(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リソソーム酵素；および
ＩＧＦ−ＩＩムテインであって、該ＩＧＦ−ＩＩムテインは：
変異が少なくとも１つのフューリンプロテアーゼ切断部位を無効にするように、配列番号１のアミノ酸３０〜４０に対応する領域内に変異を含む、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩ（配列番号１）と同一のアミノ酸配列を有し、かつ、
インスリンレセプターに対する天然に存在するヒトＩＧＦ−ＩＩの親和性と比べて該インスリンレセプターに対して低い結合親和性を有し、
ここで、該変異は、配列番号１のＡｒｇ３７に対応する位置におけるＡｌａへの置換からなる、
ＩＧＦ−ＩＩムテイン；
を含む、標的化された治療用融合タンパク質であって、
ここで、該ＩＧＦ−ＩＩムテインは、フューリンの切断に対して抵抗性であり、かつ、マンノース−６−リン酸非依存的様式でヒトカチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプターに結合する、標的化された治療用融合タンパク質。
【請求項２】
前記ＩＧＦ−ＩＩムテインが、
（ａ）配列番号１の２〜７位に対応するアミノ酸の欠失または置き換え；および／または
（ｂ）配列番号１の１〜７位に対応するアミノ酸の欠失または置き換え；
をさらに含む、請求項１に記載の標的化された治療用融合タンパク質。
【請求項３】
前記ＩＧＦ−ＩＩムテインが、ＩＧＦ−Ｉレセプターに対する天然に存在するヒトＩＧＦ−ＩＩの親和性と比べて該ＩＧＦ−Ｉレセプターに対して低い結合親和性を有する、請求項１に記載の標的化された治療用融合タンパク質。
【請求項４】
前記リソソーム酵素が、ヒト酸性アルファ−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）またはその機能的バリアントである、請求項１記載の標的化された治療用融合タンパク質。
【請求項５】
前記リソソーム酵素が、ヒトＧＡＡのアミノ酸７０〜９５２を含む、請求項４に記載の標的化された治療用融合タンパク質。
【請求項６】
前記標的化された治療用融合タンパク質が、前記リソソーム酵素と前記ＩＧＦ−ＩＩムテインとの間にスペーサーをさらに含む、請求項１に記載の標的化された治療用融合タンパク質。
【請求項７】
前記スペーサーが、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏを含む、請求項６に記載の標的化された治療用融合タンパク質。
【請求項８】
前記リソソーム酵素が、以下：
酸性−α１，４−グルコシダーゼ；β−ガラクトシダーゼ；β−ヘキソサミニダーゼＡ；β−ヘキソサミニダーゼＢ；α−ガラクトシダーゼＡ；グルコセレブロシダーゼ；アリールスルファターゼＡ；ガラクトシルセラミダーゼ；酸性スフィンゴミエリナーゼ；酸性セラミダーゼ；酸性リパーゼ；α−Ｌ−イズロニダーゼ；イズロン酸スルファターゼ；ヘパランＮ−スルファターゼ；α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ；アセチル−ＣｏＡ−グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ；Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ；ガラクトサミン−６−スルファターゼ；アリールスルファターゼＢ；β−グルクロニダーゼ；α−マンノシダーゼ；β−マンノシダーゼ；α−Ｌ−フコシダーゼ；Ｎ−アスパルチル−β−グルコサミニダーゼ；α−ノイラミニダーゼ；リソソームの保護タンパク質；α−Ｎ−アセチル−ガラクトサミニダーゼ；Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ；およびパルミトイル−タンパク質チオエステラーゼ
からなる群より選択される、請求項１に記載の標的化された治療用融合タンパク質。
【請求項９】
前記リソソーム酵素が、酸性リパーゼである、請求項８に記載の標的化された治療用融合タンパク質。
【請求項１０】
前記リソソーム酵素が、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼである、請求項８に記載の標的化された治療用融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１に記載の標的化された治療用融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸を含む細胞。
【請求項１３】
請求項１に記載の標的化された治療用融合タンパク質を含む、リソソーム蓄積症の処置に適した薬学的組成物。
【請求項１４】
標的化された治療用融合タンパク質を生成する方法であって：
細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する工程
を包含し、ここで、
該哺乳動物細胞は、請求項１１に記載の核酸を保有し；そして
該培養する工程は、該標的化された治療用融合タンパク質の発現を可能にする条件下で行われる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する参照
本願は、２００８年５月７日に出願された米国仮特許出願第６１／０５１，３３６号および２００９年１月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／１４４，１０６号の利益を主張し、上記特許出願のそれぞれの内容全体が本明細書において参照により援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
通常、哺乳動物のリソソーム酵素は、サイトゾルにおいて合成され、ＥＲを横断し、そのＥＲにおいてＮ結合型で高マンノース型の炭水化物によってグリコシル化される。ゴルジでは、これらのタンパク質をリソソームに標的化するマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）を付加することによって、リソソームタンパク質上に高マンノース炭水化物が修飾される。Ｍ６Ｐで修飾されたタンパク質は、２つのＭ６Ｐレセプターのいずれかとの相互作用を介してリソソームに送達される。修飾の最も好ましい形態は、２つのＭ６Ｐが高マンノース炭水化物に付加されているときである。
【０００３】
４０を超えるリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）は、リソソーム内に１つ以上のリソソーム酵素が存在しないことによって、直接または間接的に引き起こされる。ＬＳＤｓに対する酵素補充療法が活発に追跡されている。治療は、一般に、Ｍ６Ｐ依存的様式でＬＳＤタンパク質が取り込まれ、種々の細胞型のリソソームに送達されることを必要とする。１つの可能性のあるアプローチは、ＬＳＤタンパク質を精製し、それを、Ｍ６Ｐを有する炭水化物部分を組み込むように修飾することを含む。この修飾された材料は、細胞表面上のＭ６Ｐレセプターとの相互作用に起因して、未修飾のＬＳＤタンパク質よりも効率的に細胞によって取り込まれ得る。
【０００４】
本願の発明者らは、以前に、治療用酵素をリソソームにより効率的に送達することを可能にするペプチドベースの標的化技術を開発した。この独占権下技術は、リソソームを標的化する部分としてペプチドタグがＭ６Ｐに取って代わるので、グリコシル化非依存性リソソーム標的化（Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）（ＧＩＬＴ）と呼ばれる。ＧＩＬＴ技術の詳細は、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９および特許文献１０（これらのすべての開示が本明細書によって参考として援用される）に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／００８２１７６号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４／０００６００８号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００３／００７２７６１号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００５／０２８１８０５号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００５／０２４４４００号明細書
【特許文献６】国際公開第０３／０３２９１３号
【特許文献７】国際公開第０３／０３２７２７号
【特許文献８】国際公開第０２／０８７５１０号
【特許文献９】国際公開第０３／１０２５８３号
【特許文献１０】国際公開第２００５／０７８０７７号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要旨
本発明は、ＧＩＬＴ技術に基づいた効率的なリソソーム標的化のための、さらに改善された組成物および方法を提供する。とりわけ、本発明は、フューリン（ｆｕｒｉｎ）抵抗性リソソーム標的化ペプチドを用いてリソソーム酵素をリソソームに標的化するための方法および組成物を提供する。本発明はまた、インスリンレセプターに対する結合親和性が小さいかまたは低いリソソーム標的化ペプチドを用いてリソソーム酵素をリソソームに標的化するための方法および組成物も提供する。本発明は、本発明に記載のフューリン抵抗性リソソーム標的化ペプチドがインスリンレセプターに対して低い結合親和性を有するという予想外の発見を含む。
【０００７】
いくつかの実施形態において、本発明は、フューリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩムテインを提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩ（配列番号１）と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列および少なくとも１つのフューリンプロテアーゼ切断部位を無効にする変異を有するフューリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩムテインを提供する。
【０００８】
いくつかの実施形態において、本発明は、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩ（配列番号１）と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列、および野生型ヒトＩＧＦ−ＩＩと比較するときインスリンレセプターに対して結合親和性を減少させるかまたは低下させる変異を含むＩＧＦ−ＩＩムテインを提供する。
【０００９】
いくつかの実施形態において、フューリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩムテインは、ＩＧＦ−Ｉレセプターに対する天然に存在するヒトＩＧＦ−ＩＩの親和性と比べて、ＩＧＦ−Ｉレセプターに対して低い結合親和性を有する。
【００１０】
いくつかの実施形態において、本発明は、リソソーム酵素；および成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩ（配列番号１）と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するＩＧＦ−ＩＩムテインを含む標的化された治療用融合タンパク質を提供し、ここで、そのＩＧＦ−ＩＩムテインは、フューリンの切断に対して抵抗性であり、マンノース−６−リン酸非依存的様式でヒトカチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプターに結合する。
【００１１】
いくつかの実施形態において、本発明は、リソソーム酵素；および成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩ（配列番号１）と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有し、かつインスリンレセプターに対する天然に存在するヒトＩＧＦ−ＩＩの親和性と比べてインスリンレセプターに対して低い結合親和性を有するＩＧＦ−ＩＩムテインを含む標的化された治療用融合タンパク質を提供し；ここで、そのＩＧＦ−ＩＩムテインは、マンノース−６−リン酸非依存的様式でヒトカチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプターに結合する。
【００１２】
いくつかの実施形態において、本発明は、リソソーム酵素；および成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩ（配列番号１）と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有し、かつインスリンレセプターに対する天然に存在するヒトＩＧＦ−ＩＩの親和性と比べてインスリンレセプターに対して低い結合親和性を有するＩＧＦ−ＩＩムテインを含む標的化された治療用融合タンパク質を提供し；ここで、ＩＧＦ−ＩＩムテインは、フューリンの切断に対して抵抗性であり、マンノース−６−リン酸非依存的様式でヒトカチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプターに結合する。
【００１３】
いくつかの実施形態において、本発明に適したＩＧＦ−ＩＩムテインは、配列番号１のアミノ酸３０〜４０に対応する領域内に変異を含む。いくつかの実施形態において、本発明に適したＩＧＦ−ＩＩムテインは、変異が少なくとも１つのフューリンプロテアーゼ切断部位を無効にするように、配列番号１のアミノ酸３４〜４０に対応する領域内に変異を含む。いくつかの実施形態において、適当な変異は、アミノ酸の置換、欠失および／または挿入である。いくつかの実施形態において、変異は、配列番号１のＡｒｇ３７またはＡｒｇ４０に対応する位置におけるアミノ酸の置換である。いくつかの実施形態において、アミノ酸の置換は、ＬｙｓまたはＡｌａへの置換である。
【００１４】
いくつかの実施形態において、適当な変異は、配列番号１の３１〜４０、３２〜４０、３３〜４０、３４〜４０、３０〜３９、３１〜３９、３２〜３９、３４〜３７、３２〜３９、３３〜３９、３４〜３９、３５〜３９、３６〜３９、３７〜４０、３４〜４０およびそれらの組み合わせからなる群から選択される位置に対応するアミノ酸残基の欠失または置き換えである。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本発明に記載のＩＧＦ−ＩＩムテインは、配列番号１の２〜７位に対応するアミノ酸の欠失または置き換えをさらに含む。いくつかの実施形態において、本発明に記載のＩＧＦ−ＩＩムテインは、配列番号１の１〜７位に対応するアミノ酸の欠失または置き換えをさらに含む。いくつかの実施形態において、本発明に記載のＩＧＦ−ＩＩムテインは、配列番号１の６２〜６７位に対応するアミノ酸の欠失または置き換えをさらに含む。いくつかの実施形態において、本発明に記載のＩＧＦ−ＩＩムテインは、配列番号１のＴｙｒ２７、Ｌｅｕ４３またはＳｅｒ２６に対応する位置におけるアミノ酸の置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、本発明に記載のＩＧＦ−ＩＩムテインは、Ｔｙｒ２７Ｌｅｕ、Ｌｅｕ４３Ｖａｌ、Ｓｅｒ２６Ｐｈｅおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸の置換を含む。いくつかの実施形態において、本発明に記載のＩＧＦ−ＩＩムテインは、配列番号１の４８〜５５位に対応するアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、本発明に記載のＩＧＦ−ＩＩムテインは、配列番号１の８、４８、４９、５０、５４および５５位に対応するアミノ酸からなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、本発明のＩＧＦ−ＩＩムテインは、配列番号１の５４および５５位に対応する位置において、各々がｐＨ７．４において無電荷であるかまたは負に帯電しているアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩムテインは、ＩＧＦ−Ｉレセプターに対する天然に存在するヒトＩＧＦ−ＩＩの親和性と比べて、ＩＧＦ−Ｉレセプターに対して低い結合親和性を有する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、本発明に適したリソソーム酵素は、ヒト酸性アルファ−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）またはその機能的バリアントである。いくつかの実施形態において、本発明に適したリソソーム酵素は、ヒトＧＡＡのアミノ酸７０〜９５２を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本発明の標的化された治療用融合タンパク質は、リソソーム酵素とフューリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩムテインとの間にスペーサーをさらに含む。いくつかの実施形態において、スペーサーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏを含む。
【００１８】
本発明はまた、上の様々な実施形態において記載されたようなＩＧＦ−ＩＩムテインまたは標的化された治療用融合タンパク質をコードする核酸も提供する。本発明は、本発明の核酸を含む様々な細胞をさらに提供する。
【００１９】
本発明は、治療有効量の本発明の標的化された治療用融合タンパク質を含む、リソソーム蓄積症の処置に適した薬学的組成物を提供する。本発明は、リソソーム蓄積症を処置する方法をさらに提供し、その方法は、処置の必要な被験体に、本発明に記載の標的化された治療用融合タンパク質を投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、リソソーム蓄積症は、ポンペ病である。いくつかの実施形態において、リソソーム蓄積症は、ファブリー病である。いくつかの実施形態において、リソソーム蓄積症は、ゴーシェ病である。
