(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞から核酸を回収する核酸試料の製造方法であって、
下記（Ａ）〜（Ｅ）工程を含むことを特徴とする製造方法。
（Ａ）溶媒中で、前記細胞を含む細胞試料について、前記細胞から核酸複合体を放出させる工程であり、前記溶媒が水性溶媒である、工程
（Ｂ）前記（Ａ）工程後の前記細胞試料を含む処理液と、担体とを接触させる工程であり、前記担体が、不織布以外の担体である、工程
（Ｃ）前記担体と前記処理液とを分離する工程
（Ｄ）前記担体に、９０〜１００℃で１〜５分間の加熱処理を施す工程
（Ｅ）前記（Ｄ）工程の前または後、前記担体に分散媒を添加する工程であり、前記分散媒が水性溶媒である、工程
【請求項２】
前記（Ａ）工程が、プロテアーゼおよび界面活性剤を含む処理試薬と、前記細胞試料とを混合する工程であり、
前記処理試薬と前記細胞試料とを混合した処理液において、前記プロテアーゼの濃度が０．５ｍＵ／μＬ以上であり、界面活性剤の濃度が、０．１体積％以上である、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記処理液において、前記プロテアーゼの濃度が０．５〜１０００ｍＵ／μＬであり、前記界面活性剤の濃度が、０．１〜２０体積％である、請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
前記処理液において、前記細胞１×１０２〜１×１０９個に対する前記プロテアーゼの割合が、０．０２ｍＵ以上であり、前記細胞１×１０２〜１×１０９個に対する前記界面活性剤の割合が、１フェムトモル（１×１０-１５モル）以上である、請求項２または３記載の製造方法。
【請求項５】
前記処理液において、前記細胞試料５０μＬに対する前記プロテアーゼの割合が、０．０２ｍＵ以上であり、前記細胞試料５０μＬに対する前記界面活性剤の割合が、１フェムトモル以上である、請求項２から４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記プロテアーゼが、プロテイナーゼＫ、キモトリプシン、ペプシン、カテプシンＤおよびパパインからなる群から選択された少なくとも一つのプロテアーゼである、請求項２から５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、請求項２から６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項８】
前記非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン−ｐ−イソオクチルフェノール、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウリル酸、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、および、ノニルフェノールポリチオエトキシレートからなる群から選択された少なくとも一つの界面活性剤である、請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
前記処理試薬が、さらに、キレート剤およびタンパク質変性剤の少なくとも一方を含む、請求項２から８のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記細胞が、真核細胞であり、
前記（Ａ）工程が、界面活性剤無添加であり且つプロテアーゼを含む処理試薬と、凍結融解後または冷蔵保存後の前記細胞試料とを混合する工程である、請求項１記載の製造方法。
【請求項１１】
前記細胞が、血中細胞、唾液中細胞、口腔粘膜細胞、体細胞、生殖細胞および腫瘍細胞からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記細胞が、培養細胞である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記細胞試料が、血液、唾液、口腔粘膜、爪および毛髪からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記細胞試料が、細胞の培養物である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記細胞試料が、未希釈の細胞試料である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１６】
前記細胞が、原核細胞であり、
前記（Ａ）工程が、前記原核細胞を含む細胞試料を、凍結融解または冷蔵保存する工程である、請求項１記載の製造方法。
【請求項１７】
前記（Ａ）工程において、プロテアーゼ無添加であり且つ界面活性剤を含む処理試薬または界面活性剤無添加であり且つプロテアーゼを含む処理試薬と、凍結融解後または冷蔵保存後の前記細胞試料とを混合する工程である、請求項１６記載の製造方法。
【請求項１８】
前記担体が、織布および多孔質体の少なくとも一方である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１９】
前記担体が、多孔質体であり、その平均孔径が、１０〜１０００μｍである、請求項１から１８のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項２０】
前記担体が、織布であり、そのメッシュサイズが、１０〜１０００μｍである、請求項１から１８のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項２１】
前記担体の形状が、フィルター状、シート状、ブロック状およびビーズ状からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１から２０のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項２２】
前記担体が、ビーズであり、体積充填率が、０．１〜１０％の範囲である、請求項２１記載の製造方法。
【請求項２３】
前記担体が、ポリマー製担体および金属製担体の少なくとも一方である、請求項１から２２のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項２４】
前記ポリマーが、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリエーテル、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルおよびポリテトラフルオロエチレンからなる群から選択された少なくとも一つのポリマーである、請求項２３記載の製造方法。
【請求項２５】
前記金属が、ステンレス、チタンおよびアルミニウムからなる群から選択された少なくとも一つである、請求項２３記載の製造方法。
【請求項２６】
前記（Ｄ）工程における加熱温度が、９５〜９６℃である、請求項１から２５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項２７】
前記核酸が、ＤＮＡおよびＲＮＡの少なくとも一方である、請求項１から２６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項２８】
前記ＤＮＡが、ゲノムＤＮＡおよびミトコンドリアＤＮＡの少なくとも一方である、請求項２７記載の製造方法。
【請求項２９】
前記分散媒のｐＨが、７．８〜９．５である、請求項１から２８のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項３０】
核酸増幅方法により、目的配列の核酸増幅物を製造する方法であって、
下記（ａ）および（ｂ）工程を含むことを特徴とする核酸増幅物の製造方法。
（ａ）請求項１から２９のいずれか一項に記載の核酸試料の製造方法により、細胞を含む細胞試料から核酸試料を回収する工程
（ｂ）前記（ａ）工程で回収した前記核酸試料中の核酸を鋳型として、核酸増幅方法により、前記鋳型における目的配列の核酸増幅物を製造する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を含む細胞試料から核酸を回収して核酸試料を製造する方法、および、それを用いた核酸増幅物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療分野において、感染症および遺伝子疾患等を遺伝子レベルで診断する方法として、患者から採取したＤＮＡ等の核酸を鋳型として核酸増幅を行い、特定の変異または一塩基多型（ＳＮＰ）を解析する方法が広く実施されている。核酸は、通常、患者の全血から回収されるが、全血には、赤血球や血漿等の様々な成分が含まれ、中には、多量に残存すると、後の増幅反応に影響を及ぼす成分も存在する。また、核酸は、一般に白血球に含まれるが、核酸を放出した後の白血球の残骸も、後の増幅反応に影響を及ぼす可能性がある。このため、患者の血液試料から鋳型となる核酸を回収するにあたっては、白血球から核酸を放出させて、且つ、不要な成分をある程度除去することが必要とされている。【０００３】
また、近年、遺伝子の解析装置およびそれに用いるチップ等のツールの小型化が求められている。そして、それに応じて、少量の全血から効率よく鋳型となる核酸を回収することも必要となってきている。このように、不要な成分の除去および少量の生体試料からの核酸の高効率回収が求められることから、以下のような方法が開示されている。【０００４】
まず、第１の方法として、高濃度のカオトロピック塩の存在下で、核酸をシリカ粒子に結合させる方法があげられる（特許文献１）。この方法によれば、核酸がシリカ粒子に結合するため、核酸とシリカ粒子との複合体を液体画分と分離することで、核酸を回収できる。しかし、カオトロピック塩は、腐食性を有する変性剤であり、人体および環境への影響が問題視されている。また、カオトロピック塩は、核酸とシリカ粒子との結合に必須であるが、ＤＮＡポリメラーゼおよび制限酵素等の多くの酵素の反応を阻害するため、エタノール等の核酸不溶性の有機溶媒による洗浄が必要である。しかし、エタノール等の有機溶媒も、種々の酵素反応を阻害するため、例えば、乾燥によって完全に除去することが必要であり、操作が煩雑という問題がある。また、前記有機溶媒は、通常、揮発性であることから、取り扱いも困難である。さらに、この方法では、核酸を回収するための担体が、シリカおよびその誘導体の粒子に限定され、また、試薬も、カオトロピック塩を含む特殊な試薬に限定される。このため、これら以外の担体や試薬で代用できず、コストおよび調製に手間がかかるという問題がある。【０００５】
第２の方法は、生体試料を、界面活性剤の存在下、ビーズ状支持体に接触させることで、前記生体試料中のＤＮＡを前記支持体に結合させ、回収する方法である（特許文献２）。この方法では、ＤＮＡは、ゲル状のＤＮＡ−ビーズ複合体として回収できる。しかしながら、この方法では、生体試料から十分量のＤＮＡを放出させるため、多量の細胞懸濁液を界面活性剤で処理する必要があり、結果的に、サンプル量が多くなり、効率よくビーズと接触できないおそれがある。このため、あらかじめ、遠心ろ過等により細胞を濃縮する、あるいは、不要な細胞や物質を除去してから必要な細胞を濃縮する等の前処理が生じ、操作が煩雑となる。また、この複合体は、ピペッティングおよびボルテックス混合等の操作で簡単に破壊され、ＤＮＡの収量が著しく減少するという問題がある。このため、ゆるやかに操作したり、または、磁性ビーズを使用し、ＤＮＡが結合した磁性ビーズを磁石によって回収することで、液相から分離する必要がある。【０００６】
第３の方法は、細胞抽出液を不織布に接触させることで、前記細胞抽出液中の核酸を不織布に吸着させる方法である（特許文献３）。しかしながら、この方法によると、核酸を不織布に吸着させるために、前記細胞抽出液を高塩濃度条件にする必要がある。このため、得られた核酸を核酸増幅に使用する場合、例えば、塩による影響を回避するために、予め、塩を除去する必要があり、操作が煩雑である。また、核酸は不織布に非常に強固に付着するため、不織布からのＤＮＡの溶出が困難である。このため、溶出は、極めて過酷な環境下での処理、例えば、ｐＨ１２のような強アルカリ条件下での長時間加熱処理、その他にも、活性酸素での処理等が必要となる。このような方法では、操作が煩雑であるだけでなく、溶出によって核酸に損傷が生じる可能性が極めて高いと考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第２６８０４６２号公報
【特許文献２】特許第３７８７３５４号公報
【特許文献３】国際公開第０３／００６６５０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明は、従来のように、例えば、危険性の高いカオトロピック塩等を大量に使用する必要がなく、特殊な担体に制限されず、安全性に優れ、簡便な核酸試料の製造方法およびそれを用いた核酸増幅物の製造方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の核酸試料の製造方法は、細胞から核酸を回収する核酸試料の製造方法であって、下記（Ａ）〜（Ｅ）工程を含むことを特徴とする。
（Ａ）前記細胞を含む細胞試料について、前記細胞から核酸複合体を放出させる工程
（Ｂ）前記（Ａ）工程後の前記細胞試料を含む処理液と、担体とを接触させる工程
（Ｃ）前記担体と前記処理液とを分離する工程
