(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インタクトな非マウス抗体または該インタクトな抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメントであって、該抗体は、配列番号１２０または１２１からなるＭ−ＣＳＦのエピトープに結合し、少なくとも１０−９Ｍまたはそれよりも高い、配列番号９のＭ−ＣＳＦに対する親和性Ｋｄを保持し、かつ、ヒトＭ−ＣＳＦ活性を中和する、非マウス抗体。
【請求項２】
モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト遺伝子操作抗体、ヒト抗体、または単鎖抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
ＩｇＧ抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
Ｆ（ａｂ’）２フラグメントである、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
配列番号１８、２１、２４、２９、３２および３６の全て、または、これらからの少なくとも１アミノ酸置換改変体を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】
配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である可変軽鎖アミノ酸配列、および配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である可変重鎖アミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８】
ヒト抗体配列の定常領域ならびに
ヒト抗体配列の１つ以上の重鎖可変フレームワーク領域および軽鎖可変フレームワーク領域
を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項９】
前記ヒト抗体配列が、個々のヒト配列、ヒトコンセンサス配列、個々のヒト生殖細胞系配列、またはヒトコンセンサス生殖細胞系配列である、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
ＩｇＧ１定常領域のフラグメントを含む、請求項８に記載の抗体。
【請求項１１】
抗体依存性細胞傷害活性または補体依存性細胞傷害活性を減少させるＩｇＧ１定常領域における変異を含む、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
ＩｇＧ４定常領域のフラグメントを含む、請求項８に記載の抗体。
【請求項１３】
半抗体の形成を減少させるＩｇＧ４定常領域における変異を含む、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
アミノ酸配列
【数１】
0005422101.tif 000032
を含む重鎖可変領域と、以下：
アミノ酸配列
【数７】
0005422101.tif 000033
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数８】
0005422101.tif 000034
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数９】
0005422101.tif 000035
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数１０】
0005422101.tif 000036
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数１１】
0005422101.tif 000037
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数１２】
0005422101.tif 000038
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数１３】
0005422101.tif 000039
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数１４】
0005422101.tif 000040
を含む軽鎖可変領域
からなる群より選択される軽鎖可変領域
を含み、Ｘは任意のアミノ酸である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１５】
アミノ酸配列
【数２】
0005422101.tif 000041
を含む重鎖可変領域と、以下：
アミノ酸配列
【数７】
0005422101.tif 000042
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数８】
0005422101.tif 000043
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数９】
0005422101.tif 000044
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数１０】
0005422101.tif 000045
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数１１】
0005422101.tif 000046
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数１２】
0005422101.tif 000047
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数１３】
0005422101.tif 000048
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数１４】
0005422101.tif 000049
を含む軽鎖可変領域
からなる群より選択される軽鎖可変領域
を含み、Ｘは任意のアミノ酸である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１６】
アミノ酸配列
【数３】
0005422101.tif 000050
を含む重鎖可変領域と、以下：
アミノ酸配列
【数７】
0005422101.tif 000051
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数８】
0005422101.tif 000052
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数９】
0005422101.tif 000053
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数１０】
0005422101.tif 000054
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数１１】
0005422101.tif 000055
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数１２】
0005422101.tif 000056
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数１３】
0005422101.tif 000057
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数１４】
0005422101.tif 000058
を含む軽鎖可変領域
からなる群より選択される軽鎖可変領域
を含み、Ｘは任意のアミノ酸である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１７】
アミノ酸配列
【数４】
0005422101.tif 000059
を含む重鎖可変領域と、以下：
アミノ酸配列
【数７】
0005422101.tif 000060
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数８】
0005422101.tif 000061
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数９】
0005422101.tif 000062
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数１０】
0005422101.tif 000063
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数１１】
0005422101.tif 000064
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数１２】
0005422101.tif 000065
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数１３】
0005422101.tif 000066
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数１４】
0005422101.tif 000067
を含む軽鎖可変領域
からなる群より選択される軽鎖可変領域
を含み、Ｘは任意のアミノ酸である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１８】
アミノ酸配列
【数５】
0005422101.tif 000068
を含む重鎖可変領域と、以下：
アミノ酸配列
【数７】
0005422101.tif 000069
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数８】
0005422101.tif 000070
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数９】
0005422101.tif 000071
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数１０】
0005422101.tif 000072
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数１１】
0005422101.tif 000073
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数１２】
0005422101.tif 000074
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数１３】
0005422101.tif 000075
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数１４】
0005422101.tif 000076
を含む軽鎖可変領域
からなる群より選択される軽鎖可変領域
を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１９】
アミノ酸配列
【数６】
0005422101.tif 000077
を含む重鎖可変領域と、以下：
アミノ酸配列
【数７】
0005422101.tif 000078
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数８】
0005422101.tif 000079
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数９】
0005422101.tif 000080
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数１０】
0005422101.tif 000081
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数１１】
0005422101.tif 000082
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数１２】
0005422101.tif 000083
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数１３】
0005422101.tif 000084
を含む軽鎖可変領域、
アミノ酸配列
【数１４】
0005422101.tif 000085
を含む軽鎖可変領域
からなる群より選択される軽鎖可変領域
を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２０】
Ｋａｂａｔの番号付けを使用して、少なくとも１つのＸが、配列番号２または４における対応する同じ位置のアミノ酸と同じである、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２１】
Ｋａｂａｔの番号付けを使用して、少なくとも１つのＸが、ヒト抗体配列内の対応する同じ位置のアミノ酸である、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２２】
Ｋａｂａｔの番号付けを使用して、少なくとも１つのＸが、ヒトコンセンサス抗体配列内の対応する同じ位置のアミノ酸である、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２３】
前記ヒト抗体配列が、ヒトコンセンサス配列、ヒト生殖細胞系配列、ヒトコンセンサス生殖細胞系配列、またはＫａｂａｔにおけるヒト抗体配列のいずれか１つである、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２４】
配列番号１１４、１１６または１１９に記載の重鎖配列のいずれか１つと、配列番号４５、４７、４８、５１、５３または１３６に記載の軽鎖配列のいずれか１つを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２５】
配列番号４１または４３に記載の重鎖可変領域配列のいずれか１つと、配列番号４５、４７、４８、５１、５３または１３６に記載の軽鎖配列のいずれか１つを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２６】
配列番号１１４に記載の重鎖配列および配列番号４７に記載の軽鎖配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項２７】
配列番号１１６に記載の重鎖配列および配列番号４７に記載軽鎖配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項２８】
配列番号１１９に記載の重鎖配列および配列番号４７に記載の軽鎖配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項２９】
配列番号４１または４３に記載の可変重鎖アミノ酸配列と少なくとも９０％同一である可変重鎖アミノ酸配列を含む、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３０】
配列番号４５、４７、４８、５１または５３に記載の可変軽鎖アミノ酸配列と少なくとも９０％同一である可変軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３１】
配列番号１２０または１２１からなるＭ−ＣＳＦのエピトープに結合するインタクトな非マウス抗体、または、該インタクトな非マウス抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメントであって、該抗体は、請求項１４〜１９、２４、２５または２９のいずれか１項に記載の重鎖および請求項１４〜１９、２４、２５または３０のいずれか１項に記載の軽鎖を含み、ここで、該抗体は、少なくとも１０−９Ｍまたはそれより高い、配列番号９のＭ−ＣＳＦに対する親和性Ｋｄを保持し、そして、該抗体は、ヒトＭ−ＣＳＦ活性を中和する、インタクトな非マウス抗体、または、そのＦ（ａｂ’）２フラグメント。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載の抗体の軽鎖をコードする核酸配列、および、配列番号１または配列番号４０もしくは４２に記載の重鎖ヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一である重鎖核酸配列を含む、単離核酸であって、ここで、該単離核酸は、少なくとも１０−９Ｍまたはそれより高い、配列番号９のＭ−ＣＳＦに対する親和性Ｋｄを保持する抗体であって、ヒトＭ−ＣＳＦ活性を中和する抗体をコードする、単離核酸。
【請求項３３】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載の抗体の重鎖をコードする核酸配列、および、配列番号３または配列番号４４、４６、５２、１３５もしくは１３７に記載の軽鎖ヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一である軽鎖核酸配列を含む、単離核酸であって、ここで、該単離核酸は、少なくとも１０−９Ｍまたはそれより高い、配列番号９のＭ−ＣＳＦに対する親和性Ｋｄを保持する抗体であって、ヒトＭ−ＣＳＦ活性を中和する抗体をコードする、単離核酸。
【請求項３４】
請求項３２〜３３のいずれか１項に記載の単離核酸を含む、ベクター。
【請求項３５】
前記単離核酸が、調節制御配列に作動可能に連結されている、請求項３４に記載のベクター。
【請求項３６】
請求項３５に記載のベクターまたは請求項３２〜３３のいずれか１項に記載の核酸を含む、宿主細胞。
【請求項３７】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載の抗体を産生するための方法であって、該方法は、
前記単離核酸が発現されて該抗体を産生するように請求項３６に記載の宿主細胞を培養する工程
を包含する、方法。
【請求項３８】
前記宿主細胞培養物から前記抗体を回収する工程
をさらに包含する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の方法によって産生される、単離抗体。
【請求項４０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体を分泌する、ハイブリドーマまたは宿主細胞。
【請求項４１】
毒素に結合体化している、請求項１〜３１または３９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４２】
請求項１〜３１または３９に記載の抗体のいずれか１つおよび
薬学的に適切なキャリア、賦形剤または希釈剤
を含む、薬学的組成物。
【請求項４３】
第二の治療薬をさらに含む、請求項４２に記載の薬学的組成物。
【請求項４４】
前記第二の治療薬が、癌化学療法薬である、請求項４３に記載の薬学的組成物。
【請求項４５】
前記第二の治療薬が、ビスホスホネートである、請求項４３に記載の薬学的組成物。
【請求項４６】
前記ビスホスホネートが、ゼレドロネート、パミドロネート、クロドロネート、エチドロネート、チルンドロネート、アレンドロネートまたはイバンドロネートである、請求項４５に記載の薬学的組成物。
【請求項４７】
前記第二の治療薬が、別の抗体である、請求項４３に記載の薬学的組成物。
【請求項４８】
骨溶解を引き起こす疾患または骨溶解に寄与する疾患に罹患している被験体を予防するための、請求項１〜１９または２１のいずれか１項に記載のＭ−ＣＳＦに結合する抗体であって、該抗体は、該疾患に関連する骨損失の重篤度を有効に低下させる、抗体。
【請求項４９】
骨溶解を引き起こす疾患または骨溶解に寄与する疾患に罹患している被験体を処置するための、請求項１〜３１または３９のいずれか１項に記載のＭ−ＣＳＦに結合する抗体であって、該抗体は、該疾患に関連する骨損失の重篤度を有効に低下させる、抗体。
【請求項５０】
骨溶解を引き起こす疾患または骨溶解に寄与する疾患に罹患している被験体において骨損失を予防または低減するための組成物であって、該組成物は、
請求項１〜３１または３９のいずれか１項に記載の抗体
を含む、組成物。
【請求項５１】
骨溶解を引き起こす疾患または骨溶解に寄与する疾患に罹患している被験体を治療するための組成物であって、該組成物は、
請求項１〜３１または３９のいずれか１項に記載の抗体
を含む、組成物。
【請求項５２】
骨への転移癌を予防または処置するための組成物であって、該組成物は、
請求項１〜３１または３９のいずれか１項に記載の抗体
を含む、組成物。
【請求項５３】
癌を処置する必要がある被験体において癌を処置するための組成物であって、該組成物は、
請求項１〜３１または３９のいずれか１項に記載の抗体
を含む、組成物。
【請求項５４】
前記組成物が第二の治療薬と組み合わせて投与されることを特徴とする、請求項５０〜５３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５５】
前記第二の治療薬が、癌化学療法薬である、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
前記第二の治療薬が、非Ｍ−ＣＳＦコロニー刺激因子、または抗ＲＡＮＫＬ抗体、または可溶性ＲＡＮＫＬレセプターである、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５７】
前記第二の治療薬が、ビスホスホネートである、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５８】
前記ビスホスホネートが、ゼレドロネート、パミドロネート、クロドロネート、エチドロネート、チルンドロネート、アレンドロネートまたはイバンドロネートである、請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
前記被験体が、ビスホスホネート処置の受容を妨げられることを特徴とする、請求項５７または５８に記載の組成物。
【請求項６０】
前記抗体が、治療効果を達成するために必要とされる第二の治療薬の投薬量の低減に有効である、請求項５４〜５９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６１】
前記被験体が、哺乳動物である、請求項５０〜６０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６２】
前記組成物が、腫瘍細胞により誘導される破骨細胞増殖および／または分化の抑制に有効な量で投与されることを特徴とする、請求項５０〜６０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６３】
前記組成物が、２μｇ／ｋｇ体重〜３０ｍｇ／ｋｇ体重の間の用量で投与されることを特徴とする、請求項５０〜６２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６４】
前記組成物が、０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜３０ｍｇ／ｋｇ体重の間の用量で投与されることを特徴とする、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６５】
前記組成物が、０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の間の用量で投与されることを特徴とする、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６６】
骨溶解を示している患者において骨損失を予防または低減するための医薬の製造における、請求項１〜３１または３９のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項６７】
骨溶解を引き起こす疾患または骨溶解に寄与する疾患に罹患している患者を処置するための医薬の製造における、請求項１〜３１または３９のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項６８】
転移癌を罹患している患者において骨転移癌を処置または予防するための医薬の製造における、請求項１〜３１または３９のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項６９】
癌に罹患している患者を処置するための医薬の製造における、請求項１〜３１または３９のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項７０】
前記医薬が、第二の治療薬を使用する処置と協調することを特徴とする、請求項６６〜６９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７１】
前記第二の治療薬が、癌化学療法薬である、請求項７０に記載の使用。
【請求項７２】
前記第二の治療薬が、非Ｍ−ＣＳＦコロニー刺激因子、または抗ＲＡＮＫＬ抗体、または可溶性ＲＡＮＫＬレセプターである、請求項７０に記載の使用。
【請求項７３】
前記第二の治療薬が、ビスホスホネートである、請求項７０に記載の使用。
【請求項７４】
前記ビスホスホネートが、ゼレドロネート、パミドロネート、クロドロネート、エチドロネート、チルンドロネート、アレンドロネートまたはイバンドロネートである、請求項７３に記載の使用。
【請求項７５】
前記患者が、ビスホスホネート処置の受容を妨げられることを特徴とする、請求項７３または７４に記載の使用。
【請求項７６】
前記患者が、前記第二の治療薬での前処置を受けていることを特徴とする、請求項６６〜６９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７７】
前記第二の治療薬が、癌化学療法薬である、請求項７６に記載の使用。
【請求項７８】
前記第二の治療薬が、非Ｍ−ＣＳＦコロニー刺激因子、または抗ＲＡＮＫＬ抗体、または可溶性ＲＡＮＫＬレセプターである、請求項７６に記載の使用。
【請求項７９】
前記第二の治療薬が、ビスホスホネートである、請求項７６に記載の使用。
【請求項８０】
前記ビスホスホネートが、ゼレドロネート、パミドロネート、クロドロネート、エチドロネート、チルンドロネート、アレンドロネートまたはイバンドロネートである、請求項７９に記載の使用。
【請求項８１】
前記患者が、ビスホスホネート処置の受容を妨げられることを特徴とする、請求項７９または８０に記載の使用。
【請求項８２】
前記医薬中の抗体の量が、腫瘍細胞によって誘導される破骨細胞増殖および／または分化を阻害するために有効である、請求項６６〜８１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８３】
前記医薬中の抗体の量が、２μｇ／ｋｇ体重〜３０ｍｇ／ｋｇ体重の間の用量である、請求項６６〜８２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８４】
前記医薬中の抗体の量が、０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜３０ｍｇ／ｋｇ体重の間の用量である、請求項８３に記載の使用。
【請求項８５】
前記医薬中の抗体の量が、０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の間の用量である、請求項８４に記載の使用。
【請求項８６】
キットであって、該キットは、
バイアルまたは瓶などの容器にパッケージされた、治療有効量の請求項１〜３１または３９のいずれか１項に記載の抗体
を備え、そして
該容器に貼り付けられたかまたは該容器に共にパッケージされた、ラベル
をさらに備え、該ラベルは、該容器の内容物を表示し、そして骨損失を予防または低減するための該容器の内容物の使用に関する指示および／または指図を提供する、キット。
【請求項８７】
キットであって、該キットは、
バイアルまたは瓶などの容器にパッケージされた、治療有効量の請求項１〜３１または３９のいずれか１項に記載の抗体
を備え、そして
該容器に貼り付けられたかまたは該容器に共にパッケージされた、ラベル
をさらに備え、該ラベルは、該容器の内容物を表示し、そして骨溶解を引き起こす疾患または骨溶解に寄与する疾患に罹患している患者に対する該容器の内容物の使用に関する指示および／または指図を提供する、キット。
【請求項８８】
キットであって、該キットは、
バイアルまたは瓶などの容器にパッケージされた、治療有効量の請求項１〜３１または３９のいずれか１項に記載の抗体
を備え、そして
該容器に貼り付けられたかまたは該容器に共にパッケージされたラベル
をさらに備え、該ラベルは、該容器の内容物を表示し、そして骨転移癌を予防または処置するための該容器の内容物の使用に関する指示および／または指図を提供する、キット。
【請求項８９】
キットであって、該キットは、
バイアルまたは瓶などの容器にパッケージされた、治療有効量の請求項１〜３１または３９のいずれか１項に記載の抗体
を備え、そして
該容器に貼り付けられたかまたは該容器に共にパッケージされた、ラベル
をさらに備え、該ラベルは、該容器の内容物を表示し、そして癌を処置するための該容器の内容物の使用に関する指示および／または指図を提供する、キット。
【請求項９０】
第二の治療薬をさらに備える、請求項８６〜８９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項９１】
前記第二の治療薬が、癌化学療法薬である、請求項９０に記載のキット。
【請求項９２】
前記第二の治療薬が、非Ｍ−ＣＳＦコロニー刺激因子、または抗ＲＡＮＫＬ抗体、または可溶性ＲＡＮＫＬレセプターである、請求項９０に記載のキット。
【請求項９３】
前記第二の治療薬が、ビスホスホネートである、請求項９０に記載のキット。
【請求項９４】
前記ビスホスホネートが、ゼレドロネート、パミドロネート、クロドロネート、エチドロネート、チルンドロネート、アレンドロネートまたはイバンドロネートである、請求項９３に記載のキット。
【請求項９５】
ビスホスホネート処置の受容を妨げられた患者を処置するための指図を備える、請求項８６〜９４のいずれかに記載のキット。
【請求項９６】
治療効果を達成するために必要とされる第二の治療薬の投薬量の低減に有効な用量の抗体を備える、請求項８６〜９５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項９７】
腫瘍細胞によって誘導される破骨細胞増殖および／または分化を阻害するために有効な用量の抗体を備える、請求項８６〜９５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項９８】
２μｇ／ｋｇ体重〜３０ｍｇ／ｋｇ体重の間の用量の抗体を備える、請求項８６〜９７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項９９】
０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜３０ｍｇ／ｋｇ体重の間の用量の抗体を備える、請求項９８に記載のキット。
【請求項１００】
０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の間の用量の抗体を備える、請求項９９に記載のキット。
【請求項１０１】
請求項１に記載のＭ−ＣＳＦ特異的抗体についてスクリーニングするインビトロの方法であって、該方法は、
ａ）配列番号１２０または１２１を含むＭ−ＣＳＦのエピトープに対する候補抗体の結合を検出する工程；
ｂ）該Ｍ−ＣＳＦに対する候補抗体の結合親和性をスクリーニングする工程；
ｃ）転移性腫瘍細胞培地、破骨細胞および候補抗体を接触させる工程；
ｄ）破骨細胞の形成、増殖および／または分化を検出する工程；ならびに
ｅ）破骨細胞の形成、増殖および／または分化の減少が検出された場合に、該候補抗体をＭ−ＣＳＦ特異的抗体と同定する工程
を包含する、方法。
【請求項１０２】
前記転移性腫瘍細胞培地が、腫瘍細胞を含む、請求項１０１に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０３】
前記候補抗体が、Ｍ−ＣＳＦに結合するかどうかを決定する工程をさらに包含する、請求項１０１〜１０２に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０４】
前記候補抗体が、Ｍ−ＣＳＦとそのレセプターＭ−ＣＳＦＲとの間の相互作用を阻害するかどうかを決定する工程
をさらに包含する、請求項１０１〜１０３に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００４年１月７日に出願された米国仮特許出願番号第６０／５３５，１８１号、および２００４年６月２日に出願された同第６０／５７６，４１７号の優先権を主張し、これらそれぞれは、その全体が参照として本明細書中に援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、Ｍ−ＣＳＦ特異的抗体を被験体に投与することによる、骨溶解、癌転移および癌転移に関連する骨損失を予防および処置するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
癌転移は、癌患者における術後または治療後再発の主因である。治療法を開発する徹底した努力にもかかわらず、癌転移は、実質的に治療が難しいままである。骨は、ヒトの様々なタイプの癌（例えば、乳癌、肺癌、前立腺癌および甲状腺癌）の最も一般的な転移部位の一つである。溶骨性骨転移の発生により、難治性疼痛、高骨折罹病率、神経圧迫および高カルシウム血症に起因して重篤な病的状態が生じる。これらの臨床的問題の重要性にもかかわらず、癌転移に関連する骨損失に利用できる治療は、ほとんどない。
【０００４】
破骨細胞は、骨吸収を媒介する。破骨細胞は、造血細胞から分化する多核細胞である。不完全細胞分裂ではなく、骨髄における造血幹細胞由来の単核前駆体の融合によって破骨細胞が形成されることは、一般に認められている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）。それらは、単核細胞−マクロファージ系細胞と共通の幹細胞を共有している（非特許文献８，非特許文献９）。破骨細胞前駆体の成熟多核破骨細胞への分化には、ホルモン刺激および局所刺激をはじめとする種々の因子が必要であり（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献７；非特許文献１２）、生きている骨および骨細胞が破骨細胞の発生に重要な役割を果たすことは証明されている（非特許文献１３）。破骨細胞の分化には、骨芽細胞または骨髄間質細胞も必要である。破骨細胞形成を支援するこれらの細胞によって生産される因子の一つが、マクロファージコロニー刺激因子、Ｍ−ＣＳＦである（非特許文献１４；非特許文献１５）。ＮＦ−κＢリガンドのレセプターアクチベータ（ＲＡＮＫＬ；ＴＲＡＮＣＥ、ＯＤＦおよびＯＰＧＬとしても知られている）は、もう一つのシグナルであり（非特許文献４）、これは、骨芽細胞／間質細胞が、破骨細胞および破骨細胞前駆体上の位置するレセプター、ＲＡＮＫ（ＴＲＡＮＣＥＲ）により破骨細胞の形成および吸収を刺激するシグナルである（非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１）。骨芽細胞は、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ；ＯＣＩＦとしても知られている）と呼ばれる破骨細胞形成を強力に抑制するタンパク質も分泌し、これが、ＲＡＮＫおよびＲＡＮＫＬによる破骨細胞と骨芽細胞の間の正のシグナルを阻害するようにＲＡＮＫＬのおとりレセプターとして作用する。
【０００５】
破骨細胞は、無機と有機、両方の骨基質の溶解の原因となる（非特許文献２２）。破骨細胞は、特定の膜領域ならびに幾つかの膜および細胞質マーカー、例えば酒石酸抵抗性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９７９）、炭酸脱水酵素ＩＩ（非特許文献２３）、カルシトニンレセプター（非特許文献２４）およびビトロネクチンレセプター（非特許文献２５）を有する独特の分極形態を発現する最終分化細胞の代表である。多核破骨細胞は、通常は核を１０未満含有するが、直径が１０μｍと１００μｍの間の核を１００まで含有することができる（非特許文献２）。このことによりそれらを比較的容易に光学顕微鏡で同定することができる。それらは、活性状態にあるときには非常に多くの空胞を有し、また多数のミトコンドリアを含有し、これは高い代謝率を示す（非特許文献２６）。破骨細胞は、溶骨性骨転移において主要な役割を果たすため、破骨細胞の刺激および機能を抑制するための新規薬剤および方法が、当該技術分野において必要とされている。
【非特許文献１】Ｃｈａｍｂｅｒｓ、Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８９年６：ｐ．１−２５
【非特許文献２】Ｇｏｅｔｈｌｉｎｇら、Ｃｌｉｎ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｌａｔ  Ｒ．，１９７６年１２０：ｐ．２０１−２２８
【非特許文献３】Ｋａｈｎら、Ｎａｔｕｒｅ，１９７５年  ２５８：ｐ．３２５−３２７
【非特許文献４】Ｓｕｄａら、Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ，１９９２年  １３：ｐ．６６−８０
【非特許文献５】Ｗａｌｋｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９７３年  １８０：ｐ．８７５
【非特許文献６】Ｗａｌｋｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９７５年  １９０：ｐ．７８５−７８７
【非特許文献７】Ｗａｌｋｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９７５年  １９０：ｐ．７８４−７８５
【非特許文献８】Ａｓｈら、Ｎａｔｕｒｅ，１９８０年  ２８３：ｐ．６６９−６７０
【非特許文献９】Ｋｅｒｂｙら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ，１９９２年  ７：ｐ．３５３−６２
【非特許文献１０】Ａｔｈａｎａｓｏｕら、Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ，１９８８年  ３：ｐ．３１７−３３３
【非特許文献１１】Ｆｅｌｄｍａｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１９８０年  １０７：ｐ．１１３７−１１４３
【非特許文献１２】Ｚｈｅｎｇら、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｊ，１９９１年  ２３：ｐ．１８０−１８８
【非特許文献１３】Ｈａｇｅｎａａｒｓら、Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ，１９８９年  ６：ｐ．１７９−１８９
【非特許文献１４】Ｗｉｋｔｏｒ−Ｊｅｄｒｚｅｊｃｚａｋら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１９９０年  ８７：ｐ．４８２８−４８３２
【非特許文献１５】Ｙｏｓｈｉｄａら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９０年  ３４５：ｐ．４４２−４４４
【非特許文献１６】Ｌａｃｅｙら、Ｃｅｌｌ，１９９８年  ９３：ｐ．１６５−１７６
【非特許文献１７】Ｔｓｕｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏ，１９９７年  ２３４：ｐ．１３７−１４２
【非特許文献１８】Ｗｏｎｇら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，１９９７年  １８６：ｐ．２０７５−２０８０
【非特許文献１９】Ｗｏｎｇら、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１９９７年  ２７２：ｐ．２５１９０−２５１９４
【非特許文献２０】Ｙａｓｕｄａら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１９９８年  １３９：ｐ．１３２９−１３３７
【非特許文献２１】Ｙａｓｕｄａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳ，１９９８年  ９５：ｐ．３５９７−３６０２
【非特許文献２２】Ｂｌａｉｒら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１９８６年  １０２：ｐ．１１６４−１１７２
【非特許文献２３】Ｖａｅａｅｎａｅｎｅｎら、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８３年  ７８：ｐ．４８１−４８５
【非特許文献２４】Ｗａｒｓｈａｆｓｋｙら、Ｂｏｎｅ，１９８５年  ６：ｐ．１７９−１８５
【非特許文献２５】Ｄａｖｉｅｓら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１９８９年  １０９：ｐ．１８１７−１８２６
【非特許文献２６】Ｍｕｎｄｙ著「Ｐｒｉｍｅｒ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｂｏｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ」，１９９０年、ｐ．１８−２２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このように、溶骨性骨転移をはじめとする骨溶解または癌転移を予防または処置するための新規薬剤および方法の特定が、当該技術分野において必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明の材料および方法は、当該技術分野における上述および他の要求を満たすものである。本発明の一つの実施形態において、図４、１４および１５に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するマウスモノクローナル抗体ＲＸ１、ＭＣ１またはＭＣ３のうちのいずれか１つと同じＭ−ＣＳＦのエピトープに特異的に結合する、機能フラグメントを含む非マウスモノクローナル抗体を提供する。関連実施形態において、ポリクローナル抗体；Ｈｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体をはじめとするモノクローナル抗体；ヒト化抗体；ヒト抗体；キメラ抗体；Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＳｃＦｖもしくはＳＣＡ抗体フラグメント；ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）；線状抗体（ｌｉｎｅａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）またはこれらの抗体のうちのいずれか１つの突然変異タンパク質からなる群より選択される、好ましくは少なくとも１０−７、１０−８もしくは１０−９またはそれ以上の結合親和性を保持する上述の抗体を提供する。図４に記載のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体ＲＸ１、ＭＣ１および／またはＭＣ３と、７５％より多くＭ−ＣＳＦに結合することで競合する、機能フラグメントを含む非マウスモノクローナル抗体も考えられる。
【０００８】
別の実施形態において、機能フラグメントを含む非マウスモノクローナル抗体であって、図１２のアミノ酸９８〜１０５の少なくとも４、５、６、７または８つの連続する残基を含むＭ−ＣＳＦのエピトープと結合する非マウスモノクローナル抗体またはその機能フラグメントを提供する。
【０００９】
別の実施形態において、本発明は、機能フラグメントを含む非マウスモノクローナル抗体であって、図１２のアミノ酸６５〜７３または１３８〜１４４の少なくとも４、５、６、７または８つの連続する残基を含むＭ−ＣＳＦのエピトープ（５Ｈ４またはＭＣ３によって認識されるＭ−ＣＳＦエピトープに相当する）と結合する非マウスモノクローナル抗体またはその機能フラグメントを提供する。
【００１０】
さらに別の実施形態において、図１２のアミノ酸９８〜１０５を含むＭ−ＣＳＦのエピトープと結合する上述の抗体またはフラグメントを提供する。関連実施形態において、図４ＡのＣＤＲ３を含む上述の抗体を提供する。別の実施形態において、図４Ａに記載のマウス抗体ＲＸ１の少なくとも１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含む抗体を提供する。マウス抗体ＲＸ１の少なくとも１、２、３、４または５つのＣＤＲを含むそうした抗体は、図１６Ａ〜Ｂに記載の抗体５Ｈ４の６つのＣＤＲのいずれかのうち少なくとも１、２、３、４または５つのＣＤＲも含むこともできる。あるいは、マウス抗体ＲＸ１の少なくとも１、２、３、４または５つのＣＤＲを含む抗体は、図１６Ａ〜Ｂに記載の抗体ＭＣ１の６つのＣＤＲのいずれかのうち少なくとも１、２、３、４または５つのＣＤＲも含むこともできる。さらに別の代替では、上述の抗体は、図１６Ａ〜Ｂに記載の抗体ＭＣ３の６つのＣＤＲのいずれかのうち少なくとも１、２、３、４または５つのＣＤＲも含むこともできる。関連実施形態において、図１６Ａ〜Ｂに記載のコンセンサスＣＤＲセットのうち少なくとも１、２、３、４または５つのＣＤＲを含むことができる、マウス抗体ＲＸ１の少なくとも１、２、３、４または５つのＣＤＲを含む抗体を提供する。さらにもう一つの関連実施形態では、上述の抗体におけるコンセンサスＣＤＲの１つ以上の残基が、抗体マウスＲＸ１、５Ｈ４、ＭＣ１またはＭＣ３のＣＤＲのいずれかの対応する残基により置換されている。その抗体におけるアミノ酸の１つ以上が、例えばＣＤＲにおける保存的置換ならびに／または低および中リスク残基における保存的もしくは非保存的変更による突然変異を受けていたとしても、所望の結合親和性は保持され得る。
【００１１】
本発明の別の実施形態において、図４Ａ、１３、１４または１５に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％相同である可変重鎖アミノ酸配列を含む上述の抗体の変異体を提供する。関連実施形態において、図４Ａ、１３、１４または１５に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％相同である可変軽鎖アミノ酸配列を含む抗体を提供する。
【００１２】
さらに別の実施形態において、本抗体は、ヒト抗体配列の定常領域および１つ以上の重鎖および軽鎖可変フレームワーク領域を含む。関連実施形態において、本抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の修飾または非修飾定常領域を含む。好ましい実施形態において、この定常領域は、一定の特性を強化または低下させるように場合によっては修飾されていることがあるヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４である。ＩｇＧ１の場合、定常領域、特にヒンジまたはＣＨ２領域に対する修飾により、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性をはじめとするエフェクター機能を増加または低下させることができる。他の実施形態では、ＩｇＧ２定常領域を修飾して、抗体−抗原凝集体形成を減少させる。ＩｇＧ４の場合、定常領域、特にヒンジ領域に対する修飾により、半抗体の形成を減少させることができる。
【００１３】
本発明のさらにもうひとつの実施形態において、上述の抗体は、ヒトコンセンサス配列の一部、ヒト生殖細胞系配列、ヒトコンセンサス生殖細胞系配列、またはＫａｂａｔ，ＮＣＢＩ  Ｉｇ  Ｂｌａｓｔ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／ｓｈｏｗＧｅｒｍｌｉｎｅ．ｃｇｉ、  Ｋａｂａｔ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／ｓｅｑｔｅｓｔ．ｈｔｍｌ、  ＦＴＰ  ｓｉｔｅ  ｆｏｒ  Ｋａｂａｔ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ５．０（１９９２）ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ／ｋａｂａｔ／Ｒｅｌ５．０／、  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｄａｔａｂａｓｅ（Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ  Ｆｒａｎｃｅ）ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｎｕｓｃ．ｆｒ：８１０４／、  Ｖ−Ｂａｓｅ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ：ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ＬＩＳＴ．ｐｈｐ？ｍｅｎｕ＝９０１、  Ｚｕｒｉｃｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｚｈ．ｃｈ／〜ａｎｔｉｂｏｄｙ／Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ、Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＴＡＨＨＰ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／〜ｍｒｃ７／ｈｕｍａｎｉｓａｔｉｏｎ／ＴＡＨＨＰ．ｈｔｍｌ、  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｏｍａｉｎｓ  ｈｔｔｐ：／／ｈｏｗ．ｔｏ／ＡｎａｌｙｓｅＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ／、  Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｅｓｉｇｎ  ｈｔｔｐ：／／ｐｅｏｐｌｅ．ｃｒｙｓｔ．ｂｂｋ．ａｃ．ｕｋ／〜ｕｂｃｇ０７ｓ／、  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ．ｈｔｍｌ、  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ｂｙ  ＴＴ  Ｗｕ），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓにおけるヒト抗体配列のうちのいずれか１つに由来するもしくは基づくものであるか、それを含有する。
【００１４】
本発明の好ましい局面において、上述の抗体は、Ｈｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体である。例えば、Ｈｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体配列は、図２３〜２４に記載の配列のいずれか１つである。他のＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体またはそれらの変異体が、考えられる。
【００１５】
例えば、一つの実施形態において、重鎖可変領域が、アミノ酸配列
【００１６】
【数１７】
0005422101.tif 000002
（この場合、Ｘは、任意のアミノ酸である）を含む、上述のＲＸ１に基づく抗体を提供する。関連実施形態において、重鎖可変領域が、アミノ酸配列
【００１７】
【数１８】
0005422101.tif 000003
（この場合、Ｘは、任意のアミノ酸である）を含む、抗体を提供する。
【００１８】
本発明のさらに別の実施形態において、重鎖可変領域が、アミノ酸配列
【００１９】
【数１９】
0005422101.tif 000004
（この場合、Ｘは、任意のアミノ酸である）を含む、上述の抗体を提供する。関連実施形態において、重鎖可変領域が、アミノ酸配列
【００２０】
【数２０】
0005422101.tif 000005
（この場合、Ｘは、任意のアミノ酸である）を含む、抗体を提供する。さらに別の実施形態において、重鎖可変領域が、アミノ酸配列
【００２１】
【数２１】
0005422101.tif 000006
