(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)式
【化１】
0005528110.tif 000077
を有するイソプレノイド化合物又はその立体異性体であって、上式で、ZはH、O-R又はO-C(=O)Rであり;かつRはH、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルカリール又はアラルキルであり、該イソプレノイド化合物の量が該燃料組成物の全重量に基づき少なくとも2%である、前記イソプレノイド化合物又はその立体異性体と;
(b)燃料成分と;を含む混合物を含み、
38℃以上の引火点を有する、燃料組成物。
【請求項２】
T90蒸留温度が282℃から338℃である、請求項1記載の燃料組成物。
【請求項３】
前記イソプレノイド化合物の量が前記燃料組成物の全重量に基づき5重量%から90重量%である、請求項1記載の燃料組成物。
【請求項４】
前記イソプレノイド化合物の量が、前記燃料組成物の全重量に基づき少なくとも10重量%である、請求項1記載の燃料組成物。
【請求項５】
前記燃料組成物が、該燃料組成物の全重量に基づき20ppm未満の硫黄含有量を有し、かつ該燃料組成物の全容量に基づき20容量%未満の芳香族含有量を有する、請求項1記載の燃料組成物。
【請求項６】
前記燃料組成物が、100℃を超える初留点を有し、かつ200℃を超える終留点を有する、請求項1記載の燃料組成物。
【請求項７】
前記燃料組成物が100℃と150℃の間の初留点及び300℃を超える終留点を有する、請求項1記載の燃料組成物。
【請求項８】
前記燃料成分が留出ディーゼル燃料を含み、該留出ディーゼル燃料の量が前記燃料組成物の全重量に基づき少なくとも10重量%である、請求項1記載の燃料組成物。
【請求項９】
(a)少なくとも50容量%の量の燃料成分と;
(b)少なくとも2容量%以上かつ50容量%未満の式
【化２】
0005528110.tif 000078
のイソプレノイド化合物又はその立体異性体と;
を含む混合物を含む燃料組成物であって、上式で、ZはH、O-R又はO-C(=O)Rであり;かつRはH、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルカリール又はアラルキルであり、
38℃以上の引火点を有する、前記燃料組成物。
【請求項１０】
燃料添加剤をさらに含む、請求項1〜9のいずれかに記載の燃料組成物。
【請求項１１】
前記燃料添加剤が、潤滑性向上剤、抗酸化剤、熱安定性向上剤、セタン向上剤、安定剤、コールドフロー向上剤、助燃剤、泡止め剤、濁り防止添加剤、腐食抑制剤、アイシング抑制剤、噴射器清浄添加剤、煙抑制剤、ドラッギング低減添加剤、金属活性低下剤、分散剤、界面活性剤、デマルシファイアー、色素、マーカー、静電放散剤、殺生物剤及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項10記載の燃料組成物。
【請求項１２】
前記燃料成分がジェット燃料、ディーゼル燃料、又は留出ディーゼル燃料である、請求項1〜9のいずれかに記載の燃料組成物。
【請求項１３】
前記イソプレノイド化合物が、
【化３】
0005528110.tif 000079
若しくはその立体異性体(式中、ZはOHである)、又は
【化４】
0005528110.tif 000080
若しくはその立体異性体(式中、RはH、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルカリール又はアラルキルである)である、請求項1〜9のいずれかに記載の燃料組成物。
【請求項１４】
前記イソプレノイド化合物が式(IV)であり、式中RはC1〜C3アルキルである、請求項13記載の燃料組成物。
【請求項１５】
燃料組成物の製造方法であって、式
【化５】
0005528110.tif 000081
を有するイソプレノイド化合物又はその立体異性体を、燃料成分、燃料添加剤又はそれらの組合せと混合することを含み、上式で、ZはH、O-R又はO-C(=O)Rであり;かつRはH、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルカリール又はアラルキルであり、該イソプレノイド化合物の量が該燃料組成物の全重量に基づき少なくとも2%であり、
該燃料組成物が38℃以上の引火点を有する、前記製造方法。
【請求項１６】
T90蒸留温度が282℃から338℃である、請求項15記載の製造方法。
【請求項１７】
前記イソプレノイド化合物の量が前記燃料組成物の全重量に基づき5重量%から90重量%である、請求項15記載の製造方法。
【請求項１８】
燃料の製造方法であって、燃料添加剤を式
【化６】
0005528110.tif 000082
を有するイソプレノイド化合物又はその立体異性体と混合することを含み、上式で、ZはH、O-R又はO-C(=O)Rであり;かつRはH、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルカリール又はアラルキルであり、
該燃料組成物が38℃以上の引火点を有する、前記製造方法。
【請求項１９】
式(I)又は(II)の前記イソプレノイド化合物がC15イソプレノイド出発物質から化学的に変換される、請求項15又は18記載の製造方法。
【請求項２０】
前記C15イソプレノイド出発物質が生物供給源から得られる、請求項19記載の製造方法。
【請求項２１】
前記C15イソプレノイド出発物質が
【化７】
0005528110.tif 000083
又はその立体異性体であり、該出発物質が水素化及びエステル化されて
【化８】
0005528110.tif 000084
又はその立体異性体を生成し、上式で、RはH、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルカリール又はアラルキルである、請求項20記載の製造方法。
【請求項２２】
前記C15イソプレノイド出発物質が
【化９】
0005528110.tif 000085
又はその立体異性体であり、該出発物質が水素化及びエステル化されて
【化１０】
0005528110.tif 000086
又はその立体異性体を生成し、上式で、RはH、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルカリール又はアラルキルである、請求項20記載の製造方法。
【請求項２３】
RがC1〜C3アルキルである、請求項21又は22記載の製造方法。
【請求項２４】
請求項15又は18記載の方法によって製造される燃料。
【請求項２５】
それぞれ独立して式(III)、(IV)又は(V)
【化１１】
0005528110.tif 000087
を有するかその立体異性体である少なくとも2つの異なる化合物を含む混合物を含む燃料組成物であって、上式で、RはC1〜C5アルキルであり、かつ該2つの化合物はそれぞれ、該燃料組成物の全重量に基づき少なくとも5重量%の量で存在し、
38℃以上の引火点を有する、前記燃料組成物。
【請求項２６】
内燃機関;該内燃機関に連結される燃料タンク;及び該燃料タンク内の請求項1〜9のいずれかに記載の燃料組成物;を含む乗物であって、該燃料組成物が該内燃機関を動かすために用いられる、前記乗物。
【請求項２７】
前記内燃機関がディーゼルエンジンである、請求項26記載の乗物。
【請求項２８】
前記燃料組成物の沸点が282℃から338℃、140℃から320℃、又は、200℃未満である、請求項1〜9のいずれかに記載の燃料組成物。
【請求項２９】
請求項1〜9のいずれかに記載の燃料組成物を燃焼させるステップを含む、エンジンを動かす方法。
【請求項３０】
燃料成分及び生体工学によって作られたC15イソプレノイド化合物を含む燃料組成物であって、
該C15イソプレノイド化合物が、下記の式を有するか、又はその立体異性体であり、
【化１２】
0005528110.tif 000088
式中、ZはH、O-R又はO-C(=O)Rであり;かつRはH、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルカリール又はアラルキルであり、該イソプレノイド化合物が、該燃料組成物の全重量に基づき少なくとも2%の量で存在し、；かつ
38℃以上の引火点を有する、前記燃料組成物。
【請求項３１】
微生物を用いてファルネセンを調製し、該ファルネセンからファルネサンを調製し、及び該ファルネサンから燃料組成物を調製することによって製造され、
38℃以上の引火点を有する、燃料組成物。
【請求項３２】
単純糖から誘導されるイソプレノイド化合物を含む燃料成分を含む燃料組成物であって、
該イソプレノイド化合物が、下記の式を有するか、又はその立体異性体であり、
【化１３】
0005528110.tif 000089
式中、ZはH、O-R又はO-C(=O)Rであり;かつRはH、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルカリール又はアラルキルであり、該イソプレノイド化合物が、該燃料組成物の全重量に基づき少なくとも2%の量で存在し、；かつ
38℃以上の引火点を有する、前記燃料組成物。
【請求項３３】
単純糖から燃料組成物を製造する方法であって、
(a)C15イソプレノイド出発物質を製造することができる細胞を、該C15イソプレノイド出発物質を製造するのに適する条件下で該単純糖と接触させるステップと;
(b)該C15イソプレノイド出発物質を水素化して水素化C15イソプレノイド化合物を形成するステップと;
(c)該水素化C15イソプレノイド化合物を1つ以上の燃料成分又は燃料添加剤と混合して該燃料組成物を製造するステップと；を含み、
該C15イソプレノイド化合物が、下記の式を有するか、又はその立体異性体であり、
【化１４】
0005528110.tif 000090
式中、ZはH、O-R又はO-C(=O)Rであり;かつRはH、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルカリール又はアラルキルであり、該イソプレノイド化合物が、該燃料組成物の全重量に基づき少なくとも2%の量で存在する、前記製造方法。
【請求項３４】
前記単純糖がグルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、リボース又はそれらの組合せである、請求項33記載の製造方法。
【請求項３５】
前記単純糖がグルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、リボース又はそれらの組合せである、請求項32記載の燃料組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(従来の関連出願)
本出願は、2006年10月10日出願の米国特許仮出願第60/850,881号及び2006年11月21日出願の第60/860,854号の米国特許法第119条(e)に基づく利益を主張するものであり、そのすべては引用により本明細書にその全体が組み込まれている。
【０００２】
(発明の分野)
本発明は、とりわけ、ディーゼル燃料及びジェット燃料などの燃料組成物を包含する。詳細には、本発明は、ファルネサンを含む燃料組成物、並びに該燃料組成物の製造及び使用方法を包含する。ある実施態様では、本発明は、少なくとも一部は微生物から容易に効率よく生成されるファルネサンを含む安定した燃料組成物を包含する。ある実施態様では、本発明は、生体工学によって作られたファルネサンを高濃度で含む燃料組成物を包含する。
【背景技術】
【０００３】
(発明の背景)
生物学的に生成された燃料(「生物燃料」)は、上昇する石油価格、逼迫した供給制約、及び増加する地球規模の二酸化炭素排出に対する懸念のために、ここ数十年の間かなり注目されている。石油及び石炭などの再生不可能な天然のエネルギー源と対照的に、生物燃料は再生可能な天然源、一般的に生物及びそれらの代謝副産物に由来する。
【０００４】
現在まで、ディーゼルエンジンなどの内燃機関に適する生物燃料は、一般に植物油に由来する。いわゆる第1世代「バイオディーゼル」は、一般的に、植物油のエステル転移反応から形成されるC16〜C18脂肪酸メチルエステルである。より最近、第2世代の「バイオディーゼル」は、国際公開第2006/075057号に開示されているNExBTL法などの新しい方法によって生成され、該方法は、植物油又は動物脂肪を水素化して対応するアルカン又はパラフィンを生じる。出発物質の性質により、どちらの方法も、バッチによって異なり得る生成物の複雑で不均質な混合物を生じる。この生成物の変動は、既定の仕様又は必要条件による燃料の製造を複雑にすることがある。その結果、燃料組成物を製造するための燃料添加剤及び燃料成分の必要性、並びにディーゼルエンジン及びジェットエンジンなどの内燃機関で使用するために安心して再生可能に製造することができる燃料成分の必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
(発明の要旨)
本明細書で、イソプレノイド又はそれらの誘導体を含む燃料組成物、燃料成分又は燃料添加剤、並びにその製造及び使用方法が提供される。これらの組成物の実施態様は、前述の必要性を満たすと考えられる。より具体的には、イソプレノイド及びそれらの誘導体は、燃料組成物の燃料成分として用いることができる。ある実施態様では、イソプレノイド又はそれらの誘導体は、燃料組成物自体として、燃料組成物の主要成分として、又は燃料組成物の少量成分として用いることができる。イソプレノイド及びそれらの誘導体は、生体工学によって作られた微生物を含む微生物から製造することができる。本明細書で開示される燃料組成物は、ガソリンエンジン、ディーゼルエンジン及びジェットエンジンなどの内燃機関の燃料として用いることができる。
【０００６】
ある実施態様では、本発明は、1つ以上の生体工学によって作られた燃料成分を含むディーゼル燃料を包含する。ある実施態様では、本発明は、1つ以上の生体工学によって作られた燃料成分を含むジェット燃料を包含する。これらの実施態様では、生体工学によって作られた燃料成分は、遺伝子操作された微生物、野生型微生物又はその選択された株などの、生体工学によって作られた燃料成分を生成することができる任意の微生物によって生成することができる。ある実施態様では、生体工学によって作られる燃料成分は、本明細書で開示されるイソプレノイド又はその誘導体である。
【０００７】
ある実施態様では、生体工学によって作られる燃料成分は、容易に利用でき、再生可能な材料から得ることができる。注目すべきことに、したがって本発明は、容易に利用でき、再生可能なエネルギー源、及びエネルギー生産のためのそれらの使用方法を提供する。ある実施態様では、生体工学によって作られる燃料成分は、単糖類(単純糖)又は二糖類などの糖から得ることができる。
【０００８】
ある他の実施態様では、生体工学によって作られる燃料成分は、アセテート又はグリセロールなどの、容易に利用できる非発酵性の炭素源から得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
(図面の説明)
【図１】イソペンテニル二リン酸 (「IPP」)の生成のためのメバロン酸(mevalonate)(「MEV」)経路の略図である。
【００１０】
【図２】IPP及びジメチルアリルピロリン酸 (「DMAPP」)の生成のためのDXP経路の略図である。Dxsは、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸合成酵素であり;Dxrは、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸リダクトイソメラーゼ(別名IspC)であり;IspDは、4-ジホスホシチジル-2C-メチル-D-エリスリトール合成酵素であり;IspEは、4-ジホスホシチジル-2C-メチル-D-エリスリトール合成酵素であり;IspFは、2C-メチル-D-エリスリトール2,4-シクロ二リン酸合成酵素であり;IspGは、1-ヒドロキシ-2-メチル-2-(E)-ブテニル-4-二リン酸合成酵素(IspG)であり;及び、ispHは、イソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸合成酵素である。
【００１１】
【図３】発現プラスミドpAM97のマップを示す図である。
【００１２】
【図４】発現プラスミドpAM408のマップを示す図である。
【００１３】
【図５】発現プラスミドpAM424のマップを示す図である。
【００１４】
【図６Ａ】ベクターpAM489のERG20-PGAL-tHMGR挿入断片のマップを示す図である。
【図６Ｂ】ベクターpAM491のERG13-PGAL-tHMGR挿入断片のマップを示す図である。
【図６Ｃ】ベクターpAM493のIDI1-PGAL-tHMGR挿入断片のマップを示す図である。
【図６Ｄ】ベクターpAM495のERG10-PGAL-ERG12挿入断片のマップを示す図である。
【図６Ｅ】ベクターpAM497のERG8-PGAL-ERG19挿入断片のマップを示す図である。
【００１５】
【図７】発現プラスミドpAM373及びpAM342のマップを示す図である。
【００１６】
【図８】発現プラスミドpAM404のマップを示す図である。
【００１７】
【図９】BP Whiting製油所からのNo.2ディーゼル、並びにこの燃料との、ファルネサン(AMD-200)の5%、20%及び50%混合物のASTM D975試験データを示す図である。
【００１８】
【図１０】Caliornia Air Resources Boardの要件を満たす(CARB燃料)BP Carson製油所からのディーゼル燃料、並びにこの燃料とのファルネサン(AMD-200)の5%、20%、50%及び65%混合物のASTM D975試験データを示す図である。CARB燃料のこの特定の試料は、CARB燃料に一般に見られる潤滑増強剤を含有しない。
【００１９】
【図１１Ａ】ファルネサン(AMD-200)の様々な量と混合したNo.2ディーゼルの蒸留プロフィールを示す図である。
【図１１Ｂ】ファルネサン(AMD-200)の様々な量と混合したCARBディーゼルの蒸留プロフィールを示す図である。
【００２０】
(定義)
ASTM Internationalによって発行されているASTM D975規格は、米国で用いられるディーゼル燃料の種々の等級について、ある最小限の受入れ要件を設定する。例えば、超低硫黄ディーゼル燃料等級No.2-Dは、0.05重量%の最大硫黄含有量(ASTM D2622試験に基づく)、0.01重量%の最大灰分(ASTM D482試験に基づく)、40の最低セタン価(ASTM D6079試験に基づく)、1.9cStから2.4cStの40℃における粘度(ASTM D445試験に基づく)及び52℃の最低引火点を有すると予想される。日本及びヨーロッパは、ディーゼル燃料の同等の等級について、米国のものに類似したディーゼル燃料規格を有する。例えば、日本のJIS K 2204、等級No.2のディーゼル燃料は、2.0cStの40℃における最低粘度、0.05重量%の最大硫黄含有量及び45の最低セタン価を有すると予想される。比較すると、ヨーロッパのCEN 590、等級A〜Fのディーゼル燃料は、2.0cStから4.5cStの40℃における粘度、0.05重量%の最大硫黄含有量及び49の最低セタン価を有すると予想される。一部の実施態様では、本明細書で開示される燃料組成物は、上記の特性の少なくとも1つ又はすべてを満たす。
【００２１】
ASTM Internationalによって発行されているASTM D1655規格は、Jet Aについて、ある最小限の受入れ要件を設定する。
【００２２】
「灰分」は、ディーゼル燃料をASTM D482に記載の条件下で燃焼させた後に残る、残留物の量を指す。
【００２３】
「バイオディーゼル」は、生物供給源、例えば植物油又は動物脂肪に由来する種類のディーゼル燃料を指す。バイオディーゼルは、主に、油及びメタノールの混合物のエステル転移反応から導かれる、脂肪酸メチルエステルを含むアルキルエステルの混合物である。ダイズ油がバイオディーゼルの最も大きな供給源であるが、他の植物からの油又は動物脂肪も供給材料であってよい。
【００２４】
「生体工学によって作られる燃料成分」は、少なくとも一部が、任意の古細菌、細菌又は真核生物の細胞を含む、宿主細胞によって生成される燃料成分を指す。
【００２５】
「生物燃料」は、ウシからの下肥などのバイオマス、即ち、最近生存している生物又はそれらの代謝副産物に由来する、任意の燃料を指す。石油、石炭及び核燃料など他の天然資源と異なり、それは再生可能なエネルギー源である。
【００２６】
「C15イソプレノイド出発物質」は、ファルネシルピロリン酸(「FPP」)又はFPPから導くことができる化合物を指す。
【００２７】
「セタン価」は、ASTM D613に記載の条件下で、燃料がどれだけ容易に燃え始める(自己発火する)かを示す尺度を指す。高いセタン価の燃料は、それがシリンダーに注入された直後に燃え始め、それは、短い発火待時間を有する。逆に、低いセタン価の燃料は、自己発火に抵抗し、より長い発火待時間を有する。
【００２８】
「曇り点」は、ASTM D2500に記載の条件下で冷却される燃料試料中に、ワックス結晶の濁りが最初に出現する温度を指す。
【００２９】
「コールドフィルター目詰まり点(cold filter plugging point)」(CFPP)は、燃料が設定時間内にワイヤメッシュを通過するのに最初に失敗するときの温度の近似指標を指す。ASTM D6371試験は、燃料系統内のフィルターを通過する冷却燃料の流れをシミュレーションする。したがって、CFPPは燃料の動的コールドフロー特性の尺度である。
【００３０】
「ディーゼル燃料」は、燃料が高圧縮下で空気の熱によって点火される、ディーゼルエンジンでの使用に適する燃料を指す。ディーゼル燃料の類には、幅広い分子量を有する炭化水素が含まれる。一部の実施態様では、本明細書のディーゼル燃料には、少なくとも15個の炭素を含む炭化水素が含まれる。他の実施態様では、本明細書のディーゼル燃料には、少なくとも15個の炭素を含む炭化水素、少なくとも3個の炭素を含むアルコール、少なくとも10個の炭素を含む脂肪酸エステル、並びにそれらの混合物が含まれる。ディーゼル燃料の種類には、それらに限定されないが、石油ディーゼル、バイオディーゼル、生体工学によって作られたディーゼル又はそれらの混合物が含まれる。ディーゼル燃料は、合成燃料、例えばシェールオイル、又はフィッシャー-トロプシュ燃料、例えば合成ガス及び石炭液化から誘導されるものから得ることもできる。
【００３１】
「ファルネサン」は、式(III) を有する化合物、又はその立体異性体を指す。
【化１】
0005528110.tif 000002
一部の実施態様では、ファルネサンはファルネサンの実質的に純粋な立体異性体を含む。他の実施態様では、ファルネサンは、ファルネサンの鏡像異性体及びジアステレオマーなどの立体異性体の混合物を含む。さらなる実施態様では、ファルネサン混合物中の立体異性体のそれぞれの量は、独立して、ファルネサン混合物の全重量に基づき、約0.1重量%から約99.9重量%、約0.5重量%から約99.5重量%、約1重量%から約99重量%、約5重量%から約95重量%、約10重量%から約90重量%、約20重量%から約80重量%である。
【００３２】
「α-ファルネセン」は、以下の式を有する化合物、又はその立体異性体を指す。
【化２】
0005528110.tif 000003
一部の実施態様では、α-ファルネセンはα-ファルネセンの実質的に純粋な立体異性体を含む。他の実施態様では、α-ファルネセンは、シス-トランス異性体などの立体異性体の混合物を含む。さらなる実施態様では、α-ファルネセン混合物中の立体異性体のそれぞれの量は、独立して、α-ファルネセン混合物の全重量に基づき、約0.1重量%から約99.9重量%、約0.5重量%から約99.5重量%、約1重量%から約99重量%、約5重量%から約95重量%、約10重量%から約90重量%、約20重量%から約80重量%である。
【００３３】
「β-ファルネセン」は、以下の式を有する化合物、又はその立体異性体を指す。
【化３】
0005528110.tif 000004
一部の実施態様では、β-ファルネセンはβ-ファルネセンの実質的に純粋な立体異性体を含む。他の実施態様では、β-ファルネセンは、シス-トランス異性体などの立体異性体の混合物を含む。さらなる実施態様では、β-ファルネセン混合物中の立体異性体のそれぞれの量は、独立して、β-ファルネセン混合物の全重量に基づき、約0.1重量%から約99.9重量%、約0.5重量%から約99.5重量%、約1重量%から約99重量%、約5重量%から約95重量%、約10重量%から約90重量%、約20重量%から約80重量%である。
【００３４】
