(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アグリカルチュラル・リサーチ・カルチャー・コレクションに寄託番号ＮＲＲＬ−Ｂ５０３２７として寄託されたＬＴ１２または免疫調節活性および／または抗アレルギー活性を有するその遺伝子組み換え変異株である、単離されたラクトバチルス・パラカゼイ株。
【請求項２】
前記ラクトバチルス・パラカゼイ株が、アグリカルチュラル・リサーチ・カルチャー・コレクションに寄託番号ＮＲＲＬ−Ｂ５０３２７として寄託されたＬＴ１２である、請求項１に記載の単離されたラクトバチルス・パラカゼイ株。
【請求項３】
請求項１に記載のラクトバチルス・パラカゼイ株を含む組成物。
【請求項４】
前記ラクトバチルス・パラカゼイ株が、アグリカルチュラル・リサーチ・カルチャー・コレクションに寄託番号ＮＲＲＬ−Ｂ５０３２７として寄託されたＬＴ１２である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
抗アレルギー活性を有する、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
免疫調節活性および抗アレルギー活性を有する、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
前記ラクトバチルス・パラカゼイ株が生菌である、請求項３に記載の組成物。
【請求項８】
前記ラクトバチルス・パラカゼイ株が不活化されている、請求項３に記載の組成物。
【請求項９】
食品、飲料または薬剤である、請求項３に記載の組成物。
【請求項１０】
第２のラクトバチルス・パラカゼイ株をさらに含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ラクトバチルス・パラカゼイ株の前記第２のラクトバチルス・パラカゼイ株に対する比率が、細菌数で２：１から１００：１の間である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
免疫調節活性及び／または抗アレルギー活性を有する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
食品、飲料または薬剤である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
有効量の免疫調節活性を有する請求項１のラクトバチルス・パラカゼイ株およびその製薬上許容される担体を含む、免疫調節のための組成物。
【請求項１５】
前記ラクトバチルス・パラカゼイ株が、アグリカルチュラル・リサーチ・カルチャー・コレクションに寄託番号ＮＲＲＬ−Ｂ５０３２７として寄託されたＬＴ１２である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
自然免疫または適応免疫を調節する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
サイトカイン産生を刺激する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
前記サイトカインが、ＩＬ−１α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＭＣＰ-２およびＴＮＦ-αからなる群から選択される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
有効量の抗アレルギー活性を有する請求項１に記載のラクトバチルス・パラカゼイ株およびその製薬上許容される担体を含む、アレルギー治療のための組成物。
【請求項２０】
前記ラクトバチルス・パラカゼイ株が、アグリカルチュラル・リサーチ・カルチャー・コレクションに寄託番号ＮＲＲＬ−Ｂ５０３２７として寄託されたＬＴ１２である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
