(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶離液を送液する溶離液送液手段と、試料を導入する試料導入手段と、導入された試料を分離する分析カラムと、分析カラムから溶出した成分を検出する検出手段と、を備えた液体クロマトグラフで用いる、試料導入手段と分析カラムとの間に備えたフィルターであって、
試料導入手段側から順に、濾紙、１枚以上のメンブレンフィルター、焼結フィルター、を設けた、前記フィルター。
【請求項２】
フィルターに設けるメンブレンフィルターがそれぞれ異なる孔径を有した２枚以上のメンブレンフィルターであり、かつ試料導入手段側に設けたメンブレンフィルターの有する孔径が分析カラム側に設けたメンブレンフィルターの有する孔径よりも大きい、請求項１に記載のフィルター。
【請求項３】
請求項１または２に記載のフィルターにタンパク質を含むエージング溶液を導入して処理した、エージング処理フィルター。
【請求項４】
エージング溶液がさらにカオトロピックイオンを含んでいる、請求項３に記載のエージング処理フィルター。
【請求項５】
請求項１または２に記載のフィルターにタンパク質を含むエージング溶液を導入して処理する、フィルターのエージング処理方法。
【請求項６】
エージング溶液がさらにカオトロピックイオンを含んでいる、請求項５に記載のフィルターのエージング処理方法。
【請求項７】
溶離液を送液する溶離液送液手段と、試料を導入する試料導入手段と、導入された試料を分離する分析カラムと、分析カラムから溶出した成分を検出する検出手段と、を備えた液体クロマトグラフであって、
試料導入手段と分析カラムとの間に、試料導入手段側から順に、濾紙、１枚以上のメンブレンフィルター、焼結フィルター、を設けたフィルターを備えた、前記液体クロマトグラフ。
【請求項８】
タンパク質を含むエージング溶液をフィルターに導入してフィルターをエージング処理するエージング溶液導入手段と、
フィルターを通過した溶液が流れる流路とカラムへ導入する流路または廃液への流路とを切り替え可能な流路切り替え手段と、
をさらに備えた請求項７に記載の液体クロマトグラフ。
【請求項９】
試料導入手段とエージング溶液導入手段とが一体となった、請求項８に記載の液体クロマトグラフ。
【請求項１０】
分析カラムから溶出した成分を誘導体化させるための反応液を送液する反応液送液手段と、
前記溶出した成分を反応液により誘導体化させる反応手段と、
をさらに備えており、
検出手段が反応手段により誘導体化された前記溶出した成分を検出する手段である、
請求項７から９のいずれかに記載の液体クロマトグラフ。
【請求項１１】
試料がリポ蛋白を含む血液試料である、請求項７から１０のいずれかに記載の液体クロマトグラフ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフ用フィルター、その使用方法およびそれを備えた装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
生化学、医学研究、臨床化学の分野、特に臨床検査の分野における分析手段として、液体クロマトグラフがよく用いられる。液体クロマトグラフでは、試料中の各成分の性質が異なることを利用して、試料を分析カラムに供することにより各成分を分離、分析する。このため、試料中に含まれる微粒子などの不純物、ポンプシールのゴミ、溶離液中のゴミなどが分析カラムに入ると分析精度が低下したり、時には分析不能となる。
【０００３】
通常液体クロマトグラフでは、前記不純物などが含まれる可能性を有した試料については、遠心分離やメンブレンフィルターを用いた濾過を行なうことで徹底的に不純物を除去した後、分析を行なう。しかしながら、ヘモグロビンＡ１ｃやリポ蛋白（高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ））などの分析においては、前処理による試料中の不純物の除去操作は煩雑であり、自動化も困難であるので、不純物の除去を行なわず、採取した試料をそのまま測定に供する。例えば、糖尿病の検査項目であるヘモグロビンＡ１ｃは、採血後ＥＤＴＡ２Ｋを加えた血液に界面活性剤を含んだ溶血液で希釈混合して得られた試料をそのまま分析カラムへ導入する。また、リポ蛋白（ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ）の分析では、血清数μＬをそのまま分析カラムに注入する。そして前述した分析精度が低下する問題を防ぐために、試料注入バルブから分析カラムまでの流路の間に焼結フィルター（特許文献１）、または濾紙とメンブレンフィルターと組み合わせたフィルター（特許文献２）を備えている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０００−１３１３０２号公報
【特許文献２】特許第３３２４１６２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】蛋白質・酵素の基礎実験法、南江堂、堀江武一  山下仁平  編、１９８１年、ｐ．２３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前述した分析カラムと試料注入バルブの流路の間に備えるフィルター（焼結フィルター）（特許文献１）または濾紙とメンブレンフィルターを組み合わせたフィルター（特許文献２））は試料中の不純物を除去する能力としては十分使用可能なものであるが、液体クロマトグラフに用いられる分析カラムは一般に高価であるので、不純物を除去する効果がより高いフィルターが求められている。
【０００７】