「引火点」は、ASTM D93に記載の条件下で、発火源の添加がディーゼル燃料上の蒸気の発火を起こさせるときの最低温度を指す。
【００３５】
「燃料」は、1つ以上の炭化水素、1つ以上のアルコール、1つ以上の脂肪酸エステル又はそれらの混合物を指す。好ましくは、液体炭化水素が用いられる。燃料は、レシプロエンジン(例えば、ガソリンエンジン及びディーゼルエンジン)、ワンケルエンジン、ジェットエンジン、一部のロケットエンジン、ミサイルエンジン及びガスタービンエンジンなどの内燃機関を動かすために用いることができる。一部の実施態様では、燃料は一般的に、アルカン、シクロアルカン及び芳香族炭化水素などの炭化水素の混合物を含む。一部の実施態様では、燃料は、本明細書で開示されるC15イソプレノイド化合物の1つ以上を含む。
【００３６】
「燃料添加剤」は、燃料の特性を変化させるために、例えば、エンジン性能、燃料取扱い、燃料の安定性を改善するために、又は混入物の制御のために燃料に加えられる化学成分などの、少量の燃料成分を指す。添加剤の種類には、それらに限定されないが、抗酸化剤、熱安定性向上剤、セタン向上剤、安定剤、コールドフロー向上剤、助燃剤、泡止め剤、濁り防止添加剤、腐食抑制剤、潤滑性向上剤、アイシング抑制剤、噴射器清浄添加剤、煙抑制剤、ドラッギング低減添加剤、金属活性低下剤、分散剤、界面活性剤、デマルシファイアー、色素、マーカー、静電放散剤、殺生物剤及びそれらの組合せが含まれる。用語「従来の添加剤」は、上記のものなどの、本発明のイソプレノイド化合物ではない、当業者に公知である燃料添加剤を指す。
【００３７】
「燃料組成物」は、少なくとも2つの燃料成分を含む燃料を指す。
【００３８】
「燃料成分」は、燃料組成物を調製するために用いられる、任意の化合物又は化合物の混合物を指す。「主要な燃料成分」及び「少量燃料成分」がある。主要な燃料成分は、燃料組成物中に容積で少なくとも50%存在し、少量燃料成分は、燃料組成物中に50%未満存在する。燃料添加剤は、少量燃料成分である。本明細書で開示されるイソプレノイド化合物は、それら自体が、又は他の燃料成分との混合物において、主要成分又は少量成分となり得る。
【００３９】
本明細書で「イソプレノイド」及び「イソプレノイド化合物」は互換的に用いられ、イソペンテニル二リン酸(「IPP」)から誘導可能な化合物を指す。
【００４０】
「初留点」及び「終留点」は、次第に高い温度に試料を加熱することによって取り出される試料分画に関連する、蒸留曲線中の点を指す。初留点は、最初の液滴が凝縮器を出るときの沸点であり、終留点は、最後の液滴が凝縮器を出るときの沸点である。試料が単一の成分で構成される場合、初留点及び終留点は同一であり、「沸点」と呼ばれる。燃料の蒸留曲線を判定するために一般に認められている手順は、ASTM規格D86である。
【００４１】
「ジェット燃料」は、ジェットエンジンで使用するために適する燃料を指す。
【００４２】
「灯油」は、一般に大気圧下の150℃と275℃の間の、石油(別名「原油」)の特定の分取留出物を指す。原油は、主に、パラフィン、ナフテン及び芳香族類の炭化水素で構成される。
【００４３】
「潤滑性」は、ASTM D6079に記載の条件下の、高圧転がり点接触下での金属同士の接触の間、エンジン部品により効率のよい摩耗保護を提供するディーゼル燃料の能力の尺度を指す。
【００４４】
「石油ディーゼル」は、一般に大気圧下の120℃及び380℃の間の、石油の特定の分取留出物を指す。他の実施態様では、石油ディーゼルは、1気圧下の150℃及び370℃の間の、石油の分取留出物を指す。
【００４５】
「流動点」は、燃料を容器から注ぐか取り出すことができるか、又は、管及びパイプに流すことができるときの最低温度の近似指標を指し、ASTM D97に記載の条件下で測定される。流動点は、より寒冷な気候における燃料の有用性及び実用性を決定する特性の1つである。
【００４６】
「実質的に純粋な」化合物である組成物は、1つ以上の他の化合物を実質的に含有しない組成物を指し、即ち、その組成物は、該組成物の全容量又は全重量に基づき、その化合物を80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%若しくは99.9%を超えて含有するか;又は、該1つ以上の他の化合物を20%未満、10%未満、5%未満、3%未満、1%未満、0.5%未満、0.1%未満若しくは0.01%未満含有する。
【００４７】
化合物を「実質的に含有しない」組成物とは、該組成物の全容量又は全重量に基づき、その化合物を20%未満、10%未満、5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、1%未満、0.5%未満、0.1%未満又は0.01%未満含有する組成物を指す。
【００４８】
上記の定義に加えて、本明細書に記載のある化合物は、シス異性体、トランス異性体、E-異性体及びZ-異性体などの1つ以上の立体異性体として存在することができる、1つ以上の二重結合を有する。ある実施態様では、個々の立体異性体としてのこれらの化合物は、他の立体異性体を実質的に含有しない。ある他の実施態様では、これらの化合物は、様々な立体異性体の混合物である。
【００４９】
「Tx」は、引用により本明細書中に組み込まれているASTM D-86に従って、燃料組成物の元の量のx%が蒸留されたときの蒸留温度を指す。例えば、「T10」、「T50」及び「T90」は、燃料組成物の元の量のそれぞれ10%、50%及び90%がASTM D86に従って蒸留されたときの蒸留温度を指す。「T10」、「T50」及び「T90」は、それぞれ10容量%温度、50容量%温度及び90容量%温度としても知られる。
【００５０】
以下の説明では、本明細書で開示されるすべての数字は、単語「約」又は「近似の」がそれと共に用いられているかどうかに関係なく、近似の値である。数字は、1%、2%、5%、又は、時には10〜20%変動することがある。下限RL及び上限RU付きで数値の範囲が開示される場合はいつでも、その範囲に入るあらゆる数字が特に開示される。詳細には、範囲の中の以下の数字が特に開示される:R=RL+k*(RU-RL)、式中kは、1%づつ増加する1%から100%の変数であり、即ち、kは、1%、2%、3%、4%、5%、...、50%、51%、52%、...、95%、96%、97%、98%、99%又は100%である。さらに、上で定義される2つのR数字によって定義される任意の数値範囲も、特に開示される。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
(発明の実施態様の説明)
本発明の実施態様は、主要又は少量の燃料成分として、1つ以上のC15イソプレノイド化合物を含む燃料組成物を提供する。本明細書で、任意のC15イソプレノイド化合物を用いることができる。一部の実施態様では、C15イソプレノイド化合物のそれぞれは、式:
【化４】
0005528110.tif 000005
の1つを有することができ、上式で、ZはH、O-R又はO-C(=O)Rであり;RはH、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルカリール又はアラルキルである。一部の実施態様では、ZはO-R又はO-C(=O)Rであり;RはC1〜C6アルキルである。他の実施態様では、ZはO-R又はO-C(=O)Rであり、式中、Rはメチルである。他の実施態様では、ZはO-R又はO-C(=O)Rであり、式中、Rはエチルである。さらに他の実施態様では、C15イソプレノイド化合物はファルネサンであり、即ち、式(I)又は(II)のZはHである。
【００５２】
1セットの実施態様では、イソプレノイド化合物は以下の通りであり:
【化５】
0005528110.tif 000006
上式で、Zは上記に定義した通りである。
【００５３】
別のセットの実施態様では、イソプレノイド化合物は以下の通りであり:
【化６】
0005528110.tif 000007
上式で、Zは上記に定義した通りである。
【００５４】
別のセットの実施態様では、イソプレノイド化合物は以下の式の1つ以上の化合物であり:
【化７】
0005528110.tif 000008
上式で、Zは上記に定義した通りである。式(I-a)、(I-b)、(I-c)及び(I-d)は式(I)の4つの可能な立体異性体であり、式(II-a)、(II-b)、(II-c)及び(II-d)は式(II)の4つの可能な立体異性体である。
【００５５】
別のセットの実施態様では、イソプレノイド化合物は以下の通りであるか、又はその立体異性体である。
【化８】
0005528110.tif 000009
【００５６】
別のセットの実施態様では、イソプレノイド化合物は以下の通りであるか、又はその立体異性体であり
【化９】
0005528110.tif 000010
式中、Rは以前に定義した通りである。別のセットの実施態様では、RはC1〜C3アルキルである。別のセットの実施態様では、Rはメチルである。さらに別のセットの実施態様では、Rはエチルである。
【００５７】
別のセットの実施態様では、イソプレノイド化合物は以下の通りであるか、又はその立体異性体であり
【化１０】
0005528110.tif 000011
式中、Rは以前に定義した通りである。別のセットの実施態様では、RはC1〜C3アルキルである。別のセットの実施態様では、Rはメチルである。さらに別のセットの実施態様では、Rはエチルである。
【００５８】
別のセットの実施態様では、イソプレノイド化合物は式:
【化１１】
0005528110.tif 000012
を有し、上式で、Rはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert-ブチル、及び直鎖若しくは分枝鎖のペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、エイコシル、ドコシルなどのアルキルである。他の実施態様では、イソプレノイド化合物は式(III)、(IV)及び(V)の混合物を含む。
【００５９】
別のセットの実施態様では、イソプレノイド化合物は、式(III)、(IV)又は(V)を有する少なくとも2つの異なる化合物、又はその立体異性体を含み
【化１２】
0005528110.tif 000013
式中、RはC1〜C5アルキルであり、かつ該2つの化合物はそれぞれ、燃料組成物の全重量又は全容量に基づき少なくとも約5%の量で存在する。
【００６０】
別のセットの実施態様では、イソプレノイド化合物は下記式の1つ以上であり:
【化１３】
0005528110.tif 000014
上式で、Rは上記に定義した通りである。式(III-a)、(III-b)、(III-c)及び(III-d)は式(III)の4つの可能な立体異性体であり、式(IV-a)、(IV-b)、(IV-c)及び(IV-d)は式(IV)の4つの可能な立体異性体である。式(V-a)、(V-b)、(V-c)及び(V-d)は、式(V)の4つの可能な立体異性体である。
【００６１】
燃料組成物中のイソプレノイド化合物のそれぞれは、それが酸素などのオキシダントと化学反応するときにエネルギーを放出することができる燃料成分として;又は、燃料成分の性能若しくは特性を変化させることができる燃料添加剤として;機能することができる。一部の実施態様では、イソプレノイド化合物は、燃料組成物の全重量又は全容量に基づき、少なくとも約2%、少なくとも約3%、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%又は少なくとも約90%の量で存在する。他の実施態様では、イソプレノイド化合物は、燃料組成物の全重量又は全容量に基づき、多くとも約5%、多くとも約10%、多くとも約15%、多くとも約20%、多くとも約25%、多くとも約30%、多くとも約35%、多くとも約40%、多くとも約45%、多くとも約50%、多くとも約60%、多くとも約70%、多くとも約80%又は多くとも約90%の量で存在する。さらなる実施態様では、イソプレノイド化合物は、燃料組成物の全重量又は全容量に基づき、約2%から約99%、約2.5%から約95%、約5%から約90%、約7.5%から約85%、約10%から約80%、約15%から約80%、約20%から約75%又は約25%から約75%の量で存在する。
【００６２】
一部の実施態様では、C15イソプレノイド化合物は、生体工学によって作られたC15イソプレノイド出発物質から誘導される。ある実施態様では、生体工学によって作られるC15イソプレノイド出発物質は、炭素源をC15イソプレノイド出発物質に変換することによって、宿主細胞によって作られる。
【００６３】
他の実施態様では、炭素源は、単糖類(単純糖)、二糖類などの糖、又はそれらの1つ以上の組合せである。ある実施態様では、糖は、本明細書で提供される細胞の1つ以上の増殖を支えることができる単純糖である。単純糖は、当業者に公知である任意の単純糖であってよい。適する単純糖又は単糖類のそれらに限定されないいくつかの例には、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、リボース及びそれらの組合せが含まれる。適する二糖類のそれらに限定されないいくつかの例には、ショ糖、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース及びそれらの組合せが含まれる。
【００６４】
他の実施態様では、炭素源は多糖類である。適する多糖類のそれらに限定されないいくつかの例には、デンプン、グリコーゲン、セルロース、キチン及びそれらの組合せが含まれる。
【００６５】
さらに他の実施態様では、炭素源は、非発酵性の炭素源である。適する非発酵性の炭素源のそれらに限定されないいくつかの例には、アセテート及びグリセロールが含まれる。
【００６６】
他の実施態様では、燃料組成物は、石油、石炭、木材又は任意の他の炭化水素源に由来する従来の燃料成分をさらに含むことができる。従来の燃料成分の例示的な例には、ディーゼル燃料、ジェット燃料、灯油、ガソリン及びフィッシャー-トロプシュ誘導燃料が含まれる。一部の実施態様では、従来の燃料成分は、石油又は石炭から誘導される。ある実施態様では、燃料成分は、ディーゼル燃料、ジェット燃料、灯油、ガソリン又はそれらの組合せであるかそれらを含む。他の実施態様では、燃料成分は、留出ディーゼル燃料であるかそれを含む。さらなる実施態様では、燃料成分の量は、燃料組成物の全重量又は全容量に基づき、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%又は少なくとも90%である。さらなる実施態様では、燃料成分の量は、燃料組成物の全重量又は全容量に基づき、多くとも10%、多くとも20%、多くとも30%、多くとも40%、多くとも50%、多くとも60%、多くとも70%、多くとも80%又は多くとも90%である。
【００６７】
一部の実施態様では、燃料組成物は従来の燃料添加剤をさらに含むことができる。1つ以上の添加剤の性質及び量は、最終燃料組成物の所望の用途によって決まる。
【００６８】
ある実施態様では、燃料組成物はディーゼルエンジンでの使用を意図する。米国材料試験協会 (ASTM)は、ディーゼル燃料を3つの一般群に分類している。これらの燃料を分類する必要性は、ディーゼルエンジンの様々な用途から生じ、ディーゼルエンジンは、標準のディーゼル燃料の1つで効率よく作動するように設計されている。
【００６９】
第1-Dは、頻繁な負荷変動及び速度変化(例えば、トラック、トラクターエンジン)が必須であるエンジンのための、灯油に類似した軽い留分である。この燃料は、38℃を超える引火点及び40の最低セタン価を有する。この燃料は、寒冷気象時の作動のために特に適する。
【００７０】
第2-Dは、第1-Dよりも低い揮発性及び高い密度を有する中間の留出燃料である。この燃料は、均一な速度であるが第1-Dの使用時に遭遇するよりも重い負荷で作動する、より重い負荷のエンジン、例えば鉄道用機関で有用である。引火点は52℃を超え、最低セタン価は40である。
【００７１】
第4-Dは、3つのディーゼル燃料の中で最高の密度及び最低の揮発性を有する、重い留出燃料である。それは、持続負荷の下で作動する、船舶用エンジン及び発電エンジンなどの低速及び中速エンジンで有用である。引火点は55℃を超え、最低セタン価は30である。
【００７２】
プレミアム等級のディーゼル燃料は、National Conference on Weights and Measures(NCWM)又はEngine Manufacturers Association(EMA)のプレミアムディーゼル定義を満たすもの、又はそれを超えるものである。
【００７３】
一般に、ディーゼル燃料は、数千個の個々の化合物の複合混合物である。これらの化合物のほとんどはC10〜C22炭化水素であり、一般に、パラフィン、ナフテン(シクロパラフィン)及び芳香族化合物である。通常のパラフィンは、直鎖炭素鎖を有するアルカン(水素及び炭素で構成される)を指す。
【００７４】
ディーゼル燃料は一般に、1気圧で390から715°F(200から380℃)の蒸留範囲、及び0.760から0.935の比重範囲を有する。これらの特性に加えて、ディーゼル燃料は、＜1重量%の硫黄、＜0.1重量%の灰分、＜0.5容量%の水泥分、及び55℃を超える引火点を有しているべきである。
【００７５】
ディーゼル燃料の品質はセタン価によって特徴づけることができ、セタン価は通常30から60の範囲にある。高いセタン価は、エンジンの容易な始動及び円滑な動作の能力を示す。セタン価は自動車用エンジンオクタン価の類似形であり、セタン(n-ヘキサデカン、C16H34)は100の任意に割り当てられた数を有する。目盛の反対側に、セタンの異性体であるヘプタメチルノナンは、割り当てられたセタン価である0を有する。ディーゼル燃料のセタン価は、セタン及びヘプタメチルノナンの混合物との比較によって決定される。それは、燃料と同じ発火性を有するセタン-ヘプタメチルノナン混合物中の、セタンの容積部数に対応する。
【００７６】
一般に、正規のディーゼル燃料は、20重量%を超える芳香族含有量及び数百ppm以上の硫黄含有量を有する。それらは、さらなる酸素及び/又は窒素の不純物をさらに含むことができる。所望のディーゼル燃料を得るために、正規のディーゼル燃料は、正規のディーゼル燃料に存在する芳香族炭化水素が、シクロパラフィンなどの非芳香族炭化水素に変換される変換段階を一般的に経る。このことは、一般的に、水素化触媒の存在下で正規のディーゼル燃料を水素化することによって達成される。他の変換工程を用いることもできる。
【００７７】
通常、原油の単蒸留によって生成される「直留」ディーゼル燃料は、芳香族炭化水素含有量がかなり低い。しかし、ガソリン及びディーゼル生成を増加させるための残留油の接触分解は、芳香族化合物含有量の増加をもたらす。一般的な直留ディーゼルは容積で20から25%の芳香族化合物を含むことができようが、接触分解ストックから調合されるディーゼルは、40から50%の芳香族化合物を有することがあり得る。本明細書で開示される燃料組成物の芳香族炭化水素含有量は、燃料組成物の全容量に基づき、約50容量%未満、約45容量%未満、約40容量%未満、約35容量%未満、約30容量%未満、約25容量%未満又は約20容量%未満であることができる。一部の実施態様では、燃料組成物の芳香族炭化水素含有量は、燃料組成物の全容量に基づき、15容量%未満、10容量%未満、5容量%未満、2.5容量%未満又は1容量%未満である。他の実施態様では、燃料組成物は芳香族炭化水素含有量を実質的に含まない。
【００７８】
芳香族炭化水素は自己発火特性が劣っているので、高分量の芳香族化合物を含むディーゼル燃料は、セタン価が低い傾向がある。直留ディーゼルの一般的なセタン価は、50から55の範囲であり;非常に芳香性のディーゼル燃料のそれらは、一般的に40から45の範囲であり、さらに低いこともある。このことは常温始動をより困難にし、発火の遅延のために燃焼騒音を増加させることがある。
【００７９】
本明細書で開示される燃料組成物の硫黄含有量を低減させるために、燃料組成物中のディーゼル燃料成分を低減させるために脱硫工程を用いることができ、且つ/又は、より多い量のイソプレノイド化合物を用いることができる。本発明の実施態様で、任意の脱硫方法を用いることができる。所望のディーゼル燃料を得るために、酸素及び/又は窒素を除去する追加の段階を用いることもできる。米国特許第5,611,912号、同5,068,025号、同4,746,420号及び同4,675,102号は、本発明の実施態様で用いることができる水素化及び/又は脱硫工程を開示している。上の特許すべての開示は、その全体が引用により本明細書中に組み込まれている。本明細書で開示される燃料組成物の硫黄含有量は、燃料組成物の全重量に基づき、約500ppm未満、約100ppm未満、約50ppm未満、約30ppm未満、約20ppm未満若しくは約15ppm未満を有すること、又は有するようにすることができる。他の実施態様では、燃料組成物の硫黄含有量は、10ppm未満である。さらなる実施態様では、燃料組成物は硫黄含有量を実質的に含まない。
【００８０】
ある実施態様では、燃料組成物はジェットエンジンでの使用を目的とする。最も一般的なジェット燃料は、ジェットA-1と分類される灯油/パラフィン油を基剤とした燃料であり、それは、国際的に標準化された仕様セットに合わせて製造される。米国だけで、ジェットAとして知られるジェットA-1の変種も用いられる。民間の航空で通常用いられる別のジェット燃料は、ジェットBと呼ばれる。ジェットBは、その強化された寒冷気象時の性能のために用いられる、ナプサ(naptha)-灯油領域のより軽い燃料である。ジェットBの蒸留範囲は、一般に140から460°F(50から250℃)である。ジェットA、ジェットA-1及びジェットBは、ASTM規格D.1655-68に規定されている。或いは、ジェット燃料は、世界中の軍隊によってJP番号の系で分類される。いくつかはそれらの民用の対応物とほとんど同一であり、少数の添加剤の量が異なるだけである。例えば、ジェットA-1はJP-8に類似し、ジェットBはJP-4に類似する。或いは、ジェット燃料は、灯油型又はナフサ型と分類することもできる。灯油型ジェット燃料のそれらに限定されないいくつかの例には、ジェットA、ジェットA1、JP-5及びJP-8が含まれる。ナフサ型ジェット燃料のそれらに限定されないいくつかの例には、ジェットB及びJP-4が含まれる。他の実施態様では、燃料組成物が式(III)又は式(I)又は(II)を含み、式中、ZがHであるとき、燃料組成物はASTM規格D1655-68に従いジェットBを含まない。
【００８１】
ジェットAは、1950年代から用いられる米国では標準のジェット燃料型である。-40℃のそのより高い凍結温度を除いて、ジェットAはジェットA1に類似している。ジェットA-1と同様に、ジェットAは最低38℃のかなり高い引火点を有し、自己発火温度は210℃である。
【００８２】
ある実施態様では、燃料組成物は少なくとも従来の燃料添加剤を含む。従来の燃料添加剤のそれらに限定されないいくつかの例には、抗酸化剤、熱安定性向上剤、セタン向上剤、安定剤、コールドフロー向上剤、助燃剤、泡止め剤、濁り防止添加剤、腐食抑制剤、潤滑性向上剤、アイシング抑制剤、噴射器清浄添加剤、煙抑制剤、ドラッギング低減添加剤、金属活性低下剤、分散剤、界面活性剤、デマルシファイアー、色素、マーカー、静電放散剤、殺生物剤及びそれらの組合せが含まれる。燃料組成物中の燃料添加剤の全量は、燃料組成物の全重量に基づき0.001から10重量%の範囲であることができ、一実施態様では0.01から5重量%である。
【００８３】
一部の従来の燃料添加剤は、引用により本明細書中に組み込まれているChunsham Songらの文献「ディーゼル燃料の化学(Chemistry of Diesel Fuel)」(Taylor & Francis、London、Chapter 1、pp.32-36(2000))に記載されている。さらに、以下の米国特許は、本発明の実施態様で添加剤として使用することができる様々な添加剤を開示している:第6,054,420号;第6,051,039号;第5,997,593号;第5,997,592号;第5,993,498号;第5,968,211号;第5,958,089号;第5,931,977号;第5,891,203号;第5,882,364号;第5,880,075号;第5,880,072号;第5,855,629号;第5,853,436号;第5,743,922号;第5,630,852号;第5,529,706号;第5,505,867号;第5,492,544号;第5,490,864号;第5,484,462号;第5,321,172号;及び、第5,284,492号。先の米国特許すべての開示は、その全体が引用により本明細書中に組み込まれている。
【００８４】