【００２０】
別の局面において、本発明は、標的化された治療用融合タンパク質を生成する方法を提供し、その方法は、細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する工程を包含し、ここで、その哺乳動物細胞は、本発明の核酸、特に、本明細書中の様々な実施形態に記載されるような核酸を保有し；そして、培養は、標的化された治療用融合タンパク質の発現を可能にする条件下で行われる。
【００２１】
なおも別の局面において、本発明は、標的化された治療用融合タンパク質を生成する方法を提供し、その方法は、細胞培養培地中でフューリン欠損細胞（例えば、フューリン欠損哺乳動物細胞）を培養する工程を包含し、ここで、そのフューリン欠損細胞は、リソソーム酵素および成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩ（配列番号１）と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するＩＧＦ−ＩＩムテインを含む融合タンパク質をコードする核酸を保有し、ここで、そのＩＧＦ−ＩＩムテインは、マンノース−６−リン酸非依存的様式でヒトカチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプターに結合し；そして培養は、標的化された治療用融合タンパク質の発現を可能にする条件下で行われる。
【００２２】
本発明の他の特徴、目的および利点は、以下の詳細な説明において明らかになる。しかしながら、詳細な説明は、本発明の実施形態を示すが、単に例示の目的で与えられるものであり、限定を目的としないことが理解されるべきである。本発明の範囲内での様々な変更および改変は、詳細な説明から当業者に明らかになるだろう。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
リソソーム酵素；および
成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩ（配列番号１）と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するＩＧＦ−ＩＩムテインであって、ここで、該ＩＧＦ−ＩＩムテインは、フューリンの切断に対して抵抗性であり、かつ、マンノース−６−リン酸非依存的様式でヒトカチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプターに結合する、ＩＧＦ−ＩＩムテイン
を含む、標的化された治療用融合タンパク質。
（項目２）
リソソーム酵素；および
成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩ（配列番号１）と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有し、かつ、インスリンレセプターに対する天然に存在するヒトＩＧＦ−ＩＩの親和性と比べて該インスリンレセプターに対して低い結合親和性を有する、ＩＧＦ−ＩＩムテイン；
を含む、標的化された治療用融合タンパク質であって、
ここで、該ＩＧＦ−ＩＩムテインは、マンノース−６−リン酸非依存的様式でヒトカチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプターに結合する、標的化された治療用融合タンパク質。
（項目３）
リソソーム酵素；および
成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩ（配列番号１）と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有し、かつ、インスリンレセプターに対する天然に存在するヒトＩＧＦ−ＩＩの親和性と比べて該インスリンレセプターに対して低い結合親和性を有する、ＩＧＦ−ＩＩムテイン；
を含む、標的化された治療用融合タンパク質であって、
ここで、該ＩＧＦ−ＩＩムテインは、フューリンの切断に対して抵抗性であり、かつ、マンノース−６−リン酸非依存的様式でヒトカチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプターに結合する、標的化された治療用融合タンパク質。
（項目４）
上記ＩＧＦ−ＩＩムテインが、配列番号１のアミノ酸３０〜４０に対応する領域内に変異を含む、項目１〜３のいずれか１項に記載の標的化された治療用融合タンパク質。
（項目５）
変異が少なくとも１つのフューリンプロテアーゼ切断部位を無効にするように、上記ＩＧＦ−ＩＩムテインが、配列番号１のアミノ酸３４〜４０に対応する領域内に該変異を含む、前述の項目のいずれか１項に記載の標的化された治療用融合タンパク質。
（項目６）
上記変異が、アミノ酸の置換、欠失および／または挿入である、項目４または５に記載の標的化された治療用融合タンパク質。
（項目７）
上記変異が、配列番号１のＡｒｇ３７またはＡｒｇ４０に対応する位置におけるアミノ酸の置換である、項目６に記載の標的化された治療用融合タンパク質。
（項目８）
上記アミノ酸の置換が、ＬｙｓまたはＡｌａへの置換である、項目７に記載の標的化された治療用融合タンパク質。
（項目９）
上記変異が、配列番号１の３１〜４０、３２〜４０、３３〜４０、３４〜４０、３０〜３９、３１〜３９、３２〜３９、３４〜３７、３２〜３９、３３〜３９、３４〜３９、３５〜３９、３６〜３９、３７〜４０、３４〜４０およびそれらの組み合わせからなる群から選択される位置に対応するアミノ酸残基の欠失または置き換えである、項目６に記載の標的化された治療用融合タンパク質。
（項目１０）
上記ＩＧＦ−ＩＩムテインが、配列番号１の２〜７位に対応するアミノ酸の欠失または置き換えをさらに含む、前述の項目のいずれか１項に記載の標的化された治療用融合タンパク質。
（項目１１）
上記ＩＧＦ−ＩＩムテインが、配列番号１の１〜７位に対応するアミノ酸の欠失または置き換えをさらに含む、項目１〜１０のいずれか１項に記載の標的化された治療用融合タンパク質。
（項目１２）
上記ＩＧＦ−ＩＩムテインが、配列番号１の６２〜６７位に対応するアミノ酸の欠失または置き換えをさらに含む、前述の項目のいずれか１項に記載の標的化された治療用融合タンパク質。
（項目１３）
上記ＩＧＦ−ＩＩムテインが、配列番号１のＴｙｒ２７、Ｌｅｕ４３またはＳｅｒ２６に対応する位置におけるアミノ酸の置換をさらに含む、前述の項目のいずれか１項に記載の標的化された治療用融合タンパク質。
（項目１４）
上記ＩＧＦ−ＩＩムテインが、Ｔｙｒ２７Ｌｅｕ、Ｌｅｕ４３Ｖａｌ、Ｓｅｒ２６Ｐｈｅおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸の置換を含む、項目１３に記載の標的化された治療用融合タンパク質。
（項目１５）
上記ＩＧＦ−ＩＩムテインが、配列番号１の４８〜５５位に対応するアミノ酸を含む、前述の項目のいずれか１項に記載の標的化された治療用融合タンパク質。
（項目１６）
上記ＩＧＦ−ＩＩムテインが、配列番号１の８、４８、４９、５０、５４および５５位に対応するアミノ酸からなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸を含む、前述の項目のいずれか１項に記載の標的化された治療用融合タンパク質。
（項目１７）
上記ＩＧＦ−ＩＩムテインが、配列番号１の５４および５５位に対応する位置において、各々がｐＨ７．４において無電荷であるかまたは負に帯電しているアミノ酸を含む、前述の項目のいずれか１項に記載の標的化された治療用融合タンパク質。
（項目１８）
上記ＩＧＦ−ＩＩムテインが、ＩＧＦ−Ｉレセプターに対する天然に存在するヒトＩＧＦ−ＩＩの親和性と比べて該ＩＧＦ−Ｉレセプターに対して低い結合親和性を有する、前述の項目のいずれか１項に記載の標的化された治療用融合タンパク質。
（項目１９）
上記リソソーム酵素が、ヒト酸性アルファ−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）またはその機能的バリアントである、前述の項目のいずれか１項に記載の標的化された治療用融合タンパク質。
（項目２０）
上記リソソーム酵素が、ヒトＧＡＡのアミノ酸７０〜９５２を含む、項目１８に記載の標的化された治療用融合タンパク質。
（項目２１）
上記標的化された治療用融合タンパク質が、上記リソソーム酵素と上記ＩＧＦ−ＩＩムテインとの間にスペーサーをさらに含む、前述の項目のいずれか１項に記載の標的化された治療用融合タンパク質。
（項目２２）
上記スペーサーが、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏを含む、項目２１に記載の標的化された治療用融合タンパク質。
（項目２３）
前述の項目のいずれか１項に記載の標的化された治療用融合タンパク質をコードする核酸。
（項目２４）
項目２３に記載の核酸を含む細胞。
（項目２５）
前述の項目のいずれか１項に記載の標的化された治療用融合タンパク質を含む、リソソーム蓄積症の処置に適した薬学的組成物。
（項目２６）
リソソーム蓄積症を処置する方法であって、処置の必要のある被験体に、前述の項目のいずれか１項に記載の標的化された治療用融合タンパク質を投与することを包含する、方法。
（項目２７）
上記リソソーム蓄積症が、ポンペ病である、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
上記リソソーム蓄積症が、ファブリー病である、項目２６に記載の方法。
（項目２９）
上記リソソーム蓄積症が、ゴーシェ病である、項目２６に記載の方法。
（項目３０）
標的化された治療用融合タンパク質を生成する方法であって：
細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する工程
を包含する方法であって、ここで、
該哺乳動物細胞は、項目２３に記載の核酸を保有し；そして
該培養する工程は、該標的化された治療用融合タンパク質の発現を可能にする条件下で行われる、方法。
（項目３１）
標的化された治療用融合タンパク質を生成する方法であって：
細胞培養培地中でフューリン欠損細胞を培養する工程
を包含し、ここで、
該フューリン欠損細胞は、リソソーム酵素、および成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩ（配列番号１）と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するＩＧＦ−ＩＩムテインを含む融合タンパク質をコードする核酸を保有し、ここで、該ＩＧＦ−ＩＩムテインは、マンノース−６−リン酸非依存的様式でヒトカチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプターに結合し；そして
ここで、該培養する工程は、該標的化された治療用融合タンパク質の発現を可能にする条件下で行われる、方法。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
図面は、例示目的のみであって、限定のためではない。
【図１】図１は、ＺＣ−７０１のＮ末端のマップを示している。四角で囲まれた２つのアミノ酸残基が、切断事象の部位である。１つ目は、シグナルペプチド切断の部位であり、２つ目は、フューリンの切断の部位である。
【図２】図２は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆで処理した後のＺＣ−７０１の例示的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示している。右側のレーンは、フューリンで追加的に処理されている。
【図３】図３の左：フューリン切断部位が改変されている例示的なＺＣ−７０１変異体の略図。中央：細胞培養の３〜７日後にＰＮＧａｓｅ処理された変異体の例示的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。右：フューリンで処理されたＰＮＧａｓｅ処理変異体の例示的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。
【図４】図４は、例示的な競合的ＩＧＦ−ＩＩレセプター結合の結果を示している。
【図５】図５は、追加の例示的な競合的ＩＧＦ−ＩＩレセプター結合の結果を示している。
【図６】図６は、例示的なインスリンレセプター競合アッセイの結果を示している。
【図７】図７は、例示的なＩＧＦ−Ｉレセプター競合アッセイの結果を示している。
【図８】図８は、ある特定のインスリンレセプター結合アッセイの例示的な結果を示している。
【図９】図９は、ある特定のインスリンレセプター結合アッセイの例示的な結果を示している。
【図１０】図１０は、一過性トランスフェクションからの部分的に精製されたＧＩＬＴタグ化ＧＡＡの例示的な解析を示している。ＨＥＫ２９３細胞を、構築物１４７９、１４８７またはＺＣ−７０１でトランスフェクトした。回収後、培養上清を疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）によって部分的に精製した。すべてのサンプルをＰＮＧａｓｅで処理した後、電気泳動した。左パネル：部分的に精製されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。精製されたＺＣ−７０１  Ｂ１２をコントロールとして示す。右パネル：部分的に精製されたタンパク質の免疫ブロット解析。記載の１次抗体を使用した。下のパネルは、外来性フューリンでさらに処理した。構築物１４８７によってコードされるタンパク質は、構築物１４６１（Ｒ３７Ａ）によってコードされるタンパク質と配列が同一である。構築物１４７９によってコードされるタンパク質は、構築物１４５９（Ｒ３７Ｋ）によってコードされるタンパク質と同一である。
【図１１】図１１は、例示的なフューリン抵抗性ＧＩＬＴタグ化ＧＡＡのラットＬ６筋芽細胞への例示的な取り込みの結果を示している。タンパク質１４７９、１４８７、ＺＣ−７０１および精製ＺＣ−７０１に対するＫ取り込みは、それぞれ、４．５ｎＭ、４．４ｎＭ、５．０ｎＭおよび２．６ｎＭである。構築物１４８７によってコードされるタンパク質は、図３における構築物１４６１（Ｒ３７Ａ）によってコードされるタンパク質と配列が同一である。構築物１４７９によってコードされるタンパク質は、図３における構築物１４５９（Ｒ３７Ｋ）によってコードされるタンパク質と同一である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
定義
回復：本明細書中で使用されるとき、用語「回復」は、状態の予防、減少もしくは寛解、または被験体の状態の改善を意味する。回復は、疾患状態の完全な快復または完全な予防を含むが、そうである必要はない。いくつかの実施形態において、回復は、関連性のある疾患組織のリソソーム内に蓄積された材料の減少を含む。
【００２５】
フューリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩムテイン：本明細書中で使用されるとき、用語「フューリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩムテイン」とは、野生型ヒトＩＧＦ−ＩＩペプチドと比較するとき、フューリンの切断が、妨げられるか、阻害されるか、減少されるか、または減速するように、少なくとも１つの天然のフューリンプロテアーゼ切断部位を無効にするか、または天然のフューリンプロテアーゼ切断部位に近接もしくは隣接した配列を変化させる、変更されたアミノ酸配列を含むＩＧＦ−ＩＩベースのペプチドのことを指す。本明細書中で使用されるとき、フューリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩムテインは、フューリンに対して抵抗性であるＩＧＦ−ＩＩムテインとも称される。
【００２６】
フューリンプロテアーゼ切断部位：本明細書中で使用されるとき、用語「フューリンプロテアーゼ切断部位」（「フューリン切断部位」または「フューリン切断配列」とも称される）とは、フューリンまたはフューリン様プロテアーゼの酵素的プロテアーゼ切断に対する認識配列として働くペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のことを指す。代表的には、フューリンプロテアーゼ切断部位は、コンセンサス配列Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ａｒｇ（配列番号２）を有し、Ｘは、任意のアミノ酸である。切断部位は、その配列内のカルボキシ末端のアルギニン（Ａｒｇ）残基の後に位置する。いくつかの実施形態において、フューリン切断部位は、コンセンサス配列Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号３）を有してもよく、Ｘは、任意のアミノ酸である。切断部位は、その配列内のカルボキシ末端のアルギニン（Ａｒｇ）残基の後に位置する。
【００２７】
フューリン：本明細書中で使用されるとき、用語「フューリン」とは、本明細書中に定義されるようなフューリンプロテアーゼ切断部位を認識し得、そして切断し得る、フューリンまたはフューリン様プロテアーゼをはじめとした任意のプロテアーゼのことを指す。フューリンは、対形成（ｐａｉｒｅｄ）塩基性アミノ酸切断酵素（ＰＡＣＥ）としても知られる。フューリンは、スブチリシン様プロタンパク質コンバターゼファミリーに属する。フューリンをコードする遺伝子は、ＦＵＲ（ＦＥＳ上流領域）として知られていた。
【００２８】
フューリン欠損細胞：本明細書中で使用されるとき、用語「フューリン欠損細胞」とは、フューリンプロテアーゼ活性が阻害されているか、低下しているか、または無くなっている任意の細胞のことを指す。フューリン欠損細胞は、フューリンを産生しないか、または少量のフューリンもしくは不完全なフューリンプロテアーゼを産生する、哺乳動物細胞と非哺乳動物細胞との両方を含む。
【００２９】
