(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
成体ＳＴＲＯ−１＋多能性細胞を富化させる方法であって、
(i) 組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＰ）マーカーを発現する細胞を含む組織源から細胞サンプルを作製し、前記細胞サンプルとＴＮＡＰ結合因子とを接触させ、ＴＮＡＰ結合因子と結合した細胞を分離し、ＴＮＡＰマーカーを発現する成体多能性細胞を富化させる工程、及び
(ii) 工程(i)で得られた細胞集団からＳＴＲＯ−１マーカーを発現する細胞を富化させる工程
を含み、
前記ＴＮＡＰ結合因子が、ブタペスト条約の条項のもと、受託番号ＰＴＡ−７２８２で２００５年１２月１９日にＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されたＳＴＲＯ−３抗体又は該抗体と同じエピトープに結合する抗体である、前記方法。
【請求項２】
工程(ii)の結果ＣＤ４５の発現が失われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程(ii)が、工程(i)で得られた細胞集団を培養する工程を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＴＮＡＰ結合因子が、ＴＮＡＰのＬＡＰ、ＫＡＰおよび／またはＢＡＰアイソフォームに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＴＮＡＰ結合因子が、ＴＮＡＰのＢＡＰアイソフォームに特異的に結合する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程(i)が、ＬＦＡ−３、ＴＨＹ−１、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＰＥＣＡＭ−１、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、ＣＤ４９ａ／ＣＤ４９ｂ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｃ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｄ／ＣＤ２９、ＣＤ２９、ＣＤ１８、ＣＤ６１、インテグリンベータ，６−１９、トロンボモジュリン、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＳＣＦ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＥＧＦ−Ｒ、ＩＧＦ１−Ｒ、ＮＧＦ−Ｒ、ＦＧＦ−Ｒ、レプチン−Ｒ、（ＳＴＲＯ−２＝レプチン−Ｒ）、ＲＡＮＫＬ  ＳＴＲＯ−１briおよびＣＤ１４６から成る群より選択されるマーカーまたはこれらのマーカーの任意の組み合わせに結合する結合因子と細胞を接触させることをさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＴＮＡＰ結合因子を標識する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＴＮＡＰ結合因子を蛍光標識化合物にカップリングさせる、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＴＮＡＰ結合因子に結合した細胞の分離が、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いて行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＴＮＡＰ結合因子を固体粒子に連結させる、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記固体粒子が、磁性粒子である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記組織源が、脂肪組織、歯、歯髄、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、網膜、脳、毛包、腸、肺、脾臓、リンパ節、胸腺、膵臓、骨、靭帯、骨髄、腱および骨格筋から成る群より選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法によって得られた成体多能性細胞の富化集団。
【請求項１４】
成体多能性細胞の富化集団であって、全細胞集団の少なくとも１％が、ＳＴＲＯ−１＋、組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＰ）＋成体多能性細胞である、請求項１３に記載の富化集団。
【請求項１５】
請求項１３または請求項１４に記載の成体多能性細胞の富化集団を培養することによって得られる増幅細胞集団。
【請求項１６】
遺伝子改変細胞を含む、請求項１３もしくは請求項１４に記載の富化集団または請求項１５に記載の増幅細胞集団。
【請求項１７】
組織特異的コミットメントを受けた細胞集団の生成方法であって、
１つまたはそれ以上の刺激因子の存在下で請求項１３、請求項１４または請求項１５に記載の成体多能性細胞の集団を培養すること；および
前記培養集団を、その成体多能性細胞の分化を特定の組織タイプに偏らせる条件下に置くこと
を含む方法。
【請求項１８】
前記組織タイプが、心筋、血管組織、骨組織、神経組織、平滑筋および内皮組織から成る群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記刺激因子が、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3（１，２５Ｄ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）および間質由来因子１α（ＳＤＦ−１α）から成る群より選択される、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１３または請求項１４に記載の富化成体多能性細胞の集団および／または請求項１５に記載の増幅細胞集団を含む組成物。
【請求項２１】
刺激因子をさらに含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記刺激因子が、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3（１，２５Ｄ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）および間質由来因子１α（ＳＤＦ−１α）から成る群より選択される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
フィブリン糊をさらに含む、請求項２０から２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
被験者における組織の生成または修復用の医薬組成物であって、請求項１３から１６のいずれか一項に記載の富化細胞集団または増幅細胞集団を含む、前記医薬組成物。
【請求項２５】
被験者における組織の生成または修復用の医薬組成物であって、請求項２０から２３のいずれか一項に記載の組成物を含む、前記医薬組成物。
【請求項２６】
前記組織が、骨または軟骨組織である、請求項２４または請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記組織が、心臓組織である、請求項２４または請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記細胞の少なくとも一部を遺伝子改変する、請求項２４から２７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
被験者における組織の生成または修復用の薬物を製造するための、請求項１３から１６のいずれか一項に記載の富化細胞集団または増幅細胞集団の使用。
【請求項３０】
被験者における組織の生成または修復用の薬物を製造するための、請求項２０から２３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項３１】
ブタペスト条約の条項のもと受託番号ＰＴＡ−７２８２で２００５年１２月１９日にＡＴＣＣに寄託されたＳＴＲＯ−３ハイブリドーマ細胞株。
【請求項３２】
ブタペスト条約の条項のもと受託番号ＰＴＡ−７２８２で２００５年１２月１９日にＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されたＳＴＲＯ−３抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成体多能性細胞（adult multipotential cell）を特定および／または単離するためのマーカーとしての組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＰ）の使用に関する。本発明は、本発明の方法によって富化された細胞集団およびこれらの細胞の治療用途にも関する。
【背景技術】
【０００２】
成体多能性細胞の富化（enrichment）
線維芽細胞、脂肪細胞、軟骨芽細胞、平滑筋細胞、骨芽細胞および骨の他の細胞要素を含む骨髄（ＢＭ）の非造血細胞が、骨髄腔および周辺結合組織あたりにある多能性骨髄間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）集団に由来するという概念は、非常に多数の研究により支持されている（Bianco et al., 2001；Gronthos and Simmons, 1996；Owen and Friedenstein, 1988；Prockop, 1997）。これらのＭＰＣは、表現型および機能的には同一である、より多くの細胞を生じさせる（自己複製プロセス）ばかりでなく、分化し系統コミットメントされた間葉系子孫も生じさせると考えられている。詳細に明らかにされたマーカーがないため、系統コミットメントされた子孫へのヒトＭＰＣの分化および成熟中に発生する、遺伝子発現の表現型およびパターンの発生学的に調節された変化については、正確にはほとんどわかっていない。骨形成のプロセスを調査する研究により、骨形成性細胞系統にコミットメントさせたＭＰＣの特定を可能にする１つのそうした初期マーカー、転写因子ＣＢＦＡ１、が特定された（Ducy et al., 1997）。しかし、ＣＢＦＡ１などのマーカーは、不均一な細胞集団内の生細胞の単離および操作には使用することができない。これは、重大な制限を意味し、またＭＰＣ区画に特異的なまたは限定される細胞表面抗原を特定できるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の不足がさらにそれに併さる。
【０００３】
今のところ、ＳＴＲＯ−１モノクローナル抗体は、ヒト骨髄の吸引液からのすべてのコロニー形成ＭＰＣ（ＣＦＵ−Ｆ：コロニー形成単位−線維芽細胞）との免疫反応性を示しながら造血幹細胞との反応性を欠く、唯一の試薬だと言われている（Dennis et al., 2002；Gronthos et al., 2003；Simmons and Torok−Storb, 1991）。
【０００４】
本発明者らの研究により、エクスビボで増幅させたヒトＭＰＣは、血清の存在下で急速に分化し、骨形成性細胞系統および他の細胞系統へのコミットメントに関連した多数のマーカーを発現し始めることが明らかになった（Gronthos et al., 2003）。インビボですべてのＭＰＣ（ＣＦＵ−Ｆ）を特定するｍＡｂ ＳＴＲＯ−１は、ＭＰＣのエクスビボ培養後にダウンレギュレートされる。重要なこととして、培養細胞のうちの少量は、エクスビボ増幅後に引き続きＳＴＲＯ−１を発現し、これらの細胞は、未分化ＭＰＣに特有である（Gronthos et al., 1999；Stewart et al., 1999）。
【０００５】
アルカリホスファターゼ
アルカリホスファターゼ（ＡＰ、ＥＣ  ３．１．３．１）は、無機ホスフェートの放出を伴うアルカリ条件下でのホスホモノエステルの加水分解を触媒する二量体金属結合酵素のユビキタスファミリーに属する（McComb et al., 1979）。ヒトにおける４つのアイソザイム［ｉ）胎盤特異的ＡＰ、ｉｉ）生殖細胞特異的（胎盤の）ＡＰ、ｉｉｉ）腸のＡＰおよびｉｖ）組織非特異的ＡＰ（ＴＮＡＰ）］を区別することができる（Harris, 1990）。ＴＮＡＰの産生は、肝臓（ＬＡＰ）、腎臓（ＫＡＰ）および骨（ＢＡＰ）において最も強く（Moss, 1992）ならびに血清においてＡＰアイソフォームが最も頻出する（Mulivor, et al., 1985）。ＬＡＰ、ＫＡＰおよびＢＡＰの違いは、異なる翻訳後Ｏ−グリコシル化パターンに起因し（Miura, et al., 1994）、これは、異なる特異的活性も生じさせる（Nosjean et al., 1997）が、それらのアミノ酸配列は、本質的に同一である（Weiss et al., 1988）。さらに、Ｎｏｓｊｅａｎら（１９９７）は、ｔｎｓ−ＡＰのＮ−グリコシル化がその酵素的活性に必須であることを証明した。それ故、組織非特異的ＡＰは、異なるグリコシル化ＡＰの混合物である。
【０００６】
ヒトＴＮＡＰの遺伝子が、１９８６年にクローニングされた（Weiss, et al., 1986）。これは、１７アミノ酸長のＮ末端シグナル配列と、そのタンパク質を血漿膜の外側にインビボでアンカーするＣ末端ＧＰＩアンカー配列とを有する５２４のアミノ酸から成るタンパク質をコードしている（Hooper, 1997）。ＣＯＳ−１などの真核細胞における（Fukushi, et al., 1998）およびバキュロウイルスに感染させた昆虫細胞における（Oda, et al., 1999）生物活性のある組換えＴＮＡＰ酵素の発現が報告されている。
る。
【０００７】
７０年よりも前に発見されたのだが、骨および骨髄組織におけるＴＮＡＰ分子の正確な機能は、不明である。哺乳動物におけるＴＮＡＰについては幾つかの生物学的役割が提案されており、それらとしては、非リン酸部分を供給するためのリン酸エステルの加水分解；リン酸エステルの合成のためのトランスフェラーゼ作用；無機リン酸代謝の調節；ホスホリル代謝物の定常状態レベルの維持；ホスホプロテインホスファターゼとしての作用が挙げられる（Whyte, 1994）。Ｂ／Ｌ／Ｋ−ＴＮＡＰは、石灰化阻害剤、例えば無機ピロリン酸塩を加水分解することにより、骨格石灰化において特異的な役割を果たすこともあり、これは、高濃度の場合、水酸アパタイト結晶の成長を阻害することができる（De Broe and Moss, 1992；Moss, 1992；Whyte, 1994）。あるいは、ＴＮＡＰは、無機リン酸塩の血漿膜輸送因子（リン酸カルシウム沈降を誘発し、類骨における無機質沈着を方向付ける細胞外カルシウムイオン結合タンパク質）であり得ると提案されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＴＮＡＰが骨芽細胞分化のマーカーであることは公知である。しかし、本発明者らの知る限り、未熟多能性細胞によるＴＮＡＰの細胞表面発現についての報告は、以前にはない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、未分画骨髄から成体多能性細胞を特定および単離することができ、インビボにおいてもインビトロにおいてもＳＴＲＯ−１集団を細分させる（subdivide）能力を有する、新規ｍＡｂ（ＳＴＲＯ−３と呼ぶ）を、最近、生じさせた。本発明者らは、ＳＴＲＯ−３が、組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＰ）に結合することを実証した。本発明者らの結果により、ＳＴＲＯ−３が、成体骨髄吸引液内に含まれる比率の低い細胞とのみ反応し、ヒト成体骨髄吸引液中のＣＤ３４ポジティブ造血幹細胞とは反応しないことも明らかになった。これは、ＴＮＡＰが、様々な組織源からの成体多能性細胞の単一の試薬を富化させるために用いることができるマーカーであることを最初に示すものである。
【００１０】
従って、本発明は、成体多能性細胞の特定および／または富化のためのマーカーとしてのＴＮＡＰの使用に関する。
【００１１】
本発明は、成体多能性細胞を富化させる方法も提供し、この方法は、組織源から細胞サンプルを調製することおよびＴＮＡＰマーカーを発現する細胞を富化させることを含む。
【００１２】
一例では、成体多能性細胞を富化させるこの方法は、
ＴＮＡＰ結合因子へのＴＮＡＰの結合を可能にする条件下で細胞サンプルとＴＮＡＰ結合因子を接触させること；および
ＴＮＡＰ結合因子に結合した細胞を分離すること
を含む。
【００１３】
本発明は、細胞サンプルにおいて成体多能性細胞の存在を特定する方法も提供し、この方法は、そのサンプルにおいてＴＮＡＰマーカーを発現する細胞を特定することを含む。
【００１４】
一例では、細胞サンプルにおいて成体多能性細胞の存在を特定するためのこの方法は、
ＴＮＡＰ結合因子へのＴＮＡＰの結合に適する条件下でその細胞サンプルとＴＮＡＰ結合因子を接触させること；および
サンプル中の細胞に結合したＴＮＡＰ結合因子の存在を検出すること
を含み、この場合、その成体多能性細胞の存在は、ＴＮＡＰ結合因子に結合している細胞によって示される。
【００１５】
本発明に関連して、細胞サンプルが、成体多能性細胞を含有すると推測される任意の組織源由来のものであってもよいことは、理解されるであろう。例えば、組織源は、脂肪組織、歯、歯髄、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、網膜、脳、毛包、腸、肺、脾臓、リンパ節、胸腺、卵巣、膵臓、骨、靭帯、骨髄、腱および骨格筋であり得る。好ましい実施形態おいて、組織源は、骨髄である。
【００１６】
好ましい細胞源は、ヒトであるが、本発明は、農業動物、例えばウシ、ヒツジ、ブタなど、家畜、例えばイヌおよびネコ、実験動物、例えばマウス、ラット、ハムスターおよびウサギ、またはスポーツに用いることができる動物、例えばウマを含む他の動物にも適用できると予想される。
【００１７】
この方法は、最初の富化工程の前に多能性細胞源を採収することを含む場合もある。これは、例えば、被験者から組織を外科手術により除去すること、およびその組織の細胞を分離して単細胞懸濁液を作ることを含み得る。この分離は、物理的または酵素的手段によって達成することができる。本発明の一例では、この工程は、公知の技法を用いて骨髄細胞を採収することを含む。
【００１８】
本発明の方法において使用されるＴＮＡＰ結合因子は、ＴＮＡＰへの結合親和性を有すると特定された任意のポリペプチドまたは化合物であり得る。例えば、このＴＮＡＰ結合因子は、抗体またはコラーゲン、好ましくはＩ型コラーゲンであり得る。
【００１９】
このＴＮＡＰ結合因子は、ＴＮＡＰのＬＡＰ、ＫＡＰまたはＢＡＰアイソフォームのうちのいずれか１つまたはそれ以上に結合することができる。しかし、ある好ましい実施形態では、このＴＮＡＰ結合因子はＢＡＰに結合する。別の好ましい実施形態では、このＴＮＡＰ結合因子は、ＢＡＰに特異的に結合する。
【００２０】
「ＢＡＰに特異的に結合する」とは、そのＴＮＡＰ結合因子が、過剰量の他の物質、例えばＫＡＰおよびＬＡＰの存在下で選択的な様式で、かつＢＡＰを発現する細胞の選択的富化に有用なツールとなる十分な緊密度で（すなわち、十分に高い親和性で）ＢＡＰに結合することができることを意味する。
【００２１】
好ましい実施形態において、ＴＮＡＰ結合因子は、（任意の源からの、天然または組換え）抗ＴＮＡＰ抗体である。この抗ＴＮＡＰ抗体は、ポリクローナル抗体であってもよく、またはモノクローナル抗体であってもよい。好ましい実施形態において、この抗ＴＮＡＰ抗体は、モノクローナル抗体である。
【００２２】
本発明において使用するために適する抗ＴＮＡＰモノクローナル抗体の例としては、B4-78, 50およびB4-50(Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa);ab17973およびab17989 (Abcam Ltd, Cambridge, UK);ならびにMagnusson et al. (2002)において言及された抗ＴＮＡＰ  ｍＡｂが挙げられる。
【００２３】
本発明の特に好ましい実施形態において、この抗ＴＮＡＰモノクローナル抗体は、ブタペスト条約の条項のもと受託番号ＰＴＡ−７２８２で２００５年１２月１９日にＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されたＳＴＲＯ−３抗体であるか、ＴＮＡＰ上の、そのＳＴＲＯ−３抗体と同じエピトープに結合するｍＡｂである。
【００２４】
本発明の成体多能性細胞の富化方法は、ＴＮＡＰマーカーのみの存在に基づくものであり得る。言い換えれば、本富化方法は、単一の試薬（すなわち、ＴＮＡＰ結合因子）に影響を与えることができる。
【００２５】
しかし、本発明は、ＴＮＡＰのみの発現による細胞の富化に限定されず、状況によっては、２つ、３つまたはそれ以上の追加のマーカーとの組み合わせでのＴＮＡＰの発現に基づき成体多能性細胞を富化させることが好ましいこともある。従って、本成体多能性細胞の富化方法は、ＬＦＡ−３、ＴＨＹ−１、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＰＥＣＡＭ−１、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、ＣＤ４９ａ／ＣＤ４９ｂ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｃ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｄ／ＣＤ２９、ＣＤ２９、ＣＤ１８、ＣＤ６１、インテグリンベータ，６−１９、トロンボモジュリン、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＳＣＦ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＥＧＦ−Ｒ、ＩＧＦ１−Ｒ、ＮＧＦ−Ｒ、ＦＧＦ−Ｒ、レプチン−Ｒ、（ＳＴＲＯ−２＝レプチン−Ｒ）、ＲＡＮＫＬ、ＳＴＲＯ−１（好ましくはＳＴＲＯ−１bri）およびＣＤ１４６から成る群より選択される１つまたはそれ以上のマーカーまたはこれらのマーカーの任意の組み合わせの追加的存在に基づくこともある。
【００２６】
例えば、本方法は、第一成体多能性細胞特異的マーカーの発現を富化することにより細胞の第一部分的富化プールを作製する工程、それに続く、細胞のその部分的富化プールからのＴＮＡＰの発現を富化させる工程を含み得る。もう１つの例では、本方法は、ＴＮＡＰを発現する細胞の選択に基づく初期富化工程、それに続く、異なる成体多能性細胞マーカーを富化させることを含む工程を含み得る。さらにもう１つの例では、本方法は、ＴＮＡＰおよび１つまたはそれ以上の追加の成体多能性細胞特異的マーカーを発現する細胞を同時に選択することを含む。
【００２７】
この分離の基礎となるＴＮＡＰを有する細胞の認識を多数の異なる方法によって行うことができるが、ある意味、これらの方法のすべてが、ＴＮＡＰ結合因子への細胞の結合、それに続く、結合（高レベル結合もしくは低レベル結合）を示すまたは結合を示さない細胞の分離に依存することは、理解されるであろう。最も都合のよい結合因子は、抗体または抗体ベース分子であり、好ましくは、これらの特異性のため、モロクロナール抗体またはモノクローナル抗体を基にした分子である。
【００２８】
粗分離ができるように、ＴＮＡＰ結合因子を固体支持体に付着させることもある。この分離技術は、好ましくは、回収すべき画分の生存率の保持を最大にする。効力の異なる様々な技術を利用して、比較的粗い分離を達成することができる。利用する特定の技術は、分離効率、関連の細胞毒性、実行の容易さおよび速度、ならびに高性能機器および／または技術的熟練の必要性に依存するであろう。分離の手順としては、抗体でコーティングされた磁気ビーズを使用する磁性分離、親和性クロマトグラフィー、および固体マトリックスに付着させた抗体での「パニング」を挙げることができるが、これらに限定されない。正確な分離をもたらす技術としては、ＭＡＣＳ、Ｄｙｎａｌ磁気ビーズ選択およびＦＡＣＳが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
本発明のある例では、ＴＮＡＰ結合因子を標識する。別の例では、ＴＮＡＰ結合因子に結合した細胞の分離を、メカニカルセルソーターによって行う。
【００３０】
本発明さらなる例では、ＴＮＡＰ結合因子を蛍光標識化合物にカップリングさせる。この場合、ＴＮＡＰ結合因子に結合した細胞の分離は、好ましくは、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いて行う。
【００３１】
本発明のさらなる例では、ＴＮＡＰ結合因子を固体粒子に連結させる。好ましくは、この固体粒子は、磁性粒子である。本発明のこの実施形態において、ＴＮＡＰ結合因子に結合した細胞の分離は、好ましくは、液相から粒子相を分離することによって行う。本発明のさらなる好ましい実施形態では、分離工程前に、細胞サンプルと、固体粒子に連結したＴＮＡＰ結合因子に対する抗体とを接触させ、この場合、ＴＮＡＰ結合因子に結合した細胞の分離は、液相から特定の相を分離することによって行う。
【００３２】
本発明のさらなる例において、細胞サンプルの細胞は、固体支持体上で培養された付着細胞であり、未結合ＴＮＡＰ結合因子の除去は、すすぎによって行う。
【００３３】
本発明のさらなる例では、細胞サンプルの細胞を浮遊状態で培養し、未結合ＴＮＡＰ結合因子の除去は、その細胞サンプルを遠心分離し、結果として生じた上清を分離除去することによって行う。
【００３４】
さらなる例では、細胞サンプルをさらなる細胞選別手順に付して、少なくとも１つのさらなる多能性細胞マーカーを発現する細胞中の細胞集団を富化または減少させる。この多能性細胞マーカーは、ＬＦＡ−３、ＴＨＹ−１、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＰＥＣＡＭ−１、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、ＣＤ４９ａ／ＣＤ４９ｂ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｃ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｄ／ＣＤ２９、ＣＤ２９、ＣＤ１８、ＣＤ６１、インテグリンベータ，６−１９、トロンボモジュリン、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＳＣＦ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＥＧＦ−Ｒ、ＩＧＦ１−Ｒ、ＮＧＦ−Ｒ、ＦＧＦ−Ｒ、レプチン−Ｒ、（ＳＴＲＯ−２＝レプチン−Ｒ）、ＲＡＮＫＬ、ＳＴＲＯ−１（好ましくはＳＴＲＯ−１bri）およびＣＤ１４６から成る群より選択される１つまたはそれ以上のマーカーまたはこれらのマーカーの任意の組み合わせであり得る。
【００３５】
本発明は、本発明の方法によって得られるような成体多能性細胞の富化集団も提供する。
【００３６】
本発明は、ＴＮＡＰ＋成体多能性細胞の富化集団も提供する。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態において、全富化細胞集団の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％が、表現型ＴＮＡＰ＋を有する成体多能性細胞である。
【００３８】
１つの実施形態において、本発明の富化集団の培養は、マーカーとしてＳＴＲＯ−１を使用して選択し、同じ条件下で培養した細胞と比較したとき、ＳＴＲＯ＋である細胞をより高い比率で生じさせる。好ましくは、こうした培養は、約４または約６継代にわたる。好ましくは、これらの細胞は、骨髄から得たものである。
【００３９】
もう１つの実施形態において、本発明の富化集団は、ＣＤ４５＋である細胞を約７９％から約９９％、さらに好ましくは約８４％から約９４％、およびさらにいっそう好ましくは約８９％含む。
【００４０】
好ましくは、成体多能性細胞の富化集団は、本発明の方法によって得たものである。
【００４１】
本発明は、本発明に従って成体多能性細胞の富化集団を培養することによって得られた増幅細胞集団も提供する。
【００４２】
１つの実施形態において、本発明の富化細胞集団または本発明の増幅細胞集団は、遺伝子改変されている細胞を少なくとも一部は含む。
【００４３】
本発明は、組織特異的コミットメントを受けた細胞集団を生成する方法も提供し、この方法は、