ある他の実施態様では、燃料組成物は、潤滑性の向上剤又は強化剤である燃料添加剤を含む。一部の実施態様では、1つ以上の潤滑性向上剤がディーゼル燃料と混合される。一般的に、燃料中の潤滑性向上剤の濃度は、燃料組成物の全重量に基づき、約1ppmから約50,000ppm、約10ppmから約20,000ppm、約25ppmから10,000ppm、又は約50ppmから1000ppmの範囲である。適する潤滑性向上剤のそれらに限定されないいくつかの例には、モノオレイン酸グリセロール及びアジピン酸ジイソデシルなどの脂肪酸エステル;Lubrizol Chemical社から入手可能なもの(例えば、LZ 539 C)などのアミドベースの添加剤;二量体化リノール酸;アミノアルキルモルホリン;ジチオリン酸ジエステル-ジアルコール;並びに、少なくとも1つのカルボキシル基を有するアルキル芳香族化合物が含まれる。一部の適する潤滑性の向上剤又は強化剤は、国際公開第95/33805号;国際公開第94/17160号;国際公開第98/01516号;及び米国特許第5,484,462号及び第5,490,864号などの特許文献;並びに、Danping Wei及びH.A.Spikesの論文「ディーゼル燃料の潤滑性(The Lubricity of Diesel Fuels)」(Wear、III(1986)217 235)に記載され、これらのすべては引用により本明細書中に組み込まれている。市販の潤滑性向上剤のそれらに限定されないいくつかの例には、OLI 9000(Octel社、Manchester、UK)、PARADYNE(商標)655及びVEKTRON(商標)6010(Infineum社、Linden、NJ(ニュージャージー)州)、並びにHITEC(商標)E580(Ethyl社、Richmond、VA(バージニア)州)が含まれる。
【００８５】
ある他の実施態様では、燃料組成物は、界面活性剤である燃料添加剤を含む。一般に、界面活性剤添加剤の量は、燃料組成物の全重量に基づき、10,000ppm未満、1000ppm未満、100ppm未満又は10ppm未満である。適する界面活性剤のそれらに限定されないいくつかの例には、ポリアミンのポリオレフィン置換のスクシンイミド又はスクシンアミド、例えばポリイソブチレンスクシンイミド又はポリイソブチレンアミンスクシンアミド、脂肪族アミン、マンニッヒ塩基又はアミン、及びポリオレフィン(例えばポリイソブチレン)無水マレイン酸が含まれる。いくつかの適するスクシンイミド界面活性剤が、英国特許第960493号、欧州特許第0147240号、欧州特許第0482253号、欧州特許第0613938号、欧州特許第0557561号及び国際公開第98/42808号に記載され、それらのすべては引用により本明細書中に組み込まれている。一部の実施態様では、界面活性剤はポリイソブチレンスクシンイミドなどのポリオレフィン置換スクシンイミドである。市販の界面活性剤添加剤のそれらに限定されないいくつかの例には、F7661及びF7685(Infineum社、Linden、NJ(ニュージャージー)州)、並びにOMA 4130D(Octel社、Manchester、UK)が含まれる。
【００８６】
ある他の実施態様では、燃料組成物は、セタン向上剤である燃料添加剤を含む。セタン向上剤のそれらに限定されないいくつかの例には、過酸化物、硝酸化合物、亜硝酸化合物、アゾ化合物などが含まれる。硝酸アミル、硝酸ヘキシル及び混合硝酸オクチル、2-メチル-2-ニトロプロピル硝酸及び2-エチルヘキシル硝酸などの硝酸アルキルを用いることができる。一部の実施態様では、セタン向上剤は、商品名C1-0801の下、Associated Octel社から市販されている2-エチルヘキシル硝酸である。セタン向上剤は、燃料組成物中に、燃料組成物の全重量に基づき約0.001から5重量%の濃度で、一実施態様では0.01から2.5重量%の濃度で存在することができる。
【００８７】
ある他の実施態様では、燃料組成物は、安定剤である燃料添加剤を含む。安定剤のそれらに限定されないいくつかの例には、三級アルキル一級アミン類が含まれる。多くの安定剤は、腐食抑制剤としても作用する。安定剤は、燃料組成物中に、燃料組成物の全重量に基づき約0.001から2重量%の濃度で、一実施態様では0.01から1重量%の濃度で存在することができる。
【００８８】
ある他の実施態様では、燃料組成物は、助燃剤である燃料添加剤を含む。助燃剤のそれらに限定されないいくつかの例には、フェロセン(ジシクロペンタジエニル鉄)、鉄ベースの助燃剤(例えば、TURBOTECT(商標)ER-18、Turbotect(米国)社、Tomball、Texas(テキサス)州)、バリウムベースの助燃剤、セリウムベースの助燃剤、並びに、鉄及びマグネシウムベースの助燃剤(例えば、TURBOTECT(商標)703、Turbotect(米国)社、Tomball、Texas(テキサス)州)が含まれる。助燃剤は、燃料組成物中に、燃料組成物の全重量に基づき約0.001から1重量%の濃度で、一実施態様では0.01から1重量%の濃度で存在することができる。
【００８９】
別の態様において、
(a)式
【化１４】
0005528110.tif 000015
を有するイソプレノイド化合物;
(b)従来の燃料成分;及び
(c)燃料添加剤;
を含む燃料組成物が提供され、上式で、ZはH、O-R又はO-C(=O)Rであり;かつRはH、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルカリール又はアラルキルであり;該イソプレノイド化合物の量は少なくとも約1容量%であり、かつ該従来の燃料成分の量は少なくとも約5容量%であり、両方の量は該燃料組成物の全容量に基づき;及び該燃料組成物は38℃以上の引火点を有し、かつ約100℃から約200℃の初留点を有する。
【００９０】
一部の実施態様では、本明細書で開示される燃料組成物中のイソプレノイド化合物の量は、燃料組成物の全容量に基づき、少なくとも2容量%、3容量%又は4容量%である。他の実施態様では、イソプレノイド化合物の量は、燃料組成物の全容量に基づき、約1容量%から約90容量%、約2容量%から約90容量%、約3容量%から約90容量%、又は約4容量%から約90容量%である。
【００９１】
別の態様において、
(a)式
【化１５】
0005528110.tif 000016
を有するイソプレノイド化合物;
(b)従来の燃料成分;及び
(c)燃料添加剤;
を有する燃料組成物が提供され、上式で、ZはH、O-R又はO-C(=O)Rであり;かつRはH、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルカリール又はアラルキルであり;該イソプレノイド化合物の量は少なくとも約5容量%であり、かつ該従来の燃料成分の量は少なくとも約5容量%であり、両方の量は該燃料組成物の全容量に基づき;及び該燃料組成物は38℃以上の引火点を有し、かつ約100℃から約200℃の初留点を有する。
【００９２】
一部の実施態様では、本明細書で開示される燃料組成物中のイソプレノイド化合物の量は、燃料組成物の全容量に基づき、約5容量%から約90容量%である。他の実施態様では、イソプレノイド化合物の量は、燃料組成物の全容量に基づき、約75容量%未満、約65容量%未満、約50容量%未満、又は約45容量%未満である。他の実施態様では、イソプレノイド化合物の量は、約5容量%から約10容量%である。他の実施態様では、イソプレノイド化合物の量は、約15容量%から約25容量%である。さらに他の実施態様では、イソプレノイド化合物の量は、約45容量%から約55容量%である。
【００９３】
他の実施態様では、本明細書で開示される燃料組成物中の従来の燃料成分の量は、燃料組成物の全容量に基づき、少なくとも約20%であり、イソプレノイド化合物の量は約5%から約75%である。ある実施態様では、従来の燃料成分の量は、燃料組成物の全容量に基づき、少なくとも30%であり、イソプレノイド化合物の量は約5%から約65%である。ある他の実施態様では、従来の燃料の量は、燃料組成物の全容量に基づき、少なくとも40%であり、イソプレノイドの量は約5%から約50%である。ある他の実施態様では、従来の燃料の量は、燃料組成物の全容量に基づき、少なくとも50%であり、イソプレノイドの量は約5%から約45%である。
【００９４】
一部の実施態様では、従来の燃料成分は、石炭ベースの燃料である。他の実施態様では、従来の燃料成分は石油ディーゼルである。さらに他の実施態様では、従来の燃料成分は灯油である。
【００９５】
一部の実施態様では、本明細書で開示される燃料組成物は、約100℃、約110℃、約120℃、約130℃又は約140℃を超える初留点を有する。他の実施態様では、初留点は約100℃から約150℃である。
【００９６】
一部の実施態様では、本明細書で開示される燃料組成物は、約200℃を超える終留点を有する。他の実施態様では、終留点は約225℃、約250℃、約275℃、約300℃又は約325℃を超える。さらなる実施態様では、終留点は約350℃を超える。ある実施態様では、終留点は約375℃を超える。
【００９７】
他の実施態様では、本明細書で開示される燃料組成物は、約100℃から約200℃の初留点、及び約300℃を超える終留点を有する。別の実施態様では、燃料組成物は、約110℃から約140℃の初留点、及び約350℃を超える終留点を有する。他の実施態様では、燃料組成物は、約110℃から約140℃の初留点、及び約375℃を超える終留点を有する。
【００９８】
一部の実施態様では、本明細書で開示される燃料組成物は、約270℃から約350℃のT90蒸留温度を有する。他の実施態様では、T90蒸留温度は約282℃から約338℃である。
【００９９】
他の実施態様では、本明細書で開示される燃料組成物は、約175℃から約375℃、約200℃から約350℃、約225℃から約325℃又は約250℃から約300℃のT50蒸留温度を有する。
【０１００】
他の実施態様では、本明細書で開示される燃料組成物は、約150℃から約350℃、約175℃から約325℃、約200℃から約300℃又は約225℃から約275℃のT10蒸留温度を有する。
【０１０１】
一部の実施態様では、本明細書で開示される燃料組成物は、少なくとも約40、少なくとも約45、少なくとも約50、少なくとも約55、少なくとも約60又は少なくとも約65のセタン価を有する。さらなる実施態様では、燃料組成物は少なくとも約70のセタン価を有する。ある実施態様では、燃料組成物は、40から90、45から80、又は50から70のセタン価を有する。
【０１０２】
一部の実施態様では、本明細書で開示される燃料組成物は、0℃以下である曇り点を有する。別の実施態様セットでは、燃料組成物は、-5℃以下である曇り点を有する。別の実施態様セットでは、燃料組成物は、-10℃以下である曇り点を有する。別の実施態様セットでは、燃料組成物は、-15℃以下である曇り点を有する。別の実施態様セットでは、燃料組成物は、-20℃以下である曇り点を有する。別の実施態様セットでは、燃料組成物は、-25℃以下である曇り点を有する。
【０１０３】
一部の実施態様では、本明細書で開示される燃料組成物は、低硫黄含有量を有する。他の実施態様では、燃料組成物の硫黄含有量は、燃料組成物の全重量に基づき500ppm未満である。さらなる実施態様では、硫黄含有量は、燃料組成物の全重量に基づき、250ppm未満、150ppm未満、100ppm未満、50ppm未満、25ppm未満、20ppm未満、10ppm未満又は5ppm未満である。ある実施態様では、燃料組成物は測定可能な硫黄含有量を有しない。
【０１０４】
一部の実施態様では、本明細書で開示される燃料組成物は、No.2ディーゼルのASTM D975規格を満たす。
【０１０５】
別の態様において、
(a)少なくとも約1容量%の量のC20炭化水素;及び
(b)少なくとも約1容量%の量の式
【化１６】
0005528110.tif 000017
のイソプレノイド化合物;を含む燃料組成物が提供され、ここで、各量は該燃料組成物の全容量に基づき、かつ、Zは、H、O-R又はO-C(=O)Rであり;かつRはH又はC1〜C6アルキルである。一部の実施態様では、イソプレノイド化合物は、少なくとも約2容量%、3容量%又は4容量%の量である。一部の実施態様では、燃料組成物は、 (c) 燃料組成物の全容量に基づき、少なくとも約1容量%の量のC10炭化水素をさらに含む。
【０１０６】
別の態様において、
(a)少なくとも約1容量%の量のC20炭化水素;及び
(b)少なくとも約5容量%の量の式
【化１７】
0005528110.tif 000018
のイソプレノイド化合物;を含む燃料組成物が提供され、ここで、各量は該燃料組成物の全容量に基づき、かつ、Zは、H、O-R又はO-C(=O)Rであり;かつRはH又はC1〜C6アルキルである。一部の実施態様では、燃料組成物は、 (c) 燃料組成物の全容量に基づき、少なくとも約1容量%の量のC10炭化水素をさらに含む。
【０１０７】
一部の実施態様では、C10炭化水素の量は、少なくとも約2容量%、3容量%、4容量%又は5容量%である。他の実施態様では、C20炭化水素の量は、少なくとも約2容量%、3容量%、4容量%又は5容量%である。
【０１０８】
一部の実施態様では、燃料組成物はC11〜C19炭化水素をさらに含み、ここで、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18及びC19炭化水素の各セットは、燃料組成物の全容量に基づき、少なくとも約1容量%の量で存在する。
【０１０９】
本明細書で開示される燃料組成物は、ディーゼル燃料又はジェット燃料などの燃料を必要とする、非常発電機又は内燃機関などの任意の機器を動かすために用いることができる。ある実施態様では、上記の燃料組成物の1つ以上を含む非常用燃料が提供される。ある実施態様では、本明細書で、非常用燃料としての上記の燃料組成物の使用が提供される。用語「非常用燃料」は、一般に乗物のガスタンク以外の容器に保存される燃料を指す。燃料は、長期間、例えば6〜12カ月の間安定であるべきである。乗物の燃料切れの場合、非常用燃料が乗物のガスタンクに加えられ、乗物に燃料を供給する。本発明の実施態様に従って製造されるディーゼル燃料の引火点は一般に140°F(60℃)を超えるので、それは、ディーゼル車のトランクで安全に保管することができる。本燃料組成物は、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれている、米国特許第6,096,103号に記載の代替燃料として用いることもできる。
【０１１０】
別の態様において、本明細書で開示される燃料組成物を含む燃料タンクを含む、燃料系統が提供される。任意選択で、燃料系統は、再循環エンジン冷却剤を有するエンジン冷却系、燃料タンクを内燃機関と連結する送油経路及び/又は送油経路上に配置される燃料フィルターをさらに含むことができる。内燃機関のそれらに限定されないいくつかの例には、レシプロエンジン(例えば、ガソリンエンジン及びディーゼルエンジン)、ワンケルエンジン、ジェットエンジン、一部のロケットエンジン及びガスタービンエンジンが含まれる。
【０１１１】
一部の実施態様では、燃料タンクは、再循環エンジン冷却剤から燃料タンクに含まれる燃料組成物への熱伝達を可能にするように、前記冷却系と共に配置される。他の実施態様では、燃料系統は、ディーゼルエンジン用の第2の燃料を含む第2の燃料タンク、及び、第2の燃料タンクを内燃機関に連結する第2の送油経路をさらに含む。任意選択で、第1及び第2の送油経路には、互いに独立に、又は同時に開放すること又は閉じることができる電磁作動バルブを備えることができる。さらなる実施態様では、第2の燃料は石油ディーゼルである。
【０１１２】
別の態様において、内燃機関、本明細書で開示される燃料組成物を含む燃料タンク、燃料タンクを内燃機関に連結する送油経路を含むエンジン配置が提供される。任意選択で、エンジン配置は、燃料フィルター及び/又は再循環エンジン冷却剤を含むエンジン冷却系をさらに含むことができる。一部の実施態様では、内燃機関はディーゼルエンジンである。他の実施態様では、内燃機関はジェットエンジンである。
【０１１３】
本明細書で開示される燃料組成物を用いる場合、それをエンジンに噴射する前に、燃料組成物に由来する粒子状物質を除去することが望ましい。したがって、本明細書で開示される燃料系統で使用するのに適する燃料フィルターを選択することが望ましい。内燃機関で用いられる燃料中の水は、少量でさえも、エンジンに非常に有害であり得る。したがって、燃料組成物中に存在する水は、エンジン内への噴射の前に除去されることが望ましい。一部の実施態様では、水及び粒子状物質は、タービン遠心機を利用する燃料フィルターを用いて除去することができ、そこでは、水及び粒子状物質は、エンジンの損傷のリスクなしに濾過燃料組成物のエンジンへの噴射を可能にする程度まで、燃料組成物から分離される。水及び/又は粒子状物質を除去することができる他の種類の燃料フィルターを、用いることもできる。
【０１１４】
別の態様において、内燃機関、本明細書で開示される燃料組成物を含む燃料タンク、燃料タンクを内燃機関に連結する送油経路を含む乗物が提供される。任意選択で、乗物は、燃料フィルター及び/又は再循環エンジン冷却剤を含むエンジン冷却系をさらに含むことができる。乗物のそれらに限定されないいくつかの例には、車、オートバイ、列車、船及び航空機が含まれる。
【０１１５】
別の態様では、式
【化１８】
0005528110.tif 000019
のイソプレノイド化合物の製造方法が提供され、上式で、ZはH、O-R又はO-C(=O)Rであり;かつRはH、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルカリール又はアラルキルである。本方法は、
a)生物供給源からC15イソプレノイド出発物質を得ることと、
b)化学合成を用いてC15イソプレノイド出発物質を該化合物に変換することと
を含む。
【０１１６】
別の態様において、イソプレノイド化合物
【化１９】
0005528110.tif 000020
が提供され、上式で、ZはH、O-R又はO-C(=O)Rであり;かつRはH、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルカリール又はアラルキルであり、該化合物は、
a)生物供給源からC15イソプレノイド出発物質を得ることと、
b)化学合成を用いて該C15イソプレノイド出発物質を該化合物に変換することと
によって製造される。
【０１１７】
別の態様において、
a)生物供給源からC15イソプレノイド出発物質を得ることと、
b)化学合成を用いてC15イソプレノイド出発物質を変換して式
【化２０】
0005528110.tif 000021
のイソプレノイド化合物を製造することと
から生成される生物燃料が提供され、上式で、ZはH、O-R又はO-C(=O)Rであり;かつRはH、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルカリール又はアラルキルである。
【０１１８】
1セットの実施態様では、C15イソプレノイド出発物質は
【化２１】
0005528110.tif 000022
であり、それは水素化されて
【化２２】
0005528110.tif 000023
又はその立体異性体を生成する。
【０１１９】
別のセットの実施態様では、C15イソプレノイド出発物質は
【化２３】
0005528110.tif 000024
であり、それは、水素化及びエステル化されて
【化２４】
0005528110.tif 000025
又はその立体異性体を生成し、式中、Rはアルキルである。
【０１２０】
別のセットの実施態様では、C15イソプレノイド出発物質は
【化２５】
0005528110.tif 000026
であり、それは、水素化及びエステル化されて
【化２６】
0005528110.tif 000027
又はその立体異性体を生成し、式中、Rはアルキルである。
【０１２１】
別の態様では、燃料組成物の製造方法であって、
a)C15イソプレノイド出発物質を製造することができる細胞を、該C15イソプレノイド出発物質を製造するのに適する条件下で単純糖と接触させることと;
b)該C15イソプレノイド出発物質を水素化して水素化C15イソプレノイド化合物を形成することと;
c)該水素化C15イソプレノイド化合物を1つ以上の燃料成分又は燃料添加剤と混合して該燃料組成物を製造することと
を含む方法が提供される。
【０１２２】
別の態様では、燃料組成物の製造方法であって、
a)C15イソプレノイド出発物質を製造することができる細胞を、該C15イソプレノイド出発物質を製造するのに適する条件下で非発酵性炭素源と接触させることと;
b)該C15イソプレノイド出発物質を水素化して水素化C15イソプレノイド化合物を形成することと;
c)該水素化C15イソプレノイド化合物を1つ以上の燃料成分又は燃料添加剤と混合して該燃料組成物を製造することと
を含む方法が提供される。
【０１２３】
別の態様において、本発明の燃料、生体工学によって作られる燃料成分、又は生体工学によって作られる燃料添加剤の製造のための設備が提供される。ある実施態様では、設備はC15出発物質の生物学的製造が可能である。ある実施態様では、設備は、出発物質からイソプレノイドの燃料添加剤又は燃料成分を調製することがさらにできる。
【０１２４】
設備は、微生物を用いてC15出発物質を調製するために有用な、任意の構造を含むことができる。一部の実施態様では、生物学的設備は、本明細書で開示される細胞の1つ以上を含む。一部の実施態様では、生物学的設備は、少なくともC15出発物質を、細胞培養の全重量に基づき少なくとも約1重量%、少なくとも約5重量%、少なくとも約10重量%、少なくとも約20重量%又は少なくとも約30重量%の量で含む細胞培養を含む。さらなる実施態様では、生物学的設備は、本明細書で記載される1つ以上の細胞を含む発酵槽を含む。
【０１２５】
本明細書で、細胞又は細菌に、それらが増殖又は繁殖することができる安定した最適な環境を提供することができる任意の発酵槽を用いることができる。一部の実施態様では、発酵槽は、本明細書で開示される細胞の1つ以上を含む培養を含む。他の実施態様では、発酵槽は、ファルネシルピロリン酸(FPP)を生物学的に製造することができる細胞培養を含む。さらなる実施態様では、発酵槽は、イソペンテニル二リン酸(IPP)を生物学的に製造することができる細胞培養を含む。ある実施態様では、発酵槽は、少なくともC15出発物質を、細胞培養の全重量に基づき少なくとも約1重量%、少なくとも約5重量%、少なくとも約10重量%、少なくとも約20重量%又は少なくとも約30重量%の量で含む細胞培養を含む。
【０１２６】
設備は、C15出発物質から燃料成分又は燃料添加剤を製造することができる任意の構造をさらに含むことができる。構造は、C15出発物質の水素化のために、水素化装置を含むことができる。本明細書で、当業者に公知である条件下でC=C二重結合をC-C単結合に還元するために用いることができる、任意の水素化装置を用いることができる。水素化装置は、本明細書で開示される水素化触媒を含むことができる。一部の実施態様では、構造は、ミキサー、容器、並びに容器内の水素化段階からの水素化生成物及び従来の燃料添加剤の混合物をさらに含む。
【０１２７】
(宿主細胞)
C15イソプレノイド出発物質は、生物学的方法、化学合成(生物学的に誘導された物質を使用しない)、並びに生物学的及び化学的手段を用いるハイブリッド方法を含む、当技術分野で公知である任意の方法によって製造することができる。C15イソプレノイド出発物質が生物学的に製造される場合、1つの方法は、所望の生成物を生成するように修飾された宿主細胞の使用を含む。すべてのイソプレノイド類と同様に、C15イソプレノイド出発物質は、一般的な中間体、イソペンテニル二リン酸(「IPP」)を通して生化学的に製造される。
【０１２８】
宿主細胞は、当分野の技術者に公知である任意の技術によって増殖させることができる。詳細には、宿主細胞は、宿主細胞に適当な培地で増殖させることができる。有利な実施態様では、培地は、容易に利用でき、再生可能な成分を含む。したがって本発明は、容易に利用でき、再生可能なエネルギー源、及び燃料組成物の生成のためのそれらの使用方法を提供する。ある実施態様では、宿主細胞は、それらの増殖及びC15イソプレノイドの生成に適する条件下で、単純糖との接触によって増殖又は培養される。ある実施態様では、宿主細胞は、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、リボース又はそれらの組合せとの接触によって増殖させること、又は培養することができる。したがって本発明は、単純糖、例えばグルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、リボース及びそれらの組合せから誘導される燃料組成物、並びに、単純糖からのそれらの製造方法を提供する。
【０１２９】