そこで本発明の課題は、試料中の不純物を除去する効果が従来のフィルターよりも高いフィルター、およびそれを備えた液体クロマトグラフを提供することである。また、本発明は前記フィルターを用いた、試料をさらに精度高く分析するための方法も提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従来、液体クロマトグラフ用フィルターとして、捕獲粒子径（濾過精度）が０．１から２０μｍのステンレスなどの金属の破砕粉体や繊維を材料とした焼結フィルター、または捕獲粒子径（孔径）が０．１から５．０μｍのメンブレンフィルターが多く用いられてきた。しかしながら、ヘモグロビンＡ１ｃやリポ蛋白（ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ）などを分析する際、分析試料として希釈した全血試料や血清試料を用いる場合、試料中に不純物として血餅状のものを含む場合があり、このような粘度の高いゲル状の不純物は焼結フィルターの細孔を急速に詰まらせるという問題点があった。またメンブレンフィルターは、粘度の大小にかかわらず細孔が詰まりやすい性質を有しているため、メンブレンフィルターを使用する際は、測定試料の前処理が必須であった。
【０００９】
前記課題を解決すべく、以前発明者は濾紙とメンブレンフィルターとを組み合わせた液体クロマトグラフ用フィルターを発明している（特許文献２）。前記フィルターを液体クロマトグラフに備えている分析カラムの上流側に設けることで、試料の前処理を行なわなくてもフィルターの目詰まりがしにくくなり、交換頻度を抑えることができた。しかしながら、定期的に（例えば１００測定ごとに）前記フィルターを交換したとしても、徐々に分析カラムが詰まり、交換も余儀なくなる問題は依然として発生した。
【００１０】
通常分析カラムは、充填したゲルが漏れ出さないように捕獲粒子径が充填したゲルの粒子径より細かいステンレス製の焼結フィルターを両端（入口側／出口側）に設けている。また前記フィルターのうち、濾紙はセルロース製であり、メンブレンフィルターは通常セルロースアセテート製、ニトロセルロース製、四フッ化エチレン樹脂製、親水性ポリスルホン樹脂製、親水性ポリプロピレン樹脂製、親水性ナイロン樹脂製であり、いずれも前記分析カラムに設けた焼結フィルターより細かい孔径のものを用いる。濾紙およびメンブレンフィルターの台座としては通常濾過精度が５０から１００μｍ程度のステンレス製金網を用いる。したがって、試料由来の不純物のうち、濾紙およびメンブレンフィルターで捕獲されない程度の小さな不純物（通常、濾紙およびメンブレンフィルターは孔径０．５μｍ程度のものを用いるため、０．５μｍ以下の粒子の不純物を示す）であって、濾紙やメンブレンフィルターの素材に吸着されないが焼結フィルターの素材（ステンレス）に吸着される不純物が、分析カラムの詰まりの原因となっていることが判明した。なお、前記不純物により詰まりが生じた分析カラムは溶離液を流したときの圧力が上昇するが、入口側の焼結フィルターを交換することで、溶離液を流したときの圧力が低下することから、充填剤（ゲル）内部が詰まっているのではないことを確認している。
【００１１】
そこで、前記事実より本発明者が鋭意検討した結果、分析カラムの両端（入口側／出口側）に通常設ける焼結フィルターを、濾紙とメンブレンフィルターとを組み合わせた液体クロマトグラフ用フィルターの台座とすることで、試料中の不純物を除去する効果が高く、かつ分析カラムの詰まりを防止することを見いだし、本発明に至った。
【００１２】
すなわち第一の発明は、
溶離液を送液する溶離液送液手段と、試料を導入する試料導入手段と、導入された試料を分離する分析カラムと、分析カラムから溶出した成分を検出する検出手段と、を備えた液体クロマトグラフで用いる、試料導入手段と分析カラムとの間に備えたフィルターであって、
試料導入手段側から順に、濾紙、１枚以上のメンブレンフィルター、焼結フィルター、を設けた、前記フィルターである。
【００１３】
第二の発明は、フィルターに設けるメンブレンフィルターがそれぞれ異なる孔径を有した２枚以上のメンブレンフィルターであり、かつ試料導入手段側に設けたメンブレンフィルターの有する孔径が分析カラム側に設けたメンブレンフィルターの有する孔径よりも大きい、第一の発明に記載のフィルターである。
【００１４】
第三の発明は、第一または第二の発明に記載のフィルターにタンパク質を含むエージング溶液を導入して処理した、エージング処理フィルターである。
【００１５】
第四の発明は、エージング溶液がさらにカオトロピックイオンを含んでいる、第三の発明に記載のエージング処理フィルターである。
【００１６】
第五の発明は、第一または第二の発明に記載のフィルターにタンパク質を含むエージング溶液を導入して処理する、フィルターのエージング処理方法である。
【００１７】
第六の発明は、エージング溶液がさらにカオトロピックイオンを含んでいる、第五の発明に記載のフィルターのエージング処理方法である。
【００１８】
第七の発明は、
溶離液を送液する溶離液送液手段と、試料を導入する試料導入手段と、導入された試料を分離する分析カラムと、分析カラムから溶出した成分を検出する検出手段と、を備えた液体クロマトグラフであって、
試料導入手段と分析カラムとの間に、試料導入手段側から順に、濾紙、１枚以上のメンブレンフィルター、焼結フィルター、を設けたフィルターを備えた、前記液体クロマトグラフである。
【００１９】
第八の発明は、
タンパク質を含むエージング溶液をフィルターに導入してフィルターをエージング処理するエージング溶液導入手段と、
フィルターを通過した溶液が流れる流路とカラムへ導入する流路または廃液への流路とを切り替え可能な流路切り替え手段と、
をさらに備えた第七の発明に記載の液体クロマトグラフである。
【００２０】
第九の発明は、試料導入手段とエージング溶液導入手段とが一体となった、第八の発明に記載の液体クロマトグラフである。
【００２１】
第十の発明は、
分析カラムから溶出した成分を誘導体化させるための反応液を送液する反応液送液手段と、
前記溶出した成分を反応液により誘導体化させる反応手段と、
をさらに備えており、
検出手段が反応手段により誘導体化された前記溶出した成分を検出する手段である、
第七から第九のいずれかの発明に記載の液体クロマトグラフである。
【００２２】
第十一の発明は、試料がリポ蛋白を含む血液試料である、第七から第十のいずれかの発明に記載の液体クロマトグラフである。
