(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
他の立体異性体に比べて、少なくとも９０重量％のパーセント光学純度を有する、以下の構造式：
【化１】
0005570590.tif 000059
で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を含有してなる、虚血障害または虚血−再灌流障害を治療するための医薬組成物。
【請求項２】
前記薬学的に許容される塩が、一価のカチオンまたは二価のカチオンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記一価のカチオンが一価の金属カチオンであり、前記二価のカチオンが二価の金属カチオンである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
以下の構造式：
【化２】
0005570590.tif 000060
で表され、他の立体異性体に比べて、少なくとも９０重量％のパーセント光学純度を有する化合物を含有してなる、虚血障害または虚血−再灌流障害を治療するための医薬組成物。
【請求項５】
該化合物が少なくとも９９重量％のパーセント光学純度を有する、請求項１〜４いずれかに記載の組成物。
【請求項６】
薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤をさらに含む、請求項１〜５いずれかに記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年５月１４日にファイルされた米国特許出願第１２／４６６，１７０号の一部継続出願である。上記出願の教示内容全体を本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００２】
米国では、男女ともに死因の第一位が心血管疾患である。米国だけでも毎年１００万人を超える数の人々が心臓発作に見舞われている。血流減少と心筋（ｈｅａｒｔ  ｍｕｓｃｌｅ）すなわち心筋（ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ）への酸素量の減少を特徴とする症状である心虚血が、最終的に心臓発作すなわち心筋梗塞を引き起こしかねない心血管疾患の顕著な特徴のひとつである。また、心血管疾患は身体の他の部分への血流減少と酸素供給量の低下を招くことがあり、これのために脳をはじめとする各種臓器および組織の虚血障害を生じて脳卒中の引き金になる場合もある。
【０００３】
虚血エピソード後の患部での血流の回復すなわち再灌流と再酸素負荷は、不可逆的な損傷を抑える上で重要なものである。しかしながら、再灌流には、再灌流障害などの有害な結果を伴う可能性もある。これは、虚血エピソード後の冠動脈血流の回復によって引き起こされ、再灌流時の活性酸素種および窒素種の生成と蓄積から生じるものである。虚血・再灌流障害は、生化学的に、虚血性イベントにおける酸素の枯渇、その結果として生じる細胞内カルシウムレベルの増加、つづく再酸素化とこれに不随する再灌流時の活性酸素種の生成を特徴とする（Ｐｉｐｅｒ，  Ｈ．  Ｍ．，  Ａｂｄａｌｌａｈ，  Ｃ．，  Ｓｃｈａｆｅｒ，  Ｃ．，  Ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｍｉｎｕｔｅｓ  ｏｆ  ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ：  ａ  ｗｉｎｄｏｗ  ｏｆ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｙ  ｆｏｒ  ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ．  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ２００３，  ７５：６４４；  Ｙｅｌｌｏｎ，  Ｄ．  Ｍ．，  Ｈａｕｓｅｎｌｏｙ，  Ｄ．  Ｊ．，  Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ．    Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００７，  ３５７：１１２１）。再灌流障害は、心筋梗塞後の心臓に対する障害の５０％という大きな割合を占めることがある（Ｙｅｌｌｏｎ，  Ｄ．  Ｍ．，  Ｈａｕｓｅｎｌｏｙ，  Ｄ．  Ｊ．，  Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ．  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００７，  ３５７：１１２１）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
米国ならびに世界中における心血管疾患の有病率のために、心臓発作または脳卒中に起因する虚血および虚血・再灌流障害を効果的に予防、軽減またはこれに対抗できる治療法および治療薬の開発が必要になっている。機械的な虚血プレコンディショニングなどの心筋梗塞によって生じる虚血および虚血・再灌流障害を治療するための現行の治療法は臨床的に非実用的であることが分かっているのに対し、カルシウム流入を遮断するアンタゴニストや活性酸素種のスカベンジャーなどを用いる他の治療法では、期待はずれの臨床転帰が生じてしまっている（Ｏｔａｎｉ，  Ｈ．，  Ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ：  Ｆｒｏｍ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｔｏ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ．  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ  ＆  Ｒｅｄｏｘ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，  ２００８，  １０：２０７；  Ｙｅｌｌｏｎ，  Ｄ．  Ｍ．，  Ｈａｕｓｅｎｌｏｙ，  Ｄ．  Ｊ．，  Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ．  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００７，  ３５７：１１２１）。
【０００５】
よって、心血管疾患および他の症状に起因する虚血および虚血再灌流障害を治療するための新規かつ一層効果的な治療法および治療剤にはかなりの需要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の開示
本明細書に記載した本発明は、アポトーシスを阻害する細胞シグナル伝達経路に関与するキナーゼを活性化させ、活性酸素種を捕捉することによって、心筋虚血および虚血・再灌流障害をはじめとする虚血、虚血障害および虚血・再灌流障害を治療する必要性に言及したものである。特に、本発明は、ここに開示の化合物またはそれらの薬学的に許容される塩を含む組成物ならびに、細胞保護キナーゼの活性化因子としてのその効果的な用途に関する。
【０００７】
一実施形態では、本発明は、構造式Ｉ
【化１】
0005570590.tif 000002
（式中、Ｒ１およびＲ２は各々独立に、Ｈまたは加水分解可能な基である）で表される実質的に純粋な化合物またはその薬学的に許容される塩を含む組成物に関する。
【０００８】
もうひとつの実施形態では、本発明は、構造式ＩＩ
【化２】
0005570590.tif 000003
で表される実質的に純粋な化合物またはその薬学的に許容される塩を含む組成物に関する。
【０００９】
別の実施形態では、本発明は、構造式ＩＩＩ
【化３】
0005570590.tif 000004
で表される実質的に純粋な化合物を含む組成物に関する。
【００１０】
もうひとつの実施形態では、本発明は、ｉ）薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤と、ｉｉ）構造式Ｉ
【化４】
0005570590.tif 000005
（式中、Ｒ１およびＲ２は各々独立に、Ｈまたは加水分解可能な基である）で表される実質的に純粋な化合物またはその薬学的に許容される塩と、を含む、組成物に関する。
【００１１】
他の実施形態では、本発明は、細胞に、構造式Ｉ
【化５】
0005570590.tif 000006
（式中、Ｒ１およびＲ２は各々独立に、Ｈまたは加水分解可能な基である）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効量で接触させることを含む、細胞中において少なくとも１種類の細胞保護キナーゼ（Ａｋｔキナーゼ、ＩＲＫキナーゼ、ＩＧＦ１Ｒキナーゼ、Ｓｒｃキナーゼなど）を活性化する方法に関する。特定の実施形態では、細胞保護キナーゼが、Ａｋｔキナーゼであるか、あるいはＡｋｔキナーゼと同じ細胞シグナル伝達経路で機能するキナーゼ（ＩＲＫキナーゼなど）である。
【００１２】
もうひとつの実施形態では、本発明は、被検体に、構造式Ｉ
【化６】
0005570590.tif 000007
（式中、Ｒ１およびＲ２は各々独立に、Ｈまたは加水分解可能な基である）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効量で投与することを含む、哺乳類の被検体において虚血または虚血・再灌流障害を治療する方法に関する。特定の実施形態では、虚血または虚血・再灌流障害が、心筋虚血または虚血・再灌流障害である。
【００１３】
さらに別の実施形態では、本発明は、被検体に、構造式Ｉ
【化７】
0005570590.tif 000008
（式中、Ｒ１およびＲ２は各々独立に、Ｈまたは加水分解可能な基である）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効量で投与することを含む、被検体においてアポトーシスを阻害する方法に関する。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、被検体に、構造式Ｉ
【化８】
0005570590.tif 000009
（式中、Ｒ１およびＲ２は各々独立に、Ｈまたは加水分解可能な基である）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効量で投与することを含む、被検体において細胞質カルシウム過負荷を予防する方法に関する。
【００１５】
もうひとつの実施形態では、本発明は、被検体に、構造式Ｉ
【化９】
0005570590.tif 000010
（式中、Ｒ１およびＲ２は各々独立に、Ｈまたは加水分解可能な基である）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効量で投与することを含む、被検体（虚血のある被検体など）においてペルオキシルラジカルの吸収度を高める方法に関する。
【００１６】
もうひとつの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の化合物を複数用量投与することを含む、哺乳類の被検体において虚血、虚血障害または虚血・再灌流障害を治療する方法を提供するものである。特定の実施形態では、本発明は、被検体に、以下の構造式
【化１０】
0005570590.tif 000011
で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を、少なくとも２用量で投与することを含む、虚血障害または虚血・再灌流障害の治療を必要とする被検体においてそれを治療する方法に関し、この化合物のＲ１およびＲ２は各々独立に、Ｈまたは加水分解可能な基であり、なおかつこの化合物またはその薬学的に許容される塩が、少なくとも９０％エナンチオマー的に純粋である。この方法は、非最終用量の化合物またはその薬学的に許容される塩と、最終用量の化合物またはその薬学的に許容される塩とを、被検体に投与することを含む。本明細書で説明するように、最終用量を障害の直前に投与し、非最終用量および最終用量を、化合物の単一用量投与に関連する障害を治療するための化合物の有効性を高める投与間隔で投与する。
【００１７】
さらに別の実施形態では、本発明は、被検体に、以下の構造式
【化１１】
0005570590.tif 000012
で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を少なくとも２用量で投与することを含む、虚血障害または虚血・再灌流障害の治療を必要とする被検体においてそれを治療するための方法を提供するものであり、この化合物のＲ１およびＲ２は各々独立に、Ｈまたは加水分解可能な基であり、なおかつこの化合物またはその薬学的に許容される塩が、少なくとも９０％エナンチオマー的に純粋である。この方法は、非最終用量の化合物またはその薬学的に許容される塩と、最終用量の化合物またはその薬学的に許容される塩とを被検体に投与することを含む。本明細書で説明するように、最終用量を障害前に化合物の約２半減期以内の時点で被検体に投与し、非最終用量を最終用量の投与前に化合物の少なくとも約４半減期の時点で被検体に投与する。
【００１８】
本明細書に記載の化合物および方法は、虚血、虚血障害および虚血・再灌流障害の治療時に予想外に有効である。特に、「Ｒ」配置でリポイル部分を有する本発明の化合物は、各々をエナンチオマー的に純粋な化合物として与えたときにラセミ混合物よりもｉｎ  ｖｉｖｏにて強力であり、さらに、リポイル部分を「Ｓ」配置で有するその立体異性体な相手よりも一層有効であった。また、被検体で薬剤の一定の血漿濃度を維持するために複数用量の薬剤を被検体に一定間隔で投与する（経口投与で４時間ごとまたは１２時間ごとなど）と、通常はその有効性が持続することが標準的な薬学的プロトコールで十分に許容されてはいるが、複数用量の本発明の化合物を本明細書に記載の用量および時間間隔で投与すると、虚血、虚血障害および虚血・再灌流障害を治療するための権利請求された化合物の有効性が持続するだけでなく、その有効性が増大する。特に、本明細書で説明するように、権利請求された化合物を、次の用量の投与前に当該権利請求された化合物の血漿濃度が化合物の初期の最大濃度よりもかなり低い値まで減少可能な投与間隔で複数用量投与することは、標準的な製剤プロトコール上での経験とは相容れないが、化合物の有効性についての想定外の相乗が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨおよび関連の化合物の潜在的な作用機序の説明となる提案された細胞シグナル伝達経路を示す図である。
【図２】さまざまな濃度でのＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨおよびＲＬｉｐ−ＯＨが、Ａ５４９細胞におけるＡｋｔリン酸化レベルに対しておよぼす作用を示すグラフである。データは、リン酸化Ａｋｔと全Ａｋｔとのバックグラウンド除去比の平均±ｓｅｍ（Ｎ＝４）として示してある。
【図３】さまざまな濃度のＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨが、Ａ５４９細胞単独または周知のホスホチジルイノシトール−３’−キナーゼインヒビターであるＬＹ２９４００２の存在下でのＡｋｔリン酸化のレベルに対しておよぼす作用を示すグラフである。データは、リン酸化Ａｋｔと全Ａｋｔとのバックグラウンド除去比の平均±ｓｅｍ（Ｎ＝４）として示してある。
【図４】チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞においてさまざまな濃度のＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨ、Ａｃ−ＥＡ−ＯＨ、ＲＬｉｐ−ＯＨがカルシウム流動に対しておよぼす作用を示すグラフである。データは、緩衝液のみの対照に対するパーセンテージとして、細胞質カルシウムレベルを測定する平均±ｓｅｍ（Ｎ＝４）として示してある。
【図５】心筋虚血・再灌流障害のラットモデルにおけるＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨの有効性を示すグラフである。データは、心筋梗塞の大きさを危険のある総面積で割った比（ＭＩ／ＡＲ）として示してある。結果は、ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨを１ｍｇ／ｋｇ（Ｎ＝６４）心臓内注射で処理した動物対生理食塩水ビヒクルで処理した動物のメタ解析を示す（Ｎ＝５４）。ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨで処理した動物は、生理食塩水ビヒクルを与えられた動物に比して危険のあるエリアに対する梗塞巣（死組織）の比が有意に（ｐ＜０．００１）低下（３３％）した。
【図６】心虚血・再灌流障害のラットモデルにおいてＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨを１ｍｇ／ｍＬで心臓内投与するタイミングが心筋損傷の低減に対しておよぼす作用を示すグラフである。データは、心筋梗塞の大きさを危険のある総面積で割った比（ＭＩ／ＡＲ）として示してあり、平均±ｓｅｍ（Ｎ＝１２〜１５／群）として表示してある。結果は、ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨで処理すると、閉塞の１５分前に生理食塩水ビヒクルを与えられた動物と比較して、閉塞の１５分前（閉塞前、３８％）、閉塞の１５分後（閉塞時、２４％）、再灌流後１分以内（再灌流時、３２％）で、心筋組織死が有意に（ｐ＜０．０５）減少することを示している。
【図７】心筋虚血・再灌流障害のラットモデルにおいて異なる用量のＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨがおよぼす作用を示すグラフである。閉塞の１５分前に静脈内（ＩＶ）または左心室内心臓（ＩＣ）投与によってＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨを投与した。データは、心筋梗塞の大きさを危険のある総面積で割った比（ＭＩ／ＡＲ）として示してあり、平均±ｓｅｍ（Ｎ＝１０〜１２／群）として表示してある。結果は、ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨで処理すると、心筋組織死が有意に（ｐ＜０．０５）減少することを示しており、用量依存的であった。
【図８】心筋虚血・再灌流障害のラットモデルで評価した、静脈内投与したＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨの異なる単一用量および複数用量での投与計画のｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性を比較したグラフである。
【図９Ａ】ヒト平均血漿ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨ濃度対時間データを線形目盛でプロットしたグラフである。
【図９Ｂ】ヒト平均血漿ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨ濃度対時間データを片対数目盛でプロットしたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
定義
「アルキル」という用語は、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖状または分枝状鎖の炭化水素ラジカルを意味し、たとえば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシルなどを含む。
【００２１】
「シクロアルキル」という用語は、３〜１０個の炭素原子を有する単環、二環または三環の飽和炭化水素環を意味し、たとえば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、ビシクロ［２．２．２］オクチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、スピロ［４．４］ノナン、アダマンチルなどを含む。
【００２２】
「アリール」という用語は、フェニル基、ナフチル基、インダニル基またはテトラヒドロナフタレン基である芳香族ラジカルを意味する。アリール基は、１〜４個の置換基で場合により置換されていてもよい。例示的な置換基としては、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルホニル、ハロゲン、トリフルオロメチル、ジアルキルアミノ、ニトロ、シアノ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯＮＨ２、Ｎ−モノアルキル置換アミドおよびＮ，Ｎ−ジアルキル置換アミドがあげられる。
【００２３】