（Ｄ）前記担体に加熱処理を施す工程
（Ｅ）前記（Ｄ）工程の前または後、前記担体に分散媒を添加する工程【００１０】
本発明の核酸増幅物の製造方法は、核酸増幅方法により、目的配列の核酸増幅物を製造する方法であって、下記（ａ）および（ｂ）工程を含むことを特徴とする。
（ａ）本発明の核酸試料の製造方法により、細胞を含む細胞試料から核酸試料を回収する工程
（ｂ）前記（ａ）工程で回収した前記核酸試料中の核酸を鋳型として、核酸増幅方法により、前記鋳型核酸における目的配列の核酸増幅物を製造する工程
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、細胞から核酸複合体を放出させることにより、優れた効率で核酸を回収できる。このため、例えば、ゲノムＤＮＡやＲＮＡ以外に、ミトコンドリアＤＮＡの回収も可能である。また、前記細胞からの核酸複合体の放出は、例えば、特殊な試薬を使用することなく行えるため、安全性や操作性にも優れる。このように、本発明は、安全性ならびに操作性に優れ、且つ、回収率に優れることから、例えば、少量の細胞や少量の細胞試料からでも、核酸増幅等に必要な鋳型となる核酸を、十分量回収できる。さらに、このように少量の細胞や少量の細胞試料からの回収を、簡便な操作で効率良く行えることから、例えば、近年注目されているマイクロチップおよびマイクロタス等を用いた核酸回収ならびに核酸増幅にも有用といえる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明における核酸回収用ピペットチップの一例を示す断面図である。
【図２】図２（Ａ）〜（Ｄ）は、本発明における核酸回収用ピペットチップを使用した核酸回収方法の概略を示す模式図である。
【図３】図３（Ａ）〜（Ｄ）は、本発明における核酸回収用バイオチップの一例を示す模式図である。
【図４】図４（Ａ）〜（Ｄ）は、本発明における核酸増幅用バイオチップの一例を示す模式図である。
【図５】図５は、本発明の実施例１で使用した治具装置の一例を示す模式図であり、（Ａ）が上面図、（Ｂ）が断面図、（Ｃ）が担体に対する液体の通過方向を示す模式図である。
【図６】図６は、本発明の実施例２で使用した治具装置の一例を示す模式図であり、（Ａ）および（Ｂ）が斜視図、（Ｃ）が上面図、（Ｄ）が断面図である。
【図７】図７は、参考例における核酸複合体のギムザ染色を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜核酸試料の製造方法＞
本発明の核酸試料の製造方法は、前述のように、細胞から核酸を回収する核酸試料の製造方法であって、下記（Ａ）〜（Ｅ）工程を含むことを特徴とする。本発明の核酸試料の製造方法は、核酸試料の調製方法、核酸試料の回収方法または細胞からの核酸の回収方法ということもできる。
（Ａ）前記細胞を含む細胞試料について、前記細胞から核酸複合体を放出させる工程
（Ｂ）前記（Ａ）工程後の前記細胞試料を含む処理液と、担体とを接触させる工程
（Ｃ）前記担体と前記処理液とを分離する工程
（Ｄ）前記担体に加熱処理を施す工程
（Ｅ）前記（Ｄ）工程の前または後、前記担体に分散媒を添加する工程
【００１４】
本発明の製造方法において、核酸の回収は、以下のメカニズムによると推定されるが、本発明は、これには限定されない。従来の核酸回収、特に、ゲノムＤＮＡの回収では、通常、まず、血液等の試料の処理として、細胞（例えば、白血球）内の核の破壊、前記核内でパッケージングされた染色体の放出、不要なタンパク質および繊維等の除去による核ゲノムの直鎖化を行った上で、例えば、種々の担体に核ゲノムを保持させて、前記担体と液体画分との分離により核ゲノムを回収している。これに対して、本発明においては、細胞の核から核ゲノムを含む染色体を放出させるものの、核ゲノムを直鎖化させるのではなく、核ゲノムが絡み合った高度な高次構造である粒子形状の核酸複合体として、核ゲノムを維持させている。この核酸複合体は、通常、直径５０〜２００μｍ程度であり、直径が１０μｍ以下である核よりも大きく、また、直鎖の核ゲノムよりも立体障害が大きく、且つ、高度な高次構造をとっている。このため、例えば、担体に保持され易い。したがって、細胞由来の核ゲノムを、効率良く担体で捕獲できる。さらに、このように核酸複合体の状態で核ゲノムを前記担体に捕獲させることによって、ミトコンドリアゲノムの回収も可能である。ミトコンドリアゲノムは、約１７，０００個程度のヌクレオチドがつながった環状ＤＮＡであって、非常に微細であることから、これを回収することは極めて困難であった。しかし、本発明によれば、前記担体に捕獲された核酸複合体は、核酸が絡み合った構造であるため、この構造内に、さらにミトコンドリアゲノムが捕獲されると考えられる。また、このような核酸複合体は、例えば、直鎖の核ゲノムと比較すると、非常に安定性に優れるため、例えば、ピペッティングおよびボルテックス混合等の操作によっても破壊され難い。このため、回収操作による回収率の低下を防止できる。そして、前記担体に捕獲された核酸複合体に加熱処理を施すのみで、前記核酸複合体に含まれる各種核酸、例えば、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ等を分散媒中に回収できる。
【００１５】
前記（Ｂ）工程において、前記（Ａ）工程後の前記処理液と、前記担体とを接触させる方法、および、前記（Ｃ）工程において、前記担体と前記処理液とを分離する方法は、それぞれ、特に制限されず、例えば、後述するように、前記担体の形状や、その配置状態等に応じて適宜決定できる。前記（Ｃ）工程において、前記担体と前記処理液との分離は、例えば、前記担体と液体画分との分離ということもでき、また、前記処理液または前記液体画分の除去ということもできる。なお、前記処理液（液体画分）は、例えば、前記担体から完全に除去されなくてもよく、例えば、前記担体に前記処理液が残存してもよい。
【００１６】
前記（Ｅ）工程における分散媒の添加は、前述のように、加熱処理を施す前記（Ｄ）工程の前に行ってもよいし、後に行ってもよい。前記（Ｅ）工程を前記（Ｄ）工程の後に行う場合、本発明の製造方法は、例えば、前記（Ａ）工程〜（Ｃ）工程をこの順序で行い、続いて加熱処理の前記（Ｄ）工程を行った後に、前記分散媒を添加する前記（Ｅ）工程を行う。また、前記（Ｅ）工程を前記（Ｄ）工程の前に行う場合、本発明の製造方法は、例えば、前記（Ａ）工程〜（Ｃ）工程をこの順序で行い、続いて前記分散媒を添加する前記（Ｅ）工程を行った後に、加熱処理の前記（Ｄ）工程を行う。
【００１７】
（第１の実施形態）
本発明の核酸試料の製造方法において、前記（Ａ）工程の核酸複合体を放出させる手段は、特に制限されない。本発明の核酸試料の製造方法の一例として、前記（Ａ）工程が、例えば、プロテアーゼおよび界面活性剤を含む処理試薬と、前記細胞試料とを混合する（Ａ１）工程である、第１の製造方法があげられる。第１の製造方法においては、例えば、このように、前記（Ａ）工程において、前記細胞試料と前記処理試薬とを混合することによって、前記細胞から核酸複合体を放出させた処理液が得られる。
【００１８】
以下に、本発明の第１の製造方法について説明するが、本発明は、これには制限されない。本発明において、以下、細胞試料と混合する前の、前記プロテアーゼおよび界面活性剤を含む試薬を「処理試薬」といい、前記処理試薬と細胞試料とを混合したものを「処理液」または「混合処理液」という。なお、本発明において、前記細胞試料と前記処理試薬との混合とは、例えば、前記処理試薬を前記細胞試料に添加してもよいし、前記処理試薬に前記細胞試料を添加してもよい。本発明の第１の製造方法において使用する前記処理試薬は、例えば、「第１の処理試薬」ともいう。
【００１９】
前記処理試薬と前記細胞試料とを混合した処理液において、前記プロテアーゼの濃度は、例えば、０．５ｍＵ／μＬ以上であり、前記界面活性剤の濃度は、例えば、０．１体積％以上であることが好ましい。このような条件で前記細胞試料を処理することによって、前記核酸複合体を十分に放出できる。前記プロテアーゼ濃度および前記界面活性剤濃度は、例えば、それぞれ、前記処理試薬と前記細胞試料とを含む処理液における濃度であって、前記処理液における細胞の含有量を約１×１０２〜１×１０９個と仮定した場合の濃度である。また、前記プロテアーゼ濃度および前記界面活性剤濃度は、例えば、それぞれ、前記処理試薬と前記細胞試料とを含む処理液における濃度であって、前記処理液における前記細胞試料の添加割合を５０〜１００μＬ、好ましくは５０μＬと仮定した場合の濃度であってもよい。
【００２０】
前記処理液において、前記プロテアーゼの濃度の下限は、例えば、０．５ｍＵ／μＬ以上であり、好ましくは１ｍＵ／μＬ以上であり、より好ましくは２ｍＵ／μＬ以上である。前記処理液において、前記プロテアーゼ濃度の上限は、特に制限されないが、例えば、１Ｕ／μＬ以下であり、好ましくは５００ｍＵ／μＬ以下である。前記プロテアーゼの濃度範囲としては、例えば、０．５〜１０００ｍＵ／μＬであり、好ましくは１〜１０００ｍＵ／μＬであり、より好ましくは２〜５００ｍＵ／μＬであり、特に好ましくは５〜１５ｍＵ／μＬの範囲である。プロテアーゼの活性単位（Ｕ：ユニット）は、一般に、ヘモグロビンを基質として３７℃で１分間に１μｍｏｌのチロシンに相当するペプチドを生成する酵素量を１Ｕとする。
【００２１】
前記処理液において、例えば、前記細胞１×１０２〜１×１０９個に対するプロテアーゼの割合は、特に制限されないが、下限が、例えば、０．０２ｍＵ以上であり、好ましくは０．０８ｍＵ以上であり、上限が、例えば、１００Ｕ以下であり、好ましくは５０Ｕ以下である。また、前記処理液において、例えば、前記細胞試料５０μＬに対するプロテアーゼの割合は、特に制限されないが、下限が、例えば、０．０２ｍＵ以上であり、好ましくは０．０８ｍＵ以上であり、上限が、例えば、１００Ｕ以下であり、好ましくは５０Ｕ以下である。
【００２２】
前記処理液において、前記界面活性剤の濃度の下限は、特に制限されないが、例えば、０．１体積％以上であり、好ましくは０．２体積％以上である。また、前記処理液において、前記界面活性剤の上限は、特に制限されないが、例えば、２０体積％以下であり、好ましくは１０体積％以下であり、より好ましくは５体積％以下であり、さらに好ましくは２体積％以下である。前記界面活性剤の濃度範囲は、例えば、０．１〜２０体積％であり、好ましくは０．１〜５体積％であり、より好ましくは０．１〜２体積％であり、特に好ましくは０．２〜０．８体積％の範囲である。
【００２３】
また、前記処理液において、前記細胞１×１０２〜１×１０９個に対する界面活性剤の割合は、特に制限されないが、下限が、例えば、１フェムトモル（１×１０-１５モル）以上であり、好ましくは、２フェムトモル以上であり、上限が、例えば、２００フェムトモル以下であり、好ましくは１００フェムトモル以下である。また、前記処理液において、前記細胞試料５０μＬに対する前記界面活性剤の割合は、特に制限されないが、下限が、例えば、１フェムトモル以上であり、好ましくは、２フェムトモル以上であり、上限が、例えば、２００フェムトモル以下であり、好ましくは１００フェムトモル以下である。
【００２４】
前述のプロテアーゼおよび界面活性剤の割合は、前記細胞が真核細胞（有核細胞）の場合、好ましくは１×１０２〜１×１０８個に対する割合であることが好ましく、より好ましくは１×１０３〜１×１０７個に対する割合である。前記真核細胞の中でも、特に、前記細胞が全血由来の細胞（例えば、白血球）の場合、例えば、５×１０３〜１×１０７個に対する割合であることが好ましく、より好ましくは２．５×１０４〜１×１０７個に対する割合である。前記真核細胞の中でも、特に唾液由来の細胞の場合、例えば、１×１０２〜１×１０７個に対する割合であることが好ましく、より好ましくは１×１０３〜１×１０６個に対する割合である。また、前記細胞が原核細胞の場合、例えば、１×１０３〜１×１０９個に対する割合であることが好ましく、より好ましくは１×１０３〜１×１０８個に対する割合であり、例えば、大腸菌等も同様である。
【００２５】
前記処理試薬におけるプロテアーゼ濃度および界面活性剤濃度は、特に制限されず、例えば、前記処理試薬を前記細胞試料と混合した際に、前記処理液において、前述のような濃度になるよう設定することが好ましい。
【００２６】
前記処理試薬におけるプロテアーゼの濃度は、特に制限されないが、下限が、例えば、１ｍＵ／μＬ以上であり、好ましくは２ｍＵ／μＬ以上であり、より好ましくは４ｍＵ／μＬ以上であり、上限が、例えば、２Ｕ／μＬ以下であり、好ましくは１Ｕ／μＬ以下であり、濃度範囲は、例えば、１〜２０００ｍＵ／μＬであり、好ましくは２〜２０００ｍＵ／μＬであり、より好ましくは４〜１０００ｍＵ／μＬであり、特に好ましくは１０〜３０ｍＵ／ｍＬの範囲である。前記処理試薬における界面活性剤の濃度としては、特に制限されないが、下限が、例えば、０．２体積％以上であることが好ましく、上限が、例えば、４０体積％以下であり、より好ましくは２０体積％以下であり、さらに好ましくは１０体積％以下であり、特に好ましくは４体積％以下であり、濃度範囲は、例えば、０．２〜４０体積％であり、好ましくは０．２〜１０体積％であり、より好ましくは０．２〜４体積％であり、特に好ましくは０．４〜１．６体積％の範囲である。
【００２７】
前記細胞試料（Ｓ）と前記処理試薬（Ｔ）との添加割合（体積比Ｓ：Ｔ）は、特に制限されないが、例えば、１：０．５〜１：２０であり、好ましくは１：０．５〜１：１０であり、より好ましくは１：０．５〜１：５である。
【００２８】
