。運転条件は、最小インソースフラグメンテーションのために選んだ。質量スペクトルを、０．１秒のインタースキャン時間のスペクトルあたりの０．４秒の比で１００〜９００Ｄａ／ｅから収集した。基準スペクトルを、３秒毎に、Ｌｏｃｋｓｐｒａｙ（商品名）プローブから収集し、１０の基準スペクトルを、内部質量補正のために平均化した。狭いイオンの微量を、期待された代謝のプロトン化、又は非プロトン化した質量あたりで＋／−２５ｍＤａを用いて抽出した。
【００８１】
（結果）
ＦＳＳＣ−ＰＡＬ２４ＣＬ１ＲＥＳ菌株とＦＳＳＣ−ＰＡＬ２４ＣＬ１ＶＳＴ１菌株を実施例８に記載のように１００ｇ／ｌのガラクトースで培養し、ピノシルビンの含量を分析した。さらに、空のベクターのみを含むコントロール菌株のＦＳＳＣコントロールを含めた。ＨＰＬＣ分析は、ＦＳＳＣ−ＰＡＬ２４ＣＬ１ＶＳＴ１菌株とＦＳＳＣ−ＰＡＬ２４ＣＬ１ＲＥＳ菌株がトランス−ピノシルビンと同じ８．８〜９．０分の保持時間を有する成分を含むことを示した（図４及び図５）。この結果は、８．２分の保持時間を有するＦＳＳＣ−ＰＡＬ２４ＣＬ１ＶＳＴ１菌株の浮遊物中の成分の存在を明らかにするＬＣ−ＭＳによっても確認され、この浮遊物中の成分は、２１１．０５７９Ｄａ／ｅ±２５のＭ／Ｚを有し、ネガティブイオンモードで純粋ピノシルビンのＭ／Ｚに実際に一致した。
さらに、ＵＶ吸収スペクトルは、約３０６ｎｍのλｍａｘを有する純粋なトランス−ピノシルビン（図示せず）の吸収スペクトルに類似した。
【００８２】
したがって、これらの結果は、トランス−ピノシルビンのインビボ生産を導くＳ．セレヴィシエの活性フェニル−プロパノイド経路の存在を示した。明確な増殖条件下にバッチ培養及び連続培養で菌株を培養し、及び／又は個々の酵素の発現／活性を最適化することによってピノシルビンの生産が最も高い可能性で向上できるだろう。
【００８３】
（実施例１０）
ａ）大腸菌におけるＰＡＬ２の発現用細菌ベクターの構築
以下の実施例で用いられたプラスミドは１つ以上のマーカー遺伝子を持っており、それらを持つ微生物を、それらを持たない微生物から選択することができる。選択システムは、優性マーカー、例えば、アンピシリンとカナマイシンに対する耐性に基づく。さらに、プラスミドは、組換え遺伝子の発現を可能とするプロモーター配列とターミネーター配列を含む。さらに、プラスミドはＤＮＡ断片のクローニングとそれに引き続く組換え体の同定を容易にする好適な独自の制限部位を含む。本実施例において、プラスミドは、ｐＥＴ１６ｂ（ノヴァゲン社（Ｎｏｖａｇｅｎ））と呼ばれるアンピシリン耐性遺伝子又はｐＥＴ２６ｂ（ノヴァゲン社（Ｎｏｖａｇｅｎ））と呼ばれるカナマイシン耐性遺伝子のいずれかを含む。
【００８４】
実施例１に記載のように単離されたＰＡＬ２をコードする遺伝子を、好適な制限部位を含む５'突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＰＡＬ２（実施例２）からＰＣＲにより再増幅した。遺伝子の５'末端と３'末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物を乳酸連鎖球菌に由来するＴ７を含む消化ｐＥＴ１６Ｂベクターに連結することができる。得られたプラスミドｐＥＴ１６Ｂ−ＰＡＬ２は、Ｔ７プロモーターの制御下にＰＡＬ２をコードする遺伝子を含有する。
【００８５】
ｂ）大腸菌における４ＣＬ１及びＶＳＴ１発現用細菌ベクターの構築
実施例１に記載のように単離された４ＣＬ１をコードする遺伝子を、好適な制限部位を含む５'突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いてプラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡ−４ＣＬ１−ＶＳＴ１（実施例５）からＰＣＲにより再増幅する。遺伝子の５'末端と３'末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物を消化ｐＥＴ２６Ｂベクターに連結することができる。得られたプラスミドｐＥＴ２６Ｂ−４ＣＬ１は、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）由来のＴ７プロモーターの制御下に４ＣＬ１をコードする遺伝子を含有する。
【００８６】
実施例１に記載のように単離されたＶＳＴ１をコードする遺伝子を、好適な制限部位を含む５'突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡ−４ＣＬ１−ＶＳＴ１（実施例５）からＰＣＲにより再増幅した。遺伝子の５'末端と３'末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物を消化ｐＥＴ１６Ｂベクターに連結することができる。得られたプラスミドｐＥＴ１６Ｂ−ＶＳＴ１は、Ｔ７プロモーターの制御下にＶＳＴ１をコードする遺伝子を含む。Ｔ７プロモーターと、ＶＳＴ１をコードする遺伝子とを、好適な制限部位を含む５'突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドｐＥＴ１６Ｂ−ＶＳＴ１からＰＣＲにより１つの断片として再増幅する。ＤＮＡ断片の５'末端と３'末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物を消化プラスミドｐＥＴ２６Ｂ−４ＣＬ１に連結することができる。得られたプラスミドｐＥＴ２６Ｂ−４ＣＬ１−ＶＳＴ１は、個々のＴ７プロモーターの制御下に４ＣＬ１及びＶＳＴ１をそれぞれコードする遺伝子を含む。４ＣＬ１とＶＳＴ１をコードする遺伝子の配列を、ｐＥＴ２６Ｂ−４ＣＬ１−ＶＳＴ１の２つの異なるクローンの配列決定により検証する。
【００８７】
ｃ）大腸菌において、ピノシルビンを導く経路の発現
大腸菌の菌株を、（ａ）と（ｂ）に記載されたベクターで別々に、又は組合せて形質転換した。細菌細胞の形質転換は、当分野で公知の方法にしたがって、コンピテント細胞、又はその代わりになるものとして例えば電気穿孔法を用いて実施した（例えば、サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８９年を参照）。形質転換体は、抗生物質アンピシリン（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ａｍｐｉｃｉｌｉｎ）及びカナマイシンを含む培地上で選択し、画線を同培地上で精製した。
【００８８】
別に、大腸菌の菌株Ｂ２１（ＤＥ３）をベクターｐＥＴ１６Ｂ−ＰＡＬ２（ａ）により形質転換して、菌株ＦＳＥＣ−ＰＡＬ２を得て、ｐＥＴ２６Ｂ−４ＣＬ１−ＶＳＴ１（ｂ）により菌株ＦＳＥＣ−４ＣＬ１ＶＳＴ１を得た。さらに、大腸菌の菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を、ｐＥＴ１６Ｂ−ＰＡＬ２（ａ）により同時形質転換し、この形質転換された菌株をＦＳＥＣ−ＰＡＬ２４ＣＬ１ＶＳＴ１と命名した。
【００８９】
ｄ）発酵槽での組換え大腸菌株による発酵
組換え酵母菌株は、バッチ培養、流加バッチ培養又はケモスタット培養として操作される発酵槽で増殖させることができる。この場合、発酵を、振盪フラスコで行った。
【００９０】
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の前培養物を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと６０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む７ｍｌのＬＢ培地で、１６０ｒｐｍ、３７℃にてガラス管中で増殖させた。指数関数的に成長する前培養物を、５０ｇ／ｌのグルコース、５ｇ／ｌのＫ２ＨＰＯ４、８０μｇ／ｍｌのアンピシリン及び５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを追加した２００ｍｌのＬＢ培地を含む５００ｍｌバッフル付き振盪フラスコの接種に用いて、１６０ｒｐｍ、３７℃でインキュベートする。５時間後、３遺伝子（ＰＡＬ２、４ＣＬ１及びＶＳＴ１）のそれぞれの上流に存在するＴ７プロモーターの誘導因子として、イソプロピルβ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭの最終濃度で加えた。３７℃での４８時間のインキュベーション時間の後、細胞を採取し、抽出手順に供し、産生したピノシルビンの有無を分析した。
【００９１】
ｅ）大腸菌におけるピノシルビンの抽出と分析
抽出と分析は実施例９に記載された方法を用いて実施した。
記述した改変菌株（上段）と対照菌株（下段）を使用する発酵に由来する抽出物について行ったＨＰＣＬの結果を、図９に示す。ピノシルビンとケイヒ酸の生成物は、図にマークされている。
【００９２】
（実施例１１）
ａ）乳酸連鎖球菌におけるＰＡＬ２の発現用細菌ベクターの構築
下記実施例に使用されるプラスミドｐＳＨ７１とその誘導体は、大腸菌と乳酸連鎖球菌に由来する複数の複製開始点を有する二機能性シャトルベクターである。それによって、宿主域特異性は大腸菌及び他の種の乳酸菌にわたる。したがって、乳酸連鎖球菌の形質転換は通常は問題なく進むが、他の種の乳酸菌の推定上の困難な形質転換は組換えプラスミドの構築のための中間ホストとして大腸菌を用いることにより克服することができる。プラスミドは１つ以上のマーカー遺伝子を持っており、それらを持つ微生物を、それらを持たない微生物から選択することができる。乳酸連鎖球菌に用いられる選択システムは、優性マーカー、例えば、エリスロマイシンとクロラムフェニコールに対する耐性に基づくが、糖質代謝に関与する遺伝子、ペプチダーゼ及び食品用マーカーに基づくシステムも記載されてきた。さらに、プラスミドは、組換え遺伝子の発現を可能とするプロモーター配列とターミネーター配列を含む。好適なプロモーターは、乳酸連鎖球菌の遺伝子、例えば、ｌａｃＡから取られる。さらに、プラスミドはＤＮＡ断片のクローニングとそれに引き続く組換え体の同定を容易にする好適な独自の制限部位を含む。
【００９３】
下記の手順において、プラスミドは、ｐＳＨ７１−ＥＲＹｒと呼ばれるエリスロマイシン耐性遺伝子又はｐＳＨ７１−ＣＭｒと呼ばれるクロラムフェニコール耐性遺伝子のいずれかを含む。
【００９４】
実施例１に記載のように単離されたＰＡＬ２をコードする遺伝子を、好適な制限部位を含む５'突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＰＡＬ２（実施例２）からＰＣＲにより再増幅した。遺伝子の５'末端と３'末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物を乳酸連鎖球菌に由来するｌａｃＡプロモーターを含む消化ｐＳＨ７１−ＥＲＹｒベクターに連結することができる。得られたプラスミドｐＳＨ７１−ＥＲＹｒ−ＰＡＬ２は、乳酸連鎖球菌由来のｌａｃＡプロモーターの制御下にＰＡＬ２をコードする遺伝子を含有する。ＰＡＬ２をコードする遺伝子の配列は２つの異なるｐＳＨ７１−ＥＲＹｒ−ＰＡＬ２のクローンの配列決定により検証した。
【００９５】
ｂ）乳酸連鎖球菌における４ＣＬ１及びＶＳＴ1の発現用細菌ベクターの構築
実施例１に記載のように単離された４ＣＬ１をコードする遺伝子を、好適な制限部位を含む５'突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ１−ＶＳＴ１（実施例５）からＰＣＲにより再増幅した。遺伝子の５'末端と３'末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物を消化ｐＳＨ７１−ＣＭｒベクターに連結することができる。得られたプラスミドｐＳＨ７１−ＣＭｒ−４ＣＬ１は、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）由来のｌａｃＡプロモーターの制御下に４ＣＬ１をコードする遺伝子を含有する。
実施例１に記載のように単離されたＶＳＴ１をコードする遺伝子を、好適な制限部位を含む５'突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ１−ＶＳＴ１（実施例５）からＰＣＲにより再増幅した。遺伝子の５'末端と３'末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物を消化ｐＳＨ７１−ＥＲＹｒベクターに連結することができる。得られたプラスミドｐＳＨ７１−ＥＲＹｒ−ＶＳＴ１は、乳酸連鎖球菌に由来するｌａｃＡプロモーターの制御下にＶＳＴ１をコードする遺伝子を含む。ｌａｃＡプロモーターと、ＶＳＴ１をコードする遺伝子とを、好適な制限部位を含む５'突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドｐＳＨ７１−ＥＲＹｒ−ＶＳＴ１からＰＣＲにより１つの断片として再増幅する。ＤＮＡ断片の５'末端と３'末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物を消化プラスミドｐＳＨ７１−ＣＭｒ−４ＣＬ１に連結することができる。得られたプラスミドｐＳＨ７１−ＣＭｒ−４ＣＬ１−ＶＳＴ１は、個々のｌａｃＡプロモーターの制御下に４ＣＬ１及びＶＳＴ１をそれぞれコードする遺伝子を含む。４ＣＬ１とＶＳＴ１をコードする遺伝子の配列を、ｐＳＨ７１−ＣＭｒ−４ＣＬ１−ＶＳＴ１の２つの異なるクローンの配列決定により検証する。
【００９６】
ｃ）乳酸連鎖球菌においてピノシルビンを導く経路の発現
乳酸連鎖球菌株を、実施例１６及び実施例１７に記載されたベクターで別々に、又は組合せて形質転換する。細菌細胞の形質転換は当分野で公知の方法にしたがって、例えば、コンピテント細胞又は電気穿孔法を用いて実施した（例えば、サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．）（１９８９年）を参照）。形質転換体は、抗生物質のエリスロマイシンとクロラムフェニコールとを含有する培地上で選択し、画線を同培地上で精製した。
【００９７】
別に、乳酸連鎖球菌株ＭＧ１３６３をベクターｐＳＨ７１−ＥＲＹｒ−ＰＡＬ２（実施例１６）により形質転換して、菌株ＦＳＬＬ−ＰＡＬ２を得る。さらに、乳酸連鎖球菌株ＭＧ１３６３を、ｐＳＨ７１−ＥＲＹｒ−ＰＡＬ２（実施例１６）及びｐＳＨ７１−ＣＭｒ−４ＣＬ１−ＶＳＴ１（実施例１７）により同時形質転換し、この形質転換された菌株をＦＳＬＬ−ＰＡＬ２４ＣＬ１ＶＳＴ１と命名する。
【００９８】
ｄ）発酵槽での組換え乳酸連鎖球菌株による発酵
組換え乳酸連鎖球菌株は、バッチ培養、流加バッチ培養又はケモスタット培養として操作される発酵槽で増殖させることができる。
【００９９】
（バッチ培養と流加バッチ培養）