「ヘテロアリール」という用語は、Ｎ、Ｏ、Ｓから選択される０〜４個のヘテロ原子を含む飽和または不飽和の環に融合されていてもよい５員環または６員環の複素芳香族ラジカルを意味し、たとえば、２−チエニルまたは３−チエニル、２−フラニルまたは３−フラニル、２−ピロリルまたは３−ピロリル、２−ピリジル、３−ピリジルまたは４−ピリジル、２−ピラジニル、２−ピリミジニル、４−ピリミジニルまたは５−ピリミジニル、３−ピリダジニルまたは４−ピリダジニル、１Ｈ−インドール−６−イル、１Ｈ−インドール−５−イル、１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル、１Ｈ−ベンズイミダゾール−５−イル、２−キナゾリニル、４−キナゾリニル、５−キナゾリニル、６−キナゾリニル、７−キナゾリニルまたは８−キナゾリニル、２−キノキサリニル、３−キノキサリニル、５−キノキサリニル、６−キノキサリニル、７−キノキサリニルまたは８−キノキサリニル、２−キノリニル、３−キノリニル、４−キノリニル、５−キノリニル、６−キノリニル、７−キノリニルまたは８−キノリニル、１−イソキノリニル、３−イソキノリニル、４−イソキノリニル、５−イソキノリニル、６−イソキノリニル、７−イソキノリニルまたは８−イソキノリニル、２−チアゾリル、４−チアゾリルまたは５−チアゾリル、２−ピラゾリル、３−ピラゾリル、４−ピラゾリルまたは５−ピラゾリル、２−イミダゾリル、３−イミダゾリル、４−イミダゾリルまたは５−イミダゾリルである複素芳香族ラジカルを含む。ヘテロアリールは、場合により置換されていてもよい。例示的な置換基としては、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルホニル、ハロゲン、トリフルオロメチル、ジアルキルアミノ、ニトロ、シアノ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯＮＨ２、Ｎ−モノアルキル置換アミドおよびＮ，Ｎ−ジアルキル置換アミドがあげられ、あるいは、Ｎ−オキシドを形成するオキソによるものがあげられる。
【００２４】
「ヘテロシクリル」という用語は、Ｎ、Ｏ、Ｓから独立に選択される１〜４個のヘテロ原子を含む、４員環、５員環、６員環または７員環の飽和または部分的に不飽和の複素環を意味する。例示的なヘテロシクリルとしては、ピロリジン、ピロリジン−２−オン、１−メチルピロリジン−２−オン、ピペリジン、ピペリジン−２−オン、２−ピリドン、４−ピリドン、ピペラジン、１−（２，２，２−トリフルオロエチル）ピペラジン、ピペラジン−２−オン、５，６−ジヒドロピリミジン−４−オン、ピリミジン−４−オン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、テトラヒドロチオフェン、テトラヒドロチオピラン、イソオキサゾリジン、１，３−ジオキソラン、１，３−ジチオラン、１，３−ジオキサン、１，４−ジオキサン、１，３−ジチアン、１，４−ジチアン、オキサゾリジン−２−オン、イミダゾリジン−２−オン、イミダゾリジン−２，４−ジオン、テトラヒドロピリミジン−２（１Ｈ）−オン、モルホリン、Ｎ−メチルモルホリン、モルホリン−３−オン、１，３−オキサジナン−２−オン、チオモルホリン、チオモルホリン１，１−ジオキシド、テトラヒドロ−１，２，５−チアオキサゾール１，１−ジオキシド、テトラヒドロ−２Ｈ−１，２−チアジン１，１−ジオキシド、ヘキサヒドロ−１，２，６−チアジアジン１，１−ジオキシド、テトラヒドロ−１，２，５−チアジアゾール１，１−ジオキシド、イソチアゾリジン１，１−ジオキシドがあげられる。ヘテロシクリルは、１〜４個の置換基で場合により置換されていてもよい。例示的な置換基としては、アルキル、ハロアルキル、オキソがあげられる。
【００２５】
ここに開示の化合物のいくつかは、さまざまな立体異性体形態で存在し得る。立体異性体とは、その空間配置だけが異なる化合物である。最も多くはキラル中心として作用する非対称に置換された炭素原子を含むために互いに重ねることができない鏡像関係にある立体異性体の対が、エナンチオマーである。「エナンチオマー」とは、互いに鏡像関係にある一対の分子の片方を意味し、重ねることができない。最も多くは非対称に置換された炭素原子を２つ以上含むために鏡像関係にはならない立体異性体が、ジアステレオマーである。構造式における記号「＊」は、キラル炭素中心の存在を示す。「Ｒ」および「Ｓ」は、１個以上のキラル炭素原子周囲の置換基の配置を示す。よって、「Ｒ＊」および「Ｓ＊」は、１個以上のキラル炭素原子周囲の置換基の相対配置を示す。
【００２６】
「ラセミ体」または「ラセミ混合物」は、２つのエナンチオマーからなる等モル量の化合物を意味し、このような混合物は光学活性を示さないすなわち、偏光面を回転させない。
【００２７】
「左旋性」とは、非対称化合物を通るときに偏光が左に回転することを示す。左旋性を示す接頭辞は「ｌ」である。
【００２８】
「右旋性」とは、非対称化合物を通るときに偏光が右に回転することを示す。右旋性を示す接頭辞は「ｄ」である。
【００２９】
「幾何異性体」は、炭素−炭素二重結合、シクロアルキル環または架橋二環系に対する関係で置換基原子の配向が異なる異性体を意味する。炭素−炭素二重結合の両側の原子（水素以外）は、Ｅ（置換基が炭素−炭素二重結合の反対側に向いている）またはＺ（置換基が同じ側に向いている）配置であり得る。
【００３０】
ここに開示の化合物の立体化学を構造から命名または表記する場合、この命名または表記された立体異性体は、他の立体異性体と少なくとも６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、９９重量％または９９．９重量％関連している。単一のエナンチオマーを構造から命名または表記する場合、この表記または命名したエナンチオマーは、少なくとも６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、９９重量％または９９．９重量％光学的に純粋である。重量比での光学純度（％）は、エナンチオマーの重量にその光学異性体の重量を加えたものに対するエナンチオマーの重量比である。
【００３１】
ここに開示の化合物が少なくとも１個のキラル中心を有し、立体化学を示さずに構造から命名または表記される場合、これはその名称または構造が、対応する光学異性体を含まない化合物の１つのエナンチオマー、化合物のラセミ混合物、対応する光学異性体に比して１つのエナンチオマーが豊富に含まれる混合物を包含すると理解される。
【００３２】
ここに開示の化合物が少なくとも２個のキラル中心を有し、立体化学を示さずに構造から命名または表記される場合、これはその名称または構造が、他のジアステレオマーを含まないジアステレオマー、他のジアステレオマー対を含まない一対のジアステレオマー、ジアステレオマーの混合物、ジアステレオマー対の混合物、他のジアステレオマーに比して１つのジアステレオマーが豊富に含まれるジアステレオマーの混合物、１つのジアステレオマー対が他のジアステレオマー対に比して豊富に含まれるジアステレオマー対の混合物を包含すると理解される。
【００３３】
１以上の二重結合を含む本発明の化合物では、「Ｅ」、「Ｚ」、「ｃｉｓ」、「ｔｒａｎｓ」の表示は、コア分子に対する配置を示す。
【００３４】
アミノ酸は、さまざまな立体異性体形態で存在することもある。グリセルアルデヒドの不斉炭素原子周囲の基の配置との対比でアミノ酸の不斉炭素原子周囲の基の配置を示す方法として、一般にフィッシャー投影式が用いられる。α−アミノ酸の場合、Ｃα原子周囲のアミノ、カルボキシル、Ｒ（すなわち側鎖）、Ｈ基が、それぞれグリセルアルデヒドのヒドロキシル、アルデヒド、ＣＨ２ＯＨ、Ｈ基に対応する。
【化１２】
0005570590.tif 000013
【００３５】
Ｌ−グリセルアルデヒドとＬ−α−アミノ酸は同じ相対配置を有し、Ｄ−グリセルアルデヒドとＤ−α−アミノ酸は同じ相対配置を有する。ＬまたはＤの表示は、アミノ酸’の偏光面を回転させる機能を示すものではない。多くのＬ−アミノ酸が右旋性である。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「実質的に純粋な」とは、表記または命名された化合物が、少なくとも約６０重量％であることを意味する。たとえば、「実質的に純粋な」は、約６０％、７０％、７２％、７５％、７７％、８０％、８２％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％あるいは、７０％〜１００％のパーセンテージを意味し得る。一実施形態では、実質的に純粋なとは、表記または命名された化合物が、少なくとも約７５％であることを意味する。特定の実施形態では、実質的に純粋なとは、表記または命名された化合物が少なくとも約９０重量％であることを意味する。構造式Ｉで表される化合物を含む実質的に純粋な組成物は、構造式ＩＶ、Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩで表される４種類の化合物を、単独またはこれらの任意の組み合わせで含み得る。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「有効量」とは、投与条件下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの条件下、ｉｎ  ｖｉｖｏの条件下またはｅｘ  ｖｉｖｏの条件下で、所望の作用を達成できるだけの量であり、たとえば、細胞において１種類以上の細胞保護キナーゼを活性化できるだけの量、細胞のアポトーシスを阻害できるだけの量、虚血および虚血再灌流障害（被検体におけるものなど）を阻害（予防、遅延など）できる量である。治療法の効果については、本明細書に記載の方法を含む当業者間で周知の好適な方法で判断することができる。
【００３８】
本明細書で定義するように、「治療有効量」とは、投与条件下で所望の治療効果または予防効果を必要とする被検体でそれを達成できるだけの量であり、たとえば、（被検体における１つ以上の羅患細胞のアポトーシスを阻害するなどして）被検体において虚血および虚血再灌流障害を阻害（予防、遅延など）できるだけの量である。治療法の効果については、当業者間で周知の好適な方法で判断することができる。
【００３９】
本発明は、一部、本明細書に記載のリポ酸誘導体化合物が、細胞保護特性および抗酸化特性を有するという本出願人らによる発見に基づくものである。特に、本出願人らは、特定のリポ酸誘導体であるＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨが、アポトーシスを阻害し、細胞の生存を促進する細胞シグナル伝達経路を媒介することが知られているＡｋｔキナーゼおよび他のキナーゼ（ＩＲＫ、ＩＧＦ１Ｒ、Ｓｒｃなど）を活性化することを示した（図１）。本出願人らはさらに、ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨが、心筋虚血・再灌流障害の動物モデルにおいて虚血および虚血・再灌流障害の度合いを軽減することも示した。
【００４０】
一実施形態では、本発明は、構造式Ｉ
【化１３】
0005570590.tif 000014
（式中、Ｒ１およびＲ２は各々独立に、Ｈまたは加水分解可能な基である）で表される実質的に純粋な化合物またはその薬学的に許容される塩を含む組成物に関する。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「加水分解可能な基」という用語は、本発明の分子に存在する場合、加水分解時にカルボン酸またはその塩を生成する部分を示す。加水分解は、たとえば、生理学的環境（血液、たとえば肝臓、腎臓、肺、脳などの代謝的に活性な組織など）の酸性または塩基性条件下で自然に起こり得るか、酵素（エステラーゼ、ペプチダーゼ、ヒドロラーゼ、オキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ、リアーゼまたはリガーゼなど）による触媒可能なものである。加水分解可能な基は、本発明の化合物に対し、水溶解性の改善、血液中での循環半減期の改善、取り込みの改善、持続時間の改善または作用開始の改善といった好都合な特性をｉｎ  ｖｉｖｏにてもたらすものである。
【００４２】
一実施形態では、加水分解可能な基は、化合物の生物活性を破壊しない。他の実施形態では、加水分解可能な基を有する化合物は、生物学的に不活性であってもよいが、ｉｎ  ｖｉｖｏで生物学的に活性な化合物に変換可能である。
【００４３】
加水分解可能な基を含む本発明の化合物が、プロドラッグとして作用することもある。本明細書で使用する場合、「プロドラッグ」という用語は、加水分解可能、酸化可能、代謝可能または生物学的条件下で反応して本発明の化合物を生成する化合物を意味する。プロドラッグは、生物学的条件下にてこのような反応時に活性になり得るか、あるいは未反応の形態で活性を持ち得る。プロドラッグは、（加水分解可能な基の存在のためなどにより）生理学的条件下で代謝が落ちることがあるため、プロドラッグの（血液中などにおける）循環半減期が改善される。プロドラッグは一般に、Ｂｕｒｇｅｒ’ｓ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  （１９９５）  １７２〜１７８，  ９４９〜９８２  （Ｍａｎｆｒｅｄ  Ｅ．  Ｗｏｌｆｆ  ｅｄ．，  ５ｔｈ  ｅｄ）に記載されているものなどの周知の方法を用いて調製可能である。
【００４４】
一実施形態では、加水分解可能な基が、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、アリール、アリール（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキルからなる群から選択され、各々、ハロ、ニトロ、シアノ、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、アミノ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルアミノ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、モルホリノ、フェニル、ベンジルからなる群から選択される１〜３個の置換基で場合により置換されていてもよい。
【００４５】
もうひとつの実施形態では、加水分解可能な基が、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、アリル、エトキシメチル、メトキシエチル、メトキシエトキシメチル、メトキシエトキシエチル、ベンジル、ペンタフルオロフェニル、２−Ｎ−（モルホリノ）エチル、ジメチルアミノエチルおよびパラ−メトキシベンジルからなる群から選択される。
【００４６】
加水分解可能な基の加水分解によってカルボン酸が生成される。たとえば、化合物Ａのｔｅｒｔ．−ブチルが切断されて、穏やかな酸性条件で化合物Ｂのカルボン酸基が生成される。
【化１４】
0005570590.tif 000015
【００４７】
Ｒ１およびＲ２は、化合物Ｃなどの化合物が得られる異なる加水分解可能な基であってもよく、この場合は２種類の異なるエステルが存在する。異なる加水分解可能な基を用いると、特定のエステルの選択的な加水分解が可能になる。たとえば、Ｒ１またはＲ２のいずれかが酸性環境に対して安定する加水分解可能な基であってもよく、他方が塩基性環境に対して安定する加水分解可能な基であってもよい。他の実施形態では、Ｒ１またはＲ２のいずれかが特定の酵素によって切断される加水分解可能な基であってもよく、かたや他方はその酵素では切断されない。いくつかの実施形態では、２種類のエステルの加水分解が同時に起こり得る。あるいは、２種類のエステルの加水分解が段階的であってもよい。もうひとつの例では、化合物Ｃのｔｅｒｔ．−ブチル基がおだやかな酸性条件下で切断されるのに対し、２−Ｎ−モルホリノエチル部分がリゾプス・ニベウス（Ｒ．  ｎｉｖｅｕｓ）由来のリパーゼで酵素的に切断されてもよい。
【化１５】
0005570590.tif 000016
【００４８】
加水分解可能な基の選択、導入、後で除去するための方法は、当業者間で周知である。（Ｔ．Ｗ．  Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．  Ｇ．  Ｍ．  Ｗｕｔｓ  “Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９９）。
【００４９】
あるいは、Ｒ１またはＲ２の一方だけが存在する形で、単一のエステルを加水分解してカルボン酸またはその塩を生成してもよい。
【化１６】
0005570590.tif 000017
【００５０】
本発明の化合物と一緒に他の加水分解性の保護基を取り入れて、本説明に包含されるプロドラッグを得るようにしてもよいことは、当業者であれば理解できよう。
【００５１】
本発明の化合物は、薬学的に許容される塩の形で存在してもよい。医薬品で使用する場合、本発明の化合物の塩とは、無毒の薬学的に許容される塩を示す。
【００５２】
ここに開示の化合物の薬学的に許容される塩は、酸付加塩および塩基付加塩を含む。「薬学的に許容される塩」という用語は、アルカリ金属塩を形成したり、遊離酸または遊離塩基の付加塩を形成したりするのに一般に用いられている塩を包含する。塩の性質は重要ではないが、薬学的に許容されるものとする。
【００５３】
ここに開示の化合物の薬学的に許容される好適な酸付加塩については、無機酸または有機酸から調製することができる。このような無機酸の例として、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、炭酸、硫酸、リン酸があげられる。適当な有機酸については、脂肪族酸、脂環式酸、芳香族酸、アリール脂肪族酸、複素環式酸、カルボン酸ならびに、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、マレイン酸、エンボン酸（パモ酸）、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、パントテン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、スルファニル酸、メシル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、ステアリン酸、アルギン酸、β−ヒドロキシ酪酸、マロン酸、ガラクタル酸、ガラクツロン酸などの有機酸のスルホン酸クラスから選択することができる。薬学的に許容される酸性／アニオン性塩としては、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、炭酸水素塩、酒石酸水素塩、臭化物、カルシウムエデト酸塩、カンシル酸塩、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストル酸塩、エシル酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニル酸塩、ヘキシルレゾルシン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メチル硫酸塩、ムチン酸塩、ナプシル酸塩、硝酸塩、パモ酸塩、パントテン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシル酸塩、トリエチヨージド（ｔｒｉｅｔｈｉｏｄｉｄｅ）塩があげられる。
【００５４】
ここに開示の化合物の薬学的に許容される好適な塩基付加塩は、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛から生成される金属塩あるいは、Ｎ，Ｎ'−ジベンジルエチレン−ジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルタミン、リジン、アルギニン、プロカインから生成される有機塩を含むがこれに限定されるものではない。これらの塩はいずれも、従来の手段で、ここに開示の化合物で表される対応する化合物から、たとえば、ここに開示の化合物を適当な酸または塩基で処理して調製可能なものである。薬学的に許容される塩基性／カチオン性塩は、ジエタノールアミン塩、アンモニウム塩、エタノールアミン塩、ピペラジン塩、トリエタノールアミン塩も含む。
【００５５】
一実施形態では、薬学的に許容される塩が一価のカチオンまたは二価のカチオンを含む。特定の実施形態では、薬学的に許容される塩がリジン塩である。
【００５６】
もうひとつの実施形態では、一価のカチオンが一価の金属陽イオンであり、二価のカチオンが二価の金属陽イオンである。特定の実施形態では、一価の金属陽イオンがナトリウムカチオンである。
【００５７】
もうひとつの実施形態では、本発明は、構造式ＩＩ
【化１７】
0005570590.tif 000018
で表される実質的に純粋な化合物またはその薬学的に許容される塩を含む組成物に関する。本明細書で使用する場合、ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨは、構造式ＩＩを示す。
【００５８】
別の実施形態では、本発明は、構造式ＩＩＩ
【化１８】
0005570590.tif 000019
で表される実質的に純粋な化合物を含む組成物に関する。
【００５９】
もうひとつの実施形態では、本発明は、構造式ＩＶ
【化１９】
0005570590.tif 000020