を含む、抗体を提供する。さらに別の実施形態において、重鎖可変領域が、アミノ酸配列
【００２２】
【数２２】
0005422101.tif 000007
を含む、抗体を提供する。
【００２３】
本発明の別の実施形態において、軽鎖可変領域が、アミノ酸配列
【００２４】
【数２３】
0005422101.tif 000008
（この場合、Ｘは、任意のアミノ酸である）を含む、上述の抗体を提供する。関連実施形態において、軽鎖可変領域が、アミノ酸配列
【００２５】
【数２４】
0005422101.tif 000009
（この場合、Ｘは、任意のアミノ酸である）を含む、抗体を提供する。さらに別の実施形態において、軽鎖可変領域が、アミノ酸配列
【００２６】
【数２５】
0005422101.tif 000010
（この場合、Ｘは、任意のアミノ酸である）を含む、抗体を提供する。
【００２７】
本発明の別の実施形態において、軽鎖可変領域が、アミノ酸配列
【００２８】
【数２６】
0005422101.tif 000011
（この場合、Ｘは、任意のアミノ酸である）を含む、上述の抗体を提供する。関連実施形態において、軽鎖可変領域が、アミノ酸配列
【００２９】
【数２７】
0005422101.tif 000012
（この場合、Ｘは、任意のアミノ酸である）を含む、抗体を提供する。さらに別の実施形態において、軽鎖可変領域が、アミノ酸配列
【００３０】
【数２８】
0005422101.tif 000013
を含む、抗体を提供する。
【００３１】
本発明のさらに別の実施形態において、軽鎖可変領域が、アミノ酸配列
【００３２】
【数２９】
0005422101.tif 000014
を含む、上述の抗体を提供する。別の実施形態において、軽鎖可変領域が、アミノ酸配列
【００３３】
【数３０】
0005422101.tif 000015
を含む、抗体を提供する。
【００３４】
本発明の別の実施形態において、少なくとも１つのＸが、図４Ａに記載のアミノ酸配列内の対応するアミノ酸である、上述の抗体を提供する。関連実施形態において、少なくとも１つのＸが、図４Ａに記載のアミノ酸配列内の対応するアミノ酸の保存的置換（表１のとおり）である、抗体を提供する。さらにもう一つの関連実施形態において、少なくとも１つのＸが、図４Ａに記載のアミノ酸配列内の対応するアミノ酸の非保存的置換（表１のとおり）である、抗体を提供する。本発明のさらに別の実施形態において、少なくとも１つのＸが、ヒト抗体配列内の対応するアミノ酸である、抗体を提供する。
【００３５】
上述のＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体は、ヒト抗体コンセンサス配列の一部、ヒト生殖細胞系配列、ヒトコンセンサス生殖細胞系配列、またはＫａｂａｔ，ＮＣＢＩ  Ｉｇ  Ｂｌａｓｔ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／ｓｈｏｗＧｅｒｍｌｉｎｅ．ｃｇｉ、  Ｋａｂａｔ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／ｓｅｑｔｅｓｔ．ｈｔｍｌ、  ＦＴＰ  ｓｉｔｅ  ｆｏｒ  Ｋａｂａｔ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ５．０（１９９２）ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ／ｋａｂａｔ／Ｒｅｌ５．０／、  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｄａｔａｂａｓｅ（Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ  Ｆｒａｎｃｅ）ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｎｕｓｃ．ｆｒ：８１０４／、  Ｖ−Ｂａｓｅ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ：ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ＬＩＳＴ．ｐｈｐ？ｍｅｎｕ＝９０１、  Ｚｕｒｉｃｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｚｈ．ｃｈ／〜ａｎｔｉｂｏｄｙ／Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ、Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＴＡＨＨＰ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／〜ｍｒｃ７／ｈｕｍａｎｉｓａｔｉｏｎ／ＴＡＨＨＰ．ｈｔｍｌ、  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｏｍａｉｎｓ  ｈｔｔｐ：／／ｈｏｗ．ｔｏ／ＡｎａｌｙｓｅＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ／、  Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｅｓｉｇｎ  ｈｔｔｐ：／／ｐｅｏｐｌｅ．ｃｒｙｓｔ．ｂｂｋ．ａｃ．ｕｋ／〜ｕｂｃｇ０７ｓ／、  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ．ｈｔｍｌ、  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ｂｙ  ＴＴ  Ｗｕ），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓにおけるヒト抗体配列のうちのいずれか１つに由来するもしくは基づくものであるか、それを含有する。
【００３６】
本発明の別の実施形態において、Ｈｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体配列が、図２３〜２４または２９〜３０に示す配列のうちの一つである、上述の抗体を提供する。別の実施形態において、本抗体は、図１９Ｂに記載の重鎖アミノ酸配列の１つと少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である可変重鎖アミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態において、本抗体は、図２０Ｂ〜２２Ｂのいずれか１項に記載の軽鎖アミノ酸配列の１つと少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である可変軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００３７】
さらに別の実施形態において、図２４Ｃ〜２４Ｅのうちの１つに記載する配列を有する上述の抗体、例えば５Ｈ４、ＭＣ１またはＭＣ３抗体は、低、中または高リスク残基を特定するために図２４Ｃ〜２４Ｅに記載のＫａｂａｔの番号付けを使用し、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａらの米国特許第５，７６６，８８６号および本明細書の実施例４Ａに記載の方法に従って、Ｈｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭされる。関連実施形態において、重鎖もしくは軽鎖のいずれかまたは両方の全ての低リスク残基が、必要に応じてヒト標準免疫グロブリン配列と同じ残基になるように修飾される、上述の抗体を提供する。同様に、本発明のもう一つの実施形態は、重鎖もしくは軽鎖のいずれかまたは両方の全ての低＋中リスク残基が、必要に応じてヒト標準免疫グロブリン配列と同じ配列になるように修飾される、上述の抗体を提供する。全ての低リスク残基が修飾されている重鎖を、全ての低および中リスク残基が修飾されている軽鎖と組み合わせることができ、その逆も可能である。同様に、上述のＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ軽鎖または重鎖を、ヒト化抗体またはキメラ抗体の軽鎖または重鎖と組み合わせることができる。
【００３８】
さらに別の実施形態において、本抗体は、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ法に従ってＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭしたすぐ上に記載の重鎖アミノ酸配列のうちの１つと少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である可変重鎖アミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態において、本抗体は、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ法に従ってＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭしたすぐ上に記載の軽鎖アミノ酸配列のうちの１つと少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である可変軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００３９】
さらに別の実施形態において、上に記載したような重鎖および上に記載したような軽鎖を含む抗体を提供する。
【００４０】
本発明のさらに別の実施形態において、上述の抗体は、少なくとも１０［−７］の親和性Ｋｄを有する。関連実施形態において、この抗体は、少なくとも１０［−９］の親和性Ｋｄを有する。
【００４１】
本発明の別の実施形態において、ポリクローナル抗体；Ｈｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体をはじめとするモノクローナル抗体；ヒト化抗体；ヒト抗体；キメラ抗体；Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＳｃＦｖもしくはＳＣＡ抗体フラグメント；ダイアボディ；線状抗体（ｌｉｎｅａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）；またはこれらの抗体のうちのいずれか１つの突然変異タンパク質である上述の抗体を提供する。関連実施形態において、前記モノクローナル抗体は、単離抗体である。
【００４２】
本発明のさらに別の実施形態において、上述の抗体の軽鎖をコードする核酸配列を含む単離核酸を提供する。関連実施形態において、前記単離核酸は、図４Ａ、１３、１４または１５に記載の重鎖ヌクレオチド配列と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である重鎖核酸配列を含む。さらにもう一つの関連実施形態において、前記単離核酸は、図４Ａ、１３、１４または１５に記載の軽鎖ヌクレオチド配列と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である軽鎖核酸配列を含む。
【００４３】
別の実施形態において、上述の単離核酸を含むベクターを提供する。関連実施形態において、単離核酸が、調節コントロール配列に作動可能に連結されている、上述のベクターを提供する。さらに別の実施形態において、上述のベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００４４】
本発明では多数の方法が考えられる。例えば、単離核酸を発現して抗体を生産するように上述の宿主細胞を培養することを含む、上述の抗体の生産方法を提供する。関連実施形態において、本方法は、その宿主細胞培養物から抗体を回収する工程をさらに含む。関連実施形態において、上述の方法により生産された単離抗体を提供する。
【００４５】
本発明は、上述の抗体を分泌するハイブリドーマも提供する。加えて、毒素に結合体化している上述の抗体を提供する。
【００４６】
本発明の別の実施形態において、上述の抗体のいずれか１つおよび薬学的に適切なキャリア、賦形剤または希釈剤を含む、薬学的組成物を提供する。関連実施形態において、前記薬学的組成物は、第二の治療薬をさらに含む。さらにもう一つの関連実施形態において、前記第二の治療薬が癌化学療法薬である薬学的組成物を提供する。さらにもう一つの関連実施形態において、前記第二の治療薬がビスホスホネートである薬学的組成物を提供する。別の実施形態において、前記第二の治療薬は、別の抗体である。
【００４７】
本発明の抗体は、疾病および疾患の処置のために多数の望ましい特性を有すると考えられる。本発明の一つの実施形態において、骨溶解を引き起こすか、または骨溶解に寄与する疾病に罹患している被験体を予防するための、Ｍ−ＣＳＦに結合する上述の抗体のうちの一つであって、前記疾病に関連する骨損失の重篤度を有効に低下させる抗体を提供する。同様に、骨溶解を引き起こすか、または骨溶解に寄与する疾病に罹患している被験体を処置するための、Ｍ−ＣＳＦに結合する上述の抗体のうちの一つであって、前記疾病に関連する骨損失の重篤度を有効に低下させる抗体を提供する。
【００４８】
多数の疾病および疾患が、本発明の抗体に基づく処置の対象となると考えられる。本発明の一つの実施形態において、前記疾病が、内分泌障害（副腎皮質機能亢進、性機能亢進、原発性もしくは続発性副甲状腺機能亢進、甲状腺機能亢進）、高カルシウム血症、欠乏状態（くる病／骨軟化症、壊血病、栄養失調）、慢性疾患（吸収不良症候群、慢性腎不全（腎性骨形成異常）、慢性肝疾患（肝性骨形成異常））、薬物（糖質コルチコイド（糖質コルチコイド誘導骨粗しょう症）、ヘパリン、アルコール）および遺伝性疾患（骨形成不全、ホモシスチン尿症）、癌、骨粗しょう症、大理石骨病、関節炎および関節リウマチに関連する骨の炎症、歯周病、線維性形成異常ならびに／またはパジェット病をはじめとする、破骨細胞活性の相対的増大に関連する代謝性骨疾患からなる群より選択される、上述の抗体を提供する。
【００４９】
関連実施形態において、骨転移癌を予防または処置するための、Ｍ−ＣＳＦに結合する抗体であって、前記転移性癌が、乳癌、肺癌、腎癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、血液細胞悪性疾患（白血病またはリンパ腫を含む）；頭頚部癌；胃腸癌（食道癌、胃癌、結腸癌、腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胆管または胆嚢の癌を含む）；女性生殖管の悪性疾患（卵巣癌、子宮内膜癌、膣癌または子宮頚癌を含む）；膀胱癌；脳の癌（神経芽細胞種を含む）；肉腫、骨肉腫；ならびに皮膚癌（悪性黒色腫または扁平上皮癌を含む）である、上述の抗体を提供する。
【００５０】
本発明の別の実施形態において、転移性腫瘍細胞培地、破骨細胞および候補抗体を接触させる工程；破骨細胞形成、増殖および／または分化を検出する工程；ならびに破骨細胞形成、増殖および／または分化の減少が検出された場合に前記候補抗体をＭ−ＣＳＦ特異的抗体と特定する工程を含む、Ｍ−ＣＳＦ特異的抗体のスクリーニング方法を提供する。同様に、前記転移性腫瘍細胞培地が腫瘍細胞を含む、上述の方法を提供する。
【００５１】
別の実施形態において、前記接触工程（ａ）がインビボで行われ、前記検出工程（ｂ）が、骨転移のサイズおよび／または数の検出を含み、ならびに前記候補抗体が、骨転移のサイズおよび／または数の減少が観察された場合にＭ−ＣＳＦ特異的抗体と特定される、上述のスクリーニング方法を提供する。関連実施形態において、前記候補抗体が、Ｍ−ＣＳＦに結合するかどうかを判定する工程をさらに含む、上述の方法を提供する。同様に、本発明のもう一つの実施形態は、前記候補抗体が、Ｍ−ＣＳＦとそのレセプターＭ−ＣＳＦＲの間の相互作用を阻害するかどうかを判定する工程をさらに含む、上述の方法を提供する。
【００５２】
本発明の別の実施形態において、（ａ）図１２のアミノ酸９８〜１０５のうちの少なくとも４つの連続する残基を含むＭ−ＣＳＦのエピトープに対する候補抗体の結合を検出する工程；および（ｂ）骨転移癌を予防または処置する前記候補抗体の能力をインビトロまたはインビボでアッセイする工程を含む、骨転移癌を予防または処置することができるＭ−ＣＳＦ特異的抗体を特定する方法を提供する。
【００５３】
本発明の別の実施形態において、（ａ）図１２のアミノ酸６５〜７３または１３８〜１４４のうちの少なくとも４つの連続する残基を含むＭ−ＣＳＦのエピトープ（５Ｈ４またはＭＣ３により認識されるＭ−ＣＳＦエピトープに対応する）に対する候補抗体の結合を検出する工程；および（ｂ）骨転移癌を予防または処置する前記候補抗体の能力をインビトロまたはインビボでアッセイする工程を含む、骨転移癌を予防または処置することができるＭ−ＣＳＦ特異的抗体を特定する方法を提供する。
【００５４】
本発明の別の実施形態において、図１２のアミノ酸９８〜１０５を含むＭ−ＣＳＦのエピトープと結合する抗体のＣＤＲを変更する方法を提供し、この方法は、図４Ａに記載のアミノ酸配列のＣＤＲ内のアミノ酸を変更すること、および少なくとも１０［−７］の親和性ＫａでＭ−ＣＳＦと結合する抗体を選択することを含む。別の実施形態において、図４Ａに記載の重鎖アミノ酸配列の６０％以下を系統的に変更する方法を提供し、この方法は、アミノ酸配列
【００５５】
【数３１】
0005422101.tif 000016
内のＸ１〜Ｘ５２のいずれかを変更すること、およびその変更されたアミノ酸配列を含む抗体を、図１２のアミノ酸９８〜１０５を含むＭ−ＣＳＦのエピトープに対する結合について検査することを含む。
【００５６】
関連実施形態において、図４Ａに記載の軽鎖アミノ酸配列の６０％以下を系統的に変更する方法を提供し、この方法は、アミノ酸配列
【００５７】
【数３２】
0005422101.tif 000017
内のＸ１〜Ｘ５２のいずれかを変更すること、およびその変更されたアミノ酸配列を含む抗体を、図１２のアミノ酸９８〜１０５を含むＭ−ＣＳＦのエピトープに対する結合について検査することを含む。
【００５８】
さらに別の実施形態において、図１２のアミノ酸６５〜７３または１３８〜１４４を含むＭ−ＣＳＦのエピトープ（５Ｈ４またはＭＣ３により認識されるＭ−ＣＳＦエピトープに対応する）と結合する抗体のＣＤＲを変更する方法を提供し、この方法は、図１３、１４および１５に記載のアミノ酸配列のＣＤＲ内のアミノ酸を変更すること、および少なくとも１０［−７］の親和性ＫａでＭ−ＣＳＦと結合する抗体を選択することを含む。別の実施形態において、図１３、１４および１５のうちの１つに記載する重鎖アミノ酸配列の６０％以下を系統的に変更する方法を提供し、この方法は、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａらの米国特許第５，７６６，８８６号および本明細書の実施例４Ａに記載の方法に従って、および図２４Ｃ〜２４Ｅに記載のＫａｂａｔの番号付けに従って上述の配列を変更すること、ならびにその変更されたアミノ酸配列を含む抗体を、図１２のアミノ酸６５〜７３または１３８〜１４４を含むＭ−ＣＳＦのエピトープ（５Ｈ４またはＭＣ３により認識されるＭ−ＣＳＦエピトープに対応する）に対する結合について検査することを含む。関連実施形態では、全ての低リスク残基を修飾する。同様に、本発明のもう一つの実施形態では、全ての低および中リスク残基を修飾する。さらにもう一つの実施形態では、プロリンを除く全ての低および中リスク残基を修飾する。
【００５９】
本発明の別の実施形態において、上述のプロセスにより設計されたＣＤＲを有する抗体を発現する方法を提供する。別の実施形態において、ＭＣＳＦと結合する抗体であって、上述の方法を使用して作られる抗体を含む薬学的組成物を提供する。
【００６０】
本発明のさらに別の実施形態において、骨損失の予防または低減方法を提供し、この方法は、骨溶解を引き起こすか、または骨溶解に寄与する疾病に罹患している被験体に、治療有効量の上述の抗体のいずれか１つを投与すること、それによって前記疾病に関連する骨損失を予防または低減することを含む。関連実施形態において、骨溶解を引き起こすか、または骨溶解に寄与する疾病に罹患している被験体を処置する方法を提供し、この方法は、前記被験体に、治療有効量の上述の抗体のいずれか１つを投与すること、それによって前記疾病に関連した骨損失の重篤度を低下させることを含む。
【００６１】
関連実施形態において、前記疾病が、内分泌障害（副腎皮質機能亢進、性機能亢進、原発性もしくは続発性副甲状腺機能亢進、甲状腺機能亢進）、高カルシウム血症、欠乏状態（くる病／骨軟化症、壊血病、栄養失調）、慢性疾患（吸収不良症候群、慢性腎不全（腎性骨形成異常）、慢性肝疾患（肝性骨形成異常））、薬物（糖質コルチコイド（糖質コルチコイド誘導骨粗しょう症）、ヘパリン、アルコール）および遺伝性疾患（骨形成不全、ホモシスチン尿症）、癌、骨粗しょう症、大理石骨病、関節炎および関節リウマチに関連する骨の炎症、歯周病、線維性形成異常ならびに／またはパジェット病をはじめとする、破骨細胞活性の相対的増大に関連する代謝性骨疾患からなる群より選択される、上述の方法を提供する。
【００６２】
さらに別の実施形態において、骨転移癌を予防または処置する方法を提供し、この方法は、転移癌に罹患している被験体に、治療有効量の上述の抗体のいずれか１つを投与することを含む。関連実施形態において、前記転移癌が、乳癌、肺癌、腎癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、血液細胞悪性疾患（白血病もしくはリンパ腫を含む）；頭頚部癌、胃腸癌（食道癌、胃癌、結腸癌、腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胆管もしくは胆嚢の癌を含む）；女性生殖管の悪性疾患（卵巣癌、子宮内膜癌、膣癌もしくは子宮頚癌を含む）；膀胱癌；脳の癌（神経芽細胞種を含む）；肉腫、骨肉腫；または皮膚癌（悪性黒色腫もしくは扁平上皮癌を含む）である方法を提供する。
【００６３】
本発明のさらに別の実施形態において、骨損失および腫瘍成長を予防する方法を提供し、この方法は、治療有効量の上述の抗体のいずれか１つをその必要がある被験体に投与することを含む。関連実施形態において、前記方法は、第二の治療薬の投与をさらに含む。さらに別の実施形態において、前記第二の治療薬が、癌化学療法薬またはビスホスホネートである方法を提供する。さらにもう一つの関連実施形態において、前記ビスホスホネートが、ゼレドロネート、パミドロネート、クロドロネート、エチドロネート、チルンドロネート、アレンドロネートまたはイバンドロネートである方法を提供する。さらにもう一つの関連実施形態において、前記治療薬が細胞毒性化学療法薬である、上述の方法を提供する。別の実施形態において、前記被験体が、ビスホスホネート処置を受けられないようにする、上述の方法を提供する。
【００６４】
さらにもう一つの関連実施形態において、前記抗体が、治療効果を達成するために必要な第二の治療薬の投薬量の低減に有効である、上述の方法を提供する。別の実施形態において、前記第二の治療薬は、非Ｍ−ＣＳＦコロニー刺激因子、例えばＧ−ＣＳＦ、または抗ＲＡＮＫＬ抗体、または可溶性ＲＡＮＫＬレセプターである。
【００６５】
本発明の別の実施形態において、前記被験体が哺乳動物である、上述の方法を提供する。関連実施形態において、前記哺乳動物は、ヒトである。
【００６６】
別の実施形態において、前記抗体が、Ｍ−ＣＳＦとそのレセプター（Ｍ−ＣＳＦＲ）の間の相互作用を阻害する、上述の方法を提供する。もう一つの関連実施形態において、前記抗体は、腫瘍細胞によって誘導される破骨細胞増殖および／または分化を抑制する。さらに別の実施形態において、前記抗体が、約２μｇ／ｋｇ（体重）〜３０ｍｇ／ｋｇの間、０．１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇの間または０．１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇの間の用量で投与される、上述の方法を提供する。
【００６７】
本発明の別の実施形態において、骨溶解の症状を示している患者において骨損失を予防または低減するための医薬の製造、ならびに骨溶解を引き起こすか、または骨溶解に寄与する疾病に罹患している患者を処置するための医薬の製造における本発明の抗体の使用が考えられる。前記疾病が、内分泌障害（副腎皮質機能亢進、性機能亢進、原発性もしくは続発性副甲状腺機能亢進、甲状腺機能亢進を含む）、高カルシウム血症、欠乏状態（くる病／骨軟化症、壊血病、栄養失調を含む）、慢性疾患（吸収不良症候群、慢性腎不全（腎性骨形成異常を含む）、慢性肝疾患（肝性骨形成異常を含む）を含む）、薬物（糖質コルチコイド（糖質コルチコイド誘導骨粗しょう症）、ヘパリン、アルコールを含む）および遺伝性疾患（骨形成不全、ホモシスチン尿症を含む）、癌、骨粗しょう症、大理石骨病、関節炎および関節リウマチに関連する骨の炎症、歯周病、線維性形成異常ならびに／またはパジェット病をはじめとする、破骨細胞活性の相対的増大に関連する代謝性骨疾患からなる群より選択される、上述の使用がさらに考えられる。
【００６８】
別の実施形態において、転移癌に罹患している患者において骨転移癌を予防または処置するための医薬の製造における本発明の抗体の使用が考えられる。関連実施形態において、前記転移癌は、乳癌、肺癌、腎癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、血液細胞悪性疾患（白血病もしくはリンパ腫を含む）；頭頚部癌；胃腸癌（食道癌、胃癌、結腸癌、腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胆管もしくは胆嚢の癌を含む）；女性生殖管の悪性疾患（卵巣癌、子宮内膜癌、膣癌もしくは子宮頚癌を含む）；膀胱癌；脳の癌（神経芽細胞種を含む）；肉腫、骨肉腫；または皮膚癌（悪性黒色腫もしくは扁平上皮癌を含む）である。
【００６９】
さらに別の実施形態において、癌に罹患している患者を処置するための医薬の製造における本発明の抗体の使用が考えられる。
【００７０】
上述の使用のいずれかにおいて、前記医薬と、第二の治療薬を使用する処置とを協調させる。関連実施形態において、前記第二の治療薬は、化学療法薬である。関連実施形態において、前記第二の治療薬は、非Ｍ−ＣＳＦコロニー刺激因子、または抗ＲＡＮＫＬ抗体、または可溶性ＲＡＮＫＬレセプター、またはビスホスホネートである。関連実施形態において、前記ビスホスホネートは、ゼレドロネート、パミドロネート、クロドロネート、エチドロネート、チルンドロネート、アレンドロネートまたはイバンドロネートである。
【００７１】
本発明のさらに別の実施形態において、前記患者が、ビスホスホネート処置を受けられないようにする、および／または前記患者が、前記第二の治療薬での前処置を受けている、上述の使用が考えられる。関連実施形態において、前記第二治療は、癌化学療法薬、非Ｍ−ＣＳＦコロニー刺激因子、または抗ＲＡＮＫＬ抗体、または可溶性ＲＡＮＫＬレセプター、またはビスホスホネートである。さらにもう一つの関連実施形態において、前記ビスホスホネートは、ゼレドロネート、パミドロネート、クロドロネート、エチドロネート、チルンドロネート、アレンドロネートまたはイバンドロネートである。さらにもう一つの関連実施形態では、前記患者が、ビスホスホネート処置を受けられないようにする。
【００７２】
本発明の別の実施形態において、骨溶解の症状を示している患者を処置するための医薬であり、第二の治療薬を使用する処置と協調させる医薬を調製するための、本発明の抗体の相乗的組合せの使用が考えられる。関連実施形態において、前記第二治療は、癌化学療法薬、非Ｍ−ＣＳＦコロニー刺激因子、または抗ＲＡＮＫＬ抗体、または可溶性ＲＡＮＫＬレセプター、またはビスホスホネートである。関連実施形態において、前記ビスホスホネートは、ゼレドロネート、パミドロネート、クロドロネート、エチドロネート、チルンドロネート、アレンドロネートまたはイバンドロネートである。さらにもう一つの関連実施形態において、前記患者が、ビスホスホネート処置を受けられないようにする。
【００７３】
前記医薬中の抗体の量が、治療効果を達成するために必要な第二の治療薬の投薬量の低減に有効な用量でのものである、上述の使用のいずれかの実施形態が考えら得る。癌に関連する骨損失に関連する上述の実施形態のいずれかにおいて、前記医薬中の抗体の量は、好ましくは、腫瘍細胞によって誘導される破骨細胞増殖および／または分化の抑制に有効である。
【００７４】
上述の医薬のいずれかにおける抗体の量は、約２μｇ／ｋｇ（体重）〜３０ｍｇ／ｋｇの間であり得る。関連実施形態において、前記医薬中の抗体の量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ（体重）〜３０ｍｇ／ｋｇの間の用量でのものである。さらに別の実施形態において、前記医薬中の抗体の量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ（体重）〜１０ｍｇ／ｋｇの間の用量でのものである。
【００７５】
本発明は、キットも考えている。一つの実施形態において、バイアルまたは瓶などの容器にパッケージされた治療有効量の本発明の抗体を含み、ならびに前記容器に貼り付けられた、またはその容器に共にパッケージされたラベル（前記容器の内容物を表示し、骨損失を予防または低減するための前記容器の内容物の使用に関する指示および／または説示を提供するラベル）をさらに含むキットを提供する。
【００７６】
別の実施形態において、バイアルまたは瓶などの容器にパッケージされた治療有効量の本発明の抗体を含み、ならびに前記容器に貼り付けられた、またはその容器に共にパッケージされたラベル（前記容器の内容物を表示し、骨溶解を引き起こすか、または骨溶解に寄与する疾病に罹患している患者に対する前記容器の内容物の使用に関する指示および／または説示を提供するラベル）をさらに含むキットを提供する。
【００７７】
関連実施形態において、前記疾病が、内分泌障害（副腎皮質機能亢進、性機能亢進、原発性もしくは続発性副甲状腺機能亢進、甲状腺機能亢進を含む）、高カルシウム血症、欠乏状態（くる病／骨軟化症、壊血病、栄養失調を含む）、慢性疾患（吸収不良症候群、慢性腎不全（腎性骨形成異常を含む）、慢性肝疾患（肝性骨形成異常を含む）を含む）、薬物（糖質コルチコイド（糖質コルチコイド誘導骨粗しょう症）、ヘパリン、アルコールを含む）および遺伝性疾患（骨形成不全、ホモシスチン尿症を含む）、癌、骨粗しょう症、大理石骨病、関節炎および関節リウマチに関連する骨の炎症、歯周病、線維性形成異常ならびに／またはパジェット病をはじめとする、破骨細胞活性の相対的増大に関連する代謝性骨疾患からなる群より選択されるキットを提供する。
【００７８】
別の実施形態において、バイアルまたは瓶などの容器にパッケージされた治療有効量の本発明の抗体を含み、ならびに前記容器に貼り付けられた、またはその容器に共にパッケージされたラベル（前記容器の内容物を表示し、骨転移癌を予防または処置するための前記容器の内容物の使用に関する指示および／または説示を提供するラベル）をさらに含むキットを提供する。関連実施形態において、前記転移癌は、乳癌、肺癌、腎癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、血液細胞悪性疾患（白血病もしくはリンパ腫を含む）；頭頚部癌；胃腸癌（食道癌、胃癌、結腸癌、腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胆管もしくは胆嚢の癌を含む）；女性生殖管の悪性疾患（卵巣癌、子宮内膜癌、膣癌もしくは子宮頚癌を含む）；膀胱癌；脳の癌（神経芽細胞種を含む）；肉腫、骨肉腫；または皮膚癌（悪性黒色腫もしくは扁平上皮癌を含む）である。
【００７９】
さらに別の実施形態において、バイアルまたは瓶などの容器にパッケージされた治療有効量の本発明の抗体を含み、ならびに前記容器に貼り付けられた、またはその容器に共にパッケージされたラベル（前記容器の内容物を表示し、癌を処置するための前記容器の内容物の使用に関する指示および／または説示を提供するラベル）をさらに含むキットを提供する。
【００８０】
別の実施形態において、前記キットは、第二の治療薬をさらに含む。関連実施形態において、前記第二治療は、癌化学療法薬、非Ｍ−ＣＳＦコロニー刺激因子、または抗ＲＡＮＫＬ抗体、または可溶性ＲＡＮＫＬレセプター、またはビスホスホネートである。関連実施形態において、前記ビスホスホネートは、ゼレドロネート、パミドロネート、クロドロネート、エチドロネート、チルンドロネート、アレンドロネートまたはイバンドロネートである。さらに別の実施形態において、前記キットは、ビスホスホネート処置を受けられなくする患者を処置するための説示を含む。
【００８１】
別の実施形態において、治療効果を達成するために必要な第二の治療薬の投薬量の低減に有効な用量の抗体を含む上述のキットを提供する。別の実施形態において、前記キットは、相乗的用量の抗体を含む。さらに別の実施形態において、前記キットは、腫瘍細胞によって誘導される破骨細胞増殖および／または分化の抑制に有効な用量の抗体を含む。
【００８２】
本発明のさらに別の実施形態において、上述のキットは、約２μｇ／ｋｇ（体重）〜３０ｍｇ／ｋｇの間の用量の抗体を含む。別の実施形態において、前記キットは、約０．１ｍｇ／ｋｇ（体重）〜３０ｍｇ／ｋｇの間の用量の抗体を含む。さらに別の実施形態において、前記キットは、約０．１ｍｇ／ｋｇ（体重）〜１０ｍｇ／ｋｇの間の用量の抗体を含む。
【００８３】
本発明のさらに別の実施形態において、１つ以上の上述の抗体を含む医薬、および前記医薬を手術または放射線療法と併用すべきであるという説示を含む、パッケージ、バイアルまたは容器を提供する。別の実施形態において、被験体に上述の抗体のいずれか１つを投与する工程および手術または放射線療法で被験体を処置する工程を含む、骨転移癌の予防または処置方法を提供する。別の実施形態において、その表面に膜結合型Ｍ−ＣＳＦを発現する腫瘍細胞をターゲットにする方法を提供し、この方法は、放射線核種または他の毒素に結合体化している上述の抗体のいずれか１つを投与する工程を含む。さらに別の実施形態において、治療有効量の上述の抗体のいずれか１つを投与することを含む、癌に罹患している被験体の処置方法を提供する。
【００８４】
本発明のさらに別の実施形態において、骨損失を予防する方法を提供し、この方法は、骨溶解を引き起こすか、または骨溶解に寄与する疾病に罹患している被験体に、その被験体によって生産されるＭ−ＣＳＦの中和に有効な量で、癌細胞によって生産されるＭ−ＣＳＦの中和に有効な量より多い量の上述の抗体のいずれか１つを投与することを含む。関連実施形態において、骨溶解を引き起こすか、または骨溶解に寄与する疾病に罹患している被験体を処置する方法を提供し、この方法は、前記被験体に、その被験体によって生産されるＭ−ＣＳＦの中和に有効な量で、癌細胞によって生産されるＭ−ＣＳＦの中和に有効な量より多い量の上述の抗体のいずれか１つを投与することを含む。
【００８５】
本発明の一つの実施形態において、抗体ＲＸ１、５Ｈ４、ＭＣ１および／もしくはＭＣ３、または非マウスＲＸ１、５Ｈ４、ＭＣ１および／もしくはＭＣ３由来の抗体、またはＲＸ１、５Ｈ４、ＭＣ１および／もしくはＭＣ３競合抗体、ならびに癌治療薬を含む薬学的組成物を提供する。本発明の別の実施形態において、抗体ＲＸ１、５Ｈ４、ＭＣ１および／もしくはＭＣ３、または非マウスＲＸ１、５Ｈ４、ＭＣ１および／もしくはＭＣ３由来の抗体、またはＲＸ１、５Ｈ４、ＭＣ１および／もしくはＭＣ３競合抗体を含む医薬、ならびにその医薬を手術または放射線療法と併用すべきであるという説示を含む、パッケージ、バイアルまたは容器を提供する。
【００８６】
本発明のさらに別の実施形態において、上述の抗体のいずれか１つを投与する工程を含む、癌に罹患しており、その癌を含む細胞がＭ−ＣＳＦを分泌しない被験体を処置する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８７】
（詳細な説明）
転移する能力は、癌の明確な特徴である。転移は、身体の他の部分への癌細胞の拡大、またはこの拡大によって生じる状態を指す。転移は、細胞の遺伝物質の変化、原発性腫瘍を形成するように修飾された細胞の無制御増殖、その原発性腫瘍のための新たな血液補給の発達、その原発性腫瘍からの細胞による循環系の侵襲、身体の他の部分への原発腫瘍細胞の小凝塊の分散およびこれらの部位における続発性腫瘍の成長を含む、複合多工程プロセスである。
【００８８】
骨は、ヒト乳癌、肺癌、前立腺癌および甲状腺癌ならびに他の癌において最も一般的な転移部位であり、剖検では６０％にも上る癌患者に骨転移の罹患が見出せる。骨溶解性骨転移は、他の器官への転移には見られない独特な骨溶解性骨吸収工程を示す。癌転移に関連する骨損失は、破骨細胞（石灰化した組織を再吸収する能力を有する多核巨大細胞）により媒介され、これは、腫瘍産物により活性化されるようである。
【００８９】
コロニー刺激因子（ＣＳＦ−１）は、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）としても知られており、これは、破骨細胞形成に不可欠であることが判明した。加えて、Ｍ−ＣＳＦは、成熟破骨細胞の破骨機能を調節すること、他の可溶性因子と協力してそれらの移動およびそれらの生存を調節すること、ならびに骨芽細胞および線維芽細胞によりもたらされる細胞間相互作用を調節することが証明された（Ｆｉｘｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｌｏｒａｎ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １０：３−７，１９９８；  Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．ｉｎ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ８：１０７−２３（１９９８））。
【００９０】
完全長ヒトＭ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡは、アミノ酸数５５４の前駆タンパク質をコードしている。可変ｍＲＮＡスプライシングおよび差別的翻訳後タンパク分解プロセッシングにより、Ｍ−ＣＳＦは、プロテオグリカンを含有する糖タンパクもしくはコンドロイチン硫酸として血行へ分泌され得るか、Ｍ−ＣＳＦ生産細胞の表面において膜貫通型糖タンパクとして発現され得る。細菌により発現されたヒトＭ−ＣＳＦアミノ末端１５０アミノ酸（完全なインビボ生物活性に必要な最少配列）の三次元構造は、このタンパク質がジスルフィド連結型二量体であり、その各単量体は４つのアルファヘリックスの束と１つの非平行ベータシートから成ることを示唆している（Ｐａｎｄｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：１３５８−６２（１９９２））。３つの別個のＭ−ＣＳＦ種が、可変ｍＲＮＡスプライシングにより生産される。その３つのポリペプチド前駆体は、アミノ酸数２５６のＭ−ＣＦＳα、アミノ酸数５５４のＭ−ＣＳＦβおよびアミノ酸数４３８のＭ−ＣＳＦγである。Ｍ−ＣＳＦβは、膜結合形では発生しない分泌タンパク質である。Ｍ−ＣＳＦαは、タンパク分解性切断によってゆっくりと放出される膜内在性タンパク質として発現される。Ｍ−ＣＳＦαは、図１０に記載の配列のアミノ酸１９１〜１９７で切断される。膜結合形のＭ−ＣＳＦは、近接細胞上のレセプターと相互作用することができ、それにより特異的な細胞間接触を媒介する。用語「Ｍ−ＣＳＦ」は、図１２のアミノ酸３６〜４３８も包含し得る。
【００９１】
様々な形態のＭ−ＣＳＦが、ターゲット細胞上のそのレセプターＭ−ＣＳＦＲに結合することにより機能する。Ｍ−ＣＳＦＲは、５つの細胞外免疫グロブリン様ドメイン、１つの膜貫通ドメインおよび１つの細胞内分断Ｓｒｃ関連チロシンキナーゼドメインを有する膜貫通型分子である。Ｍ−ＣＳＦＲは、ｃ−ｆｍｓ癌原遺伝子によってコードされる。Ｍ−ＣＳＦＲの細胞外ドメインへのＭ−ＣＳＦの結合は、そのレセプターの二量体化を導き、これが、細胞質キナーゼドメインを活性化して、他の細胞タンパク質の自己リン酸化およびリン酸化を導く（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｊ．Ａ．，Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．，６２（２）：１４５−５５（１９９７）；  Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｊ，Ａ．，Ｉｍｍｕｎｏ  Ｔｏｄａｙ．，１８（７）：３１３−７（１９９７））。
【００９２】
リン酸化した細胞タンパク質は、細胞応答に至る生物学的事象のカスケード（有糸分裂、サイトカインの分泌、膜ラッフリング、およびそれ自体のレセプターの転写の調節）を誘導する（Ｆｉｘｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｌｏｒａｎ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １０：３２−３７（１９９８））。
【００９３】
Ｍ−ＣＳＦは、間質細胞、骨芽細胞および他の細胞で発現される。乳房、子宮および卵巣腫瘍細胞においても発現される。これらの腫瘍における発現の程度は、予後良好および不良と相関する（Ｋａｃｉｎｓｋｉ  Ａｎｎ．  Ｍｅｄ．２７：７９−８５（１９９５）；  Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１：３１３−２５（１９９５））。乳癌におけるＭ−ＣＳＦの発現は、分泌管内癌（上皮内癌）とは対照的に浸潤腫瘍細胞において頻出する（Ｓｃｈｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８６：１２０−６（１９９４））。加えて、Ｍ−ＣＳＦが、乳腺腫瘍の悪性腫瘍への進行を促進することは証明されている（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．９３：７２７−３９（２００１））。乳房および卵巣の癌については、Ｍ−ＣＳＦの生産が、その腫瘍へのマクロファージの動員の原因となるようである。
【００９４】
本明細書に示すように、Ｍ−ＣＳＦ特異的抗体、例えば、ＲＸ１、５Ｈ４、ＭＣ１またはＭＣ３抗体は、癌の動物モデルにおいて転移癌細胞による破骨細胞誘導を中和し、および／または骨への転移を減少させる。故に、本発明は、癌、癌転移および癌転移に関連する骨損失を処置または予防するための組成物および方法を提供する。
【００９５】
好ましい抗Ｍ−ＣＳＦ抗体マウスＲＸ１は、ＳｔｕｄｎｉｃｋａらのＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＴＭ法を基づき、ヒトにおいてさほど免疫原性でないように修飾した。好ましい実施形態では、ヒト環境に対するその免疫原性を低下させると同時に、抗原結合またはタンパク質フォールディングのいずれかに悪影響を及ぼす可能性が低いと判定された位置で、ヒト残基に対して、重鎖可変領域の８から１２の表面露出アミノ酸残基および軽鎖領域の１６〜１９の表面露出残基の修飾を行った。修飾された重鎖および／または軽鎖可変領域を含有する合成遺伝子を構築し、ヒトγ重鎖および／またはκ軽鎖定常領域に連結させた。ヒト重鎖および軽鎖定常領域はいずれも、Ｈｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体可変領域と併用することができる。それらのヒト重鎖および軽鎖遺伝子を哺乳動物細胞に導入し、結果として生じた組換え免疫グロブリン産物を得、特性付けした。他の例示的な抗Ｍ−ＣＳＦ抗体、例えば、５Ｈ４、ＭＣ１またはＭＣ３を同様にＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭした。
【００９６】
用語「ＲＸ１由来の抗体」には、以下のうちのいずれか１つが含まれる：
１）相同性決定のために類似のアミノ酸を考慮に入れて、図４に記載するようなアミノ酸配列に少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９％相同である可変重鎖アミノ酸配列を含む、および／または図４に記載するようなアミノ酸配列に少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９％相同である可変軽鎖アミノ酸配列を含む変異体をはじめとする、図４に記載のアミノ酸配列を有するマウス抗体ＲＸ１のアミノ酸変異体；
２）図４に記載のアミノ酸配列を有するマウス抗体ＲＸ１の１つもしくはそれ以上の相補鎖決定領域（ＣＤＲ）を含む、好ましくはＲＸ１  重鎖の少なくともＣＤＲ３を含む、および好ましくは２つもしくはそれ以上、または３つもしくはそれ以上、または４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上、または６つ全てのＣＤＲを含む、Ｍ−ＣＳＦ結合ポリペプチド（マウス抗体ＲＸ１を除く）；
３）図１９Ｂから２２Ｂに記載の重鎖および軽鎖アミノ酸配列を有するＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体、または図１９Ｂから２２Ｂの元のＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ重鎖もしくは軽鎖との少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％同一を含む）を有する重鎖もしくは軽鎖を含むそれらの変異体；
４）図１９Ｂから２２ＢのＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体の１つもしくはそれ以上のＣＤＲの高リスク残基を含む、好ましくは２つもしくはそれ以上、または３つもしくはそれ以上、または４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上、または６つ全てのＣＤＲの高リスク残基を含む、Ｍ−ＣＳＦ結合ポリペプチド（マウス抗体ＲＸ１を除く）；
５）図４Ｂに記載の高リスクアミノ酸残基を保持し、図４Ｂに記載の低もしくは中リスク残基における１つもしくはそれ以上の変更を含む、
例えば、図４Ｂに記載の低リスク残基における１つもしくはそれ以上の変更および中リスク残基における保存的置換を含む、または
例えば、図４Ｂに示す中および高リスクアミノ酸残基を保持し、低リスク残基での１つもしくはそれ以上の変更を含む、
Ｍ−ＣＳＦに結合する能力を保持する、Ｈｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体または変異体（この場合の変更は、挿入、欠失または置換を含み、保存的置換であってもよく、あるいはその操作された抗体の配列が、ヒト軽鎖もしくは重鎖配列、ヒト生殖細胞系軽鎖もしくは重鎖配列、コンセンサスヒト軽鎖もしくは重鎖配列、またはコンセンサスヒト生殖細胞系軽鎖もしくは重鎖配列に、より近くなるようすることができる）；
こうした抗体は、好ましくは、少なくとも１０−７、１０−８もしくは１０−９またはそれ以上の親和性でＭ−ＣＳＦに結合し、好ましくは、Ｍ−ＣＳＦの破骨細胞発生誘導活性を中和する。
【００９７】
同様に、用語「ＭＣ３由来の抗体」には、以下のうちのいずれか１つが含まれる：
１）相同性決定のために類似のアミノ酸を考慮に入れて、図１５に記載するようなアミノ酸配列に少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９％相同である可変重鎖アミノ酸配列を含む、および／または図１５に記載するようなアミノ酸配列に少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９％相同である可変軽鎖アミノ酸配列を含む変異体をはじめとする、図１５に記載のアミノ酸配列を有するマウス抗体ＭＣ３のアミノ酸変異体；
２）図１５に記載のアミノ酸配列を有するマウス抗体ＭＣ３の１つもしくはそれ以上の相補鎖決定領域（ＣＤＲ）を含む、好ましくはＭＣ３  重鎖の少なくともＣＤＲ３を含む、および好ましくは２つもしくはそれ以上、または３つもしくはそれ以上、または４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上、または６つ全てのＣＤＲを含む、Ｍ−ＣＳＦ結合ポリペプチド（場合により、マウス抗体ＭＣ３を含む、または除く）；
３）低、中または高リスク残基を特定するために図２４Ｃ〜２４Ｅに記載のＫａｂａｔの番号付けを使用し、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａらの米国特許第５，７６６，８８６号および本明細書の実施例４Ａに記載の方法に従ってマウス配列を変更することにより調製したＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体であって、以下の重鎖のうちの少なくとも１つおよび以下の軽鎖のうちの少なくとも１つを含む抗体：（ａ）ヒト標準免疫グロブリン配列と同じ残基になるように、必要に応じて全ての低リスク残基を修飾した重鎖または（ｂ）ヒト標準免疫グロブリン配列と同じ残基になるように、必要に応じて全ての低および中リスク残基を修飾した重鎖、（ｃ）ヒト標準免疫グロブリン配列と同じ残基になるように、必要に応じて全ての低リスク残基を修飾した軽鎖または（ｄ）ヒト標準免疫グロブリン配列と同じ残基になるように、必要に応じて全ての低および中リスク残基を修飾した軽鎖；
４）元のＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ重鎖もしくは軽鎖との少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％同一を含む）を有する重鎖もしくは軽鎖を含む、前のパラグラフ（３）における前記抗体の変異体；
５）図１５のマウスＭＣ３抗体の１つもしくはそれ以上のＣＤＲの高リスク残基を含む、好ましくは２つもしくはそれ以上、または３つもしくはそれ以上、または４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上、または６つ全てのＣＤＲの高リスク残基を含む、Ｍ−ＣＳＦ結合ポリペプチド（場合により、マウス抗体ＭＣ３を含む、または除く）；
６）マウスＭＣ３抗体の高リスクアミノ酸残基を保持し、低もしくは中リスク残基での１つもしくはそれ以上の変更を含む、
例えば、低リスク残基における１つもしくはそれ以上の変更および中リスク残基における保存的置換を含む、または
例えば、中および高リスクアミノ酸残基を保持し、低リスク残基における１つもしくはそれ以上の変更を含む、
Ｍ−ＣＳＦに結合する能力を保持する、Ｈｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体または変異体（この場合の変更は、挿入、欠失または置換を含み、保存的置換であってもよく、あるいはその操作された抗体配列が、ヒト軽鎖もしくは重鎖配列、ヒト生殖細胞系軽鎖もしくは重鎖配列、コンセンサスヒト軽鎖もしくは重鎖配列、またはコンセンサスヒト生殖細胞系軽鎖もしくは重鎖配列に、より近くなるようすることができる）；
こうした抗体は、好ましくは、少なくとも１０−７、１０−８もしくは１０−９またはそれ以上の親和性でＭ−ＣＳＦと結合し、および好ましくは、Ｍ−ＣＳＦの破骨細胞発生誘導活性を中和する。
【００９８】
用語「５Ｈ４由来の抗体」または「ＭＣ１由来の抗体」は、上の説明に従って同様に定義される。
【００９９】
本明細書において詳細に説明するような、Ｈｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体または変異体を含むＲＸ１、５Ｈ４、ＭＣ１またはＭＣ３由来の抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭまたはＩｇＥなどの異なるアイソタイプのものであり得る。ＩｇＧクラスの抗体は、異なる定常領域を含むことができ、例えば、ＩｇＧ２抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域を提示するように修飾することができる。好ましい実施形態において、本発明は、修飾または非修飾ＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域を含むＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体または変異体を提供する。ＩｇＧ１の場合、定常領域、特にヒンジまたはＣＨ２領域に対する修飾により、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性をはじめとするエフェクター機能を増大または低下させることができる。他の実施形態では、ＩｇＧ２定常領域を修飾して、抗体−抗原凝集体形成を減少させる。ＩｇＧ４の場合、定常領域、特にヒンジ領域に対する修飾により、半抗体の形成を減少させることができる。特定の例示的な実施形態では、ＩｇＧ４ヒンジ配列Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−ＣｙｓのＩｇＧ１ヒンジ配列Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓへの突然変異を生じさせる。