被験者がＩｇＥ媒介性即時型過敏症またはＴ細胞媒介性遅延型過敏症に罹患している、請求項１９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）株とその免疫調節及びアレルギー関連疾患治療における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギーとは、細菌や花粉、埃など「アレルゲン」として知られる特定の異物に対する我々の免疫系の過剰な反応を指す。これらアレルゲンは実際に伝染性または毒性があるわけではないのに、時に人体に有害で危険であるとみなされて免疫系の一部が働く。アレルゲンが人体と接触し、アレルギー反応が起きると、ヒスタミンとプロスタグランジンが続いて放出され、気道炎症やアトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、蕁麻疹、湿疹、特定の胃腸障害、ぜんそくなどを含むアレルギー性疾患が起こることがある。 
【０００３】
発展途上国では、公衆衛生の改善とワクチン及び抗生物質の使用が、通常アレルギーやぜんそくに不利となる感染の発生を減少させるため、子供にアレルギーが起こりやすくなっていることが報告されている。医療においては、「衛生仮説」と呼ばれており、幼児期の感染性病原体に対する暴露が不足すると、Ｔｈ−２媒介性免疫応答、すなわちＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３の過剰産生につながると指摘されている。これらＴｈ−２サイトカインが、ＩｇＥと共に、またはＩｇＥと共同で作用する好酸球、好塩基球および肥満細胞を炎症部位に集め、アレルギーが発生する。一方、ＩＬ−４とＩＬ−１３はＢ細胞のイソタイプスイッチを刺激して、ＩｇＥの血中濃度を高める。衛生仮説によると、Ｔｈ−１応答の上方制御、すなわちＩＦＮ−γの発現を刺激することがアレルギー活性の抑制に有効である可能性がある。
【０００４】
ラクトバチルス種（Lactobacillus sp.）は、サイトカイン発現の刺激、マクロファージとナチュラルキラー細胞の活性化および抗体の産生を含む、免疫調節活性をインビボで有することが多くの研究で示されている（非特許文献１）。特許文献１では、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）のＡＨ１０２またはＡＨ１０３、ＡＨ１０５、ＡＨ１０９またはＡＨ１１０株が炎症活動の予防及び／または治療における抗炎症生物製剤として有用であることが開示されている。特許文献２では、ラクトバチルス・パラカゼイＧＭ−０８０株がＩＦＮ−γの分泌とアレルギー関連疾患の治療を刺激することが示されている。
【０００５】
しかしながら、さまざまな天然物から単離された乳酸菌の効果はまだ完全に研究・解明されているとは言えない。本発明は関連の先行技術における株とは異なる、新規ラクトバチルス・パラカゼイ株を含む組成物とその免疫調節活性のための使用を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】Collins et al.（米国特許第７３９０５１９号明細書）
【特許文献２】Hsu et al.（米国特許第６９９４８４８号明細書）
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Madsen et al.、2001、Gastroenterology 121：580-591
【発明の概要】
【０００８】
本発明の一態様において、本発明は免疫調節活性（例えば抗アレルギー活性）を有する、新規ラクトバチルス・パラカゼイＬＴ１２株を提供する。
【０００９】
本発明の別の一態様において、本発明は前記ラクトバチルス・パラカゼイＬＴ１２株と担体を含む組成物を提供する。前記組成物は、食品（例えばヨーグルト、クッキー、シリアル、チョコレート、スナックバーなど）、飲料（例えばお茶、ソフトドリンク、牛乳、ジュースなど）、または製薬上許容される担体を含有する薬剤とすることができる。
【００１０】
本発明のさらに別の一態様において、本発明は上述の任意の組成物を必要とする被験者に投与することで免疫（すなわち、自然免疫または適応免疫）を調節する、またはアレルギーを治療する方法を提供する。前記被験者は、ＩｇＥ媒介性即時型過敏症またはＴ細胞媒介性遅延型過敏症に罹患した患者（例えばヒトの患者）とすることができる。
【００１１】
さらに、上述のラクトバチルス・パラカゼイＬＴ１２株の免疫調節またはアレルギー治療のための薬剤の製造における使用も本発明の範囲に包含される。
【００１２】
本発明の１以上の実施態様について、以下において詳細に説明する。以下の図面及びいくつかの実施態様の詳細な説明、添付の特許請求の範囲においても、本発明のその他の特徴及び利点を明らかにする。
