(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
高濃度の１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３グリコシド及びケルセチングリコシドを含むソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮植物抽出物（ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｐｌａｎｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）を調製及び精製する方法であり、以下：
ａ）８０／２０〜２５／７５のエタノール／水（ｖ／ｖ）比率（％）のエタノール／水混合溶媒を使用してソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）種の植物体又はその部分を抽出し；そして
ｂ）工程ａ）で取得した植物抽出物を、以下の：
ｂ１）ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼンコポリマー、アクリル性エステルポリマー、及びポリフェノール樹脂から選択される非イオン性ポリマー樹脂を含むカラムに工程ａ）で取得した植物抽出物をアプライし；
ｂ２）水で前記カラムを洗浄し；
ｂ３）カラムから前記濃縮植物抽出物を溶出し；そして
ｂ４）前記濃縮植物抽出物を濃縮及び／又は乾燥する
工程を使用して精製する
工程を含む、前記方法。
【請求項２】
前記エタノール／水の混合溶媒が、浸透型の抽出に使用される場合、エタノール／水の比率（％）が、エタノール／水（ｖ／ｖ）で、７５／２５又は２５／７５であり、あるいは、浸漬型の抽出に使用される場合、６５／３５である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
浸透型の抽出に使用される場合、前記溶媒／薬物の比率（％）が９（ｖ／ｗ）であり、あるいは浸漬型の抽出に使用される場合、５（ｖ／ｗ）である、請求項１又は２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
工程ａ）が、４０℃〜６０℃の温度範囲内で行われ、そして工程ａ）の溶媒が、５．５〜６．５の特定のｐＨ値に調整される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程ａ）及び／又は工程ｂ）で取得した植物抽出物を、不揮発成分２５〜３５％を含有するように濃縮又は乾燥させる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程ａ）で取得した抽出物を、加熱−／高温処理に付する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記非イオン性ポリマー樹脂が、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−７、ＸＡＤ−７ＨＰ、ＸＡＤ−８及びＸＡＤ−１１８０樹脂から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程ａ）及び／又はｂ）で取得した抽出物が、スプレー乾燥、バンド乾燥、又は凍結乾燥させられる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法により取得された、又は取得可能な、ソラリウム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｒｉｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮植物抽出物。
【請求項１０】
請求項９に記載の濃縮植物抽出物であり、成分として：
（ａ）活性ビタミンＤ３の濃度が３００μｇ／ｇ以上であり、全体で１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３のグリコシドと決定される、ビタミンＤ３代謝物：
（ｂ）１００ｍｇ／ｇ以上の濃度の、酸加水分解後ケルセチン（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）と決定される、ケルセチングリコシド
を含む、前記濃縮植物抽出物。
【請求項１１】
アルカロイドの含有量が検出限界の１０μｇ／ｇを下回ることを追加的な特徴とする、請求項９又は１０に記載の濃縮植物抽出物。
【請求項１２】
医薬組成物であり：
１．請求項９〜１１のいずれか１項に記載のソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮植物抽出物；及び
２．任意で、医薬として許容される担体及び／又はビヒクル
を含む、前記医薬組成物。
【請求項１３】
ヒト又は動物の骨減少症又は骨粗鬆症を含む骨量の減少に関連する疾患を予防又は治療する医薬組成物を調製するための、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮植物抽出物の使用。
【請求項１４】
家禽の脛骨の軟骨形成不全（Ｔｉｂｉａｌ  Ｄｙｓｃｈｏｎｄｒｏｐｌａｓｉａ）を予防又は治療する医薬組成物を調製するための、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮植物抽出物の使用。
【請求項１５】
乳を生産する動物の分ぺん不全麻痺（ｐａｒｔｕｒｉｅｎｔ  ｐａｒｅｓｉｓ）又は授乳熱（ｍｉｌｋ  ｆｅｖｅｒ）を予防又は治療する医薬組成物を調製するための、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮植物抽出物の使用。
【請求項１６】
ヒト又は動物への栄養補助に使用される医薬組成物を調製するための、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮植物抽出物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高濃度の１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３グリコシド及びフラボノール、特にケルセチングリコシドを含むソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮及び平衡化植物抽出物（ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ａｎｄ  ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｅｄ  ｐｌａｎｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）の調製に関する。特に、本発明は、そのような植物抽出物を産業スケール又は実験室スケールのいずれかで調製する方法を記載する。更に、本発明は、そのような植物抽出物又は類似の（合成）組成物の、骨減少症又は骨粗鬆症等の、骨量の減少に関連する疾患を予防及び処置するための、好ましくは家禽の脛骨の軟骨形成不全（Ｔｉｂｉａｌ  Ｄｙｓｃｈｏｎｄｒｏｐｌａｓｉａ）を予防及び処置するための、好ましくは授乳熱（ｍｉｌｋ  ｆｅｖｅｒ）を処置するための、そしてヒト又は獣医が使用するための栄養補助食品としての使用を記載する。
【背景技術】
【０００２】
骨の健康は、骨吸収及び骨形成プロセスの微妙なバランスにより成り立っており、それにより骨格は、個体の生涯にわたり変化する要求に対応する。故に、頭蓋骨の成長により視認できるように、骨格は幼年期に成長し、そこでは外側にミネラルが沈着し、そして骨は、脳が成長するための所定のスペースを確保するように、内側が吸収される。成年期では、骨は、スポーツの実施又は重いものの運搬に適応するために、自体が強化され得る。骨のリモデリングは、骨の表面の特定の領域に骨を吸収する破骨細胞が滞在し、そして骨材料の吸収が開始されるという、典型的な機序を有するプロセスである。その結果、小腔あるいはピットが形成される。そのようなピットの上に、骨を形成する骨芽細胞が付着し、その細胞が新たに骨材料を沈着させる。そのようなサイクルを経て、強固な骨構造を有する領域が残る。しかしながら、老人や更年期の女性において、その平衡が骨量の減少の方にシフトする。骨量の減少は、長期間の臥床又は低重力条件下でも起る。図１に示すように、骨量は中年期にピークを迎え、そして次第に低下する。閉経後にエストロゲンホルモンの生産が停止した女性において、骨量減少のリスクが増大する。そのような骨量の減少は、典型的には、骨粗鬆症又は骨減少症（Ｏｓｔｅｏｐｅｎｉａ）（前者の軽症型）と診断されるもので、該疾患は、高齢化が進行する集団において、特に西洋文明において、主要な健康上の問題となっている。
【０００３】
ヒトの他に動物も、老齢又は幼若個体の両方において、集約的成長（ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ）の期間中、骨形成傷害の疾患に罹病する。一例として、動物において、特に急速に成長して食物を生産する動物、例えば家禽等において、下肢脱力及び一つの結果としての脛骨の軟骨形成不全（Ｔｉｂｉａｌ  Ｄｙｓｃｈｏｎｄｒｏｐｌａｓｉａ）（ＴＤ）は、肉質の低下及び劣化を引き起こす主要な問題である。また、動物の福祉の理由からも、脛骨の軟骨形成不全は避けられなければならない（刊行物Ｔｉｂｉａｌ  Ｄｙｓｃｈｏｎｄｒｏｐｌａｓｉａ，  ａ  Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｌｅｇ  Ｐｒｏｂｌｅｍ．  Ｒａｔｈ  ＮＣ，  ＵＳＤＡ／ＡＲＳ，  Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｒｋａｎｓａｓ，  ＵＳＡ  （０９／０４／２００３）を参照されたい）。更に、産卵鶏は、卵殻を形成するために活発にカルシウムのターンオーバーを行う。それらの動物は、カルシウムプールの約１０分の１の量のカルシウムを毎日餌から摂取しなければならず、それが骨に保存され、そして数時間以内に卵殻の生産に充てられる。故に、ビタミンＤの供給不十分も、産卵鶏の骨粗鬆症を引き起こす。
【０００４】
加齢に関連する、及び閉経後の骨量減少を防止するために、多くのアプローチが提案及び推進され、例えば、体力トレーニング及び医薬治療が、骨粗鬆症の治療において選択される方法である。今日、医薬治療／薬物治療は、典型的には、治療的（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）又は治癒的（ｃｕｒａｔｉｖｅ）アプローチの後に行われ、ここで治療は、既に病的症状が診断されたとき、即ち骨量若しくは骨密度が必要な一定の最低レベルを下回ったとき、又は最悪の場合、既に骨折が生じたとき、開始される。故に、骨量若しくは骨密度が必要最低レベルを下回るのを防ぐことは治療においてより好ましいが、治療は、骨密度がまだ高レベルにあるときに開始されるべきであり、そして治療は、図１に示されているように、長期間行われるべきである。故に、生理的機構を支持する、天然由来の処置は、合成薬物を用いた治癒処置の有益な代替であり得る。
【０００５】
今日、抗骨粗鬆症薬物は、典型的には、それらの作用方式に基づいて、それぞれ抗吸収剤、同化剤又はステロイドホルモン、骨形成剤及びその他に分類され得る。あるいは、又は加えて、抗骨粗鬆症薬物は、それらの化学構造に基づいて分類され得て、それらは上記作用方式の１つを補足する。既知の抗骨粗鬆症薬物として、例えばビスホスホネート群、合成エストロゲン、ビタミンＤ及びその代謝物等が挙げられる。
【０００６】
今日、殆どの処方される薬物は、ビスホスホネート群に属し、これは骨吸収破骨細胞に作用して、骨吸収を低下させる（例えばＦｌｅｉｓｃｈ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  （１９９８）１９（１）：  ８０−１００  Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ：  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ａｃｔｉｏｎを参照されたい）。ビスホスホネート群の薬物を用いた処置の短所として、骨ターンオーバーをブロックすることによる、骨リモデリングの低下が挙げられる。
【０００７】
閉経後の著しい骨量減少により証明されるように、女性ホルモンも、骨に強い影響を及ぼす。故に、合成エストロゲンを用いたホルモン置換療法は、骨粗鬆症の処置に有効な場合がある。しかしながら、そのような処置は女性に限定され、そして多くの臨床研究により副作用で乳癌の発生率が増大することが示されたため、現在では推奨されない。
【０００８】
更に、上記疾患の予防又は治療のいずれかのために、より生理的で、それ故より有望なアプローチが、処置を受ける患者のカルシウム制御の、そして自然骨のミネラル維持（ｍｉｎｅｒａｌ  ｈｏｕｓｅｈｏｌｄ）の補助となる。
【０００９】
カルシウム制御及び自然骨のミネラル維持に関与する多くの要素が存在する。カルシウムホメオスタシスに作用する因子として、例えば、カルシトニン又は副甲状腺ホルモン等のホルモン及びその誘導体が挙げられる。しかしながら、それらのペプチドホルモンは経口投与できず、注射により、又は鼻腔内スプレーとして投与される必要があり、故にそれを必要とする患者に簡単に投与することが出来ない。
【００１０】
動物及びヒトのカルシウム制御（自然骨のミネラル維持等）において最も重要な因子としてカルシウムが挙げられ、典型的には、好ましい可溶性の塩又はＣａ２＋の形態で存在する。上記に加えて、カルシウムは、細胞内シグナル、神経伝達及び筋収縮においても、重要な因子となる（Ｃａｓｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｆｏｕｎｄ  Ｓｙｍｐ．  ２００７，  ２８２：１２３−３８，  ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  １３８−４２，  ２１２−８；  ａｎｄ  Ｐａｒｆｉｔｔ  ＡＭ．  Ｂｏｎｅ．  １９８７，  ８  Ｓｕｐｐｌ．  １：  Ｓ１−８）。ヒト又は動物の身体中のカルシウム供給が不足すると、カルシウム濃度が低下して、必要最低限の骨量又は骨密度を下回る。一方、有効な制御がなされない場合、ヒト又は動物の身体中のカルシウムの濃度が著しく増大し、細胞内シグナル、神経伝達及び筋収縮が干渉を受け、又は毒性の副作用が引き起こされる場合もある。故に、全ての温血動物は、カルシウム濃度を厳密な制御系の下に置くことにより、身体中のカルシウム濃度が毒性に至るのを防いでいる。
【００１１】
自然骨のミネラル維持におけるカルシウム制御の更なる主要な成分は、ビタミンＤである。ビタミンＤは、くる病の予防及び治癒において見られるように、最適な骨の発達に必須の栄養素であり、ここでは、の天然及び合成のビタミンＤ誘導体が使用されることが知られている。しかしながら、コレカルシフェロール（ビタミンＤ３）又はエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ２）の形態の天然ビタミンＤは、生物学的に不活性である。故に、コンセンサス会議で述べられたように、天然のビタミンＤは、骨粗鬆症等の緩慢に進行する骨疾患を治癒することが出来ない（Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ．  ＮＩＨ  Ｃｏｎｓｅｎｓ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ  Ｏｎｌｉｎｅ  ２０００  Ｍａｒｃｈ  ２７−２９；  １７（１）：  １−３６．）。これは、天然のビタミンＤが活性を生ずるのに２つの変換ステップを必要とし、その第二のステップが厳密に制御されているからである。第一のステップにおいて、皮膚の中で形成され、摂取により取り込まれたコレカルシフェロール（ビタミンＤ３）は、ヒト及び動物の肝臓内で、貯蔵形態の２５−ヒドロキシビタミンＤ３（２５（ＯＨ）Ｄ３とも略される）に変換される。完全なビタミンＤ３の貯蔵は、ヒトにおいて２〜３ヶ月に渡りくる病を防ぐ。しかしながら、該貯蔵形態は、未だ生物学的に活性ではなく、第二のステップにおいて、腎臓の酵素により、活性型ビタミンＤ３、即ち１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（１，２５（ＯＨ）２Ｄ３カルシトリオールとも略される）に活性化されることを必要とする。そして、活性化形態の１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３は、感受性組織中の遺伝子産物を活性化する。腸においてはカルビンジン（Ｃａｌｂｉｎｄｉｎ）がこれにあたり、これは、最終的に食物からのカルシウム取り込みを引き起こす、カルシウム結合タンパク質である。形成された１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３は、更に腸管におけるカルシウム取込み、並びにカルシウムの骨への沈着、及び骨からの遊離をコントロールする。
【００１２】
しかしながら、そのような内性的なコントロール機構は、多くの場合、ヒト又は動物の体内で、特に老齢の個体での、骨粗鬆症等の緩慢に発達する骨疾患を防ぎ、又は家禽の脛骨の軟骨形成不全等の動物における他の疾患を防ぐのに、十分な濃度の活性化代謝産物をもたらすことが出来ない。
【００１３】
活性化の原理が最初に発見されて以来、ビタミンＤ３の医療における使用を提供するための様々なアプローチが始められている。なぜなら、ビタミンＤは食物中に豊富に含まれていないからである（相当量を含むのはマリンオイル（ｍａｒｉｎｅ  ｏｉｌ）のみ）。ビタミンＤ３又はその代謝物の提供は、上記疾患のいずれかの治療に有効な、必須の基礎及び困難な側面を表す。例えば、ＵＳ  ５，５０８，３９２は、合成ビタミンＤ３グリコシド、ビタミンＤ３オルトエステルグリコシド、ビタミンＤ３類似体グリコシド及びビタミンＤ３類似体オルトエステルグリコシドの、骨粗鬆症の処置における使用を開示する。
【００１４】
ビタミンＤ３及びその合成類似体の投与の負の難点は、医薬としての治療濃度域（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｗｉｎｄｏｗ）の極端な狭さ、並びに、異常かつ毒性の血中カルシウム濃度により最終的に軟組織及び腎臓に重度のダメージを生じる、高カルシウム血症のリスクである。これは、推奨日常許容量の１００倍超の過剰投与によるビタミンＤ３の中毒（高ビタミンＤ３症）により引き起こされ得る。そのような基本的な難点は、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３において特に知られており、医薬としての狭い濃度域は、有効量の用量と毒性の副作用が発生する用量との間の範囲内に開いており、その比率は２〜５である。一例として、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の高用量の投与による測定可能な副作用は、家禽においては、顕著な体重増加の低下であった。しかしながら、上記の難点にかかわらず、ビタミンＤ３及びその類似体は、上記治療のいずれかにおいて、なおも魅力的な化合物として使用されていると思われる。
【００１５】
とは言え、ある治療が適切か否かは、更なる要素、例えばそこで使用される有効成分の調製にかかるコスト等にも依存する。ビタミンＤ３又はその類似体を使用しての上記疾患の経済的な治療においてボトルネックとなるのは、結局は、ビタミンＤ代謝物の安価な提供又は調製である。
【００１６】
