(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１ドメインおよび第２ドメインを含む一本鎖ポリペプチドであって：
該第１ドメインが、クロストリジウム菌神経毒素軽鎖であり、該第１ドメインが、エキソサイトーシスに必須の１以上の小胞または形質膜結合タンパク質を切断することが可能であり；そして
該第２ドメインが、以下であり：
（ｉ）クロストリジウム菌神経毒素重鎖ＨＮ部分またはそのフラグメントもしくは改変体であり、該第２ドメインが、
（ａ）該ポリペプチドを細胞にトランスロケートし、または
（ｂ）該第１ドメイン自体の溶解性と比較して該ポリペプチドの溶解性を増加させ、または
（ｃ）該ポリペプチドを細胞にトランスロケートしそして該第１ドメイン自体の溶解性と比較して該ポリペプチドの溶解性を増加させる両方が可能であり；および
（ｉｉ）分子クランプペプチド配列であり、該分子クランプペプチド配列が、別のペプチド上に存在する分子クランプペプチド相補配列と非共有結合を形成し、それによって該第２ドメインを該別のペプチドにカップリングさせ、該分子クランプペプチド配列の相補対が、ロイシンジッパー、多イオン性ペプチド、および／またはインテインの自己切断配列から選択され、
そして該第２ドメインが、ＨＣと命名されたクロストリジウム菌神経毒素重鎖の機能的Ｃ末端部分を欠き、それによって該ポリペプチドが、天然のクロストリジウム菌神経毒素が結合する天然の細胞表面レセプターである細胞表面レセプターに結合できなくなる、
ポリペプチド。
【請求項２】
前記第２ドメインの分子クランプペプチド配列が、該第２ドメインのＣ末端に位置している、請求項１に記載の一本鎖ポリペプチド。
【請求項３】
前記一本鎖ポリペプチドが、配列番号６０、６２、６４、６６、６８、１１６、１１８、１２０、および１２２から選択される配列を含む、請求項１または２に記載の一本鎖ポリペプチド。
【請求項４】
タンパク質分解酵素による切断部位を含み、該切断部位が、前記第１ドメインと前記第２ドメインとの間のタンパク質分解切断を可能とする、請求項１に記載の一本鎖ポリペプチド。
【請求項５】
前記切断部位が、天然のクロストリジウム菌神経毒素に存在しない、請求項４に記載の一本鎖ポリペプチド。
【請求項６】
前記切断部位が、前記第１ドメインおよび前記第２ドメインのタンパク質分解切断を可能にし、そしてそのように切断される場合、該第１ドメインが、該タンパク質分解切断前の前記ポリペプチドが示す１以上の小胞または形質膜結合タンパク質を切断する酵素活性よりも大きい酵素活性を示す、請求項４または５に記載の一本鎖ポリペプチド。
【請求項７】
前記第２ドメインが、ＨＣと命名されたクロストリジウム菌神経毒素重鎖のＣ末端部分を欠く、請求項１から６のいずれかに記載の一本鎖ポリペプチド。
【請求項８】
前記別のペプチドが、前記ポリペプチドを細胞に結合する第３ドメインを含み、該結合が、該第３ドメインの細胞への直接の結合によって、あるいは細胞に結合する１または複数のリガンドへの該第３ドメインの結合によって行われ、該別のペプチドが、前記分子クランプペプチド配列の相補対によって、前記一本鎖ポリペプチドの前記第２ドメインに、非共有結合で結合されている、請求項１から７のいずれかに記載の一本鎖ポリペプチド。
【請求項９】
前記第３ドメインが、前記ポリペプチドを免疫グロブリンに結合するためのものであり、好ましくは前記第３ドメインが、ブドウ球菌のプロテインＡのドメインｂに由来するタンデムリピート合成ＩｇＧ結合ドメインであり、または前記第３ドメインが、細胞表面レセプターに結合するアミノ酸配列を含み、または前記第３ドメインが、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）である、請求項８に記載の一本鎖ポリペプチド。
【請求項１０】
アフィニティーマトリクスに結合する精製タグをさらに含み、それによって該マトリクスを用いる前記ポリペプチドの精製を容易にする、請求項１から９のいずれかに記載の一本鎖ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかに記載のポリペプチドをコードする、核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え毒素フラグメント、これらのフラグメントをコードするＤＮＡ、ならびにワクチンにおけるおよびインビトロおよびインビボ目的でのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロストリジウム菌神経毒素は、神経細胞におけるカルシウム依存的神経伝達物質分泌の強力なインヒビターである。これらは、現在、神経伝達物質分泌の小胞ドッキングおよび膜融合事象の中心にある、VAMP、シンタキシン、またはSNAP-25の３つの小胞または前シナプス膜結合タンパク質うちの少なくとも１つの特異的なタンパク質内分解切断によってこの活性を媒介すると考えられている。破傷風菌神経毒素およびボツリヌス菌神経毒素の神経細胞ターゲティングは、レセプター媒介事象であると考えられ、その後、毒素は、インターナライズされ、そして続いて適切な細胞内コンパートメントに移り、そこでエンドペプチダーゼ活性を発揮する。
【０００３】
クロストリジウム菌神経毒素は、レセプター結合およびトランスロケーションＨ鎖（ＨＣ、約１００ｋＤａ）にジスルフィド結合した触媒Ｌ鎖（ＬＣ、約５０ｋＤａ）の共通の構成物を有する。ＨＣポリペプチドは、２つの異なる機能的ドメインのすべてまたは一部を含むと考えられる。ＨＣドメインと命名したＨＣのカルボキシ末端半分（約５０ｋＤａ）は、標的ニューロンにおける細胞表面レセプターへの神経毒素の高親和性の神経特異的結合に関連し、一方、ＨＮドメインと命名したアミノ末端半分（約５０ｋＤａ）は、神経毒素の少なくともいくつかの部分の細胞膜を横切るトランスロケーションを媒介すると考えられ、そのためＬＣの機能的活性が標的細胞内で発現される。ＨＮドメインはまた、低ｐＨ条件下で、脂質膜においてイオン透過性チャネルを形成する特性を有し、そしてこれは、いくつかの様式で、そのトランスロケーション機能に関連し得る。
【０００４】
ボツリヌス菌神経毒素Ａ型（ＢｏＮＴ／Ａ）については、ＨＣについてはアミノ酸残基８７２〜１２９６、ＨＮについてはアミノ酸残基４４９〜８７１、およびＬＣについては残基１〜４４８内に、これらのドメインがあると考えられる。トリプシンでの消化は、ＢｏＮＴ／ＡのＨＣドメインを効果的に分解して、ＬＨＮと命名された非毒性フラグメントを生成し、これはもはやニューロンに結合および侵入し得ない（図１）。このように生成されたＬＨＮフラグメントもまた、親のホロ毒素および単離されたＬＣの両方と比較して増強された溶解性の特性を有する。
【０００５】
したがって、神経毒素分子内のドメインの機能的定義を、以下のように提供することができる：
（Ａ）クロストリジウム菌神経毒素軽鎖：
エキソサイトーシス過程に関連する小胞および／または形質膜結合タンパク質に高い基質特異性を示す、メタロプロテアーゼ。特に、これは、SNAP-25、VAMP（シナプトブレビン／セルブレビン）、およびシンタキシンの１つ以上を切断する。
【０００６】
（Ｂ）クロストリジウム菌神経毒素重鎖ＨＮドメイン：
重鎖の一部であって、これは、軽鎖活性の機能的発現が標的細胞内で起きるように、神経毒素分子のこの一部のトランスロケーションを可能にする。
【０００７】
結合ドメインを介して神経毒素がその特異的細胞表面レセプターへ結合した後、標的細胞へのエンドペプチダーゼ活性のトランスロケーションの原因となるドメイン。
【０００８】
低ｐＨ条件下で脂質膜においてイオン透過性孔の形成の原因となるドメイン。
【０００９】
軽鎖単独の溶解性と比較して、ポリペプチド全体の溶解性を増加させる原因となるドメイン。
【００１０】
（Ｃ）クロストリジウム菌神経毒素重鎖ＨＣドメイン：
細胞への毒素のインターナリゼーションの前の、クロストリジウム菌毒素の中毒作用に関連する細胞表面レセプターへの天然のホロ毒素の結合の原因である重鎖の一部。
【００１１】
これらの毒素に対する細胞認識マーカーの同一性は、現在理解されておらず、そして特異的レセプター種は未だ同定されていないが、Kozakiらは、シナプトタグミンがボツリヌス菌神経毒素Ｂ型に対するレセプターであり得ることを報告している。神経毒素のそれぞれが異なるレセプターを有するようである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
毒素アッセイのための陽性コントロールを有すること、クロストリジウム菌毒素ワクチンを開発すること、およびクロストリジウム菌毒素の所望の特性を組み込む治療剤を開発することが所望される。
【００１３】
しかし、その極端な毒性のため、天然の毒素の取り扱いは危険である。
【００１４】
本発明は、クロストリジウム菌毒素の生成および取り扱いに関連する問題を克服または少なくとも改善するために探求される。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、第１ドメインおよび第２ドメインを含む一本鎖ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは、
該第１ドメインが、クロストリジウム菌神経毒素軽鎖またはそのフラグメントもしくは改変体であり、該第１ドメインが、エキソサイトーシスに必須の１以上の小胞または形質膜結合タンパク質を切断することが可能であり；そして
該第２ドメインが、以下であり：
（ｉ）クロストリジウム菌神経毒素重鎖ＨＮ部分またはそのフラグメントもしくは改変体であり、該第２ドメインが、
（ａ）該ポリペプチドを細胞にトランスロケートし、または
（ｂ）該第１ドメイン自体の溶解性と比較して該ポリペプチドの溶解性を増加させ、または
（ｃ）該ポリペプチドを細胞にトランスロケートしそして該第１ドメイン自体の溶解性と比較して該ポリペプチドの溶解性を増加させる両方が可能であり；および
（ｉｉ）分子クランプペプチド配列であり、該分子クランプペプチド配列が、別のペプチド上に存在する分子クランプペプチド相補配列と非共有結合を形成し、それによって該第２ドメインを該別のペプチドにカップリングさせ、
そして該第２ドメインが、ＨＣと命名されたクロストリジウム菌神経毒素重鎖の機能的Ｃ末端部分を欠き、それによって該ポリペプチドが、天然のクロストリジウム菌神経毒素が結合する天然の細胞表面レセプターである細胞表面レセプターに結合できなくなる。
【００１６】
１つの実施態様では、上記第２ドメインの分子クランプペプチド配列は、該第２ドメインのＣ末端に位置している。
【００１７】
１つの実施態様では、上記分子クランプペプチド配列の相補対は、ロイシンジッパー、多イオン性ペプチド、ブドウ球菌のプロテインＡの合成ＩｇＧ結合ドメイン、および／またはインテインの自己切断配列から選択される。
【００１８】
１つの実施態様では、上記一本鎖ポリペプチドは、配列番号６０、６２、６４、６６、６８、１１６、１１８、１２０、および１２２から選択される配列を含む。
【００１９】
１つの実施態様では、上記一本鎖ポリペプチドは、タンパク質分解酵素による切断部位を含み、該切断部位は、上記第１ドメインと上記第２ドメインとの間のタンパク質分解切断を可能とする。
【００２０】
さらなる実施態様では、上記切断部位は、天然のクロストリジウム菌神経毒素に存在しない。
【００２１】
さらなる実施態様では、上記切断部位は、上記第１ドメインおよび上記第２ドメインのタンパク質分解切断を可能にし、そしてそのように切断される場合、該第１ドメインは、該タンパク質分解切断前の前記ポリペプチドが示す１以上の小胞または形質膜結合タンパク質を切断する酵素活性よりも大きい酵素活性を示す。
【００２２】
１つの実施態様では、上記第２ドメインは、ＨＣと命名されたクロストリジウム菌神経毒素重鎖のＣ末端部分を欠く。
【００２３】
１つの実施態様では、上記別のペプチドは、上記ポリペプチドを細胞に結合する第３ドメインを含み、該結合が、該第３ドメインの細胞への直接の結合によって、あるいは細胞に結合する１または複数のリガンドへの該第３ドメインの結合によって行われ、該別のペプチドは、上記分子クランプペプチド配列の相補対によって、上記一本鎖ポリペプチドの上記第２ドメインに、非共有結合で結合されている。
【００２４】
さらなる実施態様では、上記第３ドメインは、上記ポリペプチドを免疫グロブリンに結合するためのものであり、好ましくは上記第３ドメインは、ブドウ球菌のプロテインＡのドメインｂに由来するタンデムリピート合成ＩｇＧ結合ドメインであり、または上記第３ドメインは、細胞表面レセプターに結合するアミノ酸配列を含み、または上記第３ドメインは、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）である。
【００２５】
１つの実施態様では、上記一本鎖ポリペプチドは、アフィニティーマトリクスに結合する精製タグをさらに含み、それによって該マトリクスを用いる前記ポリペプチドの精製を容易にする。
【００２６】
本発明はまた、上記ポリペプチドをコードする、核酸を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ボツリヌス菌神経毒素Ａ型（ＢｏＮＴ／Ａ）のドメイン構造の模式図を示す。
【図２】ＬＨ４２３／Ａと命名した本発明の実施態様についての遺伝子のアセンブリの模式図を示す。
【図３】インビトロペプチド切断アッセイにおいて、天然の毒素、トリプシンで生成した「天然の」ＬＨＮ／Ａ、および２ＬＨ４２３／Ａ（Ｑ２Ｅ，Ｎ２６Ｋ，Ａ２７Ｙ）と命名した本発明の実施態様の活性を比較するグラフである。
【図４】天然の毒素の公表された配列の最初の３３アミノ酸と本発明の実施態様との比較である。
【図５】Ｌ／４Ｈ４２３／Ａと命名された本発明の実施態様の転位領域を示し、ＨＮ配列のＮ末端の４つのアミノ酸の挿入を示す；Eco 47 III制限エンドヌクレアーゼ切断部位によってコードされるアミノ酸に印をつけ、そしてＨＮ配列はＡＬＮ．．．で始まる。
【図６】ＬＦＸａ／３Ｈ４２３／Ａと命名された本発明の実施態様の転位領域を示し、Ｌ鎖のＣ末端の第Ｘａ因子切断部位の挿入、およびＨ配列のＮ末端にコードされる３つの付加アミノ酸を示す；切断活性化したＨＮのＮ末端アミノ酸はシステインである。
【図７】融合タンパク質であるＬＦＸａ／３Ｈ４２３／Ａ−ＩＧＦ−１と命名された本発明の実施態様のアミノ酸配列のＣ末端部分を示す；ＩＧＦ−１配列はＧ８８２位で始まる。
【図８】融合タンパク質であるＬＦＸａ／３Ｈ４２３／Ａ−ＣｔｘＡ１４と命名された本発明の実施態様のアミノ酸配列のＣ末端部分を示す；Ｃ末端ＣｔｘＡ配列はＱ８８２位で始まる。
【図９】融合タンパク質であるＬＦＸａ／３Ｈ４２３／Ａ−ＺＺと命名された本発明の実施態様のアミノ酸配列のＣ末端部分を示す；Ｃ末端ＺＺ配列は、ジェネナーゼ認識部位（下線）のすぐ後のＡ８９０位で始まる。
【図１０】本発明のポリペプチドの操作の模式図を示す；アフィニティー精製ペプチド（この場合はＧＳＴ）のＮ末端付加およびＩｇ結合ドメインのＣ末端付加を有するＬＨ４２３／Ａを示す；プロテアーゼ切断部位Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、ドメインの選択的酵素分離を可能にする。
【図１１】本発明のポリペプチドの操作の模式図を示す；プロテアーゼ切断部位Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３ならびにＣ末端融合ペプチド配列の特定の例を示す。
【図１２】本発明のポリペプチドのトリプシン感受性活性化領域を示す。
【図１３】大腸菌から発現した組換えＬＨ１０７／Ｂのウエスタンブロット分析を示す；パネルＡは、抗ＢｏＮＴ／Ｂ抗血清でプローブした；レーン１、分子量標準；レーン２および３、天然のＢｏＮＴ／Ｂ；レーン４、免疫精製したＬＨ１０７／Ｂ；パネルＢは、抗Ｔ７ペプチドタグ抗血清でプローブした；レーン１、分子量標準；レーン２および３、陽性コントロールの大腸菌Ｔ７発現；レーン４、免疫精製したＬＨ１０７／Ｂ。
【図１４】本発明の融合タンパク質を示し、この融合タンパク質は、精製タグ（TAG）と第１ドメイン（Ｌ鎖）との間に２つの異なるタンパク質分解切断部位（Ｅ１およびＥ２）を含み、そして第１ドメイン（Ｌ鎖）と第２ドメイン（ＨＮ）との間に二重のタンパク質分解切断部位（Ｅ２）を含む。Ｅ２プロテアーゼの使用により、２つの所定のＥ２切断部位での同時切断が生じて、第１および第２ドメインを含む二本鎖ポリペプチド分子を残すが、Ｅ１プロテアーゼの使用により、単一の所定のＥ１切断部位での切断が生じて、第１および第２ドメインを含む単一のポリペプチド鎖分子が残る。
【図１５】第１および第２ドメイン（例えば、ＬＨＮ）を含むポリペプチドと、第３ドメイン（例えば、リガンド）を含む第２分子とを一緒に融合するための分子クランピング技術の使用を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
したがって、本発明は、第１および第２ドメインを含むポリペプチドを提供し、該第１ドメインは、神経エキソサイトーシスに必須の１以上の小胞または形質膜結合タンパク質を切断するように適合され、そして該第２ドメインは、（ｉ）該ポリペプチドを細胞にトランスロケートするように、または（ii）該第１ドメイン自体の溶解性と比較して該ポリペプチドの溶解性を増加させるように、または（iii）該ポリペプチドを細胞にトランスロケートしそして該第１ドメイン自体の溶解性と比較して該ポリペプチドの溶解性を増加させる両方に適合され、該ポリペプチドは、クロストリジウム菌神経毒素を含まず、そしてタンパク質分解作用によって毒素に変換され得るあらゆるクロストリジウム菌神経毒素前駆体を含まない。したがって、本発明は、クロストリジウム菌毒素軽鎖に等価なドメインおよびクロストリジウム菌毒素重鎖のＨＮの機能的局面を提供するドメインを含むが、クロストリジウム菌毒素ＨＣドメインの機能的局面を欠く、一本鎖ポリペプチドを提供し得る。
【００２９】
好適な実施態様では、本発明は、第１および第２ドメインを含む一本鎖ポリペプチドを提供し、
該第１ドメインは、クロストリジウム菌神経毒素軽鎖またはそのフラグメントもしくは改変体であり、ここで該第１ドメインは、エキソサイトーシスに必須の１以上の小胞または形質膜結合タンパク質を切断し得；そして
該第２ドメインは、クロストリジウム菌神経毒素重鎖ＨＮ部分またはそのフラグメントもしくは改変体であり、ここで該第２ドメインは、（ｉ）該ポリペプチドを細胞にトランスロケートし、または（ii）該第１ドメイン自体の溶解性と比較して該ポリペプチドの溶解性を増加させ、または（iii）該ポリペプチドを細胞にトランスロケートしそして該第１ドメイン自体の溶解性と比較して該ポリペプチドの溶解性を増加させる両方が可能であり；そして該第２ドメインは、ＨＣと命名されたクロストリジウム菌神経毒素重鎖の機能的Ｃ末端部分を欠き、それによって該ポリペプチドが、天然のクロストリジウム菌神経毒素が結合する天然の細胞表面レセプターである細胞表面レセプターに結合できなくなる。
【００３０】
上記の好適な実施態様では、第１ドメインは、特定の切断機能の存在の必要条件によって認定される。この切断機能は、軽鎖（Ｌ鎖）成分が一本鎖ポリペプチド分子自体の一部である場合に存在し得る。あるいは、切断機能は、一本鎖ポリペプチド分子に実質的に潜在し得、そして第１ドメインと第２ドメインとの間の一本鎖ポリペプチドのタンパク質分解切断によって活性化されて、例えば、一緒にジスルフィド結合した第１および第２ドメインを含む二本鎖ポリペプチド分子を形成し得る。
【００３１】
第１ドメインは、クロストリジウム菌神経毒素軽鎖（Ｌ鎖）に基づき、そしてこれらの成分が必要な切断機能を有する限り、該Ｌ鎖のフラグメントおよび改変体の両方を包含する。改変体の例は、１以上のアミノ酸残基が天然のクロストリジウム菌Ｌ鎖配列に関して変更されているＬ鎖（またはそのフラグメント）である。１つの実施態様では、改変は、１以上の保存的アミノ酸置換を包含し得る。他の改変は、天然のクロストリジウム菌Ｌ鎖配列に関して１以上のアミノ酸残基の除去または付加を包含し得る。しかし、あらゆるこのようなフラグメントまたは改変体は、前述の切断機能を保持しなければならない。
【００３２】
クロストリジウム菌神経毒素の構造は、本発明の前に周知である−例えば、Kurazonoら(1992) J. Biol. Chem., 267, 21, 14721-14729頁を参照のこと。特に、Kurazonoの文献は、クロストリジウム菌神経毒素Ｌ鎖の切断活性（例えば、タンパク質分解酵素活性）に必要とされる最小ドメインを記載している。同様の議論は、Poulainら(1989) Eur. J. Biochem., 185, 197-203頁、Zhouら(1995), 34, 15175-15181頁、およびBlausteinら(1987), 226, 1号, 115-120頁により提供されている。
【００３３】
例として、Kurazonoら(1992)の14726頁の表IIは、多くのＬ鎖欠失変異体を例示している（アミノ末端およびカルボキシ末端の両方のＬ鎖欠失変異体が例示されている）。問題のＬ鎖成分が必要な切断活性を有するならば、このような変異体は、例えば、類似アミノ酸欠失または保存的アミノ酸置換を含む他のＬ鎖変異体とともに、本発明の第１ドメインの定義に包含される。
【００３４】
本出願の前に、多くの従来の簡単なアッセイが利用可能であり、所定のＬ鎖（または等価のＬ鎖成分）が必要な切断活性を有するかどうかを、当業者が日常的に確認できた。これらのアッセイは、機能的Ｌ鎖が、神経エキソサイトーシスに関連する特異的な小胞または形質膜結合タンパク質（例えば、シナプロブレビン、シンタキシン、SNAP-25）のペプチド切断を行う本来の能力に基づき、そしてこのタンパク質分解反応の切断された産物の存在についての簡単なテストである。
【００３５】
例えば、間に合わせのアッセイでは、SNAP-25（またはシナプトブレビン、またはシンタキシン）は、テストするＬ鎖（または等価のＬ鎖成分）とともにチャレンジされ、次いでSDS-PAGEペプチド分離技法によって分析され得る。SNAP-25（または神経分泌機構の他の成分）の切断された産物に対応する分子量を有するペプチドの（例えば、銀染色による）その後の検出は、必要な切断活性を有するＬ鎖（または等価のＬ鎖成分）の存在を示す。