【０１００】
ＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域を含有するＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体が、ＩｇＧ２定常領域を含有するＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体と比較して改善された特性を有することを、本明細書において証明する。ＩｇＧ１またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域の選択により、結合親和性、ＭＣＳＦ中和活性、および抗破骨細胞活性が改善された。加えて、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域の選択により、親マウス抗体によって形成されるものにより近似した抗体−抗体複合体が生じた。
【０１０１】
このように、ヒンジ領域における可動性は、二量体抗原ＭＣＳＦに対する抗体の結合ならびにその抗体の中和活性に著しい影響を与えるように見える。本発明では、一般に、修飾または非修飾ＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域、特に、ヒンジおよびＣＨ２ドメインまたは好ましくは少なくともヒンジドメインを含む重鎖を含有する抗体の調製により、結合親和性が改善され、および／または二量体抗原からの抗体の解離が遅速すると考えられる。
【０１０２】
用語「ＲＸ１競合抗体」は、以下を包含する：
１）図４に記載の完全軽鎖および重鎖配列を有するマウスＲＸ１と同じＭ−ＣＳＦのエピトープに結合する非マウスまたは非齧歯動物モノクローナル抗体；
２）図１２のＭ−ＣＳＦのアミノ酸９８〜１０５の少なくとも４つの連続するアミノ酸に結合する非マウスまたは非齧歯動物モノクローナル抗体；および
３）図４に記載の完全配列を有するマウス抗体ＲＸ１と、７５％より多く、８０％より多く、または８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％もしくは９５％より多くＭ−ＣＳＦに結合することで競合する非マウスまたは非齧歯動物モノクローナル抗体。こうした抗体は、好ましくは、少なくとも１０−７、１０−８もしくは１０−９またはそれ以上の結合親和性でＭ−ＣＳＦに結合し、および好ましくはＭ−ＣＳＦの破骨細胞発生誘導活性を中和する。
【０１０３】
用語「ＭＣ１競合抗体」または「ＭＣ３競合抗体」または「５Ｈ４競合抗体」は、図１３、１４または１５にそれぞれ記載する完全軽鎖および重鎖配列を有するマウス５Ｈ４、ＭＣ１またはＭＣ３抗体を参照して、ならびに抗体により結合されるＭ−ＣＳＦのエピトープ、例えば、図１２のアミノ酸６５〜７３または１３８〜１４４（５Ｈ４またはＭＣ３により認識されるＭ−ＣＳＦエピトープに対応する）を参照して、同様に定義する。
【０１０４】
場合により、本願の出願日前に公開された、または本願の出願日前に出願された出願に開示されているキメラ、ヒトまたはヒト化Ｍ−ＣＳＦ抗体はいずれも、本発明の範囲から除外される。
【０１０５】
本明細書において広く定義する「非齧歯動物」モノクローナル抗体は、齧歯動物ハイブリドーマにより産出される完全インタクト齧歯動物モノクローナル抗体ではないあらゆる抗体である。従って、非齧歯動物抗体には、具体的には、齧歯動物抗体の変異体、齧歯動物抗体フラグメント、線状抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、Ｈｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体およびヒト抗体（トランスジェニック動物からまたはファージディスプレイ法により生産されたヒト抗体を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。同様に、非マウス抗体には、マウス抗体の変異体、マウス抗体フラグメント、線状抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、Ｈｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体およびヒト抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０６】
本明細書において用いる「腫瘍」は、悪性であろうと、または良性であろうと、全ての新生細胞成長および増殖、ならびに全ての前癌および癌細胞ならびに前癌および癌組織を指す。
【０１０７】
用語「癌」および「癌の」は、無調節細胞成長を典型的な特徴とする、哺乳動物における生理状態を指すまたは描写する。癌の例には、癌腫；リンパ腫、芽種、肉腫および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。こうした癌のさらに特定的な例には、乳癌、前立腺癌、結腸癌、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、グリア芽細胞種、子宮頚癌、子宮癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーム、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、ならびに様々なタイプの頭頚部癌が挙げられる。
【０１０８】
「処置」は、疾患の発症を予防することまたは疾患の病状を変えることを目的として行う介入である。従って、「処置」は、治療的処置と予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃまたはｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）処置の両方を指す。処置の必要がある者には、その疾患に既に罹患している者、ならびにその疾患を予防すべきである者が含まれる。腫瘍（例えば癌）処置において、治療薬は、腫瘍細胞の病理を直接低減することができ、または腫瘍細胞を、他の治療薬による処置、例えば、放射線療法および／もしくは化学療法に対して、より感受性にすることができる。骨溶解などの疾病の臨床症状、生化学的症状、放射線学的症状または自覚症状がある患者の処置は、そうした症状の幾つかもしくは全ての緩和、またはその疾病対する素因の低減を含み得る。癌の「病状」は、その患者の健康を損なわせる全ての現象を含む。これには、異常または制御不能な細胞増殖、転移、隣接細胞の正常な機能化への干渉、サイトカインまたは他の分泌産物の異常レベルでの放出、炎症反応または免疫応答の抑制または悪化などが挙げられるが、これらに限定されない。従って、処置後の改善は、腫瘍サイズの低下、腫瘍成長速度の低下、既存の腫瘍細胞もしくは転移細胞の破壊、および／または転移のサイズもしくは数の低下として顕在化され得る。
【０１０９】
処置のための「哺乳動物」は、ヒト、家畜、畜産動物、動物園の動物、競技動物またはペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどをはじめとする、哺乳動物として分類されるあらゆる動物を指す。好ましくは、前記哺乳動物は、ヒトである。
【０１１０】
本明細書において用いるフレーズ「転移癌」は、身体の他の部分、特に骨、に拡大する可能性がある癌と定義する。様々な癌が骨に転移し得るが、最も一般的な転移癌は、乳癌、肺癌、腎癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌および前立腺癌である。例として、骨に転移する可能性がある他の癌には、腺癌、血液細胞悪性疾患（白血病またはリンパ腫を含む）；頭頚部癌；胃腸癌（食道癌、胃癌、結腸癌、腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胆管または胆嚢の癌を含む）；女性生殖管の悪性疾患（卵巣癌、子宮内膜癌、膣癌または子宮頚癌を含む）；膀胱癌；脳の癌（神経芽細胞種を含む）；肉腫、骨肉腫；および皮膚癌（悪性黒色腫またはは扁平上皮癌を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明は、骨における腫瘍誘導骨溶解性病変の予防および処置を特に考えている。
【０１１１】
本明細書において用いるフレーズ「治療有効量」は、所望の処置方式に従って投与されたとき、所望の処置もしくは予防効果または処置もしくは予防応答を惹起する、本発明の実施形態に適するであろう治療用または予防用Ｍ−ＣＳＦ抗体の量を指す、指すという意味である。
【０１１２】
本明細書において用いるヒト「Ｍ−ＣＳＦ」は、Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：２９１（１９８５）、  Ｃｅｒｒｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２５：７６１（１９８８）、またはＬａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６：２６９３（１９８７）に記載されている成熟ヒトＭ−ＣＳＦα、Ｍ−ＣＳＦβまたはＭ−ＣＳＦγポリペプチドと実質的に同じアミノ酸配列を有するヒトポリペプチドを指す（前記各文献は、本明細書に参考として組み込まれている）。こうした専門用語は、これら３つの成熟Ｍ−ＣＳＦが、上で説明したように異なるアミノ酸配列を有する、および活性形のＭ−ＣＳＦが、ジスルフィド結合型二量体であるという見解を反映しており、従って、用語「Ｍ−ＣＳＦ」が生物活性形を指す場合、その二量体形を意味する。「Ｍ−ＣＳＦ二量体」は、二量体化した２つのＭ−ＣＳＦポリペプチド単量体を指し、ホモ二量体（同じタイプの２つのＭ−ＣＳＦ単量体から成る）とヘテロ二量体（２つの異なる単量体から成る）の両方を含む。Ｍ−ＣＳＦ単量体は、米国特許第４，９２９，７００号に記載されているように、インビトロでＭ−ＣＳＦ二量体に転化させることができる（前記特許は、本明細書に参考として組み込まれている）。
【０１１３】
（抗ＭＣＳＦ抗体）
本発明は、Ｍ−ＣＳＦ特異的抗体、例えばＲＸ１、５Ｈ４，ＭＣ１および／またはＭＣ３；Ｍ−ＣＳＦ特異的抗体、例えばＲＸ１、５Ｈ４，ＭＣ１および／またはＭＣ３を含む薬学的調合物；その薬学的調合物を調製する方法；ならびにその薬学的調合物および化合物で患者を処置する方法を提供する。用語「抗体」は、最も広い意味で用い、ならびに完全に組み立てられた抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗原に結合することができる抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ’（ａｂ）２、Ｆｖ、単鎖抗体、ダイアボディ）、および所望の生物活性を示すのであれば上記のものを含む組換えペプチドを包含する。
【０１１４】
本明細書において用いる用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、前記集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る可能性がある天然突然変異を除き、同一である。モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、単一の抗原部位に方向付けられている。さらに、異なる決定基（エピトープ）に方向付けられた異なる抗体を典型的に含む通常の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に方向付けられている。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、均質培養により合成され、異なる特異性および特性を有する他の免疫グロブリンにより汚染されない点で有利である。
【０１１５】
修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体集団から得られる場合の抗体の形質を示すものであり、いずれかの特定の方法による抗体の生産を必要とすると解釈すべきでない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５［１９７５］が最初に説明したハイブリドーマ法によって調製することができ、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）により調製することができる。「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４６２８［１９９１］およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載されている技法を使用してファージ抗体ライブラリから単離することもできる。
【０１１６】
免疫グロブリンは、それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依存して、異なるクラスに割り当てることができる。５つの主クラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらのうちの幾つかは、サブクラスまたはアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元配置はよく知られている。異なるアイソタイプは、異なるエフェクター機能を有する。例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソトープは、ＡＤＣＣ活性を有する。
【０１１７】
「抗体フラグメント」は、完全長抗体の一部、好ましくはそのインタクトな抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；ダイアボディ；線状抗体（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５））；単鎖抗体分子；および抗体フラグメントから成る多重特異性抗体が挙げられる。抗体のパパイン分解により、２つの同一の抗原結合フラグメント（「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれ、各々が、単一の抗原結合部位を有する）と残余「Ｆｃ」フラグメント（この名前は、３５を容易に結晶化するその能力を反映している）が生産される。ペプシン処理により、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む２つの「１本鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体を有するＦ（ａｂ’）２フラグメントが生じ、この場合、これらのドメインは、一本のポリペプチド鎖中に存在する。好ましくは、このＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含み、それによってＦｖは抗原結合に望ましい構造を形成することができる。ｓＦｖの概要については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｖｏｌ．１  １３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）参照。
【０１１８】
用語「超可変」領域、は、抗原結合に責任を負う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、相補鎖決定領域すなわちＣＤＲからのアミノ酸残基［すなわち、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）により説明されているような、軽鎖可変ドメイン内の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン内の残基３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）］および／または超可変ループからの残基（すなわち、［Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）］により説明されているような、軽鎖可変ドメイン内の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン内の残基２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３））を含む。
【０１１９】
「フレームワーク」またはＦＲ残基は、超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【０１２０】
用語「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントを指し、これらのフラグメントは、同じポリペプチド鎖内にある軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ  ＶＬ）。同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするほど短いリンカーを使用することにより、それらのドメインを別の鎖の相補ドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を作らせる。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開パンプレット第９３／１１１６１号；および３０  Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）において、より詳細に説明されている。
【０１２１】
一部の実施形態では、少なくとも２つの異なるアイソトープに対する結合特異性を有する、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、Ｈｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体または変異抗Ｍ−ＣＳＦ抗体をはじめとする、多重特異性（例えば、二重特異性）モノクローナル抗体を調製することが望ましいこともある。例示的な二重特異性抗体は、Ｍ−ＣＳＦの２つの異なるエピトープに結合することができる。あるいは、抗Ｍ−ＣＳＦアームを、Ｔ細胞レセプター分子（例えばＣＤ２もしくはＣＤ３）またはＩｇＧのＦｃレセプター（ＦｃγＲ）、例えばＦｃγＲＩ（ＣＤ６４），ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦＣγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、などの白血球上のターゲット分子に結合するアームと連結させて、細胞の防御メカニズムをＭ−ＣＳＦ発現細胞に集中させることができる。二重特異性抗体を使用して、Ｍ−ＣＳＦを発現する細胞に細胞毒性剤を局在させることもできる。これらの抗体は、Ｍ−ＣＳＦ結合アームと細胞毒性剤（例えば、サポリン、抗インターフェロン−６０、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセートまたは放射性同位元素ハプテン）に結合するアームとを有する。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２二重特異性抗体）として調製することができる。
【０１２２】
二重特異性抗体を調製するためのもう一つのアプローチに従って、一対の抗体分子間の界面を、組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体のパーセンテージを最大にするように操作することができる。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、一次抗体分子の界面からの１つ以上の小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換する。大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置換することにより、二次抗体分子の界面上にその大きな側鎖（複数を含む）と同じまたは類似したサイズの代償「空洞」が作られる。これは、ホモ二量体などの他の望ましくない最終産物よりヘテロ二量体の収量を増加させるメカニズムをもたらす。１９９６年９月６日発行の国際公開パンフレット第９６／２７０１１号参照。
【０１２３】
二重特異性抗体は、架橋または「ヘテロ結合体」抗体を含む。例えば、ヘテロ結合体の一方の抗体がアビジンとカップリングし、他方が、ビオチンとカップリングする。ヘテロ結合体化抗体は、従来のあらゆる架橋方法を用いて調製することができる。適する架橋剤は当該技術分野においてよく知られており、米国特許第４，６７６，９８０号に多数の架橋技法と共に開示されている。
【０１２４】
抗体フラグメントから二重特異性抗体を調製する技法もその文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を用いて調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）には、インタクトな抗体をタンパク分解切断して、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを調製する手順が開示されている。これらのフラグメントをジチオール錯化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、隣接するジチオールを安定させ、分子内ジスルフィドの形成を抑制する。次に、調製したＦａｂ’フラグメントをチオニトロベンゼン（ＴＮＢ）誘導体に転化させる。その後、そのＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一方を、メルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ’−チオールに再び転化させ、等モル量の他方のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して、二量体特異性抗体を形成する。生産された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための作用物質として使用することができる。なお、さらなる実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から直接回収したＦａｂ’−ＳＨフラグメントをインビトロで化学的にカップリングさせて、二重特異性抗体を形成することができる（Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２））。
【０１２５】
Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）には、完全ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の生産が記載されている。各Ｆａｂ’フラグメントを大腸菌から選択的に分泌させ、インビトロでの定方向化学的カップリングに付して、二重特異性抗体を形成した。こうして形成された二重特異性抗体は、ＨＥＲ２レセプターを過発現する細胞および正常なヒトＴ細胞に結合することができ、ならびにヒト乳房腫瘍ターゲットに対するヒト細胞毒性リンパ球の溶解活性を誘導することができた。
【０１２６】
組換え細胞培養物から二重特異性抗体フラグメントを直接調製および単離する様々な技法も記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて生産されている（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２））。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合により、２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結させた。その抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元して単量体を形成し、その後、再び酸化して抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法は、抗体ホモ二量体の生産にも利用することができる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）により説明された「ダイアボディ」技法は、二重特異性抗体フラグメントを調製するための代替メカニズムをもたらした。
【０１２７】
これらのフラグメントは、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするほど短いリンカーにより軽鎖可変領域（ＶＬ）に連結された重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。従って、一方のフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインをもう一方のフラグメントの相補ＶＬおよびＶＨドメインと対合させ、それによって２つの抗原結合部位が形成される。１本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用により二重特異性抗体フラグメントを調製するもう一つの戦略も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）参照。
【０１２８】
あるいは、二重特異性抗体は、Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）に記載されているとおり生産された「線状抗体」であってもよい。簡単に言うと、これらの抗体は、一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。線状抗体は、二重特異性であることもあり、または単一特異性であることもある。
【０１２９】
２より大きな価を有する抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。（Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１））
特定の実施形態において、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、Ｈｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体または変異抗Ｍ−ＣＳＦ抗体は、抗体フラグメント、例えば、ＲＸ１抗体フラグメント、５Ｈ４抗体フラグメント、ＭＣ１抗体フラグメントまたはＭＣ３抗体フラグメントである。抗体フラグメントを生産するために、様々な技法が開発されている。伝統的には、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク分解により誘導された（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）およびＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）参照）。しかし、現在、これらのフラグメントは、組換え宿主細胞により直接生産され得る。Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３（１９９８）には、細菌からの機能的抗体フラグメントの分泌が開示されている（例えば、Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４１（１９９８）参照）。例えば、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントは、大腸菌から直接回収し、化学的にカップリングさせてＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成することができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２））。もう一つの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、Ｆ（ａｂ’）２分子の組立てを促進するためにロイシンジッパーＧＣＮ４を使用して形成される。もう一つのアプローチによると、Ｆｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体フラグメントの生産のための他の技法は、当業者には明らかであろう。
【０１３０】
「単離」抗体は、その自然環境の成分から特定され、分離され、回収されたものである。その自然環境の汚染成分は、その抗体の診断または治療使用を妨げるであろう物質であり、そうしたものには、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質系または非タンパク質系溶質を挙げることができる。好ましい実施形態において、抗体は、（１）ローリー法により判定して、９５重量％より高い、最も好ましくは９９重量％より高い抗体重量％に、（２）スピニング・カップ・シークエネータの使用により、Ｎ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るために十分な程度に、または（３）クマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を使用する、還元もしくは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、均質まで精製されるであろう。単離抗体は、組換え細胞の中のインサイチューの抗体を包含する。その抗体の自然環境の少なくとも１つの成分は、存在しないだろうからである。しかし、通常、単離抗体は、少なくとも１つの精製工程により調製されるであろう。
【０１３１】
抗体の構造および調製の詳細な説明については、Ｒｏｔｈ，Ｄ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｃｒａｉｇ，Ｎ．Ｌ．，Ｃｅｌｌ，９４：４１１−４１４（１９９８）および米国特許第６，２５５，４５８号参照（これらは、その全文、本明細書に参考として組み込まれている）。簡単に言うと、重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子をコードするＤＮＡを調製するプロセスは、主としてＢ細胞を発生させる際に行われる。様々な免疫グロブリン遺伝子セグメントの再配列および連結の前、Ｖ、Ｄ、Ｊおよびコンスタント（Ｃ）遺伝子セグメントが、一般に、一つの染色体上に比較的至近距離で見出せる。Ｂ細胞の分化中に、そのＶ、Ｄ、Ｊ（または軽鎖遺伝子の場合はＶおよびＪのみ）遺伝子セグメントの各々の適切なファミリーメンバーの１つを組み換えて、機能的に再配列された重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子を形成する。この遺伝子セグメント再配列プロセスは、逐次的であるように見える。先ず、重鎖のＤとＪの連結が作られ、続いて重鎖のＶとＤＪの連結、そして軽鎖のＶとＪの連結が作られる。
【０１３２】
機能的重鎖および軽鎖可変領域を形成するための可変領域遺伝子セグメントの組換えは、組換え能力のあるＶ、ＤおよびＪセグメントに隣接する組換えシグナル配列（ＲＳＳ）により媒介される。直接組換えに必要、十分なＲＳＳは、二回対称七量体、高ＡＴの九量体、および１２または２３塩基対の介在スペーサ領域を含む。これらのシグナルは、Ｄ−Ｊ（またはＶ−Ｊ）組換えを行う異なる座および種の間で保存され、機能的に互換性である。Ｏｅｔｔｉｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８，１５１７−１５２３およびそこに引用されている参考文献参照。前記七量体は、配列ＣＡＣＡＧＴＧまたはその類似配列を含み、それに非保存配列のスペーサ、そして配列ＡＣＡＡＡＡＡＣＣまたはその類似配列を有する九量体が続く。これらの配列は、ＶおよびＤ遺伝子各々のＪ側、すなわち下流側で見出される。生殖細胞系ＤおよびＪセグメントの直ぐ前は、再び２つの組換えシグナル配列であり、最初に九量体、そして次に７量体があり、これらもまた非保存配列により隔てられている。ＶＬ、ＶＨまたはＤセグメントに続く七量体および九量体配列は、それらによって組み換えられるそのＪＬ、ＤまたはＪＨセグメントの前のものに相補的である。七量体配列と九量体配列の間のスペーサは、１２塩基対の長さであるか、２２塩基対と２４塩基対の間の長さである。
【０１３３】
Ｖ、ＤおよびＪセグメントの再配列に加えて、軽鎖のＶおよびＪセグメントが連結する位置ならびに重鎖のＤおよびＪセグメントが連結する位置での可変組換えにより、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の主レパートリーにさらなる多様性を生じさせる。軽鎖におけるこうした変異は、典型的にはＶ遺伝子セグメントの最終コドンおよびＪセグメントの最初のコドン内で発生する。連結に関する同様の不正確さが、重鎖染色体のＤセグメントとＪＨセグメントの間で発生し、１０ものヌクレオチドにわたることもある。さらに、ゲノムＤＮＡによりコードされない、Ｄ遺伝子セグメントとＪＨ遺伝子セグメントの間およびＶＨ遺伝子セグメントとＤ遺伝子セグメントの間に、幾つかのヌクレオチドを挿入することができる。これらのヌクレオチドの追加は、Ｎ領域多様性として知られている。
【０１３４】
可変領域遺伝子セグメントにおけるそうした再配列およびそうした連結中に発生し得る可変組換えの正味の効果は、一次抗体レパートリーの生産である。
【０１３５】
「Ｆｖ」は、完全抗体認識および結合部位を含有する最少抗体フラグメントである。この領域は、緊密な非共有結合性会合状態の重鎖可変ドメイン１つと軽鎖可変ドメイン１つの二量体から成る。この立体配置では、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ  ＶＩ二量体の表面の抗原結合部位を規定する。集合的に、６つのＣＤＲが、抗体に対する抗原結合特異性を付与する。しかし、完全な結合部位より低い親和性であるが、単一の可変ドメイン（または抗原に対して特異的なＣＤＲを３つしか含まない、Ｆｖの半分）でさえ、抗原を認識し、結合する能力を有する。
【０１３６】
Ｆａｂフラグメントも、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂフラグメントは、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインをはじめとする少数の残基が追加されていることが、Ｆａｂ’フラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数を含む）が遊離チオール基を有するＦａｂ’についての本明細書における呼称である。当初、Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、それらの間にヒンジシステインを有する、対のＦａｂ’フラグメントとして生産された。
【０１３７】
「中和抗体」とは、結合されるターゲット抗原のエフェクター機能を消去するか有意に低下させることができる抗体分子を意味する。従って、「中和」抗ターゲット抗体は、酵素活性、リガンド結合または細胞内シグナル伝達などのエフェクター機能を消去するか有意に低下させることができる。
【０１３８】
本明細書において提供する、癌転移および／または癌転移に関連する骨損失を処置するための組成物および方法は、単独で使用される、または他の治療薬と併用される１つ以上の抗体を利用して、所望の効果を達成することができる。本発明の抗体は、環境抗原との直接接触またはその抗原での免疫化の結果として抗体を生産する動物から単離することができる。あるいは、当該技術分野においてよく知られている抗体発現系の１つを使用して組み換えＤＮＡ法により抗体を生産することができる（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９９８）参照）。こうした抗体には、組換えＩｇＧ抗体、免疫グロブリン由来の配列を有するキメラ融合タンパク抗体、または「Ｈｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ」抗体を挙げることができ、これらは全て、本発明に従って癌転移および／または癌転移に関連する骨損失を処置するために使用することができる。インタクトな完全長分子に加えて、用語「抗体」は、それらのフラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ）’２フラグメントなど）、またはＭ−ＣＳＦ（もしくはＭ−ＣＳＦＲ）に結合するインタクト分子および／もしくはフラグメントの多量体もしくは凝集体も指す。これらの抗体フラグメントは、抗原に結合し、また例えばガラクトース残基の組み込みによりクリアランスおよび取り込みを助長する構造的特徴を示すように誘導体化することができる。
【０１３９】
本発明の一つの実施形態において、Ｍ−ＣＳＦモノクローナル抗体は、本質的にはＨａｌｅｎｂｅｃｋらの米国特許第５，４９１，０６５号（１９９７）に記載されているとおり調製することができる（前記特許は、本明細書に参考として組み込まれている）。例示的なＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体には、組替え体と会合している見掛けの配座エピトープまたは天然二量体Ｍ−ＣＳＦに結合し、それに付随して生物活性を中和するものが挙げられる。これらの抗体は、単量体Ｍ−ＣＳＦおよび化学的に誘導体化された二量体Ｍ−ＣＳＦをはじめとする生物不活性形態のＭ−ＣＳＦとは実質的に反応しない。
【０１４０】
本発明の他の実施形態において、Ｈｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗Ｍ−ＣＳＦモノクローナル抗体を提供する。フレーズ「Ｈｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体」は、非ヒト抗体、典型的にはマウスモノクローナル抗体から誘導される抗体を指す。あるいは、Ｈｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体は、親、非ヒト、抗体の抗原結合特性を保持または実質的に保持するが、ヒトに投与されたときにその親抗体と比較して減弱された免疫原性を示すキメラ抗体から誘導することができる。本明細書において用いるフレーズ「キメラ抗体」は、典型的には異なる種から生じる２つの異なる抗体から誘導された配列を含有する抗体を指す（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）。最も典型的には、キメラ抗体は、ヒトおよびマウス抗体フラグメント、一般に、ヒト定常領域およびマウス可変領域を含む。
【０１４１】
フレーズ「相補鎖決定領域」または用語「ＣＤＲ」は、天然免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性および特異性を協力して規定するアミノ酸配列アミノ酸配列を指す（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１  ９１７（１９８７）；  Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１  ３２４２（１９９１）参照）。フレーズ「定常領域」は、エフェクター機能を付与する抗体分子の部分を指す。本発明において、マウス定常領域は、好ましくは、ヒト定常領域により置換されている。主題の抗体の定常領域は、ヒト天然免疫グロブリンから誘導される。重鎖定常領域は、５つのアイソタイプ（アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマまたはミュー）のいずれかから選択することができる。
【０１４２】
本発明の抗体は、約１０６Ｍ−１またはそれ以上、好ましくは約１０７Ｍ−１またはそれ以上、さらに好ましくは約１０８Ｍ−１またはそれ以上、最も好ましくは約１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１もしくは１０１２Ｍ−１またはそれ以上のＫａで抗原に結合する場合、免疫特異的である、または特異的に結合していると言う。抗Ｍ−ＣＳＦ抗体は、宿主組織／被験体組織により発現されたものならびに腫瘍により発現されたものをはじめとする、種々の自然発生形態のＭ−ＣＳＦに結合することができる。本明細書において開示するモノクローナル抗体、例えば、ＲＸ１、５Ｈ４、ＭＣ１またはＭＣ３抗体は、Ｍ−ＣＳＦに対して親和性であり、少なくとも１０−４Ｍ、好ましくは少なくとも約１０−７Ｍから約１０−８Ｍ、さらに好ましくは少なくとも約１０−８Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍまたは１０−１２Ｍの解離平衡定数（Ｋｄ）を特徴とする。こうした親和性は、従来どおりの技法を使用して、例えば、平衡透析法により；ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００機器を使用し、その製造業者により概説された一般手順を用いることにより；１２５Ｉ標識Ｍ−ＣＳＦを使用するラジオイムノアッセイにより；または当業者に知られている別の方法により、容易に判定することができる。親和性データは、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，５１：６６０（１９４９）の方法により分析することができる。従って、好ましいＭ−ＣＳＦ抗体が、Ｍ−ＣＳＦに対して高い親和性度を示し、他の分子に対しては実質的にそれより低い親和性で結合することは、明らかであろう。好ましい抗体は、図４のマウスＲＸ１がＭ−ＣＳＦに結合するのと同様の親和性でＭ−ＣＳＦを結合し、低い免疫原性を示し、および転移性疾患動物モデルにおいて試験したときに癌細胞の転移を阻害する。他の例示的な抗体は、それぞれ図１３、１４または１５のマウス５Ｈ４、ＭＣ１またはＭＣ３と同様の親和性でＭ−ＣＳＦを結合する。
【０１４３】
抗体の生産に使用することができる抗原は、例えば、インタクトなＭ−ＣＳＦ、またはそのエピトープをその天然配座で提示することができる別のポリペプチドに場合によっては融合している所望のエピトープを保持する、Ｍ−ＣＳＦのフラグメントであり得る。あるいは、Ｍ−ＣＳＦを細胞表面で発現する細胞を使用して、抗体を調製することができる。こうした細胞は、Ｍ−ＣＳＦを発現するように形質転換することができ、またはＭ−ＣＳＦを発現する他の自然発生細胞であってもよい。抗体の調製に有用なＭ−ＣＳＦの他の形態は、当業者には明らかであろう。
【０１４４】
（ポリクローナル抗体）
ポリクローナル抗体は、好ましくは、適切な抗原およびアジュバントの複数の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射により、動物において産生させる。二官能性物質または誘導体化試薬、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基による結合体化）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基による）、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物または当該技術分野において知られている他の物質を使用して、免疫を受ける種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリンまたは大豆トリプシン阻害剤に、適切な抗原を結合体化することにより、改善された抗体応答を得ることができる。
【０１４５】
例えば、１００μｇもしくは５μｇのタンパク質もしくは結合体（それぞれ、ウサギもしくはマウス用）を３容量のフロイト完全アジュバントと併せ、その溶液を複数の部位に皮内注射することにより、動物を抗原、免疫原性結合体または誘導体に対して免疫する。一ヶ月後、複数部位での皮下注射により、フロイト完全培地中のペプチドまたは結合体の最初の量に対して１／５｛比率１／１０｝で動物を追加免疫する。追加抗原注射後７〜１４日目に動物から血液採取し、その血清を抗体力価についてアッセイする。力価がプラトーに達するまで動物から血液採取する。好ましくは、同じ抗原のものであるが、異なるタンパク質に結合体化した、および／または異なる架橋剤によって結合体化した結合体で、動物を追加免疫する。結合体は、タンパク質融合のような組換え細胞培養で調製することもできる。また、ミョウバンなどの凝集剤を適切に使用して、免疫応答を強化する。
【０１４６】
（モノクローナル抗体）
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）により最初に説明されたハイブリドーマ法を使用して調製することができ、または組換えＤＮＡ法により生産することができる。
【０１４７】
ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えば、ハムスターまたはマカークザルを本明細書において説明するとおり免疫して、その免疫処置に使用したタンパク質に特異的に結合するであろう抗体を生産するまたは生産することができるリンパ球を惹起する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫してもよい。その後、適する融合剤、例えば、ポリエチレングリコールを使用して、リンパ球を骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
【０１４８】
このように調製したハイブリドーマを、その融合親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つ以上の物質を好ましくは含有する適切な培地に接種し、成長させる。例えば、その親骨髄腫細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、そのハイブリドーマ用の培地は、典型的にはヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠乏細胞の成長を妨げる）含むであろう（ＨＡＴ培地）。
【０１４９】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的融合し、選択された抗体生産細胞による抗体の安定した高レベルの生産を支援し、および培地に対して感受性であるものである。ヒトモノクローナル抗体の生産のために、ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞系も記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；  Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。例示的なマウス骨髄腫系には、米国、カリフォルニア州、サンディエゴのＳａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒから入手できるＭＯＰ−２１およびＭ．Ｃ．−１１マウス腫瘍由来のもの、ならびに米国、メリーランド州、ロックヴィルの米国微生物系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手できるＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞が挙げられる。
【０１５０】
ハイブリドーマ細胞が成長している培地を抗原に対するモノクローナル抗体の生産についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により生産されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法により、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイにより判定する。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、スキャッチャード分析（Ｍｕｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０））により判定することができる。
【０１５１】
所望の特異性、親和性および／または活性の抗体を生産するハイブリドーマ細胞を特定した後、それらのクローンを限界希釈手順によりサブクローニングし、標準的な方法（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））により成長させることができる。この目的に適する培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。加えて、ハイブリドーマ細胞を動物においてインビボで腹水として成長させることができる。サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、透析または親和性クロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順により、培地、腹水または血清から適切に分離することができる。
【０１５２】
（抗体の組換え生産）
従来の手順を用いて（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）、モノクローナル抗体をコードするＤＮＡをハイブリドーマ細胞から単離し、塩基配列決定することができる。配列決定には、一般に、昆虫の遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部の単離が必要である。通常、これには、モノクローナル抗体をコードするＤＮＡまたは好ましくはｍＲＮＡ（すなわち、ｃＤＮＡ）のクローニングが必要である。クローニングは、標準的な技法を使用して行われる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ，Ｖｏｌｓ  １−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ参照；これは、本明細書に参考として組み込まれている）。例えば、ポリＡ＋ｍＲＮＡ、好ましくは膜会合型ｍＲＮＡの逆転写によりｃＤＮＡライブラリを構築し、ヒト免疫グロブリンポリペプチド遺伝子配列に特異的なプローブを使用してそのライブラリをスクリーニングすることができる。しかし、好ましい実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、昆虫の免疫グロブリン遺伝子セグメント（例えば、軽鎖可変セグメント）をコードするｃＤＮＡ（または全長ｃＤＮＡの部分）を増幅する。増幅された配列は、あらゆる適切なベクター、例えば発現ベクター、ミニ遺伝子ベクターまたはファージディスプレイベクター、に容易にクローニングすることができる。対象となる免疫グロブリンポリペプチドのなんらかの部分の配列を決定することができるのであれば、使用される個々のクローニング法が重要でないことは、理解されるであろう。本明細書において用いる「単離」核酸分子または「単離」核酸配列は、（１）その核酸の天然源に通常付随する少なくとも１つの混在核酸分子から特定および分離されるか、（２）クローニングされ、増幅され、標識され、または対象となる核酸の配列を決定することができるようにバックグラウンド核酸と別様に区別される、単離されたと見なされる核酸分子である。単離核酸分子は、天然に見られる形態またはセッティング以外のものである。従って、単離核酸分子は、天然細胞中に存在するような核酸分子とは区別される。しかし、単離核酸分子は、例えば核酸分子が天然細胞とは異なる染色体座にある抗体を通常は発現する細胞に含まれている核酸分子を含む。
【０１５３】
