(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＤＹＹＭＨを含む、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１；
アミノ酸配列ＹＩＳＲＳＧＳＬＩＹＹＶＤＳＶＫＧを含む、重鎖ＣＤＲ２；
アミノ酸配列ＧＧＰＹＳＧＳＰＦＤＹを含む、重鎖ＣＤＲ３；
アミノ酸配列ＲＰＳＱＲＩＳＲＹＬＮを含む、軽鎖ＣＤＲ１；
アミノ酸配列ＡＡＳＳＬＰＳを含む、軽鎖ＣＤＲ２；
アミノ酸配列ＱＱＳＹＳＴＰＰＷＴを含む、軽鎖ＣＤＲ３；
を含み、ＰＤＧＦＲ−アルファに約４０ｐＭ未満のＫｄで結合する、ＰＤＧＦＲ−アルファに特異的に結合する単離された抗体またはその抗体の結合性フラグメント。
【請求項２】
２μｇ／ｍｌの濃度でＰＤＧＦＲ−アルファに結合し、２５ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＡＡとインキュベートするＭＧ−６３細胞においてＰＤＧＦＲ−アルファのチロシンリン酸化を９０％以上阻害する、請求項１に記載の抗体またはその抗体の結合性フラグメント。
【請求項３】
ＰＤＧＦＲ−ベータ受容体とは交差反応しない、請求項１または２に記載の抗体またはその抗体の結合性フラグメント。
【請求項４】
哺乳動物において腫瘍の増殖および転移を阻害する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体の結合性フラグメント。
【請求項５】
重鎖がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１３４のアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体の結合性フラグメント。
【請求項６】
軽鎖がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１３５のアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体の結合性フラグメント。
【請求項７】
抗体が完全ヒトモノクローナル抗体であるか、結合性フラグメントが完全ヒトモノクローナル抗体の結合性フラグメントである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体の結合性フラグメント。
【請求項８】
結合性フラグメントがＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはｄＡｂである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体の結合性フラグメント。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体の結合性フラグメントをコードする核酸分子。
【請求項１０】
請求項９の核酸分子を含むベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体の結合性フラグメント、および療法薬を含む、コンジュゲート。
【請求項１３】
療法薬が毒素である、請求項１２のコンジュゲート。
【請求項１４】
療法薬が放射性同位体である、請求項１２のコンジュゲート。
【請求項１５】
療法薬が医薬組成物である、請求項１２のコンジュゲート。
【請求項１６】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体の結合性フラグメントおよび医薬的に許容できるキャリヤーを含む組成物。
【請求項１７】
新生物疾患の処置のための医薬の調製における、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体の結合性フラグメントの使用。
【請求項１８】
新生物疾患が、黒色腫、小細胞性肺癌、非小細胞性肺癌、神経膠腫、肝細胞性癌、胆管癌、および頭頚部癌である、請求項１７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引照
本出願は３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９のもとで、米国仮特許出願Ｎｏ．６０／８３５，６４７（２００６年８月３日出願）に基づく優先権を主張し、その全体を本明細書に援用する。
【０００２】
技術分野
本発明は、ターゲット抗原ＰＤＧＦＲ−アルファに対するターゲテッド結合剤（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）およびそれらの結合剤の使用に関する。ある態様において、本発明はＰＤＧＦＲ−アルファに対して指向性である完全ヒトモノクローナル抗体およびそれらの抗体の使用に関する。本発明の観点は、それらのターゲテッド結合剤または抗体を発現するハイブリドーマまたは他の細胞系にも関する。記載したターゲテッド結合剤および抗体は、ＰＤＧＦＲ−アルファの活性および／または過剰発現に関連する疾患の診断薬として、またその処置に有用である。
【背景技術】
【０００３】
血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は細胞の増殖および分裂を調節するタンパク質である。５つの異なるイソ型のＰＤＧＦ（Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＡＢヘテロ二量体）があり、これらは二量体として存在し、２つの異なる受容体（ＰＤＧＦＲ−アルファおよびＰＤＧＦＲ−ベータ）を介して細胞応答を活性化する。詳細には、ＰＤＧＦ二量体は２つの受容体に同時に結合して受容体の二量体化、自己リン酸化および細胞内シグナル伝達を誘導する。
【０００４】
血小板由来増殖因子受容体−アルファ（ＰＤＧＦＲ−アルファ、ＣＤ１４０ａとしても知られる）は、５つのＩｇＧ様ドメインをもつ細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび触媒性細胞内ドメインを特徴とする、タイプＩＩＩ受容体型チロシンキナーゼである。ＰＤＧＦＲ−アルファは、ホモ二量体、または構造類似ＰＤＧＦＲ−ベータとのヘテロ二量体を形成することができる。ＰＤＧＦ−ＡＡはアルファ−アルファ受容体二量体のみを活性化し、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＣＣはアルファ−アルファおよび／またはアルファ−ベータ受容体二量体を活性化し、ＰＤＧＦ−ＢＢは３種類すべての組合わせの受容体二量体を活性化する。
【０００５】
ＰＤＧＦＲ−アルファは腫瘍発生に関係づけられ、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、大腸癌および子宮内膜癌、ならびに肝細胞性癌、神経膠腫、黒色腫および消化器間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）を含めた多数の癌に関連があるとされている。
【０００６】
ＰＤＧＦＲ−アルファをターゲティングする治療薬を数社が開発した。Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ（登録商標））およびＳＵＴＥＮＴ／ＳＵ１１２４８（リンゴ酸スニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ  ｍａｌａｔｅ），Ｐｆｉｚｅｒ（登録商標））は、ＰＤＧＦＲ−アルファおよび他の受容体型チロシンキナーゼをターゲティングする低分子薬物である。さらに、ＰＤＧＦＲ−アルファをターゲティングするモノクローナル抗体が報告された。国際特許出願公開番号ＷＯ１９９２／０１３８６７には、ＰＤＧＦ受容体構築体に対するマウスまたはラットのモノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体を作製しうると記載されている。国際特許出願公開番号ＷＯ１９９５／０００６５９はＰＤＧＦＲ−アルファに特異的なモノクローナル抗体に関連し、それはＰＤＧＦＲ−アルファを結合し、ＰＤＧＦＲ−ベータを結合しないことを特徴とする。その出願は２種類の抗体を開示している；これらは固相酵素結合イムノソルベントアッセイにより測定して５０ｐＭおよび７５ｐＭの最大半量結合アフィニティーをもつことを特徴とする。国際特許出願公開番号ＷＯ２００６／１３８７２９には、ＰＤＧＦＲ−アルファをターゲティングする３Ｇ３（ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）と呼ばれる完全ヒトモノクローナル抗体が開示されている。報告によれば、この抗体は二価アフィニティーアッセイにより測定して可溶性ＰＤＧＦＲ−アルファアに対し４０ｐＭのフィニティーをもつ；その場合、可溶性ＰＤＧＦＲ−アルファはセンサーチップ上に固定化され、種々の濃度の抗体が注入された。本明細書に述べるように、二価アッセイでは実験アーティファクトがアフィニティー測定値に影響を及ぼす可能性がある。
【０００７】
４０ｐＭより高いアフィニティーをもつ抗体が望ましいであろう；そのような抗体は、ヒトに標準量で投与した場合、より高度および／またはより長期間のＰＤＧＦＲ−アルファ阻害を生じる可能性があるからである。４０ｐＭより高いアフィニティーをもつ抗体はより低いアフィニティーをもつ抗体より低い有効量で投与でき、あるいはより低いアフィニティーをもつ抗体に標準的な投与期間と比較してより長い投与期間、投与できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際特許出願公開番号ＷＯ１９９２／０１３８６７
【発明の概要】
【０００９】
本発明の態様は、ＰＤＧＦＲ−アルファに特異的に結合し、ＰＤＧＦＲ−アルファを発現する細胞の増殖を阻害する、ターゲテッド結合剤に関する。これを達成できる機序には、リガンド結合の遮断、および／または腫瘍細胞増殖に関連があるとされる細胞シグナル伝達の阻害、ならびに間質線維芽細胞成分を阻害して血管形成を低下させることが含まれる可能性があるが、これらに限定されない。これらのターゲテッド結合剤は腫瘍増殖および血管形成を低下させるために有用である。
【００１０】
本発明の１態様において、ターゲテッド結合剤は、ＰＤＧＦＲ−アルファに結合してＰＤＧＦＲ−アルファへのＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢおよび／またはＰＤＧＦ−ＣＣリガンドの結合を阻害する、完全ヒト抗体である。本発明のさらに他の態様は、ＰＤＧＦＲ−アルファに結合して受容体の自己リン酸化を阻害する、完全ヒトモノクローナル抗体である。本発明のさらに他の態様は、ＰＤＧＦＲ−アルファに結合して細胞増殖に関連があるとされる下流の細胞シグナル伝達を阻害する、完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００１１】
ある態様において、ターゲテッド結合剤はＰＤＧＦＲ−アルファに結合し、ＰＤＧＦＲ−ベータ受容体とは交差反応しない；すなわち、本発明の結合剤は一特異性である。ある態様において、ターゲテッド結合剤はＰＤＧＦＲ−アルファに結合し、クラスＩＩＩ受容体型チロシンキナーゼファミリーの他のメンバー、たとえばＦＬＴ３、ｃ−ｋｉｔおよび／またはＣＳＦ−１Ｒとは交差反応しない。
【００１２】
本発明の他の態様は、結合に関して本明細書に記載するいずれかのターゲテッド結合剤または抗体と競合するターゲテッド結合剤である。
１態様において、ターゲテッド結合剤は約５００ピコモル濃度（ｐＭ）未満のＫＤでＰＤＧＦＲ−アルファを結合する。他の態様において、ターゲテッド結合剤は約４００、３００、２００または１００ｐＭ未満のＫＤで結合する。１態様において、ターゲテッド結合剤は約７５、６０、５０、４０、３０、２０、１０または５ｐＭ未満のＫＤで結合する。アフィニティーおよび／またはアビディティー測定値は、本明細書に記載するように、ＦＭＡＴ、ＦＡＣＳ、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）および／またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）により測定できる。
【００１３】
他の態様において、ターゲテッド結合剤は一価アフィニティーアッセイで測定して約４００、３００、２００、または１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１０、または５ｐＭ未満のＫＤでＰＤＧＦＲ−アルファを結合する。一価アフィニティーは、可溶性受容体を固定化抗体上に流すＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）アッセイにより測定できる。二価アフィニティーアッセイと比較して、一価アフィニティーアッセイにより報告されるＫＤは実験アーティファクトにより影響を受ける可能性がはるかに少ないので、抗体の真の一価アフィニティーにはるかに近似するＫＤを報告することができる。二価アフィニティーアッセイにおいては、一価抗体分子が固定化受容体上を流れるのに伴って固定化受容体を２回結合および／または再結合する度合いに、固定化受容体の密度が影響を及ぼす。したがって、二価アフィニティーアッセイにおいては、報告されるＫＤに受容体密度が直接影響する可能性がある。このため、一価アフィニティーアッセイの方がはるかに生物学的関係性の高いアフィニティー測定値を提供する。
【００１４】
他の態様において、ターゲテッド結合剤は、飽和リガンド濃度に近似する状態で実施した場合、受容体二量体内でのリガンド誘導リン酸基転移を約４００、３００、２００、または１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１０、または５ｐＭ未満のＩＣ５０で阻害する。
【００１５】
他の態様において、ターゲテッド結合剤は、飽和リガンド濃度に近い状態で実施した場合、リガンド誘導による受容体自己リン酸化を約４００、３００、２００、１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１０または５ｐＭ未満のＩＣ５０で阻害する。
【００１６】
本発明の１態様において、ターゲテッド結合剤は抗体である。本発明の１態様において、ターゲテッド結合剤はモノクローナル抗体である。本発明の１態様において、ターゲテッド結合剤は完全ヒトモノクローナル抗体である。本発明の他の態様において、ターゲテッド結合剤はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４イソ型の完全ヒトモノクローナル抗体である。本発明の他の態様において、ターゲテッド結合剤はＩｇＧ２イソ型の完全ヒトモノクローナル抗体である。このイソ型は他のイソ型と比較してエフェクター機能を誘発する可能性が低く、これにより毒性が低下する可能性がある。
【００１７】
他の態様は、ＰＤＧＦＲ−アルファに結合し、表１２に示す１、２または３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）配列をもつＨ鎖（重鎖）アミノ酸配列、および表１３に示す１、２または３つのＣＤＲ配列をもつＬ鎖（軽鎖）アミノ酸配列を含む、抗体である。ある態様において、抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。ある態様において、本発明は、本明細書に記載するいずれかの抗体が結合するものと同一のエピトープに結合する抗体を提供する。
【００１８】
１態様においては、抗体２．１７５．３、２．４５１．１、２．４４９．１．３、２．９９８．２または２．８４．３のＨ鎖をヘテロロガスＬ鎖と対合させる。Ｌ鎖の乱交雑性（ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ）は当技術分野で十分に確立されている。したがって、抗体２．１７５．３、２．４５１．１、２．４４９．１．３、２．９９８．２もしくは２．８４．３または本明細書に開示する他の抗体のうちいずれかのＨ鎖を、抗体２．１７５．３、２．４５１．１、２．４４９．１．３、２．９９８．２、２．８４．３または本明細書に開示する他の抗体のうちいずれのＬ鎖とも対合させることができる。
【００１９】
１態様において、抗原結合部位は、開示したＣＤＲ内に２０、１６、１０、９またはそれ未満、たとえば１、２、３、４または５つのアミノ酸の付加、置換、欠失および／または挿入を含む抗体２．１７５．３、２．４５１．１、２．４４９．１．３、２．９９８．２、２．８４．３のうちいずれかのＨ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびにＬ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むことができる。そのような修飾は、それらのＣＤＲ内のいずれの残基においても行なうことができる。
【００２０】
他の態様において、ターゲテッド結合剤または抗体は、表１２または表１３に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のうちいずれか１、２、３、４、５または６つを含む配列を含むことができる。他の態様において、ターゲテッド結合剤または抗体は、表１２に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含むことができる。他の態様において、ターゲテッド結合剤または抗体は、表１３に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含むことができる。他の態様において、ターゲテッド結合剤または抗体は、表１２に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに表１３に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含むことができる。ＣＤＲの決定は当業者が容易に達成できることを明記する。たとえば、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, NIH Publication 91-3242, メリーランド州ベセスダ(1991), vols. 1-3を参照。
【００２１】
他の態様において、ターゲテッド結合剤または抗体は、表１２または表１３に示す完全ヒトモノクローナル抗体２．１７５．３、２．４４９．１．３または２．９９８．２のいずれかのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列のうちいずれか１、２、３、４、５または６つを含む配列を含むことができる。１態様において、ターゲテッド結合剤または抗体は、表１２に示す完全ヒトモノクローナル抗体２．１７５．３、２．４４９．１．３または２．９９８．２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含むことができる。他の態様において、ターゲテッド結合剤または抗体は、表１３に示す完全ヒトモノクローナル抗体２．１７５．３、２．４４９．１．３または２．９９８．２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含むことができる。他の態様において、ターゲテッド結合剤または抗体は、表１２に示す完全ヒトモノクローナル抗体２．１７５．３、２．４４９．１．３または２．９９８．２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに表１３に示す完全ヒトモノクローナル抗体２．１７５．３、２．４４９．１．３または２．９９８．２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含むことができる。
【００２２】
他の態様において、ターゲテッド結合剤または抗体は、表１２に示す完全ヒトモノクローナル抗体２．１７５．３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに表１３に示す完全ヒトモノクローナル抗体２．１７５．３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含むことができる。他の態様において、ターゲテッド結合剤または抗体は、表１２に示す完全ヒトモノクローナル抗体２．４４９．１．３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに表１３に示す完全ヒトモノクローナル抗体２．４４９．１．３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含むことができる。他の態様において、ターゲテッド結合剤または抗体は、表１２に示す完全ヒトモノクローナル抗体２．９９８．２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに表１３に示す完全ヒトモノクローナル抗体２．９９８．２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含むことができる。
【００２３】
本発明の他の態様は、ＰＤＧＦＲ−アルファへの結合に関して本発明のターゲテッド結合剤または抗体と競合するターゲテッド結合剤である。本発明の他の態様には、ＰＤＧＦＲ−アルファへの結合に関して本発明のターゲテッド結合剤または抗体と競合する抗体がある。他の態様において、ターゲテッド結合剤または抗体は、ＰＤＧＦＲ−アルファへの結合に関して完全ヒトモノクローナル抗体２．１７５．３、２．４４９．１．３または２．９９８．２のいずれか１つと競合する。本発明の１態様においては、ＰＤＧＦＲ−アルファへの結合に関して完全ヒトモノクローナル抗体２．１７５．３、２．４４９．１．３または２．９９８．２のいずれか１つと競合する抗体が提供される。
【００２４】
本発明の他の態様は、ＰＤＧＦＲ−アルファ上において本発明のターゲテッド結合剤または抗体が結合するものと同一のエピトープに結合するターゲテッド結合剤または抗体である。本発明の他の態様には、ＰＤＧＦＲ−アルファ上において本発明のターゲテッド結合剤または抗体が結合するものと同一のエピトープに結合する抗体がある。本発明の１態様においては、ＰＤＧＦＲ−アルファ上において完全ヒトモノクローナル抗体２．１７５．３、２．４４９．１．３または２．９９８．２のいずれか１つが結合するものと同一のエピトープに結合するターゲテッド結合剤が提供される。本発明の１態様においては、ＰＤＧＦＲ−アルファ上において完全ヒトモノクローナル抗体２．１７５．３、２．４４９．１．３または２．９９８．２のいずれか１つが結合するものと同一のエピトープに結合する抗体が提供される。
【００２５】
本発明の他の態様は、枠組み構造領域および／または相補性決定領域（ＣＤＲ）に及ぶ連続Ｈ鎖およびＬ鎖配列、具体的には表１２または表１３に示すモノクローナル抗体のいずれかのＦＲ１〜ＦＲ４またはＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含むターゲテッド結合剤または抗体である。
【００２６】
１態様は、ターゲテッド結合剤またはその抗原結合部分であって、結合剤またはその結合部分がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２の配列をもつＨ鎖ポリペプチドを含むものを提供する。１態様において、結合剤またはその結合部分はさらにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：４の配列をもつＬ鎖ポリペプチドを含む。他の態様は、ターゲテッド結合剤またはその抗原結合部分であって、結合剤または結合部分がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１０の配列をもつＨ鎖ポリペプチドを含むものを提供する。１態様において、結合剤またはその結合部分はさらにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１２の配列をもつＬ鎖ポリペプチドを含む。さらに他の態様は、ターゲテッド結合剤またはその抗原結合部分であって、結合剤またはその結合部分がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１４の配列をもつＨ鎖ポリペプチドを含むものを提供する。１態様において、結合剤またはその結合部分はさらにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１６の配列をもつＬ鎖ポリペプチドを含む。
【００２７】
１態様において、ターゲテッド結合剤は完全ヒトモノクローナル抗体２．１７５．３、２．４４９．１．３または２．９９８．２のうち１以上を含む。
１態様において、本発明のターゲテッド結合剤はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２の配列を含むポリペプチドを含み、その際、この配列は表６の各列により示される生殖細胞系列および非生殖細胞系列の残基のユニーク組合わせのいずれか１つを含む。１態様において、本発明のターゲテッド結合剤はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１０の配列を含むポリペプチドを含み、その際、この配列は表８の各列により示される生殖細胞系列および非生殖細胞系列の残基のユニーク組合わせのいずれか１つを含む。１態様において、本発明のターゲテッド結合剤はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１４の配列を含むポリペプチドを含み、その際、この配列は表１０の各列により示される生殖細胞系列および非生殖細胞系列の残基のユニーク組合わせのいずれか１つを含む。１態様において、本発明のターゲテッド結合剤はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：４の配列を含むポリペプチドを含み、その際、この配列は表７の各列により示される生殖細胞系列および非生殖細胞系列の残基のユニーク組合わせのいずれか１つを含む。１態様において、本発明のターゲテッド結合剤はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１２の配列を含むポリペプチドを含み、その際、この配列は表９の各列により示される生殖細胞系列および非生殖細胞系列の残基のユニーク組合わせのいずれか１つを含む。１態様において、本発明のターゲテッド結合剤はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１６の配列を含むポリペプチドを含み、その際、この配列は表１１の各列により示される生殖細胞系列および非生殖細胞系列の残基のユニーク組合わせのいずれか１つを含む。
【００２８】
１態様において、本発明の抗体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２の配列を含むＨ鎖ポリペプチドを含み、その際、この配列は表６の各列により示される生殖細胞系列および非生殖細胞系列の残基のユニーク組合わせのいずれか１つを含む。１態様において、本発明の抗体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１０の配列を含むＨ鎖ポリペプチドを含み、その際、この配列は表８の各列により示される生殖細胞系列および非生殖細胞系列の残基のユニーク組合わせのいずれか１つを含む。１態様において、本発明の抗体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１４の配列を含むＨ鎖ポリペプチドを含み、その際、この配列は表１０の各列により示される生殖細胞系列および非生殖細胞系列の残基のユニーク組合わせのいずれか１つを含む。１態様において、本発明の抗体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：４の配列を含むＬ鎖ポリペプチドを含み、その際、この配列は表７の各列により示される生殖細胞系列および非生殖細胞系列の残基のユニーク組合わせのいずれか１つを含む。１態様において、本発明の抗体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１２の配列を含むＬ鎖ポリペプチドを含み、その際、この配列は表９の各列により示される生殖細胞系列および非生殖細胞系列の残基のユニーク組合わせのいずれか１つを含む。１態様において、本発明の抗体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１６の配列を含むＬ鎖ポリペプチドを含み、その際、この配列は表１１の各列により示される生殖細胞系列および非生殖細胞系列の残基のユニーク組合わせのいずれか１つを含む。
【００２９】
１態様において、本発明のターゲテッド結合剤または抗体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２、６または１０に従うＨ鎖配列を含み、その際、
位置３０の残基はＳまたはＲから選択され；
位置３１の残基はＳ、ＮまたはＤから選択され；
位置３３の残基はＧまたはＹから選択され；
位置３５の残基はＳ、ＨまたはＮから選択され；
位置５０の残基はＹ、ＶまたはＦから選択され；
位置５３の残基はＹ、ＳまたはＲから選択され；
位置５４の残基はＳまたはＤから選択され；
位置５７の残基はＴ、Ｌ、ＮまたはＩから選択され；
位置５８の残基はＫまたはＩから選択され；
位置６１の残基はＶまたはＡから選択され；
位置９９の残基はＧ、ＤまたはＥから選択され、あるいはこの残基は欠失し；
位置１００の残基はＧから選択され、あるいはこの残基は欠失し；
位置１０１の残基はＳ、Ｈ、ＰまたはＲから選択され；
位置１０２の残基はＹまたはＩから選択され；
位置１０３の残基はＳ、ＶまたはＡから選択され；
位置１０４の残基はＧまたはＡから選択され；
位置１０５の残基はＳまたはＲから選択され；
位置１０６の残基はＰまたはＧから選択され；
位置１０７の残基はＦまたはＭから選択され；
位置１０９の残基はＹまたはＶから選択される。このグループのＨ鎖配列を”グループＡ”と命名する。
【００３０】
１態様において、本発明のターゲテッド結合剤または抗体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１４または１８に従うＨ鎖配列を含み、その際、
位置２７の残基はＧまたはＤから選択され；
位置２８の残基はＳまたはＦから選択され；
位置３２の残基はＳまたはＦから選択され；
位置３３の残基はＳ、Ｎ、ＴまたはＩから選択され；
位置５２の残基はＳまたはＴから選択され；
位置５６の残基はＳまたはＴから選択され；
位置５８の残基はＳまたはＴから選択され；
位置６３の残基はＳまたはＰから選択され；
位置１００の残基はＨから選択され、あるいはこの残基は欠失し；
位置１０１の残基はＨから選択され、あるいはこの残基は欠失し；
位置１０３の残基はＶから選択され、あるいはこの残基は欠失している。このグループのＨ鎖配列を”グループＢ”と命名する。
【００３１】
１態様において、本発明のターゲテッド結合剤または抗体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：４、８または１２に従うＬ鎖配列を含み、その際、
位置２５の残基はＡまたはＰから選択され；
位置２７の残基はＱ、ＲまたはＨから選択され；
