(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物被験体に投与せずに、アレルゲン、免疫原、免疫調節剤、免疫治療剤及び潜在的ワクチン剤の評価を可能にする人工免疫システムであって、
コラーゲンクッション、ゼラチン、ヒアルロン酸、小腸粘膜下組織、膀胱粘膜、ＰＬＧＡ、ヒドロゲル、コラーゲンで覆われたプレート、マイクロキャリア、反転性（inverted）コロイド結晶マトリクス、合成細胞外マトリクス材料、及び天然細胞外マトリクス材料から成る群より選択される培養組織構築物、並びに
前記培養組織構築物内に包埋されるか、又はその上に固定される少なくとも１つの三次元人工胚中心であって、
濾胞樹状細胞、
Ｂ細胞、及び
Ｔ細胞
を含む、少なくとも１つの三次元人工胚中心
を含む、人工免疫システム。
【請求項２】
前記Ｂ細胞及び前記Ｔ細胞が、ワクチン、アジュバント、免疫調節剤、免疫治療剤候補、化粧品、薬剤、生物製剤(biologic)、及び化合物から成る群より選択される作用物質で免疫された個体から単離される、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項３】
濾胞白血球をさらに含む、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項４】
前記培養組織構築物が、コラーゲンスポットで覆われたプレートを含む、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項５】
前記コラーゲンスポットが架橋される、請求項４に記載の人工免疫システム。
【請求項６】
前記濾胞樹状細胞が、前記コラーゲンスポットと接着する、請求項４に記載の人工免疫システム。
【請求項７】
前記システムが、前記培養組織構築物に分布する間質細胞をさらに含む、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項８】
前記システムが、ＩＬ−４抗体、ＣＤ４０Ｌ抗体、及び抗ＣＤ４０抗体から成る群より選択される可溶性因子をさらに含む、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項９】
前記システムが、ワクチン、アジュバント、免疫調節剤、免疫治療剤候補、化粧品、薬剤、生物製剤、及び化合物から成る群より選択される作用物質をさらに含む、請求項１に記載の人工免疫システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連技術の相互参照］
本出願は、２００５年１２月２１日に提出された米国仮特許出願第６０／７５２，０３４号（参照により本明細書中にその全体が援用される）の利益を主張している。
【背景技術】
【０００２】
本発明者等はこれまでに、ナイーブマウスＢ細胞を用いた機能的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ胚中心（ＧＣ）を開発している。このモデルは、培養プレートにおいて二次元（２Ｄ）で研究した。これらのマウスのｉｎ  ｖｉｔｒｏのＧＣにおいて、免疫グロブリン（Ｉｇ）クラススイッチ、体細胞超変異、高親和性Ｂ細胞の選択、及び親和性成熟が実証された。これらの活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでワクチンを研究するという目的に重要である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＧＣにおいて、濾胞樹状細胞（ＦＤＣ）は、Ｔ細胞−Ｂ細胞の相互作用を促進する機能、及びＢ細胞の生存率を高める機能の２つの主な機能を果たす。これらの機能の両方が、特異的なＢ細胞の活性化、抗体産生及びプラズマ細胞への分化を可能にし促進させる。
【０００３】
１９６８年に、Szakal and Hanna（J. Immunol. 101, 949-962; Exp. Mol. Pathol. 8, 75-89）及びNossal et al.（J. Exp. Med. 127, 277-290）が、今では濾胞樹状細胞（ＦＤＣ）として知られるものの最初の報告及び電子顕微鏡写真を公開した。両方のグループが１２５Ｉ標識抗原を用い、電子顕微鏡を用いて齧歯類の脾臓又はリンパ節における濾胞のオートラジオグラフを調べた。両方のグループによって、放射標識が特有の不規則な形をした真性染色質の（euchromatic）核を有する樹状型の細胞の非常に複雑な微細細胞突起の表面上又は表面の近くに残存したことが見出された。微細細胞突起が、通過リンパ球の周りに複雑な網状構造を形成し、広範な細胞間接触を可能にした。これらの細胞に対して、幾つかの名称が用いられているが、命名委員会は、「濾胞樹状細胞」という名称及び「ＦＤＣ」という略称を推奨しており、これらが一般的に採用されている（Tew et al. (1982) J. Reticuloendothelial Soc. 31, 371-380）。
【０００４】
濾胞におけるＦＤＣ位置と共に、抗原−抗体複合体を捕捉し維持するというＦＤＣの能力によって、ＦＤＣは他の細胞、例えば他の樹状細胞（ＤＣ）から区別される。特異的な抗原を有するＦＤＣが、完全なＧＣの開発に必要であり（Kosco et al. (1992) J. Immunol. 148, 2331-2339; Tew et al. (1990) Immunol. Rev. 117, 185-211）、Ｉｇのクラススイッチ、記憶Ｂ細胞の産生、高親和性レセプターを有する体細胞変異Ｂ細胞の選択、親和性成熟、二次抗体応答の誘導、及び高親和性抗体を有する血清ＩｇＧの調節に関与すると考えられている（Tew et al. (1990) Immunol Rev. 117, 185-211; Berek & Ziegner (1993) Immunol. Today 14, 400-404; MacLennan & Gray (1986) Immunol. Rev. 91, 61-85; Kraal et al. (1982) Nature 298, 377-379; Liu et al. (1996) Immunity 4, 241-250; Tsiagbe et al. (1992) Immunol. Rev. 126, 113-141）。多くの研究者が、ｉｎ  ｖｉｖｏのＧＣを模倣するという概念で、二次元における培養下においてＦＤＣを用いて研究している。ＦＤＣの補助機能の評価及びこれらの機能の調節は、完全に機能的で成熟した抗体応答を理解するのに重要である。
【０００５】
ＦＤＣ発生はＢ細胞依存性であり、ＦＤＣは、例えばＳＣＩＤマウス、（Ｂ細胞を取り除くために）抗ｍｕで処理したマウス、又はｍｕ鎖を欠失したマウス（Ｂ細胞が発生しない場合）では検出不可能である（MacLennan & Gray (1986) Immunol. Rev. 91, 61-85; Kapasi et al. (1993) J. Immunol. 150, 2648-2658）。Ｔ細胞欠損マウス（例えばヌードマウス）では、ＦＤＣが発生するにはするが、その発生は遅延され、ＦＤＣはあまり多くのＦＤＣマーカーを発現しないと思われる（Tew et al. (1979) Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 57, 401-414）。
【０００６】
Ｂ細胞及びＴ細胞の両方が適合移植される場合、ＳＣＩＤマウスにおいてＦＤＣの再構築が最良に行われ、このことによりＴ細胞がＦＤＣ発生にも関与することが示唆される（Kapasi et al. (1993) J. Immunol. 150, 2648-2658）。ＬＴ／ＴＮＦ又は同族レセプターの崩壊がリンパ節の器官形成を崩壊させ、ＦＤＣ網目構造の発達を妨げる（De Togni et al. (1994) Science 264, 703-707; Rennert et al. (1996) J. Exp. Med. 184, 1999-2006; Chaplin & Fu (1998) Curr. Opin. Immunol. 10, 289-297; Endres et al. (1999) J. Exp. Med. 189, 159-168; Ansel et al. (2000) Nature 406, 309-314）。Debard et al. (1999)によって要約されたように、ＬＴα、ＬＴβ、ＴＮＦαＲ１、及びＬＴβＲの欠失がＦＤＣ網目構造の発達を妨げることが知られている（Semin. Immunol, 11, 183-191）。Ｂ細胞は、ＬＴα／βヘテロ三量体の重要な供給源であり、これはＦＤＣ発生がＢ細胞依存性であることを示すデータに一致している（Endres et al. (1999) J. Exp. Med. 189, 159-168; Ansel et al. (2000) Nature 406, 309-314; Fu et al. (1998) J. Exp. Med. 187, 1009-1018）。
【０００７】
哺乳動物のリンパ節の機能的因子は濾胞であり、これは抗原によって刺激された場合にＧＣを発生する。ＧＣはリンパ節における活性領域であり、効果的な体液性免疫応答の発生に対して重要な相互作用が起こる。抗原刺激の際、濾胞が複製され、活性ヒトリンパ節は、ＧＣを機能させながら多くの活性濾胞を有し得る。Ｂ細胞、Ｔ細胞、及びＦＤＣ間の相互作用がＧＣで行われる。ｉｎ  ｖｉｖｏでのＧＣの様々な研究によって、以下の事象がＧＣで起こることが示される：
・免疫グロブリン（Ｉｇ）のクラススイッチ、
・迅速なＢ細胞増殖（ＧＣ暗帯）、
・記憶Ｂ細胞の産生、
・抗原特異的なＴ細胞及びＢ細胞の選択集団の蓄積、
・超変異、
・高親和性レセプターを有する体細胞突然変異Ｂ細胞の選択、
・低親和性Ｂ細胞のアポトーシス、
・親和性成熟、
・二次抗体応答の誘導、及び
・高親和性抗体を有する血清免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の調節。
【０００８】
同様に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＧＣモデルのデータによって、ＦＤＣが：
・マイトジェンでＢ細胞増殖を刺激すること（これは抗原（Ａｇ）によっても実証され得る）、
・抗体の産生、例えば再生抗体応答を促進すること、
・Ｂ細胞を引き付けるケモカイン及び或る特定の集団のＴ細胞を産生すること、及び
・Ｂ細胞のアポトーシスを遮断すること
に関与することが示される。
【０００９】
Ｔ細胞は、Ｔ細胞依存性抗原に対するＢ細胞応答に必要であるが、ほとんどのワクチンで要求される完全に機能的で成熟した抗体応答の発生には十分ではない。ＦＤＣは、Ｂ細胞がこれらの潜在性を完全に達成するのに必要な重要な補助を与える（Tew et al. (2001) Trends Immunol. 22, 361-367）。
【００１０】
ワクチン評価における体液性応答は、人工免疫システム（ＡＩＳ）を用いて調べることができる。濾胞樹状細胞の補助機能及びこれらの機能の調節は、完全に機能的で成熟した抗体応答を理解するのに重要である。
【００１１】
重要な分子は、ＦＤＣ又はＢ細胞上のリガンド及びレセプターを遮断することを特徴としている。ＦＤＣは抗原−抗体複合体を捕捉し、ＧＣのＢ細胞上のＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）との相互作用に対して無傷抗原を与え、この抗原−ＢＣＲの相互作用が、Ｂ細胞の活性化及び分化に対して正のシグナルを与える。補体由来ＦＤＣ−ＣＤ２１ＬによるＢ細胞コレセプター複合体におけるＣＤ２１の係合が重要な補助シグナルを伝達する。ＢＣＲ及びＣＤ２１の同時ライゲーション（Coligation）は、２つの受容体の連結を高め、ＣＤ１９の細胞質尾部は、Ｂ細胞レセプター複合体に関連するチロシンキナーゼによってリン酸化される（Carter et al. (1997) J. Immunol. 158, 3062-3069）。この補助シグナルは、抗原によるＢＣＲの係合によって伝達される刺激を劇的に高め、ＦＤＣ−ＣＤ２１Ｌの遮断によって免疫応答が約１０倍〜約１０００倍低減する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、動物被験体に投与せずに、アレルゲン、免疫原、免疫調節剤、免疫治療剤及び潜在的ワクチン剤の評価を可能にする人工免疫システムであって、
培養組織構築物、並びに
培養組織構築物内に包埋されるか、又はその上に固定される少なくとも１つの三次元人工胚中心であって、
濾胞樹状細胞、
Ｂ細胞、及び
Ｔ細胞
を含む、少なくとも１つの三次元人工胚中心
を含む、動物被験体に投与せずに、アレルゲン、免疫原、免疫調節剤、免疫治療剤及び潜在的ワクチン剤の評価を可能にする人工免疫システムに関する。
【００１３】
本発明の人工免疫システムは、作用物質に対する動物の潜在的な反応を評価する方法で用いることができる。このような方法は、作用物質を本発明の人工免疫システムに投与すること、及び当該作用物質に対するＢ細胞及び／又はＴ細胞の応答を評価することを含む。
【００１４】