前記プロテアーゼとしては、例えば、プロテイナーゼＫ、キモトリプシン、ペプシン、カテプシンＤ、パパイン等があげられる。これらのプロテアーゼは、いずれか一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【００２９】
前記界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、非イオン性界面活性剤が好ましい。前記非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレン−ｐ−イソオクチルフェノール（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｐ−ｉｓｏｏｃｔｙｌｐｈｅｎｏｌ）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウリル酸（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｓｏｒｂｉｔａｎ  Ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ）、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ノニルフェノールポリチオエトキシレート等があげられる。これらの界面活性剤としては、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｒｏｎ（商標）Ｘ−１１４等のＴｒｉｔｏｎ系、Ｎｏｎｉｄｅｔ（商標）Ｐ４０等のＮｏｎｉｄｅｔ系、Ｔｗｅｅｎ（商標）２０、Ｔｗｅｅｎ（商標）８０等のＴｗｅｅｎ系の界面活性剤があげられる。これらの界面活性剤は、いずれか一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【００３０】
前記処理試薬の形態は、特に制限されず、例えば、固体（乾燥体）でもよいし、液体でもよい。後者の場合、例えば、溶媒に、前記プロテアーゼおよび前記界面活性剤が添加されていることが好ましい。前記溶媒は、特に制限されないが、例えば、水、各種緩衝液、緩衝生理食塩水等の水性溶媒、有機溶媒、または、それらの混合液があげられる。前記緩衝液としては、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＢＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＳＳＣ、ＴＡＥ、ＴＢＥ、ＴＧ、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤｌＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ、ＰＢＳ、ホウ酸、カコジル酸、クエン酸、グリシン、グリシルグリシン、イミダゾール、クエン酸リチウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、トリチル酢酸アンモニウム（Ｔｒｉｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  Ａｃｅｔａｔｅ）等があげられる。前記処理試薬における緩衝液の濃度は、特に制限されないが、例えば、０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは０．１〜２０ｍｍｏｌ／Ｌである。前記処理試薬のｐＨは、例えば、７．８〜９．５であり、８．５〜８．９が好ましい。
【００３１】
前記処理試薬は、例えば、さらに、タンパク質変性剤等を含んでもよい。前記タンパク質変性剤としては、例えば、尿素、β−メルカプトエタノール、ラウリル硫酸ナトリウム、ジチオトレイトール、グアニジン塩酸等があげられる。前記処理試薬における前記タンパク質変性剤の濃度は、特に制限されないが、例えば、０〜８ｍｏｌ／ｍＬであり、好ましくは１〜５ｍｏｌ／ｍＬであり、より好ましくは１〜３ｍｏｌ／ｍＬである。これらは、一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【００３２】
前記処理試薬は、例えば、さらに、キレート剤を含んでもよい。前記キレート剤としては、例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＮＴＡ、ＤＴＰＡ、ＧＬＤＡ、ＨＥＤＴＡ、ＧＥＤＴＡ、ＴＴＨＡ、ＨＩＤＡ、ＤＨＥＧ等があげられる。前記処理試薬における前記キレート剤の濃度は、特に制限されないが、例えば、０〜１０ｍｍｏｌ／ｍＬであり、好ましくは０〜１ｍｍｏｌ／ｍＬであり、より好ましくは０〜０．１ｍｍｏｌ／ｍＬである。
【００３３】
前記細胞としては、例えば、核酸を含有している細胞であればよく、真核細胞および原核細胞があげられる。前記真核細胞としては、例えば、白血球等の血中細胞、口腔内細胞、爪の細胞および毛髪の細胞等の体細胞、生殖細胞および腫瘍細胞等があげられ、また、これらの培養細胞であってもよい。また、前記細胞として前記真核細胞を含む細胞試料は、特に制限されないが、例えば、血液、唾液、口腔粘膜、爪および毛髪等があげられ、また、前記真核細胞の培養物であってもよい。前記原核細胞としては、特に制限されないが、例えば、大腸菌等があげられ、また、その培養細胞であってもよい。また、前記細胞として前記原核細胞を含む細胞試料は、特に制限されないが、例えば、前記原核細胞の培養物であってもよい。前記培養物としては、例えば、細胞の培養液、回収した培養細胞等があげられる。また、前記細胞試料は、例えば、未希釈の細胞試料および希釈した細胞試料のいずれでもよいが、本発明は、未希釈の細胞試料からの核酸回収に適用することが好ましい。前記細胞試料が、例えば、口腔内細胞、または、培養後に回収した培養細胞等の場合、例えば、あらかじめ生理食塩水や緩衝液等に前記細胞を懸濁したものを、細胞試料として、前記処理試薬と混合してもよいし、細胞をそのまま細胞試料として、前記処理試薬と混合してもよい。また、前記細胞試料は、例えば、採取直後の細胞試料でもよいし、室温放置、冷蔵保存、または凍結後融解した細胞試料であってもよい。
【００３４】
前記血液としては、例えば、全血、溶血した全血、全血の血球画分、前記血球画分の分散液等があげられる。前記血液は、未希釈血液および希釈血液のいずれでもよいが、例えば、未希釈血液からの核酸回収に適用することが好ましい。前記血液は、例えば、採取直後の血液でもよいし、室温放置、冷蔵保存または凍結後融解した血液であってもよい。
【００３５】
本発明により回収される核酸は、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡの少なくとも一方である。前記ＤＮＡとしては、例えば、ゲノムＤＮＡの他に、プラスミドＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ等があげられる。
【００３６】
前記（Ｂ）工程では、前記（Ａ）工程後の前記細胞試料を含む処理液、例えば、前記処理試薬と前記細胞試料とを混合した処理液に、前記担体を接触させる。前記（Ｂ）工程における担体は、特に制限されず、例えば、前記（Ａ）工程において、前記処理試薬との処理によって前記細胞から放出された前記核酸複合体を捕獲できればよい。前記核酸複合体の平均直径は、例えば、５０〜２００μｍである。したがって、前記担体は、例えば、前記核酸複合体が通過し難く、且つ、液体画分が通過できる空隙を有することが好ましい。これによって、例えば、前記核酸複合体を保持し、且つ、液体画分を除去できる。また、前記核酸複合体は、前述のように高度な高次構造を有しているため、例えば、繊維等に付着し易い（絡み易い）。このため、前記担体における空隙の大きさは、特に制限されず、例えば、織布および不織布の繊維等の担体自体に、前記核酸複合体が付着することで、前記核酸複合体が保持されてもよい。また、その高次構造から、前記担体に付着した核酸複合体によって、さらに他の核酸複合体が保持されると考えられる。
【００３７】
前記担体としては、例えば、不織布、メッシュ状織布等の織布、スポンジ等の多孔質体等があげられる。その形状も特に制限されず、例えば、シート状、フィルム状、ブロック状、ビーズ状等があげられる。また、前記ビーズ状の担体は、例えば、不織布、織布、多孔質体等から形成されてもよいし、非孔質体から形成されてもよい。
【００３８】
以下に、前記各担体の特性を例示するが、本発明は、これには制限されない。
＜不織布＞
平均繊維直径：例えば、２０ｎｍ〜１００μｍ、好ましくは約２μｍ
目付：例えば、２０〜１５０ｇ／ｍ３、好ましくは約２０ｇ／ｍ３
＜織布＞
メッシュのサイズ：例えば、１０〜１０００μｍ、好ましくは、１００〜２５０μｍ
糸径（線径）：例えば、４０〜５００μｍ、好ましくは、４７〜１５２μｍ
目開き：例えば、５０〜３００μｍ、好ましくは、５０〜１０５μｍ
＜多孔質体＞
平均孔径：例えば、１０μｍ〜１０００μｍ、好ましくは、３０μｍ〜１０００μｍ
平均密度：例えば、１５〜８５ｋｇ／ｍ３、好ましくは、３０〜８０ｋｇ／ｍ３
孔の形状：例えば、独立気泡体、連続気泡体
＜ビーズ＞
形状：真球、楕円球等の球形
直径（粒径）：例えば、３０ｎｍ〜１００μｍ、好ましくは、約５μｍ
表面積比：例えば、０．５〜２００ｍ２／ｇ、好ましくは、１．１ｍ２／ｇ
充填率：例えば、０．１〜１０％、好ましくは、０．１〜５％
【００３９】
前記担体は、例えば、ポリマー製担体があげられる。前記ポリマーとしては、特に制限されず、例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエステル、ポリアミド（例えば、商品名ナイロン）、ポリウレタン、ポリエーテル、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、例えば、テフロン（登録商標）等のポリテロラフルオロエチレン等があげられる。中でも、例えば、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリウレタン、ポリエステルが好ましく、より好ましくはポリプロピレン、ポリウレタン、ポリエステルである。
【００４０】
前記ポリマー製担体は、例えば、全体が前記ポリマーから形成された担体でもよいし、血液と接触する部分のみ、例えば、露出表面のみが、前記ポリマーに被覆された担体でもよい。
【００４１】
前記ビーズ状のポリマー製担体は、例えば、前述のように、多孔質体から形成されてもよいし、非多孔質体から形成されてもよい。前記ビーズ状のポリマー製担体としては、例えば、磁石による回収が可能であることから、磁性を帯びた磁性ビーズも好ましい。前記磁性ビーズを構成するポリマーとしては、特に制限されないが、例えば、ポリスチレン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、キトサンや、これらのポリマーとマレイン酸との共重合体等があげられる。また、前記磁性ビーズは、例えば、ＰＥＧ−ＣＯＯＨ、ａｌｋｙｌ−ＯＨ、ＳＯ３Ｈ、ＳｉＯ２等で表面処理されていてもよい。また、前記磁性ビーズは、例えば、金属等の磁性体から構成されるビーズの表面に、前述のようなポリマーが被覆されているものでもよい。前記金属としては、例えば、マグネタイト、マグヘマイト、鉄、ニッケル等があげられる。
【００４２】
また、前記担体としては、この他に、例えば、金属製担体があげられる。前記金属としては、例えば、ステンレス、チタン、アルミニウム等があげられる。これらの金属は、一種類でもよいし、二種類以上であってもよい。
【００４３】
前記担体は、例えば、単層体でもよいし、二層以上の積層体であってもよい。前記積層体は、例えば、いずれか一種類の部材から構成されてもよいし、異なる二種類以上の部材から構成されてもよく、また、異なる材質の部材から構成されてもよい。
【００４４】
使用する前記担体の大きさは、制限されず、例えば、前記（Ａ）工程における前記細胞試料の量、前記細胞試料と前記処理試薬とを混合した処理液の量、および、前記担体の形状等に応じて適宜決定できる。なお、具体例については、後述する。
【００４５】
前記（Ｂ）工程において、前記処理液と前記担体とを接触させる方法、および、前記（Ｃ）工程において、前記処理液と前記担体とを分離する方法は、それぞれ、特に制限されず、例えば、後述するように、前記担体の形状や、その配置状態等に応じて適宜決定できる。なお、前記担体から前記処理液は、前述のように、完全に分離されなくてもよい。
【００４６】
本発明の第１の核酸試料の製造方法について、一例として、全血から核酸を回収する方法を説明するが、本発明は、これには限定されない。
【００４７】
血液の処理工程
まず、全血に前記処理試薬を添加する。これによって、全血の白血球から核酸複合体が放出される。この核酸複合体には、例えば、ゲノムＤＮＡやＲＮＡの他に、ミトコンドリアＤＮＡが含まれる。
【００４８】
前記処理試薬による処理条件は、特に制限されないが、処理時間は、例えば、１〜６００秒であり、好ましくは５〜６００秒であり、より好ましくは５〜３００秒である。処理温度は、例えば、４〜６０℃であり、好ましくは１０〜６０℃であり、より好ましくは１５〜４０℃である。
【００４９】
担体との接触工程
続いて、前記全血と前記処理試薬とを混合した前記処理液を、前記担体に接触させる。これによって、前記担体に、核酸含有細胞である全血の白血球から放出された核酸複合体が捕獲される。
【００５０】
前記担体の大きさは、前述のように、特に制限されず、例えば、処理する全血の量、前記担体の材質および形状等によって適宜決定できる。具体例を以下に示す。