グリコシル化非依存性リソソーム標的化：本明細書中で使用されるとき、用語「グリコシル化非依存性リソソーム標的化」（「ＧＩＬＴ」とも称される）とは、マンノース−６−リン酸に非依存的なリソソーム標的化のことを指す。
【００３０】
ヒト酸性アルファ−グルコシダーゼ：本明細書中で使用されるとき、用語「ヒト酸性アルファ−グルコシダーゼ」（「ＧＡＡ」とも称される）とは、哺乳動物のリソソームにおいてグリコーゲンレベルを低下させることができるか、または１つ以上のポンペ病の症状を救出し得るかもしくは回復させ得る、ヒトＧＡＡの野生型前駆体または機能的バリアントのことを指す。
【００３１】
改善する、増加する、または減少する：本明細書中で使用されるとき、用語「改善する」、「増加する」もしくは「減少する」または文法上の等価物は、ベースライン測定値（例えば、本明細書中に記載される処置を開始する前の同じ個体における測定値、または本明細書中に記載される処置を行っていないコントロール個体（もしくは複数のコントロール個体）における測定値）に対する値のことを示す。「コントロール個体」は、処置される個体とほぼ同じ齢の、処置される個体と同じ形態のリソソーム蓄積症（例えば、ポンペ病）に苦しんでいる個体である（処置される個体およびコントロール個体における疾患の段階が同等であることを確かにするために）。
【００３２】
個体、被験体、患者：本明細書中で使用されるとき、用語「被験体」、「個体」または「患者」とは、ヒトまたは非ヒト哺乳動物被験体のことを指す。処置される個体（「患者」または「被験体」とも称される）は、リソソーム蓄積症、例えば、ポンペ病（すなわち、乳児期（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ）発症型、若年発症型または成人発症型のポンペ病）に罹患しているか、またはリソソーム蓄積症（例えば、ポンペ病）を発症する可能性を有する個体（胎児、乳児、小児、青年または成体のヒト）である。
【００３３】
リソソーム蓄積症：本明細書中で使用されるとき、「リソソーム蓄積症」とは、リソソーム内において高分子をペプチド、アミノ酸、単糖類、核酸および脂肪酸に分解するために必要とされる酵素（例えば、酸性加水分解酵素）の少なくとも１つの欠損に起因する遺伝性障害の群のことを指す。結果として、リソソーム蓄積症に罹患している個体は、リソソーム内に蓄積された材料を有する。例示的なリソソーム蓄積症を表１に列挙する。
【００３４】
リソソーム酵素：本明細書中で使用されるとき、用語「リソソーム酵素」とは、哺乳動物のリソソーム内における蓄積された材料を減少させることができるか、または１つ以上のリソソーム蓄積症の症状を救出し得るかもしくは回復させ得る、任意の酵素のことを指す。本発明に適したリソソーム酵素は、野生型のリソソーム酵素と改変されたリソソーム酵素の両方を含み、組換え方法および合成方法を用いて生成され得るか、または天然の起源から精製され得る。例示的なリソソーム酵素を表１に列挙する。
【００３５】
スペーサー：本明細書中で使用されるとき、用語「スペーサー」（「リンカー」とも称される）とは、融合タンパク質における２つのタンパク質部分の間のペプチド配列のことを指す。スペーサーは、通常、可撓性であるように、または２つのタンパク質部分の間にアルファ−ヘリックスなどの構造を挿入するように、設計される。スペーサーは、比較的短いこともあるし（例えば、配列Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列番号４）またはＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号５））、またはそれよりも長い（例えば、１０〜２５アミノ酸長）こともある。
【００３６】
治療有効量：本明細書中で使用されるとき、用語「治療有効量」とは、いずれの医学的処置にも適用可能な合理的な利点／リスク比において、処置される被験体に対して治療効果を付与する、標的化された治療用融合タンパク質の量のことを指す。その治療効果は、客観的（すなわち、いくつかの試験またはマーカーによって測定可能）であってもよいし、主観的（すなわち、被験体が、効果の徴候を示すか、または効果を感じる）であってもよい。特に、「治療有効量」とは、所望の疾患または状態を処置するか、回復させるか、もしくは予防するのに有効であるか、または検出可能な治療的効果もしくは予防的効果を示すのに有効である（例えば、その疾患に関連する症状を回復させること、その疾患の発症を予防するか、もしくは遅延させること、および／またはその疾患の症状の重症度もしくは頻度を低下させることによって）、治療用の融合タンパク質または組成物の量のことを指す。治療有効量は、通常、複数の単位用量を含んでもよい投薬レジメンにおいて投与される。任意の特定の治療用の融合タンパク質について、治療有効量（および／または有効な投薬レジメン内において適切な単位用量）は、例えば、投与経路、他の医薬品との併用に応じて、変動してもよい。また、任意の特定の患者に対する特定の治療有効量（および／または単位用量）は、処置される障害およびその障害の重症度；使用される特定の医薬品の活性；使用される特定の組成物；患者の齢、体重、全般的な健康状態、性別および食餌；投与時間、投与経路および／または使用される特定の融合タンパク質の排出速度もしくは代謝速度；処置の期間；ならびに医学分野において周知であるような類似の因子をはじめとした種々の因子に依存してもよい。
【００３７】
処置：本明細書中で使用されるとき、用語「処置」（また、「処置する（ｔｒｅａｔ）」または「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」）とは、特定の疾患、障害および／または状態の１つ以上の症状または特徴を、部分的または完全に、緩和する、回復させる、軽減する、阻害する、その発症を遅延する、その重症度を低下させる、および／またはその発生頻度を低下させる、治療用融合タンパク質の任意の投与のことを指す。そのような処置は、関連性のある疾患、障害および／もしくは状態の徴候を示さない被験体、ならびに／またはその疾患、障害および／もしくは状態の初期の徴候だけを示す被験体に対するものであってもよい。あるいはまたはさらに、そのような処置は、関連性のある疾患、障害および／または状態の１つ以上の立証された徴候を示す被験体に対するものであってもよい。例えば、処置とは、心臓の状態の改善（例えば、拡張末期および／もしくは収縮末期の容積の増加、またはポンペ病に典型的に見られる進行性の心筋症の低減、回復もしくは予防）または肺機能の改善（例えば、ベースラインの能力を超える啼泣時肺活量の増加、および／または啼泣中の酸素脱飽和の正常化）；神経発生および／または運動技能の改善（例えば、ＡＩＭＳスコアの上昇）；疾患に冒されている個体の組織におけるグリコーゲンレベルの低下；またはこれらの効果の任意の組み合わせのことを指し得る。いくつかの実施形態において、処置は、グリコーゲンクリアランスの改善、特に、ポンペ病関連の心筋症の低減または予防を含む。
【００３８】
本願において使用されるとき、用語「約」および「およそ」は、等価物として使用される。約／およそを伴うかまたは伴わない、本願において使用される任意の数詞は、関連性のある分野の当業者によって認識される通常の任意の変動を包含すると意味される。
【００３９】
発明の詳細な説明
本発明は、グリコシル化非依存性リソソーム標的化（ＧＩＬＴ）技術に基づいてリソソーム酵素を標的化するための改善された方法および組成物を提供する。とりわけ、本発明は、フューリンに対して抵抗性であり、かつ／またはインスリンレセプターに対する結合親和性が小さいかもしくは低いＩＧＦ−ＩＩムテイン、および本発明のＩＧＦ−ＩＩムテインを含む標的化された治療用融合タンパク質を提供する。本発明はまた、それを生成する方法および使用する方法を提供する。
【００４０】
本発明の様々な局面は、以下の項で詳細に記載される。その項の効果は、本発明を限定すると意味されない。各項は、本発明の任意の局面に適用され得る。本願において、「または」の使用は、別段述べられない限り、「および／または」を意味する。
【００４１】
リソソーム酵素
本発明に適したリソソーム酵素は、哺乳動物のリソソーム内において、蓄積された材料を減少させることができるか、または１つ以上のリソソーム蓄積症の症状を救出し得るか、もしくは回復させ得る、任意の酵素を含む。適当なリソソーム酵素は、野生型のリソソーム酵素または改変されたリソソーム酵素の両方を含み、組換え方法もしくは合成方法を用いて生成され得るか、または天然の起源から精製され得る。例示的なリソソーム酵素を表１に列挙する。
【００４２】
【表１−１】
0005627571.tif 000002
【００４３】
【表１−２】
0005627571.tif 000003
【００４４】
【表１−３】
0005627571.tif 000004
【００４５】
【表１−４】
0005627571.tif 000005
いくつかの実施形態において、本発明に適したリソソーム酵素は、哺乳動物のリソソームにおいて蓄積される材料を減少させることができるか、または１つ以上のリソソーム蓄積症の症状を救出し得るか、もしくは回復させ得る、タンパク質をなおもコードしつつ、表１に示されているヒト酵素の天然に存在するポリヌクレオチド配列に対して５０、５５、６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９および１００％を含む５０〜１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
【００４６】
リソソーム酵素配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列をアラインメントし、必要であれば、最大のパーセント配列同一性を達成するようにギャップを導入した後の、配列同一性の部分としていかなる保存的置換も考慮しない、天然に存在するヒト酵素配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェア（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア）を用いて、当該分野の技術の範囲内である様々な方法で達成され得る。当業者は、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムをはじめとした、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。好ましくは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２ソフトウェアが、アミノ酸配列同一性を決定するために使用される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２６６，４６０−４８０（１９９６）；ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌ）。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、いくつかの検索パラメータを使用し、そのほとんどが、デフォルトの値に設定される。調整可能なパラメータは、以下の値に設定される：オーバーラップスパン（ｏｖｅｒｌａｐ  ｓｐａｎ）＝１、オーバーラップフラクション（ｏｖｅｒｌａｐ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）＝０．１２５、ワード（ｗｏｒｌｄ）閾値（Ｔ）＝１１。ＨＳＰスコア（Ｓ）およびＨＳＰ  Ｓ２パラメータは、動的な値であり、特定の配列の組成に応じてそのプログラム自体によって確定されるが、しかしながら、最小値は、調整されてもよく、上に示したように設定される。
【００４７】
ポンペ病
１つの例示的なリソソーム蓄積症は、ポンペ病である。ポンペ病は、エネルギーのために使用される貯蔵型の糖であるグリコーゲンの分解に必要な酵素の酸性アルファ−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）の欠損によって引き起こされる珍しい遺伝的障害である。ポンペ病は、糖原病ＩＩ型、ＧＳＤ  ＩＩ、ＩＩ型糖原病、糖原貯蔵症ＩＩ型、酸性マルターゼ欠損、アルファ−１，４−グルコシダーゼ欠損、びまん性糖原性心肥大（ｃａｒｄｉｏｍｅｇａｌｉａ  ｇｌｙｃｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｆｆｕｓａ）および全身型糖原病の心臓型としても知られる。グリコーゲンの増大は、全身にわたる進行性の筋力低下（筋障害）を引き起こし、様々な体組織、特に、心臓、骨格筋、肝臓、呼吸器系および神経系に影響を及ぼす。
【００４８】
ポンペ病の臨床上の主症状は、疾患発症の齢および残留ＧＡＡ活性に応じて広く変動し得る。残留ＧＡＡ活性は、グリコーゲン蓄積の量および組織分布の両方、ならびに疾患の重症度と相関する。乳児期発症型ポンペ病（１％未満の正常なＧＡＡ活性）は、最も重篤な形態であり、緊張低下、全身性の筋力低下および肥大型心筋症、ならびに心臓および他の筋組織におけるかなりのグリコーゲン蓄積を特徴とする。通常、心肺不全に起因して生後１年以内に死に至る。Ｓｃｒｉｖｅｒらｅｄｓ．，Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，３３８９−３４２０における、Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎら（２００１）“Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｔｙｐｅ  ＩＩ：Ａｃｉｄ  Ａｌｐｈａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ（Ａｃｉｄ  Ｍａｌｔａｓｅ）Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ”。若年発症型（１〜１０％の正常ＧＡＡ活性）および成人発症型（１０〜４０％の正常ＧＡＡ活性）のポンペ病は、より臨床上不均一であり、発症齢、臨床像および疾患進行が大きくばらつく。若年発症型および成人発症型のポンペ病は、一般に、重篤な心臓の合併症がないこと、発症齢がより高いこと、および疾患進行がより遅いことを特徴とするが、最終的な呼吸器の合併症または肢の筋肉の合併症によって、著しい病的状態および死亡率がもたらされる。平均余命は、異なり得るが、一般に、呼吸不全に起因して死に至る。Ｓｃｒｉｖｅｒらｅｄｓ．，Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，３３８９−３４２０における、Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎら（２００１）“Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｔｙｐｅ  ＩＩ：Ａｃｉｄ  Ａｌｐｈａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ（Ａｃｉｄ  Ｍａｌｔａｓｅ）Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ”。
【００４９】
ポンペ病を処置するのに適したＧＡＡ酵素は、直鎖状オリゴ糖におけるα１−４結合を切断する能力を保持する、野生型ヒトＧＡＡまたはそのフラグメントもしくは配列バリアントを含む。
【００５０】
酵素補充療法
酵素補充療法（ＥＲＴ）は、欠損している酵素を血流中に注入することによって酵素欠損を是正する治療ストラテジーである。その血液が患者組織を灌流すると、酵素は、細胞によって取り込まれてリソソームに運搬され、そこでその酵素は、酵素欠損に起因してリソソーム内に蓄積された材料を除去するように作用する。リソソーム酵素補充療法が有効であるためには、貯蔵の欠陥が明らかな組織において適切な細胞内のリソソームに治療用酵素が送達されなければならない。従来のリソソーム酵素置き換え療法は、標的細胞の表面上の特異的レセプターと会合する、タンパク質に天然に結合している炭水化物を用いて送達される。カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプター（ＣＩ−ＭＰＲ）は、ほとんどの細胞型の表面上に存在するので、１つのレセプターであるＣＩ−ＭＰＲが、置き換えリソソーム酵素を標的化するために特に有用である。
【００５１】
用語「カチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプター（ＣＩ−ＭＰＲ）」、「Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプター」、「ＣＩ−ＭＰＲ／ＩＧＦ−ＩＩレセプター」、「ＩＧＦ−ＩＩレセプター」もしくは「ＩＧＦ２レセプター」またはそれらの省略形は、本明細書中で交換可能に使用され、それらは、Ｍ６ＰとＩＧＦ−ＩＩとの両方に結合する細胞レセプターのことを指す。
【００５２】
グリコシル化非依存性リソソーム標的化
本発明者らは、治療用酵素をリソソームに標的化するグリコシル化非依存性リソソーム標的化（ＧＩＬＴ）技術を開発した。詳細には、ＧＩＬＴ技術は、リソソーム標的化のために、Ｍ６Ｐの代わりに、ＣＩ−ＭＰＲと会合するペプチドタグを用いる。代表的には、ＧＩＬＴタグは、マンノース−６−リン酸非依存的様式でＣＩ−ＭＰＲに結合する、タンパク質、ペプチドまたは他の部分である。都合の良いことに、この技術は、リソソーム酵素の取り込みに対する正常な生物学的機構を模倣するが、マンノース−６−リン酸に非依存的な様式で模倣するものである。
【００５３】
好ましいＧＩＬＴタグは、ヒトインスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）に由来する。ヒトＩＧＦ−ＩＩは、ＩＧＦ−ＩＩレセプターとも称されるＣＩ−ＭＰＲに対する高親和性リガンドである。ＧＩＬＴタグ化された治療用酵素がＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターに結合することにより、そのタンパク質がエンドサイトーシス経路を介してリソソームに標的化される。このタンパク質はいったん単離されると、さらに修飾を行う必要がないので、この方法は、グリコシル化を含む方法よりも、容易さおよび費用効果の高さをはじめとした数多くの利点を有する。
【００５４】
