(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１３又は配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
被験者の体液中の配列番号１３又は配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを測定するための、請求項１に記載のペプチドを特異的に認識する抗体又はその断片を含有する、アルツハイマー病の診断薬。
【請求項３】
検体中の配列番号１３又は配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを検出するステップを備える、アルツハイマー病を診断するための情報を提供する方法。
【請求項４】
検体中の配列番号１３又は配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを検出するステップを備える、アルツハイマー病の状態又は進行をモニターするための情報を提供する方法。
【請求項５】
以下のステップを備える、請求項３又は請求項４に記載の方法：
ａ）被験者由来の試料を調整するステップ、
ｂ）少なくとも１つの配列番号１３又は配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを認識する抗体又はその断片に該試料を接触させるステップ、
ｃ）配列番号１３又は配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドへの該抗体又はその断片の結合を検出して配列番号１３又は配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドのレベルを測定するステップ、並びに、
ｄ）配列番号１３又は配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドのレベルと被験者におけるアルツハイマー病の有無又は程度との関連付けを行うステップ。
【請求項６】
以下のステップを備える、請求項３又は請求項４に記載の方法：
ａ）被験者由来の試料を調整するステップ、
ｂ）配列番号１３又は配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを分離するステップ、
ｃ）分離された配列番号１３又は配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドのアミノ酸配列に関する情報を検出するステップ、
ｃ）配列番号１３又は配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドのレベルと、被験者におけるアルツハイマー病の有無又は程度との関連付けを行うステップ。
【請求項７】
以下のステップを備える、請求項３又は請求項４に記載の方法：
ａ）被験者由来の試料を調整するステップ、
ｂ）配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを認識する抗体又はその断片、及び、配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを認識する抗体又はその断片に該試料を接触させるステップ、
ｃ）配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、及び、配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドへの該抗体又はその断片の結合を検出して、配列番号１３、及び、配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドのレベルを測定するステップ、
ｄ）  配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量と、配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量との比を算出するステップ、並びに、
ｅ）算出された比と、被験者におけるアルツハイマー病の有無又は程度との関連付けを行うステップ。
【請求項８】
以下のステップを備える、請求項３又は請求項４に記載の方法：
ａ）被験者由来の試料を調整するステップ、
ｂ）配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、及び、配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを分離するステップ、
ｃ）分離された配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、及び、配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドのアミノ酸配列に関する情報を検出するステップ、
ｄ）  配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量と、配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量との比を算出するステップ、並びに、
ｅ）算出された比と、被験者におけるアルツハイマー病の有無又は程度との関連付けを行うステップ。
【請求項９】
更に、以下のステップを備える、請求項５〜請求項８のいずれか１項に記載の方法：
ｉ）検体中のアミロイドβ４２及びアミロイドβ４０を検出するステップ、
ｉｉ）検出されたアミロイドβ４２とアミロイドβ４０との比を算出するステップ、
ｉｉｉ）配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量と配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量との比を算出するステップ、並びに、
ｉｖ）アミロイドβ４２とアミロイドβ４０との比と、配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量と配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量との比と、被験者におけるアルツハイマー病の有無又は程度との関連付けを行うステップ。
【請求項１０】
検体が、被験者の体液である、請求項３〜請求項９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
被験薬を投与するステップ、及び、検体中の配列番号１３又は配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを検出するステップを備える、アルツハイマー病の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病の診断分野に関する。より具体的には、本発明は体液中の変異アルカデインペプチド切断物の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ：ＡＤ）は、種々の認知機能が進行しながら障害を受ける神経変性疾患である。アルツハイマー病の病態解明及び病因メカニズムの解明が進むにつれて根本的治療（ｄｉｓｅａｓｅ−ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｙ）の開発が進展している。このような治療方法の開発が進むにつれて、アルツハイマー病の早期診断・発見が求められるようになってきた。近年、アルツハイマー病を診断するためのマーカとして、アミロイドβタンパク質前駆体（ａｍｙｌｏｉｄ  β  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ：以下、「ＡＰＰ」という）がβセクレターゼ（β−ｓｉｔｅ  ＡＰＰ−ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ：以下、「ＢＡＣＥ」という）により切断された分解物のＣ末端断片が、更にγセクレターゼにより切断されて生じるアミロイドβペプチド（以下、「Ａβ」という）が注目を集めている。分泌されたＡβは、ヒトの脳脊髄液から検出することが可能であり、アルツハイマー病のバイオマーカ、又は、診断若しくは分類の中間表現型（ｅｎｄｏｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ）として有用であることが期待されている（非特許文献１、非特許文献２及び非特許文献３参照）。特に、４２番目のアラニン残基で終わるＡβ４２は、家族性アルツハイマー病において、産生が上昇していること等から、アルツハイマー病の診断への利用が考えられてきた。【０００３】
しかし、アルツハイマー病患者の血清中のＡβ４２濃度は、発症前及び／又は疾患の軽度認識機能障害ステージの間は正常値以上に上昇していることが報告されている（非特許文献４）が、その後、Ａβペプチドが脳血管のアミロイド及び脳実質の斑に取り込まれることにより正常値以下のレベルまで下がることが報告されており（非特許文献２及び非特許文献５参照）、疾患の進行に応じてそのレベルが二相性変化すると考えられることから、アルツハイマー病の診断マーカとして利用する上で安定性に問題があることが知られていた。【０００４】
アルカデイン（Ａｌｃａｄｅｉｎ：以下、「Ａｌｃ」という）は、主に神経細胞に発現している、進化的に保存されたタイプＩ膜タンパク質のファミリーから構成される。Ａｌｃは、神経特異的アダプタータンパク質Ｘ１１Ｌ結合タンパク質（非特許文献６参照）、及び、シナプス後のＣａ２＋結合タンパク質（カルシンテニン（ｃａｌｓｙｎｔｅｎｉｎ）とも呼ばれている）（非特許文献７参照）の両方として個別に同定されてきた。哺乳類では、Ａｌｃには次の４つの異性体が報告されている：Ａｌｃα１（ヒトでは９７１アミノ酸）、Ａｌｃα２（ヒトでは９８１アミノ酸）、Ａｌｃβ（ヒトでは９５６アミノ酸）、及び、Ａｌｃγ（ヒトでは９５５アミノ酸）（非特許文献６参照）。Ａｌｃα、Ａｌｃβ、及び、Ａｌｃγは、独立した遺伝子によりコードされる一方、Ａｌｃα１及びＡｌｃα２はＡｌｃα遺伝子のスプライスバリアントである。【０００５】
ＡＰＰは、老人斑のジストロフィー神経突起を含む脳ニューロンにおいて、Ａｌｃαと共局在しており（非特許文献６参照）、アルツハイマー病の発症において重要な役割を果たすと考えられているタイプＩ膜タンパク質である（非特許文献８及び非特許文献９参照）。ＡＰＰは、膜近傍部位におけるαセクレターゼ又はβセクレターゼによるプロセッシング、及び、膜間部位におけるγセクレターゼ複合体によるプロセッシングを連続的に受ける。βセクレターゼ及びγセクレターゼの組み合わせによるＡＰＰの切断により生じるＡβは、アルツハイマー病の主要な原因であると考えられていることから、ＡＰＰの切断が継続的に研究されている（非特許文献８及び非特許文献９参照）。【０００６】
Ａｌｃは、Ｘ１１Ｌとの相互作用を介して、安定化され、かつ、非直接的にＡＰＰと複合体を形成する。Ａｌｃ及びＡＰＰは、Ｘ１１Ｌと三量体を形成している場合、いずれもタンパク質分解代謝に抵抗性を示す（非特許文献６）。Ｘ１１−Ｌ不全マウスの脳中においては、Ａβを含む内因性のＡＰＰ代謝物のレベルが上昇しており、ＡＰＰとＸ１１Ｌ間の相互作用が生体内の脳において生理学的に起きていると考えられている（非特許文献１０参照）。Ａｌｃ−Ｘ１１Ｌ−ＡＰＰ複合体中のＡｌｃはタンパク質分解に抵抗性を示すが、複合体を形成しないＡｌｃは連続したタンパク質分解により切断されて短鎖ペプチドを生成することが報告されている（非特許文献１１参照）。また、Ａｌｃの一次切断が細胞外膜近傍領域で起こり、Ａｌｃの細胞外ドメイン（可溶性Ａｌｃ（ｓｏｌｕｂｌｅ  Ａｌｃ）：ｓＡｌｃ）を放出すること、切断後のＡｌｃの細胞結合型Ｃ末端断片（ａｌｃａｄｅｉｎ  ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ、以下「ＣＴＦ」という）は、膜間部切断プロテアーゼにより切断されること、及び、Ａｌｃ切断の両方がＡＰＰにおいて対応する反応と調和していることが報告されている。（非特許文献１１参照）。【０００７】
ＡＤＡＭ１０及びＡＤＡＭ１７は、ＡＰＰ６９５の６１２番目のリジンと６１３番目のロイシンの間の結合を切断し、Ａβドメインを破壊するαセクレターゼとして同定されている。この膜近傍領域における切断は、膜近傍の二次切断を誘発させ、２４〜２６アミノ酸からなるアミロイド非生成性の３ｋＤａのペプチド（ｐ３）を分泌させることが報告されている（非特許文献８参照）。しかし、Ａｌｃの一次切断酵素に関する報告はなかった。【０００８】
また、ＡＰＰのｐ３ドメインに該当する、Ａｌｃα由来の短鎖ペプチド（以下、「ｐ３−Ａｌｃα」という）が、Ａｌｃ  ＣＴＦがγセクレターゼによる切断により分泌されることから、Ａｌｃの二次切断（Ａｌｃ  ＣＴＦの切断）には、プレセニン（以下、「ＰＳ」という）依存性γセクレターゼが関与していることが報告されている。プレセニンは、γセクレターゼ複合体の酵素成分であること、及び、ＰＳ１及びＰＳ２遺伝子のいくつかの変異が家族性アルツハイマー病を引き起こすことが知られている。いくつかの家族性アルツハイマー病関連ＰＳ１変異がＡＰＰ  ＣＴＦｓの切断部位を変化させ、Ａβ４２等のＣ末端が延長したＡβ種の生成を促進させることが知られている（非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４、及び、非特許文献１５参照）。【０００９】
Ａｌｃの切断部位については、Ａｌｃαの一次切断サイトが、８１５番目のメチオニンと８１６番目のアラニンとの間のペプチド結合、８２０番目のグルタミンと８２１番目のフェニルアラニンとの間のペプチド結合、及び、８３８番目のアラニンと８３９番目のアスパラギンとの間のペプチド結合であること、並びに、Ａｌｃαの二次切断サイトが、８４２番目のプロリンと８４３番目のフェニルアラニンとの間のペプチド結合、８４３番目のフェニルアラニンと８４４番目のアラニンとの間のペプチド結合、及び、８５１番目のスレオニンと８５２番目のバリンとの間のペプチド結合であることが報告されている（特許文献１参照）。また、１６６番目のロイシンがプロリンに変換された変異を有するプレセニリン１（ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ  １、以下、「ＰＳ１」という）を発現している細胞において、二次切断部位に変化が生じ、８５３番目のバリンと８５４番目のバリンとの間のペプチド結合、８５４番目のバリンと８５５番目のイソロイシンとの間のペプチド結合、８５５番目のイソロイシンと８５６番目のバリンとの間のペプチド結合、及び、８５６番目のバリンと８５７番目のバリンとの間のペプチド結合が二次切断により切断されることが報告されている（特許文献１参照）。しかし、ＰＳ１変異体は複数報告されているにもかかわらず、他のＰＳ１変異体による切断部位の変化については報告されていなかった。また、ｐ３−Ａｌｃ特異的に認識する抗体の作成は困難であり、特許文献１においては、ｐ３−Ａｌｃの測定の代わりにＦＬＡＧ修飾した人工ペプチド（ＡｌｃαΔＥ）を使用してＡｌｃのγ−切断部位の同定を行っている。その他、ｐ３−Ａｌｃペプチドを回収したとの報告はこれまでなく、当該ペプチドの構造については知られていなかった。
【特許文献１】国際公開公報ＷＯ２００５／０４４８４７
【非特許文献１】Ｋａｎａｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．４４，１７−２６．
【非特許文献２】Ｇｒａｆｆ−Ｒａｄｆｏｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．６４，３５４−３６２．
【非特許文献３】Ｋａｕｗｅ，ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，６１，４４６−４５３．
【非特許文献４】Ｍａｙｅｕｘ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．４６，４１２−４１６．
【非特許文献５】Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ（２００３）ＪＡＭＡ  ２８９，２０９４−１０３．
【非特許文献６】Ａｒａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，４９４４８−４９４５８．
【非特許文献７】Ｖｏｇｔ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７，１５１−１６６．
【非特許文献８】Ｇａｎｄｙ，Ｓ（２００５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５，１１２１−１１２９．
【非特許文献９】Ｓｍａｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｎｅｕｒｏｎ  ５２，１５−３１．
【非特許文献１０】Ｓａｎｏ，ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１，３７８５３−３７８６０．
【非特許文献１１】Ａｒａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，２４３４３−２４３５４．
【非特許文献１２】Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７５，  ７５４−７６０．
【非特許文献１３】Ｋｗｏｋ，ｅｔａｌ．，（１９９７）Ｎｅｕｒｏ  Ｒｅｐ．８，１５３７−１５４２．
【非特許文献１４】Ｍｏｅｈｌｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９，８０２５−８０３０．
【非特許文献１５】Ｄｅｖｉ，ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．５７，１４５４−１４５７．
【発明の開示】
【００１０】
ＡＤＡＭ１０は、ＡＰＰをα−サイトで切断する酵素（αセクレターゼ）である可能性が最も高いと考えられている（Ｌａｍｍｉｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６，３９２２−３９２７．）。そこで、本発明者らは、Ａｌｃファミリータンパク質であるＡｌｃα、Ａｌｃβ、及び、ＡｌcγがＡＤＡＭ１０により切断されるかについて検討した。その結果、ＡＤＡＭ１０がＡｌｃα、Ａｌｃβ、及び、Ａｌcγの主要な分解酵素の一つであることを見出した。また、ＡＰＰは、他のαセクレターゼであるＡＤＡＭ１７により切断されることが報告されている（Ｂｕｘｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２７７６５−２７７６７．；Ｌａｍｍｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６，３９２２−３９２７．；Ａｌｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７１，２５３９−２５４７．）。よって、本発明者らは、ＡＤＡＭ１７が、Ａｌｃファミリータンパク質であるＡｌｃα、Ａｌｃβ、及び、Ａｌcγを切断するかについて検討した。その結果、ＡＤＡＭ１７がＡＰＰと同様にＡｌｃα、Ａｌｃβ、及び、Ａｌcγを切断することを見出した。即ち、本発明者らは、３種類の全てのＡｌｃファミリー（Ａｌｃα、Ａｌｃβ、及び、Ａｌｃγ）が、ＡＰＰのαセクレターゼとして知られているＡＤＡＭ１０及びＡＤＡＭ１７により切断されることを見出した。Ａｌｃは主に神経細胞において発現していることから、神経細胞においては、ＡｌｃとＡＰＰはＸ１１Ｌとの複合体から解放された時に同じ酵素により一次切断を受けることが明らかとなった。
【００１１】
本発明者らはＡｌｃの膜近傍領域の抗原の工夫を重ねることにより、各Ａｌｃの膜近傍領域を特異的に認識する抗体を作製することに成功した。本発明者らは、当該抗体を利用することにより、初めて、Ａｌｃα、Ａｌｃβ、及び、Ａｌｃγを発現しているＨＥＫ２９３細胞の培養液からγセクレターゼによる分解物であるｐ３−Ａｌｃα、ｐ３−Ａｌｃβ、及び、ｐ３−Ａｌｃγを回収することに成功し、回収したペプチドをＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳ分析することにより、Ａｌｃα、Ａｌｃβ、及び、Ａｌｃγの一次切断部位及び二次切断部位を同定すると共に、ｐ３−Ａｌｃα、ｐ３−Ａｌｃβ、及び、ｐ３−Ａｌｃγの配列を決定することに成功した。
【００１２】
同様に、本発明者らは、家族性アルツハイマー病関連ＰＳ１変異の存在下で、ｐ３−Ａｌｃの配列及び長さを決定し、切断部及び生成するペプチドに変化が起こるか否かを確認した。即ち、本発明者らは、野生型又は６つの病原性変異型のそれぞれのＰＳ１を発現している細胞培養液中、並びに、高齢の非認知症のヒト又は散発性アルツハイマー病に罹患した患者から得た脳脊髄液中のｐ３−Ａｌｃα、ｐ３−Ａｌｃβ、及び、ｐ３−Ａｌｃγペプチドの配列及び切断部位を決定した。細胞培養実験においては、野生型及びいくつかの病原性変異型ＰＳ１の発現は、延長し又は短縮したｐ３−Ａｌｃ種を生成させるような切断を生じ、変異型ＰＳ１がＡβにスペシエーションを起こすのと同様に、ｐ３−Ａｌｃα、ｐ３−Ａｌｃβ、及び、ｐ３−ＡｌｃγのＣ末断片のスペシエーションを起こすことを見出した。また、異常なｐ３−Ａｌｃ種の正常なｐ３−Ａｌｃに対する比をＡβ４２とＡβ４０との比と比較した結果、異常なｐ３−Ａｌｃ種の分泌の割合が、Ａβ４２とＡβ４０の比と共に上昇することを見出した。このことから、本発明者らは、プレセニリンの変異型を有する家族性アルツハイマー病患者におけるγセクレターゼによる誤切断が、ＡＰＰ以外にもＡｌｃに対しても起きていることを見出した。
【００１３】
そこで、本発明者らは、脳脊髄液中のｐ３−Ａｌｃ種がγセクレターゼ機能のサロゲートマーカとなり、散発性アルツハイマー病に関する新しい知見を与えるものと考え、ヒトの脳脊髄液中におけるｐ３−Ａｌｃα、ｐ３−Ａｌｃβ、及び、ｐ３−Ａｌｃγ種を測定した。その結果、散発性アルツハイマー病の患者におけるｐ３−Ａｌｃαのスペシエーションが健常人と比較して変化しており、この変化は、家族性アルツハイマー病の変異型ＰＳ１を発現している細胞培養液において観察されたものと近いものであることを見出した。これらの結果から、本発明者らは、γセクレターゼの機能不全が家族性及び散発性の両方のアルツハイマー病の特徴であること、γセクレターゼのＡｌｃ分解物を測定することにより、アルツハイマー病を診断することが可能であること、及び、アルツハイマー病の治療薬又は予防薬、特には、γセクレターゼを標的とする治療薬又は予防薬の有効性の評価を行うことが可能であることを見出した。
【００１４】
更に、本発明者らは、互いに同一配列を有するｐ３−Ａｌｃ種の中で、特定のｐ３−Ａｌｃ種（例えば、ｐ３−Ａｌｃα３５）を特異的に認識する抗体を作成することに成功し、これにより、特定のｐ３−Ａｌｃ種について抗体を利用した定量的測定を可能とし、本発明を完成させた。
【００１５】
よって、一の態様において、本発明は、患者由来の体液検体における異常な切断を受けたＡｌｃタンパク質断片の存在又は非存在を測定することを含む、患者がアルツハイマー病を罹患しているか、罹患の傾向にあることの尤度を決定する方法であって、ここで、１又はそれ以上の当該断片の存在は該患者がアルツハイマー病に罹患し又は罹患の傾向にあることを意味する方法に関する。他の態様において、本発明は、患者由来の体液検体における異常な切断を受けたＡｌｃタンパク質断片の存在又は非存在を検出するための診断薬に関する。
【００１６】
具体的な態様において、本発明は、以下の（１）〜（１７）に記載の発明に関する：
（１）  アルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物を認識する抗体又はその断片を含有する、γセクレターゼ異常に基づく疾患の診断薬。
（２）  被験者の体液中のアルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物を測定するための、（１）に記載のγセクレターゼ異常に基づく疾患の診断薬。