位置２８の残基はＧ、Ｖ、Ｓ、Ｉ、ＤまたはＲから選択され；
位置２９の残基はＩまたはＦから選択され；
位置３０の残基はＳ、Ｎ、Ａ、ＲまたはＴから選択され；
位置３１の残基はＳ、Ｈ、Ｋ、ＴまたはＲから選択され；
位置３２の残基はＳ、Ｔ、Ｙ、Ｄ、ＮまたはＦから選択され；
位置３３の残基はＬまたはＩから選択され；
位置５０の残基はＡ、Ｇ、Ｌ、Ｙ、ＳまたはＶから選択され；
位置５１の残基はＡ、ＧまたはＳから選択され；
位置５３の残基はＴ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、ＲまたはＳから選択され；
位置５４の残基はＬ、ＲまたはＳから選択され；
位置５５の残基はＱ、Ｐ、Ｆ、ＡまたはＶから選択され；
位置５６の残基はＳ、Ｎ、ＴまたはＧから選択され；
位置９１の残基はＳまたはＴから選択され；
位置９２の残基はＹまたはＦから選択され；
位置９４の残基はＮ、Ｔ、Ｓから選択され、あるいはこの残基は欠失し；
位置９５の残基はＦ、Ｗ、Ｐ、Ｉ、Ａ、Ｌから選択され、あるいはこの残基は欠失し；
位置９６の残基はＰから選択され、あるいはこの残基は欠失し；
位置９７の残基はＷ、Ｌ、Ｒ、Ｉから選択され、あるいはこの残基は欠失している。このグループのＬ鎖配列を”グループＣ”と命名する。
【００３２】
１態様において、本発明のターゲテッド結合剤または抗体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１６または２０に従うＬ鎖配列を含み、その際、
位置２８の残基はＳ、Ｉ、Ｇ、Ｄ、ＲまたはＶから選択され；
位置２９の残基はＦ、ＩまたはＶから選択され；
位置３０の残基はＳ、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＲまたはＮから選択され；
位置３１の残基はＳ、Ｒ、Ｋ、ＮまたはＴから選択され；
位置３２の残基はＹ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、ＤまたはＳから選択され；
位置３３の残基はＬまたはＩから選択され；
位置３４の残基はＮ、ＡまたはＨから選択され；
位置５０の残基はＡ、Ｙ、Ｇ、ＬまたはＶから選択され；
位置５１の残基はＡ、ＧまたはＳから選択され；
位置５２の残基はＡ、Ｙ、Ｇ、ＬまたはＶから選択され；
位置５４の残基はＬ、ＲまたはＳから選択され；
位置５５の残基はＱ、Ｆ、Ｖ、ＡまたはＰから選択され；
位置５６の残基はＳ、Ｎ、ＴまたはＧから選択され；
位置９２の残基はＳまたはＴから選択され；
位置９３の残基はＳ、ＮまたはＩから選択される。このグループのＬ鎖配列を”グループＤ”と命名する。
【００３３】
１態様において、本発明のターゲテッド結合剤または抗体は、グループＡのいずれかのＨ鎖配列、およびグループＣまたはグループＤのいずれかのＬ鎖配列を含む。
１態様において、本発明のターゲテッド結合剤または抗体は、グループＢのいずれかのＨ鎖配列、およびグループＣまたはグループＤのいずれかのＬ鎖配列を含む。
【００３４】
１態様において、ターゲテッド結合剤は抗体を含み、これは本明細書に開示するＣＤＲまたは本明細書に開示するＬ鎖もしくはＨ鎖配列または本明細書に開示するモノクローナル抗体の変異型もしくは誘導体を含む。変異型には、表１２もしくは表１３に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３のいずれか、または本明細書に開示するＬ鎖もしくはＨ鎖配列、または本明細書に開示するモノクローナル抗体と、少なくとも約６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８または約９９％のアミノ酸配列同一性をもつＬ鎖またはＨ鎖配列を含む抗体が含まれる。１態様において変異型は、本明細書に開示するＣＤＲ配列またはＬ鎖もしくはＨ鎖配列中に、自然界で起きた変化または組換えＤＮＡ技術もしくは変異形成技術を用いて天然配列のインビトロ工学処理により導入された変化を含む。自然変異型には、外来抗原に対して抗体が産生される際に、対応する生殖細胞系列ヌクレオチド配列中にインビボで形成されたものが含まれる。１態様において、誘導体はヘテロ抗体、すなわち２種類以上の抗体が互いに連結した抗体であってもよい。誘導体には、化学修飾した抗体が含まれる。例には、１以上のポリマー、たとえば水溶性ポリマー、Ｎ−結合もしくはＯ−結合した炭水化物、糖類、ホスフェート類、および／またはこれらに類する他の分子の共有結合が含まれる。誘導体は、結合した分子のタイプまたは位置において天然抗体または出発抗体と異なる状態に修飾される。誘導体にはさらに、その抗体上に自然界で存在する１以上の化学基が欠失したものが含まれる。
【００３５】
本発明の他の態様には、ＰＤＧＦＲ−アルファを結合し、ＶＨ３−１１生殖細胞系列配列に由来するＨ鎖ポリペプチドを含む、ヒトモノクローナル抗体が含まれる。本発明の他の態様には、ＰＤＧＦＲ−アルファを結合し、ＶＨ４−３９生殖細胞系列配列に由来するＨ鎖ポリペプチドを含む、ヒトモノクローナル抗体が含まれる。本発明の他の態様には、ＰＤＧＦＲ−アルファを結合し、Ｄ１−２６、Ｄ６−６またはＤ７−２７生殖細胞系列配列に由来するＨ鎖ポリペプチドを含む、ヒトモノクローナル抗体が含まれる。本発明のある態様には、ＰＤＧＦＲ−アルファを結合し、Ｖκ  Ｌ鎖を含む、ヒトモノクローナル抗体が含まれる。本発明のさらに他の態様には、ＶＨ３−１１もしくはＶＨ４−３９のＨ鎖遺伝子によりコードされるかまたはそれらに由来するＨ鎖と対合したＶκ  Ｌ鎖を含む、モノクローナル抗体が含まれる。ある態様において、Ｖκ  Ｌ鎖ポリペプチドはＪＫ１  Ｌ鎖遺伝子によりコードされるかまたはそれらに由来する。他の態様において、Ｖκ  Ｌ鎖ポリペプチドはＪＫ５  Ｌ鎖遺伝子によりコードされるかまたはそれらに由来する。
【００３６】
本発明の他の態様には、ＰＤＧＦＲ−アルファを結合し、ＶＨ３−１１生殖細胞系列配列に由来するＨ鎖ポリペプチド、およびＯ１２  Ｌ鎖遺伝子に由来するＶｋ  Ｌ鎖ポリペプチドを含む、ヒトモノクローナル抗体が含まれる。本発明の他の態様には、ＰＤＧＦＲ−アルファを結合し、ＶＨ３−１１生殖細胞系列配列に由来するＨ鎖ポリペプチド、およびＯ１２生殖細胞系列配列Ｌ鎖に由来するＶｋ  Ｌ鎖ポリペプチドを含み、その際、Ｌ鎖のＣＤＲ１中の第２アミノ酸がプロリンをコードしている、ヒトモノクローナル抗体が含まれる。ＶＨ３−１１  Ｈ鎖遺伝子利用とＯ１２  Ｌ鎖遺伝子利用の組合わせ、ならびにＬ鎖のＣＤＲ１の第２アミノ酸位置にコードされたプロリンというこの組合わせの例は、多様なＣＤＲ３のＨ鎖およびＬ鎖配列をもつ独立した系列からの２つの抗体、すなわち２．４４９．１．３および２．１７５．３に由来する抗体である（表１２および１３を参照）。
【００３７】
モノクローナル抗体２．１７５．３および２．４４９．１．３は、両方ともＰＤＧＦＲａに対する高アフィニティー抗体であり、インビトロにおいてＰＤＧＦが駆動する細胞応答を高い抗体価で遮断する。これら２種類の抗体はＶＨ（ＶＨ３−１１）およびＶｋ（Ｏ１２）利用を共有するが、それらはＤ、ＪＨおよびＪｋ利用において異なる。したがって、それらは異なるＢ細胞系列に由来する。しかし、それらは実際にＶｋに異例な配列パターンを共有する。両抗体において残基２５はプロリンであり、生殖細胞系列のアラニンから変異している。プロリンはいかなるＶｋ生殖細胞系列遺伝子においても使われておらず、Ｋａｂａｔデータベースではこの位置に０．２％のヒト配列でみられるにすぎない。位置２５のプロリンはペプチド主鎖に堅牢なペプチド結合および鋭角を導入し、したがってこれら両抗体のＬ鎖のＶｋ領域内にユニークな構造特徴をもたらすであろう。同様に、変異アルギニンが２．１７５．３および２．４４９．１．３の両方でＶｋのＣＤＲ１の位置２７ｅ（Ｋａｂａｔ番号）に用いられている。アルギニンはいかなるＶｋ生殖細胞系列遺伝子においてもこの規定位置（ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｌｏｃａｔｉｏｎ）に使われておらず、Ｋａｂａｔデータベースでは０．４％のヒト配列にみられるにすぎない。本発明の１態様においては、ＰＤＧＦＲ−アルファを結合し、残基２５にプロリンを含む、ヒトモノクローナル抗体が提供される。本発明の１態様においては、ＰＤＧＦＲ−アルファを結合し、ＣＤＲ１の位置２７ｅにアルギニンを含む、ヒトモノクローナル抗体が提供される。
【００３８】
１態様において本発明は、本発明のターゲテッド結合剤またはその結合性フラグメント、および医薬的に許容できるキャリヤーを含む、組成物を提供する。他の態様において本発明は、本発明の抗体またはその結合性フラグメント、および医薬的に許容できるキャリヤーを含む、組成物を提供する。
【００３９】
本発明のさらに他の態様には、新生物疾患に罹患している動物を効果的に処置する方法であって、新生物疾患の処置を必要とする動物を選択し、該動物に療法有効量の、ＰＤＧＦＲ−アルファに特異的に結合するターゲテッド結合剤を投与することを含む方法が含まれる。ある態様において、動物はヒトである。ある態様において、ターゲテッド結合剤は完全ヒトモノクローナル抗体である。ある態様において、ターゲテッド結合剤は本発明の抗体であり、２．１７５．３、２．４４９．１．３または２．９９８．２よりなる群から選択できる。
【００４０】
処置できる新生物疾患には、たとえば下記を含めた癌が含まれる：黒色腫、小細胞性肺癌、非小細胞性肺癌、神経膠腫、肝細胞性（肝）癌（hepatocellular(liver)carcinoma）、甲状腺腫瘍、胃癌（gastric (stomach) cancer）、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、神経膠芽腫、子宮内膜癌、腎癌、大腸癌、膵臓癌、食道癌、頭頚部癌、中皮腫、肉腫、胆管癌（biliary (cholangiocarcinoma)）、小腸腺癌、小児悪性疾患、類表皮癌および消化器間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）。
【００４１】
１態様において、本発明は、専らまたは部分的にＰＤＧＦＲ−アルファ依存性である腫瘍を伴う患者において、ＰＤＧＦＲ−アルファに拮抗する際に使用するのに適切である。
本発明の他の態様には、動物において腫瘍細胞の増殖を阻害する方法が含まれる。これらの方法は、腫瘍細胞の増殖を処置する必要がある動物を選択し、該動物に療法有効量のターゲテッド結合剤を投与することを含み、その際、結合剤はＰＤＧＦＲ−アルファに特異的に結合する。他の態様においてこの方法は、腫瘍細胞の増殖を処置する必要がある動物を選択し、その動物に療法有効量の完全ヒトモノクローナル抗体を投与することを含み、その際、抗体はＰＤＧＦＲ−アルファに特異的に結合する。
【００４２】
本発明の他の態様には、動物においてＰＤＧＦＲ−アルファ発現を伴う疾患の処置のための医薬の調製における、ターゲテッド結合剤の使用が含まれ、その際、結合剤はＰＤＧＦＲ−アルファに特異的に結合する。他の態様において、本発明には、動物においてＰＤＧＦＲ−アルファ発現を伴う疾患の処置のための医薬の調製における、抗体の使用が含まれ、その際、モノクローナル抗体はＰＤＧＦＲ−アルファに特異的に結合する。
【００４３】
他の態様において、本明細書に記載するターゲテッド結合剤または抗体は動物において新生物疾患の処置のための医薬の調製に使用でき、その際、抗体はＰＤＧＦＲ−アルファに特異的に結合する。
【００４４】
本明細書に記載する本発明の態様は、ＰＤＧＦＲ−アルファを結合してＰＤＧＦＲ−アルファの機能に影響を及ぼすモノクローナル抗体に関する。他の態様は、療法面からみて望ましい特性をもつ完全ヒト抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体および抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体製剤に関する；この特性には、ＰＤＧＦＲ−アルファに対する高い結合アフィニティー、ＰＤＧＦＲ−アルファシグナル伝達の阻害に関する高い選択性、低い毒性、ＰＤＧＦ−ＡＡリガンドがＰＤＧＦＲ−アルファに結合するのを遮断する能力、ＰＤＧＦ−ＡＢリガンドがＰＤＧＦＲ−アルファに結合するのを遮断する能力、ＰＤＧＦ−ＢＢリガンドがＰＤＧＦＲ−アルファに結合するのを遮断する能力、ＰＤＧＦ−ＣＣリガンドがＰＤＧＦＲ−アルファに結合するのを遮断する能力、ならびに／あるいはインビトロおよびインビボで腫瘍細胞増殖を阻害する能力が含まれる。ある態様は、実質的にＰＤＧＦＲ−ベータと交差反応しない完全ヒト抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体に関する。さらに他の態様は、有意のヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）応答を生じることがなく、これにより反復投与が可能な、完全ヒト抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体および抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体製剤に関する。
【００４５】
１態様において、本発明は、ＰＤＧＦＲ−アルファにきわめて高いアフィニティー（Ｋｄ）で結合する抗体を含む。たとえば、１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、もしくは１０−１１Ｍ未満、またはこれに含まれるいずれかの範囲もしくは数値（これらに限定されない）のＫｄでＰＤＧＦＲ−アルファを結合しうるヒト、ウサギ、マウス、キメラまたはヒト化抗体。アフィニティーおよび／またはアビディティーの測定値は、本明細書に記載するようにＫｉｎＥｘＡ（登録商標）および／またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）により測定できる。
【００４６】
したがって本明細書に記載する１態様には、ＰＤＧＦＲ−アルファに結合する単離された抗体またはそれらの抗体のフラグメントが含まれる。当技術分野で知られているように、抗体は有利にはたとえばポリクローナル抗体、オリゴクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および／または完全ヒト抗体であってもよい。本明細書に記載する本発明の態様は、これらの抗体を産生させるための細胞をも提供する。
【００４７】
本発明の態様がいずれか特定の形の抗体または調製方法もしくは製造方法に限定されないことは認識されるであろう。たとえば、抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体は全長抗体（たとえば無傷のヒトＦｃ領域をもつもの）または抗体の結合性フラグメント（たとえばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、ＦｖまたはｄＡｂ）であってもよい。さらに抗体は、抗体を分泌するハイブリドーマから、またはその抗体をコードする遺伝子（１以上）で形質転換もしくはトランスフェクションした組換え処理細胞から調製できる。さらに抗体は、ＰＤＧＦＲ−アルファに結合する単一ドメイン抗体、たとえばラクダ科動物（ｃａｍｅｌｉｄ）またはヒトの単一ＶＨまたはＶＬドメイン、たとえばｄＡｂフラグメントであってもよい。
【００４８】
本発明の他の態様には、本明細書に記載するいずれかのターゲテッド結合剤もしくは抗体をコードする単離核酸分子、抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体をコードする単離核酸分子を含むベクター、またはそのようないずれかの核酸分子で形質転換した宿主細胞が含まれる。さらに本発明の１態様は、核酸分子が発現して抗体を産生する条件下で宿主細胞を培養し、続いて抗体を回収することにより、抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体を調製する方法である。
【００４９】
本発明の他の態様には、ヒトＰＤＧＦＲ−アルファを発現する細胞、ヒトＰＤＧＦＲ−アルファを含む単離した細胞膜、精製したヒトＰＤＧＦＲ−アルファもしくはそのフラグメント、および／またはその１以上のオルソログ配列もしくはフラグメントで哺乳動物を免疫化することにより、ＰＤＧＦＲ−アルファに対する高アフィニティー抗体を調製する方法が含まれる。
【００５０】
他の態様は、ＰＤＧＦＲ−アルファに特異的に結合する単離抗体の生成および同定に基づく。ＰＤＧＦＲ−アルファは多数の腫瘍タイプに発現する。ＰＤＧＦＲ−アルファを中和する抗体は、ＰＤＧＦＲ−アルファにより誘導される腫瘍の増殖を阻害し、また他の望ましい効果をもたらすことができる。
【００５１】
本発明の他の態様には、疾患または状態の診断方法であって、本明細書の記載に従って調製した抗体を利用して患者または患者試料におけるＰＤＧＦＲ−アルファの濃度を検出する方法が含まれる。他の態様においては、リスク因子の同定方法、疾患の診断方法、および疾患の病期判定方法であって、抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体を用いてＰＤＧＦＲ−アルファの発現および／または過剰発現を同定することを伴う方法が提供される。ある態様において、これらの方法は、細胞上のＰＤＧＦＲ−アルファタンパク質に選択的に結合する完全ヒト抗体コンジュゲートを患者に投与することを含む。これらの抗体コンジュゲートは、ＰＤＧＦＲ−アルファに選択的に結合する抗体、および標識を含む。これらの方法はさらに、患者における標識の存在を観察することを含む。標識の量が相対的に高いことはその疾患のリスクが相対的に高いことの指標となり、標識の量が相対的に低いことはその疾患のリスクが相対的に低いことの指標となるであろう。１態様において、標識はグリーン蛍光タンパク質である。
【００５２】
本発明はさらに、患者試料におけるＰＤＧＦＲ−アルファ濃度をアッセイするための方法であって、抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体を患者からの生物試料と接触させ、その抗体と試料中のＰＤＧＦＲ−アルファとの結合レベルを検出することを含む方法を提供する。より具体的な態様において、生物試料は血液または血清である。
【００５３】
本発明の他の態様には、細胞におけるＰＤＧＦＲ−アルファの発現に関連する状態を診断するための方法であって、血清または細胞を抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体と接触させ、その後ＰＤＧＦＲ−アルファの存在を検出することを含む方法が含まれる。
【００５４】
他の態様において、本発明には、哺乳動物の組織、細胞または体液中のＰＤＧＦＲ−アルファを検出し、ＰＤＧＦＲ−アルファを発現する細胞を伴う疾患をスクリーニングするための、アッセイキットが含まれる。このキットは、ＰＤＧＦＲ−アルファに結合する抗体、およびＰＤＧＦＲ−アルファが存在する場合には抗体とＰＤＧＦＲ−アルファが反応したことを指示する手段を含む。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。１態様において、ＰＤＧＦＲ−アルファを結合する抗体は標識されている。他の態様において、抗体は非標識一次抗体であり、キットはさらに一次抗体を検出する手段を含む。１態様においてこの手段は、標識した二次抗体、すなわち抗免疫グロブリンを含む。好ましくは、抗体は、蛍光色素、酵素、放射性核種および放射線不透過性物質よりなる群から選択されるマーカーで標識されている。
【００５５】
さらに他の態様には、患者に有効量の抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体を投与することにより、患者においてＰＤＧＦＲ−アルファの発現と関連する疾患または状態を処置する方法が含まれる。抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体を単独で投与することができ、あるいは他の抗体もしくは化学療法薬または放射線療法と組み合わせて投与することができる。たとえば、腫瘍の増殖を阻害するモノクローナル、オリゴクローナルまたはポリクローナルＰＤＧＦＲ−アルファ抗体混合物を、腫瘍細胞の増殖を直接阻害することが示されている薬物と組み合わせて投与することができる。この方法はインビボで実施でき、患者は好ましくはヒト患者である。
【００５６】
ある態様においては、抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体を修飾して、それらが相補体を固定して相補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）に関与する能力を高めることができる。他の態様においては、抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体を修飾して、それらがエフェクター細胞を活性化して抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）に関与する能力を高めることができる。さらに他の態様においては、抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体を修飾して、それらがエフェクター細胞を活性化して抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）に関与する能力を高め、かつそれらが相補体を固定して相補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）に関与する能力を高めることができる。
【００５７】
他の態様において、本発明は容器を含む製品を提供する。この容器には、抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体を含む組成物、およびＰＤＧＦＲ−アルファの発現または過剰発現を特徴とする疾患の処置にその組成物を使用しうることを指示したパッケージ挿入物またはラベルが収容されている。
【００５８】
他の態様において、本発明は、ＰＤＧＦＲ−アルファの発現を伴う疾患を処置するためのキットであって、抗ＰＤＧＦＲ−アルファモノクローナル抗体および処置を必要とする対象にそのモノクローナル抗体を投与するための指示を含むキットを提供する。
【００５９】
他の観点においては、患者において癌性細胞を選択的に死滅させる方法が提供される。この方法は、完全ヒト抗体コンジュゲートを患者に投与することを含む。完全ヒト抗体コンジュゲートは、ＰＤＧＦＲ−アルファの癌性ドメインに結合しうる抗体、および薬剤を含む。この薬剤は、癌細胞を死滅させる毒素、放射性同位体または他の物質である。これにより抗体コンジュゲートは癌細胞を選択的に死滅させる。薬剤はサポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）であってもよい。
【００６０】
１観点においては、ＰＤＧＦＲ−アルファに結合するコンジュゲートした完全ヒト抗体が提供される。この抗体には薬剤が結合しており、抗体が細胞に結合すると薬剤が細胞へ送達される。１態様において、前記のコンジュゲートした完全ヒト抗体はＰＤＧＦＲ−アルファの細胞外ドメインに結合する。他の態様において、抗体およびコンジュゲートした毒素はＰＤＧＦＲ−アルファを発現する細胞に内部移行（インターナリゼーション）する。他の態様において、薬剤は細胞毒性物質である。他の態様において、薬剤はたとえばサポリン、またはオーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、シュードモナス外毒素、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、リシン（ｒｉｃｉｎ）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）またはメイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）系免疫コンジュゲートなどである。さらに他の態様において、薬剤は放射性同位体である。
【００６１】
本発明のある態様においては、本明細書に提示する抗体のグリコシル化パターンを改変して、ＡＤＣＣおよびＣＤＣエフェクター機能を高める。Shields RL et al., (2002) JBC. 277:26733; Shinkawa T et al., (2003) JBC. 278:3466、およびOkazaki A et al., (2004) J. Mol. Biol., 336: 1239を参照。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】５種類の選択したモノクローナル抗体に関する用量応答を、抗体（ｎｇ／ｍｌ）に対するＰＤＧＦＲ−アルファ誘導によるＭＧ−６３腫瘍細胞の増殖の阻害率％として示すグラフである。細胞刺激は１００ｎｇ／ｍｌ（３．４５ｎＭ）のＰＤＧＦ−ＡＡを用いて行なわれた。
【図２ａ】図２ａは、Ｃａｌｕ−６非小細胞性肺癌異種移植モデルにおける２．１７５．３および２．４４９．１．３のインビボ抗腫瘍評価の結果を示す。図２ａは時間（日数）に対する平均腫瘍サイズ（ｍｍ3）を示し、図２ｂは時間（日数）に対する平均体重（ｇ）を示す。四角形の点はビヒクル処置グループを示し；円形の点は１０ｍｇ／ｋｇの２．１７５．３処置グループを示し；三角形の点は１０ｍｇ／ｋｇの２．４４９．１．３処置グループを示す。
【図２ｂ】図２ｂは、Ｃａｌｕ−６非小細胞性肺癌異種移植モデルにおける２．１７５．３および２．４４９．１．３のインビボ抗腫瘍評価の結果を示す。図２ａは時間（日数）に対する平均腫瘍サイズ（ｍｍ3）を示し、図２ｂは時間（日数）に対する平均体重（ｇ）を示す。四角形の点はビヒクル処置グループを示し；円形の点は１０ｍｇ／ｋｇの２．１７５．３処置グループを示し；三角形の点は１０ｍｇ／ｋｇの２．４４９．１．３処置グループを示す。
【図３】ＳＣＩＤマウスでのＵ１１８神経膠腫異種移植モデルにおける抗体のインビボ評価の結果を示す。抗体による処置時間（日数）に対する腫瘍サイズ（ｍｍ3）をグラフ化した。四角形の点はビヒクル処置グループを示し；円形の点は１０ｍｇ／ｋｇの２．１７５．３処置グループを示し；三角形の点は１０ｍｇ／ｋｇの２．４４９．１．３処置グループを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
本明細書に記載する本発明の態様は、ＰＤＧＦＲ−アルファに結合するターゲテッド結合剤に関する。ある態様において、ターゲテッド結合剤は、ＰＤＧＦＲ−アルファに結合して腫瘍細胞の増殖を阻害する抗体である。本発明の他の態様には、療法用として有用な完全ヒト抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体および抗体製剤が含まれる。そのような抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体製剤は、好ましくは望ましい療法特性をもつ；これには、ＰＤＧＦＲ−アルファに対する強い結合アフィニティー、ＰＤＧＦＲ−アルファシグナル伝達の阻害に関する高い選択性、低い毒性、ＰＤＧＦ−ＡＡリガンドがＰＤＧＦＲ−アルファに結合するのを遮断する能力、ＰＤＧＦ−ＡＢリガンドがＰＤＧＦＲ−アルファもしくはＰＤＧＦＲ−アルファ／ベータヘテロ二量体に結合するのを遮断する能力、ＰＤＧＦ−ＢＢリガンドがＰＤＧＦＲ−アルファもしくはＰＤＧＦＲ−アルファ／ベータヘテロ二量体に結合するのを遮断する能力、ＰＤＧＦ−ＣＣリガンドがＰＤＧＦＲ−アルファもしくはＰＤＧＦＲ−アルファ／ベータヘテロ二量体に結合するのを遮断する能力、ならびに／あるいはインビトロおよびインビボで腫瘍細胞の増殖を阻害する能力が含まれる。ある態様は、ＰＤＧＦＲ−ベータと交差反応しない完全ヒト抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体に関する。
【００６４】
本発明の態様には、抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体の単離された結合性フラグメントであるターゲテッド結合剤も含まれる。好ましくは、結合性フラグメントは完全ヒト抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体に由来する。フラグメントの例には、後記にさらに詳細に記載するように、Ｆｖ、Ｆａｂ’、ｄＡｂ、または他の周知の抗体フラグメントが含まれる。本発明の態様には、ＰＤＧＦＲ−アルファに対する完全ヒト抗体を発現する細胞も含まれる。細胞の例には、ハイブリドーマ、または組換えにより作製した細胞、たとえばＰＤＧＦＲ−アルファに対する抗体を産生するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が含まれる。
【００６５】
さらに、本発明組成物にはこれらの抗体を疾患の処置のために使用する方法が含まれる。抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体は、腫瘍の増殖を阻害するのに有用である。その作用機序には、リガンド結合の遮断、および／または細胞増殖に関係するとされる細胞シグナル伝達の阻害が含まれる可能性があるが、これらに限定されない。この機序により処置できる疾患には、新生物疾患、たとえば下記を含めた癌が含まれるが、これらに限定されない：肺癌、卵巣癌、前立腺癌、大腸癌、神経膠芽腫、黒色腫および消化器間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）。
【００６６】
本発明の他の態様には、患者または生物試料中のＰＤＧＦＲ−アルファの存在および／または量を特異的に判定するための診断アッセイが含まれる。アッセイキットは、抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体およびそれらの抗体の検出に必要な標識を含むことができる。これらの診断アッセイは、ＰＤＧＦＲ−アルファ関連疾患をスクリーニングするために有用であり、これらの疾患には下記を含めた癌が含まれるが、これらに限定されない：乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、大腸癌、神経膠芽腫、黒色腫および消化器間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）。
【００６７】
他の態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２の配列を含むＨ鎖ポリペプチドを含む抗体である。１態様において、この抗体はさらにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：４の配列を含むＬ鎖ポリペプチドを含む。他の態様には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１０の配列を含むＨ鎖ポリペプチドを含む抗体が含まれる。１態様において、この抗体はさらにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１２の配列を含むＬ鎖ポリペプチドを含む。さらに他の態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１４の配列を含むＨ鎖ポリペプチドを含む抗体である。１態様において、この抗体はさらにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１６の配列を含むＬ鎖ポリペプチドを含む。