ＧＩＬＴ技術およびＧＩＬＴタグの詳細な説明は、米国公開番号２００３００８２１７６、２００４０００６００８、２００４０００５３０９および２００５０２８１８０５（これらのすべての教示は、その全体が本明細書によって参考として援用される）に見られ得る。
【００５５】
フューリン抵抗性ＧＩＬＴタグ
リソソーム蓄積症を処置するためのＧＩＬＴタグ化リソソーム酵素の開発の際、ＩＧＦ−ＩＩ由来ＧＩＬＴタグが、哺乳動物細胞内での生成中にフューリンによるタンパク分解性切断に供されてもよいことが明らかになってきた（実施例の項を参照のこと）。フューリンプロテアーゼは、代表的には、コンセンサス配列Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ａｒｇ（配列番号２）（Ｘは、任意のアミノ酸である）を有する切断部位を認識し、切断する。切断部位は、その配列内のカルボキシ末端のアルギニン（Ａｒｇ）残基の後に位置する。いくつかの実施形態において、フューリン切断部位は、コンセンサス配列Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号３）（Ｘは、任意のアミノ酸である）を有する。切断部位は、その配列内のカルボキシ末端のアルギニン（Ａｒｇ）残基の後に位置する。本明細書中で使用されるとき、用語「フューリン」とは、本明細書中に定義されるようなフューリンプロテアーゼ切断部位を認識し得、切断し得る、フューリンまたはフューリン様プロテアーゼをはじめとした任意のプロテアーゼのことを指す。フューリンは、対形成塩基性アミノ酸切断酵素（ＰＡＣＥ）としても知られる。フューリンは、膵島細胞においてプロインスリンの成熟に関与するプロテアーゼであるＰＣ３を含むスブチリシン様プロタンパク質コンバターゼファミリーに属する。フューリンをコードする遺伝子は、ＦＵＲ（ＦＥＳ上流領域）として知られていた。
【００５６】
成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩペプチド配列を以下に示す。
【００５７】
【化１】
0005627571.tif 000006
見られるように、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩは、残基３４〜４０（太字の下線部分）の間に２つの重複している潜在的なフューリン切断部位を含む。矢印が２つの潜在的なフューリン切断位置を指摘している。
【００５８】
本発明者らは、フューリンによる切断に対して抵抗性であり、かつマンノース−６−リン酸非依存的様式でＣＩ−ＭＰＲに結合する能力をなおも保持する、改変ＧＩＬＴタグを開発した。詳細には、フューリン抵抗性ＧＩＬＴタグは、変異が少なくとも１つのフューリン切断部位を無効にするように１つ以上のフューリン切断部位においてアミノ酸配列を変異させることによって設計され得る。したがって、いくつかの実施形態において、フューリン抵抗性ＧＩＬＴタグは、野生型ＩＧＦ−ＩＩペプチド（例えば、野生型ヒト成熟ＩＧＦ−ＩＩ）と比較するとき、フューリン切断が、妨げられるか、阻害されるか、減少するか、または減速するように、少なくとも１つのフューリンプロテアーゼ切断部位を無効にするか、またはフューリンプロテアーゼ切断部位に隣接した配列が変更された、変異を含むフューリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩムテインである。代表的には、適当な変異は、フューリン抵抗性ＧＩＬＴタグがヒトカチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプターに結合する能力に影響しない。特に、本発明に適したフューリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩムテインは、ｐＨ７．４において１０−７Ｍ以下の解離定数（例えば、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１またはそれ未満）で、マンノース−６−リン酸非依存的様式においてヒトカチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプターに結合する。いくつかの実施形態において、フューリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩムテインは、配列番号１のアミノ酸３０〜４０（例えば、３１〜４０、３２〜４０、３３〜４０、３４〜４０、３０〜３９、３１〜３９、３２〜３９、３４〜３７、３２〜３９、３３〜３９、３４〜３９、３５〜３９、３６〜３９、３７〜４０、３４〜４０）に対応する領域内に変異を含む。いくつかの実施形態において、適当な変異は、少なくとも１つのフューリンプロテアーゼ切断部位を無効にする。変異は、アミノ酸の置換、欠失、挿入であり得る。例えば、配列番号１の残基３０〜４０（例えば、３１〜４０、３２〜４０、３３〜４０、３４〜４０、３０〜３９、３１〜３９、３２〜３９、３４〜３７、３２〜３９、３３〜３９、３４〜３９、３５〜３９、３６〜３９、３７〜４０、３４〜４０）に対応する領域内のいずれか１つのアミノ酸が、他の任意のアミノ酸で置換され得るか、または欠失され得る。例えば、３４位における置換は、第１の切断部位のフューリン認識に影響を及ぼしてもよい。各認識部位内における１つ以上の追加アミノ酸の挿入は、一方または両方のフューリン切断部位を無効にしてもよい。縮重位置における残基の１つ以上の欠失もまた、両方のフューリン切断部位を無効にしてもよい。
【００５９】
いくつかの実施形態において、フューリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩムテインは、配列番号１のＡｒｇ３７またはＡｒｇ４０に対応する位置におけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、フューリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩムテインは、Ａｒｇ３７またはＡｒｇ４０位におけるＬｙｓまたはＡｌａへの置換を含む。３７位と４０位との両方におけるＬｙｓおよび／もしくはＡｌａへの変異の組み合わせ、またはＬｙｓもしくはＡｌａ以外のアミノ酸の置換を含む、他の置換も可能である。
【００６０】
いくつかの実施形態において、本発明に適したフューリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩムテインは、追加の変異を含み得る。例えば、最大３０％またはそれ以上の配列番号１の残基が、変更され得る（例えば、最大１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％またはそれ以上の残基が変更されてもよい）。したがって、本発明に適したフューリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩムテインは、配列番号１と少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％を含む、少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有してもよい。
【００６１】
いくつかの実施形態において、本発明に適したフューリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩムテインは、詳細には、ＣＩ−ＭＰＲに標的化される。ＩＧＦ−ＩＩに結合すると知られている他のレセプターに、天然のＩＧＦ−ＩＩと比べて低い親和性で結合しつつ、高親和性（例えば、ｐＨ７．４において１０−７Ｍ以下の解離定数）でＣＩ−ＭＰＲに結合するタンパク質をもたらすＩＧＦ−ＩＩポリペプチドにおける変異が、特に有用である。例えば、本発明に適したフューリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩムテインは、ＩＧＦ−Ｉレセプターに対する天然に存在するヒトＩＧＦ−ＩＩの親和性と比べて、ＩＧＦ−Ｉレセプターに対して低い結合親和性を有するように改変され得る。例えば、ＩＧＦ−ＩＩ残基Ｔｙｒ２７のＬｅｕによる置換、ＶａｌによるＬｅｕ４３の置換またはＰｈｅによるＳｅｒ２６の置換は、ＩＧＦ−Ｉレセプターに対するＩＧＦ−ＩＩの親和性をそれぞれ９４倍、５６倍および４倍低下させる（Ｔｏｒｒｅｓら（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８（２）：３８５−４０１）。ヒトＩＧＦ−ＩＩの残基１〜７の欠失は、ヒトＩＧＦ−Ｉレセプターに対する親和性を３０倍低下させ、同時に、ラットＩＧＦ−ＩＩレセプターに対する親和性を１２倍増加させた（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（３０）：１８０１３−８）。ＩＧＦ−ＩＩのＮＭＲ構造は、Ｔｈｒ７が、残基４８Ｐｈｅおよび５０Ｓｅｒの近く、ならびに９Ｃｙｓ−４７Ｃｙｓジスルフィド架橋の近くに位置することを示している。Ｔｈｒ７とこれらの残基との相互作用が、ＩＧＦ−Ｉレセプター結合に必要とされる可撓性のＮ末端のヘキサペプチドを安定化させ得ると考えられる（Ｔｅｒａｓａｗａら（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊ．１３（２３）５５９０−７）。同時に、この相互作用は、ＩＧＦ−ＩＩレセプターへの結合を調節し得る。ＩＧＦ−ＩＩのＣ末端の切断（残基６２〜６７）もまた、ＩＧＦ−Ｉレセプターに対するＩＧＦ−ＩＩの親和性を５倍低下させると見られる（Ｒｏｔｈら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８１（２）：９０７−１４）。
【００６２】
ＩＧＦ−Ｉレセプターおよびカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターに対する結合表面は、ＩＧＦ−ＩＩの別個の面に存在する。構造的および変異的データに基づいて、ヒトＩＧＦ−ＩＩよりも実質的に小さい機能的カチオン非依存性Ｍ６Ｐ結合ドメインが構築され得る。例えば、アミノ末端のアミノ酸（例えば、１〜７または２〜７）および／またはカルボキシ末端の残基６２〜６７が、欠失され得るか、または置き換えられ得る。さらに、アミノ酸２９〜４０が、そのポリペプチドの残りの部分のフォールディングまたはカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターへの結合を変更させることなく、おそらく除去され得るか、または置き換えられ得る。このようにして、アミノ酸８〜２８および４１〜６１を含む標的化部分が、構築され得る。これらの一続きのアミノ酸は、おそらく、直接結合され得るか、またはリンカーによって分断され得る。あるいは、アミノ酸８〜２８および４１〜６１は、別個のポリペプチド鎖上に提供され得る。ＩＧＦ−ＩＩに相同であり、かつＩＧＦ−ＩＩの構造と密接な関係がある三次構造を有する、インスリンの類似のドメインは、別個のポリペプチド鎖に存在するときでさえも、適切な三次構造への適切な再フォールディングを可能にするのに十分な構造的情報を有する（Ｗａｎｇら（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２７９−２８１）。したがって、例えば、アミノ酸８〜２８またはその保存的置換バリアントが、リソソーム酵素に融合され得；得られる融合タンパク質が、アミノ酸４１〜６１またはその保存的置換バリアントと混合されて、患者に投与され得る。
【００６３】
ＩＧＦ−ＩＩを、血清ＩＧＦ結合タンパク質への結合を最小にするように改変する（Ｂａｘｔｅｒ（２０００）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．２７８（６）：９６７−７６）ことにより、ＩＧＦ−ＩＩ／ＧＩＬＴ構築物の隔離が回避され得る。多くの研究が、ＩＧＦ結合タンパク質への結合に必要な残基をＩＧＦ−ＩＩに局在化させている。これらの残基に変異を有する構築物は、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターに対する高親和性の結合性の保持およびＩＧＦ結合タンパク質に対する低い親和性についてスクリーニングされ得る。例えば、ＩＧＦ−ＩＩのＰｈｅ２６をＳｅｒで置き換えることは、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターへの結合に対して影響せずに、ＩＧＦＢＰ−１および−６に対するＩＧＦ−ＩＩの親和性を低下させると報告されている（Ｂａｃｈら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（１３）：９２４６−５４）。Ｇｌｕ９の代わりにＬｙｓを用いるなどの他の置換もまた、有益であり得る。ＩＧＦ−ＩＩと高度に保存されたＩＧＦ−Ｉの領域における、別個または組み合わせでの類似の変異が、ＩＧＦ−ＢＰの結合を大きく減少させる（Ｍａｇｅｅら（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８（４８）：１５８６３−７０）。
【００６４】
代わりのアプローチは、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターに高親和性で結合し得るＩＧＦ−ＩＩの最小領域を同定することである。Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターへのＩＧＦ−ＩＩの結合に関係する残基は、たいてい、ＩＧＦ−ＩＩの１つの面の上に密集する（Ｔｅｒａｓａｗａら（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊ．１３（２３）：５５９０−７）。ＩＧＦ−ＩＩ三次構造は、通常、３つの分子内ジスルフィド結合によって維持されるが、適切に折り畳まれ、かつ結合活性を有するように、ＩＧＦ−ＩＩのＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプター結合表面上にアミノ酸配列を組み込むペプチドを設計することができる。そのような最小の結合ペプチドは、高度に好ましいリソソーム標的化ドメインである。例えば、好ましいリソソーム標的化ドメインは、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸８〜６７である。Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターに結合する、アミノ酸４８〜５５付近の領域に基づいて設計されたペプチドもまた、望ましいリソソーム標的化ドメインである。あるいは、酵母ツーハイブリッドアッセイまたはファージディスプレイ型アッセイのいずれかを介して、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターに結合する能力についてペプチドのランダムライブラリーをスクリーニングすることができる。
【００６５】
インスリンレセプターに対する結合親和性
本願の発明者らは、本明細書中に記載される多くのフューリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩムテインが、インスリンレセプターに対して小さいかまたは低い結合親和性を有することを予想外にも発見した。したがって、いくつかの実施形態において、本発明に適したペプチドタグは、インスリンレセプターに対する天然に存在するヒトＩＧＦ−ＩＩの親和性と比べて、インスリンレセプターに対して小さいかまたは低い結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、本発明に適したインスリンレセプターに対して小さいかまたは低い結合親和性を有するペプチドタグは、野生型成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのインスリンレセプターに対する結合親和性よりも１．５倍超、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１４倍、１６倍、１８倍、２０倍、５０倍、１００倍低い結合親和性を有するペプチドタグを含む。インスリンレセプターに対する結合親和性は、当該分野で公知の様々なインビトロアッセイおよびインビボアッセイを用いて測定され得る。例示的な結合アッセイは、実施例の項に記載される。
【００６６】
突然変異誘発
ＩＧＦ−ＩＩムテインは、適切なヌクレオチドの変更をＩＧＦ−ＩＩ  ＤＮＡに導入することによって、または所望のＩＧＦ−ＩＩポリペプチドを合成することによって、調製され得る。ＩＧＦ−ＩＩ配列におけるバリエーションは、例えば、米国特許第５，３６４，９３４号に示されている、例えば、保存的変異および非保存的変異のための任意の手法およびガイドラインを用いて作製され得る。バリエーションは、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの天然に存在する配列と比較するとき、ＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸配列の変更をもたらす、ＩＧＦ−ＩＩをコードする１つ以上のコドンの置換、欠失または挿入であってもよい。アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を、類似の構造的および／または化学的特性を有する別のアミノ酸で置き換えた結果（例えば、セリンによるロイシンの置き換え、すなわち、保存的なアミノ酸の置き換え）であり得る。アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を、似ていない構造的特性および／または化学的特性を有する別のアミノ酸で置き換えた結果、すなわち、非保存的なアミノ酸の置き換えでもあり得る。挿入または欠失は、必要に応じて、１〜５個のアミノ酸の範囲であってもよい。許容されるバリエーションは、その配列におけるアミノ酸の挿入、欠失または置換を体系的に作製し、そして得られたバリアントを、当該分野で公知のインビボアッセイまたはインビトロアッセイ（例えば、ＣＩ−ＭＰＲに対する結合アッセイまたはフューリン切断アッセイ）において活性について試験することによって、判定されてもよい。