で表される実質的に純粋な化合物またはその薬学的に許容される塩を含む組成物に関する。Ｒ１およびＲ２の値は、構造式（Ｉ）について上記にて定義したとおりである。
【００６０】
もうひとつの実施形態では、本発明は、構造式Ｖ
【化２０】
0005570590.tif 000021
で表される実質的に純粋な化合物またはその薬学的に許容される塩を含む組成物に関する。Ｒ１およびＲ２の値は、構造式（Ｉ）について上記にて定義したとおりである。
【００６１】
もうひとつの実施形態では、本発明は、構造式ＶＩ
【化２１】
0005570590.tif 000022
で表される実質的に純粋な化合物またはその薬学的に許容される塩を含む組成物に関する。Ｒ１およびＲ２の値は、構造式（Ｉ）について上記にて定義したとおりである。
【００６２】
もうひとつの実施形態では、本発明は、構造式ＶＩＩ
【化２２】
0005570590.tif 000023
で表される実質的に純粋な化合物またはその薬学的に許容される塩を含む組成物に関する。Ｒ１およびＲ２の値は、構造式（Ｉ）について上記にて定義したとおりである。
【００６３】
本発明の組成物は、ここに開示の化合物に代えて、あるいはこれに加えて、ここに開示の化合物で表される化合物の薬学的に許容される塩あるいは、このような化合物または塩のプロドラッグまたは薬学的に活性な代謝物と、１種類以上の薬学的に許容されるキャリアとを含み、周知の薬剤送達方法でレシピエント被検体（好ましくはヒト）に送達される。本発明の化合物は、単独で投与してもよいし、細胞保護キナーゼの活性化および／または虚血障害または虚血再灌流障害の治療に有用であることが周知または本出願人らが有用であると信じる少なくとも１種類の他の作用剤と併用投与してもよい。
【００６４】
あるいは、本発明の組成物は、ここに開示の化合物で表される化合物またはその薬学的な塩を、組成物中の薬学的に活性な唯一の作用物質として含むものであってもよい。
【００６５】
もうひとつの実施形態では、本発明は、ｉ）薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤と、ｉｉ）構造式Ｉ
【化２３】
0005570590.tif 000024
（式中、Ｒ１およびＲ２は各々独立に、Ｈまたは加水分解可能な基である）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩と、を含む組成物に関する。
【００６６】
本発明の薬学的に許容される組成物は、本明細書に開示の１種類以上の化合物を、１種類以上の無毒かつ薬学的に許容されるキャリアおよび／または希釈剤および／またはアジュバントおよび／または賦形剤（本明細書では「キャリア」材料と総称する）と、必要があれば、他の活性成分との関連で含む。
【００６７】
また、本発明は、細胞中で細胞保護キナーゼを活性化する方法にも関する。本明細書で使用する場合、「細胞保護キナーゼ」という用語は、活性化されると、細胞の生存を促進および／または細胞死（アポトーシスなど）を阻害する１つ以上の細胞シグナル伝達経路の成分をリン酸化するキナーゼを示す。
【００６８】
したがって、一実施形態では、本発明は、細胞と、構造式Ｉ
【化２４】
0005570590.tif 000025
（式中、Ｒ１およびＲ２は各々独立に、Ｈまたは加水分解可能な基である）で表される有効量の化合物またはその薬学的に許容される塩とを接触させることを含む、細胞において細胞保護キナーゼ（インスリンレセプターキナーゼ、Ａｋｔキナーゼ、インスリン様成長因子１レセプターキナーゼ、Ｓｒｃキナーゼなど）を活性化する方法に関する。
【００６９】
特定の実施形態では、本発明は、細胞と、構造式ＩＩ
【化２５】
0005570590.tif 000026
で表される有効量の化合物またはその薬学的に許容される塩とを接触させることを含む、経路が細胞における細胞保護性であるキナーゼを活性化する方法に関する。
【００７０】
もうひとつの実施形態では、本発明は、細胞と、構造式ＩＩＩ
【化２６】
0005570590.tif 000027
で表される有効量の化合物とを接触させることを含む、細胞において細胞保護キナーゼを活性化する方法に関する。
【００７１】
細胞保護キナーゼの活性化は、細胞保護キナーゼを含む１つ以上の細胞保護細胞シグナル伝達経路の活性化につながり得る。特定の実施形態では、細胞における本発明の化合物による１種類以上の細胞保護キナーゼの活性化によって、キナーゼが活性化されている細胞のアポトーシスを阻害（予防、遅延など）可能である。
【００７２】
細胞保護キナーゼの活性化に関する本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（培養細胞を使用する、単離された細胞を使用するなど）またはｉｎ  ｖｉｖｏ（本発明の化合物を生きた生物体に投与するなど）にて実施可能である。特定の実施形態では、本発明の化合物は、ヒトにおける１種類以上の細胞で１種類以上の細胞保護キナーゼを活性化するための方法で用いられる。
【００７３】
一実施形態では、細胞保護キナーゼがＡｋｔキナーゼである。Ａｋｔキナーゼの活性化によって、細胞保護性の１つ以上のＡｋｔ細胞シグナル伝達経路を活性化可能である。Ａｋｔキナーゼは、Ａｋｔ、ＰＫＢおよびＲａｃ−ＰＫとしても知られ、セリン／トレオニンキナーゼのＡｋｔ／ＰＫＢファミリに属し、細胞の生存および増殖に関する経路（Ｓｏｎｇ，  Ｇ．，  Ｏｕｙａｎｇ，  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｂａｏ，  Ｓ．，  Ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｋｔ／ＰＫＢ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ２００５  ９：５９；  Ｈａｕｓｅｎｌｏｙ，  Ｄ．Ｊ．，  Ｙｅｌｌｏｎ，  Ｄ．Ｍ．，  Ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｓａｌｖａｇｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：  ｔａｋｉｎｇ  ａ  ＲＩＳＫ  ｆｏｒ  ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ．  Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌ  Ｒｅｖ  ２００７，  １２：２１７．）をはじめとして、多種多様な多くのシグナル伝達経路に関与することが示されている（Ａｌｅｓｓｉ，  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｄｅｖ．  ８  （１９９８），  ５５〜６２）。Ａｋｔは、Ｎ末端脂質結合プレクストリン相同領域と、Ｃ末端触媒領域とからなる。休眠状態の細胞では、すべてのＡｋｔアイソフォームが細胞質にあるが、外部配位子による刺激後に細胞膜に転位置する。転位置とその後の活性化は、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＥＧＦ、βＦＧＦおよびインスリンを含むいくつかの異なる配位子によって誘導される。この活性化は、ＰＩ３−キナーゼ活性に左右され、それぞれＰＤＫ−１およびＰＤＫ−２によるＡｋｔのＴｈｒ３０８およびＳｅｒ４７３の階層的リン酸化を必要とする（Ａｌｅｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．  ８  （１９９８），  ６９〜８１）。ひとたび活性化されると、Ａｋｔは、アポトーシスの予防、分化および／または増殖の誘導、タンパク質合成およびインスリンの代謝的効果をはじめとするいくつかの異なる機能を媒介する。
【００７４】
本明細書の実施例２で説明するように、本発明の化合物は、細胞ベースのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにてＡｋｔリン酸化を増大する。細胞におけるＡｋｔキナーゼリン酸化については、たとえば、提供業者から入手可能な細胞におけるＡＫＴリン酸化を試験するためのキットおよびアッセイをはじめとする従来技術において周知の１つ以上のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ａｋｔキナーゼリン酸化アッセイを用いて評価可能である（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ａｋｔ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ；ｐｈｏｓｐｈｏ  ＡＫＴ  （Ｓ４７３）向け細胞ウエスタン解析におけるＦＡＣＥ（商標）  ＡＫＴ、Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ；ＰａｔｈＳｃａｎ（登録商標）  Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ  （Ｔｈｒ３０８）  Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）  ＳｕｒｅＦｉｒｅ（登録商標）  Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔｓ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ；Ａｋｔ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓなど）。Ａｋｔキナーゼリン酸化を評価するための例示的なアッセイは、実施例２にて本明細書に記載される（Ｃｈｅｎ，  Ｈ．，  Ｋｏｖａｒ，  Ｊ．，  Ｓｉｓｓｏｎｓ，  Ｓ．，  ｅｔ．  ａｌ．  Ａ  ｃｅｌｌ  ｂａｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｋｉｎａｓｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｅｆｆｉｃａｃｙ．  Ａｎａｌｙｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２００５  ３３８：  １３６）。
【００７５】
Ａｋｔ活性化を、被検体から得られる細胞試料で実施される免疫検出方法などによって、ｉｎ  ｖｉｖｏにて評価することも可能である。リン酸化部位特異的Ａｋｔ抗体（ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｅｒ４７３に特異的、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｔｈｒ３０８に特異的など）を含むいくつかのＡｋｔ特異的抗体が市販されている（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒなど）。
【００７６】
もうひとつの実施形態では、細胞保護キナーゼがインスリンレセプターキナーゼ（「ＩＲＫ」）である（Ｄｉｅｓｅｌ，  Ｂ．，  Ｋｕｌｈａｎｅｋ−Ｈｅｉｎｚｅ，  Ｓ．，  Ｈｏｌｔｊｅ，  Ｍ．，  ｅｔ．  ａｌ．，  α−Ｌｉｐｏｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｓ  ａ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２００７  ４６：２１４６；  Ｈａｕｓｅｎｌｏｙ，  Ｄ．Ｊ．，  Ｙｅｌｌｏｎ，  Ｄ．Ｍ．  Ｎｅｗ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｅａｒｔ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ：  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｓａｌｖａｇｅ  ｋｉｎａｓｅ  （ＲＩＳＫ）−ｐａｔｈｗａｙ．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ２００４  ６１：４４８）。ＩＲＫ活性化は、Ａｋｔのリン酸化および活性化につながる（Ａｌｅｓｓｉ，  Ｄ．Ｒ．，  Ａｎｄｊｅｌｋｏｖｉｃ，  Ｍ．，  Ｃａｕｄｗｅｌｌ，  Ｂ．，  Ｃｒｏｎ，  Ｐ．，  Ｍｏｒｒｉｃｅ，  Ｎ．，  Ｃｏｈｅｎ，  Ｐ．，  Ｈｅｍｍｉｎｇｓ，  Ｂ．Ａ．  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｂ  ｂｙ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｎｄ  ＩＧＦ−１．  ＥＭＢＯ  Ｊ  １９９６  １５：６５４１〜６５５１）。ＩＲＫの活性化によって、細胞保護性である１つ以上のＩＲＫ細胞シグナル伝達経路の活性化が可能である。本明細書の実施例３で説明するように、本発明の化合物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生化学的アッセイでＩＲＫを活性化する。ＩＲＫ活性化は、従来技術において周知の１つ以上のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＩＲＫ活性化アッセイを用いて評価可能である。ＩＲＫ活性化を評価するための例示的なアッセイを、実施例３にて本明細書に記載する（Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ｓｈｉｆｔ  Ｋｉｎａｓｅ  Ａｓｓａｙ，  Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｈａｎｏｖｅｒ，  ＭＤ）。
【００７７】
もうひとつの実施形態では、細胞保護キナーゼがインスリン様成長因子１レセプター（「ＩＧＦ１Ｒ」）キナーゼである。ＩＧＦ１Ｒキナーゼの活性化によって、細胞保護性である１つ以上のＩＧＦ１Ｒ細胞シグナル伝達経路の活性化が可能である。本明細書の実施例４で説明するように、本発明の化合物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生化学的アッセイでＩＧＦ１Ｒキナーゼを活性化する。ＩＧＦ１Ｒキナーゼ活性化は、従来技術において周知の１つ以上のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＩＧＦ１Ｒキナーゼ活性化アッセイを用いて評価可能である。ＩＧＦ１Ｒキナーゼ活性化を評価するための例示的なアッセイを、実施例４にて本明細書に記載する。
【００７８】
別の実施形態では、細胞保護キナーゼがＳｒｃキナーゼである。Ｓｒｃキナーゼの活性化によって、細胞保護性の１つ以上のＳｒｃ細胞シグナル伝達経路の活性化が可能である。本明細書の実施例４で説明するように、本発明の化合物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生化学的アッセイでＳｒｃキナーゼを活性化する。Ｓｒｃキナーゼ活性化は、従来技術において周知の１つ以上のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｓｒｃキナーゼ活性化アッセイを用いて評価可能である。
【００７９】
ＩＧＦ１ＲおよびＳｒｃチロシンキナーゼは、心臓を虚血・再灌流障害から保護する上で何らかの役割を果たす（Ｂｕｄｄｈａｄｅｂ，  Ｄ．，  Ｔａｋａｎｏ，  Ｈ．，  Ｔａｎｇ，  Ｘ．−Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｓｒｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎ  ｌａｔｅ  ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２００２  ２８３：Ｈ５４９；  Ｐａｓｄｏｉｓ，  Ｐ．，  Ｑｕｉｎｌａｎ，  Ｃ．Ｌ．，  Ｒｉｓｓａ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｕａｂａｉｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｒａｔ  ｈｅａｒｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｖｉａ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  Ｓｒｃ  ｋｉｎａｓｅ，  ｍｉｔｏＫＡＴＰ，  ａｎｄ  ＲＯＳ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２００６，  ２９２：Ｈ１４７０；  Ｓｕｚｕｋｉ，  Ｙ．  Ｊ．  Ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｆｏｒ  ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．  Ａｎｔｉｏｘ  Ｒｅｄｏｘ  Ｓｉｇｎａｌ  ２００３，  ５：７４１；  Ｈａｕｓｅｎｌｏｙ，  Ｄ．Ｊ．，  Ｙｅｌｌｏｎ，  Ｄ．Ｍ．，  Ｎｅｗ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｅａｒｔ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｓｃｈａｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ：  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  Ｉｎｊｕｒｙ  Ｓａｌｖａｇｅ  Ｋｉｎａｓｅ  （ＲＩＳＫ）−ｐａｔｈｗａｙ．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ２００４  ６１：４４８）。
【００８０】
本発明によれば、本発明の化合物によって細胞にて１種類以上の細胞保護キナーゼが活性化されると、細胞のアポトーシスを阻害する（予防、遅延など）ことが可能である。アポトーシスを評価する方法は従来技術において周知である。アポトーシス細胞の研究には、（クロマチン凝縮および細胞質収縮などのアポトーシスに関連する形態学的変化を検出する方法などによって）アポトーシス細胞を可視化するための顕微鏡解析（光学顕微鏡法、電子顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、レーザー走査顕微鏡法など）が一般に用いられている。
【００８１】
アガロースゲルにおけるＤＮＡ断片化の研究も、アポトーシスを示すものとされている。多数の技術で、フラグメントの標識ならびにアポトーシス細胞の割合の定量化にＤＮＡの断片化を活用している。各ＤＮＡフラグメントは３’−ＯＨ末端部分を有する。この末端フラグメントはさまざまな方法で標識可能（たとえば、修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼの助けを借りるなど）なものであるため、標識率はＤＮＡ断片化の度合いに比例する。
【００８２】
特に、ＴｄＴによるｄＵＴＰ  Ｎｉｃｋ−Ｅｎｄ  ＬａｂｅｌｉｎｇすなわちＴＵＮＥＬは、アポトーシスプロセスの最終段階付近で生じる断片化したＤＮＡを検出するための技法である。アポトーシス細胞の断片化したＤＮＡは、酵素末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を用いてＤＮＡ末端の３’−ＯＨでフルオレセイン−ｄＵＴＰを取り込むことができ、これがＴＵＮＥＬアッセイの原理でポリマー尾を形成する。標識後のＤＮＡは、蛍光顕微鏡法で直接的に可視化またはフローサイトメトリーで定量化が可能になる。
【００８３】
現行の技術の中には、アポトーシス細胞に早い段階で生じる膜リン脂質の変化を活用したものもある。アポトーシス細胞によって外部環境に曝露された、負に荷電した膜リン脂質は、蛍光色素コンジュゲート分子で標識されるため、蛍光細胞のパーセンテージを容易に定量化可能である。
【００８４】
また、蛍光コンジュゲートＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖを用いてアポトーシスを検出することも可能である。Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖは、負に荷電したリン脂質を優先的に結合する抗凝固タンパク質である。アポトーシスプロセスの初期の段階は、膜リン脂質の不斉性を破壊して、細胞質膜の外小葉のホスファチジルセリン（ＰＳ）を露出させる。蛍光コンジュゲートＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖを使用して、無傷の生きた細胞にてこのホスファチジルセリンの外在化を検出することが可能である。壊死細胞を検出するための第２の蛍光色素として、ヨウ化プロピジウムが併用されることが多い。アポトーシスの誘導によって、活性な１８ｋＤａのカスパーゼ−３フラグメントを生成するプロカスパーゼ−３タンパク質分解切断が生じ、これがポリＡＤＰ−リボースポリメラーゼおよび他のカスパーゼを含むアポトーシス経路の重要なモジュレーターを、切断目的で標的する。アポトーシス細胞で他の活性なカスパーゼを検出するためのアッセイは従来技術において周知である（Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）  Ａｓｓａｙｓ，  Ｐｒｏｍｅｇａなど）。