【００３６】
代替のアッセイでは、SNAP-25（または異なる神経エキソサイトーシス分子）は、テストするＬ鎖（または等価のＬ鎖成分）とともにチャレンジされ、そして切断産物は、本願の出願人であるMicrobiological Research Authorityの名義でPCT/GB95/01279（すなわち、WO95/33850）に記載されるように、抗体検出に供される。より詳細には、SNAP-25の切断を検出するための特異的抗体が用いられ、この抗体は、切断されたSNAP-25を認識するが切断されていないSNAP-25を認識しない。抗体によって切断された産物の同定は、必要な切断活性を有するＬ鎖（または等価のＬ鎖成分）の存在を確認する。例として、このような方法は、これもまたMicrobiological Research Authorityの名義のPCT/GB96/00916（すなわち、WO96/33273）の実施例２および３に記載されている。
【００３７】
本発明の好適な実施態様では、第２ドメインは、２つの機能、すなわち（ｉ）トランスロケーションおよび／または（ii）第１ドメインの増加した溶解性、の１つまたは両方を提供する能力によって認定される。
【００３８】
第２ドメインは、クロストリジウム菌神経毒素のＨＮ部分に基づき、この部分は、文献に広く記載されそして特徴付けられている。特定の記載がKurazonoら(1992)になされており、そこでは、クロストリジウム菌神経毒素重鎖の構造が、そのＨＮおよびＨＣ部分と関連する機能とともに議論されている［例えば、Kurazonoら(1992)の14722頁の図１の下の図を参照のこと］。より詳細には、ＨＮドメインは、小胞のエンドソーム膜を横切ってクロストリジウム菌Ｌ鎖をトランスロケートするように機能するクロストリジウム菌神経毒素のドメインであり、そしてクロストリジウム菌神経毒素のＨ２ドメインと同義である［Poulain, B.ら(1989)の197頁の左下欄および脚部；Blaustein, R.ら(1987)の図１；およびShone, C.ら(1987), Eur. J. Biochem., 167, 175-180頁の178〜179頁にまたがる文を参照のこと］。
【００３９】
本発明の第２ドメインの定義は、これらの成分が必要な（ｉ）トランスロケーションおよび／または（ii）改善された溶解性機能を提供する限り、クロストリジウム菌神経毒素のＨＮ部分のフラグメントおよび改変体を包含する。改変体の例は、１以上のアミノ酸残基が天然のクロストリジウム菌ＨＮドメイン配列に関して変更されているＨＮ部分（またはそのフラグメント）である。１つの実施態様では、改変は、１以上の保存的アミノ酸置換を包含し得る。他の改変は、天然のクロストリジウム菌ＨＮ配列に関する１以上のアミノ酸残基の除去または付加を包含し得る。しかし、あらゆるこのようなフラグメントまたは改変体は、上述の（ｉ）トランスロケーションおよび／または（ii）改善された溶解性機能を提供しなければならない。
【００４０】
（ｉ）トランスロケーションおよび（ii）改善された溶解性機能を、ここでより詳細に説明する。
【００４１】
本出願の前に、多くの従来の簡単なアッセイが利用可能であり、特定のクロストリジウム菌神経毒素ＨＮ部分（または等価のＨＮ成分）が必要なトランスロケーション機能を有するかどうかを、当業者が日常的に確認できた。これに関して、Shoneら(1987)およびBlausteinら(1987)に記載されるアッセイに対して特定の記載がなされており、ここで議論する。
【００４２】
これらの文献は、クロストリジウム菌神経毒素のトランスロケーション機能の研究を記載し、そしてこの神経毒素がチャネルを形成する能力が、トランスロケーション機能の存在に関連することを証明している。
【００４３】
Shoneら(1987)は、リン酸カリウム緩衝液（pH7.2）および放射標識したＮＡＤを充填した人工リポソームを用いるアッセイを記載している。したがって、クロストリジウム菌神経毒素のテストするＨＮ部分（または等価のＨ鎖成分）が必要なトランスロケーション機能を有するかどうかを確認するために、人工リポソームは、テストするＨＮ部分とともにチャレンジされる。リポソームからのＫ＋およびＮＡＤの放出は、チャネル形成活性、したがって、トランスロケーション機能の存在の指標である。
【００４４】
代替のアッセイが、Blausteinら(1987)に記載されており、ここでは、平面のリン脂質二層膜を用いてチャネル形成活性についてテストされている。膜のいずれかの側の塩溶液は、シス側はpH4.7または5.5およびトランス側はpH7.4の異なるｐＨに緩衝化されている。したがって、クロストリジウム菌神経毒素のＨＮ部分（または等価のＨ鎖成分）が必要なトランスロケーション機能を有するかどうかを確認するために、テストするＨＮ部分は、膜のシス側に添加されて、膜を横切る電流をモニターするために、電位固定条件下で電気測定が行われる（116〜118頁の2.2段落を参照のこと）。所望のトランスロケーション活性の存在は、チャネルターンオンの定常速度によって確認される（118頁の３段落を参照のこと）。
【００４５】
ここで第２の重鎖機能、すなわち（ii）第１ドメインの増加した溶解性に話を変える。クロストリジウム菌神経毒素Ｌ鎖分子の調製に関連する従来の問題は、このＬ鎖分子が、一般的に溶解性に乏しい特徴を有することである。したがって、本発明の１つの実施態様では、第２ドメイン（クロストリジウム菌神経毒素のＨＮ部分に基づく）のＬ鎖への融合は、Ｌ鎖の溶解性を増加させる。同様に、第２ドメインのＬ鎖等価分子（例えば、Ｌ鎖のフラグメントまたは改変体）への付加は、Ｌ鎖等価分子の溶解性を増加させる。
【００４６】
本出願の前に、多くの従来の簡単なアッセイが利用可能であり、特定のクロストリジウム菌神経毒素ＨＮ部分（または等価のＨＮ成分）がＬ鎖（または等価のＬ鎖成分）の溶解性を増加させるために必要な能力を有するかどうかを、当業者が日常的に確認できた。溶解性を評価するための最も普通の方法は、遠心分離の使用、次いで一連のタンパク質決定方法による。例えば、発現したクロストリジウム菌エンドペプチダーゼを含む溶解した大腸菌細胞を、25,000×gで15分間遠心分離して細胞破砕物をペレットにし、そしてタンパク質材料を凝集させる。上清（可溶性タンパク質を含む）の除去後、細胞破砕物は、（乏しい溶解性のタンパク質を可溶化するために）SDS含有試料緩衝液中で再構成されて、SDS-PAGEによって２つの画分が分析され得る。電気泳動したタンパク質のクーマシーブルー染色、次いで関連のタンパク質バンドのデンシトメトリー分析は、発現したタンパク質の溶解性の半定量分析を容易にする。
【００４７】
本発明の好適な実施態様によれば、一本鎖ポリペプチド分子のさらなる必要条件は、第２ドメインがＨＣと命名されたクロストリジウム菌神経毒素重鎖の機能的Ｃ末端部分を欠くことであり、それによって、このポリペプチドが、天然のクロストリジウム菌神経毒素が結合する天然の細胞表面レセプターである細胞表面レセプターに結合できなくなる。この必要条件は、ここでより詳細に議論され、そして本明細書を通して結合できないというときは、天然のクロストリジウム菌神経毒素と比較した場合に、実質的に結合できないまたは結合能力が減少していると解釈されるべきである。
【００４８】
例えば、上記の文献およびその他には、天然のクロストリジウム菌神経毒素が、毒素重鎖のＨＣドメインおよび標的細胞上の特異的レセプターに関連する結合相互作用によって、特異的標的細胞に結合することが十分に論じられている。
【００４９】
しかし、天然の神経毒素とは逆に、本発明の好適な実施態様の一本鎖ポリペプチド分子は、天然のクロストリジウム菌神経毒素の機能的ＨＣドメインを欠く。したがって、本発明の好適な一本鎖ポリペプチド分子は、天然のクロストリジウム菌神経毒素によってターゲティングされる特異的レセプターに結合できない。
【００５０】
本出願の前に、多くの従来の簡単なアッセイが利用可能であり、特定のクロストリジウム菌神経毒素ＨＮ部分（または等価のＨＮ成分）が天然のクロストリジウム菌神経毒素の結合能力を欠くかどうかを、当業者が日常的に確認できた。これに関して、Shoneら(1985) Eur. J. Biochem., 151(1), 75-82頁、ならびにBlackおよびDolly(1986) J. Cell. Biol., 103, 521-534頁に記載されるアッセイに対して特定の記載がなされている。基本的なShoneら(1985)の方法は、破傷風菌毒素の結合能力を評価するために、近年、Suttonら(2001), 493, 45-49頁に報告されている。
【００５１】
これらの文献は、クロストリジウム菌神経毒素のＨ鎖のその標的細胞である運動ニューロンへの結合を評価するための簡単な方法を記載している。したがって、これらの方法は、Ｈ鎖に対する改変により運動ニューロンに対するＨ鎖の天然の結合親和性がなくなるかまたは減少するかどうかを日常的に決定するための手段を提供する。この方法は、ここでより詳細に議論される。
【００５２】
Shoneら(1985)の方法は、競合結合アッセイに基づき、そこでは、テストする神経毒素Ｈ鎖フラグメントが、精製ラット大脳皮質シナプトソーム（すなわち、天然の毒素標的細胞）に結合する能力において、放射標識した天然の神経毒素と比較される。ＨＣ機能（すなわち、結合能力）の減少は、テストするＨ鎖フラグメントが、シナプトソームへの結合に対して、標識された未処理の毒素と競合する能力が減少することによって証明される（76頁１欄51行目〜２欄５行目を参照のこと）。
【００５３】
Suttonら(2001)は、放射標識した未処理の破傷風菌神経毒素（ＴｅＮＴ）および非標識の部位特異的（ＴｅＮＴ）変異体を用いる類似の競合結合実験を行った。上記のように、アッセイにおける陽性の結果は、変異体フラグメントが、シナプトソームへの結合に対して、標識されたＴｅＮＴと競合する能力がないことによって証明される。
【００５４】
代替のアプローチは、BlackおよびDolly(1986)によって記載され、この方法は、電子顕微鏡オートラジオグラフィーを用いて、インビボおよびインビトロの両方で、脊椎動物神経筋接合部での放射標識されたクロストリジウム菌神経毒素の結合を可視的に評価する。したがって、このアッセイは、テストするＨＮドメイン（または等価のＨＮ成分）が機能的ＨＣドメインを欠くかどうかを確認するための簡単な可視方法を示す。
【００５５】
機能的ＨＣドメインを欠く第２ドメインが調製され得る多くの方法がある。これに関して、ＨＣドメインの不活性化は、アミノ酸レベルで（例えば、誘導体化用化学品、またはタンパク質分解酵素の使用によって）、または核酸レベルで（例えば、部位特異的変異誘発、ヌクレオチド挿入または欠失または改変の使用によって、あるいは短縮型核酸の使用によって）達成され得る。
【００５６】
例えば、ＨＣドメインの除去または改変に適切な従来の誘導体化用化学品またはタンパク質分解剤を選択することは、当業者には日常的である。標準的な誘導体化用化学品またはタンパク質分解剤は当該技術分野で容易に利用可能であり、そしてこの化学／薬剤が、上記のような多くの簡単なテストのいずれか１つを行うことによって、天然の結合親和性が減少または除去されたＨＮドメインを提供することを確認することは、当業者には日常的である。
【００５７】
従来の誘導体化用化学品としては、以下のいずれか１つが挙げられ得、これは、非網羅的な例のリストを形成する：
（１）無水物、より詳細にはマレイン酸無水物のような、チロシン誘導体化用化学品；
（２）ビス-ジアゾ化o-トリジン、およびジアゾ化p-アミノベンゾイルビオシチンのような、ジアゾニウムに基づく誘導体化用化学品；
（３）ＥＤＣ（1-エチル1-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸）；
（４）テトラニトロメタン続いて亜ジチオン酸ナトリウムでの二重の処理のような、イソシアネートに基づく誘導体化用化学品；および
（５）クロラミン-T（N-クロロトルエンスルホンアミド）またはIODO-GEN（1,3,4,6-テトラクロロ-3a,ba-ジフェニルグリコウリル）のような、ヨウ素化誘導体化用化学品。
【００５８】
従来のタンパク質分解剤としては、以下のいずれか１つが挙げられ得、これは、非網羅的な例のリストを形成する：
（１）トリプシン［Shoneら(1985)に示される］；
（２）プロリンエンドペプチダーゼ；
（３）lysＣプロテイナーゼ；
（４）キモトリプシン；
（５）サーモリシン；および
（６）argＣプロテイナーゼ。
【００５９】
あるいは、従来の核酸変異誘発方法が用いられて、機能的ＨＣドメインを欠く第２ドメインをコードする改変された核酸配列を生成し得る。例えば、Kurazonoら(1992)に記載されるような変異誘発方法が用いられ得る。ＤＮＡの変異誘発のための一連のシステムが利用可能であり、これは、Kunkel T.(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488-492頁；Taylor, J. W.ら(1985) Nucleic Acids Res. 13, 8749-8764頁 (1995)；ならびに、Deng G.およびNickeloff J. A.(1992) Anal. Biochem., 200, 81-88頁に記載のＤＮＡ操作技法に基づく。
【００６０】
本発明のすべての一般的な局面によれば、本発明のポリペプチドは、可溶性であり得るが、天然の毒素のトランスロケーション機能を欠く−これは、毒素によるチャレンジに対して個体をワクチン接種するまたはワクチン接種を補助するための免疫源を提供することに使用される。以下の実施例に記載される本発明の特定の実施態様では、ＬＨ４２３／Ａと命名されたポリペプチドは、神経毒素Ａ型に対する中和抗体を惹起した。したがって、本発明のポリペプチドは、同様に、比較的不溶性であり得るが、天然の毒素のトランスロケーション機能を保持する−これは、溶解性が、１以上の他の成分によって、ポリペプチドと１以上の他の成分とからなる組成物に付与される場合に使用される。
【００６１】
本発明のポリペプチドの第１ドメインは、エキソサイトーシスの特異的な細胞プロセスに必須の１以上の小胞または形質膜結合タンパク質を切断し、そしてこれらのタンパク質の切断により、代表的には、非細胞傷害様式で、エキソサイトーシスが阻害される。影響を受けた１または複数の細胞は、特定のタイプまたはサブグループに制限されないが、神経および非神経の両方の細胞を包含し得る。クロストリジウム菌神経毒素がエキソサイトーシスを阻害する活性は、実際、Aplysia（アメフラシ）、Drosophila（ショウジョウバエ）、および哺乳動物の神経細胞のような多様な細胞を包含する、関連の細胞表面レセプターを発現する真核生物細胞に、ほとんど普遍的に観察されており、そして第１ドメインの活性は、対応する範囲の細胞を含むように理解されるべきである。
【００６２】
本発明のポリペプチドは、組換え核酸、好ましくはＤＮＡの発現によって得られ得、そして一本鎖ポリペプチドであり、言い換えると、別々の軽鎖および重鎖ドメインに切断されていない。したがって、ポリペプチドは、組換え技法を用いて便利におよび大量に入手可能である。
【００６３】
本発明のポリペプチドにおいて、この第１ドメインは、好ましくは、クロストリジウム菌毒素軽鎖またはクロストリジウム菌毒素軽鎖のフラグメントもしくは改変体を含む。フラグメントは、エキソサイトーシスに必須の小胞または形質膜結合タンパク質を切断する能力を実質的に保持する限り、必要に応じて、軽鎖のＮ末端またはＣ末端フラグメントであり、あるいは内部フラグメントである。クロストリジウム菌毒素の軽鎖の活性に必要な最小ドメインは、J. Biol. Chem., 267巻, 21号, 1992年７月, 14721-14729頁に記載されている。改変体は、軽鎖またはフラグメントとは異なるペプチド配列を有するが、これもまた小胞または形質膜結合タンパク質を切断し得る。便利には、軽鎖またはそのフラグメントの挿入、欠失、および／または置換によって得られる。以下の記載の本発明の実施態様では、改変体配列は、（ｉ）クロストリジウム菌毒素軽鎖またはフラグメントに対するＮ末端伸長、（ii）少なくとも１つのアミノ酸の変更によって改変されたクロストリジウム菌毒素軽鎖またはフラグメント、（iii）クロストリジウム菌毒素軽鎖またはフラグメントに対するＣ末端伸長、または（iv）（ｉ）〜（iii）の２以上の組み合わせを含む。
【００６４】
第１ドメインは、好適には、SNAP-25、シナプトブレビン／VAMP、およびシンタキシンの１以上から選択される基質に特異的なエンドペプチダーゼ活性を示す。クロストリジウム菌毒素は、好適には、ボツリヌス菌毒素または破傷風菌毒素である。
【００６５】
以下の実施例に記載の本発明の１つの実施態様では、毒素軽鎖および毒素重鎖の部分は、ボツリヌス菌毒素Ａ型由来である。以下の実施例に記載の本発明のさらなる実施態様では、毒素軽鎖および毒素重鎖の部分は、ボツリヌス菌毒素Ｂ型由来である。ポリペプチドは、必要に応じて、１つの毒素型の軽鎖またはフラグメントまたは改変体および他の毒素型の重鎖またはフラグメントまたは改変体を含む。
【００６６】
本発明のポリペプチドでは、第２ドメインは、好適には、クロストリジウム菌毒素重鎖ＨＮ部分またはクロストリジウム菌毒素重鎖ＨＮ部分のフラグメントもしくは改変体を含む。フラグメントは、ＨＮドメインの機能を保持する限り、必要に応じて、Ｎ末端またはＣ末端または内部フラグメントである。その機能の原因であるＨＮ内の領域の教示は、例えば、Biochemistry 1995, 34, 15175-15181頁およびEur. J. Biochem, 1989, 185, 197-203頁に提供される。改変体は、ＨＮドメインまたはフラグメントとは異なる配列を有するが、これもまたＨＮドメインの機能を保持する。便利には、ＨＮドメインまたはそのフラグメントの挿入、欠失、および／または置換によって得られる。以下に記載の本発明の実施態様では、これは、（ｉ）ＨＮドメインまたはフラグメントに対するＮ末端伸長、（ii）ＨＮドメインまたはフラグメントに対するＣ末端伸長、（iii）少なくとも１つのアミノ酸の変更によるＨＮドメインまたはフラグメントへの改変、または（iv）（ｉ）〜（iii）の２以上の組み合わせを含む。クロストリジウム菌毒素は、好適には、ボツリヌス菌毒素または破傷風菌毒素である。
【００６７】
本発明はまた、クロストリジウム菌神経毒素軽鎖およびクロストリジウム菌神経毒素重鎖のＮ末端フラグメントを含むポリペプチドを提供し、このフラグメントは、好適には、ボツリヌス菌毒素Ａ型の重鎖のＮ末端アミノ酸の少なくとも４２３個、ボツリヌス菌毒素Ｂ型の重鎖のＮ末端アミノ酸の少なくとも４１７個、または他の型のクロストリジウム菌毒素の重鎖のＮ末端アミノ酸の等価の数を含み、そのため、このフラグメントは、相同アミノ酸残基の等価のアラインメントを有する。
【００６８】
したがって、本発明のこれらのポリペプチドは、例えば、ジスルフィド架橋によって複合分子に連結された、２以上のポリペプチドから構成されない。代わりに、これらのポリペプチドは一本鎖であり、そして活性がないか、またはそれらの活性が神経毒素エンドペプチダーゼ活性のインビトロアッセイで顕著に減少している。
【００６９】
さらに、ポリペプチドは、トリプシンのようなタンパク質分解剤の作用によってエンドペプチダーゼ活性を示す形態に変換されやすくてもよい。このように、毒素軽鎖のエンドペプチダーゼ活性を制御することが可能である。
【００７０】
本発明のさらなる実施態様では、ポリペプチドは、改変されたアミノ酸配列を含み、そのため、（ａ）ポリペプチドのＬＣ成分とＨＮ成分との間にプロテアーゼ感受性領域がない、または（ｂ）プロテアーゼ感受性領域が特定のプロテアーゼに特異的である。この後者の実施態様は、特定の環境または細胞において軽鎖のエンドペプチダーゼ活性を活性化することが所望される場合に使用される。しかし、一般的には、本発明のポリペプチドは、投与前に活性化される。
【００７１】
より一般的には、タンパク質分解切断部位は、一本鎖ポリペプチド分子の任意の２つのドメイン間に導入され得る。
【００７２】
例えば、切断部位は、第１ドメインと第２ドメインとの間に導入され得、そのため、その切断は、一本鎖ポリペプチド分子を二本鎖ポリペプチド構造に変換し、ここで、第１および第２ドメインは、ジスルフィド結合によって一緒に連結される。このような分子の特定の実施例は、本出願の配列番号１１〜１８に提供され、そこでは、第Ｘａ因子切断部位が、第１ドメイン（Ｌ鎖）と第２ドメイン（ＨＮ）との間に導入されている。
【００７３】
固有の切断部位を有する一連のペプチド配列は、本発明のポリペプチドの１以上のドメイン間の接合部への挿入に利用可能である。例えば、第１ドメイン（Ｌ鎖）と第２ドメイン（ＨＮ）との間の切断部位の挿入により、タンパク質分解切断可能である一本鎖ポリペプチド鎖分子が二本鎖ポリペプチドを形成し得、ここで第１および第２ドメインは、第１および第２ドメイン間のジスルフィド結合によって一緒に保持される。タンパク質分解切断は、インビトロでは使用前に、またはインビボでは細胞内タンパク質分解作用による細胞特異的活性化によって行われ得る。
【００７４】
あるいは（またはさらに）、切断部位は、第２ドメインと第３ドメインとの間、または精製タグと本発明のポリペプチドとの間に導入され得る。本発明の第３ドメインおよび精製タグ局面は、以下でより詳細に論ずる。
【００７５】
ＬＣドメインとＨＮドメインとの間の接合部への一連の切断部位の便利な挿入を容易にするために、将来のクローン開発のためのテンプレートとして用いられ得る発現クローンを調製することが好ましい。このようなテンプレートは、配列番号１０３に示され、ここでＬＨＮ／ＢをコードするＤＮＡは、独特の制限酵素部位を組み込むように標準的な変異誘発技法によって改変されている。接合部に新しい切断部位を導入することは、新しい切断部位をコードする新規なオリゴヌクレオチドの簡単な挿入を必要とする。
