(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
硫酸還元細菌と硫酸イオンとを含む培養液に電極を浸漬し、この電極に電位を印加して前記培養液の銀・塩化銀電極に対する酸化還元電位Ｘ（Ｖ）をＸ≦−０．６に制御しながら嫌気条件下で前記硫酸還元細菌を培養することを特徴とする硫酸還元細菌の培養方法。
【請求項２】
前記酸化還元電位の制御は、前記電極に印加された電位により酸化還元反応を生じる酸化還元物質を前記培養液に含ませて、前記電極に印加された電位により前記酸化還元物質の酸化体と還元体の濃度比を制御することにより行う請求項１記載の硫酸還元細菌の培養方法。
【請求項３】
硫酸還元細菌と硫酸イオンとを含む培養液に電極を浸漬し、この電極に電位を印加して前記培養液の銀・塩化銀電極に対する酸化還元電位Ｘ（Ｖ）をＸ≦−０．６に制御しながら嫌気条件下で前記硫酸還元細菌を培養する際に発生する硫化水素を、重金属含有排水と接触させることを特徴とする排水処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は硫酸還元細菌の培養方法に関する。さらに詳述すると、本発明は、硫酸還元細菌の培養の高効率化や硫酸還元細菌の集積培養に好適な培養方法と、この方法を利用した重金属含有排水の処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在様々な分野で利用されている微生物は自然界に存在する全微生物の１％に満たないと言われている。そこで、残り９９％の膨大な微生物資源を有効利用するため、新しい概念に基づく微生物の培養技術が多数開発されている。
【０００３】
例えば、特許文献１には、環境汚染物質である六価クロムを無害な三価クロムに還元する能力を有するクロム還元菌を集積培養する技術が開示されている。具体的には、六価クロムを溶解させてクロム還元菌以外の雑多な微生物にとって増殖し難い環境とした培養液中で、六価クロムに対して還元活性を有するShewanella、Pseudomonas、Sulfate reducing bacteria、Arthrobacter、Bacillus、Aerococcus、Micrococcus、Aeromonas、Thermoanaerobacter、Cellulomonas、Geobacter、Streptomyces、Escherichia、Enterobacter等のクロム還元菌を選択的に集積培養し、その際に、培養液中に流した電気により、クロム還元菌によって還元されて生成された三価クロムを酸化して六価クロムに再生しながら培養を行うようにしたものである。
【０００４】
ここで、クロム還元菌以外にも、環境汚染物質を処理する能力を有する微生物が多数知られている。例えば、硫酸還元細菌は硫酸イオンを電子受容体として、硫酸呼吸により硫化水素を産生する微生物として知られている。硫化水素は水溶性であり、且つ、重金属を不溶化させることができる。したがって、排水（廃水）中に含まれる重金属を水に溶けにくい状態あるいは水に溶けない状態、つまり、重金属の硫化物沈殿を生成したり、重金属を元素状態に還元することにより、重金属を排水と固液分離することが可能な状態とすることができる。そこで、硫化水素により重金属を不溶化して排水から固液分離するために、硫酸還元細菌を利用することができる。また、硫酸還元細菌の中には、硫酸還元と相補的にベンゼンやトルエンなどの芳香族化合物を分解処理する能力を有しているものも存在する。このように、硫酸還元細菌は、様々な環境汚染物質を処理することのできる有用な微生物である。
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−５５１３４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、硫酸還元細菌の増殖速度は一般的な微生物と比較して低いことから、培養を効率的に行えないという問題があった。また、一般的な微生物と比較して増殖速度が低いことに起因して、雑多な微生物群が競合している環境下で優先的に増殖させることが非常に困難であり、集積培養が難しいという問題もあった。このことから、様々な有用な機能を有する硫酸還元細菌の有効活用が図れないという問題があった。
【０００７】
そこで、本発明は、硫酸還元細菌の増殖を促進することのできる培養方法を提供することを目的とする。
【０００８】
また、本発明は、雑多な微生物群が競合している環境下においても、硫酸還元細菌を優先的に増殖させることができる培養方法を提供することを目的とする。
【０００９】
さらに、本発明は、重金属含有排水を効率よく処理する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