【００８５】
また、活性な１８ｋＤａのカスパーゼ−３フラグメントをマーカーとして用いてアポトーシス細胞を検出することも可能である。アポトーシスの誘導によって、活性な１８ｋＤａのカスパーゼ−３フラグメントを生成するプロカスパーゼ−３タンパク質分解切断が生じ、これがポリＡＤＰ−リボースポリメラーゼおよび他のカスパーゼを含むアポトーシス経路の重要なモジュレーターを、切断目的で標的する。活性な１８ｋＤａのフラグメントだけを認識するいくつかの抗体が、提供業者（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｔｒｅｖｉｇｅｎなど）から入手可能である。
【００８６】
また、フローサイトメトリーアッセイを用いて、アポトーシス細胞に関連する核変化を監視および定量化することも可能である。
【００８７】
アポトーシスの阻害を検出するための例示的なアッセイについては、実施例５にて本明細書に記載する。
【００８８】
細胞の細胞保護キナーゼの活性化には、損傷および機能異常につながる羅患組織または臓器での余分なまたは不要なアポトーシス細胞死に起因する症状の治療における有用性もある。このような症状としては、特に、虚血および虚血・再灌流障害があげられる。よって、本発明は、被検体に、構造式Ｉ
【化２７】
0005570590.tif 000028
（式中、Ｒ１およびＲ２は各々独立に、Ｈまたは加水分解可能な基である）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効量で投与することを含む、哺乳類の被検体で虚血または虚血・再灌流障害を治療するための方法にも関する。
【００８９】
特定の実施形態では、本発明は、被検体に、構造式ＩＩ
【化２８】
0005570590.tif 000029
で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効量で投与することを含む、哺乳類の被検体で虚血または虚血・再灌流障害を治療する方法に関する。
【００９０】
もうひとつの実施形態では、本発明は、被検体に、構造式ＩＩＩ
【化２９】
0005570590.tif 000030
で表される化合物を有効量で投与することを含む、哺乳類の被検体で虚血または虚血・再灌流障害を治療する方法に関する。
【００９１】
本明細書で使用する場合、「虚血が原因の障害」、「虚血によって引き起こされる障害」、「虚血障害」とは、虚血によって引き起こされる細胞、組織または臓器の障害あるいは、血液の供給が不十分である（動脈閉塞などによる）のために酸素の供給も不十分になり、組織または臓器の損傷または機能異常につながったものを示す（Ｐｉｐｅｒ，  Ｈ．  Ｍ．，  Ａｂｄａｌｌａｈ，  Ｃ．，  Ｓｃｈａｆｅｒ，  Ｃ．，  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ２００３，  ７５：６４４；  Ｙｅｌｌｏｎ，  Ｄ．  Ｍ．，  Ｈａｕｓｅｎｌｏｙ，  Ｄ．  Ｊ．，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００７，  ３５７：１１２１）。虚血に起因する障害は、さまざまな組織および臓器に影響し得る。このような障害は、本発明の化合物および方法で治療可能なものであり、たとえば、心血管虚血、脳血管虚血、腎虚血、肝虚血、虚血性心筋症、皮膚虚血、腸管虚血、腸虚血、胃虚血、肺虚血、膵臓虚血、骨格筋虚血、腹筋虚血、肢虚血、虚血性大腸炎、腸間膜虚血、無症候性虚血によって引き起こされる障害を含む。このように、虚血が原因の障害は、たとえば、心臓、腎臓、肝臓、脳、筋肉、腸、胃、肺または皮膚に影響し得る。
【００９２】
特定の実施形態では、虚血が原因の障害が心筋虚血の結果である。心筋虚血に起因する障害は、たとえば、個人における心筋梗塞（急性心筋梗塞など）に起因し得る。
【００９３】
もうひとつの実施形態では、虚血が原因の障害が、個人における脳虚血（脳卒中など）に起因する障害である。
【００９４】
もうひとつの実施形態では、虚血が原因の障害が、虚血・再灌流障害である。本明細書で使用する場合、「虚血・再灌流障害」という用語は、虚血性イベントのためにかつて血流が不足した組織または臓器の領域に対する血流の回復に起因する障害を示す。再灌流に関連する酸化ストレスが、羅患組織または臓器に対する損傷を引き起こすこともある。虚血・再灌流障害は、生化学的に、虚血性イベントにおける酸素の枯渇、その後の再酸素化とこれに付随する再灌流時の活性酸素種の生成を特徴とする（Ｐｉｐｅｒ，  Ｈ．  Ｍ．，  Ａｂｄａｌｌａｈ，  Ｃ．，  Ｓｃｈａｆｅｒ，  Ｃ．，  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ２００３，  ７５：６４４；  Ｙｅｌｌｏｎ，  Ｄ．  Ｍ．，  Ｈａｕｓｅｎｌｏｙ，  Ｄ．  Ｊ．，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００７，  ３５７：１１２１）。
【００９５】
虚血・再灌流障害は、たとえば、自然なイベント（心筋梗塞後の血流の回復など）、外傷によって、あるいは、血液供給量が減っていた組織または臓器への血流を回復させる１つ以上の外科的手法または他の治療的介入によって生じ得る。このような外科的手法としては、たとえば、冠動脈バイパス移植手術、冠動脈形成術、臓器移植手術など（心肺バイパス手術など）があげられる。特定の実施形態では、本発明の化合物および方法は、虚血または虚血・再灌流障害によって引き起こされる周術期心臓損傷を治療するのに有用である。
【００９６】
外科的手法などの治療的介入によって生じた虚血性障害および虚血再灌流障害の治療のためには、治療を受ける被検体に、治療的介入（心臓手術、臓器移植など）の前に本発明の化合物を投与すると好ましい。たとえば、本発明の化合物は、治療的介入の約１時間前、約２時間前、約３時間前、約４時間前、約５時間前、約１２時間前、約２４時間前または約４８時間前などに治療を受ける被検体に対して投与可能である。本発明の化合物は、たとえば、治療的介入の約５分前、約１０分前、約１５分前、約２０分前、約３０分前または約４５分前に、治療を受ける被検体に投与可能である。
【００９７】
これに代えて、あるいはこれに加えて、本発明の化合物を、治療的介入の時点またはその間に、治療を受ける被検体に投与可能である。たとえば、化合物を、治療的介入の過程で間隔をあけて（１５分間隔など）１回以上投与可能である。あるいは、化合物を、治療的介入の期間をとおして連続的に投与可能である。
【００９８】
さらに、治療的介入後に、本発明の化合物を治療を受ける被検体に投与可能である。たとえば、本発明の化合物を、治療的介入の約１時間後、約２時間後、約３時間後、約４時間後、約５時間後、約１２時間後、約２４時間後または約４８時間後などに治療を受ける被検体に投与可能である。また、本発明の化合物を、たとえば、治療的介入の約５分後、約１０分後、約１５分後、約２０分後、約３０分後または約４５分後に治療を受ける被検体に投与可能である。
【００９９】
本発明の化合物を使用して、治療的介入（移植法で用いられる組織、臓器移植手術に用いられる臓器など）の前に、ｅｘ  ｖｉｖｏでの細胞、組織または臓器への虚血または虚血・再灌流障害を阻害することもできる。たとえば、宿主個体への臓器移植前（滅菌環境における臓器の保管または搬送時など）に、臓器を本発明の化合物（本発明の化合物を含む溶液に入れるなど）と接触させ、虚血または虚血・再灌流障害を阻害することができる。
【０１００】
本明細書で説明するように、虚血に起因する症状、虚血または虚血再灌流によって引き起こされる障害は、羅患細胞、組織または臓器でアポトーシス細胞死を誘導して、損傷および機能異常を招きかねない。よって、本発明の化合物は、過剰なまたは不要なアポトーシスにつながる虚血または他の症状または機能障害を起こしている細胞、組織または臓器（移植組織または臓器あるいは、被検体の細胞、組織または臓器など）でアポトーシスを阻害する方法においても有用性がある。この方法は、細胞、組織または臓器に対して、構造式Ｉ
【化３０】
0005570590.tif 000031
（式中、Ｒ１およびＲ２は各々独立に、Ｈまたは加水分解可能な基である）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効量で接触させるか、これを被検体に投与する。
【０１０１】
特定の実施形態では、本発明は、被検体に、構造式ＩＩ
【化３１】
0005570590.tif 000032
で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効量で投与することを含む、過剰なまたは不要なアポトーシスにつながる虚血または他の症状または機能障害を起こしている細胞、組織または臓器におけるアポトーシスを阻害する方法に関する。
【０１０２】
もうひとつの実施形態では、本発明は、被検体に、構造式ＩＩＩ
【化３２】
0005570590.tif 000033
で表される化合物を有効量で投与することを含む、過剰なまたは不要なアポトーシスにつながる虚血または他の症状または機能障害を起こしている細胞、組織または臓器におけるアポトーシスを阻害する方法に関する。
【０１０３】
細胞、組織または臓器におけるアポトーシスを評価するための方法は、従来技術において周知であり、本明細書に記載のものを含む。
【０１０４】
本発明の化合物および方法で治療可能な不要なおよび／または余分なアポトーシスに関連する症状としては、余分なアポトーシスに関連した神経変性疾患（パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、網膜色素変性、てんかんなど）、余分なアポトーシスに関連した血液疾患（再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、Ｔ  ＣＤ４＋リンパ球減少症、Ｇ６ＰＤ欠損など）、余分なアポトーシスに関連した組織損傷（心筋梗塞、脳血管発作、虚血性腎損傷、多嚢胞腎疾患など）、ＡＩＤＳ，および妊娠高血圧腎症を含むがこれに限定されるものではない。
【０１０５】
虚血・再灌流障害の顕著な特徴のひとつに、虚血性イベントの間に酸素が枯渇することに起因する細胞質カルシウムレベルの増加がある（Ｐｉｐｅｒ，  Ｈ．  Ｍ．，  Ａｂｄａｌｌａｈ，  Ｃ．，  Ｓｃｈａｆｅｒ，  Ｃ．，  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ２００３，  ７５：６４４；  Ｙｅｌｌｏｎ，  Ｄ．  Ｍ．，  Ｈａｕｓｅｎｌｏｙ，  Ｄ．  Ｊ．，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００７，  ３５７：１１２１）。細胞質カルシウムの増加と遊離ラジカルの増加が重なることで、アポトーシスの引き金になると仮定されてきた（Ｃｈｅｎ，  Ｘ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｘ．，  Ｈｕｂｏ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ２００５，  ９７：１００９；  Ｌｏｐｅｓ−Ｎｅｂｌｉｎａ，  Ｆ．，  Ｔｏｌｅｄｏ，  Ａ．Ｈ．，  Ｔｏｌｅｄｕ−Ｐｅｒｅｙｒａ，  Ｌ．Ｈ．  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｓｕｒｇ  ２００５，  １８：３３５）。しかしながら、今日まで、カルシウムの流入を遮断するアンタゴニストまたは活性酸素種のスカベンジャーのいずれかを用いての急性心筋梗塞患者の治療では、それぞれ期待はずれの臨床転帰となっていた（Ｙｅｌｌｏｎ，  Ｄ．  Ｍ．，  Ｈａｕｓｅｎｌｏｙ，  Ｄ．  Ｊ．，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００７，  ３５７：１１２１）。
【０１０６】
また、Ａｋｔで活性化される生存促進性経路によって、細胞質カルシウム過負荷が阻害される（Ｊｏｓｅｐｈ，  Ｓ．Ｋ．，  Ｈａｊｎｏｃｚｋｙ，  Ｇ．，  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ２００７，  １２：９５１；  Ｐｉｎｔｏｎ，  Ｐ．，  Ｒｉｚｚｕｔｏ，  Ｒ．，  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆ  ２００６，  １３：１４０９；  Ｋｈａｎ，  Ｍ．Ｔ．，  Ｗａｇｎｅｒ，  Ｌ．  ＩＩ，  Ｙｕｌｅ，  Ｄ．Ｉ．，  Ｂｈａｎｕｍａｔｈｙ，  Ｃ．，  Ｊｏｓｅｐｈ，  ．Ｓ．Ｋ．  ２００６，  Ａｋｔ  ｋｉｎａｓｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｏｓｉｔｏｌ  １，４，５−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：３７３１）。Ａｋｔ依存性シグナル伝達経路は、Ｂｃｌ−２を調節することで細胞内カルシウム過負荷も防止する（Ｒａｐｈａｅｌ，  Ｊ．，  Ａｂｅｄａｔ，  Ｓ．，  Ｒｉｖｏ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２００６，  ３１８：１８６；  Ｔｈｏｍｅｎｉｕｓ，  Ｍ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｄｉｓｔｅｌｈｏｒｓｔ，  Ｃ．  Ｗ．，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  ２００３，  １１６：４４９３）。
【０１０７】
よって、Ａｋｔの活性化を誘導する本発明の化合物は、細胞、組織または臓器（虚血に羅患した被検体におけるものなど）で、細胞質カルシウムを減らす方法においても有用性がある。この方法は、被検体に、構造式Ｉ
【化３３】
0005570590.tif 000034
（式中、Ｒ１およびＲ２は各々独立に、Ｈまたは加水分解可能な基である）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効量で投与することを含む。
【０１０８】
特定の実施形態では、本発明は、被検体に、構造式ＩＩ
【化３４】
0005570590.tif 000035
で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効量で投与することを含む、細胞、組織または臓器における細胞質カルシウムを減らす方法に関する。
【０１０９】
もうひとつの実施形態では、本発明は、被検体に、構造式ＩＩＩ
【化３５】
0005570590.tif 000036
で表される化合物を有効量で投与することを含む、細胞、組織または臓器における細胞質カルシウムを減らす方法に関する。
【０１１０】
細胞質カルシウムのレベルを検出するための例示的なアッセイについては、実施例６にて本明細書に記載する。
【０１１１】
本発明の化合物は、ペルオキシルラジカル吸収能増大も示す。生物学的生物体は、脳、心臓、肺、筋肉組織などの組織の正常な代謝活動の過程で、有害な活性酸素種（ＲＯＳ）およびさまざまな遊離ラジカルを生成する（Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ，  Ｂ．  ａｎｄ  Ｇｕｔｔｅｒｉｄｇｅ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｃ．，  ｅｄｓ．  （Ｏｘｆｏｒｄ：  Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９））。多岐にわたる重要な疾患と薬剤の副作用におけるＲＯＳおよび遊離ラジカルの役割についての認識が、近年になってかなり高まっている。多くの研究で、多数の疾患状態および治療用薬剤の有害な副作用が、ＲＯＳおよびさまざまな遊離ラジカルの生成率についていく個体の抗酸化防御システムの不具合と結び付いていることが示された（たとえば、Ｃｈａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖ．  Ｎｅｕｒｏｌ．，  １９９６，  ７１：２７１〜２７９；  ＤｉＧｕｉｓｅｐｐｉ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ，  Ｉ．，  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．，  １９８４，  １２：３１５〜３４２を参照のこと）。たとえば、異常に高いＲＯＳレベルが、脳卒中または心筋梗塞で心筋に発生する無酸素症での虚血によって誘発される無酸素症の条件下で認められた（たとえば、Ｗａｌｔｏｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  Ｒｅｖ．，  １９９９，  ２９：１３７〜１６８；  Ｐｕｌｓｉｎｅｌｌｉ，  Ｗ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ．，  １９８２，  １１：  ４９９〜５０２；  Ｌｕｃｃｈｅｓｉ，  Ｂ．  Ｒ．，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．，  １９９０，  ６５：１４１〜２３１を参照のこと）。また、ＲＯＳおよび遊離ラジカルの増加は、腎移植後の再灌流損傷とも結び付いていた。
【０１１２】
よって、ＲＯＳおよび遊離ラジカルの増加が、加齢に伴う酸化ストレス誘導損傷、遅発性ジスキネジア、パーキンソン病、ハンチントン病、変性眼疾患、敗血症性ショック、頭部および脊髄障害、アルツハイマー病、潰瘍性大腸炎、ヒト白血病および他の癌、糖尿病（たとえば、Ｒａｔａｎｉｓ，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ，  ｐｐ．  ７４〜８０  （Ａｐｒｉｌ  １９９１）を参照のこと）をはじめとする多くの疾患、薬剤治療、外傷、変性症状において発生する合併症および進行と結び付いている。
【０１１３】
たとえば、レベルが上昇したＲＯＳおよび遊離ラジカルが、虚血性イベント後の再灌流時に細胞および組織で生成されることが知られている。このような増大したレベルのＲＯＳおよび遊離ラジカルは、すでにストレスのかかったまたは衰弱した臓器または組織にかなりの損傷を引き起こし得る。ペルオキシルラジカル吸収能を呈する本発明の化合物を使用して、脳卒中、心臓発作または腎疾患などの疾患および症状ならびに腎臓移植で生じる再灌流障害後に存在する高レベルの有害な遊離ラジカルを処理してもよい。脳卒中および心臓発作のように虚血性イベントがすでに起こっている、本明細書に記載の化合物を個体に投与して、血液、羅患組織または臓器にすでに存在する増加したＲＯＳおよび遊離ラジカルを解毒してもよい。
【０１１４】
あるいは、臓器移植または虚血障害または虚血・再灌流障害を引き起こし得る他の手法（冠動脈バイパス移植手術、冠動脈形成術、心肺バイパス手術など）など、虚血性イベントが予測される場合、施術または虚血性イベントの前に、本明細書で説明するような投与間隔で本明細書に記載の化合物を予防的に投与して、権利請求した化合物の有効性を高めるようにしてもよい。
【０１１５】
本明細書に記載の化合物を使用して、望ましくないレベルのＲＯＳおよび遊離ラジカルに関連した疾患または症状を治療あるいは、望ましくないレベルのＲＯＳおよび遊離ラジカルによって引き起こされる疾患、機能障害または症状を予防してもよい。本発明によれば、本明細書に記載の化合物を投与して、早産児における酸素毒性、熱傷、組織および臓器に対する物理的外傷、敗血症性ショック、多外傷性（ｐｏｌｙｔｒａｕｍａｔｏｕｓ）ショック、頭部外傷、脳外傷、脊髄障害、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、年齢に関連したＲＯＳおよび遊離ラジカルの増加、老衰、潰瘍性大腸炎、ヒト白血病および他の癌、ダウン症候群、関節炎、黄斑変性症、統合失調症、てんかん、放射線損傷（ＵＶによって誘発される皮膚損傷を含む）、ＲＯＳおよび遊離ラジカルの薬剤による増加を含むがこれに限定されるものではない、多岐にわたる他の疾患および症状と関連する増加したＲＯＳおよび他の遊離ラジカルの治療的または予防的治療を提供してもよい。
【０１１６】
ＲＯＳおよび遊離ラジカルの形成が原因となる酸化ストレスの進行性の亢進も、老化に伴って起こる（Ｍｅｃｏｃｃｉ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｏ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．，  ２０００，  ２８：  １２４３〜１２４８などを参照のこと）。これは、ラット組織（Ｅｒｄｉｎｃｌｅｒ，  Ｄ．  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ，  １９９７，  ２６５：  ７７〜８４）および高齢のヒト患者の血液細胞（Ｃｏｎｇｉ，  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｅｓｓｅ．  Ｍｅｄ．，  １９９５，  ２４：  １１１５〜１  １１８）における脂質ペルオキシダーゼの形成の増加を見つけることで検出されていた。よって、本明細書に記載の化合物は、ペルオキシルラジカルを吸収でき、老化過程に伴うＲＯＳおよび遊離ラジカルのレベル増加による組織損傷の増大および平均余命の低下を予防および／またはこれに対抗する方法で使用するのに適している。