１つまたはそれ以上の刺激因子の存在下で本発明の成体多能性細胞の集団を培養すること；および
前記培養集団を、特定の組織タイプに成体多能性細胞の分化を偏らせる条件に置くこと
を含む。
【００４４】
本発明のこの方法の１つの実施形態において、組織タイプは、心筋、血管組織、骨組織、軟骨組織、脂肪組織、神経組織、平滑筋および内皮組織から成る群より選択される。
【００４５】
本発明は、本発明の富化成体多能性細胞および／または本発明の増幅細胞集団を含む組成物を包含することも理解されるだろう。
【００４６】
好ましい実施形態において、本組成物は、刺激因子をさらに含む。こうした組成物は、治療に有益である可能性が高く、それ故、医薬的に許容される形態で作製される。
【００４７】
本組成物中に存在する刺激因子のレベルは、経験に基づいて決定することができるが、ほとんどの場合、ミリリットル当たりナノグラムから数十ナノグラム程度である可能性が高い。
【００４８】
本発明の方法において用いられる、および／または本発明の組成物中に存在する刺激因子は、細胞分裂および／または分化を促進することができる任意の適する因子であり得る。こうした因子は、当分野において周知であり、それらには、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3（１，２５Ｄ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）および間質由来因子１α（ＳＤＦ−１α）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
もう１つの実施形態において、本組成物は、１つの特定の組織タイプに本発明の成体多能性細胞の分化を偏らせる因子をさらに含む。好ましくは、この組織タイプは、心筋、血管組織、骨組織、軟骨組織、脂肪組織、神経組織、平滑筋および内皮組織から成る群より選択される。
【００５０】
骨前駆細胞または骨に本発明の成体多能性細胞の分化を偏らせる条件は、例えば、１０％ＦＣＳ、１００μＭ Ｌ−アスコルベート−２−ホスフェート、デキサメタゾン １０-7Ｍおよび３ｍＭ 無機ホスフェートを追加したαＭＥＭ中での培養を含み得る。これらの条件が、石灰化骨基質をインビトロで発現させるようにヒト骨髄間質細胞を誘導することは、証明されている（Gronthos et al., 1994）。
【００５１】
骨芽細胞に本発明の成体多能性細胞を分化させるために適する条件は、Ｉ型コラーゲン、フィブリノゲン、フィブリン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、オステオカルシンまたはオステオネクチンの存在下で細胞を培養することを含み得る。１つの特定の例において、細胞は、Ｉ型コラーゲン、フィブリノゲンおよびフィブリンの存在下で培養される。別の例では、細胞は、Ｉ型コラーゲン、フィブリノゲン、フィブリン、オステオカルシンおよびオステオネクチンの存在下で培養される。この方法に関連して、Ｉ型コラーゲン、フィブリノゲン、フィブリン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、オステオカルシンまたはオステオネクチンは、単独で使用されることもあり、または成長因子と併用されることもある。この段落中の上に挙げた化合物の任意の組み合わせが、本発明によって意図されることは、理解されるであろう。
【００５２】
さらなる実施形態において、本発明の組成物は、フィブリン糊をさらに含む。
【００５３】
本発明は、本発明の富化細胞集団または増幅細胞集団を被験者に投与することを含む、被験者において組織を生成または修復する方法も提供する。
【００５４】
本発明は、本発明の組成物を被験者に投与することを含む、被験者において組織を生成または修復する方法も提供する。
【００５５】
本発明に従って得られた多能性細胞の富化細胞集団または増幅細胞集団は、例えば骨の形成および修復において使用することができ、従って、多能性細胞と適する支持体の組み合わせを、骨形成が必要な部位に導入することができる。従って、例えば、骨損傷または腫瘍に感染した部分の骨の除去に起因する骨格欠損は、リン酸カルシウムセラミックビヒクルに含まれた培養成体多能性細胞または増幅成体多能性細胞をその欠損部位に移植することによって、修復することができる。適切な方法および技術については、米国特許第５，２２６，９１４号および同第５，８３７，５３９号におけるＣａｐｌａｎらの方法および技術を参照のこと。これらの特許は、両方とも、本発明と比較した場合、より粗製の幹細胞製剤を使用している。
【００５６】
加えて、本富化細胞集団または組成物は、補綴装置のアンカーを補助するために使用することができる。例えば、股関節、膝関節および肩関節置換術において使用されるものなどの補綴装置の表面を、移植前に本富化多能性細胞でコーティングすることができる。本多能性細胞は、その後、骨形成原細胞に分化して、その結果、骨移入および補綴装置組み込みのプロセスを加速させることができる（米国特許第５，２２６，９１４号および同第５，８３７，５３９号におけるＣａｐｌａｎら参照）。
【００５７】
本富化細胞集団または組成物は、例えば、富化集団がそれに形質転換させた外因性核酸を有することができ、その上、そうした集団を患者の体内に導入して疾病または状態を治療することができるため、遺伝子療法においても使用することができる。あるいは、治療薬の放出に用いることができる。適切な技術については、Ｇｅｒｓｏｎらによる米国特許第５，５９１，６２５号を参照する。これは、本発明と比較した場合、より粗製の幹細胞製剤を使用している。
【００５８】
あるいは、本富化集団または組成物は、骨髄移植を強化するために使用することができ、この場合、富化成体多能性細胞を含有する組成物は、骨髄移植を受ける患者に全骨髄の導入前に注入することができる。このようにして、造血の速度を、特に放射線療法または化学療法後、増加させることができる。本組成物は、多能性細胞と造血細胞の混合物も包含することができ、これは、放射線療法または化学療法において有用であり得る。
【００５９】
被験者における組織の生成または修復用の薬物を製造するための本発明の富化細胞集団または増幅細胞集団の使用も提供する。
【００６０】
被験者における組織の生成または修復用の薬物を製造するための本発明の組成物の使用も提供する。
【００６１】
本発明は、本発明の方法によって得られた単離細胞、その子孫細胞も提供し、細胞は、遺伝子改変される。
【００６２】
好ましい実施形態において、細胞は、異種タンパク質を発現するように遺伝子改変される。この異種タンパク質は、関心のある任意のタンパク質であり得る。例えば、異種タンパク質は、刺激因子、例えば、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3（１，２５Ｄ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）および間質由来因子１α（ＳＤＦ−１α）であり得る。
【００６３】
もう１つの例では、異種タンパク質は、特定の組織タイプへの成体多能性細胞の分化を促進する生物活性因子である。この生物活性因子は、例えば、合成グルココルチコイド、例えばデキサメタゾン、または骨形態形成タンパク質、例えばＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６またはＢＭＰ−７であり得る。
【００６４】
本発明は、ブタペスト条約の条項のもと受託番号ＰＴＡ−７２８２で２００５年１２月１９日にＡＴＣＣに寄託された［ＳＴＲＯ−３］ハイブリドーマ細胞株も提供する。
【００６５】
本発明は、ブタペスト条約の条項のもと受託番号ＰＴＡ−７２８２で２００５年１２月１９日にＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されたＳＴＲＯ−３抗体も提供する。
【００６６】
本発明は、ブタペスト条約の条項のもと受託番号ＰＴＡ−７２８２で２００５年１２月１９日にＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されたＳＴＲＯ−３抗体と同じ、多能性細胞上のエピトープに結合する、単離抗体も提供する。
【００６７】
本発明は、本発明の抗体を含む組成物も提供する。好ましくは、本組成物は、１つまたはそれ以上の適する担体をさらに含む。
【００６８】
本発明の富化細胞集団、本発明の増幅細胞集団、本発明の組成物、本発明の単離細胞、本発明のハイブリドーマおよび／または本発明の抗体を含むキットも提供する。
【００６９】
本明細書を通して、「含む（comprise）」という語または語尾変化形、例えば「含む（comprises）」「含むこと（comprising）」は、述べられている要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしくは工程の群の包含を意味し、任意の他の要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしくは工程の群の排除を意味しないことは理解されるであろう。
【００７０】
上の個々のセクションにおいて言及した本発明の様々な特徴および実施形態は、適切な場合には、必要な変更を加えて他のセクションにも適用できる。
【００７１】
従って、あるセクションにおいて明記されている特徴と他のセクションにおいて明記されている特徴とを、適切な場合には併用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７２】
微生物寄託の詳細
ＳＴＲＯ−３と称するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、２００５年１２月１９日、米国微生物系統保存機関（American Type Culture Collection: ATCC）に受託番号ＰＴＡ−７２８２で寄託された。
【００７３】
この寄託は、特許手続きを目的とした微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の条項およびそれらの規定のもとで行われた。これは、寄託日から３０年間、生培養物の保存を保証する。該当特許の発行に基づき、その培養物の後代の永久的で制約の無い利用可能性を公衆に保障するブタペスト条約の約定のもとでＡＴＣＣによりこれらの生物を利用可能できるようになる。
【００７４】
本出願の譲受人は、その培養寄託物が、適する条件下で培養されて死んだまたは失われたまたは破壊された場合、通知に基づき同じ培養物の生存能力のある標品と速やかに交換することに同意している。寄託株の利用可能性は、任意の政府の権限のもとでその特許法に従って与えられた権利に反する本発明の実施に対するライセンスと解釈すべきではない。
【００７５】
一般的技術
特に別様に定義されていない限り、本明細書において用いるすべての技術および科学用語は、（例えば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学および生化学における）当業者により一般に理解されているのと同じ意味を有すると解釈するものとする。
【００７６】
別様に指示されていない限り、本発明において利用する組換えタンパク質、細胞培養および免疫学的技術は、当業者には周知の標準的な手技である。こうした技術は、J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John. Wiley and Sons (1984)、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)、 T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991)、D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996)、およびF.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub, Associates and Wiley-Interscience (1988, 現在までのすべての改訂版を含む)、Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)、およびJ.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (現在までのすべての改訂版を含む)などの出典に、その文献全体にわたって記載および説明されている。
【００７７】
成体多能性細胞
「成体多能性細胞」とは、幾つかの成熟細胞タイプのうちのいずれかを生じさせることができる、成体組織由来の細胞を意味する。本明細書において用いる場合、このフレーズは、成体幹細胞および始原細胞、例えば間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）およびこれらの細胞の多能性子孫を包含する。
【００７８】
間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）は、骨髄、血液、真皮および骨膜において見出される細胞であり；ならびに脂肪組織、骨組織、軟骨組織、弾性組織、筋肉組織および線維性結合組織をはじめとする特定のタイプの間葉系組織または結合組織に分化することができる。これらの細胞が入る特定の系統コミットメントおよび分化経路は、機械的影響、および／または内因性生物活性因子、例えば成長因子、サイトカイン、および／または宿主組織により確立される局所的微小環境条件からの様々な影響に依存する。間葉系前駆細胞は、最終分化しておらず、制限なく分裂することができ、且つ、分裂して幹細胞である娘細胞を生じさせる、またはいずれは不可逆的に分化して１つの表現型の細胞を生じさせる始原細胞を生じさせる細胞と定義する。ＭＰＣは、多数の多能性細胞を形成することができる非造血始原細胞である。
【００７９】
用語「富化された」、「富化」またはこれらの語尾変化形は、１つの特定の細胞タイプの比率または多数の特定の細胞タイプの比率が未処理の集団と比較して増加されている細胞の集団を記述するために本明細書では用いる。
【００８０】
本発明の好ましい実施形態において、全富化細胞集団の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％が、表現型ＴＮＡＰ＋を有する成体多能性細胞である。
【００８１】
特に好ましい実施形態において、本発明のＴＮＡＰ＋細胞は、ブタペスト条約の条項のもと受託番号ＰＴＡ−７２８２で２００５年１２月１９日にＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されたＳＴＲＯ−３抗体に結合することができる。
【００８２】
１つの実施形態において、本発明の富化集団は、ＣＤ４５＋である細胞を約７９％から約９９％、さらに好ましくは約８４％から約９４％、およびさらにいっそう好ましくは約８９．２％含む。
【００８３】
もう１つの実施形態において、本発明の富化集団は、ＣＤ３４＋である細胞を約２％未満、さらに好ましくは約１％未満含む。もう１つの実施形態において、本富化集団は、ＣＤ３４＋である細胞を含まない。
【００８４】
もう１つの実施形態において、本発明の富化集団は、ＣＣ９＋である細胞を約６％未満、さらに好ましくは約３．５％未満含む。
【００８５】
さらなる実施形態において、本発明の富化集団は、３Ｇ５＋である細胞を約２３％から約３％、さらに好ましくは約８％から約１８％、およびさらにいっそう好ましくは約１３．２％含む。
【００８６】
さらなる実施形態において、本発明の富化集団は、ＳＴＲＯ−１＋である細胞を約１２％から約３％、さらに好ましくは約１０％から約６％、およびさらにいっそう好ましくは約７．８％含む。
【００８７】
さらなる実施形態において、本発明の富化細胞集団は、インビトロで培養されたものではない。
【００８８】
さらに、好ましい実施形態において、本発明の富化細胞集団は、クローン形成性ＣＦＵ−Ｆを生じさせることができる。
【００８９】
ある実施形態において、本発明の富化集団の培養は、マーカーとしてＳＴＲＯ−１を使用して選択し、同じ条件下で培養した細胞と比較したとき、ＳＴＲＯ＋である細胞をより高い比率で生じさせる。好ましくは、こうした培養は、約４または約６継代にわたる。好ましくは、これらの細胞は、骨髄から得たものである。
【００９０】
さらなる実施形態において、本発明の富化集団の培養は、例えば２、４または６継代後、出発細胞集団と比較したとき、ＳＴＲＯ＋である子孫細胞数の増加を生じさせる。比較して、ＳＴＲＯ−１富化細胞の培養は、例えば４または６継代後、出発（ＳＴＲＯ−１選択）細胞集団と比較したとき、ＳＴＲＯ＋である子孫細胞の数の減少を生じさせる。
【００９１】
もう１つの実施形態において、本富化細胞集団は、ＴＮＡＰ＋細胞に相同である。
【００９２】
本発明は、本発明の成体多能性細胞のインビトロ培養物から産生される子孫細胞（本明細書では増幅細胞とも呼ぶ）にも関する。本発明の増幅細胞は、培養条件（その培地中の刺激因子の数および／またはタイプを含む）および継代数などに依存して、広範な表現型を有し得る。
【００９３】
１つの実施形態において、こうした増幅細胞は（少なくとも５継代後）、ＴＮＡＰ−、ＣＣ９+、ＨＬＡクラスＩ+、ＨＬＡクラスＩＩ-、ＣＤ１４-、ＣＤ１９-、ＣＤ３-、ＣＤ１１ａ〜ｃ-、ＣＤ３１-、ＣＤ８６-、および／またはＣＤ８０-であり得る。しかし、本明細書に記載のものとは異なる培養条件下で、種々のマーカーの発現が変わり得る可能性がある。また、これらの表現型の細胞が、本増幅細胞集団では優勢であり得るが、それは、この（これらの）表現型を有さない、より低い比率の細胞が存在する（例えば、本増幅細胞のうちのわずかな比率がＣＣ９−であり得る）という意味ではない。１つの好ましい実施形態において、本発明の増幅細胞は、異なる細胞タイプに分化する能力を、尚、有する。
【００９４】
１つの実施形態において、本発明の増幅細胞集団は、少なくとも２５％、さらに好ましくは少なくとも５０％がＣＣ９＋である細胞を有する。
【００９５】
もう１つの実施形態おいて、本発明の増幅細胞集団は、少なくとも４０％、さらに好ましくは少なくとも４５％の細胞がＳＴＲＯ−１＋である細胞を有する。
【００９６】
さらなる実施形態において、本発明の富化集団の培養は、ＬＦＡ−３、ＴＨＹ−１、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＰＥＣＡＭ−１、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、ＣＤ４９ａ／ＣＤ４９ｂ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｃ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｄ／ＣＤ２９、ＣＤ２９、ＣＤ１８、ＣＤ６１、インテグリンベータ，６−１９、トロンボモジュリン、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＳＣＦ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＥＧＦ−Ｒ、ＩＧＦ１−Ｒ、ＮＧＦ−Ｒ、ＦＧＦ−Ｒ、レプチン−Ｒ、（ＳＴＲＯ−２＝レプチン−Ｒ）、ＲＡＮＫＬ、ＳＴＲＯ−１brightおよびＣＤ１４６から成る群より選択されるマーカーまたはこれらのマーカーの任意の組み合わせも発現し得る成体多能性細胞を生じさせる。
【００９７】
本成体多能性細胞の有意な比率が、少なくとも２つの被コミットメント細胞タイプに分化することができることが好ましい。本成体多能性細胞がコミットメントされ得る系統の非限定的な例としては、骨前駆細胞；胆管上皮細胞および肝細胞に向けて多分化能性である始原肝細胞；乏突起膠細胞および星状細胞に進むグリア細胞前駆体を生じさせることができる神経限定細胞；神経細胞に進む神経前駆細胞；心筋および心筋細胞、グルコース反応性インスリン分泌膵臓ベータ細胞株についての前駆体が挙げられる。他の系統としては、象牙質芽細胞、象牙質生産細胞および軟骨細胞、ならびに以下の細胞の前駆細胞：網膜色素上皮細胞、線維芽細胞、皮膚細胞、例えばケラチノサイト、樹状細胞、毛包細胞、腎管上皮細胞、平滑筋および骨格筋細胞、精巣始原細胞、血管内皮細胞、腱細胞、靭帯細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、骨髄間質細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、周皮細胞、血管細胞、上皮細胞、グリア細胞、ニューロン細胞、星状細胞および乏突起膠細胞、が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、本成体多能性細胞は、脂肪細胞、骨細胞および／または軟骨細胞を産生するようにインビボまたはインビトロで培養することが、少なくともできる。
【００９８】
もう１つの実施形態において、本発明の「成体多能性細胞」は、培養により、造血細胞を生じさせることができない。
【００９９】
用語「成体」は、その最も広い意味で用いて、生後の被験者を含む。好ましい実施形態において、用語「成体」は、思春期後である被験者を指す。本明細書において用いられる場合、用語「成体」は、女性から得た臍帯血も含むことができる。用語「成体」は、胚および／胎児から得た細胞を含まない。従って、本発明の「成体多能性細胞」を「非胚性多能性細胞」とみなすこともできる。
【０１００】
ある細胞を所与のマーカーに対して「ポジティブ」であると呼ぶとき、それは、そのマーカーが細胞表面に存在する程度に依存してそのマーカーの低（ｌｏまたは暗い（ｄｉｍ））発現である場合もあり、または高（明るい（ｂｒｉｇｈｔ、ｂｒｉ））発現である場合もあり、これらの用語は、細胞の色彩選別プロセスにおいて使用される蛍光または他の色彩の強度に関する。ｌｏ（または暗い（ｄｉｍ）または鈍い（ｄｕｌｌ））とｂｒｉの区別は、選別される特定の細胞集団に対して使用するマーカーに関連して理解されるであろう。本明細書において、ある細胞を所与のマーカーに対して「ネガティブ」であると呼ぶとき、それは、そのマーカーがその細胞によってまったく発現されないという意味ではない。そのマーカーが、その細胞によって相対的に非常に低いレベルで発現されること、および検出可能に標識されたときに非常に低いシグナルを生じさせることを意味する。
【０１０１】
本明細書において用いられる場合、用語「明るい」は、検出可能に標識されたときに相対的に高いシグナルを生じさせる、細胞表面上のマーカーを指す。理論により限定されることを望まないが、「明るい」細胞は、そのサンプル中の他の細胞より多くのターゲットマーカー蛋白（例えば、ＳＴＲＯ−１によって認識される抗原）を発現することを提案する。例えば、ＳＴＲＯ−１bri細胞は、ＦＩＴＣ結合型ＳＴＲＯ−１抗体で標識したとき、ＦＡＣＳ分析によって判定して、明るくない細胞（ＳＴＲＯ−１dull/dim）より大きな蛍光シグナルを生じさせる。好ましくは、「明るい」細胞は、その出発サンプルに含有される最も明るく標識された骨髄単核細胞の少なくとも約０．１％を構成する。他の実施形態において、「明るい」細胞は、その出発サンプルに含有される最も明るく標識された骨髄単核細胞の少なくとも約０．１％。少なくとも約０．５％。少なくとも約１％、少なくとも約１．５％または少なくとも約２％を構成する。好ましい実施形態において、ＳＴＲＯ−１bright細胞は、ＳＴＲＯ−１表面発現について２log規模のより高い発現を有する。これは、「バックグラウンド」、すなわちＳＴＲＯ−１-である細胞を基準にして計算される。比較すると、ＳＴＲＯ−１dimおよび／またはＳＴＲＯ−１intermediate細胞は、ＳＴＲＯ−１表面発現について２log未満の規模のより高い発現、典型的には「バックグラウンド」の約１logまたはそれ未満の発現を有する。
【０１０２】
組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＰ）
本明細書で用いる場合、用語「ＴＮＡＰ」は、タンパク質のすべてのアイソフォームを包含すると解釈する。例えば、この用語は、肝臓アイソフォーム（ＬＡＰ）、骨アイソフォーム（ＢＡＰ）および腎臓アイソフォーム（ＫＡＰ）を包含する。好ましい実施形態において、ＴＮＡＰは、ＢＡＰである。特に好ましい実施形態において、ＴＮＡＰは、本明細書において用いられる場合、ブタペスト条約の条項のもと受託番号ＰＴＡ−７２８２で２００５年１２月１９日にＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されたＳＴＲＯ−３抗体に結合することができる分子を指す。
【０１０３】
本発明に関連して、ＴＮＡＰは、好ましくは、ヒトＴＮＡＰである。例えば、ＴＮＡＰは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むヒトＴＮＡＰであり得る。
【０１０４】
しかし、用語「ＴＮＡＰ」は、ヒト配列に限定されず、任意の供給源から得られる相同配列、例えば、下で論じるような、相同体、特にオルソログ（すなわち、ヒト以外の種から得られた相同体）、対立遺伝子変異体、ならびにこれらのフラグメントおよび合成ペプチドまたは誘導体も含むことは理解されるであろう。
【０１０５】
多数のＴＮＡＰオルソログが既に知られており、それらとしては、マウスＴＮＡＰ（配列番号２）およびラットＴＮＡＰ（配列番号３）が挙げられる。
【０１０６】
本発明の好ましい実施形態において、相同配列は、配列番号１、配列番号２または配列番号３で示されるような配列を有する少なくとも２０、好ましくは５０または１００のアミノ酸にわたって、アミノ酸レベルで少なくとも７０、８０または９０％同一、好ましくは少なくとも９５または９８％同一であるアミノ酸配列である。
【０１０７】
当分野では類似性（すなわち、類似した化学特性／機能を有するアミノ酸残基）の点から見て相同性を考えることもあるが、本発明の状況では、配列同一性の点から見て相同性を表現するほうが好ましい。ポリペプチドの同一％は、デフォルト設定と少なくともアミノ酸数５０の長さのクエリ配列とを用いてＦＡＳＴＡ（Pearson and Lipman, 1988）分析（ＧＣＧプログラム）により判定し、ＦＡＳＴＡ分析は、少なくともアミノ酸数５０の領域にわたって２つの配列をアラインする。さらに好ましくは、ＦＡＳＴＡ分析は、少なくともアミノ酸数１００の領域にわたって２つの配列をアラインする。さらに好ましくは、ＦＡＳＴＡ分析は、少なくともアミノ酸数２５０の領域にわたって２つの配列をアラインする。さらにいっそう好ましくは、ＦＡＳＴＡ分析は、少なくともアミノ酸数３５０の領域に対して２つの配列をアラインする。
【０１０８】
本発明のアミノ酸配列に関連して、および／または本発明において用いるために、用語「変異体」または「誘導体」は、アミノ酸配列からの、またはその配列への１つ（もしくはそれ以上の）アミノ酸の任意の置換、変型、修飾、代置（replacement）、欠失もしくは付加を包含するが、但し、結果として生じるアミノ酸配列が、好ましくは、天然のＴＮＡＰの生物活性の少なくとも２５から５０％、さらに好ましくは少なくとも実質的にそれと同じ活性を有することを条件とする。関連生物活性としては、天然ＴＮＡＰリガンドに結合するその変異体または誘導体の能力が挙げられる。
【０１０９】
一般に、天然のＴＮＡＰの対応する領域と比較した場合、変異体または誘導体のアミノ酸残基の好ましくは２０％、１０％または５％未満が改変されており、典型的にはこのパーセンテージが低いほどそのアミノ酸配列は短く、例えば、アミノ酸数２０またはそれ以下のアミノ酸配列の場合は５％未満である。
【０１１０】
用語「ＴＮＡＰ」は、本明細書における配列リストに記載の配列のフラグメントを含む、上述の完全長ポリペプチドおよびそれらの変異体のフラグメントを包含する。好ましいフラグメントとしては、エピトープを含むものが挙げられる。適するフラグメントは、長さがアミノ酸数少なくとも約６または７のもの、例えば、長さがアミノ酸数少なくとも１０、１２、１５または２０のものである。長さがアミノ酸数２００、１００または５０未満である場合もある。本配列リストに記載のポリペプチドならびにそれらの対立遺伝子変異体および種変異体のポリペプチドフラグメントは、保存的置換を含む、１つまたはそれ以上（例えば、２、３、５または１０）の置換、欠失または挿入を有する。例えば組換え技術によって、置換、欠失および／または挿入が成されている場合、好ましくは、本配列リストに記載のアミノ酸残基の２０％、１０％または５％未満が改変されている。
【０１１１】
ある実施形態において、用語ＴＮＡＰは、胎盤性ＡＰを包含しない。
【０１１２】
ＴＮＡＰ結合因子
本明細書で用いる場合、「ＴＮＡＰ結合因子」というフレーズは、ＴＮＡＰを認識するおよび／またはＴＮＡＰに結合する部分を指す。
【０１１３】
好ましいＴＮＡＰ結合因子は、ＴＮＡＰへの結合親和性を有すると特定されたポリペプチドまたは化合物である。例えば、ＴＮＡＰは、コラーゲン結合ループを有すると特性付けされている（Mornet et al., 2001）。従って、ＴＮＡＰ作用因子は、コラーゲン、好ましくはＩ型コラーゲンであってもよい。