【００７６】
適切な切断部位としては、表１に記載のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
【表１】
0005570936.tif 000002
【００７８】
いくつかの場合、ある切断部位および対応するタンパク質分解酵素（例えば、プレシション、トロンビン）の使用は、ポリペプチド上の短いＮ末端伸長を切断部位のＣ末端位置に残す（表１で例示のプロテアーゼについて下向き矢印の切断パターンを参照のこと）。
【００７９】
ペプチド配列は、任意の２つのドメイン間に導入されて、より後の段階でのドメインの特異的切断を容易にし得る。このアプローチは、精製タグを含む融合タンパク質からの精製タグ（例えば、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン域（Ｈｉｓ６））の切断および遊離のための独特の発現系に通常用いられる。これに関して、精製タグは、好適には、問題のポリペプチドのＮまたはＣ末端に融合される。
【００８０】
切断部位の選択は、遊離されたポリペプチドのＮ末端（またはＣ末端）の正確な性質との関係を有し得る。これを示すために、このような独特の系で産生された同一のＬＨＮ／Ｂフラグメントを、配列番号８８、９４、９６、および９８に記載し、ここで、ＬＨＮ／Ｂ配列へのＮ末端伸長は、それぞれＩＳＥＦＧＳ、ＧＳ、ＳＰＧＡＲＧＳ、およびＡＭＡＤＩＧＳである。ＬＨＮ／Ｃフラグメントの場合、配列番号１２６、１２８、および１３０は、Ｎ末端配列ＶＰＥＦＧＳＳＲＶＤＨ、ＩＳＥＦＧＳＳＲＶＤＨ、およびＶＰＥＦＧＳＳＲＶＤＨを記載し、それに続いて、それぞれエンテロキナーゼ、ジェネナーゼ、および第Ｘａ因子による融合タグからのＬＨＮ／Ｃフラグメントを遊離する。これらの伸長ペプチド配列のそれぞれは、本発明の改変体Ｌ鎖配列の一例である。同様に、精製タグが第２ドメインのＣ末端に融合されるべき場合、得られる切断されたポリペプチド（すなわち、融合タンパク質マイナス精製タグ）は、Ｃ末端伸長アミノ酸を含む。これらの伸長ペプチドのそれぞれは、本発明の改変体ＨＮ部分の一例を提供する。
【００８１】
いくつかの場合、例えば、精製タグと本発明のポリペプチドとの間の特異的部位での切断は、所望よりも低い効率であり得る。この潜在的な問題に対して、本出願人は、２つの特定の方法で独特のベクターを改変し、この改変は、独立してまたは互いに組み合わせて用いられ得る。この改変は本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質における任意の２つのドメイン間の切断部位に適用され得るが、以下の議論は、精製タグ−第１ドメイン切断事象を簡単に説明する。
【００８２】
第１に、ＤＮＡは、さらなるペプチドスペーサー配列を含むように改変され、これは、必要に応じて、精製タグとポリペプチドとの接合部に１以上の追加の切断部位を示し得る。このアプローチからの全長の発現したポリペプチドの例は、配列番号８６、９０、および９２に示される。このようなアプローチにより、目的のポリペプチドが効率的に切断および遊離している。任意のポリペプチド内切断部位（例えば、第１ドメインと第２ドメインとの間）の存在および性質に依存して、融合タンパク質からの精製タグの切断は、第１ドメインと第２ドメインとの間のタンパク質分解切断と同時に起こり得る。あるいは、精製タグの遊離は、第１ドメインと第２ドメインとの間でのタンパク質分解切断を生じることなく起こり得る。これらの２つの切断スキームを、図１４に示す。
【００８３】
選択した切断酵素に依存して、この方策により、ポリペプチドのＮ末端（またはＣ末端）への短いアミノ酸伸長が生じ得る。例えば、配列番号９２の場合、発現した産物のエンテロキナーゼでの切断により、第１ドメイン−第２ドメイン接合部（すなわち、Ｌ鎖−ＨＮ接合部）での単一のジスルフィド結合によってカップリングした２つのポリペプチドを生じ、これは、未処理の第Ｘａ因子部位に類似の短いＮ末端ペプチド伸長およびポリリンカー配列（ＩＥＧＲＩＳＥＦＧＳ）による短いＮ末端伸長を有する。
【００８４】
第２に、自己スプライシングするインテイン配列をコードするＤＮＡが用いられ得、このインテインは、ｐＨおよび／または温度制御下で自己スプライシングするように誘導され得る。インテイン配列（配列番号１１０に、ポリペプチド配列ＩＳＥＦＲＥＳＧＡＩＳＧＤＳＬＩＳＬＡＳＴＧＫＲＶＳＩＫＤＬＬＤＥＫＤＦＥＩＷＡＩＮＥＱＴＭＫＬＥＳＡＫＶＳＲＶＦＣＴＧＫＫＬＶＹＩＬＫＴＲＬＧＲＴＩＫＡＴＡＮＨＲＦＬＴＩＤＧＷＫＲＬＤＥＬＳＬＫＥＨＩＡＬＰＲＫＬＥＳＳＳＬＱＬＳＰＥＩＥＫＬＳＱＳＤＩＹＷＤＳＩＶＳＩＴＥＴＧＶＥＥＶＦＤＬＴＶＰＧＰＨＮＦＶＡＮＤＩＩＶＨＮとして示される）は、示されたポリペプチド（例えば、精製タグ−ＬＨＮ／Ｂ）の自己切断を容易にして、精製タグを含まない一本鎖ポリペプチド分子を得る。したがって、このプロセスは、最初の発現産物のプロテアーゼでの処理を必要とせず、そして得られたポリペプチド（すなわち、Ｌ鎖−第Ｘａ因子活性化部位−ＨＮ）は、このアプローチが適用され得る方法を簡単に例示する。
【００８５】
以下の実施例に記載される本発明のさらなる実施態様によれば、クロストリジウム菌毒素重鎖のＨＣと命名された部分を欠くポリペプチドが提供される。天然に産生される毒素で見られるこの部分は、毒素のインターナリゼーションの前の細胞表面レセプターへの毒素の結合の原因である。したがって、この特定の実施態様は、例えば、タンパク質分解酵素の作用によって活性な毒素に変換され得ないように適合される。したがって、本発明はまた、クロストリジウム菌毒素軽鎖およびクロストリジウム菌毒素重鎖のフラグメントを含むポリペプチドを提供し、このフラグメントは、クロストリジウム菌毒素の中毒作用に関連する細胞表面レセプターに結合できず、そしてこのようなポリペプチドが、クロストリジウム菌毒素重鎖のＨＣと命名された未処理部分を欠くことが好ましい。
【００８６】
本発明のさらなる実施態様では、クロストリジウム菌毒素軽鎖およびクロストリジウム菌毒素重鎖のＨＮと命名された部分を含むポリペプチドを含む組成物が提供され、ここで、この組成物は、クロストリジウム菌毒素を含まず、そしてタンパク質分解酵素の作用によってクロストリジウム菌毒素に変換され得るあらゆるクロストリジウム菌毒素前駆体を含まない。これらの組成物の例としては、ボツリヌス菌毒素Ａ、Ｂ、Ｃ１、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧ型の毒素軽鎖配列およびＨＮ配列を含む組成物が挙げられる。
【００８７】
本発明のポリペプチドは、第３ドメイン（例えば、所望の細胞にターゲティングするためのリガンド）に結合またはこれを含むように便利に適合される。ポリペプチドは、必要に応じて、例えば、免疫グロブリンに結合する配列を含む。適切な配列は、ブドウ球菌のプロテインＡのドメインＢに由来するタンデムリピートの合成ＩｇＧ結合ドメインである。次いで、免疫グロブリン特異性の選択は、ポリペプチド−免疫グロブリン複合体に対する標的を決定する。あるいは、ポリペプチドは、細胞表面レセプターに結合する非クロストリジウム菌配列、特定の細胞タイプ上の特異的レセプターに結合するインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）を含む適切な配列、およびコレラトキシンＢサブユニットに結合してGM1ガングリオシドに結合し得るコレラトキシンＡサブユニットのカルボキシ末端由来の１４アミノ酸残基配列を含む。したがって、本発明のポリペプチドは、必要に応じて、ポリペプチドの細胞への結合のために適合された第３ドメインをさらに含む。
【００８８】
好適な実施態様では、第３ドメインは、標的細胞上のレセプターに結合し、このレセプターは、エンドソームプロセシングを受けやすい。
【００８９】
本発明の第２の局面によれば、（ａ）上記のような本発明のポリペプチドと（ｂ）クロマトグラフィーマトリクスへの結合のために適合された第２のポリペプチド（精製タグとしても公知である）との融合物を含む融合タンパク質が提供され、そのため、このクロマトグラフィーマトリクスを用いて融合タンパク質の精製が可能である。第２のポリペプチドがグルタチオンSepharoseのようなアフィニティーマトリクスに結合するように適合されることは便利であり、細胞抽出物または上清のような不純なソースから融合タンパク質を迅速に分離および精製することが可能である。
【００９０】
１つの可能性のある第２の精製ポリペプチドは、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）であり、そして他は、当業者に明らかであり、従来の技法に従ってクロマトグラフィーカラムでの精製を可能にするように選択される。
【００９１】
本発明の他の実施態様によれば、スペーサー配列が、一本鎖ポリペプチド分子の２以上のドメイン間に導入され得る。例えば、スペーサー配列は、本発明のポリペプチド分子の第２ドメインと第３ドメインとの間に導入され得る。あるいは（またはさらに）、スペーサー配列は、精製タグと本発明のポリペプチドとの間に、あるいは第１ドメインと第２ドメインとの間に導入され得る。スペーサー配列は、タンパク質分解切断部位を含み得る。
【００９２】
より詳細には、第２ドメイン−第３ドメイン接合部への特異的ペプチド配列の挿入は、第３ドメイン（例えば、リガンド）と第２ドメイン（例えば、ＨＮ）との間隔をあける目的で行われ得る。このアプローチは、第３ドメインと特異的結合標的との効率的な相互作用を容易にし、および／またはポリペプチドのフォールディング特徴を改善し得る。スペーサーペプチドの例を、表２に提供する。
【００９３】
【表２】
0005570936.tif 000003
【００９４】
好適な実施態様では、スペーサー配列は、第１ドメインと第２ドメインとの間に導入され得る。例えば、新規な一本鎖ポリペプチドハイブリッド第１ドメイン−第２ドメイン融合物の調製に有利である特徴を組み込む種々の第１ドメイン（例えば、Ｌ鎖）発現構築物が調製されている。このような発現カセットを、配列番号６９、７１、７３、７５、７７、および１１３に例示する。
【００９５】
上記のカセットは、天然のクロストリジウム菌神経毒素のＬ鎖のＣ末端とＨＮドメインのＮ末端との間の領域に存在する天然のリンカー配列を利用する。より詳細には、Ｌ鎖およびＨＮドメインを一緒にカップリングするために用いる天然のリンカー配列の各末端にシステインがあり、次いで一本鎖ポリペプチド分子をタンパク質分解切断して、二本鎖カウンターパートとする。これらのシステイン基は、上記のカセット中に保存される。したがって、リンカー配列のいずれかの末端にシステインアミノ酸を維持することによって、および必要に応じて特異的タンパク質分解部位を組み込んで天然の配列を置換することによって、第１ドメインと第２ドメインとの間で特異的に切断可能な特性を有する種々の構築物が調製されている。
【００９６】
例えば、ＨＮ／Ｂのような目的の配列を配列番号６９に記載の配列に融合することによって、ジスルフィド結合形成を容易にする特異的リンカー領域によって連結されるＬ鎖／Ａ−ＨＮ／Ｂ新規ハイブリッドを日常的に調製することが可能である。したがって、発現された融合タンパク質は、第１ドメイン（Ｌ鎖）と第２ドメイン（ＨＮ）との間のタンパク質分解切断に適切である。必要に応じてこの切断部位を含む同じリンカーは、本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質の他のドメインを一緒に連結するために使用され得る。
【００９７】
本発明のさらなる実施態様では、分子クランプは、本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質の２以上のドメインとともにクランピングするために用いられ得る。分子クランプは、上記のスペーサー配列の特定のサブセットとみなされ得る。
【００９８】
より詳細には、分子クランピング（指示カップリングとしても公知である）は、非共有タンパク質−タンパク質相互作用を容易にする特異的相補ペプチド配列の使用によって２以上のポリペプチドドメインを一緒に連結する方法である。
【００９９】
このようなペプチド配列の例としては、ロイシンジッパー（junおよびfos）、多イオン性ペプチド（例えば、ポリグルタミン酸およびそのポリアルギニン対）、およびブドウ球菌のプロテインＡの合成ＩｇＧ結合ドメインが挙げられる。
【０１００】
第１および第２ドメイン（例えば、ＬＨＮ）を含むポリペプチドが調製され、分子クランピング配列が２つの方法によって第２（例えば、ＨＮ）ドメインのＣ末端に融合されている。
【０１０１】
第１に、分子クランプをコードするＤＮＡは、ＬＨＮコード配列に存在する停止コドンを除去した後、ＬＨＮポリペプチドをコードするＤＮＡに直接ライゲートされている。ＬＨＮ配列の３’へのクランプ配列をコードする重複オリゴヌクレオチドおよび３’停止コドンの挿入によって、発現カセットが生成されている。このような配列の例を、配列番号６３に示し、ここでfos（ＬＴＤＴＬＱＡＥＴＤＱＬＥＤＥＫＳＡＬＱＴＥＩＡＮＬＬＫＥＫＥＫＬＥＦＩＬＡＡＨ）として公知の分子クランプをコードするＤＮＡ配列は、ＬＨＮ／Ａポリペプチドをコードする核酸分子の３’に導入されており、この分子はまた、第１ドメイン（Ｌ鎖）と第２ドメイン（ＨＮ）とのコード領域間にエンテロキナーゼ切断部位をコードする核酸配列を有する。
【０１０２】
第２に、部位特異的組換えを利用して、短いペプチドGly-GlyによってＨＮドメインから離れたＬＨＮポリペプチドの３’にクランプ配列を組み込んでいる（例えば、以下に記載のGATEWAYシステムを参照のこと）。ＨＮのＣ末端からクランプ配列を離すためのこのペプチドの使用を、配列番号１１７／１１８に示す。
【０１０３】
いくつかの実施態様では、システイン側鎖をクランプペプチドに組み込んで、クランプに渡したジスルフィド結合の形成を容易にすることが好ましいことであり得、そしてこうして、例えば、第２ドメイン（ＨＮ）と第３ドメイン（例えば、リガンド）との間に共有結合を作成する。システインコドンのクランプ配列への組み込みは、標準的技法によって行われ、配列番号５９／６０、６１／６２、１１７／１１８、および１１９／１２０に示すタイプの配列が得られている。
【０１０４】
適切なＬＨＮポリペプチドの調製への分子クランピングの応用についての模式図を図１５に示す。
【０１０５】
第３ドメイン（例えば、リガンド）への部位特異的カップリングに適切な第１および第２ドメインを含む全長ポリペプチドの発現のためのさらなる代替法は、第２ドメイン（例えば、ＨＮ）の３’にインテインの自己切断配列を組み込むことである。配列番号６７／６８は、このような１つの構築物を示し、第１ドメイン（例えば、Ｌ鎖）と第２ドメイン（例えば、ＨＮ）との間にエンテロキナーゼ切断部位を有するＬＨＮ／Ａは、Ｃ末端にCys残基、次いでインテイン配列を有するように発現される。自己切断後、次いで、例えば、Bruickら, Chem. Biol. (1996), 49-56頁に記載のように、第３ドメインへの特異的カップリング反応に関与し得る反応性チオエステルが形成される。このようなポリペプチドは、他に異種最終産物を生じ得るランダム誘導体化およびランダムカップリングに関する問題を生じることなく、第３ドメイン（例えば、目的のリガンド）への部位特異的化学カップリングを容易にする。
【０１０６】
本出願の全体の開示から当業者に明らかなように、第１および第２ドメインは、任意のクロストリジウム菌神経毒素ソース由来のＬ鎖およびＨ鎖成分を用い得る。ボツリヌス菌ソースが好適であり得るが、破傷風菌ソースは等しい適用可能性を有する。これに関して、Eisel,U.ら(1986) EMBO J. 5 (10), 2495-2502頁および受入図書番号X04436によって本出願前に公開されているように、破傷風菌神経毒素（ＴｅＮＴ）の全配列は、参照が容易なように、配列番号１４０／１４１として本出願に含まれている。
【０１０７】
この点の説明を補助するために、いくつかのＴｅＮＴに基づくポリペプチドが本発明に従って調製されており、そして配列番号１４３を参照すると、これはＥＥＤＩＤＶ８７９のＣ末端配列を有するＬＨＮポリペプチドである。配列番号１４７も参照すると、これはＥＥＤＩＤＶＩＬＫＫＳＴＩＬ８８７のＣ末端配列を有するＬＨＮポリペプチドである。これらのＬＨＮ配列の両方とも「天然の」ＴｅＮＴ ＬＨＮ配列を代表し、これらはＬ鎖とＨＮドメインとの間に特異的切断部位が導入されていない。したがって、配列番号１４５は、本発明のＴｅＮＴポリペプチドを示し、ここではＬ鎖とＨＮドメインとの間の天然のＴｅＮＴリンカー領域が、特異的エンテロキナーゼ切断配列を含むポリペプチドで置換されている。
【０１０８】
任意の２つのドメイン（例えば、Ｌ鎖とＨＮドメイン、またはＬ鎖と精製タグ）間に特異的切断部位およびスペーサー／クランピング配列を導入するための本明細書に記載の一般的なアプローチが、本発明のＴｅＮＴ含有ポリペプチド分子の調製に日常的に適用可能であることもまた理解される。
【０１０９】
本発明の第３の局面は、クロストリジウム菌毒素の誘導体を含む組成物を提供し、この誘導体は、クロストリジウム菌毒素のエンドペプチダーゼ活性の少なくとも１０％を保持し、この誘導体は、さらに、細胞表面レセプターに結合する能力がないためインビボで非毒性であり、そしてこの組成物は、毒素またはさらなる毒素誘導体のようなインビボで毒性であるあらゆる成分を含まない。誘導体の活性は、好適には、天然の毒素の活性に近づき、したがって、好適には少なくとも３０％および最も好適には天然の毒素の少なくとも６０％である。組成物の全体のエンドペプチダーゼ活性はまた、当然、存在する誘導体の量によって決定される。
【０１１０】
天然に産生されるクロストリジウム菌毒素を処理してＨＣドメインを除去することは公知であるが、この処理は調製物の毒性を全体的に除去せず、代わりにいくつかの残存毒素活性が残ったままである。したがって、この方法で処理された天然の毒素は、未だ完全に安全ではない。ポリペプチドの純粋なソースの処理によって誘導体化された本発明の組成物は、有利には、毒性がなく、そして毒素アッセイにおける陽性コントロールとして、クロストリジウム菌毒素に対するワクチンとして、または組成物中に残存毒性がないことが必須である他の目的のために、便利に使用され得る。
【０１１１】
本発明は、組換え手段によって本発明のポリペプチドおよび融合タンパク質の産生を可能にする。
【０１１２】
本発明の第４の局面は、上記の本発明のいずれかの局面のポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸を提供する。
【０１１３】
本発明のこの局面の１つの実施態様では、ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするために提供されるＤＮＡ配列は、天然のクロストリジウム菌配列に由来しないが、天然に予め存在しない人工的に誘導体化した配列である。
【０１１４】
以下で詳細に記載する特異的ＤＮＡ（配列番号１）は、ボツリヌス菌毒素Ａ型の残基１〜８７１をコードするヌクレオチドを含むポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする。このポリペプチドは、軽鎖ドメインおよびボツリヌス菌毒素Ａ型重鎖のアミノ末端部分の最初の４２３アミノ酸残基を含む。この組換え産物は、ＬＨ４２３／Ａと命名されている（配列番号２）。
【０１１５】
本発明のこの局面の第２の実施態様では、ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、天然のクロストリジウム菌配列に由来するが、天然には見られないポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする。
【０１１６】
以下で詳細に記載する特異的ＤＮＡ（配列番号１９）は、ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードし、そしてボツリヌス菌毒素Ｂ型の残基１〜１１７１をコードするヌクレオチドを含む。このポリペプチドは、軽鎖ドメインおよびボツリヌス菌Ｂ型重鎖のアミノ末端タンパク質の最初の７２８アミノ酸残基を含む。この組換え産物は、ＬＨ７２８／Ｂと命名されている（配列番号２０）。
【０１１７】
したがって、本発明はまた、本発明の第３の局面のＤＮＡを宿主細胞中で発現させる工程を含む、ポリペプチドの製造方法を提供する。宿主細胞は、適切には、軽毒素鎖と重毒素鎖とを分離するように本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質を切断できず；例えば、非クロストリジウム菌宿主である。
【０１１８】
本発明はさらに、ポリペプチドの製造方法を提供し、この方法は、上記の融合タンパク質をコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させる工程、該融合タンパク質を保持するように適合したクロマトグラフィーカラムを通して溶出する工程、該融合タンパク質を置換するように適合したリガンドを該クロマトグラフィーカラムを通して溶出させる工程、および該融合タンパク質を回収する工程によって該融合タンパク質を精製することを含む。したがって、実質的に純粋な融合タンパク質の生成が可能になる。同様に、第２のポリペプチドは、同じタイプのクロマトグラフィーカラムを用いて便利に除去され得るので、融合タンパク質は、容易に切断されて、これもまた実質的に純粋な形態で、本発明のポリペプチドを得る。
【０１１９】
二本鎖の天然の毒素に由来するＬＨＮ／Ａは、重鎖のＣ末端の１／２であるＨＣドメインを除去するために、トリプシンでの広範囲の消化を必要とする。このドメインの喪失により、宿主標的細胞との相互作用を抑制することによって、インビボで毒素が効果的に不活性化される。しかし、残存毒性活性があり、これは、Ａ型神経毒素の夾雑しているトリプシン非感受性形態を示し得る。
【０１２０】
