(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（１）または（２）に示すタンパク質：
（１）配列番号４に示すアミノ酸配列において、４番目のアミノ酸残基がグリシン残基からアラニン残基に、６番目のアミノ酸残基がグルタミン残基からヒスチジン残基に、１４番目のアミノ酸残基がセリン残基からスレオニン残基に、３７番目のアミノ酸残基がアラニン残基からスレオニン残基またはアルギニン残基に、５０番目のアミノ酸残基がプロリン残基からグルタミン残基に、６７番目のアミノ酸残基がグルタミン酸残基からグリシン残基に、８０番目のアミノ酸残基がアスパラギン残基からチロシン残基に、９３番目のアミノ酸残基がバリン残基からメチオニン残基に、１５６番目のアミノ酸残基がアルギニン残基からプロリン残基に、１６４番目のアミノ酸残基がロイシン残基からメチオニン残基に、２０２番目のアミノ酸残基がアスパラギン残基からアスパラギン酸残基に、２３５番目のアミノ酸残基がスレオニン残基からアラニン残基に、３４８番目のアミノ酸残基がアスパラギン残基からチロシン残基に、３６２番目のアミノ酸残基がグリシン残基からアルギニン残基に、および４７３番目のバリン残基がアラニン残基に変化した変異のうち、少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、
上記記載の変異の内、
１）６番目の変異以外の全ての変異（但し３７番目のアミノ酸残基はアルギニン残基への変異である）を有する配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；
２）配列番号１で示されるアミノ酸の１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質；
３）配列番号１で示されるアミノ酸の１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質；
４）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質；
５）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質；
６）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質；
７）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質；
８）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質；
９）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列；
１０）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３７番目のアルギニン残基がスレオニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質；
１１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の４番目のアラニン残基がグリシン残基であり、３７番目のアルギニン残基がスレオニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質；
１２）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３７番目のアルギニン残基がスレオニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、２３５番目のアラニン残基がスレオニン残基であり、３４８番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質；
１３）配列番号１で示されるアミノ酸配列の４番目のアラニン残基がグリシン残基であり、３７番目のアルギニン残基がスレオニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、３４８番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質；
１４）配列番号１で示されるアミノ酸配列の４番目のアラニン残基がグリシン残基であり、１４番目のスレオニン残基がセリン残基であり、３７番目のアルギニン残基がスレオニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、２３５番目のアラニン残基がスレオニン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質；
１５）配列番号１で示されるアミノ酸配列の４番目のアラニン残基がグリシン残基であり、３７番目のアルギニン残基がスレオニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、２３５番目のアラニン残基がスレオニン残基であり、３４８番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質；
１６）配列番号１で示されるアミノ酸配列の４番目のアラニン残基がグリシン残基であり、１４番目のスレオニン残基がセリン残基であり、３７番目のアルギニン残基がスレオニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、２３５番目のアラニン残基がスレオニン残基であり、３４８番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質；
１７）配列番号１で示されるアミノ酸配列の４番目のアラニン残基がグリシン残基であり、１４番目のスレオニン残基がセリン残基であり、３７番目のアルギニン残基がスレオニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、９３番目のメチオニン残基がバリン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、２３５番目のアラニン残基がスレオニン残基であり、３４８番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質；
１８）配列番号１で示されるアミノ酸配列の４番目のアラニン残基がグリシン残基であり、１４番目のスレオニン残基がセリン残基であり、３７番目のアルギニン残基がスレオニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、９３番目のメチオニン残基がバリン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、２３５番目のアラニン残基がスレオニン残基であり、３４８番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、３６２番目のアルギニン残基がグリシン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質；
１９）配列番号１で示されるアミノ酸配列の４番目のアラニン残基がグリシン残基であり、１４番目のスレオニン残基がセリン残基であり、３７番目のアルギニン残基がスレオニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、９３番目のメチオニン残基がバリン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、１６４番目のメチオニン残基がロイシン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、２３５番目のアラニン残基がスレオニン残基であり、３４８番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質；
２０）配列番号１で示されるアミノ酸配列の４番目のアラニン残基がグリシン残基であり、６番目のグルタミン残基がヒスチジン残基であり、１４番目のスレオニン残基がセリン残基であり、３７番目のアルギニン残基がスレオニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、９３番目のメチオニン残基がバリン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、１６４番目のメチオニン残基がロイシン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、２３５番目のアラニン残基がスレオニン残基であり、３４８番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、３６２番目のアルギニン残基がグリシン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質；および
２１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の４番目のアラニン残基がグリシン残基であり、１４番目のスレオニン残基がセリン残基であり、３７番目のアルギニン残基がアラニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、９３番目のメチオニン残基がバリン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、１６４番目のメチオニン残基がロイシン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、２３５番目のアラニン残基がスレオニン残基であり、３４８番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、３６２番目のアルギニン残基がグリシン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）上記（１）に記載のアミノ酸配列において、変異したアミノ酸残基以外のアミノ酸残基の１乃至２０個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されたアミノ酸配列からなり、且つ１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素活性を有し、４５℃、１０分の加熱で、８％以上の１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素活性を保持する耐熱性のタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子。
【請求項３】
請求項２に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項５】
形質転換体の宿主が大腸菌である請求項４に記載の形質転換体。
【請求項６】
請求項４または５に記載の形質転換体を培養し、培養物から請求項１に記載のタンパク質を採取することを含む耐熱性１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素の製造法。
【請求項７】
請求項１に記載の１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素活性を有する耐熱性のタンパク質を用いた１，５−アンヒドログルシトールの測定法。
【請求項８】
１，５−アンヒドログルシトールの測定を、アルブミンを共存させて行う請求項７に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定法。
【請求項９】
測定法が、レドックスメディエーターとしてフェノチアジン系化合物を用い、参照電極及び/又は対極として銀塩化銀電極を用いる電気化学的測定法である請求項７に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定法。
【請求項１０】
請求項１に記載のタンパク質を含む、１，５−アンヒドログルシトール測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１，５−アンヒドログルシトールの酵素的測定法に有用な耐熱性１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素、耐熱性１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素遺伝子、組換えベクター、形質転換体、耐熱性１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素の製造法、耐熱性１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素を用いた１，５−アンヒドログルシトールの酵素的測定法及び該測定法に使用するキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
１，５−アンヒドログルシトール（以下、１，５−ＡＧという）は、ヒトの血清、血漿、尿等の体液中に存在し、ある種の疾患、特に糖尿病において体液中の量が大きく変動する。このため、体液中における１，５−ＡＧの測定値は有用な診断指標となり、近年臨床検査において重要な検査項目となっている。【０００３】
この１，５−ＡＧの定量法としては、特許文献１等に記載の１，５−ＡＧにピラノースオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化水素をパーオキシダーゼ発色系にて比色定量する方法が主流となり、汎用の自動分析装置にて行われている。【０００４】
他の測定方法としては、特許文献２に記載の１，５−ＡＧにリン酸基供与体の存在下、１，５−ＡＧのリン酸化酵素を作用させて得られる１，５−ＡＧ−６−リン酸を１，５−ＡＧ−６−リン酸脱水素酵素により比色定量する方法等が知られている。【０００５】
また、１，５−ＡＧを１，５−ＡＧ脱水素酵素を用いて測定する方法も特許文献３乃至５に報告されている。１，５−ＡＧに作用する脱水素酵素としては、特許文献４及び５に記載のアグロバクテリウム・ツメファシエンス由来の脱水素酵素、特許文献６記載のサイトファーガ属細菌由来の脱水素酵素、特許文献７記載のラフネラ・アクアティリス、エンテロバクター・クロアカエやセラチア・マルセッセンス由来の脱水素酵素、特許文献８記載のオイペニシリウム・クルセタセウム、ハンセヌラ・カリホニア、ピチア・カルソニー、ピチア・シュードポリモルファ等の真菌類由来の脱水素酵素、特許文献９記載のトリコデルマ・ロンギブラキアツム由来の脱水素酵素等が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特公平５−４１２３８号公報
【特許文献２】特開２００２−１８６４９７号公報
【特許文献３】特公平３−２４２００号公報
【特許文献４】特許第２８７２９８３号公報
【特許文献５】特許第３８１９０９４号公報
【特許文献６】特開平７−６７６９７号公報
【特許文献７】特開平１１−１８７６２号公報
【特許文献８】特開平２−２６８６７９号公報
【特許文献９】特開２０００−１３５０７９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来のピラノースオキシダーゼを用いた測定方法では、１，５−ＡＧのみならずグルコースにも強く作用してしまうので、共存するグルコースを事前に且つ完全に消化する為に、グルコース消化酵素等を含む複雑な測定系が必要となる。
また、１，５−ＡＧ−６−リン酸脱水素酵素により比色定量する方法でも、グルコースの消化酵素、１，５−ＡＧリン酸化酵素等を測定系に共存させなければならず、煩雑である。【０００８】
一方、１，５−ＡＧ脱水素酵素を用いて測定する方法は、この酵素が１，５−ＡＧに対する特異性が高くグルコース消化の負荷が少なくて済むこと、また、電子キャリアー非存在下において１，５−ＡＧに作用し直接還元性発色剤を還元させることから、簡便な方法ではあるが、１，５−ＡＧ脱水素酵素自体の安定性が十分とは言えず、実用的な自動分析装置用の１，５−ＡＧ測定試薬や１，５−ＡＧ測定センサーを開発することはできず、酵素の安定性向上が実用化上の課題であった。【０００９】
本発明の目的は、１，５−ＡＧに特異的に作用するとともに、安定性に優れた新規な１，５−ＡＧ脱水素酵素及びその製造法を提供し、臨床検体の１，５−ＡＧ測定に応用可能な測定法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従来の１，５−ＡＧ脱水素酵素は、補酵素としてＮＡＤ（Ｐ）を要求したり、熱に対する安定性が十分ではなく実用上の応用は困難であった。一方、これに対して特許文献３記載のシュードモナス属細菌由来の１，５−ＡＧ脱水素酵素は、補酵素非依存性であるため、改変により耐熱性を付与し保存安定性を高めれば１，５−ＡＧの臨床上の測定法に応用が可能と考え、主に該酵素について検討した。すなわち、上記課題を解決するため本発明者等は鋭意検討し、特許文献３記載の１，５−ＡＧ脱水素酵素生産菌であるシュードモナス  エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＮＫ−８５００１（独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター寄託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−０１０３７）から１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードする遺伝子を取得し、該遺伝子にランダム変異導入法等を行い、変異遺伝子ライブラリーを作製し、該ライブラリーから耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素を産生する変異株を取得し、更に酵素の保存安定性を高める為に耐熱性変異を重ね合わせることによる１，５−ＡＧ脱水素酵素の改変を行った結果、元の酵素のアミノ酸配列にアミノ酸の置換を導入することで保存安定性が著しく向上することを見出し、本発明を完成するに至った。【００１１】
即ち、本発明は以下の［１］乃至［１２］に関する。
［１］．下記の（１）または（２）に示すタンパク質：
（１）配列番号４に示すアミノ酸配列において、４番目のアミノ酸残基がグリシン残基からアラニン残基に、６番目のアミノ酸残基がグルタミン残基からヒスチジン残基に、１４番目のアミノ酸残基がセリン残基からスレオニン残基に、３７番目のアミノ酸残基がアラニン残基からスレオニン残基またはアルギニン残基に、５０番目のアミノ酸残基がプロリン残基からグルタミン残基に、６７番目のアミノ酸残基がグルタミン酸残基からグリシン残基に、８０番目のアミノ酸残基がアスパラギン残基からチロシン残基に、９３番目のアミノ酸残基がバリン残基からメチオニン残基に、１５６番目のアミノ酸残基がアルギニン残基からプロリン残基に、１６４番目のアミノ酸残基がロイシン残基からメチオニン残基に、２０２番目のアミノ酸残基がアスパラギン残基からアスパラギン酸残基に、２３５番目のアミノ酸残基がスレオニン残基からアラニン残基に、３４８番目のアミノ酸残基がアスパラギン残基からチロシン残基に、３６２番目のアミノ酸残基がグリシン残基からアルギニン残基に、および４７３番目のバリン残基がアラニン残基に変化した変異のうち、少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）上記（１）に記載の少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列において、変異したアミノ酸残基以外のアミノ酸残基の１乃至複数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されたアミノ酸配列からなり、且つ１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素活性を有する耐熱性のタンパク質。
［２］．４５℃、１０分の加熱で、８％以上の１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素活性を保持する上記［１］に記載のタンパク質。
［３］．以下のタンパク質から選ばれる上記［１］または［２］に記載のタンパク質：
１）上記［１］の（１）に記載の変異の内、６番目の変異以外の全ての変異（但し３７番目のアミノ酸残基はアルギニン残基への変異である）を有する配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；
２）配列番号１で示されるアミノ酸の１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質；
３）配列番号１で示されるアミノ酸の１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質；
４）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質；
５）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質；
６）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質；
７）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質；
８）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質；
９）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列；
１０）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３７番目のアルギニン残基がスレオニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質；
