(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラッカーゼ活性を有し、以下の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ａ）配列番号１０に示すアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１１に示すアミノ酸配列
【請求項２】
ラッカーゼ活性を有するタンパク質をコードし、以下の何れかの塩基配列を有するポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号８に示す塩基配列
（ｂ）配列番号９に示す塩基配列
【請求項３】
請求項２に記載のポリヌクレオチドのうち、少なくともコーディング領域を含む組換えベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項５】
前記組換えベクターを大腸菌に導入した請求項４に記載の形質転換体。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の形質転換体を利用してラッカーゼ活性を有するタンパク質を産生する方法。
【請求項７】
次の性質を有する微生物由来のラッカーゼ活性を有するタンパク質。
（１）活性（基質特異性）：２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、シリンガルダジン、グアイアコール、ジメトキシフェノールを酸化する
（２）至適反応温度８０℃付近
（３）至適反応ｐＨ５付近
（４）温度安定性  ｐＨ５で４００分間保持した場合に、６０℃まで安定である
（５）分子量５４．６〜５５．３ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
【請求項８】
環境試料である堆肥からメタゲノムＤＮＡを抽出する工程、および、当該メタゲノムＤＮＡからラッカーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを増幅するＰＣＲ工程を有し、
前記ＰＣＲ工程において、配列番号１２，１３のプライマー対、配列番号１４，１５のプライマー対、配列番号１６，１７のプライマー対、および、配列番号１８，１９のプライマー対を用いてラッカーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを増幅するラッカーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの取得方法。
【請求項９】
前記堆肥が、木材を成分として含有する木材堆肥である請求項８に記載のラッカーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの取得方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環境試料、特に木材堆肥より取得したラッカーゼ活性を有する新規なタンパク質、当該タンパク質をコードする新規なポリヌクレオチドであり、当該タンパク質を産生する方法、および、当該ポリヌクレオチドを簡便に取得する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラッカーゼ（ポリフェノールオキシダーゼ、ウルシオールオキシダーゼとも呼ばれる）はフェノールオキシダーゼの総称であり、微生物・菌類・植物などに広く存在し、酸素の存在下、フェノール性化合物を酸化する酵素である。ラッカーゼは、リグニン分解作用、ウルシオールやラッコール等のフェノール性化合物、p-フェニレンジアミン等の芳香族アミン、タンパク質等の酸化反応を触媒する。この触媒能力は種々の化学反応に応用可能である。例えば、毒性の強いフェノール性化合物や芳香族アミンを含む廃液の処理、パルプ製造処理等におけるリグニンの除去、バイオ電池、バイオセンサー、人工漆の製造、有機化合物の合成、有毒性化学物質の解毒、食品の苦渋味の除去、接着剤の製造、コンクリート混和剤の合成、紅茶の褐変処理、化粧品用メラニン製造、食品のゲル化剤、臨床検査試薬、漂白剤としての利用等、多くの産業分野への利用が期待されている。
【０００３】
特許文献１には、糸状菌由来であって、複素環系化合物または芳香族アミンに強く作用する基質特異性を有するアルカリラッカーゼが記載してある。当該ラッカーゼにおいては、至適ｐＨは約１０、至適作用温度は５０℃、分子量は約４２，０００〜４３，０００とされている。
【０００４】
特許文献２には、放線菌由来であって、カテコール、レゾルシノール、ハイドロキノン、ピロガロール、クレゾール、グアヤコール、ｐ−フェニレンジアミン、ｐ−トルイジン、Ｌ−チロシン、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、Ｌ−アスコルビン酸を酸化する基質特異性を有するラッカーゼが記載してある。当該ラッカーゼにおいては、至適ｐＨは約４．５、至適反応温度は約５０℃、分子量は約７３，０００とされている。
【０００５】
特許文献３には、不完全菌類由来であって、２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、グアヤコール、４−ヒドロキシインドール、２，６−ジメトキシフェノール、カテコール、ピロガロール、シリングアルダジンを基質とした酸化反応を触媒するラッカーゼが記載してある。当該ラッカーゼにおいては、至適ｐＨは６．５〜７．５、至適反応温度は４０〜４５℃、分子量は７０，０００〜８０，０００とされている。
【０００６】
特許文献４には、高度好熱菌サーマス属細菌に属する微生物由来であって、銅イオンの存在下、フェノール系化合物、複素環系化合物に強く作用する活性を有するラッカーゼが記載してある。当該ラッカーゼにおいては、至適ｐＨは５．０、至適反応温度は９２℃、分子量は５３ｋＤａとされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−２０８５０３号公報
【特許文献２】特開２００２−１７１９６８号公報
【特許文献３】特開２００４−４１１２４号公報
【特許文献４】特開２００６−１５８２５２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ラッカーゼおよびポリフェノールオキシダーゼは、一般に自然界に広く存在している。ラッカーゼの生産菌としては、上述した糸状菌（特許文献１）、放線菌（特許文献２）、不完全菌（特許文献３）が公知であるが、これらの菌は、培養時の生育速度が非常に遅く、概して大量培養が困難である。また、これらの菌由来のラッカーゼの生産性を向上させるためには、遺伝子操作や変異体の作製が必要となるが、生育速度が早い原核生物で発現させるのは困難である。そのため、これらの菌類から安定的かつ安価にラッカーゼを大量生産することは非常に困難であった。
【０００９】
上述した生産菌由来のラッカーゼを多岐に亘る産業分野で利用する場合、当該ラッカーゼは構造的に安定であることが望まれる。例えば特許文献１〜３のラッカーゼは至適反応温度が４０〜５０℃程度であり、熱安定性は低いと考えられる。そのため、廃液の処理やパルプ製造処理におけるリグニンの除去等の使用には不適な場合があった。
一方、高度好熱菌サーマス属細菌（特許文献４）が産生するラッカーゼは、至適反応温度が９０℃程度であり、熱安定性は高いと考えられる。
【００１０】
熱安定性の高い酵素を取得するためには、主として温泉などの高温環境で微生物（好熱菌サーマス属細菌）が採取される。産業上利用の観点から、温泉のような限られた環境からだけでなく、様々な環境に生息する微生物からラッカーゼを取得できれば、ラッカーゼを簡便に大量生産することができると考えられる。
【００１１】
従って、本発明の目的は、耐熱性および耐久性に優れた新規なラッカーゼ活性を有するタンパク質および当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ることを目的とする。また、当該タンパク質を産生する方法、および、当該ポリヌクレオチドを簡便に取得する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