逆に、本発明の組換え調製物は、慎重に定義された遺伝子コード配列の産物であり、そして全長毒素タンパク質によって夾雑され得ない。さらに、大腸菌からおよび他の組換え発現宿主から回収された産物は、不活性な一本鎖ペプチドであり、あるいは発現宿主がプロセシングされた活性なポリペプチドを産生するならば、これは毒素ではない。現在のインビトロペプチド切断アッセイによって評価されるようなＬＨ４２３／Ａのエンドペプチダーゼ活性は、トリプシンによる残基４３０と４５４との間の組換え分子の活性化に全体的に依存的である。これらの２つの残基間を切断する他のタンパク質分解酵素はまた、一般的に、組換え分子の活性化に適切である。トリプシンは、アルギニンのＣ末端側またはリジンのＣ末端側のペプチド結合を切断し、そしてこれらの残基は４３０〜４５４領域で見出されそして露出しているので適切である（図１２を参照のこと）。
【０１２１】
本発明の組換えポリペプチドは、関連の基質を発現する細胞にターゲティングするための可能性のある治療剤であるが、ボツリヌス中毒を起こすことに関連しない。神経伝達物質の分泌が不適切であるかまたは所望でない場合、あるいは神経細胞が神経伝達物質以外の物質の調節された分泌に関して活動過多である場合が、その例であり得る。このような例において、天然の毒素のＨＣドメインの機能は、例えば、細胞レセプターリガンドおよび／またはトランスロケーションドメインを提供する代替のターゲティング配列に置換され得る。
【０１２２】
本発明の組換えポリペプチドの１つの適用は、WO-A-94/21300に開示されるような、治療分子の合成のための試薬成分である。組換え産物はまた、例えば、EP-A-0763131に開示されるような食料品または環境のいずれかにおける機能的ボツリヌス菌または破傷風菌神経毒素の検出のためのインビトロアッセイの評価および開発のための非毒性標準としての適用が見出される。
【０１２３】
さらなる選択肢は、本発明のポリペプチドのＣ末端への、タンパク質および非タンパク質の両方の起源のターゲティングリガンドへの特異的化学結合を可能にするペプチド配列の付加である。
【０１２４】
なおさらなる実施態様では、代わりのターゲティングリガンドが、本発明のポリペプチドのＮ末端に付加される。組換えＬＨＮ誘導体は、推定トリプシン感受性領域のＬＣのＣ末端でおよび完全タンパク質産物の最もＣ末端でもまた、操作された特異的プロテアーゼ切断部位を有するように指定されている。これらの部位は、組換え産物の活性化特異性を増強し、そのため、二本鎖種は、トリプシンの使用よりも予測可能な性質のタンパク質分解切断によってのみ活性され得る。
【０１２５】
天然のＢｏＮＴ／Ａから酵素的に生成されたＬＨＮは、効率的な免疫源であり、したがってあらゆる全長神経毒素と全体的に分離した組換え形態は、ワクチン成分を示す。組換え産物は、上記の領域のいずれかを支持する所定のタンパク質改変を生成するための基本的な試薬として用いられ得る。
【０１２６】
組換え構築物は、これらが公表されたドメイン中の翻訳されたＤＮＡ配列にまたは詳細には配列番号２および配列番号２０に関連するので、それらのアミノ酸配列長および軽鎖（Ｌ鎖、Ｌ）および重鎖（Ｈ鎖、Ｈ）内容に基づいて区別される呼称が割り当てられている。「ＬＨ」の名称は「／Ｘ」が続き、ここで「Ｘ」は、対応するクロストリジウム菌毒素血清型またはクラス、例えば、ボツリヌス菌神経毒素Ａ型については「Ａ」あるいは破傷風菌毒素については「ＴｅＴｘ」を示す。天然の毒素ポリペプチドに由来する配列改変体は、標準形式では括弧で示され、すなわち、残基の位置の番号は、天然の配列の残基が前に付きそして改変体の残基が終わりに付けられる。
【０１２７】
下付きの数字の接頭辞は、翻訳された配列に対するアミノ末端（Ｎ末端）伸張、あるいは負の場合は欠失を示す。同様に、下付きの数字の接尾辞は、カルボキシ末端（Ｃ末端）伸長あるいは負の数字が用いられる場合は欠失を示す。プロテアーゼ切断部位のような特異的な配列インサートは、略語を用いて示され、例えば、第Ｘａ因子はＦＸａに略されている。Ｌ鎖Ｃ末端接尾辞およびＨ鎖Ｎ末端接頭辞は、「／」によって分離されて、Ｌ鎖とＨ鎖との間の予測接合部を示す。操作されたリガンド配列についての略語は、翻訳産物における位置に対応するクロストリジウム菌Ｌ鎖またはＨ鎖の前または後に付けられる。
【０１２８】
この用法を以下に示す、
ＬＨ４２３／Ａ  ＝  配列番号２、Ｌ鎖全体およびボツリヌス菌神経毒素Ａ型のＨ鎖の４２３アミノ酸を含む；
２ＬＨ４２３／Ａ  ＝  この分子の改変体、Ｌ鎖のＮ末端への２アミノ酸伸長を含む；
２Ｌ／２Ｈ４２３／Ａ  ＝  さらなる改変体、この分子は、Ｌ鎖およびＨ鎖の両方のＮ末端における２アミノ酸伸長を含む；
２ＬＦＸａ／２Ｈ４２３／Ａ  ＝  さらなる改変体、Ｌ鎖のＮ末端への２アミノ酸伸長、Ｌ鎖のＣ末端での第Ｘａ因子切断配列を含み、第Ｘａ因子での分子の切断後に、Ｈ鎖成分に２アミノ酸Ｎ末端伸長が残る；および
２ＬＦＸａ／２Ｈ４２３／Ａ−ＩＧＦ−１  ＝  この分子の改変体、Ｈ鎖へのさらなるＣ末端伸長を有し、この例では、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）配列である。
【０１２９】
本発明を実施するために必要とされる基本的分子生物学技法は、本出願の優先日以前に当該技術分野で容易に利用可能であり、そしてこのように、当業者には日常的である。
【０１３０】
本出願の実施例１は、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を調製するための従来の制限エンドヌクレアーゼ依存的切断およびライゲーション方法論を説明する。
【０１３１】
実施例４以降は、ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ依存的切断およびライゲーションの伝統的方法を必要としない組換えＤＮＡ分子を操作するための、多くの代替の従来の方法を説明する。１つのこのような方法は、Invitrogen, Inc.の部位特異的組換えGATEWAY（登録商標）クローニングシステムであり、これは、λファージベースの部位特異的組換えを用いる［Landy, A. (1989) Ann. Rev. Biochem. 58, 913-949頁］。この方法は、ここでは少しだけより詳細に記載される。
【０１３２】
標準的制限エンドヌクレアーゼ消化、またはポリメラーゼ連鎖反応技法を用いて、第１および第２ドメイン（例えば、ＢｏＮＴ  ＬＨＮ分子）をコードするＤＮＡ配列は、侵入ベクター中にクローニングされ得る。GATEWAY（登録商標）マニュアルに記載のように、必要なatt部位組換え配列に隣接する正確なコード配列の生成については多くの選択肢がある。
【０１３３】
例えば、１つの経路は、一般的なポリリンカーを侵入ベクター中に挿入することであり、ここで、挿入されたＤＮＡは、ポリリンカー配列によって分離された２つのatt部位を含む。このアプローチは、使用者が定義した制限エンドヌクレアーゼ部位で、種々のフラグメントを侵入ベクター中に挿入することを容易にする。
【０１３４】
第２の経路は、目的のＤＮＡの増幅のために使用されるプライマーにatt部位を挿入することである。このアプローチでは、増幅されたフラグメントのＤＮＡ配列は、５’および３’末端で適切なatt部位を含むように改変される。
【０１３５】
ＬＨＮ／Ｃ（配列番号１３５）、停止コドンを含まずにリガンドへの直接融合を容易にするＬＨＮ／Ｃ（配列番号１３６）、および適切な第２または第３ドメインとの組み合わせを容易にし得るＬ鎖／Ｃ配列（配列番号１３４）についての侵入ベクターの例が提供される。
【０１３６】
改変された侵入ベクター（目的のＤＮＡを含む）と選択した仕向ベクターとの組み合わせによって、発現クローンが生成される。仕向ベクターは、代表的には、目的の挿入されたＤＮＡの転写を容易にし、そして適切な宿主細胞に導入される場合にタンパク質の発現を容易にするための必要な情報を提供する。
【０１３７】
仕向ベクターは、Ｎ末端および／またはＣ末端融合タグおよび／または追加のタンパク質ドメインの発現を確実にするように調製され得る。非伝達性ベクター骨格においてＭＢＰタグ付けしたタンパク質の発現のための新規の操作された仕向ベクターの例を、配列番号１３７に示す。この特定の実施態様では、配列番号１３７で同定される仕向ベクターとともに目的の配列を有する侵入ベクターの組換えにより、大腸菌発現のための発現ベクターが得られる。
【０１３８】
発現クローンを調製するための侵入ベクターと仕向ベクターとの組み合わせにより、改変された配列を有する発現されたタンパク質が得られる。配列番号３０および１２４に示す実施例では、ＴＳＬＹＫＫＡＧＦのペプチド配列が、精製タグを除去するための切断後に、エンドペプチダーゼのＮ末端で見られるべきである。このペプチド配列は、att部位を形成しそしてこのように構築および発現されるすべてのクローンの特徴であるＤＮＡによってコードされる。
【０１３９】
att部位配列が、特異的プロテアーゼ切断部位をコードするＤＮＡ（例えば、表１から）を侵入クローンのatt部位の３’に挿入するように改変され得ることが理解される。
【０１４０】
任意のポリペプチド（例えば、ＬＨＮフラグメント）の正確なＮ末端が、エンドペプチダーゼＤＮＡが侵入ベクターおよびその関連の５’att部位に導入される方法に依存して変化することも理解される。配列番号２９／３０および１２３／１２４は、適切な場合である。配列番号３０のＮ末端伸長はＴＳＬＹＫＫＡＧＦＧＳであるが、配列番号１２４のＮ末端伸長はＩＴＳＬＹＫＫＡＧＦＧＳＬＤＨである。これらのアミノ酸伸長含有ドメインは、本発明の第１／第２ドメイン改変体のさらなる例を提供する。
【０１４１】
本発明の文脈内で、以下の定義を留意すべきである。
【０１４２】
用語ポリペプチド「フラグメント」とは、問題のポリペプチド「フラグメント」が、好適には参照の配列番号のポリペプチド配列の少なくとも５０％の長さであることを意味する。したがって、参照の配列番号のポリペプチドが、例えば５００アミノ酸残基を有するアミノ酸配列であるならば、対応する「フラグメント」は、少なくとも２５０アミノ酸残基を有するアミノ酸配列である。より好適な実施態様では、「フラグメント」は、参照の配列番号のポリペプチドの、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８５％、特に好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％の長さである。
【０１４３】
ポリペプチド「フラグメント」は、好適には、参照の配列番号のポリペプチド配列のエピトープを含み、これは、抗体交差反応性によって確認され得る。ポリペプチド「フラグメント」は、好適には、エキソサイトーシスに必須の１以上の小胞または形質膜結合タンパク質を切断し得る第１ドメインを含む。
【０１４４】
用語「改変体」とは、参照の配列番号のポリペプチドと、少なくとも７０、好ましくは少なくとも８０、より好ましくは少なくとも９０パーセントのアミノ酸配列相同性を有するポリペプチドまたはポリペプチド「フラグメント」を意味する。「改変体」の例は、アミノ酸の１以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸）または置換された連結を含むポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントである。用語「相同性」および「同一性」は、本明細書では同義とみなされる。
【０１４５】
配列比較については、代表的には、１つの配列（例えば、参照の配列番号ポリペプチド）が参照配列として用いられ、これに対して「改変体」配列が比較され得る。配列比較アルゴリズムを用いる場合、「改変体」および参照配列はコンピュータに入力され、次の座標が指定され、そして必要ならば、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照の配列番号のポリペプチド配列に対する「改変体」配列についての配列同一性の割合を算出する。
【０１４６】
比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、SmithおよびWaterman［Adv. Appl. Math. 2: 484 (1981)］の局所相同性アラインメントアルゴリズムによって、NeedlemanおよびWunsch［J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)］のアルゴリズムによって、PearsonおよびLipman［Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)］の類似性方法についての検索によって、これらのアルゴリズム（GAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA - Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705）のコンピュータ実行によって、または目視検査によって行われ得る［Current Protocols；Molecular Biology，F.M. Ausbelら編，Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc.およびJohn Wiley & Sons, Inc. (1995 Supplement) Ausbubelを参照のこと］。
【０１４７】
配列類似性のパーセントを決定するために適切なアルゴリズムの例は、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズム［Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410頁；およびthe National Center for Biotechnology Informationの「http://www.ncbi.nlm.nih.gov/」を参照のこと］である。
【０１４８】
好ましい相同性比較において、同一性は、少なくとも５０アミノ酸残基長、より好ましくは少なくとも１００アミノ酸残基長、特に好ましくは少なくとも１５０アミノ酸残基長、および最も好ましくは少なくとも２００アミノ酸残基長である配列の領域にわたり存在する。あるいは、同一性は、例えば、「改変体」ポリペプチドの配列全体にわたって存在する。
【０１４９】
本発明で使用される場合、用語ＤＮＡ「フラグメント」は、用語ポリペプチド「フラグメント」（上述）と一致して解釈されるべきであり、そして問題のＤＮＡ「フラグメント」が、好ましくは参照の配列番号のＤＮＡ配列の少なくとも５０％の長さであることを意味する。したがって、参照の配列番号のＤＮＡ配列が、例えば、５００ヌクレオチド残基を有する核酸配列であるならば、対応する「フラグメント」は、少なくとも２５０ヌクレオチド残基を有する核酸配列である。より好適な実施態様では、「フラグメント」は、参照の配列番号のＤＮＡ配列の、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８５％、特に好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％の長さである。
【０１５０】
用語ＤＮＡ「改変体」とは、参照のＤＮＡ配列（またはそのフラグメント）と実質的な相同性または実質的な類似性を有するＤＮＡ配列を意味する。核酸またはそのフラグメントは、他の核酸（またはその相補鎖）と（適切なヌクレオチド挿入または欠失とともに）最適にアラインされる場合に、ヌクレオチド塩基の少なくとも約６０％、通常は少なくとも約７０％、より通常には少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、およびより好ましくはヌクレオチド塩基の少なくとも約９５％〜９８％でヌクレオチド配列同一性があるならば、他に対して「実質的に相同」（または「実質的に類似」）である。相同性決定は、ペプチドについて上述のように行われる。
【０１５１】
あるいは、ＤＮＡ「改変体」は、選択的ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る場合、参照の配列番号のＤＮＡ配列のコード配列（またはそのフラグメント）と実質的に相同（または実質的に類似）である。ハイブリダイゼーションの選択性は、ハイブリダイゼーションが生じる場合に存在し、全体的に特異性がない場合よりも実質的により選択的である。代表的には、少なくとも約５０ヌクレオチドの長さにわたって少なくとも約６５％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約７５％、および最も好ましくは少なくとも約９０％の相同性がある場合に、選択的ハイブリダイゼーションが生じる。Kanehisa (1984) Nuc. Acids Res. 12: 203-213を参照のこと。上記のように、相同性比較の長さは、より長い長さにわたるものであり得、そしてある実施態様では、しばしば、少なくとも約１００ヌクレオチド、通常は少なくとも約１５０ヌクレオチド、より通常には少なくとも約２００ヌクレオチド、代表的には少なくとも約２５０ヌクレオチド、より代表的には少なくとも約３００ヌクレオチド、および好ましくは少なくとも約３５０以上のヌクレオチドの長さにわたる。あるいは、同一性は、例えば、「改変体」ＤＮＡ配列の配列全体にわたって存在する。
【０１５２】
核酸ハイブリダイゼーションが、塩基組成、相補鎖の長さ、およびハイブリダイズしている核酸間のヌクレオチド塩基ミスマッチの数に加えて、塩濃度（例えば、NaCl）、温度、または有機溶媒のような条件によって影響を受けることは、当業者には容易に理解される。好ましくは、ストリンジェントな温度条件が用いられ、そして一般的には３０℃超える、代表的には３７℃を超える、および好ましくは４５℃を超える温度を含む。ストリンジェントな塩条件は、普通には１０００ｍＭ未満、代表的には５００ｍＭ未満、および好ましくは２００ｍＭ未満である。ｐＨは、代表的には７．０〜８．３である。しかし、パラメータの組み合わせは、任意の単一のパラメータの基準よりも非常に重要である。例えば、WetmurおよびDavidson (1968) J. Mol. Biol. 31: 349-370を参照のこと。
【０１５３】
上記の用語ＤＮＡ「フラグメント」および「改変体」は、互いに共通して、得られるペプチド産物が、好ましくは、対応する参照の配列番号のポリペプチドと実質的に同じである交差反応性抗原性特性を有する。好ましくは、本発明の上記ＤＮＡ「フラグメント」および「改変体」実施態様のポリペプチド産物のすべては、参照の配列番号のポリペプチドにも結合する抗体と結合する。
【０１５４】
以下は、本発明の特定の実施態様の説明であり、図面によって説明される。
【０１５５】
本出願に付随する配列表は、以下の配列を含む。
【０１５６】
配列番号 配列
１          ＬＨ４２３／ＡをコードするＤＮＡ。
【０１５７】
２          ＬＨ４２３／Ａ。
【０１５８】
３          ２３ＬＨ４２３／Ａ（Ｑ２Ｅ，Ｎ２６Ｋ，Ａ２７Ｙ）をコードするＤＮＡ、そのＮ末端部分を図４に示す。
【０１５９】
４          ２３ＬＨ４２３／Ａ（Ｑ２Ｅ，Ｎ２６Ｋ，Ａ２７Ｙ）。
【０１６０】
５          ２ＬＨ４２３／Ａ（Ｑ２Ｅ，Ｎ２６Ｋ，Ａ２７Ｙ）をコードするＤＮＡ、そのＮ末端部分を図４に示す。
【０１６１】
６          ２ＬＨ４２３／Ａ（Ｑ２Ｅ，Ｎ２６Ｋ，Ａ２７Ｙ）。
【０１６２】
７          Binzらの天然のＢｏＮＴ／ＡをコードするＤＮＡ。
【０１６３】
８          Binzらの天然のＢｏＮＴ／Ａ。
【０１６４】
９          Ｌ／４Ｈ４２３／ＡをコードするＤＮＡ。
【０１６５】
１０        Ｌ／４Ｈ４２３／Ａ。
【０１６６】
１１        ＬＦＸａ／３Ｈ４２３／ＡをコードするＤＮＡ。
【０１６７】
１２        ＬＦＸａ／３Ｈ４２３／Ａ。
【０１６８】
１３        ＬＦＸａ／３Ｈ４２３／Ａ−ＩＧＦ−１をコードするＤＮＡ。
【０１６９】
１４        ＬＦＸａ／３Ｈ４２３／Ａ−ＩＧＦ−１。
【０１７０】
１５        ＬＦＸａ／３Ｈ４２３／Ａ−ＣｔｘＡ１４をコードするＤＮＡ。
【０１７１】
１６        ＬＦＸａ／３Ｈ４２３／Ａ−ＣｔｘＡ１４。
【０１７２】
１７        ＬＦＸａ／３Ｈ４２３／Ａ−ＺＺをコードするＤＮＡ。
【０１７３】
１８        ＬＦＸａ／３Ｈ４２３／Ａ−ＺＺ。
【０１７４】
１９        ＬＨ７２８／ＢをコードするＤＮＡ。
【０１７５】
２０        ＬＨ７２８／Ｂ。
【０１７６】
２１        ＬＨ４１７／ＢをコードするＤＮＡ。
【０１７７】
２２        ＬＨ４１７／Ｂ。
【０１７８】
２３        ＬＨ１０７／ＢをコードするＤＮＡ。
【０１７９】
２４        ＬＨ１０７／Ｂ。
【０１８０】
２５        ＬＨ４２３／Ａ（Ｑ２Ｅ，Ｎ２６Ｋ，Ａ２７Ｙ）をコードするＤＮＡ。
【０１８１】
２６        ＬＨ４２３／Ａ（Ｑ２Ｅ，Ｎ２６Ｋ，Ａ２７Ｙ）。
【０１８２】
２７        ＬＨ４１７／ＢをコードするＤＮＡ、ここで、最初の２７４塩基は大腸菌コドンバイアスを有するように改変される。
【０１８３】
２８        ＬＨ４１７／ＢをコードするＤＮＡ、ここで、天然のＢｏＮＴ／Ｂ配列の塩基６９１〜１６４１は、天然のＢｏＮＴ／Ｂポリペプチドのアミノ酸残基２３１〜５４７をコードする縮重ＤＮＡによって置換されている。
【０１８４】
２９        Gateway適合仕向ベクターから発現されるＬＨＮ／ＡをコードするＤＮＡ。ＬＨＮ／Ａは、ＬＣ−ＨＮ接合部にエンテロキナーゼ活性化部位、およびＬＨＮ／Ａ配列の５’末端に１１アミノ酸のatt部位ペプチド伸長を組み込む。
【０１８５】
３０        配列番号２９の発現によって産生されるＬＨＮ／Ａ、このポリペプチドは、ＬＣ−ＨＮ接合部にエンテロキナーゼ活性化部位、およびＬＨＮ／Ａ配列の５’末端に１１アミノ酸のatt部位ペプチド伸長を組み込んでいる。
【０１８６】