【００１３】
本発明の上述及び以下の詳細な説明は、図面を参照するとより理解が促進される。しかしながら、本発明は図示される厳密な配置および手段に限定されるものではない。
【００１４】
それら図面のほか、メンブレン上のサイトカイン抗体アレイマップを表５に示す。
【００１５】
これ以上詳述しなくても、当業者は本明細書の説明に基づいて本発明を最大限に利用できると考えられる。したがって、以下に提示する特定の実施態様は、本発明を例示したものに過ぎず、いかなる意味でも本発明のその他部分を限定するものとみなされてはならない。本明細書で引用されるすべての刊行物は、参照により組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】１Ａ． ＰＢＭＣソースＣブランク群のヒトサイトカイン抗体アレイブロット写真である。１Ｂ． ＬＴ１２単独によって刺激されたＰＢＭＣソースＣのヒトサイトカイン抗体アレイブロット写真である。１Ｃ． 第２のラクトバチルス・パラカゼイを組み合わせたＬＴ１２によって刺激されたＰＢＭＣソースＣのヒトサイトカイン抗体アレイブロット写真である。１Ｄ． ＰＢＭＣソースＥブランク群のヒトサイトカイン抗体アレイブロット写真である。１Ｅ． ＬＴ１２によって刺激されたＰＢＭＣソースＥのヒトサイトカイン抗体アレイブロット写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、免疫調節及びアレルギー治療が可能な、ＬＴ１２株（以下「ＬＴ１２」という）と呼ばれる新規ラクトバチルス・パラカゼイ株を提供する。該ＬＴ１２株は、ブダペスト条約に従って、国際寄託機関であるアグリカルチュラル・リサーチ・カルチャー・コレクション（Agricultural Research Culture Collection、International Depositary Authority）（1815  N. University  Street, Peoria, Illinois, 61601, U.S.A.）に２００９年９月２１日に寄託され、寄託番号ＮＲＲＬ−Ｂ５０３２７を付与された。
【００１８】
ラクトバチルス・パラカゼイＬＴ１２株はヒト糞便から単離された。 糞便試料の処理は採集後１２時間以内に行われた。計量した試料（約１ｇ）をストマッカー（Stomacher 400、Seward、英国）で３０秒間均質化してから、予備還元(pre-reduced)ブレインハートインフュージョン培地で希釈し、適切な選択培地で培養を行った。ロゴサ酢酸塩寒天培地（Rogosa Acetate agar）（Difco、米国）と、バンコマイシン（Sigma、米国）１２μｇ／ｍｌを添加したロゴサ酢酸塩寒天培地（Difco、米国）を使用して適切な希釈物を塗布し、合計のラクトバチルス種（Lactobacillus spp.）とバンコマイシン非感受性乳酸菌（すなわち、L. paracasei、L. casei、L. rhamnosus を含む L. paracasei 群）をそれぞれ数えた。ＡＰＩ５０ＣＨＬ（bioMerieux, Inc. 米国）を実行してバンコマイシン非感受性 L. paracasei 群中の菌種を同定した。結果を表１に示す。
【００１９】
ＬＴ１２の微生物学的性状を以下に示す。
（１）形態的特性：
（ａ） 細胞の形状と大きさ：細菌はＭＲＳブロス中において一晩３７℃で培養し、顕微鏡で観察したとき、桿状で円形の端部を示す。 
（ｂ） 運動：運動性
（ｃ） 鞭毛：なし
（ｄ） 胞子形成：胞子形成なし
（ｅ） グラム染色：陽性
（２）培養特性：
（ａ） 培地：ラクトバチルスＭＲＳブロス（Difco、米国）、最終ｐＨ６．２〜６．５
（ｂ） 培養条件：３７℃、嫌気性または好気性培養
（３）生理特性:
（ａ） カタラーゼ：陽性
（ｂ） オキシダーゼ：陰性
（ｃ） ＡＰＩ５０ＣＨＬ検査：結果を表１に示す。
（４）遺伝的特性：
【００２０】
実施例２に示すように、ランダム増幅多型ＤＮＡ（Randomly amplified polymorphic  DNA、ＲＡＰＤ解析法）が、ＬＴ１２、ラクトバチルス・パラカゼイ（Cell biotech Co., Ltd.、韓国、「ＬＰ−ＣＢＴ」）、ラクトバチルス・パラカゼイＧＭＮＬ３２（「ＧＭＮＬ３２」）、ラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイＢＣＲＣ１４０２３（「ＢＣＲＣ１４０２３」）およびラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイＢＣＲＣ１２１８８（「ＢＣＲＣ１２１８８」）について実施された。１２のランダムプライマーが選択され、これを表２に示す。電気泳動の結果は、ＬＴ１２が異なるバンドパターンを有することを示した（表３参照）。上述を受けて、ＬＴ１２は新規のラクトバチルス・パラカゼイ株である。
