(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を有する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）において突然変異のための重鎖および／または軽鎖可変領域中の１以上のフレームワークアミノ酸位置を同定する方法であって：
ａ）生殖系列または成熟ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列の第一のデータベースを提供し；
ｂ）ｓｃＦｖ抗体ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列の第二のデータベースを提供し、これらの配列の全てが少なくとも１つの所望の機能特性を有し、ここで、所望の機能特性は安定性改善、溶解性改善、非凝集、または発現改善であり、そして、ここで第二のデータベースは第一のデータベースとは異なり；
ｃ）第一のデータベースの各フレームワーク位置および第二のデータベースの各フレームワーク位置でアミノ酸変動性を決定する、ここで各フレームワーク位置でのアミノ酸変動性はシンプソン指数を用いて保存の度合いを割り当てることによって決定され、１以上のフレームワークアミノ酸位置が、突然変異のために、以下の事項に基き同定される
（ｉ）第一のデータベースに比較した際、ｓｃＦｖデータベースにおいて、より低いシンプソン指数値を有する１以上のフレームワークアミノ酸位置；または
（ｉｉ）第一のデータベースに比較した際、ｓｃＦｖデータベースにおいて、より高いシンプソン指数値を有する１以上のフレームワークアミノ酸位置；
ｄ）第一のデータベースおよび第二のデータベース間で、アミノ酸変動性の度合いが異なる、１以上のフレームワーク位置を同定して、それによって一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）における突然変異のための１以上のフレームワークアミノ酸位置を同定する
工程を含む、前記方法。
【請求項２】
第一のデータベースが生殖系列ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
第一のデータベースが生殖系列ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列からなる、請求項１の方法。
【請求項４】
第一のデータベースが成熟ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を含む、請求項１の方法。
【請求項５】
第一のデータベースが成熟ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列からなる、請求項１の方法。
【請求項６】
成熟ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列がＫａｂａｔデータベース（ＫＤＢ）由来である、請求項４または５の方法。
【請求項７】
第二のデータベースが、ＱＣアッセイから選択されるｓｃＦｖ抗体ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項の方法。
【請求項８】
第二のデータベースが、ＱＣアッセイから選択されるｓｃＦｖ抗体ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列からなる、請求項１〜６のいずれか一項の方法。
【請求項９】
所望の機能特性が安定性改善、溶解性改善、非凝集、または発現改善である、請求項１〜８のいずれか一項の方法。
【請求項１０】
発現改善が原核細胞において観察される、請求項９の方法。
【請求項１１】
所望の機能特性が、抗原結合アフィニティーの改善ではないという条件の、請求項１〜１０のいずれか一項の方法。
【請求項１２】
第一のデータベースに比較した際、ｓｃＦｖデータベースにおいて、より低いシンプソン指数値を有する１以上のフレームワークアミノ酸位置に基づいて、突然変異のための１以上のフレームワークアミノ酸位置を同定する、請求項１の方法。
【請求項１３】
第一のデータベースに比較した際、ｓｃＦｖデータベースにおいて、より高いシンプソン指数値を有する１以上のフレームワークアミノ酸位置に基づいて、突然変異のための１以上のフレームワークアミノ酸位置を同定する、請求項１の方法。
【請求項１４】
第一と第二のデータベースの配列が、それらのサブタイプに従ってグループ化される、請求項１の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００７年３月１２日に出願された、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｈａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”と題される米国仮出願第６０／９０６，３６５号に優先権を請求する。
【０００２】
本出願はまた、２００８年３月１２日に出願された、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｈａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”と題される米国仮出願第ＸＸ／ＸＸＸ，ＸＸＸ号、および２００８年３月１２日に出願された、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ａｎｄ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ”と題される米国仮出願第ＸＸ／ＸＸＸ，ＸＸＸ号にも関する。
【０００３】
前述の出願の全内容は、本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００４】
抗体は、癌、自己免疫疾患および他の障害の治療において、非常に有効でそして成功する療法剤であることが証明されている。典型的には、全長抗体が臨床的に用いられてきているが、抗体断片の使用が提供しうるいくつかの利点、例えば組織浸透増加、他のエフェクター機能を付加する能力と組み合わされたＦｃエフェクター機能の非存在、およびｉｎ  ｖｉｖｏ全身半減期がより短い結果として全身副作用が少ない可能性がある。抗体断片の薬物動態学的特性は、これらが局所療法アプローチに特によく適している可能性もあることを示す。さらに、抗体断片は、特定の発現系において、全長抗体よりも産生がより容易でありうる。
【０００５】
抗体断片の１つのタイプは、リンカー配列を通じて、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）にコンジュゲート化された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）で構成される、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。したがって、ｓｃＦｖはすべての抗体定常領域ドメインを欠き、そして前者の可変／定常ドメイン界面のアミノ酸残基（界面残基）は溶媒に曝露されるようになる。ｓｃＦｖは、確立された組換え操作技術を通じて、全長抗体（例えばＩｇＧ分子）から調製可能である。しかし、全長抗体のｓｃＦｖへの変換は、しばしば、タンパク質の劣った安定性および溶解性、低い生産収量、ならびに免疫原性のリスクを増加させる、高い凝集傾向を生じる。
【０００６】
したがって、ｓｃＦｖの溶解性および安定性などの特性を改善するための試みがなされてきている。例えば、Ｎｉｅｂａ，  Ｌ．ら（Ｐｒｏｔ．  Ｅｎｇ．（１９９７）  １０：４３５−４４４）は、界面残基であることが知られる３つのアミノ酸残基を選択し、そしてこれらを突然変異させた。Ｎｉｅｂａらは、細菌において、突然変異ｓｃＦｖの周辺質発現の増加ならびに熱誘導性凝集速度の減少を観察したが、熱力学的安定性および溶解性は有意には改変されなかった。ｓｃＦｖ内の特定のアミノ酸残基に対して部位特異的突然変異誘発を行う他の研究もまた報告されている（例えば、Ｔａｎ，  Ｐ．Ｈ．ら（１９８８）  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．  ７５：１４７３−１４８２；  Ｗｏｒｎ，  Ａ．およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，  Ａ．（１９９８）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３７：１３１２０−１３１２７；  Ｗｏｒｎ，  Ａ．およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，  Ａ．（１９９９）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３８：８７３９−８７５０）。これらの多様な研究において、突然変異誘発のために選択されたアミノ酸残基は、ｓｃＦｖ構造内の既知の位置に基づいて選択された（例えば、分子モデリング研究によるもの）。
【０００７】
別のアプローチにおいて、非常に劣って発現されるｓｃＦｖ由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）が、好ましい特性を有すると立証されているｓｃＦｖのフレームワーク領域内に移植された（Ｊｕｎｇ，  Ｓ．およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，  Ａ．（１９９７）  Ｐｒｏｔ．  Ｅｎｇ．  １０：９５９−９６６）。生じたｓｃＦｖは、溶解性発現および熱力学的安定性の改善を示した。
【０００８】
機能特性を改善させるｓｃＦｖの操作における進歩は、例えば、Ｗｏｒｎ，  Ａ．およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，  Ａ．（２００１）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３０５：９８９−１０１０に概説される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｎｉｅｂａ，  Ｌ．ら（Ｐｒｏｔ．  Ｅｎｇ．（１９９７）  １０：４３５−４４４）
【非特許文献２】Ｔａｎ，  Ｐ．Ｈ．ら（１９８８）  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．  ７５：１４７３−１４８２
【非特許文献３】Ｗｏｒｎ，  Ａ．およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，  Ａ．（１９９８）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３７：１３１２０−１３１２７
【非特許文献４】Ｗｏｒｎ，  Ａ．およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，  Ａ．（１９９９）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３８：８７３９−８７５０
【非特許文献５】Ｊｕｎｇ，  Ｓ．およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，  Ａ．（１９９７）  Ｐｒｏｔ．  Ｅｎｇ．  １０：９５９−９６６
【非特許文献６】Ｗｏｒｎ，  Ａ．およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，  Ａ．（２００１）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３０５：９８９−１０１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、優れた機能特性を持つｓｃＦｖの合理的設計を可能にするには、新規アプローチ、特に、当業者が、操作に潜在的に問題となるアミノ酸残基を選択するのを補助するアプローチがなお必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、配列に基づく分析を用いて、ｓｃＦｖ配列内の潜在的に問題となるアミノ酸残基の同定を可能にする方法を提供する。さらに、本発明の方法にしたがって同定されたアミノ酸残基を、突然変異のために選択してもよいし、そして突然変異されている操作されたｓｃＦｖを調製し、そして機能特性改善に関してスクリーニングしてもよい。特に好ましい態様において、本発明は、機能的に選択されたｓｃＦｖのデータベースを用いて、生殖系列および／または成熟抗体免疫グロブリン配列中の対応する位よりも、変動により耐えるかまたはより耐えないアミノ酸残基位を同定し、それによってこうした同定された残基位が安定性および／または溶解性などのｓｃＦｖ機能性を改善するように操作するのに適している可能性もあることを示す。したがって、本発明は、機能的に選択されたｓｃＦｖ配列のデータベースの使用に基づく「機能コンセンサス」アプローチの利点を提供し、そして立証する。
【００１２】
さらに他の好ましい態様において、本発明は、免疫結合剤において、関心対象のアミノ酸位（例えば、成熟抗体配列のデータベース、例えばＫａｂａｔデータベースに対して、例えばＱＣアッセイで選択されるような少なくとも１つの所望の特性を有するｓｃＦｖ配列のデータベースを比較することによって同定されるアミノ酸位）で置換すべき好ましいアミノ酸残基（あるいは排除すべきアミノ酸残基）を同定するための方法を提供する。したがって、本発明はさらに、特定のアミノ酸残基を選択するための「濃縮／排除」（Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ／Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）法を提供する。さらに、本発明は、本明細書に記載する「機能コンセンサス」アプローチを用いて同定された特定のフレームワークアミノ酸位を突然変異させることによって、免疫結合剤（例えばｓｃＦｖ）を操作する方法を提供する。好ましい態様において、本明細書記載の「濃縮／排除」分析法を用いて「濃縮」残基であることが見出される残基により、存在するアミノ酸残基を置換することによって、フレームワークアミノ酸位を突然変異させる。
【００１３】
１つの側面において、本発明は、ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を有する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）において突然変異のためのアミノ酸位を同定する方法であって：
ａ）ｓｃＦｖ  ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列が、データベースの抗体ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列と並列されるように、多数の抗体ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を含むデータベース内に、ｓｃＦｖ  ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を入力し；
ｂ）ｓｃＦｖ  ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内のアミノ酸位を、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位と比較し；
ｃ）ｓｃＦＶ  ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内のアミノ酸位が、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位で保存されているアミノ酸残基によって占められているかどうかを決定し；そして
ｄ）アミノ酸位がデータベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位で保存されていないアミノ酸残基によって占められている場合、ｓｃＦｖ  ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内のアミノ酸位を突然変異のためのアミノ酸位と同定する
工程を含む、前記方法を提供する。
【００１４】
該方法は、ｓｃＦｖ  ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の突然変異のために同定されたアミノ酸位を突然変異させる工程をさらに含んでもよい。例えば、突然変異のために同定されたアミノ酸位を、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位で保存されているアミノ酸残基で置換してもよい。さらにまたはあるいは、突然変異のために同定されたアミノ酸位を、ランダム突然変異誘発によって、またはバイアス化突然変異誘発によって突然変異させて、突然変異ｓｃＦｖのライブラリーを生成し、その後、突然変異ｓｃＦｖライブラリーのスクリーニングおよび少なくとも１つの改善された機能特性を有するｓｃＦｖの選択が続いてもよい（例えば酵母品質管理系（ＱＣ系）を用いたライブラリーのスクリーニングによる）。
【００１５】
本発明の方法において、多様なタイプのデータベースが使用可能である。例えば、１つの態様において、データベースの抗体ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列は、生殖系列抗体ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列である。別の態様において、データベースの抗体ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列は、再編成されたアフィニティー成熟抗体ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列である。さらに別の、特に好ましい態様において、データベースの抗体ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列は、少なくとも１つの所望の機能特性（例えばｓｃＦｖ安定性またはｓｃＦｖ溶解性）を有するとして選択されたｓｃＦｖ抗体ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列である。さらに別の態様において、１より多いデータベースを比較目的に用いてもよい。例えば、特に好ましい態様において、少なくとも１つの所望の機能特性を有するとして選択されたｓｃＦｖのデータベースとともに、１以上の生殖系列データベースまたは再編成されたアフィニティー成熟抗体データベースを用い、ここでｓｃＦｖデータベース由来の配列比較結果を、他のデータベース（単数または複数）由来の結果に比較する。
【００１６】
本発明の方法を用いて、例えばｓｃＦｖのＶＨ領域、ｓｃＦｖのＶＬ領域または両方を分析可能である。したがって、１つの態様において、ｓｃＦｖ  ＶＨアミノ酸配列をデータベース内に入力し、そしてデータベースの抗体ＶＨアミノ酸配列と並列させる。別の態様において、ｓｃＦｖ  ＶＬアミノ酸配列をデータベース内に入力し、そしてデータベースの抗体ＶＬアミノ酸配列と並列させる。さらに別の態様において、ｓｃＦｖ  ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列をデータベース内に入力し、そしてデータベースの抗体ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列と並列させる。
【００１７】
本発明の方法を用いて、関心対象のｓｃＦｖ内の関心対象の単一のアミノ酸位を分析してもよいが、より好ましくは、該方法を用いて、ｓｃＦｖ配列に沿った多数のアミノ酸位を分析する。したがって、好ましい態様において、方法の工程ｂ）において、ｓｃＦｖ  ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の多数のアミノ酸位を、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位と比較する。例えば、好ましい態様において、ｓｃＦｖ  ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列内の各フレームワーク位を、データベースの抗体ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列内の対応する各フレームワーク位と比較する。さらにまたはあるいは、ｓｃＦｖの１以上のＣＤＲ内の１以上の位を分析してもよい。さらに別の態様において、ｓｃＦｖ  ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列内の各アミノ酸位を、データベースの抗体ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列内の対応する各アミノ酸位と比較する。