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２４】
本発明のフィルターで用いる濾紙の材料としては、セルロース繊維、ポリエステル繊維、ガラス繊維などが例示できる。濾紙の捕獲粒子径（孔径）は０．１μｍ以上とすると好ましく、０．５μｍ以上とするとより好ましい。また、後述するメンブレンフィルターの捕獲粒子径（孔径）と同じまたはそれより大きくする（例えばメンブレンフィルターの孔径が０．５μｍのときは０．５から１．５μｍとする）と好ましい。
【００２５】
本発明のフィルターで用いるメンブレンフィルターの材料としては、セルロースアセテート、ニトロセルロース、四フッ化エチレン樹脂、セルロール混合エステル、親水性ポリスルホン樹脂、親水性ポリプロピレン樹脂、親水性ナイロン樹脂などが例示できる。なお、メンブレンフィルターは２枚以上設けていると好ましく、さらに、２枚以上設けたメンブレンフィルターがそれぞれ異なる孔径を有しており、かつ液体クロマトグラフに備えた際、試料導入手段側（濾紙に近い側）に設けたメンブレンフィルターの有する孔径を分析カラム側（２枚目以降）に設けたメンブレンフィルターの有する孔径よりも大きくすると、より好ましい。一例として、試料導入手段側（濾紙に近い側）のメンブレンフィルターとして捕獲粒子径（孔径）が５．０μｍ以上のメンブレンフィルターを用いた場合、分析カラム側（２枚目以降）のメンブレンフィルターとして捕獲粒子径（孔径）が５．０μｍ未満のメンブレンフィルターを用いればよい。また、好ましい一態様として、メンブレンフィルターを２枚設け、試料導入手段側（濾紙に近い側）のメンブレンフィルターとして捕獲粒子径（孔径）が７．０から２０μｍのメンブレンフィルターとし、分析カラム側（後述の焼結フィルターに近い側）のメンブレンフィルターとして捕獲粒子径（孔径）が０．１から１．０μｍのメンブレンフィルターとした態様があげられる。なお、メンブレンフィルターを２枚以上設けた場合、試料導入手段側（濾紙に近い側）のメンブレンフィルターを、セルロース繊維、ポリオレフィン繊維、ポリエステル繊維といった繊維材料を用いた不織布タイプのメンブレンフィルターとすると、通常のメンブレンフィルターに比べ目詰まりが生じにくくなる点で好ましい。
【００２６】
本発明のフィルターで用いる焼結フィルターの材料としては、ステンレス、チタンなどが例示できる。なお、本発明のフィルターで用いる焼結フィルターの材料を分析カラム入口側に設けた焼結フィルターと同一の材料とすると、材料の違いによる不純物の吸着の差が生じなくなる点で好ましい。分析カラム入口側に設けた焼結フィルターは通常ステンレス製の粒子を焼結して作成した焼結フィルターを用いるため、この場合は本発明のフィルターで用いる焼結フィルターもステンレス製であると好ましい。本発明のフィルターで用いる焼結フィルターは、試料中の不純物のうち、濾紙およびメンブレンフィルターで除去できなかった細かい粒子の不純物であり、かつ分析カラムの入口側に設けた焼結フィルターの表面に吸着する不純物を除去することを目的とする。そのため、捕獲粒子径（濾過精度）が１００μｍ以下の焼結フィルターを用いると不純物を効率よく吸着できる点で好ましい。
【００２７】
本発明のフィルターの好ましい一態様として、試料導入手段側から順に、
（１）捕獲粒子径（孔径）が０．１μｍ以上の濾紙、
（２）捕獲粒子径（孔径）が５．０μｍ以上のメンブレンフィルター、
（３）捕獲粒子径（孔径）が５．０μｍ未満のメンブレンフィルター、
（４）捕獲粒子径（濾過精度）が１００μｍ以下の焼結フィルター、
を設けたフィルターがあげられる。
【００２８】
本発明のフィルターを液体クロマトグラフで用いる場合、特にフィルターの使い始めにおいて試料中の成分が吸着し回収率が低下する現象が発生する。そのため、特許文献１でも開示されている、タンパク質を含むエージング溶液を予めフィルターに導入することで回収率の低下を防止する、エージング処理（またはブロッキング処理）を行なうと好ましい。前記エージング処理により、フィルター表面の非特異的吸着部分をタンパク質で覆うことで、回収率の低下を防止できる。実際、本発明のフィルターにおいても、濾紙、メンブレンフィルター、焼結フィルターをエージング処理することで、測定開始２回目より良好な分析結果を得られる。なお、前記エージング処理は、濾紙、メンブレンフィルター、焼結フィルターのすべてを処理するのが最も好ましいが、少なくともメンブレンフィルターさえエージング処理すれば、測定開始２回目より良好な分析結果を得られることが判明している（実施例４）。
【００２９】
エージング処理に用いるエージング溶液はタンパク質を含む溶液であればよく、具体的には牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、セリシン、グロブリン、ヘモグロビンなどを含む溶液をエージング溶液として用いてもよいし、測定試料として使用されることの多い血清や血漿をエージング溶液として用いてもよい。なお、前記エージング溶液にさらにカオトロピックイオンが含まれていると、本発明のフィルターのエージング処理の効率を高めることができるため、好ましい。また、タンパク質を含むエージング溶液を少量ずつ複数回に分けてフィルターに導入してエージング処理を行なう場合には、さらに別途カオトロピックイオンを含んだ溶液を導入することで同様な効果が得られる。カオトロピックイオンはタンパク質の高次構造を緩ませる効果がある。そのため、タンパク質の内部の疎水部分が表面に現れやすくなり、フィルター表面の非特異的吸着部分をタンパク質で覆う効率を高めることができる。カオトロピックイオンの強さは、ＣＢｒＣＯＯ−＞ＣＣｌ３ＣＯＯ−＞ＳＣＮ−＝ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ＞Ｉ−＝ＣｌＯ４−＞ＣＨＣｌ２ＣＯＯ−＞ＮＯ３−＝Ｂｒ−＞Ｃｌ−＞ＣＨ３ＣＯＯ−＞Ｆ−＞ＳＯ４２−の順に弱くなることが知られている（非特許文献１）。本発明のフィルターをエージング処理するために用いるエージング溶液に含まれると好ましいカオトロピックイオンは、塩化物イオン（Ｃｌ−）よりカオトロピック効果の高いイオンであり、具体的には、硝酸イオン（ＮＯ３−）、過塩素酸イオン（ＣｌＯ４−）、チオシアン酸イオン（ＳＣＮ−）、グアニジン（ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ）などが例示できる。
