(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つのモノマー断片のポリペプチド二量体であって、
モノマー断片は、
（ａ）ｇｐ１３０のドメイン４から６（Ｄ４からＤ６）を含まない、グリコプロテイン（ｇｐ）１３０の細胞外部位のドメイン１から３（Ｄ１からＤ３）と、
（ｂ）それらのＣ末端での５から３０のアミノ酸長を有するポリペプチドスペーサとを含み、
２つのモノマー断片は、ジスルフィド結合の形成を可能とする１以上の遊離のシステイン残基を含む天然又は人工のポリペプチドへのモノマー断片の融合による、１以上のジスルフィド架橋によって互いに共有結合し、
スペーサ長は、得られる二量体プロテインのＩＬ−６／可溶ＩＬ−６レセプター複合体への最適結合を決定し、
ポリペプチド二量体は、ｇｐ１３０のドメイン（Ｄ４からＤ６）を含まず、
相同凝集体及び分子断片の著しく低減した形成能を示し、
宿主細胞において著しく高い生成率が得られる２つのモノマー断片のポリペプチド二量体。
【請求項２】
２つのモノマー断片が同一である請求項１のポリペプチド二量体。
【請求項３】
ジスルフィド架橋が、ＩｇＧ−Ｆｃ部位へのモノマー断片の融合によって生成される請求項１のポリペプチド二量体。
【請求項４】
ポリペプチドスペーサが、たんぱく質分解的切断から分子を保護するために選択的にグリコシル化されてなる請求項１から３のいずれか１つのポリペプチド二量体。
【請求項５】
ポリペプチドスペーサが、１０から２５のアミノ酸長を有する請求項１から４のいずれか１つのポリペプチド二量体。
【請求項６】
ポリペプチドスペーサが、１５から２５のアミノ酸長を有する請求項５のポリペプチド二量体。
【請求項７】
スペーサは、１、２、３、４、５又は６のｎで、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）nを有する請求項１から６のいずれか１つのポリペプチド二量体。
【請求項８】
５０％未満の相同凝集体及び分子断片を形成する請求項１から７のいずれか１つのポリペプチド二量体。
【請求項９】
２５％未満の相同凝集体及び分子断片を形成する請求項８のポリペプチド二量体。
【請求項１０】
１０％未満の相同凝集体及び分子断片を形成する請求項９のポリペプチド二量体。
【請求項１１】
５％未満の相同凝集体及び分子断片を形成する請求項１０のポリペプチド二量体。
【請求項１２】
モノマーは、図８に表されたアミノ酸配列を有する請求項１から１１のいずれか１つのポリペプチド二量体。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
ポリヌクレオチド配列が、真核生物宿主細胞、バクテリア、イースト又は昆虫細胞でコードされたタンパク質の生成のために最適化されたコドンである請求項１３のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
図７に表された核酸配列を含む請求項１３又は１４のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１３から１５のいずれか１つのポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１６の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１７の宿主細胞を培養し、ポリペプチドモノマー又は二量体を前記宿主細胞又は培養媒体から回収し、それを生成することを含む請求項１から１２のいずれか１つのポリペプチド二量体を生成する方法。
【請求項１９】
請求項１から１４のいずれか１つのポリペプチド二量体又は請求項１３から１５のいずれか１つのポリヌクレオチドを含む医薬組成物。
【請求項２０】
骨吸収、高カルシウム血症、悪液質、腫瘍、ガン、自己免疫病気、炎症性疾患、細菌性又はウィルス性感染症の治療又は予防のための医薬組成物の製造のための、請求項１から１２のいずれか１つのポリペプチド二量体又は請求項１３から１５のいずれか１つのポリヌクレオチドの使用。            
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
グリコプロテイン（ｇｐ）１３０の細胞外（可溶性）部分のドメイン１〜３と、特定のポリペプチドスペーサを含む２つの同一のモノマー断片から構成されるポリペプチド二量体が記載され、それは、互いに共有結合されており、宿主細胞中のそれらの生成率、それらの改善された精製及びそれらのＩＬ−６／可溶性ＩＬ−６レセプター複合体に結合する能力に関して、顕著な利点を有する。また、その二量体分子を含む医薬組成物及び種々の医療用途が記載されている。
【背景技術】
【０００２】
多形質発現サイトカインインターロイキン−６（ＩＬ−６）は、主として、Ｂ及びＴ細胞の刺激、後天性及び先天性の免疫プロセスの制御及び肝臓の急性期タンパク質合成の誘導が顕著である、広範な生物学的機能を示す。ＩＬ−６は、結合によって細胞反応を誘発するｇｐ１３０の二量体化を誘導する膜結合又は可溶性ＩＬ−６レセプター（「ＩＬ−６Ｒ」または「ｇｐ８０」）によってその活性を示す。
【０００３】
ＩＬ−６Ｒの細胞質ドメインはキナーゼ活性を欠いているため、ｇｐ１３０ホモ二量体によるシグナリングは、膜結合又は可溶性ＩＬ−６Ｒとの複合体におけるＩＬ−６によって誘導することができる。ｇｐ１３０は、ほとんどすべての細胞タイプで見出すことができるが、ＩＬ−６Ｒ発現は、肝細胞及び白血球に制限される。しかし、これらの細胞は、タンパク質分解的切断又は選択的スプライシングのいずれかによるＩＬ−６Ｒ発現細胞から放出されるｓＩＬ−６Ｒ経由ＩＬ−６によって活性化することができる。このメカニズムは、トランスシグナリングと呼ばれている。実際、いくつかの細胞の活性が、ＩＬ−６単独で誘導されず、ｓＩＬ−６ＲとＩＬ−６との複合体に依存することが示されている。
トランスシグナリングは、先天性免疫反応から後天性免疫反応へのスイッチで重要な役割を果たし、好中球浸潤のクリアランスならびに継続した免疫学的応答に対するＴ細胞とＢ細胞との漸増及び活性化のために重要である。このメカニズムの調節不全は、クローン病、慢性関節リウマチ、喘息等の慢性及び／又はアレルギー性炎症性疾患の発現及び持続をもたらす。
【０００４】
これらの疾患の治療に関して、ＩＬ−６によって媒介されるプロセスの特定の遮断が治療的に有効であることが示された。残念なことに、この目的のために現在利用できるすべての化合物は、これまでのところ、いくぶん重篤な副作用（例えば、二次感染、結核、敗血症）、毒性又は免疫原性の問題を有する。また、未解決の問題は、有用で経済的な精製方法の開発中に認められている。
【発明の開示】
【０００５】
技術的問題の解決は、クレームにおいて特徴付けられた実施形態の提供によって達成される。本発明を導く実験の間に、ｇｐ１３０の全細胞外部分の２つの分子からなる親化合物ｓｇｐ１３０Ｆｃの精製が十分でないことが見出された。この融合タンパク質は、真核性ＣＨＯ細胞で発現された場合、望まない副生成物（例えば、より小さな断片、オリゴマー及び多様な組合せにおける凝集）を構築する傾向がある。その不純物及び核となる生成物は非常に類似した化学的及び物理的特性を有するため、適当な量で、これらの不純物から目的化合物を分離する適当な精製方法を見出すことは不可能であった。特に、試験方法は、異なる親和性、サイズ除外及びイオン交換クロマトグラフィ（イオン添加又はｐＨシフト等によるタンパク質の可溶性を変えるためにアプローチした）であった。これらの方法のいずれも、満足な結果を与えなかったか、ＧＭＰに対応した精製プロセスを開発するためのグレードアップに適していなかった。それに対して、親分子ｓｇｐ１３０Ｆｃのより短い変異体（ｓｇｐ１３０（Ｄ１−３）Ｆｃと呼ぶ、細胞外ドメイン４〜６を欠損）が精製副生成物から良好に分離されたことが見出された。これは、親ｓｇｐ１３０Ｆｃ分子のフィブロネクチンIII領域（ドメイン４〜６）内のエレメントを形成する凝集が良好に消失したことを示した。さらに、この分子は、著しく高率で、真核細胞によって発現された。