【００２１】
本発明の一実施態様によると、前記ＬＴ１２株またはその変異株は生細胞の形態で使用することができる。本発明の別の実施態様では、前記ＬＴ１２株はＬＴ１２株により産生される有益な要素を含有する加熱殺傷細胞などの非生細胞とすることができる。
【００２２】
本発明は、免疫調節活性及び／または抗アレルギー活性を有するＬＴ１２株またはその変異株を提供する。「免疫調節活性」とは、安定的または抑制された免疫機能を活性化する機能（免疫賦活活性）、または免疫機能の超過または過剰反応を適切なレベルにまで抑制する機能（免疫抑制活性）を指す。つまり、免疫細胞（すなわち、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ）を制御して免疫応答の全体的バランスを安定化することである。例えば、サイトカイン産生の促進または抑制、リンパ球の活性化、Ｔｈ１／Ｔｈ２の活性の平衡化、およびアレルギー活性の阻害などであるが、これらに限定されない。 
【００２３】
本発明はまた、アレルギー治療が可能なＬＴ１２株またはその変異株も提供する。「アレルギー」とは、防御免疫の生理状態による宿主に有害な免疫応答を指す。最も一般的なアレルギーの形態は、ＩｇＥ媒介性即時型過敏症とＴ細胞媒介性遅延型過敏症によって引き起こされる。アレルギー活性は臨床的にアレルギー性鼻炎、アレルギー性ぜんそく、食品アレルギー、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性眼疾患、およびアナフィラキシーなどとして現れる。「アレルギー治療」とは、上記のアレルギー性症状を逆行させる可能性がある一連の免疫活性を刺激することを指す。例えば、Ｔｈ−２媒介性免疫のブロック、Ｔｈ−２媒介性サイトカイン（すなわち、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３）産生の減少、Ｔｈ−１媒介性サイトカイン（すなわち、ＩＮＦ−γ）の増加、およびＩｇＥ＋メモリーＢ細胞と好酸球の活性化または分化の阻止などであるが、これらに限定されない。
【００２４】
本発明の一実施態様において、ＬＴ１２は志願者から分離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を刺激して、ＥＬＩＳＡによって示されるように、ＩＮＦ−γを分泌させることができた（表４参照）。ＩＮＦ−γはウイルス性及び細胞内細菌感染に対する自然免疫と適応免疫に重要なサイトカインである。これはＴｈ１細胞の代表的サイトカインであり、Ｔｈ−２細胞分化を阻害するため、ＩｇＥへの免疫グロブリンクラススイッチと、ナイーブ及びＩｇＥ＋メモリーＢ細胞集団の増殖（clonal expansion）を誘導する、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３の産生を減少させる。したがって、ＩＦＮ−γの発現を刺激することはアレルギー治療において有効であり得る。
【００２５】
本発明の別の実施態様において、ＬＴ１２は末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のＩＬ−１α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＭＣＰ−２およびＴＮＦ−αを含むその他サイトカインの分泌を刺激することも可能であり、ヒトサイトカイン抗体アレイによって判定された（図１Ａから１Ｅと表６を参照）。
【００２６】
したがって、本発明は、有効量のラクトバチルス・パラカゼイＬＴ１２株とその製薬上許容される担体を含む組成物を、必要とする被験者に投与する工程を含む、免疫調節の方法を提供する。
【００２７】
本発明はまた、有効量のラクトバチルス・パラカゼイ ＬＴ１２株とその製薬上許容される担体を含む組成物を必要とする被験者に投与する工程を含むアレルギー治療の方法も提供する。ここでいう「製薬上許容される担体」とは、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びその組み合わせを含むことができるが、それらに限定されない。
