(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的流体サンプル中のフォレートのレベルを非放射性かつ非微生物的手法により評価する方法であって、該方法は、以下：  該サンプルに、グリシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＧＮＭＴ）ならびに過剰のＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）および過剰のグリシンを提供する工程；  フォレートを含まないコントロールに、該ＧＮＭＴならびに過剰のＳＡＭおよび過剰のグリシンを、該サンプルに提供した量に匹敵する量提供する工程；および  該サンプル中で形成された少なくとも一つのＧＮＭＴ生成物の濃度を、該コントロール中で形成された該生成物の濃度と比較する工程、を包含し、  ここで該コントロールと比較した、該サンプル中の該生成物のレベルの差異は、該サンプル中のフォレートのレベルに正比例する、方法。
【請求項２】
検出される前記生成物が、Ｓ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＳＡＨが、前記サンプルを、ＳＡＨをホモシステインに変換するためにＳＡＨａｓｅと、ホモシステイナーゼ（ＨＣＹａｓｅ）とで処理する工程、およびＨＣＹａｓｅと該ホモシステインとの反応によって得られる少なくとも一つの生成物の濃度を測定する工程、を包含する方法により測定される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
測定される前記生成物がＨ2Ｓである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記測定する工程が、前記サンプルをジアルキルフェニレンジアミンおよび酸化剤で処理する工程を包含する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ジアルキルフェニレンジアミンがＤＢＰＤＡであり、前記酸化剤が第二鉄イオンである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項２に記載の方法であって、前記サンプルおよびコントロールを、該サンプル中のいかなるフォレートをもホリポリグルタメート（ＦＰＧ）に変換するために効率的な濃度の、ホリポリグルタメート合成酵素（ＦＰＧＳ）およびグルタミン酸の存在下で、前記ＧＮＭＴと共にインキュベートし、ここで該サンプル中のＳＡＨ濃度は、該コントロール中に存在するＳＡＨよりも、該サンプル中のフォレート濃度に正比例する程度に小さい、方法。
【請求項８】
測定される前記生成物がサルコシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記サルコシンが、前記サンプルをサルコシンオキシダーゼで処理する工程、およびサルコシンとサルコシンオキシダーゼとの反応生成物の少なくとも一つのレベルを測定する工程、によって測定される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
測定される前記生成物が過酸化水素である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記測定する工程が、ペルオキシダーゼで処理する工程を包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記測定する工程がさらに、前記サンプルにジアルキルフェニレンジアミンを提供する工程を包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ジアルキルフェニレンジアミンがＤＢＰＤＡである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記測定する工程が、ペルオキシダーゼならびに４−クロロ−１−ナフトールおよびｏ−トルイジンを提供する工程を包含する、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】  本願は１９９９年４月１６日付け出願の仮特許出願番号６０／１２９，７３０号をもとに米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権を主張する。上記仮出願の内容は参考として本明細書に援用される。