【０００６】
次の工程で、新しい分子ｓｇｐ１３０（Ｄ１−３）ＦｃのＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒへの結合効率を、ｓｇｐ１３０（Ｄ１−３）及びＩｇＧ−Ｆｃ部位間での種々の長さのポリペプチドスペーサを融合させることによって最適化した。結果として生じた分子の結合技術を、特異的酵素結合抗体免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で測定し、親分子ｓｇｐ１３０Ｆｃと比較した（図５）。
【０００７】
ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ複合体の結合は、クローン病患者の単球におけるＩＬ−６の反アポトーシス作用を阻害することが示されており、そのような化合物がクローン病及び大腸炎、慢性関節リウマチ、乾癬、腹膜炎等のような関連疾患の治療に有用であることを示す。
【０００８】
クローン病は、急性炎症の頻繁に起こる再発によって特徴づけられる全ての消化管の慢性炎症性障害である。感染、けが及び他の要因と関連した炎症は、急性期タンパク質（ＡＰＰｓ）の発現を伴う急性期反応（ＡＰＲ）を迅速に誘発する。ＡＰＲは、主に脈管透過性の増加及び発熱をもたらす。ＩＬ−６族類は、ＳＴＡＴ３によって媒介されるタイプIIＡＰＰ遺伝子の発現を亢進する。ＳＴＡＴ３（つまり、チロシンリン酸化）の強力な活性は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）患者からの結腸組織で示されている。さらに、ＳＴＡＴ３活性化の減少が、実験的なネズミ大腸炎の減少した発現を関連するＩＬ−６-1-マウスで観察された(Suzukiら、J. Exp. Med., 2001, 193:471)。
これらの実験は、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒによって媒介されるＳＴＡＴ３の活性が、大腸炎の発現及び永続化で重要な役割を果たすことを示した。もう一つの炎症性モデルでは、リウマチ様関節炎（ＲＡ）において、ＳＴＡＴ３がＲＡ滑液線維芽細胞の残存にとって重要であることが示された(Krauseら、J. Immunol, 2002, 169:6610)。従って、ＳＴＡＴ３は、遺伝子治療の良好なターゲットとなるかもしれないことが示唆された。本質的なＳＴＡＴ３活性は、「発癌性」要因であり、反アポトーシスタンパク質（例えば、Ｂｃｌ−２及びＢｃＩ−ＸＬ）のアップグレード化を伴うことが知られている(Turksonら、Oncogene, 2000, 19:6613)。
【０００９】
ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒによって媒介されるＳＴＡＴ３活性化が親ｓｇｐ１３０Ｆｃ化合物に匹敵する有効性レベルでｓｇｐ１３０（Ｄ１−３）Ｆｃによって著しく減少させられることが見出された。さらに、ｓｇｐ１３０（Ｄ１−３）Ｆｃ（ｓｇｐ１３０Ｖａｒ）は、真核細胞中でｓｇｐ１３０Ｆｃより高い量で発現され、望まれていない副生成物を生成せず、標準的なカラムクロマトグラフィーによって残留する不純物から分離することができた。これらの利点は、適当なＧＭＰ生成方法の開発を顕著に強化し、製品コストを低減させる。
【００１０】
従って、本発明は、２つのモノマー断片のポリペプチド二量体に関し、モノマー断片は、グリコプロテイン（ｇｐ）１３０の細胞外部分のドメイン１〜３（Ｄ１からＤ３）及びそれらのＣ末端で、５〜３０の長さのアミノ酸を有するポリペプチドスペーサを含み、両モノマー断片は、互いに共有結合しており、スペーサ長は、ＩＬ−６／可溶性ＩＬ−６レセプター複合体への、結果として生じる二量体タンパク質の最適結合を決定し、ポリペプチド二量体は、相同凝集体及び分子断片を構成する能力の顕著な減少を示し、宿主細胞において顕著に高い生産性が得られる。
【００１１】
本発明のポリペプチド二量体は、既知の方法を使用して設計することができる。ここで用いられる用語「可溶性」（省略形「s」）は、少なくとも細胞内ドメイン及び膜内外ドメインが欠損したｇｐ１３０分子を指す。利用されるドメインは、ｇｐ１３０の細胞外ドメインＤ１からＤ３からなるか、あるいは、それらは、作動性複合体ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒの活性の阻害能を維持するそれらの変異体又は断片からなっていてもよい。好ましくは、ｇｐ１３０の可溶性部分に対応するポリペプチドは、本発明のポリペプチド二量体の唯一の生物学的に活性なポリペプチドである。
【００１２】
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチド二量体の２つのモノマー断片は、同一である。
本発明のポリペプチド二量体のさらに好ましい実施形態において、二量体はｓｇｐ１３０のさらなるドメイン（Ｄ４からＤ６）を含まない。
【００１３】
二量体を構成する２つのモノマーの結合は、公知の方法を用いて、当業者によって実行することができる。二量体を形成するために、２つの可溶性ｇｐ１３０分子は、１以上のジスルフィド架橋によって互いに結合させることができる。これは、例えば、組換発現によって行うことができ、ｓｇｐ１３０をコードする核酸配列が、そのＣ末端で、ｓｇｐ１３０のＣ末端と停止コドンとの間のシステイン残基をコードする１以上のコドンを含むポリペプチドリンカーに融合する。あるいは、二量体を生成するために、２つのｓｇｐ１３０分子の間の分子間結合（例えば、共有結合、イオン結合）のいずれかを与える各ｓｇｐ１３０分子の末端へのリンカーを用いることができる。
【００１４】
このリンカーは、完全に人工的であってっもよい（例えば、特定の間隔でセリン、アラニン及び／又はトレオニンによって中断されるかもしれないポリグリシンの反復）。あるいは、二量体を生成するために、２つの可溶性ｇｐ１３０分子が、ヒンジ領域（直接又はリンカーを介して）を含むＩｇＧ−Ｆｃ断片に、Ｃ末端で融合されていてもよい。さらに、Ｆｃ分子のヒンジ領域内の遊離システイン残基は、望まない分子間ジスルフィド架橋を構成する危険を減らすために、変異体によって欠損されていてもよい。また、二量体の分子は、例えば、His-His-His-His-His-His（His6）、Ｍｙｃ、連鎖球菌（Strep）、ポリアルギニン、フラグ（Flag）、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＴＡＰ、グルタチオンＳ−転移酵素（ＧＳＴ）、ＨＡ、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｖ５、ＨＳＶ、Ｓ、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、プロテインＣ、ルシフェラーゼ、GIu-GIu、Ｅ、β−ＧＡＬ、Ｔ７あるいは、抗体又は他の結合分子が、適当なクロマトグラフィーシステム及び／又は検出、例えば、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、生物検定等によって精製を可能にして利用することができるような他のエピトープによって標識されていてもよい。
【００１５】
ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ複合体への最適な結合を得るために必要である二量体分子内で、２つのｓｇｐ１３０サブユニット間の最適距離を与えるために、ｓｇｐ１３０サブユニットは、５〜３０のアミノ酸長、好ましくは(ｉ)１０〜２５、(ii)１５〜２５、特に好ましくは１０〜１５のアミノ酸長を有する（ポリ）ペプチドスペーサに、それらのＣ末端で融合されている。スペーサを構成するアミノ酸の種類は特に重要でないが、（ａ）モノマーの最適なアライメントが可能な理想的な立体柔軟性を確実にし、（ｂ）プロテアーゼ及び抗体によって容易に影響を受けず、（ｃ）他の分子と二量体とのいかなる望まれない凝集又は三量体等の形成を減少させるために帯電されていない、アミノ酸（Ｇ又はＳのように）が好ましい。スペーサ分子を構成するための好ましいアミノ酸は、アミノ酸配列「ＧＧＧＧＳ」の１以上の反復であるが、スペーサは、ｓｇｐ１３０分子の結合するリガンドを強化する他のいかなる配列をも有することができる。
【００１６】
本発明のポリペプチド二量体の特に好ましい実施形態では、スペーサは、タンパク質分解的切断から分子を保護するために、選択的にグリコシル化される。
【００１７】
特に好ましい実施形態では、本発明のポリペプチド二量体は、５０％未満の相同凝集体及び分子断片を、好ましくは２５％未満の相同凝集体及び分子断片を、より好ましくは１０％未満の相同凝集体及び分子断片を、最も好ましくは５％未満の相同凝集体及び分子断片を形成する。
【００１８】
また、本発明は、本発明のポリペプチド二量体（又はそれぞれのモノマー）をコードするポリヌクレオチドを提供し、それは真核宿主細胞、バクテリア、酵母又は昆虫細胞においてコードされたタンパク質の効率的な生成のために最適化されたコドンであってもよい。好ましくは、そのポリヌクレオチドは、図７に示される核酸配列を含む。
【００１９】
さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び対応宿主細胞に関する。
【００２０】
種々の手段を、望む特性を有するｓｇｐ１３０の変異体又は修飾を発現させる及び確認するために用いることができる。ｓｇｐ１３０をコードするＤＮＡの標準技術による部位特異的突然変異誘発法又は制限消化及びリゲーション等の最高水準の方法を用いることができ、続いて、望む特性を有する変異分子を同定するために生成物のコレクションを分析する。
【００２１】
本発明のポリペプチド二量体は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びベクター、好ましくはポリヌクレオチドを含む発現ベクターの使用によって、好ましくはリコンビナント的に生成される。本発明のポリペプチドの生成のために、ポリヌクレオチドは、既存のクローン、つまり、好ましくは天然に存在するポリペプチド又はその一部をコードする既存のクローンから得られる。ポリペプチドは、ポリペプチドが本来の配列の生物学的活性を維持し、本発明のポリペプチドを生成するために有用である限り、非常にストリンジェント又は中等度にストリンジェントな状況下で、天然のＤＮＡ又はＲＮＡの相補体にハイブリダイズするいかなるポリヌクレオチドによってもコードされる（定義に関して、Sambrook、Molecular Cloning A Laboratory Manual、Cold Spring Habor Laboratory（1989）N. Y参照）。
【００２２】
組換えベクターは、当業者によく知られた方法（例えば、Sambrook、Molecular Cloning A Laboratory Manual、Cold Spring Habor Laboratory（1989）N. Y）に従って構築することができる。種々の発現ベクター／宿主システムが、本発明のｓｇｐ１３０ポリペプチドをコードする配列を含み及び発現させるために利用することができる。限定されないが、これらは、微生物（例えば、組換バクテリオファージで形質変換したバクテリア、プラスミド又はコスミドＤＮＡ発現ベクター）;イースト発現ベクターで形質変換したイースト;ウイルス発現ベクターで感染した昆虫細胞システム（例えば、バキュロウイルス）;ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ、タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）又はバクテリア発現ベクター（例えば、Ｉｉ又はｐＢＲ３２２）で形質変換された植物細胞システム;又は動物細胞システムを含む。
【００２３】
「制御要素」又は「調節塩基配列」は、ベクター−エンハンサーの未翻訳領域、プロモーター、転写及び翻訳を行うために宿主細胞タンパク質と相互作用する５’及び３’−未翻訳領域である。そのような要素は、それらの強度及び特異性において異なるかもしれない。利用されるベクターシステム及びホストによって、多くの適当な転写及び翻訳要素（構造性及び誘導可能なプロモーターを含む）を、用いることができる。例えば、バクテリアシステムにおいてクローニングする場合、Bluescript. RTM. Phagemid (Stratagene, LaJoIIa, CA)又はｐＳＰＯＲＴ１．ＴＭプラスミド（ギブコ、ＢＲＬ）等のハイブリッドｌａｃＺプロモーターのような誘導可能プロモーターが挙げられる。バキュロウイルスポリヘドリン（polyhedrin）プロモーターを、昆虫細胞において用いることができる。植物細胞のゲノムに由来する（例えば、熱ショック、ＲＵＢＩＳＣＯ及び貯蔵タンパク質遺伝子）又は植物ウィルスに由来する（例えば、ウィルスプロモーター又はリーダー配列）プロモーター又はエンハンサーは、ベクターにクローン化することができる。哺乳類の細胞システムで、哺乳類の遺伝子又は哺乳類のウィルスからのプロモーターが好ましい。ｓｇｐ１３０ポリペプチドをコードする配列の複数のコピーを含む細胞系を生成するために必要であれば、ＳＶ４０又はＥＢＶに基づくベクターを適当な選択可能マーカーとともに用いることができる。
【００２４】
バクテリアのシステムでは、いくつかの発現ベクターを、本発明のポリペプチド二量体を目的とする使用によって、選択することができる。本発明における使用のために適するベクターとしては、特に限定されないが、バクテリアの発現のためのｐＳＫＫ発現ベクターが挙げられる。
【００２５】
イースト、サッカロマイセス・セレヴィシエでは、アルファ因子のような構造性又は誘導可能なプロモーターを含むいくつかのベクター、アルコールオキシダーゼ及びＰＧＨを用いることができる。検討のために、Grantら、(1987) Methods Enzymol. 153 :516-544参照。
【００２６】
植物発現ベクターが用いられる場合、本発明の抗体をコードする配列の発現が、いくつかのプロモーターのいずれにおいても促進されるかもしれない。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ及び１９Ｓプロモーターのようなウィルスプロモーターを、単独又はＴＭＶからのオメガリーダー配列との組み合わせにおいて用いることができる(Takamatsu, N (1987) EMBO J. [pound]: 307-311)。あるいは、ＲＵＢＩＳＣＯの小さなサブユニットのような植物プロモーター又は熱ショックプロモーターを用いることができる（(Coruzzi, G.ら、(1984) EMBO J. 3:1671-1680、Broglie, R.ら、(1984) Science 224 :838-843及びWinter, J.ら、(1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85-105)。構造体は、直接のＤＮＡ形質変換又は病原によって媒介されるトランスフェクションによって植物細胞に導入することができる。そのような技術は、多くの一般に利用できる文献に記載されている（例えば、Hobbs, S.及びMurry, L. E. in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York, NY; pp. 191-196参照）。