【００６８】
さらに他の態様は、前記の抗体のＬ鎖および／またはＨ鎖を産生するハイブリドーマである。このハイブリドーマは、完全ヒトモノクローナル抗体のＬ鎖および／またはＨ鎖を産生することができる。１態様において、ハイブリドーマは、完全ヒトモノクローナル抗体２．１７５．３、２．４４９．１．３および２．９９８．２のＬ鎖および／またはＨ鎖を産生する。あるいはこのハイブリドーマは、完全ヒトモノクローナル抗体２．１７５．３、２．４４９．１．３および２．９９８．２が結合するものと同一のエピトープ（１以上）に結合する抗体を産生することができる。あるいはこのハイブリドーマは、ＰＤＧＦＲ−アルファへの結合に関して完全ヒトモノクローナル抗体２．１７５．３、２．４４９．１．３および２．９９８．２と競合する抗体を産生することができる。
【００６９】
さらに他の態様は、前記の抗体のＬ鎖またはＨ鎖をコードする核酸分子である。この態様において、核酸分子は完全ヒトモノクローナル抗体のＬ鎖またはＨ鎖をコードすることができる。１態様において、核酸分子は完全ヒトモノクローナル抗体２．１７５．３、２．４４９．１．３または２．９９８．２のいずれか１つのＬ鎖またはＨ鎖をコードする。
【００７０】
他の態様は、前記の核酸分子（１以上）を含むベクターであり、その際、ベクターは前記に定めた抗体のＬ鎖および／またはＨ鎖をコードする。
本発明の１態様には、前記のベクターを含む宿主細胞が含まれる。あるいは、宿主細胞は１より多いベクターを含むことができる。
【００７１】
さらに、本発明の１態様は、核酸分子が発現して抗体を産生する条件下で宿主細胞を培養し、続いて抗体を回収することにより、抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体を調製する方法である。
【００７２】
１態様において本発明には、前記のターゲテッド結合剤をコードする少なくとも１つの核酸分子で少なくとも１つの宿主細胞をトランスフェクションし、宿主細胞において核酸分子を発現させ、そしてターゲテッド結合剤を単離することにより、ターゲテッド結合剤を調製する方法が含まれる。本発明の他の態様は、前記の抗体をコードする少なくとも１つの核酸分子で少なくとも１つの宿主細胞をトランスフェクションし、宿主細胞において核酸分子を発現させ、そしてターゲテッド結合剤を単離することにより、抗体を調製する方法である。
【００７３】
本発明の他の観点は、前記のターゲテッド結合剤を投与することにより、ＰＤＧＦＲ−アルファを発現する細胞の増殖を阻害する方法である。この方法は、ＰＤＧＦＲ−アルファ発現に関連する疾患の処置を必要とする動物を選択し、ＰＤＧＦＲ−アルファに特異的に結合する療法有効量のターゲテッド結合剤をその動物に投与することを含むことができる。
【００７４】
さらに他の観点は、ＰＤＧＦＲ−アルファを特異的に結合する療法有効量のターゲテッド結合剤を投与することにより、哺乳動物において新生物疾患を処置する方法である。この方法は、新生物疾患の処置を必要とする動物を選択し、ＰＤＧＦＲ−アルファを特異的に結合する療法有効量のターゲテッド結合剤をその動物に投与することを含むことができる。ターゲテッド結合剤は単独で投与でき、あるいは抗体、化学療法薬または放射性薬物から選択される第２の抗新生物薬と組み合わせて投与することができる。
【００７５】
他の１観点は、ＰＤＧＦＲ−アルファを特異的に結合する療法有効量のターゲテッド結合剤を投与することにより、哺乳動物において癌を処置する方法である。この方法は、癌の処置を必要とする動物を選択し、ＰＤＧＦＲ−アルファを特異的に結合する療法有効量のターゲテッド結合剤をその動物に投与することを含むことができる。ターゲテッド結合剤は単独で投与でき、あるいは抗体、化学療法薬または放射性薬物から選択される第２の抗新生物薬と組み合わせて投与することができる。
【００７６】
本発明の他の観点によれば、ＰＤＧＦＲ−アルファを特異的に結合するターゲテッド結合剤を新生物疾患の処置のための医薬の製造に使用できる。
本発明の１態様は、専らまたは部分的にＰＤＧＦＲ−アルファ発現依存性である腫瘍を伴う患者において腫瘍増殖の阻害に使用するのに特に適切である。
【００７７】
本発明の他の態様には、哺乳動物の組織、細胞または体液中のＰＤＧＦＲ−アルファを検出して、新生物性および／または線維性および／または免疫系の疾患をスクリーニングするためのアッセイキットが含まれる。このキットは、ＰＤＧＦＲ−アルファに結合するターゲテッド結合剤、およびＰＤＧＦＲ−アルファが存在する場合にはこのターゲテッド結合剤とＰＤＧＦＲ−アルファが反応したことを指示する手段を含む。ターゲテッド結合剤はモノクローナル抗体であってもよい。１態様において、ＰＤＧＦＲ−アルファを結合する抗体は標識されている。他の態様において、抗体は非標識一次抗体であり、キットはさらに一次抗体を検出する手段を含む。１態様においてこの手段には、標識した二次抗体、すなわち抗免疫グロブリンが含まれる。好ましくは、抗体は、蛍光色素、酵素、放射性核種および放射線不透過性物質よりなる群から選択されるマーカーで標識されている。
【００７８】
ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体に関する他の態様、特徴などを以下にさらに詳細に示す。
定義
別途定義しない限り、本明細書中で用いる科学用語および技術用語は、当業者が一般的に理解している意味をもつものとする。さらに、内容により別途要求されない限り、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数を含むものとする。一般に、本明細書に記載する細胞および組織の培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴ−またはポリヌクレオチドの化学、ならびにハイブリダイゼーションに関して用いる名称および技術は、当技術分野で周知の慣用されるものである。
【００７９】
組換えＤＮＡ法、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換（たとえばエレクトロポレーション、リポフェクション）には標準法を用いる。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様書に従って、または当技術分野で一般的に行われるように、または本明細書中の記述に従って実施される。以上の技術および操作は一般に、当技術分野で周知の常法に従って、また本明細書全体において引用および考察する各種の全般的参考文献およびより詳細な参考文献の記載に従って実施される。たとえばSambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー(2001))を参照；これを本明細書に援用する。本明細書に記載する分析化学、合成有機化学、ならびに医化学および薬化学に関して用いる名称ならびに実験法および実験技術は、当技術分野で周知の慣用されるものである。化学合成、化学分析、医薬の製造、配合および送達、ならびに患者の処置には標準法を用いる。
【００８０】
本発明の開示に従って用いる下記の用語は、別途指示しない限り、下記の意味をもつものと理解すべきである：
化合物は、約２０００ダルトン未満の分子量をもついずれかの低分子量化合物を表わす。
【００８１】
用語”ＰＤＧＦＲ−アルファ”は、ＰＤＧＦＲ−遺伝子がコードする血小板由来増殖因子チロシンキナーゼ受容体−アルファを表わす。ＰＤＧＦＲ−アルファはＣＤ１４０ａおよびＰＤＧＦＲ−αとしても知られる。
【００８２】
ターゲテッド結合剤、たとえば抗体について述べる際に”中和する”という用語は、その物質がターゲット抗原の活性を排除または有意に低下させる能力に関する。したがって、本発明のＰＤＧＦＲ−アルファ抗体を”中和する”ことにより、ＰＤＧＦＲ−アルファの活性を排除または有意に低下させることができる。ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体の中和は、たとえばリガンドがそれの受容体ＰＤＧＦＲ−アルファに結合するのを遮断することにより実施できる。
【００８３】
本明細書中で用いる用語”単離したポリヌクレオチド”は、それが自然界で存在する環境から単離されたポリヌクレオチドを意味するものとする。そのようなポリヌクレオチドはゲノム、ｃＤＮＡまたは合成によるものであってもよい。単離したポリヌクレオチドは、自然界でそれらと会合しているポリヌクレオチドのすべてまたは一部と会合していないことが好ましい。単離したポリヌクレオチドを、自然界では結合していない他のポリヌクレオチドに作動可能な状態で結合させることができる。さらに、単離したポリヌクレオチドは、より大きな配列の一部としての自然な状態にはないことが好ましい。
【００８４】
本明細書中で述べる用語”単離したタンパク質”は、それの自然環境から単離されたタンパク質を意味するものとする。そのようなタンパク質は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えＤＮＡ、組換えＲＮＡから誘導されるもの、もしくは合成によるもの、またはそのいずれかの組合わせであってもよい；その起源、または誘導体化の原料により、”単離したタンパク質”は、（１）自然界でみられるタンパク質と会合していない、（２）同一原料に由来する他のタンパク質を含まない、たとえばネズミのタンパク質を含まない、（３）異なる種に属する細胞により発現する、または（４）自然界に存在しない。
【００８５】
用語”ポリペプチド”は、本明細書中で天然タンパク質、フラグメント、またはポリペプチド配列類似体を表わす総称として用いられる。したがって、天然タンパク質、フラグメントまたは類似体は、ポリペプチド属の種である。本発明による好ましいポリペプチドには、ヒトＨ鎖免疫グロブリン分子、およびヒトカッパＬ鎖免疫グロブリン分子、ならびにＨ鎖免疫グロブリン分子とＬ鎖免疫グロブリン分子、たとえばカッパまたはラムダＬ鎖免疫グロブリン分子を含む組合わせにより形成された抗体分子、およびその逆、ならびにそのフラグメントおよび類似体が含まれる。本発明による好ましいポリペプチドは、ヒトＨ鎖免疫グロブリン分子またはそのフラグメントのみを含むこともできる。
【００８６】
本明細書中で、ある物質に適用して用いる”天然（自然界に存在する）”という用語は、ある物質を自然界でみることができるという事実を表わす。たとえば、天然原料から分離できる生物（ウイルスを含む）内に存在し、かつヒトが実験室内その他で意図的に修飾していないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然である。
【００８７】
本明細書中で用いる用語”作動可能な状態で結合した”は、そのように記載した構成要素がそれらの意図する様式で機能しうる関係にある配置を表わす。たとえば、コード配列に”作動可能な状態で結合した”制御配列は、その制御配列に適合する条件下でコード配列の発現が達成されるように結合している。
【００８８】
本明細書中で用いる用語”制御配列”は、それらが結合しているコード配列の発現およびプロセシングを達成するかまたはそれに影響を及ぼすのに必要なポリヌクレオチド配列を表わす。そのような制御配列の性質は宿主生物に応じて異なる；原核生物では、そのような制御配列には一般にプロモーター、リボソーム結合部位、および転写終止配列が含まれる；真核生物では、そのような制御配列には一般にプロモーター、エンハンサー、イントロン、転写終止配列、ポリアデニル化シグナル配列、ならびに５’および３’側非翻訳領域を含めることができる。用語”制御配列”は、少なくとも発現およびプロセシングのためにその存在が必須であるすべての構成要素を含むものとし、その存在が有利である追加の構成要素、たとえばリーダー配列および融合パートナー配列も含むことができる。
【００８９】
本明細書中で述べる用語”ポリヌクレオチド”は、少なくとも１０塩基の長さのポリマー形ヌクレオチド、すなわちリボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチド、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾形、またはＲＮＡ−ＤＮＡヘテロデュプレックスを意味する。この用語には、一本鎖形および二本鎖形のＤＮＡが含まれる。
【００９０】
本明細書中で述べる用語”オリゴヌクレオチド”には、天然結合および非天然結合により互いに結合した天然および修飾ヌクレオチドが含まれる。オリゴヌクレオチドは、一般に２００塩基以下の長さからなるポリヌクレオチドサブセットである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは１０〜６０塩基の長さ、最も好ましくは１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０〜４０塩基の長さである。オリゴヌクレオチドは、たとえばプローブ用としては通常は一本鎖であるが、たとえば遺伝子変異体の構築用としてはオリゴヌクレオチドは二本鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドはセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれであってもよい。
【００９１】
本明細書中で述べる用語”天然ヌクレオチド”には、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドが含まれる。本明細書中で述べる用語”修飾ヌクレオチド”には、修飾または置換された糖基をもつヌクレオチドなどが含まれる。本明細書中で述べる用語”オリゴヌクレオチド結合”には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニラデート、ホスホロアミデートなどが含まれる。たとえば、LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al. Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein編, Oxford University Press, 英国オックスフォード(1991)); Stec et al. U.S.Pat. No. 5,151,510；Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990)；それらの開示内容を本明細書に援用する。オリゴヌクレオチドは、所望により検出のための標識を含むことができる。
【００９２】
本明細書中で述べる用語”選択的にハイブリダイズする”は、検出可能な状態で特異的に結合することを意味する。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびそのフラグメントは、非特異的核酸への認めうる量の検出可能な結合を最小限に抑えるハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で選択的に核酸鎖にハイブリダイズする。当技術分野で既知でありかつ本明細書中に記載するように、高緊縮条件を用いて選択的ハイブリダイゼーション条件を達成できる。一般に、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたは抗体フラグメントと目的とする核酸配列の核酸配列相同性は、少なくとも８０％であり、より一般的には好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％および１００％と相同性が増大する。
【００９３】
用語”ＣＤＲ領域”または”ＣＤＲ”は、免疫グロブリンのＨ鎖およびＬ鎖の超可変部を示すものとする；Kabat et al. 1991 (Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. US Department of Health and Human Services, Public Service, NIH, ワシントン)、および後続版により定義。抗体は一般に３つのＨ鎖ＣＤＲおよび３つのＬ鎖ＣＤＲを含む。本明細書中で用語ＣＤＲは、その状況に応じて、抗体が認識する抗原またはエピトープに対する抗体のアフィニティーによる結合に関与する大部分のアミノ酸残基を含むこれらの領域のうちの１もしくは数個またはこれらの領域全部を示すために用いられる。
【００９４】
Ｈ鎖の第３のＣＤＲ（ＨＣＤＲ３）は、より大きなサイズ可変度をもつ（より大きな多様性は本質的に、それを生じる遺伝子アレンジメント機序による）。知られている最長サイズは２６であるが、それはアミノ酸２個という短いものであってもよい。ＣＤＲの長さは、基礎となる特定の枠組み構造が収容しうる長さによっても変動する可能性がある。機能的に、ＨＣＤＲ３は抗体の特異性決定に部分的役割を果たす(Segal et al., PNAS, 71:4298-4302, 1974, Amit et al., Science, 233:747-753, 1986, Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901-917, 1987, Chothia et al., Nature, 342:877- 883, 1989, Caton et al., J. Immunol., 144:1965-1968, 1990, Sharon et al., PNAS, 87:4814-4817, 1990, Sharon et al., J. Immunol., 144:4863-4869, 1990, Kabat et al., J. Immunol., 147:1709-1719, 1991)。
【００９５】
本明細書中で述べる用語”一組のＣＤＲ”は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。たとえば、一組のＨＣＤＲとはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を表わし、一組のＬＣＤＲとはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を表わす。別途記載しない限り、”一組のＣＤＲ”にはＨＣＤＲおよびＬＣＤＲが含まれる。
【００９６】
２つのアミノ酸配列は、それらの配列間に部分的または完全な同一性があれば”相同”である。たとえば８５％相同性は、最大整合が得られるように２つの配列をアラインさせた際に８５％のアミノ酸が同一であることを意味する。整合度を最大にする際にギャップ（整合させた２配列のいずれかにおける）が許容される；ギャップ長さ５以下が好ましく、または２以下がより好ましい。あるいは好ましくは、２つのタンパク質配列（またはそれらに由来する、少なくとも約３０アミノ酸長さのポリペプチド配列）が、変異データマトリックスを備えたプログラムＡＬＩＧＮを用いてギャップペナルティー６以上で５を超えるアラインメント評点（標準偏差単位で）をもつ場合、それらは相同である（この用語を本明細書中で用いるように）。Dayhoff, M.O., Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101-110 (5巻, National Biomedical Research Foundation (1972))およびこの巻のSupplement 2, pp. 1-10を参照。より好ましくは、これら２配列またはその一部は、ＡＬＩＧＮプログラムを用いて最適状態にアラインさせた際にそれらのアミノ酸が５０％以上同一である場合、相同である。２つのオーソロガス配列内には異なる相同性の領域がありうることを認識すべきである。たとえば、マウスとヒトのオーソログの機能性部位は、非機能性領域より高度の相同性をもつ可能性がある。
【００９７】
用語”に一致する”は、本明細書中で、あるポリヌクレオチド配列が基準ポリヌクレオチド配列の全体もしくは一部と相同である（すなわち、必ずしも進化的に厳密に関係なく、同一である）こと、またはあるポリヌクレオチド配列が基準ポリヌクレオチド配列と同一であることを意味するために用いられる。
【００９８】
これに対し、用語”に相補的である”は、本明細書中で、その相補配列が基準ポリヌクレオチド配列の全体または一部と相同であることを意味するために用いられる。説明として、ヌクレオチド配列”ＴＡＴＡＣ”は基準配列”ＴＡＴＡＣ”に一致し、基準配列”ＧＴＡＴＡ”に相補的である。
【００９９】
配列に関して用語”配列同一性”または”同一性”は、２つのポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が比較ウィンドウ上において同一である（すなわちヌクレオチド毎または残基毎に）ことを意味する。用語”配列同一性パーセント”は、比較ウィンドウにおいて最適状態にアラインさせた２配列を比較し、同一の核酸塩基（たとえばＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＩ）またはアミノ酸残基が両方の配列中に現われる位置の数を判定して整合位置の数を求め、この整合位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数（すなわちウィンドウサイズ）で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性パーセントを得ることにより計算される。本明細書中で用いる用語”実質的な同一性”はポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の特徴を表わし、そのポリヌクレオチドまたはアミノ酸は、少なくとも１８ヌクレオチド（６アミノ酸）位置の比較ウィンドウ上において、しばしば少なくとも２４〜４８ヌクレオチド（８〜１６アミノ酸）位置の比較ウィンドウ上において、少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０〜９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性をもつ配列を含む；その際、配列同一性パーセントは、比較ウィンドウ上において合計で基準配列の２０％以下の欠失または付加を含む可能性のある配列と基準配列を比較することにより計算される。基準配列は、より大きな配列のサブセットであってもよい。
【０１００】
本明細書中で用いる２０種類の一般的なアミノ酸およびそれらの略号は、慣用に従う。Immunology - A Synthesis (第2版, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, マサチュセッツ州サンダーランド(1991))を参照；これを本明細書に援用する。２０種類の一般的なアミノ酸の立体異性体（たとえばＤ−アミノ酸）、天然に存在しないアミノ酸、たとえばα−，α−ジ置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、および他の一般的でないアミノ酸も、本発明のポリペプチドの適切な成分となりうる。一般的でないアミノ酸の例には下記のものが含まれる：４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、ならびにこれらに類する他のアミノ酸およびイミノ酸（たとえば４−ヒドロキシプロリン）。標準的な用法および慣例に従って、本明細書中で用いるポリペプチド表記において左手方向はアミノ末端方向であり、右手方向はカルボキシ末端方向である。
【０１０１】
同様に、別途明記しない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左手末端は５’末端である；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向を５’方向と呼ぶ。新生ＲＮＡ転写体の５’から３’への付加方向を転写方向と呼ぶ；ＲＮＡと同一配列をもち、ＲＮＡ転写体の５’末端に対して５’側にあるＤＮＡ鎖上の配列領域を”上流配列”と呼ぶ；ＲＮＡと同一配列をもち、ＲＮＡ転写体の３’末端に対して３’側にあるＤＮＡ鎖上の配列領域を”下流配列”と呼ぶ。
【０１０２】
ポリペプチドに適用した用語”実質的同一性”は、２つのペプチド配列をたとえばプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによりデフォルトギャップ重みを用いて最適状態にアラインさせた場合、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性をもつことを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は同類アミノ酸置換による相異である。同類アミノ酸置換は、類似側鎖をもつ残基との互換性を表わす。たとえば、脂肪族側鎖をもつアミノ酸のグループはグリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンである；脂肪族−ヒドロキシル側鎖をもつアミノ酸のグループはセリンおよびトレオニンである；アミド含有側鎖をもつアミノ酸のグループはアスパラギンおよびグルタミンである；芳香族側鎖をもつアミノ酸のグループはフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンである；塩基性側鎖をもつアミノ酸のグループはリシン、アルギニンおよびヒスチジンである；硫黄含有側鎖をもつアミノ酸のグループはシステインおよびメチオニンである。好ましい同類アミノ酸置換は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。
【０１０３】
本明細書中で述べるように、抗体または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列のわずかな変異は、アミノ酸配列におけるそれらの変異が本明細書に記載する抗体または免疫グロブリン分子との少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、最も好ましくは９９％の配列同一性を維持するならば、本発明に含まれるとみなされる。特に、同類アミノ酸置換が考慮される。同類置換は、関連側鎖をもつアミノ酸ファミリー内で行なわれるものである。遺伝子コードされたアミノ酸は、一般に下記のファミリーに分類される：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）荷電していない極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。より好ましいファミリーは下記のものである：セリンおよびトレオニンは脂肪族−ヒドロキシルファミリーである；アスパラギンおよびグルタミンはアミド含有ファミリーである；アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンは脂肪族ファミリーである；ならびにフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは芳香族ファミリーである。たとえば、ロイシンとイソロイシンもしくはバリン、アスパラギン酸とグルタミン酸、トレオニンとセリン、または同様なあるアミノ酸と構造関連アミノ酸の置換という孤立した置換は、特にその置換が枠組み構造部位を伴わない場合、生成分子の結合機能または特性に大きな影響をもたないであろうと予想するのは妥当である。アミノ酸交換の結果として機能性ペプチドが生成したかどうかは、そのペプチド誘導体の特定の活性をアッセイすることによって容易に判定できる。アッセイ法は本明細書に詳細に記載されている。抗体または免疫グロブリン分子のフラグメントまたは類似体は、当業者が容易に調製できる。フラグメントまたは類似体の好ましいアミノ末端およびカルボキシ末端は、機能性ドメインの境界付近にある。構造および機能性ドメインは、そのヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列データを公開または専有の配列データベースと比較することにより同定できる。好ましくは、コンピューター比較法を用いて、既知の構造および／または機能をもつ他のタンパク質中にある配列モチーフまたは推定タンパク質コンホメーションドメインを同定する。折りたたまれて既知の三次元構造になるタンパク質配列を同定する方法が知られている。Bowie et al. Science 253:164 (1991)。したがって、以上の例により、本明細書に記載する抗体に従った構造および機能性ドメインの決定に使用できる配列モチーフおよび構造コンホメーションを当業者が認識できることが証明される。
【０１０４】
好ましいアミノ酸置換は下記のものである：（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させる、（２）酸化に対する感受性を低下させる、（３）タンパク質複合体形成に関する結合アフィニティーを変化させる、（４）結合アフィニティーを変化させる、および（４）そのような類似体の他の物理化学的特性または機能特性を付与または改変する。類似体には、天然ペプチド配列以外の多様な変異タンパク質（ｍｕｔｅｉｎ）を含めることができる。たとえば、天然配列に（好ましくは、ポリペプチドの分子間接点を形成するドメインの外側にある部分において）単一または複数のアミノ酸置換（好ましくは同類アミノ酸置換）を行なうことができる。同類アミノ酸置換により親配列の構造特性が実質的に変化すべきではない（たとえば、置換アミノ酸は親配列に生じるらせん構造を破壊する傾向または親配列を特徴づける他のタイプの二次構造を撹乱する傾向をもつべきではない）。当技術分野で認識されているポリペプチド二次構造および三次構造の例は、Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton編, W. H. Freeman and Company, ニューヨーク(1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze編, Garland Publishing, ニューヨーク州ニューヨーク(1991));およびThornton et at. Nature 354:105 (1991)に記載されている。
【０１０５】
アミノ酸配列を本明細書に示したものを含めた本発明のＶＨおよびＶＬドメインならびにＣＤＲの変異型であって、ＰＤＧＦＲ−アルファに対するターゲティング剤および抗体に使用できるものは、配列を変更または変異させ、そして目的特性を備えた抗原ターゲティングについてスクリーニングする方法により得ることができる。目的特性の例には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：その抗原に対する特異的な既知の抗体と比較して抗原に対する結合アフィニティーの増大；活性が既知である場合、その抗原に対する特異的な既知の抗体と比較して抗原活性の中和度の増大；特定のモル比でその抗原に対する既知の抗体またはリガンドと特異的に競合する能力；リガンド−受容体複合体を免疫沈降させる能力；特異的エピトープ［線状エピトープ、たとえばペプチド結合スキャンにより、たとえば線状および／または拘束されたコンホメーションでスクリーニングしたペプチドを用いて同定したペプチド配列；非連続残基により形成されたコンホメーショナルエピトープ］に結合する能力；ＰＤＧＦＲ−アルファもしくは下流分子の新規な生物活性を調節する能力；結合能力および／または中和能力および／または他のいずれかの目的特性。