【００１８】
データベースの配列間で「保存されている」アミノ酸位は、１以上の特定のタイプのアミノ酸残基によって占められていてもよい。例えば、１つの態様において、「保存されている」位は、その位で非常に高い頻度で存在する１つの特定のアミノ酸残基によって占められている。すなわち、方法の工程ｃ）において、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位で保存されているアミノ酸残基は、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内のその位で最も頻繁なアミノ酸残基である。この状況では、操作されたｓｃＦｖを生成するため、突然変異のために同定されるアミノ酸位を、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位で最も頻繁なアミノ酸残基で置換してもよい。
【００１９】
別の態様において、データベースの配列間で「保存されている」アミノ酸位は、例えば、（ｉ）疎水性アミノ酸残基、（ｉｉ）親水性アミノ酸残基、（ｉｉｉ）水素結合形成可能アミノ酸残基、または（ｉｖ）βシートを形成する傾向を有するアミノ酸残基によって占められていてもよい。すなわち、方法の工程ｃ）において、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位を：（ｉ）疎水性アミノ酸残基、（ｉｉ）親水性アミノ酸残基、（ｉｉｉ）水素結合形成可能アミノ酸残基、または（ｉｖ）βシートを形成する傾向を有するアミノ酸残基で保存する。
【００２０】
したがって、操作されたｓｃＦｖを生成するため、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位が疎水性アミノ酸残基で保存されている場合、ｓｃＦｖ内の突然変異のために同定されたアミノ酸位を、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位で最も頻繁な疎水性アミノ酸残基で置換してもよい。さらにまたはあるいは、ｓｃＦｖ内で突然変異のために同定されたアミノ酸位を、ｓｃＦｖ内のその位で最適にフィットするとして選択された疎水性アミノ酸残基（例えば分子モデリング研究に基づいて、ｓｃＦｖの構造および機能を維持する可能性が最も高い疎水性残基）で置換してもよい。さらにまたはあるいは、ｓｃＦｖ内で突然変異のために同定されたアミノ酸位を、部位特異的突然変異誘発を介して、一団の疎水性アミノ酸残基で置換して、操作されたｓｃＦｖのライブラリーを生成してもよく、そして所望の機能特性に関してライブラリーをスクリーニングすることによって（例えば酵母ＱＣ系において）、最も好ましい置換（単数または複数）を選択してもよい。
【００２１】
さらに、操作されたｓｃＦｖを生成するため、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位が親水性アミノ酸残基で保存されている場合、ｓｃＦｖ内の突然変異のために同定されたアミノ酸位を、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位で最も頻繁な親水性アミノ酸残基で置換してもよい。さらにまたはあるいは、ｓｃＦｖ内で突然変異のために同定されたアミノ酸位を、ｓｃＦｖ内のその位で最適にフィットするとして選択された親水性アミノ酸残基（例えば分子モデリング研究に基づいて、ｓｃＦｖの構造および機能を維持する可能性が最も高い親水性残基）で置換してもよい。さらにまたはあるいは、ｓｃＦｖ内で突然変異のために同定されたアミノ酸位を、部位特異的突然変異誘発を介して、一団の親水性アミノ酸残基で置換して、操作されたｓｃＦｖのライブラリーを生成してもよく、そして所望の機能特性に関してライブラリーをスクリーニングすることによって（例えば酵母ＱＣ系において）、最も好ましい置換（単数または複数）を選択してもよい。
【００２２】
さらに、操作されたｓｃＦｖを生成するため、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位が水素結合形成可能アミノ酸残基で保存されている場合、ｓｃＦｖ内の突然変異のために同定されたアミノ酸位を、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位で最も頻繁な水素結合形成可能アミノ酸残基で置換してもよい。さらにまたはあるいは、ｓｃＦｖ内で突然変異のために同定されたアミノ酸位を、ｓｃＦｖ内のその位で最適にフィットするとして選択された水素結合形成可能アミノ酸残基（例えば分子モデリング研究に基づいて、ｓｃＦｖの構造および機能を維持する可能性が最も高い残基）で置換してもよい。さらにまたはあるいは、ｓｃＦｖ内で突然変異のために同定されたアミノ酸位を、部位特異的突然変異誘発を介して、一団の水素結合形成可能アミノ酸残基で置換して、操作されたｓｃＦｖのライブラリーを生成してもよく、そして所望の機能特性に関してライブラリーをスクリーニングすることによって（例えば酵母ＱＣ系において）、最も好ましい置換（単数または複数）を選択してもよい。
【００２３】
さらに、操作されたｓｃＦｖを生成するため、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位がβシートを形成する傾向を有するアミノ酸残基で保存されている場合、ｓｃＦｖ内の突然変異のために同定されたアミノ酸位を、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位で最も頻繁なβシートを形成する傾向を有するアミノ酸残基で置換してもよい。さらにまたはあるいは、ｓｃＦｖ内で突然変異のために同定されたアミノ酸位を、ｓｃＦｖ内のその位で最適にフィットするとして選択されたβシートを形成する傾向を有するアミノ酸残基（例えば分子モデリング研究に基づいて、ｓｃＦｖの構造および機能を維持する可能性が最も高い残基）で置換してもよい。さらにまたはあるいは、ｓｃＦｖ内で突然変異のために同定されたアミノ酸位を、部位特異的突然変異誘発を介して、βシートを形成する傾向を有する一団のアミノ酸残基で置換して、操作されたｓｃＦｖのライブラリーを生成してもよく、そして所望の機能特性に関してライブラリーをスクリーニングすることによって（例えば酵母ＱＣ系において）、最も好ましい置換（単数または複数）を選択してもよい。
【００２４】
別の態様において、ｓｃＦｖ抗体ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列に高い類似性を有する抗体ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列のみがデータベース中に含まれる、制約データベースであるデータベースを用いて、ｓｃＦｖにおいて、突然変異のためのアミノ酸位を同定するための本発明の方法を実行してもよい。
【００２５】
好ましい態様において、分析しているアミノ酸位（すなわちデータベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の「対応する位」）の保存を定量化するため、アミノ酸位に、シンプソン指数を用いて保存の度合いを割り当てる。
【００２６】
また、本発明の方法を用いて、共変異（ｃｏｖａｒｉａｎｔ）対位の一方または両方が、突然変異のために同定可能であるように、ｓｃＦｖ配列内のアミノ酸位の対を調べて、互いに共変異するアミノ酸位を同定することも可能である。したがって、別の態様において、本発明は：
ａ）データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列に対して共変異分析を実行して、アミノ酸位の共変異対を同定し；
ｂ）アミノ酸位の共変異対を、ｓｃＦｖ  ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位と比較し；
ｃ）ｓｃＦｖ  ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位が、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内のアミノ酸位の共変異対で保存されているアミノ酸残基によって占められているかどうかを決定し；そして
ｄ）ｓｃＦｖ内の対応する位の一方または両方が、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内のアミノ酸位の共変異対で保存されていないアミノ酸残基によって占められている場合、ｓｃＦｖ  ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位の一方または両方を、突然変異のためのアミノ酸位として同定する
工程を含む、前記方法を提供する。
【００２７】
また、工程ａ）〜ｄ）を含む上述の方法が：
ｅ）データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列に対して共変異分析を実行して、アミノ酸位の共変異対を同定し；
ｆ）アミノ酸位の共変異対を、ｓｃＦｖ  ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位と比較し；
ｇ）ｓｃＦｖ  ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位が、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内のアミノ酸位の共変異対で保存されているアミノ酸残基によって占められているかどうかを決定し；そして
ｈ）ｓｃＦｖ内の対応する位の一方または両方が、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内のアミノ酸位の共変異対で保存されていないアミノ酸残基によって占められている場合、ｓｃＦｖ  ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位の一方または両方を、突然変異のためのアミノ酸位として同定する
工程をさらに含むように、個々のアミノ酸位の分析と、この共変異分析を組み合わせてもよい。
【００２８】
共変異分析法を単一の共変異対に適用してもよいし、あるいはデータベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内で、アミノ酸位の多数の共変異対を同定して、そしてｓｃＦｖ  ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位に比較してもよい。
【００２９】
該方法は、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内のアミノ酸位の共変異対で保存されていないアミノ酸残基によって占められているｓｃＦｖ内の対応する位の一方または両方を突然変異させる工程をさらに含んでもよい。例えば、１つの態様において、アミノ酸位の共変異対で保存されていないアミノ酸残基によって占められているｓｃＦｖ内の対応する位の一方を、共変異対アミノ酸位で最も頻繁であるアミノ酸残基で置換する。別の態様において、アミノ酸位の共変異対で保存されていないアミノ酸残基によって占められているｓｃＦｖ内の対応する位の両方を、共変異対アミノ酸位で最も頻繁であるアミノ酸残基で置換する。
【００３０】
ｓｃＦｖ配列内の突然変異のためのアミノ酸位を同定するための、配列に基づく本発明の方法を、ｓｃＦｖの構造分析を可能にする他の方法と組み合わせてもよい。例えば、１つの態様において、配列に基づく方法を分子モデリング法と組み合わせて、ｓｃＦｖの構造をさらに分析してもよい。したがって、１つの態様において、工程ａ）〜ｄ）を含む上述の方法は、例えば：
ｅ）ｓｃＦｖ  ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を分子モデリングに供し；そして
ｆ）ｓｃＦｖ  ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列内の少なくとも１つのさらなるアミノ酸位を突然変異のために同定する
工程をさらに含んでもよい。この方法は、分子モデリングによって、突然変異のために同定されたｓｃＦｖ  ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列内の少なくとも１つのさらなるアミノ酸位を突然変異させる工程をさらに含んでもよい。
【００３１】
別の側面において、本発明は、突然変異のために同定された１以上のアミノ酸位で１以上の突然変異を行う本発明の方法にしたがって調製したｓｃＦｖ組成物に関する。典型的には、ｓｃＦｖ組成物および薬学的に許容されうるキャリアーを含む、薬学的配合物もまた提供する。
【００３２】
さらに別の側面において、本発明は、ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を有する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）において突然変異のための１以上のフレームワークアミノ酸位を同定する方法であって：
ａ）ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列の第一のデータベースを提供し；
ｂ）少なくとも１つの所望の機能特性を有するとして選択されたｓｃＦｖ抗体ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列の第二のデータベースを提供し；
ｃ）第一のデータベースの各フレームワーク位および第二のデータベースの各フレームワーク位でアミノ酸変動性を決定し；
ｄ）第一のデータベースおよび第二のデータベース間で、アミノ酸変動性の度合いが異なる、１以上のフレームワーク位を同定して、それによって一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）における突然変異のための１以上のフレームワークアミノ酸位を同定する
工程を含む、前記方法を提供する。
【００３３】
好ましくは、シンプソン指数を用いて保存の度合いを割り当てることによって、各フレームワーク位でのアミノ酸変動性を決定する。１つの態様において、第一のデータベースに比較した際、第二のデータベースにおいて、より低いシンプソン指数（ＳＩ）値を有する１以上のフレームワークアミノ酸位に基づいて、突然変異のための１以上のフレームワークアミノ酸位を同定する。別の態様において、第一のデータベース（例えば生殖系列データベース）に比較した際、第二のデータベースにおいて、より高いシンプソン指数値を有する１以上のフレームワークアミノ酸位に基づいて、突然変異のための１以上のフレームワークアミノ酸位を同定する。１つの好ましい態様において、第二のデータベース（例えばＱＣデータベース）のアミノ酸位は、第一のデータベース（例えばＫａｂａｔデータベース）中の対応するアミノ酸位のＳＩ値より、少なくとも０．０１少ない、そしてより好ましくは０．０５（例えば０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、または０．１）少ない。より好ましい態様において、第二のデータベースのアミノ酸位は、第一のデータベース中の対応するアミノ酸位のＳＩ値より、少なくとも０．１少ない（例えば０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、または０．５少ない）。
【００３４】
別の側面において、本発明は、免疫結合剤において、置換のための好ましいアミノ酸残基を同定する方法であって：
ａ）グループ化されたＶＨまたはＶＬアミノ酸配列（例えば、Ｋａｂａｔファミリーサブタイプにしたがってグループ化された生殖系列および／または成熟抗体配列）の第一のデータベースを提供し；
ｂ）少なくとも１つの所望の機能特性を有するとして選択された（例えばＱＣアッセイにしたがって）、グループ化されたｓｃＦｖ抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列の第二のデータベースを提供し；
ｃ）第一のデータベースのフレームワーク位および第二のデータベースの対応するフレームワーク位のアミノ酸残基に関してアミノ酸頻度を決定し；
ｄ）アミノ酸残基が、第一のデータベースに比較して、第二のデータベースにおいてより高い頻度で存在する場合（すなわち濃縮残基）、免疫結合剤の対応するアミノ酸位で、置換のための好ましいアミノ酸残基として、アミノ酸残基を同定する
工程を含む、前記方法を提供する。
【００３５】
特定の態様において、工程（ｄ）において、第一および第二のデータベース間のアミノ酸残基の相対頻度の比（本明細書において、「濃縮係数」）が、少なくとも１（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）である場合、アミノ酸残基が同定される。好ましい態様において、濃縮係数は、約１．０より大きい（例えば１．０、１．１、１．２、１．３、１．４または１．５）。さらに別の好ましい態様において、濃縮係数は、約４．０〜約６．０である（例えば、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９または６．０）。別の態様において、濃縮係数は、約６．０〜約８．０である（例えば、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９または８．０）。
【００３６】
さらに別の側面において、本発明は、免疫結合剤から排除すべきアミノ酸残基を同定する方法であって：
ａ）グループ化されたＶＨまたはＶＬアミノ酸配列（例えば、Ｋａｂａｔファミリーサブタイプにしたがってグループ化された生殖系列および／または成熟抗体配列）の第一のデータベースを提供し；
ｂ）少なくとも１つの所望の機能特性を有するとして選択された（例えばＱＣアッセイにしたがって）、グループ化されたｓｃＦｖ抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列の第二のデータベースを提供し；
ｃ）第一のデータベースのフレームワーク位および第二のデータベースの対応するフレームワーク位のアミノ酸残基に関してアミノ酸頻度を決定し；
ｄ）アミノ酸残基が、第一のデータベースに比較して、第二のデータベースにおいてより低い頻度で存在する場合、免疫結合剤の対応するアミノ酸位で、置換のための好ましくないアミノ酸残基として、アミノ酸残基を同定する、ここで前記アミノ酸残基タイプは好ましくないアミノ酸残基（すなわち排除される残基）である
工程を含む、前記方法を提供する。特定の好ましい態様において、濃縮係数（ＥＦ）が１未満である場合、好ましくないアミノ酸残基が同定される。
【００３７】
特定の態様において、第一のデータベースは、生殖系列ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を含む。他の態様において、第一のデータベースは、生殖系列ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列からなる。さらに別の態様において、第一のデータベースは、成熟ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を含む。別の態様において、第一のデータベースは、成熟ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列からなる。例となる態様において、成熟ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列は、Ｋａｂａｔデータベース（ＫＤＢ）由来である。
【００３８】
特定の態様において、第二のデータベースは、ＱＣアッセイから選択されたｓｃＦｖ抗体ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を含む。別の態様において、第二のデータベースは、ＱＣアッセイから選択されたｓｃＦｖ抗体ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列からなる。
【００３９】
１つの態様において、所望の機能特性は安定性改善である。別の態様において、所望の機能特性は溶解性改善である。さらに別の態様において、所望の機能特性は非凝集である。さらに別の態様において、所望の機能特性は発現改善である（例えば原核細胞における）。特定の態様において、所望の機能特性は、抗原結合アフィニティーの改善ではない。