１１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の４番目のアラニン残基がグリシン残基であり、３７番目のアルギニン残基がスレオニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質；
１２）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３７番目のアルギニン残基がスレオニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、２３５番目のアラニン残基がスレオニン残基であり、３４８番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質；
１３）配列番号１で示されるアミノ酸配列の４番目のアラニン残基がグリシン残基であり、３７番目のアルギニン残基がスレオニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、３４８番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質；
１４）配列番号１で示されるアミノ酸配列の４番目のアラニン残基がグリシン残基であり、１４番目のスレオニン残基がセリン残基であり、３７番目のアルギニン残基がスレオニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、２３５番目のアラニン残基がスレオニン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質；
１５）配列番号１で示されるアミノ酸配列の４番目のアラニン残基がグリシン残基であり、３７番目のアルギニン残基がスレオニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、２３５番目のアラニン残基がスレオニン残基であり、３４８番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質；
１６）配列番号１で示されるアミノ酸配列の４番目のアラニン残基がグリシン残基であり、１４番目のスレオニン残基がセリン残基であり、３７番目のアルギニン残基がスレオニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、２３５番目のアラニン残基がスレオニン残基であり、３４８番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質；
１７）配列番号１で示されるアミノ酸配列の４番目のアラニン残基がグリシン残基であり、１４番目のスレオニン残基がセリン残基であり、３７番目のアルギニン残基がスレオニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、９３番目のメチオニン残基がバリン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、２３５番目のアラニン残基がスレオニン残基であり、３４８番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質；
１８）配列番号１で示されるアミノ酸配列の４番目のアラニン残基がグリシン残基であり、１４番目のスレオニン残基がセリン残基であり、３７番目のアルギニン残基がスレオニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、９３番目のメチオニン残基がバリン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、２３５番目のアラニン残基がスレオニン残基であり、３４８番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、３６２番目のアルギニン残基がグリシン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質；
１９）配列番号１で示されるアミノ酸配列の４番目のアラニン残基がグリシン残基であり、１４番目のスレオニン残基がセリン残基であり、３７番目のアルギニン残基がスレオニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、９３番目のメチオニン残基がバリン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、１６４番目のメチオニン残基がロイシン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、２３５番目のアラニン残基がスレオニン残基であり、３４８番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質；
２０）配列番号１で示されるアミノ酸配列の４番目のアラニン残基がグリシン残基であり、６番目のグルタミン残基がヒスチジン残基であり、１４番目のスレオニン残基がセリン残基であり、３７番目のアルギニン残基がスレオニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、９３番目のメチオニン残基がバリン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、１６４番目のメチオニン残基がロイシン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、２３５番目のアラニン残基がスレオニン残基であり、３４８番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、３６２番目のアルギニン残基がグリシン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質；および
２１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の４番目のアラニン残基がグリシン残基であり、１４番目のスレオニン残基がセリン残基であり、３７番目のアルギニン残基がアラニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、９３番目のメチオニン残基がバリン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、１６４番目のメチオニン残基がロイシン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、２３５番目のアラニン残基がスレオニン残基であり、３４８番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、３６２番目のアルギニン残基がグリシン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質。
［４］．下記の（１）または（２）に示すＤＮＡからなる遺伝子：
（１）上記［１］から［３］のいずれか記載のタンパク質をコードするＤＮＡ；
（２）上記［１］から［３］のいずれか記載のタンパク質をコードするＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素活性を有する耐熱性のタンパク質をコードするＤＮＡ。
［５］．上記［４］に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
［６］．上記［５］に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
［７］．形質転換体の宿主が大腸菌である上記［６］に記載の形質転換体。
［８］．上記［６］または［７］に記載の形質転換体を培養し、培養物から上記［１］から［３］のいずれか記載のタンパク質を採取することを含む耐熱性１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素の製造法。
［９］．上記［１］から［３］のいずれか記載の１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素活性を有する耐熱性のタンパク質を用いた１，５−アンヒドログルシトールの測定法。
［１０］．１，５−アンヒドログルシトールの測定を、アルブミンを共存させて行う上記［９］に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定法。
［１１］．測定法が、レドックスメディエーターとしてフェノチアジン系化合物を用い、参照電極及び／又は対極として銀塩化銀電極を用いる電気化学的測定法である上記［９］に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定法。
［１２］．上記［１］から［３］のいずれか記載のタンパク質を含む、１，５−アンヒドログルシトール測定用キット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素は、１，５−ＡＧに特異的に作用し、耐熱性を有することから優れた保存安定性を示し、１，５−ＡＧの定量試薬や酵素センサーを製品化して簡便で実用的な１，５−ＡＧ測定を実施する上で極めて有用な酵素である。また、耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素を使用する１，５−ＡＧの測定法は高感度な安定した方法となり実用化が可能となる。更に、耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素を含有する１，５−ＡＧ測定用キットは保存安定性が高まり臨床現場で使用可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．０からＶｅｒ．１２．０を作製するまでの系統図を表すフローチャートである。
【図２】図２は、実施例１で構築したプラスミドｐＴｒｃ−ＰＳ１５ＤＨを示す図である。本プラスミド中に示す１，５−ＡＧ脱水素酵素遺伝子は、１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．０をコードする。なお、プラスミド中の１，５−ＡＧ脱水素酵素遺伝子において１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．１．０〜Ｖｅｒ．１２．０をそれぞれコードする場合は、ｐＴｒｃ−ＰＳ１５ＤＨ（Ｖｅｒ．１．０）〜ｐＴｒｃ−ＰＳ１５ＤＨ（Ｖｅｒ．１２．０）を、それぞれ示す。
【図３−１】図３−１は、それぞれの耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．１．０〜Ｖｅｒ．５．１の変異分布を示す図である。
【図３−２】図３−２は、それぞれの耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．６．０〜Ｖｅｒ．９．０の変異分布を示す図である。
【図３−３】図３−３は、それぞれの耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．１０．０〜Ｖｅｒ．１２．０の変異分布を示す図である。
【図４】図４は、５０例の血清検体について、本発明の吸光度法（耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素にＶｅｒ．７．１使用）による測定方法を用いた１，５−ＡＧ測定値と市販の１，５−ＡＧ測定試薬である「ラナ１，５ＡＧオートリキッド」による１，５−ＡＧ測定値をプロットした図である。
【図５】図５は、５０例の血清検体について、本発明の吸光度法（耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素にＶｅｒ．１０．０使用）による測定方法を用いた１，５−ＡＧ測定値と「ラナ１，５ＡＧオートリキッド」による１，５−ＡＧ測定値をプロットした図である。
【図６】図６は、本発明の１，５−ＡＧの電気化学的測定に用いる電極を簡略化して示した図である。
【図７】図７は、１，５−ＡＧの電気化学的測定における電荷量と１，５−ＡＧ量との検量線を示す図である。
【図８】図８は、２３例の全血検体における本発明の電気化学的測定法を用いた１，５−ＡＧ測定値と「ラナ１，５ＡＧオートリキッド」による血清検体における１，５−ＡＧ測定値をプロットした図である。
【図９】図９は、耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．２．０、３．２及び１０．０を使用して作製したセンサチップを５５℃に５３日間保存した時に得られた電気化学的応答を縦軸に相対的にプロットし保存安定性を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素は、下記の（１）または（２）に示すタンパク質である：
（１）配列番号４に示すアミノ酸配列において、４番目のアミノ酸残基がグリシン残基からアラニン残基に、６番目のアミノ酸残基がグルタミン残基からヒスチジン残基に、１４番目のアミノ酸残基がセリン残基からスレオニン残基に、３７番目のアミノ酸残基がアラニン残基からスレオニン残基またはアルギニン残基に、５０番目のアミノ酸残基がプロリン残基からグルタミン残基に、６７番目のアミノ酸残基がグルタミン酸残基からグリシン残基に、８０番目のアミノ酸残基がアスパラギン残基からチロシン残基に、９３番目のアミノ酸残基がバリン残基からメチオニン残基に、１５６番目のアミノ酸残基がアルギニン残基からプロリン残基に、１６４番目のアミノ酸残基がロイシン残基からメチオニン残基に、２０２番目のアミノ酸残基がアスパラギン残基からアスパラギン酸残基に、２３５番目のアミノ酸残基がスレオニン残基からアラニン残基に、３４８番目のアミノ酸残基がアスパラギン残基からチロシン残基に、３６２番目のアミノ酸残基がグリシン残基からアルギニン残基に、および４７３番目のバリン残基がアラニン残基に変化した変異のうち、少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）上記（１）に記載の少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列において、変異したアミノ酸残基以外のアミノ酸残基の１乃至複数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されたアミノ酸配列からなり、且つ１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素活性を有する耐熱性のタンパク質。
ここで、配列番号４に示すアミノ酸配列は、特許文献３記載の１，５−ＡＧ脱水素酵素生産菌であるシュードモナス  エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＮＫ−８５００１（独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター寄託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−０１０３７）から得られる１，５−ＡＧ脱水素酵素のアミノ酸配列に相当する。そして、本発明の耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素は、上記（１）に記載される通り、配列番号４に示すアミノ酸配列において、４番目のグリシン残基からアラニン残基への変異、６番目のアミノ酸残基がグルタミン残基からヒスチジン残基への変異、１４番目のセリン残基からスレオニン残基への変異、３７番目のアラニン残基からスレオニン残基またはアルギニン残基への変異、５０番目のプロリン残基からグルタミン残基への変異、６７番目のグルタミン酸残基からグリシン残基への変異、８０番目のアスパラギン残基からチロシン残基への変異、９３番目のバリン残基からメチオニン残基への変異、１５６番目のアルギニン残基からプロリン残基への変異、１６４番目のロイシン残基からメチオニン残基への変異、２０２番目のアスパラギン残基からアスパラギン酸残基への変異、２３５番目のスレオニン残基からアラニン残基への変異、３４８番目のアスパラギン残基からチロシン残基への変異、３６２番目のグリシン残基からアルギニン残基への変異、および４７３番目のバリン残基からアラニン残基への変異のうち、少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列からなるタンパク質に相当する。
更に、本発明の耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素は、上記（２）に記載される通り、上記（１）に記載の少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列において、変異したアミノ酸残基以外のアミノ酸残基の１乃至複数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されたアミノ酸配列からなり、且つ１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素活性を有する耐熱性のタンパク質に相当する。このようなタンパク質としては、好ましくは１〜２０個程度、特に好ましくは２〜１０個程度のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されたアミノ酸配列からなり、且つ１，５−ＡＧ脱水素酵素活性を有する耐熱性のタンパク質が挙げられる。
【００１５】
本発明において耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素若しくは１，５−ＡＧ脱水素酵素活性を有する耐熱性のタンパク質とは、４５℃１０分の加熱で８％以上の１，５−ＡＧ脱水素酵素活性を保持するもの、好ましくは４５℃１０分の加熱で３０％以上の活性を保持するもの、より好ましくは５０℃１０分の加熱で５０％以上の活性を保持するもの、更に好ましくは５５℃１０分の加熱で６０％以上の活性を保持するもの、より更に好ましくは６０℃１０分の加熱で７０％以上の活性を保持するものである。
【００１６】
本発明の耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素としては、例えば、後記の図３−１、図３−２、図３−３に示すように、以下のタンパク質が好ましい：
１）上記（１）に記載の変異の内、６番目の変異以外の全ての変異（但し３７番目のアミノ酸残基はアルギニン残基への変異である）を有する配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質（以後、Ｖｅｒ．１２．０ということがある）；
２）配列番号１で示されるアミノ酸の１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質（以後、Ｖｅｒ．１１．１ということがある）；
３）配列番号１で示されるアミノ酸の１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質（以後、Ｖｅｒ．１１．０ということがある）；
４）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質（以後、Ｖｅｒ．１０．０ということがある）；
５）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質（以後、Ｖｅｒ．９．０ということがある）；
６）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質（以後、Ｖｅｒ．８．４ということがある）；
７）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質（以後、Ｖｅｒ．８．２ということがある）；
８）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質（以後、Ｖｅｒ．８．１ということがある）；
９）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列（以後、Ｖｅｒ．８．０ということがある）；
１０）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３７番目のアルギニン残基がスレオニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質（以後、Ｖｅｒ．７．１ということがある）；
１１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の４番目のアラニン残基がグリシン残基であり、３７番目のアルギニン残基がスレオニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質（以後、Ｖｅｒ．７．０ということがある）；
１２）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３７番目のアルギニン残基がスレオニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、２３５番目のアラニン残基がスレオニン残基であり、３４８番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質（以後、Ｖｅｒ．６．１ということがある）；
１３）配列番号１で示されるアミノ酸配列の４番目のアラニン残基がグリシン残基であり、３７番目のアルギニン残基がスレオニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、３４８番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質（以後、Ｖｅｒ．６．０ということがある）；
１４）配列番号１で示されるアミノ酸配列の４番目のアラニン残基がグリシン残基であり、１４番目のスレオニン残基がセリン残基であり、３７番目のアルギニン残基がスレオニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、２３５番目のアラニン残基がスレオニン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質（以後、Ｖｅｒ．５．１ということがある）；