３１        ＬＣ−ＨＮ接合部にエンテロキナーゼ活性化部位を有するＬＨＮ／ＡをコードするＤＮＡ。
【０１８７】
３２        配列番号３１の発現によって産生されるＬＨＮ／Ａ、このポリペプチドは、ＬＣ−ＨＮ接合部にエンテロキナーゼ活性化部位を有する。
【０１８８】
３３        ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子プロテアーゼ活性化部位を有するＬＨＮ／ＡをコードするＤＮＡ。
【０１８９】
３４        配列番号３３の発現によって産生されるＬＨＮ／Ａ、このポリペプチドは、ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子プロテアーゼ活性化部位を有する。
【０１９０】
３５        ＬＣ−ＨＮ接合部にプレシションプロテアーゼ活性化部位を有するＬＨＮ／ＡをコードするＤＮＡ。
【０１９１】
３６        配列番号３５の発現によって産生されるＬＨＮ／Ａ、このポリペプチドは、ＬＣ−ＨＮ接合部にプレシションプロテアーゼ活性化部位を有する。
【０１９２】
３７        ＬＣ−ＨＮ接合部にトロンビンプロテアーゼ活性化部位を有するＬＨＮ／ＡをコードするＤＮＡ。
【０１９３】
３８        配列番号３７の発現によって産生されるＬＨＮ／Ａ、このポリペプチドは、ＬＣ−ＨＮ接合部にトロンビンプロテアーゼ活性化部位を有する。
【０１９４】
３９        ＬＨＮ／Ａ−リガンド（Erythrina cristagalliレクチン）融合物をコードするＤＮＡ、ここで、ＬＣ−ＨＮ接合部は、特異的プロテアーゼ切断部位を組み込まず、そしてリガンドは、（ＧＧＧＧＳ）３スペーサーによってＨＮドメインから離れている。
【０１９５】
４０        配列番号３９の発現によって産生されるＬＨＮ／Ａ−リガンド（Erythrina cristagalliレクチン）融合物、ここで、ＬＣ−ＨＮ接合部は、特異的プロテアーゼ切断部位を組み込まず、そしてリガンドは、（ＧＧＧＧＳ）３スペーサーによってＨＮドメインから離れている。
【０１９６】
４１        ＬＨＮ／Ａ−リガンド（Erythrina cristagalliレクチン）融合物をコードするＤＮＡ、ここで、ＬＣ−ＨＮ接合部は、特異的プロテアーゼ切断部位を組み込まず、そしてリガンドは、ヘリカルスペーサーによってＨＮドメインから離れている。
【０１９７】
４２        配列番号４１の発現によって産生されるＬＨＮ／Ａ−リガンド（Erythrina cristagalliレクチン）融合物、ここで、ＬＣ−ＨＮ接合部は、特異的プロテアーゼ切断部位を組み込まず、そしてリガンドは、ヘリカルスペーサーによってＨＮドメインから離れている。
【０１９８】
４３        ＬＨＮ／Ａ−リガンド（Erythrina cristagalliレクチン）融合物をコードするＤＮＡ、ここで、ＬＣ−ＨＮ接合部は、特異的エンテロキナーゼプロテアーゼ活性化部位を組み込み、そしてリガンドは、（ＧＧＧＧＳ）３スペーサーによってＨＮドメインから離れている。
【０１９９】
４４        配列番号４３の発現によって産生されるＬＨＮ／Ａ−リガンド（Erythrina cristagalliレクチン）融合物、ここで、ＬＣ−ＨＮ接合部は、特異的エンテロキナーゼプロテアーゼ活性化部位を組み込み、そしてリガンドは、（ＧＧＧＧＳ）３スペーサーによってＨＮドメインから離れている。
【０２００】
４５        ＬＨＮ／Ａ−リガンド（Erythrina cristagalliレクチン）融合物をコードするＤＮＡ、ここで、ＬＣ−ＨＮ接合部は、特異的エンテロキナーゼプロテアーゼ活性化部位を組み込み、そしてリガンドは、ヘリカルスペーサーによってＨＮドメインから離れている。
【０２０１】
４６        配列番号４５の発現によって産生されるＬＨＮ／Ａ−リガンド（Erythrina cristagalliレクチン）融合物、ここで、ＬＣ−ＨＮ接合部は、特異的エンテロキナーゼプロテアーゼ活性化部位を組み込み、そしてリガンドは、ヘリカルスペーサーによってＨＮドメインから離れている。
【０２０２】
４７        ＬＨＮ／Ａ−リガンド（Erythrina cristagalliレクチン）融合物をコードするＤＮＡ、ここで、ＬＣ−ＨＮ接合部は、特異的トロンビンプロテアーゼ活性化部位を組み込み、そしてリガンドは、ヘリカルスペーサーによってＨＮドメインから離れている。
【０２０３】
４８        配列番号４７の発現によって産生されるＬＨＮ／Ａ−リガンド（Erythrina cristagalliレクチン）融合物、ここで、ＬＣ−ＨＮ接合部は、特異的トロンビンプロテアーゼ活性化部位を組み込み、そしてリガンドは、ヘリカルスペーサーによってＨＮドメインから離れている。
【０２０４】
４９        ＬＨＮ／Ａ−リガンド（Erythrina cristagalliレクチン）融合物をコードするＤＮＡ、ここで、ＬＣ−ＨＮ接合部は、特異的トロンビンプロテアーゼ活性化部位を組み込み、そしてリガンドは、（ＧＧＧＧＳ）３スペーサーによってＨＮドメインから離れている。
【０２０５】
５０        配列番号４９の発現によって産生されるＬＨＮ／Ａ−リガンド（Erythrina cristagalliレクチン）融合物、ここで、ＬＣ−ＨＮ接合部は、特異的トロンビンプロテアーゼ活性化部位を組み込み、そしてリガンドは、（ＧＧＧＧＳ）３スペーサーによってＨＮドメインから離れている。
【０２０６】
５１        ＬＨＮ／Ａ−リガンド（Erythrina cristagalliレクチン）融合物をコードするＤＮＡ、ここで、ＬＣ−ＨＮ接合部は、特異的プレシションプロテアーゼ活性化部位を組み込み、そしてリガンドは、ヘリカルスペーサーによってＨＮドメインから離れている。
【０２０７】
５２        配列番号５１の発現によって産生されるＬＨＮ／Ａ−リガンド（Erythrina cristagalliレクチン）融合物、ここで、ＬＣ−ＨＮ接合部は、特異的プレシションプロテアーゼ活性化部位を組み込み、そしてリガンドは、ヘリカルスペーサーによってＨＮドメインから離れている。
【０２０８】
５３        ＬＨＮ／Ａ−リガンド（Erythrina cristagalliレクチン）融合物をコードするＤＮＡ、ここで、ＬＣ−ＨＮ接合部は、特異的プレシションプロテアーゼ活性化部位を組み込み、そしてリガンドは、（ＧＧＧＧＳ）３スペーサーによってＨＮドメインから離れている。
【０２０９】
５４        配列番号５３の発現によって産生されるＬＨＮ／Ａ−リガンド（Erythrina cristagalliレクチン）融合物、ここで、ＬＣ−ＨＮ接合部は、特異的プレシションプロテアーゼ活性化部位を組み込み、そしてリガンドは、（ＧＧＧＧＳ）３スペーサーによってＨＮドメインから離れている。
【０２１０】
５５        ＬＨＮ／Ａ−リガンド（Erythrina cristagalliレクチン）融合物をコードするＤＮＡ、ここで、ＬＣ−ＨＮ接合部は、特異的第Ｘａ因子プロテアーゼ活性化部位を組み込み、そしてリガンドは、ヘリカルスペーサーによってＨＮドメインから離れている。
【０２１１】
５６        配列番号５５の発現によって産生されるＬＨＮ／Ａ−リガンド（Erythrina cristagalliレクチン）融合物、ここで、ＬＣ−ＨＮ接合部は、特異的第Ｘａ因子プロテアーゼ活性化部位を組み込み、そしてリガンドは、ヘリカルスペーサーによってＨＮドメインから離れている。
【０２１２】
５７        ＬＨＮ／Ａ−リガンド（Erythrina cristagalliレクチン）融合物をコードするＤＮＡ、ここで、ＬＣ−ＨＮ接合部は、特異的第Ｘａ因子プロテアーゼ活性化部位を組み込み、そしてリガンドは、（ＧＧＧＧＳ）３スペーサーによってＨＮドメインから離れている。
【０２１３】
５８        配列番号５７の発現によって産生されるＬＨＮ／Ａ−リガンド（Erythrina cristagalliレクチン）融合物、ここで、ＬＣ−ＨＮ接合部は、特異的第Ｘａ因子プロテアーゼ活性化部位を組み込み、そしてリガンドは、（ＧＧＧＧＳ）３スペーサーによってＨＮドメインから離れている。
【０２１４】
５９        ＬＣ−ＨＮ接合部にエンテロキナーゼプロテアーゼ活性化部位、および１対のＣｙｓ残基によって結合したＣ末端fosリガンドを組み込んでいるＬＨＮ／ＡをコードするＤＮＡ。
【０２１５】
６０        配列番号５９の発現によって産生されるＬＨＮ／Ａ、このポリペプチドは、ＬＣ−ＨＮ接合部にエンテロキナーゼプロテアーゼ活性化部位、および１対のＣｙｓ残基によって結合したＣ末端fosリガンドを組み込んでいる。
【０２１６】
６１        ＬＣ−ＨＮ接合部にエンテロキナーゼプロテアーゼ活性化部位、および１対のＣｙｓ残基によって結合したＣ末端（Ｇｌｕ）８ペプチドを組み込んでいるＬＨＮ／ＡをコードするＤＮＡ。
【０２１７】
６２        配列番号６１の発現によって産生されるＬＨＮ／Ａ、このポリペプチドは、ＬＣ−ＨＮ接合部にエンテロキナーゼプロテアーゼ活性化部位、および１対のＣｙｓ残基によって結合したＣ末端（Ｇｌｕ）８ペプチドを組み込んでいる。
【０２１８】
６３        ＬＣ−ＨＮ接合部にエンテロキナーゼプロテアーゼ活性化部位、およびＣ末端fosリガンドを組み込んでいるＬＨＮ／ＡをコードするＤＮＡ。
【０２１９】
６４        配列番号６３の発現によって産生されるＬＨＮ／Ａ、このポリペプチドは、ＬＣ−ＨＮ接合部にエンテロキナーゼプロテアーゼ活性化部位、およびＣ末端fosリガンドを組み込んでいる。
【０２２０】
６５        ＬＣ−ＨＮ接合部にエンテロキナーゼプロテアーゼ活性化部位、およびＣ末端（Ｇｌｕ）８ペプチドを組み込んでいるＬＨＮ／ＡをコードするＤＮＡ。
【０２２１】
６６        配列番号６５の発現によって産生されるＬＨＮ／Ａ、このポリペプチドは、ＬＣ−ＨＮ接合部にエンテロキナーゼプロテアーゼ活性化部位、およびＣ末端（Ｇｌｕ）８ペプチドを組み込んでいる。
【０２２２】
６７        ＬＣ−ＨＮ接合部にエンテロキナーゼプロテアーゼ活性化部位、および化学的指示カップリングにおける使用のためのチオエステル形成を容易にするためにＣ末端自己切断可能なインテインポリペプチドを組み込んでいるＬＨＮ／ＡをコードするＤＮＡ。
【０２２３】
６８        配列番号６７の発現によって産生されるＬＨＮ／Ａ、このポリペプチドは、ＬＣ−ＨＮ接合部にエンテロキナーゼプロテアーゼ活性化部位、および化学的指示カップリングにおける使用のためのチオエステル形成を容易にするためにＣ末端自己切断可能なインテインポリペプチドを組み込んでいる。
【０２２４】
６９        停止コドンがなく、ＨＮドメインの最初の６アミノ酸を組み込むリンカーペプチド、およびエンテロキナーゼ切断部位を有するＬＣ／ＡをコードするＤＮＡ。
【０２２５】
７０        配列番号６９の発現によって産生されるＬＣ／Ａ、このポリペプチドは、停止コドンがなく、ＨＮドメインの最初の６アミノ酸を組み込むリンカーペプチド、およびエンテロキナーゼ切断部位を有する。
【０２２６】
７１        停止コドンを含まず、ＨＮドメインの最初の６アミノ酸を組み込むリンカーペプチド、および第Ｘａ因子切断部位を有するＬＣ／ＡをコードするＤＮＡ。
【０２２７】
７２        配列番号７１の発現によって産生されるＬＣ／Ａ、このポリペプチドは、停止コドンを含まず、ＨＮドメインの最初の６アミノ酸を組み込むリンカーペプチド、および第Ｘａ因子切断部位を有する。
【０２２８】
７３        停止コドンを含まず、ＨＮドメインの最初の６アミノ酸を組み込む天然のＬＣ−ＨＮ配列を示すリンカーペプチドを有するＬＣ／ＡをコードするＤＮＡ。
【０２２９】
７４        配列番号７３の発現によって産生されるＬＣ／Ａ、このポリペプチドは、停止コドンを含まず、ＨＮドメインの最初の６アミノ酸を組み込む天然のＬＣ−ＨＮ配列を示すリンカーペプチドを有する。
【０２３０】
７５        停止コドンを含まず、ＨＮドメインの最初の６アミノ酸を組み込むリンカーペプチド、およびプレシション切断部位を有するＬＣ／ＡをコードするＤＮＡ。
【０２３１】
７６        配列番号７５の発現によって産生されるＬＣ／Ａ、このポリペプチドは、停止コドンを含まず、ＨＮドメインの最初の６アミノ酸を組み込むリンカーペプチド、およびプレシション切断部位を有する。
【０２３２】
７７        停止コドンを含まず、ＨＮドメインの最初の６アミノ酸を組み込むリンカーペプチド、およびトロンビン切断部位を有するＬＣ／ＡをコードするＤＮＡ。
【０２３３】
７８        配列番号７７の発現によって産生されるＬＣ／Ａ、このポリペプチドは、停止コドンを含まず、ＨＮドメインの最初の６アミノ酸を組み込むリンカーペプチド、およびトロンビン切断部位を有する。
【０２３４】
７９        ＬＣ−ＨＮ接合部（ＬＣおよびＨＮドメインのＣｙｓ残基間に１１アミノ酸がある）にエンテロキナーゼプロテアーゼ活性化部位、および６アミノ酸Ｎ末端伸長を組み込んでいるＬＨＮ／ＢをコードするＤＮＡ。
【０２３５】
８０        配列番号７９の発現によって産生されるＬＨＮ／Ｂ、このポリペプチドは、ＬＣ−ＨＮ接合部（ＬＣおよびＨＮドメインのＣｙｓ残基間に１１アミノ酸がある）にエンテロキナーゼプロテアーゼ活性化部位、および６アミノ酸Ｎ末端伸長を組み込んでいる。
【０２３６】
８１        ＬＣ−ＨＮ接合部（ＬＣおよびＨＮドメインのＣｙｓ残基間に２０アミノ酸がある）にエンテロキナーゼプロテアーゼ活性化部位、および６アミノ酸Ｎ末端伸長を組み込んでいるＬＨＮ／ＢをコードするＤＮＡ。
【０２３７】
８２        配列番号８１の発現によって産生されるＬＨＮ／Ｂ、このポリペプチドは、ＬＣ−ＨＮ接合部（ＬＣおよびＨＮドメインのＣｙｓ残基間に２０アミノ酸がある）にエンテロキナーゼプロテアーゼ活性化部位、および６アミノ酸Ｎ末端伸長を組み込んでいる。
【０２３８】
８３        ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子プロテアーゼ活性化部位、およびインテイン自己切断ポリペプチドに切断から生じる１１アミノ酸Ｎ末端伸長を組み込んでいるＬＨＮ／ＢをコードするＤＮＡ。
【０２３９】
８４        配列番号８３の発現によって産生されるＬＨＮ／Ｂ、このポリペプチドは、ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子プロテアーゼ活性化部位、およびインテイン自己切断ポリペプチドに切断から生じる１１アミノ酸Ｎ末端伸長を組み込んでいる。
【０２４０】
８５        ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子プロテアーゼ活性化部位、およびＴＥＶプロテアーゼ切断部位に切断（精製タグからＬＨＮ／Ｂを遊離することを含む）から生じる１１アミノ酸Ｎ末端伸長（第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を保持する）を組み込んでいるＬＨＮ／ＢをコードするＤＮＡ。
【０２４１】
８６        配列番号８５の発現によって産生されるＬＨＮ／Ｂ、このポリペプチドは、ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子プロテアーゼ活性化部位、およびＴＥＶプロテアーゼ切断部位に切断（精製タグからＬＨＮ／Ｂを遊離することを含む）から生じる１１アミノ酸Ｎ末端伸長（第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を保持する）を組み込んでいる。
【０２４２】
８７        ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子プロテアーゼ活性化部位、および６アミノ酸Ｎ末端伸長を組み込んでいるＬＨＮ／ＢをコードするＤＮＡ。
【０２４３】
８８        配列番号８７の発現によって産生されるＬＨＮ／Ｂ、このポリペプチドは、ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子プロテアーゼ活性化部位、および６アミノ酸Ｎ末端伸長を組み込んでいる。
【０２４４】
８９        ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子プロテアーゼ活性化部位、および第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位に切断（精製タグからＬＨＮ／Ｂを遊離することを含む）から生じる１１アミノ酸Ｎ末端伸長（エンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位を保持する）を組み込んでいるＬＨＮ／ＢをコードするＤＮＡ。
【０２４５】
９０        配列番号８９の発現によって産生されるＬＨＮ／Ｂ、このポリペプチドは、ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子プロテアーゼ活性化部位、および第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位に切断（精製タグからＬＨＮ／Ｂを遊離することを含む）から生じる１１アミノ酸Ｎ末端伸長（エンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位を保持する）を組み込んでいる。
【０２４６】
９１        ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子プロテアーゼ活性化部位、およびエンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位に切断（精製タグからＬＨＮ／Ｂを遊離することを含む）から生じる１０アミノ酸Ｎ末端伸長（第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を保持する）を組み込んでいるＬＨＮ／ＢをコードするＤＮＡ。
【０２４７】
９２        配列番号９１の発現によって産生されるＬＨＮ／Ｂ、このポリペプチドは、ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子プロテアーゼ活性化部位、およびエンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位に切断（精製タグからＬＨＮ／Ｂを遊離することを含む）から生じる１０アミノ酸Ｎ末端伸長（第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を保持する）を組み込んでいる。
【０２４８】
９３        ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子プロテアーゼ活性化部位、および２アミノ酸（Gly-Ser）Ｎ末端伸長を組み込んでいるＬＨＮ／ＢをコードするＤＮＡであり、pGEX-4T-2で発現される。
【０２４９】
９４        配列番号９３の発現によって産生されるＬＨＮ／Ｂ、このポリペプチドは、ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子プロテアーゼ活性化部位、および２アミノ酸（Gly-Ser）Ｎ末端伸長を組み込んでおり、pGEX-4T-2で発現される。
【０２５０】
９５        ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子プロテアーゼ活性化部位、および７アミノ酸（Ser-Pro-Gly-Ala-Arg-Gly-Ser）Ｎ末端伸長を組み込んでいるＬＨＮ／ＢをコードするＤＮＡであり、pET-43aで発現される。
【０２５１】
９６        配列番号９５の発現によって産生されるＬＨＮ／Ｂ、このポリペプチドは、ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子プロテアーゼ活性化部位、および７アミノ酸（Ser-Pro-Gly-Ala-Arg-Gly-Ser）Ｎ末端伸長を組み込んでおり、pET-43aで発現される。
【０２５２】
９７        ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子プロテアーゼ活性化部位、および７アミノ酸（Ala-Met-Ala-Glu-Ile-Gly-Ser）Ｎ末端伸長を組み込んでいるＬＨＮ／ＢをコードするＤＮＡであり、pET-32aで発現される。
【０２５３】
９８        配列番号９７の発現によって産生されるＬＨＮ／Ｂ、このポリペプチドは、ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子プロテアーゼ活性化部位、および７アミノ酸（Ala-Met-Ala-Asp-Ile-Gly-Ser）Ｎ末端伸長を組み込んでおり、pET-32aで発現される。
【０２５４】
９９        ＬＣ−ＨＮ接合部にトロンビンプロテアーゼ活性化部位、および６アミノ酸（Ile-Ser-Glu-Phe-Gly-Ser）Ｎ末端伸長を組み込んでいるＬＨＮ／ＢをコードするＤＮＡであり、pMAL-c2で発現される。
【０２５５】
１００      配列番号９９の発現によって産生されるＬＨＮ／Ｂ、このポリペプチドは、ＬＣ−ＨＮ接合部にトロンビンプロテアーゼ活性化部位、および６アミノ酸（Ile-Ser-Glu-Phe-Gly-Ser）Ｎ末端伸長を組み込んでおり、pMAL-c2で発現される。
【０２５６】
１０１      ＬＣ−ＨＮ接合部にＴＥＶプロテアーゼ活性化部位、および６アミノ酸（Ile-Ser-Glu-Phe-Gly-Ser）Ｎ末端伸長を組み込んでいるＬＨＮ／ＢをコードするＤＮＡであり、pMAL-c2で発現される。
【０２５７】