【０１１７】
よって、本発明の化合物には、有害な活性酸素種（ＲＯＳ）および他の遊離ラジカルによって引き起こされる症状および機能障害の治療における有用性がある。よって、本発明はさらに、被検体に、構造式Ｉ
【化３６】
0005570590.tif 000037
（式中、Ｒ１およびＲ２は各々独立に、Ｈまたは加水分解可能な基である）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効量で投与することを含む、被検体（虚血に羅患した被検体など）の組織におけるペルオキシルラジカルの吸収度を高める方法に関する。
【０１１８】
特定の実施形態では、本発明は、被検体に、構造式ＩＩ
【化３７】
0005570590.tif 000038
で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効量で投与することを含む、被検体の組織におけるペルオキシルラジカルの吸収度を高める方法に関する。
【０１１９】
もうひとつの実施形態では、本発明は、被検体に、構造式ＩＩＩ
【化３８】
0005570590.tif 000039
で表される化合物を有効量で投与することを含む、被検体の組織におけるペルオキシルラジカルの吸収度を高める方法に関する。
【０１２０】
ペルオキシルラジカルの吸収度を検出するための例示的なアッセイについては、実施例７にて本明細書に記載する。遊離ラジカルの吸収度を検出する他の方法が、米国特許第６，８９０，８９６号明細書（その内容を本明細書に援用する）に記載されている。
【０１２１】
本発明の化合物によるＡｋｔキナーゼの活性化には、虚血障害を含むがこれに限定されるものではない、細胞におけるＡｋｔ活性が低いまたは不十分であることに起因する症状の治療における有用性がある。本発明の化合物および方法を用いての治療対象となるＡｋｔ活性が低いことに起因する好適な症状には、たとえば、不十分な血管新生（糖尿病性潰瘍、壊疽、治癒を容易にするのに血管新生を必要とする創傷、バージャー症候群、高血圧症、微小血管系の低減を特徴とする症状など）を特徴とする疾患または機能障害ならびに、特定の神経性疾患または機能障害（パーキンソン病、アルツハイマー病、鬱、心配、躁うつ病、外傷後ストレス障害、軽度認知障害（ＭＣＩ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、脊髄小脳変性症、多発性硬化症（ＭＳ）、ピック病、統合失調症、不安神経症、強迫性神経症、頭部外傷、脊髄障害、脳血管障害、脳血管痴呆、無症候性脳梗塞、ポリグルタミン病、プリオン病、皮質基底核神経節変性症、進行性核上性麻痺、ＡＩＤＳ脳症、筋ジストロフィー、糖尿病性ニューロパチーなど）がある。
【０１２２】
本発明の化合物および方法を用いて治療できる、Ａｋｔ活性の低下に起因する他の症状として、糖尿病網膜症、糖尿病性腎症、肝硬変、アルコール肝炎、自己再生能の低下を特徴とする老人病、非代謝性骨疾患、代謝性骨疾患、関節症、歯周病、サイトメガロウイルス感染、関節リウマチ、ライム病、痛風、敗血症症候群、高熱、潰瘍性大腸炎、腸炎、骨粗鬆症、歯周病、糸球体腎炎、肺の慢性非伝染性炎症、サルコイドーシス、喫煙者の肺、肉芽腫形成、肝臓の線維症、肺の線維症、移植拒絶、移植片対宿主疾患、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、腫瘍性疾患、気管支喘息、Ｉ型インスリン依存型真性糖尿病、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、乾癬、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、分類不能免疫不全症、播種性血管内凝固、全身性強皮症、脳脊髄炎、肺炎、高ＩｇＥ症候群、癌転移、癌増殖、養子免疫治療、後天性呼吸促迫症候群、敗血症、再灌流症候群、術後炎症、臓器移植、脱毛症があげられるが、これに限定されるものではない。
【０１２３】
ＡＫＴ活性の低下に起因するＡＫＴによる機能障害は、米国特許出願公開第２００４／０１２２０７７号明細書、同第２００６／０２４１１６８号明細書、同第２００７／０２１９１３９号明細書（その内容を本明細書に援用する）にも開示されている。
【０１２４】
本明細書に開示の医薬品は、標準的な手法で調製され、低減、予防または排除するか、あるいは治療対象となる症状の進行を遅くするまたは停止するよう選択された薬用量で投与される（ヒト治療法向けのさまざまな作用剤を投与する方法の一般的な説明については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ，  ａｎｄ  Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．（その内容を本明細書に援用する）などを参照のこと）。ここに開示の化合物で表される化合物の組成物は、放出制御送達系または徐放性送達系（カプセル、生分解性マトリクスなど）を用いて送達可能である。ここに開示の化合物の組成物の投与に適した薬剤送達用の例示的な徐放送達系は、米国特許第５，９９０，０９２号（Ｗａｌｓｈに付与）、同第５，０３９，６６０号（Ｌｅｏｎａｒｄに付与）、同第４，４５２，７７５号（Ｋｅｎｔに付与）、同第３，８５４，４８０号（Ｚａｆｆａｒｏｎｉに付与）（これらの教示内容全体を本明細書に援用する）に記載されている。
【０１２５】
本発明の化合物から製剤組成物を調製するために、薬学的に許容されるキャリアは、固体であっても液体であってもよい。固体形態の調製物は、粉末、錠剤、ピル、カプセル、カシェー、坐剤、分散性顆粒を含む。たとえば、本発明の化合物は、送達時に再構成される粉末形態であってもよい。固体のキャリアには、希釈剤、香味料、可溶化剤、潤滑剤、懸濁剤、バインダー、保存料、錠剤崩壊剤または被包材料としても作用し得る１種類以上の物質が可能である。粉末では、キャリアは、微粉砕された活性成分との混合物状態である微粉砕された固体である。
【０１２６】
錠剤では、活性成分は、必要な結合特性を有するキャリアと好適な比率で混合され、所望の形状およびサイズに打錠される。
【０１２７】
粉末および錠剤は、好ましくは、約１〜約７パーセントの活性成分を含有する。好適なキャリアは、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、スターチ、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、カカオバターなどである。錠剤、粉末、カシェー、薬用キャンディ、速溶性ストリップ、カプセル、ピルを、経口投与に適した活性成分を含有する固体剤形として使用することも可能である。
【０１２８】
液体形態の調製物は、溶液、懸濁液、停留浣腸液、エマルション、たとえば、水または水プロピレングリコール溶液を含む。非経口注射用として、液体調製物を、ポリエチレングリコール水溶液中の溶液として配合可能である。
【０１２９】
経口投与に適した水溶液は、活性成分を水に溶解させ、必要に応じて好適な着色料、香料、安定化剤、増粘剤を加えることで調製可能なものである。経口投与用の水性懸濁液は、天然または合成のゴム、樹脂、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、他の周知の懸濁剤などの粘性材料を含む水に微粉砕した活性成分を分散させることで調製可能である。
【０１３０】
製剤組成物は、好ましくは単位剤形のものである。このような形態で、組成物を、適切な量の活性成分を含有する単位用量に細分する。単位剤形は、パッケージに封入された調製物であってもよく、このパッケージに離散量の錠剤、粉末、カプセルなどが、バイアルまたはアンプルに入って含まれる。また、単位剤形は、錠剤、カシェー、カプセルまたは薬用キャンディ自体であってもよく、あるいは、これらのいずれかを適切な量でパッケージに封入した形態であってもよい。単位用量の調製物における活性成分の量を、約０．１ｍｇ〜約１０００．０ｍｇ、好ましくは約０．１ｍｇ〜約１００ｍｇ（静脈内投与用など）または約１．０ｍｇ〜約１０００ｍｇ（経口投与用など）で変更または調整してもよい。しかしながら、患者の要件、治療対象となる症状の重篤度、利用する化合物および投与経路に応じて薬用量を変更してもよい。特定の状況に合わせた適切な薬用量の決定は当業者が対応できる範囲内である。また、製剤組成物は、必要であれば、他の適合する治療剤を含むものであってもよい。
【０１３１】
通常、ここに開示の化合物および本発明の製剤組成物をｉｎ  ｖｉｖｏにて送達するための方法では、作用剤を送達するための当該技術分野で認められているプロトコールを利用し、手順の点での実質的な変更は、当該技術分野で認められているプロトコールにおける薬剤に代えて、ここに開示のいずれかの化合物によって表される化合物を用いる点だけである。
【０１３２】
本発明の化合物は、どのような経路で投与してもよいものであり、好ましくはこのような経路に適した製剤組成物の形態で投与すればよく、治療対象となる症状に左右される。化合物および組成物を、たとえば、血管内、筋肉内、皮下、腹腔内、経口または局所投与してもよい。以下の剤形が、活性成分として、本発明の化合物または本発明の化合物の対応する薬学的に許容される塩を含むものであってもよいことは、当業者であれば自明であろう。本発明の化合物に好ましい投与方法は静脈内投与である。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、組成物を注射で非経投与してもよい。非経口投与は、たとえば、関節内、筋肉内、静脈内、脳室内、動脈内、くも膜下腔内、皮下または腹腔内投与を含み得る。非経口投与用の製剤は、水性の形態であってもよいし、非水性の等張滅菌注射溶液の形態または懸濁液の形態であってもよい。これらの溶液または懸濁液は、経口投与用の製剤で用いる場合に説明した１種類以上のキャリアを含む滅菌粉末または顆粒から調製することができる。化合物を、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、とうもろこし油、ベンジルアルコール、塩化ナトリウム、および／またはさまざまな緩衝液（重炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウムなど）に溶解させてもよい。
【０１３４】
経口投与用では、製剤組成物は、たとえば、錠剤、カプセル、懸濁液または液体の形態であってもよい。組成物は、好ましくは、治療有効量の活性成分を含有する投与単位の形態で生成される。このような投与単位の例として、錠剤およびカプセルがあげられる。治療目的で、錠剤およびカプセルは、活性成分に加えて、アカシアゴム、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ソルビトールまたはトラガントなどの結合剤；リン酸カルシウム、グリシン、ラクトース、トウモロコシスターチ、ソルビトールまたはスクロースなどのフィラー；ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、シリカまたはタルクなどの潤滑剤；ジャガイモスターチ、香味料または着色料または許容可能な湿潤剤などの崩壊剤といった従来のキャリアを含有可能である。通常は水性または油性の溶液、懸濁液、エマルション、シロップまたはエリキシル剤の形態である経口液体調製物は、懸濁剤、乳化剤、非水性剤、保存料、着色料および香味料などの従来の添加剤を含有するものであってもよい。液体調製物用の添加剤の例としては、アカシア、アーモンド油、エチルアルコール、分留済ココナッツオイル、ゼラチン、グルコースシロップ、グリセリン、水添食用脂、レシチン、メチルセルロース、メチルまたはプロピルパラ−ヒドロキシベンゾエート、プロピレングリコール、ソルビトールまたはソルビン酸があげられる。
【０１３５】
局所用では、本発明の化合物を、皮膚あるいは、鼻や喉の粘膜に適用される好適な形態で調製してもよいし、クリーム、軟膏、液体スプレーまたは吸入剤、薬用キャンディまたは喉用の塗り薬の形態をとってもよい。このような局所用製剤は、活性成分の表面浸透を容易にするためのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの化学化合物を含み得る。局所投与用の好適なキャリアとしては、ミネラルオイル、ワセリンなどを用いた水中油滴型または油中水滴型エマルションならびに、ハイドロゲルなどのゲルがあげられる。別の局所製剤として、シャンプー調製物、経口ペースト、口腔洗浄薬があげられる。
【０１３６】
眼または耳への塗布用では、本発明の化合物を、軟膏、クリーム、ローション、ペイントまたは粉末などの疎水性または親水性ベースに配合した液体または半液体形態で調製してもよい。
【０１３７】
直腸投与用では、本発明の化合物を、カカオバター、ワックスまたは他のグリセリドなどの従来のキャリアと混合した坐剤の形態で投与してもよい。坐剤を調製するには、脂肪酸グリセリドまたはカカオバターの混合物などの低融点ワックスをまず溶融させ、活性成分を攪拌による場合のようにそこに均質に分散させる。次に、この溶融した均質な混合物を都合のよい大きさの型に注ぎ、そのまま冷まして固化させる。
【０１３８】
送達を患者の脳または体腔への注射によって、あるいは持続放出または徐放マトリクス送達系を使用することで、あるいはミセル、ゲル、リポソームを用いるオンサイト送達によって実施することも可能である。噴霧装置、粉末吸入器、エアロゾル化した溶液が、呼吸器へのこのような調製物の投与に使用できる代表的な方法である。送達は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏであり得る。
【０１３９】
たとえば、本発明の化合物に好適な静脈内薬用量は、治療ごとの体重基準で、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇであり得る。特定の作用剤、患者および虚血または虚血・再灌流障害に合った薬用量および投与経路の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。好ましくは、薬用量は、有害な副作用を引き起こさないか、生じても最小限のものである。
【０１４０】
治療有効量の本発明の化合物を単独で投与してもよいし、１種類以上の他の治療剤と併用投与しても構わない。本発明の化合物との併用で投与可能な、虚血障害の治療に有用な好適な治療剤としては、カルシウムチャネルブロッカー、βブロッカー、ニトログリセリン、アスピリン、抗炎症剤、ナトリウム利尿因子、血管拡張薬、血栓溶解剤および抗血栓剤があげられるが、これに限定されるものではない。
【０１４１】
よって、本発明の化合物は、（１種類以上の他の治療剤などとの）併用剤の一部として投与可能なものである。本発明の化合物を、１種類以上の他の治療剤の前、後または同時発生的に投与可能である。いくつかの実施形態では、本発明の化合物および他の治療剤を、別の製剤として、あるいはジョイント製剤として、同時に（同時発生的になど）同時投与可能である。あるいは、作用剤を別々の組成物として、熟練した臨床医が判断する適切な時間枠内（治療法での薬剤作用のオーバーラップが可能なだけの時間など）で順次投与してもよい。本発明の化合物および１種類以上の他の治療剤を、単一用量で投与してもよいし、所望の治療効果（関節炎の低減および／または阻害；虚血の低減および／または阻害、虚血障害の低減および／または阻害；虚血・再灌流障害の低減および／または阻害など）を得るのに適した順序およびスケジュールで、複数用量で投与してもよい。好適な薬用量および投与の投与計画は、臨床医が判断できるものであり、選択される作用剤、薬学的製剤および投与経路、さまざまな患者要因および他の考慮事項に左右される。
【０１４２】
本明細書で説明するように、本発明はさらに、複数用量の本発明の化合物を非標準の延長された投与間隔で投与することで、化合物の単回用量投与の場合に比して、虚血障害または虚血・再灌流障害を治療するための化合物の有効性を高められるという驚くべき発見に基づくものである。よって、特定の実施形態では、本発明は、被検体に、多（すなわち２以上）用量の本発明の化合物を投与することを含む、虚血障害または虚血・再灌流障害の治療を必要とする被検体においてそれを治療するための方法に関する。特定の実施形態では、この方法は、虚血障害または虚血・再灌流障害の前に被検体に、少なくとも２用量の本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含み、この用量は、非最終用量および最終用量を含む。本明細書で使用する場合、「最終用量」とは、虚血障害または虚血・再灌流障害の前に被検体に投与される本発明の化合物の最後の用量を示す。好ましくは、最終用量は、障害の直前に投与される。本明細書で使用する場合、「最終用量」および「障害」との関連での「即時」という表現は、時間的に近いまたは極めて近いことを意味し、最終用量と障害との間に介在用量がない。本明細書で定義するように、「障害の直前」とは、障害の約０分前（障害開始時など）から約２時間前の範囲の時点を意味する。最終用量の投与に合った例示的な時点として、たとえば、障害の約５分前、約１０分前、約１５分前、約３０分前、約４５分前、約６０分前、約９０分前があげられる。
【０１４３】
「非最終用量」という用語は、最終用量に先行する本発明の化合物の用量を示し、非最終用量と最終用量との間に被検体に投与される化合物の介在用量がない。通常、非最終用量は、障害の約４８時前以内の時点で被検体に投与され、好ましくは障害の約２４時間前以内、一層好ましくは障害の約１２時間前以内（障害の約１０時間前、約８時間前、約６時間前または約４時間前など）に投与される。
【０１４４】
本発明によれば、非最終用量および最終用量を、化合物の単一用量投与の場合と比較して障害を治療するための化合物の有効性を高める投与間隔で投与する。本明細書で使用する場合、「高める」という表現は、薬剤の作用を増強または増大させる、あるいは生化学的作用または生理学的作用または薬剤の作用を促進または強化することを意味する。本明細書で使用する場合、「化合物の有効性を高める」という言い回しは、特に治療が求められる虚血障害または〆虚血・再灌流障害の１種類以上の症候の治療に関する場合、生化学的作用または生理学的作用あるいは被検体における化合物の作用を増強または増大させることを意味する。
【０１４５】
一般に、薬理作用物質の有効性はその血漿濃度と直接関係があり、血漿濃度が下がると有効性も低くなる。よって、標準的な複数用量での投与計画においては、薬理作用物質を、治療を受ける被検体であらかじめ定められた血漿濃度または最適な血漿濃度を維持するよう設計された投与スケジュールで投与する。最適な間隔より長い投与間隔で作用剤を投与すると、次の用量を投与する前にその血漿濃度が望ましくないほどに低いレベルまで下がる場合があり、これに伴って有効性も低下する。しかしながら、本明細書で説明するように、複数用量の本発明の化合物を、標準的な間隔（化合物の少なくとも約４半減期の投与間隔など）よりかなり長い投与間隔で投与すると、予想外に化合物の有効性が増加する。
【０１４６】
虚血障害または虚血・再灌流障害を治療するための化合物の有効性については、測定対象となるパラメータに合った標準的なアッセイを用いて、被検体の治療前後の被検体における生化学的または生理学的パラメータを測定することで、当業者であれば容易に評価可能である。たとえば、虚血障害または虚血・再灌流障害の前後のさまざまな時点で被検体から得られる血液試料中での特定の心筋酵素（クレアチンキナーゼ（ＣＫ−ＭＢなど）、トロポニン−Ｔ、トロポニン−Ｉ）を含む代替心臓バイオマーカーのレベルを分析することで、本発明の化合物の有効性を求めることが可能であり、この場合、酵素レベルの統計的に有意な低減が、障害の治療にあたって有効性のある化合物を示すものとなる。例示的な評価では、障害の前（障害の約６〜約４８時間前など）に１種類以上の血液試料を被検体から採取し、ＣＫ−ＭＢおよびトロポニン−Ｔレベルを分析する。次に、障害後のさまざまな時点（障害の６．０時間後、１２．０時間後、１８．０時間後、２４．０時間後など）で血液試料を被検体から採取し、これらの試料１つ以上でＣＫ−ＭＢおよびトロポニン−Ｔレベルを分析する。
【０１４７】
また、本発明の化合物の有効性を、心電図（ＥＣＧ）の観察によって求めることができる。たとえば、投与前（投与の約５分前など）に電子的なデータ記憶部を有する１２誘導ＥＣＧ連続監視装置を被検体に取り付けた上で、標準１２誘導ＥＣＧによる連続監視を実施することができる。そして、障害の前と後（障害の約２４時間後までなど）にＥＣＧの記録を得ることが可能である。異常なＥＣＧトレースから正常なＥＣＧトレース（高いＳＴセグメントの低下など）への変化が、障害の治療にあたって有効性のある化合物を示すものとなる。
【０１４８】