【００６７】
スキャニングアミノ酸解析もまた、連続した配列において１つ以上のアミノ酸を同定するために使用され得る。比較的小さく中性のアミノ酸が、好ましいスキャニングアミノ酸である。そのようなアミノ酸としては、アラニン、グリシン、セリンおよびシステインが挙げられる。アラニンは、ベータ炭素からとび出た側鎖を持たず、かつバリアントの主鎖の立体配座を変更させる可能性が低いので、この群の中でもアラニンが代表的に好ましいスキャニングアミノ酸である。また、アラニンは、最も一般的なアミノ酸であるので、代表的に好ましい。さらに、アラニンは、しばしば埋没した位置と露出した位置との両方に見られる［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１（１９７６）］。アラニン置換が、適切な量のバリアントをもたらさない場合、等配電子の（ｉｓｏｔｅｒｉｃ）アミノ酸が使用され得る。
【００６８】
それらのバリエーションは、当該分野で公知の方法（例えば、オリゴヌクレオチド媒介性（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャニングおよびＰＣＲ突然変異誘発）を用いて作製され得る。部位特異的突然変異誘発［Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：４３３１（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１０：６４８７（１９８７）］、カセット突然変異誘発  ［Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ，３４：３１５（１９８５）］、制限部位選択突然変異誘発（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）［Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  ＳｅｒＡ，３１７：４１５（１９８６）］または他の公知の手法を、クローニングされたＤＮＡに対して行うことにより、ＩＧＦ−ＩＩムテインが生成され得る。
【００６９】
スペーサー
フューリン抵抗性ＧＩＬＴタグは、リソソーム酵素をコードするポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。このＧＩＬＴタグは、リソソーム酵素ポリペプチドに直接融合され得るか、またはリンカーもしくはスペーサーによってリソソーム酵素ポリペプチドと分断され得る。アミノ酸のリンカーまたはスペーサーは、通常、可撓性であるように、または２つのタンパク質部分の間にアルファ−ヘリックスなどの構造を挿入するように、設計される。リンカーまたはスペーサーは、比較的短いこともあるし（例えば、配列Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列番号４）またはＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号５））、それよりも長い（例えば、１０〜２５アミノ酸長）こともある。融合連結の部位は、両方の融合パートナーの適切なフォールディングおよび活性を促すように、そしてＧＡＡポリペプチドからのペプチドタグの早期の分断を防ぐように、注意して選択されるべきである。好ましい実施形態において、リンカー配列は、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列番号４）である。
【００７０】
本発明の方法および組成物において使用され得るＧＩＬＴタグ化ＧＡＡタンパク質の追加の構築物は、米国公開番号２００５０２４４４００（その開示全体が本明細書中で参考として援用される）に詳細に記載された。
【００７１】
細胞
細胞培養およびポリペプチドの発現を行いやすい任意の哺乳動物の細胞または細胞型（例えば、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、サル腎臓（ＣＯＳ）、ＨＴ１０８０、Ｃ１０、ＨｅＬａ、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、３Ｔ３、Ｃ１２７、ＣＶ−１、ＨａＫ、ＮＳ／ＯおよびＬ−９２９細胞）が、本発明に従って利用され得る。本発明に従って使用され得る哺乳動物細胞の非限定的な例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウスミエローマ株（ＮＳＯ／ｌ、ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ：８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６（ＣｒｕＣｅｌｌ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））；ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）；ヒト胎児腎株（２９３細胞、または懸濁培養において生育するためにサブクローン化された２９３細胞，Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１  ５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット（ｂｕｆｆａｌｏ  ｒａｔ）肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒトヘパトーム株（Ｈｅｐ  Ｇ２）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、ＣＨＯ細胞株から産生される。
【００７２】
本発明の融合タンパク質は、種々の非哺乳動物宿主細胞（例えば、昆虫（例えば、Ｓｆ−９、Ｓｆ−２１、Ｈｉ５）、植物（例えば、Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａ、穀類またはタバコ）、酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｉｖｉｓａｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、原核生物（例えば、Ｅ．Ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよび他のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ）または真菌類）においても発現され得る。
【００７３】
いくつかの実施形態において、フューリン抵抗性ＧＩＬＴタグを有するかまたは有しない融合タンパク質が、フューリン欠損細胞において産生され得る。本明細書中で使用されるとき、用語「フューリン欠損細胞」とは、フューリンプロテアーゼ活性が阻害されているか、低下しているか、または無くなっている、任意の細胞のことを指す。フューリン欠損細胞は、フューリンを産生しないか、または少量のフューリンプロテアーゼもしくは不完全なフューリンプロテアーゼを産生する、哺乳動物細胞と非哺乳動物細胞との両方を含む。ＦＤ１１細胞（Ｇｏｒｄｏｎら（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６５（８）：３３７０  ３３７５）およびＭｏｅｂｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍｏｅｈｒｉｎｇ（１９８３）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４１（３）：９９８  １００９に記載されているそれらの変異細胞を含むがこれらに限定されない例示的なフューリン欠損細胞が、当業者に公知であり、かつ利用可能である。あるいは、フューリン欠損細胞は、上に記載した哺乳動物細胞および非哺乳動物細胞を突然変異誘発処理、例えば、照射、エチジウムブロマイド、臭素化（ｂｒｏｍｉｄａｔｅｄ）ウリジン（ＢｒｄＵ）など、好ましくは、化学的突然変異誘発さらにより好ましくはエチルメタンスルホネート突然変異誘発に曝露し、その処理を生き延びる細胞を回収し、そしてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａの毒性に対して抵抗性であることが見出される細胞について選択することによって得られてもよい（Ｍｏｅｈｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍｏｅｈｒｉｎ（１９８３）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４１（３）：９９８  １００９を参照のこと）。
【００７４】
低グリコシル化（Ｕｎｄｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）
本発明の標的化された治療用タンパク質は、低グリコシル化され（ｕｎｄｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）得る、すなわち、通常、天然に存在するヒトタンパク質上に存在するだろう１つ以上の炭水化物構造が、好ましくは、取り除かれるか、除去されるか、改変されるか、または遮蔽される。いかなる理論にも拘束されるつもりはないが、低グリコシル化されたタンパク質は、哺乳動物におけるそのタンパク質の半減期を延長し得ると企図される。低グリコシル化は、多くの方法で達成され得る。いくつかの実施形態において、本発明の標的化された融合タンパク質は、融合タンパク質の分泌を促進する分泌シグナルペプチドを用いて作製され得る。例えば、その融合タンパク質は、ＩＧＦ−ＩＩシグナルペプチドを用いて作製され得る。一般に、ＩＧＦ−ＩＩシグナルペプチドを用いて作製された融合タンパク質は、野生型酵素と比較して、そのタンパク質の表面上において低いマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）レベルを有する。いくつかの実施形態において、タンパク質は、完全に低グリコシル化されてもよく（Ｅ．ｃｏｌｉにおいて合成されるときのように）、部分的に低グリコシル化されてもよく（部位特異的突然変異誘発によって１つ以上のグリコシル化部位を破壊した後に哺乳動物系において合成されるときのように）、または非哺乳動物のグリコシル化パターンを有してもよい。例えば、低グリコシル化された融合タンパク質は、部位特異的突然変異誘発によって、１つ以上のグリコシル化部位を改変するか、置換するか、または無くすことによって、生成されてもよい。例えば、野生型ＧＡＡは、代表的には、Ｎ結合型グリコシル化のための基準の認識配列Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ（配列番号７）（Ｘａａは、Ｐｒｏ以外の任意の残基であり得る）とマッチする７つの部位、すなわち、Ａｓｎ−１４０、−２３３、−３９０、−４７０、−６５２、−８８２および−９２５を有する（Ｈｏｅｆｓｌｏｏｔら、１９８８；Ｍａｒｔｉｎｉｕｋら、１９９０ｂ）。上に記載した位置における１つ以上のＡｓｎが、変更されるか、または排除されることにより、低グリコシル化されたＧＡＡが生成されてもよい。いくつかの実施形態において、Ａｓｎは、Ｇｌｎに変更されてもよい。
【００７５】
いくつかの実施形態において、治療用融合タンパク質は、合成後に脱グリコシル化され得る。例えば、脱グリコシル化は、化学的または酵素的な処理によるものであり得、完全な脱グリコシル化をもたらしてもよく、または炭水化物構造の一部だけが除去される場合は、部分的な脱グリコシル化をもたらしてもよい。
【００７６】
いくつかの実施形態において、リソソーム酵素のグリコシル化が、例えば、酸化および還元によって改変されることにより、血液からの治療用タンパク質のクリアランスが減少する。例えば、リソソーム酵素は、ペリオデート処理によって脱グリコシル化され得る。特に、ペリオデートおよび水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤による処理が、ほとんどの糖タンパク質の炭水化物構造を改変するのに効果的である。ペリオデート処理は、近接するジオールを酸化し、炭素−炭素結合を切断し、そしてヒドロキシル基をアルデヒド基で置き換え；水素化ホウ素は、アルデヒドをヒドロキシルに還元する。例えば、１ｍＭの濃度において、ペリオデートは、もっぱらシアル酸基を酸化し、１０ｍＭ以上において、利用可能なすべての近接するジオールが、アルデヒドに変換される（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．１９９６，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ）。アルデヒド基は、いったん形成されると、高度に反応性であり、そのタンパク質内の第１級アミノ基とシッフ塩基結合を形成し得、結果として分子内結合をもたらし得る。ゆえに、形成されるアルデヒド基は、アルコール基に還元されるのが妥当である。一般に使用される還元剤は、ＮａＢＨ４であり、その反応は、アルカリ性条件下において最もよく進む。ゆえに、近接するジオールを含む多くの糖残基が、この処理によって切断される。それにもかかわらず、この処理は、環状炭水化物を直鎖状炭水化物に変換するが、炭水化物を完全に除去しないことから、潜在的にプロテアーゼ感受性または抗原性であるポリペプチド部位を露出するリスクが最小になる。
【００７７】
Ｇｒｕｂｂ，Ｊ．Ｈ．ら（Ｇｒｕｂｂら、２００８，ＰＮＡＳ  １０５：２６１６）は、ヒトβ−グルクロニダーゼをメタ過ヨウ素酸ナトリウムで処理した後の水素化ホウ素ナトリウム還元を報告している。改変されたベータ−グルクロニダーゼは、９０％の活性を保持したが、マンノースとマンノース−６−リン酸との両方に依存するレセプター取り込み活性を喪失した。Ｇｒｕｂｂらによって説明されたような水素化ホウ素ナトリウム試薬に起因する、還元において使用されたアルカリ性ｐＨ条件は、すべてのリソソーム酵素に対して適するものではなく、それらの酵素の多くが、アルカリ性条件下において不安定である。
【００７８】
ゆえに、いくつかの実施形態において、シアノ水素化ホウ素ナトリウムが、還元剤として使用される。シアノ水素化ホウ素によるアルデヒドの還元速度は、中性ｐＨ以上において無視できるが、その反応速度は、酸性ｐＨにおいて速くなる（Ｂｏｒｃｈら、１９７１，ＪＡＣＳ  ９３：２８９７）。例えば、ｐＨ３．５〜４においてメタ過ヨウ素酸ナトリウムおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いるレジメンが、使用され得る。
【００７９】
例えば、ポンペ病およびファブリー病において欠損している酵素である、ＧＡＡまたはアルファガラクトシダーゼＡを、ｐＨ５．６においてそれぞれペリオデートおよびシアノ水素化ホウ素で処理することにより、良好な酵素活性が回復した。０．１Ｍ酢酸Ｎａ，ｐＨ５．６中に２０ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウムおよび４０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムを含む等体積の混合物と酵素とを、６０分間、氷上でインキュベートした。未反応のペリオデートを、１５分間、氷上においてグリセロール（最終濃度１０％）でクエンチした。最後にそのタンパク質を、Ａｍｉｃｏｎ遠心濾過デバイスを用いるダイアフィルトレーションによってリン酸緩衝食塩水，ｐＨ６．２に交換した。他の還元試薬、例えば、ジメチルアミンボランもまた、酸性条件下におけるＧＡＡなどの糖タンパク質のメタ過ヨウ素酸ナトリウムの酸化によって生成されるアルデヒドを還元するのに有用であり得る。
【００８０】
したがって、いくつかの実施形態において、メタ過ヨウ素酸ナトリウムで処理されたＧＡＡの還元は、ｐＨ３．０〜ｐＨ６の酸性ｐＨにおけるシアノ水素化ホウ素ナトリウムの使用を含む。化学修飾のための至適条件は、２つのアッセイ：ＣｏｎＡセファロースへの結合の低下、およびＪ７７４Ｅマクロファージへの少ない取り込みによって容易に決定され得る。
【００８１】
例えば、ペリオデート／水素化ホウ素で改変されたβ−グルクロニダーゼがＣｏｎＡ−セファロースに結合する能力を、無処理のβ−グルクロニダーゼの能力と比較した。それらの酵素を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８、０．５Ｍ  ＮａＣｌ中の５０μｌのＣｏｎＡビーズとともに室温において１５分間インキュベートした。１５秒間、最高速度でビーズを遠心した。上清（フロースルー）を慎重に廃棄し、ＧＵＳ活性についてアッセイし、ＳＤＳ／ＰＡＧＥによって解析した。本発明者らが、Ｇｒｕｂｂらにおいて報告されたようにＧＵＳを厳密に処理したとき、６０％のＣｏｎＡ結合活性が失われ、未結合のＧＵＳは、ペリオデート処理されたサンプルおよびその後の水素化ホウ素ナトリウムで還元されたサンプルのフロースルー中にだけ存在した。
【００８２】
治療用タンパク質の投与
本発明によれば、本発明の治療用タンパク質は、代表的には、単独で、または本明細書中に記載されるような、その治療用タンパク質を含む組成物もしくは薬物として（例えば、疾患を処置するための薬物の製造において）、個体に投与される。その組成物は、薬学的組成物を調製する生理的に許容可能なキャリアまたは賦形剤とともに製剤化され得る。そのキャリアおよび組成物は、滅菌され得る。製剤化は、投与様式に適するものであるべきである。
【００８３】
適当な薬学的に許容可能なキャリアとしては、水、塩溶液（例えば、ＮａＣｌ）、食塩水、緩衝食塩水、アルコール、グリセロール、エタノール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物（例えば、ラクトース、アミロースまたはデンプン）、糖（例えば、マンニトール、スクロースまたはその他）、デキストロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘稠性パラフィン、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなど、ならびにそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。薬学的調製物は、所望であれば、活性化合物と有害に反応しないかまたはその活性を干渉しない、補助剤（例えば、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響するための塩、緩衝液、着色剤、香味料および／または芳香物質など）と混合され得る。好ましい実施形態において、静脈内投与に適した水溶性キャリアが使用される。