一つの可能性として、ビタミンＤ代謝物は、立体選択的な化学合成により提供され得る。残念ながら、立体選択的合成は、典型的には労働集約型であり、そして、ビタミンＤ３又はその類似体のエナンチオマー選択的（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃａｌｌｙ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ）な、又は純粋な形態を取得するのに、多くの合成及び精製工程を必要とする。故に、ビタミンＤの立体選択的合成は高コストで、多くの合成ビタミンＤ３医薬が認可され、処方されているが、現段階では、上記疾患のいずれかの安価な治療を実現し得ない。更に、化学合成により生産された１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の高濃度の投与は、前述した医薬として極端に狭い治療濃度域の難点を有し、そして高カルシウム血症のリスクを伴う。故に、ビタミンＤ３又はその類似体を提供するのに、他の供給源が好ましい。
【００１７】
更に、驚くべきことに、高濃度のビタミンＤ代謝物を含む植物が見出された。この種類の植物として、例えば、ソラナケア（ナス科のハーブ）のファミリーの種類が挙げられ、特にソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）（ソラヌム・マラコキシロン（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍａｌａｃｏｘｙｌｏｎ）又はソラヌム・ガラウクム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ）とも称される）、ソラヌム・トルウム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｏｒｖｕｍ）、ソラヌム・エスリアレ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｅｓｕｒｉａｌｅ）、ソラヌム・ウェルバスキ・フォリウム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｖｅｒｂａｓｃｉ  ｆｏｌｉｕｍ）、ケストルム・ジウルヌム（Ｃｅｓｔｒｕｍ  ｄｉｕｒｎｕｍ）等、ニエレムベルギア・ウェイクチイ（Ｎｉｅｒｅｍｂｅｒｇｉａ  ｖｅｉｃｈｔｉｉ）の種類、並びにグラミネアエ（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）の種類、特にトリセツム・フラウェスケンス（Ｔｒｉｓｅｔｕｍ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）等が挙げられる。過去１０年の精力的な研究により、トマト植物（ソラナケア（Ｓｏｌａｎａｃｅａ）類のリコペルシコン・エスクレンツム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ））の葉に、２５（ＯＨ）Ｄ３  ａｎｄ  １，２５（ＯＨ）２Ｄ３−グリコシドの形態のビタミンＤ３が一定量含まれることが明らかになった（Ｐｒｅｍａ  ａｎｄ  Ｒｈａｇａｍｕｌｕ，  １９９６，  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．  ４２（３），  ６１７−６２０）。同様に、ジャガイモ植物（ソラヌム・ツベロスム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ））、ナス植物（ソラヌム・メロンゲナ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍｅｌｏｎｇｅｎａ））及びズッキーニ植物（ククビタ・ペポＬ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｐｅｐｏ  Ｌ．）亜種  ｐｅｐｏ  ｃｏｎｖａｒ．  ｇｉｒｏｍｏｎｔｉｎａ）  （例えばＡｂｕｒｊａｊ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８，  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．  ４６（６），  １００５−１０１８）、その他にニコチアナ・グラウカ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｇｌａｕｃａ）（ソラナケアエ（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）類の青緑タバコ（ｂｌｕｅ  ｇｒｅｅｎ  ｔｏｂａｃｃｏ））（Ｓｋｌｉａｒ  ｅｔ  ａｌ，  ２０００，  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５６，  １９３−１９９）は、顕著なビタミンＤ含有量を示した。故に、幾つかの植物は、ビタミンＤ又はその代謝物の供給源となり得る可能性がある。
【００１８】
この発見は、これらの植物の葉や他の部分を餌として与えた動物に有利な効果が生じたことに基づく。そのようなカルシノジェニック（ｃａｌｃｉｎｏｇｅｎｉｃ）植物の干草の有利な効果の幾つかは、公表されている（例えばＢｏｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ００，  １  −１３  （２００３）を参照されたい）。また、幾つかの特許出願も、これらの植物の抽出物の使用を開示している。例えば、ＵＳ  ５，７７６，４６１は、フィトビタミンＤを含む美容用組成物、特に選択された水酸化ビタミンＤ組成物（植物供給源由来のフィトビタミンＤ）又はそのグリコシドを含む無添加のスキンケア組成物を開示する。
【００１９】
ビタミンＤの含有量が最も多い植物は、ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）であった。特に、ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）（以前はソラヌム・マラコキシロン（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍａｌａｃｏｘｙｌｏｎ）として知られていた）が、ビタミンＤを含むことが分かった。ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の一部の種類において、有効成分は、ビタミンＤ３代謝物１，２５−ジヒドロキシビタミンとＤ３と同定された（例えばＤｅ  Ｖｅｒｎｅｊｏｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａ  Ｎｏｕｖｅｌｌｅ  Ｐｒｅｓｓｅ  ｍｅｄｉｃａｌｅ，  ７，  ２２，  １９４１−４３（１９７８）を参照されたい）。
【００２０】
ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ））中にビタミンＤ有効成分が存在することを述べた文献は多いが、その植物の他の成分について述べたものは殆ど知られていない。該植物中にアルカロイドのソラソジン（ｓｏｌａｓｏｄｉｎｅ）が存在することを述べた唯一の文献（Ｊａｉｎ  ａｎｄ  Ｓａｈｏｏ，  Ｐｈａｒｍａｚｉｅ  （１９８６）  ４１  ：８２０−８２１）、及び量的な記載は無いがフェノール化合物の存在を記載した１つの文献（Ｒａｐｐａｐｐｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ！，  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （１９７７）  １６：１  １１５−６）が存在する。主要な成分１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の他に、ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）は、ブタノール抽出により、一群のフェノールゴリコシド、例えばハイドロキノリン（ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ）、ケンフェロール（ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ）及びケルセチン（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）等、並びに以下の既知のグリコシド、アルブチン（ａｒｂｕｔｉｎ）、Ｏ−メチルアルブチン、イソケルセチン（ｉｓｏｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）、アビクラリン（ａｖｉｃｕｌａｒｉｎ）、ルチン（ｒｕｔｉｎ）、ケンフェロール３−Ｏ−ルチノシド、及びイソラムネチン−３−Ｏ−ルチノシドが検出された。新規ケルセチンのトリオシドである、化合物ケルセチン３−Ｏ−［２Ｇ−ｂ−Ｄ−アピオシル］ルチノシドも、ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）において見出された。これらのフェノール化合物の多くは全ての植物の構成要素であり、Ｒａｐｐａｐｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７７，同上）の文献において、量的な記載は無い。更に、植物フェノールのサブクラスであるフラボノイドは、典型的には抗酸化剤として取り上げられるが、骨形成において正の活性を有することは、知られておらず、又は議論されていない。更に、骨細胞に対する（植物フェノールのサブクラスである）フラボノール（ケルセチン及びケンフェロール）の効果のみが、これまでに記載されている。例えば、最近のインビトロ実験では、ケルセチン及びルチンにより、破骨細胞前駆細胞の破骨細胞形成及び分化が阻害されることが示されている。Ｙａｍａｇｕｃｈｉは、ケルセチン及びケンフェロールによる、インビトロでの、骨形成よりも破骨細胞形成及び骨吸収に対する、強力な阻害効果を見出した（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２００７  Ｊｕｎ  １  ）。遺伝子レベルで、ケルセチン及びそのグルクロニドは、骨シアロタンパク質のｍＲＮＡレベルの増大を促進する（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２００７  Ｊｕｎ  １  ）。他の破骨細胞系列の細胞におけるインビトロでの研究により、骨吸収において重要な決定的段階である破骨細胞分化に対する阻害的な効果が確認されたが、骨形成に対する正の効果は示されなかった（Ｗａｔｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２００４  Ｍａｙ  １５；  ９２（２）：２８５−９５）。
【００２１】
より高いレベルにおいて、小骨組織培養（Ｓｚｉｋｌａｉ  ａｎｄ  Ｒｉｂａｒｉ，  Ａｃｔａ  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．  １９９５  Ｍａｒ；１１５（２）：２９６−９）、及びラット頭蓋冠骨芽細胞（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｚｈｏｎｇ  Ｙａｏ  Ｃａｉ．  ２００６  Ｍａｙ；２９（５）：４６７−７０）における実験においても、骨芽細胞に対するケルセチンの阻害的効果が示された。更に、無傷動物を用いた２つの研究において、ケルセチンは、ストレプトズトシン誘導糖尿病マウスにおける、骨ミネラル代謝、生化学強度及び骨構造に有効であり（Ｋａｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｆｕｎｃｔ．  ２００７  Ｊａｎ  ３１）、そしてルチンは、ラットの卵巣摘出誘導骨減少症に有効であった（Ｈｏｒｃａｊａｄａ−Ｍｏｌｔｅｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．  ２０００  Ｎｏｖ；１５（１  １）：２２５１−８．  Ｃｏｍｍｅｎｔ  ｉｎ：  Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００１  Ｍａｙ；１６（５）：９７０−１）。しかしながら、これらの化合物がソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の植物中に生じることが決定されても、上記の如く、従来技術は、疾患の処置においてビタミンＤのみが有効成分として取り上げられていた。
【００２２】
ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）中にビタミンＤ代謝物の１，２５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ３が高度に含まれることが見出された時点で、その植物がヒト及び動物の骨疾患の処置に使用され得るか否かが推測され、そしてその抽出物の生物学的活性が、実験動物において調査された。そのような実験は、ビタミンＤ活性を証明するため、ビタミンＤを消耗した動物が使用された（例えば、Ｄｅ  Ｖｅｒｎｅｊｏｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９７８），同上を参照されたい）。Ａｚｃｏｎａ（Ａｚｃｏｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｚｏｏｔｅｃｈｎｉｃａ  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １９８２  ｐ．  １２−１３）。Ｍｏｒｒｉｓは、ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の乾燥させた葉を与えた後、卵の殻の強度が向上することを見出した（Ｍｏｒｒｉｓ  ＫＭＬ，  Ｔｈｅ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｃｏｒｄ，  １０１，  ５０２−５０４  （１９７７））。Ｎｏｒｒｄｉｎは、同植物の乾燥させた葉を与えた後のニワトリの骨の骨量及び破壊強度が増大することに気づいた（Ｎｏｒｒｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｌｃｉｆｉｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  （１９７９）  ２８（１）：２３９−２４３）。更に、水性葉抽出物は、ウシ及びヒツジのルーメン液とインキュベーションした後、ビタミンＤ活性が増大することが示された（Ｍｅｌｌｏ  ａｎｄ  Ｈａｂｅｒｍｅｈｌ，  Ｄｔｓｃｈ  Ｔｉｅｒａｒｚｔｌ  Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ．  １９９２  Ｓｅｐ；９９（９）：３７１−６）。ＷＯ  ８５／０５１１０から、南アメリカの植物であるソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の葉の抽出物が１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３及び１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３と異なる水溶性成分を含み、そしてルーメン液による処理で、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３及び水溶性炭水化物が得られることも既知であった。該従来技術において、更に、の水溶性中中津物が、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３と類似の生物学的活性を有することが述べられていた。ＷＯ  ８５／０５１１０の約９年後に公開されたＡｕｓｔｒｉａｎ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＡＴ  ３９８  ３７２  Ｂから、ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の乾燥させた葉が、実際に件の活性を有するだけでなく、上記既知の高度の毒性という難点を有することが認められる。続いて、Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）は、ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の乾燥させた葉を与えたブロイラー種のニワトリにおいて、リンの利用性が改善したことを見出した（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｏｕｌｔ  Ｓｃｉ．  ２００４  Ｍａｒ；８３（３）：４０６−１３．）。更に、は、ビタミンＤ及びその代謝物を含む植物から取得したビタミンＤ及びその代謝物が、食肉処理前にその植物を与えた家畜の肉の柔軟性を改善し得ることを見出した（Ｆｏｏｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ａｎｉｍ  Ｓｃｉ．  ２００４  Ｊａｎ；８２（１  ）：２４２−９）。しかしながら、これらの全ての試みは���上記既知の高度の毒性という難点を有する。
【００２３】
更に、前記植物の乾燥させた葉を、甲状腺機能亢進症及び腎臓の機能不全に罹患した患者に、７日に渡り与えた。血漿カルシウムを正常化する効果か観察された（例えばＭａｕｔａｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃａｌｃｉｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．  １９７７  Ｍａｙ；２２  Ｓｕｐｐｌ：５３４−７．；  ａｎｄ  Ｈｅｒｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ，  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｍｅｔ  ａｌｂｏｌｉｓｍ．  Ｐｐ．  ７０３−７０８．  Ｗ．  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ，  Ｂｅｒｌｉｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ，  １９７７）。特に、本ケースにおける限定は、典型的には毒性のアルカロイドを含む、未知の活性の未精製抽出物の適用である。
【００２４】
これらの試みに共通していることは、使用された材料が特定されておらず、そして全ての実験において、有効成分が測定されていなかったことである。更に、ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）において、ビタミンＤに類似の効果以外を記載しているものは無かった。
【００２５】
一方、ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の有効成分を分析し、及び植物抽出物を調製しようとする試みに関する、幾つかの文献が出版されている。例えばＰｅｔｅｒｌｉｋ及びＷａｓｓｅｒｍａｎ（１９７５）は、クロロホルム／メタノール混合物を用いて乾燥させた葉を抽出し（Ｐｅｔｅｒｌｉｋ  ａｎｄ  Ｗａｓｓｅｒｍａｎ，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  （１９７５）  ５６：１６−１９）、一方、Ｍｅｌｌｏ及びＨａｂｅｒｍｅｈｌ（１９９８）は、温水を用いて乾燥植物材料を抽出した（Ｍｅｌｌｏ  ａｎｄ  Ｈａｂｅｒｍｅｈｌ，  Ｄｔｓｃｈ  Ｔｉｅｒａｒｚｔｌ  Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ．  １９９８  Ｊａｎ；１０５（１）：２５−９）。更なる精製は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ１５及びＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ２０を用いたクロマトグラフィーにより（Ｖｉｄａｌ  ｅｔ  ａｌ，  Ｔｕｒｒｉａｌｂａ  （１９８５）  ３５：６５−７０）、又は固定相としてシリカ及びＣ１８修飾シリカを使用するカラムを用いた調製ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより（Ｓｋｌｉａｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  １９９２  Ｄｅｃ；４３（７）：６７７−８２）行った。