微生物を、１．５リットルの有効容積のバッフル付きバイオリアクターで、嫌気的、好気的又は微好気的条件で増殖させる。すべての培養物を３０℃で、３５０ｒｐｍにてインキュベートする。ｐＨ６．６で一定になるように１０ＭのＫＯＨの自動添加により維持する。細胞を、以下の成分を補充した合成ＭＳ１０培地中でラクトースにより増殖させて好気的条件下の増殖を可能とする：ＭｎＳＯ４（１．２５×１０−５ｇ／ｌ）、チアミン（１ｍｇ／ｌ）及びＤＬ−６，８−チオクト酸（２．５ｍｇ／ｌ）。ラクトース濃度は、例えば、５０ｇ／ｌである。３倍高い濃度のＫ２ＨＰＯ４とＫＨ２ＰＯ４で緩衝化した上記培地により、振盪フラスコ内、３０℃で増殖させた前培養物の細胞をバイオリアクターに接種する。接種前にＮ２（純度９９．９９８％）を培地に流すことにより、かつ培養中にバイオリアクターの上部空間にＮ２５０ｍｌ／分の定速を維持することにより好気的条件を確保する。微好気的条件及び好気的培養のために用いられるバイオリアクターは、空気（ＤＯＴ、１００％）及びＮ２（ＤＯＴ、０％）で較正されたポーラログラフィー酸素センサーを備える。好気的条件はバイオリアクターに空気を１ｖｖｍの速度で拡散させてＤＯＴが８０％を超えることを確保することで得られる。微好気的実験中、Ｎ２と大気の空気の混合物からなる気体を０．２５ｖｖｍの速度でリアクターに拡散することによりＤＯＴが５％の一定に保たれる。
【０１００】
（ケモスタット培養物）
ケモスタット培養物において、細胞は例えば１Ｌの有効容積のアプリコン（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）実験室用発酵槽で、３０℃、３５０ｒｐｍで増殖させることができる。希釈率（Ｄ）は、異なった値、例えば、０．０５０ｈ−１、０．１０ｈ−１、０．１５ｈ−１又は０．２０ｈ−１に設定することができる。消泡剤（５０μｌ／ｌ）を追加した上記成長培地を用いて、５ＭのＫＯＨの自動追加によりｐＨを一定、例えば６．６に保つ。ラクトースの濃度を異なる値、例えば、３．０ｇ／ｌ、６．０ｇ／ｌ、１２．０ｇ／ｌ、１５．０ｇ／ｌ又は１８．０ｇ／ｌに設定することができる。バイオリアクターに１ｍｇ／ｌの初期バイオマス濃度で接種し、指数増殖期の終わりにフィードポンプを作動させる。
【０１０１】
嫌気的定常状態は５０ｍｌ／分のＮ２（純度９９．９９８％）をバイオリアクターの上部空間に導入することにより得る。異なる無酸素性定常状態は、Ｎ２（純度９９．９９８％）と大気の空気とから多様な比率で構成される２５０ｍｌ／分のガスをリアクターに拡散させることにより得ることができる。バイオリアクターに空気（１００％ＤＯＴ）とＮ２（０％ＤＯＴ）を拡散させることにより酸素電極を較正する。
【０１０２】
すべての条件で、ガスはバイオリアクターに導入する前に滅菌ろ過する。オフガスは、−８℃未満に冷却した冷却器を経て、アコースティックガスアナライザーによりそのＣＯ２とＯ２の体積含量が分析される。
【０１０３】
少なくとも５滞留時間後、及びバイオマスと発酵最終生成物の濃度が最後の少なくとも２滞留時間にわたって変化しない（５％相対偏差未満）の場合、培養は定常状態にあると考えられる。
【０１０４】
ｅ）乳酸連鎖球菌におけるピノシルビンの抽出と分析
抽出と分析は実施例９に記載された方法を用いて実施する。
【０１０５】
(実施例１２)
ａ）アスペルギルス属に属する種におけるＰＡＬ２の発現用真菌ベクターの構築
本実施例で使用されるプラスミドは、黒色アスペルギルスと麹菌で自己プラスミド複製も維持する、アスペルギルス  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のＡＭＡ１開始複製配列を含有するｐＡＲｐ１から得られる（ゲムスら（Gems et al.）、１９９１年）。さらに、プラスミドは大腸菌の複製配列を含むシャトルベクターであるので、黒色アスペルギルス及び麹菌での固有の困難な形質転換が、組換えプラスミドの構築のために中間ホストとして大腸菌を用いることにより克服することができる。プラスミドは１つ以上のマーカー遺伝子を持っており、それらを持つ微生物を、それらを持たない微生物から選択することを可能とする。選択システムは、優性マーカー、例えば、ハイグロマイシンＢ、フレオマイシン及びブレオマイシンに対する耐性、又は異種マーカー、例えば、アミノ酸及びｐｙｒＧ遺伝子に基づくことができる。さらに、プラスミドは組換え遺伝子の発現を可能とするプロモーター配列とターミネーター配列を含む。好適なプロモーターは、アスペルギルス  ｎｉｄｕｌａｎｓの遺伝子、例えば、ａｌｃＡ、ｇｌａＡ、ａｍｙ、ｎｉａＤ及びｇｐｄＡから得られる。さらに、プラスミドはＤＮＡ断片のクローニング及びその後の組換え体の同定を容易にする好適な独自の制限部位を含む。
【０１０６】
プラスミドは強力な構成的ｇｐｄＡプロモーターと栄養要求性マーカーを含み、これらすべてがアスペルギルス  ｎｉｄｕｌａｎｓを起源とする。メチオニン生合成に関与する遺伝子ｍｅｔｈＧを含むプラスミドをｐＡＭＡ１−ＭＥＴと命名する。ヒスチジン生合成に関与する遺伝子ｈｉｓＡを含むプラスミドをｐＡＭＡ１−ＨＩＳと命名する。
【０１０７】
実施例１に記載のように単離されたＰＡＬ２をコードする遺伝子を、好適な制限部位を含む５'突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ＰＡＬ２（実施例２）からＰＣＲにより再増幅する。遺伝子の５'末端と３'末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物をアスペルギルス  ｎｉｄｕｌａｎｓに由来するｇｐｄＡプロモーターを含む消化ｐＡＭＡ１−ＭＥＴベクターに連結することができる。得られたプラスミドｐＡＭＡ１−ＭＥＴ−ＰＡＬ２は、アスペルギルス  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のｇｐｄＡプロモーターの制御下にＰＡＬ２をコードする遺伝子を含有する。ＰＡＬ２をコードする遺伝子の配列を、ｐＡＭＡ１−ＭＥＴ−ＰＡＬ２の２つの異なるクローンの配列決定により検証する。
【０１０８】
ｂ）アスペルギルス属に属する種における４ＣＬ１及びＶＳＴ１の発現用真菌ベクターの構築
実施例１に記載のように単離された４ＣＬ１をコードする遺伝子を、好適な制限部位を含む５'突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ１−ＶＳＴ１（実施例５）からＰＣＲにより再増幅する。遺伝子の５'末端と３'末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物を、アスペルギルス  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のｇｐｄＡプロモーターを含む消化ｐＡＭＡ１−ＨＩＳベクターに連結することができる。得られたプラスミドｐＡＭＡ１−ＨＩＳ−４ＣＬ１は、アスペルギルス  ｎｉｄｕｌａｎｓに由来するｇｐｄＡプロモーターの制御下に４ＣＬ１をコードする遺伝子を含む。
【０１０９】
実施例１に記載のように単離されたＶＳＴ１をコードする遺伝子を、好適な制限部位を含む５'突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ１−ＶＳＴ１（実施例５）からＰＣＲにより再増幅する。遺伝子の５'末端と３'末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物を、アスペルギルス  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のｇｐｄＡプロモーターを含む消化ｐＡＭＡ１−ＭＥＴベクターに連結して、ｐＡＭＡ１−ＭＥＴ−ＶＳＴ１を得ることができる。
【０１１０】
ｇｐｄＡプロモーターと、ＶＳＴ１をコードする遺伝子とを、好適な制限部位を含む５'突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドｐＡＭＡ１−ＭＥＴ−ＶＳＴ１からＰＣＲにより１つの断片として再増幅する。ＤＮＡ断片の５'末端と３'末端における該制限酵素部位の導入により、制限ＰＣＲ産物を消化プラスミドｐＡＭＡ１−ＨＩＳ−４ＣＬ１に連結することができる。得られたプラスミドｐＡＭＡ１−ＨＩＳ−４ＣＬ１−ＶＳＴ１は、アスペルギルス  ｎｉｄｕｌａｎｓに由来する個々のｐｇｄＡプロモーターの制御下にＣ４Ｌ１とＶＳＴ１をそれぞれコードする遺伝子を含む。４ＣＬ１とＶＳＴ１をコードする遺伝子の配列をｐＡＭＡ１−ＨＩＳ−４ＣＬ１−ＶＳＴ１の２つの異なるクローンの配列決定により検証する。
【０１１１】
ｃ）黒色アスペルギルスにおいてピノシルビンを導く経路の発現
黒色アスペルギルス菌株を、（ａ）及び（ｂ）に記載されたベクターで、別々に、又は組合せて形質転換する。細菌細胞の形質転換は当分野で公知の方法にしたがって、例えば、電気穿孔法又は接合を用いて実施する（例えば、サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．）（１９８９年）を参照）。形質転換体は、メチオニン及び／又はヒスチジンを欠く最小培地により選択する。
【０１１２】
ヒスチジンとメチオニンに対して栄養要求性のあるアスペルギルス  ｎｉｇｅｒの菌株、例えば、別々にＦＧＳＣ  Ａ９１９菌株（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｇｓｃ．ｎｅｔを参照）をベクターｐＡＭＡ１−ＭＥＴ−ＰＡＬ２（ａ）により形質転換して菌株ＦＳＡＮ−ＰＡＬ２を得て、ｐＡＭＡ１−ＨＩＳ−４ＣＬ１−ＶＳＴ１（ｂ）により形質転換して菌株ＦＳＡＮ−４ＣＬ１ＶＳＴ１を得る。さらに、黒色アスペルギルス菌株ＦＧＳＣ  Ａ９１９をｐＡＭＡ１−ＭＥＴ−ＰＡＬ２（ａ）とｐＡＭＡ１−ＨＩＳ−４ＣＬ１−ＶＳＴ１（ｂ）とで同時形質転換して、形質転換菌株をＦＳＡＮ−ＰＡＬ２４ＣＬ１ＶＳＴ１と名付ける。
【０１１３】
（実施例１３）
麹菌においてピノシルビンを導く経路の発現
ＰＡＬ２、及び４ＣＬ１をコードする天然の遺伝子組を含有する麹菌の菌株（セシムら（Ｓｅｓｈｉｍｅ  ｅｔ  ａｌ．）、２００５年）であって、メチオニンに対して栄養要求性のある菌株をベクターｐＡＭＡ１−ＭＥＴ−ＶＳＴ１（実施例２９）により形質転換して、菌株ＦＳＡＯ−ＶＳＴ１を得る。真菌細胞の形質転換は当分野で公知の方法にしたがって、例えば、電気穿孔法又は接合を用いて実施する（例えば、サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．）（１９８９年）を参照）。形質転換体はメチオニンを欠く培地により選択する。
【０１１４】
（実施例１４）
培養槽における黒色アスペルギルス及び麹菌の組換え菌株による発酵
組換えアスペルギルス菌株は、バッチ培養、流加バッチ培養又はケモスタット培養として操作される発酵槽で増殖させることができる。
【０１１５】
（バッチ培養及び流加バッチ培養）
微生物は、好気的条件下で、１．５リットルの有効容積のバッフル付きバイオリアクターで増殖させる。すべての培養物を３０℃で、５００ｒｐｍにてインキュベートする。ｐＨ６．０で一定となるように１０ＭのＫＯＨの自動添加により維持し、好気的条件は空気を１ｖｖｍの速度でバイオリアクターに拡散させてＤＯＴが８０％を超えることを確保することで得られる。以下の成分からなる合成培地中で細胞をグルコースで増殖させてバッチ培養で増殖させる。７．３ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．５ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、１．０ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．０ｇ／ｌのＮａＣｌ、０．１ｇ／ｌのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．１ｍｌ／ｌのシグマ社製の消泡剤、７．２ｍｇ／ｌのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．３ｍｇ／ｌのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．３ｍｇ／ｌのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、３．５ｍｇ／ｌのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ及び６．９ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ。グルコース濃度は、例えば、１０ｇ／ｌ、２０ｇ／ｌ、３０ｇ／ｌ、４０ｇ／ｌ又は５０ｇ／ｌである。流加バッチ培養で細胞を増殖させるために、培地は、バッチ相中の７．３ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、４．０ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、１．９ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．３ｇ／ｌのＮａＣｌ、０．１０ｇ／ｌのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．１ｍｌ／ｌのシグマ社製の消泡剤、７．２ｍｇ／ｌのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．３ｍｇ／ｌのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．３ｍｇ／ｌのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、３．５ｍｇ／ｌのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ及び６．９ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ４・Ｈ２Ｏからなる。次に、リアクターに、例えば、２８５ｇ／ｋｇのグルコースと４２ｇ／ｋｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４を供給する。
【０１１６】
前バッチからの遊離した菌糸体を用いて、バッチ培養物及び流加バッチ培養物に接種する。２．１０９／ｌ濃度の胞子を用いて、ｐＨ２．５の前バッチ培養物に接種する。以下の成分が添加された２９ｇの米により凍結乾燥胞子を増殖させて胞子を得る。６ｍｌの１５ｇ／ｌのスクロース、２．３ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．０ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５０ｇ／ｌのＮａＣｌ、１４．３ｍｇ／ｌのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．５ｍｇ／ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．５０ｍｇ／ｌのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ及び１３．８ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ。これらの胞子は、３０℃で、７〜１４日間増殖して米粒上に胞子の黒い層を生じ、滅菌水中の１００ｍｌの０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を加えることにより胞子を回収する。すべての条件に関して、ガスはバイオリアクターに導入する前に滅菌ろ過する。オフガスは−８℃未満に冷却した冷却器を経て、アコースティックガスアナライザーによりそのＣＯ２とＯ２の体積含量を分析する。