【００８４】
本組成物または薬物は、所望であれば、微量の湿潤剤もしくは乳化剤またはｐＨ緩衝剤も含み得る。本組成物は、液体の溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル、徐放製剤または粉末であり得る。本組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドなどのキャリアを用いて、坐剤としても製剤化され得る。経口製剤は、標準的なキャリア（例えば、製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ｐｙｒｏｌｌｉｄｏｎｅ）、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなど）を含み得る。
【００８５】
本組成物または薬物は、ヒトへの投与に適合された薬学的組成物として通例の手順に従って製剤化され得る。例えば、好ましい実施形態において、静脈内投与用の組成物は、代表的には、滅菌された等張性水性緩衝液における溶液である。必要であれば、その組成物は、可溶化剤、および注射部位における疼痛を和らげる局所麻酔剤も含んでもよい。一般に、それらの成分は、活性な薬剤の量が示されているアンプルまたはサシェ（ｓａｃｈｅｔｔｅ）などの空気を通さないように密閉された容器内において、別々に、または単位剤形に共に混合された状態で、例えば、凍結乾燥された乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、供給される。本組成物は、注入によって投与される場合、滅菌された製薬グレードの水、食塩水またはデキストロース／水が入った注入ボトルを用いて調剤され得る。本組成物は、注射によって投与される場合、投与前にそれらの成分が混合されてもよいように、注射用の滅菌水または食塩水のアンプルが、提供され得る。
【００８６】
治療用タンパク質は、中性または塩の形態として製剤化され得る。薬学的に許容可能な塩としては、遊離アミノ基を用いて形成される塩（例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから得られる塩）および遊離カルボキシル基を用いて形成される塩（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから得られる塩）が挙げられる。
【００８７】
治療用タンパク質（または治療用タンパク質を含む組成物もしくは薬物）は、任意の適切な経路によって投与される。好ましい実施形態において、治療用タンパク質は、静脈内に投与される。他の実施形態において、治療用タンパク質は、標的組織（例えば、心臓もしくは筋肉（例えば、筋肉内）または神経系（例えば、脳への直接注射；脳室内；髄腔内））への直接投与によって投与される。あるいは、治療用タンパク質（または治療用タンパク質を含む組成物もしくは薬物）は、非経口的、経皮的または経粘膜的に（例えば、経口的または経鼻的に）投与され得る。所望であれば、２つ以上の経路が同時に使用され得る。
【００８８】
治療用タンパク質（または治療用タンパク質を含む組成物もしくは薬物）は、単独で、あるいは他の薬剤（例えば、抗ヒスタミン剤（例えば、ジフェンヒドラミン）もしくは免疫抑制剤、または抗ＧＩＬＴタグ化リソソーム酵素抗体を打ち消す他の免疫治療薬）とともに、投与され得る。用語「とともに」は、その薬剤が、治療用タンパク質（または治療用タンパク質を含む組成物もしくは薬物）の前、それとほぼ同時、またはその後に、投与されることを示す。例えば、その薬剤は、治療用タンパク質を含む組成物中に混合され得、それにより、治療用タンパク質と同時に投与されるか；あるいは、その薬剤は、混合せずに（例えば、治療用タンパク質も投与される静脈ライン上におけるその薬剤またはその逆の「ピギーバック」送達によって）、同時に投与され得る。別の例では、その薬剤は、別々に（例えば、混合されずに）、しかし、治療用タンパク質を投与した後の短い期間内（例えば、２４時間以内）に、投与され得る。
【００８９】
治療用タンパク質（または治療用タンパク質を含む組成物もしくは薬物）は、治療有効量（すなわち、一定間隔で投与されるときに、疾患を処置する（例えば、疾患に関連する症状を回復させること、疾患の発症を予防するかもしくは遅延させること、および／または上に記載されたような疾患の症状の重症度もしくは頻度を低下させることによって）のに十分な投薬量）で投与される。その疾患の処置に治療的に有効であろう用量は、その疾患の影響の性質および程度に依存し、標準的な臨床上の手法によって決定され得る。さらに、当該分野で公知の方法を用いて最適な投与量の範囲を特定するのを助けるために、インビトロアッセイまたはインビボアッセイが必要に応じて使用されてもよい。使用される正確な用量もまた、投与経路および疾患の重症度に依存し、開業医の判断および各患者の事情に従って決定されるべきである。有効量は、インビトロ試験系または動物モデル試験系から得られた用量反応曲線から推定されてもよい。治療的に有効な投薬量は、例えば、約０．１〜１ｍｇ／ｋｇ、約１〜５ｍｇ／ｋｇ、約５〜２０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜５０ｍｇ／ｋｇまたは２０〜１００ｍｇ／ｋｇであり得る。特定の個体のための有効量は、その個体の要求に応じて、時間をかけて変更することができる（例えば、増加または減少）。例えば、身体的な疾病もしくはストレスのとき、または疾患症状が悪化している場合、投薬量は、増加され得る。
【００９０】
治療用タンパク質（または治療用タンパク質を含む組成物もしくは薬物）の治療有効量は、疾患の影響の性質および程度に応じて、一定間隔で継続的に投与される。ある「間隔」における投与は、本明細書中で使用されるとき、治療有効量が、周期的に投与されることを示す（１回の用量と区別されるとき）。その間隔は、標準的な臨床上の手法によって決定され得る。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質は、隔月、毎月、１ヶ月に２回、３週間ごと、隔週、毎週、１週間に２回、１週間に３回または毎日、投与される。単一の個体のための投与間隔は、固定された間隔である必要はないが、個体の要求に応じて、時間をかけて変更することができる。例えば、身体的な疾病もしくはストレスのとき、または疾患症状が悪化している場合、投与の間隔は、短縮され得る。
【００９１】
本明細書中で使用されるとき、用語「隔月」は、２ヶ月あたり１回（すなわち、２ヶ月ごとに１回）の投与を意味し；用語「毎月」は、１ヶ月あたり１回の投与を意味し；用語「３週間ごと」は、３週間あたり１回（すなわち、３週間ごとに１回）の投与を意味し；用語「隔週」は、２週間あたり１回（すなわち、２週間ごとに１回）の投与を意味し；用語「毎週」は、１週間あたり１回の投与を意味し；そして用語「毎日」は、１日あたり１回の投与を意味する。
【００９２】
本発明はさらに、本明細書中に記載されている方法などによってポンペ病を処置するために組成物を投与するための指示を含むラベルを有する容器（例えば、バイアル、ボトル、静脈内投与用のバッグ、注射器など）内の、本明細書中に記載されるような治療用タンパク質を含む薬学的組成物に関する。
【００９３】
本発明は、さらにおよびより詳細に、以下の実施例によって説明される。しかしながら、実施例は、限定ではなく例示の目的で含められる。
【実施例】
【００９４】
実施例１：フューリンはＩＧＦ−ＩＩベースＧＩＬＴタグを切断する
ＺＣ−７０１は、ポンペ病の処置のために開発されてきた。ＺＣ−７０１は、３アミノ酸スペーサーを介してヒト酸性α−グルコシダーゼ（ｈＧＡＡ）の残基７０〜９５２に融合されたＮ末端のＩＧＦ−ＩＩベースＧＩＬＴタグを含むキメラタンパク質である。詳細には、ＺＣ−７０１は、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸１および８〜６７（すなわち、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのΔ２−７）、スペーサー配列Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ、ならびにヒトＧＡＡのアミノ酸７０〜９５２を含む。その完全長アミノ酸配列を以下に示す。スペーサー配列は、太字にされている。スペーサー配列に対してＮ末端の配列は、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸１および８〜６７が反映されており、スペーサー配列に対してＣ末端の配列は、ヒトＧＡＡのアミノ酸７０〜９５２が反映されている。ＩＧＦ−ＩＩタグ配列内の２つの重複する潜在的なフューリン切断部位は、太字にされており、下線が付されている。矢印は、２つの潜在的なフューリン切断位置を指摘している。
【００９５】
【化２】
0005627571.tif 000007
ＺＣ−７０１開発の過程において、ＺＣ−７０１分子の一部におけるＩＧＦ−ＩＩ由来ＧＩＬＴタグが、ＣＨＯ細胞において産生される間に、フューリンによるタンパク分解性切断に供されることが明らかになってきた。ＺＣ−７０１バッチ１０−２−Ｆ４５−５４のｎ末端の解析から、２つのｎ末端配列の存在が明らかになった。一方は、ＺＣ−７０１の予測されるｎ末端に適合したことから、予測されるＺＣ−７０１タンパク質の存在が示唆される。他方のｎ末端配列は、ＺＣ−７０１のタグ部分内の配列と整合したことから、ＺＣ−７０１のアミノ酸残基３４における内部タンパク分解性の（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ）切断と一致するＺＣ−７０１の誘導体の存在が示唆される。この２つのｎ末端の推定モル比に基づいて、このバッチのＺＣ−７０１は、約１：１の比のインタクト種と切断種を有することが見出された。
【００９６】
この結果を受けて、ＺＣ−７０１の他のバッチの各々を、ｎ末端配列決定に供した。そのすべてのバッチが、同じ２つのｎ末端を示し、切断種は、全化合物の２０〜５０％に及んだ。以前に低い取り込み活性を有すると示された１つのバッチは、追加のタンパク質分解を示唆するｎ末端のセットを示した。本発明者らは、本発明者らのＺＣ−７０１のすべてのバッチにおける第２の種に関与するタンパク分解性事象が、フューリンまたはフューリン様プロテアーゼによって行われたと結論づけた。
【００９７】
図１は、ＺＣ−７０１のアミノ末端のマップを示している。２つの四角で囲まれたアミノ酸残基は、すべてのＺＣ−７０１バッチにおいてマッピングされたｎ末端の部位である。第１のＮ末端は、シグナルペプチド切断の部位であり、ＺＣ−７０１の予測されるｎ末端をもたらす。四角で囲まれた第２の残基は、望まれないタンパク分解性切断事象の部位である。その切断部位に近位のアミノ酸配列は、Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ（配列番号９）である。これは、Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ａｒｇ（配列番号１０）の後ろを切断する、フューリンと呼ばれるＣＨＯ細胞に存在するプロテアーゼの基準の切断部位とマッチする。フューリンは、膵島細胞におけるプロインスリンの成熟に関与するプロテアーゼであるＰＣ３をはじめとしたプロホルモンコンバターゼのファミリーのメンバーである。実際に、プロインスリンにおけるＰＣ３切断部位は、保存されており、フューリンがＩＧＦ−ＩＩタグを切断する部位と同一である。
【００９８】
フューリンによって切断されたＺＣ−７０１は、インタクトなＺＣ−７０１と分子量が約３０００ダルトン異なり、これは、３％未満の分子量の差異である。タンパク質におけるオリゴ糖の不均一性に起因して、切断されたＺＣ−７０１の存在は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって予め検出されなかった。しかしながら、ＺＣ−７０１を、まず、ペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）で処理することによって脱グリコシル化する場合は、切断されたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってインタクトなＺＣ−７０１から分割され得る。
【００９９】
図２に示されるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーン１は、脱グリコシル化された精製ＺＣ−７０１の電気泳動パターンを示している。２つのバンドが明らかである。上のバンドは、インタクトなＺＣ−７０１であると考えられ、下のバンドは、フューリンによって切断されたＺＣ−７０１であると考えられる。下のバンドが、本当にフューリンによって切断されたＺＣ−７０１であることを証明するために、レーン１に充填された同じタンパク質を、まず、フューリンで処理し、次いで、レーン２に充填した。図２に示されるように、レーン２におけるタンパク質のすべてが、レーン１における下のバンドと共に移動していることから、下のバンドが、実際にフューリンによって切断されたＺＣ−７０１であることが示唆される。
【０１００】
本発明者らは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるバンド強度の定量化およびＮ末端配列決定実験において明らかになったアミノ酸の定量化によって、ＺＣ−７０１のいくつかのバッチにおいてフューリンによって切断されたＺＣ−７０１の割合を推定した。上で述べたように、切断されたＺＣ−７０１の断片は、様々なバッチにおいて２０％〜５０％に及んだ。
【０１０１】
実施例２．フューリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩベースＧＩＬＴタグを含む標的化された融合タンパク質
本発明者らは、アミノ酸の変更が少なくとも１つのフューリン切断部位を無効にするようにＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸配列を変更することによって、フューリン切断の問題を回避するように設計することができる。ＺＣ−７０１の一連の変異体バージョンを作製し、フューリンによる切断に対する抵抗性についてアッセイした。ＺＣ−７０１の例示的な変異体バージョンを以下に記載されるように作製した。
【０１０２】
ＺＣ−７０１
下記のＧＩＬＴΔ２−７−ＧＡＡ７０−９５２カセットを、そのカセットおよびベクターｐＣＥＰ４のＡｓｐ７１８およびＮｏｔＩ部位を用いてクローニングすることにより、ｐＣＥＰ−ＧＩＬＴΔ２−７−ＧＡＡ７０−９５２（プラスミドｐ７０１）を作製した。クローニングのための制限酵素認識部位は、太字の小文字で表されている。スペーサーアミノ酸配列Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ（下線の配列）は、ＧＡＡ遺伝子とＧＩＬＴΔ２−７タグ（大文字の配列）とを分断している。そのスペーサーおよびタグは、ＧＡＡ残基Ａｌａ７０の上流に配置されている。
【０１０３】
【化３−１】
0005627571.tif 000008
【０１０４】
【化３−２】
0005627571.tif 000009
構築物１４５９
下記のＧＩＬＴΔ２−７／Ｋ３７−ＧＡＡ７０−９５２カセットを、そのカセットおよびベクターｐＣＥＰ４のＡｓｐ７１８およびＮｏｔＩ部位を用いてクローニングすることにより、ｐＣＥＰ−ＧＩＬＴΔ２−７／Ｋ３７−ＧＡＡ７０−９５２（プラスミドｐ１４５９）を作製した。クローニングのための制限酵素認識部位は、太字の小文字で表されている。スペーサーアミノ酸配列Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ（下線の配列）は、ＧＡＡ遺伝子とＧＩＬＴΔ２−７／Ｋ３７タグ（大文字の配列）とを分断している。そのスペーサーおよびタグは、ＧＡＡ残基Ａｌａ７０の上流に配置されている。ＧＩＬＴΔ２−７／Ｋ３７カセットは、ヒトＩＧＦ−ＩＩ配列のアミノ酸３７におけるＡｒｇからＬｙｓへの置換（太字の大文字）を含む。
【０１０５】
【化４−１】
0005627571.tif 000010
【０１０６】
【化４−２】
0005627571.tif 000011
構築物１４６０
下記のＧＩＬＴΔ２−７／Ｋ４０−ＧＡＡ７０−９５２カセットを、そのカセットおよびベクターｐＣＥＰ４のＡｓｐ７１８およびＮｏｔＩ部位を用いてクローニングすることにより、ｐＣＥＰ−ＧＩＬＴΔ２−７／Ｋ４０−ＧＡＡ７０−９５２（プラスミドｐ１４６０）を作製した。クローニングのための制限酵素認識部位は、太字の小文字で表されている。スペーサーアミノ酸配列Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ（下線の配列）は、ＧＡＡ遺伝子とＧＩＬＴΔ２−７／Ｋ４０タグ（大文字の配列）とを分断している。そのスペーサーおよびタグは、ＧＡＡ残基Ａｌａ７０の上流に配置されている。ＧＩＬＴΔ２−７／Ｋ４０カセットは、ヒトＩＧＦ−ＩＩ配列のアミノ酸４０におけるＡｒｇからＬｙｓへの置換（太字の大文字）を含む。
【０１０７】
【化５−１】
0005627571.tif 000012
【０１０８】
【化５−２】
0005627571.tif 000013
構築物１４６１
下記のＧＩＬＴΔ２−７／Ａ３７−ＧＡＡ７０−９５２カセットを、そのカセットおよびベクターｐＣＥＰ４のＡｓｐ７１８およびＮｏｔＩ部位を用いてクローニングすることにより、ｐＣＥＰ−ＧＩＬＴΔ２−７／Ａ３７−ＧＡＡ７０−９５２（プラスミドｐ１４６１）を作製した。クローニングのための制限酵素認識部位は、太字の小文字で表されている。スペーサーアミノ酸配列Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ（下線の配列）は、ＧＡＡ遺伝子とＧＩＬＴΔ２−７／Ａ３７タグ（大文字の配列）とを分断している。そのスペーサーおよびタグは、ＧＡＡ残基Ａｌａ７０の上流に配置されている。ＧＩＬＴΔ２−７／Ａ３７カセットは、ヒトＩＧＦ−ＩＩ配列のアミノ酸３７におけるＡｒｇからＡｌａへの置換（太字の大文字）を含む。