【００２８】
予期せぬことに、本発明はさらに、ＬＴ１２と第２のラクトバチルス・パラカゼイ株を含む組成物が免疫調節活性及び／または抗アレルギー活性を有することも発見した。一つの実施態様において、第２のラクトバチルス・パラカゼイ株はＬＰ−ＣＢＴであり、ＬＴ１２対第２の株の比率は細菌数で１００：１である。ＬＴ１２対第２の株の比率は２：１が好ましい。実施例４に示すように、組み合わせ組成物も末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のＩＬ−１α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＭＣＰ−２、ＴＮＦ−αを含むその他サイトカイン分泌を刺激することが可能であり、ヒトサイトカイン抗体アレイによって判定された。さらに、ＭＣＰ−３はＬＴ１２を組み合わせた組成物によって刺激されたＰＢＭＣにおいてのみ発現された。
【００２９】
本発明に従って、前記ＬＴ１２株は優れた免疫調節および抗アレルギー活性を提供する。本発明の一つの例において、前記ＬＴ１２株またはその組み合わせは組成物の中の有効成分として使用することができる。組成物は食品や飲料、薬剤として製造することができる。さらに、さまざまな添加物を含めることができる。添加物の例としては、着色料（例えば、ベータカロテン、アナトー、ターメリック、パプリカ、ＦＤ＆Ｃ着色料）、香料、芳香料、甘味料、乳化剤、増粘剤、保存料、ビタミン、抗酸化剤（例えばビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｂ−１、Ｂ−５、Ｂ−６、 亜鉛、セレニウム、カルシウム、α−トコフェロール、グルタチオン、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、およびシステイン）を含むが、それらに限定されない。
【００３０】
本発明はさらに、限定ではなく例示目的で示す以下の実施例によって説明される。
【実施例１】
【００３１】
ラクトバチルス・パラカゼイＬＴ１２株の単離
【００３２】
ラクトバチルス・パラカゼイＬＴ１２株がヒト糞便から単離された。糞便試料の処理は採集後１２時間以内に行われた。計量した試料（約１ｇ）をストマッカー（Stomacher 400、Seward、英国）で３０秒間均質化してから、予備還元ブレインハートインフュージョン培地で希釈し、適切な選択培地で培養を行った。ロゴサ酢酸塩寒天培地（Rogosa Acetate agar）（Difco、米国）と、バンコマイシン（Sigma、米国）１２μｇ／ｍｌを添加したものを使用して適切な希釈物を塗布し、合計のラクトバチルス種（Lactobacillus spp.）とバンコマイシン非感受性乳酸菌（すなわち、L. paracasei、L. casei、L. rhamnosus を含む  L. paracasei 群）をそれぞれ数えた。ＡＰＩ５０ＣＨＬ（bioMerieux, Inc, 米国）を実行してバンコマイシン非感受性 L. paracasei 群中の菌種を同定した。
【実施例２】
【００３３】
ラクトバチルス・パラカゼイＬＴ１２株の特徴づけ
【００３４】
菌種同定
【００３５】
乳酸菌の同定にはＡＰＩ５０ＣＨＬシステムが使用される。一連の酵素の反応を分析することで、乳酸の特徴が確立される。ＬＴ１２のＡＰＩ５０ＣＨＬ検査の結果を表１に示す。
【００３６】
【表１】
0005511649.tif 000002
【００３７】
ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ解析）
【００３８】
表２に示す１２のランダムプライマーによるＲＡＰＤ解析のため、ＬＴ１２、ラクトバチルス・パラカゼイ（Cell biotech Co., Ltd.、韓国、「ＬＰ−ＣＢＴ」）、ラクトバチルス・パラカゼイＧＭＮＬ３２（「ＧＭＮＬ３２」）、ラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイＢＣＲＣ１４０２３（「ＢＣＲＣ１４０２３」）およびラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイＢＣＲＣ１２１８８（「ＢＣＲＣ１２１８８」）の４０時間培養後のＤＮＡ抽出が実施された。ＲＡＰＤの結果を表３に示す。ＬＴ１２は電気泳動によってほかの４つの菌株に比べ異なるバンドパターンが観察された。