【００２６】
２００６年のｖｏｎ  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  Ｓ．  Ｊ．の文献（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  Ｓ．  Ｊ．，  ２００６，  ＰｈＤ−ｔｈｅｓｉｓ，  Ｌｕｄｗｉｇｓ−  Ｍａｘｉｍｉｌｉａｎｓ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｍｕｎｉｃｈ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）及び続いて２００７年のｖｏｎ  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  Ｓ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．の文献（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  Ｓ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅ  １０３，  Ｉｓｓｕｅｓ  ３−５，  Ｍａｒｃｈ  ２００７，  Ｐａｇｅｓ  ５９６−６００）は、更に、食品添加物として、又はヒトの治療、特に骨粗鬆症の治療に使用される、ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）及びトリセツム・フラウェスケンス（Ｔｒｉｓｅｔｕｍ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）由来の植物抽出物を開示する。それらの文献で開示される該植物抽出物は、Ｈｅｒｂｏｎｉｓ  ＡＧ，  Ｂａｓｅｌ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから提供されたものであり、乾燥させた植物の水抽出、続いて該抽出物をマトリックス材料としてＳｅｐｈａｄｅｘを用いた高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して精製することにより調製された。該抽出は、有効成分として、ビタミンＤ代謝物の１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３のみ含有していた。
【００２７】
これまでに幾つかの実験室での抽出方法が公開されているが、上記文献のいずれも、ビタミンＤ成分を含む植物抽出物を抽出及び／又は精製する、十分に高収量、即ち産業的に利用可能な方法を同様に開示するものではない。使用されている方法は、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を発見するのに便利であるが、収量を最善化し、そして生産物の毒性を最小化するための検討はなされていない。遊離１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を結合型から分離するのに純水、若しくは水性組成物が使用され、又は遊離１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を水溶性の成分から単離するのに、それ自体毒性の溶媒であるクロロホルムが使用された。有効成分の遊離１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の精製において、シリカ材料又はＳｅｐｈａｄｅｘゲルを使用するカラムクロマトグラフィーを使用する幾つかの方法が記載されているが、それらの方法は、より多量の抽出物を生産するのに現実的ではない。特に、シリカ材料を使用するクロマトグラフィーのビタミンＤ代謝物の収量は低いため、大量のビタミンＤを得なければならない産業スケールで、更に、上記ビタミンＤ含有植物抽出物を生産することは出来ない。更に、植物抽出物を取得するための前記のいずれの方法も、高濃度で投与されたときの高度の毒性という難点を部分的にも解決していない。
【００２８】
従って、本発明の目的は、上記不利益を克服し、大量に、良好な費用効率で、耐性を改善させたソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）抽出物、特に特に高濃度のビタミンＤの毒性により上記制限を阻害しない抽出物を提供することである。
【００２９】
本発明は、下記の、及び添付の特許請求の範囲に示した、根本的な目的に対する解決策を提供する。
【００３０】
本発明によると、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３グリコシド及びフラボノール、特にケルセチングリコシドの両方を十分な高収量で含む、ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮（及び平衡）植物抽出物を生産し、産業スケールに適用可能な新規方法により、前記目的は満足する。
【００３１】
驚くべきことに、本発明の発明者らは、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３グリコシド及びフラボノール、特にケルセチングリコシドの両方の濃度を増強したソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の植物抽出物が、上記高度の毒性という難点を示さないことを見出した。即ち、高カルシウム血症のリスクを負わず、従来技術におけるよりも遥かに高濃度でビタミンＤ代謝物を投与し得る。加えて、そのような濃縮植物抽出物は、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３グリコシド及びフラボノール、特にケルセチングリコシドの両方をより低い濃度で投与しても、なおも測定可能で良好な効果を引き起こし得る。言い換えると、驚くべきことに、本発明の発明者らは、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３グリコシド及びフラボノール、特にケルセチングリコシドの両方を高濃度で含む、ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の植物抽出物は、従来技術で知られるビタミンＤ３ばかり含む抽出物と異なり、ビタミンＤ代謝物の医薬としての使用において特に狭かった治療濃度域を顕著に拡張することが出来る。しかし、当該技術分野において、そのような濃縮植物抽出物の抽出を可能とする、又はそのような特性を示す植物抽出物の開示は存在しなかった。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００３２】
ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮植物抽出物の調製及び精製方法
第一の態様において、本発明は、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３グリコシド及びフラボノール、特にケルセチングリコシドが濃縮されたソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮（及び平衡化）植物抽出物の調製及び精製方法を提供し、ここで、該方法は、好ましくは、以下の：
ａ）アルコールベース溶媒を使用してソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）種の植物体又はその部分を抽出し；そして
ｂ）工程ａ）で取得した植物抽出物を、好ましくは以下の：
ｂ１）非イオン性ポリマー樹脂を含むカラムに工程ａ）で取得した植物抽出物をアプライし；
ｂ２）任意で、本明細書中に定義された水及び／又はアルコールベース溶媒で前記カラムを洗浄し；
ｂ３）カラムから前記濃縮植物抽出物を溶出し；そして
ｂ４）任意で、前記濃縮植物抽出物を濃縮及び／又は乾燥する；
工程を含む；
工程を含む。
【００３３】
ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）から濃縮植物抽出物を調製及び精製する本発明の精製工程ａ）において、ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）種由来の植物体又はその部分はアルコールベース溶媒を使用して抽出され、その方法は、上記従来技術の方法より優れており、産業スケールに利用することが出来る。対照的に、公開されていた方法は、解析的問題にばかり注視し、産業スケールの実現に注視していない。更に、そのような方法は、純粋なビタミンＤ３有効成分を取得するためだけに設計されている。加えて、そのような方法は、使用される溶媒の毒性のため、部分的には、ヒト又は獣医的使用に適さない。一例として、クロロホルム−メタノールの使用に基づく従来技術として公開されたソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の抽出方法は、第用量の使用に堪えず、そして毒性の薬剤を含むことになる。更に、水のみを含む公開された抽出方法は、ビタミンＤの活性が低い。アルコールベース溶媒を使用することにより驚くべき最良の結果がもたらされるというのが、出願人自身の見解である。故に、本発明に係る調製及び精製方法の抽出工程ａ）に適したアルコールベース溶媒は、好ましくは、水及びアルコールの混合物、又はアルコール単独を含む群から選択され、ここで、アルコールは、好ましくはメタノール、エタノール、又はイソプロパノールから、より好ましくはエタノール又はメタノールから選択される。他の適切な、及び広く使用される溶媒（例えば水）を使用する、本発明の抽出工程ａ）におけるソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）種由来の植物体又はその部分の抽出も本明細書中に包含されるが、最適な植物抽出物を得るのには好ましくない。なおもより好ましくは、ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の植物抽出物を調製及び精製する本発明の方法の工程ａ）における溶媒は、エタノール／水の比率（ｖ／ｖ）が約１００／０〜ａｂｏｕｔ０／１００のエタノール／水混合物から選択され、例えば、エタノール／水の比率が、約１００／０（ｖ／ｖ）、エタノール／水が約９５／５（ｖ／ｖ）、エタノール／水が約９０／１０（ｖ／ｖ）、エタノール／水が約８５／１５（ｖ／ｖ）、エタノール／水が約８０／２０（ｖ／ｖ）、エタノール／水が約７５／２５（ｖ／ｖ）、エタノール／水が約７０／３０（ｖ／ｖ）、エタノール／水が約６５／３５（ｖ／ｖ）、エタノール／水が約６０／４０（ｖ／ｖ）、エタノール／水が約５５／４５（ｖ／ｖ）、エタノール／水が約５０／５０（ｖ／ｖ）、エタノール／水が約４５／５５（ｖ／ｖ）、エタノール／水が約４０／６０（ｖ／ｖ）、エタノール／水が約３５／６５（ｖ／ｖ）、エタノール／水が約３０／７０（ｖ／ｖ）、エタノール／水が約２５／７５（ｖ／ｖ）、エタノール／水が約２０／８０（ｖ／ｖ）、エタノール／水が約１５／８５（ｖ／ｖ）、エタノール／水が約１０／９０（ｖ／ｖ）、エタノール／水が約５／９５ｅｔｈａｎｏｌ／ｗａｔｅｒ（ｖ／ｖ）、又はエタノール／水が約０／１００（ｖ／ｖ）のエタノール／水混合物から選択され得て、又は、上記特定の数値の２つにより形成される領域から選択され得る。そのような混合物は、本発明の濃縮植物抽出物の両方の望ましい成分、即ち１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３グリコシド及びフラボノール、特にケルセチングリコシドの両方を最大の収量で取得するという本発明の課題において優れていることが見出された。最も好ましくは、ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮植物抽出物を調製及び精製する本発明の方法の抽出工程ａ）における溶媒は、エタノール／水の比率（ｖ／ｖ）が、約８０／２０〜約５０／５０、及び／又は約３５／６５〜約２０／８０であるエタノール／水混合物から選択され得る。エタノール／水の具体的な比率（ｖ／ｖ）は、更に、本明細書中に定義された濃縮植物抽出物中の所望の特定の１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３グリコシドの量に基づいて選択され得る。そのような具体的なエタノール／水の比率（ｖ／ｖ）は、具体的な抽出及び精製方法、より好ましくは本明細書中に記載の方法に依存して、当業者により選択され得る。
【００３４】
あるいは、好ましくないが、ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮植物抽出物を調製及び精製する本発明の方法の抽出工程ａ）における溶媒は、メタノール／水の比率が上記エタノール／水の混合物におけるものと同じであるメタノール／水の混合物から選択され得る。より好ましくは、該メタノール／水の比率は、メタノール／水（ｖ／ｖ）が約９０／１０〜約２５／７５から選択され得て、例えば、メタノール／水が約９０／１０（ｖ／ｖ）、メタノール／水が約８５／１５（ｖ／ｖ）、メタノール／水が約８０／２０（ｖ／ｖ）、メタノール／水が約７５／２５（ｖ／ｖ）、メタノール／水が約７０／３０（ｖ／ｖ）、メタノール／水が約６５／３５（ｖ／ｖ）、メタノール／水が約６０／４０（ｖ／ｖ）、メタノール／水が約５５／４５（ｖ／ｖ）、メタノール／水が約５０／５０（ｖ／ｖ）、メタノール／水が約４５／５５（ｖ／ｖ）、メタノール／水が約４０／６０（ｖ／ｖ）、メタノール／水が約３５／６５（ｖ／ｖ）、メタノール／水が約３０／７０（ｖ／ｖ）、又はメタノール／水が約２５／７５（ｖ／ｖ）のメタノール／水の混合物から選択され得て、又は、上記特定の数値の２つにより形成される領域、特にメタノール／水の比率（ｖ／ｖ）が約９０／１０〜約６０／４０、及び／又は約４０／６０〜約２５／７５（ｖ／ｖ）の領域から選択され得る。
【００３５】
好ましくないが更なる代替的態様として、ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮植物抽出物を調製及び精製する本発明の方法の抽出工程ａ）における溶媒は、イソプロパノール／水の比率が上記メタノール／水又はエタノール／水の混合物におけるものと同じであるイソプロラノール／水の混合物から選択され得る。
【００３６】
ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）種の（乾燥した）植物体又はその部分の上記アルコールベース溶媒中の濃度は、溶媒中で、使用される溶媒対（乾燥した）植物体又はその部分（薬物）（合計量）が、特定の比率であることが必要な場合もある。該溶媒／薬物の特定の比率（％）は、好ましくは約４〜４０（ｖ／ｗ）、より好ましくは約４〜３０（ｖ／ｗ）、又は約４〜２５（ｖ／ｗ）であり、そしてなおもより好ましくは、使用される抽出方法に依存し得て、例えば浸透（ｐｅｒｃｏｌａｔｉｏｎ）型抽出においては、約７〜１２又は８〜１０（ｖ／ｗ）、最も好ましくは約９（ｖ／ｗ）であり、あるいは例えば浸漬（ｍａｃｅｒａｔｉｏｎ）型抽出においては、３〜７又は４〜６（ｖ／ｗ）、最も好ましくは約５（ｖ／ｗ）である。ここで、透過型抽出及び浸漬型透析は、本発明の方法の抽出工程ａ）における等価な代替手法と見做されている。
【００３７】
ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮植物抽出物を調製及び精製する本発明の方法の抽出工程ａ）における溶媒は、更に添加物を含み得る。そのような添加物は、取得される抽出物の質を改善するために添加され得る。一般に、そのような添加物は、意図される目的に適した濃度で、本発明の調製及び精製方法の工程ａ）における溶媒に含有され、その濃度は、その抽出工程の具体的な要求に従い、当業者により決定され得る。典型的には、そのような添加物は、工程ａ）による抽出がそれらの化合物に干渉されないが、追加的な安定化及び／又は保護的抗酸化剤効果等を付与する濃度を選択して用いられる。本発明における添加物として、例えば、濃度が約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約２％（ｗ／ｖ）、好ましくは濃度が約０．０５％（ｗ／ｖ）〜約１％（ｗ／ｖ）、そして最も好ましくは濃度が約０．０５％（ｗ／ｖ）〜０．５％（ｗ／ｖ）の抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、又は、濃度が約０．０２〜約１％（ｗ／ｖ）、より好ましくは濃度が約０．０５％（ｗ／ｖ）〜約０．２５％（ｗ／ｖ）のトコフェロール若しくはｇａｌｌｅｒｔ型（Ｅ３１０、Ｅ２１１又はＥ３１２）抗酸化剤等が挙げられる。添加物は、更に、好ましくは濃度が約０．０５  ％  （ｗ／ｖ）〜約１  ％  （ｗ／ｖ）、なおもより好ましくは濃度が約０．１  ％  （ｗ／ｖ）  〜約０．５  ％  （ｗ／ｖ）の、適切な酸、好ましくは有機酸、より好ましくは植物由来の酸又は植物中に生じる酸、例えば酢酸、硫酸、クエン酸等を含む。いずれの％（ｗ／ｖ）も、工程ａ）における抽出に使用される溶媒の総量に基づいて決定される。そのような酸の添加は、抽出及びその後の工程の過程での褐色化（ｂｒｏｗｎｉｎｇ）反応を低下するのに好ましい。故に、本発明の抽出工程ａ）における抽出の過程で、ｐＨ値が、約４．０〜約８．０の特定のｐＨ値に、より好ましくは約５．５〜約６．５の特定のｐＨ値に調整され得る。ｐＨ値の調整は、適切な量の酸、例えば上記の酸の添加により、又は必要な場合、適切な量の塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の添加により実施され得る。
【００３８】
ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮植物抽出物を調製及び精製する本発明の方法の工程ａ）における抽出は、ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）種の植物体又は部分、例えば葉を破砕（ｇｒｉｎｄｉｎｇ）、浸透及び／又は浸漬する工程を含み得る。該破砕、浸透及び／又は浸漬する工程は、連続的プロセスで、又は非連続的プロセスで実施され得る。
【００３９】
ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮植物抽出物を調製及び精製する本発明の方法の抽出工程ａ）は、室温〜約８５℃、例えば約２０℃又は３０℃〜約８５℃、より好ましくは約３０℃〜約７０℃の温度範囲内で、そして最も好ましくは、約４０℃〜６０℃の温度範囲内で、特に約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、又は約６０℃の温度で、より好ましくは約５０℃、約５５℃、又は６０℃の温度で、又は前記数値のいずれか２つにより形成される温度範囲内で実施され得る。
【００４０】
ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮植物抽出物を調製及び精製する本発明の方法の工程ａ）における抽出は、１回以上、好ましくは１〜２回、１〜３回、１〜５回以上繰り返され、好ましくは抽出に使用されたものと同一のアルコールベース溶媒を、（ベッド）体積の約５倍、１〜４倍、１〜３倍、１〜２倍又は１倍用いることにより、抽出される有効成分の収量を増大させられる。該溶媒は、抽出後に組み合わせられ得る。適切な選択は使用される抽出方法、例えば浸漬又は浸透型抽出等に依存し得る。抽出方法として浸漬を使用する場合、抽出工程ａ）は、好ましくは１〜２回繰り返され、抽出工程ａ）における最初の抽出に使用されたのと同一のアルコールベース溶液を（ベッド）体積の約２倍〜約５倍用いる。ここで、驚くべきことに、発明者らは、前記植物又はその部分を粉砕しないことが、工程ａ）における中出の過程で良好な収量を得るのに必須であることを見出し、この点注目に値する。
【００４１】