【０１１４】
特に好ましいＴＮＡＰ結合因子は、（任意の供給源からの天然または組換え）抗ＴＮＡＰ抗体である。
【０１１５】
本発明において用いる場合、用語「抗体」は、エピトープ決定基に結合することができるインタクトな分子ならびにそれらのフラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖを含む。これらの抗体フラグメントは、その抗原または受容体と選択的に結合する何らかの能力を保持しており、次のように定義される：
【０１１６】
（１）Ｆａｂ、１本のインタクトな軽鎖と１本の重鎖の一部とを生じさせる酵素パパインでの全抗体の消化によって生成され得る、抗体分子の一価抗原結合フラグメントを含有するフラグメント；
【０１１７】
（２）Ｆａｂ’、全抗体をペプシンで処理し、その後、還元して１本のインタクトな軽鎖と１本の重鎖の一部を生じさせることにより得ることができる、抗体分子のフラグメント；抗体１分子につき２つのＦａｂ’フラグメントが得られる；
【０１１８】
（３）（Ｆａｂ’）２、全抗体を酵素ペプシンで処理し、その後の還元を伴わずに得ることができる、抗体のフラグメント；Ｆ（ａｂ）２は、２つのジスルフィド結合によって互いに保持されている２つのＦａｂ’フラグメントの二量体である；
【０１１９】
（４）Ｆｖ、２本の鎖として発現された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する、遺伝子操作されたフラグメントと定義される；ならびに
【０１２０】
（５）単鎖抗体（「ＳＣＡ」）、遺伝子融合単鎖分子に適するポリペプチドリンカーにより連結された軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含有する、遺伝子融合単鎖分子として遺伝子操作された分子と定義される。
【０１２１】
これらのフラグメントの製造方法は、当分野において公知である。（例えば、本明細書に参考として組み込まれる、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, New York (1988) 参照）。
【０１２２】
本発明の抗体は、ＴＮＡＰを発現する細胞、完全長ＴＮＡＰまたはそれらのフラグメントを免疫抗原として使用することにより作製することができる。動物を免疫するために使用されるペプチドは、翻訳ｃＤＮＡまたは化学合成から誘導されたものでよく、所望される場合には、それを精製し、担体タンパク質にコンジュゲートさせる。ペプチドに化学的にカップリングさせる、そのような一般に使用されている担体としては、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、サイログロブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、および破傷風トキソイドが挙げられる。その後、そのカップリングさせたペプチドを使用して、動物（例えば、マウスまたはウサギ）を免疫することができる。
【０１２３】
所望される場合には、ポリクローナル抗体を、例えば、それらの抗体を生じさせた対象であるペプチドが結合しているマトリックスに結合させ、そのマトリックスから溶離することによって、さらに精製することができる。当業者は、モノクローナル抗体はもちろんポリクローナル抗体の精製および／または濃縮のための、免疫学では一般的な様々な技術を知っているだろう（例えば、参考として組み込まれる、Coligan, et al., Unit 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991参照）。
【０１２４】
モノクローナル抗体は、培養での連続継代性細胞株による抗体分子の産生の手だてとなる任意の技術、例えばハイブリドーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法など（Kohler et al., 1975；Kozbor et al., 1985；Cote et al., 1983；Cole etal., 1984）を用いて作製することができる。
【０１２５】
当分野において公知の方法により、抗体発現ライブラリーからＴＮＡＰへの結合を示す抗体を特定し、単離することもできる。
【０１２６】
ｍＡｂ ＳＴＲＯ−３のものと同じであるか、それに類似しているエピトープ特異性を有する抗体を、ＴＮＡＰ（例えば、細胞担持ＴＮＡＰ（例えば、ＭＰＣ）または単離ＴＮＡＰタンパク質もしくはそれらのフラグメント）への結合についての特定のｍＡｂのものと競合するそれらの能力によって、特定することができる。受容体キメラ（Rucker et al., 1996）または当業者に公知である他の技法を用いて、ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂの結合部位をマッピングすることができる。
【０１２７】
あるモノクローナル抗体が、ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂと同じ特異性を有するかどうかは、前者が、後者がＴＮＡＰに結合するのを妨げるかどうかを確かめることにより、過度の実験を伴わずに判定することもできる。ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂによる結合の減少によって証明されるように、試験するモノクローナル抗体が、ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂと競合する場合には、それら２つのモノクローナル抗体は、同じまたは近縁のエピトープに結合している。
【０１２８】
モノクローナル抗体がＳＴＲＯ−３ ｍＡｂの特異性を有するかどうかを判定するさらにもう１つの方法は、試験するモノクローナル抗体をＴＮＡＰと共に予めインキュベートし、その後、ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂを添加して、ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂが、ＴＮＡＰに結合するその能力を阻害するかどうかを判定することである。ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂの結合が阻害された場合には、おそらく、試験したモノクローナル抗体は、ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂと同じまたは機能的に等価のエピトープ特異性を有する。
【０１２９】
本発明において有用なモノクローナル抗体は、その抗体のアイソタイプを変更するように工学的に製造することができる。例えば、ＩｇＧ２ＡアイソタイプをＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ｂまたは他のアイソタイプとして工学的に製造することができる。
【０１３０】
本発明の抗体などのＴＮＡＰ結合因子を、例えば細胞分離、治療または診断用途において有用である化合物にコンジュゲートできることは、理解されるであろう。１つの例では、本発明の抗体を標識にコンジュゲートさせる。この標識は、その存在を容易に検出することができる、いずれの実在であってもよい。例えば、この標識は、直接標識、例えば、Ｍａｙらの米国特許第５，６５６，５０３号に詳細に記載されているものであり得る。直接標識は、それらの自然な状態で、裸眼で、または光学フィルターおよび／または印加刺激、例えば蛍光を促進するためにＵＶ線を利用して、容易に見ることができる実在である。例としては、放射性化合物、化学発光化合物、電気活性化合物（例えば、レドックス標識）および蛍光化合物が挙げられる。粒状直接標識、例えば、染料ゾル、金属ゾル（例えば、金）および着色ラテックス粒子も非常に適し、ならびに、蛍光化合物との併用が、好ましい。これらの選択肢のうち、着色ラテックス粒子および蛍光化合物が、最も好ましい。小さなゾーンまたは容量に標識を集中させることによって、容易に検出できるシグナル、例えば強く着色された領域を生じさせることができる。酵素、例えばアルカリホスファターゼおよびホースラディッシュペルオキシダーゼ、などの間接標識を用いることもできるが、これらは、通常、１つまたはそれ以上の現像試薬、例えば基質の添加を必要とし、その後、可視シグナルを検出できる。
【０１３１】
本発明の抗体などの結合因子への標識のコンジュゲーションは、共有もしくは非共有結合（疎水性結合を含む）または吸収によるものであり得る。こうしたコンジュゲーションのための技法は、当分野ではありふれたものであり、利用される特定の試薬に容易に合わせることができる。
【０１３２】
本発明の抗体などの、本発明の方法において使用するための結合因子は、固体支持体にコーティングすることもできる。たとえば、本抗体は、合成プラスチック材料、磁性粒子、マイクロタイターアッセイプレート、マイクロアレイチップ、ラテックスビーズ、セルロースまたは合成ポリマー材料を含むフィルター、ガラスまたはプラスチック製スライド、計量棒、キャピラリー充填装置などにコーティングすることができる。
【０１３３】
本発明の抗体などの、本発明の方法において使用するための結合因子は、細胞分離用装置に組み込むこともできる。例えば、その装置は、ＭＡＣＳ技術に基づく自動細胞選択装置であってもよい。こうした装置は、密閉された無菌のシステムでの大規模な磁気細胞選択を可能にする。例えば、その装置は、統合コンピューター、磁気分離ユニット、蠕動式ポンプおよび様々なピンチ弁を含み得る。好ましくは、統合ピューターが、その装置のすべての構成要素を制御し、標準的な順序で処理を行うようにそのシステムに命令する。好ましくは、磁気分離ユニットは、可動性永久磁石と、選択カラム用のホルダーとを含む。好ましくは、蠕動式ポンプは、そのチューブセットを通して流量を制御する。ピンチ弁を使用して、バッファーおよび細胞懸濁液の流れを確実に制御することができる。選択前、本発明の抗体を使用することによって細胞を磁気標識する。その後、分離カラムを含む使い捨てチューブセットをその装置に取り付け、標識細胞を収容した細胞調製バッグをそのチューブセットに接続することができる。選択プログラム開始後、そのシステムが、サンプルを分離カラムに自動的に適用し、選択したプログラムに依存して一連の洗浄工程を行い、最後に、精製されたターゲット細胞を溶出する。
【０１３４】
細胞選別技術
抗ＴＮＡＰ抗体などのＴＮＡＰ結合因子で成体多能性細胞を認識できることによって、組織サンプル中のこれらの細胞を特定および定量できるばかりでなく、懸濁状態でそれらを分離し、富化させることもできる。これは、細胞−抗体複合体に付随する特性または抗体に取り付けられた標識を参照することにより物理的に細胞を分離する多数の細胞選別技術によって、達成することができる。この標識は、磁性粒子である場合もあり、または蛍光分子である場合もある。抗体は、それらが多数の細胞の凝集体を形成するように架橋させることができ、凝集体をそれらの密度によって分離することができる。あるいは、所望の細胞を接着する固定マトリックスに抗体を取り付けてもよい。
【０１３５】
抗体結合細胞と未結合細胞とを分離する様々な方法が知られている。例えば、細胞に結合した抗体（または抗アイソタイプ抗体）を標識し、その後、その標識の存在を検出するメカニカルセルソーターによってそれらの細胞を分離することができる。蛍光活性化セルソーターは、当分野において周知である。１つの実施形態では、抗ＴＮＡＰ抗体を固体支持体に取り付ける。様々な固体支持体が当業者に知られており、それらとしては、アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、中空繊維膜、ポリマー、およびプラスチックペトリ皿が挙げられるが、これらに限定されない。抗体が結合した細胞は、その固体支持体を細胞懸濁液から単に物理的に分離することにより、細胞懸濁液から除去することができる。
【０１３６】
超常磁性微粒子を細胞分離に使用してもよい。例えば、微粒子を抗ＴＮＡＰ抗体でコーティングすることができる。その後、その抗体標識超常磁性微粒子を、関心のある細胞を含有する溶液と共にインキュベートする。微粒子が所望の成体多能性細胞の表面に結合し、その後、磁場でこれらの細胞を回収することができる。
【０１３７】
もう１つの例では、細胞サンプルを、例えば固相連結型抗ＴＮＡＰモノクローナル抗体と、物理的に接触させる。固相連結は、例えば、それらの抗体のプラスチック、ニトロセルロースまたは他の表面への吸着を含む。抗体を中空繊維膜の大きな気孔（細胞が流れて通ることができる十分な大きさ）の壁上に吸着させることもできる。あるいは、抗体を表面またはビーズ、例えばＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＭＢ  マクロビーズ、に共有結合させることができる。固相連結型抗体と成体多能性細胞含有懸濁液とをインキュベートするための正確な条件および継続時間は、利用されるシステムに特有の幾つかの要因に依存するであろう。しかし、適切な条件の選択は、十分に当業者の技術の範囲内である。
【０１３８】
十分な時間により成体多能性細胞を結合させた後、未結合細胞を溶離し、生理緩衝液で洗い流す。その後、所望の分離が達成したことを確実にするために適切な試験を行った後、未結合細胞を回収し、他の目的のために使用してもよいし、または廃棄してもよい。その後、それらの結合細胞は、主として固相および抗体の性質に依存して、任意の適する方法により、その固相から分離する。例えば、結合細胞は、激しく攪拌することによって、プラスチック製ペトリ皿から溶離することができる。あるいは、結合細胞は、固相と抗体の間の酵素感受性「スペーサー」配列を酵素的に「ニッキングすること」または消化することによって、溶離することができる。アガロースビーズに結合したスペーサーは、例えばＰｈａｒｍａｃｉａから市販されている。
【０１３９】
その後、その溶離した細胞富化画分は遠心分離によってバッファーでさらに洗浄することができ、富化画分または未結合画分のいずれかを、従来の技術に従って後の使用のために様々な状態で凍結保存することができ、または移植受容者に導入することができる。
【０１４０】
遺伝子改変細胞の産生
１つの実施形態において、本発明は、遺伝子改変細胞、特に、遺伝子改変した本発明の成体多能性細胞に関する。好ましくは、異種タンパク質を生じさせるように細胞を遺伝子改変する。典型的には、その異種タンパク質がそれらの細胞から分泌されるように細胞を遺伝子改変することとなる。しかし、ある実施形態では、ポリヌクレオチド、例えばｄｓＲＮＡ（典型的に、ＲＮＡサイレンシングのため）、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは触媒核酸（例えば、リボザイムもしくはＤＮＡザイム）をコードしている機能的非タンパク質を発現するように、細胞を改変することができる。
【０１４１】
遺伝子改変細胞は、少なくとも１つのサイトカインがそれらの改変細胞の成長を支援するために十分な量で存在する状態で、培養することができる。こうして得られた遺伝子改変細胞は、（例えば、移植において）直ちに使用してもよいし、インビトロで培養し、増幅させてもよいし、または後の使用のために保存してもよい。改変細胞は、当分野では周知の方法によって保存すること、例えば液体窒素中で凍結させること、ができる。
【０１４２】
本明細書で用いる場合、遺伝子改変は、外因性または外来ポリヌクレオチドの成体多能性細胞への導入または成体多能性細胞内の内因性遺伝子の改変を含む任意の遺伝子改変方法を包含する。遺伝子改変としては、形質導入（インビトロまたはインビボのいずれかでの宿主またはドナーから受容者への宿主ＤＮＡのウイルス媒介移入）、トランスフェクション（単離ウイルスＤＮＡゲノムでの細胞の形質転換）、リポソーム媒介移入、エレクトロポレーション、リン酸カルシウムトランスフェクションまたは共沈およびその他が挙げられるが、これらに限定されない。形質導入の方法としては、プロデューサー細胞（Bregni et al., 1992）での細胞の直接共培養、またはウイルス上清単独での、適する成長因子およびポリカチオンを伴うもしくは伴わない培養（Xu et al., 1994）が挙げられる。
【０１４３】
外因性ポリヌクレオチドは、好ましくは、ベクターで宿主細胞に導入する。好ましくは、ベクターは、挿入されるコード配列の転写および翻訳に必要な要素を含む。こうしたベクターを構築するために用いられる方法は、当分野では周知である。例えば、適する発現ベクターを構築する技術は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N. Y. (3rd Ed., 2000)；およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York (1999) に詳細に記載されている。
【０１４４】
ベクターとしては、ウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクター；コスミドベクター；プラスミドベクター；合成ベクター；ならびに当分野において一般に使用されている他の組換えビヒクルが挙げられるが、これらに限定されない。プロモーターと、ポリヌクレオチドを作動可能に連結することができるクローニング部位との両方を含有するベクターが、当分野において周知である。こうしたベクターは、インビトロまたはインビボでＲＮＡを転写することができ、またＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（カリフォルニア州ラ・ホーヤ（La Jolla, Calif)）およびＰｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（ウィスコンシン州マディソン（Madison, Wis））などの供給業者から市販されている。具体的な例としては、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのｐＳＧ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＸｔｌ；およびＰｈａｒｍａｃｉａからのｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＰＶおよびｐＳＶＫ３が挙げられる。
【０１４５】
好ましいベクターとしては、レトロウイルスベクター（Coffin et al., "Retroviruses", Chapter 9 pp; 437−473, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997参照）が挙げられる。本発明において有用なベクターは、当分野において周知の手順によって組換え産生することができる。例えば、ＷＯ９４／２９４３８、ＷＯ９７／２１８２４およびＷＯ９７／２１８２５には、レトロウイルスパッケージングプラスミドおよびパッキング細胞株の構築が記載されている。具体例としてのベクターには、ｐＣＭＶ哺乳動物発現ベクター、例えばｐＣＭＶ６ｂおよびｐＣＭＶ６ｃ（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．）、ｐＳＦＦＶ−Ｎｅｏ、ならびにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ＋が挙げられる。有用なレトロウイルスベクターの非限定的な例は、マウス、鳥または霊長類レトロウイルス由来のものである。一般的なレトロウイルスベクターとしては、モロニーマウス白血病ウイルスに基づくもの（ＭｏＭＬＶ−ベクター）が挙げられる。他のＭｏＭＬＶ由来ベクターとしては、Ｌｍｉｌｙ、ＬＩＮＧＦＥＲ、ＭＩＮＧＦＲおよびＭＩＮＴが挙げられる。さらなるベクターとしては、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）およびモロニーマウス肉腫ウイルス（ＭＯＭＳＶ）および脾臓病巣形成ウイルス（ＳＦＦＶ）に基づくものが挙げられる。マウス幹細胞ウイルス（ＭＥＳＶ）由来のベクターとしては、ＭＥＳＶ−ＭｉＬｙが挙げられる。
【０１４６】
レトロウイルスベクターは、レンチウイルスに基づくベクターも含み、非限定的な例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）に基づくベクターが挙げられる。
【０１４７】
レトロウイルスベクター構築物を産生させる際、ウイルスｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ配列をウイルスから除去して、外来ＤＮＡ配列の挿入のための余地を作ることができる。外来ＤＮＡによってコードされた遺伝子は、通常、長い末端反復配列（ＬＴＲ）における強いウイルスプロモーターの制御下で発現される。適切な制御調節配列の選択は、使用される宿主細胞に依存し、選択は、当業者の技術の範囲内である。ＬＴＲのプロモーターに加えて、非常の多数のプロモーターが知られている。非限定的な例としては、λファージＰＬプロモーター；ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時型初期プロモーター；モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭＭＳＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）または脾臓病巣形成ウイルス（ＳＦＦＶ）のＵ３領域プロモーター；グランザイムＡプロモーターおよびグランザイムＢプロモーターが挙げられる。加えて、誘導性または多制御要素を使用してもよい。適するプロモーターの選択は、当業者には明らかであろう。
【０１４８】
こうした構築物は、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ機能をパッキング細胞株によりトランスでもたらせば、ウイルス粒子に効率的にパッキングすることができる。従って、そのベクター構築物をパッケージング細胞に導入すると、細胞によって産生されたｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖタンパク質がそのベクターＲＮＡで組み立てられて、感染性ウイルス粒子（viron）を産生し、それらが培地に分泌される。このように産生されたウイルスは、ターゲット細胞に感染させ、そのＤＮＡに組み込むことができ、重要なパッケージング配列を欠くので感染性ウイルス粒子を産生しない。現在使用されているパッキング細胞株のほとんどが、必要コード配列のうちの１つを各々含有する別のプラスミドでトランスフェクトされたものであり、そのため、複製適合ウイルスを産生できるようになる前に多数の組換え事象を必要とする。あるいは、パッケージング細胞株は、プロウイルスを宿す（harbour）。プロウイルスは、感染性ウイルスを組み立てるために必要なすべてのタンパク質を産生できるが、その固有のＲＮＡはウイルスにパッケージングすることができないため、無能であった。代わりに、組換えウイルスから産生されるＲＮＡがパッケージングされる。従って、パッケージング細胞から放出されるウイルス株は、組換えウイルスしか含有しない。レトロウイルスパッケージング系の非限定的な例としては、ＰＡ１２、ＰＡ３１７、ＰＥ５０１、ＰＧ１３、ＰＳＬ．ＣＲＩＰ、ＲＤＩ  １４、ＧＰ７Ｃ−ｔＴＡ−Ｇ１０、ＰｒｏＰａｋ−Ａ（ＰＰＡ−６）、およびＰＴ６７が挙げられる。Miller et al., 1986；Miller et al., 1989；Danos et al., 1988；Pear et al., 1993；およびFiner et al., 1994参照。
【０１４９】
他の適するベクターとしては、アデノウイルスベクター（Frey et al., 1998；およびＷＯ  ９５／２７０７１参照）およびアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。これらのベクターは、例えば、Chatterjee et al., 1996；およびStem Cell Biology and Gene Therapy, eds. Quesenberry et al., John Wiley & Sons, 1998；ならびに米国特許第５，６９３，５３１号および同第５，６９１，１７６号に記載されているように、当分野ではすべて周知である。アデノウイルス由来ベクターの使用は、それらが非分裂性細胞を感染させることができないので、一定の状況下では有利であり得る。レトロウイルスＤＮＡとは異なり、アデノウイルスＤＮＡは、ターゲット細胞のゲノムには組み込まれない。さらに、外来ＤＮＡを担持する収容力は、レトロウイルスベクターよりアデノウイルスベクターにおけるほうがずっと大きい。アデノ随伴ウイルスベクターは、もう１つの有用な送達システムである。このウイルスのＤＮＡは、非分裂性細胞に組み込むことができ、アデノ随伴ウイルスベクターの使用により多数のポリヌクレオチドの異なる細胞タイプへの組み込みが成功している。
【０１５０】
一部の実施形態において、構築物またはベクターは、２つまたはそれ以上の非相同ポリヌクレオチド配列を含むであろう。好ましくは、その追加の核酸配列は、選択マーカー、構造遺伝子、治療遺伝子またはサイトカイン／ケモカイン遺伝子をコードするポリヌクレオチドである。
【０１５１】
選択マーカーは、成功した遺伝子改変をモニターするため、およびＤＮＡが組み込まれた細胞を選択するために、構築物またはベクターに含めることができる。非限定的な例としては、薬物耐性マーカー、例えば、Ｇ１４８またはヒグロマイシンが挙げられる。加えて、例えばそのマーカーがＨＳＶ−ｔｋ遺伝子である場合、ネガティブ選択を用いることができる。この遺伝子は、細胞を、アシクロビルおよびガンシクロビルなどの薬剤に対して感受性にするであろう。ＮｅｏＲ（ネオマイシン／Ｇ１４８耐性）遺伝子が一般に使用されているが、使用され得るそのターゲット細胞中にその遺伝子配列がまだ存在していないいずれの適便なマーカー遺伝子を使用してもよい。さらなる非限定的な例としては、低親和性神経成長因子（ＮＧＦＲ）、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＦＧＰ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ）、細菌ｈｉｓＤ遺伝子、マウスＣＤ２４（ＨＳＡ）、マウスＣＤ８ａ（ｌｙｔ）、ピューロマイシンまたはフレオマイシンに対する耐性を付与する細菌遺伝子、およびβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。
【０１５２】
追加のポリヌクレオチド配列は、同じベクターを用いて宿主細胞に導入してもよいし、または第二のベクターを用いて宿主細胞に導入してもよい。好ましい実施形態では、選択マーカーを、そのポリヌクレオチドと同じベクターを用いて含めることとなる。
【０１５３】
本発明は、その内因性遺伝子の発現がアップレギュレートされ、その結果、野生型成体多能性細胞と比較してコードされるタンパク質の生産が増すような、内因性遺伝子のプロモーター領域の遺伝子改変も包含する。
【０１５４】
刺激因子の投与
本発明の方法は、１つまたはそれ以上の刺激因子の使用を伴うことができる。さらに、本発明の組成物は、１つまたはそれ以上の刺激因子を含むことができる。
【０１５５】
１つの実施形態において、本発明の方法は、１つまたはそれ以上の刺激因子、例えば、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3（１，２５Ｄ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）および間質由来因子１α（ＳＤＦ−１α）を局所的に、全身的に、または局部的に、例えばインプラントまたはデバイス内に、投与することを含むことがある。
【０１５６】
特定の実施形態において、刺激因子に好ましい範囲は、０．１ｎＭ〜０．１Ｍ、０．１ｎＭ〜０．０５Ｍ、０．０５ｎＭ〜１５μＭまたは０．０１ｎＭ〜１０μＭであり得る。緩和すべき状態の重症度によって用量値が変わることがあることに注意しなければならない。任意の特定の被験者についての具体的な薬剤投与計画は、その個人の必要、およびそれらの組成物を投与する人またはそれらの組成物の投与を管理する人の専門家としての判断に従って、徐々に調整することができる。本明細書に記載の用量範囲は、単なる例示であり、それらの用量範囲に限定されず、用量範囲は、医師によって選択され得る。
【０１５７】