土壌や河川などの環境には多種多様な微生物が生息している。従来の微生物のゲノム解析では、単一菌種の分離・培養過程を経てゲノムＤＮＡを調製していた。一方、メタゲノミクスと呼ばれる新たな研究分野では、当該環境から採取した試料（環境試料）から直接に回収されたＤＮＡを扱う。即ち、メタゲノミクスでは、単一菌種の分離・培養過程を経ずに、多種多様な微生物の集団からそれらのゲノム（メタゲノム）を一括して調製し、そのヘテロな状態となっているメタゲノムを大腸菌等の宿主に組み込んでスクリーニングを行う、或いは、メタゲノムのままシークエンシングする手法が用いられる（メタゲノム解析）。
地球上に棲息する細菌の９９％以上は単独では培養できない菌種であると推察されている。メタゲノム解析により従来の方法では困難であった難培養菌のゲノム情報が入手可能となった。そのため、メタゲノム解析は環境中に埋没する膨大な数の未知の微生物、未知の遺伝子を解明する手法として期待されている。
【００１３】
本発明者らは、ラッカーゼ活性を有する新規なタンパク質、および、当該タンパク質をコードする新規なポリヌクレオチドの取得方法を提供すべく鋭意検討した結果、環境試料のうち、木材を成分として含有する堆肥試料を選択することにより、極めて効率よくラッカーゼ活性を有するタンパク質、および、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを取得することができることを見出し、本発明を完成した。
【００１４】
即ち、上記目的を達成するため、以下の［１］〜［８］に示す発明を提供する。
［１］ラッカーゼ活性を有し、以下の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ａ）配列番号１０に示すアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１１に示すアミノ酸配列
［２］  ラッカーゼ活性を有するタンパク質をコードし、以下の何れかの塩基配列を有するポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号８に示す塩基配列
（ｂ）配列番号９に示す塩基配列
［３］  上記［２］に記載のポリヌクレオチドのうち、少なくともコーディング領域を含む組換えベクター。
［４］  上記［３］に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
［５］  前記組換えベクターを大腸菌に導入した上記［４］に記載の形質転換体。
［６］  上記［４］又は［５］に記載の形質転換体を利用してラッカーゼ活性を有するタンパク質を産生する方法。
［７］  次の性質を有する微生物由来のラッカーゼ活性を有するタンパク質。
（１）活性（基質特異性）：２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、シリンガルダジン、グアイアコール、ジメトキシフェノールを酸化する
（２）至適反応温度８０℃付近
（３）至適反応ｐＨ５付近
（４）温度安定性  ｐＨ５で４００分間保持した場合に、６０℃まで安定である
（５）分子量５４．６〜５５．３ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
【００１５】
上記［１］〜［７］の構成によれば、ラッカーゼ活性を有する新規なタンパク質、および、当該タンパク質をコードする新規なポリヌクレオチドを得ることができる。これらは、特に特許文献４に記載のラッカーゼとのホモロジーが殆ど認められなかったため、従来公知の耐熱性を有するラッカーゼとは異なるものである。
また本発明のタンパク質およびポリヌクレオチドは、例えば大腸菌などの公知の宿主にクローニングすることで大量生産することができるため、工業的に有利なタンパク質およびポリヌクレオチドである。また、本発明のラッカーゼ活性を有するタンパク質は耐熱性および耐久性に優れているため、従来活用が困難であった分野においても利用することができる。
【００１６】
［８］  環境試料である堆肥からメタゲノムＤＮＡを抽出する工程、および、当該メタゲノムＤＮＡからラッカーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを増幅するＰＣＲ工程を有し、前記ＰＣＲ工程において、配列番号１２，１３のプライマー対、配列番号１４，１５のプライマー対、配列番号１６，１７のプライマー対、および、配列番号１８，１９のプライマー対を用いてラッカーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを増幅するラッカーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの取得方法。
［９］  前記堆肥が、木材を成分として含有する木材堆肥である上記［８］に記載のラッカーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの取得方法。
【００１７】
上記［８］〜［９］の構成によれば、ラッカーゼ活性を有する新規なタンパク質、および、当該タンパク質をコードする新規なポリヌクレオチドは、由来となる微生物を特定するのではなく、発酵発熱によって高温となりうる環境試料である堆肥より取得した、所謂メタゲノムＤＮＡから、直接スクリーニングすることによって効率よく簡便に取得できる。特に堆肥が木材堆肥であれば、その入手は容易であるため、本発明の方法は、工業的に有用な方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】メタゲノムＤＮＡを鋳型として配列番号１〜３のプライマーを使用して増幅したＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動を示す写真である。
【図２】メタゲノムＤＮＡを鋳型として配列番号１２〜１５のプライマーを使用して増幅したＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動を示す写真である。
【図３】ｍｇＬＡＣ−１とLCS_Trichodesmiumとのアミノ酸配列を比較した図である。
【図４】ｍｇＬＡＣ−２とLCS_Sorangiumとのアミノ酸配列を比較した図である。
【図５】ｍｇＬＡＣ−１とＴｔｈＬＡＣとのアミノ酸配列を比較した図である。
【図６】ｍｇＬＡＣ−２とＴｔｈＬＡＣとのアミノ酸配列を比較した図である。
【図７】精製した発現タンパク質のアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示した写真である。
【図８】３種類のラッカーゼの温度依存性を比較した図である。
【図９】３種類のラッカーゼのｐＨ依存性を比較した図である。
【図１０】２種類のラッカーゼ（ｍｇＬＡＣ−１,ｍｇＬＡＣ−２）の高温耐久性を比較した図である。
【図１１】ｍｇＬａｃ−１の部分配列を増幅するプライマーを用いて、５種類の環境試料から増幅したＰＣＲ産物の電気泳動解析の結果を示した写真である。
【図１２】ｍｇＬａｃ−２の部分配列を増幅するプライマーを用いて、５種類の環境試料から増幅したＰＣＲ産物の電気泳動解析の結果を示した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の実施例を図面に基づいて説明する。
本発明は、ラッカーゼ活性を有する新規なタンパク質、および、当該タンパク質をコードする新規なポリヌクレオチドである。特に本発明では、土壌や堆肥などの環境から採取した環境試料から、直接、メタゲノムを調整してラッカーゼ活性を有するタンパク質および当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを取得する。
【００２０】