本発明の人工免疫システムは、作用物質に特異的な抗体を産生する方法で用いることもできる。このような方法は、作用物質を本発明の人工免疫システムに投与すること、及び当該作用物質に特異的な抗体を人工免疫システムから単離することを含む。同様に、作用物質に特異的な抗体を産生するＢ細胞、又は作用物質に特異的なＴ細胞も、本発明の人工免疫システムから単離することができる。単離Ｂ細胞（対象の作用物質に対してモノクローナルであり得る）は、単離、クローン化及び不死化することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、ＧＣを三次元（３Ｄ）組織培養構築物（ＥＴＣ）に組み込むというこれまでに報告された研究に対する改善である。本発明の一実施形態では、本発明者等は人工免疫システム（ＡＩＳ）の設計でＧＣを組み込み、ワクチン、アレルゲン、免疫原、免疫調節剤、免疫治療剤及び他の作用物質に対する免疫（特に体液性）応答を調べている。本発明の一実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＧＣの発生によって、ヒト被験体を用いることなく正確に再生可能であるヒトＢリンパ球による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏヒト体液性応答を発生することができるという点で、ＡＩＳに機能性が付与される。本発明は、例えばワクチン、アレルゲン、免疫調節剤、免疫治療剤（immunogherapies）及び免疫原、並びに他の作用物質を評価し、また所与の抗原に特異的なヒトＢ細胞を活性化し、それからそれを用いて抗体を生成することもできる。本発明の一実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＧＣの機能は、３Ｄ  ＥＴＣ中にＦＤＣ及び他の免疫細胞を入れることによって高まり、ＦＤＣは長時間にわたってより有効になると思われる（抗体産生は最大１４日間持続される）。
【００１６】
本発明の実施形態は、ＦＤＣが三次元で発生することができる、ＥＴＣ、例えばコラーゲンクッション、ゼラチン、ヒアルロン酸、小腸粘膜下組織、膀胱粘膜、ＰＬＧＡ、ヒドロゲル、コラーゲンで覆われたプレート、マイクロキャリア、反転性コロイド結晶マトリクス、他の合成または天然の細胞外マトリクス材料中にＦＤＣを入れることを含む。ほとんどの免疫システムの細胞がそうであるように、ｉｎ  ｖｉｖｏ環境下でのＦＤＣはコラーゲン繊維と接着し、循環しない。したがって、例えばコラーゲンマトリクス中にＦＤＣを入れることは、よりｉｎ  ｖｉｖｏ様であるはずである。他の実施形態では、三次元でＧＣを作製することに加えて、ＥＴＣマトリクスによって与えられる足場（scaffolding）においてＧＣ、Ｔ細胞帯、Ｂ細胞帯を有する濾胞を発達させることができる。固定ＦＤＣが中心を形成し、ＦＤＣが分泌するケモカインが、活性濾胞の基本的特性を明らかにするのを助けることができる。
【００１７】
生産性の体液性免疫応答に重要な事象が起こる濾胞を再構築できるということは、ワクチンを評価するのに重要なことである。例えば、特定のワクチンに対する非応答者が見つかることは珍しくなく、このような人々は生ワクチンが与えられると危険にさらされる可能性がある。本発明の一実施形態では、このような非応答者は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫システムのモデルを確立すること、及び非応答状態又は低応答状態（poorly responsive state）を確定することによって、これらの個体が害を及ぼす危険性のある生ワクチンでチャレンジされる前に同定することができる。本発明の別の実施形態では、このような応答性の低い個体を良好な応答者に変えることができる免疫調節剤を同定し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用のために処方することができる。このようなアプローチには、ワクチン開発の時間及び費用を削減し、またワクチン効率を改善し、動物モデルに対する依存を減らす可能性がある。
【００１８】
本発明は、作用物質に特異的な抗体、作用物質に特異的な抗体を産生するＢ細胞、及び／又は作用物質に特異的なＴ細胞を産生するのに用いることもできる。このような実施形態では、作用物質（すなわち、ワクチン、アジュバント、免疫治療剤候補、化粧品、薬剤、生物製剤、炎症促進剤、化合物、アレルゲン、免疫原又は免疫調節剤）は、本発明の人工免疫システムに投与される。人工免疫システムが作用物質に対する免疫応答を生じるために十分な時間が経過した後に、作用物質に特異的な抗体、作用物質に特異的な抗体を産生するＢ細胞、及び／又は作用物質に特異的なＴ細胞が人工免疫システムから単離される。作用物質に特異的な抗体（任意でモノクローナル抗体）を産生する単離Ｂ細胞、及び抗原に特異的な単離Ｔ細胞をクローン化及び不死化することができる。Ｂ細胞及びＴ細胞を不死化する方法は当業者に周知である。例えば、Aguirre et al., (2000) J. Virol. 74(2): 735-743; and Robek et al. (1999) J. Viol. 73(6): 4856-4865を参照されたい。
【００１９】
加えて、幾つかの治療剤及び工業用化学薬品は免疫システムに対して毒性があり、他の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ胚中心を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫システムを用いて、ヒト免疫システムモデルに関して、免疫毒性及びアレルゲンの効果を評価することができる。本発明を用いて、免疫応答者を非応答者に変えることができる治療剤を評価することができ、これは抗体媒介性自己免疫障害の治療に有益であろう。
【００２０】
ＬＴβＲ−Ｉｇで動物を処置することによって、免疫複合体（ＩＣ）を保有するＦＤＣの能力が壊され、このことがＢ細胞由来ＬＴα／βヘテロ三量体に対する競合に起因しており、このようにしてＦＤＣを刺激する能力が低減することが観察された（Mackay & Browning (1998) Nature 395, 26-27）。これらの条件下で、ＦＤＣは、活性化表現型を失うと考えられ、ＩＣは消失する傾向にある。本発明者等は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて同様の結果を得ており、細胞がＬＴβＲ−Ｉｇとインキュベートされる場合に、抗体産生を促進し、Ｂ細胞アポトーシスを遮断するＦＤＣの機能が悪影響を受けることを示している。
【００２１】
本発明者等のデータは、ＬＴ又はＴＮＦの刺激の欠如の結果としてＦＤＣが死滅しないこと、及びＦＤＣは休止状態で長期間存在することができることを示す。実際、抗原性表現型（ＤＲＣ−１、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ３５に対して陽性）がわずか数日後に消失したが、増殖せずに細胞培養下で数ヶ月間、Ｂ細胞の非存在下でヒトＦＤＣが生存することが報告されている（Tsunoda et al. (1990) Virchows. Arch. B Cell. Pathol. Incl. Mol. Pathol. 59, 95-105）。マウスＦＤＣも、培養下で数ヶ月間生存することができ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＧＣで存在する場合、マウスＦＤＣはＴ細胞、Ｂ細胞、及び機能性免疫システムを維持する（Qin et al. (1999) J. Immunol. Methods 226, 19-27）。本発明者等は、精製マウスＦＤＣが、他の細胞の非存在下で長期間（少なくとも６週間）生存することができることを見出した。しかし、これらの休止ＦＤＣは、ＩＣ及び補体と共に、Ｔ細胞及びＢ細胞によるＦＤＣの刺激によって活性化することができると考えられる。
【００２２】
本発明者等は、ＦＤＣがＣＤ４０を発現し、新たに単離したＦＤＣに対するレベルがＢ細胞に対するレベルよりも高いと考えられることを見出しており、このことはＧＣのＴ細胞がＣＤ４０Ｌに対する誘引性レセプターを有し得ることを示唆している。ＣＤ４０の係合は、Ｂ細胞、樹状細胞及びマクロファージを活性化することが知られる。これらの免疫学的に関連した細胞の活性化におけるＣＤ４０の重要性を考慮すると、ＦＤＣ−ＣＤ４０は、ＦＤＣ活性化にも関与し得る（Caux et al. (1994) J. Exp. Med. 180, 1263-1272）。幾つかのＦＤＣマーカー（例えば、ＣＤ２３）がＴ細胞依存性であると考えられ、活性ＧＣにおけるＴ細胞上のＣＤ４０ＬによるＦＤＣ−ＣＤ４０の係合は、活性ＦＤＣ表現型の完全な発現に重要である可能性がある。ＦＤＣ−Ｍ２抗原及びＣＤ２１Ｌの発現は補体依存性である。今ではＦＤＣ−Ｍ２抗原はＣ４断片であることが知られており、これはＦＤＣ上でＩＣと共有結合する（Marie Kosco-Vilbois, personal communication）。同様に、Ｃ３断片はＩＣと共有結合して、ＣＤ２１Ｌを形成する（Qin et al. (1998) J. Immunol. 161, 4549-4554）。したがって、ＦＤＣの発生、成熟及び完全な活性化には、Ｂ細胞、Ｔ細胞及び補体が必要である。
【００２３】
本発明者等は、ＦＤＣの補助分子及び補助機能も調べている。ＦＤＣ、Ｂ細胞及びＴ細胞はＧＣで共に集合化され、本発明者等は依然として半透膜を越えて良好に働くＦＤＣ補助活性を見出していないので、細胞間接触は重要であると考えられる（Wu el al. (1996) J. Immunol. 157, 3404-3411; Tew et al. (1997) Immunol. Rev. 156, 39-52）。ＦＤＣは重要なサイトカインを産生することができるが、明らかに細胞表面分子はこれらの細胞間相互作用に重要である。幾つかの本発明者等のデータの総説がこれまでに公開された（Tew et al. (2001) Trends Immunol. 22, 361-367）。
【００２４】
免疫原は、前免疫（複数可）由来の免疫動物に残る抗体によって、免疫複合体（ＩＣ）に迅速に変わり、一次抗体が産生されるとすぐに一次応答でＩＣが形成される。これらのＩＣはＦＤＣによって捕捉され、これによってＧＣが形成される。免疫複合体はｉｎ  ｖｉｔｒｏでは免疫原性が低いが、最少量の抗原（ｉｎ  ｖｉｖｏでＩＣに変わる）によって、潜在的再生応答が引き起こされる。
【００２５】
本発明者等の結果は、ＦＤＣによってＩＣの免疫原性が高くなることを示している。実際、ＦＤＣの存在下で、ＩＣは遊離抗原よりも免疫原性が高い（Tew et al. (2001) Trends Immunol. 22, 361-367）。ＦＤＣ上の高密度のＦｃγＲＩＩＢは、ＩＣのＩｇ−Ｆｃと結合し、その結果、Ｂ細胞−ＦｃγＲＩＩＢを介して伝達されるＩＴＩＭ（免疫受容体チロシン系抑制モチーフ）シグナルが遮断され得る。ＢＣＲと架橋する抗原−抗体複合体が、この抑制シグナル及びＢ細胞上のＦｃγＲＩＩＢを引き起こす。ＢＣＲはこのモデルではＢ細胞のＦｃγＲＩＩＢと架橋せず、したがってＦＤＣ上の高濃度のＦｃγＲＩＩＢはＢ細胞に対する負のシグナルを最小にする。加えて、ＦＤＣは、Ｂ細胞によって非常に良好である（palatable）ことが見出されるＩＣに覆われたボディ（イコソーム（iccosomes））を与える。イコソーム膜は、抗原、ＣＤ２１Ｌ及び接着したＩｇ−Ｆｃを有するＦＤＣ膜に由来する。イコソームはＢ細胞と強く結合し、迅速にエンドサイトーシスを行う（Szakal et al. (1988) J. Immunol. 140, 341-353）。イコソームの抗原−ＣＤ２１Ｌ−Ｉｇ−Ｆｃ複合体とのＢ細胞のＢＣＲ及びＣＤ２１の結合は、エンドサイトーシスプロセスに重要であると考えられる。Ｂ細胞は、このＦＤＣ由来抗原を処理し、提示し、これによりＴ細胞ヘルプが得られる（Kosco et al. (1988) J. Immunol. 140, 354-360）。したがって、これらのリガンド−レセプターの相互作用はＢ細胞が刺激されるのを助け、Ｔ細胞によって与えられる補助を超えた補助が与えられる。
【００２６】
ＦＤＣ機能に関連した別の重要な分子はＣＤ２３である。本発明者等は、血清ＩｇＥが、高レベルのＣＤ２３がＦＤＣ及びＢ細胞及び幾つかのＴ細胞で発現される、ＣＤ２３トランスジェニックマウスで抑制されることを見出した（Payet-Jamroz et al. (2001) J. Immunol. 166, 4863-4869）。精製トランスジェニックＢリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＢ細胞増殖及びＩｇＥ合成アッセイにおける対照と比較したが、この２つは区別できなかった。同様に、リンフォカイン産生の研究によって、トランスジェニック動物のＴ細胞機能が正常であったことが示唆された。しかし、養子免疫伝達（adoptive transfer）研究によって、放射線耐性トランスジェニックＦＤＣにおけるＣＤ２３レベルが高いトランスジェニックマウスを再構築するのに正常なリンパ球を用いた場合、ＩｇＥ産生が劇的に抑制されることが示された。さらに、ＦＤＣがトランスジェニックマウスから単離された場合、細胞培養下でのＦＤＣ依存性ＩｇＧ産生は正常に近かったが、ＩｇＥ産生は劇的に低減し、これによってＦＤＣにおける高レベルのＣＤ２３はＩｇＥ応答を選択的に抑制することが示唆された（Payet-Jamroz et al. (2001) J. Immunol. 166, 4863-4869）。興味深いことに、ＩＬ−４はＢ細胞においてＣＤ２３を誘導するが、ＦＤＣにおいてはＣＤ２３を誘導しないと考えられる。しかし、完全フロインドアジュバンド（ＣＦＡ）を用いて免疫したマウスでは、ＦＤＣにおけるＣＤ２３のレベルが劇的に増大する（Maeda et al. (1991) In 「リンフォイド組織の樹状細胞（Dendritic Cells in Lymphoid Tissues）」 Y. Imai, J. G. Tew & E. C. M. Hoefsmit, eds. Elsevier Science, Amsterdam, pp. 261-269）。ＣＤ２３が上昇すると、ＦＤＣにおける非占有ＣＤ２３がＢ細胞表面−ＩｇＥと結合し、このことがＩｇＥ産生の阻害をもたらし得る。このように、ＣＤ２３レベルが高いＦＤＣは、特異的なＩｇＥ応答を選択的に下方調節する可能性があり、このことによってＣＦＡ免疫動物におけるＩｇＥ応答が比較的低い理由が説明できる。さらに、ＣＦＡとの関連性によって、ＦＤＣにおけるＣＤ２３がＴｈ−１リンフォカインによって調節され得ることが示唆される。