本発明の実施では、任意の適する宿主細胞を用いることができる。一実施態様では、宿主細胞は、所望のイソプレノイド若しくはイソプレノイド誘導体を生成するために、又は所望のイソプレノイド若しくはイソプレノイド誘導体の収量を増加させるために、核酸分子が挿入、削除又は修飾されている(即ち、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、置換及び/又は転位などによって変異している)遺伝子組換えの宿主微生物である。別の実施態様では、宿主細胞は、液体増殖培地で増殖させることができる。
【０１３０】
適する宿主細胞の例示的な例には、古細菌細胞、細菌細胞及び真核生物の細胞が含まれる。古細菌細胞のそれらに限定されないいくつかの例には、以下の属に属するものが含まれる:エロピラム(Aeropyrum)、アルケオグロブス(Archaeglobus)、ハロバクテリウム(Halobacterium)、メタノコッカス(Methanococcus)、メタノバクテリウム(Methanobacterium)、ピロコッカス(Pyrococcus)、スルフォロブス(Sulfolobus)及びサーモプラズマ(Thermoplasma)。古細菌株のそれらに限定されないいくつかの例には、エロピラム・パーニックス(Aeropyrum pernix)、アルケオグロブス・フルギデュス(Archaeoglobus fulgidus)、メタノコッカス・ジャナシイ(Methanococcus jannaschii)、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム(Methanobacterium thermoautotrophicum)、ピロコッカス・アビシイ(Pyrococcus abyssi)、ピロコッカス・ホリコシイ(Pyrococcus horikoshii)、サーモプラズマ・アシドフィラム(Thermoplasma acidophilum)及びサーモプラズマ・ボルカニウム(Thermoplasma volcanium)などが含まれる。
【０１３１】
細菌細胞のそれらに限定されないいくつかの例には、以下の属に属するものが含まれる:アグロバクテリウム(Agrobacterium)、アリシクロバシラス(Alicyclobacillus)、アナベナ(Anabaena)、アナシスティス(Anacystis)、アルスロバクター(Arthrobacter)、アゾバクター(Azobacter)、バシラス(Bacillus)、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)、クロマティウム(Chromatium)、クロストリジウム(Clostridium)、コリネバクテリウム(Corynebacterium)、エンテロバクター(Enterobacter)、エルウィニア(Erwinia)、エシェリヒア(Escherichia)、ラクトバシラス(Lactobacillus)、ラクトコッカス(Lactococcus)、メソリゾビウム(Mesorhizobium)、メチロバクテリウム(Methylobacterium)、ミクロバクテリウム(Microbacterium)、ホルミジウム(Phormidium)、シュードモナス(Pseudomonas)、ロドバクター(Rhodobacter)、ロドシュードモナス(Rhodopseudomonas)、ロドスピリルム(Rhodospirillum)、ロドコッカス(Rhodococcus)、サルモネラ(Salmonella)、セネデスムン(Scenedesmun)、セラチア(Serratia)、シゲラ(Shigella)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、シネコッカス(Synnecoccus)及びザイモモナス(Zymomonas)。
【０１３２】
細菌株のそれらに限定されないいくつかの例には、枯草菌(Bacillus subtilis)、バシラス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefacines)、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス(Brevibacterium ammoniagenes)、ブレビバクテリウム・イマリオフィルム(Brevibacterium immariophilum)、クロストリジウム・ベイジェリンキイ(Clostridium beijerinckii)、エンテロバクター・サカザキイ(Enterobacter sakazakii)、大腸菌(Escherichia coli)、ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)、メソリゾビウム・ロティ(Mesorhizobium loti)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、シュードモナス・メバロニイ(Pseudomonas mevalonii)、シュードモナス・プディカ(Pseudomonas pudica)、ロドバクター・カプスラータス(Rhodobacter capsulatus)、ロドバクター・スフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides)、ロドスピリルム・ルブラム(Rhodospirillum rubrum)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、チフス菌(Salmonella typhi)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、志賀赤痢菌(Shigella dysenteriae)、フレキシナ赤痢菌(Shigella flexneri)、ソンネ赤痢菌(Shigella sonnei)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)などが含まれる。
【０１３３】
一般に、細菌の宿主細胞を用いる場合、非病原性株が好まれる。非病原性株のそれらに限定されないいくつかの例には、枯草菌、大腸菌、アシドフィルス菌(Lactobacillus acidophilus)、ラクトバシラス・ヘルベティクス(Lactobacillus helveticus)、緑膿菌、シュードモナス・メバロニイ、シュードモナス・プディタ(Pseudomonas pudita)、ロドバクター・スフェロイデス、ロドバクター・カプスラータス、ロドスピリルム・ルブラムなどが含まれる。
【０１３４】
真核生物の細胞のそれらに限定されないいくつかの例には、真菌細胞が含まれる。真菌細胞のそれらに限定されないいくつかの例には、以下の属に属するものが含まれる:アスペルギルス(Aspergillus)、カンジダ(Candida)、クリソスポリウム(Chrysosporium)、クリプトコッカス(Cryptococcus)、フザリウム(Fusarium)、クルイベロミセス(Kluyveromyces)、ネオチホイジウム(Neotyphodium)、ニューロスポラ(Neurospora)、ペニシリウム(Penicillium)、ピキア(Pichia)、サッカロミセス(Saccharomyces)及びトリコデルマ(Trichoderma)。
【０１３５】
真核生物の株のそれらに限定されないいくつかの例には、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、黒色麹菌(Aspergillus niger)、麹菌(Aspergillus oryzae)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、クリソスポリウム・ルクノウェンス(Chrysosporium lucknowense)、フザリウム・グラミネアラム(Fusarium graminearum)、フザリウム・ベネナタム(Fusarium venenatum)、クルイベロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、アカパンカビ(Neurospora crassa)、ピキア・アングスタ(Pichia angusta)、ピキア・フィンランディカ(Pichia finlandica)、ピキア・コダマエ(Pichia kodamae)、ピキア・メンブラネファシエンス(Pichia membranaefaciens)、ピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)、ピキア・オプンチエ(Pichia opuntiae)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、ピキア・ピジュペリ(Pichia pijperi)、ピキア・ケルカム(Pichia quercuum)、ピキア・サリクタリア(Pichia salictaria)、ピキア・テルモトレランス(Pichia thermotolerans)、ピキア・トレハロフィラ(Pichia trehalophila)、ピキア・スチピチス(Pichia stipitis)、ストレプトマイセス・アンボファシエンス(Streptomyces ambofaciens)、ストレプトマイセス・アウレオファシエンス(Streptomyces aureofaciens)、ストレプトマイセス・アウレウス(Streptomyces aureus)、サッカロミセス・バヤヌス(Saccaromyces bayanus)、サッカロミセス・ブラルジ(Saccaromyces boulardi)、酵母(Saccharomyces cerevisiae)、ストレプトマイセス・フンギシジクス(Streptomyces fungicidicus)、ストレプトマイセス・グリセオクロモゲネス(Streptomyces griseochromogenes)、ストレプトマイセス・グリセウス(Streptomyces griseus)、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)、ストレプトマイセス・オリボグリセウス(Streptomyces olivogriseus)、ストレプトマイセス・ラメウス(Streptomyces rameus)、ストレプトマイセス・タナシエンシス(Streptomyces tanashiensis)、ストレプトマイセス・ビナセウス(Streptomyces vinaceus)及びトリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)が含まれる。
【０１３６】
一般に、真核生物の細胞を用いる場合、非病原性株が好まれる。非病原性株のそれらに限定されないいくつかの例には、フザリウム・グラミネアラム、フザリウム・ベネナタム、ピキア・パストリス、サッカロミセス・ブラルジ及び酵母が含まれる。
【０１３７】
さらに、ある株は、食品医薬品局によってGRAS、即ち、「一般に安全とみなされる(Generally Regarded As Safe)」と指定されている。これらの株のそれらに限定されないいくつかの例には、枯草菌、アシドフィルス菌、ラクトバシラス・ヘルベティクス及び酵母が含まれる。
【０１３８】
(IPP経路)
IPP及びその異性体、ジメチルアリルピロリン酸(「DMAPP」)を合成する、2つの既知の生合成経路がある。植物以外の真核生物は、メバロン酸依存性(「MEV」)イソプレノイド経路のみを用いて、アセチル補酵素A(「アセチルCoA」)を、後にDMAPPに異性化されるIPPに変換する。原核生物は、一部の例外を除き、メバロン酸非依存性又はデオキシキシルロース5-リン酸(「DXP」)の経路を用いて、分岐点を通してIPP及びDMAPPを別々に生成する。一般に、植物はIPP合成のためにMEV及びDXP経路の両方を用いる。
【０１３９】
(MEV経路)
MEV経路の略図を、図1に示す。一般に、本経路は6つの段階を含む。
【０１４０】
第1段階では、アセチル補酵素Aの2つの分子が酵素的に組み合わされて、アセトアセチルCoAを形成する。この段階を触媒することが知られている酵素は、例えば、アセチルCoAチオラーゼである。そのような酵素をコードするヌクレオチド配列のそれらに限定されないいくつかの例には、以下のGenBankアクセッション番号及びそれらの配列が由来する生物体が含まれる:(NC_000913 REGION:2324131..2325315;大腸菌)、(D49362;パラコッカス・デニトリフィカンス(Paracoccus denitrificans))、及び(L20428;酵母)。
【０１４１】
MEV経路の第2段階では、アセトアセチルCoAは、アセチルCoAの別の分子と酵素的に縮合されて、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA(HMG-CoA)を形成する。この段階を触媒することが知られている酵素は、例えば、HMG-CoA合成酵素である。そのような酵素をコードするヌクレオチド配列のそれらに限定されないいくつかの例には、(NC_001145.complement(補体)19061..20536;酵母)、(X96617;酵母)、(X83882;シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana))、(AB037907;キタサトスポラ・グリセオーラ(Kitasatospora griseola))、(BT007302;ヒト(Homo sapiens))、及び(NC_002758、Locus tag(遺伝子座タグ)SAV2546、GeneID 1122571;黄色ブドウ球菌)が含まれる。
【０１４２】
第3段階では、HMG-CoAはメバロン酸に酵素的に変換される。この段階を触媒することが知られている酵素は、例えば、HMG-CoA還元酵素である。そのような酵素をコードするヌクレオチド配列のそれらに限定されないいくつかの例には、(NM_206548;キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster))、(NC_002758、遺伝子座タグSAV2545、GeneID 1122570;黄色ブドウ球菌)、(NM_204485;ニワトリ(Gallus gallus))、(AB015627;ストレプトマイセスsp.KO 3988)、(AF542543;ニコチアーナ・アテヌアータ(Nicotiana attenuata))、(AB037907;キタサトスポラ・グリセオーラ)、(AX128213、トランケーションされたHMGRをコードする配列を提供する;酵母)及び(NC_001145:補体(115734..118898;酵母)が含まれる。
【０１４３】
第4段階では、メバロン酸は酵素的にリン酸化されて、メバロン酸5-リン酸を形成する。この段階を触媒することが知られている酵素は、例えば、メバロン酸キナーゼである。そのような酵素をコードするヌクレオチド配列のそれらに限定されないいくつかの例には、(L77688;シロイヌナズナ)及び(X55875;酵母)が含まれる。
【０１４４】
第5段階では、第2のリン酸基がメバロン酸5-リン酸に酵素的に加えられて、メバロン酸5-ピロリン酸を形成する。この段階を触媒することが知られている酵素は、例えば、ホスホメバロン酸キナーゼである。そのような酵素をコードするヌクレオチド配列のそれらに限定されないいくつかの例には、(AF429385;ヘベア・ブラジリエンシス(Hevea brasiliensis))、(NM_006556;ヒト)及び(NC_001145.補体712315..713670;酵母)が含まれる。
【０１４５】
第6段階では、メバロン酸5-ピロリン酸は、IPPに酵素的に変換される。この段階を触媒することが知られている酵素は、例えば、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼである。そのような酵素をコードするヌクレオチド配列のそれらに限定されないいくつかの例には、(X97557;酵母)、(AF290095;エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium))及び(U49260;ヒト)が含まれる。
【０１４６】
IPPをDMAPPに変換する場合、第7の段階が必要とされる。この段階を触媒することが知られている酵素は、例えば、IPPイソメラーゼである。そのような酵素をコードするヌクレオチド配列のそれらに限定されないいくつかの例には、(NC_000913、3031087..3031635;大腸菌)及び(AF082326;ヘマトコッカス・プルビアリス(Haematococcus pluvialis))が含まれる。
【０１４７】
(DXP経路)
DXP経路の略図を、図2に示す。一般に、DXP経路は、7つの段階を含む。第1段階では、ピルベートをD-グリセルアルデヒド3-リン酸と縮合させて、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸を製造する。この段階を触媒することが知られている酵素は、例えば、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸合成酵素である。そのような酵素をコードするヌクレオチド配列のそれらに限定されないいくつかの例には、(AF035440;大腸菌)、(NC_002947、遺伝子座タグPP0527;シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)KT2440)、(CP000026、遺伝子座タグSPA2301;サルモネラ・エンテリカ・パラチフィ(Salmonella enterica Paratyphi)、ATCC 9150を参照)、(NC_007493、遺伝子座タグRSP_0254;ロドバクター・スフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides)2.4.1)、(NC_005296、遺伝子座タグRPA0952;ロドシュードモナス・パルストリス(Rhodopseudomonas palustris)CGA009)、(NC_004556、遺伝子座タグPD1293;キシレラ・ファスチディオサ・テメクラール(Xylella fastidiosa Temeculal))及び(NC_003076、遺伝子座タグAT5G11380;シロイヌナズナ)が含まれる。
【０１４８】
第2段階では、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸は、2C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸に変換される。この段階を触媒することが知られている酵素は、例えば、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸リダクトイソメラーゼである。そのような酵素をコードするヌクレオチド配列のそれらに限定されないいくつかの例には、(AB013300;大腸菌)、(AF148852;シロイヌナズナ)、(NC_002947、遺伝子座タグPP1597;シュードモナス・プチダKT2440)、(AL939124、遺伝子座タグSCO5694;ストレプトマイセス・コエリカラー(Streptomyces coelicolor)A3(2))、(NC_007493、遺伝子座タグRSP_2709;ロドバクター・スフェロイデス2.4.1)及び(NC_007492、遺伝子座タグPfl_1107;蛍光菌(Pseudomonas fluorescens)PfO-1)が含まれる。
【０１４９】
第3段階では、2C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸は、4-ジホスホシチジル-2C-メチル-D-エリスリトールに変換される。この段階を触媒することが知られている酵素は、例えば、4-ジホスホシチジル-2C-メチル-D-エリスリトール合成酵素である。そのような酵素をコードするヌクレオチド配列のそれらに限定されないいくつかの例には、(AF230736;大腸菌)、(NC_007493、遺伝子座_タグRSP_2835;ロドバクター・スフェロイデス2.4.1)、(NC_003071、遺伝子座_タグAT2G02500;シロイヌナズナ)及び(NC_002947、遺伝子座_タグPP1614;シュードモナス・プチダKT2440)が含まれる。
【０１５０】
第4段階では、4-ジホスホシチジル-2C-メチル-D-エリスリトールは、4-ジホスホシチジル-2C-メチル-D-エリスリトール-2-リン酸に変換される。この段階を触媒することが知られている酵素は、例えば、4-ジホスホシチジル-2C-メチル-D-エリスリトールキナーゼである。そのような酵素をコードするヌクレオチド配列のそれらに限定されないいくつかの例には、(AF216300;大腸菌)及び(NC_007493、遺伝子座_タグRSP_1779;ロドバクター・スフェロイデス2.4.1)が含まれる。
【０１５１】
第5段階では、4-ジホスホシチジル-2C-メチル-D-エリスリトール-2-リン酸は、2C-メチル-D-エリスリトール2,4-シクロ二リン酸に変換される。この段階を触媒することが知られている酵素は、例えば、2C-メチル-D-エリスリトール2,4-シクロ二リン酸合成酵素である。そのような酵素をコードするヌクレオチド配列のそれらに限定されないいくつかの例には、(AF230738;大腸菌)、(NC_007493、遺伝子座_タグRSP_6071;ロドバクター・スフェロイデス2.4.1)及び(NC_002947、遺伝子座_タグPP1618;シュードモナス・プチダKT2440)が含まれる。
【０１５２】
第6段階では、2C-メチル-D-エリスリトール2,4-シクロ二リン酸は、1-ヒドロキシ-2-メチル-2-(E)-ブテニル-4-二リン酸に変換される。この段階を触媒することが知られている酵素は、例えば、1-ヒドロキシ-2-メチル-2-(E)-ブテニル-4-二リン酸合成酵素である。そのような酵素をコードするヌクレオチド配列のそれらに限定されないいくつかの例には、(AY033515;大腸菌)、(NC_002947、遺伝子座_タグPP0853;シュードモナス・プチダKT2440)及び(NC_007493、遺伝子座_タグRSP_2982;ロドバクター・スフェロイデス2.4.1)が含まれる。
【０１５３】
第7段階では、1-ヒドロキシ-2-メチル-2-(E)-ブテニル-4-二リン酸は、IPP又はその異性体DMAPPに変換される。この段階を触媒することが知られている酵素は、例えば、イソペンチル/ジメチルアリル二リン酸合成酵素である。そのような酵素をコードするヌクレオチド配列のそれらに限定されないいくつかの例には、(AY062212;大腸菌)及び(NC_002947、遺伝子座_タグPP0606;シュードモナス・プチダKT2440)が含まれる。
【０１５４】
一部の実施態様では、宿主細胞自身の代謝プロセスと本発明によって提供されるIPPの生成に関与する工程との間の「クロストーク」(又は干渉)は、最小化されるか完全に除去される。例えば、宿主微生物がIPPの合成のためにDXP経路に排他的に依存し、かつ追加のIPPを提供するためにMEV経路が導入される場合に、クロストークは最小化されるか完全に除去される。そのような宿主生物体は、又はMEV経路酵素の発現を変化させるか、MEV経路と関連する中間体を加工する能力を有するようにはならない。DXP経路に排他的に又は主に依存する生物体には、例えば、大腸菌が含まれる。
【０１５５】
一部の実施態様では、宿主細胞は、排他的に又はDXP経路と一緒に、MEV経路を通してIPPを生成する。他の実施態様では、宿主のDXP経路は、宿主細胞が異種から導入されたMEV経路を通して排他的にIPPを生成するように、機能的に無能化される。DXP経路は、遺伝子発現を無効にするか、DXP経路酵素の1つ以上の機能を不活性化することによって、機能的に無能化することができる。
【０１５６】
(C15イソプレノイド出発物質)
IPPと同様に、ファルネシルピロリン酸(「FPP」)も生物学的に製造することができる。一般に、IPPの2つの分子及びDMAPPの1つの分子が縮合されてFPPを形成する。一部の実施態様では、本反応は、この段階を触媒することが知られている酵素、例えばファルネシルピロリン酸合成酵素によって触媒することができる。
【０１５７】