１０２      配列番号１０１の発現によって産生されるＬＨＮ／Ｂ、このポリペプチドは、ＬＣ−ＨＮ接合部にＴＥＶプロテアーゼ活性化部位、および６アミノ酸（Ile-Ser-Glu-Phe-Gly-Ser）Ｎ末端伸長を組み込んでおり、pMAL-c2で発現される。
【０２５８】
１０３      ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子プロテアーゼ活性化部位、および６アミノ酸（Ile-Ser-Glu-Phe-Gly-Ser）Ｎ末端伸長を組み込んでいるＬＨＮ／ＢをコードするＤＮＡであり、pMAL-c2で発現される。ＤＮＡは、ＬＣ−ＨＮ接合部に新規のリンカー配列の組み込みのためのMfeIおよびAvrII制限酵素部位を組み込む。
【０２５９】
１０４      配列番号１０３の発現によって産生されるＬＨＮ／Ｂ、このポリペプチドは、ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子プロテアーゼ活性化部位、および６アミノ酸（Ile-Ser-Glu-Phe-Gly-Ser）Ｎ末端伸長を組み込んでおり、pMAL-c2で発現される。
【０２６０】
１０５      ＬＣ−ＨＮ接合部（ＬＣおよびＨＮドメインのＣｙｓ残基間に２０アミノ酸がある）にエンテロキナーゼプロテアーゼ活性化部位、および６アミノ酸（Ile-Ser-Glu-Phe-Gly-Ser）Ｎ末端伸長を組み込んでいるＬＨＮ／ＢをコードするＤＮＡ。ArvII制限部位は欠失されている。
【０２６１】
１０６      配列番号１０５の発現によって産生されるＬＨＮ／Ｂ、このポリペプチドは、ＬＣ−ＨＮ接合部（ＬＣおよびＨＮドメインのＣｙｓ残基間に２０アミノ酸がある）にエンテロキナーゼプロテアーゼ活性化部位、および６アミノ酸（Ile-Ser-Glu-Phe-Gly-Ser）Ｎ末端伸長を組み込んでいる。
【０２６２】
１０７      ＬＣ−ＨＮ接合部（ＬＣおよびＨＮドメインのＣｙｓ残基間に２０アミノ酸がある）にエンテロキナーゼプロテアーゼ活性化部位、および６アミノ酸（Ile-Ser-Glu-Phe-Gly-Ser）Ｎ末端伸長を組み込んでいるＬＨＮ／ＢをコードするＤＮＡ。
【０２６３】
１０８      配列番号１０７の発現によって産生されるＬＨＮ／Ｂ、このポリペプチドは、ＬＣ−ＨＮ接合部（ＬＣおよびＨＮドメインのＣｙｓ残基間に２０アミノ酸がある）にエンテロキナーゼプロテアーゼ活性化部位、および６アミノ酸（Ile-Ser-Glu-Phe-Gly-Ser）Ｎ末端伸長を組み込んでいる。
【０２６４】
１０９      マルトース結合タンパク質−第Ｘａ因子−インテイン−ＬＣ／Ｂ−第Ｘａ因子−ＨＮ発現構築物をコードするＤＮＡ。
【０２６５】
１１０      配列番号１０９の発現によって産生されるＭＢＰ−ＬＨＮ／Ｂ、このポリペプチドは、ＭＢＰ精製タグの除去を容易にするための自己切断可能なインテイン配列、およびＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子プロテアーゼ活性化部位を組み込んでいる。
【０２６６】
１１１      ＬＣ−ＨＮ接合部（ＬＣおよびＨＮドメインのＣｙｓ残基間に１１アミノ酸がある）にエンテロキナーゼプロテアーゼ活性化部位、およびベクターのatt部位適合に由来する１１アミノ酸（Thr-Ser-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ala-Gly-Phe-Gly-Ser）Ｎ末端伸長を組み込んでいるＬＨＮ／ＢをコードするＤＮＡ。この構築物は、フラグメントとリガンドとの直接融合を容易にするためにＣ末端停止コドンが除去されている。
【０２６７】
１１２      配列番号１１１の発現によって産生されるＬＨＮ／Ｂ、このポリペプチドは、ＬＣ−ＨＮ接合部（ＬＣおよびＨＮドメインのＣｙｓ残基間に１１アミノ酸がある）にエンテロキナーゼプロテアーゼ活性化部位、およびベクターのatt部位適合に由来する１１アミノ酸（Thr-Ser-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ala-Gly-Phe-Gly-Ser）Ｎ末端伸長を組み込んでいる。
【０２６８】
１１３      停止コドンを含まず、ＨＮドメインの最初の６アミノ酸を組み込むリンカーペプチド、およびＣｙｓ残基によって結合したエンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位を有するＬＣ／ＢをコードするＤＮＡ。
【０２６９】
１１４      配列番号１１３の発現によって産生されるＬＣ／Ｂ、このポリペプチドは、停止コドンを含まず、ＨＮドメインの最初の６アミノ酸を組み込むリンカーペプチド、およびＣｙｓ残基によって結合したエンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位を有する。
【０２７０】
１１５      ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子切断部位、ベクターのatt部位適合に由来する１１アミノ酸（Thr-Ser-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ala-Gly-Phe-Gly-Ser）Ｎ末端伸長、および分子クランピングを容易にするためのＣ末端（Ｇｌｕ）８ペプチドを組み込んでいるＬＨＮ／ＣをコードするＤＮＡ。
【０２７１】
１１６      配列番号１１５の発現によって産生されるＬＨＮ／Ｃ、このポリペプチドは、ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子切断部位、ベクターのatt部位適合に由来する１１アミノ酸（Thr-Ser-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ala-Gly-Phe-Gly-Ser）Ｎ末端伸長、および分子クランピングを容易にするためのＣ末端（Ｇｌｕ）８ペプチドを組み込んでいる。
【０２７２】
１１７      ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子切断部位、ベクターのatt部位適合に由来する１１アミノ酸（Thr-Ser-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ala-Gly-Phe-Gly-Ser）Ｎ末端伸長、および分子クランピングを容易にするために１対のＣｙｓ残基によって結合されたＣ末端fosリガンドを組み込んでいるＬＨＮ／ＣをコードするＤＮＡ。
【０２７３】
１１８      配列番号１１７の発現によって産生されるＬＨＮ／Ｃ、このポリペプチドは、ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子切断部位、ベクターのatt部位適合に由来する１１アミノ酸（Thr-Ser-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ala-Gly-Phe-Gly-Ser）Ｎ末端伸長、および分子クランピングを容易にするために１対のＣｙｓ残基によって結合されたＣ末端fosリガンドを組み込んでいる。
【０２７４】
１１９      ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子切断部位、ベクターのatt部位適合に由来する１１アミノ酸（Thr-Ser-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ala-Gly-Phe-Gly-Ser）Ｎ末端伸長、および分子クランピングを容易にするために１対のＣｙｓ残基によって結合されたＣ末端（Ｇｌｕ）８ペプチドを組み込んでいるＬＨＮ／ＣをコードするＤＮＡ。
【０２７５】
１２０      配列番号１１９の発現によって産生されるＬＨＮ／Ｃ、このポリペプチドは、ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子切断部位、ベクターのatt部位適合に由来する１１アミノ酸（Thr-Ser-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ala-Gly-Phe-Gly-Ser）Ｎ末端伸長、および分子クランピングを容易にするために１対のＣｙｓ残基によって結合されたＣ末端（Ｇｌｕ）８ペプチドを組み込んでいる。
【０２７６】
１２１      ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子切断部位、ベクターのatt部位適合に由来する１１アミノ酸（Thr-Ser-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ala-Gly-Phe-Gly-Ser）Ｎ末端伸長、および分子クランピングを容易にするためのＣ末端fosリガンドを組み込んでいるＬＨＮ／ＣをコードするＤＮＡ。
【０２７７】
１２２      配列番号１２１の発現によって産生されるＬＨＮ／Ｃ、このポリペプチドは、ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子切断部位、ベクターのatt部位適合に由来する１１アミノ酸（Thr-Ser-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ala-Gly-Phe-Gly-Ser）Ｎ末端伸長、および分子クランピングを容易にするためのＣ末端fosリガンドを組み込んでいる。
【０２７８】
１２３      ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子切断部位、およびベクターのatt部位適合に由来する１５アミノ酸（Ile-Thr-Ser-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ala-Gly-Phe-Gly-Ser-Leu-Asp-His）Ｎ末端伸長を組み込んでいるＬＨＮ／ＣをコードするＤＮＡ。
【０２７９】
１２４      配列番号１２３の発現によって産生されるＬＨＮ／Ｃ、このポリペプチドは、ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子切断部位、およびベクターのatt部位適合に由来する１５アミノ酸（Ile-Thr-Ser-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ala-Gly-Phe-Gly-Ser-Leu-Asp-His）Ｎ末端伸長を組み込んでいる。
【０２８０】
１２５      ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子切断部位、およびエンテロキナーゼでのタンパク質の切断後に誘導される１１アミノ酸（Val-Pro-Glu-Phe-Gly-Ser-Ser-Arg-Val-Asp-His）Ｎ末端伸長を組み込んでいるＬＨＮ／ＣをコードするＤＮＡ。
【０２８１】
１２６      配列番号１２５の発現によって産生されるＬＨＮ／Ｃ、このポリペプチドは、ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子切断部位、およびＮ末端ＭＢＰ精製タグを遊離させるためにエンテロキナーゼでのタンパク質の切断後に誘導される１１アミノ酸（Val-Pro-Glu-Phe-Gly-Ser-Ser-Arg-Val-Asp-His）Ｎ末端伸長を組み込んでいる。
【０２８２】
１２７      ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子切断部位、およびジェネナーゼでのタンパク質の切断後に誘導される１０アミノ酸（Val-Glu-Phe-Gly-Ser-Ser-Arg-Val-Asp-His）Ｎ末端伸長を組み込んでいるＬＨＮ／ＣをコードするＤＮＡ。
【０２８３】
１２８      配列番号１２７の発現によって産生されるＬＨＮ／Ｃ、このポリペプチドは、ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子切断部位、およびＮ末端ＭＢＰ精製タグを遊離させるためにジェネナーゼでのタンパク質の切断後に誘導される１０アミノ酸（Val-Glu-Phe-Gly-Ser-Ser-Arg-Val-Asp-His）Ｎ末端伸長を組み込んでいる。
【０２８４】
１２９      ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子切断部位、および第Ｘａ因子でのタンパク質の切断後に誘導される１１アミノ酸（Ile-Ser-Glu-Phe-Gly-Ser-Ser-Arg-Val-Asp-His）Ｎ末端伸長を組み込んでいるＬＨＮ／ＣをコードするＤＮＡ。
【０２８５】
１３０      配列番号１２９の発現によって産生されるＬＨＮ／Ｃ、このポリペプチドは、ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子切断部位、および第Ｘａ因子でのタンパク質の切断後に誘導される１１アミノ酸（Ile-Ser-Glu-Phe-Gly-Ser-Ser-Arg-Val-Asp-His）Ｎ末端伸長を組み込んでいる。
【０２８６】
１３１      ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子切断部位、ベクターのatt部位適合に由来する１５アミノ酸（Ile-Thr-Ser-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ala-Gly-Phe-Gly-Ser-Leu-Asp-His）Ｎ末端伸長および２１アミノ酸（Leu-Gln-Thr-Leu-Asp-Asp-Pro-Ala-Phe-Leu-Tyr-Lys-Val-Val-Ile-Phe-Gln-Asn-Ser-Asp-Pro）Ｃ末端伸長を組み込んでいるＬＨＮ／ＣをコードするＤＮＡ。クローンは、ＨＮドメインのＣ末端上へのリガンドの融合を容易にするために停止コドンを有さない。
【０２８７】
１３２      配列番号１３１の発現によって産生されるＬＨＮ／Ｃ、このポリペプチドは、ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子切断部位、ベクターのatt部位適合に由来する１５アミノ酸（Ile-Thr-Ser-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ala-Gly-Phe-Gly-Ser-Leu-Asp-His）Ｎ末端伸長および２１アミノ酸（Leu-Gln-Thr-Leu-Asp-Asp-Pro-Ala-Phe-Leu-Tyr-Lys-Val-Val-Ile-Phe-Gln-Asn-Ser-Asp-Pro）Ｃ末端伸長を組み込んでいる。クローンは、ＨＮドメインのＣ末端上へのリガンドの融合を容易にするために停止コドンを有さない。
【０２８８】
１３３      ＬＣ−ＨＮ接合部に第Ｘａ因子切断部位、ベクターのatt部位適合に由来するＮ末端伸長およびＣ末端伸長を組み込んでいるＬＨＮ／ＣをコードするＤＮＡ。クローンは、ＨＮドメインのＣ末端上へのリガンドの融合を容易にするために停止コドンを有さない。
【０２８９】
１３４      Gateway部位特異的組換えクローニングシステムにおける使用のためのpENTRY2で調製される場合のＬＣ／ＣをコードするＤＮＡ。ＬＣ／Ｃは、組換えによるＬＣ−ＨＮ融合物の生成を容易にするために停止コドンを有さない。
【０２９０】
１３５      Gateway部位特異的組換えクローニングシステムにおける使用のためのpENTRY2で調製される場合のＬＨＮ／ＣをコードするＤＮＡ。ＬＨＮ／Ｃは、停止コドンを有し、したがって適切な仕向ベクターへの組み込みのための正確な形式である。
【０２９１】
１３６      Gateway部位特異的組換えクローニングシステムにおける使用のためのpENTRY2で調製される場合のＬＨＮ／ＣをコードするＤＮＡ。ＬＨＮ／Ｃは、組換えによるＬＨＮ／Ｃ−リガンド融合物の生成を容易にするために停止コドンを有さない。
【０２９２】
１３７      侵入ベクター由来のエンドペプチダーゼフラグメントを挿入するために適切な仕向ベクターであるように改変されたpMTLベクターのＤＮＡ配列。ベクターは、pMAL-c2XへのGatewayベクター変換カセットリーディングフレームＡの挿入によって構築された。発現カセット（ptacプロモーター、雄遺伝子、Gatewayカセット、およびポリリンカー）は、続いてpMTLにクローニングされた。
【０２９３】
１３８      ＬＨＮ／Ａ−リガンド（Erythrina cristagalliレクチン）融合物をコードするＤＮＡ、ここで、ＬＣ−ＨＮ接合部は、特異的エンテロキナーゼプロテアーゼ活性化部位を組み込み、そしてリガンドは、ＲＮアーゼＡループ由来のペプチド配列によってＨＮドメインから離れている。
【０２９４】
１３９      配列番号１３８の発現によって産生されるＬＨＮ／Ａ−リガンド（Erythrina cristagalliレクチン）融合物、ここで、ＬＣ−ＨＮ接合部は、特異的エンテロキナーゼプロテアーゼ活性化部位を組み込み、そしてリガンドは、ＲＮアーゼＡループ由来のペプチド配列によってＨＮドメインから離れている。
【０２９５】
１４０      破傷風菌毒素をコードするＤＮＡ。
【０２９６】
１４１      配列番号１４０の発現によって産生される破傷風菌毒素、このポリペプチドは、ＬＣ、ＨＮ、およびＨＣドメインを組み込んでいる。
【０２９７】
１４２      破傷風菌毒素のＬＨＮをコードするＤＮＡ、ここで、クローンの３’末端は、配列....Glu-Glu-Asp-Ile-Asp-Val-停止コドンをコードし、残基Val879で終わる。
【０２９８】
１４３      配列番号１４２の発現によって産生される破傷風菌毒素のＬＨＮ、このポリペプチドは、配列....Glu-Glu-Asp-Ile-Asp-Val-停止コドンで終わり、残基Val879で終わる。
【０２９９】
１４４      破傷風菌毒素のＬＨＮをコードするＤＮＡ、ここで、クローンの３’末端は、配列番号１４２のような配列....Glu-Glu-Asp-Ile-Asp-Val-停止コドンをコードする。クローンはまた、ＬＣおよびＨＮドメインの接合部に特異的エンテロキナーゼプロテアーゼ活性化部位を組み込む。
【０３００】
１４５      配列番号１４４の発現によって産生される破傷風菌毒素のＬＨＮ、このポリペプチドは、配列番号１４３のような配列....Glu-Glu-Asp-Ile-Asp-Val-停止コドンで終わる。タンパク質はまた、ＬＣおよびＨＮドメインの接合部に特異的エンテロキナーゼプロテアーゼ活性化部位を組み込む。
【０３０１】
１４６      破傷風菌毒素のＬＨＮをコードするＤＮＡ、ここで、クローンの３’末端は、配列....Glu-Glu-Asp-Ile-Asp-Val-Ile-Leu-Lys-Lys-Ser-Thr-Ile-Leu-停止コドンをコードし、残基Leu887で終わる。
【０３０２】
１４７      配列番号１４６の発現によって産生される破傷風菌毒素のＬＨＮ、このポリペプチドは、配列....Glu-Glu-Asp-Ile-Asp-Val-Ile-Leu-Lys-Lys-Ser-Thr-Ile-Leu-停止コドンで終わり、残基Leu887で終わる。
【０３０３】
１４８      ２ＬＨ４２３／Ａ（Ｑ２Ｅ）をコードするＤＮＡ。
【０３０４】
１４９      ２ＬＨ４２３／Ａ（Ｑ２Ｅ）、これは、ＢｏＮＴ／ＡのＬ鎖、およびＢｏＮＴ／ＡのＨ鎖のＮ末端の４２３アミノ酸残基を含む一本鎖ポリペプチドである。このポリペプチドは、ＧＳＴ精製タグからの切断により生成し、そして精製タグからのＬ鎖のタンパク質分解切断から生じるＬ鎖のＮ末端における２アミノ酸伸長（ＧＳ）を有する。このポリペプチドは、天然の血清型ＡのＬ鎖におけるＱと比較して２位に改変アミノ酸残基Ｅを有する。
【０３０５】
１５０      ２ＬＨ４２３／Ａ（Ｑ２Ｅ）をコードするＤＮＡ、ここで、ＤＮＡは大腸菌コドンバイアスを有する。
【０３０６】
１５１      ２ＬＨ４２３／Ａ（Ｑ２Ｅ）、これは、配列番号１４９と等価である。
【０３０７】
１５２      ＬＨ４２３／Ａ（Ｑ２Ｅ）をコードするＤＮＡ、ここで、ＤＮＡは大腸菌コドンバイアスを有する。
【０３０８】
１５３      ＬＨ４２３／Ａ（Ｑ２Ｅ）、これは、配列番号１５１と等価であるが、Ｌ鎖へのいずれのＮ末端伸長も含まない。
【０３０９】
１５４      ＬＨ４２３／Ａ（Ｑ２Ｅ）をコードするＤＮＡ。
【０３１０】
１５５      ＬＨ４２３／Ａ（Ｑ２Ｅ）、これは、配列番号１４９と等価であるが、Ｌ鎖へのいずれのＮ末端伸長も含まない。
【０３１１】
１５６      ２ＬＦＸａ／３Ｈ４２３／Ａ（Ｑ２Ｅ）をコードするＤＮＡ。
【０３１２】
１５７      ２ＬＦＸａ／３Ｈ４２３／Ａ（Ｑ２Ｅ）、これは、配列番号１５１と等価であり、そして第Ｘａ因子切断部位がポリペプチドのＬ鎖成分とＨ鎖成分との間に導入されている。
【０３１３】
１５８      ＬＨ４２３／Ａ（Ｑ２Ｅ）−６ＨｉｓをコードするＤＮＡ。
【０３１４】
１５９      ＬＨ４２３／Ａ（Ｑ２Ｅ）−６Ｈｉｓ、これは、天然のＬＨＮ分子であり、そしてＣ末端ポリＨｉｓ精製タグを含む。
【０３１５】
１６０      ２ＬＦＸａ／３Ｈ４２３／Ａ（Ｑ２Ｅ）ＦＸａ−６ＨｉｓをコードするＤＮＡ。
【０３１６】
１６１      ２ＬＦＸａ／３Ｈ４２３／Ａ（Ｑ２Ｅ）ＦＸａ−６Ｈｉｓ、これは、配列番号１５７と等価であり、そしてポリＨｉｓ精製タグの除去を容易にするために第Ｘａ因子切断部位を含む。
【０３１７】
１６２      ２ＬＨ４２３／Ａ（Ｑ２Ｅ，Ｈ２２７Ｙ）をコードするＤＮＡ。
【０３１８】
１６３      ２ＬＨ４２３／Ａ（Ｑ２Ｅ，Ｈ２２７Ｙ）、これは、配列番号１４９と等価であり、そしてポリペプチドは、天然の血清型ＡのＬ鎖におけるＨと比較して２２７位に改変アミノ酸残基Ｙを有する。
