(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）第１のエンドキャップと第２のエンドキャップとの間の空間を含む培養室内に配置され、ホルダによって保持される三次元の多孔性足場を提供するステップと、
（ｂ）１つもしくは複数の生体細胞を提供するステップと、
（ｃ）液体増殖培地を提供するステップと、
（ｄ）少なくとも１つの前記エンドキャップが垂直軸に沿って動くことにより、前記足場と少なくとも１つのエンドキャップとの間で往復運動を引き起こし、前記足場を介して前記増殖培地を運動させるステップと、
前記ホルダが前記エンドキャップの１つと一体であること
を含む、培養物中で細胞を成長させる方法。
【請求項２】
ステップ（ｄ）の間、前記足場と少なくとも１つのエンドキャップとの間で回転運動を引き起こすことをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項３】
前記往復運動は、前記細胞に剪断応力を与えることをさらに含む、請求項１または２の方法。
【請求項４】
前記足場が（１）前記増殖培地から離れた高位置または（２）前記増殖培地内の低位置のうちの１つに交互に配置される場合があり、ステップ（ｄ）の前に、
前記足場が前記高位置に配置される間に前記増殖培地内の懸濁液中で前記細胞を成長させるステップと、
前記低位置にまで前記足場を低下させるステップと、
をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｄ）の間、前記足場が１つの前記エンドキャップと連動する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記培養室の内外に前記増殖培地を流すために前記培養室がコネクタをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記培養室が撹拌バーをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｄ）の前に前記増殖培地内の懸濁液中で前記細胞を成長させるステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
培養物中で細胞を成長させるためのバイオリアクターであって、
（ａ）空間を画定するのに接続された第１のエンドキャップおよび第２のエンドキャップを含む培養室と、少なくとも１つの前記エンドキャップが培養室の垂直軸に沿って動作可能なように接続されるエンドキャップ駆動手段と、
（ｂ）細胞を成長させるかまたは維持するための多孔性の三次元足場を保持するのに構成されるホルダと、
（ｃ）前記ホルダの往復運動を作動させるのに操作可能なように接続される駆動手段と
を含み、
少なくとも１つの前記エンドキャップを培養室の垂直軸に沿って動作させ、前記ホルダが前記エンドキャップ間に配置されることで、前記ホルダと少なくとも１つの前記エンドキャップとの間での往復運動を可能にし、前記ホルダが前記エンドキャップの１つと一体であるバイオリアクター。
【請求項１０】
（ｄ）前記培養室内に細胞を成長させるために培養液に回転運動を与える撹拌ユニットをさらに備える、請求項９に記載のバイオリアクター。
【請求項１１】
前記往復運動は、前記細胞に剪断応力を与えることをさらに含む、請求項９または１０に記載のバイオリアクター。
【請求項１２】
前記ホルダが１つの前記エンドキャップと連動する、請求項９または１０に記載のバイオリアクター。
【請求項１３】
前記ホルダが、（１）保持される足場を配置するための増殖培地から離れた高位置または（２）保持される足場を配置するための増殖培地内の低位置のうちの１つに交互に配置される場合がある、請求項９または１０に記載のバイオリアクター。
【請求項１４】
前記培養室が前記培養室の内外の増殖培地の流れを可能にするように配置される接続をさらに含む、請求項９または１０に記載のバイオリアクター。
【請求項１５】
前記培養室に接続されるガスポートをさらに含む、請求項９または１０に記載のバイオリアクター。
【請求項１６】
懸濁液中で細胞を成長させるための撹拌ユニットをさらに含む、請求項９または１０に記載のバイオリアクター。
【請求項１７】