【００２７】
ＦＤＣで捕捉されたＩＣによってＧＣが形成される。ＧＣ形成には、記憶Ｂ細胞の産生、体細胞超変異、高親和性レセプターによる体細胞変異したＢ細胞の選択、親和性成熟、及び高親和性抗体による血清ＩｇＧの調節が関与する（Tew et al. (1990) Immunol. Rev. 1 17, 185-211; Berek & Ziegner (1993) Immunol. Today 14, 400-404; MacLennan & Gray (1986) Immunol. Rev. 91, 61-85; Kraal et al. (1982) Nature 298, 377-379; Liu et al. (1996) Immunity 4, 241-250; Tsiagbe et al. (1992) Immunol. Rev. 126, 113-141）。
【００２８】
ＧＣは記憶Ｂ細胞の産生の中心として一般的に認識され、本発明者等は、形質細胞系の細胞も産生されることを見出している（Kosco et al. (1989) Immunol. 68, 312-318; DiLosa et al. (1991) J. Immunol. 1460, 4071-4077; Tew et al. (1992) Immunol. Rev. 126, 1-14）。ＧＣにおける抗体形成細胞（ＡＦＣ）の数は初期段階の間に最大になり（二次抗原チャレンジ後、約３〜約５日）、それから減少する。ＧＣの大きさが最大に達する約１０日までに、ＡＦＣはほとんど存在しなくなる（Kosco et al. (1989) Immunol. 68, 312-318）。初期段階の間、ＧＣのＢ細胞が、ＡＦＣになるのに必要なシグナルを受け取る。ＧＣが浮腫状になり、ＡＦＣは離れ、胸管リンパ中及び血中に見られるようになる。これらのＧＣのＡＦＣが成熟する場合、骨髄に存在し、大部分の血清抗体を産生する（DiLosa et al. (1991) J. Immunol. 1460, 4071-4077; Tew et al. (1992) Immunol. Rev. 126, 1-14; Benner et al. (1981) Clin. Exp. Immunol. 46, 1-8）。チャレンジ後、約１０〜１４日で最大になる第２段階において、ＧＣが大きくなり、記憶Ｂ細胞プールが回復し拡大する。これにより、記憶Ｂ細胞の産生及び完全に機能的で成熟した抗体応答には、ＧＣとＦＤＣとが必要であると考えられる。
【００２９】
ＦＤＣの有無に関わらず、Ｂ細胞の生存率を上げ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＧＣの有効性を高めることができる。方法は、線維芽細胞又は他の間質細胞、例えば滑膜組織由来間質細胞株を加えることであり、この効果は細胞間の共刺激によってｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＢ細胞の生存を延ばすことである（例えば、Hayashida et al. (2000) J. Immunol, 164, 1110-1116）。ナイーブＢ細胞及び記憶Ｂ細胞の生存率を増大させることが示されている別の可溶性作用物質は還元型グルタチオン（ＧＳＨ）であり、おそらくは抗酸化活性による（Jeong et al. (2004) Mol. Cells 17, 430-437を参照されたい）。Jeong et al.は、ＧＣのＢ細胞の生存率を増大しなかったが、線維芽細胞及びＧＳＨは、ナイーブＢ細胞及び記憶Ｂ細胞を大いに高め、末梢Ｂリンパ球を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＧＣを集合化することができることを示唆した。他の可溶性因子、例えばＩＬ−４、ＣＤ４０Ｌ及び抗ＣＤ４０はＢ細胞の生存率を高めることが示されている（L. Mosquera's work and M. Grdisa (2003) Leuk. Res. 27, 951-956）。ＦＤＣの有無に関わらずＢ細胞の生存率を増大させる付属因子及び細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＧＣ性能を高める。
【００３０】
他の白血球に比べて、ＦＤＣはほとんど注目を浴びていない。ＦＤＣの理解は、Ｂリンパ球の成熟及び抗体産生を理解するために重要である。このＦＤＣに対する情報の不足は、これらの細胞が珍しく、壊れやすいためであろう。より典型的な白血球の知識は主に、単離集団のｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究から得られている。
【００３１】
本発明者等は、ＦＤＣを用いて単離研究する技法を開発し、ＦＤＣ−リンパ球の相互作用はこれより、抗原、抗原−抗体複合体、及びポリクローナルＢ細胞活性因子と共にｉｎ  ｖｉｔｒｏで研究され得る。Ｂ細胞と相互作用する場合、適切なＩＣを有するＦＤＣは顕著な補助活性を有し：
・Ｂ細胞のアポトーシスを遮断し（Schwarz et al. (1999) J. Immunol 163, 6442-6447; Qin et al. (1999) J. Immunol. Methods 226, 19-27）、
・ＩＣで刺激したＢ細胞のＩＴＩＭ（免疫受容体チロシン系抑制モチーフ）シグナル伝達を遮断し（Aydar et al. (2004) Eur. J. Immunol. 34, 98-107）、
・抗原又はマイトジェンで刺激したＢ細胞増殖を促進し（Burton et al.(1993) J. Immunol. 150, 31-38）、
・再生応答を促進し（Tew et al. (2001) Trends Immunol. 22, 361-367）、
・ＩｇＭを産生するようにバージンＢ細胞を誘導し、ＩｇＧへのクラススイッチを促進し（Kraal et al. (1982) Nature 298, 377-379; Liu et al. (1996) Immunity 4, 241-250; Aydar et al. (2005) J. Immunol. 174, 5358-5366）、
・体細胞超変異及び高親和性抗体の発生を促進する（Aydar et al (2005) J. Immunol. 174, 5358-5366）
ことができる。これらは、体液性免疫応答の重要な特性である。
【００３２】
ｉｎ  ｖｉｖｏのＦＤＣはコラーゲンとコラーゲン関連分子とが連結した網目構造に存在する。この連結によって、ＦＤＣ網目構造を同じ状態に保つことができ、一方で、Ｂ細胞及びＴ細胞がＦＤＣ及び関連抗原と接触するように、また接触しないように動く。この配置は本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏのＧＣで再構築されている。
【００３３】
本発明者等は、ＦＤＣがＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ビグリカン、フィブロネクチン、及びヒアルロン酸に接着する能力を有することを立証している。さらに、本発明者等は、コラーゲンに接着するＦＤＣが相互連結プロセスで細網（reticulum）を再生することを立証している。このコラーゲン及びコラーゲン関連分子に接着する能力は、プラスチック又はガラスに直接接着する能力の欠如と対照的である。本発明者等のデータは、ＦＤＣがコラーゲン及びコラーゲン関連分子と接着する場合に抗体応答が改善されることを示す。
【００３４】
ワクチン接種部位モデル
樹状細胞（ＤＣ）は最も強力な抗原提示細胞（ＡＰＣ）の１つであり、一次免疫応答においてナイーブＴ細胞を刺激する能力がある細胞株で唯一知られているものである。末梢血単球は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＤＣ生成のための前駆細胞の確かな供給源として広く認知されている。このような単球由来のＤＣ（ｍｏ−ＤＣ）は、ｉｎ  ｖｉｖｏのＤＣで見出される全表現型及び抗原提示能を有する（posses）。
【００３５】
ｍｏ−ＤＣに一般的な生成技法は、５日間、サイトカインＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を用いることに基づき、未成熟表現型の細胞をもたらす。その後２日間の抗原の初回刺激（priming）の後、ｍｏ−ＤＣは共刺激能及び抗原提示能を増大し、成熟と呼ばれる状態になる。
【００３６】
興味深いことに、Randolph et al.は、単球の経内皮移動の自然発生的に起こり得るプロセスが、外因性サイトカインを加えずにちょうど２日でＤＣに分化するプロセスを誘導することを見出した。このプロセスは、管腔方向から管腔外（abluminal）方向へ内皮細胞の単層を横切る単球から始まり、その後細胞外マトリクス（特異的な抗原を含有しやすい）内での静止（相互作用）の４８時間後、管腔表面に逆移動する。
【００３７】
本発明の実施形態において、ワクチン接種部位モデルは、Ｉ型ウシコラーゲンマトリクス（クッション）を超えるコンフルエンシーまで培養した単層の内皮細胞（ヒト臍帯静脈内皮細胞、ＨＵＶＥＣ）を含む。コラーゲンの代わりに様々なＥＣＭ材料を用いて、他のワクチン接種部位モデルを利用することもできる。本発明の実施形態では、ＥＣＭは、クッション又は膜配置、或いはポリカーボネート又は他の膜（例えばトランスウェル）上で培養した内皮中に存在し得る。全単球分化プロセスは、組織への単球の自然発生的漏出が、管腔外方向から管腔方向に内皮細胞を横切ることによってリンパ管の管腔へと抜ける組織耐性マクロファージ及び移動性樹状細胞を発生させる場合にｉｎ  ｖｉｖｏで起こると考えられるものに類似している。他の実施形態では、ＤＣ成熟は、マトリクス中に包埋された刺激物の存在に基づき達成することができる。 
【００３８】
本発明者等は、移動性末梢血単球から未成熟ＤＣを生成するｉｎ  ｖｉｔｒｏシステムを開発している。本発明の実施形態では、このシステムには、内皮細胞のコンフルエント単層で各側面を封止するコラーゲン膜が含まれる。集積バイオリアクターにおけるこのｉｎ  ｖｉｔｒｏワクチン接種部位（ＶＳ）の集合化によって、独立した液体流を有する２室装置（bicameral device）が作製される。上のチャンバは連続循環単球を含有し、下のチャンバはｉｎ  ｓｉｔｕでいつでも抗原的に初回刺激できるように移動性未成熟ＤＣを受ける。所定期間後、抗原的に活性化したｍｏ−ＤＣは再局在化し（例えば、ゆっくりした流れ又はケモカイン誘引によって）、特異的免疫応答の誘導のために予め準備された（pre-established）リンパ組織等価物（ＬＴＥ）に残存し得る。これらのｍｏ−ＤＣはＧＣも含有するＬＴＥにおいて免疫応答を誘導する。
【実施例】
【００３９】
特に指示がない限り、全ての培養条件を反復し（検定力に従って３〜６反復）、遮断抗体をある範囲の濃度（典型的には約１、約１０、約１００μｇ／ｍＬ）で用い、実験は再現性が確立されるまで繰り返した。典型的には、抗原−抗体複合体における抗原の用量は約１０〜約５０ｎｇ／ｍＬであり、わずかに抗原が過剰なこれらの抗原−抗体複合体を予め作製し、刺激活性を最適にする。ＥＬＩＳＡを用いて、抗体（抗ＮＩＰ、抗ＴＴ、又は全ＩｇＧ）のレベルを測定する（１ｍＬ当たりの抗体（ｎｇ）として表される）。
【００４０】
所定の抗原特異性を有するＢ細胞の頻度は、Crotty et al. (2004) J. Immunol. Meths. 286, 111-122で記載されるような改良ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで求めることができる。簡潔には、ＡＩＳから単離したＢ細胞は、ＥＬＩＳＰＯＴプレートにおいてプレート結合抗原で約５時間刺激する。特定の抗原に特異的な活性化Ｂ細胞は抗体を分泌し、プレート結合タンパク質上で捕捉する。捕捉抗体は比色検定で検出することができ、スポットの数によって、応答細胞の頻度が高感度で求められる。分泌サイトカインへの類似のＥＬＩＳＰＯＴに基づいたアプローチを用いて、ＡＩＳ内で産生した抗原特異的Ｔ細胞の数を推測することもできる。別の実施形態では、抗原特異的刺激後に産生されるサイトカインに対する細胞内標的化が同様の読み出し（readout）を与え得る。破傷風トキソイド等の明確な抗原に対して、特定のペプチドを有するＭＨＣ分子の三量体複合体を用いて、Ｔ細胞レセプター自体の直接検出によって、抗原特異的Ｔ細胞の頻度を求めることができる。
【００４１】
活性化Ｂ細胞及びＴ細胞の直接分析は、抗原遭遇後の様々な時点で、リンパ球を培養組織構築物（ＥＴＣ）マトリクスから単離することによっても行うことができる。様々なＥＴＣ材料が細胞をマトリクスから解離させる異なるアプローチを必要とする。例えば、コラゲナーゼを用いて、コラーゲン足場（collagen scaffold）を破壊することができる。
【００４２】
Ｂ細胞及びＴ細胞の活性化の特性は、抗原遭遇後に細胞が迅速に増殖することである。リンパ球応答の強度を調べるために、蛍光色素ＣＦＳＥで細胞を予め標的化した後に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのリンパ節と考えられ得るリンパ組織等価物（ＬＴＥ）に細胞を導入することによって、Ｂ細胞及びＴ細胞の増殖を追跡することができる。ＣＦＳＥは、酵素反応を介して細胞質タンパク質と結合する安定で長寿命の分子である。この分裂高感度色素は、細胞分裂後の娘細胞間で等しく分配され、したがってそれぞれの分裂細胞は親細胞のＣＦＳＥ蛍光強度の半分である。フローサイトメトリ分析によって、増殖細胞集団内で最大で約８〜約１０個の細胞分裂を検出することができる。
【００４３】