【００２７】
昆虫システムを本発明のｓｐｇ１３０分子を発現させるために用いてもよい。例えば、そのようなシステムの１つとして、オートグラフカリフォルニア核多角体病（ＡｃＮＰＶ）が、Spodoptera Frugiperda細胞において又はTrichoplusia larvaeにおいて、外来遺伝子を発現させるためにベクターとして用いられる。配列はポリヘドリン遺伝子のようなウィルスの非必須領域にクローニングすることができ、ポリヘドリンプロモーターの制御下で配置することができる。ｓｐｇ１３０をコードする遺伝子の良好な導入は、ポリヘドリン遺伝子を不活性化させ、コートタンパク質を欠いた組換ウィルスを生成するであろう。よって、組換ウィルス、例えば、ＡＰＯＰを発現させることができるS. frugiperda細胞又はTrichoplusia larvaeを、感染させるために用いることができる (Engelhard, E. K.ら、(1994) Proc . Nat. Acad. Sci . SKL:3224-3227)。
【００２８】
哺乳類の宿主細胞において、多くのウィルス系発現システムを利用することができる。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、本発明のポリペプチドをコードする配列を、後期プロモーター及び三深裂したリーダー配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体にリゲートすることができる。ウィルスゲノムの必須でないＥ１又はＥ３領域における挿入を、感染細胞におけるタンパク質を発現することができる生存可能なウイルスを得るために用いることができる(Logan, J.及びShenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 3655-3659)。また、転写エンハンサー（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサー）を、哺乳類の宿主細胞の発現を増加させるために用いることができる。
【００２９】
また、ヒト人工染色体（ＨＡＣｓ）を、プラスミドにおいて含まれ、発現することができるよりも、より大きなＤＮＡ断片を与えるために使用することができる。６から１０ＭのＨＡＣｓが、治療目的のための従来の送出方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー又は小嚢）によって構築され、与えられる。
【００３０】
特定の開始シグナルを、より効果的な翻訳を成し遂げるのに用いることができる。そのようなシグナルは、ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列を含む。ｓｇｐ１３０をコードする配列、その開始コドン及び上流配列が適当な発現ベクターに挿入される場合、さらなる転写又は翻訳制御シグナルは必要でないかもしれない。しかし、コード配列のみが挿入される場合、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性の翻訳制御シグナルが提供されなければならない。さらに、開始コドンが、全ての挿入物の翻訳を確実にするために、正しい読み枠中になければならない。外因性の翻訳要素及び開始コドンは、種々の起源（天然及び合成の双方）のものかもしれない。発現効率は、例えば、文献記載のそれらのような、用いられる特定の細胞システムのために適切なエンハンサーの包含物によって強化されるかもしれない(Scharf, D.ら、(1994) Results Probl . Cell Differ. 20:125-162)。
【００３１】
さらに、宿主細胞株を、挿入された配列の発現を調整するか、望ましい方法で発現されたポリペプチド鎖を処理するその能力のために選択することができる。また、ポリペプチドの「プリプロ（prepro）」の形態を開裂するポスト翻訳処理を、正しい挿入、折りたたみ及び／又は機能を促進するために用いることができる。ポスト翻訳活性のための特定の細胞機構及び特徴的なメカニズムを有する異なる宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３又はＷ１３８）が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ：ベセズダ、ＭＤ）から入手可能であり、外来のポリペプチド鎖の正しい修飾及び処理を確実にするために選択することができる。
【００３２】
組換ポリペプチドの持続性、高収率のために、安定した発現が好ましい。例えば、安定にｓｇｐ１３０鎖を発現する細胞系は、複製及び／又は内因性発現要素のウィルス起源及び同じ又は別々のベクターにおける選択可能なマーカー遺伝子を含むかもしれない発現ベクターを用いて形質変換することができる。ベクターの導入後、それらが選択的なメディアにスイッチされる前に、細胞は、富化媒体で１〜２日間成長することができるかもしれない。選択可能なマーカーの目的は、選択に対する抵抗を与えることであり、その存在は導入された配列を首尾よく発現する細胞の成長及び回収を可能にする。安定な形質変換細胞の耐性クローンは、細胞タイプに適する技術を用いて増殖させることができる。
【００３３】
組換ベクターの導入後、宿主細胞は選択的媒体（それはベクター含有細胞の成長のために選択する）中で成長する。多くの選択システムを、形質変換細胞系を回収するために用いることができる。これらは、限定されないが、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（Wigler、M.ら、(1977) Cell 11：223-232）及びそれぞれtk.sup.又はaprt. sup. -cellsで使用することができるアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy, I.ら、(1980) Cell 22:817-823)遺伝子を含む。また、代謝拮抗物質、抗生物質又は除草剤抵抗性が、選択のベースとして用いることができる。例えば、メトトレキサートに対する耐性を与えるdhfr(Wigler, M.ら、(1980) Proc. Natl. Acd. Sci. 77: 3567-3570);アミノグリコシドネオマイシン及びＧ−４１８に対する耐性を与えるnpt(Colbere-Garapin, F.ら、(1981) J. MoI. Biol. 150:1-14)及び、それぞれ、クロロスルフロン（chlorsulfuron）及びホスフィノトリシン（phosphinotricin）アセチルトランスフェラーゼに耐性を与えるals又はpat(Murry, supra)である。さらなる選択可能な遺伝子、例えば、ｔｒｐＢ（それは細胞にトリプトファンの代わりにインドールの利用を可能にする）又はｈｉｓＤ（それは細胞にヒスチジンの代わりにヒスチノールの利用を可能にする）が記載されている（Hartman, S. C.及びMulligan, R. C. (1988) Proc . Natl. Acad. Sci. 85:8047-8051)。最近、可視マーカーの使用が、形質変換体の同定のみならず、特定のベクターシステムに起因することができる過渡的又は安定的なタンパク質発現を定量化するために広く用いられている、アントシアニン、β−グルクロニダーゼ及びその基質ＧＵＳ、ルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリン等のマーカーで、支持率を獲得している(Rhodes, CA.ら、(1995) Methods MoI. Biol. 55: 121- 131)。
