(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子篩作用を有する樹脂を充填した充填塔を少なくとも４つ直列に連結してなる擬似移動層を備えた擬似移動床式クロマト分離装置を用いた、レバウディオサイドＡとステビオサイドとを分離してレバウディオサイドＡを精製する方法であって、
上記樹脂として水分含量が50〜57質量％であるスチレン系のゲル型強酸性陽イオン交換樹脂を用い、且つ
（a）レバウディオサイドＡとステビオサイドを含む被験試料を上記擬似移動層に供する
工程、
（b）当該擬似移動層から、吸収波長210nmの吸光度を指標に、ピーク画分に相当する溶離液を回収する工程、
（c）上記溶離液を再び上記工程（a）および（b）に、少なくとも１回供する工程
を有することを特徴とする、上記方法。
【請求項２】
上記工程（c）において、工程（a）および（b）に供されて回収される溶離液中の「レバ
ウディオサイドＡとステビオサイドとの重量比（Reba A/Stev）」が、当該工程（a）および（b）に供される直前の溶離液中の「レバウディオサイドＡとステビオサイドとの重量
比（Reba A/Stev）」よりも大きいことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（b）後に、さらに回収された溶離液を逆浸透膜濃縮処理に供する工程を有すること
を特徴とする、請求項１または２に記載する方法。
【請求項４】
レバウディオサイドＡとステビオサイドを含む被験試料が、レバウディオサイドＡとステビオサイドを含むステビア抽出物である、請求項１乃至３のいずれかに記載する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ステビア（Stevia rebaudiana）に含まれる天然甘味成分であるレバウディオサイドＡをより純度の高い形で調製する方法に関する。より詳細には、レバウディオサイドＡとステビオサイドとを含む混合物から、レバウディオサイドＡを分離精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ステビア（学名：Stevia rebaudiana）はパラグアイを始めとする南米を原産地とするキク科多年性植物であり、一般にステビアと略称されている。ステビアに含まれる甘味成分としては、ステビオサイド、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＢ、レバウディオサイドＣ、レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＥ、レバウディオサイドＦ、ズルコサイドＡ、ルブソシド、ステビオールビオシド等が知られており、これらの甘味成分のうち、ステビオサイド、レバウディオサイドＡ及びレバウディオサイドＣ、特にステビオサイドとレバウディオサイドＡが主としてステビア抽出物の成分を占める。
ステビオサイドは砂糖の２００倍の甘味を有し、その甘味は比較的砂糖に似ているが苦味等の残味がある。またレバウディオサイドＣは砂糖の４０〜６０倍の甘味しかないうえに、その甘味は渋味が強いという欠点がある。これに対し、レバウディオサイドＡは砂糖の３００倍の甘味を有し、その甘昧は砂糖に類似してまろやかで残味がなく、高甘味度甘味料としての有用性が極めて高い。
【０００３】
しかしながら、現在食品工業で用いられているステビア由来の甘味料のほとんどは上記甘味成分の混合物であるため、レバウディオサイドＡの長所が他の甘味成分であるステビオサイド、レバウディオサイドＣ等で消失してしまい、全体として苦味、渋味のある甘味料となっている。
【０００４】
この欠点に対して、呈味質の良いレバウディオサイドＡを高純度で調製する方法としては再結晶方法が一般的であるが（例えば、特許文献１等参照）、かかる再結晶法を適用するには、抽出の段階で70%以上もの高濃度でレバウディオサイドＡを含有する抽出物を取得しなくてはならない。
さらに再結晶化にはアルコール等の有機溶媒を大量に使用するという問題もある。
【０００５】
そこで、従来から、レバウディオサイドＡの含量が少ない原料からも高純度でレバウディオサイドＡを取得する方法が求められている。例えば、ステビオサイド、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＣおよびズルコサイドＡの混合物からレバウディオサイドＡを精製する方法として、固定相として親水性のビニルポリマーを素材とするゲルろ過用充填剤を、移動相として水を用いたゲル濾過クロマトグラフィーを用いる方法が提案されているが（例えば、特許文献２参照）、かかる方法では、1回に精製できる被験試料の量が限られ、またレバウディオサイドＡの精製に16時間以上を要するため、大量に処理することができず、工業規模で使用することが難しいという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開昭５２−６２３００号公報
【特許文献２】特開平６−１９２２８３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、レバウディオサイドＡを精製する方法を提供することを目的とする。より詳細には、本発明は、ステビアに含まれる天然甘味成分であるレバウディオサイドＡを、特にステビオサイドと分離して、高純度の形態で取得することができる方法であって、しかも工業規模で使用可能な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
工業的分離法として従来より擬似移動床法（Sumilated Moving Bed：SMB）が知られている。擬似移動床法は、２以上の成分を含む溶液（原液）から、各成分の移動速度の差に応じて当該２つの成分を２つの画分に分離するための方法である。より具体的には、当該方法は、原液中に含まれる２以上の成分中の目的成分に対して選択的吸着能力を有する吸着剤を充填した４以上の単位充填塔を直列に連結するとともに、最下流部の単位充填塔と最上流部の単位充填塔を連結することによって無端円状の循環系を構成した充填層に、２以上の成分を含む原液と溶離液を通流させることにより、当該充填層の循環系に前記吸着剤に対する親和力の順に吸着帯域を形成させ、原液供給口、溶離液供給口、原液に含まれるＡ成分（充填層内を移動する速度の大きい成分）の抜き取り口、原液に含まれるＢ成分（充填層内を移動する速度の小さい成分）の抜き取り口を、一定の位置関係に保ちながら充填層の流体循環方向の下流側に順位移動させることで、擬似的に充填層（固定相）を溶離液（移動相）の流れに対して逆方向に移動させ、目的成分（Ａ成分またはＢ成分）を連続的に分離する方法である（特開2003-61700号公報等参照）。