ファルネシルピロリン酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列のそれらに限定されないいくつかの例には、(ATU80605;シロイヌナズナ)、(ATHFPS2R;シロイヌナズナ)、(AAU36376;クソニンジン(Artemisia annua))、(AF461050;ウシ(Bos taurus))、(D00694;大腸菌K-12)、(AE009951、遺伝子座AAL95523;フゾバクテリウム・ヌクレアタム亜種ヌクレアタム(Fusobacterium nucleatum subsp.nucleatum)ATCC 25586)、(GFFPPSGEN;ギベレラ・フジクロイ(Gibberella fujikuroi))、(CP000009、遺伝子座AAW60034;グルコノバクター・オキシダンス(Gluconobacter oxydans)621H)、(AF019892;ヒマワリ(Helianthus annuus))、(HUMFAPS;ヒト)、(KLPFPSQCR;クルイベロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis))、(LAU15777;ルピナス・アルブス(Lupinus albus))、(LAU20771;ルピナス・アルブス)、(AF309508;ハツカネズミ(Mus musculus))、(NCFPPSGEN;アカパンカビ(Neurospora crassa))、(PAFPS1;パルテニウム・アルゼンタータム(Parthenium argentatum))、(PAFPS2;パルテニウム・アルゼンタータム)、(RATFAPS;ドブネズミ(Rattus norvegicus))、(YSCFPP;酵母)、(D89104;分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe))、(CP000003、遺伝子座AAT87386;化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes))、(CP000017、遺伝子座AAZ51849;化膿連鎖球菌)、(NC_008022、遺伝子座YP_598856;化膿連鎖球菌MGAS10270)、(NC_008023、遺伝子座YP_600845;化膿連鎖球菌MGAS2096)、(NC_008024、遺伝子座YP_602832;化膿連鎖球菌MGAS10750)、及び(MZEFPS;トウモロコシ(Zea mays))が含まれる。
【０１５８】
IPP及びFPPの生物学的生産の方法は、国際公開第2006/014837号、並びに米国特許公開第2003/0148479号、第2004/0005678号及び第2006/0079476号を含む参考文献によってそれ以前に記載されている。実施例1及び2も、これらの化合物を製造するための実施態様を提供する。
【０１５９】
その後FPPは、様々なC15イソプレノイドに変換することができる。一般に、非環状(分枝状又は直鎖状)及び環状(側鎖を有する又は有さない)のC15イソプレノイドを、出発物質として用いることができる。しかし、非環状C15イソプレノイドは、本発明の実施のための所望の化合物を生成するために、より少ない化学段階を必要とする。適するC15イソプレノイド出発物質の非限定的ないくつかの例には、
【化２７】
0005528110.tif 000028
が含まれるが、それらに限定されない。
【０１６０】
(α-ファルネセン)
その構造が
【化２８】
0005528110.tif 000029
であるα-ファルネセンは、それらに限定されないがアリのDufour腺を含む様々な生物供給源、並びに、リンゴ及びナシの皮の皮膜に見られる。生化学的に、α-ファルネセンは、α-ファルネセン合成酵素によってFPPから製造される。そのような酵素をコードする、適するヌクレオチド配列のそれらに限定されないいくつかの例には、(DQ309034;セイヨウナシ(Pyrus communis)栽培品種d'Anjou)及び(AY182241;リンゴ(Malus domestica))が含まれる。Pechouusらの文献(Planta 219(1):84-94(2004))を参照。
【０１６１】
(β-ファルネセン)
その構造が
【化２９】
0005528110.tif 000030
であるβ-ファルネセンは、それらに限定されないがアブラムシ及びハッカ油などの精油を含む様々な生物供給源に見られる。野生のジャガイモなどの一部の植物では、β-ファルネセンは天然の昆虫忌避剤として合成される。生化学的に、β-ファルネセンは、β-ファルネセン合成酵素によってFPPから製造される。そのような酵素をコードする、適するヌクレオチド配列のそれらに限定されないいくつかの例には、(AF024615;ペパーミント(Mentha x piperita))及び(AY835398;クソニンジン)が含まれる。Picaudらの文献(Phytochemistry 66(9):961-967(2005))を参照。
【０１６２】
(ファルネソール)
その構造が
【化３０】
0005528110.tif 000031
であるファルネソールは、昆虫並びにシントロネラ、ネロリ、シクラメン、レモングラス、チュベローズ及びバラ由来の精油を含む、様々な生物供給源に見られる。生化学的に、ファルネソールは、ファルネソール合成酵素などのヒドロキシラーゼによってFPPから製造される。そのような酵素をコードする、適するヌクレオチド配列のそれらに限定されないいくつかの例には、(AF529266;トウモロコシ)及び(YDR481C;酵母)が含まれる。Song,L.の文献(Applied Biochemistry and Biotechnology 128:149-158(2006))を参照。
【０１６３】
(ネロリドール)
その構造が
【化３１】
0005528110.tif 000032
であるネロリドールは、ペルビオール(peruviol)としても知られ、ネロリ、ショウガ、ジャスミン、ラベンダー、チャノキ及びレモングラス由来の精油を含む様々な生物供給源に見られる。生化学的に、ネロリドールは、ネロリドール合成酵素などのヒドロキシラーゼによってFPPから製造される。そのような酵素をコードする、適するヌクレオチド配列のそれに限定されない例には、トウモロコシ(メイズ;遺伝子tps1)からのAF529266が含まれる。
【０１６４】
一部の実施態様では、イソプレノイド出発物質は、多種多様の植物、例えばコパイフェラ・ラングスドルフィー(Copaifera langsdorfii)、針葉樹及びトウダイグサ;昆虫、例えばスワローテールチョウ、葉の甲虫、シロアリ及びマツハバチ;並びに海洋生物、例えば藻類、海綿、珊瑚、軟体動物及び魚が生成することができる、天然のテルペンから得ること又は調製することができる。
コパイフェラ・ラングスドルフィー又はコパイフェラ樹は、ディーゼル樹及び灯油樹としても知られる。それは、kupa'y、cabismo及びcopauvaを含む、地方言語による多くの名称を有する。コパイフェラ樹は、その木部及び葉で、大量のテルペン炭化水素を生成することができる。一般に、1本のコパイフェラ樹木は、1年に約30から約40リットルのテルペン油を生成することができる。
【０１６５】
テルペン油は、針葉樹及びトウダイグサから得ることもできる。針葉樹は、マツ植物又は球果植物の植物門に属し、一般に、維管束組織を有する、球果を有する種子植物である。大多数の針葉樹は樹木であるが、一部の針葉樹は潅木であり得る。適する針葉樹のそれらに限定されないいくつかの例には、スギ、イトスギ、ダグラスファ、モミ、ビャクシン、カウリマツ、カラマツ、マツ、アメリカスギ、トウヒ及びイチイが含まれる。トウダイグサ、別名ユーホルビア属は、非常に多様な世界的に分布する植物属であり、トウダイグサ科(トウダイグサ科(Euphorbiaceae))に属する。約2160の種類からなり、トウダイグサは植物界で最大の属の1つである。
【０１６６】
C15イソプレノイド出発物質は、テルペンと呼ばれるより大きなクラスの化合物の一部であるセスキテルペンである。大きく、多様なクラスの炭化水素、テルペンには、ヘミテルペン、モノテルペン、セスキテルペン、ジテルペン、セスタテルペン、トリテルペン、テトラテルペン及びポリテルペンが含まれる。その結果、適するC15イソプレノイド出発物質は、本発明に用いられるテルペン油から単離することができる。
【０１６７】
(化学的変換)
本明細書で開示される燃料組成物の燃料成分は、
【化３２】
0005528110.tif 000033
を含むことができ、上式で、Zは上記に定義した通りである。式(I)又は(II)は、生物学的方法又は化学合成(生物学的に誘導された物質を使用しない)を含む、当技術分野で公知である任意の方法によって調製することができる。一実施態様では、C15イソプレノイド出発物質は、天然源から単離される。例えば、ファルネソールは、シントロネラ、エンロリ(enroli)、シクラメン、レモングラス、チュベローズ及びバラから単離することができる。別の実施態様では、C15イソプレノイド出発物質は、その化合物を生成するか、又は天然化合物の収率を増加させるように修飾されている宿主細胞によって製造される。
【０１６８】
その供給源に関係なく、C15イソプレノイド出発物質のそれぞれは、水素化、又は還元反応及びエステル化の組合せなどの任意の公知の還元反応によって、本明細書で開示される燃料成分又は燃料添加剤に化学的に変換することができる。一部の実施態様では、C15イソプレノイド出発物質は、Pd、Pd/C、Pt、PtO2、Ru(PPh3)2Cl2、ラネーニッケルなどの触媒、又はその組合せを用いて、水素によって還元することができる。一実施態様では、触媒はPd触媒である。別の実施態様では、触媒は5% Pd/Cである。さらなる実施態様では、触媒は高圧反応容器内の10% Pd/Cであり、反応を完了するまで進行させる。一般に、完了後、反応混合液を洗浄、濃縮及び乾燥させて、対応する水素化生成物を生成することができる。或いは、C=C結合をC-C結合に還元することができる、任意の還元剤を用いることもできる。例えば、O2雰囲気の下で、5-エチル-3-メチルルミフラビニウム過塩素酸などの触媒の存在下で、ヒドラジンによる処理によりC15イソプレノイド出発物質を水素化して、対応する水素化生成物を与えることができる。ヒドラジンによる還元反応は、引用により本明細書中に組み込まれているImadaらの文献(J.Am.Chem.Soc.、127、14544-14545(2005))に開示されている。
【０１６９】
一部の実施態様では、C15イソプレノイド出発物質中のC=C結合は、室温にて触媒及び水素の存在下で水素化によって対応するC-C結合に還元される。さらなる実施態様では、下のスキーム1に示すように、触媒は10% Pd/Cである。
【化３３】
0005528110.tif 000034
【０１７０】
上記のスキーム1に従って得られる完全飽和C15アルコールは、任意の公知のエステル化剤、例えばカルボン酸、カルボン酸ハライド(例えば、フッ化物、塩化物、臭化物及びヨウ化物)並びにカルボン酸無水物によって対応する飽和C15エステルを生成するように、さらに修飾することができる。エステル化反応は、当業者によって認識される任意の反応条件で実施することができる。一部の実施態様では、C15アルコール出発物質は、酸若しくは塩基の触媒の存在下で所望のカルボン酸と反応させるか、又は、フィッシャー若しくはシュテークリヒのエステル化条件を用いることによってエステル化される。他の実施態様では、C15アルコール出発物質は、アミン又はピリジン化合物などの塩基触媒の存在下又は非存在下で、所望のカルボン酸ハライドと反応させることによってエステル化される。他の実施態様では、下のスキーム2に表すように、C15アルコール出発物質は、アミン化合物(例えば、トリエチルアミン)などの塩基触媒の存在下で所望のカルボン酸無水物と反応させることによってエステル化される。完了した反応混合液を濃縮、洗浄及び乾燥させて、対応するエステルを生成することができる。
【化３４】
0005528110.tif 000035
【０１７１】
或いは、飽和C15エステルは、下のスキーム3に示すように、エステル転移反応を介して飽和C15アルコール及び所望のエステルから得ることができる。エステル転移反応は、当業者によって認識される任意の反応条件で実施することができる。一部の実施態様では、エステル転移反応は、アルカリ(例えばLi、Na、K、Rb及びCs)若しくはアルカリ性(例えば、Mg、Ca、Sr及びBa)の水酸化物、炭酸塩又は酢酸塩などの塩基触媒、又はそれらの組合せによって触媒される。
【化３５】
0005528110.tif 000036
【０１７２】
一部の実施態様では、完全飽和C15アルコールは、R-X(ここで、Rはアルキル、Xは、ハロ、スルホニル、硫酸基などの優れた脱離基である。) などの任意の公知のアルキル化剤によって対応するエーテルを生成するようにさらに修飾することができ、アルキル化剤のそれらに限定されないいくつかの例には、ハロゲン化アルキル、アルキルスルホン酸及びアルキル硫酸が含まれる。一般に、C15アルコールは先ず塩基によってC15アルコキシドに変換することができ、次に、C15アルコキシドをその後R-X(ここで、XはCl、Br又はIである。) と反応させて、下のスキーム4に示すように対応するエーテルを形成することができる。一部の実施態様では、塩基は、金属ナトリウム又は金属水素化物、例えば水素化ナトリウム、水素化アルミニウムリチウム及び水素化ホウ素ナトリウムなどの活性金属であることができる。
【化３６】
0005528110.tif 000037
【０１７３】
或いは、先に記載したようにC15オレフィンアルコールは先ずアルキル化又はエステル化することができ、その後、下のスキーム5に表すように水素化することができ、式中、R'はR又はC(=O)Rであり、RはH又はアルキルである。
【化３７】
0005528110.tif 000038
【０１７４】
下のスキーム6に関して、エステル化は先に記載したものと同様に実施することができる。以降の水素化は、先に記載したものと同様に実施することができる。或いは、二重結合の以降の水素化は、-O-C(=O)R基に影響を及ぼさない任意の水素化触媒を用いて、選択的に実行することができる。一部の実施態様では、水素化触媒は、O-C(=O)R基の水素化分解なしでオレフィン官能性を選択的に低減させる触媒毒としてジフェニルスルフィドを用いるPd/Cであり、そのことは、引用により本明細書中に組み込まれているMoriらの文献(Org.Lett.、8、3279-3281(2006))に開示されている。他の実施態様では、ポリ(エチレングリコール)及びアダムズ触媒、即ちPtO2は、1気圧の下で水素により二重結合を選択的に水素化する溶媒として用いることができる。アダムズ触媒の使用は、引用により本明細書中に組み込まれているChandrasekharらの文献(J.Org.Chem.、71、2196-2199(2006))に開示されている。
【化３８】
0005528110.tif 000039
【０１７５】
C15イソプレノイド出発物質の水素化を、ロジウム-キラルジホスフィン錯体などの不斉水素化触媒の存在下で実施して、他の立体異性体が実質的に含まれない立体特異的水素化生成物を形成することができる。不斉水素化触媒の限定されない例には、ロジウム-DIPAMP触媒が含まれる。ロジウム-DIPAMP触媒及び他の不斉水素化触媒は、Vineyardらの文献(J.Am.Chem.Soc.1977、99、(18)、5946);Ryoji Noyoriの文献「有機合成における不斉触媒反応(Asymmetric Catalysis In Organic Synthesis)」(John Wiley & Sons Inc.、New York、Chapter 2、pp.16-94(1994));及びBlaserらの文献「工業規模の不斉触媒反応:挑戦、手法及び解法(Asymmetric Catalysis on Industrial Scale:Challenges、Approaches and Solutions)」(Wiley-VCH、Weinheim、pp.23-52(2004))に開示され、それらのすべては引用により本明細書中にその全体が組み込まれている。
【０１７６】
一部の実施態様では、α-ファルネセン及びβ-ファルネセンは、以下に示すように、不斉水素化触媒の存在下で水素化して、ファルネサンの4つの可能な立体異性体、即ち化合物(III-a)、(III-b)、(III-c)及び(III-d)の1つを形成することができる。
【化３９】
0005528110.tif 000040
【０１７７】
同様に、ファルネソールは、以下に示すように、不斉水素化触媒の存在下で水素化して、3,7,11-トリメチルドデカン-1-オールの4つの可能な立体異性体の1つを形成することができる。
【化４０】
0005528110.tif 000041
【０１７８】
同様に、ネロリドールは、以下に示すように、不斉水素化触媒の存在下で水素化して、3,7,11-トリメチルドデカン-3-オールの4つの可能な立体異性体の1つを形成することができる。
【化４１】
0005528110.tif 000042
【０１７９】
同様に、C15オレフィンアルコール又はそれらのアルキル化、エステル化、硫酸化、リン酸化、スルホン化又はホスホン化された生成物を、不斉水素化触媒の存在下で水素化して、対応する立体特異的水素化生成物を形成することもできる。
【０１８０】
さらに別の代替法では、C15オレフィンアルコールの水素化及びアルキル化、エステル化、硫酸化、スルホン化、リン酸化又はホスホン化は、同時に行うことができる。
【０１８１】
(燃料組成物)
本明細書で開示される燃料組成物は、費用効果が高くて環境にやさしい方法で生成することができる。有利には、本明細書で提供されるイソプレノイド化合物は、1つ以上の微生物によって生成することができる。したがって、これらのイソプレノイド化合物は、ディーゼル又はジェット燃料のための再生可能なエネルギー源、特に本明細書で提供される燃料組成物を提供することができる。さらに、これらのイソプレノイド化合物は、燃料、燃料成分及び/又は燃料添加剤の再生不可能な源に対する依存を低下させることができる。ある実施態様では、本発明は、生体工学によって作られたファルネサンを含む燃料組成物を包含する。
【０１８２】
上で証明されるように、本発明の実施態様は、ディーゼル又はジェット燃料として特に有用である様々な燃料組成物を提供する。今日利用できるディーゼル及び脂肪酸メチルエステルから誘導されたバイオディーゼル燃料と比較して、本明細書で開示される燃料組成物は酸化分解により耐性であり得、したがって有効期間が延長される。その結果、一部の実施態様では、燃料組成物は、少なくとも約1年、少なくとも約2年、少なくとも約3年、少なくとも約4年、少なくとも約5年、少なくとも約10年、少なくとも約15年、少なくとも約20年又は少なくとも約25年の有効期間を有する。他の実施態様では、燃料組成物は少なくとも約50年の有効期間を有する。さらなる実施態様では、燃料組成物は50年を超える有効期間を有する。
【０１８３】
本発明は限定された数の実施態様に関して記載されたが、一実施態様の特定の特徴を本発明の他の実施態様に帰するべきではない。単一の実施態様が、本発明のすべての態様を代表することはない。一部の実施態様では、組成物又は方法は、本明細書で指摘されない多数の化合物又は段階を含むことができる。他の実施態様では、組成物又は方法は、本明細書で挙げられていないいかなる化合物又は段階も含まないか、実質的に含まない。記載された実施態様の変形形態及び改変形態が存在する。例えば、ディーゼル燃料は、通常のパラフィン及び分枝状パラフィンの混合物である必要はない。ディーゼル燃料中の芳香族化合物含有量が10重量%未満であり、かつ硫黄含有量が100ppm未満である限り、それは任意の種類の炭化水素を含むことができる。ディーゼル燃料は10重量%未満の芳香族化合物含有量及び100ppm未満の硫黄含有量を有することが好ましいが、10重量%を超える芳香族化合物含有量及び/又は100ppmより高い硫黄含有量を有するディーゼル燃料も、目的によっては許容される。ディーゼル燃料の用途はディーゼルエンジンに限定されない点に留意する必要があり、それは、非常用発電機などのディーゼル燃料を必要とする任意の機器で用いることができる。すべてのディーゼル燃料が少なくとも40のセタン価を有することが規制要件であるが、本発明の実施態様に従うすべてのディーゼル燃料がこの規制要件を満たす必要はない。言い換えると、40未満のセタン価を有するディーゼル燃料も、許容される。なお、ディーゼル燃料の製造及び使用方法が、いくつかの段階に関して記載される。一部の実施態様では、これらの段階は任意の順序で実施することができる。一部の実施態様では、1つ以上の段階を省略又は併合することができるが、それでもまだ実質的に同じ結果を達成することができる。添付の特許請求の範囲は、そのような変形形態及び改変形態のすべてを、本発明の範囲に入るものとして含むことを意図する。
【０１８４】
本明細書で言及されているすべての刊行物及び特許出願は、個々の刊行物又は特許出願が引用により組み込まれていることが具体的に及び個々に示されているかのように、引用により本明細書中に組み込まれている。上記の発明は理解の明快さの目的のために例示及び例として多少詳細に記載したが、本発明の教示に照らし、添付の請求項の精神又は範囲を逸脱しないである変更及び修正をそれに加えることができることは、当分野の技術者にとって容易に明らかになる。
【実施例】
【０１８５】
本発明の実施は、特に明記しない限り、生合成工業などの従来の技術を使用することができ、これらは当技術分野の範囲内である。そのような技術が本明細書で完全に記載されていない限り、科学文献でそれらの十分な参考文献を見出すことができる。
【０１８６】
以下の実施例では、用いる数字(例えば、量、温度、その他)に関して正確を期するために努力を払ったが、変化及び変更を受け入れることができ、また、本明細書で報告される数字の誤記が存在する場合には、本発明が関係する分野の技術者は、本明細書の残りの開示を考慮して正しい量を推測することができる。特に明記しない限り、温度は摂氏温度で報告され、圧は、海水面での大気圧又はその近くである。すべての試薬は、特に明記しない限り市販品である。以下の実施例は例示だけが目的であるものとし、本発明の範囲をいかようにも限定するものではない。
【０１８７】
(実施例1)
この実施例は、オペロンで構成された酵母由来のMEV経路の酵素を含む酵素をコードする、発現プラスミドの作製方法を記載する。
【０１８８】
発現プラスミドpMevTは、MevTオペロンをpBAD33ベクターに挿入することによって生成した。MevTオペロンは、遍在する前駆体アセチルCoAを(R)-メバロン酸に一緒に変換するMEV経路酵素のセット、即ち、アセトアセチルCoAチオラーゼ、HMG-CoA合成酵素及びHMG-CoA還元酵素をコードする。MevTオペロンは、大腸菌ゲノムDNAからatoB遺伝子のコード配列(GenBankアクセッション番号NC_000913領域:2324131..2325315)(アセトアセチルCoAチオラーゼをコードする)を、酵母ゲノムDNAからERG13遺伝子のコード配列(GenBankアクセッション番号X96617、領域:220..1695)(HMG-CoA合成酵素をコードする)を、及び酵母ゲノムDNAからHMG1遺伝子のコード領域の断片(GenBankアクセッション番号M22002、領域:1660..3165)(トランケーションされたHMG-CoA還元酵素(tHMGR)をコードする)をPCR増幅することによって生成した。HMG1遺伝子断片の増幅のために用いた上流側PCRプライマーには、人工開始コドンが含まれた。増幅断片は重複伸長部を用いて一緒に接合(SOEing)し、その工程の間に、リボソーム結合部位をatoB及びERG13コード配列の後に導入した。3'A突出部の付加の後、MevTオペロンをTAクローニングベクターpCR4(Invitrogen社、Carlsbad、CA(カリフォルニア)州)に連結した。その後MevTオペロンを、ベクターpBAD33のXmaI PstI制限部位に連結した(Guzmanら(1995)の文献(J.Bacteriol.177(14):4121-4130))。オペロンをPLacプロモーターの調節下に置くために、pBAD33のaraC-PBAD NsiI-XmaI断片をpBBR1MCSのNsiI-XmaI断片で置換し、発現プラスミドpMevTを得た(米国特許第7,192,751号を参照)。
【０１８９】