また、本明細書の実施例８で説明するように、心筋梗塞エリア（ＭＩ）と危険のある虚血エリア（ＡＲ）との比を求めて、本発明の化合物の有効性を評価することも可能であり、この場合、ＭＩ／ＡＲ比の統計的に有意な低下が、害の治療にあたって有効性のある化合物を示すものとなる。
【０１４９】
上述したもの（心筋酵素レベル、ＥＣＧトレース、ＭＩ／ＡＲ比など）を含む有効性についてのいずれかの好適な尺度を用いて、当業者であれば、化合物を複数用量で投与すると単一用量投与の場合よりも化合物の有効性が高くなるか否かを判断可能である。たとえば、複数用量での投与計画に対する化合物の有効性についての尺度を、同一の経路による単一用量投与の場合のその有効性についての対応する尺度と比較することが可能である。単一用量として投与した場合の特定の薬用量（５．０ｍｇ／ｋｇ静脈内など）に対応する有効性の測定は、たとえば、個体群前研究（ｐｒｉｏｒ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ）（臨床試験など）に基づく典型的または標準的な有効性の測定である。あるいは、特定用量の化合物の単一用量投与での有効性を、同一の障害での治療対象となる別の患者で実験的に判断可能である。
【０１５０】
具体的には、これらのパラメータを測定する標準プロトコールでの臨床研究で得られたデータを使用して、特定の個体群（本明細書に記載の特定の外科的手法を受けている患者など、治療の必要な被検体を含む個体群など）で本発明の化合物の有効性を高めるのに好適な薬用量および投与間隔を求めることが可能である。被検体または被検体個体群での実測パラメータの統計的に有意な増減は、虚血障害または虚血性再灌流障害を治療するための化合物の有効性を高める用量および投与間隔を示すものである。
【０１５１】
化合物の単一用量投与の場合に比して複数用量での方法における本発明の化合物の有効性を高める非最終用量と最終用量との間の投与間隔は一般に、少なくとも約４時間の長さであり、たとえば、約４〜約１２時間、好ましくは約４〜約８時間、一層好ましくは約４〜約６時間の範囲である。
【０１５２】
上述したように、薬理作用物質の有効性は通常その血漿濃度と相関し、血漿濃度が下がるにつれて有効性も低下する。化合物の血漿濃度はその半減期と直接関連しているため、治療を受ける被検体においてあらかじめ定められた血漿濃度または最適な血漿濃度を維持するための適切な投与間隔の判断には、化合物の半減期が用いられることが多い。したがって、化合物の有効性を高めるための投与間隔を、化合物の半減期で定義することが可能である。よって、もうひとつの実施形態では、本発明は、被検体に、２用量の本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩を、障害の前に投与することを含み、２用量が、非最終用量と最終用量とを含み、
（ａ）障害の前に、化合物の約２半減期以内の時点で最終用量を被検体に投与し、
（ｂ）最終用量の投与前に、化合物の少なくとも約４半減期の時点で被検体に非最終用量を投与する、虚血障害または虚血・再灌流障害の治療を必要とする被検体においてそれを治療するための方法に関する。
【０１５３】
好ましくは、障害の前に化合物の約０．２５半減期〜約２半減期、一層好ましくは、障害の前に化合物の約０．２５〜約１半減期の範囲の時点で、化合物の最終用量を被検体に投与する。よって、障害の前に、化合物の約０．２５、０．５、０．７５、１．０、１．２５、１．５、１．７５または約２．０半減期の時点で、最終用量を被検体に投与可能である。
【０１５４】
非最終用量を、最終用量の投与前に化合物の少なくとも約４半減期の時点で、被検体に投与し、最終用量の投与前に約４半減期、約５半減期、約６半減期、約７半減期、約８半減期、約９半減期、約１０半減期、約１２半減期、約１５半減期、約２０半減期、約３０半減期を含むがこれに限定されるものではない。本明細書に記載の理由から、例示的な間隔は、標準的な投与計画で一般に用いられているものよりも長い。
【０１５５】
化合物の半減期は、化合物の濃度がその（初期）最大値の半分（５０％）に落ちるまでに必要な時間の尺度であり、当業者が標準的な方法論で判断可能なものである。よって、たとえば１半減期で、化合物の相対濃度はその初期（すなわち時刻０）濃度の５０％になるのに対し、２半減期では化合物がその初期濃度の２５％で存在し、３半減期では化合物がその初期濃度の１２．５％で存在し、４半減期では化合物がその初期濃度の６．２５％で存在し、５半減期では化合物がその初期濃度の３．１２％で存在し、６半減期では化合物がその初期濃度の１．５６％で存在するといった具合である。このように、化合物の半減期は、化合物を投与された被検体での血中濃度の減少率の尺度として機能する。
【０１５６】
一次プロセスでは、以下のようにして半減期を計算する。
【数１】
0005570590.tif 000040
式中、ｋは任意の一次速度定数である。
【０１５７】
当業者であれば、たとえば化合物を被検体に投与し、化合物投与後のさまざまな時点で被検体から血液試料を採取し、血液試料（質量分析によるなど）中の化合物のレベルおよび／または濃度を分析し、好適なソフトウェアプログラムまたはアルゴリズムを用いてデータを処理することによって、本発明の化合物の半減期を判断可能である。たとえば、ＷｉｎＮｏｌｉｎ（登録商標）ソフトウェア製品（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ（登録商標）；Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して、化合物の半減期および他のＰＫパラメータを容易に計算することが可能である。
【０１５８】
半減期を測定する標準的なプロトコールでの臨床研究で得られるデータを使用して、本明細書に記載のどのような化合物の半減期でも判断可能である。この情報は、虚血障害または虚血性再灌流障害を治療するための化合物の有効性を高める好適な用量および投与間隔を判断するにあたって、臨床医または医師が使用可能なものである。
【０１５９】
ラットおよびヒトにおける異なる薬用量の化合物ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨの半減期を、実施例１２および１３の表１５〜１７で本明細書に記載する。
【０１６０】
好ましくは、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩の濃度が、最終用量の投与時に被検体から得られる血液試料（血清、血漿、全血など）中で、投与後にその最大濃度（Ｃｍａｘ）または最大観察血漿（または血液）レベルの約１０％以下である。たとえば、化合物またはその薬学的に許容される塩の濃度を、最終用量の投与時に被検体から得られる試料中におけるその最大濃度（Ｃｍａｘ）の約０％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９または約１０％にすることが可能である。化合物のＣｍａｘについては、たとえば、化合物を投与した被検体から血液試料を採取した後、適切な分析方法（質量分析など）を用いて試料の化合物濃度を分析することによって判断可能である。得られたデータを用いて、Ｃｍａｘは一般に、好適なアルゴリズムまたはソフトウェアプログラム（ＷｉｎＮｏｌｉｎ（登録商標）ソフトウェア製品（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ（登録商標）；Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）など）を用いて計算される。被検体における化合物のＣｍａｘの判断は、熟練した臨床医または医師によって容易に実施可能である。
【０１６１】
一実施形態では、非最終用量と最終用量とが等量である。あるいは、非最終用量と最終用量との量が異なっていてもよい（非最終用量約１．０ｍｇ／ｋｇ、最終用量約０．５ｍｇ／ｋｇ、この場合、両用量が静脈内で提供されるなど）および／または投与経路（たとえば静脈内非最終用量および心臓内最終用量。好ましくは、非最終用量および最終用量を、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５．０ｍｇ／ｋｇの範囲の薬用量で被検体に静脈内投与する。本発明の化合物の他の好ましい投与経路として、たとえば、心臓内（ＩＣ）、腹腔内（ＩＰ）、経口（ＰＯ）があげられる。本明細書で説明するように、化合物ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨは、静脈内投与（大量瞬時ＩＶおよび点滴による）、経口、心臓内投与した場合に、Ｉ／Ｒ障害のラットモデルで有効であった。
【０１６２】
被検体に与えられる本発明の化合物の薬用量を、患者の要件、治療対象となる症状の重篤度、利用する投与経路および化合物に応じて変更してもよい。特定の状況に合わせた適切な薬用量の決定は当業者が対応できる範囲内である。たとえば、ヒトへの投与に適した薬用量は、動物（ラットなど）モデルでの実験で得られるデータから外挿可能である。非ヒト動物モデルの薬用量データをヒトでの薬用量に外挿するためのガイダンスを、たとえば、ＦＤＡ  Ｄｒａｆｔ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ：  Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｄｏｓｅ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ  （２００５）に見つけられる。
【０１６３】
本明細書に記載の複数用量での本発明の方法は、特定の実施形態において、１以上の追加の用量の本発明の化合物を投与するステップを含み得る。このような追加の用量は、非最終用量と最終用量との間ではなく前に（すなわち非最終用量の前）投与可能である。このような事前用量は一般に、障害の約７日以内前に投与され、たとえば、障害の約６日以内、約５日以内、約４日以内、約３日以内、約２日以内または約１日以内前に投与される。複数用量での投与計画で非最終用量の投与前に本発明の化合物を投与するための他の好適な時点として、障害の約１８時間前、約１５時間前、約１２時間前、約１０時間前、約８時間前があげられるが、これに限定されるものではない。
【０１６４】
これに代えてあるいはこれに加えて、１以上の用量の化合物を、虚血障害または虚血・再灌流障害が起こった後に、本発明の複数用量での投与計画で、被検体に投与可能である。虚血障害または虚血・再灌流障害後に複数用量の本発明の化合物を投与するのに好適な時点として、本明細書で先に記載されたものがあげられ、たとえば、障害の約１時間後、約２時間後、約３時間後または約４時間後である。
【０１６５】
よって、本発明の化合物は、これを必要とする被検体に、２以上の用量、たとえば、２用量、３用量、４用量、５用量、６用量、７用量、８用量、９用量または１０用量で投与可能なものである。このような用量は、虚血障害または虚血・再灌流障害の約７日前から虚血障害または虚血・再灌流障害の約７日後までの時間におよび得るものであり、好ましくは、虚血障害または虚血・再灌流障害の約２日前から虚血障害または虚血・再灌流障害の約１日後までの範囲である。
【０１６６】
非最終用量前および／または障害後の追加の用量は、非最終用量および最終用量と同一の投与間隔および／または投与経路で投与可能であり、あるいは、非最終用量および最終用量とは異なる投与間隔および／または投与経路で与えてもよい。たとえば、本発明の化合物は、これを必要とする被検体に、３用量で投与可能であり、この場合、用量を障害の８時間前（すなわち非最終用量の前の追加の用量）、５時間前（すなわち非最終用量）、０．２５時間前（すなわち最終用量）に与える。
【０１６７】
同様に、非最終用量の前または障害の後に投与される追加の用量各々を、非最終用量または最終用量に等しい用量または１以上の他の異なる用量で与えることも可能である。たとえば、本発明の化合物を、これを必要とする被検体に、非最終用量、最終用量、追加の用量を含む３用量で投与可能であり、この場合、非最終用量および最終用量を０．５ｍｇ／ｋｇで静脈内に与え、追加の用量を１．０ｍｇ／ｋｇで静脈内に与える。
【０１６８】
特定の本発明の化合物、患者および虚血または虚血・再灌流障害に合った適切な多投与計画の判断は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【実施例】
【０１６９】
実施例１：化合物の合成
材料および方法：
ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨ（Ｌｉｐ−ＥＡ）の合成
Ｒリポ酸（ＲＬｉｐ−ＯＨ、１．００ｇ）をジオキサンに溶解させた。反応フラスコをホイルで覆って溶液を直射光から保護した。ＤＩＥＡ（０．８４５ｍＬ）およびＤＳＣ（１．２４ｇ）を順次加え、反応物を室温にて一晩攪拌・通気して、Ｌｉｐ−ＮＨＳをｉｎ  ｓｉｔｕにて形成した。グルタミル−アラニン（Ｈ−ＥＡ−ＯＨ、１．１１ｇ）およびＤＩＥＡ（２．６５ｍＬ）の水溶液を調製し、Ｌｉｐ−ＮＨＳの溶液に加えた。この混合溶液を一晩攪拌した後、分液漏斗に移した。酢酸エチルに続いて５％ＫＨＳＯ４（ａｑ）を反応混合物に加えた。有機相を回収し、５％ＫＨＳＯ４（ａｑ）で洗浄した後、飽和ＮａＣｌ（ａｑ）で洗浄した。有機相を再び回収し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過後にｉｎ  ｖａｃｕｏで蒸発させて、粗ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨを淡黄色泡沫として得た。粗泡沫の一部を、２：１水-アセトニトリル（０．５％ＨＯＡｃ）を用いるＲＰ−ＨＰＬＣでの精製用に溶解させ、アセトニトリル（０．５％酢酸）を水（０．５％酢酸）に入れた増加する勾配で、ＹＭＣ  Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８逆相カラムで生成物を単離した。画分を含む生成物を分析用ＨＰＬＣで同定し、プールし、冷凍し、凍結乾燥させて、ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨ（１６５ｍｇ）を１００％ＨＰＬＣ純度（２２０ｎｍでの面積％）で得た。生成物のＮＭＲは構造と一致し、観察された質量が４０５（Ｍ−１）、計算値は４０６であった。
【０１７０】
同様の手法を用いてＲ／ＳＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨ，およびＳＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨを調製した。ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨおよびＳＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨの調製用に、それぞれ光学的に純粋なＲＬｉｐ−ＯＨおよびＳＬｉｐ−ＯＨ開始材料を得た。光学回転によって光学純度をアッセイし、出荷規格（ｒｅｌｅａｓｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を満たした。生成物の構造と同一性を、ＭＳ、ＨＰＬＣ保持時間シフト（Ｌｉｐ−ＯＨ開始材料との関係）、殆どの事例ではＮＭＲで確認した。本明細書に記載の化合物についての化合物の構造、名称、適切な略記を表１にあげておく。この実施例で説明する化合物の分析データを表２に示す。
【０１７１】
ＲＬｉｐ−ＯＨについては市販品を入手した（Ｌａｂｏｃｈｉｍ，  Ｍｉｌａｎ，  Ｉｔａｌｙ）。Ｒ／ＳＬｉｐ−Ｅａ−ＯＨおよびＡｃ−ＥＡ−ＯＨを契約によって取得した。
【０１７２】
ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨ（Ｌｉｐ−ＥＡ）のジリジン塩の調製
ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨ（２０．０ｇ）をエタノール-水（１９：１）に溶解させた。２等量のリジン（１４．４ｇ）をＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨのエタノール溶液に加え、スラリーを還流するまで温めた。３０分間の還流後、溶液をそのまま室温まで冷ました。生成物であるＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨのジリジン塩を濾過により回収し、無水エタノールですすぎ、ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨのジリジン塩を９６％回収できる一定重量まで乾燥させた。
【０１７３】
【表１】
0005570590.tif 000041
【０１７４】
【表２】
0005570590.tif 000042
【０１７５】
実施例２：ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨ処理によって、培養細胞にて用量依存的にＡｋｔリン酸化／活性化が誘導される
細胞の細胞膜における周知のレセプターでシグナル形質導入経路を活性化させることで、Ａｋｔをリン酸化して活性化する。リン酸化Ａｋｔは、固定細胞および透過処理した細胞にて特異的抗体でｉｎ  ｓｉｔｕにて容易に検出される。
【０１７６】
材料および方法：
Ａｋｔ活性化用のサイトブロットアッセイ
細胞内ウェスタンブロットすなわちサイトブロットを使用して、ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨがリン酸化Ａｋｔを増加させる機能をアッセイした。Ａ５４９細胞（ヒト非小細胞肺癌細胞系）を、これらの細胞がリン酸化Ａｋｔのレベルを増減させるよう操作可能であるという理由で選択した。細胞を培養プレートに播種し、底に付着させた後、処理し、固定し、透過処理した。透過処理後、細胞をｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔまたは全Ａｋｔのいずれかに特異的な抗体で処理した。次に、細胞を蛍光二次抗体で処理して、結合した一次抗体の量を定量化した。全Ａｋｔおよびｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔを同時に検出した。
【０１７７】
Ａ５４９細胞を３８４ウェルの黒壁透明底の細胞培養処理マイクロタイタープレートに７０％コンフルエンスで蒔いた。細胞を一晩インキュベートして、細胞の結合を可能にした。培地を低血清（０．１％、ウシ胎仔血清［ＦＢＳ］）に変更し、細胞をさらに２４時間インキュベートした。細胞を被験化合物で処理し、固定し、Ａｋｔアッセイ用に透過処理した。固定液には３．７％ホルムアルデヒドをリン酸緩衝生理食塩水に入れたものを用いた。透過処理緩衝液には０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００をリン酸緩衝生理食塩水に入れたものを用いた。細胞の透過処理後、２つのリン酸化部位（トレオニン−３０８およびセリン−４７３）のいずれかにおける全Ａｋｔおよびリン酸化Ａｋｔの量を７通りの試験濃度で求め、各々四重に実施した。ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔデータを全Ａｋｔに正規化し、解析用にバックグラウンドを除去した。
【０１７８】
基底Ａｋｔリン酸化を抑えるための一晩の血清飢餓後、細胞を、ビヒクル、ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨまたはＲＬｉｐ−ＯＨで刺激した。細胞を４５分間または３時間処理し、セリン−４７３またはトレオニン３０８でのリン酸化についてそれぞれ検討した。
【０１７９】
リン酸化Ａｋｔの免疫組織化学アッセイ
ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨがリン酸化Ａｋｔを増加させる機能をＨ９ｃ２細胞で免疫細胞化学的にアッセイした後、顕微鏡で可視化した。Ｈ９ｃ２細胞は、ラット心臓筋細胞由来の細胞系であり、リン酸化Ａｋｔのレベルを増減させるよう操作可能である。細胞を培養プレートに播種し、そのまま底に付着させ、処理し、固定し、透過処理した。透過処理後、細胞をまずは特異的ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ抗体で処理した後、蛍光二次抗体で処理して結合された一次抗体の量を定量化した。
【０１８０】
Ｈ９ｃ２細胞を、１２ウェルの細胞培養処理プレートに７０％コンフルエンスでに蒔いた。細胞を一晩インキュベートして、細胞の結合を可能にした。培地を低血清（０．５％、ウシ胎仔血清［ＦＢＳ］）に変更し、細胞をさらに４８時間インキュベートした。細胞を、ビヒクル、ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨ（５０μＭ）のいずれかで３時間処理し、あるいは、３．７％ホルムアルデヒドをリン酸緩衝生理食塩水に入れたもので固定したＬＹ２９４００２（２５μＭ）で同時処理し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００をリン酸緩衝生理食塩水に入れたもので透過処理した。透過処理後、細胞をトレオニン−３０８でのＡｋｔリン酸化に特異的な抗体で処理した後、蛍光標識二次抗体で処理した。