【０１１７】
（ケモスタット培養）
ケモスタット培養では、例えば１．５リットルの有効容積のバッフル付きバイオスタットＢ実験室用発酵槽で、３０℃、５００ｒｐｍで細胞を増殖させることができる。ｐＨ６．６で一定になるように１０ＭのＫＯＨの自動添加により維持し、好気的条件は、空気を１ｖｖｍの速度でバイオリアクターに拡散して、確実にＤＯＴが８０％を超えさせることにより得られる。希釈率（Ｄ）は、異なる値、例えば、０．０５０ｈ−１、０．１０ｈ−１、０．１５ｈ−１又は０．２０ｈ−１に設定できる。以下の成分を有する最小成長培地を用いて、１０Ｍの自動追加によりｐＨを一定、例えば、６．６に保持する。２．５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．７５ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、１．０ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．０ｇ／ｌのＮａＣｌ、０．１ｇ／ｌのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．１ｍｌ／ｌのシグマ社製消泡剤、７．２ｍｇ／ｌのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．３ｍｇ／ｌのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．３ｍｇ／ｌのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、３．５ｍｇ／ｌのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ及び６．９ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ。グルコースの濃度は異なる値、例えば、３．０ｇ／ｌ、６．０ｇ／ｌ、１２．０ｇ／ｌ、１５．０ｇ／ｌ又は１８．０ｇ／ｌに設定することができる。バイオリアクターには上記のように前バッチ培養物からの遊離菌糸体が接種され、指数増殖期の終わりにフィードポンプを作動させる。
【０１１８】
すべての条件について、ガスはバイオリアクターに導入する前に滅菌ろ過する。オフガスは−８℃未満に冷却した冷却器を経て、アコースティックガスアナライザーによりそのＣＯ２とＯ２の体積含量を分析する。
【０１１９】
少なくとも５滞留時間後、及びバイオマスグルコースとオフガスの組成が最後の２滞留時間にわたって変化しない（５％相対偏差未満）の場合、培養は定常状態にあると考えられる。
【０１２０】
（実施例１５）
黒色アスペルギルス及び麹菌におけるリスベラトロールの抽出と分析
抽出と分析は実施例９に記載された方法を用いて実施する。
【０１２１】
（実施例１６）
黒色アスペルギルスＡＲ１におけるピノシルビンの生産
黒色アスペルギルスＡＲ１は、次の遺伝子ａｒｇＢ２、ｐｙｒＧ８９、ｖｅＡを削除した。
【０１２２】
ａ）ａｒｇＢマーカー（オルニチン  カルバモイルトランスフェラーゼ）を有する糸状菌発現ベクターの構築
【０１２３】
同種のプロモーター、及び終了配列を含むａｒｇＢをコードする遺伝子を、制限酵素認識部位  ＥｃｏＲＩ及びＸｍａＩをそれぞれ含む５'突出を有するフォワードプライマー  ５−ＣＧ  ＧＡＡＴＴＣ  ＡＴＡ  ＣＧＣ  ＧＧＴ  ＴＴＴ  ＴＴＧ  ＧＧＧ  ＴＡＧ  ＴＣＡ−３（配列番号１７）、及びリバースプライマー  ５−ＣＧ  ＣＣＣＧＧＧ  ＴＡＴ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＴＡＣ  ＡＧＣ  ＣＡＴ  ＴＧＣ  ＧＡＡ−３（配列番号１８）を用いて、黒色アスペルギルスＡＲ１ゲノムＤＮＡから増幅した。
ＰＣＲ生成物において、組み込まれた制限酵素認識部位は、ｐＵＣ１９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ．）への挿入が許可され、ｐＵＣ１９−ａｒｇＢを与えるＥｃｏＲＩとＸｍａＩとで消化した。
【０１２４】
ｔｒｐＣ（インドール−３−グリセロールフォスフェートシンターゼ）ターミネーターを、制限酵素認識部位  ＢａｍＨＩ及び２７の塩基対ａｄａｐｔａｍｅｒをそれぞれ含む５'突出を有するフォワードプライマー  ５−ＧＣ  ＧＧＡＴＣＣ  ＡＴＡ  ＧＧＧ  ＣＧＣ  ＴＴＡ  ＣＡＣ  ＡＧＴ  ＡＣＡ  ＣＧＡ−３（配列番号１９）、及びリバースプライマー  ５−ＣＧＧＡＧＡＧＧＧＣＧＣＧＣＣＣＧＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＣＴ  ＴＡＡ  ＣＧＴ  ＴＡＣ  ＴＧＡ−３（配列番号２０）を使って、黒色アスペルギルスＡＲ１ゲノムＤＮＡから増幅した。
【０１２５】
ｇｐｄＡ（グリセルアルデヒド−３−フォスフェートデヒドロゲナーゼ）プロモーターを、２７の塩基対ａｄａｐｔａｍｅｒ及び制限酵素認識部位  ＨｉｎｄＩＩＩをそれぞれ含む５'突出を有するフォワードプライマー  ５−ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＧＧＧＣＧＣＧＣＣＣＴＣＴＣＣＧ  ＧＣＧ  ＧＴＡ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＴＣＴ  ＧＣＴ  ＣＡＡ−３（配列番号２１）、及びリバースプライマー  ５−ＣＧ  ＡＡＧＣＴＴ  ＴＡＴ  ＡＡＴ  ＴＣＣ  ＣＴＴ  ＧＴＡ  ＴＣＴ  ＣＴＡ  ＣＡＣ−３（配列番号２２）を用いて、黒色アスペルギルスＡＲ１ゲノムＤＮＡから増幅した。
ＰＣＲ生成物において、組み込まれた制限酵素認識部位をもつ断片ｔｒｐＣ及びｇｐｄＡの融合ＰＣＲ生産物は、ｐＡＴ３を産出するＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｐＵＣ１９−ａｒｇＢへの挿入を許可する。
【０１２６】
ｂ）黒色アスペルギルスＡＲ１におけるＣ４Ｈ（シンナメート−４−ヒドロキシラーゼ）の発現のｐｙｒＧ（ｏｒｏｔｉｄｉｎｅ−５’−モノフォスフェートデカルボキシラーゼ）マーカーを有する糸状菌発現ベクターの構築
【０１２７】
Ｃ４Ｈをコードする遺伝子を、制限酵素認識部位  ＢｓｓＨＩＩ及びＮｏｔＩをそれぞれ含む５'突出を有するフォワードプライマー  ５−ＣＧ  Ｇ  ＣＧＣＧ  Ｃ  ＡＴＡ  ＡＴＧ  ＧＡＣ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＴＴＧ  ＣＴＧ  ＧＡＧ−３（配列番号２３）、及びリバースプライマー  ５−ＧＧ  ＧＣ  ＧＧＣＣ  ＧＣ  ＴＴＡ  ＴＴＡ  ＡＣＡ  ＧＴＴ  ＣＣＴ  ＴＧＧ  ＴＴＴ  ＣＡＴ  ＡＡＣ  Ｇ−３（配列番号２４）を用いて、酵母菌プラスミドｐＥＳＣ−ＩＲＡ−ＰＡＬ２−Ｃ４Ｈ（ＷＯ２００６０８９８９８、実施例３）から再増幅した。
ＰＣＲ生成物において、組み込まれた制限酵素認識部位は、ＢｓｓＨＩＩ及びｐＡＴ３−Ｃ４Ｈを与えるＮｏｔＩで消化されたｐＡＴ３への挿入を許可した。該構築は、制限酵素切断及び配列によって検証された。ａｒｇＢマーカーを、２つの制限酵素ＢｓｉＷＩ及びＰｃｉＩを使うことによって取り除いた。
【０１２８】
同種のプロモーター、及び終了配列を含むｐｙｒＧをコードする遺伝子を、フォワードプライマーにおいては制限酵素認識部位  ＢｓｒＧＩ、ＰａｃＩ、ＡｓｉＳＩ、リバースプライマーにおいてはＰｃｉＩを含む５'突出を有するフォワードプライマー  ５−ＣＧＴ  ＧＴＡＣ  ＡＡＴＡ  ＴＴＡ  ＡＴ  ＴＡＡ  ＣＧＡＧＡ  ＧＣＧ  ＡＴ  ＶＧＶ  ＡＡＴ  ＡＡＣ  ＣＧＴ  ＡＴＴ  ＡＣＣ  ＧＣＣ  ＴＴＴ  ＧＡＧ−３（配列番号２５）、及びリバースプライマー  ５−ＣＧＡ  ＣＡＴＧ  ＴＡＴ  ＴＣＣ  ＣＧＧ  ＧＡＡ  ＧＡＴ  ＣＴＣ  ＡＴＧ  ＧＴＣ  Ａ−３（配列番号２６）を用いて、黒色アスペルギルスＡＲ１ゲノムＤＮＡから再増幅した。ＰＣＲ生成物において、組み込まれた制限酵素認識部位は、ｐＡＴ３−Ｃ４Ｈ−ｐｙｒＧを与えるＢｓｉＷＩ及びＰｃｉＩで消化されたｐＡＴ３への挿入を許可した。該構築は、制限酵素切断及び配列によって検証された。
【０１２９】
ｃ）黒色アスペルギルスＡＲ１における４ＣＬ１（４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ）の発現のａｒｇＢマーカーを有する糸状菌発現ベクターの構築
【０１３０】
４ＣＬ１をコードする遺伝子を、フォワードプライマー  ５−ＧＣＧＧＡＧＡＧＧＧＣＧＣＧ  ＡＴＧ  ＧＣＧ  ＣＣＡ  ＣＡＡ  ＧＡＡ  ＣＡＡ  ＧＣＡ−３（配列番号２７）、及びリバースプライマー  ５−ＴＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣ  ＴＣＡ  ＣＡＡ  ＴＣＣ  ＡＴＴ  ＴＧＣ  ＴＡＧ  ＴＴＴ  ＴＧＣ−３（配列番号２８）を用いて、酵母菌プラスミドｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ１−ＶＳＴ１から再増幅した。
４ＣＬ１遺伝子は、注入ＰＣＲ（Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎＴＭＰＣＲ）クローン技術（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ）を使って、ｐＡＴ３−４ＣＬ１を産出するために、ＢｓｓＨＩＩ及びＮｏｔＩで消化されたｐＡＴ３ベクターへ挿入された。該構築は、制限酵素切断及び配列によって検証された。
【０１３１】
ｄ）黒色アスペルギルスＡＲ１におけるＶＳＴ１（リスベラトロールシンターゼ）の発現のａｒｇＢマーカーを有する糸状菌発現ベクターの構築
【０１３２】
ＶＳＴ１をコードする遺伝子を、制限酵素認識部位  ＢｓｓＨＩＩ及びＮｏｔＩをそれぞれ含む５'突出を有するフォワードプライマー  ５−ＣＧ  Ｇ  ＣＧＣＧ  Ｃ  ＡＴＡ  ＡＴＧ  ＧＣＡ  ＴＣＣ  ＧＴＡ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＴＴＣ−３（配列番号２９）、及びリバースプライマー  ５−ＧＧ  ＧＣ  ＧＧＣＣ  ＧＣ  ＴＴＡ  ＴＣＡ  ＴＴＡ  ＧＴＴ  ＡＧＴ  ＧＡＣ  ＡＧＴ  ＴＧＧ  ＡＡ−３（配列番号３０）を用いて、酵母菌プラスミドｐＥＳＣ−ＴＲＰ−４ＣＬ１−ＶＳＴ１（実施例５）から再増幅した。ＰＣＲ生成物において、組み込まれた制限酵素認識部位は、ＢｓｓＨＩＩ及びｐＡＴ３−ＶＳＴ１を与えるＮｏｔＩで消化されたｐＡＴ３への挿入を許可した。該構築は、制限酵素切断及び配列によって検証された。
【０１３３】
ｅ）Ｃ４Ｈ、４ＣＬ１、及びＶＳＴ１を使った黒色アスペルギルスＡＲ１（菌株は欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）（ａｒｇＢ２、ｐｙｒＧ８９、ｖｅＡ１）を有する）におけるピノシルビンを導く経路の発現
【０１３４】
黒色アスペルギルス真菌細胞の形質転換を、細胞壁溶解酵素を使って原形質位置（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔａｔｉｏｎ）によって当分野で公知の方法にしたがって行った。Ｃ４Ｈ、４ＣＬ１、及びＶＳＴ１のランダム融合（ｒａｎｄｏｍ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）を、２段階で行った。プラスミドｐＡＴ３−４ＣＬ１、及びｐＡＴ３−ＶＳＴ１を、栄養要求性のマーカーを利用するウエラら（Ｇｕｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．）（２００６）に従って、制限酵素ＢｍｒＩを使って線形化し、同時形質転換によってゲノム中に組み込んだ。
４ＣＬ１及びＶＳＴ１発現カセットを含む形質転換を、単離し、ＢｍｒＩで線形化されたｐＡＴ３−Ｃ４Ｈ−ｐｙｒＧで連続的形質転換は、Ｃ４Ｈ、４ＣＬ１、ＶＳＴ１を含む組み換えＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ菌株を与えた。
【０１３５】
ｆ）振盪フラスコによる組換えＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ菌株による発酵
Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓの前培養を、１ｇ／Ｌ  グルコース、０．８５ｇ／Ｌ  ＮａＮｏ３、０．１ｇ／Ｌ  ＫＣｌ、０．１ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；  及び０．３ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、０．００００８ｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０００００８ｇ／Ｌ  Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、０．０００１６ｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０００１６ｇ／Ｌ  ＭｎＳＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０００１６ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＭｏＯ４／２Ｈ２Ｏ、０．００１６ｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含む３７℃の寒天プレートにて５日間成長させた。
前培養には、１００ｍｌのＣｚａｐｅｋ  ｍｅｄｉｕｍ（ＣＺ）を含む５００ｍｌのｂａｆｆｌｅｄ振盪フラスコを植菌のため使用した。該振盪フラスコは、１５０ｒｐｍ、３０℃で培養され、その培地の初期ｐＨは６．２であった。２４時間培養した後、そのサンプルを取り出し、抽出法に従い（下記参照）、生成したピノシルビンの存在を分析した。
【０１３６】
ｇ）Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ振盪フラスコ培養物からのピノシルビンの抽出