【００４０】
さらに別の側面において、本発明は、免疫結合剤を操作する方法であって：
ａ）免疫結合剤内で、突然変異のための１以上のアミノ酸位を選択し；そして
ｂ）突然変異のために選択された１以上のアミノ酸位を突然変異させる、ここで、突然変異のために選択される１以上のアミノ酸位は：
（ｉ）ＡＨｏ番号付けを用いたＶＨ３のアミノ酸位１、６、７、８９および１０３（Ｋａｂａｔ番号付けを用いたアミノ酸位１、６、７、７８および８９）；
（ｉｉ）ＡＨｏ番号付けを用いたＶＨ１ａのアミノ酸位１、６、１２、１３、１４、１９、２１、９０、９２、９５および９８（Ｋａｂａｔ番号付けを用いたアミノ酸位１、６、１１、１２、１３、１８、２０、７９、８１、８２ｂおよび８４）；
（ｉｉｉ）ＡＨｏ番号付けを用いたＶＨ１ｂのアミノ酸位１、１０、１２、１３、１４、２０、２１、４５、４７、５０、５５、７７、７８、８２、８６、８７および１０７（Ｋａｂａｔ番号付けを用いたアミノ酸位１、９、１１、１２、１３、１９、２０、３８、４０、４３、４８、６６、６７、７１、７５、７６および９３）；
（ｉｖ）ＡＨｏ番号付けを用いたＶκ１のアミノ酸位１、３、４、２４、４７、５０、５７、９１および１０３（Ｋａｂａｔ番号付けを用いたアミノ酸位１、３、４、２４、３９、４２、４９、７３および８５）；
（ｖ）ＡＨｏ番号付けを用いたＶκ３のアミノ酸位２、３、１０、１２、１８、２０、５６、７４、９４、１０１および１０３（Ｋａｂａｔ番号付けを用いたアミノ酸位２、３、１０、１２、１８、２０、４８、５８、７６、８３および８５）；ならびに
（ｖｉ）ＡＨｏ番号付けを用いたＶλ１のアミノ酸位１、２、４、７、１１、１４、４６、５３、８２、９２および１０３（Ｋａｂａｔ番号付けを用いたアミノ酸位１、２、４、７、１１、１４、３８、４５、６６、７４および８５）
からなる群より選択される
工程を含む、前記方法を提供する。
【００４１】
特定の好ましい態様において、突然変異のために選択された１以上のアミノ酸位を、少なくとも１つの所望の機能特性を有するとして選択された（例えば酵母ＱＣ系において）抗体配列における対応するアミノ酸位で見られるアミノ酸残基に突然変異させる。さらに他の態様において、突然変異のために選択された１以上のアミノ酸位を、本発明の濃縮／排除分析方法論にしたがって同定されるアミノ酸残基（例えば「濃縮アミノ酸残基」）に突然変異させる。
【００４２】
好ましくは、免疫結合剤はｓｃＦｖであるが、他の免疫結合剤、例えば全長免疫グロブリンおよび他の抗体断片（例えばＦａｂまたはＤａｂ）もまた、方法にしたがって操作してもよい。本発明はまた、操作法にしたがって調製された免疫結合剤、ならびに該免疫結合剤および薬学的に許容されうるキャリアーを含む組成物も含む。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、本発明の方法にしたがって、ｓｃＦｖの一般的な配列に基づく分析を要約するフローチャート図である。
【図２】図２は、ｓｃＦｖの配列に基づく分析のための例示的な多工程法のフローチャート図である。
【図３】図３は、酵母において、安定でそして溶解性のｓｃＦｖの選択のための例示的な品質管理（ＱＣ）系の概略図である。この系内で、還元環境において、その発現が、安定でそして溶解性のｓｃＦｖ−ＡＤ−Ｇａｌ  １１ｐ融合タンパク質の存在に依存する、誘導性レポーター構築物の存在によって、安定でそして溶解性のｓｃＦｖを発現可能な宿主細胞を選択する。Ｇａｌ４（１−１００）と融合タンパク質の相互作用は、機能する転写因子を形成し、該因子が、選択可能マーカーの発現を活性化する（図３Ａを参照されたい）。不安定でそして／または不溶性のｓｃＦｖは、機能する転写因子を形成し、そして選択可能マーカーの発現を誘導することができず、そしてしたがって、選択から排除される（図３Ｂ）。
【図４】図４は、別の例示的な品質管理（ＱＣ）系の概略図である。溶解性でそして安定なｓｃＦｖを選択するための全体の概念は、図３に関して記載するのと同じであるが、このバージョンでは、ｓｃＦｖを、活性化ドメイン（ＡＤ）およびＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を含む、機能する転写因子に直接融合させる。図４Ａは、機能する転写因子に融合させた場合、選択可能マーカーの転写を誘発可能な、例示的な溶解性でそして安定なｓｃＦｖを示す。対照的に、図４Ｂは、転写因子に融合された場合であってさえ、不安定なｓｃＦｖが、選択可能マーカーの転写が活性化されるのを妨害するシナリオを示す。
【図５】図５は、体細胞突然変異前の天然生殖系列配列内の特定のフレームワーク（ＦＷ）残基での（図５Ａ）、そしてＱＣ系において選択された体細胞突然変異後の成熟抗体配列内の対応するＦＷ残基での（図５Ｂ）、変動性の分析の概略図である。異なる変動性値を、生殖系列およびＱＣ配列（すなわち、それぞれ「Ｇ」および「Ｑ」値）内のそれぞれのＦＷ位（例えば超可変フレームワーク残基（「ｈｖＦＲ」））に割り当ててもよい。特定の位に関してＧ＞Ｑならば、その位では、制限された数の適切な安定ＦＷ残基がある。特定の位に関してＧ＜Ｑならば、これは、最適な溶解性および安定性に関して、その位が天然に選択されていることを示しうる。
【図６】図６は、２５〜９５℃の温度範囲での熱誘導性ストレス後、ＥＳＢＡ１０５変異体に関して観察される変性プロフィールを示す。生殖系列コンセンサス残基への逆突然変異を有するＥＳＢＡ−１０５変異体（Ｖ３Ｑ、Ｒ４７Ｋ、またはＶ１０３Ｔ）を点線によって示す。本発明の方法によって同定される好ましい置換を含む変異体（ＱＣ１１．２、ＱＣ１５．２、およびＱＣ２３．２）を実線によって示す。
【図７】図７は、コンセンサス逆突然変異（Ｓ−２、Ｄ−２、Ｄ−３）、アラニンへの逆突然変異（Ｄ−１）またはＱＣ残基への逆突然変異（ＱＣ７．１、ＱＣ１１．２、ＱＣ１５．２、ＱＣ２３．２）のいずれかを含むＥＳＢＡ１０５変異体セットに関する熱安定性の比較を示す。選択されるフレームワーク位でのフレームワーク残基の同一性を図７Ａに提供する。親ＥＳＢＡ１０５抗体と異なる残基を太字斜体で示す。アミノ酸位をＫａｂａｔ番号付けで提供する。各変異体の熱安定性（恣意的アンフォールディング単位）を図７Ｂに提供する。
【図８】図８は、２５〜９５℃の温度範囲での熱誘導性ストレス後、ＥＳＢＡ２１２変異体に関して観察される変性プロフィールを示す。生殖系列コンセンサス残基への逆突然変異を有するＥＳＢＡ−２１２変異体（Ｖ３ＱまたはＲ４７Ｋ）を点線によって示す。親ＥＳＢＡ２１２分子を実線によって示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明は、配列に基づく免疫結合剤特性（特にｓｃＦｖ特性）の操作および最適化のための方法に関し、前記特性としては、限定されるわけではないが、安定性、溶解性およびアフィニティーが挙げられる。より具体的には、本発明は、ｓｃＦｖ抗体を最適化するための方法であって、抗体配列分析を用いて突然変異させるべきｓｃＦｖ内のアミノ酸位を同定し、それによってｓｃＦｖの１以上の物理的特性を改善する方法を開示する。本発明はまた、本発明の方法にしたがって産生される、操作された免疫結合剤、例えばｓｃＦｖにも関する。
【００４５】
本発明は、少なくとも部分的に、抗体配列の多数のデータベースにおいて、各重鎖および軽鎖フレームワーク位でのアミノ酸頻度の分析に基づく。特に、生殖系列および／または成熟抗体データベースの頻度分析は、所望の機能特性を有するとして選択されたｓｃＦｖ配列のデータベースの頻度分析に比較されている。各フレームワーク位に変動性の度合いを割り当てることによって（例えばシンプソン指数を用いる）、そして異なるタイプの抗体配列データベース内で各フレームワーク位の変動性の度合いを比較することによって、ここで、ｓｃＦｖの機能特性（例えば安定性、溶解性）に対して重要なフレームワーク位を同定することが可能となっている。これは、ここで、生殖系列および／または成熟抗体免疫グロブリン配列中の対応する位よりも、変動により耐えるかまたはより耐えないフレームワーク位が同定されているフレームワークアミノ酸位に対して、「機能コンセンサス」を定義することを可能にする。したがって、本発明は、機能的に選択されたｓｃＦｖ配列のデータベースの使用に基づく「機能コンセンサス」アプローチの利点を提供し、そして立証する。さらに、本発明は、本明細書に記載する「機能コンセンサス」アプローチを用いて同定された特定のフレームワークアミノ酸位を突然変異させることによって、免疫結合剤（例えばｓｃＦｖ）を操作する方法を提供する。
【００４６】
本発明をより容易に理解可能であるように、特定の用語をまず定義する。別に定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する業の一般の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと類似かまたは同等の方法および材料を、本発明の実施または試験で使用可能であるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及するすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が本明細書に援用される。矛盾の場合は、定義を含めて本明細書が統制するであろう。さらに、材料、方法、および例は例示のみであり、そして限定を意図されない。
【００４７】
用語「抗体」は、本明細書において、「免疫グロブリン」と同義語である。本発明記載の抗体は、全免疫グロブリン、あるいは単一可変ドメイン、Ｆｖ（Ｓｋｅｒｒａ  Ａ．およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，  Ａ．（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−４１）、ｓｃＦｖ（Ｂｉｒｄ，  Ｒ．Ｅ．ら（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−２６；  Ｈｕｓｔｏｎ，  Ｊ．Ｓ．ら（１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−８３）、Ｆａｂ、（Ｆａｂ'）２または当業者に周知の他の断片などの免疫グロブリンの少なくとも１つの可変ドメインを含む、その断片であってもよい。
【００４８】
用語「抗体フレームワーク」は、本明細書において、可変ドメインの抗原結合ループのための骨格として働く、ＶＬまたはＶＨいずれかのこの可変ドメインの部分を指す（Ｋａｂａｔ，  Ｅ．Ａ．ら（１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２）。
【００４９】
用語「抗体ＣＤＲ」は、本明細書において、Ｋａｂａｔ，  Ｅ．Ａ．ら（１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２によって定義されるような抗原結合ループからなる抗体の相補性決定領域を指す。抗体Ｆｖ断片の２つの可変ドメインは各々、例えば３つのＣＤＲを含有する。
【００５０】
用語「一本鎖抗体」または「ｓｃＦｖ」は、リンカーによって連結された抗体重鎖可変領域（ＶＨ）および抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む分子を指すよう意図される。こうしたｓｃＦｖ分子は、一般構造：ＮＨ２−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＯＯＨまたはＮＨ２−ＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＣＯＯＨを有してもよい。
【００５１】
本明細書において、「同一性」は、２つのポリペプチド、分子間、または２つの核酸間の配列マッチングを指す。２つの比較配列の両方における位が、同じ塩基またはアミノ酸単量体サブユニットによって占められている場合（例えば、２つのＤＮＡ分子の各々における位がアデニンによって占められるか、または２つのポリペプチドの各々における位がリジンによって占められる場合）、それぞれの分子はその位で同一である。２つの配列間の「同一性パーセント」は、２つの配列によって共有されるマッチング位の数の関数であり、これを比較する位の数で割って１００を掛けたものである。例えば、２つの配列における位の１０のうち６がマッチしている場合、２つの配列は６０％同一性を有する。例えば、ＤＮＡ配列ＣＴＧＡＣＴおよびＣＡＧＧＴＴは５０％同一性を共有する（総数６位のうち３位がマッチする）。一般的に、最大同一性が生じるように２つの配列を並列させた際に比較を行う。こうした並列は、例えばＡｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，  Ｉｎｃ．）などのコンピュータプログラムによって好適に実行される、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３−４５３の方法を用いて提供可能である。
【００５２】
「類似の」配列は、並列させた場合、同一および類似のアミノ酸残基を共有するものであり、ここで、類似の残基は、並列させた参照配列中の対応するアミノ酸残基に関する保存的置換物である。これに関連して、参照配列における残基の「保存的置換」は、対応する参照残基に物理的または機能的に類似の残基、例えば類似のサイズ、形状、電荷、共有結合または水素結合を形成する能力を含めた化学的特性等を有するものによって置換される。したがって、「保存的置換で修飾された」配列は、１以上の保存的置換が存在する点で、参照配列または野生型配列とは異なるものである。２つの配列間の「類似性パーセント」は、２つの配列によって共有されるマッチング残基または保存的置換を含有する位の数の関数であり、これを、比較する位の数で割って１００を掛けたものである。例えば、２つの配列における位の１０のうち６がマッチし、そして１０位のうち２つが保存的置換を含有する場合、２つの配列は８０％の正の類似性を有する。
【００５３】
本明細書において、「アミノ酸コンセンサス配列」は、少なくとも２つ、そして好ましくはそれより多い、並列されたアミノ酸配列のマトリックスを用いて、そして各位で最も頻繁なアミノ酸残基を決定可能であるように、並列中のギャップを可能にして生成可能なアミノ酸配列を指す。コンセンサス配列は、各位で最も頻繁に提示されるアミノ酸を含む配列である。２以上のアミノ酸が単一の位で同等に提示される場合、コンセンサス配列には、アミノ酸の両方またはすべてが含まれる。
【００５４】
タンパク質のアミノ酸配列を多様なレベルで分析してもよい。例えば、保存または変動性は、単一残基レベル、多数の残基レベル、ギャップを含む多数の残基等で示されうる。残基は、同一残基の保存を示しうるし、またはクラスレベルで保存されうる。アミノ酸クラスの例には、極性であるが非荷電のＲ基（セリン、スレオニン、アスパラギンおよびグルタミン）；陽性荷電Ｒ基（リジン、アルギニン、およびヒスチジン）；陰性荷電Ｒ基（グルタミン酸およびアスパラギン酸）；疎水性Ｒ基（アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリンおよびチロシン）；および特別なアミノ酸（システイン、グリシンおよびプロリン）が含まれる。他のクラスが当業者に知られ、そして構造決定、または置換可能性を評価する他のデータを用いて、定義可能である。この意味では、置換可能アミノ酸は、その位で置換され、そして機能的保存を維持することも可能ないかなるアミノ酸も指しうる。
【００５５】
本明細書において、１つのアミノ酸配列（例えば第一のＶＨまたはＶＬ配列）を１以上のさらなるアミノ酸配列（例えばデータベース中の１以上のＶＨまたはＶＬ配列）と並列させると、１つの配列（例えば第一のＶＨまたはＶＬ配列）におけるアミノ酸位を、１以上のさらなるアミノ酸配列における「対応する位」に比較可能である。本明細書において、「対応する位」は、配列を最適に並列させた際の、すなわち最高の同一性パーセントまたは類似性パーセントを達成するように配列を並列させた際の、比較中の配列（単数または複数）における同等の位に相当する。
【００５６】
本明細書において、用語「抗体データベース」は、２以上の抗体アミノ酸配列コレクション（「多数の」配列）を指し、そして典型的には、何十、何百またはさらに何千もの抗体アミノ酸配列のコレクションを指す。抗体データベースは、例えば、抗体ＶＨ領域、抗体ＶＬ領域または両方のコレクションのアミノ酸配列を保存してもよく、あるいはＶＨおよびＶＬ領域で構成されるｓｃＦｖ配列のコレクションを保存してもよい。好ましくは、データベースは、検索可能な固定媒体中に、例えばコンピュータ上の検索可能コンピュータプログラム内に保存される。１つの態様において、抗体データベースは、生殖系列抗体配列を含むかまたは該配列からなるデータベースである。別の態様において、抗体データベースは、成熟（すなわち発現された）抗体配列（例えば成熟抗体配列のＫａｂａｔデータベース、例えばＫＢＤデータベース）を含むかまたは該配列からなるデータベースである。さらに別の態様において、抗体データベースは、機能的に選択された配列（例えばＱＣアッセイから選択された配列）を含むかまたは該配列からなる。
【００５７】
用語「免疫結合剤」は、免疫結合剤がターゲット抗原を特異的に認識するように、抗体の抗原結合部位のすべてまたは一部、例えば重鎖および／または軽鎖可変ドメインのすべてまたは一部を含有する分子を指す。免疫結合剤の限定されない例には、全長免疫グロブリン分子およびｓｃＦｖ、ならびに抗体断片が含まれ、限定されるわけではないが、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）ヒンジ領域の一部を含む、本質的にはＦａｂ断片であるＦａｂ’断片（ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｐａｕｌ監修，  ３．ｓｕｐ．ｒｄ  ｅｄ．  １９９３を参照されたい）；（ｉｖ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら（１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；および（ｖｉｉ）ナノボディ、単一の可変ドメインおよび２つの定常ドメインを含有する重鎖可変領域が含まれる。
【００５８】
本明細書において、用語「機能特性」は、例えばポリペプチドの製造特性または療法的効能を改善するため、当業者にとって（例えば慣用的ポリペプチドに比較して）改善が望ましくそして／または好適であるポリペプチド（例えば免疫結合剤）の特性である。１つの態様において、機能特性は、安定性（例えば熱安定性）改善である。さらに別の態様において、機能特性は、溶解性（例えば細胞条件下）改善である。別の態様において、機能特性は、非凝集である。さらに別の態様において、機能特性は、発現（例えば原核細胞における）改善である。さらに別の態様において、機能特性は、封入体精製プロセス後の再フォールディング収量の改善である。特定の態様において、機能特性は、抗原結合アフィニティーの改善ではない。
【００５９】
ｓｃＦｖの配列に基づく分析
本発明は、突然変異のために選択しようとするｓｃＦｖ配列内のアミノ酸位の同定を可能にする、ｓｃＦｖ配列を分析するための方法を提供する。突然変異のために選択されるアミノ酸位は、ｓｃＦｖの機能特性、例えば溶解性、安定性および／または抗原結合に影響を及ぼすと予測されるものであり、ここで、こうした位での突然変異は、ｓｃＦｖの性能を改善すると予測される。したがって、本発明は、ｓｃＦｖ配列内のアミノ酸位を単にランダムに突然変異させるよりも、性能を最適化するためのｓｃＦｖの操作により重点を置くことを可能にする。
【００６０】
ｓｃＦｖ配列の配列に基づく分析の特定の側面を、図１のフローチャートに模式的に図示する。この図に示すように、最適化しようとするｓｃＦｖの配列を、安定でそして溶解性であるとして選択されたｓｃＦｖ配列で構成される抗体データベースを含む、１以上の抗体データベース中の配列に比較する。これは、特にｓｃＦｖ形式で、安定性および／または溶解性に重要な残基の同定、ならびに特にｓｃＦｖ形式（例えばＶＬおよびＶＨの組み合わせ）で、それぞれのＣＤＲに独立な安定性、溶解性および／または結合の改善を示すパターンの同定を可能にしうる。ひとたび重要な残基が同定されたならば、例えばそれぞれのデータベースにおいて同定されるような最も頻繁な適切なアミノ酸によって、そして／またはランダムまたはバイアス化突然変異誘発によって、これらを置換してもよい。
【００６１】
したがって、１つの側面において、本発明は、ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を有する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）において突然変異のためのアミノ酸位を同定する方法であって：