１５）配列番号１で示されるアミノ酸配列の４番目のアラニン残基がグリシン残基であり、３７番目のアルギニン残基がスレオニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、２３５番目のアラニン残基がスレオニン残基であり、３４８番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質（以後、Ｖｅｒ．５．０ということがある）；
１６）配列番号１で示されるアミノ酸配列の４番目のアラニン残基がグリシン残基であり、１４番目のスレオニン残基がセリン残基であり、３７番目のアルギニン残基がスレオニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、２３５番目のアラニン残基がスレオニン残基であり、３４８番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質（以後、Ｖｅｒ．４．０ということがある）；
１７）配列番号１で示されるアミノ酸配列の４番目のアラニン残基がグリシン残基であり、１４番目のスレオニン残基がセリン残基であり、３７番目のアルギニン残基がスレオニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、９３番目のメチオニン残基がバリン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、２３５番目のアラニン残基がスレオニン残基であり、３４８番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質（以後、Ｖｅｒ．３．２ということがある）；
１８）配列番号１で示されるアミノ酸配列の４番目のアラニン残基がグリシン残基であり、１４番目のスレオニン残基がセリン残基であり、３７番目のアルギニン残基がスレオニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、９３番目のメチオニン残基がバリン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、２３５番目のアラニン残基がスレオニン残基であり、３４８番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、３６２番目のアルギニン残基がグリシン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質（以後、Ｖｅｒ．３．１ということがある）；
１９）配列番号１で示されるアミノ酸配列の４番目のアラニン残基がグリシン残基であり、１４番目のスレオニン残基がセリン残基であり、３７番目のアルギニン残基がスレオニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、９３番目のメチオニン残基がバリン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、１６４番目のメチオニン残基がロイシン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、２３５番目のアラニン残基がスレオニン残基であり、３４８番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質（以後、Ｖｅｒ．３．０ということがある）；
２０）配列番号１で示されるアミノ酸配列の４番目のアラニン残基がグリシン残基であり、６番目のグルタミン残基がヒスチジン残基であり、１４番目のスレオニン残基がセリン残基であり、３７番目のアルギニン残基がスレオニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、９３番目のメチオニン残基がバリン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、１６４番目のメチオニン残基がロイシン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、２３５番目のアラニン残基がスレオニン残基であり、３４８番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、３６２番目のアルギニン残基がグリシン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質（以後、Ｖｅｒ．２．０ということがある）；および
２１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の４番目のアラニン残基がグリシン残基であり、１４番目のスレオニン残基がセリン残基であり、３７番目のアルギニン残基がアラニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、９３番目のメチオニン残基がバリン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、１６４番目のメチオニン残基がロイシン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、２３５番目のアラニン残基がスレオニン残基であり、３４８番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、３６２番目のアルギニン残基がグリシン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなるタンパク質（以後、Ｖｅｒ．１．０ということがある）。
【００１７】
また、これらの１）から２１）の各アミノ酸配列について、配列番号４に示すアミノ酸配列におけるアミノ酸残基が変異したアミノ酸残基以外のアミノ酸残基の１乃至複数個、好ましくは１〜２０個程度、特に好ましくは２〜１０個程度のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されたアミノ酸配列からなり、且つ１，５−ＡＧ脱水素酵素活性を有する耐熱性のタンパク質も、好ましい耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素として本発明に含まれる。
【００１８】
他方、本発明の１，５−ＡＧ脱水素酵素活性を有する耐熱性のタンパク質として、上記（１）に記載の少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号１に示すアミノ酸配列に基いて定義すれば、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、あるいは配列番号１に示すアミノ酸配列の４番目のアラニン残基、６番目のグルタミン残基、１４番目のスレオニン残基、３７番目のアルギニン残基、５０番目のグルタミン残基、６７番目のグリシン残基、８０番目のチロシン残基、９３番目のメチオニン残基、１５６番目のプロリン残基、１６４番目のメチオニン残基、２０２番目のアスパラギン酸残基、２３５番目のアラニン残基、３４８番目のチロシン残基、３６２番目のアルギニン残基、４７３番目のアラニン残基のうち、少なくとも１つが保持されたアミノ酸配列からなるタンパク質ということができる。また、上記（２）に記載のタンパク質は、保持されたアミノ酸以外の１乃至複数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されたアミノ酸配列からなり、且つ１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素活性を有する耐熱性のタンパク質ということができる。
【００１９】
また、本発明の耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素は、１，５−ＡＧ脱水素酵素活性を阻害しない形で他のタンパク質やペプタイドが、Ｎ末端やＣ末端に通常の方法で融合したものでもよい。ここでいう他のタンパク質やペプタイドには、例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）やヒスチジンタグ（ＨｉｓＴａｇ）などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００２０】
本発明には、上記した耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードするＤＮＡ、上記した耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードするＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ１，５−ＡＧ脱水素酵素活性を有する耐熱性のタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子も含まれる。
本発明の耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードするＤＮＡとしては、例えば、アミノ酸配列番号１で示される耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードする配列番号２で示す塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。ただし、アミノ酸配列をコードする遺伝子であれば特に限定されず、すべての遺伝子が含まれる。
【００２１】
本発明の上記した耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素を得る方法は特に限定されないが、例えば、１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードする遺伝子に変異を導入してスクリーニングする方法により可能である。
１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードする遺伝子に変異を導入するとは、基となる耐熱性を有しない１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードする遺伝子の塩基配列中の１〜１０個程度の塩基を他の塩基に置換等することにより１，５−ＡＧ脱水素酵素に耐熱性を付与する操作を施すことであり、これを繰り返すことにより更に耐熱性を向上させることができる。
【００２２】
上記変異を導入する基となる遺伝子としては、１，５−ＡＧ脱水素酵素を有する動物、植物、または微生物由来のいずれの遺伝子でも使用できるが、工業的な生産を考慮すると微生物由来のものが好ましい。該微生物としては、特許文献３記載のシュードモナス属細菌であるシュードモナス  エスピー  ＮＫ−８５００１（独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター寄託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−０１０３７；以後、親株ということがある）が好ましい。
【００２３】
親株の１，５−ＡＧ脱水素酵素のアミノ酸配列としては、配列番号４で示される配列が挙げられ、それをコードする遺伝子としては、例えば、配列番号３で示される塩基配列であるＤＮＡが挙げられるが、１，５−ＡＧ脱水素酵素のアミノ酸配列をコードする遺伝子であれば特に限定されず、すべての遺伝子が含まれる。
【００２４】
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、あるＤＮＡの塩基配列をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法またはプラーク・ハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、所謂特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件である。即ち、例えば相同性が高いＤＮＡ同士、少なくともある塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約８０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは、約０．１〜２倍程度の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウムと１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる。）、温度約６５℃程度のハイブリダイズ条件である。なお、相同性は塩基配列解析ソフト、例えば、ＥＭＢＯＳＳ等により計算される。
【００２５】
また、本発明における遺伝子には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡ及びｃＤＮＡも含むものとする。したがって、本発明の遺伝子にはこれらのＤＮＡ、ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの全てが含まれる。
本発明において相補的な配列とは、１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードする塩基配列に対して塩基対合則（アデニン／チミン、シトシン／グアニン）に従って形成される塩基配列をいう。
【００２６】
以下に、シュードモナス  エスピー  ＮＫ−８５００１株（親株）からの１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードする配列番号３で示される遺伝子の取得方法及びその遺伝子への変異の導入方法について説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２７】
［１］ゲノムＤＮＡの抽出
菌体（微生物）からのゲノムＤＮＡの抽出は公知の方法を適用して行うことができ、また、市販のＤＮＡ抽出キットを用いて簡便に行うことができる。市販のＤＮＡ抽出キットとしては、例えば、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ社製）、ＧＦＸ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｂｌｏｏｄ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）、ＭａｇＰｒｅｐ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）等が挙げられる。
【００２８】
［２］１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードするＤＮＡの調製
シュードモナス  エスピー  ＮＫ−８５００１株の１，５−ＡＧ脱水素酵素のアミノ酸配列は知られていないため、１，５−ＡＧ脱水素酵素と類似の作用を示し、且つアミノ酸配列が公知の酵素と相同性を示す幾つかのアミノ酸配列から、そのアミノ酸配列が保存されている領域を指標にプライマーを設計した。
既にそのアミノ酸配列が知られていたアグロバクテリウム  ツメファシエンス  ＮＴ１１３０株（特開２０００−３１６５７０号参照）の配列から、相同性検索により類似の酵素の数種、少なくも２種以上、好ましくは約３〜５種のアミノ酸配列を対比し、共通の配列または相同性の高い配列部位を選択する。選択したアミノ酸配列、例えば、配列番号５または６で示されるアミノ酸配列等をもとにオリゴヌクレオチドを設計する。設計したオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードするＤＮＡの部分断片を得る。このようなプライマーとしては、例えば、配列番号５または６に示されるアミノ酸配列に相当する塩基配列（配列番号７または８）が挙げられる。ＰＣＲ反応は公知のＰＣＲ増幅装置、例えば、サーマルサイクラー等を利用し得る。ＰＣＲのサイクルは、デナチュレーション→アニーリング→エクステンションを１サイクルとして、約１０〜１００サイクル、好ましくは約２０〜５０サイクル程度行うのが好ましい。
【００２９】
ＰＣＲにて得られたＤＮＡ断片は適当なクローニングベクター、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）へサブクローニングするか、直接アガロースゲル電気泳動後、増幅されたＤＮＡのバンドを切り出して抽出し、この抽出したＤＮＡの塩基配列を決定する。ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒへサブクローニングした場合は、次いで、前記ベクターを、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９菌株等に導入し、該菌株を形質転換体とする。この形質転換された菌株を適当な抗生物質（例、アンピシリン、クロラムフェニコール等）を含む培地で培養し、培養物から菌体を回収する。
回収された菌体から常法、例えばＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）等を用いてプラスミドＤＮＡを抽出する。この抽出されたプラスミドＤＮＡの塩基配列を決定することにより、本発明の１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードするＤＮＡの部分配列を含むＤＮＡ断片を取得することができる。
【００３０】
得られたＤＮＡ断片の塩基配列は、例えば、ジデオキシヌクレオチド酵素法等の公知の方法を応用して決定することができる。また、キャピラリ電気泳動システムを用い、検出には多色蛍光技術を使用する、例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）等を使用して自動的に分析することも可能である。
【００３１】
上記のようにして、１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードするＤＮＡは、その部分配列を含むＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、例えば、配列番号３の塩基配列の１９番目から１４３４番目に相当する塩基配列と決定し得る。次いで、該塩基配列をアミノ酸配列に翻訳して解析する。その結果、翻訳されたアミノ酸配列は、配列番号４に示すアミノ酸の７番目から４８０番目までに相当し得る。
【００３２】
１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードするＤＮＡ全体を含むＤＮＡ断片を得るには、親株の染色体ＤＮＡライブラリーを作製し、上記１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードするＤＮＡの部分断片（例えば、配列番号３の１９番目から１４３４番目に相当する塩基配列；以下同様である。）をプローブとするサザンハイブリダイゼーションにより、１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードするＤＮＡを含む染色体ＤＮＡを単離する方法が挙げられる。
【００３３】
上記の親株より抽出した染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えば、ＨｉｎｄＩＩＩ或いはＮｃｏＩ等を用いて分解し、アガロースゲルによる電気泳動後、この断片をナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋、アマシャム社製）に移し取り、前記の１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードするＤＮＡの部分断片をプローブとして用いたサザンハイブリダイゼーションを行う。
上記操作によって、１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードするＤＮＡの部分断片を含むシュードモナス属菌、例えば、シュードモナス  エスピー  ＮＫ−８５００１株の染色体ＤＮＡ制限酵素断片が７ｋｂ以内であれば、この制限酵素断片のセルフライゲーションを行う。このようにして１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードするＤＮＡの部分断片を含む環状ＤＮＡを取得することができる。
【００３４】
次に、上記にて取得した環状ＤＮＡを鋳型とし、前記にて決定された１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードするＤＮＡの部分断片をもとに設計されたプライマーを用いてインバースＰＣＲを行う。このようなプライマーとして、例えば、配列番号３の８１〜１０２番目及び１２８６〜１３０７番目に示される塩基配列に相当する部位を選び、その塩基配列またはその相補配列、例えば、配列番号９または１０を設計することができる。
【００３５】
上記インバースＰＣＲにて得られたＤＮＡ断片は１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードするＤＮＡの両末端側を含む断片である。この断片をアガロースゲル電気泳動の後、ゲルから切り出して抽出し直接塩基配列を決定するか、適当なクローニングベクター、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）へサブクローニングし、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、このプラスミドにより挿入されたＤＮＡの塩基配列を決定することにより、基となる耐熱性を有しない、シュードモナス  エスピー  ＮＫ−８５００１株（親株）からの１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードするＤＮＡを決定することができる。