【００３０】
本発明のフィルターは、試料中の不純物の種類の多い血清、血漿、全血などの血液検体において特に効果を発揮する。血清や血漿は不純物の種類が多く、特に薬物を投与している患者の検体では不純物の種類がさらに増加する。不純物の種類が増加すると濾紙、メンブレンフィルターで捕獲されない不純物も増加するが、後続の焼結フィルターで吸着除去することができるため、分析カラムの入口側に設けた焼結フィルター表面に不純物が吸着するのを防止することができる。
【００３１】
一般に液体クロマトグラフ用フィルターは、一定の回数（例えば１００検体）測定ごとに交換する必要がある。そこで、濾紙、１枚以上のメンブレンフィルター、焼結フィルター、を設けた本発明のフィルターをフィルターケース５１の中に収容し、前記フィルターケース５１をフィルターハウジング５２に収容する構成（図２）を採用すると、本発明のフィルターを交換する際、フィルターハウジング５２に収容されたフィルターケース５１ごと交換すればよく、交換作業が容易となるため好ましい。
【００３２】
前述したように、本発明のフィルターはタンパク質を含むエージング溶液でエージング処理するとフィルターの性能をより発揮させることができる。しかしながら、エージング処理したフィルターを保存するにはタンパク質を吸着した状態で保存する必要がある。そのため、使用するまでに１日以上期間がある場合は冷蔵保存が好ましいが、冷蔵保存は煩雑である。よって、装置によりエージング処理を自動的に行なえると好ましい。エージング処理を自動的に行なう装置の一例として、図４に示す、タンパク質を含むエージング溶液１０２を自動でフィルター５０に導入可能な導入手段（シリンジ）１０１を設けたエージング溶液導入手段１００があげられる。なお、図４に示すエージング溶液導入手段１００を液体クロマトグラフに備える際、フィルター５０と分析カラム６０との間に流路切り替えバルブ１１２をさらに備えると、フィルター５０を通過したエージング溶液が分析カラム６０に導入されるのを防止できるため好ましい。
【００３３】
図４に示すエージング溶液導入手段１００を備えた液体クロマトグラフにおける、フィルター５０のエージング処理の一例を以下に示す。
（１）切り替えバルブ１１１をエージング溶液導入手段１００とフィルター５０とが接続される位置（ＯＮの位置）に切り替え、切り替えバルブ１１２をフィルター５０から溶出したエージング溶液が分析カラム６０へ導入されない位置（ＯＮの位置）に切り替える。
（２）０．２から１．０％のＢＳＡまたはセリシンを含む溶液（エージング溶液）１から３ｍＬをシリンジ１０１を用いてフィルター５０へ導入し、エージング処理を行なう。
（３）エージング処理後、切り替えバルブ１１１をオートサンプラー４０とフィルター５０とが接続される位置（ＯＦＦの位置）に切り替え、切り替えバルブ１１２をフィルター５０と分析カラム６０とが接続される位置（ＯＦＦの位置）に切り替える。
なお、前記動作は各手段と接続されたパーソナルコンピューターなどの制御手段であらかじめ設定した制御シーケンスに従い自動的に行なうことができる。
【００３４】
また、試料注入量と同じ量のエージング溶液を複数回導入することでエージング操作を行なう場合、またはオートサンプラーでフィルターに導入するエージング溶液の量と試料導入量とを自動的に切り換えられる機能を有している場合は、オートサンプラーとエージング溶液導入手段とを一体化することも可能である（図５）。この場合、オートサンプラー４０とフィルター５０との間に備える切り換えバルブ（図４の１１１）は省略することができる。なお、図４および５における切り替えバルブ１１１・１１２は十分な耐圧性を有するバルブであればよく、三方または六方の回転型モーターバルブを例示することができる。
【００３５】
本発明のフィルターを備えた液体クロマトグラフ装置は、例えば全血、血清、血漿といった血液試料を測定試料としたリポ蛋白分析に用いると特に好ましい。
【発明の効果】
【００３６】
本発明は、
溶離液を送液する溶離液送液手段と、試料を導入する試料導入手段と、導入された試料を分離する分析カラムと、分析カラムから溶出した成分を検出する検出手段と、を備えた液体クロマトグラフで用いる、試料導入手段と分析カラムとの間に備えたフィルターであって、
試料導入手段側から順に、濾紙、１枚以上のメンブレンフィルター、焼結フィルター、を設けていることを特徴としている。本発明のフィルターにより、試料中の不純物を効果的に除去することができる。また、下流側に備えた分析カラムの入口側に通常設ける焼結フィルターの詰まりを防止することができるため、分析カラムの寿命を向上させることができる。特に試料が全血、血清、血漿といった血液試料の場合は、粘度の高いゲル状の不純物など従来のフィルターでは吸着除去できない、またはフィルターを詰まらせる不純物が多く含まれているが、本発明のフィルターにより前記不純物も吸着除去できるため、本発明のフィルターを用いることによる効果が大きい。
【００３７】
なお、本発明のフィルターは、試料を測定する前に、あらかじめタンパク質を含むエージング溶液を導入するエージング操作を行なうと、フィルターの各構成要素の表面にある非特異的吸着部分をタンパク質で覆うことができるため、測定開始直後から精度高い測定を実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】実施例１から５で用いた液体クロマトグラフの概要図。
【図２】本発明のフィルターの概要図。
【図３】実施例４において、実験１のエージング処理を行なったときの測定５回目の測定結果（クロマトグラム）。
【図４】本発明のフィルターおよびエージング溶液導入手段を備えた液体クロマトグラフの一態様を示す図。