【０００９】
本発明者らは、分子篩（ゲル濾過）の原理に基づいて上記擬似移動床法を用いて、レバウディオサイドＡとステビオサイドを含む被験試料から、レバウディオサイドＡを分離精製するにあたり、まずイオン交換樹脂を固定相とするクロマトグラフィーを用いて、レバウディオサイドＡとステビオサイドを含むステビア抽出液からレバウディオサイドＡを分離しようと試みた。具体的には、イオン交換樹脂として、スチレン系のゲル型強酸性陽イオン交換樹脂である三菱化学（株）製のダイヤイオンUBK510L（水分含量61-65％、架橋度：4％）、ダイヤイオンUBK530（水分含量52-55.5％、架橋度6％）およびダイヤイオンUBK550（架橋度8％）を利用して分離を試みた。ちなみに架橋度が高いほど樹脂の孔径は小さい。
【００１０】
その結果、固定相（充填剤）としてダイヤイオンUBK 550（水分含量46-49.5％、架橋度8％）を用いた場合には樹脂を素通りして分離することができず、一方、固定相（充填剤）としてダイヤイオンUBK  510L（水分含量61-65％、架橋度：4％）を用いた場合には、ベッドボリュームに溶出するものの分離することができなかった（実験例１参照）。
【００１１】
これに対して、固定相（充填剤）としてダイヤイオンUBK530（水分含量52-55.5％、架橋度6％）を用いた場合には、ボイドボリュームに溶出して樹脂を素通りする傾向にあったものの、レバウディオサイドＡに比してステビオサイドの溶出が遅延する傾向にあった。本来、ダイヤイオンUBK530は分子量が500以下の物質の精製、分離に使用される樹脂であり、当該樹脂に対して分子量が大きいレバウディオサイドA（C44H70O23、分子量967）及びステビオサイド（C38H60O18、分子量805）の分離、精製はできないものと考えられる。
【００１２】
しかし、本発明者らはかかるダイヤイオンUBK530を用いることにより、レバウディオサイドA及びステビオサイドの両物質がボイドボリュームに溶出して樹脂を素通りする傾向にあったものの、意外にも、若干ながらレバウディオサイドＡに比してステビオサイドの溶出が遅延する傾向にあることを見いだし、両者を分離できる可能性を見出した。
【００１３】
そこで、かかる知見に基づいて、上記特性の樹脂を充填したカラムを連結した擬似移動床法を用いて、レバウディオサイドＡの精製を試みたところ、擬似移動床法からの溶出を繰り返すことでレバウディオサイドＡを順次ステビオサイドと分離することができ、高度に精製されたレバウディオサイドＡが取得可能であることを確認した。このことから、充填塔に充填する樹脂として水分含量が49.5％より多く61％より少ない、具体的には水分含量が50〜57％であるスチレン系のゲル型強酸性陽イオン交換樹脂を用いて擬似移動床式クロマト分離を行うことで、レバウディオサイドＡをステビオサイドから分離して高純度に精製することができることが判明した。
【００１４】
本発明はかかる知見に基づいて完成したものであり、下記の構成を有するレバウディオサイドＡの精製方法、より詳細にはレバウディオサイドＡ及びステビオサイドを含む混合物から、レバウディオサイドＡを分離し精製する方法に関する。
【００１５】
項１．分子篩作用を有する樹脂を充填した充填塔を少なくとも４つ直列に連結してなる擬似移動層を備えた擬似移動床式クロマト分離装置を用いた、レバウディオサイドＡとステビオサイドとを分離してレバウディオサイドＡを精製する方法であって、
上記樹脂として水分含量が50〜57重量％であるスチレン系のゲル型強酸性陽イオン交換樹脂を用い、且つ
（a）レバウディオサイドＡとステビオサイドを含む被験試料を上記擬似移動層に供する工程、
（b）当該擬似移動層から、吸収波長210nmの吸光度を指標に、ピーク画分に相当する溶離液を回収する工程、
（c）上記溶離液を再び上記工程（a）および（b）に、少なくとも１回供する工程
を有することを特徴とする、上記方法。
【００１６】
項２．上記工程（c）において、工程（a）および（b）に供されて回収される溶離液中の「レバウディオサイドＡとステビオサイドとの重量比（Reba A/Stev）」が、当該工程（a）および（b）に供される直前の溶離液中の「レバウディオサイドＡとステビオサイドとの重量比（Reba A/Stev）」よりも大きいことを特徴とする、項１記載の方法。
【００１７】
項３．工程（b）後に、さらに回収された溶離液を逆浸透膜濃縮処理に供する工程を有することを特徴とする、項１または２に記載する方法。
【００１８】
項４．レバウディオサイドＡとステビオサイドを含む被験試料が、レバウディオサイドＡとステビオサイドを含むステビア抽出物である、項１乃至３のいずれかに記載する方法。
【００１９】
項５．項１乃至４のいずれかに記載する方法で精製されてなる、「レバウディオサイドＡとステビオサイドとの重量比（Reba A/Stev）」が20以上、好ましくは30以上である、レバウディオサイドＡ含有組成物。
【００２０】
項６．項５記載のレバウディオサイドＡ含有組成物からなる甘味料。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の方法によれば、ステビアに由来する天然甘味成分のうち、呈味質の最も優れたレバウディオサイドＡを効率よく低コストで工業的に調製することができる。より具体的には、本発明の方法によれば、レバウディオサイドＡとステビオサイドの混合物から、レバウディオサイドＡを効率よく且つ純度高く分離し精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明で使用する擬似移動床式クロマト分離装置の概念図を示す。（Ａ）は、５つの充填塔の下流に逆浸透膜処理機（ＲＯ機）を備えない装置を、（Ｂ）は５つの充填塔の下流に逆浸透膜処理機（ＲＯ機）を備えた装置を示す。図中、各符号の意味は下記の通りである。１：原料タンク、２：展開溶媒タンク、３：擬似移動層、3-1：充填塔１、3-2：充填塔２、3-3：充填塔３、3-4：充填塔４、3-5：充填塔５、４：ＵＶ測定部、５：精製液回収タンク、６：展開溶媒回収タンク、７：逆浸透膜濃縮機（ＲＯ機）、８：ＲＯ処理液回収タンク、９：循環液タンク。