本組成物中の刺激因子の量は、その疾状、その個人の年齢、性別および体重などの要因に従って変わることがある。薬剤投与計画は、最適な治療応答をもたらすように調整することができる。例えば、単一のボーラスを投与することができ、幾つかに分割された用量をある期間にわたって投与することができ、または治療状況の緊急性による指示に応じて用量を比例的に減少もしくは増加させることができる。投与の容易さおよび用量の均一性のため、非経口組成物を投薬単位剤形で調合することが有利であり得る。本明細書で用いる場合、「投薬単位剤形」は、治療を受ける被験者にとって単位用量として適する物理的に別個の単位と指し；各単位は、必要な医薬用担体に関連して所望の治療効果を生じさせるように計算された、活性化合物の予め決定された量を含有する。
【０１５８】
医薬的に許容される担体または賦形剤を含む組成物の形態で刺激因子を投与できることは、理解されるであろう。
【０１５９】
本明細書で用いる場合、「医薬的に許容される担体」または「賦形剤」は、生理学的に適合性である任意およびすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌および抗真菌薬、等張および吸収遅延剤などを含む。１つの実施形態において、担体は、非経口投与に適する。あるいは、担体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、舌下または経口投与に適当であり得る。医薬的に許容される担体としては、滅菌水溶液または滅菌水性分散液、および滅菌注射溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が挙げられる。医薬活性物質のこうした媒体および薬剤の使用は、当分野では周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と非相溶性である場合を除き、本発明の医薬組成物ではそれらの使用が考慮される。補助活性化合物を本組成物に組み込むこともできる。
【０１６０】
被経口投与のための医薬調合物としては、リポソームを挙げることができる。リポソームおよびエマルジョンは、疎水性薬物に特に有用である送達ビヒクルまたは担体の周知の例である。その治療薬の生物学的安定性に依存して、タンパク質安定化のための追加的戦略が用いられることがある。さらに、ターゲット設定薬物送達システム（targeted drug delivery system）で、例えば、ターゲット特異的抗体でコーティングしたリポソームで、薬物を投与することができる。このリポソームは、ターゲットタンパク質に結合し、そしてそのターゲットタンパク質を発現する細胞によって選択的に吸収されるであろう。
【０１６１】
治療組成物は、一般に、製造および保管条件下で無菌および安定でなければならない。本組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高薬物濃度に適する他の規則構造として調合することができる。この担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）および適するこれらの混合物を含有する、溶媒または分散媒体であり得る。例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒径を維持することにより、および界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール）または塩化ナトリウムを組成物に含めると好適であろう。
【０１６２】
注射用組成物の持続吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンをその組成物に含めることによって、生じさせることができる。さらに、刺激因子は、持効性調合物で、例えば徐放性ポリマーを含む組成物で、投与することができる。活性化合物は、化合物が急速に放出されないようにする担体、例えば、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む放出制御調合物を用いて調製することができる。生体分解性、生体適合性ポリマー、例えばエチレン・酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、およびポリ乳酸・ポリグリコール酸コポリマー（ＰＬＧ）を使用することもできる。こうした調合物を調製するための多数の方法が、特許化されており、または一般に、当業者には公知である。
【０１６３】
加えて、刺激因子の懸濁液を適切な注射用油性懸濁液として調製することができる。適する親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油、例えばゴマ油；または合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチルもしくはトリグリセリド；またはリポソームが挙げられる。注射に用いることができる懸濁液は、その懸濁液の粘度を上昇させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストリン、も含有することがある。場合により、懸濁液は、適する安定剤、または化合物の溶解度を上昇させて高濃度溶液の調製を可能にする薬剤も含有することがある。
【０１６４】
滅菌注射用溶液は、上に列挙した成分の１つまたは組み合わせと共に、必要な量の活性化合物を適切な溶媒に配合し、必要に応じて、その後、滅菌濾過することによって、調製することができる。一般に、分散液は、塩基性分散媒体と上に列挙したものからの他の必要成分とを含有する滅菌ビヒクルに活性化合物を配合することによって、調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥およびフリーズドライであり、それによって、それらの予め滅菌濾過された溶液から、活性成分 ＋ 追加の任意の所望成分の粉末が得られる。本発明の別の態様によると、刺激因子は、その溶解性を強化する１つまたはそれ以上の追加の化合物と調合することができる。
【０１６５】
本組成物を吸入により投与すべき場合、それらは、加圧パックまたはネブライザーからのエーロゾルスプレー押し出しの形態で、ならびに適する噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適するガスを使用して、適便に送達することができる。加圧エーロゾルの場合、計量された量を送達するための弁を設けることにより、投薬量単位を決定することができる。本化合物と適する粉末基剤、例えばデンプンまたはラクトースとの粉末混合物を収容する、例えば吸入器において使用するためのゼラチンのカプセルおよびカードリッジを作ることもできる。
【０１６６】
細胞組成物
成体多能性細胞を含むものなどの本発明の細胞組成物は、骨、軟骨、腱、靭帯、筋肉、皮膚および他の結合組織ならびに神経、心臓、肝臓、肺、腎臓、膵臓、脳および他の器官組織をはじめとする、様々なタイプの組織の再生に有用である。
【０１６７】
一部の実施形態において、本発明の組成物は、例えば、細胞を支持するためならびに骨、軟骨、筋肉、神経、表皮および／または他の結合組織の表面の成長をもたらすために、適切なマトリックスと併用で投与することができる。マトリックスは、従来のマトリックス生体材料の形態のものであり得る。マトリックスは、細胞の徐放および／またはそれらを提供するために適切な環境をもたらすことができる。一部の実施形態では、様々なコラーゲンおよび非コラーゲンタンパク質がアップレギュレートされ、細胞から分泌されると予想される。この現象は、マトリックス沈着を増進させることによって組織再生を加速する。マトリックスタンパク質は、遺伝子操作された細胞においても発現させることができ、移植領域への移植細胞の植え付けおよび付着を増進させることができる。
【０１６８】
マトリックス材料の選択は、生体適合性、生体分解性、機械的特性、美容的外観および界面特性に基づく。それらの細胞ベースの組成物の特定の用途によって、適切な調合が規定されるであろう。組成物のための可能性のあるマトリックスは、生体分解性で化学的に規定されている硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、水酸アパタイト、ポリ乳酸およびポリ無水物であり得る。他の可能性のある材料は、骨または皮膚コラーゲンなどの生体分解性で、生物学的に十分に規定されているものである。さらなるマトリックスは、純粋なタンパク質または細胞外基質成分から成る。他の可能性のあるマトリックスは、焼成水酸アパタイト、バイオグラス、アルミン酸塩、または他のセラミックスなどの、非生体分解性で化学的に規定されているものである。マトリックスが、上述のタイプの材料、例えばポリ乳酸および水酸アパタイトまたはコラーゲンおよびリン酸三カルシウムのうちのいずれかの組み合わせから成る場合もある。バイオセラミックスは、組成、例えばカルシウム−アルミン酸塩−リン酸塩、および加工を変更して、孔径、粒径、粒子形状および生分解性を変更することができる。
【０１６９】
本発明の細胞組成物を使用して、正常に発育させるために組織の疾患、外傷または欠損の結果として軟骨または骨組織の修復または補充を必要とする患者を治療すること、または美容機能をもたらすこと、例えば、顔だちまたは身体の他の容貌を強化することができる。治療は、新たな軟骨組織または骨組織を生じさせるための本発明の細胞の使用を内含し得る。例えば、未分化前駆細胞または軟骨形成性分化誘導前駆細胞を含む組成物を使用して、軟骨の状態、例えば関節リウマチまたは変形性関節症、または軟骨の外傷性もしくは外科手術に起因する損傷を治療するために使用することができる。もう１つの例として、骨前駆細胞を含む組成物を使用して、代謝性および非代謝性骨疾患を含む骨の状態を治療することができる。骨の状態の例としては、半月板披裂、脊椎固定、椎間板除去、脊椎再建、骨折、骨／脊椎変形、骨肉腫、骨髄腫、骨形成異常、脊柱側彎症、骨粗鬆症、歯周病、歯骨量減少、骨軟化症、くる病、線維性骨炎、腎骨ジストロフィー、および骨ページェット病が挙げられる。
【０１７０】
本発明の細胞組成物は、単独で投与することができ、または他の細胞との混合物として投与することができる。本発明の組成物と共に投与することができる細胞としては、他の多能性（multipotent）または多分化能性（pluripotent）細胞または軟骨細胞、軟骨芽細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨の内側の細胞（bone lining cell）、幹細胞もしくは骨髄細胞が挙げられるが、これらに限定されない。異なるタイプの細胞を、投与の直前もしくは少し前に、本発明の組成物と混合してもよいし、またはそれらを、投与前、一定期間にわたって共培養してもよい。
【０１７１】
本発明の細胞組成物は、他の有益な薬物または生体分子（成長因子、栄養因子）と共に投与することができる。本成体多能性細胞を他の薬剤と共に投与する場合、それらは、他の薬剤と、単一の医薬組成物で一緒に投与してもよいし、または別々の医薬組成物で同時にもしくは逐次的に（他の薬剤の投与の前もしくは後、いずれかに）投与してもよい。共同投与することができる生物活性因子としては、抗アポトーシス剤（例えば、ＥＰＯ、ＥＰＯ模倣体（EPO mimetibody）、ＴＰＯ、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ、ＨＧＦ、カスパーゼ阻害剤）；抗炎症薬（例えば、ｐ３８ ＭＡＰＫ阻害剤、ＴＧＦ−ベータ阻害剤、スタチン、ＩＬ−６およびＩＬ−１阻害剤、ＰＥＭＩＲＯＬＡＳＴ、ＴＲＡＮＩＬＡＳＴ、ＲＥＭＩＣＡＤＥ、ＳＩＲＯＬＩＭＵＳおよびＮＳＡＩＤ（非ステロイド性抗炎症薬；例えば、ＴＥＰＯＸＡＬＩＮ、ＴＯＬＭＥＴＩＮ、ＳＵＰＲＯＦＥＮ）；免疫抑制／免疫調節薬（例えば、カルシニューリン阻害剤、例えば、シクロスポリン、タクロリムス）；ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ＳＩＲＯＬＩＭＵＳ、ＥＶＥＲＯＬＩＭＵＳ）；抗増殖薬（例えば、アザチオプリン、ミコフェノレートモフェチル）；コルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン、ヒドロコルチゾン）；抗体、例えば、モノクローナル抗ＩＬ−２Ｒアルファ受容体抗体（例えば、バシリキシマブ、ダクリツマブ）、ポリクローナル抗Ｔ細胞抗体（例えば、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）；抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）；モノクローナル抗Ｔ細胞抗体ＯＫＴ３））-；抗血栓剤（例えば、ヘパリン、ヘパリン誘導体、ウロキナーゼ、ＰＰａｃｋ（デキストロフェニルアラニン プロリン アルギニン クロロメチルケトン）、抗トロンビン化合物、血小板受容体拮抗薬、抗トロンビン抗体、抗血小板受容体抗体、アスピリン、ジピリダモール、プロタミン、ヒルジン、プロスタグランジン阻害剤、および血小板阻害剤）；および抗酸化物質（例えば、プロブコール、ビタミンＡ、アスコルビン酸、トコフェロール、コエンザイムＱ−１０、グルタチオン、Ｌ−システイン、Ｎ−アセチルシステイン）ならびに局所麻酔薬が挙げられる。もう１つの例として、本細胞は、本明細書に参考として組み込まれる米国特許第５，８２７，７３５号に記載されているような瘢痕抑制因子と共同投与することができる。
【０１７２】
１つの実施形態において、本発明の細胞組成物は、未分化細胞として、すなわち成長媒質（Growth Medium）として、投与することができる。あるいは、本細胞組成物は、培養中に所望の表現型、例えば骨形成性表現型、に向かって分化を刺激する条件に暴露した後、投与することができる。
【０１７３】
本発明の細胞組成物は、修復または再生が必要な部位に、外科的に移植すること、注入すること、（例えば、カテーテルもしくは注射器によって）送達することまたは別様に直接もしくは間接的に投与することができる。本細胞は、マトリックス（例えば、三次元スキャホールド）によって投与することができる。本細胞は、従来の医薬的に許容される担体を用いて投与することができる。本発明の細胞またはそれらの組成物もしくは成分（例えば、ＥＣＭ、細胞溶解産物、調整培地）の投与経路としては、筋肉内投与、経眼投与、非経口投与（静脈内投与を含む）、動脈内投与、皮下投与、経口投与および経鼻投与が挙げられる。非経口投与の特定の経路としては、筋肉内投与経路、皮下投与経路、腹腔内投与経路、脳内投与経路、心室内投与経路、脳室内投与経路、髄腔内投与経路、槽内投与経路、脊髄内投与経路および／または脊椎周囲投与経路が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７４】
細胞を半固体または固体装置で投与する場合、一般に、身体の正確な位置への手術移植が、適当な投与手段である。しかし、液体または流体医薬組成物は、より全身的な位置に（例えば、広汎な感染領域全体にわたって）投与することができ、そこから、例えば化学的シグナルへの応答によって、特定の位置に移動する。
【０１７５】
他の実施形態は、細胞の成分（例えば、細胞溶解産物もしくはそれらの成分）または産物（例えば、遺伝子改変によって産生された細胞外基質、栄養因子および他の生物学的因子）を含む医薬組成物を投与することによる治療方法を包含する。
【０１７６】
本明細書に記載する細胞組成物を投与するための剤形および薬剤投与計画は、個々の患者の状態、例えば、治療する状態の性質および程度、年齢、性別、体重および一般的な健康状態ならびに医師には公知の他の因子を考慮に入れて、良好な医療行為に従って顕出される。従って、患者に投与すべき医薬組成物の有効量は、当分野において知られているとおり、これらの考慮によって決定される。
【０１７７】
本発明の一部の実施形態において、本発明の細胞組成物での治療を開始する前に患者を免疫抑制することが必要でないまたは望ましくないことがある。従って、同種成体多能性細胞の移植が、または異種成体多能性細胞の移植でさえ、一部の組織では許容され得る。
【０１７８】
しかし、他の例では、細胞療法を開始する前に患者を薬理学的に免疫抑制することが望ましいまたは適切であることがある。これは、全身もしくは局所免疫抑制剤の使用によって達成することができ、またはカプセル封入された装置内に細胞を送達することによって達成することができる。成体多能性細胞は、免疫性体液因子および細胞に浸透できないが、それらの細胞および治療因子が必要とする栄養および酸素に対して透過性であるカプセルに封入することができる。好ましくは、カプセルの材料は、低アレルギー性であり、ターゲット組織に容易に、かつ安定的に配置され、ならびに移入された構造体に付加的な保護をもたらす。移植細胞への免疫反応を低減または排除するためのこれらおよび他の手段は、当分野では公知である。代案として、成体多能性細胞を、それらの免疫原性を減少させるように遺伝子改変してもよい。
【０１７９】
生きている患者における移植細胞の生存は、様々なスキャニング技術、例えば、コンピューター体軸断層撮影（ＣＡＴもしくはＣＴ）スキャン、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）または陽電子放射型断層撮影（ＰＥＴ）スキャンの使用によって判定することができる。移植物の生存の判定は、ターゲット組織を除去し、それを目視検査または顕微鏡により検査することによって死後に行うこともできる。あるいは、特定の系統の細胞に特異的である色素で細胞を処理することができる。トレーサー色素、例えばローダミンもしくは蛍光標識マイクロスフェア、ファストブルー、ビスベンズアミド、鉄の微粒子、または遺伝的導入レポーター遺伝子産物、例えばベータ−ガラクトシダーゼもしくはベータ−グルクロニダーゼ、によって、移植細胞を特定することもできる。
【０１８０】
被験者への移植細胞の機能的組み込みは、損傷または罹病した機能の回復、例えば、関節もしくは骨機能の回復、または機能の強化を試験することによって、評価することができる。
【０１８１】
本発明の細胞組成物は、１つまたはそれ以上の生物活性因子、例えば、限定されるものではないが、成長因子、分化誘導因子、細胞生存因子（例えば、カスパーゼ阻害剤）または抗炎症薬（例えば、ｐ３８キナーゼ阻害剤）を含むことができる。
【０１８２】
あるいは、移植すべき細胞を、そうした成長因子、抗酸化物質、抗アポトーシス剤または抗炎症薬を発現するように遺伝子操作することができる。
【０１８３】
本発明の医薬組成物は、医薬的に許容される担体中の、細胞の均一もしくは不均一集団、それらの細胞外基質もしく細胞溶解産物、またはそれらの調整培地を含むことができる。本発明の細胞のための医薬的に許容される担体としては、本発明の細胞またはそれらの組成物もしくは成分と有害に反応しない、適する有機または無機担体物質が挙げられる。それらが生体適合性であるという点で適する医薬的に許容される担体としては、水、塩溶液（例えば、リンガー溶液）、アルコール、油、ゼラチン、および炭水化物、例えばラクトース、アミロースまたはデンプン、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ならびにポリビニルピロリジンが挙げられる。こうした製剤は、滅菌することができ、所望される場合には、助剤、例えば、滑沢剤、保存薬、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝剤および着色剤と混合することができる。本発明での使用に適する医薬用担体は、当分野では公知であり、例えば、Pharmaceutical Sciences (17th Ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa.)およびＷＯ ９６／０５３０９に記載されている。
【０１８４】
選択された細胞外基質成分、例えば、当分野では公知の１つもしくはそれ以上のタイプのコラーゲン、および／または成長因子、血小板多血漿および薬物をはじめとする、１つまたはそれ以上の他の成分を移植細胞に添加することができる。あるいは、本発明の細胞を、成長因子のために発現および産生するように、遺伝子操作することができる。本発明の細胞の遺伝子工学的製造に関する詳細は、本明細書の中で提供する。
【０１８５】
非限定的な実施形態において、本発明の細胞を含む調合物は、新たな組織、例えば骨組織の産生が望まれる部位に直接投与するために調製される。例えば、限定としてではないが、本細胞を注射用のヒドロゲル溶液に懸濁させることができる。本発明での使用に適するヒドロゲルの例としては、自己組立て型（self-assembling）ペプチド、例えばＲＡＤ１６が挙げられる。あるいは、移入前に、本細胞を含有するヒドロゲル溶液を例えば金型の中で硬化させて、中に細胞が分散しているマトリックスを形成することができる。または、マトリックスが硬化したら、移入前に、それらの細胞構成体を培養して、それらの細胞を有糸分裂により増幅させることができる。ヒドロゲルは、水分子を捕捉してゲルを形成する三次元開放格子構造（three−dimensional open−lattice structure）を作るように共有結合、イオン結合または水素結合によって架橋されている、（天然または合成）有機ポリマーである。ヒドロゲルを形成するために使用することができる材料の例としては、多糖類、例えばアルギネートおよびその塩、ペプチド、ポリホスファジン、およびポリアクリレート（これらは、イオン架橋される）、またはブロックポリマー、例えばポリエチレンオキシド−ポリプロピレングリコールブロックコポリマー（これらは、それぞれ、温度もしくはｐＨによって架橋される）が挙げられる。一部の実施形態において、本細胞のための支持体は、生体分解性である。
【０１８６】
本発明の一部の実施形態において、調合物は、例えば、米国特許出願公開第２００２／００２２６７６号；Anseth et al., 2002；およびWang et al., 2003 に記載されているようなインサイチュー重合性ゲルを含む。
【０１８７】
一部の実施形態において、ポリマーは、水溶液、例えば水、緩衝食塩溶液、または水性アルコール溶液に少なくとも部分的に可溶性であり、それらは、荷電側基またはそれらの一価イオン塩を有する。カチオンと反応させることができる酸性側基を有するポリマーの例は、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、アクリル酸とメタクリル酸のコポリマー、ポリ（酢酸ビニル）、およびスルホン化ポリマー、例えばスルホン化ポリスチレンである。アクリル酸またはメタクリル酸とビニルエーテルモノマーまたはポリマーとの反応によって形成された酸性側基を有するコポリマーも使用することができる。酸性基の例は、カルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化（好ましくはフッ素化）アルコール基、フェノール性ＯＨ基、および酸性ＯＨ基である。
【０１８８】
アニオンと反応させることができる塩基性側基を有するポリマーの例は、ポリ（ビニルアミン）、ポリ（ビニルピリジン）、ポリ（ビニルイミダゾール）、および一部のイミノ置換ポリホスファゼンである。ポリマーのアンモニウムまたは第四級塩を、骨格窒素またはペンダントイミノ基から形成することもできる。塩基性側基の例は、アミノおよびイミノ基である。
【０１８９】
二価カチオンを用い、水中、室温でアルギネートをイオン架橋させて、ヒドロゲルマトリックスを形成することができる。これらの穏やかな条件のため、例えばＬｉｍへの米国特許第４，３５２，８８３号に記載されているように、アルギネートは、ハイブリドーマ細胞カプセル封入に最も一般的に用いられているポリマーである。Ｌｉｍプロセスでは、カプセル封入すべき生体材料を含有する水溶液を水溶性ポリマーの溶液に懸濁させ、その懸濁液を液滴にし、それらを、多価カチオンとの接触により別個のマイクロカプセルに構成し、その後、それらのマイクロカプセルの表面をポリアミノ酸で架橋させて、カプセル封入材料の周りに半透過性膜を形成する。
【０１９０】
ポリホスファゼンは、交互の単結合と二重結合によって隔てられた窒素およびリンから成る骨格を有するポリマーである。各リン原子は、２本の側鎖に共有結合している。
【０１９１】
架橋に適するポリホスファゼンは、大部分の側鎖基が、酸性であり、二価または三価カチオンと塩架橋を形成することができる。好ましい酸性側基の例としては、カルボン酸基およびスルホン酸基が挙げられる。加水分解安定性ポリホスファゼンは、二価または三価カチオン、例えばＣａ2+またはＡｌ3+によって架橋されるカルボン酸側基を有するモノマーで構成されている。イミダゾール、アミノ酸エステルまたはグリセロール側基を有するモノマーを組み込むことによって、加水分解により分解されるポリマーを合成することができる。例えば、ポリアニオン性ポリ［ビス（カルボキシラトフェノキシ）］ホスファゼン（ＰＣＰＰ）を合成することができ、それを、溶解多価カチオンを用いて、水性媒体中、室温またはそれより低い温度で架橋させて、ヒドロゲルマトリックスを形成する。
【０１９２】
生体分解性ポリホスファゼンは、少なくとも２つの異なるタイプの側鎖（多価カチオンと塩架橋を形成することができる酸性側基、ならびにインビボ条件下で加水分解する側基、例えばイミダゾール基、アミノ酸エステル、グリセロールおよびグルコシル）を有する。
【０１９３】
側鎖の加水分解は、そのポリマーの浸食を生じさせる。加水分解性側鎖の例は、非置換および置換イミダゾールおよびアミノ酸エステルであり、この場合、その基は、アミノ結合によってリン原子に結合されている（両方のＲ基がこの様式で結合しているポリホスファゼンポリマーは、ポリアミノホスファゼンとして知られている）。ポリイミダゾールホスファゼンの場合は、そのポリホスファゼン骨格上の一部の「Ｒ」基は、環窒素原子によってその骨格中のリンに結合しているイミダゾール環である。他の「Ｒ」基は、加水分解に参加しない有機残基、例えば、メチルフェノキシ基またはAllcock et al. (1977) の科学論文に示されている他の基であり得る。ヒドロゲル材料の合成方法、ならびにそうしたヒドロゲルの作製方法は、当分野では公知である。
【０１９４】
次のもののいずれかを含む（しかし、これらに限定されない）他の成分も本調合物に含めることができる：（１）適切なｐＨおよび等張性をもたらすためのバッファー；（２）滑沢剤；（３）例えばアルギネート、寒天および植物性ゴムをはじめとする、投与部位またはその付近に本細胞を保持するための粘稠材料；ならびに（４）投与部位で所望の効果、例えば、組織の形成もしくはその物理化学的特性の強化もしくは修飾、または本細胞の生存力を支援するような効果、または炎症もしくは拒絶反応の抑制などを生じさせることができる他の細胞タイプ。本細胞を適切な創傷被覆材によって被覆して、細胞がその部位から離れないようにすることができる。こうした創傷被覆材は、当業者には公知である。
【０１９５】
フィブリン糊
フィブリン糊は、様々な臨床環境で使用されている外科用シーラントの一類である。当業者は気づくであろうが、非常に多数のシーラントが、本発明の組成物において有用である。しかし、本発明の好ましい実施形態は、本発明の細胞とフィブリン糊の使用に関する。
【０１９６】
本明細書で用いる場合、用語「フィブリン糊」は、カルシウムイオンの存在下でのフィブリンポリマーの架橋により形成される不溶性マトリックスを指す。本フィブリン糊は、フィブリンマトリックスを形成する生体組織または体液由来の、フィブリノゲンまたはその誘導体もしくは代謝産物、フィブリン（可溶性モノマーもしくはポリマー）および／またはその複合体から形成することができる。あるいは、本フィブリン糊は、組換えＤＮＡ法により製造された、フィブリノゲンまたはその誘導体もしくは代謝産物あるいはフィブリンから形成することができる。
【０１９７】
本フィブリン糊は、フィブリノゲンとフィブリン糊形成の触媒（例えば、トロンビンおよび／または第ＸＩＩＩ因子）との相互作用によって形成されることもある。当業者には理解されるであろうが、フィブリノゲンは、触媒（例えば、トロンビン）の存在下でタンパク質分解的に切断され、フィブリンモノマーに転化される。その後、それらのフィブリンモノマーがポリマーを形成し、それらが架橋してフィブリン糊マトリックスを形成し得る。フィブリンポリマーの架橋は、第ＸＩＩＩ因子などの触媒の存在下によって強化することができる。フィブリン糊形成の触媒は、フィブリノゲンまたはトロンビンを含有する、血漿、寒冷沈降物または他の血漿因子から誘導することができる。あるいは、触媒は、組換えＤＮＡ法によって製造することができる。
【０１９８】
血餅が形成する速度は、フィブリノゲンと混合されるトロンビンの濃度に依存する。酵素依存性反応であるため、温度が高い（３７℃以上）ほど、血餅形成速度は速い。血餅の引張強度は、使用されるフィブリノゲンの濃度に依存する。
【０１９９】