細胞を成長させるかまたは維持するための多孔性の三次元足場をさらに含む、請求項９または１０に記載のバイオリアクター。
【請求項１８】
前記足場が組織を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記足場が組織を含む、請求項９〜１７のいずれか一項に記載のバイオリアクター。
【請求項２０】
（ａ）第１のエンドキャップと第２のエンドキャップとの間の空間を含む培養室内に配置され、ホルダによって保持される三次元の多孔性足場を提供するステップと、
（ｂ）１つもしくは複数の生体細胞を提供するステップと、
（ｃ）液体増殖培地を提供するステップと、
（ｄ）少なくとも１つの前記エンドキャップが垂直軸に沿って動くことにより、前記足場と少なくとも１つのエンドキャップとの間で往復運動を引き起こし、前記足場を介して前記増殖培地を運動させるステップと、
前記ホルダが前記エンドキャップの１つと一体であること
を含む生体細胞の三次元培養物を生産する方法。
【請求項２１】
ステップ（ｄ）の間、前記足場と少なくとも１つのエンドキャップとの間で回転運動を引き起こすことをさらに含む、請求項２０の生体細胞の三次元培養物を生産する方法。
【請求項２２】
前記往復運動は、前記細胞に剪断応力を与えることをさらに含む、請求項２０または２１の生体細胞の三次元培養物を生産する方法。
【請求項２３】
前記足場を介して前記培地の一方向灌流を引き起こすステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２４】
前記バイオリアクターが前記足場を収容する場合、２つのポートおよび前記足場を介して一方向に流動可能なように配置される増殖培地において前記ポートをさらに含む、請求項９または１０に記載のバイオリアクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００４年５月６日出願の米国特許仮出願第６０／５６８，２５５号明細書に関して米国特許法（３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.）第１１９条に基づいて利益を主張するものであり、そのすべての開示は参照として本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、三次元環境において細胞の播種および培養を行うためのバイオリアクターである。
【背景技術】
【０００３】
二次元（２Ｄ）培養物（例えば単層）ではなく三次元（３Ｄ）環境（例えば多孔性骨格によって与えられるもの）における細胞機能の研究への関心が高まりつつある。３Ｄ骨格内での細胞培養物は、機能細胞の伸長に対する細胞治療、および移植可能な組織構造の生成に対する組織工学においても有用である可能性がある。３Ｄ骨格内での３Ｄ培養に伴う固有の問題は、（ｉ）骨格孔(scaffold pore)全体にわたる細胞の均一かつ効率的な播種、および（ｉｉ）中央の骨格部分における細胞への限られた物質移動である。発明者らは最近、骨格孔を介する細胞懸濁液とその後における培地の灌流が両方の課題に対する可能な解決策であることを報告している（ウェンツ(Wendt)ら、Biotechnol.Bioeng.８４：２１５−２１４頁、２００３年）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、多孔性骨格を含むホルダの運動が交互の方向で該骨格を介する細胞懸濁液または培地の灌流をもたらすバイオリアクターシステムの開発に関する。ホルダは完全に多孔性骨格材料から構成されうることからその表面の利用が最大になる。ホルダの運動と同時にまたはそれに先立って容器内部で撹拌バーの運動が可能であることから、混合の有無にかかわらず容器内の懸濁液中での細胞の培養が可能である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、組織工学におけるバイオリアクターおよびかかるバイオリアクターを稼動させる方法に関する。
【０００６】