【図５】本発明のフィルターおよびエージング溶液導入手段を備えた液体クロマトグラフの別の態様を示す図。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４０】
実施例１
図１に示すリポ蛋白分析装置を用いて評価を行なった。溶離液１１は１ｍＭのＥＤＴＡ２Ｎａを含んだ２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６５）を、溶離液１２は１ｍＭのＥＤＴＡ２Ｎａと５００ｍＭの過塩素酸ナトリウムを含んだ２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６５）を、分析カラム６０は東ソー株式会社製陰イオン交換カラム（ＴＳＫｇｅｌ  ＤＥＡＥ−ＮＰＲ）を、反応液７０はセロテック社製コレステロール酵素反応液（ＴＣＨＯ−Ｌ）を、それぞれ用いた。分析カラム６０から溶出したリポ蛋白は反応液７０と混合後、４５℃に維持されたリアクター８０内のポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）配管を通過することで反応し、反応した成分を検出器（可視吸光度計）９０（測定波長：６００ｎｍ）で検出する。
【００４１】
以降の実施例で用いたフィルター５０の構造について、下記条件４を例にして詳細に説明する（図２）。フィルター５０はフィルターケース５１とフィルターハウジング５２とから構成される。フィルターケース５１には、フィルターケース入口５１ａとフィルターケース出口５１ｂの間に、入口５１ａ側から、濾紙５１ｃ、メンブレンフィルター５１ｄ・５１ｅ、焼結フィルター５１ｇを設けている。またフィルターケース５１には、メンブレンフィルター５１ｄ・５１ｅと焼結フィルター５１ｇとの間にパッキン５１ｆを設置することにより、メンブレンフィルター５１ｄ・５１ｅに目詰まりが生じてきた場合であっても試料中の粒子状の不純物が横漏れするのを防止することができる。なお、フィルターケース入口５１ａ、フィルターケース出口５１ｂおよびパッキン５１ｆは、ＰＴＦＥなどのポリマー製の成形品が好ましい。なお実施例で使用したパッキン５１ｆの形状は外径が１１ｍｍで内径が９ｍｍとしたので、フィルター有効径は９ｍｍ径となる。
【００４２】
フィルターケース５１はフィルターハウジング５２内に収容される。フィルターハウジング５２はステンレスなどの金属製の成形品が好ましい。フィルターハウジング入口５２ａとフィルターハウジング出口５２ｂの間に濾紙、メンブレンフィルター、焼結フィルターを収容したフィルターケース５１を収容する。フィルターハウジング入口５２ａをあらかじめ装置に固定しておけば、フィルターハウジング締付用ノブ５２ｄを回すことで、フィルターケース押さえ５２ｃにより、フィルターケース５２は固定される。図１に示すリポ蛋白分析装置用フィルター５０として用いる場合は、オートサンプラー４０からの配管とフィルターハウジング入口５２ａとを接続し、分析カラム６０への配管とフィルターケース押さえ５２ｃとを接続して用いる。図２に示すフィルター５０は、あらかじめ濾紙、メンブレンフィルター、焼結フィルターを収容したフィルターケース５１ごと交換することで、容易にフィルター交換が可能である。
【００４３】
以降の実施例で使用したフィルターの条件を以下に示す。
（条件１）
濾紙５１ｃ：
保留粒子径０．８μｍ、Ｎｏ．１６５０濾紙、アドバンテック東洋製
メンブレンフィルター５１ｄ：
孔径０．４５μｍ、セルロース混合エステルフィルター、アドバンテック東洋製
金属網５１ｇ：
濾過精度６０μｍ、ステンレス金網、日本精線製
（条件２）
濾紙５１ｃ：
保留粒子径０．８μｍ、Ｎｏ．１６５０濾紙、アドバンテック東洋製
メンブレンフィルター５１ｄ：
孔径０．４５μｍ、セルロース混合エステルフィルター、アドバンテック東洋製
焼結フィルター５１ｇ：
濾過精度１０μｍ、ステンレス繊維焼結タイプフィルター、日本精線製
（条件３）
濾紙５１ｃ：
保留粒子径０．８μｍ、Ｎｏ．１６５０濾紙、アドバンテック東洋製
メンブレンフィルター５１ｄ：
保留粒子径１０μｍ、ポリエステル繊維フィルター、アドバンテック東洋製
メンブレンフィルター５１ｅ：
孔径０．４５μｍ、セルロース混合エステルフィルター、アドバンテック東洋製
金属網５１ｇ：
濾過精度６０μｍ、ステンレス金網、日本精線製
（条件４）
濾紙５１ｃ：
保留粒子径０．８μｍ、Ｎｏ．１６５０濾紙、アドバンテック東洋製
メンブレンフィルター５１ｄ：
保留粒子径１０μｍ、ポリエステル繊維フィルター、アドバンテック東洋製
メンブレンフィルター５１ｅ：
孔径０．４５μｍ、セルロース混合エステルフィルター、アドバンテック東洋製
焼結フィルター５１ｇ：
濾過精度１０μｍ、ステンレス繊維焼結タイプフィルター、日本精線製
オートサンプラー４０から血清を１５μＬ／回で５分ごとに注入し、フィルター５０の圧力を観察した。なお、溶離液の送液条件は溶離液１１が１００％で流速は０．５ｍＬ／ｍｉｎである。また、フィルター５０の条件は前記条件２および条件４とした。
【００４４】
表１に結果を示す。初期圧力からの差圧（かっこ内の数値）を見ると、条件２に比べて、条件４では圧力上昇が小さいことがわかる。このことから、メンブレンフィルターとして、捕獲粒子径（孔径）が５μｍ以上のメンブレンフィルターと捕獲粒子径（孔径）が５μｍ未満のメンブレンフィルターとを組み合わせて使用すると、フィルターの詰まりが生じにくくなり、圧力上昇が抑えられるため、フィルターの交換回数を減少させることができる点で好ましいといえる。
【００４５】
【表１】
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【００４６】
実施例２