【００３６】
上記サザンハイブリダイゼーションによりハイブリダイズした１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードするＤＮＡを含む制限酵素切断断片としては、シュードモナス  エスピー  ＮＫ−８５００１株染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断して得られる大きさ約４ｋｂのＤＮＡ断片、或いは、制限酵素ＮｃｏＩで切断して得られる大きさ約５ｋｂのＤＮＡ断片を挙げることができる。このＤＮＡ断片の塩基配列を決定したところ、オープンリーディングフレームの存在が確認され、その構造遺伝子領域は配列表の配列番号１１に示すアミノ酸配列中のアミノ酸番号１〜４９７の４９７個のアミノ酸配列をコードする１４９１塩基対から構成されることがわかった。
【００３７】
［３］組換えＤＮＡの調製
次に、配列番号１１で示される１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードする遺伝子のオープンリーディングフレームのＮ末端及びＣ末端配列の塩基配列をもとにオリゴヌクレオチドを設計する。設計したオリゴヌクレオチドをプライマーとして、上記で抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードするＤＮＡを得る。このようなプライマーとしては、例えば、配列番号１２または１３の塩基配列で示されるプライマーが挙げられる。配列番号１２の塩基配列で示されるプライマーは１，５−ＡＧ脱水素酵素のＮ末端配列の上流に制限酵素ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩの認識配列を、配列番号１３の塩基配列で示されるプライマーは１，５−ＡＧ脱水素酵素のＣ末端配列の下流に制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列をそれぞれ追加したものである。なお、前記認識配列は前記に限定されず、後記するベクターが有するマルチクローニング部位に含まれる制限酵素の認識配列との関係から適宜選択するのが好ましい。
【００３８】
ＰＣＲによって得られたＤＮＡ断片を制限酵素、例えば、ＥｃｏＲＩと制限酵素ＢａｍＨＩ等で処理し、同じく両制限酵素で処理した発現ベクターと連結させることにより発現ベクターを得ることができる。該発現ベクターを公知の方法で、例えば、大腸菌等の微生物に導入し上記遺伝子のクローニングを行ない得る。
【００３９】
大腸菌等の微生物への遺伝子の導入及び該遺伝子の発現は、通常の遺伝子工学実験の方法により行えばよい。大腸菌等の種々の微生物のベクターの情報や外来遺伝子の導入・発現法は、多くの実験書（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．Ｗ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載されているので、それらに従ってベクターの選択、遺伝子の導入、発現を行うことができる。
【００４０】
続いて、耐熱性を有する１，５−ＡＧ脱水素酵素を得るための方法を後記の実施例の方法を中心に説明するが、これらの方法に限定されるものではない。
基となる耐熱性を有しない１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードする遺伝子への変異の導入について説明する。
クローニングされた親株由来の該遺伝子を市販の変異導入用キット等を用いて処理すればよい。即ち、１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードする遺伝子が挿入されたベクターを用いて、変異導入用キットを該キットのプロトコール等に従い実施することにより、１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードする遺伝子に非常に高い頻度でランダムに変異が導入され、同時に該変異した遺伝子（以下、変異遺伝子という。）がＰＣＲにより増幅され得る。このような変異導入用キットとしては、例えば、Ｍｕｔａｚｙｍｅ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含むＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒ（登録商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、Ｍｕｔａｎ（登録商標）−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ（タカラバイオ社製）またはＤｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＰＣＲランダム突然変異誘発キット（ＢＤバイオサイエンス社製）等が挙げられるが、これに限定されない。
また、基となる耐熱性を有しない１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードする遺伝子へ部位特異的変異を導入するために、例えば、特定の部位のアミノ酸残基が置換された変異を導入するために、あるいは特定の部位が欠失した変異を導入するために、それらの変異を有するプライマーを用いてＰＣＲにより増幅することにより、部位特異的変異を導入することができる。また、異なる変異を有する１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードする遺伝子を含む２つのプラスミドＤＮＡを繋ぎ合わせることにより、より多くの変異が導入された遺伝子を得ることができる。また、変異を有する１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードする遺伝子をＰＣＲで増幅する際に、異なる変異を有するプライマーを用いて増幅することにより、更に、変異を導入することもできる。
【００４１】
変異導入用キットにより遺伝子に変異が導入され増幅された変異遺伝子のＰＣＲ産物を、ＤＮＡ精製用キットを用いて精製するのが好ましい。該精製用キットとしては、例えばＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）、ＳｐｉｎＣｌｅａｎ（登録商標）ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｂｉｏｔｅｃｈ社製）、ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）ＰＣＲ産物クリーンアップキット（パーキンエルマー社製）、ＪＥＴＦＬＥＸ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｏｍｅｄ社製）、ＧＦＸ  ９６  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、ＡｕｔｏＳｅｑ  Ｇ−５０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等が挙げられるが、これに限定されない。
精製した変異遺伝子のＰＣＲ産物を前記した二種類の制限酵素、例えば、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ等で切断した後、アガロースゲルからＤＮＡの精製を行うのが好ましい。該精製は市販キットを使用することができ、例えば、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）またはＳ．Ｎ．Ｐ．ＵＶ−Ｆｒｅｅ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を使用し得るが、これらに限定されない。精製された変異遺伝子のＰＣＲ産物は、適当な発現用ベクターに挿入し宿主を形質転換し、変異遺伝子ライブラリーを構築し得る。
【００４２】
発現用ベクターとしては、例えば、細菌プラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ１６ｂ、ｐＥＴ２１ｄ（＋）、ｐＥＴ３２ａ（＋）、ｐＣＩＴＥ４ａ、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３、ｐＭＡＬ−ｐ２、ｐＭＡＬ−ｃ２、ｐＢｒｉｄｇｅ  Ｖｅｃｔｏ、ｐＫＦ１８ｋ  ＤＮＡ、ｐＫＦ１９ｋ  ＤＮＡ、ｐＴｒｃ９９Ａ（アマシャムバイオサイエンス社製）、ｐＳＰＯＲＴ  １、Ｃｈａｒｍｏｍｉｄ  ９−３６  ＤＮＡ、ｐＥＵ−ＤＦＲ、ｐＩＶＥＸ  ２．３−ＭＣＳ、ｐＩＶＥＸ  ２．４ｃ、ｐＩＶＥＸ  ２．４ｂ  Ｎｄｅ、ｐＩＶＥＸ  ２．４ａ等）；ファージＤＮＡ（ランダムファージ等）；酵母プラスミド（ｐＧ−１等）；哺乳類細胞用のベクターとしてのバキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノアイルス等のウイルスＤＮＡ；ＳＶ４０とその誘導体等が挙げられ、宿主において複製可能である限り他のいかなるベクターも用いることができる。
また、宿主細胞内で外来タンパク質を安定化且つ可溶化させて発現するために用いられるシャペロンをコードする遺伝子が組み込まれたベクター（例えば、ｐＧ−ＫＪＥ８、ｐＧｒｏ７、ｐＫＪＥ７、ｐＧ−Ｔｆ２、ｐＴｆ１６等；いずれもタカラバイオ社製）を、宿主内に共存させることもできる。
【００４３】
ベクターには、例えば、複製開始点、選択マーカー、プロモーターを含み、必要に応じてエンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を含んでもよい。ベクターは、種々の制限酵素部位をその内部にもつポリリンカーを含んでいるか、または単一の制限酵素部位を含んでいることが望ましい。制限酵素部位としては、例えば、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩサイト、ＮｃｏＩサイト、ＳａｌＩサイト、ＫｐｎＩサイトまたはＨｉｎｄＩＩＩサイト等が挙げられる。これら制限酵素サイトは、各々制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、ＮｃｏＩ、ＳａｌＩ、ＫｐｎＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ等で切断され得る。
ベクターへの遺伝子導入は公知の手段を適用して行うことができる。即ち、ベクター中の特定の制限酵素部位（例えば、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ等）を特定の制限酵素（例えば、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ等）によって切断し、その切断部位に本発明の遺伝子を挿入するのが好ましい。さらに用いるベクターによってはＮ端、もしくはＣ端、あるいはその両方に指標となるタンパク質、たとえばＧＳＴ、ＨｉｓＴａｇなど融合した形で本発明の耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素を産生する形で遺伝子導入することも出来る。例えば、上記ｐＥＴ１６ｂを発現ベクターに使った場合には特定の蛋白分解酵素で分解切除できるＨｉｓＴａｇがＮ端に融合した形で本発明の１，５−ＡＧ脱水素酵素を産生することができる場合がある。このようにして本発明の遺伝子を含む組換えベクターが調製される。
【００４４】
［４］形質転換体の創製
宿主としては、例えば、大腸菌（例えば、大腸菌ＪＭ１０９菌株、ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株等）、コリネバクテリウム属菌、バチルス属菌、ストレプトミセス属の放線菌、枯草菌等の細菌；例えば、アスペルギルス属菌株等の真菌細胞；例えば、パン酵母、メタノール資化性酵母等の酵母細胞；例えば、ドロソフィランＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞；例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、３Ｔ３、Ｃ１２７等のヒト培養細胞を含む哺乳類細胞；あるいはこれらのコンピテントセル等が挙げられ、好ましくは大腸菌のコンピテントセルである。
【００４５】
形質転換は、例えば、塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション法、電気穿孔法等の方法で行うことができる。即ち、例えば、上述の変異遺伝子が挿入された発現ベクターと大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセルと混合することにより、形質転換体である微生物を得ることができる。
【００４６】
［５］形質転換体の培養
上記の変異遺伝子が挿入された発現ベクターにて形質転換された微生物（以下、単に形質転換微生物という。）は下記する微生物培養培地等で、培養温度約２０〜４０℃、培養時間約１〜７日間、培地のｐＨ約５．０〜８．０程度で培養されることが好ましい。
【００４７】
［６］耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素を産生する変異株の選択法
耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素を産生する変異株を上記の遺伝子ライブラリーから選択するためのスクリーニングは、例えば、９６穴のディープウェルプレート等を用いて、少量の培養で迅速に行うことができる。即ち、前記変異遺伝子ライブラリーのコロニーを、例えば、コロニーピッカー等により選抜し、該コロニーの菌体（微生物）を、例えば、９６穴のプレートを用いて約０．１〜１．０ｍＬ、好ましくは約０．５ｍＬの微生物培養培地等で培養を行ない菌体を得る。この菌体を約５０〜７０℃、約１０〜１２０分、好ましくは約３０分間加熱処理を行なう。この処理菌体と１，５−ＡＧと発色基質を含む反応液を室温で約１０〜２４０分間反応を行なわせ、発色基質の発色や退色等の変化により１，５−ＡＧ脱水素酵素の残存を確認することができる。かくして、加熱処理後も１，５−ＡＧ脱水素酵素活性が残存する耐熱性の１，５−ＡＧ脱水素酵素変異体を得ることができる。
【００４８】
［７］耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素活性の測定
１，５−ＡＧ脱水素酵素活性の測定は、例えば、１，５−ＡＧあるいはＬ−ソルボースを含む反応液に、発色基質と電子キャリアーの存在下、形質転換微生物から調製した無細胞抽出液を添加し、好ましくは４〜５０℃、特に好ましくは２５〜４０℃で、好ましくは１分〜３時間、より好ましくは１〜３０分間、特に好ましくは１〜１０分間インキュベートしつつ吸光度の変化を計測することにより行うことができる。
因みに、１，５−ＡＧ脱水素酵素の基質として、１，５−ＡＧの代わりにＬ−ソルボースを用いることができるのは、１，５−ＡＧ脱水素酵素の基質特異性が１，５−ＡＧとＬ−ソルボースで同程度であることによる。なお、臨床検体中にはＬ−ソルボースは含まれておらず、実用上、１，５−ＡＧの測定を妨害することはない。
【００４９】
無細胞抽出液としては、形質転換微生物を、例えば、水媒体中で超音波やガラスビーズ等で破砕した後の１，５−ＡＧ脱水素酵素を含む遠心分離上清等が挙げられる。
変異導入前と変異導入後の無細胞抽出液中の１，５−ＡＧ脱水素酵素活性を４５〜６０℃、１０〜３０分加熱処理する前と後とを比較することにより、変異導入によって耐熱性が向上した１，５−ＡＧ脱水素酵素を確認することができる。
【００５０】
［８］耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードする遺伝子の塩基配列の決定
前記のスクリーニングにより得られた形質転換微生物の菌株を約５０〜２００μｇ／ｍＬ、好ましくは約１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む微生物培養培地（例えば、ＬＢ培地等）で、約２０〜４０℃で約１時間〜４８時間、静置若しくは攪拌下に培養し、その培養液から遠心分離により菌体（微生物）を取得できる。得られた菌体からプラスミドＤＮＡを抽出する。プラスミドＤＮＡの抽出は、公知の方法を応用して行うことができ、また、市販のＤＮＡ抽出キットを用いてプラスミドＤＮＡを簡便に抽出できる。市販のプラスミド抽出キットとしては、例えば、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）等が挙げられる。この抽出されたプラスミドＤＮＡの塩基配列を決定することにより、本発明の耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードする全ＤＮＡを決定することができる。
【００５１】
このようにして耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードするＤＮＡの塩基配列を決定でき、前記の配列番号２で示される塩基配列を含む遺伝子は、親株由来の１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードする遺伝子である配列番号３で示される塩基配列の１１番目のグアニンがシトシン、４０番目のチミンがアデニン、９９番目のチミンがシトシン、１０９番目のグアニンがアデニン、１１０番目のシトシンがグアニン、１１１番目のアデニンがグアニン、１４９番目のシトシンがアデニン、２００番目のアデニンがグアニン、２３８番目のアデニンがチミン、２７７番目のグアニンがアデニン、４６７番目のグアニンがシトシン、４９０番目のシトシンがアデニン、６０４番目のアデニンがグアニン、７０３番目のアデニンがグアニン、１０４２番目のアデニンがチミン、１０８４番目のグアニンがアデニン、１４１８番目のチミンがシトシンに変異した遺伝子である。
【００５２】
次いで該塩基配列をアミノ酸配列に翻訳して解析すると、配列番号１に示す耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素の全アミノ酸配列を決定することができ、配列番号１で示される１，５−ＡＧ脱水素酵素活性を有する耐熱性のタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４で示される親株由来の１，５−ＡＧ脱水素酵素のアミノ酸配列の４番目のアミノ酸残基がグリシン残基からアラニン残基に、１４番目のアミノ酸残基がセリン残基からスレオニン残基に、３７番目のアミノ酸残基がアラニン残基からアルギニン残基に、５０番目のアミノ酸残基がプロリン残基からグルタミン残基に、６７番目のアミノ酸残基がグルタミン酸残基からグリシン残基に、８０番目のアミノ酸残基がアスパラギン残基からチロシン残基に、９３番目のアミノ酸残基がバリン残基からメチオニン残基に、１５６番目のアミノ酸残基がアルギニン残基からプロリン残基に、１６４番目のアミノ酸残基がロイシン残基からメチオニン残基に、２０２番目のアミノ酸残基がアスパラギン残基からアスパラギン酸残基に、２３５番目のアミノ酸残基がスレオニン残基からアラニン残基に、３４８番目のアミノ酸残基がアスパラギン残基からチロシン残基に、３６２番目のアミノ酸残基がグリシン残基からアルギニン残基に、４７３番目のバリン残基がアラニン残基に変化したものである。
【００５３】
次に、変異遺伝子を含む形質転換微生物から耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素の製造法を以下に説明するが、特にこの方法に限定される訳ではない。
【００５４】
［１］形質転換微生物の培養
該微生物の培養培地としては、通常の微生物の培養に使用される培地であれば好ましく用いることができ、例えば、炭素源、窒素源、無機塩類及びその他の栄養物質等を含有する天然培地または合成培地等が挙げられる。
炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、シュクロース、マンノース、マルトース、マンニトール、キシロース、ガラクトース、澱粉、糖蜜、ソルビトールまたはグリセリン等の糖質や糖アルコール；酢酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸またはグルコン酸等の有機酸；エタノールまたはプロパノール等のアルコール類等が挙げられる。また、所望によりノルマルパラフィン等の炭化水素等も用いることができる。炭素源は、１種単独で使用しても２種以上を混合して使用してもよい。
炭素源の培地における濃度は、通常０．１〜１０重量％程度である。
【００５５】
窒素源としては、例えば、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機若しくは有機アンモニウム化合物、硝酸ナトリウムまたは硝酸カリウム等の無機硝酸塩、尿素、アンモニア水等が挙げられる。また、ＮＺ−アミンやアミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用可能である。窒素源は、１種単独で使用しても２種以上を混合して使用してもよい。
窒素源の培地における濃度は使用する窒素化合物によっても異なるが、通常０．１〜１０重量％程度である。
【００５６】
無機塩類としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルトまたは炭酸カルシウム等が挙げられる。無機塩は、１種単独で使用しても２種以上を混合して使用してもよい。
無機塩類の培地における濃度は使用する無機塩によっても異なるが、通常約０．０１〜１．０重量％程度である。
【００５７】
その他の栄養物質としては、例えば、肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物または動植物若しくは微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。
栄養物質の培地における濃度は使用する栄養物質によっても異なるが、通常約０．１〜１０重量％程度である。