本実施形態にいう「ラッカーゼ」とは、ラッカーゼ活性を有するタンパク質のことを指す。また、本実施形態にいう「ラッカーゼ遺伝子」とは、ラッカーゼをコードするポリヌクレオチド、ラッカーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、これらの少なくともひとつを含有するポリヌクレオチド、から選ばれる少なくともひとつを指すものである。
【００２１】
また、本発明は、取得した新規なポリヌクレオチドを含む組換えベクター、当該組換えベクターを宿主に導入して得られる形質転換体、および、形質転換体を発現させてラッカーゼ活性を有するタンパク質を産生する方法を提供する。
【００２２】
（環境試料）
環境試料としては、土壌、堆肥（コンポスト）、河川などから採取した水等が例示される。本発明では、堆肥から採取した試料を環境試料として例示する。「堆肥」とは、植物系残渣を自然に堆積発酵させたものであり、有機物である植物系残渣を微生物によって分解した肥料のことである。本実施形態では、特に、植物系残渣として木材を成分として含有する堆肥（以下、木材堆肥と称する）及び堆肥作製途中の発酵中の試料から採取した試料を環境試料として示す。「木材を成分として含有する」とは、例えば木材を適切な大きさのフレーク状またはチップ状に刻んだ木材片（木材チップ）が堆肥の３０〜５０重量％程度含まれる状態をいうものとする。但し、木材チップの含有割合はこれに限られるものではない。木材堆肥において、木材チップ以外の成分は、家畜の糞尿などの有機物が例示されるが、これに限定されない。木材チップは、例えば間伐材・剪定材・抜根材・流木等を粉砕機によって粉砕して調製される。製材所から排出されたおが屑を用いてもよい。
【００２３】
例えば牧場の飼育場に敷き詰めた木材チップが木材堆肥として好ましく利用できる。牧場から採取した木材堆肥には、家畜の排泄物などに含まれる発酵菌が混入している。当該発酵菌は人為的に木材チップに混入させてもよい。発酵菌は、木材チップのセルロースその他の木質繊維やその他の含有炭化水素を発酵させて木材チップを堆肥化するものであり、例えば乳酸菌・放線菌・酢酸生成菌・酵母などが知られている。発酵には多種多様な微生物が関与すると考えられているため、発酵菌は上述した公知の微生物に特定されるものではなく、未知の微生物をも含む。木材堆肥は、発酵菌の発酵作用に伴う発酵発熱により、通常６０〜８０℃程度の高温となる。
【００２４】
このように当該木材堆肥には、特に木材成分を酸化分解する微生物が多く生息すると推察される。即ち、環境試料としては、発酵発熱によって高温となりうる試料や、木材成分を酸化分解する微生物が多く生息する試料であれば、木材堆肥に限定されるものではない。例えば、落葉が堆積してできた腐葉土なども環境試料となりうる。
【００２５】
（メタゲノムＤＮＡの抽出）
環境試料である木材堆肥には、多種多様な微生物が混在している。メタゲノミクスでは、単一菌種の分離・培養過程を経ずに、多種多様な微生物を含むサンプルを一括して扱うことで、目的の遺伝資源（ラッカーゼ）にアプローチする。そのアプローチに際して、まず木材堆肥からメタゲノムＤＮＡを精製する（メタゲノムＤＮＡ抽出工程）。
【００２６】
環境試料中の遺伝子を解析するに当たっては、木材堆肥から純度の高いＤＮＡを十分量回収することが必要不可欠である。メタゲノムＤＮＡの抽出は、界面活性剤や有機溶媒を用いる公知のＤＮＡ抽出方法を使用することができる。尚、環境試料から抽出した抽出物には、腐植酸等のＰＣＲ反応阻害物質が含まれる場合がある。そのため、後に行なうＰＣＲ反応を阻害する物質を排除できるような抽出系にするとよい。
【００２７】
（ラッカーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの取得）
メタゲノムＤＮＡから目的とするポリヌクレオチド配列を増幅するため、例えば、既知のラッカーゼ遺伝子の塩基配列に特異的な塩基配列あるいはアミノ酸配列に基づいてプライマー対を設計する。配列情報は、ＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ、ＮＣＢＩ、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知の核酸配列データベース、及びタンパク質（アミノ酸）配列データベースを利用して入手できる。
【００２８】
「プライマー」は、例えばＰＣＲなどの核酸増幅法などにおける酵素的重合の開始のための決められた条件下で、１本鎖の核酸又は核酸断片とハイブリダイズし、重合酵素であるポリメラーゼによる塩基伸長反応を誘導し得る数塩基〜数十塩基のオリゴヌクレオチドである。プライマーは、所望の領域を増幅するように、例えばプライマー設計支援ソフト等を利用して、所望の増幅領域を挟んで設計される。プライマーの塩基数は、標的核酸を特異的に認識するために十分に長くなければならないが、長すぎると逆に非特異的反応を誘発するので好ましくない。したがって、適当な長さはＧＣ含量等の標的核酸の配列情報、並びに、反応温度、反応液中の塩濃度等のハイブリダイゼーション反応条件など多くの因子に依存して決定されるが、好ましくは、は約１０〜５０の塩基からなるオリゴヌクレオチドが例示される。プライマーは、化学合成等の手法により合成する。当該化学合成は、公知のＤＮＡ合成手法により行なうことができる。
【００２９】
抽出したメタゲノムＤＮＡを鋳型とし、設計したプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を行うことで、既知ラッカーゼ遺伝子（ラッカーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド）、および、当該遺伝子（ポリヌクレオチド）に相同性の高いＤＮＡ断片を得ることができる（ＰＣＲ工程）。
【００３０】
核酸増幅の条件（変性温度、アニール温度およびアニール時間、サイクル数、伸延温度および伸延時間）は、設計したプライマーの長さやＧＣ含有量等によって適宜決定する。ＰＣＲに使用するポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラ−ゼのようなＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラ−ゼ等、公知の重合酵素を使用すればよい。
【００３１】
上述したＰＣＲ法によって得られたＰＣＲ増幅産物を確認するため、ＰＣＲ反応液を採取して電気泳動を行う。当該電気泳動では、適切な緩衝液およびゲルを使用して行なうとよい。電気泳動時間・電圧は適宜設定する。電気泳動の後、所定濃度のエチジウムブロマイド等の染色剤によりＰＣＲ増幅産物を所定時間染色して紫外線の照射等によって可視化することでＰＣＲ増幅産物を検出する。既知ラッカーゼ遺伝子の塩基長は既知であるため、検出されたＰＣＲ増幅産物のサイズを検討することで、当該ＰＣＲ増幅産物が既知ラッカーゼ遺伝子のホモログであるか否かを推定することができる。
【００３２】
目的のＰＣＲ増幅産物を精製してｐＵＣ１１８等の公知の適当なベクターにクローニングし、公知の手法によって当該ＰＣＲ増幅産物の塩基配列を決定する。クローニングは公知のクローニング技術を用いるとよい。塩基配列は、マキサム・ギルバート法やジデオキシ法などの公知のシークエンス技術を用いて決定することができる。
【００３３】
（ラッカーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの完全長断片の取得および増幅）
環境試料から特定遺伝子を取得する際には、一部の塩基配列が解読されたポリヌクレオチド配列の周辺領域の未知の塩基配列についても配列情報が必要である。そのために、当該ポリヌクレオチドにおける解読された配列領域から、当該領域に隣接する塩基配列が未知のポリヌクレオチド配列領域の方向に伸長するように設計されたプライマーを用い、ＰＣＲによって当該未知のポリヌクレオチド配列を増幅して完全長のラッカーゼ遺伝子を取得する。
当該プライマーは、塩基配列が解読されたポリヌクレオチド配列において、例えば末端付近の配列に基づいて設計する。抽出したメタゲノムＤＮＡを鋳型とし、前記プライマーを用いてＰＣＲによる増幅後に標的ＤＮＡ配列のバンドを確認し、既述した要領で適当なベクターにクローニングした後、塩基配列を決定する。