【０１０６】
ＣＤＲ、抗体のＶＨまたはＶＬドメイン、および抗原結合部位のアミノ酸配列内で置換を行なうのに必要な技術は、当技術分野で入手できる。本明細書に開示する抗体分子の変異型を本発明において製造および使用することができる。多変量データ解析法を構造／特性−活性関係に適用する際のコンピューター化学の先例(Wold, et al. Multivariate data analysis in chemistry. Chemometrics -Mathematics and Statistics in Chemistry (編者: B. Kowalski), D. Reidel Publishing Company, オランダ、ドルトレヒト, 1984)に従い、周知の数学的手法、たとえば統計学的回帰、パターン認識および分類を用いて、抗体の定量的な活性−特性関係を導き出すことができる(Norman et al. Applied Regression Analysis. Wiley-Interscience; 第3版(1998年4月); Kandel, Abraham & Backer, Eric. Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis. Prentice Hall PTR, (1995年5月11日); Krzanowski, Wojtek. Principles of Multivariate Analysis: A User’s Perspective (Oxford Statistical Science Series, No 22 (Paper)). Oxford University Press; (2000年12月); Witten, Ian H. & Frank, Eibe. Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java（登録商標）  Implementations. Morgan Kaufmann; (1999年10月11日); Denison David G. T. (Editor), Christopher C. Holmes, Bani K. Mallick, Adrian F. M. Smith. Bayesian Methods for Nonlinear Classification and Regression (Wiley Series in Probability and Statistics). John Wiley & Sons; (2002年7月); Ghose, Arup K. & Viswanadhan, Vellarkad N. Combinatorial Library Design and Evaluation Principles, Software, Tools, and Applications in Drug Discovery)。抗体の特性は、抗体の配列、機能および三次元構造の経験モデルおよび理論モデル（たとえば、可能性のある接触残基または計算した物理化学的特性の分析）から導き出すことができ、これらの特性を単独でまたは組み合わせて考慮することができる。
【０１０７】
抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインからなる抗原結合部位は、一般にポリペプチドの６つのループにより形成される：３つはＬ鎖可変ドメイン（ＶＬ）に由来、３つはＨ鎖可変ドメイン（ＶＨ）に由来。既知の原子構造をもつ抗体の分析により、抗体の結合部位の配列と三次元構造の関係が解明された。これらの関係から、ＶＨドメインの第３領域（ループ）を除いて、結合部位ループは少数の主要鎖コンホメーション（ｍａｉｎ−ｃｈａｉｎ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、すなわち規定構造のひとつをもつことが示唆される。特定のループに形成される規定構造は、それのサイズ、およびループと枠組み構造領域の両方において鍵となる部位に特定の残基が存在することにより決定されることが示されている。
【０１０８】
この配列−構造関係の研究を、配列は分かっているが三次元構造は未知である抗体において、それのＣＤＲループの三次元構造の維持、したがって結合特異性の維持に重要な残基を推定するのに利用できる。これらの推定をリード最適化実験からの出力と比較することにより、推定を裏付けすることができる。構造研究に際し、無料で入手できるパッケージまたは市販のパッケージ、たとえばＷＡＭを用いて、抗体分子のモデルを作製することができる。次いで、タンパク質の視覚化および解析用のソフトウェアパッケージ、たとえばＩｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．）またはＤｅｅｐ  Ｖｉｅｗを用いて、ＣＤＲ中の各位置において可能な置換を評価することができる。次いでこの情報を用いて、活性に対して最小もしくは有益な影響をもつかまたは他の望ましい特性をもたらす可能性のある置換を行なうことができる。
【０１０９】
本明細書中で用いる用語”ポリペプチドフラグメント”は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端が欠失しているが、残りのアミノ酸配列は、たとえば全長ｃＤＮＡ配列から演繹した天然配列中の対応する位置と同一であるポリペプチドを表わす。フラグメントは一般に、少なくとも５、６、８または１０アミノ酸の長さ、好ましくは少なくとも１４アミノ酸の長さ、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸の長さ、通常は少なくとも５０アミノ酸の長さ、よりさらに好ましくは少なくとも７０アミノ酸の長さである。本明細書中で用いる用語”類似体”は、演繹アミノ酸配列の一部に対して実質的な同一性をもち、かつ下記の特性のうち少なくとも１つを備えた、少なくとも２５アミノ酸のセグメントからなるポリペプチドを表わす：（１）適切な結合条件下でＰＤＧＦＲ−アルファに特異的に結合、（２）ＰＤＧＦ−ＡＡの結合を阻害する能力、（３）ＰＤＧＦ−ＡＢの結合を阻害する能力、（４）ＰＤＧＦ−ＢＢの結合を阻害する能力、および／または（５）ＰＤＧＦ−ＣＣの結合を阻害する能力。一般に、ポリペプチド類似体は天然配列に関して同類アミノ酸置換（または付加もしくは欠失）を含む。類似体は一般に、少なくとも２０アミノ酸の長さ、好ましくは少なくとも５０アミノ酸の長さ、またはそれ以上であり、しばしば全長天然ポリペプチドの長さである可能性がある。
【０１１０】
ペプチド類似体は、医薬産業において、鋳型ペプチドのものと類似の特性を備えた非ペプチド薬物として一般に用いられている。これらのタイプの非ペプチド化合物は、”模擬ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃｓまたはｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）”と呼ばれる。Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber and Freidinger TINS p.392 (1985);およびEvans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987)；これらを本明細書に援用する。そのような化合物は、しばしばコンピューター分子モデリングの補助により開発される。療法用として有用なペプチドに構造が類似する模擬ペプチドを用いて、同等な治療効果または予防効果を生じることができる。一般に、模擬ペプチドはパラダイムポリペプチド（すなわち、生化学的特性または医薬活性をもつポリペプチド）、たとえばヒト抗体に構造が類似するけれども、場合により１以上のペプチド結合が当技術分野において周知の方法で下記のものよりなる群から選択される結合と交換されている：−ＣＨ2ＮＨ−、−ＣＨ2Ｓ−、−ＣＨ2−ＣＨ2−、−ＣＨ＝ＣＨ−（ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ）、−ＣＯＣＨ2−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2−、および−ＣＨ2ＳＯ−。コンセンサス配列の１以上のアミノ酸を同一タイプのＤ−アミノ酸で系統的に置換すること（たとえば、Ｌ−リシンの代わりにＤ−リシン）を利用して、より安定なペプチドを作製することができる。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列変異を含む拘束されたペプチドを、当技術分野で既知の方法により作製できる(Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)、本明細書に援用する)；たとえば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド橋を形成しうる内部システイン残基の付加による。
【０１１１】
本明細書中で用いる用語”抗体”は、ポリペプチド鎖の折りたたみから形成される少なくとも１つの結合ドメインを含むポリペプチドまたはポリペプチドグループを表わし、このドメインは抗原の抗原決定基の特徴に相補的な内面形状および電荷分布を備えた三次元結合空間をもつ。抗体は一般に２つの同一対のポリペプチド鎖を含む四量体の形をもち、各対が１つの”Ｌ”鎖および１つの”Ｈ”鎖をもつ。各Ｌ／Ｈ鎖対の可変部が抗体の結合部位を形成する。
【０１１２】
本明細書中で用いる”ターゲテッド結合剤”は、ターゲット部位に結合する物質、たとえば抗体、またはその結合性フラグメントである。１態様において、ターゲテッド結合剤は１つのターゲット部位に対してのみ特異的である。他の態様において、ターゲテッド結合剤は１より多いターゲット部位に対して特異的である。１態様において、ターゲテッド結合剤はモノクローナル抗体であって、ターゲット部位はエピトープであってもよい。後記のように、ターゲテッド結合剤は抗体の少なくとも１つの抗原結合ドメイン（たとえばＣＤＲ）を含むことができ、このドメインがヘテロロガスタンパク質足場、たとえば非抗体−タンパク質足場内に融合または内包されている。
【０１１３】
抗体の”結合性フラグメント”は、組換えＤＮＡ技術により、または無傷の抗体の酵素開裂もしくは化学的開裂により作製される。結合性フラグメントには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ｄＡｂ、および一本鎖抗体が含まれる。”二特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）”または”二機能性（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）”抗体以外の抗体は、それの結合部位それぞれを同等に備えていると理解される。過剰の抗体がカウンターレセプター（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に付着するレセプターの量を少なくとも２０％、４０％、６０％または８０％、より普通には約８５％以上減少させる場合（インビボ競合結合アッセイで測定して）、抗体はレセプターがカウンターレセプターに付着するのを実質的に阻害する。
【０１１４】
抗体は、オリゴクローナル抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、多特異性抗体、二特異性抗体、触媒性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、抗イディオタイプ抗体、および溶解形または結合形で標識できる抗体、ならびにそのフラグメント、変異型または誘導体であってもよく、これらは単独、または既知の技術により得られる他のアミノ酸配列との組合わせである。抗体はいかなる種に由来するものであってもよい。抗体という用語には、本発明の抗体の結合性フラグメントも含まれる；フラグメントの例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、一本鎖抗体（ｓｖＦＣ）、二量体形の可変部（ディアボディー、Ｄｉａｂｏｄｙ）、およびジスルフィド安定化した可変部（ｄｓＦｖ）が含まれる。
【０１１５】
完全抗体のフラグメントが抗原結合の機能を果たしうることは示されている。結合性フラグメントの例は下記のものである(Ward, E.S. et al., (1989) Nature 341, 544-546)：ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント(McCafferty et al (1990) Nature, 348, 552-554)；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント(Holt et al (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490)；単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；(iv)ＶＨまたはＶＬドメインからなるｄＡｂフラグメント(Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989), McCafferty et al (1990) Nature, 348, 552-554, Holt et al (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490]；(v)単離されたＣＤＲ領域；(vi)Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、すなわち連結した２つのＦａｂフラグメントからなる二価フラグメント；（ｖｉｉ）一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）：この場合、ＶＨドメインとＶＬドメインがこれら２ドメインを結合しうるペプチドリンカーにより連結して抗原結合部位を形成している(Bird et al, (1988) Science, 242, 423-426, , Huston et al, (1988) PNAS USA, 85, 5879-5883)；(viii)二特異性一本鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）、ならびに（ｉｘ）遺伝子融合により構築された”ディアボディー”、多価または多特異性フラグメント(WO94/13804; Holliger, P. (1993) et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448)。Ｆｖ、ｓｃＦｖまたはディアボディー分子は、ＶＨドメインとＶＬドメインを連結するジスルフィド橋を取り込ませることによって安定化できる(Reiter, Y. et al, Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996)。ｓｃＦｖがＣＨ３ドメインに結合したものからなるミニボディー（Ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）も作製できる(Hu, S. et al, (1996) Cancer Res., 56, 3055-3061)。結合フラグメントの他の例は下記のものである；Ｆａｂ’：これは、抗体ヒンジ部に由来する１個以上のシステインを含む数個の残基がＨ鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に付加されていることにより、Ｆａｂフラグメントと異なる；およびＦａｂ’−ＳＨ：これは、Ｆａｂ’フラグメントにおいて定常ドメインのシステイン残基（１以上）が遊離チオール基を含むものである。
【０１１６】
用語”エピトープ”には、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合しうるいずれかのタンパク質決定基が含まれる。エピトープ決定基は、通常は化学的に活性な分子表面基、たとえばアミノ酸または糖側鎖からなり、必ずしも常にではないが、特定の三次元構造特性および特定の電荷特性をもつ可能性がある。抗体は、解離定数が≦１μＭ、好ましくは≦１００ｎＭ、最も好ましくは≦１０ｎＭである場合、抗原を特異的に結合すると言われる。
【０１１７】
用語”剤（物質）（ａｇｅｎｔ）”は、本明細書中で化学物質、化学物質混合物、生体高分子、または生物材料から調製した抽出物を表わすために用いられる。
ＰＤＧＦＲ−アルファに関する”活性な”または”活性”は、ＰＤＧＦＲ−アルファポリペプチドにおいて天然ＰＤＧＦＲ−アルファポリペプチドの生物学的活性または免疫学的活性をもつ部分を表わす。本明細書中で用いる”生物学的”は、天然ＰＤＧＦＲ−アルファポリペプチドの活性から生じる生物学的機能を表わす。ＰＤＧＦＲ−アルファポリペプチドの好ましい生物学的活性には、たとえば自己リン酸化が含まれる。
【０１１８】
本明細書中で用いる”哺乳動物”は、哺乳動物とみなされるいずれかの動物を表わす。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
酵素パパインで抗体を消化すると、”Ｆａｂ”フラグメントとしても知られる２つの同一の抗原結合性フラグメント、および抗原結合活性をもたないけれども結晶化能をもつ”Ｆｃ”フラグメントが生成する。酵素ペプシンで抗体を消化すると、抗体分子の２つのアームが結合したままで２つの抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）2フラグメントが生成する。Ｆ（ａｂ’）2フラグメントは抗原を架橋する能力をもつ。
【０１１９】
本明細書中で用いる”Ｆｖ”は、抗原認識部位と抗原結合部位の両方を保持した最小の抗体フラグメントを表わす。
本明細書中で用いる”Ｆａｂ”は、Ｌ鎖の定常ドメインとＨ鎖のＣＨ１ドメインを含む抗体フラグメントを表わす。
【０１２０】
”ｄＡｂ”は単一ドメイン抗体であり、抗体Ｈ鎖の可変ドメイン（ＶＨドメイン）または抗体Ｌ鎖の可変ドメイン（ＶＬドメイン）を含む。各ｄＡｂは６つの天然ＣＤＲのうち３つを含む(Ward et al., 大腸菌（Escherichia coli）から分泌されるレパトアの単一免疫グロブリン可変ドメインの結合活性. Nature 341, 544-546 (1989); Holt, et al., ドメイン抗体：治療用タンパク質, Trends Biotechnol. 21, 484-49 (2003))。それらは１１〜１５ｋＤａの分子量をもち、抗原結合性フラグメント（Ｆａｂ）２より４倍小さく、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子の半分のサイズをもつ。
【０１２１】
用語”ｍＡｂ”は、モノクローナル抗体を表わす。
本明細書中で用いる”リポソーム”は、薬物を哺乳動物に送達するのに有用な可能性のある小胞を表わし、薬物には本発明のＰＤＧＦＲ−アルファポリペプチドまたはそれらのＰＤＧＦＲ−アルファポリペプチドに対する抗体を含めることができる。
【０１２２】
本明細書中で用いる”標識”または”標識された”は、ポリペプチドに検出可能な部分、たとえば放射性標識、蛍光標識、酵素標識、化学発光標識またはビオチニル基を付加することを表わす。放射性同位体または放射性核種には３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉを含めることができ、蛍光標識にはローダミン、ランタニド系リン光体、またはＦＩＴＣを含めることができ、酵素標識には西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼを含めることができる。
【０１２３】
他の標識には、たとえば下記のものが含まれるが、これらに限定されない：酵素、たとえばグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（”Ｇ６ＰＤＨ”）、アルファ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースアミラーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、マレイン酸デヒドロゲナーゼおよびペルオキシダーゼ；色素；他の蛍光標識または蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）には、たとえばフルオレセインおよびその誘導体、蛍光色素、ＧＦＰ（ＧＦＰは”グリーン蛍光タンパク質”）、ダンシル（ｄａｎｓｙｌ）、ウンベリフェロン（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、フィコシアニン（ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、アロフィコシアニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、ｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレスカミン（ｆｌｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ）；発蛍光団、たとえばランタニドクリプテート（ｃｒｙｐｔａｔｅ）類およびキレート類、たとえばＥｕｒｏｐｉｕｍなど（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ａｎｄ  Ｃｉｓ  Ｂｉｏｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）；化学発光性標識または化学発光物質（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）、たとえばイソルミノール、ルミノール、およびジオキセタン（ｄｉｏｘｅｔａｎｅ）類；増感剤；補酵素；酵素基質；粒子、たとえばラテックスまたは炭素粒子；金属ゾル；晶子（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｔｅ）；リポソーム；セルなど、これらはさらに色素、触媒または他の検出可能な基で標識されていてもよい；ビオチン、ジゴキシゲニンまたは５−ブロモデオキシウリジンなどの分子；毒素の一部、たとえば下記よりなる群から選択される毒素の一部：シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素（ＰＥまたはその細胞毒性フラグメントもしくは変異体）、ジフテリア（Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）毒素またはその細胞毒性フラグメントもしくは変異体、ボツリヌス毒素Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥまたはＦ、リシン（ｒｉｃｉｎ）またはその細胞毒性フラグメント、たとえばリシンＡ、アブリン（ａｂｒｉｎ）またはその細胞毒性フラグメント、サポリンまたはその細胞毒性フラグメント、アメリカヤマゴボウ（ｐｏｋｅｗｅｅｄ）抗ウイルス毒素またはその細胞毒性フラグメント、ならびにブリオジン１（ｂｒｙｏｄｉｎ  １）またはその細胞毒性フラグメント。
【０１２４】
本明細書中で用いる用語”医薬または薬物”は、患者に適切に投与した際に目的とする療法効果を誘発しうる化学物質または組成物を表わす。本明細書中の他の化学用語は、The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., 編, McGraw-Hill,サンフランシスコ(1985))に例示されるように、当技術分野における慣例に従って用いられる。
【０１２５】
本明細書中で用いる”実質的に純粋な”は、対象種が存在する優勢な種であることを意味する（すなわち、モル基準でそれは組成物中の他のいずれの個々の種より多量にある）；好ましくは、実質的に純粋な画分は、対象種が存在するすべての高分子種のうち少なくとも５０％（モル基準で）を構成する組成物である。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての高分子種のうち約８０％以上、より好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上および９９％以上を含むであろう。最も好ましくは、対象種を本質的な均質度（一般的な検出法で組成物中に混在種を検出できない）になるまで精製し、その際、組成物は本質的に単一の高分子種から構成される。
【０１２６】
”抗体依存性の細胞仲介性細胞毒性（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）”および”ＡＤＣＣ”は細胞仲介反応を表わし、その際、Ｉｇ  Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的な細胞傷害性細胞（たとえばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、好中球およびマクロファージ）がターゲット細胞に結合した抗体を認識し、続いてターゲット細胞の溶解を引き起こす。ＡＤＣＣを仲介する一次細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現し、一方、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲ発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991), p.464, 表3にまとめられている。目的分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、インビトロＡＤＣＣアッセイ、たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，５００，３６２または５，８２１，３３７に記載のアッセイを実施することができる。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、目的分子のＡＤＣＣ活性はインビボで、たとえばClynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1988)に示される動物モデルにおいて評価することができる。
【０１２７】
”補体依存性−細胞毒性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）”および”ＣＤＣ”は、抗体がそれらの細胞死滅機能を行なう機序を表わす。それは、Ｃ１ｑ、すなわち補体の第１成分の構成要素が、抗原と複合体を形成しているＩｇ類、ＩｇＧまたはＩｇＭのＦｃドメインに結合することにより開始される(Hughs-Jones, N.C., and B. Gardner. 1979. Mol. Immunol. 16:697)。Ｃ１ｑは約４１０ｋＤａの大型で複雑な構造をもつ糖タンパク質であり、ヒト血清中に７０μｇ／ｍｌの濃度で存在する(Cooper, N.R. 1985. Adv. Immunol. 37:151)。Ｃ１ｑは、２種類のセリンプロテアーゼＣ１ｒおよびＣ１ｓと共に複合体Ｃ１、すなわち補体の第１成分を形成する。Ｃ１が活性化し、したがって補体カスケードが開始するためには、Ｃ１ｑのＮ末端球状ヘッドのうち少なくとも２つがＩｇ類のＦｃに結合しなければならない(Cooper, N.R. 1985. Adv. Immunol. 37:151)。
【０１２８】
”全血アッセイ”には、未分画血液を天然エフェクター源として用いる。血液は血漿中に、ＦｃＲを発現する細胞性エフェクター、たとえば多形核細胞（ＰＭＮ）および単核細胞（ＭＮＣ）と共に、補体を含有する。したがって、全血アッセイによりＡＤＣＣおよびＣＤＣエフェクター機序の相乗作用をインビトロで同時に評価することができる。
【０１２９】
用語”患者”には、ヒトおよび動物対象が含まれる。
本明細書中で用いる用語”および／または”は、それら２つの特定の特徴または成分がそれぞれ他方を含むかまたは含まないことの特定の記載と解釈すべきである。たとえば、”Ａおよび／またはＢ”は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、ならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢをそれぞれ本明細書に個別に記載したと全く同じように、それらの特定の記載と解釈すべきである。
【０１３０】
抗体の構造
基本的な抗体構造単位が四量体からなることは知られている。四量体はそれぞれ、２つの同一対のポリペプチド鎖から構成され、各対は１つの”Ｌ”鎖（約２５ｋＤａ）および１つの”Ｈ”鎖（約５０〜７０ｋＤａ）をもつ。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識に主に関与する約１００〜１１０アミノ酸またはそれ以上の可変部を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に主に関与する定常部を規定する。ヒトＬ鎖はカッパおよびラムダＬ鎖として分類される。Ｈ鎖はミュー、デルタ、ガンマ、アルファまたはイプシロンとして分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを規定する。Ｌ鎖およびＨ鎖内で、可変部と定常部が約１２アミノ酸またはそれ以上の”Ｊ”領域により連結し、Ｈ鎖は約１０アミノ酸またはそれ以上の”Ｄ”領域をも含む。全般的にFundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W.,編, 第2版. Raven Press, ニューヨーク(1989))を参照(それの全体をあらゆる目的で援用する)。各Ｌ／Ｈ鎖対の可変部は抗体の結合部位を形成する。
【０１３１】
したがって、無傷の抗体は２つの結合部位をもつ。二機能性または二特異性抗体の場合を除いて、これら２つの結合部位は同一である。
これらの鎖はすべて、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変部により連結された、比較的保存された枠組み構造領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。各対の２つの鎖に由来するＣＤＲは枠組み構造領域によりアラインし、これによって特異的エピトープへの結合が可能となる。Ｌ鎖とＨ鎖の両方とも、Ｎ末端からＣ末端へドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインに対するアミノ酸の割り当ては、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, メリーランド州ベセスダ(1987 and 1991))、またはChothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989)の定義に従う。
【０１３２】