フィブリン糊の使用並びにその作製方法および使用方法は、Ｈｉｒｓｈらにより米国特許第５，６４３，１９２号に記載されている。Ｈｉｒｓｈは、単一ドナーからのフィブリノゲンおよびトロンビン成分の抽出、ならびにフィブリン糊として使用するためのこれらの成分のみの組み合わせを開示している。Ｍａｒｘの米国特許第５，６５１，９８２号には、別の製剤およびフィブリン糊の使用方法が記載されている。Ｍａｒｘは、哺乳動物において局所シーラントとして使用するためのフィブリン糊とリポソームを提供している。創傷治癒のための局所フィブリノゲン複合体（ＴＦＣ）の作製および使用は、当分野では公知である。アメリカ赤十字社（The American Red Cross）のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９５／１５８７６、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／１７６３３は、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／１７６３３の１６〜１８頁において、フィブリノゲン、トロンビンおよび塩化カルシウムを含有するＴＦＣ製剤を論じている。
【０２００】
幾つかの出版物に、治療薬送達のためのフィブリン糊の使用が記載されている。例えば、米国特許第４，９８３，３９３号には、アガロース、寒天、食塩溶液グリコサミノグリカン、コラーゲン、フィブリンおよび酵素を含む、膣内挿入物として使用するための組成物が開示されている。さらに、米国特許第３，０８９，８１５号には、フィブリノゲンおよびトロンビンから構成される注射用医薬製剤が開示されており、ならびに米国特許第６，４６８，５２７号には、体内の特定部位への様々な生物学的および非生物学的薬剤の送達を助長するフィブリン糊が開示されている。
【０２０１】
骨組織パッチの形成
予備成形されたウェル内の本発明の細胞の培養物または共培養物は、所定の厚さおよび容積の組織パッチの製造を可能にする。結果として生じる組織パッチの容積は、そのウェルの容積、およびそのウェル内の成体多能性細胞の数に依存する。前述のパラメータのいずれかまたは両方を変えることにより、常用の実験によって、最適な所定容積の組織を作製することができる。
【０２０２】
ウェルの細胞接触表面を、その細胞接触表面への成体多能性細胞の接着を防止する分子でコーティングしてもよい。好ましいコーティング試薬としては、ケイ素系試薬、すなわちジクロロジメチルシラン、またはポリテトラフルオロエチレン系試薬、すなわちＴＥＦＬＯＮが挙げられる。ケイ素系試薬、特にジクロロジメチルシランで材料をコーティングするための手順は、当分野では周知である。例えば、Sambrook et al. (1989). "Molecular Cloning A Laboratory Mannual", Cold Spring Harbor Laboratory Press 参照（この開示は、本明細書に参考として組み込まれる）。ウェルの表面への細胞の付着を防止する他の生体適合性試薬が、本発明の実施の際に有用であり得ることは、理解される。
【０２０３】
あるいは、ウェルは、細胞それ自体の付着を許さない柔軟なまたは成形可能な生体適合性材料から鋳造することができる。こうした細胞付着を防止する好ましい材料としては、アガロース、ガラス、未処理細胞培養プラスチックおよびポリテトラフルオロエチレン、すなわちＴＥＦＬＯＮが挙げられるが、これらに限定されない。未処理細胞培養プラスチック（すなわち、静電荷を有する材料で処理していない、またはそれらから製造されたものではないプラスチック）は、市販されており、例えば、ニュージャージー州リンカーンパーク（Lincoln Park, N.J.）のＢｅｃｔｏｎ−ＤｉｃｋｉｎｓｏｎのＦａｌｃｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅから購入することができる。しかし、前述の材料に限定されるという意味ではない。成体多能性細胞の付着を本質的に防止する任意の他の柔軟なまたは成形可能な生体適合性材料が、本発明の実施の際に有用であり得ることは、理解される。
【０２０４】
懸濁状態の本発明の細胞を予備成形ウェルに接種し、培養することができる。これらの細胞は、そのウェル内での培養中に軟骨形成性または骨形成性表現型に分化するように誘導することができ、またはそのウェルに接種する前に分化を誘導しておくこともできる。培地の添加により、それらの細胞を、１ミリリットル当たり細胞数約１ｘ１０5から１ｘ１０9の細胞密度に希釈することができる。
【０２０５】
細胞は、細胞の凝集プラグ（cohesive plug）を形成することがある。この細胞の凝集プラグをウェルから除去し、組織欠損に手術移植することができる。それによって任意の未分化細胞、例えば本発明の成体多能性細胞をインサイチューで分化させてインビトロで組織を形成することができると予想される。
【０２０６】
骨欠損は、コンピューター支援断層撮影法（ＣＡＴスキャン法）；Ｘ線検査、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、滑液もしくは血清マーカーの分析によって、または当分野では公知の任意の他の手順によって、推論的に特定することができる。哺乳動物における欠損は、関節鏡検査中またはその関節の開放手術（open surgery）中に目視でも容易に特定される。それらの欠損の治療は、本明細書に開示する方法および組成物を用いて関節鏡または開放手術処置中に行うことができる。
【０２０７】
従って、欠損が特定されたら、以下の工程によってその欠損を治療することができる：（１）本明細書に記載する方法論によって作製した組織パッチを所定の部位に手術移植する工程、および（２）その組織パッチを所定の部位に同化（integrate）させる工程。
【０２０８】
場合により、組織パッチは、そのパッチが欠損に移植されたときにその移植された組織の端がその欠損の端に直接接触するようなサイズおよび形状を有する。加えて、組織パッチは、手術処置の間に適所に固定することができる。これは、そのパッチを欠損に生体分解性の糸で外科的に固定することにより、および／またはそのパッチと欠損の界面領域に生体接着剤を塗布することにより、行うことができる。
【０２０９】
場合により、損傷組織は、組織パッチの移植前に外科的に切除されることもある。
【０２１０】
スキャホールドを使用する細胞の移植
本発明の細胞組成物またはそれらの共培養物を三次元スキャホールド上またはその中に接種し、インビボで移植することができ、この場合、接種された細胞は、その患者の細胞と協同して、そのフレームワーク上で増殖し、置換組織、例えば骨組織をインビボで形成するであろう。
【０２１１】
例えば、限定としてではないが、スキャホールドは、そのスキャホールド構造が、（１）その後、分解することなく接種細胞を支持する；（２）接種時から、宿主組織によってその組織移植物が再建されるまで、接種細胞を支持する；（２）接種細胞が、インビトロでそれ自体を支持するために十分な機械的結着性を有する組織構造に付着、増殖および発育することができ、その時点でそのスキャホールドが分解するように、設計することができる。スキャホールド設計の総説は、Ｈｕｔｍａｃｈｅｒ（２００１）によって提供されている。
【０２１２】
本発明のスキャホールドは、任意の１つまたはそれ以上の成長因子、細胞、例えば幹細胞、骨髄細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨の内側の細胞もしくはこれらの前駆体、あるいは組織形成を刺激するまたは本発明の実施を別様に増進もしくは改善する上に記載した薬物または他の成分と併用で投与することができる。スキャホールドに接種される本発明の細胞は、成長因子または薬物を発現するように、遺伝子操作することができる。
【０２１３】
本発明の細胞を使用して、新たな組織をインビトロで産生させることができ、その後、それを、患者における組織修復、置換または増加を必要とする部位に移植（implant）、移植（transplant）または別様に挿入することができる。
【０２１４】
非限定的な実施形態では、本発明の細胞を使用して、インビトロで三次元組織構築物を製造し、その後それをインビボで移植する。三次元組織構築物の製造の一例として、米国特許第４，９６３，４８９号を参照のこと（これは、本明細書に参考として組み込まれる）。例えば、本発明の細胞を三次元フレームワークまたはスキャホールド上に接種し（inoculatedまたは「seeded」）、インビトロで増殖または成長させて生組織を形成することができ、それをインビボで移植することができる。
【０２１５】
本発明の細胞は、培養容器内で亜集密（sub-confluency）または集密まで自由に成長させ、その培養容器から取り除き、三次元フレームワーク上に接種することができる。
【０２１６】
高い細胞濃度、例えば１ミリリットル当たり細胞数約１０6から５ｘ１０7を有する三次元フレームワークの接種により、比較的短い期間で三次元支持体が樹立されることとなろう。
【０２１７】
本発明において使用することができるスキャホールドの例としては、不織布マット、多孔質発泡体、または自己組立て型ペプチドが挙げられる。不織布マットは、例えば、商品名ＶＩＣＲＹＬ（ニュージャージー州サマヴィル（Somerville, N.J.）のＥｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．）で販売されている、グリコール酸および乳酸の合成吸収性コポリマー（ＰＧＡ／ＰＬＡ）から構成される繊維を使用して形成することができる。例えば、米国特許第６，３５５，６９９号に記載されているような、フリーズドライ法または凍結乾燥などの処理により形成されたポリ（イプシロン−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーから成る泡沫も、可能なスキャホールドである。自己組立て型ペプチド（例えば、ＲＡＤ１６）などのヒドロゲルを使用することもできる。これらの材料は、組織の成長のための支持体として使用されることが多い。
【０２１８】
三次元フレームワークは、リン酸一、二、三カルシウム、リン酸アルファ−三、リン酸ベータ−三およびリン酸四カルシウム、水酸アパタイト、フルオロアパタイト、硫酸カルシウム、フッ化カルシウム、酸化カルシウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムマグネシウム、生物活性ガラス、例えばＢＩＯＧＬＡＳＳ（フロリダ州ゲインズヴィル（Gainesville, Fla.）のＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｆｌｏｒｉｄａ）、およびこれらの混合物をはじめとする（しかし、これらに限定されない）、セラミック材料から製造することができる。多数の適する多孔質生体適合性セラミック材料、例えば、ＳＵＲＧＩＢＯＮ（カナダのＵｎｉｌａｂ  Ｓｕｒｇｉｂｏｎｅ，Ｉｎｃ．）、ＥＮＤＯＢＯＮ（フランスのＭｅｒｃｋ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ  Ｆｒａｎｃｅ）、ＣＥＲＯＳ（スイス、ＢｅｔｔｌａｃｈのＭａｔｈｙｓ，Ａ．Ｇ．）およびＩＮＴＥＲＰＯＲＥ（米国カリフォルニア州アービン（Irvine, Calif., United State）のＩｎｔｅｒｐｏｒｅ）、ならびに石灰化コラーゲン骨移植用製品、例えば、ＨＥＡＬＯＳ（カリフォルニア州マウンテン・ビュー（Mountain View, Calif.）のＯｒｑｕｅｓｔ，Ｉｎｃ．）ならびにＶＩＴＯＳＳ、ＲＨＡＫＯＳＳおよびＣＯＲＴＯＳＳ（ペンシルバニア州マルヴァン（Malvern, Pa）のＯｒｔｈｏｖｉｔａ）が、現在、市販されている。このフレームワークは、天然および／または合成材料の混合物、ブレンドまたは複合材であり得る。一部の実施形態において、本スキャホールドは、ケージの形態である。好ましい実施形態において、本スキャホールドは、コラーゲンでコーティングされる。
【０２１９】
好ましい実施形態によると、本フレームワークは、生体吸収性材料、例えばＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬコポリマーもしくはブレンドまたはヒアルロン酸で製造された多成分糸から成り得るフェルトである。この糸は、クリンプ加工、切断、カーディングおよびニードリングから成る標準的な織物加工技術を用いてフェルトにされる。
【０２２０】
もう１つの好ましい実施形態において、本発明の細胞は、複合構造であり得る発泡体スキャホールド上に接種される。加えて、その三次元フレームワークを有用な形状、例えば、修復、置換または増加を必要とする、耳、骨、関節または体内の他の特定の構造の外部の形状に成形することができる。
【０２２１】
もう１つの好ましい実施形態において、本細胞は、米国特許第６，２００，６０６号（本明細書に参考として組み込まれている）に記載されているように、患者に移植するための補綴装置を含むフレームワーク上に接種される。そこに記載されているように、様々な臨床的に有用な補綴装置が、骨および軟骨移植処置に使用するために開発されている（例えば、Bone Grafts and Bone Substitutions. Ed. M. B. Habal & A. H. Reddi, W. B. Saunders Co., 1992 参照）。例えば、有効な膝および股関節置換装置が、臨床環境において幅広く使用されるようになり、使用され続けている。これらの装置の多くが、体内で安全に機能する、低免疫原性活性を有する様々な無機材料を使用して、二次加工されたものである。試行され、証明された合成材料の例としては、チタン合金、リン酸カルシウム、セラミック水酸アパタイト、ならびに様々なステンレス鋼およびコバルト−クロム合金が挙げられる。これらの材料は、構造用支持をもたらし、ならびに宿主血管新生および細胞移動が発生し得るスキャホールドを形成することができる。
【０２２２】
本発明の細胞を接種する前に、本フレームワークを細胞付着を増進するように処理することができる。例えば、本発明の細胞を接種する前に、ナイロンマトリックスを０．１モル濃度の酢酸で処理し、ポリリシン、ＰＢＳおよび／またはコラーゲン中でインキュベートしてそのナイロンをコーティングしてもよい。硫酸を使用してポリスチレンを同時に処理してもよい。
【０２２３】
加えて、三次元フレームワークの外面は、例えば、そのフレームワークをプラズマコーティングすることによって、または１つもしくはそれ以上のタンパク質（例えば、コラーゲン、弾性繊維、細網繊維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸）、細胞マトリックス、ならびに／または、数ある中でもゼラチン、アルギネート、寒天、アガロースおよび植物性ゴムなどの（しかし、これらに限定されない）材料の追加によって、細胞の付着もしくは増殖および組織の分化を増進するように改質することができる。
【０２２４】
一部の実施形態において、本スキャホールドは、それを非血栓形成性にする材料から成るか、そうした材料で処理される。これらの処理および材料は、内皮成長、移動および細胞外基質沈着を促進および持続させることもできる。これらの材料および処理の例としては、天然材料、例えば、基底膜タンパク質、例えばラミニンおよびＩＶ型コラーゲン、合成材料、例えば、ｅＰＴＦＥ、ならびにセグメント化ポリウレタンウレアシリコーン、例えばＰＵＲＳＰＡＮ（カリフォルニア州バークレー（Berkeley, Calif.）のＴｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの材料は、本スキャホールドを非血栓形成性にするようにさらに処理することができる。こうした処理としては、抗血栓薬、例えばヘパリン、および材料の表面電荷を変える処理、例えばプラズマコーティングが挙げられる。
【０２２５】
一部の実施形態において、本スキャホールドの表面は、テクスチャー加工されている。例えば、本発明の一部の態様では、本スキャホールドには溝−尾根模様が設けられている。この溝は、好ましくは約５００マイクロメートル未満、さらに好ましくは約１００マイクロメートル未満および最も好ましくは約１０ナノメートルと約１０マイクロメートルの間である。こうした「微小溝」により細胞は整列することができ、および／またはその表面溝に導かれて移動することができる。
【０２２６】
一部の実施形態では、インビボで見られる細胞微小環境、例えば、インビボで移入するまたはインビトロで使用する前に本発明の細胞を成長させる程度が多様であり得る細胞微小環境を、培養で再現することが重要である。加えて、成長因子、軟骨形成性分化誘導剤、骨形成誘導剤、および脈管形成因子を、細胞の接種前、中または後に培地に添加して、細胞またはそれらの子孫による分化および組織形成を誘発することができる。
【０２２７】
三次元フレームワークは、細胞の成長およびその結果としての組織の産生を増進するように、またはインプラントに対する拒絶反応の危険性を低減するように、改質することができる。たとえば、抗炎症薬、免疫抑制薬または成長因子をはじめとする（しかし、これらに限定されない）１つまたはそれ以上の生物活性化合物をフレームワークに添加することができる。
【０２２８】
実施例
ここで、以下の非限定的な実施例を参照しながら、より詳細に、本発明を説明する。
【実施例１】
【０２２９】
ｍＡｂ ＳＴＲＯ−３の生成
材料および方法
ヒトＭＰＣ培養物
本質的には以前に説明されている（Gronthos et al., 2003）とおり、間質培養物を樹立した。これらの研究のための正常骨髄（ＢＭ）細胞の使用は、オーストラリア、ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ａｄｅｌａｉｄｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの倫理委員会（the Human Ethics Committee）によって承認された。「ＨＨＦ」（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび５％ ＦＣＳを追加したハンクス緩衝塩類溶液（ＨＢＳＳ））中で３回洗浄した後、細胞数１〜５ｘ１０7の骨髄単核細胞（ＢＭＭＮＣ）を、葉酸（０．０１ｍｇ／ｍｌ）、ミオイノシトール（０．４ｍｇ／ｍｌ）（ミズーリ州セントルイス（St. Louis, MO）のＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、５０ｍＭ／Ｌ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ／Ｌ コハク酸ナトリウムヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ）、１２．５％ ＦＣＳおよび１２．５％ ウマ血清（オーストラリア、メルボルン（Melbourne, Australia）のＣＬＳ）を追加した１０ｍｌのイーグル培地のアルファ改変物（α−ＭＥＭ；スコットランド、アービン（Irvine, Scotland）のＦｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に再び懸濁させ、２５ｃｍ2 フラスコ（ニュージャージー州フランクリンレイク（Franklin Lake, NJ）のＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ）の中で培養した。集密な間質層が発現したら、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）中０．０５％（ｗ／ｖ）トリプシン−ＥＤＴＡを使用して細胞を剥離させ、２ｘ７５ｃｍ2 組織培養フラスコ（ニュージャージー州フランクリンレイクのＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ）内で同じ培地中、１ｃｍ2当たり細胞数約１〜２ｘ１０4で、再びプレーティングした。
【０２３０】
結果および考察
培養したヒトＢＭ間質細胞で免疫したマウス由来の脾細胞の融合後、ヒトＭＰＣと反応性のマウスモノクローナル抗体のパネルを作製した。正常ヒト骨細胞（ＮＨＢＣ）およびＭＰＣと反応するが、大多数のＢＭＭＮＣとは限られた反応性を示すｍＡｂを特定するために予備スクリーニングを設計した。異なる細胞株との独特な反応性パターンにより、１つのｍＡｂ、ＳＴＲＯ−３をさらなる分析のために選択した。そのＳＴＲＯ−３ハイブリドーマの第三クローンを９６ウエルプレートにおいて限界希釈法により単離し、その後、上で説明したとおりスクリーニングした。様々な間質細胞タイプを有するＳＴＲＯ−３の分布パターンを表１にまとめる。ｍＡｂ ＳＴＲＯ−３は、ＮＨＢＣおよびＭＰＣとは一定の比率まで反応性を示したが、ＢＭＭＮＣとは低率でしか反応を示さなかった。第三ハイブリドーマ上清からのＳＴＲＯ−３のこの免疫グロブリンアイソタイプは、アイソタイプ検出キット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ＩｇＧ1であると判定された。
表１：「方法」において説明したとおりインサイチュー免疫蛍光検査法を用いる異なる細胞タイプに基づく第三クローンのハイブリドーマからのＳＴＲＯ−３上清の免疫反応性
【表１】
0005462483.tif 000002
（＋）すべての細胞に対して低蛍光染色
（＋＋）すべての細胞に対して高蛍光染色
（ＮＳ）細胞に対する蛍光染色なし
（＋／−）（＋＋／−）細胞の亜集団に対して蛍光染色
【実施例２】
【０２３１】
ＳＴＲＯ−３抗原の分子特性付け
材料および方法
ＳＴＲＯ−３抗原をコードするｃＤＮＡの発現クローニング
ｍＡｂ ＳＴＲＯ−３によって特定される細胞表面抗原をコードするｃＤＮＡを、説明されている（Zannettino et al., 1996）ようにレトロウイルスベクター、ｐＲＵＦｎｅｏにおいてヒト骨髄間質細胞ｃＤＮＡライブラリーから単離した。簡単に言うと、ＨＢＭＳＣ培養物からのｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡをレトロウイルスベクターｐＲＵＦｎｅｏにクローニングした。そのライブラリーからのプラスミドＤＮＡを用いて、ウイルスパッケージング系（ＰＡ３１７）をトランスフェクトした。これらの細胞からのウイルス含有上清を用いてそのパッキング細胞株ψ２を感染させ、次にそれを用いてマウス因子依存性細胞株ＢＡＦ−３を感染させた。感染細胞をＧ４１８耐性について選択し、ＳＴＲＯ−３抗体で標識し、その抗体に特異的に結合している細胞を、免疫磁気ビーズ選択（Ｄｙｎａｂｅａｄ、スウェーデン、オスロ（Sweden, Oslo）のＤｙｎａｌ）によって単離した。最初に選択された細胞を培養で増幅させた後、免疫磁気ビーズ選択をさらに２回繰り返した。ＳＴＲＯ−３抗体に対して特異的な結合（約６０％）を示したＢＡＦ−３細胞を、以前に説明されている（Zannettino et al., 1996）ように、半固体培地において培養した後、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって精製し、クローンを単離した。ＳＴＲＯ−３抗原に対応するプロウイルスｃＤＮＡインサートを回収するために、以前に説明されている（Zannettino et al., 1996）ように、３つのＳＴＲＯ−３発現ＢＡＦ−３クローンから作成したゲノムＤＮＡに対して、レトロウイルス特異的プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。
【０２３２】
ＰＣＲレスキュー（PCR−rescued）ｃＤＮＡクローンの部分的塩基配列決定およびコンピューター分析
以前に説明されている（Zannettino et al., 1996）ように、ＰＣＲによって生成したｃＤＮＡクローンをゲル精製し、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（ウィスコンシン州マディソンのＰｒｏｍｅｇａ）に、その製造業者により推奨されているとおり、サブクローニングした。標準的なアルカリ溶解「ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ」法（Ｑｉａｇｅｎ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ）によって２本鎖ＤＮＡを作製し、１シーケンシング反応当たり１〜２μｇを用いた。反応は、ＰＲＩＳＭ（商標）Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｙｃｌｅシーケンシングキット（カリフォルニア州フォスターシティー（Foster City, CA）のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を、その製造業者により推奨されているとおりに用いて準備した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３ 自動シーケンスアナライザーを用いて、両方のｃＤＮＡ鎖を分析する反応を実行（run）し、１クローン当たり５００〜６００ｂｐの５’および３’配列データをルーチン的に得た。その後、米国立生物工学情報センター（the National Centre for Biotechnological Information）（ＮＣＢＩ）におけるGenbankおよび欧州分子生物学研究所（European Molecular Biology Laboratory）（ＥＭＢＬ）データベースにアクセスすることにより、配列データを分析した。
【０２３３】
ｐＲＵＦｎｅｏへのＳＴＲＯ−３抗原ｃＤＮＡクローンの再クローニングおよび表面抗原発現の確認
ゲノムＤＮＡからのプロウイルスｃＤＮＡインサートのＰＣＲ回復後、５’および３’隣接領域それぞれに存在する固有のＢａｍ  ＨＩおよびＸｈｏ  Ｉ制限部位を使用して、そのｃＤＮＡをレトロウイルスベクターｐＲＵＦｎｅｏのＭＣＳに「再クローニング」した。Ｑｉａｇｅｎ−ｔｉｐ  １００カラム（オーストラリア、ビクトリア（Victoria, Australia）のＱｉａｇｅｎ）を、その製造業者により推奨されているとおりに用いて、大腸菌（E. coli）ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換し、プラスミドＤＮＡを単離した。以前に説明されている（Zannettino et al., 1996）ように、安定したＧ４１８耐性ψ２ウイルス生産細胞株をリン酸カルシウムトランスフェクションによって産生させ、それらを用いて共培養によりＢＡＦ−３細胞を感染させた。その後、Ｇ４１８耐性ＦＤＣ−Ｐ１細胞を、間接的免疫蛍光検査法およびフローサイトメトリーによって抗原発現について分析した。
【０２３４】
逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析
ＲＮＡｚｏｌＢ抽出法（テキサス州ヒューストン（Houston, TX）のＢｉｏｔｅｃｘ  Ｌａｂ．Ｉｎｃ．）をその製造業者の推奨に従って用いて、ＳＴＲＯ−３抗原ＢＡＦ−３細胞のクローンから全細胞ＲＮＡを作製した。その後、各亜集団から単離したＲＮＡを、Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キット（スウェーデン、アップサラ（Uppsala, Sweden）のＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して作製するｃＤＮＡ合成のためのテンプレートとして用いた。以前に説明されている（Gronthos et al., 1999）ような標準的プロトコルを用いて、ＰＣＲ増幅により、ＡＬＰ転写産物の骨および肝臓／腎臓アイソフォームの発現を評価した。この研究において使用したアルカリホスファターゼプライマーセットは、以前に説明されている（Sato et al., 1994）。増幅後、各反応混合物を１．５％アガロースゲル電気泳動法によって分析し、エチジウムブロミド染色によって視覚化した。ＲＮＡの完全性は、ＧＡＰＤＨの発現によって評価した（Gronthos et al., 1999）。
【０２３５】
結果および考察
本発明者らの研究所において他に先駆けて開発されたレトロウイルス発現ライブラリー戦略を用いて、その後、本発明者らはＳＴＲＯ−３ ｍＡＢによって特定されるタンパク質をコードする遺伝子を特定した（Zannettino et al., 1996）。簡単に言うと、マウス細胞株ＢＡＦ−３を、培養ヒトＭＰＣ由来のｃＤＮＡのライブラリーから構築したレトロウイルス粒子で感染させた。ＳＴＲＯ−３と反応性であるＢＡＦ−３クローンを、ヒツジ抗マウスＩｇＧ磁気ビーズを用いる免疫磁気ビーズ選択によって単離した。
【０２３６】
図１に示すように、数回のビーズ選択ラウンドの後に回収された細胞のフローサイトメトリー分析により、相当なレベルでＳＴＲＯ−３抗原が発現されることが判明した。その後、「方法」において説明したように免疫磁気ビーズ選択細胞のプールを低密度で半固体メチルセルロースに接種することによって、ＳＴＲＯ−３発現ＢＡＦ−３細胞のクローンを作製した。その後、ＢＡＦ−３の無作為化選択コロニーを単離し、マウスＩＬ−３およびＧ４１８を添加して液体培養で増幅させた。その後、ＳＴＲＯ−３との高い反応性を示す選択クローンを培養で増幅させ、「方法」において説明したようにゲノムＤＮＡを作製した。その後、以前に説明されている（Zannettino et al., 1996）ようなロングレンジＰＣＲ増幅によって、そのｃＤＮＡインサートを以前のものからレスキューした。