【００３４】
決定された塩基配列情報を基に、ラッカーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの完全長断片を増幅するための特異的プライマーを設計する。抽出したメタゲノムＤＮＡを鋳型として、前記プライマーを用いてＰＣＲによる増幅を行なうことにより、当該完全長断片の増幅をすることができる。
【００３５】
（組換えベクターおよび形質転換体）
得られた完全長断片は発現ベクターに組み込み、得られた組換えベクターを適切な宿主細胞に導入して形質転換体を得る。当該形質転換体を培養すれば、当該形質転換体にラッカーゼを産生させることができる。
【００３６】
発現ベクターとしては、外来ＤＮＡを組み込め、かつ宿主細胞中で自律的に複製可能なものであれば特に制限はない。本発明であれば、任意の宿主細胞中で本発明のラッカーゼをコードする遺伝子を発現し、ラッカーゼを産生できるものとする。例えば、例えば、プラスミドベクター（ｐＥＴ系、ｐＵＣ系、及びｐＢＲ系等）、ファージベクター（λｇｔ１０、λｇｔ１１、及びλＺＡＰ等）、コスミドベクター、ウイルスベクター（ワクシニアウイルス、及びバキュロウイルス等）等を挙げることができる。
発現ベクターは、本発明のラッカーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドがその機能を発現できるように組み込まれる。この時、発現ベクターには、核酸分子の機能発現に必要な他の公知の塩基配列が含まれていてもよく、ここでいう他の公知の塩基配列は特に限定されない。
宿主細胞として特に大腸菌を用いる場合、一般に発現ベクターは少なくともプロモーター−オペレーター領域、開始コドン、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、終止コドン、ターミネーター領域および複製可能単位から構成され得る。具体的には、宿主が大腸菌の場合、好適にはTrpプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、lppプロモーター、tacプロモーター、Ｔ７プロモーターなどを含むものが例示される。ターミネーター領域および複製可能単位については公知のものを用いることができる。
【００３７】
発現ベクターへの核酸分子等の挿入は、例えば、適当な制限酵素でラッカーゼをコードするポリヌクレオチドを切断し、発現ベクターの制限酵素部位に挿入して連結する方法などを用いることができるが、これに限定されない。連結に際しては、ＤＮＡリガーゼを用いる方法等、公知の方法を利用できる。
【００３８】
形質転換体の作製に用いられる宿主細胞としては、発現ベクターに適合し、形質転換されうるものであれば特に限定されず、ラッカーゼを効率的に発現できる細胞であればよい。原核生物を好適に利用でき、特には大腸菌を利用することができる。その他、枯草菌、バシラス属細菌、シュードモナス属細菌等をも利用できる。大腸菌としては、例えば、E.coli ＤＨ５α、E.coli ＢＬ２１、E.coli ＪＭ１０９等を利用できる。更に、原核生物に限定されず真核生物細胞を利用することが可能である。例えば、Saccharomyces cerevisiae等の酵母、Ｓｆ９細胞等の昆虫細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞等の動物細胞等を利用することも可能である。
【００３９】
本発明の形質転換体は、上述の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより調製することができる。形質転換は、カルシウム処理によるコンピテントセル法・エレクトロポーレーション法・リン酸カルシウム沈殿法・リポソーム法・マイクロインジェクション法などの公知の手法によって行なうことができる。
【００４０】
（ラッカーゼ活性を有するタンパク質の産生）
本発明のラッカーゼ活性を有するタンパク質は、上記の如く調製される発現ベクターを含む形質転換体をポリペプトン−酵母エキス培地などの公知の栄養培地で培養することによって産生することができる。
【００４１】
使用される培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース・デキストラン・可溶性デンプン・ショ糖等が、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類・硝酸塩類・アミノ酸・コーンスチープリカー・ペプトン・カゼイン等が例示される。また所望により他の栄養素、例えば、無機塩（例えば塩化カルシウム・リン酸二水素ナトリウム・塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン・ネオマイシン・アンピシリン・カナマイシン等）等を含んでいてもよい。培養形態についても特に制限はないが、大量培養の観点から液体培地が好適に利用できる。
宿主細胞が大腸菌の場合、ＬＢ培地・Ｍ９培地などが好ましい培地である。
【００４２】
培養物の培地中に存在するラッカーゼは、培養物を遠心または濾過して培養上清（濾液）を得、当該培養上清から、例えば塩析・溶媒沈澱・透析・限外濾過・ゲル濾過・非変性ＰＡＧＥ・ＳＤＳ−ＰＡＧＥ・各種クロマトグラフィー（例えばゲル濾過クロマトグラフィー・イオン交換クロマトグラフィー・ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー・アフィニティークロマトグラフィー・逆相高速液体クロマトグラフィーなど）・等電点電気泳動などの公知の分離方法を適当に選択して行うことにより得ることができる。特に、収率の観点からは、イオン交換クロマトグラフィーを用いることが好ましい。
【００４３】
細胞質に存在するラッカーゼは、培養物を遠心または濾過して細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、例えば超音波処理・リゾチーム処理・凍結融解・浸透圧ショックおよび界面活性剤処理等により、細胞およびオルガネラ膜を破砕（溶解）した後、遠心分離や濾過等により可溶性画分を得、当該可溶性画分を、上記と同様の方法で処理することにより単離および／または精製することができる。上記可溶性画分の他、不溶画分から精製してもよい。
【００４４】
例えばヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）やＦｌａｇタグ（ＦＬＡＧ−ｔａｇ）などのタグを付加したラッカーゼを形質転換体に産生させるようにすれば、当該タグに親和性を有する物質（例えばＮｉ２＋レジン、タグに特異的な抗体）を用いることにより、簡便に形質転換体が産生したラッカーゼを単離・精製することができる。即ち、当該タグは、例えばヒスチジンをコードするオリゴヌクレオチドをラッカーゼ遺伝子のＣ末端側に結合させた状態で、発現ベクターにクローニングし、適当な宿主を形質転換する。形質転換体を培養することによって産生されたタンパク質は、ラッカーゼとヒスチジンとを有する融合タンパク質となっている。そのため、当該融合タンパク質は、上記タグを利用したアフィニティクロマトグラフィーにより、精製することができる。
【００４５】
精製して得られたラッカーゼの活性は、酵素溶液と基質溶液とを混合し、反応の進行に伴って基質の酸化により生成する生成物の量を特定の吸光度で測定する比色法や、反応の進行に伴って酵素が単位時間あたりに消費する酸素の量を酸素電極により測定する酸素電極法などによって測定することができる。
【００４６】
（本発明のラッカーゼ活性を有するタンパク質および当該タンパク質をコードするポリヌクレオチド）
本発明のラッカーゼ活性を有するタンパク質は、配列番号１０および配列番号１１に示すアミノ酸配列が好適に例示されるが、特定のアミノ酸配列で限定されるものではなく、当該タンパク質と類似の構造を有し、かつ、機能的に同等なタンパク質をも含む。したがって、自然界に存在するラッカーゼの他、人為的な変異誘発、又は遺伝子組換えにより改変されたタンパク質をも含むことが意図される。例えば、上記した天然由来のラッカーゼ活性を有するアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入および付加から選択される１以上の改変が生じたアミノ酸配列を有し、かつ上記したラッカーゼと生物学的機能が同等である改変体が包含し得る。