培地のｐＨは約５．０〜８．０程度が好ましい。
【００５８】
好ましい微生物培養培地としては、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地；トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、食塩１０ｇ／Ｌ）、ＮＺＹＭ培地、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ、ＳＯＢ培地、２ｘＹＴ培地、ＡＨＣ培地、ｘ１７７６培地、Ｍ９培地、ＹＰＤ培地、ＳＤ培地、ＹＰＡＤ培地またはＳｕｐｅｒ  ｂｒｏｔｈ培地等が挙げられる。また、所望によりビタミン類、抗生物質（例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン等）、遺伝子の発現誘導物質（例えば、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド、アラビノース、テトラサイクリン等）を含んでもよい。培養条件、例えば、温度、培地のｐＨ及び培養時間は、前記耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素の生産量が増加するように適宜選択すればよい。
【００５９】
［２］１，５−ＡＧ脱水素酵素の精製
上記のとおり、前記耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素を発現させた宿主である微生物（例えば、大腸菌ＪＭ１０９菌株等）の菌体は、遠心分離等の操作により培養液から採集することができる。得られた菌体を各種適切な緩衝液に懸濁した後、ソニケーション等の機械的処理やリゾチーム処理等の酵素処理を行い、菌体を破砕或いは溶菌した後、遠心分離等の操作により耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素を含む無細胞抽出液を得ることができる。更に、塩析、各種アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等の精製操作を目的に応じて組合わせて適用し、耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素を精製することができる。
さらに、耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素が他のタンパク質との融合タンパク質の形で該形質転換体の中で生産される場合にはそのタンパク質を指標に耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素を精製することができる。例えば、ＨｉｓＴａｇ融合タンパク質なら、ＨｉｓＧｒａｖｉＴｒａｐ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）などの市販のキットで精製することも出来るし、上記精製方法と組み合わせることで精製度をあげることも出来る。
【００６０】
続いて、本発明の耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素を使用する１，５−ＡＧの測定法について説明する。
［３］１，５−ＡＧの測定法
本発明の１，５−ＡＧの測定法には、血液（全血、血清または血漿）、尿、髄液等の臨床検体を使用することができ、該測定法により該臨床検体中の１，５−ＡＧ濃度を高精度で、正確な測定が可能である。血液中の１，５−ＡＧは血糖のコントロール状態をよく反映するため、本発明の１，５−ＡＧの測定法は糖尿病や食後高血糖の診断に有用である。
【００６１】
本発明の１，５−ＡＧの測定法としては、例えば、還元性発色剤を還元発色させて吸光度を測定し１，５−ＡＧを定量する吸光度法や酸化型のレドックスメディエータを還元型とし電極上で酸化型に戻す時に生ずる電気化学的シグナルを測定して１，５−ＡＧを定量する電気化学的方法等がある。
【００６２】
吸光度法にも種々の方法が考えられるが、本発明の１，５−ＡＧの測定法においては、電子受容体の存在下若しくは非存在下、還元性発色剤を還元発色させる方法を使用することができる。中でも電子受容体の非存在下において、直接、還元性の発色剤を還元発色させる方法が好ましい。還元発色させる発色基質としては、例えば、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ＩＮＴ）、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジイル］−ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド］（ＮＴＢ）、３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジイル］−ビス［２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド］（ＴＢ）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム１ナトリウム塩（ＷＳＴ−１）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム１ナトリウム塩（ＷＳＴ−３）、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）等が挙げられる。好ましくはＷＳＴ−１が挙げられる。
また、電子受容体の存在下に還元性の発色剤を還元して定量する方法の場合に使用する電子受容体としては特に制限はないが、１−メトキシフェナジンメトサルフェート（１−ｍ−ＰＭＳ）やジアホラーゼ等が好ましく、これらを共存させると還元反応を増強でき、測定感度を上げることができる場合がある。
【００６３】
電気化学的方法にも種々の方法が考えられるが、本発明の１，５−ＡＧの測定法においては酸化還元反応に関与する電子の授受の仲立ちを担うレドックスメディエータを使用して測定する方法等を使用することができる。該レドックスメディエータとしては、酸化型メディエータまたは還元型メディエータが挙げられ、酸化型メディエータが好ましく、中でもオスミウム錯体、キノン系化合物、フェロセン系化合物、フェノチアジン系化合物、フェノキサジン系化合物、フェナジン系化合物、インドフェノール系化合物、ジフェニルアミン系化合物がより好ましい。
該オスミウム錯体としては［Ｏｓ（ＩＩＩ）（ビピリジル）２（イミダゾイル）Ｃｌ］Ｃｌ２やそのポリマー体が挙げられる。
該キノン系化合物としてはベンゾキノン、２−メチルベンゾキノン、２，６−ジメチルベンゾキノン、２，６−ジクロロベンゾキノン、２，５−ジヒドロキシベンゾキノン、２−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、２−メチル−１，４−ナフトキノン、２，３−ジメトキシ−５−メチル−１，４−ベンゾキノン、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）やユビキノンが挙げられる。
【００６４】
該フェロセン系化合物としてはフェロセニルＰＥＧ、フェロセニルＴＭＡ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチルフェロセンやフェロセンメタノールが挙げられる。
該フェノチアジン系化合物としてはチオニン、メチレンブルー、メチレングリーン、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７’−ビス（ジメチルアミノ）−フェノチアジンナトリウム塩、トルイジンブルー、アズールＩ、アズールＢ、アズールＡ、アズールＣ、ニューメチレンブルーやベンゾイルロイコメチレンブルーが挙げられる。
該フェノキサジン系化合物としてはメルドラブルーが挙げられる。
該フェナジン系化合物としてはフェナジンメトサルフェート、１−ｍ−ＰＭＳ、サフラニンやフェノサフラニンが挙げられる。
該インドフェノール系化合物としてはＤＣＩＰが挙げられる。
該ジフェニルアミン系化合物としては４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン（ＢＧ）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミンナトリウム塩、Ｎ−メチル−Ｎ−フェニル−１，４−フェニレンジアミン塩酸塩、Ｎ−メチル−Ｎ−（３−メトキシフェニル）−１，４−フェニレンジアミン塩酸塩等が挙げられる。
【００６５】
中でも好ましいレドックスメディエータとしては、チオニンアセテート、チオニンクロリド、メチレンブルー等が挙げられる。
【００６６】
レドックスメディエータとしてはその他に、フェリシアン系化合物（例えば、フェリシアン化カリウム等）、ルテニウム錯体若しくはそのポリマー体、ビピリジン系化合物（例えば、メチルビオローゲン等）、トリフェニルメタン系化合物（例えば、マラカイトグリーンやＴＰＭ−ＰＳ等）、ベンゾチアゾリン系化合物（例えば、２−ヒドラゾノ−２，３−ジヒドロ−３−メチル−６−ベンゾチアゾールやそのスルホン酸塩等）、シアニン系化合物（例えば、ガロシアニン、フタロシアニンやフィコシアニン等）、アゾ系化合物（例えば、マゼンタＪ−３ＧＬ，イエローＣ−Ｙ９やブラックＣ−ＢＫ４等）、ビピリジルアゾ系化合物（例えば、５−Ｂｒ−ＰＳＡＡ，５−Ｂｒ−ＰＡＰＳやＴＡＭＳＭＢ等）、アニリン若しくはその誘導体（例えば、ＤＡＰＳ，ＨＡＬＰＳ，ＡＤＰＳ，ＡＬＰＳ，ＴＯＯＳ，ＡＬＯＳ等）、ポリアニリン若しくはその誘導体、フェノール系化合物（例えば、ｐ−アミノフェノール等）、フェニレンジアミン系化合物（例えば、バリアミンブルーＢや２，３，５，６−テトラメチル−ｐ−フェニレンジアミン等）、ローダミン系化合物（例えば、ローダミンＢ等）、キサンテン系化合物（例えば、ピロニンＹ、ピロニンＢやフルオレセインナトリウム等）、イソアロキサジン系化合物（例えば、リボフラビンやＦＡＤ等）、インジゴ系化合物（例えば、インジゴトリスルホン酸やインジゴカーミン等）、フェナントロリン系化合物（例えば、バソクブロインスルホン酸ナトリウムやバソフェナントロリンスルホン酸ナトリウム等）、スルホフタレイン系化合物（例えば、メチルチモルブルー等）、ベンチジン系化合物（例えば、ＴＭＢＺ，ＴＭＢＺ・ＰＳ，ＤＡＢやアニシジンブルー等）、テトラゾリウム系化合物（例えば、ＷＳＴ−１，ＭＴＴ，Ｎｉｔｒｏ−ＴＢやＸＴＴ等）、チトクロムＣやルミクロム、フェレドキシン類、ＥＤＴＡ類、Ｌ−アスコルビン酸、ＦＡＤ、ＮＡＤやＮＡＤＰ等も使用できる。
【００６７】
電気化学的方法で使用する電極としては、例えば、金、白金、カーボン、パラジウムまたは銀、銀塩化銀等の電極が挙げられる。
電極は２電極であっても３電極であってもよいが、２電極の場合は作用極がカーボン、対極が銀塩化銀である電極が好ましく、３電極の場合は作用極と対極がカーボン、参照極が銀塩化銀である電極が好ましい。
測定方法としてはアンペロメトリー法（電流測定方法）、クーロメトリー法（電量測定方法）、電位スイープ法やサイクリックボルタンメトリー法等が挙げられ、中でもアンペロメトリー法あるいはクーロメトリー法が好ましい。
測定電位については−１．０Ｖ〜１．０Ｖの範囲で至適な電位を選択すればよく、生体成分の影響を受けにくい０Ｖ付近の−０．２Ｖ〜０．２Ｖの範囲が好ましい。
【００６８】
１，５−ＡＧはグルコースの１位の位置が還元された化合物であり、グルコースと極めて似た化学構造をしているため、１，５−ＡＧの測定に使用する多くの酵素はグルコースとも反応する。健常者の血中には１，５−ＡＧに比べて２０倍以上と遥かに多量のグルコースが含まれており、１，５−ＡＧを酵素を用いて測定するためにはグルコースを何らかの方法で１，５−ＡＧを測定するための酵素と反応しないように消去または変換しなければならない。また、この変換により生成したグルコース誘導体が、更に１，５−ＡＧを測定するための酵素と反応する場合には、その誘導体も消去または変換しなければならない。
本発明の耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素も後記のように低いながらもグルコースとも反応する酵素であるため、より正確な１，５−ＡＧ測定を行うにはこの工程を組み合わせることが好ましい。
グルコース及び／またはその誘導体を消去、または測定に干渉しない物質へ変換する方法としては、イオン交換樹脂を用いて吸着・除去する方法に代表される方法や酵素的に変換する方法等がある。この両方法を組み合わせて行ってもよいが、酵素的に変換する方法が好ましい。
酵素的に変換する方法としては、例えば、グルコースを酵素的酸化または酵素的リン酸化する方法が挙げられ、好ましくは、ヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼによるグルコースをリン酸化する方法であり、特に好ましくは、例えば、マグネシウムイオン、ＡＴＰ、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）及びピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）の存在下でヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼによって行われる酵素サイクリング法によるグルコースをリン酸化する方法である。
【００６９】
本発明の耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素を用いて１，５−ＡＧを測定する際に、アルブミン等の蛋白を共存させる１，５−ＡＧの測定法も本発明に含まれる。
アルブミンとしてはウシ血清アルブミンが好ましい。アルブミン等の蛋白の共存により、耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素が活性化され、測定感度が上がり、測定セル等への該酵素の吸着が抑制され、その結果、１，５−ＡＧの繰り返し測定が可能となった。
【００７０】
本発明の測定キットには、例えば、検査センター等で使用される多数検体処理のための汎用の自動分析装置用の診断キット、中小病院等でも使用されるＰｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ（ＰＯＣＴ）用の診断キット、ベッドサイドや家庭用の診断キットとして使用することが可能な自己測定用キット等がある。
汎用の自動分析装置用の診断キットは、通常、液状タイプの２試薬（Ｒ１及びＲ２）より構成されており、本発明の測定キットにも適用できる。例えば、Ｒ１は先に述べたようにグルコース等１，５−ＡＧの測定を妨げる成分を測定に影響が出ないように処理する試薬組成物より主に構成され、Ｒ２は本発明の１，５−ＡＧ脱水素酵素を含む試薬組成物より主に構成される。吸光度法であれば、前記の還元性発色剤をＲ１若しくはＲ２の試薬組成物の一つとして組み込めばよい。
ＰＯＣＴ用の診断キットについても同様の原理を更にコンパクトに専用の容器に封入したり、試薬組成物を乾燥したりしたキットとして構成できる。
ベッドサイドや家庭用の自己診断用キットとは、電気化学的測定法である自己血糖測定（ＳＭＢＧ）キットのごとく、前記のレドックスメディエータと本発明の１，５−ＡＧ脱水素酵素を主要な試薬組成物として組み込んだ測定チップに加え、血液採取のための穿刺器具（ランセット）や測定器等から構成できる。
【００７１】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
なお、本発明において配列中、ａはアデニン、ｇはグアニン、ｃはシトシン、ｔはチミンを示す。本明細書において％は特に断らない限り質量％を意味する。
【実施例１】
【００７２】
親株由来の１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードするＤＮＡが増幅発現された形質転換体の作製と該ＤＮＡ高発現の確認
（Ａ）シュードモナス  エスピー  ＮＫ−８５００１の全ＤＮＡの抽出
シュードモナス  エスピー  ＮＫ−８５００１からのゲノムＤＮＡ抽出には、ＰＵＲＥＧＥＮＥ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ社製）を用いた。まず、ポリペプトン１％、酵母エキス０．２％、硫酸マグネシウム７水和物０．１％（ｐＨ７．０）からなる栄養培地２ｍＬにシュードモナス  エスピー  ＮＫ−８５００１を接種して２８℃にて一晩培養し、この培養液を２ｍＬのマイクロチューブに移し、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清を捨て、得られたペレットをキットに添付のＣｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ６００μＬに懸濁した。その後、キットの使用説明書に従い、ＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡは、ＤＮＡ  Ｈｙｄｒａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １００μＬに溶解し、６５℃、１時間熱処理した後、４℃または−２０℃で保存した。尚、２６０ｎｍの吸光度から計算したＤＮＡ濃度は０．３μｇ／μＬであった。【００７３】
（Ｂ）プライマーの選択
１，５−ＡＧ脱水素酵素と同じ作用を示す１，５−ＡＧ脱水素酵素の生産微生物として知られているアグロバクテリウム  ツメファシエンス  ＮＴ１１３０の遺伝子配列を基に、相同性検索を実施し、リゾビウム  エトリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉ）ＣＦＮ４２株（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０３（１０），３８３４−３８３９（２００６））、シノリゾビウム  メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）１０２１株（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９８（１７），９８７７−９８８２（２００１））、ブルセラ  メリテンシス  バイオバー  アボルタス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ  ｂｉｏｖａｒ  Ａｂｏｒｔｕｓ）２３０８株（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，７３（１２），８３５３−８３６１（２００５））の３菌株の類似酵素を選択した。これら４種のアミノ酸配列において保存されている領域を検討し、プライマー部位として共通配列と思われる配列番号５または６のアミノ酸配列をもとに、配列番号７または８に示す塩基配列を設計した。【００７４】
（Ｃ）ＰＣＲ反応
配列番号７または８に示すプライマーを用いて上記（Ａ）にて調製した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なった。ＰＣＲ反応にあたってはパーキンエルマー社製若しくはアプライドバイオシステムズ社のサーマルサイクラーにより、タカラバイオ社製のＬＡ−ＰＣＲキットを用いて下記の条件で行った。
反応液：２ＸＧＣ  ＢｕｆｆｅｒＩ：                    ２５μＬ
ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）：      ８μＬ
鋳型ＤＮＡ（０．３μｇ／μＬ）：            ０．５μＬ
プライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）：        各０．５μＬ
ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）：  ０．５μＬ
蒸留水：                                      １５μＬ【００７５】
ＰＣＲサイクル：デナチュレーション：９４℃、３０秒
アニーリング：      ５０℃、３０秒
エクステンション：  ７２℃、９０秒
以上を１サイクルとし、計３０サイクル行った。
本反応により生成したＤＮＡ断片を１％のアガロースゲルを用いた電気泳動を行って検出したところ、約１４００ｂｐの断片を確認することができた。【００７６】
（Ｄ）増幅断片の塩基配列の決定
（Ｃ）の約１４００ｂｐのバンドをゲルより切り出してＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により精製した。２６０ｎｍの吸光度から計算したＤＮＡ濃度は２２ｎｇ／μＬであった。この精製ＤＮＡの塩基配列の決定を行った結果、配列番号３に示す塩基配列の１９番目から１４３４番目に相当する配列となることが分かり、これに相当するアミノ酸配列は配列番号４に示すアミノ酸配列の７番目から４８０番目に相当する部分となることが明らかとなった。なお、塩基配列の決定にはアプライドバイオシステムズ社製のＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００−Ａｖａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して行った。【００７７】
（Ｅ）ゲノミック・サザンハイブリダイゼーション
（Ａ）にて得られた染色体ＤＮＡ０．９μｇに制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、ＰｓｔＩ、ＮｃｏＩをそれぞれ４０ｕｎｉｔｓ加え、３７℃にて２１時間反応させ完全分解し、アガロースゲル電気泳動に供した後、アガロースゲルをナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋、アマシャム社製）に移しとった。前記にて取得した１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードするＤＮＡの部分断片をアマシャム社製のＧｅｎｅ  Ｉｍａｇｅｓ  ｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅキットを用いてフルオレセイン標識化し、これをプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行った。検出についてはアマシャム社製のＣＤＰ−Ｓｔａｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅを用いた化学発光検出を行った。