【図２】実験例１において、ステビア甘味料（ステビロンTK、stevioside 52％、rebaudioside A 25％含有）を、スチレン系陽イオン交換樹脂（ダイヤイオンUBK-550（架橋度8、水分含量46-49.5％）：三菱化学(株)）を用いてゲル濾過クロマトグラフィーを行った結果のクロマトグラムを示す。
【図３】実験例１において、ステビア甘味料（ステビロンTK、stevioside 52％、rebaudioside 25％含有）を、スチレン系陰イオン交換樹脂（ダイヤイオンWA-30（水分含量43-55％）：三菱化学(株)）を用いてゲル濾過クロマトグラフィーを行った結果のクロマトグラムを示す。
【図４】実験例１において、ステビア甘味料（ステビロンTK、stevioside 52％、rebaudioside 25％含有）を、スチレン系陽イオン交換樹脂（ダイヤイオンUBK-530（架橋度6、水分含量52-55.5％）：三菱化学(株)）を用いてゲル濾過クロマトグラフィーを行った結果のクロマトグラムを示す。
【図５】実験例２において、ステビア甘味料（ステビロンTK、stevioside 52％、rebaudioside A 25％含有）を、５つの充填塔を備えた擬似移動床式クロマト分離装置（図１(A)）に供して第１回目の分離操作を行った結果、すなわちレバウディオサイドＡ（-■-）とステビオサイド（-◆-）の溶出パターンを示す
【図６】実験例２において、第１回目の分離操作で回収した画分（第１溶出画分）を、５つの充填塔を備えた擬似移動床式クロマト分離装置（図１(A)）に供して第２回目の分離操作を行った結果、すなわちレバウディオサイドＡ（-■-）とステビオサイド（-◆-）の溶出パターンを示す。
【図７】実験例２において、第２回目の分離操作で回収した画分（第２溶出画分）を、５つの充填塔を備えた擬似移動床式クロマト分離装置（図１(A)）に供して第３回目の分離操作を行った結果、すなわちレバウディオサイドＡ（-■-）とステビオサイド（-◆-）の溶出パターンを示す。
【図８】実験例３において、ステビア甘味料（ステビロンTK、stevioside 52％、rebaudioside A 25％, rebaudioside C 12％含有）を、５つの充填塔を備えた擬似移動床式クロマト分離装置（図１(B)）に供して第１回目の分離操作を行った結果、すなわちレバウディオサイドＡ（-■-）とステビオサイド（-◆-）の溶出パターンを示す
【図９】実験例３において、第１回目の分離操作で回収した画分（第１溶出画分）を、５つの充填塔を備えた擬似移動床式クロマト分離装置（図１(B)）に供して第２回目の分離操作を行った結果、すなわちレバウディオサイドＡ（-■-）とステビオサイド（-◆-）の溶出パターンを示す
【図１０】実験例３において、第２回目の分離操作で回収した画分（第２溶出画分）を、５つの充填塔を備えた擬似移動床式クロマト分離装置（図１(B)）に供して第３回目の分離操作を行った結果、すなわちレバウディオサイドＡ（-■-）とステビオサイド（-◆-）の溶出パターンを示す
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、レバウディオサイドＡの精製に、擬似移動床式クロマト分離装置（以下、「ＳＭＢクロマト分離装置」と称する）を用いる方法である。
【００２４】
以下、図１（Ａ）および（Ｂ）に記載するＳＭＢクロマト分離装置の概念図を参照しながら、本発明の方法を説明する。但し、図１に記載する装置は、本発明の方法で使用するＳＭＢクロマト分離装置の一態様であって、本発明の方法は当該装置に制限されるものではない。
【００２５】
本発明の方法で用いるＳＭＢクロマト分離装置は、図１（Ａ）に示すように、原料をいれた「原料タンク１」、展開溶媒をいれた「展開溶媒タンク２」、分子篩作用を有する樹脂を充填した充填塔を５つ直列に連結してなる「擬似移動層３」、擬似移動層３から溶出した溶離液の吸光度を測定する「ＵＶ検出部４」、ＵＶ検出部４で検出されたピーク画分（波長210nm付近）に相当する溶離液を回収する「精製液回収タンク５」、上記ピーク画分（波長210nm付近）以外の溶離液を回収する「展開溶媒回収タンク６」を備えている。なお、レバウディオサイドＡを含まない溶離液は必ずしも回収しておく必要はないから、当該図１において「展開溶媒回収タンク６」は任意部分である。
【００２６】
なお、図１では、充填塔を５つ直列に連結した実施態様を例示しているが、「擬似移動層３」を構成する充填塔は分子篩作用を有する樹脂を充填した充填塔を少なくとも４つ直列に連結していればよい。詳細には、レバウディオサイドＡがリッチな部分を抜き出す充填塔、ステビオサイドがリッチな部分を抜き出す充填塔、原料を供給する充填塔及びレバウディオサイドＡ及びステビオサイドを分離する充填塔の４つを有していれば良く、その限りにおいて充填塔の数は適宜調整することが可能である。好ましくは５つ以上の充填塔を有することが望ましい。
【００２７】
「擬似移動層３」を構成する充填塔に充填する樹脂としては、分子篩作用を有するスチレン系のゲル型強酸性陽イオン交換樹脂を挙げることができる。当該樹脂は、具体的には、ベンゼン環にビニル基が一つついたスチレンと、ベンゼン環にビニル基が二つついたジビニルベンゼン（DVB）とを材料として、それらを懸濁重合することで直鎖の高分子であるポリスチレン同士がDVBによって架橋されてなるものである。これにスルホン酸や4級アンモニウム塩などが官能基として導入されている。当該樹脂は、上記の懸濁重合時にポリスチレン同士を橋架けするために使用するDVBの量によって、樹脂内の分子の網目（ミクロポアー）の大きさを適宜調整することができる。DVBの量を多くすると、橋架けする箇所が多くなって網目が密になり、一方、DVBが少ないと橋架けする箇所が少なくなるため網目は大きくなる。