かかる課題を解決するため、本願発明者等が鋭意研究を行ったところ、硫酸還元細菌を培養する際の培養液の銀・塩化銀電極に対する酸化還元電位Ｘ（Ｖ）をＸ≦−０．６に制御することで、硫酸還元細菌の増殖を促進できることを見出した。また、雑多な微生物群から硫酸還元細菌を優先的に増殖できることも見出した。これらの知見に基づき本発明に至った。
【００１１】
かかる知見に基づく請求項１記載の硫酸還元細菌の培養方法は、硫酸還元細菌と硫酸イオンとを含む培養液に電極を浸漬し、この電極に電位を印加して培養液の銀・塩化銀電極に対する酸化還元電位Ｘ（Ｖ）をＸ≦−０．６に制御しながら嫌気条件下で硫酸還元細菌を培養するようにしている。
【００１２】
このように、培養液自体の銀・塩化銀電極に対する酸化還元電位Ｘ（Ｖ）をＸ≦−０．６に制御することで、硫酸還元細菌の増殖を促進することができる。また、硫酸還元細菌以外の微生物が培養液に含まれている場合であっても、硫酸還元細菌を優先的に増殖させることができる。
【００１３】
ここで、銀・塩化銀電極は標準水素電極に対して＋０．２２Ｖの値を示す。そして、銀・塩化銀電極に対する酸化還元電位に０．２２Ｖを加えることにより、銀・塩化銀電極に対する酸化還元電位を標準水素電極に対する酸化還元電位に換算することができる。したがって、銀・塩化銀電極に対する酸化還元電位から、銀・塩化銀電極以外の電極に対する酸化還元電位を換算することができる。例えば、銀・塩化銀電極に対する酸化還元電位をＸ（Ｖ）、銀・塩化銀電極以外の電極に対する酸化還元電位をＡ（Ｖ）とし、銀・塩化銀電極以外の電極の標準水素電極に対する電位をＢ（Ｖ）とすると、以下の式により、銀・塩化銀電極以外の電極に対する酸化還元電位Ａを換算することができる
[数式１]  Ａ＝Ｘ＋０．２２−Ｂ
【００１４】
つまり、数式１により得られるＡは、銀・塩化銀電極に対する酸化還元電位と同義であり、このようにして換算することに得られる酸化還元電位の範囲も本発明に含まれる。
【００１５】
例えば、銀・塩化銀電極以外の電極として飽和カロメル電極を用いた場合について説明すると、電極の標準水素電極に対する電位Ｂは＋０．２４Ｖであり、酸化還元電位Ａ（Ｖ）の範囲はＡ≦−０．６２と換算することができる。
【００１６】
また、銀・塩化銀電極以外の電極として  水銀・硫酸水銀（Ｉ）電極を用いた場合について説明すると、電極の標準水素電極に対する電位Ｂは＋０．６６Ｖであり、酸化還元電位Ａ（Ｖ）の範囲はＡ≦−１．０４と換算することができる。
【００１７】
請求項２記載の硫酸還元細菌の培養方法は、請求項１記載の硫酸還元細菌の培養方法において、培養液の酸化還元電位の制御を、電極に印加された電位により酸化還元反応を生じる酸化還元物質を培養液に含ませて、電極に印加された電位により酸化還元物質の酸化体と還元体の濃度比を制御することにより行うようにしている。
【００１８】
このように、電極に印加された電位により酸化還元物質の酸化体と還元体の濃度比を制御することで、培養液自体の酸化還元電位を一定値に制御することができる。
【００１９】
請求項３記載の排水処理方法は、硫酸還元細菌と硫酸イオンとを含む培養液に電極を浸漬し、この電極に電位を印加して培養液の銀・塩化銀電極に対する酸化還元電位Ｘ（Ｖ）をＸ≦−０．６に制御しながら嫌気条件下で硫酸還元細菌を培養する際に発生する硫化水素を、重金属含有排水と接触させるようにしている。
【００２０】
硫化水素は水溶性であり、且つ、重金属を不溶化させることができる。したがって、硫酸還元細菌を培養する際に発生する硫化水素を重金属含有排水と接触させることで、重金属を排水と固液分離することが可能な状態とすることができる。
【発明の効果】
【００２１】
請求項１記載の発明によれば、硫酸還元細菌の増殖を促進することができるので、硫酸還元細菌の培養期間を短縮することができる。また、硫酸還元細菌以外の微生物が培養液に含まれている場合であっても、硫酸還元細菌を優先的に増殖させることができるので、雑多な微生物群の中から硫酸還元細菌のみを選択的に培養することが可能となる。
【００２２】
請求項２記載の発明によれば、培養液自体の酸化還元電位を一定値に制御することができ、硫酸還元細菌の培養に好ましい酸化還元電位を長期に亘って制御し続けることが可能となる。
【００２３】
請求項３記載の発明によれば、硫酸還元細菌の増殖の促進または雑多な微生物群からの硫酸還元細菌の優先的な増殖により、硫化水素の発生量を増加させることができるので、硫酸還元細菌が生成する硫化水素を利用した重金属含有排水の処理効率を高めることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明を実施するための最良の形態について、図面に基づいて詳細に説明する。
【００２５】