あるいは、又は加えて、ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮植物抽出物を調製及び精製する本発明の方法の工程ａ）における抽出は、特定の時間間隔で実施され得て、ここで該時間間隔、即ち抽出時間は、約１時間〜約４８時間、２４時間、又は約１０時間、好ましくは約６時間〜約４８時間、より好ましくは約２４時間に渡り得る。
【００４２】
抽出工程ａ）において取得した植物抽出物は、濾過され得る。濾過は、当該技術分野で既知の方法を使用して実施され得る。濾過は、例えばメッシュ幅が４０〜６０μｍ、好ましくは５０μｍのフィルターに前記溶媒をポンプにより通すこと等により行われ得る。抽出工程ａ）における各抽出工程の後、全ての抽出工程の最後に、抽出工程ａ）において得られた抽出物は連続的に濾過され得る。
【００４３】
ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮植物抽出物を調製及び精製する本発明の方法の抽出工程ａ）において取得された抽出物は、適切な方法を使用して濃縮（濾過の前又は後）及び／又は乾燥させられる。本発明の如く、抽出工程ａ）の過程における濃縮及び／又は乾燥は、一般に、例えば工程ａ）においてソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）種の植物体又はその部分を浸透又は浸漬等した後に、該植物抽出物の水分又は液体を一定程度減少させることを意味するものと意図される。そのような、抽出工程ａ）の過程等で取得された植物抽出物の水分又は液体の減少は、好ましくは既存の濃縮及び／又は乾燥手段及び手法を使用して、より好ましくはその主成分、特に１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３グリコシド及びフラボノール、特にケルセチングリコシドを分解せずに前記濃縮植物抽出物の水分又は液体を慎重に減少させられる方法を使用して、該抽出物を濃縮することにより実施され得る。濃縮（及び／又は乾燥）方法として、限定されないが、例えば、蒸発、例えば真空下での蒸発、又は滑らかな温度（ｓｍｏｏｔｈ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）を使用する、溶媒の蒸留等が挙げられる。乾燥手法は、既に濃縮された抽出物において使用され得るが、あるいは抽出（及び／又は精製）後に取得された植物抽出物から直接開始される場合もある。そのような乾燥手法として、限定されないが、例えば、スプレー乾燥、バンド乾燥、凍結乾燥等が挙げられ、それらは特に、（中間）植物抽出物を、不揮発成分の分量が約又はほぼ１００％となる程度まで乾燥すべきときに採用される。
【００４４】
好ましくは、抽出工程ａ）における植物抽出物の濃縮又は乾燥の過程で、最初に有機溶媒が除去され、それから、溶液が、水及び不揮発成分を特定の分量（％）で含むようになるまで水が除去される。一例として、抽出工程ａ）において取得された植物抽出物は、水の分量が８５−７５％かつ不揮発成分の分量が約１５−２５％、水の分量が約８０−７０％かつ不揮発成分の分量が約２０−３０％、水の分量が約７５−６５％かつ不揮発成分の分量が約２５−３５％、水の分量が約７０−６０％かつ不揮発成分の分量が約３０−４０％、水の分量が約６５−５５％かつ不揮発成分の分量が約３５−４５％、水の分量が約６０−５０％かつ不揮発成分の分量が約４０−５０％、水の分量が約５５−４５％かつ不揮発成分の分量が約４５−５５％、水の分量が約５０−４０％かつ不揮発成分の分量が約５０−６０％、水の分量が約４５−３５％かつ不揮発成分の分量が約５５−６５％、水の分量が約４０−３０％かつ不揮発成分の分量が約６０−７０％、水の分量が約３５−２５％かつ不揮発成分の分量が約６５−７５％、水の分量が約３０−２０％かつ不揮発成分の分量が約７０−８０％、水の分量が約２５−１５％かつ不揮発成分の分量が約７５−８５％、水の分量が約２０−１０％かつ不揮発成分の分量が約８０−９０％、水の分量が約１５−５％かつ不揮発成分の分量が約８５−９５％、又は水の分量が約１０−０％かつ不揮発成分の分量が約９０−１００％、好ましくは水の分量が約８５−７５％かつ不揮発成分の分量が約１５−２５％、水の分量が約８０−７０％かつ不揮発成分の分量が約２０−３０％、水の分量が約７５−６５％かつ不揮発成分の分量が約２５−３５％、水の分量が約７０−６０％かつ不揮発成分の分量が約３０−４０％、水の分量が約６５−５５％かつ不揮発成分の分量が約３５−４５％、そして最も好ましくは、水の分量が７５−６５％かつ不揮発成分の分量が約２５−３５％であり、それぞれ濃縮又は乾燥前の、例えば浸透又は浸漬型抽出の直後に得られた植物抽出物の総重量に基づいて決定される。不揮発成分が特定の分量になるように濃縮及び／又は乾燥することにより、工程ａ）で取得した植物抽出物の様々な濃度の有効成分を特定の濃度に均一化することが出来る。有効成分の濃度が異なる植物抽出物は、例えば、工程ａ）において抽出を反復した時等、異なる体積の上記（代替的）溶媒を使用した場合に取得される。工程ａ）において取得される植物抽出物を濃縮又は乾燥して、不揮発成分の分量を約１００％にすることにより、追加的に、該抽出物を、必要最小限のスペースで、更なるプロセスに使用するまで保管できる。
【００４５】
最後に、工程ａ）で取得した植物抽出物は、該抽出物の寿命（ｓｈｅｌｆ  ｌｉｆｅ）を延長させるために、好ましくは該抽出物の（長期）保存を実現するために、加熱／高温処理に付される。そのような工程は、工程ａ）で取得した植物抽出物の濃縮及び／又は乾燥の前に、又はそれに続いて行われる。該加熱／高温処理は、当該技術分野で既知の方法を使用して実行され得る。より好ましくは、加熱／高温処理は、穏和な条件で、好ましくは約１００℃〜約１４５℃、例えば最低で約１００℃で、好ましくは３０〜４０秒、又は最高で約１４５℃、好ましくは約２〜１０秒、又はそれらの間の任意の数値、例えば約１１０℃、１１５℃、１２０℃、１２５℃，１３０℃、１３５℃又は約１４０℃等で実行され得る。
【００４６】
特に好ましい態様において、ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮植物抽出物を調製及び精製する本発明の方法の抽出工程ａ）は、研究室スケールで、又は産業スケールで実施され得て、ここで本明細書中に定義される実験室での条件は、産業スケールにも転用され得る。
【００４７】
研究室スケールで実行されるとき、調製及び精製のための本発明の方法の抽出工程ａ）は、典型的には、限定されないが、ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）種の植物体又はその部分を、約０．５ｇ〜約１０００ｇ、より好ましくは約１ｇ〜約１００ｇ、そして最も好ましくは約１ｇ〜約１０ｇ使用して開始され、ここで、葉は、前記アルコールベース溶媒中で、粉砕、浸透又は浸漬される。該アルコールベース溶媒は前記の如く選択され得て、より好ましくはエタノール／水の比率（％）が約８０／２０〜２０／８０、又はより好ましくは８０／２０〜６５／３５、あるいはエタノール／水（％）が３５／６５〜２０／８０のエタノール／水混合物から選択され得て、例えば、エタノール／水（％）が約８０／２０（ｖ／ｖ）、エタノール／水が約７５／２５（ｖ／ｖ）、エタノール／水が約７０／３０（ｖ／ｖ）、エタノール／水が約６５／３５（ｖ／ｖ）、エタノール／水が約６０／４０（ｖ／ｖ）、エタノール／水が約５５／４５（ｖ／ｖ）、エタノール／水が約５０／５０（ｖ／ｖ）、エタノール／水が約４５／５５（ｖ／ｖ）、エタノール／水が約４０／６０（ｖ／ｖ）、エタノール／水が約３５／６５（ｖ／ｖ）、エタノール／水が約３０／７０（ｖ／ｖ）、エタノール／水が約２５／７５、又はエタノール／水が約２０／８０（ｖ／ｖ）のエタノール／水混合物から選択され得て、又はこれらの数値のいずれか２つにより形成される領域から選択され得る。更に、実験室スケールでの抽出プロセスの過程で使用されるｐＨ値及び温度は、一般に上記で定義したように選択され得て、ここで好ましくは、そのような条件は、３以上の抽出効率をもたらすものが選択される（下記表１、実施例１Ａを参照されたい）。好ましくは、温度は約４０℃〜６０℃が採用されて、より好ましくは、温度は約５０℃である。上記のように抽出は反復され、好ましくは１〜５回反復される。
【００４８】
ここで、ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮植物抽出物を調製及び精製する本発明の方法の工程ａ）における抽出の効率は、以下の式：
【化１】
0005390594.tif 000002
を用いて計算され、ここで［ＶＤＭ］及び［Ｑｕ］は、抽出物１ｇあたりの値として計算される。要素［ｅｆ］は、コスト、エコロジー及び該抽出物の品質（例えば溶解度）として、経験的要素（ｅｍｐｉｒｉｃａｌ  ｆａｃｔｏｒ）を推定する（ｗｅｉｇｈｔ）。本発明の驚くべき結果として、抽出の効率を表すｙｆは３以上で、十分に良好で、公知の抽出手段を上回り、そして本発明の基準を満たす。従って、本発明の方法の抽出工程ａ）の好ましい態様は、ｙｆ＞２、より好ましくはｙｆ＞２．５、なおもより好ましくはｙｆ＞３となる抽出物を提供する。
【００４９】
産業スケールで実施されるとき、本発明の調製及び精製方法の抽出工程ａ）は、典型的には、限定されないが、ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）種を、約１０００ｇ以上、好ましくは約１０又は１００ｋｇ以上、より好ましくは約２５０ｋｇ以上、なおもより好ましくは約５００ｋｇ以上、約１０００ｋｇ以上、又は約２５００ｋｇ以上、約３０００ｋｇ以上、約４０００ｋｇ以上、約５０００ｋｇ以上使用して開始される。ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の植物体又はその部分の量は、例えば使用される工場、実際に処理される量等の具体的な要件に基づき、当業者により選択され得る。ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）種の植物体又はその部分、例えば葉等は、上記で定義したアルコールベース溶媒中で、粉砕され、浸透及び／又は浸漬される。粉砕、浸透及び／又は浸漬は、抽出工程ａ）において使用され得る。
【００５０】
例えば、浸透は、当該技術分野で公知の任意の方法により行われ得る。好ましくは、ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）種の植物体又はその部分、例えば葉等を、１つ以上のベセル（ｖｅｓｓｅｌ）に詰め（工場の型によっては、限定されないが、１つ以上、又は２、３、４、５個又はそれ以上の（繰り返し充填される（ｃｙｃｌｉｃａｌｌｙ  ｆｉｌｌｅｄ））ベセルが使用され得る）、上記で定義した溶媒を添加する。該して抽出工程ａ）用の上記で定義したアルコールベース溶媒が選択され得る。好ましくは、浸透用の溶媒は、追加的に、抽出工程ａ）用の上記で広く定義した添加物を含み得る。更に、産業スケールにおける抽出プロセスの過程で採用されるｐＨ値及び温度は、上記で広く定義したように選択され、そのような条件は、好ましくは、３を上回る抽出の効率をもたらすものが選択され得る（下記表１、実施例１Ａに対応する）。好ましくは、採用されるｐＨの値は、約４．０〜約８．０、より好ましくは約５．５〜約６．５の特定のｐＨ値である。好ましくは、前記混合物は上記の温度まで加熱され、好ましくは約４０℃〜約７５℃、より好ましくは約４０℃〜約６０℃で加熱される。浸透のプロセスは、１つ以上のベセルに特定の流速でアルコールベース溶媒をポンプ／流動させる、連続的プロセスとして、半連続的プロセスとして、又は他の更なるプロセスとして実施され得る。好ましくは、そのような流速は毎時約５００〜１５００リットル、好ましくは約８００〜１２００リットル／時間、そして最も好ましくは約１０００リットル／時間である。抽出時間は上記に定義したように様々で、例えば約６〜約４８時間、そして好ましくは約２４時間である。浸透により取得される抽出物は、上記のように、濾過、濃縮及び／又は乾燥させられ得る。
【００５１】
特に好ましい態様において、ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮植物抽出物を調製及び精製する本発明の方法の工程ａ）における抽出は、産業スケールで実施される場合、浸透型抽出であり、そして以下の特定の副工程群（抽出プロセスＥＰ）：
ＥＰ１）１つ以上（繰り返し充填される）のベセル（ｖｅｓｓｅｌ）に、ソラリウム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｒｉｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）種の植物体又はその部分を充填し；
ＥＰ２）アルコールベース溶媒を添加し、ここでアルコールベース溶媒は、好ましくは上記で定義されたエタノール／水の混合物であり、例えば約２５／７５、あるいは約７５／２５の比率（％）のエタノール／水（ｖ／ｖ）の混合物、ここで溶媒／薬物の比率は上記に定義されたもので、例えば約７〜１２（ｖ／ｗ）、最も好ましくは約９（ｖ／ｗ）であり；
ＥＰ３）上記で定義したように、任意でｐＨを５．５〜６．５に調整し；
ＥＰ４）８００〜１２００リットル／時間、より好ましくは１０００リットル／時間の流速で；好ましくは６〜４８時間、より好ましくは２４時間、エタノールベース溶媒中で、前記ソラリウム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｒｉｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）種の植物体又は部分を抽出し；
ＥＰ５）上記で定義したように、抽出中の該混合物を、約４０〜７５℃、より好ましくは４０〜６０℃の温度で加熱し；
ＥＰ６）上記で定義したように、任意で、水を約７５〜６５％含み、不揮発成分を約２５〜３５％含む溶液となるまで、先ず有機溶媒を蒸発させ、続いて水分を蒸発させることにより、工程Ｐ４及びＰ５の植物抽出物を減圧下で濃縮し；そして
ＥＰ７）該（濃縮した）植物抽出物を、任意で、スプレー乾燥、バンド乾燥、又は凍結乾燥する
特定の副工程群を含む。
【００５２】
あるいは、上記の浸漬は、典型的には、混合装置又は混合ユニット及び好ましくは加熱システムを含むリアクターベセルを使用して実施される。更に、浸漬は、好ましくは上記抽出時間制限並びに上記温度及びｐＨ値の中で、前記葉をベセルに充填し、前記で定義したアルコールベース溶媒を添加し、そして該（ベセル中の）混合物を加熱及び混合することにより実施される。好ましくは、浸漬用のアルコールベース溶媒は、追加的に、抽出工程ａ）用の上記で広く定義した添加物を含み得る。該アルコールベース溶媒は、更に、抽出工程ａ）用の上記一定の比率（％）のエタノール／水（ｖ／ｖ）が広く選択され得る。更に、更に、産業スケールでの抽出プロセスにおいて採用されるｐＨ値及び温度は、上記で広く定義したように選択され得る。それらの条件は、好ましくは、３を上回る抽出の効率をもたらすものが選択される（下記表１、実施例１Ａに対応する）。好ましくは、ｐＨ値は、約４．０〜８．０、より好ましくは約５．５〜約６．５のｐＨ値が採用され得る。好ましくは、前記温度は５５℃で、２４時間維持される。浸漬により取得された抽出物は、前記で定義したように、濾過、洗浄、濃縮及び／又は乾燥させられ得る。
【００５３】
特に好ましい態様において、ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮植物抽出物を調製及び精製する本発明の方法の工程ａ）における抽出は、産業スケールで実施されるとき、浸漬型抽出であり、以下の特定の副工程群（抽出プロセスＥＭ）：
ＥＭ１）１つ以上の、好ましくは混合装置及び加熱装置を取り付けたベセルに、ソラリウム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｒｉｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）種の植物体又はその部分を充填し；
ＥＭ２）上記アルコールベース溶媒を添加し、ここで該アルコールベース溶媒は、好ましくは、上記で定義したエタノール／水の混合物から選択され、例えばエタノール／水（ｖ／ｖ）の比率は約６５／３５（％）であり、溶媒／薬物の比率は、好ましくは、上記で定義したように、例えば約４〜６（ｖ／ｗ）、最も好ましくは約５（ｖ／ｗ）であり；該アルコールベース溶媒は、上記で定義した、例えば０．１％アスコルビン酸等の添加物を追加的に含有し；
ＥＭ３）上記で定義したように、任意でｐＨを約５．５〜６．５、好ましくは約５．５に調整し；
ＥＭ４）上記で定義した温度及び時間で、好ましくは約５５℃の温度で約２４時間、エタノールベース溶媒中で、前記ソラリウム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｒｉｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）種の植物体又は部分を抽出し；
ＥＭ４）前記ベセルから植物抽出物を取り出し、これを、例えば５０μｍメッシュ幅のフィルターにポンプにより通して濾過し；
ＥＭ５）任意で、工程Ｍ４及びＭ５の抽出で残った固体を、上記のエタノール／水混合物と同じ、好ましくは溶媒／薬物の比率が約３の溶媒で１回又は２回洗浄し；
ＥＭ６）任意で、水分を約７５〜６５％含み、不揮発成分を約２５〜３５％含む溶液となるまで、先ず有機溶媒を蒸発させ、続いて水分を蒸発させることにより、減圧下で該植物抽出物を濃縮し；そして
ＥＭ７）任意で、該（濃縮した）植物抽出物を、スプレー乾燥、バンド乾燥、又は凍結乾燥する；
特定の副工程群を含む。
【００５４】
ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の植物抽出物の調製及び精製における本発明の方法は、更に、抽出工程ａ）において取得された抽出物を精製するために、精製工程ｂ）を含む。そのような精製工程ｂ）は、本発明の方法において、本発明の植物抽出物の主成分、即ち１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３グリコシド及びフラボノール、特にケルセチングリコシドを良好な収量で取得するのに不可欠である。最も驚くべき結果は、精製工程ｂ）における良好な収量が、主に非イオン性ポリマー樹脂を含むカラムへの前記抽出物のアプライに依存していたことであり、これは、先行技術に基づいて、当業者が予測し得ないことであった。そのような非イオン性ポリマー樹脂を使用した場合にのみ、本発明のソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮植物抽出物の２つの主成分の効果的な濃縮が可能となり、そして、これらの有効成分、即ち１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３グリコシド及びフラボノール、特にケルセチングリコシドの両方の顕著な高収量が実現される。そのような両方の有効成分の濃縮は、他のカラム材料を使用した場合、不可能である。本明細書の導入部で示唆したように、技術的サイズでの当該技術分野で既知の植物成分の単離方法は、蒸留、溶媒−溶媒（向流（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｃｕｒｒｅｎｔ））抽出を最初に選択し、続いてカラムクロマトグラフィー等のクロマトグラフィー法を行う。そのようなクロマトグラフィープロセスは、典型的には、限られた場合、例えば所望の生産物が、液体−液体抽出又は蒸留等を使用するのみで十分に精製された生産物を得られるという特殊な物理化学的性質を有する場合等にのみ省略され得る。しかしながら、当該技術分野において、既知の精製の試みは全て、純粋な活性ビタミンＤ生産物を得ることを目標としており、上記２つの有効成分を得ることを目標としていない。更なる精製においてクロマトグラフィーが必要な場合、当業者は、植物抽出物のクロマトグラフィー精製用の材料として、常に、文献において見出される、シリカ材料及びＳｅｐｈａｄｅｘを選択する（上記参照）。シリカ材料及びＳｅｐｈａｄｅｘの両方とも、本発明の発明者らが見出したように、上記両有効成分を共に精製するのに、顕著な難点を有する。即ち、シリカ材料を用いたクロマトグラフィーは１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の収量が低く、一方Ｓｅｐｈａｄｅｘクロマトグラフィーは、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３のみ濃縮されるが、フラボノールは峻別される。図６のレーン９を参照されたい。故に、それらの材料は、僅かに異なる物理化学的性質を有する前記２つの有効成分を同時に精製するのに適さない。これに関連して、フラボノールは、処置に重要なものであると見做されておらず、また、両方の有効成分を含む植物抽出物を精製しようという試みもなされていない。よって、当業者は、常に、上記のように、主成分としてビタミンＤ代謝物を含む植物抽出物を精製するために、シリカ材料又はＳｅｐｈａｄｅｘに基づく方法を選択する。また、本発明の発明者らは、イオン性ポリマー樹脂（ｄｅ  Ｂｏｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．同上参照）は、溶出にイオン性の塩��必要であるところ、植物抽出物中の塩の量が、カラムの容量をオーバーフローさせてしまうため、適切な代替とならないことを見出した。