１００ｍｌの培養物（細胞と培養液の両方）からなるサンプルは、振盪フラスコから回収された。代謝物の抽出は、次のように行った。サンプルは２つのＳａｒｔｏｒｉｕｓ  ｔｕｂｅｓに移し、４５００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った。浮遊物は、ビーカーに移し、約３００μｌのガラスビーズ（０．２５〜０．５０ｍｍ）を含むカップで２ｍｌＳａｒｔｏｒｉｕｓマイクロ管に移されて、バイオマスは８つのアリコートに分割した。該管は、Ｆａｓｔｐｒｅｐ１２０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ．）に挿入し、１回につき３０秒間レベル６．５で４サイクル行ない、サイクルの間に冷たい状態を維持した。破砕細胞は２つの１５ｍｌ  Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ｔｕｂｅｓに分割した。該管は、１０ｍｌの浮遊物で満たし、３ｍｌのエチルアセテートを添加した。該管は、渦巻きミキサーで活発に２分間混合させ、５分間氷を当てた。エチルアセテート相は、４５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、４つの１．５ｍｌエッペンドルフ管に集めた。エチルアセテートは、４５分間凍結乾燥させて、乾燥させたサンプルは、実施例９ｂに記述したように、ＨＰＬＣ分析のために、０．３ｍｌ、５０％メタノールで再溶解させた。
【０１３７】
ｈ）組換えＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ由来の振盪フラスコ結果
図７は、典型的な振盪フラスコ実験由来のＨＰＬＣ−クロマトグラムを表す。上段は、ピノシルビンを生産する人工的に作り出された菌株由来の結果で、下段は、親野生型対照菌株由来の結果を示す。人工的に作り出された菌株によって生産されたピノシルビン濃度は、１．０〜２．０ｍｇ／ｌの範囲で変化させた。対照菌株は、あらゆるピノシルビンの形成体を示すものではない。
ピノシルビンピークの識別は、純粋な標準ＵＶ−クロマトグラムと比較することによって、ダイオードアレイＵＶ−スペクトルで、さらに確認された（図８）。
【０１３８】
（実施例１７）
ＰＡＬＣＰＲの連続的培養物においてスチルベノイドの細胞内及び細胞外の濃度の定量
過剰発現したＣＰＲを有する酵母菌株ＦＳＳＣ−ＰＡＬ２Ｃ４Ｈ４ＣＬ２ＶＳＴ１−ｐＡＤＨ１ＣＰＲ１を、１リッターの可動範囲で炭素制限された連続的培養物中で成長させた。ヴェルダインら（Ｖｅｒｄｕｙｎ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９２）に従って、５．０ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、３．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、微量金属、ビタミン、及び、成長を制限する栄養物として５／ｌのグルコース及び３５ｇ／ｌのガラクトースを含有する特定の培地で培養物を成長させた。泡立ちを避けるために、消泡剤（３００μｌ／Ｌ、シグマ社（Ｓｉｇｍａ）、Ａ−８４３６）を、加えた。炭素源を、無機培地とは別にオートクレーブし、その後、発酵装置に加えた。さらに、培地をオートクレーブ及び冷却した後、ビタミンと、微量金属の溶解液を、除菌により発酵装置に加えた。発酵システムは、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＢＢＩシステムであり、Ｂｉｏｓｔａｔ  Ｂ  Ｐｌｕｓコントローラーを具備した１リッターの可動範囲を有するでバッフル３リッター反応器からなる。反応器は、２つのＲｕｓｈｔｏｎ  ｔｕｒｂｉｎｅを具備し、該Ｒｕｓｈｔｏｎ  ｔｕｒｂｉｎｅｓは、１０００ｒｐｍもしないで回転した。温度を３０±１℃に維持し、２Ｍ  ＫＯＨの自動添加によってｐＨを５．５±０．２に維持した。ガス流を、質量流量コントローラーによって制御し、１．５ｖｖｍ（１．５  ｌ／分）に設定した。排気ガスを、冷却されたコンデンサーに導き、Ｏ２とＣＯ２について分析した（Ｍｏｄｅｌ  １３０８、イノヴァ社（Ｉｎｎｏｖａ）、デンマーク）。３５ｇ／ｌのガラクトースを有する初期バッチ培養を、５ｇ／ｌグルコース及び３５ｇ／ｌガラクトースを含む、１０ｍｌの対数的に成長する振盪フラスコ培養を有する培養の植菌によって開始した。バッチ培養を、反応物に継続的に同じ培地を供給することによって継続モードに交換した。Ｄ＝０．０５０ｈ−１になるように一定の基準レベルで希釈率を制御した。希釈率と排ガスシグナルの両方が、少なくとも５度の滞留時間において変化しなかった時、及び、１つの滞留時間の間隔でとった２つの連続的なサンプルにおける代謝濃度が、３％未満を逸脱しなかった時、連続的培養は定常状態であるとみなした。連続的に観察された溶解酸素濃度を、６０％を超える空気の飽和状態に維持した。前記条件下で、菌株は、全てのガラクトースを消費し、主にバイオマス、ＣＯ２、及び、ごく少量のエタノールを生産した。さらに、ＲＱは、一致に近く、代謝の大部分が呼吸モードであることを示した。
【０１３９】
スチルベノイドの定量するために、サンプルを、約３００時間で１５保持時間に対応する発酵中に採取した。５０００ｇの細胞を、５分間遠心分離することによって収穫した。スチルベノイドの細胞外の濃度の定量のために、浮遊物の２５ｍｌのアリコートを、１０ｍｌエチルアセテートで一度に抽出した。エチルアセテートを、凍結乾燥し、乾燥生成物を、０．６ｍｌのエタノール中で再溶解した。サンプルを、ＨＰＬＣバイアル中に移し、水で５０倍に希釈し、ＨＰＬＣの小瓶に移し、ＨＰＣＬによって分析した。さらに、生成されたスチルベノイドのレベルが、培地の溶解度を超えたか、或いは、細胞培養の１ｍｌアリコートの細胞膜に結合しているかを評価するために、細胞と培地の両方を、１００％エタノールの１ｍｌと混合し、遠心分離の前に激しく混合した。浮遊物を、ＨＰＬＣの小瓶に移し、スチルベノイドの量を直接分析した。スチルベノイドの細胞内の濃度の定量するために、５０ｍｌ培養のアリコートを、サンプリングし、細胞と培地を、遠心分離によって分離した。沈殿物を５０ｍｌの水で洗浄し、細胞結合又は沈殿物中に閉じ込められた全てのスチルベノイドを取り除いた。再沈澱させた後、該沈殿物を１ｍｌの水に溶解した。得られた細胞懸濁液を、抽出管に分配し、迅速調製装置を使って、ガラス玉で砕いた。粗性抽出物を、１０ｍｌの１００％メタノールに集め、４℃の冷暗室で２４時間、回転チャンバーで抽出した。その後、５０００ｇの細胞の破片を５分間の遠心分離で取り除き、残っているメタノールを、一晩凍結乾燥することで取り除いた。乾燥した残渣を、０．４ｍｌのメタノールと０．１ｍｌの水に再溶解した。水で５０倍に希釈したサンプルをＨＰＬＣの小瓶に移し、ＨＰＣＬによって分析した。
次の表は、３００時間の連続的な培養後の結果をまとめたものである。
【０１４０】
【表２】
0005528108.tif 000003
【０１４１】
スチルベノイドの細胞内の濃度を、次のセクションで説明される計算に従って、グラムバイオマス（乾燥重量）あたりのｍｇで表した。抽出物中のピノシルビンの濃度は１６４６ｍｇ／ｌであり、抽出物の量は０．５ｍｌであり、抽出されたピノシルビンの絶対値は０．５＊１６４６／１０００＝０．８２３０ｍｇであった。スチルベノイドを、５０ｍｌ培養−アリコートから抽出し、リッター培養あたりで表されたピノシルビンの細胞内の濃度は、０．８２３０＊（１０００／５０）＝１６．４６ｍｇ／ｌであった。前記培養のバイオマス濃度は９ｇ／ｌであった。グラム乾燥重量あたりで表された細胞内のピノシルビンの濃度は、１６．４６／９＝１．８３ｍｇ／ｇ乾燥重量であった。
【０１４２】
（実施例１８）
脂肪性の酵母菌、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおけるトランスピノシルビンの経路のクローニング
【０１４３】
ａ）遺伝子の単離
遺伝子がタンパク質のコード配列として定義される、ＰＡＬ（フェニルアラニン  アンモニアリアーゼ）、ＣＬ（シンナモイル：ＣｏＡリガーゼ）、及びＶＳＴ１遺伝子を、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける発現に対するコドン最適化で、合成遺伝子（ジェンスクリプト  コーポレーション（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ピスカタウェィ、ニュージャージー州、アメリカ合衆国）として生成する。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおけるコドン使用量の定量は、前述した（ＷＯ２００６１２５０００）。ＰＡＬと４ＣＬ遺伝子は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  ｃＤＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からＰＣＲによって単離することができる。シンナモイル：ＣｏＡリガーゼＣＬは、基質としてケイヒ酸を受容するあらゆるヒドロキシシンナモイル：ＣｏＡリガーゼになりえる。例えば、４ＣＬ１及び４ＣＬ２遺伝子によってコードされたＡ．ｔｈａｌｉａｎａ由来の４−クマロイル：ＣｏＡリガーゼは、好ましい基質は４−ヒドロキシケイヒ酸（クマル酸）であるが、ケイヒ酸を受容する（Ｈａｍｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｈｌｂｒｏｃｋ，２００４；コスタら（Ｃｏｓｔａ  ｅｔ  ａｌ），２００５）。最も好ましくは、ＣＬが、ストレプトミセスｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ由来のシンナメイト：ＣｏＡなど、基質としてケイヒ酸に対して特有のコドンで最適化されたリガーゼである（カネコら（Ｋａｎｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ），２００３）。同様に、リスベラトロール、いわゆるリスベラトロールシンターゼを生成するスチルベンシンターゼにおいて、通常好ましい基質は４−クマロイル：ＣｏＡであるが、ＶＳＴ1遺伝子は、あらゆる基質としてシンナモイル：ＣｏＡを受容するコドンで最適化された、又は、最適化されていないスチルベンシンターゼであってもより。２重の基質の許容性のタイプは、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａに由来するＶＳＴ１遺伝子（配列番号９）の性質を持っている。もっとも好ましくは、基質としてシンナモイル：ＣｏＡに特有のＰｉｎｕｓのファミリー由来のスチルベンシンターゼを用いる（シャンズら（Ｓｃｈａｎｚ  ｅｔ  ａｌ），１９９２、コダンら（Ｋｏｄａｎ  ｅｔ  ａｌ），２００２）。
【０１４４】
ｂ）プロモーターとターミネーターの単離
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいて非相同遺伝子の発現に使用することができるプロモーターは、次のプロモーターに制限されてはいないが、例えば、長鎖アシル：ＣｏＡオキシダーゼＰＯＸ２、ｈｐ４ｄ、イソシトレート・リアーゼＩＣＬ１、細胞外のアルカリプロテアーゼＸＰＲ２、翻訳延長ファアクターＴＥＦ、リボソームタンパク質Ｓ７  ＲＰＳ７、グリセルアルデヒド−３−フォスフェイトデヒドロゲナーゼＧＰＤ、ＹＡＴ１、ＧＰＡＴ、ＦＢＡ１、及びＦＢＡＩＮプロモーターが挙げられる（ミューラーら（Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ），１９９８、ＷＯ２００６０５５３２２、ＷＯ２００６１２５０００）。
【０１４５】
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいて非相同遺伝子の発現に使われるターミネーターは、次のターミネーターに制限されてはいないが、例えば、ＸＰＲ２、ＬＩＰ２、ＰＥＸ２０、及びＳＱＳターミネーターが挙げられる（メルクロブら（Ｍｅｒｋｕｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ），２０００、ＷＯ２００６０５５３２２、ＷＯ２００６１２５０００）。
【０１４６】
ターミネーターとプロモーターＤＮＡ断片の単離は、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの全細胞から調製されたＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ遺伝子のＤＮＡ由来のＰＣＲによって行うことができ、限定されないが、例えばＡＴＣＣ１６６１８、ＡＴＣＣ１８９４３、ＡＴＣＣ１８９４４、ＡＴＣＣ９０８１１、ＡＴＣＣ９０８１２、ＡＴＣＣ９０９０３等のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション由来の細胞が挙げられる。
【０１４７】
ｃ）発現カセットの産出
発現カセットの産出は、例えば５’−プロモーター：：遺伝子：：ターミネーター−３’ＤＮＡ断片など、非相同遺伝子のタンパク質をコードする配列とターミネーター配列と共に融合されたプロモーター（構造性の又は誘導性の）を含む線状二本鎖ＤＮＡ断片の集合を意味する。
【０１４８】
発現カセットは、プロモーター、遺伝子をコードする配列、ターミナル断片を含む異なる遺伝子断片の融合ＰＣＲの組み合わせによって産出されうる。例えば、ＰＡＬ遺伝子は、ＸＰＲ２プロモーターに対するＰＣＲ技術と融合され、また、得られるＸＰＲ２：：ＰＡＬ断片は、ターミネーターへの第２のＰＣＲ反応によってさらに融合され、発現カセットＸＰＲ２：：ＰＡＬ：：ターミネーターを産出することができる。
【０１４９】
発現カセットを産出する別の方法として、既存発現ベクターと、これに限定されないが例えばＡＴＣＣベクター６９３５５（商品名）において、非相同遺伝子（ＰＡＬ等）のすでにプロモーター（ＸＰＲ２）及びターミネーター領域を有し、また、標準的な分子生物学のツールによって非相同遺伝子を導入するための、プロモーターとターミネーターとの間に固有の制限部位を有する、多重クローニング部位（ＭＣＳ）を有する。標的となるベクターにおいて、プロモーター領域とターミネーター領域との間の制限部位の数が制限される場合、遺伝子組み入れに対するベクターにおいて唯一の制限部位が必要なので、導入クローン化キット技術を使用することができる（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）。プロモーターとターミネーターとの間のベクターに遺伝子を組み入れることによって、発現カセットプロモーター：：遺伝子：：ターミネーターが、円形ベクターの内側で創造され、単一の二本鎖のＤＮＡ断片としてではなく創造される。線状ＤＮＡ発現カセット断片が必要とされる場合、ＰＣＲは発現ベクター由来の発現カセットの増幅に使用されうる。当業者は、いくつかの発現カセットは、好ましくはピノシルビンの生成経路（ＰＡＬ、ＣＬ、及びＶＳＴ１遺伝子）などの全代謝経路由来の遺伝子と発現カセットのクラスターで得られる、同じプラスミド又はベクターに導入されうることを認めるだろう。ピノシルビンの生成（ＰＡＬ、ＣＬ、及びＶＳＴ１）に必要とされる３つの遺伝子に対する発現カセットのクラスターは、ピノシルビン経路発現クラスターとして定義される。
【０１５０】
ｄ）Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける、ピノシルビン生成のための非相同遺伝子、ＰＡＬ、ＣＬ、及びＶＳＴ１の組み入れ