図１に、本発明の硫酸還元細菌の培養方法の実施形態の一例として、電気培養装置１を用いた場合について説明する。本発明の硫酸還元細菌の培養方法は、硫酸還元細菌２と硫酸イオン１３とを含む培養液４に電極を浸漬し、この電極に電位を印加して培養液４の銀・塩化銀電極に対する酸化還元電位Ｘ（Ｖ）をＸ≦−０．６に制御しながら嫌気条件下で硫酸還元細菌２を培養するものである。
【００２６】
電解槽５はイオン交換膜６によって培養槽７と対極槽８に仕切られている。培養槽７と対極槽８には培養液４が充填され、培養槽７には作用極９及び参照電極１１が、対極槽８には対極１０が浸漬される。作用極９、対極１０及び参照電極１１は３電極式の電位制御装置（ポテンシオスタット）１２に結線され、培養槽７内の作用極９の電位を厳密に設定可能としている。
【００２７】
培養槽７には、酸化還元物質３がさらに添加される。
【００２８】
酸化還元物質３としては、培養液４に浸されている作用極９と可逆的に酸化還元反応を生じ得る物質であり、且つ、硫酸還元細菌２に対して毒性を示さない物質であればよい。例えば、土壌成分として一般的な鉄イオンが挙げられる。鉄イオンは以下に示す化学反応式１により酸化体と還元体に可逆的に変化する。
[化学反応式１]  Ｆｅ(III)  ＋  ｅ−  ＝  Ｆｅ(II)
【００２９】
ここで、鉄イオンを培養液４中で安定に存在させるためには、鉄イオンをキレート剤に配位させて培養液中に添加することが好ましい。キレート剤としては、鉄イオンを配位しうるものであれば任意のキレート剤を用いることができるが、例えばジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、テトラエチレントリアミン（ＴＥＴ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）、クエン酸、シュウ酸、クラウンエーテル、ニトリロテトラ酢酸、エデト酸二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、ペニシラミン、ペンテテートカルシウム三ナトリウム、ペンテト酸、スクシメルおよびエデト酸トリエンチンを挙げることができ、好ましくはＥＤＴＡである。
【００３０】
尚、鉄イオンをキレート剤に配位させて用いることにより、硫酸還元細菌２が産生する硫化水素により鉄イオンが硫化物となって沈殿するのを防ぐ効果もある。
【００３１】
鉄イオン以外にも、フェロシアン化カリウム、アントラキノンジスルホン酸ナトリウムなどのキノン化合物、メチルビオロゲンを用いることができる。これらの物質も酸化還元反応により、酸化体と還元体に可逆的に変化する。特に、キノン化合物は土壌成分の一つとして知られている物質であり、好ましい。つまり、土壌そのものを培養液４に添加することで、土壌に含まれている酸化還元物質３により培養液の酸化還元電位が制御できる場合がある。尚、酸化還元物質３は上記した物質に限定されるものではない。
【００３２】
尚、酸化還元物質３の培養槽７への添加量は、培養液４の酸化還元電位を制御できる量であれば特に限定されないが、培養液４の濃度を０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌとすることが好適である。０．１ｍｍｏｌ／Ｌ未満とすると酸化還元電位の制御を十分に行うことができない可能性が生じやすくなる。また、１００ｍｍｏｌ／Ｌを超えると培養液に完全に溶解しない、もしくは微生物の生育を阻害する可能性が生じやすくなる。
【００３３】
また、培養液４に含有させる硫酸イオン１３は、硫酸還元細菌に呼吸を行わせてエネルギーを獲得させるために必須の成分である。硫酸イオン源としては、例えば、硫酸マグネシウムや硫酸カルシウム等を用いることができるが、これらに限定されるものではない。また、硫酸イオン１３の添加量については、硫酸還元細菌に呼吸を十分に行わせることのできる量であれば特に限定されるものではないが、例えば、硫酸還元細菌の菌体密度１０７〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬに対して、培養液４の硫酸イオン濃度を１０００〜１５００ｐｐｍとすることが好適である。
【００３４】
ここで、本発明の硫酸還元細菌の培養方法において、硫酸還元細菌２の培養環境は嫌気条件下としている。硫酸還元細菌２は嫌気性微生物であることから、培養環境を嫌気環境とすることが必要である。嫌気環境は、例えば電気培養装置１の電解槽５をボックス（不図示）内に入れ、当該ボックス内に水素ガス、二酸化炭素、不活性ガス（窒素、希ガス）、またはそれらの混合ガスを充填することにより形成することができるが、このような方法に限定されるものではない。
【００３５】
次に、培養液４の酸化還元電位について説明する。培養液４の酸化還元電位は、数式１に示すネルンストの式により表される。
【００３６】
[数式２]  Ｅ＝Ｅ０＋ＲＴ／ｎＦ×ｌｎ（Ｃｏｘ／Ｃｒｅｄ）
【００３７】