本発明の第１の好ましい実施形態は、第１のエンドキャップと第２のエンドキャップとの間の空間を含む培養室内に配置される三次元の多孔性骨格を提供するステップと、１つもしくは複数の生体細胞を提供するステップと、液体増殖培地を提供するステップと、骨格と少なくとも１つのエンドキャップとの間で相対運動を引き起こすことによって骨格を介して増殖培地を運動させるステップと、を含む培養物中の細胞を成長させるための方法である。
【０００７】
さらに好ましい実施形態では、第１の実施形態の骨格は、（１）該増殖培地から離れた高位置または（２）該増殖培地内の低位置のうちの１つに交互に配置される場合があり、該方法は、相対運動を引き起こすステップの前に、該骨格が高位置に配置される間に該増殖培地内の懸濁液中で該細胞を成長させるステップと、低位置にまで該骨格を低下させるステップとをさらに含む。
【０００８】
さらに別の好ましい実施形態では、第１の実施形態の方法のステップの削減および拡張を行う間、骨格は１つのエンドキャップと連動する。
【０００９】
さらに別の好ましい実施形態では、第１の実施形態の培養室は、該培養室の内外に該増殖培地を流すためのコネクタをさらに含む。
【００１０】
さらに別の好ましい実施形態では、第１の実施形態の培養室は撹拌バーをさらに含む。
【００１１】
さらに別の好ましい実施形態は、相対運動を引き起こすステップの前に、該増殖培地内の懸濁液中で該細胞を成長させるステップを含む。
【００１２】
本発明の第２の好ましい実施形態は、培養物中で細胞を成長させるためのバイオリアクターであって、空間を画定するのに接続された第１のエンドキャップおよび第２のエンドキャップを含む培養室と、細胞の成長および維持を目的に多孔性の三次元骨格を保持するのに構成されるホルダとを含み、ホルダがエンドキャップ間に配置され、ホルダと少なくとも１つの該エンドキャップとの間で往復運動が発生しうるように整えられる、バイオリアクターである。
【００１３】
さらに別の好ましい実施形態では、第２の好ましい実施形態のバイオリアクターにおけるホルダは１つのエンドキャップと連動する。
【００１４】
さらに別の好ましい実施形態では、第２の好ましい実施形態のバイオリアクターは、往復運動を作動させるのに操作可能なように接続される駆動手段をさらに含む。
【００１５】
さらに別の好ましい実施形態では、ホルダは該エンドキャップの１つと一体である。
【００１６】
さらに別の好ましい実施形態では、多孔性骨格が第２の実施形態の細胞培養に対する該室内に収容される場合、骨格は（１）増殖培地から離れた高位置または（２）増殖培地内の低位置のうちの１つに交互に配置されうる。
【００１７】
さらに別の好ましい実施形態では、第２の実施形態の培養室は、該培養室の内外の増殖培地の流れを可能にするように配置される接続をさらに含む。
【００１８】
さらに別の好ましい実施形態では、第２の実施形態は、培養室に接続されるガスポートをさらに含む。
【００１９】
さらに別の好ましい実施形態では、第２の実施形態は、細胞を成長させるための多孔性の三次元骨格をさらに含む。
【００２０】
さらに別の好ましい実施形態は、該骨格が組織（ここで組織が生体組織と不活性化(devitalized)／脱細胞化(decellularized)組織の両方および等価物を意味する）を含む、上記の方法のいずれかである。
【００２１】
さらに別の好ましい実施形態は、該骨格が組織を含む、上記のバイオリアクターのいずれかである。
【００２２】
さらに別の好ましい実施形態は、上記の方法のいずれかによって生成される生体細胞の３Ｄ培養物である。
【００２３】
さらに別の好ましい実施形態は、最後のステップまたは最後のステップの後のステップが該骨格を介する該培地の一方向灌流を含む、最初に述べた方法の実施形態である。
【００２４】
さらに別の好ましい実施形態は、バイオリアクターが骨格を収容する場合、２つのポートおよび該骨格を介して一方向に流動可能なように配置される増殖培地において２つのポートをさらに含む第２の実施形態のバイオリアクターである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
細胞培養に対する既存の灌流バイオリアクターを上回る本発明の利点は、（ｉ）単純であるが高度に柔軟な操作モードと、（ｉｉ）閉じた系において骨格を介したその後の灌流による浮遊培養相への可溶性と、（ｉｉｉ）簡単なスケールアップとを含む。
【００２６】