（３）  アルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物が、配列番号１１〜配列番号１６、及び、配列番号１８〜配列番号２５から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである、（１）又は（２）に記載のγセクレターゼ異常に基づく疾患の診断薬。
（４）  抗体が、配列番号５に記載のアミノ酸配列、配列番号６に記載のアミノ酸配列、配列番号７に記載のアミノ酸配列、配列番号８に記載のアミノ酸配列、配列番号９に記載のアミノ酸配列、配列番号１０、配列番号２６、又は、配列番号２７に記載のアミノ酸配列をエピトープとして認識する抗体である、（１）〜（３）のいずれか１項に記載のγセクレターゼ異常に基づく疾患の診断薬。
（５）  γセクレターゼ異常に基づく疾患が、アルツハイマー病である、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の診断薬。
（６）  検体中のアルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物を分離する手段、及び、分離されたアルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物のアミノ酸配列に関する情報を検出する手段を備える、γセクレターゼ異常に基づく疾患の診断装置。
（７）  配列番号１１〜配列番号１６、及び、配列番号１８〜配列番号２５から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
（８）  配列番号５に記載のアミノ酸配列、配列番号６に記載のアミノ酸配列、配列番号７に記載のアミノ酸配列、配列番号８に記載のアミノ酸配列、配列番号９に記載のアミノ酸配列、配列番号１０に記載のアミノ酸配列、配列番号２６に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号２７に記載のアミノ酸配列をエピトープとして認識する抗体又はその断片。
（９）  検体中のアルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物を検出するステップを備える、γセクレターゼ異常に基づく疾患の診断方法。
（１０）  以下のステップを備える、γセクレターゼ異常に基づく疾患の診断方法：
ａ）被験者由来の試料を調整するステップ、
ｂ）少なくとも１つのアルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物を認識する抗体又はその断片に該試料を接触させるステップ、
ｃ）アルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物への該抗体又はその断片の結合を検出してアルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物のレベルを測定するステップ、並びに、
ｄ）アルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物のレベルと被験者におけるγセクレターゼ異常に基づく疾患の有無又は程度との関連付けを行うステップを含む方法。
（１１）  以下のステップを備える、γセクレターゼ異常に基づく疾患の診断方法：
ａ）被験者由来の試料を調整するステップ、
ｂ）アルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物を分離するステップ、
ｃ）分離されたアルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物のアミノ酸配列に関する情報を検出するステップ、
ｃ）アルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物のレベルと、被験者におけるγセクレターゼ異常に基づく疾患の有無又は程度との関連付けを行うステップ。
（１２）  アルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物が、配列番号１１〜配列番号１６、又は、配列番号１８〜配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである、（９）〜（１１）のいずれか１項に記載のγセクレターゼ異常に基づく疾患の診断方法。
（１３）  以下のステップを備える、γセクレターゼ異常に基づく疾患の診断方法：
ａ）被験者由来の試料を調整するステップ、
ｂ）配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、及び、配列番号１８〜配列番号２５から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを認識する抗体又はその断片に該試料を接触させるステップ、
ｃ）配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、及び、配列番号１８〜配列番号２５から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドへの該抗体又はその断片の結合を検出して、配列番号１又は、配列番号１２、及び、配列番号１８〜配列番号２５から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドのレベルを測定するステップ、
ｄ）  配列番号１８〜配列番号２０から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量と、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量との比、あるいは、配列番号２１〜配列番号２５から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量と、配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量との比を算出するステップ、並びに、
ｅ）算出された比と、被験者におけるγセクレターゼ異常に基づく疾患の有無又は程度との関連付けを行うステップ。
（１４）  以下のステップを備える、γセクレターゼ異常に基づく疾患の診断方法：
ａ）被験者由来の試料を調整するステップ、
ｂ）配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、及び、配列番号１８〜配列番号２５から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを分離するステップ、
ｃ）分離された配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、及び、配列番号１８〜配列番号２５から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドのアミノ酸配列に関する情報を検出するステップ、
ｄ）  配列番号１８〜配列番号２０から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量と、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量との比、あるいは、配列番号２１〜配列番号２５から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量と、配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量との比を算出するステップ、並びに、
ｅ）算出された比と、被験者におけるγセクレターゼ異常に基づく疾患の有無又は程度との関連付けを行うステップ。
（１５）  更に、以下のステップを備える、（１１）又は（１２）に記載のγセクレターゼ異常に基づく疾患の診断方法：
ｉ）検体中のアミロイドβ４２及びアミロイドβ４０を検出するステップ、
ｉｉ）検出されたアミロイドβ４２とアミロイドβ４０との比を算出するステップ、
ｉｉｉ）配列番号１８〜配列番号２５から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量と配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量との比を算出するステップ、並びに、
ｉｖ）アミロイドβ４２とアミロイドβ４０との比と、配列番号１８〜配列番号２５から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量と配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量との比と、被験者におけるγセクレターゼ異常に基づく疾患の有無又は程度との関連付けを行うステップ。
（１６）  検体が、被験者の体液である、（９）〜（１５）に記載のγセクレターゼ異常に基づく疾患の診断方法。
（１７）  γセクレターゼ異常に基づく疾患が、アルツハイマー病である、（９）〜（１６）のいずれか１項に記載のγセクレターゼ異常に基づく疾患の診断方法。
【００１７】
また、別の態様において、本発明は、以下の（１８）〜（２６）に記載の発明に関する：
（１８）  検体中のアルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物を検出するステップを備える、γセクレターゼ異常に基づく疾患を診断するための情報を収集する方法。
（１９）  以下のステップを備える、γセクレターゼ異常に基づく疾患を診断するための情報を収集する方法：
ａ）被験者由来の試料を調整するステップ、
ｂ）少なくとも１つのアルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物を認識する抗体又はその断片に該試料を接触させるステップ、
ｃ）アルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物への該抗体又はその断片の結合を検出してアルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物のレベルを測定するステップ、並びに、
ｄ）アルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物のレベルと被験者におけるγセクレターゼ異常に基づく疾患の有無又は程度との関連付けを行うステップを含む方法。
（２０）  以下のステップを備える、γセクレターゼ異常に基づく疾患の診断方法：
ａ）被験者由来の試料を調整するステップ、
ｂ）アルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物を分離するステップ、
ｃ）分離されたアルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物のアミノ酸配列に関する情報を検出するステップ、
ｃ）アルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物のレベルと、被験者におけるγセクレターゼ異常に基づく疾患の有無又は程度との関連付けを行うステップ。
（２１）  アルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物が、配列番号１１〜配列番号１６、又は、配列番号１８〜配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである、（１８）〜（２０）のいずれか１項に記載のγセクレターゼ異常に基づく疾患を診断するための情報を収集する方法。
（２２）  以下のステップを備える、γセクレターゼ異常に基づく疾患を診断するための情報を収集する方法：
ａ）被験者由来の試料を調整するステップ、
ｂ）配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、及び、配列番号１８〜配列番号２５から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを認識する抗体又はその断片に該試料を接触させるステップ、
ｃ）配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、及び、配列番号１８〜配列番号２５から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドへの該抗体又はその断片の結合を検出して、配列番号１又は、配列番号１２、及び、配列番号１８〜配列番号２５から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドのレベルを測定するステップ、
ｄ）  配列番号１８〜配列番号２０から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量と、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量との比、あるいは、配列番号２１〜配列番号２５から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量と、配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量との比を算出するステップ、並びに、
ｅ）算出された比と、被験者におけるγセクレターゼ異常に基づく疾患の有無又は程度との関連付けを行うステップ。
（２３）  以下のステップを備える、γセクレターゼ異常に基づく疾患を診断するための情報を収集する方法：
ａ）被験者由来の試料を調整するステップ、
ｂ）配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、及び、配列番号１８〜配列番号２５から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを分離するステップ、
ｃ）分離された配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、及び、配列番号１８〜配列番号２５から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドのアミノ酸配列に関する情報を検出するステップ、
ｄ）  配列番号１８〜配列番号２０から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量と、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量との比、あるいは、配列番号２１〜配列番号２５から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量と、配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量との比を算出するステップ、並びに、
ｅ）算出された比と、被験者におけるγセクレターゼ異常に基づく疾患の有無又は程度との関連付けを行うステップ。
（２４）  更に、以下のステップを備える、（２２）又は（２３）に記載のγセクレターゼ異常に基づく疾患を診断するための情報を収集する方法：
ｉ）検体中のアミロイドβ４２及びアミロイドβ４０を検出するステップ、
ｉｉ）検出されたアミロイドβ４２とアミロイドβ４０との比を算出するステップ、
ｉｉｉ）配列番号１８〜配列番号２５から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量と配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量との比を算出するステップ、並びに、
ｉｖ）アミロイドβ４２とアミロイドβ４０との比と、配列番号１８〜配列番号２５から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量と配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量との比と、被験者におけるγセクレターゼ異常に基づく疾患の有無又は程度との関連付けを行うステップ。
（２５）  検体が、被験者の体液である、（１８）〜（２４）に記載のγセクレターゼ異常に基づく疾患を診断するための情報を収集する方法。
（２６）  γセクレターゼ異常に基づく疾患が、アルツハイマー病である、（１８）〜（２５）のいずれか１項に記載のγセクレターゼ異常に基づく疾患を診断するための情報を収集する方法。
【００１８】
更に別の態様において本発明は、本発明は、以下の（２７）〜（２６）に記載の発明に関する：
（２７）  検体中のアルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物を検出するステップを備える、γセクレターゼ異常に基づく疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法。
（２８）  以下のステップを備える、γセクレターゼ異常に基づく疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法：
ａ）変異型γセクレターゼ発現細胞に被験薬を接触させるステップ、
ｂ）培養液を試料として調整するステップ、
ｃ）少なくとも１つのアルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物を認識する抗体又はその断片に試料を接触させるステップ、
ｄ）アルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物への該抗体又はその断片の結合を検出してアルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物のレベルを測定するステップ、並びに、
ｅ）アルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物のレベルと被験薬のγセクレターゼ異常に基づく疾患の治療又は予防効果の有無又は程度との関連付けを行うステップを含む方法。
（２９）  以下のステップを備える、γセクレターゼ異常に基づく疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法：
ａ）γセクレターゼ異常を有する動物又はヒトに被験薬を投与するステップ、
ｂ）投与された対象の体液を試料として調整するステップ、
ｃ）少なくとも１つのアルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物を認識する抗体又はその断片に試料を接触させるステップ、
ｄ）アルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物への該抗体又はその断片の結合を検出してアルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物のレベルを測定するステップ、並びに、
ｄ）アルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物のレベルと被験薬のγセクレターゼ異常に基づく疾患の治療又は予防効果の有無又は程度との関連付けを行うステップを含む方法。
（３０）  以下のステップを備える、γセクレターゼ異常に基づく疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法：
ａ）変異型γセクレターゼ発現細胞に被験薬を接触させるステップ、
ｂ）培養液を試料として調整するステップ、
ｃ）アルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物を分離するステップ、
ｄ）分離されたアルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物のアミノ酸配列に関する情報を検出するステップ、
ｅ）アルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物のレベルと被験薬のγセクレターゼ異常に基づく疾患の治療又は予防効果の有無又は程度との関連付けを行うステップを含む方法。
（３１）  以下のステップを備える、γセクレターゼ異常に基づく疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法：
ａ）γセクレターゼ異常を有する動物又はヒトに被験薬を投与するステップ、
ｂ）投与された対象の体液を試料として調整するステップ、
ｃ）アルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物を分離するステップ、
ｄ）分離されたアルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物のアミノ酸配列に関する情報を検出するステップ、
ｅ）アルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物のレベルと被験薬のγセクレターゼ異常に基づく疾患の治療又は予防効果の有無又は程度との関連付けを行うステップを含む方法。
（３２）  アルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物が、配列番号１１〜配列番号１６、又は、配列番号１８〜配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである、（２７）〜（３１）のいずれか１項に記載のγセクレターゼ異常に基づく疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法。
（３３）  アルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物のレベルと被験薬のγセクレターゼ異常に基づく疾患の治療又は予防効果の有無又は程度との関連付けを行うステップが、
ｅ−１）配列番号１８〜配列番号２０から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量と、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量との比、あるいは、配列番号２１〜配列番号２５から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量と、配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量との比を算出するステップ、並びに、
ｅ−２）算出された比と、被験薬のγセクレターゼ異常に基づく疾患の治療又は予防効果の有無又は程度との関連付けを行うステップ、を備える、（３２）に記載のγセクレターゼ異常に基づく疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法。
（３４）  更に、以下のステップを備える、（３２）又は（３３）に記載ののγセクレターゼ異常に基づく疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法：
ｉ）検体中のアミロイドβ４２及びアミロイドβ４０を検出するステップ、
ｉｉ）検出されたアミロイドβ４２とアミロイドβ４０との比を算出するステップ、
ｉｉｉ）配列番号１８〜配列番号２５から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量と配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量との比を算出するステップ、並びに、
ｉｖ）アミロイドβ４２とアミロイドβ４０との比と、配列番号１８〜配列番号２５から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量と配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量との比と、被験薬のγセクレターゼ異常に基づく疾患の治療又は予防効果の有無又は程度との関連付けを行うステップ。