数式２において、Ｅは溶液の酸化還元電位、Ｅ０は酸化還元物質の標準酸化還元電位、Ｒは気体定数、Ｔは絶対温度、ｎは反応電子数、Ｆはファラデー定数、Ｃｏｘは酸化体の濃度、Ｃｒｅｄは還元体の濃度である。つまり、培養液中に含まれる酸化還元物質３の酸化体の濃度と還元体の濃度の比を一定に制御することにより、培養液４自体の酸化還元電位を制御することができる。要するに、酸化還元物質３が培養液４の酸化還元電位を決定する要素であり、培養液４の組成は酸化還元電位にほとんど影響を与えることがない。
【００３８】
３極式の電位制御装置１２では、作用極９と参照電極１１間の電位差を測定し、測定した電位差が設定電位Ｖに達するように作用極９と対極１０との間に電流を流し、基準となる参照電極１１には一切電流が流れないようにしている。このようにして作用極９の電位を一定の電位Ｖに制御し、酸化還元物質３の酸化体の濃度と還元体の濃度の比を一定に制御することにより、培養液４自体の酸化還元電位が一定に制御される。ここで、培養液４の酸化還元電位は、作用極９の酸化還元電位に相当する。したがって、設定電位Ｖ、つまり、参照電極１１に対する作用極９の電位が培養液４の酸化還元電位に相当する。
【００３９】
例として、酸化還元電位が＋０．５Ｖの培養液の酸化還元電位を−０．５Ｖに制御する場合について図２に基づいて説明する。初期状態、つまり作用極９に電位を印加していない場合は、作用極９の酸化還元電位測定値は、作用極９と参照電極１１との間の電位差である＋０．５Ｖとなる（図２の（１））。次に、設定電位を−０．５Ｖとして電位制御を開始すると、作用極９の電位は瞬時に設定電位となり、培養液４中の酸化還元物質３が酸化還元反応を生じて、酸化還元物質３の酸化体と還元体の濃度比が制御され、培養液４の電位が徐々に設定電位に近づき（図２の（２））、定常状態となって、培養液４の酸化還元電位が−０．５Ｖとなる（図２の（３））。このときの作用極９の酸化還元電位測定値は、作用極９と参照電極１１の電位差である−０．５Ｖとなる。
【００４０】
ここで、酸化還元電位は、参照電極１１に対する作用極９の電位に相当するので、参照電極１１の種類により酸化還元電位の値は変化する。本明細書における酸化還元電位は、標準水素電極に対して＋０．２２Ｖを示す銀・塩化銀電極に対する値としているが、参照電極１１は銀・塩化銀電極に限られるものではない。銀・塩化銀電極以外の電極を用いた場合の酸化還元電位は上述した方法により容易に換算でき、銀・塩化銀電極以外の電極を用いた場合に換算した酸化還元電位の範囲も本発明に含まれる。
【００４１】
尚、培養槽７に投入された微生物が酸化還元物質を酸化あるいは還元することにより、Ｃｏｘ／Ｃｒｅｄ（酸化体と還元体の濃度比）が変化した場合でも、可逆性の酸化還元物質を用いることで、所定のＣｏｘ／Ｃｒｅｄに制御して、酸化還元電位を一定値に保つことができる。
【００４２】
ここで、電解槽５を二槽に区画しているイオン交換膜６は、一価の陽イオンのみを透過する膜である。したがって、二価の鉄イオンや三価の鉄イオンは透過しないので、酸化還元物質３が対極槽８に移動することはない。また、したがって、酸化還元物質３は培養槽７で繰り返し利用できる。対極槽８に設置された対極１０では、作用極９の逆反応として水素の還元・酸化反応が生じる。また、膜間のイオン電流の伝達は、培養液４に含まれる水素イオン、ナトリウムイオン(Ｎａ＋)、カリウムイオン（Ｋ＋）などの一価の陽イオンにより行われる。このような電気化学反応が電解槽５で進行し、培養液４の酸化還元電位が一定に制御される。
【００４３】
本発明において、培養液４の銀・塩化銀電極に対する酸化還元電位Ｘ（Ｖ）はＸ≦−０．６としている。酸化還元電位をＸ＞−０．６とすると、硫酸還元細菌２の増殖が促進されなくなる。尚、酸化還元電位の下限値については、−０．８Ｖの場合には硫酸還元細菌２の増殖が促進されることが確認された。しかも、酸化還元電位を−０．６Ｖとした場合よりも−０．８Ｖとした場合の方が、より増殖が促進されやすいことが確認されたことから、Ｘ≦−０．８の場合であっても硫酸還元細菌２の増殖が促進されるものと考えられる。しかしながら、酸化還元電位をＸ＜−０．８とすると、対極１０からの水素発生量が増加しすぎて酸化還元電位の制御が正確に行えなくなる。したがって、酸化還元電位は−０．８Ｖ〜−０．６Ｖとすることが好適である。
【００４４】
本発明の培養方法よれば、硫酸還元細菌２を単独で培養する場合に、硫酸還元細菌２の増殖を促進することができる。尚、培養対象となる硫酸還元細菌２としては、公知ないしは新規の硫酸還元細菌全般を用いることができる。公知の硫酸還元細菌としては、例えば、Desulfovibrio, Desulfomicrobium, Desulfobacula, Desulfobacterが挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００４５】