【０２３７】
ＳＴＲＯ−３についての代表的なクローンのＰＣＲ増幅を図２に示す。アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロミド染色後、ＱＬＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（米国、カリフォルニア州チャッツワース（Chatsworth, CA, USA）のＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．）を使用して３つの異なるクローンからの対応するＰＣＲ産物をゲル精製し、そのｐＧＥＭ−Ｔベクターにおいて、その製造業者により推奨されているとおりにクローニングした。ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列は、ＰＲＩＳＭ（商標）Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ＤｙｅＤｅｏｘｙ（商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（米国、カリフォルニア州フォスターシティーのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、その製造業者の仕様書に従ってシーケンシングすることによって誘導した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  ３７３自動シーケンスアナライザーを用いて反応を実行（run）し、数百の塩基対の核酸配列データを各クローンについて得た。得られた部分ヌクレオチド配列を、標準ＦＡＳＴＡアラインメント分析により、Genbank／ＥＭＢＬデータベースに付託された登録事項と比較した。両方の抗原についての部分ＤＮＡ配列を与える（図３）。ＥＭＢＬ／Genbank複合データベースにおける配列との比較により、骨／肝臓／腎臓形態のアルカリホスファターゼ、すなわちＴＮＡＰ、に対応するようなＳＴＲＯ−３抗原を特定した。
【０２３８】
その後、ＡＬＰの骨、肝臓および腎臓アイソフォームの各々の間で保存されているエピトープを認識するアルカリホスファターゼ特異的抗体、Ｂ４−７８、５０（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ）でのＴＮＡＰ発現ＢＡＦ−３クローンの免疫蛍光検査法およびフローサイトメトリー分析に従って、ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂの特異性の独立した確認を達成した（図４）。
【０２３９】
加えて、骨ＡＰ酵素に対して特異的であることが以前に証明されているｍＡｂ Ｂ４−５０（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ）は、ＴＮＡＰトランスフェクタントとの免疫反応性も示した。対照的に、ヒト胎盤ＡＰ抗原上にしか存在しないエピトープを特定するｍＡＢ  ８Ｂ６（ＤＡＫＯ）でのＴＮＡＰトランスフェクタントの染色後、反応性は観察されなかった。加えて、ＴＮＡＰ−ＢＡＦ−３ ｃＤＮＡインサートで再びトランスフェクトしたＢＡＦ−３細胞は、アルカリホスファターゼ基質の存在下でのポジティブな反応性によって証明されるように、活性形態のアルカリホスファターゼを発現することが判明した（図５）。骨および肝臓形態のアルカリホスファターゼに対する特異的プライマー（Sato et al., 1994）を用いるＰＣＲ分析により、それらの転写産物は骨特異的と特定された（図６）。
【実施例３】
【０２４０】
ＢＭトレフィンの切片におけるＳＴＲＯ−３ ｍＡｂによるＴＮＡＰの免疫組織学的検出
材料および方法
パラフィンに包埋された生後の正常な骨の５マイクロメートル切片を、３−アミノプロピル−トリエトキシシランをコーティングしたスライドガラス上で切断し、３％ Ｈ2Ｏ2／メタノールとのインキュベーションにより内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。その後、マイクロウェーブ抗原性回復法を、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０バッファーの存在下で行った。このスライドガラスを放置して４０℃に冷却し、切片を３％ 正常ウマ血清と共に１時間、室温でインキュベートすることによって非特異的結合をブロックした。その後、それらのスライドガラスを、アイソタイプにマッチした非結合性対照ｍＡｂ（１Ｂ５、ＩｇＧ1）またはＳＴＲＯ−３ ｍＡｂのいずれかと共に一晩、インキュベートした。スライドガラスを（ａ）親和精製ＨＲＰ結合ヤギ抗マウス抗体（オーストラリア、ニューサウスウェールズ州、ボタニー（Botany, NSW, Australia）のＤａｋｏ）、続いて（ｂ）親和精製ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ブタ抗ヤギ免疫グロブリン（米国、カリフォルニア州バーリンゲーム（Burlingame, CA, USA）のＴａｇｏ）、そして（ｃ）基質としての過酸化水素および染料としてのアミノエチルカルバゾール（ミズーリ州セントルイスのＡＥＣ，Ｓｉｇｍａ）と共に順次インキュベートする、三段階免疫ペルオキシダーゼ法（Gronthos et al., 2000；Gronthos et al, 2003）を用いて、結合抗体を明らかにした。スライドガラスをヘマトキシリン溶液で簡単に対比染色し、Ｇｕｒｒ  Ａｑｕａｍｏｕｎｔ（イングランド、プール（Poole, UK）のＢＤＨ）中でマウントした。
【０２４１】
結果と考察
ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂの免疫反応性を、日齢５５日のヒト肢由来の発育骨髄の切片において評価した。骨膜または軟骨において染色は観察されなかった（図７）。しかし、骨髄腔、血管周囲領域の間葉系細胞において、および成長板領域の界面において、ＴＮＡＰの顕著な発現があった。
【実施例４】
【０２４２】
ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂを用いるヒト骨髄細胞の単離
ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ａｄｅｌａｉｄｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの倫理委員会により承認された手順に従って、健常成人ボランティア（２０〜３５歳）から骨髄（ＢＭ）を採取した。簡単に言うと、４０ｍｌのＢＭを後腸骨稜から吸引し、ヘパリンリチウム凝固防止剤が入っている試験管に入れた。ＢＭＭＮＣは、以前に説明されている（Zannettino et al., 1998）ようなＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（ノルウェー、オスロ（Oslo, Norway）のＮｙｃｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａ）を用いる密度勾配分離によって用意した。４００ｘｇで３０分間、４℃での遠心分離後、軟膜（buffy layer）を全量ピペットで除去し、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ，オーストラリア、ビクトリア（Victoria, Australia）のＣＳＬ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）を含有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ；メリーランド州ゲーサーズバーグ（Gaithersburg, MD）のＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から構成される「ＨＨＦ」中で３回洗浄した。
【０２４３】
その後、以前に説明されている（Gronthos et al., 2003；Gronthos et al, 1995）ように、磁気活性化細胞選別によってＴＮＡＰ＋を単離した。簡単に言うと、氷上で２０分間、ＨＨＦ中１０％（ｖ／ｖ）の正常ウサギ血清からなるブロッキングバッファー中で、約１〜３ｘ１０8個のＢＭＭＮＣをインキュベートする。それらの細胞を、氷上で１時間、ブロッキングバッファー中のＳＴＲＯ−３ ｍＡｂの１０μｇ／ｍｌ溶液（２００μＬ）と共にインキュベートする。その後、それらの細胞を、４００ｘｇでの遠心分離によってＨＨＦ中で２回洗浄する。ＨＨＦバッファー中のヤギ抗マウスγ−ビオチン（英国、バーミンガム（Birmingham, UK）のＳｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）の１／５０希釈液を添加し、それらの細胞を氷上で１時間、インキュベートする。細胞を、ＭＡＣＳバッファー（１％ ＢＳＡ、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．０１％ アジ化ナトリウムを追加した、Ｃａ2+およびＭｎ2+不含のＰＢＳ）中で上のように２回洗浄し、最終量０．９ｍｌのＭＡＣＳバッファーに再び懸濁させる。
【０２４４】
１００μＬのストレプトアビジンマイクロビーズ（ドイツ、ベルギッシュグラトバッハ（Bergisch Gladbach, Germany）のＭｉｌｉｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）をその細胞懸濁液に添加し、氷上で１５分間、インキュベートする。その細胞懸濁液を２回洗浄し、０．５ｍｌのＭＡＣＳバッファーに再び懸濁させ、その後、ミニＭＡＣＳカラム（ＭＳ  Ｃｏｌｕｍｎｓ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に負荷し、０．５ｍｌ ＭＡＣＳバッファーで３回洗浄して、ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂに結合していない細胞を回収する。さらなる１ｍｌのＭＡＣＳバッファーの添加後、そのカラムをマグネットから外し、ＴＮＡＰポジティブ細胞を正圧によって単離する。各画分からの細胞のアリコートは、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣで染色し、フローサイトメトリーによって純度を評価することができる。ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂは、ＢＭＭＮＣの小亜集団（＜１％）を特定することが判明した。
【０２４５】
以前に説明されている（Gronthos et al, 1995）ように、２０％ ウシ胎仔血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１００μｍ Ｌ−アスコルベート−２−ホスフェートを追加したα−ＭＥＭ中でのプレーティングにより、ＭＡＣＳ単離ＴＮＡＰ＋細胞から初代培養物を樹立する。
【実施例５】
【０２４６】
ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂにより選択されるヒト骨髄細胞はＣＦＵ−Ｆを生じさせる
材料および方法
磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）
ＴＮＡＰ＋細胞のＣＦＵ−Ｆ増生能力を評価するために、ＭＡＣＳ選別を用いて骨髄からＴＮＡＰ＋細胞およびＴＮＡＰ−細胞を分離した。これは、ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂを用いたが、一般には以前に説明されている（Gronthos and Simmons, 1995；Gronthos et al., 2003）とおり行った。簡単に言うと、約１〜３ｘ１０8個の正常ヒト骨髄単核細胞を、ＳＴＲＯ−３上清、抗ＩｇＧ−ビオチン、ストレプトアビジンマイクロビーズそして最後にストレプトアビジンＦＩＴＣ（カリフォルニア州バーリンゲームのＣａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共にインキュベートした後、Ｍｉｎｉ  ＭＡＣＳ磁気カラム（カリフォルニア州オーバン（Auburn, CA）のＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．）を用い、その製造業者のインストラクションに従って分離した。
【０２４７】
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）
ＳＴＲＯ−１の＋ｖｅまたは−ｖｅ発現を基に選別されたＳＴＲＯ−３選択細胞に関するＣＦＵ−Ｆ増生能力も検査した。
【０２４８】
これは、以前に説明されている（Gronthos and Simmons, 1995；Gronthos et al., 2003）とおり行った。簡単に言うと、約１〜３ｘ１０8個の正常ヒト骨髄単核細胞を、ＳＴＲＯ−１上清、抗ＩｇＭ−ビオチン、ストレプトアビジンマイクロビーズそして最後にストレプトアビジンＦＩＴＣ（カリフォルニア州バーリンゲームのＣａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に順次インキュベートした後、Ｍｉｎｉ  ＭＡＣＳ磁気カラム（カリフォルニア州オーバンのＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．）を用い、その製造業者のインストラクションに従って分離した。
【０２４９】
それらのＳＴＲＯ−１+ ＭＡＣＳ単離細胞をストレプトアビジン結合ＦＩＴＣで標識し、その後、氷上で３０分間、精製ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂまたはアイソタイプ対照１Ｂ５（１０μｇ／ｍｌ）のいずれかと共にインキュベートし、洗浄し、そして氷上でさらに２０分間、フィコエリトリン（ＰＥ）結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（１／５０；アラバマ州バーミンガム（Birmingham, AL）のＳｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）と共にインキュベートした。ＦＡＣＳｔａｒPLUSフローサイトメーター（カリフォルニア州サニーヴェール（Sunnyvale, CA）のＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて、細胞を選別した。２０％ ウシ胎仔血清、Ｌ−グルタミン ２ｍＭ、アスコルベート−２−ホスフェート（１００μＭ）を追加したイーグル培地のアルファ改変物中でＳＴＲＯ−１bri／ＳＴＲＯ−３+またはＳＴＲＯ−１bri／ＳＴＲＯ−３-細胞を培養して、５％ ＣＯ2中、３７℃加湿雰囲気で初代培養を開始した。
【０２５０】
結果および考察
ＣＦＵ−Ｆ増殖用の細胞を単離するための単一試薬としてＳＴＲＯ−３ ｍＡｂを使用する可能性を検査するために試験を設計した（図８）。ＴＮＡＰ発現に基づくＭＡＣＳ単離により、クローン形成性ＣＦＵ−ＦのみがＴＮＡＰ+ ＢＭＭＮＣ画分において検出されることが、明らかになった。
【０２５１】
ＳＴＲＯ−３（ＩｇＧ1）が、ＳＴＲＯ−１（ＩｇＭ）のものとは異なるアイソタイプであると仮定して、クローン形成性ＣＦＵ−Ｆを特定するＳＴＲＯ−３の能力を、ＭＡＣＳ手順を用いて単離したＳＴＲＯ−１+ 細胞とのその共発現に基づく二色ＦＡＣＳ分析によって評価した（図９）。ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂは、ＳＴＲＯ−１抗原を高レベルで発現するＳＴＲＯ−１+ ＢＭＭＮＣ画分のサブセット（ＳＴＲＯ１−bright画分）と反応する固有の結合パターンを示し、それによってＭＰＣ集団を有効に単離および富化した（表２）。さらに、ｍＡｂ ＳＴＲＯ−３は、ヒト成人骨髄吸引液中のＣＤ３４ポジティブ造血幹細胞と反応することができなかった（データは示さない）。
【０２５２】
表２：細胞表面マーカーＳＴＲＯ−１およびＴＮＡＰの共発現に基づく二色ＦＡＣＳ分析によるヒト骨髄細胞の富化（図９参照）。ＦＡＣＳ選別細胞を、２０％ ＦＣＳを追加したアルファＭＥＭ中、標準的なクローン形成性条件下で培養した。データは、プレーティングした細胞１０5個当たりの１４日目のコロニー形成細胞の平均数±ＳＥ（ｎ＝３ 異なる骨髄吸引液）を表す。これらのデータは、ヒトＭＰＣが、ＳＴＲＯ−１抗原を明るく共発現するＢＭのＴＮＡＰポジティブ画分に排他的に限定されることを示唆している。
【表２】
0005462483.tif 000003
【実施例６】
【０２５３】
培養増幅前および後のＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ選択細胞の表現型
材料および方法
本質的にはＧｒｏｎｔｈｏｓら（１９９９）に記載されているとおり、単色フローサイトメトリーを行った。簡単に言うと、各継代の細胞の培養物をトリプシン／ＥＤＴＡによって遊離させ、その後、ブロッキングバッファー中で３０分間、氷上でインキュベートした。約１ｘ１０5個の細胞を上で説明したとおり洗浄し、氷上で、１時間、２００μＬの一次抗体に再び懸濁させた。ヒトＣＣ９に対する飽和濃度のマウスＩｇＭモノクローナル抗体ＳＴＲＯ−１および／またはマウスＩｇＧモノクローナル抗体ならびにＳＴＲＯ−３から成る一次抗体を用いた。用いた他の抗体としては、ＣＤ４５、ＣＤ３４および３Ｇ５に結合するｍＡｂが挙げられる。
【０２５４】
マウスアイソタイプＩｇＭおよびＩｇＧネガティブ対照ｍＡｂを同一条件下で処理した。細胞を洗浄した後、第二標識を、ヤギ抗マウスＩｇＭ μ鎖特異的ＦＩＴＣ（１／５０希釈物）とヤギ抗マウスＩｇＧ γ特異的ＰＥ（１／５０希釈物）または抗ウサギＩｇ特異的ＰＥ（１／５０希釈物）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）のいずれかとから成る最終量１００μＬに添加した。それらの細胞を氷上で４５分間インキュベートし、ＦＡＣｓＦＩＸ（１％（ｖ／ｖ）、２％（ｗ／ｖ）Ｄ−グルコース、０．０１％アジ化ナトリウムを追加したＰＢＳ）中で２回洗浄し、固定した。その後、それらの細胞をＥｐｉｃｓ（登録商標）ＸＬ−ＭＣＬフローサイトメーター（フロリダ州ハイアレア（Hialeah, FL）のＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析した。そのドットプロットヒストグラムは、リストモードデータとして収集された５ｘ１０4の事象を表す。
【０２５５】
結果および考察
図１０からわかるように、磁気的に標識されたＳＴＲＯ−３ ｍＡｂを用いるヒト骨髄単核細胞の免疫選択により、約９０％のＴＮＡＰ＋細胞がＣＤ４５を共発現する、高レベルのＴＮＡＰおよびＣＤ４５表面抗原発現によって特徴付けられる細胞集団が、結果として単離される（図１０）。対照的に、造血幹細胞マーカーＣＤ３４を発現したＳＴＲＯ−３ ｍＡｂを用いた場合には１％未満のＴＮＡＰ＋富化細胞が単離された。加えて、本発明の方法を用いて富化させたＴＮＡＰ＋細胞の５％より多くが、ＳＴＲＯ−１、ＣＣ９／ＣＤ１４６、および３Ｇ５をはじめとする、ＭＰＣを単離するために以前に用いられたマーカーのいずれかを共発現することはなかった。
【０２５６】
培養増幅後、本発明の方法を用いて富化させたＴＮＡＰ＋細胞は、富化され新たに単離された細胞とは異なる安定な表現型を示した、図１１。初期（継代２）と後期（継代５）の両方の培養増幅ＳＴＲＯ−３選択細胞は、高レベルのＣＣ９／ＣＤ１４６およびＨＬＡクラスＩ分子を均一に発現するが、ＣＤ４５、ＨＬＡクラスＩＩ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３、ＣＤ１１ａ〜ｃ、ＣＤ３１、ＣＤ８６およびＣＤ８０については一様にネガティブであることが判明した。目と引くこととして、ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂによって検出されるようなＴＮＡＰ表面発現は、初期培養継代（継代２）では一様にポジティブであったが、後期培養継代（継代５）ではネガティブであった。
【０２５７】
培養増幅後のＳＴＲＯ−３反応性の漸進的喪失とは対照的に、ＳＴＲＯ−３選択によって富化されたこれらのＴＮＡＰ＋細胞は、ＳＴＲＯ−１抗原の表面発現の漸進的増加を示した、図１１および図１３。継代２に関して言えば、そのＩｇＭアイソタイプ対照と比較してそれらの細胞の約８４％が、ＳＴＲＯ−１ポジティブであり、約半分（５２％）がＳＴＲＯ−１を明るく（例えば、これは、ＳＴＲＯ−１表面発現についてのＳＴＲＯ−１ネガティブ細胞より２ログ規模高い発現によって規定される）発現した。継代５に関して言えば、大部分（約６９％）の細胞は、ＳＴＲＯ−１ポジティブのままであったが、低率（約２１％）の細胞は、ＳＴＲＯ−１を明るく発現した。これは、ＳＴＲＯ−３で選択されたＴＮＡＰ＋細胞の初期培養物がＳＴＲＯ−１抗原をアップレギュレートさせることを示しており、これは自発的分化を伴わない増殖をおそらく反映しているが、培養を続けると、明るい発現から中等度の発現へとＳＴＲＯ−１抗原密度をダウンレギュレーションさせる。
【０２５８】
著しく対照的に、磁気的に標識されたＳＴＲＯ−１ ｍＡｂを用いるヒト骨髄単核細胞の免疫選択により、高い（約５０％）ＳＴＲＯ−１発現とＣＤ４５発現の不在とを特徴とする細胞集団が単離される（図１２、およびＷＯ／２００４／０８５６３０）。この高レベルの初期ＳＴＲＯ−１発現にもかかわらず、ＳＴＲＯ−１選択細胞の培養増幅は、継代４から６によるＳＴＲＯ−１発現の漸進的減少をもたらす。培養増幅後のこれらの低減ＳＴＲＯ−１レベルは、出発集団と比較しても、同じ継代４から６におけるＳＴＲＯ−３選択による培養増幅ＴＮＡＰ＋富化細胞と比較しても、有意に減少される（図１１）。
【０２５９】
ともに、これらの結果は、ＳＴＲＯ−３選択によるＴＮＡＰ＋富化集団が、最初に新たに単離されたときも、培養増幅後も、表現型特性の点でＳＴＲＯ−１＋富化集団とは異なることを示している。
【実施例７】
【０２６０】
ＴＮＡＰ＋細胞の分化−脂肪形成
材料および方法
脂肪形成アッセイ手順
脂肪形成誘導培地の調製：脂肪形成誘導培地は、細胞が１００％集密になったら（約５〜１３日）使用すべきである。細胞が集密になる前に培地を調製する。
１．７０％ ｖ／ｖ エタノールまたはイソプロパノールで、脂肪形成誘導培地（ＰＴ−３１０２Ｂ）および以下のＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ（登録商標）の外面の汚染を除去する：
ａ．ｈ−インスリン（組換え）
ｂ．Ｌ−グルタミン
ｃ．ＭＣＧＳ
ｄ．デキサメタゾン
ｅ．インドメタシン
ｆ．ＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチル−キサンチン）
ｇ．Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ。
２．上記ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓを無菌開封し、その内容物を１７５ｍｌの脂肪形成誘導培地に添加する。
３．各ＳｉｇｌｅＱｕｏｔバイアルを培地ですすぐ。
４．添加済み培地は、細胞の脂肪形成誘導ためだけに使用する。必要となるまで暗所で、２℃から８℃で保管する。
【０２６１】
次のように脂肪形成維持培地を調製する：
１．７０％ ｖ／ｖ エタノールまたはイソプロパノールで、脂肪形成維持培地（ＰＴ−３１０２Ａ）および以下のＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ（登録商標）の外面の汚染を除去する：
ａ．ｈ−インスリン（組換え）
ｂ．Ｌ−グルタミン
ｃ．ＭＣＧＳ
ｄ．Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ。
２．上記ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓを無菌開封し、その内容物を１７５ｍｌの脂肪形成維持培地に添加する。
３．各ＳｉｇｌｅＱｕｏｔバイアルを培地ですすぐ。
４．添加済み脂肪形成維持培地は、必要となるまで暗所で、２℃から８℃で保管する。
【０２６２】
脂肪形成培養プロトコル：
１．組織培養表面積のｃｍ2当たり０．２から０．３ｍｌのＭＳＣＧＭ中、組織培養表面積のｃｍ2当たり２．１ｘ１０4個のＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ選択細胞をプレーティングする。例えば、６ウエルプレートの９．６ｃｍ2ウェル当たり、２ｍｌ 培地中２ｘ１０5個の細胞。それらの細胞は、５％ＣＯ2の加湿雰囲気下、３７℃でインキュベートする。
【０２６３】
２．培養物が集密に達するまで（５〜１３日）、培地を完全に置換することにより、２〜３日ごとにそれらの細胞に新たなＭＳＣＧＭを供給する。最適な脂肪形成性分化のために、これらの細胞は、集密になるか集密後でなければならない。
【０２６４】
３．集密度１００％で、３サイクルの誘導／維持が、最適な脂肪形成性分化を誘発するだろう。各サイクルは、添加済み脂肪形成誘導培地の細胞への供給、３日間の培養（３７℃、５％ＣＯ2）、それに続く添加済み脂肪形成維持培地中で１〜３日の培養から成る。同じスケジュールで非誘導対照細胞に添加済み脂肪形成維持培地のみを供給する。脂肪形成性細胞は、繊細である。それらの細胞中の非常に多数の脂質胞の破壊を回避するように、取り扱いに注意すべきである。培地交換の際に細胞を乾燥させないようにする。
【０２６５】
４．３サイクルの誘導／維持が完了した後、添加済み脂肪形成維持培地中でさらに７日間、培地を２〜３日ごとに交換しながら細胞を培養する。
【０２６６】
５．誘導細胞中の脂質胞の顕微鏡観察によって、脂肪形成性分化の程度を書き留めてもよい。その脂肪形成性分化の記録をとるために、培養物をＡｄｉｐｏＲｅｄで染色してもよい。非誘導細胞は、あったとしてもほんの少数の脂質胞しか有さないであろう。
【０２６７】
６．脂肪細胞を必要とするアッセイには未固定細胞の培養物を用いてもよい。
【０２６８】
インビトロ脂肪形成についてのＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）アッセイ
６、１２、２４および４８ウエルプレートのためのプロトコル：
【０２６９】
１．適切な容量の細胞培地を用いて、細胞を３０，０００個／ｃｍ2で接種し、上で説明したようにそれらの細胞を培養し、分化させる。
【０２７０】
２．そのアッセイの直前に、各プレートをＰＢＳですすぎ、表３に記載の容量を用いてＡｄｉｐｏＲｅｄを添加する。
表３．ＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）アッセイについての容量
【表３】
0005462483.tif 000004
【０２７１】
３．ＡｄｉｐｏＲｅｄの添加後、各ウェルの内容物の５０％を２回、ピペットで吸い上げて出すことによって（６ウエルプレートについては３回）、試薬の最良混合を達成する。青色ＡｄｉｐｏＲｅｄ試薬の均一な分散を達成することが重要である。ピペットの先端が細胞単層に触れないようにまたはウェル表面から細胞を除去しないように、非常に注意しなければならない。
【０２７２】
４．１０分後、蛍光計にプレートを配置し、４８５ｎｍの励起および５７２ｎｍの放射で蛍光を測定する。その蛍光計が適切なフィルターを有さない場合には、一般的な蛍光体蛍光について用いられている設定（励起４８５ｎｍ；放射５３５ｎｍ）を用いることができる。
【０２７３】
結果および考察
２ロットの細胞を分化能力についてアッセイした。細胞のａｍｐを標識した：
２２４２Ａ                ２０７０Ｃ
Ｐ．２ｏ                  Ｐ．２ｏ
〜３０Ｅ６細胞            〜３０Ｅ６細胞
０２ＮＯＶ２００５      ０８ＮＯＶ２００５
【０２７４】
結果を図１４に提供する。これらは、ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂで選択された細胞が、脂肪細胞に分化する能力を有することを示している。
【実施例８】
【０２７５】
ＴＮＡＰ＋細胞の分化−骨形成
材料および方法
骨形成性アッセイ手順
次のように骨形成誘導培地を調製する：
【０２７６】