リンパ球の活性化は、Ｂ細胞及びＴ細胞の機能を調節する膜タンパク質の発現の変化にも関連する。ナイーブＢ細胞の活性化の特徴は、表面のＩｇＭから他の抗体クラス（特にＩｇＧ）への発現の切り替えである。さらに、表面のＭＨＣ及び補助分子、例えばＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ８０及びＣＤ８６の上方調節発現がＢ細胞の活性化を示唆し、表面のＣＤ２７の発現の増大が、Ｂ細胞における記憶表現型の獲得の特徴となる。Ｔ細胞の活性化は、分子の移動（ＣＤ１１ａ、ＣＤ６２Ｌ）及び活性化（ＣＤ２８、ＣＤ２５）を調節する分子の発現の変化に関連する。これらの表面分子の発現パターンの変化は、標準的なフローサイトメトリ技法及び市販の抗体（例えば、BD Pharmingen, CA製の抗体）を用いてモニタリングすることができる。
【００４４】
可溶性増殖因子の産生を用いて、抗原特異的なリンパ球応答の誘導を評価することができる。分泌サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−６及びＩＬ−１０が含まれるが、これらに限定されない）は、抗原遭遇後に検出することができる。特定のＴ細胞亜集団だけによって発現される或る特定のサイトカインプロファイル、例えばＩＬ−４及びＩＬ−１０の発現によって、生じる適応応答の質の手掛かりが与えられ得る。現在、市販の反応試薬によって、ｐｇ／ｍＬ範囲の濃度で可溶性サイトカインの検出が可能である。
【００４５】
抗原投与後、約７日〜約１４日にＡＩＳのリンパ組織等価物（ＬＴＥ）内の適応免疫応答の発生を調べることができるが、典型的にこの時間がｉｎ  ｖｉｖｏ応答及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ応答中の測定可能な保護免疫の導入に必要となる。Ｂ細胞及びＴ細胞の活性化／分化の指標となる可溶性タンパク質の発現パターンの変化は、ＬＴＥから回収した上清において調べることができる。具体的には、Ｂ細胞の活性化が、市販の反応試薬（例えば、Bethyl Laboratories, TX製の反応試薬)を用いたＥＬＩＳＡによって定量化することができる分泌抗体分子の産生を誘発する。この高感度技法を用い、様々なＩｇクラス（ＩｇＭ、ＩｇＧ等）の発現を調べることによって、Ｂ細胞の成熟／分化の重要な特徴であるクラススイッチを検出することができる。抗原特異的抗体産生を求めるために、全タンパク質を用いて、ＥＬＩＳＡにおける特異的抗体を捕捉することができる。例えば、既知の（well-established）ＮＰ実験モデルにおいて、ＮＩＰ−５及びＮＩＰ−１９を用いて、それぞれ高親和性及び高／低親和性を有するＮＰに対する抗体の産生を特異的に検出することができる。
【００４６】
実施例１
動物及び免疫
正常な８〜１２週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスをNational Cancer Institute（Frederick, MD）又はThe Jackson Laboratory（Bar Harbor, ME）から購入することができる。マウスは、上部にフィルターを備えた標準的なプラスチック製のケージに入れ、特定の病原体無含有状態を維持した。食餌及び水は自由に与えることができる。ＣＧＧ（ニワトリγグロブリン）初期刺激Ｔ細胞が、２０μｇのＣＧＧ（Pel-Freez Biologicals, Rogers, Arkansas）で免疫後に得られ、約５×１０８個の熱殺菌した百日咳菌が、これまでに記載されたように（５、２８）硫酸アルミニウムカリウム（Ａ７１６７、Sigma）中に析出した。約５０μｇのＣＧＧの腹腔内注射、並びに約５μｇのＣＧＧの前肢及び後足蹠への皮下注射の２週間後、追加免疫（booster immunization）を行った。
【００４７】
実施例２
抗体及び試薬
マウスＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）マイクロビーズ、マウスＣＤ９０（Ｔｈｙ１．２）マイクロビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、及びＭＡＣＳ  ＬＳカラムは、Miltenyi Biotec GmbH（Auburn, CA）から購入することができる。ビオチン標識化ラット抗マウスκは、Zymed（San Francisco, CA）から購入することができる。アルカリホスファターゼ標識化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、及びアルカリホスファターゼ標識化ヤギ抗マウスＩｇＭは、例えばKirkegaard & Perry Laboratories（Gaithersburg, MD）から購入することができる。抗マウスＦＤＣ（ＦＤＣ−Ｍ１）及び抗マウスＣＤ２１／ＣＤ３５は、例えばPharmingen （San Diego, CA）から購入することができる。ＮＩＰ１９−ＯＶＡ（１つのＯＶＡ当たり１９個のＮＩＰ基を有する４−ヒドロキシ−３−ヨード（ioda）−５−ニトロフェニルアセチルオボアルブミン）、ＮＩＰ５−ＯＶＡ（１つのＯＶＡ当たり５つのＮＩＰ基を有する）、及びＮＰ３０−ＣＧＧは、例えばBiosearch Technologies（Novata, CA）から得ることができる。ラット抗マウスＣＤ４０は、例えばSouthern Biotechnology Associates, Incから得ることができる。ｌｏｗ−ｔｏｘ−ｍウサギ補体は、例えばCedarlane Laboratories Limited（Westbury, NY）から購入することができ、熱不活性化は、５６℃で約３０分間、水浴で補体をインキュベートすることによって達成された。ＮＰ−ＣＧＧ抗ＣＧＧのＩＣは、１ｎｇ／ｍｌのＮＰ−ＣＧＧから６ｎｇ／ｍＬのマウス抗ＣＧＧとの最終比で３７℃で２時間、抗原及び抗体をインキュベートすることによって調製した。抗ＣＧＧは、１ｍｇ／ｍｌを上回る抗ＣＧＧのＩｇＧレベルで高度免疫マウスから得られた。或る特定の実験では、２時間のインキュベート中、１２倍希釈でｌｏｗ−ｔｏｘ−ｍウサギ補体を用いて補体担持（complement-bearing）ＩＣを作製した。抗ＣＤ２１／３５は、Pierce（Rockford, IL）のＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２精製キット（カタログ番号４４８８８）を用いて、Ｆ（ａｂ’）２断片に変換した。抗ＣＤ２３（クローンＢ３Ｂ４）は、Dr. Daniel Conradによって与えられた。
【００４８】
実施例３
ＦＤＣ単離
ＦＤＣは、これまでに記載されたように（５、２８）、正常で若年成体マウスのリンパ節（腋窩リンパ節、外側腋窩リンパ節、鼠径リンパ節、膝窩リンパ節、腸間膜リンパ節、及び大動脈周囲リンパ節）から単離した。簡潔には、ＦＤＣ単離の１日前に、マウスの全身を放射線に曝し、ほとんどのＴ細胞及びＢ細胞を排除した（１３７Ｃｓソースを用いて、１０００ｒａｄ）（Kosco et al. (1992) J. Immunol. 148, 2331-2339）。リンパ節を回収し、２つの２６ゲージ針を用いてそれぞれのリンパ節カプセルを開いた。それから、リンパ節を、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２ｍＭのグルタミン、５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、及びＭＥＭ非必須アミノ酸（GIBCO）を補充した１ｍｌのコラゲナーゼＤ（１６ｍｇ／ｍＬ、Ｃ−１０８８８８２、Roche）、０．５ｍＬのＤＮａｓｅＩ（５０００単位／ｍＬ、Ｄ−４５２７、Sigma）、及び０．５ｍＬのＤＭＥＭから成る酵素カクテルに入れた。ＣＯ２インキュベータ中で３７℃で３０分後、培地及び放出細胞を取り出し、２０％のＦＣＳと共に５ｍＬのＤＭＥＭを含有する１５ｍＬ容の円錐形の遠心管に移し、氷上に置いた。新たな一定分量の酵素混合物中で残存組織をさらに（second）３０分消化して、細胞をこれまで通り回収した。単離細胞を洗浄した後、氷上で４５分間、ラット抗マウスＦＤＣ特異的抗体（ＦＤＣ−Ｍ１）とインキュベートした。細胞を洗浄し、氷上で４５分間、κ軽鎖に特異的なビオチン化抗ラットＩｇ  １μｇとインキュベートした。それから、細胞を３６０μＬのＭＡＣＳ緩衝液に加えた４０μＬの抗ビオチンマイクロビーズ（Miltenyi Biotec）と氷上で１５〜２０分間インキュベートした。予め１ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液で湿らせたＭＡＣＳ  ＬＳカラム上に細胞を堆積させ、１０ｍＬの氷冷ＭＡＣＳ緩衝液で洗浄した。ＬＳカラムをＶａｒｉｏＭＡＣＳから取り出し、結合細胞を１０ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液で放出させた。これらの細胞の約８５〜９５％が、ＦＤＣ表現型、ＦＤＣ−Ｍ１＋、ＣＤ４０＋、ＣＲ１＆２＋、及びＦｃγＲＩＩ＋を発現した（Sukumar et al.,非公開)。ヒトＦＤＣは、これまでに記載されるように、ＦＤＣ特異的ｍＡｂ  ＨＪ２による正の選択を用いて単離することができる（Fakher et al. (2001) Eur. J. Immunol. 31, 176-185）。
【００４９】
実施例４
ＡＩＤ（活性化誘導性シチジンデアミナーゼ）の分析のための細胞培養物
リンパ球（約４×１０６個）は、５％のＣＯ２雰囲気下で３７℃で約２日間、４８ウェル培養プレート（CoStar; Cambridge, MA）において約１．６×１０６個のＦＤＣと共培養した。ウェルは、約１ｍＬ／ウェルの完全培地（１０％のＦＣＳ、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２ｍＭのグルタミン、５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、及びＭＥＭ非必須アミノ酸を補充したＤＭＥＭ）を含有していた。１０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ（Ｌ−２３８７、Sigma）又は１００ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ４０＋１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４（R&D Systems, Minneapolis, MN）を用いて、リンパ球を刺激した。ＦＤＣ共刺激活性が準最適（Sub-optimal）濃度の一次シグナルで最も明らかであったので、準最適レベルのＬＰＳ、抗ＣＤ４０＋ＩＬ−４を用いた。ＦＤＣの影響はより高濃度の一次シグナルでも明らかなままであったが、その差はより小さく、研究するのがより難しかった。４８時間後、細胞を回収し、トリゾール（Invitrogen）を用いて溶解して、全ＲＮＡを製造業者のプロトコルに従い抽出した。幾つかの実験では、７２時間、ＦＤＣの存在下又は非存在下で、λ＋Ｂ細胞及びＣＧＧ初回刺激Ｔ細胞及びＮＰ−ＣＧＧ＋抗ＣＧＧ免疫複合体を培養した。７２時間の終わりに、抗Ｂ２２０マイクロビーズ及びＭＡＣＳシステムを用いて、Ｂ細胞を単離した。トリゾールを用いて、約２×１０６個のＢ細胞から全ＲＮＡを抽出した。
【００５０】
実施例５
定量逆転写酵素ＰＣＲ分析
ＡＩＤ（活性化誘導性シチジンデアミナーゼ）に対するｍＲＮＡレベルを、定量逆転写酵素ＰＣＲ（ｑＲＴ  ＰＣＲ）を用いて測定した。１８ｓ  ｒＲＮＡレベルを内部対照として用いて、ＡＩＤの発現レベルを正規化した。透明な光学品質のシールテープ（Bio-Rad）で覆った９６ウェル薄壁ＰＣＲプレートでＰＣＲ反応を行った。以下の条件下で、ワンステップＲＴ−ＰＣＲキット（Applied Biosystems）を用いて増幅を行った：４８℃で３０分間（ｃＤＮＡ合成）、９５℃で１０分間の最初の変性、その後の９５℃で１５秒間の変性、そして６０℃で１分間のアニーリング／伸長工程の組合せを４０サイクル。ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱソフトウェア（BioRad）を用いてデータ解析を行った。最終的に、ΔΔＣＴ法（Livak & Schmittgen (2001) Methods 25, 402-408）を用いて、ｍＲＮＡ発現レベルの差を算出した。ＰＣＲ効率は、ｍＲＮＡの連続希釈を用いて複数の標準曲線を作成することによって、１００％近くまで求められた。蛍光シグナルが任意の閾値を超える（cross）ＰＣＲサイクルの数として定義される増幅サイクルの閾値（ＣＴ値）は、それぞれの反応において算出された。ｍＲＮＡ発現レベル間のホールド変化は以下のように求めた：ホールド変化＝２−ΔΔＣＴ（式中、ΔΔＣＴ＝（ＣＴ  Ｇｏｌ−ＣＴ  Ｈｋ）サンプル−（ＣＴ  Ｇｏｌ−ＣＴ  Ｈｋ）対照（ＣＴ＝サイクル閾値、Ｇｏｌ＝対象の遺伝子、及びＨｋ＝ハウスキーピング遺伝子）。
【００５１】
実施例６
ナイーブＢ細胞の調製