【０１０９】
【化６−１】
0005627571.tif 000014
【０１１０】
【化６−２】
0005627571.tif 000015
構築物１４６３
下記のＧＩＬＴΔ２−７／Ａ４０−ＧＡＡ７０−９５２カセットを、そのカセットおよびベクターｐＣＥＰ４のＡｓｐ７１８およびＮｏｔＩ部位を用いてクローニングすることにより、ｐＣＥＰ−ＧＩＬＴΔ２−７／Ａ４０−ＧＡＡ７０−９５２（プラスミドｐ１４６３）を作製した。クローニングのための制限酵素認識部位は、太字の小文字で表されている。スペーサーアミノ酸配列Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ（下線の配列）は、ＧＡＡ遺伝子とＧＩＬＴΔ２−７／Ａ４０タグ（大文字の配列）とを分断している。そのスペーサーおよびタグは、ＧＡＡ残基Ａｌａ７０の上流に配置されている。ＧＩＬＴΔ２−７／Ａ４０カセットは、ヒトＩＧＦ２配列のアミノ酸４０におけるＡｒｇからＡｌａへの置換（太字の大文字）を含む。
【０１１１】
【化７−１】
0005627571.tif 000016
【０１１２】
【化７−２】
0005627571.tif 000017
構築物１４７９
下記のＧＩＬＴΔ２−７Ｍ１／Ｋ３７−ＧＡＡ７０−９５２カセットを、そのカセットおよびベクターｐＣＥＰ４のＡｓｐ７１８およびＮｏｔＩ部位を用いてクローニングすることにより、ｐＣＥＰ−ＧＩＬＴΔ２−７Ｍ１／Ｋ３７−ＧＡＡ７０−９５２（プラスミドｐ１４７９）を作製した。クローニングのための制限酵素認識部位は、太字の小文字で表されている。スペーサーアミノ酸配列Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ（下線の配列）は、ＧＡＡ遺伝子とＧＩＬＴΔ２−７Ｍ１／Ｋ３７タグ（大文字の配列）とを分断している。そのスペーサーおよびタグは、ＧＡＡ残基Ａｌａ７０の上流に配置されている。ＧＩＬＴΔ２−７Ｍ１／Ｋ３７カセットは、ヒトＩＧＦ−ＩＩ配列のアミノ酸３７におけるＡｒｇからＬｙｓへの置換（太字の大文字）を含む。
【０１１３】
【化８−１】
0005627571.tif 000018
【０１１４】
【化８−２】
0005627571.tif 000019
構築物１４８７
下記のＧＩＬＴΔ２−７Ｍ１／Ａ３７−ＧＡＡ７０−９５２カセットを、そのカセットおよびベクターｐＣＥＰ４のＡｓｐ７１８およびＮｏｔＩ部位を用いてクローニングすることにより、ｐＣＥＰ−ＧＩＬＴΔ２−７Ｍ１／Ａ３７−ＧＡＡ７０−９５２（プラスミドｐ１４８７）を作製した。クローニングのための制限酵素認識部位は、太字の小文字で表されている。スペーサーアミノ酸配列Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ（下線の配列）は、ＧＡＡ遺伝子とＧＩＬＴΔ２−７Ｍ１／Ａ３７タグ（大文字の配列）とを分断している。そのスペーサーおよびタグは、ＧＡＡ残基Ａｌａ７０の上流に配置されている。ＧＩＬＴΔ２−７Ｍ１／Ａ３７カセットは、ヒトＩＧＦ−ＩＩ配列のアミノ酸３７におけるＡｒｇからＡｌａへの置換（太字の大文字）を含む。
【０１１５】
【化９−１】
0005627571.tif 000020
【０１１６】
【化９−２】
0005627571.tif 000021
図３に示されるように、３つの例示的な変異体（すなわち、構築物１４５９、１４６０および１４６１）（ここで、アラニンまたはリシンが基準のアルギニン残基の１つの代わりに用いられている）は、フューリンによる検出可能な切断なしに発現された。また、図３（右パネル）に示されるように、Ｒ３７Ａ置換を含む構築物１４６１は、外来性フューリンの添加に対してさらに抵抗性である。
【０１１７】
構築物１７２６
下記のＧＩＬＴΔ２−７Δ３０−３９−ＧＡＡ７０−９５２カセットを、そのカセットおよびベクターｐＣＥＰ４のＡｓｐ７１８およびＮｏｔＩ部位を用いてクローニングすることにより、ｐＣＥＰ−ＧＩＬＴΔ２−７Δ３０−３９−ＧＡＡ７０−９５２（プラスミド１７２６）を作製した。クローニングのための制限酵素認識部位は、太字の小文字で表されている。スペーサーアミノ酸配列Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ（下線の配列）は、ＧＡＡ遺伝子とＧＩＬＴΔ２−７Δ３０−３９タグ（大文字の配列）とを分断している。そのスペーサーおよびタグは、ＧＡＡ残基Ａｌａ７０の上流に配置されている。ＧＩＬＴΔ２−７Δ３０−３９カセットは、ヒトＩＧＦ−ＩＩ配列由来のアミノ酸残基３０〜３９（Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ）の欠失を含む。
【０１１８】
【化１０】
0005627571.tif 000022
構築物１７４９
下記のＧＩＬＴΔ２−７Δ３１−３９−ＧＡＡ７０−９５２カセットを、そのカセットおよびベクターｐＣＥＰ４のＡｓｐ７１８およびＮｏｔＩ部位を用いてクローニングすることにより、ｐＣＥＰ−ＧＩＬＴΔ２−７Δ３１−３９−ＧＡＡ７０−９５２（プラスミド１７４９）を作製した。クローニングのための制限酵素認識部位は、太字の小文字で表されている。スペーサーアミノ酸配列Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ（下線の配列）は、ＧＡＡ遺伝子とＧＩＬＴΔ２−７Δ３１−３９タグ（大文字の配列）とを分断している。そのスペーサーおよびタグは、ＧＡＡ残基Ａｌａ７０の上流に配置されている。ＧＩＬＴΔ２−７Δ３１−３９カセットは、ヒトＩＧＦ−ＩＩ配列由来のアミノ酸残基３１〜３９（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ）の欠失を含む。
【０１１９】
【化１１】
0005627571.tif 000023
構築物１７４６
下記のＧＩＬＴΔ２−７Δ３２−３９−ＧＡＡ７０−９５２カセットを、そのカセットおよびベクターｐＣＥＰ４のＡｓｐ７１８およびＮｏｔＩ部位を用いてクローニングすることにより、ｐＣＥＰ−ＧＩＬＴΔ２−７Δ３２−３９−ＧＡＡ７０−９５２（プラスミド１７４６）を作製した。クローニングのための制限酵素認識部位は、太字の小文字で表されている。スペーサーアミノ酸配列Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ（下線の配列）は、ＧＡＡ遺伝子とＧＩＬＴΔ２−７Δ３２−３９タグ（大文字の配列）とを分断している。そのスペーサーおよびタグは、ＧＡＡ残基Ａｌａ７０の上流に配置されている。ＧＩＬＴΔ２−７Δ３２−３９カセットは、ヒトＩＧＦ−ＩＩ配列由来のアミノ酸残基３２〜３９（Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ）の欠失を含む。
【０１２０】
【化１２−１】
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【０１２１】
【化１２−２】
0005627571.tif 000025
構築物１７４７
下記のＧＩＬＴΔ２−７Δ３３−３９−ＧＡＡ７０−９５２カセットを、そのカセットおよびベクターｐＣＥＰ４のＡｓｐ７１８およびＮｏｔＩ部位を用いてクローニングすることにより、ｐＣＥＰ−ＧＩＬＴΔ２−７Δ３３−３９−ＧＡＡ７０−９５２（プラスミド１７４７）を作製した。クローニングのための制限酵素認識部位は、太字の小文字で表されている。スペーサーアミノ酸配列Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ（下線の配列）は、ＧＡＡ遺伝子とＧＩＬＴΔ２−７Δ３３−３９タグ（大文字の配列）とを分断している。そのスペーサーおよびタグは、ＧＡＡ残基Ａｌａ７０の上流に配置されている。ＧＩＬＴΔ２−７Δ３３−３９カセットは、ヒトＩＧＦ−ＩＩ配列由来のアミノ酸残基３３〜３９（Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ）の欠失を含む。
【０１２２】
【化１３−１】
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【０１２３】
【化１３−２】
0005627571.tif 000027
構築物１７５８
下記のＧＩＬＴΔ２−７Δ３４−３９−ＧＡＡ７０−９５２カセットを、そのカセットおよびベクターｐＣＥＰ４のＡｓｐ７１８およびＮｏｔＩ部位を用いてクローニングすることにより、ｐＣＥＰ−ＧＩＬＴΔ２−７Δ３４−３９−ＧＡＡ７０−９５２（プラスミド１７５８）を作製した。クローニングのための制限酵素認識部位は、太字の小文字で表されている。スペーサーアミノ酸配列Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ（下線の配列）は、ＧＡＡ遺伝子とＧＩＬＴΔ２−７Δ３４−３９タグ（大文字の配列）とを分断している。そのスペーサーおよびタグは、ＧＡＡ残基Ａｌａ７０の上流に配置されている。ＧＩＬＴΔ２−７Δ３４−３９カセットは、ヒトＩＧＦ−ＩＩ配列由来のアミノ酸残基３４〜３９（Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ）の欠失を含む。
【０１２４】
【化１４−１】
0005627571.tif 000028
【０１２５】
【化１４−２】
0005627571.tif 000029
構築物１７５０
下記のＧＩＬＴΔ２−７Δ３５−３９−ＧＡＡ７０−９５２カセットを、そのカセットおよびベクターｐＣＥＰ４のＡｓｐ７１８およびＮｏｔＩ部位を用いてクローニングすることにより、ｐＣＥＰ−ＧＩＬＴΔ２−７Δ３５−３９−ＧＡＡ７０−９５２（プラスミド１７５０）を作製した。クローニングのための制限酵素認識部位は、太字の小文字で表されている。スペーサーアミノ酸配列Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ（下線の配列）は、ＧＡＡ遺伝子とＧＩＬＴΔ２−７Δ３５−３９タグ（大文字の配列）とを分断している。そのスペーサーおよびタグは、ＧＡＡ残基Ａｌａ７０の上流に配置されている。ＧＩＬＴΔ２−７Δ３５−３９カセットは、ヒトＩＧＦ−ＩＩ配列由来のアミノ酸残基３５〜３９（Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ）の欠失を含む。
【０１２６】
【化１５−１】
0005627571.tif 000030
【０１２７】
【化１５−２】
0005627571.tif 000031
構築物１７４８
下記のＧＩＬＴΔ２−７Δ３６−３９−ＧＡＡ７０−９５２カセットを、そのカセットおよびベクターｐＣＥＰ４のＡｓｐ７１８およびＮｏｔＩ部位を用いてクローニングすることにより、ｐＣＥＰ−ＧＩＬＴΔ２−７Δ３６−３９−ＧＡＡ７０−９５２（プラスミド１７４８）を作製した。クローニングのための制限酵素認識部位は、太字の小文字で表されている。スペーサーアミノ酸配列Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ（下線の配列）は、ＧＡＡ遺伝子とＧＩＬＴΔ２−７Δ３６−３９タグ（大文字の配列）とを分断している。そのスペーサーおよびタグは、ＧＡＡ残基Ａｌａ７０の上流に配置されている。ＧＩＬＴΔ２−７Δ３６−３９カセットは、ヒトＩＧＦ−ＩＩ配列由来のアミノ酸残基３６〜３９（Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ）の欠失を含む。
【０１２８】
【化１６−１】
0005627571.tif 000032
【０１２９】
【化１６−２】
0005627571.tif 000033
構築物１７５１
下記のＧＩＬＴΔ２−７Δ２９−４０−ＧＡＡ７０−９５２カセットを、そのカセットおよびベクターｐＣＥＰ４のＡｓｐ７１８およびＮｏｔＩ部位を用いてクローニングすることにより、ｐＣＥＰ−ＧＩＬＴΔ２−７Δ２９−４０−ＧＡＡ７０−９５２（プラスミド１７５１）を作製した。クローニングのための制限酵素認識部位は、太字の小文字で表されている。スペーサーアミノ酸配列Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ（下線の配列）は、ＧＡＡ遺伝子とＧＩＬＴΔ２−７Δ２９−４０タグ（大文字の配列）とを分断している。そのスペーサーおよびタグは、ＧＡＡ残基Ａｌａ７０の上流に配置されている。ＧＩＬＴΔ２−７Δ２９−４０カセットは、ヒトＩＧＦ−ＩＩ配列由来のアミノ酸残基２９〜４０（Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ）の欠失を含む。
【０１３０】
【化１７−１】
0005627571.tif 000034
【０１３１】
【化１７−２】
0005627571.tif 000035
構築物１７５２
下記のＧＩＬＴΔ２−７Δ３０−４０−ＧＡＡ７０−９５２カセットを、そのカセットおよびベクターｐＣＥＰ４のＡｓｐ７１８およびＮｏｔＩ部位を用いてクローニングすることにより、ｐＣＥＰ−ＧＩＬＴΔ２−７Δ３０−４０−ＧＡＡ７０−９５２（プラスミド１７５２）を作製した。クローニングのための制限酵素認識部位は、太字の小文字で表されている。スペーサーアミノ酸配列Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ（下線の配列）は、ＧＡＡ遺伝子とＧＩＬＴΔ２−７Δ３０−４０タグ（大文字の配列）とを分断している。そのスペーサーおよびタグは、ＧＡＡ残基Ａｌａ７０の上流に配置されている。ＧＩＬＴΔ２−７Δ３０−４０カセットは、ヒトＩＧＦ−ＩＩ配列由来のアミノ酸残基３０〜４０（Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ）の欠失を含む。
【０１３２】
【化１８−１】
0005627571.tif 000036
【０１３３】
【化１８−２】
0005627571.tif 000037
構築物１７５３
下記のＧＩＬＴΔ２−７Δ３１−４０−ＧＡＡ７０−９５２カセットを、そのカセットおよびベクターｐＣＥＰ４のＡｓｐ７１８およびＮｏｔＩ部位を用いてクローニングすることにより、ｐＣＥＰ−ＧＩＬＴΔ２−７Δ３１−４０−ＧＡＡ７０−９５２（プラスミド１７５３）を作製した。クローニングのための制限酵素認識部位は、太字の小文字で表されている。スペーサーアミノ酸配列Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ（下線の配列）は、ＧＡＡ遺伝子とＧＩＬＴΔ２−７Δ３１−４０タグ（大文字の配列）とを分断している。そのスペーサーおよびタグは、ＧＡＡ残基Ａｌａ７０の上流に配置されている。ＧＩＬＴΔ２−７Δ３１−４０カセットは、ヒトＩＧＦ−ＩＩ配列由来のアミノ酸残基３１〜４０（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ）の欠失を含む。
【０１３４】
【化１９】
0005627571.tif 000038
構築物１７５４
下記のＧＩＬＴΔ２−７Δ３２−４０−ＧＡＡ７０−９５２カセットを、そのカセットおよびベクターｐＣＥＰ４のＡｓｐ７１８およびＮｏｔＩ部位を用いてクローニングすることにより、ｐＣＥＰ−ＧＩＬＴΔ２−７Δ３２−４０−ＧＡＡ７０−９５２（プラスミド１７５４）を作製した。クローニングのための制限酵素認識部位は、太字の小文字で表されている。スペーサーアミノ酸配列Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ（下線の配列）は、ＧＡＡ遺伝子とＧＩＬＴΔ２−７Δ３２−４０タグ（大文字の配列）とを分断している。そのスペーサーおよびタグは、ＧＡＡ残基Ａｌａ７０の上流に配置されている。ＧＩＬＴΔ２−７Δ３２−４０カセットは、ヒトＩＧＦ−ＩＩ配列由来のアミノ酸残基３２〜４０（Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ）の欠失を含む。
【０１３５】
【化２０】
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構築物１７５５
下記のＧＩＬＴΔ２−７Δ３３−４０−ＧＡＡ７０−９５２カセットを、そのカセットおよびベクターｐＣＥＰ４のＡｓｐ７１８およびＮｏｔＩ部位を用いてクローニングすることにより、ｐＣＥＰ−ＧＩＬＴΔ２−７Δ３３−４０−ＧＡＡ７０−９５２（プラスミド１７５５）を作製した。クローニングのための制限酵素認識部位は、太字の小文字で表されている。スペーサーアミノ酸配列Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ（下線の配列）は、ＧＡＡ遺伝子とＧＩＬＴΔ２−７Δ３３−４０タグ（大文字の配列）とを分断している。そのスペーサーおよびタグは、ＧＡＡ残基Ａｌａ７０の上流に配置されている。ＧＩＬＴΔ２−７Δ３３−４０カセットは、ヒトＩＧＦ−ＩＩ配列由来のアミノ酸残基３３〜４０（Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ）の欠失を含む。
【０１３６】
【化２１−１】
0005627571.tif 000040
【０１３７】
【化２１−２】
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構築物１７５６
下記のＧＩＬＴΔ２−７Δ３４−４０−ＧＡＡ７０−９５２カセットを、そのカセットおよびベクターｐＣＥＰ４のＡｓｐ７１８およびＮｏｔＩ部位を用いてクローニングすることにより、ｐＣＥＰ−ＧＩＬＴΔ２−７Δ３４−４０−ＧＡＡ７０−９５２（プラスミド１７５６）を作製した。クローニングのための制限酵素認識部位は、太字の小文字で表されている。スペーサーアミノ酸配列Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ（下線の配列）は、ＧＡＡ遺伝子とＧＩＬＴΔ２−７Δ３４−４０タグ（大文字の配列）とを分断している。そのスペーサーおよびタグは、ＧＡＡ残基Ａｌａ７０の上流に配置されている。ＧＩＬＴΔ２−７Δ３４−４０カセットは、ヒトＩＧＦ−ＩＩ配列由来のアミノ酸残基３４〜４０（Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ）の欠失を含む。