【００２８】
好ましくは官能基として硫酸基を有するスチレン系のゲル型強酸性陽イオン交換樹脂を、さらに好ましくはスチレンスルホン酸ナトリウムからなるゲル型強酸性陽イオン交換樹脂を挙げることができる。
【００２９】
かかるゲル型強酸性陽イオン交換樹脂中の橋架けの度合い、すなわち架橋度は、樹脂の水分含量と相関していることが知られている（例えば、「DIAION １イオン交換樹脂・合成吸着剤マニュアル」第48頁など参照、三菱化学(株)）。上記樹脂は上述するように、スチレンとジビニルベンゼンとを材料として懸濁重合することで製造されるが、製造時の水分量が少ないとスチレン及びジビニルベンゼンの架橋反応が進む一方、水分量が多いと両者間の水分によって架橋反応が進みにくくなるためである。従って、イオン交換樹脂中の架橋度は、樹脂中の水分含量によって示すことができる。なお、樹脂中の「水分含量」（質量％）は、室温状態にある樹脂を105℃で6時間乾燥させた前後の重量差から、下式に従って求めることができる。
【００３０】
【数１】
0005570162.tif 000002
【００３１】
本発明で用いるスチレン系ゲル型強酸性陽イオン交換樹脂の水分含量としては、50〜57質量％を挙げることができる。好ましくは52〜55.5質量％を挙げることができる。なお、当該水分含量を有する樹脂は6を中心として5〜7、好ましくは5.5〜6.5、より好ましくは6の架橋度を有している。
【００３２】
また、本発明で用いるスチレン系のゲル型強酸性陽イオン交換樹脂としては、樹脂の粒度分布が200〜240μm（85％以上）であるものを挙げることができる。ここで「200〜240μm（85％以上）」とは、樹脂の85％以上の粒子の直径が200〜240μmの範囲にあることを意味する。当該粒子の直径は篩いを用いて測定することができ、この場合、具体的には孔径が240μmの篩いを通過し、且つ孔径が199μmの篩いを通過しない粒子の割合が、全体の85％以上を占める場合を「粒度分布が200〜240μm（85％以上）である」とすることができる。
【００３３】
かかる樹脂としては、具体的にはダイヤイオンUBK-530（架橋度6、水分含量52〜55.5％）（以上、三菱化学(株)製）などの市販品を用いることができる。
【００３４】
「擬似移動層３」はかかる樹脂を充填した充填塔（分離カラム）を少なくとも４つ連結してなるものである。充填塔の数は４以上、好ましくは５以上であればよく、その上限は、制限されないが、通常１０程度を挙げることができる。各充填層には、同一の樹脂を充填してもよいが、これに限定されることなく、上記限りにおいて異なる架橋度および／または粒度分布を有するものを充填してもよい。好ましくは同一の樹脂である。
【００３５】
充填塔の大きさや充填する樹脂の量は、精製するレバウディオサイドＡの量に応じて適宜設定することができ、特に制限されない。一例を挙げるとすれば、例えば、レバウディオサイドＡを10〜20ｇ含むステビア抽出液20〜100mlを被験試料とする場合、使用する樹脂の総量としては3500〜7000mlを挙げることができる。かかる量の樹脂を上記少なくとも４つの充填塔（分離カラム）に分けて充填して使用される。
【００３６】
ＳＭＢに使用する展開溶媒は、特に制限はないが、好ましくは含水低級アルコールを挙げることができる。ここで低級アルコールとしては、炭素数１〜６のアルコール、好ましくは炭素数１〜３のアルコールを挙げることができる。好ましくはエタノールである。含水アルコールのアルコール濃度としては、20〜80容量％、好ましくは30〜60容量％、より好ましくは40〜50容量％を挙げることができる。
【００３７】
ＳＭＢに供する原料、すなわち被験試料は、少なくともレバウディオサイドＡとステビオサイドを含むものであればよく、さらにレバウディオサイドＣを含むものであってもよい。好ましくは被験試料中に含まれるレバウディオサイドＡの割合が5〜80重量％であり、より好ましくは10〜30重量％である。
【００３８】
従来、レバウディオサイドＡを高純度で調製する方法として一般に使用されてきた再結晶法は、再結晶化する前に70％以上もの高濃度でレバウディオサイドＡを含有する抽出物を取得しなければならないという欠点を抱えていた。しかし、本発明に係る精製方法を用いれば、レバウディオサイドＡの割合が10〜30重量％といった低含量である被験試料からであってもレバウディオサイドＡを高度に分離、精製することができるという極めて優れた利点を有する。
【００３９】
かかるレバウディオサイドＡとステビオサイドを含むものとしては、ステビア（Stevia rebaudiana Bertoni）の抽出液、またはこれを原料として調製される、レバウディオサイドＡとステビオサイドを含むステビア抽出物を含むステビア甘味料を挙げることができる。
例えば、市販されているステビア甘味料として、守田化学株式会社製の「ステビロンＴＫ」、ＤＩＣライフテック株式会社製の「ステビアＤＩＣ  Ｃ−Ｐ」、池田糖化工業株式会社製の「ステビアＳＴ−ＡＢ」、日本製紙ケミカル株式会社製の「ステビアフィンＨ」、丸善製薬株式会社製の「純マルミロン」等を例示することができる。
【００４０】
本発明の方法は、前述するＳＭＢクロマト分離装置を用いて、下記（a）〜（c）の工程を行うことによって実施することができる：
（a）レバウディオサイドＡとステビオサイドを含む被験試料を上記擬似移動層に供する工程、
（b）当該擬似移動層から、吸収波長210nmの吸光度を指標に、ピーク画分に相当する溶離液を回収する工程、
（c）上記溶離液を再び上記工程（a）および（b）に、少なくとも１回供する工程。
【００４１】
これを図１（Ａ）に基づいて説明する。
【００４２】
図１（Ａ）において、「展開溶媒タンク２」から供給された上記展開溶媒は「擬似移動層３」内を流通している。その中で「原料タンク１」から原料（被験試料）が「擬似移動層３」の上流部、すなわち第１の充填塔１（符号3-1）の上流部に添加されることで、本発明の方法が開始する（(a)工程）。
【００４３】