（３５）  γセクレターゼ異常に基づく疾患が、アルツハイマー病である、（２７）〜（３４）のいずれか１項に記載のγセクレターゼ異常に基づく疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法。
【００１９】
本明細書において、「アルカデイン」とは、神経特異的アダプタータンパク質Ｘ１１Ｌ結合タンパク質、又は、シナプス後のＣａ２＋結合タンパク質（カルシンテニン（ｃａｌｓｙｎｔｅｎｉｎ）とも呼ばれている）としても知られるタイプＩ膜タンパク質であるアルカデインファミリータンパク質の総称であり、Ａｌｃα、Ａｌｃβ、及び、Ａｌｃγを含む。アルカデインは、Ａｌｃα、Ａｌｃβ、又は、Ａｌｃγのいずれかのタンパク質を意味していてもよいし、全てのタンパク質を意味していてもよい。例えば、アルカデインは、Ａｌｃαであってもよい。
【００２０】
本明細書において、「αセクレターゼ」とは、ＡＰＰの一次切断に関与するタンパク質分解酵素のことであり、例えば、ＡＤＡＭ１０又はＡＤＡＭ１７を挙げることができる。αセクレターゼは、膜近傍部位の細胞外領域においてＡＰＰ及びＡｌｃを切断する。本明細書においては、ＡＰＰ及びＡｌｃにおけるαセクレターゼの分解部位を「α−サイト」という。Ａｌｃは、αセクレターゼにより分解されてＮ末端断片とＣ末端断片に分解される。αセクレターゼによりＡｌｃが分解されて生じるＮ末端断片は、細胞表面から放出され、分泌される。本明細書においては、当該Ｎ末端断片を可溶性Ａｌｃ（ｓｏｌｕｂｌｅ  Ａｌｃ）又はｓＡｌｃという。一方、αセクレターゼにより分解されたＣ末端断片は膜貫通部位を有するため細胞膜上に残存する。本明細書においては、当該Ｃ末端断片を「ＣＴＦ」という。
【００２１】
本明細書において、「γセクレターゼ」とは、ＡＰＰの二次切断に関与するタンパク質分解酵素のことであり、例えば、プレセニリンを挙げることができる。プレセニリンは、第１４染色体上にあるプレセニリン１及び第１染色体に位置し、ボルガジャーマン家系等の原因となるプレセニリン２が含まれる。プレセニリンは、６〜８回膜貫通型膜タンパク質である。γセクレターゼによる分解は、αセクレターゼによる分解により誘導される。γセクレターゼは、膜間部においてＡＰＰ及びＡｌｃを切断する。本明細書においては、ＡＰＰ及びＡｌｃにおけるγセクレターゼの分解部位を「γ−サイト」という。Ａｌｃは、γセクレターゼにより分解されてＮ末端断片とＣ末端断片に分解される。γセクレターゼによりＡｌｃが分解されて生じるＮ末端断片は、細胞表面から放出され、分泌される。本明細書においては、当該Ｎ末端断片をｐ３−Ａｌｃという。
【００２２】
本明細書において、「アルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物」とは、Ａｌｃがαセクレターゼ及びγセクレターゼの分解を受けることにより生じた分解物のことであり、具体的には、Ａｌｃがαセクレターゼにより一次切断を受けて生じたＡｌｃＣＴＦが、更にγセクレターゼによる二次切断を受けることにより生じたペプチドのことである。アルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物は、上述のｐ３−Ａｌｃと同義である。アルカデインのαセクレターゼ切断部位及びγセクレターゼ切断部位として複数の部位が存在することから、アルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物としては複数種類が存在する。具体的には、ｐ３−Ａｌｃαとして、例えば、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、又は、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有するペプチドが、ｐ３−Ａｌｃβとして、配列番号１３、又は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有するペプチドが、ｐ３−Ａｌｃγとして、配列番号１５、又は、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。以下においては、このような様々なｐ３−Ａｌｃ断片を総称して「ｐ３−Ａｌｃ種」という。
【００２３】
また、本発明は、アルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物を認識する抗体を包含する。ここで、「アルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物を認識する抗体」とは、ｐ３−Ａｌｃを認識する抗体であれば特に限定されない。好ましくは、ｐ３−Ａｌｃを特異的に認識する抗体であり、より好ましくは、ｐ３−Ａｌｃα、ｐ３−Ａｌｃβ、又は、ｐ３−Ａｌｃγのいずれかを特異的に認識する抗体である。より好ましくは、ｐ３−Ａｌｃα３４、ｐ３−Ａｌｃα３５、ｐ３−Ａｌｃα３６、ｐ３−Ａｌｃα３７、ｐ３−Ａｌｃα３８、又は、ｐ３−Ａｌｃα３９を特異的に認識する抗体である。
【００２４】
また、本発明の抗体が認識するｐ３−Ａｌｃの由来としては、特に限定されるものではなく、哺乳動物のｐ３−Ａｌｃであり、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ラビット又はヒトのｐ３−Ａｌｃであってもよく、好ましくは、ヒトｐ３−Ａｌｃである。アルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物を認識する抗体としては、例えば、配列番号５に記載のアミノ酸配列、配列番号６に記載のアミノ酸配列、配列番号７に記載のアミノ酸配列、配列番号８に記載のアミノ酸配列、配列番号９に記載のアミノ酸配列、配列番号１０に記載のアミノ酸配列、配列番号２６に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号２７に記載のアミノ酸配列をエピトープとして認識する抗体を挙げることができる。また、アルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物を認識する抗体として、例えば、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、又は、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として使用することにより得られる抗体を挙げることができる。
【００２５】
本発明の抗体は、非ヒト動物の抗体、非ヒト動物の抗体のアミノ酸配列とヒト由来の抗体のアミノ酸配列を有する抗体、及び、ヒト抗体を包含する。非ヒト動物の抗体としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ラビットなどの抗体を挙げることができ、好ましくは、ハイブリドーマを作製することができる動物の抗体であり、より好ましくはマウスの抗体である。非ヒト動物の抗体のアミノ酸配列とヒト由来の抗体のアミノ酸配列を有する抗体としては、ヒト抗体に動物由来のモノクローナル抗体の抗原結合ドメインＦｖを入れ替えたヒト型キメラ抗体、動物由来抗体モノクローナル抗体の抗原結合に直接関わるＦｖドメイン上の配列であるＣＤＲをヒト抗体のフレームに組み込んだヒト化抗体を挙げることができる。また、ヒト抗体とは、完全にヒト由来の抗体遺伝子の発現産物であるヒト抗体のことである。また、本発明の抗体のイムノグロブリンクラスは特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＹのいずれのイムノグロブリンクラスであってもよく、好ましくはＩｇＧである。また、本発明の抗体はいずれのアイソタイプの抗体をも包含するものである。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。
【００２６】
「アルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物を認識する抗体の断片」とは、上述の「アルカデインのαセクレターゼ及びγセクレターゼ分解物を認識する抗体」の断片であれば、特に限定されない。ここで、「抗体の断片」とは、抗体の一部分（部分断片）又は抗体の一部分を含むペプチドであって、抗体の抗原への結合作用を保持するものことである。このような抗体の断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、一本鎖Ｆｖ（以下、「ｓｃＦｖ」という）、ジスルフィド結合Ｆｖ（以下、「ｄｓＦｖ」という）若しくはこれらの重合体、二量体化Ｖ領域（以下、「Ｄｉａｂｏｄｙ」という）、又は、ＣＤＲを含むペプチドを挙げることができる。Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧをタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。Ｆａｂ’は、該Ｆ（ａｂ’）のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。ｓｄＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬがペプチドリンカーで連結された抗原結合活性を有するポリペプチドである。ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のシステイン残基に置換されたアミノ酸残基がジスルフィド結合を介して結合している抗原結合活性を有する断片である。Ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した断片である。本発明のＤｉａｂｏｄｙは、モノスペシフィックでもよいし、バイスペシフィック（多重特異性抗体）でもよい。二量体化しているｓｃＦｖは、同一であっても良いし、異なっていても良い。ＣＤＲを含むペプチドは、重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び、ＣＤＲ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲのアミノ酸配列を含むペプチドのことである。
【００２７】
「γセクレターゼ異常に基づく疾患」とは、γセクレターゼの異常により引き起こされる疾患であれば特に限定されない。γセクレターゼの異常は、機能不全であってもよいし、切断部位（γ−サイト）の変化であってもよい。γセクレターゼの異常に基づく疾患としては、例えば、アルツハイマー病を挙げることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ＡＤＡＭ１０遺伝子ホモノックアウトマウス（−／−）由来のマウス胚性線維芽細胞、及び、ＡＤＡＭ１０遺伝子ヘテロノックアウトマウス（＋／−）由来のマウス胚性線維芽細胞の培養液中又は細胞溶解物中における、ＦＬＡＧラベル化Ａｌｃα、Ａｌｃｐ３−Ａｌｃγ、又は、ＡＰＰのウェスタンブロットの結果、並びに、レーン１におけるｓＡｌc（培養液中分泌分解物）を１とした場合のレーン２のｓＡｌc（培養液中分泌分解物）の割合のグラフを示す。ウェスタンブロットの写真は、それぞれ、図１ＡはＡｌｃα、図１ＢはＡｌｃβ、図１ＣはＡｌｃγ、図１ＤはＡＰＰの結果を示す。ｓＡｌｃ及びｓＡＰＰは、それぞれ切断され、分泌されたＡｌｃ及びＡＰＰ分解物を示す。また、Ｍｅｄｉｕｍは、培養液中に分泌されたｓＡｌｃ又はｓＡＰＰを示し、Ｃｅｌｌは細胞内Ａｌｃ又はＡＰＰを示す。
【図２】様々なレベルのＡＤＡＭ１０を発現させたＡＤＡＭ１０遺伝子ホモノックアウトマウス（−／−）由来のマウス胚性線維芽細胞における、培養液中又は細胞溶解物中における、Ａｌｃα、Ａｌｃβ、Ａｌｃγ、又は、ＡＰＰのウェスタンブロットの結果を示す。それぞれ、図２ＡはＡｌｃα、図２ＢはＡｌｃβ、図２ＣはＡｌｃγ、図２ＤはＡＰＰの結果を示す。また、Ｍｅｄｉｕｍは、培養液中に分泌されたｓＡｌｃ又はｓＡＰＰを示し、Ｃｅｌｌは細胞内Ａｌｃ又はＡＰＰ、及び、細胞内ＡＤＡＭ１０の発現を示す。ｆｏｌｄは、ＡＤＡＭ１０−ＨＡ遺伝子を導入しない細胞（０μｇＤＮＡ)によるｓＡｌｃ又はｓＡＰＰの分泌量を１とした場合の、ＡＤＡＭ１０−ＨＡ遺伝子を導入した細胞によるｓＡｌｃ又はｓＡＰＰの分泌量を示したものである。
【図３】様々なレベルのＡＤＡＭ１７を発現させたＮ２ａ細胞における、培養液中又は細胞溶解物中における、Ａｌｃα、Ａｌｃβ、Ａｌｃγ、又は、ＡＰＰのウェスタンブロットの結果（左図）、並びに、ＡＤＡＭ１７−ＨＡ遺伝子を導入しない細胞（０μｇＤＮＡ)によるｓＡｌｃ又はｓＡＰＰの分泌量を１とした場合の、ＡＤＡＭ１７−ＨＡ遺伝子を導入した細胞によるｓＡｌｃ又はｓＡＰＰの分泌量を示したグラフ（右図）を示す。それぞれ、図３ＡはＡｌｃα、図３ＢはＡｌｃβ、図３ＣはＡｌｃγ、図３ＤはＡＰＰの結果を示す。また、Ｍｅｄｉｕｍは、培養液中に分泌されたｓＡｌｃ又はｓＡＰＰを示し、Ｃｅｌｌは細胞内Ａｌｃ又はＡＰＰ、及び、細胞内ＡＤＡＭ１７の発現を示す。
【図４】細胞外に分泌されたｐ３−Ａｌｃα、ｐ３−Ａｌｃβ、及び、ｐ３−Ａｌｃγのマススペクトルの結果を示す。図４ＡはＡｌｃα、図４ＢはＡｌｃβ、図４ＣはＡｌｃγの結果を示す。左図は分子量を決定するためにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦにより分析した結果を示す。図４Ａにおける矢印「３５」及び矢印「２Ｎ＋３５」は、ぞれぞれｐ３−Ａｌｃα３５及びｐ３−Ａｌｃα２N＋３５を示す。図４Ｂにおける矢印「３７」及び矢印「４０」は、それぞれ、ｐ３−Ａｌｃβ３７及びｐ３−Ａｌｃβ４０を示す。図４Ｃにおける矢印「３１」及び矢印「３４」は、それぞれ、ｐ３−Ａｌｃγ３１及びｐ３−Ａｌｃγ３４を示す。中央図及び右図は、対応する左図において矢印で示されたシグナルを更にＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳにより分析した結果を示す。図４Ｃの左図において矢印「３４」で示されたシグナルは弱かったため、ｐ３−Ａｌｃγ３４に関しては、Ｌ１６６Ｐ変異株を発現するＨＥＫ２９３細胞から得られたｐ３−Ａｌｃγ３４をＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳにより分析した結果を図４Ｃ右図に示した。
【図５】上から順に、Ａｌｃα１、Ａｌｃβ、Ａｌｃγ、及び、ＡＰＰのｐ３付近のアミノ酸配列を示す。配列下方の上向き矢印は、一次切断部位を示し、Ａｌｃα１、Ａｌｃβ、及び、Ａｌｃγはα−サイトを、ＡＰＰは、α−サイト（「α」で示す）及びβ−サイト（「β」で示す）を示す。配列上方の下向き矢印は、二次切断部位（γ−サイト）を示す。配列下方の二重線は、それぞれ、ｐ３−Ａｌｃα３５、ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３５、ｐ３−Ａｌｃβ３７、ｐ３−Ａｌｃγ３１、Ａβ、及び、ｐ３のアミノ酸配列を示す。また、配列下線の一重線は、膜貫通部位を示す。
【図６】図６Ａは、野生型ＰＳ１又は家族性アルツハイマー病関連ＰＳ１変異体を発現している細胞から分泌されたｐ３−Ａｌｃαのマススペクトル分析の結果を示す。野生型ＰＳ１を安定的に発現している細胞を「WT」、未発現の細胞を「Ｍｏｃｋ」で示す。また、その他の記号は各家族性アルツハイマー病関連ＰＳ１変異体の変異を表す：Ｍｅｔ１４６Ｌｅｕ（Ｍ１４６Ｌ）、Ｌｅｕ１６６Ｐｒｏ（Ｌ１６６Ｐ）、Ａｌａ２４６Ｇｌｕ（Ａ２４６Ｅ）、Ａｒｇ２７８Ｔｈｒ（Ｒ２７８Ｔ）、Ｌｅｕ２８６Ｖａｌ（Ｌ２８６Ｖ）、Ａｌａ４３４Ｃｙｓ（Ａ４３４Ｃ）、Ａｌａ７９Ｖａｌ（Ａ７９Ｖ）、Ｈｉｓ１６３Ａｒｇ（Ｈ１６３Ｒ）、及び、Ｉｌｅ１４３Ｔｈｒ（Ｉ１４３Ｔ）。  図６Ｂは、図６Ａに示した各細胞における（１）ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３４のｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３５に対する比、（２）ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３６のｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３５に対する比、（３）ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３７のｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３５に対する比、及び、（４）ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３８のｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３５に対する比と、Ａβ４２／４０比の関係を示す。縦軸は、（１）ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３４のｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３５に対する比、（２）ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３６のｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３５に対する比、（３）ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３７のｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３５に対する比、又は、（４）ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３８のｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３５に対する比を示し、横軸はＡβ４２／４０を示す。
【図７】図７Ａは、野生型ＰＳ１又は家族性アルツハイマー病関連ＰＳ１変異体を発現している細胞から分泌されたｐ３−Ａｌｃβのマススペクトル分析の結果を示す。野生型ＰＳ１を安定的に発現している細胞を「WT」、未発現の細胞を「Ｍｏｃｋ」で示す。また、その他の記号は各家族性アルツハイマー病関連ＰＳ１変異体の変異を表す：Ｍｅｔ１４６Ｌｅｕ（Ｍ１４６Ｌ）、Ｌｅｕ１６６Ｐｒｏ（Ｌ１６６Ｐ）、Ａｌａ２４６Ｇｌｕ（Ａ２４６Ｅ）、Ａｒｇ２７８Ｔｈｒ（Ｒ２７８Ｔ）、Ｌｅｕ２８６Ｖａｌ（Ｌ２８６Ｖ）、Ａｌａ４３４Ｃｙｓ（Ａ４３４Ｃ）。  図７Ｂは、図７Ａに示した各細胞における（１）ｐ３−Ａｌｃβ３８ｐ３−Ａｌｃβ３７に対する比、（２）ｐ３−Ａｌｃβ３９ｐ３−Ａｌｃβ３７に対する比、及び、（３）ｐ３−Ａｌｃβ４０のｐ３−Ａｌｃβ３７に対する比と、Ａβ４２／４０比の関係を示す。縦軸は、（１）ｐ３−Ａｌｃβ３８のｐ３−Ａｌｃβ３７に対する比、（２）ｐ３−Ａｌｃβ３９のｐ３−Ａｌｃβ３７に対する比、又は、（３）ｐ３−Ａｌｃβ４０のｐ３−Ａｌｃβ３７に対する比を示し、横軸はＡβ４２／４０を示す。  図７Ｃは、野生型ＰＳ１又は家族性アルツハイマー病関連ＰＳ１変異体を発現している細胞から分泌されたｐ３−Ａｌｃγのマススペクトル分析の結果を示す。野生型ＰＳ１を安定的に発現している細胞を「WT」、未発現の細胞を「Ｍｏｃｋ」で示す。また、その他の記号は各家族性アルツハイマー病関連ＰＳ１変異体の変異を表す：Ｍｅｔ１４６Ｌｅｕ（Ｍ１４６Ｌ）、Ｌｅｕ１６６Ｐｒｏ（Ｌ１６６Ｐ）、Ａｌａ２４６Ｇｌｕ（Ａ２４６Ｅ）、Ａｒｇ２７８Ｔｈｒ（Ｒ２７８Ｔ）、Ｌｅｕ２８６Ｖａｌ（Ｌ２８６Ｖ）、Ａｌａ４３４Ｃｙｓ（Ａ４３４Ｃ）。  図７Ｄは、図７Ｃに示した各細胞における（１）ｐ３−Ａｌｃγ３０のｐ３−Ａｌｃγ３１に対する比、（２）ｐ３−Ａｌｃγ３２のｐ３−Ａｌｃγ３１に対する比、及び、（３）ｐ３−Ａｌｃγ３４のｐ３−Ａｌｃγ３１に対する比と、Ａβ４２／４０比の関係を示す。縦軸は、（１）ｐ３−Ａｌｃγ３０のｐ３−Ａｌｃγ３１に対する比、（２）ｐ３−Ａｌｃγ３２のｐ３−Ａｌｃγ３１に対する比、又は、（３）ｐ３−Ａｌｃγ３４のｐ３−Ａｌｃγ３１に対する比を示し、横軸はＡβ４２／４０を示す。
【図８】各ＰＳ１変異体におけるＡβ４２／４０の比を表わす。ＷＴは野生型ＰＳ１発現細胞、Ｍ１４６Ｌ、Ｌ１６６Ｐ、Ａ２４６Ｅ、Ｒ２７８Ｔ、Ｌ２８６Ｖ、Ａ４３４Ｃ、A79V,H163R 、及び、 I143Tは、当該変異を有するＰＳ１変異体を表す。
【図９】ＰＳ１／２ノックアウトマウス由来ＭＥＦｓ及び野生型マウス由来ＭＥＦsの培養液中のｐ３−Ａｌｃβをマススペクトルで測定した結果を示す。縦軸は強度を、横軸はｍ／ｚを表す。
【図１０】ＰＳ１／２ノックアウトマウス由来ＭＥＦｓ及び野生型マウス由来ＭＥＦsの培養液中のＡｌｃβ及びＡｌｃβＣＴＦをウェスタンブロッティングにより確認した結果を表わす。左側のレーンから順に、Ａｌｃβ導入野生型マウス由来ＭＥＦs、Ａｌｃβ未導入野生型マウス由来ＭＥＦs、Ａｌｃβ導入ＰＳ１／２ノックアウトマウス由来ＭＥＦｓ、Ａｌｃβ未導入ＰＳ１／２ノックアウトマウス由来ＭＥＦｓの結果を示す。図中、ＡｌｃβＣＴＦで示す矢印はＡｌｃβＣＴＦのバンドを、Ａｌｃβで示す矢印はＡｌｃβのバンドを表す。
【図１１】Ａｌｃβ又はＡｌｃα導入細胞から得られた培養液中のＡｌｃβ、ＡｌｃβＣＴＦ及びｐ３−Ａｌｃβ、又は、Ａｌｃα、ＡｌｃαＣＴＦ及びｐ３−Ａｌｃαをウェスタンブロッティングにより確認した結果を表わす。左側のレーンから順に、Ａｌｃβ又はＡｌｃα未導入ＭＥＦs、Ａｌｃβ又はＡｌｃα導入ＭＥＦs、ＤＡＰＴ添加Ａｌｃβ又はＡｌｃα導入ＭＥＦｓＡｌｃβ又はＡｌｃα導入ＰＳ１のＤ３８５Ａ変異体発現ＭＥＦｓの結果を示す。図中、ｐ３−Ａｌｃβで示す矢印は、ｐ３−Ａｌｃβのバンドを、ＡｌｃβＣＴＦで示す矢印はＡｌｃβＣＴＦのバンドを、Ａｌｃβで示す矢印はＡｌｃβのバンドを表す。また、図中、ｐ３−Ａｌｃαで示す矢印は、ｐ３−Ａｌｃαのバンドを、ＡｌｃαＣＴＦで示す矢印はＡｌｃαＣＴＦのバンドを、Ａｌｃαで示す矢印はＡｌｃαのバンドを表す。
【図１２】５〜１０人の個人（７０〜９０歳）から得られたヒト脳脊髄液（０．３〜１．０ｍＬ）の混合物における、ｐ３−Ａｌｃα、ｐ３−Ａｌｃβ、又は、ｐ３−Ａｌｃγについてマススペクトルにより解析した結果を表す図である。
【図１３】５〜１０人の個人（７０〜９０歳）から得られたヒト脳脊髄液（０．３〜１．０ｍＬ）の混合物における、ｐ３−Ａｌｃα、ｐ３−Ａｌｃβ、又は、ｐ３−Ａｌｃγについてマススペクトルにより解析した結果（左図）、及び、矢印で示されたペプチドを回収し、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳ解析によりアミノ酸配列を解析した結果（右図）を表わす。
【図１４】マススペクトルのリクレクターモードにより、３７アミノ酸からなるｐ３−Ａｌｃ“３７”を解析した結果を示す（左図）。また、解析した結果、ｐ３−Ａｌｃα３７及びｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３５に該当するアミノ酸配列を表す（右図）。
【図１５】３人のコントロールの脳脊髄液（図１５Ａ〜Ｃ）及び４人のアルツハイマー病患者の脳脊髄液（図１５Ｄ〜Ｇ）をマススペクトルにより解析した結果を表す。
【図１６】非認知症のヒト（コントロール）（ＣＤＲ＝０）、アルツハイマー病の疑いがある患者（ＣＤＲ＝０．５）、散発性アルツハイマー病（ＣＤＲ＝１．０）の脳脊髄液におけるｐ３−Ａｌｃαを測定した結果を示す。
【図１７】非認知症のヒト（コントロール）（ＣＤＲ＝０）、アルツハイマー病の疑いがある患者（ＣＤＲ＝０．５）、散発性アルツハイマー病（ＣＤＲ＝１．０）の脳脊髄液における、（１）ｐ３−Ａｌｃα３４のｐ３−Ａｌｃα３５に対する比、（２）ｐ３−Ａｌｃα３６のｐ３−Ａｌｃα３５に対する比、（３）ｐ３−Ａｌｃα３７のｐ３−Ａｌｃα３５に対する比、（４）３−Ａｌｃα３８のｐ３−Ａｌｃα３５に対する比、及び、ｐ３−Ａｌｃα３９のｐ３−Ａｌｃα３５に対する比の比を、Ａβ４２／４０比と比較した結果を示す。垂直の点線は、アルツハイマー病が疑われる患者（ＣＤＲ＝０．５）のＡβ４２／４０比の平均値を示す。水平の点線は他の神経性または神経変性疾患患者のＡβ４２／４０の最大値を示す。