【００５１】
前記担体が、例えば、不織布、織布または多孔質体から構成されるシート状、フィルム状またはブロック状等の担体である場合、例えば、以下のような条件で、全血と担体とを接触させる。前記（Ａ）工程で処理した全血の体積（Ｘ）に対する前記担体の体積（Ｙ：空隙を含む）の比（Ｘ：Ｙ）は、例えば、１：２．２×１０−３〜１：０．７であり、好ましくは１：２．２×１０−３〜１：０．３１であり、より好ましくは１：２．２×１０−３〜１：０．１３である。また、前記（Ａ）工程後の全血を含む前記処理液の体積（Ｘ’）に対する前記担体の体積（Ｙ：空隙を含む）の比（Ｘ’：Ｙ）は、例えば、１：１．１×１０−３〜１：０．３５であり、好ましくは１：１．１×１０−３〜１：０．１６であり、より好ましくは１：１．１×１０−３〜１：０．０７である。
【００５２】
前記担体が、例えば、ビーズである場合、複数のビーズを使用することが好ましい。前記ビーズの形状は、特に制限されないが、例えば、真球、略真球、楕円球等があげられる。前記ビーズの平均直径は、例えば、３０ｎｍ〜１００μｍであり、好ましくは３０ｎｍ〜２０μｍであり、より好ましくは３０ｎｍ〜５μｍである。例えば、全血５０μＬから核酸を回収する場合、前記複数のビーズの総表面積（Ｚ）は、例えば、５〜２０００ｃｍ２であり、好ましくは１０〜２０００ｃｍ２であり、より好ましくは２００〜２０００ｃｍ２である。また、前記ビーズの充填率は、例えば、０．１〜１０％であり、好ましくは、０．１〜５％であり、より好ましくは、１〜５％である。
【００５３】
前記処理液と前記担体とを接触させて、前記核酸複合体を前記担体に捕獲させる際の処理条件は、特に制限されないが、処理温度が、例えば、１５〜４０℃であり、好ましくは２０〜３５℃であり、特に好ましくは室温（約２５℃）であり、処理時間は、例えば、１秒〜１０分であり、好ましくは３０秒〜５分である。
【００５４】
前記処理液と前記担体とを接触させる方法は、特に制限されず、前述のように、例えば、前記担体の形状等に応じて適宜決定できる。前記両者は、例えば、エッペンドルフチューブ、試験管、流路を備えるチップ等の容器内で接触させることができる。具体的には、前記容器内に、前記担体と前記処理液とを入れることで前記両者を接触させてもよいし、予め前記担体を固定化した前記容器に、前記処理液を入れることで、前記両者を接触させてもよい。
【００５５】
また、後述するように、例えば、チップ等の流路内に前記担体を配置し、前記流路に前記処理液を流し、前記担体の内部を通過させることによって、両者を接触させてもよい。このような方法によれば、前記処理液中の核酸複合体は、前記担体に保持され、それ以外の成分を除去できる。ここで、「前記担体を通過」とは、例えば、前記処理液が、前記担体内部に入り、前記担体の内部を移動することを意味する。特に、前記担体に供給した前記処理液の全部または一部が、前記担体の内部に入り、前記担体の内部から前記担体の外部に通り抜けることが好ましい。このように前記担体の内部から前記担体の外部に前記処理液を通過させれば、例えば、前記担体内に残存する前記処理液中の不要成分の量を低減できる。これによって、最終的に得られる核酸試料における不要成分の含有量を、さらに低減できる。また、例えば、チップ等の流路内に複数の前記担体（例えば、ビーズ）を配置し、前記処理液を、前記担体と担体との間を通過させることによって、両者を接触させてもよい。これによっても、前述と同様に、前記核酸複合体は前記担体に保持され、それ以外の成分を除去できる。前記処理液は、例えば、減圧または加圧によって、前記流路内の前記担体の内部、または、前記担体の間を通過させることができる。
【００５６】
分離工程
続いて、前記担体と前記処理液とを分離する。前記両者の分離方法は、特に制限されず、例えば、前記担体の形状や、その配置状態等によって適宜決定できる。前記担体が容器に固定されていない場合、例えば、前記容器から前記担体または前記処理液を取り出すことによって、両者を分離できる。また、前述の磁性体ビーズの場合は、例えば、磁石等でビーズを回収することによって、両者を分離できる。一方、前記担体が容器に固定されている場合、例えば、前記容器から前記処理液を除去（排出）することで、両者を分離できる。また、前述のように流路内に前記担体を配置している場合は、前記担体の内部または複数の前記担体と担体との間に前記処理液を通過させることで、例えば、血中細胞から前記処理液中に放出された核酸複合体を、前記担体に捕獲させると共に、前記処理液と前記担体とを分離できる。
【００５７】
分散媒の添加工程
つぎに、前記処理液を除去した前記担体に分散媒を添加する。なお、前記分散媒の添加は、このように、次工程の加熱処理の前に行ってもよいし、加熱処理の後に行ってもよい。
【００５８】
前記分散媒の添加によって、前記担体が前記分散媒中に浸漬した状態となることが好ましい。前記分散媒は、特に制限されないが、水、各種緩衝液、緩衝生理食塩水等の水性溶媒、有機溶媒、または、それらの混合液があげられる。前記緩衝液としては、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤｌＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ等があげられる。前記緩衝液の濃度は、特に制限されないが、例えば、０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは、０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは、０．１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌである。前記分散媒のｐＨは、例えば、７．８〜９．５であり、８．５〜８．９が好ましい。
【００５９】
前記分散媒の添加割合は、特に制限されないが、例えば、前記（Ａ）工程で処理した全血の体積（Ｘ）に対する分散媒の体積（Ｄ）の比（体積比Ｘ：Ｄ）は、例えば、１：０．５〜１：１０であり、好ましくは、１：０．５〜１：５であり、より好ましくは、１：１〜１：３である。
【００６０】
なお、前記担体への前記分散媒の供給に先立って、例えば、洗浄液の供給および除去を行ってもよい。これによって、前記担体に残存している不要な成分をさらに排除できる。前記洗浄液としては、特に制限されず、例えば、前記分散媒と同じものが使用できる。また、前記分散媒の供給に先立って、加熱処理を施す場合は、前記加熱処理に先立って、前記担体への洗浄液の供給および前記洗浄液の除去を行うことが好ましい。
【００６１】
加熱処理工程
前記分散媒中の前記担体に加熱処理を施す。これによって、前記担体に捕獲された前記核酸複合体から核酸が放出され、前記放出された核酸が、前記分散媒中に解放（遊離）される。
【００６２】
加熱処理の温度は、特に制限されないが、例えば、５０〜１３０℃であり、好ましくは８０〜１３０℃であり、より好ましくは９０〜１００℃である。加熱処理は、例えば、一定の温度で行ってもよいし、温度を、連続的または段階的に上昇させてもよい。また、処理時間は、特に制限されないが、例えば、１〜３０分であり、好ましくは１〜５分である。
【００６３】
なお、前記分散媒の添加に先立って加熱処理を行った場合は、加熱処理によって前記核酸複合体から核酸を放出させた後、前記分散媒を添加して、前記放出された核酸を前記分散媒中に遊離させればよい。
【００６４】
続いて、加熱処理後の前記分散媒を回収する。前述のように、核酸が前記分散媒中に放出されているため、この分散媒を、全血由来の核酸を含有する核酸試料として回収できる。本発明により得られる核酸試料の用途は、特に制限されないが、例えば、後述する核酸増幅に使用することが好ましい。なお、全血以外の細胞試料についても、同様に処理を行い、核酸試料を回収できる。
【００６５】
本発明の方法によれば、例えば、前記細胞試料が全血であり、処理する全血が５０μＬ、使用する前記処理試薬が５０μＬ、前記分散媒が１００μＬの場合、例えば、１００〜１００００ｃｏｐｙ／μＬの核酸試料を回収できる。この量の核酸であれば、例えば、ＰＣＲ等の核酸増幅法において十分な鋳型となり得る。また、本発明の方法によれば、ゲノムＤＮＡやＲＮＡだけでなく、従来、回収が困難であったミトコンドリアＤＮＡも回収可能である。
【００６６】
（第２の実施形態）
本発明の製造方法において、細胞が真核細胞であって、真核細胞を含む細胞試料が、冷蔵保存または凍結融解後の試料である場合、例えば、以下に示す第２の製造方法が好ましい。本発明の第２の製造方法は、例えば、前記（Ａ）工程が、界面活性剤無添加であり且つプロテアーゼを含む処理試薬と、凍結融解後または冷蔵保存後の前記細胞試料とを混合する（Ａ２）工程の製造方法である。本発明の第２の製造方法において使用する前記処理試薬は、例えば、「第２の処理試薬」ともいう。なお、特に示さない限り、第２の製造方法は、例えば、前記（Ａ１）工程に代えて前記（Ａ２）工程を行えばよく、その他は、前記第１の製造方法と同様に行うことができる。
【００６７】
本発明における細胞試料としては、前述の真核細胞を含む細胞試料があげられる。本発明の第２の製造方法において、前記第２の処理試薬は、前述のように、界面活性剤無添加であり且つプロテアーゼを含む試薬が使用できる。凍結融解後または冷蔵保存後の細胞試料は、真核細胞の細胞膜の一部もしくは大部分が破壊されているため、例えば、界面活性剤による細胞膜の破壊を省略でき、界面活性剤を含まない前記処理試薬であっても、効率良く核酸複合体を放出できると推測される。このため、処理試薬のコストをより一層低下できる。なお、この推測は、本発明を何ら制限しない。
【００６８】
前記細胞試料の凍結融解の条件は、何ら制限されず、細胞試料を凍結した後、融解すればよい。凍結温度は、例えば、−１５〜−２００℃であり、融解温度は、例えば、４〜５０℃である。また、前記細胞試料の冷蔵保存の条件は、何ら制限されないが、例えば、冷蔵温度は、例えば、０〜８℃であり、保存時間は、例えば、４日〜１年であり、１週間〜１ヵ月であってもよい。
【００６９】
前記第２の処理試薬は、例えば、冷蔵保存前または凍結保存前から、前記細胞試料に添加してもよいし、冷蔵保存後または凍結融解後に、前記細胞試料に添加してもよい。
【００７０】
前記第２の処理試薬の組成は、界面活性剤無添加である以外は、前記第１の製造方法における第１の処理試薬と同様である。また、前記第２の処理試薬と細胞試料とを混合した処理液において、真核細胞ならびに細胞試料に対するプロテアーゼの割合も、前記第１の製造方法と同様である。
【００７１】
（第３の実施形態）
本発明の製造方法において、細胞が真核細胞であって、真核細胞を含む細胞試料が、凍結融解後の試料である場合、例えば、以下に示す第３の製造方法が好ましい。本発明の第３の製造方法は、例えば、前記（Ａ）工程が、界面活性剤無添加且つプロテアーゼ無添加の処理試薬と、凍結融解後の前記細胞試料とを混合する（Ａ３）工程の製造方法である。本発明の第３の製造方法において使用する前記処理試薬は、例えば、「第３の処理試薬」ともいう。なお、特に示さない限り、第３の製造方法は、例えば、前記（Ａ１）または（Ａ２）工程に代えて、前記（Ａ３）工程を行えばよく、その他は、前記第１または第２の製造方法と同様に行うことができる。また、第３の製造方法においては、例えば、前記（Ａ）工程において前記第３の処理試薬と混合することなく、前記（Ｂ）工程において、前記凍結融解後の前記細胞試料を前記担体に接触させてもよい。
【００７２】
本発明における細胞試料としては、前述の真核細胞を含む細胞試料があげられる。本発明の第３の製造方法において、前記第３の処理試薬は、前述のように、界面活性剤無添加且つプロテアーゼ無添加の試薬が使用できる。凍結融解後の細胞試料は、真核細胞の細胞膜および核膜の一部または大部分が破壊され、同時に、一部の細胞では核内で核酸をパッケージングしていたタンパク質が変性し、パッケージの機能を失うことで、核酸複合体を放出すると考えられる。このため、例えば、界面活性剤およびプロテアーゼを含まない処理試薬であっても、効率良く核酸複合体を放出させることができる。このため、処理試薬のコストをより一層低下できる。
【００７３】
前記細胞試料の凍結融解の条件は、何ら制限されず、細胞試料を凍結した後、融解すればよい。凍結温度は、例えば、−１５〜−２００℃であり、融解温度は、例えば、４〜５０℃である。
【００７４】
前記第３の処理試薬は、例えば、凍結保存前から、前記細胞試料に添加してもよいし、凍結融解後に、前記細胞試料に添加してもよい。
【００７５】
前記第３の処理試薬の組成は、例えば、界面活性剤およびプロテアーゼ無添加である以外は、前記第１の製造方法における第１の処理試薬と同様であり、例えば、前述の各種溶媒等があげられる。
【００７６】
（第４の実施形態）
本発明の製造方法において、細胞が原核細胞であって、原核細胞を含む細胞試料が、冷蔵保存または凍結融解後の試料である場合、例えば、以下に示す第４の製造方法が好ましい。本発明の第４の製造方法は、例えば、前記（Ａ）工程が、前記原核細胞を含む細胞試料を、凍結融解または冷蔵保存する工程の製造方法である。なお、特に示さない限り、第４の製造方法は、例えば、前記（Ａ１）、（Ａ２）または（Ａ３）工程に代えて、前記（Ａ４）工程を行えばよく、その他は、前記第１から第３の製造方法と同様に行うことができる。
【００７７】
本発明における細胞試料としては、前述の原核細胞を含む細胞試料があげられる。第４の製造方法においては、例えば、細胞試料を冷蔵保存または凍結融解するのみで、前記核酸複合体を放出させることができる。