【００４７】
当業者は、アミノ酸配列の改変に際して本発明のラッカーゼ活性を有するタンパク質のその酵素活性を保持する改変を容易に予測することができる。具体的には、例えばアミノ酸置換の場合には、タンパク質構造保持の観点から極性、電荷、親水性、若しくは疎水性等の点で置換前のアミノ酸と類似した性質を有するアミノ酸に置換することができる。このような置換は保守的置換として当業者には周知である。具体例を挙げると、例えば、アラニン・バリン・ロイシン・イソロイシン・プロリン・メチオニン・フェニルアラニン・トリプトファンは、共に非極性アミノ酸に分類されるため互いに似た性質を有する。また、非荷電性アミノ酸としては、グリシン・セリン・スレオニン・システイン・チロシン・アスパラギン・グルタミンが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、リジン・アルギニン・ヒスチジンが挙げられる。これらの各グループ内のアミノ酸置換は、タンパク質の機能が維持されるとして許容される。また、その後の精製、固相への固定化等の便宜のため、アミノ酸配列のＮ、又はＣ末端にＨｉｓ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇ等を付加したものも好適に例示される。このようなｔａｇペプチドの導入は常法により行なうことができる。また、酵素活性の消失を引き起こさない範囲内で、Ｃ末端側若しくはＮ末端側のアミノ酸残基を切断した切断型でもよい。更に、グルコシル化等の化学修飾を付加してもよい。
【００４８】
このような改変体は自然又は人工の突然変異により生じた突然変異体の中から当該活性を有するタンパク質をスクリーニングすることにより取得できる。或いは、ラッカーゼをコードするポリヌクレオチドに対して改変を施すことによっても取得できる。
また、このようにして得られた改変体については、上述した手法によりラッカーゼ活性の有無を確認するとよい。
【００４９】
本発明のラッカーゼ活性を有するタンパク質は、基質として、２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、シリンガルダジン、グアイアコール、ジメトキシフェノールを酸化する活性を有する。
また、至適反応温度８０℃付近、至適反応ｐＨ５付近である。温度安定性は、ｐＨ５で４００分間保持した場合に、６０℃まで８０％失活レベルに達しないため、安定した酵素活性を維持する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定された分子量は、５５．３〜５４．６ｋＤａである。
【００５０】
本発明のラッカーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号８および配列番号９に示す塩基配列が好適に例示されるが、特定の塩基配列で限定されるものではなく、ラッカーゼの活性を保持したタンパク質をコードする限り、ラッカーゼをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むものと解される。
そして、ラッカーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドの塩基配列において、１又は複数の塩基の欠失、置換、挿入および付加から選択される１以上の改変が生じた塩基配列も含まれる。したがって、配列番号８および配列番号９の塩基配列の３'、又は５'末端にＨｉｓ−Ｔａｇ配列をコードする塩基配列が付加したものも好適に例示される。
上述した本発明のラッカーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドは、当該塩基配列に相補的な塩基配列も本発明の範囲に含まれると解する。
【００５１】
「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。ストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション反応や洗浄の際の塩濃度および温度等を適宜変化させることにより調節することができる。
ハイブリダイゼーションの条件は、例えば６×ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳおよび３０〜５
０％（好ましくは５０％）ホルムアミドの溶液中で３７〜５０℃（好ましくは４２℃）にて１６〜２０時間加温することが例示される。洗浄条件としては、０.１×ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳの溶液中で６８℃にて５分間洗浄することが例示される。しかし、ハイブリダイゼーションの条件および洗浄条件の何れもこのような態様に限られるものではない。
【００５２】
ポリヌクレオチドに改変を施す方法としては、特に制限はなく、当業者に公知の改変タンパク質作製のための変異導入技術を利用することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ等を利用して点変異を導入するＰＣＲ突然誘発法、あるいは、トランスポゾン挿入突然変異誘発法などの公知の変異導入技術を利用することができる。また、常法のホスホルアミダイト法等のＤＮＡ合成法を利用して、所望の改変を施したポリヌクレオチドを構築することによっても調製することができる。もしくは、配列番号８および配列番号９の塩基配列を有するポリヌクレオチドに対してエキソヌクレアーゼを作用させることによって取得することができる。
【００５３】
本発明の組換えベクターは、上述したラッカーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドのうち、少なくともコーディング領域を含み、本発明の形質転換体は、当該組換えベクターを含む。
【００５４】
〔実施例１〕
（環境試料である木材堆肥の採取と木材堆肥中に含まれるメタゲノムＤＮＡの抽出）
木材堆肥として、千葉市県内の牧場から木材成分を酸化分解するバクテリアが多く含まれる牧場堆肥を採取し、環境試料とした。木材堆肥の採取は、堆肥作製直後、堆肥作製一月後、堆肥作製四〜五月後（最終堆肥）の三回行なった。
【００５５】
尚、本実施形態の木材堆肥は、以下のようにして作成された。
間伐材や剪定材を粉砕機で粉砕して木材チップを製造した。当該木材チップと発酵菌を含有する牛糞とを体積比が約１：１となるように混合した後、堆肥切り返し機を用いて７〜１０日に一度の割合いで混合し、５０〜７０℃で高温発酵させた。
【００５６】
木材堆肥からメタゲノムＤＮＡを抽出するためのサンプリングは、木材堆肥作製直後、木材堆肥作製一月後、および、木材堆肥作製四〜五月後（最終）に行なった。
サンプリングした２〜６ｇ（湿重量）の木材堆肥から、PowerMax Soil DNA isolation Kit（MO BIO Laboratories社製）を用いて、製造業者の指示に従ってメタゲノムＤＮＡの抽出を行った。抽出したメタゲノムＤＮＡは、最終的に５ｍＬのＴｒｉｓ緩衝液に溶解させた。本キットを使用すれば、後に行なうＰＣＲ反応を阻害する物質を排除できる。
尚、対象試料として、籾殻堆肥作製二ヶ月後、および、牛糞（脱糞直後）の環境試料からメタゲノムＤＮＡの抽出を行った。
【００５７】
〔実施例２〕
（ラッカーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの取得）
メタゲノムＤＮＡを利用する場合、まず目的とするポリヌクレオチド配列を増幅するため、ＰＣＲ法に使用するプライマーを設計する。具体的には、既知のラッカーゼの共通アミノ酸配列に基づいて、コードホップ（ＣＯＤＥＨＯＰ）プログラム（