【０１８１】
結果：
ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨおよびＲＬｉｐ−ＯＨが、全Ａｋｔに比してＡｋｔリン酸化に対しておよぼす作用を、上述したようなサイトブロットアッセイを用いてＡ５４９細胞で評価した。リン酸化ＡｋｔがＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨおよびＲＬｉｐ−ＯＨでの処理後に４５分後にセリン４７３で３倍および２倍増加したのが観察された（図２）。ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨおよびＲＬｉｐ−ＯＨの両方で、リン酸化Ａｋｔの量が全Ａｋｔに比して用量依存的に増加した。ほとんどの用量レベルでＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨのほうがＲＬｉｐ−ＯＨよりも効果的であった。
【０１８２】
周知のホスホチジルイノシトール−３’−キナーゼインヒビター（Ｖｌａｈｏｓ，  Ｃ．Ｊ．，  Ｍａｔｔｅｒ，  Ｗ．Ｆ．，  Ｈｕｉ，  Ｋ．Ｙ．，  Ｂｒｏｗｎ，  Ｒ．Ｆ．  Ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ３−ｋｉｎａｓｅ，  ２−（４−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）−８−ｐｈｅｎｙｌ−４Ｈ−１−ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ−４−ｏｎｅ  （ＬＹ２９４００２）．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９４，  ２６９：５２４１−５２４８）であるＬＹ２９４００２の存在下および非存在下でのＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨ処理についても評価した。細胞を３時間処理し、チロシン−３０８でのリン酸化について検討した。ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨ単独での処理の３時間後にＡｋｔリン酸化の増加を観察した。ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨ処理に応答したＡｋｔリン酸化の増加は、５μＭのＬＹ２９４００２での同時処理によって完全に阻害された（図３）。
【０１８３】
また、ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨがＡｋｔリン酸化に対しておよぼす作用を、上述した免疫組織化学アッセイを用いてＨ９ｃ２細胞で評価した。ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨ処理を、ＬＹ２９４００２の存在下でビヒクル処理またはＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨ処理のいずれかと比較した。ビヒクルで処理した細胞はほとんど蛍光を示さなかった。蛍光強度は、ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨで３時間処理した細胞のほうがかなり明るかった。ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨを加える前にＬＹ２９４００２でさらに３０分間細胞を同時処理したところ、Ａｋｔリン酸化から蛍光強度が低下した。
【０１８４】
実施例３：ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨはインスリンレセプターチロシンキナーゼ（ＩＲＫ）を活性化する
材料および方法：ＩＲＫ活性化アッセイ
Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）  ３０００および１２−ｓｉｐｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）を用いる移動度シフトアッセイによって、インスリンレセプターキナーゼ活性を容易に測定し、リン酸化基質と未リン酸化基質の両方を検出した（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ａｌｌｉａｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，  Ｈａｎｏｖｅｒ，  ＭＤ）。移動度シフトキナーゼアッセイでは、蛍光ペプチド基質のリン酸化生成物への変換を測定するのにマイクロ流体チップを使用する。マイクロタイタープレートウェルからの反応混合物を毛細管シッパー（ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｓｉｐｐｅｒ）を介してチップに導入し、非リン酸化基質とリン酸化生成物とを電気泳動で分離して、レーザ誘導蛍光で検出した。経時的な蛍光シグナルのサインから、反応の程度が明らかになった。チロシンキナーゼの触媒サブユニットはＡＴＰおよび基質の存在下にて内在性の活性レベルを有するため、結果を対照の％として示す。
【０１８５】
具体的には、各被験化合物を１００％ＤＭＳＯでそのアッセイ濃度の２５倍に希釈し、室温で１５分間のプレインキュベーションの前にジチオスレイトール（ＤＴＴ、２ｍＭ）およびインスリンレセプターキナーゼドメイン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号１４〜４６６、８０ｎＭ）を含有する１２μＬのアッセイ緩衝液溶液（１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５ｍＭ  Ｂ−ＧＰおよび０．００２％Ｂｒｉｊ）に加えた。プレインキュベーション後、３μＭの蛍光ペプチド基質およびＡＴＰ（１６２０μＭ）を含有するアッセイ緩衝液（１２μＬ）を加え、混合物を室温にてさらに１．５時間インキュベートした後、その時点で約５０％の基質が生成物に変換された。試料をＬａｂＣｈｉｐ  ３０００に置き、親基質およびリン酸化生成物の量を測定した。
【０１８６】
結果：
上述したＩＲＫ活性化アッセイを使用して、化合物がインスリンレセプターチロシンキナーゼ（ＩＲＫ）を活性化する機能を１００μＭで評価した。このアッセイの結果を表３に示す。
【０１８７】
【表３】
0005570590.tif 000043
【０１８８】
実施例４：ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨはＩＧＦ１ＲキナーゼおよびＳｒｃチロシンキナーゼを活性化する
材料および方法：ＩＧＦ１およびＳｒｃチロシンキナーゼ活性化アッセイ。
ＩＧＦ１ＲおよびＳｒｃチロシンキナーゼは、ＡＴＰおよび基質の存在下にて内在性の活性レベルを有する。この活性を、Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）  ３０００および１２−ｓｉｐｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）を用いる移動度シフトアッセイで容易に測定し、リン酸化基質と未リン酸化基質の両方を検出した（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ａｌｌｉａｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）。酵素、基質、ＡＴＰ濃度を各アッセイに合わせて最適化した。ＩＧＦ１Ｒアッセイでは、酵素、ペプチド、ＡＴＰの最終濃度をそれぞれ２０ｎＭ、１．５μＭ、１２２０μＭとした。Ｓｒｃアッセイでは、酵素、ペプチド、ＡＴＰの最終濃度をそれぞれ２．５ｎＭ、１．５μＭ、１７μＭとした。
【０１８９】
ＩＧＦ１レセプターキナーゼ（ＩＧＦ１Ｒ）およびＳｒｃの活性化に対する作用について、ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨを複数の濃度で評価した。１００μＭ濃度の異なるＬｉｐ−ＥＡ化合物がキナーゼ活性化に対しておよぼす作用を表４ａに示す。試験した化合物は、ＩＧＦ１ＲおよびＳｒｃを異なる選択性で活性化した。
【０１９０】
３００μＭのＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨまたはＲＬｉｐ−ＯＨが異なるチロシンキナーゼの活性化に対しておよぼす作用も評価した（表４ｂ）。この濃度で、ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨは、ビヒクル対照に比してＩＲＫおよびＳｒｃチロシンキナーゼの両方でＲＬｉｐ−ＯＨよりも有意に大きな活性化を誘導した。
【０１９１】
【表４】
0005570590.tif 000044
【０１９２】
【表５】
0005570590.tif 000045
【０１９３】
実施例５：ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨは、培養細胞でアポトーシスを予防し、細胞の生存を促進する
材料および方法：Ｊｕｒｋａｔ細胞での細胞生存アッセイ
ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨがアポトーシスを予防し、細胞の生存を促進する機能を、細胞死を媒介するタンパク質であるレセプター相互作用タンパク質（ＲＩＰ）を欠損したＪｕｒｋａｔ細胞で評価した。Ｊｕｒｋａｔ細胞系は、ヒトＴ−リンパ球由来である。ＲＩＰ欠損Ｊｕｒｋａｔ細胞は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）で処理するとアポトーシスの影響を受ける。これらの細胞をビヒクルまたはＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨのいずれかで処理した後、ＴＮＦαでアポトーシスを引き起こした。細胞の生存を評価して、ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨが細胞をＴＮＦα誘導アポトーシスから保護するか否かを調べた。
【０１９４】
ＲＩＰ欠損Ｊｕｒｋａｔ細胞を９６ウェルのプレートに１ウェルあたり細胞２０，０００個で播種し、ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨ（各濃度について６ウェル）またはＤＭＳＯで２時間処理した。前処理後、各用量の薬剤について３ウェルを１０ｎｇ／ｍＬのヒト組換えＴＮＦαに曝露した（他の３ウェルにはＴＮＦαを加えなかった）。ＴＮＦα処理の２４時間後、ＡＴＰ細胞の生存度を求め（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ，  Ｐｒｏｍｅｇａ）、この値を用いて細胞の％生存を計算した。
【０１９５】
ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨの非存在下、約２０％の細胞がＴＮＦα処理で生存しなかった。細胞をＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨで処理すると、用量依存的にＴＮＦα誘導細胞死が防止された（表５）。
【０１９６】
【表６】
0005570590.tif 000046
【０１９７】
実施例６：ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨは、培養細胞にて細胞内カルシウムのカルバコール刺激増加を用量依存的に阻害する
材料および方法：細胞質カルシウム過負荷アッセイ
細胞質カルシウムは、カルバコールで刺激するとＣＨＯ  Ｍ１−ＷＴ３細胞で増加し（［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏｔｅ  ２，  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ＦＬＩＰＲ（登録商標）  ａｎｄ  ＦＬＥＸｓｔａｔｉｏｎ（商標）  ｆｏｒ  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ］）、カルシウムを結合する蛍光染料で検出できる。カルバコール刺激後の蛍光の増加は、細胞質カルシウムの増加と解釈される。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を９６ウェルの培養プレートの底に付着させた。蛍光染料および被検試料をプレートに載せ細胞に取り込ませた。２秒ごとにプレートリーダー（Ｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ  ＩＩ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  ＣＡ）を用いて蛍光レベルを測定した。細胞をカルバコールで刺激し、蛍光データをカルバコール刺激後の基線上の蛍光のピーク増加として報告した。データを対照試料のピークカルバコール応答に正規化した。
【０１９８】
細胞系ＣＨＯ−Ｍ１−ＷＴ３由来のＣＨＯ細胞を、１０％ＦＢＳおよび５μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８を加えたＨａｍｓ  Ｆ１２培地で成長させ、Ｍ１ムスカリニックレセプターの発現を維持した。実験前夜に細胞３０，０００個／ウェルの濃度で黒壁透明底の９６ウェルのマイクロプレート（「アッセイプレート」）の１ウェルあたり１００μＬの容量にて細胞を播種した。細胞を３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、３７℃で６０分間、Ｆｌｕｏ−４  ＮＷまたはカルシウム−３とともに、ハンクス平衡塩類溶液ならびに２．５ｍＭの水溶性プロベネシドおよび表記の濃度での被験化合物またはビヒクル中で細胞をインキュベートした。各ウェルの最終容量を２００μＬとした。細胞をＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎシステムに入れ、最終濃度２００ｎＭで５０μＬの１μＭカルバコールを添加する前後の蛍光を観察した。カルバコール添加の１７秒前とカルバコール添加の４３秒後に蛍光を測定した。Ｆｌｕｏ−４染料は波長４８５ｎｍで励起され、５２５ｎｍで放出が測定された。カルシウム−３染料は波長４９４ｎｍで励起され、５２５ｎｍで放出が測定された。カルシウム応答を、ピーク蛍光マイナスカルバコール添加前の蛍光の平均として求めた基線蛍光として報告した。
【０１９９】
結果：
ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨ、ＲＬｉｐ−ＯＨ、Ａｃ−ＥＡ−ＯＨがＣＨＯ  Ｍ１−ＷＴ３細胞においてカルシウム過負荷を予防する機能を判断した。ムスカリニックＭ１レセプターを発現するＣＨＯ細胞の細胞質カルシウムにおけるピーク上昇を、カルバコール刺激に応答して測定した。ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨは細胞質カルシウムにおける流動を用量依存的に減少させたのに対し、ＲＬｉｐ−ＯＨおよびＡｃ−ＥＡ−ＯＨは最小限の作用であった（図４）。ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨは、細胞質カルシウムのカルバコール刺激増加に対する阻害作用を有し、この阻害は用量依存的である。ＲＬｉｐ−ＯＨおよびＡｃ−ＥＡ−ＯＨは、おだやかな細胞質カルシウム低減活性を持つにとどまった。
【０２００】
実施例７：ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨは、ＲＬｉｐ−ＯＨより大きなペルオキシルラジカル吸収能を呈する。
材料および方法：酸素ラジカル吸収能（ＯＲＡＣ）アッセイ
ペルオキシルラジカルは、再灌流時に細胞によって生成される活性酸素の１種である。ペルオキシルラジカルの存在は、フルオレセイン酸化によって検出可能である。ペルオキシルラジカルの存在下、フルオレセイン蛍光が経時的に減衰する。酸素ラジカルスカベンジャーの存在下、減衰率は低下する。対照とスカベンジャーの存在下での減衰率の変化を用いて、被験化合物のペルオキシルラジカル捕捉機能を測定する。
【０２０１】
試験した各化合物を、１０ｎＭフルオレセインを含有する１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）にて２５μＭ〜２５０μＭの範囲の濃度まで希釈した。緩衝液および化合物を３７℃で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ  ＩＩ、Ｅｘ＝４８５、Ｅｍ＝５２０）を用いてフルオレセイン蛍光を測定した。２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）ジヒドロクロリド（ＡＡＰＨ）を加える前に基線蛍光測定値を１５分間記録した。蛍光の減衰を９０分間記録した。化合物なしでの蛍光の減衰を化合物のある場合の蛍光の減衰から減算した。減衰対濃度の勾配を吸収能として報告する。
【０２０２】
結果：
リポイル含有化合物に対するペルオキシルラジカル吸収能を求めた（表６ａおよび６ｂ）。ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨは、ＲＬｉｐ−ＯＨより大きなペルオキシルラジカル吸収能を呈した。結果はまた、アセチル−グルタミルアラニンには認識できるペルオキシルラジカル吸収機能がないため、リポイル部分がＯＲＡＣアッセイにおけるペルオキシルラジカルの捕捉で重要であることも示している。
【０２０３】
【表７】
0005570590.tif 000047
【０２０４】
【表８】
0005570590.tif 000048
【０２０５】
実施例８：ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨは、ｉｎ  ｖｉｖｏにて心筋を虚血・再灌流障害から保護する
材料および方法：心筋Ｉ／Ｒ障害のラットモデル
心筋Ｉ／Ｒ障害のラットモデルを、特定のリポ酸誘導体化合物が心臓保護性（心筋虚血・再灌流障害に対するものなど）であるか否かを判断するためのｉｎ  ｖｉｖｏスクリーンとして使用した。このモデルは、冠動脈閉塞および冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）などの心臓手術の手技後に心臓患者で観察される虚血・再灌流障害と類似している（Ｍａｔｓｕｉ，  Ｔ．，  Ｔａｏ，  Ｊ．，  ｄｅｌ  Ｍｏｎｔｅ，  Ｆ．，  Ｌｅｅ，  Ｋ．−Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｋｔ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｐｒｅｓｅｒｖｅｓ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｓ  Ｉｎｊｕｒｙ  Ａｆｔｅｒ  Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｉｓｃｈｅｍｉａ  Ｉｎ  ｖｉｖｏ，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００１，  １０４：３３０）。
【０２０６】
一般手順
左冠状動脈の回旋枝を一時的にライゲートして、左心室腫瘤に領域的な虚血を誘導した後、蛍光ミクロスフェアを注射して虚血性領域を描写した。動物を再灌流の約２４時間後に屠殺し、心臓を切り出し、切開してトリフェニルテトラゾリウムで染色した。心筋梗塞エリア（ＭＩ）、危険のある虚血性エリア（ＡＲ）、左心室エリア（ＬＶ）を測定することで、薬理学的介入の直接的な影響を判断した。ＡＲに対するＭＩの低下（ＭＩ／ＡＲ比）をビヒクル対照に対する薬効の一次測定値として使用した。
【０２０７】
詳細な手順
これらの実験には、３００〜３５０グラムのオスのスプラーグドーリーラットを使用した。誘導チャンバにて３〜４％イソフルランで麻酔を誘導した。誘導後、経口的に気管に導入したＲｏｄｅｎｔ  Ｖｅｎｔｉｌａｔｏｒによって１６ゲージの血管カテーテル経由で投与して、１．５〜２．０％イソフルランでの麻酔を外科平面で維持した。換気装置を１分あたり６０〜６５呼吸の速度で２．５ｃｃに設定し手術時の換気を維持した。動物のコア温度を監視し、温度コントローラに接続された加熱用ランプおよび経直腸プローブを用いて３７℃に維持した。
【０２０８】
左前方開胸を実施し、垂直心膜切開で心臓を露出させた。心血管用７．０モノフィラメント縫合糸を用いて、１１ｍｍの針で左冠状動脈（ＬＣｘ）の回旋枝を大動脈から約４ｍｍライゲートし、左心室に虚血を誘導した。
【０２０９】
ライゲーションの１０〜２０分後に後に蛍光ミクロスフェア（３００μＬ）を左心室腔に注射して、虚血エリアを描写した。ライゲーションの３０分後に縫合糸を取り除き、虚血エリアを再灌流し、虚血エリアの再灌流を確認した。
【０２１０】