斯くして「擬似移動層３」に供された被験試料は、展開溶媒とともに、擬似移動層３内、すなわち「充填塔１→充填塔２→充填塔３→充填塔４→充填塔５」内を通過し、最後尾の充填塔５（符号3-5）の下流部から溶出される。溶出された溶離液は、「ＵＶ測定部４」において吸収波長210nmにおける吸光度が測定される。当該吸収波長210nmは、レバウディオサイドＡの極大吸収波長に相当する。ここでかかる吸光度を指標として、ピーク画分に相当する溶離液は「精製液回収タンク５」に回収される（（b）工程）。一方、そうでない溶離液は「展開溶媒回収タンク６」に回収される。
【００４４】
「精製液回収タンク５」に回収された溶液は、次いで、必要に応じて濃縮される。かかる濃縮に使用する方法は、特に制限されないが、簡便には減圧濃縮を挙げることができる。この場合、減圧濃縮により展開溶媒中に含まれるアルコールと水が蒸発して展開溶媒のアルコール濃度が変化する。このため、濃縮後、「擬似移動層３」に供給する上記展開溶媒と同じアルコール濃度になるように調整される。
【００４５】
斯くて調整された溶液は、「原料タンク１」に送られて、再び「擬似移動層３」に供される（工程(c)における工程(a)）。具体的には、前述するように「擬似移動層３」の上流部、すなわち第１の充填塔１（符号3-1）の上流部に添加され、当該「擬似移動層３」の「充填塔１→充填塔２→充填塔３→充填塔４→充填塔５」を通じて精製され、次いで、充填塔５（符号3-5）から溶出された溶離液は、「ＵＶ測定部４」において測定される吸収波長210nmにおける吸光度を指標として、ピーク画分に相当する溶離液が「精製液回収タンク５」に回収される（工程(c)における(b)工程）。
【００４６】
斯くして回収された溶液は、レバウディオサイドＡが分離精製されるまで、必要に応じて再び、濃縮されて、上記(a)および(b)工程に供することができる。
【００４７】
斯くして得られる溶離液、すなわち工程(c)において上記(a)および(b)工程に供され、ピーク画分として回収された溶離液は、当該溶離液中の「レバウディオサイドＡとステビオサイドとの重量比」（以下、「Reba A/Stev」という。）が、その工程（a）に供される直前の溶離液中の「Reba A/Stev」よりも大きいことを特徴とする。すなわち、工程(c)において工程（a）および(b)を経る毎に、その回数に応じて、溶離液中に含まれるレバウディオサイドＡの割合（重量）がステビオサイドの割合よりも多くなり、その「Reba A/Stev」が、その工程（a）に供される直前の溶離液中の「Reba A/Stev」よりも大きくなる。
【００４８】
この場合のレバウディオサイドＡの分離精製の指標としては、特に制限されないが、例えば溶離液中の「Reba A/Stev」が20以上となることを挙げることができる。好ましくは30以上、より好ましくは35以上である。
【００４９】
なお、上記では、「精製液回収タンク５」に回収された溶液の濃縮に減圧濃縮を例示したが、これに代えて、逆浸透膜を使用することもできる。かかる逆浸透膜（RO）による濃縮工程を有する擬似移動床式クロマト分離装置の概念図を図１（Ｂ）に示す。かかる逆浸透膜（RO）による濃縮によれば、溶液中のアルコール濃度が変わらないので、得られた濃縮液は、アルコール濃度の調整をする必要なく、再度原料タンク１に供給することができる。
【００５０】
ここで逆浸透膜に用いられる膜素材としては、試料中に含まれるレバウディオサイドＡ、ステビオサイド、ならびにレバウディオサイドＣなどの成分は透過せず、水やアルコールなどの溶媒を選択的に透過するものであればよく、この限りにおいて、天然、合成、半合成の別を問わない。例えばセルロース、セルロース・ジ-アセテート若しくはトリ-アセテート、ポリアミド、ポリスルホン、ポリスチレン、ポリイミド、ポリアクリロニトリルなどを挙げることができる。一例として、逆浸透膜として、合成高分子系複合膜（PVA系）を用いたNaCl阻止率90％以上の高透過水量タイプの低圧RO膜である日東電工（株）製の「NTR-729HR」、またNaCl阻止率99.5％以上の高透過水量タイプの超低圧RO膜である日東電工（株）製の「ES10-D」を例示することができる。
【００５１】
この場合、「精製液回収タンク５」に回収された溶液は、ＲＯ機７に供されて、ここで濃縮される。ここで濃縮されたレバウディオサイドＡを含む溶液は、「原料タンク１」に送られて、再び「擬似移動層３」に供給され、当該「擬似移動層３」の「充填塔１→充填塔２→充填塔３→充填塔４→充填塔５」を通じて精製される（工程（c）における工程(a)）。次いで、充填塔５（符号3-5）から溶出された溶離液は、「ＵＶ測定部４」において測定される吸収波長210nmにおける吸光度を指標として、ピーク画分に相当する溶離液が「精製液回収タンク５」に回収される（工程(c)における(b)工程）。
【００５２】
斯くして回収された溶液は、図１（Ａ）に関して説明したように、レバウディオサイドＡが分離精製されるまで、必要に応じて再び、濃縮されて、上記(a)および(b)工程に供される。
【００５３】
一方、ＲＯ機７での濃縮で生じたレバウディオサイドＡ等を含まない溶液は、ＲＯ処理液回収タンク８に回収される。当該溶液は、循環液タンク９に供給されて、展開溶媒として繰り返し使用される。
【００５４】
かかるＳＭＢクロマト分離装置において、展開溶媒の流速は、充填塔の大きさおよび分離する被験試料の量によっても相違するが、通常5〜30ml/min、好ましくは10〜15ml/minを挙げることができる。
【００５５】
当該ＳＭＢクロマト分離装置において、溶離液中の「Reba A/Stev」が80以上、好ましくは90以上、より好ましくは98以上となることを指標として、レバウディオサイドＡの分離精製を終了することができる。
【００５６】
斯くして得られる溶離液は、必要に応じて濃縮または乾燥し、レバウディオサイドＡを高純度に含む甘味料として提供することができる。
【実施例】
【００５７】
以下、本発明の内容を以下の実験例を用いて具体的に説明する。但し、これらの実験例は本発明の一態様に過ぎず、本発明はこれらの例に何ら限定されるものではない。なお、特に記載のない限り「％」は「質量％」意味するものとする。
【００５８】
実験例１