ａ）ｓｃＦｖ  ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列が、データベースの抗体ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列と並列されるように、多数の抗体ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を含むデータベース内に、ｓｃＦｖ  ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を入力し；
ｂ）ｓｃＦｖ  ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内のアミノ酸位を、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位と比較し；
ｃ）ｓｃＦＶ  ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内のアミノ酸位が、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位で保存されているアミノ酸残基によって占められているかどうかを決定し；そして
ｄ）アミノ酸位がデータベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位で保存されていないアミノ酸残基によって占められている場合、ｓｃＦｖ  ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内のアミノ酸位を突然変異のためのアミノ酸位と同定する
工程を含む、前記方法を提供する。
【００６２】
したがって、本発明の方法において、関心対象のｓｃＦｖの配列（すなわちＶＨ、ＶＬまたは両方の配列）を、抗体データベースの配列と比較して、そして関心対象のｓｃＦｖにおけるアミノ酸位が、データベースにおける配列の対応する位で「保存されている」アミノ酸残基によって占められているかどうかを決定する。ｓｃＦｖ配列のアミノ酸位が、データベースの配列内の対応する位で「保存されて」いないアミノ酸残基によって占められている場合、ｓｃＦｖのそのアミノ酸位は、突然変異のために選択される。好ましくは、分析されるアミノ酸位は、関心対象のｓｃＦｖ内のフレームワークアミノ酸位である。さらにより好ましくは、関心対象のｓｃＦｖ内のすべてのフレームワークアミノ酸位を分析してもよい。別の態様において、関心対象のｓｃＦｖの１以上のＣＤＲ内の１以上のアミノ酸位を分析してもよい。さらに別の態様において、関心対象のｓｃＦｖ内の各アミノ酸位を分析してもよい。
【００６３】
アミノ酸残基が、抗体データベースの配列内の特定のアミノ酸位（例えばフレームワーク位）で「保存されている」かどうかを決定するため、特定の位の保存の度合いを計算してもよい。所定の位でのアミノ酸多様性を定量化可能な、当該技術分野に知られる多様な異なる方法があり、これらはすべて、本発明の方法に適用可能である。好ましくは、多様性の測定値であるシンプソンの多様性指数を用いて、保存の度合いを計算する。該指数は、各位に存在するアミノ酸の数、ならびに各アミノ酸の相対的存在量を考慮に入れる。シンプソン指数（Ｓ．Ｉ．）は、２つのランダムに選択された抗体配列が、特定の位で同じアミノ酸を含有する確率に相当する。シンプソン指数は、保存を測定する際、２つの主な要因である、豊富さおよび均等さを考慮に入れる。本明細書において、「豊富さ」は、特定の位に存在する、異なる種類のアミノ酸数の測定値である（すなわち、その位で、データベースにおいて現れる、異なるアミノ酸残基の数が、豊富さの測定値である）。本明細書において、「均等さ」は、特定の位に存在するアミノ酸各々の存在量の測定値である（すなわちアミノ酸残基がデータベースの配列内のその位に存在する頻度が、均等さの測定値である）。
【００６４】
残基の豊富さは、特定の位での保存の度合いを調べるため、そのまま測定値として使用可能であるが、特定の位に存在する各アミノ酸残基の相対頻度は考慮に入れない。残基の豊富さは、データベースの配列内の特定の位に非常にまれにしか存在しないアミノ酸残基に、同じ位で非常に頻繁に存在する残基にこの値が与えるのと同じ荷重を与える。均等さは、位の豊富さを構成する、異なるアミノ酸の相対的存在量の測定値である。シンプソン指数は豊富さおよび均等さの両方を考慮に入れ、そしてしたがって、本発明にしたがった保存の度合いを定量化するのに好ましい方式である。特に、非常に保存された位に低頻度の残基があると、潜在的に問題となると見なされ、そしてしたがって、突然変異のために選択可能である。
【００６５】
シンプソン指数の式は、Ｄ＝Σｎｉ（ｎｉ−１）／Ｎ（Ｎ−１）であり、式中、Ｎはサーベイにおける（例えばデータベースにおける）配列総数であり、そしてｎｉは分析中の位での各アミノ酸残基の頻度である。データベースにおけるアミノ酸事象（ｉ）の頻度は、データベースに存在するアミノ酸の回数（ｎｉ）である。計数ｎｉはそれ自体、相対頻度で示され、これは、これらが事象総数によって標準化されていることを意味する。最大多様性が存在する場合、Ｓ．Ｉ．値はゼロであり、そして最小多様性が存在する場合、Ｓ．Ｉ．値は１である。したがって、Ｓ．Ｉ．範囲は０〜１であり、多様性および指数値の間には、逆相関がある。
【００６６】
データベースの配列内のフレームワークアミノ酸位の分析のための、多数の工程を要約するフローチャートを、図２にさらに詳細に記載する。
したがって、上述の方法の好ましい態様において、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位に、シンプソン指数を用いて保存の度合いを割り当てる。対応する位のＳ．Ｉ．値を、その位の保存の指標として用いてもよい。
【００６７】
他の態様において、本発明において、緊密に関連する抗体配列の信頼される並列を用いて、アミノ酸の相対的存在量および決定された位の保存の度合いのマトリックスを生成する。これらのマトリックスは、抗体−抗体データベース比較で使用するために設計される。各残基の観察される頻度を計算し、そして期待される頻度（これは本質的に、各位に関する、データベース中の各残基の頻度である）と比較する。
【００６８】
記載した方法を用いた所定のｓｃＦｖ抗体の分析は、所定のｓｃＦｖ抗体における特定の位での生物学的に許容されうる突然変異および異常な残基に関する情報を提供し、そしてフレームワーク内の潜在的な弱点の予測を可能にする。Ｓ．Ｉ．値および相対頻度を基準として用いて、ルーチンを用い、アミノ酸頻度データセットに「最適に」フィットするアミノ酸置換を操作してもよい。
【００６９】
上述の配列に基づく分析を、ｓｃＦｖのＶＨ領域、ｓｃＦｖのＶＬ領域、または両方に適用してもよい。したがって、１つの態様において、ｓｃＦｖ  ＶＨアミノ酸配列をデータベース内に入力し、そしてデータベースの抗体ＶＨアミノ酸配列と並列させる。別の態様において、ｓｃＦｖ  ＶＬアミノ酸配列をデータベース内に入力し、そしてデータベースの抗体ＶＬアミノ酸配列と並列させる。さらに別の態様において、ｓｃＦｖ  ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列をデータベース内に入力し、そしてデータベースの抗体ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列と並列させる。１つの配列をデータベース中の他の配列のコレクションと並列させるためのアルゴリズムが、当該技術分野によく確立されている。配列間の最高の同一性または類似性パーセントが達成されるように、配列を並列させる。
【００７０】
本発明の方法を用いて、ｓｃＦｖ配列内の関心対象の１つのアミノ酸位を分析してもよいし、またはより好ましくは、本発明の方法を用いて、関心対象の多数のアミノ酸位を分析してもよい。したがって、上述の方法の工程ｂ）において、ｓｃＦｖ  ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の多数のアミノ酸位を、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位と比較してもよい。分析するのが好ましい位は、ｓｃＦｖのＶＨおよび／またはＶＬ配列内のフレームワーク位である（例えば各ＶＨおよびＶＬフレームワーク位を分析してもよい）。さらにまたはあるいは、ｓｃＦｖの１以上のＣＤＲ内の１以上の位を分析してもよい（しかし、ＣＤＲ内の突然変異は、フレームワーク領域内の突然変異より、抗原結合活性に影響を及ぼす可能性がより高いため、ＣＤＲ内のアミノ酸位を突然変異させることは好ましくない可能性もある）。さらに、本発明の方法は、ｓｃＦｖ  ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列内の各アミノ酸位の分析を可能にする。
【００７１】
本発明の方法において、関心対象のｓｃＦｖの配列を、１以上の多様な異なるタイプの抗体配列データベース内の配列に比較してもよい。例えば、１つの態様において、データベースの抗体ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列は、生殖系列抗体ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列である。別の態様において、データベースの抗体ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列は、再編成されたアフィニティー成熟抗体ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列である。さらに別の好ましい態様において、データベースの抗体ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列は、ｓｃＦｖ安定性またはｓｃＦｖ溶解性などの（以下にさらに論じられる）、少なくとも１つの所望の機能特性を有するとして選択されたｓｃＦｖ抗体ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列である。
【００７２】
生殖系列配列の配列並列から、または天然に存在する任意の他の抗体配列から、抗体配列情報を得て、蓄積して、そして／または生成してもよい。配列供給源には、限定されるわけではないが、以下のデータベースの１以上が含まれてもよい
・Ｋａｂａｔデータベース（．ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ；  Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｗｕ（２００１）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２９：２０５−２０６；  Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｗｕ（２０００）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２８：２１４−２１８）。２０００由来の生データは、米国においてＦＴＰによって入手可能であり、そして英国において反映されている。
・Ｋａｂａｔｍａｎは、使用者が、配列の異常な特徴に関してＫａｂａｔ配列を検索することを可能にし、そして使用者が特定の抗体配列において、ＣＤＲに関する規範的な割り当てを発見することを可能にするデータベースを含有する。
・ＡＡＡＡＡウェブサイト（ｗｗｗ．ｂｉｏｃ．ｕｎｉｚｈ．ｃｈ／ａｎｔｉｂｏｄｙ／）、抗体に関する配列情報および構造データを提供する、Ａｎｎｅｍａｒｉｅ  Ｈｏｎｅｇｇｅｒによって用意された抗体ページ。
・ＡＢＧ：抗体の３Ｄ構造のディレクトリ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｇｒｏｕｐ（ＡＢＧ）によって生成された該ディレクトリは、使用者が、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）に蓄積された抗体構造にアクセスするのを可能にする。該ディレクトリにおいて、各ＰＤＢエントリーは、元来の供給源へのハイパーリンクを有し、完全な情報が容易に回収できるようになっている。
・ＡＢＧ：マウスＶＨおよびＶＫ生殖系列セグメント部分の生殖系列遺伝子ディレクトリ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ  ｄｅ  Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ，  ＵＮＡＭ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｘｉｃｏ）のＡｎｔｉｂｏｄｙ  Ｇｒｏｕｐのウェブページの一部。
・ＩＭＧＴ（登録商標）、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム（登録商標）−Ｍａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ  Ｌｅｆｒａｎｃ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ  Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ  ＩＩ，  ＣＮＲＳ）によって１９８９に生成されたもの、ＩＭＧＴは、ヒトおよび他の脊椎動物種に関する、免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体、および免疫系の関連タンパク質に特化した統合知識供給源である。ＩＭＧＴは、配列データベース（ＩＭＧＴ／ＬＩＧＭ−ＤＢ、ヒトおよび他の脊椎動物由来のＩＧおよびＴＲの包括的データベース、完全に注釈が付けられた配列に関する翻訳、ＩＭＧＴ／ＭＨＣ−ＤＢ、ＩＭＧＴ／ＰＲＩＭＥＲ−ＤＢを含む）、ゲノムデータベース（ＩＭＧＴ／ＧＥＮＥ−ＤＢ）、構造データベース（ＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＤＢ）、ウェブ供給源（ＩＭＧＴ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）（ＩＭＧＴ、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム＠；  ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ；  Ｌｅｆｒａｎｃら（１９９９）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２７：２０９−２１２；  Ｒｕｉｚら（２０００）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２８：２１９−２２１；  Ｌｅｆｒａｎｃら（２００１）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２９：２０７−２０９；  Ｌｅｆｒａｎｃら（２００３）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１：３０７−３１０）からなる。
・Ｖ  ＢＡＳＥ−千を超える公表配列から蓄積されたすべてのヒト生殖系列可変領域配列の包括的ディレクトリ、ＧｅｎｂａｎｋおよびＥＭＢＬデータライブラリーの現在の公開におけるものを含む。
【００７３】
好ましい態様において、還元環境において、安定性および溶解性増進に関して選択されている、定義されたフレームワークを有するｓｃＦｖライブラリーから抗体配列情報を得る。より具体的には、還元環境において、安定性および溶解性が増進されたｓｃＦｖフレームワークの選択を可能にする、酵母品質管理（ＱＣ）系が記載されている（例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ  ２００１／４８０１７；米国出願第２００１／００２４８３１号およびＵＳ  ２００３／００９６３０６号；米国特許第７，２５８，９８５号および第７，２５８，９８６号を参照されたい）。この系において、ｓｃＦｖライブラリーを、特定の既知の抗原を発現し、そして抗原−ｓｃＦｖ相互作用の存在下でのみ生存可能な宿主細胞内に形質転換する。形質転換された宿主細胞を、抗原およびｓｃＦｖの発現に適しており、そして抗原−ｓｃＦｖ相互作用の存在下でのみ細胞生存を許す条件下で培養する。こうして、生存細胞で発現され、そして還元環境において安定でそして溶解性である、定義されたフレームワークを有するｓｃＦｖを単離可能である。したがって、ＱＣ系を用いて、巨大なｓｃＦｖライブラリーをスクリーニングし、それによって還元環境において、安定でそして溶解性であるフレームワークを有する好ましいｓｃＦｖを単離することも可能であり、そしてこれらの選択されたｓｃＦｖの配列をｓｃＦｖ配列データベース内に蓄積することも可能である。次いで、本発明の方法を用いて、こうしたｓｃＦｖデータベースを関心対象の他のｓｃＦｖ配列と比較する目的で用いてもよい。ＱＣ系を用いて先に選択されそして定義された、好ましいｓｃＦｖフレームワーク配列は、ＰＣＴ公報ＷＯ  ２００３／０９７６９７および米国出願第２００６００３５３２０号にさらに詳細に記載される。
【００７４】
元来のＱＣ系の変形が当該技術分野に知られる。図３に図式的に例示される１つの例示的な態様において、ｓｃＦｖライブラリーをＧａｌ４酵母転写因子の活性化ドメイン（ＡＤ）に融合させ、これを次に、いわゆるＧａｌ１１ｐタンパク質（１１ｐ）の部分に融合させる。次いで、ｓｃＦｖ−ＡＤ−Ｇａｌ１１ｐ融合構築物を、Ｇａｌ４の最初の１００アミノ酸を発現し、そしてしたがってＧａｌ４  ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ；Ｇａｌ４（１−１００））を含有する宿主細胞内に形質転換する。Ｇａｌ１１ｐは、Ｇａｌ４（１−１００）に直接結合することが知られる点突然変異である（Ｂａｒｂｅｒｉｓら，  Ｃｅｌｌ，  ８１：３５９（１９９５）を参照されたい）。ｓｃＦｖ融合タンパク質の発現に適しており、そしてｓｃＦｖ融合タンパク質がＧａｌ４（１−１００）と相互作用し、そしてそれによってＤＢＤに連結されたＡＤを含有する機能する転写因子を形成するために十分に安定でありそして溶解性である場合にのみ細胞生存を可能にする条件下で、形質転換宿主細胞を培養する（図３Ａ）。こうして、生存細胞中で発現され、そして還元環境において安定でありそして溶解性である、定義されたフレームワークを有するｓｃＦｖが単離可能である。この例示的なＱＣ系のさらなる説明が、Ａｕｆ  ｄｅｒ  Ｍａｕｒら，  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ３４：２１５−２２４（２００４）に記載される。
【００７５】
別の例示的な態様において、本発明の方法で使用するＱＣ系を図４に示す。ＱＣ系のこのバージョンにおいて、ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖライブラリーを、機能する転写因子に直接融合させて、そして選択可能マーカーを含有する酵母株において発現させる。選択可能マーカーは、機能するｓｃＦｖ−転写因子融合物の存在下でのみ活性化され、これは全体としての構築物が安定でそして溶解性である必要があることを意味する（図４Ａ）。ｓｃＦｖが不安定である場合、ｓｃＦｖは凝集体を形成し、そして次第に分解され、それによってまた、それに融合した転写因子の分解も引き起こし、したがって、もはや選択可能マーカーの発現を活性化不能であろう（図４Ｂを参照されたい）。
【００７６】
本発明の方法において、関心対象のｓｃＦｖの配列を、抗体データベース内のすべての配列と比較してもよいし、あるいはデータベース中の配列の選択された部分のみを、比較目的に用いてもよい。すなわち、データベースは、関心対象のｓｃＦｖに高い割合の類似性または同一性を有する配列のみに限定されるか、または制約されてもよい。したがって、本発明の方法の１つの態様において、データベースは、ｓｃＦｖ抗体ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列に高い類似性を有する抗体ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列のみがデータベース中に含まれる、制約データベースである。
【００７７】
ひとたび関心対象のｓｃＦｖ配列をデータベース内に入力し、そしてデータベース内の抗体配列に比較したら、配列情報を分析して、所定の位のアミノ酸の頻度および変動性に関する情報を提供し、そして潜在的に問題となるアミノ酸位、特にｓｃＦｖのフレームワーク内の潜在的に問題となるアミノ酸位を予測する。こうした情報を用いて、ｓｃＦｖの特性を改善する突然変異を設計することもまた可能である。例えば、溶媒に曝露された疎水性残基を、そうでなければこの位に頻繁に存在する親水性残基で置換することによって、抗体溶解性を改善してもよい。