【００５５】
当業者により予想される結果と対照的に、本発明者らは、驚くべきことに、非イオン性ポリマー樹脂が、一般に、与えられた目標、即ち前記２つの有効成分、即ち１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３グリコシド及びフラボノール、特にケルセチングリコシドの組み合わせであり、これらの有効成分の分量が最適に近く、そしてアルカロイドの分量が最小に近い抽出物を提供する方法を達成するのに適していることを見出した。
【００５６】
従って、工程ａ）で取得した植物抽出物精製する精製工程ｂ）は、以下の：
ｂ１）非イオン性ポリマー樹脂を含むカラムに工程ａ）で取得した植物抽出物をアプライし；
ｂ２）必要に応じて上記で定義した水及び／又はアルコールベース溶媒で前記カラムを洗浄し；
ｂ３）カラムから前記濃縮植物抽出物を溶出し；そして
ｂ４）必要に応じて前記濃縮植物抽出物を乾燥する
工程を含む。
【００５７】
ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮植物抽出物を調製及び精製する本発明の方法の精製工程ｂ）の副工程ｂ１）において、該抽出物は、非イオン性ポリマー樹脂を含むカラムに充填される。本発明において、工程ｂ）の副工程ｂ１）に適した非イオン性ポリマー樹脂は、（多孔質又は非多孔質）非イオン性ポリマー樹脂であり、限定されないが、ポリスチレン、スチレンジビニルベンゼンコポリマー、アクリルエステルコポリマー、及びポリフェノール樹脂等であり得る。より好ましくは、前記（多孔質又は非多孔質）非イオン性材料は、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−１、ＸＡＤ−２、ＸＡＤ−４、ＸＡＤ−５（これらは商標で、米国Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ  Ｃｏ．製で、これらの樹脂はスチレンジビニルベンゼンコポリマーで構成される）、及びＤｉａｉｏｎ  ＨＰ１０、ＨＰ２０、ＨＰ３０、ＨＰ４０、ＨＰ５０（これらは商標で、日本国Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．製で、これらの樹脂はスチレンジビニルベンゼンコポリマーで構成される）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−７、ＸＡＤ−７ＨＰ、ＸＡＤ−８、又はＸＡＤ−１１８０（アクリルエステルポリマーで構成される吸着材の商標で、Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ  Ｃｏ．製である）、及びＤｕｏｌｉｔｅ  Ｓ−３０（フェノール樹脂で構成される吸着財の商標で、米国Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｃｏ．製である）、又は上記で特に挙げたものと同等の非イオン性ポリマー樹脂、例えば他の供給元の同等の樹脂から選択される。なおもより好ましくは、本発明の方法の工程ｂ）に適した（多孔質又は非多孔質）非イオン性材料は、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−樹脂、例えばＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−１、ＸＡＤ−２、ＸＡＤ−４、ＸＡＤ−５、及びＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−７、ＸＡＤ−７ＨＰ、ＸＡＤ−８又はＸＡＤ−１１８０から選択され、そして最も好ましくは、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−７、ＸＡＤ−７ＨＰ、ＸＡＤ−８又はＸＡＤ−１１８０から選択され、あるいは上記で特に挙げたものと同等の非イオン性ポリマー樹脂、例えば他の供給元の同等の樹脂から選択される。
【００５８】
更に、精製工程ｂ）の副工程ｂ１）に適した前記非イオン性材料は、好ましくはデキストランベースの樹脂を含むべきではなく、より好ましくはＳｅｐｈａｄｅｘ又はＳｕｐｅｒｄｅｘ樹脂材料を含むべきではなく、そしてなおもより好ましくは、非イオン性Ｓｅｐｈａｄｅｘ又はＳｕｐｅｒｄｅｘ樹脂材料を含むべきではなく、好ましくは、それらは、本発明の対象である工程ｂ）に適した非イオン性材料から明示的に除外される。
【００５９】
ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮植物抽出物を調製及び精製する本発明の方法の精製工程ｂ）の副工程ｂ１）において、カラムへの前記植物抽出物のアプライは、当該技術分野の任意の適切な方法を使用して実行され得る。限定されないが、そのような方法として、本発明の方法を実験室スケールで行う場合、シリンジの使用等が挙げられ、又は本発明の方法を産業スケールで行う場合、ポンプの使用等が挙げられる。好ましくは、植物抽出物をアプライするカラムは、長さ／幅の比率が約２〜６である。該カラムは、使用前に、本明細書中に定義した溶媒で、好ましくは上記で定義した溶媒で、及び／又は水及び／又はアセトンで、使用前に予め洗浄され得る。該カラムは、更に、好ましくは水、又は上記で定義したアルコールベース溶媒で、使用前に平衡化され得て、該カラムは、平衡化の過程で乾燥させられない。精製工程ｂ）の副工程ｂ１）に従い植物抽出物をカラムにアプライするとき、該植物抽出物（上記に定義した溶媒が含まれているため水溶液である）は、好ましくは１、２、３、４、５又はそれ以上のベッド体積分、好ましくは３ベッド体積分のスピードで、カラムの上端にアプライ又はポンプ注入される。抽出工程ａ）において取得したのと同じ植物抽出物を、該カラムに、数回、例えば１回、２回、３回、４回、５回、又はそれ以上の回数アプライされ得て、カラムの最初の（典型的には透明の）溶出物は、捨てられル場合がある。
【００６０】
ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮植物抽出物を調製及び精製する本発明の方法の精製工程ｂ）の任意の副工程ｂ２）において、植物抽出物がアプライされたカラムは、必要に応じて、上記で定義した水及び／又はアルコールベース溶媒で洗浄される。アルコールベース溶媒が使用される場合、アルコールベース溶媒は、上記で挙げた任意のアルコールベース溶媒であり、好ましくは、カラムから濃縮植物抽出物又はその任意の成分が短時間で溶出するのを防ぐために、典型的には２０％（ｖ／ｖ）を越える量のアルコールを含まないアルコールベース溶媒である。特に適切なアルコールベース溶媒は、限定されないが、エタノール／水（ｖ／ｖ）の比率（％）が約０／１００〜２０／８０のエタノール／水混合物から選択され、例えば、エタノール／水が約０／１００（ｖ／ｖ）、エタノール／水が約５／９５（ｖ／ｖ）、エタノール／水が約１０／９０（ｖ／ｖ）、エタノール／水が約１５／８５（ｖ／ｖ）又はエタノール／水が約２０／８０（ｖ／ｖ）のエタノール／水混合物、より好ましくはエタノール／水が約５／９５（ｖ／ｖ）、エタノール／水が約１０／９０（ｖ／ｖ）又はエタノール／水が１５／８５（ｖ／ｖ）のエタノール／水混合物から選択され得る。あるいは、好ましくないが、本発明の方法の精製工程ｂ）の任意の副工程ｂ２）のアルコールベース溶媒は、上記エタノール／水混合物の場合と同じメタノール／水の比率を有するメタノール／水混合物から選択され得る。ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮植物抽出物を調製及び精製する本発明の方法の精製工程ｂ）の副工程ｂ２）の任意の洗浄工程は、１回以上、好ましくは１〜２回、任意で１〜３回、１〜４回、１〜５回、又はそれ以上実施される場合がある。本発明の方法の精製工程ｂ）の副工程ｂ２）における洗浄は、特定の順番の水及び／又はアルコールベース溶媒による洗浄を続けて行う場合がある。例えば、前記カラムは、第一段階で、１回以上、水又は上記アルコールベース溶媒で、好ましくは水で、例えば１回、２回、３回等、例えば水で１回等、洗浄され得る。水又は他の溶媒による第一の洗浄は、好ましくは、溶出液が無色になるまで行われる。続いて、第二の任意の洗浄工程において、異なる溶媒、即ち上記で定義した水又はアルコールベース溶媒、好ましくは上記で特に挙げた濃度のアルコールベース溶媒を使用して、更なる洗浄の手順が続けられ得る。前記カラムは、好ましくは、第二の工程で、１回以上、２回、１〜３回、１〜４回、１〜５回、又はそれ以上、好ましくは１〜３回、上記で定義したアルコールベース溶媒で洗浄され得る。前記アルコールベース溶媒は、好ましくは、上記で定義したものである。そのような第二の任意の洗浄は、好ましくは、１、２、３、４、５（１〜２、１〜３、１〜４、１〜５）、又はそれ以上の（カラムの）ベッド体積分、好ましくは１〜３（カラムの）ベッド体積分を使用して実行される。
【００６１】
ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮植物抽出物を調製及び精製する本発明の方法の精製工程ｂ）の任意の副工程ｂ３）において、濃縮植物抽出物は、カラムから溶出させられる。カラムからの溶出のために、上記の溶媒は、アルコール、例えばエタノール、メタノール、イソプロパノール、好ましくはエタノール又はメタノール、又はケトン、例えばアセトン、又は上記で定義した適切なアルコールベース溶媒から選択される。適切なアルコールベース溶媒として、上記で定義した任意のアルコールベース溶媒、例えば、限定されないが、エタノール／水（ｖ／ｖ）の比率（％）が約１００／００〜７０／３０、例えばエタノール／水（ｖ／ｖ）の比率（％）が約１００／００  、エタノール／水（ｖ／ｖ）の比率（％）が約  ９５／５  、エタノール／水（ｖ／ｖ）の比率（％）が約  ９０／１０  、エタノール／水（ｖ／ｖ）の比率（％）が約  ８５／１５  、エタノール／水（ｖ／ｖ）の比率（％）が約  ８０／２０  、エタノール／水（ｖ／ｖ）の比率（％）が約  ７５／２５、又はエタノール／水（ｖ／ｖ）の比率（％）が約７０／３０のエタノール／水混合物が挙げられる。より好ましくは、前記エタノール／水混合物は、エタノール／水（ｖ／ｖ）の比率（％）が約１００／００〜９５／５、最も好ましくはエタノール／水（ｖ／ｖ）の比率（％）が約９５／５、９６／４、９７／３、９８／２、９９／１又は１００／０のエタノール／水混合物から選択され得る。あるいは、好ましくないが、本発明の方法の精製工程ｂ）の副工程ｂ３）のアルコールベース溶媒は、メタノール／水の比率が上記エタノール／水の混合物におけるものと同じであるメタノール／水混合物、又はイソプロパノール／水の比率が上記エタノール／水の混合物におけるものと同じであるイソプロパノール／水混合物から選択される。精製工程ｂ）の副工程ｂ３）におけるカラムからの濃縮植物抽出物の溶出において、前記溶媒は、１、２、３、４、５（１〜２、１〜３、１〜４、１〜５）、又はそれ以上の（カラムの）ベッド体積分、好ましくは２〜５（カラムの）ベッド体積分を使用してアプライされる。
【００６２】
ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮植物抽出物を調製及び精製する本発明の方法の精製工程ｂ）の任意の副工程ｂ４）において、濃縮植物抽出物は、任意で、上記抽出工程ａ）に記載したように乾燥させられる場合がある。好ましくは、植物抽出物は、限定されないが、スプレー乾燥、バンド乾燥、凍結乾燥等により乾燥させられ、好ましくは不揮発成分の分量が１００％に近く、例えば水の分量が約１０〜０％、不揮発成分が約９０〜１００％で、それぞれの値は乾燥させられる前の植物抽出物、例えば、溶出の後、精製工程ｂ）の任意の副工程ｂ３）に従い取得される植物抽出物の総量に基づいて決定される。
【００６３】
上記調製及び精製する本発明の方法の精製工程ｂ）の任意の副工程ｂ４）における植物抽出物の乾燥は、更に、その後の加熱／高温処理と組み合わせられ得る。該加熱／高温処理は、ａ）において定義されたもので、濃縮植物抽出物の寿命を延長させるために、好ましくは、例えば該抽出物が使用前に保存される場合、該濃縮植物抽出物の保存を可能とするために行われる。
【００６４】
一つの好ましい態様において、ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮植物抽出物を調製及び精製する本発明の方法の精製工程ｂ）における精製は、好ましくは、それが実験室スケールで行われる場合、以下の特定の特徴（精製プロセス：ＰＬ）：
ＰＬ１）工程ａ）において取得された植物抽出物を、非イオン性ポリマー樹脂、好ましくはＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−７  ＨＰ若しくはＸＡＤ−１１８０、又は他の供給元の同等の樹脂を含むカラムにアプライし；
ＰＬ２）該カラムを、１回、好ましくは２回以上、任意で３回水で、好ましくは溶出液が無色になるまで洗浄し；そして該カラムを、１回以上、上記で定義した比率（％）の、例えばエタノール／水（ｖ／ｖ）が約０／１００、エタノール／水（ｖ／ｖ）が約１０／９０、より好ましくはエタノール／水（ｖ／ｖ）が約５／９５のエタノール／水混合物で洗浄し；そして
ＰＬ３）上記で定義したアルコールベース溶媒、好ましくはエタノール／水混合物、より好ましくは上記で定義した比率（％）の、例えばエタノール／水（ｖ／ｖ）が約９５／５〜１００／０、最も好ましくはエタノール／水（ｖ／ｖ）が約９６／４のエタノール／水混合物を、好ましくは２〜５ベッド体積分使用して、濃縮植物抽出物を溶出し、
ＰＬ４）必要に応じて、工程ＰＬ３）において取得した濃縮植物抽出物を乾燥させる；
特定の特徴を含む。
【００６５】
特に好ましい態様において、ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮植物抽出物を調製及び精製する本発明の方法の精製工程ｂ）における精製は、好ましくは、それが産業スケールで行われる場合、以下の特定の特徴（精製プロセス：ＰＦ）：
ＰＦ１）好ましくは浸透（型抽出）プロセス（工程ＥＰ１〜ＥＰ７を含むプロセス）を使用して、より好ましくはエタノール／水（ｖ／ｖ）の比率（％）が約２５／７５のエタノール／水の混合物を用いた浸透プロセスを使用して、工程ａ）で取得した植物抽出物を、好ましくはＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−７  ＨＰ若しくはＸＡＤ−１１８０又は他の供給元の同等の製品から選択される、非イオン性ポリマー樹脂を含むカラムにアプライし；そしてカラム透過液をそのカラムに再アプライし、好ましくはこれを３回繰り返し；
ＰＦ２）該カラムを、１回以上、好ましくは透過液が無色になるまで水で洗浄し；そして該カラムを、１回以上、好ましくはベッド体積の２倍の、エタノール／水の比率（％）が約１０／９０〜約０／１００（ｖ／ｖ）のエタノール／水の混合物で洗浄し；そして
ＰＦ３）エタノール／水の比率（％）が約９５／５〜約１００／０（ｖ／ｖ）の、好ましくは約９６／４、９７／３、９８／２、９９／１又は１００／０（ｖ／ｖ）の、最も好ましくは約９６／４（ｖ／ｖ）の、エタノール／水の混合物を使用して、該カラムから前記濃縮植物抽出物を溶出し；
ＰＦ４）必要に応じて、工程ＰＦ３）において取得した濃縮植物抽出物を乾燥させる；
特定の特徴を含む。
【００６６】
特に一層好ましい態様において、ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮植物抽出物を調製及び精製する本発明の方法の精製工程ｂ）における精製は、好ましくは、それが産業スケールで実施されるとき、工程ｂ）が、以下の特定の特徴（精製プロセスＰＳ）：
ＰＳ１）好ましくは浸漬（型抽出）プロセス（工程ＥＰ１〜ＥＰ７を含むプロセス）を使用して、より好ましくはエタノール／水（ｖ／ｖ）の比率が約６５／３５のエタノール／水の混合物を用いて、工程ａ）で取得した植物抽出物を、好ましくはＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−７  ＨＰ若しくはＸＡＤ−１１８０、又は他の供給元の同等の樹脂から選択される、非イオン性ポリマー樹脂を含むカラムにアプライし、カラム透過液をそのカラムに再アプライし、好ましくはこれを３回繰り返し；
ＰＳ２）該カラムを、１回以上、好ましくは透過液が無色になるまで水で洗浄し、そして該カラムを、１回以上、好ましくはベッド体積の２倍の、エタノール／水の比率（％）が約１０／９０〜約０／１００（ｖ／ｖ）のエタノール／水の混合物で洗浄し；そして
ＰＳ３）エタノール／水の比率（％）が約９５／５〜約１００／０（ｖ／ｖ）の、好ましくは約９６／４、９７／３、９８／２、９９／１又は１００／０（ｖ／ｖ）の、最も好ましくは９６／４（ｖ／ｖ）の、エタノール／水の混合物を使用して、該カラムから前記濃縮植物抽出物を溶出する
特定の特徴を含む。
【００６７】
上記に挙げたいずれかの代替的手段は、互いに組み合わせられる場合がある。特に、産業的抽出プロセスＥＰ又はＥＭ（又は実験室抽出プロセス）は、適宜、産業的精製プロセスＰＦ又はＰＳと組み合わせられ得る。
【００６８】
濃縮植物抽出物
本発明は、更に、上記ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮植物抽出物を調製及び精製する本発明の方法の直接生産物としてのソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮植物抽出物、即ち上記本発明の方法により取得された、又は取得され得るソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮植物抽出物に関する。そのような濃縮植物抽出物は、特に、その特定の及び有利な組成に特徴付けられ、該組成は、上記本発明の方法における特定の特徴を使用した場合にのみ実現され得る。より具体的には、上記本発明の方法を使用して直接取得された、又は取得され得る、そのような本発明に係る濃縮植物抽出物は、好ましくは、以下の組成を示す。
【００６９】
有効成分
ビタミンＤ３代謝物は、好ましくは活性ビタミンＤ３の濃度が３００μｇ／ｇ以上、好ましくは５００μｇ／ｇ超、なおもより好ましくは２０００μｇ／ｇ超で、好ましくは全体として１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３と解析的に決定され、好ましくは１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３のグリコシド又は異なるグリコシドの混合物で、又はより好ましくは、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３−１β−グルコピラノシドであり、以下の式（Ｉ）：
【化２】
0005390594.tif 000003
で表され；並びに
活性ケルセチングリコシドは、１００ｍｇ／ｇ以上、より好ましくは１５０ｍｇ／ｇ以上、そして最も好ましくは２００ｍｇ／ｇ以上で、加水分解後ケルセチンと決定される。
【００７０】
不活性成分