クローニングおよび塩基配列決定に使用される一つのＲＮＡ源は、トランスジェニックマウスからＢ細胞を得、そのＢ細胞を不朽細胞に融合させることによって生産させたハイブリドーマである。ハイブリドーマを使用する利点は、それらを簡単にスクリーニングできること、および対象となるヒトモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを容易に選択できることである。あるいは、免疫した動物のＢ細胞（または全脾臓）からＲＮＡを単離することができる。ハイブリドーマ以外の源を使用する場合、特異的結合特性を有する免疫グロブリンまたは免疫グロブリンポリペプチドをコードする配列をスクリーニングすることが望ましいであろう。そうしたスクリーニングの一つの方法は、ファージディスプレイ法の使用である。ファージディスプレイは、例えば、Ｄｏｗｅｒらの国際公開パンフレット第９１／１７２７１号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらの国際公開パンフレット第９２／０１０４７号、およびＣａｔｏｎ  ａｎｄ  Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６４５０−６４５４（１９９０）に記載されており、これらの各文献は、本明細書に参考として組み込まれている。ファージディスプレイ法を使用する一つの実施形態では、免疫されたトランスジェニックマウスからｃＤＮＡ（例えば、脾臓ｃＤＮＡ）を単離し、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、免疫グロブリンポリペプチドの一部、例えばＣＤＲ領域をコードするｃＤＮＡを増幅し、増幅された配列をファージベクターに挿入する。パンニングなどの標準的な技法により、所望の結合特性を有する対象となるペプチド、例えば可変領域ペプチド、をコードするｃＤＮＡを特定する。
【０１５４】
増幅し、クローニングした核酸の配列を、その後、決定する。一般的には、免疫グロブリンポリペプチドの全可変領域をコードする配列を決定するが、場合によっては、可変領域の一部、例えばＣＤＲをコードする部分、のみの配列決定で十分であろう。一般に、塩基配列決定する部分は、少なくとも３０塩基の長さであろう。より多くの場合、可変領域の少なくとも約三分の一または少なくとも約二分の一の長さのコーディングを基に、塩基配列決定がなされるであろう。
【０１５５】
塩基配列決定は、ｃＤＮＡライブラリから単離されたクローンを用いて行うことができ、またはＰＣＲを用いる場合には、増幅した配列をサブクローニングした後、行うことができ、もしくは増幅したセグメントの直接ＰＣＲ配列決定により行うことができる。塩基配列決定は、標準的な技法を用いて行う（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ，Ｖｏｌｓ  １−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、およびＳａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９７７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３−５４６７参照；これらは、本明細書に参照として組み込まれている）。クローニングされた核酸の配列とヒト免疫グロブリン遺伝子およびｃＤＮＡの公開されている配列を比較することにより、当業者は、塩基配列決定がなされる領域に依存して、（ｉ）ハイブリドーマ免疫グロブリンポリペプチド（重鎖のアイソタイプを含む）の生殖細胞系セグメントの使用法、および（ｉｉ）Ｎ領域付加および体細胞突然変異プロセスから生じた配列をはじめとする重鎖および軽鎖可変領域の配列を容易に決定することができるであろう。一つの免疫グロブリン遺伝子配列情報源は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．である。
【０１５６】
一旦、単離したら、そのＤＮＡを発現ベクター中に配置することができ、それを、その後、そうしなければ免疫グロブリンタンパク質を生産しない宿主細胞、例えば、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、ヒト胚腎臓２９３細胞（例えば、２９３Ｅ細胞）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を達成する。抗体の組換え生産は、当該技術分野ではよく知られている。
【０１５７】
発現制御配列は、特定の宿主生物における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核動物に適する制御配列は、例えば、プロモータ、場合によりオペレータ配列、およびリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモータ、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが知られている。
【０１５８】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれるとき、作動可能に連結される。例えば、プレ配列または分泌リーダーについてのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合には、そのポリペプチドについてのＤＮＡに作動可能に連結されており；プロモータまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合には、そのコード配列に作動可能に結合されており；またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を助長するように配置されている場合には、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結されるとは、連結されるＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していると共に読み込み相（ｒｅａｄｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、近接している必要がない。連結は、適便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そうした部位が存在しない場合には、従来の施行に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプタまたはリンカーを使用する。
【０１５９】
細胞、細胞系および細胞培養物は、多くの場合、区別なく用いており、本明細書における全てのそうした呼称は、後代を包含する。形質転換体および形質転換細胞は、一次対象細胞、および形質転換数にかかわらず、それに由来する培養物を含む。計画的または偶発的突然変異のため、全ての後代のＤＮＡ内容が正確に同じであるとはかぎらない。元の形質転換細胞においてスクリーニングしたものと同じ機能または生物活性を有する突然変異後代を含む。別個の呼称が意図されている場合、それはその文脈から明らかであろう。
【０１６０】
別の実施形態では、対象となる免疫グロブリンのアミノ酸配列を直接タンパク質配列決定により決定することができる。適するコード化ヌクレオチド配列は、汎用コドン表に従って設計することができる。
【０１６１】
所望の抗体のアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチドの変更をコード化ＤＮＡに導入することにより、またはペプチド合成により、調製することができる。こうした変異体は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、および／または抗体のアミノ酸配列内の残基への挿入、および／または抗体のアミノ酸配列内の残基の置換を含む。欠失、挿入および置換のあらゆる併用を行って、最終構築物に到達するが、但し、最終構築物が、所望の特性を有することを条件とする。アミノ酸の変更、例えばグリコシル化部位の数および位置の変更、により、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、Ｈｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体または変異抗体の後翻訳プロセスを修飾することもできる。
【０１６２】
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該技術分野において知られている様々な方法によって調製することができる。これらの方法には、天然源からの単離（天然アミノ酸配列変異体の場合）、またはオリゴヌクレオチド媒介（または部位特異的）突然変異誘導、ＰＣＲ突然変異誘導、および抗体の以前に調製された変異もしくは非変異バージョンのカセット式突然変異誘導による調製が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１６３】
本発明は、宿主細胞により認識される制御配列に場合によっては作動可能に連結されている本発明の抗体をコードする単離核酸；前記核酸を含むベクターおよび宿主細胞；ならびに前記核酸を発現するように前記宿主細胞を培養することおよび場合によっては前記宿主細胞培養物または培地から前記抗体を回収することを含み得る、抗体を生産するための組換え法も提供する。
【０１６４】
抗体の組換え生産については、それをコードする核酸を単離し、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のためまたは発現のために複製可能なベクターに挿入する。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）、容易に単離され、塩基配列決定され。多くのベクターを利用することができる。ベクター成分は、一般に、以下のものの１つ以上を含むが、それらに限定されない：シグナル配列、複製起点、１つ以上の選択マーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモータ、および転写終結配列。
【０１６５】
（１）シグナル配列成分
本発明の抗体は、直接、組換え生産することができるばかりでなく、異種ポリペプチド（好ましくは、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドである）との融合ポリペプチドとしても組換え生産することができる。選択されるシグナル配列は、好ましくは、宿主細胞により認識され、プロセッシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）ものである。原核宿主細胞が、天然の抗体シグナル配列を認識およびプロセッシングしない場合、そのシグナル配列を、例えばペクチン酸リアーゼ（例えば、ｐｅｌＢ）アルカリホスファアーゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーからなる群より選択されるシグナル配列により置換してもよい。酵母分泌のために、その天然シグナル配列を、例えば酵母転化酵素リーダー、α−因子リーダー（サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびクライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）α−因子リーダーを含む）、酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．アルビカンスグルコアミラーゼリーダーまたは国際公開パンフレット第９０／１３６４６号に記載されているシグナルにより、置換してもよい。哺乳動物細胞発現には、哺乳動物シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、例えば単純疱疹ｇＤシグナルを利用することができる。
【０１６６】
そうした前駆領域についてのＤＮＡを、読み取り枠内で、抗体をコードするＤＮＡにライゲートする。
【０１６７】
（２）複製起点成分
発現ベクターとクローニングベクターの両方が、選択された１つ以上の宿主細胞においてベクターを複製することができる核酸配列を含有する。一般に、クローニングベクターにおけるこの配列は、宿主染色体ＤＮＡとは無関係にそのベクターを複製することができるものであり、複製起点または自律複製配列を含む。様々な細菌、酵母およびウイルスについてのこうした配列は、よく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点は大部分のグラム陰性菌に適し、２μプラスミド起点は酵母に適し、ならびに様々なウイルス起点が哺乳動物細胞におけるベクターのクローニングに有用である。一般に、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターには必要とされない（一般には、ＳＶ４０起点が唯一使用され得る。初期プロモータを含有するためである）。
【０１６８】
（３）選択マーカー成分
発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択可能マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有し得る。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗体または他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、テトラサイクリン、Ｇ４１８、ゲネチシン、ヒスチジノールもしくはマイコフェノール酸、に対する耐性を付与する、（ｂ）栄養要求体欠失を相補する、または（ｃ）自然培地から入手することができない重大な栄養素を供給するタンパク質をコードする（例えば、杆菌（Ｂａｃｉｌｌｉ）についてのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。
【０１６９】
選択機構の一例は、宿主細胞の成長を阻止する薬物を利用するものである。異種遺伝子で首尾よく形質転換されている細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、故に、選択レジメにも生き残る。こうした優性選択の例には、薬物メトトレキセート、ネオマイシン、ヒスチジノール、プロマイシン、マイコフェノール酸およびヒグロマイシンが使用される。
【０１７０】
哺乳動物細胞に適する選択可能マーカーのもう一つの例は、抗体をコードする核酸、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−ＩおよびＩＩ、好ましくは霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどを取り込む能力がある細胞を識別することができるものである。
【０１７１】
例えば、メトトレキセート（Ｍｔｘ）、ＤＨＦＲの競合的拮抗薬、を含有する培地中で形質転換体の全てを培養することにより、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞を先ず識別する。野生型ＤＨＦＲを利用するときに適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠如したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系である。
【０１７２】
あるいは、本発明の抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質およびもう一つの選択可能マーカー、例えばアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）で形質転換または共形質転換された宿主細胞（特に、内在性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）は、アミノグリコシド抗生物質、例えばカナマイシン、ネオマイシンまたはＧ４１８などの選択可能マーカーに対する選択物質を含有する培地中で細胞を成長させることにより、選択することができる。米国特許第４，９６５，１９９参照。
【０１７３】
酵母での使用に適する選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９））。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中での成長能力が欠如した酵母の突然変異株、例えばＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１、のための選択マーカーをもたらす。Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７）。酵母宿主細胞ゲノム内のｔｒｐ１損傷の存在は、トリプトファン不在下での成長による形質転換の検出に有効な環境をもたらす。同様に、Ｌｅｕ２欠失酵母菌株（ＡＴＣＣ  ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知プラスミドにより相補される。ｕｒａ３欠失酵母菌株は、ｕｒａ３遺伝子を有するプラスミドにより相補される。
【０１７４】
加えて、１．６μｍ環状プラスミドｐＫＤ１から誘導したベクターをクライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）酵母の形質転換に使用することができる。あるいは、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）についての組換え子ウシキモシンの大量生産のための発現系が、報告されている。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５（１９９０）。工業用クライベロマイシン株による成熟組換えヒト血清アルブミンの分泌に適するマルチコピー型発現ベクターも開示されている。Ｆｌｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９６８−９７５（１９９１）。
【０１７５】
（４）プロモータ成分
発現ベクターおよびクローニングベクターは、宿主生物により認識される、および抗体をコードする核酸に作動可能に連結されているプロモータを、通常、含有する。原核宿主での使用に適するプロモータには、アラビノース（例えば、ａｒａＢ）プロモータｐｈｏＡプロモータ、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモータ系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータ系、ならびにハイブリッドプロモータ、例えばｔａｃプロモータが挙げられる。しかし、他の既知細菌プロモータが適する。細菌系において使用するためのプロモータは、本発明の抗体をコードするＤＮＡに作動可能に連結されたシャイン−ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列も含有するであろう。
【０１７６】
真核細胞についてのプロモータ配列は、既知である。実質的に全ての真核遺伝子が、転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置する高ＡＴ領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始点から７０〜８０塩基上流に見出せるもう一つの配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域であり、この場合のＮは、いずれのヌクレオチドであってもよい。大部分の真核遺伝子の３’末端にはＡＡＴＡＡＡ配列があり、これは、そのコード配列の３’末端へのポリＡテイルの付加に関するシグナルであり得る。これらの配列の全てが、真核発現ベクターに適切に挿入される。
【０１７７】
酵母宿主での使用に適する促進配列の例には、３−ホスホグリセレートキナーゼまたは他の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼ、のためのプロモータが挙げられる。
【０１７８】
成長条件により制御される転写のさらなる利点を有する誘導プロモータである他の酵母プロモータは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連した分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにメタロースおよびガラクトース利用の要因となる酵素についてのプロモータ領域である。酵母発現での使用に適するベクターおよびプロモータは、欧州特許第７３，６５７号にさらに記載されている。酵母エンハンサーも酵母プロモータとともに有利に使用される。
【０１７９】
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの抗体の転写は、例えば、エーベルソン白血病ウイルス、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、最も好ましくはサイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから、異種哺乳動物プロモータ、例えばアクチンプロモータまたは免疫グロブリンプロモータから、熱ショックプロモータから得られるプロモータにより制御されるが、但し、そうしたプロモータが宿主細胞系と共存できることを条件とする。
【０１８０】
ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモータは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限フラグメントとして適便に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの即時型初期プロモータは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限フラグメントとして適便に得られる。ウシ乳頭腫ウイルスをベクターとして使用して哺乳動物宿主においてＤＮＡを発現させるための系は、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の変形は、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。単純疱疹ウイルスからのチミジンキナーゼプロモータの制御下でのマウス細胞におけるヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現に関するＲｅｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：５９８−６０１（１９８２）も参照。あるいは、ラウス肉腫ウイルスレトロウイルスをプロモータとして使用することができる。
【０１８１】
（５）エンハンサー成分
高等真核生物による本発明の抗体をコードするＤＮＡの転写は、多くの場合、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増加される。今では哺乳動物遺伝子からの多くのエンハンサー配列（グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ−フェトプロテイン、およびインスリン）が知られている。しかし、一般的には真核細胞ウイルスからのエンハンサーが使用されるであろう。例には、複製起点の遅い側（ｂｐ１００〜２７０）にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモータエンハンサー、複製起点の遅い側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核プロモータの活性化のための促進要素に関するＹａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：１７−１８（１９８２）も参照。エンハンサーは、抗体をコードする配列に対して５’または３’位でベクターにスプライシングすることができるが、プロモータから５’の座に位置することが好ましい。
【０１８２】
（６）転写終結成分
真核宿主細胞（酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞、ヒト細胞、または他の多細胞生物からの有核細胞）において使用される発現ベクターは、転写の終結に必要な配列およびｍＲＮＡを安定させるために必要な配列も含有するであろう。こうした配列は、真核またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および場合により３’非翻訳領域から一般に得ることができる。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化フラグメントとして転写されたヌクレオチドセグメントを含有する。一つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開パンフレット第９４／１１０２６号、および本明細書に開示する発現ベクター参照。もう一つは、マウス免疫グロブリン軽鎖転写ターミネータである。
【０１８３】
（７）宿主細胞の選択および形質転換
本明細書において、ベクターでのＤＮＡのクローニングまたは発現に適する宿主細胞は、上で説明した原核動物、酵母または高等真核動物細胞である。この目的に適する原核動物には、グラム陰性またはグラム陽性生物などの真性細菌、例えば、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、例えばネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、例えばセラチア・マルセッカンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｃａｎｓ）および赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）などの腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｓｅ）；枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびＢ．リシェニフォルミス（Ｂ．Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば、１９８９年４月１２日公開の旧東ドイツ特許２６６，７１０号に開示されているＢ．リシェニフォルミス  ４１Ｐ）などの杆菌（Ｂａｃｉｌｌｉ）；緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）などのシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）；ならびにストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。一つの好ましい大腸菌クローニング宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）であるが、大腸菌Ｂ株、大腸菌Ｘ１７７６株（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）および大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）などの他の株は適する。これらの例は、限定ではなく実例となるものである。
【０１８４】
原核動物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物は、抗体をコードするベクターに適するクローニングまたは発現宿主である。サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または一般のパン酵母が、下等真核宿主微生物の間で最も一般的に使用されている。しかし、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）；クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主、例えば、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、Ｋ．ブルガリクス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ  １６，０４５）、Ｋ．ウィッケルアミイ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ  ２４，１７８）、Ｋ．ワルチ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ  ３６，９０６）、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、およびＫ．マルキサヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）など；ヤロウィア（欧州特許第４０２，２２６号）；ピキア・パストルス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｓ）（欧州特許第１８３，０７０号）；カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）；トリコデルマ・レッシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ）（欧州特許第２４４，２３４号）；アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）；シュワニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えば、シュワニオミセス−オキシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）；ならびに、糸状菌、例えば、例えばアカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主［例えば、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）および黒色アスペルギルス（Ａ．ｎｉｇｅｒ）］など、のような多数の他の属、種および株が、ここでは利用可能であり、有用である。
【０１８５】
グリコシル化抗体の発現に適する宿主細胞は、多細胞生物由来のものである。脊椎動物細胞の例には、植物および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株および変異体、ならびにツマジロクサヨウトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（毛虫）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ショウジョウバエ）、およびカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）などの宿主からの対応する許容昆虫宿主細胞が特定されている。トランスフェクションのための様々なウイルス株、例えばオートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１変異体およびカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）ＮＰＶのＢｍ−５株、を、公的に利用することができ、こうしたウイルスを、特にツマジロクサヨウトウ細胞のトランスフェクションのために、本発明に従ってここでのウイルスとして使用することができる。
【０１８６】
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ツクバネアサガオ、トマト、タバコ、アオウキクサおよび他の植物細胞の植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。
【０１８７】
しかし、脊椎動物細胞への関心が最も高く、培養（組織培養）での脊椎動物細胞の増殖が、常用手順になってきている。有用な哺乳動物宿主細胞の例は、ＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４およびチャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））をはじめとするチャイニーズハムスター卵巣細胞；ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚腎臓系（２９３細胞、または浮遊培養で成長させるためにサブクローニングした２９３細胞［Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）］；仔ハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ，Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳腺癌（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞癌系（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０１８８】
抗体生産のために宿主細胞を上記発現ベクターまたはクローニングベクターで形質転換またはトランスフェクトし、適切な場合にはプロモータの導入、形質転換体の選択または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために変性された通常の栄養培地でそれを培養する。加えて、選択マーカーにより分離された転写単位の複数のコピーを有する新規ベクターおよび被トランスフェクト細胞は、Ｍ−ＣＳＦをターゲットにする抗体の発現に特に有用であり、好ましい。
【０１８９】
（８）宿主細胞の培養
本発明の抗体の生産に使用される宿主細胞は、様々な培地で培養することができる。ハムのＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最少必須培地（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）およびダルベッコ変性イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地が、宿主細胞の培養に適する。加えて、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）；  Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）；  米国特許第４，７６７，７０４号、同第４，６５７，８６６号、同第４，９２７，７６２号、同第４，５６０，６５５号もしくは同第５，１２２，４６９号；  国際公開パンフレット第９０１０３４３０号、同第８７／００１９５号；または米国特許再発行番号３０，９８５に記載されている培地はいずれかも、宿主細胞のための培地として使用することができる。これらの培地はいずれも、必要に応じてホルモンおよび／または他の成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリンまたは上皮成長因子）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩）、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗体（例えば、ＧｅｎｔａｍｙｃｉｎＴＭ薬）、微量元素（ミクロモル範囲内の最終濃度で、通常、存在する、無機化合物と定義する）、およびグルコースまたは等価エネルギー源を補足することができる。当業者に知られている他のいずれかの必要補足物を適切な濃度で含めてもよい。培養条件、例えば温度およびｐＨなどは、発現のために選択される宿主で以前に使用されたものであり、通常の当業者には明らかであろう。
【０１９０】
（９）抗体の精製
組換え法を用いる場合、抗体は、ペリプラスム間隙内で細胞内生産することができ、または微生物培養物からのものを含む培地に直接分泌することができる。抗体を細胞内生産する場合、第一工程として、例えば遠心分離または限外濾過により、特定の破壊組織片、宿主細胞または溶解フラグメントのいずれか、を除去する。Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３（１９９８）；  ＩＣＳＵ  Ｓｈｏｒｔ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １０：１０５（１９９０）；およびＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：４５７−４６１（１９９３）には、大腸菌のペリプラスム間隙に分泌される抗体の単離手順が記載されている（［Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２）］も参照）。
【０１９１】
微生物細胞または哺乳動物細胞から調製した抗体は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーカチオンまたはアニオン交換クロマトグラフィー、および親和性クロマトグラフィーを使用して精製することができ、好ましい精製法は、親和性クロマトグラフィーである。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適性は、抗体中に存在するいずれかの免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２またはγ４重鎖に基づく抗体を精製するために使用することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプに、およびヒトγ３に推奨されている（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。親和性リガンドを結合させる基質は、最も多くの場合、アガロースであるが、他の基質を利用することもできる。細孔制御ガラスまたはポリ（スチレンビニル）ベンゼンなどの機械的に安定な基質により、アガロースで達成することができるより早い流速および短い加工時間が可能となる。抗体が、ＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸＴＭ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。回収すべき抗体によっては、タンパク質精製のための他の技法、例えば、イオン交換カラムでの濾過、エタノール沈降法、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭでのクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラムなど）でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈降法も利用することができる。
【０１９２】
（キメラ抗体およびヒト化抗体）
キメラ抗体またはヒト化抗体は、親マウスモノクローナル抗体よりヒトにおける免疫原性が低いため、はるかに低い過敏症リスクでヒトの処置に使用することができる。従って、これらの抗体が、ヒトへのインビボ投与を含む治療用途に好ましいこともある。
【０１９３】
マウスモノクローナル抗体の可変Ｉｇドメインが、ヒト定常Ｉｇドメインに融合しているキメラモノクローナル抗体は、当該技術分野において知られている標準的な手順を用いて調製することができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ；  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｒｅｇｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１，６８４１−６８５５；およびＢｏｕｌｉａｎｎｅ，Ｇ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２，６４３−６４６．（１９８４）参照）。一部のキメラモノクローナル抗体は、ヒトにおいて低免疫原性であることが証明されているが、それでもやはり、マウス可変Ｉｇドメインは、有意なヒト抗マウス応答に導くことができる。
【０１９４】
ヒト化抗体は、例えば、（１）ヒトフレームワークおよび定常領域に非ヒト相補鎖決定領域（ＣＤＲ）をグラフトする方法（当該技術分野において「ＣＤＲグラフティング」によるヒト化と呼ばれるプロセス）、またはあるいは、（２）全非ヒト可変ドメインを移植するが、表面残基の置換によりヒト様表面でそれらを「覆い隠す（ｃｌｏａｋｉｎｇ）」方法（当該技術分野では「ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）」と呼ばれるプロセス）を含む、さまざまな方法により獲得することができる。本発明におけるヒト化抗体は、「ヒト化」抗体と「ベニヤード（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）」抗体の両方を含む。これらの方法は、例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２  ５２５（１９８６）；  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：６８５１  ６８５５（１９８４）；  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｉ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：６５  ９２（１９８８）；  Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４  １５３６（１９８８）；  Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９  ４９８（１９９１）；  Ｐａｄｌａｎ，  Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（３）：１６９  ２１７（１９９４）；およびＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．４（７）：７７３  ８３（１９９１）に開示されており、前記各文献は、本明細書に参考として組み込まれている。
【０１９５】
特に、齧歯動物抗体は、単独でまたは結合体としてヒトに繰り返しインビボ投与すると、その受容者に齧歯動物抗体に対する免疫応答、いわゆるＨＡＭＡ応答（ヒト抗マウス抗体）を生じさせる。ＨＡＭＡ応答は、反復投薬が必要な場合、その薬剤の有効性を制限し得る。抗体の免疫原性は、ポリエチレングリコールなどの親水性ポリマーでの抗体の科学的修飾によって、またはその抗体結合構造をよりヒト様にするように遺伝子操作する方法を使用することによって、低下させることができる。例えば、ＣＥＡと結合する齧歯動物抗体の可変ドメインについての遺伝子配列でヒト骨髄腫タンパク質の可変ドメインを置換し、そのようにして組換えキメラ抗体を生産することができる。これらの手順は、欧州特許第１９４２７６号、同第０１２０６９４号、同第０１２５０２３号、同第０１７１４９６号、同第０１７３４９４号および国際公開パンフレット第８６／０１５３３号において詳述されている。あるいは、齧歯動物抗体のＣＤＲの遺伝子配列を単離または合成し、それらで相同ヒト抗体遺伝子の対応する配列領域を置換して、元の齧歯動物抗体の特異性を有するヒト抗体を生産することができる。これらの手順は、欧州特許第０２３９４０号、国際公開パンフレット第９０／０７８６１号および同第９１／０９９６７号に記載されている。あるいは、齧歯動物抗体の可変ドメインの多数の表面残基を相同ヒト抗体上で通常見出せる残基に交換して、残基の表面「ベニヤ（ｖｅｎｅｅｒ）」を有する、従って、人体に自己として認識されるであろう、齧歯動物抗体を生産することができる。これらのアプローチは、Ｐａｄｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８，４８９により実証されている。
【０１９６】
ＣＤＲグラフティングは、マウス重鎖および軽鎖可変Ｉｇドメインからの６つのＣＤＲのうちの１つ以上を、ヒト可変Ｉｇドメインの適切な４つのフレームワーク領域に導入することを含み、ＣＤＲグラフティングとも呼ばれる。この技法（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２，３２３（１９８８））は、足場として保存フレームワーク領域（ＦＲ１−ＦＲ４）を利用して、抗原との主接触物であるＣＤＲループを支持する。しかし、ＣＤＲグラフティングの不利点は、フレームワーク領域のアミノ酸が、抗原架橋の一因となり得るため、およびＣＤＲループのアミノ酸が、２つの可変Ｉｇドメインの会合に影響を及ぼし得るため、元のマウス抗体より実質的に低い結合親和性を有するヒト化抗体を生じ得る点である。ヒト化モノクローナル抗体の親和性を維持するために、元のマウス抗体のフレームワーク領域に最も近似しているヒトフレームワーク領域を選択することによって、および抗原結合部位のコンピューターモデリングを利用したそのフレームワークまたはＣＤＲ内の１つのアミノ酸に対する部位特異的突然変異誘導（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，２９６８−２９７６）によって、ＣＤＲグラフティング技法を改善することができる。
【０１９７】
抗体をヒト化する一つの方法は、非ヒト重鎖および軽鎖配列とヒト重鎖および軽鎖配列とのアラインメントを行うこと、そうしたアラインメントを基に非ヒトフレームワークを選択し、ヒトフレームワークで置換すること、分子モデルを調製して、そのヒト化配列の立体配座を予測し、親抗体の立体配座と比較することを含む。このプロセスの後、そのヒト化配列モデルの予測立体配座が、親非ヒト抗体の非ヒトＣＤＲの立体配座に厳密に近づくまで、ＣＤＲの構造を妨げるＣＤＲ領域内の残基の復帰突然変異を繰り返し行う。こうしたヒト化抗体は、例えばＡｓｈｗｅｌｌレセプターによる取り込みおよびクリアランスを助長するようにさらに誘導化してもよい（例えば、米国特許第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号参照；これらの特許は、本明細書に参考として組み込まれている）。
【０１９８】
合理的な設計によるマウスモノクローナル抗体の多数のヒト化が報告されている（例えば、２００２年７月１１日発行の２００２００９１２４０、国際公開パンフレット９２／１１０１８号、米国特許第５，６９３，７６２号および同第５，７６６，８６６号参照）。
【０１９９】
（アミノ酸配列変異体）
突然変異誘導に好ましい位置である抗体の一定の残基または領域を特定するための一つの有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１０８１−１０８５（１９８９）により記載されているように、「アラニンスキャニング突然変異誘導」と呼ばれる。この場合、ターゲット残基のうちの１つの残基またはターゲット残基のグループを特定し（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓおよびｇｌｕなどの荷電残基）、中性または負の電荷を有するアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）により置換して、抗原とアミノ酸の相互作用に影響を及ぼす。次に、置換部位に（または、に対して）さらなるまたは他の変異体を導入することにより、その置換に対して官能基的感受性を示すアミノ酸位置をさらに正確にする。このように、アミノ酸配列の変化を導入するための部位は、前もって定められるが、本質的には突然変異の性質を前もって定める必要はない。例えば、所定の部位での突然変異の実行を分析するために、アラニンスキャニングまたはランダム突然変異誘導をターゲットコドンまたは領域で行い、発現された抗体変異体を所望の活性についてスクリーニングする。
【０２００】
アミノ酸配列挿入物は、１つの残基から、１００またはそれ以上の残基を含有するポリペプチドにわたる長さのアミノおよび／またはカルボキシ末端融合物、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入物を含む。末端挿入物の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体、またはエピトープタグもしくはサルベージレセプターエピトープに融合した前記抗体（抗体フラグメントを含む）が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異体は、例えばＮ末端またはＣ末端における、抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合を含む。
【０２０１】
用語「エピトープ標識された」は、エピトープタグに融合した抗体を指す。エピトープタグポリペプチドは、そのエピトープに対する抗体を作ることができるエピトープを提供するために十分な残基を有するが、その抗体の活性に干渉しないように十分短い。エピトープタグは、好ましくは、そのエピトープに対する抗体が実質的に他のエピトープと交差反応しないように十分に一意的である。適するタグポリペプチドは、一般には少なくとも６のアミノ酸残基を有し、通常は約８〜５０の間のアミノ酸残基（好ましくは約９〜３０の間の残基）を有する。例には、ｆｌｕ  ＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５［Ｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：２１５９−２１６５（１９８８）］；ｃ−ｍｙｃタグおよびそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体［Ｅｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５（１２）：３６１０−３６１６（１９８５）］；ならびに単純疱疹ウイルス糖タンパクＤ（ｇＤ）タグおよびその抗体［Ｐａｂｏｒｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ３（６）：５４７−５５３（１９９０）］が挙げられる。他の例示的なタグは、ニッケルキレート化を用いてそのように標識した化合物を単離することができる多ヒスチジン配列、一般にはヒスチジン残基数約６のものである。当該技術分野においてよく知られており、常用されている他のラベルおよびタグ、例えばＦＬＡＧ（登録商標）タグ（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）は、本発明に包含される。
【０２０２】
本明細書において用いる用語「サルベージレセプター結合エピトープ」は、そのＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を増加させる原因となるＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す。
【０２０３】
もう一つのタイプの変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、除去された抗体分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基、およびその場所に挿入された異なる残基を有する。超可変領もしくはＣＤＲ領域またはフレームワーク領域のいずれかにおける置換突然変異誘導も考えられる。保存的置換を表１に示す。最も保存的な置換は、「好ましい置換」の見出しのもとに見出せる。こうした置換が、生物活性の変化を生じさせない場合には、表１において「例示的な置換」と命名されている、またはアミノ酸クラスを参照して後でさらに説明するような、より実質的な変化を導入し、それらの産物をスクリーニングしてもよい。
【０２０４】
【表１−１】
0005422101.tif 000018
【０２０５】
【表１−２】
0005422101.tif 000019
抗体の生物学的特性に関する実質的な修飾は、（ａ）その置換領域内のポリペプチド骨格の構造、例えば、シートもしくはらせん立体配座など、（ｂ）ターゲット部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさを維持しながら、それらの効果が有意に異なる置換を選択することにより達成される。天然残基は、共通の側鎖特性を基に、以下のグループに分けられる：
（１）疎水性：  ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ：
（２）中性親水性：  ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：  ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：  ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響する残基：  ｇｌｙ、ｐｒｏ；および
（６）芳香族：  ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【０２０６】