また、本発明の培養方法によれば、培養液４中に硫酸還元細菌２以外にも微生物が存在する場合であっても、硫酸還元細菌２の増殖を促進させることによって硫酸還元細菌２を優先的に増殖させることができる。つまり、硫酸還元細菌２の増殖を促進させることによって、培養液４中に存在する炭素源（乳酸、酵母エキスなど）が硫酸還元細菌２に消費されやすくなる。その結果として、競合している他の微生物が炭素源を摂取できなくなり、硫酸還元細菌２の増殖に伴って、競合している他の微生物が減少し、最終的には硫酸還元細菌２が優先的に増殖することになる。したがって、本発明の培養方法によれば、雑多な微生物群の中から、硫酸還元細菌２を集積培養することも可能である。
【００４６】
ここで、硫酸還元細菌は、硫酸イオンを還元して硫化水素を産生することができる。したがって、この硫化水素を利用して排水に含まれる重金属を不溶化することにより、重金属を排水から固液分離して除去することができる。また、硫酸還元細菌の中には、硫酸還元と相補的にベンゼン、トルエンなどの芳香族化合物を分解する機能を有するものも存在する。本発明の培養方法によれば、このように様々な環境汚染物質を処理する機能を有する有用な微生物である硫酸還元細菌の増殖を促進することにより、硫酸還元細菌の培養期間の短縮を図ることや、雑多な微生物群から硫酸還元細菌を優先的に増殖させて集積培養することが可能となる。
【００４７】
また、本発明の硫酸還元細菌の培養方法の実施と同時に、重金属含有排水の処理を行うようにしてもよい。例えば、図３に示すように、電気培養装置１の培養槽７を硫酸還元細菌２を通過させることなく、硫酸還元細菌２により生成される硫化水素（硫化物イオン）を通過させるメンブレンフィルタ１６で仕切って処理槽１７を形成し、処理槽１７に重金属２１を含む排水１８を収容し、処理槽１７と培養槽７との間の濃度勾配によりメンブレンフィルタ１６を通過した硫化水素（硫化物イオン）と排水１８に含まれる重金属２１とを接触させて重金属２１を不溶化することにより、重金属２１を排水１８から固液分離して除去することができる。培養槽７の硫酸還元細菌２は培養液４の酸化還元電位が制御されて増殖が促進されているので、重金属を効率よく不溶化できるバイオリアクターとなる。尚、この形態において、培養液４内で十分にイオン電流が流れない場合には、排水１８に酸化還元物質３を添加するようにしても良い。
【００４８】
尚、本発明の重金属含有液の処理方法において不溶化され得る重金属２１は、排水中で亜セレン酸イオン（ＳｅＯ３２−）の形態で存在しているセレン（Ｓｅ）並びに排水中で陽イオンの形態で存在している鉄（Ｆｅ）、銅（Ｃｕ）、銀（Ａｇ）、亜鉛（Ｚｎ）、鉛（Ｐｂ）、コバルト（Ｃｏ）、ニッケル（Ｎｉ）、モリブデン（Ｍｏ）、砒素（Ａｓ）、カドミウム（Ｃｄ）、水銀（Ｈｇ）、マンガン（Ｍｎ）及びスズ（Ｓｎ）のうちの一種以上である。
【００４９】
排水中で亜セレン酸イオン（ＳｅＯ３２−）の形態で存在しているセレン（Ｓｅ）は、供給された硫化水素により硫化物沈殿が生成されるか、あるいは供給された硫化水素が還元剤として作用することにより元素状セレンとなって不溶化される。排水中で陽イオンの形態で存在している銅（Ｃｕ）、銀（Ａｇ）、鉛（Ｐｂ）、カドミウム（Ｃｄ）、水銀（Ｈｇ）、スズ（Ｓｎ）、ニッケル（Ｎｉ）、コバルト（Ｃｏ）、鉄（Ｆｅ）、亜鉛（Ｚｎ）、マンガン（Ｍｎ）及びアルミニウム（Ａｌ）は、供給された硫化水素と反応して硫化物沈殿が生成され、不溶化される。尚、アルミニウム（Ａｌ）は、硫化物沈殿ではなく、水酸化物沈殿であるＡｌ(ＯＨ)３となって不溶化される。したがって、重金属２１は排水１８と固液分離することが可能な状態となるので、排水を、例えば濾過処理等により固液分離することにより、重金属含有液から重金属を回収して無害化することができる。
【００５０】
上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。例えば、硫酸還元細菌２の培養中に培養槽７の培養液４にベンゼン、トルエンなどの芳香族化合物を直接添加し、硫酸還元細菌２にこれらを分解させながら培養を行い、ベンゼン、トルエンなどの芳香族化合物の分解処理と硫酸還元細菌２の培養を同時に行うようにしてもよい。
【実施例】
【００５１】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれら実施例に限られるものではない。
【００５２】
（１）培養液の調整