ピノシルビン経路遺伝子（ＰＡＬ、ＣＬ、ＶＳＴ１）は、プロモーター、及びターミネータープロモーター：：遺伝子：ターミネーターと発現カセットとして組み立てられる。プロモーター及びターミネーターは、異なる遺伝子、ＰＡＬ、ＣＬ、及びＶＳＴ１に対する異なるプロモーターとターミネーターの同一物或いは組み合わせになりうる。当業者は、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいてピノシルビン経路発現クラスター（遺伝子ＰＡＬ、ＣＬ、及びＶＳＴ１を有する発現カセットを含む）の導入と発現に必要とされる利用できるクローニング技術、クローニングベクター、クローニングツールを、これらのツールがさまざまな文献（レダルら（Ｌｅ  ＤＡｌｌ  ｅｔ  ａｌ），１９９４、ピグネデら（Ｐｉｇｎｅｄｅ  ｅｔ  ａｌ），２０００、ジュレツゼクら（Ｊｕｒｅｔｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ），２００１、マザクら（Ｍａｄｚａｋ  ｅｔ  ａｌ），２００４）、及び公報（ＷＯ２００６０５５３２２、ＷＯ２００６１２５０００）に記述されてきたので認めるだろう。
【０１５１】
要約すれば、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいてピノシルビン経路（ＰＡＬ、ＣＬ、及びＶＳＴ１）を発現するために適する発現カセットを得られれば、それらを、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａホストにおいてピノシルビン経路発現クラスターを確立するために、（ｉ）ホスト細胞における自己複製が可能なプラスミドベクターに置くことができ、又は、（ｉｉ）ホスト細胞のゲノムに直接結合させることができ、又は組み合わせることができる。発現カセットは、ホストゲノム内に無作為に結合してデザインされ、又は、特有の部位を標的にされうる。両方の場合、発現カセットはさらに発現カセットの両側にホストゲノムと相同の周囲領域を含むように構成される。相同の領域は、ホスト遺伝子座と標的組換えに十分な２００〜１０００塩基対であってもよい。単一コピーは、必須遺伝子の欠失を導かないゲノムの全ての部分に標的にされうる。遺伝子の高い発現レベルが要求されるとき、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａゲノム内の複数の部位にへの融合は、特に有益である。発現カセットの複数のコピーの融合のターゲットは、これらに限定されないが、例えば、リボソームのＤＮＡ配列（ｒＤＮＡ）、又はレトロ・トランスポゾン成分（ＴＹ１成分）（ピグネデら（Ｐｉｇｎｅｄｅ  ｅｔ  ａｌ），２０００）が挙げられる。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａゲノム中のランダムな部位を標的にした発現カセットの複数のコピーを融合するとき、融合によって、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいて既に存在するターミネーターが、発現カセットのためのターミネーターとなるので、発現カセットプロモーター−遺伝子−ターミネーターは、実際にはプロモーター遺伝子のみを含み短くすることができる。
【０１５２】
発現カセットに望まれるコピーナンバーに達するために発現カセットを含むプラスミドＤＮＡを代わりの遺伝子座に融合することができ、これに限定されないが、例えば、ＵＲＡ３遺伝子座（受入番号  ＡＪ３０６４２１）、及びＬＥＵ遺伝子座（受入番号  ＡＦ２６０２３０）が挙げられる。ＬＥＵ２融合ベクターは、これに限定されないが、例えばＡＴＣＣベクター６９３５５（商品名）が挙げられる。発現カセットを含む発現ベクターは、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａＬＥＵ２マーカー遺伝子を含む発現ベクターを選択するためのロイシンについて栄養要求性のＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞への形質転換に直接使用される。発現カセットは、適した選択的抗生物質マーカー、又は生合成アミノ酸マーカーを含むその他の発現ベクターの構築にさらに使用されるＰＣＲ技術によって発現ベクターから増幅されうる。
【０１５３】
ＵＲＡ３の融合部位は、５−ｆｌｕｏｒｏｏｒｏｔｉｃ  ａｃｉｄ（５−ＦＯＡ）選択との組み合わせで繰り返し使用することができる。詳細には、ネガティブＵＲＡ３遺伝子は、ＵＲＡ−栄養素要求性の表現型を有する菌株を産出するためのＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａホスト菌株において取り除かれ、５−ＦＯＡ抵抗に基づいて選択が行われる。ＵＲＡ３が存在するとき、５−ＦＯＡは、ＵＲＡ３遺伝子によってエンコードされたオロチジン−５’−フォスフェートデカルボキシラーゼによって毒性化合物５−フルオロウラシルに分解され、ＵＲＡ３遺伝子が欠損した細胞だけが抵抗するだろう。その結果として、複数の発現カセットのクラスター、及び新しいＵＲＡ３遺伝子を、複数の円形型においてＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａゲノムの異なる遺伝子座へ結合することができ、それによりＵＲＡ＋原栄養の表現型を有する新しい菌株を形成することができる。その結果生じた結合は、導入されたＵＲＡ３遺伝子が独立して取り除かれるとき（いわゆる、ループアウト又はポップアウト）、５−ＦＯＡ選択を再度使って新しいＵＲＡ３−栄養要求性の菌株を形成する。従って、５−ＦＯＡ選択との組み合わせにおけるＵＲＡ３遺伝子は、遺伝子組み換え及び発現カセットの融合の複数の円形型における選択マーカーとして使用することができる。
【０１５４】
ｅ）Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの形質転換
標準的な形質転換技術（チェンら（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ），１９９７、ＷＯ２００６１２５０００）を、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａホストへ発現カセットを含む異質ＤＮＡ、自己複製ベクター、又はＤＮＡ断片を導入するために使用することができる。これに限定されないが、例えば、ＡＴＣＣ９０８１１、ＡＴＣＣ９０８１２、及びＡＲＣＣ９０９０３等のホスト細胞が挙げられる。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａに導入された異質ＤＮＡを維持するために使用される選択方法は、アミノ酸マーカー（フィッカーら（Ｆｉｃｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ），２００３）、又は抗生物質マーカー（コルデロら（Ｃｏｒｄｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ），１９９６）に基づいていてもよい。
【０１５５】
（実施例１９）
（ａ）組み換え型大腸菌の菌株を使ったバッチ培養
大腸菌ＰＡＬ２４ＣＬ１ＶＳＴ１及びＢＬ２１（ＤＥ３）（対照菌株）の組換え型菌株を、好気的条件下で、１．５リッターの可動範囲のバッフルされた生物反応器で成長させた。培養を、３０℃、８００ｒｐｍでインキュベートした。一定ｐＨ７を、２ＮのＫＯＨの自動添加によって維持した。好気的条件は、溶解酸素濃度（ＤＯＴ）が６０％を超えることを確かめるために、１ｖｖｍの割合で生物反応器に、空気を散布することによって得られた。空気を、生物反応器に導入する前に細菌ろ過した。排気ガスを、コンデンサーを通じて導き、６℃未満に冷却し、音響ガス分析機（ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｇａｓ  ａｎａｌｙｓｅｒ）によってＣＯ２及びＯ２の容積測定の含有量について分析した。生物反応器には、空気（ＤＯＴ、１００％）とＮ２（ＤＯＴ、０％）で較正されたポーラログラフの酸素センサーが備え付けられた。
【０１５６】
細胞を、バッチ培養で成長するように、次の成分からなる準定義された培地においてグリセロールについて成長させた。６．０ｇ／ｌの酵母菌の抽出物、２７．２ｇ／ｌのＮａ２ＨＰＨＯ４（無水）、１２．０ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、２．０ｇ／ｌのＮａＣｌ、４．０ｇ／ｌのＮＨ４Ｃｌ。グリセロールの濃度は、２０ｇ／ｌであった。培地に、５０ｍｇ／ｌのアンピシリン、及び５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを補足した。消泡剤を、最終的な濃度が５０μｌ／ｌとなるまで加えた。
【０１５７】
生物反応器を、１ｍｌの組み換え型菌株のグリセロール保存培養で植菌し、６００ｎｍにおける最終的な光学的濃度を約０．０３にした。グリセロール保存培養を、３０℃、１５０ｒｐｍで、準定義された培地上で振盪フラスコ内の細胞を成長させることによって得た。培地の組成は、上述したものと同様にしたが、４倍低くし縮小した。例えば、：５ｇ／ｌのグリセロール、１．５ｇ／ｌの酵母菌抽出物、６．８ｇ／ｌのＮａ２ＨＰＨＯ４（無水）、３．０ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／ｌのＮａＣｌ、及び１．０ｇ／ｌのＮＨ４Ｃｌである。培地に、５０ｍｇ／ｌのアンピシリン、及び５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを補足した。細胞を、後半の指数増殖期中に採取し、遠心分離によって収集し、滅菌グリセロール溶液１５％（ｗ／ｖ）の適した体積中で再懸濁し、６００ｎｍにおける最終的な光学的濃度は、３０であった。懸濁された細胞の１ｍｌのアリコートを、−８０℃で保存した。
【０１５８】
細胞が、生物反応器内で成長し始めた後（植菌後５．５時間）、イソプロピルβ−チオガラクトピラノサイド（ＩＰＴＧ）を、３つの遺伝子ＰＡＬ２、４ＣＬ１、及びＶＳＴ１のそれぞれ直前であるＴ７プロモーターの誘導因子として、１ｍＭの最終濃度に加えた。
細胞の培養液のサンプルは、バッチ培養の過程で採取され、ピノシルビンの存在について分析された。加えて、サンプルを、バイオマス（光学的濃度ＯＤ６００に関して）、炭素源（グリセロール）、及び主要な副生成物（エタノール、アセテート、ピルビン酸塩、コハク酸エステル）について分析した。
【０１５９】
（ｂ）大腸菌におけるピノシルビンの抽出
細胞内のピノシルビンをエチルアセテートを使って抽出した。その目的のために、４ｍｌのエチルアセテートを８ｍｌの細胞培養液に加えた。その抽出物を、混合し（３０秒）、遠心分離器（４℃で、５分間、４５００ｒｐｍ）によって相分離した。アセテート相を、凍結乾燥し（約２時間）、乾燥生成物を０．５ｍｌのメタノールに再溶解し、ＨＰＬＣによって分析した。これらのサンプルを、さらに水で希釈し（１：５）、ＨＰＬＣによって分析した。
【０１６０】
（ｃ）ピノシルビンの分析
バッチ培養由来のサンプルにおけるピノシルビンの分析を、実施例９ｂで記述されたような方法を使って行った。サンプルを、あらかじめ次のサンプル前処理手順で、同時に処理した。（ｉ）細胞培養液の遠心分離（５分）と浮遊物の分析、（ｉｉ）エタノール（９９．９％）添加して５０％（ｖ／ｖ）の最終濃度にし、渦（３０秒）、遠心分離（５分）を行い、浮遊物を分析、（ｉｉｉ）上記（ｂ）に従ってエチルアセテートで抽出し、メタノール中に再溶解させた乾燥したサンプルを分析。
【０１６１】
（結果）
実施例１０ｃに示されるように、大腸菌ＦＳＥＣ−ＰＡＬ２４ＣＬ１ＶＳＴ１、及びＢＬ２１（ＤＥ３）（対照菌株）の組み換え型菌株を、上述の（ａ）のように、バッチモードにおいて生物反応器で２０ｇ／Ｌのグリセロールで培養した。培養過程で、組み換え型菌株を、上述の（ｃ）に従ってピノシルビンの含有量について分析した。
【０１６２】
ＨＰＬＣ分析によって、菌株ＦＳＥＣ−ＰＡＬ２４ＣＬ１ＶＳＴ１が、トランス−ピノシルビンの標準物質と同一の保持時間を有する成分を含むことが示された（図４及び５）。加えて、ＵＶ吸収スペクトルは、約３０６ｎｍのλｍａｘを有する純粋なトランス−ピノシルビン（図示せず）の吸収スペクトルに類似した。
検出されたピノシルビンの最大濃度を、次の表に示す。
【０１６３】
【表３】
0005528108.tif 000004
【０１６４】
対照菌株を用いたバッチ培養由来のサンプルにおいて、ピノシルビンは検出されなかった。
その結果は、したがって、バッチモードの生物反応器内で成長した大腸菌において、トランス−ピノシルビンの生体内の生成につながる活性化されたフェニル−プロパノイド経路の存在を明らかにした。
【０１６５】
（実施例２０）
（ａ）組み換え型の黒色アスペルギルス菌株を用いたバッチ培養
Ｃ４Ｈ、４ＣＬ１、及びＶＳＴ１を含む黒色アスペルギルスの組み換え型菌株を、好気的条件下で１．５リッターの可動範囲のバッフルされた生物反応器内で成長させた。培養を、３０℃、７００ｒｐｍでインキュベートした。一定ｐＨ６を、２ＮのＫＯＨの自動添加によって維持した。好気的条件は、溶解させた酸素圧（ＤＯＴ）が６０％を超えることを確認するために、１ｖｖｍの割合で生物反応器に空気を散布することによって得られた。空気を、生物反応器に導入する前に細菌濾過した。排気ガスを、コンデンサー通じて導き、６℃未満に冷却し、音響ガス分析機（ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｇａｓ  ａｎａｌｙｓｅｒ）によってＣＯ２及びＯ２の容積測定の含有量について分析した。生物反応器には、空気（ＤＯＴ、１００％）とＮ２（ＤＯＴ、０％）で較正されたポーラログラフの酸素センサーが備え付けられた。細胞を、次の成分を含む定義された培地のスクロース上で成長させた。３．０ｇ／ｌのＮａＮＯ３、１．０ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／ｌのＫＣｌ、０．５ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇ／ｌのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ。スクロースの濃度は３０ｇ／ｌであった。消泡剤を最終濃度が５０μ／ｌとなるまで添加した。
【０１６６】
生物反応器を、次の組成の固体の最小培地上であらかじめ繁殖させたＣ４Ｈ、４ＣＬ１、及びＶＳＴ１を含む黒色アスペルギルス菌株の胞子を使ってインキュベートをした。１ｇ／Ｌのグルコース、０．８５ｇ／ＬのＮａＮＯ３、０．１ｇ／ＬのＫＣｌ、０．１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、及び、０．３ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．０００００８ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０００００８ｇ／ＬのＮａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、０．０００１６ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０００１６ｇ／ＬのＭｎＳＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０００１６ｇ／ＬのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．００１６ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ。胞子を５日間３７℃で培養し、Ｔｗｅｅｎ８０％溶液（０．２５％（ｗ／ｖ））を添加することによって集菌した。