【０３１９】
１６４      ２ＬＨ４２３／Ａ（Ｑ２Ｅ，Ｈ２２７Ｙ）をコードするＤＮＡ、ここで、ＤＮＡは大腸菌コドンバイアスを有する。
【０３２０】
１６５      ２ＬＨ４２３／Ａ（Ｑ２Ｅ，Ｈ２２７Ｙ）、これは、配列番号１６３と等価である。
【０３２１】
１６６      ２ＬＨ４２３／Ａ（Ｑ２Ｅ，Ｅ２２４Ｑ）をコードするＤＮＡ、ここで、ＤＮＡは大腸菌コドンバイアスを有する。
【０３２２】
１６７      ２ＬＨ４２３／Ａ（Ｑ２Ｅ，Ｅ２２４Ｑ）、これは、配列番号１５１と等価であり、そしてポリペプチドは、天然の血清型ＡのＬ鎖におけるＥと比較して２２４位に改変アミノ酸残基Ｑを有する。
【０３２３】
１６８      ２ＬＨ４２３／Ａ（Ｑ２Ｅ，Ｅ２２４Ｑ，Ｈ２２７Ｙ）をコードするＤＮＡ、ここで、ＤＮＡは大腸菌コドンバイアスを有する。
【０３２４】
１６９      ２ＬＨ４２３／Ａ（Ｑ２Ｅ，Ｅ２２４Ｑ，Ｈ２２７Ｙ）、これは、配列番号１６７と等価であり、そしてポリペプチドは、天然の血清型ＡのＬ鎖におけるＨと比較して２２７位に改変アミノ酸残基Ｙを有する。
【０３２５】
１７０      ＬＦＸａ／Ｈ４１７／ＢをコードするＤＮＡ。
【０３２６】
１７１      ＬＦＸａ／Ｈ４１７／Ｂ、これは、ＢｏＮＴ／ＢのＬ鎖、およびＢｏＮＴ／ＢのＨ鎖のＮ末端の４１７アミノ酸残基を含む一本鎖ポリペプチドであり、第Ｘａ因子切断部位がＬ鎖とＨ鎖との間に存在する。
【０３２７】
１７２      ＬＦＸａ／Ｈ４１７／ＢをコードするＤＮＡ。
【０３２８】
１７３      ＬＦＸａ／Ｈ４１７／Ｂ、これは、ＢｏＮＴ／ＢのＬ鎖、およびＢｏＮＴ／ＢのＨ鎖のＮ末端の４１７アミノ酸残基を含む一本鎖ポリペプチドであり、第Ｘａ因子切断部位がＬ鎖とＨ鎖との間に存在する。
【０３２９】
１７４      ＬＦＸａ／Ｈ４１７／ＢをコードするＤＮＡ。
【０３３０】
１７５      ＬＦＸａ／Ｈ４１７／Ｂ、これは、配列番号１７３と等価であり、改変されたリンカー配列が、配列番号１７３に対してＬ鎖とＨ鎖との間に存在する。
【実施例】
【０３３１】
実施例１
２６１６塩基対の二本鎖遺伝子配列（配列番号１）を、合成ＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、およびポリメラーゼ連鎖反応で生成したＤＮＡの組み合わせから組み立てた（図２）。この遺伝子は、軽鎖全体（ＬＣ、４４８アミノ酸）およびボツリヌス菌神経毒素Ａ型の重鎖（ＨＣ）のアミノ末端の４２３残基に対応する８７１アミノ酸残基のポリペプチドをコードする。この組換え産物を、ＬＨ４２３／Ａフラグメントと命名する（配列番号２）。
【０３３２】
組換え産物の構築
最初の９１８塩基対の組換え遺伝子を、短いオリゴヌクレオチドの連結によって合成して、大腸菌コドンバイアスを有するコード配列を生成した。この領域における両方のＤＮＡ鎖を、短い重複オリゴヌクレオチドとして完全合成し、リン酸化し、アニールし、そしてライゲートして、独特のKpnI制限部位を有する完全合成領域末端を生成した。ＬＨ４２３／Ａコード配列の残りを、Clostridium botulinum由来のトータル染色体ＤＮＡからＰＣＲ増幅し、そして遺伝子の合成部分にアニールした。
【０３３３】
次いで、内部ＰＣＲ増幅産物配列を欠失させ、そしてC. botulinum染色体起源のクローン由来の天然の完全に配列決定された領域と置換して、最終遺伝子構築物を生成した。最終組成は、合成ＤＮＡ（塩基１〜９１３）、ポリメラーゼ増幅したＤＮＡ（塩基９１４〜１１３８および１９７６〜２６１６）、およびC. botulinum染色体起源である残り（塩基１１３９〜１９７５）である。次いで、組み立てた遺伝子を完全に配列決定し、そして発現分析用の種々の大腸菌プラスミドベクターにクローニングした。
【０３３４】
組換え遺伝子の発現およびタンパク質産物の回収
ＤＮＡを、99,951ダルトンの推定分子量の可溶性一本鎖ポリペプチドを産生する単一の核酸転写物として、大腸菌で発現させる。遺伝子は、現在は、Schistosoma japonicumのグルタチオンS-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の市販の利用可能なコード配列への融合物として大腸菌で発現されるが、pEZZ18、pTrc99、pFLAG、またはpMALシリーズのような広い範囲の組換え遺伝子発現ベクターのいずれも、グラム陽性桿菌、酵母P. pastorisのような他の真核生物または原核生物宿主において、あるいは昆虫または哺乳動物細胞において、適切な条件下での発現と等しく効果的であり得る。
【０３３５】
現在は、発現構築物を有する大腸菌を、細胞密度（バイオマス）が600nmで０．４〜０．６の吸光度を有し、そして細胞が対数増殖中期になるまで、Luria-Bertaniブロス（Ｌブロス、pH7.0、10g/lのバクトトリプトン、５g/lのバクトイーストエキストラクト、および10g/lの塩化ナトリウムを含む）中で37℃にて増殖させる。次いで、遺伝子の発現を、0.5ｍMの最終濃度のイソプロピルチオ-β-ガラクトシダーゼ（IPTG）の添加によって誘導する。組換え遺伝子発現は、25℃の低い温度にて90分間行う。次いで、細胞を遠心分離によって回収し、10 mM Na2HPO4、0.5 M NaCl、10 mM EGTA、0.25% Tween、pH 7.0を含む緩衝液に再懸濁し、次いで−20℃で凍結する。組換えタンパク質の抽出については、細胞を超音波処理によって破砕する。次いで、細胞抽出物を、遠心分離によって破砕物を取り除き、そして可溶性組換え融合タンパク質（ＧＳＴ−ＬＨ４２３／Ａ）を含む澄明になった上清液を、精製するまで−20℃で保存する。組換え体物質の割合は、超音波処理によって放出されることがなく、これはおそらく不溶性または封入体形成を反映する。現在、発明者らは、分析のためにこの物質を抽出しないが、所望であれば、これは、当業者に公知の方法を用いて容易に達成され得る。
【０３３６】
組換えＧＳＴ−ＬＨ４２３／Ａを、市販の調製されたアフィニティーマトリクスであるグルタチオンSepharose上への吸着、次いで還元型グルタチオンでの溶出によって精製する。次いで、ＧＳＴアフィニティー精製マーカーをタンパク質分解切断およびグルタチオンSepharoseへの再吸着によって除去し；組換えＬＨ４２３／Ａを非吸着材料中に回収する。
【０３３７】
構築物改変体
この分子の改変体であるＬＨ４２３／Ａ（Ｑ２Ｅ，Ｎ２６Ｋ，Ａ２７Ｙ）（配列番号２６）を、産生した。ここでは、ＬＨ４２３／Ａの軽鎖内で３つのアミノ酸残基が改変されており、ＢｏｎＴ／Ａの軽鎖の公表されたアミノ酸配列とは異なる軽鎖配列を含むポリペプチドを産生する。
【０３３８】
発現させた遺伝子配列および精製した対応する産物のさらに２つの改変体は、ＢｏＮＴ／Ａの推定の天然のＬ鎖と比較して２３アミノ酸Ｎ末端伸長を有する２３ＬＨ４２３／Ａ（Ｑ２Ｅ，Ｎ２６Ｋ，Ａ２７Ｙ）（配列番号４）、および２アミノ酸Ｎ末端伸長を有する２ＬＨ４２３／Ａ（Ｑ２Ｅ，Ｎ２６Ｋ，Ａ２７Ｙ）（配列番号６）である（図４）。
【０３３９】
さらに他の改変体では、配列番号１に記載の遺伝子配列のヌクレオチド１３４４と１３４５との間にEco 47 III制限部位を含む遺伝子が産生されている。この改変は、天然の神経毒素において重鎖と軽鎖との界面を示す遺伝子中の位置に制限部位を提供し、そして当業者に公知の標準的な制限酵素方法論を用いてこの点に挿入する能力を提供する。多くの制限部位のいずれか１つがこのように用いられ得、そしてEco 47 III挿入が単にこのアプローチの例示であることはまた、当業者に自明である。同様に、記載の方法での制限部位の挿入が本発明のいずれの遺伝子においても行われ得ることは、当業者に自明である。記載された遺伝子は、発現された場合、ポリペプチドＬ／４Ｈ４２３／Ａ（配列番号１０）をコードし、これは、天然のＢｏＮＴ／Ａの重鎖のアミノ末端に等価の位置でＬＨ４２３／Ａのアミノ酸４４８と４４９との間に追加の４アミノ酸を含む。
【０３４０】
遺伝子の改変体を発現させたＬＦＸａ／３Ｈ４２３／Ａ（配列番号１２）では、特異的タンパク質分解切断部位を、軽鎖ドメインのカルボキシ末端に、詳細にはＬ／４Ｈ４２３／Ａの残基４４８の後に組み込んだ。組み込まれた切断部位は、第Ｘａ因子プロテアーゼ用であり、そして配列番号１の改変によってコードされた。他の特定のプロテアーゼについての切断部位が同様に組み込まれ、そして必要とされる切断部位をコードするあらゆる遺伝子配列が用いられ得ることは、当業者に明らかである。所定のプロテアーゼ部位をコードするためのこの方法での遺伝子配列の改変は、本発明のあらゆる遺伝子において行われ得る。
【０３４１】
ＬＦＸａ／３Ｈ４２３／Ａの改変体を構築し、ここでは、第３ドメインがポリペプチドのカルボキシ末端に存在し、これはポリペプチドに特異的結合活性を組み込む。
【０３４２】
記載した特定の例は以下のとおりである：
（１）ＬＦＸａ／３Ｈ４２３／Ａ−ＩＧＦ−１（配列番号１４）、ここでは、カルボキシ末端ドメインは、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）と等価の配列を有し、そして高い親和性でインスリン様増殖因子レセプターと結合し得る；
（２）ＬＦＸａ／３Ｈ４２３／Ａ−ＣｔｘＡ１４（配列番号１６）、ここでは、カルボキシ末端ドメインは、コレラトキシンのＡサブユニット（ＣｔｘＡ）のカルボキシ末端由来の１４アミノ酸と等価の配列を有し、そしてそれによってコレラトキシンＢサブユニットペンタマーと相互作用し得る；および
（３）ＬＦＸａ／３Ｈ４２３／Ａ−ＺＺ（配列番号１８）、ここでは、カルボキシ末端ドメインは、タンデム繰り返し合成ＩｇＧ結合ドメインである。この改変体もまた、本発明に適用可能な他の改変を例示し、すなわち、クロストリジウム菌重鎖配列の末端と結合リガンドをコードする配列との間に位置するプロテアーゼ切断部位をコードする配列の遺伝子に包含される。詳細には、この例では、ジェネナーゼ切断部位をコードするヌクレオチド２６５０〜２６６６に配列が挿入される。この遺伝子の発現は、ＨＮ機能を提供するドメインと結合ドメインとの間の界面に所望のプロテアーゼ感受性を有するポリペプチドを産生する。このような改変は、関連のプロテアーゼでのポリペプチドの処理によるＣ末端結合ドメインの選択的除去を可能にする。
【０３４３】
このような多くの結合ドメインのいずれか１つが、本発明のポリペプチド配列に組み込まれ得、そして上記の例がこの概念を単に例示するだけであることは明らかである。同様に、このような結合ドメインは、本発明の基礎であるポリペプチド配列のいずれにも組み込まれ得る。さらに、このような結合ドメインが、本発明のポリペプチド分子内の任意の適切な位置に組み込まれ得ることに留意すべきである。
【０３４４】
したがって、本発明のさらなる実施態様を、所望の位置に所望の制限エンドヌクレアーゼ部位をさらに含む本発明のＤＮＡによって、および所望の位置に所望のプロテアーゼ切断部位をさらに含む本発明のポリペプチドによって説明する。
【０３４５】
制限エンドヌクレアーゼ部位は、本発明のポリペプチドを発現させるための発現ベクターの製造におけるＤＮＡのさらなる操作を容易にするように導入され得；これは、ＤＮＡの製造における先の工程の結果として導入され得；これは、公知配列の挿入、置換、または欠失による改変によって導入され得る。ＤＮＡの改変の結果、アミノ酸配列は変化しなくてもよく、またはアミノ酸配列が変化して、例えば、所望のプロテアーゼ切断部位の導入を生じてもよく、いすれにせよ、ポリペプチドは、本発明に必要とされる特性を有する第１および第２ドメインを保持する。
【０３４６】
図１０は、発現産物の模式図であり、本実施例に記載の特徴を例示する。詳細には、ボツリヌス菌神経毒素Ａ型の軽鎖に等価のドメインおよびボツリヌス菌神経毒素Ａ型の重鎖のＨＮドメインに等価のドメインを組み込んでいる一本鎖ポリペプチドを示し、Ｎ末端伸長は、アフィニティー精製ドメイン、すなわちＧＳＴを提供し、そしてＣ末端伸長は、リガンド結合ドメイン、すなわちＩｇＧ結合ドメインを提供している。ポリペプチドのドメインは、図面に例示するようにドメインの選択的酵素分離を可能にする特異的プロテアーゼ切断部位によって空間的に離されている。この概念は、図１１により詳細に記載され、ここでは、種々のプロテアーゼ感受性が例示の目的で定義されている。
【０３４７】
産物活性のアッセイ
ボツリヌス菌神経毒素Ａ型のＬＣは、シナプス小胞結合タンパク質SNAP-25に対して亜鉛依存的エンドペプチダーゼ活性を発揮し、これは、特異的な様式で１つのペプチド結合を切断する。２ＬＨ４２３／Ａ（Ｑ２Ｅ，Ｎ２６Ｋ，Ａ２７Ｙ）（配列番号６）は、天然の毒素と同じ条件下でインビトロで合成SNAP-25基質を切断する（図３）。したがって、天然の配列に対する２ＬＨ４２３／Ａ（Ｑ２Ｅ，Ｎ２６Ｋ，Ａ２７Ｙ）のポリペプチド配列のおよび最小の機能的ＬＣドメイン内での改変は、ＬＣドメインの機能的活性を抑制しない。
【０３４８】
この活性は、一本鎖ポリペプチド産物をジスルフィド結合した二本鎖種に変換するための組換えＧＳＴ−２ＬＨ４２３／Ａ（Ｑ２Ｅ，Ｎ２６Ｋ，Ａ２７Ｙ）のタンパク質分解改変に依存的である。これは、現在は、タンパク質分解酵素のトリプシンを用いて行われる。組換え産物（100〜600μg/ml）を、140 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、1.8 mM KH2PO4、pH 7.3を含む溶液中で、トリプシン（10μg/ml）とともに37℃にて10〜50分間インキュベートする。反応を、100倍モル過剰のトリプシンインヒビターの添加によって停止する。トリプシンによる活性化は、ジスルフィド結合した二本鎖種を生成し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびポリクローナル抗ボツリヌス菌神経毒素Ａ型抗血清を用いるイムノブロッティング分析によって決定される。
【０３４９】
２ＬＨ４２３／Ａは、トリプシンの存在下でより安定であり、そして２３ＬＨ４２３／Ａよりもインビトロペプチド切断アッセイにおいてより活性である。しかし、両方の改変体とも、インビトロペプチド切断アッセイにおいては完全に機能的である。これは、組換え体分子が、Ｎ末端アミノ酸伸長に耐性があり、そしてこれは、当業者に明らかなように、他の化学または有機部分へ広げられ得ることを示す。
【０３５０】
実施例２
本発明のさらなる例示として、ボツリヌス菌神経毒素Ｂ型の軽鎖全体に対応し、そして重鎖のアミノ末端由来の残基の数を変化させているポリペプチドをコードする多くの遺伝子配列が組み立てられている。この開示の例示において、組み立てられた遺伝子配列は、染色体ＤＮＡおよびポリメラーゼ連鎖反応で生成したＤＮＡの組み合わせから得られ、したがって天然の遺伝子の等価の領域のヌクレオチド配列を有し、そのためこの開示の物質が天然ならびに合成の遺伝子配列に基づき得るという原理を例示する。
【０３５１】
本実施例に関連する遺伝子配列を、Sambrook J、Fritsch E F、およびManiatis T (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版)、Ford N、Nolan C、Ferguson M、およびOckler M (編), Cold Spring Harbor Laboratory Press、New Yorkに詳述されるおよび当業者に公知の方法論を用いて、すべて組み立てて発現させた。
【０３５２】
神経毒素Ｂ型の軽鎖全体（４４３アミノ酸）および重鎖のアミノ末端由来の７２８残基に対応する１１７１アミノ酸のポリペプチドをコードする遺伝子を構築した。この遺伝子の発現は、ポリペプチドＬＨ７２８／Ｂ（配列番号２０）を産生し、これは、全長ＢｏＮＴ／Ｂの特異的神経結合活性がない。
【０３５３】
改変体ポリペプチドＬＨ４１７／Ｂ（配列番号２２）をコードする遺伝子も組み立てた。これは、天然のＬＨＮ／Ａにおける重鎖フラグメントのＣ末端の配列とのアミノ酸相同性によって等価なアミノ酸配列をそのカルボキシ末端に有する。
【０３５４】
改変体ポリペプチドＬＨ１０７／Ｂ（配列番号２４）をコードする遺伝子も組み立てた。これは、発現したポリペプチドの溶解性を維持するために十分なＢｏＮＴ／Ｂの重鎖のアミノ末端由来の短い配列をそのカルボキシ末端に発現する。
【０３５５】
構築物改変体
配列番号２１に示す遺伝子の最初の２７４塩基のコード配列の改変体を産生した。これは、非天然ヌクレオチド配列であるが、天然のポリペプチドをコードする。
【０３５６】
２つの二本鎖、すなわち２６８塩基対および９５１塩基対の遺伝子配列を、重複プライマーＰＣＲ方策を用いて生成した。大腸菌コドン使用バイアスを有するように、これらの配列のヌクレオチドバイアスを設計した。
【０３５７】
第１の配列については、ボツリヌス菌毒素Ｂ型についての天然の配列の最初の（５’）２６８ヌクレオチドを示す６個のオリゴヌクレオチドを合成した。第２の配列については、ボツリヌス菌毒素Ｂ型についての天然の配列の内部配列のヌクレオチド６９１〜１６４１を示す２３個のオリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリゴヌクレオチドは、５７〜７３ヌクレオチドの長さの範囲であった。重複領域である１７〜２０ヌクレオチドを設計して、５２〜５６℃の範囲の融点を得た。さらに、合成産物の末端制限エンドヌクレアーゼ部位を構築して、天然の配列の正確な対応領域へのこれらの産物の挿入を容易にした。２６８ｂｐの５’合成配列は、元の最初の２６８塩基の代わりに、配列番号２１に示す遺伝子に組み込まれている（そして配列番号２７に示される）。同様に、配列は、実施例の他の遺伝子に挿入され得る。
【０３５８】
配列番号２１のヌクレオチド６９１〜１６４１に等価であり、そして非天然のコドン使用を用いるが天然のポリペプチド配列をコードする他の改変体配列が、内部合成配列を用いて構築されている。この配列(配列番号２８)は、実施例の遺伝子のいずれかにおける等価のコード配列の代わりに、単独でまたは他の改変体配列と組み合わせて組み込まれ得る。
【０３５９】
実施例３
本発明の有用性の例は、非毒性かつ有効な免疫源としてである。組換え体である一本鎖物質の非毒性の性質を、ＧＳＴ−２ＬＨ４２３／Ａのマウスへの腹腔内投与によって証明した。ポリペプチドを、上記のように調製しそして精製した。最終調製物中の免疫反応性物質の量を、天然のＬＨＮ／Ａ上のコンホメーション依存的エピトープに対して反応性であるモノクローナル抗体（ＢＡ１１）を用いる酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定した。組換え体物質を、リン酸緩衝化生理食塩液（ＰＢＳ；NaCl 8 g/l、KCl 0.2 g/l、Na2HPO4 1.15 g/l、KH2PO4 0.2 g/l、pH 7.4）中で連続希釈し、0.5ml容量を１群４匹からなる３群のマウスに注射し、各群のマウスは、それぞれ10、５、および１マイクログラムの物質を投与された。マウスを４日間観察し、そして死亡は見られなかった。
【０３６０】
免疫接種については、フロイント完全アジュバント（初回注射のみ）またはフロイント不完全アジュバントを用いる1.0ml容量の油中水型エマルジョン（１：１ 容量：容量）中の20μgのＧＳＴ−２ＬＨ４２３／Ａを、モルモットに２箇所の背部皮下注射によって投与した。10日間隔で３回注射し（１日目、10日目、および20日目）、そして30日目に抗血清を採取した。抗血清は、天然のボツリヌス菌神経毒素Ａ型およびその誘導体であるＬＨＮ／Ａに対して免疫反応性であることが、ＥＬＩＳＡによって示された。１：2000希釈でボツリヌス菌神経毒素反応性である抗血清を、マウスでの中和効率の評価に用いた。中和アッセイについては、0.1mlの抗血清を、2.5mlのゼラチンリン酸緩衝液（ＧＰＢ；Na2HPO4無水物 10 g/l、ゼラチン(Difco) 2 g/l、pH 6.5〜6.6）に希釈し、これは0.5μg（5×10-6g）〜５ピコグラム（5×10-12g）の希釈範囲を含んでいた。0.5mlアリコートをマウスに腹腔内注射し、そして４日間にわたって死亡を記録した。結果を表３および表４に示す。0.5mlの１：40希釈した抗ＧＳＴ−２ＬＨ４２３／Ａ抗血清が、５pg〜50ngの範囲のボツリヌス菌神経毒素での腹腔内チャレンジに対してマウスを防御し得ることが明らかに示され得る（１〜10,000マウスLD50；１マウスLD50＝５pg）。
【０３６１】
【表３】
0005570936.tif 000004
【０３６２】
【表４】
0005570936.tif 000005
【０３６３】
実施例４−大腸菌における組換え体ＬＨ１０７／Ｂの発現
ボツリヌス菌神経毒素Ａ型以外の血清型のクロストリジウム菌神経毒素のＬＨＮをコードする核酸の発現の例示として、ポリペプチドＬＨ１０７／Ｂ（配列番号２４）をコードする核酸配列（配列番号２３）を、市販の入手可能なプラスミドpET28a（Novogen, Madison, WI, USA）に挿入した。この核酸を、Ｎ末端Ｔ７融合ペプチドとの融合タンパク質として、１mMでのIPTG誘導下で37℃にて90分間、E. coli BL21 (DE3)（New England BioLabs, Beverley, MA, USA）中で発現させた。培養物を回収し、そして組換えタンパク質を、ＬＨ４２３／Ａについての既述のように抽出した。
【０３６４】
組換えタンパク質を回収し、そしてＴ７タグ精製キット（New England BioLabs, Beverley, MA, USA）を用いる固定化抗Ｔ７ペプチドモノクローナル抗体への免疫アフィニティー吸着によって細菌ペーストライセートから精製した。精製した組換えタンパク質をグラジエント（４〜20％）変性ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（Novex, San Diego, CA, USA）およびポリクローナル抗ボツリヌス菌神経毒素型抗血清または抗Ｔ７抗血清を用いるウエスタンブロッティングによって分析した。ウエスタンブロッティング試薬はNovexから購入し、免疫染色したタンパク質を、Amershamから購入した増強化学発光システム（ＥＣＬ）を用いて可視化した。抗Ｔ７抗体および抗ボツリヌス菌神経毒素Ｂ型抗血清に反応性の組換え産物の発現を、図１３に示す。