完全培地（１０％のＦＣＳ、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２ｍＭのグルタミン、５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、及びＭＥＭ非必須アミノ酸を補充したＤＭＥＭ）において２つの滅菌スライドの曇り端（frosted ends）の間でナイーブマウス由来のリンパ節をグラインドすることによって、単一の細胞懸濁液を調製した。懸濁細胞を遠心分離し（５分、１０００ｒｐｍ、４℃）、完全培地で再懸濁した。抗Ｂ２２０担持マイクロビーズを用いて、κ＋λ陽性Ｂ細胞（全Ｂ細胞）が正に選択された。簡潔には、リンパ球は、氷上で１５〜２０分間、４０μＬの抗Ｂ２２０マイクロビーズ（ＭＡＣＳ緩衝液中で１０倍希釈）とインキュベートした。１ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液で予め湿らせたＭＡＣＳ  ＬＳカラム上に細胞を積層させ、１０ｍＬの氷冷ＭＡＣＳ緩衝液で洗浄した。ＬＳカラムをＶａｒｉｏＭＡＣＳから取り出し、１０ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液によって結合した細胞を放出させ、洗浄して、κ＋λ陽性Ｂ細胞として用いた。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの抗ＮＰ抗体は主にλ軽鎖を有し（Jack et al. (1977) Eur. J. Immunol. 7, 559-565; Reth et al. (1978) Eur. J. Immunol. 8, 393-400）、本発明者等は、λ陽性ナイーブＢ細胞が培養下で豊富であった場合、ＮＰ応答が高められると結論付けた。λ陽性ナイーブＢ細胞を得るために、本発明者等は、氷上で４５分間、１０μｇのκ軽鎖特異的ビオチン化ラット抗マウスｍＡｂを用いて、κ陽性Ｂ細胞を取り除き、抗ビオチンマイクロビーズ（Miltenyi Biotec）でＭＡＣＳカラム上にκ陽性Ｂ細胞を捕捉した。本発明者等は、通過液中のＢ２２０陽性細胞がλ鎖を発現し、この細胞が上記のように抗Ｂ２２０を用いて単離したと結論付けた。ナイーブＢ細胞が膜ＩｇＭを発現し、本発明者等のナイーブＢ細胞集団におけるＩｇＭの存在をフローサイトメトリによって確認した。正常なマウス由来のリンパ節細胞の単細胞懸濁液は、ＦＩＴＣ  Ｂ２２０、ＰＥ結合抗マウスＩｇＭ、及びビオチン標識化ラット抗マウスλで三重標識化した。この結果によって、本発明者等のＢ細胞の約９５％がλ軽鎖よりもむしろκ軽鎖を発現したことが示された。しかし、λ軽鎖を発現した細胞の９８％近くがＩｇＭ陽性であり、これはナイーブ状態のＢ細胞であると予測される。これらのドナーマウスの血清抗ＮＩＰレベルは測定するのに低く（１ｎｇ／ｍＬ未満）、またナイーブ特性のＮＩＰ特異的Ｂ細胞を支持した。同じアプローチを用いて、ナイーブヒトＢ細胞をＰＢＬから得ることができ、マーカーはＩｇＭ陽性及びＣＤ１９陽性である。
【００５２】
実施例７
ＣＧＧ初回刺激Ｔ細胞の単離
ＣＧＧ追加免疫後１週間以上、ＣＧＧ免疫マウスのリンパ節を排出することによってＣＧＧ初回刺激リンパ球が得られた。リンパ節は外科的に取り除かれ、２つの滅菌スライドの曇り端間でグラインドした。細胞を洗浄し、氷上で約４５分間４０μＬのマウス抗ＣＤ９０（Ｔｈｙ１．２）マイクロビーズ（ＭＡＣＳ緩衝液中１０倍希釈）とインキュベートし、それから１ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液で予め湿らせたＭＡＣＳ  ＬＳカラム上に堆積させ、約１０ｍＬの氷冷ＭＡＣＳ緩衝液で洗浄した。ＬＳカラムをＶａｒｉｏＭＡＣＳから取り出し、上記のように結合した細胞を回収した。血清陽性ヒト由来のＴＴ（破傷風トキソイド）初回刺激Ｔ細胞を抗ＣＤ２で得ることができる。
【００５３】
実施例８
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＧＣ反応及び抗ＮＩＰ抗体応答
４８ウェル培養プレート（CoStar; Cambridge, MA）において、ナイーブλ陽性Ｂ細胞（約１０×１０５細胞数／ｍＬ）、ＦＤＣ（約４×１０５細胞数／ｍＬ）、及びＣＧＧ初回刺激Ｔ細胞（約５×１０５細胞数／ｍＬ）を、ＮＰ−ＣＧＧ＋抗ＣＧＧ  ＩＣ（１つのウェル当たり１００ｎｇのＮＰ−ＣＧＧ）と共培養することによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＧＣ反応を起こさせた。このウェルは、１ｍＬ／ウェルの完全培地（１０％のＦＣＳ、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２ｍＭのグルタミン、５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、及びＭＥＭ非必須アミノ酸を補充したＤＭＥＭ）を含んでいた。ＩＣをＮＰ−ＣＧＧ及び抗ＣＧＧ血清を用いて調製し、リンパ球を刺激するのに用いた。培養物を５％のＣＯ２雰囲気下、３７℃でインキュベートした。上清液を７日及び１４日で回収し、固相ＥＬＩＳＡを用いて、ＮＩＰ特異的な低親和性及び高親和性のＩｇＭ抗体及びＩｇＧ抗体に対して分析した。それぞれの実験群を三連で構成した。
【００５４】
実施例９
抗ＮＩＰ及び親和性に対するＥＬＩＳＡ
異なる比率でＮＩＰと結合するＯＶＡ、それぞれＮＩＰ１９−ＯＶＡ及びＮＩＰ５−ＯＶＡによるＥＬＩＳＡを用いて、抗ＮＩＰ抗体の相対的親和性を求めた。ＮＩＰは、ＮＰよりも抗ＮＰ抗体に対する親和性が高く、この理由からＮＩＰを用いた（４４、４５）。簡潔には、４℃で一晩、ＰＢＳ中で平底９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Falcon; Becton Dickinson, CA）を１００μｇ／ｍＬのＮＩＰ５−ＯＶＡ又はＮＩＰ１９−ＯＶＡで覆った。０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有する１×ＰＢＳで三回プレートを洗浄した後、プレートをＢＳＡで遮断した（５％、２時間、室温）。それから、応答が低いウェルに対して２倍希釈から始めて、培養物由来の上清液をプレートに加え、４℃で一晩インキュベートした。マウスのＩｇＭ又はＩｇＧに特異的なアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗体を加え、一晩インキュベートした。ｐＮＰＰホスファターゼ基質キット（Kirkegaard & Perry Laboratories, MD）を用いて、アルカリホスファターゼ活性を視覚化し、最適密度を４５０ｎｍで求めた。プレートを１００μｇ／ｍＬの親和性精製ヤギ抗マウスのＩｇＭ又はＩｇＧ（Sigma, Saint Louis, MO）とインキュベートすることによって、ＩｇＭ又はＩｇＧに対する標準曲線を定めた。それから、プレートを洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬから始まる２倍希釈のマウスのＩｇＭ又はＩｇＧ（Sigma）とインキュベートし、このプレートを４℃で一晩インキュベートした。標準曲線をそれぞれのプレートで作成し、直線用量範囲で標準曲線と比較することによって、抗ＮＩＰのＩｇＭ抗体又はＩｇＧ抗体の濃度を算出した。抗体の相対的親和性が、ＮＩＰ１９−ＯＶＡを用いる抗体のレベルによって示され、高い親和性の抗ＮＩＰだけを示すＮＩＰ５−ＯＶＡに対して高親和性及び低親和性の両方の抗ＮＩＰを測定する。
【００５５】
実施例１０
統計分析
ＥＬＩＳＡ読みの分析に対して、ｔ検定（両側分布）を用いた。幾つかの実験では、最大５つの異なる比較を行い、複数の比較でｐ値が０．０１未満である必要があった。Livak & Schmittgen(2001)（Methods 25, 402-408）で記載した２−ΔΔＣＴ法を用いて、リアルタイム定量ＰＣＲ結果を分析した。
【００５６】
実施例１１
組織化学的手法
「光学顕微鏡レベル及び電子顕微鏡レベルでの免疫細胞化学におけるモノクローナル抗体の使用（Use of monoclonal antibodies in immunocytochemistry at the light and electron microscopic levels）」と題された章（Szakal et al. (1986)「モノクローナル抗体：ハイブリドーマ技法（Monoclonal Antibodies: Hybridoma Techniques）」 L. B. Schook, ed. Marcel Dekker, Inc, New York, pp. 229-263）は、これらを詳細に記載している。ビオチン化プローブが、ＨＲＰアビジンの使用を可能にさせ、光学顕微鏡レベル及び電子顕微鏡レベルの両方の研究を可能にする。
【００５７】
実施例１２
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＧＣに関する研究。ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＧＣにおけるＮＩＰ特異的なＩｇＭ応答の促進
抗原特異的なＢ細胞の刺激及びクラススイッチがＧＣで行われ、ＦＤＣは、ＩｇＭ応答及びＩｇクラススイッチを高めることができる。これを評価するために、本発明者等はナイーブのＩｇＭ発現Ｂ細胞を単離し、産生ＩｇＭからＩｇＧへの切り替えが容易にモニタリングすることができる。正常なマウス由来のλ軽鎖発現Ｂ細胞（λ  Ｂ細胞）、ＣＧＧ免疫マウス由来の担体初回刺激Ｔ細胞（ＣＧＧ−Ｔ細胞）、正常なマウス由来のＦＤＣ、及びＮＰ−ＣＧＧ−抗ＣＧＧから成るＩＣを用いて、ＮＩＰ特異的な抗体応答をｉｎ  ｖｉｔｒｏのＧＣで開始した。一晩のインキュベート後、ＦＤＣリンパ球クラスタが見られ、これはKosco et al (1992)（J. Immunol. 148, 2331-2339）によって記載されたものと類似しており、これらのクラスタは１４日の培養を通して存在した。ナイーブＢ細胞は最初にＩｇＭを産生し、図２Ａで示されるように（４番目の白いバー）、この組合せの免疫原及び細胞を用いて、７日までに１２０ｎｇを超えるＩｇＭ抗ＮＩＰが蓄積したと考えられる。
【００５８】
抗ＮＩＰは主にλ担持Ｂ細胞に由来し、正常な量の（約９５％のκ）κ及びλ  Ｂ細胞（κ＋λ  Ｂ細胞）を含有するナイーブＢ細胞がＩｇＭ抗ＮＩＰ（約２０ｎｇ／ｍＬ）だけでなく、λ担持細胞も産生したので（図２の白いバー３対白いバー４）、精製λ  Ｂ細胞の使用は有用であった。遊離抗原（ＮＰ−ＣＧＧ）はＩＣと同じようには働かないので（図２の白いバー４対白いバー５）、ＦＤＣによって捕捉及びＢ細胞に提示され得るＩＣの使用も重要であった。免疫原（抗原又はＩＣ）又はＦＤＣが無くなった場合、又はＯＶＡ初回刺激Ｔ細胞がＣＧＧ初回刺激Ｔ細胞に置き換わった場合、典型的にＮＩＰ特異的ＩｇＭ応答は検出不可能であった。この実験において、７日目でＦＤＣの非存在下でＩＣを用いて得られた低ＩｇＭ応答は一貫した観察ではなかった。培養培地を７日目に交換し、幾らかのＩｇＭは２週目に蓄積したが（図２の黒いバー）、レベルは１週目の抗ＮＩＰのＩｇＭに比べて低かった。ＮＩＰ−５を用いて、高親和性の抗体を検出するアッセイは、ＦＤＣの存在下であっても、ほんのわずかしかＩｇＭ抗ＮＩＰが産生されないことを示した（図２、パネルＢ）。
【００５９】
実施例１３
免疫グロブリンクラススイッチ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＧＣにおけるＮＩＰ特異的ＩｇＧ応答
ＮＩＰ特異的ＩｇＭに関して図２で記載されたのと同じ培養下で、ＩｇＧ抗ＮＩＰ応答を試験した。λ  Ｂ細胞、ＣＧＧ初回刺激Ｔ細胞、ＦＤＣ、及びＮＰ−ＣＧＧ−抗ＣＧＧのＩＣに対する必要性は最適ＩｇＧ産生に対するものと同じであり、ＩｇＭに対しても同様であることは明らかであった（図３Ａの３番目の白いバー及び３番目の黒いバー）。図３Ａの１週目に蓄積した抗ＮＩＰのＩｇＧは、図２Ａの抗ＮＩＰのＩｇＭレベルの約半分であった（約１２０ｎｇ／ｍＬのＩｇＭに対して約６０ｎｇ／ｍＬのＩｇＧ）。しかし、これらの関係は２週目で、わずか約２０ｎｇ／ｍＬのＩｇＭに対して約１４０ｎｇ／ｍＬを超えるＩｇＧになり逆転した（図２Ａ対図３Ａにおける黒いバー）。したがって、産生したＩｇアイソタイプは、１週目では主にＩｇＭから２週目では主にＩｇＧへ切り替わった。
【００６０】
実施例１４
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの親和性成熟の検出及びＦＤＣ−ＩＣの重要性
ＮＩＰ−５を用いて高親和性抗体を検出したとき、ＩｇＭに対してＩｇＧの量が明らかに多かった。興味深いことに、１週目で産生されたわずか約３０〜５０％のＩｇＧが高親和性であった（ＮＩＰ−５対ＮＩＰ−１９）。しかし、２週目で産出されたほとんど全てのＩｇＧが高親和性であった（図３Ｂ）。これは、高親和性Ｂ細胞の選択、及び親和性成熟に関連した高親和性ＩｇＧを産生するためのこれらの細胞の選択刺激に一致している。さらに、抗原がＦＤＣによって捕捉及びＢ細胞に提示されるＩＣ形態であった場合にのみ親和性成熟が見られた。ＢＣＲに効率的に関与する遊離抗原（ＮＰ−ＣＧＧ）は低親和性のＩｇＧを刺激するが（図３Ａの１番目の黒いバー及び４番目の黒いバー）、検出可能なレベルの高親和性ＩｇＧは刺激しなかった（図３Ｂ）。ＦＤＣの非存在下において、ＩＣはＩＴＩＭ活性をもたらすＢＣＲ及びＦｃγＲＩＩ、ＳＨＩＰリン酸化及び応答性の欠乏に関与する。Ｉｇ−ＦＣをＦＤＣ上の高レベルのＦｃｇＲＩＩで捕捉することによって、Ｂ細胞上のＦｃｇＲＩＩの関与が最小になり、生産的ＩｇＧ応答を容易にする（Aydar et al. (2004) Eur. J. Immunol. 34, 98-107; Aydar et al (2003) J. Immunol. 171 , 5975-5987）。したがって、生産的ＩｇＧ応答に対してＢ細胞を刺激することができるＩＣのみがＦＤＣによって捕捉されると考えられる。
【００６１】
実施例１５
ＦＤＣのＣＤ２１−ＣＤ２１リガンドのＩｇＭ応答及びクラススイッチに対する相互作用の重要性の計測（Gauging）