【図１８】抗ｐ３−Ａｌｃα３５抗体である、Ａｌｃ８３９抗体の特異性をＥＬＩＳＡ法により確認した結果を示す図である。ひし形は、γ５（ＫＫＣＶＰＳＴＡＴＶＶＩＶ）（配列番号２８）との結合性、四角は、ＴＳ−Ｃ（８ｍｅｒ）（ＫＣＶＰＳＴＡＴ）（配列番号２９）との結合性、三角は、ＴＳ−Ｃ（１１ｍｅｒ）（ＣＰＳＴＡＴＶＶＩＶＶ）（配列番号３０）との結合性を示す。図中、縦軸は波長４９０ｎｍにおける吸光度を示し、横軸は希釈倍率を示す。
【図１９】Ａｌｃ８１７抗体及びＡｌｃ８３９抗体を用いて作製した標準曲線の結果を示す図である。図中、縦軸は波長４５０ｎｍにおける吸光度を示し、横軸はｐ３−Ａｌｃα３５ペプチドの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。
【図２０】非痴呆のヒト（健常人）、家族性アルツハイマー病患者（ＦＡＤ）、及び、その他の神経性又は神経変性疾患患者（ＯＮＤ）から得た脳脊髄液中のｐ３−Ａｌｃα３５の濃度をＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す図である。図中、縦軸はｐ３−Ａｌｃα３５ペプチドの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
１．抗ｐ３−Ａｌｃ抗体作製
本発明の抗体は、例えば、ｐ３−Ａｌｃ、又は、配列番号５〜１０、配列番号２６若しくは配列番号２７のいずれか１つの配列番号に記載のアミノ酸配列を有するペプチド等のｐ３−Ａｌｃの一部を有するペプチド（以下、「ｐ３−Ａｌｃの一部を有するペプチド」という）を、必要に応じて免疫賦活剤（例えば、鉱油若しくはアルミニウム沈殿物と加熱死菌若しくはリポ多糖体、フロインドの完全アジュバント、又は、フロインドの不完全アジュバント等）とともに、非ヒト哺乳動物又は鳥類に免疫することにより作製することができる。免疫原として使用するｐ３−Ａｌｃは、哺乳動物のｐ３−Ａｌｃであれば、特に限定は無いが、好ましくは、ヒトｐ３−Ａｌｃである。例えば、ｐ３−Ａｌｃαに対する抗体は、免疫原として、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、又は、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを使用することに得ることができる。特に、ｐ３−Ａｌｃα３５に対する抗体は、免疫原として、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、又は、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを使用することに得ることができる。その他のｐ３−Ａｌｃα種を特異的に認識する抗体は、ｐ３−Ａｌｃα３５に対する抗体を得る場合に使用した免疫原の選択方法に準じて免疫原を選択することにより得ることができる。ｐ３−Ａｌｃβに対する抗体は、免疫原として、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、又は、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを使用することに得ることができる。ｐ３−Ａｌｃαに対する抗体は、免疫原として、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを使用することにより得ることができる。本発明の抗体の作製に使用する免疫原は、ｐ３−Ａｌｃ又はｐ３−Ａｌｃの一部を有するペプチドをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等に導入し、発現させることにより得ることができる。免疫原として、ｐ３−Ａｌｃの一部を有するペプチドを使用する場合には、ｐ３−Ａｌｃの一部を有するペプチドをそのまま使用することもできるし、１種類又は２種類以上のｐ３−Ａｌｃの一部を有するペプチドをリンカーを介して結合させて使用することもできる。【００３０】
ｐ３−Ａｌｃ又はｐ３−Ａｌｃの一部を有するペプチドは、Ｆｍｏｃ法又はＢｏｃ法等を用いて化学合成により作製できる。例えば、ＭＫ又はＭＫの一部を有するペプチドのＣ末端のアミノ酸をポリスチレン担体に固定化し、９-フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）又はtert-ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）で保護されたアミノ酸を、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）等の縮合剤を用いて反応させることにより結合させ、洗浄、脱保護の工程を繰り返すことにより、所望のアミノ酸配列を有するペプチドを得ることができる。また、ｐ３−Ａｌｃ又はｐ３−Ａｌｃの一部を有するペプチドは、自動ペプチド合成機を用いて合成することもできる。このようなペプチド合成機としては、例えば、ＰＳＳＭ−８（島津製作所）；モデル４３３Ａペプチドシンセサイザ（アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．））；ＡＣＴ３９６Ａｐｅｘ（アドバンストケムテック社（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ  Ｉｎｃ．））等が挙げられる。また、ＭＫは、報告された方法に従って合成することもできる（Ｉｎｕｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉ．，ｐ.２８−３９，１９９６）。【００３１】
免疫動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット、ニワトリ、アヒル等ハイブリドーマを作製することが可能な動物であれば特に限定はない。動物への免疫原の投与は、例えば、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射又は足蹠注射により行うことができるが、好ましくは、皮下注射又は腹腔内注射である。使用する免疫原の量は、抗体を産生できる量であれば特に限定は無いが、好ましくは、０．１〜１０００μｇであり、より好ましくは、１〜５００μｇであり、より更に好ましくは、１０〜１００μｇである。免疫は、１回又は適当な間隔をあけて数回行うことができる。好ましくは、１〜５週間に１回の免疫を合計２〜５回行い、より好ましくは、３週間に１回の免疫を合計３回行う。最後の免疫から１〜２週間後に、免疫した動物の眼窩又は尾静脈から採血を行い、その血清を用いて抗体価の測定を行う。抗体価の測定は、当業者周知の方法で行うことができる。例えば、放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ法）、固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）、蛍光抗体法、受身血球凝集反応法を挙げることができ、好ましくは、ＥＬＩＳＡ法である。本発明の抗体は、十分な抗体価を示す動物の血清から精製することにより得ることができる。【００３２】
モノクローナル抗体は、上記方法により免疫した免疫感作動物から得た抗体産生細胞と、骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）を融合することにより得られるハイブリドーマを培養することにより得ることができる。当該融合方法としては、例えば、ミルステインらの方法（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３−４６，１９８１）を挙げることができる。使用する抗体産生細胞は、上記方法により免疫し血清が十分な抗体価を示したマウス又はラットの脾臓、膵臓、リンパ節、末梢血より採取することができる。使用する骨髄腫系細胞は、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ラビット又はヒト等の哺乳動物に由来する細胞であって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な細胞であれば特に限定はない。このような細胞としては、例えば、Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５，１９７５）、Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１（ＮＳ１）（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，２９２，１９７６）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１，１，１９７８）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８，１９７９）、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／Ｏ）（Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９，１９７８）、Ｓｐ２／Ｏ／ＦＯ−２（ＦＯ−２）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３５，１，１９８０）等を挙げることができる。上述の方法に従って得られた抗体産生細胞及び骨髄腫細胞は、培地、ＰＢＳ(Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ)等で洗浄後、ポリエチレングリコール（以下、「ＰＥＧ」という）等の細胞凝集性媒体を加え、細胞を融合させる（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９８８）。融合させる際の抗体産生細胞及び骨髄腫細胞の比率は、例えば、２：１〜１：２である。細胞融合を行った後、ＨＡＴ（ヒポキサンチン（Hypoxanthine）−アミノプテリン（aminopterin）−チミジン（thymidine））培地等の培地で培養することにより、ハイブリドーマを選択的に増殖させる。培養後、培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡ等により、抗原タンパク質に結合し、非抗原タンパク質に結合しないサンプルを選択する。当該サンプルを限界希釈法により単一細胞化を行い、安定して高い抗体価を示す細胞を選択する。モノクローナル抗体は、上述の方法により得られたハイブリドーマをｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、培養液を精製することによって得ることができる。また、本発明のモノクローナル抗体は、予めプリスタンを腹腔内に投与した同系動物又は免疫不全動物にハイブリドーマを移植した後、腹水化させ、採取した腹水を精製することによっても得ることができる。【００３３】
モノクローナル抗体の精製は、遠心分離後、プロテインＡカラム、プロテインＧカラム等を用いてＩｇＧ画分を回収することにより得ることができる。抗体のクラスが、ＩｇＹ及びＩｇＭの場合には、メルカプトピリジンをリガンドとしたカラムで精製することができる。また、抗体のクラスによらず、ＭＫ固相化カラム、イオン交換クロマトグラフィ、疎水相互作用クロマトグラフィ等を用いて精製することもできる。【００３４】
２．抗体断片の作製
本発明の抗体の断片（Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ若しくはこれらの重合体、Ｄｉａｂｏｄｙ、又は、ＣＤＲを含むペプチド）は、以下の方法により作製することができる。本発明のＦ（ａｂ’）２断片は、ｐ３−Ａｌｃに結合するＩｇＧ抗体をタンパク質分解酵素ペプシンで処理し、Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断することにより、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片として得ることができる。また、本発明のＦ（ａｂ’）２断片は、後述のＦａｂ’をチオエーテル結合又はジスルフィド結合させることにより得ることができる。本発明のＦａｂ’断片は、上述の方法により得られたｐ３−Ａｌｃに結合するＦ（ａｂ’）２を還元剤であるジチオスレイトール処理して得ることができる。また、本発明のＦａｂ’断片は、本発明のＭＫに結合する抗体のＦａｂ’をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。【００３５】
本発明のＦａｂ断片は、ｐ３−Ａｌｃに結合する抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理し、Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断することにより、Ｈ鎖のＮ末端側の約半分の領域とＬ鎖の全領域がジスルフィド結合により結合された分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片として得ることができる。また、本発明のＦａｂ断片は、本発明のＭＫに結合する抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。本発明のｓｃＦｖは、ｐ３−Ａｌｃに結合する抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、これらの遺伝子の間にリンカー配列をコードするＤＮＡを挿入し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、当該ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。リンカーの長さは、ＶＨとＶＬが会合することができる長さであれば特に限定は無いが、好ましくは１０〜２０残基であり、より好ましくは１５残基である。また、リンカーの配列は、ＶＨとＶＬの二つのドメインのポリペプチド鎖の折りたたみを阻害しないものであれば特に限定は無いが、好ましくは、グリシン及び／又はセリンからなるリンカーであり、より好ましくは、ＧＧＧＧＳ（Ｇ：グリシン、Ｓ：セリン）又はその繰り返し配列である。【００３６】
本発明のｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基を部位特異的突然変異によりシステイン残基に置換し、ＶＨ及びＶＬを当該システイン残基間のジスルフィド結合で結合させることにより得ることができる。置換するアミノ酸は、立体構造に基づき抗原結合に影響の無いアミノ酸残基であれば特に限定はない。本発明のＤｉａｂｏｄｙは、上述のｓｃＦｖをコードするＤＮＡにおいて、リンカーのアミノ酸配列が８残基以下（好ましくは５残基）となるように構築し、当該ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。バイスペシフィックなＤｉａｂｏｄｙは、異なる２種類のｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬのＤＮＡを組み合わせてｓｃＦｖを作製することにより得ることができる。ＣＤＲを含むペプチドは、本発明のｐ３−Ａｌｃに結合する抗体のＶＨ又はＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを構築し、当該ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。【００３７】
３．ｐ３−Ａｌｃ結合抗体等の選択
必要に応じて、上述の方法により得られたｐ３−Ａｌｃに結合する抗体又はその断片から、ｐ３−Ａｌｃへの結合能の高い抗体を選択することができる。抗体又はその断片のｐ３−Ａｌｃへの結合は、当業者周知の方法で測定することができる。このような方法として、例えば、ウェスタンブロッティング、クロマトグラフィ（アフィニティクロマトグラフィ）、Ｘ線結晶解析の他、ビアコアシステム（ビアコア社）を挙げることができる。結合するｐ３−Ａｌｃα種は特定の種であってもよいし、全てのｐ３−Ａｌｃαと結合してもよい。ＥＬＩＳＡにより特定のＡｌｃα種を測定する場合には、特定のｐ３−Ａｌｃαに特異的な抗体を選択することが好ましい。また、全てのｐ３−Ａｌｃα種を免疫沈降により回収する場合には、全てのｐ３−Ａｌｃαと結合する抗体が好ましい。また、抗ｐ３−Ａｌｃα抗体は、他のｐ３−Ａｌｃ種（ｐ３−Ａｌｃβ及びｐ３−Ａｌｃγ）と交差反応しないことが好ましい。ｐ３−Ａｌｃβ及びｐ３−Ａｌｃγについても同様である。【００３８】
４．診断薬
本発明の診断薬は、ｐ３−Ａｌｃ抗体又はその断片を用いた公知の方法に基づくことができる。このような方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ（Ｃａｔｔｙ，Ｒａｙｋｕｎｄａｌｉａ，１９８９）、ラジオイムノアッセイ（Ｃａｔｔｙ，Ｍｕｒｐｈｙ，１９８９）、免疫組織化学的方法（Ｈｅｉｄｅｒら、１９９３）、又は、ウェスタンブロット等を挙げることができる。ｐ３−Ａｌｃ抗体又はその断片は、ｐ３−Ａｌｃα、ｐ３−Ａｌｃβ、又は、ｐ３−Ａｌｃγのそれぞれに特異的な抗体が好ましい。ＥＬＩＳＡ等の抗体への結合量を指標としてｐ３−Ａｌｃ種の量又は濃度を測定する場合には、本発明の診断薬は、各ｐ３−Ａｌｃ種に特異的な抗体（例えば、ｐ３−Ａｌｃα３４、ｐ３−Ａｌｃα３５、ｐ３−Ａｌｃα３６、ｐ３−Ａｌｃα３７、ｐ３−Ａｌｃα３８、又は、ｐ３−Ａｌｃα３９に特異的な抗体）を備えることが好ましい。本発明の診断薬は、単独で使用する診断キットであってもよいし、他の機器と組み合わせて使用する試薬であってもよい。本発明の診断薬の検体としては、例えば、生検として被験者から採取した組織試料又は液体を使用することができる。使用される生検は、ＭＫの免疫学的測定の対象となるものであれば特に限定はなく、例えば、組織、血液、尿、漿液、髄液（特には脳脊髄液）、関節液、眼房水、涙液、唾液又はそれらの分画物若しくは処理物を挙げることができる。本発明の診断薬による分析は、定性的、定量的又は半定量的に行うことができる。【００３９】
５．診断装置
本発明の診断装置は、検体中のｐ３−Ａｌｃを分離する手段、及び、分離されたｐ３−Ａｌｃ種を検出する手段を備える。検体中のｐ３−Ａｌｃを分離する手段は、ｐ３−Ａｌｃを分離可能な手段であれば特に限定されず、例えば、免疫沈降、ウェスタンブロット、又は、アフィニティクロマトグラフィ等を挙げることができる。検体中のｐ３−Ａｌｃを分離する手段は、ｐ３−Ａｌｃを分離するための試薬として、ｐ３−Ａｌｃと結合する物質を備えていることが好ましい。ｐ３−Ａｌｃと結合する物質としては、好ましくは、ｐ３−Ａｌｃに対する抗体又はその断片であり、より好ましくは、ｐ３−Ａｌｃに特異的に結合する抗体又はその断片である。ｐ３−Ａｌｃ抗体又はその断片は、ｐ３−Ａｌｃα、ｐ３−Ａｌｃβ、又は、ｐ３−Ａｌｃγのそれぞれに特異的な抗体を使用することが好ましい。例えば、抗ｐ３−Ａｌｃα抗体としては、配列番号５〜配列番号７のいずれか１つの配列番号に記載のアミノ酸配列を抗原として取得した抗体を使用することができ、抗ｐ３−Ａｌｃβ抗体としては、配列番号８又は配列番号９に記載のアミノ酸配列を抗原として取得した抗体を使用することができ、抗ｐ３−Ａｌｃγ抗体としては、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を抗原として取得した抗体を使用することができる。【００４０】
分離されたｐ３−Ａｌｃ種を検出する手段は、ｐ３−Ａｌｃ種を検出可能な手段であれば特に限定されない。ここで、「ｐ３−Ａｌｃ種を検出」とは、当該ペプチドを構成するアミノ酸の配列情報、当該ペプチドを構成するアミノ酸の個数に関する情報、当該ペプチドの分子量、当該ペプチドを構成するアミノ酸に配列に基づく物理的若しくは化学的な情報、当該ペプチドの量に関する情報を検出することを包含し、これらの１つの情報であってもよいし、複数の情報であってもよい。アミノ酸配列に関する情報を検出する手段としては、例えば、マススペクトル又はプロテインシーケンサー等を挙げることができる。【００４１】
６．診断方法及び診断するための情報を収集する方法
本発明のバイオマーカは、γセクレターゼ異常に基づく疾患、特にはアルツハイマー病、の指標となる。よって、本発明のバイオマーカ又は本発明の抗体若しくはその断片は、γセクレターゼ異常に基づく疾患の診断方法、γセクレターゼ異常に基づく疾患の診断ための情報を提供する方法、γセクレターゼ異常に基づく疾患の状態又は進行をモニターする方法、及び、γセクレターゼ異常に基づく疾患に対する治療薬の治療効果の判定方法（以下、総称して「γセクレターゼ異常に基づく疾患の診断方法等」という）に使用することができる。【００４２】
本発明のγセクレターゼ異常に基づく疾患の診断方法等は、検体中のｐ３−Ａｌｃを検出するステップを備え、ｐ３−Ａｌｃ種の生成量を指標として診断を行うことができる。本発明の診断方法においてｐ３−Ａｌｃ種の生成量を指標として診断を行う場合、測定するｐ３−Ａｌｃ種として、好ましくは、ｐ３−Ａｌｃα３４、ｐ３−Ａｌｃα３５、ｐ３−Ａｌｃα３６、ｐ３−Ａｌｃα３７、ｐ３−Ａｌｃα３８、又は、ｐ３−Ａｌｃα３９等のｐ３−Ａｌｃα種であり、より好ましくは、ｐ３−Ａｌｃα３４、ｐ３−Ａｌｃα３５、ｐ３−Ａｌｃα３７、及び、ｐ３−Ａｌｃα３９である。【００４３】
より具体的には、本発明のγセクレターゼ異常に基づく疾患の診断方法は、以下のステップ：
ａ）被験者由来の試料を調整するステップ、
ｂ）少なくとも１つのｐ３−Ａｌｃを認識する抗体又はその断片に該試料を接触させるステップ、
ｃ）ｐ３−Ａｌｃへの該抗体又はその断片の結合を検出してp3-Alcのレベルを測定するステップ、並びに、
ｄ）ｐ３−Ａｌｃのレベルと被験者におけるγセクレターゼ異常に基づく疾患の有無又は程度との関連付けを行うステップ、により行うことができる。
例えば、上記方法は、ＥＬＩＳＡ法、又は、イムノクロマト法により行うことができる。【００４４】
また、本発明のγセクレターゼ異常に基づく疾患の診断方法は、以下のステップ：
ａ）被験者由来の試料を調整するステップ、
ｂ）ｐ３−Ａｌｃを分離するステップ、
ｃ）分離されたｐ３−Ａｌｃ種を検出するステップ、
ｄ）ｐ３−Ａｌｃのレベルと、被験者におけるγセクレターゼ異常に基づく疾患の有無又は程度との関連付けを行うステップ、により行うことができる。
例えば、上記方法は、クロマトグラフィとマススペクトルを組み合わせて使用することにより行うことができる。【００４５】
上記診断方法において、ｐ３−Ａｌｃとしては、配列番号１１〜配列番号１６、又は、配列番号１８〜配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを使用することができる。また、上述において、「ｐ３−Ａｌｃのレベルと、被験者におけるγセクレターゼ異常に基づく疾患の有無又は程度との関連付けを行うステップ」は、ｐ３−Ａｌｃ、好ましくは、配列番号１１〜１６、及び、配列番号１８〜２０から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドの量が大きい被験者をγセクレターゼ異常に基づく疾患に罹患している又は罹患の程度が高い患者として判定することを含むことができる。【００４６】
また、本発明のγセクレターゼ異常に基づく疾患の診断方法等は、検体中のｐ３−Ａｌｃを検出するステップを備え、ｐ３−Ａｌｃ種の生成量の比を指標として診断を行うことができる。本発明の診断方法においてｐ３−Ａｌｃ種生成量の比を指標として診断を行う場合、測定するｐ３−Ａｌｃ種として、好ましくは、ｐ３−Ａｌｃα３４、ｐ３−Ａｌｃα３５、ｐ３−Ａｌｃα３６、ｐ３−Ａｌｃα３７、ｐ３−Ａｌｃα３８、又は、ｐ３−Ａｌｃα３９等のｐ３−Ａｌｃα種である。また、本発明の診断方法においてｐ３−Ａｌｃ種の生成量の比を指標として診断を行う場合、好ましくは、ｐ３−Ａｌｃα３５と、他のｐ３−Ａｌｃα種（ｐ３−Ａｌｃα３４、ｐ３−Ａｌｃα３６、ｐ３−Ａｌｃα３７、ｐ３−Ａｌｃα３８、又は、ｐ３−Ａｌｃα３９）との比（例えば、ｐ３−Ａｌｃα３７／ｐ３−Ａｌｃα３５、又は、ｐ３−Ａｌｃα３５／ｐ３−Ａｌｃα３７等）を指標とする。【００４７】