【００７８】
第４の製造方法においては、例えば、前述のように、前記（Ａ）工程において、前記細胞試料を、凍結融解または冷蔵保存することによって、前記細胞から核酸複合体を放出させた処理液が得られる。この前記（Ａ）工程後の処理液は、例えば、前記担体に接触させる前記（Ｂ）工程の前に、例えば、処理試薬と混合することが好ましい。前記処理試薬としては、例えば、前記プロテアーゼおよび前記界面活性剤のいずれも含まない試薬、または、前記プロテアーゼおよび前記界面活性剤のいずれか一方を含み且つ他方が無添加である試薬があげられる。本発明の第４の製造方法において使用する前記処理試薬は、例えば、「第４の処理試薬」ともいう。前記第４の処理試薬がプロテアーゼまたは界面活性剤を含む場合、その添加割合は、例えば、前記第１の製造方法における第１の処理試薬と同様である。また、細胞試料に対する添加割合も、前記第１の製造方法と同様である。前記第４の処理試薬がプロテアーゼおよび界面活性剤を含まない場合、前記第４の処理試薬は、例えば、これらが無添加である以外は、前記第１の製造方法における第１の処理試薬と同様であり、例えば、前述の各種溶媒等があげられる。
【００７９】
凍結融解後または冷蔵保存後の細胞試料は、原核細胞の細胞壁が破壊されている、もしくは、破壊され易くなっている。そして、原核細胞は、細胞核が存在しないため、前述のように細胞壁が破壊されている、または、破壊され易くなっている。これによって、例えば、界面活性剤およびプロテアーゼ、または、いずれか一方を含まない第４の処理試薬であっても、効率良く核酸複合体を放出させることができる。このため、処理試薬のコストをより一層低下できる。
【００８０】
前記第４の処理試薬は、例えば、冷蔵保存前または凍結保存前から、前記細胞試料に添加してもよいし、冷蔵保存後または凍結融解後に、前記細胞試料に添加してもよい。
【００８１】
＜増幅産物の製造方法＞
以上のように、本発明の核酸試料の製造方法により得られた核酸試料は、例えば、各種核酸増幅方法の鋳型試料として使用できる。そこで、本発明は、核酸増幅方法により、目的配列の核酸増幅物を製造する方法であって、下記（ａ）および（ｂ）工程を含むことを特徴とする。また、本発明は、目的配列の増幅方法ということもできる。
（ａ）本発明の核酸試料の製造方法により、細胞を含む細胞試料から核酸試料を回収する工程
（ｂ）前記（ａ）工程で回収した前記核酸試料中の核酸を鋳型として、核酸増幅方法により、前記鋳型における目的配列の核酸増幅物を製造する工程
【００８２】
本発明の核酸増幅物の製造方法は、本発明の核酸試料の製造方法により核酸を回収する点が特徴であり、その他の工程や条件等は、何ら制限されない。また、前述のように、本発明の核酸試料の製造方法によれば、鋳型として使用可能な十分量の核酸を得ることができるため、例えば、前記（ａ）工程の核酸を、そのまま前記（ｂ）工程に使用できる。
【００８３】
前記（ｂ）工程における核酸増幅方法の種類は、何ら制限されず、従来公知の増幅方法があげられる。具体例としては、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＭａｒｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）法等があげられる。また、各種核酸増幅方法の工程や反応条件等は、制限されず、例えば、従来公知の条件に従って行うことができる。
【００８４】
前記核酸増幅方法に使用する試薬としては、特に制限されず、従来公知の試薬が使用でき、例えば、ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、緩衝剤、水や緩衝液等の溶媒等があげられる。この他にも、例えば、グリセロ−ル、ヘパリン、ベタイン、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４等を含んでもよい。
【００８５】
＜核酸回収用試薬＞
本発明の第１の核酸回収用試薬は、本発明の第１の核酸試料の製造方法に使用するための試薬であり、前記プロテアーゼおよび前記界面活性剤を含む。本発明の第１の核酸回収用試薬は、例えば、本発明の第１の核酸試料の製造方法における第１の処理試薬と同様である。前記核酸回収用試薬において、前記プロテアーゼおよび界面活性剤は、前記細胞試料と混合した際に、前記細胞１×１０２〜１×１０９個に対する前記プロテアーゼの割合が、例えば、０．０２ｍＵ以上となり、前記細胞１×１０２〜１×１０９個に対する前記界面活性剤の割合が、１フェムトモル以上となるように、配合されていることを特徴とする。
【００８６】
なお、本発明の第１の核酸回収用試薬は、例えば、前記細胞試料と混合した際、前述の範囲となるように、前記プロテアーゼおよび界面活性剤が配合されていればよい。
【００８７】
本発明の第２の核酸回収用試薬は、本発明の第２の核酸試料の製造方法に使用するための試薬であり、特に制限されないが、少なくともプロテアーゼを含んでいればよく、前記細胞試料と混合した際に、前記第１の処理試薬と同様の範囲となるように、前記プロテアーゼを含んでいることが好ましい。本発明の第２の核酸回収用試薬は、例えば、本発明の第２の核酸試料の製造方法における第２の処理試薬と同様である。また、本発明の第３の核酸回収用試薬は、本発明の第３の核酸試料の製造方法に使用するための試薬であり、例えば、前記プロテアーゼおよび前記界面活性剤のいずれか一方を含んでもよいし、いずれも含まない溶媒であってもよい。本発明の第３の核酸回収用試薬は、例えば、本発明の第３の核酸試料の製造方法における第３の処理試薬と同様である。本発明の第４の核酸回収用試薬は、本発明の第４の核酸試料の製造方法に使用するための試薬であり、例えば、前記プロテアーゼおよび前記界面活性剤のいずれも含まない溶媒でもよいし、前記プロテアーゼおよび前記界面活性剤のいずれか一方を含み且つ他方が無添加である溶媒であってもよい。本発明の第４の核酸回収用試薬は、例えば、本発明の第４の核酸試料の製造方法における第４の処理試薬と同様である。
【００８８】
本発明の各核酸回収用試薬は、例えば、液体でも固体であってもよい。液体の場合、例えば、原液をそのまま前述の処理試薬として使用してもよいし、使用前に希釈した希釈液を前述の処理試薬として使用してもよい。固体の場合、例えば、前記細胞試料と混合する前に、前述の処理試薬の溶媒に溶解または分散し、これを前述の処理試薬として使用することもできる。本発明の各核酸回収用試薬は、例えば、さらに他の成分を含んでもよい。本発明の核酸回収用試薬を用いて、例えば、細胞からの核酸の回収ならびに目的配列の核酸増幅を行う場合、本発明の各核酸回収用試薬は、さらに、核酸増幅に必要な成分を適宜含んでもよく、例えば、ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、緩衝剤、水や緩衝液等の溶媒等があげられる。本発明の各核酸回収用試薬は、例えば、本発明の核酸増幅物の製造方法に使用するための製造用試薬ともいえる。
【００８９】
＜核酸回収用キット＞
本発明の第１の核酸回収用キットは、本発明の第１の核酸試料の製造方法に使用するためのキットであり、前記担体と、前記プロテアーゼと、前記界面活性剤とを含むことを特徴とする。本発明において、前記担体、前記プロテアーゼおよび前記界面活性剤は、前述の通りである。
【００９０】
本発明の第１の核酸回収用キットは、前記担体として、例えば、後述する、前記担体を有する本発明の核酸回収用チップまたは核酸増幅用チップを含んでもよい。
【００９１】
本発明の第１の核酸回収用キットにおいて、前記プロテアーゼと前記界面活性剤は、例えば、それぞれ別個の容器に収容されてもよいし、両者が共存して同じ容器に収容されてもよい。前記プロテアーゼと前記界面活性剤とが共存している場合、本発明の第１の核酸回収用キットは、例えば、前記担体と前記本発明の第１の核酸回収用試薬とを含むことが好ましい。前記本発明の第１の核酸回収用試薬は、前述の通りであって、前記プロテアーゼと前記界面活性剤とを含んでいればよく、液体でも固体でもよい。本発明の第１の核酸回収用キットにおいて、前記プロテアーゼと前記界面活性剤との割合は、特に制限されず、例えば、使用時において、前述のような割合となるように使用できればよい。
【００９２】
本発明の第２の核酸回収用キットは、本発明の第２の核酸試料の製造方法に使用するためのキットであり、特に制限されないが、前記担体と、前記プロテアーゼとを含み、例えば、前記担体と前記本発明の第２の核酸回収用試薬とを含んでもよい。また、本発明の第３の核酸回収用キットは、本発明の第３の核酸試料の製造方法に使用するためのキットであり、例えば、前記担体と、前記プロテアーゼおよび前記界面活性剤のいずれか一方とを含んでもよいし、前記担体と、前記プロテアーゼおよび前記界面活性剤のいずれも含まない溶媒とを含んでもよく、また、例えば、前記担体と前記本発明の第３の核酸回収用試薬とを含んでもよい。本発明の第４の核酸回収用キットは、本発明の第４の核酸試料の製造方法に使用するためのキットであり、例えば、前記担体と、前記プロテアーゼおよび前記界面活性剤のいずれも含まない溶媒とを含んでもよいし、前記担体と、前記プロテアーゼおよび前記界面活性剤のいずれか一方を含み且つ他方が無添加である溶媒とを含んでもよく、また、例えば、前記担体と前記本発明の第４の核酸回収用試薬とを含んでもよい。
【００９３】
本発明の各核酸回収用キットは、例えば、さらに、使用説明書を含んでもよい。また、本発明の各核酸回収用キットは、例えば、さらに他の成分を含んでもよい。本発明の核酸回収用キットを用いて、例えば、細胞からの核酸の回収ならびに目的配列の核酸増幅を行う場合、本発明の核酸回収用キットは、さらに、核酸増幅に必要な成分を適宜含んでもよく、例えば、ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、緩衝剤、水や緩衝液等の溶媒等があげられる。本発明の核酸回収用キットは、例えば、本発明の核酸増幅物の製造方法に使用するための製造用キットともいえる。
【００９４】
＜核酸回収用チップ＞
本発明の核酸回収用チップは、本発明の核酸試料の製造方法に使用するためのチップであり、チップ本体と前記担体とを有し、前記チップ本体が、液体の流路を備え、前記流路内に前記担体が配置されていることを特徴とする。本発明の核酸回収用チップと前記本発明の核酸回収用試薬とを使用することによって、例えば、本発明の核酸試料の製造方法を実施できる。
【００９５】
本発明の核酸回収用チップは、例えば、前記細胞試料および前記処理試薬等の液体が通る流路に、前記担体が配置されていればよく、その他の構成や形状等は何ら制限されない。以下に、本発明の核酸回収用チップの形態を例示するが、本発明は、これには制限されない。
【００９６】
（第１の核酸回収用チップ）
第１の核酸回収用チップは、例えば、前記チップ本体と前記担体とを有し、前記チップ本体が、液体の流路を有し、前記流路の一端が液体を導入および排出するための第１の開口部を備え、前記流路の他端が圧力制御手段と連結可能な第２の開口部を備え、前記流路内に前記担体が配置されている。前記担体は、例えば、フィルターとなるシート状担体でもよいし、複数のビーズ状担体であってもよい。
【００９７】
前記第１の核酸回収用チップは、例えば、使用時において、前記第２の開口部に圧力制御手段を連結し、前記圧力制御手段により前記流路を減圧条件に制御することで、液体を前記第１の開口部から前記流路内部に導入し、前記圧力制御手段により前記流路を加圧条件に制御することで、導入された液体を前記第１の開口部から前記流路外部に排出できる。このため、まず、減圧条件で、前記細胞試料を含む前記処理液を前記流路内部に導入すれば、前記処理液が、配置された前記担体を通過する。このため、例えば、前記処理試薬によって細胞試料中の細胞から放出した核酸複合体が、通過の際、前記担体に捕獲される。続いて、加圧状態で、導入された前記処理液を前記流路外部に排出すれば、前記細胞試料由来の不要成分を除去できる。そして、減圧条件で前記分散媒を前記流路内部に導入した後、前記分散媒の存在下で前記担体に加熱処理を施せば、前記担体に捕獲された前記核酸複合体から核酸が前記分散媒中に放出される。そこで、加圧条件で、前記分散媒を前記流路外部に排出すれば、前記核酸を含有する分散媒を、核酸試料として回収できる。核酸回収用チップと圧力制御手段との連結は、直接的であっても間接的であってもよい。なお、前記細胞試料および前記処理試薬の導入方法は、特に制限されず、例えば、予め、前記細胞試料と前記処理試薬とを混合した処理液を準備し、これを導入してもよいし、一方を導入してこれを他方に排出する操作（ピペッティング）を繰り返し、最終的に、前記処理液を導入してもよい。
【００９８】
このような形態の核酸回収用チップとしては、例えば、吸引装置に装着して使用するピペットチップがあげられる。この場合、例えば、手動や自動のピペッター等の吸引装置が、前記圧力制御手段に該当する。前記第１の核酸回収用チップとして、ピペットチップを例にあげて、図１を用いて説明する。同図は、核酸回収用ピペットチップ（以下、「ピペットチップ」という）の断面図である。同図に示すように、ピペットチップ１は、中空の円錐状本体１３、液体の導出口である第１の開口部１１およびピペッターに装着可能な第２の開口部１２を備え、円錐状本体１３の内部であって、第１の開口部１１側に、担体１０が配置されている。ピペットチップ１において、円錐状本体１３の内部の空隙が、液体の流路ならびに導入された液体の収容部となる。
【００９９】