本発明は、（ｉ）３Ｄ環境における細胞機能の研究支援を目的とする「使いやすい」バイオリアクター、（ｉｉ）効率的増幅（例えば造血前駆細胞）または特異的なタンパク質（例えば、抗体、酵素、アゴニスト、アンタゴニスト、ホルモン、薬剤）に特化した生産に対する３Ｄ環境における細胞培養を目的とするバイオリアクター、（ｉｉｉ）臨床移植または体外生命維持（例えばバイオ人工肝臓補助装置）に対する３Ｄ組織の自動生成を目的とするバイオリアクター、および（ｉｖ）組織の維持または再生を目的とするバイオリアクターにおいて使用されうる。
【００２７】
３Ｄ細胞培養の１つの利点は、特定の細胞、例えば幹細胞は、単層内での従来の成長との比較として３Ｄ内で成長する場合、高められた特性（例えば、先祖の形質の保持を高めることなど）を示しうるということである。
【００２８】
バイオリアクターは、同室の少なくとも一端に対する往復運動によって骨格孔を介して細胞懸濁液または培地の灌流をもたらす、１つもしくは複数の多孔性骨格を保持可能な（場合によって細胞が懸濁液中で培養可能な場合に撹拌バーを含む）１つのチャンバで構成される。骨格ホルダまたはパンチは、別々の部品として複数の例の中で示されるが、場合によってプランジャ自体が骨格でありうる。骨格もホルダもいずれかの特定の形状に限定されない。骨格は、バスケット内部に含まれる顆粒または類似の集合体から構成されうる。主な革新については、（ｉ）骨格を介する灌流が（いかなるタイプのポンプも介さずに）いかにして適用されるか、および（ｉｉ）スピナーフラスコの特徴と直接灌流システムの特徴の組み合わせに関する。したがって、バイオリアクターは、（ｉ）浮遊培養液中での細胞伸長、（ｉｉ）細胞懸濁液の直接灌流による多孔性骨格内への細胞播種、および（ｉｉｉ）灌流下で３Ｄ骨格内での細胞培養といったプロセスの組み合わせを可能にする単一の閉じた系を表す。
【００２９】
図１は、本発明の、撹拌バーを含む、平坦な底部を有する環状容器で構成される典型的な底部ユニットまたはエンドキャップを示す。培地および細胞懸濁液を、ルアーロック(luer lock)コネクタを取り付けたチャンバの底部の流入口／流出口ポートを介して満たし、変化させてもよい。チャンバを磁気撹拌板(magnetic stirring plate)上に設けることで、撹拌速度を２０ｒｐｍまで低下させることが可能である。参照文字は、（１）中央または底に開口部を有する流入口／流出口のルアーロックポート、（２）ベロー、（３）環状容器（細胞接着を最小にするため、ここではＰＴＦＥ製である。）、および（４）磁気撹拌バー(magnetic stirring bar)である。
【００３０】
図２は、底部ユニット真上の中央に設けられかつ底部の環状容器の外側にゆるく接触される環状蓋で構成される、本発明の典型的な上部ユニットまたはエンドキャップを示す。蓋の中央には、下端の上に環状パンチを具備する小さい空洞棒(hollow rod)がある。パンチは、骨格ホルダとして機能し、底部容器の内径に正確にはまる。図２Ａは骨格ホルダを具備する上部ユニットを示し、図２Ｂは骨格ホルダを具備しないユニットを示す。蓋およびパンチは、高位の境界から低位の容器底部にかけての上下運動が可能であり、パンチは撹拌バーの直上で停止する。ルアーロックコネクタを有する２つの流入口／流出口ポート（または制御された組成物のガスとともに使用するにも適したガスポート）は、骨格ホルダの直上にある開口部とともに細菌フィルタを介するガス交換および空洞棒を介する培地の充填または交換を可能にする。
【００３１】
図２の参照文字は以下の通りである。すなわち、（５）空洞棒、（６）換気のための流入口／流出口のルアーロックコネクタ、（７）培地交換用に骨格ホルダ（パンチ）の直上の開口部を具備する流入口／流出口のルアーロックコネクタ、（８）骨格ホルダ（この例は８×５ｍｍの大きさを有する６つの骨格に対応する）の機能を有する同棒の下端に固定された環状パンチ、および（９）底部ユニットとともに組み立てた後に気密閉鎖用にベローを挿入するための環状ノッチである。
【００３２】