任意で、本発明の方法により取得される本発明の濃縮植物抽出物は、更に、以下の内容量により特徴付けられる：
−無機成分：好ましくは最大で６％（Ｃａ、Ｋ、Ｍｇ及びＳの元素を０．１〜１％含み、そしてＢｒ、Ｃｌ、Ｐ、Ｓｉ、Ａｌ、Ｎａ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｚｎの元素を０．１％未満含む）；
−炭水化物：好ましくは５０〜７５％；
−タンパク質：好ましくは２％未満（アレルギー発生の可能性を顕著に低下させる）；
−脂肪：好ましくは２％未満；
【００７１】
毒性成分
加えて、本発明の方法により取得される本発明の濃縮植物抽出物は、アルカロイドのレベルが低いことも特徴であり得る。ソラヌム（Ｓｏｌａｎｕｍ）属は毒性アルカロイドを含むこと、特にソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）がソラソジンを含むことが知られているため、該特徴は顕著かつ有利である。故に、本発明により取得される本発明の濃縮植物抽出物は、アルカロイド（特にソラソジン）が検出限界の１０μｇ／ｇを下回ることを、追加的な特徴とし得る。
【００７２】
上記のソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮植物抽出物を調製及び精製する本発明の方法により取得される本発明の濃縮植物抽出物は、従来の抽出物と比べて、とりわけ、以下の特徴を有する：
・前記両有効成分：１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３及びフラボノールのケルセチン（いずれもグリコシド結合形態）の内容量が増大している。
・本来的に水溶性であるため、単純な（複雑ではない）製剤化が可能であり、界面活性剤の添加を必要としない。
・褐色化／変色し難い（褐色化／変色反応は、フラボノール等の植物フェノールの内容量を低下させるので望ましくない）。
【００７３】
本発明の方法により取得される濃縮植物抽出物は、とりわけ、従来の抽出物と比較して、以下の如き優位の生物学的特徴を有する。
【００７４】
・最も有効な成分の１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３のみにより、ビタミンＤ活性が高い。
【００７５】
・グリコシド構造（内性活性ビタミンＤ代謝物の１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３のプロドラッグ形態として振舞う）により、元の化合物の１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３よりも上記式（Ｉ）の１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３−１β−グルコピラノシドの方が生物学的耐性に優れている。
【００７６】
・ビタミンＤ３単独の場合と比較して治療効果のエントリーが早くなる。
【００７７】
・本発明の濃縮植物抽出物において、前記両骨有効成分の、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３及びフラボノール、特にケルセチンの内容量が増大して存在していることにより、治療濃度域が顕著に拡張されるため、高カルシウム血症のリスクが低下する。
【００７８】
・本発明の植物抽出物は、食肉用の動物において、歩行障害の緩和及び骨強度の改善に優位な効果を示す。
【００７９】
・本発明の植物抽出物は、卵殻の質の改善に高度に作用する。
【００８０】
・本発明の植物抽出物は、出産の過程での血中カルシウムの低下（授乳熱）の防止に高度に作用する。
【００８１】
・更に、本発明の植物抽出物は、ＦＤＡに認可されたヒト骨粗鬆症における前臨床ラットモデルで高度に活性であった。一つの実験において、ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の未精製抽出物を、卵巣を摘出した雌ラット（ヒト女性の閉経後骨粗鬆症を模す動物モデル）に適用すると、抗骨粗鬆症効果を示したが、軟組織中にカルシウムの沈着も起こった。しかし、上記の如き本発明の方法により取得された同一のビタミンＤ内容量の精製抽出物は、抗骨粗鬆症効果を示したが、軟組織の石灰化は認められなかった。
【００８２】
上記驚くべき結果に基づき、本発明の一つの態様は、好ましくは以下の成分を含む、（合成）植物抽出組成物にも関する：
ａ）有効成分のビタミンＤであり、好ましくは１−α−ヒドロキシ置換ビタミンＤ代謝物、又はより好ましくは１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３で、天然の、又は合成した、遊離又はグリコシド結合形態のもの、好ましくは全体として１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３と解析的に決定され、より好ましくは１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３のグリコシド、若しくは異なるグリコシドの混合物、又はより好ましくは１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３−１β−グルコピラノシドであり、以下の式（Ｉ）：
【化３】
0005390594.tif 000004
で表され、好ましくは活性ビタミンＤ３の濃度が、３００μｇ／ｇ以上、好ましくは５００μｇ／ｇ超、なおもより好ましくは２０００μｇ／ｇ超である。
ｂ）１００  ｍｇ／ｇ以上、より好ましくは１５０  ｍｇ／ｇ以上、そして最も好ましくは  ２００  ｍｇ／ｇ以上の濃度の、１つ以上の（活性）フラボノール。
【００８３】
本発明において、本発明の（合成）植物抽出組成物中に含有されるフラボノールは、当該技術分野で既知の任意のフラボノール又はそれらのグリコシドから、好ましくは骨の成長に有益な治療効果を有することが知られているフラボノール又はそれらのグリコシドから選択され得る。そのようなフラボノールは、ミリセチン（ｍｙｒｉｃｅｔｉｎ）、ケルセチン、ケンフェロール（ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ）、フィセチン（ｆｉｓｅｔｉｎ）、イソハムネチン（ｉｓｏｈａｍｎｅｔｉｎ）、パキポドール（ｐａｃｈｙｐｏｄｏｌ）、ラムナジン（ｒｈａｍｎａｚｉｎ）、パツレチン（ｐａｔｕｌｅｔｉｎ）、ユーパリチン（ｅｕｐａｌｉｔｉｎ）、ユーパトリチン（ｅｕｐａｔｏｌｉｔｉｎ）、５−ヒドロキシフラボン、６−ヒドロキシフラボン、７−ヒドロキシフラボン、５−ヒドロキシ−７−メトキシフラボン、７−ヒドロキシ−５−メトキシフラボン、又はそれらのグリコシド等の化合物から選択され得る。より好ましくは、本発明の（合成）植物組成物中に含有されるフラボノールは、上記フラボノールのグリコシドから、例えばミリセチン、ケルセチン、ケンフェロール、フィセチン、イソハムネチン、パキポドール、ラムナジン、パツレチン、ユーパリチン、ユーパトリチン、５−ヒドロキシフラボン、６−ヒドロキシフラボン、７−ヒドロキシフラボン、５−ヒドロキシ−７−メトキシフラボン、７−ヒドロキシ−５−メトキシフラボン等のグリコシドから選択され、特に好ましくはケルセチン及びそのグリコシドから選択され得る。
【００８４】
医薬組成物
他の特定の態様において、本発明は：
（ａ）上記本発明の濃縮植物抽出物又は上記（合成）植物組成物（又は植物抽出物の成分、特に上記で定義した、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３グリコシド及びフラボノール、より具体的にはケルセチングリコシド）；及び
（ｂ）任意で医薬として許容される担体及び／又はビヒクル
を含む医薬組成物にも関する。
【００８５】
本発明の医薬組成物は、（ａ）上記本発明の（合成）植物組成物、又はその成分を、好ましくは上記濃度で含み得る。
【００８６】
本発明の医薬組成物は、更に、（ｂ）医薬として許容される担体及び／又はビヒクルを含み得る。本発明において、本発明の医薬組成物の医薬として許容される担体又はビヒクルは、典型的には、一緒に製剤化される前記植物抽出物の成分、特に１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３グリコシド及びフラボノール、より具体的にはケルセチングリコシドの薬理活性を破壊しない非毒性の担体又はビヒクルをさす。
【００８７】
本発明の医薬組成物に使用され得る医薬として適切な単体又はビヒクルは、典型的には、固体又は液体の担体又はビヒクルに分類され得る。ここで、具体的な定量法は、使用される各担体又はビヒクルの粘性に依存し得る。
【００８８】
ここで、固体の担体及びビヒクルは、典型的には、例えば、限定されないが、イオン交換体、アルミナ、アルミニウムステアレート、レシチン、及び固体の形態で提供される塩、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素ナトリウム、リン酸水素カリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、又はポリビニルピロリドン、蝋、ポリエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー、羊毛脂、糖類、例えばラクトース、グルコース及びスクロース；賦形剤、例えばマルトデキストリン、キシリトール、澱粉、例えばコーンスターチ又はポテトスターチ；又はセルロースベースの物質、例えばセルロース及びその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロース；微細化トラガカント；麦芽；ゼラチン；獣脂；（固体）滑剤、例えばステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム；硫酸カルシウム；湿潤剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム；着色料；香料；薬物（活性薬剤）の担体；錠剤形成剤；安定化剤；抗酸化剤；保存料；コーティング剤等である。
【００８９】
例えば水性又は油性の懸濁物用の液体の担体又はビヒクルは、典型的には、限定されないが、例えば、水；パイロジェンフリー水；イオン交換体の溶液、例えばアルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、又は血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン；アルギン酸；等張生理食塩水溶液又はリン酸緩衝溶液、リンゲル溶液、等張塩化ナトリウム溶液等、又は可溶化形態で提供される塩又は電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸塩、例えばリン酸水素ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、又は（他の）緩衝物質、例えばグリシン、ソルビン酸、ソルビン酸ナトリウム；ポリオールの液体溶液、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、グリセロール、１，３−ブタンジオール、ソルビトール、マンニトール；滅菌固定油、任意の適切な無味の固定油、例えば合成モノ−又はジ−グリセリド、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、脂肪酸、例えばオレイン酸及びそのグリセリド誘導体、天然の医薬として許容される油、例えば植物油、例えば落花生油、綿実油、ゴマ油、トウモロコシ油及びテオブロマ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）の油；オリーブ油又はヒマシ油、特にそれらがポリオキシエチル化したものである。これらの液体の担体又はビヒクルは、長鎖アルコール希釈剤又は分散剤、例えばカルボキシメチルセルロース又は類似の分散剤、又は通常使用される界面活性剤又は乳化剤、例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）、Ｓｐａｎｓ、及び他の乳化剤、又は液体の形態で提供される生体利用可能性亢進剤等を含む場合もある。
【００９０】
本発明の医薬組成物は、経口投与、直腸投与、リザーバー移植、又は任意の非経口投与により投与され得る。
【００９１】
好ましくは、上記本発明の医薬組成物は、経口（直腸）投与可能な剤形で経口（直腸）等よされ得て、限定されないが、カプセル、錠剤、水性懸濁液又は溶液であり得る。経口用の錠剤の場合、通常使用される担体は、ラクトース及びコーンスターチである。滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムも、典型的には添加される。必要に応じて、幾つかの甘味料、香料又は着色料が添加される場合もある。カプセルの形態で経口投与される場合、使用される希釈剤として、ラクトース及び乾燥コーンスターチが挙げられる。カプセルの調製において特に担体及びビヒクルが使用され得て、好ましくは賦形剤として、マルトデキストリン、キシリトール、澱粉、例えばコーンスターチ又はポテトスターチ等から選択される。錠剤の調製において、特に担体及びビヒクルが使用され得て、好ましくは滑剤、例えばステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム；賦形剤、例えばマルトデキストリン、キシリトール、澱粉、例えばコーンスターチ又はポテトスターチ；及び錠剤に適したコーティング剤等から選択されるこれらの錠剤及びカプセルの徐放型、即ち有効成分を持続的に放出する型も想定され得て、該徐放型は、好ましくは上記有効成分を含み、これが生分解性生体ポリマー中に埋め込まれ、又は上記有効成分は被覆材で包まれ（遅延放出用）ることにより、有効成分の分散をコントロールできる。水性懸濁液が経口使用を要するとき、前記有効成分は、例えば乳化剤及び懸濁材と組み合わせられ得る。そのような製剤は、直腸投与にも、又は移植したリザーバーを介した投与にも使用され得る。
【００９２】
本発明の医薬組成物は、典型的には、「安全かつ有効な量の」１つ以上の前記両有効成分、即ち上記１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３グリコシド及びフラボノール、より具体的にはケルセチングリコシドを含む。本明細書中で使用されるとき、「安全かつ有効な量の」とは、これらの主成分が、本明細書中の疾患又は症状の正の改変を顕著に誘導するのに十分な量を意味する。一方、同時に、「安全かつ有効な量の」とは、深刻な副作用を避けるのに十分な少量であり、即ち、利益とリスクとが妥当なバランスを取っていることを意味する。これらの限度の決定は、典型的には、妥当な医師の判断の範囲内にある。前記両有効成分、即ち上記１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３グリコシド及びフラボノール、より具体的にはケルセチングリコシドの「安全かつ有効な量」は、処置が行われる条件に応じて、また処置を受ける患者の年齢及び健康状態、体重、総体的健康、性別、食生活、投与の時間、排出の速度、薬物の組み合わせ、採用した特定の自己抗原タンパク質及び／又は抗体、症状の重症度、処置の期間、付随する治療の性質、使用される具体的な医薬として許容される担体、並びに医師の知識と経験の中での類似の要素との関係で、更に変化し得る。本発明の医薬組成物は、ヒトに使用され得て、及び獣医学的目的にも使用され得る。
【００９３】
本発明のソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）植物抽出物及び本発明の医薬組成物
本発明の医薬組成物、上記本発明のソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）濃縮植物抽出物を調製及び精製する方法により取得された、又は取得され得る、本発明の濃縮植物抽出物、本発明の（合成）植物抽出組成物、又は本発明の濃縮植物抽出物又は本発明の（合成）植物抽出組成物の２つの主成分、即ち上記１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３グリコシド及びフラボノール、より具体的にはケルセチングリコシドの両方は、本明細書中に定義した疾患のいずれかを処置するためにそれを必要とするヒト又は動物に投与され得る。
【００９４】
前記疾患は、特に、骨量減少に関連する疾患、例えば骨減少症、又は特に人類の（加齢又は閉経後）骨粗鬆症であり得る。
【００９５】
前記疾患は、特に、好ましくは家禽、より好ましくはニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ及びアヒルにおける、脛骨の軟骨形成不全、及び他の骨に関連し、石灰化に関連する四肢の問題であり得る。
【００９６】
前記疾患は、特に、乳を生産する動物、特に乳牛及び他の乳を生産する動物の、分ぺん不全麻痺としても知られる出産期の低カルシウム血症麻痺、又は授乳熱であり得る。また、乳牛及び他の乳を生産する動物における分ぺん中の血漿カルシウムの減少に関連する任意の疾患であってもよい。ここで、授乳熱は、出産期に、母親の血液中に循環するカルシウムを使い果たしたときに発症する、乳を生産する動物における代謝疾患である。内性的なカルシウムのホメオスタシスは、食物又は骨から、血中カルシウムの低下を防ぐのに十分なカルシウムを動員することが出来ない。場合によっては、カルシウム濃度が低いと、筋肉の麻痺が引き起こされる。現在の処置は、出産期に大量のカルシウムを投与するものである（Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｐａｒｔｕｒｉｅｎｔ  Ｐａｒｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｃｏｗｓ参照）が、これは、本発明の植物抽出物の投与に劣っている。
【００９７】
本明細書に定義する疾患のいずれかに対する投与は、本発明の医薬組成物において、特に投与方法及び投与されるべき安全かつ有効な量が求められる。
【００９８】
故に、本発明の更なる態様は、本明細書中に定義した疾患又は症状を予防又は処置するための本発明の医薬組成物を調製するための、特に上記で定義したソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）濃縮植物抽出物を調製及び精製する本発明の方法により取得された、又は取得され得る本発明の濃縮植物抽出物の使用、本発明の（合成）植物抽出組成物、又は本発明の濃縮植物抽出物又は本発明の（合成）植物抽出組成物の２つの主成分、即ち上記１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３グリコシド及びフラボノール、より具体的にはケルセチングリコシドの両方の使用にも関する。特に、該医薬組成物は、骨量減少に関連する疾患、例えば骨減少症、又は特にヒトの（加齢又は閉経後）骨粗鬆症の予防及び処置、特に成人の骨減少症の予防及び処置、又はペットの骨減少症の予防及び処置；好ましくは家禽、より好ましくはニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ及びアヒルの脛骨の軟骨形成不全及び他の骨に関連し石灰化に関連する四肢の問題の予防又は処置、例えば骨量及び破壊強度の改善；家禽の卵殻の強度及び厚さの改善；家禽及びブタのカルシウム及びリンの取り込みを改善することによる、尿及び堆肥へのリンの排出（の増大）の減少又は防止；乳を生産する動物の分ぺん不全麻痺としても知られる出産期の低カルシウム血症麻痺又は授乳熱の予防又は処置に使用され得る。また、該医薬組成物は、乳牛及び他の乳を生産する動物の出産期の血漿カルシウムの減少に関連する任意の疾患の予防又は処置にも使用され得る。
【００９９】