【００７８】
本発明の方法において、データベースの抗体配列内の特定の位で「保存され」うる、ありうるタイプのアミノ酸残基がいくつかある。例えば、１つの特定のアミノ酸残基が、非常に高い頻度でその位で見られる可能性もあり、これは、この特定のアミノ酸残基が、その特定の位で好ましいことを示す。したがって、本発明の１つの態様において、工程ｃ）において、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位で保存されているアミノ酸残基は、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内のその位で最も頻繁なアミノ酸残基である。他の態様において、位は、特定のタイプまたはクラスのアミノ酸残基で「保存され」ていてもよい（すなわち、位は、単一の特定のアミノ酸残基のみによって優先的に占められるのではなく、各々、同じタイプまたはクラスの残基である、いくつかの異なるアミノ酸残基によって優先的に占められる）。例えば、工程ｃ）において、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位は：（ｉ）疎水性アミノ酸残基、（ｉｉ）親水性アミノ酸残基、（ｉｉｉ）水素結合形成可能アミノ酸残基、または（ｉｖ）βシートを形成する傾向を有するアミノ酸残基で保存されうる。
【００７９】
方法の工程ｄ）において、アミノ酸位が、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位で保存されていないアミノ酸残基によって占められている場合、ｓｃＦｖ  ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内のアミノ酸位を、突然変異のためのアミノ酸位と同定する。アミノ酸位を「保存されていない」アミノ酸残基によって占められているとして、そしてしたがって潜在的に問題となるとして同定するであろう、ありうるいくつかの状況がある。例えば、データベース内の対応するアミノ酸位が、疎水性残基で保存されており、そしてｓｃＦｖ中の位が親水性残基によって占められている場合、この位は、ｓｃＦｖにおいて潜在的に問題となり、そしてこの位は突然変異のために選択されうる。同様に、データベース内の対応するアミノ酸位が親水性残基で保存され、そしてｓｃＦｖ中の位が疎水性残基によって占められている場合、この位は、ｓｃＦｖにおいて潜在的に問題となり、そしてこの位は突然変異のために選択されうる。さらに他の例において、データベース内の対応するアミノ酸位が、水素結合形成可能であるか、またはβシートを形成する傾向を有するアミノ残基で保存され、そしてｓｃＦｖ中の位が水素結合形成不能であるかまたはβシートを形成する傾向を持たない残基によって占められている場合、この位は、ｓｃＦｖにおいて潜在的に問題となり、そしてこの位は突然変異のために選択されうる。
【００８０】
好ましい態様において、本発明記載の方法を単独で用いてもよいし、または組み合わせて用いて、抗体一本鎖断片の安定性および／または溶解性を改善するアミノ酸置換の組み合わせリストを生成してもよい。
【００８１】
共変異分析
本発明はまた、データベース内の抗体配列に比較した際のｓｃＦｖの配列内の共変異を分析するための方法にも関する。共変異する残基は、例えば（ｉ）フレームワーク領域（ＦＲ）中の残基およびＣＤＲ中の残基；（ｉｉ）１つのＣＤＲ中の残基および別のＣＤＲ中の残基；（ｉｉｉ）１つのＦＲ中の残基および別のＦＲ中の残基；または（ｉｖ）ＶＨ中の残基およびＶＬ中の残基であってもよい。抗体の三次構造において、互いに相互作用する残基は、好ましいアミノ酸残基が共変異対の両方の位で保存されうるように、共変異していてもよいし、そして一方の残基が改変された場合、抗体構造を維持するために、他方の残基もまた改変しなくてはならない。アミノ酸配列セットに対して共変異分析を実行するための方法が当該技術分野に知られる。例えば、Ｃｈｏｕｌｉｅｒ，  Ｌ．ら（２０００）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ４１：４７５−４８４は、ヒトおよびマウス生殖系列ＶκおよびＶＨ配列並列に共変異分析を適用する工程を記載する。
【００８２】
方法が以下の工程をさらに含むように、保存されるアミノ酸位（上述の方法における工程ａ）〜ｄ））を分析するための上述の方法と、共変異分析を組み合わせてもよい：
ｅ）データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列に対して共変異分析を実行して、アミノ酸位の共変異対を同定し；
ｆ）アミノ酸位の共変異対を、ｓｃＦｖ  ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位と比較し；
ｇ）ｓｃＦｖ  ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位が、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内のアミノ酸位の共変異対で保存されているアミノ酸残基によって占められているかどうかを決定し；そして
ｈ）ｓｃＦｖ内の対応する位の一方または両方が、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内のアミノ酸位の共変異対で保存されていないアミノ酸残基によって占められている場合、ｓｃＦｖ  ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位の一方または両方を、突然変異のためのアミノ酸位として同定する。
【００８３】
さらにまたはあるいは、本発明が以下の工程を含む方法を提供するように、共変異分析をそのまま行ってもよい：
ａ）データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列に対して共変異分析を実行して、アミノ酸位の共変異対を同定し；
ｂ）アミノ酸位の共変異対を、ｓｃＦｖ  ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位と比較し；
ｃ）ｓｃＦｖ  ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位が、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内のアミノ酸位の共変異対で保存されているアミノ酸残基によって占められているかどうかを決定し；そして
ｄ）ｓｃＦｖ内の対応する位の一方または両方が、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内のアミノ酸位の共変異対で保存されていないアミノ酸残基によって占められている場合、ｓｃＦｖ  ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位の一方または両方を、突然変異のためのアミノ酸位として同定する。
【００８４】
本発明の共変異分析法を用いて、１つの共変異対、または１より多い共変異対を分析してもよい。したがって、方法の１つの態様において、アミノ酸位の多数の共変異対をデータベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内で同定し、そしてｓｃＦｖ  ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位に比較する。
【００８５】
方法は、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内のアミノ酸位の共変異対で保存されていないアミノ酸残基によって占められるｓｃＦｖ内の対応する位の一方または両方を突然変異させる工程をさらに含んでもよい。１つの態様において、アミノ酸位の共変異対で保存されていないアミノ酸残基によって占められるｓｃＦｖ内の対応する位の一方を、共変異対アミノ酸位で最も頻繁であるアミノ酸残基で置換する。別の態様において、アミノ酸位の共変異対で保存されていないアミノ酸残基によって占められるｓｃＦｖ内の対応する位の両方を、共変異対アミノ酸位で最も頻繁であるアミノ酸残基で置換する。
【００８６】
分子モデリング
潜在的に問題となる残基に関してｓｃＦｖを分析するための本発明の配列に基づく方法を、抗体構造／機能関係を分析するための当該技術分野に知られる他の方法と組み合わせてもよい。例えば、好ましい態様において、本発明の配列に基づく分析法を、潜在的に問題となるさらなる残基を同定する分子モデリングと組み合わせる。ｓｃＦｖ構造を含めて、抗体構造をコンピュータモデリングするための方法およびソフトウェアが、当該技術分野において確立されており、そしてこれを本発明の配列に基づく方法と組み合わせてもよい。したがって、別の態様において、工程ａ）〜ｄ）に示すような、配列に基づく上述の方法は：
ｅ）ｓｃＦｖ  ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を分子モデリングに供し；そして
ｆ）ｓｃＦｖ  ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列内の少なくとも１つのさらなるアミノ酸位を突然変異のために同定する
工程をさらに含む。該方法は、分子モデリングによって、突然変異のために同定されたｓｃＦｖ  ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列内の少なくとも１つのさらなるアミノ酸位を突然変異させる工程をさらに含んでもよい。
【００８７】
「機能コンセンサス」対「慣用的コンセンサス」分析
特に好ましい態様において、１以上のフレームワーク位での変動性の度合いを、抗体配列（例えば生殖系列データベース（単数または複数）（例えばＶｂａｓｅおよび／またはＩＭＧＴ）または成熟抗体データベース（例えばＫＢＤ））の第一のデータベース、および１以上の所望の特性を有するとして選択されたｓｃＦｖの第二のデータベース、例えば酵母におけるＱＣスクリーニングによって選択されたｓｃＦｖのデータベース、すなわちＱＣデータベース間で比較する。図５に例示するように、図５において「Ｇ」値と称される変動性値（例えばシンプソン指数値）を、第一の（例えば生殖系列）データベース内のフレームワーク位に割り当ててもよく、そして図５において「Ｑ」値と称される変動性値（例えばシンプソン指数値）を、第二のデータベース（例えばＱＣデータベース）内の対応するフレームワーク位に割り当ててもよい。特定の位で、Ｇ値がＱ値よりも大きい場合（すなわち選択されたｓｃＦｖ配列におけるより、その位の生殖系列配列において、より高い変動性）、これは、その位で、制限された数の安定なｓｃＦｖフレームワークアミノ酸残基があることを示し、この安定なｓｃＦｖフレームワークアミノ酸残基は、任意のＣＤＲで使用するのに適している可能性もある。あるいは、特定の位で、Ｇ値がＱ値よりも小さい場合（すなわち生殖系列配列におけるより、その位の選択されたｓｃＦｖ配列において、より高い変動性）、これは、この特定の位が、ｓｃＦｖにおいて変動により耐え、そしてしたがってアミノ酸置換がｓｃＦｖの安定性および／または溶解性を最適にしうる位に相当する可能性もあることを示す。表１２は、いくつかのアミノ酸位の要約表、およびＧがＱより大きいかまたはＧがＱより小さいかいずれかの、超可変フレームワーク残基（ｈｖＦＲ）を示す。表１２に示すように、アミノ酸総数における変動性（Ａａ＃）および超可変フレームワーク残基における変動性（ｈｖＦＲ）は、生殖系列およびＱＣ−ＦＷ間で有意に増加している。
【００８８】
表１２．要約表
【００８９】
【表１】
0005622397.tif 000002
【００９０】
前記を考慮すると、さらに別の側面において、本発明は、ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を有する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）において突然変異のための１以上のフレームワークアミノ酸位を同定する方法であって：
ａ）ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列（例えば生殖系列および／または成熟抗体配列）の第一のデータベースを提供し；
ｂ）少なくとも１つの所望の機能特性を有するとして選択されたｓｃＦｖ抗体ＶＨ、ＶＬまたはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列の第二のデータベースを提供し；
ｃ）第一のデータベースの各フレームワーク位および第二のデータベースの各フレームワーク位でアミノ酸変動性を決定し；
ｄ）第一のデータベースおよび第二のデータベース間で、アミノ酸変動性の度合いが異なる、１以上のフレームワーク位を同定して、それによって一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）における突然変異のための１以上のフレームワークアミノ酸位を同定する
工程を含む、前記方法を提供する。
【００９１】
好ましくは、シンプソン指数を用いて保存の度合いを割り当てることによって、各フレームワーク位でアミノ酸変動性を決定する。１つの態様において、第一のデータベースに比較した際、第二の（ｓｃＦｖ）データベースにおいて、より低いシンプソン指数値を有する１以上のフレームワークアミノ酸位に基づいて、突然変異のための１以上のフレームワークアミノ酸位を同定する。別の態様において、第一のデータベースに比較した際、第二のデータベースにおいて、より高いシンプソン指数値を有する１以上のフレームワークアミノ酸位に基づいて、突然変異のための１以上のフレームワークアミノ酸位を同定する。
【００９２】
３つのヒトＶＨファミリーおよび３つのヒトＶＬファミリーに関する、変動性分析、および突然変異のための残基の同定を、以下の実施例２および３にさらに詳細に記載する。
濃縮／排除分析
別の側面において、本発明は、免疫結合剤内の関心対象のフレームワーク位で、好ましいアミノ酸残基置換を選択する（あるいは特定のアミノ酸置換を排除する）ための方法を提供する（例えば安定性および／または溶解性などの機能特性を改善するため）。本発明の方法は、抗体配列の第一のデータベース（例えば生殖系列データベース（単数または複数）、例えばＶｂａｓｅおよび／またはＩＭＧＴ、あるいはより好ましくは、成熟抗体データベース、例えばＫａｂａｔデータベース（ＫＢＤ））における関心対象のフレームワーク位でのアミノ酸残基の頻度を、１以上の所望の特性を有するとして選択されたｓｃＦｖの第二のデータベース、例えば酵母におけるＱＣスクリーニングによって選択されたｓｃＦｖのデータベース、すなわちＱＣデータベースにおける、対応するアミノ酸位でのアミノ酸残基の頻度と比較する。
【００９３】
以下の実施例４に詳細に記載するように、第一のデータベース（例えば成熟抗体配列のデータベース）由来の抗体配列（例えばＶＨまたはＶＬ配列）を、Ｋａｂａｔファミリーサブタイプ（例えばＶｈ１ｂ、ＶＨ３など）にしたがってグループ化してもよい。各配列サブタイプ（すなわちサブファミリー）内で、各アミノ酸残基（例えばＡ、Ｖなど）の頻度をそのサブタイプのすべての分析した配列の割合として決定する。第二のデータベース（すなわち１以上の所望の特性を有するとして、例えばＱＣスクリーニングによって選択されたｓｃＦｖのデータベース）のすべての配列に関して同じことを行う。各サブタイプに関して、特定の位での各アミノ酸残基タイプに関する、生じた割合（相対頻度）を、第一および第二のデータベース間で比較する。特定のアミノ酸残基の相対頻度が、第一のデータベース（例えばＫａｂａｔデータベース）に比較して、第二のデータベース（例えばＱＣデータベース）で増加している場合、これは、それぞれの残基が好ましく選択され（すなわち「濃縮残基」）、そして配列に好ましい特性を与えることを示す。逆に、アミノ酸残基の相対頻度が、第一のデータベースに比較して、第二のデータベースで減少している場合、これは、それぞれの残基が好ましくないことを示す（すなわち「排除残基」）。したがって、濃縮残基は、免疫結合剤の機能特性（例えば安定性および／または溶解性）を改善するために好ましい残基であり、一方、排除残基は、好ましくは回避される。
【００９４】
前述を考慮して、１つの態様において、本発明は、免疫結合剤において、置換のための好ましいアミノ酸残基を同定する方法であって：
ａ）グループ化されたＶＨまたはＶＬアミノ酸配列（例えば、Ｋａｂａｔファミリーサブタイプにしたがってグループ化された生殖系列および／または成熟抗体配列）の第一のデータベースを提供し；
ｂ）少なくとも１つの所望の機能特性を有するとして選択された（例えばＱＣアッセイにしたがって）、グループ化されたｓｃＦｖ抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列の第二のデータベースを提供し；
ｃ）第一のデータベースのフレームワーク位および第二のデータベースの対応するフレームワーク位のアミノ酸残基に関してアミノ酸頻度を決定し；
ｄ）アミノ酸残基が、第一のデータベースに比較して、第二のデータベースにおいてより高い頻度で存在する場合（すなわち濃縮残基）、免疫結合剤の対応するアミノ酸位で、置換のための好ましいアミノ酸残基として、アミノ酸残基を同定する
工程を含む、前記方法を提供する。
【００９５】
第二の（ｓｃＦｖ）データベース（例えばＱＣデータベース）におけるアミノ酸残基の濃縮を定量化してもよい。例えば、第二のデータベース内の残基の相対頻度（ＲＦ２）および第一のデータベース内の残基の相対頻度（ＲＦ１）間の比を決定してもよい。この比（ＲＦ２：ＲＦ１）を「濃縮因子（ＥＦ）」と名付けてもよい。したがって、特定の態様において、工程（ｄ）において、第一および第二のデータベース間のアミノ酸残基の相対頻度の比（本明細書において、「濃縮係数」）が、少なくとも１（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）である場合、アミノ酸残基が同定される。好ましい態様において、濃縮係数は、約１．０より大きい（例えば１．０、１．１、１．２、１．３、１．４または１．５）。さらに別の好ましい態様において、濃縮係数は、約４．０〜約６．０である（例えば、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９または６．０）。別の態様において、濃縮係数は、約６．０〜約８．０である（例えば、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９または８．０）。
【００９６】
別の態様において、本発明は、免疫結合剤から排除すべきアミノ酸残基を同定する方法であって：
ａ）グループ化されたＶＨまたはＶＬアミノ酸配列（例えば、Ｋａｂａｔファミリーサブタイプにしたがってグループ化された生殖系列および／または成熟抗体配列）の第一のデータベースを提供し；
ｂ）少なくとも１つの所望の機能特性を有するとして選択された（例えばＱＣアッセイにしたがって）、グループ化されたｓｃＦｖ抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列の第二のデータベースを提供し；
ｃ）第一のデータベースのフレームワーク位および第二のデータベースの対応するフレームワーク位のアミノ酸残基に関してアミノ酸頻度を決定し；
ｄ）アミノ酸残基が、第一のデータベースに比較して、第二のデータベースにおいてより低い頻度で存在する場合、免疫結合剤の対応するアミノ酸位で、置換のために好ましくないアミノ酸残基として、アミノ酸残基を同定する、ここで前記アミノ酸残基タイプは好ましくないアミノ酸残基（すなわち排除される残基）である
工程を含む、前記方法を提供する。特定の好ましい態様において、上記工程（ｄ）において、濃縮係数（ＥＦ）が１未満である場合、好ましくないアミノ酸残基が同定される。
【００９７】
ｓｃＦｖの突然変異
本発明の方法において、ｓｃＦｖ内の１以上のアミノ酸位がｓｃＦｖの機能特性に関して潜在的に問題であると同定されているならば、方法は、ｓｃＦｖ  ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内のこれらの１以上のアミノ酸位を突然変異させる工程をさらに含んでもよい。例えば、突然変異のために同定されたアミノ酸位を、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位で保存されているアミノ酸残基で置換してもよい。
【００９８】