【０１６７】
（ｂ）黒色アスペルギルスにおけるピノシルビンの抽出
細胞を、均質化によって分裂させ（ポリトロン細胞組織ホモジナイザー）、細胞内のピノシルビンを、１０ｍｌのエチルアセテートを用いて抽出した。その抽出物を、回転混合機によって混合し（約１５分）、遠心分離器（４℃で、５分間、４５００ｒｐｍ）によって、相分離した。アセテート相を、凍結乾燥（約２時間）し、乾燥生成物を０．５ｍｌのメタノールで再溶解し、ＨＰＬＣによって分析した。
【０１６８】
（ｃ）ピノシルビンの分析
バッチ培養由来のサンプルにおけるピノシルビンの分析を、実施例９ｂに記述されたような方法で行った。
【０１６９】
（結果）
実施例１６ｅに記述されているようにＣ４Ｈ、４ＣＬ１、及びＶＳＴ１を含む黒色アスペルギルスの組み換え型菌株を、実施例ＨＤ４に従って、バッチモードにおいて生物反応器で３０ｇ／Ｌのスクロースで培養した。約４８時間の培養後、細胞を生物反応器から集菌し、均質化によって分裂させ、上述した（ｂ）及び（ｃ）に従ってピノシルビンの細胞内の含有量について分析した。
【０１７０】
ＨＰＬＣ分析によって、Ｃ４Ｈ、４ＣＬ１、及びＶＳＴ１を含む黒色アスペルギルス菌株が、細胞内にトランス−ピノシルビンの標準物質と同一の保持時間を有する成分を発現することを示した（図４及び５）。さらに、ＵＶ吸収スペクトルは、約３０６ｎｍのλｍａｘを有する純粋なトランス−ピノシルビン（図示せず）の吸収スペクトルに類似した。
その結果は、したがって、バッチモードの生物反応器内で成長した黒色アスペルギルスにおいて、トランス−ピノシルビンの生体内の生成につながる活性化されたフェニル−プロパノイド経路の存在を明らかにした。
【０１７１】
参考文献
下記の刊行物はすべて、参照され本明細書の一部とされる。
南アフリカ特許番号第ＺＡ２００４０８１９４号
欧州特許番号第ＥＰ０３０９８６２号
欧州特許番号第ＥＰ０４６４４６１号
米国特許番号第ＵＳ５３９１７２４号
米国特許番号第ＵＳ５９７３２３０号
【０１７２】
国際公開第ＷＯ２００６１２５０００号
Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ  ｉｎ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｏｌｅａｇｉｎｏｕｓ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ
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【０１７３】
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Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２００５：６６：２０７２−２０９１
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Ｆｉｃｋｅｒｓ  Ｐ，  Ｌｅ  Ｄａｌｌ  ＭＴ，  Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ  Ｃ，  Ｔｈｏｎａｒｔ  Ｐ，  Ｎｉｃａｕｄ  ＪＭ．  Ｎｅｗ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｇｅｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｒｋｅｒ  ｒｅｓｃｕｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ．  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００３：５５：７２７−３７．
【０１８４】
Ｇｅｈｌｅｒｔ，  Ｒ．，  Ｓｃｈｏｐｐｅｒ，  Ａ．  ａｎｄ  ｋｉｎｄｌ，  Ｈ．  Ｓｔｉｌｂｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ  ｏｆ  ｐｉｎｕｓ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ−ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｆｕｎｇａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．  Ｍｏｌ．  Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ３  （１９９０）４４４−４９．
【０１８５】
Ｇｅｍｓ，  Ｄ．，  Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ，  Ｉ．Ｌ．  ａｎｄ  Ｃｌｕｔｔｅｒｂｕｃｋ，  Ａ．Ｊ．（１９９１）．  Ａｎ  ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｓ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ．  Ｇｅｎｅ  ９８，  ６１−６７．
【０１８６】
Ｈａｉｎ，  Ｒ．，  Ｒｅｉｆ，  Ｈ．Ｊ．，  Ｋｒａｕｓｅ，  Ｅ．，  Ｌａｎｇｅｂａｒｔｅｌｓ，  Ｒ．，  Ｋｉｎｄｌ，  Ｈ．，  Ｖｏｒｎａｍ，  Ｂ．，  Ｗｉｅｓｅ，  Ｗ．，  Ｓｃｈｍｅｌｚｅｒ，  Ｅ．，  Ｓｃｈｒｅｉｅｒ，  Ｐ．Ｈ．，  Ｓｔｏｃｋｅｒ，  Ｒ．Ｈ．  ａｎｄ  Ｓｔｅｎｚａｌ，  ｋ．（１９９３）．  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｐｈｙｔｏａｌｅｘｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｌａｎｔ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３６１，  １５３−１５６．
【０１８７】
Ｈｗａｎｇ  ＥＩ，  Ｋａｎｅｋｏ  Ｍ，  Ｏｈｎｉｓｈｉ  Ｙ，  Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ  Ｓ．（２００３）．  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｎｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｌａｖａｎｏｎｅｓ  ｂｙ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａｎ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｇｅｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９，  ２６９９−７０６．
【０１８８】
Ｈａｍｂｅｒｇｅｒ，  Ｂ．  ａｎｄ  Ｈａｈｌｂｒｏｃｋ，  Ｋ．  （２００４）．  Ｔｈｅ  ４−ｃｏｕｍａｒａｔｅ：ＣｏＡｌｉｇａｓａ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ  ｏｎｅ  ｒａｒｅ，  ｓｉｎａｐａｔｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｒｅｅ  ｃｏｍｍｏｎｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｉｓｏｅｎｚｙｍｅｓ．  ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  １０１，  ２２０９−２２１４．
【０１８９】
Ｈａｒｔ，  Ｊ．Ｈ．  （１９８１）  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｈｙｔｏｓｔｉｌｂｅｎｅｓ  ｉｎ  ｄｅｃａｙ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １９，  ４３７−４５８．
【０１９０】
Ｈａｒｔ，  Ｊ．Ｈ．，  Ｓｈｒｉｍｐｔｏｎ，  Ｄ．Ｍ．（１９７９）．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｓｔｉｌｂｅｎｅｓ  ｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｗｏｏｄ  ｔｏ  ｄｅｃａｙ．  Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ６９，  １１３８−１１４３．
【０１９１】
Ｈｅｍｉｎｇｗａｙ  Ｒ．Ｗ．，  ＭｃＧｒａｗ，  Ｇ．Ｗ．  ａｎｄ  Ｂａｒｒａｓ，  Ｓ．Ｊ．  （１９７７）．  Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｒａｔｏｃｙｓｔｉｓ  ｍｉｎｏｒ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ：Ｆｕｎｇａｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ，  ｐｈｌｏｅｍ  ａｎｄ  ｘｙｌｅｍ  ｐｈｅｎｏｌｓ．  Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，  ２５，  ７１７−７２２．
【０１９２】
Ｊｕｖｖａｄｉ，  Ｐ．Ｒ．，  Ｓｅｓｈｉｍｅ，  Ｙ．，  Ｋｉｔａｍｏｔｏ，  Ｋ．  （２００５）．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓｒｅｖｅａｌｓ  ｔｒａｃｅｓ  ｏｆ  ｆｕｎｇａｌ  ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄ−ｆｌａｖｏｎｏｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｕｓ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ．  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３，  ４７５−４８６．
【０１９３】
Ｊｕｒｅｔｚｅｋ  Ｔ，  Ｌｅ  Ｄａｌｌ  Ｍ，  Ｍａｕｅｒｓｂｅｒｇｅｒ  Ｓ，  Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ  Ｃ，  Ｂａｒｔｈ  Ｇ，  Ｎｉｃａｕｄ  Ｊ．
Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ．
Ｙｅａｓｔ．２００１：１８：９７−１１３．
【０１９４】
Ｋａｎｅｋｏ，  Ｍ．，  Ｏｈｎｉｓｈｉ，  Ｙ．  ａｎｄ  Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ，  Ｓ．  Ｃｉｎｎａｍａｔｅ：Ｃｏｅｎｚｙｍｅ  （２００３）．  Ａ  ｌｉｇａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２），  ｊ．  Ｂａｃｔ．１８５，  ２０−２７．
【０１９５】
Ｋｉｎｄｌ，  Ｈ．（１９８５）  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｓｔｉｌｂｅｎｓｅ．  Ｉｎ  Ｈｉｇｕｃｈｉ  Ｔ，  ｅｄ，  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｏｏｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  ｐｐ  ３４９−３７７．
【０１９６】
Ｋｏｄａｎ，  Ａ．，  Ｋｕｒｏｄａ，  Ｈ．  ａｎｄ  Ｓａｋａｉ，  Ｆ．（２００２）．Ａ  ｓｔｉｌｂｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｒｅｄ  ｐｉｎｅ  （ｐｉｎｕｓ  ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａ）：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｐｈｙｔｏａｌｅｘｉｎ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎａｎｄ  ｄｏｗｎ−ｒｅｑｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．９９，  ３３３５−３３３９．
【０１９７】
Ｌｅ  Ｄａｌｌ  ＭＴ，  Ｎｉｃａｕｄ  ＪＭ，  Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ  Ｃ．
Ｍｕｌｔｉｐｉｌｅ−ｃｏｐｙ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ
Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ．１９９４：２６：３８−４４．
【０１９８】
Ｌｉｅｕｔｉｅｒ，  Ｆ．，  Ｓａｕｖａｒｄ，  Ｄ．，  Ｂｒｉｇｎｏｌａｓ，  Ｆ．，  Ｐｉｃｒｏｎ，  Ｖ．，  Ｙａｒｔ，  Ａ．，  Ｂａｓｔｉｅｎ，  Ｃ．  ａｎｄ  Ｊａｙ−Ａｌｌｅｍａｎｄ，  Ｃ．（１９９６）  Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｐｈｅｎｏｌｉｃ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ｏｆ  Ｓｃｏｔｓ  ｐｉｎｅ  ｐｈｌｏｅｍ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ  ｂｒｕｎｎｅｏ−ｃｉｌｉａｔｕｍ，  ａ  ｂａｒｋ  ｂｅｅｔｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆｕｎｇｕｓ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｆｏｒ  Ｐａｔｈｏｌ．２６，  １４５−１５８．
【０１９９】
Ｌｉｎｄｂｅｒｇ  Ｌｅ，  Ｗｉｌｌｆｏｒ  ＳＭ，  Ｈｏｌｍｂｏｍ  ＢＲ．  （２００４）  Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｋｎｏｔｗｏｏｄ  ｅｘｔｒａｃｔｉｖｅｓ  ｏｎ  ｐａｐｅｒ  ｍｉｌｌ  ｂａｃｔｅｒｉａ．  Ｊ  Ｉｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３１，  １３７−１４７．
【０２００】