上部および底部ユニットは、骨格の取り付けおよび滅菌の後に組み立てられる。弾性ベローを用いると外部との気密閉鎖が得られることから、蓋の自由運動およびバイオリアクター内部の無菌性が保証される。図３は、典型的な組み立てられた組織培養ユニットを示す。参照文字は以下の通りである。すなわち、（１）ルアーロックコネクタを具備する底部流入口／流出口、（２）底部および上部ユニットの気密接続のための弾性ベロー、（６）バイオリアクター内部の無菌性を保証するための、０.２ｍの孔サイズを有する細菌フィルタに接続される空気の流入口／流出口、（１０）直線駆動モータへのコネクタ、（７）骨格ホルダの直上の開口部を具備する、蓋の中央における空洞棒を介する培地交換のための流入口／流出口のルアーロックコネクタ、および（１１）上下に可動性のある上部ユニットである。
【００３３】
バイオリアクターの上部の運動は、ステッパーモータによって駆動される直線アクチュエータまたは直線位置決めテーブルによって行われる。あるいは、回転モータが往復運動をもたらすように接続される場合、それを使用してもよい。例えば空圧または水圧駆動といった他の駆動手段を用いてもよい。制御ユニットは、異なる運動レジーム（例えば、周波数、振幅、ランプ、プラトー、および波形）の適用を容易にする。内部的に無菌の閉じた組織培養ユニットを運動ユニットに対する底部に固定してもよく、蓋が直線駆動に接続される。完全なアセンブリは、規定された温度、湿度、ＣＯ2およびＯ2の含量でインキュベータ内の磁気撹拌器上に設けられる。
【００３４】
図４Ａは本発明の典型的な組織培養ユニットを示し、図４Ｂは本発明の典型的な直線駆動ユニットを示し、図４Ｃは同駆動ユニットに取り付けられた組織培養ユニットを示す。参照文字は以下の如くである。すなわち、（１２）組織培養ユニットの底部に正確な適合性を有するホルダ、（１３）調節可能な終了および開始スイッチ、（１４）ステッパーモータ、（１５）ステッパーモータによって駆動される、上下運動に対して配置されるネジ棒、（１６）モータを濃縮水および湿潤空気から隔離するためのモータカバー、（１７）組織培養ユニット、（１８）運動ユニットのホルダ内に取り付けられ固定された組織培養ユニットの底部、および（１９）組織培養ユニット上部の直線運動を可能にするネジ棒に接続された蓋である。
【００３５】
種々の生体適合性材料（例えば、合成高分子、天然高分子、金属、およびセラミック）または組織から骨格を作製してもよい。ここで組織とは、両方の生体組織、不活性化／脱細胞化組織、再構成された天然組織、および等価物を意味する。骨格が合成材料からできている場合、それは泡、スポンジ、不織布メッシュ、ゲル、セラミック、または金属を例とする細胞成長に適する材料である必要がある。骨格が不活性化組織を含む組織を含む場合、例えば真皮、膀胱、骨、動脈、および心臓弁を含む多種多様な組織を用いてもよいであろう。
【００３６】
多数の組織タイプ（例えば、肝臓、腎臓、血管）においては、適切な発現および機能にとって一方向の流れが重要である。本発明では、静止状態を維持した骨格を備えるリアクターを介して培地を直接ポンピングすることにより、これを容易に得ることができる。交互の灌流によって骨格に播種した後にこれを行ってもよい。
【００３７】
本発明は、組織を再生させうるか、生体組織の生存率を維持しうる。次いで本発明によると、かかる組織は患者の中に移植されうる。組織は、同種または異種でありうる。臨床的に自系細胞の使用が好ましい場合が多いが、細胞が自系である必要はない。
【００３８】
典型的な使用方法
懸濁液中の細胞培養物
浮遊培養の間、バイオリアクターのパンチ（骨格ホルダ）を、培地の表面とパンチとの間の空気によって浮遊培養物の上に位置決めする。培地に接触することなくパンチを上下運動させることにより、インキュベータの環境下での（細菌フィルタを介する）空気交換を確実にする。細胞懸濁液を撹拌することで、細胞の壁への沈殿および付着を回避し、さらに培地全体での酸素と栄養素の混合を生じさせる。培地は、細胞の流れではなく培地の流れを可能にするマイクロフィルタを介して変化しうる。懸濁液中の培養物は、骨髄由来の幹細胞の効率的伸長を可能にすることが最近になって判明している（バクシュ(Baksh)ら、Exp.Hematol.３１：７２３−７３２頁、２００３年）。
【００３９】
３Ｄ−骨格内への細胞播種