当該技術分野でよく確立された、いくつかのありうる突然変異誘発の１つを用いて、突然変異のために同定されたアミノ酸位を突然変異させてもよい。例えば、部位特異的突然変異誘発を用いて、関心対象のアミノ酸位で特定のアミノ酸置換を作製してもよい。また、部位特異的突然変異誘発を用いて、限定されたレパートリーのアミノ酸置換が関心対象のアミノ酸位で導入されている、突然変異ｓｃＦｖセットを生成してもよい。
【００９９】
さらにまたはあるいは、突然変異のために同定されたアミノ酸位を、ランダム突然変異誘発によって、またはバイアス化突然変異誘発によって突然変異させて、突然変異ｓｃＦｖのライブラリーを生成し、その後、突然変異ｓｃＦｖライブラリーのスクリーニングおよびｓｃＦｖの選択、好ましくは少なくとも１つの改善された機能特性を有するｓｃＦｖの選択が続いてもよい。好ましい態様において、還元環境において、安定性および／または溶解性が増進したｓｃＦｖフレームワークの選択を可能にする、酵母品質管理系（ＱＣ系）（上記にさらに詳細に記載する）を用いて、ライブラリーをスクリーニングする。
【０１００】
ｓｃＦｖライブラリーをスクリーニングするための他の適切な選択技術が当該技術分野に記載されてきており、これには、限定されるわけではないが、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイおよび酵母ディスプレイなどのディスプレイ技術が含まれる（Ｊｕｎｇら（１９９９）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９４：１６３−１８０；  Ｗｕら（１９９９）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９４：１５１−１６２；  Ｓｃｈｉｅｒら（１９９６）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２５５：２８−４３）。
【０１０１】
１つの態様において、突然変異のために同定されたアミノ酸位を、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位で最も頻繁なアミノ酸残基で置換する。別の態様において、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位が、疎水性アミノ酸残基で保存され、そしてｓｃＦｖ内の突然変異のために同定されたアミノ酸位を、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位で最も頻繁な疎水性アミノ酸残基で置換する。さらに別の態様において、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位が、親水性アミノ酸残基で保存され、そしてｓｃＦｖ内の突然変異のために同定されたアミノ酸位を、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位で最も頻繁な親水性アミノ酸残基で置換する。さらに別の態様において、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位が、水素結合形成可能アミノ酸残基で保存され、そしてｓｃＦｖ内の突然変異のために同定されたアミノ酸位を、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位で最も頻繁な水素結合形成可能アミノ酸残基で置換する。さらに別の態様において、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位が、βシートを形成する傾向を有するアミノ酸残基で保存され、そしてｓｃＦｖ内の突然変異のために同定されたアミノ酸位を、データベースの抗体ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応する位で最も頻繁なβシートを形成する傾向を有するアミノ酸残基で置換する。
【０１０２】
１つの態様において、全体の自由エネルギーを最小限にする最適置換を、関心対象のアミノ酸位（単数または複数）で行うべき突然変異として選択する。ボルツマンの法則を用いて、全体の自由エネルギーを最小限にする最適置換を決定してもよい。ボルツマンの法則の公式は、ΔΔＧｔｈ＝ＲＴｌｎ（ｆ親／ｆコンセンサス）である。
【０１０３】
例えば、局所および非局所相互作用、規範的残基、界面、曝露の度合いおよびβターンの傾向を調べることによって、突然変異を潜在的に安定化させる役割をさらに決定してもよい。例えば、潜在的に安定化させる突然変異の役割をさらに調べる際に、当該技術分野に知られる分子モデリング法を適用してもよい。また、一団のありうる置換を考慮する場合、分子モデリング法を用いて、「最適フィット」アミノ酸置換を選択してもよい。
【０１０４】
特定のアミノ酸位に応じて、さらなる分析を保証してもよい。例えば、残基は、重鎖および軽鎖間の相互作用に関与してもよいし、あるいは塩橋またはＨ結合を通じて、他の残基と相互作用してもよい。これらの場合、特別の分析が必要となりうる。本発明の別の態様において、安定のために、潜在的に問題となる残基を、共変異対における対応物と適合するものに変化させてもよい。あるいは、問題となると初めに同定されたアミノ酸に適合させるため、対応残基を突然変異させてもよい。
【０１０５】
溶解性最適化
ｓｃＦｖ抗体において、溶解性に関して潜在的に問題となる残基には、ｓｃＦｖ中で溶媒に曝露され、そして天然状態では可変および定常ドメイン間の界面に包埋される疎水性アミノ酸が含まれる。定常ドメインを欠く、操作されたｓｃＦｖにおいて、可変および定常ドメイン間の相互作用に関与する疎水性残基は、溶媒に曝露される（例えば、Ｎｉｅｂａら（１９９７）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  １０：４３５−４４を参照されたい）。ｓｃＦｖの表面上のこれらの残基は、凝集を引き起こし、そしてしたがって溶解性の問題となる傾向がある。
【０１０６】
ｓｃＦｖ抗体上の溶媒に曝露される疎水性アミノ酸を置換する、いくつかの戦略が記載されてきている。当業者によく知られるように、特定の位で残基を修飾すると、安定性、溶解性、およびアフィニティーなどの抗体の生物物理学的特性に影響が及ぼされる。多くの場合、これらの特性は相互関係を有し、これは１つの単一アミノ酸の変化が、上述の特性のいくつかに影響を及ぼしうることを意味する。したがって、非保存的方式で、溶媒に曝露される疎水性残基を突然変異させると、安定性の減少および／または抗原に関するアフィニティーの喪失を引き起こしうる。
【０１０７】
他の類似のアプローチは、大部分の場合、タンパク質ディスプレイ技術および／またはスクリーニング努力を徹底的に用いることによって、溶解性の問題を解決することを意図する。しかし、こうした方法は時間を浪費し、しばしば溶解性タンパク質を得ることに失敗するか、あるいはより低い安定性または抗体アフィニティーの減少を生じる。本発明において、配列に基づく分析を用いて，溶媒に曝露される疎水性残基の、より高い親水性を持つ残基への突然変異を設計する方法を開示する。定義される位で、最も頻繁に示される親水性アミノ酸を選択することによって、潜在的に問題となる残基を置換してもよい。残基が抗体において任意の他の残基と相互作用することが見出された場合、潜在的に問題となる残基を、最も頻繁な残基ではなく、共変異対の第二のアミノ酸と適合するものに突然変異させてもよい。あるいはまた、アミノ酸の組み合わせを回復するため、共変異対の第二のアミノ酸も突然変異させてもよい。さらに、配列間の類似性パーセントを考慮に入れて、２つの相互関係アミノ酸の最適な組み合わせの発見を補助してもよい。
【０１０８】
限定されるわけではないが、溶媒曝露、実験情報および配列情報に基づくアプローチ、ならびに分子モデリングを含む、いくつかのアプローチを用いて、ｓｃＦｖ表面上の疎水性アミノ酸を同定する。
【０１０９】
本発明の１つの態様において、ｓｃＦｖ抗体表面上に曝露される疎水性残基を、データベースにおいてこれらの位に存在する最も頻繁な親水性残基で置換することによって、溶解性が改善される。この論理的根拠は、頻繁に存在する残基は問題とならない可能性が高いという事実に基づく。当業者に認識されるように、保存的置換は、通常、分子を不安定化する際に小さい影響しか持たないが、非保存的置換は、ｓｃＦｖの機能特性に有害である可能性もある。
【０１１０】
ときに、抗体表面上の疎水性残基は、重鎖および軽鎖間の相互作用に関与するか、あるいは塩橋またはＨ結合を通じて、他の残基と相互作用しうる。これらの場合、特別の分析が必要となりうる。本発明の別の態様において、安定のために潜在的に問題となる残基を、最も頻繁な残基ではなく、共変異対と適合するものに突然変異させてもよいし、または第二の突然変異を実行して共変異アミノ酸の組み合わせを回復してもよい。
【０１１１】
さらなる方法を用いて、溶媒に曝露される疎水性位で突然変異を設計してもよい。本発明の別の態様において、修飾しようとするｓｃＦｖに最高の類似性を示す配列へのデータベースの制約を使用する方法を開示する（上記にさらに論じる）。こうした制約された参照データベースを適用することによって、最適化しようとする抗体の特定の配列背景において、最適にフィットするように、突然変異を設計する。この状況において、選択される親水性残基は、実際、多数の配列（すなわち制約されないデータベース）と比較した際、それぞれの位でほとんど提示されない可能性もある。
【０１１２】
安定性最適化
一本鎖抗体断片は、軽鎖および重鎖可変ドメインを共有結合させるペプチドリンカーを含有する。こうしたリンカーは、可変ドメインが離れるのを回避するのに有効であり、そしてそれによってｓｃＦｖをＦｖ断片より優れたものにしているが、ｓｃＦｖ断片はなお、どちらもＶＨおよびＶＬが定常ドメインを介して間接的にしか連結されていないＦａｂ断片または全長抗体に比較すると、アンフォールディングおよび凝集の傾向がより高い。
【０１１３】
ｓｃＦｖの別の一般的な問題は、分子間凝集につながるｓｃＦｖ表面上の疎水性残基の曝露である。さらに、ときに、アフィニティー成熟プロセス中に獲得される体細胞突然変異が、親水性残基をβシートのコアに置く。こうした突然変異は、ＩｇＧ形式において、またはＦａｂ断片においてさえもよく許容されうるが、ｓｃＦｖにおいては、これは明らかに不安定化に、そしてその結果としてアンフォールディングに寄与する。
【０１１４】
ｓｃＦｖ不安定化に寄与することが知られる要因には：ｓｃＦｖ抗体表面上の、溶媒に曝露される疎水性残基；タンパク質コアに包埋された異常な親水性残基、ならびに重鎖および軽鎖間の疎水性界面に存在する親水性残基が含まれる。さらに、コアにおける非極性残基間のファンデルワールス充填相互作用が、タンパク質安定性において重要な役割を演じることが知られる（Ｍｏｎｓｅｌｌｉｅｒ  Ｅ．およびＢｅｄｏｕｅｌｌｅ  Ｈ．（２００６）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３６２：５８０−９３，  Ｔａｎら（１９９８）  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．  ７５：１４７３−８２；  Ｗｏｒｎ  Ａ．およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ａ．（１９９８）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：１３１２０−７）。
【０１１５】
したがって、１つの態様において、ｓｃＦｖ抗体の安定性を増加させるため、非常に保存される位の異常なそして／または好ましくないアミノ酸を同定し、そしてこれらの保存される位でより一般的なアミノ酸に突然変異させる。こうした異常なそして／または好ましくないアミノ酸には：（ｉ）ｓｃＦｖ抗体表面上の、溶媒に曝露される疎水性残基；（ｉｉ）タンパク質コアに包埋された異常な親水性残基；ならびに（ｉｉｉ）重鎖および軽鎖間の疎水性界面に存在する親水性残基が含まれる。
【０１１６】
したがって、本発明の１つの態様において、それらの位にほとんど現れないアミノ酸を、これらの位で最も頻繁に存在するアミノ酸によって置換することにより、安定性増加を達成してもよい。存在頻度は、一般的に、生物学的許容性の指標を提供する。
【０１１７】
残基は重鎖および軽鎖間の相互作用に関与してもよいし、あるいは塩橋またはＨ結合を通じて他の残基と相互作用してもよい。これらの場合、特別な分析が必要とされうる。本発明の別の態様において、安定のために潜在的に問題となる残基を、共変異対における対応物と適合するものに変化させてもよい。あるいは、問題となると初めに同定されたアミノ酸に適合させるため、対応残基を突然変異させてもよい。
【０１１８】
さらなる方法を用いて、突然変異を設計して安定性を改善してもよい。本発明の別の態様において、修飾しようとするｓｃＦｖに最高の類似性を示す配列へのデータベースの制約を使用する方法を開示する（上記にさらに論じる）。こうした制約された参照データベースを適用することによって、最適化しようとする抗体の特定の配列背景において、最適にフィットするように、突然変異を設計する。該突然変異は、データベース配列の選択されたサブセットに存在する、最も頻繁なアミノ酸を用いる。この状況において、選択される残基は、実際、多数の配列（すなわち制約されないデータベース）と比較した際、それぞれの位でほとんど提示されない可能性もある。
【０１１９】
ｓｃＦｖ組成物および配合物
本発明の別の側面は、本発明の方法にしたがって調製されるｓｃＦｖ組成物に関する。したがって、本発明は、関心対象の元来のｓｃＦｖに比較した際、１以上の突然変異がアミノ酸配列内に導入されている、操作されたｓｃＦｖ組成物を提供し、ここで突然変異（単数または複数）は、安定性または溶解性などの１以上の生物学的特性に影響を及ぼすと予測される位（単数または複数）、特に１以上のフレームワーク位に導入されている。１つの態様において、ｓｃＦｖは、１つの突然変異アミノ酸位（例えば１つのフレームワーク位）を含有するように操作されている。他の態様において、ｓｃＦｖは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０または１０より多い突然変異アミノ酸位（例えばフレームワーク位）を含有するよう操作されている。
【０１２０】
本発明の別の側面は、本発明のｓｃＦｖ組成物の薬学的配合物に関する。こうした配合物は、典型的には、ｓｃＦｖ組成物および薬学的に許容されうるキャリアーを含む。本明細書において、「薬学的に許容されうるキャリアー」には、生理学的に適合する、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等が含まれる。好ましくは、キャリアーは、例えば、静脈内、筋内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例えば注射または注入による）に適している。投与経路に応じて、ｓｃＦｖを物質でコーティングして、酸、および化合物を不活性化させうる他の天然条件の作用から、化合物を防御してもよい。
【０１２１】
本発明の薬学的化合物には、１以上の薬学的に許容されうる塩が含まれてもよい。「薬学的に許容されうる塩」は、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、そしていかなる望ましくない毒性学的効果も与えない塩を指す（例えば、Ｂｅｒｇｅ，  Ｓ．  Ｍ．ら（１９７７）  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ６６：１−１９を参照されたい）。こうした塩の例には、酸付加塩および塩基付加塩が含まれる。酸付加塩には、非毒性無機酸、例えば塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸等に由来するもの、ならびに非毒性有機酸、例えば脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸等に由来するものが含まれる。塩基付加塩には、アルカリ土類金属、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等に由来するもの、ならびに非毒性有機アミン、例えばＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカイン等に由来するものが含まれる。
【０１２２】
本発明の薬学的組成物にはまた、薬学的に許容されうる酸化防止剤も含まれてもよい。薬学的に許容されうる酸化防止剤の例には：（１）水溶性酸化防止剤、例えばアスコルビン酸、システイン塩酸、二硫酸ナトリウム、メタ二硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等；（２）脂溶性酸化防止剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロール等；および（３）金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等が含まれる。
【０１２３】
本発明の薬学的組成物で使用可能である、適切な水性および非水性キャリアーの例には、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、およびその適切な混合物、植物油、例えばオリーブ油、ならびに注射可能有機エステル、例えばオレイン酸エチルが含まれる。例えば、レシチンなどのコーティング物質を用いることによって、分散物の場合は必要な粒子サイズを維持することによって、そして界面活性剤を用いることによって、適切な流動性を維持してもよい。
【０１２４】
これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントも含有してもよい。上記滅菌法、ならびに多様な抗細菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等の包含の両方によって、微生物の存在の予防を確実にしてもよい。等張剤、例えば糖、塩化ナトリウム等を組成物内に含むことが望ましい可能性もまたある。さらに、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの、吸収を遅延させる剤を包含することによって、注射可能薬学的型の吸収延長をもたらしてもよい。
【０１２５】
薬学的に許容されうるキャリアーには、無菌水溶液または分散物、および無菌注射可能溶液または分散物のその場での調製用の無菌粉末が含まれる。薬学的活性物質のためのこうした媒体および剤の使用が当該技術分野に知られる。いかなる慣用的な媒体または剤も活性化合物と不適合である場合を除いて、本発明の薬学的組成物におけるその使用が意図される。補助的活性化合物もまた、組成物内に取り込まれてもよい。
【０１２６】
療法組成物は、典型的には、製造および保存条件下で無菌および安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い薬剤濃度に適した他の秩序だった構造として配合されてもよい。キャリアーは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、およびその適切な混合物を含有する、溶媒または分散媒体であってもよい。例えば、レシチンなどのコーティングを用いることによって、分散物の場合は必要な粒子サイズを維持することによって、そして界面活性剤を用いることによって、適切な流動性を維持してもよい。多くの場合、等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましいであろう。吸収を遅延させる剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に包含することによって、注射可能組成物の吸収延長をもたらしてもよい。
【０１２７】
必要に応じて上に列挙する成分の１つまたはその組み合わせを含めて、適切な溶媒中、必要な量で、活性化合物を取り込み、その後、滅菌精密ろ過することによって、無菌注射可能溶液を調製してもよい。一般的に、基本分散媒体および上に列挙するもの由来の必要な他の成分を含有する無菌ビヒクル内に、活性化合物を取り込むことによって、分散物を調製する。無菌注射可能溶液の調製用の無菌粉末の場合、好ましい調製法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、活性成分の粉末に加えて、先に滅菌ろ過した溶液に由来する任意のさらなる望ましい成分を生じる。
【０１２８】