１．７０％ ｖ／ｖ エタノールまたはイソプロパノールで、分化基底培地−骨形成性（the Differentiation Basal Medium−Osteogenic）および以下のＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓの外面の汚染を除去する：
ａ．デキサメタゾン
ｂ．Ｌ−グルタミン
ｃ．アスコルベート
ｄ．Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ
ｅ．ＭＣＧＳ
ｆ．β−グリセロリン酸塩。
【０２７７】
２．上記ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓを無菌開封し、その内容物を１８５ｍｌの分化基底培地−骨形成性に添加する。
【０２７８】
３．各ＳｉｇｌｅＱｕｏｔバイアルを培地ですすぐ。
【０２７９】
４．必要となるまで暗所で、２℃から８℃でその添加済み骨形成分化培地を保管する。
【０２８０】
骨形成培養プロトコル
１．組織培養面積のｃｍ2当たり０．２〜０．３ｍｌのＭＳＣＧＭ中、組織培養表面積のｃｍ2当たり３．１ｘ１０3個のＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ選択細胞をプレーティングする。例えば、６ウエルプレートの９．６ｃｍ2ウェル当たり、２ｍｌ 培地中３ｘ１０4個の細胞。
【０２８１】
２．それらの細胞を、４から２４時間、ＭＳＣＧＭ中、３７℃、５％ ＣＯ2の加湿雰囲気下で、培養表面に付着させる。
【０２８２】
３．そのＭＳＣＧＭを骨形成誘導培地で置換することにより、骨形成を誘導する。
【０２８３】
４．培地を完全に置換することにより、２〜３週間、３〜４日ごとにそれらの誘導細胞に新たな骨形成誘導培地を供給する。非誘導対照細胞には同じスケジュールでＭＳＣＧＭを供給する。
【０２８４】
５．骨形成誘導細胞は、それらが分化し、石灰化するにつれて、紡錘形から立方形へと細胞形態の変化を示すであろう。集密後細胞層に裂け目が形成されることがあり、細胞が培養表面から離層し始めることがある。この離層が観察されたら、カルシウム沈着によって存在が示されるような骨形成性分化の分析を直ちにし始めるか、それらの誘導細胞を骨細胞を必要とする他のアッセイに用いる。
【０２８５】
６．カルシウム沈着アッセイのために、カルシウム不含ＰＢＳ中で細胞をすすぎ、その後、０．５Ｍ ＨＣｌの存在下で培養表面から細胞を掻き取ることによって、細胞を回収する。骨形成誘導培地からの抽出物をカルシウム含量についてアッセイし、非誘導対照細胞からの抽出物と比較する。
【０２８６】
インビトロ骨形成についてのカルシウム沈着アッセイ
材料：
ＤＰＢＳ、カルシウムおよびマグネシウム不含−Ｃａｍｂｒｅｘカタログ番号１７−５１６Ｑ
・０．５Ｎ ＨＣｌ
・Ｃａｌｃｉｕｍ（ＣＰＬ）Ｌｉｑｕｉｃｏｌｏｒ  ｋｉｔ−Ｓｔａｎｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙカタログ番号０１５０−２５０
・骨形成誘導培地
・プレートリーダーまたは分光光度計
【０２８７】
手順：
・試験すべき誘導または対照細胞が入っている６ウエル培養プレートの各ウェルからすべての培養培地を吸引する。
・細胞を押しのけないように注意しながら１ｍｌのＰＢＳを各ウェルの側面に添加することによって、そのプレート内の細胞をすすぐ。
・そのＰＢＳを吸引除去し、再び上のようにすすぐ。
・その第二洗液を吸引し、０．５ｍｌの０．５Ｎ ＨＣｌを各ウェルに添加する。
・セルリフターを用いてその表面から細胞を掻き取り、細胞およびＨＣｌをポリプロピレンチューブ（１．５ｍｌ エッペンドルフチューブまたはぴったりと合う蓋を有する任意の２〜５ｍｌ ポリプロピレンチューブ）に移す。
・追加の０．５ｍｌの０．５Ｎ ＨＣｌを各ウェルに添加して、そのウェル内に残存する一切の細胞を回収し、これを適切なチューブに移す。
・直ちに試験しない場合は、サンプルにしっかりと蓋をし、−２０℃で１ヶ月間保管することができる。
・オービタルシェーカーを用いて３〜２４時間、４℃でチューブを振盪することによってそれらの細胞からカルシウムを抽出する。もし冷凍サンプルを使用するなら、解凍するために余分な時間をかける。
・サンプルチューブを５００ｇで２分間、遠心分離する。
・抽出されたカルシウムを含む上清をペレットを壊さずに注意深く収集し、新たなチューブに移す。
・Ｓｔａｎｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃａｌｃｉｕｍ（ＣＰＣ）Ｌｉｑｕｉｃｏｌｏｒ  ｋｉｔに付いていたインストラクションに従って、そのカルシウム標準物質で標準曲線を作成し、各対照および骨誘導サンプル中のカルシウム量を決定する。
・サンプルおよびアッセイ試薬量は、マクロタイタープレート（２００μＬ）または分光光度計キュベット（２ｍｌ）に合うように調整することができる。
・１０μＬ〜１００μＬのサンプルを各カルシウム判定に用いる。未使用サンプル抽出物は、さらなる再アッセイのために再冷凍してもよい。
【０２８８】
結果および考察
結果を図１５に提供する。これらの結果は、ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂで選択された細胞が骨細胞に分化できることを示している。
【実施例９】
【０２８９】
ＴＮＡＰ＋細胞の分化−軟骨形成、脂肪形成および骨形成
以前に説明されている（Gronthos et al., 2003）ように１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β３で処理した凝集培養物において軟骨形成性分化を評価した。アルシアンブルーは、ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ選択細胞はプロテオグリカンを産生することができ（図１６Ｃ）、従って軟骨細胞を産生することができることを示した。
【０２９０】
ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ選択細胞は、１０％ ＦＣＳ、１００μＭ Ｌ−アスコルベート−２−ホスフェート、デキサメタゾン、１０〜７Ｍおよび３ｍＭ 無機リン酸塩を追加したαＭＥＭ中で３週間培養した後、機能的骨芽細胞にも分化した。ポジティブのアリザリンレッド染色により石灰沈着を特定した（図１６Ａ）。
【０２９１】
同様に、前に説明したように０．５ｍＭ メチルイソブチルメチルキサンチン、０．５μＭ ヒドロコルチゾンおよび６０μＭ インドメタシンの存在下で脂肪形成を誘導した（図１６Ｂ）。オイルレッドＯ染色は、脂質沈着脂肪細胞の存在を明らかにした。
【実施例１０】
【０２９２】
増幅ヒトＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ選択細胞の移植はインビボで新規骨形成を誘導する。
以前に説明されている（Gronthos et al., 2003）ように、ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ選択骨髄細胞に由来する約５．０ｘ１０6個のエクスビボ増幅細胞を、４０ｍｇの水酸アパタイト／リン酸三カルシウム（ＨＡ／ＴＣＰ）セラミックパウダー（インディアナ州ワルシャワ（Warsaw, IN）のＺｉｍｍｅｒ  Ｉｎｃ．）と混合し、その後、８週間の間、週齢６週の免疫無防備状態ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（オーストラリア、ウエスタンオーストラリア州、パース（Perth, WA, Australia）のＡＲＣ）の背面に皮下移植した。これらの処置は、承認された動物実験計画書（University of Adelaide Ethics Number M19/2005）の明細に従って行った。回収したインプラントを４％ パラホルムアルデヒド中で固定し、その後、１０％ ＥＤＴＡ溶液で脱石灰した後、パラフィンに包埋した。Ｈ＆Ｅで染色した８週経った移植片の代表的断面図を示す。組織検査により、新たな骨の形成の存在が証明された（図１６Ｄ）。
【実施例１１】
【０２９３】
ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ選択細胞は骨修復に有用である
材料および方法
脛骨臨界サイズ欠損
背側横臥位（dorsal recumbency）の状態のヒツジを用いて、左後脚（中大腿骨）の上から足のほうへと羊毛および毛髪を除去した。ポビドンヨード（ベタジン）とアルコールでの交互の手洗消毒を行い、脛骨を覆う皮膚に無菌手術のための準備を施した。無菌手術のために脚を布で覆った。周術期抗生物質予防（アンセフ（Ancef）；手術前に１グラム、手術中に１グラムおよび創傷閉鎖後に１グラムを静脈内投与）をこの時点で始めた。骨膜に達する６ｃｍの皮膚切開を脛骨の内側骨幹に施した。骨膜および上に重なる軟組織は、周囲に鈍的に持ち上げた。食塩溶液で絶えず冷却しながらオシレーティング・ソーを用い、２回の骨切断術で、骨幹中間位に５ｃｍの区域性欠損を作った。
【０２９４】
その欠損を、骨髄間ロック用釘（locking intermedullary nail）を用いて修復した。この釘の挿入のために、中線に対してちょうど中央の縦切開を、左膝（後膝）関節の膝が曲がる位置に施した。関節包を裂き、膝蓋骨腱を横方向に後退させ、脛骨プラトーの中央を切開して関節内の脂肪組織を除去した。６ｍｍの侵入口をドリルによって作り、そしてその釘を挿入プレス嵌めできるまでハンドリーマーでその脛骨の骨幹をリーミングした。必要な場合には、脛骨骨幹遠位端を８ミリドリルでリーミングして、釘の遠位部を手作業で挿入してもよい。この釘は、挿入ハンドルとその釘の近位端に接続された駆動ヘッドとを使用して挿入した。近位と遠位の連結は、近位および遠位照準装置を用いて行った。
ヒツジの脛骨臨界サイズ欠損への培養増幅ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ選択細胞およびＨＡ／ＴＣＰ担体の投与
【０２９５】
欠損にＨＡ／ＴＣＰ担体またはＨＡ／ＴＣＰ＋ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ選択培養増幅細胞を充填し、ＯＲ設定で短時間インキュベートした後、それらの欠損を治療群に依存して様々な濃度（２５Ｍ、７５Ｍまたは２２５Ｍ）で検査した。その後、軟組織を欠損の上で閉じて、担体および細胞を確実に包み込んだ。
【０２９６】
全身麻酔下で動物の横および頭−尾（ＡＰ）の単純Ｘ線写真を撮った。Ｘ線写真は、次の時点で撮影した：第０日（手術）ならびに１、２および３ヶ月。
【０２９７】
Ｘ線写真を次の基準に従って解釈した：
仮骨架橋％は、近位と遠位、両方の欠損領域に拡大した石灰化組織の量の測定値を合計し、それを全欠損長で割ったものであった。
癒合は、以下の採点システムによって特性付けした：
０（癒合なし）；
１（中等度の癒合）；
２（強い相互に接続した癒合塊）。
【０２９８】
脊椎固定処置
ヒツジを麻酔し、そのヒツジの背側腰部から羊毛を除去し、手術台の上に胸骨横臥位（sternal recumbency）で配置した。イソプロピルアルコールと交互にポビドンヨードで多数回、手洗することによって腰領域に無菌手術のための準備を施した。この領域を布で覆い、局所麻酔（リドカイン）を、背側進入路に沿って棘突起の背側のＬ４からＬ５に浸潤させた。
【０２９９】
横突起への進入路：２０ｃｍ皮膚切開を行った。傍脊椎柱筋群を切開して、棘突起および有棘層を除去することとなる。Ｌ３とＬ４の間の椎間関節および横突起を露出させることとなる。
【０３００】
計測および脊椎固定法：Ｌ３およびＬ４の横突起を左右対称に剥皮した。ＨＡ／ＴＣＰ代用移植片（担体）または担体＋同種異系細胞もしく自己移植片を、横突起間に配置した。施術におけるこの時点で、スクリューおよびロッド（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ−Ｓｏｆａｍｏｒ−Ｄａｎｅｋ；ＣＤ−Ｈｏｒｏｚｏｎ，Ｍ８固定スクリューヘッドシステム）を用いて椎弓根スクリュー固定術をヒツジに施した。その手術部位を通常通りに閉じた。
【０３０１】
４ヵ月後、すべてのヒツジを人道的に安楽死させ、接続ロッドの除去後直ちに外植脊椎をＣＴスキャン、単純Ｘ線写真およびＦａｘｉｔｒｏｎ分析に付した。
【０３０２】
脊椎の機械試験
安楽死直後、無傷の腰椎を回収し、直ぐに機械試験のための準備をした。２つの変質（癒合）椎骨ならびにその癒合椎骨より上および下のレベルのさらなる椎骨から成る４つの椎骨を腰椎から単離した。いずれの靭帯および小関節包構造も保たれるように注意しながら、これらの単離検体からすべての脊椎周囲軟組織を剥ぎ取った。大部分の頭側椎骨の上終板に数本のスクリューをドリルし、尾側椎骨の下終板を金属注封固定具（metal potting fixture）に連結させ、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）を用いてそのスクリュー−椎骨構成体を固定した。検体は、準備および試験処置すべての間、湿性にしておいた。
【０３０３】
動態解析−荷重負荷および可動域判定
注文設計の脊椎試験固定具に検体を取り付けた。その試験固定具を標準サーボ油圧式試験フレーム（ＭＴＳ）に連結させ、滑車およびピンと張ったワイヤーから成るシステムを用いて、屈曲／伸展、右および左横曲げ、ならびに右および左軸方向回転での純モーメントを検体に加えた。最大５Ｎ−ｍまで荷重を負荷した。検体を再び３サイクル、プレコンディショニングした。第４サイクルでデータを収集することとなる。
【０３０４】
荷重依存性三次元置換は、立体写真測量法の原理を用いて計算した。下および上の注封固定具と癒合に関係する２つのレベルの両方に３つの非共線マーカーを取り付けた。３つの高解像度カメラ（米国、Ｖｉｃｏｎ  Ｐｅａｋ，Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ，ＣＯ）を用いて、これらのマーカーにより反射される光を検出し、収集したデータを特注のソフトウェア（脊椎柔軟性検査用ソフトウェア、ＭＦＬＥＸ）で処理して、癒合塊全体にわたって適切な椎骨間角度を決定した。結果として生じたデータにより、３つすべての屈曲平面についての関係レベルおよび隣接分節全体にわたる中立帯および可動域データ、両方が得られた。
【０３０５】
統計解析
治療群間の上述のパラメータに関する統計学的有意性は、標準的な一元配置ＡＮＯＶＡと多重比較のためのフィッシャーの最小有意差ＰＬＳＤ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定（米国、ノースカロライナ州、ケアリー（Cary, NC, USA）のＳｔａｔＶｉｅｗ，ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．）を用いて行った。０．０５未満のｐ値は、統計学的に有意とみなされるであろう。
【０３０６】
全身麻酔下で動物の横および頭−尾（ＡＰ）の単純Ｘ線写真を撮った。Ｘ線写真は、次の時点で撮影した：第０日（手術）ならびに１、２、３および４ヶ月。加えて、屠殺した時点で乳房Ｘ線撮影フィルムを用いてＦａｘｉｔｒｏｎ分析を行った。
【０３０７】
Ｘ線写真は次の基準に従って解釈した：
０（癒合なし）；
１（中等度の癒合）；
２（強い相互に接続した癒合塊）。
【０３０８】
結果および考察
図１７は、ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ選択され、培養増幅された、同種異系成体多能性細胞が、Ｘ線分析によって判定したところ、ヒツジ椎弓根スクリュー固定術脊椎モデルにおいて、ＨＡ／ＴＣＰ担体と共に投与された後、対照単独または自己移植片と比較して有意な脊椎癒合を生じさせることを示している。有意な脊椎癒合は、３ヶ月ほどもの早期に観察され、４ヶ月の時点で増加し続けていた。この効果は、最も低い用量でさえ、対照担体およびおよび自己移植片と比較して有意な脊椎癒合を生じさせるので、用量依存性ではないようであった。
【０３０９】
図１８は、ヒツジ椎弓根スクリュー固定術脊椎モデルにおいて、ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ選択され、培養増幅され、ＨＡ／ＴＣＰ担体と共に投与された、同種異系成体多能性細胞が、器機を取り外し、乳房Ｘ線撮影フィルムを用いるＦａｘｉｔｒｏｎ分析によってその領域を評価したとき、屠殺時の担体対照と比較して強い脊椎癒合を示すことを示している。すべての用量の多能性細胞が、関心のある自己移植片標準と比較できる脊椎癒合密度を示す。
【０３１０】
図１９は、ヒツジ椎弓根スクリュー固定術脊椎モデルにおいて、ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ選択され、培養増幅され、ＨＡ／ＴＣＰ担体と共に投与された、同種異系成体多能性細胞が、自己移植片対照と機械的に比較できる癒合を示すことを示している。すべての用量の多能性細胞が、癒合した骨に特有の機械的負荷に対する屈曲、側方拡大およびねじれ可動域を生じさせた。
【０３１１】
図２０は、ヒツジ臨界サイズ５ｃｍ欠損脛骨モデルにおいて、ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ選択され、培養増幅され、ＨＡ／ＴＣＰ担体と共に投与された、同種異系成体多能性細胞が、用量依存的様式で早期骨成長を生じさせたことを示すものである。ＨＡ／ＴＣＰ担体と併せた２２５Ｍの細胞は、損傷後３ヶ月ほどの早期に６０％を越える仮骨形成を生じさせた。
【０３１２】
図２１は、ヒツジ臨界サイズ５ｃｍ欠損脛骨モデルにおいて、ＨＡ／ＴＣＰ担体と共に投与されたＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ選択、培養増幅、同種異系成体多能性細胞が、担体単独の対照と比較して癒合率増加を生じさせたことを示す図である。７５Ｍおよび２２５Ｍの細胞用量のみが、３ヶ月でのＸ線分析により、定義したような癒合を生じさせた。
【０３１３】
これらの結果は、本発明の増幅細胞が骨修復を増進できることを示している。
【実施例１２】
【０３１４】
ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ選択成体多能性細胞は心臓機能を改善する
材料および方法
開胸処置
ヒツジについて、胸部および上腹部を刈り込み、石鹸および水で手術の準備処置をし、ベタジン溶液を塗った（これは、放置して乾燥させる）。手術現場を無菌ドレープで覆い、手術台に付くすべての人は、全身術衣を着用し、マスクをし、手袋をはめ、帽子をかぶった。胸部手術は、すべて、左開胸術によって行う。できる限り最小の切開を用い、第３、第４または第５肋間に入った。スカペルで皮膚切開を施した。皮下組織および筋肉は、止血を増進するために普通に焼灼術で分割した。心膜を開き、心臓を心臓周囲離被架（pericardial cradle）で支持した。心外膜の心エコー図を無菌法のもとで行った。ポリプロピレン（＃０）糸を用いて、適切な冠動脈を結紮した。この動物モデルでの前壁心尖部心筋梗塞モデルは、以前に十分に確立されている。簡単に言うと、左動脈前下行枝（ＬＡＤ）の遠位１／３の糸結紮と第二冠動脈対角枝（Ｄ２）の結紮によって、左心室の約２０〜２５％を含む前壁心尖部心筋梗塞を一様に生じさせることとなる。この技法は、時間の経過とともに心室のリモデリングおよびうっ血性心不全（ＣＨＦ）を招く傷害を、一貫して確実に生じさせる。開胸術の創傷は、吸収性３−０ Ｖｉｃｒｙｌ糸（running 3−0 Vicryl suture）で閉じ、皮膚は、３−０ Ｖｉｃｒｙｌの皮内縫合で閉じた。閉胸前に、ブピバカイン（５ｃｃの０．２５％溶液）を用いて手術部位の肋間神経ブロックを行った。胸腔チューブを左胸膜腔に配置し、動物からチューブを取り除くまで２０ｃｍ水吸引ドレナージを行いながら配置しておいた。
【０３１５】
この処置の間、麻酔下で完全に動物をモニターした（例えば、ＢＰ−動脈ライン、心拍出量−Ｓｗａｎ−Ｇａｎｚ／コンダクタンスカテーテル）。動物は、完全に目覚めて立つまで、チューブを取り除いた後数時間、本発明者らの研究所内で注意深く観察する。あらゆる不整脈または低心拍出量の徴候についてその後６〜２４時間にわたって綿密に観察し、必要に応じて疼痛制御、体液貯留または食欲不振についてモニターし、治療した。
【０３１６】
ヌードラットにおいて追加の開胸術を行った。左動脈前下行枝結紮を全身麻酔下で行い、その後、動物の梗塞周囲領域に細胞を注射し、心膜および創傷を縫合し、動物を２週間、生き延びさせ、２週間の時点で屠殺した。
成体多能性細胞の投与
【０３１７】
ヒツジについては、インビトロ増幅ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ選択骨髄細胞または対照Ｐｒｏｆｒｅｅｚｅ培地を３７℃の水浴内で解凍した。その後、４ｍｌバイアルをアルコールでふき、アンギオキャス（angiocath）針注射器を用いて、１ｍｌ量を吸引し、４つの１ｍｌ注射器に移した。４ｍｌのうちの合計約３．５ｍｌを回収した。その後、それぞれの１ｍｌ注射器に２７ゲージ針を付け、約１６〜２０回の注射により梗塞周囲境界域の周囲に０．２ｍｌを注射した。
【０３１８】
ラットについては、１００万個の細胞を含有する０．２ｍｌの培地を、梗塞周囲境界域に、２７ゲージ針によって注射した。
【０３１９】
心エコー検査
定量的経横隔膜心エコー検査のための開腹術
ヒツジについては、ほぼベースライン、梗塞形成直後、梗塞形成の４週間後の各動物に完全全身麻酔（イソフルラン）のもとで開腹術を施して、定量的経横隔膜心エコー検査を行った。ヒツジでは定量分析のため妥当な経胸または経食道心エコー像を得ることができないため、開腹術を必要とする。これらの動物は、心臓を全体的に覆う巨大な肺を有する。肺内の空気は、実質的に画像の品質を低下させる。これらの試験中は、血行動態、例えば、血圧、心拍数および心拍出量を、注意深くモニターした。
【０３２０】
具体的には、上腹部を刈り込み、石鹸および水で手術の準備処置をし、ベタジン溶液を塗った（これは、放置して乾燥させる）。手術現場を無菌ドレープで覆い、手術台に付くすべての人は、全身術衣を着用し、マスクをし、手袋をはめ、帽子をかぶった。肺が重なっているため、心エコー図は、横隔膜下面像からとった。スカルペルで中線に最初の切開を施し、焼灼器で皮下および筋肉層の切開を遂行した。腹膜腔を開いた。無菌プラスチックバッグの中でエコープローブを横隔膜の下に導入した。すべての試験は、滅菌条件下で行う。腹膜と後部筋膜の両方を通して切開を単純結節０−プロレン縫合で閉じる。皮下組織を３−０吸収性Ｖｉｃｒｙｌで閉じた。皮膚は、３−０皮内Ｖｉｃｒｙｌで閉じる。
【０３２１】
ラットについては、２Ｄ心エコー図を用いて、収縮期および拡張期容積パラメータを測定した。
【０３２２】
データ分析
すべての画像をオフラインで分析した。すべての測定は、ＬＶ腔領域が最小である枠として特定される収縮終期に行った。三次元レンダリングを表すすべてのプロットは、Ｔｅｃｐｌｏｔ（Ｖｅｒｓｉｏｎ １０；ワシントン州ベルヴュー（Bellevue, Washington）のＡｍｔｅｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を用いて作成した。脊椎表面フィットおよびガウス曲率は、Ｍａｔｌａｂで計算した。すべての測定値は、平均ＳＤとして提示される。対応のあるｔ検定を用いてベースラインと閉塞後の比較を行う。以前に説明されているように長軸と短軸の両方での２ＤＣＥデータについて画像処理およびデータ解析を行った。簡単に言うと、梗塞前および梗塞の１時間後に境界域における心内膜の曲率（Ｋ）および心室壁厚（ｈ）を測定した。すべての３ＤＣＥ回転断面像を次のように分析した。心内膜の輪郭および心外膜の輪郭は、本研究の仮説を知らない心エコー検査専門技術者がトレースした（ＵＴＨＳＣＳＡ  ＩｍａｇｅＴｏｏｌ；テキサス州サンアントニオ（San Antonio, Texas）の、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｅｎｔａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ）。
【０３２３】
心内膜および心外膜は、収縮終期に、あらゆる個々の回転断面において各々をトレースすることによって、再構成した。心内膜および心外膜の各々の位置での心筋灌流の存在および不在を判定した。そのために灌流状態をＬＶ幾何形状とともに登録し、その結果、境界域心筋層の正確で明瞭な判定が可能となった。その後、断面データをあわせて、灌流状態によってインデックスされたＬＶ心内膜および心外膜表面の三次元図を再び作成した。薄板平滑化スプライン（ｘ）を用いて心内膜および心外膜表面を当てはめ、空間的分解ガウス曲率をはじめとするこの表面の特性を計算した。
【０３２４】
結果および考察
図２２は、左冠動脈前下行枝の急性結紮の２４時間後に５匹のラットの心臓に直接注射した５継代後のヒトＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ選択細胞の影響を示している。２週間の時点で、それらの細胞は、対照の培地単独の注射と比較して約５０％大きな梗塞領域の変化を誘導する。
【０３２５】
図２３は、両方の冠動脈対角枝の急性結紮直後にヒツジの心臓に直接注射した５継代後の同種異系ヒツジＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ選択細胞の影響を示している。４および８週の時点で、ＳＴＲＯ−３選択細胞で治療した動物は、対照の培地のみで治療した動物と比較して、有意に大きい駆出分画（Ａ）、ならびに有意に低い拡張期（Ｂ）および収縮期（Ｃ）容積を示す。
【０３２６】
これらの結果は、本発明の増幅細胞が心機能を改善できることを示している。
【実施例１３】
【０３２７】
（１）骨再生、または（２）心機能回復／血管形成の増加を必要とするヒト患者における、ヒトＳＴＲＯ−３により選択され培養増幅されたＴＮＡＰ富化細胞の使用
材料および方法
Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ（オーストラリアのＰｅｔｅｒ  ＭａｃＣｕｌｌｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅと提携している）の標準操作プロトコルは、ヒトＢＭからの培養増幅ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ免疫選択ＴＮＡＰ＋細胞に対して用い、骨再生または心機能／血管形成のいずれかを必要とする患者においてそれらのインビボでの使用を可能にした。
【０３２８】
骨髄吸引手順
１．骨髄（ＢＭ）は、腸骨稜（寛骨）の後部における約１／２から１ｃｍ離れた２つまたはそれ以上の部位から常用の手順で採取する。
２．局所麻酔注射を股関節を覆う皮膚に施して、その皮膚領域を麻酔する。皮膚に小さな切断を施し、骨に針を入れる。
３．５〜２０ｍｌの骨髄を吸引し、針を取り出し、そして４０ｍｌの骨髄を採取するまで、前に吸引した領域から離れたその骨の異なる部分に同じ皮膚の切り目を通してその針を再び挿入しておく。
４．ＢＭを慣例的に吸引してリチウム−ヘパリンが入っているチューブに入れるが、他の抗凝固剤も許容される。その骨髄吸引液は、採取から１時間以内に、下で説明するように処理することが好ましい。
【０３２９】
骨髄単核標品−密度勾配分離
すべての技法は、生物学用安全キャビネットＩＩにおいて行う。
１．通常は４０ｍｌのＢＭ吸引液を４本の試験管に収容することとなる（約１０ｍｌ／試験管）。
２．均等な混合を確保するために、すべてのＢＭ画分を５０ｍｌ試験管（Ｆａｌｃｏｎ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にプールする。ＢＭ容量を同量に分けて２本の５０ｍｌ試験管に入れる。同じ容量のブロッキングバッファーを添加する。
３．白血球液（ＷＣＦ）を用いて白血球定量を行う。細胞数（前処理カウント）を評定する。
４．７０ｍｍ セルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて、その希釈されたＢＭを濾過して２本の５０ｍｌ遠心管に入れ、一切の小凝塊および骨片を除去する。
５．１０本の「丸底」１４ｍｌポリスチレン管（Ｆａｌｃｏｎ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に、３ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）溶液を入れる。
６．ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐに７．５ｍｌのＢＭを注意深くかぶせる。
７．４００ｘｇ（１４００ｒｐｍ）で３０分間、室温で管を遠心分離する。遠心分離機のブレーキがｏｆｆであることを確認すること。