培養液４ａは以下のようにして調整した。即ち、乳酸ナトリウム；４．０ｍＬ、ＮＨ４Ｃｌ；１．０ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４；０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；２．０ｇ、クエン酸三ナトリウム二水和物；５．０ｇ、ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ；１．０ｇを蒸留水１Ｌに溶解して調整した。調整後の培養液４ａは、オートクレーブ滅菌処理した。また、培養槽７に充填する培養液４ｂには、培養液４ａに酵母エキス；１．０ｇ、Ｆｅ(III)−ＥＤＴＡ；０．４２ｇをさらに加え、フィルター（０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＳ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、Ｉｒｅｌａｎｄ）によりろ過除菌してから使用した。尚、いずれの培養液も希水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを７．２に調整した。
【００５３】
（２）培養装置
硫酸還元細菌の生育には図４に示す電気培養装置１を使用した。電解槽５は外径７５ｍｍ、高さ９０ｍｍのガラス製深底シャーレの内側を、一価の陽イオン透過性の交換膜（旭化成、Ｋ−１９２）６で仕切った二槽式とし、一方を培養槽７、他方を対極槽８とした。培養槽７には炭素板（４０ｍｍ×７０ｍｍ、４ｍｍ厚）の作用極９と、銀・塩化銀参照電極１１（ＨＳ−２０５Ｃ、東亜ＤＫＫ社）を設置した。対極槽８には炭素板（４０ｍｍ×７０ｍｍ、４ｍｍ厚）の対極１０を設置した。これら３本の電極９,１０,１１は電位制御装置（扶桑製作所、ＰＯＴＥＮＴＩＯ／ＧＡＬＶＡＮＯＳＴＡＴ ｍｏｄｅｌ １１０）１２に結線して、培養槽７内の作用極９の電位を厳密に設定可能とした。
【００５４】
培養槽７には培養液４ｂを充填し、対極槽８には培養液４ａを充填した。
【００５５】
培養に際しては、電解槽５をアクリル製の嫌気ボックス１４内に封入し、さらに嫌気ボックス全体を３０℃に設定した恒温槽（不図示）内に設置した。嫌気ボックス１４には、常時窒素ガスを注入し（０．２Ｌ／ｍｉｎ）、嫌気雰囲気を維持した。
【００５６】
（３）微生物群集からの硫酸還元細菌の集積の検討
以下の（ａ）〜（ｄ）に示す条件で、微生物群集を含む０．５〜１．０×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬの懸濁液を、培養液１００ｍＬに対して２ｍＬ添加し、上記電気培養装置１で１週間培養して、ＤＧＧＥ（変性剤濃度勾配ゲル電気泳動）法により微生物群集の遺伝子解析を行った。尚、以下に説明する酸化還元電位は、銀・酸化銀参照電極１１に対する値である。また、微生物群集は、本願発明者等が財団法人電力中央研究所の我孫子研究所近辺の水田及び手賀沼から採取した泥を低温保存していたものに含まれていたものであり、実験の際には、この泥をそのまま使用した。
（ａ）酸化還元電位：制御せず
（ｂ）酸化還元電位：＋０．４Ｖ
（ｃ）酸化還元電位：−０．１Ｖ
（ｄ）酸化還元電位：−０．６Ｖ
【００５７】
ＤＧＧＥ法は、以下の手順により行った。培養終了後の培養液４ｂをそれぞれ２ｍＬ採取し、これをＴＥバッファーに懸濁・撹拌して３０分間静置し、上清を採取して１５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈殿を回収した。この沈殿に細胞壁分解酵素とproteinase Kを含むＤＮＡ抽出用バッファー（５００Ｕ／ｍＬ  アクロモペプチダーゼ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  塩化ナトリウム）を添加し、培養液４ｂに含まれる微生物群集由来のＤＮＡを抽出した。
【００５８】
抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により１６Ｓ ｒＤＮＡの約２００ｂｐを増幅した。プライマーには、環境微生物の検索に用いられる一般的なユニバーサルプライマー（E.coil No.341-534)を使用した。使用したプライマーの塩基配列を図５に示す。ＤＮＡポリメラーゼにはＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（Applied Biosystem, CA, USA）を用い、サーマルサイクラーにはＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Applied Biosystem, CA, USA）を用いた。ＰＣＲの条件は、９４℃（３０秒）→５５℃（３０秒）→７２℃（３０秒）を１サイクルとし、これを３０サイクル繰り返した。
【００５９】
ＰＣＲにより得られた産物をＤＧＧＥ解析の試料とした。ＤＧＧＥはＤｃｏｄｅ  ＤＧＧＥコンプリートシステム（BIO RAD, CA, USA）を用いて行った。変性剤濃度勾配は電気泳動方向に２０％→７０％とした。ポリアクリルアミドゲル濃度は１０％とした。ゲル変性剤には尿素（BIO RAD, CA, USA）とホルムアミド（BIO RAD, CA, USA）を使用した。電気泳動条件は、電圧を１００Ｖとし、泳動時間を５時間とした。