二特異性抗体または二機能性抗体は、２つの異なるＨ／Ｌ鎖対および２つの異なる結合部位をもつ人工ハイブリッド抗体である。二特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの連結を含めた多様な方法で作製できる。たとえば、Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990)、Kostelny et al. J. Immunol. 148:1547-1553 (1992)を参照。二特異性抗体は、単一結合部位をもつフラグメント（たとえばＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦｖ）の形で存在することはない。
【０１３３】
ＶＨドメインまたはＶＬドメインを単独で用いて抗原を結合することができるが、一般にＶＨドメインをＶＬドメインと対合させて抗体の抗原結合部位を提供する。ＶＨドメイン（表１２参照）をＶＬドメイン（表１３参照）と対合させることができ、こうしてＶＨドメインとＶＬドメインの両方を含む、抗体の抗原結合部位が形成される。
【０１３４】
ヒト抗体および抗体のヒト化
ヒト抗体は、ネズミまたはラットの可変部および／または定常部をもつ抗体に関連する問題のうちあるものを回避する。ネズミまたはラットに由来するそのようなタンパク質が存在すると、抗体の急速なクリアランスが生じ、あるいは抗体に対して患者による免疫反応が発生する可能性がある。ネズミまたはラットに由来する抗体の使用を避けるために、機能性ヒト抗体遺伝子座をげっ歯類、他の哺乳動物または動物に導入し、これによりげっ歯類、他の哺乳動物または動物に完全ヒト抗体を産生させることによって、完全ヒト抗体を作製することができる。
【０１３５】
完全ヒト抗体を作製するための１方法は、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系統のマウスの使用による；これは、ヒトＨ鎖遺伝子座およびカッパＬ鎖遺伝子座の１０００ｋｂ未満のサイズの生殖細胞系列構造のフラグメントを含むように工学的に処理されている。Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997)およびGreen and Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998)を参照。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系統はＡｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州フリーモント）から入手できる。
【０１３６】
したがって、そのようなマウスはヒトの免疫グロブリン分子および抗体を産生することができ、ネズミの免疫グロブリン分子および抗体の産生を行わない。これを達成するために用いられる技術は、米国特許出願Ｎｏ．０８／７５９，６２０（１９９６年１２月３日出願）ならびに国際特許出願Ｎｏｓ．ＷＯ  ９８／２４８９３（１９９８年６月１１日公開）およびＷＯ  ００／７６３１０（２０００年１２月２１日公開）に開示されている；それらの開示内容を本明細書に援用する。Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997)も参照されたい；その記載内容を本明細書に援用する。
【０１３７】
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系統のマウスの作製は、さらに下記に考察および概説されている：米国特許出願Ｎｏｓ．０７／４６６，００８（１９９０年１月１２日出願）、０７／６１０，５１５（１９９０年１１月８日出願）、０７／９１９，２９７（１９９２年７月２４日出願）、０７／９２２，６４９（１９９２年７月３０日出願）、０８／０３１，８０１（１９９３年３月１５日出願）、０８／１１２，８４８（１９９３年８月２７日出願）、０８／２３４，１４５（１９９４年４月２８日出願）、０８／３７６，２７９（１９９５年１月２０日出願）、０８／４３０，９３８（１９９５年４月２７日出願）、０８／４６４，５８４（１９９５年６月５日出願）、０８／４６４，５８２（１９９５年６月５日出願）、０８／４６３，１９１（１９９５年６月５日出願）、０８／４６２，８３７（１９９５年６月５日出願）、０８／４８６，８５３（１９９５年６月５日出願）、０８／４８６，８５７（１９９５年６月５日出願）、０８／４８６，８５９（１９９５年６月５日出願）、０８／４６２，５１３（１９９５年６月５日出願）、０８／７２４，７５２（１９９６年１０月２日出願）、０８／７５９，６２０（１９９６年１２月３日出願）、Ｕ．Ｓ．Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ２００３／００９３８２０（２００１年１１月３０日出願）、ならびにＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．６，１６２，９６３、６，１５０，５８４、６，１１４，５９８、６，０７５，１８１および５，９３９，５９８、ならびに日本特許Ｎｏｓ．３  ０６８  １８０  Ｂ２、３  ０６８  ５０６  Ｂ２および３  ０６８  ５０７  Ｂ２。下記も参照されたい：欧州特許Ｎｏ．ＥＰ  ０  ４６３  １５１  Ｂ１（１９９６年６月１２日特許公開）、国際特許出願Ｎｏ．ＷＯ  ９４／０２６０２（１９９４年２月３日公開）、国際特許出願Ｎｏ．ＷＯ  ９６／３４０９６（１９９６年１０月３１日公開）、ＷＯ  ９８／２４８９３（１９９８年６月１１日公開）、ＷＯ  ００／７６３１０（２０００年１２月２１日公開）。上記に引用した特許、特許出願および参考文献それぞれの開示内容全体を本明細書に援用する。
【０１３８】
他の方法において、ＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ．を含む他の場合は”ミニ遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）”法が用いられた。ミニ遺伝子座法では、外来Ｉｇ遺伝子座に由来する片（個々の遺伝子）を導入することにより、外来Ｉｇ遺伝子座を模倣する。たとえば１以上のＶＨ遺伝子、１以上のＤＨ遺伝子、１以上のＪＨ遺伝子、ミュー定常部、および通常は第２定常部（好ましくはガンマ定常部）を、動物に導入するための構築体に形成する。この方法は下記に記載されている：Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，５４５，８０７（Ｓｕｒａｎｉら）、ならびにＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，５４５，８０６、５，６２５，８２５、５，６２５，１２６、５，６３３，４２５、５，６６１，０１６、５，７７０，４２９、５，７８９，６５０、５，８１４，３１８、５，８７７，３９７、５，８７４，２９９および６，２５５，４５８（それぞれＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙ）、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，５９１，６６９および６，０２３．０１０（ＫｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔおよびＢｅｒｎｓ）、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，６１２，２０５、５，７２１，３６７および５，７８９，２１５（Ｂｅｒｎｓら）、ならびにＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，６４３，７６３（ＣｈｏｉおよびＤｕｎｎ）、ならびにＧｅｎＰｈａｒｍ  ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌのＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｉａｌ  Ｎｏｓ．０７／５７４，７４８（１９９０年８月２９日出願）、０７／５７５，９６２（１９９０年８月３１日出願）、０７／８１０，２７９（１９９１年１２月１７日出願）、０７／８５３，４０８（１９９２年３月１８日出願）、０７／９０４，０６８（１９９２年６月２３日出願）、０７／９９０，８６０（１９９２年１２月１６日出願）、０８／０５３，１３１（１９９３年４月２６日出願）、０８／０９６，７６２（１９９３年７月２２日出願）、０８／１５５，３０１（１９９３年１１月１８日出願）、０８／１６１，７３９（１９９３年１２月３日出願）、０８／１６５，６９９（１９９３年１２月１０日出願）、０８／２０９，７４１（１９９４年３月９日出願）；それらの開示内容を本明細書に援用する。下記も参照されたい：欧州特許Ｎｏ．０  ５４６  ０７３  Ｂ１、国際特許出願Ｎｏｓ．ＷＯ  ９２／０３９１８、ＷＯ  ９２／２２６４５、ＷＯ  ９２／２２６４７、ＷＯ  ９２／２２６７０、ＷＯ  ９３／１２２２７、ＷＯ  ９４／００５６９、ＷＯ  ９４／２５５８５、ＷＯ  ９６／１４４３６、ＷＯ  ９７／１３８５２およびＷＯ  ９８／２４８８４、ならびにＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，９８１，１７５；それらの開示内容全体を本明細書に援用する。さらに下記も参照されたい：Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３、Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）、およびＴｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）；それらの開示内容全体を本明細書に援用する。
【０１３９】
Ｋｉｒｉｎもマウスからのヒト抗体作製を立証し、この場合はマイクロセル融合によって大きな染色体片または染色体全体が導入された。欧州特許出願Ｎｏｓ．７７３  ２８８および８４３  ９６１を参照；それらの開示内容を本明細書に援用する。さらに、ＫｉｒｉｎのＴｃマウスとＭｅｄａｒｅｘのミニ遺伝子座（Ｈｕｍａｂ）マウスの交雑育種の結果であるＫＭＴＭマウスが作製された。これらのマウスは、ＫｉｒｉｎマウスのヒトＩｇＨトランスクロモソームとＧｅｎｐｈａｒｍマウスのカッパ鎖トランスジーンを保有する(Ishida et al., Cloning Stem Cells, (2002) 4:91-102)。
【０１４０】
ヒト抗体はインビトロ法により誘導することもできる。適切な例には、ファージディスプレー（ＣＡＴ、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ、Ｄｙａｘ、Ｂｉｏｓｉｔｅ／Ｍｅｄａｒｅｘ、Ｘｏｍａ、Ｓｙｍｐｈｏｇｅｎ、Ａｌｅｘｉｏｎ（以前はＰｒｏｌｉｆｅｒｏｎ）、Ａｆｆｉｍｅｄ）、リボソームディスプレー（ＣＡＴ）、酵母ディスプレーなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４１】
他の態様において、本発明の抗体は開示した抗体と競合する。抗体間の競合は、インビトロで容易にアッセイできる：たとえばＥＬＩＳＡを利用する；および／または他の１以上のタグなし抗体の存在下で検出できる特異的レポーター分子タグを１つの結合メンバーに付けて、同一エピトープまたはオーバーラップエピトープを結合する抗体を同定することができる。それらの方法は当業者に自明であり、本明細書中にさらに詳細に記載されている。したがって本発明の他の観点は、ヒト抗体の抗原結合部位を含む抗原結合部位を提供する；これは、ＰＤＧＦＲ−アルファを結合する抗体分子、たとえば特にＶＨおよび／またはＶＬドメイン、ＣＤＲ、たとえばＨＣＤＲ３または親抗体もしくは本明細書に開示するいずれかの抗体の一組のＣＤＲを含む抗体分子と競合する。１態様において、本発明の抗体は２．１７５．３、２．４４９．１．３および／または２．９９８．２と競合する。
【０１４２】
抗体の作製
一般に、融合ハイブリドーマにより産生された抗体は、完全ヒトカッパまたはラムダＬ鎖を含むヒトＩｇＧ２またはＩｇＧ４のＨ鎖であった。抗体は、ＩｇＧ１のＨ鎖を含む他のヒト−イソ型であってもよい。これらの抗体は高いアフィニティーをもち、ＦＡＣＳベースのアフィニティー測定法で測定した場合に一般に約１０−６〜約１０−１２Ｍまたはそれ以下のＫｄをもつ。アフィニティーは固相法および液相法により測定することもできる。１態様において、本明細書に記載する抗体はＣＤ  ＰＤＧＦＲ−アルファ２０を約５００、４００、３００、２００または１００ピコモル濃度（ｐＭ）未満のＫｄで結合し、腫瘍の増殖を阻害する。ある態様において、本明細書に記載する抗体はＰＤＧＦＲ−アルファを約７５、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１０または５ｐＭ未満のＫｄで結合する。
【０１４３】
認識されるように、抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体はハイブリドーマ細胞系以外の細胞系においても発現させることができる。特定の抗体をコードする配列を用いて、適切な哺乳動物の宿主細胞を形質転換することができる。形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための既知のいずれの方法によるものであってもよい；これには、たとえばポリヌクレオチドをウイルス内（またはウイルスベクター内）にパッケージし、このウイルス（またはウイルスベクター）で宿主細胞をトランスダクションする方法、またはＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．４，３９９，２１６、４，９１２，０４０、４，７４０，４６１および４，９５９，４５５（これらの特許を本明細書に援用する）により例示されるように当技術分野で既知のトランスフェクション法が含まれる。採用する形質転換法は、形質転換すべき宿主細胞に依存する。ヘテロロガスポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入するための方法は当技術分野で周知であり、デキストラン仲介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）仲介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へのポリヌクレオチド（１以上）の封入、および核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションが含まれる。
【０１４４】
発現のための宿主として利用できる哺乳動物細胞系は当技術分野で周知であり、これにはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手できる多数の不死化細胞系が含まれる：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ハムスター乳仔腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（たとえばＨｅｐ  Ｇ２）、ヒト上皮性腎２９３細胞、および他の多数の細胞系が含まれるが、これらに限定されない。特に好ましい細胞系は、どの細胞系が高い発現レベルをもち、構成性ＰＤＧＦＲ−アルファ結合特性を備えた抗体を産生するかを判定することにより選択される。
【０１４５】
抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体は、患者試料中のＰＤＧＦＲ−アルファを検出するのに有用であり、したがって本明細書に記載する疾病状態の診断薬として有用である。さらに、それらが腫瘍の増殖を阻害する能力に基づいて、抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体はＰＤＧＦＲ−アルファ発現から生じる症状および状態の処置に際して療法効果をもつ。具体的な態様において、本発明の抗体および方法は、ＰＤＧＦＲ−アルファにより誘発される腫瘍の増殖から生じる症状の処置に関する。他の態様は、本明細書に記載する抗体および方法を用いて、新生物疾患、たとえば肺癌、卵巣癌、前立腺癌、大腸癌、神経膠芽腫、黒色腫および消化器間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）を含む癌を処置することを伴う。
【０１４６】
抗体の配列
本発明の態様には、後記の表１に挙げる特異的な抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体が含まれる。この表には、抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体それぞれの識別番号、ならびに対応するＨ鎖およびＬ鎖の可変部の遺伝子のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．を報告する。
【０１４７】
各抗体に、２または３つの数字を１または２つの小数点で区切ったものを含む識別番号を付けた。場合により、２つだけの識別番号を１つの小数点で区切ったものを挙げる。しかし、場合により１つの抗体の数クローンを調製した。それらのクローンは親配列と同一の核酸配列およびアミノ酸配列をもつが、それらも別個に挙げ、クローン番号を第２小数点の右の数字により示した。したがって、たとえば抗体２．８４の核酸配列およびアミノ酸配列は２．８４．１、２．８４．２および２．８４．３の配列と同一である。
【０１４８】
【表１−１】
0005437804.tif 000002
【０１４９】
【表１−２】
0005437804.tif 000003
【０１５０】
【表１−３】
0005437804.tif 000004
【０１５１】
【表１−４】
0005437804.tif 000005
【０１５２】
本明細書において実施例に記載するように、下記に従ってＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を利用して抗体を調製した。したがって、それらのマウスはヒト免疫グロブリンおよび抗体を産生することができ、ネズミの免疫グロブリンおよび抗体の産生を行わない。これを達成するために用いた技術は本明細書の背景のセクションに示した特許、特許出願および参考文献に開示されている。ただし、特にトランスジェニックマウス作製およびそれからの抗体の産生の好ましい態様は、米国特許出願Ｎｏ．０８／７５９，６２０（１９９６年１２月３日出願）ならびに国際特許出願Ｎｏｓ．ＷＯ  ９８／２４８９３（１９９８年６月１１日公開）およびＷＯ  ００／７６３１０（２０００年１２月２１日公開）に開示されている；それらの開示内容を本明細書に援用する。Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997)も参照されたい；その記載内容を本明細書に援用する。
【０１５３】
そのような技術を用いて、多様な抗原に対する完全ヒトモノクローナル抗体を調製した。本質的に、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系統のマウスを目的抗原（たとえばＰＤＧＦＲ−アルファ）で免疫化し、この高度免疫化マウスからリンパ球（たとえばＢ細胞）を回収し、回収したリンパ球を骨髄タイプの細胞系と融合させて、不死ハイブリドーマ細胞系を作製する。これらのハイブリドーマ細胞系をスクリーニングおよび選択して、目的抗原に対して特異的な抗体を産生したハイブリドーマ細胞系を同定する。本明細書には、ＰＤＧＦＲ−アルファに対して特異的な抗体を産生する多数のハイブリドーマ細胞系を作製するための方法を提供する。さらに、そのような細胞系が産生した抗体の特性分析を本明細書に提供する；これには、そのような抗体のＨ鎖およびＬ鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の分析が含まれる。
【０１５４】
あるいは、骨髄腫細胞に融合させてハイブリドーマを作製するのではなく、Ｂ細胞を直接アッセイすることができる。たとえば、ＣＤ１９＋  Ｂ細胞を高度免疫ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）から単離し、増殖させて抗体分泌型の形質細胞に分化させることができる。次いで細胞上清からの抗体を、ＰＤＧＦＲ−アルファ免疫原に対する反応性についてＥＬＩＳＡによりスクリーニングする。上清をＰＤＧＦＲ−アルファのフラグメントに対する免疫反応性についてスクリーニングして、種々の抗体をＰＤＧＦＲ−アルファ上の機能的に関心のあるドメインへの結合についてさらにマッピングすることもできる。他の関連ヒト受容体、ならびにラット、マウス、およびヒト以外の霊長類、たとえばカニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）のＰＤＧＦＲ−アルファのオーソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ）に対して、抗体をスクリーニングすることもできる（後者は種交差反応性を判定するため）。目的抗体を収容したウェルからのＢ細胞を多様な方法で不死化することができ、これには個々のウェルもしくはプールしたウェルから融合によりハイブリドーマを作製する方法、またはＥＢＶ感染による方法、もしくは既知の不死化遺伝子によりトランスフェクションし、次いで適切な培地で平板培養する方法が含まれる。あるいは、目的の特異性をもつ抗体を分泌する単一の形質細胞を、次いでＰＤＧＦＲ−アルファ特異的溶血プラークアッセイにより単離する(たとえばBabcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-48 (1996)を参照)。溶血のターゲットにする細胞は、好ましくはＰＤＧＦＲ−アルファ抗原でコーティングしたヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）である。
【０１５５】
目的の免疫グロブリンおよび補体を分泌する形質細胞を含むＢ細胞培養物の存在下で溶血プラークが形成されたことは、その形質細胞の周囲にあるヒツジ赤血球がＰＤＧＦＲ−アルファ仲介によって特異的に溶解されたことの指標となる。プラークの中心にある１個の抗原特異的な形質細胞を単離し、抗体の特異性をコードする遺伝子の情報をその１個の形質細胞から得ることができる。逆転写に続くＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、その抗体のＨ鎖およびＬ鎖可変部をコードするＤＮＡをクローン化することができる。次いでそのようなクローン化ＤＮＡを、適切な発現ベクター、好ましくはベクターカセット、たとえばｐｃＤＮＡ、より好ましくは免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖の定常ドメインを含むｐｃＤＮＡベクターに、さらに導入することができる。次いで、形成されたベクターを宿主細胞、たとえばＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞内にトランスフェクションし、転写の誘導に適切となるように改変した一般的な栄養培地で培養し、形質転換体を選択し、または目的配列をコードする遺伝子を増幅させることができる。
【０１５６】
抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体は、ＰＤＧＦＲ−アルファ発現に関連する症状および状態の処置に際して療法効果をもつことができる。たとえば、これらの抗体はＰＤＧＦＲ−アルファを発現する細胞の増殖を阻害することにより腫瘍の増殖を阻害することができ、あるいはこれらの抗体は薬剤と結合して致死毒素を標的細胞へ送達することができる。抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体は、線維性疾患、たとえば心臓、肺、肝臓、腎臓または皮膚の線維症の処置に際して療法効果をもつことができる。抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体は、同種移植血管障害または再狭窄の処置に際して療法効果をもつこともできる。さらに、抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体は、疾病状態、特に新生物疾患、線維性疾患および免疫系疾患の診断薬として有用である。
【０１５７】
所望により、たとえば異なるイソ型の生物学的特性を利用するために、抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体のイソ型を切り換えることができる。たとえば、ある状況では、ＰＤＧＦＲ−アルファに対する療法用抗体としての抗体の調製に関して、抗体が補体を固定して補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）に関与しうることが望ましい可能性がある。これを行なうことができる多数のイソ型抗体があり、これには下記のものが含まれるが、これらに限定されない：ネズミＩｇＭ、ネズミＩｇＧ２ａ、ネズミＩｇＧ２ｂ、ネズミＩｇＧ３、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＡ、ヒトＩｇＧ１、およびヒトＩｇＧ３。他の態様においては、ＰＤＧＦＲ−アルファに対する療法用抗体としての抗体の調製に関して、抗体がエフェクター細胞上のＦｃ受容体を結合して抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）に関与しうることが望ましい可能性がある。これを行なうことができる多数のイソ型抗体があり、これには下記のものが含まれるが、これらに限定されない：ネズミＩｇＧ２ａ、ネズミＩｇＧ２ｂ、ネズミＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ１、およびヒトＩｇＧ３。生成する抗体が最初にそのようなイソ型をもつ必要はなく、むしろ生成した抗体はいずれかのイソ型をもち、その後その抗体を当技術分野で周知の常法によりイソ型切り換えできることは認識されるであろう。そのような技術には、特に直接組換え技術（たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，８１６，３９７を参照）、細胞−細胞融合技術（たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，９１６，７７１および６，２０７，４１８を参照）の利用が含まれる。
【０１５８】
たとえば、本明細書中に述べる抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体は完全ヒト抗体である。抗体が目的とするＰＤＧＦＲ−アルファ結合性をもつ場合、それをイソ型切り換えしてなおかつ同一の可変部（抗体の特異性および一部のアフィニティーを決定する）をもつヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ３イソ型を作製することが容易にできる。そのような分子は、次いで補体を固定してＣＤＣに関与することができ、および／またはエフェクター細胞上のＦｃ受容体を結合してＡＤＣＣに関与することができる。
【０１５９】
細胞−細胞融合技術においては、目的とするいずれかのイソ型をもつＨ鎖を保有する黒色腫細胞、ＣＨＯ細胞または他の細胞系を調製し、Ｌ鎖をもつ他の黒色腫細胞、ＣＨＯ細胞または他の細胞系を調製する。その後、それらの細胞を融合させて、無傷の抗体を発現する細胞系を単離することができる。
【０１６０】
したがって、目的とする前記の”構造”性状に適合する抗体候補が生成するので、それらは一般にイソ型切り換えにより少なくとも特定の目的”機能”性状を備えることができる。
【０１６１】
療法投与および配合物
本発明の態様には、疾患の処置に有用な抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体の無菌医薬配合物が含まれる。それらの配合物は、細胞の増殖を阻害し、これにより、たとえばＰＤＧＦＲ−アルファ発現が異常に増大している病的状態またはＰＤＧＦＲ−アルファ発現細胞により仲介される疾病状態が効果的に処置される。抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体は、好ましくはＰＤＧＦＲ−アルファを特異的に結合するのに適切なアフィニティーをもち、かつ好ましくはヒトに低頻度で投与できるのに適切な作用持続時間をもつ。作用持続時間の延長によって、皮下注射または筋肉内注射など別の非経口経路での、より少ない頻度およびより好都合な投与計画が可能となるであろう。
【０１６２】
無菌配合物は、抗体の凍結乾燥および再構築の前または後に、たとえば無菌濾過膜を通した濾過により調製できる。抗体は、通常は凍結乾燥形態または溶液状で保存されるであろう。療法用抗体組成物は、一般に無菌採取口を備えた容器、たとえば配合物の取出しが可能なアダプター、たとえば皮下注射針が貫通しうる栓を備えた、静注液バッグまたはバイアルに収容される。
【０１６３】
抗体の投与経路は、既知の方法、たとえば静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、クモ膜下による注射もしくは注入、吸入、または病変部内経路、または前記の持続放出系に従う。本発明の抗体は、好ましくは注入により連続投与され、またはボーラス注射により投与される。
【０１６４】
療法に用いられる抗体の有効量は、たとえば療法目的、投与経路、および患者の状態に依存するであろう。したがって、最適療法効果を得るために必要に応じて治療者が用量を判定し、かつ投与経路を改変することが好ましい。一般に臨床医は、目的効果が達成される用量に達するまで抗体を投与するであろう。この療法の経過は一般的なアッセイ法または本明細書に記載するアッセイ法によって容易にモニターされる。
【０１６５】
本明細書に記載する抗体は、医薬的に許容できるキャリヤーとの混合物として調製することができる。この療法用組成物は、静脈内に、または鼻腔もしくは肺を通して好ましくは液体または粉末エアゾール（凍結乾燥状態）として、投与することができる。この組成物は、所望により非経口または皮下投与することもできる。全身投与する場合、療法用組成物は、ｐＨ、等張性および安定性に関して妥当に考慮された、無菌で、発熱物質を含まず、非経口用として許容できる液剤とすべきである。これらの条件は当業者に既知である。要約すると、本明細書に記載する化合物の投与用配合物は、目的純度をもつ化合物を生理的に許容できるキャリヤー、賦形剤または安定剤と混合することにより、貯蔵または投与のために調製される。それらの物質は、使用する用量および濃度でレシピエントに対して無毒性であり、下記のものを含む：ＴＲＩＳ  ＨＣｌ、リン酸、クエン酸、酢酸、および他の有機酸の塩類などの緩衝液；酸化防止剤、たとえばアスコルビン酸；低分子量（約１０残基未満）ペプチド、たとえばポリアルギニン、タンパク質、たとえば血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、たとえばポリビニルピロリジノン；アミノ酸、たとえばグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニン；単糖類、二糖類および他の炭水化物：セルロースもしくはその誘導体、グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む；キレート化剤、たとえばＥＤＴＡ；糖アルコール、たとえばマンニトールまたはソルビトール；対イオン、たとえばナトリウム、および／または非イオン界面活性剤、たとえばＴＷＥＥＮ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ、またはポリエチレングリコール。