細胞伸長の見込みに対して浮遊培養を行った後、パンチ（骨格ホルダ）を具備する蓋を細胞懸濁液中に下降運動させ、次いで培地表面から撹拌用の撹拌バーの上の底部にかけて上下運動させることが可能である。それによって細胞懸濁液が三次元骨格の孔を介して押し込まれ（直接灌流）、細胞は骨格表面に均一的に付着可能である。最大の播種効率を保証しかつ骨格全体にわたる細胞分布を均一にするのに、異なる運動レジームを適用することが可能である（例えば、周波数、プラトー、振幅、ランプ、および波形）。播種の間に細胞懸濁液を連続的に撹拌することは可能で、これにより細胞沈殿が回避され、酸素と栄養素の混合が保証される。１つの構成では、パンチ全部を多孔性骨格によって置き換え可能であり、そうすることによって播種される細胞物質の量が最大になる。多孔性骨格を介する細胞懸濁液の直接灌流によって播種効率、均一性、および播種細胞の生存度が高まることが最近になって判明している（ウェンツ(Wendt)ら、Biotech Bioeng ８４：２０５−２１４頁、２００３年）。
【００４０】
骨格内での細胞灌流培養
細胞播種後、相２におけるような（ここでは細胞を含まない）培地を介する骨格の同じ振動運動によってコンストラクトの培養が引き続き行われる。骨格の構成および生成されるべき組織に依存し、栄養素の物質移動と細胞廃棄物との間での精密なバランス、コンストラクト内部で新たに合成される細胞外マトリックス成分の保持、および流体によって誘発される孔内部の剪断応力を達成するのに、パンチの速度および運動レジームを画定する必要がある。特定の時刻でまたは外部ポンプと連続的に、利用可能な２つのポート（コネクタ）を介して培地を変化させることが可能である。物質移動を改善するのに、灌流培養の間に培地の最適な撹拌を追加的に行うことが可能である。
【００４１】
本システムを利用することで、３つの上記培養相の一部もしくはすべてを機能させることが可能である。３つの培養相の機能を利用することで、懸濁液中で伸長された後に多孔性骨格の内／外に播種されて培養される骨髄由来細胞を出発とする骨様コンストラクト(bone-like construct)が生成されることが予見される。骨誘導性の移植片としてまたは３Ｄ間質組織内部で造血性幹細胞を伸長させるための系として、骨様コンストラクトの使用が可能である。
【００４２】
本発明は特定の好ましい実施形態に関連して説明されているが、一当業者であれば、追加、削除、置き換え、変形および改善が添付の特許請求の範囲に定義されるように本発明の趣旨および範囲内にとどまる一方で、それらを行うことが可能であることを理解するであろう。
【００４３】
図面は、培養室を、ほぼ環状のキャップを具備し、ほぼ円筒状をなすものとして示すが、本発明のエンドキャップは環状キャップである必要はなく、培養室の形状に依存する他の形状をとってもよい。培養室への接近を容易にするのに取り外し可能なエンドキャップが好ましいが、本発明の培養室は取り外し可能なキャップを具備するものに限定されるものではない。
【００４４】
骨格がエンドキャップと連動する場合の実施形態について複数の例が検討されるが、本発明は、必ずしもエンドキャップ間の互いに相対的な運動を含む必要がなく、骨格と少なくとも１つのエンドキャップとの間に相対運動を引き起こすことによって実施可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明の底部ユニットまたはエンドキャップを示す。
【図２】本発明の上部ユニットまたはエンドキャップを示す。図２Ａは骨格ホルダを具備する上部ユニットを示し、図２Ｂは骨格ホルダを具備しない同ユニットを示す。
【図３】本発明の組み立てられたバイオリアクターを示す。
【図４】本発明のバイオリアクターを示す。図４Ａは単独で有効なバイオリアクターを示し、図４Ｂは直線駆動ユニットを示し、図４Ｃは駆動ユニットに取り付けられたバイオリアクターを示す。
【図１】
0005386756.tif 000002
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
0005386756.tif 000004
【図３】
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【図４Ａ】
0005386756.tif 000006
【図４Ｂ】
0005386756.tif 000007
【図４Ｃ】
0005386756.tif 000008