【０００２】    （技術分野）  本発明は特定の代謝産物、特にフォレート（ｆｏｌａｔｅ）の異常レベルにより特徴付けられる状態の診断方法、および単純化された検出方法に関する。本発明の改良方法はフォレートおよび他の分析物の濃度の迅速かつ正確な評価を提供する。
【０００３】    （背景技術）  フォレートはメチル基転移反応における重要な補因子である。血液および血漿などの生物学的流体におけるフォレートレベルの異常は、メチル基の不適切または不十分な転移を特徴とする状態の指標である。そのため、このような液体中のフォレートレベルの正確な測定を提供し得、それらを正常な個体において予期されるフォレートレベルと比較し得ることが重要である。フォレート濃度の低下は巨赤芽球性貧血および低ＤＮＡ合成、ならびに心臓血管疾患に関連している。先天性異常（ｂｉｒｔｈ  ｄｅｆｅｃｔ）もまた生じ得る。本発明の方法を用いることによって、フォレートを効率的に測定し得る。本発明はまた、ペルオキシダーゼの存在下でＨ2Ｏ2を検出する改良方法も提供する。
【０００４】    （発明の開示）  生物学的流体中のフォレートレベルを決定する本発明の方法は、グリシンがサルコシンに変換されるメチル基転移反応をフォレートが阻害する能力を利用する。この変換を行う酵素、グリシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＧＮＭＴ）は肝臓または膵臓から単離され得る。本発明のアッセイ系では、グリシンおよびＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）が反応体であり、サルコシンおよびＳ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）が生成物である。これらの反応体を変換する際のＧＮＭＴの効率は、インビボでのフォレート濃度に依存する。
【０００５】  サンプル中のフォレートは、ＧＮＭＴの前記生成物形成能力を阻害する形態に変換され得る（ある程度は、既にこの形態で存在している）。サンプル中のフォレートを最初に、ＧＮＭＴのインヒビターであるホリポリグルタメート（ｆｏｌｙｐｏｌｙ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ）（ＦＰＧ）に変換する。イェオ（Ｙｅｏ，Ｅ−Ｊ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）２７４巻：３７５５６−３７５６４ページ。このような条件のもとでは、サンプル中のフォレートの量が多ければ多いほど、形成される生成物は少なくなる。本発明の方法では、生成物のレベルを代表的に測定する。反応体レベルを過剰に提供すると、反応体の減少を測定することは、理論的に可能であるとはいえ、あまり好ましくない。なぜなら、大きい濃度における小さい差異を検出することは、ゼロからの差異を測定するより当然難しいからである。しかし、これは不可能ではなく、そのような測定も同様に本発明の範囲内である。
【０００６】  ＳＡＨまたはサルコシンのどちらかの濃度を測定してもよいし、両方を測定してもよい。場合に応じて種々の方法が利用可能である。しかしＳＡＨの測定のために好ましい実施形態には、以下にさらに記載するように、それをホモシステインに変換し、その後ホモシステインを溶解して、容易に検出可能な生成物を得る工程が含まれる。サルコシンの場合の変換方法は、このアミノ酸の存在下で過酸化水素を生成する特定のオキシダーゼの使用である。過酸化水素はまた、当該分野において公知の種々の方法によって容易に検出され得る。この好ましい実施形態は以下に説明される。従って、一つの局面において、本発明は以下に関する：  生物学的流体サンプル中のフォレートのレベルを評価する方法であって、該方法は、以下：  該サンプルに、グリシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＧＮＭＴ）ならびに過剰のＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）および過剰のグリシンを提供する工程；  フォレートを含まないコントロールに、該ＧＮＭＴならびに過剰のＳＡＭおよび過剰のグリシンを、該サンプルに提供した量に匹敵する量提供する工程；  該サンプル中で形成された少なくとも一つの生成物の濃度を、コントロール中で形成された該生成物の濃度と比較する工程、を包含し、  ここで該コントロールと比較した、該サンプル中の該生成物のレベルの差異は、該サンプル中のフォレートのレベルに正比例する、方法。