【００３９】
ＡＰＩ５０ＣＨＬ同定とＲＡＰＤ解析によると、ＬＴ１２は従来のラクトバチルス・パラカゼイ株とは異なるものであった。上述を受けて、ＬＴ１２は新規ラクトバチルス・パラカゼイ株であった。
【００４０】
【表２】
0005511649.tif 000003
【００４１】
【表３】
0005511649.tif 000004
【実施例３】
【００４２】
アレルギー調節におけるＬＴ１２及びその他乳酸菌の活性
【００４３】
細菌の調製
【００４４】
ＬＴ１２、ＬＰ−ＣＢＴ、ラクトバチルス・ラムノーサスＧＧ（以下「ＬＧＧ」という）がラクトバチルスＭＲＳブロス中において３７℃で２４時間培養され、３０００ｒｐｍの遠心分離１５分間によって採集された。ペレットは１ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で２回洗浄された後、９５℃で３０分間加熱され、加熱処理死菌体を得た。
【００４５】
末梢血単核球の単離
【００４６】
健康な志願者（男性２名、女性３名、２４〜４０歳）から取得した鮮血試料が２０００ｒｐｍで室温で１０分間遠心分離された後、バフィーコート層から試料が採集された。採集された試料には等量の希釈培地（ＲＰＭＩ−１６４０＋２％のウシ胎児血清（ＦＢＳ））が添加された後、４ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７フィコールプラス溶液にゆっくりと取り出された。１２００ｒｐｍでの３０分間の遠心分離後、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）が試料のインターフェースから採取され、８ｍｌの洗浄用メディウム（ＲＰＭＩ−１６４０＋２％のＦＢＳと１％のＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水））で２回洗浄された。ＰＢＭＣ（１０６細胞／ｍｌ）が２４ウェルプレートのウェルに移され、完全培地（ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％のＦＢＳと１％のＰＢＳ）で培養された。
【００４７】
ＩＦＮ−γ分泌の促進とＩＦＮ−γレベルの判定
【００４８】
ＰＢＭＣ試料が特定量（５×１０６、５×１０７または５×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）のＬＴ１２、ＬＰ−ＣＢＴ、ＬＧＧと共培養された。４８時間の共培養後、以下の手順を含むＥＬＩＳＡによるＩＦＮ−γレベル判定のため各ウェルの上清が採取された。５μｇ／ｍｌのＰＨＡ（植物性凝集素）と１０μｇ／ｍｌのＬＰＳ（リポ多糖）が陽性対照として使用された。
【００４９】
１００μｌ／ウェル（９６ウェルプレート）の４μｇ／ｍｌの抗ＩＦＮ−γ抗体（RayBio（登録商標）Human IFN-γ ELISA、RayBiotech Inc.、米国）を加えて４℃で一晩置き、各ウェルを２５０μｌの洗浄バッファで５回洗浄した。２００μｌ／ウェルのアッセイ希釈液を加えて、１時間室温で反応させた。各ウェルを２５０μｌの洗浄バッファで５回洗浄し、各ウェルに１００μｌ／ｍｌのＰＭＢＣ試料上清を加えて２時間室温で反応させた。各ウェルを２５０μｌの洗浄バッファで５回洗浄し、各ウェルに１００μｌ／ウェルの検出用抗体を加えて１時間置いた。各ウェルを２５０μｌの洗浄バッファで５回洗浄し、各ウェルに１００μｌ／ウェルのアビジン−ＨＲＰを加えて（１：２５０）３０分間置いた。各ウェルを２５０μｌの洗浄バッファで７回洗浄し、各ウェルに１００μｌ／ウェルの基質溶液を加えた。３〜１５分間のインキュベーション後、５０μｌ／ウェルの２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止させた。プレートの各ウェルの吸光を４５０ｎｍで測定した。ＩＦＮ−γ濃度レベルが検量線から変換され、計算された。結果を表４に示す。
【００５０】
細菌のうち、ＬＴ１２は異なるＣＦＵ群で最も強力なＩＦＮ−γ分泌刺激能力を有した。
【００５１】
【表４】
0005511649.tif 000005
【実施例４】
【００５２】