Ｂ細胞のコレセプター複合体（ＣＤ２１／ＣＤ１９／ＣＤ８１）におけるＦＤＣ−ＣＤ２１リガンドとＣＤ２１との間の相互作用は、ＦＤＣ関連抗原が最適な再生応答を刺激するのに重要である（Tew et al. (2001) Trends Immunol. 22, 361-36; Qin et al. (1998) J. Immunol 161, 4549-4554）。また、ＣＤ２１／ＣＤ１９ノックアウトマウスのＩｇＭ応答が抑制される（Chen et al. (2000) Immunol. Rev. 176, 194-204）。したがって、ＦＤＣ−ＣＤ２１リガンド−ＣＤ２１の相互作用を介してＢ細胞に伝達される遮断シグナルは、ＩｇＭ産生及びクラススイッチを阻害し得る。本発明者等の結果によって、抗ＣＤ２１が、クラススイッチの低減と一致してＩｇＭ応答を阻害し、ＩｇＧ応答が２週目のピークで劇的に低減した（９０％超）ことが示された。抗ＣＤ２１で処理した培養下に存在するＢ細胞の数が、アイソタイプ対照を有するＢ細胞の数よりも有意に低くなかったので、ＩｇＧ応答の低下は、ＣＤ２１リガンド−ＣＤ２１の相互作用の非存在下におけるＢ細胞の喪失に単純には起因しなかった。本発明者等は、無処理のＩｇＧ結合Ｂ細胞−ＣＤ２１のＦｃ部分がＢ細胞−ＦｃγＲＩＩと結合し、ＩＴＩＭを活性化して、これにより抗ＣＤ２１との抗体応答の低減を説明することができる可能性についても考慮している。しかし、抗ＣＤ２１がレセプターを単純に遮断する場合、抗ＣＤ２１のＦ（ａｂ’）２が無傷抗体と同様に作用する必要があり、そうであることが証明された。
【００６２】
ＦＤＣ及びＢ細胞の両方がＣＤ２１及びＣＤ２３を発現する。ＣＤ２３はヒトのシステムにおけるＣＤ２１に対するリガンドであり（Aubry et al. (1992) Nature 358:505）、これにより抗ＣＤ２１がＦＤＣ活性に影響を与え得る、又はＦＤＣ−ＣＤ２３が、Ｂ細胞のＣＤ２１と結合し、Ｂ細胞にシグナルを与え得る可能性が高まる。しかし、抗ＣＤ２１によるＦＤＣの処理はこれらの活性を阻害せず、抗ＣＤ２３によるＢ細胞及びＦＤＣの処理は検出可能な効果を全く有しなかった。
【００６３】
本発明者等は、ＦＤＣにおけるＣＤ２１リガンドレベルの増加が、クラススイッチ及び高親和性ＮＩＰ特異的ＩｇＧの産生を増大させるか否かを判定しようとした。ＦＤＣにおいてＣＤ２１リガンドレベルを高めるための補体によるＩＣの処理は抗ＮＩＰ応答を増大させなかった。このことは、さらなるＣＤ２１リガンドが正常なマウスのマウス抗ＯＶＡ応答を増大させなかったというこれまでのデータに一致している（Aydar et al. (2002) Eur. J. Immunol. 32, 2817-2826）。しかし、加齢マウスにおけるＦＤＣと共有結合したＣＤ２１リガンドのレベルは低いと考えられ、加齢ＦＤＣにおけるＦＤＣ−ＣＤ２１リガンドのレベルを増大させるためのウサギ補体の添加が補助活性及びＢ細胞応答を改善した（Aydar et al. (2002) Eur. J. Immunol. 32, 2817-2826）。
【００６４】
実施例１６
ＡＩＤ発現及びＦＤＣの存在
ＡＩＤは、クラススイッチに重要であり、ＧＣ−Ｂ細胞及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでクラススイッチ再結合を受けるＢ細胞で発現される（Muramatsu et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 18470-18476; Muramatsu et al. (2000) Cell 102, 553-563; Faili et al. (2002) Nat. Immunol. 3, 815-821）。ＦＤＣは、ＧＣ−Ｂ細胞によってＡＩＤ発現を調節するのを助けることができ、本発明者等はこれを調べようとした。Ｂ細胞の大部分がこれらのポリクローナルＢ細胞活性化因子で刺激される場合、ＡＩＤのｍＲＮＡの発現は、ＬＰＳ、又はＩＬ−４＋抗ＣＤ４０で刺激したリンパ球で検出することができる。ＦＤＣとのＢ細胞の共刺激がＡＩＤのｍＲＮＡを増幅し得る。定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ＡＩＤのｍＲＮＡのレベルを求めた。準最適な量のＬＰＳ（１０ｎｇ）、ＩＬ−４（１０ｎｇ）、及び抗ＣＤ４０（１００ｎｇ）を用いて、リンパ球における低レベルのＡＩＤを刺激した。ＦＤＣ由来のｍＲＮＡが全ての培養下で一定になるように、共刺激を与える開始時、又は培養の終了時のいずれかでＦＤＣを加えた。正常なリンパ球におけるＡＩＤのｍＲＮＡレベルを１倍とし、ＬＰＳ、又はＩＬ−４＋抗ＣＤ４０処理単独、或いはＦＤＣの存在下での効果を比較した。ＲＴ−ＰＣＲによる分析によって、ＬＰＳがリンパ球集団のＡＩＤを約８倍、及びＦＤＣを約２倍増加させたことが示された。しかし、ＬＰＳとＦＤＣとの組合せは相乗作用があり、ＡＩＤのｍＲＮＡ発現は約１３０倍増大した。ＩＬ−４＋抗ＣＤ４０による結果は同様であった。ＦＤＣによるＡＩＤのｍＲＮＡレベルが約３倍、及びＩＬ−４＋抗ＣＤ４０によるＡＩＤのｍＲＮＡレベルが約１８倍であったのに対し、ＩＬ−４＋抗ＣＤ４０とＦＤＣとの組合せは、約１８０倍のＡＩＤのｍＲＮＡレベルの上昇をもたらした。
【００６５】
ＦＤＣ単独をＬＰＳ又は抗ＣＤ４０＋ＩＬ−４で刺激した場合、有意なＡＩＤのｍＲＮＡは見られず、このことによりＦＤＣ及びＢ細胞が同時に培養された場合、Ｂ細胞がｍＲＮＡの供給源であったことが示唆された。このことは、ＭＡＣＳシステムでＢ２２０マイクロビーズを用いて、２日の培養期間後に精製したＢ細胞からｍＲＮＡを単離することによって確認された。ほぼ全てのＡＩＤのｍＲＮＡはＢ細胞分画内にあり、フロースルー分画が検出可能な活性を含有していた一方で、このＡＩＤのｍＲＮＡを占める可能性がある幾つかの汚染Ｂ細胞も含んでいた。さらに、同数のＢ細胞（約２×１０６個）を用いてｍＲＮＡを得て、１８ｓ  ｒＲＮＡを内部負荷対照として用いたので、Ｂ細胞におけるＡＩＤ活性の増大は、ＦＤＣによって引き起こされるＢ細胞の生存率又は増殖の増大に単純には起因しないと考えられた。したがって、Ｂ細胞をＦＤＣの存在下で培養した場合、１つのＢ細胞当たりのＡＩＤのｍＲＮＡのレベルが上昇した。
【００６６】
実施例１７
ＡＩＤ発現及びクラススイッチにおけるＣＤ２１−ＣＤ２１リガンドの相互作用の関与
ＣＤ２１リガンド−ＣＤ２１の相互作用が遮断された際に見られたクラススイッチの低減によって、ＦＤＣ−ＣＤ２１リガンドと、Ｂ細胞−ＣＤ２１との間の相互作用がコレセプター複合体を通って伝わり、ＡＩＤの発現の調節を助けることが示唆された。これを調べるために、抗ＣＤ２１／３５を用いて、ＦＤＣ−ＣＤ２１リガンド−Ｂ細胞−ＣＤ２１の相互作用を妨げ、ＡＩＤ発現レベルを約９０％低減し、このことはこの相互作用が働いていることを示した。
【００６７】
実施例１８
ＡＩＤ応答のＦＤＣ媒介性増大に対するＩＣ及びＣＤ２１リガンドの重要性
本発明者等は、最適な高親和性抗体応答を促進するために、ＩＣがＦＤＣの能力に寄与するか否かを判定しようとした。促進されるクラススイッチ及び親和性成熟におけるＦＤＣ−ＩＣの重要性を考慮して、本発明者等は、ＩＣ及びＣＤ２１リガンド−ＣＤ２１の相互作用が、ＮＰ−ＣＧＧシステムにおけるＡＩＤ発現のＦＤＣ媒介性増大に重要であったか否かを判定しようとした。ＮＰ−ＣＧＧに対して応答するＢ細胞が少数なので、ＡＩＤ調節の研究はより困難になる。しかし、７２時間の培養後のＲＮＡ精製に約２×１０６個の精製Ｂ細胞を用いた場合、ＡＩＤのｍＲＮＡのＦＤＣ媒介性増大を検出することが可能であった。ＮＰ−ＣＧＧ抗ＣＧＧのＩＣは増大を刺激したが、ＮＰ−ＣＧＧは検出可能な増大を刺激することはできなかった。さらに、抗ＣＤ２１／３５は、ポリクローナル活性因子で刺激したＢ細胞の研究で見られたものと同じ様式で抗原刺激応答を阻害した。
【００６８】
実施例１９
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＣＧにおける体細胞超変異
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＧＣにおける体細胞超変異を調べるために、本発明者等はＰＣＲを用いて、抗ＮＰを作製するためにマウスで用いられるＶＨ１８６．２遺伝子を増幅した。ＰＣＲ産物を電気泳動ゲルから切り取り、抽出して、クローン化した後に、複数のクローンをシークエンシングした。２０個の読み取り可能な配列のうち７つの配列がＶｈ１８６．２生殖系列と相同性であり、ＶＨ１８６クローンと呼ばれた。この配列は、ＶＨ１８６．２生殖系列コード遺伝子に対してアラインしている。突然変異は置換ヌクレオチドで示される。図１０で示されるように、かなりの突然変異が、体細胞超変異と一致して可変遺伝子で起こった。これらの突然変異はＣＤＲ配列でより高頻度であった（図１１）。突然変異の分析によって、以下のことが明らかになった：
・平均４１個の突然変異（３２〜４５個の範囲）が、シークエンシングされたＶＨ１８６遺伝子（３０６ヌクレオチド）１つ当たりで見られた。これはｉｎ  ｖｉｖｏのＧＣの研究で得られた結果と一致して高いものである。
・ほとんどの突然変異は、１つの欠失を有する点突然変異であった。これは、ｉｎ  ｖｉｖｏの胚中心及び体細胞超変異に特有でもある。
・１つを除く全ての突然変異がＣＤＲにおける置換突然変異であった一方で、フレームワーク領域におけるサイレント突然変異に対する置換の比率はほぼ１：１であり、両方とも強い選択圧を示した。
・トランスバージョンによる転移の優位性が見られた。
・本発明者等は、シークエンシングされた全てのＣγ領域において１つだけ突然変異を認め、ＰＣＲ増幅の忠実性（fidelity）に対する内部対照を与えた。
【００６９】
これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏのＧＣで得られた突然変異の特徴は、抗ＮＰ応答に対してｉｎ  ｖｉｖｏのＧＣで得られた特徴と同様である。したがって、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏのＧＣはｉｎ  ｖｉｖｏのＧＣで起こる重要な事象を忠実に反映していると思われる。
【００７０】
実施例２０
ＦＤＣによって分泌されるケモカインであるＣＸＣＬ１３はヒトのＢ細胞及びＴ細胞を濾胞帯に引き付けることが示されている（Estes et al. (2004) J. Immunol. 173, 6169-6178）。他の実施形態では、このケモカイン又はその受容体ＣＸＣＲ５の遮断は、Ｂ細胞及びＴ細胞がＦＤＣ豊富域に移動するのを阻害し得る。さらに、ＧＣのＢ細胞が活性化され、特有の表現型、ＰＮＡ＋、ＧＬ−７＋、ＣＤ９５ｈｉ及びＣＤ２３ｌｏを発現し、Ｂ細胞が中心細胞である場合は明帯に、Ｂ細胞が胚中心細胞である場合は暗帯に分かれる。他の実施形態では、これらの特性はリンパ節濾胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルに存在し得る。
【００７１】
実施例２１
他の実施形態において、ＦＤＣ、Ｂ細胞、又はＴ細胞の精製調製物は、例えばセルロースベースのマイクロキャリア、コラーゲンクッション及びリンパ節細胞外材料を含むＥＴＣ中に包埋させることができる。これは、固まる前に細胞をＥＴＣ懸濁液に加えること、又は懸濁液をＥＴＣに直接注入することによって行うことができる。これらの細胞をマトリクス中で平衡化することができ、それから視覚化され、それが２週間にわたって続く可能性がある。ヒトのＢ細胞及びＴ細胞は、抗１４、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３、及び抗ＣＤ５６を用いる負の選択によって、健常なドナーの末梢血から単離し、不要な細胞を取り除くことができる。マウスのＢ細胞及びＴ細胞はリンパ節から得て、これまでに記載されたように、正の選択によって精製することができる。
【００７２】
実施例２２
ＦＤＣは、ＭＨＣ又は種の制限なしでＢ細胞を共培養することができ、本発明の実施形態では、ＦＤＣは、これまでに記載されたようにＦＤＣ特異的ｍＡｂ  ＨＪ２を用いて、ナイーブのマウス又は若年患者から外科的に取り除いたヒトの甲状腺のリンパ節から単離することができる（Fakher et al. (2001) Eur. J. Immunol. 31, 176-185）。
【００７３】
実施例２３
他の実施形態において、ＦＤＣを組み込む場合、「ｉｎ  ｓｉｔｕゼリー化（jellification）」、「注射」、「クッション−ビーズ組合せ」、加えて小クッションとの組合せ、全ての細胞型に対する単一クッション、及びクッションの貫通等の様々な手法を一般的なＬＴＥアーキテクチャに用いることができる。他の実施形態では、ＥＴＣとしては、例えばコラーゲンクッション、セルロースベースのマイクロキャリア、合成及び他の天然の生体材料、及び／又はリンパ節細胞外材料が挙げられ得る。
【００７４】
実施例２４
さらなる実施形態において、ＦＤＣ、Ｔ細胞、及びＢ細胞は同じＥＴＣではあるが、異なる位置に配置することができる。まずＦＤＣがＥＴＣ内に入り、ＥＴＣと接着することが可能になり、それからＴ細胞及びＢ細胞が近くに配置され得る。リンパ球がＦＤＣに引き付けられ、ＦＤＣの周りで集合化し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＧＣを形成することができる。本発明者等は、ＣＤ３選択Ｔ細胞及び陰性選択Ｂ細胞は、ケモカインの非存在下でコラーゲンクッションにおける低い細胞運動性を示すことを認めている。ＦＤＣ及び関連のケモカインの存在が、リンパ球の自然の運動性を増大させる可能性がある。
【００７５】
実施例２５
さらに他の実施形態において、ＦＤＣ、Ｔ細胞、及びＢ細胞は、単一のＥＴＣに配置され、クラスタ化を視覚化するか、又は別々のＥＴＣに配置され、リンパ節のＴ細胞域及びＢ細胞域を刺激することができる。正規の顕微鏡解析に加えて、細胞をクッションで蛍光標識して、共焦点顕微鏡によって視覚化することができる。さらに、他の実施形態では、破傷風トキソイド（ＴＴ）免疫した人々から単離したＢリンパ球及びＴリンパ球は、ＦＤＣ含有ＥＴＣで共培養し、さらにＴＴ−抗ＴＴのＩＣで刺激することができ、抗原特異的ＧＣに対するモデルとして有用である。
【００７６】
実施例２６