より具体的には、本発明のγセクレターゼ異常に基づく疾患の診断方法は、以下のステップ：
ａ）被験者由来の試料を調整するステップ、
ｂ）配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、及び、配列番号１８〜配列番号２５から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを認識する抗体又はその断片に該試料を接触させるステップ、
ｃ）配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、及び、配列番号１８〜配列番号２５から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドへの該抗体又はその断片の結合を検出して、配列番号１又は、配列番号１２、及び、配列番号１８〜配列番号２５から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドのレベルを測定するステップ、
ｄ）  配列番号１８〜配列番号２０から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量と、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量との比、あるいは、配列番号２１〜配列番号２５から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量と、配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量との比を算出するステップ、並びに、
ｅ）算出された比と、被験者におけるγセクレターゼ異常に基づく疾患の有無又は程度との関連付けを行うステップ、により行うことができる。【００４８】
また、本発明のγセクレターゼ異常に基づく疾患の診断方法は、以下のステップ：
ａ）被験者由来の試料を調整するステップ、
ｂ）配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、及び、配列番号１８〜配列番号２５から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを分離するステップ、
ｃ）分離された配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、及び、配列番号１８〜配列番号２５から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドのアミノ酸配列に関する情報を検出するステップ、
ｄ）  配列番号１８〜配列番号２０から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量と、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量との比、あるいは、配列番号２１〜配列番号２５から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量と、配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量との比を算出するステップ、並びに、
ｅ）算出された比と、被験者におけるγセクレターゼ異常に基づく疾患の有無又は程度との関連付けを行うステップにより行うことができる。【００４９】
上記診断方法において、ｐ３−Ａｌｃとしては、配列番号１１〜配列番号１６、又は、配列番号１８〜配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを使用することができる。また、上述において、「算出された数値と被験者におけるγセクレターゼ異常に基づく疾患の有無又は程度との関連付けを行うステップ」は、配列番号１８〜２０に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量の配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量に対する比、又は、配列番号２１〜２５に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量の配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量に対する比が大きい被験者をγセクレターゼ異常に基づく疾患に罹患している又は罹患の程度が高い患者として判定することにより行うことができる。【００５０】
本発明のγセクレターゼ異常に基づく疾患の診断方法等は、既にアルツハイマー病の指標として用いられているＡβの測定と組み合わせて行うことができる。具体的には、本発明のγセクレターゼ異常に基づく疾患の診断方法等は、上述に記載のステップに加えて、
ｉ）検体中のアミロイドβ４２及びアミロイドβ４０を検出するステップ、
ｉｉ）検出されたアミロイドβ４２とアミロイドβ４０との比を算出するステップ、
ｉｉｉ）配列番号１８〜配列番号２５から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量と配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量との比を算出するステップ、並びに、
ｉｖ）アミロイドβ４２とアミロイドβ４０との比と、配列番号１８〜配列番号２５から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量と配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量との比と、被験者におけるγセクレターゼ異常に基づく疾患の有無又は程度との関連付けを行うステップ。【００５１】
本発明の方法において使用する患者由来の検体としては、バイオマーカの発現を検出することができる検体であれば特に限定されず、例えば、生検として被験者から採取した組織試料または液体を使用することができる。使用される検体は、本発明の測定の対象となるものであれば特に限定はなく、例えば、組織、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、漿液、髄液（例えば、脳脊髄液）、関節液、眼房水、涙液、唾液またはそれらの分画物若しくは処理物を挙げることができ、好ましくは食道癌組織又は血液（血漿又は血清を含む）である。また、本発明の方法において使用する患者由来の試料は、測定試験に先立ち前処理されたものであってもよいし、患者から採取した検体をそのまま使用してもよい。また、本発明の診断方法による分析は、定性的、定量的又は半定量的に行うことができる。また、本発明の診断方法において、γセクレターゼ異常に基づく疾患は、好ましくはアルツハイマー病である。上記において、γセクレターゼ異常に基づく疾患の診断方法は、γセクレターゼ異常に基づく疾患の診断ための情報を提供する方法、又は、γセクレターゼ異常に基づく疾患の状態又は進行をモニターする方法であってもよい。【００５２】
また、本発明のバイオマーカは、疾患の指標となることから、γセクレターゼ異常に基づく疾患のスクリーニングにおいて、患者の治療効果の指標として用いることができる。例えば、変異型γセクレターゼ発現細胞に被験薬を添加し、γセクレターゼ異常モデル動物に被験薬を投与し、又は、γセクレターゼ異常に基づく疾患の患者に被験薬を投与し、一定時間後の本発明のバイオマーカの生成量を測定することにより、当該治療薬がγセクレターゼ異常に基づく疾患を治療するものであるか否かを判定することができる。本発明のスクリーニング方法は、検体中のｐ３−Ａｌｃを検出するステップを備え、ｐ３−Ａｌｃ種の生成量を指標として診断を行うことができる。【００５３】
本発明の検体中のｐ３−Ａｌｃを検出するステップを備える、γセクレターゼ異常に基づく疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法は、具体的には、以下のステップ：
ａ）変異型γセクレターゼ発現細胞に被験薬を接触させるステップ、
ｂ）培養液を試料として調整するステップ、
ｃ）少なくとも１つのｐ３−Ａｌｃを認識する抗体又はその断片に試料を接触させるステップ、
ｄ）ｐ３−Ａｌｃへの該抗体又はその断片の結合を検出してｐ３−Ａｌｃのレベルを測定するステップ、並びに、
ｅ）ｐ３−Ａｌｃのレベルと被験薬のγセクレターゼ異常に基づく疾患の治療又は予防効果の有無又は程度との関連付けを行うステップ、により行うことができる。【００５４】
また、本発明の検体中のｐ３−Ａｌｃを検出するステップを備える、γセクレターゼ異常に基づく疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法は、以下のステップ：
ａ）γセクレターゼ異常を有する動物又はヒトに被験薬を投与するステップ、
ｂ）投与された対象の体液を試料として調整するステップ、
ｃ）少なくとも１つのｐ３−Ａｌｃを認識する抗体又はその断片に試料を接触させるステップ、
ｄ）ｐ３−Ａｌｃへの該抗体又はその断片の結合を検出してｐ３−Ａｌｃのレベルを測定するステップ、並びに、
ｄ）ｐ３−Ａｌｃのレベルと被験薬のγセクレターゼ異常に基づく疾患の治療又は予防効果の有無又は程度との関連付けを行うステップにより行うことができる。【００５５】
更に、本発明の検体中のｐ３−Ａｌｃを検出するステップを備える、γセクレターゼ異常に基づく疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法は、以下のステップ：
ａ）変異型γセクレターゼ発現細胞に被験薬を接触させるステップ、
ｂ）培養液を試料として調整するステップ、
ｃ）ｐ３−Ａｌｃを分離するステップ、
ｄ）分離されたｐ３−Ａｌｃ種を検出するステップ、
ｅ）ｐ３−Ａｌｃのレベルと被験薬のγセクレターゼ異常に基づく疾患の治療又は予防効果の有無又は程度との関連付けを行うステップにより行うことができる。【００５６】
又は、本発明の検体中のｐ３−Ａｌｃを検出するステップを備える、γセクレターゼ異常に基づく疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法は、以下のステップ：
ａ）γセクレターゼ異常を有する動物又はヒトに被験薬を投与するステップ、
ｂ）投与された対象の体液を試料として調整するステップ、
ｃ）ｐ３−Ａｌｃを分離するステップ、
ｄ）分離されたｐ３−Ａｌｃ種を検出するステップ、
ｅ）ｐ３−Ａｌｃのレベルと被験薬のγセクレターゼ異常に基づく疾患の治療又は予防効果の有無又は程度との関連付けを行うステップにより行うことができる。【００５７】
また、本発明の本発明のγセクレターゼ異常に基づく疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法は、検体中のｐ３−Ａｌｃを検出するステップを備え、ｐ３−Ａｌｃ種の生成量の比を指標として診断を行うことができる。例えば、上述の本発明のγセクレターゼ異常に基づく疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法における、ｐ３−Ａｌｃのレベルと被験薬のγセクレターゼ異常に基づく疾患の治療又は予防効果の有無又は程度との関連付けを行うステップは、以下のステップ、
ｅ−１）配列番号１８〜配列番号２０から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量と、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量との比、あるいは、配列番号２１〜配列番号２５から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量と、配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量との比を算出するステップ、並びに、
ｅ−２）算出された比と、被験薬のγセクレターゼ異常に基づく疾患の治療又は予防効果の有無又は程度との関連付けを行うステップ、により行うことができる。【００５８】
本発明のγセクレターゼ異常に基づく疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法は、既にアルツハイマー病の指標として用いられているＡβの測定と組み合わせて行うことができる。具体的には、本発明のγセクレターゼ異常に基づく疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法は、上述に記載のステップに加えて、
ｉ）検体中のアミロイドβ４２及びアミロイドβ４０を検出するステップ、
ｉｉ）検出されたアミロイドβ４２とアミロイドβ４０との比を算出するステップ、
ｉｉｉ）配列番号１８〜配列番号２５から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量と配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量との比を算出するステップ、並びに、
ｉｖ）アミロイドβ４２とアミロイドβ４０との比と、配列番号１８〜配列番号２５から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量と配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量との比と、被験薬のγセクレターゼ異常に基づく疾患の治療又は予防効果の有無又は程度との関連付けを行うステップを備えていてもよい。【００５９】
本発明のγセクレターゼ異常に基づく疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法において、ｐ３−Ａｌｃは、ｐ３−Ａｌｃα、ｐ３−Ａｌｃβ、ｐ３−Ａｌｃγのいずれのｐ３−Ａｌｃ種であってもよく、例えば、ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３４、ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３５、ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３６、ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３７、ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３８、ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３９、ｐ３−Ａｌｃα３４、ｐ３−Ａｌｃα３５、ｐ３−Ａｌｃα３６、ｐ３−Ａｌｃα３７、ｐ３−Ａｌｃα３８、又は、ｐ３−Ａｌｃα３９であってもよく、具体的には、配列番号１１〜配列番号１６、又は、配列番号１８〜配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。また、上述において、「ｐ３−Ａｌｃのレベルと被験薬のγセクレターゼ異常に基づく疾患の治療又は予防効果の有無又は程度との関連付けを行うステップ」は、ｐ３−Ａｌｃ、好ましくは、配列番号１１〜１６、及び、配列番号１８〜２０から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドの量が小くなる被験薬をγセクレターゼ異常に基づく疾患の治療又は予防効果がある又は治療又は予防効果が高いと判定することを含むことができる。「算出された比と、被験薬のγセクレターゼ異常に基づく疾患の治療又は予防効果の有無又は程度との関連付けを行うステップ」は、配列番号１８〜２０に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量の配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量に対する比、又は、配列番号２１〜２５に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量の配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量に対する比が小さくなる被験薬をγセクレターゼ異常に基づく疾患の治療又は予防効果がある又は治療又は予防効果が高いと判定することを含むことができる。【００６０】
本発明の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法の検体としては、培養液、又は、例えば、生検として被験者から採取した組織試料又は液体を使用することができる。使用される生検は、ＭＫの免疫学的測定の対象となるものであれば特に限定はなく、例えば、組織、血液、血清、血漿、尿、漿液、髄液（特には脳脊髄液）、関節液、眼房水、涙液、唾液又はそれらの分画物若しくは処理物を挙げることができ、好ましくは、体液であり、より好ましくは、血液、血清、血漿、又は、髄液（特には脳脊髄液）である。本発明の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法による分析は、定性的、定量的又は半定量的に行うことができる。本発明の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法において、γセクレターゼ異常に基づく疾患は、好ましくは、アルツハイマー病である。【００６１】
上述の方法において、「検体中のｐ３−Ａｌｃを検出するステップ」は、検体中のｐ３−Ａｌｃを検出可能な方法であって、当業者周知の方法により行うことができる。ｐ３−Ａｌｃの検出は、各ｐ３−Ａｌｃ種の同定及び定量を含むことができる。例えば、検体中のｐ３−Ａｌｃは、各ｐ３−Ａｌｃ種に特異的な抗体を用いることにより、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学的方法、又は、ウェスタンブロット等を用いて検出することもできる。また、「検体中のｐ３−Ａｌｃを検出するステップ」は、検体から所望のｐ３−Ａｌｃを分離した後、分離されたｐ３−Ａｌｃ種を検出することにより行うこともできる。検体からのｐ３−Ａｌｃの分離は、ペプチドの分離に使用される方法であって、当業者周知の方法により行うことができ、例えば、免疫沈降、ウェスタンブロット、又は、アフィニティクロマトグラフィ等により行うことができる。分離されたｐ３−Ａｌｃ種を検出する方法は、ペプチドのアミノ酸配列、分子量、物理的性質、又は、化学的性質に関する情報であって、ｐ３−Ａｌｃの種を特定可能な情報が得られる方法であれば限定されず、当業者周知の方法により行うことができ、例えば、マススペクトル、プロテインシーケンサー、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ等を挙げることができる。【００６２】
「配列番号１８〜配列番号２０から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量と、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量との比、又は、配列番号２１〜配列番号２５から選択される１の配列番号に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量と、配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量との比を算出するステップ」は、先の工程において決定したｐ３−Ａｌｃに関する情報に基づき、配列番号１１、配列番号１２、及び、配列番号１８〜配列番号２５のアミノ酸配列からなるペプチドに該当するペプチドの量に関する情報を取得するステップ、並びに、それにより得られた量を基に、配列番号１８〜２０に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量の配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量に対する比、又は、配列番号２１〜２５に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量の配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量に対する比（分母と分子が逆であってもよい）を計算により求めるステップにより行うことができる。【００６３】
ｐ３−Ａｌｃ種の測定とＡβを組み合わせて測定する場合には、配列番号１８〜２０に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量の配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量に対する比、又は、配列番号２１〜２５に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量の配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量に対する比、並びに、Ａβ４２／４０比の両者の組み合わせと被験者におけるγセクレターゼ異常に基づく疾患の有無又は程度との関連付けを行うことにより診断することができる。具体的には、配列番号１８〜２０に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量の配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの量に対する比が大きい被験者であって、Ａβ４２／４０比が大きい被験者をγセクレターゼ異常に基づく疾患に罹患している又は罹患の程度が高い患者として判定することにより行うことができる。【００６４】
本明細書において、患者のγセクレターゼ異常に基づく疾患を診断するために、測定されたｐ３−Ａｌｃ種の分泌とγセクレターゼ異常に基づく疾患の有無又は程度との関係において用いられる「関連付けをする」という用語は、被験者におけるｐ３−Ａｌｃ種の存在、レベル、又は、存在比を、γセクレターゼ異常に基づく疾患患者又はγセクレターゼ異常に基づく疾患であろうことが知られている患者、あるいは、γセクレターゼ異常に基づく疾患ではなかった患者又はγセクレターゼ異常に基づく疾患ではないと信じられている患者におけるｐ３−Ａｌｃ種の存在、レベル、又は、存在比と比較することを意味する。比較対象となる患者におけるｐ−Ａｌｃ種のレベル又は比は、例えば、本発明の開示により、又は、既にγセクレターゼ異常に基づく疾患又はその程度が判明している患者由来の検体におけるｐ３−Ａｌｃ種のレベルを測定することにより、あるいは、他のγセクレターゼ異常に基づく疾患の指標による評価と組み合わせて評価することにより知ることができる。ｐ３−Ａｌｃ種のレベル又は比を利用して、患者がγセクレターゼ異常に基づく疾患に罹患している可能性又は罹患の程度を判定することができる。ｐ３−Ａｌｃ種のレベル又は比とγセクレターゼ異常に基づく疾患との関連付けは、統計的分析により行うことができる。統計学的有意性は、２以上の集団を比較し、信頼区間及び／又はｐ値を決定することにより決定される（Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiely & Sons,
NewYord, 1983）。本発明の信頼区間は、例えば、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％又は９９．９９％であってもよい。また、本発明のｐ値は、例えば、０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００２又は０．０００１であってもよい。【００６５】