保存的置換は、アミノ酸の、そのクラスの別のメンバーでの置換を含む。非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーの、別のクラスのメンバーでの置換を含む。
【０２０７】
モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、Ｈｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体または変異抗体の固有立体配座の維持に関与しないいずれかのシステイン残基を、一般にはセリンで置換して、その分子の酸化安定性を改善し、異常架橋を抑制することもできる。逆に言えば、システイン結合（複数を含む）を抗体に追加して、その安定性を改善することができる（特に、その抗体が、Ｆｖフラグメントなどの抗体フラグメントである場合）。
【０２０８】
親和性成熟は、親抗体のＣＤＲ内に置換を有する抗体変異体の調製およびスクリーニング、ならびにその親抗体を基準にして改善された生物学的特性、例えば結合親和性を有する変異体の選択を含む。こうした置換変異体を調製するための適便な方法は、ファージディスプレイを使用する親和性成熟である。簡単に言えば、幾つかの超可変領域部位（例えば、６〜７部位）を突然変異させて、各部位で可能なアミノ酸置換全てを発生させる。そのようにして調製した抗体変異体は、各粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合体として糸状ファージ粒子から一価の様式で提示される。提示されたファージを、その後、それらの生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。
【０２０９】
アラニンスキャニング突然変異誘導を行って、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を特定することができる。あるいは、または加えて、その抗原−抗体複合体の結晶構造を分析して、その抗体と抗原の間の接点を特定することは、有益であり得る。こうした接触残基および隣接残基は、本明細書において詳しく述べる技法による置換の候補である。こうした変異体を調製していたら、本明細書において説明するように変異体のパネルをスクリーニングし、１つ以上の関連アッセイにおいて優れた特性を有する抗体をさらなる開発のために選択することができる。
【０２１０】
抗体変異体は、親抗体を基準にして修飾されたグリコシル化パタン、例えばその抗体において見出せる炭水化物部分１つもしくはそれ以上の欠失、および／またはその抗体中に存在しないグリコシル化部位１つ以上の追加を有する。
【０２１１】
抗体のグリコシル化は、典型的にはＮ連結またはＯ連結のいずれかである。Ｎ−連結は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（この場合のＸは、プロリンを除くいずれかのアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合についての認識配列である。ポリペプチド中のこれらのいずれかのトリペプチド配列の存在が、潜在的グリコシル化部位を作る。従って、これらのトリペプチド配列のうちの１つ以上を含有するようにアミノ酸配列を修飾することにより、Ｎ−連結グリコシル化部位を抗体に追加することができる。Ｏ−連結グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸に対する糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースのうちの１つの結合を指し、前記ヒドロキシアミノ酸は、最も一般的にはセリンまたはトレオニンであるが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンを使用することもできる。Ｏ−連結グリコシル化部位は、元の抗体の配列に１つ以上のセリンまたはトレオニン残基を挿入するか置換することにより、抗体に追加することができる。例として、図４Ａの４１〜４３位でのＲＸ１のアミノ酸（ＮＧＳ）は、保持され得る。あるいは、アミノ酸４１と４２（ＮＧ）のみが、保持され得る。
【０２１２】
元来、Ｈｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体のアミノ酸変異体は、（例えば、図１９Ｂから２２Ｂのいずれかにあるような）重鎖または軽鎖いずれかの元のＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体アミノ酸配列との少なくとも６０％の、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％を含む）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するであろう。本明細書では、この配列に関する同一性または相同性は、配列をアラインし、最大の配列同一性度を達成するために必要に応じてギャップを導入した後のＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ残基と同一である候補配列内のアミノ酸残基のパーセンテージと定義し、（上の表１で定義したような）いかなる保存的置換も配列同一性の一部と見なさない。Ｎ末端、Ｃ末端もしくは内部の伸張、欠失、または抗体配列への挿入は、配列同一性または相同性に影響を与えると考えないことにする。従って、配列同一性は、２つのポリペプチドのアミノ酸の位置における類似点を比較するために一般に用いられている標準的な方法により判定することができる。ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡなどのコンピュータプログラムを使用して、２つのポリペプチドを、（一方もしくは両方の配列の全長に沿って、または一方もしくは両方の配列の所定の位置に沿って）それらそれぞれのアミノ酸が最適にマッチングするようにアラインする。これらのプログラムは、デフォルトオープニングペナルティーとデフォルトギャップペナルティーを規定し、またＰＡＭ  ２５０［標準スコアリングマトリックス；  Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ａｌｔａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐ．３（１９７８）参照］などのスコアリングマトリックスをそのコンピュータプログラムと共に使用することができる。その後、例えば、同一度を次のように計算することができる：  同一マッチの総数に１００を掛け、次にそれを、マッチしたスパン内の長いほうの配列の長さと２つの配列をアラインするために長いほうの配列に導入したギャップの数との合計で割る。
【０２１３】
抗体の他の修飾も考えられる。例えば、本発明の抗体をエフェクター機能に関して修飾して、例えば癌の処置における本抗体の有効性を強化することが望ましいこともある。例えば、システイン残基（複数を含む）をＦｃ領域に導入し、それによってこの領域における鎖内ジスルフィド結合の形成を可能ならしめることができる。このようにして調製されたホモ二量体抗体は、改善された内在化能力、ならびに／または補体媒介細胞致死および抗体依存性細胞毒性作用（ＡＤＣＣ）の増大を有し得る。Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７６：１９１１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）参照。Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されているようなヘテロ二官能性架橋剤を使用して、抗腫瘍活性が強化されたホモ二量体抗体を調製することもできる。あるいは、二重Ｆｃ領域を有し、その結果、強化された補体溶解およびＡＤＣＣ能力を有し得る抗体を設計することができる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３：２１９−２３０（１９８９）参照。加えて、ＣＤＲ内の配列が、抗体をＭＨＣクラス  ＩＩに結合させ、望ましくないヘルパーＴ細胞応答を誘導し得ることが証明された。保存的置換は、抗体が結合活性を保持することを可能にし、しかもなお、望ましくないＴ細胞応答を誘導する能力を失わせることができる。マウス可変領域をヒトγ１、γ２、γ３およびγ４定常領域と連結させたキメラ抗体が記載されている、Ｓｔｅｐｌｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９８８；８５（１３）：４８５２−６（これは、その全文、本明細書に参考として組み込まれている）も参照のこと。
【０２１４】
本発明の特定の実施形態では、インタクトな抗体ではなく抗体フラグメントを使用して、例えば腫瘍の進入を増加させることが望ましいことがある。この場合、抗体フラグメントを修飾して、その血清半減期を増させること、例えば、ＰＥＧまたは他の水溶性ポリマー（多糖類ポリマーを含む）などの分子を抗体フラグメントに付加させて、半減期を増させることが望ましいことがある。これは、例えば、抗体フラグメントにサルベージレセプター結合性エピトープを組み込むことにより（例えば、抗体フラグメントの適切な領域の突然変異により、または例えばＤＮＡもしくはペプチド合成によって、そのエピトープをペプチドタグに組み込み、その後、それを抗体フラグメントのいずれかの末端または中間に融合させることにより）、達成することもできる（国際公開パンフレット第９６／３２４７８号参照）。
【０２１５】
サルベージレセプター結合性エピトープは、Ｆｃドメインの１つまたは２つのループからの１つ以上のいずれかのアミノ酸残基が、抗体フラグメントの類似の位置に移入される領域を、好ましくは構成する。さらにいっそう好ましくは、Ｆｃドメインの１つまたは２つのループからの３つ以上の残基が移入される。さらにいっそう好ましくは、このエピトープは、（例えば、ＩｇＧの）Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインから取られ、抗体のＣＨ１、ＣＨ３もしくはＶＨ領域、またはそうした領域の１つより多くに移入される。あるいは、このエピトープは、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインから取られ、抗体フラグメントのＣ．ｓｕｂ．Ｌ領域もしくはＶ．ｓｕｂ．Ｌ領域、または両方に移入される。Ｆｃ変異体およびサルベージレセプターとのそれらの相互作用が記載されている、国際出願国際公開パンフレット第９７／３４６３１号、および同第９６／３２４７８号も参照のこと。
【０２１６】
従って、本発明の抗体は、ヒトＦｃ部分；ヒトコンセンサスＦｃ部分；あるいはＦｃサルベージレセプターと相互作用する能力を保持するそれらの変異体（ジスルフィド結合に関与するシステインが修飾されているか、除去されている変異体、および／またはＮ末端に１つのｍｅｔが付加している変異体、および／またはＮ末端の２０のアミノ酸のうちの１つ以上が除去されている変異体、および／またはＣ１ｑ結合部位などの補体と相互作用する領域が除去されている変異体、および／またはＡＤＣＣ部位が除去されている抗体を含む）を含み得る［例えば、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（５）：６３３−９（１９９２）参照］。
【０２１７】
以前の研究により、ＦｃＲについての、主としてＩｇＧ残基２３３〜２３９から成るより低いヒンジ領域に対するヒトおよびマウスＩｇＧ上の結合部位が、マッピングされた。他の研究により、さらなる広いセグメント、例えば、ヒトＦｃレセプターＩについてのＧｌｙ３１６〜Ｌｙｓ３３８、ヒトＦｃレセプターＩＩＩについてのＬｙｓ２７４〜Ａｒｇ３０１およびＴｙｒ４０７〜Ａｒｇ４１６が提案され、またはより低いヒンジの外側の少数の特異的残基、例えば、マウスＦｃレセプターＩＩと相互作用するマウスＩｇＧ２ｂについてのＡｓｎ２９７およびＧｌｕ３１８が発見された。ヒトＦｃレセプターＩＩＩＡを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントの３．２Å結晶構造の報告には、ＦｃレセプターＩＩＩＡへの結合に関与するものとして、ＩｇＧ１残基Ｌｅｕ２３４〜Ｓｅｒ２３９、Ａｓｐ２６５〜Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７〜Ｔｈｒ２９９およびＡｌａ３２７〜Ｉｌｅ３３２が明確に描写されている。より低いヒンジ（Ｌｅｕ２３４〜Ｇｌｙ２３７）に加えて、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインループＦＧ（残基３２６〜３３０）およびＢＣ（残基２６５〜２７１）における残基は、ＦｃレセプターＩＩＡへの結合に一定の役割たし得ることが、結晶構造を基に提案された。Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（９）：６５９１−６６０４（２００１）参照（これは、その全文、本明細書に参考として組み込まれている）。Ｆｃレセプター結合部位内の残基の突然変異は、結果として、エフェクター機能の変化、例えば、ＡＤＣＣもしくはＣＤＣ活性の変化、または半減期の変化をもたらす。上に記載したように、潜在的突然変異には、アラニンでの置換、保存的置換、非保存的置換、または異なるＩｇＧサブクラスからの同じ位置の対応するアミノ残基での置換（例えば、ＩｇＧ１残基の、その位置における対応するＩｇＧ２残基での置換）をはじめとする、一つ以上の残基の挿入、欠失または置換が挙げられる。
【０２１８】
Ｓｈｉｅｌｄｓらは、全ヒトＦｃレセプターへの結合に関与するＩｇＧ１残基が、ヒンジに隣接するＣＨ２ドメイン内に位置し、次のような２つのカテゴリーに分類されると報告している：１）全ＦｃＲと直接相互作用することができる位置にはＬｅｕ２３４〜Ｐｒｏ２３８、Ａｌａ３２７およびＰｒｏ３２９（ならびにことによるとＡｓｐ２６５）が挙げられる；２）炭水化物の特性または位置に影響を及ぼす位置には、Ａｓｐ２６５およびＡｓｎ２９７が挙げられる。ＦｃレセプターＩＩへの結合に影響を及ぼす追加のＩｇＧ１残基は、次のとおりである：（最も大きな影響）Ａｒｇ２５５、Ｔｈｒ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｓｅｒ２６７、Ａｓｐ２７０、Ｇｌｕ２７２、Ａｓｐ２８０、Ａｒｇ２９２、Ｓｅｒ２９８、および（より小さい影響）Ｈｉｓ２６８、Ａｓｎ２７６，Ｈｉｓ２８５、Ａｓｎ２８６、Ｌｙｓ２９０、Ｇｌｕ２９５、Ａｒｇ３０１、Ｔｈｒ３０７、Ｌｅｕ３０９、Ａｓｎ３１５、Ｌｙｓ３２２，Ｌｙｓ３２６，Ｐｒｏ３３１、Ｓｅｒ３３７、Ａｌａ３３９、Ａｌａ３７８およびＬｙｓ４１４。Ａ３２７Ｑ、Ａ３２７Ｓ、Ｐ３２９Ａ、Ｄ２６５ＡおよびＤ２７０Ａは、結合を減少させた。全ＦｃＲについて上で特定した残基に加えて、ＦｃレセプターＩＩＩＡへの結合を４０％またはそれ以上減少させるさらなるＩｇＧ１残基は、次のとおりである：
Ｓｅｒ２３９、Ｓｅｒ２６７（Ｇｌｙのみ）、Ｈｉｓ２６８、Ｇｌｕ２９３、Ｇｌｎ２９５、Ｔｙｒ２９６、Ａｒｇ３０１、Ｖａｌ３０３、Ｌｙｓ３３８およびＡｓｐ３７６。ＦｃＲＩＩＩＡへの結合を改善した変異体には、Ｔ２５６Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４ＡおよびＡ３３９Ｔが挙げられる。Ｌｙｓ４１４は、ＦｃＲＩＩＡおよびＦｃＲＩＩＢに対する結合の４０％減少を示し、Ａｒｇ４１６は、ＦｃＲＩＩＡおよびＦｃＲＩＩＩＡに対する結合の３０％減少を示し、Ｇｌｎ４１９は、ＦｃＲＩＩＡへの結合の３０％減少およびＦｃＲＩＩＢへの結合の４０％減少を示し、ならびにＬｙｓ３６０は、ＦｃＲＩＩＩＡへの結合の２３％改善を示した。Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．（２００１）３０，４８７−４９０も参照。
【０２１９】
例えば、米国特許第６，１９４，５５１号（その全文、本明細書に参考として組み込まれている）には、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域内のアミノ酸位置３２９、３３１または３２２（Ｋａｂａｔの番号付けを使用）における突然変異を含有し、これらのうちの幾つかはＣ１ｑ結合またはＣＤＣ活性の低下を提示する、変化したエフェクター機能を有する異性体が記載されている。もう一つの例として、米国特許第６，７３７，０５６号（その全文、本明細書に参考として組み込まれている）には、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域内のアミノ酸位置２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９（Ｋａｂａｔの番号付けを使用）における突然変異を含有し、これらのうちの幾つかはＡＤＣＣまたはＣＤＣ活性の低下に関連したレセプタープロフィールを提示する、変化したエフェクターまたはＦｃ−γ−レセプター結合を有する変異体が記載されている。これらのうち、アミノ酸位置２３８、２６５、２６９、２７０、３２７または３２９における突然変異によりＦｃＲＩへの結合の減少が開始し、アミノ酸位置２３８、２６５、２６９、２７０、２９２、２９４、２９５、２９８、３０３、３２４、３２７、３２９、３３３、３３５、３３８、３７３、３７６、４１４、４１６、４１９、４３５、４３８または４３９における突然変異によりＦｃＲＩＩへの結合の減少が開始し、およびアミノ酸位置２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２６５、２６８、２６９、２７０、２７２、２７８、２８９、２９３、２９４、２９５、２９６、３０１、３０３、３２２、３２７、３２９、３３８、３４０、３７３、３７６、３８２、３８８、３８９、４１６、４３４、４３５または４３７における突然変異によりＦｃＲＩＩＩへの結合の減少が開始する。
【０２２０】
米国特許第５，６２４，８２１号（その全文、本明細書に参考として組み込まれている）には、マウス抗体のＣｌｑ結合活性は、重鎖のアミノ酸残基３１８、３２０および３２２を突然変異させることにより変化させることができること、および残基２９７（Ａｓｎ）の置換の結果として溶解活性が除去されることが報告されている。
【０２２１】
米国特許出願公開第２００４０１３２１０１号（その全文、本明細書に参考として組み込まれている）には、アミノ酸位置２４０、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６６、２９９、３１３、３２５、３２８もしくは３３２（Ｋａｂａｔの番号付けを使用）または位置２３４、２３５、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６９、２９６、２９７、２９８、２９９，３１３、３２５、３２７、３２８、３２９、３３０もしくは３３２（Ｋａｂａｔの番号付けを使用）における突然変異を有し、それらのうちの位置２３４、２３５、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６９、２９６、２９７、２９８、２９９、３１３、３２５、３２７、３２８、３２９、３３０または３３２における突然変異により、ＡＤＣＣ活性が減少し得るか、Ｆｃγレセプターへの結合が減少し得る変異体が記載されている。
【０２２２】
Ｃｈａｐｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １９９１；８８（２０）：９０３６−４０（その全文、本明細書に参考として組み込まれている）には、ＩｇＧ１の細胞親和活性がその重鎖ＣＨ２ドメインの固有特性であることが、報告されている。ＩｇＧ１のアミノ酸残基２３４〜２３７のいずれかにおける単点突然変異は、その活性を有意に低下させるか、完全に破壊した。全結合活性を回復するためには、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４への全てのＩｇＧ１残基２３４−２３７（ＬＬＧＧ）の置換が必要であった。全ＥＬＬＧＧＰ配列（残基２３３〜２３８）を含有するＩｇＧ２抗体は、野生型ＩｇＧ１より活性であることが、観察された。
【０２２３】
Ｉｓａａｃｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８；１６１（８）：３８６２−９（その全文、本明細書に参考として組み込まれている）には、ＦｃγＲ結合に重要なモチーフ内での突然変異（グルタメート２３３からプロリンへ、ロイシン／フェニルアラニン２３４からバリンへ、およびロイシン２３５からアラニンへ）がターゲット細胞の消耗を完全に抑制したことが、報告されている。グルタメート３１８からアラニンへの突然変異は、マウスＩｇＧ２ｂのエフェクター機能を消去し、ヒトＩｇＧ４の効力も低下させた。
【０２２４】
Ａｒｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；４０（９）：５８５−９３（その全文、本明細書に参考として組み込まれている）では、野生型ＩｇＧ１より少なくとも１０倍低い効率で活性化レセプター、ＦｃγＲＩＩａ、と反応するが、阻害性レセプター、ＦｃγＲＩＩｂ、へのその結合は４倍しか低減されないＩｇＧ１変異体が特定されている。突然変異は、アミノ酸２３３〜２３６の領域内で、ならびに／またはアミノ酸位置３２７、３３０および３３１でなされた。国際公開パンフレット第９９／５８５７２号も参照（その全文、本明細書に参考として組み込まれている）。
【０２２５】
Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９４；２６９（５）：３４６９−７４（その全文、本明細書に参考として組み込まれている）には、ＩｇＧ１  Ｐｒｏ３３１からＳｅｒへの突然変異により、Ｃ１ｑ結合が著しく減少し、溶解活性が実質的に消去されたことが、報告されている。対照的に、ＩｇＧ４におけるＳｅｒ３３１のＰｒｏでの置換は、そのＩｇＧ４  Ｐｒｏ３３１変異体に一部の溶解活性（４０％）をもたらした。
【０２２６】
Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，．Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；３８（１）：１−８（その全文、本明細書に参考として組み込まれている）には、重鎖間架橋形成に関与するヒンジシステインの１つ、Ｃｙｓ２２６の突然変異が、結果としてより安定な重鎖間架橋を生じさせることが、報告されている。ＩｇＧ４ヒンジ配列Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−ＣｙｓからＩｇＧ１ヒンジ配列Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓへの突然変異も、重鎖間の共有結合性相互作用を著しく安定させた。
【０２２７】
Ａｎｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３；３０（１）：１０５−８（その全文、本明細書に参考として組み込まれている）には、ＩｇＧ４におけるアミノ酸位置２４１のセリンから（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２のその位置で見出せる）プロリンへの突然変異により、均質抗体の生産が導かれ、ならびに元のキメラＩｇＧ４と比較して血清半減期の延長および組織分布の改善が導かれたことが、報告されている。
【０２２８】
（ヒト抗体およびＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体）
（Ｈｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＴＭ）
抗体可変ドメインのＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＴＭは、抗体分子の結合活性を維持しながら免疫原性を低下させる方法として、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａにより説明された［例えば、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａらの米国特許第５，７６６，８８６号；  Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７：８０５−８１４（１９９４）参照］。この方法に従って、各可変領域アミノ酸に置換のリスクが割り当てられた。アミノ酸置換は、次の３つのリスクカテゴリーのうちの一つに分類される：（１）低リスク変更は、免疫原性を低下させる可能性が最も高く、抗原結合を破壊する機会が最も少ないものであり；（２）中リスク変更は、免疫原性をさらに低下させるであろうが、抗原結合またはタンパク質フォールディングに影響を及ぼす機会がより多いものであり、（３）高リスク残基は、結合にまたは抗体構造の維持に重要であるものであり、ならびに抗原結合またはタンパク質フォールディングに影響を及ぼすであろうリスクが最も高いものである。プロリンの三次元構造的役割のため、プロリンにおける修飾は、その位置が一般には低リスク位置であったとしても、少なくとも中リスク変更での修飾であると一般に考えられる。
【０２２９】
齧歯動物抗体の軽鎖および重鎖の可変領域は、抗原結合またはタンパク質フォールディングのいずれかに悪影響を及ぼす可能性が低いが、ヒト環境において免疫原性を低下させる可能性が高いと判定された位置のヒトアミノ酸を置換するように、Ｈｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭされる。「低リスク」位置にあり、且つ、この方法による修飾の候補であるアミノ酸残基は、齧歯動物可変領域のアミノ酸配列とヒト可変領域配列とのアラインメントを行うことによって特定される。個々のＶＨもしくはＶＬ配列またはヒトコンセンサスＶＨもしくはＶＬ配列あるいは個々のまたはコンセンサスヒト生殖細胞系配列をはじめとするあらゆるヒト可変領域を使用することができる。いずれかの数の低リスク位置または全ての低リスク位置におけるアミノ酸残基を変更することができる。例えば、アラインされるマウスおよびヒトアミノ酸残基が異なる各低リスク位置でのアミノ酸修飾は、その齧歯動物残基をヒト残基で置換することにより導入される。あるいは、全ての低リスク位置およびいずれかの数の中リスク位置におけるアミノ酸残基を変更することができる。理想的には、最少の免疫原性を達成するために、全ての低および中リスク位置を齧歯動物配列からヒト配列に変更する。
【０２３０】
修飾された変性重鎖および／または軽鎖可変領域を含有する合成遺伝子が考えられ、それをヒトγ重鎖および／またはκ軽鎖定常領域に連結させる。ヒト重鎖および軽鎖定常領域はいずれも、ＩｇＡ（いずれかのサブクラスのもの、例えば、ＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（いずれかのサブクラスのもの、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４）またはＩｇＭをはじめとするＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体可変領域と併用することができる。ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を哺乳動物細胞などの宿主細胞に導入し、結果として生じる組換え免疫グロブリン産物を得、特性付けする。
【０２３１】
（トランスジェニック動物からのヒト抗体）
内在性免疫グロブリン生産を有さず、ヒト免疫グロブリン座を含有するように操作されたトランスジェニック動物を使用して、Ｍ−ＣＳＦに対するヒト抗体を生産することもできる。例えば、国際公開パンフレット第９８／２４８９３号には、ヒトＩｇ座を有するトランスジェニック動物が開示されており、この場合の動物は、内在性重鎖および軽鎖座の不活性化のため、機能的な内在性免疫グロブリンを生産しない。国際公開パンフレット第９１／７４１号には、免疫原に対する免疫応答をマウントすることができるトランスジェニック非霊長類哺乳動物宿主も開示されており、この場合の抗体は、霊長類定常および／または可変領域を有し、ならびにこの場合の内在性免疫グロブリンをコードしている座は、置換されているか、不活性化されている。国際公開パンフレット第９６／３０４９８号には、哺乳動物において免疫原座を修飾するための、例えば、全てまたは一部の定常または可変領域を置換して修飾抗体分子を形成するための、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ系の使用が開示されている。国際公開パンフレット第９４／０２６０２号には、不活性化された内在性Ｉｇ座および機能的ヒトＩｇ座を有する非ヒト哺乳動物宿主が開示されている。米国特許第５，９３９，５９８号には、内在性重鎖を欠き、ならびに１つ以上の異種定常領域を含む外在性免疫グロブリン座を発現するトランスジェニックマウスを作る方法が開示されている。
【０２３２】
上に記載したトランスジェニック動物を使用することにより、免疫応答を生じさせて抗原分子を選択することができ、ならびに抗体生産細胞をその動物から除去し、ヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの生産に使用することができる。免疫化プロトコルおよびアジュバントなどは、当該技術分野において知られており、例えば国際公開パンフレット第９６／３３７３５号に記載されているようなトランスジェニックマウスの免疫化に使用される。この出版物には、ＩＬ６、ＩＬ８、ＴＮＦａ、ヒトＣＤ４、Ｌセレクチン、ｇｐ３９、および破傷風毒素をはじめとする様々な抗原分子に対するモノクローナル抗体が開示されている。モノクローナル抗体は、対応するタンパク質の生物活性または生理作用を阻害または中和する能力について検査することができる。国際公開パンフレット第９６／３３７３５号には、ＩＬ−８で免疫し、ＩＬ−８により誘導される好中球機能をブロックしたトランスジェニックマウスの免疫細胞に由来するＩＬ−８に対するモノクローナル抗体が開示されている。トランスジェニック動物を免疫するために使用される抗原に対する特異性を有するヒトモノクローナル抗体も、国際公開パンフレット第９６／３４０９６号、ならびに米国特許出願第２００３０１９４４０４号および同第２００３００３１６６７号に開示されている。
【０２３３】
Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；  Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）；米国特許第５，５９１，６６９号、同第５，５８９，３６９号、および同第５，５４５，８０７号；ならびに米国特許出願第２００２０１９９２１３号も参照。米国特許出願第２００３００９２１２５号には、動物の免疫応答を所望のエピトープに偏らせる方法が開示されている。ヒト抗体は、インビトロ活性化Ｂ細胞によって生じさせることもできる（米国特許第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５号参照）。
【０２３４】
（ファージディスプレイ法からのヒト抗体）
組換えヒト抗体遺伝子のレパートリーを調製するための技法の開発および線状バクテリオファージの表面でのコード化抗体フラグメントの提示は、ヒト抗体を直接調製する手段をもたらした。ファージ法により生産される抗体は、細菌において抗原結合フラグメント（通常はＦｖまたはＦａｂフラグメント）として生産され、それ故、エフェクター機能を欠く。エフェクター機能は、次の２つの戦略のうちの１つにより導入することができる：
フラグメントを操作して、哺乳動物細胞における発現のために完全な抗体にするか、エフェクター機能を誘導することができる第二結合部位を有する二特異性抗体フラグメントにすることができる。
【０２３５】
典型的に、抗体のＦｄフラグメント（ＶＨ−ＣＨ１）および軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）をＰＣＲにより別々にクローニングし、コンビナトリアルファージディスプレイライブラリの中でランダムに組み換え、それをその後、特定の抗原への結合のために選択することができる。Ｆａｂフラグメントをそのファージ表面で発現させる。すなわち、それらをコードする遺伝子に物理的に連結させる。従って、抗原結合によるＦａｂの選択と共に、Ｆａｂコード化配列を選択し、それを、その後、増幅させることができる。数ラウンドの抗原結合および再増幅（パニングと呼ばれる手順）により、その抗原に特異的なＦａｂを濃縮し、最終的には単離する。
【０２３６】
１９９４年、「誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる抗体のヒト化のためのアプローチが説明された。誘導選択は、マウスモノクローナル抗体のヒト化のためにファージディスプレイ法の力を利用する（Ｊｅｓｐｅｒｓ，Ｌ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２，８９９−９０３（１９９４））。このため、マウスモノクローナル抗体のＦｄフラグメントをヒト軽鎖ライブラリとの組合せで提示することができ、得られたハイブリッドＦａｂライブラリを、その後、抗原を用いて選択することができる。それによって、マウスＦｄフラグメントは、選択を導くためのテンプレートをもたらす。その後、選択されたヒト軽鎖をヒトＦｄフラグメントライブラリと組み合わせる。得られたライブラリの選択により、ヒトＦａｂが完全に得られる。
【０２３７】
ファージディスプレイライブラリからヒト抗体を誘導するための様々な手順が記載されている（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；  Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１−５９７（１９９１）；  米国特許第５，５６５，３３２号および同第５，５７３，９０５号；  Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．，ＴＩＢＴＥＣＨ  １２，１７３−１８４（１９９４）参照）。特に、ファージディスプレイライブラリから誘導された抗体のインビボ選択および進化は、強力なツールとなってきた（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｂａｒｂａｓ  ＩＩＩ，Ｃ．Ｆ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７，１９１−２８０（１９９４）；およびＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２，４３３−４５５（１９９４）；  米国特許出願番号第２００２０００４２１５号および国際公開パンフレット第９２／０１０４７号；２００３年１０月９日発行の米国特許出願番号第２００３０１９０３１７号および米国特許第６，０５４，２８７号；  米国特許第５，８７７，２９３号参照）。
【０２３８】
Ｗａｔｋｉｎｓ，「Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｈａｇｅ−Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｂｙ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｌｉｆｔ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １７８：１８７−１９３、および２００３年３月６日発行の米国特許出願番号第２００１２００３００４４７７２号には、キャプチャーリフト（固体支持体上への候補結合分子の固定化を含む方法）により、ファージ発現抗体ライブラリまたは他の結合分子をスクリーニングする方法が記載されている。
【０２３９】
抗体生産物は、本明細書における「スクリーニング方法」と題するセクションで説明するようなアッセイを使用して、または当該技術分野において知られているいずれかの適するアッセイを使用して、活性および本発明の処置方法における適性についてスクリーニングすることができる。
【０２４０】
（他の共有結合修飾）
抗体の共有結合修飾も、本発明の範囲に包含される。これらは、適用可能ならば、化学合成により、または抗体の酵素的もしくは化学的切断により行うことができる。抗体の他のタイプの共有結合修飾は、選択された側鎖またはＮもしくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化試薬と抗体の標的アミノ酸残基を反応させることによって、分子に導入される。
【０２４１】
最も一般的には、システイン残基をα−ハロアセテート（および対応するアミン）、例えばクロロギ酸またはクロロアセトアミド、と反応させて、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイニル残基は、ブロモトリフルオロアセトン、．アルファ．−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルリン酸塩、Ｎ−アルキルマレイミド、二硫化３−ニトロ−２−ピリジル、二硫化メチル２−ピリジル、ｐ−クロロメルクリベンゾエート、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によっても誘導体化される。
【０２４２】
ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５〜７．０でのジエチルピロカーボネートとの反応により誘導体化される。この物質が、ヒスチジル側鎖に比較的特異的であるためである。臭化ｐ−ブロモフェナシルも有用である。この反応は、好ましくは、ｐＨ６．０で、０．１Ｍ  カコジル酸ナトリウム中で行われる。
【０２４３】
リシニルおよびアミの末端残基は、コハク酸無水物または他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの物質の誘導体化は、リシニル残基の電荷を逆転せる効果を有する。アルファ．−アミノ含有残基の誘導体化に適する他の試薬には、イミドエステル、例えばピコリンイミド酸メチル、リン酸ピリドキサル、クロロ水素化ホウ素ピリドキサル、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオン、およびグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応が挙げられる。
【０２４４】
アルギニル残基は、従来の１つまたは幾つかの試薬、中でもフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリン、との反応により修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基のｐＫａが高いため、その反応をアルカリ性条件下で行う必要がある。さらに、これらの試薬は、リシンの基ならびにアルギニンイプシロン−アミノ基と反応することができる。
【０２４５】
チロシル残基の特異的修飾を行うことができ、特に興味深いのは、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によるチロシル残基へのスペクトル標識の導入である。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンを用いて、Ｏ−アセチルチロシル化学種および３−ニトロ誘導体をそれぞれ形成する。ラジオイムノアッセイにおいて使用するために、１２５Ｉまたは１３１Ｉを使用してチロシル残基をヨウ化して標識タンパク質を調製する。
【０２４６】
カルボキシ側基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ−Ｎ．ｄｂｄ．Ｃ．ｄｂｄ．Ｎ−Ｒ’）との反応により選択的に修飾され、この場合のＲおよびＲ’は、異なるアルキル基、例えば、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドである。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応により、アスパラギニルおよびグルタミニル残基に転化させる。
【０２４７】
グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、多くの場合、脱アミド化して、それぞれ対応するグルタミルおよびアスパルチル残基にする。これらの残基は、中性または塩基性条件下で脱アミド化する。これらの残基の脱アミノ化形態は、本発明の範囲に包含される。
【０２４８】
他の修飾には、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖の．アルファ．−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３））、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびにいずれかのＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【０２４９】
もう一つのタイプの共有結合修飾は、抗体へのグリコシドの化学的または酵素的カップリングを含む。これらの手順は、Ｎ−またはＯ−連結グリコシル化のためにグリコシル化能力を有する宿主細胞において抗体を生産する必要がない点で有利である。使用するカップリング様式に依存して、糖（複数を含む）を、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基、例えばシステインのもの、（ｄ）遊離ヒドロキシル基、例えば、セリン、トレオニンもしくはヒドロキシプロリンのもの、（ｅ）芳香族残基、例えば、フェニルアラニン、チロシンもしくはトリプトファンのもの、または（ｆ）グルタミンのアミノ基に結合させることができる。これらの方法は、１９８７年９月１１日発行の国際公開パンフレット第８７／０５３３０号、およびＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６（１９８１）に記載されている。
【０２５０】
抗体上に存在するいずれの炭水化物部分の除去も、化学的または酵素的に達成することができる。化学的脱グリコシル化は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または同等の化合物への抗体の暴露を必要とする。この処理の結果、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除く大部分または全ての糖が切断されるが、抗体はインタクトのままである。化学的脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ，ｅｔ  ａｌ．  Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２（１９８７）およびＥｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８：１３１（１９８１）により記載されている。抗体上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０（１９８７）により記載されているように、様々なエンド−およびエキソ−グリコシダーゼの使用により達成することができる。
【０２５１】
抗体のもう一つのタイプの共有結合修飾は、様々な非タンパク質系ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール、ポリオキシアルキレン、または多糖類ポリマー（例えば、デキストラン）、のうちの１つに抗体を連結させることを含む。こうした方法は、当該技術分野において知られている。例えば、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号、同第４，１７９，３３７号、同第４，７６６，１０６号、同第４，１７９，３３７号、同第４，４９５，２８５号、同第４，６０９，５４６号、または欧州特許第３１５  ４５６号を参照のこと。
【０２５２】
（遺伝子療法）
適切な細胞への治療用抗体の送達は、物理的ＤＮＡ移入法（例えば、リポソームもしくは化学的治療）の使用またはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスもしくはレトロウイルス）の使用によるものをはじめとする当該技術分野において知られているいずれかの適するアプローチの使用による、エクスビボ、インサイチューまたはインビボでの遺伝子療法によって行うことができる。例えば、インビボ療法については、所望の抗体をコードする核酸を単独でまたはベクター、リポソームもしくは沈殿物と併用で被験体に直接注射することができ、一部の実施形態では、抗体化合物の発現が望まれる部位に注射することができる。エクスビボ治療については、被験体の細胞を除去し、核酸をこれらの細胞に導入し、修飾された細胞を被験体に直接戻すか、例えば、多孔質膜に内包させ、それをその患者に移植する。例えば、米国特許第４，８９２，５３８号および同第５，２８３，１８７号参照。生細胞への核酸の導入に利用できる様々な技法がある。これらの技法は、その核酸がインビトロで培養細胞に移入されるのか、またはインビボで所定の宿主の細胞に移入されるのかによって変わる。インビトロでの哺乳動物細胞への核酸の移入に適する技法には、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストランおよびリン酸カルシウム沈降法の使用が挙げられる。核酸のエクスビボ送達に一般に使用されるベクターは、レトロウイルスである。
【０２５３】
他のインビボ核酸移入技法には、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、単純疱疹Ｉ型ウイルスまたはアデノ随伴ウイルス）および脂質に基づく系でのトランスフェクションが挙げられる。核酸およびトランスフェクション作用因子は、場合によっては微粒子に関連する。例示的なトランスフェクション作用因子は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、第四アンモニウム両親媒性ＤＯＴＭＡ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬによりＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎとして市販されている、臭化（ジオレオイルオキシプロピル）トリメチルアンモニウム）（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４，７４１３−７４１７；  Ｍａｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６  ６０７７−６０８１）；ペンダントトトリメチルアンモニウムヘッドを有する親油性グルタミン酸ジエステル（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０２３，１２４−１３２）；代謝性親脂質、例えば、カチオン性脂質ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミルスペルミン（ＤＰＰＥＳ）（Ｊ．Ｐ．Ｂｅｈｒ（１９８６）  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２７，５８６１−５８６４；  Ｊ．Ｐ．Ｂｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，６９８２−６９８６）；代謝性第四アンモニウム塩（ＤＯＴＢ、メチル硫酸Ｎ−（１−［２，３−ジオレイオイルオキシ］プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＡＰ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ジオレオイルエステル、ＣｈｏＴＢ、ＣｈｏＳＣ、ＤＯＳＣ）（Ｌｅｖｅｎｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｉｎｔｅｒ．２２，２３５−２４１）；３ベータ［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）／３ベータ［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロールＤＣ−Ｃｈｏｌの１対１混合物（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０６５，８−１４）、スペルミン、スペルミジン、リポポリアミン（Ｂｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ，１９９４，５：３８２−３８９）、親油性ポリリシン（ＬＰＬＬ）（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９３９，８−１８）、過剰なホスファチジルコリン／コレステロールを伴う水酸化［［（１，１，３，３−テトラメチルブチル）クレ−ゾキシ］エトキシ］エチル］ジメチルベンジルアンモニウム（水酸化ＤＥＢＤＡ）（Ｂａｌｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９３９，８−１８）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）／ＤＯＰＥ混合物（Ｐｉｎｎａｄｕｗａｇｅ  ｅｔ  ａｌ，（１９８９）Ｂｉ��ｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９８５，３３−３７）、グルタミン酸（ＴＭＡＧ）と、ＤＯＰＥ、ＣＴＡＢ、ＤＥＢＤＡ、臭化ジドデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）、およびホスファチジルエタノールアミンとの混合物でのステアリルアミンとの親油性ジエステル（Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  １０，５２０−５２５）、ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ（ＴｒａｎｓｆｅｃｔＡＣＥ，ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、ならびに脂質を有するオリゴガラクトースが挙げられる。移入効率を上昇させる例示的なトランスフェクションエンハンサー作用因子には、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリブレン、リソソーム破断ペプチド（Ｏｈｍｏｒｉ  Ｎ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｊｕｎ．２７，１９９７；２３５（３）：７２６−９）、コンドロイタンに基づくプロテオグリカン、硫酸化プロテオグリカン、ポリエチレンイミン、ポリリシン（Ｐｏｌｌａｒｄ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９９８  ２７３（１３）：７５０７−１１）、インテグリン結合ペプチドＣＹＧＧＲＧＤＴＰ、線状デキストラン九糖類、グリセロール、オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオシド間連結につながれているコレステリル基（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．１９８９  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：（１７）：６５５３−６）、リソホスファチド、リソホスファチジルコリン、リソホスファチジルエタノールアミン、および１−オレオイルリソホスファチジルコリンが挙げられる。
【０２５４】