【０１６６】
注射用無菌組成物は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (第20版, Lippincott Williams & Wilkens Publishers (2003))に記載される医薬一般法に従って調製できる。たとえば、有効化合物を、水、または天然植物油、たとえばゴマ油、ラッカセイ油もしくは綿実油、または合成脂肪性ビヒクル、たとえばオレイン酸エチルなどのビヒクルに溶解または懸濁することが望ましい。一般に認められている医薬実務に従って緩衝剤、保存剤、酸化防止剤などを含有させることができる。
【０１６７】
持続放出製剤の適切な例には、前記ポリペプチドを収容した固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、それらのマトリックスは造形品、フィルムまたはマイクロカプセルの形状である。持続放出マトリックスの例には下記のものが含まれる：ポリエステル、ヒドロゲル（たとえばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）：Langer et al., J. Biomed Mater. Res., (1981) 15:167-277およびLanger, Chem. Tech., (1982) 12:98-105に記載、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．３，７７３，９１９、ＥＰ  ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマ−Ｌ−グルタミン酸エチルのコポリマー(Sidman et al., Biopolymers, (1983) 22:547-556)、非分解性のエチレン−酢酸ビニル(Langer et al., 前掲)、分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー、たとえばＬＵＰＲＯＮ  Ｄｅｐｏｔ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドからなる注射用マイクロスフェア）、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ  １３３，９８８）。
【０１６８】
エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーは、１００日以上、分子を放出できるが、ある種のヒドロゲルはより短い期間、タンパク質を放出する。封入されたタンパク質が体内に長期間残留すると、それらは３７℃で水分に曝露された結果として変性または凝集し、その結果、生物活性が失われ、免疫原性が変化する可能性がある。関与する機序に応じて、タンパク質安定化のために妥当な方策を施すことができる。たとえば、凝集機序がジスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると認められた場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、含水率の制御、適切な添加剤の使用、および特殊なポリマーマトリックス組成物の開発により達成できる。
【０１６９】
持続放出組成物には、結晶を懸濁状態に保持しうる適切な配合物中に懸濁した抗体結晶製剤も含まれる。これらの製剤は、皮下または腹腔内に注射した場合、持続放出効果を生じることができる。他の組成物には、リポソーム封入抗体も含まれる。そのような抗体を収容したリポソームは、それ自体既知の方法で調製できる：Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．ＤＥ  ３，２１８，１２１； Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1985) 82:3688-3692; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1980) 77:4030-4034; ＥＰ  ５２，３２２；ＥＰ  ３６，６７６；ＥＰ  ８８，０４６；ＥＰ  １４３，９４９；１４２，６４１；日本特許出願８３−１１８００８；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．４，４８５，０４５および４，５４４，５４５；ならびにＥＰ  １０２，３２４。
【０１７０】
特定患者に対する抗体配合物の投与量は、薬物の作用を変化させることが知られている多様な要因を考慮して、担当医が決定するであろう；これには、疾患の重症度およびタイプ、体重、性別、食事、投与の時間および経路、他の投薬、ならびに他の関連臨床要因が含まれる。療法有効量は、インビトロ法またはインビボ法で決定できる。
【０１７１】
療法に用いるための本明細書に記載する抗体の有効量は、たとえば療法目的、投与経路、および患者の状態に依存するであろう。したがって、最適療法効果を得るために、必要に応じて治療者が投与量を判定し、投与経路を変更することが好ましい。一般的な一日量は、前記の要因に応じて約０．００１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまで、またはそれ以上の可能性がある。一般に臨床医は、目的効果を達成する用量に達するまで療法用抗体を投与するであろう。この療法の経過は、一般的アッセイ法または本明細書の記載に従って容易にモニターされる。
【０１７２】
本発明の組成物および方法による療法薬の投与は適切なキャリヤー、賦形剤、および伝達、送達、耐容性などを改善するために配合物に含有させる他の物質と共に行なわれることは認識されるであろう。これらの配合物には、たとえば粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（カチオン性またはアニオン性）含有ベシクル（たとえばＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収性ペースト、水中油型および油中水型エマルション、エマルションカーボワックス（多様な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびカーボワックス含有−半固体混合物が含まれる。配合物中の有効成分が配合物によって不活性化されず、配合物が投与経路に生理的に適合および耐容しうる限り、以上の混合物はいずれも本発明による処置および療法に適切となりうる。医薬化学者に周知の配合物、賦形剤およびキャリヤーに関する他の情報については、Baldrick P. ”医薬賦形剤の開発：前臨床試験指針の必要性”, Regul. Toxicol. Pharmacol. 32(2):210-8 (2000)、Wang W. ”固体タンパク質医薬の凍結乾燥と開発”, Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000)、Charman WN ”脂質、親油性薬物、および経口薬物送達−ある新たな概念”, J Pharm Sci. 89(8): 967-78 (2000)、Powell et al. ”非経口配合物用の賦形剤の概説”, PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998)、ならびにそれらに引用された文献も参照されたい。
【０１７３】
他の療法薬の設計および調製
本発明に従い、本明細書中でＰＤＧＦＲ−アルファに対して生成および特性分析した抗体の活性に基づいて、療法様式の設計を行ない、当業者に開示した。そのような様式には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：進歩した抗体療法薬、たとえば二特異性抗体、免疫毒素、放射性標識療法薬、および単一の抗体Ｖドメイン、Ｖ領域以外の足場に基づく抗体様結合剤；ペプチド療法薬、遺伝子療法薬、特にイントラボディー（ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、アンチセンス療法薬および低分子薬物の作製。
【０１７４】
抗原結合部位は、非抗体タンパク質足場、たとえばフィブロネクチンまたはシトクロムＢなどにＣＤＲを配置することにより(Haan & Maggos (2004) BioCentury, 12(5): A1-A6; Koide et al. (1998) Journal of Molecular Biology, 284: 1141-1151; Nygren et al. (1997) Current Opinion in Structural Biology, 7: 463-469)、またはタンパク質足場内のループのアミノ酸残基をランダム化もしくは変異させて目的ターゲットに対する結合特異性を付与することにより提供できる。タンパク質中に新たな結合部位を工学的に形成するための足場は、Nygrenら(Nygren et al. (1997) Current Opinion in Structural Biology, 7: 463-469)が詳細に紹介している。模擬抗体のためのタンパク質足場はＷＯ／００３４７８４に開示されており、それの全体を本明細書に援用する；その発明者らは、少なくとも１つのランダム化ループをもつフィブロネクチンタイプＩＩＩドメインを含むタンパク質（模擬抗体）を記載している。１以上のＣＤＲ、たとえば一組のＨＣＤＲをグラフトさせるのに適切な足場は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのいずれかのドメインメンバーにより得ることができる。足場はヒトのタンパク質またはヒト以外のタンパク質であってもよい。非抗体タンパク質足場の利点は、少なくともある抗体分子より小さい足場分子および／またはより容易に作製できる足場分子内に抗原結合部位を提供できることである。小さいサイズの結合メンバーは、有用な生理的特性、たとえば細胞に進入し、組織内へ深く浸透し、もしくは他の構造体内のターゲットに到達し、またはターゲット抗原のタンパク質キャビィティー内に結合する能力をもたらす可能性がある。非抗体タンパク質足場内の抗原結合部位の使用は、Wess, 2004 (Wess, L. In: BioCentury, The Bernstein Report on BioBusiness, 12(42), A1-A7, 2004)に概説されている。代表例は、安定な主鎖および１以上の可変ループをもつタンパク質であり、これらにおいてはループのアミノ酸配列を特異的またはランダムに変異させて、ターゲット抗原を結合する抗原結合部位が形成されている。そのようなタンパク質には、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に由来するプロテインＡのＩｇＧ−結合ドメイン、トランスフェリン、アルブミン、テトラネクチン、フィブロネクチン（たとえば、第１０フィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン）、リポカリン（ｌｏｐｏｃａｌｉｎ）類、ならびにガンマ−クリスタリンおよび他のＡｆｆｉｌｉｎ（商標）足場（Ｓｃｉｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）が含まれる。他の方法の例には、シクロタイド（ｃｙｃｌｏｔｉｄｅ）類に基づく合成”ミクロボディー（Ｍｉｃｒｏｂｏｄｉｅｓ）”−分子内ジスルフィド結合をもつ低分子タンパク質、ミクロプロテイン（Ｍｉｃｒｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）（Ｖｅｒｓａｂｏｄｉｅｓ（商標），Ａｍｕｎｉｘ）、およびアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ）が含まれる。
【０１７５】
本発明によるターゲテッド結合剤は、抗体配列および／または抗原結合部位のほか、他のアミノ酸、たとえば折りたたみドメインなどのペプチドもしくはポリペプチドを形成するもの、またはその分子に抗原を結合する能力以外の他の機能特徴を付与するものを含むことができる。本発明のターゲテッド結合剤は、検出可能な標識をもつことができ、あるいは毒素またはターゲティング部分または酵素にコンジュゲートしていてもよい（たとえばペプチジル結合またはリンカーによる）。たとえば、ターゲテッド結合剤は抗原結合部位のほか触媒部位を含むことができ（たとえば酵素ドメイン中に）、その場合、抗原結合部位が抗原に結合し、したがって触媒部位が抗原をターゲティングする。触媒部位は、たとえば開裂により抗原の生物学的機能を阻害することができる。
【０１７６】
補体固定が望ましい方策である進歩した抗体療法薬の作製に関連して、たとえば二特異性抗体、免疫毒素または放射性標識の使用により、細胞を死滅させるために補体に依存するのを回避できる。
【０１７７】
たとえば、下記のものを含む二特異性抗体を作製することができる：（ｉ）互いに共有結合した２つの抗体：１つはＰＤＧＦＲ−アルファに対する特異性をもつもの、他の１つは第２分子に対する特異性をもつもの、（ｉｉ）ＰＤＧＦＲ−アルファに特異的な１つの鎖、および第２分子に特異的な第２の鎖をもつ、単一抗体、または（ｉｉｉ）ＰＤＧＦＲ−アルファと他方の分子の両方に対する特異性をもつ単一鎖抗体。そのような二特異性抗体は、周知の技術を用いて作製できる；たとえば（ｉ）および（ｉｉ）に関しては、たとえばFanger et al. Immunol Methods 4:72-81 (1994)、およびWright and Harris（前掲）を参照；（ｉｉｉ）に関しては、たとえばTraunecker et al. Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52 (1992)を参照。それぞれの場合、第２特異性を目的に従って形成できる。Ｈ鎖活性化受容体に対して第２特異性を形成することができ、限定ではないが、これにはたとえばＣＤ１６もしくはＣＤ６４（たとえばDeo et al. 18:127 (1997)を参照）またはＣＤ８９（たとえばValerius et al. Blood 90:4485-4492 (1997)を参照）が含まれる。
【０１７８】
当技術分野で周知の技術を用いて、抗体を免疫毒素として作用するように修飾することもできる。たとえばVitetta Immunol Today 14:252 (1993)を参照。Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，１９４，５９４も参照されたい。放射性標識抗体の作製に関して、そのような修飾抗体も当技術分野で周知の技術を用いて容易に作製できる。たとえばJunghans et al. Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (第２版, Chafner and Longo, 編, Lippincott Raven (1996))を参照。Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．４，６８１，５８１、４，７３５，２１０、５，１０１，８２７、５，１０２，９９０（ＲＥ  ３５，５００）、５，６４８，４７１および５，６９７，９０２も参照されたい。免疫毒素および放射性標識分子はそれぞれ、目的とする多量体酵素サブユニットオリゴマー化ドメインを発現している細胞を死滅させる可能性がある。ある態様においては、有効量の抗体を医薬的に許容できるキャリヤーまたは希釈剤と共に含む医薬組成物が提供される。
【０１７９】
ある態様においては、抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体をある薬剤（たとえば放射性同位体、医薬組成物、または毒素）に結合させる。好ましくは、そのような抗体は疾患の処置に使用でき、そのような疾患はＰＤＧＦＲ−アルファを発現する細胞またはＰＤＧＦＲ−アルファを過剰発現する細胞に関連する可能性がある。たとえば、この薬物は有糸分裂抑制薬、アルキル化剤、代謝拮抗薬、抗血管形成薬、アポトーシス誘発薬、アルカロイド、ＣＯＸ−２、および抗生物質、ならびにその組合わせの群から選択される医薬特性をもつことが考慮される。薬物は下記の群から選択できる：ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソ尿素、トリアゼン類、葉酸類似体、アントラサイクリン類、タキサン類、ＣＯＸ−２阻害薬、ピリミジン類似体、プリン類似体、代謝拮抗薬、抗生物質、酵素、エピポドフィロトキシン、白金配位錯体、ツルニチニチソウアルカロイド、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制薬、アンタゴニスト、エンドスタチン、タキソール類、カンプトテシン類、オキサリプラチン、ドキソルビシン類、ならびにその類似体およびその組合わせ。
【０１８０】
毒素の例には、さらにゲロニン、シュードモナス外毒素（ＰＥ）、ＰＥ４０、ＰＥ３８、ジフテリア毒素、リシン、リシン、アブリン、アルファ溶血毒、サポリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅ  Ｉ、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）エンテロトキシン−Ａ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、シュードモナス内毒素、ならびにその誘導体、組合わせおよび修飾体が含まれる。
【０１８１】
放射性同位体の例には、局在化および／または療法に使用できるガンマ放射体、陽電子放射体、およびｘ線放射体、ならびに療法に使用できるベータ放射体およびアルファ放射体が含まれる。診断、予後および病期判定に有用なものとしてこれまでに記載された放射性同位体も療法薬として有用である。抗癌薬または抗白血病薬の例には、限定ではないが、アントラサイクリン類、たとえばドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）（アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ））、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）（ダウノマイシン（ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ））、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ならびにそのモルホリノ誘導体および置換誘導体、組合わせ、および修飾体が含まれる。例示医薬には、シスプラチン（ｃｉｓ−ｐｌａｔｉｎｕｍ）、タキソール（ｔａｘｏｌ）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）（Ａｒａ−Ｃ））、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、プレドニソン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）、ダウノルビシン、イダルビシン、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、インターフェロン−アルファ、ヒドロキシ尿素、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、サリドマイド（ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ）、およびブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、ならびにその誘導体、組合わせおよび修飾体が含まれる。好ましくは、抗癌薬または抗白血病薬はドキソルビシン、モルホリノドキソルビシンまたはモルホリノダウノルビシンである。
【０１８２】
本発明の抗体には、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、非修飾抗体のものより長い半減期（たとえば血清半減期）をもつ抗体も含まれる。１態様において、抗体半減期は約１５日より長く、約２０日より長く、約２５日より長く、約３０日より長く、約３５日より長く、約４０日より長く、約４５日より長く、約２カ月より長く、約３カ月より長く、約４カ月より長く、約５カ月より長い。哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、本発明の抗体またはそのフラグメントの半減期が延長すると、哺乳動物における抗体または抗体フラグメントの血清抗体価が増大し、したがって抗体または抗体フラグメントの投与頻度が低下し、および／または抗体または抗体フラグメントの投与濃度が低下する。延長したインビボ半減期をもつ抗体またはそのフラグメントは、当業者に既知の技術で作製することができる。たとえば、延長したインビボ半減期をもつ抗体またはそのフラグメントは、ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体の相互作用に関与すると同定されたアミノ酸残基を修飾（たとえば置換、欠失または付加）することにより作製できる（たとえば国際特許出願Ｎｏｓ．ＷＯ  ９７／３４６３１およびＷＯ  ０２／０６０９１９を参照；それらの全体を本明細書に援用する）。延長したインビボ半減期をもつ抗体またはそのフラグメントは、その抗体または抗体フラグメントにポリマー分子、たとえば高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を付着させることにより作製できる。多官能性リンカーを用いて、または用いずに、抗体または抗体フラグメントのＮ末端またはＣ末端へのＰＥＧの部位特異的コンジュゲーションにより、あるいはリシン残基上に存在するイプシロン−アミノ基を介して、ＰＥＧを抗体または抗体フラグメントに付着させることができる。生物活性の損失を最小限に抑えた線状または分枝ポリマー誘導体化を採用する。抗体にＰＥＧ分子が適正に結合したことを確認するために、コンジュゲートの程度をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析によって厳密にモニターする。未反応ＰＥＧは、たとえばサイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーにより抗体−ＰＥＧコンジュゲートから分離することができる。
【０１８３】
当業者に自明のとおり、前記の態様においてアフィニティー価が重要な可能性はあるが、抗体の特定の機能によっては他の要因も同様またはそれ以上に重要な可能性がある。たとえば、免疫毒素（抗体と会合した毒素）については、ターゲットへの抗体の結合作用が有用な可能性はある；しかし、ある態様においては、目的とする最終結果は細胞への毒素の内部移行である。したがって、これらの状況では高率の内部移行を伴う抗体が望ましい可能性がある。したがって１態様においては、高い内部移行効率をもつ抗体が考慮される。高い内部移行効率は内部移行した抗体のパーセントとして測定でき、低い数値から１００％までの可能性がある。たとえば、多様な態様において、０．１〜５、５〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜９９、および９９〜１００％が高い効率となりうる。当業者に自明のとおり、望ましい効率は種々の態様において、たとえば会合している薬剤、ある領域へ投与できる抗体の量、抗体−薬剤複合体の副作用、処置すべき問題のタイプ（たとえば癌のタイプ）および重症度に応じて異なる可能性がある。
【０１８４】
他の態様において、本明細書に開示する抗体は、ＰＤＧＦＲ−アルファの発現の変化と関連する疾患または障害をスクリーニングするために哺乳動物の組織または細胞におけるＰＤＧＦＲ−アルファ発現を検出するアッセイキットを提供する。このキットは、ＰＤＧＦＲ−アルファを結合する抗体、および抗原が存在する場合に抗体と抗原が反応したことを指示する手段を含む。
【０１８５】
ある態様においては、抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体を含有する組成物を収容した容器、およびＰＤＧＦＲ−アルファの発現または過剰発現を特徴とする疾患の処置にその組成物を使用しうることを指示したパッケージ挿入物またはラベルを含む、製品が提供される。好ましくは、哺乳動物、より好ましくはヒトに、抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体を投与する。
【０１８６】
併用
本発明に定める抗新生物処置を唯一の療法として適用してもよく、あるいは本発明化合物のほかに一般的な外科処置、骨髄および末梢血幹細胞の移植、または放射線療法もしくは化学療法を伴ってもよい。そのような化学療法には、下記のカテゴリーの抗腫瘍薬のうち１種類以上を含めることができる：
（ｉ）癌医療に用いられる他の抗増殖／抗新生物薬およびその組合わせ、たとえばアルキル化剤（たとえばシスプラチン、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ナイトロジェンマスタード（ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｍｕｓｔａｒｄ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｐｈａｎ）、テモゾラミド（ｔｅｍｏｚｏｌａｍｉｄｅ）およびニトロソ尿素類）；代謝拮抗薬（たとえばゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）および葉酸代謝拮抗薬、たとえばフルオロピリミジン類、たとえば５−フルオロウラシルおよびテガフル（ｔｅｇａｆｕｒ）、ラルチトレキセド（ｒａｌｔｉｔｒｅｘｅｄ）、メトトレキセート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、シトシンアラビノシド（ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）およびヒドロキシ尿素（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ））；抗腫瘍性抗体（たとえばアントラサイクリン類、たとえばアドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノマイシン（ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、マイトマイシン−Ｃ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ−Ｃ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）およびマイトマイシン（ｍｉｔｈｒａｍｙｃｉｎ））；有糸分裂抑制薬（たとえばツルニチニチソウアルカロイド、たとえばビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）およびビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、ならびにタキソイド類、たとえばタキソール（ｔａｘｏｌ）およびタキソテール（ｔａｘｏｔｅｒｅ）、ならびにポロキナーゼ阻害薬）；ならびにトポイソメラーゼ阻害薬（たとえばエピポドフィロトキシン、たとえばエトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）およびテニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）およびカンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ））；
（ｉｉ）静細胞薬、たとえば抗エストロゲン薬（たとえばタモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、フルベストラント（ｆｕｌｖｅｓｔｒａｎｔ）、トレミフェン（ｔｏｒｅｍｉｆｅｎｅ）、ラロキシフェン（ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ）、ドロロキシフェン（ｄｒｏｌｏｘｉｆｅｎｅ）およびヨードキシフェン（ｉｏｄｏｘｙｆｅｎｅ））、抗アンドロゲン薬（たとえばビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、フルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ニルタミド（ｎｉｌｕｔａｍｉｄｅ）および酢酸シプロテロン（ｃｙｐｒｏｔｅｒｏｎｅ  ａｃｅｔａｔｅ））、ＬＨＲＨアンタゴニストまたはＬＨＲＨアゴニスト（たとえばゴセレリン（ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）、ロイプロリン（ｌｅｕｐｒｏｒｅｌｉｎ）およびブセレリン（ｂｕｓｅｒｅｌｉｎ））、プロゲストーゲン類（たとえば酢酸メゲストロール（ｍｅｇｅｓｔｒｏｌ  ａｃｅｔａｔｅ））、アロマターゼ阻害薬（たとえばアナストロゾール（ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）、レトロゾール（ｌｅｔｒｏｚｏｌｅ）、ボラゾール（ｖｏｒａｚｏｌｅ）およびエキセメスタン（ｅｘｅｍｅｓｔａｎｅ））、および５α−レダクターゼ阻害薬、たとえばフィナステリド（ｆｉｎａｓｔｅｒｉｄｅ）；
（ｉｉｉ）抗浸潤薬（たとえばｃ−Ｓｒｃキナーゼファミリー阻害薬、たとえば４−（６−クロロ−２，３−メチレンジオキシアニリノ）−７−［２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エトキシ］−５−テトラヒドロピラン−４−イルオキシキナゾリン（ＡＺＤ０５３０；国際特許出願ＷＯ  ０１／９４３４１）およびＮ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−｛６−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］−２−メチルピリミジン−４−イルアミノ｝チアゾール−５−カルボキサミド（ダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）、ＢＭＳ−３５４８２５；J. Med. Chem., 2004, 47, 6658-6661)、ならびにメタロプロテイナーゼ阻害薬、たとえばマリマスタット（ｍａｒｉｍａｓｔａｔ）、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体機能の阻害薬、またはカテプシンの阻害薬、セリンプロテアーゼ、たとえばマトリプターゼ（ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ）、ヘプシン（ｈｅｐｓｉｎ）、ウロキナーゼの阻害薬、ヘパラナーゼの阻害薬）；