”CODEHOP(Consensus-Degenerate Hybrid Oligonucleotide Primer)PCR primer design”Timothy M.Rose, Jorja G.Henikoff and Steven Henikoff, Nucleic Acid Research, 2003, Vol.31,No.13, 3763-3766）（http://blocks.fhcrc.org/blocks/codehop.html）を利用してディジェネレートプライマーを設計した。コードホッププログラムとは、アミノ酸配列をもとに遺伝子をクローニングするために用いられるディジェネレートＰＣＲのためのプライマーを設計するＰＣＲ支援ツールソフトである。
プログラムに入力した既知ラッカーゼ遺伝子配列として、Cyanothece (NCBI accession number ZP_01731625)、Lyngbya (NCBI accession number ZP_01621366)、Synechococcus (NCBI accession number ZP_01081498)、
Thermus (NCBI accession number YP_005339)、Trichodesmium(NCBI accession number YP_720301)を用いた。
このプログラムにより以下のプライマーを設計した。これらプライマーを使用して増幅されるＰＣＲ産物の長さは約９００ｂｐであると予想された。
【００５８】
5’-CCCTGCTGGAATGTTCTGGTAYCAYCCNCA-3’（フォワードプライマー：配列番号１）
5’-CCAGATCCTCATGGTCCAGAATRTGRCARTG-3’（リバースプライマー：配列番号２）
5’-GGATTGACATGTACGTGAAAGGGRTGRTCCAT-3’（リバースプライマー：配列番号３）
【００５９】
Multiplex PCR Assay Kit（Takara-Bio社製）を用いて、実施例１で抽出したメタゲノムＤＮＡを鋳型として、９４℃で３０秒間の熱変性反応後、９４℃で３０秒間の熱変性反応、５５℃で３０秒間のアニーリング反応、７４℃で９０秒間の伸長反応を４０サイクル繰り返すことでＰＣＲ反応を行なった。その後、７４℃で７分間の最終伸長工程を行い、反応を終了した。
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分析した結果を図１に示した。各レーンの鋳型ＤＮＡの由来となる環境試料は、それぞれ、レーン１は木材堆肥作製直後、レーン２は木材堆肥作製一月後、レーン３は木材堆肥作製四〜五月後（最終）、レーン４は籾殻堆肥作製二ヶ月後、レーン５は牛糞（脱糞直後）を使用した。レーン６は、大腸菌のゲノムＤＮＡである。
この結果、三種類の環境試料の全てにおいて、約９００ｂｐのバンドの増幅が確認できた。即ち、これら環境試料において、既知のバクテリアにおけるラッカーゼと相同性の高いＤＮＡ断片、即ち、ラッカーゼ遺伝子の候補となるＤＮＡ断片が増幅されたものと認められた。
【００６０】
目的のＤＮＡ断片（約９００ｂｐ）を精製し、ｐＵＣ１１８ベクター（Takara-Bio社製）に公知の手法によってクローニングした後、塩基配列を決定した（結果は示さない）。
【００６１】
〔実施例３〕
（ラッカーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの完全長断片の取得）
塩基配列を解読したポリヌクレオチド配列領域から、当該領域に隣接する塩基配列が未知のポリヌクレオチド配列領域の方向に伸長するように設計されたプライマーを使用することによって、既知ラッカーゼ遺伝子ホモログの完全長配列を決定した。
鋳型ＤＮＡは抽出したメタゲノムＤＮＡを用い、プライマーは、塩基配列が解読されたポリヌクレオチド配列の末端付近の配列に基づいて設計したものを用い、インバースＰＣＲ法を利用して未知のポリヌクレオチド配列を増幅した。詳細な手順を以下に説明する。
【００６２】
抽出したメタゲノムＤＮＡに制限酵素BamHI,HindIII,EcoRI,SmaI（NEB社製）をそれぞれ５０ユニット加え、３７℃にて５時間制限酵素反応を行った。反応溶液は、それぞれの制限酵素に付属のものを５０μＬ使用した。反応溶液後の溶液中のＤＮＡは、ＤＮＡ精製キット（GE-Healthcare社製）を用いて精製した。
次に、精製したＤＮＡをＴＥ緩衝液に溶解し２０μＬとし、この溶液にＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ）（タカラバイオ社製）を２０μＬ加え、１６℃にて一晩保ち、セルフライゲーション反応をさせた。反応終了後、ＤＮＡ精製キット（GE-Healthcare社製）を用いてライゲーションされたＤＮＡを精製した。
【００６３】
精製後の試料に含まれるＤＮＡの全量をインバースＰＣＲ法の鋳型として用いた。インバースＰＣＲに用いる反応溶液は、上記鋳型ＤＮＡに、ＤＮＡポリメラーゼとしてPrimeSTAR GXL DNA Polymerase（Takara-Bio社製）およびプライマー（終濃度０．２μＭ）を添加し、滅菌蒸留水で５０μＬにメスアップすることにより調製した。当該プライマーの配列は以下の通りである。本実施形態ではプライマー対を２セット使用した。
【００６４】
５’−CAGGTTATCCGGATTCTGCTGGTTTG−３’（フォワードプライマー：配列番号４）
５’−GATAGCGACGAGTGGCACCCGTTCCATATC−３’（リバースプライマー：配列番号５）
【００６５】
５’−CAAAGCGCGGATCGATCTGCCCATC−３’（フォワードプライマー：配列番号６）
５’−AAGGTGATTGCGCGTAACGGTCAGC−３’（リバースプライマー：配列番号７）
【００６６】
サーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて上記反応溶液をＰＣＲ反応させた。
ＰＣＲ反応は、９８℃で１０秒間の熱変性反応、６８℃で１２０秒間のアニーリングおよび伸長反応を２５サイクル繰り返し、６８℃で１０分間の最終伸長反応を行なった。
ＰＣＲ反応後の溶液をアガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ゲル上の標的ＤＮＡ配列に該当するバンドの有無を検出装置および目視により判定した。その結果、インバースＰＣＲ方法による増幅後に標的ＤＮＡ配列のバンドを確認することができた（結果は示さない）。
【００６７】
得られた目的のＤＮＡ断片をｐＵＣ１１８ベクターにクローニング後、塩基配列を決定した。これにより、２種類のラッカーゼ遺伝子（ｍｇＬａｃ−１,ｍｇＬａｃ−２）のＮ末端領域をコードする５’末端配列及びＣ末端領域をコードする３’末端配列が明らかとなった。これにより、ラッカーゼのコーディング領域を含む全塩基配列を決定した（ｍｇＬａｃ−１：配列番号８、ｍｇＬａｃ−２：配列番号９）。また、これら塩基配列から推定されるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１０（ｍｇＬＡＣ−１）および配列番号１１（ｍｇＬＡＣ−２）に示す。
【００６８】
〔実施例４〕
（ラッカーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの完全長断片の増幅）
完全長断片を増幅するため、まず、得られたラッカーゼ遺伝子ホモログの部分配列（ラッカーゼのＮ末端領域をコードする５’末端配列、及び、Ｃ末端領域をコードする３’末端配列）に対する以下の特異的プライマーを設計した。
【００６９】
・ｍｇＬａｃ−１を増幅するプライマー
5’-GAGCATATGGAAGATTCCAGACGGCATGG-3’（フォワードプライマー：配列番号１２）
5’-CTAAAGCTTCTCCACAACCTCGATGATGC-3’（リバースプライマー：配列番号１３）
・ｍｇＬａｃ−２を増幅するプライマー
5’-GAGCATATGAATAGGAAGAGTTTGCAGAG-3’（フォワードプライマー：配列番号１４）
5’-CTAAAGCTTCTGCGCGGCACGCGTACGCT-3’（リバースプライマー：配列番号１５）