その結果、染色体ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ処理した場合約４ｋｂ、ＮｃｏＩ処理した場合約５ｋｂの位置に上記プローブがそれぞれ強くハイブリダイズした。【００７８】
（Ｆ）インバースＰＣＲ
（Ｅ）にて得られた０．９μｇのＨｉｎｄＩＩＩ断片を、１６μＬのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解し、８μＬのＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を添加し、１６℃にて６０分反応（セルフライゲーション）させ、環状ＤＮＡを取得した。この環状ＤＮＡを鋳型として、配列番号９及び１０に示すプライマーを用いてＰＣＲを行った。プライマーの設計は上記（Ｄ）にて決定されたＤＮＡ断片の塩基配列をもとに行った。ＰＣＲ反応にあたってはアプライドバイオシステムズ社製のサーマルサイクラーを用いて下記条件で行った。
反応液：２ＸＧＣ  ＢｕｆｆｅｒＩ：                    ２５μＬ
ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）：      ８μＬ
鋳型ＤＮＡ（０．０４μｇ／μＬ）：              ５μＬ
プライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）：            各１μＬ
ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）：  ０．５μＬ
蒸留水：                                    ９．５μＬ【００７９】
ＰＣＲサイクル：デナチュレーション：９６℃、２０秒
アニーリング：      ６０℃、３０秒
エクステンション：  ７２℃、３００秒
以上を１サイクルとし、計３５サイクル行った。
本反応により生成したＤＮＡ断片を１％のアガロースゲルを用いた電気泳動を行って検出したところ、約３ｋｂｐの断片を確認することができた。【００８０】
（Ｇ）１，５−ＡＧ脱水素酵素全塩基配列の決定
（Ｆ）にて得られたＤＮＡ断片を（Ｄ）と同様の操作でゲルより切り出して、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により精製した。２６０ｎｍの吸光度から計算したＤＮＡ濃度は、９０ｎｇ／μＬであった。
この精製ＤＮＡの塩基配列の決定を行った結果、ＨｉｎｄＩＩＩにて処理された１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片の塩基配列は、配列番号１１に示す塩基配列であることが分かり、このうち１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードする遺伝子配列は、配列番号１１に示す塩基配列の２０１番目から１６９１番目に相当する配列となることが分かった。また、１，５−ＡＧ脱水素酵素のアミノ酸配列は配列番号１１に示す全長４９７個のアミノ酸が繋がったポリペプチド鎖であることが明らかとなった。【００８１】
（Ｈ）１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードする遺伝子の増幅
（Ａ）で取得したシュードモナス  エスピー  ＮＫ−８５００１の染色体ＤＮＡより１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードする遺伝子をＰＣＲ反応により増幅するためプライマーを合成した。即ち、上記（Ｇ）で明らかとなった１，５−ＡＧ脱水素酵素遺伝子のオープンリーディングフレームのＮ末端及びＣ末端部分の塩基配列を利用し制限酵素の認識配列として、Ｎ末端の前にＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩ認識配列を追加した配列番号１２で示すプライマーと、Ｃ末端の後にＢａｍＨＩ認識配列を追加した配列番号１３で示すプライマーを合成した。【００８２】
これらのＤＮＡプライマーを用いて下記ＰＣＲ条件にて１，５−ＡＧ脱水素酵素遺伝子の増幅を行った。
反応液：２ＸＧＣ  ＢｕｆｆｅｒＩ：                    ２５μＬ
ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）：      ８μＬ
鋳型ＤＮＡ（０．３μｇ／μＬ）：                １μＬ
プライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）：        各０．５μＬ
ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）：  ０．５μＬ
蒸留水：                                  １４．５μＬ【００８３】
ＰＣＲサイクル：デナチュレーション：９４℃、４０秒
アニーリング：      ６３℃、３０秒
エクステンション：  ７２℃、１２０秒
以上を１サイクルとし、計３５サイクル行った。
本反応により生成したＤＮＡ断片を１％のアガロースゲルを用いた電気泳動を行って検出したところ、約１５００ｂｐの断片を確認することができた。【００８４】
（Ｉ）組換え１，５−ＡＧ脱水素酵素発現ベクターの作製
（Ｈ）で得られた１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードする遺伝子を、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断して分離し、発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（アマシャムバイオサイエンス社製）に挿入することにより発現させた。即ち、上記（Ｈ）におけるＰＣＲにより増幅された１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードする遺伝子断片を含むＰＣＲ溶液をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により精製し、各々１０Ｕの制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩを用いて３７℃で３時間切断反応を行った。反応後の溶液を１％アガロースゲル電気泳動により分離し、約１５００ｂｐに相当するバンドをゲルより切り出してＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により精製した。【００８５】
次に、１μｇのｐＴｒｃ９９Ａを各１０Ｕの制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩを用いて３７℃で一晩静置し、ｐＴｒｃ９９Ａの制限酵素部位の切断反応を行った。反応後の溶液を１％アガロースゲル電気泳動により切断を確認し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔに（Ｑｉａｇｅｎ社製）より精製し、５０μＬのトリス−塩酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．５）に溶解した。【００８６】
制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断して得た約１５００ｂｐの１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードする遺伝子断片を含む溶液８μＬとＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断して得たｐＴｒｃ９９Ａの溶液８μＬをＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈと混合し、１６℃で３０分間連結反応を行った。反応後の溶液２μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。
形質転換した大腸菌ＪＭ１０９を含む溶液を１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、０．１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）及び０．００４％のＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上に塗布し、３７℃で一晩培養してコロニーを形成させた。それぞれについて白色の陽性コロニーを選択し、３ｍＬの１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含んだＬＢ液体培地に移植し、３７℃で一晩培養した。培養液を遠心分離して集菌後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により約２μｇのプラスミドＤＮＡを精製した。そのうち約０．５μｇのプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断し、１％アガロースゲル電気泳動により約１５００ｂｐに相当する挿入断片の存在を確認した。更に挿入断片の塩基配列をシークエンス反応により確認したところ、変異は認められなかった。この発現プラスミドをｐＴｒｃ−ＰＳ１５ＤＨとした。尚、本発現プラスミドにより翻訳される組換え１，５−ＡＧ脱水素酵素（配列番号４）は、配列番号１１に示されるオリジナルな１，５−ＡＧ脱水素酵素のアミノ酸配列とはＮ末端配列側で異なっている。即ち、オリジナルな１，５−ＡＧ脱水素酵素のアミノ酸配列はＶａｌ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−に対して、組換え１，５−ＡＧ脱水素酵素のアミノ酸配列はＭｅｔ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−である。【００８７】
（Ｊ）組換え１，５−ＡＧ脱水素酵素の大腸菌での発現及び活性測定
上記（Ｉ）で挿入断片が確認されたｐＴｒｃ−ＰＳ１５ＤＨベクターを導入した大腸菌ＪＭ１０９株を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む３ｍＬのＬＢ培地に移植し、２８℃で１４時間培養した。この培養液のうち、０．２ｍＬを１０ｍＬのＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）に接種した。約３時間後、培養液のＯＤ６００が０．４〜０．７に上昇したことを確認後、最終濃度で０．１ｍＭになるように０．１ＭのＩＰＴＧを培地に添加し１，５−ＡＧ脱水素酵素の大腸菌での発現を誘導させた。その培養液を更に、一晩２８℃で培養し、培養液を１００００×ｇ、５分間の遠心分離により細胞を沈殿させ、上清を除いた後、０．８５％のＮａＣｌ水溶液で２回洗浄した。遠心分離により細胞を沈殿させた後、その菌体を１ｍＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５に懸濁し、０．２５％になる様にＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加し、氷中で冷却しながらビーズ衝撃法細胞破砕装置ＭＩＮＩ−ＢＥＡＤＢＥＡＴＥＲ（３０秒×４回、セントラル科学貿易社製）でその菌体を破壊した。２００００×ｇで１０分間遠心分離した後、その上清を粗酵素液として１，５−ＡＧ脱水素酵素活性を調べた。反応液の組成は以下の通りである。尚、１，５−ＡＧ脱水素酵素はＬ−ソルボースも基質とすることから、酵素活性の測定には、１，５−ＡＧの代りに便宜上Ｌ−ソルボースを用いた。【００８８】
反応液組成：
０．１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０              ２００μＬ
１Ｍ  Ｌ−ソルボース                                    ２００μＬ
３ｍＭ  ＤＣＩＰ（２，６−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ
ｉｎｄｏｐｈｅｎｏｌ）（Ｍｅｒｃｋ社製）          ２８μＬ
３ｍＭ  １−ｍ−ＰＭＳ（同仁化学研究所社製）              ４０μＬ
蒸留水                                                  １２２μＬ
粗酵素液                                                  １０μＬ
粗酵素液以外の成分を混合し、３７℃、１０分間保温した後、粗酵素液を反応液に添加し反応を開始する。３７℃に保ったまま１分間における６００ｎｍの吸光度の減少を測定する。【００８９】
酵素活性は次式によって求めることができる。
酵素活性（Ｕ／ｍＬ）＝（Δ６００／ｍｉｎ×０．６（ｍＬ）×粗酵素液の希釈倍率）／（１６．３×０．０１（ｍＬ））
上記の粗酵素液の活性は４．４Ｕ／ｍＬであった。
【実施例２】
【００９０】
耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素の取得
実施例１にて取得した１，５−ＡＧ脱水素酵素をＶｅｒ．０とし、図１に示すとおり変異を導入して耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素（Ｖｅｒ．１．０〜Ｖｅｒ．１２．０）を取得した。【００９１】
［１］ランダム変異導入法による耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素の取得
耐熱性改良のステップを図１及び図３−１、図３−２、図３−３に示す。１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．０からＶｅｒ．１．０、Ｖｅｒ．１．０からＶｅｒ．２．０、Ｖｅｒ．２．０からＶｅｒ．３．０とＶｅｒ．３．１、Ｖｅｒ．４．０からＶｅｒ．５．０とＶｅｒ．５．１、Ｖｅｒ．５．０からＶｅｒ．６．０とＶｅｒ．６．１、Ｖｅｒ．７．１からＶｅｒ．８．１とＶｅｒ．８．２とＶｅｒ．８．４、Ｖｅｒ．８．０からＶｅｒ．９．０、Ｖｅｒ．１０．０からＶｅｒ．１１．０へと耐熱性を改善した酵素を作製する場合、各バージョンの酵素遺伝子からランダム変異導入法により作製した変異ライブラリーを作り、これらの酵素遺伝子を発現させ、その中から耐熱性の向上したものをスクリーニングして取得した。【００９２】
例えば、１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．０からＶｅｒ．１．０を取得する場合は次の様に行った。まず実施例１で作製したｐＴｒｃ−ＰＳ１５ＤＨを用いてＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  ＩＩ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）のプロトコールに従いランダムに変異を導入することにより点変異遺伝子ライブラリーを構築した。このＫｉｔに含まれているＭｕｔａｚｙｍｅ  ＩＩ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは従来のＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅと比べ非常に高い頻度で変異を導入することができ、更に初期のベクターの濃度を制御することにより導入される変異の頻度を制御できる。そこでｐＴｒｃ−ＰＳ１５ＤＨを鋳型としてＰＣＲを行うことにより導入される変異を制御した。このときプライマーはクローニングの時と同様にＮ末端の前にＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩ認識配列を追加した５’プライマー（配列番号１２）とＣ末端の後にＢａｍＨＩ認識配列を追加した３’プライマー（配列番号１３）を用いて行った。変異ＰＣＲの条件は以下の通りである。
変異ＰＣＲ条件：鋳型ＤＮＡ  ２．３μｇ、Ｍｕｔａｚｙｍｅ  ＩＩ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ２．５ｕｎｉｔｓ、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  ＩＩ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔに添付の反応バッファー（１Ｘ）、ｄＮＴＰ  ０．２ｍＭ、５’プライマー（配列番号１２）３２０ｐｍｏｌ／ｍＬ及び３’プライマー（配列番号１３）３２０ｐｍｏｌ／ｍＬの混合物に水を加え、総量５０μＬの溶液を作製し、９６℃で３分間熱処理後、９６℃で１分、６３℃で１分、７２℃で１分４０秒、３０サイクルのプログラムで増幅を行い、その後７２℃で１０分間処理した。増幅反応後の溶液５μＬを１％濃度のアガロースゲル電気泳動を行った結果、目的としていた約１５００ｂｐの１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードするＤＮＡ断片が増幅されていることを確認した。【００９３】
次に、ランダム変異導入法により増幅した変異ＰＣＲ産物を大腸菌ＪＭ１０９に導入し、変異遺伝子ライブラリーを構築した。即ち、変異型１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードする遺伝子を含むＰＣＲ溶液を１％濃度のアガロースゲル電気泳動により分離し、約１５００ｂｐに相当するバンドをゲルより切り出してＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により該バンド部分のＤＮＡを精製し、各々２０ｕｎｉｔｓの制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩを用いて３７℃で一晩切断反応を行った後、フェノール・クロロホルムを用いて該ＤＮＡを抽出し、続いてエタノールを用いて沈殿した後、１２μＬのＴＥバッファーに溶解した。精製したＮｃｏＩとＢａｍＨＩで切断した約１５００ｂｐに相当するＤＮＡ部分のＤＮＡ溶液２μＬと、１μＬのＮｃｏＩとＢａｍＨＩで切断したベクターｐＴｒｃ９９Ａを２μＬのＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）と混合し、１６℃で約３０分間連結反応を行った。連結反応後の溶液１．５μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換させ変異遺伝子ライブラリーを作製した。【００９４】
変異遺伝子ライブラリーのコロニーをコロニーピッカー（ＰＭ−２ｓ、マイクロテック・ニチオン製）によりランダムに約１０１００株を選抜し、一次スクリーニングへ供した。一次スクリーニングは１．２ｍＬ容量の９６穴の角型ディープウェルプレート（ナルジェヌンク社製）を用い、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む５００μＬのＬＢ液体培地に植菌し、９６穴の角型プレート振動機（ＴＩＴＲＡＭＡＸ１００、ＨＥＩＤＯＬＰＨ社製）で一晩培養した（２８℃、９００ｒｐｍ）。９６穴の角型ディープウェルプレートを２０００ｒｐｍで１０分間遠心することにより菌体を分離し、−８０℃で１時間処理した。菌体を解凍後、６０℃で２０分間処理を行った。活性を有する変異酵素の選別は、６０℃処理した菌体に２００μＬの０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む０．１Ｍ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）、３０μＬの６ｍＭ  ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）、５μＬの５０ｍｇ／ｍＬ  １，５−ＡＧを添加し、懸濁することで行った。酵素活性を有するコロニーはＤＣＩＰの青色が透明になる。その結果、１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．０に比べ耐熱性が向上した１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．１．０を保持するコロニーについて、ＤＣＩＰの青色が透明になることが観察された。【００９５】
１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．１．０からＶｅｒ．２．０、Ｖｅｒ．２．０からＶｅｒ．３．０とＶｅｒ．３．１、Ｖｅｒ．４．０からＶｅｒ．５．０とＶｅｒ．５．１、Ｖｅｒ．５．０からＶｅｒ．６．０とＶｅｒ．６．１、Ｖｅｒ．７．１からＶｅｒ．８．１とＶｅｒ．８．２とＶｅｒ．８．４、Ｖｅｒ．８．０からＶｅｒ．９．０、Ｖｅｒ．１０．０からＶｅｒ．１１．０を取得する場合も同様の方法を行った。