好ましくは、ｐ３−Ａｌｃ種は、その存在量又は存在比によりγセクレターゼ異常に基づく疾患又はその程度と関連付けることができる。例えば、各ｐ３−Ａｌｃ種、例えば、配列番号１２、配列番号１８、配列番号１９、又は、配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなるペプチドについてγセクレターゼ異常に基づく疾患への罹患の指標としての閾値レベル又は当該疾患への罹患の程度の指標として各程度に対する閾値レベルを設定し、患者由来の試料における各ｐ−Ａｌｃのレベルを、閾値レベルと比較することにより関連付けてもよい。このような閾値レベルは、例えば、感度が、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は、９８％以上となるように設定することができる。また、閾値レベルは、特異度が、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は、９８％以上となるように設定することができる。また、各ｐ−Ａｌｃについて１又は複数種類のｐ３−Ａｌｃ（例えば、健常人において分泌が認められるｐ３−Ａｌｃ、ｐ３−Ａｌｃα３５、ｐ３−Ａｌｃβ３７、及び、ｐ３−Ａｌｃγ３１）と、他のｐ−Ａｌｃ種との比率について、γセクレターゼ異常に基づく疾患への罹患の指標としての閾値レベル又は当該疾患への罹患の程度の指標として各程度に対する閾値レベルを設定し、患者由来の試料における各ｐ−Ａｌｃの比を、閾値レベルと比較することにより関連付けてもよい。このような閾値レベルは、例えば、感度が、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は、９８％以上となるように設定することができる。また、閾値レベルは、特異度が、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は、９８％以上となるように設定することができる。【００６６】
明細書において、γセクレターゼ異常に基づく疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニングするために、測定されたｐ３−Ａｌｃ種の分泌とγセクレターゼ異常に基づく疾患の治療又は予防効果の有無又は程度との関係において用いられる「関連付けをする」という用語は、被験薬を投与した細胞培養液、動物モデル又はヒト（患者）におけるｐ３−Ａｌｃ種の存在、レベル、又は、存在比を、被験薬を投与していない細胞培養液、動物モデル又はヒト（患者）、あるいは、対象薬を投与した細胞培養液、動物モデル又はヒト（患者）におけるｐ３−Ａｌｃ種の存在、レベル、又は、存在比と比較することを意味する。具体的な関連付けは、上述の診断方法に準じて行うことができる。
【実施例】
【００６７】
以下、本発明をより詳細に説明するため実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。【００６８】
実施例１．プラスミドの構築
ヒトアルカデインｃＤＮＡは、ｈＡｌｃα１（配列番号１：ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ７５３３０１）、ｈＡｌｃβ（配列番号２：ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１４７１８）、及び、ｈＡｌｃγ（配列番号３：ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０２２１３１）を使用した。ＦＬＡＧ配列を、ｈＡｌｃαの３８番目のロイシンと３９番目のグルタミン酸の間に挿入して、ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ｈＡｌｃαを、ｈＡｌｃβの２６番目のリシンと２７番目のプロリンの間に挿入して、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−ｈＡｌｃβを、ｈＡｌｃγの２９番目のグルタミンと３０番目のアルギニンの間に挿入して、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−ｈＡｌｃγを作製した。ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ＡＰＰ６９５は、Ａｎｄｏ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９，４４２１−４４２７．記載の方法に従って作製した。また、ｐｃＤＮＡ３−ＡＤＡＭ１０−ＨＡ及びｐｃＤＮＡ３−ＡＤＡＭ１７−ＨＡは、Ｅｎｄｒｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，（２００５）ＦＥＢＳ  Ｊ．２７２，５８０８−５８２０．記載の方法に従って作製した。【００６９】
ヒトプレセニリン１（ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ１：以下「ＰＳ１」という）（配列番号４）をコードするｃＤＮＡを有するプラスミドであるｐｃＤＮＡ３−ＰＳ１ｗｔは、Ａｒａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，２４３４３−２４３５４．記載の方法に従って作製した。家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）に関連した変異は、ＰＣＲ法を用いてＰＳ１に導入した。具体的には、ＰＳ１配列の１４６番目のメチオニンをロイシンに変えた変異体をコードするプラスミドｐｃＤＮＡ４−ＰＳ１Ｍ１４６Ｌ、ＰＳ１配列の１６６番目のロイシンをプロリンに変えた変異体をコードするプラスミドｐｃＤＮＡ４−ＰＳ１Ｌ１６６Ｐ、ＰＳ１配列の２４６番目のアラニンをグルタミン酸に変えた変異体をコードするプラスミドｐｃＤＮＡ４−ＰＳ１Ａ２４６Ｅ、ＰＳ１配列の２７８番目のアルギニンをスレオニンに変えた変異体をコードするプラスミドｐｃＤＮＡ４−ＰＳ１Ｒ２７８Ｔ、ＰＳ１配列の２８６番目のロイシンをバリンに変えた変異体をコードするプラスミドｐｃＤＮＡ４−ＰＳ１Ｌ２８６Ｖ、ＰＳ１配列の４３４番目のアラニンをシステインに変えた変異体をコードするプラスミドｐｃＤＮＡ４−Ａ４３４Ｃ、及び、ＰＳ１配列の３８５番目のアスパラギン酸をアラニンに変えた変異体をコードするプラスミドｐｃＤＮＡ４−ＰＳ１Ｄ３８５Ａを作製した。以下の実験において、ＨＥＫ２９３細胞にこれらのプラスミドをトランスフェクトして使用した。また、安定的にＰＳ１を発現する細胞をクローニングした。【００７０】
実施例２．抗体の調整
ウサギ抗Ａｌｃαポリクローナル抗体ＵＴ１３４及びＵＴ１３５は、それぞれヒトＡｌｃα１の８２１番目から８４３番目までのアミノ酸配列にシステインを付加したアミノ酸配列からなるペプチド（ＦＶＨＰＥＨＲＳＦＶＤＬＳＧＨＮＬＡＮＰＨＰＦ＋Ｃ：配列番号５）、及び、ヒトＡｌｃα１の８３９番目から８５１番目までのアミノ酸配列にシステインを付加したアミノ酸配列からなるペプチド（ＮＰＨＰＦＡＶＶＰＳＴＡＴ＋Ｃ：配列番号６）に対する抗体として得た。抗Ａｌｃαモノクローナル抗体３Ｂ５は、ヒトＡｌｃα１の８２１番目から８２６番目までのアミノ酸配列にシステインを付加したアミノ酸配列からなるペプチド（Ｃ＋ＦＶＨＰＥＨ：配列番号７）に対する抗体として得た。ウサギ抗Ａｌｃβ抗体ＵＴ１４２及びＵＴ１４３は、それぞれ、ヒトＡｌｃβの８３７番目から８４９番目までのアミノ酸配列にシステインを付加したアミノ酸配列からなるペプチド（ＳＳＨＲＮＳＭＩＰＳＡＡＴ＋Ｃ：配列番号８）、及び、ヒトＡｌｃβの８１９番目から８４７番目までのアミノ酸配列（ＦＬＨＲＧＨＱＰＰＰＥＭＡＧＨＳＬＡＳＳＨＲＮＳＭＩＰＳＡ：配列番号９）を含むＧＳＴ融合タンパク質に対する抗体として得た。ウサギ抗Ａｌｃγポリクローナル抗体ＵＴ１６６は、ヒトＡｌｃγの８２３番目から８３４番目までのアミノ酸配列にシステインを付加したアミノ酸配列からなるペプチド（Ｃ＋ＩＱＨＳＳＶＶＰＳＩＡＴ：配列番号１０）に対する抗体として得た。これらのＡｌｃ特異的抗体は、Ａｌｃファミリータンパク質の細胞外膜近傍領域に対して作製され、それぞれに対応するｐ３−Ａｌｃ標的に特異的であった。これらの抗体は、ｐ３−Ａｌｃの単離及び検出に用いた。抗Ａｌｃα細胞質ドメイン抗体ＵＴ８３、及び、抗Ａｌｃβ細胞質ドメイン抗体ＵＴ９９は、既知の方法（Ａｒａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９，  ２４３４３−２４３５４．）を用いて作製した。抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Ｍ２、シグマアルドリッチ社）、及び、抗ＨＡ抗体（１２ＣＡ５、ＢＤバイオサイエンス社）は、市販のものを使用した。抗マウス及び抗ウサギペルオキシダーゼ結合種特異的全抗体は、ＧＥヘルスケア社から購入した。【００７１】
実施例３．ＡＤＡＭ１０遺伝子ノックアウトマウス由来胚性線維芽細胞におけるＡｌｃ及びＡＰＰの切断
（１）細胞の調整
ＡＤＡＭ１０遺伝子ホモノックアウトマウス（−／−）由来のマウス胚性線維芽細胞（ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ：ＭＥＦｓ）（以下、「ＡＤＡＭ（−／−）ＭＥＦｓ」という）、及び、ＡＤＡＭ１０遺伝子ヘテロノックアウトマウス（＋／−）由来のマウス胚性線維芽細胞（以下、「ＡＤＡＭ（＋／−）ＭＥＦｓ」という）は、既知の方法（Ｈａｒｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  １１，  ２６１５−２６２４．）により作製した。【００７２】
（２）遺伝子導入
ＡＤＡＭ（−／−）ＭＥＦｓ及びＡＤＡＭ（＋／−）ＭＥＦｓに、ＦＬＡＧ−Ａｌｃα、ＦＬＡＧ−Ａｌｃβ、ＦＬＡＧ−Ａｌｃγ、又は、ＦＬＡＧ−ＡＰＰを導入し、発現させた。遺伝子導入は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００又はＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（いずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で、実施例１で作製したｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ｈＡｌｃα、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−ｈＡｌｃβ、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−ｈＡｌｃγ、又は、ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ＡＰＰ６９５プラスミドを用い、製造者のプロトコルに従って、ＭＥＦｓ（０．３〜１．０×１０６個）に遺伝子導入することにより行った。導入２４時間後に、培地を交換し、更に細胞を２４時間培養した。【００７３】
（３）培養液免疫沈降物及び細胞溶解物の回収、ウェスタンブロッティング
ｓＡｌｃ及びｓＡＰＰを抗ＦＬＡＧ抗体及びプロテインＧセファロースを用いて免疫沈降させることにより馴化培地から回収した。細胞性タンパク質を分析するため、細胞を回収し、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するＨｅｐｅｓ−バッファサリン（Ｈｅｐｅｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｗｉｔｈ  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００：ＨＢＳＴ）中で溶解させた（Ａｒａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９，  ２４３４３−２４３５４．）。細胞溶解物及び免疫沈降物は、実施例２で作製した抗体を用いてウェスタンブロッティングを行い、ＥＣＬ（ＧＥヘルスケア社）を用いて検出し、ＶｅｒｓａＤｏｃイメージングシステム（ＢｉｏＲａｄ社）を用いて定量した。【００７４】
（４）結果
結果を図１に示す。ＡＰＰの一次切断は、ＡＤＡＭ（−／−）ＭＥＦｓでは確認できなかったが、ＡＤＡＭ（＋／−）ＭＥＦｓでは確認された（図１Ｄ）。ＡＤＡＭ（−／−）ＭＥＦｓによるｓＡＰＰの分泌レベル（図１Ｄレーン２）は、ＡＤＡＭ（＋／−）ＭＥＦｓによるｓＡＰＰの分泌レベル（図１Ｄレーン１）より４０％低かった。ＡＤＡＭ（−／−）ＭＥＦｓによるｓＡｌｃα、ｓＡｌｃβ、及び、ｓＡｌcγの分泌量は、ＡＰＰと同程度に低下していた（図１Ａ〜Ｃ）。これらの結果から、ＡＰＰと同様にＡｌｃα、Ａｌｃβ、及び、ＡｌcγがＡＤＡＭ１０による一次切断を受けることが示された。【００７５】
実施例４．ＡＤＡＭ１０遺伝子ノックアウトマウス由来ウス胚性線維芽細胞へのＡＤＡＭ１０遺伝子導入によるＡｌｃ及びＡＰＰの切断
実施例３と同様に入手したＡＤＡＭ（−／−）ＭＥＦｓに、ＦＬＡＧ−Ａｌｃα、ＦＬＡＧ−Ａｌｃβ、ＦＬＡＧ−Ａｌｃγ、又は、ＦＬＡＧ−ＡＰＰ、及び、ＡＤＡＭ１０を導入し、発現させた。遺伝子導入は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００又はＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（いずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で、実施例１で作製したｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ｈＡｌｃα（０．５μｇ）、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−ｈＡｌｃβ（０．２５μｇ）、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−ｈＡｌｃγ（０．５μｇ）、又は、ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ＡＰＰ６９５（０．５μｇ）、及び、ｐｃＤＮＡ３−ＡＤＡＭ１０−ＨＡ（１．５μｇ又は、４．５μｇ）用い、製造者のプロトコルに従って、ＭＥＦｓ（０．３〜１．０×１０６個）に遺伝子導入することにより行った。導入２４時間後に、培地を交換し、更に細胞を２４時間培養した。その後、実施例３と同様にして、培養液免疫沈降物及び細胞溶解物の回収、ウェスタンブロッティングを行った。【００７６】
結果を図２に示す。外因性ＡＤＡＭ１０の発現によりｓＡＰＰの分泌が回復した（図２Ｄ）。外因性ＡＤＡＭ１０を分泌させたＡＤＡＭ（−／−）ＭＥＦｓによるｓＡＰＰの分泌量は、ＡＤＡＭ（−／−）ＭＥＦｓによるｓＡＰＰの分泌量の約１．７倍であった。また、ＡＤＡＭ（−／−）ＭＥＦｓにおける、ＡＤＡＭ１０の基質でありｓＡＰＰを生じる細胞内成熟ＡＰＰ（ｍＡＰＰ）の発現レベルは、外因性ＡＤＡＭ１０の発現に応じて減少した。ＡＤＡＭ（−／−）ＭＥＦｓにおける、ｓＡｌｃα、ｓＡｌｃβ、及び、ｓＡｌcγの分泌量は、外因性ＡＤＡＭ１０の発現に応じて回復した（図２Ａ〜Ｃ）。外因性ＡＤＡＭ１０を分泌させたＡＤＡＭ（−／−）ＭＥＦｓによるｓＡｌｃの分泌量は、ＡＤＡＭ（−／−）ＭＥＦｓによるｓＡｌｃの分泌量の１．８〜２．２倍に上昇した。これらの結果から、ＡＤＡＭ１０がＡｌｃα、Ａｌｃβ、及び、Ａｌcγの主要な分解酵素の一つであることが示された。【００７７】
実施例５．Ｎ２ａ細胞へのＡＤＡＭ１７遺伝子導入によるＡｌｃ及びＡＰＰの切断
Ｎ２ａ細胞（ATCCより購入）に、ＦＬＡＧ−Ａｌｃα、ＦＬＡＧ−Ａｌｃβ、ＦＬＡＧ−Ａｌｃγ、又は、ＦＬＡＧ−ＡＰＰ、及び、ＡＤＡＭ１７を導入し、発現させた。遺伝子導入は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００又はＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（いずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で、実施例１で作製したｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ｈＡｌｃα（０．５μｇ）、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−ｈＡｌｃβ（０．５μｇ）、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−ｈＡｌｃγ（１．０μｇ）、又は、ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ＡＰＰ６９５（０．５μｇ）、及び、ｐｃＤＮＡ３−ＡＤＡＭ１７−ＨＡ（０．５μｇ）、又は、１．５μｇ）を用い、製造者のプロトコルに従って、ＭＥＦｓ（０．３〜１．０×１０６個）に遺伝子導入することにより行った。導入２４時間後に、培地を交換し、更に細胞を２４時間培養した。その後、実施例３と同様にして、培養液免疫沈降物及び細胞溶解物の回収、ウェスタンブロッティングを行った。【００７８】
結果を図３に示す。Ｎ２ａ細胞において、ＡＤＡＭ１７はＡＰＰを切断した（図３Ｄ）。ＡＤＡＭ１７の発現量を増やすことにより、ｓＡＰＰの分泌量は増加した。このことから、外因性に発現されたＡＤＡＭ１７がＡＰＰの切断活性を有することが示された。また、外因性ＡＤＡＭ１７を発現しているＮ２ａ細胞によるｓＡｌｃ（ｓＡｌｃα、ｓＡｌｃβ、及び、ｓＡｌcγ）の分泌が、ＡＤＡＭ１７の外来性発現量に応じて増加した。これらの結果から、ＡＤＡＭ１０による結果と同様に、ＡＤＡＭ１７がＡＰＰと同様にＡｌｃα、Ａｌｃβ、及び、Ａｌcγを切断することが示された。【００７９】
実施例６．培養液中へ分泌されたｐ３−Ａｌｃの同定及び解析
８〜９×１０６個のＨＥＫ２９３細胞に、６μｇのｐｃＤＮＡ３−ｈＡｌｃα１、ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＡｌｃβ、又は、ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＡｌｃγを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００中で２４時間導入した。６ｍＬの培地中に分泌されたｐ３−Ａｌｃα、ｐ３−Ａｌｃβ、及び、ｐ３−Ａｌｃγを、ぞれぞれ、アフィニティにより精製された２５μｇの抗ｐ３−Ａｌｃαポリクローナル抗体ＵＴ１３５、血清１００μＬの抗ｐ３−Ａｌｃβポリクローナル抗体ＵＴ１４３、及び、血清１００μＬの抗ｐ３−Ａｌｃγポリクローナル抗体ＵＴ１６６、並びに、プロテインＧセファロースビーズを用いて免疫沈降を行うことにより回収した。【００８０】
ビーズは、続いて洗浄緩衝液Ｉ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）ｎ−オクチル−Ｄ−グルコース、０．０２５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム）、及び、洗浄緩衝液ＩＩ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．０２５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム）を用いて洗浄し、その後、検体はシナピン酸（ｓｉｎａｐｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）で飽和させたトリフルオロ酢酸／アセトニトリル／水（１：２０：２０）を用いて溶出させた。溶解させた検体は標的板上で乾燥させ、Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＰＲＯ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメータ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、又は、ＵｌｔｒａｆｌｅｘＩＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社）を用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析を行った。分子量は、ＰｒｏｔｅｏＭａｓｓ  ＡＣＴＨ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  １８−３９  ＭＡＬＤＩ−ＭＳ  Ｓｔａｎｄａｒｄ、及び、Ｖｏｙｇｅｒ−ＤＥ  ＰＲＯ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメータ用インスリン（シグマアルドリッチ社）、並びに、ＵｌｔｒａｆｌｅｘＩＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ用ペプチド調整スタンダード（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社）を用いて調整した。各メジャーピーク産物のアミノ酸配列は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳ分析により決定した。【００８１】
結果を図４に示す。ｐ３−Ａｌｃαのスペクトラムは、分子量３８０４及び４００７にメジャーピークを示した（図４Ａ）。ｐ３−Ａｌｃβのスペクトラムは、分子量３９６４及び４３０３にメジャーピーク（図４Ｂ）を示した。ｐ３−Ａｌｃγのスペクトラムは、分子量３３７７にメジャーピークを、３６８９にマイナーピークを示した（図４Ｃ）。アミノ酸分析の結果、ｐ３−Ａｌｃαのメジャーピークは３５及び３７アミノ酸、ｐ３−Ａｌｃβのメジャーピークは３７及び４０アミノ酸、ｐ３−Ａｌｃγのメジャーピークは３１及び３４アミノ酸からなることが示された（図４、中央図及び右図）。本実験の結果明らかとなった各ｐ３−Ａｌｃの配列を図５に示した。Ａｌｃα１を発現するＨＥＫ２９３細胞により分泌されたｐ３−Ａｌｃα３５及びｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３５は、メジャーなｐ３−Ａｌｃα種であり、それぞれ、ヒトＡｌｃαの８１７番目のアラニン（Ａｌａ８１７）から８５１番目のスレオニン（Ｔｈｒ８５１）までの配列を含むペプチド（配列番号１１）、及び、ヒトＡｌｃαの８１５番目のアラニン（Ａｌａ８１５）から８５１番目のスレオニン（Ｔｈｒ８５１）までの配列を含むペプチド（配列番号１２）であった。Ａｌｃβを発現するＨＥＫ２９３細胞により分泌されたｐ３−Ａｌｃβ３７及びｐ３−Ａｌｃβ４０は、メジャーなｐ３−Ａｌｃβ種であり、それぞれ、ヒトＡｌｃβの８１３番目のバリン（Ｖａｌ８１３）から８４９番目のスレオニン（Ｔｈｒ８４９）までの配列を含むペプチド（配列番号１３）、及び、ヒトＡｌｃβの８１３番目のバリン（Ｖａｌ８１３）から８５２番目のイソロイシン（Ｉｌｅ８５２）までの配列を含むペプチド（配列番号１４）であった。Ａｌｃγを発現するＨＥＫ２９３細胞により分泌されたｐ３−Ａｌｃγ３１及びｐ３−Ａｌｃγ３４は、メジャーなｐ３−Ａｌｃγ種であり、それぞれ、ヒトＡｌｃγの８０４番目のロイシン（Ｌｅｕ８０４）から８３４番目のスレオニン（Ｔｈｒ８３４）までの配列を含むペプチド（配列番号１５）、及び、ヒトＡｌｃγの８０４番目のロイシン（Ｌｅｕ８０４）から８３７番目のイソロイシン（Ｉｌｅ８３７）までの配列を含むペプチド（配列番号１６）であった。【００８２】
（一次切断部位）
本発明者らは、以前の報告において、ガスフェーズタンパク質シークエンサを使用して、ＡｌｃαＣＴＦのアミノ末端アミノ酸として８１６番目のアラニン（Ａｌａ８１６）（Ａｌｃα１アイソフォームにおける番号）を同定した。このことから、ＡＤＡＭ１０及びＡＤＡＭ１７が８１５番目のメチオニン（Ｍｅｔ８１５）と８１６番目のアラニン（Ａｌa)との間のペプチド結合を切断すると考えられた。そこで、ｐ３−Ａｌｃα３５及びｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３５のＮ末アミノ酸をＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳにより解析したところ、それぞれ、８１７番目のアラニン（Ａｌａ８１７）及び８１５番目のメチオニン（Ｍｅｔ８１５）であることを確認した（図４Ａ）。よって、一次切断により生じたＡｌｃαＣＴＦのＮ末のＭｅｔ８１５及び／又はＡｌａ８１６が、ｐ３−Ａｌｃαの分泌過程においてアミノ末端エキソペプチダーゼにより除去されることが示された。【００８３】