本発明の他の態様は、ヒト又は獣医が使用するための栄養補助食品としての、上記で定義したソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）濃縮植物抽出物を調製及び精製する本発明の方法により取得された、又は取得され得る本発明の濃縮植物抽出物の使用、本発明の（合成）植物抽出組成物、又は本発明の濃縮植物抽出物又は本発明の（合成）植物抽出組成物の２つの主成分、即ち上記１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３グリコシド及びフラボノール、より具体的にはケルセチングリコシドの両方の使用に関する。そのような食品添加物は、上記で挙げた疾患、特に骨量の減少に関連する疾患、例えば骨減少症又は骨粗鬆症、脛骨の軟骨形成不全、乳を生産する動物の分ぺん不全麻痺又は授乳熱等のいずれの症状も発生又は検出されていない時点で投与される。即ち、非治療的理由で、あるいは上記疾患の予防手段として投与される。
【０１００】
最後に、本発明は、上記で定義したソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）濃縮植物抽出物を調製及び精製する本発明の方法により取得された、又は取得され得る本発明の濃縮植物抽出物、本発明の（合成）植物抽出組成物、又は本発明の濃縮植物抽出物又は本発明の（合成）植物抽出組成物の２つの主成分、即ち上記１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３グリコシド及びフラボノール、より具体的にはケルセチングリコシドの両方、及び／又は本発明の医薬組成物、及び任意で技術指示又は取扱説明書を含む、好ましくは上記で挙げたいずれかの使用、処置又は治療のための、キット、特にキットの部分にも関する。
【０１０１】
本発明の利点
本発明は、上記で定義したソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）濃縮植物抽出物を調製及び精製する方法を提供する点で有利であり、これにより、個別の２つの有効成分、即ち１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３グリコシド（１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３グリコシド−β−グルコピラノシドを含む）及びフラボノール、より具体的にはケルセチングリコシドの分量が増大（濃縮）した前記植物抽出物を取得できる。上記で定義したソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）濃縮植物抽出物は、科学的に受け入れられているヒト閉経後骨粗鬆症の前臨床モデルにおいて、驚異的に活性であることが証明された。また、本質的に活性のビタミンＤ代謝物の濃縮を補助し得るため、腎臓に機能障害を有する対象に適している。また、本発明の濃縮植物抽出物は、動物におけるカルシウム及びリン酸の取り込み、骨量及び破壊強度の改善、家禽の脛骨の軟骨形成不全の予防、及び乳を生産する動物における分ぺん不全麻痺として知られる乳牛の出産期の血漿カルシウムの低下の防止に、驚異的に活性である。特に、本発明の濃縮植物組成物は、２つの有効成分、即ち１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３グリコシド（１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３グリコシド−β−グルコピラノシドを含む）及びフラボノール、より具体的にはケルセチングリコシドの分量が増大（濃縮）していることにより、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３において知られている本来極めて狭い治療濃度域を驚異的に拡張する点で有利である。これにより、本発明の濃縮植物抽出物は、遊離ビタミンＤ３単独よりも驚くほど良好な耐容性を有する。更に、単独で使用される前記化合物１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３と比較して、高カルシウム血症のリスクが低下し、臨床使用においてより低濃度で使用され、故に、元の化合物単独よりもヒトにとって安全であり得る。本発明の量有効成分の生物学的応答の発生がビタミンＤ単独と比較して早いことも見出され、これは、本発明の濃縮植物抽出物中の１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３及び１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３−β−グルコピラノシドの存在によると考えられる。最後に、前記植物の生の材料に含まれる毒性の成分は、本発明の濃縮植物組成物中に、検出可能な量で存在しない。上記本発明のソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の濃縮植物抽出物は、変色の程度が低く、そして、タンパク質の分量が低いため、アレルギー性も低い。
【０１０２】
以下の図は、本発明を更に説明することを意図する。それらは、本発明の対象をそれらの範囲内に限定することを意図しない。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】雌雄間で骨粗鬆症時における骨量に対する影響を測定したものを示す。図１に示されているように、全生涯にわたり、栄養は、最も重要な要素である。特定の医薬は、４５歳超の年齢の患者において重要な役割を果たす。
【０１０４】
【図２】精製した抽出物を解析用Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラムを用いてのクロマトグラフィー分離にかけることによる、本発明の濃縮植物抽出物の特徴付けを示す。サンプルの一部を加水分解し、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を測定した。分子量マーカーとして、１４００、４３００及び６８００Ｄａｌｔｏｎの水溶性ポリスチレンを使用した。図２に示されているように、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３は本発明の濃縮植物抽出物の主要な成分である。
【０１０５】
【図３】精製した抽出物を解析用Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−３０カラムを用いての異なる種類のクロマトグラフィー分離にかけることによる、本発明の濃縮植物抽出物の特徴付けを示す。サンプルの一部を加水分解し、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を測定した。分子量マーカーとして、１３５５Ｄａｌｔｏｎのコバラミンを使用した。図３に示されているように、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３は本発明の濃縮植物抽出物の主要な成分である。
【０１０６】
【図４】以下の式で計算される前記抽出の効率を示す：       ｙｆ＝ＶＤＭ（抽出物）．［Ｑｕ（抽出物）／１０００］．ｅｆ実験室での実験の結果、良好性の要素は２つの最適値をとり、それらは産業スケールのプロセスにも適用できる。
【０１０７】
【図５】ＵＶ−、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにより明らかにされた成分１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の構造を示す。
【０１０８】
【図６】前記取得された調製物の高効率薄層クロマトグラフィーによる特徴付け、並びにスタンダード並びにイチョウ及びサンザシ抽出物との比較を示す（実施例３（ｉｉｉ）参照）。以下の条件で行った：プレート：ＵＶインジケーター付きシリカゲルＧ  １０ｘ１０ｃｍ  Ｍｅｒｃｋ（Ｃａｍａｇ  ＡＧ，  Ｍｕｔｔｅｎｚ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）溶媒：酢酸エチル／蟻酸／酢酸／水（１００＋１１＋１１＋２６）。プレコンディション４５分、ランタイム４５分。検出：Ｎａｔｕｒｓｔｏｆｆ−Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃａｍａｇ  ＡＧ，  Ｍｕｔｔｅｎｚ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）アプライレーン１：ケルセチン（ｒｆ０．８８；０．５６μｇ）；ハイペロシド（ｈｙｐｅｒｏｓｉｄ）（ｒｆ０．５５；１．２５μｇ）；クロロゲン酸（ｒｆ０．４２；１．２μｇ）；ルチン（ｒｆ０．３７；０．７３μｇ）レーン２：ケンフェロール（ｒｆ０．９０；０．２５μｇ）；イソケルシトリン（ｒｆ０．５７；１．２５μｇ）；ハイペロシド（ｒｆ０．５４；１．２５μｇ）；レーン３：コーヒー酸（ｒｆ０．８２；０．１μｇ）；イソケルシトリン（ｒｆ０．５７；１．２５μｇ）レーン４：精製抽出物（Ｂａｔｃｈ  １；４１μｇ；ケルセチン及びケルセチングリコシドを指示する）レーン５：精製抽出物（Ｂａｔｃｈ  ２；４１μｇ；ケルセチン及びケルセチングリコシドを指示する）レーン６：ギンコ・ビロバ（ｇｉｎｋｇｏ  ｂｉｌｏｂａ）抽出物（市販品；１０μｌ）レーン７：サンザシ抽出物（市販品；２０１μｇ）レーン８：レーン１と同じスタンダードレーン９：従来技術で取得した比較用精製抽出物（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０によるクロマトグラフィー）（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０で精製した抽出物の比較用サンプル。ビタミンＤ活性の増大率が高度である（２０００μｇ／ｇ）一方、フラボノールが殆ど存在しない）
【０１０９】
【図７】出産期の血漿カルシウムの進行（分ぺん不全麻痺）を示す。第一の柱は、本発明の精製植物抽出物（精製抽出物）、第二の柱はカルシウム塩のボーラス適用による処置（Ｂｏｖｉｃａｌｃ，  Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ、取扱説明書に従い適用した）。本図に示されているように、いずれの処置も等しく血漿カルシウムの低下を防止することが出来る（カルシウムスタンダードを用いた場合よりも、本発明の精製植物抽出物（精製抽出物）を用いた場合の方が、僅かにカルシウムレベルが良好である）。図７に示されているように、処置をしない場合、血漿カルシウムの顕著な低下は免れない。各柱は、以下の条件を指す。ａ．ｐ：分ぺん後２４時間、ｐｐ：分ぺん時点（出産）；ｐｌｕｓ−１２：出産後１２時間；ｐｌｕｓ−７２：出産後７２時間。
【０１１０】
【図８】未処理のウシにおける出産期の血漿カルシウムレベルの変化を描いている。
【０１１１】
【図９】骨粗鬆症のラットモデルを６ヶ月処置した後の右脛骨の骨量を示す（実施例４も参照されたい）。本図に示されているように、本発明の組成物による処置は、卵巣摘出により誘導される骨量の減少を防止しただけでなく、本組成物は、偽手術（ｓｈａｍ−  ｏｐｅｒａｔｅｄ）コントロールの脛骨の骨量をも増大させた。
【実施例】
【０１１２】
以下の実施例は、本発明を更に解説することを意図する。それらは、本発明の対象を限定するそれらに限定することを意図しない。
【０１１３】
実施例１−抽出
ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）における公知の抽出方法では、クロロホルム−メタノールを用いた抽出が最も効率的な手法であるが、この方法は、体積が大きくなり、そして毒性の試薬が混入するので、利用できない。他の公知の抽出方法として水を用いるものがあるが、ビタミンＤの活性が低いので、これも本発明の方法に劣る。対照的に、本発明は、実施例１に記載されるように、毒性の試薬を使用しない、顕著に高収量の、ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）植物の好ましくは乾燥葉を抽出及び精製するための、技術的に最適化した、及びエコロジカルなプロセスを提供する。
【０１１４】
実施例１Ａ−実験室スケールの抽出（プロセスＬ）
ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の粉砕した葉１ｇを、ＡＳＥ−１００装置（Ｄｉｏｎｅｘ，  ＵＳＡ）中で自動的に溶媒抽出にかけた。溶媒として、以下のアルコールベース溶媒を使用し、そして質量を取得した（表１参照）。
【０１１５】
【表１】
0005390594.tif 000005
抽出：１）Ｄｉｏｎｅｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｏｌｔｅｎ  ＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄのＡＳＥ−１００モデルを使用して、温度５０℃、５サイクルの条件で行った。
収量：２）乾燥抽出物ｍｇ／生の材料ｇ
ＶＤＭ：３）解析により決定された加水分解後の１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３測定値
Ｑｕ：４）Ｐｈ．  Ｅｕｒ．に従う、酸加水分解後ケルセチングリコシド
ｅｆ：５）経験的プロセス要素（ｅｍｐｉｒｉｃａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆａｃｔｏｒ）
ｙｆ：６）推定されるプロセスの良好性であり、式ｙｆ＝ＶＤＭ＊（Ｑｕ／１０００）＊ｅｆで求められる。
【０１１６】
前記抽出の効率は、以下の式により計算された：
ｙｆ＝ＶＤＭ（抽出物）．［Ｑｕ（抽出物）／１０００］．ｅｆ
ここで、［ＶＤＭ］及び［Ｑｕ］は、抽出物１ｇあたりの値として計算される。要素［ｅｆ］は、コスト、エコロジー及び該抽出物の品質（例えば溶解度）として、経験的要素（ｅｍｐｉｒｉｃａｌ  ｆａｃｔｏｒ）を推定する。実験室での実験の結果、取得される良好性の要素は、図４のグラフとして表現される。
【０１１７】
上記関数による図４のグラフで見られる２つのピークは、本発明の基準を満たし、満足させるもので、そして公知の抽出方法を上回る、本プロセスのメリットを表す。他の適切かつ広く使用される溶媒を用いた抽出は、最適な組成の生産物を取得するのに好ましくない。
【０１１８】
エタノール／水が２５／７５の溶媒混合物のピークは特に興味深く、乾燥抽出物が優秀な水溶性を有し、そのような抽出物は任意の経口投与に適し、例えば、乳化剤の添加（通常の脂溶性ビタミンにおけるように）を要さずに飲料水に混入して投与することが出来る。エタノール／水が６５／３５の溶媒を使用して取得した抽出物の水溶性は低いので、例えば乳化剤を用いた場合は例えば不溶性製剤等に、乳化剤を必要とせずに、錠剤、カプセル等の他の形態で使用され得る。
【０１１９】
本実験の結果、抽出の効率のｙｆが３以上で、満足させるもので、既知の抽出方法を上回り、そして本発明の基準を満たす。他の適切かつ広く使用されている溶媒を用いた抽出は、最適な組成の生産物を取得するのに好ましくない。
【０１２０】
実験室プロセスＥＬで取得された抽出物の精製から取得されたデータを以下に示す。
【表２】
0005390594.tif 000006
【０１２１】
表１Ｂ−産業スケールでの抽出
ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の乾燥葉（含水量５〜１５％）１００ｋｇを、安定化剤として０．１％アスコルビン酸を含む、２５〜７５％のエタノール−水（ｗ／ｗ）混合物１５〜３０’０００リットル（好ましくは２５’０００リットル）を用いて抽出した。浸透は、４個の繰り返し充填されるベセル中、５５℃で、１サイクル２４時間で、最新式のプラント中、流速１．０００リットル／時間で実行された。取得される液体のｐＨはコントロールされ、最終的には、酢酸の添加によりｐＨ５．５〜６．５に調整される。取得される抽出物が回収され、そして減圧下で、不揮発成分の分量が３５％になるまで濃縮させられた。上記のように、乾燥処理が実行された。プロセスＥＰで取得された抽出物の精製から取得されたデータを以下に示す。
【表３】
0005390594.tif 000007
【０１２２】
（ｉｉ）プロセスＥＭ
浸透に代えて、浸漬プロセスも使用され得る。１０００ｋｇの乾燥葉を、混合装置及びダブルジャケット加熱システムを備えた適切なステンレススチールのリアクター中に充填した。９’０００リットルのエタノール−水（４０〜８０％ｗ／ｗ、０，１％アスコルビン酸を含む）を添加した。該混合物を、攪拌しながら、４０〜７５℃（好ましくは５５℃）で６〜４８時間（好ましくは２４時間）加熱し、続いてフィルタープレス中で液体／固体を分離する。単離された葉は、８’０００リットルの溶媒混合物を使用して、同じ手順により、２回目の抽出に供された。該抽出物は濾過され、ｐＨが酢酸で５．５〜６．５に調整され、そして２段階減圧蒸発ユニット中で、不揮発成分の分量が２５〜５０％になるまで濃縮させられた。上記のように、高温処理が実行された。プロセスＲＭで取得されたデータを、以下に示す。
【表４】
0005390594.tif 000008
【０１２３】
（ｉｉｉ）プロセスＥＰ＋ＥＭ
（ｉ）及び（ｉｉ）（プロセスＥＰ＋ＥＭ）の濃縮抽出物を両方とも上記で定義した高温処理に付し、それらを直接以降の工程に使用し、又はスプレー乾燥、バンド乾燥又は凍結乾燥させられた。
【０１２４】
実施例２−精製
実施例２Ａ−実験室スケールでの精製（プロセスＰＬ）
約３００ｍｇの生の抽出物を１ｍｌの水に溶解し（約３０％（ｗ／ｖ）の溶液）、これをベッド体積９ｍｌの、試験される樹脂を充填したカラム（該カラムは仕様書に従いプレコンディションした）にアプライした。全ての溶液は、流速約０．３ベッド体積／分でアプライされる。該カラムは、３ベッド体積の水で洗浄される。溶出は、９５／０５（ｖ／ｖ）のエタノール／水を３ベッド体積使用して行われ、溶出物は、解析のために回収された。カラムは３ベッド体積のアセトンで再生させられる。３つのフラクション、即ち洗浄に用いた水（Ｄ１０５／１Ａ）、エタノール溶出液（Ｄ１０５／１Ｂ）、及び再生用のアセトン（Ｄ１０５／１Ｃ）の全てが回収され、乾燥するまで蒸発させられ、そして解析に付された。カラムは、再利用させられる前に、２ベッド体積のエタノール、２ベッド体積の５０％エタノール及び４ベッド体積の水でコンディショニングさせられた。
【０１２５】
実験室プロセス精製（ＰＬ）。この表は、以下の４つの試行において取得された全ての実験データを記載する：
・試行１：エタノール／水が２５／７５（ｖ／ｖ）の溶媒及びカラムＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ  １１８０を使用して取得した抽出物
・試行２：エタノール／水が２５／７５（ｖ／ｖ）の溶媒及びカラムＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ７ＨＰを使用して取得した抽出物
・試行３：エタノール／水が６５／３５（ｖ／ｖ）の溶媒及びカラムＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ  １１８０を使用して取得した抽出物
・試行４：エタノール／水が６５／３５（ｖ／ｖ）の溶媒及びカラムＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ７ＨＰを使用して取得した抽出物
全ての試行において、上記方法に従い、３つのフラクション：洗浄用の水（Ａ）、溶出物（Ｂ）及び再生用の液体（Ｃ）が回収された。
【０１２６】
プロセスＰＬにおいて取得されたデータを、以下に示す。
【表５】
0005390594.tif 000009
【０１２７】
考察：
文献に記載されていたように、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−１１８０及びＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−７ＨＰによる精製は、シリカゲル及びＳｅｐｈａｄｅｘ材料によるクロマトグラフィーより優れている（データ無し）。
【０１２８】
Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−１１８０を用いたソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の生抽出物のクロマトグラフィーで、溶解度が高く、薄い色の生産物が得られる。しかしながら、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−７ＰＨのクロマトグラフィーで回収される生産物は、高質量及び高ＶＤＭであるが、ケルセチンの収量は僅かに低い。純度は、いずれの樹脂も同程度であった。