状況によっては、核酸含有ベクターをターゲット細胞に向ける作用因子で核酸を送達することが望ましいことがある。こうした「ターゲッティング」分子には、ターゲット細胞上の細胞膜タンパク質に特異的な抗体、またはターゲット細胞上のレセプターに対するリガンドが挙げられる。リポソームを利用する場合、エンドサイトーシスに関連する細胞膜タンパク質に結合するタンパク質をターゲッティングに、および／または取り込みの助長に使用することができる。こうしたタンパク質の例には、特定の細胞タイプのほうに向くカプシドタンパク質およびそれらのフラグメント、サイクリング中に内在化されるタンパク質に対する抗体、ならびに細胞内局在化をターゲットにし、細胞内半減期を増させるタンパク質が挙げられる。他の実施形態では、レセプター媒介エンドサイトーシスを用いることができる。こうした方法は、例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７またはＷａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０に記載されている。現在知られている遺伝子マーキングおよび遺伝子療法プロトコルの総説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  １９９２参照。国際公開パンフレット第９３／２５６７３号およびそこに引用されている参考文献も参照。遺伝子療法技術のさらなる総説については、Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２７５−１２８１（１９８９）；  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｔｏ  ｖｏｌ．３９２，ｎｏ  ６６７９，ｐｐ．２５−３０（１９９８）；  Ｖｅｒｍａ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ：６８−８４（１９９０）；および  Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３５７：４５５４６０（１９９２）参照。
【０２５５】
（スクリーニング方法）
有効な療法は、意図した効果を生じ、有意な毒性がない薬剤の特定に依存する。抗体は、当該技術分野において知られている方法により、結合親和性についてスクリーニングすることができる。例えば、ゲル−シフトアッセイ、ウエスタンブロット法、放射性標識競合アッセイ、クロマトグラフィーによる共分画、共沈、架橋、ＥＬＩＳＡなどを使用することができ、これらは、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹに記載されている（これは、その全文、本明細書に参考として組み込まれている）。
【０２５６】
Ｍ−ＣＳＦ上の所望のエピトープに結合する抗体（例えば、Ｍ−ＣＳＦへのＲＸ１、５Ｈ４、ＭＣ１および／またはＭＣ３の結合を阻害するもの）について最初にスクリーニングするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されているようなルーチンクロスブロッキングアッセイを行うことができる。未知の抗体を、本発明のＭ−ＣＳＦ特異性抗体へのＭ−ＣＳＦの結合を阻害するその能力により特性付けする、常用の競合結合アッセイも使用することができる。インタクトなＭ−ＣＳＦ、そのフラグメント、または線状エピトープ、例えば、図１２のＭ−ＣＳＦのアミノ酸９８〜１０５または図１２のアミノ酸６５〜７３もしくは１３８〜１４４により表されるもの（５Ｈ４またはＭＣ３により認識されるＭ−ＣＳＦエピトープに対応する）を使用することができる。エピトープマッピングは、Ｃｈａｍｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３８８−１３９４（１９９５）に記載されている。
【０２５７】
次にそれらの抗体を破骨細胞発生に対するそれらの影響について検査し、その後、動物に投与することが、さらに考えられる。癌転移に関連する骨損失の予防または処置に潜在的に有用な化合物は、様々なアッセイを使用してスクリーニングすることができる。例えば、候補拮抗薬を先ず培養細胞系で特性付けして、破骨細胞発生の誘導に関してＭ−ＣＳＦを中和するそれらの能力を判定することができる。こうした系には、マウス頭蓋冠骨芽細胞と脾臓細胞の共培養物（Ｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１３：６６  ８０，１９９２；  Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｕｄａｇａｗａ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．９：６−１２，１９９８）、マウス間質細胞系（例えば、ＭＣ３Ｔ３−Ｇ２／ＰＡ６およびＳＴ２）とマウス脾臓細胞の共培養物（Ｕｄａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２５：１８０５  １３，１９８９）、およびＳＴ２細胞と骨髄細胞、抹消血管単核細胞または肺胞マクロファージの共培養物（Ｕｄａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：７２６０  ４，１９９０；  Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：４６２  ７，１９９８；  Ｍａｎｃｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．１００：１８−２４，２００１）を挙げることができる。いずれのＭ−ＣＳＦ拮抗薬も不在の状態では、そうした共培養で作られた多核細胞は、破骨細胞の主要な基準、例えば、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ、破骨細胞のマーカー酵素）活性、カルシトニンレセプター、ｐ６０Ｃ−ＳＴＣ、ビトロネクチンレセプター、ならびに骨および象牙質切片上に吸収ピットを作る能力を満たす。有効なＭ−ＣＳＦ拮抗薬の存在により、こうした多核細胞の形成が阻害される。
【０２５８】
上記共培養系に加えて、破骨細胞発生を阻害する候補Ｍ−ＣＳＦ抗体の能力は、間質細胞負含または骨芽細胞負含の系においてアッセイすることができる。破骨細胞発生に必要なＭ−ＣＳＦは、共培養転移癌細胞（例えば、ＭＤＡ２３１）もしくはこれらの細胞からの調整培地（Ｍａｎｃｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．０：１８−２４，２００１）によって、または精製Ｍ−ＣＳＦの添加によって供給することができる。
【０２５９】
癌転移に関連する骨損失の予防または処置における所定のＭ−ＣＳＦ抗体の効能を、当業者によく知られている動物骨転移モデル系のいずれかで検査することもできる。こうしたモデル系には、骨の骨髄腔への腫瘍細胞の直接注射を含むもの（Ｉｎｇａｌｌ，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１１７：８１９−２２，１９６４；  Ｆａｌａｓｋｏ，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．１６９：２０  ７，１９８２）、ラット腹部大動脈への腫瘍細胞の直接注射を含むもの（Ｐｏｗｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２８：３１６  ２１，１９７３）、マウス側尾脈またはマウス左心室への腫瘍細胞の直接注射を含むもの（Ａｕｇｕｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：６８７６  ８１，１９８８）が挙げられる。有効なＭ−ＣＳＦ拮抗薬が不在の状態で注入された腫瘍細胞から生じた骨溶解性骨転移は、放射線写真（骨溶解性骨病変の範囲）または組織学および免疫組織化学（骨および軟組織）により判定することができる。Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５５：３５５１  ７，１９９５；  Ｙｏｎｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：２５０９  １７，１９９７．Ｃｌｏｈｉｓｙ  ａｎｄ  Ｒａｍｎａｒａｉｎｅ，Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｓ．１６：６６０  ６，１９９８．  Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：１９７  ２０６，１９９９。有効なＭ−ＣＳＦ抗体が存在する状態では、骨溶解性骨転移は、転移がより少数および／またはより小さくなるように予防または抑制され得る。
【０２６０】
本発明のＭ−ＣＳＦ抗体は、癌転移の予防または処置においても有用である。癌転移の予防または処置における候補Ｍ−ＣＳＦ抗体の有効性は、Ｆｉｌｄｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５２：３６６１６，１９９２に記載されているようなヒト羊膜基底膜侵襲モデルを使用してスクリーニングすることができる。加えて、様々なタイプの癌の転移についての動物モデル系のいずれを使用してもよい。そうしたモデル系には、Ｗｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  １９：１６９  ７３，２００２；  Ｙｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２：９１７  ２３，２００２；  Ｔｓｕｔｓｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ  １６９：７７−８５，２００１；  Ｔｓｉｎｇｏｔｊｉｄｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２１：９７１  ８，２００１；  Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ５９：７５  ８０，２０００；  Ｃｕｌｐ  ａｎｄ  Ｋｏｇｅｒｍａｎ，Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．３：Ｄ６７２  ８３，１９９８；  Ｒｕｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｒａｄｉｏｌ．３２：２１２  ７；  Ｓｈｉｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．６４：１２２  ６，１９９７；  Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．３７：２２９３  ３０１，１９９６；  Ｋｕｒｕｐｐｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ．１１：２６  ３２，１９９６に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。有効なＭ−ＣＳＦ抗体が存在する状態では、癌転移は、転移がより少数および／またはより小さくなるように予防または抑制され得る。
【０２６１】
特定のＭ−ＣＳＦ抗体またはＭ−ＣＳＦ抗体の組合せの抗腫瘍活性は、適する動物モデルを使用してインビボで評価することができる。例えば、ヒトリンパ腫細胞が、ヌードマウスまたはＳＣＩＤマウスなどの免疫能低下動物に導入される、異種リンパ腫癌モデル。効能は、腫瘍形成、腫瘍退縮または転移などの阻害を測定するアッセイを使用して予測することができる。
【０２６２】
インビトロアッセイの１つの変形局面において、本発明は、（ａ）固定されたＭ−ＣＳＦを候補抗体と接触させる工程、および（ｂ）Ｍ−ＣＳＦへの候補抗体の結合を検出する工程を含む方法を提供する。別の実施形態では、候補抗体を固定し、Ｍ−ＣＳＦへの結合を検出する。固定化は、支持体、ビーズまたはクロマトグラフィー用樹脂への共有結合、ならびに非共有結合性高親和性相互作用、例えば抗体結合、または固定される化合物がビオチン部分を含む場合のストレプタビジン／ビオチン結合の使用をはじめとする、当該技術分野においてよく知られている方法のいずれかを使用して達成される。結合の検出は、（ｉ）固定されない化合物上の放射性標識を使用して、（ｉｉ）非固定化化合物上の蛍光標識を使用して、（ｉｉｉ）非固定化化合物に対して免疫特異的な抗体を使用して、（ｉｖ）固定される化合物を取り付ける蛍光支持体を励起させる非固定化化合物上の標識を使用して、ならびに当該技術分野においてよく知られており、日常的に実施されている他の技法を使用して、達成することができる。
【０２６３】
Ｍ−ＣＳＦの活性または発現を修飾する（すなわち、増加させる、減少させる、または阻害する）抗体は、Ｍ−ＣＳＦを発現する細胞とともに推定モジュレータをインキュベートし、Ｍ−ＣＳＦの活性または発現に対するその推定モジュレータの影響を判定することによって特定することができる。Ｍ−ＣＳＦポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性を修飾する抗体の選択性は、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対するその影響と他の関連化合物に対するその影響を比較することにより、評価することができる。選択的モジュレータには、例えば、抗体および他のタンパク質、ペプチド、またはＭ−ＣＳＦポリペプチドにもしくはＭ−ＣＳＦポリペプチドをコードする核酸に特異的に結合する有機分子が挙げられる。Ｍ−ＣＳＦ活性のモジュレータは、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドの正常または異常活性が関与する疾病および生理状態の処置の際、治療上、有用であろう。
【０２６４】
本発明は、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドの生物活性と相互作用するか、それらを阻害する（すなわち、酵素的活性、結合活性などを阻害する）抗体を特定するためのハイスループットアッセイ（ＨＴＳ）も包含する。ＨＴＳアッセイは、効率的な様式での多数の化合物のスクリーニングを可能にする。Ｍ−ＣＳＦポリペプチドとそれらの結合パートナーの間の相互作用を調査するために、細胞ベースのＨＴＳ系が考えられる。所望の特性を有する「ヒット」または「リード化合物」を特定するようにＨＴＳアッセイを設計し、そこから所望の特性を改善するように変形したものを設計することができる。その「ヒット」または「リード化合物」の化学的修飾は、多くの場合、その「ヒット」とＭ−ＣＳＦポリペプチドの間の特定可能な構造／活性に基づく。
【０２６５】
本発明のもう１つの局面は、Ｍ−ＣＳＦの活性を修飾する（すなわち、低下させる）抗体を特定する方法に関し、この方法は、Ｍ−ＣＳＦを抗体と接触させること、およびその抗体がＭ−ＣＳＦの活性を修飾するかどうか判定することを含む。被検抗体存在下での活性を被検抗体不在下での活性と比較する。被検抗体を含有するサンプルの活性が、被検化合物を欠くサンプルにおける活性より低い場合、その抗体の活性は阻害されていよう。
【０２６６】
当業者によく知られている組み換えポリペプチドの機能的発現に、様々な異種系を利用することができる。こうした系には、細菌（Ｓｔｒｏｓｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９２）１３：９５−９８）、酵母（Ｐａｕｓｃｈ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９７）１５：４８７−４９４）、幾つかの種類の昆虫細胞（Ｖａｎｄｅｎ  Ｂｒｏｅｃｋ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌｏｇｙ（１９９６）１６４：１８９−２６８）、両生類細胞（Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９７）８：６２９−６３４）および幾つかの哺乳動物細胞系（ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳなど；Ｇｅｒｈａｒｄｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（１９９７）３３４：１−２３参照）が挙げられる。これらの例は、線虫から得られた細胞系（ＰＣＴ出願国際公開パンフレット第９８／３７１７７号）をはじめとする他の可能な細胞発現系の使用を除外するものではない。
【０２６７】
本発明の１つの実施形態において、Ｍ−ＣＳＦの活性を修飾する抗体をスクリーニングする方法は、被検抗体をＭ−ＣＳＦポリペプチドと接触させること、およびその抗体とＭ−ＣＳＦとの複合体の存在についてアッセイすることを含む。こうしたアッセイにおいて、リガンドは、一般には標識される。適するインキュベーションの後、遊離リガンドを結合形で存在するものと分離し、その遊離標識または複合体を形成していない標識の量が、Ｍ−ＣＳＦまたはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドに結合するその特定の抗体の能力の尺度である。
【０２６８】
本発明のもう１つの実施形態では、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドに対する適切な結合親和性を有する抗体フラグメントまたはＣＤＲについてのハイスループットスクリーニングを利用する。簡単に言うと、多数の異なる小ペプチド被検化合物を固体基質上で合成する。それらのペプチド被検抗体をＭ−ＣＳＦポリペプチドと接触させ、洗浄する。その後、当該技術分野においてよく知られている方法により、結合したＭ−ＣＳＦポリペプチドを検出する。本発明の精製ポリペプチドは、上述の薬物スクリーニング法において使用するためのプレートに直接塗布することができる。加えて、非中和抗体を使用して、タンパク質を補足し、それをその固体支持体上に固定することができる。
【０２６９】
（併用療法）
動物モデルにおいて有効であるＭ−ＣＳＦ抗体を１つより多く特定したら、癌転移および／または癌転移に関連する骨損失に対してさらに改善された効力をもたらすために、２つ以上のそうしたＭ−ＣＳＦ抗体を混合することがさらに有利であることがある。癌転移および／または癌転移に関連する骨損失に罹患している、または罹患する素因を有する人または哺乳動物に、１つ以上のＭ−ＣＳＦ抗体を含む組成物を投与することができる。２つの治療薬の併用投与は、それらの薬剤がそれらの治療効果を発揮している期間に重なりがあるならば、それらの薬剤を同時にまたは同じ経路で投与する必要はない。別の日または週での投与であるような同時または逐次投与が考えられる。
【０２７０】
Ｍ−ＣＳＦ抗体療法は、癌の全ての期に有用であり得るが、抗体療法は、進行または転移癌に特に適切であり得る。抗体治療法を化学療法または放射線方式と併用することが、化学療法での治療を受けたことがない患者には好ましいこともあるが、抗体療法での治療が、１つ以上の化学療法を受けている患者に指示されるあることもある。加えて、抗体療法は、特に、化学療法薬の毒性に対する耐性が不良な患者において、併用化学療法の低減投薬量の使用を可能にすることもできる。
【０２７１】
本発明の方法では、単独の抗Ｍ−ＣＳＦ抗体の投与ならびに異なる抗体の併用物、すなわち「カクテル」の投与が考えられる。こうした抗体カクテルは、一定の利点を有し得る。それらが、異なるエフェクターメカニズムを利用する抗体を含有する、または毒性抗体を免疫エフェクターの機能性に依存する抗体と直接組み合わせるのと同じだからである。併用でのこうした抗体は、相乗的治療効果を示し得る。
【０２７２】
ＲＸ１またはＲＸ１抗体のＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ誘導体と他の治療薬の併用は、骨破壊性疾患および／または腫瘍成長もしくは転移を経験している患者に対して効果を有し得る。例えば、骨溶解性疾患に罹患している患者を治療するための医薬の製造にＲＸ１抗体を使用することができ、この場合、前記医薬と、抗ＲＡＮＫＬ抗体、可溶性ＲＡＮＫＬレセプター、他のＲＡＮＫＬ阻害剤、またはビスホスホネート（例えば、Ａｒｅｄｉａ；Ｚｏｍｅｔａ；Ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅ）を使用する処置とを協調させる。あるいは、骨溶解性疾患に罹患している患者を処置するための治療用医薬の製造において抗ＲＡＮＫＬ抗体またはビスホスホネートを使用することができ、この場合、前記医薬と、ＲＸ１抗体またはＲＸ１のＨｕｍａｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ誘導体を使用する処置とを協調させる。この併用は、処置を受ける患者における相乗効果も有し得る。ＲＸ１抗体および他の治療薬を同時に投与する必要はない。ＲＸ１またはＨｕｍａｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ変異体および他の治療薬を、互いに１日、１週間、２週間、４週間、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年または２年以内に投与することができる。
【０２７３】
本発明では、骨溶解性疾患に罹患している患者を処置するための医薬の製造におけるＲＸ１抗体またはＲＸ１抗体のＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ誘導体の使用も考えられ、この場合、前記医薬は、抗ＲＡＮＫＬ抗体またはビスホスホネートでの前処置を受けた患者において使用される。「前処置」は、患者が、ＲＸ１またはＲＸ１のＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ変異体での処置前２年、１年、６ヶ月、３ヶ月、２ヶ月、１ヶ月、２週間、１週間または少なくとも１日以内に処置を受けたことを意味する。
【０２７４】
ＲＸ１抗体またはＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ変異体は、他の癌療法薬と併用することができる。例えば、癌疾患に罹患している患者を処置するための医薬の製造においてＲＸ１抗体またはＨｕｍａｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ変異体を使用することができ、この場合、前記医薬は、様々な化学療法薬、アンドロゲン遮断薬、および免疫修飾物質（例えば、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＬＣ）、ビホスホネート（例えば、Ａｒｅｄｉａ；Ｚｏｍｅｔａ；Ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅ）、手術、放射線、細胞毒性化学療法、ホルモン療法（例えば、Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ；抗アンドロゲン療法）、抗体療法（例えば、ＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫ中和抗体、ＰＴＨｒＰ中和抗体、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ２２抗体、ＶＥＧＦ抗体、ＩＧＦＲ−１抗体、ＥｐｈＡ２抗体、ＨＡＡＨ抗体、ＴＭＥＦＦ２抗体、ＣＡＩＸ抗体）、治療タンパク質療法（例えば、可溶性ＲＡＮＫＬレセプター、ＯＰＧ阻害剤、ＰＤＧＦ阻害剤およびＭＭＰ阻害剤）、小分子薬物療法（例えば、Ｓｒｃ−キナーゼ阻害剤）、成長因子レセプターのキナーゼ阻害剤、またはＲＡＮＫＬ阻害剤、オリゴヌクレオチド療法（例えば、ＲＡＮＫＬまたはＲＡＮＫまたはＰＴＨｒＰアンチセンス）、遺伝子療法（例えば、ＲＡＮＫＬまたはＲＡＮＫ阻害剤）、ペプチド療法（例えば、ＲＡＮＫＬの突然変異タンパク質）、ならびに本明細書に記載のタンパク質、ペプチド、化合物および小分子を含む（しかし、これらに限定されない）他の治療薬および／または手順を使用する処置と協調させる。
【０２７５】
ＲＸ１およびＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ変異体は、上述の療法での前処置を受けた患者を処置するための医薬の製造において使用することができる。
【０２７６】
細胞毒性剤は、細胞の機能を阻害もしくは抑制する、および／または細胞の破壊を生じさせる物質を指す。この用語は、放射性同位元素（例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０およびＲｅ１８６）、化学療法薬、および毒素、例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物由来の酵素的に活性な毒素または合成毒素、あるいはこれらのフラグメントを含むと解釈する。非細胞毒性剤は、細胞の機能を阻害もしくは抑制しない、および／または細胞の破壊を生じさせない物質を指す。非細胞毒性剤は、細胞毒性になるように活性化することができる物質を含み得る。非細胞毒性剤には、ビーズ、リポソーム、マトリックスまたは粒子を挙げることができる（例えば、米国特許公開第２００３／００２８０７１号および同第２００３／００３２９９５号参照；これらは、本明細書に参考として組み込まれている）。こうした薬剤は、本発明の抗体と結合体化、カップリング、連結または会合させることができる。
【０２７７】
癌化学療法薬には、アルキル化剤、例えばカルボプラチンおよびシスプラチン；ナイトロジェンマスタードアルキル化剤；ニトロソウレアアルキル化剤、例えばカルムスチン（ＢＣＮＵ）；代謝拮抗物質、例えばメトトレキセート；フォリン酸；プリン類似体代謝拮抗物質、メルカプトプリン；ピリミジン類似体代謝拮抗物質、例えばフルオロウラシル（５−ＦＵ）およびゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））；ホルモン抗新生物薬、例えばゴセレリン、ロイプロリドおよびタモキシフェン；天然抗新生物薬、例えばアルデスロイキン、インターロイキン−２、ドセタキセル、エトポシド（ＶＰ−１６）、インターフェロンアルファ、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））およびトレチノイン（ＡＴＲＡ）；抗生物質天然抗新生物薬、例えばブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ダウノマイシンおよびマイトマイシン（マイトマイシンＣを含む）；ならびにビンカアルカロイド天然抗新生物薬、例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン；ヒドロキシウレア；アセグラクトン、アドリアマイシン、イホスファミド、エノシタビン、エピトスタノール、アクラルビシン、アンシタビン、ニムスチン、塩酸プロカルバジン、カルボキノン、カルボプラチン、カルモフル、クロモマイシンＡ３、抗腫瘍性多糖類、抗腫瘍性血小板因子、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘｉｎ（登録商標））、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌａｎ、シタラビン（シトシンアラビノシド）、ダカルバジン、チオイノシン、チオテパ、テガフール、ドラスタチン、ドラスタチン類似体、例えばオーリスタチン、ＣＰＴ−１１（イリノテカン）、ミトザントロン、ビノレルビン、テニポシド、アミノプテリン、カルミノマイシン、エスペラマイシン（例えば、米国特許第４，６７５，１８７号参照）、ネオカルジノスタチン、ＯＫ−４３２、ブレオマイシン、フルツロン、ブロクスウリジン、ブスルファン、ホンバン、ペプロマイシン、ベスタチン（Ｕｂｅｎｉｍｅｘ（登録商標））、インターフェロン−β、メピチオスタン、ミトブロニトール、メルファラン、ラミニンペプチド、レンチナン、カワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）エキス、テガフール／ウラシル、エストラムスチン（エストロゲン／メクロレタミン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２７８】
さらに、癌患者のための療法として使用される追加の薬剤には、ＥＰＯ；Ｇ−ＣＳＦ；ガンシクロビル；抗生物質；ロイプロリド；メペリジン；ジドブジン（ＡＺＴ）；インターロイキン１から１８（突然変異体および類似体を含む）；インターフェロンまたはサイトカイン、例えばインターフェロンα、βおよびγ；ホルモン、例えば黄体化ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）および類似体ならびに性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）；成長因子、例えば形質転換因子−β（ＴＧＦ−β）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、成長ホルモン放出因子（ＧＨＲＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子相同因子（ＦＧＦＨＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）およびインスリン成長因子（ＩＦＧ）；腫瘍壊死因子−α＆β（ＴＮＦ−α＆β）；浸潤抑制因子−２（ＩＩＦ−２）；骨形態発生タンパク質１〜７（ＢＭＰ１〜７）；ソマトスタチン；チモシン−α−１；γ−グロブリン；スーパーオキシドジムスターゼ（ＳＯＤ）；補体因子；抗血管新生因子；抗原物質；ならびにプロドラッグが挙げられる。
【０２７９】
プロドラッグは、親薬と比較して腫瘍細胞に対する細胞毒性が低いまたは細胞毒性が無く、ならびに活性なまたはより活性な親形態へ酵素的に活性化するまたは転化させることができる、薬学的に活性な物質の前駆体または誘導体形態を指す。例えば、Ｗｉｌｍａｎ，「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ」  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，１４，ｐｐ．３７５−３８２，６１５ｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｂｅｌｆａｓｔ（１９８６）、およびＳｔｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：  Ａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄ．），ｐｐ．２４７−２６７，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）参照。プロドラッグには、より活性で、細胞毒性がない薬物に転化させることができる、リン酸塩含有プロドラッグ、チオリン酸塩含有プロドラッグ、硫酸塩含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸変性プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、場合により置換されているフェノキシアセトアミドを含有するプロドラッグ、または場合により置換されているフェニルアセトアミドを含有するプロドラッグ、５−フルオロシトシンおよび他の５−フルオロウリジンプロドラッグが挙げられるが、これらに限定されない。ここで使用するためのプロドラッグ形態に誘導体化することができる細胞毒性薬の例には、上に記載した化学療法薬が挙げられるが、それらに限定されない。
【０２８０】
（投与および調製）
本発明の方法を実施する際に使用される抗Ｍ−ＣＳＦ抗体は、所望の送達方法に適するキャリアを含む薬学的組成物に調合することができる。適するキャリアには、抗Ｍ−ＣＳＦ抗体と併用したとき、その抗体の抗腫瘍機能を保持し、被験体の免疫系と非反応性である、あらゆる材料を含む。例には、無菌リン酸緩衝食塩液、静菌水などのような多数の標準的な薬学的キャリアのいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。様々な水性キャリア、例えば、水、緩衝水、０．４％食塩水、０．３％グリシンなどを使用することができ、ならびに中等度の化学的修飾などを受けた、安定性向上のための他のタンパク質、例えば、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなどを含むことができる。
【０２８１】
抗体の治療用調合物は、所望の純度を有する抗体を生理学的に許容される任意のキャリア、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することにより、凍結乾燥調合物または水性溶液の形態で保存用に調製することができる。許容されるキャリア、賦形剤または安定剤は、利用される投薬量および濃度で受容者に毒性でなく、そうしたものには、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；保存薬（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えばメチルもしくはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノールおよびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリシン；単糖類、二糖類および他の炭水化物（グルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む）；キレート化剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール；塩形成性対イオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭもしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
【０２８２】
本明細書において、調合物は、処置する特定の適応症のために必要に応じて１つより多くの活性化合物、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するもの、を含有することもできる。例えば、免疫抑制剤をさらに供給することが望ましいことがある。こうした分子は、意図された目的に有効な量での組合せで安定に存在する。
【０２８３】
活性成分は、例えばコアセルベーション法または界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルそれぞれの中に、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）の中に、またはマクロエマルジョンの中に封入することもできる。こうした技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示される。
【０２８４】
インビボ投与に使用することとなる調合物は、無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜による濾過により容易に達成することができる。
【０２８５】
本抗体は、非経口投与、皮下投与、腹腔内投与、肺内投与および鼻腔内投与、ならびに局所治療のために所望される場合には病巣内投与をはじめとする、あらゆる適する手段により投与される。非経口注入には、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮内投与または皮下投与が挙げられる。加えて、本抗体は、パルス注入、特に漸減用量の抗体でのパルス注入により適切に投与される。好ましくは、投薬は、その投与が短期的なものであるか長期的なものであるかに一部依存して、注射、最も好ましくは静脈内または皮下注射により施される。局所（ｔｏｐｉｃａｌ）投与、特に経皮投与、経粘膜投与、直腸内投与、経口投与または局部（ｌｏｃａｌ）投与、例えば所望の部位の近くにカテーテルを配置することによるもの、をはじめとする他の投与方法が考えられる。
【０２８６】
本発明の組成物は、例えば、顆粒、粉末、錠剤、カプセル、シロップ、座剤、注射剤、乳剤、エリキシル、懸濁液または溶液の形態であり得る。本組成物は、様々な経路の投与、例えば、経口投与による、経鼻投与による、直腸内投与、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射または腹腔内注射による投与のために調合することができる。以下の在家は、例として与えるものであり、本発明を限定するものと解釈すべきではない。
【０２８７】
経口、口腔内および舌下投与については、粉末、懸濁液、顆粒、錠剤、ピル、カプセル、ゲルキャップおよびキャプレットが、固体剤形として許容される。これらは、例えば、本発明の１つもしくはそれ以上の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは互変異性体を、少なくとも１つの添加剤、例えばデンプンまたは他の添加剤と混合することにより調製することができる。適する添加剤は、スクロース、ラクトース、セルロース糖、マンニトール、マルチトール、デキストラン、デンプン、寒天、アルジネート、キチン、キトサン、ペクチン、トラガカントゴム、アラビアゴム、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、アルブミン、合成もしくは半合成ポリマーまたはグリセリンである。場合により、経口剤形は、投与を助長する他の成分、例えば、不活性希釈剤、滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム）、保存薬（例えばパラベンもしくはソルビン酸）、酸化防止剤（例えば、アルコルビン酸、トコフェロールもしくはシステイン）、崩壊剤、結合剤、増粘剤、緩衝液、甘味料、着香剤または香料を含有することができる。錠剤およびピルは、当該技術分野において知られる適切なコーティング材でさらに処理することができる。
【０２８８】
経口投与のための液体剤形は、薬学的に許容される乳剤、シロップ、エリキシル、懸濁液および溶液の形態であり得、これらは、不活性希釈剤、例えば水を含有することができる。薬学的調合物および医薬は、油、水、アルコールおよびこれらの混合物など（しかし、それらに限定されない）の滅菌液を使用して懸濁液または溶液として調製することができる。経口または非経口投与のために、薬学的に適する界面活性剤、懸濁化剤、乳化剤を添加してもよい。
【０２８９】
上述したように、懸濁液は油を含むことができる。そうした油には、落花生油、ごま油、綿実油、トウモロコシ油およびオリーブ油が挙げられるが、これらに限定されない。懸濁製剤は、脂肪酸のエステル、例えば、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、脂肪酸グリセリドおよびアセチル化脂肪酸グリセリドも含有することができる。懸濁調合物は、エタノール、イソプロピルアルコール、ヘキサデシルアルコール、グリセロールおよびプロピレングリコールなど（しかし、これらに限定されない）のアルコールを含むことができる。ポリ（エチレングリコール）など（しかし、これに限定されない）のエーテル、鉱物油およびワセリンなどの石油炭化水素、ならびに水も懸濁調合物に使用することができる。
【０２９０】
経鼻投与のための薬学的調合物および医薬は、適切な溶媒（複数を含む）および場合により他の化合物、例えば安定剤、抗微生物薬、酸化防止剤、ｐＨ調節剤、界面活性剤、バイオアベイラビリティ調節剤およびこれらの組合せ（しかし、それらに限定されない）、を含有するスプレー剤またはエアロゾルであり得る。エアロゾル調合物のための噴射剤には、圧縮空気、窒素、二酸化炭素、または炭化水素系低沸点溶媒を挙げることができる。
【０２９１】
注射用剤形には、一般に、水性懸濁液または油性懸濁液が挙げられ、これらは、適する分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して調製することができる。注射用形態は、溶液相でまたは懸濁液の形態であり得、これは、溶媒または希釈剤を用いて調製される。許容される溶媒またはビヒクルには、滅菌水、リンゲル溶液または等張食塩水溶液が挙げられる。あるいは、滅菌油を溶媒または懸濁化剤として利用することができる。好ましくは、前記油または脂肪酸は不揮発性であり、これには、天然もしくは合成油、脂肪酸、モノ、ジもしくはトリグリセリドが挙げられる。
【０２９２】
注射のための薬学的調合物および／または医薬は、上に記載したような適切な溶液での再構成に適する粉末であり得る。これらの例には、凍結乾燥、回転乾燥もしくはスプレー乾燥粉末、非晶質粉末、顆粒、沈殿物または粒子が挙げられるが、これらに限定されない。注射のための調合物は、安定剤、ｐＨ調節剤、界面活性剤、バイオアベイラビリティ調節剤およびこれらの組合せを場合により含有することができる。
【０２９３】
直腸内投与のための薬学的調合物および医薬は、腸、Ｓ状結腸および／または直腸内で化合物を放出するために座剤、軟膏、浣腸剤、錠剤またはクリームの形態であり得る。肛門座剤は、本発明の１つもしくはそれ以上の化合物または本化合物の薬学的に許容される塩もしくは互変異性体を、許容されるビヒクル、例えばカカオ脂またはポリエチレングリコールと混合することにより調製され、前記ビヒクルは、通常の保管温度では固相で存在し、身体内部、例えば直腸内での薬物の放出に適する温度では液相で存在する。ソフトゼラチンタイプの調合物および座剤の調製に油を利用することもできる。懸濁化剤、例えば、ペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースまたはカルボキシメチルセルロースならびに懸濁液および保存薬も含有し得る懸濁調合物の調製に、水、食塩水、水性デキストロースおよび関連糖溶液ならびにグリセロールを利用することができる。
【０２９４】
持効性製剤を調製することができる。持効性製剤の適する例には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、成形品、例えばフィルム、またはマイクロカプセルの形態である。持効性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とｙエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばＬｕｐｒｏｎ  ＤｅｐｏｔＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから成る注射用マイクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーが、１００日間にわたって分子を放出することができる一方で、一定のヒドロゲルは、より短い期間、タンパク質を放出する。内包された抗体は、長期にわたりそのボディーの中にあり続けると、３７℃での湿度への暴露の結果として変性または凝集することがあり、その結果、生物活性が失われ、免疫原性が変化し得る。関与するメカニズムに依存して安定性についての合理的な戦略を編み出すことができる。例えば、その凝集メカニズムが、チオ−ジスルフィド交換による分子内Ｓ−−Ｓ結合の形成であることがわかった場合、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、含水率を制御し、適切な添加剤を使用し、特異的ポリマーマトリックス組成物を創り出すことにより、安定化を実現することができる。
【０２９５】
本発明の調合物は、本明細書において説明するように、短時間作用性、速放性、長時間作用性、または持効性であるように設計することができる。従って、本薬学的調合物は、制御放出用にも調合することができ、または遅速放出用にも調合することができる。
【０２９６】
本組成物は、例えば、ミセルもしくはリポソーム、または他の内包形態を含むこともでき、あるいは持続型放出形態で投与して長期保管および／または送達効果をもたらすことができる。従って、本薬学的調合物および医薬は、ペレットまたは柱体に圧縮し、蓄積注射またはインプラント、例えばステントとして筋肉内にまたは皮下に移植することができる。こうしたインプラントには、既知不活性材料、例えば、シリコーンおよび生体分解性ポリマーを利用することができる。
【０２９７】
上に記載した代表的な剤形に加えて、薬学的に許容される賦形剤およびキャリアが、一般に、当業者に知られており、故に、本発明に包含される。こうした賦形剤およびキャリアは、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９１）に記載されている（これは、本明細書に参考として組み込まれている）。
【０２９８】
具体的な投薬量は、疾病の状態、被験体の年齢、体重、全身の健康状態、性別および食事、投薬間隔、投与経路、排泄率、ならびに薬の組合せに依存して調節することができる。有効量を含有する上記剤形のいずれもが、十分に日常的な経験の範囲内であり、従って、十分に本発明の範囲内である。
【０２９９】
癌転移または癌転移に関連する骨損失の療法薬として有用なＭ−ＣＳＦ抗体は、多くの場合、他の天然免疫グロブリンまたは他の生体分子を実質的に含まずに調製されるであろう。また、好ましいＭ−ＣＳＦ抗体は、癌転移または癌転移に関連する骨損失に罹患している、または罹患する素因を有する哺乳動物に投与されたとき、最少の毒性を示すであろう。
【０３００】
本発明の組成物は、よく知られている従来の滅菌法により滅菌することができる。得られた溶液は、無菌条件下で使用のためにパッケージするか、濾過し、凍結乾燥させ、その凍結乾燥された製剤を投与前に滅菌溶液と併せる。本組成物は、生理条件に近づけるために、ｐＨ調節剤および緩衝剤、毒性調節剤など、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムおよび安定剤（例えば、１．２０％マルトースなど）のような薬学的に許容される補助物質を必要に応じて含有することができる。
【０３０１】
本発明のＭ−ＣＳＦ抗体は、リポソームによって投与することもでき、このリポソームは、様々なタイプの脂質および／またはリン脂質および／または界面活性剤から成る小胞であり、薬物（例えば、本明細書に開示する抗体および場合により化学療法薬）の送達に有用である。リポソームには、乳剤、フォーム、ミセル、可溶性単層、リン脂質分散液、ラメラ層などが挙げられ、Ｍ−ＣＳＦ抗体のターゲットを特定の組織に合わせるため、ならびに組成物の半減期を増させるためのビヒクルとしての役割を果たすことができる。例えば米国特許第４，３７８，０２８号および同第５，０１９，３６９号に記載されているような様々な方法をリポソームの調製のために利用することができる（これらの特許は、本明細書に参考として組み込まれている）。
【０３０２】
抗体を含有するリポソームは、例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８（１９８５）；  Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０（１９８０）；ならびに米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号に記載されているものなどの当該技術分野において知られている方法によって調製される。循環時間が向上されたリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物での逆相蒸発法により調製することができる。リポソームは、所望の直径を有するリポソームを生じるように規定の細孔サイズのフィルタを通して押出される。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントは、ジスルフィド交換反応により、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：  ２８６−２８８（１９８２）に記載されているようにリポソームに結合体化させることができる。場合により、化学療法薬（例えば、ドキソルビシン）をリポソームの中に含める［例えば、Ｇａｂｉｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８１（１９）：１４８４（１９８９）参照］。
【０３０３】
これらの組成物中のＭ−ＣＳＦ抗体の濃度は、幅広く、すなわち、約１０重量％未満、通常は少なくとも約２５重量％から、多くとも７５重量％乃至は９０重量％まで変化し得、ならびに選択される特定の投与方式に従って、主として液体体積、粘度などにより選択されるであろう。経口、局所および非経口投与可能な組成物の実際の調製方法は、当業者には周知または明らかであろう。それらは、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９５）に詳細に記載されている（これは、本明細書に参考として組み込まれている）。
【０３０４】
患者において癌転移および／または癌転移に関連する骨損失を処置するための本発明の組成物の有効量の決定は、当該技術分野においてよく知られている標準的な経験法により達成することができる。例えば、所定の投薬量のＭ−ＣＳＦ抗体で処置した被験体からの血清のインビボ中和活性は、Ｃｅｎｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５５：１２７９−８７，２０００に記載されているように、インビボでマウス単球（Ｍ−ＣＳＦに対して高レベルのレセプターを発現するＣＤ１１ｂ＋  細胞、ＣＤ１１細胞のサブセット）のＭ−ＣＳＦ誘導増殖および生存を阻害する血清の能力を判定するアッセイを使用して評価することができる。
【０３０５】
本発明の組成物は、癌転移および／または癌転移に関連する骨損失に既に罹患しているか、その素因を有する哺乳動物に、癌転移および／または癌転移に関連する骨損失を予防または少なくとも一部は抑制するために十分な量で投与される。これを達成するために妥当な量を「治療有効用量」と定義する。Ｍ−ＣＳＦ抗体の有効量は、変化し、その疾病の重篤度、処置を受ける患者の体重および全身の状態に依存するであろうが、一般に、約１．０μｇ／ｋｇ（体重）から約１００ｍｇ／ｋｇ、または約１０μｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、通常、１適用あたり約０．１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇまたは約１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇが用いられる。例えば、１回またはそれ以上の別投与によるにしても、または連続注入によるにしても、例えば抗体約１０μｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇまたは約３０μｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇが、患者に投与するための最初の候補投薬量である。投与は、その疾病に対する応答およびその療法に対する患者の寛容性に依存し、必要に応じて、毎日、１日おき、週１度、またはより少ない頻度である。疾病の症状の所望の抑制が発生するまで、長期間、例えば４、５、６、７、８、１０もしくは１２週またはそれ以上にわたる維持投薬量が必要であり得、投薬量は、必要に応じて調節することができる。この療法の進行は、従来の技法およびアッセイにより容易にモニターされる。
【０３０６】
処置する医師により選択される投薬レベルおよびパタンで、１回または複数回の組成物投与を行うことができる。疾病の予防または処置のための適切な抗体投薬量は、上で定義したような処置する疾病のタイプ；その疾病の重篤度および経過；その抗体が予防目的で投与されるのか、治療目的で投与されるのか；以前の療法；患者の臨床履歴；抗体に対する応答；ならびに掛かりつけの医師の自由裁量に依存するであろう。本抗体は、１回でまたは一連の処置にわたって適切に患者に投与される。
【０３０７】
とにかく、本調合物は、癌転移および／または癌転移に関連する骨損失を有効に予防するか、その重篤度を有効に最小にするために十分な時間にわたって一定の量のＭ−ＣＳＦ抗体を提供しなければならない。本発明の組成物は、単独で投与することができ、または癌転移および／または癌転移に関連する骨損失の処置のための当該技術分野において知られている他の療法と共に補助療法として投与することができる。
【０３０８】
本抗体組成物は、良好な医学的実践に合うようなやり方で調合され、計量分配され、投与されるであろう。これに関連して考慮する因子には、処置する特定の疾患、処置する特定の哺乳動物、その個々の患者の臨床状態、その疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与の日程計画、および医師に知られている他の因子が挙げられる。投与される抗体の治療有効量は、そうした考慮に左右されることとなり、ならびにＭ−ＣＳＦによって媒介される疾病、状態または疾患を予防、改善または処置するために、特に癌細胞を処置するために、最も特に腫瘍細胞転移を処置するために必要な最少量である。そうした量は、宿主に毒性である量または宿主の感染しやすさを有意に高める量より、好ましくは下である。
【０３０９】
本抗体は、問題の疾患を予防または処置するために現在使用されている１つ以上の薬剤とともに、必要ではないが場合によっては、調合される。例えば、癌の場合、本抗体は、化学療法薬と共に、または上に記載したようなＡＤＥＰＴで投与することができる。こうした他の薬剤の有効量は、その調合物中に存在する抗体の量、疾病、状態もしくは疾患または処置のタイプ、および上で論じた他の因子に依存する。一般に、これらは、本明細書において上で使用したのと同じ投薬量および投薬経路で、または従来利用されている投薬量の約１から９９％で使用される。