フィルター５０の条件を前述の条件１から４のいずれかとし、溶離液の送液条件を溶離液１１が７５％で溶離液１２が２５％とし、溶離液１１と溶離液１２との合計流量を０．５ｍＬ／ｍｉｎとした他は、実施例１と同様な方法で評価を行なった。結果を表２に示す。初期圧力からの圧力の差圧（かっこ内の数値）を見ると、条件１に比べて条件３が、条件２に比べて条件４が、それぞれ圧力上昇が小さいことがわかる。このことから、メンブレンフィルターとして、捕獲粒子径（孔径）が５μｍ以上のメンブレンフィルターと捕獲粒子径（孔径）が５μｍ未満のメンブレンフィルターとを組み合わせて使用すると、フォルターの詰まりが生じにくくなり、圧力上昇が抑えられるため、フィルターの交換回数を減少させることができる点で好ましいといえる。
【００４７】
【表２】
0005521218.tif 000003
【００４８】
なお、溶離液１１を１００％で送液した場合（実施例１、表１）と比べて、溶離液１１を７５％で溶離液１２を２５％で送液した場合（本実施例、表２）は圧力の上昇が軽度である。これは血清中に含まれる種々の凝集塊が溶離液１２に含まれる過塩素酸イオンにより、ある程度分散され粒子系が小型化したことによると推測される。また、初期圧力からの差圧について最も分析カラム６０に近い側に金属網を設けた場合（条件１および３）と焼結フィルターを設けた場合（条件２および４）とで比較すると、焼結フィルターの方が詰まりが生じにくいことがわかる。
【００４９】
実施例３
図１に示すリポ蛋白分析装置を用いて評価を行なった。オートサンプラー４０から血清を１５μＬ／回で５分ごとに８回注入し、その後フィルター５０を新しいものに交換してからカラムの圧力を観察した。溶離液の送液条件は、溶離液１１が７５％で溶離液１２が２５％であり、溶離液１１と溶離液１２との合計流量は０．５ｍＬ／ｍｉｎである。フィルター５０の条件は前述の条件１から４のいずれかであり、フィルター５０内のパッキン（図２の５１ｆ）はフィルター有効径が９ｍｍ径となるものを使用した。また、ステンレス鋼の破砕粉末の粒子を焼結して作成した焼結フィルター（濾過精度１μｍ）を分析カラム６０の両端（入口側／出口側）に設けている。
【００５０】
表３に結果を示す。初期圧力からの差圧（かっこ内の数値）を比べると、条件１に比べて条件３が、条件２に比べて条件４が、それぞれ圧力上昇が小さいことがわかる。このことから、フィルターケース出口（図２の５１ｂ）側で用いるフィルター（図２の５１ｇ）として、分析カラムの入口に設ける焼結フィルターと同じ素材であるステンレス製の焼結フィルターを採用することで、分析カラムの詰まりを生じにくくし、カラムの圧力上昇を防止することができる。
【００５１】
【表３】
0005521218.tif 000004
【００５２】
実施例４
図１に示すリポ蛋白分析装置を用いて評価を行なった。分析を実施する前に、フィルター５０中の濾紙５１ｃ、メンブレンフィルター５１ｄ・５１ｅ、焼結フィルター５１ｇの全部または一部をエージング処理を行なった後、血清試料を５回連続測定した。エージング処理は、０．５％のＢＳＡ溶液（純水による溶解液）をシリンジで２．０ｍＬ導入することで実施した。本実施例の測定条件を以下に示す。
（測定条件）
フィルター５０（前述の条件４）：
濾紙５１ｃ：
保留粒子径０．８μｍ、Ｎｏ．１６５０濾紙、アドバンテック東洋製
メンブレンフィルター５１ｄ：
保留粒子径１０μｍ、ポリエステル繊維フィルター、アドバンテック東洋製
メンブレンフィルター５１ｅ：
孔径０．４５μｍ、セルロース混合エステルフィルター、アドバンテック東洋製
焼結フィルター５１ｇ：
濾過精度１０μｍ、ステンレス繊維焼結タイプフィルター、日本精線製
溶離液１１：
１ｍＭのＥＤＴＡ２Ｎａを含んだ２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６５）
溶離液１２：
１ｍＭのＥＤＴＡ２Ｎａと５００ｍＭの過塩素酸ナトリウムを含んだ２０ｍＭトリ
ス緩衝液（ｐＨ７．６５）
ポンプ２１・２２・２３：ＤＰ−８０２０（東ソー株式会社製）
ポンプ２１・２２の流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
ポンプ２１・２２のグラジエント条件
０から２．０ｍｉｎ  溶離液１１：溶離液１２＝８２．８：１７．２
２．０から４．０ｍｉｎ  溶離液１１：溶離液１２＝７８．２：２１．８
４．０から５．５ｍｉｎ  溶離液１１：溶離液１２＝７６．４：２３．６
５．５から７．０ｍｉｎ  溶離液１１：溶離液１２＝６７．４：３２．６
７．０から８．０ｍｉｎ  溶離液１１：溶離液１２＝０．０：１００．０
８．０から１０．０ｍｉｎ  溶離液１１：溶離液１２＝９０．０：１０．０
ポンプ２３の流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
測定時間：１０分／テスト
ミキサー３０：ミキサーＣ（東ソー株式会社製）
オートサンプラー４０：ＡＳ−８０２０（東ソー株式会社製）
試料注入量：２．０μＬ（血清）／テスト
分析カラム（陰イオン交換カラム）６０：
ＴＳＫｇｅｌ  ＤＥＡＥ−ＮＰＲ（カラムサイズ  内径３．０ｍｍＩＤ  長さ１５
ｍｍ、東ソー株式会社製）
反応液（コレステロール酵素反応液）７０：ＴＣＨＯ−Ｌ（セロテック社製）
リアクター８０：内径０．２５ｍｍ×長さ３０ｍのＰＴＦＥ配管
リアクター８０温度：４５℃
検出器（可視吸光度計）９０：ＵＶ−８０２０（東ソー株式会社製）
検出器９０の検出波長：６００ｎｍ
試料の回収率として、測定５回目の各リポ蛋白の測定結果（各リポ蛋白のピーク面積の総和）を１００％としたときの、測定１回目から４回目までの面積（％）を算出した。結果を表４に示す。また、図３に実験１のエージング処理を行なったときの測定５回目の測定結果のクロマトグラムを示す。なお、本実施例で用いた血清の総コレステロールは、１７７ｍｇ／ｄＬである。
【００５３】
【表４】
0005521218.tif 000005
【００５４】