【０１２９】
エタノール／水が２５／７５よりも６５／３５の比率の混合物で抽出を行った方がＶＤＭ／ケルセチンの商は大きくなったが、回収量は減少した。
【０１３０】
アプライされた条件下で取得した抽出物は、１  ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３グリコシド及びケルセチングリコシドのみ含む（ＨＰＬＣにより証明された）（図６、レーン４）。
【０１３１】
エタノール／水が９６／０４（ｖ／ｖ）の比率の混合物を用いた抽出条件で取得されるＶＤＥの収量は最適となる。
【０１３２】
実施例２Ｂ−産業スケールでの精製
（ｉ）産業精製プロセス（実施例ＰＦ）
生抽出物（プロセスＥＰにより取得される（実施例１Ｂ（ｉ）））０．４ｋｇを、容積４ＬのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−７ＨＰカラムにアプライした。精製生産物６４ｇには、ビタミンＤ代謝物（ＶＤＭ、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３と解析的に決定された）が２２９ｐｐｍ、そしてフラボノール（酸加水分解後ケルセチンと決定された）が１７．７％含まれていた。該精製された生産物は、加水分解後フラボノール成分としてケルセチンのみ含む。
【０１３３】
プロセスＰＦにおいて取得されたデータを、以下に示す。
【表６】
0005390594.tif 000010
【０１３４】
（ｉｉ）産業精製プロセス（実施例ＰＳ）
３０％の生抽出溶液（プロセスＥＭにより取得される（実施例１Ｂ（ｉｉ）））９．１リットルを、容積３５ＬのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−１１８０カラムにアプライした。精製生産物５７５ｇには、ビタミンＤ代謝物（ＶＤＭ、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３と解析的に決定された）が３２２ｐｐｍ、そしてフラボノール（酸加水分解後ケルセチンと決定された）が１５．９％含まれていた。該精製された生産物は、加水分解後フラボノール成分としてケルセチンのみ含む。
【０１３５】
プロセスＰＳにおいて取得されたデータを、以下に示す。
【表７】
0005390594.tif 000011
【０１３６】
上記精製工程（ｉ）又は（ｉｉ）のいずれかを用いて取得した本発明の濃縮植物抽出物は、標準化された分量の、ゴリコシド結合した形態の、活性ビタミンＤ３代謝物の１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、並びに最適かつ均一な分量の骨活性フラボノールの、同じくグリコシド結合した形態のケルセチンを含む組成物である。
【０１３７】
実施例３−濃縮植物抽出物の性状の特徴付け
（ｉ）濃縮植物抽出物の一般的な特徴付け：
取得された調製物を解析し、有効成分、不活性の成分、及び毒性成分に関して特徴付けられ、ここで該生産物は毒性成分の分量が最小となり、そして製造工程における褐色化／変色が最小となるように最適化される。特に、前記濃縮植物抽出物、即ち上記調製（実施例１及び２）により取得された生産物は、以下の特性について特徴付けられた：
【表８】
0005390594.tif 000012
【０１３８】
（ｉｉ）ビタミンＤ有効成分による特徴付け
組成物、即ち上記で調製された本発明の濃縮植物抽出物は、更に、分子量分布が５９６．８（４１６．６＋１８０．２）〜４５００ダルトンの、有効成分１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３グリコシドの存在により特徴付けられる（前記精製抽出物の解析用Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラムを用いたクロマトグラフィー分離の結果を、図２に示す。フラクションの一部を加水分解し、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を測定した。１４００、４３００及び６８００ダルトンの水溶性ポリスチレンを、分子量マーカーとして使用した。前記精製抽出物の解析用Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−３０カラムを用いたクロマトグラフィー分離の結果を、図３に示す。前記フラクションの一部を加水分解し、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を測定した。１３５５ダルトンのコバラミンを分子量マーカーに使用した）。更に、ＬＣ−ＭＳ−、ＵＶ−、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにより明らかにされるように、前記組成物は、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３−１β−グルコピラノシドの存在により特徴付けられる（図５も参照されたい）。
【化４】
0005390594.tif 000013
【０１３９】
本発明の濃縮植物抽出物の更なる特徴は、遊離１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３及び２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の不在である。
【０１４０】
主成分である１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３−１β−グルコピラノシドの解析データを、以下に示す。
【０１４１】
【表９】
0005390594.tif 000014
【０１４２】
故に、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３−１β−グルコピラノシドは、明らかに同定された。
【０１４３】
（ｉｉｉ）植物フラボノールによる特徴付け
前記組成物、即ち上記で調製された本発明の濃縮植物抽出物は、更に、唯一の生物活性フラボノイドとしてグリコシド形態のフラボノールケルセチンが存在することにより特徴付けられる。ケルセチングリコシドの組成は表２に記載されており、図６の高効率薄層クロマトグラフィー後のフィンガープリントとして特徴付けられる。高効率薄層クロマトグラフィーによる特徴付けは、前記で取得された調製物、並びにスタンダード、イチョウ抽出物及びサンザシ抽出物を使用して実施された（実施例３（ｉｉｉ）参照）。条件は、以下に示される：
プレート：ＵＶインジケーター付きシリカゲルＧ  １０ｘ１０ｃｍ  Ｍｅｒｃｋ（Ｃａｍａｇ  ＡＧ，  Ｍｕｔｔｅｎｚ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）
溶媒：酢酸エチル／蟻酸／酢酸／水（１００＋１１＋１１＋２６）。プレコンディション４５分、ランタイム４５分。
検出：Ｎａｔｕｒｓｔｏｆｆ−Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃａｍａｇ  ＡＧ，  Ｍｕｔｔｅｎｚ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）
アプライ
レーン１：ケルセチン（ｒｆ０．８８；０．５６μｇ）；ハイペロシド（ｒｆ０．５５；１．２５μｇ）；クロロゲン酸（ｒｆ０．４２；１．２μｇ）；ルチン（ｒｆ０．３７；０．７３μｇ）（レーンにＦｌｕｋａ  ＡＧ，  Ｂｕｃｈｓ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄの参照スタンダードが含まれる）；
レーン２：ケンフェロール（ｒｆ０．９０；０．２５μｇ）；イソケルシトリン（ｒｆ０．５７；１．２５μｇ）；ハイペロシド（ｒｆ０．５４；１．２５μｇ）（レーンにＦｌｕｋａ  ＡＧ，  Ｂｕｃｈｓ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄの参照スタンダードが含まれる）；
レーン３：コーヒー酸（ｒｆ０．８２；０．１μｇ）；イソケルシトリン（ｒｆ０．５７；１．２５μｇ）（レーンにＦｌｕｋａ  ＡＧ，  Ｂｕｃｈｓ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄの参照スタンダードが含まれる）；
レーン４：精製抽出物（Ｂａｔｃｈ  １；４１μｇ）、
本発明の濃縮植物抽出物４１μｇがアプライされている。ケルセチン、ケルセチングリコシド、並びにコーヒー酸及びクロロゲン酸等の偏在二次植物抽出物が分離され得る（図６参照）；
レーン５：精製抽出物（Ｂａｔｃｈ  ２；４１μｇ）
同様に、本発明の濃縮植物抽出物４１μｇがアプライされている。ケルセチン、ケルセチングリコシド、並びにコーヒー酸及びクロロゲン酸等の偏在二次植物抽出物が分離され得る（図６参照）；
レーン４及び５は、僅かなバッチ間の相異を示す；
レーン６：ギンコ・ビロバ（ｇｉｎｋｇｏ  ｂｉｌｏｂａ）抽出物（市販品；１０μｌ）（市販ギンコ・ビロバ（ｇｉｎｋｇｏ  ｂｉｌｏｂａ）抽出物（Ｃｅｒｅｓ  ＡＧ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））
レーン７：サンザシ抽出物（市販品；２０１μｇ）（市販サンザシ抽出物（Ｚｅｌｌｅｒ  ＡＧ，  Ｒｏｍａｎｓｈｏｒｎ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。両レーン６及び７は、明確に異なる組成物である。
レーン８：レーン１と同じスタンダード（Ｆｌｕｋａ  ＡＧ，  Ｂｕｃｈｓ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；
レーン９：従来技術で取得した比較用精製抽出物（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０によるクロマトグラフィー）（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０で精製した抽出物の比較用サンプル。ビタミンＤ活性の増大率が高度である（２０００μｇ／ｇ）一方、フラボノールが殆ど存在しない）。
【０１４４】
高効率薄層クロマトグラフィーによる特徴付けの解析により、以下の結果が導かれた（表２参照）：
【表１０】
0005390594.tif 000015
【０１４５】
図５のレーン９において見られるように、Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂を用いたクロマトグラフィーによる精製で取得される生産物は、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３分量が高いが、フラボノールを殆ど含まない点に注目されたい。
【０１４６】
実施例３−本発明の濃縮植物抽出物の生物活性の試験
（ｉ）日本うずらにおけるバイオアッセイによるビタミンＤ活性の評価（実験１）
Ｒａｍｂｅｃｋら（Ｒａｍｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｎｎ．  Ｎｕｔｒ．  Ｍｅｔａｂ．  ３０，  ９−１４，  （１９８６）参照）によると、ウズラ卵殻アッセイが、ビタミンＤ活性を評価するための単純なバイオアッセイとして使用されることは公知である。このアッセイにおいて、産卵期の日本うずら（コツルニクス・ジャポニカ（Ｃｏｔｕｒｎｉｘ  ｊａｐｏｎｉｃａ））の産卵効率が＞８０％の個体に、ビタミンＤを欠くが他の栄養分は最適量含む餌を与えた。約８日後、最も敏感なマーカーの産卵効率は、１０％を下回った。そして、試験動物はランダムに１０羽の群に分けられ、同一の餌に試験される物質を添加して与えた。２１日間、産卵効率を、他のビタミンＤ代謝マーカー、例えば結晶中のアルカリホスファターゼ及びカルシウム等と共にモニタリングした。
【０１４７】
実験１において、３つのうずらの群に、餌１ｋｇあたり１００、２００及び４００国際単位のビタミンＤ３を与え、５つの群に精製植物抽出物２、８、３２、１２８及び５１４ｍｇ／ｋｇを与え、そして１つの群に合成１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（１μｇ／餌１ｋｇ）を与え、他の１つの群に、ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の粉砕した乾燥葉（１０００ｍｇ／餌１ｋｇ）を与えた。
【０１４８】
【表１１】
0005390594.tif 000016
【０１４９】
卵殻の重量のプロビット解析による評価で、精製抽出物のビタミンＤ３活性が約１０，０００  ＩＵＤ／ｇを示した一方、ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の葉におけるビタミンＤ３活性は、約２００  ＩＵＤ／ｇであった（１国際単位（ＩＵ）のビタミンＤは、０．０２５μｇのコレカルシフェロール／エルゴカルシフェロールと生物学的に同等である）。故に、前記取得された組成物は、基礎となる生材料の５０倍のビタミンＤ活性を有する。
【０１５０】
ビタミンＤ活性の決定に加えて、前記実験は、前記精製抽出物が、広い投与範囲にわたり良好な寛容性を有することを明らかにした。合成１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３は、ニワトリにおいて治療濃度域が２〜５（同上Ｒａｍｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．参照）であった一方、前記精製抽出物は、産卵効率を低下させることなく、３２ｍｇ／餌１ｋｇ（効果が出始める）〜５１２ｍｇ／餌１ｋｇの投与範囲にわたり、良好な耐容性を示した（表３のＥＳＷ）。
【０１５１】
更に、ソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の精製抽出物を用いた処置の開始後の産卵の発現（ｏｎｓｅｔ）は、ビタミンＤ３を用いた処理よりも早く、その時間は、産卵効率が５０％を越えた時間により見積もられ得る。前記精製抽出物を用いた処置では２４〜４８時間で、ビタミンＤ３を用いた処置では４８〜７２時間であった。
【０１５２】
更なる発見は、前記精製抽出物を与えた群における卵の重量が、４００  ＩＵＤ／餌１ｋｇを与えたスタンダードの群と比較して、顕著に増大していたことである。
【表１２】
0005390594.tif 000017
【０１５３】
（ｉｉ）ブロイラーを用いた肢の奇形の実験（実験２）
実験２において、１日齢の雄のブロイラーニワトリに、１，０００  ＩＵＤ／餌１ｋｇのビタミンＤ３をを含む市販の餌を不断給餌した。コントロール群では添加物を入れない餌が与えられ、他の２つの群では、それぞれ３２ｍｇ／ｋｇ及び１２８ｍｇ／ｋｇの前記精製抽出物（１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３ではそれぞれ４．３及び７６．８μｇに相当する）が加えられた餌が与えられた（抽出物のインビトロ加水分解後に決定された）。表５は、市販のブロイラーニワトリの、本発明のソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の精製抽出物による処置後の、脛骨の軟骨形成不全（ＴＤ）及び他の肢の奇形の減少を示す。
【表１３】
0005390594.tif 000018
【０１５４】
（ｉｉｉ）出産期の血中カルシウムの減少の防止における活性（実験３）
授乳熱は、乳を生産する動物の出産期の代謝疾患であり、乳の生産の際に母親の血中を循環するカルシウムが消耗する。内性的なカルシウムのホメオスタシスは、血中カルシウムの顕著な減少を防ぐために、食物又は骨から十分なカルシウムを動員することが出来ない。場合によっては、カルシウム濃度の低下は、筋肉の麻痺を誘導する。従来の処置は、出産期に多量のカルシウムを投与することからなる（Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｐａｒｔｕｒｉｅｎｔ  Ｐａｒｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｃｏｗｓを参照されたい）。
【０１５５】
本実験における妊娠乳牛は、２つの処置レジームにランダムに分けられた。１つの群には、投与ボーラスあたり４２ｇのカルシウムを含む市販の生産物を与えた。供給者の推奨に従い、出産期に４ボーラスを投与した。本発明の生産物は、分ぺん前７２時間〜２４時間の間に、５ｇが単発で投与された。倫理的理由により、無処置群は設けなかった；出産期における血漿カルシウムの低下はよく記載されている（Ｆｉｇｕｒｅ  ７，  Ｇｏｆｆ  ＪＰ，  Ｈｏｒｓｔ  ＲＬ．  Ｊ  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．  １９９７  Ｊａｎ；８０（１）：１７６−８６．  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｏｒ  ｓｏｄｉｕｍ，  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｃａｌｃｉｕｍ，  ｔｏ  ｐｒｅｐａｒｔｕｍ  ｒａｔｉｏｓ  ｏｎ  ｍｉｌｋ  ｆｅｖｅｒ  ｉｎ  ｄａｉｒｙ  ｃｏｗｓ．を参照されたい）。
【０１５６】
結果として、本発明の組成物の単発投与は、図７に示されているように、出産期にカルシウムを４３ｇ適用したのと同程度に、血漿カルシウムの低下を防止することが出来た。
【０１５７】
（ｉｖ）ヒト骨粗鬆症の動物モデルにおける活性（実験４）
天然のマトリックス中に、両有効成分、即ち１  ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３−１β−グルコピラノシド）及びフラボノイドケルセチンを含む、本発明の濃縮植物抽出物の活性は、ヒト閉経期骨粗鬆症のモデル、骨粗鬆症の前臨床モデルである、卵巣摘出誘導ラットにおいて試験された。
【０１５８】
卵巣を摘出した雌のラット及び偽手術をした同腹子で体重１２０ｇの個体をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ，  Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ，  Ｆｒａｎｃｅから調達し、それらを複数の群に分けた。順化の後、それらにコントロール飼料を与え（偽及びｏｖｘ群）、又は試験生産物（溶液及びアレンドロネート）を含む同一の飼料を与えた。アレンドロネートは、実験を確認するための陽性コントロールとして試験された。アレンドロネートは、ヒトの抗骨粗鬆症治療において導入される。実験の過程で、血液及び尿が回収され、そして骨のターンオーバー及び形成のマーカーが評価された。６ヶ月後、実験が終了し、そして骨灰及び脛骨のＸ線トモグラフィーを測定した。
【０１５９】
本発明の組成物のケルセチン成分の活性を決定するためのインビトロ実験は、陽性コントロールとして、遊離ケルセチン及び遊離１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を含む骨細胞培養液中で行われた
【０１６０】
全体の結果として、本発明の濃縮植物組成物において、予想外の強力な効果が見出され、それは、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３及びケルセチンの協調的な作用により表され得る。故に、本発明の組成物を用いた処理は、卵巣摘出により誘導される骨の減少を防止するだけでなく、該組成物は、偽手術コントロールの脛骨の骨量を増大させる。
【図１】
0005390594.tif 000019
【図２】
0005390594.tif 000020
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0005390594.tif 000025
【図８】
0005390594.tif 000026
【図９】
0005390594.tif 000027