【００３４】
組換ポリペプチドの精製は、この目的のために知られているいずれかの方法、つまり、抽出、析出、クロマトグラフィ、電気泳動等を含む従来のいずれかの方法によって行われる。使用することができるさらなる精製方法は、モノクローナル抗体又はターゲットポリペプチドに結合し、カラム内に含まれるゲルマトリクスに導入され、固定化される他の分子を用いた親和性クロマトグラフィである。組換ポリペプチドを含有する不純な試料がカラムを通されるか、マトリックスが、目標ポリペプチドを結合するためにバッチ技術で使用される。ポリペプチドはマトリックスに結合し、不純物は結合しないであろう。洗浄後、ポリペプチドは、ｐＨ又はイオン強度の変化によって、マトリックスから抽出される。
【００３５】
従って、本発明は、本発明のポリペプチド二量体を生産する方法に関し、それは、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列で形質変換された宿主細胞を培養し、宿主細胞又は培養媒体からポリペプチドを回収することを含む。
【００３６】
本発明のポリペプチド二量体は、すべての病変の治療及び／又は予防に有用であり、作動性ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ複合体の活性が疾患の病変に関与し、阻害するに違いない。例えば、本発明のポリペプチド二量体の治療用途は、以下を含む。
ａ)ＩＬ−６は、腫瘍形成を促進するためにオートクライン又はパラクリン方式のいずれかで作用することによって、多発性骨髄腫に直接関係しているようである。また、高いＩＬ−６レベルが、好ましくない二次作用（例えば、骨吸収、高カルシウム血症及び悪液質）を招く。これらの場合、ｓＩＬ−６ＲがＩＬ−６に対して標的細胞を敏感にすることが知られている。従って、ここで記載されている本発明のポリペプチド二量体は、二次作用及び腫瘍成長の阻害の双方に対して有益であろう。
ｂ）自己免疫疾患：自己免疫不全におけるＩＬ−６の病態重要性が、文献において多くの著者によって検討されており（例えば、Yoshizakiら、(1992) Semin. Immunol. 4(3) : 155-166参照)、よって、ＩＬ−６シグナル形質導入に対する干渉が、自己免疫疾患の治療に役立つかもしれない(Nishimotoら、(1999) Intern. Med. 38 (2):178-182)。そのような病態の例は、全身エリテマトーデス、橋本病、硬皮症、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、自己免疫上皮炎、真性糖尿病、シェーグレン症候群、多発性筋炎、糸球体腎炎及び他の炎症性疾患（例えば、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎及びブドウ膜炎）である。さらに、大腸がんのような特定の炎症関連のガン疾患が挙げられる。
ｃ）骨粗鬆症において、それは閉経後の女性のエストロゲン濃度の低下によって又は卵巣切除術によって悪化するかもしれず、ＩＬ−６は、破骨細胞形成の重要なメディエータであるようであり、骨吸収をもたらす。重要なことに、ＩＬ−６は、エストロゲン減少状態で主な役割を果たすようであり、明らかに通常の骨メンテナンスに最小限に関与しているだけである。これと一致して、実験的な証拠は、ＩＬ−６に対する機能阻害抗体が破骨細胞の数を減少させることができることを示す。エストロゲン補充療法が行われる一方、子宮内膜及び胸ガンのリスクを増加させるかもしれない副作用をもたらすようである。このように、本発明のポリペプチド二量体は、より特異的に、破骨細胞形成を正常レベルに低減させるであろう。
ｄ）おそらく、脂肪組織でリポ蛋白リパーゼ活性を減少させることによって、ＩＬ−６は、エイズ及びガンに伴う悪液質に至る腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のメディエータとなるかもしれない。従って、ここに記載される本発明のポリペプチド二量体は、そのような患者で悪液質を軽減又は減少させることに役立つ。
ｅ）細菌性及びウィルス性感染症：ヒトヘルペスウィルス（ＨＨＶ８）の存在は、９１％以上のカポジ肉腫（ＫＳ）障害で証明されている。さらに、そのウイルスは、一次性流出リンパ腫（ＰＥＬ）及び多中心性カースルマン疾患（ＭＣＤ）患者で同定された。おもしろいことに、多発性骨髄腫（ＭＭ）患者からの骨髄樹枝細胞は、ＨＨＶ８によって侵されることが示された。それ以来、ＨＨＶ８のＭＭとの関連が、激しい議論の対象となっており、それは最近復活した。ＨＨＶ８のゲノムは、ヒト抗アポトーシスタンパク質、ケモキネシス及び人ＩＬ−６に２５％相同性を有するウィルスＩＬ−６（ｖＩＬ−６）の生存形態を含むサイトカインに顕著に相同するいくつかのタンパク質をコードする。ｖＩＬ−６は、ヒトＩＬ−６を暗示する生物学活性、つまり、ネズミハイブリドーマ及びヒト骨髄腫細胞の激増の刺激を有することが証明されている。最近、ｖＩＬ−β誘発血管形成及び血液生成であるｖＩＬ−６−トランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞を注射されたマウスで示された。これらの機能によって、ｖＩＬ−６がＨＨＶ８関連障害の病態で重要な役割を果たすと結論された。ｖＩＬ−６シグナリングへのＩＬ−６Ｒの寄与は、論争的に議論されている。ｖＩＬ−６トランスフェクトＣＯＳ−７細胞の生成されていない上澄を用いた１つのグループが、ＳＴＡＴ活性がＩＬ−６Ｒでなく、ｇｐ１３０を発現する細胞で誘導されたことが示された。対照的に、もう一つのグループは、ｖＩＬ−６活性が、ＩＬ−６Ｒアンタゴニストによって減少されたことを見出し、ｖＩＬ−６シグナリングにおけるＩＬ−６Ｒの関係が議論されている。
【００３７】
このように、本発明は、本発明のポリペプチド二量体またはポリヌクレオチドの有効な量を含む医薬組成物に関し、好ましくは、薬学的に許容できるキャリヤと組み合わせられる。「薬学的に許容できる」とは、活性成分の生物学的活性の効果に干渉せず、それが投与されるホストに毒性を示さないいずれかのキャリヤを含むことを意味する。適当な薬学的キャリヤの例は、当該分野でよく知られており、リン酸緩衝サリン溶液、水、例えば、油／水エマルジョン等のエマルジョン類、種々の湿潤剤、滅菌溶液等を含む。そのようなキャリヤは、従来の方法によって製剤化され、有効量で患者に投与することができる。
【００３８】
「有効量」とは、病気の過程及び重篤性に影響を及ぼすのに十分である活性成分の量を指し、そのような病態の低減又は緩和をもたらす。
【００３９】
これらの病気又は障害の治療及び／又は予防に有用な「有効量」は、当業者に公知の方法を用いて決定することができる（例えば、Finlら、(1975) The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman and Gilman, eds. Macmillan Publishing Co., New York, pp. 1-46参照）。
【００４０】
適当な組成物の投与は、例えば、静脈、腹腔内、皮下、筋肉内、局所（例えば、浣腸、吸入、膏薬、液滴）又は経皮投与等の種々の方法によって作用させることができる。投与ルートは、もちろん、治療の種類、医薬組成物に含まれる化合物の種類に依存する。投与計画は、主治医及び他の臨床要因で決定される。医術において知られていているように、いずれかの患者の用量は、患者の大きさ、体表面積、体重、年齢、性別、投与される特定の化合物、時間及び投与経路、治療の種類、健康状態、同時に投与される他の薬物に依存する。
【００４１】