【００７０】
Multiplex PCR Assay Kit（タカラバイオ社製）を用いて、実施例１で抽出したメタゲノムＤＮＡを鋳型として、９８℃で１０秒間の熱変性反応、６８℃で１２０秒間のアニーリングおよび伸長反応を２５サイクル繰り返すことでＰＣＲ反応を行なった。その後、６８℃で１０分間の最終伸長工程を行い、反応を終了した。
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分析した結果を図２に示した。図２において、レーン１がｍｇＬａｃ−１、レーン２がｍｇＬａｃ−２である。当該ＰＣＲ産物は、アガロースゲルから精製され、ｐＵＣ１１８ベクターにクローニングした。
【００７１】
〔実施例５〕
（新規ラッカーゼ遺伝子のホモロジー検索）
Trichodesmium erythraeumのラッカーゼタンパク質とのホモロジー検索の結果から、ラッカーゼ遺伝子ｍｇＬａｃ−１のコーディング領域は１４９７ｂｐであり、塩基配列から推定されるタンパク質（ｍｇＬＡＣ−１）は４９９残基であること、ラッカーゼ遺伝子ｍｇＬａｃ−２のコーディング領域は１４８５ｂｐであり、塩基配列から推定されるタンパク質（ｍｇＬＡＣ−２）は４９４残基であることが明らかとなった。また遺伝子のコーディング領域上流には、−１２ｂp前後に原核生物に特異的な翻訳シグナルであるＳＤ配列などの原核生物プロモーターに特徴的な配列が存在していた。
【００７２】
類似性の高いシーケンス群を見つけ出すＢＬＡＳＴ検索でデフォルト（初期条件）のパラメーターを用いた場合、ｍｇＬＡＣ−１ではTrichodesmium erythraeumのラッカーゼ（LCS_Trichodesmium）とのホモロジーはアミノ酸レベルで３２％（図３）、ｍｇＬＡＣ−２ではSorangium cellulosumのラッカーゼ（LCS_Sorangium）とのホモロジーはアミノ酸レベルで５６％（図４）であった。
【００７３】
また、特許文献４に記載の高度好熱菌サーマス属細菌のラッカーゼ（ＴｔｈＬＡＣ）とのアミノ酸配列を比較した結果を図５（ｍｇＬＡＣ−１）、図６（ｍｇＬＡＣ−２）に示す。ｍｇＬＡＣ−１とＴｔｈＬＡＣとのホモロジーはアミノ酸レベルで２９％、ｍｇＬＡＣ−２とＴｔｈＬＡＣとのホモロジーはアミノ酸レベルで２７％であったため、アミノ酸配列の相同性はないものと認められた。
【００７４】
〔実施例６〕
（組換えベクターおよび形質転換体の構築）
本実施形態では、以下のようにラッカーゼ発現用大腸菌を構築した。
ラッカーゼ遺伝子を、６残基のヒスチジンからなるペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを含む大腸菌発現用ベクターであるｐＥＴ２２ｂ（ノバジェン社製）のNdeI/HindIIIサイトにクローニングした。クローニングは、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を使用し、製造業者の指示に従って反応を行なった。
本発明の新規なラッカーゼ遺伝子をクローニングしたプラスミドは、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−７８２（ｍｇＬＡＣ−１）、ＮＩＴＥ  Ｐ−７８３（ｍｇＬＡＣ−２）として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに２００９年７月１５日に寄託してある。
このようにして得られたプラスミドを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（ノバジェン社製）に形質転換し、ラッカーゼ遺伝子の発現菌体を得た。
【００７５】
〔実施例７〕
（融合タンパク質の構築とタンパク質の精製）
プラスミドを導入した大腸菌をＬＢ液体培地によって１５時間培養し、その培養液５０ｍＬをＬＢ液体培地で５００ｍＬにメスアップした状態で、吸光度ＯＤ６００が約０．６になるまで３７℃で培養し、１ｍＭのＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  ｔｈｉｏ−β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を加えて３７℃でさらに４時間培養し、融合タンパク質（ラッカーゼとヒスチジン）を誘導し発現させた。
培養液を遠心分離して大腸菌を回収し、菌体（湿重量２００ｇ）に２００μＬの可溶化液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０））を加えて懸濁後、超音波により菌体を破砕した（破砕条件：30-s pulses; maximum power; high intensity; 0.5-s repeating duty cycle）。菌体破砕液を１５０００ｇで１０分間遠心し、上清を３分間９５℃で熱処理した。
【００７６】
得られた上清５０ｍＭにＮａＣｌを加え、酵素液をＮｉ２＋カラムクロマトグラフィーにかけ、３００ｍＭイミダゾールを含む溶液で融合タンパク質を溶出して、活性画分をまとめ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を透析外液として一晩透析を行い、精製ラッカーゼとした。
このようにして得られた酵素溶液を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）にて透析した。本実施例ではバッチ法を採用したが、カラム法により精製することもできる。必要に応じて、精製ラッカーゼは限外ろ過膜で濃縮した。タンパク質の確認は、２０μＬの酵素溶液に２０μＬの可溶化液を加えて３分間９５℃で熱処理したサンプルを、１２．５％アクリルアミドゲル（アトー社製）で電気泳動し、ＣＢＢ染色法で酵素を可視化した。その結果を図７に示す。
この結果、および、ラッカーゼ遺伝子ｍｇＬａｃ−１およびｍｇＬａｃ−２から推定されるアミノ酸配列を基に、それらのタンパク質（ラッカーゼ）の分子量は、５４．６〜５５．３ｋＤａであると算出された。
【００７７】
〔実施例８〕
（ラッカーゼの活性測定）
ラッカーゼ活性の測定は、１ｍＭ  ＡＢＴＳを含むｐＨ５．０の２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を反応液として用いて比色法で行った。まず、反応液を３０℃に１０分間保ち、温度平衡にした後、酵素液を加えて反応を開始させた。反応の液量は１００μＬとした。基質（ＡＢＴＳ）の酸化に伴う４２０ｎｍの吸光度の増加を測定することでラッカーゼの活性を測定した（ＡＢＴＳのモル吸光度係数：３６０００／Ｍ／ｃｍ）。
【００７８】
本発明酵素を含む３種類のラッカーゼ活性を有するタンパク質（以下、単にラッカーゼと称する）（ｍｇＬＡＣ−１,ｍｇＬＡＣ−２,ＴｔｈＬＡＣ）の活性を比較した。活性の測定条件は酸性条件（ｐＨ５．５）および中性条件（ｐＨ７．５）とした。
酵素の分子活性Ｋｃａｔは、これは酵素１分子あたり１分間に何個の基質を触媒するかを示すパラメータである。例えば、上記３種類の酵素の分子活性測定結果は以下の通りである。
【００７９】
ｍｇＬＡＣ−１：Ｋｃａｔ＝４×１０３／分（６０℃、ｐＨ５．５，１ｍＭ  ＡＢＴＳ）
ｍｇＬＡＣ−２：Ｋｃａｔ＝６×１０３／分（６０℃、ｐＨ５．５，１ｍＭ  ＡＢＴＳ）
ＴｔｈＬＡＣ：Ｋｃａｔ＝１×１０３／分（６０℃、ｐＨ７．５，１ｍＭ  ＡＢＴＳ）
【００８０】
表１に、３種類のラッカーゼのうち、ＴｔｈＬＡＣの活性を１とした場合の相対活性を表した結果を示した。
その結果、精製したタンパク質には活性が認められたことから、実施例４で得られたラッカーゼ遺伝子ホモログｍｇＬａｃ−１とｍｇＬａｃ−２には、ラッカーゼ活性を有するタンパク質がコードされていることが確認できた。
また、酸性条件の場合、ｍｇＬＡＣ−１およびｍｇＬＡＣ−２の活性はＴｔｈＬＡＣの活性の約３〜５倍もの高い活性を有することが判明した。
【００８１】
【表１】
0005534502.tif 000002
【００８２】
以上より、本発明のラッカーゼ（ｍｇＬＡＣ−１，ｍｇＬＡＣ−２）は、基質であるＡＢＴＳを酸化することが確認できた。