ＦＤＣは、Ｂ細胞及び濾胞Ｔヘルパー細胞の両方に対する化学誘引物質として作用するケモカインＣＸＣＬ１３を分泌し、これらの細胞をＧＣに補充する（５４）。他の実施形態では、Ｂ細胞及びＴ細胞をＦＤＣ含有ＥＴＣに加え、ＣＸＣＬ１３、又はそのレセプターであるＣＸＣＲ５に対する中和抗体の存在下又は非存在下で、例えばＬＰＳ又はＣｏｎＡを用いて刺激することができる。他の実施形態では、ＣＸＣＬ１３ノックアウトマウス由来のＦＤＣを用いることができる。他の実施形態では、抗ＣＤ２１抗体、抗ＩＣＡＭ−１抗体、抗ＶＣＡＭ抗体、及び抗ＢＡＦＦ抗体をこれらの培養物に別々に加え、ＦＤＣ−Ｂ細胞−Ｔ細胞クラスタの形成におけるこれらの表面分子の重要性を調べることができる。これまでの研究によって、培養ウェル中のＦＤＣ周辺のＢ細胞のクラスタ化におけるこれらの分子の役割が示されている。
【００７７】
実施例２７
ＦＤＣが抗原を備えている場合のＧＣ及び包括的なＢ細胞の特徴
一次抗原チャレンジ後、約６〜８日でＧＣが形成され、特有のＧＣのＢ細胞表現型（ＰＮＡ＋、ＧＬ−７＋、ＣＤ９５ｈｉ、ＣＤ２３ｌｏ）を発現する迅速分裂Ｂ細胞から成る暗帯に隣接して存在する明帯におけるＩＣが施されたＦＤＣ及び補体断片の存在によって検出される。これらのＧＣのＢ細胞は、特異的抗原に応答するＢ細胞であり、クラススイッチ及び体細胞超変異を受け、高親和性のＩｇＧ抗体を生成させる。
【００７８】
実施例２８
他の実施形態において、ＴＴ免疫した個体から単離したＢ細胞及びＴ細胞をコラーゲンクッション含有ＦＤＣで培養し、ＴＴ−抗ＴＴのＩＣで刺激することができる。培養の約１０日後、Ｂ細胞を回収し、標識化して、フローサイトメトリによってＰＮＡ、ＧＬ−７、ＣＤ９５及びＣＤ２３の表面発現に対して分析することができる。これらの濾胞形態の詳細な分析は、共焦点顕微鏡を用いて行うこともできる。
【００７９】
実施例２９
さらに別の実施形態において、抗原免疫した個体から単離したＢ細胞及びＴ細胞をコラーゲンクッション含有ＦＤＣで培養し、抗原−抗抗原（antigen-anti antigen）のＩＣで刺激することができる。培養の約１０日後、Ｂ細胞を回収し、標識化して、フローサイトメトリによってＰＮＡ、ＧＬ−７、ＣＤ９５及びＣＤ２３の表面発現に対して分析することができる。これらの濾胞形態の詳細な分析は、共焦点顕微鏡を用いて行うこともできる。
【００８０】
実施例３０
本発明者等がｉｎ  ｖｉｔｒｏで研究している二次元クラスタにおいて、ＧＣ又はＴ細胞周辺にマントル領域を形成し、集合し、別個のユニットを形成するＢ細胞は見られなかった。しかし、二次元配置は細網繊維、又は細胞の配列を助ける他の構造を有していない。本発明の他の実施形態では、ＥＴＣを用いて、Ｔ細胞及びＢ細胞がＧＣ周辺で分離され、別々の領域を形成するような状態を提供することができる。ＧＣ周辺の細胞は、Ｔ細胞特異的抗体及びＢ細胞特異的抗体を用いて調べることができる。ＧＣのＢ細胞がＩｇＤを発現しないが、マントル帯のＢ細胞がＩｇＤを発現するので、抗ＩｇＤによる標識化が有益である可能性もある。
【００８１】
二次リンパ組織が適切な抗原でチャレンジされる場合、活性ＧＣで発達した非常に多くの新規濾胞の結果として、この二次リンパ組織が劇的に広がる。これらの濾胞は異なるＴ細胞帯及びＢ細胞帯、並びに迅速増殖Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、ＦＤＣ、及びＦＤＣから生存シグナルを受けていないアポトーシスＢ細胞を一掃するマクロファージから成る活性ＧＣで組織化される。それぞれの活性ＧＣは、ＦＤＣ、Ｔ細胞、及びＢ細胞が相互作用する場合は明帯、及びＢ細胞が迅速に増殖する場合は暗帯にさらに分かれる。
【００８２】
濾胞は、リンパ節だけでなく、膵臓、リンパ結節（例えばパイアー斑）でも明らかであり、全ての種のリンパ節で保存される。抗原が、リンパ節中にある輸入リンパ管から、或いは膵臓の周縁洞を介して、又はＭ細胞（パイアー斑の場合）によって血液から濾胞に輸送されるか否かは問題ではないと考えられる。
【００８３】
抗原が濾胞内にあると、活性ＧＣを有する二次濾胞の発達、及び体液性免疫の発生に必要なアゴニストが存在する。三次元で完全に発達した濾胞構造は、十分な量の高親和性抗体の産生に重要であると考えられる。
【００８４】
実施例３１
リンパ組織が消化され、細胞を従来の組織培養物に入れる場合、これらは濾胞組織を失い、組織を壊し二次元状態を維持する。本発明の実施形態では、ＦＤＣをこのような培養物に加え、ＦＤＣ−Ｂ細胞−Ｔ細胞クラスタを形成することができる。本発明者等は、このようなｉｎ  ｖｉｔｒｏのＧＣにおける免疫グロブリンのクラススイッチ、体細胞超変異、及び親和性成熟を実証している。
【００８５】
実施例３２
本発明の実施形態において、濾胞白血球を天然又は合成されたＥＴＣマトリクス中に入れることができ、ＦＤＣを固定することができ、Ｔ細胞及びＢ細胞をＦＤＣ周辺に配置し、濾胞のｉｎ  ｖｉｖｏ環境面を再生させることができる。ＥＴＣに好適な材料としては、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）、小腸粘膜下組織、膀胱粘膜、ＰＬＧＡ、ヒドロゲル、反転性コロイド結晶マトリクス、マイクロキャリア、及びコラーゲンで覆われたプレートが挙げられる。本発明の他の実施形態では、ＥＴＣマトリクスは存在せず、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びＦＤＣが標準的な二次元ウェルで単純に培養される。
【００８６】
実施例３３
本発明の他の実施形態において、機能的なＬＴＥ含有ＦＤＣ、及び確定した又は未確定のＴ細胞帯及びＢ細胞帯を用いて、ワクチンを評価することができる。ＦＤＣを用いて、Ｔ細胞帯及びＢ細胞帯を確定するのを助けることができ、これらの細胞帯を予め形成させる必要はない。同様に、別の実施形態では、Ｔ細胞帯及びＢ細胞帯は必要ではない。一次免疫応答では、統合されたｉｎ  ｖｉｔｒｏワクチン接種部位から初回刺激を受けた単球由来の樹状細胞を用いることができ、モデル抗原、例えば再生応答のための破傷風及び一次応答におけるモデルを検証するためのインフルエンザを用いることができ、同様に他の抗原、免疫原及び／又はアレルゲンを用いることができる。
【００８７】
実施例３４
マウス細胞を用いた実験において、本発明者等は二次元培養物における機能的なｉｎ  ｖｉｔｒｏのＧＣに対する証拠が提示される。具体的には、ナイーブλ陽性Ｂ細胞、ＦＤＣ、ＮＰ−ＣＧＧ（トリγグロブリン）＋抗ＣＧＧのＩＣ、及びＣＧＧ初回刺激Ｔ細胞を共培養することによって、マウスＧＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製した。これによって、ＦＤＣ−リンパ球クラスタ及び抗ＮＩＰのＩｇＭ及びＩｇＧの産生がもたらされた。
【００８８】
クラススイッチは、１週目でのＩｇＭから２週目でのＩｇＧへの移動によって示され、親和性成熟は、１週目の大部分が低親和性のＩｇＭ及びＩｇＧから２週目のほぼ全てが高親和性のＩｇＧ抗ＮＩＰへの変化によって示された。クラススイッチ及び親和性成熟は、適切な免疫複合体（ＩＣ）を有するＦＤＣの存在下では容易に検出可能であったが、ＦＤＣの非存在下、又はＩＣで関係のない抗原を有するＦＤＣの存在下では検出不可能であった。
【００８９】
ＦＤＣに加えて遊離抗原によって低親和性ＩｇＧが得られるが、ＦＤＣがＩＣを有していた場合にのみ親和性成熟は明らかであった。クラススイッチは活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）依存性であり、ＦＤＣ−ＣＤ２１リガンド−Ｂ細胞ＣＤ２１の相互作用の遮断が、ＡＩＤ産生のＦＤＣ−ＩＣ媒介性増大及びＩｇＧ応答を阻害した。ＦＤＣはＡＩＤ及びエラープローンポリメラーゼの両方の産生を促進した。これらの酵素は体細胞超変異に必要である。可変領域遺伝子のシーケンシングは、高親和性抗体の産生と一致した多数の突然変異を示していた。
【００９０】
実施例３５
本発明の実施形態において、ＡＩＳで統合することができる三次元培養組織構築物におけるヒト細胞系が構築される。ｉｎ  ｖｉｖｏ状態であれば、ＦＤＣはコラーゲン繊維と接着することができ、ＧＣが三次元で発生することができる足場を提供する。マウスシステムで認められたＮＩＰ特異的なＩｇＭ及びＩｇＧの産生、クラススイッチ、体細胞超変異及び親和性成熟は、二次元のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＧＣを用いたこれまでの研究の結果と比較することができる。
【００９１】
実施例３６
本発明の実施形態において、ＴＴ特異的な記憶Ｔ細胞がほとんどの人々に豊富に存在するので、ヒトＧＣはキャリアとして破傷風トキソイド（ＴＴ）を用いて確立することができる。他の実施形態では、ＮＰ破傷風トキソイドを用いて、ＧＣを作製することができる。それから、抗ＮＰ産生によって、高親和性抗体及び低親和性抗体の両方の産生を単純に測定でき、親和性成熟を調べることが可能になるので、抗ＮＰ産生を調べることができる。他の実施形態では、ナイーブヒトＴ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで初回刺激し、それからそれを用いて、Ｔ細胞の補助をｉｎ  ｖｉｔｒｏのＧＣに与えることができる。培養物、又はＣＧＧで刺激したｉｎ  ｖｉｔｒｏワクチン接種部位（ＶＳ）細胞のいずれかからの単球由来のＤＣを用いて、ナイーブヒトＴ細胞をＣＧＧで初回刺激することができる。それから、このような初回刺激Ｔ細胞は、ＣＧＧ−ＮＰを有するマウスシステムに用いたのと同じ方法に用いることができる。
【００９２】
実施例３７
ＦＤＣはｉｎ  ｖｉｖｏで細網繊維と接着し、濾胞内で固定した網目構造である。リンパ球は再循環するが、ＦＤＣは静止したままである。しかし、ｉｎ  ｖｉｖｏでこの状態のＦＤＣは成熟している。ラットの尾のコラーゲンから作製されたコラーゲンクッションが確立された。ＦＤＣが接着し、コラーゲン上にクラスタを配置した。
【００９３】
実施例３８
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＬＴＥに免疫複合体が包含されていることは、完全に分化した記憶Ｂ細胞の生成に重要である。本発明の実施形態では、２段階のＬＴＥが用いられる。第１段階において、ナイーブ抗原特異的Ｂ細胞が刺激され、Ｔ細胞に依存して抗体を産生する。ＦＤＣに合わせてこの構築物から導かれた免疫複合体及び記憶Ｔ細胞はシグナルを与え、第２のＬＴＥ構築物で完全に分化するようにナイーブＢ細胞の新たなバッチを誘発した。
【００９４】
別のアプローチにおいて、ＩＣは、抗体が非特異的に抗原と人為的に結合することによって発生させることができる。例えば、ハプテンは対象の抗原と複合体化し、それから特異的抗体で結合される。複合体形成後、タンパク質の抗原性を維持するように特別な注意を払い、文献の手法を用いて、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）は標的タンパク質の一級アミノ基と連結することができる。これに関して、フルオレセイン−ＥＸ又は細長いリンカーを有する他の誘導体は、ＦＩＴＣ及び他のハプテンによって形成された強いリンカー−抗原複合体よりも有利であり得る。それから、市販の高親和性の抗ＦＩＴＣ抗体を用いて、抗原−ハプテン複合体と結合させ、完全なＩＣを形成することができる。ほとんどの成体が破傷風トキソイドで免疫しており、この抗原に対して発生する体液性及び細胞媒介性の免疫応答が十分に特徴付けられているので、破傷風トキソイドをモデル抗原として用いることができる。他のリンカー及び抗原、例えばそれぞれジゴキシン及びＮＰも用いることができる。別の実施形態では、抗体は、アミン−チオール架橋法を用いて抗原と直接化学結合することができる。これらの非特異的化学物質を用いるには、ポリクローナル抗体に有用なものを作製する凝集工程を必要としない。さらに、ＩＣの化学量論は、この複合体の大きさ又は密度に影響を与えることなく操作することができる。
【００９５】
実施例３９
本実施例において、ＬＰＳをＢ細胞に加え、シグナルを提供した後、ＦＤＣを加え、共刺激シグナルを提供して、実験を行った。次に抗体産生が試験された。本発明者等は２週間細胞を追跡した。培養培地を１週目の終わりに回収し、タイターは１日目〜７日目まで抗体合成を示す。培地を交換し、上清液を１４日目に回収した。これらのタイターは７日目〜１４日目まで抗体合成を示す。ＦＤＣは、予測通り潜在的共刺激活性を有していたが、７日目ではコラーゲンと接着するＦＤＣと、プラスチックプレート上に浮かぶＦＤＣとの間の抗体産生に差はなかった。しかし、１４日目では、コラーゲンに接着したＦＤＣは、プラスチックプレート上に浮かぶＦＤＣと比較すると、抗体産生を促進する活性が約３倍であった。２週目のＩｇＧ 応答は１週目より低かったが、これは迅速に応答し、そして迅速に減衰するＬＰＳ刺激細胞に特有のものである。対して、抗原刺激細胞は典型的に、２週目にＩｇＧ産生がピークに達する。これらの結果は、コラーゲン上にＦＤＣを置くことによって、生物学的活性が高まることを示している。
【００９６】
実施例４０
図１２は、新たに単離したＦＤＣを示す。モノクローナル抗体であるＦＤＣ−Ｍ１を用いて、正の選択前に典型的なプロセスで幾つかのＦＤＣを見出すことができる。しかし、正の選択後、ほとんどのプロセスは残らない（図１３、図１４、図１５）。
【００９７】
実施例４１
本発明者等は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒトＩｇＧの一次応答を誘導しようと、また抗体が低濃度で機能することができるような親和性を有する高品質抗体を生成しようとした。オボアルブミン（ＯＶＡ）を例示的な抗原として用い、用いた遮断ドナーはＯＶＡ血清反応が陰性であった。Ｔ細胞を単球由来のＤＣで初回刺激した。単球（約１×１０７個）をＩＬ−４（約１０００Ｕ／ｍＬ）及びＧＭ−ＣＳＦ（約８００Ｕ／ｍＬ）で培養し、未成熟ＤＣを生成した。５日後、ＯＶＡ（１μｇ／ｍＬ）を加え、抗原を処理し、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）を加え、ＤＣ成熟を刺激した。８日後、ＯＶＡ初回刺激のために、約２０×１０６個のＣＤ４＋Ｔ細胞を加えた。マウス実験において５日間（実験１）及び１０日間（実験２）、ヘルパーＴ細胞に対する初回刺激及び成熟を続けた。この初回刺激期間後、Ｔ細胞及びＤＣを、実験１ではナイーブＢ細胞（約１５×１０６個）、並びに実験２では約１０×１０６個のナイーブＢ細胞に混合した。ＯＶＡ（約５μｇ）＋マウス抗ＯＶＡ（約３０μｇ）を複合体化して、ＯＶＡのＩＣを生成し、実験１では、細胞及びＩＣを放射線照射マウスの首の後ろに注射し、実験２では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＣを約３×１０６個の新たに単離したＦＤＣと共に入れた。このようにして、本発明者等は、実験１において１４日目で約３０ｎｇ／ｍＬの抗ＯＶＡを得た。