前記ピペットチップの大きさや形状は、特に制限されず、例えば、導入する前記細胞試料を含む前記処理液の量に応じて、適宜設定できる。また、本発明の核酸回収用チップは、前述のように、前記担体を備えることが特徴であることから、例えば、市販のピペットチップに前記担体を配置するのみで製造可能である。また、ピペット等の吸引装置への装着方法等も従来と同様に行うことができる。
【０１００】
ピペットチップ１を使用した核酸試料の製造方法（核酸回収方法）の一例を、図２を用いて説明する。なお、本発明はこれに制限されない。図２は、ピペットチップを用いた核酸試料の製造方法の工程の概略を示した断面図である。図２において、図１と同一箇所には同一符合を付している。
【０１０１】
まず、ピペットチップ１を第２の開口部１２からピペッター（図示せず）に装着する。そして、図２（Ａ）に示すように、ピペッターの操作により、第１の開口部１１から処理液２０を吸引する。その際、吸引した処理液２０の全てが、ピペットチップ１内の担体１０を通過することが好ましい。これによって、処理液２０中に放出された核酸複合体が担体１０に捕獲される。つぎに、図２（Ｂ）に示すように、ピペッターの操作により、吸引した処理液２０を第１の開口部１１から外部に排出する。ここで排出される処理液２０’は、核酸複合体が担体１０により除去されており、核酸回収に不要な成分、例えば、赤血球等を含む液体である。続いて、図２（Ｃ）に示すように、ピペッターの操作により、第１の開口部１１から分散媒３０を吸引する。この際、ピペットチップ１内の担体１０が、吸引した分散媒３０で満たされていることが好ましい。そして、この状態、すなわち、担体１０が分散媒３０中に存在する状態で、前述のような加熱処理を行う。最後に、図２（Ｄ）に示すように、ピペッターの操作により、第１の開口部１１から加熱処理後の分散媒４０を外部に排出する。排出した分散媒４０には、前述のように、担体１０に捕獲されていた前記核酸複合体から放出された核酸が含まれている。この分散媒４０を核酸試料として回収すれば、例えば、核酸増幅の鋳型試料に利用できる。この核酸試料は、図２（Ｂ）で表される工程において、核酸回収に不要な成分が排出されていることから、前記不要成分の含有量も低減されている。
【０１０２】
（第２の核酸回収用チップ）
第２の核酸回収用チップは、例えば、前記チップ本体と前記担体とを有し、前記チップ本体が、液体の流路を有し、前記流路の一端が加圧手段と連結可能であり且つ液体を導入するための第１の開口部を備え、前記流路の他端が液体を排出するための第２の開口部を備え、前記流路内に本発明の核酸回収用担体が配置されている。
【０１０３】
前記第２の核酸回収用チップは、使用時において、前記第１の開口部に加圧手段を連結し、前記加圧手段により液体を加圧することで、前記液体を前記第１の開口部から前記流路内部に導入し、前記加圧手段により前記流路を加圧して、導入された液体を前記第２の開口部から前記流路外部に排出することができる。このため、まず、加圧条件下で前記処理液を前記流路内部に導入すれば、前記処理液は配置された前記担体を通過するため、前記担体に前記処理液中の核酸複合体が捕獲される。つづいて、加圧条件下で導入された前記処理液を前記流路外部に排出すれば、細胞試料由来の不要成分を除去できる。そして、加圧条件で前記分散媒を前記流路内部に導入した後、前記分散媒の存在下で前記担体に加熱処理を施せば、前記担体に捕獲されている前記核酸複合体から核酸が前記分散媒中に解放される。そこで、加圧条件で前記分散媒を前記流路外部に排出すれば、核酸を含有する分散媒を核酸試料として回収できる。なお、核酸回収用チップと加圧手段との連結は、直接的であっても間接的であってもよい（以下、同様）。
【０１０４】
このような形態の核酸回収用チップとしては、例えば、表面に凹状の流路が形成された支持基板と、前記表面を覆うカバー基板とから形成される、いわゆるバイオチップがあげられる。前記第２の核酸回収用チップとして、バイオチップを例にあげて、図３を用いて説明する。同図は、核酸回収用バイオチップ（以下、「バイオチップ」という）の概略を示す模式図であり、（Ａ）は側面図、（Ｂ）は上面図、（Ｄ）は前記（Ｂ）のＡ−Ａ方向断面図である。また、同図（Ｃ）は、バイオチップを構成する支持基板２２の上面図である。同図に示すように、バイオチップ２は、支持基板２２とカバー基板２１とを含む。支持基板２２の表面には、流路２３、流路２３から分岐する流路２７、流路２７に連結された排液部２４、流路２３に連結された核酸含有液（核酸試料）の収容部２５が、凹状の溝として形成されている。カバー基板２１は、支持基板２２の凹状の溝が形成された表面に被覆されており、これによって、流路２３の末端（図において左端）が液体の導入口２６となる。そして、流路２３内部であって、排液部２４および収容部２５との連結部よりも導入口２６側に、担体１０が配置されている。流路２３は、核酸試料の収容部２５と、流路２７を介して排液部２４との両方に連結しているが、排液部２４への液体の導入と収容部２５への液体の導入とは、適宜切り替え可能である。バイオチップの大きさや形状は、特に制限されない。
【０１０５】
バイオチップ２を使用した核酸回収方法として、シリンジ加圧等の加圧送液装置を用いた一例を、図３を用いて説明する。なお、本発明はこれに制限されない。
【０１０６】
加圧送液装置（図示せず）により、導入口２６から処理液を送液する。これによって、送液された処理液は、流路２３内に配置された担体１０を通過して、流路２７を介して排液部２４に収容される。そして、処理液中に放出されている核酸複合体が担体１０に捕獲される。ここで排液部２４に収容される処理液は、前記核酸複合体が担体１０により除去されており、核酸回収に不要な成分、例えば、赤血球等を含む液体である。つぎに、同様にして、加圧送液装置により、導入口２６から分散媒を送液する。この際、流路２３内の担体１０が、分散媒で満たされていることが好ましい。そして、この状態、すなわち、担体１０が分散媒中に存在する状態で、前述のような加熱処理を行う。最後に、加圧送液装置により、加熱処理後の分散媒を、核酸含有液の収容部２５に移動させる。収容部２５に収容された分散媒には、前述のように、捕獲されていた前記核酸複合体から放出された核酸が含まれている。この核酸を含有する分散媒を核酸試料として、例えば、核酸増幅の鋳型試料に利用できる。また、この核酸試料は、核酸回収に不要な成分が排出されていることから、前記不要成分の含有量も低減されている。
【０１０７】
前述の手法は、加圧により液体を導入および排出する例であるが、本発明は、これに制限されない。すなわち、例えば、（１）減圧により液体を導入および排出、（２）加圧により液体を導入して減圧により液体を排出、または、（３）減圧により液体を導入して加圧により液体を排出することもできる。前記（１）の方法に使用する核酸回収用チップとしては、例えば、前記チップ本体が、前記流路の一端に、液体を導入するための第１の開口部を備え、前記流路の他端に、減圧手段と連結可能であり、且つ、液体を排出するための第２の開口部を備えることが好ましい。この核酸回収用チップは、例えば、使用時において、前記第２の開口部に減圧手段を連結し、前記減圧手段により前記流路内部を減圧して、前記液体を前記第１の開口部から前記流路内部に導入し、且つ、導入された液体を前記第２の開口部から前記流路外部に排出することが好ましい。なお、核酸回収用チップと減圧手段との連結は、直接的であっても間接的であってもよい（以下、同様）。また、前記（２）の方法に使用する核酸回収用チップとしては、例えば、前記チップ本体が、前記流路の一端に、加圧手段と連結可能であり、且つ、液体を導入するための第１の開口部を備え、前記流路の他端に、減圧手段と連結可能であり、且つ、液体を排出するための第２の開口部を備えることが好ましい。この核酸回収用チップは、例えば、使用時において、前記第１の開口部に加圧手段を連結し、前記加圧手段により液体を加圧して、前記液体を前記第１の開口部から前記流路内部に導入し、前記第２の開口部に減圧手段を連結し、前記減圧手段により前記流路内部を減圧して、導入された液体を前記第２の開口部から前記流路外部に排出することが好ましい。また、前記（３）の方法に使用する核酸回収用チップとしては、例えば、前記チップ本体が、前記流路の一端に、加圧手段と連結可能であり、且つ、液体を導入するための第１の開口部を備え、前記流路の他端に、減圧手段と連結可能であり、且つ、液体を排出するための第２の開口部を備え、使用時において、前記第２の開口部に減圧手段を連結し、前記減圧手段により前記流路内部を減圧して、前記液体を前記第１の開口部から前記流路内部に導入し、前記第１の開口部に加圧手段を連結し、前記加圧手段により前記流路を加圧して、導入された液体を前記第２の開口部から前記流路外部に排出することが好ましい。これらの形態は、例えば、液体を導入する第１の開口部を加圧手段と連結可能にしたり、液体を排出する第２の開口部を減圧手段と連結可能にする等、組合せによって適宜設定可能である。
【０１０８】
なお、前記担体として、例えば、ビーズ状等の担体を複数使用することもできる。この場合、例えば、前記流路内に前記ビーズ状担体が充填された形態があげられる。本形態においては、例えば、前記流路に前記処理液を送液することで、前記ビーズ状担体の間を前記処理液が通過し、その際に、各ビーズ状担体の表面において前記処理液中の核酸複合体が捕獲される。また、前記ビーズ状担体が、例えば、多孔質体の場合は、外側の表面だけでなく、例えば、空隙部の露出表面においても、前記核酸複合体を捕獲することが可能である。
【０１０９】
本発明の核酸回収用バイオチップは、例えば、さらに、核酸を用いた各種反応を行う反応部および検出部、前記反応に必要な試薬を収容する試薬部等を有していてもよい。具体的には、核酸回収用バイオチップ内において、前記収容部が、流路を介して、反応部と連結されていてもよいし、また、前記反応部が、流路を介して、前記試薬部ならびに検出部等と連結されていてもよい。また、予め、前記収容部に目的の反応に必要な試薬を配置してもよいし、前記収容部が、流路を介して、前記試薬部と連結されてもよい。このような形態においては、例えば、前記収容部が前記反応部となる。このように反応部および検出部等が連結されることによって、例えば、一つのバイオチップ内で、細胞試料からの核酸の回収だけでなく、回収した核酸を用いて目的の反応を行い、さらにその反応結果を測定することも可能となる。このため、本発明を、核酸を用いる各種分析、例えば、核酸増幅やＳＮＰ検出等に利用することで、従来よりもさらに簡便な分析が可能となる。また、本発明の核酸回収用チップは、流路に前記担体を配置するのみで足りることから、例えば、バイオチップの小型化も可能になる。このようなバイオチップのさらなる形態として、以下に、一例として核酸増幅用チップをあげる。
【０１１０】
＜核酸増幅用チップ＞
本発明の核酸増幅用チップは、本発明の核酸増幅物の製造方法に使用するためのチップであって、
チップ本体と担体とを有し、
前記チップ本体が、液体を導入する開口部、排液を収容する排液部、核酸増幅反応を実施する反応部、および、液体の流路を有し、
前記流路の一端が前記開口部であり、
前記流路が、前記排液部および前記反応部と連結され、
前記流路内であって、前記排液部および前記反応部との連結部よりも前記開口部側に、前記担体が配置されていることを特徴とする。本発明の核酸増幅用チップと前記本発明の核酸回収用試薬とを使用することによって、例えば、本発明の核酸試料の製造方法を利用した核酸増幅物の製造方法を実施できる。
【０１１１】
本発明の核酸増幅用チップは、前記処理液、前記細胞試料および前記処理試薬等の液体が通る流路に、前記担体を備えていればよく、その他の構成や形状は制限されない。
【０１１２】
本発明の核酸増幅用チップは、例えば、前記流路（第１の流路）に加え、第２の流路および第３の流路をさらに含み、前記反応部が、前記第２の流路によって直接または間接的に前記第１の流路と連結され、前記排液部が、前記第３の流路によって直接または間接的に前記第１の流路と連結されていてもよい。また、本発明の核酸増幅用チップは、例えば、前記排液部への液体の導入と前記反応部への液体の導入とが切り替え可能であることが好ましい。より具体的には、例えば、前記第２の流路への液体の導入と前記第３の流路への液体の導入とが切り替え可能であることにより、前記排液部への液体の導入と前記反応部への液体の導入とが切り替え可能であることがさらに好ましい。
【０１１３】
本発明において、前記担体に捕獲された前記核酸複合体からの核酸の放出ならびに増幅反応に必要な処理は、ともに加熱処理である。したがって、本発明の核酸増幅用チップによれば、例えば、温度制御手段を備える装置にセットして温度制御を行うのみで、核酸の回収ならびに増幅反応を実施することができる。
【０１１４】
このような形態の核酸増幅用チップとしては、例えば、表面に凹状の流路が形成された支持基板と、前記表面を覆うカバー基板とから形成される、いわゆるバイオチップがあげられる。本発明の核酸増幅用チップとして、バイオチップを例にあげて、図４を用いて説明する。なお、図４に示すバイオチップは、特に示さない限り、図３に示すバイオチップと同様の形態であり、また、同様にして使用できる。
【０１１５】