その他の基質に対する活性を調べた結果を表２に示す。各基質の活性は、上述したＡＢＴＳの活性を測定する手法に準じて測定した。表２には、ＡＢＴＳの活性を１とした場合の相対活性を記載してある。
【００８３】
【表２】
0005534502.tif 000003
【００８４】
この結果、本発明のラッカーゼ（ｍｇＬＡＣ−１，ｍｇＬＡＣ−２）は、ＡＢＴＳだけでなく、シリンガルダジン、グアイアコール、ジメトキシフェノールに対しても酸化作用を有することが判明した。
【００８５】
本発明酵素を含む３種類のラッカーゼ活性を有するタンパク質の金属イオン要求性を調べた。
測定は、１ｍＭ  ＡＢＴＳと０．２ｍＭ各種金属イオンを含むｐＨ５．０の２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を反応液として用いて比色法で行った。まず、反応液を５０℃に１０分間保ち、温度平衡にした後、酵素液を加え、反応を開始させた。反応の液量は１００μＬとした。基質（ＡＢＴＳ）の酸化に伴う４２０ｎｍの吸光度の増加を測定した。結果を表３に示した。表３には、ＣｕＣｌ２の要求量を１とした場合の相対値を記載してある。
【００８６】
【表３】
0005534502.tif 000004
【００８７】
この結果、ＣｕＣｌ２およびＣｕＳＯ４の要求量が高い値を示したことから、本発明のラッカーゼ（ｍｇＬＡＣ−１，ｍｇＬＡＣ−２）は、その活性に銅イオンが必要であると認められた。
【００８８】
〔実施例９〕
（ラッカーゼの特性解析（活性の温度依存性））
本発明酵素を含む３種類のラッカーゼ（ｍｇＬＡＣ−１,ｍｇＬＡＣ−２,ＴｔｈＬＡＣ）の活性の温度依存性を、３０℃から９０℃の温度範囲で上記比色法に準じて測定した。酵素量がそれぞれｍｇＬＡＣ−１：１５００ｎｇ／μＬ、ｍｇＬＡＣ−２：１０００ｎｇ／μＬ、ＴｔｈＬＡＣ：６０００ｎｇ／μＬとなるように酵素液を調製した。２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）、０．１ｍＭ硫酸銅、１ｍＭ  ＡＢＴＳを含む活性測定液中に酵素液を添加し、各温度での４１８ｎｍにおける吸光度変化を測定した結果を図８に示す。この結果から、３種の酵素は約８０℃で反応速度が最大となり、６０〜９０℃、好ましくは７０〜９０℃、より好ましくは７５〜８５℃が至適温度であることが判明した。図８では、８０℃の反応速度を１とした場合の相対活性を示した。以上より、ｍｇＬＡＣ−１,ｍｇＬＡＣ−２は高温で効率的に反応することが判明した。
【００８９】
〔実施例１０〕
（ラッカーゼの特性解析（活性のｐＨ依存性））
本発明酵素を含む３種類のラッカーゼ（ｍｇＬＡＣ−１,ｇＬＡＣ−２,ＴｔｈＬＡＣ）の活性のｐＨ依存性をｐＨ５．０から８．５の範囲で上記比色法に準じて測定した。それぞれの酵素液は実施例９と同様に調製した。５０℃での、４１８ｎｍにおける吸光度変化を測定した結果を図９に示す。この結果、ｍｇＬＡＣ−１,ｍｇＬＡＣ−２はｐＨ５において反応速度が最大となることが判明した。これらはｐＨ５．５付近まで最大反応速度の８割程度を維持しているため、反応ｐＨは５〜５．５付近とするのが好ましい。
一方、ＴｔｈＬＡＣは、ｐＨ７付近で反応速度が最大となった。図９においては、ｍｇＬＡＣ−１,ｍｇＬＡＣ−２ではｐＨ５の反応速度を１とし、ＴｔｈＬＡＣではｐＨ７の反応速度を１とした場合の相対活性を示した。
【００９０】
〔実施例１１〕
（ラッカーゼの特性解析（高温耐久性））
本発明酵素を含む３種類のラッカーゼ（ｍｇＬＡＣ−１,ｇＬＡＣ−２,ＴｔｈＬＡＣ）を高温（６０℃および８０℃）に曝したときに、酵素活性がどのように変化するか調べた。
図１０に、高温暴露直後の酵素活性を１とした場合に、経時的な相対活性の変化を示した。酵素活性の測定は、実施例９に準じて行なった（ｐＨ５．５）。その結果、６０℃に加温した場合（図１０（ａ））では、４００分経過後も相対活性は殆ど変化せず、８０％失活レベルに達しない。一方、８０℃に加温した場合（図１０（ｂ））では、２５分経過後に相対活性は１/１０程度に低下した。これより、本発明のラッカーゼは、ｐＨ５．５で４００分間保持した場合に、６０℃まで活性が安定していることが判明した。
【００９１】
〔実施例１２〕
（環境試料に含まれている遺伝子の確認）
実施例１，２でラッカーゼ遺伝子ホモログの増幅に用いた各種環境試料から抽出されたメタゲノムＤＮＡを鋳型に用い、実施例３で得られたラッカーゼ遺伝子（ｍｇＬａｃ−１，ｍｇＬａｃ−２）の部分配列（約６００ｂｐ）を増幅する特異的プライマーを設計し、ＰＣＲを行った。
【００９２】
ｍｇＬａｃ−１の部分配列を増幅するプライマーは、以下の通りである。
５’−TTCGAATTCAACCTGCCGGAGAACC−３’（フォワードプライマー：配列番号１６）
５’−CGAAGCGAATTTCTCGATGCACATCCAC−３’（リバースプライマー：配列番号１７）
【００９３】
ｍｇＬａｃ−２の部分配列を増幅するプライマーは、以下の通りである。
５’−CGAAGGATGCCGGGACGTTCTGGTT−３’（フォワードプライマー：配列番号１８）
５’−CATAGGTCACGTCCACGCCCTCCTT−３’（リバースプライマー：配列番号１９）
【００９４】
鋳型として実施例１で抽出したメタゲノムＤＮＡを含む試料（１８ｎｇ/μＬ）を段階希釈した希釈液（鋳型溶液）１μＬを使用し、Multiplex PCR Assay Kit（Takara-Bio社製）を用いて、９８℃で１０秒間の熱変性反応、６８℃で３０秒間のアニーリングおよび伸長反応を６０サイクル繰り返すことでＰＣＲ反応を行なった。その後、７２℃で１０分間の最終伸長工程を行い、反応を終了した。
【００９５】
５種類の環境試料から増幅したＰＣＲ産物の電気泳動解析結果を図１１（ｍｇＬａｃ−１）、図１２（ｍｇＬａｃ−２）に示す。矢印は、ラッカーゼ遺伝子の予想増幅サイズを示す。各レーンの鋳型ＤＮＡの由来となる環境試料は、それぞれ、レーン１は木材堆肥作製直後、レーン２は木材堆肥作製一月後、レーン３は木材堆肥作製四〜五月後（最終）、レーン４は籾殻堆肥作製二ヶ月後、レーン５は牛糞（脱糞直後）を使用した。
この結果、ｍｇＬａｃ−１は試料Ｎｏ．１（木材堆肥作製直後），試料Ｎｏ．２（木材堆肥作製一月後），試料Ｎｏ．３（木材堆肥最終）から得られ、ｍｇＬａｃ−２は試料Ｎｏ．１，２からのみ得られた。試料Ｎｏ．４（籾殻堆肥）および試料Ｎｏ．５（牛糞）からはラッカーゼ遺伝子が取得できていないことが判明した。
以上より、新規なラッカーゼ遺伝子を単離するにあたり、環境試料の選択について鋭意検討した結果、木材チップを選択したことで、新規なラッカーゼ遺伝子の取得に成功したといえる。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明のラッカーゼ活性を有するタンパク質、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、当該タンパク質を産生する方法、および、当該ポリヌクレオチドの取得方法は、廃液の処理、パルプ製造処理等におけるリグニンの除去、バイオ電池、バイオセンサー、人工漆の製造、有機化合物の合成、有毒性化学物質の解毒、食品の苦渋味の除去、接着剤の製造、コンクリート混和剤の合成、紅茶の褐変処理、化粧品用メラニン製造、食品のゲル化剤、臨床検査試薬、漂白剤としての利用等、多くの産業分野に利用できる。
【受託番号】
【００９７】
ＮＩＴＥ  Ｐ−７８２
ＮＩＴＥ  Ｐ−７８３
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１】
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【図２】
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【図７】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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