【０３６５】
組換え体産物は可溶性であり、そしてエンドペプチダーゼ活性の原因である軽鎖の一部を保持していた。
【０３６６】
したがって、本発明は、特に、免疫源として、酵素標準として、およびWO-A-94/21300に記載される分子の合成のための成分として有用な、組換えポリペプチドを提供する。
【０３６７】
実施例５：ＬＨＮＣの発現および精製
天然のクロストリジウム菌神経毒素遺伝子由来のＬＨＮＣ ＤＮＡフラグメントを、SalI-PstIフラグメントとして、発現ベクターpMal-c2x（New England Biolabs）中にサブクローニングした。遺伝子フラグメントおよびＭＢＰ融合タンパク質からタンパク質分解プロセシング後に生成されるタンパク質産物を、配列番号１２９／１３０に定義する。pETベクター（Novagen）、pGEXベクター（Pharmacia）、またはpQEベクター（Qiagen）のような他の市販の入手可能な発現系も、遺伝子フラグメントの発現に適切である。
【０３６８】
発現クローンを、コドンATA、AGA、およびCTAについてのｔＲＮＡ遺伝子を有するpACYCプラスミドを含む宿主株AD494（Novagen）にトランスファーした（例えば、NovagenからのRosetta株として市販で入手可能）。これらのコドンは大腸菌でめったに使用されないが、神経毒素をコードするクロストリジウム菌遺伝子では頻繁に使用されるので、これらのｔＲＮＡ遺伝子の含有は、発現レベルを顕著に上昇させる。当業者は、この効果が、ＬＨＮ／Ｃに限定されず、すべての天然のクロストリジウム菌ＬＨＮフラグメントに広く適用可能であることを認識する。同様の効果を、HMS174（Novagen）およびTB1（NEB）を含む他の宿主株で観察し、そして広範な他の宿主がこれらのフラグメントの発現に適切であった。
【０３６９】
AD494 (pACYC tRNA) pMalc2x LHN/Cの発現培養物を、35μg/ml クロラムフェニコール、100μg/ml アンピシリン、１μM ZnCl2、および0.5% (w/v)グルコースを含むTerrific Broth中で増殖し、一晩培養物を、新鮮な培地で１：100に希釈し、0.6〜１のＯＤ６００になるまで37℃にて約３時間増殖させた。培養物を、１mM IPTGで誘導し、そして30℃にて３〜４時間増殖させた。他の発現系は、抗生物質をカナマイシンに変更したこと以外は同様の条件を用いた。細胞を、カラム緩衝液（20 mM Hepes 125 mM NaCl １mM ZnCl2 pH 7.2）中での超音波処理または適切なデタージェント処理（例えば、Bugduster試薬；Novagen）のいずれかによって溶解し、そして細胞破砕物を遠心分離によってペレットにした。上清タンパク質をカラム緩衝液で平衡化したアミロース樹脂カラムにロードし、そしてタンパク質を、10mMマルトースを含むカラム緩衝液を用いる１段階溶出によって溶出した。
【０３７０】
本実施例に用いたＭＢＰ−ＬＨＮ／Ｃ構築物は、ＭＢＰとＬＨＮドメインとの間に位置する第Ｘａ因子部位を有し、そしてＬドメインとＨＮドメインとの間にも第Ｘａ因子部位を有して、二本鎖ＬＨＮ形態の形成を可能にする。融合タグを除去するためにおよびこの場合にはＬＨＮフラグメントを活性化するために、アミロースカラムから溶出したタンパク質を、50μgの精製した融合タンパク質当たり１ユニットのプロテアーゼ活性の濃度の（製造業者、例えば、NEBによって概説されるように）第Ｘａ因子で、25℃にて約20時間処理する。次いで、タンパク質を20 mM Hepes pH 7.2で１：５希釈し、そしてQ-sepharose fast flowカラムにロードし、このカラムを洗浄し、そしてタンパク質を20 mM Hepes緩衝液中の25〜500mM NaClの直線グラジエントを用いて溶出する。遊離のＬＨＮフラグメントを、約50mM NaClで溶出し、そして非切断融合タンパク質および遊離のＭＢＰを、より高濃度のNaClで溶出する。
【０３７１】
当業者は、ＭＢＰタグの除去のための部位がジェネナーゼであるpMal-c2gのような別の発現ベクターについて、２つのその後のプロテアーゼ切断反応が、融合パートナーの除去（ジェネナーゼ切断）およびその後のＬＨＮの活性化（第Ｘａ因子消化）に必要とされることを認識する。これらの切断反応は、同時に、あるいは夾雑タンパク質を除去するための中間イオン交換精製とともに行われ得る。精製／活性化のこのモデルの例は、以下で同定される。これらの考察は、配列情報に詳述した天然または合成の活性化部位について、およびすべての血清型のＬＨＮフラグメントについて、等しく有効である。
【０３７２】
実施例６  ＬＨＮ／Ｆの発現および精製
天然のＢｏＮＴ／Ｆ遺伝子由来のＬＨＮフラグメントをＰＣＲによって改変して、BamHIおよびHindIII、または他の適切な部位を、５’および３’末端にそれぞれ組み込んだ。遺伝子フラグメントを、pET28にクローニングして、Ｎ末端Ｈｉｓ６精製タグを有するリーディングフレームを維持した。発現クローンを、実施例５に概説するようなpACYC tRNAプラスミドと、Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子を有するＤＥ３リソーゲンとを有する宿主株にトランスファーした。適切な宿主株としては、適切な遺伝子エレメントを有するJM109、AD494、HMS174、TB1 TG1、またはBL21が挙げられる。例えば、HMS174 (DE3) pACYC tRNA pET28a LHN/Fを、発現および精製に用いた。
【０３７３】
HMS174 (DE3) pACYC tRNA pET28a LHN/Fの発現培養物を、35μg/ml クロラムフェニコール、35μg/mlカナマイシン、１μM ZnCl2、および0.5% (w/v)グルコースを含むTerrific Broth中で、ＯＤ６００が２．０になるまで30℃にて増殖し、そして培養物を500μM IPTGで誘導し、25℃にて２時間増殖して、遠心分離によって回収した。細胞を、超音波処理またはデタージェント溶解によって20 mM Hepes 500 mM NaCl pH 7.4中で溶解し、そして可溶性タンパク質画分を、CuSO4をロードした金属キレートカラム（例えば、IMAC HiTrapカラム Amersham-Pharmacia）上にロードした。タンパク質を、イミダゾールの直線グラジエントを用いて溶出し、Ｈｉｓ６ ＬＨＮ／Ｆを50〜250mMのイミダゾールで溶出した。
【０３７４】
Ｈｉｓ６タグを、本質的に実施例５に記載のようにトロンビンでの処理によって除去した。遊離したＬＨＮフラグメントを、実施例５に記載のQ-sepharoseカラムでのイオン交換を用いて精製した。
【０３７５】
実施例７  ＬＨＮＴｅＮＴの発現および精製
天然のＬＨＮＴｅＮＴ遺伝子フラグメントを改変して、天然のリンカー領域を配列番号１４４／１４５に示すようにエンテロキナーゼ切断可能リンカーと置換しそして５’末端（BamHI）および３’末端（HindIII）にクローニング部位を組み込んだ。このフラグメントを、pMAL c2xにサブクローニングし、そして実施例５に記載のようにHMS174 (pACYC tRNA)中で発現させた。溶出ピークの位置が、遊離のＭＢＰが遊離のＬＨＮのピークの前に溶出するように逆転したこと以外は、アミロース樹脂カラムでの最初の精製、融合タグを除去するための第Ｘａ因子での切断、およびイオン交換精製もまた、実施例５に記載のように行った。
【０３７６】
実施例８  Gateway適合した発現ベクターからのＬＨＮ／Ｃの発現
ＬＨＮＣフラグメントを、SalI-PstIとしてGateway侵入ベクターにクローニングした。２つのバージョンを作成し、３’PstI部位内に停止コドンを有してこの位置でタンパク質を停止させた（ＬＨＮＣ  ＳＴＯＰ；配列番号１２３／１２４）か、あるいは停止コドンがなくＣ末端融合パートナーを有するフラグメントの発現を可能にした（ＬＨＮＣ  ＮＳ；配列番号１３１／１３２）。侵入ベクターを、仕向ベクターと組換えて、Ｎ末端ＭＢＰタグを有するフラグメントの発現を可能にした。組換えは、標準的プロトコルに従って行った（Invitrogen Gateway発現マニュアル）。
【０３７７】
AD494 (pACYC tRNA) pMTL-malE-GW LHNC STOP株からの融合タンパク質の発現、およびその精製を、実施例５に記載のように行った。追加のＮ末端配列の付加は、全体の発現および精製に顕著な変化を起こさなかった。第Ｘａ因子切断後の最終産物は、上記のようにジスルフィド結合した二本鎖フラグメントであった。
【０３７８】
追加のＣ末端ドメインを有するフラグメントの発現のために、ＬＨＮＣ  ＮＳ侵入ベクターを付加部位の後かつ適切なフレーム内に付加配列を有する仕向ベクターと組換えた。完全融合物を生成するための組換えを容易にするために必要な特性を有するatt部位に隣接するＬＨＮ／ＣフラグメントをコードするＤＮＡの配列を、配列番号１３３に記載する。例えば、仕向ベクターpMTL-malE-GW-att-IGFを、ヒトＩＧＦのコード配列をXbaI-HindIIIフラグメントとして適切な部位にサブクローニングすることによって生成した。このベクターへのＬＨＮ／Ｃ  ＮＳフラグメントの組換えにより、pMTL-malE-GW-LHNC-att-IGFを得た。
【０３７９】
このクローンを、上記のように発現しそして精製した。Ｃ末端ＩＧＦドメインの結合特性を利用するさらなる精製方法も、所望であれば使用され得る。
【０３８０】
当業者は、同様のアプローチがＢｏＮＴ／Ｃまたは他の血清型のいずれかに由来する他のＬＨＮフラグメントに使用され得ることを認識する。同様に、他のＣ末端精製タグまたはリガンドが、上記のＩＧＦについてと同様に仕向ベクターに組み込まれ得る。
【０３８１】
実施例９  Gateway適合した発現ベクター由来のＬＨＮＴｅＮＴの発現
実施例７に記載のＬＨＮＴｅＮＴ BamHI-HindIIIフラグメントを、適切なリーディングフレームを維持するために侵入ベクターにサブクローニングした。侵入ベクターを、BamHI部位に直接隣接する第Ｘａ因子部位を組み込むように設計し、そのため切断によって、BamHI部位によってコードされるGlySer残基で始まるタンパク質を得た。侵入ベクターを、Ｎ末端6-Ｈｉｓタグを有する市販の入手可能な仕向ベクター（例えば、pDEST17；Invitrogen）と組換えた。得られたクローンpDEST17 LHNTeNTを、実施例６に記載のように、宿主HMS174 (pACYC tRNA)株中で発現させた。融合タンパク質の精製も、実施例５に記載のとおりであり、Ｎ末端Ｈｉｓタグを第Ｘａ因子処理で除去し、次いで第Ｘａ因子をQ-sepharoseカラムで除去した。
【０３８２】
実施例１０  fos/junまたはGlu/Arg分子クランプによるＬＨＮ／Ｂフラグメントとリガンドとの指示カップリング
配列番号１１５／１１６、１１７／１１８、１１９／１２０、および１２１／１２２に記載の型のＬＨＮ／Ｃクローンを、実施例５に既述のように発現および精製した。次いで、精製した活性化ＬＨＮ／Ｃタンパク質を、相補クランプパートナー（配列番号１１７／１１８および１２１／１２２についてはjunタグ付けリガンド；配列番号１１５／１１６および１１９／１２０についてはポリアルギニンタグ付けリガンド）でタグ付けした当モル量のリガンドと混合した。タンパク質を穏やかに混合して結合を促進し、次いで精製して、結合したリガンド−エンドペプチダーゼフラグメントを単離した。
【０３８３】
実施例１１  酸／塩基分子クランプによるＬＨＮＴｅＮＴフラグメントとリガンドとの指示カップリング
配列番号１４２／１４３、１４４／１４５、および１４６／１４７に記載の型のＬＨＮＴｅＮＴクローンを改変して、酸／塩基ロイシンジッパークランピングシステムの１成分を組み込んだ。実施例５に既述のようにタグ付けしたタンパク質の発現および精製後、タグ付けしたリガンドとの結合を、本質的に実施例１０に記載のように行った。
【０３８４】
実施例１２  二本鎖フラグメントを得るための、トロンビンプロテアーゼプロセシング部位を有するＬＨＮ／Ｂの活性化
配列番号９９／１００のように、ＬドメインとＨＮドメインとの間のリンカーにトロンビン部位を有するＬＨＮ／Ｂを、本質的に実施例５に記載のようにpMAL c2xから発現させた。精製したＬＨＮ／Ｂフラグメントを、１mgタンパク質当たり１ユニットのトロンビンとともに25℃にて20時間インキュベートした。実施例５に記載のようにQ-sepharoseカラムでのさらなる精製によって、二本鎖ＬＨＮをトロンビンと分離した。
【０３８５】
実施例１３  二本鎖フラグメントを得るための、エンテロキナーゼプロセシング部位を有するＬＨＮＴｅＮＴの活性化
活性化した二本鎖ＬＨＮを調製するために、精製したタンパク質（例えば、配列番号１４４／１４５から得られる）を、50μgの精製タンパク質当たり１酵素ユニットの濃度のエンテロキナーゼで、25℃にて20時間処理した。次いで、活性化した二本鎖ＬＨＮを、（実施例５に記載のように）第Ｘａ因子切断後の精製に用いたのと同一条件下でQ-sepharoseカラムでのイオン交換によって、あるいは、エンテロキナーゼに特異的に結合して除去するための20 mM Hepes 100 mM NaCl pH 7.2中で平衡化したベンズアミジンセファロースカラムを用いて、エンテロキナーゼから精製した。
【０３８６】
本発明によれば、以下が提供される。
【０３８７】
１．第１および第２ドメインを含む一本鎖ポリペプチドであって：
該第１ドメインが、クロストリジウム菌神経毒素軽鎖またはそのフラグメントもしくは改変体であり、該第１ドメインが、エキソサイトーシスに必須の１以上の小胞または形質膜結合タンパク質を切断することが可能であり；そして
該第２ドメインが、クロストリジウム菌神経毒素重鎖ＨＮ部分またはそのフラグメントもしくは改変体であり、該第２ドメインが、（ｉ）該ポリペプチドを細胞にトランスロケートし、または（ii）該第１ドメイン自体の溶解性と比較して該ポリペプチドの溶解性を増加させ、または（iii）該ポリペプチドを細胞にトランスロケートしそして該第１ドメイン自体の溶解性と比較して該ポリペプチドの溶解性を増加させる両方が可能であり；そして該第２ドメインが、ＨＣと命名されたクロストリジウム菌神経毒素重鎖の機能的Ｃ末端部分を欠き、それによって該ポリペプチドが、天然のクロストリジウム菌神経毒素が結合する天然の細胞表面レセプターである細胞表面レセプターに結合できなくなり；そして該一本鎖ポリペプチドが、以下からなる群より選択される配列を含む、ポリペプチド：
（Ｉ）配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３９、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、および１７５；または
（II）エキソサイトーシスに必須の１以上の小胞または形質膜結合タンパク質を切断し得る第１ドメインを有する（Ｉ）のフラグメントまたは改変体。
【０３８８】
２．前記クロストリジウム菌毒素重鎖が、ボツリヌス菌神経毒素重鎖である、項１に記載のポリペプチド。
【０３８９】
３．前記クロストリジウム菌毒素重鎖が、破傷風菌神経毒素重鎖である、項１に記載のポリペプチド。
【０３９０】
４．前記第１ドメインが、SNAP-25、シナプトブレビン／VAMP、およびシンタキシンの１以上から選択される基質に特異的なエンドペプチダーゼ活性を示す、項１から３のいずれかに記載のポリペプチド。
【０３９１】
５．前記第２ドメインが、クロストリジウム菌毒素重鎖ＨＮ部分である、項１から４のいずれかに記載のポリペプチド。
【０３９２】
６．前記クロストリジウム菌神経毒素重鎖が、ボツリヌス菌神経毒素Ａ型鎖である、項１に記載のポリペプチド。
【０３９３】
７．前記第２ドメインが、ボツリヌス菌毒素Ａ型重鎖の４２３個のＮ末端アミノ酸を含む、項１に記載のポリペプチド。
【０３９４】
８．前記クロストリジウム菌神経毒素重鎖が、ボツリヌス菌神経毒素Ｂ型鎖である、項１に記載のポリペプチド。
【０３９５】
９．前記第２ドメインが、ボツリヌス菌毒素Ｂ型重鎖の１０７個のＮ末端アミノ酸を含む、項１に記載のポリペプチド。
【０３９６】
１０．前記第２ドメインが、ボツリヌス菌毒素Ｂ型重鎖の４１７個のＮ末端アミノ酸を含む、項１に記載のポリペプチド。
【０３９７】
１１．前記第２ドメインが、破傷風菌重鎖の４２２個のＮ末端アミノ酸を含む、項１に記載のポリペプチド。
【０３９８】
１２．前記第２ドメインが、クロストリジウム菌神経毒素重鎖の１００個のＮ末端アミノ酸を含む、項１に記載のポリペプチド。
【０３９９】
１３．タンパク質分解酵素によって切断される部位を含む、項１に記載のポリペプチド。
【０４００】
１４．前記切断部位が、天然のクロストリジウム菌神経毒素に存在しない、項１３に記載のポリペプチド。
【０４０１】
１５．前記切断部位が、前記第１および第２ドメインのタンパク質分解切断を可能にする、項１３または１４に記載のポリペプチド。
【０４０２】
１６．前記切断部位が、前記第１および第２ドメインのタンパク質分解切断を可能にし、そしてそのように切断される場合、該第１ドメインが、該タンパク質分解切断前の前記ポリペプチドが示す１以上の小胞または形質膜結合タンパク質を切断する酵素活性よりも大きい酵素活性を示す、項１３から１５のいずれかに記載のポリペプチド。
【０４０３】
１７．項１に記載のペプチドをコードする第２の核酸配列内に、前記切断部位をコードする第１の核酸配列を提供することによって得られ得る、項１３から１６のいずれかに記載のポリペプチド。
【０４０４】
１８．前記第２ドメインが、ＨＣと命名されたクロストリジウム菌神経毒素重鎖のＣ末端部分を欠く、項１から１７のいずれかに記載のポリペプチド。
【０４０５】
１９．前記ポリペプチドを細胞に結合する第３ドメインをさらに含む、項１から１８のいずれかに記載のポリペプチドであって、該結合が、第３ドメインの細胞への直接的な結合によって、あるいは細胞に結合する１または複数のリガンドへの第３ドメインの結合によって行われる、ポリペプチド。
【０４０６】
２０．前記第３ドメインが、前記ポリペプチドを免疫グロブリンに結合するためのものである、項１９に記載のポリペプチド。
【０４０７】
２１．前記第３ドメインが、ブドウ球菌のプロテインＡのドメインｂに由来するタンデムリピート合成ＩｇＧ結合ドメインである、項２０に記載のポリペプチド。
【０４０８】
２２．前記第３ドメインが、細胞表面レセプターに結合するアミノ酸配列を含む、項１９に記載のポリペプチド。
【０４０９】
２３．前記第３ドメインが、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）である、項２２に記載のポリペプチド。
【０４１０】
２４．前記第１ドメインと前記第２ドメインとの間にスペーサー分子を含む、項１から２３のいずれかに記載のポリペプチド。
【０４１１】
２５．前記第２ドメインと前記第３ドメインとの間にスペーサー分子を含む、項１９から２３のいずれかに記載のポリペプチド。
【０４１２】
２６．アフィニティーマトリクスに結合する精製タグをさらに含み、それによって該マトリクスを用いる前記ポリペプチドの精製を容易にする、項１から２５のいずれかに記載のポリペプチド。
【０４１３】
２７．前記精製タグと前記ポリペプチドとの間にスペーサー分子を含む、項２６に記載のポリペプチド。
【０４１４】
２８．前記精製タグが、グルタチオンセファロースのアフィニティーマトリクスに結合する、項２６または２７に記載のポリペプチド。
【０４１５】
２９．第１のプロテアーゼ切断部位が、項１から２３のいずれかに記載のポリペプチドと前記精製タグとの間に組み込まれ、該プロテアーゼ切断部位が、該精製タグからの該ポリペプチドのタンパク質分解分離を可能にする、項２６から２８のいずれかに記載のポリペプチド。
【０４１６】
３０．第２のプロテアーゼ切断部位が、項１から２３のいずれかに記載のポリペプチドの前記第１ドメインと前記第２ドメインとの間に組み込まれ、該プロテアーゼ切断部位が、該第１ドメインと該第２ドメインとのタンパク質分解切断を可能にする、項２６から２９のいずれかに記載のポリペプチド。
【０４１７】
３１．項１から３０のいずれかに記載のポリペプチドをコードする、核酸。
【０４１８】
３２．前記核酸が、クロストリジウム菌神経毒素のＨＣと命名された部分をコードするヌクレオチドを欠く、項３１に記載の核酸。
【０４１９】
３３．ボツリヌス菌毒素Ａ型重鎖ＨＮドメインの残基１から４２３をコードするヌクレオチドを含む、項３１または３２に記載の核酸。
【０４２０】
３４．ボツリヌス菌毒素Ｂ型重鎖ＨＮドメインの残基１から４１７をコードするヌクレオチドを含む、項３１または３２に記載の核酸。
【０４２１】
３５．タンパク質分解切断部位をコードするヌクレオチドを含む、項３１から３４のいずれかに記載の核酸。
【０４２２】
３６．前記タンパク質分解切断部位が、天然のクロストリジウム菌神経毒素に存在しない、項３５に記載の核酸。
【０４２３】
３７．前記タンパク質分解切断部位が、前記ポリペプチドの前記第１ドメインと前記第２ドメインとの間に位置する、項３６に記載の核酸。
【０４２４】
３８．項２９に記載の核酸配列内に前記切断部位をコードする核酸配列を提供することによって得られ得る、項３６または３７に記載の核酸。
【０４２５】
３９．配列番号６９、７１、７３、７５、７７、１１３、１３４、またはそれらのフラグメントもしくは改変体からなる群より選択される、核酸配列。
【０４２６】
４０．配列番号７０、７２、７４、７６、７８、１１４、またはそれらのフラグメントもしくは改変体からなる群より選択される、一本鎖ポリペプチド。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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