（ｉｖ）細胞毒性薬剤、たとえばフルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、２−クロロデオキシアデノシン、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）またはドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、およびその組合わせ、たとえばフルダラビン＋シクロホスファミド、ＣＶＰ：シクロホスファミド＋ビンクリスチン＋プレドニソン、ＡＣＶＢＰ：ドキソルビシン＋シクロホスファミド＋ビンデシン＋ブレオマイシン＋プレドニソン、ＣＨＯＰ：シクロホスファミド＋ドキソルビシン＋ビンクリスチン＋プレドニソン、ＣＮＯＰ：シクロホスファミド＋ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）＋ビンクリスチン＋プレドニソン、ｍ−ＢＡＣＯＤ：メトトレキセート＋ブレオマイシン＋ドキソルビシン＋シクロホスファミド＋ビンクリスチン＋デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）＋ロイコボリン（ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ）、ＭＡＣＯＰ−Ｂ：メトトレキセート＋ドキソルビシン＋シクロホスファミド＋ビンクリスチン＋プレドニソン固定量＋ブレオマイシン＋ロイコボリン、またはＰｒｏＭＡＣＥ  ＣｙｔａＢＯＭ：プレドニソン＋ドキソルビシン＋シクロホスファミド＋エトポシド＋シタラビン＋ブレオマイシン＋ビンクリスチン＋メトトレキセート＋ロイコボリン；
（ｖ）増殖因子機能の阻害薬、たとえばそのような阻害薬には下記のものが含まれる：増殖因子抗体および増殖因子受容体抗体（たとえば抗ｅｒｂＢ２抗体トラスツヅマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）［Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）］、抗−ＥＧＦＲ抗体パニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、抗ｅｒｂＢ１抗体セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）［Ｅｒｂｉｔｕｘ、Ｃ２２５］、およびStern et al.Critical reviews in oncology / haematology, 2005, Vol. 54, pp11-29により示されるいずれかの増殖因子抗体または増殖因子受容体抗体）;そのような阻害薬には、下記のものも含まれる：チロシンキナーゼ阻害薬、たとえば上皮増殖因子ファミリーの阻害薬（たとえばＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害薬、たとえばＮ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−メトキシ−６−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン−４−アミン（ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、ＺＤ１８３９）、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−４−アミン（エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、ＯＳＩ−７７４）および６−アクリルアミド−Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−（３−モルホリノプロポキシ）−キナゾリン−４−アミン（ＣＩ  １０３３）、ｅｒｂＢ２チロシンキナーゼ阻害薬、たとえばラパチニブ（ｌａｐａｔｉｎｉｂ）、肝細胞増殖因子ファミリーの阻害薬、血小板由来増殖因子ファミリーの阻害薬、たとえばイマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）、セリン／トレオニンキナーゼの阻害薬（たとえばＲａｓ／Ｒａｆシグナル伝達阻害薬、たとえばファルネシルトランスフェラーゼ阻害薬、たとえばソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）（ＢＡＹ  ４３−９００６））、ＭＥＫおよび／またはＡＫＴキナーゼによる細胞シグナル伝達の阻害薬、肝細胞増殖因子ファミリーの阻害薬、ｃ−ｋｉｔ阻害薬、ａｂｌキナーゼ阻害薬、ＩＧＦ受容体（インスリン様増殖因子）キナーゼ阻害薬、オーロラキナーゼ阻害薬（たとえばＡＺＤ１１５２、ＰＨ７３９３５８、ＶＸ−６８０、ＭＬＮ８０５４、Ｒ７６３、ＭＰ２３５、ＭＰ５２９、ＶＸ−５２８およびＡＸ３９４５９）、サイクリン依存性キナーゼ阻害薬、たとえばＣＤＫ２および／またはＣＤＫ４阻害薬、ならびに生存シグナル伝達タンパク質、たとえばＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬの阻害薬、たとえばＡＢＴ−７３７；
（ｖｉ）抗血管形成薬、たとえば血管内皮増殖因子の作用を阻害するもの［たとえば抗血管内皮増殖因子抗体ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）（Ａｖａｓｔｉｎ（商標））およびＶＥＧＦ受容体型チロシンキナーゼ阻害薬、たとえば４−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−６−メトキシ−７−（１−メチルピペリジン−４−イルメトキシ）キナゾリン（ＺＤ６４７４；ＷＯ  ０１／３２６５１の例２）、４−（４−フルオロ−２−メチルインドール−５−イルオキシ）−６−メトキシ−７−（３−ピロリジン−１−イルプロポキシ）キナゾリン（ＡＺＤ２１７１；ＷＯ  ００／４７２１２の例２４０）、バタラニブ（ｖａｔａｌａｎｉｂ）（ＰＴＫ７８７；ＷＯ  ９８／３５９８５）およびＳＵ１１２４８（スニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）；ＷＯ  ０１／６０８１４）、国際特許出願ＷＯ９７／２２５９６、ＷＯ  ９７／３００３５、ＷＯ  ９７／３２８５６、ＷＯ  ９８／１３３５４、ＷＯ００／４７２１２およびＷＯ０１／３２６５１に開示される化合物、ならびに他の機序で作動する化合物（たとえばリノミド（ｌｉｎｏｍｉｄｅ）、インテグリンαｖβ３機能の阻害薬、およびアンギオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ））］、またはコロニー刺激因子１（ＣＳＦ１）もしくはＣＳＦ１受容体の作用を阻害するもの；
（ｖｉｉ）血管傷害薬、たとえばコンブレタスタチンＡ４（Ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ  Ａ４）、ならびに国際特許出願ＷＯ  ９９／０２１６６、ＷＯ  ００／４０５２９、ＷＯ  ００／４１６６９、ＷＯ  ０１／９２２２４、ＷＯ  ０２／０４４３４およびＷＯ  ０２／０８２１３に開示される化合物；
（ｖｉｉｉ）アンチセンス療法薬、たとえば前記に挙げたターゲットを指向するもの、たとえばＧ−３１３９（Ｇｅｎａｓｅｎｓｅ）、すなわち抗ｂｃｌ２アンチセンス；
（ｉｘ）たとえば下記を含む遺伝子療法：異常な遺伝子、たとえば異常なｐ５３または異常なＢＲＣＡ１もしくはＢＲＣＡ２を置換する方法、ＧＤＥＰＴ（gene directed enzyme pro drug therapy、遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法）、たとえばシトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼまたは細菌性ニトロレダクターゼ酵素を用いる方法、ならびに化学療法または放射線療法に対する患者の耐容性を高める方法、たとえば多剤耐性遺伝子療法；ならびに
（ｘ）たとえば下記を含む免疫療法：アレムツヅマブ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）（ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ（商標））、すなわちＣＤ５２を指向するモノクローナル抗体による処置、またはＣＤ２２を指向する抗体による処置、患者の腫瘍細胞の免疫原性を高めるためのエクスビボおよびインビボ法、サイトカイン、たとえばインターロイキン２、インターロイキン４または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子によるトランスフェクション、Ｔ細胞アネルギーを低下させる方法、たとえばＣＴＬＡ−４機能を阻害するモノクローナル抗体による処置、トランスフェクションした免疫細胞、たとえばサイトカイントランスフェクションした樹状細胞を用いる方法、サイトカイントランスフェクションした腫瘍細胞系を用いる方法、ならびに抗イディオタイプ抗体を用いる方法；
（ｘｉ）タンパク質分解の阻害薬、たとえばプロテアソーム阻害薬、たとえばＶｅｌｃａｄｅ（ボルテゾミド（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｄ））；
（ｘｉｉ）生物学的療法、たとえば受容体リガンドを封鎖するか、受容体へのリガンド結合を遮断するか、または受容体のシグナル伝達を低下させる（たとえば受容体の分解を増大させ、または発現レベルを低下させることによる）ペプチドまたはタンパク質（たとえば抗体または可溶性外部受容体ドメイン構築体）を用いる方法。
【０１８７】
そのような併用処置は、処置の個々の成分の同時、逐次または個別の投与により達成できる。そのような組合わせ製剤には、本発明の化合物またはその医薬的に許容できる塩類を前記の用量範囲で、および他の医薬有効物質をそれの承認された用量範囲で使用する。
【０１８８】
本発明の１態様において、本発明の抗新生物処置は下記のものと併用される：血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の作用を阻害する薬剤（たとえば抗血管内皮増殖因子抗体ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（商標））、抗血管内皮増殖因子受容体抗体、たとえば抗ＫＤＲ抗体および抗ｆｌｔ１抗体、国際特許出願ＷＯ  ９７／２２５９６、ＷＯ  ９７／３００３５、ＷＯ  ９７／３２８５、ＷＯ  ９８／１３３５４、ＷＯ  ００／４７２１２およびＷＯ  ０１／３２６５１に開示される化合物）、および他の機序で作動する化合物（たとえばリノミド、インテグリンαｖβ３機能の阻害薬、およびアンギオスタチン）。本発明の他の態様において、本発明の抗血管形成処置は、血管内皮増殖因子受容体ＫＤＲのチロシンキナーゼ活性を阻害する薬剤（たとえばＡＺＤ２１７１またはＡＺＤ６４７４）と併用される。ＡＺＤ２１７１に関するさらに詳細な記述は、Wedge et al (2005) Cancer Research. 65(10): 4389-400中にみられる。ＡＺＤ６４７４に関するさらに詳細な記述は、Ryan & Wedge (2005) British Journal of Cancer. 92 Suppl 1: 6-13中にみられる。両刊行物の全体を本明細書中に援用する。本発明の他の態様においては、完全ヒト抗体１．１．２、１．５．３、２．１．２を単独で、または組み合わせて、Ａｖａｓｔｉｎ（商標）、ＡＺＤ２１７１またはＡＺＤ６４７４と併用する。
【０１８９】
そのような併用処置は、処置の個々の成分の同時、逐次または個別の投与により達成できる。そのような組合わせ製剤には、本発明の化合物またはその医薬的に許容できる塩類を前記の用量範囲で、および他の医薬有効物質をそれの承認された用量範囲で使用する。
【実施例】
【０１９０】
以下の実施例は、実施した実験および得られた結果を含めて、説明のために示されるにすぎず、本明細書中の教示を限定するものと解釈すべきではない。
実施例１
免疫化および抗体価測定
免疫原
組換え可溶性ＰＤＧＦＲ−アルファ細胞外ドメインをＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州ミネアポリス，カタログ＃：３２２−ＰＲ／ＣＦ）から入手し、免疫原として用いた。さらに、ＢＨＫ（ハムスター乳仔腎臓）細胞において発現させた組換えヒトＰＤＧＦＲ−アルファを免疫化のための抗原として用いた。ＢＨＫ細胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、カタログｎｏ．ＣＣＬ−１０から入手された。
【０１９１】
免疫化
ＰＤＧＦＲ−アルファに対するモノクローナル抗体は、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）マウス（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ系統：ＸＭＧ２（ＩｇＧ２カッパ）およびＸＭ３Ｃ−１（ＩｇＧ４カッパ），Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．，カリフォルニア州フリーモント）をＰＤＧＦＲ−アルファ細胞外ドメイン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃：３２２−ＰＲ／ＣＦ）で逐次免疫化することにより産生された。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ動物を、すべての注射につき常法により足蹠（ｆｏｏｔｐａｄ）経路で免疫化した。各注射の総容量は、マウス当たり１０マイクログラムのＰＤＧＦＲ−アルファ細胞外ドメインを含有する５０μｌ、足蹠当たり２５μｌであった。アジュバントには、Ｔｉｔｅｒｍａｘ  Ｇｏｌｄ（商標）（Ｓｉｇｍａ，カタログＴ２６８４）、リン酸アルミニウムゲルアジュバント、ＨＣＬ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ（カタログ１４５２−２５０）およびＩｍｍｕｎｅＥａｓｙマウスアジュバント（ｑＣｐＧ，ＱｉａｇｅｎカタログＮｏ  ３０３１０５）が含まれた。初回注射をＴｉｔｅｒｍａｘ  Ｇｏｌｄ（商標）と共に投与した（０日目）。ブースターを５ｕｌのリン酸アルミニウムゲルアジュバント（５ｕｌ）およびｑＣｐＧ（１５ｕｌ）として、１０ｕｇのＰＤＧＦＲ−アルファ細胞外ドメインと共に３、６、１０、１３、２０、２４、２７、３１および３４日目に投与した。
【０１９２】
実施例２
リンパ球の回収、Ｂ細胞の単離、ハイブリドーマの融合および作製
免疫化マウスを頚部脱臼により屠殺し、各コホートからリンパ節排出液を採集してプールした。ＤＭＥＭ中で摩砕することによりリンパ細胞を解離して組織から細胞を遊離させ、細胞をＤＭＥＭに懸濁した。細胞を計数し、リンパ細胞１００００万個につき０．９ｍｌのＤＭＥＭを細胞ペレットに添加して、細胞を穏やかに、ただし完全に再懸濁した。細胞１００００万個につき１００μｌのＣＤ９０＋磁性ビーズを用い、細胞を磁性ビーズと共に４℃で１５分間インキュベートすることにより、細胞を標識した。１０8個のプラス細胞（または最高で総数２ｘ１０9個の細胞）を含有する磁気標識細胞懸濁液をＬＳ＋カラムに入れ、カラムをＤＭＥＭで洗浄した。溶出液全体をＣＤ９０マイナス画分（これらの細胞は大部分がＢ細胞であると予想された）として採集した。
【０１９３】
前記で得た洗浄すみの濃縮Ｂ細胞と、ＡＴＣＣから入手した非分泌型骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（カタログｎｏ．ＣＲＬ  １５８０）(Kearney et al, J. Immunol. 123, 1979, 1548-1550)を１：１の比率で混合することにより、融合を実施した。この細胞混合物を８００ｘｇで遠心することによって穏やかにペレット化した。上清を完全に除去した後、細胞を２〜４ｍＬのＰｒｏｎａｓｅ溶液（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ，カタログ＃５３７０２；０．５ｍｇ／ｍＬ，ＰＢＳ中）で２分間以内、処理した。次いで３〜５ｍｌのＦＢＳを添加して酵素活性を停止し、この懸濁液を、エレクトロ細胞融合溶液（ｅｌｅｃｔｒｏ  ｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）ＥＣＦＳ（０．３Ｍのショ糖，Ｓｉｇｍａ，カタログ＃  Ｓ７９０３，０．１ｍＭの酢酸マグネシウム，Ｓｉｇｍａ，カタログ＃  Ｍ２５４５，０．１ｍＭの酢酸カルシウム，Ｓｉｇｍａ，カタログ＃  Ｃ４７０５）により４０ｍＬの全容量に調整した。遠心後に上清を除去し、細胞を４０ｍＬのＥＣＦＳに再懸濁した。この洗浄工程を繰り返し、細胞を再びＥＣＦＳに再懸濁して、２ｘ１０6個／ｍＬの濃度にした。
【０１９４】
エレクトロ細胞融合は、融合発生装置、モデルＥＣＭ２００１（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃ，Ｉｎｃ．，カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて実施された。用いた融合チャンバーのサイズは２．０ｍＬであり、下記の装置設定を用いた：アラインメント条件：電圧５０Ｖ、時間：５０秒；膜の破壊：電圧：３０００Ｖ、時間：３０μ秒；融合後の保持時間：３秒。
【０１９５】
ＥＣＦの後、細胞懸濁液を融合チャンバーから無菌条件下で慎重に取り出し、同容量のハイブリドーマ培養培地（ＤＭＥＭ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ），１５％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）；下記を補充したもの：Ｌ−グルタミン，ペニシリン／ストレプトマイシン，ＯＰＩ（オキサロ酢酸、ピルビン酸、ウシインスリン）（すべてＳｉｇｍａから）およびＩＬ−６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ））を入れた無菌試験管に移した。細胞を３７℃で１５〜３０分間インキュベートし、次いで４００ｘｇ（１０００ｒｐｍ）で５分間遠心した。細胞を少量のハイブリドーマ選択培地（ハイブリドーマ培養培地に０．５ｘＨＡ（Ｓｉｇｍａ，カタログ＃  Ａ９６６６）を補充したもの）に穏やかに再懸濁し、９６ウェルにつき合計５ｘ１０6個のＢ細胞およびウェル当たり２００μＬの最終接種に基づいて、さらにハイブリドーマ選択培地で容量を適宜調整した。細胞を穏やかに混合し、９６ウェルプレートにピペットで分注し、増殖させた。７または１０日目に、培地の半分を取り出し、細胞にハイブリドーマ選択培地を再供給した。
【０１９６】
ＥＬＩＳＡスクリーニング
ＥＬＩＳＡ分析には、組換えヒトＰＤＧＦＲ−アルファ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ＃３２２−ＰＲ／ＣＦ）を４ｕｇ／ｍｌの濃度で捕獲試薬として用いた。ＥＬＩＳＡプレートを、抗原コーティング用緩衝液（０．１Ｍ炭酸緩衝液，ｐＨ９．６，ＮａＨＣＯ３（ＭＷ８４）８．４ｇ／Ｌ）中、５０μｌ／ウェルの容量の組換えヒトＰＤＧＦＲ−アルファでコーティングし、４℃で一夜インキュベートした。翌日、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄用緩衝液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０，１ｘＰＢＳ中）で３回洗浄し、続いて２００μｌ／ウェルの遮断用緩衝液（１％  ＢＳＡ，０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０，０．０１％チメロサール，１ｘＰＢＳ中）により室温で１時間遮断した。遮断工程が終了した時点で、５０μｌ／ウェルのハイブリドーマ上清を室温で２時間インキュベートした。インキュベート後、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄用緩衝液中で３回洗浄した。洗浄工程後、５０μｌ／ウェルの検出抗体をウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。続いてＥＬＩＳＡプレートを洗浄用緩衝液中で３回洗浄し、ＴＭＢ基質を添加した（５０μｌ／ウェル）。停止溶液（５０μｌ／ウェル）の添加後、ＥＬＩＳＡプレートを６５０ｎｍでＥＬＩＳＡプレート読取り装置により読み取った。ＥＬＩＳＡにより陽性と推定された上清を続いてＦＭＡＴおよびＦＡＣＳにより評価した。
【０１９７】
実施例３
ＦＭＡＴおよびＦＡＣＳによる候補抗体の選択
１４日間の培養後、ハイブリドーマ上清を、蛍光測定微量アッセイ法（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｍｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ＦＭＡＴ）で、ヒト骨肉腫ＭＧ−６３細胞系、またはヒトＰＤＧＦＲ−アルファでトランスフェクションして親ＨＥＫ２９３細胞に対しカウンタースクリーニングした組換えＨＥＫ２９３細胞のいずれかに対してスクリーニングすることにより、ＰＤＧＦＲ−アルファ特異的モノクローナル抗体につきスクリーニングした。
【０１９８】
この一次スクリーニングに基づいて陽性であるハイブリドーマ細胞増殖ウェルから培養上清を取り出し、ＰＤＧＦＲ−アルファ陽性ハイブリドーマ細胞を新鮮なハイブリドーマ培養培地で懸濁し、２４ウェルプレートに移した。２日間の培養後、これらの上清は二次確認スクリーニングに使用可能となった。二次確認スクリーニングでは、抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体が完全ヒト型であることを確認するために、一次スクリーニングで陽性であったものをＦＡＣＳにより２組または３組の検出抗体を個別に用いてスクリーニングした：ヒト−ガンマ鎖検出には１．２５ｕｇ／ｍｌのＧＡＨ−ガンマＣｙ５（ＪＩＲ＃１０９−１７６−０９８）；ヒト−カッパＬ鎖検出には１．２５ｕｇ／ｍｌのＧＡＨ−カッパＰＥ（Ｓ．Ｂ．＃２０６３−０９）；およびヒト−ラムダＬ鎖検出には１．２５ｕｇ／ｍｌのＧＡＨ−ラムダＰＥ（Ｓ．Ｂ．＃２０７３−０９）。
【０１９９】
実施例４
ＰＤＧＦＲチロシンリン酸化アッセイ
７９１の抗体系列をＰＤＧＦＲチロシンリン酸化（ｐＴｙｒ）アッセイにより調べて、その抗体系列が腫瘍細胞においてＰＤＧＦＲ−アルファのリン酸化を阻害するかを判定した。
【０２００】
要約すると、ヒト骨肉腫ＭＧ−６３細胞を、９６ウェルＦＭＡＴアッセイプレートにウェル当たり１０，０００個の細胞で、１００μｌの飢餓培地（１％の炭／デキストラン処理ＦＢＳ）中において接種し、３７℃で約２０時間培養した。飢餓培地を取り出し、試料を入れたすべてのウェルに培地３７．５μｌを添加し、対照（マウスｍＡｂ抗ＰＤＧＦＲａ（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，カタログ＃  ５５６００１）またはマウスＩｇＧ２ａ（ｓｅｒｏｔｅｃｈ，２Ｘ最終濃度））を入れたウェルに１２．５μｌを添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。１％のアッセイ培地中、２Ｘ最終濃度（５０ｎｇ／ｍｌ）のＰＤＧＦ−ＡＡ（Ｒ＆Ｄ）５０μｌをすべてのプレートに添加し、対照プレートの列１２に培地を添加した。プレートを３７℃で１０分間インキュベートした。培地を取り出し、ＰＢＳ／３％ＢＳＡ中の３．７％ホルムアルデヒド１００μｌを添加し、室温で２０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳで２回洗浄し、１００μｌの透過用緩衝液（０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ，３％ＢＳＡ／ＰＢＳ中）を各ウェルに添加し、室温で１０分間インキュベートし、廃棄した。ＰＢＳ／３％  ＢＳＡ中の０．６％過酸化水素１００ｍｌを添加して内因性ペルオキシダーゼ活性を不活性化し、室温で２０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、ＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０中の１０％  ＦＢＳ  １００μｌで遮断した。プレートを室温で１時間インキュベートし、遮断用緩衝液を除去し、５０μｌの抗ホスホＰＤＧＦａ抗体（ｓｃ−１２９１０−Ｒ）（１μｇ／ｍｌ）を１０％  ＦＢＳ／ＰＢＳ−Ｔ中において各ウェルに添加した。プレートを室温で２時間インキュベートし、次いでＰＢＳＴで３回、各洗浄間に５分間浸漬しながら洗浄した。遮断用緩衝液中に希釈した５０μｌのヤギ−抗ウサギＩｇＧＦｃ−ＨＲＰ二次抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５分間ずつ３回洗浄し、かるく叩いて乾燥させた。５０μｌのＥＣＬ試薬（ＬｕｍｉＧＬＯ  Ｒｅｓｅｒｖｅ，ＫＰＬ，カタログ＃  ５４−７１−０１）を添加し、直ちにＲＬＵを読み取った。プレートをＰＢＳＴで２回洗浄し、かるく叩いて乾燥させた。次いでプレートを−８０℃で３０〜６０分間凍結させた。プレートを室温にし、１００μｌのＣｙＱｕａｎｔを各ウェルに添加した。プレートを蛍光読取り装置により４８５ｎｍでの励起および５３０ｎｍでの発光で読み取った。
【０２０１】
ｐＴｙｒアッセイにおける９０％以上中和を基準として、１０３系列を選択した；すなわち、選択された抗体系列はＰＤＧＦ受容体−アルファのチロシンリン酸化を９０％以上阻害した（データを示してはいない）。
【０２０２】
実施例５
ハイブリドーマ上清のアフィニティーおよび濃度の分析
高アフィニティー（ＨＡ）／限定抗原（ＬＡ）分析
下記に従い、１０３の抗体系列を高アフィニティー（ＨＡ）／限定抗原（ＬＡ）分析により調べた。ＨＡは抗体濃度依存性反応であり、したがって抗体濃度の尺度である。ＬＡはほぼ抗体アフィニティー依存性反応であり、したがって抗体アフィニティーの尺度にすることができる。
【０２０３】
高抗原定量アッセイ
要約すると、ＥＬＩＳＡプレートを、下記の限定抗原定量アッセイと比較してより多量のヒトＰＤＧＦＲ−アルファ抗原（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．，  ミネソタ州ミネアポリス，カタログＮｏ．３２２−ＰＲ−０５０／ＣＦ）でコーティングした。抗体を含有するハイブリドーマ上清を希釈範囲１：５１〜１：１６５６にわたって抗体価測定した。既知のマウス−抗ヒトＰＤＧＦＲ−アルファ特異的抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，カタログＮｏ．  ５５６００１）の対照を用いて、アッセイの直線範囲を決定した。次いで直線範囲内のデータを用いて、抗体価測定試料それぞれにおけるＰＤＧＦＲ特異的抗体の相対濃度を求めた。
【０２０４】
限定抗原定量アッセイ
マイクロタイタープレートを、前記の高抗原定量アッセイと比較してより少量のヒトＰＤＧＦＲ−アルファ抗原でコーティングした。１％スキムミルク／１Ｘ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４／０．５％アジド中、６４、３２、１６、８、４および２ｎｇ／ｍｌ（８．５〜０．２６ｎＭの範囲に及ぶ）のヒトＰＤＧＦＲ−アルファ５０マイクロリットル（５０μＬ）を、各ウェルに添加した。プレートを３０分間インキュベートした。
【０２０５】
プレートを水で４回洗浄し、被験抗体を含有するハイブリドーマ上清を１％スキムミルク／１Ｘ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４／０．５％アジド中に１：２５希釈したもの５０μＬを、ウェルに添加した。プレートをプラスチックラップまたはパラフィンフィルムで密に包み、室温で振とうしながら一夜インキュベートした。
【０２０６】
翌日、すべてのプレートを５回洗浄し、１％ミルク、１Ｘ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４中、０．５ｕｇ／ｍｌ濃度のヤギ−抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ  ＨＲＰポリクローナル抗体５０μＬを、各ウェルに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした。
【０２０７】
プレートを水道水で少なくとも５回洗浄した。ＨＰＲ基質ＴＭＢ  ５０マイクロリットル（５０μＬ）を各ウェルに添加し、プレートを３０分間インキュベートした。１Ｍリン酸５０μＬを各ウェルに添加することにより、ＨＲＰ−ＴＭＢ反応を停止した。４５０ｎｍにおける光学濃度（吸光度）を、プレートの各ウェルについて測定した。
【０２０８】
相対結合アフィニティーに基づいて、３４の抗体系列を選択した。選択は１６ｎｇ／ｍｌおよび２ｎｇ／ｍｌの抗原での抗体価測定に基づいた。選択カットオフは、０．３  ＯＤ単位および３．３μｇ／ｍｌを超えるＬＡであった。抗原濃度２ｎｇ／ｍｌの抗原で弱い反応性を示した系列を選択から除いた。
【０２０９】
ＭＧ−６３細胞におけるＰＤＧＦＲ−アルファリン酸化の阻害に基づく９つの追加系列を加えて候補プールを増加し、したがって有効なチロシンリン酸化阻害およびＨＡ／ＬＡ分析に基づく高い相対アフィニティーを示した合計４３の抗体系列を以後に使用した。前記の９つの追加系列はＰＤＧＦＲ−アルファリン酸化の完全阻害（すなわち１００％）を示した。これらの系列はいずれもＰＤＧＦＲ−ベータまたは相同体（ＦＬＴ３、ｃ−ｋｉｔ、ＣＳＦ−１Ｒ）と交差反応しなかった。
【０２１０】
【表２−１】
0005437804.tif 000006
【０２１１】
【表２−２】
0005437804.tif 000007
【０２１２】
実施例６
クローン化モノクローナル抗体のインビトロスクリーニングおよびデータ解析
下記に従って３０の抗体系列をクローン化し、さらに調べた。
【０２１３】
ｐＴｙｒアッセイ
前記の実施例４に記載したＭＧ−６３細胞を用いて、ＰＤＧＦＲチロシンリン酸化（ｐＴｙｒアッセイ）を実施した。結果を表３に示す。
【０２１４】
増殖アッセイ
ＰＤＧＦＲ−アルファに対する精製モノクローナル抗体によるＭＧ−６３細胞増殖阻害を、ＰＤＧＦ−ＡＡ増殖アッセイスクリーニングにより評価した。
【０２１５】