発現プラスミドpAM36-MevT66は、MevT66オペロンをpAM36ベクターに挿入することによって生成した。pAM36ベクターは、AscI-SfiI-AsiSI-XhoI-PacI-FsIl-PmeI制限部位を含むオリゴヌクレオチドカセットをpACYC184ベクター(GenBankアクセッション番号X06403)に挿入し、テトラマイシン耐性を付与するpACYC184の遺伝子を除去することによって生成した。MevT66オペロンは、配列番号1を鋳型として用いて合成により生成したが、その配列は、大腸菌由来のatoB遺伝子(GenBankアクセッション番号NC_000913領域:2324131..2325315)、酵母由来のERG13遺伝子(GenBankアクセッション番号X96617、領域:220..1695)及び酵母由来のHMG1遺伝子のトランケーションされたバージョン(GenBankアクセッション番号M22002、領域:1777..3285)を含み、3つの配列すべては大腸菌での発現のためにコドンが最適化されている。合成により生成されたMevT66オペロンには、5'EcoRI制限部位及び3'Hind III制限部位が連なり、したがって、標準のpUC又はpACYC起点ベクターなどのクローニングベクターの適合する制限部位にクローニングすることができた。MevT66オペロンを、連結するSfiI及びAsiSI制限部位でPCR増幅し、増幅したDNA断片を、SfiI及びAsiSI制限酵素を用いて完全に消化し、反応混合液をゲル電気泳動によって分解し、約4.2kb DNA断片を、ゲル精製キット(Qiagen社、Valencia、CA(カリフォルニア)州)を用いてゲル抽出し、単離したDNA断片をpAM36ベクターのSfiI AsiSI制限部位に連結させて、発現プラスミドpAM36-MevT66を得た。
【０１９０】
発現プラスミドpAM25は、MevT66オペロンをpAM29ベクターに挿入することによって生成した。pAM29ベクターは、pZS24-MCS1(Lutz及びBujard(1997)の文献(Nucl Acids Res.25:1203-1210))由来のp15A複製起点及びカナマイシン耐性付与遺伝子を、オリゴヌクレオチド生成のlacUV5プロモーターと組み合わせることによって製造した。MevT66オペロンを含むDNA合成構築物(上記のpAM36-MevT66の記載を参照)を、EcoRI及びHind III制限酵素を用いて完全に消化し、反応混合液をゲル電気泳動によって分解し、約4.2kbのDNA断片をゲル抽出し、単離したDNA断片を、pAM29のEcoRI Hind III制限部位に連結して、発現プラスミドpAM25を得た。
【０１９１】
発現プラスミドpMevB-Cmは、MevBオペロンをpBBR1MCS-1ベクターに挿入することによって生成した。MevBオペロンは、(R)-メバロン酸をIPPに一緒に変換する酵素のセット、即ち、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ及びメバロン酸ピロリン酸カルボキシラーゼをコードする。MevBオペロンは、酵母ゲノムDNAから、ERG12遺伝子(GenBankアクセッション番号X55875、領域:580..1911)(メバロン酸キナーゼをコードする)、ERG8遺伝子(GenBankアクセッション番号Z49939、領域:3363..4718)(ホスホメバロン酸キナーゼをコードする)及びMVD1遺伝子(GenBankアクセッション番号X97557、領域:544..1734)(メバロン酸ピロリン酸カルボキシラーゼをコードする)のコード配列をPCR増幅し、重複伸長部を用いてPCR断片を一緒に接合させる(SOEingする)ことによって生成した。適当なプライマー配列を選択することによって、増幅の間ERG12及びERG8の終止コドンをTAAからTAGに変え、リボソーム結合部位を導入した。3'A突出部の付加の後、MevBオペロンをTAクローニングベクターpCR4(Invitrogen社、Carlsbad、CA(カリフォルニア)州)に連結した。MevBオペロンを、PstI制限酵素を用いてクローニング構築物を完全に消化することによって切り取り、反応混合液をゲル電気泳動によって分解し、約4.2kbのDNA断片をゲル抽出し、単離したDNA断片をベクターpBBRlMCS-1(Kovachらの文献(Gene 166(1):175-176(1995)))のPstI制限部位に連結して、発現プラスミドpMevB-Cmを得た。
【０１９２】
発現プラスミドpMBIは、MBIオペロンをpBBRIMCS-3ベクターに挿入することによって生成した。MevBオペロンの酵素に加えて、MBIオペロンは、DMAPPへのIPPの変換を触媒するイソペンテニルピロホスファターゼイソメラーゼもコードする。MBIオペロンは、大腸菌ゲノムDNAから、それらの5'末端にXmaI制限部位を含むプライマーを用いてidi遺伝子のコード配列(GenBankアクセッション番号AF119715)をPCR増幅し、増幅されたDNA断片を、XmaI制限酵素を用いて完全に消化し、反応混合液をゲル電気泳動によって分解し、約0.5kbの断片をゲル抽出し、単離したDNA断片を発現プラスミドpMevB-CmのXmaI制限部位に連結し、それによってMevBオペロンの3'末端にidiを置くことによって生成した。MBIオペロンをベクターpBBR1MCS-3(Kovachらの文献(Gene 166(1):175-176(1995)))のSalI SacI制限部位にサブクローニングして、発現プラスミドpMBIを得た(米国特許第7,192,751号を参照)。
【０１９３】
発現プラスミドpMBISは、ispA遺伝子をpMBIに挿入することによって生成した。ispA遺伝子は、IPPの2分子とDMAPPの1分子との縮合を触媒してFPPを製造する、ファルネシルピロリン酸合成酵素をコードする。ispA遺伝子(GenBankアクセッション番号D00694、領域:484..1383)のコード配列を、SacII制限部位を有する順方向プライマー及びSacI制限部位を有する逆方向プライマーを用いて、大腸菌ゲノムDNAからPCR増幅した。増幅したPCR生成物を、SacII及びSacI制限酵素を用いて完全に消化し、反応混合液をゲル電気泳動によって分解し、約0.9kbのDNA断片をゲル抽出し、単離したDNA断片をpMBIのSacII SacI制限部位に連結し、それによって、ispA遺伝子をidi及びMevBオペロンの3'に置き、発現プラスミドpMBISを得た(米国特許第7,192,751号を参照)。
【０１９４】
発現プラスミドpAM45は、MBISオペロンをpAM36-MevT66に挿入し、MBIS及びMevT66オペロンの前にlacUV5プロモーターを加えることによって生成した。MBISオペロンを、5' XhoI制限部位及び3' PacI制限部位を含むプライマーを用いてpMBISからPCR増幅し、増幅したPCR生成物を、XhoI及びPacI制限酵素を用いて完全に消化し、反応混合液をゲル電気泳動によって分解し、約5.4kbのDNA断片をゲル抽出し、単離したDNA断片をpAM36-MevT66のXhoI PacI制限部位に連結させて、発現プラスミドpAM43を得た。lacUV5プロモーターをコードするヌクレオチド配列を含むDNA断片をオリゴヌクレオチドから合成し、pAM43のAscI SfiI及びAsiSI XhoI制限部位にサブクローニングして、発現プラスミドpAM45を得た。
【０１９５】
(実施例2)
この実施例は、オペロンで構成された黄色ブドウ球菌由来のMEV経路の酵素を含む酵素をコードする、発現ベクターの作製方法を記載する。
【０１９６】
発現プラスミドpAM41は、トランケーションされた酵母HMG-CoA還元酵素をコードするHMG1遺伝子のコード配列を、黄色ブドウ球菌HMG-CoA還元酵素をコードするmvaA遺伝子のコード配列(GenBankアクセッション番号BA000017、領域:2688925..2687648)で置換することによって、発現プラスミドpAM25から誘導した。mvaA遺伝子のコード配列を、プライマー4-49 mvaA SpeI(配列番号13)及び4-49 mvaAR XbaI(配列番号14)を用いて、黄色ブドウ球菌亜種アウレウス(aureus)(ATCC 70069)ゲノムDNAからPCR増幅し、増幅したDNA断片を、SpeI制限酵素を用いて完全に消化し、反応混合液をゲル電気泳動によって分解し、約1.3kbのDNA断片をゲル抽出した。HMG1コード配列は、HindIII制限酵素を用いてプラスミドを完全に消化することによって、pAM25から取り出した。生じた線状DNA断片の末端突出部は、T4 DNAポリメラーゼを用いて平滑にした。次に、SpeI制限酵素を用いてDNA断片を部分的に消化し、反応混合液をゲル電気泳動によって分解し、約4.8kbのDNA断片をゲル抽出した。単離したDNA断片を、SpeIで消化したmvaA PCR生成物に連結して、発現プラスミドpAM41を得た。
【０１９７】
発現プラスミドpAM52は、酵母HMG-CoA合成酵素をコードするERG13遺伝子のコード配列を、黄色ブドウ球菌HMG-CoA合成酵素をコードするmvaS遺伝子のコード配列(GenBankアクセッション番号BA000017、領域:2689180..2690346)で置換することによって、発現プラスミドpAM41から誘導した。mvaS遺伝子のコード配列は、プライマーHMGS 5' Sa mvaS-S(配列番号15)及びHMGS 3' Sa mvaS-AS(配列番号16)を用いて黄色ブドウ球菌亜種アウレウス(ATCC 70069)ゲノムDNAからPCR増幅し、Geiserらの文献(BioTechniques 31:88-92(2001))の方法に従ってpAM41のHMG1遺伝子のコード配列を置換するために、増幅したDNA断片をPCRプライマーとして用い、発現プラスミドpAM52を得た。pAM52に含まれるatoB(opt):mvaS:mvaAオペロンのヌクレオチド配列は、配列番号2である。
【０１９８】
発現プラスミドpAM97は、MevT66オペロンを発現プラスミドpAM52の(atoB(opt):mvaS:mvaA)オペロンで置換することによって、発現プラスミドpAM45から誘導した。AsiSI及びSfiI制限酵素を用いて、発現プラスミドpAM45を完全に消化し、反応混合液をゲル電気泳動によって分解し、MevT66オペロンを欠く約8.3kbのDNA断片をゲル抽出した。プライマー19-25 atoB SfiI-S(配列番号17)及び19-25 mvaA-AsiSI-AS(配列番号18)を用いてpAM52の(atoB(opt):mvaS:mvaA)オペロンをPCR増幅し、SfiI及びAsiSI制限酵素を用いてPCR生成物を完全に消化し、反応混合液をゲル電気泳動によって分解し、約3.8kbのDNA断片をゲル抽出し、単離したDNA断片を発現プラスミドpAM45のAsiSI SfiI制限部位に連結して、発現プラスミドpAM97を得た(プラスミドマップについては図3を参照)。
【０１９９】
(実施例3)
この実施例は、オペロンで構成された大腸菌由来のDXP経路の酵素を含む酵素をコードする、発現プラスミドの作製方法を記載する。
【０２００】
発現プラスミドpAM408は、「トップ」DXP経路の酵素をコードする遺伝子をpAM29ベクターに挿入することによって生成した。「トップ」DXP経路の酵素には、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸合成酵素(大腸菌のdxs遺伝子によってコードされる)、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸リダクトイソメラーゼ(大腸菌のdxr遺伝子によってコードされる)、4-ジホスホシチジル-2C-メチル-D-エリスリトール合成酵素(大腸菌のispD遺伝子によってコードされる)及び4-ジホスホシチジル-2C-メチル-D-エリスリトール合成酵素(大腸菌のispE遺伝子によってコードされる)が含まれ、それらは一緒に、ピルベート及びD-グリセルアルデヒド-3-リン酸を4-ジホスホシチジル-2C-メチル-D-エリスリトール-2-リン酸に変換する。「トップ」DXP経路の酵素をコードするヌクレオチド配列を含むDNA断片は、大腸菌株DH1(ATCC #33849)由来の追加の最適なShine Dalgarno配列及び5'及び3'制限部位を有するdxs(GenBankアクセッション番号U00096領域:437539..439401)、dxr(GenBankアクセッション番号U00096領域:193521..194717)、ispD(GenBankアクセッション番号U00096領域:2869803..2870512)及びispE(GenBankアクセッション番号U00096領域1261249..1262100)遺伝子のコード配列を、配列番号19〜26に示すPCRプライマーを用いてPCR増幅することによって生成した。PCR生成物は、ゲル電気泳動によって分解し、ゲル抽出し、適当な制限酵素(dxs遺伝子を含むPCR生成物のためにはXhoI及びKpnI;dxr遺伝子を含むPCR生成物のためにはKpnI及びApaI;ispD遺伝子を含むPCR生成物のためにはApaI及びNdeI;ispE遺伝子を含むPCR生成物のためにはNdeI及びMluI)を用いて完全に消化し、PCR精製キット(Qiagen社、Valencia、CA(カリフォルニア)州)を用いて精製した。次に、各PCR生成物の概ね等モル量を連結反応に加え、個々の遺伝子をオペロンに組み立てた。この連結反応から1μlの反応混合物を用いて、2つの別々の遺伝子カセット、即ち、dxs-dxr及びispD-ispE遺伝子カセットをPCR増幅した。プライマー67-1A-C(配列番号19)及び67-1D-C(配列番号22)を用いてdxs-dxr遺伝子カセットをPCR増幅し、プライマー67-1E-C(配列番号23)及び67-1H-C(配列番号26)を用いてispD-ispE遺伝子カセットをPCR増幅した。2つのPCR生成物をゲル電気泳動によって分解し、ゲル抽出した。XhoI及びApaI制限酵素を用いてdxs-dxr遺伝子カセットを含むPCR生成物を完全に消化し、ApaI及びMluI制限酵素を用いてispD-ispE遺伝子カセットを含むPCR生成物を完全に消化した。2つのPCR生成物を精製し、精製したDNA断片をpAM29ベクターのSalI MluI制限部位に連結して、発現プラスミドpAM408を得た(プラスミドマップについては図4を参照)。
【０２０１】
発現プラスミドpAM409は、「ボトム」DXP経路の酵素をコードする遺伝子をpAM369ベクターに挿入することによって生成した。「ボトム」DXP経路の酵素には、2C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸合成酵素(大腸菌のispF遺伝子によってコードされる)、1-ヒドロキシ-2-メチル-2-(E)-ブテニル-4-二リン酸合成酵素(大腸菌のispG遺伝子によってコードされる)及びイソペンテニル/ジメチルアリル二リン酸合成酵素(大腸菌のispH遺伝子によってコードされる)が含まれ、それらは一緒に、4-ジホスホシチジル-2C-メチル-D-エリスリトール-2-リン酸をIPP及びDMAPPに変換する。IPPは、イソペンチル二リン酸イソメラーゼ(大腸菌のidi遺伝子によってコードされる)の活性を通して、DMAPPにも変換される。DMAPPは、ファルネシル二リン酸合成酵素(例えば、大腸菌のispA遺伝子によってコードされるもの)の活性を通して、FPPにさらに変換することができる。「ボトム」DXP経路の酵素、並びにイソペンチル二リン酸イソメラーゼ及びファルネシル二リン酸合成酵素をコードするオペロンは、追加の最適なShine Dalgarno配列並びに5'及び3'の制限部位を有する、大腸菌株DH1(ATCC #33849)由来のispF(GenBankアクセッション番号U00096領域:2869323..2869802)、ispG(GenBankアクセッション番号U00096領域:2638708..2639826)、ispH(GenBankアクセッション番号U00096領域:26277..27227)、idi(GenBankアクセッション番号AF119715)及びispA(GenBankアクセッション番号D00694領域:484..1383)遺伝子を、配列番号27〜36に示すPCRプライマーを用いてPCR増幅することによって生成した。PCR生成物をゲル電気泳動によって分解し、ゲル抽出し、適当な制限酵素(ispF遺伝子を含むPCR生成物のためにはBamHI及びApaI;ispG遺伝子を含むPCR生成物のためにはKpnI及びApaI;ispH遺伝子を含むPCR生成物のためにはSalI及びKpnI;idi遺伝子を含むPCR生成物のためにはSalI及びHindIII;ispA遺伝子を含むPCR生成物のためにはHindIII及びNcoI)を用いて消化し、精製した。次に、各PCR生成物の概ね等モル量を連結反応に加え、個々の遺伝子をオペロンに組み立てた。この連結反応から1μlの反応混合物を用いて、2つの別々の遺伝子カセット、即ち、ispF-ispG及びispH-idi-ispA遺伝子カセットをPCR増幅した。ispF-ispG遺伝子カセットは、プライマー67-2A-C(配列番号27)及び67-2D-C(配列番号30)を用いてPCR増幅し、ispH-idi-ispA遺伝子カセットは、プライマー67-2E-C(配列番号31)及び67-2J-C(配列番号36)を用いてPCR増幅した。2つのPCR生成物をゲル電気泳動によって分解し、ゲル抽出した。BamHI及びKpnI制限酵素を用いてispF-ispG遺伝子カセットを含むPCR生成物を完全に消化し、KpnI及びNcoI制限酵素を用いてispH-idi-ispA遺伝子カセットを含むPCR生成物を完全に消化した。2つのPCR生成物を精製した。pAM369ベクターは、pAM29由来のp15A複製起点、及びpZE12-luc(Lutz及びBujard(1997)の文献(Nucl Acids Res.25:1203-1210))由来のアンピシリン耐性のβラクタマーゼ遺伝子を、オリゴヌクレオチド生成のlacUV5プロモーターと組み合わせることによって製造した。「ボトム」DXP経路オペロンを含む2つの単離したPCR生成物を、pAM369ベクターのBamHI NcoI制限部位に連結して、発現プラスミドpAM409を得た。
【０２０２】
広い宿主範囲のRK2複製起点を含む発現プラスミドpAM409の誘導体である発現プラスミドpAM424は、pAM409のlacUV5プロモーター及びispFGH-idi-ispAオペロンをpAM257ベクターに移すことによって生成した。ベクターpAM257は、以下の通りに生成した:RK2 par遺伝子座を、プライマー9-156A(配列番号37)及び9-156B(配列番号38)を用いてRK2プラスミドDNA(Meyerら(1975)の文献(Science 190:1226-1228))からPCR増幅し、AatII及びXhoI制限酵素を用いて2.6kbのPCR生成物を完全に消化し、DNA断片を、ベクターpZA31-luc(Lutz及びBujard(1997)の文献(Nucl Acids Res.25:1203-1210))由来のp15複製起点及びクロラムフェニコール耐性付与遺伝子を含むプラスミドに連結して、プラスミドpAM37-parを得;制限酵素SacI及びHindIIIを用いてpAM37-parを完全に消化し、反応混合液をゲル電気泳動によって分解し、RK2 par遺伝子座及びクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むDNA断片をゲル抽出し、単離したDNA断片をmini-RK2レプリコンpRR10(Robertsら(1990)の文献(J Bacteriol.172:6204-6216))のSacI HindIII部位に連結してベクターpAM133を得;BglII及びHindIII制限酵素を用いてpAM133を完全に消化し、反応混合液をゲル電気泳動によって分解し、アンピシリン耐性遺伝子及びoriT接合起点を欠く約6.4kbのDNA断片をゲル抽出し、単離したDNA断片を、PciI及びXhoI制限部位を含む複数のクローニング部位を含む合成DNA断片に連結して、ベクターpAM257を得た。XhoI及びPciI制限酵素を用いて発現プラスミドpAM409を完全に消化し、反応混合液をゲル電気泳動によって分解し、約4.4kbのDNA断片をゲル抽出し、単離したDNA断片をpAM257ベクターのXhoI PciI制限部位に連結して、発現プラスミドpAM424を得た(プラスミドマップについては図5を参照)。
【０２０３】
(実施例4)
この実施例は、MEV経路の酵素を含む酵素をコードする核酸の、酵母の特定の染色体位置への目標を定めた組込みのためのベクターの作製方法を記載する。
【０２０４】
ゲノムDNAを、酵母株Y002(CEN.PK2バックグラウンド;MATA;ura3-52;trp1-289;leu2-3,112;his3Δ1;MAL2-8C;SUC2)、Y007(S288CバックグラウンドMATA trp1Δ63)、Y051(S288Cバックグラウンド;MATαhis3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 PGAL1-HMG11586-3323 PGAL1-upc2-1 erg9::PMET3-ERG9::HIS3 PGAL1-ERG20 PGAL1-HMG11586-3323)及びEG 123(MATA ura3;trp1;leu2;his4 can1)から分離した。これらの株は、1%酵母抽出物、2% Bactoペプトン及び2%デキストロースを含む液体培地(YPD培地)で、一晩増殖させた。細胞は、3,100rpmの遠心分離、10mL超純水中での細胞ペレットの洗浄、及び再遠心分離により、10mL液体培養から単離した。ゲノムDNAは、Y-DER酵母DNA抽出キット(Pierce Biotechnologies社、Rockford、IL(イリノイ)州)を製造業者の推奨プロトコルに従って用いて抽出した。抽出したゲノムDNAを100μLの10mMトリス-Cl、pH8.5に再懸濁し、Nd-1000分光光度計(NanoDrop Technologies社、Wilmington、DE)上でOD260/280の値を読み取って、ゲノムDNAの濃度及び純度を判定した。
【０２０５】
Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼシステム(Finnzymes OY社、Espoo、Finland)を製造業者の推奨プロトコルに従って用いて、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によるDNA増幅をApplied Biosystems 2720 Thermocycler(Applied Biosystems社、Foster City、CA(カリフォルニア)州)で実施した。TOPO TA pCR2.1クローニングベクター(Invitrogen社、Carlsbad、CA(カリフォルニア)州)に挿入予定のDNA断片のPCR増幅の終了後、1μLのQiagen Taqポリメラーゼ(Qiagen社、Valencia、CA(カリフォルニア)州)を反応混合液に加えて、72℃PCR伸長段階をさらなる10分間実施し、その後4℃に冷却することによってAヌクレオチド突出部を製造した。PCR増幅の終了後、8μLの50%グリセロール溶液を反応混合物に加え、全混合液を0.5μg/mL臭化エチジウムを含有する1% TBE(0.89Mのトリス、0.89Mのホウ酸、0.02MのEDTAナトリウム塩)アガロースゲル上に加えた。
【０２０６】
アガロースゲル電気泳動は、120V、400mAで30分間実施し、紫外線を用いてDNAバンドを可視化した。滅菌したかみそりの刃でDNAバンドをゲルから切り取り、切り取ったDNAは、ZymocleanゲルDNA回収キット(Zymo Research社、Orange、CA(カリフォルニア)州)を製造業者の推奨プロトコルに従って用いてゲル精製した。精製したDNAを10μL超純水に溶出させ、ND-1000分光光度計でOD260/280の値を読み取り、DNAの濃度及び純度を判定した。
【０２０７】
連結は、100〜500μgの精製PCR生成物及び高濃度T4 DNAリガーゼ(New England Biolabs社、Ipswich、MA(マサチューセッツ)州)を製造業者の推奨プロトコルに従って用いて実施した。プラスミド増殖のために、製造業者の推奨プロトコルに従って、連結構築物を大腸菌DH5αの化学的にコンピテントな細胞(Invitrogen社、Carlsbad、CA(カリフォルニア)州)に形質転換した。陽性の形質転換体は、1.5% Bacto寒天、1%トリプトン、0.5%酵母抽出物、1% NaCl及び50μg/mLの適当な抗生物質を含有する固体培地上で選択した。単離した形質転換体は、50μg/mLのカルベニシリン又はカナマイシン抗生物質を含む液体LB培地で37℃で16時間増殖させ、QIAprep Spin Miniprepキット(Qiagen社、Valencia、CA(カリフォルニア)州)を製造業者の推奨プロトコルに従って用いて、プラスミドを単離、精製した。診断的制限酵素消化を実施し、アガロースゲル上でDNA断片を分解、視覚化することによって、構築物を確認した。選択構築物は、Elim Biopharmaceuticals社(Hayward、CA(カリフォルニア)州)が実施したDNAシークエンシングによっても確認された。