フィルター５０中の全ての構成要素をエージング処理した場合（実験１）は、測定１回目から９７％の回収率を得ており、測定当初から良好な測定を実現している。濾紙５１ｃのみをエージング処理した場合（実験２）は、測定２回目から９４％と良好な回収率を得ているが、当該結果は濾紙５１ｃに含まれたエージング液が測定開始時にメンブレンフィルターにエージング効果をもたらしたと考えられるため、当該結果の再現性は高くないことが予想される。メンブレンフィルター５１ｄのみをエージング処理した場合（実験３）には、測定１回目から９０％と良好な回収率を得ている。メンブレンフィルター５１ｅのみをエージング処理した場合（実験４）には、測定１回目は６５％とやや低い回収率であったが、測定２回目では８０％、測定３回目では８７％と回収率が向上した。焼結フィルター５１ｇのみをエージング処理した場合（実験５）には、測定２回目では９２％と高い回収率を示したものの、測定１回目では４８％と極めて低い回収率であった。実験２から５の結果をまとめると、フィルター５０の各構成要素のみをエージング処理する場合は、濾紙５１ｃまたはメンブレンフィルター５１ｄをエージング処理すれば、安定な測定が実施できることがわかる。
【００５５】
メンブレンフィルター５１ｄ・５１ｅをエージング処理した場合（実験６）は、測定１回目では６１％とやや低い回収率であったが、測定２回目では８７％と概ね良好な回収率を示した。濾紙５１ｃおよびメンブレンフィルター５１ｄ・５１ｅをエージング処理した場合（実験７）は、測定１回目では７０％とやや低い回収率であったが、測定２回目では９４％と良好な回収率を示した。何もエージング処理しなかった場合（実験８）は、測定１回目および２回目ではピークが検出されず、測定３回目で７８％、測定４回目では９２％と回収率は向上した。
【００５６】
実験１から８の結果をまとめると、安定な測定を実施するためには、フィルター５０の各構成要素のうち少なくともメンブレンフィルター５１ｄ・５１ｅをエージング処理すると好ましく、フィルター５０中の全ての構成要素をエージング処理すると最も好ましいことがわかる。
【００５７】
実施例４
図１に示すリポ蛋白分析装置を用いて評価を行なった。測定条件は実施例３と同じである。分析を実施する前に、フィルター５０中の全ての構成要素（濾紙５１ｃ、メンブレンフィルター５１ｄ・５１ｅ、焼結フィルター５１ｆ）について、下記に示すエージング溶液をシリンジで１．０ｍＬ導入することでフィルター５０をエージング処理した。
（エージング溶液）
溶液１：０．５％のＢＳＡを含む２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）
溶液２：０．５％のＢＳＡと２５０ｍＭの過塩素酸ナトリウムを含む２０ｍＭトリス
緩衝液（ｐＨ７．５）
溶液３：０．５％のＢＳＡと５００ｍＭの過塩素酸ナトリウムを含む２０ｍＭトリス
緩衝液（ｐＨ７．５）
溶液４：０．５％のＢＳＡと２５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス緩衝
液（ｐＨ７．５）
溶液５：０．５％のＢＳＡと２５０ｍＭの硝酸アンモニウムを含む２０ｍＭトリス緩
衝液（ｐＨ７．５）
溶液６：０．５％のＢＳＡと１５０ｍＭのチオシアン酸カリウムを含む２０ｍＭトリ
ス緩衝液（ｐＨ７．５）
溶液７：０．５％のＢＳＡと１００ｍＭのグアニジン塩酸を含む２０ｍＭトリス緩衝
液（ｐＨ７．５）
溶液８：０．５％セリシン水溶液
溶液９：０．５％のセリシンを含む２５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム水溶液
血清試料を５回連続測定後、測定試料の回収率として、測定５回目の各リポ蛋白の測定結果（各リポ蛋白のピーク面積の総和）を１００％としたときの測定１回目から４回目までの面積（％）を算出した。結果を表５に示す。
【００５８】
【表５】
0005521218.tif 000006
【００５９】
エージング溶液に過塩素酸ナトリウムを含まない場合（溶液１および８）と過塩素酸ナトリウムを含む場合（溶液２、３および９）とで、測定１回目および２回目の回収率を比較したところ過塩素酸ナトリウムを含む場合のほうが回収率が向上していた。当該結果より、エージング溶液に過塩素酸ナトリウムを含んでいると、エージング処理の効果が高まることがわかる。
【００６０】
溶液４から７はエージング溶液に含まれる塩類を検討したものである。エージング溶液に塩化ナトリウムを含む場合（溶液４）での測定１回目および２回目の回収率は、エージング溶液に硝酸アンモニウム（溶液５）、チオシアン酸カリウム（溶液６）またはグアニジン塩酸（溶液７）を含む場合と比較し、若干低い回収率となった。塩化ナトリウムを溶解したときに含まれる塩化物イオンは、本実施例で使用した塩類に含まれる陰イオンの中で一番カオトロピック効果が低い。以上より、エージング溶液に塩化物イオンよりカオトロピック効果の高いカオトロピックイオンが含まれていると、エージング処理の効果をより高めることができることがわかる。
【００６１】
実施例５
図１に示すリポ蛋白分析装置を用いて評価を行なった。測定条件は実施例３と同じである。分析を実施する前に、フィルター５０中の全ての構成要素（濾紙５１ｃ、メンブレンフィルター５１ｄ・５１ｅ、焼結フィルター５１ｆ）について、下記に示すエージング溶液をシリンジで２．０ｍＬ導入することでフィルター５０をエージング処理した。
（エージング溶液）
溶液１０：０．５％のＢＳＡを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）
溶液１１：０．５％のＢＳＡを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）
溶液１２：０．５％のＢＳＡを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）
溶液１３：０．５％のＢＳＡを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
溶液１４：０．５％のＢＳＡを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）
溶液１５：０．５％のＢＳＡを含む２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．５）