【００６０】
電気泳動終了後、変性剤濃度勾配ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、染色されたＤＮＡがＵＶ（３１０ｎｍ）照射下で発光する励起光をＣＣＤカメラで撮影した。
【００６１】
ＤＧＧＥ解析結果を図６に示す。図６においてレーン１はサイズマーカーを示し、レーン２は上記（ａ）の条件で培養した結果を示し、レーン３は上記（ｂ）の条件で培養した結果を示し、レーン４は上記（ｃ）の条件で培養した結果を示し、レーン５は上記（ｄ）の条件で培養した結果を示している。この結果から、酸化還元電位を制御せずに培養した場合には少なくとも４種類の微生物が存在することが確認された（レーン２）。これに対し、酸化還元電位を−０．６Ｖに制御した場合には、レーン２で示された４種のバンドのうち、一番下のバンドのみが存在していることが確認され、しかもこのバンドの色が濃かったことから、一番下のバンドに由来する微生物のみが優先的に増殖していることが明らかとなった（レーン５）。
【００６２】
次に、得られたDGGE解析結果をもとにレーン２において一番下に存在するＤＮＡバンドを切り出し、ＤＮＡを抽出した後、その一部を鋳型としてＧＣクランプのないユニバーサルプライマー（E.coil No.341-534）を用いて再度PCRを行い、増幅したDNA断片を定法に基づきクローニング後、ABI PRISM BigDye termination v3.0 cycle sequencing kit とABI PRISM 3100 genetic analyzer (Applied Biosystems Japan, Tokyo) を用い、dideoxy nucleotide chain termination法により塩基配列の同定を行った。そして、同定した塩基配列をもとに国際塩基配列データベース(Genebank, EMBL, DDBJ)を使用して一致する16S rRNA 遺伝子を検索したところ、この遺伝子が、硫酸還元細菌の16Sr RNA遺伝子と一致した。したがって、レーン２において一番下に存在しているＤＮＡバンドは、硫酸還元細菌由来のバンドであり、酸化還元電位を−０．６Ｖに制御することにより、複数の微生物群から、硫酸還元細菌のみを優先的に増殖させることが可能であることが明らかとなった。
【００６３】
（４）硫酸還元細菌単独での生育の促進効果の検討
次に、硫酸還元細菌として、Desulfovibrio desulfuricans(ATCC7757）を使用し、培養液の酸化還元電位を制御した場合の硫酸還元細菌単独での増殖の促進効果について検討した。
【００６４】
硫酸還元細菌２の培養には、上記電気培養装置１と同様の培養装置を用いた。但し、酸化還元物質３として、キノン化合物であるアントラキノン−２，６−ジスルホン酸（アントラキノン−２，６−ジスルホン酸二ナトリウム０．４２ｇを培養液４ｂに添加）を使用した。また、硫酸還元細菌Desulfovibrio desulfuricans(ATCC7757)は、乳酸を炭素源として培養可能であるが、生育に必要な微量元素を補填する目的で酵母エキスの添加も上記の培養液の場合と同様に行った。
【００６５】
硫酸還元細菌の初期添加量は、培養液１００ｍＬに対して０．５〜１．０×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬの懸濁液を２ｍＬとした。そして、以下の（ｅ）〜（ｈ）に示す条件で７０時間培養を行った。
（ｅ）酸化還元電位：＋０．４Ｖ
（ｆ）酸化還元電位：−０．４５Ｖ
（ｇ）酸化還元電位：−０．７Ｖ
（ｈ）酸化還元電位：制御せず
【００６６】
培養開始直後（０時間）と、培養開始から８時間後，２２時間後，３６時間後，４０時間後，４６時間後，５８時間後，７０時間後の菌体密度を光学顕微鏡を用いて計測した。また、培養開始直後（０時間）と、培養開始から８時間後，２２時間後，３６時間後，４０時間後，４６時間後，５８時間後，７０時間後の硫酸イオン濃度をイオンクロマトアナライザ（ＩＣＳ-１５００、ＤＩＯＮＥＸ製）により測定した。さらに、培養開始直後（０時間）と、培養開始から２２時間後、３６時間後、４０時間後、４６時間後、５８時間後、７０時間後の乳酸イオン濃度をイオンクロマトアナライザ(ＩＣＳ-１５００、ＤＩＯＮＥＸ製)により測定した。
【００６７】
菌体密度の計測結果を図７に示し、硫酸イオン濃度の測定結果を図８に示し、乳酸イオン濃度の測定結果を図９に示す。図７〜９において、◆は酸化還元電位を＋０．４Ｖに制御して培養した場合の測定結果を示し（ｅ）、■は酸化還元電位を−０．４５Ｖに制御して培養した場合の測定結果を示し（ｆ）、▲は酸化還元電位を−０．７Ｖに制御して培養した場合の測定結果を示し（ｇ）、×は酸化還元電位を制御せずに培養した場合の測定結果を示している（ｈ）。