図４は、核酸増幅用バイオチップ（以下、「バイオチップ」という）の概略を示す模式図であり、（Ａ）は側面図、（Ｂ）は上面図、（Ｄ）は前記（Ｂ）のＡ−Ａ方向断面図である。また、同図（Ｃ）は、バイオチップを構成する支持基板２２の上面図である。同図において、図３と同一箇所には同一符号を付している。同図に示すように、バイオチップ３は、支持基板２２とカバー基板２１とを含む。支持基板２２の表面には、第１の流路２３、第１の流路２３に連結された第３の流路２７、第３の流路２７に連結された排液部２４、第１の流路２３に連結された核酸含有液（核酸試料）の収容部２５、収納部２５に連結された第２の流路３３、第２の流路３３に連結された反応部３１が、凹状の溝として形成されている。カバー基板２１は、支持基板２２の凹状の溝が形成された表面に被覆されており、これによって、流路２３の末端（図において左端）が液体の導入口２６となる。そして、流路２３内部であって、排液部２４および収容部２５との連結部（第３の流路２７との連結部）よりも導入口２６側に、担体１０が配置されている。なお、流路２３は、核酸含有液の収容部２５と第３の流路２７を介して排液部２４との両方に連結しているが、排液部２４への液体の導入と収容部２５への液体の導入とは、適宜切り替え可能である。
【０１１６】
バイオチップ３では、収容部２５に収納された核酸含有液を、例えば、さらに第２の流路３３を介して反応部３１に移動させる。そして、増幅反応に必要な試薬が反応部３１に配置されている場合は、そのまま増幅反応を開始させることができる。また、別個に試薬を収容した試薬部（図示せず）を備える場合には、例えば、試薬部内の試薬を反応部３１に送液した後、増幅反応を開始させることができる。増幅反応の検出は、例えば、反応部３１でそのまま行ってもよいし、さらに、検出部（図示せず）を備える場合は、例えば、反応部３１から反応液を検出部に送液し、前記検出部にて検出を行ってもよい。
【実施例】
【０１１７】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は下記実施例により制限されない。【０１１８】
［実施例１］
下記表２に示す各種担体（１ａおよび１ｂ）を直径２ｍｍの円形に切り抜き、これを、図５に示すように治具装置にセットした。図５は、担体をセットした治具装置の模式図である。同図において、（Ａ）が、担体をセットした治具装置の上面図、（Ｂ）が、前記（Ａ）のＩ−Ｉ方向断面図、（Ｃ）が、担体に対する液体の通過方向を示す模式図である。治具装置４は、流路２３と担体１０を有しており、流路２３の軸方向中央付近に担体１０が配置されている。具体的には、治具装置４において、担体１０は、アルミ製の凹状部材６ａの凹部に配置され、さらに、前記凹部にアルミ製の凸状部材６ｂの凸部を嵌入することによって、凹状部材６ａと凸状部材６ｂとからなるアルミブロック内に固定されている。なお、図示していないが、前記アルミブロックは、底面（同図（Ｂ）において下側の面）が露出するように、プラスチック製部材で固定されている。この治具装置４を、前記露出した底面が接触するように、ヒートブロック上に配置した。各図において矢印は、液体の進行方向を示す。同図（Ｃ）の矢印に示すように、本実施例において、液体は、担体１０の円形表面から導入され、他方の表面から排出される。【０１１９】
他方、全血５０μＬと下記表１の処理試薬１−１  ５０μＬとを混合して処理液１００μＬを準備した。前記処理液において、全血５０μＬに対して、プロテアーゼの添加量は５．４Ｕであり、界面活性剤の添加割合は０．２５体積％とした。そして、前記処理液１００μＬを、治具装置４の流路２３の一端の開口部から流路２３内部に加圧によって注入し、担体１０を通過させ、流路２３の他端の開口部から排出させた。つぎに、下記表１の洗浄液１００μＬを同様にして注入し、担体１０に通過させた後、排出した。そして、ヒートブロックにより、治具装置４内の担体１０を９６℃で５分間加熱した後、下記表１の分散媒１００μＬを同様にして注入し、担体１０に前記分散媒を通過させ、前記分散媒を排出させた。排出させた前記分散媒を核酸試料とした。【０１２０】
【表１】
0005570422.tif 000002
【０１２１】
【表２】
0005570422.tif 000003
１ａ：商品名ナイロン、ＳＥＦＡＲ社製
１ｂ：商品名ＭＦ８０Ａ、イノアックコーポレーション社製【０１２２】
回収した核酸試料について、ゲノムＤＮＡの濃度をＲｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法により測定した。また、全血５０μＬあたりのゲノムＤＮＡ量の理論値を算出し、下記式から、前記各担体によるゲノムＤＮＡの回収率を算出した。これらの結果を、前記表２にあわせて示す。
回収率（％）＝１００×（Ａ×Ｂ）／Ｃ
Ａ：核酸試料のＤＮＡ濃度
Ｂ：核酸試料の体積
Ｃ：全血５０μＬ当たりのＤＮＡ量の理論値【０１２３】
前記表２に示すように、本実施例の方法によれば、従来とは異なり、例えば、特殊な薬剤を使用することなく、簡便にゲノムＤＮＡを回収できた。また、回収した核酸試料中のゲノムＤＮＡ濃度も、５００ｃｏｐｙ／μＬ以上であり、ＰＣＲ等における必要量であることが確認できた。【０１２４】
［実施例２］
下記表３に示す各種担体（２ａ〜２ｊ）を準備した。２ｂ（織布）、２ｃ（織布）および２ｊ（不織布）の担体は、直径２ｍｍの円形に切り抜いて、厚みが１．５ｍｍとなるように積層し、円柱状の担体とした。残りの担体は、直径２ｍｍ、高さ１．５ｍｍの円柱状に切り抜いた。２ｂ、２ｃおよび２ｊの積層体および他の単層体を、それぞれ円柱状担体として、図６に示すように治具装置にセットした。図６は、前記担体をセットした治具装置の模式図である。同図において、（Ａ）が、治具装置本体と担体とを示す斜視図、（Ｂ）が本体に担体をセットした治具装置の斜視図、（Ｃ）が前記（Ｂ）の上面図、（Ｄ）が前記（Ｃ）のII−II方向断面図である。治具装置５は、直径１ｍｍの流路２３と担体配置部８とを有する本体７、および、担体１０を備え、流路２３の軸方向中央付近に、担体配置部８が設けられ、担体配置部８内に担体１０が配置されている。さらに、図示していないが、担体１０の露出面（同図（Ｄ）において上側の面）は、粘着シートで覆われている。なお、本実施例においては、図６（Ｂ）〜（Ｄ）の矢印に示すように、各種液体は、円柱状担体の側面から導入され、側面から排出される。【０１２５】
他方、全血５０μＬと前記実施例１の処理試薬１−１  ５０μＬとを混合して処理液１００μＬを準備した。そして、前記処理液１００μＬを、治具装置５の流路２３の一端の開口部から流路２３内部に加圧によって注入し、担体１０を通過させ、流路２３の他端の開口部から排出させた。つぎに、前記実施例１の洗浄液１００μＬを同様にして注入し、前記洗浄液を担体１０に通過させた後、排出した。そして、治具装置５から担体１０を取り出し、前記実施例１の分散媒１００μＬ中に浸漬させた。そして、前記各担体を９６℃で５分間加熱した。加熱後の前記分散媒を回収し、これを核酸試料とした。【０１２６】
【表３】
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２ａ：商品名ＭＡＰＳ、イノアックコーポレーション社製
２ｂ：商品名ＰＥＴ１５０−ＨＤ、ＳＥＦＡＲ社製
２ｃ：商品名９Ｐ−１５０、ＳＥＦＡＲ社製
２ｄ：商品名ＣＦＳ、イノアックコーポレーション社製
２ｅ：商品名ＭＦ５０、イノアックコーポレーション社製
２ｆ：商品名ＭＦ８０、イノアックコーポレーション社製
２ｇ：商品名８００ＥＡ、倉敷紡績株式会社製
２ｈ：商品名８０６ＥＡ、倉敷紡績株式会社製
２ｉ：商品名８５２ＥＡ、倉敷紡績株式会社製
２ｊ：商品名ＥＭ０２０１０、東レ・ファインケミカル株式会社製
ＰＰ：ポリプロピレン
ＰＥ：ポリエチレン【０１２７】
回収した核酸試料について、前記実施例１と同様に、ゲノムＤＮＡの濃度を測定し、前記各担体によるゲノムＤＮＡの回収率を算出した。これらの結果を、前記表３にあわせて示す。【０１２８】
実施例２ａの核酸試料については、ミトコンドリアＤＮＡの濃度をＲｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法により測定した。その結果、約１０５ｃｏｐｙ／μＬであった。【０１２９】
前記表３に示すように、本実施例の方法によれば、従来とは異なり、例えば、特殊な薬剤を使用することなく、簡便にゲノムＤＮＡを回収できた。回収した核酸試料中のゲノムＤＮＡ濃度も、３０００ｃｏｐｙ／μＬ以上であり、ＰＣＲ等における必要量であることが確認できた。また、ミトコンドリアＤＮＡについても、十分量を回収することができた。【０１３０】
［実施例３］
まず、全血５０μＬと前記実施例１の処理試薬１−１  ５０μＬとを混合して処理液１００μＬを準備した。他方、担体として、下記表４に示す各種担体（実施例３ａ〜３ｇ）を直径２ｍｍの円形に切り抜いた。１．５ｍＬ容量のチューブ内に、切り抜いた前記各担体と前記処理液１００μＬとを入れ、ボルテックスで混合した後、前記処理液を除去した。前記チューブ内に、前記実施例１の洗浄液１００μＬを添加し、ボルテックスで混合した後、前記洗浄液を廃棄した。そして、前記チューブから前記各担体を取り出し、新たなチューブ内に、前記実施例１の分散媒１００μＬと共に入れ、９６℃で５分間加熱した。加熱後の前記分散媒を回収し、核酸試料とした。【０１３１】
【表４】
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３ａ：商品名ＬＶ、セルポール工業社製
３ｂ：商品名ＭＡＰＳ、イノアックコーポレーション社製
３ｃ：商品名ＰＥＴ２５０−ＨＤ、ＳＥＦＡＲ社製
３ｄ：商品名ＰＥＴ１５０−ＨＤ、ＳＥＦＡＲ社製
３ｅ：商品名９Ｐ−１５０、ＳＥＦＡＲ社製
３ｆ：商品名ＣＦＳ、イノアックコーポレーション社製
３ｇ：商品名ＥＭ０２０１０、東レ・ファインケミカル株式会社製
ＰＥ：ポリエチレン
ＰＰ：ポリプロピレン【０１３２】
回収した核酸試料について、前記実施例１と同様に、ゲノムＤＮＡの濃度を測定し、前記各担体によるゲノムＤＮＡの回収率を算出した。これらの結果を、前記表４にあわせて示す。【０１３３】
前記表４に示すように、本実施例の方法によれば、従来とは異なり、例えば、特殊な薬剤を使用することなく、簡便にゲノムＤＮＡを回収できた。また、回収した核酸試料中のゲノムＤＮＡ濃度も、１５００ｃｏｐｙ／μＬ以上であり、ＰＣＲ等における必要量であることが確認できた。【０１３４】
［実施例４］
１．５ｍＬ容量のチューブ内で、全血５０μＬと前記実施例１の処理試薬１−１  ５０μＬとを混合して処理液１００μＬを準備した。前記チューブに、さらに、担体として、下記表５に示す各種磁性ビーズ（実施例４ａおよび４ｂ）を総量１ｍｇ添加して、ボルテックスで混合した。磁石で前記磁性ビーズを回収して、前記チューブ内の前記処理液を除去し、前記チューブ内に、回収した前記磁性ビーズと前記実施例１の洗浄液１００μＬとを入れ、ボルテックスで混合し、再度、前記磁性ビーズを回収して、前記洗浄液を除去した。そして、前記チューブに、回収した前記磁性ビーズと前記実施例１の分散媒１００μＬとを入れ、ボルテックスで混合し、９６℃で５分間加熱した。加熱後、前記チューブを遠心分離に供して前記磁性ビーズを除去し、前記分散媒を回収した。これを核酸試料とした。【０１３５】
【表５】
0005570422.tif 000006
４ａおよび４ｂ：商品名ｍｉｃｒｏｍｅｒ（商標）Ｍ、
ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製
ＰＳ：ポリスチレン【０１３６】
回収した核酸試料について、前記実施例１と同様に、ゲノムＤＮＡの濃度を測定し、前記各担体によるゲノムＤＮＡの回収率を算出した。これらの結果を、前記表５にあわせて示す。【０１３７】
前記表５に示すように、本実施例の方法によれば、従来とは異なり、例えば、特殊な薬剤を使用することなく、簡便にＤＮＡを回収できた。また、回収した核酸試料中のＤＮＡ濃度も、４００ｃｏｐｙ／μＬ以上であり、ＰＣＲ等における必要量であることが確認できた。【０１３８】
［参考例１］
全血を本発明の核酸回収用試薬（処理試薬）で処理して、フィルター状の担体に保持される核酸複合体を確認した。【０１３９】
全血１０μＬと下記表６の処理試薬１０μＬとを混合して処理液２０μＬを準備した。担体としては、目開き１００μｍのフィルター（商品名ナイロンメッシュ；ＳＥＦＡＲ社製）を使用した。この処理液２０μＬを、前記実施例１と同様にして、前記担体に通過させた。そして、前記担体を、常法に従ってギムザ染色し、光学顕微鏡で観察した。この結果を、図７に示す。同図の光学顕微鏡写真において、矢印で示すように、直径約２００μｍ程度の紫色で染色された核酸複合体が、担体に付着していることが確認された。【０１４０】
【表６】
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【０１４１】
［実施例５］
全血からのＲＮＡの回収
担体として、商品名ＭＦ−８０Ａ（イノアックコーポレーション社製）を使用した。この担体を直径２ｍｍの円形に切り抜き、前記実施例１と同様にして治具装置にセットした。他方、異なる検体から三種類の全血（新鮮血）を準備し、各全血５０μＬと下記表７の処理試薬５−１  ５０μＬとを混合して処理液１００μＬを調製した。前記処理液において、全血５０μＬに対して、プロテアーゼの添加量は１．３５Ｕであり、界面活性剤の添加割合は０．２５体積％である。そして、下記表７の洗浄液および分散媒を使用した以外は、前記実施例１と同様にして、核酸試料を調製した。回収した核酸試料について、One  Step  SYBR  Prime  Script  RT-PCR  Kit  II（TAKARA）およびβ−アクチン用の下記プライマーセットを用いて、ＲＮＡの定量を行った。コントロールとして、同一の全血からQIAamp  RNA  Blood  Mini（QIAGEN社製）を用いて精製した核酸試料についても、同様にＲＮＡの定量を行った。そして、コントロールの回収ＲＮＡ量を１００％とした場合の、本実施例の回収ＲＮＡ量の相対値（％）を求めた。【０１４２】