キャリアー物質と組み合わせて、単回投薬型を生じることも可能な活性成分の量は、治療中の被験体および特定の投与様式に応じて多様であろう。キャリアー物質と組み合わせて単回投薬型を生じることも可能な活性成分の量は、一般的に、療法効果を生じる組成物の量であろう。一般的に、１００パーセントのうち、この量は、薬学的に許容されうるキャリアーと組み合わせて、活性成分約０．０１パーセント〜約９９パーセント、好ましくは約０．１パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは活性成分約１パーセント〜約３０パーセントの範囲であろう。
【０１２９】
投薬措置を調整して、最適な望ましい反応（例えば療法反応）を提供する。例えば、単回ボーラスを投与してもよいし、数回の分割用量を長期に渡って投与してもよいし、あるいは療法的状況の要求によって示されるように、用量を比例的に減少させるかまたは増加させてもよい。投与の容易さおよび投薬型の均一性のため、投薬単位型で、非経口組成物を配合することが特に好適である。本明細書において、投薬単位型は、治療しようとする被験体のため、単回投薬型として適した物理的に別個の単位を指し；各単位は、必要な薬学的キャリアーと会合した、所望の療法効果を生じるように計算された、あらかじめ決定された量の活性化合物を含有する。本発明の投薬単位型の明細は、（ａ）活性化合物のユニークな特性および達成しようとする特定の療法効果、ならびに（ｂ）治療のためにこうした活性化合物を化合する技術分野に固有の、個体における感度の限界に支配され、そしてこうした要因に直接依存する。
【０１３０】
「機能コンセンサス」アプローチに基づく免疫結合剤操作
実施例２および３に詳細に記載するように、フレームワーク位変動性を分析するために、改善された特性に関して選択されたｓｃＦｖ配列のデータベースを用いる、本明細書記載の「機能コンセンサス」アプローチは、生殖系列および／または成熟抗体データベース中のこれらの同じ位での変動に比較した際、変動により耐えるかまたはより耐えないかいずれかのアミノ酸位の同定を可能にする。実施例５および６に詳細に記載するように、試料ｓｃＦｖ内の特定のアミノ酸位の逆突然変異は、中立のまたは有害な効果のいずれかを有する一方、「機能コンセンサス」残基を含有するｓｃＦｖ変異体は、野生型ｓｃＦｖ分子と比較した際、熱安定性増加を示す。したがって、機能コンセンサスアプローチを通じて、本明細書に同定されたフレームワーク位は、ｓｃＦｖの機能特性を改変し、そして好ましくは改善するための、ｓｃＦｖ修飾のために好ましい位である。実施例３の表３〜８に示すように、以下のフレームワーク位は、示すＶＨまたはＶＬ配列において、修飾に好ましい位と同定されている（以下に用いる番号付けは、ＡＨｏ番号付け系であり；ＡＨｏ番号付けをＫａｂａｔ系番号付けに変換する変換表を、実施例１の表１および２に示す）：
ＶＨ３：アミノ酸位１、６、７、８９および１０３；
ＶＨ１ａ：アミノ酸位１、６、１２、１３、１４、１９、２１、９０、９２、９５および９８；
ＶＨ１ｂ：アミノ酸位１、１０、１２、１３、１４、２０、２１、４５、４７、５０、５５、７７、７８、８２、８６、８７および１０７；
Ｖκ１：アミノ酸位１、３、４、２４、４７、５０、５７、９１、および１０３；
Ｖκ３：  ２、３、１０、１２、１８、２０、５６、７４、９４、１０１および１０３；ならびに
Ｖλ１：  １、２、４、７、１１、１４、４６、５３、８２、９２および１０３。
【０１３１】
したがって、これらのアミノ酸位の１以上をｓｃＦｖ分子などの免疫結合剤における操作に関して選択して、それによって免疫結合剤の変異体（すなわち突然変異）型を産生してもよい。したがって、さらに別の側面において、本発明は、免疫結合剤を操作する方法であって：
ａ）免疫結合剤内で、突然変異のための１以上のアミノ酸位を選択し；そして
ｂ）突然変異のために選択された１以上のアミノ酸位を突然変異させる、ここで、突然変異のために選択される１以上のアミノ酸位は：
（ｉ）ＡＨｏ番号付けを用いたＶＨ３のアミノ酸位１、６、７、８９および１０３（Ｋａｂａｔ番号付けを用いたアミノ酸位１、６、７、７８および８９）；
（ｉｉ）ＡＨｏ番号付けを用いたＶＨ１ａのアミノ酸位１、６、１２、１３、１４、１９、２１、９０、９２、９５および９８（Ｋａｂａｔ番号付けを用いたアミノ酸位１、６、１１、１２、１３、１８、２０、７９、８１、８２ｂおよび８４）；
（ｉｉｉ）ＡＨｏ番号付けを用いたＶＨ１ｂのアミノ酸位１、１０、１２、１３、１４、２０、２１、４５、４７、５０、５５、７７、７８、８２、８６、８７および１０７（Ｋａｂａｔ番号付けを用いたアミノ酸位１、９、１１、１２、１３、１９、２０、３８、４０、４３、４８、６６、６７、７１、７５、７６および９３）；
（ｉｖ）ＡＨｏ番号付けを用いたＶκ１のアミノ酸位１、３、４、２４、４７、５０、５７、９１および１０３（Ｋａｂａｔ番号付けを用いたアミノ酸位１、３、４、２４、３９、４２、４９、７３および８５）；
（ｖ）ＡＨｏ番号付けを用いたＶκ３のアミノ酸位２、３、１０、１２、１８、２０、５６、７４、９４、１０１および１０３（Ｋａｂａｔ番号付けを用いたアミノ酸位２、３、１０、１２、１８、２０、４８、５８、７６、８３および８５）；ならびに
（ｖｉ）ＡＨｏ番号付けを用いたＶλ１のアミノ酸位１、２、４、７、１１、１４、４６、５３、８２、９２および１０３（Ｋａｂａｔ番号付けを用いたアミノ酸位１、２、４、７、１１、１４、３８、４５、６６、７４および８５）
からなる群より選択される
工程を含む、前記方法を提供する。
【０１３２】
好ましい態様において、突然変異のために選択される１以上のアミノ酸位は、ＡＨｏ番号付けを用いたＶＨ３のアミノ酸位１、６、７、８９および１０３（Ｋａｂａｔ番号付けを用いたアミノ酸位１、６、７、７８および８９）からなる群より選択される。
【０１３３】
別の好ましい態様において、突然変異のために選択される１以上のアミノ酸位は、ＡＨｏ番号付けを用いたＶＨ１ａのアミノ酸位１、６、１２、１３、１４、１９、２１、９０、９２、９５および９８（Ｋａｂａｔ番号付けを用いたアミノ酸位１、６、１１、１２、１３、１８、２０、７９、８１、８２ｂおよび８４）からなる群より選択される。
【０１３４】
別の好ましい態様において、突然変異のために選択される１以上のアミノ酸位は、ＡＨｏ番号付けを用いたＶＨ１ｂのアミノ酸位１、１０、１２、１３、１４、２０、２１、４５、４７、５０、５５、７７、７８、８２、８６、８７および１０７（Ｋａｂａｔ番号付けを用いたアミノ酸位１、９、１１、１２、１３、１９、２０、３８、４０、４３、４８、６６、６７、７１、７５、７６および９３）からなる群より選択される。
【０１３５】
別の好ましい態様において、突然変異のために選択される１以上のアミノ酸位は、ＡＨｏ番号付けを用いたＶκ１のアミノ酸位１、３、４、２４、４７、５０、５７、９１および１０３（Ｋａｂａｔ番号付けを用いたアミノ酸位１、３、４、２４、３９、４２、４９、７３および８５）からなる群より選択される。
【０１３６】
別の好ましい態様において、突然変異のために選択される１以上のアミノ酸位は、ＡＨｏ番号付けを用いたＶκ３のアミノ酸位２、３、１０、１２、１８、２０、５６、７４、９４、１０１および１０３（Ｋａｂａｔ番号付けを用いたアミノ酸位２、３、１０、１２、１８、２０、４８、５８、７６、８３および８５）からなる群より選択される。
【０１３７】
別の好ましい態様において、突然変異のために選択される１以上のアミノ酸位は、ＡＨｏ番号付けを用いたＶλ１のアミノ酸位１、２、４、７、１１、１４、４６、５３、８２、９２および１０３（Ｋａｂａｔ番号付けを用いたアミノ酸位１、２、４、７、１１、１４、３８、４５、６６、７４および８５）からなる群より選択される。
【０１３８】
多様な態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２０より多くの上述のアミノ酸位を、突然変異のために選択する。
【０１３９】
好ましくは、免疫結合剤はｓｃＦｖであるが、全長免疫グロブリン、Ｆａｂ断片または本明細書記載の任意の他のタイプの免疫結合剤などの他の免疫結合剤もまた、本発明の方法にしたがって操作可能である。本発明はまた、操作法にしたがって調製された免疫結合剤、ならびに免疫結合剤および薬学的に許容されうるキャリアーを含む組成物も含む。
【０１４０】
前述にもかかわらず、多様な態様において、特定の免疫結合剤は、本発明の操作法での使用の余地がなく、そして／または操作法によって産生される免疫結合剤組成物である余地がない。例えば、多様な態様において、免疫結合剤が、ＰＣＴ公報ＷＯ  ２００６／１３１０１３およびＷＯ  ２００８／００６２３５に開示されるようなＥＳＢＡ１０５またはその変異体などの、ＰＣＴ公報ＷＯ  ２００６／１３１０１３およびＷＯ  ２００８／００６２３５に開示されるようなｓｃＦｖ抗体またはその変異体のいずれでもないという条件があり、該公報の各々の内容は本明細書に完全に援用される。
【０１４１】
多様な他の態様において、上述の方法にしたがって操作しようとする免疫結合剤が、ＰＣＴ公報ＷＯ  ２００６／１３１０１３またはＷＯ  ２００８／００６２３５に開示されるｓｃＦｖ抗体またはその変異体のいずれかである場合、操作法にしたがった置換のために選択可能なありうるアミノ酸位のリストには、いずれかのまたはすべての以下のアミノ酸位が含まれないという条件がありうる：Ｖκ１またはＶλ１のＡＨｏ４位（Ｋａｂａｔ  ４）；Ｖκ３のＡＨｏ１０１位（Ｋａｂａｔ  ８３）；ＶＨ１ａまたはＶＨ１ｂのＡＨｏ１２位（Ｋａｂａｔ  １１）；ＶＨ１ｂのＡＨｏ５０位（Ｋａｂａｔ  ４３）；ＶＨ１ｂのＡＨｏ７７位（Ｋａｂａｔ  ６６）；ＶＨ１ｂのＡＨｏ７８位（Ｋａｂａｔ  ６７）；ＶＨ１ｂのＡＨｏ８２位（Ｋａｂａｔ  ７１）；ＶＨ１ｂのＡＨｏ８６位（Ｋａｂａｔ  ７５）；ＶＨ１ｂのＡＨｏ８７位（Ｋａｂａｔ  ７６）；ＶＨ３のＡＨｏ８９位（Ｋａｂａｔ  ７８）；ＶＨ１ａのＡＨｏ９０位（Ｋａｂａｔ  ７９）；および／またはＶＨ１ｂのＡＨｏ１０７位（Ｋａｂａｔ  ９３）。
【０１４２】
さらに多様な他の態様において、上述の方法にしたがって操作しようとするいかなる免疫結合剤、および／または上述の方法にしたがって産生されるいかなる免疫結合剤に関しても、操作法にしたがった置換のために選択可能なありうるアミノ酸位のリストには、いずれかのまたはすべての以下のアミノ酸位が含まれないという条件がありうる：Ｖκ１またはＶλ１のＡＨｏ４位（Ｋａｂａｔ  ４）；Ｖκ３のＡＨｏ１０１位（Ｋａｂａｔ  ８３）；ＶＨ１ａまたはＶＨ１ｂのＡＨｏ１２位（Ｋａｂａｔ  １１）；ＶＨ１ｂのＡＨｏ５０位（Ｋａｂａｔ  ４３）；ＶＨ１ｂのＡＨｏ７７位（Ｋａｂａｔ  ６６）；ＶＨ１ｂのＡＨｏ７８位（Ｋａｂａｔ  ６７）；ＶＨ１ｂのＡＨｏ８２位（Ｋａｂａｔ  ７１）；ＶＨ１ｂのＡＨｏ８６位（Ｋａｂａｔ  ７５）；ＶＨ１ｂのＡＨｏ８７位（Ｋａｂａｔ  ７６）；ＶＨ３のＡＨｏ８９位（Ｋａｂａｔ  ７８）；ＶＨ１ａのＡＨｏ９０位（Ｋａｂａｔ  ７９）；および／またはＶＨ１ｂのＡＨｏ１０７位（Ｋａｂａｔ  ９３）。
【０１４３】
他の態様
本発明にはまた、米国仮特許出願第６０／９０５，３６５号の別表（Ａ〜Ｃ）に示される方法論、参考文献、および／または組成物のいずれも含まれ、限定されるわけではないが、同定されるデータベース、バイオインフォマティクス、コンピュータ内データ操作および解釈法、機能アッセイ、好ましい配列、好ましい残基（単数または複数）位／改変、フレームワーク同定および選択、フレームワーク改変、ＣＤＲ並列および組込み、ならびに好ましい改変／突然変異が含まれることが理解される。
【０１４４】
これらの方法論および組成物に関するさらなる情報は、それぞれ２００６年７月および２００７年２月６日出願の、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．  ６０／８１９，３７８；および６０／８９９，９０７、ならびに“ｓｃＦｖ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｗｈｉｃｈ  Ｐａｓｓ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ａｎｄ／Ｏｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｌａｙｅｒｓ”と題されるＰＣＴ公報ＷＯ  ２００８／００６２３５；  ２００６年６月６日出願の“Ｓｔａｂｌｅ  Ａｎｄ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ＴＮＦα”と題されるＷＯ０６１３１０１３Ａ２；  ２００３年５月２１日出願の“Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｒａｍｅｗｏｒｋｓ  Ｗｈｉｃｈ  Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｏｆ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｓａｍｅ”と題されるＥＰ１５０６２３６Ａ２；  ２０００年１２月１８日出願の“Ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ  ＳｃＦｖ  ｗｉｔｈ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｓｔａｂｌｅ  ｉｎ  ａ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ”と題されるＥＰ１４７９６９４Ａ２；  ２０００年１２月１８日出願の“Ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ  Ｗｉｔｈ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  Ｔｈａｔ  Ｉｓ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｉｎ  Ａ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ”と題されるＥＰ１２４２４５７Ｂ１；  ２００３年５月２１日出願の“Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｒａｍｅｗｏｒｋｓ  Ｗｈｉｃｈ  Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｏｆ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｓａｍｅ”と題されるＷＯ０３０９７６９７Ａ２；ならびに２０００年１２月１８日出願の“Ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ  Ｗｉｔｈ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  Ｔｈａｔ  Ｉｓ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｉｎ  Ａ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ”と題されるＷＯ０１４８０１７Ａ１；ならびにＨｏｎｅｇｇｅｒら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３０９：６５７−６７０（２００１）に見出されうる。
【０１４５】
さらに、本発明には、他の抗体形式、例えば全長抗体またはその断片、例えばＦａｂ、Ｄａｂ等の発見および／または改善に適した方法論および組成物もまた含まれうることが理解される。したがって、所望の生物物理学的および／または療法的特性を達成するために、選択または改変に適していると本明細書に同定される原理および残基は、広範囲の免疫結合剤に適用可能である。１つの態様において、本明細書に開示するような１以上の残基位を修飾することによって、療法的に適した抗体、例えば、ＦＤＡが認可する抗体を改善する。
【０１４６】
本開示を以下の実施例によってさらに例示し、該実施例は、さらなる限定と見なされてはならない。本出願全体で引用するすべての図およびすべての参考文献、特許、ならびに刊行特許出願は、その全体が明確に本明細書に援用される。
【実施例】
【０１４７】
実施例１：抗体位番号付け系
本実施例において、抗体重鎖および軽鎖可変領域におけるアミノ酸残基位を同定するのに用いた２つの異なる番号付け系に関する変換表を提供する。Ｋａｂａｔ番号付け系は、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔ，  Ｅ．  Ａ．ら（１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  第５版，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ９１−３２４２）にさらに記載される。ＡＨｏ番号付け系は、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，  Ａ．およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，  Ａ．（２００１）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３０９：６５７−６７０）にさらに記載される。
【０１４８】
重鎖可変領域番号付け
表１：重鎖可変ドメインにおける残基位に関する変換表
【０１４９】
【表２−１】
0005622397.tif 000003
【０１５０】
【表２−２】
0005622397.tif 000004
【０１５１】
第１列、Ｋａｂａｔ番号付け系における残基位。第２列、第１列に示す位に関するＡＨｏの番号付け系において対応する番号。第３列、Ｋａｂａｔの番号付け系における残基位。第４列、第３列に示す位に関するＡＨｏの番号付け系において対応する番号。第５列、Ｋａｂａｔの番号付け系における残基位。第６列、第５列に示す位に関するＡＨｏの番号付け系において対応する番号。
【０１５２】
軽鎖可変領域番号付け
表２：軽鎖可変ドメインにおける残基位に関する変換表
【０１５３】
【表３−１】
0005622397.tif 000005
【０１５４】
【表３−２】
0005622397.tif 000006
【０１５５】
第１列、Ｋａｂａｔ番号付け系における残基位。第２列、第１列に示す位に関するＡＨｏの番号付け系において対応する番号。第３列、Ｋａｂａｔの番号付け系における残基位。第４列、第３列に示す位に関するＡＨｏの番号付け系において対応する番号。第５列、Ｋａｂａｔの番号付け系における残基位。第６列、第５列に示す位に関するＡＨｏの番号付け系において対応する番号。
【０１５６】
実施例２：ｓｃＦｖ配列の配列に基づく分析
本実施例において、ｓｃＦｖ配列の配列に基づく分析を詳細に記載する。分析プロセスを要約するフローチャートを図１に示す。
【０１５７】
ヒト免疫グロブリン配列の収集および並列
ヒト成熟抗体および生殖系列の可変ドメインの配列を異なるデータベースから収集し、そしてカスタマイズしたデータベース内に１文字暗号アミノ酸配列として入力した。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ配列並列アルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，  ４８（３）：４４３−５３（１９７０））のＥＸＣＥＬ実行を用いて、抗体配列を並列させた。次いで、データベースを以下のように４つの異なるアレイに細分して（元来のデータ供給源にしたがって）、続く分析および比較を容易にした：
ＶＢａｓｅ：ヒト生殖系列配列
ＩＭＧＴ：ヒト生殖系列配列
ＫＤＢデータベース：成熟抗体
ＱＣデータベース：品質管理スクリーニングによって選択された、選択ｓｃＦｖフレームワーク
選択される所望の機能特性を有するＱＣスクリーニング系、およびｓｃＦｖフレームワーク配列は、例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ  ２００１／４８０１７；米国出願第２００１００２４８３１号およびＵＳ  ２００３００９６３０６号；米国特許第７，２５８，９８５号および第７，２５８，９８６号；ＰＣＴ公報ＷＯ  ２００３／０９７６９７および米国出願第２００６００３５３２０号にさらに記載される。
【０１５８】
ギャップの導入および残基位の命名を、免疫グロブリン可変ドメインに関するＡＨｏ番号付け系にしたがって行った（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，  Ａ．およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，  Ａ．（２００１）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３０９：６５７−６７０）。続いて、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔ，  Ｅ．  Ａ．ら（１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  第５版，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ９１−３２４２）にしたがって、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域を同定した。ＫＤＢデータベースにおいて、７０％完全未満であるか、またはフレームワーク領域中に多数の決定されていない残基を含有する配列を廃棄した。分析におけるランダムノイズを回避するため、データベース内の任意の他の配列と９５％より大きい同一性を持つ配列もまた排除した。