上述した本発明のポリペプチド二量体及びポリヌクレオチドの好ましい医療用途は、骨吸収、高カルシウム血症、悪液質、腫瘍、ガン、自己免疫病気、炎症性病気（例えば、クローン病）、潰瘍性大腸炎、慢性関節リウマチ、若年性慢性関節リウマチ、喘息、乾癬、紅斑性狼瘡、多発性硬化症、ブドウ膜炎等、細菌性又はウィルス性感染症の治療である。
【００４２】
最後に、本発明はまた、本発明のポリペプチド二量体に結合する抗体に関する。好ましくは、そのような抗体はスペーサ領域、リンカー領域及び／又はＤ３／スペーサ接合領域に結合する。そのような抗体は、本発明のポリペプチドに結合する抗体の検出に基づく診断方法において有用である。
【００４３】
以下の実施例は、本発明をより詳細に説明する。
実施例１：ｓｇｐ１３０変異体ｓｐｇ１３０（Ｄ１−Ｄ３）Ｓｎ−Ｆｃの製造
(Ａ)材料
ｓｇｐ１３０Ｆｃ（全長）の配列が最適化されたコドンを合成し、ＧｅｎｅＡＲＴ(Regensburg, Germany)によって構築されたｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ−ＡＭＰとして提供した。ゲータウェイクローニングシステムコンポーネント（AccuPrime Pfx DNA ポリメラーゼ、ドナーベクターpD0NR221、ＣＭＶプロマータ制御発現ベクターpcDNA-DEST40、挿入転写用ＢＰ及びＬＲリコンビナーゼ及びコンピテントE. coli細胞）をInvitrogen(Karlsruhe, Germany)から購入した。QuikChange II部位特異的突然変異誘発キットをStratagene (Amsterdam, The Netherlands)から得た。HYPUR精製突然変異誘発プライマーをMWGBiotech (Ebersberg, Germany)から得た。ＣＨＯ−Ｋｌ細胞をGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures(Braunschweig, Germany)から得た。培養媒体成分を以下から購入した。ハムのＦ１２媒体及びＰＢＳ(PAA Laboratories; Colbe, Germany)、ＦＢＳ(Biochrom; Berlin, Germany)、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液(Invitrogen)及びＧ４１８溶液(Sigma-Aldrich; Taufkirchen, Germany)。トランスフェクション試薬リポフェクタミン２０００をInvitrogenから得た。Santa Cruz(Heidelberg, Germany)供給タンパク質Ａ／Ｇプラスアガロース（免疫沈降用）。免疫沈降及びウェスタンブロットの一次検出の双方のために、マウス抗ヒトＩｇＧ(Ｆｃ)モノクローナル抗体を用いた(CBL102; Chemicon; Hofheim, Germany)。ウェスタンブロット二次検出を抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ結合抗体で行い、ＥＣＬ−プラスウェスタンブロット基質及びハイパーフィルムＥＣＬを、全てGE Healthcare（Freiburg, Germany) から入手した。ローラーボトル(2.1 L、2, 5X 表面)をGreiner Bio-One (Frickenhausen, Germany)から購入した。
【００４４】
（Ｂ）ｓｇｐ１３０（Ｄ１−Ｄ３）Ｓn−Ｆｃの構築
全長ｓｇｐ１３０Ｆｃを、標準ゲータウェイ法で、ゲータウェイプライマー、AccuPrime Pfx ＤＮＡポリメラーゼ及びＢＰリコンビナーゼを用いて、ｐＤＯＮＲ２２１にサブクローン化した。サブクローン化されたインサートを、２５０〜３００ｂｐおきに積層正逆シーケンシングプライマーを用いて完全に配列検証した。QuikChange IIキットによる部位特異的突然変異誘発において、ｓｇｐ１３０ＦｃのドメインＤ４−Ｄ６を、ドメインＤ３（ＹＥＤ）の末端及びｓｇｐ１３０ＦｃのＦｃ部位（ＳＣＤ）の最初に架橋したプライマー対を用いて、理想的なスペーサ要素（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３及びＳ５）によって置換し、アミノ酸スペーサ配列「グリシン−グリシン−グリシン−グリシン−セリン」(ＧＧＧＧＳ)の種々の反復をコードした。変異体ｓｇｐ１３０（Ｄ１−Ｄ３）Ｆｃを、スペーサなしとした（説明目的のために：変異体「ｓｇｐ１３０（Ｄ１−Ｄ３）Ｓ0−Ｆｃ」と示される場合、これは、スペーサペプチドを含まない分子を意味し、従ってｓｇｐ１３０（Ｄ１−Ｄ３）Ｆｃと同一である）。陽性クローンを、ＡｌｗＮＩで制限消化によって同定し、上述した完全なシーケンシングによって検証した。その後、インサートを、ゲートウェイＬＲ組換によって発現ベクターｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０へ転写した。インサートが、Ｆｃ部位の後、２つの停止コドンをコードしたため、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０（Ｖ５及び６ｘＨｉｓエピトープ）のタグは、タンパク質ｓｇｐ１３０（Ｄ１−Ｄ３）Ｓn−Ｆｃに存在しない。また、陽性クローンを、ＡＩｗＮＩ制限消化によって同定した。ゲートウェイ組換法は非常に特異的で、ＤＮＡ増幅を必要としないため、配列確認は必要でなかった。ゲートウェイ組換を用いたインサートの正しい転写が、我々の研究所の別個の実験で確認されている。
【００４５】
（Ｃ）培養及びトランスフェクション
ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、１０％ＦＢＳ捕捉ハムＦ１２培地にて、３７℃、水飽和雰囲気下、５％二酸化炭素で成長させた。維持培養を、３〜４日ごとに分割し、最高２０継代のみを用いた。細胞を、リポフェクタミン２０００及びインビトロゲンによって供給されたＣＨＯ−Ｋ１用の標準条件を用いて発現構成ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０＿ｓｇｐ１３０（Ｄ１−Ｄ３）Ｓn−Ｆｃでトランスフェクションした。最初の一時的な発現テストのために、ＣＨＯ−Ｋ１を、６ウェルプレートでトランスフェクトし、細胞及び上澄を、トランスフェクションの２４時間後に収穫した。ｓｇｐ１３０（Ｄ１−Ｄ３）Ｓn−Ｆｃを、メーカーの指示に従って、プロテインＡ／Ｇプラスアガロース及び抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を用いて上澄から免疫沈降した。全細胞タンパク質を抽出し、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を用いたウェスタンブロットを、Waetzigら、J. Immunol.168: 5342 (2002)で記載されたように、細胞溶解物及び免疫沈降を用いて行った。
【００４６】
（Ｄ）ＣＨＯ細胞中でのｓｇｐ１３０（Ｄ１−Ｄ３）Ｓn−Ｆｃの発現
成功した一時的な発現後、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、１０ｃｍのプレートで４００μｇ／ｍｌＦ４１８を用いてトランスフェクトし、選択した。製品品質及び特性についての一次影響のために、予め選ばれた多クローン性ＣＨＯ−Ｋ１プールを、ローラーボトルへ移した。融合性細胞の上澄を、１週間につき３回収穫し、細胞デブリスを除去するために１５分間４，０００ｒｐｍ、４℃にて２回遠心分離し、すぐに処理するか、−８０℃で凍結した。平行に、安定した細胞クローンを、限られた希釈法を用いて、予め選ばれたプールから選択し、上述したように、ウエスタンブロット発現分析によって特徴づけした。最も高い及び最も安定した発現のクローンを、ローラーボトルに移し、さらなる生成のために使用した。