【０１３８】
【化２２−１】
0005627571.tif 000042
【０１３９】
【化２２−２】
0005627571.tif 000043
構築物１７６３
下記のＧＩＬＴΔ２−７Ｍ１／Ｌ２７Ａ３７−ＧＡＡ７０−９５２カセットを、そのカセットおよびベクターｐＣＥＰ４のＡｓｐ７１８およびＮｏｔＩ部位を用いてクローニングすることにより、ｐＣＥＰ−ＧＩＬＴΔ２−７Ｍ１／Ｌ２７Ａ３７−ＧＡＡ７０−９５２（プラスミド１７６３）を作製した。クローニングのための制限酵素認識部位は、太字の小文字で表されている。スペーサーアミノ酸配列Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ（下線の配列）は、ＧＡＡ遺伝子とＧＩＬＴΔ２−７Ｍ１／Ｌ２７Ａ３７タグ（大文字の配列）とを分断している。そのスペーサーおよびタグは、ＧＡＡ残基Ａｌａ７０の上流に配置されている。ＧＩＬＴΔ２−７Ｍ１／Ｌ２７Ａ３７カセットは、ヒトＩＧＦＩＩ配列においてＹ２７ＬおよびＲ３７Ａ置換を含む。このＧＩＬＴカセットのＤＮＡ配列は、６つ目のコドンごとにヒトＤＮＡ配列と異なる。
【０１４０】
【化２３−１】
0005627571.tif 000044
【０１４１】
【化２３−２】
0005627571.tif 000045
実施例３：ＧＩＬＴタグ化されたＧＡＡ酵素の発現および精製
組織培養
ＧＩＬＴタグ化ＧＡＡプラスミドを各々、製造者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって説明されているように懸濁ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３−Ｆ細胞にトランスフェクトした。簡潔には、３７℃および８％ＣＯ２におけるオービタルシェーカー上のポリカーボネート振盪フラスコにおけるＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で細胞を生育した。細胞を１×１０６細胞／ｍｌの濃度に調整し、次いで、１：１：１の比のｍｌ細胞：μｇＤＮＡ：μｌ２９３フェクチン（ｆｅｃｔｉｎ）でトランスフェクトした。培養物のアリコートをトランスフェクションの５〜７日後に回収し、５，０００×ｇで５分間遠心した。上清を−８０℃において凍結保存した。
【０１４２】
タンパク質の精製および濃縮
出発物質は、−８０℃における保存から解凍された、上に記載されたような哺乳動物細胞の培養上清であった。クエン酸を加えることによりｐＨ６．０に達し、次いで、硫酸アンモニウムを加えることにより最終濃度１Ｍに達した。その材料を０．２μｍ  Ｓｕｐｏｒ−Ｍａｃｈフィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ）に通した。
【０１４３】
濾過された材料を、ＨＩＣ  Ｌｏａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭクエン酸塩ｐＨ６．０，１Ｍ  ＡｍＳＯ４）を用いて調製されたＰｈｅｎｙｌ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ６  Ｌｏｗ−Ｓｕｂ  Ｆａｓｔ−Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラム上に充填した。そのカラムを１０カラム体積のＨＩＣ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭクエン酸塩ｐＨ６．０、０．８Ｍ  ＡｍＳＯ４）で洗浄し、５カラム体積のＨＩＣ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭクエン酸塩ｐＨ６．０）で溶出した。溶出ピークからのサンプルをプールし、ｃｅｎｔｒｉｃｏｎスピンコンセントレータ（Ａｍｉｃｏｎ）およびＢｉｏ−Ｓｐｉｎ−６脱塩カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、緩衝液をリン酸緩衝食塩水（１４５．１５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．３３ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ６．２）に交換した。
【０１４４】
酵素活性
パラ−ニトロフェノール（ＰＮＰ）酵素アッセイによってＧＡＡの発現を測定した。ＧＡＡ酵素を、１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．２および１０ｍＭパラ−ニトロフェノール（ＰＮＰ）α−グルコシド基質（Ｓｉｇｍａ  Ｎ１３７７）を含む５０μｌの反応混合物中でインキュベートした。反応物を３７℃で２０分間インキュベートし、３００μｌの１００ｍＭ炭酸ナトリウムを用いて停止した。４０５ｎｍにおける吸光度を９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて測定し、ｐ−ニトロフェノール（Ｓｉｇｍａ  Ｎ７６６０）から得られた検量線と比較した。１ＧＡＡ  ＰＮＰ単位は、１ナノモルの加水分解型ＰＮＰ／時と定義される。
【０１４５】
実施例４：競合的レセプター結合アッセイ
ＩＧＦ２レセプター（ＩＧＦ２Ｒ）、ＩＧＦ１レセプター（ＩＧＦ１Ｒ）およびインスリンレセプター（ＩＲ）に対するＧＩＬＴタグ化タンパク質の親和性を、９６ウェルプレートの形式で行われる競合的結合実験において調べた。０．５μｇ／ウェル（ＩＧＦ２Ｒ）または１μｇ／ウェル（ＩＧＦ１Ｒ、ＩＲ）の濃度において、Ｃｏａｔｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（０．０５Ｍ炭酸塩緩衝液，ｐＨ９．６）中のＲｅａｃｔｉ結合白色プレート（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｃａｔ＃４３７１１１）上にレセプターを室温で一晩コーティングした。プレートを洗浄緩衝液（リン酸緩衝食塩水＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で洗浄し、次いで、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｃａｔ＃３７５１６）中で１時間ブロッキングした。別のプレートを洗浄した後、ビオチン化リガンド（Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）をウェルに加え；ＩＧＦ２Ｒウェルには８ｎＭ  ＩＧＦ２−ビオチンを加え、ＩＧＦ１Ｒウェルには３０ｎＭ  ＩＧＦ１−ビオチンを加え、ＩＲウェルには、２０ｎＭインスリン−ビオチンを加えた。ウェルには、ビオチン化リガンドとともに、ＧＩＬＴタグ化ＧＡＡタンパク質サンプルの段階希釈物、またはビオチン化リガンドに対する結合インヒビターとして作用するビオチン化されていないコントロールリガンドも含まれていた。穏やかに振盪させながら２時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰとインキュベート（Ｒ＆Ｄ，Ｃａｔ＃８９０８０３，ブロッキング緩衝液中１：２００希釈，３０分間）した後、Ｓｕｐｅｒ  Ｅｌｉｓａ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅとインキュベートする（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｃａｔ＃３７０７０，５分間）ことによって、結合したビオチン化リガンドを検出した。化学発光シグナルを４２５ｎｍにおいて測定した。
【０１４６】
結合したビオチン化リガンドのパーセントを、ＩＧＦ２Ｒ結合競合アッセイにおいて各競合物濃度について算出し、ＩＣ５０値を決定した（図４）。ＩＧＦ２残基３０〜４０の欠失を有するタンパク質１７５２は、ＧＩＬＴタグ化されたＺＣ−７０１と同様のＩＣ５０値を示したことから（図４）、ＩＧＦ２ループ領域におけるこれらの残基の欠失が、ＩＧＦ２Ｒ結合に影響しないと見られることが示唆される。ＩＧＦ２残基２９〜４０の欠失を有するタンパク質１７５１は、より高いＩＣ５０値を示したことから（図４）、それが、同様にＩＧＦ２Ｒに対する結合について競合しないことが示唆される。
【０１４７】
別個のＩＧＦ２Ｒアッセイプレート上において、ＺＣ−７０１とタンパク質１７６３とを比較することにより、３５％異なるＩＣ５０値が得られた（図５を参照のこと）。
【０１４８】
プレートに結合されたインスリンへのビオチン化インスリンの結合の競合を測定するアッセイにおいて、１７５１および１７５２タンパク質は、７０１またはＩＧＦ−ＩＩと比べて、インヒビビターほど有効ではなかった（図６を参照のこと）。これは、ＧＩＬＴタグのアミノ酸３０〜４０に対応するループ領域において欠失を有する１７５１および１７５２タンパク質が、７０１におけるインタクトなＧＩＬＴタグまたはＩＧＦ−ＩＩと比較して、インスリンレセプターに対して低い親和性を有したことを示唆する。
【０１４９】
プレートに結合されたＩＧＦ１Ｒへのビオチン化ＩＧＦ−Ｉの結合の競合を測定するアッセイにおいて、１７６３タンパク質は、７０１、ＩＧＦ−ＩＩまたはＩＧＦ−Ｉと比較して、インヒビターほど有効ではなかった（図７を参照のこと）。これは、ＧＩＬＴタグにおいてΔ２−７、Ｙ２７ＬおよびＲ３７Ａ変異を有する１７６３タンパク質が、ＺＣ−７０１またはＩＧＦ−ＩＩと比較して、ＩＧＦ１レセプターに対して低い親和性を有したことを示唆する。
【０１５０】
実施例４．追加のインスリンレセプター結合アッセイ
インスリンレセプターに対する結合親和性についてタンパク質ＺＣ−１４８７を試験した。タンパク質ＺＣ−１４８７は、ヒトＩＧＦ２配列のアミノ酸３７におけるＡｒｇからＡｌａへの置換を有するＧＩＬＴＤ２−７Ｍ１／Ａ３７カセットを含み、フューリンによるタンパク質分解に対して抵抗性である。ＣＨＯ細胞から精製されたこのタンパク質の２つの異なるバッチＺＣ−１４８７−Ｂ２６およびＺＣ−１４８７−Ｂ２８を、プレートに結合したインスリンに対するビオチン化インスリンの結合の競合を測定するアッセイにおいて解析した。
【０１５１】
インスリン、ＩＧＦ−ＩＩ、ＺＣ７１０Ｂ２０およびＺＣ１４８７Ｂ２６またはＺＣ−１４８７−Ｂ２８を、インスリンレセプター（インスリン−Ｒ）へのビオチン化インスリンの結合と競合させることによって、インスリンレセプター結合アッセイを行った。
【０１５２】
詳細には、白色Ｒｅａｃｔｉ−ＢｉｎｄＴＭプレートを、１μｇ／ウェル／１００μｌ（３８．４ｎＭ）という濃度のインスリン−Ｒでコーティングした。コーティングされたプレートを、室温において一晩インキュベートし、次いで、洗浄緩衝液で３回洗浄した（３００μｌ／ウェル）。次いで、そのプレートをブロッキング緩衝液で（３００μｌ／ウェル）１時間ブロッキングした。洗浄工程を繰り返し、プレート内のすべての微量の溶液を取り出した。
【０１５３】
ビオチン化されたインスリンを、段階希釈による様々な濃度のインスリン、ＩＧＦ−ＩＩ、ＺＣ７０１Ｂ２０、Ｂ２６およびＢ２８と２０ｎＭにおいて混合した（最終濃度を表２に示す）。２０ｎＭインスリン−ビオチン中の１００μｌの希釈されたインスリン、ＩＧＦ−ＩＩ、ＺＣ７１０Ｂ２０、ＺＣ１４８７Ｂ２６およびＺＣ１４８７Ｂ２８を、コーティングされたプレートに加え、そのプレートを室温において２時間インキュベートした。次いで、そのプレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。１００μｌのストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）−ＨＲＰ使用溶液（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（１０ｍｌのブロッキング緩衝液中、５０μｌのストレプトアビジン−ＨＲＰ）をそのプレートに加え、そのプレートを室温において３０分間インキュベートした。Ｅｌｉｓａ−Ｐｉｃｏ化学発光基質を含む１００μｌのＥｌｉｓａ−Ｐｉｃｏ使用溶液を加え、４２５ｎｍにおいて化学発光を測定した。例示的な結果を表２、図８および図９に示す。ＺＣ−１４８７との両方のバッチが、ＺＣ−７０１またはインスリンコントロールと比較して、インヒビターほど有効ではなかった。表２および図８に見られるように、フューリン抵抗性ペプチドＺＣ−１４８７Ｂ２６は、ＺＣ−７０１よりも１０倍超、および野生型ＩＧＦ−ＩＩよりも２０倍超、弱く（ｌｅｓｓ  ａｖｉｄｌｙ）インスリンレセプターに結合する。
【０１５４】
このことは、１４８７タンパク質が、ＺＣ−７０１におけるＧＩＬＴタグと比較して、インスリンレセプターに対して低い親和性を有したことを示唆している。
【０１５５】
【表２】
0005627571.tif 000046
実施例５．取り込みアッセイ
いくつかの変異体を取り込み活性の保持について試験した。ＨＥＫ２９３細胞を構築物１４７９（Ｒ３７Ｋ）、１４８７（Ｒ３７Ａ）またはＺＣ−７０１でトランスフェクトした。培養上清を回収した後、ＨＩＣクロマトグラフィによって部分的に精製した。すべてのサンプルをＰＮＧａｓｅで処理した後、電気泳動を行った。
【０１５６】
図１０は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット法によって解析された、フューリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩムテインタグを含む標的化された融合タンパク質の部分的に精製された調製物を示している。示されるように、Ｒ３７Ａ変異を含む構築物１４８７によってコードされる融合タンパク質は、外来性フューリンに対して抵抗性である。
【０１５７】
図１１は、ラットＬ６筋芽細胞への、フューリン抵抗性ＧＩＬＴタグ化ＧＡＡの例示的な取り込みの結果を示している。図１１に示されるように、タンパク質１４７９、１４８７、ＺＣ−７０１および精製ＺＣ−７０１に対する例示的なＫ取り込みは、それぞれ４．５ｎＭ、４．４ｎＭ、５．０ｎＭおよび２．６ｎＭであり、このことから、構築物１４８７（Ｒ３７Ａ）および１４７９（Ｒ３７Ｋ）によってコードされるタンパク質は、ラットＬ６筋芽細胞への効率的な取り込みに対する能力を保持していることが示唆される。フューリン抵抗性ＧＩＬＴタグを含む融合タンパク質の効率的な取り込みは、フューリン抵抗性タグが、ＣＩ−ＭＰＲに対する高親和性を保持することも示唆する。
【０１５８】
等価物
当業者は、本明細書中に記載された本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するだろうし、単なる通例の実験を用いて確かめることができるだろう。本発明の範囲は、上記の説明に限定されると意図されず、むしろ、添付の請求項に示されるとおりである。冠詞「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、明細書および請求項において本明細書中で使用されるとき、明らかに逆のことが示されない限り、複数の指示対象を含むと理解されるべきである。ある群の１つ以上のメンバーの間に「または」を含む請求項または説明は、逆のことが示されていないか、または文脈から別段明らかでない限り、１つ、１つより多い、またはすべての、その群のメンバーが、所与の生成物もしくはプロセスに存在するか、それにおいて使用されるか、またはそれと別途関連性があることを満たすと考えられる。本発明は、その群の厳密に１つのメンバーが、所与の生成物もしくはプロセスに存在するか、それにおいて使用されるか、またはそれと別途関連性がある実施形態を含む。本発明はまた、１つより多いまたはすべてのその群のメンバーが、所与の生成物もしくはプロセスに存在するか、それにおいて使用されるか、またはそれと別途関連性がある実施形態も含む。さらに、別段示されないか、または矛盾もしくは不一致が生じ得ることが当業者に明らかでない限り、本発明は、１つ以上の請求項からの１つ以上の限定、エレメント、節、説明的な用語などが、同じ基本請求項に従属する（または関連性のある他の任意の請求項として）別の請求項に導入されている、バリエーション、組み合わせおよび順列を包含すると理解されるべきである。エレメントが、例えば、マーカッシュグループまたは類似の形式で、リストとして提示されている場合、それらのエレメントの各サブグループもまた開示されること、および任意のエレメントがそのグループから除去され得ることが、理解されるべきである。一般に、本発明または本発明の局面が、特定のエレメント、特徴などを含むと言及されている場合、本発明のある特定の実施形態または本発明の局面は、そのようなエレメント、特徴などからなるか、またはそれらから本質的になることが理解されるべきである。単純化の目的で、それらの実施形態は、すべての場合において本明細書中で詳細に示されるとは限らない。また、本発明の任意の実施形態、例えば、従来技術内に見られる任意の実施形態は、特定の排除が本明細書において述べられているか否かに関係なく、請求項から明確に排除され得ることが理解されるべきである。
【０１５９】
明らかに逆のことが示されていない限り、１つより多い行為を含む本明細書中において特許請求されている任意の方法において、その方法の行為の順序は、その方法の行為が述べられている順序に必ずしも限定されないが、本発明は、その順序がそのように限定された実施形態を含むことも理解されるべきである。さらに、請求項が組成物を述べている場合、本発明は、その組成物を使用する方法およびその組成物を作製する方法を包含する。請求項が、組成物を述べている場合、本発明は、その組成物を使用する方法およびその組成物を作製する方法を包含すると理解されるべきである。
【０１６０】
参考文献の援用
本願において引用されたすべての刊行物および特許文書は、その個別の刊行物または特許文書の各々の内容が本明細書中で援用されたかのように、同程度にその全体が参考として援用される。
【図１】
0005627571.tif 000047
【図２】
0005627571.tif 000048
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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