Ｍａｄｚａｋ  Ｃ，  Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ  Ｃ，  Ｂｅｃｋｅｒｉｃｈ  ＪＭ．
Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｏｎ−ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｙｅａｓｔ  Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ：  ａ  ｒｅｖｉｅｗ．  Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４：１０９：６３−８１．
【０２０１】
Ｍａｒｔｉｎ，  Ｖ．Ｊ．Ｊ．，  Ｐｉｔｅｒａ，  Ｄ．  Ｊ．，  Ｗｉｔｈｅｒｓ，  Ｓ．Ｔ．，  Ｎｅｗｍａｎ，  Ｊ．Ｄ．  ａｎｄ  Ｋｅａｓｌｉｎｇ，  Ｊ．Ｄ．（２００３）．  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａ  ｍｅｖａｌｎｏｔｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１，  ７９６−８０２．
【０２０２】
Ｍｅｌｃｈｉｏｒ  Ｆ，  Ｋｉｎｄｌ  Ｈ  （１９９１）．  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  ａｎｄ  ｅｌｉｃｉｔｏｒ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｉｌｂｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ａｎｄ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ａｍｍｏｎｉａｌｙａｓｅ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｖｉｔｉｓ  ｃｖ．  Ｏｐｔｉｍａ．  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ２８８，  ５５２−５５７．
【０２０３】
Ｍｅｌｌａｎｅｎ，  Ｐ．，  Ｐｅｔａｎｅｎ，  Ｔ．，  ｌｅｈｔｉｍａｋｉ，  Ｊ．，  Ｍａｋｅｌａ，  Ｓ．，  Ｂｙｌｕｎｄ，  Ｈｏｌｍｂｏｍ，  Ｂ．，  Ｍａｎｎｉｌａ，  Ｅ．，  Ｏｉｋａｒｉ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｓａｎｔｔｉ，  Ｒ．（１９９６）．  Ｗｏｏｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｅｓｔｒｏｇｅｎｓ：ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｗｉｔｈ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎ  ｔｒｏｕｔ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  Ａｐｐ．  Ｐｈａｒｍ．１３６，  ３８１−３８８．
【０２０４】
Ｍｅｒｋｕｌｏｖ  Ｓ，  ｖａｎ  Ａｓｓｅｍａ  Ｆ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｊ，  Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  Ｄｅｌ  ｃａｒｍｅｎ  Ａ，  Ｍｏｏｉｂｒｏｅｋ  Ｈ．
Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ｓｑｕａｌｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＳＱＳ１）ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｅｒｇ９  ｍｕｔａｔｉｏｎ．
Ｙｅａｓｔ．２０００：１６：１９７−２０６．
【０２０５】
Ｍｉｚｕｔａｎｉ  Ｍ  ａｎｄ  Ｏｈｔａ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ，  １９９８
Ｔｗｏ  Ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ＮＡＤＰＨ：Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ．  Ｇｅｎｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌｓ，  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１６，  ３５７−３６７．
【０２０６】
Ｍｏｒｉｔａ，  Ｈ．，  ｎｏｇｕｃｈｉ  Ｈ．，  Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ａｂｅ，  Ｉ．（２００１）．  Ｎｏｖｅｌ  ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅｓ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｈｉｇｈｅｒ  ｐｌａｎｔ  ｓｔｉｌｂｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ．  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８，  ３７５９−３７６６．
【０２０７】
Ｍｕｌｌｅｒ  Ｓ，  Ｓａｎｄａｌ  Ｔ，  Ｋａｍｐ−Ｈａｎｓｅｎ  Ｐ，  Ｄａｌｂφｇｅ  Ｈ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ    ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔｓ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，  Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ，  Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ，  Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ  ａｎｄ  Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ．  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｆｒｏｍ  Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ．  Ｙｅａｓｔ．１９９８：１４：１２６７−８３．
【０２０８】
Ｎｉｃａｕｄ  ＪＭ，  Ｍａｄｚａｋ  Ｃ，  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｏｅｋ  Ｐ，  Ｇｙｓｌｅｒ  Ｃ，  Ｄｕｂｏｃ  Ｐ，  Ｎｉｅｄｅｒｂｅｒｇｅｒ  Ｐ，  Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ  Ｃ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ．  ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．２００２：２：３７１−９．
【０２０９】
Ｐｉｇｎｅｄｅ  Ｇ，  Ｗａｎｇ  ＨＪ，  Ｆｕｄｅｌｅｊ  Ｆ，  Ｓｅｍａｎ  Ｍ，  Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ  Ｃ，  Ｎｉｃａｕｄ  ＪＭ．
Ａｕｔｏｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＬＩＰ２  ｉｎ  Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ．  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０００：６６：３２８３−９．
【０２１０】
Ｐｒｅｉｓｉｇ−Ｍｕｌｌｅｒ，  Ｒ．，  Ｓｃｈｗｅｋｅｎｄｉｅｋ，  Ａ．，  Ｂｒｅｈｍ，  Ｉ．，  Ｒｅｉｆ，  Ｈ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｋｉｎｄｌ，  Ｈ．（１９９９）．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｉｎｅ    ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｅｌｉｃｉｔｏｒ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｓｔｉｌｂｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｇｅｎｅｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．１９９９  ３９，  ２２１−２２９．
【０２１１】
Ｐａｃｈｅｒ  Ｔ，  Ｓｅｇｅｒ  Ｃ，  Ｅｎｇｅｌｍｅｉｅｒ  Ｄ，  Ｖａｊｒｏｄａｙａ  Ｓ，  Ｈｏｆｅｒ  Ｏ，  Ｇｒｅｇｅｒ  Ｈ，  （２００２）．  Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ  ｓｔｉｌｂｅｎｏｉｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｓｔｅｍｏｎａ  ｃｏｌｌｉｎｓａｅ．  Ｊ  Ｎａｔ  Ｐｒｏｄ．６５，  ８２０−８２７．
【０２１２】
Ｒａｉｂｅｒ  Ｓ，  Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  Ｇ，  Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  Ｊ，  （１９９５）．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｓｔｉｌｂｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｅａｓｔｅｒｎ  ｗｈｉｔｅ  ｐｉｎｅ  （Ｐｉｎｕｓ  ｓｔｒｏｂｕｓ）．  Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  Ａｒｇ／Ｈｉｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐＨ  ｄｅｐｅｎｄａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍｅｓ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３６１，  ２９９−３０２．
【０２１３】
Ｒｉｃｈｅｒ，  Ｃ．，  Ｗｉｌｅｄ，  Ａ．（１９９２）．  Ｐｈｅｎｏｌｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｉｎ  ｎｅｅｄｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｗａｙ  ｓｐｒｕｃｅ  ｔｒｅｅｓ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｎｏｖｅｌ  ｆｏｒｅｓｔ  ｄｅｃｌｉｎｅ：Ｉ．  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｒｅｅｓ  ｆｒｏｍ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌａｃｋ  Ｆｏｒｅｓｔ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｐｆｌａｎｚ  １８８，  ３０５−３２０．
【０２１４】
Ｒｏ  Ｄ．Ｋ．，  Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｃ．Ｊ．（２００４）．  Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｔｒｙ  ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  ｐｌａｎｔ  ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｉｏｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ  （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｆｌｕｘ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｉｏｄ  ｐａｔｈｗａｙ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，  ２６００−２６０７．
【０２１５】
Ｒｏｓｅｍａｎｎ，  Ｄ．，  Ｈｅｌｌｅｒ，  Ｗ．  ａｎｄ  Ｓａｎｄｅｒｍａｎｎ，  Ｈ．（１９９１）．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  Ｏｚｏｎｅ．  ＩＩ．  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｉｌｂｅｎｅ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｓｃｏｔｓ  Ｐｉｎｅ  （Ｐｉｎｕｓ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ  Ｌ．）  Ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ．  Ｊｒ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９７，１２８０−１２８６．
【０２１６】
Ｒｏｕｐｅ，  Ｋ．Ａ．，  Ｆｕｋｕｄａ，  Ｃ．，  Ｈａｌｌｓ，  Ｓ．，  Ｙａｎｅｚ，  Ｊ．Ａ．  ａｎｄ  Ｄａｖｉｅｓ  Ｎ．Ｍ．（２００５）  Ｐｉｎｏｓｙｌｖｉｎ：  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔｓ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ．  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ．Ａｃｃｅｐｔｅｄ．
【０２１７】