ゲル濾過法は分子量の異なる成分を固定相（樹脂）によって形成される網目構造の孔径に応じて目的物を分離する方法であり、分子量の大きいものから溶出してくる。
【００５９】
レバウディオサイドＡとステビオサイドを含むステビア甘味料を原料として、下記の３種類の樹脂（(a)、(b)、(c)）を固定相としてゲル濾過クロマトグラフィーを行い、ゲル濾過法による分離の可能性を探った。
【００６０】
（1）原料液
レバウディオサイドＡとステビオサイドを含むステビア甘味料（ステビロンＴＫ： stevioside 52%, rebaudioside A 25%含有：守田化学工業(株)）1ｇをエタノール濃度が25容量％の含水エタノール10mlに溶解したものを使用。
【００６１】
（2）ゲル濾過クロマトグラフィー
（i）装置：直径50mm×長さ50cmのガラスカラムに下記の樹脂を700ml充填し、同じものを５本直列につなぐ。
（ii）溶離液：エタノール濃度55容量％の含水エタノール
（iii）固定相：下記いずれかの充填剤を硝子製カラム（カラム直径450mm×600mm）に充填（500ml）したものを使用
(a) スチレンスルホン酸ナトリウムのゲル型強酸性陽イオン交換樹脂（ダイヤイオンUBK-550（架橋度8、水分含量46−49.5％）：三菱化学(株)）
(b) スチレン系ジメチルアミンのポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂（ダイヤイオンWA-30：（水分含量43−55％）三菱化学(株)）
(c)スチレンスルホン酸ナトリウムのゲル型強酸性陽イオン交換樹脂（ダイヤイオンUBK-530（架橋度6、水分含量52−55.5％）：三菱化学(株)）
（iv）流速：定量ポンプにて約10ml/min
（v）検出方法：フローセル検出器（UV210nm）。
【００６２】
（3）実験とその結果
充填剤として（a）の樹脂（ダイヤイオンUBK-550）を用いたときのゲル濾過クロマトグラフィーを図２に示す。図２からわかるように、レバウディオサイドＡとステビオサイドはいずれも当該樹脂（ダイヤイオンUBK-550）のボイドボリュームで溶出した。このことは、これらの成分はいずれも樹脂の孔径に入ることなく、空隙（ボイドボリューム）を素通りすることを示している。また両ピークともシャープであることから、レバウディオサイドＡとステビオサイドはいずれも当該樹脂に吸着しないことが確認された。
【００６３】
充填剤として（b）の樹脂（ダイヤイオンWA-30）を用いたときのゲル濾過クロマトグラフィーを図３に示す。通常ポーラス型のイオン交換樹脂はゲル型のイオン交換樹脂よりも孔径が大きい。図３からわかるように、レバウディオサイドＡとステビオサイドはいずれも当該樹脂（ダイヤイオンWA-30）のベッドボリュームで溶出した。このことは、これらの成分はいずれも樹脂の孔径に入ることを示している。しかし、また両ピークともブロードであることから、レバウディオサイドＡとステビオサイドはいずれも当該樹脂に吸着性を有することが確認された。しかし、かかる樹脂では、両成分を分離することができなかった。
【００６４】
また実施例には示さないが、樹脂としてスチレンスルホン酸ナトリウムのゲル型強酸性陽イオン交換樹脂（ダイヤイオンUBK-510L（架橋度4、水分含量61〜65％）：三菱化学(株)）を用いた場合も、レバウディオサイドＡとステビオサイドの両成分を分離することはできなかった。
【００６５】
充填剤として（c）の樹脂（ダイヤイオンUBK-530）を用いたときのゲル濾過クロマトグラフィーを図４に示す。図４からわかるように、ダイヤイオンUBK-550の場合と同様に、レバウディオサイドＡとステビオサイドはいずれも当該樹脂（ダイヤイオンUBK-530）のボイドボリュームで溶出した。このことは、これらの成分はいずれも樹脂の孔径に入ることなく空隙を素通りすることを示している。しかし、わずかながらではあるが、レバウディオサイドＡの溶出は、ステビオサイドの溶出よりも遅延する傾向が認められ、当該樹脂により両成分を分離することができると考えられた。
【００６６】
実験例２
実験例１の結果から、擬似移動床式クロマト分離装置の固定相（充填剤）として（c）の樹脂（ダイヤイオンUBK-530）、すなわちスチレンスルホン酸ナトリウムのゲル型強酸性陽イオン交換樹脂を用いて、下記の方法によりレバウディオサイドＡを精製した。
【００６７】
（1）精製対象とする原料液
レバウディオサイドＡとステビオサイドを含むステビア甘味料（ステビロンＴＫ： stevioside 52%, rebaudioside A 25%含有：守田化学工業(株)）1.5ｇを水10mlに溶解したものを使用した。
【００６８】
（2）ＳＭＢ条件
(a) 溶離液：エタノール濃度55容量％の含水エタノール
(b) 固定相（充填剤）：スチレンスルホン酸ナトリウムのゲル型強酸性陽イオン交換樹脂（ダイヤイオンUBK530（架橋度6、水分含量52-55.5％）：三菱化学(株)）
(c)充填塔（カラム）：硝子製の５本のカラム（カラム直径450mm×600mm）に上記充填剤を充填した５充填塔を使用（充填剤の総量：3500ml）、
(d)原料液の流速：9.4ml/min
(e)溶離液の流速：9.4ml/min 
(f)カラム温度：室温  24℃
(g)サイクルタイム：480分。
【００６９】
（3）実験とその結果
以下、分離操作を図１（A）に示す擬似移動床式クロマト分離装置の模式図、並びに図５〜７を参照しながら説明する。
【００７０】
(i)第１回目の分離操作（図５参照）
まず、上記原料液を、「原料タンク１」から上記５つの充填塔3-1〜3-5を備えた擬似移動床式クロマト分離装置（図１(Ａ)）を用いて、２循環を１サイクルとして処理した。かかる分離操作（２循環）におけるレバウディオサイドＡ（-■-）とステビオサイド（-◆-）の溶出パターンを図５に示す。１循環目（０〜２４０分）の溶出パターンでは溶出し始めの140分〜145分ではレバウディオサイドＡ／ステビオサイドの比は高いものの（140分：4、143分：2、145分：1）、それ以後の145分〜240分では逆転し、その比は低くなっているのがわかる（160分：0.32、170分：0.31）。
【００７１】