【０２０８】
プラスミドpAM489は、ベクターpAM471のERG20-PGAL-tHMGR挿入断片をベクターpAM466に挿入することによって生成した。ベクターpAM471は、ERG20(ERG20ヌクレオチド位置1〜1208;ATG開始コドンのAはヌクレオチド1である)の読取り枠(ORF)(ERG20)、分岐GAL1及びGAL10プロモーター(GAL1ヌクレオチド位置-1〜-668)を含むゲノム遺伝子座(PGAL)、及びHMG1(HMG1ヌクレオチド位置1586〜3323)のトランケーションされたORF(tHMGR)を含むDNA断片ERG20-PGAL-tHMGRを、TOPO Zero Blunt IIクローニングベクター(Invitrogen社、Carlsbad、CA(カリフォルニア)州)に挿入することによって生成した。ベクターpAM466は、ヌクレオチド位置-856から位置548にわたって伸長し、かつ塩基-226及び-225の間に本来のものでない内部XmaI制限部位を有する、酵母の野生型TRP1遺伝子座の断片を含むDNA断片TRP1-856〜+548を、TOPO TA pCR2.1クローニングベクター(Invitrogen社、Carlsbad、CA(カリフォルニア)州)に挿入することによって生成した。表1で概説されるように、DNA断片ERG20-PGAL-tHMGR及びTRP1-856〜+548は、PCR増幅によって生成した。pAM489の構築のために、XmaI制限酵素(New England Biolabs社、Ipswich、MA(マサチューセッツ)州)を用いて400ngのpAM471及び100ngのpAM466を完全に消化し、ERG20-PGAL-tHMGR挿入断片及び線状pAM466ベクターに対応するDNA断片をゲル精製し、4モル当量の精製挿入断片を1モル当量の精製線状ベクターに連結して、pAM489を得た(マップについては図6Aを、ERG20-PGAL-tHMGR挿入断片のヌクレオチド配列については配列番号3を参照)。
【表１】
0005528110.tif 000043
【０２０９】
プラスミドpAM491は、ベクターpAM472のERG13-PGAL-tHMGR挿入断片をベクターpAM467に挿入することによって生成した。ベクターpAM472は、ERG13(ERG13ヌクレオチド位置1〜1626)のORF(ERG13)、分岐GAL1及びGAL10プロモーター(GAL1ヌクレオチド位置-1〜-668)を含むゲノム遺伝子座(PGAL)、及びHMG1(HMG1ヌクレオチド位置1586〜3323)のトランケーションされたORF(tHMGR)を含むDNA断片ERG13-PGAL-tHMGRを、TOPO Zero Blunt IIクローニングベクターのXmaI制限部位に挿入することによって生成した。ベクターpAM467は、ヌクレオチド位置-723から位置-224にわたって伸長し、かつ塩基-224及び-223の間に本来のものでない内部XmaI制限部位を有する、酵母の野生型URA3遺伝子座の断片を含むDNA断片URA3-723〜701を、TOPO TA pCR2.1クローニングベクターに挿入することによって生成した。表2で概説されるように、DNA断片ERG13-PGAL-tHMGR及びURA3-723〜701は、PCR増幅によって生成した。pAM491の構築のために、XmaI制限酵素を用いて400ngのpAM472及び100ngのpAM467を完全に消化し、ERG13-PGAL-tHMGR挿入断片及び線状pAM467ベクターに対応するDNA断片をゲル精製し、4モル当量の精製挿入断片を1モル当量の精製線状ベクターに連結して、pAM491を得た(マップについては図6Bを、ERG13-PGAL-tHMGR挿入断片のヌクレオチド配列については配列番号4を参照)。
【表２】
0005528110.tif 000044
【０２１０】
プラスミドpAM493は、ベクターpAM473のIDI1-PGAL-tHMGR挿入断片をベクターpAM468に挿入することによって生成した。ベクターpAM473は、IDI1(IDI1ヌクレオチド位置1〜1017)のORF(IDI1)、分岐GAL1及びGAL10プロモーター(GAL1ヌクレオチド位置-1〜-668)を含むゲノム遺伝子座(PGAL)、及びHMG1(HMG1ヌクレオチド位置1586〜3323)のトランケーションされたORF(tHMGR)を含むDNA断片IDI1-PGAL-tHMGRを、TOPO Zero Blunt IIクローニングベクターに挿入することによって生成した。ベクターpAM468は、ヌクレオチド位置-225から位置653にわたって伸長し、かつ塩基-226及び-225の間に本来のものでない内部XmaI制限部位を有する、酵母の野生型ADE1遺伝子座の断片を含むDNA断片ADE1-825〜653を、TOPO TA pCR2.1クローニングベクターに挿入することによって生成した。表3で概説されるように、DNA断片IDI1-PGAL-tHMGR及びADE1-825〜653は、PCR増幅によって生成した。pAM493の構築のために、XmaI制限酵素を用いて400ngのpAM473及び100ngのpAM468を完全に消化し、IDI1-PGAL-tHMGR挿入断片及び線状pAM468ベクターに対応するDNA断片をゲル精製し、4モル当量の精製挿入断片を1モル当量の精製線状ベクターに連結して、ベクターpAM493を得た(マップについては図6Cを、IDI1-PGAL-tHMGR挿入断片のヌクレオチド配列については配列番号5を参照)。
【表３】
0005528110.tif 000045
【０２１１】
プラスミドpAM495は、pAM474のERG10-PGAL-ERG12挿入断片をベクターpAM469に挿入することによって生成した。ベクターpAM474は、ERG10(ERG10ヌクレオチド位置1〜1347)のORF(ERG10)、分岐GAL1及びGAL10プロモーター(GAL1ヌクレオチド位置-1〜-668)を含むゲノム遺伝子座(PGAL)、及びERG12(ERG12ヌクレオチド位置1〜1482)のORF(ERG12)を含むDNA断片ERG10-PGAL-ERG12を、TOPO Zero Blunt IIクローニングベクターに挿入することによって生成した。ベクターpAM469は、ヌクレオチド位置-32から位置-1000及びヌクレオチド位置504から位置1103にわたって伸長する酵母の野生型HIS遺伝子座の2つの断片、HISMXマーカー、並びに、HIS3504〜-1103配列とHISMXマーカーとの間の本来のものでないXmaI制限部位を含むDNA断片HIS3-32〜-1000-HISMX-HIS3504〜-1103を、TOPO TA pCR2.1クローニングベクターに挿入することによって生成した。表4で概説されるように、DNA断片ERG10-PGAL-ERG12及びHIS3-32〜1000-HISMX-HIS3504〜-1103は、PCR増幅によって生成した。pAM495の構築のために、XmaI制限酵素を用いて400ngのpAM474及び100ngのpAM469を完全に消化し、ERG10-PGAL-ERG12挿入断片及び線状pAM469ベクターに対応するDNA断片をゲル精製し、4モル当量の精製挿入断片を1モル当量の精製線状ベクターに連結して、ベクターpAM495を得た(マップについては図6Dを、ERG10-PGAL-ERG12挿入断片のヌクレオチド配列については配列番号6を参照)。
【表４】
0005528110.tif 000046
【０２１２】
プラスミドpAM497は、pAM475のERG8-PGAL-ERG19挿入断片をベクターpAM470に挿入することによって生成した。ベクターpAM475は、ERG8(ERG8ヌクレオチド位置1〜1512)のORF(ERG8)、分岐GAL1及びGAL10プロモーター(GAL1ヌクレオチド位置-1〜-668)を含むゲノム遺伝子座(PGAL)、及びERG19(ERG19ヌクレオチド位置1〜1341)のORF(ERG19)を含むDNA断片ERG8-PGAL-ERG19を、TOPO Zero Blunt IIクローニングベクターに挿入することによって生成した。ベクターpAM470は、ヌクレオチド位置-100から位置450及びヌクレオチド位置1096から位置1770にわたって伸長する酵母の野生型LEU2遺伝子座の2つの断片、HISMXマーカー、並びに、LEU21096〜1770配列とHISMXマーカーとの間の本来のものでないXmaI制限部位を含むDNA断片LEU2-100〜450-HISMX-LEU21096〜1770を、TOPO TA pCR2.1クローニングベクターに挿入することによって生成した。表5で概説されるように、DNA断片ERG8-PGAL-ERG19及びLEU2-100〜450-HISMX-LEU21096〜1770は、PCR増幅によって生成した。pAM497の構築のために、XmaI制限酵素を用いて400ngのpAM475及び100ngのpAM470を完全に消化し、ERG8-PGAL-ERG19挿入断片及び線状pAM470ベクターに対応するDNA断片を精製し、4モル当量の精製挿入断片を1モル当量の精製線状ベクターに連結して、ベクターpAM497を得た(マップについては図6Eを、ERG8-PGAL-ERG19挿入断片のヌクレオチド配列については配列番号7を参照)。
【表５】
0005528110.tif 000047
【０２１３】
(実施例5)
この実施例は、FPPを変換する酵素をコードする発現プラスミドの作製方法を記載する。
【０２１４】
発現プラスミドpAM373は、大腸菌での発現のためにコドンを最適化したクソニンジンのβ-ファルネセン合成酵素をコードするヌクレオチド配列(GenBankアクセッション番号AY835398)を、pTrc99Aベクターに挿入することによって生成した。β-ファルネセン合成酵素をコードするヌクレオチド配列は、配列番号8を鋳型として用いて合成により生成し、プライマーA(配列番号86)及びプライマーB(配列番号87)のプライマーを用いてそのDNA合成構築物からPCR増幅した。β-ファルネセン合成酵素コード配列を含むPCR生成物内にリーダーNcoI制限部位を形成するために、元のポリペプチド配列の第2のアミノ酸をコードするコドン(セリンをコードするTCG)を、5'PCRプライマーのアスパラギン酸をコードするコドン(GAC)によって置換した。NcoI制限酵素を用いて生じたPCR生成物を部分的に消化し、SacI制限酵素を用いて完全に消化し、反応混合液をゲル電気泳動によって分解し、β-ファルネセン合成酵素コード配列を含む約1.7kbのDNA断片をゲル抽出し、単離したDNA断片をpTrc99AベクターのNcoI SacI制限部位に連結して、発現プラスミドpAM373を得た(プラスミドマップについては図7を参照)。
【０２１５】
発現プラスミドpAM342は、大腸菌での発現のためにコドンを最適化したヨーロッパトウヒ(Picea abies)のα-ファルネセン合成酵素をコードするヌクレオチド配列(GenBankアクセッション番号AY473627、領域;24..1766)を、pTrc99Aベクターに挿入することによって生成した。α-ファルネセンをコードするヌクレオチド配列は、配列番号9を鋳型として用いて合成により生成し、プライマーC(配列番号88)及びプライマーD(配列番号89)のプライマーを用いてそのDNA合成構築物からPCR増幅した。生じたPCR生成物を、NcoI及びSacI制限酵素を用いて完全に消化し、反応混合液をゲル電気泳動によって分解し、α-ファルネセン合成酵素コード配列を含む約1.7kbのDNA断片をゲル抽出し、単離したDNA断片をpTrc99AベクターのNcoI SacI制限部位に連結して、発現プラスミドpAM342を得た(プラスミドマップについては図7を参照)。
【０２１６】
発現プラスミドpAM341及びpAM353は、それぞれα-ファルネセン合成酵素又はβ-ファルネセン合成酵素をコードするヌクレオチド配列を、pRS425-Gal1ベクターに挿入することによって生成した(Mumbergら(1994)の文献(Nucl.Acids.Res.22(25):5767-5768))。ヌクレオチド配列挿入断片は、ヨーロッパトウヒのα-ファルネセン合成酵素遺伝子のコード配列(GenBankアクセッション番号AY473627、領域:24..1766)、又はクソニンジンのβ-ファルネセン合成酵素遺伝子のコード配列(GenBankアクセッション番号AY835398)を鋳型として用いて合成により生成したが、両配列は、酵母での発現のためにコドンを最適化した(それぞれ配列番号11及び10)。合成により生成されたヌクレオチド配列には、5'BamHI及び3'XhoI制限部位が連なり、したがって、標準のpUC又はpACYC起点ベクターなどのクローニングベクターの適合する制限部位にクローニングすることができた。各々の合成により生成されたヌクレオチド配列は、BamHI及びXhoI制限酵素を用いてDNA合成構築物を完全に消化することによって単離した。反応混合液をゲル電気泳動によって分解し、α-ファルネセン合成酵素又はβ-ファルネセン合成酵素コード配列を含む約1.7kbのDNA断片をゲル抽出し、単離したDNA断片をpRS425-Gal1ベクターのBamHI XhoI制限部位に連結して、それぞれ発現プラスミドpAM341又はpAM353を得た。
【０２１７】
発現プラスミドpAM404は、酵母での発現のためにコドンを最適化したクソニンジンのβ-ファルネセン合成酵素をコードするヌクレオチド配列(GenBankアクセッション番号AY835398)を、ベクターpAM178に挿入することによって生成した。β-ファルネセン合成酵素をコードしているヌクレオチド配列は、プライマーGW-52-84 pAM326 BamHI(配列番号90)及びGW-52-84 pAM326 NheI(配列番号91)を用いて、pAM353からPCR増幅した。生じたPCR生成物を、BamHI及びNheI制限酵素を用いて完全に消化し、反応混合液をゲル電気泳動によって分解し、β-ファルネセン合成酵素コード配列を含む約1.7kbのDNA断片をゲル抽出し、単離したDNA断片をベクターpAM178のBamHI NheI制限部位に連結して、発現プラスミドpAM404を得た(プラスミドマップについては図8を参照)。
【０２１８】
(実施例6)
この実施例は、本発明で有用な大腸菌宿主株の生成を記載する。
【０２１９】
表6で詳述するように、宿主株は、化学的にコンピテントな大腸菌親細胞を、実施例1から3及び実施例5の1つ以上の発現プラスミドで形質転換することによって製造した。
【表６】
0005528110.tif 000048
【０２２０】
宿主細胞形質転換体は、抗生物質を含むLuria Bertoni(LB)寒天上で選択した。単一のコロニーを、LB寒天から5mLのLB液体培地及び抗生物質を含む培養試験管へ移した。増殖が定常期に達するまで、250rpmの回転振盪機でB526、B552及びB592宿主細胞形質転換体を37℃でインキュベートした。B650、B651、B652及びB653宿主細胞形質転換体は、250rpmの回転振盪機で、30℃で30時間インキュベートした。0.8%グルコース及び抗生物質を含むM9-MOPS培地(M9-MOPS培地の組成については、表7を参照)で連続して4〜5回継代培養することによって、細胞を最少培地に適応させた。細胞は、冷凍バイアル中の400μL滅菌50%グリセロール及び600μL液体培養からなるストックした1mLの一定分量に入れて、-80℃で保存した。
【表７】
0005528110.tif 000049
【０２２１】
(実施例7)
この実施例は、本発明で有用な酵母株の生成を記載する。
【０２２２】
酵母株Y141及びY140を調製するために、酵母株EPY224由来の発現プラスミド(Roら(2006)の文献(Nature 440:940-943);国際公開第2007/005604号)を、富栄養培地で培養することによって取り出し、株EPY300を得た。次に、株EPY300を発現プラスミドpAM341又はpAM353で形質転換して、それぞれ宿主株Y141又はY140を得た。宿主細胞形質転換体は、2%グルコース及びロイシンを除くすべてのアミノ酸を含む、合成の規定培地上で選択した(SM-glu)。ロイシンを欠く5mLの液体SM-gluを含む培養バイアルへ単一のコロニーを移し、増殖が定常期に達するまで、培養物を30℃で振盪によりインキュベートした。細胞は、冷凍バイアル中の400μL滅菌50%グリセロール及び600μL液体培養からなる冷凍した1mLの一定分量に入れて、-80℃で保存した。
【０２２３】
酵母株Y258を調製するために、ERG9プロモーターを酵母MET3プロモーターでADE1 ORFをカンジダ・グラブラータ(Candida glabrata)LEU2遺伝子(CgLEU2)で置換することによって、誘導可能なMEV経路遺伝子の導入のために、酵母株CEN.PK2-1C(Y002)(MATA;ura3-52;trp1-289;leu2-3,112;his3Δ1;MAL2-8C;SUC2)及びCEN.PK2-1D(Y003)(MATα;ura3-52;trp1-289;leu2-3,112;his3Δ1;MAL2-8C;SUC2)(van Dijkenら(2000)の文献(Enzyme Microb.Technol.26(9-10):706-714))を調製した。これは、天然のERG9プロモーターと45個の塩基対の相同性を含む、プライマー50-56-pw100-G(配列番号93)及び50-56-pw101-G(配列番号94)を用いてベクターpAM328のKanMX-PMET3領域(配列番号12)をPCR増幅し、40%w/wポリエチレングリコール3350(Sigma-Aldrich、St.Louis、MO(ミズーリ)州)、100mM酢酸リチウム(Sigma-Aldrich、St.Louis、MO(ミズーリ)州)及び10μgサケ精子DNA(Invitrogen社、Carlsbad、CA(カリフォルニア)州)を用いて、生じたPCR生成物の10μgを指数的に増殖するY002及びY003細胞に形質転換し、30℃で30分間細胞をインキュベートし、その後42℃で30分間熱ショックを与えることによって行った(Schiestl及びGietz.(1989)の文献(Curr.Genet.16、339-346))。陽性の組換え体は、0.5μg/mLジェネテシンを含有する富栄養培地(Invitrogen社、Carlsbad、CA(カリフォルニア)州)上で増殖するそれらの能力によって特定し、選択コロニーを診断的PCRによって確認した。生じたクローンは、Y93(MAT A)及びY94(MATα)と命名した。次に、ADE1 ORFと50個の塩基対の連結相同性を含むプライマー61-67-CPK066-G(配列番号95)及び61-67-CPK067-G(配列番号96)を用いて、3.5kb CgLEU2ゲノム遺伝子座をカンジダ・グラブラータゲノムDNA(ATCC、Manassas、VA(バージニア)州)から増幅し、生じたPCR生成物の10μgを指数的に増殖するY93及びY94細胞に形質転換し、陽性の組換え体をロイシン補充の非存在下での増殖について選択し、選択クローンを診断的PCRによって確認した。生じたクローンは、Y176(MAT A)及びY177(MATα)と命名した。
【０２２４】
次に株Y188は、PmeI制限酵素(New England Biolabs社、Beverly、MA(マサチューセッツ)州)を用いて2μgのpAM491及びpAM495プラスミドDNAを完全に消化し、精製DNA挿入断片を指数的に増殖するY176細胞に導入することによって生成した。陽性の組換え体は、ウラシル及びヒスチジンを欠く培地上での増殖によって選択し、正しいゲノム遺伝子座への組込みは診断的PCRによって確認した。
【０２２５】
次に、PmeI制限酵素を用いて2μgのpAM489及びpAM497プラスミドDNAを完全に消化し、精製DNA挿入断片を指数的に増殖するY177細胞に導入することによって、株Y189生成した。陽性の組換え体は、トリプトファン及びヒスチジンを欠く培地上での増殖によって選択し、正しいゲノム遺伝子座への組込みは診断的PCRによって確認した。
【０２２６】
次に株Y238は、接合させるために室温で6時間、YPD培地プレートの上で株Y188及びY189の約1×107個の細胞を混合し、次に、ヒスチジン、ウラシル及びトリプトファンを欠く培地に混合細胞培養を平板培養して二倍体細胞の増殖について選択することによって生成した。次に、二倍体細胞は、PmeI制限酵素を用いて完全に消化した2μgのpAM493プラスミドDNAを用い、精製DNA挿入断片を指数的に増殖する二倍体細胞に導入して形質転換した。陽性の組換え体は、アデニンを欠く培地上での増殖によって選択し、正しいゲノム遺伝子座への組込みは診断的PCRによって確認した。
【０２２７】
一倍体の株Y211(MATα)は、2%酢酸カリウム及び0.02%ラフィノースの液体培地で株Y238に胞子を形成させ、Singer Instruments MSM300シリーズマイクロマニピュレーター(Singer Instrument社、Somerset、UK)を用いて約200個の遺伝子四分子を分離し、アデニン、ヒスチジン、ウラシル及びトリプトファンの非存在下で増殖するそれらの能力によって、導入遺伝物質の適当な相補体を含む個々の遺伝的分離株を特定し、診断的PCRによってすべての導入DNAの組込みを確認することによって生成した。
【０２２８】
最後に、宿主株Y258は、株Y211をpAM404プラスミドDNAで形質転換することによって生成した。宿主細胞形質転換体は、2%グルコース及びロイシンを除くすべてのアミノ酸を含む、合成の規定培地上で選択した(SM-glu)。ロイシンを欠く5mLの液体SM-gluを含む培養バイアルに単一のコロニーを移し、増殖が定常期に達するまで、培養物を30℃で振盪によりインキュベートした。細胞は、冷凍バイアル中の400μL滅菌50%グリセロール及び600μL液体培養からなる冷凍した1mLの一定分量に入れて、-80℃で保存した。
【０２２９】
(実施例8)
この実施例は、大腸菌宿主株におけるMEV経路を経たα-ファルネセン及びβ-ファルネセンの生成を記載する。
【０２３０】
宿主株B552及びB592の種培養物は、表6に詳述したように、ストックした各株の一定分量を25mLのM9-MOPS、0.8%グルコース、0.5%酵母抽出物及び抗生物質を含む別々の125mLフラスコに加え、培養物を一晩増殖させることによって樹立した。種培養物は、約0.05の初期OD600で、40mLのM9-MOPS、2%グルコース、0.5%酵母抽出物及び抗生物質を含む別々の250mLフラスコに接種するために用いた。培養物は、250rpmの回転振盪機で、約0.2のOD600に到達するまで30℃でインキュベートし、その時点で40μLの1M IPTGを培地に加えることによって、宿主細胞でのファルネセンの生成を誘導した。誘導時に、ファルネセンを捕捉するために、培養物に8mLの有機オーバレイを重層した。2〜10μLの有機オーバレイを、内標準としてトランスカリオフィレンを混入した1mL酢酸エチルを含有する清潔なガラスバイアルに移すことによって、試料を24時間ごとに採取した。
【０２３１】
酢酸エチル試料は、Agilent 5975質量分析計を備えたAgilent 6890Nガスクロマトグラフ(GC/MS)(Agilent Technologies社、Palo Alto、CA(カリフォルニア)州)で、フルスキャンモード(50-500m/z)で分析した。各試料の1μLの一定分量中の化合物を、HP-5MSカラム(Agilent Technologies社、Palo Alto、CA(カリフォルニア)州)、ヘリウムキャリヤーガス及び以下の温度プログラムを用いて分離した:150℃で3分間保持、25℃/分で200℃の温度に上昇、60℃/分で300℃の温度に上昇、及び300℃で1分間保持。このプロトコルを用いて、β-ファルネセンは、4.33分の保持時間を有することが以前に示された。ファルネセン力価は、生成ピーク面積を、トランスカリオフィレン混入酢酸エチルでの精製されたβ-ファルネセン(Sigma-Aldrich Chemical社、St.Louis、MO(ミズーリ)州)の定量較正曲線に対して比較することによって計算した。
【０２３２】
宿主株B592は、120時間の時点でα-ファルネセン約400mg/L(3つの独立したクローンの平均;0時点で誘導)を生成し、約46mg/L/OD600(1代表クローン)の最大比生産性を有していた。宿主株B552は、120時間の時点でβ-ファルネセン約1.1g/L(3つの独立したクローンの平均)を生成し、約96mg/L/OD600(1代表クローン)の最大比生産性を有していた。
【０２３３】
(実施例9)
この実施例は、大腸菌宿主株におけるDXP経路を経たβ-ファルネセンの生成を記載する。