【００４７】
（Ｅ）結果
図２に示したように、ｓｇｐ１３０（Ｄ１−Ｄ３）Ｓn−Ｆｃ（具体例として、ｓｇｐ１３０（Ｄ１−Ｄ３）Ｓ1−Ｆｃを示した）は、親のｓｇｐ１３０Ｆｃタンパク質のために得られるそれらよりさらに良好な生成率で発現した。これは、ｓｇｐ１３０Ｆｃのより小さな変異体の発現能が強化されたようであり、タンパク質の製造に利点を与えることを示す。
最後に、より高生成率は、工業生産のための経費をかなり低減する。
【００４８】
実施例２；ｓｇｐ１３０（Ｄ１−Ｄ３)Ｓn−Ｆｃの精製
（Ａ）材料
真空ろ過ユニット用酢酸セルロースフィルター（０．４５μｍ）をSartorius(Gottingen, Germany)から購入した。ＰＢＳをＰＡＡラボラトリー(Colbe, Germany)から得た。親和性及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、全てGE Healthcare (Freiburg, Germany)から得た。ＸＫ１６／２０カラム中のMabSelect材料(プロダクトコード17-5199-01)、ＰＤ−１０脱塩カラム及びＳＥＣ用HiLoad ２６／６０Superdex 200 pg。Amicon Ultra-15 50 kD Ultracel-PL膜濃縮ユニットをMillipore (Eschborn, Germany)から購入した。ＰＡＧＥ用の既製アクリルアミド−ビス溶液(１９:１、３０％)が、Bio-Rad (Munich, Germany)によって供給された。
【００４９】
（Ｂ）親和性クロマトグラフィ
ｓｇｐ１３０（Ｄ１−Ｄ３)Ｓn−Ｆｃ変異体の生成を、具体例として、ｓｇｐ１３０（Ｄ１−Ｄ３）Ｓ1−Ｆｃで示す。ローラーボトル培養からのｓｇｐ１３０（Ｄ１−Ｄ３）Ｓ1−Ｆｃ含有上澄を、４℃にて、Ｐ−Ｉ蠕動ポンプ及びAKTA Purifier 100システム(双方GE Healthcareから入手、Freiburg, Germany)を用いて精製した。プロトコールは、モノクローナル抗体の精製用にメーカー推奨方法に基づいた。遠心後、新鮮又は解凍（氷上で）した上澄のｐＨを６．７〜７．０に調整した。真空ろ過（０．４５μｍ）を２回繰り返した後、上澄を、脱気し、必要により、再度６．７〜７．０にｐＨ値を再調整した。その後、ＰＢＳ平衡親和性クロマトグライーカラム（ＸＫ１６／２０カラム中、６〜２５ｍｌMabSelect）に２〜４リットルの上澄を、Ｐ−Ｉポンプを用いて３〜１０ｍｌ／分の流速で充填した。ＰＢＳで洗浄した後、カラムを、ＡＫＴＡ精製器に移し、Ａ280が、未結合タンパク質の量的除去後安定するまで、ＰＢＳで再洗浄した。溶出のために、ＡＫＴＡシステムに、それぞれ、ｐＨ３．２５及び５．５で２つの５０ｍＭのクエン酸ナトリウムバッファを装備し、それを、望ましいｐＨ条件を与えるために混合した。ｐＨ５．１での１つの洗浄工程の後、ｐＨ３．７での溶出を続けた。１０ｍｌのフラクションを２ｍｌの１Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ１１）を含有する１５ｍｌの試験管に採取した。ピークフラクションをプールし、ｐＨを測定し、必要に応じて、７．５に調整した。プールのタンパク質濃度をＡ280で測定し、プールを、Amicon Ultra-15 50kDユニットを使って、最高１．５ｍｇ／ｍｌに慎重に濃縮した。ＰＢＳ平衡ＰＤ−１０脱塩カラムを、バッファをＰＢＳに変えるために用い、次いで、２８０ｎｍでもう一つのタンパク質濃度を測定した。
【００５０】
（Ｃ）ゲルろ過によるサイズ除外クロマトグラフィ（ＳＥＣ）
ＳＥＣのために、ＰＢＳ中１．２ｍｇ／ｍｌの最高濃度が推奨された。ＳＥＣを、ＰＢＳ平衡HiLoad 26/60 Superdex 200 pgカラム中で、流速０．８ｍｌ／ｍｉｎにて、ＡＫＡＴシステムで行った。ｓｇｐ１３０（Ｄ１−Ｄ３）Ｓ1−Ｆｃを、高分子量の凝集の低プラトー後に、単一ピークで溶出した（図４Ａ）。最初の動作で、全てのフラクションのサンプルを、ＰＡＧＥ分析のために得た（以下参照）。ピークフラクションをプールし、それらのタンパク質濃度を測定し、ＰＢＳ中４００〜５００μｇ／ｍｌにセットし、単一使用のアリコートを長期保存のために−８０℃で凍結した。
【００５１】
（Ｄ）ポリペプチドアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）
フラクション及びプールサンプルを、本来のＰＡＧＥ（７．５％ポリペプチドアクリルアミドゲル）によって分析し、銀又はクマシー染色した（図４Ａ）。
【００５２】
（Ｅ）結果
図４Ａ及び４Ｂで示したように、望まれていない二次生成物の量は、もう一つの実験（結果を図３に示す）で平行に精製した親化合物ｓｇｐ１３０Ｆｃと比較して、かなり減少した。さらに、主要生成物（図４Ａ中のレーン８〜１４）の溶出は、不純物フラクション（図４Ａ中のレーン１〜６）と、明確に分離できる。ｓｇｐ１３０Ｆｃは、非常に多量の不純物を生成する傾向がある（図３中の最初のクロマトグラムピークとＰＡＧＥ参照）。さらに、主要生成物（図３中のレーン６〜１１）を含む溶出フラクションのいずれも、不純物を含む。これらの結果は、親ｓｇｐ１３０Ｆｃ分子と比較して、ｓｇｐ１３０（Ｄ１−Ｄ３）Ｓn−Ｆｃの明確な改善を示す。しかし、スペーサ長は、ｓｇｐ１３０（Ｄ１−Ｄ３）Ｓn−Ｆｃ分子の精製能に対して決定的である。結合能、よって、治療効果は、スペーサ長さを増やすことにより改善される。ｎ＝３で、「最適精製能のウインドウ」が最適条件である（図４Ｂ）。従って、最適活性又は最適純度ならびに収率の必要によって、理想的なスペーサ長は、３及び５要素の間にある。
【００５３】
実施例３：ｓｇｐ１３０Ｆｃ及びｓｇｐ１３０（Ｄ１−Ｄ３）Ｓn−ＦｃのＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ複合体結合タンパク質の比較
（Ａ）材料
９６ウェルのマイクロロン・マイクロタイター・プレートをGreiner Bio-One (Frickenhausen, Germany)から購入した、組換ヒトＩＬ−６及び可溶性ＩＬ−６レセプター(ｓＩＬ−６Ｒ)を、BioSource (Solingen, Germany)及びR&D Systems (Wiesbaden, Germany)から、それぞれ得た。一次抗ｓＩＬ−６Ｒ抗体(クローンＭ９１、マウスＩｇＧｌ)をBeckman Coulter (Krefeld, Germany)から得た。二次抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ結合抗体をから得、ウエスタン部ロット実験（実施例１のＡ〜Ｃ参照）と同じものであった。すぐに使用ができるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ)ＨＲＰ基質をSigma-Aldrich (Taufkirchen, Germany)から購入した。
【００５４】
（Ｂ）酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）