次いで、142分〜170分の溶出画分を回収して、２循環目の処理を行った。つまり、充填塔５（符号3-5）より溶出した液のうち142分から170分の部分を充填塔１（符号3-1）に戻し２循環目の処理を行った。その他の部分(170分〜300分)は展開液回収タンクへ回収し、展開溶媒タンクには新たな展開溶媒（55%EtOH）を追加した。２循環目の溶出（300分〜480分）では300分〜350分では１循環目より更にレバウディオサイドＡ/ステビオサイド比が高くなっていたので300分〜350分を「精製液回収タンク」に回収した。この精製液は、次いでロータリーエバポレーターにて真空濃縮し、含水アルコール（55%EtOH）で希釈調整した後、次回の第２回目の分離操作の精製に使用した。
【００７２】
(ii)第２回目の分離操作（図６参照）
上記の第１回目の分離操作で回収し濃縮し、含水アルコール（55%EtOH）で調整した第１精製液40ｍｌを、再び上記５つの充填塔を備えた擬似移動床式クロマト分離装置（図１(Ａ)）の原液供給口（充填塔１（符号3-1）の上流部）に供し、充填塔５(符号3-5)の下流部から溶出させた。次いで、この138〜170分の溶出画分を充填塔１（符号3-1）に戻して２循環させ、２循環目の290〜314分の溶出画分を「精製液回収タンク５」に回収し、その他の部分は展開液回収タンクへ回収した。回収した精製液は、次いでロータリーエバポレーターにて真空濃縮し、含水アルコール（55%EtOH）で希釈調整した後、次回の第２回目の分離操作の精製に使用した（第２溶出画分）。かかる分離操作におけるレバウディオサイドＡ（-■-）とステビオサイド（-◆-）の溶出パターンを図６に示す。
【００７３】
(iii)第３回目の分離操作（図７参照）
上記の第２回目の分離操作で回収し濃縮し、含水アルコール（55%EtOH）で調整した第２精製液15ｍｌを、再び上記５つの充填塔を備えた擬似移動床式クロマト分離装置（図１(Ａ)）の原液供給口（充填塔１（符号3-1）の上流部）に供し、充填塔５（符号3-5）の下流部から溶出し138〜150分の溶出画分を充填塔１（符号3-1）に戻し２循環させ(グラフのスポットは記載されていない)、２循環目の276〜314分画分を「精製液回収タンク」に回収した（第３溶出画分）。かかる分離操作におけるレバウディオサイドＡ（-■-）とステビオサイド（-◆-）の溶出パターンを図７に示す。
【００７４】
上記で得られた第１溶出画分、第２溶出画分および第３溶出画分に含まれているレバウディオサイドＡとステビオサイドの割合を、下記条件のHPLCで分析し、レバウディオサイドＡ（RebaA）とステビオサイド（Stev）の重量比（RebaA／Stev）を求めた。
【００７５】
＜HPLC条件＞
装置：日本分光製HPLC2000シリーズ                              
固定相：Shodex社製  Asahipak NH2P-50                            
移動相： CH3CN：H2O＝80:20  アイソクラティック
流速：1ml/min
検出波長  210nm。
【００７６】
その結果、第１回目の分離操作において、ステビロンＴＫ（原料）のレバウディオサイドＡ（RebaA）とステビオサイド（Stev）の重量比（RebaA／Stev）は0.48であったものが、第１溶出画分では0.94に上昇し、さらに第２溶出画分では1.44、またさらに第３溶出画分では21.0と上昇し、分離操作を繰り返すにつれて、レバウディオサイドＡの割合が増加し、レバウディオサイドＡが順次精製されていくことが確認された。
【００７７】
また、図１(Ａ)において、５つの充填塔に代えて４つの充填塔を備えた擬似移動床式クロマト分離装置を用いても、上記と同様に、ステビア甘味料（ステビロンＴＫ： stevioside 52%, rebaudioside A 25%含有：守田化学工業(株)）から、レバウディオサイドＡが精製できることが確認された。
【００７８】
実験例３
実験例２により樹脂UBK530を使用することによってレバウディオサイドＡとステビオサイドが、若干ではあるが分離することがわかり、上記操作を繰り返すことで徐々にレバウディオサイドＡが精製できることを確信した。しかし、この操作は２循環を１サイクルとするバッチ処理であるため、工業スケールで行うことは難しい。そこで、この操作を連続的に行うことを検討した。レバウディオサイドＡ／ステビオサイド比が一定であれば溶出パターンは同じであることが分かっているので、溶出液の流れる部分にフローＵＶメーターを設置し、溶出開始時を検出させ回収を始める。その後、一定時間後にタイマー信号によりバルブを切り替え、別の場所に回収をすることにより精製液（図１（Ｂ）：精製液回収タンク５）と非精製液（循環液回収タンク６）の回収が可能となる。
【００７９】
充填塔１〜５内を循環する展開溶媒においても、成分がテーリングしていることより循環には使用することができず、回収した液（精製液回収部と非精製液回収部）は新規の展開溶媒を添加してやる必要がある。この問題点を解決するためにＲＯ機（ＲＯ濃縮機）を循環内に組みこんだ。ＲＯ機は、水、アルコール等の低分子成分は透過し、レバウディオサイドＡ等の成分は透過させないという特徴がある。このためＲＯ機７を透過した液は、使用前の展開溶媒と同等のものになるため、展開溶媒が必要でなくなり、ＲＯ機導入により、同じ溶媒を循環させ続けることが可能になる。またＲＯ濃縮液は含水アルコール濃度の変化もないことから、実施例１で行ったアルコール調整も必要でなく、このため一定の濃度になったら原料タンクにそのまま返送することができる。このように、実験例２で使用したバッチシステムをＲＯ機の導入とコンピュータ制御によりバッチ連続システムに変換することができた。このシステムを図１（Ｂ）に示す。
【００８０】
擬似移動床式クロマト分離装置の固定相（充填剤）として（c）の樹脂（ダイヤイオンUBK-530）、すなわちスチレンスルホン酸ナトリウムのゲル型強酸性陽イオン交換樹脂を用いて、下記の方法によりレバウディオサイドＡを精製した。
【００８１】
（1）精製対象とする原料液