ＬＴ１２とその組成物のＰＢＭＣサイトカイン産生に対する影響の判定
【００５３】
加熱殺傷ＬＴ１２及びＬＴ１２とＬＰ−ＣＢＴを細菌数で２：１の比率で含むＬＴ１２組成物が上で開示した通りに作製された。ＲａｙＢｉｏ（登録商標）ヒトサイトカイン抗体アレイ（Cat. AAH-CYT-1、RayBiotech Inc.、米国）を使用して、ＬＴ１２（５×１０７／ｍｌ）およびＬＴ１２組成物（５×１０７／ｍｌ）と４８時間共培養されたＰＢＭＣ（ソースＣおよびソースＥ）におけるサイトカイン発現プロファイルが判定された。
【００５４】
アレイプロトコルはキット付属のメーカー説明書（http://www.raybiotech.com/cytokine_antibody_array.asp）に従った。簡単に説明すると、先が平坦なピンセットを使用して保護シートの間から使用する各メンブレンを取り出し、８ウェルプレートのウェルの中に配置した。２ｍｌ／ウェルのブロック用バッファを加え、プレートを３０分間振とうさせてインキュベートした。ブロック用バッファをウェルから吸引し、１ｍｌ／ウェルの試料を加えた。プレートを２時間振とうさせてインキュベートした後、各ウェルを２ｍｌの洗浄バッファＩで２回、さらに２ｍｌの洗浄バッファＩＩで３回洗浄した。１ｍｌ／ウェルのビオチン化抗体溶液を加えた後、プレートを２時間振とうさせてインキュベートした。抗体溶液を吸引した後、各ウェルを２ｍｌの洗浄バッファＩで２回、さらに２ｍｌの洗浄バッファＩＩで３回洗浄した。２ｍｌ／ウェルのＨＲＰ−ストレプトアビジン溶液を加え、プレートを２時間振とうさせてインキュベートした。ピンセットを使用してメンブレンの液体を落とした後、それをウェルに戻した。０．５ｍｌ／ウェルの混合検出用バッファを加えた後、光から離して２分間インキュベートした。プレートから各メンブレンを慎重に取り出してプラスチックシートプロテクタまたはプラスチックラップ上に置いた。フィルムカセット中のラップされたメンブレンをＸ線に４０秒間暴露した。メンブレン上のサイトカイン抗体アレイマップを表５に示す。
【００５５】
【表５】
0005511649.tif 000006
【００５６】
結果を１Ａ〜Ｅと表６に示す。アレイテストは、ソースＣからのＰＢＭＣのブランク群（図１Ａ）、ＬＴ１２共培養群（図１Ｂ）およびＬＴ１２組成物共培養群（図１Ｃ）、ならびにソースＥからのＰＢＭＣのブランク群（図１Ｄ）およびＬＴ１２共培養群（図１Ｅ）の５つの群に分けられた。両方の共培養群にはＩＬ−１α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＭＣＰ−２およびＴＮＦ−αを含むサイトカインレベルの増加が観察された。これらサイトカインのうち、ＩＬ−１α、ＩＦＮ−γ、ＭＣＰ−２およびＴＮＦ−αは、ＬＴ１２またはＬＴ１２組成物によって刺激されたＰＢＭＣにおいてのみ発現した。ソースＣからのＰＢＭＣ内の群を比較すると、ＬＴ１２組成物によって刺激されたＧＲＯ−α、ＩＬ−１０およびＭＣＰ−２の発現レベルはＬＴ１２のみによって刺激されたものより高いことが示された。さらに、ＭＣＰ−３はＬＴ１２組成物によって刺激されたＰＢＭＣにおいてのみ発現した。
【００５７】
【表６】
0005511649.tif 000007
【００５８】
当業者であれば、上記の実施態様には、その広い発明概念から逸脱することなく変更がなされ得ることが分かる。よって、本発明は、開示されている特定の実施態様に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲に記載されている本発明の精神と範囲内の変更を網羅すると理解されるものである。
【００５９】
本明細書において開示されたすべての特徴は任意の組み合わせで組み合わせることが可能である。本明細書において開示された各特徴は、同一、同等、または類似の目的を果たす別の特徴によって置き換えることができる。したがって、別途明示的に説明されている場合を除き、開示された各特徴は汎用的な一連の同等または類似の特徴の単なる一例である。
【００６０】
上述の説明から、当業者は本発明の本質的な特徴を容易に確認し得、そして本発明の精神および範囲から離れることなく、種々の用法および条件に適応するために、本発明の種々の変化および改変をなし得る。したがって、ほかの実施態様も特許請求の範囲内に含まれる。
【図１】
0005511649.tif 000008
【配列表】
0005511649000001.app