なお、１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．１．０からＶｅｒ．２．０を取得する場合は変異ＰＣＲを行う際、鋳型としてｐＴｒｃ−ＰＳ１５ＤＨ（Ｖｅｒ．１．０）を、１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．２．０からＶｅｒ．３．０とＶｅｒ．３．１を取得する場合は変異ＰＣＲを行う際、鋳型として（ｐＴｒｃ−ＰＳ１５ＤＨ（Ｖｅｒ．２．０）を、１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．４．０からＶｅｒ．５．０とＶｅｒ．５．１を取得する場合は変異ＰＣＲを行う際、鋳型としてｐＴｒｃ−ＰＳ１５ＤＨ（Ｖｅｒ．４．０）を、１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．５．０からＶｅｒ．６．０とＶｅｒ．６．１を取得する場合は変異ＰＣＲを行う際、鋳型としてｐＴｒｃ−ＰＳ１５ＤＨ（Ｖｅｒ．５．０）を、１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．７．１からＶｅｒ．８．１とＶｅｒ．８．２とＶｅｒ．８．４を取得する場合は変異ＰＣＲを行う際、鋳型としてｐＴｒｃ−ＰＳ１５ＤＨ（Ｖｅｒ．７．１）を、１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．８．０からＶｅｒ．９．０を取得する場合は変異ＰＣＲを行う際、鋳型としてｐＴｒｃ−ＰＳ１５ＤＨ（Ｖｅｒ．８．０）を、１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．１０．０からＶｅｒ．１１．０を取得する場合は変異ＰＣＲを行う際、鋳型としてｐＴｒｃ−ＰＳ１５ＤＨ（Ｖｅｒ．１０．０）をそれぞれ使用した。【００９６】
また、１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．１．０からＶｅｒ．２．０を取得する場合はスクリーニングの際、ランダムに選抜した約３７００株を９６穴の角型ディープウェルプレート内にて培養し菌体を凍結解凍後、６０℃で２１分処理を行った。
１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．２．０からＶｅｒ．３．０とＶｅｒ．３．１を取得する場合はスクリーニングの際、ランダムに選抜した約１２２００株を９６穴の角型ディープウェルプレート内にて培養し菌体を凍結解凍後、６０℃で２２分処理を行った。
１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．４．０からＶｅｒ．５．０とＶｅｒ．５．１を取得する場合はスクリーニングの際、ランダムに選抜した約２２０００株を９６穴の角型ディープウェルプレート内にて培養し菌体を凍結解凍後、６０℃で２３分処理を行った。
１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．５．０からＶｅｒ．６．０とＶｅｒ．６．１を取得する場合はスクリーニングの際、ランダムに選抜した約３６００株を９６穴の角型ディープウェルプレート内にて培養し菌体を凍結解凍後、６０℃で２４分処理を行った。
１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．７．１からＶｅｒ．８．１とＶｅｒ．８．２とＶｅｒ．８．４を取得する場合はスクリーニングの際、ランダムに選抜した約１５０００株を９６穴の角型ディープウェルプレート内にて培養し菌体を凍結解凍後、６０℃で２８分処理を行った。
１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．８．０からＶｅｒ．９．０を取得する場合はスクリーニングの際、ランダムに選抜した約７００株を９６穴の角型ディープウェルプレート内にて培養し菌体を凍結解凍後、６０℃で３８分処理を行った。
１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．１０．０からＶｅｒ．１１．０を取得する場合はスクリーニングの際、ランダムに選抜した約２００株を９６穴の角型ディープウェルプレート内にて培養し菌体を凍結解凍後、６０℃で４５分処理を行った。【００９７】
［２］部位特異的変異導入法による耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素の取得
図１及び図３−１、図３−２、図３−３において、Ｖｅｒ．３．２からＶｅｒ．４．０、Ｖｅｒ．７．１からＶｅｒ．８．０、Ｖｅｒ．９．０からＶｅｒ．１０．０、Ｖｅｒ．１１．１からＶｅｒ．１２．０を作製する場合には部位特異的変異導入法を利用した。
例えば、１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．３．２からＶｅｒ．４．０を取得する場合は次の様に行った。まず実施例１で作製したｐＴｒｃ−ＰＳ１５ＤＨ（Ｖｅｒ．３．２）を鋳型としてＰＣＲを行った。このときプライマーはｐＴｒｃ−ＰＳ１５ＤＨ（Ｖｅｒ．３．２）の１，５−ＡＧ脱水素酵素遺伝子の上流部位をもとにデザインした５’プライマー（配列番号１４）とｐＴｒｃ−ＰＳ１５ＤＨ（Ｖｅｒ．３．２）のＢａｍＨＩが欠失するようデザインした３’プライマー（配列番号１５）を用いて、またこれとは別に１，５−ＡＧ脱水素酵素の９３番目のアミノ酸残基であるバリンがメチオニンに置換されるようデザインした５’プライマー（配列番号１６）とｐＴｒｃ−ＰＳ１５ＤＨ（Ｖｅｒ．３．２）の１，５−ＡＧ脱水素酵素遺伝子の下流部位をもとにデザインした３’プライマー（配列番号１７）を用いて行った。ＰＣＲの条件は以下の通りである。
ＰＣＲ条件：鋳型ＤＮＡ  ０．０２ｎｇ、ＬＡｔａｑ  ２．５ｕｎｉｔｓ、Ｅｘｔａｑバッファー（１Ｘ）、ｄＮＴＰ  ０．２５ｍＭ、５’プライマー（配列番号１４）  ６４ｐｍｏｌ／ｍＬ及び３’プライマー（配列番号１５）  ６４ｐｍｏｌ／ｍＬ、若しくは５’プライマー（配列番号１６）  ６４ｐｍｏｌ／ｍＬ及び３’プライマー（配列番号１７）  ６４ｐｍｏｌ／ｍＬの混合物に水を加え、総量５０μＬの溶液を作製し、９４℃で５分間熱処理後、９４℃で３０秒、５５℃で２分、７２℃で１分４０秒、２５サイクルのプログラムで増幅を行い、その後７２℃で５分間処理した。【００９８】
増幅反応後、それぞれのＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて精製した。このＰＣＲ産物溶液各０．５μＬ、Ｅｘｔａｑバッファー（１Ｘ）、ｄＮＴＰ  ０．２５ｍＭの混合物に水を加え、総量４７．５μＬの溶液を作製し、９４℃で１０分間熱処理後、６０分かけて３７℃に温度を落とし、３７℃で１５分間処理した後、２．５ｕｎｉｔｓのＬＡｔａｑを添加し、７２℃にて３分間処理した。その後、５’プライマー（配列番号１４）  ６４ｐｍｏｌ／ｍＬ及び３’プライマー（配列番号１７）  ６４ｐｍｏｌ／ｍＬを添加し、９４℃で５分間熱処理後、９４℃で３０秒、５５℃で２分、７２℃で１分４０秒、１０サイクルのプログラムで増幅を行い、その後７２℃で５分間処理した。増幅反応後の溶液５μＬを１％濃度のアガロースゲル電気泳動を行った結果、目的としていた約１５００ｂｐの１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードするＤＮＡ断片が増幅されていることを確認した。【００９９】
増幅した変異型１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードする遺伝子を含むＰＣＲ溶液を１％濃度のアガロースゲル電気泳動により分離し、約１５００ｂｐに相当するバンドをゲルより切り出してＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により該バンド部分のＤＮＡを精製し、各々２０Ｕの制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩを用いて３７℃で一晩切断反応を行った後、フェノール・クロロホルムを用いて該ＤＮＡを抽出し、続いてエタノールを用いて沈殿した後、１２μＬのＴＥバッファーに溶解した。精製したＮｃｏＩとＢａｍＨＩで切断した約１５００ｂｐに相当するＤＮＡ部分のＤＮＡ溶液２μＬと、１μＬのＮｃｏＩとＢａｍＨＩで切断したベクターｐＴｒｃ９９Ａを２μＬのＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）と混合し、１６℃で約３０分間連結反応を行った。この連結反応後の溶液１．５μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換させることにより、１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．３．２に比べ耐熱性が向上した１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．４．０をコードする遺伝子を含む大腸菌ＪＭ１０９を取得した。【０１００】
１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．７．１からＶｅｒ．８．０、Ｖｅｒ．９．０からＶｅｒ．１０．０、Ｖｅｒ．１１．１からＶｅｒ．１２．０を作製する場合も同様の方法を行った。
１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．７．１からＶｅｒ．８．０を取得する場合はＰＣＲを行う際、鋳型としてｐＴｒｃ−ＰＳ１５ＤＨ（Ｖｅｒ．７．１）を使用し、プライマーとして５’プライマー（配列番号１４）と３’プライマー（配列番号１５）を使用し、またこれとは別に１，５−ＡＧ脱水素酵素の３７番目のアミノ酸残基であるスレオニンが別のアミノ酸残基に置換されるようデザインした５’プライマー（配列番号１８）と３’プライマー（配列番号１７）を用いて行った。この結果、１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．７．１の３７番目のアミノ酸残基であるスレオニンがアルギニンに置換した１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．８．０をコードする遺伝子を含む大腸菌ＪＭ１０９を取得した。【０１０１】
１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．９．０からＶｅｒ．１０．０を取得する場合はＰＣＲを行う際、鋳型としてｐＴｒｃ−ＰＳ１５ＤＨ（Ｖｅｒ．９．０）を使用し、プライマーとして５’プライマー（配列番号１４）と３’プライマー（配列番号１５）を使用し、またこれとは別に１，５−ＡＧ脱水素酵素の８０番目のアミノ酸残基であるアスパラギンがチロシンに置換されるようデザインした５’プライマー（配列番号１９）と３’プライマー（配列番号１７）を用いて行った。
１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．１１．１からＶｅｒ．１２．０を取得する場合はＰＣＲを行う際、鋳型としてｐＴｒｃ−ＰＳ１５ＤＨ（Ｖｅｒ．１１．１）を使用し、プライマーとして５’プライマー（配列番号１４）と３’プライマー（配列番号１５）を使用し、またこれとは別に１，５−ＡＧ脱水素酵素の１５６番目のアミノ酸残基であるアルギニンがプロリンに置換されるようデザインした５’プライマー（配列番号２０）と３’プライマー（配列番号１７）を用いて行った。【０１０２】
［３］２つのプラスミドＤＮＡの繋ぎ合わせによる耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素の取得
図１及び図３−１、図３−２、図３−３において、Ｖｅｒ．３．０とＶｅｒ．３．１からＶｅｒ．３．２、Ｖｅｒ．５．１とＶｅｒ．６．０からＶｅｒ．７．０、Ｖｅｒ．８．２とＶｅｒ．１１．０からＶｅｒ．１１．１を作製する場合、２つのプラスミドＤＮＡを繋ぎ合わせる方法により行った。
Ｖｅｒ．３．０とＶｅｒ．３．１からＶｅｒ．３．２を取得する場合は、ｐＴｒｃ−ＰＳ１５ＤＨ（Ｖｅｒ．３．０）とｐＴｒｃ−ＰＳ１５ＤＨ（Ｖｅｒ．３．１）を各々４５Ｕの制限酵素ＡｐａＩを用いて３７℃で切断反応を行った後、１％濃度のアガロースゲル電気泳動により分離し、ｐＴｒｃ−ＰＳ１５ＤＨ（Ｖｅｒ．３．０）から約４１００ｂｐに相当するバンドを、ｐＴｒｃ−ＰＳ１５ＤＨ（Ｖｅｒ．３．１）から約１５００ｂｐに相当するバンドをゲルより切り出してＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により該バンド部分のＤＮＡを精製した。ｐＴｒｃ−ＰＳ１５ＤＨ（Ｖｅｒ．３．０）から切断した約４１００ｂｐに相当するバンド部分のＤＮＡを子牛小腸由来アルカリフォスファターゼにて脱リン酸処理した後、フェノール・クロロホルムを用いて該ＤＮＡを抽出し、続いてエタノールを用いて沈殿した後、１２μＬのＴＥバッファーに溶解した。このｐＴｒｃ−ＰＳ１５ＤＨ（Ｖｅｒ．３．０）をＡｐａＩで切断した約４１００ｂｐに相当するＤＮＡ部分のＤＮＡ溶液１μＬと、ｐＴｒｃ−ＰＳ１５ＤＨ（Ｖｅｒ．３．１）をＡｐａＩで切断した約１５００ｂｐに相当するＤＮＡ部分のＤＮＡ溶液２μＬを２μＬのＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）と混合し、１６℃で約３０分間連結反応を行った。この連結反応後の溶液１．５μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換させることにより、１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．３．０とＶｅｒ．３．１に比べ耐熱性が向上した１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．３．２をコードする遺伝子を含む大腸菌ＪＭ１０９を取得した。【０１０３】
１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．５．１とＶｅｒ．６．０からＶｅｒ．７．０、Ｖｅｒ．８．２とＶｅｒ．１１．０からＶｅｒ．１１．１を作製する場合も同様の方法を行った。Ｖｅｒ．７．０の場合、ｐＴｒｃ−ＰＳ１５ＤＨ（Ｖｅｒ．５．１）から約４１００ｂｐに相当するＤＮＡ部分を、ｐＴｒｃ−ＰＳ１５ＤＨ（Ｖｅｒ．６．０）から約１５００ｂｐに相当するＤＮＡ部分を使用し、Ｖｅｒ．１１．０の場合は、ｐＴｒｃ−ＰＳ１５ＤＨ（Ｖｅｒ．８．２）から約４１００ｂｐに相当するＤＮＡ部分を、ｐＴｒｃ−ＰＳ１５ＤＨ（Ｖｅｒ．１１．０）から約１５００ｂｐに相当するＤＮＡ部分を使用した。【０１０４】
［４］ＰＣＲによる耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素の取得
図１及び図３−１、図３−２、図３−３において、１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．６．１とＶｅｒ．７．０からＶｅｒ．７．１を作製する場合にはＰＣＲを利用した。
鋳型としてｐＴｒｃ−ＰＳ１５ＤＨ（Ｖｅｒ．７．０）を使用し、プライマーはＮ末端の前にＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩ認識配列を追加し更に１，５−ＡＧ脱水素酵素の４番目のアミノ酸残基であるグリシンがアラニンに置換されるようデザインした５’プライマー（配列番号２０）と、Ｃ末端の後にＢａｍＨＩ認識配列を追加した３’プライマー（配列番号１３）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は以下の通りである。
ＰＣＲ条件：鋳型ＤＮＡ  １．２５ｎｇ、Ｅｘｔａｑ  １．５ｕｎｉｔｓ、Ｅｘｔａｑバッファー（１Ｘ）、ｄＮＴＰ  ０．２ｍＭ  、５’プライマー（配列番号２１）  ３８４ｐｍｏｌ／ｍＬ及び３’プライマー（配列番号１３）  ３８４ｐｍｏｌ／ｍＬの混合物に水を加え、総量５０μＬの溶液を作製し、９６℃で５分間熱処理後、９６℃で１分、６３℃で１分、７２℃で１分４０秒、３０サイクルのプログラムで増幅を行い、その後７２℃で５分間処理した。増幅反応後の溶液５μＬを１％濃度のアガロースゲル電気泳動を行った結果、目的としていた約１５００ｂｐの１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードするＤＮＡ断片が増幅されていることを確認した。【０１０５】
増幅後のＰＣＲ溶液を１％濃度のアガロースゲル電気泳動により分離し、約１５００ｂｐに相当するバンドをゲルより切り出してＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により該バンド部分のＤＮＡを精製し、各々２０Ｕの制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩを用いて３７℃で一晩切断反応を行った後、フェノール・クロロホルムを用いて該ＤＮＡを抽出し、続いてエタノールを用いて沈殿した後、１２μＬのＴＥバッファーに溶解した。精製したＮｃｏＩとＢａｍＨＩで切断した約１５００ｂｐに相当するＤＮＡ部分のＤＮＡ溶液２μＬと、１μＬのＮｃｏＩとＢａｍＨＩで切断したベクターｐＴｒｃ９９Ａを２μＬのＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）と混合し、１６℃で約３０分間連結反応を行った。この連結反応後の溶液１．５μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換させることにより、１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．７．１をコードする遺伝子を含む大腸菌ＪＭ１０９を取得した。
【実施例３】
【０１０６】
耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素の熱処理温度における安定性及び塩基配列解析による変異の確認
実施例２の［１］〜［４］にて取得した耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードする遺伝子を含む大腸菌ＪＭ１０９を、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン及び０．１ｍＭのＩＰＴＧを含むＬＢ液体培地１０ｍＬに植菌し、３０℃で１６時間振とう培養を行った。その振とう培養液１０ｍＬを１００００ｒｐｍで５分間遠心分離し、培養上清を除いた後、０．８５％のＮａＣｌ水溶液で２回洗浄した。この菌体を１ｍＬの０．２５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む５０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）に懸濁し、氷中で冷却しながらビーズ衝撃法細胞破砕装置ＭＩＮＩ−ＢＥＡＤＢＥＡＴＥＲ（３０秒×４回、セントラル科学貿易社製）でその菌体を破壊し、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、その上清を粗酵素液とした。粗酵素液を熱処理する場合は、４５℃、５０℃、５５℃あるいは６０℃の水浴中にて１０分間処理をした。【０１０７】
１，５−ＡＧ脱水素酵素の酵素活性は、実施例１の（Ｊ）に記載の手法と同様の手法にて測定を行うことにより算出した。
なお、１，５−ＡＧ脱水素酵素の粗酵素液１ｍｇあたりの酵素活性を表す比活性は次の式に当てはめて算出した。
比活性（Ｕ／ｍｇ）＝酵素活性（Ｕ／ｍＬ）／粗酵素液タンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）  また、活性残存率は次の式に当てはめて算出した。
活性残存率（％）＝（熱処理後の粗酵素液の比活性／熱処理前の粗酵素液の比活性）Ｘ１００
それぞれの耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素の比活性と、各温度にて１０分間処理した後の活性残存率を表１に示す。【０１０８】
【表１】
0005622321.tif 000002
【０１０９】
この結果、高い耐熱性を示す１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．１０．０の活性残存率は、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃にて１０分間処理した後でそれぞれ９７％、９１％、８６％、４６％であった。１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．１．０〜Ｖｅｒ．１１．０の活性残存率は４５℃にて１０分間処理した後で８％以上であり、１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．２．０〜Ｖｅｒ．１１．０の活性残存率は４５℃にて１０分間処理した後で３０％以上であった。最も高い耐熱性を示す１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．１１．１とＶｅｒ．１２．０の活性残存率は、６０℃にて１０分間処理した後でそれぞれ７３％、７６％であった。【０１１０】
また、それぞれの耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素のアミノ酸残基置換部位及びそれぞれの耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードする遺伝子のうち変異が導入された部位は図３−１、図３−２、図３−３に示すとおりである。このうち、１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．２．０のアミノ酸配列及び塩基配列は配列番号２２に、１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．７．１のアミノ酸配列及び塩基配列は配列番号２３に、１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．１２．０のアミノ酸配列は配列番号１に、１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．１２．０の塩基配列は配列番号２に、それぞれ示す。
それぞれの耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素をコードする遺伝子の塩基配列は、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００−Ａｖａｎｔ（アプライドバイオシステムズ社製）にて解析した。