また、ガスフェーズタンパク質シークエンサではＡｌｃβＣＴＦのアミノ末端アミノ酸は同定できなかったが、ｐ３−Ａｌｃβ３７のＮ末アミノ酸をＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳにより解析したところ、ヒトＡｌｃβの８１３番目のバリン（Ｖａｌ８１３）であることが確認された（図４Ｂ）。よって、ヒトＡｌｃβＣＴＦのアミノ末端アミノ酸は、ヒトＡｌｃβの８１３番目のバリンであり、ＡｌｃβＣＴＦは、１４３アミノ酸からなる分子量１５．５ｋＤａのペプチドであると考えられる。【００８４】
また、同様に、ガスフェーズタンパク質シークエンサを使用して、ＡｌｃγＣＴＦ（８２４−ＬＩＶＱＰＰＦＬＱ−８３２：配列番号１７）のアミノ末端アミノ酸を同定しているが、この結果は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳにより解析と同じであった（図４Ｃ）。よって、Ａｌｃγの一次切断部位は、８０３番目のヒスチジン（Ｈｉｓ８０３）と８０４番目のロイシン（Ｌｅｕ８０４）の間のペプチド結合であることが確認された。
Ａｌｃファミリータンパク質の一次切断部位を図５の各配列の下側からの矢印として示す。また、比較として、図５にＡＰＰ６９５の一次切断部位（α−サイト及びβ−サイト）を同様に示す。  【００８５】
（二次切断部位）
また、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳにより、Ａｌｃα、Ａｌｃβ及びＡｌｃγの二次切断部位を同定した。Ａｌｃαのメジャーな二次切断部位は、８５１番目のスレオニン（Ｔｈｒ８５１）と８５２番目のバリン（Ｖａｌ８５２）の間のペプチド結合であり、この切断によりｐ３−Ａｌｃα３５を生成した。他の、Ａｌｃαの二次切断部位は、８５３番目のバリン（Ｖａｌ８５３）と８５４番目のイソロイシン（Ｉｌｅ８５４）の間のペプチド結合、この切断によりｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３５を生成した（図４Ａ）。Ａｌｃβのメジャーな二次切断部位は、８４９番目のスレオニン（Ｔｈｒ８４９）と８５０番目のロイシン（Ｌｅｕ８５０）の間のペプチド結合であり、この切断によりｐ３−Ａｌｃβ３７を生成した。他の、Ａｌｃβの二次切断部位は、８５１番目のイソロイシン（Ｉｌｅ８５１）と８５２番目のイソロイシン（Ｉｌｅ８５２）の間のペプチド結合であり、この切断により、ｐ３−Ａｌｃβ４０を生成した（図４Ｂ）。Ａｌｃγのメジャーな二次切断部位は、８３４番目のスレオニン（Ｔｈｒ８３４）と８３５番目のバリン（Ｖａｌ８３５）の間のペプチド結合であり、この切断によりｐ３−Ａｌｃγ３１を生成した。他の、Ａｌｃγの二次切断部位は、８３７番目のイソロイシン（Ｉｌｅ８３７）と８３８番目のイソロイシン（Ｉｌｅ８３８）の間のペプチド結合であり、この切断によりｐ３−Ａｌｃγ３４を生成した（図４Ｃ）。【００８６】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳ分析により決定したＡｌｃファミリータンパク質の二次切断部位を図５の各配列の上側からの矢印として示す。また、比較として、Ａβ４０（矢印４０）及びＡβ４２（矢印４２）を生成させるＡＰＰ６９５のγ−切断部位を図５に同様に示す。【００８７】
実施例７．家族性アルツハイマー病関連変異型プレセニリンによるＡｌｃのγ−切断部位の調節
（１）細胞の調整
野生型ＰＳ１（ＷＴ）（配列番号４）、家族性アルツハイマー病関連変異として、１４６番目のメチオニンのロイシンへの置換（Ｍｅｔ１４６Ｌｅｕ：Ｍ１４６Ｌ）、１６６番目のロイシンのプロリンへの置換（Ｌｅｕ１６６Ｐｒｏ：Ｌ１６６Ｐ）、２４６番目のアラニンのグルタミン酸への置換（Ａｌａ２４６Ｇｌｕ：Ａ２４６Ｅ）、２７８番目のアルギニンのスレオニンへの置換（Ａｒｇ２７８Ｔｈｒ：Ａ２７８Ｔ）、２８６番目のロイシンのバリンへの置換（Ｌｅｕ２８６Ｖａｌ：Ｌ２８６Ｖ）、若しくは、４３４番目のアラニンのシステインへの置換（Ａｌａ４３４Ｃｙｓ：Ａ４３４Ｃ)を有するＰＳ１、又は、ベクター（Ｍｏｃｋ）を発現するＨＥＫ２９３細胞に、ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ｈＡｌｃα、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−ｈＡｌｃβ、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−ｈＡｌｃγ、及び、ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ＡＰＰ６９５と共に、又は、プラスミドを加えず遺伝子導入操作を行った。また、７９番目のアラニンがバリンに置換された（Ａｌａ７９Ｖａｌ：Ａ７９Ｖ）ＰＳ１変異体、１６３番目のヒスチジンがアルギニンに置換された（Ｈｉｓ１６３Ａｒｇ）ＰＳ１変異体、及び、１４３番目のイソロイシンがスレオニンに置換された（Ｉｌｅ１４３Ｔｈｒ：Ｉ１４３Ｔ）ＰＳ１変異体を発現するＨＥＫ２９３細胞に、ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ｈＡｌｃαを遺伝子導入した。【００８８】
（２）培養液免疫沈降物の回収
培地中に分泌されたｐ３−Ａｌｃα、ｐ３−Ａｌｃβ、及び、ｐ３−Ａｌｃγを、ぞれぞれ、アフィニティにより精製された２５μｇの抗ｐ３−Ａｌｃαポリクローナル抗体ＵＴ１３５、血清１００μＬの抗ｐ３−Ａｌｃβポリクローナル抗体ＵＴ１４３、及び、血清１００μＬの抗ｐ３−Ａｌｃγポリクローナル抗体ＵＴ１６６、並びに、プロテインＧセファロースビーズを用いて免疫沈降を行うことにより回収した。【００８９】
（３）質量分析
ビーズは、続いて洗浄緩衝液Ｉ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）ｎ−オクチル−Ｄ−グルコース、０．０２５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム）、及び、洗浄緩衝液ＩＩ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．０２５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム）を用いて洗浄し、その後、検体はシナピン酸（ｓｉｎａｐｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）で飽和させたトリフルオロ酢酸／アセトニトリル／水（１：２０：２０）を用いて溶出させた。溶解させた検体は標的板上で乾燥させ、Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＰＲＯ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメータ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、又は、ＵｌｔｒａｆｌｅｘＩＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社）を用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析を行った。分子量は、ＰｒｏｔｅｏＭａｓｓ  ＡＣＴＨ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  １８−３９  ＭＡＬＤＩ−ＭＳ  Ｓｔａｎｄａｒｄ、及び、Ｖｏｙｇｅｒ−ＤＥ  ＰＲＯ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメータ用インスリン（シグマアルドリッチ社）、並びに、ＵｌｔｒａｆｌｅｘＩＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ用ペプチド調整スタンダード（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社）を用いて調整した。各メジャーピーク産物のアミノ酸配列は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳ分析により決定した。【００９０】
また、ＰＳ１の発現は、抗ＰＳ１  Ｎ末端抗体及び抗ＰＳ１  Ｃ末端抗体を用いてウェスタンブロッティングを行うことにより確認した（非図示）。また、家族性アルツハイマー病関連変異の効果は、ＰＳ及びＡＰＰ６９５を安定的に発現しているＨＥＫ２９３細胞培養液中のＡβ４２／Ａβ４０比の増加特性により確認した。【００９１】
（４）結果
結果を図６及び図７に示す。図６は、ｐ３−Ａｌｃαの結果を示す。野生型ＰＳ１（ＷＴ）又はベクター（Ｍｏｃｋ）を安定的に発現しているＨＥＫ２９３細胞は、分子量４００２の３７アミノ酸からなるｐ３−Ａｌｃα“３７”のｐ３−Ａｌｃα種を生成した（図６Ａ）。このｐ３−Ａｌｃαのアミノ酸配列をＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳにより解析した結果、ｐ３−Ａｌｃα３７ではなく、ヒトＡｌｃα１の８１５番目のメチオニン（Ｍｅｔ８１５）から８５１番目のスレオニン（Ｔｈｒ８５１）を含む、ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３５であることを確認した。また、野生型ＰＳ１（ＷＴ）又はベクター（Ｍｏｃｋ）を発現しているＨＥＫ２９３細胞は、分子量３８０４の３５アミノ酸からなるｐ３−Ａｌｃα“３５”を生成した（図６Ａ）。アミノ酸配列解析の結果、ｐ３−Ａｌｃα“３５”のアミノ酸配列は、図５に示したｐ３−Ａｌｃα３５のアミノ酸配列と一致した。よって、野生型ＰＳ１（ＷＴ）を発現しているＨＥＫ２９３細胞は、Ｃ末端がＡｌｃα１の８５１番目のＴｈｒであるｐ３−Ａｌｃα種を発現していた。【００９２】
一方で、家族性アルツハイマー病関連ＰＳ１変異を発現するＨＥＫ２９３細胞においては、ｐ３−Ａｌｃα３５及びＰ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３５の他に、異常なｐ３−Ａｌｃα種を生成していた。ｐ３−Ａｌｃα解析の結果、特に、Ｌ１６６Ｐ変異を有するＰＳ１を発現している細胞培養液中には、ヒトＡｌｃαの８１５番目のメチオニン（Ｍｅｔ８１５）から８５４番目のイソロイシン（Ｉｌｅ８５４）を含むペプチドであるｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３８（配列番号１８）、ヒトＡｌｃαの８１５番目のメチオニン（Ｍｅｔ８１５）から８５５番目のバリン（Ｖａｌ８５５）を含むペプチドであるｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３９（配列番号１９）、及び、ヒトＡｌｃαの８１５番目のメチオニン（Ｍｅｔ８１５）から８５６番目のバリン（Ｖａｌ８５６）を含むペプチドであるｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋４０（配列番号２０）が上昇していた（図６Ａ）。これらのマイナーなｐ３−Ａｌｃα種のｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３５に対する比と、Ａβ４２のＡβ４０に対する比（以下、「Ａβ４２／４０」という）との相関を図６Ｂに示した。具体的には、ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３４／ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３５を図６Ｂ（１）に、ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３６／ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３５を図６Ｂ（２）に、ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３７／ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３５を図６Ｂ（３）に、及び、ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３８／ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３５を図６Ｂ（４）に示した。ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３４／ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３５比、及び、ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３８／ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３５比は、Ａβ４２／４０と相関がみられた（Ｒ２＞０．５）。外因性Ａｌｃαを遺伝子導入していないＨＥＫ２９３細胞、及び、Ｄ３８５Ａ変異を有するＰＳ１を発現しているＨＥＫ２９３細胞においては、顕著なβ−Ａｌｃαの生成は認められなかった（非図示）。よって、幾つかの家族性アルツハイマー病関連ＰＳ１変異がγセクレターゼによるＡｌｃαの分解に影響していることが示された。【００９３】
図７Ｃは、ｐ３−Ａｌｃγの結果を示す。野生型ＰＳ１（ＷＴ）又はベクター（Ｍｏｃｋ）及びＡｌｃγを安定的に発現しているＨＥＫ２９３細胞は、分子量３３７７の３１アミノ酸からなるｐ３−Ａｌｃγ３１及び／又はβ−Ａｌｃγ３４を生成した。ｐ３−Ａｌｃγ３１のアミノ酸配列は、図５に示したｐ３−Ａｌｃγ３１のアミノ酸配列と一致した。【００９４】
また、家族性アルツハイマー病関連変異を有するＰＳ１と共にＡｌｃγを発現しているＨＥＫ２９３細胞から生成したｐ３−Ａｌｃγを解析した結果を図７Ｃに示す。家族性アルツハイマー病関連ＰＳ１変異体を発現するＨＥＫ２９３細胞のうち、Ｌ１６６Ｐ及びＲ２７８Ｔは、ｐ３−Ａｌｃγ３１が減少し、ｐ３−Ａｌｃγ３４が上昇した。ｐ３−Ａｌｃγ３１に対する、ｐ３−Ａｌｃγ３０、ｐ３−Ａｌｃγ３２、又は、ｐ３−Ａｌｃγ３４の比をＡβ４２／４０比と相関させた結果を図７Ｄに示す。ＰＳ１変異体における、γセクレターゼによるｐ３−Ａｌｃγの切断変化の程度は、Ａβ４２生成比（Ａβ４２／４０）の増加と相関関係がみられた（Ｒ２＞０．５）。外因性Ａｌｃγ未発現のＨＥＫ２９３細胞、及び、Ｄ３８５Ａ変異を有するＰＳ１を発現している細胞は、顕著なｐ３−Ａｌｃγは確認できなかった。以上より、ＡｌｃγもＰＳ依存性γセクレターゼにより二次切断を受けることが示された。また、幾つかの家族性アルツハイマー病関連ＰＳ１変異が、ｐ３−Ａｌｃα及びＡβと同様にＣ末端が延長したｐ３−Ａｌｃγを生成させることから、ｐ３−ＡｌｃγがＡβの誤処理を評価するための信頼できる代替物として利用できることが示された。【００９５】
図７Ｂは、ｐ３−Ａｌｃβの結果を示す。野生型ＰＳ１とＡｌｃβを発現している細胞（ＷＴ）及びベクター（Ｍｏｃｋ）とＡｌｃβを安定的に発現しているＨＥＫ２９３細胞は、ｐ３−Ａｌｃβ３７及びｐ３−Ａｌｃβ４０の２つのメジャーなｐ３−Ａｌｃβ種と共に、一つのマイナーなｐ３−Ａｌｃβ種であるｐ３−Ａｌｃβ３９を生成した（図７Ａ）。【００９６】
また、家族性アルツハイマー病関連変異を有するＰＳ１と共にＡｌｃβを発現しているＨＥＫ２９３細胞から生成したｐ３−Ａｌｃβを解析した結果を図７Ａに示す。家族性アルツハイマー病関連ＰＳ１変異体を発現するＨＥＫ２９３細胞のうち、Ｒ２７８Ｔ及びＡ４３４Ｃは、ｐ３−Ａｌｃβ３７が減少し、ｐ３−Ａｌｃβ４０が上昇した。ｐ３−Ａｌｃβ３７に対する、ｐ３−Ａｌｃβ３８、ｐ３−Ａｌｃβ３９、又は、ｐ３−Ａｌｃβ４０の比をＡβ４２／４０比と相関させた結果を図７Ｂに示す。ＰＳ１変異体における、γセクレターゼによるｐ３−Ａｌｃβの切断変化の程度は、Ａβ４２生成比（Ａβ４２／４０）の増加と相関関係がみられた。【００９７】
本実験において測定したＡβ４２／４０の値を図８に示す。Ａβ４２／４０比を増加させる家族性アルツハイマー病関連ＰＳ１変異体であるＬ１６６Ｐ、Ｒ２７８Ｔ、Ａ４３４Ｃ、Ａ２４６Ｅ及びＭ１４６Ｌは、同様にＡｌｃαのγ切断を変化させた。Ｌ１６６Ｐ変異体は、ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３８／ｐ３−Ａｌｃα３５、ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３７／ｐ３−Ａｌｃα３５、ｐ３−Ａｌｃβ３９／ｐ３−Ａｌｃβ３７、ｐ３−Ａｌｃγ３４／ｐ３−Ａｌｃγ３１、及び、ｐ３−Ａｌｃγ３０／ｐ３−Ａｌｃγ３１の比を変化させた。Ｒ２７８Ｔ変異体は、ｐ３−Ａｌｃβ３９／ｐ３−Ａｌｃβ３７、ｐ３−Ａｌｃβ４０／ｐ３−Ａｌｃβ３７、及び、ｐ３−Ａｌｃγ３４／ｐ３−Ａｌｃγ３１の比を変化させた。Ａ４３４変異体は、ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３６／ｐ３−Ａｌｃα３５、及び、ｐ３−Ａｌｃβ４０／ｐ３−Ａｌｃβ３７の比を変化させた。Ａ２４６Ｅ変異体は、ｐ３−Ａｌｃβ３９／ｐ３−Ａｌｃβ３７、及び、ｐ３−Ａｌｃβ４０／ｐ３−Ａｌｃβ３７の比を変化させた。Ｍ１４６Ｌ変異体は、ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３８／ｐ３−Ａｌｃα３５、及び、ｐ３−Ａｌｃγ３０／ｐ３−Ａｌｃγ３１の比を変化させた。これらの結果から、ＡｌｃはＡＰＰと同様にしてＰＳ依存性γセクレターゼ複合体により切断され、家族性アルツハイマー病関連ＰＳ１変異が、Ａｌｃファミリータンパク質のγ−切断部位の誤切断を引き起こすことが示された。よって、ｐ３−Ａｌｃは、ＰＳ１変異体によりＡβの誤切断のサロゲートマーカとして使用できることが確認された。【００９８】
実施例８．ＰＳ１欠損細胞によるｐ３−Ａｌｃβの分泌測定
（１）細胞の調整
ＰＳ１及びＰＳ２のダブル遺伝子ノックアウトマウス（ＰＳ１／２  −／−）由来のＭＥＦｓ（以下、「ＰＳ１／２（−／−）ＭＥＦｓ」という）及びワイルドタイプマウス（ＰＳ１／２  ＋／＋）由来のＭＥＦｓ（以下、「ＰＳ１／２（＋／＋）ＭＥＦｓ」という）は、既知の方法（Ｈｅｒｒｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  ２，  ４６１−４６２．）により作製した。【００９９】
（２）遺伝子導入
ＰＳ１／２（−／−）ＭＥＦｓ及びＰＳ１／２（＋／＋）ＭＥＦｓに、ＦＬＡＧ−Ａｌｃβを導入し、発現させた。遺伝子導入は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００又はＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（いずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で、実施例１で作製したｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−ｈＡｌｃβを用い、製造者のプロトコルに従って、ＭＥＦｓ（０．３〜１．０×１０６個）に遺伝子導入することにより行った。導入２４時間後に、培地を交換し、更に細胞を２４時間培養した。【０１００】
（３）培養液免疫沈降物及び細胞溶解物の回収及びウェスタンブロッティング
培地中に分泌されたｐ３−Ａｌｃβを、血清１００μＬの抗ｐ３−Ａｌｃβポリクローナル抗体ＵＴ１４３、及び、プロテインＧセファロースビーズを用いて免疫沈降を行うことにより回収した。細胞性タンパク質を分析するため、細胞を回収し、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するＨｅｐｅｓ−バッファサリン（Ｈｅｐｅｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｗｉｔｈ  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００：ＨＢＳＴ）中で溶解させた（Ａｒａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９，  ２４３４３−２４３５４．）。細胞溶解物及び免疫沈降物は、実施例２で作製した抗体を用いてウェスタンブロッティングを行い、ＥＣＬ（ＧＥヘルスケア社）を用いて検出し、ＶｅｒｓａＤｏｃイメージングシステム（ＢｉｏＲａｄ社）を用いて定量した。【０１０１】
（４）質量分析
ビーズは、続いて洗浄緩衝液Ｉ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）ｎ−オクチル−Ｄ−グルコース、０．０２５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム）、及び、洗浄緩衝液ＩＩ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．０２５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム）を用いて洗浄し、その後、検体はシナピン酸（ｓｉｎａｐｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）で飽和させたトリフルオロ酢酸／アセトニトリル／水（１：２０：２０）を用いて溶出させた。溶解させた検体は標的板上で乾燥させ、Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＰＲＯ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメータ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、又は、ＵｌｔｒａｆｌｅｘＩＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社）を用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析を行った。分子量は、ＰｒｏｔｅｏＭａｓｓ  ＡＣＴＨ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  １８−３９  ＭＡＬＤＩ−ＭＳ  Ｓｔａｎｄａｒｄ、及び、Ｖｏｙｇｅｒ−ＤＥ  ＰＲＯ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメータ用インスリン（シグマアルドリッチ社）、並びに、ＵｌｔｒａｆｌｅｘＩＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ用ペプチド調整スタンダード（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社）を用いて調整した。各メジャーピーク産物のアミノ酸配列は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳ分析により決定した。【０１０２】
（５）結果
結果を図９及び図１０に示す。Ａｌｃβは、ＰＳ１／２（−／−）ＭＥＦｓ、及び、対応する野生型コントロールＰＳ１／２（＋／＋）ＭＥＦｓにおいて発現した。ＰＳ１／２（−／−）ＭＥＦｓ、及び、対応する野生型コントロールＰＳ１／２（＋／＋）ＭＥＦｓが共に同程度のＡｌｃβを発現するにもかかわらず、質量分析の結果、ｐ３−Ａｌｃβ３７及びｐ３−Ａｌｃβ４０の両方がコントロールＰＳ１／２（＋／＋）ＭＥＦｓの培養液から検出されたが、ＰＳ１／２（−／−）ＭＥＦｓの培養液からは検出されなかった（図９）。【０１０３】