【０００７】  前記の方法において、サルコシンレベルまたはＳＡＨレベルのいずれを測定してもよい。サンプル中の生成物濃度はコントロールと比較して減少する。上記のように、フォレートをＧＮＭＴのインヒビターであるＦＰＧに変換する酵素で、サンプルを前処理することが好ましい。この酵素、ホリポリグルタメート合成酵素（ＦＰＧＳ）は当該分野で容易に入手可能である。
【０００８】  別の局面において、本発明はサルコシン測定の終点（ｅｎｄｐｏｉｎｔ）のために特に好都合な方法に関する。分析サンプル（生物学的流体を含む）中の過酸化水素を測定する特に好都合な方法は、過酸化物を含むサンプルを、ペルオキシダーゼとジアルキルフェニレンジアミンの両方で処理することであることが見出された。この結果生成した物質は着色化合物で、それは分光光度的に測定され得る。明らかなように、過酸化水素を生成する多数のプロトコル（例えば、基質を、それらの適切に対応物しそして特異的なオキシダーゼで処理する）が利用可能であるので、ペルオキシダーゼとジアルキルフェニレンジアミンとの組み合わせは広範囲の用途を有する。
【０００９】    （発明の実施形態）  本発明は一実施形態において、生物学的流体中のフォレートの測定に関する。適切な生物学的流体は最も一般的には、血液、血清および血漿である；ただし他の流体、例えば、脳脊髄液、尿、および他の血液画分も同様に興味深い。血漿または血清中での測定が好ましい。
【００１０】  「フォレート」とは葉酸およびその塩類、ならびにジヒドロおよびテトラヒドロ形態を意味する。結果の一貫性を確実にするために、反応混合物に還元剤を加えて、全てのフォレートを同じ酸化状態（すなわち、テトラヒドロフォレート（ＴＨＦ）形態）にすることが好適であり得る。しかし生物学的系における優勢形態（他の形態をほとんどを排除する）はテトラヒドロフォレートであると考えられ、特に５−メチルテトラヒドロフォレートであると考えられる。特に、内生的にＧＮＭＴのインヒビターとして作用するのは、グルタメートと組み合わせたこの形態なのである。
【００１１】  背景として、肝臓および膵臓内のＧＮＭＴの機能は、サルコシンの形態に「シンク（ｓｉｎｋ）」（この機能は知られていない）を作製することによってＳＡＭの所望されない高濃度を減少させることであると考えられている。しかしこの酵素は、フォレートによって調節される；高レベルのメチル化ＴＨＦが存在する際にはグルタメートとの結合が生じ、生成した化合物は強力なＧＮＭＴのインヒビターである。本発明は、フォレートがこのメカニズムによってＧＮＭＴを阻害する能力を利用する。
【００１２】  本発明に使用するために、ＧＮＭＴは膵臓または肝臓から単離され得るか、あるいは理論的には組換え方法で生成され得る。この酵素をネイティブな供給源から単離する場合、最初にこの酵素をいかなる内因性フォレートからをも解離するように処理されなければならない。これは、この酵素をアニオン交換カラムで処理し、例えば、ゲル排除方法を用いて分離することによってもたらされ得る。
【００１３】  本発明の方法において、グリシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＧＮＭＴ）は以下の反応を触媒する：  グリシン＋ＳＡＭ → サルコシン＋ＳＡＨＧＮＭＴは、あらゆる都合良い供給源から精製される。この酵素をラット肝臓から精製する方法は以下に記す実施例に記載されている；また単離したＧＮＭＴをアニオン交換カラムで処理し、解離したフォレートをゲル濾過によって分離することによって、インヒビターを含まない酵素を得る方法も記載されている。
【００１４】  上記方法を実施するために、いかなるフォレートをもＧＮＭＴのインヒビターであるＦＰＧに変換する酵素ＦＰＧＳの存在下で、グルタミン酸で処理した後、コントロールおよびサンプルの両方を、フォオレートを含まないＧＮＭＴと共にインキュベートする。サルコシンまたはＳＡＨのいずれかが測定され得、サンプル中に存在する生成物の量または濃度は、コントロール中の量または濃度よりも、サンプル中のフォレート濃度に比例する程度に小さくなる。こうしてサンプルおよびコントロールをグルタミンおよび合成酵素ＦＰＧＳで処理してフォレートをＧＮＭＴのインヒビター（ＦＰＧ）に変換する。この実施形態において、サンプルを、ＧＮＭＴによる処理の前または処理と同時に、適切な量のグルタミンおよびＦＰＧＳと共にインキュベートする。このアッセイの残りは、以下に概略記す代替方法によって行われる。ＳＡＨまたはサルコシンの測定はＧＮＭＴ活性の測定値を与え、ＧＮＭＴ活性測定値は、順にインヒビターのレベルに反比例し、したがってサンプル中のフォレートのレベルに反比例する。