８．滅菌カニューレを用いて、白血球バンド（バフィーコート）の約＿ｃｍ上まで培地を陰圧吸引する。使い捨てプラスチックパスツールピペットを用いて単核層を注意深く回収し、５０ｍｌ管にプールする。
９．洗浄バッファーで細胞を４０ｍｌに希釈し、サンプルを４００ｘｇ（１４００ｒｐｍ）で１０分間、遠心分離して、上のほうを分解する。
１０．細胞ペレットの丁度上までバッファーを吸引する。その試験管をボルテックスし、５０ｍｌのＨＨＦを添加する。工程９を繰り返す。
【０３３０】
ＴＮＡＰポジティブ細胞の磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）
１．免疫標識する前に、ＢＭＭＮＣ（約１〜２ｘ１０８個の細胞）を０．５ｍｌのブロッキングバッファーに再懸濁させ、氷上で３０分間インキュベートして、抗体の可能性あるＦｃ受容体媒介結合をブロックする。
２．ブロッキングバッファー中１０ｍｇ／ｍｌの濃度に予め希釈しておいた５００マイクロリットルのＳＴＲＯ−３ ｍＡｂを、ＢＭＭＮＣに加え、時々穏やかに攪拌しながら、６０分間、４ｆＣでインキュベートする。
３．ＢＭＭＮＣをＨＨＦ中で２回洗浄し、０．５ｍｌのＨＨＦ含有ビオチニル化ヤギ抗マウスＩｇＧ（ｇ鎖特異的；英国、バーミンガムのＳｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）に１／５０希釈で再び懸濁させ、４ｆＣで４５分間、インキュベートする。
４．そのＢＭＭＮＣをＭＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中１％ ＢＳＡ、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．０１％ アジ化ナトリウムを追加した、Ｃａ２＋およびＭｎ２＋不含ＰＢＳ）中で３回洗浄し、４５０＿ＬのＭＡＣＳバッファーに再び懸濁させ、それに５０＿Ｌのストレプトアビジンマイクロビーズ（ドイツ、ベルギッシュグラトバッハのＭｉｌｉｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を添加する（９０＿Ｌ ＭＡＣＳバッファー中に１０＿Ｌのマイクロビーズ／１０７個の細胞）。その混合物を４ｆＣで１５分間、インキュベートする。
５．精製プロセスをモニターするために（任意）、ストレプトアビジン−ＰＥコンジュゲート（１／５０）（カリフォルニア州、サンフランシスコ（San Francisco, CA）のＣａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、その細胞懸濁液に、さらに５分間の間、直接添加する。
６．氷冷ＭＡＣＳバッファー中で１回洗浄した後、少量の細胞（約２００Ｋ）をフローサイトメトリー分析のために除去する（プレサンプル）。その後、残りの細胞をミニＭＡＣＳカラム（細胞数１０８のカラム容量、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、ＭＳカラム）に入れる。ＴＮＡＰ−細胞（ネガティブ画分）は、カラム内に保持されず、重力下で通過して排出液となり、これに対してＴＮＡＰ＋細胞は、磁気を帯びたマトリックスに付着して残る。
７．そのカラムを０．５ｍｌのＭＡＣｓバッファーで３回洗浄して、一切の非特異的結合ＴＮＡＰ−細胞を除去する。
８．ＴＮＡＰ＋細胞は、カラムを磁場から取り除いた後、そのカラムをＭＡＣＳバッファーでフラッシュすることによって回収する。プレ、ネガティブおよびポジティブ画分の各々から小サンプルを取り、ＦＡＣＳ  Ｆｉｘ（ＰＢＳ中、１％（ｖ／ｖ）ホルマリン、０．１Ｍ Ｄ−グルコース、０．０２％ アジ化ナトリウム ）中で固定し、その後、フローサイトメトリーにより分析して純度および回収率を評定する。
【０３３１】
ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ選択細胞の樹立およびエクスビボ培養
１．ＴＮＡＰ＋富化集団（ｃｍ2当たり５ｘ１０４）を、２０％ ウシ胎仔血清、１００ｍＭ Ｌ−アスコルベート−２−ホスフェート、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０Ｕ／ｍｌ ペニシリンおよび５０ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシン（ＣＳＬ）を追加したイーグル培地のアルファ改変物（α−ＭＥＭ）が入っている組織培養フラスコまたはプレートにおいて、３７ｆＣ、４％ＣＯ２中で２週間培養する。
２．初代細胞集団を、それらの培養物が８０〜９０％の集密度に達するときまで継代しなければならない。付着細胞を無血清ＨＢＳＳで１回洗浄し、Ｔ７５フラスコ１つ当たり２ｍｌの０．５％ トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（ＪＲＨ）で５〜１０分間、３７℃での酵素的消化によってそれらの細胞を遊離しなければならない。細胞懸濁液をプールし、１０％ ＦＢＳを追加したα−ＭＥＭ成長培地に１ｃｍ２当たり０．５〜１．０ｘ１０４で再び接種する。
３．慣例的に、培養増幅細胞の単個細胞懸濁液を、上で説明したようなトリプシン／ＥＤＴＡ消化によって作製する。その後、それらの細胞を希釈し、冷ＨＦＦ中で洗浄する。遠心分離後、その細胞ペレットをＦＢＳに１ｍｌ当たり細胞数５ｘ１０6の濃度で再び懸濁させ、氷上で維持する。その後、同じ容量の冷凍混合物（冷ＦＢＳ中２０％のＤＭＳＯ）を、穏やかに攪拌しながらそれらの細胞に徐々に添加して、１０％ ＤＭＳＯ／ＦＢＳ中、１ｍｌ当たり細胞数２．５ｘ１０６の最終濃度にする。その後、１ｍｌアリコートを氷上の１．８ｍｌ クリオバイアル（ＮＵＮＣ）に分配し、その後、速度制御冷凍装置を用いて１分当たり−１℃の速度で冷凍する。その後、それらの冷凍バイアルを長期保存のために液体窒素に移す。冷凍ストックの回復は、３７℃の水浴中でそれらの細胞を急速に解凍することによって達成する。その後、それらの細胞を冷ＨＦＦに再び懸濁させ、２８０ｘｇで１０分間スピンする。細胞の生存率を評定するために、０．４％ トリパンブルー／ＰＢＳ中の１：５希釈物を作製し、血球計数器を用いて細胞数を判定する。典型的に、この手順により、８０〜９０％の間の生存率が得られる。
【０３３２】
細胞製剤の品質制御
１．ＢＭＭＳＳＣ培養物をトリプシン／ＥＤＴＡ消化によって作製し、その後、３０分間、ブロッキングバッファーに再懸濁させる。
２．最終な細胞の品質認定として、次のものが挙げられる：グラム染色ネガティブ、１４日目の細菌および真菌培養でネガティブ、エンドトキシン検査ネガティブ、およびトリパンブルー染料排除による生存率７０％。
３．免疫表現型ＳＴＲＯ−１＋、ＴＮＡＰ＋、ＣＤ１４６＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ３−、ＣＤ１４−、コロニー形成アッセイ（コロニー形成単位−線維芽細胞（ＣＦＵ−Ｆ）、および誘導骨芽細胞分化）により、細胞を特性付けする。
その後、自己由来培養増幅細胞を、骨再生を必要としている患者への移植のためにオーストラリア、メルボルンのＲｏｙａｌ  Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌに、ならびに心機能回復および／または新血管形成を必要としている患者への心筋内移植のためにオーストラリア、ニューキャッスル（Newcastle, Australia）のＪｏｈｎ  Ｈｕｎｔｅｒ  Ｈｏｓｐｉｔａｌに、氷を用いて送る。
【０３３３】
経皮的ＮＯＧＡ誘導骨髄細胞移植手順
ＮＯＧＡ（Ｂｉｏｓｅｎｓｅ）左心室電気機械的マッピングシステムでは、磁気技術を利用して８ｆｒ心内膜マッピングカテーテルを操縦し、それを右大腿動脈により経皮的に導入し、左心室に進める。その後、局所のＲ波電位を捕捉しながらそのカテーテルを心内膜表面に沿って引っ張る。電気シグナルは、表面ＥＣＧ電極によってゲートされ、その結果、局所心壁運動の情報（局所的線形性漸減スコア（local linear shortening scores））をもたらす。虚血性だが生存している心筋層領域は、局所的線形性漸減は低減したがＲ波電位は保存されている領域として、ＮＯＧＡによって検出されるであろう。正常な心筋層の定義済みＮＯＧＡパラメータは、電気活性＞５ｍＶであって局所線形漸減＞１２％の領域である。閉塞した心筋層は、電気活性＜５ｍＶであって局所線形漸減＜４％の領域であろう。虚血性だが生存している心筋層は、５ｍＭまたはそれよい大きい電位および４〜１２％の局所線形漸減スコアを有するであろう。ＮＯＧＡは、心臓カテーテル検査室（the Cardiac Catheterisation Laboratory）においてオンラインで心筋バイアビリティー評定用ツールとして広範に確認されている。Ｂｉｏｓｅｎｓｅ  Ｍｙｏ−Ｓｔａｒ  ＴＭ 注入カテーテルは、空間への配置を可能にする磁気センサーを先端に有するので、マッピングカテーテルに類似している。これは格納式の針を有し、それを用いて骨髄をターゲット領域に正確に注入することができる。このシステムは、心内膜表面と接触するので、心内膜に骨髄細胞を正確および安全に注射することができる。
【０３３４】
結果および考察
大腿骨の非癒合骨折を有する患者への、ＳＴＲＯ−３により選択され培養増幅されたＴＮＡＰ富化細胞の移植
オートバイ事故のため９ヶ月前に発生し、ロッドおよびスクリューの手術移植にもかかわらず治癒に失敗した大腿骨幹の骨折を有する１９歳の男性が、ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌに診察を受けに来た。遺残未治癒５ｃｍ欠損が、残っていた。
【０３３５】
インフォームドコンセントの後、患者から骨髄を吸引し、上述のとおり、骨髄単核細胞をＳＴＲＯ−３ ｍＡｂにより選択し、これらの細胞を培養増幅した。約６週間の培養の後、２００，０００，０００〜２２５，０００，０００個の細胞を回収し、輸注のための外科的準備をした。
【０３３６】
輸注時、細胞を滅菌食塩水／Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅに再懸濁させて５〜１０ｍｌ量にし、ウシコラーゲンを含有するＡｒｔｉｆｉｃａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｔｒｉｘ（ＨＡ／ＴＣＰ）（Ｍａｓｔｅｒｇｒａｆｔ（商標）Ｍａｔｒｉｘ）と混合した。
【０３３７】
この手順は、何事もなく、有害事象はなかった。その欠損を完全に閉じた。
【０３３８】
多発性冠動脈血管閉塞症および難治性胸痛を有する２人の患者への、ＳＴＲＯ−３により選択され培養増幅されたＴＮＡＰ富化細胞の移植
労作時持続性胸痛および多枝冠動脈閉塞を有するが、内科的および外科的治療の効果があまりでない、年齢範囲４０〜６５歳の２人の男性が、ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｈｕｎｔｅｒ  Ｈｏｓｐｉｔａｌに診察を受けに来た。
【０３３９】
インフォームドコンセントの後、患者から骨髄を吸引し、上述のとおり、骨髄単核細胞をＳＴＲＯ−３ ｍＡｂにより選択し、これらの細胞を培養増幅した。約６週間の培養の後、１００，０００，０００〜１２０，０００，０００個の細胞を患者ごとに回収し、ＮＯＧＡ（Ｂｉｏｓｅｎｓｅ）心臓カテーテルによる心筋内輸注のための準備をした。
【０３４０】
各患者に、培養細胞のＮＯＧＡカテーテル誘導心筋内注入を行った。各標的領域で細胞を含有する０．２ｍの注入を１０〜１２回行った。
【０３４１】
心エコー図は、心室壁の穿孔および続いて起こる心膜周囲タンポナーデを排除するために、この処置中および直後に行った。処置後、患者を冠疾患集中治療室において２４時間観察した。冠疾患集中治療室での観察中、８時間ごとに心エコー図および心臓酵素レベルを検査した。移植処置後最初の２４時間の間に心エコー図を取った。
【０３４２】
急性的にも、術後期間においても、有害事象は観察されなかった。患者たちを、各々、２ヶ月間、見守った。この期間の間に、各患者は胸痛の症状発現の頻度および重症度の低下を示し、労作耐性の増加を報告した。
【０３４３】
これらのデータは、増幅細胞の移植が、閉塞された冠血管によりもたらされる心筋の傷害および「ａｔ  ｒｉｓｋ」領域への血流を増加させたことを示唆している。
【実施例１４】
【０３４４】
フィブリン糊で送達した場合の細胞生存の増加
材料および方法
フィブリン糊の調製
フィブリン糊（Ｔｉｓｓｅａｌ  ＶＨ、Ｂａｘｔｅｒ）を製造業者の仕様書に従って調製した。簡単に言うと、凍結乾燥シーラータンパク質濃縮物（the freeze−dried Sealer Protein Concentrate）、線維素溶解阻害溶液（the Fibrinolysis Inhibitor Solution）およびトロンビンが入っているバイアルを水浴内で３７℃に加熱した。ＤＵＰＬＯＪＥＣＴ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを備えた滅菌再構成コンポーネントを用いて、その凍結乾燥シーラータンパク質濃縮物が入っているバイアルに、その線維素溶解阻害溶液を移し入れた。そのバイアルを３７℃で１分間放置し、その後、円運動で（過度な泡立ちを回避しながら）短時間、激しく渦攪拌し、もう１５分間、水浴に入れておいた。温まり次第、塩化カルシウム溶液をトロンビン溶液に移し入れた。
【０３４５】
細胞の再懸濁および注入
ＰＢＳ中の５，０００，０００個の培養増幅免疫選択ヒトＭＰＣを希釈トロンビン溶液に移し入れた。その後、そのトロンビン／細胞溶液および再構成シーラータンパク質溶液を、２本の無針１ｃｃインスリン注射器（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）および２７Ｇ ５／８”針（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を搭載した改良型ＤＵＰＬＯＪＥＣＴ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍに充填した。
【０３４６】
ヌードラッドのＬＡＤ結紮および梗塞形成の４８時間後、左開胸切開部を再び開き、癒着を注意深く分離させた。梗塞ゾーンを特定し、０．３ｃｃの総量（１：５希釈フィブリン糊中の１，０００，０００個の細胞を含有）を３つの等分割用量で梗塞周囲領域に注入した。切開部を一層ずつ閉じ、動物を回復させた。さらに４８時間後、標準的な方法により、動物を屠殺し、心臓組織を得、全ＤＮＡを抽出した。
【０３４７】
ラットから抽出した心臓組織ＤＮＡを用いてヒトβ−グロブリン遺伝子のＰＣＲを行って、標準曲線からヒト細胞生存を推定した。
【０３４８】
結果および考察
図２４は、本発明の培養増幅ＭＰＣが、フィブリン糊で送達されたとき、インビボでの組織内での生存増加を示すことを示している。
【０３４９】
特定の実施形態において示したような本発明に、大まかに説明したような本発明の精神または範囲を逸脱することなく、非常に多数の変形および／または変更を成すことができることは、当業者には理解されるであろう。従って、本実施形態は、すべての点で、例証とみなすべきであり、限定とはみなすべきではない。
【０３５０】
上で論じたすべての出版物は、それら全体が本明細書に参考として組み込まれる。
【０３５１】
本発明に含まれているあらゆる文献、行為、材料、装置、製品などは、単に本発明に一定の状況を提供するためのものである。これらの内容のいずれかまたはすべてが、先行技術の基礎の一部を形成していることまたは本出願の各請求の優先権主張日より前にそれが存在したため、本発明に関連した分野における一般的な知識であったことを認めるものと解釈すべきでない。
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【図面の簡単な説明】
【０３５２】
【図１】ＳＴＲＯ−３表面Ａｇを発現するＢＡＦ−３のＳＴＲＯ−３選択ＢＡＦ−３細胞の漸進的富化のフローサイトメトリー分析を示す図である。磁気ビーズ／ｍＡｂ捕捉および富化手順によって選択的に単離されたＢＡＦ−３細胞を、ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂで免疫標識し、１ラウンド（Ａ）、２ラウンド（Ｂ）および３ラウンド（Ｃ）の選択後に、フローサイトメトリーによって分析した。磁気ビーズ選択および富化は、Ａｇ発現の均一性が達成されるまで行った。
【図２】ＳＴＲＯ−３表面Ａｇを発現するＢＡＦ−３細胞から単離されたゲノムＤＮＡからのプロウイルスｃＤＮＡインサートのＰＣＲ回収を示す図である。ＳＴＲＯ−３細胞表面Ａｇを発現するＢＡＦ−３細胞から単離されたゲノムＤＮＡからのｃＤＮＡインサート（矢印）を回収するために、長距離ＰＣＲを用いた。使用したＰＣＲプライマーは、レトロウイルスベクターにおけるマルチクローニング部位に隣接した配列に相補的であった。増幅は、「方法」において詳述したとおりに行い、その後、ＰＣＲ産物を１．０％アガロースゲルで分離し、エチジウムブロミド染色によって視覚化した。
【図３】ＰＣＲ産物由来のＳＴＲＯ−３抗原のＦＡＳＴＡアラインメント解析を示す図である。部分配列分析後、得られたヌクレオチド配列を、標準的な「ＦＡＳＴＡアラインメント解析」により、Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ複合データベースに寄託された配列と比較した。ＡＬＰ相補的ＤＮＡ配列のＢＬＫアイソフォーム（Genbankアクセッション番号＃Ｈ３７９４４）と１００％の相同性を示した。
【図４】ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂが、ＢＡＦ−３トランスフェクタントにおけるＡＬＰのＢＬＫアイソフォームを認識することを示す図である。ＢＬＫ−ＡＬＰ ｃＤＮＡの１．７ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ制限フラグメント（全コード配列と５’および３’非コード領域の両方を収容している）をｐＲＵＦ．ｎｅｏベクターにサブクローニングし、その後、レトロウイルス形質導入によってＢＡＦ−３細胞に導入した（「材料および方法」参照）。得られたＧ４１８耐性細胞集団を間接免疫蛍光法によって染色し、フローサイトメトリーによって分析した。リストモードデータ ＩｇＧ１対照（薄い黒線）；（Ａ）ｍＡｂ ＳＴＲＯ−３；（Ｂ）ｍＡｂ Ｂ４−７８；（Ｃ）ｍＡｂ Ｂ４−５０および（ｄ）ｍＡｂ ８Ｂ６として収集したデータは、１ｘ１０4の光散乱をゲートした事象の単一パラメータ蛍光（ＦＩＴＣ）ヒストグラムとして表示する。
【図５】ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂにより酵素活性形態のＡＬＰが特定されることを示す図である。トランスフェクトされていないＢＡＦ−３細胞（Ａ）およびＳＴＲＯ−３ポジティブＢＡＦ−３細胞（Ｂ）のサイトスピン標品をスライドガラスの上で作製し、その後、７０％エタノールで固定した。その後、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（ＡＭ０１００）をその製造業者によって推奨されたとおり使用して、それらのスライドガラスをアルカリホスファターゼ基質と共にインキュベートした。結果は、ＳＴＲＯ−３を発現するＢＡＦ−３細胞（Ｂ）が活性化形態のアルカリホスファターゼ酵素を含有することを示した（紫／赤色）。それらの細胞をヘマトキシリンで対比染色した（青色）。
【図６】ＡＬＰ特異的ＰＣＲを示す図である。方法において説明したようにＳＴＲＯ−３細胞表面Ａｇを発現するＢＡＦ−３細胞から単離した全ＲＮＡを使用し、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ｃＤＮＡによってコードされたアルカリホスファターゼアイソフォームを特定した。以前にＳａｔｏおよび共同研究者によって記載された（１９９４）（Sato et al., 1994）ように、使用したＰＣＲプライマーによって、（Ｌ）肝臓（２１６ｂｐ）または（Ｂ）骨（２１５ｂｐ）アルカリホスファターゼアイソフォームのいずれかに特異的な配列を特定した。ＰＣＲ増幅後、それらの産物を１．５％アガロースゲルで電気泳動（run）し、エチジウムブロミドで染色した。結果は、ＢＡＦ−３細胞を発現するＳＴＲＯ−３抗原のみが、骨特異的（Ｂ）アルカリホスファターゼアイソフォームに対応する転写物を発現することを示した。
【図７】ヒト骨組織におけるＳＴＲＯ−３抗原の発現を示す図である。方法において説明したように免疫組織化学を用いて骨髄を染色（developing）している切片においてＳＴＲＯ−３ ｍＡｂの免疫反応性も評価した。パラフィンに包埋した日齢５５日のヒト肢節の５マイクロメートル切片を、「方法」において説明したように、ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂで染色した。ＳＴＲＯ−３抗原（ＴＮＡＰ）の発現は、骨髄腔（ＢＭ）の間葉系細胞、血管周囲領域（ＰＶ）および成長プレート領域の界面において顕性であったが、骨膜（Ｐ）および軟骨（Ｃ）において染色は観察されなかった。
【図８】クローン形成性細胞が、ヒトＢＭのＳＴＲＯ−３ ｍＡｂポジティブ画分に排他的に限定されることを示す図である。未分画ＢＭ（Ｐｒｅ）およびＭＡＣＳ選択ＴＮＡＰポジティブ（ＴＮＡＰ＋）およびＴＮＡＰネガティブ（ＴＮＡＰ−）ヒトＢＭの単細胞懸濁液を標準の成長培地（Gronthos et al., 2003）にプレーティングして、各細胞画分における付着コロニー形成細胞の発生率を評価した。１２日の培養の後、方法において説明したように、コロニー（５０個またはそれ以上の細胞の凝集体）を染色し、評点を付けた。この棒グラフは、２つの別の実験からの平均した、各細胞画分についてプレーティングした１０5個の細胞当たりのクローン形成性コロニーの数を示すものである。本発明者らのデータは、ＣＦＵ−Ｆが、ＢＭのＴＮＡＰポジティブ画分に排他的に限定されることを実証している。
【図９】成体ヒトＢＭＭＮＣによるＴＮＡＰと間葉系前駆細胞マーカーである、ＳＴＲＯ−１の共発現を示す図である。ＦＩＴＣにカップリングさせたヤギ抗マウスＩｇＭ抗体で間接的に標識した、ＳＴＲＯ−１ ＭＡＣＳ選択ＢＭＭＮＣ（ｘ軸）と、ＰＥにカップリグさせたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体で間接的に標識したＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ（マウスＩｇＧ１）（ｙ軸）とをインキュベートすることにより、二色免疫蛍光法およびフローサイトメトリーを行った。このドットプロットのヒストグラムは、リストモードデータとして収集した５ｘ１０4イベントを表す。縦線および横線は、アイソタイプにマッチした対照抗体［同じ条件下で処理した１Ｂ５（ＩｇＧ）および１Ａ６．１２（ＩｇＭ）］で得られた１．０％未満の平均蛍光反応性レベルにセットされた。結果は、低率の集団である明るいＳＴＲＯ−１細胞はＴＮＡＰと共発現する（右上四分の一区分）が、残りのＳＴＲＯ−１＋細胞は、ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂと反応することができなかったことを実証している。全四区画からのＦＡＣＳにより単離された細胞を、その後、ＣＦＵ−Ｆの発生率についてアッセイした（表２）。
【図１０】ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ富化細胞によるＴＮＡＰとＣＤ４５、ＣＤ３４、３Ｇ％、ＣＣ９およびＳＴＲＯ−１との共発現を示す図である。
【図１１】ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ選択細胞が多数の継代後に高レベルのＳＴＲＯ−１発現を維持することを示す図である。
【図１２】それらに結合する抗体を使用して選択された骨髄由来細胞におけるＳＴＲＯ−１発現を示す図である。
【図１３】ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂで選択され、培養増幅させた多能性細胞の初期（Ｐ２）および後期（Ｐ５）継代表現型の特徴を示す図である。ＳＴＲＯ−３選択成体多能性細胞（Ｐ１）は、ＣＣ９、ＳＴＲＯ−１およびＳＴＲＯ−３抗原の高レベルの発現を特徴とする表面表現型を有する集団である。培養で５継代後、この細胞集団（Ｐ５）は、ＳＴＲＯ−１発現の有意な維持を示す。
【図１４】脂肪細胞へのＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ選択細胞の分化を示す図である。２つのロットのＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ選択細胞（２２４２Ａおよび２０７０Ｃ）を分化能力についてアッセイした。これらのグラフは、脂肪生成誘導培地（Adipogenic Induction Medium）で誘導した細胞  対  対照非誘導細胞についての平均相対蛍光単位（Ａｖｇ ＲＦＵ）を示している。
【図１５】骨細胞へのＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ選択細胞の分化を示す図である。カルシウム濃度がわかっているＯＤ ５５０ｎｍのサンプルを用いて標準曲線を作成した。２つのロットのＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ選択細胞（２２４２Ａおよび２０７０Ｃ）を骨形成誘導培地（Osteogenic Induction Medium）で誘導した。誘導細胞および非誘導細胞の細胞抽出物を調製し、ＯＤ ５５０ｎｍで測定した。
【図１６】機能性骨芽細胞へのＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ選択細胞の分化を示す図である。Ａ−ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ選択成体多能性細胞を、１０％ＦＣＳ、１００μＭ Ｌ−アスコルベート−２−ホスフェート、デキサメタゾン １０−７Ｍおよび３ｍＭ 無機ホスフェートを追加したαＭＥＭ中で３週間培養し、アリザリンレッドで無機沈着物を染色した。Ｂ−０．５ｍＭ メチルイソブチルメチルキサンチン、０．５μＭ ヒドロコルチゾンおよび６０μＭ インドメタシンの存在下でＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ選択成体多能性細胞を培養後にオイルレッドＯ染色で染色した細胞。Ｃ−１０ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦ−β３で処理し、プロテオグリカン合成を特定するためにアルシアンブルーで染色した細胞培養物。Ｄ−移植後の培養増幅ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ選択成体多能性細胞の組織学的試験。
【図１７】培養増幅ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ選択細胞の投与後の脊椎固定率を示す図である。
【図１８】培養増幅ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ選択細胞で治療したヒツジにおけるしっかりした脊椎固定を示す図である。
【図１９】ヒツジ椎弓根スクリュー固定モデルにおける、ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ選択され、培養増幅された、同種異系成体多能性細胞を示す図である。
【図２０】臨界寸法のヒツジ頸骨分節性欠損における同種異系の、培養増幅された、ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ選択細胞による用量依存性骨成長を示す図である。
【図２１】培養増幅された、ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ選択細胞で治療した臨界寸法の頸骨分節性欠損を有する群における、より高い融合率（rate of union）を示す図である。
【図２２】培養増幅された、ＳＴＲＯ−３ ｍＡｂ選択細胞が、ラット心筋梗塞の２週間後、心臓機能を有意に改善することを示す図である。
【図２３】両方の冠動脈対角枝（diagonal and coronary arteries）の急性結紮直後にヒツジの心臓に直接注入した同種異系ヒツジの、培養増幅された、ＳＴＲＯ−３選択細胞（５継代）の効果を示す図である。ヒツジの、Ａ−駆出分画の減少％、Ｂ−拡張期容積の変化％、およびＣ−収縮期容積の変化％。
【図２４】食塩溶液と比較してフィブリン糊において送達されたとき低減された細胞生存を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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