要約すると、ＭＧ−６３細胞を完全増殖培地１００μｌ中においてウェル当たり５，０００個で黒色透明底プレートの内側ウェルに接種し、３７℃、５％  ＣＯ２で３〜４時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ  １Ｘおよび培地で洗浄し、増殖飢餓培地（ＭＥＭ，１％  ＮＥＡＡ，０．１％  ＮａＢｉｃａｒｂ，１％  Ｌ−ｇｌｕｔ）と交換し、一夜飢餓状態にした。プレートから培地を除去し、５０μｌの２Ｘ  ｍＡｂまたは培地を適切なウェルに添加した。５０μｌのＰＤＧＦ−ＡＡタイトレーション、２００ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＡＡ、または培地のみを添加し、プレートを３日間インキュベートした。プレートをＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅにより５３０ｎｍでの励起および５８０ｎｍでの発光で読み取った（ウェル当たり１００μｌ／１００μｌ）。
【０２１６】
上位１５のモノクローナル抗体、すなわち１００ｎｇ／ｍｌ（３．４５ｎＭ）のＰＤＧＦ−ＡＡを用いた細胞刺激について最低のＩＣ５０値を示すものに関するデータを下記の表３にまとめる。以後の分析のために選択したモノクローナル抗体を太字で示す。選択した抗体のうち５つについての用量応答曲線を図１に示す。２．４５１．１．１調製物は、同一Ｈ鎖をもつけれどもＬ鎖が異なる２種類の異なる抗体を含有する可能性がある；このモノクローナル抗体についてＤＮＡ配列決定した際に２つの異なるＬ鎖配列が検出されたからである。
【０２１７】
【表３】
0005437804.tif 000008
【０２１８】
ＦＡＣＳ  Ｋｄアフィニティー測定
ＰＤＧＦＲ−アルファに対する精製モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ  ２．１７５．３、２．４４９．１．３、２．４５１．１．１、２．９９８．２、２．８４．３）のアフィニティーをＦＡＣＳ分析により測定した。
【０２１９】
要約すると、ＰＤＧＦＲ−アルファを発現するＭＧ−６３細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（２％  ＦＢＳ，０．０５％  ＮａＮ３）に約３００〜５００万個／ｍＬの濃度で再懸濁した。細胞を氷上に保持した。精製抗体およびＣＤ１４０ａ対照を、９６ウェルプレート内の１１ウェルにわたって、濾過した１ｘＰＢＳ（２ｘ）中に系列希釈した。各列の１２番目のウェルには緩衝液のみを入れた。１ｘＰＢＳおよび細胞を各ｍＡｂウェルに添加して、最終容量が３０μＬ／ウェルとなり、各ウェルが約１００，０００個の細胞を含有するようにした。モノクローナル抗体の最終モル濃度は下記の範囲であった：
mAb            濃度
2.451.1.1    ＝19.1〜0.019 nM
2.175.3      ＝10.8〜0.021 nM
2.449.1.3    ＝10.7〜0.021 nM
2.449.1.3    ＝9.2〜0.009 nM
2.84.3      ＝4.4〜0.009 nM
2.449.1.3    ＝9.2〜0.009 nM
2.998.2      ＝4.6〜0.009 nM
CD140a      ＝20.2〜0.020 nM
プレートをプレート振とう機に４℃で５時間乗せ、次いで遠心し、ＰＢＳで３回洗浄した。２００μＬの１００または１３１ｎＭ  Ｃｙ５ヤギα−ヒトポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，＃１０９−１７５−００８）を各ウェルに添加し、ＣＤ１４０ａと複合体形成した細胞に２００μＬの１００ｎＭ  Ｃｙ５ヤギα−マウスポリクローナル抗体を添加した。次いでプレートを振とう機に４℃で４０分間乗せ、次いで遠心し、ＰＢＳで３回洗浄した。
【０２２０】
各ｍＡｂ濃度につき１５，０００〜２０，０００の細胞”事象”の幾何平均蛍光（ＧＭＦ）をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ計測器により測定した。各ｍＡｂについて、ＧＭＦデータを両方の反復抗体価測定につきそれぞれの抗体価測定における同一ｍＡｂ濃度ポイントに対して標準化した。対応する標準化した抗体価測定ポイントを平均して、各ｍＡｂ濃度につき１つの標準化ＧＭＦポイントを得た。ｍＡｂ  ２．３５１．３について設定した１つの抗体価測定データのみが分析に許容できる質のものであった。ｍＡｂモル濃度の関数としてのＧＭＦの非線形プロットをＳｃｉｅｎｔｉｓｔソフトウェアにより下記の方程式を用いて当てはめた：
【０２２１】
【数１】
0005437804.tif 000009
【０２２２】
上記の方程式において、Ｆ＝幾何平均蛍光、ＬＴ＝全ｍＡｂモル濃度、Ｐ’＝任意蛍光単位を結合抗体に関係づける比例定数、およびＫＤ＝平衡解離定数である。各ｍＡｂにつき、ＫＤに関する推定値をＰ’として求め、ＫＤを非線形分析において自由フロートさせた。下記の表４に、各ｍＡｂにつき得られたＫＤを当てはめの９５％信頼区間（ＣＩ）と共に挙げる。ｍＡｂをアフィニティーの低下順に挙げる。
【０２２３】
【表４】
0005437804.tif 000010
【０２２４】
マウス交差反応性
動物の異種移植試験を設定するために、内因性ＰＤＧＦＲａを発現するネズミ線維芽細胞系であるＮＩＨ３Ｔ３細胞について実施したＦＡＣＳ分析により、マウス交差反応性を判定した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を０．５ｘ１０6個／ｍｌで１０μｇ／ｍｌの被験抗体と共に氷上で１時間インキュベートし、すすぎ、次いでＰＢＳ中に、Ｃｙ５で標識したヤギ−抗ヒトＩｇＧ抗体５ｕｇ／ｍｌと共に再懸濁した。細胞をすすぎ、ＦＡＣＳによりＣｙ５の存在について分析した。試験したモノクローナル抗体のうち３種類のみがマウス交差反応性を示した。結果を表５にまとめる。
【０２２５】
内部移行率パーセント
抗体が細胞に内部移行するパーセントを標準内部移行プロトコルにより判定した。１０μｇ／ｍｌにおける内部移行率パーセント結果を表５にまとめる。
【０２２６】
結果
３０のクローン化モノクローナル抗体のインビトロスクリーニングおよびデータ解析の結果を表５にまとめる。ｍＡｂをＩＣ５０値の増大順に挙げる。斜体のｍＡｂを上位１０のｍＡｂとして選択し、太字の抗体を３つのリード候補として選択した。”（）”は表５におけるランキングを表わす。
【０２２７】
表５から分かるように、ｍＡｂ  ２．１７５．３はＰＤＧＦ−ＡＡによるＭＧ−６３細胞増殖の優れた阻害およびＭＧ−６３細胞におけるＰＤＧＦＲ−アルファのリン酸化の優れた阻害を示した。ｍＡｂ  ２．４４９．１．３および２．９９８．２も、ＭＧ−６３細胞におけるＰＤＧＦＲ−アルファのリン酸化を阻害し、ＰＤＧＦ−ＡＡによるＭＧ−６３細胞増殖を阻害した。さらに、ｍＡｂｓ  ２．４４９．１．３および２．９９８．２は、ＰＤＧＦＲ−アルファに対して高い結合アフィニティーをも備えていた。
【０２２８】
【表５−１】
0005437804.tif 000011
【０２２９】
【表５−２】
0005437804.tif 000012
【０２３０】
実施例７
抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体の構造分析
抗体のＨ鎖およびＬ鎖可変ドメインの配列を決定し、それらのＤＮＡ配列を決定した。抗ＰＤＧＦＲ−アルファ抗体の完全配列情報を、ガンマ鎖およびカッパ鎖の組合わせそれぞれについてヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を含む配列表に示す。可変Ｈ鎖配列を分析して、ＶＨファミリー、Ｄ領域配列およびＪ領域配列を決定した。次いでこれらの配列を翻訳して一次アミノ酸配列を決定し、生殖細胞系列のＶＨ、ＤおよびＪ領域配列と比較して体細胞超変異を評価した。”−”は生殖細胞系列との同一性を示す。”＃”は、その抗体配列における、生殖細胞系列にみられない追加アミノ酸を示す。
【０２３１】
表１２は、抗体のＨ鎖領域をそれらのコグネイト生殖細胞系列Ｈ鎖領域と比較した表である。表１３は、抗体のカッパＬ鎖領域をそれらのコグネイト生殖細胞系列Ｌ鎖領域と比較した表である。
【０２３２】
免疫グロブリン鎖の可変（Ｖ）部は複数の生殖細胞系列ＤＮＡセグメントによりコードされ、それらがＢ細胞個体発生中に連結して機能性可変部（ＶHＤＪHまたはＶKＪK）になる。
【０２３３】
ある抗体がそれの生殖細胞系列配列それぞれとアミノ酸レベルで異なる場合、その抗体配列が生殖細胞系列の配列に復帰変異する可能性があることも認識すべきである。そのような修正変異を、１、２、３もしくはそれ以上の位置において、またはいずれかの変異位置の組合わせにおいて、標準的な分子生物学的技術を用いて起こさせることができる。限定ではないが、たとえば表１２は、ｍＡｂ  ２．１７５．３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２）のＨ鎖配列が対応する生殖細胞系列配列と、特にＦＲ１領域におけるＱ−Ｈ変異（変異１）、ＣＤＲ１領域におけるＳ−Ｈ変異（変異２）、およびＣＤＲ２領域におけるＳ−Ｒ変異（変異３）により異なることを示す。したがって、ｍＡｂ  ２．１７５．３のＨ鎖をコードするアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を修飾して変異１を変化させ、変異１の部位に生殖細胞系列の配列を得ることができる。さらに、ｍＡｂ  ２．１７５．３のＨ鎖をコードするアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を修飾して変異２または変異３を変化させ、変異２または変異３の部位に生殖細胞系列の配列を得ることができる。実際に、ｍＡｂ  ２．１７５．３のＨ鎖をコードするアミノ酸配列または核酸配列は、２以上のいかなる組合わせの変異も含むことができ、それらの特定部位に生殖細胞系列の配列を得ることができる。下記の表６〜１１は、ｍＡｂ  ２．１７５．３、２．４４９．１．３および２．９９８．２について、そのような生殖細胞系列からの変異の位置を示す。各列は、指示した位置における生殖細胞系列と非生殖細胞系列の残基のユニークな組合わせを表わす。配列表と表６〜１１の間に不一致がある場合、表中に示した情報が優先する（表中のDELETED＝欠失）。
【０２３４】
【表６−１】
0005437804.tif 000013
【０２３５】
【表６−２】
0005437804.tif 000014
【０２３６】
【表６−３】
0005437804.tif 000015
【０２３７】
【表６−４】
0005437804.tif 000016
【０２３８】
【表６−５】
0005437804.tif 000017
【０２３９】
【表６−６】
0005437804.tif 000018
【０２４０】
【表６−７】
0005437804.tif 000019
【０２４１】
【表６−８】
0005437804.tif 000020
【０２４２】
【表６−９】
0005437804.tif 000021
【０２４３】
【表６−１０】
0005437804.tif 000022
【０２４４】
【表６−１１】
0005437804.tif 000023
【０２４５】
【表６−１２】
0005437804.tif 000024
【０２４６】
【表６−１３】
0005437804.tif 000025
【０２４７】
【表６−１４】
0005437804.tif 000026
【０２４８】
【表６−１５】
0005437804.tif 000027
【０２４９】
【表６−１６】
0005437804.tif 000028
【０２５０】
【表６−１７】
0005437804.tif 000029
【０２５１】
【表６−１８】
0005437804.tif 000030
【０２５２】
【表６−１９】
0005437804.tif 000031
【０２５３】
【表６−２０】
0005437804.tif 000032
【０２５４】
【表６−２１】
0005437804.tif 000033
【０２５５】
【表６−２２】
0005437804.tif 000034
【０２５６】
【表６−２３】
0005437804.tif 000035
【０２５７】
【表６−２４】
0005437804.tif 000036
【０２５８】
【表６−２５】
0005437804.tif 000037
【０２５９】
【表６−２６】
0005437804.tif 000038
【０２６０】
【表６−２７】
0005437804.tif 000039
【０２６１】
【表６−２８】
0005437804.tif 000040
【０２６２】
【表６−２９】
0005437804.tif 000041
【０２６３】
【表６−３０】
0005437804.tif 000042
【０２６４】
【表６−３１】
0005437804.tif 000043
【０２６５】
【表６−３２】
0005437804.tif 000044
【０２６６】
【表６−３３】
0005437804.tif 000045
【０２６７】
【表６−３４】
0005437804.tif 000046
【０２６８】
【表６−３５】
0005437804.tif 000047
【０２６９】
【表６−３６】
0005437804.tif 000048
【０２７０】
【表６−３７】
0005437804.tif 000049
【０２７１】
【表６−３８】
0005437804.tif 000050
【０２７２】
【表６−３９】
0005437804.tif 000051
【０２７３】
【表６−４０】
0005437804.tif 000052
【０２７４】
【表６−４１】
0005437804.tif 000053
【０２７５】
【表６−４２】
0005437804.tif 000054
【０２７６】
【表６−４３】
0005437804.tif 000055
【０２７７】
【表６−４４】
0005437804.tif 000056
【０２７８】
【表６−４５】
0005437804.tif 000057
【０２７９】
【表６−４６】
0005437804.tif 000058
【０２８０】
【表６−４７】
0005437804.tif 000059
【０２８１】
【表６−４８】
0005437804.tif 000060
【０２８２】
【表６−４９】
0005437804.tif 000061
【０２８３】
【表６−５０】
0005437804.tif 000062
【０２８４】
【表６−５１】
0005437804.tif 000063
【０２８５】
【表６−５２】
0005437804.tif 000064
【０２８６】
【表６−５３】
0005437804.tif 000065
【０２８７】
【表６−５４】
0005437804.tif 000066
【０２８８】
【表６−５５】
0005437804.tif 000067
【０２８９】
【表６−５６】
0005437804.tif 000068
【０２９０】
【表６−５７】
0005437804.tif 000069
【０２９１】
【表６−５８】
0005437804.tif 000070
【０２９２】
【表６−５９】
0005437804.tif 000071
【０２９３】
【表６−６０】
0005437804.tif 000072
【０２９４】
【表６−６１】
0005437804.tif 000073
【０２９５】
【表６−６２】
0005437804.tif 000074
【０２９６】
【表６−６３】
0005437804.tif 000075
【０２９７】
【表６−６４】
0005437804.tif 000076
【０２９８】
【表６−６５】
0005437804.tif 000077
【０２９９】
【表６−６６】
0005437804.tif 000078
【０３００】
【表６−６７】
0005437804.tif 000079
【０３０１】
【表６−６８】
0005437804.tif 000080
【０３０２】
【表６−６９】
0005437804.tif 000081
【０３０３】
【表６−７０】
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【０３８３】
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【０３８９】
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【０３９１】
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【０３９２】
【表６−１５９】
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【０３９３】
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【０３９４】
【表６−１６１】
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【０３９５】
【表６−１６２】
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【０４００】
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【０４０９】
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【０４１０】
【表６−１７７】
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【０４１３】
【表６−１８０】
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【０４１４】
【表６−１８１】
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【０４１５】
【表６−１８２】
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【０４１６】
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【０４１７】
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【０４１９】
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【０４２０】
【表６−１８７】
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【０４２１】
【表６−１８８】
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【０４２２】
【表６−１８９】
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【０４２３】
【表６−１９０】
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【０４２４】
【表６−１９１】
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【０４２５】
【表６−１９２】
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【０４２６】
【表６−１９３】
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【０４２７】
【表６−１９４】
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【０４２８】
【表６−１９５】
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【０４２９】
【表６−１９６】
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【０４３０】
【表６−１９７】
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【０４３１】
【表６−１９８】
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【０４３２】
【表６−１９９】
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【０４３３】
【表６−２００】
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【０４３４】
【表６−２０１】
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【０４３５】
【表６−２０２】
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【０４３６】
【表６−２０３】
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【０４３７】
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【０４３９】
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【０４４０】
【表６−２０７】
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【０４４１】
【表６−２０８】
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【０４４２】
【表６−２０９】
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【０４４３】
【表６−２１０】
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【０４４４】
【表６−２１１】
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【０４４５】
【表６−２１２】
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【０４４６】
【表６−２１３】
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【０４４７】
【表６−２１４】
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【０４４８】
【表６−２１５】
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【０４４９】
【表６−２１６】
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【０４５０】
【表６−２１７】
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【０４５１】
【表６−２１８】
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【０４５２】
【表６−２１９】
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【０４５３】
【表６−２２０】
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【０４５４】
【表６−２２１】
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【０４５５】
【表７】
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【０４５６】
【表８】
0005437804.tif 000235
【０４５７】
実施例８
Ｂｉａｃｏｒｅ分析によるアフィニティー測定
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００計測器を用いて２２℃でＢｉａｃｏｒｅ実験を実施した。バイオセンサー表面と抗体の標準アルデヒド結合を利用した。詳細には、５０μｇの各ｍＡｂと約１ｍＭのＮａＩＯ４を氷上で２５分間、０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ５．５中において反応させ、次いでＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ−５カラム（ＮＡＰ−５，ＧＥ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上において１０ｍＭ  ＮａＯＡＣ、ｐＨ４．０で試料を脱塩することにより、酸化反応を停止した。次いで、ＥＤＣ／ＮＨＳ、カルボヒドラジドおよびエタノールアミンと反応させたＣＭ５バイオセンサー表面に、ｍＡｂを流した。目的とする表面容量に達した後、０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ中の０．１Ｍ  ＮａＢＨ３ＣＮ、ｐＨ４．０を固定化ｍＡｂ上に２０分間流すことにより、ｍＡｂと表面のヒドラゾン結合を還元した。
【０４５８】
ｍＡｂ  ２．９９８．２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１４および１６）、２．１７５．３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２および４）、２．１７５．３変異型Ａ（３Ｑ，８０Ｙを含むＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４）；４６Ｌ，７７Ｓを含むＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３５））、２．４４９．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０および１２）、および２．４４９．１変異型Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０；４９Ｙ，１０７Ｉを含むＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３６））を、ＣＭ５バイオセンサーチップ上に固定化した。組換えヒトｓＰＤＧＦＲ−アルファ（Ｒ＆Ｄ  カタログ＃  ３２２−ＰＲ／ＣＦ；ロット＃  ＱＹ０５６０８１）を、濃度範囲５１．６〜０．８０６ｎＭ（２ｘ系列希釈）で９０秒間注入し、続いて３分間解離させた。解離期は試験したすべての相互作用について明らかにきわめて遅かったので、最初の３０回の注入が完了した後、さらに６回の注入（３回は２５．８ｎＭで、３回はブランク緩衝液の注入）を９０秒間の注入、１４，４００秒間（４時間）の解離期で実施した。試料は、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡを添加したＨｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水、０．００５％  ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ２０、ｐＨ７．４（ＨＢＳ−Ｐ）中に調製された。すべての試料をランダムに三重注入し、二重対比のために１０回以上の緩衝液注入を挿入した。すべてのセンサーグラムデータをＳｃｒｕｂｂｅｒ  ２．０で処理し、ＣＬＡＭＰを用いてマストランスポート（ｍａｓｓ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）に関する項を含む１：１相互作用モデルに広域的に当てはめた。得られた結合定数を次表に挙げる。ｍＡｂを最高アフィニティーから最低アフィニティーの順に挙げる。
【０４５９】
【表９】
0005437804.tif 000236
【０４６０】
表１４の結果は、２．１７５．３および２．４４９．１の生殖細胞系列変異型が、Ｂｉａｃｏｒｅ分析により測定して、それぞれの非生殖細胞系列抗体と比較して可溶性ＰＤＧＦＲａに対するアフィニティーの増大を示したことを示す。両方の生殖細胞系列はそれらの正常な同等物と比較して低下した解離定数を示し、これが観察されたアフィニティー増大に寄与している。表１４中で最高アフィニティーをもつ４種類の抗体を、実施例２に記載した可溶性ＰＤＧＦＲａ結合ＥＬＩＳＡ、および実施例４に記載したＭＧ−６３リン酸化アッセイで試験した。得られたＩＣ５０値を表１５に挙げる。
【０４６１】
【表１０】
0005437804.tif 000237
【０４６２】
実施例９
ヒト腫瘍異種移植モデルにおける抗腫瘍効果の評価
前記抗体のうち２種類の抗腫瘍効果を、非小細胞性肺癌Ｃａｌｕ−６の異種移植モデルにおいて評価した。宿主マウスは、相同組換えによりネズミＰＤＧＦＲａ遺伝子をヒトＰＤＧＦＲａで置き換えたＢｌａｃｋ６／１２９マウスとＳＣＩＤマウスの交雑により得られた。得られたマウスはヒトＰＤＧＦＲａ受容体を発現し、ネズミ受容体を発現しなかった。１９週令のこれらのノックイン／ノックアウトマウス（１０匹／グループ）に、２Ｘ１０6個のＣａｌｕ−６細胞を０．１ｍｌのｍａｔｒｉｇｅｌ中において右側腹部に注射した。腫瘍が平均１７０ｍｍ3のサイズに達した時点で、リン酸緩衝化生理食塩水ビヒクル中の抗体、または空の生理食塩水ビヒクルを、試験期間中、抗体１０ｍｇ／ｋｇで週２回、腹腔内投与した。図２ａは処置グループ当たりの経時的な平均腫瘍サイズを示し、一方、図２ｂは経時的な平均体重を示す。両方の抗体処置により腫瘍の増殖速度が有意に低下した；２．１７５．３による処置は５５％の増殖低下をもたらし（ｐ＝０．０６）、一方、２．４４９．１．３による処置は７３％の増殖率低下をもたらした（ｐ＜０．００１）。試験中の体重変化に関しては両グループ間に有意差がなかった（図２ｂ）。
【０４６３】
２．４４９．１．３および２．４４９．１．３変異型Ａの抗腫瘍効力を、Ｕ１１８神経膠腫の異種移植モデルにおいてさらに評価した。１９週令のＳＣＩＤマウス（１０匹／グループ）に、２Ｘ１０6個の細胞を０．１ｍｌのｍａｔｒｉｇｅｌ中において、動物の右側腹部に注射した。腫瘍が平均２８０ｍｍ3のサイズに達した時点で、Ｃａｌｕ−６モデルについて前記に述べたように抗体を投与した。結果を図３に示す。抗体２．４４９．１．３はＵ１１８腫瘍の増殖を９４％低下させた（ｐ＜０．０００００１）。２．４４９．１．３変異型Ａは増殖を１０１％低下させた。したがって、２．４４９．１．３および２．４４９．１．３変異型Ａは両方とも、この神経膠腫異種移植片の増殖を低下させる活性が高く、変異型Ａの変異はこのモデルにおいてインビボ活性を低下させない。
【０４６４】
援用
特許、特許出願、報文、テキストなどを含めて本明細書に引用したすべての参考文献、およびそれらに引用された参考文献（それらが既に引用されていない場合）の全体を、本明細書に援用する。
【０４６５】
均等物
以上の詳細な記載は当業者が本発明を実施できるのに十分であると考えられる。以上の記載および実施例は本発明の特定の好ましい態様を詳細に示し、本発明により考慮される最良の形態を記載する。ただし、以上の記載の表現がいかに詳細に見えても、本発明は多くの様式で実施でき、本発明は特許請求の範囲およびその均等物に従って解釈すべきであることは認識されるであろう。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
0005437804.tif 000240
【図３】
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【配列表】
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