Ｒｏｕｐｅ，  Ｋ．Ａ．，Ｅｍｓｂｅｒｇ，  Ｃ．Ｍ．，  Ｙａｎｅｚ，  Ｊ．Ａ．  ａｎｄ  Ｄａｖｉｅｓ  Ｎ．Ｍ．（２００６）．  Ｐｈａｒｍａｃｏｍｅｔｒｉｃｓ  ｏｆ  Ｓｔｉｌｂｅｎｅｓ：  ｓｅｇｕｉｎｇ  Ｔｏｗａｒｄｓ  ｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃ．  Ｃｕｒｒ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃ．１，  ８１−１０１．
【０２１８】
Ｓａｍａｐｐｉｔｏ，  Ｓ．，  Ｐａｇｅ，  Ｊ．Ｅ．，  Ｓｃｈｍｉｄｔ，  Ｊ．，  Ｄｅ−Ｅｋｎａｍｋｕｌ，  Ｗ．  ａｎｄ  Ｋｕｔｃｈａｎ，  Ｔ，Ｍ．（２００３）．  Ａｒｏｍａｔｉｃ  ａｎｄ  ｐｙｒｏｎｅ  ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅｓ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｂｙ  ａ  ｓｔｉｌｂｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｒｈｅｕｍ  ｔａｔａｒｉｃｕｍ．  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６２，    ３１３−３２３．
【０２１９】
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｅ．Ｆ．  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．（１９８９）．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．
【０２２０】
Ｓｃｈａｎｚ，  Ｓ．，  Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，  Ｇ．  ａｎｄ  Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，  Ｊ．  （１９９２）．  Ｓｔｉｌｂｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｓｃｏｔ‘ｓ  ｐｉｎｅ（Ｐｉｎｕｓ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３１３，７１−７４．
【０２２１】
Ｓｃｈｏｐｐｅｒ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｋｉｎｄｌ，  Ｈ．（１９８４）  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｓｔｉｌｂｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｐｅａｎｕｔ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９，  ６８０６−６８１１．
【０２２２】
Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  Ｇ，  Ｂｒｏｗｎ  ＪＷＳ，  Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  Ｊ．（１９８８）．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ  ｓｙｎｔｈａｓｅ．  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｗｉｔｈ  ｃｈａｌｃｏｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １７２，  １６１−１６９．
【０２２３】
Ｓｅｓｈｉｍｅ，  Ｙ．，  Ｊｕｖｖａｄｉ，  Ｐ．Ｒ．，  Ｆｕｊｉｉ，  Ｉ．  ａｎｄ  Ｋｉｔａｍｏｔｏ，  Ｋ．（２００５）．  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｅｖｉｄｅｎｃｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．３７７，  ７４７−５１．
【０２２４】
Ｓｋｉｎｎｉｄｅｒ，  Ｌ．  ａｎｄ  Ｓｔｏｅｓｓｌ  Ａ．（１９８６）．  Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈｙｔｏａｌｅｘｉｎｓ，  ｌｕｂｉｍｉｎ，  （−）−ｍａａｃｋｉａｉｎ，  ｐｉｎｏｓｙｌｖｉｎ，  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｄｅｈｙｄｒｏｌｏｒｏｇｌｏｓｓｏｌ  ａｎｄ  ｈｏｒｄａｔｉｎｅ  Ｍ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．  Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ  ４２，  ５６８−５７０．
【０２２５】
Ｓｔｏｊａｎｏｖｉｃ，  Ｓ．，  Ｓｐｒｉｎｚ，  Ｈ．  ａｎｄ  Ｂｒｅｄｅ，  Ｏ．（２００１）．  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ｏｘｉｄａｎｔ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓ−ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｄｉｃａｌ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ．  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．３９１，  ７９−８９．
【０２２６】
Ｓｕｇａ，  Ｔ．，  Ｏｈｔａ  Ｓ．，  Ｍｕｎｅｓａｄａ  Ｋ．，  Ｉｄｅ  Ｎ．，  Ｋｕｒｏｋａｗａ  ｍ．，  Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｍ．，  Ｏｈｔａ  Ｅ．（１９９３）．  Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｐｉｎｅ  ｗｏｏｄ  ｎｅｍａｔｉｃｉｄａｌ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｐｉｎｅｓ，  Ｐｉｎｕｓ  ｍａｓｓｏｎｉａｎａ，  Ｐ．  ｓｔｒｏｂｕｓ  ａｎｄ  Ｐ．  Ｐａｌｕｓｔｒｉｓ．  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３，  １３９５−１４０１．
【０２２７】
Ｔｒｏｐｆ，  Ｓ．，  Ｋａｒｃｈｅｒ，  Ｂ．，  Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，  Ｇ．  ａｎｄ  Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，  Ｊ．（１９９５）．  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｉｃ  ｐｌａｎｔ  ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ（ｓｔｉｌｂｅｎｅ  ａｎｄ  ｃｈａｌｃｏｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）．  Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｉｓ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｆｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｓｔｉｌｂｅｎｅｓ，  ｃｈａｌｃｏｎｅｓ，  ａｎｄ  ６‘−ｄｅｏｘｙｃｈａｌｃｏｎｅｓ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，  ７９２２−７９２８．
【０２２８】
Ｕｒｂａｎ  Ｐ，  Ｗｅｒｃｋ−Ｒｅｉｃｈｈａｒｔ  Ｄ，  Ｔｅｕｔｓｃｈ  ＨＧ，  Ｄｕｒｓｔ  Ｆ，  Ｒｅｇｎｉｅｒ  Ｓ，  Ｋａｚｍａｉｅｒ  Ｍ，  Ｐｏｍｐｏｎ  Ｄ（１９９４）．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｌａｎｔ  ｃｉｎｎａｍａｔｅ  ４−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ．  Ｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｐｌａｎｔ  Ｐ４５０  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄ  ｐａｙｈｗａｙ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２２：８４３−５０．
【０２２９】
Ｖｅｒｄｕｙｎ  Ｃ，  Ｐｏｓｔｍａ  Ｅ，  Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓ  ＷＡ，  Ｖａｎ  Ｄｉｊｋｅｎ  ＪＰ．（１９９２）．  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｏｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｆｌｕｘｅｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔｓ：  ａ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ−ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．  Ｙｅａｓｔ．８，  ５０１−５１７．
【０２３０】
Ｗａｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ；  Ｗａｔｔｓ  ＫＴ，  Ｍｉｊｔｓ  ＢＮ，  Ｌｅｅ  ＰＣ，  Ｍａｎｎｉｎｇ  ＡＪ，  Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｄａｎｎｅｒｔ  Ｃ．（２００６）．  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ａ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｗｉｔｃｈ  ｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ａｍｍｏｎｉａ−ｌｙａｓｅ，  ａ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｒｏｍａｔｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｌｙａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ．  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．１３：１３１７−２６．
【０２３１】
Ｗｉｅｓｅ  Ｗ，  Ｖｏｒｎａｍ  Ｂ，  Ｋｒａｕｓｅ  Ｅ，  ｋｉｎｄｌ  Ｈ（１９９４）．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｓｔｉｌｂｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｇｅｎｅｓ  ｌｏｃａｔｅｄ  ｏｎ  ａ  １３  ｋｂ  ｇｒａｐｅｖｉｎｅ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２６，  ６６７−６７７．
【０２３２】
以下は、本明細書に現れるヌクレオチド配列とアミノ酸配列の概要である。
配列番号１は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ２）をコードするシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のヌクレオチド配列である。
配列番号２は、配列番号１によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号３は、４−クマレート：補酵素Ａリガーゼ（４ＣＬ１）をコードするシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のヌクレオチド配列である。
配列番号４は、配列番号３によりコードされるアミノ酸配列である。
【０２３３】
配列番号５は、リスベラトロールシンターゼ（ＲＥＳ）をコードするＲｈｅｕｍ  ｔａｔａｒｉｃｕｍ由来のヌクレオチド配列である。
配列番号６は、配列番号５によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号７は、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での発現のためにコドン最適化されたリスベラトロールシンターゼ（ＲＥＳ）をコードするＲｈｅｕｍ  ｔａｔａｒｉｃｕｍ由来のヌクレオチド配列である。
配列番号８は、配列番号７によりコードされるアミノ酸配列である。
【０２３４】
配列番号９は、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での発現のためにコドン最適化されたリスベラトロールシンターゼ（ＶＳＴ１）をコードするＶｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ由来のヌクレオチド配列である。
配列番号１０は、配列番号９によりコードされるアミノ酸配列である。
【０２３５】
配列番号１１〜１６は、表１に現れる実施例１のプライマー配列である。
配列番号１７〜２２は、実施例１６ａで使用されるプライマー配列である。
配列番号２３〜２６は、実施例１６ｂで使用されるプライマー配列である。
配列番号２７〜３０は、実施例１６ｃで使用されるプライマー配列である。
【図１】
0005528108.tif 000005
【図２】
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【図３】
0005528108.tif 000007
【図４】
0005528108.tif 000008
【図５】
0005528108.tif 000009
【図６Ａ】
0005528108.tif 000010
【図６Ｂ】
0005528108.tif 000011
【図６Ｃ】
0005528108.tif 000012
【図６Ｄ】
0005528108.tif 000013
【図７】
0005528108.tif 000014
【図８】
0005528108.tif 000015
【配列表】
0005528108000001.app