次に、筋層用の吸収される縫合糸（Ｄｅｘｏｎ  ５−０）を用いて胸部を層にして閉じ、モノフィラメントＮｙｌｏｎ  ５−０縫合糸を用いて皮膚層を閉じた。動物を回復させた後、コロニーに戻した。
【０２１１】
再灌流の２４時間後、塩酸ケタミンを用いて麻酔を誘導し、胸部を開いた。拡張期にある心臓を停止させるための１５％塩化カリウム水溶液（ｗ／ｖ）をＬＶ腔に注射して、動物を屠殺した。心臓を大動脈弁の遠位で切り出し、生理食塩水で洗浄して血液を取り除いた。心室のベースと頂点との間で心臓の矢状切片を得た。それぞれが２ｍｍ厚の５枚の心臓組織切片を得た。この切片を、１％の２，３，５−トリフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）を生理食塩水に入れた溶液に浸漬した後、暗所にて３０分間保管して染色した。
【０２１２】
明視野下（ＴＴＣ染色を観察）と蛍光下（ミクロスフェアを観察）で切片の画像を得た。ミクロスフェアの非存在によって危険のあるエリアを判断し、ＴＴＣ染色の非存在によって梗塞巣を判断した。
【０２１３】
結果：
ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨ処理動物（ｎ＝６４）対生理食塩水ビヒクル処理（ｎ＝５４）動物の心筋虚血再灌流モデルにおけるメタ解析によって、心室腔内注射（１ｍｇ／ｋｇ  ＩＣ）として投与したＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨが、危険のあるエリア（ＡＲ）に比して心筋梗塞（ＭＩ）の大きさを効果的に減少させることが示された。ビヒクルおよびＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨ処理動物のＭＩ：ＡＲ比は、それぞれ０．３７３（ｎ＝５４）および０．２５０（ｎ＝６４）であった。これは、群間の３３％の差に相当する（ｐ＜０．００１）（図５）。ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨ処理後に心筋組織セクションで心臓損傷エリアの有意な減少が観察された。
【０２１４】
ラット心筋虚血再灌流モデルでＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨの投与のタイミングを調査した。ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨを、虚血前（閉塞の１５分前）、虚血時（閉塞の１５分後）または虚血後（再灌流後１分以内）に、１ｍｇ／ｋｇ  ＩＣで投与した。ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨは、生理食塩水ビヒクル（図６）を与えられた動物と比較して、閉塞前（３８％）、閉塞時（２４％）、再灌流（３２％）時に、心筋組織死を有意に（ｐ＜０．０５）減少させた。ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨは、予防的に投与するか治療的に投与するかを問わず、心筋損傷を低減する上で１ｍｇ／ｋｇ  ＩＣで効果的であった。また、ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨは、閉塞１５分前に静脈内投与すると、さまざまな薬用量で効果的（図７）であった。これらの結果から、ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨ投与は、虚血・再灌流障害による心臓に対する損傷を効果的に減少させることが分かる。
【０２１５】
実施例９：心筋虚血／再灌流障害を低減するには、親部分のＲＬｉｐ−ＯＨ、ラセミ混合Ｒ／ＳＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨ、ＳＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨエナンチオマーよりもＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨエナンチオマーが効果的である。
【０２１６】
本明細書の実施例８で説明した心筋虚血・再灌流障害のラットモデルを用いて、心筋Ｉ／Ｒ障害の治療時における純粋なＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨエナンチオマーの有効性を、親部分のＲＬｉｐ−ＯＨ、純粋なＳＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨ、ラセミ混合物Ｒ／ＳＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨの有効性と比較した。
【０２１７】
結果：
ＲＬｉｐ−ＯＨ（２ｍｇ／ｋｇ  ＩＣ）またはＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨ（１ｍｇ／ｋｇ  ＩＣ）で処理した動物のメタ解析を、生理食塩水ビヒクル対照と比較した％減少として表７に示す。Ａｃ−ＥＡ−ＯＨすなわち非リポイル含有化合物も評価したところ、ビヒクルと統計的に類似することが明らかになった（データ図示せず）。この結果から、ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨでの処理後のＩ／Ｒ障害からの心臓保護は、ＲＬｉｐ−ＯＨで処理する場合よりも良好であったことが分かる。
【０２１８】
【表９】
0005570590.tif 000049
【０２１９】
ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨ（１ｍｇ／ｋｇ  ＩＣ）またはＲ／ＳＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨ（１ｍｇ／ｋｇ  ＩＣ）のいずれかで処理した動物の解析を、生理食塩水ビヒクル対照と比較した％減少として表８に示す。この結果から、ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨでの処理後のＩ／Ｒ障害からの心臓保護は、Ｒ／ＳＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨで処理する場合よりも良好であったことが分かる。
【０２２０】
【表１０】
0005570590.tif 000050
【０２２１】
単一の異性体化合物ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨおよびＳＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨを比較する研究の結果を表９に示す。化合物を１ｍｇ／ｋｇまたは２ｍｇ／ｋｇのいずれかで単一の大量瞬時投与（ＩＣ）にて虚血エピソードの１５分前に投与した。等量のＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨおよびＳＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨを加えてラセミ混合物を調製した。ラセミＲ／ＳＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨも評価した。データを危険のあるエリア（ＡＲ）に対する心筋梗塞（ＭＩ）サイズの減少として示す。この結果から、ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨ処理後のＩ／Ｒ障害からの心臓保護は、対応するＳＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨで処理する場合よりも良好であったことが分かる。
【０２２２】
【表１１】
0005570590.tif 000051
【０２２３】
実施例１０：化合物を複数用量で非標準の延長された投与間隔にわたって投与することによるＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨの薬用量増加が、そのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を高める
【０２２４】
材料および方法：
詳細な手順
実施例８で説明したようにして心筋Ｉ／Ｒ障害のラットモデルを用いるｉｎ  ｖｉｖｏ実験を実施した。表１０に示すように、いくつかの単一用量および複数用量での投与計画を試験した。カテーテル処置した（頸静脈）ラットを０．２５時間前および／またはこれを含む時点で静脈内用量投与に使用した。
【０２２５】
結果：
ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨを単一大量瞬時投与すると、Ｉ／Ｒ障害に比して広い期間（すなわち手術前１５分、３時間、６時間または２４時間の時点；血管閉塞時；血管への再灌流時）にわたってＭＩ損傷を減らす上での有効性が認められた。この薬剤は、動脈閉塞時と再灌流時に有効であることも示されたが、特定の早い時点（−１５分など）で見られたほどではなかった。このラットモデルにおけるＩ／Ｒ障害に比して広い期間にわたる有効性は、ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨの短い血清半減期（すなわちラットでＣｍａｘが２０μｇ／ｍＬの場合に用量３０ｍｇ／ｋｇで約９分間）を考慮すると、逆説的である。
【０２２６】
ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨは、虚血前に単一のＩＶ大量瞬時投与として異なる用量で投与すると、Ｉ／Ｒ障害のラットモデルでベル状の用量応答曲線を呈した（表１０、エントリ１、２ａ、２ｂ、３ａ、３ｂ、４ａ、４ｂ）。虚血の１５分前または虚血の前３時間の時点で投与した単一の１０ｍｇ／ｋｇでのＩＶ大量瞬時投与用量では、ラットモデルでのＭＩ損傷が約３３％減少した（表１０、エントリ４ａ対７を参照のこと）のに対し、同単一用量を虚血前のこれより早い時点（６時間または２４時間）で投与すると、ＭＩ損傷の減少率がわずかに低くなった（表１０、エントリ８、９）。これより低い用量でのＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨ（１、３または５ｍｇ／ｋｇ）はそれほど効果的ではなく、これより高い用量のＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨ（２０ｍｇ／ｋｇまたは４０ｍｇ／ｋｇ）では、同様の時点で投与した場合に最適な低用量で見られたＭＩ損傷の減少が改善されず、場合によっては有効性に悪影響が生じた（表１０、エントリ４ａと６、７と１０または１１とを比較）。このように、ラットモデルでは、手技の前に投与した１０ｍｇ／ｋｇ用量で、これより低めや高めの用量より良好な有効性が認められた。試験した最大の用量で、有効性は偽薬レベルより下までには落ちなかった。虚血前１５分の時点での単一のＩＶ大量瞬時投与または虚血前の６０分間の点滴としてのＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨの投与によって、ＭＩ損傷に同様の減少が認められた（表１０、エントリ２ａと２ｂ、３ａと３ｂ、４ａと４ｂとを比較）。
【０２２７】
予想外に、複数（２または３）用量を投与することによってＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨの薬用量を増やすと、最適な単一用量に比してＭＩ損傷の減少率が改善された（表１０、エントリ１２対１５、７対１５；表１１、エントリ１ａ対１ｂ；エントリ２ａ対２ｂ；表１２、エントリＢ対Ｃ）。特に、２または３用量のＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨを投与すると、虚血前約０．２５時間の時点で最終用量を投与した場合に単一用量に比してＭＩ損傷の減少率の改善が見られ（表１０、エントリ１２、１３、１５対１４、１６、１７）、再灌流時にはそうならなかった（表１０、エントリ１２および１５と１６および１７とを比較）。
【０２２８】
メタ解析によって、最適な大量瞬時投与の単一用量（−３時間で１０ｍｇ／ｋｇ）でＭＩが２９％減少するのに対し、複数用量（−３時間および−０．２５時間で１０ｍｇ／ｋｇ）ではＭＩが４３％減少することが明らかになった（表１２）。
【０２２９】
【表１２】
0005570590.tif 000052
【０２３０】
【表１３】
0005570590.tif 000053
【０２３１】
【表１４】
0005570590.tif 000054
【０２３２】
実施例１１：複数用量のＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨを非標準の延長された投与間隔で投与すると、心機能不全の出現率と死亡率が低下する
【０２３３】
材料および方法
介入の必要な不整脈および心臓停止に関連した急性心機能不全の出現率およびこれらの併存症による死亡率の出現率について、ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨを投与するための異なる薬用量および投与計画で本明細書で説明する心筋Ｉ／Ｒ障害のラットモデルで検討した。実施例８で説明したようにして、実施例１０で説明した投与間隔で、ｉｎ  ｖｉｖｏでの実験を実施した。治療薬（すなわち、ビヒクル、ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨ）を左心室内注射、ＩＶ大量瞬時投与、ＩＶ点滴または経口的に投与した。具体的には、虚血時および介入（直接的な機械的心臓蘇生）を要したときの非自己回復型の心機能不全（すなわち、フィブリル化の延長、不整脈、突然の心臓停止）の出現率ならびに、心機能不全に関連した死亡率を観察した。
【０２３４】
結果：
ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨの複数および単一投与によって、命を脅かす心機能不全の出現率とこれを軽減するための付随する介入の必要性ならびに、これらの命を脅かす心機能不全に関連する死亡率が、ビヒクル対照に比して減少した（表１４）。複数投与による投与計画では、単一用量での投与に比して有意に良好な有効性が認められた。
【０２３５】
【表１５】
0005570590.tif 000055
【０２３６】
実施例１２：ラットにおけるＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨの薬物動態の評価
ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨへの全身曝露を評価するために、群にしたラットに単一用量のビヒクル（２匹／性）またはＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨを、３０、１００または２００ｍｇ／ｋｇ（６匹／性／群）の同一の用量レベルで静脈内点滴した。ビヒクル処理した群では、投与前と投与の３０分後（＋２分間）にだけすべてのラットから血液試料を回収した。ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨ処理群では、投与の１０分後、３０分後、４５分後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後（±２分間）に３匹のラット／性／群から血液試料を回収した。
【０２３７】
投与は、注入速度０．２ｍＬ／分以下でシリンジポンプを使用して、大腿静脈に外科的に留置したカテーテルへのＩＶ点滴によるものとした。各動物への投与量は直近の体重測定値を基準に定め、用量の０．１ｍＬ未満は四捨五入した。
【０２３８】
毒物動態学動物の尾静脈から約０．５ｍＬの静脈全血試料を回収して血漿を取得し、ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨ濃度を測定した。
【０２３９】
Ｋ３ＥＤＴＡの入った管に試料を入れ、少なくとも１０分間３０００ｒｐｍで冷蔵下にて遠心処理するまで氷上で保管した。遠心処理後、血漿を除去し、分析のために米国インディアナ州Ｗｅｓｔ  ＬａｆａｙｅｔｔｅのＢＡＳｉに向けて輸送するまでマイナス７０℃以下で冷凍保管した。
【０２４０】
米国インディアナ州Ｗｅｓｔ  ＬａｆａｙｅｔｔｅのＢＡＳｉにて、正のターボイオンスプレーを使う多反応監視モードで、検証済みのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を用いて血漿ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨ濃度を測定した。アッセイ用に定量化可能な範囲は０．０５〜５０μｇ／ｍＬであり、ＱＣ試料は０．１５、１０、３７．５μｇ／ｍＬで含まれていた。標準パラメータの計算によって、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎバージョン５．１を用いて毒物動態学的分析を実施した。
【０２４１】
この分析の結果を表１５に示す。
【０２４２】
【表１６】
0005570590.tif 000056
【０２４３】
実施例１３：ヒトにおけるＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨの薬物動態評価
材料および方法：
生化学的分析法
正のターボイオンスプレーを使う多反応監視モードで、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を用いて、ＢＡＳｉ，  Ｉｎｃ．（Ｗｅｓｔ  Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，  ＩＮ）で血漿および尿中のＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨ濃度を測定した。ヒト血漿での定量化可能な範囲は１．００〜５００ｎｇ／ｍＬであり、ＱＣ試料は３．００、７５．０、３７５ｎｇ／ｍＬで含まれていた。
【０２４４】
分析したデータセット
ＰＫ個体群には、ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨを与えられ、投与後ＰＫ測定が≧１の被検体を含んでいた。投与に関して不適合であるとされるか、あるいは不完全なデータを持つ被検体がいた場合は、これを分析に含めるか否かについてケースバイケースで判断した。２４例の被検体からの血漿試料（コホート１つあたりＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨの被検体６例）を分析した（表１６および１７）。
【０２４５】
結果：
平均血漿ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨ濃度対時間データを、線形目盛および片対数目盛でそれぞれ図９Ａおよび図９Ｂに示す。血漿濃度は多相的に急激に減衰した。
【０２４６】
区画化していない方法と区画化した方法の両方でのＰＫパラメータの概要を表１４および表１５に示す。ＲＬｉｐ−ＥＡ−ＯＨの平均終末期ｔ１／２は短く、２０ｍｇ用量で平均０．８６時間から３００ｍｇ用量で１．４５時間の範囲であった。ＡＵＣｉｎｆの増加は用量の増加よりもわずかに大きく、５８３〜１６４８３時＊ｎｇ／ｍＬの範囲であった。用量を増すとＣＬがわずかに減少し、３００ｍｇ用量で１９．３Ｌ／ｈから２０ｍｇ用量で３５．３Ｌ／ｈｒの範囲であった。中心コンパートメント（Ｖｃ）の分布容量は比較的小さく、約６リットルであった。Ｖｓｓは２倍から３倍大きく、約１２から１８リットルの範囲で、用量を増すと減少した。
【０２４７】
尿排泄データから、１６時間の採取期間にわたって、投与用量の約３０〜４５％が変化せずに尿中にて排泄されることが示された。尿排泄の大半は最初の４時間で生じた。
【０２４８】
【表１７】
0005570590.tif 000057
【０２４９】
【表１８】
0005570590.tif 000058
【０２５０】
参考文献
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【０２５１】
本明細書に引用したすべての特許、公開された出願および参考文献の教示内容全体を、ここに援用する。
【０２５２】
以上、本発明について、その例示的な実施形態を参照しつつ具体的に図示し説明したが、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を逸脱することなく形態および詳細に対してさまざまな変更が可能であることは当業者であれば理解できよう。
【図１】
0005570590.tif 000061
【図２】
0005570590.tif 000062
【図３】
0005570590.tif 000063
【図４】
0005570590.tif 000064
【図５】
0005570590.tif 000065
【図６】
0005570590.tif 000066
【図７】
0005570590.tif 000067
【図８】
0005570590.tif 000068
【図９Ａ】
0005570590.tif 000069
【図９Ｂ】
0005570590.tif 000070