レバウディオサイドＡとステビオサイドを含むステビア甘味料（ステビロンＴＫ： stevioside 52%, rebaudioside A 25%含有：守田化学工業(株)）20ｇを水40mlに溶解したものを使用した。
【００８２】
（2）ＳＭＢ条件
(a) 溶離液：エタノール濃度50容量％の含水エタノール
(b) 固定相（充填剤）：スチレンスルホン酸ナトリウムのゲル型強酸性陽イオン交換樹脂（ダイヤイオンUBK530（架橋度6、水分含量52-55.5％）：三菱化学(株)）
(c)充填塔（カラム）：硝子製の５本のカラム（カラム直径450mm×600mm）に上記充填剤を充填した５充填塔を使用（充填剤の総量：3500ml）、
(d)原料液の流速：9.0ml/min
(e)溶離液の流速：9.0ml/min 
(f)カラム温度：室温  24℃
(g)サイクルタイム：480分
(h)検出：UV210nmの吸光度を測定。
【００８３】
（3）実験とその結果
以下、分離操作を図１（B）に示す擬似移動床式クロマト分離装置の模式図、並びに図８〜１０を参照しながら説明する。
【００８４】
(i)第１回目の分離操作（図８参照）
まず、上記原料液を、「原料タンク１」から上記５つの充填塔（符号3-1〜3-5）を備えた擬似移動床式クロマト分離装置（図１(Ｂ)）を用い、２循環を１サイクルとして処理した（図８）。つまり１循環目は142分〜180分の溶出画分を充填塔１（符号3-1）に戻し、180〜300分の溶出画分は循環させず循環液回収タンク６に送液した。更に、300〜350分の溶出画分は精製液回収タンク５へ送液し、350〜480分溶出画分は循環液回収タンク６へ送液した。分離開始時の展開溶媒として含水アルコール（50％EtOH）を使用したが、その後は循環液回収タンク６および精製液回収タンク５に送られた回収液を、逆浸透膜装置（RO機）７（NTR-729HR、日東電工社製）で処置した透過液をＲＯ処理液回収タンク８へ送り更に循環液タンク２に送って展開溶媒として使用した。精製液回収タンク５のＲＯ膜処理濃縮液は、次回の第２回目の分離操作の原料として原料タンク１へ送った。第１回目の分離操作により得られた精製液のレバウディオサイドＡ／ステビオサイド比は、原料の0.48から1.05へと上昇した。本操作におけるレバウディオサイドＡ（-■-）とステビオサイド（-◆-）との全溶出パターンを図８に示す。
【００８５】
(ii)第２回目の分離操作（図９参照）
第１回目の分離操作で得られた精製液をＲＯ膜濃縮した原料液を、「原料タンク１」から上記５つの充填塔（符号3-1〜3-5）を備えた擬似移動床式クロマト分離装置（図１(Ｂ)）を用いて、再び２循環を１サイクルとして処理した。つまり１循環目は142〜190分の溶出画分を充填塔１（符号3-1）に戻し、190〜310分の溶出画分は循環させず循環液回収タンク６に送液した。更に、310〜360分の溶出画分は精製液回収タンク５へ送液、360分〜480分の溶出画分は循環液回収タンク６へ送液した。分離開始時の展開溶媒として含水アルコール（50％EtOH）を使用したが、その後は循環液回収タンク６および精製液回収タンク５に送られた回収液をＲＯ膜で処置した透過液をＲＯ処理液回収タンク８へ送り、更に循環液タンク６に送って展開溶媒として使用した。また精製液回収タンク５のＲＯ膜処理濃縮液を、次回の第３回目分離操作の原料として原料タンク１へ送った。かかる第２回目の分離操作により、精製液のレバウディオサイドＡ／ステビオサイド比は、原料の1.05から2.52に上昇していた。本操作におけるレバウディオサイドＡ（-■-）とステビオサイド（-◆-）との全溶出パターンを図９に示す。
【００８６】
(iii)第３回目の分離操作（図１０参照）
上記第２回目の分離操作において得られた精製液をＲＯ膜濃縮した原料液を、「原料タンク１」から上記５つの充填塔（符号3-1〜3-5）を備えた擬似移動床式クロマト分離装置（図１(Ｂ)）を用いて、再び２循環を１サイクルとして処理した。つまり１循環目は142〜190分の溶出画分を充填塔１（符号3-1）に戻し、190〜310分の溶出画分は循環させずに循環液回収タンク６に送液した。更に、310〜380分の溶出画分は精製液回収タンク５へ送液、380〜480分の溶出画分は循環液回収タンク６へ送液した。分離開始時の展開溶媒として含水アルコール（50％EtOH）を使用したが、その後は循環液回収タンク６および精製液回収タンク５に送られた回収液をＲＯ膜で処置した透過液を、ＲＯ処理液回収タンク６へ送り、更に循環液タンク９に送って展開溶媒として使用した。第３回目の分離操作により、精製液（RO膜処理濃縮液）のレバウディオサイドＡ／ステビオサイド比は、原料の2.52から34.2へと上昇した。本操作におけるレバウディオサイドＡ（-■-）とステビオサイド（-◆-）の全溶出パターンを図１０に示す。
【００８７】
上記で得られた第１回目の分離操作、第２回目の分離操作および第３回目の分離操作によって得られたＲＯ膜処理濃縮液に含まれているレバウディオサイドＡとステビオサイドの割合を、実験例２と同様の方法で分析し、レバウディオサイドＡ（RebaA）とステビオサイド（Stev）の重量比（RebaA／Stev）を求めた。
【００８８】
その結果、第１回目の分離操作において、ステビロンＴＫ（原料）のレバウディオサイドＡ（RebaA）とステビオサイド（Stev）の重量比（RebaA／Stev）は0.48であったものが、第１回目の分離操作では1.05に上昇し、さらに第２回目の分離操作では2.52、またさらに第３回目の分離操作では34.2と上昇し、分離操作を繰り返すにつれて、レバウディオサイドＡの割合が増加し、レバウディオサイドＡが順次精製されていくことが確認された。
【００８９】
また、図１(Ｂ)において、５つの充填塔に代えて４つの充填塔を備えた擬似移動床式クロマト分離装置を用いても、上記と同様に、ステビア甘味料（ステビロンＴＫ： stevioside 52%, rebaudioside A 25%含有：守田化学工業(株)）から、レバウディオサイドＡが精製できることが確認された。
【図１】
0005570162.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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