【０３１０】
本発明のもう１つの実施形態において、癌の処置をはじめとする上に記載した疾病、疾患または状態の処置に有用な材料を含有する製品を提供する。この製品は、容器およびラベルを含む。適する容器には、例えば、瓶、バイアル、注射器および試験管が挙げられる。これらの容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から作ることができる。この容器は、その状態の処置に有効な組成物を収容でき、無菌取り出し口を有し得る（例えば、この容器は、皮下注射針により穴をあけることができるストッパーを有する静脈内適用溶液用バッグまたはバイアルであり得る）。本組成物中の活性薬剤は、本発明の抗体である。容器上のまたは容器に付属するラベルは、その組成物が、選ばれた状態の処置に使用されることを示す。この製品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば、リン酸緩衝食塩水、リンゲル溶液およびデキストラン溶液を含む第二の容器をさらに含むことができる。さらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、注射器、および使用説明を伴う添付文書をはじめとする、市場および使用者の立場から望ましい他の材料を含むことができる。
【０３１１】
（免疫療法）
癌に罹患している患者の処置に有用な抗Ｍ−ＣＳＦ抗体には、腫瘍に対する強力な免疫応答を起こさせることができるもの、および直接細胞毒性作用をもたらすことができるものが挙げられる。これに関して、抗Ｍ−ＣＳＦ抗体は、補体媒介または抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）メカニズムにより腫瘍細胞の溶解を惹起することができ、これら両方のメカニズムが、エフェクター細胞Ｆｃレセプター部位または相補タンパク質との相互作用のために免疫グロブリン分子のインタクトなＦｃ部分を必要とする。加えて、腫瘍成長に対して直接生物学的効果を発揮する抗Ｍ−ＣＳＦ抗体が、本発明の実施において有用である。そうした直接細胞毒性抗体が作用できる可能性のあるメカニズムには、細胞成長の抑制、細胞分化の修飾、腫瘍血管新生因子プロフィールの修飾、およびアポトーシスの誘導が挙げられる。特定の抗Ｍ−ＣＳＦ抗体が抗腫瘍効果を発揮するメカニズムは、当該技術分野において一般に知られているような、ＡＤＣＣ、ＡＤＭＭＣ、補体媒介細胞溶解などを判定するために設計されたインビボアッセイを任意の数使用して評価することができる。
【０３１２】
一つの実施形態において、免疫療法は、分泌形のＭ−ＣＳＦに対してより膜結合形のＭ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦα）に対してのほうが高い親和性を有する抗体を使用して行われる。例えば、Ｍ−ＣＳＦαの切断部位に、もしくはその周囲に、または膜に隣接するＭ−ＣＳＦαの部分に特異的に結合する抗体を調製することができる。こうした抗体は、Ｍ−ＣＳＦαの可溶性活性部分の切断および放出を有益に抑制することもできる。
【０３１３】
抗Ｍ−ＣＳＦ抗体は、それらの「裸の」形もしくは結合体化していない形で投与することができ、またはそれらに結合体化した治療薬を有することができる。一つの実施形態において、抗Ｍ−ＣＳＦ抗体は、放射線増感剤として使用される。こうした実施形態では、抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を放射線増感物質に結合体化させる。本明細書において用いる用語「放射線増感剤」は、電磁放射線に対して放射線増感させるべき細胞の感度を増大させるために、または電磁放射線で処置することができる疾病の処置を促進するために治療有効量で動物に投与される分子、好ましくは低分子量分子と定義する。電磁放射線で処置することができる疾病には、新生物性疾患、良性および悪性腫瘍、ならびに癌性細胞が挙げられる。
【０３１４】
本明細書において用いる用語「電磁放射（線）」および「放射（線）」は、１０−２０から１００メートルの波長を有する放射線を包含するが、これに限定されない。本発明の好ましい実施形態では、γ線（１０−２０から１０−１３ｍ）、Ｘ線放射線（１０−１２から１０−９ｍ）、紫外線（１０ｎｍから４００ｎｍ）、可視光（４００ｎｍから７００ｎｍ）、赤外線（７００ｎｍから１．０ｍｍ）およびマイクロ波放射線（１ｍｍから３０ｃｍ）の電磁放射線が利用される。
【０３１５】
放射線増感剤は、電磁放射線の毒性効果に対する癌性細胞の感度を増大させることが知られている。現在、多数の癌治療プロトコルに、Ｘ線の電磁放射により活性化される放射線増感剤が利用されている。Ｘ線活性化放射線増感剤の例には、以下のものが挙げられるが、それらに限定されない：メトロニダゾール、ミソニダゾール、デスメチルミソニダゾール、ピモニダゾール、エタニダゾール、ニモラゾール、マイトマイシンＣ、ＲＳＵ  １０６９、ＳＲ  ４２３３、ＥＯ９、ＲＢ  ６１４５、ニコチンアミド、５−ブロモデオキシウリジン（ＢＵｄＲ）、５−ヨードデオキシウリジン（ＩＵｄＲ）、ブロモデオキシシチジン、フルオロデオキシウリジン（ＦＵｄＲ）、ヒドロキシウレア、シスプラシン、ならびに処置に有効なこれらの類似体および誘導体。
【０３１６】
癌の光力学的治療（ＰＤＴ）には、増感物質の放射線活性化剤として可視光が利用される。光力学的放射線増感剤の例には、以下のものが挙げられるが、それらに限定されない：ヘマトポルフィリン誘導体、Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（ｒ）、ベンゾポルフィリン誘導体、ＮＰｅ６、錫エチオポルフィリン（ＳｎＥＴ２）、フェオボルバイド−ａ、バクテリオクロロフィル−ａ、ナフタロシアニン、フタロシアニン、亜鉛フタロシアニン、ならびに処置に有効なこれらの類似体および誘導体。
【０３１７】
別の実施形態において、本抗体は、予め腫瘍にターゲットを合わせる際に利用するためのレセプター（例えばストレプタビジン）に結合体化させることができ、この場合、その抗体−レセプター結合体を患者に投与し、その後、キレート化剤を使用してその血行から未結合の結合体除去し、その後、細胞毒性剤（例えば、放射性核種）に結合体化させるリガンド（例えば、アビジン）を投与する。
【０３１８】
さらに、本発明は、検出できるように標識された形態の上記抗体を提供する。抗体は、放射性同位元素、親和性標識（例えば、ビオチン、アビジンなど）、酵素的標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、蛍光もしくは発光もしくは生物発光標識（例えば、ＦＩＴＣまたはローダミンなど）、常磁性原子などの使用により、検出できるように標識することができる。こうした標識を達成するための手順は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ，Ｌ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１８：３１５（１９７０）；  Ｂａｙｅｒ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．６２：３０８（１９７９）；  Ｅｎｇｖａｌ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：１２９（１９７２）；  Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１３：２１５（１９７６））参照。
【０３１９】
「標識」は、抗体に直接または間接的に結合体化させる検出可能な化合物または組成物を指す。標識は、それ自体によりそれ自体を検出することができる（例えば、放射性同位元素標識または蛍光標識）か、酵素的標識の場合には、検出可能な基質化合物または組成物の化学的修飾を触媒することができる。あるいは、標識は、それ自体では検出できないが、検出可能な別の物質（例えば、エピトープタグ、またはビオチン−アビジンなどの結合パートナー対の一方など）により結合される要素であり得る。従って、抗体は、その単離を助長する標識またはタグを含むことができ、ならびに抗体を特定する本発明の方法は、その標識またはタグとの相互作用によりＭ−ＣＳＦ／抗体を単離する工程を含む。
【０３２０】
例示的な治療用免疫結合体は、細胞毒性剤、例えば化学療法薬、毒素（例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物由来の酵素的に活性な毒素、またはそれらのフラグメント）に結合体化させた本明細書に記載の抗体、または放射性同位元素に結合体化させた本明細書に記載の抗体（すなわち、ラジオ結合体）を含む。融合タンパク質は、下でさらに詳細に説明する。
【０３２１】
免疫結合体生産は、米国特許第６，３０６，３９３号に記載されている。免疫結合体は、治療薬を抗体成分に直接結合体化させることにより調製することができる。一般的な技法は、Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４１：８３２−８３９（１９８８）；  Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４６：１１０１−１１０６（１９９０）；およびＳｈｉｈらの米国特許第５，０５７，３１３号に記載されている。この一般的は方法は、酸化された炭水化物部分を有する抗体成分と、少なくとも１つの遊離アミン官能基を有し、および多数の薬物、毒素、キレート化剤、ホウ素アデンドまたは他の治療薬が負荷されるキャリアポリマーとを反応させることを含む。この反応の結果、最初にシッフ塩基（イミン）結合が生じ、それを第二アミンへの還元により安定化して、最終結合体を形成することができる。
【０３２２】
キャリアポリマーは、好ましくは、アミノデキストランであるか、アミノ残基数が少なくとも５０のポリペプチドであるが、他の実質的に同等なポリマーキャリアも使用することができる。最終免疫結合体は、投与の容易さおよび処置での使用に有効なターゲッティングのため、哺乳動物の血清などの水性溶液に好ましくは可溶である。従って、キャリアポリマー上の官能基の可溶化により、最終免疫結合体の血清溶解性が向上されるであろう。特に、アミノデキストランが好ましいであろう。
【０３２３】
アミノデキストランキャリアとの免疫結合体を調製するプロセスは、典型的に、デキストランポリマー、有利には約１０，０００〜１００，０００の平均分子量のデキストランで始まる。そのデキストランを酸化剤と反応させて、その炭水化物環の一部の制御酸化を行って、アルデヒド基を生じさせる。この酸化は、従来の手順に従って、ＮａＩＯ４などの糖分解性化学試薬を用いて適便に行われる。
【０３２４】
酸化されたデキストランを、その後、ポリアミン、好ましくはジアミン、さらに好ましくはモノ−またはポリヒドロキシジアミンと反応させる。適するアミンには、エチレンジアミン、プロピレンジアミンまたは他の同様のポリメチレンジアミン、ジエチレントリアミンまたは同様のポリアミン、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンまたは他の同様のヒドロキシル化ジアミンもしくはポリアミンなどが挙げられる。そのデキストランのアルデヒド基に対して過剰なアミンを使用して、アルデヒド官能基のシッフ塩基基への実質的に完全な転化を確保する。
【０３２５】
ＮａＢＨ４、ＮａＢＨ３、ＣＮなどのような還元剤を使用して、結果として生じるシッフ塩基中間体の還元安定化を行う。結果として生じる付加体を、従来のサイジングカラムに通すことにより精製して、架橋デキストランを除去することができる。
【０３２６】
アミン官能基を導入するためにデキストランを誘導体化する他の従来的な方法、例えば、臭化シアンとの反応、その後のジアミンとの反応、を使用することもできる。
【０３２７】
その後、従来の手段により、例えばジクロロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）またはその水溶性変異体を使用して調製した、活性化形、好ましくは、カルボキシ活性化誘導体でのアミノデキストランを、負荷させる特定の薬物、毒素、キレート化剤、免疫修飾物質、ホウ素アデンドまたは他の治療薬の誘導体と反応させて、中間付加体を形成する。
【０３２８】
あるいは、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質またはリシンＡ−鎖などのポリペプチド毒素などをアミノデキストランに、グルタルアルデヒド縮合により、またはそのアミノデキストラン上のアミンとそのタンパク質上の活性化カルボキシル基を反応させることにより、カップリングさせることができる。
【０３２９】
放射性金属または磁気共鳴強化剤用のキレート化剤は、当該技術分野においてよく知られている。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）の誘導体が、代表である。典型的に、これらのキレート化剤は、そのキレート化剤をキャリアに結合させることができる基を側鎖上に有する。こうした基には、例えば、ベンジルイソチオシアネートが挙げられ、これにより、ＤＴＰＡまたはＥＤＴＡを、キャリアのアミン基にカップリングさせることができる。あるいは、キレート化剤上のカルボキシル基またはアミン基を、活性化、または事前の誘導体化およびその後のカップリングにより、全て、よく知られている手段により、キャリアとカップリグさせることができる。
【０３３０】
カルボランなどのホウ素アデンドは、従来の方法により抗体成分に結合させることができる。例えば、カルボランは、当該技術分野においてよく知られているように、ペンダント側鎖上のカルボキシル官能基を用いて調製することができる。こうしたカルボランのキャリア、例えばアミノデキストラン、への結合は、カルボランのカルボキシル基を活性化し、そのキャリア上のアミンと縮合させて、中間結合体を生成することにより、達成することができる。その後、そうした中間結合体を抗体成分に結合させて、下で説明するような処置に有用な免疫結合体を生成する。
【０３３１】
ポリペプチドキャリアをアミノデキストランの代わりに使用することができるが、そのポリペプチドキャリアは、鎖内に少なくとも５０のアミノ酸残基、好ましくは１００〜５０００のアミノ酸残基を有さねばならない。それらのアミノ酸の少なくとも一部は、リシン残基またはグルタメートもしくはアスパルテート残基でなければならない。リシン残基のペンダントアミンならびにグルタミンおよびアスパルテートのペンダントカルボキシレートは、薬物、毒素、免疫修飾物質、キレート化剤、ホウ素アデンドまたは他の治療薬の結合に適便である。適するポリペプチドキャリアの例には、ポリリシン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、それらのコポリマー、および結果として生じる負荷キャリアおよび免疫結合体に望ましい溶解性を付与するためにこれらのアミノ酸とその他、例えばセリン、の混合型ポリマーが挙げられる。
【０３３２】
抗体成分との中間結合体の結合体化は、抗体成分の炭水化物部分を酸化し、結果として生じたアルデヒド（およびケトン）と、薬物、毒素、キレート化剤、免疫修飾物質、ホウ素アデンドまたは他の治療薬を負荷させた後にキャリア上に残存するアミン基とを反応させることによって行う。あるいは、中間結合体は、治療薬を負荷させた後、中間結合体に導入されたアミン基により、被酸化抗体成分に結合させることができる。酸化は、例えばＮａＩＯ４もしくは他の糖分解試薬で化学的に、または例えばノイラミニダーゼおよびガラクトースオキシダーゼで酵素的に、適便に行うことができる。一般に、アミノデキストランキャリアの場合、治療薬を負荷させるためにそのアミノデキストランの全てのアミンが使用されるとはかぎらない。アミノデキストランの残存アミンが、被酸化抗体成分と縮合してシッフ塩基付加体を形成する。それを、その後、通常は水素化ホウ素還元試薬で還元安定化する。
【０３３３】
本発明の免疫結合体を生成するために、類似の手順を使用する。負荷させるポリペプチドキャリアは、抗体成分の被酸化炭水化物部分との縮合のために残存する遊離リシン残基を好ましくは有する。ポリペプチドキャリア上のカルボキシルは、例えばＤＣＣでの活性化および過剰なジアミンとの反応により、必要に応じてアミンに転化させることができる。
【０３３４】
最終免疫結合体は、従来の技法、例えば、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００でのサイジングクロマトグラフィーまたは１つもしくはそれ以上のＣＤ８４Ｈｙエピトープを使用する親和性クロマトグラフィーを使用して精製する。
【０３３５】
あるいは、免疫結合体は、抗体成分を治療薬と直接結合体化させることにより調製することができる。この一般手順は、治療薬を被酸化抗体成分に直接結合させること以外は、前記間接的結合体化法に類似している。
【０３３６】
他の治療薬を本明細書に記載のキレート化剤の代わりに使用することができることは、理解されるであろう。当業者は、過度の実験をせずともに結合体化機構を考え出すことができるであろう。
【０３３７】
さらなる実例として、ジスルフィド結合形成により被還元抗体成分のヒンジ領域に治療薬を結合させることができる。例えば、破傷風毒素ペプチドは、抗体成分へのそのペプチドの結合に使用される単一システイン残基を用いて構成することができる。代替として、ヘテロ二官能性架橋剤、例えば３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシニル（ＳＰＤＰ）を使用して、そうしたペプチドを抗体成分に結合させることができる。Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５６：２４４（１９９４）。こうした結合体化の一般的な技法は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、Ｗｏｎｇ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）；  Ｕｐｅｓｌａｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  １８７−２３０（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）；  Ｐｒｉｃｅ，「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  ６０−８４（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）参照。
【０３３８】
抗体と細胞毒性剤の結合体は、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジピン酸ジメチル・ＨＣＬ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、２，６−ジイソシアン酸トルイエン）、およびビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作られる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように調製することができる。炭素１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性核種の結合体化のための例示的なキレート化剤である（例えば、国際公開パンフレット第９４／１１０２６号参照）。
【０３３９】
上で説明したように、抗体のＦｃ領域内の炭水化物部分を使用して、治療薬に結合体化させることができる。しかし、このＦｃ領域は、抗体フラグメントがその免疫結合体の抗体成分として使用される場合には不在であってもよい。それにもかかわらず、抗体または抗体フラグメントの軽鎖可変領域に炭水化物部分を導入することができる。例えば、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５９１９（１９９５）；  Ｈａｎｓｅｎらの米国特許第５，４４３，９５３号参照。その操作した炭水化物を、その後、使用して、治療薬に結合させる。
【０３４０】
加えて、当業者には、結合体化方法の多数の可能な変形形態が認知されていよう。例えば、炭水化物部分を使用してポリエチレングリコールに結合させて、血液、リンパ液または他の細胞外液中のインタクトな抗体またはその抗原結合フラグメントの半減期を延長することができる。さらに、炭水化物部分および遊離スルフヒドリル基に治療薬を結合させることにより、「二価免疫結合体」を構築することができる。こうした遊離スルフヒドリル基は、抗体成分のヒンジ領域に位置し得る。
【０３４１】
（抗Ｍ−ＣＳＦ抗体融合タンパク質）
本発明では、１つ以上の抗Ｍ−ＣＳＦ抗体部分および免疫修飾物質または毒素部分を含む融合タンパク質の使用が考えられる。抗体融合タンパク質の製造方法は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、米国特許第６，３０６，３９３号参照。インターロイキン−２部分を含む抗体融合タンパク質は、Ｂｏｌｅｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．６：９４５（１９９５）、Ｎｉｃｏｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２：１６１（１９９５）、Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７８２６（１９９６）、Ｈａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２：１９５１（１９９６）、およびＨｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：４９９８（１９９６）によって記載されている。加えて、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ６：１２９（１９９５）には、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよび腫瘍壊死因子アルファ部分を含む融合タンパク質が記載されている。
【０３４２】
組み換え分子が１つ以上の抗体成分および毒素または化学療法薬を含む抗体−毒素融合タンパク質の製造方法も当業者に知られている。例えば、抗体シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）エキソトキシンＡ融合タンパク質は、Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：３９４（１９８９）、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８６１６（１９９１）、Ｂａｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５８６７（１９９２）、Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：３０５４（１９９３）、Ｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎ．６０：１３７（１９９５）、Ｆｏｍｉｎａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１０５６０  （１９９６）、Ｋｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：２８７２（１９９６）、およびＳｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎ．６５：５３８（１９９６）によって記載されている。ジフテリア毒素部分含有抗体−毒素融合タンパク質は、Ｋｒｅｉｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ７：５５３（１９９３）、Ｎｉｃｈｏｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：５３０２（１９９３）、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２８０３７（１９９５）、およびＶａｌｌｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８８：２３４２（１９９６）によって記載されている。Ｄｅｏｎａｒａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｕｍｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  １：１７７（１９９５）には、ＲＮａｓｅ部分を有する抗体−毒素融合タンパク質が記載されており、一方、Ｌｉｎａｒｄｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４−２５：２４３（１９９４）では、ＤＮａｓｅ  Ｉ成分を含む抗体−毒素融合タンパク質が製造された。Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２０９ｔｈ  ＡＣＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ａｎａｈｅｉｍ，Ｃａｌｉｆ．，Ａｐｒ．２−６，１９９５，Ｐａｒｔ  １，ＢＩＯＴ００５の抗体−毒素融合タンパク質中では、その毒素部分として、Ｇｅｌｏｎｉｎが使用された。さらなる例として、Ｄｏｈｌｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８９４５（１９９４）には、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）エンテロトキシン−Ａを含む抗体−毒素融合タンパク質が報告された。
【０３４３】
こうした結合体の調製に適切に利用される、実例となる毒素は、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅ  Ｉ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルス性タンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナスエキソトキシン、およびシュードモナスエンドトキシンである。例えば、Ｐａｓｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ４７：６４１（１９８６）、およびＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，ＣＡ−−Ａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ  ４４：４３（１９９４）参照。他の適する毒素は、当業者には周知である。
【０３４４】
本発明の抗体は、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法薬、国際公開パンフレット第８１／０１１４５号参照）を活性抗癌剤に転化させるプロドラッグ活性化酵素に抗体を結合体させることにより、ＡＤＥＰＴにおいても使用することができる。例えば、国際公開パンフレット第８８／０７３７８号および米国特許第４，９７５，２７８号参照。
【０３４５】
ＡＤＥＰＴに有用な免疫結合体の酵素成分には、それをそのより活性で細胞毒性の形態へ転化させるようにプロドラッグに対して作用することができるあらゆる酵素が挙げられる。
【０３４６】
本発明の方法に有用な酵素には、ホスフェート含有プロドラッグを遊離薬物に転化させるために有用なアルカリホスファターゼ；スルフェート含有プロドラッグを遊離薬物に転化させるために有用なアリールスルファターゼ；非毒性５−フルオロシトシンを抗癌薬、５−フルオロウラシルに転化させるために有用なシトシンジアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離薬物に転化させるために有用なセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペンチダーゼおよびカテプシン（例えば、カテプシンＢおよびＬ）などのプロテアーゼ；Ｄ−アミノ酸置換基を含有するプロドラッグを転化させるために有用なＤ−アラニンカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離薬物に転化させるために有用なβ−ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼなどの炭水化物開裂酵素；β−ラクタムで誘導体化された薬物を遊離薬物に転化させるために有用なβ−ラクタマーゼ；ならびにそれらのアミン窒素がフェノキシアセチルまたはフェニルアセチル基で誘導体化された薬物をそれぞれ遊離薬物に転化させるために有用なペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼなどのペニシリンアミダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、当該技術分野においてアブザイムとしても知られている、酵素活性を有する抗体を使用して、本発明のプロドラッグを遊離活性薬物に転化させることができる（例えば、  Ｍａｓｓｅｙ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：４５７−４５８（１９８７）参照）。抗体−アブザイム結合体は、腫瘍細胞集団へのアブザイムの送達のために、本明細書において説明するとおり調製することができる。
【０３４７】
本発明の酵素は、上で論じたヘテロ二官能性架橋試薬の使用などの当該技術分野においてよく知られている技法により、抗体に共有結合させることができる。あるいは、当該技術分野においてよく知られている組換えＤＮＡ技法（例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９８４）参照）を用いて、本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部分に連結している、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を含む、融合タンパク質を構築することができる。
【０３４８】
（非治療用途）
本発明の抗体は、Ｍ−ＣＳＦに対する親和精製剤として使用することができ、またはＭ−ＣＳＦタンパク質についての診断アッセイ、例えば、特定の細胞、組織もしくは血清におけるその発現の検出に使用することができる。本抗体は、インビボ診断アッセイに使用することもできる。一般に、これらの目的には、イムノシンチオグラフィーを使用して腫瘍を局在定位することができるように、本抗体を放射性核種（例えば、１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、３２Ｐまたは３５Ｓ）で標識する。
【０３４９】
本発明の抗体は、競合結合アッセイ、直接および間接サンドウィッチアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、ならびに免疫沈降アッセイなどの周知アッセイ方法いずれにおいても利用することができる。Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７）。本抗体は、当該技術分野において知られている方法を使用して腫瘍サンプルを標識する、免疫組織化学に使用することもできる。
【０３５０】
便宜上、本発明の抗体は、キット（すなわち、所定量の試薬と診断アッセイを行うための説示とを併せてパッケージしたもの）で提供することができる。本抗体が酵素で標識されている場合、キットは、その酵素に必要な基質および補助因子（例えば、検出可能な発色団または蛍光体を生じさせる基質前駆体）を含むであろう。加えて、他の添加剤、例えば、安定剤、緩衝液（例えば、ブロック緩衝液または溶解緩衝液）などを含むことができる。様々な試薬の相対量を幅広く変化させて、そのアッセイの感度を実質的に最適化する試薬の溶液中濃度をもたらすことができる。詳細には、試薬は、溶解すると適切な濃度を有する試薬溶液をもたらす賦形剤を含む乾燥粉末、通常は凍結乾燥された乾燥粉末として提供することができる。
【０３５１】
本発明を以下の実施例により説明する。これらの実施例は、いかなる点においても制限とは解釈されない。
【実施例】
【０３５２】
（実施例１）
この実施例は、Ｍ−ＣＳＦ抗体ＲＸ１および５Ａ１が、種特異的であること、ならびに抗体ＲＸ１、ＭＣ１およびＭＣ３が、ヒトＭ−ＣＳＦ活性を中和することを示すものである。ＲＸ１は、本出願の出願日より１年以上前に入手した市販の抗体である。例示的な市場の供給源には、マウス抗ヒトＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体クローン１１６、６９２および２１（Ａｎｏｇｅｎ）；抗ヒトＭ−ＣＳＦ抗体クローン２１１１３．１３１、２６７３０および２６７８６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）；ならびに抗ヒトＭ−ＣＳＦ抗体クローンＭ１６（Ａｎｔｉｇｅｎｉｘ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３５３】
ＲＸ１および５Ａ１の中和活性を検査するために、Ｍ−ＮＦＳ−６０細胞系の増殖アッセイを使用した（米国微生物系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）アクセッション番号ＣＲＬ−１８３８；米国、メリーランド州、ロックヴィルのＡＴＣＣから入手でき、Ｃａｓ−Ｂｒ−ＭｕＬＶ野生型マウス環境栄養性レトロウイルスで誘導された骨髄性白血病に由来するものであり、インターロイキン３とＭ−ＣＳＦの両方に応答し、ならびにレトロウイルスの組み込みにより生じたトランケート型ｃ−ｍｙｂ癌原遺伝子を含有する）。Ｍ−ＮＦＳ−６０の増殖は、用量依存的に活性Ｍ−ＣＳＦを必要とする。このアッセイでは、Ｍ−ＮＦＳ−６０細胞を洗浄し、１０％ＦＢＳおよび３０００Ｕ／ｍＬのＭ−ＣＳＦおよび１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含有するＲＰＭＩ  １６４０培地にプレーティングした。ヒトまたはマウス特異的、組換えヒトＭ−ＣＳＦ（最終濃度１０ｎｇ／ｍＬで）を様々な濃度の抗生物質と共にインキュベータの中で１時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。インキュベーション後、その混合物を９６ウエルマイクロタイタプレート内のＭ−ＮＦＳ−６０培養物に添加した。１ウエルあたりの全アッセイ量は、１００μＬであり、１０ｎｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦを含有し、図５に示す抗体濃度であった。細胞を３７℃、５％ＣＯ２下で７２時間インキュベートした後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により細胞数を定量した。上述のアッセイを抗体ＭＣ３およびＭＣ１について繰り返した。
【０３５４】
図５に示すように、Ｍ−ＣＳＦ抗体ＲＸ１および５Ａ１は、種特異的である。細胞増殖は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏアッセイからの蛍光読み取り値として提示し、これは細胞数に対して直線的である。ＲＸ１および５Ａ１の種特異的中和活性は、ヒトまたはマウスＭ−ＣＳＦ、いずれかの存在下でＭ−ＮＦＳ−６０を阻害するその能力によって示される。最後に、図５Ｂに示すように、抗体ＭＣ３およびＭＣ１もＭ−ＣＳＦ活性の有効な阻害剤である。
【０３５５】
（実施例２）
この実施例は、抗体ＲＸ１が、５ｍｇ／ｋｇの用量でヒト異種移植モデルにおいて骨溶解を有効に抑制することを示すものである。週齢４〜７週、平均体重約２０ｇの雌ヌードマウスをこの試験において使用した。１０μＬの食塩水に浮遊させた腫瘍細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、３ｘ１０５）を右頸骨骨髄腔に注射した。腫瘍接種の１日後に後肢の放射線写真を撮ってベースライン画像を得、注射により生じた骨折をチェックした。マウスを、６週間にわたって週１回、５ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射するＰＢＳおよびＲＸ１を含む処置グループに、１グループにつき１０匹で無作為に割り当てた。試験終了時に、再び後肢の放射線写真を撮り、骨損傷についてベースラインと比較した。腫瘍により生じた骨損傷の程度は、図６に示すとおり定義した。５ｍｇ／ｋｇのＲＸ１で処置したグループは、腫瘍に起因する損傷からの骨の統計学的に有意な保護を示した。
【０３５６】
（実施例３）
この実施例は、ヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を有するマウスに抗体ＲＸ１を５ｍｇ／ｋｇの濃度で投与したとき、転移数が減少したことを示すものである。
【０３５７】
週齢４〜７週、平均体重約２０ｇの雌ヌードマウスをこの試験に使用した。１０μＬの食塩水に浮遊させた腫瘍細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、３ｘ１０５）を右頸骨骨髄腔に注射した。腫瘍接種の１日後に右肢の放射線写真を撮ってベースライン画像を得、注射により生じた骨折をチェックした。マウスを、６週間にわたって週１回、５ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射するＰＢＳおよびＲＸ１を含む処置グループに、無作為にグループ分けした。試験終了時、各処置グループの肢を採取し、転移性肺小結節の計数のためにブアン溶液中に固定した。
【０３５８】
図７に示すように、ヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を有するヌードマウスに抗体ＲＸ１を５ｍｇ／ｋｇの用量で投与すると、転移数は減少する。
【０３５９】
（実施例４）
この実施例は、ＲＸ１抗体のヒト化の手順を詳説するものである。類似した手順を用いて５Ｈ４、ＭＣ１およびＭＣ３をヒト化する。
【０３６０】
（ヒト化ＲＸ１  軽鎖および重鎖についての遺伝子設計）
マウスＲＸ１についてのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図４Ｂに記載する。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅまたは類似のデータベースを使用して同定されたヒト抗体の配列を使用して、ヒト化抗体のフレームワークを提供する。ヒト化重鎖の配列を選択するために、マウスＲＸ１  重鎖配列とヒト抗体重鎖の配列とのアラインメントを行う。各位置においてヒト抗体アミノ酸をヒト化配列に対して選択するが、但し、その位置が、下に定義する４つのカテゴリーのうちのいずれの１つにも入らないことを条件とし、入る場合には、マウスＲＸ１アミノ酸を選択する：
（１）その位置が、Ｋａｂａｔ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２５，９６１−９６９（１９８０）により定義されたような、相補鎖決定領域（ＣＤＲ）内に入る；
（２）そのヒト抗体アミノ酸が、ヒト重鎖のその位置では珍しいのに対し、そのマウスＲＸ１アミノ酸は、ヒト重鎖のその位置に一般的である；
（３）その位置が、マウスＲＸ１  重鎖のアミノ酸配列においてＣＤＲに直接隣接している；または
（４）そのマウスＲＸ１抗体の３次元モデリングが、そのアミノ酸が抗原結合領域に物理的に近いことを示唆している。
【０３６１】
ヒト化軽鎖の配列を選択するために、マウスＲＸ１  軽鎖配列とヒト抗体軽鎖の配列とのアラインメントを行う。各位置においてヒト抗体アミノ酸をヒト化配列に対して選択するが、その位置も、上に記載した下に繰り返すカテゴリーの１つに入らないことを条件とする：
（１）ＣＤＲ；
（２）ヒト抗体より典型的なマウスＲＸ１アミノ酸；
（３）ＣＤＲに隣接；または
（４）結合領域への３次元近接の可能性。
【０３６２】
前記重鎖および軽鎖遺伝子の実際のヌクレオチド配列は、次のように選択する：
（１）ヌクレオチド配列が、上に記載したとおり選択したアミノ酸をコードする；
（２）これらのコード配列の５’（前記ヌクレオチド配列は、リーダー（シグナル）配列をコードする）。これらのリーダー配列を抗体の代表として選択した；
（３）それらのコード配列３’（前記ヌクレオチド配列は、マウスＲＸ１配列の一部である、マウス軽鎖Ｊ５セグメントおよびマウス重鎖Ｊ２セグメントに続く配列である）。これらの配列は、スプライス供与シグナルを含有するため含める；
（４）その配列の各末端において、Ｘｂａ  Ｉ部位は、そのＸｂａ  Ｉ部位で切断し、ベクターのＸｂａ  Ｉ部位にクローニングすることができる。
【０３６３】
（ヒト化軽鎖および重鎖遺伝子の構築）
重鎖を合成するために、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３８０Ｂ  ＤＮＡシンセサイザーを使用して４つのオリゴヌクレオチドを合成する。それらのオリゴヌクレオチドのうちの２つは、重鎖の各鎖の一部であり、各オリゴヌクレオチドは、アニーリングできるように、約２０ヌクレオチドまで次のものとオーバーラップしている。協力してそれらのオリゴヌクレオチドが、全ヒト化重鎖可変領域をカバーし、その各末端の少数の余分なヌクレオチドによりＸｂａ  Ｉ部位での切断が可能となる。それらのオリゴヌクレオチドをポリアクリルアミドゲルから精製する。
【０３６４】
標準的な手順によりＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して、各オリゴヌクレオチドをリン酸化する（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））。リン酸化されたオリゴヌクレオチドをアニーリングするために、それらを共に、４０μＬのＴＡ（３３ｍＭ  Ｔｒｉｓアセテート（ｐＨ７．９）、６６ｍＭ  酢酸カリウム、１０ｍＭ  酢酸マグネシウム）に各々約３．７５ｕＭの濃度で懸濁させ、４分間、９５℃に加熱し、ゆっくりと４℃に冷却する。各オリゴヌクレオチドの反対の鎖を合成することによりそれらのオリゴヌクレオチドから相補遺伝子を合成するために、以下の成分を最終量１００ｕＬで添加する：
１０ｕＬ              アニーリングしたオリゴヌクレオチド
０．１６ｍＭ          各デオキシリボヌクレオチド
０．５ｍＭ            ＡＴＰ
０．５ｍＭ            ＤＴＴ
１００ｕｇ／ｍＬ      ＢＳＡ
３．５ｕｇ／ｍＬ      Ｔ４  ｇ４３プロテイン（ＤＮＡポリメラーゼ）
２５ｕｇ／ｍＬ      Ｔ４  ｇ４４／６２プロテイン（ポリメラーゼ補助タンパク質）
２５ｕｇ／ｍＬ        ４５プロテイン（ポリメラーゼ補助タンパク質）。
【０３６５】
この混合物を３７℃で３０分間インキュベートする。その後、１０ｕのＴ４  ＤＮＡリガーゼを添加し、３７℃で３０分間のインキュベーションを再び開始する。それらの反応物を７０℃で１５分間インキュベートすることにより、ポリメラーゼおよびリガーゼを不活性化する。Ｘｂａ  Ｉで遺伝子を消化するために、その反応物に２００ｕｇ／ｍＬのＢＳＡおよび１ｍＭのＤＴＴを含有する５０μＬの２  ｘ  ＴＡ、４３ｕＬの水および５ｕＬ中５０ｕのＸｂａ  Ｉを添加する。その反応物を３時間、３７℃でインキュベートし、その後、ゲルで精製する。Ｘｂａ  Ｉフラグメントをゲルから精製し、標準的な方法によりプラスミドｐＵＣ１９のＸｂａ  Ｉ部位にクローニングする。標準的な技法を使用してプラスミドを精製し、ジデオキシ法を使用して塩基配列を決定する。
【０３６６】
ヒト化軽鎖および重鎖を発現するプラスミドの構築は、軽鎖および重鎖Ｘｂａ  Ｉフラグメントをそれが挿入されたｐＵＣ１９プラスミドから単離し、その後、それを適切な発現ベクターのＸｂａ  Ｉ部位に挿入することによって達成され、その発現ベクターが、適切な宿主細胞にトランスフェクトされると、高レベルの相補重鎖を発現することとなる。
【０３６７】
（ヒト化抗体の合成および親和性）
発現ベクターをマウスＳｐ２／０細胞にトランスフェクトし、プラスミドを組み込む細胞を、標準的な方法により発現ベクターによってもたらされる選択可能なマーカー（複数を含む）の基に選択する。これらの細胞が、Ｍ−ＣＳＦに結合する抗体を分泌したことを検証するために、それらの細胞からの上清を、Ｍ−ＣＳＦを発現することが知られている細胞と共にインキュベートする。洗浄後、それらの細胞をフルオレセインに結合体化したヤギ抗ヒト抗体と共にインキュベートし、洗浄し、ＦＡＣＳＣＡＮサイトフルオロメータで蛍光について分析する。
【０３６８】
次の実験のために、ヒト化抗体を生産する細胞をマウスに注射し、結果として生じた腹水を回収する。標準的な技法に従ってＡｆｆｉｇｅｌ−１０支持体（カリフォルニア州、リッチモンドのＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて調製したヤギ抗ヒト免疫グロブリン抗体の親和性カラムを通すことにより、その腹水からヒト化抗体を実質的に均質に精製する。元のマウスＲＸ１抗体を基準にしてヒト化抗体の親和性を判定するために、当該技術分野において知られている技法に従って競合結合実験を行う。
【０３６９】
（実施例４Ａ）
この実施例は、Ｈｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭＲＸ１抗体のクローニングおよび発現、ならびにそうした抗体の精製、および結合活性についての検査を説明するものである。Ｈｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ５Ｈ４、ＭＣ１およびＭＣ３抗体は、類似の手順を使用して調製する。
【０３７０】
（Ｈｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ配列の設計）
抗体可変ドメインのＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＴＭは、抗体の結合活性を維持しながら免疫原性を低下させる方法として、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａにより説明されている［例えば、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａらの米国特許第５，７６６，８８６号；  Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７：８０５−８１４（１９９４）参照］。この方法に従って、各可変領域アミノ酸に置換のリスクを割り当てた。アミノ酸置換は、次の３つのカテゴリーのうちの一つに分類される：（１）低リスク変更は、免疫原性を低下させる可能性が最も高く、抗原結合を破断する機会が最も少ないものであり；（２）中リスク変更は、免疫原性をさらに低下させるであろうが、抗原結合またはタンパク質フォールディングに影響を及ぼす機会がより多いものであり；（３）高リスク残基は、結合にまたは抗体の構造の維持に重要であり、抗原結合またはタンパク質フォールディングに影響を及ぼすであろうリスクが最も高いものである。プロリンの三次元構造的役割のため、プロリンにおける修飾は、その位置が典型的には低リスク位置であったとしても、一般には少なくとも中リスク変更での修飾であると見なされる。置換的変更は好ましいが、挿入および欠失も可能である。図４Ｂおよび４Ｃは、マウスＲＸ１  軽鎖および重鎖の各アミノ酸残基についてのリスク割り当てを示すものであり、それぞれ、高、中または低リスク変更として類別されている。
【０３７１】
この方法を使用して、マウスＲＸ１抗体の軽鎖および重鎖の可変領域をＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭした。低リスク位置でのこの方法による修飾の候補であるアミノ酸残基は、マウス可変領域のアミノ酸配列とヒト可変領域配列とのアラインメントを行うことにより特定した。個々のＶＨもしくはＶＬ配列またはヒトコンセンサスＶＨもしくはＶＬ配列をはじめとするあらゆるヒト可変領域を使用することができる。いずれかの数の低リスク位置または全ての低リスク位置のアミノ酸残基を変更することができる。図１９Ａ〜ＢにおけるＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ「低リスク」重鎖配列には、ヒトコンセンサスＶｈ２（Ｋａｂａｔに基づくもの）をテンプレートとして使用し、マウスアミノ酸残基とヒトアミノ酸残基が低リスク位置において異なる各位置には、そのマウス残基をヒト残基で置換するアミノ酸修飾を導入した。図２０Ａ〜ＢにおけるＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ「低リスク」軽鎖配列には、ヒトコンセンサスκ３（Ｋａｂａｔに基づくもの）をテンプレートとして使用し、マウスアミノ酸残基とヒトアミノ酸残基が低リスク位置において異なる各位置には、そのマウス残基をヒト残基で置換するアミノ酸修飾を導入した。合計１６のアミノ酸低リスク修飾を軽鎖に対して行い、８の低リスク修飾を重鎖に対して行った。
【０３７２】
同様に、全ての低および中リスク位置でのこの方法による修飾の候補であるアミノ酸残基を、マウス可変領域のアミノ酸配列とヒト可変領域配列とのアラインメントを行うことにより特定した。いずれかの数の低もしくは中リスク位置または全ての低および中リスク位置のアミノ酸残基を変更することができる。図１９Ａ〜ＢにおけるＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ重鎖配列には、ヒトコンセンサスＶｈ２（Ｋａｂａｔに基づくもの）をテンプレートとして使用し、マウスアミノ酸残基とヒトアミノ酸残基が低またはリスク位置において異なる各位置には、そのマウス残基をヒト残基で置換するアミノ酸修飾を導入した。図２０Ａ〜ＢにおけるＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ軽鎖配列には、ヒトコンセンサスκ３（Ｋａｂａｔに基づくもの）をテンプレートとして使用し、マウスアミノ酸残基とヒトアミノ酸残基が低またはリスク位置において異なる各位置には、そのマウス残基をヒト残基で置換アミノ酸修飾を導入した。合計１９の低および中リスクアミノ酸修飾を軽鎖に対して行い、１２の低および中リスク修飾を重鎖に対して行った。
【０３７３】
図２１Ａ〜Ｂに示すような、５４位での修飾をマウスに戻した「代替低リスク」軽鎖配列も調製した。図２１Ａ〜Ｂに示すような、５４〜５６位での修飾をマウスに戻した「代替低＋中リスク」軽鎖配列も調製した。
【０３７４】
最後に、ヒト生殖細胞系ＶＫ６サブグループ２−１−（１）Ａ１４をテンプレートとして使用して、図２２Ａ〜Ｂに示すようなＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ「低＋中リスク」軽鎖Ｖ領域配列も生産した。
【０３７５】
本発明では、グリコシル化部位を表す図４Ａのアミノ酸４１〜４３（ＮＧＳ）の保持も考えられる。あるいは、アミノ酸４１〜４３のうちの１つだけまたは２つ（例えばＮＧ）が保持されこともある。
【０３７６】
（永久細胞系発生のための発現ベクターの調製）
上で説明した重鎖および軽鎖Ｖ領域配列の各々を抗体由来のシグナル配列と共にコードするＤＮＡフラグメントを、人工ヌクレオチド合成を使用して構築した。上で説明した軽鎖Ｖ領域アミノ酸配列の各々をコードするＤＮＡを、ヒトκ軽鎖定常領域を含有するベクターｐＭＸＰ１０に挿入した。上で説明した重鎖Ｖ領域アミノ酸配列の各々をコードするＤＮＡを、ヒトγ−２重鎖定常領域を含有するベクターｐＭＸＰ６に挿入した。図２９Ａ、２９ｂおよび３０に提示する配列を有するヒトγ−１（ｃＤＮＡ）およびγ−４（ゲノムおよびｃＤＮＡ）定常領域に融合した重鎖Ｖ領域アミノ酸配列を含有する追加のベクターを構築した。これらのベクターの全てが、ｈＣＭＶプロモータおよびマウスκ軽鎖３’非翻訳領域ならびに選択可能マーカー遺伝子、例えば、Ｇ４１８−またはヒスチジノール−耐性トランスフェクタントそれぞれの選択のためのｎｅｏまたはｈｉｓを含有する。これらの軽鎖および重鎖ベクターを表２および３にそれぞれ記載する。
【０３７７】
【表２】
0005422101.tif 000020
【０３７８】
【表３】
0005422101.tif 000021