【０１５９】
サブグループへの配列の割り当て
配列相同性に基づく分類法にしたがって、抗体をクラスター化することによって、抗体配列を別個のファミリーに分類した（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，  Ｉ．Ｍ．ら（１９９２）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２７：７７６−７９８；  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｓ．Ｃ．およびＷｉｎｔｅｒ，  Ｇ．（１９９３）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２３：１４５６−１４６１）；  Ｃｏｘ，  Ｊ．Ｐ．ら（１９９４）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４：８２７−８３６）。ファミリーコンセンサスに対する相同性パーセントを７０％類似性に制約した。２以上の異なる生殖系列ファミリー間で、配列が不一致を示す場合、または相同性パーセントが７０％未満である場合（いかなるファミリーに対しても）、最も近い生殖系列対応物を決定し、ＣＤＲの長さ、規範クラスおよび定義サブタイプ残基を詳細に分析して、ファミリーを正しく割り当てた。
【０１６０】
統計分析
ファミリークラスターを定義したならば、「品質管理（「ＱＣ」）スクリーニング」において同定されたヒットに関して、統計分析を行った（こうしたＱＣスクリーニングはＰＣＴ公報ＷＯ  ２００３／０９７６９７に詳細に記載される）。分析には、配列の最小数が必要であるため、分析は、最も代表されるファミリー（ＶＨ３、ＶＨ１ａ、ＶＨ１ｂ、Ｖｋ１、Ｖｋ３およびＶλ１）に関してのみ可能であった。データセット内でその特定の残基タイプが観察される回数を配列総数によって割ることによって、各位、ｉに関する残基頻度、ｆｉ（ｒ）を計算した。単純に豊富さよりも、アミノ酸組成に関するより多くの情報を提供する、系における多様性の数学的測定値であるシンプソン指数を用いて、すべての残基位の変動性の測定値として、位のエントロピー、Ｎ（ｉ）を計算した（Ｓｈｅｎｋｉｎ，  Ｐ．Ｓ．ら（１９９１）  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １１：２９７−３１３；  Ｌａｒｓｏｎ，  Ｓ．Ｍ．およびＤａｖｉｄｓｏｎ，  Ａ．Ｒ．（２０００）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  ９：２１７０−２１８０；  Ｄｅｍａｒｅｓｔ，  Ｓ．Ｊ．ら（２００４）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３３５：４１−４８）。存在する異なるアミノ酸の数、ならびに各残基の相対的存在量を考慮して、各位、ｉに関する多様性の度合いを計算した。
【０１６１】
【化１】
0005622397.tif 000007
【０１６２】
式中：Ｄはシンプソン指数であり、Ｎはアミノ酸総数であり、ｒは各位に存在する異なるアミノ酸の数であり、そしてｎは特定のアミノ酸タイプの残基数である。
ユニークな特徴を定義する、異なる基準を用いて、選択されたＦｖフレームワーク（ＱＣスクリーニングによって選択される）のＱＣデータベースをスクリーニングした。配列データベース中の異なるアレイを用いて、Ｆｖフレームワーク内の残基位の変動性の度合いを定義し、そして選択されたＦｖフレームワークに存在する、変異に耐える、天然には一般的でない位を同定した。位のエントロピースコアの１０％以上の相違を閾値として定義した。所定の位の残基が、他の配列アレイでまれにしか観察されない、すなわち生殖系列データベース（ＶＢａｓｅおよびＩＭＧＴ）およびＫＤＢデータベースにおいてまれにしか観察されないアミノ酸によって占められている場合、さらなる位を選択した。残基の振る舞いが真に異なることが見出された場合（他の配列アレイのいずれにおいても低いかまたはまったく示されない）、残基位をユニークと定義した。
【０１６３】
選択されたＦｖフレームワーク配列のユニークな特徴の同定の背後にある論理的根拠は、フレームワークの証明された優れた特性、および骨格を改善するためのこれらの知見の潜在的な使用である。本発明者らは、選択されたフレームワークにおいて、特定の度合いの変動性を示す、天然に非常に保存された位が、ランダム突然変異誘発に耐え、そしてｓｃＦｖ形式において、天然残基に勝る代替アミノ酸を発見する可能性増加を提示すると仮定した。さらに、一般的でないアミノ酸に関する顕著な優先性は、特定の残基に対する自然選択の指標である。これらの２つの統計的指針に基づいて、重鎖および軽鎖内の異なる残基を、流動的な位（変動性に耐える）または好ましい置換（異常な残基）のいずれかとして選択した。
【０１６４】
実施例３：変動性に耐える残基位および異常な残基位の同定
実施例２に上述する、配列に基づくｓｃＦｖ分析アプローチを用いて、３つの重鎖可変領域ファミリー（ＶＨ３、ＶＨ１ａおよびＶＨ１ｂ）および３つの軽鎖可変領域ファミリー（Ｖκ１、Ｖκ３およびＶλ１）を分析して、変動性に耐えるアミノ酸位を同定した。特に、上述のように、４つの異なるデータベース、Ｖｂａｓｅ、ＩＭＧＴ、ＫＤＢおよびＱＣ（選択されたｓｃＦｖ）内の配列に関して、各アミノ酸位について、シンプソン指数を用いて計算されるような多様性の度合いを決定した。ＱＣ選択されたｓｃＦｖデータベースに比較した際、ＶｂａｓｅおよびＩＭＧＴ生殖系列データベースに関して、これらの位のシンプソン指数値の相違に基づいて、変異体に耐える位および異常な残基のアミノ酸位を同定した。さらに、関心対象の同定される位に関して、生殖系列コンセンサス残基を同定し、そしてＱＣおよびＫＤＢデータベース中のそのコンセンサス残基の頻度を決定した。
【０１６５】
重鎖可変領域ファミリーＶＨ３、ＶＨ１ａおよびＶＨ１ｂに関する変動性分析結果を、それぞれ表３、４および５に示す。各表に関して、列は以下の通りである：第１列：ＡＨｏ番号付け系を用いたアミノ酸残基位（Ｋａｂａｔ番号付け系への変換は、実施例１の表１に示す変換表を用いて達成可能である）；第２〜５列：第１列に示す残基位に関するデータベース中の各抗体アレイに関する計算された多様性；第６列：対応する生殖系列ファミリーおよびＫＤＢのコンセンサス残基；第７列：第６列中のコンセンサス残基に関するＫＤＢデータベース中の相対残基頻度；および第８列：第６列中のコンセンサス残基に関するＱＣ選択されたｓｃＦｖデータベース中の相対残基頻度。
【０１６６】
表３：ＶＨ３ファミリーに関する、生殖系列において同定されたコンセンサスアミノ酸の残基の変動性分析および対応する頻度。
【０１６７】
【表４】
0005622397.tif 000008
【０１６８】
表４：ＶＨ１ａファミリーに関する、生殖系列において同定されたコンセンサスアミノ酸の残基の変動性分析および対応する頻度。
【０１６９】
【表５】
0005622397.tif 000009
【０１７０】
表５：ＶＨ１ｂファミリーに関する、生殖系列において同定されたコンセンサスアミノ酸の残基の変動性分析および対応する頻度。
【０１７１】
【表６】
0005622397.tif 000010
【０１７２】
軽鎖可変領域ファミリーＶκ１、Ｖκ３およびＶλ１に関する変動性分析結果を、それぞれ表６、７および８に示す。各表に関して、列は以下の通りである：第１列、ＡＨｏ番号付け系を用いたアミノ酸残基位（Ｋａｂａｔ番号付け系への変換は、実施例１の表１に示す変換表を用いて達成可能である）；第２〜５列：第１列に示す残基位に関するデータベース中の各抗体アレイに関する計算された多様性；第６列：対応する生殖系列ファミリーおよびＫＤＢのコンセンサス残基；第７列：第６列中のコンセンサス残基に関するＫＤＢデータベース中の相対残基頻度；および第８列：第６列中のコンセンサス残基に関するＱＣ選択されたｓｃＦｖデータベース中の相対残基頻度。
【０１７３】
表６：Ｖκ１ファミリーに関する、生殖系列において同定されたコンセンサスアミノ酸の残基の変動性分析および対応する頻度。
【０１７４】
【表７】
0005622397.tif 000011
【０１７５】
表７：Ｖκ３ファミリーに関する、生殖系列において同定されたコンセンサスアミノ酸の残基の変動性分析および対応する頻度。
【０１７６】
【表８】
0005622397.tif 000012
【０１７７】
表８：Ｖλ１ファミリーに関する、生殖系列において同定されたコンセンサスアミノ酸の残基の変動性分析および対応する頻度。
【０１７８】
【表９】
0005622397.tif 000013
【０１７９】
上記表３〜８に示すように、ＱＣ系で選択されたｓｃＦｖフレームワークにおける残基位のサブセットが、生殖系列（ＶＢａｓｅおよびＩＭＧＴ）および成熟抗体（ＫＤＢ）において存在しないか、または少なくしか示されない特定の残基に向かって強くバイアスを受けていることが見出され、ｓｃＦｖの安定性が、品質管理酵母スクリーニング系において選択されたフレームワーク配列のユニークな特徴に基づいて、合理的に改善可能であることが示唆される。
【０１８０】
実施例４：好ましい残基の選択
ｓｃＦｖの、機能特性（例えば安定性および／または溶解性）を改善することが知られる特定のアミノ酸位で、好ましいアミノ酸残基置換を選択する（あるいはアミノ酸残基を排除する）ため、ファミリーサブタイプ（例えばＶＨ１ｂ、ＶＨ３など）にしたがって、成熟抗体配列のＫａｂａｔデータベース由来のＶＨおよびＶＬ配列をグループ分けした。配列の各サブファミリー内で、サブタイプの一群のすべての分析配列の割合として、各アミノ酸位での各アミノ酸残基の頻度を決定した。いわゆるＱＣ系によって、安定性および／または溶解性の増進に関してあらかじめ選択した抗体からなるＱＣデータベースのすべての配列に関して、同じことを行った。各サブタイプに関して、Ｋａｂａｔ配列に関してそしてＱＣ配列に関して得た各アミノ酸残基の生じた割合（相対頻度）を、対応する位各々で比較した。Ｋａｂａｔデータベースに比較してＱＣデータベースにおいて、特定のアミノ酸残基の相対頻度が増加している場合、それぞれの残基を、所定の位で、ｓｃＦｖの安定性および／または溶解性を改善するのに好ましい残基と見なした。逆に、特定のアミノ酸残基の相対頻度が、Ｋａｂａｔデータベースに比較した際、ＱＣデータベースで減少している場合、ｓｃＦｖ形式の背景において、それぞれの残基をその位で好ましくないと見なした。
【０１８１】
表９は、異なるデータベースにおいて、ＶＨ１ｂサブタイプに関してアミノ酸Ｈ７８位（ＡＨｏ番号付け；Ｋａｂａｔ  Ｈ６７位）の残基頻度の例示的な分析を示す。表９の列は以下の通りである：第１列：残基タイプ；第２列：ＩＭＧＴ生殖系列データベースにおける残基頻度；第３列：Ｖｂａｓｅ生殖系列データベースにおける残基頻度；第４列：ＱＣデータベースにおける残基頻度；第５列：Ｋａｂａｔデータベースにおける残基頻度。
【０１８２】
表９：２つの生殖系列データベース、ＱＣデータベース、および成熟抗体のＫａｂａｔデータベースにおけるＶＨ１ｂサブタイプに関する７８位（ＡＨｏ番号付け）での相対残基頻度。
【０１８３】
【表１０】
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【０１８４】
＊残基頻度の分析のために収集した配列数。
ＱＣデータベースにおいて、２４％の頻度でアラニン（Ａ）残基を観察し、これは成熟Ｋａｂａｔデータベース（ＫＤＢ＿ＶＨ１Ｂ）において同じ残基に関して観察された２％の頻度の１２倍であった。したがって、Ｈ７８位のアラニン残基（ＡＨｏ番号付け）は、ｓｃＦｖの機能特性（例えば安定性および／または溶解性）を増進させるために、その位で好ましい残基と見なされる。対照的に、バリン（Ｖ）残基は、ＱＣデータベースで４７％の相対頻度で観察され、これは、成熟Ｋａｂａｔデータベースで観察される８６％、および生殖系列データベースにおいて同じ残基に関して観察される９０％を超える頻度（ＩＭＧＴ−生殖では９１％、およびＶｂａｓｅ生殖では１００％）よりはるかに低い。したがって、バリン残基（Ｖ）は、ｓｃＦｖ形式の背景において、Ｈ７８位の好ましくない残基と見なされた。
【０１８５】
実施例５：２つの異なるアプローチ由来のＥＳＢＡ１０５  ｓｃＦｖ変異体の比較
本実施例において、２つの異なるアプローチによって調製されるｓｃＦｖ変異体の安定性を比較した。親ｓｃＦｖ抗体は、先に記載されているＥＳＢＡ１０５であった（例えばＰＣＴ公報ＷＯ２００６／１３１０１３およびＷＯ２００８／００６２３５）。品質管理酵母スクリーニング系（「ＱＣ変異体」）を用いてＥＳＢＡ１０５変異体の１セットを選択し、この変異体もまた先に記載されている（例えばＰＣＴ公報ＷＯ２００６／１３１０１３およびＷＯ２００８／００６２３５を参照されたい）。特定のアミノ酸位を、上記実施例２および３に記載する配列分析によって同定される好ましい生殖系列コンセンサス配列に逆突然変異させることによって、他の変異体セットを調製した。生殖系列配列において保存されているが、選択されたｓｃＦｖにおいて異常であるかまたは低頻度であるアミノ酸を含有する位に関して、アミノ酸配列内を検索することによって、逆突然変異を選択した（生殖系列コンセンサス操作アプローチと称する）。
【０１８６】
分子を熱誘導性ストレスに供することによって、安定性に関して変異体のすべてを試験した。広い範囲の温度（２５℃〜９５℃）に曝露することによって、すべての変異体に関して、熱アンフォールディング遷移のおよその中点（ＴＭ）を決定することが可能であった。ＩＲ光が干渉計を通じて導かれる、ＦＴ−ＩＲ  ＡＴＲ分光法を用いて、野生型分子および変異体に関する熱安定性測定を行った。測定シグナルはインターフェログラムであり、このシグナルに対してフーリエ変換を行うと、最終スペクトルは、慣用的（分散的）赤外分光法に由来するものと同一である。
【０１８７】
熱アンフォールディング結果を以下の表１０に要約し、そして図６にグラフで示す。表１０の列は以下の通りである：第１列：ＥＳＢＡ１０５変異体；第２列：突然変異を含有するドメイン；第３列：ＡＨｏ番号付けにおける突然変異（単数または複数）；第４列：図６における熱アンフォールディング曲線から計算されたＴＭ中点；第５列：親ＥＳＢＡ１０５に比較した相対活性；第５列：第１列に特定する変異体に関する突然変異誘発戦略。
【０１８８】
表１０：２つの異なるアプローチ由来のＥＳＢＡ１０５変異体の比較およびＦＴ−ＩＲで測定された全体の安定性へのその寄与（熱アンフォールディング遷移に関して計算された中点）。
【０１８９】
【表１１】
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【０１９０】
ＱＣ変異体に比較した際、生殖系列コンセンサスへの逆突然変異は、ＥＳＢＡ１０５の熱安定性および活性には負の影響を有するかまたはまったく影響しない。したがって、これらの結果は、異なる抗体および形式で他の研究者らによって安定性を改善するために用いられているコンセンサス操作アプローチと矛盾する（例えば、Ｓｔｅｉｐｅ，  Ｂら（１９９４）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２４０：１８８−１９２；  Ｏｈａｇｅ，  Ｅ．およびＳｔｅｉｐｅ，  Ｂ．（１９９９）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９１：１１１９−１１２８；  Ｋｎａｐｐｉｋ，  Ａ．ら（２０００）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９６：５７−８６，  Ｅｗｅｒｔ，  Ｓ．ら（２００３）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：１５１７−１５２８；ならびにＭｏｎｓｅｌｌｉｅｒ，  Ｅ．およびＢｅｄｏｕｅｌｌｅ，  Ｈ．（２００６）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３６２：５８０−５９３を参照されたい）。
【０１９１】
別の実験において、上記ＱＣ変異体（ＱＣ１１．２、ＱＣ１５．２、およびＱＣ２３．２）およびさらなるＱＣ変異体（ＱＣ７．１）を、コンセンサス逆突然変異（Ｓ−２、Ｄ−２、およびＤ−３）またはアラニンへの逆突然変異（Ｄ−１）のいずれかを有する第二の変異体セットと比較した（図７を参照されたい）。選択されたフレームワーク位の残基の同一性を図７Ａに示し、そして測定された熱安定性（恣意的アンフォールディング単位）を図７Ｂに示す。いくつかのコンセンサス変異体（Ｓ−２およびＤ−１）が熱安定性における顕著な増進を示したが、この増進は、４つのＱＣ変異体各々によって達成される熱安定性の増進より小さかった。
【０１９２】
したがって、本明細書の結果は、「品質管理酵母スクリーニング系」で適用される選択圧が、天然にほとんど観察されない（しかしなおヒトである）共通の特徴を含有し、そしておそらくこれらのフレームワークの優れた生物物理学的特性の原因となる、骨格の亜集団を生じることを立証する。ＥＳＢＡ１０５の異なる変異体を６０℃に曝露することによって、選択されるｓｃＦｖフレームワークデータベースで同定される好ましい置換の優れた特性を再確認することが可能であった。したがって、ＱＣ酵母スクリーニング系から得られる、選択されたｓｃＦｖ配列に基づく、本明細書記載の「機能コンセンサス」アプローチは、生殖系列コンセンサスアプローチを用いて調製される変異体より優れた熱安定性を有するｓｃＦｖ変異体を生じることが立証された。
【０１９３】
実施例６：ＥＳＢＡ２１２  ｓｃＦｖ変異体
本実施例において、ＥＳＢＡ１０５とは異なる結合特異性を持つｓｃＦｖ抗体の生殖系列コンセンサス変異体（ＥＳＢＡ２１２）の安定性を比較した。特定のアミノ酸位を、上述の実施例２および３に記載する配列分析によって同定される、好ましい生殖系列コンセンサス配列に逆突然変異させることによって、すべてのＥＳＢＡ２１２変異体を調製した。生殖系列配列において保存されているが、選択されたｓｃＦｖにおいて異常であるかまたは低頻度であるアミノ酸を含有する位に関して、アミノ酸配列内を検索することによって、逆突然変異を選択した（生殖系列コンセンサス操作アプローチと称する）。実施例５におけるように、分子を熱誘導性ストレスに供することによって、安定性に関して変異体のすべてを試験した。
【０１９４】
ＥＳＢＡ２１２変異体に関する熱アンフォールディング結果を以下の表１１に要約し、そして図８にグラフで示す。表１１の列は以下の通りである：第１列：ＥＳＢＡ２１２変異体；第２列：突然変異を含有するドメイン；第３列：ＡＨｏ番号付けにおける突然変異（単数または複数）；第４列：図７における熱アンフォールディング曲線から計算されたＴＭ中点；第５列：親ＥＳＢＡ２１２に比較した相対活性；第５列：第１列に特定する変異体に関する突然変異誘発戦略。
【０１９５】
表１１：生殖系列コンセンサス残基に逆突然変異させたＥＳＢＡ２１２変異体の比較およびＦＴ−ＩＲで測定された全体の安定性へのその寄与（熱アンフォールディング遷移に関して計算された中点）。
【０１９６】
【表１２】
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【０１９７】
関連しないＥＳＢＡ１０５  ｓｃＦｖ抗体に関して観察されたように、生殖系列コンセンサスへの逆突然変異は、ＥＳＢＡ２１２の熱安定性および活性には負の影響を有するかまたはまったく影響しなかった。したがって、これらの結果は、コンセンサスに基づく慣用的なアプローチが不適切であることをさらに強調するのに役立つ。本発明の機能コンセンサス方法論を使用することによって、これらの不全に取り組むことも可能である。
【０１９８】
同等物
当業者は、本明細書に記載する本発明の特定の態様の多くの同等物を用いることを認識するか、またはルーチンの実験以上のものを用いずに、確認することが可能である。こうした同等物は、以下の請求項によって含まれることが意図される。
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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