ＰＳ１／２（−／−）ＭＥＦｓにおける、Ａｌｃβの一次切断産物のＣ末端断片であるＡｌｃβＣＴＦの集積を測定した結果を図１０に示す。ＰＳ１／２（−／−）ＭＥＦｓ、及び、対応する野生型コントロールＰＳ１／２（＋／＋）ＭＥＦの細胞溶解物をウェスタンブロットにより解析した結果を図１０に示す。抗Ａｌｃβ細胞質抗体ＵＴ９９を用いたウェスタンブロッティングにより、約２１．５ｋＤａのＡｌｃβＣＴＦ及び全長のＡｌｃβの両方が野生型コントロールＰＳ１／２（＋／＋）ＭＥＦｓの細胞溶解物から検出された。このことから、これらの細胞はＡＤＡＭ１０やＡＤＡＭ１７等の一次切断酵素を発現していることが示された。ＡｌｃβＣＴＦは、ＰＳ１／２（−／−）ＭＥＦｓにおいて集積していた。これらの結果から、ＡｌｃβがＰＳ依存性γセクレターゼ複合体の基質であることが示された。【０１０４】
実施例９．Ｄ３８５Ａ変異を有するＰＳ１による切断
培養液中のｐ３−Ａｌｃβ及びｐ３−Ａｌｃαを免疫沈降により回収し、細胞内Ａｌｃβ及びＡｌｃβＣＴＦ、又は、細胞内Ａｌｃα及びＡｌｃαＣＴＦと共にウェスタンブロッティングにより確認した。即ち、Ａｌｃβ未導入ＨＥＫ２９３細胞、野生型ＰＳ１を発現しているＡｌｃβ導入ＨＥＫ２９３細胞、Ｄ３８５Ａ変異を有するＰＳ１を発現しているＡｌｃβ導入ＨＥＫ２９３細胞を、γセクレターゼ阻害剤であるＤＡＰＴ（１μＭ）の存在下、又は、非存在下で培養した。培養後、細胞培養液中のｐ３−Ａｌｃβ免疫沈降物及び細胞溶解物を上述の方法に従い調整し、ウェスタンブロッティングを行った。
また、同様に、Ａｌｃα未導入ＨＥＫ２９３細胞、野生型ＰＳ１を発現しているＡｌｃα導入ＨＥＫ２９３細胞、Ｄ３８５Ａ変異を有するＰＳ１を発現しているＡｌｃα導入ＨＥＫ２９３細胞を、γセクレターゼ阻害剤であるＤＡＰＴ（１μＭ）の存在下、又は、非存在下で培養した。培養後、細胞培養液中のｐ３−Ａｌｃα免疫沈降物及び細胞溶解物を上述の方法に従い調整し、ウェスタンブロッティングを行った。【０１０５】
結果を図１１に示す。レーン１は、野生型ＰＳ１を発現している、Ａｌｃβ（左図）又はＡｌｃα（右図）未導入ＨＥＫ２９３細胞（ＤＡＰＴ未添加）、レーン２は、野生型ＰＳ１を発現しているＡｌｃβ（左図）又はＡｌｃα（右図）導入ＨＥＫ２９３細胞（ＤＡＰＴ未添加）、レーン３は、野生型ＰＳ１を発現しているＡｌｃβ（左図）又はＡｌｃα（右図）導入ＨＥＫ２９３細胞（ＤＡＰＴ添加）、レーン４は、Ｄ３８５Ａ変異を有するＰＳ１を発現しているＡｌｃβ（左図）又はＡｌｃα（右図）導入ＨＥＫ２９３細胞（ＤＡＰＴ未添加）を示す。Ａｌｃβ又はＡｌｃαは、Ｄ３８５Ａ変異を有するＰＳ１の存在／非存在、又は、ＤＡＰＴの添加／未添加に関わらず発現が認められた。同程度のＡｌｃβを発現している細胞同士の比較において、Ｄ３８５Ａ変異を有するＰＳ１を発現している細胞は、Ｄ３８５Ａ変異を有するＰＳ１を発現していないコントロール細胞の約２４％のｐ３−Ａｌｃβの分泌が検出された（図１１左図レーン４）。ＤＡＰＴは、ｐ３−Ａｌｃβの生成を阻害した（図１１左図レーン３）。ＡｌｃβＣＴＦの細胞内集積は、Ｄ３８５Ａ変異を有するＰＳ１を発現している細胞、及び、ＤＡＰＴ処理細胞の両方において観察された（図１１左図レーン３及び４）。Ａｌｃαを発現させた同様の実験においては、ｐ３−Ａｌｃαの生成は、Ｄ３８５Ａ変異を有するＰＳ１を発現している細胞、及び、ＤＡＰＴ処理細胞において完全に阻害された（図１１右図レーン３及び４）。ＡｌｃαＣＴＦは、Ｄ３８５Ａ変異を有するＰＳ１を発現している細胞、及び、ＤＡＰＴ処理細胞の両方の細胞において集積していた。これらの結果から、Ａｌｃβは、ＡＰＰや他のＡｌｃファミリー（Ａｌｃα及びＡｌｃγ）と同様に、ＰＳ依存性γセクレターゼ複合体により主要な切断を受けることが確認された。【０１０６】
以上より、Ａｌｃα及びＡｌｃγと対照的に、Ａｌｃβは、家族性アルツハイマー病関連品位を有するＰＳ１を発現する細胞におけるｐ３−Ａｌｃβを生成過程において特異的性質を示した。疾患関連ＰＳ１変異体を発現する細胞から分泌されたｐ３−Ａｌｃα及びｐ３−ＡｌｃγはＣ末端が延長していたのに対し、該細胞から分泌されたｐ３−ＡｌｃβはＣ末端が短縮していた。Ａｌｃβは、他のＡｌｃファミリータンパク質と同様、ＡＰＰと共調した代謝を受けるが、Ａｌｃβの二次切断は、ｐ３−Ａｌｃα及びｐ３−Ａｌｃγとは異なるメカニズムにより制御されている可能性が示唆された。これらの違いにも関わらず、二次切断は、一次切断により誘発されることは明らかとなった。神経細胞においては、Ａｌｃファミリータンパク質からの可溶性Ａｌｃ、ｐ３−Ａｌｃ、及び、ＡｌｃＩＣＤの生成は、ＡＤＡＭ１０及び／ＡＤＡＭ１７による一次切断により始まることが示された。【０１０７】
実施例１０．ヒトの脳脊髄液中へのｐ３−Ａｌｃの分泌
（１）検体の入手、免疫沈降
ヒトの検体を使用した１回目の実験においては、５〜１０人の個人（７０〜９０歳）から得られたヒト脳脊髄液（０．３〜１．０ｍＬ）の混合物について、ｐ３−Ａｌｃα、ｐ３−Ａｌｃβ、及び、ｐ３−Ａｌｃγを、ぞれぞれ、アフィニティにより精製されたＩｇＧフラクション１５０μｇの３Ｂ５抗体、血清１００μＬの抗ｐ３−Ａｌｃβポリクローナル抗体ＵＴ１４３、及び、血清１００μＬの抗ｐ３−Ａｌｃγポリクローナル抗体ＵＴ１６６、並びに、プロテインＧセファロースビーズを用いて免疫沈降を行うことにより回収した。【０１０８】
２回目の実験においては、散発性アルツハイマー病の患者４人から得られた脳脊髄液、及び、当該患者と同年齢の３人の非認知症のヒト（コントロール）から得た脳脊髄液を検体として使用した。脳脊髄液中のｐ３−Ａｌｃα種を検出するため、８００μＬの個々の脳脊髄液について個別に前記方法と同様に免疫沈降を行った。
脳脊髄液中のアミロイドβ４２（Ａβ４２：免疫生物研究所）、及び、１８１番目のスレオニンがリン酸化されたタウ（ｐＴａｕ）（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ社）のレベルは、ＥＬＩＳＡシステムを用いて定量した（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）ＪＡＭＡ  ２８９，２０９４−１０３．）。【０１０９】
３回目の実験においては、非認知症のヒト（コントロール）（ＣＤＲ＝０）、アルツハイマー病の疑いがある患者（ＣＤＲ＝０．５）、散発性アルツハイマー病（ＣＤＲ＝１．０）、Ａ７９Ｖ、Ｈ１６３Ｒ及びＩ１４３Ｔの変異を有する家族性アルツハイマー病の患者、並びに、前頭側頭型痴呆（Ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ  Ｄｅｍｅｎｔｉａ：ＦＴＤ）、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及び脳卒中等の他の神経性又は神経変性疾患（ｏｔｈｅｒ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ：ＯＮＤ）から得た脳脊髄液中を検体として使用し、個別に前記方法と同様に免疫沈降を行った。【０１１０】
（２）質量分析
ビーズは、続いて洗浄緩衝液Ｉ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）ｎ−オクチル−Ｄ−グルコース、０．０２５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム）、及び、洗浄緩衝液ＩＩ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．０２５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム）を用いて洗浄し、その後、検体はシナピン酸（ｓｉｎａｐｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）で飽和させたトリフルオロ酢酸／アセトニトリル／水（１：２０：２０）を用いて溶出させた。溶解させた検体は標的板上で乾燥させ、Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＰＲＯ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメータ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、又は、ＵｌｔｒａｆｌｅｘＩＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社）を用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析を行った。分子量は、ＰｒｏｔｅｏＭａｓｓ  ＡＣＴＨ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  １８−３９  ＭＡＬＤＩ−ＭＳ  Ｓｔａｎｄａｒｄ、及び、Ｖｏｙｇｅｒ−ＤＥ  ＰＲＯ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメータ用インスリン（シグマアルドリッチ社）、並びに、ＵｌｔｒａｆｌｅｘＩＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ用ペプチド調整スタンダード（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社）を用いて調整した。【０１１１】
（３）その他
なお、本研究において使用したヒト脳脊髄液の使用に関しては、患者及びその家族からインフォームドコンセントを得ている。【０１１２】
（４）結果
１回目の実験の質量分析の結果を図１２に示す。３Ｂ５抗体を使用した免疫沈降により、分子量３８０４．６のペプチドが回収された（図１２Ａ）。回収されたペプチドは、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳ解析によりｐ３−Ａｌｃα３５であることが確認された（図１３Ａ）。また、分子量４０００付近に回収されたペプチドは、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳ解析により８１７番目のアラニン（Ａｌａ８１７）から８５３番目のバリン（Ｖａｌ８５３）までを含むペプチドであるｐ３−Ａｌｃα３７、及び、８１５番目のメチオニン（Ｍｅｔ８１５）から８５１番目のスレオニン（Ｔｈｒ８５１）までを含むペプチドであるｐ３−ＡｌｃαＮ２＋３５であることが確認された。これらの２種類のペプチドは、リフレクターモードにより分析により区別可能であった（図１４）。以後の実験においては、特に明記しない限り、ｐ３−Ａｌｃα３７は、ｐ３−ＡｌｃαＮ２＋３５と区別して独立した成分として測定した。
ＵＴ１４３抗体を使用した免疫沈降により、分子量３９６３．９のペプチドが回収された（図１２Ｂ）。回収されたペプチドは、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳ解析によりｐ３−Ａｌｃβ３７であることが確認された（図１３Ｂ）。
ＵＴ１６６抗体を使用した免疫沈降により、分子量３３７７．６のペプチドが回収された（図１２Ｃ）。この分子量が３３７７．６の種は、免疫沈降により回収された量が少量であったため、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳによる解析を行うことができなかったが、分子量はｐ３−Ａｌｃγ３１と同一であった（図１３Ｃ）。
これらの結果は、ヒトにおけるＡｌｃの切断部位が、先の実施例記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける実験により決定された部位と同じであること、並びに、ヒトにおいては、ｐ３−Ａｌｃα３５、ｐ３−Ａｌｃα３７、ｐ３−Ａｌｃβ３７、ｐ３−Ａｌｃβ４０、及び、ｐ３−Ａｌｃγ３１がメジャーな種として生成していることを示している。【０１１３】
２回目の実験において、４人のアルツハイマー病患者から得られた脳脊髄液のＡβ４２のレベルは、コントロールの脳脊髄液中において観察されたレベルよりも低かった。アルツハイマー病患者から得られた脳脊髄液では、Ａβ４２のレベルは２９９〜４６７ｐｇ／ｍＬ、リン酸化Ｔｈｒ１８１タウ（以下、「ｐＴａｕ」という)のレベルは６８〜１３５ｐｇ／ｍＬであった。一方、コントロールの脳脊髄液においては、Ａβ４２のレベルは７６０〜８９８ｐｇ／ｍＬ、ｐＴａｕのレベルは４２〜５２ｐｇ／ｍＬであった。ｐ３−Ａｌｃαのメジャーな種である、ｐ３−Ａｌｃα３５及びｐ３−Ａｌｃα３７は、３人のコントロールの脳脊髄液（図１５Ａ〜Ｃ）及び４人のアルツハイマー病患者の脳脊髄液（図１５Ｄ〜Ｇ）において検出された。分子量からは、“３７”のピークはｐ３−Ａｌｃα３７であると考えられるが、ｐ３−ＡｌｃαＮ２＋３５を含む可能性は否定できなかった。“３４”のピークは、全てのアルツハイマー病患者の脳脊髄液（図１５Ｄ〜Ｇ）及び一人のコントロールの脳脊髄液（図１５Ｃ）において検出され、Ｃ末端短縮型ｐ３−Ａｌｃα３４であることが確認された。“３９”のピークは、３人のアルツハイマー病患者の脳脊髄液（図１５Ｅ〜Ｇ）において検出され、Ｃ末端の延長を含むｐ３−Ａｌｃα３９であると決定された。これらのＣ末端が短縮し又は延長したｐ３−Ａｌｃα種は、遺伝子導入を行っていない細胞、及び、野生型ＰＳ１を過剰発現している細胞において検出されていない（図６Ａ参照）。これらの結果から、異常なｐ３−Ａｌｃα種の比較的大量の存在及び／又は増加は、散発性アルツハイマー病がγセクレターゼの機能不全に関連していることを示している。特に、ｐ３−Ａｌｃα３４、及び、ｐ３−Ａｌｃα３９については、アルツハイマー病患者においてそのピークが顕著であることから、アルツハイマー病の指標として利用可能であることが示された。【０１１４】
以上において得られたｐ３−Ａｌｃ種は、集積する傾向は見られなかった（非図示）。よって、ｐ３−Ａｌｃ種生成の変化は、アルツハイマー病診断において誤処理されたＡβのサロゲートマーカとして使用できることが示された。即ち、γセクレターゼの機能不全は散発性アルツハイマー病の発症を特徴づけ、異常なｐ３−Ａｌｃ断片の生成はγセクレターゼの機能不全のサロゲートマーカとなる。特に、散発性アルツハイマー病患者の脳脊髄液より検出された、Ｃ末端が延長したｐ３−Ａｌｃα種であるｐ３−Ａｌｃα３４及びｐ３−Ａｌｃα３９は、アルツハイマー病診断のマーカとして利用できると考えられる。【０１１５】
３回目の実験において、ｐ３−Ａｌｃαを測定した結果を図１６に示す。図１６において矢印で示したとおり、ｐ３−Ａｌｃα３７は、散発性アルツハイマー病患者（ＣＤＲ＝１．０）、アルツハイマー病が疑われる患者（ＣＤＲ＝０．５）、非認知症のヒト（コントロール）（ＣＤＲ＝０）の順に低く、従って、ｐ３−Ａｌｃα３７はアルツハイマー病診断のマーカとして利用できることが示された。また、本実験の結果から、ｐ３−Ａｌｃα３５に対するｐ３−Ａｌｃα３４、ｐ３−Ａｌｃα３６、ｐ３−Ａｌｃα３７、ｐ３−Ａｌｃα３８、及び、ｐ３−Ａｌｃα３９の比をＡβ４２／４０比と比較した結果を図１７に示す。アルツハイマー病患者（ＣＤＲ＝０．５及びＣＤＲ＝１．０）及びＰＳ１変異を有する患者から得た脳脊髄液のＡβ４２／４０比は、コントロール（ＣＤＲ＝０）の脳脊髄液について観測された値よりも低かった。図１７において、垂直の点線は、アルツハイマー病が疑われる患者（ＣＤＲ＝０．５）のＡβ４２／４０比の平均値を示す。ＯＮＤの患者由来のＡβ４２／４０比は同じく低いことから、Ａβ４２の低下はアルツハイマー病の一つの指標にはなり得るが、ＯＮＤとアルツハイマー病を区別できないことが示された。アルツハイマー病が疑われる患者（ＣＤＲ＝０．５）及び散発性アルツハイマー病患者（ＣＤＲ＝１．０）は、ＯＮＤ患者と比較して、高いｐ３−Ａｌｃα３４／ｐ３−Ａｌｃα３５比、及び、ｐ３−Ａｌｃα３７／ｐ３−Ａｌｃα３５を示した。水平の点線は非アルツハイマー病のヒトのＡβ４２／４０の最大値を示す。アルツハイマー病が疑われる患者（ＣＤＲ＝０．５）及び散発性アルツハイマー病患者（ＣＤＲ＝１．０）におけるｐ３−Ａｌｃα３４／ｐ３−Ａｌｃα３５やｐ３−Ａｌｃα３７／ｐ３−Ａｌｃα３５は、ＯＮＤの患者と区別可能なものであった。この結果から、Ａβ４２／４０比が低く、ｐ３−Ａｌｃα３４／ｐ３−Ａｌｃα３５やｐ３−Ａｌｃα３７／ｐ３−Ａｌｃα３５比が高い患者は、ＯＮＤではなく、アルツハイマー病の可能性があるか又は発症前であると考えられる。ＰＳ１変異としてＡ７９Ｖ、Ｈ１６３Ｒ及びＩ１４３Ｔを有する患者は、Ａβ４２／４０比が垂直ライン上の中間レベルを示し、ｐ３−Ａｌｃα３４／ｐ３−Ａｌｃα３５比、及び、ｐ３−Ａｌｃα３１／ｐ３−Ａｌｃα３５は高くなかった。異常なｐ３−Ａｌｃα種の存在及び／又は上昇は、散発性アルツハイマー病がγセクレターゼの一般的な機能不全に関連し、当該機能不全はＡＰＰのみならずＡｌｃファミリーにも影響することが明らかとなった。【０１１６】
実施例１１．ＥＬＩＳＡシステムによるｐ３−Ａｌｃα３５の測定
（１）抗原用ポリペプチドの入手
抗原用ポリペプチドとして、下記のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ａ）および（ｂ）のＨＰＬＣクロマトグラフィ精製した状態の品をＣＰＣ社（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｃｈｉｎａ）より購入した。なお、ポリペプチド（ａ）はｐ３−Ａｌｃαのアミノ酸配列の８３９〜８５１番目に該当するアミノ酸配列にシスティン（Ｃ）をＮ側に付けたものである。また、ポリペプチド（ｂ）はｐ３−Ａｌｃαのアミノ酸配列の８１７〜８２２番目に該当するアミノ酸配列にシスティン（Ｃ）をＣ側に付けたものである。
ポリペプチド（ａ）：ＣＮＰＨＰＦＡＶＶＰＳＴＡＴ（配列番号２６）
ポリペプチド（ｂ）：ＡＱＰＱＦＶＣ（配列番号２７）【０１１７】
（２）ポリクローナル抗体の作製
免疫用抗原として、（１）において得られたポリペプチド（ａ）とサイログロブリンとの結合物を用い、１週間、または２週間おきに結合物溶液の５０μｌ（１００ｍｇ／ｍｌ）を投与し、ウサギを免疫化した。抗原は初回免疫のみにフロイント完全アジュバントと混和し、二回目からはフロイント不完全アジュバントと混和した。その後、全採血を行い１，５００ｒｐｍで１５分間の遠心により抗血清を分離し、ウサギポリクローナル抗体（以下、この抗体を「Ａｌｃ８３９抗体」という）を得た。
また、免疫用抗原として、（１）において得られたポリペプチド（ｂ）とサイログロブリンとの結合物を用い、免疫化する動物としてマウスを用いる以外はＡｌｃ８３９抗体の作製方法と同様にしてマウスポリクローナル抗体（以下、この抗体を「Ａｌｃ８１７抗体」という）を得た。【０１１８】
（３）ＥＬＩＳＡ法による抗体の特異性の確認
（２）で得られたＡｌｃ８３９抗体の特異性を確認するために、ＥＬＩＳＡ法を行った。すなわち、以下の抗原ペプチドを９６ｗｅｌｌプレートに固相化し、段階希釈した抗体を反応させた後、抗ウサギＩｇＧ-西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識２次抗体と反応させ、洗浄後発色させ、吸光度４９０ｎｍで検出しその特異性を確認した。
抗原ペプチド：
γ５（ＫＫＣＶＰＳＴＡＴＶＶＩＶ）（配列番号２８）
ＴＳ−Ｃ（８ｍｅｒ）（ＫＣＶＰＳＴＡＴ）（配列番号２９）
ＴＳ−Ｃ（１１ｍｅｒ）（ＣＰＳＴＡＴＶＶＩＶＶ）（配列番号３０）【０１１９】
（４）結果
結果を図１８に示す。本抗体は、ｐ３−Ａｌｃα３５のＣ末断端配列を有するペプチドＴＳ-Ｃ（８ｍｅｒ）には強く反応したが、それ以外のペプチドである、γ５、ＴＳ−Ｃ（１１ｍｅｒ）には反応しなかった。このことから、ｐ３−Ａｌｃα３５のＣ末断端に特異的に反応する抗体であることが示された。【０１２０】
実施例１２．サンドイッチＥＬＩＳＡ法の構築
（１）Ａｌｃ８１７抗体とＨＲＰとの結合物の作製
実施例１１で得られたＡｌｃ８１７抗体とＨＲＰとの結合物を以下のように作製した。必要量のＨＲＰを蒸留水に溶解し、ＮａＩＯ４で酸化させた後、ｐＨ４.４の１ｍＭ酢酸緩衝液に一晩透析した。また、Ａｌｃ８１７抗体の２ｍｇもｐＨ９.５の０.１Ｍ炭酸緩衝液に一晩透析した。これらの透析したＡｌｃ８１７抗体とＨＲＰを、抗体１ｍｇに対してＨＲＰが０.４ｍｇになるように混合し、室温で２時間反応させた。次いで、これにＮａＢＨ４を加え氷中で２時間反応させた後ＰＢＳに一晩透析した。更に、この反応物をゲル濾過し、Ａｌｃ８１７抗体とＨＲＰとの結合物（以下、これを「Ａｌｃ８１７標識抗体」という）を作製した。【０１２１】
（２）サンドイッチＥＬＩＳＡ用プレートの作製
１０μｇ／ｍｌのＡｌｃ８３９抗体を１００μｌずつ９６ｗｅｌｌのＥＬＩＳＡ用プレートに加えた。次いで、これを４℃で一晩反応させた後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／ＮａＮ３溶液にてブロッキングを行い、Ａｌｃ８３９抗体を固相化したサンドイッチＥＬＩＳＡ用プレートとした。また、上記（１）で作製したＡｌｃ８１７抗体とＨＲＰとの結合物を標識抗体とした。【０１２２】
（３）標準曲線の作製及び結果
上記（２）で作製した９６ｗｅｌｌのＥＬＩＳＡ用プレートと、上記（１）で作製したＡｌｃ８１７標識抗体および標準物質としてＡｌｃａｄｅｉｎ  ３５ｍｅｒペプチド（配列番号１１）を用いて、ｐ３−Ａｌｃα３５の測定を行った。結果を図１９に示す。Ａｌｃ８３９抗体とＡｌｃ８１７標識抗体を用いてｐ３−Ａｌｃα３５の測定をした場合には、それぞれ濃度依存的に良好な直線性を示した。【０１２３】
実施例１２．家族性ＡＤの患者の脳脊髄液中のｐ３−Ａｌｃα３５
５人の家族性アルツハイマー病患者（γセクレターゼにＩ１４３Ｔ変異を有する患者１人、γセクレターゼにＡ７９Ｖ変異を有する患者２人、γセクレターゼにＨ１６３Ｒ変異を有する患者２人）、１６人のＯＮＤの患者（パーキンソン病の患者１０人、脳卒中の患者２人、ＦＴＤの患者３人、ＡＬＳの患者１人）、及び、健常人２６人の脳脊髄液中のｐ３−Ａｌｃα３５の量を実施例１１で作成したＥＬＩＳＡシステムを用いて測定した。【０１２４】
結果を図２０に示す。図２０に示すとおり、家族性アルツハイマー病の患者においてｐ３−Ａｌｃα３５の分泌量が多い傾向にあり、このような傾向は健常人又はＯＮＤの患者では見られなかったことから、ｐ３−Ａｌｃα３５がアルツハイマー病のバイオマーカとなり得ることが示された。【０１２５】
なお、本明細書において使用する配列番号及び配列は以下のとおりである。
【０１２６】
【表１】
0005386369.tif 000002
【０１２７】
【表２】
0005386369.tif 000003
【０１２８】
【表３】
0005386369.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【０１２９】
本発明のバイオマーカは、γセクレターゼ異常に基づく疾患の指標となることから、本発明の診断薬、診断装置及び診断方法は、γセクレターゼ異常に基づく疾患の診断、γセクレターゼ異常に基づく疾患の診断ための情報の提供、γセクレターゼ異常に基づく疾患の状態又は進行をモニター、及び、γセクレターゼ異常に基づく疾患に対する治療薬の治療効果の判定に使用することができる。
【図６】
0005386369.tif 000005
【図７】
0005386369.tif 000006
【図８】
0005386369.tif 000007
【図１２】
0005386369.tif 000008
【図１４】
0005386369.tif 000009
【図１５】
0005386369.tif 000010
【図１８】
0005386369.tif 000011
【図１９】
0005386369.tif 000012
【図２０】
0005386369.tif 000013
【図１】
0005386369.tif 000014
【図２】
0005386369.tif 000015
【図３】
0005386369.tif 000016
【図４】
0005386369.tif 000017
【図５】
0005386369.tif 000018
【図９】
0005386369.tif 000019
【図１０】
0005386369.tif 000020
【図１１】
0005386369.tif 000021
【図１３】
0005386369.tif 000022
【図１６】
0005386369.tif 000023
【図１７】
0005386369.tif 000024
【配列表】
0005386369000001.app