【００６８】
図７に示す結果から、酸化還元電位を−０．７Ｖに制御して培養した場合に、培養開始から硫酸還元細菌が増殖し始めるまでの期間である誘導期が短くなることが明らかとなった。一方、酸化還元電位を−０．４５Ｖに制御した場合、＋０．４Ｖに制御した場合には、酸化還元電位を制御しなかった場合と誘導期がほぼ等しかった。対数増殖期の曲線の傾きについては、どの培養条件においてもそれほど大きな差は見られなかった。このことから、酸化還元電位を−０．７Ｖに制御して培養することで、酸化還元電位を制御せずに培養した場合よりも誘導期を短縮して増殖を促進できることが明らかとなった。
【００６９】
また、図８並びに図９に示されるように、酸化還元電位を−０．７Ｖに制御して培養した場合には、硫酸イオン濃度と乳酸イオン濃度の減少速度が高まることが明らかとなった。つまり、酸化還元電位を−０．７Ｖに制御して培養した場合には、酸化還元電位を制御せずに培養した場合よりも誘導期が短縮されて増殖が促進され、その結果として電子受容体である硫酸イオンと炭素源である乳酸イオンの消費速度が高まったものと考えられる。
【００７０】
次に、酸化還元電位を−０．６Ｖ、−０．８Ｖとした場合についても硫酸還元細菌の培養を行い、酸化還元電位を＋０．４Ｖ、−０．４５Ｖ、−０．６Ｖ、−０．７Ｖ、−０．８Ｖとした場合の誘導期短縮時間を算出して、酸化還元電位による誘導期短縮時間の変動傾向を検討した。
【００７１】
誘導期短縮時間は以下の手順で算出した。まず、酸化還元電位を制御せずに培養した場合の初期菌密度と最大到達菌密度の中点（対数増殖期中点）における培養時間Ｔｃを求め、次に、酸化還元電位を各種制御して培養した場合の初期菌密度と最大到達菌密度の中点（対数増殖期中点）における培養時間Ｔｓを求め、ＴｃとＴｓとの差を求めることで算出した。
【００７２】
結果を図１０に示す。酸化還元電位を−０．６Ｖ〜−０．８Ｖとすることで誘導期短縮時間が６時間以上になることが明らかとなった。また、しかも、酸化還元電位を−０．６Ｖとした場合よりも−０．８Ｖとした場合の方が誘導期短縮時間が高まり、増殖が促進されやすいことが確認された。このことから、酸化還元電位Ｘ（Ｖ）をＸ≦−０．８とした場合であっても誘導期を短縮して増殖速度を高めることができるものと考えられた。しかしながら、酸化還元電位をＸ＜−０．８とすると、対極１０からの水素発生量が増加しすぎて酸化還元電位の制御が正確に行えなくなることが判明した。したがって、酸化還元電位は−０．８Ｖ〜−０．６Ｖとすることが好適であることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】本発明の硫酸還元細菌の培養方法の実施形態の一例を示す概念図である。
【図２】培養液の酸化還元電位の制御に関する説明図である。
【図３】本発明の排水処理方法の実施形態の一例を示す概念図である。
【図４】実験に使用した電気培養装置の概念図である。
【図５】１６ｓ ｒＤＮＡのＰＣＲに使用したプライマーを示す図である。
【図６】ＤＧＧＥ解析の結果を示す電気泳動写真である。
【図７】各種酸化還元電位で硫酸還元細菌を培養した場合の培養液の菌体密度の経時変化を示す図である。
【図８】各種酸化還元電位で硫酸還元細菌を培養した場合の培養液の硫酸イオンの経時変化を示す図である。
【図９】各種酸化還元電位で硫酸還元細菌を培養した場合の培養液の乳酸イオンの経時変化を示す図である。
【図１０】各種酸化還元電位で硫酸還元細菌を培養した場合の誘導期短縮期間を示すグラフである。
【符号の説明】
【００７４】
２  硫酸還元細菌
３  酸化還元物質
４,４ａ,４ｂ  培養液
９  作用極
１０  対極
１１  銀・塩化銀電極（参照電極）
１３  硫酸イオン
１８  排水
２１  重金属
【図１】
0005416355.tif 000002
【図３】
0005416355.tif 000003
【図４】
0005416355.tif 000004
【図５】
0005416355.tif 000005
【図７】
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【図８】
0005416355.tif 000007
【図９】
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【図２】
0005416355.tif 000009
【図６】
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【図１０】
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【配列表】
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