溶液１６：０．５％のＢＳＡを含む２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ９．５）
溶液１７：０．５％のセリシンを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）
溶液１８：０．５％のセリシンを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）
溶液１９：０．５％のセリシンを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）
血清試料を５回連続測定後、測定試料の回収率として、測定５回目の各リポ蛋白の測定結果（各リポ蛋白のピーク面積の総和）を１００％としたときの測定１回目から４回目までの面積（％）を算出した。結果を表６に示す。
【００６２】
【表６】
0005521218.tif 000007
【００６３】
エージング溶液中のタンパク質として０．５％のＢＳＡを用いた場合において、溶液中のｐＨを変動させた（溶液１０から１６）ところ、ｐＨ５．５（溶液１０）では、測定１回目および２回目ともにピークが確認されなかったが、その他のｐＨ（溶液１１から１６）では、測定２回目で８０％以上の回収率が、測定３回目で９０％以上の回収率が、それぞれ確認された。
【００６４】
エージング溶液中のタンパク質として０．５％のセリシンを用いた場合における、溶液中のｐＨを変動させた結果（溶液１７から１９）を比較したところ、ｐＨ５．５（溶液１７）では、測定１回目でピークの確認ができなかったが、その他のｐＨ（溶液１８から１９）では、測定１回目で８０％以上の回収率が確認された。
【００６５】
以上をまとめると、エージング溶液のｐＨを６．０から９．５とすると、安定な測定が実施できる点で好ましいといえる。
【００６６】
実施例６
図５に示すリポ蛋白分析装置を用いて評価を行なった。測定条件は実施例３と同じである。図５の装置はオートサンプラーとエージング溶液導入手段とが一体となった態様となっている。下記に示すエージング処理を自動的に実施した後に血清試料中のリポ蛋白分析を連続５回実施した。
（エージング処理方法）
実験Ａ：
フィルター５０と分析カラム６０との間の流路切り換えバルブ１１２をＯＮとする
ことで、エージング処理に伴いフィルター５０から溶出したエージング溶液がカラ
ムに導入されないようにした状態で、溶離液１１を流しながらエージング溶液
１０２（血清：５００ｍＭ過塩素酸ナトリウム溶液＝１：１）２μＬをオートサン
プラー４０より１．５分間隔で８回フィルター５０に導入することにより、エージ
ング処理を実施した。エージング処理後流路切り換えバルブ１１２をＯＦＦにし、
連続５回分析した。
【００６７】
実験Ｂ：
フィルター５０と分析カラム６０との間の流路切り換えバルブ１１２をＯＮとする
ことで、エージング処理に伴いフィルター５０から溶出したエージング溶液がカラ
ムに導入されないようにした状態で、溶離液１１を流しながらエージング溶液
１０２（血清）２μＬをオートサンプラー４０より１．５分間隔で６回フィルター
５０に導入することにより、エージング処理を実施した。エージング処理後、流路
切り換えバルブ１１２をＯＦＦにし、連続５回分析した。
【００６８】
実験Ｃ：
フィルター５０と分析カラム６０との間の流路切り換えバルブ１１２をＯＮとする
ことで、エージング処理に伴いフィルター５０から溶出したエージング溶液がカラ
ムに導入されないようにした状態で、溶離液１２を流しながらエージング溶液
１０２（血清）２μＬをオートサンプラー４０より１．５分間隔で６回フィルター
５０に導入することにより、エージング処理を実施した。エージング処理後、流路
切り換えバルブ１１２をＯＦＦにし、連続５回分析した。
【００６９】
測定試料の回収率として、測定５回目の各リポ蛋白の測定結果（各リポ蛋白のピーク面積の総和）を１００％としたときの測定１回目から４回目までの面積（％）を算出した。結果を表７に示す。
【００７０】
【表７】
0005521218.tif 000008
【００７１】
実験ＡからＣに示す、いずれのエージング処理方法であっても、その後の測定において、測定２回目から９０％以上と良好な回収率を示した。特に、過塩素酸ナトリウム５００ｍＭ含んだ溶離液１２を流しながらエージング処理を行なった実験Ｃでは、測定２回目での回収率が９９％と良好な結果を示した。
【００７２】
以上より、図５に示す装置を用いることで、エージング処理時にフィルター５０から溶出されるエージング溶液による分析カラム６０へのダメージを防止しつつ、フィルター５０が自動的にエージング処理することができる。
【符号の説明】
【００７３】
１１、１２：溶離液
２１、２２、２３：ポンプ
３０：ミキサー
４０：オートサンプラー
４１：洗浄液
４２、１０１：シリンジ
４３：サンプルループ
４４、１１１、１１２：六方バルブ
４５：ニードル
４６：試料
４７、１０３：３方バルブ
５０：フィルター
５１：フィルターケース
５１ａ：フィルターケース入口
５１ｂ：フィルターケース出口
５１ｃ：濾紙
５１ｄ、５１ｅ：メンブレンフィルター
５１ｆ：パッキン
５１ｇ：金属網または焼結フィルター
５２：フィルターハウジング
５２ａ：フィルターハウジング入口
５２ｂ：フィルターハウジング出口
５２ｃ：フィルターケース押さえ
５２ｄ：フィルターハウジング締付用ノブ
６０：分析カラム
７０：反応液
８０：リアクター
９０：検出器
１００：エージング溶液導入手段
１０２：エージング溶液
【図１】
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【図２】
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【図３】
0005521218.tif 000011
【図４】
0005521218.tif 000012
【図５】
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