ｓｇｐ１３０Ｆｃ変異体の異なるロット間の品質管理及び比較のために、標準ＥＬＩＳＡを設計した。被覆以外の全工程を、室温で行い、全洗浄工程を２５０μｌの量で３回行い、全ての条件を３重に測定した。９６ウェルマイクロタイター・プレートを、１００μｍＰＢＳ中、内部標準として、本来のｓｇｐ１３０Ｆｃの１００ｎｇ／ウェル及びｓｇｐ１３０（Ｄ１−Ｄ３）Ｓn−Ｆｃの等モル量で、４℃にて一晩被覆した。よって、ｓｇｐ１３０Ｆｃ及びその変異体は、捕捉試薬として機能し、一方、結合ｓＩＬ−βＲを検出した（以下参照）。０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳで洗浄した後、ウェルを２時間、２００μｌ／ウェルの３％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロックした。次いで、ブロッキング溶液を除去し、ウェルを１時間、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ中、組換ヒトＩＬ−６(３．２μｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ)及びｓＩＬ−６Ｒ(１．６μｇ／ｍｌ〜２５ｎｇ／ｍｌ)の１：２希釈系（１００μｌ／ウェル）でインキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳで洗浄した後、ウェルを、１時間、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ(１００μｌ／ウェル)中、一次抗ｓＩＬ−６Ｒ抗体とともにインキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳで３回洗浄した他の系を、二次抗マウスＩｇＧＨＲＰ結合抗体（１：５０００（１００μｌ／ウェル）とともに１時間インキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳ、続いてｄＨ２０で洗浄した後、プレートを、約５分間（発現した青色の強度によって）、１００μｌ／ウェルＴＭＢ基質とともにインキュベートした。基質反応を、０．５Ｍ硫酸を１００μｌ／ウェルでウェルに添加することによって停止させた。最後にＡ４５０を、マイクロプレートリーダーで測定した。
【００５５】
（Ｃ）結果
結合分析の結果を図５に示す。ｓｇｐ１３０（Ｄ１−Ｄ３）Ｓn−Ｆｃの結合能は、主に、各変異体で用いられるスペーサの反復数に依存していた。この場合、２回及び３回の反復（Ｓ２及びＳ３）を含む変異体は、ｓｇｐ１３０Ｆｃと同等か、より良好であった。
これは、親ｓｇｐ１３０Ｆｃ分子の修飾がその精製を改善し、その生物学的活性及びＩＬ−６がトリガーとなる疾患の治療用の医薬としての推定される使用に影響しなかったことを示す。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】ｓｇｐ１３０（Ｄ１−Ｄ３）Ｓn分子を示す概略図である。  ｓｇｐ１３０（Ｄ１−Ｄ３）Ｓn変異体は、親分子ｓｇｐ１３０ＦｃのドメインＤ４からＤ６の欠損及び種々の長さ（Ｓn）のポリペプチドスペーサによるそれらの置換によって発生する。「ｎ」はスペーサド領域内での反復数を示す。その後、分子は、ＩｇＧＦｃ断片（上部パネル）によって共有結合的に二量体化するか、あるいは、例えば、ジスルフィド架橋、化学的相互作用又はその他の形成によって共有結合をもたらす天然に存在する又は人工的なリンカー要素へのさらなる融合（下部パネル）によって共有結合的に二量体化する（ｓｇｐ１３０（Ｄ１−Ｄ３））Ｓn−Ｌ)。さらに、これらの分子は、精製及び／又は検出目的のためにシーケンスタグを含むことができる。
【図２】ＣＨＯ細胞でのｓｇｐ１３０（Ｄ１−Ｄ３）Ｓ１１の発現。  ｓｇｐ１３０（Ｄ１−Ｄ３）Ｓnの発現を、ｓｇｐ１３０（Ｄ１−Ｄ３）Ｓ1−Ｆｃに対して例示的に示す。各構成体（ｐＤＥＳＴ４０＿ｓｇｐ１３０（Ｄ１−Ｄ３）Ｓ1−Ｆｃ）を、ＣＨＯ細胞に、一時的にトランスフェクションした。平行して、もう一セットのＣＨＯ細胞を、親のsｇｐ１３０Ｆｃからなる構成体でトランスフェクションした。細胞を２４時間インキュベートし、上澄を回収し、ｓｇｐ１３０融合タンパク質を免疫沈降した。沈殿物は、最終的にＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、標準的なウェスタンブロット法に従って、抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて検出した。
【図３】sｇｐ１３０Ｆｃ融合分子の精製  sｇｐ１３０Ｆｃのサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）。上部パネルはＵＶスキャンによるゲル濾過の間に誘発される溶出プロフィール（クロマトグラム）を示す。中央及び下部パネルは、天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及び標準的な方法によるクマシー（ＣＯＯＭ）又は銀のいずれかでの染色によって回収したフラクションの分析を表す。
【図４】ｓｇｐ１３０（Ｄ１−Ｄ３）Ｓn-Ｆｃ融合分子の精製  (Ａ)サイズ排除クロマトフラフィー（ＳＥＣ）によるｓｇｐ１３０（Ｄ１−Ｄ３）の精製を、ｓｇｐ１３０（Ｄ１−Ｄ３）Ｓ1−Ｆｃに対して例示的に示す。上部のパネルは、ＵＶスキャンによるゲル濾過の間に誘発される溶出プロフィール（クロマトグラム）を示す。中央及び下部パネルは、天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及び標準的な方法によるクマシー（ＣＯＯＭ）又は銀のいずれかでの染色によって回収したフラクションの分析を表す。  （Ｂ）（ＧＧＧＧＳ）nスペーサによる変異体のＳＥＣ溶出クロマトグラムの比較は、生物学的活性の連続増加と相関しないｎ＝３のスペーサ長の最適精製特性を示す(下図及び図５参照)。
【図５】ｓｇｐ１３０（Ｄ１−Ｄ３）Ｓn-Ｆｃ分子によるＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒの特異結合精製されたｓｇｐ１３０（Ｄ１−Ｄ３）Ｓn−Ｆｃ分子（ｎ＝０から３）を、９６穴プレート上に被覆され、インキュベートして、組換体ＩＬ−６＋可溶ＩＬ−６レセプター（ｓＩＬ−６Ｒ）の量を増加した。結合したＩＬ−６／ｓＩＬ−６複合体を、マウス抗ＩＬ−６Ｒ抗体及び抗マウスＩｇＧ抗体に結合したホースラディッシュペルオキシダーゼを利用して検出した（白四角、黒丸、黒四角、黒三角）。平行して、親ｓｇｐ１３０Ｆｃ分子をテストした（黒ひし形）。
【図６】sｇｐ１３０(Ｄ１−Ｄ３)Ｓn−Ｆｃ結合抗体を検出するための分析の概略図。  (Ａ)固体マトリックスに固定されたｓｇｐ１３０（Ｄ１−Ｄ３）Ｓn−Ｆｃを、予め標識された（例えば、蛍光染料で）抗体混合物（例えば、血清サンプルに含まれる）とともにインキュベートした。未結合抗体を洗い流し、特異結合分子を、最高水準の技術で検出した。  （Ｂ）固体マトリックスに固定されたｓｇｐ１３０（Ｄ１−Ｄ３）Ｓn−Ｆｃを、抗体混合物（例えば、血清サンプルに含まれる）とともにインキュベートした。未結合抗体を洗い流し、残存ｓｇｐ１３０（Ｄ１−Ｄ３）Ｓn−Ｆｃ／抗体複合体を、所定量で標識された（例えば、蛍光染料で）ｓｇｐ１３０（Ｄ１−Ｄ３）Ｓn−Ｆｃとともにインキュベートし、最高水準の技術で最終的に検出した。
【図７】最適化sｇｐ１３０(Ｄ１−Ｄ３)のｃＤＮＡ配列  配列は、sｇｐ１３０のドメインＤ１からＤ３とともにシグナリングペプチドを含む。その配列は、哺乳類の細胞でコードされたポリペプチドの発現に対して最適化したコドンであった。
【図８】可溶ｇｐ１３０(Ｄ１−Ｄ３)のアミノ酸配列  所定の分子フラグメントに、以下のように下線を付した。シグナリングポリペプチド（二重線）、Ｉｇ様Ｃ２タイプドメイン（Ｄ１）（点線）、フィブロネクチンタイプIIIドメイン（Ｄ２）（一重線）、フィブロネクチンタイプIIIドメイン（Ｄ３）（細点線）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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