この結果、配列番号１に示す１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．１２．０のアミノ酸配列は、親株の１，５−ＡＧ脱水素酵素Ｖｅｒ．０と比べて、４番目がアラニン残基、１４番目がスレオニン残基、３７番目がアルギニン残基、５０番目がグルタミン残基、６７番目がグリシン残基、８０番目がチロシン残基、９３番目がメチオニン残基、１５６番目がプロリン残基、１６４番目がメチオニン残基、２０２番目がアスパラギン酸残基、２３５番目がアラニン残基、３４８番目がチロシン残基、３６２番目がアルギニン残基、４７３番目がアラニン残基に、それぞれ変換されていることを確認することができた。
【実施例４】
【０１１１】
耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素（Ｖｅｒ．２．０）の製造
（Ａ）組換え体（ｐＴｒｃ−ＰＳ−ＡＧＤＨ−ｖｅｒ２．０／ＪＭ１０９）の培養
種培養：
５００ｍＬ溶の三角フラスコに、ＬＢ培地５０ｍＬを加え、オートクレーブ滅菌し、更にアンピシリンナトリウムを終濃度１００μｇ／ｍＬとなるように使用直前に添加した。このＬＢ培地に遺伝子組換え体ｐＴｒｃ−ＰＳ−ＡＧＤＨ−ｖｅｒ２．０／ＪＭ１０９を接種し、２５℃で振とう培養（１２０ｒｐｍ）した。培養開始１６時間後の培養液を、本培養時の種菌とした。
本培養：
５００ｍＬ溶の三角フラスコに、ＬＢ培地１００ｍＬを加え、オートクレーブ滅菌し、更にアンピシリンナトリウムを終濃度１００μｇ／ｍＬとなるように使用直前に添加したフラスコ培地４０本を調製した。各々の培地に、前記で準備した種菌１ｍＬずつを植菌し、２５℃で３時間、振とう培養（１２０ｒｐｍ）した培養液にフィルター滅菌したＩＰＴＧを０．１ｍＭとなるように添加し、更に２５℃で２１時間振とう培養した。培養終了後に遠心分離機を用いて菌体を回収した。【０１１２】
（Ｂ）組換え１，５−ＡＧ脱水素酵素の精製
前記培養によって得られた菌体から、以下の各精製工程を経て、耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素（Ｖｅｒ．２．０）を分離・精製した。その結果を表２に示す。
なお、１，５−ＡＧ脱水素酵素活性は実施例１に記載の方法に基づいて測定し、比活性は実施例３記載の式にて求めた。【０１１３】
【表２】
0005622321.tif 000003
【０１１４】
無細胞抽出液（ＣＦＥ）の調製：
（Ａ）の本培養で回収した菌体に３６０ｍＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５を加え、菌体懸濁液を作製した。更に終濃度０．２５％となるようにＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加した。この菌体懸濁液を４分割し、それぞれにつき超音波破砕装置（ＫＵＢＯＴＡ社製ＩＮＳＯＮＡＴＯＲ２０１Ｍ）を用いて出力１８０Ｗ、３０分間で破砕した。これらの菌体破砕液を合わせて、遠心分離（１１０００×ｇ、４℃、３０分）し、ＣＦＥ３６０ｍＬを回収した。【０１１５】
硫安分画：
前記のＣＦＥに、氷冷下、飽和濃度２５％となるように硫酸アンモニウム５１．８４ｇを少しずつ溶解させながら加えた。硫酸アンモニウム（硫安）が溶解後、更に３０分間攪拌した。この溶解液を遠心分離（１１０００×ｇ、４℃、３０分）し、上清３８０ｍＬを回収した。次に、この上清に、氷浴下、飽和濃度４０％となるように硫酸アンモニウム３５．３４ｇを少しずつ溶解させながら加えた。硫酸アンモニウムが溶解後、更に３０分間攪拌し、その後４℃で一晩静置した。【０１１６】
透析：
前記の硫安処理液を遠心分離（１１０００×ｇ、４℃、３０分）により、硫安沈殿を集めた。硫安沈殿は、１０ｍＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５に溶解し、透析チューブに入れ、透析バッファー（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２０％グリセリン）を用いて透析を行った。【０１１７】
遠心分離：
透析チューブ内に不溶物が生じたため、遠心分離（２７０００×ｇ、４℃、１５分）により、これを除去して上清１４ｍＬを得た。【０１１８】
弱陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦａｓｔＦｌｏｗ）：
平衡化バッファー（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２０％グリセリン）で平衡化した弱陰イオン交換樹脂ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）３２０ｍＬ（カラムサイズ：２．６ｃｍ×高さ６０ｃｍ）に、前記の上清をチャージした。チャージ終了後、樹脂のｂｅｄ  ｖｏｌｕｍｅの３倍量の洗浄バッファー（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２０％グリセリン）で洗浄後、樹脂のｂｅｄ  ｖｏｌｕｍｅの５倍量の溶出バッファー（１：２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２０％グリセリン、２：２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２０％グリセリン、１Ｍ  ＮａＣｌ）を用いて、目的タンパクをグラジェント溶出させ、活性画分３９６ｍＬを得た。【０１１９】
脱塩濃縮：
限外ろ過装置モデル８２００（アミコン社製、限外ろ過メンブレン分画分子量１０万）を用いて、前記の活性画分を１７．５ｍＬに濃縮し、耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素（Ｖｅｒ．２．０）の３，２２２Ｕを得た。【０１２０】
参考例１
親株由来の１，５−ＡＧ脱水素酵素の基質特異性
変異前の１，５−ＡＧ脱水素酵素（Ｖｅｒ．０）を用い、実施例４と同様な精製方法により４０％飽和の硫酸アンモニウムの沈殿画分を遠心分離で集め、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５に溶解したものを酵素液として数種の糖または糖アルコールについて酵素活性を測定し、１，５−ＡＧを１００％とする相対活性にて表３に示す。酵素活性は、実施例１の（Ｊ）記載の方法で測定した。【０１２１】
【表３】
0005622321.tif 000004
【実施例５】
【０１２２】
吸光度法による１，５−ＡＧの測定
表４に示す組成の第一試薬と前記の本発明の耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素（Ｖｅｒ．７．１）を含む第二試薬を用いて、臨床検査で汎用されている全自動生化学検査分析装置日立７０２０で臨床検体の測定を行った。即ち、検体４．５μＬに対し、第一試薬１８０μＬを添加し３７℃５分間反応する。次に、第二試薬６０μＬを添加し３７℃５分間反応させる。測光波長は、主波長４５０ｎｍ、副波長５７０ｎｍとして１７ポイントから３５ポイントの２ポイントエンド法で吸光度を測定した。
尚、本実施例に使用した臨床検体は、健常者と糖尿病患者から採取した血清を用いた。【０１２３】
【表４】
0005622321.tif 000005
【０１２４】
検量線の作成
生理食塩水を用いて１，５−ＡＧ標準液０、５０μｇ／ｍＬを調製し、この標準液を上記の１，５−ＡＧ測定方法で測定し検量線を作成した。検量線の吸光度増加量を表５に示す。【０１２５】
【表５】
0005622321.tif 000006
【０１２６】
検体の測定
健常者と糖尿病患者からなる５０例の血清検体を、上記の１，５−ＡＧ測定方法（本法）に従って測定し、上記検量線より１，５−ＡＧ測定値を算出して求めた。
一方、同じ検体を日本化薬（株）製「ラナ１，５ＡＧオートリキッド」で測定して得られた結果と本法による結果とを比較し、図４に示す。【０１２７】
図４のグラフに示される通り、両者の測定値の間には、相関式：Ｙ＝０．９０１７Ｘ＋１．３７９４、相関係数：０．９９３６と良好な相関関係が認められた。
【実施例６】
【０１２８】
吸光度法による１，５−ＡＧの測定
表５に示す組成の第一試薬と前記の本発明の耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素（Ｖｅｒ．１０．０）を含む第二試薬を用いて、臨床検査で汎用されている全自動生化学検査分析装置日立７０２０で臨床検体の測定を行った。即ち、検体４．５μＬに対し、第一試薬１８０μＬを添加し３７℃５分間反応する。次に、第二試薬６０μＬを添加し３７℃５分間反応させる。測光波長は、主波長４５０ｎｍ、副波長５７０ｎｍとして１７ポイントから３５ポイントの２ポイントエンド法で吸光度を測定した。
尚、本実施例に使用した臨床検体は、健常者と糖尿病患者から採取した血清を用いた。【０１２９】
【表６】
0005622321.tif 000007
【０１３０】
検量線の作成
生理食塩水を用いて１，５−ＡＧ標準液０、５０μｇ／ｍＬを調製し、この標準液を上記の１，５−ＡＧ測定方法で測定し検量線を作成した。検量線の吸光度増加量を表６に示す。【０１３１】
【表７】
0005622321.tif 000008
【０１３２】
検体の測定
健常者と糖尿病患者からなる５０例の血清検体を、上記の１，５−ＡＧ測定方法（本法）に従って測定し、上記検量線より１，５−ＡＧ測定値を算出して求めた。
一方、同じ検体を日本化薬（株）製「ラナ１，５ＡＧオートリキッド」で測定して得られた結果と本法による結果とを比較し、図５に示す。【０１３３】
図５のグラフに示される通り、両者の測定値の間には、相関式：Ｙ＝１．０４１４Ｘ−０．１７４１、相関係数：０．９９３５と良好な相関関係が認められた。
【実施例７】
【０１３４】
アルブミンを共存させた吸光度法による１，５−ＡＧ測定
表７に示す第一試薬とアルブミンを含む第二試薬（１，５−ＡＧ脱水素酵素はＶｅｒ．７．１）を用い、生理食塩水で調製した１，５−ＡＧ標準液０μｇ／ｍＬ、１，５−ＡＧ標準液５０μｇ／ｍＬを検体として、臨床検査で汎用されている全自動生化学検査分析装置日立７０２０を用いて連続繰り返し測定を行った。
測定方法は、検体４．５μＬに対し、第一試薬１８０μＬを添加し３７℃５分間反応する。次に、第二試薬６０μＬを添加し３７℃５分間反応させる。測光波長は、主波長４５０ｎｍ、副波長５７０ｎｍとして１７ポイントから３５ポイントの２ポイントエンド法で吸光度を測定した。１，５−ＡＧ標準液の測定は、１，５−ＡＧ標準液０μｇ／ｍＬと１，５−ＡＧ標準液５０μｇ／ｍＬを４回繰り返し連続測定を行った。【０１３５】
【表８】
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【０１３６】
比較例１
表８の第一試薬と、変異前の１，５−ＡＧ脱水素酵素を含む第二試薬を用いて実施例７と同様に連続測定を行った。【０１３７】
【表９】
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【０１３８】
実施例７と比較例１の測定試薬で１，５−ＡＧ標準液の吸光度を繰り返し測定した時の結果を表９に示す。【０１３９】
【表１０】
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【０１４０】
表９から、比較例１の１，５−ＡＧ標準液５０μｇ／ｍＬの吸光度は、同一セルの繰り返し測定による使用回数に伴って増加してしまうが、実施例７の１，５−ＡＧ標準液５０μｇ／ｍＬの吸光度は、同一セルの使用回数に関係なく、吸光度の増加は認められない。この結果から明らかなように、１，５−ＡＧの測定おいてアルブミンを共存させることで、安定した１，５−ＡＧの繰り返し測定が可能である。
【実施例８】
【０１４１】
電気化学測定法による１，５−ＡＧの測定
［１］１，５−ＡＧを基質とする１，５−ＡＧ脱水素酵素活性の測定法
電気化学測定法では、１，５−ＡＧ脱水素酵素の活性値を１，５−ＡＧを基質とする以下の方法で決定した。
反応液組成：
（１）０．１Ｍ  Ｎ−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−３−アミノプロパンスルホン酸バッファーｐＨ８．０    ０．１４ｍＬ
（２）２０ｍＭ  ＷＳＴ−１（（１）に溶解）    ０．１２ｍＬ
（３）蒸留水    ０．１３ｍＬ
（４）１Ｍ  １，５−ＡＧ水溶液    ０．２０ｍＬ
（５）酵素液    ０．０１ｍＬ
（６）酵素希釈液（（１）に同じ）    ０．０１ｍＬ
操作
恒温水槽と分光光度計のセルホルダーを３７℃に設定する。
１）石英セル（光路長１ｃｍ，光路幅２ｍｍ）を３７℃セルホルダーに入れ５分間保温する。
２）試薬（１）〜（４）を４ｍＬ容ガラス試験管に入れ混合し、３７℃恒温水槽で５分間保温する。
３）２）に（５）酵素液を加え混合し、直ちに１）の石英セルに移し、セルホルダーにセットし、ＯＤ４３８ｎｍの吸光度変化量を測定する。
４）ＯＤ４３８ｎｍの測定開始３０秒後から１分間の吸光度変化量をΔＯＤ／ｍｉｎとする。
５）（５）酵素液の代わりに（６）酵素希釈液を添加したものをブランク値ΔＯＤｂｌａｎｋ／ｍｉｎとする。
計算式
活性（Ｕ／ｍＬ）＝｛（ΔＯＤ／ｍｉｎ−ΔＯＤ  ｂｌａｎｋ／ｍｉｎ）×０．６  （ｍＬ）×希釈倍率｝／｛１．０  （ｃｍ）×３７（ｃｍ２／μｍｏｌ）＊×０．０１  （ｍＬ）｝
上記の条件において、１分間に１μｍｏｌのＷＳＴ−１を還元する酵素量を１Ｕとする。
＊３７（ｃｍ２／μｍｏｌ）：ＷＳＴ−１のミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／μｍｏｌ）
［２］グルコース変換試薬
１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ７．７に調整した後の組成が、１７．６ｍＭのＭｇＣｌ２、１７．６ｍＭのＫＣｌ、１７５．７ｍＭのホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、１７．６ｍＭのＡＴＰ、１２３Ｕ／ｍＬのピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、７５Ｕ／ｍＬのグルコキナーゼ、２００Ｕ／ｍＬのアスコルビン酸酸化酵素、１００ｍＭの塩化ナトリウム、０．１％のＮａＮ３、０．１ｍＭのＥＤＴＡ及び０．０６％のＢＳＡ（牛血清アルブミン）となるように１０．０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に各成分を加え、グルコース変換試薬とした。【０１４２】
［３］センサチップ
ポリエチレンテレフタレートの基盤に作用極とリード部、対極とリード部をカーボンインク（（株）アサヒ化学研究所製、製品名カーボンペーストＴＵ１５ＳＴ）で、参照極とリード部を銀塩化銀インク（アチソン（株）製、製品ＥｌｅｃｔｒｏｄａｇＰＥ−４０９）で、厚さ１０μｍでスクリーン印刷し、１５０℃で４０分焼入れし、次いで電極部と、測定装置との接続部とをのぞく部分にレジストインク（（株）アサヒ化学研究所製、製品名ＣＲ１８Ｇ−ＫＦ）を厚さ２０μｍでスクリーン印刷し、１３０℃で１５分焼入れして図６に示す電極を作成した。
次に、１２０μＭのチオニンアセテート（シグマーアルドリッチ（株）製）、２．１６Ｕ／ｍＬの本発明の１，５−ＡＧ脱水素酵素（Ｖｅｒ．２．０）の組成となるように各成分を精製水に溶解して電極試薬溶液を調製し、この電極の作用極に２μＬを塗布して、５０℃で５分乾燥してセンサチップを作製した。【０１４３】
［４］検量線作成
１，５−ＡＧ検量線作成用として、羊血清（日本バイオテスト（株）製）に濃度既知の１，５−ＡＧ標品を加えた６検体（各検体の１，５−ＡＧ濃度は、０．６、２．８、５．０、１０．０、２４．７、５０．２μｇ／ｍＬであった）各１０μＬとグルコース変換試薬５μＬとをエッペンドルフチューブ内で混合して５分間放置した。その後、先に作成したセンサチップの検体添加位置１（図６）に反応液１０μＬを滴下し、参照極（銀塩化銀）を基準にして−０．１Ｖを１０秒、次いで０Ｖを１１０秒印加し、０Ｖの印加開始から１００秒間のクーロン量を電気化学検出器（ＧＰＩＢ  ＲＳ２３２Ｃ付き８ＣＨ  マルチポテンショスタット  ＭＯＤＥＬ  ＰＳ−０８；（株）東方技研）で測定して、クーロン量と１，５−ＡＧ濃度から検量線を作成した。良好な直線性を示した検量線を図７に示した。【０１４４】
［５］全血検体中の１，５−ＡＧ測定操作
糖尿病患者を含む２３例の全血検体各１０μＬとグルコース変換試薬５μＬとをエッペンドルフチューブ内で混合して５分間放置した。その後、先に作成したセンサチップの検体添加位置１（図６）に反応液１０μＬを滴下し、参照極（銀塩化銀）を基準にして−０．１Ｖを１０秒、次いで０Ｖを１１０秒印加し、０Ｖの印加開始から１００秒間のクーロン量を電気化学検出器で測定して、検量線と対比して２３検体について全血中の１，５−ＡＧ量を求めた。なお、結果は４回測定したその平均値である。【０１４５】
本実施例で測定に使用した全血各検体から遠心分離操作により得られた各血漿中の１，５−ＡＧ量を、日本化薬（株）製「ラナ１，５ＡＧオートリキッド」で測定した。【０１４６】
図８に本実施例の測定値とラナ１，５−ＡＧオートリキッドの測定値をプロットしたグラフを示すが、両者の相関係数は０．９６０６であり、両者は良好な相関をしている。この結果は本発明によって糖尿病患者の全血中の１，５−ＡＧの測定が可能であることを示している。
【実施例９】
【０１４７】
電気化学測定法による、各耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素の安定性比較
［１］グルコース変換試薬
実施例８と同様にしてグルコース変換試薬を調製した。【０１４８】
［２］センサチップ
実施例８と同様にして、図６に示す電極を作成した。
次に、１２０μＭのチオニンアセテート（シグマーアルドリッチ（株）製）、３．２６Ｕ／ｍＬの本発明の１，５−ＡＧ脱水素酵素（Ｖｅｒ．２．０）、５０ｍＭのピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）（ｐＨ７．０）の組成となるように各成分を精製水に溶解して電極試薬溶液を調製し、この電極の作用極に２μＬを塗布して、５０℃で５分乾燥してセンサチップを作製した。以後、これをＶｅｒ．２．０チップということがある。
同様にして、１２０μＭのチオニンアセテート（シグマーアルドリッチ（株）製）、３．２６Ｕ／ｍＬの本発明の１，５−ＡＧ脱水素酵素（Ｖｅｒ．３．２）、５０ｍＭのピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）（ｐＨ７．０）の組成となるように各成分を精製水に溶解して電極試薬溶液を調製し、この電極の作用極に２μＬを塗布して、５０℃で５分乾燥してセンサチップを作製した。以後、これをＶｅｒ．３．２チップということがある。
また同様にして、１２０μＭのチオニンアセテート（シグマーアルドリッチ（株）製）、３．２６Ｕ／ｍＬの本発明の１，５−ＡＧ脱水素酵素（Ｖｅｒ．１０．０）、５０ｍＭのピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）（ｐＨ７．０）の組成となるように各成分を精製水に溶解して電極試薬溶液を調製し、この電極の作用極に２μＬを塗布して、５０℃で５分乾燥してセンサチップを作製した。以後、これをＶｅｒ．１０．０チップということがある。【０１４９】
［３］保存安定性試験
上記の様にして作成した各センサチップを、遮光した上でシリカゲルとともに密閉容器に入れ、５５℃のインキュベータに５３日間保存した。【０１５０】
［４］電気化学測定による評価
上記の様にして一定期間保存したチップで電気化学測定を行い、劣化の度合いを評価し、各耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素の安定性を評価して比較した。
０．３８％クエン酸ナトリウム水溶液に１，５−ＡＧ標品を加えた１，５−ＡＧ標準液（標準液の１，５−ＡＧ濃度は、５０．４μｇ／ｍＬであった）を調製した。この標準液１０μＬとグルコース変換試薬５μＬとをエッペンドルフチューブ内で混合して５分間放置した。その後、先に作成したセンサチップの検体添加位置１（図６）に反応液１０μＬを滴下し、参照極（銀塩化銀）を基準にして−０．１Ｖを１０秒、次いで０Ｖを１１０秒印加し、０Ｖの印加開始から１００秒間のクーロン量を電気化学検出器（ＧＰＩＢ  ＲＳ２３２Ｃ付き８ＣＨ  マルチポテンショスタット  ＭＯＤＥＬ  ＰＳ−０８；（株）東方技研）で測定した。３日保存後のクーロン量を１００％とし、７日、１４日、３１日、３５日、４６日及び５３日間経過後のクーロン量から各相対変動率（％）を求めた。【０１５１】
本実施例の結果を図９に示した。１，５−ＡＧ脱水素酵素の耐熱性が向上するに従い、センサチップとしての安定性が格段に向上していることが明らかである。
【産業上の利用可能性】
【０１５２】
本発明の耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素は、１，５−ＡＧに特異的に作用し、耐熱性を有することから優れた保存安定性を示し、１，５−ＡＧの定量試薬や酵素センサーを製品化して簡便で実用的な１，５−ＡＧ測定を実施する上で極めて有用な酵素である。また、耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素を使用する１，５−ＡＧの測定法は高感度な安定した方法となり実用化が可能となる。更に、耐熱性１，５−ＡＧ脱水素酵素を含有する１，５−ＡＧ測定用キットは保存安定性が高まり臨床現場で使用可能となる。
【符号の説明】
【０１５３】
１  検体添加位置
２  支持体
３  作用極
４  対極
５  レジスト
６  参照極（銀塩化銀インク）
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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