次に、所望のＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ軽鎖プラス重鎖遺伝子（γ−１、γ−２およびγ−４）を含むベクターを構築した。これらの「２−遺伝子」ベクターは、ｈＣＭＶプロモータの制御下で各抗体鎖、重鎖および軽鎖をコードする遺伝子、ＣＭＶスプライス供与体、ＳＶ４０  １６Ｓスプライスレセプター、ならびにポリＡ部位を含むマウスκ軽鎖３’非翻訳ＤＮＡを含有する。これらは、ｎｅｏまたはｈｉｓなどの選択可能マーカー遺伝子、およびアンピシリン耐性遺伝子も含有する。重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子の両方を含有するベクターを表４に記載する。軽鎖および重鎖遺伝子各々の２つのコピーを含むベクター（４つの遺伝子ベクター）も構築することができる。
【０３７９】
【表４】
0005422101.tif 000022
【０３８０】
【表５】
0005422101.tif 000023
（一過性発現のための発現ベクターの調製）
上で説明した軽鎖または重鎖のいずれかを含有するベクターを一過性トランスフェクションのためにも構築した。これらのベクターは、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス核抗原を発現するＨＥＫ２９３細胞での複製のために、ｎｅｏまたはｈｉｓ遺伝子の代わりにＥｐｓｔｅｉｎ−ＢａｒｒウイルスｏｒｉＰを含有すること以外は、永久トランスフェクションについて上で説明したものと同様である。一過性トランスフェクションのためのベクターを表５および６に記載する。
【０３８１】
【表６】
0005422101.tif 000024
（ＨＥＫ２９３Ｅ細胞におけるＨｕｍａｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＲＸ１の一過性発現）
上で説明したＥｐｓｔｅｉｎ−ＢａｒｒウイルスからのｏｒｉＰおよび軽鎖または重鎖遺伝子を各々が含有する別個のベクターをＨＥＫ２９３Ｅ細胞に一過的にトランスフェクトした。一過的にトランスフェクトした細胞を１０日以下の間インキュベートさせておき、その後、上清を回収し、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して抗体を精製した。２９３Ｅ細胞の一過性トランスフェクションにより生産されたタンパク質を下の表７に記載する。
【０３８２】
【表７】
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（永久トランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞の発生）
軽鎖および重鎖遺伝子各々のコピー１つを共に含有する上（表４）に記載のベクターをＥｘ−Ｃｅｌｌ３０２適応ＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクトする。Ｅｘ−Ｃｅｌｌ  ３０２培地中での浮遊成長に適合させたＣＨＯ−Ｋ１細胞を、典型的には４０ｕｇの線状化ベクターと共にエレクトロポレーションにかける。あるいは、線状化ＤＮＡを線状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と複合させ、トランスフェクションに使用することができる。１％ＦＢＳおよびＧ４１８を補足したＥｘ−Ｃｅｌｌ  ３０２培地が入っている９６ウエルプレートに、それらの細胞をプレーティングする。９６ウエルプレート内でクローンをスクリーニングし、各トランスフェクションからのクローンのトップから約１０％を、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ  ３０２培地が入っている２４ウエルプレートに移す。
【０３８３】
Ｅｘ−Ｃｅｌｌ  ３０２培地中、２４ウエルプレートで、７および１４日間の培養物成長についての生産性の検定を行い、この時、ＩｇＧについての免疫グロブリンＥＬＩＳＡアッセイにより、培養物の上清を分泌された抗体のレベルについて検査する。
【０３８４】
Ｅｘ−Ｃｅｌｌ  ３０２培地が入っているフラスコにトップクローンを移して振盪する。細胞を浮遊成長に適合させたらすぐにＥＸ−Ｃｅｌｌ  ３０２培地中のこれらのクローンで振盪フラスコ検査を行う。２５ｍＬの培地が入っている１２５ｍＬエルレンマイヤーフラスコ内で１０日以下の間、細胞を成長させる。インキュベーション期間の少なくとも１日おきには気体交換ができるようにフラスコを開け、各インキュベーション期間終了時、ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡによってその培地中の免疫グロブリンポリペプチドのレベルを判定する。２つまたは３つの多ユニット転写ベクターでの同細胞系の多重逐次トランスフェクションの結果、免疫グロブリン生産レベルのさらなる増加、好ましくは３００μｇ／ｍＬまたはそれ以上への増加を示すクローンおよび細胞系が生じる。
【０３８５】
（精製）
本発明のベクターおよび全ての系統から免疫グロブリンポリペプチドを精製するためのプロセスを設計することができる。当該技術分野においてよく知られている方法に従って、細胞を終結後に濾過によって除去する。濾液をプロテインＡカラムに充填する（必要な場合には、複数回通す）。カラムを洗浄し、その後、発現および分泌された免疫グロブリンポリペプチドをカラムから溶離する。抗体産物の調製のために、ウイルス不活性化工程としてプロテインＡプールを低ｐＨで保持する（最低３０分間、最高１時間にわたってｐＨ３）。次に吸着カチオン交換工程を用いて、その産物をさらに精製する。吸着分離カラムからの溶離物をウイルス保持フィルタに通して、潜在的ウイルス粒子をさらに取り除く。その濾液を、その産物が結合しないアニオン交換カラムに通すことによりさらに精製する。最後に、産物をダイアフィルトレーションによって調合緩衝液に移すことにより、精製プロセスを終える。保持物を少なくとも１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度に調整し、安定剤を添加する。
【０３８６】
（結合活性）
組換えＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体のＭＣＳＦ結合活性を評価する。プロテインＡカラムに通すことにより、振盪フラスコ培養上清からタンパク質を精製し、その後、Ａ２８０により濃度を決定する。結合アッセイは、上の実施例１において説明しように、または下の実施例１２において説明するように行う。Ｉｍｍｕｌｏｎ  ＩＩプレートを、ＰＢＳコーティング溶液中で予め希釈したｓＭ−ＣＳＦでプレコートして、それをマイクロプレートに固定する。０．２５から２０ｕｇ／ｍＬにわたる様々な被検濃度のＭ−ＣＳＦを５０ｕＬ／ウエルで添加し、４℃で一晩インキュベートする。その後、プレートをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄する。ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎに１％ＢＳＡを添加し、その後、３７℃で３０分インキュベートすることによって、ブロッキングを行う。免疫グロブリンポリペプチドの希釈物をＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ  １％ＢＳＡ溶液中で調製する。２または３倍系列希釈物を調製し、二重反復または三重反復で添加する（１００ｕＬ／ウエル）。３７℃で９０分インキュベートした後、そのマイクロプレートをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄する。シグナルを発生させるために、ペルオキシダーゼに結合体化したヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ特異的またはＦｃ特異的）二次抗体を各ウエルに添加し、６０分間、３７℃でインキュベートし、その後、クエン酸緩衝液プラス０．０１２％Ｈ２Ｏ２中０．４ｍｇ／ｍＬでＯＰＤを添加する。室温で５〜１０分後、１００ｕＬの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４の添加によりアッセイを停止させ、プレートを４９０ｎｍで読み取る。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ特異的）抗体とヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体の両方を利用した。
【０３８７】
（実施例５）
以下の実施例は、修飾または非修飾ＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域を有するＲＸ１  Ｈｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体をはじめとする、ＲＸ１由来の抗体またはＲＸ１競合抗体などのＭ−ＣＳＦ特異的抗体を使用してヒトを処置する手順を詳説するものである。ＭＣ１もしくはＭＣ３由来の抗体またはＭＣ１もしくはＭＣ３競合抗体についても、この手順をなぞることができる。予測される効能を生じる投薬範囲は、２ｕｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇである。この概算は、実験データにより実証される以下の原理に基づくものである：
ヒト血漿中のＭ−ＣＳＦレベルの測定値（健康な患者と乳癌患者の両方）は、約１ｎｇ／ｍＬである。Ｍ−ＣＳＦ中和抗体ＲＸ１は、１ｎｇ／ｍＬのヒトＭ−ＣＳＦに対して２ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０測定値を有する。従って、ヒト血漿中の有効抗体濃度は、そのＥＣ５０の１０から５０，０００倍、すなわちヒト血漿中、抗体２０ｎｇ／ｍＬから１００ｕｇ／ｍＬであると予測される。ＰＫ試験に基づき、ヒトの患者においてこの濃度を実現するためには、２μｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇの投薬が、血漿中、２０ｎｇ／ｍＬから１００ｕｇ／ｍＬの抗体濃度を達成するために必要である。
【０３８８】
（実施例６）
この実施例は、皮下モデルにおける抗Ｍ−ＣＳＦモノクローナル抗体の抗癌活性を評価するための手順を詳述するものである。上の実施例２は、抗Ｍ−ＣＳＦモノクローナル抗体治療により骨髄における腫瘍成長が有意に抑制されることを示した。この試験の目的は、その抗体が軟組織における腫瘍成長も抑制することができるかどうかを評価することである。
【０３８９】
この試験には週齢１０週で平均体重約２０ｇの雌ｎｕ／ｎｕマウスを使用しよう。マウスは、試験開始前少なくとも７日の順化期間に付されることとなる。０日目、ヌードマウスの右側腹部にマウス１匹につき１００μＬあたり細胞数５ｘ１０６でＳＷ６２０ヒト結腸癌細胞を皮下注射することとなる。腫瘍体積が１００〜２００ｍｍ３に達したら（通常、腫瘍接種の１週間後）、マウスを次のような５つのグループに１グループあたりマウス１０匹で無作為に割り付けることとなる：
１）ＰＢＳ
２）ＲＸ１
３）５Ａ１
４）ｍＩｇＧ１＋ｒＩｇＧ１アイソタイプＡｂコントロール
５）５Ａ１＋ＲＸ１。
【０３９０】
マウスは、１０ｍｐｋの指定の抗体で週１回、４週間にわたって腹腔内処置することとなる。腫瘍体積が２０００ｍｍ３に達したら、試験を停止することとなる。あるいは、動物は、次の状況のうちのいずれかになったら、安楽死させることにもなる：腫瘍表面潰瘍形成が、全表面積の３０％より大きい、有意な体重減少（＞２０％）、脱水、および瀕死の状況。全血を全てのマウスから採取し、単球集団を潜在的代理マーカーとして分析することとなる。腫瘍成長／サイズは、２Ｄ分析により測定することとなる。腫瘍の幅および長さの測定値を使用して、腫瘍体積を計算することとなる。軟組織における腫瘍成長は、上述の試験の結果として抑制されるであろうと予測される。
【０３９１】
（実施例７）
以下の実施例は、癌転移に関連する幾つかの骨溶解性疾患の処置および予防のための併用療法を評価する手順を詳述するものである。
【０３９２】
実験設計。次のことを除き、上の実施例５において説明した試験を本質的には説明したとおり繰り返す。下の処置グループで述べる抗体または抗体の組合せに加えて、動物たちは、次の追加処置のうちの１つを受けることとなる：
１．ビスホスホネート（例えば、Ａｒｅｄｉａ；Ｚｏｍｅｔａ；Ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅ）
２．手術
３．放射線
４．化学療法
５．ホルモン療法（例えば、Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ；抗アンドロゲン療法）
６．抗体療法（例えば、ＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫ中和抗体；ＰＴＨｒＰ中和抗体）
７．治療用タンパク質療法（例えば、可溶性ＲＡＮＫＬレセプター；ＯＰＧ、ならびにＰＤＧＦおよびＭＭＰ阻害剤）
８．小分子薬物療法（例えば、Ｓｒｃ−キナーゼ阻害剤）
９．オリゴヌクレオチド療法（例えば、ＲＡＮＫＬまたはＲＡＮＫまたはＰＴＨｒＰアンチセンス）
１０．遺伝子療法（例えば、ＲＡＮＫＬまたはＲＡＮＫ阻害剤）
１１．ペプチド療法（例えば、ＲＡＮＫＬの突然変異タンパク質）。
【０３９３】
処置グループは、次のとおりである。上の追加処置は、下では「プラス療法Ｘ」と示す：
１．ＰＢＳのみ
２．療法Ｘのみでの治療
３．ラットＩｇＧ１アイソタイプコントロール
４．マウスＩＧ１アイソタイプコントロール
５．ＲＸ１抗ヒトＭＣＳＦのみ
６．５Ａ１ラットＩｇＧ１抗マウスＭＣＳＦのみ
７．ラットＩｇＧ１とマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロールの併用
８．ＲＸ１と５Ａ１の併用
９．ラットＩｇＧ１アイソタイプコントロールプラス療法Ｘ
１０．マウスＩＧ１アイソタイプコントロールプラス療法Ｘ
１１．ＲＸ１抗ヒトＭＣＳＦプラス療法Ｘ
１２．５Ａ１ラットＩｇＧ１抗マウスＭＣＳＦプラス療法Ｘ
１３．ラットＩｇＧ１とマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロールの併用プラス療法Ｘ
１４．ＲＸ１と５Ａ１の併用プラス療法Ｘ。
【０３９４】
投薬：  ０．１〜３０ｍｇ／ｋｇの各抗体を各動物への投与に使用する。好ましい投薬は、１０ｍｇ／ｋｇである。投与経路は、ＩＶ、ＩＰ、ＳＣであり得る。好ましい経路は、ＩＰである。処置は、上の実施例５で説明したような腫瘍細胞注射の翌日に開始することとなる。
【０３９５】
測定：様々な処置グループ間の骨溶解の重篤度を評価するために、各マウスは、腫瘍細胞注射の翌日、ベースラインＦａｘｉｔｒｏｎ画像の撮影を受ける。Ｆａｘｉｔｒｏｎ画像は、試験終了時（８週目）にも撮影する。腫瘍細胞が安定してルシフェラーゼを発現するため、Ｘｅｎｏｇｅｎシステムを使用して同時に腫瘍成長を測定する。癌転移に関連する重症骨溶解性疾患を処置および予防するための併用療法は、抗体療法単独を基準にして、改善されるであろうと予測される。
【０３９６】
（実施例８）
以下の実施例は、蛍光発光セルソータを使用して、Ｍ−ＣＳＦ特異的抗体が例えば乳癌細胞（細胞系ＭＤＡ２３１）または多発性骨髄腫癌細胞（細胞系ＡＲＨ７７）に結合する能力を評価するためのプロトコルを提供するものである。
【０３９７】
先ず、細胞をＰＢＳ（Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋負含）で２回洗浄した。各１０ｃｍプレートに２ｍＬの３ｍＭ  ＥＤＴＡを添加し、プレートを３７℃で、細胞が丸まり、皿から剥離し始めるまで、２〜３分間インキュベートした。次に、１０ｍＬの緩衝液Ａ（ＰＢＳ＋５％ＦＢＳ）を添加し、混合した。この時点で、細胞をペレット化し、ＰＢＳ＋５％ＦＢＳに細胞数約５ｘ１０６／ｍＬで再び浮遊させ、細胞を１００μＬ／サンプルで細管に入れた。
【０３９８】
この時点で、０．１〜１０ｕｇ／ｍＬの一次抗体（指示濃度でＭ−ＣＳＦ抗体またはコントロール抗体を使用）を添加した。必要に応じて、５％ＦＢＳ／ＰＢＳ中で希釈を行った。その後、その混合物を３０分間、４℃でインキュベートした。インキュベーション時間の後、細胞を４００ｇでの５分間の遠心分離により３回洗浄し、細胞をＰＢＳに再び浮遊させた。
【０３９９】
ＦＩＴＣまたはＰＥ標識抗ＩｇＧ抗体（０．２５ｕｇ／サンプル）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中、最適希釈で希釈し、細胞をこの溶液に再び浮遊させ、３０分間４℃でインキュベートした。次に、上で説明したように細胞を３回洗浄した。細胞洗浄後、細胞を０．５ｍＬ／サンプルのＰＩ−ＰＢＳで再び浮遊させた（死滅細胞を生細胞と区別する必要がある場合）。後の分析のために、細胞を固定することもできる（細胞は、０．１％ホルムアルデヒドで固定すると、約３日、存続し得る）。次に、標準的な手順を使用して、蛍光発光ＦＡＣＳで細胞を分析した。
【０４００】
図８Ａおよび８Ｂに示すように、ＭＣＳＦ特異的抗体ＲＸ１は、示されているような様々な抗体濃度で乳癌細胞系ＭＤＡ２３１または多発性骨髄腫癌細胞系ＡＲＨ７７に結合させた。
【０４０１】
（実施例９）
以下の実施例は、Ｍ−ＣＳＦが多数の癌細胞表面上に頻出することを示すものである。Ｍ−ＣＳＦ特異的抗体ＲＸ１を使用して、Ｍ−ＣＳＦの免疫組織化学染色を次のとおり行った。
【０４０２】
最初に、スライドガラスをオーブン内で１時間、５５〜６０℃で加熱し、２〜３分間、放置して冷却した。以下の脱ろうおよび再水和パラメータを使用した：
ａ．キシレン    ３  ｘ  ５分
ｂ．１００％試薬アルコール    ２  ｘ  ５分
ｃ．９５％試薬アルコール    ２  ｘ  ４分
ｄ．７５％試薬アルコール    ２  ｘ  ３分
ｅ．５０％試薬アルコール    １  ｘ  ３分
ｇ．ｄＩ  Ｈ２Ｏ    ２〜３回、短時間すすぐ。
【０４０３】
過酸化物ブロッキング工程の前に、１  ｘ  Ｂｉｏｇｅｎｅｘ  Ｃｉｔｒａ  Ｐｌｕｓを使用して抗原賦活化の準備をした。最初、その溶液を全出力でマイクロ波処理して沸騰させた。その溶液が沸騰したら、マイクロ波装置をさらに１３分間、出力レベル２にすばやく設定し、放置して冷却した後、続行した。過酸化物ブロッキング工程は、次のように行った。スライドガラスは、３％Ｈ２Ｏ２（２５ｍＬ  ３０％から２５０ｍＬ  ｄＩ  Ｈ２Ｏ）に浸漬し、１０分間、室温で置いた。次に、スライドガラスをｄＩ  Ｈ２Ｏで２回すすぎ、１  Ｘ  ＰＢＳで２分間、２回洗浄した。
【０４０４】
アビジン／ビオチンブロッキング手順は、次のように行った。スライドガラスを金属ラックの上に平らに置いた。組織の周囲にＢｌｕｅ  ＰＡＰペンを使用した（疎水性スライドマーカー）。次に、−−組織を覆うために十分な−−  ２滴のＺｙｍｅｄ  Ａｖｉｄｉｎ（試薬Ａ）を添加し、それらのスライドガラスを室温で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、スライドガラスを次のように洗浄した：
１Ｘ  ＰＢＳ中で３分間、２回の洗浄
２滴のＺｙｍｅｄ  Ｂｉｏｔｉｎ（試薬Ｂ）、室温で１０分間
１Ｘ  ＰＢＳ中で３分間、２回の洗浄。
【０４０５】
タンパク質ブロッキング手順は、次のように行った。先ず、二次抗体種の１０％血清［から２％最終濃度］を添加した。次に、ＢｉｏＧｅｎｅｘ  Ｐｏｗｅｒ  ＢｌｏｃｋをｄＩ  Ｈ２Ｏで１Ｘに希釈した。スライドガラスのラックを８分間、室温でＰｏｗｅｒ  Ｂｌｏｃｋに浸漬し、それらのスライドガラスを１Ｘ  ＰＢＳ中で２回すすいだ。
【０４０６】
一次抗体（ＲＸ１）を添加するために、スライドガラスを金属ラックの上の平らに置いた。各切片を覆うように抗体を添加し（約３５０μＬ）、組織を削り落とさずに、（必要な場合には）ピペットの先端で抗体を広げた。その後、それらのスライドガラスを１時間、室温でインキュベートした。インキュベーション後、スライドガラスを１ｘＰＢＳで３回、各回３〜５分、洗浄した。この時点で、ＢｉｏＧｅｎｅｘ  Ｍｕｌｔｉ−Ｌｉｎｋを切片に適用し、１０〜１１分間、室温でインキュベートした。その後、切片を各回３分洗浄した。
【０４０７】
ＢｉｏＧｅｎｅｘ  ＨＲＰ  Ｌａｂｅｌを切片に適用することにより標識付けを行い、その後、それらを室温で１０〜１１分間インキュベートし、１  ｘ  ＰＢＳで３分間、３回洗浄した。次に、ＢｉｏＧｅｎｅｘ  Ｈ２Ｏ２基質をそれらの切片に添加し（Ｈ２Ｏ２  ２．５ｍＬごとに１滴のＡＥＣ）、室温で１０分間、インキュベートした。その後、切片をｄＩ  Ｈ２Ｏで数回すすいだ。対比染色工程は、次のように行った。切片を１分間、室温でヘマトキシリンで染色した。次に、それらの切片をＨ２Ｏで２回洗浄し、その後、１  Ｘ  ＰＢＳ中で１分間インキュベートした。その後、切片をＨ２Ｏでよくすすいで、ＰＢＳを除去した。一滴のＢｉｏＧｅｎｅｘ  Ｓｕｐｅｒ  Ｍｏｕｎｔを切片に適用し、その後、一晩、室温で空気乾燥させることによって、切片をマウントした。
【０４０８】
図９に示すように、Ｍ−ＣＳＦは、癌細胞表面に頻出する。示されている癌細胞タイプについての切片に次のように評点を付けた：
０    無染色
１    染色は、バックグラウンドと同様であった
２    陽性、しかし弱い染色
３    陽性で有意な染色
４    陽性で強い染色。
【０４０９】
（実施例１０）
以下の実施例は、抗体ＭＣ１およびＭＣ３を生産するための手順を示すものである。ＭＣ１およびＭＣ３は、ヒトＭ−ＣＳＦ抗体を中和し、ヒトＭ−ＣＳＦに結合する２つのモノクローナルマウス抗体である。これらの抗体のアミノ酸配列を図１４および１５にそれぞれ示す。以下を含む一連の工程により、これらを同定した：ａ）組換えヒトＭ−ＣＳＦでＢａｌｂ  Ｃマウスを免疫する工程；ｂ）ＥＬＩＳＡ形式でヒトＭ−ＣＳＦに結合する抗体を生産する陽性クローンをスクリーニングする工程；ｃ）陽性クローンをサブクローニングして、安定なハイブリドーマクローンを調製する工程；ｄ）細胞培養の規模を拡大して、大量の抗体を生産する工程；ｅ）前の実施例で説明したような親和分析、細胞結合アッセイおよび中和活性アッセイにおいて抗体を精製および特性付けする工程。
【０４１０】
図１６Ａおよび１６Ｂは、抗体ＲＸ１、５Ｈ４、ＭＣ１およびＭＣ３の重鎖および軽鎖のＣＤＲのアラインメントをそれぞれ示すものである。
【０４１１】
ヒト化およびＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ変種は、上の実施例において説明したように調製する。
【０４１２】
（実施例１１）
この実施例は、Ｍ−ＣＳＦ抗体ＲＸ１および５Ｈ４ならびにそれらのＦａｂフラグメントが、異なる中和活性を有することを示すものである。以下の実施例は、抗体ＲＸ１、５Ｈ４およびＭＣ３が、Ｍ−ＣＳＦに対して様々な親和性を有することを示すものでもある。この実施例により、上述のインタクトな抗体の親和性が上述の抗体のＦａｂフラグメントを基準にして高いことが、さらに実証される。
【０４１３】
様々な抗体濃度の存在下でのＭ−ＣＳＦ依存性細胞増殖を測定することにより、ＲＸ１および５Ｈ４のＦａｂフラグメントの中和活性に対するインタクトなＲＸ１および５Ｈ４の中和活性を判定した。細胞増殖は、化学発光染料により判定した。図１７に示すように、インタクトなＲＸ１が、最も高い効力を有する一方で、ＲＸ１のＦａｂフラグメントは、その効力を失い、５Ｈ４および５Ｈ４  Ｆａｂフラグメントのように挙動する。
【０４１４】
Ｂｉａｃｏｒｅ分析を使用して、上述の抗体の結合特性を分析した。Ｍ−ＣＳＦに対するＲＸ１、５Ｈ４およびＭＣ３の相対親和性を判定するために、ウサギ抗マウスＦｃを、アミンカップイングにより、ＣＭ５バイオセンサーチップ上に固定した。その後、１．５μｇ／ｍＬで３分間、２μＬ／分で抗マウスＦｃ／ＣＭ５バイオセンサーチップを用いて、上述の抗体を捕捉した。ＭＣＳＦを様々な濃度（Ｒｍａｘ約１５）でその変性バイオセンサー表面上に流した。被検抗体および抗原は、０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ  ＮａＣＬ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０（ＨＢＳ−ＥＰ）中で希釈した。全ての実験は、２５℃で行った。反応速度定数および親和定数は、１：１相互作用モデル／全フィットでＢｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して決定した。下の表８に示すように、ＲＸ１は、５Ｈ４およびＭＣ３を基準にして最も高い親和性でＭ−ＣＳＦに結合する。
【０４１５】
【表８】
0005422101.tif 000026
ＲＸ１、５Ｈ４およびＭＣ３のインタクトなＭａｂおよびＦａｂフラグメントの結合親和性における相対差を判定するために、Ｂｉａｃｏｒｅ分析において交互配置を使用した。具体的には、Ｍ−ＣＳＦをアミンカップリングによりＣＭ５バイオセンサーチップ上に固定した。１０ｍＭ  酢酸Ｎａ（ｐＨ４．０）中０．０５μｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦを５分間、１μＬ／分で注射して、ＲＬ＝６〜１２ＲＵを達成した。被検抗体（またはＦａｂフラグメント）を様々な濃度でその変性バイオセンサー表面上に流した。被検抗体は、０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ  ＮａＣＬ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０（ＨＢＳ−ＥＰ）中で希釈し、全ての実験を２５℃で行った。反応速度定数および親和定数は、１：１相互作用モデル／全フィットでＢｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して決定した。下の表９に示すように、ＲＸ１は、検査した他の抗体を基準にして最も高い親和性でＭ−ＣＳＦに結合する。ＲＸ１のＦａｂフラグメントは、そのＲＸ１完全タンパク質を基準にして有意に低い親和性でＭ−ＳＣＦに結合する。
【０４１６】
【表９】
0005422101.tif 000027
結合親和性および中和データは、ＲＸ１の中和活性が、Ｍ−ＣＳＦに対するその著しく高い親和性に主として起因すること、そして、この高い親和性が、Ｍ−ＣＳＦ二量体に同時に結合する抗体の両方のアームの能力に少なくとも一部は起因し得ることを示している。
【０４１７】
（実施例１２）
以下の実施例は、抗体ＲＸ１、５Ｈ４およびＭＣ３により認識されるＭ−ＣＳＦ上の線状エピトープ（すなわち、アミノ酸配列）を明らかにするものである。
【０４１８】
最初、抗体ＲＸ１、５Ｈ４およびＭＣ３が、線状エピトープを認識するのか、Ｍ−ＣＳＦ内の配座エピトープを認識するのかを判定するように、エピトープマッピング戦略を設計した。従って、抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を還元条件下ならびに非還元条件下で０．１μｇのＭ−ＣＳＦに対して検査した。Ｍ−ＣＳＦの非還元形態のみが、各抗体により認識された。これは、認識されるエピトープが、自然界では一貫性がないことを示唆している。
【０４１９】
次に、Ｍ−ＣＳＦの線状エピトープを各抗体について決定した。具体的には、対象となるＭ−ＣＳＦフラグメント配列（１つのアミノ酸オフセットで合成されたオーバーラップする１０量体ペプチド）をそのセルロース膜支持体上に負荷させたＳＰＯＴ膜（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ）を調製した。その後、これらの膜を上述の抗体でプローブし、反応性ＳＰＯＴを特定した。その後、膜上のその対応する位置によりペプチド配列を特定し、陽性反応するペプチドの中のオーバーラップするアミノ酸をエピトープとして特定した。図１８に示すように、ＲＸ１は、５Ｈ４およびＭＣ３とは異なる線状エピトープに結合し、これらは、Ｍ−ＣＳＦ上の異なる位置に位置する。ＲＸ１は、ＲＦＲＤＮＴＰＮ（配列番号１２０）またはＲＦＲＤＮＴＡＮ（配列番号１２１）、図１２のＭ−ＣＳＦのアミノ酸９８〜１０５によって表される線状エピトープに結合する。５Ｈ４は、ＩＴＦＥＦＶＤＱＥ（配列番号１２２）、図１２のＭ−ＣＳＦのアミノ酸６５〜７３によって表される線状エピトープに結合する。ＭＣ３は、（１）ＩＴＦＥＦＶＤＱＥ（配列番号１２２）、図１２のＭ−ＣＳＦのアミノ酸６５〜７３および（２）ＦＹＥＴＰＬＱ（配列番号１２３）、図１２のＭ−ＣＳＦのアミノ酸１３８〜１４４によって表される２つの線状エピトープに結合する。
【０４２０】
（実施例１３）
上の実施例４Ａで説明したように調製したＲＸ１抗体のＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ変種の結合親和性を判定した。この実施例は、異なるＩｇＧサブクラス定常領域を有するＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭＲＸ１抗体が、インビトロで異なる親和性でＭ−ＣＳＦに結合することを示すものである。Ｂｉａｃｏｒｅ分析によりインタクトな抗体の結合親和性における相対差を判定するために、Ｍ−ＣＳＦをアミンカップリングによりＣＭ５バイオセンサーチップ上に固定した。１０ｍＭ  酢酸Ｎａ（ｐＨ４．０）中０．０５μｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦを５分間、１μＬ／分で注射して、ＲＬ＝６〜１２ＲＵを達成した。被検抗体またはＦａｂフラグメントを、その変性バイオセンサー表面上に、２倍希釈で１００ｎＭから１．５ｎＭにわたる様々な濃度で流した。被検抗体は、０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ  ＮａＣＬ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０（ＨＢＳ−ＥＰ）中で希釈し、全ての実験を２５℃で行った。各濃度点および緩衝ブランクを三重反復でランし、３分の会合および８分の解離でデータを回収した。反応速度定数および親和定数は、１：１相互作用モデル／全フィットでＢｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して決定した。下の表１０に示すように、ｈｅＲＸ１−１．Ｇ１およびｈｅＲＸ１−１．Ｇ４は、マウスＲＸ１−Ｍ−ＣＳＦの結合親和性に最も近似した親和性でＭ−ＣＳＦに結合する。
【０４２１】
【表１０】
0005422101.tif 000028
対照的に、下の表１１に示すように、結合親和性に多少の変動はあるが、γ−２構築物の全てが、親マウス抗体と比較して少なくとも７倍の結合親和性低下を提示する。
【０４２２】
【表１１−１】
0005422101.tif 000029
【０４２３】
【表１１−２】
0005422101.tif 000030
（実施例１４）
この実施例は、異なるＩｇＧサブクラス定常領域を有するＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭＲＸ１抗体が、インビトロで異なる中和活性を有することを示すものである。Ｍ−ＣＳＦ抗体の中和活性を検査するために、Ｍ−ＮＦＳ−６０細胞系の増殖アッセイを使用した（米国微生物系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）アクセッション番号ＣＲＬ−１８３８；米国、メリーランド州、ロックヴィルのＡＴＣＣから入手でき、Ｃａｓ−Ｂｒ．ＭｕＬＶ野生型マウス環境栄養性レトロウイルスで誘導された骨髄性白血病に由来するものである。この細胞系は、インターロイキン３とＭ−ＣＳＦの両方に応答し、ならびにレトロウイルスの組み込みにより生じたトランケート型ｃ−ｍｙｂ癌原遺伝子を含有する）。Ｍ−ＮＦＳ−６０の増殖は、用量依存的に活性Ｍ−ＣＳＦを必要とする。このアッセイでは、Ｍ−ＮＦＳ−６０細胞を洗浄し、１０％ＦＢＳおよび１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含有するＲＰＭＩ  １６４０培地にプレーティングした。組換えヒトＭ−ＣＳＦ（最終濃度１０ｎｇ／ｍＬでのもの；これは、３０００Ｕ／ｍＬのＭ−ＣＳＦ活性と等価である）を（系列２倍希釈で）１ｕｇ／ｍＬから０．５ｎｇ／ｍＬにわたる様々な濃度で、インキュベータの中で、１時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。インキュベーション後、その混合物を９６ウエルマイクロタイタプレート内のＭ−ＮＦＳ−６０培養物に添加した。１ウエルあたりの全アッセイ量は、１００ｕＬであり、１０ｎｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦを含有し、示されている抗体濃度であった。細胞を３７℃、５％ＣＯ２下で７２時間インキュベートした後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により細胞数を定量した。各抗体を三重反復で検査し、翌日、反復した（１抗体あたり合計６回のアッセイのため）。各抗体のＩＣ５０を曲線当てはめにより分析した。
【０４２４】
このアッセイを、ヒト血清中ＭＣＳＦ、ＭＤＡ２３１調整培地（Ｍ−ＣＳＦを含有する）、カニクイザル血清中ＭＣＳＦ、およびカニクイザル組換えＭＣＳＦを使用して反復した。結果を図２５（組換えＭＣＳＦ）、２６（ヒト血清中ＭＣＳＦ）および２７（ＭＤＡ２３１調整培地）に、細胞数に対して直線的であるＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏアッセイからの蛍光読み取り値として提示する。抗体の中和活性は、Ｍ−ＮＦＳ−６０細胞の増殖の抑制として示す。
【０４２５】
結果は、ｈｅＲＸ１−１−ＩｇＧ１およびｈｅＲＸ１−１−ＩｇＧ４のＩＣ５０が、組換えマウス親ＲＸ１抗体とほぼ同じであった一方で、ｈｅＲＸ１−１−ＩｇＧ２のＩＣ５０は、約２倍から４倍高かったことを示している。
【０４２６】
下の表１２は、上の実施例４Ａにおいて説明したように調製した様々なＩｇＧ２構築物の相対ＩＣ５０を（ＩＣ５０倍数減損によって）示すものである。これらの構築物のうち、ｈｅＲＸ１−１．Ｇ２およびｈｅＲＸ１−１０．Ｇ２が、最少のＩＣ５０減少を示した。
【０４２７】
【表１２】
0005422101.tif 000031
（実施例１５）
この実施例は、異なるＩｇＧサブクラス定常領域を有するＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭＲＸ１抗体が、インビトロ破骨細胞発生アッセイにおいて異なるＴＲＡＰ活性を有することを示すものである。
【０４２８】
ここで説明する実験条件下でヒト骨髄ＣＤ３４＋  細胞（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒカタログ番号２Ｍ−１０１Ａ、細胞数３  ｘ  １０５／バイアル）を破骨細胞に分化するように誘導した。１日目、ＣＤ３４＋  細胞を１つの凍結バイアルから解凍して、１０ｍＬの培地（１０％ＦＣＳ、１  ｘ  Ｐｅｎ  Ｓｔｒｅｐおよび１ｘ  フンギソンを含有するＡｌｐｈａ  ＭＥＭ）に入れた。細胞を１回洗浄し、２ｍＬの培地に再び浮遊させ、１ウエルあたり１００ｕＬで９６ウエルプレートに配置した。２日目、元の培地を除去せずに、各ウエルに５０ｕＬの４ｘ  ＣＳＦ−１を最終濃度３０ｎｇ／ｍＬまで、および５０ｕＬの４ｘ  ＲＡＮＫＬ（ｓＲＡＮＫＬ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎカタログ＃  ＧＦ０９１、１０ｕｇ／パッケージ）を１００ｎｇ／ｍＬの最終濃度まで添加した。７日目、各ウエルに５０ｕＬの５ｘ  ＲＡＮＫＬを１００ｎｇ／ｍＬの最終濃度まで添加した。１７日目、それらの細胞をＴＲＡＰ活性のために染色し（ＴＲＡＰ染色用のＬｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｃｉｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅキット、Ｓｉｇａｍカタログ＃  ３８７−Ａ）、顕微鏡もとで検査した。
【０４２９】
Ｍ−ＣＳＦ中和抗体は、アッセイの２日目に添加した。図２８に示すように、これらの抗体は、用量依存的に破骨細胞分化を抑制する。破骨細胞分化アッセイにおける抗体の抑制活性は、アッセイの１７日目に見ることができる破骨細胞の不足として示す。
【０４３０】
（実施例１６）
異なるＩｇＧサブクラス定常領域を有するＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭＲＸ１抗体をさらに特性付けした。
【０４３１】
緩衝液中でＭ−ＣＳＦと抗体を等モル比で併せ、その後、サイズ排除クロマトグラフィーまたは光散乱を使用してその抗体−抗原複合体のサイズを分析することにより、様々なＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭＲＸ１抗体がＭＣＳＦと形成する抗原−抗体複合体を研究した。結果は、マウス親ＲＸ１が、約２００ｋＤａのＭＣＳＦと１：１複合体を形成するように見えることを示した。ｈｅＲＸ１−９．Ｇ２または１−１０．Ｇ２抗体は、約４００ｋＤａのＭＣＳＦと２：１または２：２複合体を形成するように見えた。ｈｅＲＸ１−１．Ｇ２は、２  ｘ  １０６Ｄａより大きいＭＣＳＦで大きな格子状凝集体を形成するように見えた。ＩｇＧ１およびＩｇＧ４構築物は、マウス親ＲＸ１のものに類似した小さな複合体を形成した。
【０４３２】
ｈｅＲＸ１−１．Ｇ４の変性還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＩｇＧ４変種が、予想通り半抗体を形成するように見えることを示した。
【０４３３】
上記、本明細書中に引用されている、および／または出願データシートに挙げられている米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許出版物の全てが、それら全文、本明細書に参考として組み込まれている。
【０４３４】
本発明の特定の実施形態を説明のために本明細書に記載したが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく様々な変形を成すことができることは、上述から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０４３５】
【図１】図１は、トランケートされた二量体Ｍ−ＣＳＦにおけるジスルフィド結合を示すトポロジー図である。
【図２】図２は、残基を１０ごとに標識し、点線によって非結晶対称軸を示した、Ｍ−ＣＳＦのＣ−アルファ骨格の立体図である。
【図３】図３は、精製Ｍ−ＣＳＦとＭＤＡ２３１細胞およびＭＣＦ７細胞からの調整培地（ＣＭ）の間の破骨細胞誘導活性の比較する図である。
【図４Ａ】図４Ａは、Ｍ−ＣＳＦ特異的マウス抗体ＲＸ１（配列番号２および４）（米国、ヴァージニア州、マナッサスの米国微生物系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）にＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−６１１３で寄託されたプラスミドのｃＤＮＡ挿入物によりコードされたもの）のアミノ酸配列および対応する核酸配列（配列番号１および３）を示す図である。ＣＤＲ領域は、番号を付け、太字で示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａらの国際公開パンフレット第９３／１１７９４号に従って特定した高リスク残基（太字）、中リスク残基（下線）および低リスク残基を有するＭ−ＣＳＦ特異的マウス抗体ＲＸ１の軽鎖（配列番号５）および重鎖（配列番号６）のアミノ酸配列をそれぞれ示す図である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａらの国際公開パンフレット第９３／１１７９４号に従って特定した高リスク残基（太字）、中リスク残基（下線）および低リスク残基を有するＭ−ＣＳＦ特異的マウス抗体ＲＸ１の軽鎖（配列番号５）および重鎖（配列番号６）のアミノ酸配列をそれぞれ示す図である。
【図５Ａ】図５Ａは、Ｍ−ＣＳＦ抗体ＲＸ１および５Ａ１が種特異的であることを示す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、抗体ＭＣ１およびＭＣ３のＭ−ＣＳＦ中和活性を示す図である。
【図６】図６は、抗体ＲＸ１が、濃度５ｍｇ／ｋｇでヒト異種移植モデルにおいて骨溶解を有効に抑制することを示す図である。
【図７】図７は、ヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を有するヌードマウスに抗体ＲＸ１を５ｍｇ／ｋｇの濃度で投与すると転移数が減少されることを示す図である。
【図８】図８は、Ｍ−ＣＳＦ特異的抗体が、乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１または多発性骨髄腫癌細胞系ＡＲＨ７７に結合したことを示す図である。
【図９】図９は、Ｍ−ＣＳＦが、多数の癌細胞表面に頻出することを示す図である。
【図１０】図１０は、Ｍ−ＣＳＦαのアミノ酸配列（配列番号７）である。
【図１１】図１１は、Ｍ−ＣＳＦβのアミノ酸配列（配列番号８）である。
【図１２】図１２は、Ｍ−ＣＳＦγのアミノ酸配列（配列番号９）である。ＤＮＡ配列における多数の多形性によりアミノ酸に違いが生じ得る。例えば、一般的多形性により、１０４位にはＰｒｏではなくＡｌａがもたらされる。
【図１３】図１３は、Ｍ−ＣＳＦ特異的マウス抗体５Ｈ４（配列番号１０および１１）、ＭＣ１（配列番号１２および１３）（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−６２６３で寄託されたハイブリドーマにより生産されたもの）ならびにＭＣ３（配列番号１４および１５）（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−６２６４で寄託されたハイブリドーマにより生産されたもの）のアミノ酸配列をそれぞれ示す図である。
【図１４】図１４は、Ｍ−ＣＳＦ特異的マウス抗体５Ｈ４（配列番号１０および１１）、ＭＣ１（配列番号１２および１３）（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−６２６３で寄託されたハイブリドーマにより生産されたもの）ならびにＭＣ３（配列番号１４および１５）（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−６２６４で寄託されたハイブリドーマにより生産されたもの）のアミノ酸配列をそれぞれ示す図である。
【図１５】図１５は、Ｍ−ＣＳＦ特異的マウス抗体５Ｈ４（配列番号１０および１１）、ＭＣ１（配列番号１２および１３）（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−６２６３で寄託されたハイブリドーマにより生産されたもの）ならびにＭＣ３（配列番号１４および１５）（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−６２６４で寄託されたハイブリドーマにより生産されたもの）のアミノ酸配列をそれぞれ示す図である。
【図１６Ａ】図１６Ａは、ヒトＭ−ＣＳＦ特異的マウス抗体ＲＸ１、５Ｈ４、ＭＣ１およびＭＣ３（配列番号１６〜３８）の重鎖および軽鎖アミノ酸配列のＣＤＲ領域のアラインメントである。
【図１６Ｂ】図１６Ａは、ヒトＭ−ＣＳＦ特異的マウス抗体ＲＸ１、５Ｈ４、ＭＣ１およびＭＣ３（配列番号１６〜３８）の重鎖および軽鎖アミノ酸配列のＣＤＲ領域のアラインメントである。
【図１７】図１７は、ＲＸ１対５Ｈ４についてのインタクト対Ｆａｂフラグメントの中和活性を示す図である。
【図１８】図１８は、ＲＸ１、５Ｈ４およびＭＣ３エピトープを目立たせたＭ−ＣＳＦの構造（配列番号１２０、１２２および１２３）を示す図である。
【図１９Ａ】図１９Ａは、（ａ）マウスＲＸ１の重鎖についてのリスクライン（Ｈ＝高リスク、Ｍ＝中リスク、Ｌ＝低リスク）、（ｂ）ＲＸ１の重鎖アミノ酸配列（配列番号６）、（ｃ）ＲＸ１に対してアラインした最も近いヒトコンセンサス配列、Ｋａｂａｔ  Ｖｈ２コンセンサス、のアミノ酸配列（配列番号３９）、および（ｄ）例示的な２つのＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ配列（配列番号４１および４３）を調製するために行った変更を示す図である。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、「低リスク」および「低＋中リスク」と示す例示的な２つの重鎖Ｈｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ配列のアミノ酸配列（配列番号４１および４３）ならびに対応する核酸配列（配列番号４０および４２）を示す図である。
【図２０Ａ】図２０Ａは、（ａ）マウスＲＸ１の軽鎖についてのリスクライン（Ｈ＝高リスク、Ｍ＝中リスク、Ｌ＝低リスク）、（ｂ）ＲＸ１の軽鎖アミノ酸配列（配列番号５）、（ｃ）ＲＸ１に対してアラインした最も近いヒトコンセンサス配列、Ｋａｂａｔ  Ｖｋ３コンセンサス、のアミノ酸配列（配列番号４９）、および（ｄ）例示的な２つのＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ配列（配列番号４５および４７）を調製するために行った変更を示す図である。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、「低リスク」および「低＋中リスク」と示す例示的な２つの軽鎖Ｈｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ配列のアミノ酸配列（配列番号４５および４７）ならびに対応する核酸配列（配列番号４４および４６）を示す図である。
【図２１Ａ】図２１Ａは、（ａ）マウスＲＸ１の軽鎖についてのリスクライン（Ｈ＝高リスク、Ｍ＝中リスク、Ｌ＝低リスク）、（ｂ）ＲＸ１の軽鎖アミノ酸配列（配列番号５）、（ｃ）ＲＸ１に対してアラインした最も近いヒトコンセンサス配列、Ｋａｂａｔ  Ｖｋ３コンセンサス、のアミノ酸配列（配列番号４９）、および（ｄ）５４〜５６位が変更されていない（すなわち、マウス配列のままである）代替の例示的なアミノ酸配列（配列番号４８）を示す図である。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、例示的な２つの交互軽鎖Ｈｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ配列のアミノ酸配列（配列番号４８、１３６）ならびに対応する核酸配列（配列番号１３７および１３５）を示す図である。
【図２２Ａ】図２２Ａは、（ａ）マウスＲＸ１の軽鎖についてのリスクライン（Ｈ＝高リスク、Ｍ＝中リスク、Ｌ＝低リスク）、（ｂ）ＲＸ１の軽鎖アミノ酸配列（配列番号５）、（ｃ）ＲＸ１に対してアラインした最も近いヒトコンセンサス配列、Ｖｋ６  Ｓｕｂｇｒｏｕｐ  ２−１−（１）  Ａ１４、のアミノ酸配列（配列番号５０）、および（ｄ）例示的な２つのＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ配列（配列番号５１および５３）を調製するために行った変更を示す図である。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、「低リスク」および「低＋中リスク」と示す例示的な２つの軽鎖Ｈｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ配列のアミノ酸配列（配列番号５１および５３）ならびに対応する核酸配列（配列番号５２）を示す図である。
【図２３Ａ】図２３Ａは、Ｋａｂａｔの番号付けシステムを使用する、マウスＲＸ１の軽鎖アミノ酸配列（配列番号５４）と、様々なヒトコンセンサスおよびヒト生殖細胞系コンセンサス配列のアラインメント（「ＰＯＳ」と示すラインにアミノ酸番号付けを示す）（配列番号５５〜８２）を示す図である。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、Ｋａｂａｔの番号付けシステムを使用する、マウスＲＸ１の軽鎖アミノ酸配列（配列番号５４）と、様々なヒトコンセンサスおよびヒト生殖細胞系コンセンサス配列のアラインメント（「ＰＯＳ」と示すラインにアミノ酸番号付けを示す）（配列番号５５〜８２）を示す図である。
【図２４Ａ】図２４Ａは、Ｋａｂａｔの番号付けシステムを使用する、マウスＲＸ１の重鎖アミノ酸配列（配列番号８３）と、様々なヒトコンセンサスおよびヒト生殖細胞系コンセンサス配列のアラインメント（「ＰＯＳ」と示すラインにアミノ酸番号付けを示す）（配列番号８４〜１１２）を示す図である。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、Ｋａｂａｔの番号付けシステムを使用する、マウスＲＸ１の重鎖アミノ酸配列（配列番号８３）と、様々なヒトコンセンサスおよびヒト生殖細胞系コンセンサス配列のアラインメント（「ＰＯＳ」と示すラインにアミノ酸番号付けを示す）（配列番号８４〜１１２）を示す図である。
【図２４Ｃ】図２４Ｃは、抗体５Ｈ４、ＭＣ１およびＭＣ３のアミノ酸配列が、Ｋａｂａｔの番号付けシステムにどれほど対応するか（それぞれ、配列番号１０および１１；配列番号１２および１３；配列番号１４および１５）を示す図である。
【図２４Ｄ】図２４Ｄは、抗体５Ｈ４、ＭＣ１およびＭＣ３のアミノ酸配列が、Ｋａｂａｔの番号付けシステムにどれほど対応するか（それぞれ、配列番号１０および１１；配列番号１２および１３；配列番号１４および１５）を示す図である。
【図２４Ｅ】図２４Ｅは、抗体５Ｈ４、ＭＣ１およびＭＣ３のアミノ酸配列が、Ｋａｂａｔの番号付けシステムにどれほど対応するか（それぞれ、配列番号１０および１１；配列番号１２および１３；配列番号１４および１５）を示す図である。
【図２５】図２５は、ｒｍＲＸ１と標識した組換えマウスＲＸ１抗体、ならびにｈｅＲＸ１−１．Ｇ１、ｈｅＲＸ１−１．Ｇ２およびｈｅＲＸ１−１．Ｇ４と標識した異なる定常領域（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４）を各々が有するＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭＲＸ１−１抗体の３つの変種（全ての低リスク変更を行ったもの）による、組換えヒトＭＣＳＦの中和の比較を示す図である。
【図２６】図２６は、ｒｍＲＸ１と標識した組換えマウスＲＸ１抗体、ならびにＲＸ２、ＲＸ１−１−ＩｇＧ２、ＲＸ１−１−ＩｇＧ１、ＲＸ１−１−ＩｇＧ１、ＲＸ１−１−ＩｇＧ４、ＲＸ１−ａ−ＩｇＧ４と標識した異なる定常領域（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４）を各々が有するｈｅＲＸ１−１の幾つかの異なる変種（全ての低リスク変更を行ったもの）による、ヒト血清の中和の比較を示す図である。
【図２７】図２７は、組換えマウスＲＸ１抗体、ｒｍＲＸ１、ならびにＲＸ２、ＲＸ１−１−ＩｇＧ２、ＲＸ１−１−ＩｇＧ１、ＲＸ１−１−ＩｇＧ１、ＲＸ１−１−ＩｇＧ４、ＲＸ１−ａ−ＩｇＧ４と標識した異なる定常領域（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４）を各々有するｈｅＲＸ１−１の幾つかの異なる変種（全ての低リスク変更を行ったもの）による、ＭＤＡ２３１（乳癌細胞系）の中和の比較を示す図である。
【図２８】図２８は、組換えマウスＲＸ１抗体、ｒｍＲＸ１、ならびにｈｅＲＸ１−１．ＩｇＧ１およびｈｅＲＸ１−１．ＩｇＧ２と標識した異なる定常領域（Ｉｇ１またはＩｇＧ２）を各々が有する２つの異なる変種ｈｅＲＸ１−１の、破骨細胞発生に対する影響（ＴＲＡＰ活性により測定したもの）を示す図である。
【図２９Ａ】図２９Ａは、低リスクアミノ酸変更を行ったｈｅＲＸ１−１．ＩｇＧ１についてのアミノ酸配列（配列番号１１４）およびヌクレオチド配列（配列番号１１３）を示す図である。
【図２９Ｂ】図２９Ｂは、低＋中リスクアミノ酸変更を行ったｈｅＲＸ１−１．ＩｇＧ１についてのアミノ酸配列（配列番号１１６）およびヌクレオチド配列（配列番号１１５）を示す図である。
【図３０】図３０は、低リスクアミノ酸変更を行ったｈｅＲＸ１−１．ＩｇＧ４についてのアミノ酸配列（配列番号１１９）およびヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ（配列番号１１８）およびゲノムＤＮＡ（配列番号１１７））を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２４Ｅ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０】
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【配列表】
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