【００９８】
実験２において、５日目で、本発明者等は特異的な抗ＯＶＡを約１２ｎｇ／ｍＬと測定した。１０日目で、抗ＯＶＡのレベルは約２０ｎｇ／ｍＬであった（これらのレベルはＥＬＩＳＡによって容易に評価された）。したがって、５０ｍＬの培地では、このことが５日目の約６００ｎｇの抗ＯＶＡ、及び１０日間の約１０００ｎｇの全抗ＯＶＡに対応する。次に、本発明者等は親和性成熟を試験した。この試験とは、抗ＯＶＡをＥＬＩＳＡプレートに結合させ、それから高い塩濃度を添加し、振盪器において２時間でどのくらいの量の結合抗体が解離したか定量することであった。プレートは次に洗浄され、ＥＬＩＳＡがこれまでのように行われた。低親和性抗体は解離され、洗い流し、高親和性抗体は結合を維持し、ＥＬＩＳＡで検出される。５日目の抗体のほとんどが１ＭのＮａＣｌで解離し、１０日目の抗体のほとんどが結合を維持し、このことが、この期間で低親和性抗体から高親和性抗体へと変化したことを示唆していた。
【００９９】
実施例４２
全マウスＩｇＧが、ＩＣ及び補体の有り又は無しで、マウスリンパ球及びＬＰＳとインキュベート後のコラーゲンＩ型ビーズ上で新たなマウスＦＤＣによって産生された。本実施例では、本発明者等は、ＦＤＣがコラーゲン上で網目構造を構成した後に、新たな免疫複合体及び補体を加えることによって、ＦＤＣを活性化させようとした。本発明者等は、約８０００〜９０００ｎｇの新たなＦＤＣを有する抗体を測定し、７日後でもまだ、ＩＣを有するＦＤＣの抗体濃度は約８０００〜９０００ｎｇ／ｍＬであった。１４日後では、抗体濃度は４０００〜５０００ｎｇ／ｍＬであり、ビーズ上で維持されたＩＣ及びＦＤＣは、プラスチック上に維持されたものよりも良好であった。したがって、ＦＤＣは少なくとも約２週間、ビーズ上で良好な活性を維持することができる。ヒトＦＤＣはＩＣ及び補体から利益を受けた。
【０１００】
実施例４３
化学架橋なしでのコラーゲンの直接沈着
本実施例において、ＰｕｒａＣｏｌ（１ｍＭの硝酸における超純粋ウシＩ型コラーゲン、Inamed, CA）溶液（約５０μＬ）を２５０μＬ容プラスチックピペットチップに入れ、ピペッティングせずにマニュアルでパターン形成するための「ペン」として用いた。この方法は洗浄及び細胞培養物とのインキュベートに耐えることができる楕円形及び円形スポット（約８００〜１０００μｍ）のプリントを可能にした。このようにしてコラーゲンでスポットされた組織培養プレート又はペトリ皿はバイオハザードフードに入れ、フードのＵＶ光下で約１時間乾燥させた。記載されたようにコラーゲンでパターン形成した組織培養物（マルチウェル）プレート又はペトリ皿をＰＢＳで満たし、約１０分間室温でインキュベートした。それから、ペトリ皿を空にし、蒸留水で満たして、約５分間インキュベートした。この蒸留水の洗浄を３回繰り返し、その後さらにＵＶ光に約３０分間曝すことを含めて３時間、ペトリ皿をバイオハザードフードで乾燥させた（図１６）。
【０１０１】
実施例４４
化学架橋によるコラーゲンの沈着
別の実施形態において、コラーゲンスポットの耐久性（hardiness）を増大させるために、化学架橋法を用いることができる。例えば、グルタルアルデヒドを洗浄／中和溶液に添加し、コラーゲンの架橋を開始させることができる。未反応グルタルアルデヒドを、トリメチルアミンの溶液で洗浄することによって中和し、蒸留水で複数回洗浄することで取り除くことができる。
【０１０２】
実施例４５
レーザーマイクロマシンによるパターン形成
別の実施形態において、コラーゲンによるペトリ皿の連続被覆、及びその後のレーザービームを用いたパターン形成は、規則的なパターンを作成するのに用いることができる方法である。レーザーマイクロマシーンは、コラーゲンパターンの接着及び安定性を改善するプラスチック表面の化学修飾及び活性化にも有用であり得る。
【０１０３】
実施例４６
記憶Ｂ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの胚中心で大量に形成される
記憶Ｂ細胞は、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ胚中心でも見出される。これを評価するために、本発明者等はｉｎ  ｖｉｔｒｏの一次応答の開始後１２日でヒトリンパ球を採取し、新たにＦＤＣ及び免疫複合体を加え、二次応答を引き起こさせた。これらの培養物由来の上清液は回収され、測定可能なレベルの高親和性の特異的ＩｇＧ抗体を含んでいた。
【０１０４】
実施例４７
本発明の実施形態において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで危険性の高い免疫原に対する一次応答を誘導し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＧＣで特異的記憶細胞を広げた後に、より多くのＦＤＣ及び免疫原を有するこれらの記憶細胞を用いて、培養物をさらに広げることができる。このプロセスは、１回又は複数回繰り返すことができる。最終産物は、ヒトに危険性の高い免疫原を曝すことのない大量の高親和性で特異的なヒトＩｇＧ抗体である。
【０１０５】
実施例４８
図１６は、実施例４３に従って調製したコラーゲンドットを示す。図１７の結果はコラーゲン被覆Ｃｙｔｏｄｅｘビーズによるものであり、ＣｙｔｏｄｅｘにおいてＦＤＣによる１ｍＬ当たり約７０００ｎｇのＩｇＧが典型的な結果である。図１８の結果はコラーゲンドットパターンによるものである。ここで、本発明者等は約４７０００ｎｇのＩｇＧを測定した。
【０１０６】
本発明の実施形態は、ＦＤＣがリンパ球を引き付ける場合、ＦＤＣをコラーゲンドットに接着させることを含む。コラーゲンドットは、例えばウシコラーゲン又はラット尾Ｉ型コラーゲンによって調製することができる（図１６）。コラーゲンは、例えば組織培養プレートウェルの底を覆うのに用いることもできる。高レベルの抗体が得られた（約２９５００ｎｇ／ｍＬ）。
【０１０７】
任意の機構によって結合されることを望まず、幾つかのＦＤＣがコラーゲンドットの上面にくっつく一方で、他のＦＤＣはドットの底部周辺で輪を形成すると思われる。上部とくっついたＦＤＣは不規則な形状のクラスタを形成し、リンパ球を引き付けると考えられ、リンパ球は、さらにＦＤＣ網目構造とは離れてより分散される。
【０１０８】
上記の明細書が、例示目的で与えられた実施例によって本発明の原理を教示しているが、本開示を読むことで当業者によって、本発明の真の範囲を逸脱することなく、形態及び詳細の様々な変更を行うことができることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】Ｂ細胞をシグナル伝達するのに重要なレセプター及びリガンドを示す図である。Ｂ細胞ＭＨＣ  ＩＩが抗原をＴＣＲに提示する必要性は、ＣＤ４０の関与であるとして周知である。重要な事象としては以下のものが挙げられる：  ・ＦＤＣがＢＣＲとの相互作用に対して無傷抗原を与え、この抗原−ＢＣＲ相互作用がＢ細胞の活性化及び分化に対して正のシグナルを与える。
【０１１０】
・ＦＤＣが補体由来ＣＤ２１ＬをＢ細胞−ＣＤ２１に与え、ＣＤ２１／ＣＤ１９／ＴＡＰＡ−１複合体とのこの相互作用がＢ細胞の活性化及び分化に対して正の補助シグナルを与える。
【０１１１】
・ＦＤＣ上のＦｃγＲＩＩＢが、抗原−抗体複合体でＩｇ−Ｆｃと結合し、その結果としてＢ細胞におけるＩＴＩＭを介して伝達されたシグナルが遮断され得る（Ｂ細胞上のＦｃγＲＩＩＢは関与しないことに留意されたい）。したがって、ＦＤＣはＢ細胞に対して負のシグナルを最小にする。
【０１１２】
・ＦＤＣはＩＣで覆われたボディ（イコソーム)を与え、Ｂ細胞が非常に良好であることが見出される。イコソーム抗原によって抗原がＢ細胞に与えられ、Ｔ細胞に提示される。
【図２】ＦＤＣは、ナイーブＢ細胞による共培養下でＮＰ特異的なＩｇＭの産生を促進する。ナイーブλ＋Ｂ細胞及びＦＤＣは、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスから単離され、ＣＣＧ初回刺激Ｔ細胞は、ＣＧＧで免疫されたＣ５７ＢＬ／６マウスから単離された。ＩＣはＮＰ−ＣＧＧ及び抗ＣＧＧ高度免疫マウス血清を用いて調製した。約１×１０６個のナイーブλ＋Ｂ細胞、約０．５×１０６個のＣＧＧ初回刺激Ｔ細胞、約０．４×１０６個のＦＤＣは、ＩＣにおいて１００ｎｇのＮＰ−ＣＧＧの存在下又は非存在下で、或いは遊離抗原として共培養した。培養上清液を７日目に回収し、新しい培地と交換した。ＥＬＩＳＡを用いて、細胞培養の７日目及び１４日目で上清液に蓄積したＮＩＰ特異的ＩｇＭを測定した。全てのデータは、３つの独立実験の代表的なものである。パネルＡは全ＮＩＰ特異的ＩｇＭを示し、パネルＢは高親和性ＮｌＰ特異的ＩｇＭ抗体を示す。白いカラムは第１週に発生したＮＩＰ特異的ＩｇＭ抗体を表し、黒いカラムは第２週に発生したＮＩＰ特異的ＩｇＭを表す。ＮＩＰ特異的ＩｇＭの親和性成熟は、トータルに対してＮＩＰ１９−ＯＶＡと結合したＮＩＰ特異的ＩｇＭの量と、高親和性ＮＩＰ特異的ＩｇＭ抗体に対してＮＩＰ５−ＯＶＡと結合したＮＩＰ特異的ＩｇＭの量とを比較することによって推測された。平均値周りの誤差バーは反復培養に対する平均値の標準誤差を表す。
【図３】ＦＤＣが、ナイーブＢ細胞による共培養下でＮＰ特異的ＩｇＧの産生及び親和性成熟を促進することを示す図である。図１でＮＩＰ特異的ＩｇＭの産生を研究するのに用いられた同じ細胞培養物を用いて、全ＩｇＧ抗体及び抗親和性ＮＩＰ特異的ＩｇＧ抗体を研究した。培養上清液を７日目に回収し、新しい培地に交換した。ＥＬＩＳＡを用いて、細胞培養後７日目及び１４日目に上清液で蓄積したＮＩＰ特異的ＩｇＧを測定した。全てのデータは、３つの独立実験の代表的なものである。パネルＡは全ＮＩＰ特異的ＩｇＧを示し、パネルＢは高親和性ＮＩＰ特異的ＩｇＧ抗体を示す。白いカラムは第１週に発生したＮＩＰ特異的ＩｇＧ抗体を表し、黒いカラムは第２週に発生したＮＩＰ特異的ＩｇＧ抗体を表す。ＩｇＭからＩｇＧへのクラススイッチは、第１週で発生したＩｇＭ及びＩｇＧの量と、第２週で発生したＩｇＭ及びＩｇＧの量とを比較することによって推測された。ＮＩＰ特異的ＩｇＧの親和性成熟は、ＮＩＰ１９−ＯＶＡと結合したＮＩＰ特異的ＩｇＧの量と、ＮＩＰ５−ＯＶＡと結合したＮＩＰ特異的ＩｇＧの量とを比較することによって推測された。ＮＩＰ１９−ＯＶＡと結合したＮＩＰ特異的ＩｇＧと、ＮＩＰ５−ＯＶＡと結合したＮＩＰ特異的ＩｇＧとの間の違いは、ＮＩＰ特異的ＩｇＧ抗体の親和性成熟に反映する。平均値周りの誤差バーは反復培養に対する平均値の標準誤差を表す。
【図４】Randolph et al. (1998) Science 282, 480-3からの組織セッティングモデルファクト。
【図５】マイクロキャリア上のＤＣ、ＦＤＣ、Ｔ細胞及びＢ細胞を組み込むｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＬＴＥ／ＧＣの立体配置。
【図６】ＥＣＭマトリクス中にＤＣ、ＦＤＣ、Ｔ細胞及びＢ細胞を組み込むｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＬＴＥ／ＧＣの別の立体配置。
【図７】７日後のＩｇＧ産生。
【図８】１４日後のＩｇＧ産生。
【図９】ＦＤＣが約１週間コラーゲン上に存在した後に、広域なプロセスが見られる。
【図１０】ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＧＣにおいて体細胞超変異を試験するために、本発明者等は、マウスで用いられるＶＨ１８６．２遺伝子を増幅し、抗ＮＰを作製するためにＰＣＲを用いた。ＰＣＲ産物を電気泳動ゲルから切断し、抽出して、クローン化した後、多重クローンをシークエンシングした。２０個の読み取り可能な配列のうち、７つがＶｈ１８６．２生殖細胞系列に対して相同性を有し、ＶＨ１８６クローンと称された。この配列は、ＶＨ１８６．２生殖細胞系列コード遺伝子に対してアラインされた。突然変異とは、置換されたヌクレオチドを示す。相当の突然変異が可変遺伝子で起こり、これは体細胞超変異に一致していた。
【図１１】１０個のヌクレオチド塩基当たりの特有の突然変異の数を塩基の位置に対してプロットした。
【図１２】単離後であるが、正の選択前のＦＤＣ。
【図１３】単離後であるが、正の選択前の選択された新しいＦＤＣ。幾つかのＦＤＣが突起を有していることに留意されたい。
【図１４】正の選択後のＦＤＣ。
【図１５】正の選択後のＦＤＣ。
【図１６】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＧＣ様帯を形成するためのコラーゲンドットパターンの使用。ＦＤＣの好ましい接着域は空間的に限定され、境界は「無ＦＤＣ」帯として与えられる。
【図１７】ＦＤＣは２４時間Ｃｙｔｏｄｅｘビーズとインキュベートした後、白血球を加えた。７日後、ＩｇＧ産生を測定した。
【図１８】ＦＤＣは２４時間コラーゲンドットパターンプレート上でインキュベートした後、白血球を加えた。７日後、ＩｇＧ産生を測定した（これは非組織培養処理プレート上であった）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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