【表７】
0005570422.tif 000008
【０１４３】
その結果、三種類の検体についての結果は、それぞれ５．６％、１２．３％、７．２％であった。この回収率は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲの鋳型としては十分量である。したがって、本実施例によれば、従来とは異なり、特殊な薬剤を使用することなく、簡便に必要量のＲＮＡを回収することができた。【０１４４】
［実施例６］
唾液からのゲノムＤＮＡの回収
まず、唾液１００μＬ（ヒト核酸含有細胞数：約150,000個）と下記表８の各処理試薬１００μＬとを混合して処理液２００μＬを準備した。前記処理液において、唾液５０μＬに対して、プロテアーゼの添加量は１Ｕであり、界面活性剤の添加割合は０．５体積％、１体積％、２体積％である。他方、担体として、孔径６０μｍのＰＥＴ製メッシュ状織布（サンフラテック社製、メッシュサイズ６０μｍ）を使用した。この担体を直径３．５ｍｍの円形に切り抜き、図１に示すピペットチップ（容量２００μＬ）内部に装着した（有効径２．２ｍｍ）。前記有効径とは、前記ピペットチップ内部に装着した前記担体において、実際に通液可能な直径を意味する。このピペットチップをピペッターに装着し、前記処理液２００μＬを吸引吐出した後、前記実施例１の洗浄液２００μＬの吸引吐出を行った。再度、新たな前記洗浄液２００μＬを吸引吐出した後、前記ピペットチップから担体を取り出した。この担体を前記実施例１の分散媒１００μＬに浸漬し、９５℃で５分間加熱することで、核酸試料を得た。これらの核酸試料について、前記実施例１と同様にして、ゲノムＤＮＡの濃度を測定した。これらの結果を、下記表８にあわせて示す。【０１４５】
【表８】
0005570422.tif 000009
【０１４６】
前記表８に示すように、本実施例の方法によれば、唾液についても、ＰＣＲの鋳型として十分量である３０００ｃｏｐｙ／μＬ程度のゲノムＤＮＡを回収できた。【０１４７】
［実施例７］
口腔粘膜細胞からのゲノムＤＮＡの回収
まず、綿棒（1P1501V、日本綿棒製)で頬の内側を左右それぞれ１０回、円を描くようにこすり、下記表９の各処理試薬２００μＬに混合して処理液２００μＬ（ヒト核酸含有細胞数：約250,000個）を準備した。前記処理液において、口腔粘膜細胞懸濁液５０μＬに対して、プロテアーゼの添加量は１Ｕであり、界面活性剤の添加量は０．５体積％、１体積％、２体積％である。他方、前記実施例６における担体を装着したピペットチップを用いて、同様にして、核酸試料を調製した。これらの核酸試料について、前記実施例１と同様にして、ゲノムＤＮＡの濃度を測定した。これらの結果を、下記表９にあわせて示す。【０１４８】
【表９】
0005570422.tif 000010
【０１４９】
前記表９に示すように、本実施例の方法によれば、口腔粘膜細胞についても、ＰＣＲの鋳型として十分量である１０００〜２０００ｃｏｐｙ／μＬ程度のゲノムＤＮＡを回収できた。【０１５０】
［実施例８］
培養細胞からのゲノムＤＮＡの回収
まず、アジア人由来正常臍帯静脈血管内皮細胞（KJB-110、DS  PHARMA  BIOMEDICAL）の培養細胞懸濁液を、生理食塩水で洗浄して培地成分を除去し、前記培養細胞を１×１０３ｃｅｌｌｓ／μＬになるように生理食塩水に懸濁した。前記培養細胞懸濁液１００μＬ（核酸含有細胞数：約１×１０５個）を、下記表１０の各処理試薬１００μＬに混合して処理液２００μＬを準備した。前記処理液において、培養細胞懸濁液５０μＬに対して、プロテアーゼの添加量は１Ｕであり、界面活性剤の添加割合は０．５体積％、１体積％、２体積％とした。他方、前記実施例６における担体を装着したピペットチップを用いて、同様にして、核酸試料を調製した。これらの核酸試料について、前記実施例１と同様にして、ゲノムＤＮＡの濃度を測定した。これらの結果を、下記表１０にあわせて示す。【０１５１】
【表１０】
0005570422.tif 000011
【０１５２】
前記表１０に示すように、本実施例の方法によれば、培養細胞についても、ＰＣＲの鋳型として十分量である数百ｃｏｐｙ／μＬ程度のゲノムＤＮＡを回収できた。【０１５３】
［実施例９］
大腸菌からのプラスミドＤＮＡの回収
まず、ＩＡＰＰ（膵島アミロイドペプチド）配列を組み込んだプラスミドＤＮＡを有する大腸菌を、ＬＢ培地で１２時間培養した後、培養液１００μＬ（核酸含有細胞数：約１×１０７個）を以下の各処理試薬１００μＬに混合して、処理液２００μＬを準備した。なお、下記表１１の処理試薬９−１で処理する大腸菌は、培養後、培養液のまま−８０℃で凍結し、使用時に２５℃で融解させた後、同様にして前記処理試薬９−１と混合した。前記処理液において、培養細胞懸濁液５０μＬに対して、プロテアーゼの添加量は、０、１Ｕであり、界面活性剤の添加割合は、０体積％、０．５体積％、１体積％、２体積％である。他方、前記実施例６における担体を装着したピペットチップを用いて、同様にして、核酸試料を調製した。これらの核酸試料について、前記実施例１と同様にして、プラスミドＤＮＡの濃度を測定した。また、これらの核酸試料について、２６０ｎｍの吸光度測定から、ゲノムＤＮＡの濃度を測定した。これらの結果を、下記表１１にあわせて示す。【０１５４】
【表１１】
0005570422.tif 000012
【０１５５】
前記表１１に示すように、本実施例の方法によれば、大腸菌の培養細胞についても、ＰＣＲの鋳型として十分量である約５０万ｃｏｐｙ／μＬ程度のプラスミドＤＮＡ、約３万ｃｏｐｙ／μＬのゲノムＤＮＡをそれぞれ回収できた。また、各処理試薬９−１を使用した結果から、大腸菌の培養細胞を凍結融解することによって、プロテアーゼおよび界面活性剤を使用することなく、同定度のプラスミドＤＮＡならびにゲノムＤＮＡを回収できることがわかった。【０１５６】
［実施例１０］
全血からのゲノムＤＮＡの回収
まず、４℃で７０日間冷蔵保存した全血１００μＬ、および、−３０℃で９カ月間凍結保存後、融解した全血１００μＬを、それぞれ、下記表１２の各処理試薬１００μＬに混合して処理液２００μＬを準備した。前記冷蔵保存全血１００μＬ中の核酸含有細胞数は、約580,000個であり、前記凍結融解全血１００μＬ中の核酸含有細胞数は、約560,000個であった。前記処理液において、全血５０μＬに対して、プロテアーゼの添加量は１Ｕ、２Ｕであり、界面活性剤は無添加である。他方、前記実施例６における担体を装着したピペットチップを用いて、同様にして、核酸試料を調製した。これらの核酸試料について、前記実施例１と同様にして、ゲノムＤＮＡの濃度を測定した。これらの結果を、下記表１２にあわせて示す。【０１５７】
【表１２】
0005570422.tif 000013
【０１５８】
前記表１２に示すように、本実施例の方法によれば、全血を冷蔵保存または凍結融解することによって、界面活性剤を使用することなしに、ＰＣＲの鋳型として十分量であるゲノムＤＮＡを回収できた。【０１５９】
［実施例１１］
１．新鮮血からのゲノムＤＮＡの回収
冷蔵または冷凍保存していない採血当日の新鮮全血を、以下に示す種々の条件で処理した後、ゲノムＤＮＡの回収を行った。前記新鮮全血の白血球数は、約５，５００個／μＬであった。【０１６０】
チューブ内に、５０μＬの下記表１３の処理試薬６と５０μＬの新鮮全血とを入れ、処理液を調製した。なお、前記処理試薬６におけるプロテアーゼおよび界面活性剤の濃度は、下記表１４に示す。また、前記処理液におけるプロテアーゼおよび界面活性剤の濃度は、下記表１４の濃度の１／２である（以下、同様）。他方、担体として、孔径１０５μｍのＰＥＴ製メッシュ状織布（商品名ＰＥＴ１０５、ＳＥＦＡＲ社製、メッシュサイズ１０５μｍ）を準備した。この担体を直径２．５ｍｍの円形に切り抜き、図１に示すピペットチップ（容量２００μＬ）内部に装着した（有効径１．４ｍｍ）。このピペットチップをピペッターに装着し、前記処理液１００μＬの吸引吐出を２０回行い、前記処理液を吐出した。続いて、新たなチューブに洗浄液１（２５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ水溶液）１００μＬを入れ、前記ピペットチップを用いて吸引吐出を１０回行い、前記洗浄液１を吐出した。さらに、新たなチューブに洗浄液２（０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡおよび１ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）１００μＬを入れ、前記ピペットチップへの吸引吐出を１０回行い、前記洗浄液２を吐出した後、前記ピペットチップから担体を取り出した。この担体を、分散媒（０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡおよび１ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）１００μＬに浸漬し、その状態で、５分間９５℃で処理することで、核酸試料を得た。これらの核酸試料について、前記実施例１と同様にして、ゲノムＤＮＡの濃度を測定した。これらの結果を、下記表１４にあわせて示す。なお、プロテアーゼおよび界面活性剤を含む処理試薬を使用した例を実施例Ａ１〜Ａ６、いずれか一方または両方が無添加である処理試薬を使用した例を比較例Ａ１〜Ａ３とした。
【表１３】
0005570422.tif 000014
【０１６１】
【表１４】
0005570422.tif 000015
【０１６２】
前記表１４に示すように、本実施例によれば、新鮮全血から、ＰＣＲの鋳型として十分量である約１００ｃｏｐｙ／μＬ程度のゲノムＤＮＡをそれぞれ回収できた。これに対して、プロテアーゼおよび界面活性剤を添加していない比較例Ａ１、いずれか一方を添加していない比較例Ａ２およびＡ３については、ＤＮＡがほとんど回収できなかった。【０１６３】
２．冷蔵血からのゲノムＤＮＡの回収
２ヵ月間冷蔵保存した全血を、以下に示す種々の条件で処理した後、ゲノムＤＮＡの回収を行った。前記冷蔵血の白血球数は、約６，９００個／μＬであった。【０１６４】
前記処理試薬６におけるプロテアーゼおよび界面活性剤の濃度を下記表１５に示す濃度とした以外は、前記新鮮全血と同様にしてゲノムの回収ならびに測定を行った。【０１６５】
【表１５】
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【０１６６】
前記表１５の実施例Ｂ１に示すように、冷蔵血であれば、界面活性剤無添加且つプロテアーゼを含む処理試薬で処理した後、前述のように加熱処理することで、ＰＣＲの鋳型として十分量であるゲノムＤＮＡを回収できた。このように、全血を冷蔵保存した場合は、前記処理試薬が界面活性剤を含有しなくても、効率良くＤＮＡを回収できることがわかった。また、前記表１５の実施例Ｂ２に示すように、前記処理試薬が、プロテアーゼの他に、さらに界面活性剤を含むことによって、より一層ゲノムＤＮＡの回収率を向上できることがわかった。これに対して、前記表１５に示すように、プロテアーゼおよび界面活性剤を添加していない比較例Ｂ１については、ＤＮＡがほとんど回収できなかった。【０１６７】
３．凍結血からのゲノムＤＮＡの回収
−３０℃で２時間凍結保存した全血を、室温解凍して以下に示す種々の条件で処理した後、ゲノムＤＮＡの回収を行った。前記凍結血の白血球数は、約５，５００個／μＬであった。【０１６８】
前記処理試薬６におけるプロテアーゼおよび界面活性剤の濃度を下記表１６に示す濃度とした以外は、前記新鮮全血と同様にしてゲノムの回収ならびに測定を行った。【０１６９】
【表１６】
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【０１７０】
前記表１６の実施例Ｃ１に示すように、凍結融解後の全血であれば、界面活性剤およびプロテアーゼが無添加であっても、前述のように加熱処理することで、ＰＣＲの鋳型として十分量であるゲノムＤＮＡを回収できた。また、実施例Ｃ２およびＣ３に示すように、プロテアーゼを含有する処理試薬を使用することによって、ＤＮＡの回収率を向上でき、さらに、実施例Ｃ４に示すように、プロテアーゼと界面活性剤とを含む処理試薬を使用することで、より一層ＤＮＡの回収率を向上できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１７１】
以上のように、本発明によれば、例えば、特殊な試薬を使用することなく、簡便に核酸を回収することができる。さらに、本発明によれば、優れた効率で細胞からの核酸回収が可能であり、例えば、ゲノムＤＮＡやＲＮＡ以外に、ミトコンドリアＤＮＡの回収も可能である。このように、本発明は、安全性ならびに操作性に優れ、且つ、核酸の回収率も優れることから、例えば、少量の細胞試料からでも、核酸増幅等に必要な鋳型核酸を十分量回収することができる。さらに、このように少量の細胞試料からの回収を簡便な操作で行うことが可能であることから、例えば、近年注目されているマイクロチップやマイクロタス等を用いた核酸回収や核酸増幅にも有用といえる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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