【００１５】    （ＳＡＨの検出）  好ましいＳＡＨ検出方法において、反応混合物をＳ−アデノシルホモシステイナーゼ（ＳＡＨａｓｅ）で処理する：Ｓ−アデノシルホモシステイナーゼはＳＡＨをホモシステインに変換する。次いで、ホモシステインは当該分野で都合の良い任意の方法で測定され得る。しかし特に好ましい実施形態は、特にホモシステインに特異的な組換えホモシステイナーゼ（ＨＣＹａｓｅ）（好ましくは、ＨＹａｓｅTM）を用いる。この酵素は１９９９年２月４日に公開されたＰＣＴ公開番号第ＷＯ９９／０５３１１号（これは参考として本明細書に援用される）に詳細に記載されている。この特定のＨＹａｓｅTMホモシステイナーゼの使用は、サンプル中に存在するメチオニンまたはシステインから形成され得る、いかなるバックグラウンド生成物をも実質的かつ本質的に排除するという利点を有する。この酵素によるホモシステイン触媒作用の生成物は、アンモニア、硫化水素、およびα−ケトブチレートである。これら生成物のいずれも測定され得るが、任意のジアルキルフェニレンジアミンの存在下、最も好都合にはジ−Ｎ−ブチル実施形態（ＤＢＰＤＡ）の存在下で酸化剤を使用する方法によって、硫化水素を測定するのが最も都合が良い。酸化剤の存在下で硫化水素とジアルキルフェニレンジアミンとの間で形成される錯体は色素生産性および蛍光性であり、検出のためにどちらの特性を用いてもよい。蛍光特性の使用が若干より感受性が高いようである。
【００１６】  従って、好ましい一実施形態において、上記反応混合物をＳＡＨａｓｅおよび組換えホモシステイナーゼＨＹａｓｅで、そして色素原ＤＢＰＤＡおよび酸化剤（例えば、第二鉄イオン）で処理する。約６７５ｎｍの吸光度か、約６６５ｎｍでの励起および６９０ｎｍでの発光における蛍光のどちらかを測定する。
【００１７】    （サルコシンの測定）  サルコシン生成物のレベルはサルコシン特異的酵素を用いて、都合良く測定され得る。特に好ましいサルコシン特異的酵素はサルコシンオキシダーゼ（サントス（Ｓａｎｔｏｓ，Ｆ．）ら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（１９９５）１６巻、１８９８−１８９９ページ）である。サルコシンオキシダーゼは過酸化水素を生成する。ジアルキルフェニレンジアミンはまた、過酸化水素の存在下で、ペルオキシダーゼによる分解に際して色素生産性である；あるいは、４−クロロ−１−ナフトールおよびオルト−トルイジンのような他の試薬類を用いて着色生成物を獲得し得る。
【００１８】    （過酸化物の測定）  個々の基質に特異的であり、そして過酸化水素の産生を生じる多くの生物学的反応（特に、オキシダーゼ反応）がある。本発明の別の局面は、過酸化水素濃度を測定する改良方法である。この方法は、過酸化物を測定しようとするサンプルに、西洋ワサビペルオキシダーゼのようなペルオキシダーゼと、ジアルキルフェニレンジアミンとを両方加える工程を包含する。好ましい化合物はＤＢＰＤＡである。これらの試薬の例示的な量は下記の実施例に記載されている。  上記反応の生成物は分光光度的に測定され得る。あるいは相当に検出され得る蛍光生成物を形成する。  下記の実施例は本発明を例示するためのものであって、制限するものではない。
【００１９】    （製法Ａ）  （ラット肝臓グリシン Ｎ−メチルトランスフェラーゼ（ＧＮＭＴ）の精製）  この方法は、オガワ（Ｏｇａｗａ，Ｈ．）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８２）２５７巻、３４４７−３４５２ページ；イェオ（Ｙｅｏ，Ｅ．Ｊ．）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９２）２６７巻：２４６６９−２４６７４ページに記載されている方法の改良型である。ラットを断頭によって殺傷し、肝臓を速やかに取り出し、氷上で冷やした。約４００ｇの肝臓を、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ緩衝液（ｐＨ７．２）１．２リットルと共に、ブレンダー中でホモジナイズした。１．０Ｍ酢酸ナトリウムを滴下してｐＨ５．５に調整した後、１０，０００Ｘｇで１５分間遠心分離して沈殿物を除去した。澄明な上清液を回収し、２Ｎ ＫＯＨでｐＨ７に調整した。上清液に１％硫酸アンモニウムを加え、この混合物をおだやかに撹拌しながら３０分間放置した。１０，０００ｇで３０分間遠心分離後、上清液を回収し、上清液１００ｍｌにつき８ｇの硫酸アンモニウムで処理した。３０分後、混合物を上記のように遠心分離し、ペレットを取り出し、溶解し、一晩透析した。