【０２３４】
宿主株B650、B651、B652及びB653の種培養物は、表6に詳述したように、ストックした各株の一定分量を25mLのM9-MOPS、0.8%グルコース、0.5%酵母抽出物及び抗生物質を含む別々の125mLフラスコに加え、培養物を一晩増殖させることによって確立した。種培養物は、約0.05の初期OD600で、40mLのM9-MOPS、45μg/mLチアミン、微量栄養素、1.00E-5モル/LのFeSO4、0.1MのMOPS、2%グルコース、0.5%酵母抽出物及び抗生物質を含む別々の250mLフラスコに接種するために用いた。培養物は、250rpmの加湿インキュベーション振盪機で、0.2から0.3のOD600に到達するまで30℃でインキュベートし、その時点で40μLの1M IPTGを培地に加えることによって、宿主細胞でのβ-ファルネセンの生成を誘導した。誘導時に、β-ファルネセンを捕捉するために、培養物に8mLの有機オーバレイを重層した。上の有機オーバレイの100μLの試料を清潔な試験管へ移すことによって、様々な時点で試料を採取した。残留している細胞又は培地を分離するために試験管を遠心分離にかけ、有機オーバレイ試料の10μLを、清潔なガラスバイアル中の、内標準としてβ-又はトランスカリオフィレンを混入した500μLの酢酸エチルに移した。混合液を30秒間ボルテックスにかけ攪拌、次に実施例8に記載のように分析した。
【０２３５】
宿主株B653は、β-ファルネセンを約7mg/g DCW生成した(DCWは、「乾燥菌体重量(dry cell weight)」である)。
【０２３６】
(実施例10)
この実施例は、酵母宿主株におけるα-ファルネセン及びβ-ファルネセンの生成を記載する。
【０２３７】
宿主株Y141、Y140及びY258の種培養物は、ロイシンを欠く25mL SM-gluを含む別々の125mLフラスコにストックの一定量を加え、培養物を一晩増殖させることによって確立した。種培養物は、約0.05の初期OD600で、0.2%グルコース及び1.8%ガラクトースを含み、ロイシンを欠く40mLの合成規定培地を含有する別々の250mLバッフルフラスコに接種するために用いた。培養物は、200rpmの回転振盪機で、30℃でインキュベートした。Y141及びY140培養物には、8mLのドデカンを重層し;Y258培養物には、8mLのミリスチン酸イソプロピルを重層した。Y141及びY140培養物の試料は120時間まで24時間ごとに1回採取し、Y258培養物の試料は、2μLから10μLの有機オーバレイを、内標準としてβ-又はトランスカリオフィレンを混入した500μL酢酸エチルを含有する清潔なガラスバイアルに移すことによって、誘導の72時間後に採取した。Y141及びY140の試料は実施例8に記載のように分析し、Y258の試料は実施例11に記載のように分析した。
【０２３８】
宿主株Y141は、120時間の時点でα-ファルネセン約9.8mg/L(3つの独立したクローンの平均)を生成し、約3mg/L/OD600(1代表クローン)の最大比生産性を有していた。宿主株Y140は、120時間の時点でβ-ファルネセン約56mg/L(3つの独立したクローンの平均)を生成し、約20mg/L/OD600(1代表クローン)の最大比生産性を有していた。宿主株Y258は、72時間の時点でβ-ファルネセン約762mg/L(3つの独立したクローンの平均)を生成し、約145mg/L/OD600(1代表クローン)の最大比生産性を有していた。
【０２３９】
(実施例11)
この実施例は、有酸素、窒素制限、フェドバッチ培養での、大腸菌宿主株におけるβ-ファルネセンの生成を記載する。
【０２４０】
発酵のための宿主株B526の種培養物は、該株の1つのストック一定分量を、50mL M9-MOPS培地及び抗生物質を含有する250mLフラスコに加え、培養物を250rpmの回転振盪機で、37℃で一晩インキュベートすることによって確立した。種培養物は、約1の初期OD600で、40mL M9-MOPS培地及び抗生物質を含有する250mLフラスコに接種するために用いた。培養物は、それが3から5のOD600に到達するまで、250rpmの回転振盪機で、37℃で再びインキュベートした。
【０２４１】
表8は、発酵運転070522-1(窒素過剰)及び070522-5(窒素制限)のための、最終培地組成を示す。バッチ培地は、2つのバイオリアクター(ADI 1010コントローラを備えた2LのApplikon Bioconsole ADI 1025、Applikon Biotechnology社、Foster City、CA(カリフォルニア)州)のそれぞれで、121℃で30分間熱滅菌した。滅菌後の添加物(post sterile addition)(PSA)及び抗生物質(最終濃度100μg/Lのカルベニシリン及び34μg/Lのクロラムフェニコール)を保存溶液としてろ過滅菌し、ヘッドプレートを通して各バイオリアクターに注入した。すべての微量金属を合わせて濃縮溶液(表9)として前調製し、PSA又はフィード培地に加えた。各発酵運転の開始容量は、1Lであった。すべての運転は、ヘッドプレートを通して50mLの種培養物を注入することによって接種した(5%(v/v))。
【表８】
0005528110.tif 000050
【表９】
0005528110.tif 000051
【０２４２】
最初のグルコースボーラス(15g)が消耗され、溶存酸素が上昇したとき、6時間の倍加時間による指数関数的なグルコースフィードを開始した。以下の方程式によってフィード速度を最大31g/時間まで計算するように、発酵槽ソフトウェア(BioXpert、Applikon Biotechnology社、Foster City、CA(カリフォルニア)州)をプログラムした:
【数１】
0005528110.tif 000052
上式で、msは基質の質量流速(g/hr)であり、μは比増殖速度であり、t0は最初のグルコースボーラスが枯渇した時間であり、S0は最初の基質濃度である。最大速度に到達すると、グルコースフィードを11.7g/時間の速度に低下させ、発酵運転の残りの間、この速度を一定に保持した。
【０２４３】
発酵は、30℃に下げた温度で実施し;バイオリアクター内の気流を1vvmに設定し;初期攪拌は700rpmであり;Biospumex泡止め剤200Kで泡を制御し;溶存酸素圧は、攪拌カスケード(700〜1,200rpm)及び酸素濃縮を用いて40%に制御し;pHは、9.9N NH4OH(2部の濃縮NH4OH、1部のH2O)を用いて、7に維持した。アンモニアは、NOVA Bioprofile 300アナライザー(Nova Biomedical社、Waltham、MA(マサチューセッツ)州)で、製造業者の説明書に従って測定した。
【０２４４】
宿主細胞でのβ-ファルネセンの生成は、1mLの1M IPTGを培地に加えることによって、約30のOD600で誘導した。揮発性のβ-ファルネセンは、200mLヘプタノールを含むガスワッシャーを通してオフガスを通気させることによって捕捉した。その後、ヘプタノール溶液を酢酸エチルに希釈した(希釈係数100×)。溶解性のβ-ファルネセンは、50μLの培養液を950μLのHPLC級メタノールと組み合わせ、試料をFisher Vortex Genie 2(商標)ミキサー(Scientific Industries社、Bohemia、NY(ニューヨーク)州)により約30分間最高速度で振盪し、14,000×gで10分間の遠心分離によって試料から細胞片をペレット化し、アセトニトリル溶液をガラス製HPLCバイアル内の990μLのHPLC級酢酸エチルで希釈することによって、発酵培養液から抽出した。
【０２４５】
酢酸エチル試料は、炎イオン化検出器を備えたAgilent 6890N Networkガスクロマトグラフィーシステム(Gas Chromatography System with flame ionization detection)(GCFID)(Agilent Technologies社、Palo Alto、CA(カリフォルニア)州)で分析した。各試料の1μLの一定分量を注入し、試料に含まれる化合物は、DBI-MSカラム(30m×250μm×0.25μm;Agilent Technologies社、Palo Alto、CA(カリフォルニア)州)、ヘリウムキャリヤーガス及び以下の温度プログラムを用いて分離した:200℃で1分間保持、10℃/分で230℃の温度に上昇、40℃/分で300℃の温度に上昇、及び300℃で1分間保持。このプロトコルを用いて、β-ファルネセンは、4.33分の保持時間を有することが以前に示された。ファルネセン力価は、生成ピーク面積を、トランスカリオフィレン混入酢酸エチル(内標準として利用)での精製されたβ-ファルネセン(Sigma-Aldrich Chemical社、St.Louis、MO(ミズーリ)州)の定量較正曲線に対して比較することによって計算した。
【０２４６】
発酵運転070522-5(窒素制限)は、運転070522-1(窒素過剰)よりも低い細胞培養密度及びより高いβ-ファルネセン力価を示した。発酵運転070522-5(窒素制限)は50時間までに発酵培地中のすべてのアンモニウムを消耗したが、運転070522-1(窒素過剰)はすべての試料採取時点で過剰なアンモニウムを含有していた。表10に示すように、両発酵運転は、培養液中に生成されたβ-ファルネセンの大部分を含有していた。
【表１０】
0005528110.tif 000053
【０２４７】
(実施例12)
この実施例は、大腸菌宿主株の培養内のβ-ファルネセンの分布の判定を記載する。
【０２４８】
65.5時間の培養(実施例11を参照)後に発酵運転070522-1から得られた冷凍完全細胞培養液(whole cell broth)(WCB)を、周囲温度で解凍した。WCBの約1.4mLを2mLの目盛り付きスナップキャップ試験管に入れ、スウィンギングカップローター内で、10,600のRCFで10分間遠心分離にかけた。遠心分離の後、3つの異なる層、即ち細胞ペレット、上清及び有機固形物(軽固形物)の層を試験管中に見ることができた。試験管を傾斜させると、さらなる液体の層(軽液体)が有機固形物の上に見られた(おそらく、軽固形物を突破した上清)。軽液体を別の試験管にピペットで移し;ピペットチップを用いて軽固形物を別の試験管に移して計量し;上清をデカントして別の試験管に移し、再遠心分離にかけてすべての細胞片を除去し;細胞ペレットを脱イオン水に再懸濁して1.4mLの容積にした。実施例11で記載のように、各層を、GCFID分析のためにHPLC級のメタノールで抽出した。
【０２４９】
培養で生成されたβ-ファルネセンの約50%は、軽固形物中に存在する。生成されたβ-ファルネセンの32%は、様々な層で説明されなかったが、それはおそらく小量で調べるのが困難なことに起因する。
【表１１】
0005528110.tif 000054
【０２５０】
(実施例13)
この実施例は、α-ファルネセンのファルネサンへの水素化を記載する。
α-ファルネセン(204g、1モル、255mL)を、10% Pd/C(5g、α-ファルネセンの5重量%)を含む500mL Parr高圧容器に加えた。反応容器を密封し、室減圧下で5分間排気させ、その後、25℃で反応混合液を35psiまでH2で加圧した。H2圧のさらなる低下が観察されなくなるまで(約16時間)、反応混合液を振盪した。室減圧下で余分なH2ガスを除去し、その後、N2雰囲気に換気した。薄層クロマトグラフィー(「TLC」、Rf=0.95、ヘキサン、p-アニスアルデヒド染色又はヨウ素)は、反応体の完全な消滅を示した。反応内容物をシリカゲル(60
【数２】
0005528110.tif 000055
、Aldrich社製)パッドの上で減圧ろ過し、その後、ヘキサン(2L)でシリカゲルを洗浄した。ろ液を、回転蒸発装置の上で濃縮した。単離した生成物を高真空下でさらに乾燥させて残りのヘキサンを除去し、無色液体のファルネサン(195g、244mL、95%)を得た。1H-NMR(CDCl3,500MHz):δ1.56-1.11(m,17H),0.88-0.79(重複t&d,15H).
【０２５１】
(実施例14)
この実施例は、3,7,11-トリメチルドデカン-2,6,10-トリエン-1-オール又はファルネソールの3,7,11-トリメチルドデカン-1-オールへの水素化を記載する。
【０２５２】
ファルネソール(572g、2.58モル、650mL)を、10% Pd/C(23g、ファルネソールの4重量%)を含む1000mL Parr高圧容器に加えた。反応容器を密封し、室減圧下で5分間排気させ、その後、反応混合液を1000psiまでH2で加圧した。反応混合液を25℃で攪拌し、約12時間後に、薄層クロマトグラフィー(「TLC」、Rf=0.32、ヘキサン:酢酸エチル90:10)によって完全であると判断された。反応容器を減圧下で減圧させ、その後、N2雰囲気に換気した。反応内容物をシリカゲル(60
【数３】
0005528110.tif 000056
、Aldrich社製)パッドの上で減圧ろ過し、その後、酢酸エチル(「EtOAc」、3L)でシリカゲルを洗浄した。ろ液を、回転蒸発装置の上で濃縮した。単離した生成物を高真空下でさらに乾燥させて残りのEtOAcを除去し、淡く着色した黄色の粘性液体の3,7,11-トリメチルドデカン-1-オールを得た。1H-NMR(CDCl3,500MHz):δ3.71(m,2H),1.65-1.05(m,17H),0.89-0.83(重複t&d,12H).
【０２５３】
(実施例15)
この実施例は、3,7,11-トリメチルドデカン-1-オールからの3,7,11-トリメチルドデシル酢酸の合成を記載する。
【０２５４】
25℃のCH2Cl2(1500mL)中の3,7,11-トリメチルドデカン-1-オル(542g、2.38モル)の攪拌溶液に、無水酢酸(267g、2.63モル、247mL)を、続いてトリエチルアミン(360g、3.57モル、497mL)を加えて、無色の溶液を生成した。攪拌を約12時間周囲温度で継続した後、暗いさび色の溶液が生成した。TLC(Rf=0.32、ヘキサン:酢酸エチル96:4)分析により、その反応が完全であると判断された。反応を終了して、以下の操作を行った。反応内容物を回転蒸発装置で濃縮してCH2Cl2を除去し、EtOAc(2L)で希釈した。有機層をH2O(3×、1L)で洗浄し、次にエーレンマイヤーフラスコに流し込んだ。脱色チャコール(20g)を加え、15分間攪拌し、セライト層の上でろ過し、EtOAc(2L)で洗浄して淡黄色ろ液を生成した。ろ液を回転蒸発装置で濃縮し、減圧下でさらに乾燥させて、淡黄色粘性液体の3,7,11-トリメチルドデシル酢酸を得た。1H-NMR(CDCl3,500MHz):δ4.11(t,2H),2.04(s,3H),1.62-1.09(m,17H)0.91-0.83(重複t&d,12H).
【０２５５】
(実施例16)
この実施例は、微生物由来のβ-ファルネセンのファルネサンへの水素化を記載する。
β-ファルネセン(5.014gのKJF-41-120-05及びKJF-41-120-06)を500mLのガラス製圧フラスコに入れ、そこに、10%パラジウム/炭素(Sigma-Aldrich #205699-50G)101mgを加えた。フラスコを10分間排気させ、次に、振盪しながら水素(Airgas UHP)で55psiまで加圧した。8分後、水素が枯渇したので容器を水素で53psiに加圧したが、水素は16分で枯渇した。振盪を停止し、48時間にわたって53psiの4L水素シリンダーにフラスコを開放した。Fene-Fane-Split100法を用いるGC/MS分析は反応が不完全であることを示したので、フラスコを52psiまで加圧して一晩振盪した。次の数日間圧が48psi未満に下がったとき、反応を48psiまで再チャージした。反応がまだ不完全であることをGC/MS分析が示した場合、同じパラジウム/炭素のさらなる101mgを加え、反応を48psiまで再びチャージした。17分後、水素が枯渇したので、それを48psiまでチャージした。次の数日間圧が48psi未満に下がったとき、反応が完全であることをGC/MS分析が示すまで、反応を48psiまで再チャージした。フリット化漏斗上のシリカゲルろ過材を用いて触媒をろ過除去し、無色の油1.47gを生じた。GC/FIDを用いた生成物の分析は、99.42%の生成物純度を示した。
【０２５６】
(実施例17)
この実施例は、β-ファルネセンのファルネサンへの大規模水素化を記載する。
2ガロンのリアクターに、4kg(4.65L=1.23ガロン)の液体ファルネセンと、24gの10重量% Pd/C(乾燥)触媒を加えた。これは、5.16g/Lの初期触媒負荷量を与えた。容器を密封し、窒素ガスでパージし、次に減圧下で排気させた。攪拌を開始し、圧縮水素ガスを100psigで連続的に加えた。リアクターを80℃に加熱した。23時間後に、分析のために試料を採取した。GC-FIDを用いて、ファルネサン濃度は45.87%と測定された。さらに4時間後、第2の試料を採取して分析した。GC-FIDを用いて、ファルネサン濃度は47%と測定された。リアクターを冷却、開放し、10gの10重量% Pd/C(乾燥)触媒を加えた(合計34g)。リアクターを上記の反応条件に戻した。〜24時間後に、第3の試料を採取して分析した。GC-FIDを用いて、ファルネサン濃度は67.86%と測定された。リアクターを冷却、開放し、24gの10重量% Pd/C(乾燥)触媒を加えた(合計58g)。リアクターを上記の反応条件に戻した。〜24時間後に、第4の試料を採取して分析した。GC-FIDを用いて、ファルネサン濃度は97.27%と測定された。リアクターを冷却、開放し、10gの10重量% Pd/C(乾燥)触媒を加えた(合計68g)。リアクターを上記の反応条件に戻した。〜24時間後に、第5及び最終の試料を採取して分析した。GC-FIDを用いて、ファルネサンの最終濃度は99.71%と測定された。リアクターを冷却、排気及び開放させた。次に、反応混合液を0.5ミクロンフィルターカートリッジに通してろ過し、2つの1ガロンガラス瓶に入れた。全反応時間は、約96時間であった。
【０２５７】
以前のバッチでの経験に基づき、以降のバッチでは手順を修正した。2ガロンのリアクターに、4kg(4.65L=1.23ガロン)の液体ファルネセンと、75gの10重量% Pd/C(乾燥)触媒を加えた。これは、16.13g/Lの初期触媒負荷量を与えた。容器を密封し、窒素ガスでパージし、次に減圧下で排気させた。攪拌を開始し、圧縮水素ガスを100psigで連続的に加えた。リアクターを80℃に加熱した。全反応時間は、約48時間であった。GC-FIDを用いて、ファルネサンの最終濃度は99.76%と測定された。リアクターを冷却、排気及び開放させた。次に、反応混合液を0.5ミクロンフィルターカートリッジに通してろ過し、2つの1ガロンガラス瓶に入れた。
【０２５８】
所望により、蒸留によって生成物をさらに精製することができる。例示的な1Lの蒸留プロトコルは、以下の通りである。約1Lのファルネサンを、接合部に付けたビグロウカラムと共に水冷蒸留ヘッドを備えた2L丸底フラスコに入れた。液体を攪拌し、14トルまで排気させた。この時点で、液体を155℃に加熱し、フラスコをガラスウール並びにアルミ箔で包んだ。加熱の間に、液体は透明から淡黄色に変化した。蒸気は、120℃でヘッド上に来るようになった。蒸留の停止までに、約950mLの透明なファルネサンが収集された。
【０２５９】
(実施例18)
この実施例は、90%の超低硫黄ディーゼル(ASTM D975規格を満たすディーゼルNo.2)、並びに3,7,11-トリメチルドデシル酢酸及びファルネサンを含んでいる10%の混合物を調合した混合物の特性を記載する。本混合物は、主に3,7,11-トリメチルドデシル酢酸を含み、ファルネサンは少量存在する。
【表１２】
0005528110.tif 000057
【０２６０】
(実施例19)
この実施例は、Whitting、Indiana(インディアナ)州のBP精油所又はCarson、California(カリフォルニア)州のBP精油所から得られた超低硫黄ディーゼルでの、様々な量のファルネサンの試験を記載する。BP Carson精油所からのディーゼルは、California(カリフォルニア)州で使用するためのCalifornia Air Resources Boardの要件を満たすCARB燃料である。精油所では一般に潤滑剤がCARB燃料に加えられるが、このCARB燃料試料は、潤滑剤が加えられる前に得られた。図9及び10は、精油所からのディーゼル燃料と混合した様々な量のファルネサンの試験データを示す。図11A〜Bは、試験した様々な燃料及び混合物の蒸留プロフィールを示す。
【０２６１】
(実施例20)
この実施例は、石油ディーゼル、即ち数千個の個々の化合物の複合混合物で天然に見られるファルネサンの量の判定を記載する。これらの化合物のほとんどはC10〜C22炭化水素であり、一般に、パラフィン、ナフテン及び芳香族化合物である。
【０２６２】
ディーゼル試料をヘキサンで希釈し、次に、Zielinskaらの文献(J.Air & Waste Manage.Assoc.54:1138-1150(2004))に記載のようにGC-MSによって測定した。表13は、結果をμg/mL、重量%及び容量%で示す。
【表１３】
0005528110.tif 000058
【０２６３】
表13の最後の2つの試料を除いて、すべてのディーゼル試料は、ディーゼル燃料を販売しているガソリンスタンドから購入した燃料であった。WhitingからのNo.2ディーゼルは、BP Whiting精油所からのものである。CARBディーゼルはBP Carson精油所からのものであって、潤滑強化剤は含まれていない。
【０２６４】
(実施例21)
この実施例は、BP Whiting精油所からのディーゼル又はBP Carson精油所からのCARBディーゼルとのファルネサンの混合物への、潤滑強化剤の添加を記載する。
【０２６５】
BP Whiting精油所からのディーゼル燃料は、200ppmのInfinium R696潤滑強化剤(旧称、ECD-1)を含む。追加の100ppmをベース燃料に加え、ベース燃料とのファルネサンの5容量%、20容量%及び50容量%の混合物を、ASTM D6079に従って潤滑性について試験した。5容量%、20容量%及び50容量%の混合物について得られた潤滑性(HFRR、60℃)は、それぞれ300μm、240μm及び450μmであった。
【０２６６】
BP Carson精油所からのCARBディーゼルには、潤滑添加剤は含まれていなかった。300ppmのInfinium R696をベース燃料に加え、ベース燃料とのファルネサンの5容量%、20容量%、50容量%及び65容量%の混合物を、ASTM D6079に従って潤滑性について試験した。5容量%、20容量%、50容量%及び65%の混合物について得られた潤滑性(HFRR、60℃)は、それぞれ200μm、240μm、280μm及び240μmであった。
【０２６７】
【化４２】
0005528110.tif 000059
【０２６８】
【化４３】
0005528110.tif 000060
【０２６９】
【化４４】
0005528110.tif 000061
【０２７０】
【化４５】
0005528110.tif 000062
【０２７１】
【化４６】
0005528110.tif 000063
【０２７２】
【化４７】
0005528110.tif 000064
【０２７３】
【化４８】
0005528110.tif 000065
【０２７４】
【化４９】
0005528110.tif 000066
【０２７５】
【化５０】
0005528110.tif 000067
【０２７６】
【化５１】
0005528110.tif 000068
【０２７７】
【化５２】
0005528110.tif 000069
【０２７８】
【化５３】
0005528110.tif 000070
【０２７９】
【化５４】
0005528110.tif 000071
【０２８０】
【化５５】
0005528110.tif 000072
【０２８１】
【化５６】
0005528110.tif 000073
【０２８２】
【化５７】
0005528110.tif 000074
【０２８３】
【化５８】
0005528110.tif 000075
【０２８４】
【化５９】
0005528110.tif 000076
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１（Ａ）】
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【図１１（Ｂ）】
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【配列表】
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