【００２０】  透析した酵素調製物を二等分に分け、各々を、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ緩衝液（ｐＨ７．２）、で平衡化したＤＥＡＥセファロースカラム（５ｘ２５ｃｍ）上に置いた。通過した画分をあわせ、硫酸アンモニウムを３０ｇ／１００ｍｌ加えた。一晩放置後、ペレットを遠心分離によって集め、緩衝液に溶解した。  １．０Ｍ硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ緩衝液（ｐＨ７．２）であらかじめ洗浄したフェニルセファロース６ＦＦ（５ｘ２５ｃｍ）カラムに、１．０Ｍ硫酸アンモニウムを含む上記酵素溶液を適用した。１０ｍＭ緩衝液（ｐＨ７．２）を用いて、結合ＧＮＭＴタンパク質が硫酸アンモニウム濃度の減少する直線勾配で溶出した。活性を示すピークを集め、一晩透析した。
【００２１】  （製法Ｂ）  （ＡｐｏＧＮＭＴの製法）  製法Ａのように調製したＧＮＭＴからフォレートを除去した。製法Ａにおいて調製した酵素溶液を、アニオン交換カラムを通過させてフォレートリガンドを解離させ、その後標準方法を用いて遠心分離ゲル排除を行った。
【００２２】  （製法Ｃ）  （インヒビターＦＰＧの製法）  ＦＰＧを血清からか、または標準５−メチルテトラヒドロフォレート溶液から、組換えヒトＦＰＧＳで処理することによって調製した（パレシュ（Ｐａｒｅｓｈ，Ｃ．）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐ  ＆  Ｐｕｒ（２０００）１８巻、３６−４５ページ）。血清または５−メチルＴＨＦと３ｍｇの精製組換えヒトＦＰＧＳ（０．１μＭ）とを、１５ｍＭグルタミン酸、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５ｍＭ  ＡＴＰ、２０ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  β−メルカプトエタノール、２５０μｇ  ＢＳＡ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．７）の総量５００μｌの存在下で、３７℃で１．０時間インキュベートした。
【００２３】    （実施例１）  （ＦＰＧによるＧＮＭＴ阻害によるフォレートの決定）  製法Ａで調製したようなＧＮＭＴ（０．９５μｇ）を処理して、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）および５ｍＭ  ＤＴＴを含む標準反応混合物（１〜１００ｎＭ  ＦＰＧ）中または試験血清サンプル中のＦＰＧと結合させた。製法Ｃの種々の希釈物（標準メチルＴＨＦまたは血清から調製されたＦＰＧ）を８００μｌ反応混合物中に加えた。これを２５℃で１５分間インキュベートした。 ＧＮＭＴとＦＰＧ（標準かまたは血清に由来するかのいずれか）とを結合させた後、５ｍＭグリシン  １００μｌおよび１ｍＭ  ＳＡＭ  １００μｌを用いて各サンプルの容量を１０００μｌにした。この反応系はまた、１０μｌの組換えＳＡＨａｓｅ（２．０単位／ｍｌ）および組換えＨＹａｓｅ（３００単位／ｍｌ）のアッセイ混合物も含んでいた。これを３７℃で３０分間インキュベートした。この期間中に全てのＳＡＨ生成物はホモシステインに変換され、次いで、硫化水素、アンモニアおよびピルベートに変換された。３０分間のインキュベーション後、５０μｌの４０ｍＭ ＤＢＰＡおよび４０ｍＭ  Ｋ3Ｆｅ（ＣＮ）6を加え、反応混合物を３７℃で１０分間インキュベートし、６７５ｎｍで読み取った。
【００２４】    （実施例２）  （代替的評価方法）Ａ．血清中のフォレートの評価を実施例１に記載のように行ったが、ただし、ＳＡＨａｓｅおよびＨＣＹａｓｅを反応混合物中に含む代わりに、この反応系は１０μｌサルコシンオキシダーゼ（ＳＯＸ）（４ｍｇ／ｍｌ）ペルオキシダーゼ（２ｍｇ／ｍｌ）および１０μｌの４−クロロ−１−ナフトール（２％Ｗ／Ｖ、ジエチレングリコール中）および２０μｌのｏ−トルイジン（飽和溶液、７％酢酸中）を含んでいた。インキュベーションは再度３７℃で行い、光学密度を読んだ。Ｂ．製法Ａのアッセイを、４−クロロ−１−ナフトールもｏ−トルイジンも反応混合物に加えずに行った。代わりに、５ｍＭ  ＤＢＰＤＡを含めた。３０分間のインキュベーション終了後に５５８ｎｍの光学密度を読んだ。